BRPI0709427A2

BRPI0709427A2 - "construto cìclico, composição farmacêutica e uso de um composto

Info

Publication number: BRPI0709427A2
Application number: BRPI0709427-2A
Authority: BR
Inventors: Shubh D Sharma; Margarita Bastos; Wei Yang; Hui-Zhi Cai
Original assignee: Palatin Technologies Inc
Priority date: 2006-03-30
Filing date: 2007-03-30
Publication date: 2011-07-12
Also published as: KR101434612B1; US7622440B2; AU2007233116B2; JP5355383B2; WO2007115175A2; WO2007115175A3; EA016804B1; US8580747B2; US20100075895A1; AU2007233116A1; CA2647143A1; MX2008012663A; IL194262A; HK1134022A1; EA200802059A1; EP2001518B1; CO6140040A2; US20070265206A1; ES2430323T3; EP2001518A4

Abstract

CONSTRUTO CìCLICO, COMPOSIçãO FARMACêUTICA E USO DE UM COMPOSTO. Construto cíclico com um N-terminal e um C-terminal que se liga a um receptor de peptídeo natriurético e que inclui uma pluralidade de resíduos aminoácido, pelo menos um substituto de aminoácido de fórmula 1: onde R, R', Q, Y, W, Z, J, x e n são conforme definidos no relatório, e opcionalmente pelo menos um grupo protético, composições farmacêuticas incluindo tais construtos cíclicos, bem como métodos para tratar insuficiência cardíaca congestiva e outras condições, síndromes ou doenças, para os quais se deseja a induçào de efeitos antihipertensivos, cardiovasculares, renais e endócrinos.

Description

"CONSTRUTO CÍCLICO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USO DE UM COMPOSTO".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a construtos de peptídeo natriurético cíclico que incluem uma pluralidade de resíduos aminoácido, substitutos de aminoácido constrito no anel e, opcionalmente, um ou mais grupos protéticos, sendo que os construtos ligam-se a um receptor de peptídeo natriurético e podem ser empregados para fins terapêuticos.

Histórico da Invenção

O sistema de peptídeo natriurético vem sendo intensivamente explorado desde a identificação da seqüência de peptídeo natriurético atrial (ANP) humano e da estrutura gênica em 1984. O ANP é âs vezes designado "ANF", ou fator natriurético. 0 ANP faz parte do sistema de peptídeo natriurético que, nos seres humanos, envolve um gene ANP que, através de diferenças no processamento pós-translacional resulta tanto em ANP como em urodilatina, um gene que produz BNP, ou peptídeo natriurético cerebral, e um gene que produz CNP, um peptídeo natriurético do tipo C. ANP, urodilatina, BNP e CNP são estruturas de anel, com um laço de 17 aminoácidos formado por uma ligação dissulfeto cisteína-cisteína. A seqüência e estrutura de aminoácido do ANP humano (hANP) é mostrado na Figura 1. ANP, urodilatina, BNP e CNP estão estreitamente relacionados, diferenciando-se por cinco ou seis aminoácidos no anel, embora as caudas N- e C-terminais sejam substancialmente diferentes.

O ANP, BNP e CNP são específicos para receptoresdistintos, receptores de peptídeo natriurético A, B e C (NPRA, NPRB e NPRC). O NPRA e o NPRB estão ligados a guanilil ciclases, ao passo que o NPRC é um receptor de depuração ("clearance") ligado à proteína G. O ANP, BNP e CNP são os peptídeos natriuréticos endógenos primários de mamíferos identificados até o momento. Porém, existem diversos peptídeos natriuréticos não de mamífero queforam identificados e que podem ter aplicação farmacêutica em mamíferos. Estes incluem peptídeo natriurético ou cardíaco de salmão (sCP), peptídeo natriurético ventricular (VNP), um peptídeo natriurético cardíaco identificado em enguias e uma variedade de peptídeo natriurético de peixe e peptídeo natriurético de dendroaspis (DNP), um peptídeo natriurético identificado em veneno de cobra mamba, e três peptídeos do tipo natriurético (TNP-a, TNP-b e TNP-c) isolado de veneno de 10 cobra Taipan. Vide, geralmente Tervonen V, Ruskoaho H, Lecklin T, ilves M, Vuolteenaho O. O peptídeo natriurético cardíaco de salmão é um hormônio regulador de volume. Am. J.Physiol.Endocrinol.Metab.2 83:E353 -61(2002); Takey Y., Fukuzawa A, Itahara Y, Watanabe TXi 15 Yoshizawa Kumagaye K, Nakajima K, Yasuda A, Smith MP, Duff DW, Olson KR. Um novo peptídeo natriurético isolado do átrio cardíaco de trutas, Oncorhynchus mykiss. FEBS Ltt.414:377-80 (1997); Schweitz H, Vigne P, Moinier D, Frelin C, Lazdunski M. Um novo membro da família depeptídeo natriurético está presente no veneno da cobraverde mamba (Dendroaspis angusticeps). J.Biol.Chem. 267:13928-32 91992); Lisy O, Jougasaki M, Heublein DM, Schirger JA, Chen HH, Wennberg PW, Burnett JC. Atividades renais do peptídeo natriurético sintético de dendroaspis. Kidney Int. 56:502-8 (1999); e Fry BG, Wickramaratana JC, Lemme S, Beuve A, Garbers D, Hodgson WC, Alewood P. Peptídeos natriuréticos novos de veneno de Oxyuranus microlepidotus: isolamento, caracterização química e biológica. Biochem. Biophys. Res. Comm. 327:1011-1015(2 005). 0 ANP é endogenamente predominantemente secretadoem resposta à pressão atrial aumentada, embora outros fatores, incluindo a estimulação do receptor de citocina, possam contribuir para a secreção endógena. Após liberado, o ANP é um regulador hormonal da pressão arterial, da homeostase de sódio e líquidos, provendo efeitos vasorrelaxantes, afetando a remodelagem cardiovascular, e similares. Assim, o ANP, inclusive oANP endógeno, é eficaz na insuficiência cardíaca congestiva e em outra doença cardiovascular, provendo, em parte, defesa contra um sistema de renina-angiotensina-aldosterona cronicamente ativado. 0 ANP circulante é rapidamente removido da circulação através de dois mecanismos, ligação a um receptor de peptídeo natriurético e degradação enzimática.

0 ANP humano é também designado ANP, hANP, ANP(1-28) e ANP(99-126) humano do tipo selvagem (este último referese à seqüência relevante no proANP(1-126), que é normalmente clivado em Arg89-Ser98 na região C-terminal durante a secreção). Na presente invenção, o ANP humano é às vezes designado "hANP".

Em geral, acredita-se que os peptídeos natriuréticos e suas variantes encontram utilidade no tratamento de insuficiência cardíaca congestiva, hipertensão renal, insuficiência renal aguda e condições relacionadas, bem como qualquer condição, doença ou síndrome na qual uma resposta diurética, natriurética e/ou vasodilatadorapoderia ter um efeito terapêutico ou preventivo. Umartigo de revisão descrevendo peptídeos natriuréticos, inclusive ANP, e o uso do sistema de peptídeonatriurético na insuficiência cardíaca é Schmitt Μ. , Cockcroft J.R., e Frenneaux M.P. Modulation of the natriuretic peptide system in heart failure: from bench to bedside? (Modulação do sistema de peptídeo natriurético na insuficiência cardíaca: da bancada para a cabeceira do doente? Clinicai Science 105:141-160 (2003). Um grande número de miméticos e variações de ANP foipreparado, sendo alguns deles de tamanho substancialmentereduzido de ANP. Uma versão de ANP de tamanho reduzido, porém biologicamente ativo, é o peptídeo cíclico de dissulfeto de 15-mer H-Met-ciclo(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-lle-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2 (SEQ ID NO:1) conforme descrito em Li B, Tom JY, Oare D, Yen R, Fairbrother WJ, Wells JA, Cunningham BC. Minimization of a polypeptide hormone. Science 270:1657-60 (1995). Essepeptídeo de 15-mer é comumente designado como "mini-ANP". Diversas patentes e pedidos de patente foram depositados a respeito de miméticos sintéticos diferentes de peptídeos natriuréticos, declarados como superiores em relação aos peptídeos natriuréticos do tipo selvagem com base em um ou mais fatores. Estes incluem os construtos

<table>table see original document page 5</column></row><table> 2004/0002458; 2004/0063630; 2004/0077537; 2005/0113286; 2005/0176641; 2006/0030004. Além disso, diversas patentes e pedidos de patente não-americanos descrevem construtos que Íncluem:WO 85/04870; WO 85/04872; WO 88/03537; WO 88/06596; WO 89/10935; WO 89/05654; WO 90/01940; WO 90/14362; WO 92/06998; WO 95/13296; WO 99/08510; WO 99/12576; WO 01/016295; WO 2004/047871; WO 2005/072055; EPO 0 291 999; EPO 0 323 740; EPO 0 341 603; EPO 0 350 318; EPO 0 356 124; EPO 0 385 476; EPO 0 497 368; e EPO 0 542 863. Peptídeos natriuréticos quiméricos, tal como um peptídeo denominado "peptídeo de vasonatrina" e descrito como uma quimera de ANP e CNP, são descritos, como na patente americana 5.583.108 ou nas patentes americanas 6.407.211 e 6.818.619, descrevendo peptídeos quiméricos de dendroaspis. Os ensinamentos de cada uma das patentes e pedidos de patente são incorporados por referência, como se descritos na íntegra.

Há um produto de peptídeo natriurético aprovado pelo Food and Drug Administration dos Estados Unidos, vendido sob o nome genérico de nestiritide e nome comercial de Natrecor® (Seios Inc.). Trata-se de um peptídeonatriurético do tipo B humano preparado a partir de E.coli utilizando tecnologia de DNA recombinante. Esse produto é aprovado apenas para infusão intravenosa no tratamento de pacientes com insuficiência cardíaca congestiva descompensada aguda, que apresentam dispnéia em repouso ou com atividade mínima. Embora eficaz, a farmacocinética e meia-vida do nestiritide permitem que o produto possa ser empregado apenas por infusão intravenosa, o que restringe o uso do fármaco ao campo hospitalar ou médico especializado.

Não obstante o grande número de compostos desenvolvidos, nenhum deles é virtualmente comercializado, nem encontra-se em desenvolvimento clínico ativo. Há uma necessidade substancial de produtos com características melhoradas, inclusive potência, meia-vida, modos de administração, biodisponibilidade e duração de efeito prolongado melhorados, que sejam eficazes para uma ou mais indicações terapêuticas, e que possam preferivelmente ser administrados a pacientes ambulatoriais.

Breve sumário da invenção

Em um dos aspectos, a invenção provê um construto cíclico que se liga a um receptor para um peptídeo natriurético, inclusive, porém não limitado a um receptor para ANP, BNP, CNP, sCP, DNP, TNP - a, TNP-b ou TNP-c, onde tal construto inclui uma pluralidade de resíduos aminoácido, pelo menos um substituto de aminoácido da fórmula geral I :

<formula>formula see original document page 6</formula>

onde:

R e R' são, cada qual, independentemente H ou uma porção de cadeia lateral de aminoácido natural ou não natural ou derivado de uma porção de cadeia lateral de aminoácido; χ é 1 OU 2; Y é CH2 OU C=0; W é CH2, NH OU NR"1; Z é H OUCH3; η é Ο, 1 ou 2; J é -C(=0)- salvo se o substituto estiver na posição C-terminal do construto, quando então J é -Hi -0H, -C(=0)-0H, -C(=0)-NH2, ou um grupo capeador C-terminal; Q é uma ligação, salvo se o substituto 5 estiver na posição N-terminal do construto, quando então Q é -H ou um grupo capeador de amina; R'" é um acila, uma cadeia de alquila C1 a Ci7 linear ou ramificado, uma cadeia de alquil acila C2 a Ci9 linear ou ramificado, um ômega amino alifático C1 a C17 linear ou ramificado ou um 10 acila ômega amino alifático Ci a C17 linear ou ramificado; opcionalmente pelo menos um grupo protético covalentemente ligado ao grupo reativo numa cadeia lateral de pelo menos um dos resíduos aminoácido, a um grupo capeador de amina onde o substituto encontra-se na 15 posição N-terminal do construto, ou a um grupo capeador C-terminal, onde o substituto está na posição C-terminal do construto; e os átomos de carbono marcados com um asterisco podem ter qualquer configuração estereoquímica.O construto é um construto cíclico, ciclizado através de uma ligação entre cadeias laterais de dois resíduos aminoácido adjacentes, entre uma cadeia lateral de resíduo aminoácido e um grupo R ou R' de substituto de aminoácido, entre os grupos R ou R' de dois substitutos de aminoácido, entre um grupo terminal do construto e uma cadeia lateral de resíduo aminoácido, ou entre um grupo terminal do construto e grupo R e R' de um substituto aminoácido. Preferivelmente, os dois resíduos aminoácido formando uma ligação entre as cadeias laterais dos mesmos são separados por entre cerca de oito e dez resíduos 30 aminoácido e opcionalmente zero, um ou dois substitutos de aminoácido. A pluralidade de resíduos aminoácido pode incluir qualquer resíduo aminoácido selecionado do grupo consistindo de α-aminoácidos, /3-aminoácidos naturais ou não naturais simples, aminoácidos a,α-di-substituídos e 35 aminoácidos N-substituídos, incluindo todas as configurações (R) ou (S) de qualquer um dos anteriormente citados.0(s) grupo(s) protético(s) pode incluir grupos compreendendo unidades de repetição incluindo um ou mais átomos de carbono e hidrogênio e, opcionalmente, outros átomos, inclusive oxigênio. Tais grupos poliméricos são preferivelmente polímeros solúveis em água, e são preferivelmente poli(óxido de alquileno), poli(vinil pirrolidona), álcool polivinílico, polioxazolina ou poli(acriloilmorfolina). Um poli(óxido de alquileno) preferido é o poli(etileno glicol) (PEG), opcionalmente derivatizado com um grupo ligante.

Em um aspecto, J é um grupo capeador C-terminal selecionado de: - (CH2)m-OH,-C (=0) - (CH2)m-N(V1) (V2) , -C (=0) -O-(CH2)m-CH3, -0- (CH2)m-CH3, -0- (CH2)m-N(V1) (V2) , -0- (CH2)m-OH, -C (=0) -NH- (CH2)m-S(V1) , 20 -C (=0)-NH-(CH2)m-CH3, -C (=0)-NH-(CH2) m-N (V1) (v2) , -C (=0)-N- ( (CH2)m-N(V1) (V2) )2, -C (=0) -NH-CH (-C (=0) -0H) - (CH2)m-N(V1) (v2) ,

-C (=0) -NH- (CH2) m-NH-C(=0) -CH(Niv1) (v2) ) ( (CH2)m-N(V1) (v2) ) , ou -C (=0) -NH-CH (-C (=0) -N(V1) (v2) ) - (CH2)m-N(V1) (v2) ;

incluindo todas as configurações (R) ou (S) dos anteriormente citados, onde V1 e V2 são cada qual independentemente H ou uma cadeia de alquila C1 a C17 linear ou ramificado e m é, em cada caso, independentemente de 0 a 17.

Em outro aspecto, quando o substituto de aminoácido estiver na posição C-terminal do construto, J é um grupo capeador C-terminal consistindo de um ômega amino alifático, grupo arila ou aralquila terminal ou qualquer a-aminoácido, B-aminoácido natural ou não natural simples, aminoácido a, of-di-substituído ou aminoácido N-substituído, incluindo todas as configurações (R) ou (S)de um aminoácido a,a-di-substituído, onde os substituintes são diferentes, opcionalmente em combinação com um grupo capeador C-terminal, conforme acima definido.

Em outro aspecto, Q é um grupo capeador de amina selecionado de:

- (CH2)ra-N(V3) (V4) ,

- (CH2 ) m-CH3 /

- (CH2)ra-O(V3) ,

- (CH2)m-Ci=O) - (V3) ,

- (CH2)ra-C(=0) -O- (V3) ,

- (CH2)ra-S(V3) ,

-C (=0) - (CH2)ra-CH3, -C (=0) - (CH2)m-N(V3) (V4) , -C (=0) - (CH2)m-C (=0) - (V3) , -C (=0) - (CH2)ra-O(V3) , ou -C (=0) - (CH2)m-S (V3) ;

onde V3 e V4 são, cada qual, independentemente H, uma cadeia de alquila C1 a Cn linear ou ramificado ou uma cadeia de alquil acila C2 a C19 linear ou ramificado, contanto que, se um de V3 ou V4 for uma cadeia de alquil acila, então o outro de v3 ou V4 seja Hem seja de 0 a 17 .

Num aspecto relativo, um substituto de aminoácido da fórmula I está na posição C-terminal do construto, e pelo menos um de R e R"é uma porção de cadeia lateral de aminoácido natural ou não natural ou derivado de uma porção de cadeia lateral de aminoácido com um grupo heteroátomo compreendendo pelo menos um átomo de nitrogênio, e o restante de R e R' é H ou uma porção de cadeia lateral de aminoácido natural ou não natural ou derivado de uma porção de cadeia lateral de aminoácido. Numa concretização relativa, a invenção prove um construto que se liga a um receptor para um peptídeo natriurético, que inclui, porém não se restringe a um receptor para ANP, BNP, CNP, sCP, DNP, TNP - a, TNP-b ou TNP-c, onde tal construto inclui uma pluralidade deresíduos aminoácido e pelo menos um substituto de aminoácido localizado em qualquer posição que não a posição C-terminal e posição N-terminal e covalentemente ligado por duas ligações peptídicas, e de fórmula II:

<formula>formula see original document page 10</formula>

ReR' são, cada qual, independentemente H ou uma porção de cadeia lateral de aminoácido natural ou não natural ou derivado de uma porção de cadeia lateral de aminoácido; χ 10 é 1 ou 2; Y é CH2 ou C=O; W é CH2, NH ou NR'"; Z é H ou CH3; -R'" é um acila, uma cadeia de alquila C1 a C17 linear ou ramificado, uma cadeia de alquil acila C2 a C19 linear ou ramificado, um ômega amino alifático Ci a Ci7 linear ou ramificado ou um acila ômega amino alifático C1 a C17 linear ou ramificado; η é 0, 1, ou 2; os átomos de carbono marcados com asterisco podem ter qualquer configuração estereoquímica; e as linhas tracejadas indicam a ligação formando uma ligação peptídica. Quando o substituto de fórmula I encontra-se na posição C-terminal do construto, ele é covalentemente ligado ao mesmo por uma ligação peptídica simples, de forma que o substituto tenha a fórmula:

<formula>formula see original document page 10</formula>

onde a linha tracejada indica a ligação formando uma ligação peptídica. Quando o substituto está na posição N- terminal do construto, tem preferivelmente a fórmula I, e é covalentemente ligado ao mesmo por uma ligação peptídica simples, de forma que o substituto tenha a seguinte fórmula:

<formula>formula see original document page 10</formula>

onde:onde a linha interrompida indica a ligação que forma uma ligação peptídica. Porém, quando o substituto estiver em outra posição que não a posição N-terminal ou C-terminal do construto, ele apresenta preferivelmente a fórmula II e é covaIentemente ligado ao mesmo por duas ligações peptídicas.

Em concretizações diferentes da invenção, um substituto de aminoácido pode ser empregado num construto da invenção, dois substitutos de aminoácido podem ser empregados num construto da invenção, ou mais de dois substitutos de aminoácido podem ser empregados num construto da invenção.

Em outra concretização preferida, a invenção provê um construto onde uma ou mais ligações peptídicas entre os resíduos aminoácido são substituídas com uma ligação não-peptídica.

Um dos objetos principais da invenção consiste em prover construtos natriuréticos receptor-específicos. Outro objeto da presente invenção consiste em prover construtos natriuréticos receptor-específicos, onde um ou mais resíduos aminoácido são substituídos com um substituto de aminoácido constrito no anel. Outro objeto da presente invenção consiste em prover um construto natriurético receptor-específico, sendo que oconstruto exibe, quando administrado a um mamífero, umaou mais vantagens relacionadas com a seqüência de aminoácido correspondente não compreendendo um substituto de aminoácido, as vantagens sendo selecionadas do grupo consistindo de aumento da resistência à degradaçãoenzimática, aumento da meia-vida de circulação, aumentoda biodisponibilidade, aumento da eficácia, duração de efeito prolongada e suas combinações.

Outro objeto da presente invenção consiste em prover umconstruto natriurético receptor-específico, onde o construto possui pelo menos 10% da atividade estimulante de cGMP, na mesma concentração da seqüência de aminoácido correspondente não compreendendo um substituto de aminoácido.

Outro objeto da presente invenção consiste em prover um construto natriurético receptor-específico, onde o construto possui pelo menos 100% da atividade estimulante de cGMP na mesma concentração da seqüência de aminoácido correspondente não compreendendo um substituto de aminoácido.

Outro objeto da presente invenção consiste em prover um construto natriurético receptor-específico, onde o construto possui mais de 100% da atividade estimulante de cGMP na mesma concentração da seqüência de aminoácido correspondente não compreendendo um substituto de aminoácido.

Outro objeto da presente invenção consiste em prover um construto natriurético receptor-específico, onde o construto possui uma afinidade de ligação a receptor em equilíbrio, determinada pelo valor Ki(nM), não mais que duas ordens logarítmicas maior que o valor Ki(nM) da seqüência de aminoácido correspondente não compreendendo um substituto de aminoácido. Outro objeto da presente invenção consiste em prover um construto natriurético receptor-específico, onde o construto possui uma afinidade de ligação a receptor em equilíbrio, determinada pelo valor Ki(nM), não mais que três ordens logarítmicas maior que o valor Ki(nM) da seqüência de aminoácido correspondente não compreendendoum substituto de aminoácido.

Outro objeto da presente invenção consiste em prover um construtor natriurético receptor-específico, onde o construto possui uma afinidade de ligação a receptor em equilíbrio, determinada pelo valor Ki(nM), igual ou menor que o valor Ki(nM) da seqüência de aminoácido correspondente não compreendendo um substituto deaminoácido.

Outro objeto da presente invenção consiste em prover um construto natriurético receptor-específico, onde o construto possui uma afinidade de ligação a receptor em equilíbrio, determinada pelo valor Ki(nM), menor que o valor Ki(nM) da seqüência de aminoácido correspondente não compreendendo um substituto de aminoácido. Outro objeto da presente invenção consiste em prover um construto natriurético receptor-específico, onde o construto possui uma afinidade de ligação a receptor em relação a um receptor de peptídeo natriurético maior que a afinidade de ligação a receptor da seqüência de aminoácido correspondente não compreendendo um substituto de aminoácido.

Outro objeto da presente invenção consiste em prover um construto natriurético receptor-específico, onde o construto possui eficácia biológica, determinada pelo aumento da pressão sangüínea ou o aumento no volume urinário ao longo do tempo, pelo menos tão eficaz oumais eficaz do que a mesma dose da seqüência deaminoácido correspondente não compreendendo um substituto de aminoácido.

Outro objeto da presente invenção consiste em prover um construto natriurético receptor-específico, onde o construto possui eficácia biológica, determinada pelo aumento da pressão sangüínea ou o aumento no volume urinário ao longo do tempo, pelo menos mais eficaz do que a mesma dose da seqüência de aminoácido correspondente não compreendendo um substituto de aminoácido.

Outro objeto da presente invenção consiste em prover umconstruto natriurético receptor-específico, onde a seqüência de aminoácido correspondente não compreendendo um substituto de aminoácido possui cerca de pelo menos 60% de homologia com a seqüência de um peptídeo natriurético.

Outro objeto da presente invenção consiste em prover um construto natriurético receptor-específico, onde aseqüência de aminoácido correspondente não compreendendo um substituto de aminoácido possui cerca de pelo menos 80% de homologia com a seqüência de um peptídeo natriurético.

Outro objeto da presente invenção consiste em prover um construto natriurético receptor-específico, onde a seqüência de aminoácido correspondente não compreendendo um substituto de aminoácido possui cerca de pelo menos 60% de homologia com a seqüência de um peptídeo que se liga a um receptor para ANP, BNP, CNP, sCP, DNP, TNP-a, TNP-b ou TNP-C.

Outro objeto da presente invenção consiste em prover um construto natriurético receptor-específico, onde a seqüência de aminoácido correspondente não compreendendo um substituto de aminoácido possui cerca de pelo menos 80% de homologia com a seqüência de um peptídeo que se liga a um receptor para ANP, BNP, CNP, sCP, DNP, TNP-a, TNP-b ou TNP-c.

Outro objeto da presente invenção consiste em prover um construto natriurético receptor-específico, onde a seqüência de aminoácido correspondente não compreendendo um substituto de aminoácido possui cerca de pelo menos 60% de homologia com a seqüência H-Met-ciclo(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2 (SEQ ID NO:1).

Outro objeto da presente invenção consiste em prover um construto natriurético receptor-específico, onde a seqüência de aminoácido correspondente não compreendendo um substituto de aminoácido possui cerca de pelo menos 80% de homologia com a seqüência H-Met-ciclo (Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-lie-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2 (SEQ ID NO:1).

Outro objeto da presente invenção consiste em prover um construto natriurético receptor-específico, onde a seqüência de aminoácido correspondente não compreendendo

um substituto de aminoácido possui cerca de pelo menos 60% de homologia com a seqüência H-Met-ciclo(Xaa-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Xaa)-Tyr-Arg-NH2 (SEQ ID NO:2), onde Xaa são cada qual independentemente qualquer resíduo aminoácido juntos formando um peptídeo cíclico. Outro objeto da presente invenção consiste em prover um construto natriurético receptor-específico, onde a seqüência de aminoácido correspondente não compreendendo um substituto de aminoácido possui cerca de pelo menos 80% de homologia com a seqüência H-Met-ciclo(Xaa-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Xaa)-Tyr-Arg-NH2 (SEQ ID NO: 2), onde Xaa são cada qual independentemente qualquer resíduo aminoácido juntos formando um peptídeo cíclico. Outro objeto da presente invenção consiste em prover um construto natriurético receptor-específico incluindo um substituto, conforme aqui definido, onde a seqüência de aminoácido correspondente não compreendendo um substituto de aminoácido é um peptídeo que se liga a um receptor para ANP.

Outro objeto da presente invenção consiste em prover um construto natriurético receptor-específico incluindo um substituto, conforme aqui definido, onde a seqüência de aminoácido correspondente não compreendendo um substituto de aminoácido é um peptídeo que se liga a um receptor para BNP.

Outro objeto da presente invenção consiste em prover construtos natriuréticos receptor-específicos com maior biodisponibilidade e meia-vida do que as formas naturais ou recombinantes de ANP ou BNP.

Outro objeto da presente invenção consiste em prover construtos natriuréticos receptor-específicos que podem ser administrados a pacientes com insuficiência cardíaca congestiva.

Outro objeto da presente invenção consiste em prover construtos natriuréticos receptor-específicos que podem ser administrados através de pelo menos uma via de administração além da administração intravenosa.

Outro objeto da presente invenção consiste em prover construtos natriuréticos receptor-específicos que podemser administrados a pacientes através de injeção subcutânea ou intramuscular.

Outro objeto da presente invenção consiste em prover construtos natriuréticos receptor-específicos com resistência aumentada à degradação, mas que possuem uma afinidade de ligação significativamente alta a seu receptor.

Outro objeto da presente invenção consiste em prover construtos natriuréticos receptor-específicos numa formulação de liberação contínua.

Outros objetos, vantagens e características novas e ainda o escopo de aplicabilidade da presente invenção serão descritos em parte na descrição detalhada a seguir, em conjunto com os desenhos anexos e em parte serão evidentes para os habilitados na técnica ao examinar o relatório, ou podem ser aprendidos pela prática da invenção. Os objetos e vantagens da invenção poderão ser realizados e obtidos através dos meios e combinações descritos nas reivindicações em anexo.

Breve descrição dos desenhos

Os desenhos anexos ilustram uma ou mais concretizações da presente invenção e, juntamente com a descrição, servem para explicar princípios da invenção. Os desenhos servem apenas para ilustrar uma ou mais concretizações preferidas da invenção, não devendo ser interpretados como restringindo a invenção.

Nos desenhos:

A Figura 1 é a seqüência de ANP humano endógeno do tipo selvagem (hANP);

A Figura 2 é um gráfico da concentração do construto 1-18 em ratos ao longo do tempo quando administrado por viacutânea a 5mg/kg e por via intravenosa a 2 mg/kg;

A Figura 3 é um gráfico de volume urinário no período de trinta minutos, num grupo de quatro ratos quando os construtos 1-18 e 1-63 são administrados por vias IV; e

A Figura 4 é um gráfico de volume urinário no período de quarenta e cinco minutos, num grupo de quatro ratos quando os construtos 1-18 são administrados em dosesdiferentes por vias SC. Descrição detalhada da invenção

A invenção provê construtos natriuréticos receptor-específicos preparados com uma pluralidade de resíduos aminoácido, pelo menos um substituto de aminoácido constrito no anel e, opcionalmente, pelo menos um grupo protético. Os substitutos de aminoácido constrito no anel empregados na invenção podem ser preferivelmente preparados com um N-terminal amino protegido convencional, utilizando um grupo protetor tal como Fmoc, e um C-terminal carboxila reativo, e pode assim ser empregado nas metodologias de síntese de peptídeo convencionais, ficando entendido que se o substituto de aminoácido estiver na posição C-terminal do construto, 15 outro que não o terminal carboxila pode ser empregado em tal substituto. Assim, numa concretização preferida, a invenção provê construtos preparados sinteticamente, sintetizados utilizando metodologias de síntese de peptídeos modificadas conforme apropriado, e compreendendo uma pluralidade de resíduos aminoácido e pelo menos um substituto de aminoácido constrito no anel. Numa concretização preferida, o construto inclui ainda pelo menos um grupo protético.

Grupos protéticos preferidos incluem grupos poliméricoscompreendendo unidades de repetição que incluem um oumais átomos de carbono e hidrogênio e, opcionalmente, outros átomos, inclusive oxigênio. Tais grupos poliméricos são preferivelmente polímeros solúveis em água, e são preferivelmente poli(óxido de alquileno), poli(vinil pirrolidona), álcool polivinílico,polioxazolina ou poli(acriloilmorfolina). Um poli(óxido de alquileno) preferido é o poli(etileno glicol) (PEG), opcionalmente derivatizado com um grupo ligante. Em um aspecto, a invenção provê um construto com umaseqüência de aminoácido que é um homólogo de um peptídeonatriurético conhecido, tal como ANP ou BNP, ou que é um homólogo de qualquer variante peptídica conhecida de umpeptídeo natriurético, onde o construto inclui pelo menos um substituto de aminoácido de fórmula I ou II. A seqüência de aminoácido correspondente não compreendendo um substituto de aminoácido pode ser idêntica a um peptídeo natriurético conhecido ou a uma variante peptídica conhecida, ou pode ser homóloga aos mesmos, tal como uma seqüência de aminoácido correspondente que é pelo menos 60% homóloga, ou mais preferivelmente 80% homóloga. Conforme aqui utilizado, a expressão "seqüência de aminoácido correspondente não compreendendo um substituto de aminoácido" significa uma seqüência de aminoácido, incluindo uma seqüência de aminoácido conhecida, que se liga a um receptor para um peptídeo natriurético, e que não inclui um substituto. Tal seqüência de aminoácido conhecida é idêntica ao construto se a seqüência de aminoácido for a mesma, exceto para a substituição com ou adição de um ou mais substitutos de aminoácido. De forma similar, a homologia é determinada por referência para identificar a seqüência de aminoácido conhecida em relação ao construto, exceto para a substituição com ou adição de um ou mais substitutos de aminoácido.

Em outro aspecto, a invenção provê um construto que é modelado num peptídeo conhecido que se liga a um receptor para um peptídeo natriurético, mas que inclui um ou mais substitutos de aminoácido, tais substitutos sendo ou substituídos com um ou mais resíduos aminoácido contidos no peptídeo conhecido, ou sendo adicionais à seqüência compreendendo o peptídeo conhecido. O peptídeo conhecido pode ser qualquer peptídeo natriurético conhecido noestado da técnica, incluindo, porém não se restringindo aos descritos em qualquer publicação, patente, pedido ou referência aqui citados, inclusive, porém não restritos aos peptídeos natriuréticos descritos nas patentes americanas Nos. 4,496,544;4,609,725; 4,656,158; 4,673,732 ; 4,716,147 ; 4,757,048; 4,764,504; 4,804,650; 4,816,443 ;4,824,937; 4,861,755; 4,904,763;184 , 935,492; 4 ,952, 561; 5,047,397; 5,057,495;

5, 057,603;5,091,366; 5,095,004; 5,106,834;

5, 114 , 923;5,159,061; 5,2 04,32 8; 5,212,286;

5,352,587;5,376,635; 5,418,219; 5,665,704;

5, 846, 932;5,583,108; 5,965,533; 6,028,055;

6,083,982;6,124,430; 6,150,402; 6,407,211; 6,525,022; 6,586,396 or 6,818,619; nas Publicações de pedido de patente americana

04/00 02458; 2 0 04/0063 63 0; 2 0 04/007753 7; 2 005/01132 86; 10 2005/0176641; ou 2006/0030004; ou nas diversas patentes e pedidos de patente não americanos, inclusive WO 85/04870; WO 85/04872; WO 88/03537; WO 88/06596; WO 89/10935; WO 89/05654; WO 90/01940; WO 90/14362; WO 92/06998; WO 95/13296; WO 99/08510; WO 99/12576; WO 01/016295; WO 15 2004/047871; WO 2005/072055; EPO 0 291 999; EPO 0 323 740; EPO 0 341 603; EPO 0 350 318; EPO 0 356 124; EPO 0 385 476; EPO 0 497 368; or EPO 0 542 863. Em um aspecto, o peptídeo conhecido é um peptídeo ou homólogo do mesmo descritos nas patentes americanas 4,656,158,4,824,937, 20 4,935,492, 5,159,061, 5,204,328,5,376,635, 5,665,704, 5,846,932, 6,028,055,6,407,211, 6,525,022, 6,586,396, ou 6,818,619, Publicações de pedido de patente americana Nos.2004/0002458, 2004/0063630, ou 2005/0176641, ou Publicações de pedido de patente internacional WO 2004/047871 ou WO 2005/072055. Os ensinamentos de cada uma das patentes e pedidos de patentes acima citados são incorporados por referência em sua totalidade. Em uma concretização especialmente preferida, a invenção provê um construto, compreendendo uma seqüência de 3 0 aminoácido que se liga a um receptor de peptídeo natriurético, onde um ou mais resíduos em tal seqüência de aminoácido que se liga a um receptor de peptídeo natriurético é substituído com um substituto de aminoácido de fórmula I. Em um aspecto, a seqüência de 35 aminoácido que se liga a um receptor de peptídeo natriurético é, antes da substituição, H-Met-cyclo(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2(SEQ ID NO:1).

Em outro aspecto ainda, a invenção provê um construto que se liga a um receptor para um peptídeo natriurético, incluindo um receptor para ANP ou BNP, e que inclui pelo 5 menos um substituto de aminoácido de fórmula I ou II, cujo construto, porém, não é homólogo a nenhum peptídeo conhecido que se ligue a um receptor para um peptídeo natriurético.

Em uma concretização a invenção provê um construto cíclico de fórmula III:

<formula>formula see original document page 20</formula>

aminoácido ou um aminoácido a., α-di-substituído derivadoisômero de um α-aminoácido ou ^-aminoácido incluindo ou derivado de Nle, Ala, Leu, Ile, Vai, Arg, Phe, Lys, Tyr, Asp, Nva, Met, Met (0) , ou Met(O2), ou um Nle, Ala, Leu, lie, Vai, Arg, Phe, Lys, Tyr, Asp, Nva, Met, Met (O) , ou Met(O2)fOu um aminoácido a,α-di-substituído derivado de Nle, Ala, Leu, Ile, Vai, Arg, Phe, Lys, Tyr, Asp, Nva, Met, Met (0) , ou Met(O2), ou um Nle, Ala, Leu, lie, Vai, Arg, Phe, Lys, Tyr, Asp, Nva, Met, Met (0) , ou Met(O2), incluindo todas as configurações (R) ou (S) de aminoácidos a, ce-di-substituídos, onde os substituintes são diferentes, ou Aaa1 é um acila compreendendo um alquila linear C2 a C18, um alquila ramificado C3 a C17, um alquenila ou alquinila linear C2 a C8i ou um alquenila ou alquinila ramificado C3 a C18, ou Aaa1 é um substituto de aminoácido da estrutura:onde a linha tracejada indica uma ligação peptídica; R e R'são independentemente H, uma cadeia alifática Ci a C6 linear ou ramificada, -(CH2)y-S-CH3, - (CH2) y-S (=0) -CH3, -(CH2)y-S(O2)-CH3, uma ligação e um anel de ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano ou ciclohexano, ou uma cadeia alifática C1 a C3 e um anel de ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano ou ciclohexano; χ é 1 ou 2; Y é CH2 ou C=O; W é CH2, NH OU NR'"; Z é H OU CH3; Q é -H, -(CH2)m-N(V3)(V4), -(CH2)m-CH3, -(CH2)m-O(V3), -(CH2)m-Ci=O)-(v3), - (CH2)m-C (=0) -0- (V3) , -(CH2)m-S(V3),

-C (=0) - (CH2)m-CH3, -C (=0) - (CH2)m-N(V3) (v4) ,

-C(=0) - (CH2)m-Ci=O) - (V3) , -C (=0) - (CH2)m-O(V3) , ou C (=0) - (CH2) m-S (v3) ; R'" é um acila, uma cadeia de alquila Ci a Ci7 linear ou ramificado, uma cadeia de alquil acila C2 a C19 linear ou ramificado, um ômega amino alifático Ci a C17 linear ou ramificado, ou um acila ômega amino alifático C1 to C17 linear ou ramificado; η é 0, 1 ou 2; m é 0 a 17; y é de 1 a 5; V3 e V4 são, cada qual, independentemente H, uma cadeia de alquila C1 a C17 linear ou ramificado ou uma cadeia de alquil acila C2 a C19 linear ou ramificado, contanto que, se um de v3 ou v4 for uma cadeia de alquil acila, então o outro de v3 e V4 é H; e os átomos de carbono marcados com asterisco podem ter qualquer configuração estereoquímica; Aaa2 e Aaa13 são iguais ou diferentes e são, cada qual, resíduos aminoácido de L- ou D-isômero formando uma ponte cíclica através das cadeias laterais de cada de Aaa2 e Aaa13, onde o grupo ligante da ponte cíclica é -S-S-, -S-CH2-S-, -S-CH2-, -CH2-S-, -C(=0)-NH-, -NH-C(=0)-, -CH2-NH-, -NH-CH2-, -CH2-S(O)n- onde η é 1 ou 2, -S(O)n-CH2-onde η é 1 ou 2, -CH2-CH2-, -CH=CH- (E ou Ζ) , -C=C-, -C(=0)-0-, -0-C(=0)-, -C (=0) -CH2-, -CH2-C(=0)-, -0-C(=0)-NH-, -NH-C(=0)-0-, ou -NH-C(=0)-NH-;

Aaa3 é um L- ou D-isômero de um α-aminoácido ou β-aminoácido, inclusive ou derivado de His, Ala, Ser, Thr, Lys, HLys, Orn, Cys, HCys, Dap, ou Dab, ou um aminoácido a, α-di-substituído derivado de His, Ala, Ser, Thr, Lys,HLys, Orn, Cys, HCys, Dap, ou Dab7 inclusive todas as configurações (R) ou (S) de aminoácidos a, a-di-substituídos onde os substituintes são diferentes, ou onde R e R' são independentemente H ou uma porção de cadeia lateral de aminioácido deHis, Ala, Ser, Thr, Lys, HLys, Orn, Cys, HCys, Dap, ou Dab ou um derivado de uma porção de cadeia lateral de aminoácido de His, Ala, Ser, Thr, Lys, HLys, Orn, Cys, HCys, Dap, ou Dab; χ é 1 ou 2; Y é CH2 ou C=O; W é CH2, NH ou NR'"; Z é H ou CH3; R'" é um acila, uma cadeia de alquila C1 a C17 linear ou ramificado, uma cadeia de alquil acila C2 a C19 linear ou ramificado, um ômega amino alifático C1 a C17 linear ou ramificado; ou um acila ômega amino alifático C1 a C17 linear ou ramificado; e η é O, 1 ou 2 ;

Aaa4 é um L- ou D-isômero de um α-aminoácido ou β-aminoácido incluindo ou derivado de Phe, HPhe ou Pgl, ou Tyr, Leu, lie, Vai, Ala, Nle, Nva ou Tle substituído ou não substituído, ou um aminoácido a,a-di-substituído derivado de Phe, HPhe ou Pgl, ou Tyr, Leu, Ile, Vai, Ala, Nle, Nva ou Tle substituído ou não substituído, inclusive todas as configurações (R) ou (S) de aminoácidos a;,Q!-di-substituídos onde os substituintes são diferentes, ou Aaa4 é um substituto de aminoácido como para Aaa3 onde R e R' são independentemente H ou uma porção de cadeia lateral de aminoácido de Phe, HPhe ou Pgl, ou Tyr, Leu, Ile, Vai, Ala, Nle, Nva ou Tle substituído ou não substituído ou um derivado de uma porção de cadeia lateral de aminoácido de Phe, HPhe ou Pgl, ou Tyr, Leu, lie, Vai, Ala, Nle, Nva ou Tle substituído ou não substituído;

Aaa5 é Gly, Sar, um L- ou D-isômero de um α-aminoácido ou

Aaa3 é um substituto de aminoácido da estrutura:

<formula>formula see original document page 22</formula>jS-aminoácido inclusive ou derivado de Ala, ou Aib, que é o derivado de aminoácido a,a-di-substituído derivado de Ala, ou Aaa5 é um substituto de aminoácido como para Aaa3 onde ReR' são independentemente H ou -CH3;

Aaa6 é Gly, Sar, um L- ou D-isômero de um α-aminoácido ou /3-aminoácido inclusive ou derivado de Ala, ou Aib, ou Aaa6 é substituto de aminoácido como para Aaa3 onde R e R' são independentemente H ou -CH3;

Aaa7 é um L- ou D-isômero de um ce-aminoácido ou β-aminoácido inclusive ou derivado de Arg, His, Ala, Ser, HSer, Thr, Lys, HLys, Orn, Cys, HCys, Cit, Abu, Dap, ou Dab, ou um aminoácido cx, α-di-substituído derivado de Arg, His, Ala, Ser, HSer, Thr, Lys, HLys, Orn, Cys, HCys, Cit, Abu, Dap, ou Dab, inclusive todas as configurações (R) ou (S) de aminoácidos a, α-di-substituídos onde os substituintes são diferentes, ou Aaa7 é um substituto de aminoácido como para Aaa3 onde R e R' são independentemente H ou uma porção de cadeia lateral de aminoácido de Arg, His, Ala, Ser, HSer, Thr, Lys, HLys, Orn, Cys, HCys, Abu, Dap, ou Dab ou um derivado de uma porção de cadeia lateral de aminoácido de Arg, His, Ala, Ser, HSer, Thr, Lys, HLys, Orn, Cys, HCys, Abu, Dap, ou Dab;

Aaa8 é Gly, um L- ou D-isômero de um a-aminoácido ou β-aminoácido inclusive ou derivado de Nle, lie, Leu, Vai, Phe, Ala, Nva, Met (O), Met(O2), ou Tle, ou um aminoácido o;, oí-di-substituído derivado de Nle, lie, Leu, Vai, Phe, Ala, Nva, Met (O), Met(O2), ou Tle, inclusive todas as configurações (R) ou (S) de aminoácidos oí, a-di-substituídos onde os substituintes são diferentes, ou Aaa8 é um substituto de aminoácido como para Aaa3 onde R e R' são independentemente H ou uma porção de cadeia lateral de aminoácido de Nle, lie, Leu, Vai, Phe, Ala, Nva, Met (O), Met(O2), ou Tle, ou um derivado de uma porção de cadeia lateral de aminoácido de Nle, lie, Leu, Vai, Phe, Ala, Nva, Met(0), Met(O2), ou Tle; Aaa9 é um L- ou D-isômero de um cx-aminoácido ou β-aminoácido inclusive ou derivado de Asp, Glu, His, Ala, Ser, Thr, Lys, HLys, Cys, HCys, Met (O) , Met(O2), Orn, Dap, ou Dab, ou um aminoácido oí, α-di-substituído derivado de Asp, Glu, His, Ala, Ser, Thr, Lys, HLys, Cys, HCys, Met(O), Met(O2), Orn, Dap, ou Dab, inclusive todas as configurações (R) ou (S) de aminoácidos a,a:-di-substituídos onde os substituintes são diferentes, ou Aaa9 é um substituto de aminoácido como para Aaa3 onde R e R' são independentemente H ou uma porção de cadeia lateral de aminoácido de Asp, Glu, His, Ala, Ser, Thr, Lys, HLys, Cys, HCys, Met (O), Met(O2), Orn, Dap, ou Dab ou um derivado de uma porção de cadeia lateral de aminoácido de Asp, Glu, His, Ala, Ser, Thr, Lys, HLys, Cys, HCys, Met (O), Met(O2), Orn, Dap, ou Dab; Aaa10 é um L- ou D-isômero de um α-aminoácido ou β-aminoácido inclusive ou derivado de Arg, His, Ala, Ser, Thr, Lys, HLys, Cys, HCys, Cit, Met(O), Orn, Dap, ou Dab, ou um aminoácido α,α-di-substituído derivado de Arg, His, Ala, Ser, Thr, Lys, HLys, Cys, HCys, Met(O), Orn, Dap, ou Dab, inclusive todas as configurações (R) ou (S) de aminoácidos o;, α-di-substituídos onde os substituintes são diferentes, ou Aaa10 é um substituto de aminoácido como para Aaa3 onde R e R' são independentemente H ou uma porção de cadeia lateral de aminoácido de Arg, His, Ala, Ser, Thr, Lys, HLys, Cys, HCys, Cit, Met(O), Orn, Dap, ou Dab ou um derivado de uma porção de cadeia lateral de aminoácido de Arg, His, Ala, Ser, Thr, Lys, HLys, Cys, HCys, Met(O), Orn, Dap, ou Dab;

Aaa11 é Gly ou um D- ou L-isômero de um α-aminoácido ou -aminoácido inclusive ou derivado de Nle, Ile, Leu, Vai, Phe, Ala, Nva, Cys, HCys, Abu ou Tle, ou um aminoácido o;, a-di - substituído derivado de Nle, lie, Leu, Vai, Phe, Ala, Nva, Cys, HCys, Abu ou Tle, inclusive todas as configurações (R) ou (S) de aminoácidos a, a-di-substituídos, onde os substituintes são diferentes, ou Aaa11 é um substituto de aminoácido como para Aaa3 onde R e R' são independentemente H ou uma porção de cadeialateral de aminoácido de Nle, lie, Leu, Vai, Phe, Ala, Nva, Cys, HCys, Abu ou Tle ou um derivado de uma porção de cadeia lateral de aminoácido de Nle, Ile, Leu, Vai, Phe, Ala, Nva, Cys, HCys, Abu ou Tle;

Aaa12 é Gly, um L- ou D-isômero de um α-aminoácido ou β-aminoácido inclusive ou derivado de Ser, Nle, lie, Leu, Vai, Phe, Ala, Nva, Arg, Lys, Orn, Cys, HCys, Abu ou Tle, ou um aminoácido a,α-di-substituído derivado de Ser, Nle, lie, Leu, Vai, Phe, Ala, Nva, Arg, Lys, Orn, Cys, HCys, Abu ou Tle, inclusive todas as configurações (R) ou (S) de aminoácidos a,α-di-substituídos, onde os substituintes são diferentes, ou Aaa12 é um substituto de aminoácido como para Aaa3 onde R e R' são independentemente H ou uma porção de cadeia lateral de aminoácido de Ser, Nle, lie, Leu, Vai, Phe, Ala, Nva, Arg, Lys, Orn, Cys, HCys, Abu ou Tle ou um derivado de uma porção de cadeia lateral de aminoácido de Ser, Nle, Ile, Leu, Vai, Phe, Ala, Nva, Arg, Lys, Orn, Cys, HCys, Abu ou Tle;

Aaa14 é um L- ou D-isômero de um α-aminoácido ou β-aminoácido inclusive ou derivado de Phe, HPhe ou Pgl, ou Tyr, Leu, lie, Vai, Ala, Lys, Orn, Nle, Nva ou Tle substituídos ou não substituídos, ou um aminoácido a, Oi-di - substituído derivado de Phe, HPhe ou Pgl, ou Tyr, Leu, lie, Vai, Ala, Lys, Orn, Nle, Nva ou Tle substituídos ou não substituídos, inclusive todas as configurações (R) ou (S) de aminoácidos a,Q!-di-substituídos onde os substituintes são diferentes, ou Aaa14 é um substituto de aminoácido da estrutura defórmula II como para Aaa3 onde R e R' sãoindependentemente H ou uma porção de cadeia lateral de aminoácido de Phe, HPhe ou Pgl, ou Tyr, Leu, lie, Vai, Ala, Lys, Orn, Nle, Nva ou Tle substituído ou não substituído ou um derivado de uma porção de cadeia lateral de aminoácido de Phe, HPhe ou Pgl, ou Tyr, Leu, Ile, Vai, Ala, Lys, Orn, Nle, Nva ou Tle substituídos ou não substituídos;Aaa15 é um D- ou L-isômero de um α-aminoácido ou β-aminoácido inclusive ou derivado de Ala, Arg, Orn, Lys, Dap, Dab, HArg, ou HLys, ou um aminoácido «,a-di-substituído derivado de Ala, Arg, Orn, Lys, Dap, Dab, 5 HArg, ou HLys, inclusive todas as configurações (R) ou (S) de aminoácidos a,α-di-substituídos, onde os substituintes são diferentes,ou Aaa15 é um substituto de aminoácido com a seguinte estrutura:

<formula>formula see original document page 26</formula>

onde a linha tracejada indica uma ligação peptídica; pelo 10 menos um de R e R' é (CH2)y- R" e se um, o restante de R e R' é H, onde R" é: -NH2,

-NH-C(=NH)-NH2, -NH- (CH2)y-NH2, -NH-C(=0)-NH2, -C (=0) -NH2, -C (=0) -NH-CH3, -C (=0) -NH- (CH2)y-NH2, -NH-C(=NH)-NH-Me, -NH-C(=NH)-NH-Et, -NH-C(=NH)-NH-Pr, -NH-C(=NH)-NH-Pr-i, -NH-C (=0) -CH3, -NH-C (=0) -CH2-CH3, 25 -NH-C (=0)-CH- (CH3) 2, -NH-C (=0) -O-CH3, -NH-C (=0) -O-CH2-CH3, -NH-C (=0) -0-C- (CH3) 3, -NH-C(=0)-NH-CH3, 3 0 -NH-C (=N-C (=0) -0-C- (CH3) 3) -NH-C (=0) -0-C- (CH3) 3, -N (C (=0) -0-C- (CH3)3) -C (=NH) -NH-C (=0) -0-C- (CH3)3,<formula>formula see original document page 27</formula><formula>formula see original document page 28</formula>

χ é 1 ou 2; Y é CH2 ou C=O; W é CH2, NH ou NR' " ; Z é H ou CH3; J é -H, -(CH2)m-OHi -C (=0)-CH2) m-0H,-C (=0) -CH2) O1-N(V1) (V2) , -C(=0)-O-(CH2)m-CH3, -O-(CH2)m-CH3, -O-(CH2)m-N(V1)(V2), -O-(CH2)m-OH, -C (=0)-NH-(CH2) m-CH3, 5-C (=0) -NH-(CH2)m-N(V1) (V2) , -C (=0)-NH-(CH2)m-S (Vi),-C (=0) -N- ( (CH2)m-N(V1) (V2)) 2, -C(=0)-NH-CH(-C(=0)-0H)-(CH2)m-N(V1) (V2) ,-C (=0) -NH- (CH2)m-NH-C (=0) -CH(Niv1) (v2) ) ( (CH2)m-N(V1) (v2) ), -C(=0) -NH-CH (-C (=0) -N(V1) (v2) ) - (CH2)m-N(V1) (v2) ,um ômega amino alifático, grupo arila ou aralquila terminal, qualquer α-aminoácido simples natural ou não natural, β-aminoácido ou aminoácido a, oí-di-substituí do em combinação com um dos grupos anteriormente citados definindo J, ou qualquer oí-aminoácido simples natural ou não natural, β-aminoácido ou aminoácido a,α-di-substituído, inclusive todas as configurações (R) e (S) de qualquer um dos anteriormente citados; R'" é um acila, uma cadeia de alquila C1 a C17 linear ou ramificado, uma cadeia de alquil acila C2 a C19 linear ou ramificado, um ômega amino alifático C1 a C17 linear ou ramificado, ou um acila ômegaamino alifático Ci a Ci7 linear ou ramificado; V1 e V2 são cada qual independentemente H ou uma cadeia de alquila Ci to Ci7 linear ou ramificado; η é 0, 1 ou 2; m é de 0 a 17; y é de 1 a 5; e os átomos de carbono marcados com asterisco podem ter qualquer configuração estereoquímica; contanto que pelo menos um de Aaa1, Aaa3 a Aaa12, Aaa14 ou Aaa15 seja um substituto de aminoácido.

Uma concretização relativa de fórmula III prove um construto onde um ou mais de Aaa1, Aaa3 a Aaa12, Aaa14 ou Aaa15 é um substituto de aminoácido conforme acima definido, e quando um grupo protético, conforme adiante definido, estiver ligado a um grupo reativo de uma cadeia lateral de um resíduo aminoácido em um ou mais de Aaa1, Aaa3 a Aaa12, Aaa14 ou Aaa15 , a um grupo R e R'reativo de um substituto de aminoácido em Aaa3 a Aaa12 ou Aaa14, diretamente ou através de um grupo Q ao amina terminal de um substituto de aminoácido em Aaa1, a um carboxila terminal reativo de um substituto de aminoácido em Aaa15, ou a um grupo reativo formando uma parte de J de um substituto de aminoácido em Aaa15' 0 grupo reativo ao qual o um ou mais grupos protéticos são covalentemente ligados pode ser uma amina primária, uma amina secundária, um grupo carboxila, um grupo tiol ou um grupo hidroxila. Em um aspecto, o grupo protético pode ser covalentemente ligado a uma amina reativa na posição Aaa1, Aaa3, Aaa7, Aaa10, Aaa12 ou Aaa15 ,ou uma combinação dos anteriormente citados. Em outro aspecto, o grupo protético pode ser covalentemente ligado a um carboxila reativo na posição Aaa9 ou Aaa15, ou ambas. Em outro aspecto, o grupo protético pode ser covalentemente ligado a um tiol reativo na posição Aaa3, Aaa7, Aaa9, Aaa10, Aaa11 ou Aaa12, ou uma combinação dos anteriormente citados. Num aspecto preferido do construto de fórmula III, um, dois ou três de Aaa1 a Aaa15 (excluindo-se Aaa2 e Aaa13) são um substituto de aminoácido de uma das fórmulas anteriormente mencionadas. Num primeiro aspecto especialmente preferido, um de Aaa1, Aaa5 e Aaa15 é umsubstituto de aminoácido. Num segundo aspecto especialmente preferido, dois de Aaa1, Aaa5 ou Aaa15 são substitutos de aminoácido. Num terceiro aspecto especialmente preferido, cada um de Aaa1, Aaa5 e Aaa15 são substitutos de aminoácido. Em outro aspecto

especialmente preferido, um, dois ou três de Aaa1, Aaa5 e Aaa15 são substitutos de aminoácido, e o construto é um construto cíclico formado pela formação de ligação dissulfeto através das cadeias laterais de Aaa2 e Aaa15. Em outro aspecto especialmente preferido, quando dois ou mais de Aaa1 a Aaa15 são substitutos de aminoácido, os substitutos de aminoácido não são contíguos, ou seja, cada substituto de aminoácido é separado de outro substituto de aminoácido por pelo menos um resíduo aminoácido sendo interposto entre eles na seqüência primária.

Em outra concretização preferida ainda, no construto de fórmula III pelo menos um de Aaa3, Aaa5, Aaa6, Aaa7, Aaa9 ou Aaa12 é um L- ou D-isômero de Ala, preferivelmente um L-isômero de Ala.

Em outra concretização ainda, a invenção provê um construto de fórmula III, compreendendo ainda um ou mais ligações não peptídicas. Ligações não peptídicas podem ser empregdas para reduzir a suscetibilidade de um construto da invenção de se degradar, tal como melhorando a estabilidade in vivo de construtos em relação a proteases do tipo trípticas, através da substituição da ligação peptídica nativa antes de cada resíduo Lys ou Arg com uma ligação não-peptídica, tal como um isóstero de uma amida, uma amida substituída ou uma ligação peptidomimética. Em uma concretização preferida, as ligações peptídicas nativas são substituídas com ligações peptídicas com polaridade invertida. Em geral,qualquer ligação não-peptídica pode ser empregada, e pode ser 35 utilizada entre quaisquer dois resíduos. Uma ligação não-peptídica inclui ligações nas quais o átomo de carbono que participa da ligação entre dois resíduos é reduzido30

de um carbono de carbonila para um carbono de metileno, tal como uma ligação não-peptídica -CH2-NH- ou seu isóstero -NH-CH2- ou o uso de outras ligações tais como -CH2-S-, -CH2-O- ou -C(=0)-CH2- ou um isóstero de qualquer 5 um dos anteriormente citados, ou -CH2-CH2- ou -CH=CH-. Em geral, ligações não-peptídicas incluem uma ligação imino, éster, hidrazina, semicarbazida, oxima ou azo. Os construtos definidos acima podem incluir um ou mais grupos protéticos. Grupos protéticos podem ser empregados 10 para modular o tempo de permanência em circulação, a biodisponibilidade, imunogenicidade de construtos, ou similares. Em geral, grupos protéticos "modulam" aumentando o tempo de permanência, biodisponibilidade ou similares, conforme o caso, porém grupos protéticos podem 15 opcionalmente reduzir o tempo de permanência, biodisponibilidade ou similar. Um "grupo protético" inclui assim qualquer composto conjugado, tal como através de uma ligação covalente, a um construto de qualquer fórmula, com a finalidade de melhorar as 2 0 propriedades farmacocinéticas ou farmacodinâmicas do construto. Grupos protéticos preferidos incluem grupos poliméricos, compreendendo unidades de repetição que, por sua vez, compreendem um ou mais átomos de carbono e hidrogênio e, opcionalmente, outros átomos, inclusive 25 átomos de oxigênio. Tais grupos poliméricos são preferivelmente polímeros solúveis em água, e são preferivelmente poli(oxido de alquileno), poli(vinil pirrolidona), álcool polivinílico, polioxazolina ou poli(acriloilmorfolina). Um poli(óxido de alquileno) 30 preferido é o poli (etileno glicol) (PEG) . Além de PEG, outros polímeros de poli(óxido de alquileno) podem ser empregados, tais como poli(propileno glicol) e poli(butileno glicol).

Em uma concretização, o grupo protético é um ou mais polímeros de PEG covalentemente ligado a um grupo reativo do construto. 0 polímero de PEG, ou outro grupo protético, pode ser covalentemente ligado a um gruporeativo na cadeia lateral de um ou mais resíduos aminoácido, ou pode ser covalentemente ligado a um grupo reativo num substituto de aminoácido. Tais grupos reativos de um substituto de aminoácido podem incluir um grupo covalentemente ligado, diretamente ou através de um ou mais intermediários, a Q ou J, ou podem incluir um grupo reativo formando parte de R ou r'.

Se PEG for empregado como grupo protético, o polímero de PEG pode ter um peso molecular de cerca de 200 MW a cerca de 50000 MW. 0 polímero de PEG pode ser linear e, se linear, pode ser monofuncional, com um grupo reativo numa extremidade e um grupo não reativo na outra extremidade, homobifuncional, com o mesmo grupo reativo em cada extremidade, ou heterobifuncional, com um grupo reativo diferente em cada extremidade. Alternativamente, o polímero de PEG pode ser ramificado, tendo geralmente uma configuração em forma de "Y", multiramifiçado, tal como com duas, três, quatro ou oito ramificações, ou outras configurações conhecidas no estado da técnica. 0 polímero de PEG possui preferivelmente pelo menos um grupo reativo derivatizado para ligação a um ou mais grupos definidos no construto de qualquer uma das fórmulas de III a XIII, preferivelmente por meio de uma ligação covalente. 0 grupo reativo derivatizado pode ligar-se,por exemplo, a um grupo amina, hidroxila, tiol oucarboxila num construto, incluindo um grupo terminal de um resíduo aminoácido, numa cadeia lateral de um resíduo aminoácido, num grupo Q de um substituto, num grupo J de um substituto, ou um grupo R ou R' de um substituto.

0 polímero de PEG pref erivelmente possui, em umaextremidade, um grupo de capeamento terminal, tal como um hidroxila, alcoxi, alcoxi substituído, alquenoxi, alquenoxi substituído, alquinoxi, alquinoxi substituído, ariloxi ou ariloxi substituído. 0 polímero de PEG preferivelmente possui ainda, pelo menos uma outra extremidade, um grupo reativo derivatizado. Em uma concretização, o polímero de PEG é um poliéter linear ouramificado com um grupo hidroxila terminal, tal como um monometoxi PEG, que é derivatizado com um grupo ligante, tal como uma amina, maleimida ou ácido carboxílico. Os grupos reativos disponíveis do construto determinam o grupo ligante derivatizado empregado no polímero de PEG. Assim, em uma concretização, a amina N-terminal do construto é empregada, utilizando um PEG derivatizado com um ácido carboxílico. Em outra concretização, a amina C-terminal do construto é empregada, novamente utilizando um PEG derivatizado com ácido carboxílico. Em outra concretização ainda, se um resíduo Lys ou homólogo do mesmo, estiver presente no construto, pode ser empregado ou o grupo α-amino ou o grupo ε- amino do mesmo, novamente utilizando um PEG derivatizado com ácido carboxílico. PEG derivatizado com maleimida pode ser empregado ou com um grupo tiol rfeativ o ou com um grupo hidroxila no construto. De forma similar, PEG derivatizado com amina pode ser empregado com um grupo carboxila reativo em qualquer grupo terminal ou cadeia lateral de um resíduo aminoácido, num grupo Q de um substituto, num grupo J de um substituo, ou num grupo R ou R' de um substituto.

Assim, em um aspecto, PEG é ativado com um ou mais grupos eletrofílicos, e pode ser empregado para acoplamento agrupos amino do construto, incluindo o acoplamento a umgrupo ε-amino de uma cadeia lateral ou uma amina N-terminal ou C-terminal. Grupos reativos eletrofílicos representativos incluem succinimidil α-metilbutanoato e outros ésteres de ácido α-metilbutírico, conforme descrito nas patentes americanas 5.672.662 e 6.737.505, podendo ser usados com proteínas, conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente Americana 2004/0235734. Alternativamente, propionato de succinimidila pode ser empregado como grupo reativo, conforme descrito na patente americana 5.567.662, ou N-hidroxisuccinimida podeser empregada com um PEG ramificado, conforme descrito na patente americana 5.932.462. Os ensinamentos de cada umadas patentes e pedidos de patente anteriormente citados são incorporados por referência, como se citados na íntegra.

Em outro aspecto, os polímeros de PEG são providos com um ou mais grupos aldeído reativos, e empregados para acoplamento a uma amina primária terminal, tal como amina N-terminal ou C-terminal. Em outro aspecto, polímeros de PEG são providos com um ou mais grupos tiol-reativos, tal como um grupo maleimida, orto-piridisulfeto ou tiol, e são empregados para acoplamento a um tiol reativo no construto de qualquer uma das fórmulas de III a XIII, tal como um tiol reativo numa cadeia lateral de cisteína ou um tiol reativo num grupo Q de um construto. Em um aspecto, qualquer um dos métodos, conjugados ou esquemas descritos na Publicação de Patente Internacional No. WO 2004/047871, ou qualquer referência ali citada, podem ser empregados com os construtos da presente invenção. O ensinamento dos pedidos de patente anteriormente citados é incorporado por referência como se citados na íntegra.

Em geral, alguma forma de modificação química pode ser empregada para preparar um derivado de PEG reativo com um grupo reativo. O grupo reativo pode ser um carbonato ativo, um éster ativo, um aldeído, um tresilato. Em parte, o grupo reativo do PEG determina o grupo ou a porção de cadeia lateral de aminoácido à/ao qual o derivado de PEG é ligado. Em geral, o tratamento com PEG sítio-específico é preferido, em parte porque o construto resultante é homogêneo, minimizando a perda de atividade biológica e reduzindo a imunogenicidade.

Em uma concretização, o PEG possui um peso molecular de cerca de 200 MW a cerca de 50.000 MW, mais preferivelmente de cerca de 2.000 MW a cerca de 20.000 MW. Em outra concretização, monometoxi PEG, tal como da fórmula CH3-O(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-OH ou CH3-O(CH2-CH2-O)n-H, onde η é qualquer número inteiro de 2 a cerca de 1200, é empregado, preferivelmente derivatizado com um grupoligante amina, maleimida ou ácido carboxílico. Em outra concretização, o grupo protético, tal como PEG, é conjugado a um construto por meio de um ligante enzimaticamente lábil(instável) conforme descrito em Veronese FM e Pasut G.Pegylation, método bem sucedido para liberação de fármaco. Drug Discovery Today 10:1451-1458 (2005) e os métodos descritos no mesmo são aqui incorporados por referência.

Em outra concretização, o grupo protético empregado é um polímero tendo tanto uma porção lipofílica como uma porção de polímero hidrofílico, conforme descrito nas patentes americanas 5.359.030 e 5.681.811. Numa concretização relativa, o grupo protético empregado é um conjugado de oligômero com um componente hidrofílico, tal como um polímero de PEG e um componente lipofílico, tal como uma cadeia ramificada de ácido graxo ou alquila, ligada por uma ligação hidrolisável, tal como uma ligação éster, conforme descreve a patente americana No. 6.309.633. Em outra concretização relativa, o grupoprotético empregado é um oligômero que incluipoli(propileno glicolO e preferivelmente pelo menos duas subunidades de poli(propileno glicol), conforme descrito na patente americana 6.858.580. Os ensinamentos de cada uma das patentes e pedidos de patentes anteriormente citados são incorporados por referência como se citados na íntegra.

Em outra concretização ainda, os ensinamentos do Pedido de Patente Americana publicado 2004/0203081 são incorporados aqui por referência, inclusiveespecificamente os ensinamentos relacionados com gruposprotéticos, designado em tal pedido como "porções modificadoras", ligadas a diversos compostosnatriuréticos, e estruturas especificamente oligoméricos com uma variedade de extensões e configurações. Numa concretização relacionada, os ensinamentos da Publicação de Patente Internacional WO 2004/047871 são incorporados por referência, inclusive os ensinamentos relacionadoscom "porções modificadoras" ligadas por meio de "sítios de conjugação de porção modificadora" a moléculas natriuréticas que se ligam a NPRA, ficando entendido que métodos similares podem ser empregados com moléculas natriuréticas que se ligam a outros receptores natriuréticos.

Certos termos utilizados em todo relatório e reivindicações são definidos conforme abaixo:o "construto" e "seqüências de resíduo aminoácido" da presente invenção podem ser a). de ocorrência natural; b) produzidos através de síntese química, c) . produzidos através de tecnologia de DNA recombinante, d). produzidos através de fragmentação bioquímica ou enzimática de moléculas maiores, e). produzidos através de métodos resultantes da combinação dos métodos de a) a d) acima relacionados, ou f). produzidos através de quaisquer outros meios para produção de peptídeos ou seqüências de aminoácidos.

Ao empregar a síntese química, um meio preferido deprodução, é possível introduzir diversos aminoácidos que

não ocorrem naturalmente no construto, modificar o N- ou C-terminal, e similares, provendo desta forma estabilidade e formulação melhoradas, resistência à degradação da protease, e similares, e introduzir um ou mais substitutos de aminoácido no construto.

o termo "peptídeo" utilizado em todo o relatório e nas reivindicações pretende incluir qualquer estrutura compreendendo dois ou mais aminoácidos, inclusive modificações químicas e derivados de aminoácidos. Osaminoácidos que formam todo ou uma parte de um peptídeopodem ser aminoácidos de ocorrência natural, estereoisômeros e modificações de tais aminoácidos, aminoácidos não protéicos, aminoácidos pós-translacionalmente modificados, aminoácidos enzimaticamente modificados, e similares. o termo "peptídeo" também inclui dímeros ou multímeros de peptídeos. Um peptídeo "manufaturado" inclui um peptídeoproduzido através de síntese química, tecnologia de DNA recorabinante, fragmentação bioquímica ou enzimática de moléculas maiores, combinações dos anteriormente citados, ou, em geral, fabricados através de qualquer outro método.

O termo "porção de cadeia lateral de aminoácido" utilizado na presente invenção, inclusive conforme utilizado no relatório e nas reivindicações, inclui qualquer cadeia lateral de quaisquer aminoácidos, de acordo com a definição de "aminoácido" aqui citada. Isso, portanto, inclui a porção de cadeia lateral presente em aminoácidos de ocorrência natural. Inclui ainda porções de cadeia lateral em aminoácidos de ocorrência natural modificados, tais como aminoácidos glicosilados. Inclui também porções de cadeia lateral em estereoisômeros e modificações de aminoácidos protéicos de ocorrência natural, aminoácidos não-protéicos, aminoácidos pós-translacionalmente modificados, aminoácidosenzimaticamente sintetizados, aminoácidos derivatizados, construtos ou estruturas criadas para simularaminoácidos, e similares. Por exemplo, a porção de cadeia lateral de qualquer aminoácido aqui descrito está incluída na definição. Um "derivado de uma porção de cadeia lateral de aminoácido", conforme adiante definido, está incluído na definição de uma porção de cadeia lateral de aminoácido.

O "derivado de uma porção de cadeia lateral de aminoácido" é uma modificação ou variação em qualquer porção de cadeia lateral de aminoácido, inclusive uma modificação ou variação numa porção de cadeia lateral deaminoácido de ocorrência natural ou não natural, onde a modificação ou variação inclui: (a) adicionar um ou mais átomos de carbono saturado ou insaturado a uma cadeia de alquila, arila, ou aralquila existente; (b) substituir um carbono na cadeia lateral com outro átomo, preferivelmente oxigênio ou nitrogênio; (c) adicionar um grupo terminal a um átomo de carbono da cadeia lateral,inclusive metila (-CH3), metoxi (-OCH3), nitro (-NO2), hidroxila (-0H), ou ciano (-C=N); (d) para porções de cadeia lateral incluindo um hidroxila, tiol ou grupos amino, adicionar um grupo protetor hidroxi, tiol ou amino adequado; ou(e) para porções de cadeia lateral incluir uma estrutura de anel, adicionar um ou substituintes de anel, inclusive grupos hidroxila, halogênio, alquila ou arila ligados diretamente ou através de uma ligação éter. Para grupos amino, grupos amino protetores adequados 1 incluem, porém não se restringem a Z, Fmoc, Boc, Pbf, Pmc e similares.

Os "aminoácidos" utilizados nas concretizações da presente invenção, e o termo conforme utilizado no relatório e nas reivindicações incluem os aminoácidos protéicos de ocorrência natural conhecidos, que são designados tanto por sua abreviação comum de três letras como pela abreviação de letra única. Vide geralmente Synthetic Peptides: A User's Guide, G. A. Grant, editor, W. H. Freeman & Co., New York (1992), cujos ensinamentos foram aqui incorporados por referência, inclusive o texto e a tabela citada nas páginas de 11 a 24. Um "aminoácido" inclui α-aminoácidos convencionais e ainda β-aminoácidos, aminoácidos a,a-di-substituídos e aminoácidos N-substituídos, onde pelo menos uma cadeia lateral é umaporção de cadeia lateral de aminoácido, conforme aquidefinida. Um "aminoácido" inclui ainda α-aminoácidos de N-alquila, onde o grupo amino N-terminal possui um substituinte alquila C1 a C6 linear ou ramificado. Pode-se assim observar que o termo "aminoácido" incluiestereoisômeros e modificações de aminoácidos protéicosde ocorrência natural, aminoácidos não-protéicos, aminoácidos pós-traslacionalmente modificados,aminoácidos enzimaticamente sintetizados, aminoácidos derivatizados, construtos ou estruturas criadas para simular aminoácidos, e similares. Aminoácidos modificados e incomuns são geralmente descritos em Synthetic Peptides: A User1s Guide, citado acima; Hruby V. J.,Al-obeidi F., Kazmierski W., Biochem. J. 268:249-262 (1990); e Toniolo C., Int. J. Peptide Protein Res. 35:287-300 (1990); cujos ensinamentos foram aqui incorporados por referência. Além disso, as abreviações a seguir, incluindo os aminoácidos e os grupos modificadores e protetores dos mesmos, têm os seguintes significados:

Abu - ácido gama amino butírico

12-Ado - ácido 12-amino dodecanóico

Aib - ácido alfa-aminoisobutírico

6-Ahx - ácido 6-amino hexanóico

Amc - ácido 4-(aminometil)-ciclohexano carboxílico

8-Aoc - ácido 8-amino octanóico Bip - bifenilalanina

Boc - t-butoxicarbonila

Bzl - benzila

Bz - benzoíla

Cit - citrulina

Dab - ácido diaminobutírico

Dap - ácido diaminopropiônico

Dip - 3,3-difenilalanina

Disc - ácido 1,3-dihidro-2H-isoindolcarboxíIico Et - etila

Fmoc - fluorenilmetoxicarbonila

Hept - heptanoíIa (CH3- (CH2) 5-C (=0) - )

Hex - hexanoila (CH3-(CH2)4-Ci=O)-)

HArg - homoarginina

HCys - homocisteína HLys - homolisina

HPhe - homofenilalanina

HSer - homoserina Me - metila

Met(O) -sulfóxido de metionina Met(O2) - metionina sulfona 3

Nva - norvalina

Pgl - fenilglicina Pr - propilaPr-i - isopropila Sar - sarcosina Tle - ter-butilamina Z - benziloxicarbonila Na listagem de construtos de acordo com a invenção, resíduos aminoácido convencionais têm seu significado convencional conforme atribuído no capítulo 2400 de Manual of Patent Examining Procedure, 8a edição. Assim, "Nle" é norleucina; "Asp" é ácido aspártico; "His" é histidina; "Arg" é arginina; "Trp" é triptofano; "Lys" é lisina; "Gly" é glicina; "Pro" é prolina; "Tyr" é tirosina, "Ser" é serina e assim por diante. Todos os resíduos estão na configuração de L-isômero, salvo se o D-isômero estiver especificado, como em "D-Ala" para D-alanina.

Um aminoácido simples, incluindo estereoisômeros e modificações de aminoácidos protéicos de ocorrência natural, aminoácidos não-protéicos, aminoácidos pós-translacionalmente modificados, aminoácidos sinteticamente sintetizados, aminoácidos derivatizados, um aminoácido a,a-di-substituído derivado de qualquer um dos anteriormente citados(ou seja, um aminoácido a,a-di-substituído onde pelo menos uma cadeia lateral é igual à do resíduo do qual deriva), um β-aminoácido derivado de qualquer um dos anteriormente citados (ou seja, um β-aminoácido que, exceto pela presença de um β-carbono é igual ao resíduo do qual deriva) e similares, inclusive todos os anteriormente citados, é às vezes designado como "resíduo".

Um "aminoácido a,α-di-substituído" inclui qualquer a-aminoácido que possua um outro substituinte na posição-α, substituinte este que pode ser igual ou diferente da porção de cadeia lateral do α-aminoácido. Substituintes adequados, além da porção de cadeia lateral do a-aminoácido, inclui alquila Ci a C6 linear ou ramificado. Aib é um exemplo de um aminoácido a,a-di-substituído. Embora os aminoácidos a,a-di-substituídos possam serdesignados pelo uso de referências L- e D-isoméricas convencionais, fica entendido que tais referências servem como referência e que, quando os substituintes na posição α forem diferentes, tal aminoácido pode ser reciprocamente designado como aminoácido α,α-di-substituído derivado de L- ou D-isômero, conforme apropriado, de um resíduo com a porção de cadeia lateral de aminoácido designada. Assim ácido (S)-2-amino-2-metil-hexanóico pode ser designado ou como aminoácido α,α-di-substituído derivado de L-Nle ou como aminoácido α,α-di-substituído derivado de D-Ala. Sempre que for provido um aminoácido a,a-di-substituído, entende-se como incluindo todas as configurações (R) e (S) dos mesmos. Um "aminoácido N-substituído" inclui qualquer aminoácido onde uma porção de cadeia lateral de aminoácido é covalentemente ligada ao grupo amino da cadeia principal, onde não existam nenhum substituinte que não H na posição α-carbono. Sarcosina é um exemplo de um aminoácido N-substituído. Para fins de exemplo, sarcosina pode ser designada como um derivado de aminoácido N-substituído de Ala, no qual a porção de cadeia lateral de sarcosina e Ala é a mesma, metila.

O termo "substituto de aminoácido" inclui uma molécula aqui descrita que é mímica de um resíduo, inclusive porém não restrito a moléculas núcleo de piperazina, moléculas núcleo de ceto-piperazina, e moléculas núcleo de diazepina. Salvo se especificado de outra forma, um substituto de aminoácido é entendido como incluindo tanto um grupo carboxila como um grupo amino, e um grupo que corresponde a uma cadeia lateral de aminoácido, ou nocaso de um substituto de aminoácido de glicina, nenhuma cadeia lateral que não hidrogênio. Assim, um substituto de aminoácido inclui uma molécula da fórmula geral de fórmula I ou II citada acima. Um substituto de aminoácido inclui ainda moléculas de qualquer uma das estruturas anteriores, ficando entendido que, por conveniência, tais estruturas são dadas como substituto isolado, nãoincluindo nenhum grupo protetor e não sendo ligadas por uma ou duas ligações peptídicas a um ou dois resíduos aminoácido que faça parte de um construto da invenção:

<formula>formula see original document page 42</formula>

onde R, R', χ e os asteriscos são conforme definidos para o substituto de fórmula I. Um substituto de aminoácido inclui ainda moléculas de qualquer uma das estruturas anteriores, ficando novamente entendido que, por conveniência, tais estruturas são dadas como substituto isolado, não incluindo nenhum grupo protetor e não sendo ligadas por uma ou duas ligações peptídicas a um ou dois resíduos aminoácido que faça parte de um construto da invenção:

<formula>formula see original document page 42</formula>

onde R, R', χ e os asteriscos são conforme definidos para o substituto de fórmula I. Para fins de síntese, o grupo carboxila ou o grupo amino de qualquer substituto de aminoácido é preferivelmente protegido por um grupo protetor, de forma tal que não seja reativo enquanto o grupo protetor estiver presente, e, de forma similar, qualquer grupo reativo que faça parte de R e R' pode ser similarmente protegido através de um grupo protetor. Será apreciado que os substitutos da presente invenção possuem mais de um centro assimético, sendo, portanto, capazes de existir em mais de uma forma estereoisomérica. Alguns dos compostos podem também existir na forma de isômeros ou rotâmeros geométricos. Além disso, alguns compostos da invenção podem também ter quiralidade axial conformacional resultando em atropisômeros. A invenção abrange cada uma dessas formas individualmente e suasmisturas, incluindo os racematos. Em um aspecto, os isômeros substitutos podem ser separadosconvencionalmente através de métodos cromatográficos ou mediante o uso de agente de resolução. Em outro aspecto, isômeros substitutos individuais, ou substitutos enantiomericamente puros, são preparados através de esquemas sintéticos, tais como os aqui descritos ou variantes de tais esquemas, empregando sínteseassimétrica que utiliza intermediários, reagentes ou catalisadores quirais.

0 termo "grupo capeador C-terminal" inclui qualquer grupo terminal ligado através do átomo de carbono de anel terminal ou, se provido, grupo carboxila terminal, do C-terminal de um construto. 0 átomo de carbono de anel terminal ou, se provido, o grupo carboxila terminal, pode fazer parte de um resíduo, ou pode fazer parte de um substituto de aminoácido. Num aspecto preferido, o grupo capeador C-terminal forma uma parte de um substituto de aminoácido que está na posição C-terminal do construto. O grupo capeador C-terminal inclui, porém não se restringe a-(CH2)n-OH, - (CH2)n-Ci=O)-0H, -(CH2)m-OH, - (CH2) n-C (=0) -N(V1) (V2) , - (CH2)n-C (=0) - (CH2)m-N(V1) (v2) ,- (CH2)n-O- (CH2)m-CH3, - (CH2) n-C(=0) -NH- (CH2)m-CH3, - (CH2) n-C(=0) -NH- (CH2)m-N(V1) (v2) ,- (CH2) n-C (=0) -N- ( (CH2)m-N(V1) (v2) ) 2,- (CH2)a-Ci=O) -NH-CH (-C (=0) -0H) - (CH2)m-N(V1) (v2) , -C (=0)-NH-(CH2) m-NH-C(=0)-CH (N(Vi) (v2) ) ((CH2)m-N(V1)(V2)), ou

- (CH2)n-C (=0)-NH-CH(-C (=0)-NH2) - (CH2)m-N(V1) (v2) , inclusive todas as configurações (R) ou (S) dos anteriormente citados, onde V1 e V2 são, cada qual,independentemente H, uma cadeia alquila linear ou ramificada C1 a C17, m é 0 a 17 e η é 0 a 2; ou qualquer ômega amino alifático, arila ou aralquila terminal, incluindo grupos tais como metila, dimetila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, pentila, hexila, alila, metil ciclopropano, hexanoíla,heptanoíla, acetila, propionoíla, butanoíla,

fenilacetila, ciclohexilacetila, naftilacetila cinamoíla, fenila, benzila, benzoíla, 12-Ado, 7'-amino heptanoíla, 6-Ahx, Ame, ou 8-Aoc, ou qualquer α-aminoácido natural ou não natural simples, β-aminoácido ou aminoácido α,α-di-substituído, incluindo todas as configurações (R) ou (S) dos anteriormente citados, opcionalmente em combinação com qualquer um dos grupos capeadores não de aminoácido anteriormente citados. No texto anteriormente citado, fica entendido que, por exemplo,

<formula>formula see original document page 44</formula>

O termo "grupo capeador N-terminal" inclui qualquer grupo terminal ligado através da amina terminal do N-terminal de um construto. A amina terminal pode formar parte de um resíduo, ou pode formar uma parte de um substituto de aminoácido. Num aspecto preferido, o grupo capeador N-terminal forma uma parte de um substituto de aminoácido que se encontra na posição N-terminal do construto. O grupo capeador N-terminal inclui,porém não se restringe a qualquer ômega amino alifático, grupo acila ou arila ou aralquila terminal, incluindo grupos tais como metila, dimetila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, pentila, hexila, alila, metil ciclopropano, hexanoíla, heptanoíla, acetila, propionoíla, butanoíla, fenilacetila, ciclohexilacetila, naftilacetila,cinamoíla, fenila, benzila, benzoíla, 12-Ado, 7'-amino heptanoíla, 6-Ahx, Ame, ou 8-Aoc, ou alternativamente um grupo capeador N-terminal é

-(CH2)m-CH3, -C(=0) - (CH2)m-CH3, -C (=0) - (CH2) m-NH (v3) ,

-C (=0) - (CH2) m-C (=0) -0H, -C (=0) - (CH2)m-C(=0) - (V4) ,

- (CH2) m-C(=0)-0H, - (CH2) m-C(=0) - (V4) , C (=0) - (CH2) m-0 (V3) , -(CH2)m-O(V3), C (=0) - (CH2)m-S(V3) , ou -(CH2)m-S(V3), onde V3é H ou uma cadeia alquila Ci a Ci7 linear ou ramificada e V4 é uma cadeia alquila C1 a Ci7 linear ou ramificada e m é O a 17.

Um anel fenila é "substituído" quando o anel fenila inclui um ou mais substituintes independentemente compreendendo grupos hidroxila, halogênio, alquila ou arila ligados diretamente ou através de uma ligação éter. Quando o anel fenila for substituído desta forma, o resíduo aminoácido pode ser designado como substituído, como em Phe substituído, HPhe substituído ou Pgl substituído.

0 termo "alqueno" inclui hidrocarbonetos insaturados que contém uma ou mais ligações duplas carbono-carbono. Exemplos de grupos alqueno incluem etileno, propeno e similares.

0 termo "alquenila" inclui um radical hidrocarboneto monovalente linear de dois a seis átomos de carbono ou um radical hidrocarboneto monovalente ramificado de três a seis átomos carbono contendo pelo menos uma ligaçãodupla; exemplos dos mesmos incluem etenila, 2-propenila esimilares.

Os grupos "alquila" aqui especificados incluem os radicais alquila na extensão designada numa configuração linear ou ramificada. Exemplos de radicais alquila incluem metila, etila, propila, isopropila, butila, sec-butila, butila terciário, pentila, isopentila, hexila, isohexila e similares.

0 termo "alquinila" inclui um radical hidrocarboneto monovalente linear de dois a seis átomos de carbono ou umradical hidrocarboneto monovalente ramificado de três aseis átomos de carbono contendo pelo menos uma ligação tripla; exemplos dos mesmos incluem etinila, propinila, butinila, e similares.

0 termo "arila" inclui um radical hidrocarboneto aromático monocíclico ou bicíclico de 6 a 12 átomos de anel e, opcionalmente substituído independentemente com um ou mais substituintes selecionados de alquila,haloalquila, cicloalquila, alcoxi, alquiltio, halo, nitro, acila, ciano, amino, amino monosubstituído, amino di-substituído, hidroxi, carboxi, ou alcoxi-carbonila. Exemplos de grupos arila incluem fenila, bifenila, 5 naftila, 1-naftila, e 2-naftila, derivados dos mesmos e similares.

0 termo "aralquila" inclui um radical -RaRb onde Ra é um grupo alquileno (alquila bivalente) e Rb é um grupo arila conforme acima definido. Exemplos de grupos aralquila incluem benzila, feniletila, 3 -(3-clorofenil)-2 -metilpentila e similares.

O termo "alifático" inclui compostos com cadeias hidrocarbônicas, tais como por exemplo alcanos, alquenos, alquinos, e seus derivados. 15 O termo "acila" inclui um grupo R-C (=0)-, onde R é um grupo orgânico. Um exemplo é o grupo acetila CH3-C(=0)-, aqui designado "Ac".

Uma porção peptídica ou alifática é "acilada" quando um grupo arila, alquila ou alquila substituído, conforme 20 acima definido, é ligado através de um ou mais grupos carbonil{-(C=O)-}. Um peptídeo é o mais usualmente acilado no N-terminal.

Um "ômega amino alifático" inclui uma porção alifática com um grupo amino terminal. Exemplos de ômega amino 25 alifático incluem 7"-amino-heptanoíIa e as porções de cadeia lateral de aminoácido de ornitina e lisina. 0 termo "heteroarila" inclui anéis mono e bicíclicos aromáticos contendo de 1 a 4 heteroátomos selecionados de nitrogênio, oxigênio e enxofre. Heteroarila de 5 ou 6 3 0 membros são anéis heteroaromáticos monocíclicos; exemplos incluem tiazol, oxazol, tiofeno, furano, pirrol, imidazol, isoxazol, pirazol, triazol, tiadiazol, tetrazol, oxadiazol, piridina, piridazina, pirmidina, pirazina, e similares. Anéis heteroaromáticos bicíclicos incluem, porém não se restringem a benzotiadiazol, indol, benzotiofeno, benzofurano, benzimidazol, benzisoxazol, benzotiazol, quinolina, benzotriazol, benzoxazol,isoquinolina, purina, furopiridina e tienopiridina. Uma "amida" inclui compostos que possuem um nitrogênio trivalente ligado a um grupo carbonila (C-(=0)-NH2) , tal como por exemplo metilamida, etilamida, propilamida e similares.

Uma "imida" inclui compostos contendo um grupo imido (-C(=0)-NH-C(=0)-).

Uma "amina" inclui compostos que contém um grupo amino (-NH2) .

Um "nitrila" inclui compostos que são derivados de ácido carboxílico e que contém um grupo (-CN) ligado a um grupo orgânico.

O termo "halogênio" pretende incluir os átomos de halogênio flúor, cloro, bromo, e iodo, e os grupos incluindo um ou mais átomos de halogênio, tal como -CF3 e similares.

O termo "composição", como em composição farmacêutica, pretende abranger um produto compreendendo o(s) ingrediente (s) ativo(s) e o(s) grupo(s) inerte(s) que constituem o portador, bem como qualquer produto queresulte, direta ou indiretamente, da combinação, complexação ou agregação de quaisquer dois ou mais dos ingredientes, ou da dissociação de um ou mais dos ingredientes, ou de outros tipos de reações ou interações de um ou mais dos ingredientes. Conseqüentemente, as composições farmacêuticas da presente invenção abrangem qualquer composição preparada misturando-se um construto da presente invenção e um portador farmaceuticamente aceitável.

O termo "EC50" pretende incluir a concentração molar deagonista que produziu 50% da resposta máxima possível para aquele agonista. Como exemplo, um construto que, a uma concentração de 72 nM, produza 50% da resposta máxima possível para aquele construto, conforme determinado num ensaio cGMP, possui um EC50 de 72 nM. Salvo se especificado de outra forma, a concentração molar associada com uma determinação de EC50 é em nanomoles(nM) .

O termo "Ki(nM) pretende incluir a afinidade de ligação a receptor em equilíbrio representando a concentração molar de composto competidor que se liga à metade dos sítios de 5 ligação de um receptor em equilíbrio na ausência de um competidor. Em geral, o Ki está inversamente correlacionado com a afinidade do composto para o receptor, de forma tal que se o Ki for baixo, a afinidade será alta. Ki pode ser determinado utilizando a equação 10 de Cheng e Prusoff (Cheng Y., Prusoff

W.H.Biochem.Pharmacol., 22:3099-3108, 1973).

<formula>formula see original document page 48</formula>

onde "ligante" é a concentração de ligante, que pode ser um radioligante, e Ka é uma medição inversa de afinidade de receptor que produz 50% de ocupação do receptor. Salvo 15 se especificado de outra forma, a concentração molar associada com uma determinação Ki é nM.

o protocolo de nomenclatura química e os diagramas estruturais aqui utilizados empregam e baseiam-se nas características de nomenclatura química conforme 20 utilizadas pelo programa ChemDraw(disponível da Cambridgesoft Corp., Cambridge, Mass.). Em especial, certos nomes de compostos derivam das estruturas utilizando o programa Autonom utilizado por Chemdraw Ultra ou ISIS base (MDL Corp.) . Em geral, os diagramas 25 estruturais não ilustram os átomos de hidrogênio associados com os átomos de carbono que não em grupos terminais e outras circunstâncias especiais. Certos diagramas estruturais e desenhos aqui contidos, tais como os constantes das Tabelas 1 e 2, ilustram construtos compostos de substitutos de aminoácido e resíduos aminoácido, com os substitutos identificados por diagramas estruturais e os resíduos aminoácido identificados por uma abreviação de três letras. Salvo seespecificado de outra forma, fica entendido que a ligação entre o substituto e o resíduo, ou entre o resíduo e o substituto, ou entre um substituto e resíduos tanto na lateral N-terminal como na lateral C-terminal do mesmo, é uma ligação peptídica convencional, -C(=0)-NH- ou, no caso em que a ligação peptídica é ao nitrogênio de anel no N-terminal do substituto, -C(=0)-N-. Em geral, na representação de tais compostos, os átomos do substituto de aminoácido são representados (ex; -C(=0)- ou -Ν), embora os átomos do resíduo aminoácido não sejam representados.

Formulação e Utilidade

Os construtos aqui descritos podem ser utilizados tanto em aplicações médicas como em pecuária e aplicações veterinárias. Tipicamente, o construto, ou uma composição farmacêutica que inclua o construto, é utilizado em seres humanos, podendo, porém, ser também utilizado em outros mamíferos. 0 termo "paciente" pretende estipular um indivíduo mamífero, sendo empregado em todo o relatório e nas especificações. As principais aplicações da presente invenção envolvem pacientes humanos, embora a invenção possa também ser aplicada animais de laboratório, gado, animais de zoológico, de estimação, esportivo ou outros animais.

Os construtos aqui descritos podem ser usados no tratamento de qualquer condição, síndrome ou doença para o/a qual a indução de efeitos anti-hipertensivos, cardiovasculares, renais e/ou endócrinos são desejados. Isso inclui especificamente qualquer condição, síndrome ou doença para o/a qual um peptídeo natriurético nativo possa ser empregado. Assim, o construto aqui descrito pode ser empregado para causar natriurese, diurese e/ou vasodilatação desejadas num paciente.

Em um aspecto, os construtos aqui descritos são usados no tratamento do estágio inicial, tal como o de classe 1, da insuficiência cardíaca congestiva. Em outro aspecto, os construtos aqui descritos são usados no tratamento deinsuficiência cardíaca congestiva crônica ou descompensada. Em outro aspecto, os construtos aqui descritos são usados no tratamento de insuficiência cardíaca congestiva descompensada aguda em pacientes com dispnéia em repouso ou com atividade mínima.

Forma Salina dos Construtos. Os construtos da presente invenção podem ser apresentados na forma de qualquer sal farmacêuticamente aceitável. O termo "saisfarmaceuticamente aceitáveis" refere-se a sais preparados 10 com bases ou ácidos atóxicos farmaceuticamente aceitáveis, inclusive as bases e os ácidos orgânicos ou inorgânicos. Sais derivados de bases inorgânicas incluem sais de alumínio, amônio, cálcio, cobre, férrico, ferroso, lítio, magnésio, mangânico, manganoso, potássio, sódio, zinco e similares. Especialmente preferidos são os sais de amônio, cálcio, lítio, magnéso, potássio e sódio. Sais derivados de bases atóxicas orgânicas farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de aminas primárias, secundárias e terciárias, aminas substituídas incluindo as aminas substituídas de ocorrência natural, aminas cíclicas e resinas básicas de troca iônica, tais como arginina, betaína, cafeína, colina, N,N'-dibenziletilenodiamina, dietilamina, 2-dietilaminoetanol, 2-dimetilaminoetanol, etanolamina, etilenodiamina, n-etil-morfolina, N-etilpiridina, glucamina, glucosamina, histidina, hidrabamina, isopropilamina, lisina, metilglucamina, morfolina, piperazina, piperidina, resinas de poliamina, procaína, purinas, teobromina, trietilamina, trimetilamina, tripropilamina, trometamina e similares.

Quando o construto da presente invenção for básico, sais de adição de ácido podem ser preparados com os ácidos atóxicos farmaceuticamente aceitáveis, incluindo os ácidos inorgânicos e orgânicos. Sais ácidos incluem ácido acético, benzenossulfônico, benzóico, canforssulfônico, carboxílico, cítrico, etanossulfônico, fórmico, fumárico, glucônico, glutâmico, bromídrico, clorídrico, isotiônico,láctico, málico, mandélico, metanossulfônico, malônico, múcico, nítrico, pamóico, pantotênico, fosfórico, propiônico, succínico, sulfúrico, tartárico, ácido p-toluenossulfônico, ácido trifluoroacético, e similares.

Sais de adição de ácido dos construtos da presente invenção são preparados num solvente apropriado do construto e um excesso de um ácido, tal como ácido clorídrico, bromídrico, sulfúrico, fosfórico, acético, trifluoroacético, cítrico, tartárico, maleico, succínico 10 ou metanossulfônico. A forma salina de acetato é especialmente útil. Quando os construtos da presente invenção incluem uma porção ácida, sais farmaceuticamente aceitáveis adequados podem incluir sais alcalino-metálicos, tais como sais de sódio ou de potássio, ou sais metálicos alcalinoterrosos, tais como sais de cálcio ou magnésio.

Além disso, os depositantes descobriram, vantajosamente que certas formas salinas dos construtos peptídicos da invenção,incluindo as formas salinas de pamoato, octanoato, decanoato, oleato, estearato, tanato sódico, e palmitato apresentam meia-vida de circulação aumentada, em alguns casos duplicada, versus a forma salina de acetato correspondente. Essas formas salinas são especialmente apropriadas para administração através de injeção subcutânea ou injeção intramuscular, especialmente para tratamento crônico, devido à freqüência reduzida de dosagem que pode ser obtida como resultado das meia-vidas mais longas. Sem se restringir a nenhuma teoria, acredita-se que a meia-vida aumentada 30 esteja relacionada com a redução na solubilidade, em comparação com a forma salina do acetato. As formas salinas com meia-vida aumentada dos construtos peptídicos da invenção podem ser manufaturadas através de qualquer método, inclusive, por exemplo, troca iônica, misturando-3 5 se uma solução de uma forma salina de acetato de um construto com pamoato dissódico para formar uma suspensão de pamoato, ou o uso do sal desejado durantea(s)etapa (s) final de purificação na fabricação dos construtos.

Composições Farmacêuticas. Outra concretização da presente invenção provê uma composição farmacêutica que inclui um construto da presente invenção e um portador farmaceuticamente aceitável. 0 portador pode ser uma formulação líquida, sendo preferivelmente uma solução tamponada, isotônica, aquosa.

Portadoresfarmaceuticamente aceitáveis também incluem excipientes, tais como diluentes, portadores e similares, e aditivos, tais como agentes estabilizantes, preservativos, agentes solubilizantes, tampões e similares, conforme adiante descrito.

Os construtos de diversas concretizações da presente invenção podem ser formulados ou combinados em composições farmacêuticas que incluem pelo menos um construto da presente invenção juntamente com um ou mais portadores farmaceuticamente aceitáveis, incluindo os excipientes, tais como diluentes, portadores e similares, e aditivos, tais como agentes estabilizantes, preservativos, agentes solubilizantes, tampões e similares, conforme desejado. Os excipientes da formulação podem incluir polivinilpirrolidona, gelatina, hidroxicelulose, acácia, polietileno glicol, manitol, cloreto de sódio e citrato de sódio. Para injeção ou outras formulações de administração líquida, água contendo pelo menos um ou mais constituintes tamponantes é preferida, bem como agentes estabilizantes, preservativos e agentes solubilizantes podem também ser empregados. Para formulações de administração sólida, qualquer um de uma variedade de aditivos espessantes, de carga, de volume e portadores podem ser empregados, tais como amidos, açúcares, ácidos graxos e similares. Para formulações de administração tópica qualquer um de uma variedade de cremes, pomadas, géis, loções e similares pode ser empregado. Para a maioria das formulações farmacêuticas, ingredientes não ativos constituirão amaior parte, em peso ou volume, da preparação. Para formulações farmacêuticas, também se prevê que qualquer um de uma variedade de formulações e aditivos de liberação dosimetrada, lenta ou gradual podem ser empregados, de forma que a dosagem possa ser formulada para efetuar a liberação de um construto da presente invenção durante um período de tempo. Por exemplo, gelatina, carboximetilcelulose sódica, e/ou outros excipientes celulósicos podem ser incluídos para prover formulações de liberação gradual ou de liberação mais lenta, especialmente para administração através de injeção subcutânea ou intramuscular.

Em geral, a quantidade real de construtos administrados a um paciente variará entre faixas bastante amplas, dependendo do modo de administração, da formulação utilizada e da resposta desejada.

No uso prático, os construtos podem ser combinados como o ingrediente ativo numa mistura com um portador farmacêutico de acordo com técnicas de combinação farmacêutica convencionais. O portador pode assumir uma variedade de formas, dependendo da forma de preparação desejada para administração, por exemplo, oral, parenteral (inclusive intravenosa), uretral, vaginal, nasal, dérmica, transdérmica, pulmonar, pulmonar profunda, inalação, bucal, sublingual ou similares. Na preparação das composições para a forma de dosagem oral, qualquer um dos meios farmacêuticos normais podem ser empregados, tais como, por exemplo, água, glicóis, óleos, álcoóis, agentes aromatizantes, preservativos, agentes corantes, e similares no caso de preparações orais líquidas, tais como, por exemplo, suspensões, elixires e soluções,-ou portadores tais como amidos, açúcares, celulose microcristalina, diluentes, agentes granulantes, lubrificantes, ligantes, agentes desintegrantes e similares no caso de preparações orais sólidas tais como, por exemplo, cápsulas e comprimidos duros e moles.Devido à facilidade de administração, os comprimidos e cápsulas representam uma forma unitária de dosagem oral vantajosa. Se desejado, uma composição que inclua um construto da presente invenção pode ser revestida através 5 de técnicas padrão aquosas ou não-aquosas. A quantidade de construto ativo em tais composições terapeuticamente úteis é tal que uma dosagem eficaz será obtida. Em outra forma unitária de dosagem vantajosa, composições

farmacêuticas sublinguais podem ser empregadas, tais como 10 folhas, wafers(hóstias), comprimidos ou similares. O construto ativo pode também ser administrado intranasalmente tal como, por exemplo, através de gotas líquidas ou pulverização.

Os comprimidos, pílulas, cápsulas e similares podem 15 também conter um ligante tal como goma tragacanto, acácia, amido de milho ou gelatina; excipientes tais como fosfato dicálcico; um agente desintegrante tal como amido de milho, amido de batata ou ácido algínico; um lubrificante tal como estearato de magnésio; e um agenteadoçante tal como sacarose, lactose ou sacarina.

Quando uma forma unitária de dosagem for uma cápsula, ela pode conter, além dos materiais do tipo acima, uum portador líquido tal como óleo graxo.

Diversos outros materiais podem ser utilizados como 25 revestimentos ou para modificar a forma física da unidade de dosagem. Por exemplo, comprimidos podem ser revestidos com goma-laca, açúcar ou ambos. Um xarope ou elixir pode conter, além do ingrediente ativo, sacarose como agente adoçante, metil e propilparabenos como preservativos, umcorante e um aromatizante tal como cereja ou laranja.

Os construtos podem também ser administrados parenteralmente. Soluções ou suspensões desses peptídeos ativos podem ser preparados em água adequadamente misturada com um surfactante, tal comohidroxipropilcelulose. As dispersões podem também ser preparadas em glicerol, polietileno glicóis líquidos, e suas misturas em óleos. Essas preparações podemopcionalmente conter um preservativo para prevenir o crescimento de microorganismos. Formulações liofilizadas unitárias únicas podem também ser utilizadas, sendo reconstituídas, tais como com solução salina, imediatamente antes da administração, e assim, não requerem um preservativo.

As formas farmacêuticas apropriadas para uso injetável incluem, por exemplo, soluções ou dispersões aquosas estéreis bem como pós estéreis, tais como as formulações liofilizadas, para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Em todos os casos, a forma deve ser estéril e fluida a ponto de poder ser administrada através de seringa. A forma deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e preservadas contra a ação contaminante de microorganismos, tais como bactérias e fungos. 0 portador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, um poliol, como por exemplo glicerol, propileno glicol ou polietileno glicol líquido, misturas apropriadas dos mesmos, e óleos vegetais.

Construtos, conforme aqui descritos, podem ser terapeuticamente aplicados por meio de administração nasal. Por "administração nasal" entende-se qualquer forma de administração intranasal de qualquer um dosconstrutos da presente invenção. Os construtos podem serapresentados como uma solução aquosa, tal como uma solução que inclui solução salina, citrato ou outros excipientes ou preservativos comuns. Os construtos podem também ser apresentados como uma formulação seca ou empó.

Numa concretização alternativa, os construtos podem ser administrados diretamente no pulmão. A administração intrapulmonar pode ser realizada por meio de um inalador dosimetrado, um dispositivo que permite a auto-administração de um bolus metrado de um construto da presente invenção quando acionado por um paciente durante a inspiração. Tanto a inalação de pó seco como osaerossóis nebulizados podem ser empregados. De acordo com outra concretização da presente invenção, construtos da presente invenção podem ser formulados com qualquer um de uma variedade de agentes que aumentem a absorção nasal eficaz de fármacos, inclusive fármacos peptídicos. Esses agentes devem aumentar a absorção nasal sem danos inaceitáveis à membrana mucosa. As patentes americanas 5.693.608 e 5.977.070 e 5.908.825, entre outras, ensinam a respeito de diversas composições farmacêuticas que podem ser empregadas, inclusive intensificadores de absorção, e os ensinamentos de cada um dos anteriormente citados, e todas as referências e patentes aqui citadas, são incorporadas por referência. Se numa solução aquosa, certos construtos da presente 15 invenção podem ser apropriadamente tamponados por meio de solução salina, acetato, fosfato, citrato, acetato, ou outros agentes tamponantes, que podem ter qualquer pH fisiologicamente aceitável, geralmente de cerca de pH 4 a cerca de pH 7. Uma combinação de agentes tamponantes pode também ser empregados, tais como solução salina tamponada com fosfato, um tampão de solução salina e acetato, e similares. No caso de uma solução salina, uma solução salina a 0,9%, pode ser empregada. No caso de acetato, fosfato, citrato, acetato e similar, uma solução 50mMpode ser empregada. Além dos agentes tamponantes, um

preservativo apropriado pode ser empregado, para impedir ou limitar a proliferação de bactérias e de outros micróbios. Tal preservativo que pode ser empregado é o cloreto de benzalcônio a 0,05%.

É também possível e previsto que o construto possa estarnuma forma seca e particulada. Numa concretização preferida, as partículas estão entre cerca de 0,5 e 6,0 μπ\, de forma que as partículas tenham massa suficiente para se depositarem na superfície pulmonar, e não serem exaladas, sendo porém pequenas o bastante para serem depositadas nas superfícies das vias aéreas antes de atingir o pulmão. Qualquer uma de uma variedade detécnicas diferentes pode ser empregada para preparar micropartículas de pó seco, inclusive, porém não restrito a micro-trituração, secagem por pulverização e um aerossol de congelamento rápido seguido de Iiofilização.

Com micropartículas, os construtos podem ser depositados profundamente no pulmão, provendo assim absorção rápida e eficiente pela corrente sangüínea. Além disso, mediante o uso de tal técnica, não são necessários os intensificadores de penetração, como às vezes é o caso das vias de administração transdérmica, nasal ou de mucosa oral. Qualquer um de uma variedade de inaladores pode ser empregado, inclusive os aerossóis à base de propelente, nebulizadores, inaladores de pó seco de dose única, e inaladores de pó seco de doses múltiplas. Dispositivos comuns utilizados atualmente incluem os inaladores dosimetrados, que são usados para liberar medicações para o tratamento da asma, doença pulmonar obstrutiva crônica e similares. Dispositivos preferidos incluem inaladores de pó seco, criados para formar uma nuvem ou aerossol de pó fino com um tamanho de partícula que é sempre inferior a cerca de 6,0 μτα.

O tamanho da micropartícula, incluindo distribuição média de tamanho, pode ser controlada através do método de fabricação. Para micro-trituração, o tamanho do cabeçote do triturador, velocidade do rotor, tempo de processamento e similares controlam o tamanho da micropartícula. Para secagem por pulverização, o tamanho do bico, taxa de escoamento, calor do secador e similares controlam o tamanho da micropartícula. Para fabricação através de aerossol de congelamento rápido seguido de liofilização, o tamanho do bico, taxa de escoamento, concentração da solução aerosolizada, e similares, controlam o tamanho da micropartícula. Esses parâmetros e outros podem ser empregados para controlar o tamanho da partícula.

Os construtos da presente invenção podem ser terapeuticamente administrados por meio de injeção,tipicamente uma injeção intramuscular profunda, tal como na região glútea ou músculo deltóide, de uma formulação injetável de liberação gradual. Em uma concretização, um construto da presente invenção é formulado com um PEG, tal como poli(etileno glicol) 3350, e opcionalmente um ou mais excipientes e preservativos adicionais, inclusive, porém não restritos a excipientes tais como sais, polisorbato 80, hidróxido de sódio ou ácido clorídrico para ajustar o pH e similares. Em outra concretização, um construto da presente invenção é formulado com um poli(orto éster), que pode ser um poli(orto éster) auto-catalisado com qualquer um de uma porcentagem variável de ácido láctico na cadeia polimérica principal, e opcionalmente um ou mais excipientes adicionais. Em uma concretização, polímero de poli(D,L-lactídeo-co-glicolídeo) (polímero PLGA) é empregado, preferivelmente um polímero PLGA com um grupo hidrofílico terminal, tal como PLGA RG5 02H da Boehringer Ingelheim, Inc.(Inglelheim, Alemanha). Tais formulações podem ser preparadas, por exemplo, combinando-se um construto da presente invenção num solvente adequado, tal como metanol, com uma solução de PLGA em cloreto de metileno, e adicionando-se ao mesmo uma solução de álcool polivinílico em fase contínua, sob condições apropriadasde misturação num reator. Em geral, qualquer um dediversos polímeros injetáveis e biodegradáveis, que também são preferivelmente polímeros adesivos, pode ser empregado numa formulação injetável de liberação gradual. Os ensinamentos das patentes americanas 4.938.763, 6.432.438 e 6.673.767, e os polímeros biodegradáveis e métodos de formulação ali descritos, são aqui incorporados por referência. A formulação pode ser tal que uma injeção seja necessária em base periódica semanal, mensal ou outra, dependendo da concentração equantidade de construto, da taxa de biodegradação dopolímero e de outros fatores conhecidos no estado da técnica.Vias de Administração. Se a administração for por injeção, a injeção pode ser intravenosa, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal ou outros meios conhecidos no estado da técnica. Os construtos da presente invenção podem ser formulados através de quaisquer meios conhecidos no estado da técnica, inclusive, porém não restritos à formulação na forma de comprimidos, cápsulas, comprimidos revestidos, suspensões, pós, preparações Iiofilizadas, supositórios, gotas oculares, adesivos 10 transdérmicos, formulações orais solúveis, sprays, aerossóis, e similares, e podem ser misturados e formulados com tampões, ligantes, excipientes, estabilizantes, antioxidantes, e outros agentes conhecidos no estado da técnica. Em geral, qualquer via de administração por meio da qual os construtos da presente invenção são introduzidos por uma camada epidérmica de células pode ser empregada. Os meios de administração podem então incluir administração através de membranas mucosas, administração bucal, administração 20 oral, administração dérmica, administração por inalação, administração pulmonar, administração nasal,administração uretral, administração vaginal, e similares.

Em um aspecto, o construto da presente invenção é administrado por meio de uma formulação injetável de liberação gradual, tal como um construto da presente invenção numa formulação com um PEG, poli(orto éster) ou polímero PLGA.Em outro aspecto, um construto da presente invenção é administrado através de um dispositivo de liberação automatizado provendo liberação subcutânea, de forma contínua ou intermitente. Qualquer um dos métodos e formulações anteriormente citados, são especialmente aplicáveis no tratamento de condições ou síndromes crônicas, inclusive insuficiência cardíaca congestiva 35 crônica, e especialmente insuficiência cardíaca congestiva descompensada crônica.

Em um aspecto, qualquer construto da presente invençãopode ser administrado através de administração subcutânea, inclusive todos os métodos descritos na patente americana 6.586.3 96. Em outro aspecto, um paciente, especialmente um paciente relativamente descompensado ou um paciente com insuficiência cardíaca congestiva na condição ambulatorial, pode receber um construto da presente invenção através dos métodos e em doses conforme descrito na publicação de pedido de patente americana 2004/0077537 e publicação de pedido de patente internacional WO 2003/079979. Em outro aspecto, um paciente pode receber um construto da presente invenção através dos métodos descritos na publicação de pedido de patente americana 2005/0113286. Em outro aspecto ainda, um paciente que tenha sofrido lesão no miocárdio pode ser tratado para remodelagem cardíaca através dos métodos descritos na publicação de pedido de patente americana 2006/0019890.

Um construto da presente invenção pode também ser administrado através de administração transdérmica, inclusive por meio do sistema de administração, inclusive o aparelho e os métodos descritos na publicação de pedido de patente americana 2006/0034903. De forma similar, as formulações em hidrogel e as formulações em estado sólido descritos em tal patente podem ser adaptadas para uso com os construtos da presente invenção.

Quantidade Terapeuticamente Eficaz. Em geral, a quantidade real de um construto da presente invenção administrada a um paciente variará entre faixas bastante amplas, dependendo do modo de administração, da formulação utilizada, e da resposta desejada. A dosagem para o tratamento é a administração através de qualquer um dos meios anteriormente citados ou quaisquer outros meios conhecidos no estado da técnica, de uma quantidade suficiente para produzir o efeito terapêutico desejado. Assim, uma quantidade terapeuticamente eficaz inclui uma quantidade de um construto ou de uma composição farmacêutica da presente invenção que seja suficientepara induzir um efeito desejado, incluindo especificamente um efeito anti-hipertensivo,

cardiovascular, renal e/ou endócrino. Em um aspecto, uma quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade que 5 resulta na natriurese, diurese e/ou vasodilatação desej adas.

Em geral, os construtos da presente invenção são altamente ativos. Por exemplo, um construto pode ser administrado a cerca de 0,001, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 10 5, 10 ou 100 μ<g/ peso corporal, dependendo do construto específico selecionado, da resposta terapêutica desejada, da via de administração, da formulação e de outros fatores conhecidos no estado da técnica. Terapia de Combinação 15 É também possível e previsto que construtos de acordo com diversas concretizações da presente invenção sejam utilizados em combinação com outros fármacos ou agentes, especialmente no tratamento de insuficiência cardíaca congestiva.

De acordo com outro aspecto da presente invenção, um método para o tratamento de insuficiência cardíaca congestiva é provido. 0 método inclui administrar ao paciente com insuficiência cardíaca congestiva uma quantidade terapeuticamente eficaz de um construto conforme aqui descrito, em combinação com uma quantidade terapeuticamente eficaz de outro composto que seja útil no tratamento de insuficiência cardíaca congestiva, ou alternativa que seja útil para aumentar a biodisponibilidade de um construto da presente invenção 30 num paciente. Em um aspecto, um paciente pode receber um construto da presente invenção em combinação com um diurético, tal como por meio dos métodos e diuréticos descritos na publicação de pedido de patente americana 2004/0063630. Os diuréticos que podem ser empregados em combinação com diuréticos tiazídicos, diuréticos de alça e diuréticos poupadores de potássio, inclusive, sem limitação, diuréticos tais como hidroclorotiazida(Hydrodiuri1®), clortalidona, furosemida (Lasix®) , espironolactona (Aldactone®) e triantereno. Em outro aspecto da presente invenção, um método para tratar insuficiência cardíaca congestiva é provido através da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um construto, conforme aqui descrito, em combinação com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente anti-hipertensivo que não um diurético. Tais agentes anti-hipertensivos incluem geralmente bloqueadores de canal de cálcio (inclusive dihidropiridinas e não-dihidropiridinas), agentes simpatolíticos, agentes bloqueadores adrenérgicos não-espec£ficos, antagonistas α-adrenérgicos (inclusive agentes al-bloqueadores seletivos e não-seletivos), β-bloqueadores (inclusive bloqueadores não-seletivos bem como bloqueadores seletivos e os que possuem atividade simpaticomimética intrínseca), vasodilatadores (para o tratamento de hipertensão resistente e emergente), inibidores da enzima conversora de angiotensina (ECA) e antagonistas de angiotensina II. Agentes anti-hipertensivos que podem ser empregados em combinação incluem α e β antagonistas mistos tais como o labetolol (Normodyne®) ; vasodilatadores tais como hidralazina (Apresoline®) , minoxidil (Loniten®), nitroprusseto (Nipride®) ou diazóxido (Hyperstat IV®),-bloqueadores de cálcio tais como nifedipino (Adalat®),dilti azem(Cardizem ), ou verapamil (Calan®);simpatolíticos tais como clonidina (Catapres®), metildopa (Aldomet®), reserpina (Serpasil®), ou guanetidina (Ismelin®) ; inibidores da ECA tais como captopril (Capoten®), enalapril (Vasotec®) ou lisinopril (Prinivil®); antagonistas α-adrenérgicos tais como fentolamina (Regitine®) ou prazosina (Minipress®); antagonistas de angiotensina II tais como losartan (Cozaar®) ; ou antagonistas /S-adrenérgicos tais como propranolol (Inderal®), nadolol (Corgard®), metoprolol (Lopressor®) ou pindolol.Outras Indicações

Embora o principal uso dos construtos da presente invenção seja o tratamento e melhora dos sintomas de insuficiência cardíaca congestiva, insuficiência renal aguda, e hipertensão renal, os construtos da presente invenção podem ser empregados em qualquer esquema ou modalidade de tratamento para o qual compostos natriuréticos, diuréticos e/ou vasodilatadores provêem um benefício terapêutico. Assim, em um aspecto, os construtos da presente invenção podem ser empregados como aditivos a soluções de diálise peritoneal, conforme descrito na patente americana 5.965.533. Em outro aspecto, os construtos da presente invenção podem ser empregados em aplicações oftalmológicas, conforme descrito na publicação de patente internacional WO 00/18422.

Métodos Sintéticos de Substitutos de Aminoácido Os exemplos e métodos a seguir descritos de síntese de substitutos de aminoácidos pretendem ser exemplificativos, ficando entendido que se pode fazeralterações nos mesmos incluídas no escopo da presente invenção.

Síntese de Estruturas de Cetopiperazina Simulando Aminoácidos sem Cadeia Lateral R Funcionalizada (Métodos A e B)

Os construtos foram preparados através de uma variedade de métodos conforme descritos nos Métodos AeB. Método A : Os dipeptídeos (3) foram formados através do método de anidrido misto, utilizando Boc-serina (OBn)-OH (1) e um α-amino éster (2) .

Os dipeptídeos foram obtidoscom altos rendimentos, e geralmente nenhuma purificação foi necessária. A redução tanto de metil éster como de grupo amida foi executada utilizando-se diborano-tetrahidrofurano, com as aminas secundárias protegidas para dar intermediários de aminoálcool protegido com di-Boc (4). A oxidação dos álcoóis com dicromato de piridínio (PDC) com ciclização concomitante deu aspiperazin-2-onas (5) em etapa única. A remoção de benzil éter através de hidrogenação, seguido de troca de grupo protetor deu piperazin-2-onas protegidas com Fmoc. Finalmente, o álcool primário foi oxidado ao ácido através de qualquer um dos diferentes métodos (PDC, oxidação de Jones, cloreto de rutênio-periodato de sódio, 2 , 2 , 6,6 -tetrametil-1-piperidiniloxi, oxidação de radical livre (TEMPO) para dar os produtos finais (7).

Método A

<formula>formula see original document page 64</formula>

Síntese de metil éster de ácido 2 -(3-benziloxi-2-ter-butoxicarbonilamino-propionilamino)-2-substituído (3): A uma solução de 10 mmol de Boc serina metil éster (1) em 3 0 ml de tetrahidrofurano, mantida a -2O0C sob nitrogênio, adicionou-se 22 mmol de trietilamina, seguido 15 de lenta adição de 11,4 mmol de clorof ormiato de isobutila. Houve precipitação de um sólido branco. A pasta foi agitada por 15 minutos e então 11,1 mmol de examino éster (2) foi adicionado em uma única porção. A pasta foi agitada a -2O0C por 3 0 minutos e então deixada 2 0 aquecer até temperatura ambiente, agitada por 2 horas, e então concentrada até secagem. A mistura foi então repartida em 50 ml de acetato de etila/30ml de solução deácido clorídrico. As camadas foram separadas, e a camada orgânica lavada com 1x20 ml de ácido clorídrico IN e 1 χ 20 ml de solução saturada de bicarbonato de sódio, secada sobre sulfato de magnésio e concentrada.Os compostos (3) foram geralmente obtidos em rendimentos acima de 90%, não sendo necessária purificação.

<table>table see original document page 65</column></row><table>

Síntese de Di-Boc-2-substituído-(2-amino-3-benziloxi-propilamino)-etanol (4) : A uma solução de 35 mmol de (3) em 50 ml de tetrahidrofurano seco, mantida à temperatura ambiente sob nitrogênio, adicionou-se 200 ml de solução IN de diborano em tetrahidrofurano. A solução foi agitada à temperatura ambiente da noite para o dia, e então lentamente despejada sobre uma solução gelada de 200 ml de solução IN de ácido clorídrico. A solução bifásica foi então neutralizada com hidróxido de sódio sólido. 140 ml de solução saturada de bicarbonato de65sódio foram adicionados, seguido de 70 mmol de dicarbonato de di-ter-butila e a mistura agitada por 2 dias à temperatura ambiente, diluída com 2 00 ml de acetato de etila e as camadas separadas. A camada 5 orgânica foi secada sobre sulfato de magnésio e concentrada. Os produtos (4) foram purificados através decromatografia de coluna sobre sílica gel.

<table>table see original document page 66</column></row><table>

Síntese de 1,4-di-Boc-6-benziloximetil-3-substituído-piperazin-2-ona (5) Uma solução de 70 mmol de (4) e 400 mmol de dicromato de piridínio em 300 ml de dimetilformamida seco foi agitada a 48°C sob nitrogênio por 6 horas, resfriada até temperatura ambiente, despejada em 1500 ml de água, e extraída com 4 χ 500 ml de etil éter. As camadas etéreas foram combinadas, secadas sobre sulfato de magnésio, e concentradas. Os produtos (5) foram purificados através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.<table>table see original document page 67</column></row><table>

Síntese de 4-Fmoc-6-hidroximetil-3-substituído-piperazin-2-ona (6) : Uma suspensão de 19 mmol de (5) e 2 g de paládio a 10% sobre carbono em 2 00 ml de etanol foi hidrogenada à temperatura ambiente e sob pressão atmosférica da noite para o dia. A suspensão foi filtrada em placa de celite e concentrada. O resíduo foi redissolvido em 40 ml de ácido trifluoroacético a 50% em diclorometano. A solução foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas, então concentrado. O resíduo foi redissolvido em 60 ml de tetrahidrofurano/40 ml de água e neutralizado com bicarbonato de sódio sólido, seguido de adição de 40 mmol de bicarbonato de sódio sólido e 20 mmol de cloreto de Fmoc. A mistura foi então agitada à temperatura ambiente por 2 horas, diluída com 300 ml de acetato de etila, e as camadas separadas. A camada orgânica foi secada sobre sulfato de magnésio, concentrada e purificada através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.<table>table see original document page 68</column></row><table>

Síntese de ácido 4-Fmoc-5-substituído-6-oxo-piperazino-2-carboxílico (7): Os compostos (7) foram preparados através de diversos métodos:

(a) A uma solução bifásica de 10 mmol de (6) em 180 ml de acetonitrila, 180 ml de tetracloreto de carbono, e 240 ml de água, resfriados a O0C7 adicionou-se 112 mmol de periodato de sódio sólido, seguido de 340 mg de cloreto de rutênio. A reação foi deixada aquecer até temperatura ambiente, agitada por 12 horas e então filtrada em celite. As camadas foram separadas e a camada aquosa reextraída com 2 χ 75 ml de acetato de etila. As camadas orgânicas foram combinadas, secadas sobre sulfato de magnésio, e concentradas.

(b) Uma solução de 12 mmol de (6) e 59 mmol de PDC em 60 ml de dimetilformamida secada foi agitada a 4 8°C sob nitrogênio durante ~5 horas, resfriada até temperaturaambiente e despejada sobre 600 ml de água, e extraída com 3 χ 2 00 ml de diclorometano. As camadas orgânicas foram combinadas, secadas sobre sulfato de magnésio e concentradas.

(c) A uma solução de 17 mmol de (6) em 3 50 ml de acetona mantida à temperatura ambiente adicionou-se 25 ml de reagente de Jones (preparado com 0, 8g de ácido crômico, 17,4 ml de água e 6,9 ml de ácido sulfúrico concentrado). A mistura foi agitada durante 1 hora, 150 ml de isopropanol foi adicionado, e a mistura filtrada em placa de celite. A placa de celite foi lavada com acetato de etila. As camadas orgânicas foram combinadas e concentradas. 0 resíduo foi dissolvido em 250 ml de acetato de etila e lavado com 2 χ 50 ml de água, secado sobre sulfato de magnésio e concentrado.

(d) A uma solução de 81 mmol de álcool (6) em 810 ml de acetonitrila mantida à temperatura ambiente, adicionou-se solução tampão de fosfato (preparada com 7,2g de fosfato de sódio monobásico, e 14,3 g de fosfato de sódiodibásico em 2 95 ml de água), seguido da adição de 3,3g(20,7 mmol) de TEMPO, e 18,6g (164,4 mmol) de clorito de sódio, e a solução bifásica colocada em banho de óleo a 43°C e então uma solução de 43,3 ml (25,9 mmol) de solução de hipoclorito de sódio (preparada misturando-se 19,3 ml de solução de hipoclorito de sódio a 10-13% e 24 ml de água) foi adicionada lentamente. A reação foi agitada a 43°C por 4 horas. A solução foi resfriada até temperatura ambiente e uma solução de 200 ml de solução de hidrogeno sulfito de sódio a 10% foi adicionada,agitada por 10 minutos, diluída com 500 ml de acetato deetila, e as camadas separadas. A camada orgânica foi lavada com 1 χ IOOml de salmoura, 1 χ 160 ml de solução de ácido clorídrico IN, secada sobre sulfato de sódio e concentrada.

Os produtos (7) foram purificados através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.Dados analíticos para compostos (7)

1H NMR δ (CDCl3): 2.36-2.45 (dd, 1H, CH2-Ph), 2.62-2.76 (m, % H, CH2-Ph), 2.82-2.98 (m, 1/2 H, CH2-Ph), 3.13-3.25 (m, IHi CH2N), 3.98-4.64

(uma série de m, 6H, CHN, CH2O, CH2, e CH) , 4.87 (br. m, 1/2H, NH), 6.85 (br. s, 1H, Ph), 7.0-7.40 (uma série de m, 12H, Ph e fulveno), 9.18-9.40 (br. d, 1H, CO2H), tR = 5.91 min, (M+ + 1) = 457.37.

1H NMR δ (CDCl3): 0.64-1.02 (t sobreposto, 6H,

CH3), 1.02-1.68 (três br. m, 2H, CH2), 1.96-2.16 (br. m, 1H, CH), 2.88-3.18 (m, 1H, CH2N), 3.85-4.12 (três m, 2H, CH2N7 e CHN), 4.18-4.35 (m, 1H, CH), 4.55-4.72 (m, 2H, CH2), 4.75-4.86

(br. m, 1H, NH), 7.28-7.82 (uma série de m, 8H, fulveno), 9.1-9.26 (dois br. s, 1H, CO2H), tR = 5.86 min, (M+ + 1) = 423.20.

1H NMR δ (CDCl3): 0.62-1.03 (m, 7H, CH3), 1.90-2.05 (br. m, 1H, CH), 2.87-4.60 ( uma série depicos br., 8H, CH2N, CH2O e CHN e CH), 7.29-7.80 (m, 9 H, fulveno), rendimento = 61%, tR = 5.52 min, (M+ + 1) = 409.11

Método B: Intermediários de Di-Boc-2-substituído-(2-amino-3-benziloxi-propil-amino)etanóis (4), preparados conforme descrito no método A, foram oxidados a ácido utilizando TEMPO/reagente de ácido isocianúrico, e então esterifiçados com iodometano para dar análogos dipeptídicos reduzidos totalmente protegidos (8). A desproteção dos grupos Boc e de benzil éter deu 5-hidroximetil-piperazin-2-onas 3-substituídas que foram protegidas como os derivados de Fmoc para dar (6) , que foram oxidados ao produto final conforme descrito no método A.

<formula>formula see original document page 70</formula><formula>formula see original document page 71</formula>

Síntese de metil éster de ácido acético Di-Boc-(2-amino-suspensão de 76 mmol de (4) em 680 ml de acetona, e 210 ml de uma solução saturada de bicarbonato de sódio, mantida a 0°C, adicionou-se 21 mmol de brometo de sódio sólido, e 2,9 mmol de TEMPO, seguido de lenta adição de 156 mmol de ácido tricloroisocianúrico. A reação foi agitada por 30 minutos a O0C e então à temperatura ambiente da noite para o dia, acidifiçada com uma solução de ácido clorídrico IN, e extraída com 2 χ 300 ml de acetato de etila. A camada orgânica foi lavada com 3 χ 50 ml de ácido clorídrico IN, secada sobre sulfato de magnésio e concentrada. O resíduo foi redissolvido em 40ml de dimetilformamida seca e 95 mmol de bicarbonato de sódio sólido e 112 mmol de iodometano foi adicionado e a mistura agitada à temperatura ambiente sob nitrogênio até que HPLC mostrasse que a reação estava concluída; a solução foi então diluída com 200 ml de etil éter, e lavada com 2 χ 100 ml de água, secada sobre sulfato de magnésio e concentrada. 0(s) produto (s) (8) foram purificados através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.

3-benziloxi-propilamino)-2-substituído (8): A uma<table>table see original document page 72</column></row><table>

Síntese de 4-Fmoc-6-hidroximetil-3-substituído-piperazin-2-ona(6): Uma solução de 36 mmol de (8) em 4 0 ml de ácido trifluoroacético a 50% em diclorometano foi agitada àtemperatura ambiente por 2 horas, e então despejada em200 ml de solução saturada de bicarbonato de sódio. As camadas foram separadas, e a camada orgânica concentrada. 0 resíduo foi redissolvido em 100 ml de acetato de etila, e lavado com 2 χ 50 ml de água, secado sobre sulfato demagnésio e concentrado. 0 resíduo foi dissolvido em 100 ml de etanol, e 5g de paládio a 10% sobre carbono e 35 ml de solução de ácido clorídrico IN foi adicionada, e a mistura hidrogenada à temperatura ambiente e pressão atmosférica até que HPLC mostrasse que a reação estavaconcluída; a solução foi então filtrada em placa de celite e concentrada. 0 resíduo foi redissolvido em 80 ml de acetato de etila, 70 mmol de bicarbonato de sódio em30 ml de água foram adicionados e a mistura agitada à temperatura ambiente da noite para o dia. 0 acetato deetila foi removido e 100 ml de t et rahidrof urano foram adicionados, seguido de 178 mmol de bicarbonato de sódio sólido e 43 mmol de cloreto de Fmoc, e a mistura foi agitada até que HPLC mostrasse que estava concluída, diluída com 300 ml de acetato de etila e as camadasseparadas. A camada orgânica foi lavada com 2 χ 50 ml de água, secada sobre sulfato de magnésio, e concentrada. 0 produto(s) (6) foram purificados através de cromatografia de coluna sobre silica gel.

Síntese de ácido 4-Fmoc-5-substituído-6-oxo-piperazino-2-carboxílico (7) : Os compostos (7) foram preparados conforme descrito no método A.

Esquema Sintético Geral Comum para o Preparo de Estruturas de Cetopiperazina Aplicáveis a Compostos com ou sem cadeias laterais R funcionalizadas (Métodos C, E, F)

Método C : Metil ésteres de ácido acético (2-Fmoc-amino-3-R'-O-propilamino)-2-substituído (10) foram preparados através de aminação redutiva de Fmoc serinal 0-protegido (9) com α-amino ésteres (2), utilizando cianoborohidreto de sódio ou triacetoxiborohidreto de sódio como agente redutor. 0 Fmoc serinal 0-protegido (9) necessário para aminação redutiva foi preparado de acordo com o método D, através de redução de éster (12) com hidreto de diisobutilalumínio, através de oxidação de Fmoc serinol 0-protegido (13) com periodinano Dess-Martin, ou através da redução de Fmoc serina amida Weinreb 0-protegido (14) com hidreto de lítio alumínio. 0 método preferido para a preparação de Fmoc serinais O-protegidos(9) foi a reduçãodo análogo de amida Weinreb. Metil ésteres de ácidoacético (2-Fmoc-amino-3-R'-O-propilamino)-2 - substituído (10) foram então N- e O-desprotegidos, ciclizados e protegidos com Fmoc para dar 6-hidroximetil-piperazin-2-onas 3-substituído (6) que foram então oxidados até oproduto final conforme descrito no Método A.

0 grupo protetor (R') no grupo hidroxila de Fmoc-serinal-0-protegido (9) utilizado na síntese depende da natureza da cadeia lateral R do amino éster. Quando R não continha grupos funcionais, a cadeia lateral de Fmoc serina era protegida como o tBu éter. Quando R continha grupos funcionais, a cadeia lateral de Fmoc serina era protegida como o tritil éter.Método C

<formula>formula see original document page 74</formula>

Método D

<formula>formula see original document page 74</formula>

Método D: Síntese de diversos Fmoc-serinais O-protegidos (9) . Síntese de Fmoc-0-R'serina metil éster (12) : Uma solução leve de 80 mmol de Fmoc 0-R'serina (11), IOfOg (120 mmol) de bicarbonato de sódio sólido, e 10,0 ml (160 mmol) de iodometano em 80 ml de dimetilf ormamida seca, mantidos sob nitrogênio, foi agitada à temperatura ambiente da noite para o dia. A mistura de reação foi então despejada sobre 500 ml de água, e o sólido filtrado. 0 sólido foi redissolvido em 800 ml de acetato de etila, e lavado com 1 χ 200 ml de água, secado sobresulfato de magnésio e concentrado. Não foi necessáriapurificação.

<table>table see original document page 75</column></row><table>

Síntese de Fmoc-O-R' serinol (13): A uma solução de 10,0 mmol de Fmoc o-R'serina (11) em 50 ml de tetrahidrofuranoseco, mantida a -20°C sob nitrogênio, adicionou-se 1,77 ml (12,7 mmol) de trietilamina, seguido de lenta adição de 1,57 ml(12,0 mmol) de cloroformiato de isobutila. A mistura foi agitada durante 30 minutos, e então despejada lentamente sobre uma solução gelada de 3,77g (99,6 mmol) 10 de borohidreto de sódio em 10 ml de água, mantendo-se a temperatura abaixo de 5°C. A reação foi agitada a O0C por 15 minutos e então resfriada rapidamente com solução IN de ácido clorídrico. A mistura de reação foi diluída com 100 ml de acetato de etila, e as camadas separadas. A 15 camada orgânica foi lavada com 2 χ 25 ml solução IN de ácido clorídrico, 2 χ 25 ml de água, secada sobre sulfato de magnésio e concentrada. Os compostos foram purificados através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.

<table>table see original document page 75</column></row><table>Síntese de Fmoc-O-R' serina amida Weinreb (14) : Uma suspensão de 20,2 mmol de Fmoc 0-R'serina (11), 6,98 g (21,6 mmol) de tetrafluoroborato de 2-(lH-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3 -tetrametilurônio (TBTU) e 2,5 ml (22,7 mmol) de N-metil-morfolina em 80 ml de diclorometano seco foi agitada à temperatura ambiente sob nitrogênio durante 20 minutos, e então 3,02g (31 mmol) de cloridrato de N,0-di-metil-hidroxilamina e 3,3ml (30 mmol) de N-metilmorfolina foram adicionados, e a suspensão agitada à temperatura ambiente da noite para o dia. A solução formada foi então concentrada até secagem, repartida entre 200 ml de acetato de etila e 100 ml de água, lavado com 2 χ 40 ml de solução de ácido clorídrico IN, e então 2 χ 40 ml de solução saturada de bicarbonato de sódio, secada sobre sulfato de magnésio, e concentrada. Não foi necessária purificação.

<table>table see original document page 76</column></row><table>

Síntese de Fmoc-0-R'serinal (9) de éster (12) : A uma solução de 3.5 mmol de (12) em 5 mL de tetrahidrofurano, mantida a -78°C sob nitrogênio, adicionou-se lentamente 10 ml de solução de hidreto de diisobutil alumínio IN (DIBAL), agitou-se por 15 minutos e resfriou-se rapidamente mediante lenta adição de uma solução saturada de tartarato de sódio e potássio. A reação foi deixada aquecer até temperatura ambiente, diluída com 50ml de acetato de etila, e 50 ml de solução saturada de sódio e tartarato de sódio e potássio foram adicionados. As camadas foram separadas, e a camada aquosa reextraída com1 χ 50 ml de acetato de etila. As camadas orgânicas foram combinadas, secadas sobre sulfato de magnésio, e concentradas. Os compostos (9) foram usados sem purificação adicional na etapa seguinte._

<table>table see original document page 77</column></row><table>

Síntese de Fmoc-O-R' serinal (9) de álcool (13) : A uma solução de 80 mmol de Fmoc-O-R' serinol (13) em 200 mL de diclorometano seco, mantido à temperatura ambiente sob nitrogênio, adicionou-se 88 mmol de periodinano Dess-Martin e a reação foi agitada por 2,5 horas e rapidamente 10 resfriada mediante adição de 400 ml de solução aquosa a 10% de tiossulfato de sódio. As camadas foram separadas, e a camada orgânica concentrada, diluída com 3 00 ml de etil éter, e lavada três vezes com uma solução aquosa saturada de bicarbonato contendo tiossulfato de sódio a 15 10%, secada sobre sulfato de magnésio e concentrada.

Síntese de Fmoc-0-R'serinal (9) de amida Weinreb (14): A uma solução de 8,8 g (2 0,2 mmol) de intermediário Fmoc-O-R'serina amida Weinreb (14) em 60 ml de tetrahidrofurano seco, resfriado até -78°C sob nitrogênio, adicionou-se 30 20 ml de solução IN de hidreto de lítio alumínio em tetrahidrofurano. A solução foi agitada por 15 minutos e então rapidamente resfriada mediante lenta adição de 3 0 ml de uma solução de hidrogeno sulfato de potássio 1,4N. Após aquecimento até temperatura ambiente, o sólido foi 25 filtrado e o filtrado concentrado até secagem. 0 resíduo foi repartido em 50 ml de acetato de etila e 25 ml de solução de ácido clorídrico IN. As camadas foramseparadas, e a camada orgânica secada sobre sulfato de magnésio, filtradas e concentradas.

Síntese de metil éster de ácido acético (2-Fmoc-amino-3-R'-O-propilamino)-2 - substituído (10): Compostos (10) 5 foram preparados através de aminação redutiva utilizando cianoborohidreto de sódio ou triacetoxiborohidreto de sódio como agente redutor.

Método utilizando cianoborohidreto de sódio: A uma solução de 8,5 mmol de (2) sal de cloridrato em 20 ml de 10 metanol, mantido à temperatura ambiente sob nitrogênio, adicionou-se 2,3 mmol de hidróxido de potássio sólido, e a mistura agitada por 25 minutos. Uma solução de Fmoc-O-R'serinal (9)em 10 ml de metanol foi adicionada à suspensão acima, e a mistura de reação agitada durante 1 15 hora. Uma solução de 8,5 ml de cianoborohidreto de sódio IN em tetrahidrofurano foi lentamente adicionada, e a reação agitada por mais 1 hora, filtrada e concentrada. 0 resíduo foi repartido em acetato de etila e água, e a camada orgânica lavada com 1 χ 2 Oml de bicarbonato desódio saturado, secada sobre sulfato de sódio econcentrada.

Método utilizando triacetoxiborohidreto de sódio: Uma suspensão de 21 mmol de sal de cloridrato (20 e 2, 9ml (2lmmol) de trietilamina em 50 ml de tetrahidrofurano 25 seco, foi agitada à temperatura ambiente por 45 min, e então uma solução de - 20mmol de Fmoc-(O-R')-serinal (9) em 3 0 ml de tetrahidrofurano foi adicionada, seguido de 1, 7g de crivos moleculares em pó 4A, e a suspensão agitada por mais 2 horas. 6,4g (3 0 mmol) detriacetoxiborohidreto de sódio sólido foi adicionado e asuspensão agitada à temperatura ambiente da noite para o dia. A suspensão foi diluída com metanol, e os crivos moleculares filtrados, e o filtrado concentrado. 0 resíduo foi repartido em 100 ml de acetato de etila e 50 3 5 ml de água. A camada orgânica foi secada sobre sulfato de sódio, filtrada e concentrada.

Os compostos (10) foram purificados através decromatografia de coluna sobre sílica gel.<table>table see original document page 80</column></row><table><table>table see original document page 81</column></row><table>

Síntese de 4-Fmoc-6-hidroximetil-3-substituído-piperazin-2-ona (6): Para a preparação de compostos (6) três etapas foram necessárias: (a) desproteção com Fmoc com ciclização concomitante; (b) proteção com Fmoc e (c) desproteção de grupo hidroxila.

Remoção e ciclização de grupo Fmoc: Uma solução de 10 mmol de composto cíclico em 30 ml de dietilamina a 30% em solução de acetato de etila foi agitada à temperatura ambiente da noite para o dia, e então concentrada até secagem.

(a) Proteção com Fmoc: A uma solução bifásica de 10 mmol de composto em 2Oml de tetrahidrofurano e 10 ml de água, adicionou-se 2,52g (30 mmol) de bicarbonato de sódio sólido, seguido de 3,3 6g (13 mmol) de Fmoc-Cl. A misturafoi agitada por 3 horas, diluída com acetato de etila, as camadas separadas, e a camada orgânica lavada com água, secada sobre sulfato de magnésio e concentrada.

(b) Desproteção de grupo hidroxila: para compostos contendo grupo protetor tBu éter: os compostos foramdesprotegidos com uma solução de ácido trifluoroacético a 90% em diclorometano por 1-2 horas, e então concentrados até secagem. O resíduo foi dissolvido em acetato de etila e lavado com uma solução saturada de bicarbonato de sódio, secado sobre sulfato de magnésio e então concentrado. Para compostos contendo um grupo protetor Trt éter: os compostos foram desprotegidos adicionando-se uma solução de ácido trifluoroacético a 1-10% em diclorometano contendo tri-isopropil silano a 2-10%. A reação foi instantânea. A solução foi então neutralizada despejando-se numa solução saturada de bicarbonato desódio. As camadas foram separadas, secadas sobre sulfato<table>table see original document page 82</column></row><table><table>table see original document page 83</column></row><table>

Síntese de ácido 4-Fmoc-5-substituído-6-oxo-piperazino-2-carboxílico (7) : Os compostos (7) foram preparados conforme descrito no Método A. Os compostos (7) foram purificados através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.<table>table see original document page 84</column></row><table><table>table see original document page 85</column></row><table>

Método E: Metil éster de ácido acético (2-Fmoc-amino-3-hidroxi-propil-Cbz-amino)-2 - substituído (15) foipreparado através de aminação redutiva de Fmoc serinal (OR') (9) com um α-amino éster (2), utilizando cianoborohidreto de sódio ou triacetoxiborohidreto de sódio como agente redutor. A amina secundária foi protegida com cloroformiato de benzila e então o grupo hidroxila desprotegido com solução de ácido trifluoroacético. Os compostos (15) foram então desprotegidos com Fmoc. Os intermediários de amino éster foram imediatamente ciclizados para formar 4-Cbz-3-substituído-6-hidroximetil-piperazin-2-onas-4-Cbz-3 -substituídas (16) 6-hidroximetil-piperazin-2-onas Fmoc-3-substituídas (6) foram preparadas através de troca de grupo protetor e então oxidadads aos produtos desejados (7) conforme descrito no método A.<formula>formula see original document page 86</formula>

Síntese de metil éster de ácido acético (2-Fmoc-amino-3-hidroxi-propil-Cbz-amino)-2- substituído (15) : Uma suspensão de 67 mmol de cloridrato de amino éster (2) e 5 20,9 mmol de hidróxido de potássio sólido em 80 ml de metanol foi agitada à temperatura ambiente por 2 5 minutos e então adicionada a uma suspensão de (9) em 2 50 ml de metanol. A mistura de reação foi agitada por 1,5 horas, seguida de lenta adição de 70 ml de solução IN de 10 cianoborohidreto de sódio em tetrahidrofurano. A solução foi agitada da noite para o dia e então concentrada. 0 resíduo foi repartido em 3 00 ml de tetrahidrofurano e 50 ml de solução IN de ácido clorídrico. As camadas foram separadas e a camada orgânica neutralizada com uma solução de 239 mmol de bicarbonato de sódio em 50ml de água, e então 6 6 mmol de clorof ormiato de benzila foi adicionado lentamente e a reação agitada por 3 horas, diluída com 200 ml de acetato de etila e as camadas separadas. A camada orgânica foi secada sobre sulfato de 20 magnésio, e concentrada. 0 resíduo foi dissolvido numa solução de ácido trifluoroacético em diclorometano, eagitada à temperatura ambiente por 2 horas. A solução foi despejada sobre 200ml de solução de bicarbonato de sódio saturado. As camadas foram separadas e a camada orgânica secada sobre sulfato de magnésio e concentrada. Os compostos (15) foram purificados através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.

<table>table see original document page 87</column></row><table>

Síntese de 4-Cbz-6-hidroximetil-3-substituído-piperazin-2-onas (16) : Uma solução de 24 mmol de (15) em 100 mL de dietilamina a 30% em acetato de etila foi agitada à temperatura ambiente da noite para o dia, e então concentrada até secagem. Os compostos foram purificados através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.

<table>table see original document page 87</column></row><table>

Síntese de 4-Fmoc-6-hidroximetil-3-substituído-piperazin-2-onas (6) : Uma suspensão de 15 mmol de (16), e 1.8 g de paládio a 10% sobre carbono em 50 mL de etanol foi hidrogenada à temperatura ambiente e pressão atmosférica até que HPLC mostrasse que a reação estava completa. A mistura foi então filtrada em placa de celite, concentrada, e o resíduo dissolvido em 3 5 ml de tet rahidrof urano e 10 ml de água, e então 62 mmol de bicarbonato de sódio sólido foram adicionados, seguido de 16 mmol de Fmoc-Cl, e a mistura foi agitada por 3 horas, diluída com 100 ml de acetato de etila e 10 ml de água. As camadas foram separadas e a camada orgânicasecada sobre sulfato de magnésio e concentradas. Os compostos (6) foram purificados através de cromatografiade coluna sobre sílica gel.

<table>table see original document page 88</column></row><table>

Síntese de ácido 4-Fmoc-5-substituído-6-oxo-piperazino-2-carboxílico (7) : Os compostos (7) foram preparados conforme descrito no método A, e purificados através decromatografia de coluna sobre sílica gel.

<table>table see original document page 88</column></row><table>

Método F: Metil ésteres de ácido acético(2-Cbz-amino-3-benziloxi-propylamino)-2-substituídos (20) forampreparados através de aminação redutiva de Cbz serinal (OBn) (19) com α-amino éster(2), utilizando cianoborohidreto de sódio ou triacetoxiborohidreto de sódio como agente redutor. 0 Cbz 0-benzil serinal (19) necessário para a aminação redutiva foi obtido mediante 15 oxidação de Cbz serinol (OBn) (18) com periodinano Dess-Martin. A hidrogenação de (20) seguida de ciclização deu 6-hidroximetil-piperazin-2-onas 3-substituídas que foram então protegidas com Fmoc em 6-hidroximetil-piperazin-2-onas 4-Fmoc-3-substituídas (6). Os produtos finais (7) foram obtidos conforme descrito no método A.<formula>formula see original document page 89</formula>

preparado conforme descrito para o composto (13). O composto (18) foi obtido com 79% rendimento após 5 purificação através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.

1H NMR δ (CDCl3) 3.57 -3.74 (dois m, 3H, CHN, e CH2O), 3.76-3.96 (dois m, 2H, CH2O), 4.50 (s, 2H, CH2O), 5.10 (s, 2H, CH2O), 5.40-5.50 (br. d, 1H, NH), 7.22-7.38 (m,10H, Ph); HPLC tR = 5.33 min, (M+ + Na+) = 337.64.

Síntese de Cbz serinal (OBn) (19) : 0 composto (19) foi preparado conforme descrito para composto (9) . A uma solução de 80 mmol de Cbz-O-Bn serinol (18) em 200 ml de diclorometano seco, mantida à temperatura ambiente sob nitrogênio, adicionou-se 88 mmol de periodinano Dess-Martin e a reação agitada por 2,5 horas, e então rapidamente resfriada mediante adição de 400 ml de solução aquosa a 10% de tiossulfato de sódio. As camadas foram separadas e a camada orgânica concentrada, diluídas com 300 ml de etil éter, e lavadas três vezes com uma solução saturada de bicarbonato de sódio contendotiossulfato de sódio a 10%, secadas sobre sulfato de magnésio e concentradas. 0 composto (19) foi obtido com rendimento bruto de 99% e utilizado sem purificação adicional.

1H NMR δ (CDCl3) 3.69-3.78 (dd, 1H, CH2O), 3.99-4.06 (dd, 1H, CH2O), 4.37-4.46 (m, 1H, CHN) , 4.47-4.52 (d, 2H, CH2O), 5.14 (s, 2H, CH2O), 5.65-5.75 (br. d, 1H, NH), 7.14-7.48 (uma série de m, 9H, Ph), 7.98-8.08 (dd, 1H, Ph), 9.63 (s, 1H, CHO). 10 Síntese de metil ésteres de ácido acético (2-Cbz-amino-3-benziloxi-propylamino)-2 - substituídos (20): Os compostos (2 0) foram preparados conforme descrito para o composto (10) , porém utilizando Cbz serinal (19) como o aldeído. Os compostos (2 0) foram purificados através de 15 cromatografia de coluna sobre sílica gel.

<table>table see original document page 90</column></row><table>

Síntese de 4-Fmoc-6-hidroximetil-3-substituído-piperazin-2-onas (6) : Uma suspensão de 3 8 mmol de (2 0) em 160 ml de etanol, 3 8 ml de ácido clorídrico IN, e 2Og de paládio a 10% sobre carbono, foi hidrogenada à temperatura 20 ambiente e pressão atmosférica até que HPLC mostrasse que a reação estava completa. A mistura foi então filtrada em placa de celite e concentrada até secagem. o resíduo foi diluído com 75 ml de tetrahidrofurano e neutralizado com uma solução saturada de bicarbonato de sódio. 106 mmol de bicarbonato de sódio sólido e 53 mmol de cloreto de Fmoc foram adicionados e a reação agitada à temperatura ambiente até que HPLC mostrasse que a reação estava completa, diluídos com 300 ml de acetato de etila e 300 ml de salmoura. As camadas foram separadas e a camadaorgânica lavada duas vezes com salmoura, secadas sobre sulfato de magnésio e concentradas. 0(s) produto(s) foram purificados através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.

Síntese de ácido 4-Fmoc-5-substituído-6-oxo-piperazino-2-carboxílico (7): Os compostos (7) foram preparados conforme descrito no método A

Síntese de Estruturas de cetopiperazina 2,2-di-substituídas Simulando Aminoácidos sem Cadeias Laterais 10 Funcionalizadas (Método G)

As sínteses de estruturas de ácido 4-Fmoc-5-substituído-6-oxo-piperazino-2-metil-2-carboxílico simulandoaminoácidos sem cadeias laterais funcionalizadas foram realizadas utilizando o método G. Ter-butil ésteres de 15 ácido 2-Boc-amino-3-metoxicarbonil-1-substituído-

metilamino-2-metil-propiônico (23) foram preparados através de aminação redutiva de metil éster de ácido 2-Boc-amino-2-metil-3-oxo-propiônico (22) com a-amino-éster (2) , utilizando cianoborohidreto de sódio ou triacetoxiborohidreto de sódio como agente redutor. 0 composto (22) necessário para a aminação redutiva foi obtido através da oxidação de ter-butil éster de a-metil-Boc serina (21) com periodinano Dess-Martin. 0 grupo Boc de (23) foi removido com cloreto de hidrogênio 2N em dioxano, e os amino-ésteres ciclizados a ter-butil ésteres de ácido 5-substituído-6-oxo-piperazino-2-metil-2-carboxílico desprotegidos (24), que foram protegidos com cloreto de Fmoc para dar ter-butil ésteres de ácido 4-Fmoc-5-substituído-6-oxo-piperazino-2-metil-2 -30 carboxílico, que foram desprotegidos com ácido trifluoroacético para dar os produtos finais (25).<table>table see original document page 92</column></row><table>

Síntese de ter-butil éster de ácido 2-Boc-amino-2-metil-3-oxo-propiônico (22) : A oxidação de ter-butil éster de α-metil serina (21) foi realizada utilizando periodinano Dess-Martin conforme anteriormente descrito, dando o produto desejado (22) com 96% de rendimento bruto. 0 composto foi utilizado sem purificação adicional na etapa seguinte.

1H NMR Ô (CDCl3): 1.44 (s, 18H, tBu), 1.46 (s, 3H, CH3), 5.63-5.70 (br. s, 1H, NH), 9.5 (s, 1H, CHO) Síntese de ter-butil éster de ácido 2-Boc-amino-3-metoxicarbonil-1-substituído-metilamino-2-metil-propiônico (23): Os compostos (23) foram preparados utilizando um procedimento similar ao descrito para o composto (10), porém utilizando o composto (22) como aldeído. Os compostos (23) foram purificados através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.<table>table see original document page 93</column></row><table>

Síntese de ácido 2-metil-6-oxo-5-substituído-piperazino-2-carboxílico (25): uma solução de 4mmol de (23) em 8 ml de cloreto de hidrogênio 2N em dioxano foi agitada à 5 temperatura ambiente por 5 horas, e então concentrada até secagem. 0 resíduo foi resuspenso em 2 0 ml de tetrahidrofurano, neutralizado com 10 mmol de trietilamina, e agitado a 60°C por 2 dias. Foi então concentrado até secagem, resuspenso em 20 ml de 10 tetrahidrofurano e 10 ml de água, bicarbonato de sódio sólido foi adicionado para ajustar o pH em básico, seguido de 5,6 mmol de cloreto Fmoc sólido e a mistura de reação agitada da noite para o dia à temperatura ambiente, o pH ajustado em 1 com solução de ácido 15 clorídrico, diluído com 100 ml de acetato de etila, e as camadas separadas. A camada orgânica foi lavada com 2 χ 100 ml de salmoura, secada sobre sulfato de magnésio e concentrada. O resíduo foi dissolvido em 10 ml de ácido trifluoroacético a 50% em diclorometano, e a solução 2 0 agitada à temperatura ambiente por 3 horas. 0 solvente foi concentrado e os produtos (25) purificados através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.

<table>table see original document page 93</column></row><table>

Síntese de estruturas de cetopiperazina 2,2-di-substituídas simulando aminoácidos com cadeias laterais 25 funcionalizadas (Método H)As sínteses de estruturas de ácido 4-Fmoc-5-substituído-6-oxo-piperazino-2-metil-2-carboxílico simulandoaminoácidos com cadeias laterais funcionalizadas são realizadas utilizando o método H. Metil éster de ácido 2-Aloc-amino-3-metoxicarbonil-1-substituído-metilamino-2 -metil-propiônico (30) é preparado através de aminação redutiva de metil éster de ácido 2-Aloc-amino-2-metil-3-oxo-propiônico (28) com α-amino alil éster (29) , utilizando cianoborohidreto de sódio ou triacetoxiborohidreto de sódio como agente redutor seguido de proteção da amina secundária com cloroformiato de benzila. O composto (28) necessário para a aminação redutiva é obtido através oxidação de (27) com periodinano Dess-Martin. Os grupos alil éster e aloc dos análogos (30) são removidos utilizando tetracistrifenil fosfino paládio (0) e o aminoácido ciclizado através da reação com um reagente acoplador de peptídeo para dar metil ésteres de ácido 5-substituído-6-oxo-piperazino-2-metil-2-carboxílico (31). Ácidos 4-Fmoc-5-substituído-6-oxo-piperazino-2-metil-2-carboxílicos (25) são obtidos através de saponificação do metil éster, seguido de troca de grupo protetor.

Método H

<formula>formula see original document page 94</formula><formula>formula see original document page 95</formula>

Síntese de metil éster de aloc-a-metil serina (27) : Uma solução de 8 mmol de Boc α-metil serina (26), 1,0 g (12 mmol) de bicarbonato de sódio sólido e 1,0 ml (16 mmol) de iodometano em 8 ml de dimetilformamida seca, mantida sob nitrogênio é agitada da noite para o dia. A mistura de reação é então despejada sobre 50 ml de água e extraída com 50 ml de dietil éter, e lavada com 1 χ 20 ml de água, secada sobre sulfato de magnésio e concentrada. O resíduo foi dissolvido em 2 0 ml de ácido 10 trifluoroacético a 90% em diclorometano, e a solução agitada à temperatura ambiente por 3 horas, e então concentrada até secagem. O resíduo é dissolvido em 3 5 ml de tetrahidrofurano, e 10 ml de água, seguido de adição de 30 mmol de bicarbonato de sódio sólido, e lenta adição de 12mmol de cloroformiato de alila. A mistura é agitada à temperatura ambiente por 2 horas, diluída com 50 ml de acetato de etila, e as camadas separadas. A camada orgânica é então lavada com 1 χ 10 ml de bicarbonato de sódio saturado e 1 χ 10 ml de ácido clorídrico IN e 1 χ 10 ml de água, secada sobre sulfato de magnésio e concentrada. 0 composto (27) é purificado através de cromatografia de coluna sobre sílica gel. Síntese de metil éster de ácido 2-Aloc-amino-2-metil-3-oxo-propiônico (28) : A oxidação de metil éster de aloc α-metil serina (27) é realizada utilizando periodinano Dess Martin conforme acima descrito para dar o produto desejado (28).

Síntese de alil éster de ácido 2-aloc-amino-3-metoxicarbonil-1-substituído-metil-Cbz-amino-2-metil- propiônico (3 0) : Os compostos (30) são preparados utilizando um procedimento similar ao descrito para oscompostos (15) porém utilizando o composto (28) como aldeído.

Síntese de metil éster de ácido 4-Cbz-2-metil-6-oxo-5-substituído-piperazino-2-carboxílico (31): À solução de 10 mmol de composto (30) em 3 0 ml de diclorometano, mantida à temperatura ambiente sob nitrogênio, adicionou-se 2 equivalentes de fenilsilano e 0,3 equivalentes de tetracisfenilfosfino paládio (0) e a solução foi agitada por 2 horas, e então 11 mmol de TBTU e 14 mmol de Ν-metil-morfolina foram adicionados e a solução agitada à temperatura ambiente por 2 horas e então concentrada até secagem.

Síntese de ácido 4-Fmoc-2-metil-6-oxo-5-substituído-piperazino-2 -carboxílico (25): A uma solução de composto (31) em 2 5 ml de metanol, mantida à temperatura ambiente sob nitrogênio, adicionou-se lentamente 11 mmol de solução de hidróxido de sódio IN, e a reação é agitada à temperatura ambiente da noite para o dia, neutralizada com 21 ml de solução de ácido clorídrico IN, Ig de paládio a 10% sobre carbono é adicionado, e a suspensão hidrogenada à temperatura ambiente e pressão atmosférica por 3 horas. A suspensão é filtrada em placa de celite e concentrada. O resíduo é redissolvido em 2 5 ml de tetrahidrofurano e 10 ml de água, seguido de adição de 30mmol de bicarbonato de sódio sólido, e 10 mmol decloreto de Fmoc, e a reação agitada à temperatura ambiente sob nitrogênio por 2 horas. A reação é então diluída com 50 ml de acetato de etila, e acidificada com solução de ácido clorídrico IN. As camadas são então separadas e a camada orgânica lavada com 1 χ 20 ml de água, secadas sobre sulfato de magnésio e concentradas. Os compostos (25) são purificados através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.

Síntese de estruturas de ácido(5-substituído-6-oxo-piperazin-2-il)acético (Métodos I, J, K).

As sínteses de estruturas de ácido(5-substituído-6-oxo-piperazin-2-il)acético foram realizadas através dediversos métodos.

Método I : (3-protegido-amino-4-(metoxicarbonil-

substituído-metilamino)-butiratos de ter-butila (35) foram preparados através de aminação redutiva de 3-5 protegido-amino-4-oxo-butirato de ter-butila (34) com a-amino ésteres (2) utilizando cianoborohidreto de sódio ou triacetoxiborohidreto de sódio como agente redutor. o 3-protegido-amino-4-oxo-butirato de ter-butila (34) necessário para a aminação redutiva foi preparado através 10 de redução com hidreto de lítio alumínio (LAH) dos derivados de amida Weinreb (33) . Análogos de (3-protegido-amino-4-(metoxicarbonil-substituído-metilamino)butirato de ter-butila (35) foram então desprotegidos, ciclizados e protegidos com Fmoc para dar 15 (5-substituído-6-oxo-piperazin-2-il)acetatos de ter-butila (36) , que foram então desprotegidos para dar os produtos finais (37). Método I

<formula>formula see original document page 97</formula>Síntese de amida Weinreb Asp-(OtBu) amino-protegida (33): Os compostos (33) foram preparados utilizando um procedimento similar ao descrito para o composto (14):

<table>table see original document page 98</column></row><table>

Síntese de 3-amino protegido-amino-4-oxo-butirato de ter-butila (34) : Os compostos (34) foram preparados utilizando um procedimento similar ao descrito para o composto (9)

<table>table see original document page 98</column></row><table>

Síntese de 3-Protegido-amino-4-(metoxicarbonil-substituído-metilamino)-butirato de ter-butila (35) :

Os compostos (35) foram preparados utilizando um procedimento similar ao descrito para os compostos (10), porém utilizando os compostos (34) como aldeído.

<table>table see original document page 98</column></row><table><table>table see original document page 99</column></row><table>

Síntese de (4-Fmoc-5-substituído-6-oxo-piperazin-2-il)-acetato de ter-butila (36): Para compostos contendo grupo protetor Fmoc amino, uma solução de 10 mmol de composto (35) em 30 ml de dietilamina a 30% em solução de acetato 5 de etila foi agitada à temperatura ambiente da noite para o dia e então concentrada até secagem. Para compostos contendo grupo protetor Cbz amino, uma solução de 10 mmol de composto (35) em 3 0 ml de etanol foi hidrogenada à temperatura ambiente e pressão atmosférica por 2 horas, 1 filtrada em celite e concentrada até secagem. Para proteção com Fmoc, o resíduo foi dissolvido em 20 ml de tetrahidrofurano, e 10 ml de água, e 2,52g (3 0 mmol) de bicarbonato de sódio sólido foi adicionado, seguido de adição de 3, 3g (13 mmol) de cloreto de Fmoc. A mistura 15 foi agitada por 3 horas e diluída com acetato de etila. As camadas foram separadas, e a camada orgânica lavada com água, secada sobre sulfato de magnésio e concentrada. Os compostos (36) foram purificados através decromatografia de coluna sobre sílica gel.

<table>table see original document page 100</column></row><table>

Síntese de (4-Fmoc-5-substituído-6-oxo-piperazin-2-il)-acetato (37) : Os compostos (36) foram desprotegidos com solução de ácido trifluoroacético a 90% em diclorometano por 3 horas, e então concentrados até secagem. Os produtos finais (37) foram purificados através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.<table>table see original document page 101</column></row><table>

Método J: 3-Fmoc-amino-4-(metoxicarbonil-substituído-metilamino)-butiratos de difenilmetila (41) foram preparados através de aminação redutiva de 3-Fmoc-amino-4-oxo-butirato de difenilmetila (40) com α-amino ésteres (2) utilizando cianoborohidreto de sódio ou triacetoxiborohidreto de sódio como agente redutor. O 3-Fmoc-amino-4-oxo-butirato de difenilmetila (40) necessário para a aminação redutiva foi preparado atravésde redução com hidreto de lítio alumínio do derivado de amida Weinreb(39), que se formou do derivado de a-alil éster de ácido Fmoc-aspártico (38) disponível no mercado através da proteção do β-éster sob condições Mitsunobu. 0 alil éster foi removido utilizando catalisador de paládio (O), seguido da formação de amida Weinreb utilizando TBTU como agente acoplador. 3-Fmoc-amino-4-(metoxicarbonil-subst ituído-met ilamino) -butirato de difenilmetila (41) foi então desprotegido com Fmoc, ciclizado, difenilmetil éster removido através de hidrogenação, seguido de proteção com Fmoc para dar o produto final ácido (4-Fmoc-5-substituído-6-oxo-piperazin-2-il)-acético

Método J

<formula>formula see original document page 102</formula>

Síntese de amida Weinreb Fmoc-Asp- (OCHPh2) (39) : A uma solução de 5,Ig (13,0mmol) de α-alil éster de ácido Fmoc-aspártico (38) em 30ml de tetrahidrofurano seco, contendo 3,4g (13 mmol) de trifenilfosfino e 2,41g (13,1 mmol) de difenilmetanol, mantida a O0C sob nitrogênio, adicionou-se lentamente 2,6ml (13,4mmol) de azodicarboxilato de diisopropila. 0 banho gelado foi removido, e a reaçãoagitada da noite para o dia à temperatura ambiente, concentrada até secagem, e então purificada através de cromatografia de coluna sob sílica gel.

1H NMR δ (CDCl3) 2.96-3.06 (dd, 1H, CH2CO), 3.15-3.26 (dd, 1H, CH2CO), 4.18-4.76 (uma série de m, 3H, CH, CH2), 5.14-5.32 (m, 1H, CHN), 5.76-5.86 (m, 1H, CHO), 7.20-7.80 (uma série de m, 18H, fulveno, e Ph); HPLC tR = 7.68 min, (M+ + Na+) = 583. 90.

0 produto (9.8 mmol) foi então dissolvido em 40 ml de uma solução de diclorometano:ácido acético:N-metil morfolina a 37:2:1 contendo 1,5g (l,3mmol) de tetracis trifenilfosfino paládio (0), e a solução foi agitada à temperatura ambiente da noite para o dia, concentrada até secagem, e repartida em 100 ml de acetato de etila e 30ml de água. As camadas foram separadas e a camada orgânica lavada com 1 χ 50 ml de água, secada sobre sulfato de sódio e concentrada. 0 resíduo foi suspenso em 2 Oml de diclorometano seco, e 1,65ml (15 mmol) de N-metil morfolina, e 4,07g (12,7 mmol) de TBTU foram adicionados, e a suspensão agitada à temperatura ambiente por 20 minutos, seguido de adição de 1,65 ml(15 mmol) de N-metil morfolina e 1,52 g (15,6 mmol) de sal de cloridrato de Ν,Ο-dimetil hidroxilamina. A suspensão foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas, concentrada, repartida em 100 ml de acetato de etila e 50ml de água. A camada orgânica foi lavada com 1x3 0 ml de água, 1x3Oml de solução saturada de bicarbonato de sódio e 1x3Oml de solução IN de ácido clorídrico, secada sobre sulfato de sódio, e concentrada. 0 produto foi purificado através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.

1H NMR δ (CDCl3) 2.76-2.88 (dd, 1H, CH2CO), 2.89-3.00 (dd, 1H, CH2CO), 3.16 (s, 3H, CH3N), 3.70 (s, 3H, CH3O), 4.14-4.22 (dd, 1H, CH), 4.28-4.40 (t, 2H, CH2), 5.07-5.16 (dd, 1H, CHN), 5.69-5.76 (d, 1H, CHO) , 7.24-7.8 (uma série de m, 18H, fulveno, e Ph); HPLC tR = 7.08, (M+ + Na+) = 587.03.

Síntese de 3-Fmoc-amino-4-oxo-butirato de difenilmetila(40) : O composto (40) é preparado utilizando um procedimento similar ao descrito para o composto (9). Síntese de 3-Fmoc-amino-4-(metoxicarbonil-substituído-metilamino)-butirato de difenilmetila (41): Os compostos (41) foram preparados utilizando um procedimento similar ao descrito para os compostos (10), porém utilizando o composto (4 0) como aldeído.

<table>table see original document page 104</column></row><table>

Síntese de ácido (4-Fmoc-5-substituído-6-oxo-piperazin-2-il)-acético (37) : Uma solução de 10 mmol de composto (41)em 30 mL de dietilamina a 30% em acetato de etila foi agitada à temperatura ambiente por 3 horas. A solução foi então concentrada até secagem, redissolvida em 2 χ 3Oml de acetato de etila, e reconcentrada. O resíduo foi dissolvido em 50ml de etanol, e 2Oml de solução IN de ácido clorídrico e hidrogenado à temperatura ambiente e pressão atmosférica da noite para o dia, filtrado em placa de celite e concentrado até secagem. O resíduo foi dissolvido em 20ml de tetrahidrofurano, e 10 ml de água e 2,52g(30 mmol) de bicarbonato de sódio sólido foi adicionado, seguido da adição de 3,3g (13 mmol) de cloreto de Fmoc. A mistura foi agitada por 3 horas, diluída com 100 ml de acetato de etila, as camadas separadas, e a camada orgânica lavada com 2 χ 50ml de água, secada sobre sulfato de magnésio e concentrada. O produto foi purificado através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.Dados analíticos para compostos (37)

1H NMR δ (CDCl3) 1.2-1.6 (m, e s, 7H, CH2, CH3Ph), 2.10 (s, 2H, CH2), 2.46 (s, 3H, CH3-Ph), 2.56 (s, 3H, CH3-Ph), 2.46-2.63 (br. m, 2H, CH2CO), 3.0-3.95 (3 br. m, 5H, CH2N, CHN) , 4.10-4.30 (br. m, 1H, CH), 4.40-4.80 (br. m, 3H, CHN, CH2,), 7.22-7.80 (uma série de m, 8H, fulveno), HPLC tR = 5.73, (M+ + 1) 732.24.

NHPbf

Método K: As sínteses de estruturas de

ácido (5-substituído-6-oxo-piperazin-2-il)-acético foram executadas a partir do α-ter-butil éster de ácido Fmoc-5 aspártico (42). 0 α-ter-butil éster de ácido Fmoc-aspártico é reduzido a α ter-butil éster de Fmoc-homoserina com borohidreto de sódio através de anidrido misto, seguido de proteção do álcool com brometo de benzila para dar α-ter-butil éster de Fmoc-homoserina 10 benzil éter (43). 0 ter-butil éster é então removido com ácido trifluoroacético, e o ácido reduzido ao álcool com borohidreto de sódio via anidrido misto para dar 2-Fmoc-amino-4 -benziloxi - 1 -butanol (44). 0 álcool (44) é então convertido em 2-Fmoc-amino-4-benziloxibutanal (45) utilizando periodinano Dess-Martin conforme anteriormente descrito. A aminação redutiva de 2-Fmoc-amino-4-benziloxibutanal (45) e α-amino éster (2) dá metil éster de ácido acético(2-Fmoc-amino-4-benziloxi-butilamino)-2-substituído (46) . A desproteção de Fmoc com dietilamina 20 dá a amina primária livre que cicliza em 6-benziloxietil-3-substituído-piperazin-2-ona espontaneamente. 0 benzil éter é removido por hidrogenação, e a amina secundária protegida como seu derivado de Fmoc para dar 4-Fmoc-6-hidroximetil-3-substituído-piperazin-2-onas (47).

Finalmente, o álcool primário é oxidado ao ácido para dar os produtos finais (48)conforme descrito no método A.<formula>formula see original document page 106</formula>

Síntese de α-ter butil éster de Fmoc-Homoserina (43) : A uma solução de 10.0 mmol de Fmoc Asp-OtBu (42) em 50 mL de tetrahidrofurano seco, mantida a -20°C sob nitrogênio, adicionou-se l,77ml(12,7 mmol)detrietilamina, seguido de lenta adição de l,57ml (12,0 mmol) de cloroformiato de isobutila. A mistura é agitada por 3 0 minutos, e então lentamente despejada sobre solução gelada de 3,77g (99,6 mmol) de borohidreto de sódio em 10 ml de água, mantendo-se a temperatura abaixo de 5°C. A reação é agitada a O0C por 15 minutos, e então rapidamente resfriada com solução de ácido clorídrico IN. A mistura de reação é diluída com IOOml de acetato de etila, e as camadas separadas. A camada orgânica é lavada com 2 χ 25 ml de solução de ácido clorídrico IN, 2x 25 ml de água, secada sobre sulfato de magnésio e concentrada e purificada através de cromatografia de coluna sobre sílica gel. 0 composto purificado é então dissolvido em3 0 ml de tetrahidrof urano e 12 mmol de dispersão de hidreto de sódio a 60% em óleo mineral é adicionado, seguido de 0,2mmol de iodeto de tetrabutilamônio e 12 mmol de brometo de benzila e a mistura é agitada da noite para o dia, rapidamente resfriada com 50ml de bicarbonato de sódio aquoso saturado e extraída com 100ml de acetato de etila. O composto é então purificado através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.

Síntese de 2-Fmoc-amino-4-benziloxi-1-butanol (44): A desproteção do ter-butil éster utilizando ácido trifluoroacético a 90% é realizada conforme descrito para o composto (37) no método I, seguido de redução do ácido ao álcool com borohidreto de sódio via intermediário de anidrido misto conforme descrito para o composto (13). Síntese de 2-Fmoc-amino-4-benziloxi-butanal (45): 2-Fmoc-amino-4-benziloxi-1-butanol (44) é oxidado ao aldeído utilizando periodinano Dess-Martin periodinano conforme descrito para a síntese de (9).

Síntese de metil éster de ácido acético (2-Fmoc-amino-4-benziloxi-butilamino)-2-substituído (46): a aminação redutiva de 2-Fmoc-amino-4-benziloxi-butanal (45) com a-amino éster (2) utilizando cianoborohidreto de sódio ou triacetoxiborohidreto de sódio como agente redutor é realizada conforme descrito para a síntese de (10).

Síntese de 4-Fmoc-6-hidroximetil-3-substituído-piperazin-2-onas (47) : a desproteção com Fmoc de metil éster de ácido acético (2-Fmoc-amino-4-benziloxi-butilamino)-2-substituído (46) com ciclização concomitante, seguida de desbenzilação e reproteção com Fmoc é realizada conforme descrito para o composto (37) no método J.

Síntese de ácido 4-Fmoc-5-substituído-6-oxo-piperazin-2-il-acético (37) : A oxidação de 4-Fmoc-6-hidroximetil-3-substituído-piperazin-2-onas (47) a ácido é realizada conforme descrito no Método A. A escolha do agente oxidante utilizado baseia-se na natureza do grupo na posição 5.

Síntese de estruturas de ácido 3-Oxo-[1,4]-diazepano-5 -carboxílico 2-substituído (Métodos L, Μ, N) A síntese de estruturas de ácido 3-Oxo-[1,4]-diazepano-5-carboxílico 2-substituído é realizada utilizando diversos métodos.

Método L: 2-Cbz-amino-4-(benziloxicarbonil-substituído-metil-Boc amino)-butiratos de ter-butila (52) são preparados através de aminação redutiva de Cbz-2-amino-4-oxo-butirato de ter-butila (50) com amino éster (51), utilizando cianoborohidreto de sódio outriacetoxiborohidreto de sódio como agente redutor, seguido de proteção da amina secundária com Boc. 0 Cbz-2-amino-4-oxo-butirato de ter-butila (50) necessário para a aminação redutiva é preparado através de redução com hidreto de lítio alumínio do derivado de amida de Weinreb (49). 0 anel de diazepano é formado através de remoção de grupo protetor, seguido de ciclização com um reagente formador de peptídeo para dar (53). Finalmente, ácidos 3-oxo-[1,4]-diazepano-5-carboxílico 4-Fmoc-2-substituídos (54) são formados através de troca de grupo protetor.

Método L

<formula>formula see original document page 108</formula>

Síntese de Cbz-Asp-(amida Weinreb)-O Bu (49): 0 composto (49) é preparado utilizando um procedimento similar ao descrito para o composto (14).Síntese de 3-Cbz-amino-4-oxo-butirato de ter-butila (50): O composto (50) é preparado utilizando-se um procedimento similar ao descrito para o composto (9)

Síntese de 2-Cbz-amino-4-(benziloxicarbonil-substituído-5 metilamino)-butirato de ter-butila (52): A aminação redutiva é realizada através de um procedimento similar ao descrito para o composto (10) . A amina secundária é protegida através de reação da mistura bruta com 2 equivalentes de dicarbonato de Boc em tetrahidrofurano. 10 Síntese de I-Boc 2-substituído-3-oxo-[1,4]-diazepano-5-carboxilato de ter-butila (53) : Uma solução de 10 mmol de composto (52) em 3 0 ml de etanol é hidrogenada à temperatura ambiente e pressão atmosférica por 2 horas, filtrada em placa de celite e concentrada até secagem. 0 resíduo é dissolvido em 100 ml de diclorometano e 1,2 equivalentes de TBTU, e 2,6 equivalentes de N-metil-morfolina são adicionados. A solução é agitada à temperatura ambiente da noite para o dia, e então concentrada. 0 resíduo é repartido em 50 ml de acetato de 20 etila e 25 ml de solução IN de ácido clorídrico, lavado com 1 χ 2 Oml de uma solução saturada de bicarbonato de sódio, secada sobre sulfato de magnésio e concentrada. Síntese de ácido I-Fmoc 2-substituído-3-oxo-[1,4]-diazepano-5-carboxílico (54) : Uma solução de IOmmol de 25 composto 953) em IOml de ácido trifluoroacético a 90% em diclorometano é agitada à temperatura ambiente por 2 horas, e então a solução é concentrada até secagem. 0 resíduo é dissolvido em 2Oml de tetrahidrofurano e IOml de água, e 2,52g (30 mmol) de bicarbonato de sódio sólido 30 é adicionado, seguido da adição de 3,36g (13 mmol) de Cloreto de Fmoc. A mistura é agitada por 3 horas, e então diluída com acetato de etila. As camadas são separadas, e a camada orgânica lavada com 2 χ 5Oml de água, secadas sobre sulfato de magnésio e concentradas. 35 Método M : Os análogos dipeptídicos reduzidos (60)são preparados através de aminação redutiva de Aloc-2-amino-4-oxo-butirato de difenilmetila (59) com amino éster(29) , utilizando cianoborohidreto de sódio ou triacetoxiborohidreto de sódio como agente redutor, seguido de proteção da amina secundária com Cbz. O aloc-2-amino-4-oxo-butirato de difenilmetila (59) necessário para a aminação redutiva é preparado através de redução do derivado de amina Weinreb com hidreto de lítio alumínio (58) , que é preparado através de troca de grupo protetor do derivado de amida Weinreb (57). O anel de diazepano é então formado através de remoção de grupo alila e aloc, seguido de fechamento de anel na presença de reagente formador de peptídeo. Estruturas de ácido 2-substituído 3-oxo-[1,4]-diazepano-5-carboxílico (54) são formadas através de troca de grupo protetor. Método M

<formula>formula see original document page 110</formula>Síntese de Fmoc-Asp-(amida Weinreb)-OCHPh2 (57) : 0 Composto (57) é preparado utilizando-se um procedimento similar ao descrito para o composto (39).

Síntese de Aloc-Asp-(amida Weinreb)-OCHPh2 (58): uma solução de IOmmol de composto (56) em 2Oml de dietilamina a 30% em acetato de etila é agitada por 2 horas, e concentrada até secagem. 0 resíduo é dissolvido em 2Oml de tetrahidrofurano e IOml de água e 2,52g (30 mmol) de bicarbonato de sódio sólido é adicionado, seguido daadição de 13 mmol de cloreto de aloc. A mistura é agitada por 3 horas e então diluída com acetato de etila. As camadas são separadas, e a camada orgânica lavada com água, secada sobre sulfato de magnésio e concentrada. 0 composto (58) é purificado através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.

Síntese de 3-Aloc-amino-4-oxo-butirato de difenilmetila (59) : 0 composto (59) é preparado utilizando um procedimento similar ao descrito para o composto (9) . Síntese de 2-Aloc-amino-4-(aliloxicarbonil-substituído-metilamino)-butirato de difenilmetila (60): 0 composto 60 é preparado através de aminação redutiva utilizando um procedimento similar ao descrito para compostos (15), porém utilizando o composto (59) como aldeído. 0 produto é purificado através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.

Síntese de I-Cbz 2-substituído-3-oxo-[1,4]-diazepano-5-carboxilato de difenilmetila (61): A uma solução de 1Ommol de composto (60) em 3 0 ml de diclorometano, mantida à temperatura ambiente sob nitrogênio, adicionouse 2 equivalentes de fenilsilano e 0,3 equivalentes de tetracisfenilfosfino paládio (0) e a solução agitada por 2 horas e então 1,2 equivalentes de TBTU e 1,3 equivalentes de N-metil morfolina são adicionados. A solução é agitada à temperatura ambiente da noite para o dia e concentrada. 0 resíduo é repartido em 50ml de acetato de etila e 25 ml de solução IN de ácido clorídrico, lavado com 1 χ 2Oml de uma solução saturadade bicarbonato de sódio, secado sobre sulfato de magnésio e concentrado.

Síntese de ácido I-Fmoc 2-substituído-3-oxo-[1,4]-diazepano-5-carboxíIico (54) : Uma solução de 10 mmol de 5 composto (61) em 3 Oml de etanol é hidrogenada à temperatura ambiente por 2 horas, filtrada em placa de celite e então a solução é concentrada até secagem. 0 resíduo é dissolvido em 20ml de tetrahidrofurano e IOml de água, e 2,52g (3 0 mmol) de bicarbonato de sódio sólido 10 é adicionado, seguido de adição de 3,36g (13 mmol) de cloreto de Fmoc. A mistura é agitada por 3 horas, e então diluída com acetato de etila. As camadas são separadas, e a camada orgânica lavada com água, secadas sobre sulfato de magnésio e concentradas. 15 Método N : β ter-butil éster de ácido Fmoc-aspártico é reduzido a β ter-butil éster de Fmoc-aspartanol (63) com borohidreto de sódio via anidrido misto, seguido de proteção do álcool com brometo de alila para dar Fmoc-aspartanol com β ter-butil éster de Fmoc-aspartanol alil 20 éter (64) . 0 ter-butil éster é então removido com ácido trifluoroacético e o ácido reduzido ao álcool com borohidreto de sódio via anidrido misto para dar 3-Fmoc-amino-4-aliloxi-l-butanol (65) . 0 álcool (65) é então convertido em 3-Fmoc-amino-4-aliloxibutanal (66) 25 utilizando periodinano Dess-Martin conforme previamente descrito. A aminação redutiva de 3-Fmoc-amino-4-aliloxibutanal (66) e α-amino éster (51) seguido de proteção com aloc na amina secundária, dá os benzil ésteres de ácido acético (3-Fmoc-amino-4-aliloxi-butil-30 aloc-amino)-2-substituídos (67). Aloc 7-aliloximetil-3-substituído- [1,4]-diazepan-2-onas (68) são formados através da saponificação do benzil éster, seguido de proteção de Fmoc com dietilamina para dar a amina primária livre que é ciclizado utilizando um reagente 35 formador de peptídeo tal como TBTU. 0(s) produto(s) final(ais) (54)são formados através de troca de grupo protetor: o alil éter e o aloc são removidos através depaládio (0) , e a amina secundária é protegida como seu derivado de Fmoc para dar 4-Fmoc-7-benziloximetil-3-substituído-[1,4]-diazepan-2-onas, seguido de oxidação com álcool primário ao ácido para dar os produtos finais (54). A escolha do agente oxidante utilizado é baseado na natureza do grupo na posição 2. Método N

<formula>formula see original document page 113</formula>

Síntese de β ter-butil éster de Fmoc-Aspartanol (63) : 0 composto (63) é preparado conforme descrito para a síntese do composto (13), utilizando β ter-butil éster de Fmoc-aspártico (62) como material de partida. Síntese de ter-butil éster de ácido 3- Fmoc-amino-4-aliloxi-butírico (64) : A uma solução de 10 mmol de (63) em 3 Oml de tetrahidrofurano, mantida à temperatura 15 ambiente sob nitrogênio, é adicionado 12mmol de dispersão de hidreto de sódio em óleo mineral, 2mmol de iodeto de tetrabutilamônio e 13 mmol de brometo de alila, e a mistura é agitada da noite para o dia, rapidamenteresfriada com IOml de bicarbonato de sódio aquoso saturado, eextraída com 50ml de acetato de etila.

Síntese de 3-Fmoc-amino-4-aliloxi-1-butanol (65): 0 composto (65) é preparado conforme descrito para a síntese do composto (44).

Síntese de 3-Fmoc-amino-4-aliloxi-butanal (66): 3-Fmoc-amino-4-aliloxi-l-butanol (65) é oxidado a aldeído utilizando periodinano Dess-Martin conforme descrito para a síntese de (9).

Síntese de metil éster de ácido acético (3-Fmoc-amino-4-aliloxi-butil-aloc-amino)-2-substituído (67): aaminação redutiva de3-Fmoc-amino-4-benziloxi-butanal 966) com α-amino éster (51)utilizando cianoborohidreto de sódio ou triacetoxiborohidreto como agente redutor conforme descrito para o composto (10), seguido de proteção da amina secundária como derivado de aloc, é realizada conforme descrito para o composto (150, porém utilizando cloroformiato de alila em vez de cloroformiato de benzila.

Síntese de 4-Aloc-7-aliloximetil-3 - substituído-[1, 4 ] -diazepan-2-onas (68) : Uma solução de 10 mmol of metil éster de ácido acético (3-Fmoc-amino-4-aliloxi-butil-aloc-amino)-2-substituído(67), 20 mmol de carbonato de potássio em 20 ml de metanol, e 10 ml de água é agitada à temperatura ambiente por 3 horas, neutralizada com 21 ml de uma solução IN de ácido clorídrico e então concentrada até secagem. O resíduo é dissolvido em 2 Oml de dietilamina a 30% em acetato de etila e agitado por 3 horas e então concentrado até secagem. O resíduo é dissolvido em 100 ml de diclorometano, e 12 mmol de TBTU e 24 mmol de N-metilmorfolina são adicionados e a solução agitada à temperatura ambiente da noite para o dia, e então concentrada até secagem. O resíduo é repartido em 30 ml de acetato de etila e 30ml de solução IN de ácido clorídrico e então as camadas são separadas. A camada orgânica é lavada com 30 ml de uma solução saturada debicarbonato de sódio, secada sobre sulfato de magnésio e purificada através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.

Síntese de ácido 4-Fmoc-2-substituído-3-oxo-[1,4] -diazepano-5-carboxílico (54) : À solução de 10 mmol de composto (68) em 30 ml de diclorometano, mantida à temperatura ambiente sob nitrogênio, adicionou-se 2 equivalentes de tetracistrifenilfosfino paládio (0) e a solução foi então agitada por 2 horas, e concentrada até secagem. A amina secundária é dissolvida em 20 ml de tetrahidrofurano e 10 ml de água, seguida de adição de 2,52g (30 mmol) de bicarbonato de sódio sólido e 1,2 equivalentes de cloreto de Fmoc e a solução bifásica é agitada à temperatura ambiente por 2 horas, diluída com 30 ml de acetato de etila,e as camadas separadas.

A oxidação de 4-Fmoc-7-hidroximetil-3-substituído- [1,4]-diazepan-2-onas ao produto final (54) é realizada conforme descrito no método A. A escolha do agente oxidante utilizado baseia-se na natureza do grupo na posição 2, como no Método A para a conversão de (6) em (7). Síntese de estruturas de ácido 6-substituído-5-oxo-piperazino-2-carboxíIico (Método O)

As síntese de estruturas de ácido 6-substituído-5-oxo-piperazino-2-carboxíIico contendo cadeias laterais não funcionalizdas na posição 6 são realizadas conforme descrito no Método 0, iniciando-se com a resina de 1-cloro-tritil 3-Fmoc-amino-1,2-propan-diol disponível no mercado (39) que é oxidada a cetona (70) utilizando periodinano Dess-Martin. A aminação redutiva a cetona (70) com α-amino éster (2) dá o metil éster de ácido acético (l-aminometil-2-cloro-tritiloxi-etilamino)-2-substituído ligado a resina (71), que é ciclizado a 5-clorotritiloximetil-3-substituído-piperazin-2-ona (72) após desproteção da amina. A reproteção da amina secundária, seguida de clivagem da resina, dá Fmoc-5-hidroximetil-3-substituído-piperazin-2-ona (73) que éoxidado a ácido 6-substituído-5-oxo-piperazino-2-carboxílico (74) utilizando qualquer um dos procedimentos descritos no Método A.

Método 0

<formula>formula see original document page 116</formula>

Síntese de l-amino-3-clortritiloxi-propan-2-ona (70): a oxidação de álcool ligado a resina (69) é realizada através de oxidação com trióxido de enxofre, oxidação com NMO/TPAP (N-óxido de N-metilmorfolina/perrutenato de tetrapropil amônio ou oxidação com PDC. Para a oxidação 10 com trióxido de enxofre, um procedimento similar ao descrito em Parikh7 J.R. e Doering, W.V., J. Am. Chem. Soe. 89:5505-5507 (1967) é utilizado.Para a oxidação com NMP/TPAP, a 0,3mmol de álcool ligado a resina adiciona-se uma solução de 3mmol de N-met ilmorf olina em 10 ml de 15 dimetilformamida seca e então 0,06 mmol de perrutenato de tetrapropilamônio (TPAP) é adicionado à suspensão de resina. A reação é sacudida por 8 0 minutos. 0 solvente é drenado, a resina lavada com tetrahidrofurano e diclorometano e então secada sob vácuo. Para a oxidação 20 com PDC, uma suspensão de álcool ligado a resina em 0,2M de dicromato de piridinio em dimetilformamida é sacudida a 3 7°C por 4 horas, o solvente é drenado e a resina lavada com dimetilformamida, tetrahidrofurano e diclorometano.

Síntese de metil éster de ácido acético(1-aminometil-2 -cloro-tritiloxi-etilamino)-2-substituído (71): A aminaçãoredutiva de cetona ligada a resina (70) com amino éster é realizada através de qualquer de dois métodos diferentes. Em um método, a uma solução de 2,6 mmol de α-amino éster (2) em 20ml de ácido acético 1% em dimetilf ormamida adiciona-se 2,6 mmol de triacetoxiborohidreto de sódio, seguido de adição imediata de 0,5 mmol de resina derivatizada com cetona (70) e a mistura é sacudida por 60 minutos, lavada com metanol, diisopropil etil amina a 10%, dimetilformamida, e metanol. Num segundo método, uma suspensão de 0,05 mmol de resina derivatizada com cetona (70) e 2,OM de cloridrato de α-amino éster (2) em metanol, contendo 0,05M cianoborohidreto de sódio é sacudida à temperatura ambiente por 5 horas, drenada e lavada.

Síntese de 5-clorotritiloximetil-3-substituído-piperazin-2-ona (72) : Uma suspensão de 0.05 mmol de resina em 10 ml de piperidina a 20% em dimetilformamida é sacudida à temperatura ambiente por 2 horas.

Síntese de Fmoc-5-hidroximetil-3-substituído-piperazin-2-ona (73) : Uma suspensão de 0.05 mmol de (72) em 10 mL dediclorometano, contendo 0,2 5 mmol de cloreto de Fmoc e 0,25 mmol de trietilamina é agitada à temperatura ambiente por 6 horas, drenada e lavada com diclorometano. A resina é resuspensa em 10 ml de ácido trifluoroacético a 95% em diclorometano e a suspensão sacudida por 2 horas, e filtrada, e o filtrado concentrado. Síntese de ácido Fmoc-6-substituído-5-oxo-piperazino-2-carboxílico (74) : A oxidação de (73) ao produto desejado é realizada através de qualquer um dos procedimentos descritos para o método A

Síntese de Aminoácidos a,α-Di-substituídos (Métodos P e Q)

Em certos construtos da invenção, é possível e previsto empregar um resíduo aminoácido di- substituído, tal como aminoácido α,α-disubstituído, onde os substituintes são iguais ou diferentes. Em um aspecto, um aminoácido «,cedi - substituído é empregado em qualquer posição Aaa1 ouAaa8, onde pelo menos uma das cadeias laterais dos aminoácidos a,α-di-substituídos é uma cadeia lateral de Nle, Ala, Leu, lie, Vai, Nva, Met(O) ou Met(O2). Os métodos sintéticos PeQ seguintes descrevem a preparação de (2-Amino-2-butil-ácido hexanóico) a,Q;-di-n- butilglicina, onde cada uma das cadeias laterais são -(CH2) 3-CH3, e assim, cada uma delas é igual à cadeia lateral de Nle. Porém, deve ficar entendido que métodos e esquemas similares podem ser empregados na preparação de outros aminoácidos α,α-di-substituídos, onde os substituintes são iguais ou diferentes. Adicionalmente, qualquer método para preparar um aminoácido α,α-di-substituído pode ser empregado na prática da presente invenção e a prática da presente invenção não se restringe aos métodos dos esquemas sintéticos a seguir descritos. Assim, qualquer método conhecido no estado da técnica, para a síntese de aminoácidos

a,α-di-substituídos pode ser empregado na prática da presente invenção. A seguir são descritos métodos alternativos para a preparação de aminoácidos a,cx-di-substituídos: Clark J.S. e Middleton M.D.: Síntese de aminoácidos alfa-substituídos e alfa,alfa-di-substituídos através do rearranjo de iletos de amônio gerados de carbenóides metálicos. Org. Lett. 4(5):765-8 (2002); Guino M., Hii K.K.: Resina Wang-aldeído como suporte reciclável para a síntese de derivados de aminoácidos alfa,alfa-disubstituídos. Org Biomol. Chem. 3 (17) : 3188-93 (2005); e Kotha S., Behera M.: Síntese e modificação de derivados de dibenzilglicina via reação de acoplamento cruzado Suzuki-Miyaura. J. Pept. Res. 64(2):72-85 (2004).<formula>formula see original document page 119</formula>

Síntese de benzoil di-n-butilglicina (80) : A uma solução de 10 mmol de benzoil glicina (75) em 20ml de diclorometano, mantida a 0°C sob nitrogênio, adicionou-se 5 lentamente 12 mmol de Ν,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC) , e a reação foi agitada por 2 horas para dar o composto (76) . 0 sólido é filtrado, e o filtrado concentrado. O resíduo é dissolvido em 15 ml de tetrahidrofurano, resfriado até 0°C, e então 24 mmol de 10 hidreto de sódio é adicionado, seguido de 3Ommol de brometo de n-butila. A suspensão é agitada a O0C por 2 horas e então deixada aquecer até temperatura ambiente, e a solução concentrada até secagem para dar o composto(77). Alternativamente, o composto (77) pode 15 também ser preparado a partir de benzoil norleucina (78) de forma similar exceto que 12 mmol de hidreto de sódio e 15 mmol de brometo de n-butila são utilizados. 0 composto (77) é dissolvido em metanol, 50 ml de solução de ácido clorídrico IN são adicionados, e a solução agitada por 2 20 horas e concentrada. 0 composto (80) é purificado atravésde cromatografia de coluna sobre sílica gel. Síntese de Fmoc di-n-butilglicina (81) : 10 mmol do composto (80) são dissolvidos em 30ml de dioxano e 10 ml de solução de ácido clorídrico 6N são adicionados e a solução refluxada da noite para o dia. A reação é resfriada até temperatura ambiente, concentrada até secagem, redissolvida em 30 ml de tetrahidrofurano e 10 ml de água e 30 mmol de bicarbonato de sódio são adicionados, seguido de 15 mmol de cloreto de Fmoc. A solução bifásica é agitada por 1 hora, e o tetrahidrofurano removido sob vácuo. A solução aquosa é extraída com 1 χ 50 ml de dietil éter, acidificada com solução IN de ácido clorídrico e extraída com 2 χ 50ml de acetato de etila. As camadas de acetato de etila são combinadas, secadas sobre sulfato de sódio e concentradas. 0 composto (8) é purificado através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.

Métodos similares podem ser empregados iniciando-se com qualquer derivado de aminoácido apropriado (similar ao composto 78), e utilizando um reagente de alquila, butila, aril butila ou aralquil butila o esquema produzirá uma variedade de substitutos de aminoácido (R,R')di-substituídos onde ReR' são diferentes.

Método Q

<formula>formula see original document page 120</formula>Síntese de Fmoc-α;, α di-n-butil glicina (87) : A uma suspensão de 2Ommol de cloridrato de metil éster de glicina (82) e 2g de crivos moleculares em pó em 40 ml de tetrahidrofurano seco, mantida à temperatura ambiente, adicionou-se 24 mmol de hidróxido de potássio, seguido de 22mmol de benzaldeído. A suspensão é agitada por 2 horas, filtrada, e o filtrado concentrado. 0 resíduo é redissolvido em 40ml de tolueno seco, e então adicionado a uma suspensão de 60 mmol de hidreto de sódio em tolueno, seguido da adição de 6Ommol de brometo de n-butila. A suspensão é agitada por 12 horas, seguida de adição de 30 ml de uma solução de ácido clorídrico 6N, agitada à temperatura ambiente por 2 horas, e então as camadas separadas. 0 sal de cloridrato de (84) assim obtido é utilizado in situ para a preparação de (87). Para isolar (84) para o sal de cloridrato, a camada aquosa é concentrada até secagem e o produto cristalizado de metanol-éter seco.

Alternativamente, o composto (84) pode ser preparado a partir de cloridrato de metil éster de norleucina utilizando um procedimento sintético similar exceto que 30 mmol de hidreto de sódio e 3 0 mmol de brometo de n-butila são utilizados para a conversão de (86) em (84). A mistura aquosa da forma de cloridrato do composto (9) conforme obtida acima é aquecida até refluxo por 1 hora e então resfriada até temperatura ambiente. É neutralizada com hidróxido de sódio sólido e então diluída com 3Oml de tetrahidrofurano. Bicarbonato de sódio (30 mmol) é adicionado seguido de 15 mmol de cloreto de Fmoc. A solução bifásica é agitada por 1 hora e o tetrahidrofurano removido sob vácuo. A solução aquosa é extraída com 1x50 ml de dietil éter, acidificada com solução de ácido clorídrico IN e extraída com 2 χ 50ml de acetato de etila. As camadas de acetato de etila são combinadas, secadas sobre sulfato de sódio e concentradas. 0 composto (87) é purificado através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.Métodos similares podem ser empregados, iniciando-se com qualquer derivado de aminoácido apropriado (similar ao composto 85) e utilizando um reagente de alquil butila, aril butila ou aralquil butila o esquema produzirá uma variedade de substitutos de aminoácido (R,R')di-substituídos onde ReR' são diferentes. Síntese de Estruturas (R,R') Di-Substituidas (Método R) A presente invenção prove ainda construtos nos quais os substitutos de aminoácido são empregados com dois grupos R, ReR'. O método a seguir descreve a síntese de ácido ácido (R) -5,5-dibutil-6-oxo-piperazino-2-carboxíIicoprotegido com Fmoc, onde ReR' são, cada qual, grupos que correspondem a uma porção de cadeia lateral de norleucina. Observa-se que o método abaixo pode ser modificado, em parte com base nos métodos anteriormente citados, para produzir substitutos de aminoácido (R, R')di-substituídos. Métodos similares podem ser empregados de forma tal que, iniciando-se com qualquer derivado de aminoácido apropriado (um composto similar ao composto (84)) o esquema possa produzir uma variedade de substitutos de aminoácido (R,R')di-substituídos onde R e R' são diferentes.

Método R

<formula>formula see original document page 122</formula>Síntese de metil éster de ácido(2-Fmoc-amino-3-ter-butoxi-propilamino)-2,2,di-n-butil acético (88): Uma suspensão de 21 mmol de (84, esquema Q) , e 2.9 mL (21 mmol) of trietilamina em 50 mL de tetrahidrofurano seco é 5 agitada à temperatura ambiente por 45 minutos, e então uma solução de ~20mmol de Fmoc-(0-t-butil)-serinal bruto (9, esquema D) em 3 0 mL de tetrahidrofurano é adicionada, seguida de l,7g de crivos moleculares em pó de 4Á e a suspensão é agitada por mais 2 horas. 6, 4g (3 0 mmol) de 10 triacetoborohidreto de sódio sólido é adicionado, e a suspensão agitada à temperatura ambiente dã noite para o dia. A suspensão é diluída com metanol, os crivos moleculares filtrados, e o filtrado concentrado. 0 resíduo é repartido em 100 ml de acetato de etila e 50ml 15 de água. A camada orgânica é secada sobre sulfato de sódio, filtrada e concentrada. 0 composto (88) é purificado através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.

Síntese de 4-Fmoc-6-hidroximetil-3,3-di-n-butil-piperazin-2-ona (89): Uma solução de 10 mmol do composto (88) em 30 mL of dietilamina a 30% em acetato de etila é agitada à temperatura ambiente da noite para o dia, e então concentrada até secagem. O resíduo é dissolvido em 20 ml de tetrahidrofurano e 10 ml de água, 2,52g (30 25 mmol) de bicarbonato de sódio sólido é adicionado, seguido de 3,3 6g (13 mmol) de cloreto de Fmoc. A mistura é agitada por 3 horas, diluída com 50ml de acetato de etila, as camadas separadas, e a camada orgânica lavada com 3Oml de água, secada sobre sulfato de magnésio e concentrada. A mistura bruta é dissolvida numa solução de 10ml de ácido trifluoroacético a 10% em diclorometano, agitada por 2 horas, e então concentrada até secagem.o resíduo é dissolvido em acetato de etila e lavado com 5 Oml de uma solução saturada de bicarbonato de sódio, 35 secado sobre sulfato de magnésio e concentrado. 0 composto (89) é purificado através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.Síntese de ácido 4-Fmoc-5,5-di-n-butil-6-oxo-piperazino-2-carboxílico (90) : A uma solução de 8 mmol de álcool (89) em 8Iml de acetonitrila mantida à temperatura ambiente, adicionou-se solução de tampão fosfato (preparada com 0,72g de fosfato de sódio monobásico e l,43g de fosfato de sódio dibásico em 29,5 ml de água), seguido de adição de 0,3 3g (2,lmmol) de TEMPO, e l,86g (16,5 mmol) de clorito de sódio, e a solução bifásica é colocada num banho de óleo mantido a 43°C. Uma solução de 4,3ml (2,6mmol) de solução de hipoclorito de sódio (preparada misturando-se 1,9ml de solução de hipoclorito de sódio a 10-13%, e 2,4ml de água) é adicionada lentamente. A reação é agitada a 43°C por 4 horas, resfriada à temperatura ambiente, 2Oml de hidrogeno sulfito de sódio a 10% adicionados, agitada por 10 minutos, diluída com 50ml de acetato de etila e as camadas separadas. A camada orgânica é lavada com 1 χ IOml de salmoura, 1 χ 10 ml de solução IN de ácido clorídrico, secada sobre sulfato de sódio e concentrada. O composto (90) é purificado através de cromatografia de coluna sobre sílica gel.

Síntese de Construtos da Invenção

Os construtos, conforme descritos nas diversas concretizações da presente invenção, podem ser prontamente sintetizados através de qualquer procedimento convencional conhecido para a formação de ligação peptídica entre aminoácidos. Tais procedimentos convencionais incluem, por exemplo, qualquer procedimento de fase em solução permitindo uma condensação entre o grupo alfa amino livre de um resíduo aminoácido tendo seu grupo carboxila ou outros grupos reativos protegidos e o grupo carboxila primário livre de outro resíduo aminoácido tendo seu grupo amino ou outros grupos reativos protegidos. Num procedimento convencional preferido, os construtos da presente invenção podem ser sintetizados através de síntese em fase sólida e purificados de acordo com os métodos conhecidos no estadoda técnica. Os substitutos de aminoácido da presente invenção podem ser incorporados aos construtos da presente invenção através de métodos substancialmente similares ou idênticos aos empregados com os resíduos.

Qualquer um de diversos procedimentos conhecidos utilizando uma variedade de resinas e reagentes podem ser utilizados para preparar os construtos da presente invenção.

O processo de sintetização dos construtos pode ser conduzido através de um procedimento, através do qual cada aminoácido ou substituto de aminoácido, na seqüência desejada, é adicionado, um de cada vez, sucessivamente a outro resíduo aminoácido ou substituto de aminoácido ou através de um procedimento por meio do qual os fragmentos de peptídeo com a seqüência de aminoácido desejada, que podem incluir um ou mais substitutos de aminoácido, são primeiramente sintetizados de forma convencional e então condensados para prover o construto desejado. O construto resultante é ciclizado para dar um construto cíclico da invenção.

Os métodos de síntese de peptídeo em fase sólida são bastante conhecidos e praticados no estado da técnica. Em tais métodos, a síntese dos construtos da invenção pode ser conduzida incorporando-se seqüencialmente os resíduos aminoácido ou os substitutos de aminoácido, um de cada vez, à cadeia peptídica crescente, de acordo com os princípios gerais dos métodos de fase sólida. Esses métodos são descritos em numerosas referências, inclusive Merrifield R.B., Síntese em Fase Sólida (Nobel lecture). Angew. Chem. 24:799-810 (1985) e Barani et al. , Os Peptídeos, Análise, Síntese e Biologia, Vol. 2, Gross E. e Meienhofer J., Eds. Academic Press, 1-284 (1980). Nas sínteses químicas dos construtos, grupos de cadeia lateral reativos dos diversos resíduos aminoácido ou substitutos de aminoácido são protegidos com grupos protetores apropriados, que impedem a ocorrência de reação química naquele local até que o grupo protetorseja removido. É também comum a proteção do grupo alfa amino de um resíduo aminoácido ou substituto de aminoácido, enquanto aquela entidade reage no grupo carboxila, seguido de remoção seletiva do grupo protetor 5 alfa amino para permitir a ocorrência de uma reação posterior naquele local. Grupos protetores específicos foram descritos e são conhecidos nos métodos de síntese em fase sólida e em métodos de síntese de fase em solução.

Grupos alfa amino podem ser protegidos através de um grupo protetor adequado, inclusive um grupo protetor do tipo uretano, tal como benziloxicarbonila (Z) e benziloxicarbonila substituído, tal como p-

clorobenziloxicarbonila, p-nitrobenziloxicarbonila, p-15 bromobenziloxicarbonila, p-bifenil-isopropoxicarbonila, 9-fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc) e p-

metoxibenziloxicarbonila (Moz); grupos protetores alifáticos tipo uretano, tais como t-butiloxicarbonila (Boc), diisopropilmetoxicarbonila, isopropoxicarbonila, ealiloxicarbonila. Fmoc é preferido para a proteção dealfa amino.

Grupos guanidino podem ser protegidos através de um grupo protetor adequado, tal como nitro, p-toluenossulfonila (Tos), Z,pentametilcromanossulfonila (Pmc),adamantiloxicarbonila, pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonila (Pbf) , Fmoc e Boc. Pbf é um grupo protetor preferido para Arg. Outros grupos protetores preferidos incluem Z, Fmoc, e Boc. Deve ficar entendido que particularmente os grupos protetores guanidino podem ser 30 clivados e removidos durante o processo sintético ou podem alternativamente não ser clivados ou removidos, quando então a cadeia lateral com o grupo protetor forma um derivado de uma porção de cadeia lateral de aminoácido, conforme aqui definido. Particularmente,quando o grupo protetor for lábil e puder ser removidoatravés de algum mecanismo in vivo mediante administração a um paciente, o construto se torna um "profármaco", ouseja, um construto que é um precursor de fármaco e que, mediante administração a um paciente, se converte na forma de fármaco desejado in vivo através de alguns processos químicos ou fisiológicos (ex: um profármaco que, ao ser trazido para pH fisiológico ou através de ação enzimática é convertido na forma de fármaco desejada).

Os construtos da invenção aqui descritos podem ser preparados utilizando síntese em fase sólida, seja manualmente ou através de um sintetizador de peptídeo automatizado, utilizando módulos de programação conforme fornecidos pelo fabricante e seguindo os protocolos estabelecidos por ele, ou através de modificações dos protocolos do fabricante para melhorar o rendimento de acoplamentos difíceis.

A síntese em fase sólida é iniciada a partir da extremidade C-terminal do construto acoplando-se um a-aminoácido protegido, substituto de α-aminoácido ou mimético de α-amino álcool a uma resina apropriada. Tal material de partida é preparado ligando-se um aminoácido protegido com α-amino ou substituto^ de aminoácido protegido com α-amino através de uma ligação éster a uma resina de álcool p-benziloxibenzíIico (Wang) ou a resina de cloreto de 2-clorotritila, através de uma ligação amida entre um ligante Fmoc, tal como ácido p-[(R, S)-a-[1-(9H-fluor-en-9-il)-metoxiformamido]-2,4-dimetiloxibenzil]-phenoxiacético (ligante de Rink) a uma resina de benzidrilamina (BHA), ou através de qualquer outro meio conhecido no estado da técnica, tal como ligando-se um mimético de álcool α-amino-protegido a um ligante de 3,4-dihidro-2H-piran-2-il-metanol ligado a resina de poliestireno de clorometila. Os suportes de Ligante-Fmoc-resina BHA estão disponíveis no mercado e são geralmente utilizados quando possível. As resinas são transportadas através de ciclos repetitivos conforme necessário para adicionar aminoácidos seqüencialmente. Os grupos protetores alfa amino Fmoc são removidos sobcondições básicas. Piperidina, piperazina, dietilamina, ou morfolina (2 0-4 0% em volume) em n,N-dimetilformamida (DMF) podem ser usados para essa finalidade. Após remoção do grupo protetor alfa-amino, os aminoácidos protegidos ou substitutos de aminoácido posteriores são acoplados em etapas na ordem desejada para se obter uma resina de peptídeo intermediário protegido. Os reagentes ativadores utilizados para acoplamento dos aminoácidos na síntese em fase sólida dos peptídeos são bastante

conhecidos no estado da técnica. Após o construto ser sintetizado, se desejado, os grupos protetores de cadeia lateral ortogonalmente protegidos podem ser removidos utilizando métodos bem conhecidos no estado da técnica para derivatização adicional do construto.

Os grupos reativos num construto podem ser seletivamente modificados, seja durante a síntese em fase sólida ou após remoção da resina. Por exemplo, os construtos podem ser modificados para se obter modificações N-terminais, tal como acetilação, enquanto em resina, ou podem ser

removidos da resina mediante o uso de um reagente declivagem e então modificados. Métodos para modificação N-terminal tal como acetilação, ou modificação C-terminal, tal como amidação ou introdução de um grupo N-acetila são bastante conhecidos no estado da técnica. De formasimilar, os métodos para modificar cadeias laterais de aminoácidos são bem conhecidos no estado da técnica da síntese de peptídeos. A escolha de modificações feitas em grupos reativos presentes no construto será determinada, em parte, pelas características desejadas no construto.

Os construtos são, em uma concretização, ciclizados antes da clivagem da resina. Para a ciclização através de porções de cadeia lateral reativa, as cadeias laterais desejadas são desprotegidas, e os construtos suspensos num solvente apropriado e um agente acoplador cíclicoadicionado. Solventes apropriados incluem, por exemplo,DMF, diclorometano (DCM) ou 1-metil-2-pirrolidona (NMP) . Reagentes de acoplamento cíclicos apropriados incluem,por exemplo, tetrafluoroborato de 2-(ΙΗ-benzotriazol-1-il)-1, 1,3,3-tetrametilurônio (TBTU), hexafluorofosfato de 2-(lH-benzotriazol-l-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio (HBTU), hexafluorofosfato de benzotriazol-l-il-oxi-tris(dimetilamino)fosfônio (BOP), hexafluorofosfato de benzotriazol-l-il-oxi-tris(pirrolidino)fosfônio (PyBOP), tetrafluoroborato de 2-(7-aza-lH-benzotriazol-l-il) -1,1,3,3-tetrametilurônio (TATU), tetrafluoroborato de 2-(2-oxo-1(2H)-piridil)-1,1,3,3-tetrametilurônio (TPTU) ou Ν,Ν'-diciclohexilcarbodiimida/l-hidroxibenzotriazol (DCCI/HOBt). O acoplamento é convencionalmente iniciado mediante o uso de uma base adequada, tal como N,N-diisopropiletilamina (DIPEA), sim-colidina or N-metilmorfolina (NMM). Após clivagem de construtos da fase sólida pós-síntese, o construto pode ser purificado através de qualquer número de métodos, tais como cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa (RP-HPLC) utilizando uma coluna apropriada, tal como uma coluna C18. Outros métodos de separação ou purificação, tal como métodos baseados no tamanho ou carga do construto, podem também ser empregados. Após purificado, o construto pode ser caracterizado através de qualquer número de métodos, tal como cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), análise de aminoácido, espectrometria de massa e similares.

Os construtos da presente invenção com um C-terminal derivado de amida substituído, tipicamente um grupo N-alquila, são preparados através de síntese em fase sólida iniciada a partir da extremidade C-terminal do construto mediante acoplamento de um aminoácido alfa-protegido ou substituto de aminoácido a uma resina apropriada. Tais métodos para preparar derivados de amida substituídos na fase sólida foram descritos no estado da técnica. Vide, por exemplo, Barn D.R., Morphi J.R., Rees D.C. Síntese de uma série de amidas através de clivagem assistida com cloreto de alumínio de ésteres ligados à resina. Tetrahedron Lett. 37, 3213-3216 (1996); DeGrado W. F.Kaiser Ε. Τ. Síntese em fase sólida de peptídeos protegidos numa oxima ligada a polímero: Preparação de segmentos compreendendo as seqüências de um análogo citotóxico de 26 peptídeos. J. Org. Chem. 47:3258-3261 (1982). Tal material de partida pode ser preparado ligando-se um aminoácido alfa-amino-protegido ou substituto de aminoácido através de uma ligação éster a uma resina de álcool p-benziloxibenzílico (Wang) através de meios bem conhecidos. A cadeia peptídica é crescida com a seqüência desejada de aminoácidos ou substitutos de aminoácido, o produto ciclizado e tratada com resina com uma solução de amina e cloreto de alumínio apropriados (tal como metilamina, dimetilamina, etilamina, e assim por diante) em diclorometano. 0 construto resultante derivado de amida é liberado em solução da resina. A resina é filtrada e o construto derivado de amida recuperado através da concentração de solvente seguido de precipitação com éter. 0 construto bruto é secado e os grupos protetores de cadeia lateral de aminoácido restantes clivados utilizando-se ácido trifluoroacético (TFA) na presença de água e triisopropilsilano (TIS). O produto final é precipitado adicionando-se éter frio e coletado por filtração. A purificação adicional é realizada através de RP-HPLC utilizando um coluna C18.

Em um método preferido, os construtos do Exemplo 1 foramsintetizados através dos métodos a seguir descritos. Cada um dos construtos possui um ou dois substitutos de aminoácido com base numa estrutura ceto-piperazínica. Os substitutos de aminoácido foram sintetizados conformeacima descrito. Os construtos foram sintetizadosutilizando química Fmoc. Um método sintético manual foi utilizado para acoplamentos imediatamente antes e após a incorporação do substituto de aminoácido ceto-piperazínico.

0 protocolo seguinte foi empregado para ligar um substituto de aminoácido à resina, tal como quando o substituto de aminoácido estava numa posição terminal. Aresina de amida Rink (carga a 0,3 mmol/g, Advanced Chem Tech) foi deixada intumescer em DMF por 3 0 minutos. A desproteção da resina com Fmoc foi realizada utilizando-se piperidina a 20%/DMF por 20 minutos. 0 acoplamento da resina com o substituto de aminoácido ceto-piperazínico protegido com Fmoc (2 eq) foi realizado através de uma incubação da noite para o dia em DMF com PyBop (2 eq) e DIEA (4 eq) . Se após o teste de Kaiser o resultado fosse positivo, a reação de acoplamento era conduzida uma 10 segunda vez. A acetilação foi conduzida utilizando-se Ac2O (10 eq) e piridina (2 0 eq) em DMF.

o protocolo seguinte foi empregado para ligar um substituto de aminoácido ceto-piperazínico à resina peptídica. 0 acoplamento foi conduzido misturando-se 15 substituto de aminoácido ceto-piperazínico protegido com Fmoc (2 eq), TBTU (2 eq) e DIEA (4 eq) em DMF e deixando-se incubar da noite para o dia, novamente com uma repetição da reação de acoplamento, se um teste de Kaiser positivo fosse obtido. A acetilação foi conduzida 20 utilizando-se Ac2O (10 eq) e piridina (20 eq)em DMF.

o protocolo seguinte foi empregado para acoplar um aminoácido protegido com Fmoc a um substituto de aminoácido ceto-piperazínico em fase sólida. Na maioria dos casos, pelo menos dois ciclos de acoplamento foram 25 necessários, e freqüentemente três ciclos foram empregados. Um aminoácido de ciclo típico protegido com Fmoc (4 eq) foi misturado com HOAt (4 eq) e DIC (4 eq) em DMF. A mistura resultante foi então misturada da noite para o dia num tubo SPE com um substituto de aminoácido 30 ceto-piperazínico ligado diretamente ou através de intermediários à resina.

Os acoplamentos entre aminoácidos que não estavam diretamente adjacentes a um substituto de aminoácido ceto-piperazínico na seqüência foram conduzidos 35 utilizando-se protocolos padrão para a síntese de peptídeo em fase sólida. Foram empregados os seguintes grupos protetores: Boc para Lys e Orn, t-butila para Tyre Ser, tritila para Cys e His, O-t-butila para Asp e Pbf para Arg.

Os construtos foram clivados da resina empregando uma mistura de TFA/tioanisol/H20/DTT/TIS87,5/2,5/2,5/5/2,5/11) (5ml) por 3 horas.o material resultante foi filtrado e precipitado de éter gelado sob condições de congelamento por uma hora. 0 peptídeo de cisteinila precipitado foi lavado com éter frio pelo menos três vezes antes de ser utilizado numa etapa de oxidação.

Na ciclização para formar ligações dissulfeto via oxidação por ar, o construto de cisteinila bruto foi dissolvido numa mistura de acetonitrila e água.o pH da mistura de reação foi ajustado em 7-8 utilizando NH4OH a 15 5%. A solução resultante foi agitada lentamente com 150mg de carbonato granular ativado por 2 dias. A conclusão da ciclização foi confirmada através de análise LC-MS antes de proceder à etapa de processo seguinte. Após ciclização, o carbono sólido foi filtrado da solução. 0 20 filtrado foi liofilizado ou secado num "speed-vac" para se obter um construto cíclico bruto.

Certos construtos da invenção, quando o substituto está ligado à resina ou a outro suporte de peptídeo sólido e se encontra na posição C-terminal, podem ser sintetizadospor meio do esquema seguinte. 0 esquema a seguir éexemplificado através da síntese do construto 1-132, ficando, porém entendido que métodos substancialmente similares podem ser empregados para qualquer construto onde o substituto está ligado à resina ou a outro suporte de peptídeo sólido.<formula>formula see original document page 133</formula>

O substituto (7) é preparado através do esquema do método A acima, ou qualquer método alternativo. A resina de amida Sieber protegida com Fmoc foi tratada intumescendo-se 23,8g (substituição com 0,63 mmol/g, 15 mmol) da resina em 200 ml de uma mistura 1:1 de dimetilformamida e diclorometano por 45 minutos, seguido de filtragem e lavagem com 2 χ 125 ml de dimet ilf ormamida. A resina lavada foi então desprotegida com 2 χ 12 5 ml de piperidina a 20% em dimetilformamida por 15 minutos, filtrada, e lavada com 4 χ 125 ml de dimetilformamida.

Uma solução de 21,5g 9 MW = 717,30 mmol) de substituto protegido com Fmoc (7) em 160 ml de dimet ilf ormamida foi adicionada à resina de amida Sieber desprotegida, de acordo com a preparação acima, seguido de 15,6 g 9MW = 520,3, 30 mmol) de PyBop sólido, e 10,4 ml (MW = 129,25, d=0,742, 60 mmol) de diisopropiletilamina, seguido de outros 40 ml de dimetilformamida. A mistura foi agitada da noite para o dia com borbulhamento de nitrogênio. A resina foi filtrada e lavada com 4 χ 13 0 ml de dimetilformamida, capeada com 150 ml de solução capeadora consistindo de uma solução 3:2:1 dedimetilformamida:anidrido acético:piridina por 30 minutos, filtrada, e lavada com 4 χ 13 0 ml de dimetilformamida para prover substituto (7) complexado em resina.

0 substituto protegido com Fmoc resultante (7) complexado em resina foi desprotegido com 2 χ 130 ml de piperidina a 20% em dimetilformamida por 15 minutos, filtrado e lavado com 4 χ 130 ml de dimetilformamida para dar o substituto (7) complexado em resina. Uma solução de 27,6g de Fmoc-Tyr-(tBu)-OH (60 mmol, 4eq.) em dimetilformamida (200 ml) foi adicionada ao substituto (7) complexado em resina, seguido de uma solução de 24,8g de HCTU (60 mmol, 4 eq) e 20,8 ml (120 mmol, 8 eq) de diisopropiletilamina em DMF até um volume final de 200 ml e acoplada da noite para o dia com borbulhamento de nitrogênio. O substituto de Fmoc-Tyr-(tBu) (7)-resina foi isolado por filtração e lavado com 2 χ 13 0 ml de dimetilformamida. Para garantir o acoplamento completo, o produto foi novamente tratado com uma solução de 27,6g de Fmoc-Tyr-(tBu)-OH (MW=459,6, 60 mmol, 4eq.) em dimetilformamida até um volume final de 200 ml seguida de uma solução de 24,8g de HCTU (60 mmol, 4eq) e diisopropiletilamina (20,8 ml, 120 mmol, 8 eq.) em DMF até um volume final de 200ml e acoplado da noite para o dia com borbulhamento de nitrogênio. HPLC e LC/MS mostraram que o acoplamento entre substituto(7)-resina e Fmoc-Tyr-(tBu)-OH estava completo.

O substituto Fmoc-Tyr-(tBu) (7)-resina foi então capeado com 150 ml de solução capeadora, conforme acima, por 30 minutos. A resina foi então filtrada, lavada com 4 χ 130 ml de dimetilformamida, 4 χ 130 ml de diclorometano, 2 χ 130 ml de MeOH, 2 χ 130 ml de dietil éter, e secada sob vácuo para dar 3 6,7g.

Em seguida, cada aminoácido seguinte pode ser acoplado. Antes do acoplamento do primeiro aminoácido, o substituto Fmoc-Tyr-(tBu)(7)-resina foi intumescido por 45 minutos com 200 ml de uma solução 1:1 de dimetilformamida:diclorometano. Cada aminoácido (Fmoc-AA-OH) foi acoplado repetindo-se o ciclo seguinte. O resíduo aminoácido terminal foi desprotegido com 2 χ 125 ml de piperidina a 2 0% em dimetilformamida por 15 minutos, filtrado e lavado com 4 χ 125 ml de dimetilformamida. Os grânulos foram examinados através do teste de ninidrina. Uma solução de Fmoc-AA-OH (60 mmol, 4 eq.) em dimetilformamida até um volume final de 200ml foi adicionada à resina, seguido de uma solução de HBTU (60 mmol, 4eq.) e (120 mmol, 8 eq) de N-metilmorfolina em DMFaté um volume final de 200 ml [concentração de Fmoc-AA-OH solução 150 mM] e acoplada por 30 minutos com borbulhamento de nitrogênio (reação de acoplamento examinada através de teste de ninidrina) . Quando o teste 5 de ninidrina deu negativo, a resina foi filtrada e lavada com 4 χ 13 0 ml de dimetilformamida.

Após todos os aminoácidos terem sido acoplados, a resina foi lavada com 4 χ 13 0 ml de diclorometano, 4 χ 13 0 ml de metanol, 4 χ 130 ml de dietil éter, e secada sob vácuo 10 para dar o produto. 0 aumento de peso foi quantitativo.100ml de reagente de clivagem consistindo de uma solução de 81,5:5:5:5:2,5:1 de ácidotrifluoroacético:fenol:tianisol:água:DDT:

triisopropilsilano foram adicionados a 32g (~6,4 mmol) do seguinte construto linear:

<formula>formula see original document page 135</formula>

A suspensão foi deixada repousar à temperatura ambiente por 5 minutos e então filtrada. Outros 100 ml de reagente de clivagem foram adicionados à resina, deixados repousar por 5 minutos e filtrados. Esse processo foirepetido.

A resina resultante foi então lavada com 2 χ 40 ml de ácido trifluoroacético. Os filtrados foram combinados e agitados por 2,5 horas à temperatura ambiente e então concentrados sob pressão reduzida até -IOOml de volume. 25 Dietil éter gelado (1,5L, pré-resfriado até 20°C) foi adicionado ao filtrado e então colocado no freezer (-20°C) por 1 hora, filtrado em funil de vidro sinterizado, e os sólidos lavados com 3 χ 200 ml de dietil éter gelado, e então secado sob vácuo por 1 hora com ossólidos triturados a cada 15 minutos, para garantir que osolvente fosse eficientemente removido. Foi obtido o construto seguinte (15,4g) (103% rendimento bruto total):<formula>formula see original document page 136</formula>

O construto acima (15,4g, 6,4 mmol)foi dissolvido em 16L de acetonitrila a 30% em água. 0 pH foi ajustado em 8,4 utilizando uma solução de hidróxido de amônio a 5%. Adicionou-se carbono ativado pulverizado (15,4g) e a suspensão foi agitada da noite para o dia. 0 carbono foi removido por filtração em celite. A celite foi lavada com 3 χ IOOml de acetonitrila em água. Os filtrados foram combinados, diluídos com água até uma concentração final de acetonitrila a 10%, e carregados na coluna para purificação. A purificação do sal de trifluoroacetato do construto resultante foi realizada sob as seguintes condições:

<table>table see original document page 136</column></row><table>

As frações puras foram combinadas e liofilizadas para daro sal de trifluoroacetato do construto. Dowex SBR, resina LCNG-OH (450g) foi suspensa em 2L de água e agitada suavemente por 15 minutos, deixada repousar por 15 minutos, e então decantada. 0 procedimento foi repetido e então 0,5 L de água adicionado e a pasta transferida para uma coluna de 6 χ 60cm. A água foi drenada, lavada com 4L de água e íons trocados com 6,5L de solução de ácido acético a 20%. A resina foi deixada repousar à temperatura ambiente da noite para o dia, e então lavadacom água até que o pH do filtrado atingisse ~4 (8L deágua utilizados). 0 sal de trifluoroacetato do construto acima (11,lg), conforme preparado acima, foi dissolvidoTrifluoroacético a 0,1% Gradiente : solvente B a 5% por 5 minutos 26% B a 52% B em 30 minutosem 80ml de água, e carregado à resina de troca iônica e eluído com água. Frações contendo 79-1 foram combinadas e solução de ácido acético a 20% adicionada para ajustar a concentração final a ácido acético a 5% e então liofilizadas. O seguinte construto 1-132 (10,4g) foi obtido:

<formula>formula see original document page 137</formula>

Métodos similares podem ser empregados com qualquer construto no qual o substituto esteja ligado à resina ou a outro suporte de peptídeo sólido e que se encontre na posição C-terminal.

O tratamento adicional dos construtos peptídicos da invenção com PEG pode ser conduzido de qualquer forma, tal como descrito abaixo.

O tratamento dos grupos amina reativos com PEG, tais como cadeias laterais de lisina ou ornitina, um ômega amino alifático na posição Aaa1, ou um grupo amina em J de um substituto de aminoácido em Aaa15, foi realizado dissolvendo-se 0,005 mmol de construto purificado em 2 ml de dimetilsulfoxido, seguido da adição de 55,5mg (0,011 2 0 mmol, 2 eq.) de PEG-5K-OSu (metoxi-PEG com MW (peso molecular) de 5.000 Da com um grupo reativo succinimidil propionato) com 17,7 μl (0,13 mmol, eq) de trietilamina então adicionada e a solução levemente turva agitada à temperatura ambiente por 3 horas. 0 PEG-5K-0Su excedente foi rapidamente resfriado mediante a adição de uL (0,111 mmol, 10 eq) de etanolamina e a reação agitada da noite para o dia.

O tratamento de grupos carboxila reativos com PEG, tais como as cadeias laterais Asp ou Glu ou um carboxila terminal em Aaa15 quer num resíduo ou num substituto, érealizado acoplando-se PEG-NH2 (PEG-amina) ao construto contendo um grupo carboxilato na cadeia lateral de Asp ouGlu ou no C-terminal. O construto de peptídeo (0,005 mmol) é dissolvido em DMSO (2ml) , seguido da adição de 55,5 mg (0,011 mmol, 2 eq.) de PEG-NH2 e HOBt (0,01 mmol). 0 acoplamento é iniciado mediante adição de 0,0055 5 mmol de reagente de acoplamento N-etil-N'-(3 -dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDAC). A solução levemente turva foi agitada à temperatura ambiente da noite para o dia. O construto de peptídeo tratado com PEG é então purificado através de HPLC. O tratamento de grupos tiol reativos com PEG, tais como cadeias laterais Cys ou Hcys ou um grupo tiol em Q de um substituto de aminoácido em Aaa1, é realizado tratando-se o construto de peptídeo em DMSO com reagente de PEG-metil-maleimida (SubnBio, Orinda, Califórnia) da noite 15 para o dia. 0 construto de peptídeo tratado com PEG é então purificado através de HPLC.

Após o tratamento com PEG, a mistura bruta resultante foi então purificada através de HPLC, produzindo um construto derivatizado com PEG, inclusive um ou mais substitutos de aminoácidos.

Sistemas de Teste In Vitro ou In Vivo

Construtos selecionados foram testados em ensaios para determinar o status funcional e de ligação. Foram empregados os ensaios a seguir descritos. 25 Cultura de células. Um clone de cDNA que codifica o receptor A de peptídeo natriurético humano (NPRA) foi adquirido da Bio S & T Inc. (Montreal, Quebec) . o clone de cDNA foi inserido no vetor de expressão de mamífero pcDNA3.1 (Invitrogen) e transfectado em células HEK-293. Clones estáveis foram selecionados através de cultura de células na presença de sulfato G418.

A expressão de NPRA foi examinada através da ligação de [125I]-peptídeo natriurético atrial ( [125I] -ANP)_a homogenados membrânicos preparados a partir de linhagens 35 celulares clonais. As células HEK-hNPRA foram mantidas em cultura a 3 7°C em CO2 5% em meio Eagle modificado da Dulbecco (DMEMO suplementado com FBS a 10%, sulfato G418(300 μ$/πι1) glutamato de sódio (0,29 mg/ml), penicilina (100 unidades/ml) e estreptomicina (100 μ$/πι1). Ensaio de Ligação Competitivo. Um ensaio de ligação de inibição competitivo foi conduzido utilizando-se homogenados membrânicos brutos preparados a partir de células hNPRA. Para preparar os homogenados membrânicos, as células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato e incubadas por 15 minutos a 4°C em tampão de Iise hipotônico (10 mM Tris, pH 7,4 + 5mM EDTA). As células foram transferidas de placas para tubos de polipropileno e homogeneizadas. Os homogenados foram centrifugados a 25.000 χ g por 20 minutos. As pelotas foram resuspensas em tampão consistindo de 50 mM Tris (pH 7,4) e 1 mM EDTA, homogeneizadas e centrifugadas a 25.000 χ g por 20 minutos. As pelotas foram resuspensas em tampão consistindo de 100 mM Tris (pH 7,4) e 10 mM MgCl2 e armazenadas a -80°C até que fosse necessário. No dia de um ensaio, os homogenados foram degelados e homogeneizados. A ligação de [125I]-ANP foi realizada em tampão contendo 25 mM Hepes (pH 7,4), IOOmM NaCl, 2 mM CaCl2, 5 mM MgCl2, 0,1% BSA e 1 mM 1,10-fenantrolina. Os homogenados (1-10 Mg proteína/cavidade) foram incubados com [125I] -ANP (25-30 pM) e concentrações crescentes de ligantes competitivos em placas de filtro Millipore por120 minutos a 4°C. Os ensaios foram interrompidosmediante adição de tampão de lavagem frio (solução salina tamponada com fosfato) seguido de filtração utilizando um coletor de vácuo. A radioatividade de ligação foi determinada utilizando-se um contador gama. A ligaçãonão-específica foi definida através da ligação de[I125]-hANP a membranas HEK293 não transfectadas. Os dadosforam analisados utilizando-se software de ajustamento decurvas GraphPad Prism.

Método geral para determinação de EC5O.

A avaliação funcional de construtos foi realizada medindo-se o acúmulo de cGMP em células HEK-293 que expressem hNPR-A recombinante. Células HEK-NPRA cellsforam coletadas através de lavagem e centrifugação em Tampão de Dissociação de Células (Gibco, Life Technologies). As células peletizadas foram resuspensas em Solução Salina Balanceada Hanks (HBSS) contendo 10 mM 5 Hepes (pH 7,4), 5 mM MgCl2, 200 mM L-glutamina, 1 mM 1, 10-fenantrolina e BSA (0.5 mg/mL) . Após a centrifugação, as células foram resuspensas no tampão acima suplementado com 0.5 mM de 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX). Células (~2 xl05/cavidade) foram 10 adicionadas a cada cavidade numa placa de 96 cavidades e incubadas por 15 minutos a 37°C. Após o período de pré-incubação, as células foram incubadas por mais 15 minutos na presença de concentrações crescentes de construtos. A reação foi concluída através de Iise das células com 15 choque de temperatura. A placa de reação foi incubada num banho de gelo seco/etanol por 15 minutos seguido de incubação a 900C por 10 minutos. 0 acúmulo de cGMP foi medido utilizando-se o cGMP Flashplate RIA (Perkin-Elmer). A análise de dados e os valores EC50 foram determinados utilizando-se análise de regressão não linear com software GraphPad Prisme.

Determinação de massa e análise de ressonância magnética nuclear

Os valores de massa de construtos conjugados com PEG 2 5 foram analisados através de espectrometria de massa MALDI-TOF (modo de íon positivo) utilizando ácido alfa-ciano-4-hidroxicinâmico (CHCA) como matriz. Metanol foi utilizado para a preparação de amostras em relações de construto para matriz de 1:10, 1:20 e 1:30. Alternativamente, outras matrizes tais como ácido sinapínico (SA) e ácido 2,5-dihidroxibenzóico (DHB) e solventes tais como acetonitrila - TFA aquoso a 0,1% podem ser usadas para a preparação de amostras. Outras determinações de valores de massa foram realizadas 35 utilizando-se um dispositivo Waters MicroMass ZQ no modo positivo. Para construtos não conjugados com PEG, as determinações de massa foram comparadas com valorescalculados e expressadas na forma de peso de massa mais dois dividido por dois (M+2)/2), salvo se especificado de outra forma.

Dados de NMR protônica foram obtidos utilizando-se um espectrômetro Bruker 3 00 MHz. Os espectros foram obtidos após dissolver os construtos num solvente deuterado tal como clorofórmio, DMSO, ou metanol, conforme apropriado. As medições por HPLC foram realizadas utilizando-se um HT da Waters Alliance com uma coluna YMC Pack Pro C18 (4,6 χ 50mm, 3μ) eluída a 1 ml/minuto num procedimento por etapas. O solvente A (água contendo ácido trifluoroacético a 0,1% em volume) e solvente B (acetonitrila contendo ácido trifluoroacético a 0,1% em volume) foram utilizados como fases móveis. Para análise de intermediários ceto piperazínicos, a coluna foi equilibrada com 10% Be então B foi aumentado até 90% por um período de 8 minutos. Para análise de peptídeos, a coluna foi equilibrada com 2% B e então B foi aumentado até 90% por um período de 8 minutos.

Modelos Animais - Implantação de Transdutor de Pressão Arterial

Ratos foram induzidos a um plano cirúrgico de anestesia com isoflurano e mantidos sobre uma almofada de aquecimento. O abdômen foi depilado e desinfetado com uma solução de álcool e betadina a 70%. Utilizando técnica asséptica, foi feita uma incisão na linha mediada do abdômen para expor a aorta descendente e a veia cava. 0 conteúdo do abdômen foi retirado com cuidado utilizando gaze estéril úmida e retratores. Com base nas instruções do fabricante (descrito em Data Sciences International's Multiplus TL Series Device Surgical Manual 2000: p.3.1-3.10), a aorta abdominal foi cuidadosamente dissecada da gordura e tecido conjuntivo adjacentes, sendo então inserido o catéter do transdutor de pressão arterial. 0 catéter do transdutor é fixado no lugar utilizando-se cola cirúrgica e o corpo do transdutor estabilizado mediante sutura à parede abdominal (sutura de seda 4-0) .Todo cuidado é empregado para manter a homeostase durante o procedimento, sem comprometer o fluxo sangüíneo (por exemplo, a aorta não fica obstruída por mais de 3 minutos de cada vez) . A colocação do transdutor é verificada 5 utilizando-se sinal telemétrico de rádio. Após a colocação do transdutor, as esponjas de gaze são removidas e a cavidade abdominal lavada com solução salina estéril. A incisão abdominal é então fechada com suturas não-absorvíveis (sutura de seda 4-0) num padrão 10 interrompido simples. A pele é fechada utilizando sutura absorvível (vicril 4-0) . Finalmente o animal é retirado do isoflurano e colocado num ambiente aquecido e monitorado até que desperte completamente. Indução Cirúrgica de Insuficiência Cardíaca congestiva 15 (Sobrecarga de Volume)

Neste procedimento, a aorta descendente e a veia cava são expostas da mesma forma que o procedimento de implantação do dispositivo de telemetria. Após ter acesso aos vasos entre a bifurcação renal e ilíaca, é feita uma punção com 20 agulha de 1,8mm (diâmetro externo) até a aorta descendente. A agulha é empurrada para dentro da veia cava inferior e retirada. O local de punção ventral na aorta descendente é vedado com tecido adesivo. A persistência de um "shunt" entre a aorta e a veia cava éconfirmada visualmente através de inchaço da veia cava emistura de sangue venoso e arterial. Caso um transdutor de pressão seja também implantado, os dois procedimentos são realizados ao mesmo tempo. Os métodos gerais descritos em Flaim, S.F., W.J. Minteer, S.H. Nellis, eD.P. Clark: "Shunt" arteriovenoso crônico: avaliação deum modelo para insuficiência cardíaca em ratos Am. J. Phisiol. 23 6:H698-H7 04 (1979) e Garcia, R. e S. Diebold: Método simples, rápido e eficaz para produzir "shunts" aortocavais em rato. Cardiovasc. Res. 24:430-432 (1990), 3 5 são aqui incorporados por referência. Monitoramento de Pressão Arterial

Sinais telemétricos dos transdutores de pressão arterial(modelo TA11PA-C40, Data Sciences International, St Paul, MN) são coletados e analisados utilizando-se software Dataquest A.R.T. Gold software versão 3.0 (Data Sciences International). Os ratos foram observados aproximadamente 5 no mesmo horário todos os dias. Cada rato, em sua gaiola, foi colocado sobre um receptor na sala de observação e ali deixado por 3 0 minutos para que se ajustasse à mudança. Registros de dados de referência são coletados durante 3 0 minutos logo antes da dosagem e os registros 10 do tratamento coletados durante 135 minutos imediatamente após dosagem IV e 210 minutos após dosagem SC. Os dados são comparados aos resultados após dosagem de solução salina de forma similar aos métodos previamente publicados em Clemens, L.E., R.G. Almirez, K.A. Baudouin, 15 E.B. Grossbard, e A. A. Protter: Peptídeo natriurético cerebral humano reduz a pressão arterial em coelhos com normotensão e hipertensão aguda induzida por norepinefrina. Am. J. Hipertens. 10:654-661 (1997),aqui incorporado por referência. 2 0 Diurese e Natriurese. Ratos foram induzidos a um plano cirúrgico de anestesia com pentobarbital sódico e mantidos sobre uma almofada de aquecimento. 0 abdômen é depilado e desinfetado com uma solução de álcool e betadina a 70%.

Utilizando técnica asséptica, foi feita uma incisão na linha mediada do abdômen para expor a bexiga urinária. Uma sutura é introduzida na superfície ventral da bexiga e uma pequena incisão é feita na área de sutura. A extremidade alargada de um catéter é inserida na abertura 30 e a sutura apertada em torno dele para mantê-lo fixo no lugar. A urina é colhida em tubos microcentrífugos pesados previamente em diversos intervalos de tempo antes e após a dosagem de forma similar aos métodos publicados em Abassi, Z.A., J.R. Powell, E. Golomb, e H.R. Keiser: 35 Efeitos renais e sistêmicos de urodilatina em ratos com insuficiência cardíaca de alto débito. Am. J. Physiol. 262:F615-F621 (1992), aqui incorporado por referência. 0volume urinário é medido em peso. EXEMPLO 1

Os construtos seguintes foram sintetizados, utilizando-se substitutos de aminoácido de um ou mais dos métodos anteriormente descritos, purificados e os pesos em massa determinados, com os resultados mostrados abaixo:<table>table see original document page 145</column></row><table><table>table see original document page 146</column></row><table><table>table see original document page 147</column></row><table><table>table see original document page 148</column></row><table><table>table see original document page 149</column></row><table><table>table see original document page 150</column></row><table><table>table see original document page 151</column></row><table><table>table see original document page 152</column></row><table><table>table see original document page 153</column></row><table><table>table see original document page 154</column></row><table><table>table see original document page 155</column></row><table><table>table see original document page 156</column></row><table><table>table see original document page 157</column></row><table><table>table see original document page 158</column></row><table><table>table see original document page 159</column></row><table><table>table see original document page 160</column></row><table><table>table see original document page 161</column></row><table><table>table see original document page 162</column></row><table><table>table see original document page 163</column></row><table><table>table see original document page 164</column></row><table><table>table see original document page 165</column></row><table><table>table see original document page 166</column></row><table><table>table see original document page 167</column></row><table><table>table see original document page 168</column></row><table><table>table see original document page 169</column></row><table><table>table see original document page 170</column></row><table><table>table see original document page 171</column></row><table><table>table see original document page 172</column></row><table><table>table see original document page 173</column></row><table><table>table see original document page 174</column></row><table><table>table see original document page 175</column></row><table><table>table see original document page 176</column></row><table><table>table see original document page 177</column></row><table><table>table see original document page 178</column></row><table><table>table see original document page 179</column></row><table><table>table see original document page 180</column></row><table><table>table see original document page 181</column></row><table><table>table see original document page 182</column></row><table><table>table see original document page 183</column></row><table><table>table see original document page 187</column></row><table><table>table see original document page 185</column></row><table><table>table see original document page 186</column></row><table><table>table see original document page 187</column></row><table><table>table see original document page 188</column></row><table><table>table see original document page 189</column></row><table><table>table see original document page 190</column></row><table><table>table see original document page 191</column></row><table><table>table see original document page 192</column></row><table><table>table see original document page 193</column></row><table><table>table see original document page 194</column></row><table><table>table see original document page 195</column></row><table>EXEMPLO 2

Os seguintes construtos da Tabela 2 são sintetizados, utilizando-se substitutos de aminoácido de um ou mais dos métodos anteriormente descritos, purificados e os pesos em massa determinados:<table>table see original document page 197</column></row><table><table>table see original document page 198</column></row><table><table>table see original document page 199</column></row><table><table>table see original document page 200</column></row><table><table>table see original document page 201</column></row><table><table>table see original document page 202</column></row><table>EXEMPLO 3

Construto 1-1, com a seguinte estrutura, foi testadoconforme descrito acima: o

<formula>formula see original document page 203</formula>

Em estudos de ligação a receptor, esse construto possuía um Ki médio de 0,3 nM num sistema de ensaio no qual hANP tinha um Ki de 0,05 nM e mini-ANP tinha um Ki de 0,6 nM. 0 construto 1-1 tinha um EC50 de 2nM num sistema de ensaio no qual hANP tinha um EC50 de 0,6 nM e mini-ANP tinha um EC50 de 3,3 nM.

EXEMPLO 4

O construto 1-9, com a seguinte estrutura, foi testado conforme acima descrito.

<formula>formula see original document page 203</formula>

Em estudos de ligação a receptor, esse construto possuía um Ki médio de 0,9 nM num sistema de ensaio no qual hANP tinha um Ki de 0,05 nM e mini-ANP tinha um Ki de 0,6 nM. O construto 1-9 tinha um EC50 de 3,5nM num sistema de ensaio no qual hANP tinha um EC50 de 0,6 nM e mini-ANP tinha um EC50 de 3,3 nM.

EXEMPLO 5

O construto 1-8, com a seguinte estrutura, foi testado conforme acima descrito.

<formula>formula see original document page 203</formula>

Em estudos de ligação a receptor, esse construto possuíaum Ki médio de 0,2 nM num sistema de ensaio no qual hANP tinha um Ki de 0,05 nM e mini-ANP tinha um Ki de 0,6 nM. O construto 1-8 tinha um EC50 de 2 nM num sistema de ensaio no qual o construto da Fig. 1 tinha um EC50 de 0,6 nM e mini-ANP tinha um EC50 de 3,3 nM.

EXEMPLO 6

O construto 1-18, com a seguinte estrutura, foi testado conforme acima descrito.

<formula>formula see original document page 204</formula>

Em estudos de ligação a receptor, esse construto possuíaum Ki médio de 0,027 nM num sistema de ensaio no qual hANP tinha um Ki de 0,05 nM e mini-ANP tinha um Ki de 0,6 nM. 0 construto 1-18 tinha um EC50 de 0,2 nM num sistema de ensaio no qual hANP tinha um EC50 de 0,6 nM e mini-ANP tinha um EC50 de 3,3 nM.

0 construto 1-18 mostrou-se estável tanto no plasma de rato quanto no plasma humano, com T 1/2 de ~2 horas a 37°C. Quando administrado IV, o T 1/2 in vivo em ratos foi de -20 minutos. Aproximadamente de 25 a 50% da dose injetada estava biodisponível em ratos quandoadministrada por via subcutânea. A Fig. 2 ilustra a concentração do construto 1-18 em ng/ml ao longo do período em ratos, com a curva para "SC" indicando administração subcutânea a uma dose de 5mg/kg, e a curva para "IV" indicando administração intravenosa a uma dosede 2mg/kg.

EXEMPLO 7

Os transdutores de pressão arterial foram implantados em ratos conforme descrito sob o título "Modelo Animal Implantação de Transdutor para Pressão Arterial". Osestudos foram conduzidos conforme descrito sob o título"Monitoramento de Pressão Arterial". Os estudos incluíam a determinação de alterações na pressão arterial sistólica em comparação com solução salina apósadministração de construtos da invenção. Em um estudo, os ratos receberam o construto 1-63 através da via IV a 0,03 mg/kg corporal (n=4), 0,1 mg/kg (n=7) ou 0,3 mg/kg (n=8). A pressão arterial foi monitorada 5 minutos antes da administração IV e 5, 10 e 15 minutos apósadministração, e em seguida em intervalos de 15 minutos até 13 5 minutos após a administração. Em todos os períodos para todas as doses, a pressão arterial sistólica medida foi inferior ao controle com solução 10 salina, com queda na pressão arterial variando de um mínimo de cerca de 5% a um máximo de cerca de 19%, geralmente na forma dose-dependente, e com a maior resposta observada dentro de 10 a 4 5 minutos após administração.

Num segundo estudo, ratos receberam o construto 1-63 por via subcutânea a 0,3 mg/kg de peso corporal (n=8) , 1,0 mg/kg (n=7) ou 3,0 mg/kg (n=7) . A pressão arterial foi monitorada a e 5 minutos antes da administração SC e a 5, 10, e 15 minutos após administração, e em seguida em 20 intervalos de 15 minutos até 210 minutos após administração. Em todos os períodos para todas as doses, a pressão arterial sistólica medida foi inferior ao controle com solução salina. A 0,3 mg/kg SC, a queda na pressão sistólica estava na faixa de 2% nos períodos após 25 2 horas pós administração, o que se encontrava dentro da margem de erro. Porém, em todos os outros períodos para 0,3 mg/kg SC e em todos os períodos para 1,0 e 3,0 mg/kg, a redução foi estatisticamente diferente e inferior ao controle com solução salina. A 3,0 mg/kg observou-se uma 3 0 redução máxima de aproximadamente 2 0% a 23% na pressão sistólica a 45 a 120 minutos pós administração, com uma redução máxima no mesmo período de tempo a l,0mg/kg de 17% a 19%.

Num terceiro estudo, ratos receberam o construto 1-18 por 3 5 via IV a 0,3 mg/kg de peso corporal (n=8) . A pressão arterial foi monitorada a 5 minutos antes da administração IV e a 5, 10 e 15 minutos após aadministração, e em seguida em intervalos de 15 minutos até 135 minutos após a administração. Em todos os períodos, para todas as doses a pressão arterial sistólica medida foi inferior ao controle com solução 5 salina, com a queda na pressão arterial variando de um mínimo de cerca de 5% a um máximo de cerca de 13%, com a maior resposta sendo observada 15 minutos após a administração.

Num quarto estudo, ratos receberam o construto 1-18 por 10 via subcutânea a 0,1 mg/kg peso corporal (n=4), 0,3 mg/kg (n=7) ou 1,0 mg/kg (n=8) . A pressão arterial foi monitorada a 15 e 5 minutos antes da administração SC e a 5, 10 e 15 minutos após a administração e em seguida em intervalos de 15 minutos até 225 minutos após a 15 administração. Em todos os períodos para todas as doses a pressão arterial sistólica medida foi menor que o controle com solução salina. A 0,1 mg/kg SC, a queda na pressão sistólica não foi estatisticamente relevante após cerca de duas horas e meia. Porém, em todos os outrosperíodos para 0,1 mg/kg SC, e em todos os períodosinferiores a cerca de duas horas e meia para 0,3 e em todos os períodos para 1,0 mg/kg, a queda foi estatisticamente diferente e inferior ao controle com solução salina. A 1,0 mg/kg observou-se uma queda máxima 25 de aproximadamente 9% a 13% na pressão sistólica a 45 a 12 0 minutos após a administração.

EXEMPLO 8

O volume urinário total em ratos foi medido conforme descrito sob o título "Diurese e Natriurese". Grupos de 30 quatro animais receberam os construtos 1-18 e 1-63 por vias IV, com os animais recebendo 0,03 mg/kg de peso corporal, 0,1 mg/kg e 0,3 mg/kg de construto 1-18, e 0,1 mg/kg de peso corporal, 0,3 mg/kg e 1,0 mg/kg de construto 1-63. 0 volume urinário total durante 30 minutos pós-dose foi medido, com os resultados mostradosna Fig. 3.

Num estudo separado, a urina total foi medida de formasimilar num grupo de quatro animais recebendo doses de 0,3, 1,0 e 3,0 mg/kg de peso corporal do construto 1-63 por via SC, com solução salina usada como controle. O volume urinário total durante 45 minutos pós dose foi medido. Os resultados constam da Fig. 4.

EXEMPLO 9

A farmacocinética de construtos selecionados da invenção foi estudada em ratos Sprague-Dawley após administração intravenosa (IV) ou subcutânea (SC). Os parâmetros farmacocinéticos de construtos selecionados m ratos foram determinados e resumidos nas Tabelas 3 e 4. Os construtos da invenção, conforme indicados nas Tabelas 4 e 5 foram preparados como o sal de TFA e dissolvidos em solução salina a 1 ml/kg tanto pelas vidas de dosagem IV como SC. A dose IV foi administrada através de uma cânulana artéria femoral a doses alvo de 0,3 e 2 mg/kg. A dose SC foi administrada a doses alvo de 1 e 5 mg/kg. Os animais não foram submetidos a jejum da noite para o dia antes da dosagem. 0 sangue foi coletado para recipientescontendo EDTA dipotássico em intervalos predeterminadosde uma cânula previamente implantada na veia jugular. 0 plasma foi obtido através de centrifugação do sangue e armazenado a -70°C até a análise.

A análise de dados utilizou um sistema LC-MS/MS incluindo um amostrador HTS-PAL automático da Leap Technologies equipado com um "loop" de injeção de 100 μΐ, duas bombas Shimadzu e um espectrômetro de massa API 4000 da Sciex. A separação cromatográfica dos analitos foi obtida numa coluna Luna C18 (4,6 χ IOOmm; 3μ) eluída a lml/min com um procedimento por etapas. Solvente A (água contendo ácido fórmico a 0,1% em volume) e solvente B (acetonitrila contendo ácido fórmico a 0,1% em volume) foram utilizados como fases móveis. Inicialmente, a coluna foi equilibrada com 5% B e, 2 minutos apósinjeção da amostra, B foi aumentado em 60% por um períodode 0,5 minutos e mantido nessa concentração por 1,1 minutos. A composição de B foi aumentada em 80% em 1,4minutos e mantida por 0,3 minuto. A composição de B retornou para 5% em 0,2 minuto. O tempo total de operação foi de 6 minutos. A detecção espectrométrica de massa dos analitos foi realizada utilizando-se a interface "lonspray" Turbo operada no modo de íon positivo. A resposta do analito foi medida através de monitoramento de reação múltipla (MRM) das transições dos íons precursores protonados para os íons de produto selecionados.

Alíquotas de plasma (100 μl) foram misturadas com o padrão interno (IS) e submetidas à extração de fase sólida utilizando cartuchos C8 num formato de 96 cavidades. Após pré-condicionamento dos cartuchos C8 com 1 ml de metanol e 1 ml de hidróxido de amônio a 2% em água, as amostras de plasma foram carregadas sobre os cartuchos. Após lavagem dos cartuchos com hidróxido de amônio a 2% em metanol a 40%, os construtos foram eluídos dos cartuchos com 1 ml de ácido acético a 2% em metanol a 60%. Os eluentes foram transferidos para uma placa limpa, evaporados sob corrente de N2 e os resíduosresuspensos em 100 μl de 20mM de acetato de amônio e acetonitrila (6:4, v:v) antes da análise LC-MS/MS. Os padrões de calibração (2-1000 ng/ml) foram preparados da mesma forma adicionando-se o construto a várias concentrações e seus respectivos IS a 100μ1 de plasma de rato não tratado. De forma similar, foram preparadas amostras de controle de qualidade adicionando-se construto e IS a 100μ1 de plasma controle a 3 concentrações diferentes (3,5, 75 e 750 ng/ml) deconstruto.

Os dados foram adquiridos e processados através do software Sciex Analyst 1.4.1. As relações de área de pico do construto para IS foram plotadas como uma função das concentrações nominais do construto. A regressão linear utilizando um fator de ponderação de l/x foi empregada para calcular a concentração do construto em amostras de plasma. O limite inferior de quantificação (LLOQ) paraesse ensaio tipicamente foi de 2 ou 5 ng/ml. Os parâmetros farmacocinéticos foram calculados através do método não-compartimentalizado estabelecido (Win-Nonlin versão2.1; Consulting Inc. Palo Alto, CA). A área sob a curva de concentração plasmática versus tempo (AUC) foi determinada utilizando-se interpolação trapezoidal linear no declive ascendente e interpolação trapezoidal logarítmica no declive descendente. A porção da AUC da última concentração mensurável até o infinito foi avaliada com base na equação Ct/kel onde Ct representa a última concentração mensurável e kel é a constante de taxa de eliminação. Esta última foi determinada com base na curva de concentração versus tempo através de regressão linear na fase terminal do gráfico semi-15 logarítmico.

Tabela 3

Sumário de Parâmetro Farmacocinéticos de Construtos emratos SD após Administração IV

<table>table see original document page 209</column></row><table>Tabela 4

Farmacocinética de construtos em ratos SD apósadministração SC_

<table>table see original document page 210</column></row><table>

Exemplo 10

Uma formulação de 1-132 foi preparada para uso farmacêutico. 1-132 foi usado na forma de sal de acetato. A formulação foi dispensada num frasco de Iml que foi tampado e vedado, com cada frasco contendo: OiImg de acetato 1-132, com base no peso de peptídeo

líquido de acetato

1,181 mg de ácido succinico, NF 47,0 manitol, USP

NaOH IN, USP, conforme necessário para ajuste de pH HCl IN, USP, conforme necessário para ajuste de pH

Água para injeção, até Iml de volume

O pH do produto final foi ajustado em 4,00 ± 0,05 com NaOH IN ou HCl IN, conforme necessário. A solução resultante foi filtrada em filtro estéril de 0,22 mícron antes do envase e armazenada a 5°C até o momento do uso.

Uma formulação alternativa de 1-132 foi preparada para uso farmacêutico, similar à formulação acima, porém incluindo adicionalmente entre cerca de 0,02 mg e 0,06mg de pamoato dissódico, de tal forma que a solução resultante fosse uma suspensão de pamoato.

EXEMPLO 11

Os construtos a seguir foram sintetizados, utilizando substitutos de aminoácido de um ou mais dos métodos anteriormente citados, purificados e conjugados com PEG-5K-0Su e os pesos em massa determinados, sendo osresultados apresentados na Tabela 5 abaixo:<table>table see original document page 211</column></row><table><table>table see original document page 212</column></row><table><table>table see original document page 213</column></row><table>EXEMPLO 12

Os construtos a seguir da Tabela 6 foram sintetizados, utilizando substitutos de aminoácido de um ou mais dos métodos anteriormente citados, purificados e conjugados com PEG-5K-0Su ou outro PEG reativo e os pesos em massa determinados:<table>table see original document page 215</column></row><table><table>table see original document page 216</column></row><table><table>table see original document page 217</column></row><table>EXEMPLO 13

O construto 5-1, com a estrutura a seguir, foi testado conforme acima descrito.

<formula>formula see original document page 218</formula>

Em estudos de ligação a receptor, esse construto tinha um Ki médio de 70 nM num sistema de ensaio no qual hANP tinha um Ki de 0,05 nM e mini-ANP tinha um Ki de 0,6 nM.

EXEMPLO 14

O construto 5-9, com a estrutura a seguir, foi testado conforme acima descrito.

<formula>formula see original document page 218</formula>

Em estudos de ligação a receptor, esse construto tinha um Ki médio de aproximadamente 2 nM num sistema de ensaio no qual hANP tinha um Ki de 0,05 nM e mini-ANP tinha um Ki de 0,6 nM. O construto 5-9 tinha um EC50 de aproximadamente 9,5 nM num sistema de ensaio no qual hANP tinha um EC50 de 0,6 nM e mini-ANP tinha um EC50 de 3,3nM.

EXEMPLO 15

Qualquer um dos construtos da invenção, inclusive, sem limitação, os construtos 1-1 a 1-248, 2-1 a 2-21, 5-1 a 5-18 e 6-1 a 6-12 é formulado para injeção de liberação gradual. Qualquer um dos construtos é formulado com um PEG, tal como poli(etileno glicol) 3350, e opcionalmente um ou mais excipientes e preservativos adicionais, inclusive, sem limitação, excipientes tais como sais, polisorbato 80, hidróxido de sódio ou ácido clorídrico para ajuste do pH e similares. Alternativamente, qualquer um dos construtos é formulado com um poli(orto éster), incluindo um poli(orto éster) auto-catalisado com qualquer porcentagem variável de ácido láctico naestrutura polimérica principal, e opcionalmente um ou mais excipientes adicionais. 0 polímero poli(D,L-lact£deo-co-glicolídeo) (polímero PLGA) pode ser empregado, preferivelmente um polímero PLGA com um grupo 5 terminal hidrofílico.

EXEMPLO 16

Um paciente com insuficiência cardíaca congestiva, tal como insuficiência cardíaca congestiva descompensada aguda com dispnéia em repouso ou com atividade mínima, 10 recebeu uma formulação incluindo um ou mais de qualquer um dos construtos 1-1 a 1-248, 2-1 a 2-21, 5-1 a 5-18 e 6-1 a 6-12, incluindo uma formulação preparada através de qualquer método do Exemplo 10, por meio de injeção subcutânea.

EXEMPLO 17

Um paciente com insuficiência cardíaca congestiva crônica recebeu uma formulação injetável de liberação gradual do Exemplo por meio de injeção, tal como injeção intramuscular profunda, por exemplo, na região glútea ou 20 músculo deltóide.

EXEMPLO 18

Os depositantes também descobriram uma correlação inversa entre a proporção de resistência à digestão por endopeptidase neutra de um construto de acordo com ainvenção e seu "clearance" (depuração) farmacocinético(CL), conforme mostra a Tabela 7 abaixo. A endopeptidase neutra ("NEP") é uma enzima endógena que inativa e elimina todos os três peptídeos natriuréticos humanos. A NEP está presente nas células tubulares renais e nascélulas vasculares. A NEP é geralmente homóloga entre asespécies mamíferas. A identidade percentual de NEP entre Rato e Camundongo é de 98,5%, entre Humano e Camundongo é de 93,6% e entre Humano e Rato é de 93,7%. A resistência de diversos construtos da invenção à NEP foi avaliada utilizando-se o procedimento experimental a seguir descrito. Todos os construtos foram diluídos em tampão Tris-HCl 0, IM (pH 7,4) até 100 μΜ. 40 μL deconstrutos diluídos foram adicionados a cada tubo e todos os tubos mantidos em gelo. 40 μΐ de NEP diluída, seja NEP recombinante humana (R&D Systems, Minneapolis, MN, catálogo #1182-ZN) a 8ng/^L ou NEP de camundongo (R&D Systems, catálogo #1126-ZN) a 2,5 ng/^L, foi adicionada a cada tubo. Os tubos foram levemente misturados e submetidos à rotação. Todos os tubos foram então incubados a 3 7°C por 0, 0,5, 1, 1,5 e 2 horas. Ao final do período de incubação, a reação foi interrompida adicionando-se 5^L de TFA a 10%. Os construtos foram linearizados utilizando-se TCEP (Tris[2-carboxietil]fosfina. A proporção em que a NEP estava ativa em relação aos construtos foi então analisada por HPLC e/ou LC/MS. A análise de dados incluiu determinar a 15 porcentagem de material de partida restante, ou seja, construto peptídico não digerido, e a porcentagem e seqüência de cada fragmento proteolítico.

TABELA 7

<table>table see original document page 220</column></row><table>

Conseqüentemente, uma concretização da invenção provê umconstruto de acordo com qualquer uma das fórmulas da invenção que demonstre pelo menos 80% do material de partida restante após 1 hora sob as condições descritas de ensaio de resistência à hNEP. Uma concretização relacionada da invenção provê um construto de acordo comqualquer uma das fórmulas da invenção que demonstre pelo menos 90% do material de partida restante após 1 hora sob as condições descritas de ensaio de resistência à hNEP. Uma outra concretização relacionada da invenção provê um construto de acordo com qualquer uma das fórmulas da invenção que demonstre pelo menos 95% de material de partida restante após 1 hora sob as condições descritas de ensaio de resistência à hNEP. Numa variação de qualquer uma dessas concretizações, o construto também demonstra pelo menos 80% de material de partida restante após 2 horas sob as condições do ensaio.

Claims

1. Construto cíclico, com um N-terminal e um C-terminal, caracterizado pelo fato de se ligar a um receptor de peptídeo natriurético e que compreende uma pluralidade de resíduos aminoácido e pelo menos um substituto de aminoácido de fórmula I:<formula>formula see original document page 222</formula>R e R' são, cada qual, independentemente H ou uma porção de cadeia lateral de aminoácido natural ou não natural ou derivado de uma porção de cadeia lateral de aminoácido; χ é 1 ou 2; I-Y é CH2 ou C=O; W é CH2, NH OU NR'"; Z é H ou CH3;J é -C(=0)- salvo se o substituto estiver na posição C-terminal do construto, quando então J é -Hi -OH, -C(=0)-OH, -C(=0)-NH2, ou um grupo capeador C-terminal; Q é uma ligação, salvo se o substituto estiver na posição N-terminal do construto, quando então Q é -H ou um grupo capeador de amina;R'" é um acila, uma cadeia de alquila C1 a C17 linear ou ramificado uma cadeia de alquil acila C2 a C19 linear ou ramificado, um ômega amino alifático C1 a C17 linear ou ramificado ou um acila ômega amino alifático C1 a C17 linear ou ramificado; η é 0, 1 ou 2; eos átomos de carbono marcados com asterisco podem ter qualquer configuração estereoquímica;com pelo menos um substituto de fórmula I sendo covalentemente ligado a pelo menos um da pluralidade de resíduos aminoácido; eo construto sendo ciclizado através de formação deligação entre cadeias laterais de dois resíduos aminoácido adjacentes, entre uma cadeia lateral de um resíduo aminoácido e um substituto de aminoácido não adjacente, entre um grupo terminal de um resíduo aminoácido e a cadeia lateral de um resíduo aminoácido não adjacente, entre um grupo terminal de um resíduo aminoácido e um substituto de aminoácido não adjacente, ou entre dois substitutos de aminoácido não adjacentes.

2. Construto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender ainda pelo menosum grupo protético covalentemente ligado a um grupo reativo numa cadeia lateral ou grupo terminal de pelo menos um dos resíduos aminoácido, a um grupo amina ou grupo reativo num grupo capeador de amina onde o substituto está na posição N-terminal do construto, ou a um grupo carboxila, grupo amina ou grupo reativo num grupo capeador C-terminal onde o substituto está na posição C-terminal do construto.

3. Construto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o substituto estar na posiçãoC-terminal do construto e J ser um grupo capeador C-terminal consistindo de: - (CH2)m-OH,-C(=0) - (CH2)m-N(V1) (v2) , -C (=0) -O-(CH2)ra-CH3, -O- (CH2)m-CH3, -O- (CH2)m-N(V1) (V2) , -0- (CH2)ra-OH, -C (=0) -NH- (CH2)ra-S (V1) , -C (=0)-NH-(CH2)ra-CH3, -C (=0) -NH-(CH2) ra-N (V1) (v2) , -C (=0) -N-( (CH2)m-N(V1) (V2)) 2, -C (=0) -NH-CH (-C (=0) -0H) - (CH2)ra-N(V1) (v2) ,-C (=0) -NH- (CH2) m-NH-C (=0) -CH (N (V1) (v2) ) ( (CH2) m-N (V1) (v2) ) , ou-C (=0) -NH-CH (-C (=0) -N(V1) (v2) ) - (CH2)ra-N(V1) (v2) ;incluindo todas as configurações (R) ou (S) dos anteriormente citados, onde V1 e v2 são cada qualindependentemente H ou uma cadeia de alquila Ci a Ci7 linear ou ramificado e m é, em cada caso, independentemente de 0 a 17.

4. Construto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o substituto estar na posição C-terminal do construto e J ser um grupo capeador C-terminal consistindo de um ômega amino alifático, grupo arila ou aralquila terminal ou qualquer o;-aminoácido, β-aminoácido natural ou não natural simples, aminoácido ot, α-di-substituído, aminoácido N-substituído, incluindo todas as configurações (R) ou (S) dos anteriormente citados, opcionalmente em combinação com um grupo capeador C-terminal, conforme definido na reivindicação 2 .

5. Construto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o substituto estar na posição N-terminal do construto e Q ser um grupo capeador de amina consistindo de:- (CH2)m-N(V3) (V4) , 20 -(CH2)m-CH3,- (CH2)m-O(V3) ,- (CH2)m-C(=0) - (V3) ,- (CH2) m-C (=0) -0- (V3) ,- (CH2)m-S(V3) ,-C (=0) - (CH2)m-CH3,-C (=0) - (CH2)m-N(V3) (V4) , -C (=0) - (CH2) m-C (=0) - (V3) , -C (=0) - (CH2)m-O(V3) , ou -C (=0) - (CH2)m-S(V3) ; onde v3 e V4 são, cada qual, independentemente H, uma cadeia de alquilaCi a Ci7 linear ou ramificado ou uma cadeia de alquil acila C2 a Ci9 linear ou ramificado, contanto que, se um de v3 ou V4 for uma cadeia de alquil acila, então o outro de V3 ou v4 seja Hem seja de 0 a 17.

6. Construto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender pelo menos umsubstituto de fórmula II:<formula>formula see original document page 225</formula>onde o substituto está localizado em qualquer posição que não a posição N-terminal ou C-terminal e as linhas tracejadas indicam ligações peptídicas.

7. Construto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de pelo menos um substituto de fórmula I estar na posição C-terminal do construto e ser covalentemente ligado ao mesmo por uma ligação peptídica, de forma que o substituto apresente a fórmula:<formula>formula see original document page 225</formula>onde a linha tracejada indica uma ligação peptídica.

8. Construto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de pelo menos um substituto de fórmula I estar na posição N-terminal do construto e ser covalentemente ligado ao mesmo por uma ligação peptídica, de forma que o substituto apresente a fórmula:<formula>formula see original document page 225</formula>onde a linha tracejada indica uma ligação peptídica.

9. Construto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de pelo menos um substituto de fórmula I estar na posição C-terminal do construto, Q ser uma ligação e R e R'dos mesmos serem, cada qual, independentemente H ou uma porção de cadeia lateral de aminoácido natural ou não natural ou derivado de uma porção de cadeia lateral de aminoácido com um grupo heteroátomo compreendendo pelo menos um átomo denitrogênio, contanto que pelo menos um de R e R' não seja H.

10. Construto, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de pelo menos um de R e R'com um grupo heteroátomo compreendendo pelo menos um átomo de nitrogênio ter a fórmula -(CH2)y-R" onde y é de 1 a 5 e R" é um grujo heteroátomo compreendendo pelo menos um átomo de nitrogênio.

11. Construto, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de R" ser:-NH2,-NH-C (=NH) -NH2, -NH- (CH2)y-NH2,-NH-C -C (=0 -C (=0 -C (=0 -NH-C -NH-C -NH-C -NH-C -NH-C -NH-C -NH-C -NH-C -NH-C -NH-C -NH-C -NH-C=0) -NH2, -NH2, -NH-CH3, -NH- (CH2)y-NH2, =NH)-NH-Me, =NH)-NH-Et, =NH)-NH-Pr, =NH)-NH-Pr-i, =0) -CH3, =0) -CH2-CH3, =0) -CH- (CH3)2, =0) -O-CH3, =0) -O-CH2-CH3, =0) -0-C- (CH3)3, =0) -NH-CH3,=N-C (=0) -0-C- (CH3) 3) -NH-C (=0) -0-C- (CH3) 3,-N (C (=0) -0-C- (CH3)3) -C (=NH) -NH-C (=0) -0-C- (CH3)3,<formula>formula see original document page 226</formula><formula>formula see original document page 227</formula><formula>formula see original document page 228</formula>onde y é de 1 a 5.

12. Construto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o receptor de peptídeo natriurético ser um receptor para ANP, BNP, CNP, sCP,DNP, TNP-a, TNP-b ou TNP-c.

13. Construto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a pluralidade de resíduos aminoácido compreender α-aminoácidos, /3-aminoácidos naturais ou não naturais, aminoácidos N-substitu£dos, ouaminoácidos a,α-di-substituídos, incluindo todas as configurações (R) ou (S) de qualquer um dos anteriormente citados, ou qualquer combinação dos anteriormente citados.

14. Construto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de pelo menos dois da pluralidadede resíduos aminoácido serem unidos por uma ligação não-peptídica.

15. Construto, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de a pelo menos uma ligação não-peptídica ser -CH2-NH-, -CH2-S-, -CH2-O-, ou -C(=0) -CH2-, um isóstero de qualquer um dos anteriormente citados, ou -CH2-CH2- ou -CH=CH-.

16. Construto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender de doze a quinzeresíduos aminoácido e um substituto de fórmula I.

17. Construto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender de onze a quatorzeresíduos aminoácido e dois substitutos de fórmula I.

18. Construto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender de onze a quatorze resíduos aminoácido, um substituto de fórmula I e um substituto de fórmula I em uma ou outra das posições N-terminal ou C-terminal.

19. Construto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de exibir, quando da administração a um mamífero, uma ou mais vantagens relativas ã seqüência de aminoácido correspondente não compreendendo um substituto de aminoácido, as vantagens selecionadas do grupo consistindo de aumento da resistência à degradação enzimática, aumento da meia-vida de circulação, aumento da biodisponibilidade, aumento da 15 eficácia, e duração de efeito prolongada.

20. Construto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de, para pelo menos um substituto, um deReR' ser Η, χ ser 1, Y ser C=O, W ser NH, Z ser Hen ser 0.

21. Construto, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de o substituto estar na posição C-terminal do construto e J ser -C(=0)-NH2, -C(=0)-0H, -CH2-OH, -C (=0)-NH- (CH2)4-NH2, -C (=0)-NH-(CH2) 5-NH2, -C (=0)-NH-(CH2)6-NH2, -C (=0)-NH-(CH2) 7-NH2, ou -C (=0) -NH-(CH2) 8-NH2.

22. Construto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de o grupo protético compreender pelo menos uma seqüência polimérica compreendendo unidades de repetição que incluem átomos de carbono e hidrogênio.

23. Construto, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de as unidades de repetição compreenderem ainda átomos adicionais.

24. Construto, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de as unidades de repetição compreenderem ainda átomos de oxigênio.

25. Construto, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de a seqüência polimérica ser uma seqüência polimérica solúvel em água.

26. Construto, de acordo com a reivindicação 22, 5 caracterizado pelo fato de a seqüência polimérica serpoli(óxido de alquileno), poli(vinil pirrolidona), álcool polivinílico, polioxazolina ou poli(acriloilmorfolina).

27. Construto, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de o poli(óxido de alquileno) ser poli(etileno glicol) (PEG).

28. Construto, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de o grupo protético compreendendo PEG ser derivatizado com um grupo ligante.

29. Construto, de acordo com a reivindicação 27, 15 caracterizado pelo fato de o PEG ter uma faixa de pesomolecular de cerca de 200 MW a cerca de 40.000 MW.

30. Construto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de o grupo protético compreender um grupo amina reativo.

31. Construto, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de o grupo protético ser covalentemente ligado a uma amina reativa numa cadeia lateral de pelo menos um dos resíduos aminoácido.

32. Construto, de acordo com a reivindicação 30, 2 5 caracterizado pelo fato de o grupo protético sercovalentemente ligado a uma amina reativa num grupo capeador C-terminal onde o substituto está na posição C-terminal do construto.

33. Construto, de acordo com a reivindicação 30, 30 caracterizado pelo fato de o grupo protético sercovalentemente ligado a uma amina reativa num grupo capeador de amina onde o substituto está na posição N-terminal do construto.

34. Construto, de acordo com a reivindicação 30, 35 caracterizado pelo fato de o grupo protético sercovalentemente ligado a uma amina reativa num grupo amina onde o substituto está na posição N-terminal doconstruto.

35. Construto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de o grupo protético compreender um grupo carboxila reativo.

36. Construto, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de o grupo protético ser covalentemente ligado a um carbonila reativo numa cadeia lateral de pelo menos um dos resíduos aminoácido.

37. Construto, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de o grupo protético sercovalentemente ligado a um carboxila reativo num grupo capeador C-terminal, onde o substituto está na posição C-terminal do construto.

38. Construto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de o grupo protético compreenderum grupo tiol reativo.

39. Construto, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de o grupo protético ser covalentemente ligado a um tiol reativo numa cadeialateral de pelo menos um dos resíduos aminoácido.

40. Construto, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de o grupo protético ser covalentemente ligado a um tiol reativo num grupo capeador de amina, onde o substituto está na posição N-terminal do construto ou num grupo capeador C-terminal, onde o substituto está na posição C-terminal do construto.

41. Construto, caracterizado pelo fato de compreender de onze a treze resíduos aminoácido e pelo menos umsubstituto de aminoácido em qualquer posição que não aposição C-terminal da seguinte fórmula:<formula>formula see original document page 231</formula>onde Q, R, R', Y, W, Ζ, χ e η são conforme definido nareivindicação 1 para a fórmula I, e um substituto de aminoácido na posição C-terminal da seguinte fórmula:onde, para o substituto de aminoácido na posição C-terminal, Y, W, Z e χ são conforme definido na reividnicação 1 para a fórmula I, J é conforme definido na reivindicação 3, pelo menos um de R e R' é um grupo heteroátomo compreendendo pelo menos um átomo de nitrogênio da fórmula (CH2)y- R" onde y é de 1 a 5 e R" é conforme definido na reivindicação 11.

42. Construtoi de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de compreender ainda pelo menos um grupo protético covalentemente ligado a um grupo reativo numa cadeia lateral ou grupo terminal de pelo menos um dos resíduos aminoácido, a um grupo amina ou grupo reativo num grupo capeador de amina onde um substituto está na posição N-terminal do construto, ou a um grupo carboxila, grupo amina ou grupo reativo num grupo capeador C-terminal do substituto na posição C-terminal do construto.

43. Construto, caracterizado pelo fato de compreender a fórmula III:Aaal-Aaa2-Aaa3-Aaa4-Aaa5-Aaa6-Aaa7-Aaa8-Aaa9-Aaai0-Aaa11-Aaa12-Aaa13-Aaa14-Aaa15aminoácido incluindo ou derivado de Nle, Ala, Leu, lie, Vai, Arg, Phe, Lys, Tyr, Asp, Nva, Met, Met (0) , ou Met(O2), ou um aminoácido a,α-di-substituído derivado de Nle, Ala, Leu, lie, Vai, Arg, Phe, Lys, Tyr, Asp, Nva, Met, Met(O), ou Met(O2), incluindo todas as configurações (R) ou (S) de aminoácidosα,α-di-substituídos, onde os substituintes são diferentes, ou Aaa1 é um acila compreendendo um alquila linear C2 a C18, um alquila ramificado C3 a C17, um alquenila ou alquinila linear C2 a C18, ou um alquenila ou alquinila ramificado C3 a C18, ou Aaa, é um substituto de aminoácido da estrutura:onde a linha tracejada indica uma ligação peptídica; R e R'são independentemente H, uma cadeia alifática C1 a C6 linear ou ramificada, -(CH2)y-S-CH3, - (CH2) y-S (=0) -CH3, -(CH2)y-S(O2)-CH3, uma ligação e um anel de ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano ou ciclohexano, ou uma cadeia alifática Cx a C3 e um anel de ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano ou ciclohexano; χ é 1 ou 2; Y é CH2 ou C=O; W é CH2, NH OU NR'"; Z é H OU CH3; Q é -H, -(CH2)m-N(V3)(V4), -(CH2)m-CH3, -(CH2)m-O(V3), - (CH2)m-C (=0)-(v3), - (CH2)m-C (=0)-0-(V3) , -(CH2)m-S(V3),-C (=0) - (CH2)m-CH3, -C (=0) - (CH2)m-N(V3) (v4) ,-C (=0) - (CH2)m-C(=0) - (V3) , -C (=0) - (CH2)m-O(V3) , ou C (=0) - (CH2) m-S (v3) ; R'" é um acila, uma cadeia de alquila C1 a Ci7 linear ou ramificado, uma cadeia de alquil acila C2 a Ci9 linear ou ramificado, um ômega amino alifático Ci a Cx7 linear ou ramificado, ou um acila ômega amino alifático Ci to Ci7 linear ou ramificado; η é 0, 1 ou 2; m é 0 a 17; y é de 1 a 5; V3 e V4 são, cada qual, independentemente H, uma cadeia de alquila Ci a Ci7 linear ou ramificado ou uma cadeia de alquil acila C2 a C19 linear ou ramificado, contanto que, se um de v3 ou V4 for uma cadeia de alquil acila, então o outro de v3 e V4 é H; e os átomos de carbono marcados com asterisco podem ter qualquer configuração estereoquímica;Aaa2 e Aaa13 são iguais ou diferentes e são, cada qual, resíduos aminoácido de L- ou D-isômero formando uma ponte cíclica através das cadeias laterais de cada de Aaa2 eAaa13i onde o grupo ligante da ponte cíclica é-S-S-, -S-CH2-S-, -S-CH2-, -CH2-S-, -C(=0)-NH-, -NH-C(=0)-, -CH2-NH-, -NH-CH2-, -CH2-S(O)n- onde η é 1 ou 2, -S(O)n-CH2- onde η é 1 ou 2, -CH2-CH2-, -CH=CH- (E ou Ζ) , -C=C-, 5 -C(=0)-0-, -0-C(=0)-, -C (=OJ-CH2-, -CH2-Ci=O)-, -0-C(=0)-NH-, -NH-C(=0)-O-, ou -NH-C(=0)-NH-;Aaa3 é um L- ou D-isômero de um cü-aminoácido ou β-aminoácido, inclusive ou derivado de His, Ala, Ser, Thr, Lys, HLys, Orn, Cys, HCys, Dap, ou Dab, ou um aminoácido 10 a, α-di-substituído derivado de His, Ala, Ser, Thr, Lys, HLys, Orn, Cys, HCys, Dap, ou Dab, inclusive todas as configurações (R) ou (S) de aminoácidos a, a-di-substituídos onde os substituintes são diferentes, ou Aaa3 é um substituto de aminoácido da estrutura:<formula>formula see original document page 234</formula>onde ReR' são independentemente H ou uma porção de cadeia lateral de aminioácido deHis, Ala, Ser, Thr, Lys, HLys, Orn, Cys, HCys, Dap, ou Dab ou um derivado de uma porção de cadeia lateral de aminoácido de His, Ala, Ser, Thr, Lys, HLys, Orn, Cys, HCys, Dap, ou Dab; χ é 1 ou 2; Y é CH2 ou C=O; W é CH2, NH ou NR'"; Z é H ou CH3; R'" é um acila, uma cadeia de alquila C1 a C17 linear ou ramificado, uma cadeia de alquil acila C2 a C19 linear ou ramificado, um ômega amino alifático Ci a Ci7 linear ou ramificado; ou um acila aminoalifático Ci a Ci7 linear ou ramificado; e η é 0, 1 ou 2;Aaa4 é um L- ou D-isômero de um a-aminoácido ou β-aminoácido incluindo ou derivado de Phe, HPhe ou Pgl, ou Tyr, Leu, lie, Vai, Ala, Nle, Nva ou Tle substituído ou não substituído, ou um aminoácido a,a-di-substituídoderivado de Phe, HPhe ou Pgl, ou Tyr, Leu, Ile, Vai, Ala,Nle, Nva ou Tle substituído ou não substituído, inclusive todas as configurações (R) ou (S) de aminoácidos οί,αί-di-substituídos onde os substituintes são diferentes, ouAaa4 é um substituto de aminoácido como para Aaa3 onde R e R' são independentemente H ou uma porção de cadeia lateral de aminoácido de Phe, HPhe ou Pgl, ou Tyr, Leu, Ilei Vai, Ala, Nle, Nva ou Tle substituído ou não substituído ou um derivado de uma porção de cadeia lateral de aminoácido de Phe, HPhe ou Pgl, ou Tyr, Leu, lie, Vai, Ala, Nle, Nva ou Tle substituído ou não substituído;Aaa5 é Gly, Sar, um L- ou D-isômero de um ce-aminoácido ou jS-aminoácido inclusive ou derivado de Ala, ou Aib, ou Aaa5 é um substituto de aminoácido como para Aaa3 onde R e R' são independentemente H ou -CH3;Aaa6 é Gly, Sar, um L- ou D-isômero de um α-aminoácido ou /?-aminoácido inclusive ou derivado de Ala, ou Aib, ou Aaa6 é substituto de aminoácido como para Aaa3 onde R e R' são independentemente H ou -CH3;Aaa7 é um L- ou D-isômero de um o;-aminoácido ou β-aminoácido inclusive ou derivado de Arg, His, Ala, Ser, HSer, Thr, Lys, HLys, Orn, Cys, HCys, Cit, Abu, Dap, ou Dab, ou um aminoácido a,α-di-substituído derivado de Arg, His, Ala, Ser, HSer, Thr, Lysj HLys, Orn, Cys, HCys, Cit, Abu, Dap, ou Dab, inclusive todas as configurações (R) ou (S) de aminoácidos a, α-di-substituídos onde os substituintes são diferentes, ou Aaa7 é um substituto deaminoácido como para Aaa3 onde R e R' sãoindependentemente H ou uma porção de cadeia lateral de aminoácido de Arg, His, Ala, Ser, HSer, Thr, Lys, HLys, Orn, Cys, HCys, Abu, Dap, ou Dab ou um derivado de uma porção de cadeia lateral de aminoácido de Arg, His, Ala,Ser, HSer, Thr, Lys, HLys, Orn, Cys, HCys, Abu, Dap, ouDab;Aaa8 é Gly, um L- ou D-isômero de um α-aminoácido ou β-aminoácido inclusive ou derivado de Nle, Ile, Leu, Vai, Phe, Ala, Nva, Met (0) , Met(O2), ou Tle, ou um aminoácido a, α-di-substituído derivado de Nle, lie, Leu, Vai, Phe, Ala, Nva, Met (O) , Met(O2), ou Tle, inclusive todas as configurações (R) ou (S) de aminoácidos a, a-di-substituídos onde os substituintes são diferentes, ou Aaa8 é um substituto de aminoácido como para Aaa3 onde R e R' são independentemente H ou uma porção de cadeia lateral de aminoácido de Nle, lie, Leu, Vai, Phe, Ala, Nva, Met(O) , Met(O2) , ou Tle, ou um derivado de uma porção de cadeia lateral de aminoácido de Nle, Ile, Leu, Vai, Phe, Ala, Nva, Met (0) , Met(O2), ou Tle; Aaa9 é um L- ou D-isômero de um α-aminoácido ou β-aminoácido inclusive ou derivado de Asp, Glu, His, Ala, Ser, Thr, Lys, HLys, Cys, HCys, Met (0) , Met(O2), Orn, Dap, ou Dab, ou um aminoácido a, α-di-substituído derivado de Asp, Glu, His, Ala, Ser, Thr, Lys, HLys, Cys, HCys, Met (0) , Met(O2), Orn, Dap, ou Dab, inclusive todas as configurações (R) ou (S) de aminoácidos a,Q!-di-substituídos onde os substituintes são diferentes, ouAaa9 é um substituto de aminoácido como para Aaa3 onde R e R' são independentemente H ou uma porção de cadeia lateral de aminoácido de Asp, Glu, His, Ala, Ser, Thr, Lys, HLys, Cys, HCys, Met (0) , Met(O2), Orn, Dap, ou Dab ou um derivado de uma porção de cadeia lateral de aminoácido de Asp, Glu, His, Ala, Ser, Thr, Lys, HLys, Cys, HCys, Met (O) , Met(O2), Orn, Dap, ou Dab; Aaa10 é um L- ou D-isômero de um α-aminoácido ou β-aminoácido inclusive ou derivado de Arg, His, Ala, Ser, Thr, Lys, HLys, Cys, HCys, Cit, Met(O), Orn, Dap, ou Dab, ou um aminoácido a,α-di-substituído derivado de Arg, His, Ala, Ser, Thr, Lys, HLys, Cys, HCys, Met(O), Orn, Dap, ou Dab, inclusive todas as configurações (R) ou (S) de aminoácidos a,α-di-substituídos onde os substituintes são diferentes, ou Aaa10 é um substituto de aminoácido como para Aaa3 onde Re R' são independentemente H ou uma porção de cadeia lateral de aminoácido de Arg, His, Ala, Ser, Thr, Lys, HLys, Cys, HCys, Cit, Met(O), Orn, Dap, ou Dab ou um derivado de uma porção de cadeia lateral de aminoácido de Arg, His, Ala, Ser, Thr, Lys, HLys, Cys, HCys, Met(O), Orn, Dap, ou Dab;Aaa11 é Gly ou um D- ou L-isômero de um a-aminoácido ouB-aminoácido inclusive ou derivado de Nle, Ile, Leu, Vai, Phe, Ala, Nva, Cys, HCys, Abu ou Tle, ou um aminoácido a, oí-di-substituído derivado de Nle, lie, Leu, Vai, Phe, Ala, Nva, Cys, HCys, Abu ou Tle, inclusive todas as configurações (R) ou (S) de aminoácidos a, a-di-substituídos, onde os substituintes são diferentes, ou Aaa11 é um substituto de aminoácido como para Aaa3 onde R e R' são independentemente H ou uma porção de cadeia lateral de aminoácido de Nle, lie, Leu, Vai, Phe, Ala, Nva, Cys, HCys, Abu ou Tle ou um derivado de uma porção de cadeia lateral de aminoácido de Nle, Ile, Leu, Val7 Phe, Ala, Nva, Cys, HCys, Abu ou Tle;Aaa12 é Gly, um L- ou D-isômero de um α-aminoácido ou β-aminoácido inclusive ou derivado de Ser, Nle, lie, Leu, Vai, Phe, Ala, Nva, Arg, Lys, Orn, Cys, HCys, Abu ou Tle, ou um aminoácido a,α-di-substituído derivado de Ser, Nle, lie, Leu, Vai, Phe, Ala, Nva, Arg, Lys, Orn, Cys, HCys, Abu ou Tle, inclusive todas as configurações (R) ou (S) de aminoácidos oi, a-di-substituídos, onde os substituintes são diferentes, ou Aaa12 é um substituto de aminoácido como para Aaa3 onde R e R' são independentemente H ou uma porção de cadeia lateral de aminoácido de Ser, Nle, Ile, Leu, Vai, Phe, Ala, Nva, Arg, Lys, Orn, Cys, HCys, Abu ou Tle ou um derivado de uma porção de cadeia lateral de aminoácido de Ser, Nle, Ile, Leu, Vai, Phe, Ala, Nva, Arg, Lys, Orn, Cys, HCys, Abu ou Tle;Aaa14 é um L- ou D-isômero de um α-aminoácido ou β-aminoácido inclusive ou derivado de Phe, HPhe ou Pgl, ou Tyr, Leu, lie, Vai, Ala, Lys, Orn, Nle, Nva ou Tle substituídos ou não substituídos, ou um aminoácido α,οι-di-substituído derivado de Phe, HPhe ou Pgl, ou Tyr, Leu, lie, Vai, Ala, Lys, Orn, Nle, Nva ou Tle substituídos ou não substituídos, inclusive todas as configurações (R) ou (S) de aminoácidos a,o;-di-substituídos onde os substituintes são diferentes, ou Aaa14 é um substituto de aminoácido da estrutura defórmula II como para Aaa3 onde R e R' são independentemente H ou uma porção de cadeia lateral de aminoácido de Phe, HPhe ou Pgl, ou Tyr, Leu, Ile, Vai, Ala, Lys, Orn, Nle, Nva ou Tle substituído ou não substituído ou um derivado de uma porção de cadeia lateral de aminoácido de Phe, HPhe ou Pgl, ou Tyr, Leu, lie, Vai, Ala, Lys, Orn, Nle, Nva ou Tle substituídos ou não substituídos;Aaa15 é um D- ou L-isômero de um α-aminoácido ou β-aminoácido inclusive ou derivado de Ala, Arg, Orn, Lys, Dap, Dab, HArg, ou HLys, ou um aminoácido α,α-di-substituído derivado de Ala, Arg, Orn, Lys, Dap, Dab, HArg, ou HLys, inclusive todas as configurações (R) ou (S) de aminoácidos a,α-di-substituídos, onde os substituintes são diferentes,ou Aaa15 é um substituto de aminoácido com a seguinte estrutura:onde a linha tracejada indica uma ligação peptídica; pelo menos um de R e R' é (CH2)y- R" e se um, o restante de R e R' é H, onde R" é: -NH2,-NH-C (=NH) -NH2, -NH- (CH2)y-NH2, -NH-C (=0) -NH2, -C (=0) -NH2, 2-C (=0)-NH-CH3,-C (=0) -NH- (CH2)y-NH2, -NH-C(=NH)-NH-Me, -NH-C(=NH)-NH-Et, -NH-C(=NH)-NH-Pr, 30 -NH-C(=NH)-NH-Pr-i, -NH-C (=0) -CH3, -NH-C (=0) -CH2-CH3,-NH-C (=0) -CH- (CH3)2, -NH-C(=0)-O-CH3, -NH-C (=0) -O-CH2-CH3, -NH-C (=0) -O-C- (CH3)3, 5 -NH-C(=0)-NH-CH3,-NH-C (=N-C (=0) -O-C- (CH3) 3) -NH-C (=0) -O-C- (CH3) 3, -N (C (=0) -O-C- (CH3)3) -C (=NH) -NH-C (=0) -O-C- (CH3)3,<formula>formula see original document page 239</formula><formula>formula see original document page 240</formula>χ é 1 OU 2; Y é CH2 OU C=O; W é CH2, NH OU NR"'; Z é H OU CH3; J é -Η, -(CH2)m-OHi -C (=0)-CH2) m-0H,C (=0) -CH2) m-N (V1) (V2) , -C (=0)-0-(CH2)m-CH3, -O-(CH2)m-CH3, -O-(CH2)m-N(V1)(V2)7 -O-(CH2)m-OH, -C (=0)-NH-(CH2) m-CH3, -C (=0) -NH- (CH2)m-N(V1) (V2) , -C (=0) -NH- (CH2)m-S (V1) ,-C (=0) -N-( (CH2)m-N(Vi) (V2)) 2, -C(=0) -NH-CH (-C (=0) -0H) -(CH2)m-N(V1) (V2) ,-C (=0) -NH- (CH2) m-NH-C(=0) -CH(Niv1) (v2) ) ( (CH2)m-N(V1) (v2) ) , -C (=0)-NH-CH (-C (=0)-N(V1) (v2) )- (CH2) m-N (V1) (v2),um ômegaamino alifático, grupo arila ou aralquila terminal, qualquer ce-aminoácido simples natural ou não natural, β-aminoácido ou aminoácido a,α-di-substituído em combinação com um dos grupos anteriormente citados definindo J, ou 5 qualquer α-aminoácido simples natural ou não natural, β-aminoácido ou aminoácido a,α-di-substituído, inclusive todas as configurações (R) e (S) de qualquer um dos anteriormente citados; R'" é um acila, uma cadeia de alquila Ci a Ci7 linear ou ramificado, uma cadeia de 10 alquil acila C2 a Ci9 linear ou ramificado, um ômega amino alifático Ci a Ci7 linear ou ramificado, ou um acila ômega amino alifático Ci a Ci7 linear ou ramificado; Vi e V2 são cada qual independentemente H ou uma cadeia de alquila Cx to Ci7 linear ou ramificado; η é 0, 1 ou 2; m é de 0 a 17; 15 y é de 1 a 5; e os átomos de carbono marcados com asterisco podem ter qualquer configuração estereoquímica; contanto que pelo menos um de Aaa1, Aaa3 a Aaa12, Aaa14 ou Aaa15 seja um substituto de aminoácido.

44. Construto, de acordo com a reivindicação 43,caracterizado pelo fato de um de Aaa1, Aaa3 a Aaa12, Aaa14ou Aaa15 ser um substituto de aminoácido.

45. Construto, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de um de Aaa1, Aaa5 e Aaa15 ser um substituto de aminoácido.

46. Construto, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de quaisquer dois de Aaa1, Aaa3 a Aaa12, Aaa14 e Aaa15 serem substitutos de aminoácido.

47. Construto, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de dois de Aaa1, Aaa5 e Aaa15serem um substituto de aminoácido.

48. Construto, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de três ou mais de Aaa1, Aaa3 a Aaa12, Aaa14 ou Aaa15 serem um substituto de aminoácido.

49. Construto, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de ser ciclizado pela formação deligação dissulfeto através das cadeias laterais de Aaa2 e Aaa13.

50. Construto, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de pelo menos um de Aaa3, Aaa5, Aaa6, Aaa7, Aaa9, Aaa10, ou Aaa12 ser um L- ou D-isômero de Ala.

51. Construto, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de compreender ainda pelo menos um grupo protético covalentemente ligado a um grupo reativo numa cadeia lateral ou grupo terminal de pelo menos um dos resíduos aminoácido, a um grupo amina ou grupo reativo num grupo capeador de amina, onde o substituto está na posição N-terminal do construto, ou a um grupo carboxila, grupo amina ou grupo reativo num grupo capeador C-terminal, onde o substituto está na posição C-terminal do construto.

52. Construto, caracterizado pelo fato de ter a fórmula IV:<formula>formula see original document page 242</formula>onde :Aaa3, Aaa4, Aaa5, Aaa6, Aaa7, Aaa8, Aaa9, Aaa10, Aaa11, Aaa12, e Aaa14 são α-aminoácidos, /3-aminoácidos ou aminoácidos a,a-di-substituídos, conforme definido na reivindicação 43;Aaa2 e Aaa13 são iguais ou diferentes, e são, cada qual, resíduos aminoácido formando uma ponte cíclica através das cadeias laterais de cada um de Aaa2 e Aaa13, onde R1 forma uma porção da cadeia lateral de cada de Aaa2 e Aaa13 ;Ri é -S-S-, -S-CH2-S-, -S-CH2-, -CH2-S-, -C(=0)-NH-, -NH-C(=0)-, -CH2-NH-, -NH-CH2-, -CH2-S(O)n- onde η é 1 ou 2, -S(O)n-CH2- onde η é 1 ou 2, -CH2-CH2-, -CH=CH- (E ou Ζ) , - CsC-, -C(=0)-O-, -O-C(=0)-, -C(=0)-CH2-, -CH2-C(=0)-, -0-C(=0)-NH-, -NH-C(=0)-0-, ou -NH-C(=0)-NH-;um de R2 e R2' é H, e o outro é H ou uma cadeia alifática C1 a C6 linear ou ramificada, -(CH2)y-S-CH3, -(CH2)y-S(=0)-CH3, -(CH2)y-S(O2)-CH3, uma ligação e um anel de ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano ou ciclohexano,ou uma cadeia alifática Ci a C3 e um anel de ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano ou ciclohexano; Um de R3 e R3- é H, e o outro é (CH2)y-R5; R4 é OH,<formula>formula see original document page 243</formula>R5 é -NH2,-NH-C (=NH) -NH2, -NH- (CH2)y-NH2, 10 -NH-C (=0) -NH2,-NH2, -NH-CH3, -NH- (CH2)y-NH2, =NH)-NH-Me, -NH-C(=NH)-NH-Et, =NH)-NH-Pr, =NH)-NH-Pr-i, =0) -CH3, =0)-CH2-CH3, =0) -CH- (CH3)2, =0) -O-CH3, =0) -O-CH2-CH3, =0) -0-C- (CH3)3, ;=0)-NH-CH3,-NH-C (=N-C (=0) -0-C- (CH3) 3) -NH-C (=0) -0-C- (CH3) 3 /-C (=0 -C (=0 -C (=0 -NH-C -NH-C -NH-C -NH-C -NH-C -NH-C -NH-C -NH-C -NH-C -NH-C -NH-C -NH-C-N (C (=0) -0-C- (CH3) 3) -C (=NH) -NH-C (=0) -0-C- (CH3) 3<formula>formula see original document page 244</formula><formula>formula see original document page 245</formula>R6 e R7 são cada qual independentemente H, uma cadeia de alquila linear ou ramificado Ci a C4; χ é, em cada caso, independentemente 1 ou 2; y é de 1 a 5 ;ζ é de 1 a 7; eonde os átomos de carbono marcados com asterisco podem ter qualquer configuração estereoquímica.

53. Construto, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de R1 ser -S-S- e Aaa2 e Aaa13serem, cada qual, Cys, Pen ou HCys.

54. Construto, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de R1 ser -C (=0)-NH- ou -NH-C (=0) -, e um de Aaa2 ou Aaa13 ser Asp ou Glu enquanto o outro de Aaa2 ou Aaa13 é Lys, Orn, Dab, ou Dap.

55. Construto, caracterizado pelo fato de apresentar a fórmula V:<formula>formula see original document page 245</formula>onde cada de Aaa2 a Aaa14, R1 e χ são conforme na reivindicação 43 e R4 é OH ou NH2.

56. Construto, caracterizado pelo fato de apresentar fórmula VI:<formula>formula see original document page 245</formula>onde cada de Aaa2 a Aaa14 e R1 são conforme definido na reivindicação 43 e R4 é OH ou NH2.

57. Construto, caracterizado pelo fato de apresentar as fórmulas VII, VIII, IX, Χ, XI ou XII:<formula>formula see original document page 246</formula>