BRPI0617236A2 - modulação da expressão de quimiocina, dependente de egfr, e influência sobre a terapia e diagnóstico de tumores e efeitos colaterais da mesma - Google Patents

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Abstract

<B>MODULAçãO DA EXPRESSãO DE QUIMIOCINA, DEPENDENTE DE EGFR, E INFLUêNCIA SOBRE A TERAPIA E DIAGNóSTICO DE TUMORES E EFEITOS COLATERAIS DA MESMA.<D> A presente invenção refere-se ao diagnóstico e à terapia de tumores utilizando o fator de crescimento epidérmico (EGFR) por meio de inibidores quimicos ou anticorpos monoclonais. A invenção também refere-se a irritações da pele, de preferência, erupção da pele, em conjunto com e associada ao tratamento de células tumorais, que utilizam o receptor de EGF, com agentes anticâncer. A invenção também está dirigida para métodos para prever a eficiência de uma terapia de tumor/resposta de tumor em um paciente, com base no tratamento com inibidores de EGFR, especialmente, anticorpos de anti-EGFR. A invenção refere-se, ainda, a um método para determinar a dose ótima de um agente anticâncer na terapia de tumores relacionados a EGFR.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MODULA-ÇÃO DA EXPRESSÃO DE QUIMIOCINA, DEPENDENTE DE EGFR, E IN-FLUÊNCIA SOBRE A TERAPIA E DIAGNÓSTICO DE TUMORES E EFEI-TOS COLATERAIS DA MESMA".
A presente invenção refere-se ao diagnóstico e à terapia de tu-mores utilizando o fator de crescimento epidérmico (EGRF) por meio de ini-bidores químicos ou anticorpos anticlonais. A invenção também refere-se airritações de pele, de preferência, erupção da pele, em conjunto com e asso-ciadas ao tratamento de tumores que utilizam o receptor de EGF com agen- tes anticâncer. A invenção também está voltada para métodos para prever aeficiência de uma terapia de tumores/resposta do tumor em um paciente,com base no tratamento com inibidores de EGFR, especialmente, anticorposanti-EGFR. A invenção refere-se, ainda, a um método para determinar a do-se ótima de um agente anticâncer na terapia de tumores relacionada a EG- FR. A invenção refere-se, ainda, a métodos de monitoramento em estágioprecoce da eficiência da terapia de câncer relacionada a EGFR, por meio deinibidores de EGFR, e da probabilidade da ocorrência de erupção de pelecomo doença de efeito colateral, em conjunto com a referida terapia. Final-mente, a invenção está voltada para o uso das quimiocinas, que são regula- das para cima ou para baixo durante o tratamento de câncer por meio de umagente anticâncer, como um marcador de diagnóstico, ou como indícios paraa identificação de novos alvos para terapêutica de tumores.
EGFR, codificado pelo gene de erbB1, tem sido implicado cau-sativamente em malignidade humana. Particularmente, a expressão aumen- tada de EGFR foi observada em câncer de mama, bexiga, pulmão, cabeça,pescoço e estômago, bem como glioblastomas. A expressão aumentada doreceptor de EGFR freqüentemente é associada à produção aumentada doIigante de EGFR, transformando o fator de crescimento alfa (TGF-α), pelasmesmas células tumorais que resultam na ativação do receptor por um ca-minho estimulador de autocrina (Baselga and Mendelsohn, Pharmac. ther.64:127 (1994)). O receptor de EGF é uma glicoproteína transmembranal,que tem um peso molecular de 170.000, e é encontrado em muitos tipos decélulas epiteliais. Atualmente, são conhecidos sete Iigantes de EGFR1 quena ligação no receptor protegem células tumorais contra estimulação porapoptose da proliferação celular e invasividade de células tumorais. Essesfatores de crescimento não se ligam a HER2, HER3 e HER4, os outros trêsmembros da família de EGFR, que podem ligar-e com o EGFR na formaçãode heterodímeros (Riese and stern, Bioassays 20:41-48 (1998); Kochupu-rakkal JBioi Chem. 280:8503-8512 (2005)).
A rede de receptor de HER pode integrar não apenas suas pró-prias entradas, mas também sinais heterólogos, incluindo hormônios, Iinfoci-nas, neutrotransmissores e indutores de estresse.
Diversos anticorpos monoclonais murinos e de rato contra o re-ceptor de EGF foram desenvolvidos e testados em relação à sua capacidadede inibir o crescimento de células tumorais in vitro e in vivo (Modjtahedi andDean, 1994, J. Oncology 4, 277). O anticorpo monoclonar humanizado 425(hMAb 425, US 5.558.864; EP 0531472) e o anticorpo monoclonal quimérico225 (cMAb 225), ambos voltados para o receptor de EGF, mostraram suaeficiência em testes clínicos. O anticorpo C225 (Cetuximab) demonstrou queinibe o crescimento de células tumorais mediado por EGF in vitro e in vivo einibe a formação de tumor humano in vivo em camundongos nus. O anticor-po, bem como, em geral, todos os anticorpos anti-EGFR atua, principalmen-te, em sinergia com determinados agentes quimioterápicos (isto é, doxorru-bicina, adriamicina, taxol e cisplatina), para erradicar tumores humanos invivo em modelos de camundongos xeno-enxertados (vide, por exemplo, EP0667165). Ye et al. (1999, Oncogene 18, 731) relataram que células de cân-cer ovariano humano podem ser tratadas, com sucesso, com uma combina-ção, tanto do MAb 225 quimérico e do MAb 4D5, que está voltado para oreceptor de HER2.
Além de anticorpos de anti-ErbB, existem numerosas moléculasquímicas pequenas, das quais se sabe que são inibidores potentes das mo-léculas do receptor de ErbB, que bloqueiam, principalmente as posições deligação de ATP do receptor. O termo "antagonista/inibidor de quinase de ti-rosina", de acordo com a presente invenção, refere-se a agentes naturais ousintéticos, que estão capacitados para inibir ou bloquear quinases de tirosi-na, incluindo quinases de tirosina de receptor. Desse modo, o termo inclui,em si, antagonistas/inibidores de receptor de ErbB, tais como definidos aci-ma. Com exceção dos anticorpos de receptor de anti-ErbB, mencionadosacima e abaixo, de modo particularmente preferido, agentes antagonistas dequinase de tirosina, sob essa definição, são compostos químicos que mos-traram eficácia na terapia de monofármaco, por exemplo, para câncer demama e próstata. Inibidores de quinase de tirosina do tipo indolocarbazolapropriados podem ser obtidos usando informações encontradas em docu-mentos tais como as patentes US 5.516.771; 5.654.427; 5.461.146;5.650.407. As patentes US 5.475.110; 5.591.855; 5.594.009 e WO 96/11933descrevem inibidores de quinase de tirosina do tipo pirrolocarbazol e câncerde próstata. Um dos agentes anticâncer mais antigos nesse contexto é gefi-tiniba (IRESSA®, Astra Zeneca), sobre o qual se informa que possui eficiên-cia terapêutica em pacientes com câncer de pulmão não de células peque-nas (NSCLC), bem como câncer de cabeça e pescoço avançado.
O termo "utilização" ou "utilizar", em contexto com o receptor deEGF tem duas conotações:
(i) ele reflete o fato de que o receptor está envolvido na sinaliza-ção. A expressão de EGFR é uma pré-condição necessária, mas não sufici-ente, para que a sinalização ocorra. A disponibilidade e qualidade de Iigan-tes disponíveis são igualmente importantes. Conseqüentemente, o grau deexpressão do receptor freqüentemente não se correlaciona diretamente coma utilização do receptor;
(ii) ele reflete o fato de que o tumor depende criticamente da uti-lização de EG FR.
Diversos agentes dirigidos a esse receptor estão em uso ou emdesenvolvimento, incluindo anticorpos monoclonais (tal como cetuximab) einibidores de quinase de tirosina (tais como erlotiniba e gefitiniba). O efeitoadverso mais usual, comum a todos os inibidores de EGFR é uma erupçãoem forma de acne, geralmente na face e no tronco superior. A erupção depele ocorre em 45-100% dos pacientes, com um rápido início na maioria dospacientes, detectável depois de aproximadamente 7-10 dias de tratamento eatingindo um máximo depois de 2-3 semanas (Robert et al., Lancet Oncol.491, 2005). Uma associação positivas da intensidade da erupção e respostaao tratamento e/ou sobrevivência foi mostrada para alguns agentes (incluin-do cetuximab e erlotiniba), tornando a erupção um marcador substituto po-tencial de atividade antitumoral (Perez-Soler and Saltz, J.Clin. Oncol.23:5235, 2005).
Os mecanismos que fundamentam a erupção de pele continuampouco conhecidos. Em adultos, EGFR é expressado, principalmente, emceratinócitos proliferantes, não diferenciados, da camada basal da epidermee da camada externa da raiz do folículo piloso (Nanney et al., J. Invest. Der-matol. 83:385, 1984). Alterações na expressão e atividade de EGFR têmsido ligadas a um crescimento e diferenciação anormais da epiderme (Muril-las R et al., EMBO J 1995; Sibilia M et al., Cell 2000; King LE et al., J InvestDermatol. 1990).
Ceratinócitos são células epiteliais estratificas, escamosas, quecompreendem pele e mucosa, inclusive epitélios orais, esofageais, córneos,conjuntivos e genitais. Ceratinócitos criam uma barreira entre o hospedeiro eo ambiente. Eles impedem a entrada de substâncias tóxicas do ambiente e aperda de constituintes importantes do hospedeiro. Os ceratinócitos se dife-renciam à medida que avançam da camada basal para a superfície da pele.O tempo de renovação normal para ceratinócitos é de cerca de 30 dias, masa renovação epidérmica pode ser acelerada em algumas doenças de pele, tais como psoríase.
A análise patológica de biópsias de pele de pacientes revelouque o bloqueio por EGFR leva ao afinamento do estrato córneo e promove ainfiltração de células inflãmatórias (incluindo neutrófilos e T-linfócitos) no te-cido dérmico, particularmente no folículo piloso (Robert et al., Lancet Oncol.6:491, 2005; Van Doorn et al., Br. J. Dermatol. 147:598, 2002). Além disso,os caminhos de transdução de sinais associados ao EGFR foram inibidos napele, sugerindo que a terapia anti-EGFR tem efeitos diretos sobre a fisologiaepidérmica. Por exmeplo, gefitiniba, um composto químico pequeno (Ires-sa®) provoca uma regulação para cima do marcador de parada de cresci-mento e maturação na camada basal da epiderme. Portanto, pode ser pos-sível que o ciclo celular de parada e maturação de ceratinócitos causa erup-ção de pele, uma vez que a diferenciação alterada de ceratinócitos pode Ie-var a oclusões foliculares, tais como observadas em pacientes (Albanell etal., J.Clin. Oncol. 20:110, 2002). Alternativamente, foi sugerido que o desen-volvimento de erupção de pele pode ser uma conseqüência direta de pa-drões de expressão de quimiocina alterados na pele, analogamente à suges-tão feita de que o EGFR funciona como um regulador de realimentação ne-gativo, para evitar uma inflamação excessiva em pele cronicamente inflama-da, in vivo (Mascia F et al, Am J Pathol. 2003).
Quimiocinas são uma família de glicoproteínas estruturalmenterelacionadas, com potente ativação de leucócitos e/ou atividade quimiotática.Os mesmos têm 70 a 90 aminoácidos em comprimento e aproximadamente8 a 10 kDa em peso molecular. A maioria deles enquadra-se em duas sub-famílias, com quatro radicais de cisteína. Essas sub-famílias estão baseadasem se os dois radicais de cisteína do terminal de amino estão imediatamenteadjacentes ou separados por um aminoácido. As quimiocinas, também co-nhecidas como quimiocinas CXC, contêm um único aminoácido entre o pri-meiro e o segundo radical de cisteína; β ou CC quimiocinas têm radicais decisteína adjacentes. A maioria das quimiocinas CXC são quimioatrativos pa-ra neutrófilos, enquanto quimiocinas CC atraem, em geral, monócitos, linfóci-tos, basófilos e eosinófilos. Também existem 2 outros subgrupos pequenos.
O grupo C tem um membro (linfotactina). Ele tem ausência de uma das cis-teínas no motivo de quatro cisteínas, mas compartilha homologia em seuterminal de carboxila com as quimiocinas C-C. A quimiocina C parece serespecífica para linfócitos. O quarto subgrupo é o sub-grupo C-X3-C. A qui-miocina C-X3-C (fractalcina/neurotactina) tem três radicais de aminoácidoentre as duas primeiras cisteínas. Ela está atado diretamente na membranacelular por meio de um talo longo de mucina e induz tanto a aderência comoa migração de leucócitos.
A invenção está baseada na conclusão principal de que o trata-mento de tumores relacionado com EGFR por meio de uma gente anticân-cer, de preferência, inibidores de EGFR, causa modulações específicas dopadrão de quimiocina no tecido da pele, bem como no respectivo tecido tu-moral ou no soro de um paciente. As quimiocinas no referido tecido ou soropodem ser reguladas para baixo ou para cima, dependendo da natureza equantidade do agente anticâncer usado na terapia.
Até o presente, não existem recomendações claras para umcontrole eficiente de erupções durante a terapia de tumores relacionada comEGFR, embora um controle ótimo seja importante, especialmente quando os inibidores de EGFR devem ser usados mais precocemente na doença, adoses mais altas e/ou por períodos mais longos. Com base nos presentesresultados, sugere-se, primeiramente, que padrão de expressão de quimio-cina modulada na pele representam marcadores úteis para prever erupçãode pele em pacientes precocemente durante o tratamento anticâncer, possi- bilitando aos médicos enfrentar a erupção, antes que ela possa ser vista.
Em segundo lugar, sugere-se que padrões de expressão dequimiocina modulada na pele são marcadores substitutos mais confiáveis dainibição eficiente do alvo (e, desse modo, possivelmente também o resultadoclínico) do que erupção de pele, uma vez que, em adição à modulação da quimiocina, a erupção de pele depende do sistema imunológico individual dopaciente. Desse modo, pacientes podem ser analisados dentro da primeirasemana de tratamento, para apontar com precisão pacientes sem probabili-dade de se beneficiarem de uma terapia anti-EGFR e, desse modo, possibili-tando aos clínicos mudar para terapias alternativas.
Além disso, sugere-se que agentes específicos, tais como agen-tes bloqueadores de receptor de quimiocina, que interferem com a quimioa-tração mediada por quimiocina, induzida por bloqueio de EGFR, podem re-presentar novos agentes terapêuticos novos para controlar efeitos colateraisde doenças de pele da terapia de tumores relacionada com EGFR. Esses agentes devem ser usados, de preferência, topicamente, uma vez que seusefeitos sobre a pele podem estar espelhados no tumor.
Em resumo, a invenção refere-se às seguintes questões:• Um método para prever a erupção e intensidade de uma irrita-ção da pele, de preferência, erupção de pele, associada a ou correlacionadacom terapia de câncer em um paciente, sendo que o método compreende:
(i) determinar em uma primeira amostra de tecido de pele o pa-drão de expressão de quimiocinas com métodos comuns, sendo que a a-mostra é tirada de um paciente antes de começar o tratamento com um a -gente anticâncer, que está dirigido contra células tumorais que utilizam oreceptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR),
(ii) determinar em uma segunda amostra de pele derivada doreferido paciente (de preferência, da mesma área de pele) o padrão de ex-pressão de quimiocinas, sendo que a amostra é tirada em um período de-pois de iniciado o tratamento com o referido agente anticâncer (de preferên-cia, 1-10 dias, de modo particularmente preferido, 1-7 dias, e de modo espe-cialmente preferido, 5-7 dias),
(iii) opcionalmente, determinar em uma terceira e outra amostrade pele o padrão de expressão de quimiocina, em que a amostra é tirada dopaciente em um período posterior ao da respectiva amostra precursora daetapa (ii),
(iv) comparar os respectivos padrões de expressão de quimioci-na das amostras de pele da etapa (ii) e, opcionalmente, (iii), com o padrãode expressão da amostra de pele da etapa (i), e determinar das mesmasquais quimiocinas mudaram em qualidade e/ou quantidade na amostra (ii) e(iii), em relação ao padrão de quimiocina da amostra de referência de (i) ouda respectiva amostra precursora;
(v) prever das mudanças no padrão de quimiocina a intensidadee a erupção em um período posterior da doença de pele provocada pelo tra-tamento com o referido agente anticâncer.
Caso não ocorram quaisquer mudanças ou mudanças significa-tivas no padrão de quimiocina dentro de um período de 5-10 dias, de prefe-rência, 7 dias, a probabilidade da ocorrência de doenças de pele, especial-mente, erupção da pele, iniciadas pelo tratamento com um anti-agente, nãoé muito alta, de acordo com as conclusões da presente invenção.• Um método correspondente de prever a resposta tumoral deum paciente que sofre de câncer ao tratamento com um agente anticâncer,em que o método compreende:
(i) determinar em uma primeira amostra de tecido o padrão deexpressão de quimiocinas com métodos comuns, sendo que a amostra étirada de um paciente antes de começar o tratamento com um agente anti-câncer, que está dirigido contra células tumorais que utili-zam/superexpressam o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR),
(ii) determinar em uma segunda amostra de tecido derivada doreferido paciente o padrão de expressão de quimiocinas, em que a amostraé tirada em um período depois de iniciado o tratamento com o referido agen-te anticâncer,
(iii) opcionalmente, determinar em uma terceira e outra amostrade tecido o padrão de expressão de quimiocina, sendo que a amostra é tira-da do paciente em um período posterior ao da respectiva amostra precurso-ra da etapa (ii),
(iv) comparar os respectivos padrões de expressão de quimioci-na das amostras de tecido da etapa (ii) e, opcionalmente, (iii), com o padrãode expressão da amostra de tecido da etapa (i), e determinar das mesmasquais quimiocinas mudaram em qualidade e/ou quantidade na amostra (ii) e(iii), em relação ao padrão de quimiocina da amostra de referência de (i) ouda respectiva amostra precursora;
(v) prever das mudanças no padrão de quimiocina a probabilida-de e intensidade da resposta tumoral do paciente ao tratamento com o refe-rido agente anticâncer.
De acordo com a invenção, foi descoberto, surpreendentemente,que o padrão de quimiocina e sua mudança relativa, em cada caso, não sóno tecido do tumor, mas também no tecido da pele do paciente, está correla-cionada com a resposta do tumor.
Um método para determinar a dose ótima de um agente anti-câncer para o tratamento de câncer em um paciente, sendo que o métodocompreende:(i) determinar em uma primeira amostra de tecido de pele ou detumor o padrão de expressão de quimiocinas com métodos comuns, sendoque a amostra é tirada de um paciente antes de começar o tratamento comum agente anticâncer, que está dirigido contra células tumorais que utili-zam/superexpressam o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR),
(ii) determinar em uma segunda amostra de tecido derivada doreferido paciente o padrão de expressão de quimiocinas, sendo que a amos-tra é tirada em um período depois de iniciado o tratamento com o referidoagente anticâncer,
(iii) opcionalmente, determinar em uma terceira e outra amostrade tecido o padrão de expressão de quimiocina, sendo que a amostra é tira-da do paciente em um período posterior ao da respectiva amostra precurso-ra da etapa (ii),
(iv) comparar os respectivos padrões de expressão de quimioci-na das amostras de pele da etapa (ii) e, opcionalmente, (iii), com o padrãode expressão da amostra de tecido da etapa (i), e determinar das mesmasquais quimiocinas mudaram em qualidade e/ou quantidade na amostra (ii) e(iii), em relação ao padrão de quimiocina da amostra de referência de (i) ouda respectiva amostra precursora;
(v) determinar a dose do agente anticâncer a ser administradaao paciente de acordo com as mudanças no padrão de quimiocina das refe-ridas amostras de tecido e, opcionalmente,
(vi) repetir as etapas (i) - (v), a fim de otimizar a dose do agenteanticâncer a ser administrada ao paciente.
No caso de não haver nenhuma modulação/ou mudança signifi-cativa no padrão de quimiocina nas amostras, antes do início do tratamentoe depois de 1 - 10 dias, de preferência, 7 dias, o tratamento adicional com oagente anticâncer ou é obsoleto ou, alternativamente, a dose deve ser au-mentada, até que possa ser observado um efeito no padrão de quimiocina.
Um método correspondente, em que a amostra da etapa (ii) étirada dentro de 1 -10 dias após o início do tratamento com o referido agen-te anticâncer.• Um método correspondente, em que a amostra da etapa (ii) étirada dentro de 2 - 7 dias após o início do tratamento com o referido agenteanticâncer.
• Um método correspondente, em que o agente anticâncer é uminibidor de EGFR.
• Um método correspondente, em que o agente anticâncer é umanticorpo de anti-EGFR.
• Um método correspondente, em que o anticorpo de anti-EGFRé Mab c225 (cetuximab) ou Mab h425 (EMD72000, matuzumab).
· Um método correspondente, em que o tratamento com o agen-te anticâncer causa uma expressão aumentada de quimiocinas, tal comoRANTES, em comparação com o paciente não tratado.
• Um método correspondente, em que o tratamento com o agen-te anticâncer causa uma expressão reduzida de quimiocinas, tal como IL-8,em comparação com o paciente não tratado.
• Um método correspondente, em que pelo menos uma das se-guintes quimiocinas está envolvida: IL-8, MCP-1, RANTES e IP-10.
• Um método in vitro de monitoração em estágio precoce da efi-ciência da terapia de câncer que utiliza/superexpressa EGFR em um pacien-te, por determinação do padrão de quimiocina em amostras de tecido de pe-le e/ou tecido de tumor e/ou soro do paciente com tumor, antes do início edurante os primeiros 1-10 dias de tratamento com um agente anticâncer.
• Um método in vitro de monitoração em estágio precoce de umairritação de pele, de preferência, erupção de pele, em conjunto com a terapiade câncer que utiliza/superexpressa EGFR em um paciente, por determina-ção do padrão de quimiocina em amostras de tecido de pele do pacientecom tumor, antes do início e durante os primeiros 1-7 dias de tratamentocom um agente anticâncer, de preferência, um inibidor de EGFR, de modoparticularmente preferido, um anticorpo de anti-EGFR, tais como Mab c225(cetuximab) ou Mab h425 (EMD72000, matuzumab), em que, de preferência,uma das seguintes quimiocinas está envolvida: IL-8, MCP-1, RANTES e IP-10.• Uso de quimiocinas, que são reguladas para cima ou para bai-xo in vivo, durante o tratamento de câncer com um agente anticâncer, comoum marcador de diagnóstico para determinar a eficiência do referido trata-mento e/ou a probabilidade da ocorrência de irritações de pele, de preferên-cia, erupção de pele, acompanhada pelo referido tratamento, sendo que oreferido câncer utiliza/superexpressa EGFR e o referido agente anticâncer éum inibidor de EGFR, de preferência, um anticorpo de anti-EGFR, tal comoMab c225 (cetuximab) ou Mab h425 (EMD72000, matuzumab).
• Uso de quimiocinas, que são reguladas pra cima ou para baixoin-vivo durante o tratamento de câncer com um agente anticâncer, para iden-tificação de um alvo a montante da referida expressão de quimiocina, apro-priado para o desenvolvimento e produção de um fármaco dirigido ao referi-do alvo, para o tratamento de câncer, que utiliza/superexpressa EGFR nopaciente, sozinho, ou em combinação com o referido agente anticâncer, emque o referido agente anticâncer é um inibidor de EGFR, de preferência, umanticorpo de anti-EGFR, tal como Mab c225 (cetuximab) ou Mab h425(EMD72000, matuzumab).
A presente invenção mostrou por trabalho experimental que blo-quear o receptor de EGF, por exemplo, com anticorpos monoclonais, taiscomo cetuximab (mAb c225) ou ou mAb h425 (matuzumab) ou inibidores dequinase de tirosina (gefitiniba, Iressa®), interfere nas cascatas de sinaliza-ção dependentes de EGFR em ceratinócitos primários. Nessas experiências,os ceratinócitos foram tratados com concentrações diferentes de inibidoresanti-EGFR, seguido de tratamento com ou sem TGF alfa ou TNF alta por,aproximadamente, 24 h. Os efeitos de inibidores anti-EGFR foram avaliadosusando Western blotting.
Tal como mostrado na figura 1, o tratamento com agentes anti-EGFR interfere na fosforilação de EGFR e ERK1/2, tal como medido por a-nálise de Western blot de ceratinócitos tratados. Tal como mostrado na figu-ra 2, o tratamento com agentes anti-EGFR interfere na indução da proteínaCOX-2. Além disso, a fosforilação de STAT3 foi induzida subseqüentementeao tratamento com agentes anti-EGFR.O trabalho experimental mostrou que o tratamento de ceratinóci-tos primários modula a expressão de quimiocinas in vitro. Quimiocinas se-cretadas foram avaliadas em meio condicionado de ceratinócitos que foramtratados com agentes anti-EGFR por 24 h. As avaliações foram realizadascom a tecnologia de contas Luminex. Nessas experiências, os ceratinócitosforam tratados com agentes anti-EGFR, seguido de tratamento com ou semTGF alfa ou TNF alfa. Entre diversas quimiocinas, IL-8 foi consistentementeregulados para baixo em resposta ao bloqueio de EGFR (figura 3), enquantoRANTES e IP-10 foram regulados para cima (figura 4-5).
IL-8 é um fator pro-angiogênico, que sugere que sua regulaçãopara baixo interfere na formação de vasos sangüíneos na pele. Em contras-te, RANTES e IP-10 foram descritos como fatores quimioatrativos para Ieu-cócitos, sugerindo que expressão aumentada (e, possivelmente, tambémoutras quimiocinas) induz infiltração de leucócitos na pele, que causam in-flamação e, eventualmente, erupção de pele.
De acordo com a invenção, o padrão de expressão de quimioci-na modulada, em resposta ao bloqueio de EGFR em ceratinócitos e tecidostumorais (com sinalização de EGFR ativa) resulta na migra-ção/quimioatração de leucócitos, que podem ser inibidos por agen-tes/fármacos, que interferem nessas quimiocinas. As experiências incluemtestes de quimiotaxia, nos quais meio condicionado de ceratinócitos é cole-tado depois de 24 h de tratamento com inibidores de EGFR e estimulaçãocom ou sem TGF alfa ou TNT alfa. O meio condicionado é colocado na câ-mara inferior e PBMC recém-isolado ou granulócitos são colocados na câ-mara superior de uma câmara Boyden. A quimiotaxia de células sangüíneasé depois monitorada por medição da quantidade de PBMC ou granulócitosna câmara inferior, após tempos específicos. Em algumas experiências,PBMC ou granulócitos são previamente ativados in vitro antes do aumentoda atividade moratória das células.
De acordo com a invenção, pode ser mostrado que as quimioci-nas em um meio condicionado causam quimiotaxia de PBMC e granulócitose isto representa parte da reação biológica vista na lesão da pele.Para demonstrar que quimiocinas específicas são responsáveispelos eventos quimiotáticos, inibidores específicos à receptores de quimioci-na são adicionados ao meio condicionado na câmara e a quimiotaxia é ava-liada em comparação com meio apenas condicionado.
Além disso, foi mostrado que a quimiotaxia é induzida por intera-ção de quimiocina/receptor de quimiocina e que o bloqueio dessa interaçãopor antagonistas de receptor de quimiocina interfere na quimiotaxia de célu-las sangüíneas.
A expressão de quimiocina modulada em resposta a bloqueio de EGFR resulta em migração/quimioatração de leucócitos na pele de camun-dongos. Além disso, a infiltração de leucócitos pode ser analisada e correla-cionada com a expressão de quimiocina. Além disso, foi mostrado de acordocom a invenção que níveis de quimiocina dentro da pele de camundongossão modulados após o tratamento com inibidores anti-EGFR, e que essamodulação é acompanhada por infiltração de leucócitos. Mostrou-se que aadministração sistêmica de antagonistas de receptor de quimiocina interferena infiltração de leucócitos na pele de animais tratados com terapia anti-EGFR e, desse modo, reduz/abole o desenvolvimento de erupção de pele.
De acordo com a invenção, indivíduos podem ser tratados com agentes anti-EGFR até serem observados os primeiros sinais de toxicidadena pele e, depois, a pele doente afetada pode ser tratada topicamente comagentes receptores antiquimiocina interferindo na infiltração de leucócitos ereduzindo a toxicidade na pele.
A administração de antagonistas de receptor de quimiocina so- bre a pele reduz a infiltração de leucócitos e a toxicidade na pele. Sugere-seque esses agentes possam ser usados na prática clínica para tratar erup-ções de pele de pacientes submetidos à terapia anti-EGFR.
Como foi demonstrado que a erupção de pele está correlaciona-da com a resposta de pacientes à terapia anti-EGFR, portanto, o padrão de expressão de quimiocinas é um indicador mais apropriado de resposta doque a toxicidade na pele por si e pode ser usado como medida de diagnósti-co para avaliar a sensibilidade do paciente à terapia anti-EGFR. Isso podeajudar a localizar precisamente pacientes com probabilidade de beneficiar-sede uma terapia anti-EGFR, durante a primeira semana de tratamento.
Mudanças moleculares de níveis de quimiocinas na pele de pa-cientes podem ser analisadas durante a primeira semana ou os primeirosdez dias após o tratamento com antagonistas anti-EGFR, para descobrir sea expressão de quimiocinas é modulada em resposta ao bloqueio de EGFR.Isso pode ser feito analisando biópsias de pele, antes e durante o tratamen-to. Níveis de quimiocina são modulados em resposta à terapia anti-EGFR eo grau de modulação pode ser usado como uma medida de diagnóstico paraprever se o paciente irá responder ao tratamento. Sugere-se que pacientesque não têm nenhuma ou pouca modulação de quimiocina são tratados adoses não ótimas com inibidores de anti-EGFR, e que as doses devem serelevadas até ser vista uma modulação. Alternativamente, senão for essa aopção, os pacientes sem modulação de quimiocina podem ser transferidospara uma terapia diferente.
A modulação descoberta pelos inventores desempenha um pa-pel importante no desenvolvimento de erupção de pele nesse contexto e po-de, portanto, ser usada como:
• Marcador de diagnóstico, para prever erupção de pele em pa-cientes com tumor em períodos precoces
• Marcador substituto da inibição dirigida eficiente em tumores(e, desse modo, possivelmente, também o resultado clínico), especialmente,para localizar precisamente pacientes sem probabilidade de se beneficiaremda terapia anti-EGFR, pouco tempo antes do início da terapia.
Desenvolvimento de novas terapias usando agentes tópicosque interferem na quimioatração de quimiocinas induzidas por bloqueio deEGFR para controlar erupção de pele.
Modulação do meio de quimiocina de tumor, inflamação de tu-mor e inibição de crescimento do tumor por inibidores de EGFR (cetuximab= c225, matuzumab = EMD72000 = h425) e outros.
Não existem biomarcadores para prever a resposta de pacientescom tumor à terapia com cetuximab. Mas, em três indicações - colorretal -pancreática - e carcinoma de células escamosas da cabeça - foi observadauma correlação significativa entre o grau de erupção de pele em forma deacne, induzida por terapia com cetuximab e resposta do tumor. Na dose detratamento padrão, os pacientes não apresentavam erupção e erupções comgravidade variável (graus l-lll), indicando que o grau do processo inflamató-rio na pele, induzido por cetuximab, deve-se à disposição imunológica dospacientes individuais e indicando, portanto, que atividade imunomoduladorasde cetuximab são um fator subjacente, que contribui para as respostas dotumor observadas. O tráfego e fenótipo celular de células imunes são contro-lados por quimiocinas, sendo que determinados conjuntos de quimiocinasapresentam atividades específicas para tipos de células.
A presente invenção sugere que a inibição da sinalização deEGFR em carcinomas produz mudanças no meio de quimiocina do carcino-ma e afeta o estado inflamatório do tumor, com inibição do crescimento dotumor como conseqüência. De acordo com a invenção, as quimiocinas sãoreguladas de modo similar em células de tumor e ceratinócitos primários invitro. Com relação a ceratinócitos, foram realizadas experiências que mos-traram que bloquear o receptor de EGF com anticorpos monoclonais, taiscomo cetuximab ou EMD72000 ou inibidores de quinase de tirosina (gefitini-ba, Iressa®) interfere nas cascatas de sinalização dependentes de EGFRem diversas linhas de células tumorais, tal como A431, representando dife-rentes indicações de tumor.
O trabalho experimental mostrou que o tratamento de linhas decélulas tumorais (tal como A431) modula a expressão de quimiocina in vitro.As células tumorais foram tratadas com agentes anti-EGFR e isso foi segui-do de tratamento com ou sem TGF alfa ou TNF alfa. As quimiocinas secre-tadas foram avaliadas em meio condicionado de células tumorais obtidasapós 24 h. A avaliação foi realizada com a tecnologia de contas Luminex.
Similarmente aos dados obtidos com ceratinócitos primários,diversas quimiocinas foram moduladas em resposta ao bloqueio de EGFRem células tumorais. IL-8 foi consistentemente regulado para baixo (figura6), enquanto RANTES e IP-10 foram regulados para cima em células turno-rais que foram tratadas com inibidores de EGFR (figuras 7-8).
Em conjunto, esses dados sugerem que caminhos de sinaliza-ção similares são modulados em ceratinócitos e em células tumorais por ini-bidores anti-EGFR. Isso corrobora a idéia de que a pele, ceratinócitos e,mais precisamente, níveis de quimiocina podem ser usados como substitu-tos para prever uma terapia anti-EGFR eficiente em pacientes com câncer.
A modulação de IL-8 foi avaliada em um painel de diferentes li-nhas de células tumorais e constatou-se que era consistentemente reguladapara baixo em resposta ao bloqueio de EGFR (figura 9). Isso sugere queníveis de IL-8 são um biomarcador de uma terapia com anti-EGFR eficiente.
Pretende-se avaliar níveis de IL-8 em sangue de pacientes submetidos auma terapia de anti-EGFR, e usar os níveis diminuídos como uma medida dediagnóstico para monitorar efeitos farmacodinâmicos de agentes anti-EGFR.
Tal como mencionado previamente, o padrão de expressão dequimiocina modulada em respota ao bloqueio de EGFR em tecido tumoral(com sinalização de EGFR ativa) resulta na migração/quimioatração de Ieu-cócitos.
As experiências incluem testes de quimiotaxia, nos quais meiocondicionado de células tumorais é coletado após 24 h de tratamento cominibidores de EGFR e estimulação com ou sem TGF alfa ou TNF alfa. Omeio condicionado é colocado na câmara inferior e PBMC recém-isolado ougranulócitos são colocados na câmara superior de uma câmara Boyden. Aquimiotaxia de células sangüíneas é depois monitorada por medição daquantidade de PBMC ou granulócitos na câmara inferior, após tempos espe-cíficos. Em algumas experiências, PBMC ou granulócitos são previamenteativados in vitro, para aumentar a atividade migratória das células. Essasexperiências mostram que as quimiocinas dentro do meio condicionado cau-sam quimiotaxia de PBMC e granulócitos.
Como um resultado da invenção, quimiocinas específicas, quesão responsáveis pelos eventos quimiotáticos, inibidores específicos parareceptores de quimiocina são adicionados ao meio condicionado na câmarainferior da câmara Boyden e a quimiotaxia é avaliada em comparação commeio apenas condicionado. A quimiotaxia é induzida por interação de quimi-ocina/receptor de quimiocina e o bloqueio dessa interação pelos antagonis-tas de receptor de quimiocina interfere na quimiotaxia de células sangüí-neas.
As experiências incluem estudos in vivo, nos quais camundon-gos que têm tumores são tratados com agentes anti-EGFR. A modulaçãodos níveis de quimiocina dentro do tumor são analisados dentro da primeirasemana de tratamento com agentes anti-EGFR. Os níveis de quimiocina sãomodulados da mesma maneira tal como observada in vitro. Além disso, ainfiltração de leucócitos é analisada em tumores, e os agentes anti-EGFRinduzem a infiltração de leucócitos no tumor, bem como seu estado de ativi-dade/diferenciação. Este último pode ser monitorado por IHC de marcadoresde ativação/diferenciação celular. Devido à correlação de erupção de pele eresposta à terapia, é sugerido que a modulação de quimiocinas ocorre nocontexto da pele, bem como câncer e que isso contribui para o mecanismode ação dos agentes anti-EGFR.
De acordo com a invenção, é proposto que um amplo monitora-mento de mudança nos perfis de expressão de quimiocina em tumores +/-inibição de EGFR e combinar as mudanças observadas com as especifici-dades celulares conhecidas de quimiocinas dentro do sistema imunológicofornece os primeiros indícios com relação a quais quimiocinas intratumoraise quais leucócitos podem contribuir para o controle imunológico do cresci-mento do tumor. Com base nessa informação, é possível identificar outrosalvos terapêuticos a montante nos caminhos que controlam a expressão dequimiocina, além de EGFR, que induz efeitos anti-tumorais imuno-mediados,independentemente da inibição de EGFR, ou com o objetivo de aumentar osefeitos anti-tumorais de agentes terapêuticos anti-EGFR. Desse modo, épossível elucidar alterações no padrão de expressão de quimiocina em tu-mores, após a inibição de sinalização de EGFR. Os padrões de quimiocinaalterados, observados sob uma terapia anti-EGFR, são, até um determinadograu, específicos para tumores.Descrição Resumida dos DesenhosFigura 1
Inibicão de caminhos de sinalização dependentes de EGFR em ceratinócitosCeratinócitos foram tratados com inibidores de EGFR (cetuxi-mab, Matuzumab ou lressa) e estimulados com ou sem diferentes fatores decrescimento (TGFa ou TNFa). Após 24 h, as células foram Iisadas e analisa-das por Western blotting. As análises revelaram que o tratamento com inibi-dores de EGFR resultou na anulação de cascatas de sinalização causadaspor EGFR em um modo dependente da dose. O tratamento com inibidoresde EGFR impediu a fosforilação de EGFR (Tyr 1068) e ERK1/2 (Thr 202/204).
Figura 2
Inibicão de caminhos de sinalização dependentes de EGFR em ceratinócitosCeratinócitos foram tratados com inibidores de EGFR (cetuxi-mab, Matuzumab ou lressa) e estimulados com ou sem diferentes fatores decrescimento (TGFa ou TNFa). Após 24 h, as células foram Iisadas e analisa-das por Western blotting. As análises revelaram que o tratamento com inibi-dores de EGFR resultou na anulação de cascatas de sinalização causadaspor EGFR em um modo dependente da dose. O tratamento com inibidoresde EGFR induziu a expressão de COX-2 e impediu a fosforilação de STAT3.
Figura 3
Modulação de níveis de IL-8 secretados em ceratinócitos
Ceratinócitos foram tratados com inibidores de EGFR (cetuxi-mab, Matuzumab ou lressa) e estimulados com ou sem diferentes fatores decrescimento (TGFa ou TNFa). Após 24 h, o sobrenadante celular foi coletadoe os níveis de IL-8 foram quantificados usando a tecnologia Luminex. As a-nálises revelaram que o tratamento com inibidores de EGFR regulou parabaixo o IL-8 em um modo dependente da dose.
Figura 4
Modulação de níveis de RANTES secretados em ceratinócitos
Ceratinócitos foram tratados com inibidores de EGFR (cetuxi-mab, Matuzumab ou lressa) e estimulados com ou sem diferentes fatores decrescimento (TGFa ou TNFa). Após 24 h, o sobrenadante celular foi coletadoe os níveis de RANTES foram quantificados usando a tecnologia Luminex.As análises revelaram que o tratamento com inibidores de EGFR reguloupara cima o RANTES em um modo dependente da dose.
Figura 5
Modulação de níveis de IP-10 secretados em ceratinócitos
Ceratinócitos foram tratados com inibidores de EGFR (cetuxi-mab, Matuzumab ou lressa) e estimulados com ou sem difrentes fatores decrescimento (TGFa ou TNFa). Após 24 h, o sobrenadante celular foi coletadoe os níveis de IP-10 foram quantificados usando a tecnologia Luminex. Asanálises revelaram que o tratamento com inibidores de EGFR regulou paracima o IP-10 em um modo dependente da dose.
Figura 6
Modulação de níveis de IL-8 secretados em A431
A431 foram tratados com inibidores de EGFR (cetuximab, Matu-zumab ou lressa) e estimulados com ou sem diferentes fatores de cresci-mento (TGFa ou TNFa). Após 24 h, o sobrenadante celular foi coletado e osníveis de IL-8 foram quantificados usando a tecnologia Luminex. As análisesrevelaram que o tratamento com inibidores de EGFR regulou para baixo oIL-8 em um modo dependente da dose.
Figura 7
Modulação de níveis de RANTES secretados em A431
A431 foram tratados com inibidores de EGFR (cetuximab, Matu-zumab ou lressa) e estimulados com ou sem diferentes fatores de cresci-mento (TGFa ou TNFa). Após 24 h, o sobrenadante celular foi coletado e osníveis de RANTES foram quantificados usando a tecnologia Luminex. Asanálises revelaram que o tratamento com inibidores de EGFR regulou paracima o RANTES em um modo dependente da dose.
Figura 8
Modulação de níveis de IP-10 secretados em A431
A431 foram tratados com inibidores de EGFR (cetuximab, Matu-zumab ou lressa) e estimulados com ou sem diferentes fatores de cresci-mento (TGFa ou TNFa). Após 24 h, o sobrenadante celular foi coletado e osníveis de IP-10 foram quantificados usando a tecnologia Luminex. As análi-ses revelaram que o tratamento com inibidores de EGFR regulou para cimao IP-10 em um modo dependente da dose.
Figura 9
Modulação de níveis de IL-8 secretados em diferentes linhas celulares tumorais
Diferentes linhas celulares tumorais (DiFi HT29, A431, MCF-7,PC-3 e U87MG) foram tratadas com inibidores de EGFR (cetuximab ou Ma-tuzumab) e estimuladas com (TGFa). Após 24 h, o sobrenadante celular foicoletado e os níveis de IL-8 foram quantificados usando a tecnologia Lumi-nex. As análises revelaram que o tratamento com inibidores de EGFR regu-lou para baixo o IL-8 em todas as linhas celulares tumorais investigadas emum modo dependente da dose.
<table>table see original document page 21</column></row><table>
Níveis de IL-8 em resposta a cetuximab (Cmab) ou matuzumab(Mmab). As células foram tratadas com 100 ng/ml de Cmab ou Mmab e es-timuladas com 100 ng/ml de TGFa; número de experiências = 1

Claims (25)

1. Método para prever a erupção e intensidade de uma irritaçãode pele associada ou correlacionada com terapia de câncer em um paciente,em que o método compreende:(i) determinar em uma primeira amostra de tecido de pele o pa-drão de expressão de quimiocinas com métodos comuns, em que a amostraé tirada de um paciente antes de começar o tratamento com um agente anti-câncer, que está dirigido contra células tumorais que utilizam o receptor dofator de crescimento epidérmico (EGFR),(ii) determinar em uma segunda amostra de pele derivada doreferido paciente o padrão de expressão de quimiocinas, em que a amostraé tirada em um período depois de iniciado o tratamento com o referido agen-te anticâncer,(iii) opcionalmente, determinar em uma terceira e outra amostrade pele o padrão de expressão de quimiocina, em que a amostra é tirada dopaciente em um período posterior ao da respectiva amostra precursora daetapa (ii),(iv) comparar os respectivos padrões de expressão de quimioci-na das amostras de pele da etapa (ii) e, opcionalmente, (iii), com o padrãode expressão da amostra de pele da etapa (i), e determinar das mesmasquais quimiocinas mudaram em qualidade e/ou quantidade na amostra (ii) e(iii), em relação ao padrão de quimiocina da amostra de referência de (i) ouda respectiva amostra precursora;(v) prever das mudanças no padrão de quimiocina a intensidadee a erupção em um período posterior da doença de pele provocada pelo tra-tamento com o referido agente anticâncer.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a irritaçãode pele é erupção de pele.
3. Método de prever a resposta tumoral de um paciente que so-fre de câncer ao tratamento com um agente anticâncer, o método compre-ende:(i) determinar em uma primeira amostra de tecido o padrão deexpressão de quimiocinas com métodos comuns, em que a amostra é tiradade um paciente antes de começar o tratamento com um agente anticâncer,que está dirigido contra células tumorais que utilizam o receptor do fator decrescimento epidérmico (EGFR),(ii) determinar em uma segunda amostra de tecido derivada doreferido paciente o padrão de expressão de quimiocinas, em que a amostraé tirada em um período depois de iniciado o tratamento com o referido agen-te anticâncer,(iii) opcionalmente, determinar em uma terceira e outra amostra de tecido o padrão de expressão de quimiocina, em que a amostra é tiradado paciente em um período posterior ao da respectiva amostra precursorada etapa (ii),(iv) comparar os respectivos padrões de expressão de quimioci-na das amostras de tecido da etapa (ii) e, opcionalmente, (iii), com o padrão de expressão da amostra de tecido da etapa (i), e determinar das mesmasquais quimiocinas mudaram em qualidade e/ou quantidade na amostra (ii) e(iii), em relação ao padrão de quimiocina da amostra de referência de (i) ouda respectiva amostra precursora;(v) prever das mudanças no padrão de quimiocina a probabilida-de e intensidade da resposta tumoral do paciente ao tratamento com o refe-rido agente anticâncer.
4. Método para determinar a dose ótima de um agente anticân-cer para o tratamento de câncer em um paciente, o método compreende:(i) determinar em uma primeira amostra de tecido o padrão deexpressão de quimiocinas com métodos comuns, em que a amostra é tiradade um paciente antes de começar o tratamento com um agente anticâncer,que está dirigido contra células tumorais que utilizam o receptor do fator decrescimento epidérmico (EGFR),(ii) determinar em uma segunda amostra de tecido derivada do referido paciente o padrão de expressão de quimiocinas, em que a amostraé tirada em um período depois de iniciado o tratamento com o referido agen-te anticâncer,(iii) opcionalmente, determinar em uma terceira e outra amostrade tecido o padrão de expressão de quimiocina, em que a amostra é tiradado paciente em um período posterior ao da respectiva amostra precursorada etapa (ii),(iv) comparar os respectivos padrões de expressão de quimioci-na das amostras de tecido da etapa (ii) e, opcionalmente, (iii), com o padrãode expressão da amostra de tecido da etapa (i), e determinar das mesmasquais quimiocinas mudaram em qualidade e/ou quantidade na amostra (ii) e(iii), em relação ao padrão de quimiocina da amostra de referência de (i) ouda respectiva amostra precursora;(v) determinar a dose do agente anticâncer a ser administradaao paciente de acordo com as mudanças no padrão de quimiocina das refe-ridas amostras de tecido e, opcionalmente,(vi) repetir as etapas (i) - (v), a fim de otimizar a dose do agenteanticâncer a ser administrada ao paciente.
5. Método de acordo com a reivindicação 3 ou 4, em que a refe-rida amostra é derivada de tecido de tumor.
6. Método de acordo com a reivindicação 3 ou 4, em que a refe-rida amostra é derivada de tecido de pele.
7. Método de acordo com uma das reivindicações 1 - 6, em quea amostra da etapa (ii) é tirada dentro de 1 - 10 dias após o início do trata-mento com o referido agente anticâncer.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que a amostrada etapa (ii) é tirada dentro de 5 - 7 dias após o início do tratamento com oreferido agente anticâncer.
9. Método de acordo com uma das reivindicações 1 - 8, em queo agente anticâncer é um inibidor de EGFR.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o inibidorde EGFR é um anticorpo de anti-EGFR.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o anticor-po de anti-EGFR é Mab c225 (cetuximab) ou Mab h425 (EMD72000, matuzumab).
12. Método de acordo com uma das reivindicações 1 - 11, emque o tratamento com o agente anticâncer causa uma expressão aumentadade quimiocinas, em comparação com o paciente não tratado.
13. Método de acordo com uma das reivindicações 1 - 11, emque o tratamento com o agente anticâncer causa uma expressão reduzidade quimiocinas, em comparação com o paciente não tratado.
14. Método de acordo com uma das reivindicações 1 - 13, emque pelo menos uma das seguintes quimiocinas estão envolvidas: IL-8,MCP-1, RANTESe IP-10.
15. Método in vitro de uma monitoração de estágio precoce daeficiência da terapia de câncer que utiliza EGFR em um paciente, por deter-minação do padrão de quimiocina em amostras de tecido de pele e/ou tecidotumoral e/ou soro do paciente com tumor, antes do início e durante os pri-meiros 1-10 dias de tratamento com um agente anticâncer.
16. Método in vitro de monitoração de estágio precoce da ocor-rência de irritação de pele, em conjunto com a terapia de câncer que utilizaEGFR em um paciente, determinando o padrão de quimiocina em amostrasde tecido de pele do paciente com tumor, antes do início e durante os primei-ros 1 - 7 dias de tratamento com um agente anticâncer.
17. Método de acordo com a reivindicação 15 ou 16, em que oagente anticâncer é um inibidor de EGFR.
18. Método de acordo com a reivindicação 17, em que o inibidorde EGFR é um anticorpo de anti-EGFR.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o inibidorde EGFR é Mab c225 (cetuximab) ou Mab h425 (EMD72000, matuzumab).
20. Método de acordo com uma das reivindicações 15 - 19, emque o tratamento com o agente anticâncer causa uma expressão aumentadade quimiocinas, em comparação com o paciente não tratado.
21. Método de acordo com uma das reivindicações 15 - 19, emque o tratamento com o agente anticâncer causa uma expressão reduzidade quimiocinas, em comparação com o paciente não tratado.
22. Método de acordo com uma das reivindicações 15 - 21, emque o pelo menos uma das seguintes quimiocinas está envolvida: IL-8, MCP--1, RANTESe IP-10.
23. Uso de quimiocinas, que são reguladas para cima e parabaixo, in vivo, durante o tratamento de câncer com um agente anticâncer,como um marcador de diagnóstico in vitro para determinar a eficiência doreferido tratamento e/ou a probabilidade da ocorrência de irritações de pele,acompanhadas do referido tratamento, em que o referido câncer utiliza EG-FR e o referido agente anticâncer é um inibidor de EGFR.
24. Uso de quimiocinas, que são reguladas para cima e parabaixo, in vivo, durante o tratamento de câncer com um agente anticâncer,para identificação de um alvo a montante da referida expressão de quimioci-na, apropriada para o desenvolvimento e produção de um medicamento diri-gido para o referido alvo, para o tratamento de câncer, que utiliza EGFR nopaciente, sozinho, ou em combinação com o referido agente anticâncer, emque o referido agente anticâncer é um inibidor de EGFR.
25. Uso de acordo com a reivindicação 23 ou 24, em que o refe-rido agente anticâncer é Mab c225 (cetuximab) ou Mab h425 (EMD72000,matuzumab).
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