BRPI0711843A2 - método para detectar a presença e/ou quantidade de pelo menos um analito em uma amostra, combinação de sonda alvo substituta e sonda de captura, cartucho descartável, e, sistema para detectar a presença ou quantidade de pelo menos um analito em uma amostra - Google Patents

Abstract

MéTODO PARA DETECTAR A PRESENçA E/OU QUANTIDADE DE PELO MENOS UM ANALITO EM UMA AMOSTRA, COMBINAçãO DE SONDA ALVO SUBSTITUTA E SONDA DE CAPTURA, CARTUCHO DESCARTáVEL, E, SISTEMA PARA DETECTAR A PRESENçA OU QUANTIDADE DE PELO MENOS UM ANALITO EM UMA AMOSTRA. Um método de detecção é descrito para detectar um analito, em particular ácidos nucleicos, em uma amostra empregando-se SE(R)RS, sem necessidade de rotulação do analito. O método de detecção é baseado no deslocamento de uma sonda alvo substituta rotulada de uma sonda de captura pelo analito da amostra. A presente invenção também fornece um correspondente sistema de detecção, um cartucho descartável para uso em tal sistema e uma combinação de sonda alvo substituta e sonda de captura.

Description

"MÉTODO PARA DETECTAR A PRESENÇA E/OU QUANTIDADE DE PELO MENOS UM ANALITO EM UMA AMOSTRA, COMBINAÇÃO DE SONDA ALVO SUBSTITUTA E SONDA DE CAPTURA, CARTUCHO DESCARTÁVEL, E, SISTEMA PARA DETECTAR A PRESENÇA OU QUANTIDADE DE PELO MENOS UM ANALITO EM UMA AMOSTRA" CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um método de ensaio SE(R)RS para detectar analitos, em particular ácidos nucleicos de amostras, e a ferramentas e dispositivos para realizar estes métodos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Detecção sensível, específica e rápida da presença de certas biomoléculas em uma amostra é de grande importância para aplicações diagnosticas moleculares. Tipicamente, as chamadas sondas de captura são imobilizadas em uma superfície sensora e a ligação específica do alvo às sondas de captura é monitorada por detecção de um rótulo introduzido dentro do alvo ou por uma segunda sonda provida com um rótulo. Isto requer o transporte do alvo, sondas e rótulos para a superfície. Uma vez que a difusão das macromoléculas é relativamente lenta, a ligação à superfície torna-se a etapa crítica de tempo das análises. A ligação do alvo à superfície pode ser reversível, p. ex., em hibridizações de DNA as moléculas alvo hibridizadas podem ser extraídas ou retiradas por fusão da superfície e o substrato pode ser reutilizado após a lavagem. Entretanto, isto é demorado. Portanto, os ensaios chamados homogêneos, por meio do qual a análise é realizada em solução, são vantajosos. Na realidade, as distâncias de difusão são muito pequenas e os dispositivos podem ser reutilizados facilmente. Contudo, trabalhar com sondas de captura imobilizadas tem a vantagem da facilidade de multiplexação (isto é, determinação de diferentes alvos ao mesmo tempo) por uma deposição padronizada.

Recentemente foi introduzida uma técnica que permite medições multiplexadas, sensíveis em solução homogênea, a chamada espectroscopia Raman intensificada na superfície (ressonante) (SE(R)RS). Para as medições SE(R)RS, as moléculas a serem detectadas precisam ser adsorvidas em uma superfície de metal nobre nanoestruturada. O sinal Raman é intensificado por diversas ordens de magnitude devido à interação entre o campo óptico do feixe de excitação e o campo plasmônico da superfície metálica (SERS) e também devido à excitação ressonante do cromóforo (SERRS). SE(R)RS tem o aspecto único de que a luz dispersa consiste de faixas pronunciadas vibracionais específicas de molécula, que fazem discriminação de múltiplos analitos dentro de uma possível solução. Na aplicação de SERRS para detecção de DNA, um rótulo SERRS com uma dupla funcionalidade é incorporado dentro da seqüência de nucleotídeo de interesse, p. ex., por PCR. O rótulo SERRS fíxar-se-á a uma superfície de prata por grupos eletricamente (positivos) carregados e gerará o sinal Raman pelos componentes de corante. O sinal Raman é fortemente amplificado pelo campo plasmônico criado na superfície da partícula de prata confinada, permitindo detecção extremamente sensível (na faixa picomolar).

Contudo, os sistemas acima descritos foram observados terem diversas limitações. A detecção do DNA, por exemplo, tem sido somente exeqüível quando o rótulo é incorporado dentro do DNA, o que geralmente requer uma etapa de amplificação. Além disso, o espectro de SERRS dos rótulos de corante não depende da seqüência ou estrutura do ácido nucleico fixado nele, significando que os iniciadores não-incorporados ou sondas não hibridizadas, respectivamente, necessitam ser separadas da solução antes da medição.

A US 6.750.065 descreve a detecção de proteínas utilizando-se SE(R)RS, por meio do que um antígeno é detectado com base em sua capacidade em deslocar um composto semelhante a analito rotulado SE(R)RS de um anticorpo específico de analito. No deslocamento, o rótulo SE(R)RS ligado ao composto semelhante a analito é detectado pela adsorção de uma superfície SE(R)RS nele.

BREVE RESUMO DA INVENÇÃO

E um objetivo da presente invenção simplificar a detecção in vitro dos ácidos nucleicos em amostras, utilizando-se um ensaio alternativo SE(R)RS5 em que a rotulação do analito não é necessária.

O objetivo acima é realizado fornecendo-se métodos para SE(R)RS competitivos, de acordo com a presente invenção e ferramentas e dispositivos para uso nestes métodos.

E uma vantagem da presente invenção que a multiplexação é facilmente exeqüível por que as pronunciadas faixas vibracionais específicas de molécula dos espectros de SE(R)RS possibilitam a detecção sensível e acurada de múltiplos rótulos simultaneamente.

E ainda uma vantagem da presente invenção que os SE(R)RS e a fluorescência possam ser medidos simultaneamente, fornecendo uma validação extra do método.

Outra vantagem da presente invenção é que a medição em tempo real de um ou outro ou de ambos de SE(R)RS e fluorescência pode fornecer respostas rápidas quanto a se ou não um certo analito está presente.

Além disso, a ocorrência de um sinal fluorescente aponta prontamente para a presença do analito na amostra. Um rápido teste quantitativo pode assim ser fornecido através da detecção somente da fluorescência.

E também uma vantagem da presente invenção que um padrão interno pode ser fornecido, possibilitando correções das variações, p. ex., na detecção óptica, de agregação das nanopartículas de prata etc.

É também uma vantagem da presente invenção que o rótulo é trazido próximo à superfície do SE(R)RS, sem a necessidade de adsorção direta do rótulo na superfície. Em vez disso, o rótulo é trazido na proximidade da superfície, via ligação da sonda alvo substituta (compreendendo o rótulo) na sonda de captura, através de hibridização de oligonucleotídeo, um processo que pode ser prontamente controlado. Desta maneira, a falta de controle do processo de adsorção de superfície de diferentes rótulos na superfície de SE(R)RS, que é um problema nos métodos atuais de detecção baseados em SE(R)RS, é evitada.

Aspectos particulares e preferidos da invenção são expostos nas reivindicações independentes e dependentes anexas. Aspectos das reivindicações dependentes podem ser combinados com aspectos das reivindicações independentes e com aspectos de outras reivindicações dependentes, como apropriado e não meramente como explicitamente exposto nas reivindicações.

Em um primeiro aspecto da presente invenção, a presença e/ou quantidade de pelo menos um analito em uma amostra é determinada por um ensaio de deslocamento baseado nas etapas de (a) contatar a amostra com pelo menos uma sonda de captura específica de alvo e pelo menos uma sonda alvo substituta deslocável (que é rotulada), por meio do que a(s) sonda(s) de captura específicas alvo é/são covalentemente ligadas a uma superfície de SE(R)RS ou a etapa (a) compreende ainda contatar a(s) sonda(s) de captura específica(s) de alvo com uma superfície SE(R)RS e (b) detectar o sinal gerado pelo(s) rótulo(s) no(s) híbrido(s) substitutos formados pela ligação da(s) sonda(s) alvo substituta(s) deslocável(eis) e da(s) sonda(s) de captura específica(s) de alvo, cujos sinal(ais) é/são proporcionais à presença e/ou quantidade do(s) analito(s) na amostra.

Dentro deste método, a etapa (a) compreende ainda as etapas de (I) contatar a(s) sonda(s) de captura específíca(s) de alvo com a(s) sonda(s) alvo substituta(s) deslocáveis, a fim de obter(em)-se o(s) híbrido(s) substitutos, por meio do que a(s) sonda(s) de captura específica(s) de alvo é/são covalentemente ligada(s) a uma superfície SE(R)RS e o(s) híbrido(s) substituto(s) adsorvidos na superfície é/são assim obtido(s) ou a etapa (I) compreende ainda contatar a(s) sonda(s) de captura especifica(s) de alvo com uma superfície SE(R)RS ou dita etapa (i) compreende ainda contatar o(s) híbrido(s) substituto(s) com uma superfície SER, de modo que o(s) híbrido(s) substituto(s) torna(m)-se adsorvidos na superfície SE(R)RS como híbrido(s) substituto(s) adsorvido(s) na superfície e (II) contatar o(s) híbrido(s) substituto(s) adsorvido(s) na superfície com a amostra, a fim de permitir o deslocamento da(s) sonda(s) alvo substituta(s) deslocável(eis) pelo(s) analito(s).

Dentro deste método, a etapa (b) pode ainda compreender as etapas de (III) detectar o(s) sinal(ais) do(s) rótulo(s) no(s) híbrido(s) substituto(s) adsorvido(s) na superfície após a etapa (I), usando-se um ou outro ou ambos de SE(R)RS e fluorescência; e (IV) detectar o(s) sinal(ais) do(s) híbrido(s) substituto(s) adsorvido(s) na superfície após a etapa (II), utilizando-se o mesmo método de detecção ou métodos usados na etapa (III). A diferença no(s) sinal(ais), obtida nas etapas (III) e (IV) é considerada como proporcional à presença e/ou quantidade do(s) analito(s) da amostra.

A Etapa (a) do método acima descrito pode também compreender ainda as etapas de (V) contatar a(s) sonda(s) de captura específica(s) de alvo com a(s) sonda(s) alvo substituta(s) deslocável(eis), a fim de obterem-se o(s) híbrido(s) substituto(s), (VI) contatar o(s) híbrido(s) substituto(s) com a superfície SE(R)RS, de modo que o(s) híbrido(s) substituto(s) torne(m)-se adsorvidos na superfície formando o(s) híbrido(s) substituto(s) adsorvido(s) na superfície e (VII) contatar o(s) híbrido(s) substituto(s) adsorvido(s) na superfície com a amostra, a fim de permitir o deslocamento da(s) sonda(s) alvo substituta(s) deslocável(eis) pelo(s) analito(s).

Para possibilitar a calibração ou correção das variações, p. ex., variações agregadas ou ópticas, um padrão é incluído no método acima descrito, como provido pelas etapas (c), contatando-se uma sonda de captura padrão e uma sonda padrão (que é rotulada), desse modo obtendo-se um híbrido padrão, e contatando-se o híbrido padrão com a superfície de SE(R)RS, desse modo obtendo-se um híbrido padrão adsorvido na superfície, e (d) detectando-se o sinal gerado pelo rótulo em dito híbrido padrão adsorvido na superfície.

Em um segundo aspecto da presente invenção, uma combinação de sonda alvo substituta e sonda de captura é descrita, por meio da qual o oligonucleotídeo da sonda alvo substituta é caracterizado por uma temperatura de fusão que é menor do que a temperatura de fusão de um oligonucleotídeo que é 100% complementar ao oligonucleotídeo da sonda de captura, e o rótulo ligado à sonda alvo substituta tem uma ou ambas dispersão Raman intensificada na superfície (ressonância) (SE(R)RS) e atividade de fluorescência.

Em um terceiro aspecto da presente invenção, é descrito um cartucho descartável para uso em um sistema para detectar a presença ou quantidade de pelo menos um analito em uma amostra e compreende (a) um conjunto de fontes compreendendo uma fonte de amostra, pelo menos uma fonte de alvo substituto, pelo menos uma fonte de sonda de captura específica de alvo e pelo menos uma fonte de aditivos servindo na detecção, (b) meios para contatar os volumes especificados das fontes e (c) meios para assegurar a provisão dos fluidos pelas fontes para os meios de contatar. Este cartucho pode ainda compreender pelo menos uma fonte de reagentes de padrão interno e uma janela para detectar o(s) sinal(ais) gerado(s) em ditos meios de contatar.

Em um quarto aspecto da presente invenção, é descrito um sistema para detectar a presença ou quantidade de pelo menos um analito em uma amostra e compreende (a) meios para contatar a amostra com pelo menos um sonda de captura específica de alvo e pelo menos uma sonda alvo substituta deslocável (que é rotulada) e (b) meios para detectar o(s) sinal(ais) gerado(s) pelo(s) rótulo(s) no(s) híbrido(s) substituto(s) formados pela ligação da(s) sonda(s) alvo substituta(s) deslocável(eis) e a(s) sonda(s) de captura específica(s) de alvo. Este sistema pode ainda compreender um meio de calcular a quantidade de analito(s), comparando-se os sinais de detecção detectados nos meios de contatar em diferentes pontos do tempo da provisão de reagentes pelas fontes aos meios de contatar.

Os ensinamentos da presente invenção permitem o projeto de métodos e aparelho aperfeiçoados para a detecção de analitos em amostras.

As características, aspectos e vantagens acima e outras da presente invenção tornar-se-ão evidentes pela seguinte descrição detalhada, tomada em conjunto com os desenhos anexos, que ilustram, como exemplo, os princípios da invenção. Esta descrição é fornecida somente para fins de exemplo, sem limitar o escopo da invenção. As figuras de referência abaixo referem-se aos desenhos anexos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 é uma representação esquemática de uma forma de realização do ensaio de deslocamento SERRS. A: A sonda de captura, compreendendo uma seqüência complementar a uma seqüência alvo do analito, é adsorvida na superfície de uma nanopartícula de prata reduzida por citrato, por interação eletroquímica entre a superfície negativamente carregada e o grupo de procura de superfície positivamente carregado. A sonda alvo substituta deslocável é complementar à sonda de captura e, portanto, hibridiza nela. Desta maneira, o corante SERRS se aproxima da superfície de prata e um forte sinal SERRS pode ser detectado. B: Após a adição de uma amostra, o analito compreendendo a seqüência alvo compete com a sonda alvo substituta para hibridização na sonda de captura. Uma vez a sonda alvo substituta deslocável (compreendendo um ou mais SNPs) não seja perfeitamente complementar à sonda de captura, a hibridização do analito é mais eficiente e a sonda alvo substituta deslocável é deslocada da superfície de prata pelo analito. O sinal SERRS diminuirá assim proporcionalmente à quantidade do analito da amostra.

A Figura 2 é um gráfico mostrando o espectro de absorção do corante SERRS HEX em função do comprimento de onda.

A Figura 3 é um gráfico mostrando o espectro SERRS de um oligonucleotídeo rotulado 5' HEX, contendo componentes de aminopropargila para promover a adsorção na superfície de prata. O sinal SERRS (sem correção de fundo) foi medido após adsorção do oligonucleotídeo nas nanopartículas de prata agregadas por espermina.

A Figura 4 é um diagrama de blocos ilustrando um método de detecção de acordo com uma forma de realização da invenção

A Figura 5 é uma representação esquemática de um dispositivo de acordo com uma forma de realização da presente invenção.

Nas diferentes figuras, os mesmos sinais de referência referem-se aos mesmos ou elementos análogos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção será descrita com respeito a formas de realização particulares e com referência a certos desenhos, porém a invenção não é limitada a eles, mas somente pelas reivindicações. Quaisquer sinais de referência das reivindicações não serão interpretados como limitando o escopo. Os desenhos descritos são somente esquemáticos e não são limitantes. Nos desenhos, o tamanho de alguns dos elementos pode ser exagerado e não desenhados em escala para fins ilustrativos. Onde o termo "compreendendo" for usado no presente relatório e reivindicações, ele não exclui outros elementos ou etapas. Onde um artigo indefinido ou definido for usado quando referindo-se a um nome singular, p. ex., "um" ou "uma", "o" ou "a", este inclui um plural daquele nome, a menos que mais alguma coisa seja especificamente citada. Além disso, os termos primeiro, segundo, terceiro e similares da descrição e das reivindicações são usados para distinguir entre elementos similares e não necessariamente para descrever uma ordem seqüencial ou cronológica. Deve ser entendido que os termos assim usados são intercambiáveis sob circunstâncias apropriadas e que as formas de realização da invenção aqui descrita são capazes de operação em outras seqüências que não as descritas ou ilustradas aqui.

Os seguintes termos ou definições são fornecidos unicamente para auxiliar no entendimento da invenção. Estas definições não devem ser interpretadas como tendo um escopo menor do que o entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica.

DEFINIÇÕES

Um "analito" como aqui usado refere-se à substância a ser detectada e/ou quantificada pelos métodos da presente invenção.

Uma "seqüência alvo" como aqui usado refere-se a uma seqüência de nucleotídeo dentro do analito, usada para especificamente detectar o analito.

Uma "amostra" como aqui usado refere-se a uma composição que se acredita compreender pelo menos um analito de interesse.

Uma "amostra de controle" como aqui usado refere-se a uma composição que é idêntica ou muito similar à amostra.

Um "rótulo" como aqui usado refere-se a uma molécula ou material capaz de gerar um sinal SE(R)RS ou de fluorescência.

Um "oligonucleotídeo" como aqui usado refere-se uma seqüência entre 5 e 200 nucleotídeos, que pode ser nucleotídeos de DNA ou RNA naturalmente ocorrentes, nucleotídeos modificados ou sintéticos ou análogos de nucleotídeo, os nucleotídeos sendo ligados como DNA, RNA, PNA ou qualquer sua variação derivada de cadeia principal.

Uma "sonda de captura" como aqui usado refere-se a uma seqüência de nucleotídeo compreendendo um grupo de procura de superfície, que permite a ligação da sonda de captura à superfície SE(R)RS. A seqüência de oligonucleotídeo de uma sonda de captura pode ser complementar à seqüência alvo ("sonda de captura específica de alvo") e capaz de especificamente hibridizar na seqüência alvo ou pode ser complementar a uma diferente seqüência padrão predeterminada ("sonda de captura padrão"), que é parte da sonda padrão.

Uma "sonda alvo substituta" como aqui usado refere-se a um oligonucleotídeo sintético rotulado, capaz de especificamente ligar-se a uma sonda de captura. Uma "sonda alvo substituta deslocável" é uma sonda alvo substituta que se liga à sonda de captura com uma intensidade que menor do que a intensidade de ligação de uma seqüência que não é modificada e 100% complementar à sonda de captura. Em uma "sonda alvo substituta não- deslocável", a seqüência é completamente complementar àquela de uma sonda de captura, a uma sonda de captura específica de alvo ou a uma sonda de captura padrão ("sonda padrão"), resultando na forte ligação da sonda alvo substituta não-deslocável à correspondente sonda de captura. O rótulo é ligado à sonda alvo substituta, p. ex., por ligação covalente, ou pode ser uma entidade separada, que se liga à sonda alvo substituta.

Um "híbrido substituto" como aqui usado refere-se à combinação de uma sonda alvo substituta e uma sonda de captura.

Um "híbrido alvo" como aqui usado refere-se à combinação da seqüência alvo dentro do analito e uma sonda de captura específica de alvo.

Um "híbrido padrão" como aqui usado refere-se a uma combinação de uma sonda padrão e uma sonda de captura padrão, que é covalente ou não-covalentemente ligada a uma superfície SE(R)RS.

Uma "superfície SE(R)RS" como aqui usado refere-se a um material que é capaz de aumentar o sinal de um rótulo SE(R)RS.

Um "híbrido substituto adsorvido na superfície", um "híbrido alvo adsorvido na superfície" e um "híbrido padrão adsorvido na superfície" como aqui usado refere-se a um híbrido substituto, um híbrido alvo e um híbrido padrão, respectivamente, que são adsorvidos em uma superfície SE(R)RS.

A presente invenção fornece métodos, ferramentas e dispositivos para a detecção da presença e/ou quantificação de um ou mais analitos em uma amostra.

A invenção é baseada na observação de que, detectando-se o analito em uma amostra com base no deslocamento de uma sonda rotulada, um método específico de analito de uma etapa é fornecido que não requer rotulação do analito. Este é um importante aperfeiçoamento de economia de tempo, que contribui ainda para a confiabilidade da detecção, visto que ela pode ser realizada com reagentes que são todos padrão e pré-fabricados.

Os métodos, ferramentas e dispositivos da invenção são baseados no uso de uma sonda alvo substituta deslocável, que é rotulada e pode hibridizar em uma sonda de captura específica de alvo, que pode ligar-se a uma superfície SE(R)RS. Onde o rótulo da sonda alvo substituta deslocável for um rótulo SE(R)RS, a hibridização da sonda de captura e a constatação com a superfície SE(R)RS resultará na geração de um "híbrido substituto adsorvido na superfície", que aumenta a detecção do rótulo. A presença de pelo menos uma desigualdade (nucleotídeo não-complementar) na seqüência da sonda de captura, na seqüência da sonda alvo substituta deslocável, faz com que a ligação da sonda alvo substituta deslocável à sonda de captura seja fraca. Na constatação, a sonda alvo substituta, ligada à sonda de captura (como tal ou como um híbrido substituto adsorvido na superfície) com um analito compreendendo a seqüência alvo que é completamente complementar à sonda de captura, é deslocada.

O analito considerado ser detectado usando-se os métodos da presente invenção é um ácido nucleico. Mais particularmente, o analito é um DNA tal como um gene, DNA viral, DNA bacteriano, DNA fungico, DNA de mamífero, DNA de plasmídeo ou um fragmento de DNA. O analito pode também ser RNA, tal como RNA viral, mRNA, rRNA. O analito pode também ser cDNA, oligonucleotídeos ou DNA, RNA, PNA, LNA sintético, uma seqüência de nucleotídeo compreendendo um ou mais oligonucleotídeos sintéticos, oligonucleotídeos modificados ou outros análogos do ácido nucleico. O analito pode ser um ácido nucleico originando-se de um organismo, tal como mas não limitado a um vírus, uma bactéria, um microorganismo tal como Salmonella, Streptococcus, Legionella, E. coli, Giardia, Cryptosporidum, Rickettsia, um esporo, um mofo, uma levedura, uma alga, uma ameba, um dinoflagelado, um organismo unicelular, um patógeno ou uma célula de um organismo multicelular, tal como um animal ou um humano.

A natureza da amostra em que a detecção de um analito é examinada de acordo com a presente invenção não é crítica e pode ser qualquer preparação suspeita compreender ácidos nucleicos. A amostra pode ser uma amostra compreendendo material biológico tal como mas não limitado a tecido ou fluido corporal, tal como sangue, saliva, sêmen, fezes ou urina, bem como composições derivadas ou extraídas de tal material biológico. A amostra pode compreender componentes de material biológico, tais como células, p. ex., células de tecido, células sangüíneas vermelhas, células sangüíneas brancas, plaquetas, células mortas. O material pode ser obtido de um organismo por meio de mechas, incluindo mas não limitado a mechas bucais, mechas vaginais, mechas uretrais, mechas cervicais, mechas de garganta, mechas retais, mechas de lesão, mechas de abscesso, mechas nasofaríngicas e similares. A amostra pode compreender um fluido corporal, tal como um fluido linfático, fluido amniótico, fluido cerebroespinhal, efusões peritoneais, efusões pleurais, fluido de cistos, fluido sinovial, humor vítreo, humor aquoso, fluido de bolsa, colírios, aspirados de olho, plasma, soro, lavagem pulmonar, aspirados de pulmão ou sua parte ou componente. A amostra pode ser obtida de material de biópsia de qualquer tecido do corpo. Além disso, as células de cultura de tecido, incluindo material explantado, células primárias, linhagens de células secundárias e similares, bem como lisados, extratos, sobrenadantes ou materiais obtidos de quaisquer células, tecidos ou órgãos são também considerados situarem-se dentro do significado do termo amostra como usado aqui. As amostras compreendendo microorganismos ou vírus são também examinadas no contexto da detecção de ácido nucleico usando-se os métodos da invenção. Os materiais obtidos pelos cenários forenses estão também dentro do significado pretendido do termo "amostra". As amostras podem também compreender gêneros alimentícios e bebidas, amostras ambientais tais como água, solo, areia etc. Estas listas não são destinadas a serem exaustivas.

Em uma forma de realização particular da invenção, a amostra é pré-tratada para facilitar a detecção do analito com o método de detecção. A extração dos ácidos nucleicos, tais como DNA ou RNA, é um pré-tratamento típico da amostra examinada no contexto da presente invenção. Métodos e kits adequados para extrair ácidos nucleicos são disponíveis na técnica e incluem métodos e kits baseados em extração de fenol-clorofórmio, extração de DNA por precipitação) e extração de tiocianato de guanidínio

Técnicas de isolamento de ácido nucleico exemplares incluem (1) extração orgânica seguida por precipitação de etanol, p. ex., usando-se um reagente orgânico de fenol/clorofórmio (p. ex., Ausbel e al, eds. (1995, incluindo suplementos até junho de 2003) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York), preferivelmente usando-se um extrator de DNA automatizado, p. ex., o Extrator de DNA Modelo 341, disponível na Applied Biosystems (Foster City, Calif), (2) métodos de adsorção de fase estacionária (e.g. Boom et al., U.S. Pat. No. 5234809; Walsh et al., BioTechniques 10(4): 506-513 (1991), e (3) métodos de precipitação de DNA induzida por sal (e.g. Miller et al., (1988) Nucl. Aeids Res., 16(3):9-10), tais métodos de precipitação sendo tipicamente referidos como métodos de cristalização. Kits comercialmente disponíveis podem ser usados para acelerar tais métodos, por exemplo, Genomic DNA Purification Kit e o Total RNA Isolation System (ambos disponíveis na Promega, Madison, Wis.). Além disso, tais métodos foram automatizados ou semi-automatizados utilizando- se, por exemplo, a ABI PRISM™ 6700 Automated Nucleic Acid Workstation (Applied Biosystems, Foster City, Calif.) ou a ABI PRISM™ 6100 Nucleic Acid PrepStation e protocolos associados, e.g. NucPrep™ Chemistry: Isolation of Genomic DNA from Animal e Plant Tissue, Applied Biosystems Protocol 4333959 Rev. A (2002), Isolation of Total RNA from Cultured Cells, Applied Biosystems Protocol 4330254 Rev. A (2002), e ABI PRISM™ Cell Lysis Control Kit, Applied Biosystems Protocol 4316607 Rev. C (2001).

Os métodos de pré-tratamento acima podem ainda compreender uma etapa de fragmentação, p. ex., por digestão enzimática, cisalhamento ou sonicação e/ou uma etapa de amplificação enzimática, p. ex., por PCR, incluindo RT-PCR. Muitíssimo preferivelmente, onde detecção sensível de um ácido nucleico for imaginada, uma amplificação PCR do DNA alvo pode ser realizada antes da detecção do analito. Assim, de acordo com a presente invenção, a amostra em que a detecção for realizada compreende um produto PCR amplificado.

Os métodos da presente invenção são projetados para a detecção de ácidos nucleicos com filamentos únicos (ss). Portanto, os ácidos nucleicos de duplo filamento (ds), a fim de serem detectados pelo método da presente invenção, precisam ser desnaturados, a fim de que os dois filamentos separem-se em filamentos de nucleotídeo únicos. Os métodos de desnaturação de DNA incluem incubação em uma alta temperatura (acima do ponto de fusão do DNA, geralmente uma temperatura de 95 0C é usada, resultando na simultânea inativação da maioria da atividade enzimática presente na amostra), imediatamente seguida por esfriamento em gelo, para evitar renaturação dos filamentos. O DNA pode também ser desnaturado por baixas concentrações de sal ou elevado pH. Diversos métodos foram descritos para a geração de DNAss de DNAds de produtos de PCR. Estes métodos incluem PCR assimétrico, PCR com iniciadores quimicamente modificados que provocam a síntese dos filamentos de comprimento desigual e a digestão exonuclease preferencial de um filamento apropriadamente modificado, seguido por uma etapa de purificação para isolar o DNAss (Pragratis N. C, 1996, Nucl. Acids Res., 24:3645- 3646).

A presente invenção fornece um ensaio de deslocamento que envolve a detecção e/ou quantificação empregando-se um rótulo. Embora os métodos da invenção façam uso de propriedades específicas do sinal combinado de um rótulo SE(R)RS e uma superfície SE(R)RS, é considerado que a detecção e/ou quantificação do analito da amostra possa ser realizada usando-se detecção baseada em SE(R)RS ou detecção de fluorescência dos rótulos, ou utilizando-se detecção tanto baseada em SE(R)RS como baseada em fluorescência. Este aspecto dos métodos da presente invenção é baseado no fato de que a) a maioria dos rótulos SE(R)RS são também fluorescentes, e vice-versa, e b) que há um efeito comparável, porém inverso, da proximidade de uma superfície SE(R)RS no SE(R)RS e sinal de fluorescência detectado de um rótulo.

Os rótulos SE(R)RS geralmente beneficiam-se do aumento da intensidade do sinal na proximidade de uma superfície metálica. Quando os rótulos são adsorvidos na ou próximo da superfície SE(R)RS com uma distância em que sua dispersão Raman é aumentada, a fluorescência emitida do rótulo é resfriada bruscamente pela superfície metálica. Quando os rótulos são posicionados mais afastados da superfície, a fluorescência, porém não a dispersão Raman, é intensificada.

Quando a distância é mais aumentada, a intensificação da fluorescência também extingue-se. Assim, quando o rótulo está em estreita proximidade com a superfície SE(R)RS, o sinal SE(R)RS é intensificado e o sinal fluorescente é resfriado bruscamente. Por outro lado, quando o rótulo é separado da proximidade da superfície SE(R)RS5 o sinal SE(R)RS extingue- se, enquanto o sinal de fluorescência pode ainda ser detectado.

Onde a detecção do analito dos métodos da invenção for baseada em SE(R)RS, a detecção do sinal SE(R)RS e/ou sua intensidade é inversamente proporcional à quantidade de analito da amostra. De fato, quando o sinal é provido pelo complexo da sonda alvo substituta deslocável hibridizada e a sonda de captura (o chamado "híbrido substituto"), uma concentração crescente de analito na amostra resultará em aumentado deslocamento da sonda alvo substituta deslocável e uma diminuição do sinal SE(R)RS.

Além disso, a detecção de SE(R)RS do analito nos métodos da invenção requer um rótulo que é um material ativo-SE(R)RS, isto é, capaz de gerar um espectro SERS ou SERRS quando apropriadamente iluminado, também referido aqui como um rótulo ou corante SE(R)RS. Exemplos não limitativos de rótulos SE(R)RS incluem corantes de fluoresceína, tais como 5- (e 6-) carbóxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetóxi fluoresceína, S-Carboxi-2',4',5',7'- tetraclorofluoresceína e 5-carboxifluoresceína, corantes de rodamina tais como 5- (e 6-) carbóxi rodamina, 6-carboxitetrametil rodamina e 6- carboxirrodamina X, ftalocianinas, tais como metila, nitrosila, sulfonila e amino ftalocianinas, corantes azo, azometines, cianinas e xantinas tais como os derivativos metila, nitro, sulfano e amino, e succinilfluoresceínas. Cada uma destas pode ser substituída em qualquer maneira convencional, dando origem a um grande número de rótulos úteis. Observamos que a escolha do rótulo pode ser influenciada por fatores tais como a freqüência de ressonância do rótulo, a freqüência de ressonância de outras moléculas presentes na amostra etc. Rótulos SE(R)RS de uso para detectar biomoléculas são descritos na técnica, tais como na Patentes U.S. Nos. 5306403, 6002471 e 6174677.

Onde a detecção do rótulo for baseada na fluorescência, a detecção do sinal e/ou sua intensidade é diretamente proporcional à quantidade de analito da amostra. Na realidade, quando o sinal de fluorescência do rótulo ligado à sonda alvo substituta deslocável é somente detectado quando não está ligado à (ou deslocado da) sonda de captura, uma concentração crescente de analito na amostra resultará em aumentado deslocamento da sonda alvo substituta deslocável e um aumento do sinal de fluorescência.

Onde a detecção do rótulo for baseada na fluorescência, são usados rótulos de fluorescência. Os rótulos de fluorescência incluem mas não são limitadas a isotiocianatos de fluoresceína (FITC), carboxifluoresceínas tais como corantes de tetrametilrodamina (TMR), carbóxi tetrametilrodamina (TAMRA), carbóxi-X-rodamina (ROX), sulforrodamina 101 (Texas Red™), Fluorescent Red e Fluorescent Orange, ficoeritrina, ficociania e Crypto- Fluor™ etc.

De acordo com uma forma de realização particular, os métodos provêm a detecção de detecção tanto de fluorescência como SE(R)RS. Os métodos que compreendem a detecção tanto de fluorescência como o sinal SE(R)RS do rótulo da sonda alvo substituta fornecem um controle adicional de precisão, visto que eles permitem uma medição tanto direta como indireta da presença e/ou quantidade do analito da amostra. Nestes métodos é usado um rótulo que é adequado para ambos métodos de detecção. Muitíssimo particularmente, os métodos da invenção são realizados usando-se um rótulo selecionado do grupo consistindo de HEX (2,5,1',3',7',9'- Hexacloro-6-carboxifluoresceína), fluoresceína, e TET (6-carbóxi-2',4,7,7'- tetracloro fluoresceína).

De acordo com a presente invenção, o rótulo é fixado a uma sonda alvo substituta, que pode ser uma sonda alvo substituta deslocável ou uma não-deslocável. A fixação de um rótulo em um oligonucleotídeo pode ser realizada pelos métodos como descritos na técnica anterior (p. ex., Patente U.S. No. 6127120). Outros métodos para preparar os oligonucleotídeos rotulados incorporando-se rótulos nos oligonucleotídeos são descritos, p. ex., nas Patentes U.S. Nos. 4962037, 5405747, 6136543, e 6210896. Em uma forma de realização particular da invenção, um rótulo SE(R)RS é usado que é ligado diretamente à sonda de nucleotídeo ou via um composto ligador. Os rótulos SE(R)RS que contêm grupos reativos projetados para covalentemente reagir com outras moléculas, tais como nucleotídeos ou ácidos nucleicos, são comercialmente disponíveis (p. ex., Molecular Probes, Eugene, Oreg.). Os rótulos SE(R)RS que são covalentemente ligados aos precursores de nucleotídeo podem ser comprados de fontes comerciais padrão (p. ex., Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, Ind.; Promega Corp., Madison, Wis.; Ambion, Inc., Austin, Tex.; Amersham Farmacia Biotech, Piscataway, N. J.).

De acordo com a presente invenção, a detecção é realizada provendo-se uma sonda alvo substituta deslocável que é rotulada e compreende uma seqüência similar à seqüência alvo dentro do analito de interesse, de modo que a competição com o analito para ligação à sonda de captura é possibilitada. A capacidade do analito de competir com e deslocar a sonda alvo substituta deslocável é assegurada fornecendo-se uma sonda alvo substituta que se liga à sonda de captura com uma intensidade que é menor do que se o analito fosse ligado à sonda de captura. De acordo com uma forma de realização particular, a temperatura de fusão (Tm), definida como a temperatura em que 50% dos híbridos são desnaturados em filamentos únicos, do híbrido substituto é mais baixa do que aquela do híbrido alvo. Tipicamente, isto é assegurado introduzindo-se uma ou mais modificações na seqüência de nucleotídeo da sonda alvo substituta deslocável, o que afeta sua ligação à sonda de captura. Modificações adequadas incluem a introdução de uma ou mais inserções de polimorfismo de nucleotídeo único (p. ex., de estruturas grampo de cabelo) etc. Numerosas diferentes maneiras de calcular a temperatura de fusão de um oligonucleotídeo são descritas na técnica e serviços calculando-se Tm com base em algoritmos são providos por diferentes fontes da internet (p. ex., Stratagene: www.stratagene.com/QPCR/tnCalc.asp). Estes métodos tornam possível avaliar o efeito da incorporação de uma ou mais desigualdades na seqüência da sonda alvo deslocável em Tm. Embora cada um destes métodos possa fornecer resultados ligeiramente diferentes e o valor Tm ótimo deve ser determinado empiricamente, a maioria destes métodos é útil para prover uma indicação da adequabilidade da sonda alvo deslocável no contexto da presente invenção.

A diferença na temperatura de fusão entre a seqüência de oligonucleotídeo de uma sonda alvo substituta deslocável e uma seqüência alvo corresponderá a uma diferença da temperatura de anelamento ótima. Se a temperatura de anelamento for fixada demasiado elevada, uma seqüência de nucleotídeo (p. ex., as sondas, o analito) não anelará eficientemente e, se a temperatura de anelamento for fixada demasiado baixa, uma seqüência de nucleotídeo (p. ex., as sondas, o analito) pode anelar não especificamente. Quando realizando os métodos da presente invenção, a fim de assegurar o deslocamento da sonda alvo substituta deslocável pelo analito, o contato do analito com a sonda de captura e a sonda alvo substituta deslocável (que foram opcionalmente permitidas formar um híbrido substituto) será realizado em uma temperatura de anelamento que é a mesma ou preferivelmente mais elevada do que a temperatura de fusão da sonda alvo substituta deslocável. Assim, de acordo com uma forma de realização, a etapa de contatar pode ser realizada na temperatura de fusão da sonda alvo substituta deslocável, mais particularmente em uma temperatura de anelamento ótima, que é entre 0-10 °C mais elevada do que a temperatura de fusão da sonda alvo substituta deslocável, muitíssimo particularmente em uma temperatura de anelamento ótima que é entre 0 - 5°C mais elevada do que a temperatura de fusão da sonda alvo substituta deslocável.

Pode ser considerado que a etapa de contatar da sonda alvo substituta deslocável e da sonda de captura compreende uma etapa de anelamento e uma temperatura de anelamento que é otimamente de 2 - 6°C mais baixa do que a temperatura de fusão do híbrido substituto.

Pode também ser considerado que a etapa de contatar do analito com a sonda de captura e a sonda alvo substituta deslocável (que foi opcionalmente permitida formar um híbrido substituto) compreende uma etapa de desnaturação (tipicamente aquecimento a cerca de 90 - 95°C) e, em seguida, uma etapa de anelamento que é realizada na temperatura de anelamento ótima da seqüência alvo (que será mais elevada do que a temperatura de anelamento ótima da sonda alvo substituta deslocável, vide acima). Uma etapa de desnaturação pode ainda ser de interesse quando informação não somente qualitativa mas também quantitativa do(s) analito(s) da amostra é necessária.

Em uma forma de realização particular, o híbrido substituto é projetado de modo que sua Tm seja de cerca de 15 a 20°C mais baixa do que a Tm do híbrido alvo. Isto pode, por exemplo, ser exeqüível incluindo-se diversas desigualdades no componente de oligonucleotídeo da sonda alvo substituta. Como resultado, o híbrido substituto será completamente fundido em uma temperatura em que o híbrido alvo permanece conservado, isto é, a sonda de captura permanece anelada na seqüência alvo. Esta abordagem possibilita o uso de uma única etapa de fusão em temperatura moderada.

Nos métodos da presente invenção, a detecção do sinal do rótulo presente na sonda alvo substituta deslocável pode ser monitorada em "tempo real" durante a fusão e/ou anelamento.

A constatação dos diferentes reagentes usados nos métodos da presente invenção pode ser variada, dependendo da natureza do sinal de detecção (e informação obtenível dele) desejado. De acordo com uma forma de realização particular da invenção, a sonda de captura e a sonda alvo substituta deslocável são contatadas primeiro e permitidas formarem um híbrido substituto. Na adição da superfície SE(R)RS a este híbrido, o sinal desta híbrido substituto pode ser detectada e serve como um sinal de detecção de linha de referência. A amostra é então contatada com o híbrido substituto e a sonda alvo substituta deslocável é deslocada da sonda de captura pelo analito presente na amostra. A detecção do sinal do híbrido substituto remanescente é indicativa da quantidade de analito da amostra. Alternativamente, a amostra, a sonda alvo substituta e a sonda de captura podem ser contatadas simultaneamente. De acordo ainda com mais uma forma de realização, a amostra é contatada com o híbrido substituto antes da adição da superfície SE(R)RS. Nas últimas duas formas de realização, não há detecção do valor da linha de referência e somente uma indicação do sinal de rótulo, na presença do analito, é obtida. Entretanto, o valor da linha de referência pode ser determinado se uma medição separada for realizada, p. ex., em uma amostra de controle, p. ex., antes da medição de um grande número de amostras similares. Alternativamente, um valor de linha de referência pode ser determinado se um padrão interno (como descrito abaixo), compreendendo um diferente rótulo SE(R)RS, for introduzido na amostra. Além disso, se somente informação qualitativa for necessária, a detecção da fluorescência (devido à sonda alvo substituta deslocada) pode ser usada para confirmar a presença da(s) seqüência(s) alvo da amostra. De acordo com uma forma de realização particular da invenção, a sonda de captura é covalentemente ligada à superfície SE(R)RS, removendo a necessidade de uma etapa adicional compreendendo a adsorção na superfície de SE(R)RS. Como indicado acima, a detecção do sinal SE(R)RS pode, na maioria dos casos, ser complementada ou substituída pela detecção de um sinal fluorescente. Em um outro aspecto da invenção, são providos métodos em que a detecção do analito é baseada em SE(R)RS competitivo, como descrito acima, por meio do que um híbrido padrão (interno) é incluído para calibrar o ensaio com respeito ao agregado e variações ópticas. De acordo com este aspecto, o método abrange ainda a etapa de adicionar uma sonda de captura e uma sonda rotulada completar a ela, que são a sonda padrão e a sonda de captura padrão, capazes de formar um "híbrido padrão". De acordo com uma forma de realização particular, o híbrido padrão é um padrão interno, isto é, adicionado à amostra. A fim de ser capaz de discriminar o sinal do híbrido padrão daquele do híbrido substituto da amostra, um diferente rótulo SE(R)RS (e/ou fluorescente) é usado. De acordo com outra forma de realização particular, o híbrido padrão é adicionado a uma parte da amostra. De acordo com ainda outra forma de realização particular, o híbrido padrão é adicionado à amostra de controle. As últimas duas formas de realização podem ser particularmente úteis quando medindo-se um grande número de amostras similares.

De acordo com uma forma de realização, a seqüência da sonda de captura padrão é a mesma que aquela da sonda de captura usada na detecção e a sonda padrão é uma sonda alvo substituta deslocável. Como a Tm da sonda alvo substituta não-deslocável é mais elevada do que aquela da sonda alvo substituta deslocável, a sonda alvo substituta não-deslocável não é deslocada da sonda de captura pelo analito na Tm da sonda alvo substituta. Alternativamente, a seqüência de nucleotídeo da sonda de captura padrão não é específica de alvo, porém uma seqüência (arbitrária) que especificamente se liga a uma surpreendentemente correspondente. Isto evita qualquer interação do híbrido padrão com a detecção do analito, mesmo quando incorporando uma etapa de temperatura mais elevada, de modo que a adição do híbrido padrão para a amostra pode ser realizado em qualquer tempo antes da detecção (ou adição da superfície de SE(R)RS, onde necessário) e como um híbrido ou como seus componentes individuais. A provisão de uma combinação de sonda padrão e sonda de captura que sejam diferentes do analito, além disso, permite o uso do mesmo híbrido padrão em diferentes detecções.

De acordo com a presente invenção, um ensaio de deslocamento é descrito que faz uso dos aspectos específicos de espectroscopia intensificada na superfície (e opcionalmente seu efeito inerente sobre a fluorescência). A detecção por espectroscopias intensificadas na superfície, tais como SE(R)RS, é baseada na forte intensificação da dispersão Raman observada para analitos adsorvidos sobre ou em estreita (< ± 30 Â) proximidade de uma superfície metálica áspera. De acordo com a presente invenção, um rótulo SE(R)RS é detectado pela adição de uma superfície SE(R)RS adequada. Tipicamente, a superfície é uma superfície metálica nobre (Au, Ag, Cu) ou alcalina (Li, Na, Κ). A superfície metálica pode, por exemplo, ser uma superfície metálica cauterizada ou de outro modo tornada áspera, um sol metálico ou, de acordo com uma forma de realização particular, uma agregação de partículas colóides metálicas, uma vez que as últimas podem assegurar um aumento maior do que 108 - 1014 da dispersão Raman. As nanopartículas metálicas compondo a superfície SE(R)RS nos métodos de detecção da presente invenção podem ser dispostas em películas de ilhas de nanopartículas metálicas, substratos baseados em nanopartícula revestida com metal, películas poliméricas com nanopartículas metálicas embutidas e similares. A superfície metálica pode ser um metal nu ou pode compreender uma camada de óxido metálico em uma superfície metálica. Ela pode incluir um revestimento orgânico, tal como de citrato ou de um polímero adequado, tal como polilisina ou polifenol, para aumentar sua capacidade de sorção.

De acordo com uma forma de realização particular da invenção, as partículas colóides metálicas compondo a superfície SE(R)RS são nanopartículas ou nanopartículas colóides agregadas em uma maneira controlada, tal como descrito na US 2005/0130163 Al. Métodos alternativos de preparar nanopartículas são conhecidos (p. ex., U.S. Pat. Nos. 6054495, 6127120, e 6149868). As nanopartículas podem também ser obtidas de fontes comerciais (p. ex., Nanoprobes Inc., Yafank, N.Y.; Polysciences, Inc., Warrington, Pa.). As partículas metálicas podem ser de qualquer tamanho, contanto que elas dêem origem a um efeito SE(R)RS. Tipicamente, elas têm um diâmetro de cerca de 4 - 50 nm, muitíssimo particularmente entre 25 - 40 nm, dependendo do tipo de metal.

De acordo com outra forma de realização particular, a superfície SE(R)RS é uma suspensão coloidal de nanopartículas de prata ou ouro ou seus colóides agregados. Um tamanho e formato ótimo das partículas colóides agregadas que podem ser críticas para reprodutibilidade e calibração da detecção podem ser assegurados utilizando-se um poliamida, tal como poli-L-lisina ou espermina. Uma vez que o tamanho dos colóides agregados pode mudar com o tempo,eles são idealmente formados in situ na amostra de detecção e o espectro de SE(R)RS deve ser obtido pouco após (preferivelmente dentro de cerca de 15 minutos da agregação).

De acordo com mais uma forma de realização particular, a superfície de SE(R)RS consiste de nanopartículas de ouro que são revestidas com prata pela adição de hidroquinona de prata após covalentemente ligar a sonda de captura às nanopartículas de ouro. Muitíssimo particularmente, de acordo com esta forma de realização, a superfície de SE(R)RS consiste de nanopartículas de prata ou ouro revestidas com uma fina camada (la alguns nanômetros) de ouro ou prata, respectivamente.

De acordo com ainda outra forma de realização particular, a superfície de SE(R)RS consiste de agrupamentos estáveis de nanopartículas de prata ou ouro e os agrupamentos são estabelecidos por reticulação com macromoléculas bi ou multifuncionais (telêmeros) que podem ser ligar quimicamente a ditos agrupamentos.

Nos métodos de detecção e/ou quantificação da presente invenção fazendo uso de um ou outro ou ambos de SE(R)RS e detecção da fluorescência, o rótulo da sonda alvo substituta é trazido para estreita proximidade com a superfície de SE(R)RS pela ligação da sonda alvo substituta na sonda de captura, a última sendo ligada à superfície SE(R)RS. A ligação da sonda de captura à superfície de SE(R)RS pode ser através de uma ligação covalente ou não-covalente. Várias opções e modos para ligar sondas de oligonucleotídeo às superfícies de SE(R)RS são conhecidas na técnica (Patentes U.S. Nos. 612712 e 6972173) e podem ser aplicadas para ligar a sonda de captura ou o híbrido substituto à superfície de SE(R)RS.

De acordo com uma forma de realização, a ligação da sonda de captura à superfície SE(R)RS é através de uma ligação covalente. A sonda de captura é equipada com um grupo de procura de superfície, a fim de promover ou facilitar a quimio-sorção da sonda na superfície SE(R)RS. Os grupos de procura de superfície são solúveis em solução, porém interagem preferencialmente com a superfície SE(R)RS. Isto pode ser assegurado incorporando-se um ou mais grupos funcionais dentro do componente de oligonucleotídeo da sonda de captura. Grupos funcionais adequados incluem as bases de Lewis, tais como tióis e aminas, que podem facilmente ser adicionadas aos ácidos nucleicos. Outros exemplos dc grupos dc procura de superfície incluem grupos complexantes, tais como nitrogênio, oxigênio, enxofre e doadores de fósforo, grupos quelantes, ligandos de ponte e ligandos formadores de polímero. Para superfícies de ouro grupos contendo fósforo e enxofre podem ser particularmente preferidos.

De acordo com uma forma de realização particular, o grupo de procura de superfície de sonda de captura é um benzotriazol possibilitando que a sonda de captura seja covalentemente ligada à superfície SE(R)RS.

De acordo com outra forma de realização particular, o grupo de procura de superfície de sonda de captura consiste de pelo menos um grupo tiol possibilitando que a sonda de captura seja covalentemente ligada à superfície SE(R)RS.

Um grupo funcional preferido é um que pode fornecer sítios catiônicos adicionais (sob as condições usadas), p. ex., um compreendendo um grupo ou grupos amino, preferivelmente amino primário. De acordo com uma forma de realização preferida, o grupo de procura de superfície de sonda de captura compreende componentes de propargilamina positivamente carregados. De acordo com outra forma de realização, a adsorção da sonda de captura à superfície SE(R)RS metálica é assegurada pela adição de uma poliamina monomérica ou polimérica, mais particularmente uma poliamina alifática de cadeia curta, tal como espermina. Assim, de acordo com uma forma de realização, os métodos da invenção compreenderão, antes da detecção, a adição de uma poliamina à amostra. A poliamina deve ser introduzida em uma ocasião que permita sua interação com o híbrido substituto, antes do espectro SE(R)RS ser obtido. A poliamina é preferivelmente uma poliamina alifática de cadeia curta, tal como espermina, espermidina, 1,4-diaminopiperazina, dietilenotriamina, N-(2-aminoetil)-l,3- propanodiamina, trietilenotetramina e tetraetilenopentamina. A espermina com seus grupos NH2 por unidades de repetição é particularmente adequada para uso na presente invenção. A poliamina é preferivelmente introduzida na forma de um sal ácido, tal como seu cloridreto. E de muitíssimo uso quando a superfície SE(R)RS é coloidal (vide acima). A quantidade de poliamina adicionada é preferivelmente da ordem de 100 a 1000 vezes mais do que seria necessário para obter-se uma cobertura de monocamada da superfície com a poliamina. A poliamina em excesso forma um revestimento na superfície, desse modo assegurando agregação e adsorção ótimas da sonda de captura e/ou híbrido substituto.

Como indicado acima, os métodos da presente invenção são de particular interesse nos métodos de detecção e/ou quantificação baseados na espectroscopia de Raman intensificada na superfície (ressonância) ou SE(R)RS. Embora seja geralmente feita referência a SE(R)RS aqui, deve ser entendido que os métodos de detecção baseados em outros tipos de espectroscopias intensificadas na superfície são também considerados, por exemplo, mas não limitado a fluorescência intensificada na superfície, dispersão Raman normal (Stokes ou anti-Stokes), dispersão Raman de ressonância, espectroscopia Raman coerente (Stokes ou anti-Stokes) (CSRS ou CARS), CARS intensificada na superfície (ressonância), dispersão Raman estimulada, espectroscopia Raman inversa, espectroscopia Raman de ganho estimulado, dispersão hiper-Raman, hiper dispersão Raman intensificada na superfície, examinador de leiser óptico molecular (MOLE) ou microssonda Raman ou microscópio Raman ou microespectrometria Raman confocal, Raman tridimensional ou de varredura, espectroscopia de saturação Raman, Raman de ressonância resolvida no tempo, espectroscopia de desacoplamento Raman ou microscopia Raman-UV.

Em uma forma de realização particular da invenção, o método de detecção da invenção envolve SERRS, uma vez que a operação na freqüência de ressonância do rótulo fornece aumentada sensibilidade. Neste caso, a fonte de luz usada para gerar o espectro Raman é uma fonte de luz coerente, p. ex., um leiser, sintonizado substancialmente na freqüência de absorção máxima do rótulo sendo usado. Esta freqüência pode mudar ligeiramente na associação do rótulo com a superfície SE(R)RS e o componente oligonucleotídeo da sonda alvo substituta, porém a pessoa hábil será bem capaz de sintonizar a fonte de luz para acomodar esta. A fonte de luz pode ser sintonizada em uma freqüência próximo da máxima absorção do rótulo ou em uma freqüência do ou próxima daquela de um pico secundário do espectro de absorção do rótulo. SERRS pode alternativamente envolver a operação na freqüência ressonante dos plasmons da superfície ativa ou colóides (agregados).

Nos métodos da invenção baseados na detecção de SE(R)RS, tipicamente um pico, correspondendo, p. ex., ao máximo de absorção do rótulo, é selecionado e a excitação é realizada somente no comprimento de onda daquele pico. Alternativamente, onde, p. ex., diferentes analitos estão sendo detectados ao mesmo tempo, usando-se diferentes rótulos, pode ser necessário detectar o inteiro espectro da "impressão digital", a fim de identificar cada rótulo. Em geral, métodos de análise multivariados (tais como regressão parcial dos quadrados mínimos, regressão dos componentes principais etc.) podem ser usados para realizar identificação qualitativa e/ou quantitativa de cada um dos rótulos presentes, utilizando-se o inteiro espectro de impressão digital, uma faixa espectral com mais do que uma faixa Raman, ou utilizando-se uma única faixa Raman.

Em uma forma de realização particular da invenção, o método de detecção da invenção envolve a detecção simultânea por espectroscopia tanto Raman intensificada na superfície (ressonância) como de fluorescência (vide acima).

Tipicamente, a etapa de detecção em um método de detecção baseado em SE(R)RS será realizada utilizando luz incidente de um leiser, tendo uma freqüência no espectro visível. A exata freqüência escolhida dependerá do rótulo, superfície e analito. Freqüências da área verde ou vermelha do espectro visível tendem, em geral, a dar origem a melhores efeitos de intensificação de superfície para superfícies de metal nobre, tal como prata e ouro. Entretanto, é possível considerar situações em que outras freqüências, por exemplo, nas faixas ultravioleta ou próxima da infravermelha, poderiam ser usadas. A seleção e, se necessário, a sintonização de uma apropriada fonte de luz, com uma apropriada freqüência e potência, estarão bem dentro da capacidade de uma pessoa de habilidade comum na técnica, particularmente com referência à literatura SE(R)RS disponível. As fontes de excitação para uso em métodos de detecção baseados em SE(R)RS incluem mas não são limitados a leiseres de nitrogênio, leiseres de hélio-cádmio, leiseres de íon de argônio, leiseres de íon de criptônio, etc. Múltiplos leiseres podem fornecer uma larga escolha de linhas de excitação que é crítica para a espectroscopia Raman de ressonância. De acordo com uma forma de realização específica, um leiser de íon de argônio é usado em um instrumento integrado LabRam (Jobin Yvon) em um comprimento de onda de excitação de 514,5 nm.

O feixe de excitação pode ser espectralmente purificado com um filtro de passa faixa e pode ser focalizado em um substrato utilizando-se lente objetiva de 6 vezes. A lente objetiva pode ser usada para tanto excitar a amostra como para coletar o sinal Raman, utilizando-se um divisor de feixe halográfico para produzir uma geometria de ângulo reto para o feixe de excitação e o sinal Raman emitido. A intensidade dos sinais Raman necessita ser medido em relação a um fundo intenso do feixe de excitação. O fiando é principalmente luz dispersa Rayleigh e reflexão especular, que podem ser seletivamente removidas com filtros ópticos de alta eficiência. Por exemplo, um filtro de entalhe holográfico pode ser usado para reduzir a radiação dispersa Rayleigh.

O sinal de emissão Raman intensificado na superfície pode ser detectado por um detector Raman. Uma variedade de unidades de detecção de uso potencial em espectroscopia Raman é conhecida na técnica e qualquer unidade de detecção Raman conhecida pode ser usada. Um exemplo de uma unidade de detecção Raman é descrito na Patente U.S. No. 6002471. Outros tipos de detectores podem ser usados, tais como um dispositivo acoplado por carga (CCD), com um dispositivo acoplado por carga intensificada aumentada-vermelha (RE-ICCD), um fotodiodo de silício ou tubos fotomultiplicadores dispostos sozinhos ou em série para amplificação em cascata do sinal. Eletrônicos de contagem de fótons podem ser usados para detecção sensível. A escolha do detector dependerá largamente da sensibilidade da detecção requerida para realizar um ensaio particular. Diversos dispositivos são adequados para coletar sinais SE(R)RS, incluindo espelhos seletivos de comprimento de onda, elementos ópticos holográficos para detecção de luz dispersa e guias de onda de fibra óptica. Várias opções são examinadas, p. ex., no WO 97/05280.

Um aparelho para obter e/ou analisar um espectro SE(R)RS pode incluir alguma forma de processador de dados, tal como um computador. Uma vez o sinal SE(R)RS tenha sido capturado por um apropriado detector, seus dados de freqüência e intensidade tipicamente serão passados para um computador para análise. O espectro de Raman de impressão digital será comparado com os espectros de referência para identificação do composto ativo Raman detectado ou a intensidade do sinal nas freqüências medidas será usada para calcular a quantidade de composto ativo Raman detectado.

Uma forma de realização da presente invenção fornece ensaios de deslocamento SE(R)RS para detectar dois produtos PCR. gene A e gene B, dentro de uma amostra. Os métodos são essencialmente como seguem. As sondas de captura para o gene A e gene B e suas correspondentes sondas alvo substitutas contendo os rótulos HEX e ΤΕΤ, respectivamente, são contatadas e permitidas hibridizar. As sondas de captura contêm grupos de procura de superfície, que promovem a adsorção na superfície de prata. A hibridização de sondas alvo substitutas e sondas de captura produz os híbridos substitutos para cada uma das seqüências alvo dos genes AeB. Os híbridos substitutos são subseqüentemente adsorvidos nos colóides de nanopartículas de prata. Uma primeira medição SE(R)RS é realizada. Uma amostra contendo os genes amplificados A e B é adicionada. Após a desnaturação, p. ex., a 95°C, a fim de dissociar os alvos substitutos e os produtos PCR de duplo filamento, a temperatura é diminuída a uma temperatura de anelamento que é ótima para anelar os DNA's do analito (isto é, genes desnaturados A e B) em suas correspondentes sondas de captura e sub-ótima para anelar as sondas alvo substitutas nestas sondas. Desta maneira, a competição entre os DNA's dos analitos e as sondas alvo substitutas ocorrerá e resultará nas sondas alvo substitutas sendo efetivamente deslocadas do híbrido substituto adsorvido na superfície. Como examinado acima, as condições de deslocamento serão ótimas em uma temperatura de anelamento que seja mais elevada do que a Tm do híbrido substituto. Uma segunda medição SE(R)RS produzirá um sinal SE(R)RS mais baixo do que antes da adição dos analitos, porque o rótulo de SE(R)RS, ligado á sonda alvo substituta deslocada, não está mais em suficiente estreita proximidade com a superfície SE(R)RS. Opcionalmente, a fluorescência é medida juntamente com ou em lugar de SE(R)RS. A fluorescência do rótulo no híbrido substituto está próxima de zero devido ao resfriamento brusco. Se o analito estiver presente na amostra, o sinal aumentará conseqüentemente, visto que o deslocamento da sonda alvo substituta remove a fonte de resfriamento brusco. A quantidade da sonda alvo substituta deslocada para cada um dos genes é indicativa da quantidade de genes AeB presentes na amostra.

A Figura 5 é uma representação esquemática do sistema 100 de acordo com uma forma de realização da presente invenção. O sistema 100 é adequado para detectar e opcionalmente quantificar a presença de pelo menos um analito em uma amostra empregando-se o ensaio de deslocamento baseado em SE(R)RS e fluorescência. Ele compreende uma fonte 101 para fornecer uma amostra, pelo menos uma fonte 102 para fornecer uma sonda alvo substituta, pelo menos uma fonte 103 para fornecer uma sonda de captura e, opcionalmente, pelo menos uma fonte 104 para fornecer os reagentes para o padrão interno e pelo menos uma fonte 105 de aditivos servindo na detecção. O dispositivo compreende ainda um meio 107, em que a(s) sonda(s) alvo substituta(s),a(s) sonda(s) de captura e o(s) analito(s) são contatados e apresentados para detecção. O meio de contato 107 também inclui uma instalação de aquecimento para assegurar apropriadas temperaturas no dispositivo de contato.

O dispositivo compreende ainda o meio 106 para

a) fornecer sonda(s) alvo substituta(s) e sonda(s) de captura das fontes 102 e 103, respectivamente, para o meio 107 para contatar a(s) sonda(s) alvo substituta(s) com a(s) sonda(s) de captura para gerar híbrido(s) substituto(s),

b) fornecer aditivos da fonte 105 para o meio 107 para contatar o(s) híbrido(s) substituto(s) com uma superfície SE(R)RS, para possibilitar a detecção do rótulo SE(R)RS ligado à(s) sonda(s) alvo substituta(s),

c) fornecer amostra compreendendo analito(s) da fonte 101 para o meio 107, para contatar a amostra com o(s) híbrido(s) substituto(s), para possibilitar o deslocamento da(s) sonda(s) alvo substituta(s) e, opcionalmente,

d) fornecer pelo menos um reagente padrão interno de pelo menos uma fonte 104 para o meio 103 para calibrar o ensaio com respeito a variações de formação de agregado e variações ópticas.

O meio 106 pode incluir alimentações gravimétricas da amostra e/ou analito e pode também incluir um arranjo de tubos/condutos e válvulas, p. ex., válvulas selecionáveis e controláveis, para permitir a provisão dos fluidos das fontes 101, 102, 103, 104 e 105 para o meio de contato 107. Alternativamente, os fluidos podem ser bombeados das fontes 101-105 para o meio de contato 107.

O arranjo acima dos componentes pode ser localizado em um cartucho 111, p. ex., um cartucho descartável 111, para uso em diagnósticos moleculares.

Circuitos de controle e análise 109, que podem estar pelo menos parcialmente no cartucho 111 ou podem opcionalmente ser externos ao cartucho Ille podem ser providos opcionalmente para controlar a operação do meio 106. Os circuitos de controle e análise 109 pode ser conectado ao meio 106 por contatos adequados na superfície do cartucho, p. ex., terminais.

Outrossim, é provido o meio 108 para detectar os rótulos. O meio 108 pode ser integrante com o cartucho 111 ou pode ser externo ao cartucho e podem ser providas janelas no cartucho Illa fim de que o meio de detecção 108 possa detectar a amostra etc. O meio 108 pode ficar sob o controle dos circuitos de controle e análise 109. O meio de detecção 108 pode ser um detector capaz de utilizar métodos de detecção SE(R)RS e de fluorescência, como mencionado acima. O meio 108 pode incluir fonte de excitação, um filtro e um detector. Tipicamente, o meio para detectar compreende um dispositivo espectrofotométrico. Sinais representativos das detecções podem ser supridos aos circuitos de controle e análise 109, que podem ser adaptados para realizar qualquer um dos algoritmos de análise da presente invenção descritos acima. Os resultados podem ser exibidos em qualquer meio de exibição 110, tal como uma unidade de exibição visual, plotador, impressora etc. Os circuitos de controle e análise 109 podem ter uma conexão a uma área local ou rede de larga área, para transmissão dos resultados a um local remoto. Os circuitos de controle e análise 109 podem ser implementados de qualquer maneira adequada, p. ex., hardware dedicado ou um computador adequadamente programado, microcontrolador ou processador embutido, tal como um microprocessador, sistema de portas tais como PAL, PLA ou FPGA ou similar.

De acordo com uma forma de realização específica da presente invenção, a amostra da fonte 101 pode ser uma solução contendo DNA obtida de uma reação PCR. Esta forma de realização é particularmente útil para uso em um cartucho descartável de diagnóstico molecular, que pode incluir uma estação de Iise celular e uma estação de reação PCR, em particular uma estação de reação PCR multiplexada. A saída da estação de reação PCR então forma a fonte 101. A sonda de captura da fonte 103 para detecção de um oligonucleotídeo amplificado é uma sonda de oligonucleotídeo específica de analito. A sonda alvo substituta da fonte 102 é uma sonda de oligonucleotídeo a que um rótulo SE(R)RS é ligado, que é adequada para detecção tanto de SE(R)RS como de fluorescência. De acordo com uma forma de realização particular, a seqüência de nucleotídeo da sonda alvo substituta contém um SNP, de modo que a intensidade da ligação da sonda alvo substituta na sonda de captura é sub-ótima. A fonte 104 contém uma quantidade predeterminada de padrão interno sendo um híbrido padrão (não-deslocável). Uma primeira fonte 105 pode conter uma superfície metálica adequada, tal como partículas ou contas colóides revestidas com superfície metálica, especialmente partículas ou contas colóides agregáveis, revestidas com superfície metálica. Uma segunda fonte 105 pode conter um agente agregante, tal como espermina.

Nesta forma de realização específica, apropriadamente provendo e contatando os reagentes das fontes 101 a 105 resulta no meio de contato 107 contendo o híbrido substituto adsorvido na superfície e híbrido padrão adsorvido na superfície. Uma primeira medição é realizada neste ponto como uma referência. Em uma próxima etapa, a amostra é adicionada.

No deslocamento da sonda alvo substituta da sonda de captura uma diminuição do sinal SE(R)RS e/ou um aumento da fluorescência são observados.

Outros arranjos dos sistemas e métodos corporificando a invenção serão óbvios para aqueles hábeis na técnica.

Ainda um outro aspecto da invenção provê o uso dos sistemas, cartuchos descartáveis, combinações e métodos da presente invenção na detecção e/ou quantificação de um analito de uma amostra do contexto de aplicações tais como mas não limitado a diagnósticos médicos tais como diagnósticos moleculares de doenças infecciosas, patologia, toxicologia, epidemiologia, guerra biológica, amostragem ambiental, forense, etc.

Deve ser entendido que, embora formas de realização preferidas, construções e configurações específicas, bem como materiais, tenham sido examinados aqui para dispositivos de acordo com a presente invenção, várias mudanças ou modificações em forma e detalhe podem ser feitas sem desvio do escopo e espírito desta invenção.

Exemplo 1 - Detecção e quantificação de genes específicos de uma amostra empregando SERRS competitivo com calibração interna

Influenza aviária altamente patogênica, causada por certos subtipos de vírus influenza A em populações animais, particularmente galinhas, apresenta um contínuo risco à saúde pública humana global. A infecção humana direta pelo vírus de influenza aviária subtipo H5N1 tem sido responsável por considerável mortalidade humana recentemente, salientando a necessidade de rápido e preciso diagnóstico. Os vírus da influenza tipo A são subtipados com base nas diferenças antigênicas das glicoproteínas externas, as hemaglutininas (HA) e as neuraminidades (NA). A presente invenção oferece uma nova, rápida e precisa abordagem para a subtipagem viral utilizando-se RT-PCR e SERRS de ácidos nucleicos virais.

O RNA viral é extraído de amostras clínicas e o cDNA complementar para o RNA viral é gerado utilizando-se transcriptase reversa viral e iniciadores aleatórios de acordo com Wright e al (1995), J. Clin. Microbiol., 33: 1180 - 1184. PCR multiplex é realizado com dois conjuntos de iniciadores específicos para os genes HA e NA do vírus influenza subtipo H5N1, como descrito em "Recommended laboratory tests to identify avian influenza A virus in specimens from humans", WHO Geneva, Junho 2005, projetado para produzir produtos PCR de 219 e 616 pb, respectivamente. Os produtos amplificados são subseqüentemente detectados por SERRS competitiva.

Além disso, duas sondas específicas de analito, chamadas sondas de captura, são projetadas para serem complementares a uma região dentro dos genes HA e NA, respectivamente, e tendo o grupo de procura de superfície consistindo de componentes de propargilamina positivamente carregados para ligação a uma nanopartículas de prata. Dois oligonucleotídeo sintéticos adicionais, chamados alvos substitutos, rotulados com os corantes SERRS HEX e ΤΕΤ, respectivamente, são projetados para serem complementares a uma parte das sondas de captura-HA e NA, respectivamente, exceto quanto a uma desigualdade (SNP).

Ao contatar as sondas alvo substitutas com as correspondentes sondas de captura, híbridos substitutos são formados. Entretanto, devido à presença da desigualdade da seqüência das sondas alvo substitutas, as sondas alvo substitutas e suas correspondentes sondas de captura HA e NA são frouxamente aneladas.

Uma quantidade predeterminada de padrão interno, que é um híbrido substituto não-deslocável, contendo um rótulo que é diferente do rótulo usado para detecção, é adicionada à mistura acima para calibração e para corrigir quanto a possíveis variações na formação do agregado intensidade de excitação.

Uma primeira etapa de detecção determina os pontos de referência para a medição SERRS de HEX e TET e um ponto de referência para a calibração interna. Para isto a solução preparada acima é misturada com 10 μl de tetracloreto de espermina (100 mM em água, frescamente preparada) seguidos por 250 μΐ de água e 250 μΐ de nanopartículas de prata reduzidas por citrato (preparadas como descrito por Munro e al (1995), Langmuir, 11:3712-3720). A adsorção dos híbridos substitutos nos colóides de prata trará os corantes HEX e TET em bastante estreita proximidade com a superfície metálica, para possibilitar a detecção de SERRS enquanto a fluorescência e resfriada bruscamente. Igualmente, a adsorção do padrão interno nos colóides de prata possibilitará a detecção de SERRS do corante do padrão interno. Imediatamente após mistura o espectro SERRS é retirado da solução preparada, utilizando-se um sistema LabRam (Jobin Yvon) com um leiser de argônio provendo excitação a 514,5 nm.

Para detecção dos genes HA e Na virais H5N1 amplificados, a saída da reação PCR é adicionada. Após desnaturação a 95 0C, incubação em uma apropriada temperatura de anelamento resulta na associação dos DNA's do analito com as sondas de captura HA e Na, a última sendo ligada aos colóides de prata agregados. Uma vez que a seqüência dos analitos é perfeitamente complementar às sondas de captura específicas de HA e NA, a hibridização dos DNA's do analito nas sondas de captura HA e Na resulta em híbridos alvo que não podem ser deslocados na temperatura de fusão dos híbridos substitutos. Desde que a Tm do híbrido padrão seja mais elevada do que aquela dos híbridos substitutos, o híbrido padrão não é afetado pela etapa de incubação acima.

Imediatamente, após ligação dos DNA's do analito com as sondas de captura e dentro de um escopo de tempo de 15 min após a primeira medição de SERRS, o segundo espectro de SERRS é considerado. A intensidade do sinal SERRS dos corantes HEX e TET é agora reduzida devido ao deslocamento das sondas alvo substitutas, a que os corantes são ligados, da superfície metálica. A quantidade de genes HA ou Na na saída PCR pode agora ser calculada visto que ela corresponde à quantidade das sondas alvo substitutas deslocadas. Além disso, as primeira e segunda medições SERRS precisam ser comparadas.

Para calibração, os primeiro e segundo espectros SERR do padrão interno são comparado e as variações de intensidade são corrigidas.

Este exemplo demonstra que uma detecção precisa dos genes de HA e NA virais, empregando-se SERRS competitivo, pode ser conseguida sem necessidade de rotular os genes amplificados.

Claims (27)

1. Método para detectar a presença e/ou quantidade de pelo menos um analito em uma amostra, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (a) contatar dita amostra com: (i) pelo menos uma sonda de captura específica de alvo compreendendo: - um oligonucleotídeo capaz de especificamente ligar-se a uma seqüência alvo dentro de dito analito, e (ii) pelo menos uma sonda alvo substituta deslocável, compreendendo: - um oligonucleotídeo capaz de especificamente ligar dita sonda de captura, - um rótulo que tem uma ou ambas dispersão Raman intensificada na superfície (ressonância) (SE(R)RS) e atividade de fluorescência, por meio do que pelo menos uma sonda de captura específica de alvo é covalentemente ligada a uma superfície SE(R)RS ou dita etapa (a) compreendendo ainda contatar dita pelo menos uma sonda de captura específica de alvo com uma superfície SE(R)RS; e (b) detectar o sinal gerado por dito rótulo em pelo menos um híbrido substituto formado pela ligação de dita pelo menos uma sonda alvo substituta deslocável e dita pelo menos uma sonda de captura específica de alvo, dito sinal sendo proporcional à presença e/ou quantidade de dito pelo menos um analito em dita amostra.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da etapa (a) compreender as etapas de: (I) contatar dita pelo menos uma sonda de captura específica de alvo com dita pelo menos uma sonda alvo substituta deslocável, a fim de obter-se pelo menos um híbrido substituto, por meio do que dita pelo menos uma sonda de captura específica de alvo é covalentemente ligada a uma superfície SE(R)RS e pelo menos um híbrido substituto adsorvido na superfície é assim obtido ou dita etapa (I) compreende ainda contatar dita pelo menos uma sonda de captura específica de alvo com uma SE(R)RS ou dita etapa (I) compreende ainda contatar dito pelo menos um híbrido substituto com dita superfície SE(R)RS5 de modo que dito pelo menos um híbrido substituto torne-se adsorvido em dita superfície como pelo menos um híbrido substituto adsorvido na superfície; (II) contatar dito pelo menos um híbrido substituto adsorvido na superfície com dita amostra, a fim de permitir o deslocamento de dita pelo menos uma sonda alvo substituta deslocável por dito pelo menos um analito; e em que a etapa (b) compreende as etapas de: (III) detectar o sinal de dito rótulo em dito pelo menos um híbrido substituto adsorvido na superfície após a etapa (I), utilizando-se um ou outro ou ambos de SE(R)RS e fluorescência; e (IV) detectar o sinal de dito pelo menos um híbrido substituto adsorvido na superfície após a etapa (II), utilizando-se o mesmo método ou métodos de detecção usados na etapa (III); em que a diferença no sinal obtido nas etapas (III) e (IV) é adotada como proporcional à presença e/ou quantidade de dito pelo menos um analito em dita amostra.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato da etapa (a) compreender as etapas de: (V) contatar dita pelo menos uma sonda de captura específica de alvo com dita pelo menos uma sonda alvo substituta deslocável, a fim de obter-se pelo menos um híbrido substituto; (VI) contatar dito pelo menos um híbrido substituto com dita superfície SE(R)RS, de modo que dito pelo menos um híbrido substituto torne-se adsorvido em dita superfície formando pelo menos um híbrido substituto adsorvido na superfície; e (VII) contatar dito pelo menos um híbrido substituto adsorvido na superfície com dita amostra, a fim de permitir o deslocamento de dita pelo menos uma sonda alvo substituta deslocável por dito pelo menos um analito.

4. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato da etapa II compreender assegurar apropriadas condições de anelamento, para permitir a hibridização de dito pelo menos um analito em dita amostra com dita pelo menos uma sonda de captura.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de dita pelo menos uma sonda alvo substituta deslocável compreender uma seqüência de oligonucleotídeo que não é 100% complementar a dita seqüência de oligonucleotídeo de dita pelo menos uma sonda de captura.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de dita pelo menos uma sonda de captura específica de alvo compreender um grupo de procura de superfície e dita pelo menos uma sonda de captura específica de alvo liga-se a dita superfície SE(R)RS através de dito grupo de procura de superfície.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender ainda a etapa de (c) contatar: (iii) uma sonda de captura padrão compreendendo: - um oligonucleotídeo, e - um grupo de procura de superfície, e (iv) uma sonda padrão compreendendo: - um oligonucleotídeo que é 100% complementar à seqüência de dita sonda de captura padrão, - um rótulo que tem uma ou ambas dispersão Raman intensificada na superfície (ressonância) e atividade de fluorescência, desse modo obtendo-se um híbrido padrão, e (v) uma superfície SE(R)RS; desse modo obtendo-se um híbrido padrão adsorvido na superfície; e (d) detectar o sinal gerado por dito rótulo em dito híbrido padrão adsorvido na superfície.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de dito híbrido padrão, obtido na etapa (c), ser adicionado a dita amostra na etapa (a) e em que dita sonda padrão compreende um rótulo que é diferente do rótulo provido em dita pelo menos uma sonda alvo substituta.

9. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de dita sonda de captura padrão compreender uma seqüência de oligonucleotídeo que não hibridiza com dita seqüência alvo.

10. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de ditas etapas (c) e (d) serem realizadas em um diferente frasco do das etapas (a) e (b).

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de dita amostra das etapas (a) e (b) ser uma amostra de controle.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de dita pelo menos uma sonda de captura compreender um grupo de procura de superfície.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de dito grupo de procura de superfície ser um benzotriazol.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de dita superfície SE(R)RS consistir de nanopartículas de ouro, que são revestidas com prata, pela adição de hidroquinona de prata, após covalentemente ligar dita sonda de captura a ditas nanopartículas de ouro.

15. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de dita superfície SE(R)RS ser uma suspensão coloidal de nanopartículas de prata ou ouro, ou seus colóides agregados.

16. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de dita superfície SE(R)RS consistir de nanopartículas de prata ou outro revestidas com uma camada fina (1-alguns nanômetros) de ouro ou prata, respectivamente.

17. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de dita superfície SE(R)RS consistir de agrupamentos estáveis de nanopartículas de prata ou ouro.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de ditos agrupamentos serem estabelecidos por reticulação com macromoléculas bi ou multifuncionais (telêmeros), que podem ligar-se quimicamente a ditos agrupamentos.

19. Combinação de sonda alvo substituta e sonda de captura, caracterizada pelo fato de compreender: (i) uma sonda de captura compreendendo: - um oligonucleotídeo, (ii) uma sonda alvo substituta compreendendo: - um oligonucleotídeo capaz de ligar-se a dita sonda de captura, por meio do que dito oligonucleotídeo é caracterizado por uma temperatura de fusão que é menor do que a temperatura de fusão de um oligonucleotídeo que é 100% complementar a dito oligonucleotídeo de sonda de captura, - um rótulo ligado a dita sonda alvo substituta, que tem um ou outra ou ambas dispersão Raman intensificada na superfície (ressonância) (SE(R)RS) e atividade de fluorescência.

20. Combinação de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de dita sonda de captura ser covalentemente ligada a uma superfície SE(R)RS.

21. Combinação de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de dita sonda de captura compreender um grupo de procura de superfície capaz de ligar-se a uma superfície SE(R)RS.

22. Cartucho descartável (111) para uso em um sistema para detectar a presença e/ou quantidade de pelo menos um analito em uma amostra, caracterizado pelo fato de compreender (a) um conjunto de fontes compreendendo: - fonte (101) de amostra, - pelo menos uma fonte (102) do alvo substituto, - pelo menos uma fonte (103) da sonda de captura específica de alvo, - pelo menos uma fonte (105) de aditivos servindo na detecção; (b) meio (107) para contatar volumes específicos de ditas fontes; e (c) meio (106) para assegurar a provisão dos fluidos de ditas fontes para o meio de contato (107).

23. Cartucho de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de compreender ainda pelo menos uma fonte (104) de reagentes padrão internos.

24. Cartucho de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de compreender ainda uma janela para detectar o sinal gerado em dito meio de contato.

25. Sistema (100) para detectar a presença ou quantidade de pelo menos um analito em uma amostra, caracterizado pelo fato de compreender: (a) meio (107) para contatar dita amostra com: (i) pelo menos uma sonda de captura específica de alvo compreendendo: - um oligonucleotídeo capaz de especificamente ligar-se a uma seqüência alvo dentro de dito analito, e (ii) pelo menos uma sonda alvo substituta deslocável compreendendo: - um oligonucleotídeo capaz de especificamente ligar-se a dita sonda de captura, - um rótulo que tem uma ou ambas de dispersão Raman intensificada na superfície (ressonância) e atividade de fluorescência; e (b) meio (108) para detectar o sinal gerado por dito rótulo em pelo menos um híbrido substituto formado pela ligação de dita pelo menos uma sonda alvo substituta deslocável e dita pelo menos uma sonda de captura específica de alvo.

26. Sistema de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de compreender ainda um meio para calcular (109) a quantidade de dito pelo menos um analito, comparando os sinais de detecção detectados em dito meio de contato (107), em diferentes pontos do tempo, com a provisão de reagentes de ditas fontes para dito meio de contato (107).

27. Sistema de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de dito meio (108) para detecção compreender uma fonte de luz, um filtro e um meio de detecção.