BRPI0613525A2

BRPI0613525A2 - métodos para produzir uma composição imunogênica, para melhorar a imunogenicidade de uma composição, para intensificar a imunogenicidade de uma composição de vacina, e para determinar a quantidade de estruturas beta-cruzadas em uma composição de vacina, usos de estruturas beta-cruzadas, e de uma composição imunogênica, vacina de subunidade, e, composição imunogênica

Info

Publication number: BRPI0613525A2
Application number: BRPI0613525-0A
Authority: BR
Inventors: Martijn Frans Ben Gerard Gerbink; Barend Bouma
Original assignee: Crossbeta Biosciences Bv
Priority date: 2005-07-13
Filing date: 2006-07-13
Publication date: 2011-05-31
Also published as: CA2615020A1; WO2007008070A2; CN101262881A; ZA200800372B; WO2007008070A3; US20080118529A1; JP2009501215A; EP1906995A2; AU2006267174A1

Abstract

MéTODOS PARA PRODUZIR UMA COMPOSIçãO IMUNOGêNICA, PARA MELHORAR A IMUNOGENICIDADE DE UMA COMPOSIçãO, PARA INTENSIFICAR A IMUNOGENICIDADE DE UMA COMPOSIçãO DE VACINA, E PARA DETERMINAR A QUANTIDADE DE ESTRUTURAS BETA-CRUZADAS EM UMA COMPOSIçãO DE VACINA, USOS DE ESTRUTURAS BETA-CRUZADAS, E DE UMA COMPOSIçãO IMUNOGêNICA, VACINA DE SUBUNIDADE, E, COMPOSIçãO IMUNOGêNICA A invenção refere-se a novos métodos e meios para prover substâncias proteináceas, como peptídeos, polipeptídeos, glicoproteinas, lipoproteinas e compostos complexos compreendendo o primeiro em combinação com outras substâncias, como ácidos nucleicos, estruturas de membrana, estruturas de carboidratos, com estruturas e-cruzadas, que melhoram a imunogenicidade de referida substância proteinácea. Os peptídeos, proteínas, glicoproteinas, etc., resultantes são preferivelmenteusados em vacinas. A invenção provê um método para produzir uma composição imunogênica compreendendo pelo menos um peptídeo, polipeptídeo, proteína, glicoproteina, e/ou lipoproteina, compreendendo prover referida composição com pelo menos uma estrutura p-cruzada. A invenção também descreve o uso de estruturas e-cruzadas na preparação de uma vacina para a profilaxia de uma doença infecciosa. A invenção ainda provê um método para melhorar a imunogenicidade de uma composição compreendendo pelo menos um peptídeo, polipeptídeo, proteína, glicoproteina e/ou lipoproteina, compreendendo contatar pelo menos um dentre referido peptídeo, polipeptídeo, proteína, glicoproteina e/ou lipoproteina com um agente indutor e-cruzado, assim provendo referida composição com estruturas e-cruzadas adicionais.

Description

"MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA,PARA MELHORAR A IMUNOGENICIDADE DE UMA COMPOSIÇÃO,PARA INTENSIFICAR A IMUNOGENICIDADE DE UMACOMPOSIÇÃO DE VACINA, E PARA DETERMINAR A QUANTIDADEDE ESTRUTURAS BETA-CRUZADAS EM UMA COMPOSIÇÃO DEVACINA, USOS DE ESTRUTURAS BETA-CRUZADAS, E DE UMACOMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, VACINA DE SUBUNIDADE, E,COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA"

A invenção refere-se a novos métodos e meios paraproporcionar substâncias proteináceas, como peptídeos, polipeptídios,glicoproteínas, lipoproteínas e compostos complexos compreendendo oprimeiro em combinação com outras substâncias, como ácidos nucleicos,estruturas de membrana, estruturas de carboidratos, com estruturas β-cruzadas, que incrementam a imunogenicidade de referida substânciaproteinácea. Os peptídeos, proteínas, glicoproteínas, etc., resultantes sãousados preferivelmente em vacinas.

Vacinas podem ser divididas em dois grupos básicos, i.e.vacinas profiláticas e vacinas terapêuticas. Vacinas profiláticas têm sidopreparadas e/ou sugeridas contra substancialmente cada agente infecciosoconhecido (vírus, bactéria, levedura, fungos, parasita, micoplasma, etc.), queapresenta alguma patologia no Homem, animais domésticos e/ou animais decriação. Vacinas terapêuticas também têm sido preparadas e/ou sugeridas paraagentes infecciosos, mas também para tratamentos de câncer e outrasaberrações, e também para induzir respostas imunes contra outros auto-antígenos, compreendendo até mesmo, p. ex. LHRH, para imunocastração dejavalis, ou para uso na prevenção da [doença] do enxerto versus hospedeiro(GvH, graft versus host) e/ou rejeições de transplante.

Em vacinas, em geral, há duas questões vitais. Vacinasprecisam ser eficazes e vacinas precisam ser seguras. Freqüentemente pareceque as duas exigências são mutuamente exclusivas quando se tentadesenvolver uma vacina. As vacinas mais eficazes até aqui têm sido agentesinfecciosos vivos modificados. Estes são modificados de uma maneira quesua virulência foi reduzida (atenuação) a um nivel aceitável. A cepa de vacina5 do agente infeccioso tipicamente não se replica no hospedeiro, mas em umnivel reduzido, de modo que o hospedeiro pode oeferecer uma resposta imuneadequada, também dotando o hospedeiro com imunidade de longo prazocontra o agente infeccioso. O lado negativo de vacinas atenuadas é que osagentes infecciosos podem reverter a uma forma mais virulenta (e, portanto,patogênica).

Isto pode ocorrer em qualquer agente infeccioso, mas tambémé um problema muito sério em vírus rapidamente mutantes (como, emparticular, vírus de RNA). Outro problema com vacinas vivas modificadas éque agentes infecciosos freqüentemente apresentam muitos serotiposdiferentes. Provou-se que, em muitos casos, é difícil proporcionar vacinas queelicitam uma resposta imune em um hospedeiro que protege contra diferentesserotipos de agentes infecciosos.

Vacinas em que o agente infeccioso foi morto são seguras, masfreqüentemente sua eficácia é medíocre na melhor das hipóteses, mesmoquando a vacina contém um adjuvante.

Um tipo de vacina que recebeu bastante atenção porque oadvento da biologia moderna é a vacina de subunidade. Nestas vacinas,apenas alguns elementos do agente infeccioso são usados para elicitar umaresposta imune. Tipicamente, uma vacina de subunidade compreende duas outrês proteínas (glicoproteínas) e/ou peptídios presentes em proteínas de umagente infeccioso (de um ou mais serotipos) que têm sido produzidos viameios recombinantes e/ou meios sintéticos. Embora, em teoria, estas vacinassejam as vacinas mais promissoras, seguras e eficazes, na prática a eficáciaprovou ser uma barreira importante. Biologia molecular proporcionou maismétodos alternativos para se chegar a vacinas seguras e eficazes que,teoricamente, também poderiam proporcionar proteção cruzada contradiferentes serotipos de agentes infecciosos. Estruturas de carboidratoderivadas de agentes infecciosos têm sido sugeridas como componentes devacinas que elicitam respostas imunes específicas, bem como estruturas delipopolissacarídeos, propôs-se até mesmo complexos de ácido nucleico.Embora estas vacinas de componente sejam geralmente seguras, sua eficácia eproteção cruzada relativamente a diferentes serotipos geralmente tem faltado.Combinações de diferentes tipos de componentes têm sido sugeridas(carboidratos com peptídios/proteínas e lipopolissacarídeo (LPS) compeptídios/proteínas opcionalmente com veículos), mas, até aqui, permanece aquestão segurança versus eficácia.

Outra abordagem para proporcionar proteção cruzada consisteem preparar agentes infecciosos que compreendem componentes antigênicosde dois ou mais serotipos de um agente infeccioso. Estes podem serproduzidos, e foram produzidos por meio de modernas técnicas da biologiamolecular. Eles podem ser produzidos como vacinas vivas modificadas, oucomo vacinas com patógenos inativados ou mortos, mas também comovacinas de subunidade. Vacinas de coquetel compreendendo antígenos deagentes infecciosos completamente diferentes também são conhecidas. Emmuitos países, crianças são vacinadas rotineiramente com vacinas de coquetelcontra, p. ex., difteria, tosse ladrante, tétano e pólio. Vacinas recombinantescompreendendo elementos antigênicos de diferentes agentes infecciosostambém foram sugeridas. Por exemplo, no caso de galináceos, sugeriu-se umavacina baseada em um vírus de anemia de frangos complementada comelementos antigênicos do vírus da doença de Marek (MDV, Marek diseasevírus), mas sugeriu-se e produziu-se muito mais combinações.

Outra vantagem importante de modernas vacinasrecombinantes é que elas proporcionaram a oportunidade de produzir vacinasmarcadoras. Vacinas marcadoras têm sido dotadas com um elementoadicional que não está presente em agente infeccioso de tipo selvagem, ouvacinas marcadoras não apresentam um elemento que está presente em agenteinfeccioso de tipo selvagem. A resposta de um hospedeiro a ambos os tipos devacinas marcadoras pode ser diferenciada (tipicamente por meio dediagnóstico sorológico) da resposta contra uma infecção com tipo selvagem.

A presente invenção proporciona métodos e meio quemelhoram a imunogenicidade de composições destinadas a elicitar umaresposta imune.

Em particular, a invenção proporciona composições comimunogenicidade incrementada para uso como vacinas, sejam profiláticas outerapêuticas. A invenção também proporciona vacinas com imunogenicidademelhorada e segurança melhorada.

Em uma concretização, a invenção proporciona um métodopara produzir uma composição imunogênica compreendendo pelo menos umpeptídio, polipeptídio, proteína, glicoproteína e/ou lipoproteína,compreendendo dotar referida composição com pelo menos uma estrutura βcruzada. Uma estrutura β cruzada é definida como uma parte de uma proteínaou peptídio, ou uma parte de uma montagem de peptídios e/ou proteínas, quecompreende um grupo ordenado de filamentos β, tipicamente um grupo defilamentos β dispostos em uma lâmina β, em particular, um grupo de lâminasβ empilhadas e estratificadas. Uma forma típica de lâminas β empilhadasencontra-se em uma estrutura similar a fibrilos em que as lâminas β podemser empilhadas em qualquer direção do eixo do fibrilo, ou perpendicular à doeixo do fibrilo. O termo estrutura pode ser usado intercambiavelmente com otermo conformação. Evidentemente, o termo peptídio destina-se a incluiroligopeptídios e também polipeptídios, e o termo proteína inclui proteínascom e sem modificações pós-tradução, como glicosilação. Ele também incluilipoproteínas e complexos compreendendo proteínas, como complexos deproteína-ácido nucleico (RNA e/ou DNA), complexos de membrana-proteína,etc.

Para proporcionar uma composição imunogênica,particularmente uma composição imunogênica destinada a elicitar umaresposta imune específica contra um antígeno específico (grupo de[antígenos]) com uma estrutura β cruzada, uma proteína ou peptídio comodefinido acima compreendendo uma estrutura β cruzada pode sersimplesmente adicionada a referida composição. De preferência, referidaproteína ou peptídio compreendendo referida estrutura β cruzada é umpeptídio ou proteína de outra forma inerte. Inerte é definido como nãoelicitando uma resposta imune indesejada ou outra reação química indesejadaem um hospedeiro, pelo menos não em um grau inaceitável, de preferência,apenas em um grau desprezível. A função desejada deveria estar presenteevidentemente em virtude da presença de estruturas β cruzadas. A proteína oupeptídio compreendendo uma estrutura β cruzada pode ser adicionado aqualquer tipo de vacina, seja terapêutico ou profilático, seja um agenteinfeccioso inteiro atenuado ou morto, seja vacina de subunidade oucarboidrato ou vacina de LPS ou combinações dos mesmos. Uma estrutura βcruzada pode estar presente em um único composto proteináceo, ou pode seruma estrutura compartilhada por vários compostos proteináceos. Estruturas βcruzadas podem ser induzidas por meio de muitos mecanismos diferentes.Muitos tipos de processos de desnaturação para proteínas e/ou polipeptídioslevam à formação de estruturas β cruzadas. Referidos processos dedesnaturação podem ser aplicados, portanto, para induzir estruturas βcruzadas em muitos tipos de polipeptídios e/ou proteínas. Exemploscompreendem tratamentos por meio de aquecimento, químicos com, p. ex.,sais superiores, materiais ácidos ou alcalinos, pressão e outros tratamentosfísicos, etc. A adição de uma estrutura β cruzada pode proporcionar umacomposição com imunogenicidade em um hospedeiro, ela também podeincrementar referida imunogenicidade já presente em uma composição. Oproteína/polipeptídio/peptídio que proporciona estrutura β cruzada pode seradicionado a uma composição per se, mas também é útil usar referidasubstância proteinácea que proporciona estrutura β cruzada como um veículoa que se associou elementos do(s) agente(s) infeccioso(s) e/ou antígeno(s).Esta ligação pode ser proporcionada por meio de ligação química (direta ouindireta) ou por meio de expressão do(s) antígeno(s) relevante(s) dasubstância proteinácea que proporciona estrutura β cruzada, como umaproteína de fusão. Em ambos os casos, podem estar presentes ligantes entre osdois. Em ambos os casos, é possível acoplar dímeros, trímeros e/oumultímeros do antígeno (ou um ou mais epítopos de um antígeno relevante)ao composto proteináceo proporcionando estrutura β cruzada. No entanto,veículos normais compreendendo antígenos ou epítopos relevantes acopladosaos mesmos também podem ser usados. A simples adição de uma substânciaproteinácea compreendendo estrutura β cruzada incrementará aimunogenicidade de um complexo do tipo referido. Isto é mais ou menosgeneralmente verdadeiro. Uma composição imunogênica de acordo com ainvenção pode compreender tipicamente uma quantidade, ou todos, osconstituintes normais de uma composição imunogênica (em particular, umavacina), suplementada com um composto proteináceo compreendendoestrutura β cruzada (conformação).

Em uma concretização preferida o polipeptídio/proteína queproporciona a estrutura β cruzada é per se um componente de vacina (i.e.,derivado do agente infeccioso ou antígeno contra o qual se deseja umaresposta imune).

Assim, em uma concretização adicional a invençãoproporciona um método de acordo com a invenção, sendo que referidaestrutura β cruzada é induzida em pelo menos parte do referido pelo menosum peptídio, polipeptídio, proteína, glicoproteína e/ou lipoproteína.Nesta concretização, uma parte do antígeno e/ou antígenosdesejados ou um ou mais epítopos de referido(s) antígeno(s) é usada como umcomposto que proporciona a estrutura β cruzada. Como indicado previamente,é possível introduzir estruturas β cruzadas de muitas maneiras. Uma maneirapreferida de introduzir estruturas β cruzadas em um antígeno é por meio deum ou mais tratamentos de aquecimento, congelamento, oxidação,glicosamento PEGilação, sulfatação, exposição a um caotrófico, depreferência, o caotrófico é uréia ou guanidínio-HCl, fosforilação, proteóliseparcial, Iise química, de preferência, com HCl ou brometo de cianogênio,sonicação, dissolução em soluções orgânicas, de preferência, 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol e ácido trifluoroacético, ou uma combinação dosmesmos.

Um epítopo per se pode ser muito pequeno para compreenderestruturas β cruzadas. Como indicado previamente, vários epítopos emconjunto podem formar uma estrutura β cruzada e/ou o epítopo pode sercolocado (sinteticamente, quimicamente ou recombinantemente) em umambiente compreendendo estruturas β cruzadas. Assim, em uma vacina desubunidade compreendendo, p. ex., dois antígenos proteináceos de um agenteinfeccioso, uma parte de um ou do outro, ou ambos os antígenos, podem serdotados com estruturas β cruzadas e, depois, dispostos juntos com o resto domaterial antigênico para proporcionar, ou pelo menos incrementai, aimunogenicidade de uma composição compreendendo estes antígenos.Novamente, é possível adicionar constituintes normais de composiçõesimunogênicas (em particular vacinas), como veículos, adjuvantes, outrosexcipientes. Se o veículo for proteináceos, ele também pode induzirvantajosamente estruturas β cruzadas em pelo menos parte de referidoveículo. Um ou mais dos componentes antigênicos da vacina de subunidadepodem ser acoplados a referido veículo. Novamente, os componentesantigênicos podem estar presentes como monômeros, dímeros, multímeros,em disposições de pé-a-cabeça (com ou sem espaçadores entre os mesmos),ou em outras disposições multiméricas (conhecidas como "árvores", ou"estrelas" e análogos). As composições imunogênicas composiçõesimunogênicas produzidas com os métodos da invenção também são parte dapresente invenção. Composições antigênicos de acordo com a invenção sãotipicamente as vacinas conhecidas contra os antígenos desejados conhecidos,a que pelo menos um composto proteináceos é adicionado numa quantidadede até 30 porcento em peso do material antigênico presente na vacina. Emuma concretização preferida, os compostos que proporcionam estrutura βcruzada estão presentes em 10-30 % em peso com relação ao materialantigênico. Quando o material compreendendo estrutura β cruzada dainvenção é usado para substituir um veículo convencional em uma vacina, elepode ser usado aproximadamente nas mesmas relações em peso que o veículooriginal. Quando parte do antígeno(s) relevente é usada para proporcionar oscompostos de estrutura β cruzada, então a quantidade total de materialantigênico deveria ser pelo menos a mesma que em uma vacina sem referidasestruturas β cruzadas. Tipicamente, isto significa que a quantidade total deantígeno (normal + compreendendo estrutura β cruzada) será de 10 a 50, depreferência, de 5 a 30 % maior do que a vacina sem estruturas β cruzadas. Doantígeno a ser usado como composto que proporciona estrutura β cruzada,tipicamente pelo menos 50 % são desnaturados, mais preferivelmente mais de90 % são desnaturados. A combinação ótima de antígeno desnaturado enormal para cada vacina é determinada por meio de simples estudos de dosecrescente. Produz-se faixas de composições antigênicos que compreendem 5,10, 20, 30, 40 50, % em peso do material antigênico desnaturado para sedeterminar a quantidade adicionada apropriada de antígenos contendoestrutura β cruzada. Quando a faixa é determinada, faz-se o ajuste fino damesma determinando-se uma faixa entre as melhores doses. O mesmo érealizado quando se usa material proteináceo inerte para proporcionar asestruturas β cruzadas.

O uso intencionado das composições antigênicos de acordocom a invenção é como vacinas, sejam terapêuticas ou profiláticas. O usopreferido é na profilaxia contra agentes infecciosos. O campo da vacina é umvelho campo da arte. Pessoas com prática na arte são mui capazes de adaptara presente invenção a vacinas conhecidas. Adicionalmente, vacinas (p. ex.vacinas de subunidade) que não apresentavam suficiente eficácia (proteção)podem ser incrementadas com os métodos e meios da presente invenção.

Assim, em uma concretização adicional a invençãoproporciona o uso de estruturas β cruzadas na preparação de uma vacina paraa profilaxia de uma doença infecciosa, ou, mais preferivelmente, o uso deestruturas β cruzadas induzidas em um componente de proteína de um agenteinfeccioso na preparação de uma vacina que induz uma resposta imune contrareferido agente infeccioso, em particular o uso acima, sendo que referidocomponente de proteína é uma proteína viral ou bacteriana e sendo quereferido agente infeccioso é um vírus, ou uma bactéria.

Em outra concretização a invenção proporciona uma vacina desubunidade compreendendo pelo menos uma proteína viral, sendo que pelomenos 4-50 %, de preferência, 10-30 % de referida proteína viral encontra-senuma conformação compreendendo estruturas β cruzadas.

Em outra concretização adicional a invenção proporciona umavacina de subunidade compreendendo pelo menos uma proteína bacteriana,sendo que pelo menos de 4 a 50 %, de preferência, de 10 a 30 % de referidaproteína bacteriana encontra-se numa conformação compreendendo estruturasβ cruzadas.

Em outra concretização adicional a invenção proporciona umavacina de subunidade compreendendo pelo menos dois proteínas virais, sendoque pelo menos de 4 a 50 %, de preferência, de 10 a 30 % de pelo menos umade referidas proteínas virais encontra-se numa conformação compreendendoestruturas β cruzadas.

Em outra concretização adicional a invenção proporciona umavacina de subunidade compreendendo pelo menos duas proteína bacterianas,sendo que pelo menos de 4 a 50 %, de preferência, de 10 a 30 % de pelomenos uma de referidas proteína bacterianas encontra-se numa conformaçãocompreendendo estruturas β cruzadas.

Em uma concretização adicional a invenção proporciona umuso de estruturas β cruzadas na preparação de uma composição imunogênicapara a profilaxia e/ou tratamento de câncer. Referida composiçãoimunogênica é, de preferência, uma vacina para a profilaxia e/ou tratamentode um tumor ou metástase. Estruturas β cruzadas induzidas em umcomponente de proteína de uma vacina são usadas, de preferência, parainduzir uma resposta imune contra um tumor ou metástase. Referidocomponente de proteína compreende, de preferência, um antígeno de tumor.

Conseqüentemente, a indução de estruturas β cruzadas em um tumor antígenoé particularmente vantajosa para a produção de uma composição imunogênicacapaz de elicitar uma resposta imune contra referido tumor. Alternativamente,ou adicionalmente, referido componente de proteína é combinado com outrocomposto compreendendo estruturas β cruzadas. Referido outro compostocompreende, de preferência, um adjuvante. De preferência, usa-se ovalbuminaem que a formação de estruturas β cruzadas foi induzida e/ou acentuada.

Em uma concretização preferida um método de acordo com ainvenção é usado para preparar uma composição imunogênica contra umtumor que é induzido por um agente infeccioso, como por exemplo um vírus.Da forma mais preferível, estruturas β cruzadas são usadas na preparação deuma composição imunogênica contra um tumor relacionado compapilomavírus humano (HPV, Human papillomavirus). De preferência,estruturas β cruzadas são induzidas e/ou acentuadas em uma proteína de HPVE6 e/ou proteína de HPV E7. Referida proteína de HPV E6 e/ou proteína deHPV Ε7 em que a formação de estruturas β cruzadas foi induzida e/ouacentuada é particularmente vantajosa para elicitar uma resposta imune contraum tumor relacionado com HPV. Alternativamente, ou adicionalmente, umaproteína de HPV E6 e/ou proteína de HPV E7 é combinada com outrocomposto compreendendo estrutura β cruzada. Referido outro compostocompreende, de preferência, um adjuvante. De preferência, usa-se ovalbuminaem que a formação de estruturas β cruzadas foi induzida e/ou acentuada.

Em outra concretização adicional a invenção proporciona umuso de estruturas β cruzadas na preparação de uma composição imunogênicapara imuno-castração. Nesta concretização a formação de estruturas βcruzadas é, de preferência, induzida e/ou acentuada em LHRH.Alternativamente, ou adicionalmente, um LHRH é combinado com outrocomposto compreendendo estrutura β cruzada. Referido outro compostocompreende, de preferência, um adjuvante.

Proporciona-se também com isso um uso de estruturas βcruzadas na preparação de uma composição imunogênica para a profilaxiae/ou tratamento de aterosclerose, amiloidoses, doenças autoimunes, rejeiçõesenxerto-versus-hospedeiro e/ou rejeições de transplante. Referida composiçãoimunogênica compreende, de preferência, uma vacina. Estruturas β cruzadas são induzidas, de preferência, em um componente de proteína de uma vacinacapaz de induzir uma resposta imune contra um componente de proteínaenvolvido em pelo menos uma das doenças indicadas acima, de preferência,aterosclerose, amiloidoses e/ou uma doença auto-imune, sendo que referidocomponente de proteína é um antígeno e sendo que referida doença éassociada com acúmulo de referido componente de proteína. Em outraconcretização adicional a invenção proporciona o uso de estruturas β cruzadasna preparação de uma composição imunogênica, de preferência, uma vacina,para induzir uma resposta imune na profilaxia ou tratamento de outrasaberrações, e também para induzir uma resposta imune contra qualquer outraporção ou auto-antígeno, de preferência, mas sem limitação, nicotina,haptenos e/ou LHRH. Em uma concretização, estruturas β cruzadas sãoinduzidas em um componente de proteína de uma vacina capaz de induziruma resposta imune contra componentes envolvidos em rejeições de enxerto-versus-hospedeiro (GvH) ou rejeições de transplante.

Em outra concretização adicional a invenção proporciona umacomposição imunogênica compreendendo um antígeno bacteriano ouparasítico ou viral, sendo que referido antígeno compreende pelo menos entrede 4 a 50 %, de preferência, de 10 a 30 %, de referido antígeno em umaconformação de estrutura β cruzada. Referido antígeno compreende, depreferência, proteína de HPV E6, proteína de HPV E7, hemaglutinina deInfluenza H5, hemaglutinina de Influenza H7, proteína do pestivírus E2,proteína de Fasciola hepatica CL3 e/ou proteína PorA de Neisseria. Referidacomposição imunogênica é, de preferência, uma vacina.

Também se proporciona com isso um método de acordo com ainvenção para produzir uma composição imunogênica e/ou para aperfeiçoar aimunogenicidade de uma composição, sendo que referida composiçãocompreende pelo menos um peptídio, polipeptídio, proteína, glicoproteínae/ou lipoproteína sendo que referido pelo menos um peptídio, polipeptídio,proteína, glicoproteína e/ou lipoproteína, compreende HPV E6, HPV E7,Fasciola hepatica CL3, Influenza H5, Influenza H7, proteína do pestivírus E2e/ou proteína PorA de Neisseria.

De acordo com a presente invenção a imunogenicidade de umaproteína ou peptídio é incrementada após indução e/ou incrementação daformação de estruturas β cruzadas em referida proteína. Referida proteínacompreende, por exemplo, β2glicoproteína I, que é uma auto-proteína. Oaumento da imunogenicidade de auto-proteínas é muito útil para a indução deuma resposta imune contra referidas proteínas, que normalmente não sãofacilmente reconhecidas pelo sistema imunológico como antígenos. Exemplosde referidas proteínas são, por exemplo, LHRH, B2glicoproteína I, eantígenos de tumor. A indução e/ou aumento da conformação da estrutura βcruzada em uma referida proteína ou peptídio antigênico da mesma em umaresposta imune (incrementada) quando da administração de referida proteínaou peptídio antigênico a um animal ou humano.

Em um aspecto a invenção proporciona uma composiçãoimunogênica compreendendo uma p2glicoproteína I ou um peptídioantigênico da mesma, sendo que referida composição imunogênicacompreende pelo menos entre 4-67 %, de preferência, de 10 a 33 % dereferida proteína ou peptídio em uma conformação de estrutura β cruzada.Outra concretização proporciona uma composição imunogênicacompreendendo uma β2glicoρroteína I ou um peptídio antigênico da mesma,sendo que referida p2glicoproteína I, ou um peptídio antigênico da mesma, éacoplada a ou misturada com outra proteína ou peptídio da mesmacompreendendo pelo menos entre 4-67 %, de preferência, de 10 a 33 % dereferida outra proteína ou peptídio em uma conformação de estrutura βcruzada. Em uma concretização proporciona-se uma composição imunogênicaque compreende uma β2glicoproteína I ou um peptídio antigênico da mesma,sendo que referida composição imunogênica compreende pelo menos entre 4-67 %, de preferência, de 10 a 33 % de referida proteína ou peptídio de β2-glicoproteína I em uma conformação de estrutura β cruzada e sendo quereferida β2glicoproteína I ou peptídio antigênico é acoplada a ou misturadacom outra proteína ou peptídio, sendo que pelo menos entre 4-67 %, depreferência, de 10 a 33 % de referida outra proteína ou peptídio é em umaconformação de estrutura β cruzada. Referidas composições imunogênicassão usadas, de preferência, como uma vacina. Em uma concretizaçãopreferida referidas composições imunogênicas são usadas para a profilaxia outratamento de uma doença autoimune.

Em outra concretização adicional a invenção proporciona umacomposição imunogênica compreendendo a proteína bacteriana ou parasíticaou viral ou um peptídio antigênico da mesma, sendo que referida proteínacompreende pelo menos entre 4-67 %, de preferência, de 10 a 33 % dereferida proteína ou peptídio em uma conformação de estrutura β cruzada.

Também se proporciona aqui uma composição imunogênica compreendendouma proteína bacteriana ou parasítica ou viral ou um peptídio antigênico damesma, sendo que referida proteína ou peptídio antigênico é acoplado a oumisturado com outra proteína ou peptídio da mesma compreendendo pelomenos entre 4-67 %, de preferência, de 10 a 33 % de referida outra proteínaou peptídio em uma conformação de estrutura β cruzada. Uma concretizaçãopreferida proporciona uma composição imunogênica compreendendo umaproteína bacteriana ou parasítica ou viral ou um peptídio antigênico damesma, sendo que referida proteína compreende pelo menos entre 4-67 %, depreferência, de 10 a 33 % de referida proteína ou peptídio em umaconformação de estrutura β cruzada, sendo que referida proteína ou peptídioantigênico é acoplado a ou misturado com outra proteína ou peptídio, sendoque pelo menos entre de 4 a 67 %, de preferência, de 10 a 33 % de referidaoutra proteína ou peptídio é em uma conformação de estrutura β cruzada. Ascomposições imunogênicas mencionadas acima compreendem, depreferência, uma vacina. Referida outra proteína compreende, de preferência,OVA ou KLH ou uma combinação de ambos, porque estes compostos sãoparticularmente bem capazes de incrementar imunogenicidade. Assim, ainvenção proporciona adicionalmente uma composição imunogênica e/ouvacina de acordo com a presente invenção, sendo que referida outra proteínacompreende OVA ou KLH ou uma combinação de ambos.

Proporciona-se aqui também uma composição imunogênica ouvacina de acordo com a invenção compreende adicionou-se um adjuvante.Um adjuvante incrementa adicionalmente a imunogenicidade.

Está claro que as vacinas de acordo com a invençãocompreendem todos os tipos de vacinas de subunidade conhecidos, quercompreendam proteínas de um ou mais agentes infecciosos, epítopos de umou mais agentes (ou combinações de epítopos e proteínas de um ou maisagentes), opcionalmente com outros compostos antigênicos (polissacarídeos,lipídeos, LPS, DNA, oligodesoxinucleotídeos (ODN), ODN-CpG),), oucomplexos incluindo proteínas de um ou mais agentes. Está claro que vacinasde acordo com a invenção compreendem todos os tipos de vacinas, incluindovacinas para profilaxia de infecções causadas por, mas sem limitação, vírus,bactérias, fungos, levedura, ou parasitas.

A invenção em uma concretização proporciona composiçõesque são substancialmente não-imunogênicas com a desejadaimunogenicidade. Em outra concretização a invenção proporcionacomposições imunogênicas conhecidas com imunogenicidade incrementadaou melhorada.

Assim, em uma concretização adicional a invençãoproporciona um método para aperfeiçoar a imunogenicidade de umacomposição compreendendo pelo menos um peptídio, polipeptídio, proteína,glicoproteína e/ou lipoproteína, compreendendo contactar pelo menos um dereferido peptídio, polipeptídio, proteína, glicoproteína e/ou lipoproteína comum agente indutor de estrutura β cruzada, proporcionando com isso referidacomposição com estruturas β cruzadas adicionais.

Em particular, a invenção objetiva o incremento daimunogenicidade de vacinas conhecidas. Assim, em uma concretizaçãoadicional a invenção proporciona um método para incrementar aimunogenicidade de uma composição de vacina compreendendo pelo menosum peptídio, polipeptídio, proteína, glicoproteína e/ou lipoproteína,compreendendo contactar pelo menos um de referido peptídio, polipeptídio,proteína, glicoproteína e/ou lipoproteína com um agente indutor de estrutura βcruzada, dotando assim referida composição de vacina com estruturas βcruzadas adicionais. Para determina se uma composição de vacina pode ter aimunogenicidade aperfeiçoada dotando-se referida composição com estruturasβ cruzadas adicionais, uma determina a quantidade de estruturas β cruzadas jápresentes ali com meios como divulgados aqui, particularmente por meio de ligação com um composto de ligação de estrutura β cruzada, comomanchamento com vermelho Congo ou Tioflavina T. De uma maneirapreferida, referida quantidade de estrutura β cruzada é determinada por meiode ligação de um composto de ligação de estrutura β cruzada, como listadosna Tabela 1-3, de preferência, tPA ou Fator XII, e detectando-se a quantidadede estrutura β cruzada ligada de uma maneira conhecida per se, edeterminando-se se a adição de estruturas β cruzadas adicionais incrementa aresposta imune.

Assim, a invenção proporciona adicionalmente um métodopara determinar a quantidade de estruturas β cruzadas em uma composição de vacina, compreendendo contactar referida composição de vacina com pelomenos um composto de ligação de estrutura β cruzada e relacionando-se aquantidade de estruturas β cruzadas ligadas com a quantidade de estruturas βcruzadas presentes na composição de vacina.

A invenção será ilustrada de forma mais detalhada na seçãoexperimental a seguir.

Exemplos 1-5

Procedimentos experimentais

Ensaio de ativação de plasminogênio, ensaio de ativação de fator XII eensaio de ativação de Fator Xll/precalicreína.

A atividade de plasmina (Plm) foi analisada como descrito1.

Peptídios e proteínas que foram testados quanto a sua capacidadeestimuladora foram usados a 100 μg ml"1, exceto se indicado de outra forma.Ativador de plasminogênio de tipo tissular (tPA [Tissue-type PlasminogenActivator], Actilyse, Boehringer-Ingelheim) e plasminogênio (Plg, plasmahumano em forma purificada por meio de cromatografia de afinidade delisina) foram usados a concentrações de 400 pM e 1,1 ou 0,22 μΜ,respectivamente. Usou-se substrato cromogênico S-2251 (Chromogenix,Instrumentation Laboratory SpA, Milano, Itália) para medir a atividade dePis. Para determinar as propriedades de ativação de tPA de adjuvantes,misturou-se 1600 pM de tPA e 0,22 μΜ de Plg com os seguintes adjuvantes:5 μg/πά de sulfato de dextrano MW = 500 kDa (DXS500k, Pharmacia,Suécia), 20x adjuvante de Freund completo diluído (CFA, DIFCO, Brunswig,#0368-60), 2,1 μg/ml de CpG (Coley Pharmaceutical Group, MA, E.U.A.), 1% vol/vol de suspensão de aluma (Imject, Pierce, Rockford, IL, E.U.A.) com0,5 % vol/vol de plasma humano citrato combinado, ou suspensão a 100μg/ml de brometo de dimetil dioctadecil amônio (DDA, Sigma, D2779).Concentrações são as concentrações finais de adjuvante usadas no ensaio.

Conversão do fator de zimogênio XII (#233490, Calbiochem,EMD Biosciences, Inc., San Diego, CA) a fator proteoliticamente ativo XII(fator XIIa) foi analisada indiretamente por meio de medição da conversão dosubstrato cromogênico Chromozym-PK (Roche Diagnostics, Almere, PaísesBaixos) formado com calicreína por meio de clivagem de precalicreína comfator XIIa. Cromozima-PK foi usada a uma concentração de 0,3 mM. FatorXII, precalicreína derivada de plasma humano (#529583, Calbiochem) e ocofator para a reação, quininogênio com alto peso molecular derivado deplasma humano (#422686, Calbiochem) foram usados a concentrações de 1μg ml"1. O tamponador de ensaio continha HBS (10 mM de HEPES, 4 mM deKCl, 137 mM de NaCl, pH 7,2, 5 μΜ de ZnCl2, 0,1 % m/v de BSA (A7906,Sigma, St. Louis, MO, E.U.A.)). Realizou-se ensaios usando placas demicrotitulação (#2595, Costar, Cambridge, MA, E.U.A. ou ExiqonPeptide/Protein Immobilizer, Vadbaek, Dinamarca). Peptídios e proteínasforam testados quanto a sua capacidade de ativar fator XII. Usou-se 150 μgml"1 de caulim, um ativador estabelecido de fator XII como controle positivo,e solvente (H2O) como controle negativo. A conversão de Cromozima-PK foiregistrada cineticamente a 37°C. Em poços de controle o fator XII foi omitidodas soluções de ensaio.

Alternativamente, mediu-se a ativação de fator XIIdiretamente usando substrato cromogênico S-2222 (Chromogenix). Aativação de fator XII no plasma foi medida usando-se 60 % vol/vol de plasma,diluído com substrato e H2O com ou sem cofator potencial. Auto-ativação defator XII purificado foi medida incubando-se 53 μg ml"1 de fator XIIpurificado em 50 mM de tamponador de Tris-HCl pH 7,5 com 1 mM deEDTA e 0,001 % vol/vol de Triton-Xl00, com S-2222 e H2O, com ou semcofator potencial.

Ligação de tPA agregados de proteína contendo conformação deestrutura β cruzada

A ligação de tPA a agregados similares a amilóide foideterminada com ELISAs. Agregados com conformação de estrutura βcruzada foram imobilizados em Exiqon (Vadbaek, Denmark), Nunc (tiras deamino, n° de catálogo 076901) placas Immobilizer ou placas com alta ligaçãode Greiner microlon (Greiner Bio-One, Países Baixos). A ligação de tPA foidetectada com um anticorpo monoclonal 374b (American Diagnostica, Tebu-Bio, Países Baixos). K2P-tPA, um análogo de tPA que não apresenta odomínio kringle 1 similar a R-EGF N-terminal (Reteplase, Boehringer-Ingelheim, Alemanha), foi usado como controle. A ligação de tPA e K2P-tPAfoi testada na presença de 10 mM de ácido ε-amino capróico (sACA), umanálogo de lisina que elimina a ligação do domínio kringle2 de tPA comradicais lisina expostos com solvente.

Preparação de agregados similares a amilóide e soluções de peptídio decontrole

Preparações amilóides de γ-globulinas humanas forampreparadas como a seguir, γ-globulinas liofilizadas (G4386, Sigma-Aldrich)foram dissolvidas numa relação volumétrica de 1(:)1 de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol e ácido trifluoroacético e secadas subseqüentementesob um fluxo de ar. γ-globulinas secas foram dissolvidas em H2O a umaconcentração final de 1 mg ml"1 e mantidas à temperatura ambiente durante pelo menos três dias. Frações foram armazenadas a -20°C.

Outras bateladas de peptídios com propriedades similares aamilóide foram preparadas como a seguir. Peptídios usados foram o tipoholandês [Dutch] humano Αβ(1-40) (DAEFRHDSGYEVHHQKL VFF AQD VGSNKGAIIGLMVGGW), fragmento amilóide detranstiretina (TTR11, YTIAALLSPYS), peptídio de núcleo amilóide delaminina de cadeia al (2097- 2108) (LAM12, AASIKVAVSADR), núcleonão amiloidogênico de camundongo IAPP(20-29) (mIAPP, SNNLGPVLPP),fragmento não-amilóide FPlO da cadeia α da fibrina humana (148-157)(KRLEVDIDIK)1 e fragmento amilóide de cadeia α da fibrina humana (148-160) com mutação Lysl57Ala (FP13, KRLEVDIDIAIRS) (BB, nãopublicado e 1>2). Αβ, IAPP, FP13 e LAM12 foram desagregados numa misturaa 1:1 (v/v) de álcool de l,l,l,3,3,3-hexafluoro-2-isopropila e ácidotrifluoroacético, secados ao ar e dissolvidos em H2O (Αβ, LAPP, LAMl2: 10mg ml"1, FP13: 1 mg ml"1). Após três dias a 37°C, peptídios foram mantidos àtemperatura ambiente durante duas semanas, antes do armazenamento a 4°C.AB recentemente dissolvido (10 mg ml"1) em álcool de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-isopropila e ácido trifluoroacético foi diluído em H2O antes daimobilização em placas de ELISA. TTRll (15 mg ml"1) foi dissolvido em 10% (v/v) de acetonitrila em água, a pH 2 (HC1), e mantido a 37°C durante trêsdias e, subseqüentemente, à temperatura ambiente durante duas semanas.mIAPP e FPlO foram dissolvidos a uma concentração de 1 mg ml"1 em H2O earmazenados a 4°C. Soluções de peptídio foram testadas quanto à presença deconformação amilóide por meio de Tioflavina T- (ThT, #T3516, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, E.U.A.) ou fluorescência de vermelho Congo comodescrito3"5. Vermelho Congo foi da Aldrich Chemical Company (#86,095-6,Milwaukee, WI, E.U.A.).Fluorescência de tioflavina T

A fluorescência de produtos de adição química depeptídio/proteína similar a amilóide - ThT foi medida como a seguir. Soluçõesde 25 μg ml"1 de preparações de proteína ou peptídio foram preparadas emtamponador de 50 mM de glicina pH 9,0 com 25 μΜ de ThT. A fluorescênciafoi medida a 485 nm com excitação a 435 nm. Sinais de fundo dotamponador, tamponador com ThT e solução de proteína/peptídio sem ThT foram subtraídos medições correspondentes com solução de proteína incubadacom ThT. Regularmente, a fluorescência de Αβ foi usada como um controlepositivo, e a fluorescência de FP10, um fragmento de fibrina não-amilóide1, etamponador foi medido como um controle negativo. A fluorescência foimedida em triplicata em um espectrofotômetro de fluorescência Hitachi F-4500 (Hitachi, Ltd., Tokyo, Japão).

Para determinar a capacidade indutora de fluorescência de ThTapresentada por adjuvantes, plasma humano diluído 80x ou 20x foi incubadocom um adjuvante e subseqüentemente diluído 40 vezes antes de sedeterminar a fluorescência de ThT. Adjuvantes e plasma diluído foramincubados durante 30 min. à temperatura ambiente, antes da diluição emtamponador de ensaio ThT. DEAE-dextrano (Pharmacia, 17-0350-01) foiusado a 5 μg ml"1, DXS500k foi usado a 5 μg ml"1, DDA foi usado a 1 μg ml"1.Specol (7925000, ID-DLO, Países Baixos) foi diluído a uma relação de 5:4com plasma diluído 40x ou IOx. CFA, adjuvante de Freund incompleto (IFA) e suspensão de aluma foram usados numa relação de 1:1 com plasma diluído40x ou IOx. CpG foi usado a uma concentração de 11 μg ml"1. Experimentoscom plasma diluído 80x incluíram uma etapa de agitação com vórtice durantea misturação de plasma diluído com todos os adjuvantes, exceto alume.Alume foi misturado com plasma rolando-se um banco de rolamento durante30 min. Quando se usou plasma diluído 20x, misturou-se plasma diluído pormeio de centrifugação com DXS5 OOk5 DEAE-dextrano, DDA e CpG,enquanto que plasma e adjuvante foram misturados por meio de agitação comvórtice durante 20 s quando se usou CFA5IFA, Specol ou alume. CpG a umaconcentração de 10,7, 21,4 e 42,8 μg ml"1 foi incubado subseqüentementedurante 30 min. à temperatura ambiente ou o/n [de um dia para o outro] a4°C, em um banco de rolamento com 1 mg ml"1 de lisozima ou endostatina.Incremento da fluorescência de ThT de maneira análoga como descrito acima.

Alternativamente, CpG a 21,4 jig ml"1 foi misturado com "1 mgml"1 de lisozima branca de ovo de galinha (Fluka, #62971), albumina de sorobovino (ICN, #160069, fração V), endostatina fragmento XVIII de colágenohumano recombinante (Entremed, Inc, Rockville, MD), γ-globulinashumanas, p2-glicoproteína I de plasma humano (ver abaixo) e β2-glicoproteína I humana recombinante (ver abaixo), e isto foi incubado de umdia para o outro em um dispositivo de rolamento a 4°C, antes de medições defluorescência de ThT. Para tal fim, soluções de proteína a 2 mg ml"1 foramultracentrifugadas durante 1 hora a 100.000*g antes do uso, esubseqüentemente isto foi diluído a 1:1 em tamponador com 42,9 μg ml"1 deCpG. Também se obteve imagens de microscopia eletrônica de transmissão(TEM, transmission electron microscopy) com amostras de CpG, CpG comlisozima, amostras de lisozima. Adicionalmente, lisozima foi incubada com250 μg ml"1 DXS500k e imagens de TEM são registradas com lisozima comDXS5OOk e com DXS500k apenas.

Ativação de tPA por p2-glicoproteína I, ligação de fator XII e tPA a β2-glicoproteína I e ThT e análise de TEM de p2-glicoproteína IPurificação de p2-glicoproteína I (P2GPI) foi realizada deacordo com métodos estabelecidos 6,1. P2GPI humano recombinante foipreparado usando-se células de inseto e purificado como descrito 6. P2GPIderivado de plasma usado em um ELISA de fator XII, o ensaio de ativação dePlg e no ELISA de anticorpo da síndrome de antifosfolipídeo (ver abaixo), foipurificado de plasma humano fresco como descrita7. Alternativamente, p2GPIfoi purificado, ou de plasma humano fresco, ou de plasma congelado usando-se uma coluna de afinidade de anticorpo anti~p2GPI .

Ativação de tPA (Actilyse, Boehringer-Ingelheim) por meio demeio de preparações de P2GPI foi testada em um ensaio de ativação de Plg(ver acima). Cem μg ml"1 de P2GPI de plasma ou P2GPI recombinante foramtestados quanto a sua atividade estimuladora no ensaio de ativação de Plg ecomparou-se com a atividade estimuladora do peptídio FP131.

Ligação de fator XII humano de plasma (Calbiochem) ou detPA humano recombinante a P2GPI purificado de plasma humano, ou a P2GPIhumano recombinante foi testada em um ELISA. Dez μg de fator XII ou tPAem PBS foram aplicados revestindo poços de uma placa de ELISA Costar2595 e recobertos com concentrações seriais de P2GPI. A ligação de P2GPI foiavaliada com anticorpo monoclonal 2B28. Ligação de fator XII a p2GPItambém foi testada usando-se imuno-manchamento. P2GPI (33 μg) purificadode plasma fresco ou de plasma congelado carregado sobre um gel de poli-acrilamida a 7,5 %. Após manchamento numa membrana de nitrocelulose(Schleicher & Schuell), o manchamento foi incubado com anticorpo de fator XII anti-humano policlonal de coelho diluído IOOOx (#233504, Calbiochem)e, após lavagem com imunoglobulinas anti-coelho de porco acoplado comperoxidase diluído 3 OOOx (SWARPO, #P0217, DAKO, Dinamarca).Fluorescência de ThT de P2GPI foi medida como a seguir. P2GPI purificadode plasma humano (400 μg ml"1 de concentração final) foi incubado com ousem 100 μΜ de vesículas de cardiolipina ou 250 μg ml"1 do adjuvanteDXS500k, em 25 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, pH 7,3. No ensaio defluorescência de ThT, fluorescência de B2GPI em tamponador, de cardiolipinaou DXS 5 OOk em tamponador, de tamponador e ThT apenas, e de produtos deadição química de 62GPI-cardiolipina e produtos de adição química dep2GPI-DXS500k, com ou sem ThT5 foi registrado como descrito acima(fluorescência de ThT de seção). Adicionalmente, imagens de microscopiaeletrônica de transmissão (TEM, transmission electron microscopy) foramregistradas com cardiolipina, P2GPI de plasma humano, com ou semcardiolipina, e com P2GPI recombinante, como descrita3.

Interferência com ligação de auto-anticorpos anti-p2GPI de pacientesautoimunes com síndrome de antifosfolipídeo a P2GPI imobilizado comP2GPI recombinante e não de P2GPI derivado de plasma.

Quando P2GPI derivado de plasma é revestido sobre placasELISA hidrofílicas, podem ligar-se auto-anticorpos anti-p2GPI isolados deplasma de pacientes autoimunes com síndrome de antifosfolipídeo9. Paraestudar a influência de co-incubações do P2GPI revestido com os anticorposjuntamente com P2GPI de plasma ou P2GPI recombinante, adicionou-seconcentrações seriais de P2GPI aos anticorpos dos pacientes.Subseqüentemente, determinou-se a ligação dos anticorpos a p2GPI revestido.Análise de estrutura de proteína após exposição a adjuvantes

Proteínas liofilizadas foram dissolvidas em solução salinatamponada com HEPES (HBS, 10 mM de HEPES, 4 mM de KCl, 137 mM deNaCl, pH 7,2) a uma concentração final de 2 mg ml"1. Proteínas foramdissolvidas cuidadosamente em um dispositivo de rolamento à temperaturaambiente, durante 10 min, a 37°C durante 10 min e, novamente, à temperaturaambiente, durante 10 min. Suspensão de caulim (6564, Genfarma, Zaandam,Países Baixos) e soluções de consumo de DXS500k de 500 μg ml"1 forampreparadas em HBS. Albumina (ICN, 160069), lisozima (ICN, 100831), γ-globulinas (G4386, Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Países Baixos), endostatina(EntreMed, Inc., Rockville, MD) e fator XII (Calbiochem, 233490) foramdiluídos a 1:1 em HBS apenas ou em HBS com caulim ou DXS500k.

Plasma citrado combinado humano foi diluído 40x em HBSantes do uso para se obter uma concentração total estimada de proteína de 2mg ml"1, e subseqüentemente diluída 1:1 em tamponador oususpensão/solução de adjuvante. Amostras de controle de proteína e asamostras de proteína-adjuvante foram incubadas de um dia para o outro a 4°Cem um dispositivo de rolamento. Após incubação, 25 μΐ das amostras foram analisados quanto à ligação de ThT (ver acima). Fluorescência do tamponadorou os adjuvantes foi registrada para fins de subtração de fundo. Amilóide-p(l-40) E22Q foi usado como um controle positivo. Alternativamente, proteínasde controle e proteínas incubadas com o adjuvante solúvel DXS500k foramimobilizadas sobre placas ELISA de alta ligação microlon Greiner. Poçosforam bloqueados com reagente de bloqueio [Blocking reagent] (Roche).Hemoglobina glicosada (Hb-AGE) foi imobilizada como um controle positivopara ligação de tPA a um agregado de proteína com propriedades similares aamilóide. Hb-AGE i) aparece como estruturas fibrosas sob o microscópioeletrônico de transmissão (não mostrado), ii) contém uma quantidadeincrementada de estrutura secundária de lâmina β, como determinado comdicroísmo circular por via espectropolarimétrica (não mostrado), e iii) acentuaa fluorescência de vermelho Congo (não mostrado). Amostras foramrecobertas com concentrações seriais de tPA de comprimento pleno ou K2P-tPA, na presença de 10 mM de cACA.

Análise de fluorescência de ThT de estrutura de lisozima após exposiçãoa lipopolissacarídeo

Lipopolissacarídeo (LPS) liga-se a lisozima10, que podeprevenir atividades biológicas de LPS11, e LPS ativa fator XII12. Nós testamosse a ligação de lisozima é acompanhada por uma alteração conformacional naproteína com introdução de estrutura similar a amilóide. Para este fim, 0, 10,25, 100, 200, 600 e 1200 μg ml"1 LPS (de Escherichia coli sorotipo 011:B4,#L2630, lote 104K4109, Sigma-Aldrich) foram incubados de um dia para ooutro a 4°C ou durante 30 min. à temperatura ambiente, em um dispositivo derolamento com 1 mg ml"1 lisozima (ICN, 100831) em HBS.Subseqüentemente, a capacidade de acentuar fluorescência de ThT foideterminada com solução diluída 40x, como descrito acima.

Alternativamente, de maneira análoga ao descrito acima paraCpG, LPS a 600 μg ml"1 foi misturado com 1 mg ml"1 de lisozima, albumina,endostatina, γ-globulinas, p2-glicoproteína I do plasma (p2GPI) e β2ΘΡΙrecombinante, e incubado de um dia para o outro em um dispositivo derolamento a 4°C, antes das medições de fluorescência de ThT. Novamente,soluções de proteína a 2 mg ml"1 foram ultracentrifugadas durante 1 h a100.000*g antes do uso, e diluídas subseqüentemente a 1:1 em tamponadorcom 1200 μg ml'1 de LPS.

Ativação de células monocíticas U937 por meio de LPS e polipeptídioscompreendendo conformação de estrutura β cruzada

Monócitos de U937 foram cultivados em placas de seis poços.Células foram estimuladas com tamponador (controle negativo), 1 μg ml"1 deLPS (controle positivo), 100 μg ml"1 de endostatina amilóide1·3, 260 μg ml"1 dehemoglobina glicada e 260 μg ml"1 de hemoglobina de controle. Após 1 h deestimulação, células foram colocadas sobre gelo. Após lavagem, RNA foiisolado e quantificado espectrofotometricamente. Usou-se quantidadenormalizadas de RNA para 26 ciclos de RT-PCR com iniciador de TNF-ahumano e 18 ciclos de RT-PCR com iniciador 18S ribossômico para fins denormalização. DNA foi analisadas em um gel de agarose a 2 %.Preparação de ovalbumina similar a amilóide, glucagônio humano,Etanercept e albumina de soro murino

Para preparar ovalbumina (OVA) alterada estruturalmente comconformação de estrutura β cruzada amilóide, aqueceu-se OVA purificada(Sigma, A-7641, lote 071k7094) a 85°C. Um mg ml"1 de OVA em 67 mM detamponador NaPi pH 7,0/100 mM de NaCl, foi aquecido durante dois ciclosem recipientes de PCR em um ciclizador térmico PTC-200 (MJ Research,Inc., Waltham, MA, E.U.A.). Em cada ciclo, OVA foi aquecida de 30 a 85°Ca uma taxa de 5°C/min. OVA nativa (nOVA) e OVA desnaturada com calorOVA (dOVA) foram testadas no ensaio de fluorescência de ThT e no ensaiode ativado de Plg. No ensaio de fluorescência e no ensaio de ativação de Plg,testou-se 25 e 100 μg ml"1 de nOVA e dOVA, respectivamente. Obteve-seimagens TEM de nOVA e dOVA para verificar a presença de agregadosgrandes.

Obteve-se albumina de soro murino (MSA, murine serumalbumin) modificada por meio de redução e alquilação. MSA (#126674,Calbiochem) foi dissolvido em 8 M de uréia, 100 mM de Tris-HCl pH 8,2, a10 mg ml"1 de concentração final. Adicionou-se ditiotreitol (DTT) a umaconcentração final de 10 mM. Ar foi substituído por N2 e a solução foiincubada durante 2 h à temperatura ambiente. Em seguida, a solução foitransferida para gelo e adicionou-se iodoacetamida de uma solução IMa umaconcentração final de 20 mM. Após uma incubação de 15 min. sobre gelo,MSA reduzido-alquilado (alquila-MSA) foi diluído a 1 mg ml"1 adicionando-se H2O. Alquila-MSA foi dialisado contra H2O antes do uso. MSA nativo(nMSA) e alquila-MSA foram testados no ensaio de fluorescência de ThT eno ensaio de ativação de Plg. No ensaio de fluorescência-ThT, testou-se 25 μgml"1 de nMSA e alquila-MSA, e no ensaio de ativação de Plg, testou-se 100μg ml"1. A presença de agregados ou fibrilos foi analisada com TEM.

Propriedades similares a amilóide no glucagônio humano(Glucagen, #PW60126, Novo Nordisk, Copenhagen, Dinamarca) foramintroduzidas como a seguir. Glucagônio liofilizado foi dissolvido a 1 mg ml"1em H2O com 10 mM de HCl. A solução foi mantida subseqüentemente a37°C durante 24 h, a 4°C durante 14 dias e novamente a 37°C durante 9 dias.Determinou-se fluorescência de ThT como descrito acima, e comparou-secom glucagônio recentemente dissolvido. Propriedades de ativação de tPA deambos, glucagônio desnaturado com calor e glucagônio dissolvidorecentemente, foram testadas a 50 μg ml"1. Realizou-se análise TEM paraavaliar a presença de grandes estruturas multiméricas.

Imunização de camundongos Balb/c com ovalbumina e ovalbumina similar a amilóide

Camundongos Balb/c fêmeas com de oito a dez semanas devida são imunizados com OVA de acordo com dois regimes de imunização(Central Animal Laboratories, Utrecht University, Países Baixos). Soro pré-imune foi recolhido antes das imunizações. Em um regime, dois grupos decinco camundongos são injetados subcutaneamente cinco dias consecutivospor semana, durante três semanas consecutivas. Doses constituídas de 10 μgOVA nativa ou de OVA desnaturada com calor OVA desnaturada com calorpara cada injeção.

Alternativamente, de acordo com o segundo protocolo, trêsgrupos de cinco camundongos recebem injeção uma vez intraperitonealmentecom doses compreendendo 5 μg de nOVA, 5 μg de OVA ou 5 μg de OVAnativa misturada a 1:1 com adjuvante de Freund completo. A cada semanacoletou-se sangue. Após três semanas, administrou-se uma segunda dose.Usou-se adjuvante de Freund incompleto em lugar de adjuvante de Freundcompleto. Coletou-se sangue após uma semana do início da imunização.Titulações de anticorpos em soros foram determinadas e soros foramanalisados quanto à presença de anticorpos específicos para conformação deestrutura β cruzada. Para tal fim, nOVA foi aplicado revestindo poços deplacas ELISA de 96 poços e isto foi incubado com diluições seriais de soros.Soros dos grupos de cinco camundongos foram combinados antes dasanálises. Placas foram lavadas e subseqüentemente incubadas comimunoglobulinas anti-camundongo de coelho acopladas com peroxidase(RAMPO, P0260, DAKOCytomation, Glostrup, Dinamarca). Placas foramreveladas subseqüentemente com substrato de tetrametilbenzidina (TMB). Areação foi terminada com H2SO4.

Exemplo de resultados de 1-5Exemplo de resultado

Fator XII é ativado por meio de superfícies carregadas negativamente e pormeio de peptídios com conformação de estrutura β cruzada.

Ativação de fator XII com agregados de proteína com conformação deestrutura β-cruzada similar a amilóide

É de conhecimento geral que contactar fator XII comsuperfícies artificiais carregadas negativamente, como caulim e DXS5 resultaem sua ativação. Aqui, nós demonstramos que agregados de peptídios comconformação de estrutura β cruzada também estimulam ativação de fator XII5como medido por meio de conversão de precalicreína a calicreína, que podeconverter substrato cromogênico Cromozima-PK. (Fig. IA, B). Nós tambémmostramos a capacidade de agregados de proteína com conformação deestrutura β cruzada de induzirem auto-ativação de fator XII (Fig. 1C). Paraeste fim, fator XII purificado foi incubado com substrato S-2222 etamponador ou 1 μg ml"1 de DXS500k, 100 μg ml"1 de FP13 K157G, 10 μgml"1 de Αβ(1-40) E22Q e 10 μg ml"1 de Hb-AGE. Todos os três agregadossimilares a amilóide são capazes de induzir auto-ativação de fator XII. FP13K157G e Hb-AGE apresentam uma potência de induzir auto-ativação que ésimilar ao ativador de superfície estabelecido DXS500k, enquanto que apotência do A6( 1 -40) E22Q é um tanto menor.

Exemplo de Resultados 2

Adiuvantes introduzem propriedades similares a amilóide em proteínasAdjuvantes atuam como desnaturadores e induzem conformação deestrutura β cruzada em proteínas

Fator XII e tPA ligam-se a agregados de proteínas ou peptídioscom conformação de estrutura β cruzada similar a amilóide1·3'13 e resultadosnão-publicados B Bouma/MFBG Gebbink. Adicionalmente, a ligação aagregados contendo estrutura β cruzada resulta em ativação de ambas serinaproteases (ver exemplo 1 e \ Adicionalmente, a ligação de ThT aconformações de proteína similares a amilóide resulta em um sinalfluorescente específico. Além disso, a agregação de peptídios e proteínas comconformação de estrutura β cruzada pode resultar finalmente em formação deprecipitados fibrilares ou amorfos que podem ser visualizados commicroscopia eletrônica de transmissão (TEM, transmission electronmicroscopy). Estes métodos foram usados, portanto, para determinar se aexposição de uma proteína ou peptídio a vários adjuvantes que são usados emregimes de vacinação, introduz propriedades similares a amilóide.

Nós teorizamos que pelo menos parte da atividade e funçãoadjuvante pode basear-se na capacidade de introduzir conformação deestrutura β cruzada ou qualquer outra conformação similar a amilóide, seja noantígeno ou em qualquer outra proteína ou peptídio que contacta o adjuvante.Alternativamente, adjuvantes baseados em peptídio ou proteína podemapresentar, eles próprios, propriedades similares a amilóide. A conformaçãode proteína similar a amilóide é então o fator imunogênico que induz uma resposta imune.

Para testar esta hipótese, expôs-se albumina purificada, γ-globulinas, lisozima, fator XII, endostatina e plasma diluído, a caulim ouDXS500k, dois compostos que são bem conhecidos por sua capacidade deativar FXII, mas também são usados como adjuvante. Subseqüentementedeterminou-se a fluorescência de ThT. Fator XII 5 só foi exposto a DXS500k.Após subtração de sinais de fundo, caulim induz um sinal incrementado defluorescência de ThT de 1,6 até 6,6 vezes. DXS500k acentua a fluorescênciade ThT 2,6 vezes (fator XII) a 17,8 vezes (albumina) (Fig. 2A). Em umELISA de tPA e K2P-tPA avaliou-se a ligação a proteínas de controleimobilizadas e misturas de proteínas com DXS500k (Fig. 2A). K2P-tPA nãose ligou a qualquer das proteínas ou misturas de proteína-DXS500k (nãomostrado). Exposição de proteínas ou plasma diluído a DXS500k aumentou aligação de tPA por um fator de 1,3 (albumina) até 10,5 (endostatina), quandocomparado com a ligação de tPA a proteínas que foram incubadas apenas comtamponador. Os dados de fluorescência de ThT e os dados de ligação de tPAindicam que a exposição de proteínas a adjuvantes a caulim e DXS500k induzou acentua propriedades similares a amilóide em proteínas.

Em seguida, avaliou-se o papel da conformação de estrutura βcruzada similar a amilóide na ativação de fator XII. Para este fim, um peptídiode fibrina amilóide FP13 K157G, um ativador efetivo de fator XII (Fig. 1C),foi incubado com fator XII purificado, na presença de substrato de fator XIIativado S2222, e com ou sem ThT (Fig. 2B). Os resultados mostram que ThT,um corante com afinidade estabelecida para agregados similares a amilóideinibe efetivamente a atividade estimuladora de FP13 K157G (Fig. 2B). Istoproporciona evidência direta para um papel da conformação de estrutura βcruzada na ativação de fator XII. Já há bastante tempo, compostos comovidro, caulim, DXS500k, aço cirúrgico, platina e ácido elágico são conhecidospor sua capacidade de induzir atividade de fator XII. A visão corrente é quefator XII é ativado por meio de interação específica da proteína com cargasnegativas. Com base em nossas observações de que vários agregadossimilares a amilóide também são capazes de ativar fator XII, nósconjecturamos que compostos carregados negativamente ativam fator XII deuma maneira indireta, por meio de conformação de estrutura β cruzadaformada em proteínas expostas a superfícies carregadas negativamente.Assim, compostos ativadores de fator XII, incluindo adjuvantes, servem comoagentes desnaturadores que induzem agregação proteína/peptídioacompanhada pela formação de propriedades similares a amilóide. Para testaresta hipótese, nós usamos condições de ensaio durante as quais fator XII não éativado ou só é ativado com dificuldade por DXS500k (Fig. 2C). Nestascondições fator XII pode ser ativado adicionando-se plasma diluído 80x.Ativação é totalmente inibida por meio de introdução de ThT. Estasobservações indicam que as proteínas desnaturadas (plasma) compreendendoconformação de estrutura β cruzada são os verdadeiros ativadores de fatorXII, ao invés da carga negativa propriamente dita. Na Fig. 2D nós mostramosque outro adjuvante adicional, Ca3(PO4)2, é um ativador de fator XII. Quandose usa quantidades suficientes de fator XII no ensaio, não é necessáriaproteína adicional para ativação. Nós também estabelecemos que fator XIIpropriamente dito pode assumir conformação similar a amilóide quandoexposto a adjuvantes (Fig. 2A). Assim, autoativação de fator XII pode serexplicada agora pelo fator de que fator XII contendo estrutura β cruzadadesnaturada e, talvez, agregado, na superfície de uma superfície carregadanegativamente pode servir como a substância ativadora para outras moléculasde fator XII. Além de plasma diluído ou níveis elevados de fator XII nósverificamos que é possível usar albumina e endostatina (Fig. 2E, F). Nemalbumina ou endostatina sozinhas, nem caulim ou DXS500k sozinhos, sãoativadores suficientes de fator XII, enquanto que combinações de cofator deproteína e adjuvante resultam em fator XII e subseqüentemente atividade deprecalicreína. Considerados em conjunto, a ativação de fator XII requer (1)uma superfície desnaturadora e (2) quantidades suficientes de uma proteínaque é capaz de desnaturação nas superfícies proporcionadas.

Nós testamos em seguida se superfícies carregadasnegativamente e adjuvantes também poderiam induzir ativação de tPA. TodosOs adjuvantes DXS500k, CFA, CpG, alume e DDA mostraram ser ativadoresde tPA (Fig. 2G, H). Nas condições testadas, i.e. 1600 pM de tPA, 0,22 μΜPlg, somente alume requer um cofator de proteína adicional (plasma diluído)para sua propriedade de ativação de tPA. Da mesma forma, com os outrosadjuvantes, tPA e/ou Plg propriamente ditos desnaturam-se parcialmente nasuperfície do adjuvante, induzindo com isso a formação da conformação deestrutura β cruzada de amilóide que, subseqüentemente, pode ativar tPA.

Os mesmos adjuvantes, em conjunto com IFA, Specol eDEAE-dextrano, também foram analisados quanto a sua capacidade deinduzir fluorescência de ThT quando incubados com plasma diluído 80x ou20x (Fig. 21 e 2 J, respectivamente). Com plasma diluído 80x, CFA, Specol,DXS500k e CpG induzem fluorescência de ThT, e com plasma diluído 20x,CFA, Specol, DXS500k, CpG, e também IFA induzem fluorescência de ThT5indicativa da formação de agregados de proteína similares a amilóide comconformação de estrutura β cruzada. Adicionalmente, CpG a 10,7, 21,4 e 42,8μg ml"1 incubada de um dia para o outro com 1 mg ml"1 de lisozima acentuoua fluorescência de ThT por um fator de 1,1, 1,2 e 1,4, respectivamente,também indicativo da capacidade desnaturadora de CpG (não mostrado).Adicionalmente, quando 10,4 ou 21,7 μg ml"1 de CpG são incubados com 1mg ml"1 de lisozima ou endostatina durante 30 min. à temperatura ambiente.,observou-se um aumento da fluorescência de ThT de aproximadamente de 8 a7 vezes para lisozima e de 39 a 56 vezes para endostatina, respectivamente(Fig. 2K, L). Adicionalmente, exposição de 1 mg ml"1 de albumina,endostatina, P2GPI do plasma ou P2GPI rec. a 21,4 μg ml"1 CpG resulta emmaior fluorescência de ThT com aproximadamente um fator 3, 10, 2 e 5,respectivamente (Fig. 2M). Com estas condições de ensaio não se observouqualquer efeito com lisozima e γ-globulinas. Análise com TEM de CpG,lisozima e lisozima com CpG, todos após incubação de um dia para o outro,revelou que estão presentes agulhas pequenas na solução de CpG (Fig. 2N) ealguns poucos agregados na solução de lisozima (Fig. 20). Quando CpG elisozima são incubadas conjuntamente, observa-se uma alta densidade deagregados relativamente espessos que parecem ser constituídos de filamentosde precipitados globulares (Fig. 2P). Observa-se uma grande quantidade deredes ainda maiores de filamentos similares de agregados globulares no casode lisozima exposta a agulhas de DXS500k (Fig. 2Q, R). As agulhas nassoluções de CpG e DXS500k desaparecem após exposição a lisozima.

Análises adicionais por meio de espectropolarimetria dedicroísmo circular, espectroscopia infra-vermelho Fourier Transform,microscopia eletrônica de transmissão, estudos de ligação com compostos deligação de conformação de estrutura β cruzada, proteínas e fragmentos deproteínas e estudos de difração de fibras de raios-X poderiam proporcionarinformação adicional sobre a presença de agregados similares a amilóide comconformação de estrutura β cruzada em proteínas e peptídios que são expostosa adjuvantes.

Em princípio, qualquer adjuvante estabelecido ou qualqueradjuvante recentemente descoberto pode ser analisado quanto a suacapacidade desnaturadora, acompanhado da formação de agregados comconformação de estrutura β cruzada, ou quanto à presença de conformação deproteína similar a amilóide no próprio adjuvante. Ensaios de imunização comespécies de tipo selvagem ou espécies transgênicas, ou ensaios imunológicosà base de células com antígenos combinados com adjuvantes desnaturadores,ou com antígeno apenas, ou com antígeno desnaturado compreendendoconformação de estrutura β cruzada revelarão se adjuvantes atuam comoindutores de uma resposta imune em virtude de sua capacidade de induziragregação acompanhada com conformação de estrutura β cruzada. Talvezadjuvantes não sejam estritamente necessários, ou seja, um antígeno comconformação de estrutura β cruzada pode ser por si só imunogênico. Paratestar esta visão, é possível realizar uma comparação entre imunizações com1) antígenos nativos, com 2) antígenos com conformação de estrutura βcruzada ou com um adjuvante que induz ou compreende conformação deestrutura β cruzada, e com 3) antígenos nativos combinados com umadjuvante convencional, como CFA, Specol, alume, LPS ou derivados dosmesmos, e CpG. Ensaios de imunização com camundongos ou com ensaios àbase de células in vitro podem ser realizados, por exemplo, com 1) OVAnativa, glucagônio, albumina ou β2ΟΡΙ do plasma, 2) OVA desnaturada comcalor, glucagônio desnaturado com calor/ácido, albumina desnaturada comcalor, albumina alquilada, β2ΰΡΙ produzido recombinantemente, β2βΡΙ doplasma em conjunto com DXS500k ou cardiolipina, e 3) CFA com OVAnativa, glucagônio, albumina ou β2ΘΡΙ. Estes experimentos tambémcontribuirão para a compreensão do mecanismo de trabalho da classe deadjuvantes similares a CpG-Iike.

Estes adjuvantes transmitem sua atividade imunogênica viareceptor similar a toll 9, via um mecanismo pouco compreendido. A interaçãodireta entre CpG e TLR9 ainda não foi demonstrada. Nossos resultadossugerem que é necessária uma proteína desnaturada. Esta proteína édesnaturada, de preferência, com CpG. O papel da conformação de estrutura βcruzada na potencialização da imunogenicidade com CpG mas pode serfacilmente testada por uma pessoa versada na arte. Se verdadeiro, aimunopotencialização de CpG deveria ser diminuída na presença de uminibidor de formação de estrutura β cruzada ou por um inibidor da interaçãoda conformação de estrutura β cruzada com uma de suas moléculas-alvo quetransduz o sinal imunogênico. Um inibidor do tipo referido poderia serqualquer composto de ligação de estrutura β cruzada, como ThT, tPA ou umequivalente do mesmo, um anticorpo contra a conformação relevante deestrutura β cruzada ou um anticorpo contra o receptor-alvo. O receptor-alvopoderia ser qualquer um dos receptores de multi-ligantes que se ligam oupossivelmente ligam proteínas compreendendo estrutura β cruzada, comotPA, fator XII, fibronectina, ativador de fator de crescimento de hepatótitos,CD 14, proteína similar a receptor de lipoproteína de baixa densidade, CD36,receptores de aglutinadores A, receptores de aglutinadores B, receptoressimilares a toll e receptores para produtos finais de glicosamento avançado.

Exemplo de Resultados 3

A relação entre a estrutura de B2-Slicoproteina I. o antígeno-alvo em pacientescom a síndrome de antifosfolipídeo. e antigenicidade.

A síndrome de antifosfolipídeo e |$2-glicoproteína I alteradaconformacionalmenteA síndrome do [anticorpo] antifosfolipídeo (APS, anti-phospolipid syndromé) é uma doença autoimune caracterizada pela presençade auto-anticorpos anti-p2-glicoproteína I. Duas das principais preocupaçõesclínicas da APS são a propensão de auto-anticorpos induzirem trombose e orisco de ressorção fetal. Sabe-se pouco acerca do início da doença autoimune.Trabalho recente demonstrou a necessidade de alterações conformacionais noantígeno principal na APS, p2-glicoproteína I (P2GPI), antes que o epítopoinicialmente oculto para auto-anticorpos seja exposto14. A ligação de P2GPInativo a determinados tipos de placas ELISA emula a exposição dos epítoposcrípticos que estão aparentemente presentes em pacientes com APSpacientes14. Demonstrou-se que auto-anticorpos anti-p2GPI não se ligam aP2GPI globular em solução, mas somente quando P2GPI foi imobilizado emdeterminados tipos de placas ELISA plates14. A forma globular (nativa) daproteína não é imunogênica, mas requer a adição de cardiolipina, célulasapoptósicas ou modificação por oxidação15"16. Assim, a geração de auto-anticorpos parece ser disparada por, e elicitada contra, uma forma de P2GPIalterada conformacionalmente. Propôs-se previamente que a indução de umaresposta imune adaptativa requer um assim-chamado sinal de "perigo" que,entre outros efeitos estimula a apresentação de antígeno e liberação decitocina por células dendríticas 17. Os resultados a seguir implicam em que acardiolipina induz conformação de estrutura p cruzada em P2GPI que, então,serve como um sinal de perigo. Em analogia, outros fosfolippideos carregadosnegativamente, ou estruturas que contêm lipídeos carregados negativamente,como liposomas ou células apoptósicas, ou outros indutores de conformaçãode estrutura p cruzada, incluindo LPS, CpG que apresentam propriedadesindutoras de conformação de estrutura P cruzada, podem ser imunogênicosdevido ao fato de que, pelo menos em parte, eles podem induzir conformaçãode estrutura p cruzada.

Fator XII e tPA ligam-se a P2GPI recombinante e a β2βΡΙ purificado deplasma congelado, mas não a P2GPI purificado de P2GPI de plasmafresco.

P2GPI recombinante, mas não P2GPI purificado de plasmafresco estimula conversão mediada-com-tPA de Plg a plasmina, conformemedido como a conversão do substrato cromogênico específico para plasminaS-2251 (Fig. 3A). Usando um ELISA mostra-se que o tPA e fator XII ligam-se a P2GPI recombinante, mas não se ligam a P2GPI purificado de plasmahumano fresco (Fig. 3B, C). p2GPI recombinante liga-se a fator XII com umakD de 20 nM (Fig. 3C) e a tPA com uma kD de 51 nM (Fig. 3B).Adicionalmente, P2GPI purificado de plasma que foi congelado a -20°C esubseqüentemente descongelado, fator XII co-elui da coluna de afinidade deanticorpo anti-p2GPI, como mostrado em Western blot após incubação do blotcom anticorpo anti-fator XII (Fig. 3D). Isto sugere que p2GPI redobra emuma conformação contendo estrutura P cruzada ao congelar. Na Figura 3E,mostra-se o efeito inibidor de P2GPI recombinante sobre a ligação de auto-anticorpos anti-p2GPI isolados de pacientes com APS a P2GPI imobilizado.Observa-se que p2GPI derivado de plasma em solução dificilmente apresentaum efeito sobre a ligação de anticorpo sobre p2GPI imobilizado. Fig. 3Fmostra que a exposição de P2GPI a cardiolipina ou DXS500k introduz umsinal incrementado de fluorescência de ThT, indicativo de uma alteraçãoconformacional na P2GPI, acompanhado da formação de conformação deestrutura p cruzada. Novamente, P2GPI recombinante já forneceu inicialmenteum maior sinal de fluorescência de ThT do que P2GPI nativa purificada deplasma. Adicionalmente, exposição de p2GPI do plasma e p2GPI rec. aadjuvantes/desnaturadores LPS ou CpG também induz um aumento dafluorescência de ThT, que é maior com P2GPI rec. do que com p2GPI doplasma para ambos os adjuvantes (Fig. 2M e Fig. 4C). Estes dados não sóindicam que P2GPI compreende mais conformação de estrutura P cruzada doque p2GPI do plasma, mas que P2GPI recombinante também assume maisfacilmente esta conformação quanto contactado com vários adjuvantes esuperfícies, i.e. cardiolipina, DXS500k, LPS e CpG. Na figura 3G mostrou-seque a exposição de P2GPI a cardiolipina, imobilizada nos poços de uma placaELISA, torna P2GPI com capacidade de ligação de tPA. A ligação de P2GPIdiretamente na placa ELISA resulta em menos ligação de tPA. Estasobservações também mostram que a cardiolipina tem um efeito desnaturador,induzindo com isso conformação similar a amilóide na P2GPI, necessária paraligação de tPA. Estas observações, em conjunto com a observação de queexposição de P2GPI a vesículas de cardiolipina induziu capacidade de ligaçãode ThT (Fig. 3F), mostram que exposição de P2GPI a uma superfíciedesnaturadora induz formação de conformação de estrutura p cruzada similara amilóide.

Epítopos para auto-anticorpos são expostos especificamente emconformações não-nativas de P2GPI compreendendo conformação deestrutura β cruzada

Figura 3 mostra que preparações de P2GPI reagem commarcadores de ThT de estrutura p cruzada amilóide, tPA e fator XII.Adicionalmente, exposição de 62GPI a cardiolipina introduz capacidade deligação de tPA (Fig. 3G). Adicionalmente, observa-se grandes estruturasfibrilares em imagens TEM de B2GPI do plasma em contato com cardiolipina(Fig. 3H, imagem 2 e 3). Vesículas pequenas de cardiolipina parecem serligadas à p2GPI fibrilar. Imagens de P2GPI do plasma apenas (Fig. 3H,imagem 1) ou cardiolipina apenas (não mostrado) revelaram que não estãopresentes ultra-estruturas visíveis. Em contraste, é possível observaragregados não-fibrilares e fibrilos relativamente finos e ondulados emimagens de P2GPI recombinante (Fig. 3H, imagem 4). Esta observaçãomostra que exposição de P2GPI a cardiolipina e expressão e purificação dep2GPI recombinante resultam em uma estrutura multimérica alterada deP2GPI, quando comparado com a estrutura monomérica observada comcristalografia de raios-X18. As preparações P2GPI com conformação deestrutura β cruzada expressam epítopos que são reconhecidos por auto-anticorpos anti-p2GPI isolados do plasma de pacientes com APS.

Adicionalmente, exposição de P2GPI a cardiolipina ou DXS500k induz umamaior fluorescência quando se adiciona ThT, indicativo da formação deconformação de estrutura β cruzada quando P2GPI contacta uma superfíciecarregada negativamente. Interessante observar que se verificou previamenteque exposição de P2GPI a cardiolipina é um pré-requisito para a detecção deanticorpos anti-p2GPI em soros de camundongos imunizados15. Estascombinações combinadas apontam para um papel para alteraçõesconformacionais em P2GPI nativa, necessário para expor novos sítiosimunogênicos. Nossos resultados indicam que o elemento de estrutura Pcruzada é parte deste epítopo. Nós predizemos que a conformação de estruturaP cruzada pode ser formada de maneira relativamente fácil por um ou maisdos cinco domínios da molécula de P2GPI estendida . Cada domíniocompreende pelo menos uma lâmina β que pode funcionar como umasemente para redobramento local em conformação de estrutura β cruzada.Uma pessoa versada na arte é agora capaz de testar a hipótese de que aconformação de estrutura β cruzada é o essencial para elicitar anticorpos anti-p2GPI. Estudos de imunização com p2GPI nativa e P2GPI alteradaconformacionalmente, com ou sem conformação de estrutura P cruzada,podem ser realizados na presença ou ausência de um composto, incluindoThT, tPA, RAGE, CD36, anticorpos anti-estrutura p cruzada ou umequivalente funcional dos mesmos, que inibe a atividade de conformação deestrutura p cruzada. Alternativamente, é possível realizar estudos in vitro comcélulas apresentadoras de antígeno (APC, antigen presenting cells), incluindocélulas dendríticas (DC). Fontes de P2GPI alterada conformacionalmente sãoP2GPI recombinante, ou P2GPI exposto a qualquer superfície desnaturadora,p. ex. plásticos, cardiolipina, DXS500k e potencialmente outros adjuvantes.Adicionalmente, β2ΘΡΙ alterada estruturalmente pode ser obtida por meio dequalquer outro tratamento químico ou físico, p. ex. aquecimento, alterações depH, redução-alquilação. Uma pessoa versada na arte é capaz de projetar erealizar ensaios celulares in vitro e modelos de camundongo in vivo para seobter evidência adicional para o papel da conformação de estrutura β cruzadana autoimunidade (ver abaixo). Para estabelecer se o elemento de estrutura βcruzada é essencial para elicitar uma resposta imune ou para ligação deanticorpo, é possível realizar estudos de inibição com qualquer composto deligação de estrutura β cruzada que pode competir com a ligação de anticorposou que pode prevenir uma resposta imune. Nossas observações indicam que aconformação de estrutura β cruzada é necessária para a indução de umaresposta imune adaptativa. A conformação de estrutura β cruzada tambémpoderia ser parte de um epítopo reconhecido por anticorpos autoimunes. Combase em nossos estudos pode-se esperar que outras doenças e complicações,em que auto-anticorpos estão implicados, sejam mediadas por uma proteínacompreendendo conformação de estrutura β cruzada. Adicionalmente àsíndrome do [anticorpo] antifosfolipídeo (APS, anti-phospolipid syndrome)referidas condições incluem, embora sem limitação, lupus eritematososistêmico (SLE, systemic lupus erythematosus), diabetes de tipo I, aplasia decélulas vermelhas e a formação de anticorpos inibidores em pacientes comhemofilia tratados com fator VIII. Uma pessoa versada na arte é agora capazde selecionar pacientes de hemofilia com auto-anticorpos anti-fator VIIIquanto à presença de anticorpos em seu plasma que reconhecem aconformação de estrutura β cruzada. Uma análise mais detalhada revelará seanticorpos de ligação de estrutura β cruzada putativa se ligam especificamente(em parte) à conformação de estrutura β cruzada no antígeno, ou se osanticorpos se ligam à conformação de estrutura β cruzada presente emqualquer proteína não-relacionada.

Exemplo de Resultados 4Incubação de monócitos U937 cultivados com proteínas compreendendoconformação de estrutura β cruzada resulta em regulação-para-cima de níveisde mRNA de fator α de necrose de tecido, e LPS induz a formação deestruturas similares a amilóide na lisozima.

Compostos ricos em estrutura β cruzada induzem expressão de RNA deTNFa em monócitos

Após exposição de monócitos U937 a LPS ou endostatinaamilóide rica em estrutura β cruzada ou Hb-AGE, DNA de TNFa é obtidoapós RT-PCR com RNA isolado (Fig. 4A). Hemoglobina de controleefetivamente induz regulação-para-cima de RNA de TNFa na mesmaextensão, mas não excede aproximadamente 30 % dos valores obtidos apósestimulação de Hb glicosada ou endostina amilóide. Quantidades de DNA deTNFa obtidas após RT-PCR com RNA de monócitos são normalizadas paraas quantidades de DNA de 18S ribossômico presentes nas amostras correspondentes.

LPS atua como um desnaturador e induz conformação de estrutura βcruzada

Após exposição de 1 mg ml"1 lisozima a 10, 25, 100, 200, 600e 1200 μg ml"1 de LPS em solução, fluorescência de ThT é acentuada 1,1, 1,3,1,6, 2,3, 5,7 e 13,1 vezes respectivamente quando comparado com lisozimaincubada em tamponador apenas, indicativo da formação de conformaçãosimilar a amilóide com estrutura β cruzada (Fig. 4B). Quando lisozima eendostatina são expostas a 200, 400 e 600 μg ml"1 de LPS, fluorescência deThT é acentuada aproximadamente 5, 11 e 18 vezes e 8, 20 e 26 vezes,respectivamente (Fig. 2K, L). Alternativamente, de maneira similar ao que seobserva com CpG (Fig. 2M), quando 1 mg ml"1 de lisozima, albumina, γ-globulinas, endostatina, B2GPI do plasma ou p2GPI rec. é exposto a 600 μgml"1 de LPS, fluorescência de ThT é acentuada aproximadamente 10, 3, 2, 10,2 e 4 vezes, respectivamente (Fig. 4C). Diagnóstico por imagem adicionalcom TEM poderia verter mais luz sobre se as proteínas expostas a LPSrearranjaram sua conformação em fibrilos similares a amilóide ou em outrosagregados visíveis. Os dados de incremento da fluorescência de ThT mostramque LPS atua como um desnaturador que converte uma proteína inicialmenteglobular em um polipeptídio similar a amilóide. Já se demonstroupreviamente que lisozima pode ligar-se a LPS purificado e a adjuvante deFreund completo, compreendendo fragmentos de parede celular bacterianacom LPS, acompanhado de alterações estruturais na proteína.

Adicionalmente, Morrison & Cochrane12 mostraram que LPS pode ativarpotencialmente fator XII, que corrobora nossa visão de que LPS atua comoum desnaturador de proteína que, por sua vez, introduz propriedadesativadoras de fator XII (ver também Fig. 2E, F). Nossos resultados revelamagora que a ligação de LPS induz conformação de estrutura β cruzada e queativação de fator XII com LPS é mediada por proteína com conformação deestrutura β cruzada, proporcionando uma explicação para estas observaçõespreviamente reportadas.

Discussão: Proteínas ricas em estrutura β cruzada, similares a LPS,induzem regulação-para-cima de TNFa em monócitos, e LPS induzconformação de estrutura β cruzada amilóide em lisozima

Estimulação de monócitos U937 com proteínas quecompreendem conformação de estrutura β cruzada como parte de seudobramento terciário/quaternário resulta em expressão de RNA de TNFa,similar à regulação-para-cima de RNA de TNFa por LPS. A observação deque hemoglobina de controle efetivamente influenciou níveis de RNA deTNFa apenas até certo ponto indica que a presença de conformação deestrutura β cruzada é um fator importante para a regulação-para-cimaobservada. Como nós mostramos aqui que LPS atua como um agente indutorde conformação de estrutura β cruzada, nós concluímos que a ativação decélulas, incluindo células do sistema imunológico, por LPS é induzida, pelomenos em parte, por uma proteína alterada conformacionalmentecompreendendo conformação de estrutura β cruzada. Assim, LPS atua comouma superfície desnaturadora ou adjuvante que induz formação deconformação de estrutura β cruzada em uma proteína que está presente nasuperfície celular ou no ambiente celular, similar à nossa observação de queLPS introduz conformação de estrutura β cruzada similar a amilóide nalisozima. A conformação formada de estrutura β cruzada é então umestimulador da resposta imune. Nossos resultados, hipóteses e conclusões sãocorroborados pelas observações na literatura de que a atividade endotóxica deLPS é incrementada na presença de albumina ou hemoglobina. Além disso,LPS induz formação de lâminas β em albumina, um elemento estrutural queestá ausente no dobramento da albumina nativa e que sugere que aconformação de estrutura β cruzada seja formada19. Respostas similares decélulas microgliais no sentido de LPS e Αβ agregados são reportadas .

Nossas observações fornecem um apoio lógico para estas e outrasobservações adicionais recentes de que o receptor de LPS CD 14 estáenvolvido na fagocitose de Αβ 21-22. À luz de nossos resultados, talvez CD14interaja com uma proteína desnaturada associada com LPS e com Αβ via umaconformação de proteína não-nativa similar nos ligantes. Isto poderia sugerirque CD 14 é um possível membro da classe de proteínas de ligação deestrutura β cruzada similar a amilóide 3. Para uma pessoa versada na arte,estas observações proporcionam o meio de realizar ensaios celulares in vitroadicionais que corroboram o papel da conformação de estrutura β cruzadasobre a ativação do sistema imunológico. Uma pessoa versada na arte podeagora selecionar os ensaios celulares apropriados, para reunir compreensãosobre o tipo de resposta imune induzida por conformação de estrutura βcruzada. Por exemplo, é possível testar a potência de ativar o sistemaimunológico adaptativo e/ou inato do hospedeiro e induzir uma respostaimune celular e/ou humoral. Mesmo num nivel mais detalhado, o tipo deresposta, i.e. um tipo de resposta de auxiliar 1 de célula T que resulta naelicitação de imunoglobulinas da subclasse IgG2a, ou um tipo de resposta detipo 2 de auxiliar de célula T resultando primariamente na elicitação de IgGl,ou um tipo de resposta regulador de células T. Experimentos de bloqueiousando compostos de ligação de estrutura β cruzada e proteínas, p. ex. ThT,vermelho Congo, Tioflavina S (ThS), tPA e fragmentos dos mesmos, fatorXII e fragmentos dos mesmos, hibridomas anti-estrutura β cruzada, podemproporcionar evidência adicional para o papel do elemento de estrutura βcruzada na ativação do sistema imunológico. Adicionalmente, é possível usarensaios celulares para estudar qual aspecto da conformação de estrutura βcruzada apresenta a natureza imunogênica, i.e. oligômeros solúveis, fibrilos,ou outros aspectos. Também é possível usar ensaios imunológicos celularespara selecionar adjuvantes estabelecidos e novos quanto a sua capacidade deinduzir uma resposta imune, mediada pela conformação de estrutura βcruzada, no próprio adjuvante ou induzido pelos adjuvantes (ver Fig. 2).Novamente, pré-tratamento de misturas de adjuvantes/proteína com proteínasou compostos de ligação de estrutura β cruzada potencialmenteneutralizadores pode prevenir uma resposta imune. Compreensão adicionalsobre o papel da capacidade desnaturadora do LPS na indução de umaresposta imune pode provir de estudos comparativos em que variantesendotóxicas ativas e inativas de LPS são testadas quanto a sua capacidade deintroduzir conformação de estrutura β cruzada em proteínas e quanto aosefeitos sobre o sistema imunológico. Exemplos de LPS endotóxico inativo sãoLPS de Rhodobacter capsulatus e lipídeo A tetra- ou penta-acilado 19Adicionalmente, é possível estudar o efeito de Polymyxin B, que inibe aatividade endotóxica de LPS, sobre as propriedades indutoras de estrutura βcruzada de LPS. Alternativamente, Polimixina B pode atuar diretamente sobreproteínas contendo estrutura β cruzada. Nesse caso, adiciona-se polimixina Bà lista de compostos de ligação de estrutura β cruzada.Nossos resultados indicam que a os efeitos potencializadoresde LPS, quando é usado como um adjuvante em experimentos de imunização,são atribuídos, pelo menos em parte, à introdução de conformação deestrutura β cruzada imunogênica no antígeno administrado, em um proteínaco-administrada ou em endógena ou conjunto de proteínas endógenas. Prediz-se agora que a determinação da(s) proteína(s) endógena(s) que formampreferivelmente a conformação de estrutura β cruzada quando exposta a LPSproporcionará uma ferramenta para o projeto de regimes de imunização maisseguros. Prediz-se que LPS pode ser reduzido ou omitido quando estasproteínas endógenas ou conjunto de proteínas desnaturadas, em que aconformação de estrutura β cruzada é introduzida, é usado diretamente comoo adjuvante. Para uma pessoa versada na arte está claro que estes resultados econclusões também podem ser obtidos com outros adjuvantes, incluindo, massem limitação CpG ou Alume.

Exemplo de Resultados 5

Imunização de camundongos na ausência de adjuvante com polipeptídioscompreendendo conformação de estrutura β cruzada.

Preparação de antígenos com conformação de estrutura β cruzada

Os dados no Exemplo 2 e Exemplo 4 mostram que váriosadjuvantes usados em regimes de vacinação animal e humana induzem aconformação de estrutura β cruzada em proteínas. A presença de conformaçãode estrutura β cruzada em vários terapêuticos à base de proteína induzimunogenicidade. Isto sugere que a imunogenicidade pode ser atribuída, pelomenos em parte, à estrutura β cruzada compreendendo proteínas oupolipeptídios. Isto nos instou a preparar ensaios de imunização comcompostos ricos em conformação de estrutura β cruzada, sem adição de umadjuvante. Com base nos resultados descritos acima prediz-se que a presençada Oconformação de estrutura β cruzada imunogênica é essencial e até mesmosuficiente para induzir uma resposta imune, como observado, por exemplo,com vários farmacêuticos à base de proteína que não contêm adjuvante.Efetivamente, obtivemos titulações superiores de anticorpos quando nósusamos OVA de frango com conformação de estrutura β cruzada (dOVA) emcomparação com OVA sem conformação de estrutura β cruzada (nOVA) emexperimentos de imunização (Fig. 5L). Também se obteve titulações comOVA sem conformação de estrutura β cruzada. Como a formação de estruturaβ cruzada em OVA pode ocorrer facilmente, prediz-se que a geração deanticorpos após imunização com nOVA também é mediada com moléculascom conformação de estrutura β cruzada. Neste caso, a conformação deestrutura β cruzada é induzida durante ou após a injeção subcutânea. Estesexperimentos estabelecem que a presença da conformação de estrutura βcruzada em uma proteína pode induzir imunogenicidade que pode ser nociva.No caso de um terapêutico de proteína, a remoção ou diminuição do teor deestrutura β cruzada do terapêutico auxiliará a se obter uma droga mais segura.

Obteve-se OVA similar a amilóide por meio de desnaturaçãocom calor a 85°C (Fig. 5A, Β, I, Κ). A presença da conformação de estruturaβ cruzada foi estabelecida com fluorescência de ThT e ensaios de ativação dePlg e por meio de diagnóstico por imagem TEM. As estruturas fibrilares comcomprimento de pelo menos até 2 μιη, como observado nas imagens TEM,provavelmente não são as únicas montagens de OVA com a presença deconformação de estrutura β cruzada, como se conclui da observação de quefiltração através de um filtro de 0,2 μπι não reduz o incremento defluorescência de ThT. Uma pessoa versada na arte pode realizar experimentossimilares com soluções de consumo de albumina de soro murino, glucagôniohumano e soluções de consumo de Etanercept com a conformação deestrutura β cruzada, como aquelas descritas abaixo (Fig. 5).

O dobramento de proteína similar a amilóide foi induzido naalbumina por meio de desnaturação com calor a 85°C e por meio de redução ealquilação de ligações dissulfeto (Fig. 5A-D). Nós também observamos quealbumina nativa incrementou fluorescência de ThT até certo grau, mas istonão foi refletido por meio de estimulação de ativação de tPA. Emboraalbumina desnaturada com calor e albumina alquilada acentuem fluorescênciade ThT em grau similar, elas diferem quanto ao potencial ativador de tPA.

Isto sugere que tPA e ThT interagem com aspectos distintos da conformaçãode estrutura β cruzada. Nós observamos previamente que vermelho Congo,outro corante específico para amilóide, pode competir eficientemente pelaligação de tPA a agregados similares a amilóide em ELISAs, enquanto queThT não inibiu completamente ligação de tPA (pedido de patente WO2004/004698).

Conformação de estrutura β cruzada similar a amilóide foiinduzida em glucagônio por meio de desnaturação com calor a 37°C a pHbaixo em tamponador de HCl (Fig. 5E, F, J). Desta maneira, obteve-se umpotente ativador de tPA que incrementou fluorescência de ThT em grandeparte. Adicionalmente, formam-se fibrilos longos e não-ramificados dobrados,como visualizado em imagens TEM (Fig. 5J). E digno de nota que, emconcentrações elevadas de glucagônio, glucagônio nativo também apresentaalgum potencial de ativação de tPA, indicativo da presença de umadeterminada quantidade de proteína rica em conformação de estrutura β cruzada.

Etanercept alquilado não ativa tPA, enquanto que Etanerceptdesnaturado com calor apresenta potencial similar ativador de tPA como γ-globulinas amilóides (Fig. 5G). Após desnaturação com calor, Etanercepttambém induz eficientemente fluorescência de ThT incrementada (Fig. 5H).Etanercept nativo induz tanto um pouco de ativação de tPA e proporcionoualgum incremento de fluorescência de ThT.

Para imunizações de camundongos Balb/c, usou-se nOVA,dOVA e nOVA com adjuvante de Freund completo. E possível realizaranálises e imunizações similares com n-MSA, MSA desnaturado com calor,alquila-MSA, glucagônio nativo, glucagônio desnaturado com calor,Etanercept nativo, Etanercept desnaturado, P2GPI nativo, alquila-p2GPI,P2GPI desnaturado, p2GPI recombinante, P2GPI dimérico23, P2GPI juntamentecom CpG, B2GPI juntamente com cardiolipina e P2GPI juntamente comDXS500k. Adicionalmente, a análise das diversas titulações pode apontarpara protocolos de imunização aperfeiçoados com relação à dose, número deinjeções, via de injeção, pré-tratamento do antígeno para introduzirconformação de estrutura P cruzada mais imunogênica.

Por exemplo, 25 μg de Etanercept, Etanercept desnaturadocom calor, glucagônio e glucagônio desnaturado com calor/ácido serãoadministrados subcutaneamente sem adjuvante no dia 0 e no dia 18. Sanguepara determinações de titulação será coletado da veia safena no dia -3, dia 18e dia 25. P2GPI nativa (15 μ§), P2GPI reduzida/alquilada (15 μ§) e P2GPInativa (15 μg) com 1,35 μg de cardiolipina serão administradasintravenosamente no dia 0, dia 4, dia 14 e dia 18. A P2GPI e cardiolipina serãomisturadas e incubadas a 400 μg ml"1 e concentrações finais de 25 μΜ.Sangue será coletado no dia -3, dia 9, dia 25. Inicialmente, titulações serãodeterminadas com ELISA1S usando placas revestidas com as proteínas nativas.

Concluímos, de nossas análises, que P2GPI com cardiolipina,dOVA, alquila-MSA, glucagônio desnaturado com calor/ácido e Etanerceptdesnaturado com calor compreendem a conformação de estrutura P cruzada.A presença da conformação de estrutura P cruzada pode ser estabelecidaadicionalmente por meio de análises de espectropolarimetria de dicroísmocircular, experimentos de difração de fibras de raios-X, espectroscopiainfravermelha de transformação de Fourier, birrefringência/fluorescência dovermelho Congo, ligação de tPA, ativação de fator XII e ligação, e mais.Avaliação da imunogenicidade de compostos com conformação deestrutura β cruzada com um ensaio de 'sangue integral'

Uma maneira de avaliar se uma proteína com conformação deestrutura β cruzada ativa células do sistema imunológico é por meio do uso deum ensaio de 'sangue integral'. Para este fim, no dia 1 adiciona-se sangue-EDTA humano recentemente coletado numa relação a 1:1 com meio RPMI-1640 (tamponado com HEPES, com L-glutamina, Gibco, Invitrogen, Breda,Países Baixos), que é pré-aquecido a 37°C. Subseqüentemente é possíveladicionar proteínas compreendendo conformação de estrutura β cruzada. Depreferência, inclui-se um controle positivo, de preferência, LPS. Um inibidorque pode ser usado para LPS é Polimixina B, concentração final de 5 μg ml"1.Polipeptídios convencionais ricos em conformação de estrutura β cruzada quepodem ser testados são Αβ, γ-globulinas amilóides, proteínas glicosadas, FP13, OVA desnaturada com calor e outros. Controles negativos são γ-globulinas nativas, albumina nativa, Hb nativa, Αβ ou FP13 recentementedissolvida, OVA nativa. Como um controle, todas as amostras de proteínapodem ser testadas na ausência ou presença de 5 μg ml"1 de Polimixina B paraexcluir efeitos observados devido a contaminações com endotoxina.Adicionalmente, proteínas nativas, sozinhas ou pré-expostas a adjuvantesdesnaturadores, p. ex. LPS, DXS500K, caulim e CpG, ou a novos adjuvantes,podem ser testadas quanto à atividade imunogênica. O sangue e o meiodeveriam ser misturados cuidadosamente e incubados de um dia para o outroem um incubador com CO2 com tampas que permitem a entrada de CO2. Nodia 2, meio será recolhido após centrifugação durante 10 minutos a 1.000*g, àtemperatura ambiente. O pellet de células será armazenado congelado. O meioserá centrifugado novamente durante 20' a 2.000*g, à temperatura ambiente.Sobrenadante será analisado empregando-se ELISAs para concentrações demarcadores de uma resposta imune, p. ex. fator-α de necrose de tecido.Quando controles positivos e negativos são estabelecida e também uma curvade titulação confiável, é possível testar qualquer solução quanto à carga deestrutura β cruzada com relação a concentrações de marcadores paraimunogenicidade. Adicionalmente, é possível testar inibidores putativos daresposta imune. Por exemplo, domínios de dedos, ThT, vermelho Congo,sRAGE e tPA podem prevenir uma resposta imune quando da adição asoluções terapêuticas de proteína compreendendo agregados.Imunogenicidade de proteínas com estrutura β cruzada

A presente invenção divulga que proteínas contendoconformação de estrutura β cruzada são imunogênicas. Para uma pessoaversada na arte está evidente agora que é possível obter evidência adicionalque corrobora o papel proposto para a conformação de estrutura β cruzada naimunogenicidade. Por exemplo, a imunogenicidade de proteínas, incluindoOVA, β2ΟΡΙ e/ou terapêuticos à base de proteína, como fator α de necrose detumor, testa-se glucagônio ou Etanercept. De preferência, a imunogenicidadedo estado nativo destas proteínas é comparado com um estado em que seintroduziu a conformação de estrutura β cruzada. De preferência, aconformação de estrutura β cruzada é induzida por meio de aquecimento,oxidação, glicosamento ou tratamento com um adjuvante, comooligonucleotídeos de CpG, LPS ou cardiolipina. O conteúdo de conformaçãode estrutura β cruzada é, de preferência, medida por meio de ThT, vermelhoCongo, TEM, cromatografia de exclusão de tamanho, atividade de ativação detPA, e ou ligação de qualquer outra proteína de ligação de estrutura β cruzadalistada nas Tabelas 1-3. A imunogenicidade de referida proteína é testadas, depreferência, in vitro e in vivo. Para uma pessoa versada na arte, vários ensaiosin vitro são preferíveis para determinar a imunogenicidade de referidaproteína.

De preferência, a ativação de células apresentando antígeno(APC, antigen presenting cells), de preferência, células dendríticas (DC) étestada após tratamento com referida proteína compreendendo estrutura βcruzada ou nativa. De preferência, isto é realizada de acordo com protocolosestabelecidos. Ativação de células apresentando antígeno pode serdeterminada por meio de análise com Separador de Células Ativadas comFluorescência [FACS ÇFluorescence Activated Cell Sorter)]. De preferência,os níveis de assim-chamadas células co-estimuladoras, como B7,l, B7,2,MHC classe II, CD40, CD80, CD86 são determinadas sobre, de preferência,células CDllc positivas. Alternativamente, a ativação de NF-κΒ e/ouexpressão de citocinas pode ser usada como indicadores de ativação decélulas envolvidos na imunogenicidade, como APC e DC.

De preferência, as citocinas a seguir deveriam serquantificadas: TNFa, IL-I, IL-2, IL-6, ou IFNy ou outras. De preferência, osníveis de citocinas poderiam ser quantificados por meio de ELISA.Alternativamente, é possível quantificar os níveis de mRNA. Para uma pessoaversada na arte é evidente que a função de APC e DC também pode sertestada.

De preferência, pode-se testar a apresentação cruzada deantígeno. De preferência, isto pode ser obtido com o uso de OVA, em suaconformação nativa e em conformações com conformação de estrutura βcruzada, como proteína-modelo. A capacidade de DC ou APC em ativarcélulas T restritas a MHC de classe II ou restritas a MHC de classe I deveriaser analisada. Para uma pessoa versada na arte isto pode ser realizado deacordo com protocolos estabelecidos 43'44. O papel de proteínas comconformação de estrutura β cruzada na ativação de APC e seu papel naapresentação de antígeno pode ser tratado adicionalmente com estesprocedimentos experimentais previamente indicados usando-se compostos deligação de estrutura β cruzada em ensaios de competição. De preferência, aativação de DC [células dendríticas] e apresentação de antígeno funcional sãotestadas na presença ou ausência de ThT, vermelho Congo, tPA, ou qualqueroutra proteína de ligação de estrutura β cruzada, incluindo aquelas listadas naTabela 1-3 ou um equivalente funcional da mesmas. A imunogenicidade deproteínas com conformação de estrutura β cruzada é demonstradaadicionalmente in vivo. Por exemplo, testa-se a indução de anticorpos e aindução e atividade de linfócitos T citotóxicos (CTL, cytotoxic T lymphocyte)quando da imunização de proteínas, incluindo OVA, P2GPI e/ou terapêuticosà base de proteína, como fator α de necrose de tumor, glucagônio ouEtanercept. De preferência, a imunogenicidade do estado nativo destasproteínas é em comparação com um estado em que a conformação deestrutura β cruzada foi introduzida. De preferência, a conformação deestrutura β cruzada é induzida por meio de aquecimento, oxidação,glicosamento ou tratamento com um adjuvante, como oligonucleotídeos deCpG, LPS ou cardiolipina. O conteúdo da conformação de estrutura β cruzadaé, de preferência, medido por meio de ThT, vermelho Congo, TEM,cromatografia de exclusão de tamanho, atividade de ativação de tPA, e ouligação de qualquer outra proteína de ligação de estrutura β cruzada listadanas Tabelas 1-3. De preferência, as titulações de anticorpos são medidas apósimunização com ELISA e mede-se a atividade de CTL usando ensaio deliberação de 51Cr. Alternativamente, é possível medir a liberação de citocinas,incluindo IL-2. Para uma pessoa versada na arte está claro agora que, paracada proteína compreendendo conformação de estrutura β cruzada, o efeitosobre a imunogenicidade pode ser testado como tal. Estes experimentospropostos elucidarão adicionalmente o papel da conformação de estrutura βcruzada na imunogenicidade.

Imunogenicidade de adjuvantes

A presente invenção revela que adjuvantes induzemconformação de estrutura β cruzada. Para uma pessoa versada na arte estáagora evidente que é possível obter evidência adicional que corrobora o papelproposto para a conformação de estrutura β cruzada na imunogenicidade deadjuvantes. Por exemplo, é possível testar adjuvantes adicionais e novos. Porexemplo, enterotoxina instável ao calor de Escherichia coli (EtxB),oligodesoxinucleotídeos relacionados com CpG diferentes e/ou variantes deLPS, ou moléculas relacionadas com LPS, como lipídeo de monofosforila A(MPL). Esta capacidade indutora de estrutura β cruzada é medida usando-seuma proteína nativa ou conjunto de proteínas, de preferência, OVA, lisozima,endostatina, y- globulinas, albumina, plasma ou uma proteína derivada deplasma ou conjunto de proteínas. O teor de estrutura β cruzada é, depreferência, medido por meio de ThT, vermelho Congo, TEM, cromatografiade exclusão de tamanho, atividade de ativação de tPA, e ou ligação dequalquer outra proteína de ligação de estrutura β cruzada listada nas Tabelas1-3. De preferência, a capacidade de indução de estrutura β cruzada destescompostos é comparada com a imunogenicidade in vitro e in vivo usando-seos ensaios descritos acima. Para uma pessoa versada na arte é possível agoraidentificar a proteína ou conjunto de proteínas que se redobra numaconformação com estrutura β cruzada quando exposto a um adjuvante. Porexemplo, um adjuvante, de preferência, CpG, LPS ou um equivalentefuncional do mesmo é imobilizado e usado subseqüentemente comoadjuvante. Em seguida, recolhe-se o adjuvante imobilizado e, após lavagemextensiva, isola-se as proteínas ligadas com conformação de estrutura β cruzada.Se necessário, as proteínas podem ser purificadas adicionalmente por meio deprocedimentos convencionais, de preferência, cromatografia de exclusão detamanho. A identidade das proteínas é revelada, de preferência, por meio deespectrometria de massa, i.e. proteômicos à base de espectrometria de massa.

O papel da conformação de estrutura β cruzada na ação deadjuvantes é tratado adicionalmente com estes procedimentos experimentaispreviamente indicados usando-se composto de ligação de estrutura β cruzadas emensaios de competição. De preferência, testa-se ativação de DC e apresentação deantígeno funcional, na presença ou ausência de ThT, vermelho Congo, tPA, ouqualquer outra proteína de ligação de estrutura β cruzada, incluindo aquelaslistadas na Tabela 1-3 ou um equivalente funcional das mesmas.

Estes experimentos elucidam adicionalmente o papel daconformação de estrutura β cruzada na imunogenicidade. Além disso, parauma pessoa versada na arte é exeqüível selecionar proteínas que se redobramem conformação de estrutura β cruzada e se tornam imunogênicas quando daligação a um adjuvante. Referidas proteínas também podem ser usadas comoadjuvantes propriamente ditos. Finalmente, para uma pessoa versada na arte épossível selecionar as proteínas compreendendo estrutura β cruzada ótimapara imunização e geração de uma resposta imune com base na ligação decompostos de ligação de estrutura β cruzada, incluindo aqueles listados naTabela 1-3, a estas proteínas compreendendo estrutura β cruzada.

Imunização com proteínas compreendendo conformação de estrutura βcruzada promovem proteção contra exposição a patógeno

A presente invenção revela que proteínas contendoconformação de estrutura β cruzada são imunogênicas. Para uma pessoaversada na arte é evidente agora que a imunização com proteínascompreendendo conformação de estrutura β cruzada induz ou acentua aproteção contra patógenos. Por exemplo, proteínas patogênicas que são bonscomponentes candidatos para desenvolvimento de vacina são combinadascom proteínas compreendendo conformação de estrutura β cruzada. Referidasproteínas patogênicas incluem, embora sem limitação, proteínas envolvidas navirulência de bactérias, como proteína similar a M, e proteínas de ligação defibronectina de espécies de Streptococcus, ou proteínas de opacidade (Opa) deNeisseria meningitidis. Alternativamente, referidas proteínas são de origemviral, como a proteína de hemaglutinina (HA) e/ou neuraminidase (NA) dovírus de influenza. Referidas proteínas patogênicas que elicitam uma respostaimune protetora são combinadas com uma proteína compreendendo umaquantidade efetiva de proteína compreendendo conformação de estrutura βcruzada e injetadas em um animal, de preferência, um camundongo.

Alternativamente, as proteínas patogênicas que induzem uma resposta imuneprotetora são tratadas de tal forma que se redobram em uma conformaçãocompreendendo estrutura β cruzada. Referidos tratamentos consistem, depreferência, de aquecimento, oxidação, e/ou sonicação ou qualquer outrotratamento que induz conformação de estrutura β cruzada. O teor deconformação de estrutura β cruzada é, de preferência, medido por meio deThT, vermelho Congo, TEM, cromatografia de exclusão de tamanho,atividade de ativação de tPA, e ou ligação de qualquer outra proteína deligação de estrutura β cruzada listada nas Tabelas 1-3. Após imunização apessoa versada na arte será capaz de determinar facilmente a resposta imunecom o auxílio de protocolos estabelecidos para a determinação da titulação deanticorpos e indução de uma resposta CTL. O efeito protetor da imunização,com proteínas compreendendo estrutura β cruzada com uma dada proteínapatogênica ou conjunto de proteínas patogênicas que se espera induzir umaresposta imune protetora é analisadas expondo-se camundongos imunizadoscom o patógeno de se derivam as proteínas patogênicas e comparando asobrevida ou gravidade de infecção com camundongos que não sãoimunizados. Por exemplo, camundongos podem ser infectados comStreptococcus aqui após imunização com proteínas de ligação de fibronectina(FNZ e/ou SF S) e/ou EAG (a2-macroglobulina, albumina, e proteína deligação de IgG) tratado para induzir conformação de estrutura β cruzada oucombinado com uma proteína compreendendo uma conformação de estruturaβ cruzada. Outro exemplo é obtido usando-se imunização com proteínasmeningocócicas recombinantes OpaB e OpaJ ou outras vesículas demembrana contendo proteínas PorA e PorB tratadas de forma a induzirconformação de estrutura β cruzada ou imunizadas com proteínascompreendendo conformação de estrutura β cruzada. Usando protocolosestabelecidos os camundongos são expostos a Neisseria meningitis. O efeitoda imunização é analisado mediante determinação da resposta de anticorpos.Em outro adicional, camundongos são imunizados com baculovírusrecombinante produziram vacinas NA e NA tratadas de forma a induzirconformação de estrutura β cruzada ou usada em combinação com umaproteína ou conjunto de proteínas compreendendo conformação de estrutura βcruzada. Subseqüentemente os camundongos são expostos a vírus de influenzapara determinar o efeito protetor da imunização com estrutura β cruzadacompreendendo proteínas por exemplo, de acordo com protocolos estabelecidos.

A proteína ideal ou conjunto de proteínas ideal a ser usado emcombinação, sendo que a proteína patogênica ou conjunto de proteínas éobtida, de preferência, a partir da análise de proteínas que estão implicadas naresposta de adjuvantes, como CpG ou LPS.

Considerados em conjunto, os resultados dos experimentosilustram adicionalmente que proteínas compreendendo estrutura β cruzada sãocomponentes valiosos de vacinas.

Exemplo 6

A cada vez usa-se duas doses de uma vacina de antígeno desuperfície de influenza inativado comercialmente obtenível (Agrippal®) paradeterminar a dose relevante de estruturas β cruzadas.

Uma dose é usada "tal qual" (A) e a outra (B) é desnaturada comum ou mais tratamentos de aquecimento, congelamento, oxidação, glicosamentoPEGilação, sulfatação, exposição a um caotrófico, de preferência, o caotrófico éuréia ou guanidínio-HCl, fosforilação, proteólise parcial, lise química, depreferência, com HCl ou brometo de cianogênio, sonicação, dissolução insoluções orgânicas, de preferência, 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol e ácidotrifluoroacético, ou uma combinação dos mesmos.

Prepara-se as combinações a seguir.

<table>table see original document page 56</column></row><table>Camundongos são imunizados com combinações de AB comodescrito acima, ou com um placebo.

Após três semanas, camundongos recebem reforço com amesma composição.

Após mais três semanas os camundongos são expostos aopatógeno.

Mede-se a resposta imune.

Exemplo 7

Proteínas compreendendo estrutura β cruzada também sãousadas como componente para aplicações médicas no tratamento e/ouprofilaxia de câncer, de preferência, mas sem limitação, câncer associado cominfecção viral. Referido câncer é, de preferência, associado com infecção porpapilomavírus humano (HPV).

Uma resposta imune é induzida, por exemplo, para neutralizar,tratar e/ou pelo menos prevenir parcialmente a ocorrência e/oudesenvolvimento de câncer, de preferência, cânceres cervical, anal, vulvar,vaginal, e/ou peniano e/ou verrugas genitais associadas com infecção porHPV, de preferência, câncer associado com HPV16 e/ou HPV18 e/ou HPV6e/ou HPVll antígeno associado com tumor. De preferência, objetiva-sepapiloma vírus humano (HPV) de proteína de tipo E6 e/ou E7. A indução deestrutura β cruzada em referido antígeno, de preferência, um antígeno E6 e/ouE7, ou combinação de referido antígeno com um componente de proteínacompreendendo uma estrutura β cruzada, resulta em um composto e/oucomposição que é particularmente vantajosa para elicitar uma resposta imuneespecífica para antígeno. De preferência, elicita-se uma resposta específicapara E6 e/ou E7. De preferência, produz-se um composto e/ou composiçãoque é capaz de proteger camundongos contra exposição a tumoresexpressando referido antígeno, de preferência, E6 e/ou E7. Da forma maispreferível, produz-se um composto e/ou composição é que é capaz deproteger, pelo menos em parte, humanos de desenvolver câncer e/ou verrugasgenitais causadas por infecção com HPV. Usa-se quantidade terapeuticamenteefetivas, de preferência, entre 1 e 100 μg de antígeno de tumor, emcombinação com quantidades terapeuticamente efetivas, de preferência, de 1 a100 μg, de um componente de proteína compreendendo estrutura β cruzada.Referido componente de proteína compreendendo estrutura β cruzada é, depreferência, ovalbumina. Ainda mais preferivelmente, referido componente deproteína compreendendo estrutura β cruzada é um antígeno associado comtumor. Conseqüentemente, estruturas β cruzadas são induzidas, depreferência, em um antígeno associado com tumor, que torna umacomposição compreendendo referido antígeno associado com tumor maisimunogênica. Desej ando-se tratamento pelo menos parcial e/ou profilaxia deCânceres associados com HPV, sendo que referido antígeno associado comtumor é, de preferência, E6 e/ou E7.

Camundongos são imunizados, de preferência, duas vezes porvia intramuscular, de preferência, com um intervalo de duas a três semanas e,de preferência, expostos com células de tumor, de preferência, 5 χ IO4 célulasde tumor TC-I e, de preferência, o crescimento do tumor é medido emonitorado ao longo do tempo. Sujeitos humanos são imunizados, depreferência, duas vezes ou mais vezes da mesma maneira, e, de preferência,monitora-se a eficácia por meio de determinação do número, início e/oucrescimento de câncer e/ou desenvolvimento de verrugas entre indivíduosimunizados e indivíduos não-imunizados.

Exemplo 8

Proteínas compreendendo estrutura β cruzada também sãousadas como componente para aplicação médica para induzirimunogenicidade na profilaxia e/ou tratamento de outras aberrações, depreferência, mas sem limitação aterosclerose ou amiloidoses, de preferência,doença de Alzheimer, e também para induzir respostas imunes contra outrosauto-antígenos, abrangendo até mesmo, p. ex., LHRH para imunocastração dejavalis, ou para uso na prevenção da doença enxerto versus hospedeiro (GvH)e/ou rejeições de transplante.

Por exemplo, para tratar aterosclerose objetiva-se, depreferência, LDL oxidado ou proteínas glicosadas ou epítopos específicos dasmesmas. De preferência, usa-se LDL oxidado e/ou proteínas glicosadas,compreendendo estrutura β cruzada, como componente de uma tal aplicaçãomédica para induzir uma resposta imune específica para proteína ox-LDL-e/ou glicosada. Usa-se quantidades terapeuticamente efetivas, de preferência,entre 1 e 100 μg de proteína ox-LDL e/ou glicada, em combinação comquantidades terapeuticamente efetivas, de preferência, de 1 a 100 μg, de umcomponente de proteína compreendendo estrutura β cruzada, sendo quereferido componente de proteína é, de preferência, oxLDL e/ou uma proteínaglicosada.

Para tratar amiloidose ou qualquer doença que causa maudobramento de proteína, de preferência, doença de Alzheimer, de preferência,usa-se uma proteína ou fragmento de proteína combinado com umaamiloidose particular como imunógeno para induzir uma resposta imuneespecífica contra referida proteína ou fragmento de proteína. De preferência,usa-se quantidades terapeuticamente efetivas, de preferência, entre 1 e 100 μg,de referida proteína ou fragmento de proteína em combinação comquantidades terapeuticamente efetivas, de preferência, de 1 a 100 μg, de umcomponente de proteína compreendendo estrutura β cruzada, sendo quereferido componente de proteína é, de preferência, sendo que referida proteínaou componente de proteína.

Para elicitar uma resposta imune contra um auto-antígeno,compreendendo até mesmo, por exemplo, para imunocastração de javalis, oupara uso na prevenção da doença de enxerto versus hospedeiro (GvH) e/ourejeições de transplante, de preferência, usa-se um auto-antígeno comoimunógeno, de preferência, com um componente de proteína compreendendoestrutura β cruzada. De preferência, referido componente de proteínacompreendendo estrutura β cruzada é referido auto-antígeno em queestruturas β cruzadas se induziu. De preferência, usa-se quantidadesterapeuticamente efetivas, de preferência, entre 1 e 100 μg, de referida auto-proteína em combinação com quantidades terapeuticamente efetivas, depreferência, de 1 a 100 μ§, de um componente de proteína compreendendoestrutura β cruzada, sendo que referido componente de proteínacompreendendo estrutura β cruzada é, de preferência, referida auto-proteínaem que estruturas β cruzadas foram induzidas. Uma resposta imune elicitada édeterminada, de preferência, por meio de um método imunológico, porexemplo, por meio de ELISA ou determinação da resposta CTL. A eficácia dereferido tratamento é determinada, por exemplo, por meio de monitoração dodesenvolvimento específico das aberrações objetivadas.

Exemplo 9

Imunogenicidade de vacinas meningocócicas de proteína de membranaexterior de sorogrupo B adjuvantadas com estrutura beta cruzada

Imunização de camundongos com uma vacina de PprAtrivalente contra Neisseria meningitidis

Objetivo

Determinar se antígeno de PorA com conformação de proteínacom dobramento incorreto similar a amilóide elicita titulações de anticorpos.Analisou-se soros de camundongo para determinar titulações de anticorpostotais e titulações de anticorpos bactericidas contra PorA a partir de trêsdiferentes cepas de Neisseria meningitidis, após duas vacinações com PorAadjuvantada com alume, PorA nativa, placebo (tamponador para injeção), ouduas preparações de PorA com, respectivamente, PorA com dobramentoincorreto a 25 % ou 75 % com propriedades similares a amilóide (adjuvantadocom estrutura beta cruzada).MA TERIAIS E MÉTODOS

Preparação de vacinas

Solução de antígeno de PorA foi obtida do Dr. G. Kersten eDr. G. van den Dobbelsteen do The Netherlands Vaccine Institute (NVI,Bilthoven, Países Baixos). PorA em vesículas de membrana exterior (OMV,outer membrane vesieles) bacterianas foi preparada substancialmente comodescrito ('). Concentração de proteína na solução de OMV foi determinadausando-se técnicas convencionais. O teor de PorA foi determinado por meiode análise densitométrica de um gel de poliacrilamida manchado comCoomassie após eletroforese em gel da preparação de PorA, e foi de 400μg/ml. O tamponador de PorA consiste de 10 mM de Tris, 3 % de sacarose,pH 7,4. Para fins de preparação de vacina, preparou-se IOx tamponador dePorA (30 % peso/peso de sucrose, 100 mM de Tris pH 7,4, esterilizadoatravés de filtro de 0,45 μηι). As OMV usadas para os estudos foram obtidasde uma cepa trivalente expressando três subtipos séricos de PorA, i.e. P 1,5-2,10, PI, 12-1,13 e P 1,7-2,4. Alume adjuvante (Adju-Phos, Brenntag, 2 % deAlPO4, 0,44 % de Al3+, batelada 8981) foi fornecido pela NVI, e tambémtamponador de PorA simples. Estas soluções de consumo estéreis foramarmazenadas a 4°C.

Introdução de conformação de proteína com dobramento incorretosimilar a amilóide em proteínas

Para a preparação de PorA com dobramento incorreto similar aamilóide usou-se os três métodos a seguir.

Método do dobramento incorreto I: desnaturação com calor por meio deciclização térmica

Um mg de OVA de frango purificada (Sigma; número decatálogo A5503) em 875 μΐ de tamponador de PorA e 125 μl de solução deconsumo de PorA ([PorA] = 50 μg/ml; [OVA] = 1 mg/ml) foi aquecidodurante cinco ciclos em recipientes de PCR em um ciclizador térmico PTC-200 (MJ Research, Inc., Waltham, MA, E.U.A.). Em cada ciclo, solução deproteína foi aquecida de 30°C a 85°C a uma taxa de 5°C/min. Soluções deproteína desnaturadas com calor foram armazenadas a -80°C.

Método do dobramento incorreto II: acoplamento de PorA a ovalbumina

Para acoplamento de PorA a OVA usando N-etil-N'-(dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC, estoque é de 400 mM) e N-hidroxisuccinimida (NHS, estoque é de 100 mM), compostos e proteína forammisturados em tamponador MES (0,02 % (m/v) NaN3, 100 mM de MES, 150mM de NaCl, pH 4,7; diluído de um estoque de 10x tamponador de MES). Demaneira resumida, adicionou-se 200 μl de 10x tamponador de MES a 250 μΐde estoque de EDC e 350 μΐ de H2O (solução 1). OVA (0,2 mg) foi dissolvidaem 100 μl de solução de consumo de PorA. Oitenta μl de solução 1 foramadicionados a esta solução de PorA/OVA; então adicionou-se 20 μl dassoluções de consumo de NHS. As misturas foram incubadas durante 2 h àtemperatura ambiente em um dispositivo de rolamento, e subseqüentementeadicionou-se 800 μΐ de PBS antes de diálise extensiva contra PBS a 4°C([PorA] = 40 μ^ηύ; [OVA] = 1 mg/ml). Na solução com conjugados dePorA-OVA foram visíveis pequenas partículas. A solução de conjugado foiaquecida subseqüentemente durante cinco ciclos térmicos como descritoacima. O conjugado foi armazenado a -80°C.

Método do dobramento incorreto III: acoplamento de polipeptídio-A apolipeptídio-Bpor meio de ativação de glutaraldeído/NaBU4

Para acoplamento de PorA a OVA, ambas as proteínas foramativadas com glutaraldeído e boroidreto de sódio e misturadas. Para este fimdissolveu-se 100 μg de OVA em 250 μΐ de solução de consumo de PorA eadicionou-se 250 μΐ de tamponador de PorA. Solução de glutaraldeído (25 %(v/v) em H2O, Merck, Hohenbrunn, Alemanha, 8.20603.1000 (UN2927,tóxico), lote S4503603 549), pré-diluída a uma solução de consumo IOOx a 4% em H2O foi adicionada a uma concentração final de 0,04 %. Após agitaçãocom vórtice e uma incubação de 2 minutos à temperatura ambiente,adicionou-se 5 μΐ de uma solução de consumo de IOOx NaBH4 120 mM(aprox. 98 %, Sigma, St. Louis, MO, E.U.A., S9125, lote 53H3475) a umaconcentração final de 1,2 mM. A solução foi submetida a agitação suficientepara se obter um vórtice e incubada durante 42 h à temperatura ambiente emum dispositivo de rolamento. Durante esta incubação tornaram-se visíveispequenas partículas flotantes. Em seguida, a solução foi dialisadaextensivamente contra PBS. A solução de conjugado foi aquecidasubseqüentemente durante cinco ciclos térmicos como descrito acima. Asconcentrações finais de PorA e OVA foram de 200 μg/ml em PBS.

Análise da presença de proteína com dobramento incorreto similar aamilóide com estrutura beta cruzada em soluções de PorAFluorescência de Τίοflavina T

Para determinar o incremento da fluorescência do coranteTioflavina T (ThT, Thiflavin T) que é específico para amilóide, por meio depreparações de PorA, adicionou-se 90 μΐ de 25 uM de solução de ThT em 50mM de tamponador de glicina (pH 9,0) a 10 μΐ de amostra em poçosduplicatas de placas pretas de 96 poços. Usou-se amilóide-β (Αβ) a umaconcentração de estoque de 1 mg/ml como um controle positivo.Fluorescência de duplicatas foi medida em um equipamento ThermoFluoroskan Ascent 2,5, com comprimentos de onda de 435 nm de excitação e485 nm de emissão. Em um ensaio, PorA e PorA com dobramento incorretode acordo com métodos de dobramento incorreto I-III foram testadas comsoluções de consumo de PorA diluídas 400 vezes. Em um segundo ensaio, ascinco soluções de vacina (a-e) foram testadas a uma diluição de 20 vezes.

Ativador de plasminogênio de tipo tissular — ensaio de ativação deplasminogênio

Ativador de plasminogênio de tipo tissular (tPA, tissue-typeplasminogen activator) liga-se e é ativado por meio de proteína comdobramento incorreto similar a amilóide. A ativação de tPA resulta naconversão de seu substrato plasminogênio a plasmina, que pode seracompanhado ao longo do tempo usando-se um substrato de plasminacromogênio. O ensaio foi realizado em placas de 96 poços (placas de ELISACostar 2595). As concentrações de tPA- (Actilyse, Boehringer-Ingelheim) eplasminogênio (Plg, purificado de plasma humano) concentrações foram de400 pM e 0,2 μΜ, respectivamente. Substrato cromogênico S-2251(Chromogenix, Milano, Itália), a 0,5 mM, foi usado para medir atividade dePlm. Tamponador de ensaio foi HBS (10 mM de HEPES, 4 mM de KCl, 137mM de NaCl5 pH 7,3). Controle negativo foi de H2O, controle positivo foi de20 μg/ml γ-globulinas com dobramento incorreto similar a amilóidedissolvido em H2O. Em um ensaio, PorA e PorA com dobramento incorretode acordo com métodos de dobramento incorreto I-III foram testados comsoluções de consumo de PorA diluídas 400 vezes. Em um segundo ensaio, ascinco soluções de vacina (a-e) foram testadas a uma diluição de 20 vezes.Amostras foram testadas em poços duplicados, completados com um poço decontrole negativo em que não se adicionou tPA. O volume de ensaio total foide 50 μl. Realizou-se leituras cinéticas com um espectrofotômetro(Spectramax) a 405 nm, e foram efetuadas de minuto em minuto durante 3 h, a37°C, com agitação antes de cada leitura.Montagem experimental de imunização

B alB/CAnNHSd fêmeas com de 7 a 9 semanas de vida(BalB/C, Harlan) foram alojados em gaiolas filtertop em cinco grupos decinco camundongos por grupo (Instalação Animal GemeenschappelijkDierenlaboratorium', Utrecht University, Países Baixos). Apósaproximadamente uma semana de ajuste ao ambiente, retirou-se sangue paracoletar soro pré-imune (dia -3). No dia 0 e dia 28, cada camundongo recebeuuma vacinação injetada subcutaneamente com um volume de 300 μl deacordo com o esquema a seguir:grupo a vacina de PorA adjuvantada com alume (controle positivo)

grupo b PorA não-adjuvantado (amostras de referência)

grupo c tamponador de PorA (placebo)

grupo d PorA não-adjuvantado a 75 %, PorA com dobramento

incorreto a 25 % (Item de teste 1)

grupo e PorA não-adjuvantado a 25 %, PorA com dobramento

incorreto a 75 % (Item de teste 2)

Soros foram recolhidos no dia 7, 14, 21, 28, 35 e 42 e

armazenados a -20°C. A dose de PorA foi de 3 pg para cada animal. Vacinas(aproximadamente 6 doses) foram preparadas como a seguir:

-> Grupo a: 1. 50 μΐ de estoque de PorA, 2. 200 μΐ detamponador IOx3 3. 50 μΐ de estoque de alume, 4. 1,7 ml de H2O, 5. 30minutos no dispositivo de rolamento à temperatura ambiente.

-> Grupo b: 1. 50 μΐ de estoque de PorA, 2. 1950 μΐ detamponador Ix de PorA.

-> Grupo c: tamponador Ix de PorA.

-> Grupo d: 1. 37,5 μΐ de estoque de PorA, 2. 50 μΐ de (PorA +

OVA) desnaturado com calor em PBS (Método do dobramento incorreto I), 3.50 μl de EDC/NHS acoplado (PorA + OVA), 307 μg/ml em PBS (Método dodobramento incorreto II), 4. 20 μΐ de NaBHVglutaraldeido desnaturado comcalor copulado (PorA-OVA) em PBS (Método do dobramento incorreto III),5.1813 μl de tamponador Ix de PorA.

-> Grupo e: 1. 12,5 μΐ de estoque de PorA, 2. 150 μΐ de (PorA+ OVA) desnaturado com calor (Método do dobramento incorreto I), 3. 150μl de EDC/NHS acoplada (PorA + OVA), 307 μg/ml em PBS (Método dodobramento incorreto II), 4. 60 μΐ de NaBHU/glutaraldeído desnaturado comcalor acoplado (PorA-OVA) em PBS (Método do dobramento incorreto III),5. 1628 μΐ de tamponador Ix de PorA.

ELISA de anticorpo anti-PorA

Titulações de IgG específicas para PorA foram determinadaspor meio do uso de montagens ELISA convencionais com cada um dos trêsdiferentes subtipos de PorA, ou com a solução de PorA trivalente aplicadarevestindo os poços. Resumidamente, para o ELISA com os três subtiposseparados de PorA, placas de microtitulação de 96 poços de fundo plano(Immulon 2, Nunc, Roskilde, Dinamarca) foram revestidas de um dia para ooutro à temperatura ambiente com vesículas de membrana exterior (OMVs,outer membrane vesicles) compreendendo um dos três subtipos de PorA decepas de Neisseria, respectivamente P 1.5-2,10, PI.12-1,13 e P 1.7-2,4 (3μg/ml). Controle negativo consistia de OMVs revestidas sem PorA. Apósincubação de um dia para o outro, as placas foram lavadas três vezes comuma solução de Tween 80 a 0,03 % em água potável. As placas foram entãoincubadas durante 80 minutos a 37°C com diluições triplas das amostras desoro de cada camundongo individual, recolhidas no dia -3 (pré-imune), 14, 28(segunda vacinação) e 42, em PBS contendo 0,05 % de Tween 80. A diluiçãoinicial foi de 100 vezes. Após incubação, as placas foram lavadas três vezescom 0,03 % de Tween 80 em água potável. Níveis de IgG específicos paraPorA foram medidos com o uso de conjugado de peroxidase de rabanete - IgGanti-camundongo de cabra (Southern Biotechnology Associated Inc.,Birmingham, ALA, E.U.A.) O conjugado foi diluído a 1:5000 em PBScontendo 0,05 % de Tween 80 e 0,5 % de leite em pó desnatado (Protifar;Nutricia, Zoetermeer, Países Baixos), e adicionou-se 100 μΐ nos poços. Asplacas foram então lavadas três vezes com 0,03 % de Tween 80 em águapotável e uma vez com água potável apenas. Adicionou-se um substrato deperoxidase (100 μΐ de 3,3'5,5'-tetrametilbenzidina com 0,01 % de H2O2 em110 mM de tamponador de acetato de sódio (pH 5,5) em cada poço, e asplacas foram então incubadas durante 10 minutos à temperatura ambiente. Areação foi interrompida adicionando-se 100 μΐ de 2 M H2SO4 em cada poço.As titulações de anticorpos IgG foram expressas como o logi o da diluição desoro que dá 50 % da densidade óptica máxima a 450 nm. Quando não seobteve mais sinal com o soro diluído inicialmente 100 vezes, a titulação foiajustada arbitrariamente em 50. Os ELISAs são realizados no NVI (Dr G. vanden Dobbelsteen).

Para a determinação de titulação de anticorpos anti-PorAtrivalente, 5 μg/ml de PorA trivalente foi introduzido revestindo poços dePlacas Microlon de alta ligação (Greiner). Após bloqueio com Reagente deBloqueio (Roche), poços foram recobertos com diluições seriais de soros queforam coletados no dia 21 e que foram combinados para cada grupo decamundongos de a até e. Tamponador de diluição foi PBS/0,1 % Tween20. Aligação de anticorpos de camundongo foi detectada usando-se RAMPO a1:3000, e uma mancha com TMB/H2S04' Absorbância foi lida a 450 nm.

Ensaio bactericida em soro

O ensaio bactericida em soro (SBA, serum bactericidal assay)com soros de camundongo após imunização com PorA da cepa trivalente (1.PI.5-2,10; 2. PI.12-1,13; 3. PI.7-2,4) foi realizado após duas imunizações,com soros coletados no dia 28 (segunda vacinação) e dia 42, como descritoacima. Em resumo, soros foram diluídos a 1:10 em Solução salina balanceadade Grey contendo 0,5 % de albumina de soro bovino e complementoinativado (30 minutos, 56°C), e adicionou-se diluições seriais em placas de 96poços. Bactérias são desenvolvidas em caldo de Mueller-Hinton(aproximadamente 80 minutos, 37°C) até uma densidade óptica a 620 nmatingisse de 0,220 a 0,240, diluídas em GBSS contendo 0,5 % albumina desoro bovino, e adicionadas nos poços (concentração total, IO4 CFU/ml). Cadapreparação foi incubada durante 20 minutos à temperatura ambiente.

Adicionou-se Complemento de coelho bebê (80 %), plaqueou-se amostras demomento zero, e as placas de 96 poços foram incubadas a 37°C durante 60minutos. A titulação de SBA foi calculada determinando-se a Iog2 recíprocada diluição de soro que resultou em >90 % de eliminação com base naconcentração nas amostras de momento zero. Quando não se obteve maissinal com o soro diluído inicialmente 10 vezes, a titulação foi ajustadaarbitrariamente em 5. Determinações de titulação de SBA foram realizadas noNYI (Dr G. van den Dobbelsteen).

Estatísticas

A titulação de IgG é expressa como o valor Iogj0 da titulaçãogeométrica média (GMT, geometric mean titer) obtida para cada grupo decamundongos mais o erro padrão da média. A titulação de SBA é expressacomo o valor médio de Iog2 obtido para cada grupo de camundongos.Experimentos foram realizados em duplicata. Diferenças entre titulaçõesforam consideradas significativas a valores P de <0,05, como determinadopelo teste t de Student.

Resultados

Análise da presença de PorA com dobramento incorreto comconformação de proteína com dobramento incorreto similar a amilóidecompreendendo estrutura beta cruzada

PorA trivalente obtida do NVI foi desnaturada de acordo comtrês métodos: desnaturação com calor cíclico na presença de OVA (Método I),desnaturação com calor cíclico de PorA conjugado a OVA usandoacoplamento de EDC/NHS (Método II) e desnaturação com calor cíclico dePorA conjugada a OVA usando acoplamento de glutaraldeído/NaBEU(Método III). A presença de conformação de proteína com dobramentoincorreto similar a amilóide foi determinada usando-se dois ensaiosdiferentes. Avaliou-se o incremento da fluorescência do corante ThTespecífico para amilóide foi avaliado (Figura 6A, C), e determinou-se oincremento de atividade de tPA, que é uma serina protease que se liga a, e éativada por, proteínas compreendendo conformação de proteína comdobramento incorreto similar a amilóide (Figura 6B, D). Na Figura 6A e Bobserva-se que todas as soluções de consumo de PorA a diluição de 400 vezescompreendem estrutura beta cruzada. Após formulação das vacinas de a até e,vacina de controle adjuvantada com alume e 75 % de vacina de PorAadjuvantada com beta cruzado testou positiva para a presença de proteína comdobramento incorreto similar a amilóide no ensaio de ativação de tPA (Figura6D). Com base na análise de fluorescência de ThT (Figura 6C), contudo,aquela testou negativa para PorA adjuvantada com alume, nós concluímosque a ativação incrementada de tPA observada com PorA adjuvantada com5 alume devida ao dobramento incorreto no-ensaio de tPA/plasminogênio nasuperfície de alume precipita, resultando em subseqüente ligação de tPA eativação. Concluindo, material de partida PorA e PorA com dobramentoincorreto compreende estrutura beta cruzada similar a amilóide.SBA e ELISA de anticorpo anti-PorA

Os resultados de determinações de titulações de anticorpo anti-PorA usando o antígeno de PorA trivalente, ou os três subtipos separados dePorA como o antígeno, são ilustrados nas Tabelas 4-18 e Figura 7A e B.Titulações totais anticorpo anti-PorA trivalente em soros combinadoscoletados no dia 21 são mostradas na Figura 7A. Está claro que soroscombinados de grupos de camundongos a, b, d, e, que receberam (todos)vacina com antígeno de PorA, apresentam titulações totais de anticorpo anti-PorA similares, sendo que grupo c (tamponador/placebo) e soro pré-imunetestaram negativos quanto à presença de anticorpos anti-PorA. Quando seavaliou titulações contra cada um dos três subtipos de PorA, observa-sediferenças entre camundongos dentro de grupos com relação aos valores detitulação. O grupo de placebo c testou negativo para todos os camundongos, etambém o soro pré-imune. Dentro de cada um dos grupos que receberamvacina de PorA, um ou mais camundongos não elicitaram titulações de modoalgum. Não se observa diferenças entre os grupos a, b, d e e.

Na Figura 7C e Tabelas 19-23, mostra-se resultados dasdeterminações de titulação de SBA com cada um dos três subtipos de PorA.Como com o ELISA de antígeno, quando se avaliar as titulações por SBAcontra cada um dos três subtipos de PorA, observa-se diferenças entrecamundongos dentro dos grupos com relação a seus valores de titulação. Ogrupo de placebo c testou negativo para todos os camundongos. Dentro decada um dos grupos que receberam vacina de PorA, um ou maiscamundongos não elicitou titulações de modo algum. Não se observoudiferenças entre grupos a, b, d e e.

Na Tabela 24, titulações de anticorpo de subtipo anti-PorA etitulações de SBA específicas para subtipo são comparadas para cadacamundongo. Está claro que titulações observadas no SBA para camundongo3/grupo a/subtipo P 1.7-2,4, camundongo 1/b/Pl .12-1,13, camundongo4/b/P1.7- 2,4 e camundongo 3/d/P 1.5-2,10 são acompanhadas da ausência deuma titulação conforme determinado no ELISA de antígeno. O oposto,significando uma titulação observada no ELISA de antígeno sem titulação noSBA, é observada em camundongos 4/a/P 1.7-2,10, 2/b/P 1.7-2,10, 2/d/P1.5-2,10, l/e/Pl.5-2,10 e 4/e/P1.7-2,4. Isto mostra claramente uma dasdificuldades que surge quando se desenvolve vacinas de subunidade deNeisseria meningitidis. Um resultado positivo em um ensaio não tem valorpreditivo consistente para o resultado esperado no segundo ensaio. Diferençasem epítopos para os anticorpos elicitados e/ou afinidade/avidez dos anticorposelicitados são a base desta discrepância. Adicionalmente, pode-se observarclaramente que camundongos não elicitam titulações de anticorpos relevantescontra todos os três subtipos de PorA. Na maior parte dos casos, desenvolve-se titulações contra um ou dois subtipos de PorA. A imunogenicidade relativados três subtipos de PorA (PI.5-2, 10 » PI.12-2, 4 « PI.7-2,4) é refletida nonúmero de camundongos que desenvolveram titulações contra os doissubtipos menos imunogênicos, quando comparado com o subtipo maisimunogênico P 1.5-2,10. Quando se compara PorA não-adjuvantado e PorAadjuvantada convencional com alume com vacina de beta cruzado-PorAadjuvantada, não se observa diferenças com relação a números decamundongos que desenvolveram anticorpos, nem se observa diferenças comrelação ao subtipo a que titulações são elicitadas, nem se observa diferençascom relação ao poder preditivo do ELISA para antígeno quando se consideraa titulação de SBA acompanhada. Assim, concluindo, no primeiro teste aelicitar anticorpos bactericidas contra PorA está provado que a tecnologia deAdjuvação-através-de-estrutura beta cruzada proporciona vacinas potentescomo PorA adjuvantada com alume usado convencionalmente. A tecnologiaAdjuvação-através-de-estrutura beta cruzada proporciona vários meios para omelhoramento das vacinas correntemente disponíveis de subtipo de PorAmultivalentes de Neisseria meningitidis. Por exemplo, agora usa-se menosmaterial para elicitar titulações protetoras. Mais importante, quando seconsidera subtipos menos imunogênicos, obtém-se melhoramento daimunogenicidade protetora efetiva por meio do uso de tecnologia deAdjuvação-através-de-estrutura beta cruzada especificamente para estessubtipos problemáticos. Após aplicação da tecnologia de Adjuvação-através-de-estrutura beta cruzada, o subtipo com estrutura beta cruzada ótima, comrelação ao potencial de elicitar anticorpos protetores, é administrado, porexemplo, em uma vacina de subunidade multivalente. Alternativamente, atecnologia é aplicada em uma vacina de subunidade multivalente completa.Ligação de subtipos de PorA com baixa intensidade imunogênica para outraproteína que compreende uma potente estrutura beta cruzada imunogênicaincrementa o desenvolvimento de anticorpos desejados. Adicionalmente,quando se aplica, além de PorA, uma proteína com estrutura beta cruzada compotente intensidade imunogênica em uma vacina multivalente, titulações deantígeno com relação à proteína não-relacionada proporcionam umaferramenta preditiva com relação ao presença de anticorpos bactericidas.

Finalmente, hoje em dia usa-se alume como o adjuvante deescol em formulações de vacinas de PorA. Quando a tecnologia deAdjuvação-através-de-estrutura beta cruzada é aplicada no desenvolvimentode vacinas, p. ex. no desenvolvimento de vacinas de PorA, não é maisnecessário implicar um adjuvante diferente de uma molécula proteináceacompreendendo estrutura beta cruzada, p. ex. alume, para formulação devacina de PorA5 na formulação final. Evidentemente, em outras ocasiõesreduz-se a quantidade de adjuvantes correntemente usados, ao invés decompletamente omitida, que também é benéfica com relação, entre outrascoisas, a questões de segurança, redução de custo, facilidade de uso, eestabilidade.

Exemplo 10

Imunização de camundongos com um antígeno humano compreendendoestrutura beta cruzada elicita titulações de anticorpos contra antígenohumano não-tratado e quebra a tolerância nos camundongosP2-glicoproteína I humana, o auto-antígeno na doença auto-imune Síndrome Antifosfolipídeo, com estrutura beta cruzada induz umatitulação contra auto- p2-glicoproteína I em camundongos

Materiais e Métodos

Imunizações com p2-Glicoproteína I com dobramento incorreto

Soluções de consumo

Solução de consumo de p2-Glicoproteína I humana; 800 μg/mlem Ix Solução salina tamponada com Tris, pH 7,2 (lx TBS). Vesículas decardiolipina foram preparadas de uma solução lamelar de cardiolipina (Sigma;C-1649) de acordo com um protocolo por Subang et al.{ ). Duzentos μΐ decardiolipina foram colocados em um tubo de vidro e etanol foi evaporado comum fluxo constante de N2. A cardiolipina secada foi reconstituída em 104 μΐde Ix TBS e submetida cuidadosamente a agitação suficiente para se obter umvórtice. A solução resultante continha 10 mg/ml (7,14 mM) de vesículas decardiolipina. Esta solução poderia ser armazenada durante 14 dias a 4°C,maximamente. Todas as diluições foram em TBS e, após armazenamento, asolução foi submetida a agitação suficiente para se obter um vórtice antes douso.

Modificações: preparação de alquila~p2gpiP2-GPI foi reduzida e alquilada como a seguir. Seiscentos equarenta μΐ de estoque de P2-GPI foram misturados com 640 μΐ de uréia 8 M(solução resfriada) em 0,1 M de Tris pH 8,2. A solução foi desgaseificadacom gás de N2 durante aproximadamente 6 minutos. Adicionou-se à solução12,8 μl de estoque de DTT 1 M, isto foi misturado e incubado durante 3 horasà temperatura ambiente. Preparou-se 1 M de iodoacetamida (Sigma; 1-6125),de que 25,6 μΐ foram adicionados à mistura de reação P2GPI. A solução foidialisada subseqüentemente contra PBS. Dobramento incorreto da resultantealquila-p2GPI foi determinada medindo-se o incremento da fluorescência deThT e por meio da maior capacidade de ativar tPA/plasminogênio, resultandoem plasmina no ensaio cromogênico. O ensaio cromogênico foi realizado com400 pM de tPA, 20 μg/ml de plasminogênio. Sinais obtidos com alquila-P2GPI foram comparados com aqueles obtidos com material de partida deP2GPI nativa.

Imunizações de camundongos com p2GPI nativa, alquila-p2gpi ecardiolipina-p2gpi

Balb/C AnNHSd fêmeas (BalB/C, Harlan) com de 7 a 9semanas de vida foram alojados em gaiolas filtertop em grupos de 5camundongos por grupo. Após aproximadamente um semana de ajuste aoambiente, coletou-se soros pré-imunes. No início da primeira semana,camundongos receberam, ou 100 μl de plasma (150 μg/ml) β2- GlicoproteínaI, 100 μΐ de alquil- p2-Glicoproteína I (150 μg/ml) ou 100 μΐ de uma misturade 150 μg/ml de p2-Glicoproteína I com 9,33 μΜ de cardiolipina (CL-P2GPI).Esta última amostra foi preparada por meio de pré-incubação de 400 μg/ml deP2-GPI com 25 μΜ de vesículas de cardiolipina durante pelo menos 10minutos à temperatura ambiente após misturação da amostra por meio depipetação; em seguida, amostras foram diluídas a 150 μg/ml. A presença deP2GPI com dobramento incorreto na preparação de CL-P2GPI foi determinadamedindo-se o incremento da fluorescência de ThT e o potencial incrementadode estimular ativação de tPA/plasminogênio. Todas as diluições forampreparadas recentemente em TBS e mantidas sobre gelo. Injeções foramadministradas intravenosamente nas veias caudais dos camundongos e dadasàs segundas-feiras e sextas-feiras da primeira e terceira semana. Sangue foicoletado três dias antes do início do estudo, e às quartas-feiras da semana 2 e4 por meio de punção da veia safena. Sangue foi coletado em tubosEasycollect, com ativador de coagulação do soro Z. Soros foram preparadospor meio de centrifugação em uma centrífuga de mesa, com um diâmetro dorotor de 7 cm, a 3800 rpm durante 10 minutos (início e parada lentos) earmazenada a -20°C até análise posterior.

Determinações de titulação

Soros foram analisados quanto a anticorpos contra P2GPInativa não-modificada (revestida). Placas de 96 poços Microlon com altaligação (Greiner, Alphen aan den Rijn, Países Baixos) foram revestidas com50 μl de P2GPI nativa (5 μ^πύ em 100 mM de NaHCO3, pH 9,6, 0,05 %NaN3) por poço durante 1 hora. Em seguida, os poços foram drenados elavados duas vezes com 300 μl de solução salina tamponada com fosfato(PBS), contendo 0,1 % de Tween20 (PBST). Após lavagem, poços forambloqueados por meio de incubação com 200 ul de Reagente de Bloqueio(Roche, Almere, Países Baixos) em PBS durante 1 hora. Os poços foramdrenados e lavados duas vezes com 300 μΐ de PBST. Titulações de anticorposforam determinadas adicionando-se soros combinados de cada grupoexperimental (n=5) em diluições seriais triplas (partindo de 1:30, 50 ul/poço)nas placas cobertas com P2GPI humana nativa. As placas foram lavadasquatro vezes com 300 μΐ de PBST. Anticorpos anti-camundongo de coelhoconjugado com peroxidase (RAMPO), diluído a 1:3000 em PBST, foramadicionados nos poços e incubados durante 1 hora. Placas foram drenadas elavadas quatro vezes com 300 μl de PBST e duas vezes com 300 μl de PBS.As placas foram então manchado durante aproximadamente 5 minutos usando100 μl/poço de substrato de TMB (Biosource Europe, Nivelles, Bélgica), areação foi interrompida com 50 μΐ/poço de H2SO4 2M e efetuou-se a leitura a450 nm em uma leitora de microplacas Spectramax340. Os valores deabsorbância foram plotados contra a diluição log. Curvas foram adequadascom uma curva sigmoidal (GraphPad Prism versão 4.02 para Windows,Graphpad Software, CA, E.U.A.). Para comparação, a diluição que deu umaabsorbância residual após subtração de fundo de 0,1 foi tomadaarbitrariamente como a titulação dos vários soros.

Em uma abordagem de ELISA similar, avaliou-se a ligação desoros diluídos 100 vezes após imunização com p2GPI humana nativa, alquila-P2GPI, CL-P2GPI e soro pré- imune sobre P2GPI murina imobilizada. Destamaneira, determina-se se as imunizações de camundongos com P2GPI humanaelicitam uma resposta auto-imune humoral contra P2GPI murina.

Resultados

Imunização de camundongos com P2GPI com dobramento incorretoadjuvantada com beta cruzada sem o uso de um adjuvante convencional

Exposição de P2GPI humana nativa a cardiolipina, oualquilação de radicais cisteína em P2GPI induz conformação de proteínasimilar a amilóide (Figura 8A, B).

Imunização de camundongos que receberam quatro injeções de15 μg de antígeno/animal, revelou que alquila-p2GPI e CL-P2GPI elicitourespostas imunes humorais muito maiores do que P2GPI nativa (Figura 8C,D). Isto mostra que adjuvação beta cruzada unicamente por meio dedobramento incorreto de P2GPI acompanhado do aparecimento decaracterísticas similares a amilóide, confere-lhe potencial imunogênico maiselevado. Quando titulações de anticorpos contra auto-P2GPI de camundongoforam avaliadas após imunizações com P2GPI humana nativa, alquila-p2GPI eCL-P2GPI, observou-se claramente que, além do incremento de titulações deanticorpos que se ligam à P2GPI humana nativa, também titulações auto-imunes de anticorpos contra P2GPI murina foram incrementadas quandoestrutura similar a amilóide está presente em P2GPI humana (Figura 8E). Istoproporciona evidência adicional para a compreensão de que propriedadessimilares a amilóide de proteínas são um disparador para imunogenicidade,levando à eliminação. Estrutura beta cruzada é parte de um mecanismo dedefesa dentro da Via Beta Cruzada para eliminação de proteínas obsoletas.Adicionalmente, mostrou-se que a tolerância não é um aspecto decisivo paraverificar se uma resposta imune humoral ocorrerá ou não. É a natureza similara amilóide do antígeno que determina se a porção é considerada perigosa parao indivíduo ou não, e, portanto, se a exposição do indivíduo à porção similar aamilóide deveria ser conquistada adequadamente. Nossos dados mostram que,se a seqüência de aminoácidos subjacente é de auto-origem ou não é de auto-origem, não constitui um parâmetro decisivo primário. Novas abordagens devacinação tornaram-se possíveis com relação ao desenvolvimento de vacinascontra auto-antígenos que desempenham um papel em doenças que nãoinfecções, por exemplo, para indução de anticorpos a LHRH paraimunocastração de javalis, ou para uso na prevenção da doença de enxertoversus hospedeiro (GvH) e/ou rejeições de transplante.

ExemploS 11-14

Materiais e métodos para ensaios de imunização com E2, CL3, H5, H7Clonagem, expressão e purificação de antígenosHemaglutinina-5 da gripe aviária

cDNA de hemaglutinina-5 (H5 ou HA5) da cepa viralA/Vietnam/1203/2004 foi um gentil presente do Dr. L. Cornelissen (ID-Lelystad, Países Baixos). DNA foi amplificado usando-se iniciadores CAI127 e 129 e foi fornecido em um plasmídio. Na instalação de expressão deABC (R. Romijn e W. Hemrika, Universidade de Utrecht, Países Baixos),cDNA de H5 foi amplificado ainda mais usando-se iniciadores 5' ggatccgatcagatttgcattggttacc 3' e 5'gcggccgccagtatttggtaagttcccat 3'. O fragmento dePCR foi ligado no vetor pCR4-TOPO. Análise de seqüências foi realizada naBaseclear (Leiden, Países Baixos). A seqüência de H5 do clone 709-5continha duas mutações silentes (ver Seqüência ID 1; negrito/sublinhado, a->g e t->a). O fragmento de DNA de H5 foi digerido BamHI e NotI, purificadoe ligado em pABC-CMV-dE-dH-sub-optimal_sp-Flag3C-hisC_(pUC) (verSeqüência ID 2; seqüência sinal sub-ótima sublinhada/itálico, marcadorFLAG — marcador His negrito/sublinhado) e marcadores de expressãopABC-CMV-dE-dH-Cistatina_sp-Flag3C- hisC_(pUC) (ABC -instalação deexpressão). Desta maneira, H5 é expressa com um marcador FLAG carbóxi-terminal — marcador His.

Expressão e purificação de H5

Para expressão de proteína H5-FLAG-His, uma cultura de 2litros de HEK293E (rim embrionário humano) células de suspensão foramtransfectadas transientemente com vetor de expressão usando-se polietileno-imina. Células transfectadas foram desenvolvidas durante de 5 a 6 dias. Parapurificação de H5 secretada no meio de cultura de células, as células forampelotizadas e o sobrenadante foi concentrado usando-se um concentradorQuixstand (AJG Technology Corp.), usando-se um filtro com corte de 10 kDa(GE Healthcare).

Realizou-se uma etapa de diálise no mesmo concentrador, e asproteínas foram dialisadas contra PBS/IM de NaCl. O meio concentrado edialisado foi filtrado (0,45 μπι, Millipore) e incubado com pérolas Ni-Sepharose Fast Flow (GE-Healthcare 17-5318-02) na presença de 7,5 mM deimidazol, durante 3 h à temperatura ambiente sob movimento constante. Umacoluna foi enchida com pérolas e as proteínas foram extraídas incrementando-se a concentração de imidazol. A purificação foi realizada em um AKTAExplorer (Pharmacia). Frações com H5 foram combinadas e novamentecarregadas nas pérolas de Ni-Sepharose para purificação adicional. Fraçõescom H5 foram combinadas e dialisadas contra PBS e, subseqüentemente,determinou-se a concentração de H5 usando-se um kit de Reagente de Ensaiode Proteína BCA convencional (Pierce No. 23225). O peso molecular da H5 éde aproximadamente 75 kDa. Solução de H5 combinada (236 μ§/ηι1) foifracionada e armazenada a -80°C (lote 1 CS210406). Uma segunda bateladade proteína de H5 (lote 2 fração X 250506CS) apresentou uma concentraçãode 140 μ^πιΐ em PBS.

H7 de gripe aviária

CDNA de H7 da cepa viral A/frango/Netherlands/621557/03foi um gentil presente do Dr. L. Cornelissen (ID-Lelystad, Países Baixos,BgIII-NotI, amplificado usando-se iniciadores RDSH7'5 e RDS7'3), e foifornecido como um fragmento de PCR. Na instalação de expressão de ABC(R. Romijn e W. Hemrika, Universidade de Utrecht, Países Baixos), ofragmento de PCR de H7 foi amplificado usando-se iniciadores 5'agatctgacaaA(g)atctgccttgggcatcat 3' e 5'gcggccgcaagtatcacatctttgtagcc 3'. Ofragmento de PCR foi ligado em vetor pCR4-TOPO. Análise de seqüênciasfoi realizada na Baseclear. A seqüência de H7 do clone 710-15 continhaquatro mutações, das quais duas resultam em mutações de aminoácidos (verSeqüência ID 3 e 4; a->g, g->a, g->a (Arg->Lys), a->g (Met->Val)). Ofragmento de DNA de H7 foi isolado mediante digestão com BamHI e NotI, eligado em pABC-CMV-dE-dH-sub-ótimo_sp-Flag3C-hisC_(pUC) (verSeqüência ID 4; seqüência sinal sub-ótima sublinhado/itálico, marcadorFLAG - marcador His negrito/sublinhado) e pABC-CMV-dE-dH-Cistatina_sp-Flag3C-hisC_(pUC) vetores de expressão (instalação deexpressão de ABC). Desta maneira, H7 é expressa com um marcador FLAGcarbóxi-terminal - marcador His.

Expressão e purificação de H7

As células de uma suspensão de células de 2 litros forampelotizadas por meio de centrifugação e o pellet de células foi isolado eressuspenso em 25 mM de Tris, 0,5 M de NaCl, pH 8,2 a um volume de 50ml. As células foram congeladas-descongeladas uma vez, e adicionou-secinco Tabletes de Coquetel de Inibidor de Protease (Roche, n° catálogo 11836 170 001) à suspensão de células. A suspensão de células foi sonicadasobre gelo e centrifugada a 21.000*g durante 1 h a 4°C. O sobrenadante foifiltrado (0,45 μιη) e incubado durante 16 h a 4°C sob movimento constante,com pérolas de Ni-Sepharose Fast Flow na presença de 20 mM de imidazol.Após enchimento de uma coluna, H7 foi eluída aumentando-se aconcentração de imidazol. A expressão de H7 foi analisada sobre gel depoliacrilamida usando Coomassie e, em um Western blot usando-se umaproporção de 1:3000 de anti-FLAG-HRP (Sigma A-8592). Frações com H7foram combinadas e dialisadas contra PBS pH 7,4 a 4°C, fracionadas earmazenadas a -80°C. A concentração da solução de H7 combinada foideterminada por meio de densitometria em um Western blot usando-se E2-Flag purificado com uma concentração conhecida para a curva padrão, e foide 10,5 μg/ml (peso molecular da H7 é de aproximadamente 75 kDa (lote 205- 2006CS).

Expressão por células HEK293E e subseqüente purificação de E2

DNA da glicoproteína E2 do vírus da febre suína clássica(CSFV, Classical Swine Fever virus) foi obtido da Geneart (Regensburg,Alemanha, Seqüência ID 5 e 6). A construção foi digerida usando BamHI eNotl, e ligada em vetor pABC674 (Instalação de expressão de ABC), queestenderá o E2 recombinante com um marcador FLAG carbóxi-terminal -marcador His. Células HEK293E foram transfectadas transientemente edesenvolvidas durante de 5 a 6 dias (C. Seinen, University Medicai CenterUtrecht, Países Baixos). Purificação foi substancialmente similar ao métododescrito para H5 e H7. Tamponador de ligação para a coluna de Ni foi 25mM de Tris, 0,5 M de NaCl, pH 8,2. Após diálise das frações combinadascom E2, determinou-se a pureza de gel usando-se o programa ImageQuant(Molecular Dynamics). A pureza de E2 foi de aproximadamente 90 %.Mediu-se a concentração de proteína com o método BCA, e foi de 655 μ^ηιΐem PBS. A concentração de E2 foi de 561 μ^ηιΐ na solução de consumofracionada, que foi armazenada a -80°C (lote 1 210406CS).Expressão por células Sf21 e subseqüente purificação de E2

Glicoproteína E2 recombinante do CSFV também foi expressae purificada para teste de uma nova vacina de E2 adjuvantada com betacruzada contra CSFV. A produção desta E2 foi realizada por R.D. Strangi(TU Eindhoven, Países Baixos) no Grupo de Ciências Animais (ASG [AnimalSciences Group], ID-Lelystad, Países Baixos). Uma fração da linha de célulasde Spodoptera frugiperda (Sf21) cell Iine (P.A. van Rijn, ID-Lelystad, 4) denitrogênio líquido foi rapidamente descongelada a 37°C em um banho deágua. Em seguida, 1,5 ml de cultura de células foi transferido para um frascode 150 cm2 com 27 ml de meio de crescimento pré-aquecido (meio livre desoro SF900-II com L-Glutamina5 Gibco) suplementado com 1 % vol/vol deantibiótico-antimicótico (Gibco, 15240-062), e desenvolvido a 28°C. Culturasde Sf21 foram expandidas subseqüentemente em frascos separados de 150cm2 até se atingir um volume de trabalho de 30 ml de suspensão de células.

Células Sf21 desenvolvidas em meio SF900-II foraminfectadas com baculovírus expressando E2 como descrito por Hulst et ai. (5)a uma múltiplo de infecção (M.O.I., multiple of infection) de 0,01 e incubadaspara 280 horas a 28°C. Em vários momentos, o nível de expressão de E2expressão em meio foi determinado por meio de ressonância de plasmon desuperfície (SPR, surface plasmon resonance), como descrito abaixo. Meio decultura foi eliminado dos fragmentos de células por meio de centrifugaçãodurante 10 minutos a 600xg, e armazenado a 4°C após adição de NaNe a umaconcentração final de 0,02 %.

Ressonância de Plasmon de Superfície com anticorpo anti-E2

Experimentos de ligação com anticorpo anti-E2 e meio decultura de células compreendendo E2 recombinante foram realizados usandoSPR em um instrumento Biacore 3000 (Biacore AB5 Uppsala, Suécia)usando-se um chip de classe de pesquisa CM5. Usou-se um procedimento deacoplamento de amina padronizado para acoplar covalentemente proteínas àsuperfície do sensor, implicando primeira ativação da superfície do dextranodo chip sensor CM5 com uma injeção de 7 minutos de uma mistura a 1:1 de100 mM de N-hidroxisuccinimida (NHS) e 400 mM de N-etil-N'-(dimetil-aminopropil)-carbodiimida (EDC) com uma taxa de fluxo de 5 μΐ/minuto.Anticorpo a-V3anti-E2 (ID- Lelystad) foi diluído a 1:40 em tamponador deacetato pH 5,5 e acoplado covalentemente ao dextrano ativado por meio deuma injeção de 7 minutos a uma taxa de fluxo de 10 μΐ/minuto. Gruposativados remanescentes sobre cada célula de fluxo foram bloqueados por meiode injeção de 35 μΐ de cloridrato de etanolamina 1 M pH 8,5. Dissociação foiiniciada com a substituição da amostra injetada por tamponador de fluxo.Determinou-se as unidades de resposta residuais (RU's [response units]) após2 minutos de dissociação. Tamponador HBS-EP filtrado e desgaseificado(150 mM de NaCl, 2 mM de EDTA, 0,005 % (v/v) de Tween-20, e 10 mM deHEPES, pH 7,4) foi usada como grupo tamponador de fluxo (Biacore). Meiode cultura foi diluído a 1:10 em tamponador de fluxo e determinou-se aligação de E2 a a-V3 imobilizado (não mostrado).

Coluna de afinidade de anticorpo anti-E2 a-V3

Anticorpo a-V3 anti-E2 monoclonal (9 mg/ml, produzido epurificado na ASG, ID-Lelystad) foi dialisado contra 0,1 M de NaHCO3 com0,5 M de NaCl, pH 8,3.

Membrana de diálise (Medicell International Ltd, com umcorte de peso molecular de 12-14,000 Da) foi aquecida durante 30 minutosem água com 2 % (peso/volume) de bicarbonato de sódio e 1 mM de EDTApH 8,0. Subseqüentemente, isto foi fervido durante 10 minutos em 1 mM deEDTA pH 8,0. Anticorpo a-V3 foi dialisado contra 4 litros de NaHCO3 0,1 Mcom 0,5 M de NaCl pH 8,3 a 4°C, que foi renovado quatro vezes ao todo.Anticorpo a-V3 monoclonal dialisado foi acoplado a Sepharose-4B ativadacom CNBr (Amersham Biosciences AB5 Uppsala, Suécia) de acordo com asinstruções do fabricante. Um grama e meio de Sepharose 4B ativada comCNBr foi intumescido em 300 ml de HCl 1 mM durante 15 minutos. Emseguida, as pérolas de Sepharose foram lavadas quatro vezes por meio derápida centrifugação e substituição do sobrenadante por HCl 1 mM fresco.

Anticorpo a-V3 em NaHCO3 0,1 M com NaCl 0,5 M, pH 8,3 foi adicionado eincubado durante 2 horas à temperatura ambiente em um dispositivo derolamento. a-V3 não-ligado foi removido por lavagem com 50 ml deNaHCO3 0,1 M com 0,5 M de NaCl, pH 8,3. Subseqüentemente, quaisquergrupos ativos remanescentes na matriz foram bloqueados com uma incubaçãode 1 hora com 20 ml de glicina pH 8,0. Em seguida, realizou-se três lavagenscom pH alternante (NaHCO3 0,1 M com 0,5 M de NaCl, pH 8,3 seguido de0,1 M de acetato de Na com 0,5 M de NaCl pH 4,0). Por fim, realizou-se umalavagem com 10 ml de glicina 0,1 M pH 2,5, seguido de uma lavar com PBS.Em seguida, a coluna foi armazenada em PBS suplementado com 0,02 %peso/peso de NaN3, a 4°C.

Purificação de E2

Após 280 horas do início da infecção com vírus das célulasSf21 expandidas, o meio de cultura foi recolhido em tubos de 50 ml eeliminado das células e fragmentos de células por meio de centrifugaçãodurante 10 minutos a 600 χ g, e armazenado a 4°C.

Sobrenadante foi separado do pellet de células e adicionou-se0,02 % peso/peso de azida. E2 foi purificado do sobrenadante de cultura decélulas em três operações subseqüentes, como descrito abaixo. Operação 1(lote 1 200406RS): meio de cultura de E2 foi circulado sobre a coluna deafinidade de a-V3 à temperatura ambiente durante 2,5 horas a uma taxa defluxo de 60 ml/hora, seguido de uma lavagem de um dia para o outro comPBS. E2 foi eluído com 0,1 M de glicina pH 2,5. Eluado foi recolhido emfrações de 3 ml e ajustador diretamente em pH 7-8 por meio de adição de 45μΐ de 3 M de Tris-base. Subseqüentemente, as frações contendo proteína E2purificada foram dialisadas contra PBS, e analisadas por meio de SDS-PAGE.Após quantificação de proteína usando o Ensaio de Proteína BCA (Pierce),frações com E2 >95 % puro foram combinadas, e armazenadas a -80°C.Concentração de E2 na fração combinadas foi de 285 μ|*/ηι1 para lote 1200406RS. Uma quantidade adicional de E2 foi extraída do mesmosobrenadante de cultura de células por meio de recirculação sobre a matriz deafinidade de a-V3 (operação 2, lote 2 030506RS). Operação 3 (lote 3100506RS): Uma segunda batelada de meio de cultura de células meio decultura células com E2 expresso foi armazenado primeiro a -80°C e, depois,usado para purificação de E2 como descrito acima.

Primeiramente, meio foi concentrado usando-se 15 ml deconcentradores Macrosep IOK (Pall). O meio de E2 concentrado 3,3 vezes foicirculado sobre a coluna de afinidade à temperatura ambiente durante 5 horas,a uma taxa de fluxo de 60 ml/hora, seguido de lavagem de 5 horas com PBS.Após a primeira etapa de purificação, o meio concentrado foi recarregado nacoluna para uma purificação subseqüente. E2 foi analisado por meio de SDS-PAGE e imuno-manchamento. Amostras foram aplicadas sobre um gel depoliacrilamida a 4-15 % (SDS-PAGE, NUPAGE, Invitrogen). Antes de SDS-PAGE, as amostras foram aquecidas durante 5 min a 950C na presença de 20mM de DTT. Proteínas separadas foram transferidas para proteínas denitrocelulose separadas e proteína E2 foi visualizada com uma incubaçãocom, primeiro, a-V3 e, depois, RAMPO, seguido de manchamento comquimiluminescência (Western Lightning, Perkin-Elmer).

Expressão e purificação de proteína Catepsina L3 de Fasciola hepaticaDNA recombinante de proteína catepsina L3 de Fasciolahepatica (proteína CL3) foi obtido da Geneart (ver Seqüência ID 7). Aconstrução foi digerida usando-se BamHI e NotI, e ligada no vetor pABC674(facilidade de expressão ABC), que estenderá a proteína CL3 recombinantecom um marcador FLAG carbóxi-terminal - marcador His. Após expressãodurante 5-6 dias, células HEK293E pelotizadas de uma cultura em suspensãode 2 litros foram ressuspensas em 25 mM de Tris, 0,5 M de NaCl, pH 8,2 aum volume de 50 ml. As células foram congeladas-descongeladas uma vez, eadicionou-se cinco Tabletes de Coquetel de Inibidor de Protease (Roche n° decatálogo 11 836 170 001) à suspensão de células. A suspensão de células foisonificada sobre gelo e centrifugada a 21.000*g durante lha 4°C. Osobrenadante foi filtrado (0,45 μηι, Millipore) e adicionou-se imidazol a umaconcentração final de 10 mM. A proteína CL3 foi carregada/re-carregadadurante 16 h a 4°C em uma coluna HisTrap HP 1 ml (GE Healthcare 17-5247-01) com uma taxa de fluxo de 0,75 ml/minuto, usando um sistemafechado. CL3-FLAG-His ligado foi eluído com aplicação de um gradiente deimidazol na coluna. A proteína purificada foi visualizada por meio deeletroforese de SDS-PAGE (Invitrogen, NuPage 4-12 % BisTris NP0323)com manchamento Coomassie (Fermentas PageBlue R0571).Adicionalmente, CL3 foi submetido a Western blot seguido de ummanchamento usando anti-FLAG-HRP (Sigma A- 8592) e substrato à base deluminol para detecção catalisada com HRP {Western Lightning Chemi-luminescence Reagent Plus n° de catálogo NEL 104). A pureza de fraçõescombinadas com proteína CL3, dialisadas contra PBS, foi estimada comdensitometria sobre gel manchado com Coomassie, e foi de aproximadamente7,5 %. A concentração de proteína total foi determinada medindo-se aabsorbância a 280 nm e calculando presumindo que uma solução com 1mg/ml de proteína resultará em um valor de absorbância de 1,0. Aconcentração de proteína total foi de 400 μg/ml. Considerando a pureza, aconcentração de proteína CL3 é de aproximadamente 30 μg/ml em PBS. Opeso molecular da proteína CL3 é de aproximadamente 38 kDa incluindo umcarboidrato ligado a N. Solução de proteína foi repartida e armazenada a -8O0C (lote 1 010606CS).

Conjugação de peptídio catepsina L3 de Fasciola hepatica à hemocianinade limpeto buraco-de-fechadura

Para ensaios de imunização peptídio catepsina L3 de Fasciolahepatica (peptídio CL3, Ansynth Service B.V, Roosendaal5 Países Baixos,lote BB1; usou-se a seqüência tomada de cisteína proteinase similar acatepsina L UniProtKB/Sw/ss-iVoí entry www.expasv.org/uniprot/P80528, eestendida com uma cisteína amino-terminal:

CSNDVSWHEWKRMYNKEYNG; Seqüência ID 8). A cisteína amino-terminal foi introduzida para fins de acoplamento com proteína-suporte dehemocianina de limpeto buraco-de-fechadura de maricultura ativada commaleimida Imject (mcKLH, marieulture Keyhole Limpet Haemoeyanin)(Pierce). A conjugação de peptídio CL3 a mcKLH ativada com maleimida foirealizada de acordo com o manual do fabricante. Peptídio CL3 liofilizado foidissolvido em tamponador de conjugação fornecido (contendo 83 raM detamponador de fosfato de sódio, 0,1 M de EDTA, 0,9 M de NaCl, 0,02 % deazida de sódio, pH 7,2) a uma concentração final de 10 mg/ml. mcKLHativada com maleimida foi reconstituída em água destilada a 10 mg/ml. Asduas soluções foram misturadas e incubadas durante 2,5 h. à temperaturaambiente em um dispositivo de rolamento. Após conjugação, os precipitadosformados foram separados do sobrenadante por meio de centrifugação durante10 minutos a ló.OOOxg. O pellet com precipitados foi armazenado sobre gelo.O conjugado em solução foi purificado do excesso de peptídio CL3 livre pormeio de aplicação do sobrenadante em colunas de dessalinização de dextranoD-Salt (corte de peso molecular de 5 kDa, Pierce) com tamponador de fluxocompreendendo 83 mM de fosfato de sódio, 0,9 M de NaCl pH 7,2. Fraçõesde 0,5 ml foram recolhidas e determinou-se a concentração de proteína com ométodo BCA (Pierce). Presença de conjugado foi avaliada com SDS-PAGE/Coomassie e com um ELISA. As frações com conjugado foramcombinadas e o pellet isolado foi dissolvido subseqüentemente nas fraçõescombinadas. Em seguida, conjugado de CL3-KLH foi dialisado contra 4 litrosde PBS. A quantificação de proteína foi realizada usando-se o ensaio deproteína BCA (Pierce) e a suspensão de conjugado foi armazenada a 4°C. Aconcentração de CL3-KLH foi de 1,35 mg/ml. Para o ELISA, concentraçõesseriais de peptídio CL3 livre, EXiH livre e conjugado de CL3-KLH, etambém tamponador de revestimento apenas foram aplicados revestindopoços de uma placa de 96 poços de alta ligação Microlon (Greiner). Apósbloqueio com Reagente de Bloqueio (Roche) poços foram recobertos comsoro anti-CL3 de camundongo diluído 500 vezes (ID-Lelystad, fornecido porJ A. Antonis, código YM30, III Cl 1C7E8') em PBS/0,1 % vol/vol de Tween20.A ligação de anticorpo anti-CL3 foi visualizada usando RAMPO (DAKOCytoination, P0260, lote 00020228)- l,2-fenilenodiamina/H2S04-leitura deabsorbância a 490 nm. A fração de CL3 no conjugado de CL3-KLH foiestimada comparando-se a ligação de anticorpos com aquela obtida com opadrão de peptídio CL3 livre revestido. A relação de CL3 (:) KLH foi deaproximadamente 1(:)1.

Preparação de vacina: Formação de conformação de proteína comdobramento incorreto similar a amilóide compreendendo estrutura beta cruzada

Introdução de conformação de proteína com dobramentoincorreto similar a amilóide nos vários antígenos é obtida usando-se diferentestécnicas de dobramento incorreto. A extensão do dobramento incorreto foiavaliada analisando-se a capacidade de uma solução de antígeno emincrementar a fluorescência de ThT e/ou avaliando-se a capacidade deestimular conversão mediada com tPA de plasminogênio a plasmina.Método do dobramento incorreto I com H5: dobramento incorretotérmico cíclico de H5 misturado com OVA

Estoque de H5 usado para fins de dobramento incorreto 236μ§/πύ de Η5 em PBS lote 1 CS210406, OVA foi dissolvido em solução de H5a uma concentração final de 1 mg/ml. Subseqüentemente, as soluções deH5/OVA foram submetidas a dobramento incorreto térmico cíclico de acordocom o procedimento descrito acima para PorA.

Método do dobramento incorreto Π com H5 de células HEK293E:dobramento incorreto por meio de ciclização térmica com H5 conjugadocom ovalbumina, usando acoplamento de EDC-NHS

O estoque de H5 usado compreendeu: 236 μ§/ηι1 de H5 nativaem PBS lote 1 CS210406. Similar a PorA (ver acima), H5 obtida de célulasHEK293E foi conjugada com OVA. Concentração de H5 e concentrações deOVA foram de 169 μ§/ηι1 e 1000 μg/ml, respectivamente. Após acoplamento,soluções foram dialisadas contra PBS. As soluções foram transferidassubseqüentemente para recipientes de PCR e conjugados foram mal-dobradospor meio de desnaturação térmica cíclica.Método do dobramento incorreto III aplicado a H5: acoplamento depolipeptídio-A a polipeptídio-B por meio de ativação deglutaraldeído/NaBEU

De maneira similar a PorA, para acoplamento de H5 a OVA,ambas as proteínas foram ativadas com glutaraldeído e boroidreto de sódio emisturadas. Para este fim, 250 μg de OVA foram dissolvidos em 1 ml desolução de consumo de H5 e adicionou-se 180 μΐ de PBS. Glutaraldeído(solução a 25 % (v/v) em H2O, Merck, Hohenbrunn, Alemanha, 8.20603.1000(UN2927, tóxico), lote S4503603 549), pré-diluído a uma solução IOOx a 4 %em H2O foi adicionado a uma concentração final de 0,04 %. Após agitaçãocom vórtice e uma incubação de 2 minutos à temperatura ambiente, umasolução 100x 120 mM de NaBH4 (aprox. 98 %, Sigma, St. Louis, MO,E.U.A., S9125, lote 53H3475) foi adicionada a uma concentração final de 1,2mM. A solução foi submetida a agitação suficiente para se obter um vórtice eincubada durante 42 h à temperatura ambiente em um dispositivo derolamento. Em seguida, a solução foi dialisada extensivamente contra PBS. Asolução de conjugado foi aquecida subseqüentemente durante cinco ciclostérmicos como descrito acima.

Método do dobramento incorreto I com H7: dobramento incorretotérmico cíclico de H7 livre ou H7 misturado com OVA

Estoque de H7 usado para fins de dobramento incorreto: 21,4μg/ml de H7 em PBS lote 1 CS210406, solução de H7 foi, ou submetidos adobramento incorreto térmico sem qualquer adição, ou H7 foi mal-dobradatermicamente após dissolução de OVA a uma concentração final de 1 mg/mlna solução de consumo de H7. Dobramento incorreto térmico cíclico foirealizado como descrito para PorA, acima.

Método do dobramento incorreto Π com H7: dobramento incorreto pormeio de ciclização térmica com H7 conjugada com ovalbumina, usando-se acoplamento de EDC-NHS

Estoque de H7 usado para fins de dobramento incorreto: 21,4μg/ml de H7 em PBS lote 1 CS210406. Similar a PorA (ver acima), H7expressa por células HEK293E foi conjugada com OVA. A concentraçãofinal de H7 foi de 10,7 μg/ml, a concentração de OVA foi de 1 mg/ml. Apósacoplamento, a solução de conjugado foi dialisada contra PBS. A solução foitransferida subseqüentemente para recipientes de PCR e o conjugado foi mal-dobrado com desnaturação térmica cíclica, por meio de aplicação de um ciclode 30°C a 85°C a 5°C/minuto, e rapidamente a 4°C.Dobramento incorreto térmico cíclico de E2 de células Sfl

E2 purificada expressa por células Sfl em PBS foi aquecidadurante cinco ciclos em recipientes de PCR em um ciclizador térmico PTC-200 (MJ Research, Inc., Waltham, MA, E.U.A.). Em cada ciclo, proteína foiaquecida de 30 a 85°C a uma taxa de 5°C/min, e rapidamente resinada devolta a 3 0°C antes de iniciar um novo ciclo. Finalmente, E2 desnaturado comcalor foi mantida a 4°C. A concentração final de E2 foi de 280 μg/ml (lote 2030506RS).

Método do dobramento incorreto IV: Reducão-alquilação de radicaisCys em E2 de células Sfl

E2 alquilada é obtida por meio de redução de ligaçõesdissulfeto, seguido de alquilação dos radicais Cys livres formados.Primeiramente, adicionou-se uréia a uma concentração final de 8 M, a 353μg/ml de E2 e isto foi misturado com centrifugação cuidadosa. Em seguida,adicionou-se ditiotreitol (DTT) a uma concentração final de 10 mM. Ar notubo foi substituído por gás de nitrogênio para inibir possível oxidação dascisteínas reduzidas. Em seguida, isto foi incubado durante 2 h. à temperaturaambiente em um dispositivo de rolamento. Subseqüentemente, a solução foiresfriada (sobre gelo) e adicionou-se iodoacetamida (Sigma) a umaconcentração final de 20 mM. Por fim, a E2 alquilada foi dialisada contra 1 1de PBS para 4 horas, seguido de 7 h. contra 5 1 e 9 h. contra 5 1 de PB S. Aconcentração de alquila-E2 após diálise foi determinada usando-se o ensaio deproteína BCA (Pierce), e foi de 167 μg/ml.

Método do dobramento incorreto I com E2 e OVA: dobramentoincorreto por meio de ciclização térmica

Um mg de OVA foi dissolvido em 1 ml de solução de E2 emPBS (concentração de OVA é de 1 mg/ml, concentração de E2 é de 280μg/ml; lote 2 030506RS). Soluções foram submetidas a dobramento incorretotérmico cíclico por meio de aquecimento de 30°C a 85°C em intervalos de5°C/minuto, e resfriamento a 30°C antes do início do ciclo seguinte (5 ciclos).Avaliou-se o incremento da fluorescência de ThT e incremento da atividadede tPA/plasminogênio atividade.

Método do dobramento incorreto II com E2 de células Sfl: dobramentoincorreto por meio de ciclização térmica com E2 conjugada comovalbumina ou KLH, usando-se acoplamento de EDC-NHS

Similar a PorA (ver acima), E2 obtida de células Sfl foionjugada com OVA, ou com KLH. Concentração de E2 e concentrações deOVA foram de 193 μ§/ηι1 e 1047 μ^ηιΐ, respectivamente. Concentrações deE2 e KLH foram de 145 e 631 μ^ηύ, respectivamente. Após acoplamento,soluções foram dialisadas contra PBS. As soluções foram transferidassubseqüentemente para recipientes de PCR e conjugados foram mal-dobradoscom desnaturação térmica cíclica.

Método do dobramento incorreto Π com E2 de células 293E: dobramentoincorreto por meio de ciclização térmica com E2 livre

Como descrito para PorA, E2 purificada de sobrenadante decultura de células HEK293E (lote 1 210406CS, 561 pg/ml em PBS) foisubmetido a dobramento incorreto térmico usando-se um aparelho de PCR.Método do dobramento incorreto II com E2 de células 293E: dobramentoincorreto por meio de ciclização térmica com E2 conjugada comovalbumina ou KLH, usando acoplamento de EDC-NHS

Similar a PorA e a E2 de células Sfl (ver acima), E2recombinante obtida de células HEK293E foi conjugada com OVA.Concentração de E2 e Concentrações de OVA foram de 561 μg/ml e 1 mg/ml,respectivamente. Após acoplamento, soluções foram dialisadas contra PBS.As soluções foram transferidas subseqüentemente para recipientes de PCR econjugados foram mal-dobrados com desnaturação térmica cíclica, (lote 1210406CS, 561 μ^πιΐ em PBS).

Método do dobramento incorreto V: dobramento incorreto de peptídioCL3 livre: dobramento incorreto térmico

O peptídio CL3 livre foi dissolvido a 1 mg/ml em H2O e usadodiretamente para a preparação de vacinas, ou mantido a 65°C ou 37°C durantevários dias antes do uso em vacinas.

Método do dobramento incorreto I com peptídio CL3 e OVA:dobramento incorreto por meio de ciclização térmica

Um mg de OVA e 1 mg de peptídio CL3, ou 1 mg de KLHliofilizado e 1 mg de peptídio CL3 foram misturados em dois recipientesseparados e dissolvidos em 1 ml de PBS (todas as concentrações de proteína /peptídio são de 1 mg/ml). Soluções foram submetidas a dobramento incorretotérmico cíclico por meio de aquecimento de 3 O0C a 850C em intervalos de5°C/minuto, e resfriamento a 30°C antes do início do ciclo seguinte (5 ciclos).Como um controle positivo, 1 mg e 10 mg/ml OVA também foramsubmetidos a dobramento incorreto térmico cíclico. Avaliou-se o incrementoda fluorescência de ThT e incremento da atividade de tPA/plasminogênio.

Método do dobramento incorreto II com peptídio CL3: dobramentoincorreto por meio de ciclização térmica com CL3 conjugada comovalbumina ou ELH, usando-se acoplamento de EDC-NHS

Similar a PorA (ver acima), peptídio CL3 foi conjugada comOVA, ou com KLH. Ambas as concentrações, de peptídio CL3 e de OVA ouKLH foram de 1,28 mg/ml. Após acoplamento, soluções foram dialisadascontra PB S. As soluções foram transferidas subseqüentemente pararecipientes de PCR e conjugados foram mal-dobrados com desnaturaçãotérmica cíclica.

Método do dobramento incorreto I com proteína CL3 e OVA:dobramento incorreto por meio de ciclização térmica

Um mg de OVA foi dissolvido em 1 ml de 30 μg/ml deproteína CL3 em PB S. As soluções foram submetidas a dobramento incorretotérmico cíclico por meio de aquecimento de 3 O0C a 85 0C em intervalos de5°C/minuto, e resfriamento a 30°C antes do início do ciclo seguinte (5 ciclos).Adicionalmente, o estoque de proteína CL3 a30 μg/ml em PBS foi mal-dobrado com ciclização térmica sem adição de proteína. Estoque de proteínaCL3 usado foi o lote 1 010606CS (ver acima).

Resultados

Introdução de estrutura similar a amilóide em antígenosOvalbuminaOVA liofilizada foi dissolvida cuidadosamente deixando-se amesma dobrar corretamente em um estado nativo, com o menor númeropossível de propriedades similares a amilóide. Apesar destes esforços, OVAapresenta características que são uma sinalizador da presença de pelo menosuma fração das moléculas com estrutura beta cruzada, como mostrado pelaativação incrementada com cortante de ThT específico para amilóide e pelaativação incrementada de tPA e plasminogênio (Figura 9A, B). Apósdobramento incorreto térmico cíclico, contudo, sinais representativos daestrutura beta cruzada são muito mais pronunciados com OVA desnaturada(DOVA, Figura 9A, B). Os dados mostrados são medidas representativas paraDOVA mal-dobrada similar a amilóide preparada rotineiramente e OVA comum dobragem mais nativa. As grandes diferenças no teor de beta cruzadatornam o par OVA/DOVA itens interessantes para fins de vacinação. Adiçãode DOVA a um antígeno nativo ou a um antígeno mal-dobrado parcialmentesimilar a amilóide serve como um potente adjuvante de estrutura beta cruzada.H5 para vacina preparação de coquetel

H5 recombinante com um marcador FLAG carbóxi-terminal -marcador His foi expressa e purificada no próprio laboratório. Determinaçãodas propriedades incrementadoras de fluorescência de ThT e propriedades deativação de tPA/plasminogênio revelaram que a H5 purificada não-tratada jácompreende algumas proteína com dobramento incorreto similar a amilóide(Figura 9C, D, E). No lote 1 210406CS de H5 parte das propriedadesativadoras de tPA são detectadas. Com H5 lote 2 a fração X 250506CS deavaliação das propriedades ativadoras de tPA/plasminogênio foi prejudicadadevido à presença de atividade convertedora de substrato de plasmina nasolução de H5, quando tPA foi omitido da mistura de reação. Quando daciclização térmica de H5 misturada com OVA ou H5 conjugada com OVAusando-se EDC/NHS, fluorescência de ThT é fortemente incrementado,mostrando um incremento do teor de estrutura beta cruzada na solução deantígeno de H5, em comparação com H5 não-tratada (Figura 9E). Aspreparações de H5 não foram só usadas para a preparação da vacina decoquetel de camundongo com E2, CL3 e H7, mas também foram usadas paraimunização de camundongos com H5 monovalente.H7 usada para vacina preparação de coquetel

H7 recombinante da cepa A/Netherlands/219/03 {ProteinSciences Corp.) foi usado como uma fonte de antígeno não-tratado parapreparação de uma vacina de coquetel juntamente com E2, H5, CL3, OVA.No entanto, nós detectamos alguma propriedade incrementadora dafluorescência de ThT com a H7 não-tratada, e também a ativação detPA/plasminogênio foi incrementada por meio de introdução da H7 na misturade reação (Figura 9F, G). Estes resultados mostram a presença de pelo menosuma pequena fração de moléculas de H7 com estrutura beta cruzada. NaFigura 9H e I mostra-se o incremento da fluorescência de ThT com H7 nativarecombinante produzida próprio laboratório, mistura termicamente mal-dobrada de 7 e OVA, e conjugado de H7-OVA mal-dobrado termicamente,obtido por meio de acoplamento de EDC/NHS, e também a influenciada sobrea atividade de tPA. Para o ensaio de ThT, soluções de consumo de H7 foramdiluídas dez vezes. No ensaio de atividade de tPA/plasminogênio usou-se H7a 1 μg/ml. Os ensaios mostram um incremento do teor de estrutura betacruzada quando da misturação ou conjugação com OVA, seguido deciclização térmica.

E2 expressa em células HEK293E para uso em uma vacina de coquetel

Proteína E2 recombinante de CSFV foi expressa no própriolaboratório em células HEK293E e purificada de sobrenadantes de cultura decélulas, e usada em ensaios de imunização de camundongo. E2 purificada foisubmetida a dois métodos de dobramento incorreto: ciclização térmica entree 85°C com a E2 livre, ou ciclização térmica após conjugação de E2 comOVA, usando-se acoplamento de EDC/NHS. Na Figura 9J, observa-seclaramente um incremento da fluorescência de ThT quando se usa os métodosde dobramento incorreto. A influenciada sobre a atividade de tPA não pôdeser avaliada devido à atividade convertedora de substrato na solução de E2purificada, indicativo da presença de quantidades em traços de proteasesimilar a plasmina. Diferenças observadas entre E2 não-tratada e E2 mal-dobrada, na potência para incrementar a fluorescência de ThT mostramclaramente o incremento no teor de estrutura beta cruzada quando se aplica osprocedimentos de dobramento incorreto.

Peptídio CL3 usado para incorporação em uma vacina de coquetel

O fragmento de CL3 de 19 radicais de aminoácidos e umaextensão Cys amino-terminal para fins de acoplamento foi submetido a váriosmétodos de conjugação proteína-proteína e, subseqüentemente, a métodos dedobramento incorreto de proteína. Na Figura 9K e L mostra-se que todas aspreparações de peptídio CL3 compreendem conformação de estrutura betacruzada até certo grau, quando se refere à propriedade de incrementar afluorescência de ThT e estimular adicionalmente tPA/plasminogênio. Mesmoo peptídio livre compreende estrutura beta cruzada após dissolução em H2O.

Em um ensaio de ativação de tPA/plasminogênio, peptídioCL3 recentemente dissolvido e peptídio incubado a 650C são ativadores detPA os mais potentes, enquanto que incubações à temperatura ambiente ou a37°C resultam em uma menor ativação do teor de estrutura beta cruzada (Figura10D). A concentração de peptídio no ensaio foi de 200 μg/ml. Peptídios foramincubados no escuro durante vários dias nas temperaturas indicadas.Antígeno de H5 beta cruzada para exposições a vírus de H5N1

A solução de consumo de H5 não-tratada para preparação deH5 mal-dobrado e para uso em preparações de vacina foi a solução deconsumo de H5 recombinante a 236 μg/ml em PBS (lote 1 210406CS, cepaA/Vietnam/1203/2004) para a primeiro vacinação e a solução de 140 μg/mlde H5 em 25 mM de Tris pH 8,2, 500 mM de NaCl (lote 2 fração X240506CS) para a segunda vacinação. H5 com conformação de proteína comdobramento incorreto similar a amilóide foi obtida, em ambos os lotes de H5,por meio de aplicação de métodos de dobramento incorreto I-III (ver acima).Na Figura 10A, o incremento da fluorescência de ThT é mostrado quando setesta 24 μg/ml de H5 de cada uma das quatro soluções de consumo. Está claroque as modificações introduzem um incremento significativo no teor deestrutura beta cruzada em todas as três preparações de H5 mal-dobrada,quando comparado com H5 não-tratada.

Antígeno de E2 de beta cruzada para exposições a CSFV

Para uma primeira vacinação contra CSFV usou-se E2 não-tratada, E2 mal-dobrada por via térmica cíclica (Método I) e alquila-E2(Método IV) (lote 1 200406RS, 285 pg/ml em PBS). A presença de estruturabeta cruzada em alquila-E2 (Método do dobramento incorreto IV) e E2 mal-dobrada por via térmica cíclica (Método do dobramento incorreto I) émostrada pela fluorescência fortemente incrementada de ThT e o incrementoda ativação de tPA/plasminogênio (Figura 10B, C).

Para a segunda imunização usou-se novamente E2recombinante expressa por células Sfl, agora do lote 2 030506RS, 280 μg/mlem PBS. E2 foi mal-dobrada usando-se quatro métodos de dobramentoincorreto: desnaturação térmica cíclica de E2 livre (Método I), de E2 napresença de OVA (Método I), de conjugado de E2-OVA obtido por meio deacoplamento de EDC/NHS (Método II) e de conjugado de E2-KLH tambémobtido por meio de acoplamento de EDC/NHS (Método II). Estas preparaçõesmal-dobradas de E2 - beta cruzada foram misturadas a 1:1:1:1 antes daincorporação em formulações de vacina.

Exemplo 11

Imunização de camundongos com um coquetel de vacina compreendendoantígeno E2 da Febre Suína Clássica, proteína e peptídio de catepsina L3de antígeno de Fasciola Hepaticai hemaglutinina 5 de antígeno da gripeaviária e hemaglutinina 7 do antígeno da gripe aviária, juntamente comovalbumina

Estudo dose-resposta e um teste para a imunogenicidade de antígenoadjuvantado com estrutura beta cruzada

Objetivo

Determinação de se antígeno E2 da Febre Suína Clássica,proteína e peptídio de catepsina L3 de antígeno de Fasciola hepatica,hemaglutinina 5 de antígeno da gripe aviária e hemaglutinina 7 do antígeno dagripe aviária, juntamente com antígeno de OVA com conformação de proteína mal-dobrada similar a amilóide, combinados em uma vacina decoquetel, elicitam titulações de anticorpos sem o uso adicional de umadjuvante: Adjuvação por meio de estrutura beta cruzada, i.e. com proteínascompreendendo propriedades amilóides, como definido aqui. Portanto, sorosde camundongo foram analisados no dia 28 após a imunização paradeterminação de titulações de anticorpos contra antígenos individuais.

Soluções de consumo de antígeno

Soluções de proteína usadas para vacinação

I. Ovalbumina (albumina de ovo de galinha, OVA, Sigma;número de catálogo A5503) a 1 mg/ml em PBS foi preparada recentemente(dissolvida por meio de pipetação; 30 minutos em um dispositivo derolamento à temperatura ambiente; lha 37°C; 1 h de dispositivo derolamento à temperatura ambiente; 4°C de armazenamento)

II. OVA mal-dobrada similar a amilóide (DOVA) a 1 mg/mlem PBS foi obtida de acordo com o protocolo de desnaturação com calorcomo descrito acima.

III. Peptídio de catepsina L3 (Ansynth Service B.V.,Roosendaal, Países Baixos, lote BB1; seqüênciaCSNDVSWHEWKRMYNKJEYNG (peptídio CL3 com extensão Cys amino-terminal)) foi dissolvido a 1 mg/ml em PBS e mantido a 4°CIV. Conjugado de KLH-peptídio CL3 mal-dobrado similar aamilóide foi obtido por meio de desnaturação com calor (concentração doconjugado é de 1,35 mg/ml em PBS; aproximadamente 50 % de peptídioCL3) lote 1 05-2006RS (ver acima)

V. Proteína CL3 (30 pg/ml em PBS) lote 1 010606CS (ver acima)

VI. Proteína CL3 desnaturada com calor similar a amilóide (30μg/ml em PBS) lote 1 010606CS

VII. Conjugado de OVA - proteína CL3 mal-dobrada similar aamilóide, desnaturado com calor (30 μ§/ηι1 em PBS) lote 1 010606CS

VIII. E2 (561 μg/ml em PBS) lote 1 210406CS (ver acima)

IX. E2 mal-dobrada similar a amilóide desnaturada com calor(561 ng/ml em PBS) lote 1 210406CS

X. Conjugado de OVA - E2 mal-dobrado similar a amilóide,desnaturado com calor (561 μg/ml em PBS) lote 1 210406CS

XI. H5 (236 μ^πιΐ em PBS) lote 1 210406CS

XII. Mistura de proteína de H5 e OVA mal-dobrada similar aamilóide, desnaturada com calor (140 μg/ml em PBS) lote 2 fração X 250506CS

XIII. Conjugado de OVA-H5 mal-dobrado similar a amilóide,desnaturado com calor (143 μg/ml em PBS) lote 2 fração X 250506CS

XIV. Estoque I de H7 (10,5 μ§/πύ em PBS) lote 2 05-2006CS(ver acima)

XV. Mistura de proteína de OVA e H7 mal-dobrada similar aamilóide, desnaturada com calor (10,5 μg/ml em PBS) lote 2 05-2006CS

XVI. Conjugado de OVA-H7 mal-dobrado similar a amilóide,desnaturado com calor (10,6 μg/ml em PBS) lote 2 05-2006CS

XVII. Estoque II de H7, 603 pg/ml (A/Netherlands/219/03,Protein Sciences Corp., Meriden, CT, E.U.A.; número de catálogo 3006, lote112305, tamponador: 10 mM de Na-HPO4, pH 7,0, 150 mM de NaCl)Montagem experimental: preparação de vacina e vacinação

Para a preparação de doses de vacinas de coquetel, preparou-seduas soluções; 1. 20 μ§/ηι1 de cada um dos antígenos não-adjuvantados, 2. 2μ§/ιη1 de H7 mal-dobrada e 19 μ§/ιη1 de cada um dos outros antígenosadjuvantados com beta cruzada. Os estoques de coquetel de 2 μ£/πύ deantígeno foram preparados por meio de diluição de décupla destes estoques(solução 3. e 4.). As vacinas com 10 μg/ml de antígeno não-adjuvantado / 10μg/ml de antígeno adjuvantado com beta cruzada e com 1 μg/ml de antígenonão-adjuvantado / 1 μg/ml de antígeno adjuvantado com beta cruzada, forampreparadas por meio de misturação na proporção de 1:1 de soluções 1. e 2., ou3. e 4., respectivamente (solução 5. e 6.).

Solução 1.

Antígenos I, III, V, VIII, XI e XVII em PBSSolução 2.

Antígenos Π, IV, VI, VII, IX, Χ, XII, XIII, XV e XVI em PBS

Para imunizações usou-se camundongos GAnNHSd/BalBfêmeas com de 7 a 9 semanas de vida (BalB/C, Harlan; seis grupos de cincocamundongos) (Animal Facility 'Gemeenschappelijk Dierenlaboratorium'GDL, Utrecht University, Países Baixos). Após aproximadamente umasemana de adaptação ao ambiente extraiu-se sangue para coleta de soro pré-imune no dia -4. No dia 0 cada camundongo recebeu uma vacinação injetadasubcutaneamente de 500 μΐ de acordo com o esquema a seguir:

<table>table see original document page 98</column></row><table>Determinação de titulação de anticorpos anti-antígeno com ELISA

Como soros obtidos no dia 21 após a vacinação, titulações deanticorpos desenvolvidas contra cada um dos componentes do coquetel devacina foram avaliadas empregando-se técnicas de ELISA convencionais. Oprotocolo foi como descrito para o conjugado de CL3-KLH. Para cada grupode camundongos a-f, soros foram combinados e preparou-se diluições seriaisem PBS/0,1 % Tween20. Antígenos revestidos são dados abaixo. Diluiçõesseriais de anticorpos de controle reconhecendo peptídio CL3, E2, H5 ou H7são usadas como controle positivo nos ELISAs. H5 e H7 foram revestidas a2,5 μg/ml, solução de consumo de E2 de Cedi-Diagnostics foi diluída 100vezes antes do revestimento, peptídio CL3 foi revestido a 10 μg/ml.

Soluções de proteína usadas como antígeno em ELISAs de titulação deanticorpos

- antígeno E2 liofilizado, reconstituído de acordo com arecomendação do fabricante (Ceditest CSFV, Cedi-Diagnostics B.V.,Lelystad, Países Baixos)

- H5, 83 μg/ml de H5 (A/Vietnam/1203/2004(H5N 1), ProteinSciences Corp., Meriden, CT, E.U.A.), número de catálogo 3006, lote 45-05034RA-2, tamponador: 10 mM de Na-HPO4, pH 7,0, 150 mM de NaCl

- H7, 603 μ^ιηΐ de H7 (A/Netherlands/219/03, ProteinSciences Corp., Meriden, CT, E.U.A.), número de catálogo 3006, lote 112305,tamponador: 10 mM Na-HPO4, pH 7,0, 150 mM de NaCl

- peptídio CL3 (fração a 4°C, lote BB1, Ansynth Service B.V.,Roosendaal, Países Baixos) NH2 - CSNDVSWHEWKRMYNKEYNG -COOH (peptídio CL3 com extensão Cys N-terminal)

- OVA, 10 mg/ml em PBS (estoque 060613NH-4°C; númerode catálogo A-5503, lote 14H7035, Sigma)

- DOVA, 10 mg/ml em PBS (estoque 060613NH-4°C),desnaturada com calorMateriais usadas para ELISAs de titulação

- placas de ELISA Microlon de alta ligação (Greiner, númerode catálogo 655092)

- tamponador de revestimento: 50 raM de NaHCO3, pH 9,6

- Reagente de Bloqueio (Roche, número de catálogo 11112589001)

- tamponador de lavagem: 50 mM de Tris, 150 raM de NaCl, - 0,1 % Tween20, pH 7,3

- soros de camundongo de animais individuais, coletados nodia -4 e dia 28 após a vacinação

- soro de camundongo anti-H5Nl ('ID-Lelystad (Dr L.Cornelissen) H5N1, gr5, 40106, 2.02.24150.00, nd2579jet, 180 μΓ) -> soroanti-H5 de controle

- anticorpo anti-E2, conjugado com HRP (Art. 7610384, lote- 06C052, Cedi Diagnostics Β. V., Lelystad, Países Baixos)

- soro anti-CL3, camundongo (ID-Lelystad (A. Antonis)YM30 III, cllc7e8) -> soro anti-CL3 de controle

- albumina de ovo (OVA) anti-galinha de fluido de ascites decamundongo, clone OVA- 14, IgGl, (Sigma, A6075, lote 074K4768 ->ascites anti-OVA de controle

- soro anti-H7N7 de camundongo ('muis-anti-H7N7, dpi: 14groep 6, 040106', ID-Lelystad, Dr L. Cornelissen) -> soro anti-H7 de controle

- tamponador de ligação: 140 mM de cloreto de sódio, 2,7 mMde cloreto de potássio, 10 mM de hidrogênio fosfato de sódio, 1,8 mM dediidrogênio fosfato de potássio, pH 7,3 (PBS) com 0,1 % de Tween20

- imunoglobulinas anti-camundongo de coelho conjugadascom peroxidase (RAMPO, P0260, DAKOCytomation, Glostrup, Dinamarca)

- PBS

- H2O2: 35 % vol/vol (Merck, Darmstadt, Alemanha)- OPD: 1,2-fenilenodiamina (Merck, número de catálogo1.07243.0050, lote L937543-84)

- citrato/fosfato tamponador pH 5,0

- 10 % vol/vol H2SO4 em H2O

- espectrofotômetro Spectramax para leituras A490nm

Resultados

Titulações anti-antígeno em soros de camundongos no dia 28 após avacinação

Camundongos Balb/c foram imunizados com uma vacina decoquetel com 1 ou 10 μg de antígenos/animal. O coquetel continha E2, CL3,H5, H7 e OVA, e/ou contrapartes mal-dobradas similares a amilóide.Diferenças no teor de estrutura beta cruzada entre as vacinas para os seisgrupos de camundongos são ilustradas na Figura 11. A propriedade deincrementar a atividade de tPA/plasminogênio foi avaliada com coquetéis deantígeno compreendendo 20 ug/ml de cada um dos antígenos, com 0, 50 e 100% de conformação de proteína com dobramento incorreto similar a amilóide,respectivamente. Estes teores relativos de proteína com dobramento incorretosão refletidos na capacidade de ativar tPA, que segue a mesma ordem. Que asolução de coquetel de antígeno não-tratada a 100 % também ativa tPA atécerto grau é explicada pelo fato de que pelo menos peptídio não-tratado CL3,H5 e OVA apresentam algumas características da presença de um pequenoteor de estrutura beta cruzada mesmo sem tratamento para induzir referidascaracterísticas. A mesma ordem de sinais, como se vê no ensaio de ativaçãode tPA, é observada com diluições de 10 vezes dos coquetéis em ensaios devermelho Congo e fluorescência de ThT (Figura 11B, C).

Com soros de camundongo combinados que foram coletadosno dia 28 após a vacinação, determinou-se na montagem de ELISA descrita astitulações contra cada um dos antígenos não-tratados individuais presentes navacina de coquetel. Adicionalmente, titulações contra DOVA também foramtestadas para verificar se são capazes de analisar a eficácia da OVAadjuvantada com estrutura beta cruzada mal-dobrada similar a amilóide.

Não se encontrou titulações nos soros contra peptídio CL3livre revestido ou contra H5 não-tratado. Titulações serão analisadasnovamente pelo menos 14 dias após os camundongos terem recebido umasegunda dose dos antígenos, o que pode, neste caso, ser necessário para seobter uma titulação detectável.

Titulações similares foram desenvolvidas contra H7 nãotratada e a mistura a 1:1 de H7 não-tratada e H7 adjuvantada com betacruzada, em ambas as doses de 1 e 10 μg/animal (mostrado para a dose de 10μg/animal na Figura 12A). A presença de uma quantidade razoável demoléculas de H7 com conformação de estrutura beta cruzada similar aamilóide na solução de consumo de H7 não-tratada (ver Figura 9F, G) explicaa imunogenicidade observada.

Quando titulações desenvolvidas contra antígeno de E2revestido são determinadas após uma vacinação de dose única, camundongosque receberam 5 ou 10 μg de E2 adjuvantada com beta cruzada, expresso emcélulas HEK293E, desenvolveram uma titulação (Figura 12B).

Aparentemente, após uma dose única, nenhuma titulação é elicitada quandocamundongos são vacinados com 1 μg de E2/animal apenas. E interessanteobservar que, quando camundongos são imunizados com E2 mal-dobrada 100% similar a amilóide expresso em células HEK293, compreendendo umaextensão marcador FLAG carbóxi - marcador His (grupo c), desenvolve-seainda uma titulação de anticorpo contra a E2 não-tratada expressa em célulasSfl. Estas observações demonstram o uso benéfico da adjuvantação por meioda tecnologia de estrutura beta cruzada. Importante observar que sem o uso deum adjuvante, nenhuma titulação foi elicitada quando se usou E2 não-tratadacomo o antígeno. Com E2 beta cruzada adjuvantada a 50 ou 100 %desenvolveram-se, contudo, titulações, sem o uso de um adjuvante. Nos seiscoquetéis de antígeno, inclui-se OVA devido a suas característicasimunogênicas. Grupo a e d contêm 20 e 2 μg de OVA/ml, grupo c e f contêm20 e 2 μg/ml de DOVA e uma quantidade adicional de DOVA devido ao usode conjugados OVA-antígeno mal-dobrados. Dos experimentos mostrados naFigura 9A e B já foi possível aprender que OVA compreende uma quantidaderelativamente pequena, embora não desprezível, de estrutura beta cruzada,quando comparado com DOVA. Dos ensaios de imunização, aprende-seagora que esta pequena quantidade não pode elicitar uma titulação anti-OVAou anti-DOVA (Figura 12C, D). Em contraste, DOVA em coquetéis de vacinab, c e e elicita ambas as titulações, anti-DOVA e anti-OVA. Está claro que seobtém uma titulação mais potente contra OVA, quando OVA é parte docoquetel de antígeno (grupo b comparado com grupo c; grupo e comparadocom grupo f (nenhuma titulação). Quando se usa 10 ou 20 μg/ml de DOVA,atinge-se titulações mais altas do que com 1 ou 2 μg/ml de DOVA. Estasobservações mostram que DOVA compreendendo teor incrementado deestrutura beta cruzada, é um estimulador mais potente de imunogenicidade doque OVA, que só contém um teor menor de estrutura beta cruzada.Adicionalmente, está claro que OVA sozinha não elicita uma titulação contraOVA ou DOVA, enquanto que quando DOVA e OVA são combinadas,obtém-se as titulações mais altas contra ambas as ocorrências do antígeno.Quando se compara as titulações desenvolvidas com coquetel de antígeno a ec, está claro que a formação de conformação de proteína com dobramentoincorreto similar a amilóide compreendendo estrutura beta cruzada em OVA ésuficiente para desenvolver titulações anti-antígeno, sem o uso de umadjuvante. Isto proporciona evidência direta para a propriedade adjuvante deestrutura beta cruzada e a tecnologia de 'adjuvantação por meio de estruturabeta cruzada1. Isto consubstancia o potencial imunogênico da conformação deestrutura beta cruzada, que pode ser adotada virtualmente por qualquerpolipeptídio, irrespectivamente da seqüência de aminoácidos ou docomprimento da seqüência. Mais especificamente, este exemplo deOVA/DOVA demonstra que a combinação de antígeno não-tratado comantígeno beta cruzada proporciona um estimulador potente do sistemaimunológico.

Exemplo 12

Adjuvantação de estrutura beta cruzada de uma vacina desubunidade de H5 e vacina de subunidade de H7 induz maiores titulações deanticorpos e vacinação de H5 de beta cruzada protege camundongos contraexposição a dose letal de vírus da gripe aviária (AIV) H5N1

Estudo de vacinação de camundongos com uma vacina desubunidade de H5

Objetivo

Determinação de se uma vacina de subunidadecompreendendo antígeno de H5 do AIV com conformação de proteína comdobramento incorreto similar a amilóide (H5 adjuvantada com estrutura betacruzada) elicita titulações de anticorpos e protege camundongos contra umaexposição ao AIV H5N1.

Introdução

Influenza, em particular influenza causada por influenza desubtipo A (H5N1) impõe uma ameaça pandêmica importante. Por esta razão,manter a saúde pública requer prevenir ou tratar a disseminação e infecçãocom AIV, em particular H5N1. A chave para se atingir estes objetivos é odesenvolvimento de vacinas seguras e efetivas. Há dois gêneros de vírus deinfluenza: um incluindo os vírus de influenza A e B, e o outro os vírus deinfluenza C. Influenza B e C são vírus humanos, enquanto que influenza Areplica e circula em uma ampla faixa de hospedeiros aviários e mamíferos.Destes, os vírus de influenza A geralmente causam os problemas mais sérios,tanto economicamente como em termos de saúde humana. Vírus de influenzaA apresentam genomas segmentados de RNA de sentido negativo defilamento simples, que são encapsulados por uma nucleoproteína codificadaviralmente. O vírus codifica dois importantes antígenos de superfície viral,glicoproteína de hemaglutinina (HA ou H) e neuraminidase (NA ou N). Osantígenos de superfície viral HA e NA são classificados sorologicamente emsubtipos; até hoje identificou-se 15 subtipos HA e 9 NA na natureza. Todos ossubtipos circulam ubiqüamente em aves aquáticas selvagens, como patos, eestes hospedeiros aviários proporcionam o reservatório natural par todos osvírus de influenza A. Nestas espécies, infecções localizam-se geralmente notrato intestinal, e altas concentrações de vírus são desprendidas nas fezes semcausar doença. A HA é responsável pela ligação de partículas de vírus areceptores de superfície celular contendo ácido siálico e, após endocitose, pelamediação de fusão das membranas viral e celular. É uma glicoproteína demembrana de tipo I contendo uma seqüência-sinal que é removida após atradução, um domínio de âncora de membrana próximo da ponta carbóxi, euma curta cauda citoplasmática. A HA é sintetizada como um precursor deaproximadamente 75 kDa que se associa não-covalentemente como homo-trímeros. Os polipeptídios precursores são clivados, após a tradução, em umradical arginina conservado, em duas subunidades, que são ligadas por umaúnica ponte dissulfeto. HA é o principal antígeno de vacina.

Portanto, até o presente, todas as vacinas de influenzacorrentemente licenciadas são geradas em ovos de galinha embrionados.Diversas desvantagens bem reconhecidas do uso de referidos ovos como osubstrato para a produção de vacina de influenza incluem a vulnerabilidadepotencial do suprimento de ovos, o longo tempo requerido para aumentar aescala da produção de ovos, e a necessidade de adaptar novas variantes paracrescimento de alto rendimento em ovos, um processo que pode ser demoradoe nem sempre bem sucedido. Adicionalmente, crescimento em ovos poderesultar na seleção de variantes de receptor que podem ser não ser ótimas paraa proteção contra cepas circulantes. Além disso, estudos recentes em humanosindicaram que uma abordagem usando uma vacina de influenza A desubvírion (H5N1) inativada pode resultar em respostas de anticorpo no soro,incluindo a formação de anticorpos neutralizadores, mas mostraram que aresposta foi incompleta e requer quantidades substanciais de antígeno ' . Afreqüência de resposta de anticorpo foi a maior entre sujeitos que recebemdoses de 45 μg ou 90 μg. Entre aqueles que receberam duas doses de 90 μg,titulações de anticorpos de neutralização atingiram 1:40 ou mais de 54porcento, e titulações de inibição de hemaglutinação atingiram 1:40 ou maisde 58 porcento. Titulações de neutralização de 1:40 ou maiores foramobservadas em 43 porcento, 22 porcento, e 9 porcento dos sujeitos querecebem duas doses de 45, 15, e 7,5 μg, respectivamente. Não se observourespostas em pacientes de placebo. Portanto, vacinas de influenza precisamser aperfeiçoadas.

Um método alternativo para a produção de vacina de influenzaé a expressão do antígeno de vacina principal, HA, por meio de técnicas deDNA recombinante. Em um estudo recente, avaliou-se uma vacina desubunidade contendo uma HA (H1 e H3), derivada de subtiposA/Panama/2007/99 (H3N2), A/New Caledonia/20/99 (H1N1), e B/HongKong/33 0/2001, e produzida em células de insetos por meio de umbaculovírus recombinante 8. Esta alternativa evita a dependência de ovos, e aexpressão eficiente de proteína, neste caso usando um sistema de expressão debaculovírus. Vacina de HA expressa em baculovírus foi segura e, comparadacom vacina de influenza inativada trivalente, induziu melhores respostas deanticorpo no soro ao componente H3 quando administrada em doses de 45 μgou 135 μg de cada HA. Ainda assim, mesmo quando se administrou 135 μg, onúmero de responsores não foi completo (entre 16 e 88 %, dependendo dosubtipo e da quantidade de vacina administrada). Estes estudos usaramvacinas sem adjuvante, porque não há adjuvante bom para uso com umavacina de influenza.O objetivo do presente estudo foi avaliar se adjuvantação deuma vacina de subunidade de HA com estrutura beta cruzada resulta emmelhor imunogenicidade, e se referida vacina protege camundongos daexposição ao AIV H5N1.

Materiais e métodos

Imunização

Usou-se oitenta e oito camundongos Balb/C fêmeas.Camundongos foram alojados nas instalações de ID-Lelystad, Países Baixos.Os camundongos tinham aproximadamente seis semanas [de vida] no iníciodo estudo. Camundongos foram alocados randomicamente a um grupo devacina ou grupo de controle, cada um dos 11 grupos compreendia oitoanimais. O animais foram deixados com comida (2185 RMH/B) e bebida à vontade.

Para imunizações de camundongos com H5 não-tratada esolução de consumo de H5 de beta cruzada usada para formulação de vacina,a solução de consumo de H5-beta cruzada usada para formulação de vacinafoi o estoque de H5 recombinante a 236 μg/ml em PBS (lote 1 210406CS,cepa A/Vietnam/1203/2004) para a primeira vacinação, e a solução de H5 a140 μg/ml em 25 mM de Tris pH 8,2, 500 mM de NaCl (lote 2 fração X240506CS) para a segunda vacinação. Para formulações de vacina usou-setrês preparações de H5 mal-dobrada similar a amilóide numa relação a 1:1:1(ver abaixo). Para cinco grupos de camundongos (oito animais em cadagrupo), formulou-se as seguintes preparações, para doses de 5 μg H5/animal:

-> grupo 2, H5 não-tratada a 100 %

-> grupo 3, H5 não-tratada a 67% H5 / H5 mal-dobrada a 33 %

-> grupo 4, H5 não-tratada a 33 % / H5 mal-dobrada a 67 %

-> grupo 5, H5 mal-dobrada a 100 %

Para imunizações de camundongos com vacina de H7 desubunidade de gripe aviária, vacinas foram formuladas usando-se H7 lote 2(160506CS, 10,5 μ§/πι1 em PBS). Para formulações de vacinacompreendendo H7 mal-dobrada similar a amilóide, usou-se a H7 de betacruzada obtida com métodos de dobramento incorreto I e II. H7 livre foi mal-dobrada, e também H7 misturada com OVA e H7 conjugada com OVAusando-se acoplamento de EDC/NHS.

No dia 0 e 21 os camundongos foram imunizadossubcutaneamente com 0,5 ml de amostra de teste, na nuca (dia 0) e do ladoesquerdo (dia 21). Grupo TOl (controle, #1.1-1.8) recebeu amostra de teste 1(água, placebo), grupo T02 (#2.1-2.8) recebeu amostra 2 (5 μg de H5 não-tratada), grupo T03 (#3.1-3.8) recebeu amostra 3 (H5 não-tratada combinadacom 33 % de H5 de beta cruzada modificada com o método I, II, III), grupoT04 (#4.1-4.8) recebeu amostra 4 (H5 não-tratada combinada com H5 de betacruzada a 66 % modificada com o método I-III), grupo T05 (#5.1-5.8)recebeu amostra 5 (H5 de beta cruzada a 100 % modificada com o método I-III), grupo T06 (#6.1-6.8) recebeu amostra 6 (0,5 μg de H7 não-tratada),grupo T07 (#7.1-7.8) recebeu amostra 7 (H7 não-tratada combinada com H7modificada com beta cruzada a 33 % modificada com o método I, II), grupoT08 (#8.1-8.8) recebeu a amostra 8 (H7 não-tratada combinada com H7 debeta cruzada a 33 % modificada com o método I, II), grupo T09 (#9.1-9.8)recebeu amostra 9 (H7 de beta cruzada a 100 % modificada com o método I,II), grupo TlO (#10.1-10.8) recebeu amostra 10 (vacina, Gallimune® FLUH5N9, lote F38785C, compreendendo vírus da gripe aviária inativado (H5N9,cepa A/Turkey/Wisconsin/68) e grupo Tll (#11.1-11.8) recebeu amostra 11(H7 não-tratada adjuvantada com Specol). No caso de H5, em todos os casosadministrou-se 5 μg de H5 ao todo (não-tratada combinada com modificada)em PBS. No caso de H7, em todos os casos administrou-se 0,5 μg de H7 aotodo em PBS.

Exposição

No dia 24, camundongos (grupos TO1, T03 e TIO) foramexpostos por meio de inoculação intranasal com 50 μΐ compreendendo umadose de 20 LD50 (2* IO5 TCID50/ml) de AIV H5N1 A/156/97/HK.

Avaliação e exame

Durante o curso de todo o estudo, os animais forammonitorados uma vez por dia (escore clínico de 0-4, mortos, sendo que (O) édefinido como saudável, (1) é definido como um pelo áspero, vital, (2) peleáspera, enrolada, menos reativa, passiva durante o manuseio, (3) é definidocomo pêlo áspero, enrolado, respiração acelerada, menos reativa, passivadurante o manuseio, e (4) é definido como pelo áspero, enrolado, respiraçãoacelerada, menos reativa, passiva durante o manuseio, incapaz de virar-sequando deitado de costas). O escore total foi obtido multiplicando-se o escorepelo número de animais por este escore. O número de animais que sofrem deproblemas respiratórios foi calculado contando-se o número de animais emcada grupo com um escore de 3.

Amostras de sangue para coleta de soro foram retiradas da veiacaudal no dia 0, 21, 33, 42 (exposição) e 56. Deixou-se o sangue coagular eobteve-se subseqüentemente o soro após centrifugação (5 minutos a 3500rpm). Soros foram armazenados a -20°C.

Titulações de anticorpos anti-H5 e titulações de anticorposanti-H7 foram avaliadas com soros de camundongo coletado no dia -1 e dia33, doze dias após a segunda vacinação com a mesma dose de 5 μg deH5/animal ou 0,5 μg de H7/animal. O antígeno de H5 usado para vacinaçõesfoi expresso em células HEK293E e compreendeu uma extensão de marcadorFLAG carbóxi-terminal - marcador His. Para determinações de titulaçõesusou-se o antígeno de H5 da mesma cepa H5N1 adquirido da ProteinSciences Corp. Para determinações de titulações relativas a anticorpos anti-H7, adquiriu-se H7 recombinante da mesma cepa (A/Netherlands/219/03) daProtein Sciences Corp.

Como soros coletados no dia -1 e 33 de camundongos,realizou-se determinações de titulação com relação a OVA. Para este fim,soros dos oito animais em um grupo foram combinados. Usou-se combinadosde soros combinados coletados no dia -1 como o controle negativo.

Resultados

Oitenta e oito camundongos (11 grupos com 8 animais emcada grupo) foram usados para o estudo. Cada camundongo foi vacinado nodia 0 e 21 com placebo (água, grupo TO1) ou uma vacina de subunidadecontendo glicoproteína H5 ou H7 estrutura produzida recombinantemente(grupos T02-T09, Tl 1) ou uma vacina de vírus H5N9 inativado (grupo TIO).

Camundongos em três grupos (T01, T03 e TIO) foram expostos no dia 42 pormeio de inoculação intranasal com 50 μΐ compreendendo uma dose de 20LD50 (2* IO5 TCID50/ml) de AIV H5N1 A/156/97/HK.

Na Figura 13 A e B mostra-se determinações de titulações comsoros de camundongo combinados coletados no dia 33 e com antígeno de H5ou H7 nativo revestido de uma fonte diferente.

Soro coletado do grupo TO1, que recebeu vacina de placebo(i.e. água), não contém anticorpos anti-H5 ou anti-H7. Nos camundongos queforam vacinados com várias vacinas de H5, grupos que receberam H5 não-tratada sem adjuvante (T02) ou H5 de beta cruzada adjuvantada a 100 %desenvolveram titulações menores, se comparado com titulações obtidas apósvacinação com H5 de beta cruzada adjuvantada a 33 % ou 67 %. Estas duasúltimas vacinas foram tão potentes quanto vacina de H5N9 inativado comrelação à titulação elicitada (Figura 13A). Estes resultados demonstram que,incluindo-se antígeno adjuvantado com beta cruzada antígeno na vacina deH5 obtém-se uma resposta imune comparável com vacina de vírus inativadoadjuvantada convencionalmente. Antígeno de H5 adjuvantada com betacruzada a 100 % é uma porção menos imunogênica em comparação comvacinas compreendendo uma fração de antígeno adjuvantado com betacruzada juntamente com antígeno não-tratado/não-adjuvantado. Com base nastitulações, grupos TO1, T03 e TlO foram submetidos a um experimento deexposição a vírus H5N1.

Com soros individuais de camundongos de grupos TOl(placebo), T03 (H5 adjuvantada com beta cruzada a 33 %) e TlO (vacina devírus H5N9 inativado), que foram submetidos a exposição ao vírus H5N1,determinou-se titulações contra H5 nativa adquirida da Protein SciencesCorp. (H5 usada para vacinação foi produzida no próprio laboratório emcélulas HEK293E). Na Figura 13E e F titulações são ilustradas para T03 eTIO. Não se observou titulações maiores do que as obtidas com soro pré-imune combinado (não mostrado). Para T03, desenvolveram-se titulações emcamundongos individuais aproximadamente na ordem camundongo 5 = 6 = 7>8>1=2 = 4>3> combinado pré-imune = nenhuma titulação. Para TIO, aordem é camundongo 6>2 = 4>3 = 8>1=5>7> combinado de soro pré-imune = nenhuma titulação. Estas diferenças na intensidade da resposta imunesão refletidas no grau de proteção contra exposição a vírus H5N1.

Para o estudo de H7, a ordem de intensidade das titulações deanticorpos anti-H7 elicitadas foi de H7/Specol > H7 de beta cruzada a 33 % >H7 de beta cruzada a 67 % > H7 não-tratada/não-adjuvantada ~ 100 % H7 debeta cruzada ~ placebo. Assim, novamente, está claro que H7 adjuvantadacom estrutura beta cruzada é uma vacina efetiva quando se consideratitulações de anticorpos. Novamente, de forma similar a H5, antígeno não-tratado/não-adjuvantado e antígeno adjuvantado com beta cruzada a 100 %sem o uso de antígeno nativo são menos imunogênicos em comparação comvacinas compreendendo antígeno adjuvantado com beta cruzada a 33 % ou 67%.

Na Figura 13C, considera-se titulações contra OVA em soroscombinados obtidos no dia 33 após a vacinação com placebo ou H5adjuvantada com beta cruzada ou H5 não-tratada/não-adjuvantada. Para OVA,a ordem de titulações anti-OVA desenvolvidas é H5 adjuvantada com betacruzada a 100 % > H5 adjuvantada com beta cruzada a 67 % > H5adjuvantada com beta cruzada a 33 % > H5 não-tratada/não-adjuvantada ~soro pré-imune. As vacinas formuladas com H5 adjuvantada com betacruzada a 33, 67 e 100 % compreendem uma quantidade crescente de OVAmal-dobrada similar a amilóide (DOVA). Quando se considera OVA,antígeno dobrado inativamente não precisar ser parte da formulação devacina. Aparentemente, em DOVA uma densidade razoável de epítopossimilares a nativos é exposta, a que titulações de reação cruzada sãoelicitadas. Os resultados provam, portanto, que antígenos com estrutura betacruzada são vantajosos para uso em vacinas para elicitar uma resposta imunedesejada contra um antígeno nativo.

Em conjunto, estes estudos mostram que boas titulações deanticorpos são obtidas com o uso de estrutura beta cruzada como adjuvante,sem a necessidade de incluir um adjuvante convencional na formulação devacina. (Embora não necessário, evidentemente também é possível usar umacombinação de um adjuvante de estrutura beta e um adjuvante convencional,opcionalmente numa dose menor do que doses convencionais, em algunscasos) em camundongos não-vacinados os primeiros sinais clínicos foramobservados 3 dias após a infecção. Os sinais foram observados até o términodo estudo. Do dia 7 todos os animais no grupo não vacinado sofreram desintomas respiratórios. Seis de 8 animais morreram ou precisaram sereutanizados antes do término do estudo. Um animal morreu no dia 1 após ainfecção, sem sinais de doença. Todos os animais vacinados sobreviveram àexposição (Figura 13D). Quando da vacinação com Gallimune® FLU H5N9,grupo TIO, nem todos os sinais de infecção puderam ser prevenidos, masnenhum dos animais sofreu de sintomas respiratórios. De maneira similar,vacinação com H5 adjuvantada com beta cruzada H5 resultou em umadiminuição dos sintomas respiratórios. Com ambos os regimes de vacina,todos os camundongos recuperaram-se completamente. Observou-se efeitosadversos em todos os camundongos quando da vacinação e exposição avacina comercialmente obtenível (Tabela 25).

Tabela 26 mostra os escores clínicos após exposição. Tabela27 mostra o escore de sintomas respiratórios. Tabela 28 mostra mortalidadequando da exposição a H5N1. Titulações de anticorpo de hemaglutinina sãomostradas na Tabela 29.

Combinados, estes estudos mostram que a adição de H5 ou H7adjuvantada com beta cruzada a uma vacina incrementa as titulações deanticorpos e que vacinação de camundongos com H5 adjuvantada com betacruzada reduz sintomas clínicos e protege camundongos da morte como umaconseqüência de infecção com H5N1. Assim, a adição de estrutura betacruzada permite imunogenicidade protetora.

Exemplo 13

Vacina de subunidade de E2 adjuvantada com estrutura beta cruzadaprotege porcos de morte após exposição a dose letal de Vírus da Febre

Suína Clássica

Estudo de vacinação de porcos com uma vacina de subunidade de E2

Objetivo

Determinação se uma vacina de subunidade compreendendoantígeno de E2 com conformação de proteína com dobramento incorretosimilar a amilóide elicita titulações de anticorpos e protege porcos de umadose letal de vírus da febre suína clássica vírus da febre suína clássica.

Introdução

Febre Suína Clássica (CSF, sinônimo de cólera dos porcos) éuma doença suína contagiosa e freqüentemente fatal, caracterizado por febre,hemorragias, ataxia, e imunossupressão. O agente causativo é vírus da febresuína clássica (CSFV), um membro do gênero Pestivírus da famíliaFlaviviridae. Em muitos países europeus, o vírus não endêmico, porémperiodicamente ocorrem surtos de CSF, e podem causar grandes perdaseconômicas. Após infecção com CSFV, anticorpos são desenvolvidos contraas glicoproteínas estruturais E2 e Erns3 e a proteína não-estrutural NS3, E2 é aproteína de envelope do CSFV mais imunogênica e induz uma resposta deanticorpo neutralizador em porcos. Vacinas baseadas no CSFV inativadoinduzem uma resposta imune rápida e protetora. No entanto, umadesvantagem destas vacinas é que soros de animais vacinados não podem serdistinguidos de animais infectados. Uma vacina de subunidade contra CSFVfoi desenvolvida com base nesta glicoproteína de envelope E29. Esta vacinade subunidade é, portanto, uma vacina marcadora potencial, porquediscriminação entre porcos vacinados e infectados pode basear-se na detecçãode anticorpos contra Erns e/ou NS3. A vacina de subunidade contém E2produzida em células de insetos foi testada quanto à segurança e eficácia 5'10.

Esta Vacina de subunidade baseada em E2 produz uma resposta imuneprotetora, embora menos rápida. Assim, deseja-se algum melhoramento paraobter uma resposta imune mais rápida.

Materiais e métodos

Preparação de vacinas

Seis grupos de seis porcos foram imunizados com 32 μg de E2recombinante/animal ou com placebo (H2O, Grupo de teste TO1). Para umaprimeira vacinação, usou-se E2 não-tratada, E2 mal-dobrada por via térmicacíclica (Método do dobramento incorreto I) e alquila-E2 (Método dodobramento incorreto IV) (lote 1 200406RS, 285 μ^/πύ em PBS) nas

seguintes relações:

Grupo 1 placebo (H2O)

Grupo 2 E2 não-tratada a 100 %

Grupo 3 E2 mal-dobrada a 50 % (Método I)/E2 não-tratada

a 50 %

Grupo 4 alquila-E2 mal-dobrada a 50 % (Método IV)/E2não-tratada a 50 %

Grupo 5 E2 mal-dobrada a 25 % (Método I)/alquila-E2 mal-

dobrada a 25 % (Método IV)/E2 não-tratada a 50 %

Grupo 6 E2 adjuvantada com emulsão água-óleo

Para a segunda imunização no dia 21 usou-se novamente E2recombinante expressa por células Sfl, agora do lote 2 030506RS, 280 μ^ιηΐem PB S. E2 foi mal-dobrada usando-se quatro métodos de dobramentoincorreto (ver acima). Para formulações de vacina, usou-se uma solução comuma relação a 1:1:1:1 das quatro preparações de E2 mal-dobrada, com umaconcentração final de E2 de 225 μ^ιηΐ em PBS. Grupos de Teste de Porco 1,2 e 6 (T01, T02, T06) receberam a mesma vacina que durante a primeiravacinação. Agora, para a segunda vacinação, vacinas para Grupos de Teste dePorco 3, 4 e 5 (T03, T04, T05) compreenderam 25 %, 50 % e 75 % da E2adjuvantada com beta cruzada. A dose foi novamente de 32 μg de E2/porco.

Imunização

Usou-se trinta e seis porcos machos. Porcos foram alojadosnas instalações da ID-Lelystad, Países Baixos. Os porcos tinhamaproximadamente 6 semanas de vida na vacinação, e eram livres deanticorpos contra CSFV, e outros pestivírus. Porcos foram alocadosrandomicamente a um grupo de vacina ou grupo de controle, cada um destes 6grupos (n=6) foi alojado em uma unidade isolada sob condições de altacontenção. Os animais foram alimentados, e podiam beber água à vontade. Nodia 0 e 21 os porcos foram imunizados por via intramuscular com 2,0 ml deamostra de teste, uma vez na coxa esquerda e uma vez na coxa direita,aproximadamente 2 cm atrás da orelha. Para a primeira imunização, grupoTOl (controle, animais #114-119) receberam amostra de teste 1 (água), grupoT02 (#120-125) receberam amostra 2 (32 μg de E2 não-tratada), grupo T03(#126-131) receberam amostra 3 (16 μg de E2 não-tratada combinada com 16μg de E2 adjuvantada com método de beta cruzada I), grupo T04 (#132-137)recebeu amostra 4 (16 μg de E2 não-tratada combinado com 16 μg de E2adjuvantada com método de beta cruzada IV), grupo T05 (#138-143) recebeuamostra 5 (16 μg de E2 não-tratada combinada com 8 μg de E2 adjuvantadacom método de beta cruzada I e 8 μg de E2 adjuvantada com método de betacruzada IV), grupo T06 (#144-149) recebeu amostra 6 (32 μg de E2 não-tratada adjuvantada com duplo óleo em água [DOE] como descrito 10. Para ogrupo de segunda imunização, TOl (controle) recebeu amostra de teste 1(água), grupo T02 recebeu amostra 2 (32 μg de E2 não-tratada), grupo T03recebeu amostra 3 (24 μg de E2 não-tratada combinada com 8 μg de E2adjuvantada com método de beta cruzada I/II), grupo T04 recebeu amostra 4(16 μg de E2 não-tratada combinado com 16 μg de E2 adjuvantada commétodo de beta cruzada I/II), grupo T05 recebeu amostra 5 (8 μg de E2 não-tratada combinada com 24 μg de E2 adjuvantada com método de beta cruzadaI/II), grupo T06 recebeu amostra 6 (32 μg de E2 não-tratada adjuvantada comduplo óleo em água [DOE]10. Um animal no grupo 6 recebeu 1,5 ml em lugarde 2 ml.

Exposição a cepa de CSFV Brescia 456610

No dia 42, dezenove porcos (todos os animais dos grupos 1, 3e 6 e 1 animal do grupo 5, #143) foram inoculados intranasalmente com umadose de 200 LD50 da cepa de CSFV altamente virulenta Brescia 456610.

Avaliação e exame

Durante o curso de todo o estudo, os animais forammonitorados uma vez por dia (escore clínico de 0 a 7). Sinais clínicos foramdefinidos como (1) mal-estar, que incluiu os sintomas de crescimentoretardado, emagrecimento (deterioração), apetite diminuído, ausência deapetite, vômitos, responsividade lenta/cansada/reduzida, porco é incapaz depermanecer de pé sem assistência, doença geral, calafrios, (2) prejuízo dosistema respiratório, que incluiu tosse, espirros, respiração acelerada, roncosou respiração superficial, descarga ocular (ou corrimento nos olhos),conjuntivite ou descarga nasal (corrimento do nariz) e (3) sangramento, queincluiu os sintomas, manchas vermelhas nas orelhas, sangue do reto, oupalidez. Cada sintoma foi contado como 1. A temperatura anal foi medidainiciando 2 dias antes da exposição até o fim do experimento (dia 56). Febrefoi definida como uma temperatura acima de 40°C.Amostras de sangue para coleta de soro foram colhidas no dia0, 2, 5, 9, 12, 16, 19, 26, 33, 42 (exposição) e 56. Deixou-se o sanguecoagular e, subseqüentemente, obteve-se soros após centrifugação (5 minutosa 3500 rpm). Soros foram armazenados a -20°C.

Soros foram testados quanto à presença de anticorposneutralizadores com um ensaio de neutralização ligado a peroxidase (NPLA)usando-se células PK15 e um vírus não-citopatogênico usando-se doisanticorpos monoclonais (batelada V3: 030502, batelada V4: 110702)reagindo-se com epítopos diferentes em E211. Diluições seriais de soro (emduplicata) foram misturadas com um volume igual de Eagle BSS contendo30±300 TCID50 CSFV (cepa Brescia). Após incubação durante 1 h a 37°Cem um incubador de CO2, adicionou-se aproximadamente 25000 células PK-15 por poço. Após quatro dias realizou-se um IPMA, como descritopreviamente 10'12.

Titulações de anticorpos foram expressas como a recíproca damaior diluição que inibiu infecção (100 %) da monocamada em 50 % dasculturas de células. Titulações <10 são interpretadas como negativas.

Soros também foram testados quanto à presença de anticorposusando-se um ELISA (Ceditest® CSFV e Ceditest® CSFV2.0, Cedi-Diagnostics, Lelystad, Países Baixos), de acordo com instruções dofabricante.

O número de leucócitos e trombócitos em amostras de sangueem EDTA foi determinado em um contador Medonic7 CA570 coultercounter. Leucopenia é definida como < 8x109 células/ 1 1 de sangue, etrombocitopenia como < 200x109 células/ 1 1 de sangue.

Resultados

Trinta e seis porcos (6 grupos com 6 animais em cada grupo)foram usados para o estudo. Cada porco foi vacinado no dia 0 e 21 com umavacina de controle (água, grupo TO1) ou uma vacina de subunidade contendoglicoproteína E2 estrutural produzida recombinantemente (grupos T02-T06),e subseqüentemente expostos a CSFV (cepa Brescia 456610) como descritona seção de Materiais e Métodos.

Determinou-se as titulações de anticorpos neutralizadores(Tabela 29). Titulações em animais vacinados com E2 adjuvantada comestrutura beta cruzada (T03 e porco #143 de T05) foram significativamentemais altas no dia 26, 33 e 42 em comparação com o grupo de controle (T01).Porco #127 em T03 quase não desenvolveu uma titulação de NPLA.

Animais no Grupo TOl (placebo), grupo T03 (método I de E2de beta cruzada a 50 % / método I e II de E2 de beta cruzada a 25 %), GrupoT05, porco n° 143 (método I de E2 de beta cruzada a 50 %/IV / método I e IIde E2 de beta cruzada a 75 %) foram envolvidos no experimento deexposição. Todos os animais que foram imunizados com placebo/água (grupode controle TO1) morreram (Figura 14). Todos os animais, com uma exceção(T03, porco n° 127, quase não apresentou titulação de NPLA), que recebeuuma vacina de E2, seja adjuvantada com estrutura beta cruzada ou DOE,sobreviveram (Figura 14). Os animais imunizados com E2 adjuvantada comDOE não apresentaram sinais clínicos de infecção. Os animais que receberamE2 adjuvantada com estrutura beta cruzada efetivamente apresentaram sinaisde infecção, porém os sinais foram menos graves se comparados com animaisem T01 (Tabela 30). Observou-se menos problemas de respiração e menossangramento em animais vacinados com E2 adjuvantada com estrutura betacruzada, quando comparado com T01 (placebo). Com porcos em TO1,observou-se sangramentos em seis de seis porcos. Dos sete porcos vacinadoscom E2 - beta cruzada, quatro de sete porcos apresentaram sangramentos apósexposição ao CSFV. A duração média dos sangramento foi de 1,8 dias nosporcos vacinados com E2 - beta cruzada versus 3,2 dias nos porcos tratadoscom placebo em T01. Em T03 (vacina E2 - beta cruzada), entre outros porcos,porco n° 127, que quase não desenvolveu titulação de NPLA, sofreusangramentos.

Os escores clínicos e a análise de amostras de sangue sãoilustrados abaixo. Tabela 31 mostra escores clínicos na fase posterior àexposição. A Tabela 32 mostra as medições da temperatura durante aexposição.

No grupo de controle (TOl) e no grupo imunizado com E2adjuvantada com estrutura beta cruzada observou-se significativa leucopenia(100 %, 87 %) e trombocitopenia (ambas 100 %) (Tabela 34), em comparaçãocom o grupo que recebeu E2 adjuvantada com DOE (0 % de leucopenia, 17 %de trombocitopenia). Porco n° 127 no grupo T03 apresentou trombocitopeniae leucopenia muito forte, relacionadas mui provavelmente com a ausência deuma titulação de NPLA. Estes estudos mostram que proteção parcial, i.e.sobrevida com redução de sintomas clínicos, contra uma dose letal de CSFV,testados em um experimento de exposição grave, é obtida com vacinação comE2 adjuvantada com estrutura beta cruzada.

Exemplo 14

Imunização de frangos com ovalbumina compreendendoestrutura beta cruzada induz quebra da tolerância e resulta na formação detitulações de auto-anticorpos

Materiais e métodos

Dobramento incorreto de OVA

Amostras usadas para imunização de frangos foram idênticasàquelas usadas para imunização de camundongos como descrito acima(exemplo 12).

Imunização

Usou-se oitenta e oito frangos machos LSL Lohman comaproximadamente 3 semanas de vida. No dia 0 e 21 os frangos foramimunizados por via intramuscular com 0,5 ml de amostra de teste, na coxaesquerdo (dia 0) e na coxa direita (dia 21). Grupo TOl (controle, #4601-4608)recebeu amostra de teste 1 (água, placebo), grupo T02 (#4609-4616) recebeuamostra 2 (5 μg de H5 não tratada), grupo T03 (#4617-4624) recebeu amostra3 (H5 não-tratada combinada com H5 de beta cruzada a 33 % modificada como método I, II, III), grupo T04 (#4625-4632) recebeu amostra 4 (H5 não-tratada combinada com H5 de beta cruzada a 66 % modificada com método I-III), grupo T05 (#4633-4640) recebeu amostra 5 (H5 de beta cruzada a 100 %modificada com o método I-III), e grupo TlO (#4673-4680) recebeu amostra(vacina, Gallimune® FLU H5N9, lote F38785C, compreendendo vírus deinfluenza aviária inativado (H5N9, cepa A/Turkey/Wisconsin/68). Em todosos casos administrou-se 5 μg de H5 ao todo (não-tratada combinada commodificada) em PB S.

Amostras de sangue foram colhidas para coleta de soro da veiada asa nos dia -1, 21, 33. Deixou-se o sangue coagular e, subseqüentemente,obteve-se soros após centrifugação (5 minutos a 3500 rpm). Soros foramarmazenados a -20°C. Titulações de anticorpos anti-OVA foram avaliadascom soros coletados no dia 0 e dia 33 usando-se um ELISA convencional.Com soros coletados de frangos no dia -1 e 33 realizou-se determinações detitulações com relação a DOVA. Para este fim, soros dos oito animais em umgrupo foram combinados. Usou-se combinados de soros coletados no dia -1como o controle negativo.

Resultados

Na Figura 15 mostra-se determinações de titulações com sorosde frangos combinados. Soro coletado do grupo TO1, que recebeu vacina deplacebo (i.e. água), contêm quantidades detectáveis de anticorpos anti-OVA.Os frangos que foram vacinados com diversas vacinas contendo OVAdesenvolveram titulações anti-OVA mais elevadas. E digno de nota queimunização com vacinas contendo amostra adjuvantada com beta cruzada a33 % resultou em titulações anti-OVA incrementadas. De maneira similar, aadição de adjuvante induziu anticorpos anti-OVA. Estes resultadosdemonstram que a inclusão de antígeno de OVA adjuvantado com betacruzada na vacina resulta em uma resposta auto-imune humoral. Devido a estapotência de estrutura beta cruzada para quebrar tolerância, desenvolve-sevacinas contra auto-antígenos. Referidas vacinas são usadas contra doençasou para fins que não só infecções, por exemplo, para a indução de anticorposa LHRH para imunocastração de javalis, ou para uso na prevenção da[doença] enxerto versus hospedeiro (GvH) e/ou rejeições de transplante.

Descrição das Tabelas

Os compostos listados na Tabela 1 e as proteínas listadas naTabela 2 ligam-se, todos, a polipeptídios com uma dobra não-nativa similar aamilóide. Na literatura, esta dobra não-nativa foi designada como agregadosde proteína, agregados amorfos, depósito amorfo, emaranhados, placas(senis), amilóide, proteína similar a amilóide, proteína desnaturada,oligômeros amilóides, depósitos amiloidogênicos, estrutura β cruzada, lâminaβ, espinha β cruzada, placa, proteína desnaturada, lâmina β cruzada,agregados ricos em estrutura β, forma agregadora infectiva de uma proteína,proteína não-dobrada, dobra/conformação similar a amilóide e, talvez,alternativamente. O tema mais comum entre todos os polipeptídios com umadobra similar a amilóide não-nativa, que são ligantes para um ou mais doscompostos listados na Tabela 1 e 2, é a presença de uma conformação deestrutura β cruzada.

Os compostos listados na Tabela 1 e 2 são considerados comoum subconjunto de todos os compostos conhecidos até aqui que se ligam aconformações de proteína não-nativa. As listas são, portanto, não-limitantes.

Conhece-se hodiernamente mais compostos que se ligam à conformação deproteína similar a amilóide. Por exemplo, na patente AU2003214375descreve-se que agregados de proteína príon, amilóide, e tau ligam-seseletivamente a agentes ligantes poliônicos, como sulfato de dextrano oupentosano (aniônico), ou a compostos de poliamina, como poli(cloreto dedialildimetilamônio) (catiônico). Compostos com especificidade para dobrasnão-nativas de proteínas listados nesta patente e alhures são, em princípio,igualmente apropriados para métodos e dispositivos revelados neste pedido depatente. Além disso, qualquer composto ou proteína relacionada com aqueleslistados na Tabela 1 e 2 são abrangidos pelas reivindicações. Por exemplo,mutantes pontuais, fragmentos, combinações produzidas recombinantementede domínios de ligação de estrutura β cruzada e mutantes de deleção einserção são parte dos conjuntos de compostos desde que sejam capazes deligar-se a uma estrutura β cruzada (i.e. desde que sejam equivalentesfuncionais). Também é possível usar qualquer proteína ou molécula pequenarecentemente descoberta que apresenta afinidade pela dobra de estrutura βcruzada, em princípio, em qualquer um dos métodos e aplicações aqui divulgados.

Os compostos listados na Tabela 3 também são consideradoscomo sendo parte da Via de estrutura beta cruzada', e esta consideraçãobaseia-se em dados da literatura, indicando interações das moléculas listadascom compostos que também compreendem a dobra de estrutura β cruzadamas que não foram revelados como tais. As tabelas de 4 a 34 ilustramresultados dos exemplos.

Legendas das figuras

Figura 1. Ativação de fator XII por caulim adjuvante e por agregados depeptídios com conformação de estrutura β cruzada.

A. Como o caulim, agregados de peptídios similares aamilóide de FP13 e AB estimulam a ativação de fator XII, como detectadopela conversão de Cromozima-PK, quando da formação de calicreína a partirde precalicreína por meio de fator XII ativado. Controle de tamponador econtroles não-amilóides[:] fragmento de fibrina FPlO e polipeptídio amilóidede ilhotas murinas não-amilóides mIAPP [murine islet amyloid polypeptide]não ativam fator XII. B. Como FP13 e AB, também peptídios ricos emconformação de estrutura β cruzada[:] laminina (LAM12) e transtiretina(TTRll) estimulam ativação de fator XII, em grau similar ao caulim. C.Autoativação de fator XII é estabelecida por meio de incubação de fator XIIpurificado com DXS 5 OOk ou com vários agregados de proteína similares aamilóide com conformação de estrutura β cruzada, na presença de substratocromogênico S-2222.

Figura 2: Adjuvantes induzem propriedades similares a amilóide emvárias proteínas.

A. Adjuvantes DXS500k e caulim induzem fluorescência deThT, e adjuvante DXS500k induz propriedades de ligação de tPA em váriasproteínas após incubação de um dia para o outro, conforme medido em umELISA com proteínas imobilizadas com ou sem DXS500k. Fluorescência deThT ou ligação de tPA com proteínas incubadas com DXS500k ou caulim édada como um múltiplo da fluorescência ou ligação de tPA observada quandoDXS500k e caulim foram omitidos durante incubações de proteína ('fator deincremento'). B. Em um ensaio de auto-ativação de fator XII cromogênico,peptídio FP13 K157G derivado de fibrina amilóide estimula autoativação defator XII, que é inibido por corante de ThT específico par amilóide. C.Adjuvante DXS5OOk é apenas um fator estimulador para ativação de fator XIIquando plasma diluído a 80x está presente. Ativação de fator XII porDXS 5 OOk e proteína de plasma são inibidos por ThT. Ativação de fator XIIfoi medido em um ensaio cromogênico. D. Na presença de plasma a 60 %vol/vol, precipitado de adjuvante Ca3(PO4)2 ativa fator XII, como detectadomedindo-se a conversão de substrato cromogênico S2222, E-F. Fator XII sohentão é ativado efetivamente quando ambos os adjuvantes, caulim ouDXS500k, e ou 1 mg ml"1 de endostatina (E), ou albumina (F) são incluídasno mix de ensaio. Ativação de fator XII na presença de precalicreína equininogênio com alto peso molecular foi determinada medindo-se aconversão de substrato de calicreína cromogênico Cromozima-PK. G-H.Adjuvantes DXS500k, CpG5 adjuvante de Freund completo (G), alume eDDA (H) induzem ativação de tPA e Plg5 como determinado medindo-se aconversão do substrato de plasmina cromogênico S 2251. Controle positivofoi de 100 μg ml"1 de γ-globulinas amilóides, controle negativo foitamponador. I. Incubação de plasma diluído 8 Ox com adjuvantes indicadosresulta em fluorescência de ThT para adjuvante de Freund completo (CFA)5Specol, DXS500k e CpG, enquanto que DEAE-dextrano, adjuvante de Freundincompleto, alume e DDA não têm efeito. Amostras foram diluídas 40x paraas medições de ThT. J. Em um experimento similar, plasma diluído 20x foiincubado com as séries indicadas de adjuvantes. Após diluição de 160x,DXS500k, CpG5 CFA, IFA e Specol induzem fluorescência de ThT. K-L.Exposição de 1 mg ml"1 de lisozima (K) ou endostatina (L) nas concentraçõesseriais indicadas de LPS ou CpG induz um maior sinal de fluorescência deThT. M. Exposição de 1 mg ml"1 de albumina, endostatina, P2GPI do plasmaou P2GPI rec. a 21,4 μg ml"1 de CpG resulta em maior fluorescência de ThTcom aproximadamente um fator de 2 a 10. Com estas condições de ensaio nãose observou efeito com lisozima e γ-globulinas. N-R. Imagens TEM de CpG(N.), lisozima (O.), lisozima exposta a CpG (P.), DXS500k (Q.) e lisozimaexposta a DXS500k (R.). A escala bar representa 200 nm.

Figura 3: Ligação de fator XII e tPA a p2-glicoproteína I e ligação deauto-anticorpos anti-p2GPI a p2GPI recombinante.

A. Ensaio de plasmina cromogênico apresentando a atividadeestimuladora de P2GPI recombinante na conversão mediada com tPA de Plg aplasmina. O controle positivo foi peptídio de fibrina amilóide FPl3. B. Emum ELISA, P2GPI recombinante liga-se a tPA imobilizado, sendo que P2GPIpurificado de plasma não se liga. A kD é de 2,3 μg ml"1 (51 nM). C. Em umELISA, fator XII liga-se a P2GPI humana recombinante purificada, e não aP2GPI que é purificado de plasma humano, quando fator XII purificado éimobilizado sobre poços de placa ELISA. P2GPI recombinante liga-se comuma kD de 0,9 μ§ ml"1 (20 nM) a fator XII imobilizado. D. Western blotincubado com anticorpo anti-fator XII humano. A P2GPI foi purificada, ou deplasma humano fresco ou de plasma que foi congelado a -20°C esubseqüentemente descongelado antes de purificação em uma coluna deafinidade de P2GPI. Frações eluídas são analisadas em Western blot apóseletroforese SDS-PA. Quando se compara faixas 2-3 com 4-5, verifica-se quecongelamento-descongelamento de plasma resulta em co-purificação de fatorXII juntamente com a P2GPI. A massa molecular de fator XII é de 80 kDa. E.

Em um ELISA, P2GPI recombinante inibe eficientemente a ligação de auto-anticorpos anti~p2GPI a p2GPI imobilizado, enquanto que P2GPI do plasmaexerce um efeito menor sobre a ligação de anticorpos. Auto-anticorpos anti-P2GPI foram purificados de plasma de pacientes com a doença autoimune'síndrome de antifosfolipídeo'. F. Exposição de 25 μg ml"1 de P2GPI5produzida recombinantemente (rp2GPI) ou purificada de plasma (np2GPI), a100 μΜ de vesículas de cardiolipina ou a 250 μg ml"1 de sulfato de dextrano500.000 Da (DXS) induz uma maior fluorescência de ThT, sugestivo de umincremento de uma quantidade de conformação de estrutura P cruzada emsolução. Sinais são corrigidos para fluorescência de fundo de cardiolipina,DXS, ThT e tamponador. G. Ligação de tPA e K2P-tPA a P2GPI imobilizadanos poços de uma placa ELISA, ou a P2GPI ligado a cardiolipina imobilizadaé avaliada. P2GPI contactada com cardiolipina liga tPA em maior grau do queP2GPI contactada diretamente com a placa de ELISA. K2P-tPA não se liga aP2GPI. TPA não se liga a cardiolipina imobilizada. H. Imagens demicroscopia eletrônica de transmissão de 400 μg ml"1 de P2GPI purificada doplasma apenas (1) ou contactada com 100 μΜ de cardiolipina (2, 3) e de 400μg ml"1 de p2GPI recombinante purificada (4).

Figura 4: Síntese de RNA de TNFa em monócitos após estimulação comLPS e compostos ricos em conformação de estrutura β cruzada, que atuacomo um desnaturador.A. Monócitos U937 cultivados foram incubados durante 1 hcom tamponador, LPS5 endostatina amilóide, Hb-AGE amilóide ou Hb decontrole. Regulação-para-cima de RNA de TNFa foi avaliada por meio derealização de RT-PCR com RNA isolado dos monócitos e iniciadores deTNFa. Quantidades de cDNA de TNFa após RT-PCR foram normalizadaspara as quantidades de cDNA ribossômico 18S, obtido com as mesmasamostras de RNA. Em monócitos incubados com tamponador não se detectouRNA de TNFa. Endostatina e Hb-AGE induzem aproximadamente 30 % daexpressão de RNA de TNFa induzida por Hb de controle é aproximadamentetrês vezes menor. B. Exposição de 1 mg ml"1 de lisozima a 0-1200 ml"1 deLPS resulta em um aumento de 1,1 até a 13,1 vezes da fluorescência de ThTcom respeito à lisozima incubada com tamponador apenas, indicativo dacapacidade de desnaturação de LPS, resultando em estruturas similares aamilóide em lisozima. Desvios padrão foram tipicamente menores do que 10% (não mostrado). C. Exposição de 1 mg ml"1 de lisozima, albumina,endostatina, γ-globulinas, P2GPI do plasma ou P2GPI rec. a 600 μg ml"1 deLPS resulta em maior fluorescência de ThT com aproximadamente um fatorde 2 a 10.

Figura 5. Conformação de estrutura β cruzada similar a amilóide emalbumina alquilada de soro murino e em ovalbumina desnaturada comcalor, albumina de soro murino, glucagônio humano e Etanercept.

A. Ativação de Plg com leitura de atividade de plasminausando-se substrato cromogênico S-2251. Propriedades de ativação dealbumina de soro murino alquilada ou reduzida (alquila-MSA) e OVAdesnaturada com calor (dOVA) são comparadas com γ-globulinas amilóides(controle positivo), tamponador (controle negativo), e albumina nativa e OVA(nMSA, nOVA). B. Ensaio de fluorescência de tioflavina T com OVA e MSAnativa ou desnaturada. C. Ensaio de ativação de Plg para comparação de MSAreduzida e alquilada e MSA desnaturada com calor. D. Ensaio defluorescência de tioflavina T com MSA reduzida/alquilada e MSAdesnaturada com calor. E. Ensaio de ativação de Plg com concentraçõesseriais de glucagônio desnaturado com calor/ácido. F. Ensaio de fluorescênciade tioflavina T com glucagônio desnaturado com calor/ácido e nativo. G.

Comparação das propriedades de ativação de tPA de Etanercept desnaturadocom calor, Etanercept nativo e Etanercept reduzido/alquilado. H.Fluorescência de tioflavina T de Etanercept nativo e desnaturado com calor. I.Imagem TEM de OVA desnaturada com calor. A escala bar representa 200nm. J. Imagem TEM de glucagônio desnaturado com calor/ácido. A escala barrepresenta 1 μΜ. Κ. Ensaio de fluorescência de tioflavina T mostrando quefiltração através de um filtro de 0,2 μτη de OVA desnaturada não influencia aspropriedades incrementadoras de fluorescência. L. Determinação de titulaçõesde anticorpos anti-nOVA em soros combinados de camundongos imunizadoscom nOVA ou dOVA. Titulação é definida como a diluição sérica que aindadá um sinal acima do valor de fundo obtido com soro pré-imuno diluído 10vezes. A titulação para os camundongos imunizados com nOVA foi de 610*,para os camundongos imunizados com dOVA 3999*. Após uma semananenhuma titulação foi detectada em ambos os grupos. A titulaçãoincrementada 6,6 vezes observada nos camundongos imunizados com dOVAaponta para uma maior atividade imunogênica de OVA desnaturada comconformação de estrutura β cruzada.

Figura 6. Detecção de proteína com dobramento incorreto similar aamilóide em preparações de PorA.

A. Soluções de consumo de PorA e PorA submetidas a um dostrês métodos de dobramento incorreto de proteína de I a III são aplicadasdiluídas 400 vezes em um ensaio de fluorescência de ThT. B. As mesmasamostras de PorA são testadas quanto a seu potencial para ativartPA/plasminogênio em um ensaio de plasmina cromogênica. Amostras foramdiluídas 400 vezes. C. Ensaio de fluorescência de ThT com preparações devacina de PorA diluídas 10 vezes (1 μ^ιηΐ de PorA no ensaio). D. Ensaio deativação de plasminogênio/tPA com preparações de vacina de PorA diluídas20 vezes (0,5 μ§/ηι1 de PorA no ensaio).

Figura 7. Determinações de titulações de anticorpos anti-PorA edeterminações de titulações de anticorpos bactericidas no soro.

A. No dia 21 após a vacinação, soros combinados de cadagrupo de camundongos foram analisados quanto a suas titulações deanticorpos anti-PorA trivalente, usando-se o antígeno de PorA trivalenteusado para vacinação no dia O, B. Titulações de anticorpos anti-PorA,determinadas com soros individuais coletados no dia 42 após a vacinação nodia O e dia 14 após a vacinação no dia 21. Antígenos usados foram os trêssubtipos de PorA que constituem a vacina trivalente. C. Titulações deanticorpos bactericidas no soro (SBA, Serum Bactericidal Antibody),determinado com soros como em B.

Figura 8. Imunização de camundongos com glicoproteína β2 I de betacruzada humana resulta em titulações de anticorpos contra auto- e não-auto-antígeno.

A. Exposição de P2GPI humana a cardiolipina torna a misturacom propriedades de ativação de plasminogênio/tPA, indicativo quanto àpresença de estrutura beta cruzada, como determinado em um ensaiocromogênico de ativação de plasminogênio/tPA com um substrato deplasmina. B. Alquilação de radicais cisteína em P2GPI humana introduzestrutura beta cruzada como determinado em um ensaio de incremento dafluorescência de ThT. C. Camundongos imunizados com uma mistura decardiolipina e P2GPI humana desenvolvem uma titulação de anticorpos contraantígeno de P2GPI humana não-tratada. D. De forma similar à cardiolipina-P2GPI com estrutura beta cruzada, também alquila-p2GPI humana comestrutura beta cruzada elicita uma titulação de anticorpos contra o antígenohumano não-tratado. E. Camundongos imunizados com P2GPI de betacruzada humana desenvolvem titulações contra P2GPI não-tratada decamundongo, demonstrando quebra de tolerância nos camundongos quandoimunizados com um antígeno que compreende estrutura beta cruzada.Figura 9. Detecção de conformação de proteína com dobramentoincorreto similar a amilóide compreendendo estrutura beta cruzada emantígenos.

Estrutura beta cruzada é detectada por meio de avaliação doincremento da fluorescência de ThT quando do contato do corante específicopara amilóide com um antígeno em solução, e medindo-se a atividade deplasmina quando da ativação de tPA, uma serina protease que se liga aestrutura beta cruzada, e que é ativada por estrutura beta cruzada, em umensaio cromogênico de conversão de substrato de plasmina. A. ativação detPA/plasminogênio por 100 μg/ml de OVA ou DOVA (Método dodobramento incorreto I), comparado com controle de tamponador. B. Ensaiode fluorescência de ThT com 100 μg/ml de OVA ou DOVA. C. Fluorescênciade ThT com estoque de H5 não-tratada diluída dez vezes (lote 1 210406CS,236 μg/ml em PBS). D. ativação de tPA com solução de consumo de H5 (lote1 210406CS, 236 μg/ml em PBS), mostrando a presença de uma fração demoléculas de H5 com conformação de estrutura beta cruzada. E.Fluorescência de ThT com H5 não-tratada, mal-dobrada termicamente (H5 +OVA) (Método I) e H5-OVA mal-dobrada termicamente (conjugado comglutaraldeído/NaBH4; Método III), todos a 14 μg/ml (lote 2 fração X250506CS, 140 μg/ml em PBS). F. Propriedades de ativação de tPA de 12μg/ml de H7 recombinante adquirida da Protein Sciences Corp., indicativo dapresença de estrutura beta cruzada. Controle positivo: γ-globulinas amilóides.G. H7 recombinante adquirida da Protein Sciences Corp. a 60 μg/ml aumentaa fluorescência de ThT até certo grau, indicativo da presença de moléculas deproteína com estrutura beta cruzada. H. Ensaio de fluorescência de ThT comH7 nativa recombinante produzida no laboratório, H7, mistura mal-dobradatermicamente de H7 e OVA, e conjugado de OVA-E7 mal-dobradotermicamente, obtido por meio de acoplamento de EDC/NHS. Soluções deconsumo de H7 foram diluídas dez vezes. I. Incremento da atividade detPA/plasminogênio quando da introdução de 1 μ§/πι1 de H7 mal-dobrada (lote205-2006CS). '(H7 + OVA)' refere-se a H7 mal-dobrada termicamente comadição de OVA, 'H7-OVA' refere-se a H7 mal-dobrada termicamente apósacoplamento de H7 a OVA usando EDC/NHS. J. Fluorescência de ThTquando do contato de preparações de E2 diluídas 10 vezes com umaconcentração de DOVA de 100 μ^ιηΐ. E2 livre de células HEK293E foi, oumal-dobrada diretamente usando-se ciclização térmica, ou primeiramenteconjugada a OVA usando EDC/NHS, antes do dobramento incorreto. Κ. Oincremento da atividade de tPA é determinada com várias preparações depeptídio CL3 a 100 μg/ml. L. No ensaio de incremento da fluorescência deThT, concentrações de amostra 1, 2, 5 e 6 foi de 136 μΒ/ιηΙ, enquanto queamostras 3 e 4 foram testadas a 100 μg/ml.

Figura 10. Antígenos usados para experimentos de exposição a H5N1 dagripe aviária, e experimentos de exposição ao CSFV.

A. Fluorescência de ThT de preparações de H5 a 24 μ§/πύ.Para amostra 2, H5 foi misturada com OVA antes de aplicação de dobramentoincorreto com ciclização térmica. H5-OVA-1, H5 conjugada a OVA usandoacoplamento de EDC/NHS; H5-OVA-2, H5 conjugada a OVA usandoacoplamento de glutaraldeído/NaBH^ B. ensaio de atividade detPA/plasminogênio com E2 nativa e duas preparações de E2 mal-dobrada.Preparações de E2 usadas para uma primeira vacinação de porcos com E2não-tratada ou várias formas mal-dobradas similares a amilóide. E2 lote 1200406RS a 285 μg/ml em PBS, expressa em células Sfl, foi usada para aimunização. No ensaio, a concentração de E2 foi de 20 μg/ml. C.Fluorescência de ThT de preparações de E2 usadas para formulação devacina. A E2 mal-dobrada foi obtida por meio de ciclização térmica de 30 a85°C e de volta. D. Em um ensaio de ativação de plasminogênio/tPA, peptídioCL3 recentemente dissolvido e peptídio incubado a 65°C são os ativadores detPA mais potentes, enquanto que incubações à temperatura ambiente ou a37°C resultam em um menor teor de ativação de estrutura beta cruzada. Aconcentração de peptídio no ensaio foi de 200 μ§/πι1.

Figura 11. Determinação do teor de estrutura beta cruzada em umavacina de coquetel compreendendo E2, CL3, H5, H7 e ovalbumina.

A. Ativação de tPA/plasminogênio é determinada comsoluções de coquetel de vacina diluídas 20 vezes a-f, resultando emaproximadamente 5 e 0,5 μβ/ιηΐ de concentração total de antígeno para gruposa-c e d-f, respectivamente. B. Ensaio de fluorescência com vermelho Congocom soluções de antígeno diluídas 10 vezes a-f. Controle positivo foiamilóide-β.

C. Ensaio de fluorescência de ThT com soluções de antígenodiluídas 10 vezes a-f. Controle positivo: AB.

Figura 12. Titulações de anticorpos anti-antígeno em soros decamundongo no dia 28 após a vacinação com coquetel de antígenosadjuvantado com beta cruzada.

A. Quando camundongos no grupo a são vacinados uma vezcom 10 μg de H7 recombinante não-tratada (Protein Sciences Corp.) poranimal desenvolveram-se titulações de anticorpos anti-H7. B. Titulaçõescontra E2 antígeno do kit de CSFV da Cedi-Diagnostics. Após um vacinação,camundongos que receberam 5 ou 10 μg de E2 adjuvantada com beta cruzada,expressa em células HEK293E, desenvolveram uma titulação. C.

Determinação de titulação com antígeno de DOVA revestido. D.

Determinação da titulação com OVA não-tratada revestida.

Figura 13: Sobrevivência de camundongos após vacinação com placebo(água, T01), vacinação com vacina de subunidade H5 adjuvantada comestrutura beta cruzada (grupo T03) ou vacinada com vírus de influenzainativado (H5N9) (grupo TIO) e exposição a 20 LD50 como descrito emmateriais e métodos.

A. Titulações de anti-H5 em soros de camundongocombinados no dia 33 após a vacinação com placebo, H5 não-tratada, vacinade H5N9 comercial ou H5 adjuvantada com beta cruzada foram avaliadasempregando H5 recombinante de uma fonte diferente do antígeno usado paravacinação que o antígeno no ELISA. B. Titulações anti-H7 em soros decamundongo combinados no dia 33 após a vacinação com placebo, H7 não-tratada, H7 adjuvantada com Specol ou H7 adjuvantada com beta cruzadaforam avaliadas em um ELISA. C. Com soros de camundongo pré- imune esoros obtidos no dia 33 após a vacinação com placebo, H5 não-tratada ou H5adjuvantada com beta cruzada, titulações contra DOVA foram avaliadas.DOVA foi parte das formulações de vacina para grupos 3, 4 e 5, D.Sobrevivência de camundongos vacinados com placebo (T01), antígeno deH5 de beta cruzada (T03) ou vacina de vírus H5N9 inativado (TIO), apósexposição a vírus H5N1. E. Titulações determinadas com soros decamundongos individuais de T03 obtidas no dia 33 após a vacinação com H5adjuvantada com beta cruzada, F. Titulações determinadas com soros decamundongo individuais de TlO obtidos no dia 33 após a vacinação com vírusH5N9 inativado.

Figura 14: Sobrevivência, no dia 14, de porcos que são vacinados com E2adjuvantada com estrutura beta cruzada ou E2 adjuvantada com DOE eexpostos com 200 LD50 da cepa Brescia 456610 do vírus da febre suínaclássica.

Sobrevivência de porcos após exposição com CSFV. GrupoT03 foi vacinado com E2 - beta cruzada, e também porco n° 143 do GrupoT05, Grupo T06 foi vacinado com emulsão de E2 adjuvantada com água-óleo(DOE).

Figura 15: Anticorpos de OVA auto-imunes formados quando davacinação com vacinas compreendendo estrutura beta cruzada.

Anticorpos em soros coletados de frangos imunizados comvacinas descritas no texto foram determinados por meio de ELISA. Usou-seOVA com propriedades similares a amilóide como o antígeno no ELISA.

Lista de Referência (exceto Exemplos de 7 a 14)

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Lista de referências para os Exemplos de 7 a 14

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Tabela 1

<table>table see original document page 137</column></row><table>

Tabela 2

<table>table see original document page 137</column></row><table><table>table see original document page 138</column></row><table> Tabela 3: Proteínas envolvidas na "Via de estrutura beta cruzada"

<table>table see original document page 138</column></row><table><table>table see original document page 139</column></row><table>

Tabela 4

<table>table see original document page 139</column></row><table>

Tabela 5

<table>table see original document page 139</column></row><table>Tabela 6 ELISA com camundongos de grupo A, PorA adjuvantada com alume Subtipo de Neisseria P1.7-2,4

<table>table see original document page 140</column></row><table>

Tabela 7

ELISA com camundongos de grupo A, PorA adjuvantada com alume

<table>table see original document page 140</column></row><table>

Tabela 8 ELISA com camundongos de grupo A, PorA adjuvantada com alume Subtipo de Neisseria PI.12-1,13

<table>table see original document page 140</column></row><table>

Tabela 9 ELISA com camundongos de grupo A, PorA adjuvantada com alume Subtipo de Neisseria P1.7-2,4 <table>table see original document page 140</column></row><table><table>table see original document page 141</column></row><table>Tabela 13

<table>table see original document page 142</column></row><table>

Tabela 14

<table>table see original document page 142</column></row><table>

Tabela 15

<table>table see original document page 142</column></row><table>

Tabela 16

<table>table see original document page 142</column></row><table><table>table see original document page 143</column></row><table>Tabela 20

<table>table see original document page 144</column></row><table>

Tabela 21

<table>table see original document page 144</column></row><table>

Tabela 22

<table>table see original document page 144</column></row><table><table>table see original document page 145</column></row><table><table>table see original document page 146</column></row><table>Tabela 28:

<table>table see original document page 147</column></row><table>

Tabela 29:

<table>table see original document page 147</column></row><table><table>table see original document page 148</column></row><table><table>table see original document page 149</column></row><table>Na última coluna indica-se o número de dias com febre (>40,0°C).<table>table see original document page 150</column></row><table>Tabela 34:

<table>table see original document page 151</column></row><table>IDENTIDADES DE SEQÜÊNCIASEQÜÊNCIA ID 1

seqüência de DNA da hemaglutinina 5 (H5) da gripe aviáriaggatccgaateagatttgeattggttaí^tgcaaacaact^^aÊgttactgi&acaraigccraagacãtact^üAgccteteattttgagggattgtagtgtagctggat®£etc^^tga^gaatggtcttacatagfcggagaaggí^atgaagaactgaaa(aMtattgagca|^taaaccattttgaga^atggettafaaaaaagaaragtgcataeoí^caataaagagi^g^ttggtâctgtgggg^tt^çcat^^aaagtggãí^^tj^gtt^trággâcãattttâRãgccgH^atggtaactgxãácáccaa gt{ftcáaHctecaHtgggggc^teaá<±ct&gtátg^óra^aúcategggfpatgúe^^CteaaagagBgBgaagaagaB π a π agagaggBctatttggagütatagcaggttttatagagggaggatggragggHátggt&gâtggttggíatgggtaçraccatagcHH^gáátecactcBB^ggç^tãgáis^ttgaggeegttggimgggaatttaataee^gàttcctagatgtct ggac ttacaat gctgaactfcctggttctc atggaaaat gãgagaactctc gârtttcat ga.ctçaáátg^câagaâçtftta^^gtttcgaafctctãtcácá H 3t^gataátgaatgtatg^a3gt^aáAaaácggaãcgtat^etacCcgcagtattcagaagaRgcaagactaaacagagaggaaataagtí^satactggçggQEgc

SEQÜÊNCIA ID 2

Seqüência de aminoácidos da hemaglutinina 5 (H5) da gripe

mrpwtotMiifeq^mj gsdgiri^hannstegylrdcsvagwUgnpmcdefmvpewsyiveka^s^nMassg^rssacpylgrssf£mv%av]ik^tyisvgtetín^ávpâat^kçagq^lfcygncmk^tpmgaínsampíhiiüipltagBcpky^gwqgmvdgwyg^hmeqgçgyaadfc^JdanéígMvwtynas JMmenertl díMsnvknlyd&vrlqh^vkn,gty<JypqyseeariffireeísgvMesmí!^^

SEQÜÊNCIA ID 3

seqüência de DNA da hemaglutinina 7 (H7) da gripe aviária

Ag^tógateâcastógüeítgggc^^gagtggMgtçgttaatgt&açtgaaircig^ggaaigttgáç^gi^^tí^gga^gctógaggcíia^ttctcagaga^Ga^ggaatt«a(»aggagataatgggattcacctacagcgRaataagaactaaí£gagcaa<xagtg»tgtaggagafcc^gatotcatt^aacseHçacaaigctgctfóccq^axitgacta^tatgggggatccaocartccggatxaactacagaacagaceaagcwagttgggagttcíaattaeraacagtaitt^aagaattgacttteatíggctgatactaaac<»t^tí^cHcgEtcactt^cagaccgtgeaagettteigí^gaingHS^^^ggagattgctateatagfggagggacaabiataagt^t«^ccttfcagaacategaaaat^cegagatatg^taagjCiMgapii^g^aaagaggaggagga^ggrctattt&gtBctaí^caatt^teaaataacâgggaaattaaateggrttatagaaaaaacteaccaacagtttgagttaattgaattcactgaggttgaaáagçaaattEgcaaígtgataaaetgg^tcctat^cgetgaajctc±tagtagc3atggagaa{«agcacaoaattgatciggccgactcagactgtacgüa(^^gaa^gacaact^gagagaatgccgaagaagatggcactggttgc(tcgaaatattteacaagCgtgatg^garf^atgi^agtattagaaaraac^a^tgatcaca^caaiaeaaaHtagaatacagattgacccagícaaacíaagcagcg^^SEQÜÊNCIA ID 4

Seqüência de aminoácidos da hemaglutinina 7 (H7) da gripe aviária

m/pwgümZZZZHicaps^agsdMclghhavsngl^

dlgqcgügtitgppqedqflefsadMerregsdvcyp^

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SEQÜÊNCIA ID 5

DNA da proteína E2 do Vírus da Febre Suína Clássica

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CTGGCTGCTGCTGGI^C^GGCGCCC&GGCX:<^C

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5 SEQÜÊNCIA ID 6

Aminoácido da proteína E2 do vírus da febre suína clássica

SEQÜÊNCIA ID 7

DNA e seqüência de aminoácidos da catepsina L3 de Fasciola hepaticacatepsina (proteína CL3)ggtaGGagatccagcaacaacgtgagetggeacgagtggaagcggstgtacaocaaagag

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SEQÜÊNCIA ID 8

Seqüência de aminoácidos do peptídio de catepsina L3 de Fasciola hepaticacom uma extensão Cys amino-terminal (peptídio CL3)CSNDVS WHE WKRMYNKE YNG

Claims

1. Método para produzir uma composição imunogênica,compreendendo pelo menos um peptídeo, polipeptídeo, proteína,glicoproteína e/ou lipoproteína, caracterizado pelo fato de compreenderprover referida composição com pelo menos uma estrutura β-cruzada.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a referida estrutura β-cruzada é induzida em pelo menos parte dereferido pelo menos um peptídeo, polipeptídeo, proteína, glicoproteína e/oulipoproteína.

3. Uso de estruturas β-cruzadas, caracterizado pelo fato de serna preparação de uma vacina para a profilaxia de uma doença infecciosa.

4. Uso de estruturas β-cruzadas induzidas em um componentede proteína de um agente infeccioso, caracterizado pelo fato de ser napreparação de uma vacina induzindo uma resposta imune contra referidoagente infeccioso.

5. Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelofato de que referido componente de proteína é uma proteína viral e em quereferido agente infeccioso é um vírus.

6. Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelofato de que referido componente de proteína é uma proteína bacteriana e emque referido agente infeccioso é uma bactéria.

7. Vacina de subunidade, caracterizada pelo fato decompreender pelo menos uma proteína viral, em que pelo menos 4-50%,preferivelmente 10-30% de referida proteína viral está em uma conformaçãocompreendendo estruturas β-cruzadas.

8. Vacina de subunidade, caracterizada pelo fato decompreender pelo menos uma proteína bacteriana, em que pelo menos 4-5 0%,preferivelmente 10-30% de referida proteína bacteriana está em umaconformação compreendendo estruturas β-cruzadas.

9. Vacina de subunidade, caracterizada pelo fato decompreender pelo menos duas proteínas virais, em que pelo menos 4-50%,preferivelmente 10-30% de pelo menos uma das referidas proteínas virais estáem uma conformação compreendendo estruturas β-cruzadas.

10. Vacina de subunidade, caracterizada pelo fato decompreender pelo menos duas proteínas bacterianas, em que pelo menos 4--50%, preferivelmente 10-30% de pelo menos uma das referidas proteínasbacterianas está em uma conformação compreendendo estruturas β-cruzadas.

11. Método para melhorar a imunogenicidade de umacomposição compreendendo pelo menos um peptídeo, polipeptídeo, proteína,glicoproteína, e/ou lipoproteína, caracterizado pelo fato de compreendercontatar pelo menos um de referido peptídeo, polipeptídeo, proteína,glicoproteína e/ou lipoproteína com um agente indutor β-cruzado, assimprovendo referida composição com estruturas β-cruzadas adicionais.

12. Método para intensificar a imunogenicidade de umacomposição de vacina compreendendo pelo menos um peptídeo, polipeptídeo,proteína, glicoproteína, e/ou lipoproteína, caracterizado pelo fato decompreender contatar pelo menos um dentre referido peptídeo, polipeptídeo,proteína, glicoproteína e/ou lipoproteína com um agente indutor β-cruzado,assim provendo referida composição de vacina com estruturas β-cruzadasadicionais.

13. Método para determinar a quantidade de estruturas β-cruzadas em uma composição de vacina, caracterizado pelo fato decompreender contatar referida composição de vacina com pelo menos umcomposto de ligação de estrutura β-cruzada e relacionar a quantidade deestruturas β-cruzadas ligadas à quantidade de estruturas β-cruzadas presentesna composição de vacina.

14. Uso de estruturas β-cruzadas, caracterizado pelo fato de serna preparação de uma composição imunogênica para a profilaxia e/outratamento de câncer.

15. Uso de estruturas β-cruzadas, caracterizado pelo fato de serna preparação de uma composição imunogênica para:- imuno-castração e/ou- a profilaxia e/ou tratamento de aterosclerose, amiloidoses,doenças autoimunes, rejeições de enxerto-versus-hospedeiro e/ou rejeições atransplantes.

16. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato decompreender um antígeno bacteriano ou parasítico ou viral, referido antígenocompreendendo pelo menos entre 4-50%, preferivelmente 10-30% de referidoantígeno está em uma conformação de estrutura β-cruzada.

17. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação-16, caracterizada pelo fato de que referido antígeno compreende proteínaHPV E6, proteína HPV E7, hemaglutinina H5 de influenza, hemaglutinina deinfluenza H7, proteína de pestivírus E2, proteína de Fasciola hepatica CL3e/ou proteína de Neisseria PorA.

18. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação-16 ou 17, caracterizada pelo fato de que é uma vacina.

19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1--2 ou 11-13, caracterizado pelo fato de que referido pelo menos um peptídeo,polipeptídeo, proteína, glicoproteína e/ou lipoproteína, compreende HPV E6,HPV E7, Fasciola hepática CL3, Influenza H5, Influenza H7, proteína depestivírus E2 e/ou proteína de Neisseria PorA.

20. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato decompreender uma p2glicoproteína I ou um peptídeo antigênico da mesma,referida composição imunogênica compreendendo pelo menos entre 4-67%,preferivelmente 10-33% de referida proteína ou peptídeo em umaconformação de estrutura β-cruzada.

21. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato decompreender uma p2glicoproteína I ou um peptídeo antigênico da mesma, emque referida p2glicoproteína I, ou um peptídeo antigênico da mesma, écopulada a ou misturada com outra proteína ou peptídeo da mesma,compreendendo pelo menos entre 4-67%, preferivelmente 10-33% de referidaoutra proteína ou peptídeo em uma conformação de estrutura β-cruzada.

22. Uso de uma composição imunogênica como definida nareivindicação 20 ou 21, caracterizado pelo fato de ser para a profilaxia outratamento de uma doença autoimune.

23. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato decompreender uma proteína bacteriana ou parasítica ou viral ou um peptídeoantigênico da mesma, referida proteína compreendendo pelo menos entre 4--67%, preferivelmente 10-33% de referida proteína ou peptídeo em umaconformação de estrutura β-cruzada.

24. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato decompreender uma proteína bacteriana ou parasítica ou viral ou um peptídeoantigênico da mesma, em que referida proteína ou peptídeo antigênico écopulado a ou misturado com outra proteína ou peptídeo compreendendo pelomenos entre 4-67%, preferivelmente 10-33% de referida outra proteína oupeptídeo em uma conformação de estrutura β-cruzada.

25. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação-21 ou 24, caracterizada pelo fato de que a referida outra proteína compreendeOVA ou KLH ou uma combinação de ambos.

26. Composição imunogênica ou vacina de acordo comqualquer uma das reivindicações 7-10, 16-18, 20-21, ou 23-25, caracterizadapelo fato de ainda compreender um adjuvante.