BRPI0709142A2 - método para a produção enzimática de ácidos carboxìlicos de 2-hidróxi-2-metila - Google Patents

Abstract

MéTODO PARA A PRODUçãO ENZIMáTICA DE áCIDOS CARBOXìLICOS DE 2-HIDRóXI-2-METILA. A presente invenção refere-se a um método para a produção enzimática de ácidos 2-hidróxi-2-metil carbocílicos a partir de ácidos carboxilicos de 3-hidróxi, em que um ácido 3-hidróxi carboxi'lico é produzido em uma solução de reação aquosa e/ou é adicionado a essa solução de reação e é incubado. A solução de reação aquosa compreende uma unidade que tem atividade de mutase de 3-hidróxi-carboxilato-CoA que tem ambas as atividades de produção de éster de 3-hidróxi-carbonil-CoA e de isomerização de éster de 3-hidróxi-carbonila-CoA e converte o ácido 3-hidróxi carboxílico no ácido 2-hidróxi-2-metil carboxílico de que é isolado como ácido, ou na forma de seus sais. Em uma modalidade preferida, a unidade tendo atividade de mutase de 3-hidróxi-carboxilato-CoA é uma unidade que inclui uma mutase dependente de cobalamina isolada e, onde apropriado, uma enzima ou sistema de enzimas produzindo éster de 3-hidróxi-carbonil-CoA ou um microrganismo que os inclui. A invenção preferivelmente refere-se a um processo biotecnológico para produzir ácidos 2-hidróxi-2-metil carboxílicos, onde os microrganismos que têm as atividades desejadas são cultivados em um sistema aquoso com a ajuda de produtos naturais simples e convertem ésteres de 3-hidro-carbonil-CoA formados intracelularmente em ácidos 2-hidróxi-2-metil carboxílicos correspondentes. A invenção de maneira semelhante abrange a produção de ácidos 2-metil carboxílicos não saturados, onde os ácidos 2-hidróxi-2-metil carboxílicos obtidos são convertidos por desidratação nos ácidos 2-metil carboxílicos não-saturados correspondentes (ácido metacrìlico e homólogos superiores).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOPARA A PRODUÇÃO ENZIMÁTICA DE ÁCIDOS CARBOXÍLICOS DE 2-HIDRÓXI-2-METILA".

A presente invenção refere-se a um método para a produçãoenzimática de ácidos 2-hidróxi-2-metil carboxílicos de ácidos 3-hidróxi car-boxílicos, em que um ácido 3-hidróxi carboxílico é produzido em uma solu-ção de reação aquosa e/ou é adicionado a essa solução de reação e é incu-bado. A solução de reação aquosa compreende uma unidade que tem ativi-dade de mutase de 3-hidróxi-carboxilato-CoA a qual tem ambas as ativida-des de produção de éster 3-hidróxi-carbonil-CoA e isomerização de éster 3-hidróxi-carbonil-CoA, e converte o ácido 3-hidróxi carboxílico no ácido 2-hidróxi-2-metil carboxílico correspondente, que é isolado como ácido ou naforma de seus sais. Em uma modalidade preferida, a unidade que tem ativi-dade de mutase de 3-hidróxi-carboxilato-CoA compreende uma mutase de-pendente de cobalamina isolada e, onde apropriado, uma enzima ou sistemade enzimas que produzem éster 3-hidróxi-carbonil-CoA, ou é um microrga-nismo incluindo-os. A invenção preferivelmente refere-se a um processo bio-tecnológico para produzir ácidos 2-hidróxi-2-metil carboxílicos, onde os mi-crorganismos que têm a atividade de mutase desejada são cultivados em umsistema aquoso com o auxílio de produtos naturais simples, e ésteres 3-hidróxi-carbonil-CoA intracelularmente formados são convertidos nos ácidos2-hidróxi-2-metil carboxílicos correspondentes. A invenção de forma seme-lhante abrange a produção de ácidos 2-metil carboxílicos não saturados,onde os ácidos 2-hidróxi-2-metil carboxílicos obtidos são convertidos peladesidratação nos ácidos 2-metil carboxílicos não saturados correspoonden-tes (ácido metacrílico e homólogos superiores).

Em uma modalidade preferida da invenção, o microrganismo deprodução de tioéster 3-hidróxi-carbonil-CoA e o de isomerização de tioéster3-hidróxi-carbonil-CoA usado é a cepa HCM-10 (DSM 18028).

Ácido metacrílico e ácidos 2-metil carboxílicos homólogos nãosaturados são largamente usados na produção de folhas de vidro de acrílico,produtos moldados por injeção, revestimentos e muitos outros produtos.Uma pluralidade de processos para a produção do ácido meta-crílico e seus homólogos tem sido descrita. Entretanto, a vasta maioria daprodução comercial no mundo inteiro está baseada em um método de hidro-Iisar os sulfatos de amida de ácido metacrílico e seus homólogos, que sãoproduzidos a partir das 2-hidróxi nitrilas correspondentes (W. Bauer, "Me-tharylic acid and derivatives", em: UIImann1S Encyclopedia of Industrial Che-mistry, 59 edition, editores: B. Elvers, S. Hawkins, G. Schulz, VCH, NewYork, 1990, Vol. A16, pp. 441-452; A. W. Gross, J. C. Dobson, "Methacrylicacid and derivatives", in Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology,4th edition, editors: J. I. Kroschwitz, M. Howe-Grant, John Wiley & Sons,New York, 1995, Vol. 16, pp. 474-506). Esse método requer, por exemplo,cerca de 1,6 kg de ácido sulfúrico para a produção de 1 kg de ácido metacrí-lico. Por este motivo, métodos alternativos para a produção comercial deácido metacrílico sem a necessidade de recuperar o ácido sulfúrico (e altoscustos de energia associados a isso) podem ser vantajosos.

US 3.666.805 e US 5.225.594 descreveram a conversão químicado ácido 2-hidróxi isobutírico em ácido metacrílico. Isto compreende desidra-tar o ácido 2-hidróxi isobutírico usando óxidos de metal, hidróxidos de metal,resinas de troca de íons, alumina, dióxido de silicone, aminas, fosfinas, alco-xidos de metal de álcali e carboxilatos de metal de álcali. As temperaturas dereação usuais são entre 160°C e 250°C. Esse método tornou possível aoácido metacrílico um rendimento de até 96%.

Um método alternativo para a produção de ácido metacrílico eseus homólogos baseia-se na hidrólise de 2-hidróxi nitrilas aos ácidos 2-hidróxi-2-metil carboxílicos correspondentes, utilizando enzimas que hidroli-sam nitrilas. Estas últimas são a nitrilase ou uma combinação de nitrila hidra-tase e amidase (A. Banerjee, R. Sharma, U. C. Banerjee, 2002, "The nitrile-degrading enzymes: current status and future prospects", Appl. Microbiol.Biotechnol., 60:33-44. Esse método é protegido por uma pluralidade de pa-tentes (US 6,582,943 B1). Uma séria desvantagem desse método reside nainstabilidade das nitrilas na faixa de pH neutro necessária para uma ativida-de eficiente das enzimas que hidrolisam nitrilas. A decomposição das nitrilasna mistura da reação resulta em acúmulo de cetonas e de cianetos, ambosos quais inibem as atividades das enzimas envolvidas na hidrólise de nitrilas.

Uma desvantagem geral de ambos os métodos, isto é, do méto-do atualmente predominante, baseado em sulfatos de amida, e do métodoenzimático de hidrólise de nitrilas, é a necessidade de 2-hidróxi nitrilas. Es-tas últimas devem ser preparadas, em primeiro lugar, a partir de reagentesprejudiciais para o ambiente, isto é, cetonas e cianeto.

Por essa razão, métodos para a produção de ácido metacrílico eseus homólogos, que se baseiam em reagentes simples e benignos para oambiente, seriam vantajosos.

Por conseguinte, a invenção teve por objetivo pesquisar possibi-lidades alternativas de produzir ácidos 2-hidróxi-2-metil carboxílicos e provermétodos que se baseiem, quando possível, na aplicação de reagentes sim-ples e benignos para o ambiente, que consumam pouca energia e que pro-duzam poucos produtos de degradação.

Esse objetivo é alcançado por um método enzimático para a pro-dução de ácidos 2-hidróxi-2-metil carboxílicos a partir de ácidos 3-hidróxicarboxílicos. De acordo com a invenção, o dito ácido 3-hidróxi carboxílico éproduzido em e/ou adicionado a uma solução de reação aquosa, que apre-senta uma unidade exibindo atividade de 3-hidróxi-carboxilato-CoA mutase.

Uma unidade exibindo atividade de 3-hidróxi-carboxilato-CoA mutase signifi-ca, para o propósito da invenção, uma unidade compreendendo uma mutasedependente de cobalamina e, onde apropriado, uma enzima produtora deéster de 3-hidróxi-carbonil-CoA ou um sistema enzimático ou um sistemabiológico que as compreende ou que as produz, que apresentam atividadede 3-hidróxi-carboxilato-CoA mutase e exibem atividade tanto de produçãode éster de 3-hidróxi-carbonil-CoA quanto de isomerização de éster de 3-hidróxi-carbonil-CoA. Após incubação, o ácido 2-hidróxi-2-metil carboxílicocorrespondentemente convertido é então isolado na forma de ácido ou naforma de seus sais.

A invenção refere-se preferivelmente a um processo biotecnoló-gico para a produção de ácidos 2-hidróxi-2-metil carboxílicos com o uso demicrorganismos. Os ditos microrganismos habitualmente possuem atividadede síntese de éster de 3-hidróxi-carbonil-CoA e são capazes de produzir oucompreender essa mutase dependente de cobalamina e, devido à atividadeda 3-hidróxi-carboxilato-CoA mutase, são capazes de converter intracelular-mente ésteres de 3-hidróxi-carbonil-CoA formados a partir de produtos natu-rais simples (a partir de reagentes tais como, por exemplo, açúcares e/ouálcoois e/ou ácidos orgânicos e seus derivados) nos ésteres de 2-hidróxi-2-metil-carbonil CoA correspondentes.

O método da invenção caracteriza-se, em particular, pelo fato deque os microrganismos que produzem ou que compreendem a mutase de-pendente de cobalamina e que exibem atividade de 3-hidróxi-carboxilato-CoA mutase são usados em sistemas aquosos para conversão de ácidos 3-hidróxi carboxílicos no ácido 2-hidróxi-2-metil carboxílico correspondente.

Em uma variante preferida do método, microrganismos que com-preendem atividade de 3-hidróxi-carboxilato-CoA mutase e que exibem ativi-dade de produção de tioéster de 3-hidróxi-carbonil-CoA e de isomerizaçãode tioéster de 3-hidróxi-carbonil-CoA são cultivados em um sistema aquosocom matérias-primas renováveis ou produtos de degradação que derivam doconsumo de matérias-primas renováveis, como fontes de carbono e de e-nergia. No processo, os tioésteres de 3-hidróxi-carboxilato-CoA formadosintracelularmente são convertidos nos ácidos 2-hidróxi-2-metil carboxílicoscorrespondentes. A reação é efetuada preferivelmente com a adição de áci-do 3-hidróxi carboxílico externo. O ácido 2-hidróxi-2-metil carboxílico cor-respondente é, a seguir, isolado como ácido ou na forma de seus sais.

Esse novo método de biotecnologia, que utiliza a produção deácidos 3-hidróxi carboxílicos a partir de produtos naturais simples e sua iso-merização a ácidos 2-hidróxi-2-metil carboxílicos, é capaz de solucionar oproblema especificado acima.

Em uma modalidade preferida da invenção, o método compre-ende as seguintes etapas:

(a) ácidos 3-hidróxi carboxílicos são produzidos a partir de pro-dutos naturais simples e, a seguir, convertidos em ácidos 2-hidróxi-2-metilcarboxílicos, em um sistema biológico apropriado, que possui atividade desíntese de ésteres de 3-hidróxi-carbonil-CoA e atividade de mutase, e

(b) os ácidos 2-hidróxi-2-metil carboxílicos são isolados na formade ácidos livres ou seus sais correspondentes.

Os ácidos 2-hidróxi-2-metil carboxílicos obtidos dessa maneirapodem ser usados de modo vantajoso para produzir ácidos isoalquenóicosC2 e C3-insaturados (ácido metacrílico e seus homólogos), possivelmentepor desidratação dos ácidos produzidos em (a) e (b) ou seus sais corres-pondentes. Essas reações são descritas abaixo:

- produtos naturais simples (por exemplo, matérias-primas reno-váveis ou produtos de degradação que derivam do consumo de matérias-primas renováveis, tais como, por exemplo, açúcares, ácidos orgânicos ouálcoois) —> ácidos 3-hidróxi carboxílicos —> ácidos 2-hidróxi-2-metil carboxíli-cos (por exemplo, pela cepa HCM-10)

- ácidos 2-hidróxi-2-metil carboxílicos —► ácido metacrílico e ho-mólogos (por exemplo, na presença de NaOH e a uma temperatura de185°C).

As condições da reação (pH, concentração de íons, necessida-des de oxigênio/dióxido de carbono, oligoelementos, temperaturas e simila-res) são naturalmente escolhidas aqui, de tal maneira que os microrganis-mos sejam capazes de converter idealmente ácidos 3-hidróxi carboxílicosem ácidos 2-hidróxi-2-metil carboxílicos. Nessas condições do processo, amutase dependente de cobalamina pode apresentar maior estabilidade eeficácia no microambiente natural, isto é, no interior da célula, do que a en-zima isolada. Além disso, a propagação celular e, portanto, um aumento naconcentração de mutase podem ser possíveis em condições apropriadas. Aconversão enzimática por meio de microrganismos constitui, portanto, ondeapropriado, uma importante vantagem no que concerne à confiabilidade, au-tomatização e simplicidade, bem como à qualidade e ao rendimento do pro-duto final do método.

Para a conversão enzimática de acordo com a invenção de áci-dos 3-hidróxi carboxílicos em ácidos 2-hidróxi-2-metil carboxílicos, é tambémpossível introduzir na solução da reação a unidade exibindo atividade de 3-hidróxi-carboxilato-CoA mutase, isto é, uma mutase dependente de cobala-mina, preferivelmente em combinação com uma atividade de síntese de és-ter de CoA, em uma forma purificada, concentrada e/ou isolada, sendo pos-sível que as enzimas sejam de origem natural, por exemplo. Naturalmente,as enzimas podem ser enzimas produzidas de modo recombinante a partirde um organismo geneticamente modificado.

Para a finalidade da invenção, as enzimas são usadas no méto-do da invenção como catalisadores, tanto na forma de células microbianasintactas quanto na forma de células microbianas permeabilizadas. Outrosusos possíveis são aqueles na forma de componentes (um ou mais) a partirde extratos de células microbianas, mas também em uma forma parcialmen-te purificada ou purificada. Onde apropriado, outras enzimas envolvidas nasíntese de éster de CoA, como, por exemplo, CoA transferase ou CoA sinte-tases, são usadas de acordo com a invenção. Os catalisadores enzimáticospodem ser imobilizados ou ligados a um material de suporte dissolvido ounão-dissolvido.

Em uma variante de modalidade preferida, compartimentos decélulas particulares ou partes dos mesmos, separados uns dos outros oucombinados, isto é, estruturas de carboidratos, lipídios ou proteínas e/oupeptídeos e também ácidos nucléicos, que são capazes de influenciar a uni-dade exibindo atividade de mutase de maneira positiva ou negativa, podemser combinados ou separados. Para utilizar essa influência de modo inten-cional, por exemplo, são preparados extratos brutos a partir dos microrga-nismos de uma maneira específica, por exemplo, onde os extratos são cen-trifugados, onde apropriado, para ser possível efetuar uma reação da inven-ção com o sedimento ou o sobrenadante.

Os ácidos 3-hidróxi carboxílicos (por exemplo, ácido 3-hidróxibutírico) ou, mais especificamente, seu CoA tioéster intracelular 3-hidróxi-carbonil-CoA, podem ser prontamente produzidos a partir de produtos natu-rais simples por um grande número de cepas de bactérias. Esses ácidos sãoos blocos/monômeros básicos de construção para a substância bacterianacomum de armazenamento de carbono e energia, o poli-3-hidroxialcanoato.

Os rearranjos do carbono dentro do esqueleto dos ácidos carboxílicos tam-bém são comuns em sistemas bacterianos, bem como em outros sistemasbiológicos. Todavia, nenhum sistema biológico para a conversão de ésteresde 3-hidróxi-carbonil-CoA nos ésteres de 2-hidróxi-2-metil-carbonil-CoA cor-respondentes havia sido previamente identificado. A invenção baseia-se noachado surpreendente de que sistemas com atividade de mutase dependen-te de cobalamina possuem ambas as propriedades.

Os microrganismos que compreendem mutases dependentes decobalamina incluem, por exemplo, Methylibium petroleiphilum PM1, Methyli-bium sp. R8 (coleção de cepas UFZ, Leipzig, Alemanha), a cepa β-proteobacteriana HCM-10, Xanthobacter autotrophicus Py2, Rhodobactersphaeroides (ATCC17029) ou Nocardioides sp. JS614.

Foi encontrado um sistema biológico preferivelmente apropriadona cepa HCM-10. A dita cepa foi depositada, de acordo com o Tratado deBudapeste, no depósito de microrganismos para as finalidades de procedi-mento de patentes no Deutschen Sammlung von Microorganismen und Zell-kulturen GmbH [Coleção de microrganismos e culturas celulares da Alema-nha], Brunswick, Alemanha, sob o No. DSM 18028 em 13.03.2006.

Usando esse sistema biológico preferido, foi possível obter umrendimento particularmente bom de ácidos 2-hidróxi-2-metil carboxílicos, emparticular de ácido 2-hidróxi isobutírico. Entretanto, a conversão enzimáticapor microrganismos não se limita, de modo algum, a essa cepa. Quaisquerorganismos capazes de converter ácidos 3-hidróxi carboxílicos em ácidos 2-hidróxi-2-metil carboxílicos podem ser usados de acordo com a invenção.

Eles podem ser microrganismos que, em primeiro lugar, possu-em o mesmo gene ou produto gênico ou que, em segundo lugar, apresen-tam um gene análogo, resultando em produtos gênicos exibindo uma ativi-dade similar ou análoga. Isto é, as atividades de 3-hidróxi-carbonil-CoA mu-tase de outra origem são igualmente cobertas pela invenção. A invençãotambém inclui sistemas transformados que exibem uma atividade de 3-hidróxi-carbonil-CoA mutase ou atividade similar como cepa HCM-10 ou a deoutra origem.

Isso pode incluir mutantes, geneticamente modificados e modifi-cações isoladas dos microrganismos, por exemplo, organismos que exibema atividade desejada de mutase dependente de cobalamina, devido à intro-dução de uma seqüência de nucleotídeos de codificação da mutase.

O sistema biológico preferivelmente usado (cepa HCM-10 - DSM18028) produz ésteres de 3-hidróxi-carbonil-CoA na forma de tioésteres apartir de produtos naturais simples, tais como açúcares e/ou ácidos orgâni-cos e/ou álcoois e seus derivados. No sistema preferido usado aqui, os éste-res de 3-hidróxi-carbonil-CoA são convertidos pela mutase de rearranjo deesqueleto de carbonos dependente de cobalamina em ésteres de 2-hidróxi-2-metil-carbonil-CoA, conforme descrito pelo exemplo do caso de (R)-3-hidróxi-butiril CoA na equação 1. O tioéster de CoA é hidrolisado no sistema,e o ácido é secretado no meio de cultura.

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(R)-3-hidroxibutiril CoA 2-hidroxiisobutiril CoA

No método da invenção, dá-se preferência ao uso, como catali-sadores enzimáticos, das cepas de microrganismos que compreendem mu·tases dependentes de cobalamina, HCM-10 (DSM 18028), Xanthobacterautotrophicus Py2, Rhodobacter sphaeroides (ATCC17029) ou Nocardioidessp. JS614, seus extratos brutos ou partes. As cepas usadas de acordo coma invenção produzem preferivelmente as proteínas com as seqüências SEQID NO: 2 e/ou SEQ ID NO: 4 ou compreendem as seqüências de ácidos nu-cléicos SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO: 3 (HCM-10), as proteínas com asseqüências SEQ ID NO: 5 e/ou SEQ ID NO: 6, ou compreendem as seqüên-cias de ácidos nucléicos SEQ ID NO: 7 e/ou SEQ ID NO: 8 (Xanthobacterautotrophicus Py2), as proteínas com as seqüências SEQ ID NO: 9 e/ouSEQ ID NO: 10, ou compreendem as seqüências de ácidos nucléicos SEQID NO: 11 e/ou SEQ ID NO: 12 (Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029) ouas proteínas com as seqüências SEQ ID NO: 13 e/ou SEQ ID NO: 14, oucompreendem as seqüências de ácidos nucléicos SEQ ID NO: 15 e/ou SEQID NO: 16 (Nocardioides sp. JS614). Para as finalidades da invenção, asditas proteínas também podem ser usadas em uma forma concentrada, iso-lada ou produzida por síntese.

Em uma variante adicional preferida da modalidade da invenção,os catalisadores enzimáticos, em particular microrganismos, extratos brutos,partes dos mesmos e/ou as enzimas concentradas ou isoladas são usadosem uma forma imobilizada. A imobilização torna as enzimas, as organelascelulares e as células insolúveis e limitadas ao espaço da reação. Por e-xemplo, podem ser imobilizadas em uma matriz de polímero (por exemplo,alginato, álcool polivinílico ou géis de poliacrilamida). Podem ser tambémimobilizadas em materiais de suporte dissolvidos ou não-dissolvidos (porexemplo, celite) para facilitar a recuperação e a reutilização dos catalisado-res. Métodos de imobilização de células em uma matriz de polímero ou emum suporte dissolvido ou não-dissolvido são conhecidos daquele versado natécnica e foram previamente descritos de modo detalhado. As atividadesenzimáticas podem ser igualmente isoladas das células microbianas. A se-guir, podem ser usadas diretamente como catalisadores ou em uma formaimobilizada em uma matriz de polímero ou em um suporte dissolvido ou não-dissolvido. Os métodos necessários para isso são conhecidos daquele ver-sado na técnica e, por exemplo, descritos em Methods in Biotechnology, Vol.1: Immobilization of enzymes and cells, editor: G. F. Bickerstaff, HumanaPress, Totowa, New Jersey1 1997.

Os ácidos 3-hidróxi carboxílicos são convertidos em ácidos 2-hidróxi-2-metil carboxílicos preferivelmente dentro da estrutura de um pro-cesso contínuo que pode ser executado em um reator de fluxo, no qual ocor-rem crescimento microbiano e, portanto, formação de produtos. Entretanto,um processo contínuo também pode significar qualquer sistema de célulasem crescimento e enzimas catalisadoras, que é suprido com solução de nu-trientes e a partir do qual se remove a solução de cultura, incluindo ácido 2-hidróxi-2-metil carboxílico enzimaticamente formado. De acordo com a in-venção, o processo também pode ser executado como processo semicontí-nuo ou de batelada.

Como foi explicado acima, o ácido 3-hidróxi carboxílico, que é omaterial de partida para o ácido 2-hidróxi-2-metil carboxílico, é produzidopreferivelmente por conversão enzimática de carboidratos e/ou ácidos orgâ-nicos e/ou álcoois ou seus derivados. No contexto da invenção, além da mu-tase dependente de cobalamina, é feito o uso, onde apropriado, de enzimasde síntese de ésteres de CoA adicionais, que estão presentes ou que sãoadicionadas ao microrganismo. Isso envolve a conversão de hidrocarbonetose/ou carboidratos e/ou ácidos orgânicos e/ou álcoois ou derivados dos mes-mos no ácido 3-hidróxi carboxílico e do ácido 3-hidróxi carboxílico no ácido2-hidróxi-2-metil carboxílico em um processo de uma única etapa, isto é, aconversão dos substratos de partida em ácido 3-hidróxi carboxílico e as rea-ções de conversão enzimáticas do ácido 3-hidróxi carboxílico no ácido 2-hidróxi-2-metil carboxílico correspondente são realizadas ao mesmo tempoou com uma ligeira diferença de tempo em uma e na mesma solução da reação.

Em uma modalidade muito particular da invenção, um substratocom um radical terc-butila como fonte de carbono e fonte de energia é usadopara cultura, dando-se preferência ao álcool terc-butílico como única fontede carbono e de energia em um meio basal.

O método da invenção é preferivelmente útil para a produção deácido 2-hidróxi-2-metil propanóico (ácido 2-hidróxi isobutírico). A produçãopreferida de ácido 2-hidróxi isobutírico é adicionalmente caracterizada pelaadição externa de ácido 3-hidróxi butírico.

O método foi realizado em condições aeróbicas, preferivelmentecom o uso de células intactas, ou em condições não-aeróbicas, por exemplo,mediante tratamento de gás com nitrogênio, preferivelmente quando sãousados extratos com enzimas purificadas.

A invenção também refere-se a moléculas de ácidos nucléicosque codificam a enzima apresentando a atividade de mutase dependente decobalamina, selecionadas a partir do grupo consistindo em:

a) moléculas de ácidos nucléicos que codificam uma proteínacompreendendo as seqüências de aminoácidos indicadas em Seq. No. 2e/ou Seq. No. 4;

b) moléculas de ácidos nucléicos compreendendo a seqüênciade nucleotídeos descrita em Seq. No. 1 e/ou Seq. No. 3.

Uma enzima da invenção demonstrou ser preferivelmente umaproteína heterodimérica que compreende as subunidades descritas em Seq.Ns 2 e Seq. Nq 4 e que, portanto, possui excelente atividade enzimática.

Uma molécula de ácido nucléico pode ser uma molécula deDNA, preferivelmente uma molécula de cDNA ou de DNA genômico e/ou deRNA. Tanto os ácidos nucléicos quanto as proteínas podem ser isolados defontes naturais, preferivelmente a partir de DSM 18028, mas também, porexemplo, de Methylibium petroleiphilum PM1, Methylibium sp. R8 (coleçãode cepas UFZ Leipzig, Alemanha), Xanthobacter autotrophicus Py2, Rhodo-bacter sphaeroides (ATCC17029) ou Nocardioides sp. JS614, ou podem sersintetizados por métodos conhecidos.

Mutações podem ser produzidas nas moléculas de ácidos nu-cléicos usadas de acordo com a invenção através de técnicas de biologiamolecular conhecidas por elas próprias, possibilitando, assim, a síntese deenzimas adicionais com propriedades análogas ou similares, que são igual-mente usadas no método da invenção. As mutações podem ser mutaçõespor deleção, que resultam em enzimas truncadas. Enzimas modificadas compropriedades similares ou análogas podem ser igualmente geradas atravésde outros mecanismos moleculares, tais como, por exemplo, inserções, du-plicações, transposições, fusão de genes, troca de nucleotídeos ou transfe-rência de genes entre diferentes cepas de microrganismos.

Essas moléculas de ácidos nucléicos podem ser identificadas eisoladas usando as moléculas de ácidos nucléicos ou partes das mesmas.As moléculas que hibridizam com as moléculas de ácidos nucléicos tambémcompreendem fragmentos, derivados e variantes alélicas das moléculas deácidos nucléicos descritas acima, que codificam uma enzima passível de serusada de acordo com a invenção. Os fragmentos aqui significam partes demoléculas de ácidos nucléicos, os quais são longos o suficiente para codifi-car a enzima descrita. Os derivados significam seqüências dessas molécu-las, que diferem das seqüências das moléculas de ácidos nucléicos descri-tas acima em uma ou mais posições, mas que apresentam um alto grau dehomologia com essas seqüências. A homologia aqui significa uma identida-de de seqüência de pelo menos 40%, em particular uma identidade de pelomenos 60%, preferivelmente de mais de 80% e em particular preferivelmentede 90%, 95%, 97% ou 99%, em nível do ácido nucléico. As enzimas codifi-cadas aqui apresentam uma identidade de seqüência com as seqüências deaminoácidos especificadas de pelo menos 60%, preferivelmente de pelomenos 80%, em particular preferivelmente de pelo menos 95%, muito parti-cularmente de preferência de pelo menos 99%, em nível de aminoácidos. Osdesvios aqui podem constituir o resultado de deleção, substituição, inserçãoou recombinação. Podem ser variações de ocorrência natural, por exemplo,seqüências de outros organismos, ou outras mutações que podem ocorrerde modo natural ou por mutagênese específica (raios UV, raios X, agentesquímicos ou outros). As variantes também podem ser seqüências produzidasde modo sintético. Essas variantes possuem características comuns particu-lares, tais como, por exemplo, atividade enzimática, concentração de enzimaativa, subunidades, grupos funcionais, reatividade imunológica, conformaçãoe/ou propriedades físicas, tais como comportamento de migração na eletro-forese em gel, comportamento cromatográfico, solubilidade, coeficientes desedimentação, pH ótimo, temperatura ótima, propriedades espectroscópicas,estabilidade e/ou outras características.

Além disso, a invenção também se refere às novas proteínascom a seqüência No. 2 e 4 e a uma proteína heterodimérica, que compreen-de a seqüência No. 2 e a seqüência No. 4 e seus homólogos de pelo menos 99%.

A SEQ ID NO: 1 descreve a seqüência de nucleotídeos de 1644pb para a subunidade grande da mutase dependente de cobalamina da DSM 18028.A SEQ ID NO: 2 descreve a seqüência de aminoácidos de 548aa da subunidade grande da mutase dependente de cobalamina da DSM18028.

A SEQ ID NO: 3 descreve 369 pb da seqüência parcial de nu-cleotídeos para a subunidade pequena da mutase dependente de cobalami-na da DSM 18028.

A SEQ ID NO: 4 descreve a seqüência parcial de 123 aa da su-bunidade da mutase dependente de cobalamina da DSM 18028.

As SEQ ID NOS: 5 e 6 descrevem as seqüências de aminoáci-dos de 562 e 135 aa, respectivamente, de uma mutase dependente de coba-lamina de Xanthobacter autotrophicus Py2.

As SEQ ID NOS: 7 e 8 descrevem os 1689 e 408 pb, respecti-vamente, da seqüência de nucleotídeos para as mutases dependentes decobalamina de Xanthobacter autotrophicus Py2.

As SEQ ID NOS: 9 é 10 descrevem as seqüências de aminoáci-dos de 563 e 135 aa, respectivamente, de uma mutase dependente de coba-lamina do Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029.

As SEQ ID NOS: 11 e 12 descrevem os 1692 e 408 pb, respecti-vamente, da seqüência de nucleotídeos para as mutases dependentes decobalamina de Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029.

As SEQ ID NOS: 13 e 14 descrevem as seqüências de aminoá-cidos de 569 e 164 aa, respectivamente, de uma mutase dependente de co-balamina de Nocardoides sp. JS614.

As SEQ ID NOS: 15 e 16 descrevem os 1710 e 495 pb, respecti-vamente, da seqüência de nucleotídeos para as mutases dependentes decobalamina de Nocardoides sp. JS614.

Os ácidos 2-hidróxi-2-metil carboxílicos produzidos de acordocom a invenção podem ser isolados através de tratamento do meio de cultu-ra (após remoção de componentes não-dissolvidos, tais como células micro-bianas) por métodos anteriormente descritos. Os exemplos desses métodossão, entre outros, concentração, troca de íons, destilação, eletrodiálise, ex-tração e cristalização. O produto pode ser isolado na forma de sal ou (apósacidificação) na forma de ácido 2-hidróxi-2-metil carboxílico protonado.

Os ácidos 2-hidróxi-2-metil carboxílicos (ou seus sais correspon-dentes) podem ser desidratados por uma multiplicidade de métodos paraproduzir os ácidos 2-metil carboxílicos não-saturados correspondentes. Osácidos isoalquenóicos C2-C3-não-saturados são produzidos pela desidrata-ção do ácido 2-hidróxi-2-metil carboxílico produzido, usando os métodos co-nhecidos da técnica anterior. Os ácidos 2-hidróxi-2-metil carboxílicos podemser desidratados usando óxidos de metais, hidróxidos de metais, resinas detroca iônica, alumina, dióxido de silício, aminas, fosfinas, alcóxidos de metaisalcalinos e carboxilatos de metais alcalinos. As temperaturas da reação sãohabitualmente entre 160°C e 250°C. Assim, por exemplo, o ácido metacrílicoé produzido pela desidratação do ácido 2-hidróxi isobutírico na presença deNaOH, a temperaturas de aproximadamente 185°C.

O ácido metacrílico produzido por esse processo e seus homó-logos são apropriadamente aplicados em todo um conjunto de setores indus-triais, como, por exemplo, na forma de aditivos e revestimentos. Em contras-te com os métodos anteriormente conhecidos, o método combina as vanta-gens desejadas de um processo em baixa temperatura, o uso de reagentesbenignos para o ambiente e uma menor produção de produtos de degradação.

A invenção será descrita de maneira mais detalhada abaixo,com base em modalidades exemplares, mas não pretende limitar-se a isso.

Material e métodos

Catalisador enzimático microbiano

Células microbianas da cepa HCM-10 (DSM 18028), caracteri-zada por uma atividade de produção de éster de 3-hidróxi-carbonil-CoA e deisomerização de éster de 3-hidróxi-carbonil-CoA ou das subunidades protéi-cas com seqüência No. 2 e No. 4 isoladas a partir disso.

Crescimento dos catalisadores enzimáticos microbianos

A cepa microbiana usada para a produção de ácidos 2-hidróxi-2-metil carboxílicos foi isolada conforme descrito aqui, adiante. As culturas deestoque ("stock cultures") são armazenadas em solução de glicerol de 20%de concentração em nitrogênio líquido.

A cepa HCM-10 foi concentrada a partir de água de lençol freáti-co em meio basal (Tabela 1) contendo álcool terc-butílico como única fontede carbono e energia. <table>table see original document page 16</column></row><table>

A cepa HCM-10 foi desenvolvida de modo aeróbico sob as se-guintes condições (Tabela 2) para ensaio da atividade de 3-hidróxi-carbonil-CoA mutase.

Tabela 2

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As células foram usadas imediatamente após a sua colheita. Ascélulas intactas podem ser utilizadas sem pré-tratamento adicional, tal como,por exemplo, permeabilização. Além disso, as células podem ser usadas emuma forma permeabilizada (por exemplo, mediante tratamento com tolueno,detergentes ou por ciclos de congelamento-descongelamento) para melhoraras taxas de difusão de substâncias para dentro e para fora das células.

A concentração de ácido 2-hidróxi isobutírico e de ácido 3-hidróxi butírico no líquido de cultura ou na mistura da reação foi determinadapor cromatografia gasosa após metanólise ácida, utilizando um detectorFFAP e FID.Exemplo 1:

Conversão do ácido 3-hidróxi butírico em ácido 2-hidróxi isobutí-rico pela cepa HCM-10

Uma suspensão de 1 g (massa seca) de células da cepa HCM-10 em 100 ml de meio basal foi introduzida em frascos de soro de 120 ml.Essa suspensão foi admisturada com 50 mg de ácido 3-hidróxi butírico, e asuspensão foi incubada em um agitador rotatório a 30°C. Depois de 0,3 horade incubação aeróbica, a suspensão foi submetida a tratamento de gás comnitrogênio e incubada com agitação a 30°C por outras 4,4 horas. Em váriosmomentos, foram obtidas amostras, e o teor de ácido 2-hidróxi isobutírico eteor de ácido 3-hidróxi butírico no sobrenadante isento de células foram de-terminados após centrifugação da suspensão. Foi constatado ser o ácido 2-hidróxi isobutírico o único produto liberado na fase anaeróbica. Em contras-te, o ácido 3-hidróxi butírico foi evidentemente degradado por completo nafase inicial aeróbica (figura 1). O rendimento de ácido 2-hidróxi isobutíricofoi, neste caso, de 5,1%, com aproximadamente 80% de ácido 3-hidróxi butí-rico permanecendo no líquido da reação.Exemplo 2:

Conversão do ácido 3-hidróxi butírico em ácido 2-hidróxi isobutí-rico por um extrato bruto da cepa HCM-10

Um extrato bruto acelular da cepa HCM-10 foi preparado ao de-sintegrar as células em um moinho de bolas, e os restos celulares foramsubseqüentemente removidos por centrifugação. O extrato bruto acelular,em uma concentração de 10 mg de proteína em 5 ml de tampão de fosfatode potássio a 50 mM (contendo MgCI2 a 1 mM em pH 7,2), foi introduzidoem frascos de vidro de 10 ml com vedação. Em seguida, a esse extrato fo-ram adicionados coenzima B12 a 0,01 mM, coenzima A a 1 mM, ATP a1 mM e 4,25 mg de ácido 3-hidróxi butírico. O líquido da reação foi submeti-do a tratamento de gás com nitrogênio, o frasco da reação foi vedado her-meticamente e incubado com agitação a 30°C durante 2 horas. Os produtosda reação foram analisados conforme ilustrado acima. O rendimento de áci-do 2-hidróxi isobutírico foi, neste caso, de 9%, com aproximadamente 88%de ácido 3-hidróxi butírico permanecendo no líquido da reação (figura 2).

Exemplo 3:

Desidratação do ácido 2-hidróxi isobutírico a metacrilato

Uma solução de ácido 2-hidróxi isobutírico (1 mg/5 ml) produzidade acordo com o procedimento realizado no exemplo 2, foi admisturada comNaOH (0,06 mg) com agitação. A solução foi incubada com agitação e res-friamento em refluxo sob pressão reduzida (40 KPa (300 torr)) a 185-195°C.Alíquotas adicionais de 0,5 mg de ácido 2-hidróxi isobutírico por 5 ml foramadicionadas a cada hora, no decorrer de um período de 5 horas, a ditas alí-quotas contendo adicionalmente 0,4 em cento por peso de p-metoxifenolpara prevenir a polimerização do metacrilato. A reação foi interrompida de-pois de 24 horas de incubação. A conversão do ácido 2-hidróxi isobutíricoem metacrilato foi de 97%. O ácido metacrílico foi removido da mistura dareação por destilação.

Claims (29)

1. Método para a produção enzimática de ácidos 2-hidróxi-2-metil carboxílicos de ácidos 3-hidróxi carboxílicos, caracterizado pelo fato deque um ácido 3-hidróxi carboxílico é produzido em e/ou adicionado a umasolução de reação aquosa compreendendo uma unidade que tem atividadede mutase de 3-hidróxi-carboxilato-CoA, que tem ambas as atividades deprodução de éster 3-hidróxi-carbonil-CoA e isomerização de éster 3-hidróxi-carbonil-CoA, e, depois da incubação, o ácido 2-hidróxi-2-metil carboxílicocorrespondentemente convertido é isolado como ácido ou na forma de seus sais.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a unidade que tem a atividade de mutase de 3-hidróxi-carboxilato-CoA compreende uma mutase dependente de cobalamina isolada.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadopelo fato de que a unidade que tem a atividade de mutase de 3-hidróxi-carboxilato-CoA compreende uma enzima ou sistema de enzimas que pro-duz éster de 3-hidróxi-carbonil-CoA.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-3, caracterizado pelo fato de que a unidade que tem a atividade de mutase-3-hidróxi-carboxilato-CoA é um microorganismo ou um extrato bruto do mesmo.

5. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 4, caracterizadopelo fato de que os microorganismos que produzem ou compreendem umamutase dependente de cobalamina, que tem atividade de mutase de 3-hidróxi-carboxilato-CoA e tendo ambas a atividade de produção de éster 3-hidróxi-carbonil-CoA e isomerização de éster 3-hidróxi-carbonil-CoA são u-sados em sistemas aquosos para converter ácidos 3-hidróxi carboxílicos noácido 2-hidróxi-2-metil carboxílico correspondente.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-5, caracterizado pelo fato de quea) microorganismos com atividade de mutase de 3-hidróxi-carboxilato-CoA, que têm ambas as atividades de produção de tioéster de 3-hidróxi-carbonil-CoA e isomerização de tioéster de 3-hidróxi-carbonil-CoA,são cultivados em um sistema aquoso com materiais brutos renováveis ouprodutos de dejetos que derivam do consumo de materiais brutos renováveiscomo fontes de carbono e energia, pelo que os tioésteres intracelulares de3-hidróxi-carboxilato-CoA são sintetizados e convertidos nos ácidos 2-hidróxi-2-metil carboxílicos correspondentes, eb) o ácido 2-hidróxi-2-metil carboxílico correspondente é isoladocomo ácido ou na forma de seus sais.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a reação é realizada com a adição de ácido- 3-hidróxi carboxílico externo.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o microrganismo é selecionado da cepa debactérias HCM-10 DSM 18028, Xanthobacter autotrophicus Py2, Rhodobac-ter sphaeroides (ATCC17029) or Nocardioides sp. JS614.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que as células intactas dos microrganismos sãousadas inalteradas, permeabilizadas ou fixadas a um suporte.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o extrato de células e/ou a mutase depen-dente de cobalamina e, onde apropriado, as outras enzimas tais como, porexemplo, enzimas de sintetização de éster de CoA, após isolamento parcialou completo dos microrganismos são usadas, onde apropriado, em umaforma purificada.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que os extratos brutos de células livres de mi-crorganismos são usados.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que as proteínas com a seqüências SEQ IDNO: 2 e/ou SEQ ID NO: 4, com as seqüências SEQ ID NO: 5 e/ou SEQ IDNO: 6, as proteínas com as seqüências SEQ ID NO: 9 e/ou SEQ ID NO: 10,ou as proteínas com as seqüências SEQ ID NO: 13 e/ou SEQ ID NO: 14 sãousadas e pelo menos 60% de seus homólogos.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-12, caracterizado pelo fato de que um açúcar e/ou um álcool e/ou um ácidoorgânico e/ou um hidrocarboneto ou seus derivados, são usados como fon-tes de carbono e energia para a conversão enzimática durante a cultura.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-13, caracterizado pelo fato de que um substrato com um radical de terc-butila é usado como fonte de carbono e fonte de energia para a cultura.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-14, caracterizado pelo fato de que o álcool de terc-butila é usado como aúnica fonte de carbono e energia em um meio basal para a cultura.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-15, caracterizado pelo fato de que a conversão enzimática de um açúcare/ou um álcool e/ou um ácido orgânico e/ou um hidrocarboneto ou seus deri-vados, no ácido 3-hidróxi carboxílico e do 3-hidróxicarboxílico no ácido 2-hidróxi-2-metil carboxílico é realizado em uma única etapa do método.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-16, caracterizado pelo fato de que o ácido 2-hidróxi isobutírico é produzidocom a adição de ácido 3-hidróxi butírico externo.

18. Método para a produção de ácidos isoalquenóicos C2-C3-não-saturados, caracterizado pelo fato de que um ácido 2-hidróxi-2-metilcarboxílico, produzido como definido em qualquer uma das reivindicações 1a 17, é desidratado.

19. Método para a produção de ácido metacrílico, caracterizadopelo fato de que um ácido 2-hidróxi isobutírico, produzido como definido emqualquer uma das reivindicaçãos 1 a 17, é desidratado.

20. Cepa de microrganismos HCM-10 - DSM 18028.

21. Molécula de ácido nucléico codificando para uma enzimaque tem a atividade de uma mutase dependente de cobalamina, selecionadado grupo que consiste ema) moléculas de ácido nucléico codificando uma proteína com-preendendo as seqüências de aminoácidos indicadas sob Seq. No. 2 e/ouSeq. No. 4;b) moléculas de ácido nucléico compreendendo a seqüência denucleotídeos descrita sob Seq. No. 1 e/ ou Seq. No. 3.

22. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que ela codifica uma proteína que, como umaenzima oligomérica composta de duas subunidades diferentes, compreendeas seqüências de aminoácidos indicadas sob as Seq. No. 2 e Seq. No. 4.

23. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 21ou 22, que é uma molécula de DNA.

24. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 23, que é um cDNA ou DNA genômico.

25. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 21ou 22, que é uma molécula de RNA.

26. Proteína tendo a atividade de uma mutase dependente decobalamina codificada por uma molécula de ácido nucléico, como definidanas reivindicações 21 e 22.

27. Proteína com a seqüência No. 2 e pelo menos 99% de seushomólogos.

28. Proteína com a seqüência No. 4 e pelo menos 99% de seushomólogos.

29. Proteína com enzima heterodimérica compreendendo a se-qüência No. 2 e a seqüência No. 4.