BR122021003080B1

BR122021003080B1 - Método de produção de um promotor vegetal, método de produção de uma planta, construção, vetor, microrganismo transgênico e usos do neena e da construção recombinante ou vetor recombinante

Info

Publication number: BR122021003080B1
Application number: BR122021003080-4A
Authority: BR
Inventors: Josef Martin Kuhn; Linda Patricia Loyall; Malte Siebert; Elke Duwenig
Original assignee: Basf Plant Science Company Gmbh
Priority date: 2009-08-31
Filing date: 2010-08-11
Publication date: 2022-05-10
Also published as: CA3048833C; US10041081B2; US10041082B2; JP5794987B2; EP3156491B1; AR078009A1; CL2012000553A1; AU2010288760A1; EP3156491A1; CN111560375A; RU2012112346A; AR115680A2; RU2015125627A3; RU2559534C2; AU2016256724A1; BR122021003076B1; AU2016256726A1; CN102575259A; AR115682A2; AU2016201517B2

Abstract

A presente invenção encontra-se no campo de biologia molecular de plantas e fornece métodos para a produção de promotores semente-específicos e/ou semente-preferenciais de alta expressão e a produção de plantas com expressão semente-específica e/ou semente-preferencial aumentada de ácidos nucleicos em que os ácido nucleicos que aumentam a expressão de ácido nucleico (NEENAs) estão funcionalmente ligados aos ditos promotores e/ou introduzidos nas plantas.

Description

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção está no campo de biologia molecular de plantas e fornece métodos para a produção de promotores semente-específicos e/ou semente-preferenciais de alta expressão e a produção de plantas com expressão semente-específica e/ou semente-preferencial aumentada de ácidos nucleicos em que os ácidos nucleicos que aumentam a expressão de ácido nucleico (NEENAs) estão funcionalmente ligados aos ditos promotores e/ou introduzidos em plantas.

[002] A expressão de transgenes em plantas é fortemente afetada por vários fatores externos e internos que resultam em um nível variável e imprevisível de expressão transgênica. Geralmente um grande número de transformantes deve ser produzido e analisado para identificar as linhagens com a força de expressão desejada. Visto que a transformação e triagem de linhagens com a força de expressão desejada é dispendiosa e trabalhosa, há a necessidade de alta expressão de um ou mais transgenes em uma planta. Esse problema é especialmente evidente quando vários genes tiverem de ser expressos de maneira coordenada em uma planta transgênica para obter um efeito específico visto que uma planta deve ser identificada onde cada e todos os genes são fortemente expressos.

[003] Por exemplo, a expressão de um transgene pode variar significativamente, dependendo do desenho de construção e dos efeitos posicionais do local de inserção de T-DNA em eventos de transformação individuais. Promotores fortes podem superar parcialmente esses desafios. Entretanto, a disponibilidade de promotores adequados que mostram forte expressão com a especificidade desejada é geralmente limitada. Para garantir a disponibilidade de promotores suficientes com a especificidade de expressão desejada, a identificação e caracterização de promotores adicionais podem ajudar a fechar essa lacuna. Entretanto, a disponibilidade natural de promotores das respectivas especificidade e força e a caracterização demorada de candidatos a promotores impede a identificação de novos promotores adequados.

[004] Para superar esses desafios, diversos elementos e/ou motivos genéticos foram mostrados para afetar positivamente a expressão genética. Entre esses, alguns íntrons foram identificados como elementos genéticos com um forte potencial para aumentar a expressão genética. Embora o mecanismo seja amplamente desconhecido, foi mostrado que alguns íntrons afetam positivamente a proporção de estado estacionário de mRNA maduro, possivelmente por atividade transcricional aumentada, maturação de mRNA aprimorada, exportação de mRNA nuclear aumentada e/ou iniciação de tradução aprimorada (por exemplo, Huang and Gorman, 1990; Le Hir et al., 2003; Nott et al., 2004). Visto que apenas os íntrons selecionados foram mostrados para aumentar a expressão, é provável que o splicing não seja responsável pelos efeitos observados.

[005] O aumento de expressão genética observado mediante a ligação funcional de íntrons a promotores é denominado aumento mediado por íntron (IME) de expressão genética e foi mostrado em várias plantas monocotiledôneas (por exemplo, Callis et al., 1987; Vasil et al., 1989; Bruce et al., 1990; Lu et al., 2008) e dicotiledôneas (por exemplo, Chung et al., 2006; Kim et al., 2006; Rose et al., 2008). Nesse aspecto, a posição do íntron em relação ao local de início de tradução (ATG) foi mostrada como crucial para o aumento mediado por íntron de expressão genética (Rose et al., 2004).

[006] Próximo a seu potencial para aumentar a expressão genética, alguns íntrons foram mostrados também para afetar a especificidade de tecido em seu ambiente nucleotídico nativo em plantas. A expressão de gene repórter foi identificada como dependente da presença de regiões genômicas contendo até dois íntrons (Sieburth et al., 1997; Wang et al., 2004). Os íntrons 5' UTR também foram relatados como importantes para a funcionalidade adequada de elementos promotores, provavelmente devido a elementos de controle genético tecido-específicos que se encontram nos íntrons (Fu et al. ,1995a; Fu et al., 1995b; Vitale et al., 2003; Kim et al., 2006). Entretanto, esses estudos também mostraram que a combinação de íntrons com promotores heterólogos pode possuir fortes impactos negativos sobre a força e/ou especificidade de expressão genética (Vitale et al., 2003; Kim et al., 2006, WO2006/003186, WO2007/098042). Por exemplo, o forte promotor semente-específico e/ou semente-preferencial CaMV35S do Vírus do Mosaico da Couve-Flor é negativamente afetado através da combinação com o íntron SeFAD2 5'UTR de gergelim (Kim et al., 2006). Em contrário a essas observações, alguns documentos mostram uma expressão aumentada de um ácido nucleico por IME sem afetar a especificidade de tecido do respectivo promotor (Schünmann et al., 2004). Os íntrons ou NEENAs que aumentam a expressão semente-específica e/ou semente-preferencial quando funcionalmente ligados a um promotor heterólogo não foram mostrados na técnica.

[007] No presente pedido, moléculas de ácido nucleico adicionais são descritas para aumentar a expressão dos ditos promotores sem afetar sua especificidade mediante a ligação funcional a promotores semente-específicos e/ou semente-preferenciais. Essas moléculas de ácido nucleico estão no presente pedido descritas como "ácidos nucleicos que aumentam a expressão de ácido nucleico" (NEENA). Os íntrons possuem a característica intrínseca retirados do respectivo pré-mRNA. Em contraste a isso, os ácidos nucleicos apresentados na finalidade de aplicação, não devem ser necessariamente incluídos no mRNA ou, se presentes no mRNA, não devem ser necessariamente retirados do mRNA para aumentar a expressão derivada do promotor ao qual os NEENAs estão funcionalmente ligados.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[008] Uma primeira realização da invenção compreende um REIV 1método para a produção de um promotor semente-específico e/ou semente- preferencial de alta expressão que compreende ligar funcionalmente a um promotor uma ou mais moléculas de ácido nucleico de aumento de expressão de ácido nucleico (NEENA) que compreende: i) a molécula de ácido nucleico que possui uma sequência como definido em qualquer uma entre SEQ ID NO: 1 a 15, ou ii) uma molécula de ácido nucleico que possui uma sequência com uma identidade de 80% ou mais com qualquer uma das sequências como definido por SEQ ID NO:1 a 15, de preferência, a identidade é 85% ou mais, com mais preferência, a identidade é 90% ou mais, com ainda mais preferência, a identidade é 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais ou 99% ou mais, na realização mais preferida, a identidade é 100% com qualquer uma das sequências como definido por SEQ ID NO:1 a 15, ou iii) um fragmento de 100 ou mais bases consecutivas, de preferência, 150 ou mais bases consecutivas, com mais preferência, 200 bases consecutivas ou ainda mais preferência, 250 ou mais bases consecutivas de uma molécula de ácido nucleico de i) ou ii) que possui uma atividade de aumento de expressão, por exemplo, 65% ou mais, de preferência, 70% ou mais, com mais preferência, 75% ou mais, com ainda mais preferência 80% ou mais, 85% ou mais ou 90% ou mais, em uma realização mais preferida essa possui 95% ou mais da atividade de aumento de expressão como a molécula de ácido nucleico correspondente que possui a sequência de qualquer uma das sequências como definido por SEQ ID NO:1 a 15, ou iv) uma molécula de ácido nucleico que é o complemento ou complemento reverso de qualquer uma das moléculas de ácido nucleico anteriormente mencionadas sob i) a iii), ou v) uma molécula de ácido nucleico que é obtenível por PCR utilizando primers de oligonucleotídeo descritos por SEQ ID NO: 20 a 29, 34 a 41, 44 a 51 e 54 a 57 como mostrado na Tabela. 2 ou vi) uma molécula de ácido nucleico de 100 nucleotídeos ou mais, 150 nucleotídeos ou mais, 200 nucleotídeos ou mais ou 250 nucleotídeos ou mais, que se hibridizam sob condições equivalentes à hibridização em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M de NaPO4, 1 mM de EDTA a 50°C com lavagem em 2 X SSC, 0,1 % de SDS a 50°C ou 65°C, de preferência, 65°C em uma molécula de ácido nucleico que compreende ao menos 50, de preferência, ao menos 100, com mais preferência, ao menos 150, com ainda mais preferência, ao menos 200, com máxima preferência, ao menos 250 nucleotídeos consecutivos de uma sequência nucleotídica de aumento de transcrição descrita por SEQ ID NO:1 a 15 ou o complemento da mesma. De preferência, a dita molécula de ácido nucleico se hibridiza sob condições equivalentes à hibridização em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M de NaPO4, 1 mM de EDTA a 50°C com lavagem em 1 X SSC, 0,1 % de SDS a 50°C ou 65°C, de preferência, 65°C em uma molécula de ácido nucleico que compreende ao menos 50, de preferência, ao menos 100, com mais preferência, ao menos 150, com ainda mais preferência, ao menos 200, com máxima preferência, ao menos 250 nucleotídeos consecutivos de uma sequência nucleotídica de aumento de transcrição descrita por SEQ ID NO:1 a 15 ou o complemento da mesma, com mais preferência, a dita molécula de ácido nucleico se hibridiza sob condições equivalentes à hibridização em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M de NaPO4, 1 mM de EDTA a 50°C com lavagem em 0,1 X SSC, 0,1 % de SDS a 50°C ou 65°C, de preferência, 65°C em uma molécula de ácido nucleico que compreende ao menos 50, de preferência, ao menos 100, com mais preferência, ao menos 150, com ainda mais preferência, ao menos 200, com máxima preferência, ao menos 250 nucleotídeos consecutivos de uma sequência nucleotídica de aumento de transcrição descrita por qualquer uma das sequências como definido por SEQ ID NO:1 a 15 ou o complemento da mesma.

[009] Em uma realização, o um ou mais NEENA é heterólogo ao promotor ao qual esse está funcionalmente ligado.

[010] Como descrito acima sob v) a molécula de ácido nucleico obtenível por PCR utilizando oligonucleotídeos como definido por SEQ IDs 20 a 29, 34 a 41, 44 a 51 e 54 a 57 como mostrado na Tabela 2 é obtenível, por exemplo, a partir de DNA genômico de plantas Arabidopsis como A. thaliana utilizando as condições descritas no Exemplo 1 abaixo.

[011] O elemento versado na técnica está ciente das variações no perfil de temperatura, número de ciclos e/ou composição de tampão ou concentração para obter a respectiva molécula de NEENA. A combinação específica de oligonucleotídeos que será usada na respectiva reação de PCR para obter uma respectiva molécula de NEENA é descrita na Tabela 2.

[012] Um elemento versado na técnica está ciente de métodos para tornar um promotor unidirecional em um bidirecional e de métodos para utilizar o complemento ou complemento reverso de uma sequência promotora para criar um promotor que possui a mesma especificidade de promotor que a sequência original. Tais métodos são, por exemplo, descritos para promotores semente-específicos e/ou semente-preferenciais bem como induzíveis por Xie et al. (2001) "Bidirectionalization of polar promoters in plants" nature biotechnology 19 páginas 677 a 679. Os autores descrevem que é suficiente adicionar um promotor mínimo à extremidade de primer 5' de qualquer determinado promotor para receber um promotor que controla a expressão em ambas as direções com a mesma especificidade de promotor. Então, um promotor de alta expressão funcionalmente ligado a um NEENA como descrito acima é funcional em complemento ou complemento reverso e, portanto, o NEENA é funcional em complemento ou complemento reverso também.

[013] A princípio o NEENA pode ser funcionalmente ligado a qualquer promotor como promotores tecido-específicos, induzíveis, específicos de desenvolvimento ou constitutivos. O respectivo NEENA irá resultar em uma expressão semente-específica e/ou semente-preferencial aumentada do ácido nucleico heterólogo sob o controle do respectivo promotor ao qual o um ou mais NEENA está funcionalmente ligado. O aumento da expressão de promotores em vez de promotores semente-específicos e/ou semente-preferenciais, por exemplo, promotores semente-específicos e/ou semente-preferenciais ou promotores com especificidade de tecido diferente, irá apresentar a especificidade desses promotores. A expressão do ácido nucleico sob o controle do respectivo promotor será significativamente aumentada em sementes, em que a transcrição do dito ácido nucleico pode não ter sido detectada ou apenas fracamente detectada sem o NEENA funcionalmente ligado a seu promotor. Então, o promotor tecido ou em desenvolvimento-específico ou qualquer outro pode se transformar em promotores semente-específicos e/ou semente- preferenciais ao ligar funcionalmente uma ou mais moléculas de NEENA como descrito acima ao dito promotor. Portanto, outra realização da invenção proporciona um método para apresentar a especificidade de qualquer determinado promotor funcional em planta a um promotor semente-específico e/ou semente-preferencial ao ligar o respectivo promotor a uma molécula de NEENA que compreende uma sequência como descrito acima sob i) a vi).

[014] De preferência, o um ou mais NEENA é funcionalmente ligado a qualquer promotor semente-específico e/ou semente-preferencial e irá aumentar a expressão da molécula de ácido nucleico sob o controle do dito promotor. Os promotores semente-específicos e/ou semente-preferenciais que serão usados em qualquer método da invenção podem ser derivados de plantas, por exemplo, plantas monocotiledôneas ou dicotiledôneas, de bactérias e/ou vírus ou podem ser promotores sintéticos. Os promotores semente-específicos e/ou semente-preferenciais que serão usados são, por exemplo, o promotor SBP de Vicia faba, o promotor de Proteína de Semente Desconhecida de Vicia faba, o promotor napina de Brassica napus, o promotor de conlinina de Linum usitatissmum, o promotor do gene A.thaliana At5g01670 que codifica a proteína similar à peroxiredoxina, o promotor da proteína similar à peroxiredoxina de Linum usitatissmum, o promotor de proteína similar à globulina de Brassica napus, o promotor de arcelin5-1 de Phaseolus vulgaris, o promotor de Zeína de Zea maize, o promotor de globulina de Zea maize, o promotor pKG86 de Zea maize como descrito no Exemplo 6 abaixo e similares.

[015] Os promotores semente-específicos e/ou semente- preferenciais de alta expressão da invenção funcionalmente ligados a um NEENA podem ser empregados em qualquer planta que compreende, por exemplo, musgo, samambaia, gimnosperma ou angiosperma, por exemplo, planta monocotiledônea ou dicotiledônea. Em uma realização preferida o dito promotor da invenção funcionalmente ligado a um NEENA pode ser empregado em plantas monocotiledôneas ou dicotiledôneas, de preferência, planta de cultura como milho, soja, canola, algodão, batata, beterraba, arroz, trigo, sorgo, cevada, musácea, cana-de-açúcar, miscanto e similares. Em uma realização preferida da invenção, o dito promotor que é funcionalmente ligado a um NEENA pode ser empregado em plantas de cultura monocotiledôneas como milho, arroz, trigo, sorgo, cevada, musácea, miscanto ou cana-de-açúcar. Em uma realização especialmente preferida o promotor funcionalmente ligado a um NEENA pode ser empregado em plantas de cultura dicotiledôneas como soja, canola, algodão ou batata.

[016] Um promotor semente-específico e/ou semente-preferencial de alta expressão como usado no pedido significa, por exemplo, um promotor que é funcionalmente ligado a um NEENA causando a expressão semente específica e/ou semente-preferencial aumentada do promotor em uma semente da planta ou parte da mesma em que o acúmulo de RNA ou a taxa de síntese de RNA em sementes derivada da molécula de ácido nucleico sob o controle do respectivo promotor funcionalmente ligado a um NEENA é maior, de preferência, significativamente maior do que a expressão em sementes causada pelo mesmo promotor desprovido de um NEENA da invenção. De preferência, a quantidade de RNA do respectivo ácido nucleico e/ou a taxa de síntese de RNA e/ou a estabilidade de RNA em uma planta é aumentada 50% ou mais, por exemplo, 100% ou mais, de preferência, 200% ou mais, com mais preferência, 5 vezes ou mais, com ainda mais preferência, 10 vezes ou mais, com máxima preferência, 20 vezes ou mais, por exemplo, 50 vezes comparada com uma planta de controle da mesma idade desenvolvida sob as mesmas condições compreendendo o mesmo promotor semente-específico e/ou semente-preferencial, sendo que a última não é funcionalmente ligada a um NEENA da invenção.

[017] Quando usado aqui, significativamente maior se refere à significância estatística que o versado na técnica está ciente de como determinar, por exemplo, ao aplicar testes estatísticos como o teste t aos respectivos conjuntos de dados.

[018] Os métodos para detectar a expressão conferida por um promotor são conhecidos na técnica. Por exemplo, o promotor pode ser funcionalmente ligado a um gene marcador como GUS, GFP ou luciferase e a atividade da respectiva proteína codificada pelo respectivo gene marcador pode ser determinada na planta ou parte da mesma. Como um exemplo representativo, o método para detectar a luciferase é descrito em detalhes abaixo. Outros métodos são, por exemplo, medir o nível de estado estacionário ou a síntese de taxa de RNA da molécula de ácido nucleico controlada pelo promotor por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, análise Northern blot, qPCR, análises operacionais ou outros métodos descritos na técnica.

[019] Um elemento versado na técnica está ciente de vários métodos para ligar funcionalmente duas ou mais moléculas de ácido nucleico. Tais métodos podem incluir a restrição/ligação, clonagem independente de ligase, recombinação ou síntese. Outros métodos podem ser empregados para ligar funcionalmente duas ou mais moléculas de ácido nucleico.

[020] Uma realização adicional da presente invenção é um método para produzir uma planta ou parte da mesma com, comparado a uma respectiva planta de controle ou parte da mesma, a expressão semente- específica e/ou semente-preferencial aumentada de uma ou mais moléculas de ácido nucleico compreendendo as etapas de introduzir na planta ou parte da mesma um ou mais NEENA que compreendem uma molécula de ácido nucleico como definido acima sob i) a vi) e ligar funcionalmente o dito um ou mais NEENA a um promotor, de preferência, um promotor semente-específico e/ou semente- preferencial e a uma molécula de ácido nucleico que está sob o controle do dito promotor, de preferência, promotor semente-específico e/ou semente- preferencial, em que o NEENA é heterólogo à dita molécula de ácido nucleico.

[021] O NEENA pode ser heterólogo à molécula de ácido nucleico que está sob o controle do dito promotor ao qual o NEENA está funcionalmente ligado ou esse pode ser heterólogo ao promotor e à molécula de ácido nucleico sob o controle do dito promotor.

[022] O termo "heterólogo" em relação a uma molécula de ácido nucleico ou DNA se refere a uma molécula de ácido nucleico que é ligada de maneira funcional a, ou é manipulada para ficar ligada de maneira funcional a, uma segunda molécula de ácido nucleico à qual esse não está ligado de maneira funcional em natureza, ou à qual está ligado de maneira funcional em uma localização diferente em natureza. Por exemplo, um NEENA da invenção está em seu ambiente natural funcionalmente ligado a seu promotor nativo, enquanto na presente invenção esse é ligado a outro promotor que pode ser derivado do mesmo organismo, um organismo diferente ou pode ser um promotor sintético. Isso também pode significar que o NEENA da presente invenção é ligado a seu promotor nativo, porém a molécula de ácido nucleico sob o controle do dito promotor é heteróloga ao promotor que compreende seu NEENA nativo. Ademais, é entendido que o promotor e/ou a molécula de ácido nucleico sob o controle do dito promotor funcionalmente ligado a um NEENA da invenção é heterólogo ao dito NEENA visto que sua sequência foi manipulada, por exemplo, por mutação como inserções, deleções e assim por diante de modo que a sequência natural do promotor e/ou a molécula de ácido nucleico sob o controle do dito promotor seja modificada e, portanto, se torne heteróloga a um NEENA da invenção. Também pode ser entendido que o NEENA é heterólogo ao ácido nucleico ao qual esse é funcionalmente ligado quando o NEENA for funcionalmente ligado a seu promotor nativo em que a posição do NEENA em relação ao dito promotor é alterada de modo que o promotor mostre expressão maior após tal manipulação.

[023] Uma planta que exibe expressão semente-específica e/ou semente-preferencial aumentada de uma molécula de ácido nucleico como entendido aqui significa uma planta que possui uma expressão semente- específica e/ou semente-preferencial maior, de preferência, estatisticamente maior significativa de uma molécula de ácido nucleico comparada com uma planta de controle desenvolvida sob as mesmas condições sem o respectivo NEENA funcionalmente ligado à respectiva molécula de ácido nucleico. Tal planta de controle pode ser uma planta de ocorrência natural ou uma planta transgênica que compreende o mesmo promotor que controla o mesmo gene como na planta da invenção em que o promotor não é ligado a um NEENA da invenção.

[024] A produção de uma planta como usado aqui compreende métodos para a transformação estável como introduzir uma construção de DNA recombinante em uma planta ou parte da mesma por meio de transformação mediada por Agrobacterium, transformação de protoplasto, bombardeamento de partículas ou similares e opcionalmente regeneração subsequente de uma planta transgênica. Essa também compreende métodos para a transformação temporária de uma planta ou parte da mesma como infecção viral ou infiltração de Agrobacterium. Um elemento versado na técnica está ciente de métodos adicionais para a transformação estável e/ou temporária de uma planta ou parte da mesma. Abordagens como métodos de reprodução ou fusão de protoplasto também devem ser empregadas para a produção de uma planta da invenção e são abrangidas com esses. O método da invenção pode ser aplicado a qualquer planta, por exemplo, gimnosperma ou angiosperma, de preferência, angiosperma, por exemplo, plantas dicotiledôneas ou monocotiledôneas, de preferência, plantas dicotiledôneas. As plantas monocotiledôneas preferidas são, por exemplo, milho, trigo, arroz, cevada, sorgo, musácea, cana-de-açúcar, miscanto e braquipódio, as plantas monocotiledôneas especialmente preferidas são milho, trigo e arroz. As plantas dicotiledôneas preferidas são, por exemplo, soja, colza, canola, linho, algodão, batata, beterraba, tagetes e Arabidopsis, as plantas dicotiledôneas especialmente preferidas são soja, colza, canola e batata.

[025] Em uma realização da invenção, os métodos conforme definidos acima compreendem as etapas de: a) introduzir o um ou mais NEENA que compreendem uma molécula de ácido nucleico como definido acima em i) a vi) em uma planta ou parte da mesma e b) integrar o dito um ou mais NEENA no genoma da dita planta ou parte da mesma, com isso o dito um ou mais NEENA é funcionalmente ligado a um ácido nucleico endógeno, de preferência, expresso de maneira semente- específica e/ou semente-preferencial heterólogo ao dito um ou mais NEENA e opcionalmente c) regenerar uma planta ou parte da mesma que compreende o dito um ou mais NEENA a partir da dita célula transformada.

[026] A uma ou mais moléculas de NEENA podem ser introduzidas na planta ou parte da mesma por meio de bombardeamento de partículas, eletroporação de protoplasto, infecção viral, transformação mediada por Agrobacterium ou qualquer outra abordagem conhecida na técnica. A molécula de NEENA pode ser introduzida integrada, por exemplo, em um plasmídeo ou DNA viral ou RNA viral. A molécula de NEENA também pode ser compreendida de um BAC, YAC ou cromossomo artificial antes da introdução na planta ou parte da planta. Essa também pode ser introduzida como uma molécula linear de ácido nucleico que compreende a sequência NEENA em que sequências adicionais podem estar presentes adjacentes à sequência de NEENA na molécula de ácido nucleico. Essas sequências próximas à sequência de NEENA podem ser de cerca de 20 pb, por exemplo, 20 pb a centenas de pares de bases, por exemplo, 100 pb ou mais e podem facilitar a integração no genoma, por exemplo, por recombinação homóloga. Qualquer outro método para a integração de genoma pode ser empregado, sendo essas abordagens de integração almejadas, como recombinação homóloga ou abordagens de integração aleatória, como recombinação ilegítima.

[027] O ácido nucleico endógeno, de preferência, expresso de maneira semente-específica e/ou semente-preferencial ao qual a molécula de NEENA pode ser funcionalmente ligada pode ser qualquer ácido nucleico, de preferência, qualquer molécula de ácido nucleico expressa de maneira semente- específica e/ou semente-preferencial. A molécula de ácido nucleico pode ser uma molécula de ácido nucleico de codificação não-codificação de proteína como RNA antissenso, rRNA, tRNA, miRNA, ta-siRNA, siRNA, dsRNA, snRNA, snoRNA ou qualquer outro RNA de não-codificação conhecido na técnica.

[028] O elemento versado na técnica está ciente de métodos para identificar moléculas de ácido nucleico expressas de maneira semente- específica e/ou semente-preferencial às quais o método da invenção pode ser, de preferência, aplicado, por exemplo, por hibridização de chip por microarranjo, qPCR, análise Northern blot, sequenciamento de próxima geração etc. Uma maneira adicional de realizar os métodos da invenção pode ser: a) fornecer uma construção de expressão que compreende um ou mais NEENA que compreendem uma molécula de ácido nucleico como definido acima em i) a vi) funcionalmente ligados a um promotor, de preferência, um promotor semente-específico e/ou semente-preferencial como definido acima e a uma ou mais moléculas de ácido nucleico sendo que o último é heterólogo ao dito um ou mais NEENA e que está sob o controle do dito promotor, de preferência, promotor semente-específico e/ou semente-preferencial e b) integrar a dita construção de expressão que compreende um ou mais NEENA no genoma da dita planta ou parte da mesma e opcionalmente c) regenerar uma planta ou parte da mesma que compreende a dita uma ou mais construções de expressão a partir da dita planta transformada ou parte da mesma.

[029] O NEENA pode ser heterólogo à molécula de ácido nucleico que está sob o controle do dito promotor ao qual o NEENA é funcionalmente ligado ou esse pode ser heterólogo ao promotor e à molécula de ácido nucleico sob o controle do dito promotor.

[030] A construção de expressão pode ser integrada no genoma da respectiva planta com qualquer método conhecido na técnica. A integração pode ser aleatória utilizando métodos como bombardeamento de partículas ou transformação mediada por Agrobacterium. Em uma realização preferida, a integração ocorre através da integração almejada, por exemplo, por recombinação homóloga. O último método poderia permitir a integração da construção de expressão que compreende um promotor de alta expressão funcionalmente ligado a um NEENA em uma região de genoma favorável. As regiões de genoma favoráveis são, por exemplo, regiões de genoma conhecidas por compreender genes que são altamente expressos, por exemplo, em sementes e, então, podem aumentar a expressão derivada da dita construção de expressão comparada com uma região do genoma que não mostra atividade transcricional.

[031] Em outra realização preferida o dito um ou mais NEENA é funcionalmente ligado a um promotor, de preferência, promotor semente- específico e/ou semente-preferencial próximo ao sítio de início de transcrição da dita molécula de ácido nucleico heteróloga.

[032] Próximo ao sítio de início de transcrição como indicado aqui compreende ligar funcionalmente o um ou mais NEENA a um promotor, de preferência, um promotor semente-específico e/ou semente-preferencial de 2500 pb ou menos, de preferência, 2000 pb ou menos, com mais preferência, 1500 pb ou menos, com ainda mais preferência, 1000 pb ou menos e com máxima preferência, 500 pb ou menos distante do sítio de início de transcrição da dita molécula de ácido nucleico heteróloga. Será entendido que o NEENA pode ser integrado a jusante ou a montante na respectiva distância do sítio de início de transcrição do respectivo promotor. Então, o um ou mais NEENA não deve ser necessariamente incluído na transcrição do respectivo ácido nucleico heterólogo sob o controle, de preferência, do promotor semente-específico e/ou semente-preferencial ao qual um ou mais NEENA está funcionalmente ligado.

[033] De preferência, o um ou mais NEENA é integrado a jusante do sítio de início de transcrição do respectivo promotor, de preferência, promotor semente-específico e/ou semente-preferencial. O sítio de integração a jusante do sítio de início de transcrição pode estar na UTR 5', UTR 3', um éxon ou íntron ou esse pode substituir um íntron ou parcial ou completamente UTR 5' ou UTR 3' do ácido nucleico heterólogo sob o controle, de preferência, do promotor semente-específico e/ou semente-preferencial. De preferência, o um ou mais NEENA é integrado na UTR 5' ou um íntron ou o NEENA está substituindo um íntron ou uma parte da UTR 5' completa, com mais preferência, é integrado na UTR 5' do respectivo ácido nucleico heterólogo.

[034] Uma realização adicional da invenção compreende uma construção de expressão recombinante que compreende um ou mais NEENA que compreende uma molécula de ácido nucleico como definido acima em i) a vi).

[035] A construção de expressão recombinante pode compreender adicionalmente um ou mais promotores, de preferência, promotor semente-específico e/ou semente-preferencial ao qual um ou mais NEENA está funcionalmente ligado e opcionalmente uma ou mais moléculas de ácido nucleico expressas, sendo que o último é heterólogo ao dito um ou mais NEENA.

[036] O NEENA pode ser heterólogo à molécula de ácido nucleico que está sob o controle do dito promotor ao qual o NEENA é funcionalmente ligado ou esse pode ser heterólogo ao promotor e à molécula de ácido nucleico sob o controle do dito promotor.

[037] A construção de expressão pode compreender uma ou mais, por exemplo, duas ou mais, por exemplo, 5 ou mais, como 10 ou mais combinações de promotores, de preferência, promotores semente-específicos e/ou semente-preferenciais funcionalmente ligados a um NEENA e uma molécula de ácido nucleico que será expressa que é heteróloga ao respectivo NEENA. A construção de expressão também pode compreender promotores adicionais que não compreendem um NEENA funcionalmente ligado às moléculas de ácido nucleico que serão expressas homólogas ou heterólogas ao respectivo promotor.

[038] Um vetor de expressão recombinante que compreende uma ou mais construções de expressão recombinantes como definido acima é outra realização da invenção. Uma grande quantidade de vetores de expressão que podem ser usados na presente invenção é conhecida por um elemento versado na técnica. Os métodos para introduzir tal vetor que compreende tal construção de expressão compreendendo, por exemplo, um promotor funcionalmente ligado a um NEENA e opcionalmente outros elementos como um terminador no genoma de uma planta e para recuperar as plantas transgênicas de uma célula transformada também são bem conhecidos na técnica. Dependendo do método usado para a transformação de uma planta ou parte da mesma o vetor inteiro deve ser integrado no genoma da dita planta ou parte da mesma ou alguns componentes do vetor devem ser integrados no genoma, como, por exemplo, um T-DNA.

[039] Uma planta transgênica ou parte da mesma que compreende um ou mais NEENA heterólogos como definido acima em i) a vi) também está contido nessa invenção. Um NEENA será entendido como sendo heterólogo à planta se esse for sintético, derivado de outro organismo ou o mesmo organismo, porém sua localização genômica natural é comparada com uma planta de controle, por exemplo, uma planta de ocorrência natural. Será entendido, que um meio de localização genômica tornado onde o NEENA fica localizado em outro cromossomo ou no mesmo cromossomo, porém 10 kb ou mais, por exemplo, 10 kb, de preferência, 5 kb ou mais, por exemplo, 5 kb, com mais preferência, 1000 pb ou mais, por exemplo 1000 pb, com ainda mais preferência, 500 pb ou mais, por exemplo 500 pb, especialmente de preferência, 100 pb ou mais, por exemplo 100 pb, com máxima preferência, 10 pb ou mais, por exemplo 10 pb deslocado de sua localização genômica natural, por exemplo, em uma planta de ocorrência natural.

[040] Uma célula transgênica ou planta transgênica ou parte da mesma que compreende um vetor de expressão recombinante como definido acima ou uma construção de expressão recombinante como definido acima é uma realização adicional da invenção. A célula transgênica, planta transgênica ou parte da mesma pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em bactérias, fungos, leveduras ou planta, insetos ou células de mamíferos ou plantas. As células transgênicas preferidas são bactérias, fungos, leveduras ou células vegetais. As bactérias preferidas são Enterobacterias como E. coli e bactérias do gênero Agrobacterium, por exemplo, Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes. As plantas preferidas são monocotiledôneas ou dicotiledôneas, por exemplo, plantas de cultura monocotiledôneas ou dicotiledôneas como milho, soja, canola, algodão, batata, beterraba, arroz, trigo, sorgo, cevada, musácea, cana-de-açúcar, miscanto e similares. As plantas de cultura preferidas são milho, arroz, trigo, soja, canola, algodão ou batata. As plantas de cultura dicotiledôneas especialmente preferidas são soja, canola, algodão ou batata.

[041] As plantas de cultura monocotiledôneas especialmente preferidas são milho, trigo e arroz.

[042] Uma cultura de célula transgênica, semente transgênica, partes ou material de propagação derivado de uma célula transgênica ou planta ou parte da mesma como definido acima que compreende o dito NEENA heterólogo como definido acima em i) a vi) ou a dita construção de expressão recombinante ou dito vetor recombinante como definido acima são outras realizações da invenção.

[043] As partes transgênicas ou material de propagação como indicado aqui compreendem todos os tecidos e órgãos, por exemplo, folha, caule e fruto bem como material que é útil para a propagação e/ou regeneração de plantas como cortes, enxertos, camadas, ramos ou brotos que compreendem o respectivo NEENA, construção de expressão recombinante ou vetor recombinante. Uma realização adicional da invenção é o uso do NEENA como definido acima em i) a vi) ou a construção recombinante ou vetor recombinante como definido acima para aumentar a expressão em plantas ou partes das mesmas.

[044] Então a aplicação manual proporciona moléculas de ácido nucleico de aumento de expressão genética semente-específica e/ou semente- preferencial que compreende um ou mais promotores, de preferência, promotor semente-específico e/ou semente preferencial funcionalmente ligados a um ou mais NEENA. Adicionalmente o uso de tais moléculas de ácido nucleico de aumento de expressão genética e construções de expressão, vetores de expressão, plantas transgênicas ou partes das mesmas e células transgênicas que compreendem tais moléculas de ácido nucleico de aumento de expressão genética são fornecidos.

[045] Um uso de uma cultura de célula transgênica, semente transgênica, partes ou material de propagação derivado de uma célula transgênica ou planta ou parte da mesma como definido acima para a produção de gêneros alimentícios, alimentações para animal, sementes, produtos farmacêuticos ou produtos químicos finos também está contido nessa invenção.

DEFINIÇÕES

[046] Abreviações: NEENA - ácido nucleico de aumento de expressão de ácido nucleico, GFP - proteína verde fluorescente, GUS - betaGlucuronidase, BAP - 6-benzilaminopurina; 2,4-D - ácido 2,4- diclorofenoxiacético; MS - meio Murashige e Skoog; NAA - ácido 1- naftalenoacético; MES, ácido 2-(N-morfolino-etanossulfônico, ácido IAA indol acético; Kan: sulfato de canamicina; ácido GA3 - Giberélico; TimentinTM: ticarcilina dissódica/clavulanato de potássio, μL: μLitro.

[047] Será entendido que essa invenção não se limita à metodologia ou protocolos particulares. Também será entendido que a terminologia usada aqui serve para o propósito de descrever apenas as realizações particulares, e não pretende limitar o escopo da presente invenção que será limitado apenas pelas reivindicações em anexo. Deve ser observado que como usado aqui e nas reivindicações em anexo, as formas no singular "um”, “e”, e "o" incluem referências no plural exceto onde o contexto indicar em contrário. Assim, por exemplo, a referência a "um vetor" é uma referência a um ou mais vetores e inclui equivalentes desses conhecidos pelos elementos versados na técnica, e assim por diante. O termo "cerca de" é usado aqui para indicar aproximadamente, mais ou menos, em torno, ou ao nível de. Quando o termo "cerca de" for usado em conjunto com uma faixa numérica, esse modifica tal faixa ao estender os limites acima e baixo dos valores numéricos apresentados aqui. Em geral, o termo "cerca de" é usado aqui para modificar um valor numérico acima e abaixo do valor declarado por uma variância de 20 por cento, de preferência, 10 por cento acima ou abaixo (maior ou menor). Como usado aqui, a palavra "ou" significa qualquer elemento de uma lista particular e também inclui qualquer combinação de elementos daquela lista. As palavras "compreendem," "compreendendo," "incluem," "incluindo," e "inclui" quando usadas nesse relatório descritivo e nas reivindicações a seguir pretendem especificar a presença de uma ou mais características, números inteiros, componentes, ou etapas determinadas, porém essas não excluem a presença ou adição de uma ou mais outras características, números inteiros, componentes, etapas, ou grupos desses. Para clareza, alguns termos usados no relatório descritivo são definidos e usados conforme exposto a seguir:

[048] Antiparalelo: "Antiparalelo" se refere aqui a duas sequências de nucleotídeo emparelhadas através de ligações de hidrogênio entre resíduos de bases complementares com ligações de fosfodiéster que se deslocam na direção 5'-3' em uma sequência nucleotídica na direção 3'-5' na outra sequência nucleotídica.

[049] Antissenso: O termo "antissenso" se refere a uma sequência nucleotídica que é invertida em relação à sua orientação normal para a transcrição ou função e então expressa uma transcrição de RNA que é complementar a uma molécula de mRNA de gene-alvo expressa dentro da célula hospedeira (por exemplo, essa pode se hibridizar com a molécula de mRNA de gene-alvo ou DNA genômico de cadeia simples através de emparelhamento de base Watson-Crick) ou que é complementar a uma molécula de DNA alvo como, por exemplo, DNA genômico presente na célula hospedeira.

[050] Região de codificação: Como usado aqui o termo "região de codificação" quando usado em referência a um gene estrutura se refere às sequências nucleotídicas que codificam os aminoácidos encontrados no polipeptídeo inicial como resultado de tradução de uma molécula de mRNA. A região de codificação é ligada, em eucariotos, no lado 5' pelo tripleto de nucleotídeo "ATG" que codifica a metionina iniciadora e no lado 3' por um dos três tripletos que especificam códons de parada (ou seja, TAA, TAG, TGA). Além de conter íntrons, as formas genômicas de um gene também podem incluir sequências localizadas na extremidade 5' e 3' das sequências que estão presentes na transcrição de RNA. Essas sequências são referidas como sequências ou regiões de "flanqueamento" (essas sequências de flanqueamento estão localizadas 5' ou 3' em relação às sequências não-traduzidas presentes na transcrição de mRNA). A região de flanqueamento 5' pode conter sequências reguladoras como promotores e intensificadores que controlam ou influenciam a transcrição do gene. A região de flanqueamento 3' pode conter sequências que dirigem a terminação da transcrição, clivagem pós-transcricional e poliadenilação.

[051] Complementar: "Complementar" ou "complementaridade" se refere a duas sequências de nucleotídeo que compreendem sequências de nucleotídeo antiparalelas capazes de se emparelhar umas com as outras (pelas regras de emparelhamento de bases) mediante a formação de ligações de hidrogênio entre os resíduos de bases complementares nas sequências de nucleotídeo antiparalelas. Por exemplo, a sequência 5'-AGT-3' é complementar à sequência 5'-ACT-3'. A complementaridade pode ser "parcial" ou "total”. A complementaridade "parcial" ocorre quando uma ou mais bases de ácido nucleico não são compatíveis de acordo com as regras de emparelhamento de bases. A complementaridade "total" ou "completa" entre as moléculas de ácido nucleico ocorre quando cada e toda a base de ácido nucleico é compatível com outra base sob as regras de emparelhamento de base. O grau de complementaridade entre as cadeias de moléculas de ácido nucleico possui efeitos significativos sobre a eficiência e força de hibridização entre as cadeias de moléculas de ácido nucleico. Um "complemento" de uma sequência de ácido nucleico como usado aqui se refere a uma sequência de nucleotídeo cujas moléculas de ácido nucleico mostram complementaridade total às moléculas de ácido nucleico da sequência de ácido nucleico.

[052] RNA de cadeia dupla: Uma molécula de "RNA de cadeia dupla" ou molécula de "dsRNA" compreende um fragmento de RNA senso de uma sequência de nucleotídeo e um fragmento de RNA antissenso da sequência de nucleotídeo, que compreendem sequências de nucleotídeo complementares umas às outras, permitindo assim os fragmentos de RNA senso e antissenso se emparelhem e formem uma molécula de RNA de cadeia dupla.

[053] Endógena: Uma sequência de nucleotídeo "endógena" se refere a uma sequência de nucleotídeo, que está presente no genoma da célula vegetal não transformada.

[054] Expressão aumentada: "aumentar" ou "elevar" a expressão de uma molécula de ácido nucleico em uma célula vegetal é usada de maneira equivalente aqui e indicam que o nível de expressão da molécula de ácido nucleico em uma planta, parte de uma planta ou célula vegetal após aplicar um método da presente invenção é maior do que sua expressão na planta, parte da planta ou célula vegetal antes de aplicar o método, ou comparado com uma planta de referência desprovida de uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção. Por exemplo, a planta de referência compreende a mesma construção que é apenas desprovida do respectivo NEENA. Os termos "aumentado" e "elevado" como usado aqui são sinônimos e significam aqui expressão maior, de preferência, significativamente maior da molécula de ácido nucleico que será expressa. como usado aqui, um "aumento" ou "elevação" do nível de um agente como uma proteína, mRNA ou RNA significa que o nível é aumentado em relação a uma planta substancialmente idêntica, parte de uma planta ou célula vegetal desenvolvida sob condições substancialmente idênticas, desprovida de uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção, por exemplo, desprovida da molécula de NEENA, a construção recombinante ou vetor recombinante da invenção. Como usado aqui, "aumento" ou "elevação" do nível de um agente, como, por exemplo, um preRNA, mRNA, rRNA, tRNA, snoRNA, snRNA expresso pelo gene-alvo e/ou do produto proteico codificado por esse, significa que o nível é aumentado 50% ou mais, por exemplo, 100% ou mais, de preferência, 200% ou mais, com mais preferência, 5 vezes ou mais, com ainda mais preferência, 10 vezes ou mais, com máxima preferência, 20 vezes ou mais, por exemplo, 50 vezes em relação a uma célula ou organismo desprovido de uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção. O aumento ou elevação pode ser determinado por métodos com os quais o elemento versado na técnica familiar. Assim, o aumento ou elevação do ácido nucleico ou a quantidade de proteína pode ser determinada, por exemplo, por meio de uma detecção imunológica da proteína. Ademais, as técnicas como análise de proteína, fluorescência, hibridização Northern, análise de proteção de nuclease, transcrição reversa (RT-PCR quantitativa), ELISA (ensaio de imunoabsorção ligado à enzima), Western blotting, radioimunoensaio (RIA) ou outros imunoensaios e a análise celular ativada por fluorescência (FACS) pode ser empregada para medir uma proteína específica ou RNA em uma planta ou célula vegetal. Dependendo do tipo do produto de proteína induzida, sua atividade ou o efeito sobre o fenótipo do organismo ou a célula também pode ser determinado. Os métodos para determinar a quantidade de proteína são conhecidos pelo elemento versado na técnica. Exemplos, que podem ser mencionados, são: o método micro-Biuret (Goa J (1953) Scand J Clin Lab Invest 5:218-222), o método Fo- lin-Ciocalteau (Lowry OH et al. (1951) J Biol Chem 193:265-275) ou medir a absorção de CBB G-250 (Bradford MM (1976) Analyt Biochem 72:248-254). Como um exemplo para quantificar a atividade de uma proteína, a detecção de atividade de luciferase é descrita nos Exemplos abaixo.

[055] Expressão: "Expressão" se refere à biossíntese de um produto genético, de preferência, à transcrição e/ou tradução de uma sequência de nucleotídeo, por exemplo, um gene endógeno ou um gene heterólogo, em uma célula. Por exemplo, no caso de um gene estrutural, a expressão envolve a transcrição do gene estrutural em mRNA e- opcionalmente - a tradução subsequente de mRNA em um ou mais polipeptídeos. Em outros casos, a expressão pode se referir apenas à transcrição do DNA que abriga uma molécula de RNA.

[056] Construção de expressão: "Construção de expressão" como usado aqui significa uma sequência de DNA capaz de dirigir a expressão de uma sequência nucleotídica particular em uma parte adequada de uma planta ou célula vegetal, que compreende um promotor funcional na dita parte de uma planta ou célula vegetal na qual essa será introduzida, ligada de maneira funcional à sequência nucleotídica de interesse que é - opcionalmente - ligada de maneira funcional a sinais de terminação. Se a tradução for exigida, essa também compreende tipicamente sequências exigidas para a tradução adequada da sequência nucleotídica. A região de codificação pode codificar uma proteína de interesse, porém também pode codificar um RNA funcional de interesse, por exemplo, RNAa, siRNA, snoRNA, snRNA, microRNA, ta-siRNA ou qualquer outro RNA regulador de não-codificação, na direção senso ou antissenso. A construção de expressão que compreende a sequência nucleotídica de interesse pode ser quimérica, indicando que um ou mais de seus componentes é heterólogo em relação a um ou mais de seus outros componentes. A construção de expressão também pode ser uma, que é naturalmente ocorrente, porém foi obtida em uma forma recombinante útil para a expressão heteróloga. Tipicamente, entretanto, a construção de expressão é heteróloga em relação ao hospedeiro, ou seja, a sequência de DNA particular da construção de expressão não ocorre naturalmente na célula hospedeira e deve ser introduzida na célula hospedeira por um evento de transformação. A expressão da sequência nucleotídica na construção de expressão pode estar sob o controle de um promotor semente-específico e/ou semente-preferencial ou de um promotor induzível, que inicia a transcrição apenas quando a célula hospedeira for exposta a algum estímulo externo particular. No caso de uma planta, o promotor também pode ser específico para um tecido ou órgão ou estado particular de desenvolvimento.

[057] Estranho: O termo "estranho" se refere a qualquer molécula de ácido nucleico (por exemplo, sequência genética) que é introduzida no genoma de uma célula por manipulações experimentais e pode incluir sequências encontradas naquela célula desde que a sequência introduzida contenha alguma modificação (por exemplo, uma mutação pontual, a presença de um gene marcador selecionável, etc.) e seja, portanto, distinguível em relação à sequência naturalmente ocorrente.

[058] Ligação funcional: o termo "ligação funcional" ou "ligado funcionalmente" deve ser entendido como, por exemplo, a disposição sequencial de um elemento regulador (por exemplo, um promotor) com uma sequência de ácido nucleico que será expressa e, se adequado, elementos reguladores adicionais (como, por exemplo, um terminador ou um NEENA) de modo que cada elemento regulador possa executar sua função pretendida para permitir, modificar, facilitar ou de outro modo influenciar a expressão da dita sequência de ácido nucleico. Como um sinônimo a palavra "ligação operável" ou "operavelmente ligado" pode ser usada. A expressão pode resultar dependendo da disposição das sequências de ácido nucleico em relação ao RNA senso ou antissenso. Para isso, a ligação direta no sentido químico não é necessariamente exigida. As sequências de controle genéticas como, por exemplo, sequências intensificadoras, também podem exercer sua função sobre a sequência alvo de posições que são distantes, ou de fato de outras moléculas de DNA. As disposições preferidas são aquelas em que a sequência de ácido nucleico ácido nucleico que será expressa de maneira recombinante é posicionada atrás da sequência que atua como um promotor, de modo que as duas sequências sejam ligadas de maneira covalente umas às outras. A distância entre a sequência promotora e a sequência de ácido nucleico que será expressa de maneira recombinante é de preferência menor do que 200 pares de bases, especialmente, de preferência, menor do que 100 pares de bases, muito especialmente de preferência, menor do que 50 pares de bases. Em uma realização preferida, a sequência de ácido nucleico que será transcrita fica localizada atrás do promotor de modo que o início da transcrição seja idêntico ao início desejado do RNA quimérico da invenção. A ligação funcional, e uma construção de expressão, podem ser geradas por meio de recombinação convencional e técnicas de clonagem, como descrito (por exemplo, em Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY); SiI- havy et al. (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY); Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc, and Wiley Interscience; Gelvin et al. (Eds) (1990) Plant Molecular Biology Manual; KIu- wer Academic Publisher, Dordrecht, The Netherlands). Entretanto, sequências adicionais, que atuam, por exemplo, como um ligante com sítios de clivagem específicos para enzimas de restrição, ou como um peptídeo de sinal, também podem ser posicionadas entre as duas sequências. A inserção de sequências também pode resultar na expressão de proteínas de fusão. De preferência, a construção de expressão, que consiste em uma ligação de uma região reguladora, por exemplo, uma sequência promotora e de ácido nucleico que será expressa, pode se apresentar em uma forma integrada ao vetor e ser inserida em um genoma vegetal, por exemplo, por transformação.

[059] Gene: O termo "gene" se refere a uma região ligada de maneira funcional a sequências reguladoras adequadas capazes de regular a expressão do produto genético (por exemplo, um polipeptídeo ou um RNA funcional) de alguma maneira. Um gene inclui regiões reguladoras não traduzidas de DNA (por exemplo, promotores, intensificadores, repressores, etc.) que precedem (a montante) e sucedem (a jusante) a região de codificação (quadro aberto de leitura, ORF) bem como, onde aplicável, sequências intervenientes (ou seja, íntrons) entre as regiões de codificação individuais (ou seja, éxons). O termo "gene estrutural" como usado aqui pretende se referir a uma sequência de DNA que é transcrita em mRNA que é então traduzida em uma sequência de aminoácidos característica de um polipeptídeo específico.

[060] Genoma e DNA genômico: Os termos "genoma" ou "DNA genômico" estão se referindo às informações genéticas herdáveis de um organismo hospedeiro. O dito DNA genômico compreende o DNA do núcleo (também referido como DNA cromossômico), porém também o DNA dos plastídios (por exemplo, cloroplastos) e outras organelas celulares (por exemplo, mitocôndria). De preferência, os termos genoma ou DNA genômica se referem ao DNA cromossômico do núcleo.

[061] Heterólogo: O termo "heterólogo" em relação a uma molécula de ácido nucleico ou DNA se refere a uma molécula de ácido nucleico que é ligada de maneira funcional, ou é manipulada para se tornar ligada de maneira funcional, uma segunda molécula de ácido nucleico à qual essa não é ligada de maneira funcional em natureza, ou à qual é ligada de maneira funcional em um local diferente em natureza. Uma construção de expressão heteróloga que compreende uma molécula de ácido nucleico e uma ou mais moléculas de ácido nucleico reguladoras (como um promotor ou um sinal de terminação de transcrição) ligadas a essa, por exemplo, é uma construção que se origina por manipulações experimentais em que a) a dita molécula de ácido nucleico, ou b) a dita molécula de ácido nucleico reguladora ou c) ambos (ou seja, (a) e (b)) não fica localizada em seu ambiente genético natural (nativo) ou foi modificada por manipulações experimentais, um exemplo de uma modificação é uma substituição, adição, deleção, inversão ou inserção de um ou mais resíduos de nucleotídeo. O ambiente genético natural se refere ao local cromossômico natural no organismo de origem, ou à presença em uma biblioteca genômica. No caso de uma biblioteca genômica, o ambiente genético natural da sequência da molécula de ácido nucleico é, de preferência, mantido, ao menos em parte. O ambiente flanqueia a sequência de ácido nucleico ao menos em um lado e possui uma sequência de ao menos 50 pb, de preferência, ao menos 500 pb, especialmente de preferência, ao menos 1.000 pb, muito especialmente de preferência, ao menos 5.000 pb, de altura. Uma construção de expressão de ocorrência natural- por exemplo- a combinação de ocorrência natural de um promotor com o gene correspondente - se torna uma construção de expressão transgênica quando essa for modificada por métodos não-naturais, "artificiais" sintéticos como, por exemplo, mutagenização. Tais métodos foram descritos (US 5.565.350; WO 00/15815). Por exemplo, uma proteína que codifica a molécula de ácido nucleico ligada de maneira funcional a um promotor, que não é o promotor nativo dessa molécula, é considerada como heteróloga em relação ao promotor. De preferência, o DNA heterólogo não é endógeno ou não naturalmente associado à célula na qual esse é introduzido, porém foi obtido de outra célula ou foi sintetizado. O DNA heterólogo também inclui uma sequência de DNA endógena, que contém alguma modificação, não é de ocorrência natural, múltiplas cópias de uma sequência de DNA endógena, ou uma sequência de DNA que não está naturalmente associada a outra sequência de DNA fisicamente ligada a essa. Geralmente, embora não necessariamente, o DNA heterólogo codifica o RNA ou proteínas que não são normalmente produzidas pela célula na qual esse é expresso.

[062] Promotor semente-específico e/ou semente-preferenciais de alta expressão: Um "promotor semente-específico e/ou semente-preferencial de alta expressão" como usado aqui significa um promotor que causa a expressão semente-específica e/ou semente-preferencial em uma planta ou parte da mesma em que o acúmulo ou taxa de síntese de RNA ou estabilidade de RNA derivada da molécula de ácido nucleico sob o controle do respectivo promotor é maior, de preferência, significativamente maior do que a expressão causada pelo promotor desprovido do NEENA da invenção. De preferência, a quantidade de RNA e/ou a taxa de síntese de RNA e/ou estabilidade de RNA é aumentada 50% ou mais, por exemplo, 100% ou mais, de preferência, 200% ou mais, com mais preferência, 5 vezes ou mais, com ainda mais preferência, 10 vezes ou mais, com máxima preferência, 20 vezes ou mais, por exemplo, 50 vezes em relação a um promotor semente-específico e/ou semente-preferencial desprovido de um NEENA da invenção.

[063] Hibridização: O termo "hibridização" como usado aqui inclui "qualquer processo por meio do qual uma cadeia de molécula de ácido nucleico se liga a uma cadeia complementar através do emparelhamento de base”. (J. Coombs (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York). A hibridização e a intensidade de hibridização (ou seja, a intensidade da associação entre as moléculas de ácido nucleico) são impactadas por tais fatores como o grau de complementaridade entre as moléculas de ácido nucleico, a severidade das condições envolvidas, a Tm do híbrido formado, e a razão G:C dentro das moléculas de ácido nucleico. Como usado aqui, o termo "Tm" é usado em referência à "temperatura de fusão”. A temperatura de fusão é a temperatura na qual metade de uma população de moléculas de ácido nucleico de cadeia dupla se torna dissociada em cadeias simples. A equação para calcular a Tm de moléculas de ácido nucleico é bem conhecida na técnica. Como indicado por referências padrão, uma estimativa simples do valor de Tm pode ser calculada pela equação: Tm=81,5+0,41 (% G+C), quando uma molécula de ácido nucleico estiver em solução aquosa em 1 M de NaCI [veja, por exemplo, Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985)]. Outras referências incluem computações mais sofisticadas, que levam características estruturais bem como sequenciais em consideração para o cálculo de Tm. As condições severas, são conhecidas pelos elementos versados na técnica e podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1 -6.3.6.

[064] "Identidade": "Identidade" quando usada em relação à comparação de duas ou mais moléculas de ácido nucleico ou aminoácido significa que as sequências das ditas moléculas compartilham um determinado grau de similaridade de sequência, sendo que as sequências são parcialmente idênticas.

[065] Para determinar a porcentagem de identidade (a homologia é usada aqui de maneira intercambiável) de duas sequências de aminoácido ou de duas moléculas de ácido nucleico, as sequências são escritas umas sob as outras para uma comparação ótima (por exemplo, lacunas podem ser inseridas na sequência de uma proteína ou de um ácido nucleico para gerar um alinhamento ótimo com a outra proteína ou outro ácido nucleico).

[066] Os resíduos de aminoácido ou moléculas de ácido nucleico nas posições de aminoácido ou posições de nucleotídeo correspondentes são então comparados. Se uma posição em uma sequência for ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou a mesma molécula de ácido nucleico que a posição correspondente na outra sequência, as moléculas são homólogas nessa posição (ou seja, "homologia" de aminoácido ou ácido nucleico como usada no presente contexto corresponde à "identidade" de aminoácido ou ácido nucleico). A porcentagem de homologia entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (ou seja, % de homologia = número de posições idênticas /número total de posições x 100). Os termos "homologia" e "identidade" são considerados, desse modo, sinônimos.

[067] Para a determinação da porcentagem de identidade de dois ou mais aminoácidos ou duas ou mais sequências nucleotídicas, diversos programas de software de computador foram desenvolvidos. A identidade de duas ou mais sequências pode ser calculada com, por exemplo, o software fasta, que atualmente foi usado na versão fasta 3 (W. R. Pearson and D. J. Lipman, PNAS 85, 2444(1988); W. R. Pearson, Methods in Enzymology 183, 63 (1990); W. R. Pearson and D. J. Lipman, PNAS 85, 2444 (1988); W. R. Pearson, Enzymology 183, 63 (1990)). Outro programa útil para o cálculo de identidades de sequências diferentes é o programa blast padrão, que é incluído no software Biomax pedant (Biomax, Munich, Federal Republic of Germany). Isso às vezes resulta infelizmente em resultados subótimos visto que blast nem sempre inclui sequências completas do assunto e da consulta. Entretanto, visto que esse programa é muito eficiente, esse pode ser usado para a comparação de um grande número de sequências. As seguintes configurações são tipicamente usadas para tais comparações de sequências: -p Nome de Programa [String]; - d Bando de dados [String]; padrão = nr; -i Arquivo de Consulta [File In]; padrão = stdin; -e Valor esperado (E) [Real]; padrão = 10,0; -m opções de visualização de alinhamento: 0 = em pares; 1 = consulta ancorada mostrando identidades; 2 = consulta ancorada sem identidades; 3 = consulta exata ancorada, mostra identidades; 4 = consulta exata ancorada, sem identidades; 5 = consulta ancorada sem identidades e extremidades cegas; 6 = consulta exata ancorada, sem identidades e extremidades cegas; 7 = XML saída Blast; 8 = tabular; 9 tabular com linhas de comentários [Integer]; padrão = O; -o relatório BLAST Output File [File Out] Opcional; padrão = stdout; -F sequência de consulta de filtro (DUST com blastn, SEG com outros) [String]; padrão = T; -G Custo para abrir uma lacuna (zero invoca o comportamento padrão) [Integer]; padrão = 0; - E Custo para estender uma lacuna (zero invoca o comportamento padrão) [Integer]; padrão = 0; -X X valor de entrega para alinhamento com lacunas (em bits) (zero invoca o comportamento padrão); blastn 30, megablast 20, tblastx 0, todos os outros 15 [Integer]; padrão = 0; -I Mostra Gl's em deflines [T/F]; padrão = F; - q Penalidade para uma incompatibilidade de nucleotídeo (apenas blastn) [Integer]; padrão = -3; -r Recompensa para uma compatibilidade nucleotídeo (apenas blastn) [Integer]; padrão = 1 ; -v Número de sequências de banco de dados para mostrar as descrições de uma linha para (V) [Integer]; padrão = 500; -b Número de sequências de banco de dados para mostrar os alinhamentos de (B) [Integer]; padrão = 250; -f Limite para estender os acertos, padrão se zero; blastp 11 , blastn 0, blastx 12, tblastn 13; tblastx 13, megablast 0 [Integer]; padrão = 0; -g Realizar o alinhamento com lacunas (não disponível com tblastx) [T/F]; padrão = T; -Q Código genético da Consulta para utilizar [Integer]; padrão = 1 ; - D DB Código genético (para tblast[nx] apenas) [Integer]; padrão = 1 ; -a Número de processadores para utilizar [Integer]; padrão = 1 ; -O arquivo SeqAlign [File Out] Opcional; -J Acreditar no defline de consulta [T/F]; padrão = F; -M Matrix [String]; padrão = BLOSUM62; -W Tamanho da palavra, padrão se zero (blastn 11 , megablast 28, todos os outros 3) [Integer]; padrão = 0; -z Comprimento efetivo do banco de dados (utilizar zero para o tamanho real) [Real]; padrão = 0; -K Número de melhores acertos de uma região para manter (fora por padrão, se o uso de um valor de 100 for recomendado) [Integer]; padrão = 0; -P 0 para múltiplos acertos, 1 para único acerto [Integer]; padrão = 0; -Y Comprimento efetivo do espaço de pesquisa (utilizar zero para o tamanho real) [Real]; padrão = 0; -S Cadeias de consulta para pesquisa contra banco de dados (para blast[nx], e tblastx); 3 é ambos, 1 é superior, 2 é inferior [Integer]; padrão = 3; -T Produzir HTML output [T/F]; padrão = F; -I Restringir a pesquisa de banco de dados à lista de Gl's [String] Opcional; -U Utilizar filtragem em caixa baixa de sequência FASTA [T/F] Opcional; padrão = F; -y X valor de entrega para extensões sem lacunas em bits (0,0 invoca o comportamento padrão); blastn 20, megablast 10, todos os outros 7 [Real]; padrão = 0,0; -Z X valor de entrega para alinhamento com lacunas final em (0,0 invoca o comportamento padrão); blastn/megablast 50, tblastx 0, todos os outros 25 [Integer]; padrão = 0; -R PSI-TBLASTN arquivo de ponto de verificação [File In] Opcional; -n busca MegaBlast [T/F]; padrão = F; -L Localização na sequência de consulta [String] Opcional; -A Tamanho de janela de múltiplos acertos, padrão se zero (blastn/megablast 0, todos os outros 40 [Integer]; padrão = 0; -w Penalidade de deslocamento de quadro (OOF algoritmo para blastx) [Integer]; padrão = 0; -t Comprimento do maior íntron permitido em tblastn para ligar HSPs (0 desabilita a ligação) [Integer]; padrão = 0.

[068] Resultados de alta qualidade são obtidos utilizando o algoritmo de Needleman e Wunsch ou Smith e Waterman. Portanto, os programas baseados nos ditos algoritmos são preferidos. Vantajosamente, as comparações de sequências podem ser feitas com o programa PiIeUp (J. MoI. Evolution., 25, 351 (1987), Higgins et al., CABIOS 5, 151 (1989)) ou, de preferência, com os programas "Gap" e "Needle", que são baseados nos algoritmos de Needleman e Wunsch (J. MoI. Biol. 48; 443 (1970)), e "BestFit", que é baseado no algoritmo de Smith e Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482 (1981)). "Gap" e "BestFit" são parte do pacote de software GCG (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 5371 1 (1991); Altschul et al., (Nucleic Acids Res. 25, 3389 (1997)), "Needle" é parte do European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS) (Trends in Genetics 16 (6), 276 (2000)). Portanto, de preferência, os cálculos para determinar as porcentagens de homologia de sequência são feitos com os programas "Gap" ou "Needle" sobre a faixa total das sequências. Os seguintes ajustes padrão para a comparação de sequências de ácido nucleico foram usados para "Needle": matriz: EDNAFULL, Gap_penalty: 10.0, Extend_penalty: 0,5. Os seguintes ajustes padrão para a comparação de sequências de ácido nucleico foram usados para "Gap": peso de lacuna: 50, peso-comprimento: 3, compatibilidade média: 10.000, incompatibilidade média: 0.000.

[069] Por exemplo, uma sequência, que é dita possuindo 80% de identidade com a sequência SEQ ID NO: 1 no nível de ácido nucleico é entendido como indicando uma sequência que, mediante a comparação com a sequência representada por SEQ ID NO: 1 pelo programa acima "Needle" com o parâmetro ajustado acima, possui 80% de identidade. De preferência, a homologia é calculada sobre o comprimento completo da sequência de consulta, por exemplo SEQ ID NO:1.

[070] Íntron: se refere a seções de DNA (sequências intervenientes) dentro de um gene que não codifica parte da proteína que o gene produz, e que é retirado do mRNA que é transcrito a partir do gene antes de ser exportado do núcleo celular. Sequência de íntron se refere à sequência de ácido nucleico de um íntron. Assim, os íntrons são aquelas regiões de sequências de DNA que são transcritas juntamente com a sequência de codificação (éxons), porém são removidas durante a formação de mRNA maduro. Os íntrons podem ser posicionados dentro da região de codificação real ou em líderes não traduzidos 5' ou 3' do pré-mRNA (mRNA não processado). Os íntrons na transcrição primária são cortados e as sequências de codificação são simultânea e precisamente ligadas para formar o mRNA maduro. As junções de íntrons e éxons formam o sítio de splicing. A sequência de um íntrons começa com GU e termina com AG. Ademais, em plantas, dois exemplos de íntrons AU-AC foram descritos: o décimo-quarto íntron do gene proteico similar a RecA e o décimo- sétimo íntron do gene G5 de Arabidopsis thaliana são os íntrons AT-AC. Os pré- mRNAs que contêm íntrons possuem três sequências curtas que são -além de outras sequências - essenciais para o íntron que será precisamente retirado. Essas sequências são o sítio de splicing 5', o sítio de splicing 3', e o ponto de ramificação. O splicing de mRNA é a remoção de sequências intervenientes (íntrons) presentes em transcrições primárias de mRNA e junção ou ligação de sequências de éxons. Isso também é conhecido como splicing cis que une dois éxons no mesmo RNA com a remoção da sequência interveniente (íntron). Os elementos funcionais de um íntron compreendem as sequências que são identificadas e ligadas pelos componentes proteicos específicos do spliceossoma (por exemplo, retirar as sequências consenso nas extremidades de íntrons). A interação dos elementos funcionais com o spliceossoma resulta na remoção da sequência de íntrons do mRNA prematuro e da reunião das sequências de éxons. Os íntrons possuem três sequências curtas que são essenciais -embora não suficientes- para o íntron que será precisamente retirado. Essas sequências são o sítio de splicing 5', o sítio de splicing 3' e o ponto de ramificação. A sequência de pontos de ramificação é importante no splicing e seleção de sítio de splicing em plantas. A sequência de pontos de ramificação fica geralmente localizada 10 a 60 nucleotídeos a montante do sítio de splicing 3'.

[071] Isogênico: organismos (por exemplo, plantas), que são geneticamente idênticos, exceto pelo fato de que esses podem se diferir pela presença ou ausência de uma sequência de DNA heteróloga.

[072] Isolado: O termo "isolado" como usado aqui significa que um material foi removido manualmente e está separado de seu ambiente nativo original e, portanto, não é um produto da natureza. Um material ou molécula isolada (como uma molécula ou enzima de DNA) pode se apresentar em uma forma purificada ou pode se apresentar em um ambiente não-nativo como, por exemplo, em uma célula hospedeira transgênica. Por exemplo, um polinucleotídeo de ocorrência natural ou polipeptídeo presente em uma planta viva não é isolado, porém o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo, separado de alguns ou todos os materiais coexistentes no sistema natural, é isolado. Tais polinucleotídeos podem ser parte de um vetor e/ou tais polinucleotídeos ou polipeptídeos poderiam ser parte de uma composição, e poderiam ser isolados, pois tal vetor ou composição não faz parte de seu ambiente original. De preferência, o termo "isolado" quando usado em relação a uma molécula de ácido nucleico, como em "uma sequência de ácido nucleico isolada" se refere a uma sequência de ácido nucleico que é identificada e separada de ao menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual está geralmente associada em sua fonte natural. A molécula de ácido nucleico isolada é a molécula de ácido nucleico presente em uma forma ou configuração que é diferente daquela encontrada na natureza. Em contrapartida, as moléculas de ácido nucleico não-isoladas são moléculas de ácido nucleico como DNA e RNA, que são encontradas no estado que se apresentam na natureza. Por exemplo, uma determinada sequência de DNA (por exemplo, um gene) é encontrada no cromossomo da célula hospedeira em proximidade aos genes adjacentes; as sequências de RNA, como uma sequência de mRNA específica que codifica uma proteína específica, são encontradas na célula como uma mistura com inúmeros outros mRNAs, que codificam uma grande quantidade de proteínas. Entretanto, uma sequência de ácido nucleico isolada que compreende, por exemplo, a SEQ ID NO: 1 inclui, a título de exemplo, tais sequências de ácido nucleico em células que geralmente contêm a SEQ ID NO:1 onde a sequência de ácido nucleico está em um local cromossômico ou extracromossômico diferente daquele de células naturais, o é de outro modo flanqueado por uma sequência de ácido nucleico diferente daquela encontrada na natureza. A sequência de ácido nucleico isolada pode estar presente sob a forma de cadeia simples ou cadeia dupla. Quando uma sequência de ácido nucleico isolada for utilizada para expressar uma proteína, a sequência de ácido nucleico irá conter no mínimo ao menos uma porção da cadeia senso ou de codificação (ou seja, a sequência de ácido nucleico pode ser de cadeia simples). Alternativamente, essa pode conter tanto cadeias senso como antissenso (ou seja, a sequência de ácido nucleico pode ser de cadeia dupla).

[073] Promotor Mínimo: os elementos promotores, particularmente um elemento TATA, que são inativos ou que possuem atividade promotora bastante reduzida na ausência de ativação a montante. Na presença de um fator de transcrição adequado, o promotor mínimo funciona para permitir a transcrição.

[074] NEENA: veja "Ácido nucleico que aumenta a expressão de ácido nucleico".

[075] Não-codificação: O termo "não-codificação" se refere a sequências de moléculas de ácido nucleico que não codificam parte ou toda uma proteína express. As sequências de não-codificação incluem, porém sem caráter limitativo íntrons, intensificadores, regiões promotoras regiões, regiões não traduzidas 3', e regiões não traduzidas 5'.

[076] Ácido nucleico que aumenta a expressão do ácido nucleico (NEENA): O termo "ácido nucleico que aumenta a expressão do ácido nucleico" se refere a uma sequência e/ou uma molécula de ácido nucleico de uma sequência específica que possui a propriedade intrínseca para aumentar a expressão de um ácido nucleico sob o controle de um promotor ao qual o NEENA está funcionalmente ligado. Diferente das sequências promotoras, o NEENA como tal não é capaz de conduzir a expressão. Para executar a função de aumentar a expressão de uma molécula de ácido nucleico funcionalmente ligada ao NEENA, o próprio NEENA deve ser funcionalmente ligado a um promotor. Diferente das sequências intensificadoras conhecidas na técnica, o NEENA está atuando em cis, porém não em trans e deve estar localizado próximo ao sítio de início de transcrição do ácido nucleico que será expresso.

[077] Ácidos nucleicos e nucleotídeos: Os termos "Ácidos nucleicos" e "Nucleotídeos" se referem a ácido nucleicos ou nucleotídeos de ocorrência natural ou sintéticos ou artificiais. Os termos "ácidos nucleicos" e "nucleotídeos" compreendem desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos ou qualquer análogo de nucleotídeo e polímeros ou híbridos desses sob a forma senso ou antissenso de cadeia simples ou dupla.

[078] Exceto onde indicado em contrário, uma sequência de ácido nucleico particular também inclui implicitamente variantes modificadas de maneira conservadora da mesma (por exemplo, substituições de códon degeneradas) e sequências complementares, bem como a sequência explicitamente indicada. O termo "ácido nucleico" é usado de maneira intercambiável aqui com o "gene", "cDNA, "mRNA", "oligonucleotídeo" e "polinucleotídeo". Os análogos de nucleotídeo incluem nucleotídeos que possuem modificações na estrutura química da base, açúcar e/ou fosfato, inclusive, porém sem caráter limitativo, modificações de pirimidina na posição 5, modificações de purina na posição 8, modificações em aminas exocíclicas de citosina, substituição de 5-bromo-uracila, e similares; e modificações de açúcar na posição 2', inclusive, porém sem caráter limitativo, ribonucleotídeos com açúcar modificado em que o 2'-OH é substituído por um grupo selecionado a partir de H, OR, R, halo, SH, SR, NH2, NHR, NR2, ou CN. RNAs de grampo curto (shRNAs) também podem compreender elementos não-naturais como bases não-naturais, por exemplo, ionosina e xantina, açúcares não-naturais, por exemplo, 2'-metóxi ribose, ou ligações de fosfodiéster não-naturais, por exemplo, metilfosfonatos, fosforotioatos e peptídeos.

[079] Sequência de ácido nucleico: a frase "sequência de ácido nucleico" se refere a um polímero de cadeia simples ou dupla de bases de desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo lidas a partir da extremidade 5' para a 3'. Essa inclui DNA cromossômico, plasmídeos autorreplicantes, polímeros infecciosos de DNA ou RNA e DNA ou RNA que realiza uma função essencialmente estrutural. "Sequência de ácido nucleico" também se refere a uma lista consecutiva de abreviações, letras, caracteres ou palavras, que representam nucleotídeos. Em uma realização, um ácido nucleico pode ser uma "sonda" que é um ácido nucleico relativamente curto, geralmente menor do que 100 nucleotídeos de comprimento. Geralmente, uma sonda de ácido nucleico possui de cerca de 50 nucleotídeos de comprimento a cerca de 10 nucleotídeos de comprimento. Uma "região-alvo" de um ácido nucleico é uma porção de um ácido nucleico que é identificada para ser de interesse. Uma "região de codificação" de um ácido nucleico é a porção do ácido nucleico, que é transcrita e traduzida de maneira sequência-específica para produção em um polipeptídeo ou proteína particular quando colocada sob o controle de sequências reguladoras adequadas. A região de codificação é considerada para codificar tal polipeptídeo ou proteína.

[080] Oligonucleotídeo: O termo "oligonucleotídeo" se refere a um oligômero ou polímero de ácido ribonucleico (RNA) ou ácido desoxirribonucleico (DNA) ou miméticos desses, bem como oligonucleotídeos que possuem porções de ocorrência não-natural que funcionam de maneira similar. Tais oligonucleotídeos modificados ou substituídos são geralmente preferidos sobre formas nativas devido a propriedades desejadas como, por exemplo, absorção celular aumentada, afinidade aumentada para ácido nucleico alvo e estabilidade aumentada na presença de nucleases. Um oligonucleotídeo inclui, de preferência, dois ou mais nucleomonômeros covalentemente acoplados uns aos outros por ligações (por exemplo, fosfodiésteres) ou ligações substitutas.

[081] Ressalto: Um "ressalto" é uma sequência nucleotídica de cadeia simples relativamente curta na extremidade 5'- ou 3'-hidroxila de uma molécula de oligonucleotídeo de cadeia dupla (também referida como uma "extensão”, "extremidade protuberante”, ou "extremidade pegajosa ").

[082] Planta: é geralmente entendida como qualquer organismo eucariótico uni ou multicelular ou uma célula, tecido, órgão, parte ou material de propagação (como sementes ou frutos) desse que é capaz de realizar fotossíntese. Para o propósito da invenção são incluídos todos os gêneros e espécies de plantas superiores e inferiores do Reino Vegetal. As plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas anuais, perenes são preferidas. O termo inclui as plantas maduras, semente, brotos e mudas e suas partes derivadas, material de propagação (como sementes ou micrósporos), órgãos vegetais, tecido, protoplastos, calo e outras culturas, por exemplo, culturas celulares, e qualquer outro tipo de agrupamento de célula vegetal para fornecer unidades funcionais ou estruturais. As plantas maduras se referem a plantas em qualquer estágio de desenvolvimento desejado além daquele da muda. Muda se refere a uma planta imatura jovem em um estágio de desenvolvimento inicial. As plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas anuais, bienais são organismos hospedeiros preferidos para a geração de plantas transgênicas. A expressão de genes é, além disso, vantajosa em todas as plantas ornamentais, árvores úteis ou ornamentais, flores, flores cortadas, arbustos ou relvas. As plantas que podem ser mencionadas a título de exemplo, porém sem caráter imitativo, são angiospermas, briófitas como, por exemplo, Hepaticae (hepáticas) e Musci (musgo); Pteridophytes como samambaias, cavalinha e musgos de clube; gimnospermas como coníferas, cicadáceas, ginkgo e Gnetatae; algas como Chlorophyceae, Phaeophpyceae, Rhodophyceae, Myxophyceae, Xanthophyceae, Bacillariophyceae (diatomáceas), e Euglenophyceae. As plantas preferidas usadas para alimentos propósitos alimentares como as famílias das Leguminosas são ervilha, alfafa e soja; Gramineas como arroz, milho, trigo, cevada, sorgo, painço, centeio, triticale, ou aveias; a família de Umbelliferae, especialmente o gênero Daucus, muito especialmente a espécie carota (cenoura) e Apium, muito especialmente a espécie Graveolens dulce (aipo) e muitas outras; a família da Solanaceae, especialmente o gênero Lycopersicon, muito especialmente a espécie esculentum (tomate) e o gênero Solanum, muito especialmente a espécies tuberosum (batata) e melongena (beringela), e muitas outras (como tabaco); e o gênero Capsicum, muito especialmente a espécie annuum (pimentas) e muitas outras; a família das Leguminosas, especialmente o gênero Glycine, muito especialmente a espécie max (soja), alfafa, ervilha, luzerna, feijões ou amendoim e muitas outras; e a família da Cruciferae (Brassicacae), especialmente o gênero Brassica, muito especialmente a espécie napus (Colza oleaginisa), campestris (beterraba), oleracea cv Tastie (repolho), oleracea cv Snowball Y (couve-flor) e oleracea cv Emperor (brócolis); e do gênero Arabidopsis, muito especialmente a espécie thaliana e muitas outras; a família da Compositae, especialmente o gênero Lactuca, muito especialmente a espécie sativa (alface) e muitas outras; a família da Asteraceae como girassol, Tagetes, alface ou Calendula e muitas outras; a família da Cucurbitaceae como melão, abóbora ou abobrinha, e semente de linho. Adicionalmente preferidos são algodão, cana-de-açúcar, cânhamo, linho, pimentas, e várias árvores, espécie de noz e vinho.

[083] Polipeptídeo: Os termos "polipeptídeo", "peptídeo", "oligopeptídeo", "polipeptídeo", "produto genético", "produto de expressão" e "proteína" são usados aqui de maneira intercambiável para se referir a um polímero ou oligômero de resíduos de aminoácido consecutivos.

[084] Pré-proteína: Proteína, que é normalmente direcionada a uma organela celular, como um cloroplasto, e ainda compreende seu peptídeo de trânsito.

[085] Transcrição primária: O termo "transcrição primária" como usado aqui se refere a uma transcrição de RNA prematura de um gene. Uma "transcrição primária", por exemplo, compreende ainda íntrons e/ou ainda não compreende uma cauda poliA ou uma estrutura de tampão e/ou são desprovidas de outras modificações necessárias para a função correta como a transcrição, por exemplo, aparamento ou correção.

[086] Promotor: Os termos "promotor", ou "sequência promotora" são equivalentes e como usado aqui, se referem a uma sequência de DNA que quando ligada a uma sequência nucleotídica de interesse é capaz de controlar a transcrição da sequência nucleotídica de interesse em RNA. Tais promotores podem ser, por exemplo, encontrados nos seguintes bancos de dados públicos http://www.grassius.org/grasspromdb.html, http://mendel.cs.rhul.ac.uk/mendel.php?topic=plantprom, http://ppdb.gene.nagoya-u.ac.jp/cgi- bin/index.cgi. Os promotores relacionados podem ser endereçados com os métodos da invenção e estão incluídos aqui a título de referência. Um promotor fica localizado 5' (ou seja, a montante), próximo ao sítio de início transcricional de uma sequência nucleotídica de interesse cuja transcrição em mRNA é controlada, e fornece um sítio para a ligação específica por RNA polimerase e outros fatores de transcrição para a iniciação de transcrição. O dito promotor compreende, por exemplo, ao menos 10 kb, por exemplo, 5 kb ou 2 kb próximos ao sítio de início de transcrição. Esse também pode compreender ao menos 1500 pb próximos ao sítio de início transcricional, de preferência, ao menos 1000 pb, com mais preferência, ao menos 500 pb, com ainda mais preferência, ao menos 400 pb, ao menos 300 pb, ao menos 200 pb ou ao menos 100 pb. Em uma realização preferida adicional, o promotor compreende ao menos 50 pb próximos ao sítio de início de transcrição, por exemplo, ao menos 25 pb. O promotor não compreende regiões de éxon e/ou íntron ou regiões não traduzidas 5'. O promotor pode ser, por exemplo, heterólogo ou homólogo à respectiva planta. Uma sequência polinucleotídica é "heteróloga a" um organismo ou uma segunda sequência polinucleotídica se essa se originar de uma espécie estranha, ou, se for da mesma espécie, é modificada a partir de sua forma original. Por exemplo, um promotor ligado de maneira funcional a uma sequência de codificação heteróloga se refere a uma sequência de codificação de uma espécie diferente daquela da qual o promotor foi derivado, ou, se for da mesma espécie, uma sequência de codificação que não está naturalmente associada ao promotor (por exemplo, uma sequência de codificação geneticamente elaborada ou um alelo de um ecotipo ou variedade diferente). Os promotores adequados podem ser derivados de genes das células hospedeiras onde a expressão deve ocorrer ou de patógenos para essas células hospedeiras (por exemplo, plantas ou patógenos vegetais como vírus vegetais). Um promotor específico vegetal é um promotor adequado para regular a expressão em uma planta. Esse pode ser derivado de uma planta, porém também de patógenos vegetais ou esse pode ser um promotor sintético projetado pelo homem. Se um promotor for um promotor induzível, então a taxa de transcrição aumenta em resposta a um agente indutor. Também, o promotor pode ser regulado de maneira específica de tecido ou preferida de tecido de modo que seja apenas ou predominantemente ativo para transcrever a região de codificação associada em um tipo(s) de tecido específico como folhas, raízes ou meristema. O termo "específico de tecido" como se aplica a um promotor se refere a um promotor que é capaz de dirigir a expressão seletiva de uma sequência nucleotídica de interesse a um tipo específico de tecido (por exemplo, pétalas) na ausência relativa de expressão da mesma sequência nucleotídica de interesse em um tipo diferente de tecido (por exemplo, raízes). A especificidade de tecido de um promotor pode ser avaliada, por exemplo, ao ligar de maneira funcional um gene repórter à sequência promotora para gerar uma construção repórter, introduzir a construção repórter no genoma de uma planta de modo que a construção repórter seja integrada em cada tecido da planta transgênica resultante, e detectar a expressão do gene repórter (por exemplo, detectar mRNA, proteína, ou a atividade de uma proteína codificada pelo gene repórter) em tecidos diferentes da planta transgênica. A detecção de um nível maior de expressão do gene repórter em um ou mais tecidos em relação ao nível de expressão do gene repórter em outros tecidos mostra que o promotor é específico para os tecidos em que níveis superiores de expressão são detectados. O termo "tipo de célula específico" como aplicado a um promotor se refere a um promotor, que é capaz de dirigir a expressão seletiva de uma sequência nucleotídica de interesse em um tipo específico de célula na ausência relativa de expressão da mesma sequência nucleotídica de interesse em um tipo diferente de célula dentro do mesmo tecido. O termo "tipo de célula específico" quando aplicado a um promotor também significa um promotor capaz de promover a expressão seletiva de uma sequência nucleotídica de interesse em uma região dentro de um único tecido. A especificidade de tipo de célula de um promotor pode ser avaliada utilizando métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, coloração de atividade GUS, coloração de proteína ou imunohistoquímica. O termo "constitutivo" quando determinado em referência a um promotor ou à expressão derivada de um promotor significa que o promotor é capaz de dirigir a transcrição de uma molécula de ácido nucleico ligada de maneira funcional na ausência de um estímulo (por exemplo, choque térmico, produtos químicos, luz, etc.) na maioria de tecidos e células vegetais ao longo substancialmente de toda a vida-útil de uma planta ou parte de uma planta. Tipicamente, os promotores semente-específicos e/ou semente-preferenciais são capazes de dirigir a expressão de um transgene em substancialmente qualquer célula e qualquer tecido.

[087] Especificidade de promotor: O termo "especificidade" quando se refere a um promotor significa o padrão de expressão conferido pelo respectivo promotor. A especificidade descreve os tecidos e/ou o estado de desenvolvimento de uma planta ou parte da mesma, em que o promotor está s conferindo a expressão da molécula de ácido nucleico sob o controle do respectivo promotor. A especificidade de um promotor também pode compreender as condições ambientais, sob as quais o promotor pode ser ativado ou infra-regulado como a indução ou repressão por estresses biológicos ou ambientais como frio, aridez, feridas ou infecção.

[088] Purificado: Como usado aqui, o termo "purificado" se refere a moléculas, sequências de ácido nucleico ou aminoácido que são removidas de seu ambiente natural, isoladas ou separadas. As moléculas "substancialmente purificadas" são ao menos 60% livres, de preferência, ao menos 75% livres, e com mais preferência, ao menos 90% livres de outros componentes com os quais essas estão naturalmente associadas. Uma sequência de ácido nucleico purificada pode ser uma sequência de ácido nucleico isolada.

[089] Recombinante: O termo "recombinante" em relação a moléculas de ácido nucleico se refere a moléculas de ácido nucleico produzidas por técnicas de DNA recombinante. As moléculas de ácido nucleico recombinantes também podem compreender moléculas, que como tais não existem na natureza, porém são modificadas, alteradas, modificadas ou de outro modo manipuladas pelo homem. De preferência, uma "molécula de ácido nucleico recombinante" é uma molécula de ácido nucleico de ocorrência não non-natural que se difere em sequência de uma molécula de ácido nucleico de ocorrência natural por ao menos um ácido nucleico. Uma "molécula de ácido nucleico recombinante" também pode compreender uma "construção recombinante" que compreende, de preferência, uma sequência ligada de maneira funcional a moléculas de ácido nucleico de ocorrência não natural naquela ordem. Os métodos preferidos para produzir a dita molécula de ácido nucleico recombinante podem compreender técnicas de clonagem, mutagênese dirigida ou não-dirigida, síntese ou técnicas de recombinação.

[090] "Promotor semente-específico" no contexto dessa invenção significa um promotor que está regulando a transcrição de uma molécula de ácido nucleico sob o controle do respectivo promotor em sementes em que a transcrição em qualquer tecido ou célula das sementes contribui em mais de 90%, de preferência, mais de 95%, com mais preferência, mais de 99% da quantidade total do RNA transcrito a partir da dita sequência de ácido nucleico em toda a planta durante qualquer estágio de desenvolvimento. O termo "expressão semente-específica" e "NEENA semente-específico" devem ser entendidos em conformidade. Então, um "NEENA semente-específico" aumenta a transcrição de um promotor semente-específico ou semente-preferencial de modo que a transcrição em sementes derivadas do dito promotor funcionalmente ligado a um respectivo NEENA contribua com mais de 90%, de preferência, mais de 95%, com mais preferência, mais de 99% da quantidade total do RNA transcrito a partir do respectivo promotor funcionalmente ligado a um NEENA e toda a planta durante qualquer estágio de desenvolvimento.

[091] "Promotor semente-preferencial" no contexto dessa invenção significa um promotor que está regulando a transcrição de uma molécula de ácido nucleico sob o controle do respectivo promotor em sementes em que a transcrição em qualquer tecido ou célula das sementes contribui com mais de 50%, de preferência, mais de 70%, com mais preferência, mais de 80% da quantidade total do RNA transcrito a partir da dita sequência de ácido nucleico em toda a planta durante qualquer estágio de desenvolvimento. Os termos "expressão semente-preferencial" e "NEENA semente-preferencial" devem ser entendidos em conformidade. Então, um "NEENA semente-preferencial" aumenta a transcrição de um promotor semente-específico ou semente- preferencial de modo que a transcrição em sementes derivadas do dito promotor funcionalmente ligado a um respectivo NEENA contribua com mais de 50%, de preferência, mais de 70%, com mais preferência, mais de 80% da quantidade total do RNA transcrito a partir do respectivo promotor funcionalmente ligado a um NEENA em toda a planta durante qualquer estágio de desenvolvimento.

[092] Senso: O termo "senso" é entendido para se referir a uma molécula de ácido nucleico que possui uma sequência que é complementar ou idêntica a uma sequência-alvo, por exemplo, uma sequência que se liga a um fator de transcrição de proteína e que está envolvida na expressão de um determinado gene. De acordo com uma realização preferida, a molécula de ácido nucleico compreende um gene de interesse e elementos que permitem a expressão do dito gene de interesse.

[093] Aumento ou redução significativa: Um aumento ou redução, por exemplo, na atividade enzimática ou na expressão genética, que é maior do que a margem de erro inerente na técnica de medida, de preferência, um aumento ou redução de cerca de 2 vezes ou mais da atividade da enzima de controle ou expressão na célula de controle, com mais preferência, um aumento ou redução de cerca de 5 vezes mais, e com máxima preferência, um aumento ou redução de cerca de 10 vezes ou mais.

[094] Pequenas moléculas de ácido nucleico: "pequenas moléculas de ácido nucleico" são entendidas como moléculas que consiste em ácidos nucleicos ou derivados desses como RNA ou DNA. Essas podem ser de cadeia dupla ou simples e estão entre cerca de 15 e cerca de 30 pb, por exemplo, entre 15 e 30 pb, com mais preferência, entre cerca de 19 e cerca de 26 pb, por exemplo, entre 19 e 26 pb, com ainda mais preferência, entre cerca de 20 e cerca de 25 pb, por exemplo, entre 20 e 25 pb. Em uma realização especialmente preferida, os oligonucleotídeos estão entre cerca de 21 e cerca de 24 pb, por exemplo, entre 21 e 24 pb. Em uma realização mais preferida, as pequenas moléculas de ácido nucleico são cerca de 21 pb e cerca de 24 pb, por exemplo, 21 pb e 24 pb.

[095] Substancialmente complementar: Em seu sentido mais amplo, o termo "substancialmente complementar", quando usado aqui em relação a uma sequência nucleotídica em relação a uma referência sequência nucleotídica de referência ou alvo, significa uma sequência nucleotídica que possui uma porcentagem de identidade entre a sequência nucleotídica substancialmente complementar e a sequência complementar exata da dita sequência nucleotídica de referência ou alvo de ao menos 60%, mais desejavelmente, ao menos 70%, mais desejavelmente, ao menos 80% ou 85%, de preferência, ao menos 90%, com mais preferência, ao menos 93%, com ainda mais preferência, ao menos 95% ou 96%, com ainda mais preferência, ao menos 97% ou 98%, com ainda mais preferência, ao menos 99% ou com máxima preferência, 100% (sendo que o último é equivalente ao termo "idêntico" nesse contexto). De preferência, a identidade é avaliada ao longo de um comprimento de ao menos 19 nucleotídeos, de preferência, ao menos 50 nucleotídeos, com mais preferência, o comprimento total da sequência de ácido nucleico até a dita sequência de referência (se não especificado de outro modo abaixo). Comparações de sequência são realizadas utilizando a análise padrão GAP com GCG de University of Wisconsin, aplicação SEQWEB de GAP, com base no algoritmo de Needleman e Wunsch (Needleman and Wunsch (1970) J MoI. Biol. 48: 443-453; como definido acima). Uma sequência nucleotídica "substancialmente complementar" a uma sequência nucleotídica de referência se hibridiza com a sequência nucleotídica de referência sob condições de baixa severidade, de preferência, condições de severidade média, com máxima preferência, condições de alta severidade (como definido acima).

[096] Transgene: O termo "transgene" como usado aqui se refere a qualquer sequência de ácido nucleico, que é introduzida no genoma de uma célula por manipulações experimentais. Um transgene pode ser uma "sequência de DNA endógena”, ou uma " sequência de DNA heteróloga" (ou seja, "DNA estranho"). O termo "sequência de DNA endógena" se refere a uma sequência nucleotídica, que é naturalmente encontrada na célula dentro da qual essa é introduzida desde que essa não contenha modificação (por exemplo, uma mutação pontual, a presença de um gene marcador selecionável, etc.) relativo à sequência de ocorrência natural.

[097] Transgênico: O termo transgênico quando se refere a um organismo significa transformado, de preferência, transformado de maneira estável, com uma molécula de DNA recombinante que compreende, de preferência, um promotor adequado ligado de maneira funcional a uma sequência de DNA de interesse.

[098] Vetor: Como usado aqui, o termo "vetor" se refere a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outra molécula de ácido nucleico à qual essa está ligada. Um tipo de vetor é um vetor genômico integrado, ou "vetor integrado", que pode se tornar integrado no DNA cromossômico da célula hospedeira. Outro tipo de vetor é um vetor epissômico, ou seja, uma molécula de ácido nucleico capaz de replicação extracromossômica. Os vetores capazes de dirigir a expressão de genes aos quais esses estão ligados de maneira funcional são referidos aqui como "vetores de expressão". No presente relatório descritivo, "plasmídeo" e "vetor" são usados de maneira intercambiável, exceto onde definido em contrário no contexto. Os vetores de expressão projetados para produzir RNAs como descrito aqui in vitro ou in vivo podem conter sequências identificadas por qualquer RNA polimerase, inclusive RNA polimerase mitocondrial, RNA pol I, RNA pol II, e RNA pol III. Esses vetores podem ser usados para transcrever a molécula de RNA desejada na célula de acordo com essa invenção. Um vetor de transformação vegetal será entendido como um vetor adequado no processo de transformação vegetal.

[099] Tipo selvagem: O termo "tipo selvagem ", "natural" ou "origem natural" significa em relação a um organismo, polipeptídeo, ou sequência de ácido nucleico, que o dito organismo é de ocorrência natural ou disponível em ao menos um organismo de ocorrência natural que não é alterado, modificado ou de outro modo manipulado pelo homem.

EXEMPLOS PRODUTOS QUÍMICOS E MÉTODOS COMUNS

[100] Exceto onde indicado em contrário, os procedimentos de clonagem realizados para os propósitos da presente invenção inclusive digestão com enzima de restrição, eletroforese em gel de agarose, purificação de ácidos nucleicos, Ligação de ácidos nucleicos, transformação, seleção e cultivo de células bacterianas foram realizados como descrito (Sambrook et al., 1989). A análise de sequência de DNA recombinante foi realizada com um sequenciador de DNA de fluorescência a laser (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) utilizando a tecnologia de Sanger (Sanger et al., 1977). Exceto onde descrito em contrário, os produtos químicos e reagentes foram obtidos junto à Sigma Aldrich (Sigma Aldrich, St. Louis, USA), de Promega (Madison, Wl, USA), Duchefa (Haarlem, The Netherlands) ou Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). As endonucleases de restrição foram obtidas junto à New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) ou Roche Diagnostics GmbH (Penzberg, Germany). Os oligonucleotídeos foram sintetizados por Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Germany). EXEMPLO 1: IDENTIFICAÇÃO DE CANDIDATOS A ÁCIDOS NUCLEICOS QUE AUMENTAM A EXPRESSÃO DE ÁCIDO NUCLEICO (NEENA) A PARTIR DE GENES COM EXPRESSÃO SEMENTE-ESPECÍFICA E/OU SEMENTE-PREFERENCIAL 1.1 IDENTIFICAÇÃO DE MOLÉCULAS DE NEENA DE GENES A. THALIANA

[101] Utilizando-se sequências de DNA genômicas publicamente disponíveis (por exemplo, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/PLANTS/PlantList.html) e dados de expressão de transcrição (por exemplo, http://www.weigelworld.org/resources/microarray/AtGenExpress/), um conjunto de 19 candidatos a NEENA que é derivado de transcrições de Arabidopsis thaliana com expressão semente-específica e/ou semente-preferencial foi selecionado para análise detalhada. Os candidatos foram denominados conforme exposto a seguir: TABELA 1: CANDIDATOS A NEENA SEMENTE-ESPECÍFICOS (NEENASS).

1.2 ISOLAMENTO DOS CANDIDATOS A NEENA

[102] O DNA genômico foi extraído de tecido verde de A. thaliana utilizando o Qiagen DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Os fragmentos de DNA genômico contendo as moléculas de NEENA putativas foram isolados por reação em cadeia da polimerase convencional (PCR). Os primers foram projetados com base na sequência genômica de A. thaliana com uma grande quantidade de candidatos a NEENA. A reação compreendia 19 conjuntos de primers (Tabela 2) e seguiu o protocolo descrito por Phusion High Fidelity DNA Polymerase (Cat No F-540L, New England Biolabs, Ipswich, MA, USA). O DNA isolado foi usado como o DNA modelo em uma amplificação PCR utilizando os seguintes primers: TABELA 2: SEQUÊNCIAS DE PRIMERS

[103] Amplificação durante a PCR foi realizada com a seguinte composição (50 μL): 3.00 μL de DNA genômico de A. thaliana (50 ng/μL) 10.00 μL 5x Tampão Phusion HF 4.00 μL de dNTP (2.5 mM) 2.50 μL primer direto (10 μM) 2.50 μL primer reverso (10 μM) 0.50 μL de DNA Polimerase Phusion HF (2U/μL)

[104] Uma abordagem “touch-down” foi empregada para a PCR com os seguintes parâmetros: 98;0°C durante 30 seg. (1 ciclo), 98,0°C durante 30 seg., 56,0°C durante 30 seg. e 72,0°C durante 60 seg. (4 ciclos), 4 ciclos adicionais cada para 54,0°C, 51,0°C e 49,0°C de temperatura de têmpera, seguido por 20 ciclos com 98,0°C durante 30 seg., 46,0°C durante 30 seg. e 72,0°C durante 60 seg. (4 ciclos) e 72,0°C durante 5 min. Os produtos de amplificação foram carregados em um gel de agarose 2 % (w/v) e separados em 80V. Os produtos de PCR foram excisados do gel e purificados com o Kit de Extração de Gel Qiagen (Qiagen, Hilden, Germany). Após uma digestão de restrição de DNA com endonuclease de restrição Ncol (10 U/μL) e Kpnl (10 U/μL), os produtos digeridos foram novamente purificados com o Kit de Extração de Gel Qiagen (Qiagen, Hilden, Germany). 1.3 CONSTRUÇÃO DO VETOR

[105] Utilizando-se o Sistema Multisite Gateway (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), o promotor::NEENA:: cassetes de gene repórter foram montados em construções binárias para a transformação vegetal O p-AtPXR de A. thaliana, (At1g48130, GenBank AC023673.3; WO2006089950; com o prefixo p- denota o promotor) o promotor semente-específico foi usado na construção de gene repórter, e luciferase de vaga-lume (Promega, Madison, Wl, USA) foi utilizada com a proteína repórter para determinar quantitativamente os efeitos que aumentam a expressão das moléculas de NEENA que serão analisadas. O vetor pENTR/A que contém o promotor p-AtPXR foi clonado através de recombinação sítio-específica (reação BP) entre o vetor pDONR/A e os produtos de amplificação p-AtPXR com primers p- AtPXR-for e p-AtPXR-rev (Tabela 3) no DNA genômico (veja acima) com os sítios de recombinação sítio-específicas em cada extremidade de acordo com o manual do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Os clones pENTR/A positivos foram submetidos à análise de sequência para garantir a exatidão do promotor p-AtPXR. TABELA 3: SEQUÊNCIAS DE PRIMERS (P-ATPXR)

[106] Um vetor ENTR/B contendo a sequência de codificação de luciferase de vaga-lume (Promega, Madison, Wl, USA) seguido pelo terminador transcricional de nopalina sintase t-nos (Genbank V00087) foi gerado. Os fragmentos de PCR de candidato a NEENA (veja acima) foram clonados separadamente a montante da sequência de codificação de luciferase de vaga- lume utilizando as enzimas de restrição Kpnl e Ncol. Os vetores pENTR/B resultantes estão resumidos na tabela 4, com as moléculas promotoras possuindo o prefixo p, as sequências de codificação possuindo o prefixo c, e as moléculas terminadoras possuindo o prefixo t. TABELA 4: TODOS OS VETORES PENTR/B MAIS E MENOS CANDIDATOS A NEENA

[107] O vetor pENTR/C foi construído pela introdução de um sítio de clonagem múltipla (SEQ ID NO60) através de sítios de restrição Kpnl e Hindlll. Ao realizar uma recombinação sítio-específica (reação LR), o pENTR/A, pENTR/B e pENTR/C criados foram combinados com o vetor de destino pSUN (derivado de pSUN) de acordo com o manual dos fabricantes (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) Multisite Gateway. As reações produziram 1 vetor binário com promotor p-AtPXR, a sequência de codificação de luciferase de vaga-lume c-LUC e o terminador t-nos e 19 vetores que abrigam a SEQ ID NO1 , NO2, NO3, NO4, NO5, NO6, NO7, NO8, NO9, NO10, NO11, NO12, NO13, NO14, NO15, NO16, NO17, NO18 e NO19 imediatamente a montante da sequência de codificação de luciferase de vaga-lume (Tabela 5), para isso a combinação com a SEQ ID NO1 é determinada como exemplificativa (SEQ ID NO61 ). Exceto para variar a SEQ ID NO2 para NO19, a sequência nucleotídica é idêntica em todos os vetores (Tabela 5). Os vetores de transformação vegetal resultantes estão resumidos na tabela 5: TABELA 5: VETORES DE EXPRESSÃO VEGETAL PARA TRANSFORMAÇÃO DE A. THALIANA

[108] Os vetores resultantes foram subsequentemente usados para gerar plantas de A. thaliana transgênicas.

EXEMPLO 2: TRIAGEM DE MOLÉCULAS DE NEENA QUE AUMENTAM A EXPRESSÃO GENÉTICA EM PLANTAS DE A. THALIANA TRANSGÊNICAS.

[109] Esse exemplo ilustra que apenas as moléculas candidatas a NEENA selecionadas são capazes de aumentar a expressão genética.

[110] Todas as construções binárias contendo as moléculas candidatas a NEENA descritas no exemplo 1 foram estavelmente transformadas em plantas de Arabidopsis thaliana juntamente com uma construcao de controle sem NEENA. Para gerar plantas de A. thaliana transgênicas, Agrobacterium tumefaciens (cepa C58C1 pGV2260) foi transformada com as várias construções de vetor descritas acima. Para a transformação de A. thaliana, o método “Floral Dip” foi empregado (Clough and Bent, 1998, Plant Journal 16: 735-743). As plantas transgênicas T1 foram selecionadas ao germinar e desenvolver mudas em Canamicina. Após 12 dias, os cotilédones de transformantes e plantas de controle do tipo selvagem foram amostrados e distribuídos em placas de 96 poços pré-carregadas com Meio Murashige-Skoog 50 μL 0,5 x e submetidos a análises de gene repórter de Luciferase (protocolo anexado após Weigel and Glazebrook, 2002, Arabidopsis, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Chapter 7, ISBN 0-87969-572-2). A luminescência de cotilédones foi determinada em uma solução contendo 0,1 mM de D-Luciferina (Cat No: L- 8220, BioSynth, Staad, Switzerland) e 0,01% de Tween20 (Sigma, Aldrich, St. Louis, USA) em um MicroLumat Plus LB96V (Berthold Technologies, Bad Wilbad, Germany) registrado 60 min. após a adição de D-Luciferina. A média de leituras de instrumento foi calculada para cada construção e com base nesses valores de expressão média, os valores de modulação foram calculados para avaliar o impacto da presença de um NEENA putativo sobre as construções de gene repórter desprovidas do respectivo NEENA putativo. Em comparação com as construções semente-específicas de gene repórter sem NEENA apenas com o promotor p-AtPXR, os 19 candidatos a NEENA testados contendo as construções mostraram efeitos negativos bem como positivos, que variam de 0,8 vez a 22,2 vezes a indução em atividade de Luciferase (Figura 1). No total, 15 moléculas de NEENA putativas compreendendo as sequências com SEQ ID NO1, NO2, NO3, NO4, NO5, NO6, NO7, NO8, NO9, NO10, NO11, NO12, NO13, NO14 e NO15 conferiram um aumento maior do que 2,5 vezes na expressão genética com base na atividade de gene repórter da luciferase comparada com a construção de gene repórter sem NEENA apenas com o promotor (Figura 1) e, então, são moléculas de NEENA funcionais. Visto que inúmeras moléculas candidatas a NEENA testadas possuem efeitos marginais ou ainda negativos sobre o aumento da expressão genética, nem todas as moléculas de NEENA putativas estão mediando um efeito estimulador comum, porém as sequências de NEENA selecionadas conduzem um aumento significativo de expressão genética (SEQ ID NO 1 a 15).

EXEMPLO 3: TESTE DE MOLÉCULAS DE NEENA QUANTO AO AUMENTO SEMENTE- ESPECÍFICO DE EXPRESSÃO GENÉTICA EM PLANTAS COLZA DE SEMENTE OLEAGINOSA

[111] Esse exemplo ilustra que as moléculas de NEENA podem ser usadas nas espécies para aumentar a expressão genética de um promotor tecido-específico comparada com a abordagem apenas com o promotor sem NEENA.

[112] As moléculas de NEENA que mediam o aumento mais vigoroso na expressão genética na pré-triagem (cp. Exemplo 2, SEQ ID NO1, NO2, NO3, NO4, NO5, NO6 e NO7) foram selecionadas para determinar o aumento sobre os níveis de expressão genética em plantas de colza de semente oleaginosa transgênicas. 3.1 CONSTRUÇÃO DE VETOR PARA TRANSFORMAÇÃO DE PLANTA B. NAPUS

[113] Para a transformação de plantas de colza de semente oleaginosa, os cassetes de expressão de gene repórter sem e com as moléculas de controle de expressão genética (SEQ IDs NO1 - NO7) foram combinados com um a cassete de expressão genética conduzindo um gene marcador selecionável para detectar as linhagens de plantas transgênicas dentro de um vetor pENTR/C. ao realizar uma recombinação sítio-específica (reação LR), como anteriormente descrito (veja acima, 1.3), o pENTR/A, pENTR/B e o pENTR/C que conduz o cassete marcador selecionável foram combinados com o vetor de destino pSUN de acordo com o manual do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) Multisite Gateway. As reações produziram um vetor binário com o promotor p-AtPXR, a sequência de codificação de luciferase de vaga-lume c-LUC, o terminador t-nos e o cassete marcador selecionável bem como 7 vetores que abrigam a SEQ ID NO1, NO2, NO3, NO4, NO5, NO6 e NO7 imediatamente a montante da sequência de codificação de luciferase de vaga-lume (Tabela 6), para isso a combinação com a SEQ ID NO1 é determinada exemplificativa (SEQ ID NO62). Exceto para a variação de SEQ ID NO2 a NO7, a sequência nucleotídica é idêntica em todos os vetores (Tabela 6). Os vetores de transformação vegetal resultantes estão resumidos na tabela 6: TABELA 6: VETORES DE EXPRESSÃO VEGETAL PARA TRANSFORMAÇÃO DE B. NAPUS

3.2 GERAÇÃO DE PLANTAS DE SEMENTE DE COLZA TRANSGÊNICAS (protocolo corrigido de acordo com Moloney et al., 1992, Plant Cell Reports, 8: 238- 242)

[114] Na preparação para a geração de plantas de semente de colza transgênicas, os vetores binários foram transformados em Agrobacterium tumefaciens C58C1 :pGV2260 (Deblaere et al., 1985, Nucl. Acids. Res. 13: 4777-4788). Uma diluição de 1:50 de uma cultura noturna de Agrobacteria que abriga a respectiva construção binária foi desenvolvida em Meio Murashige-Skoog (Murashige and Skoog, 1962, Physiol. Plant 15, 473) suplementado com 3 % de sacarose (Meio 3MS). Para a transformação de plantas de semente de colza, pecíolos ou hipocotiledôneas de plantas estéreis foram incubados com uma solução 1:50 de Agrobacterium durante 5 a 10 minutos seguido por uma co-incubação de três dias no escuro a 25°C em 3 MS. O meio suplementado com 0,8 % de bacto-agar. Após três dias, os explantes foram transferidos para o meio MS contendo 500 mg/l de Claforan (Cefotaxima Sódica), 100 nM de Imazetapyr, 20 μM de Benzilaminopurina (BAP) e 1 ,6 g/l de Glucose em um regime de 16 h na luz/ 8 h no escuro, que foi repetido em períodos semanais. Os brotos em desenvolvimento foram transferidos para o meio MS contendo 2 % de sacarose, 250 mg/l de Claforan e 0,8 % de Bacto-agar. Após 3 semanas, o ácido 2-lndolbutila do hormônio de crescimento foi adicionado ao meio para promover a formação de raízes. Os brotos foram transferidos para o solo após o desenvolvimento das raízes, se desenvolveram durante duas semanas em uma câmara de crescimento e foram desenvolvidos até a maturidade em condições de estufa. 3.3 ANÁLISE DA PLANTA

[115] As amostras de tecido foram coletadas das plantas transgênicas geradas de folhas, flores e sementes de estágios de desenvolvimento variados, armazenadas em um congelador a -80°C e submetidas a uma análise de gene repórter de Luciferase (protocolo anexado após Ow et al., 1986). Após a moagem, as amostras de tecido congeladas foram ressuspensas em 800 μL de tampão I (0,1 M de tampão fosfato pH 7,8, 1 mM de DTT (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA), 0,05 % de Tween 20 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)) seguidas por centrifugação em 10.000 g durante 10 minutos. 75 μL do sobrenadante aquoso foram transferidos para placas de 96 poços. Após a adição de 25 μL de tampão Il (80 mM de glicina-glicil (Carl Roth, Karlsruhe, Germany), 40 mM de MgSO4 (Duchefa, Haarlem, The Netherlands), 60 mM de ATP (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA), pH 7,8) e D-Luciferina a uma concentração final de 0,5 mM (Cat No: L-8220, BioSynth, Staad, Switzerland), a luminescência foi registrada em um MicroLumat Plus LB96V (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany) produzindo a unidade de luz relativa RLU por minuto (RLU/min). Para normalizar a atividade de luciferase entre as amostras, a concentração proteica foi determinada no sobrenadante aquoso em paralelo à atividade de luciferase (adaptada junto à Bradford, 1976, Anal. Biochem. 72, 248). 5 μL do extrato celular aquoso no tampão I foram misturados com 250 μL de reagente Bradford (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA), incubados durante 10 min em temperatura ambiente. A absorção foi determinada em 595 nm em um leitor de placa (Thermo Electron Corporation, Multiskan Ascent 354). As quantidades totais de proteína nas amostras foram calculadas com uma curva de concentração padrão anteriormente gerada. Os valores resultantes de uma razão de RLU/min e amostra de mg de proteína/ml foram calculados para plantas transgênicas que hospedam construções idênticas e os valores de modulação foram calculados para avaliar o impacto da presença de molécula de NEENA sobre as construções de gene repórter sem NEENA. 3.4 SEQUÊNCIAS DE NEENA MEDIAM O AUMENTO VIGOROSO DE EXPRESSÃO GENÉTICA EM SEMENTES DE COLZA DE SEMENTE OLEAGINOSA

[116] Para avaliar o potencial de aumento de expressão genética de moléculas de NEENA selecionadas (SEQ ID NO1, NO2, NO 3, NO4, NO5, NO6 ou NO7) em sementes de colza de semente oleaginosa, as sementes de estágios de desenvolvimento idênticos foram coletadas de linhagens de planta de colza de semente oleaginosa individuais que abrigam uma construção de gene repórter apenas de promotor ou construções de gene repórter de Luciferase contendo um NEENA (SEQ ID NO1, NO2, NO3, NO4, NO5, NO6 e NO7). 10 sementes foram coletadas de cada evento transgênico, processadas e analisadas quanto à atividade de Luciferase como descrito acima (Exemplo 3.3).

[117] Em comparação com as construções de gene repórter sem NEENA apenas com o promotor p-AtPXR semente-específicas, as 7 moléculas de NEENA testadas mediaram aumentos vigorosos na expressão genética, que variam de 54 vezes a 380 vezes a indução em atividade de Luciferase em sementes de canola (Figura 2a). O aumento comparável de expressão foi detectado em sementes de colza oleaginosas em estágios de maturação posteriores (dados não mostrados). 3.5 MOLÉCULAS DE NEENA ESTIMULAM A EXPRESSÃO GENÉTICA EM TECIDOS ESPECIFICAMENTE EM SEMENTES DE COLZA OLEAGINOSAS

[118] Para avaliar o aumento específico de tecido de expressão genética mediada pelas moléculas de NEENA moléculas (SEQ ID NO1, NO2, NO3, NO4, NO5, NO6 ou NO7), a atividade de Luciferase foi determinada em flores completamente desenvolvidas e abertas das plantas de colza de semente oleaginosa transgênicas que abrigam as construções de gene repórter descritas acima. Três amostras de folhas de tamanho idêntico bem como uma flor inteira foram coletadas de cada planta separadamente e submetidas a análises de gene repórter da Luciferase como descrito acima (Exemplo 3.3). 5 (Seq. ID NO1, NO2, NO3, NO4, NO5) das 7 moléculas de NEENA testadas mostraram níveis de expressão de Luciferase comparáveis com aqueles da construção de promotor p-AtPXR sem NEENA em folhas e flores e, assim, não alteram a especificidade de tecido do promotor p-AtPXR semente-específico (Figura 2, b e c). 2 moléculas de NEENA (SEQ ID NO6, NO7) aumentaram ligeiramente a atividade de Luciferase em folhas e flores das plantas de colza semente oleaginosa analisadas (Figura 2, b e c) comparadas com as plantas que compreendem a construção sem NEENA. Então, esses NEENAs SEQ ID NO 6 e 7 são NEENAs semente-preferenciais enquanto os outros NEENAs SEQ ID NO 1 a 5 são NEENAs semente-específicos.

EXEMPLO 4: ANÁLISE DE NEENA PARA AUMENTO SEMENTE-ESPECÍFICO DE PROMOTORES SEMENTE-ESPECÍFICOS FORTES

[119] Esse exemplo esclarece que as capacidades de aumento de expressão de moléculas de NEENA podem ser usadas em combinação com uma variedade de moléculas promotoras para aumentar os níveis de expressão tecido-específicos comparados com aqueles de promotores individualmente. 4.1 CONSTRUÇÃO DE VETOR PARA TRANSFORMAÇÃO DE PLANTA B. NAPUS

[120] As moléculas de NEENA selecionadas do grupo testado no exemplo 3 (SEQ IDs NO1, NO2, NO3, NO5 e NO6) foram testadas por seu efeito sobre a expressão genética tecido-específica de promotores semente- específicos fortes p-LuPXR (WO2006089950, Sequência 9) e p-VfUSP (X56240, Bae- umlein et al., 1991). A construção de vetor foi realizada como descrito acima (cp. Exemplo 1.3 e 3.1 ), com as sequências de primers descritas na tabela 7 e o vetor LJB765 (WO2009016202) como o modelo de DNA. Os clones pENTR/A positivos foram submetidos a análises de sequência para garantir a exatidão de promotores p-LuPXR e p-VfUSP. TABELA 7: SEQUÊNCIAS DE PRIMERS PARA P-LUPXR E P-VFUSP

[121] Ao realizar uma recombinação sítio-específica (reação LR) como anteriormente descrito (veja acima, 1.3), os vetores pENTR/A, pENTR/B e o vetor pENTR/C que conduz o cassete marcador selecionável foram combinados com o vetor de destino pSUN de acordo com o manual do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) Multisite Gateway. As reações produziram 1 vetor binário com o promotor p-LuPXR, a sequência de codificação de luciferase de vaga-lume e o terminador t-nos bem como o cassete marcador selecionável e os 4 vetores que abrigam a SEQ ID NO1, NO2, NO3 e NO6 imediatamente a montante da sequência de codificação de luciferase de vaga-lume (Tabela 8), para isso a combinação com a SEQ ID NO1 é determinada como exemplificativa (SEQ ID NO67). Exceto para a variação de SEQ ID NO2, NO3 e NO6, a sequência nucleotídica é idêntica em todos os vetores (Tabela 8). Similarmente, o promotor p-VfUSP foi usado para gerar a construção LJK219 apenas com o promotor bem como as construções LJK220, LJK221, LJK224 e LJK225 que contêm SEQ IDs NO1, NO2, NO3 e NO5 (Tabela 8). Os vetores de transformação vegetal resultantes estão resumidos na tabela 8: TABELA 8: VETORES DE EXPRESSÃO VEGETAL PARA TRANSFORMAÇÃO DE B. NAPUS

4.2. SEQUÊNCIAS DE NEENA MEDIAM O AUMENTO ESPECÍFICO DE EXPRESSÃO GENÉTICA DE PROMOTORES SEMENTE-ESPECÍFICOS FORTES EM SEMENTES DE COLZA DE OLEAGINOSAS

[122] A geração de plantas de semente de colza transgênicas e análises de plantas foram conduzidas como descrito acima (exemplo 3.2 e 3.3).

[123] Para o teste e efeito de moléculas de NEENA selecionadas em combinação com os promotores semente-específicos (SEQ ID NO1 , NO2, NO3, NO5 e NO6) em sementes de colza oleaginosas, sementes de estágios de desenvolvimento idênticas foram coletadas de linhagens vegetais de colza de semente oleaginosa transgênicas individuais que abrigam uma construção gene repórter apenas com o promotor (LJK212 e LJK219) ou construções de gene repórter de Luciferase contendo um NEENA (SEQ ID NO1 , NO2, NO3, NO5 e NO6) (Tabela 9). A partir de cada evento transgênico, 10 sementes foram coletadas, processadas e analisadas quanto à atividade de Luciferase como descrito acima (Exemplo 3.3).

[124] Em comparação com as construções de gene repórter semente-específicas apenas com o promotor p-LuPXR e p-VfUSP sem NEENA, todas as moléculas de NEENA testadas mediaram aumentos vigorosos na expressão genética em sementes de colza oleaginosas de maturidade mediana em combinação com ambos, o promotor p-LuPXR e p-VfUSP (Tabela 9). Um aumento similar de expressão foi detectado em sementes de colza oleaginosas em estágios de maturação posteriores. TABELA 9: EXPRESSÃO LUC EM SEMENTES DE PLANTAS DE COLZA DE SEMENTE OLEAGINOSA ESTAVELMENTE TRANSFORMADAS.

*Expressão LUC determinada como uma faixa de atividades de luciferase de vaga-lume (- nenhuma expressão a +++++ expressão muito alta), a expressão LUC relativa comparada com a expressão do promotor p-LuPXR de peroxiredoxina de semente de linho.

[125] Para avaliar o aumento tecido-específico de expressão genética mediada pelas moléculas de NEENA (SEQ ID NO1, NO2, NO3, NO5 e NO6), a atividade de Luciferase foi determinada em folhas completamente desenvolvidas das plantas de colza de semente oleaginosa transgênicas que abrigam as construções de gene repórter descritas acima. 3 amostras de folhas de tamanhos idênticos foram coletadas de cada planta separadamente e foram submetidas a análises de gene repórter de Luciferase como descrito acima (Exemplo 3.2). As especificidades de tecido das moléculas de NEENA testadas (SEQ ID NO1, NO2, NO3, NO5, NO6) em combinação com o promotor p-LuPXR e o promotor p-VfUSP se assemelham àquelas testadas com o promotor p- AtPXR analisado acima (exemplo 3.5). Conforme com o promotor p-AtPXR (exemplo 3.5), as moléculas de NEENA (SEQ ID NO1, NO2, NO3 e NO5) não mostraram alteração da especificidade de tecido do promotor p-LuPXR ou p- VfUSP (Tabela 10). Similar à atividade com o promotor p-AtPXR (exemplo 3.5), o NEENA (SEQ ID NO6) conduziu o aumento de atividade de Luciferase em sementes, porém também mediou a expressão de Luciferase nas folhas das plantas de colza de semente oleaginosa analisadas (Tabela 10). TABELA 10: EXPRESSÃO LUC EM FOLHAS DE PLANTAS DE COLZA DE SEMENTE OLEAGINOSA ESTAVELMENTE TRANSFORMADAS

*Expressão LUC determinada como uma faixa de atividades de luciferase de vaga-lume (- nenhuma expressão a +++++ expressão muito alta), a expressão LUC relativa comparada com a expressão do promotor p-LuPXR de semente de linho dentro do respectivo tecido. **Expressão de luciferase relativa comparada com a expressão controlada pelo promotor p-LuPXR de peroxiredoxina de semente de linho.

EXEMPLO 5: ANÁLISE DE AUMENTO TECIDO-ESPECÍFICO DE EXPRESSÃO GENÉTICA EM PLANTAS DE SOJA

[126] Esse exemplo ilustra que as moléculas de NEENA reivindicadas podem ser usadas em uma ampla gama de espécies vegetais e sobre bordas de espécie de famílias de plantas diferentes para aumentar a expressão genética especificamente em tecido comparado com uma abordagem somente com o promotor sem NEENA.

[127] As moléculas de sequência de NEENA que mediam o aumento mais vigoroso na expressão genética na pré-triagem (cp. Exemplo 2, SEQ ID NO1, NO2, NO 3, NO4, NO5, NO6 e NO7) foram selecionadas para determinar o aumento sobre os níveis de expressão genética em plantas de soja transgênicas. Os vetores de expressão vegetal LJK148, LJK156, LJK157, LJK158, LJ K159, LJK160 e LJK161 (cp. exemplo 3.1) foram usados para a transformação de soja estável. 5.1 GERAÇÃO DE PLANTAS DE SOJA TRANSGÊNICAS (PROTOCOLO ANEXADO DE ACORDO COM WO2005/121345; OLHOFT ETAL., 2007).

[128] A germinação de sementes de soja, propagação, A. rhizogenes e preparação de explante de meristema auxiliar, e inoculações foram realizadas como anteriormente descrito (WO2005/121345; Olhoft et al., 2007) com a exceção que as construções LJK148, LJK156, LJK157, LJK158, LJ K159, LJK160 e LJK161 (cp. exemplo 3.1) continham um gene AHAS modificado conduzido pelo promotor de ubiquitina de salsa PcUbi4-2, mediando a tolerância a herbicidas de imidazolinona para seleção. 5.2 SEQUÊNCIAS DE NEENA MEDIAM O AUMENTO VIGOROSO DE EXPRESSÃO GENÉTICA EM PLANTAS DE SOJA SOB A MANUTENÇÃO DA ESPECIFICIDADE DE TECIDO DO PROMOTOR

[129] As amostras de tecido foram coletadas das plantas transgênicas geradas de folhas, flores e sementes. As amostras de tecido foram processadas e analisadas como descrito acima (cp. exemplo 3.3) Em comparação com a construção de gene repórter LJK148 sem NEENA apenas com o promotor semente-específico p-AtPXR, as sete moléculas de NEENA testadas mediaram aumentos vigorosos na expressão genética em sementes de soja com base na atividade de Luciferase (Figura 3a). Em contrapartida, nenhuma alteração significativa na atividade de Luciferase mediada pelas moléculas de NEENA (SEQ ID NO1, NO2, NO4, a NO5, NO6 e NO7) poderia ser detectada em folhas e flores de soja (Figura 3, b e c).

EXEMPLO 6: ANÁLISE DE ATIVIDADE DE NEENA EM PLANTAS MONOCOTILEDÔNEAS

[130] Esse exemplo descreve a análise de sequências de NEENA com SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7 em plantas monocotiledôneas. 6.1 CONSTRUÇÃO DO VETOR

[131] Para analisar as sequências de NEENA com SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7 em plantas monocotiledôneas, um vetor de expressão baseado em pUC que abriga um cassete de expressão composto do promotor p-KG86 de monocotiledônea semente-específico sem NEENA de Z. mais combinado com uma sequência de codificação do gene betaGlucuronidase (GUS) seguido pelo terminador transcricional de nopalina sintase (NOS) é usado. O DNA genômico é extraído de tecido verde de A. thaliana utilizando o Kit Qiagen DNeasy Plant Mini (Qiagen, Hilden, Germany). Os fragmentos de DNA genômico contendo moléculas de NEENA são isolados por reação em cadeia da polimerase convencional (PCR). Os primers são projetados com base na sequência genômica de A. thaliana com uma grande quantidade de candidatos a NEENA. A reação compreende 7 conjuntos de primers (Tabela 11) e segue o protocolo descrito por Phusion High Fidelity DNA Polymerase (Cat No F-540L, New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) utilizando os seguintes primers: TABELA 11: SEQUÊNCIAS DE PRIMERS

[132] A amplificação durante a PCR e a purificação dos produtos de amplificação foram realizadas como detalhado acima (exemplo 1.2). Após uma digestão de restrição de DNA com endonuclease de restrição Ascl (10 U/μL), os produtos digeridos são purificados com o Kit de Extração de Gel Qiagen (Qiagen, Hilden, Germany).

[133] Os fragmentos de NEENA de PCR (veja acima) são clonados separadamente a montante da sequência de codificação de beta-Glucuronidase utilizando sítios de restrição Ascl. A reação produz um vetor binário com o promotor p-KG86, a sequência de codificação de beta-Glucuronidase c-GUS e o terminador t-nos e sete vetores que abrigam a SEQ ID NO1, NO2, NO3, NO4, NO5, NO6 e NO7, imediatamente a montante da sequência de codificação de beta-Glucuronidase (Tabela 12), para isso a combinação com a SEQ ID NO1 é determinada como exemplificativa (SEQ ID NO82). Exceto para a variação de SEQ ID NO2 a NO7, a sequência nucleotídica é idêntica em todos os vetores (Tabela 12). Os vetores resultantes estão resumidos na tabela 12, com as moléculas de promotor possuindo o prefixo p, as sequências de codificação possuindo o prefixo c, e as moléculas de terminador possuindo o prefixo t. TABELA 12: VETORES DE EXPRESSÃO VEGETAL

[134] Os vetores resultantes foram usados para analisar as moléculas de NEENA nos experimentos descritos abaixo (Exemplo 6.2). 6.2 ANÁLISE DE MOLÉCULAS DE NEENA QUE AUMENTAM A EXPRESSÃO GENÉTICA EM TECIDOS DE PLANTAS MONOCOTILEDÔNEAS

[135] Esses experimentos são realizados por bombardeamento de tecidos de plantas monocotiledôneas ou células de cultura (Exemplo 6.2.1), ou por transformação mediada por Agrobacterium (Exemplo 6.2.2). O tecido-alvo para esses experimentos pode ser tecidos vegetais (por exemplo, tecido foliar), células de plantas cultivadas (por exemplo, milho Black Mexican Sweetcorn (BMS), ou embriões vegetais para protocolos de Agrobacterium. 6.2.1 ANÁLISE TEMPORÁRIA UTILIZANDO BOMBARDEAMENTO COM MICROPROJÉTEIS

[136] As construções de plasmídeo são isoladas utilizando o kit de plasmídeo Qiagen (cat# 12143). O DNA é precipitado em 0,6 μM de partículas de ouro (Bio-Rad cat# 165 -2262) de acordo com o protocolo descrito por Sanford et al. (1993) (Optimizing the biolistic process for different biological applications. Methods in Enzymology, 217: 483-509) e acelerado em tecidos-alvo (por exemplo, folhas de milho de duas semanas de idade, células de BMS cultivadas, etc.) utilizando um dispositivo de sistema PDS-1000/He (Bio-Rad). Todas as etapas de precipitação e bombardeamento de DNA são realizadas sob condições estéreis em temperatura ambiente. As células cultivadas em suspensão de milho Black Mexican Sweetcorn (BMS) são propagadas em meio líquido de cultura celular de BMS [Murashige and Skoog (MS) sais (4,3 g/L), 3% (w/v) sucrose, mio-inositol (100 mg/L), 3 mg/L de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), hidrolisado de caseína (1 g/L), tiamina (10 mg/L) e L-prolina (1,15 g/L), pH 5,8]. A cada semana 10 mL de uma cultura de células estacionárias são transferidos para 40 mL de meio fresco e cultivados em um agitador rotativo operado em 110 rpm a 27°C em um frasco de 250 mL.

[137] 60 mg de partículas de ouro em um tubo Eppendorf siliconado são ressuspensos em 100% de etanol seguidos por centrifugação durante 30 segundos. O pélete é lavado uma vez em 100% de etanol e duas vezes em água estéril com centrifugação após cada lavagem. O pélete é finalmente ressuspenso em 1 mL de glicerol 50% de estéril. A suspensão de ouro é então dividida em alíquotas de 50 μL e armazenada a 4°C. Os seguintes reagentes são adicionados a uma alíquota: 5 μL de 1 μg/μL de DNA total, 50 μL de 2,5 M de CaCb, 20 μL de 0,1 M de espermidina, base livre. A solução de DNA é colocada sob vórtice durante 1 minuto e colocada a -80°C durante 3 minutos seguido por centrifugação durante 10 segundos. O sobrenadante é removido. O pélete e cuidadosamente ressuspenso em 1 mL. 100% etanol ao agitar o tubo seguido por centrifugação durante 10 segundos. O sobrenadante é removido e o pélete é cuidadosamente ressuspenso em 50 μL de 100% de etanol e colocado a -80°C até ser usado (30 min a 4 h antes do bombardeamento). Se os agregados de ouro forem visíveis na solução, os tubos são sonicados durante um segundo em um sonicador em banho de água pouco antes do uso.

[138] Para o bombardeamento, folhas de milho de duas semanas de idade são cortadas em pedaços de aproximadamente 1 cm de comprimento e colocadas com o lado adaxial para cima no meio de indução osmótico M-N6-702 [N6 sais (3,96 g/L), 3% (w/v) de sucrose, 1,5 mg/L de ácido 2,4 -diclorofenoxiacético (2,4-D), hidrolisado de caseína (100 mg/L), e L-prolina (2,9 g/L), solução de estoque de vitamina MS (1 mL/L), 0,2 M de manitol, 0,2 M de sorbitol, pH 5,8]. Os pedaços são incubados durante 1 a 2 horas.

[139] No caso de células cultivadas de BMS, células de suspensão de uma semana de idade são peletizadas em 1000 g em uma centrífuga Beckman/Coulter Avanti J25 e o sobrenadante é descartado. As células são colocadas em filtros Whatman redondos isentos de cinza No 42 como uma camada de 1/16 de polegada de espessura utilizando uma a espátula. Os papéis filtro que retêm os materiais vegetais são colocados no meio de indução osmótico a 27°C no escuro durante 1 a 2 horas antes do bombardeamento. Pouco antes do bombardeamento os filtros são removidos do meio e colocados em uma pilha de papel filtro estéril para permitir que superfície do calo seque parcialmente.

[140] Cada placa é lançada com 6 μL de solução de ouro de DNA duas vezes, em 12.410,6 kPa (1.800 psi) para os materiais foliares e em 7.584,2 kPa (1.100 psi) para as células cultivadas de BMS. Para manter a posição de materiais vegetais, uma tela de malha de arame esterilizada é colocada sobre a amostra. Após o bombardeamento, os filtros que retêm as amostras são transferidos para o meio M-N6-702 que é desprovido de manitol e sorbitol e incubados durante 2 dias no escuro a 27°C antes das análises temporárias.

[141] A transformação temporária através de bombardeamento com microprojéteis de outras plantas monocotiledôneas é realizada utilizando, por exemplo, uma técnica descrita em Wang et al., 1988 (Transient expression. of foreign genes in rice, wheat and soybean cells following particle bombardment. Plant Molecular Biology, 11 (4), 433-439), Christou, 1997 (Rice transformation: bombardment. Plant MoI Biol. 35 (1-2)).

[142] Os níveis de expressão dos genes expressos nas construções descritas acima (exemplo 6.1) são determinados por coloração GUS, quantificação de luminescência /fluorescência, RT-PCR, abundância proteica (detecção por anticorpos específicos) ou produtos metabólicos gerados através dos cassetes de expressão descritos acima utilizando os protocolos na técnica. A coloração GUS é realizada ao incubar os materiais vegetais em solução GUS [100 mM de NaHPO4, 10 mM de EDTA, 0,05% de Triton X100, 0,025% de solução X-Gluc (ácido 5-bromo-4-cloro -3-indolil-beta-D-glucurônico dissolvido em DMSO), 10% de metanol, pH 7,0] a 37°C durante 16 a 24 horas. Os tecidos vegetais são infiltrados a vácuo 2 vezes durante 15 minutos para ajudar a obter uma coloração uniforme. As análises de atividades de luciferase são realizadas como descrito acima (veja os exemplos 2 e 3.3).

[143] Em comparação com as construções de gene repórter sem NEENA apenas com o promotor semente-específico p-ZmKG86, todas as moléculas de NEENA mediam o aumento vigoroso na expressão genética nessas análises. 6.2.2 TRANSFORMAÇÃO E REGENERAÇÃO DE PLANTAS DE CULTURA MONOCOTILEDÔNEAS

[144] A transformação vegetal mediada por Agrobacterium utilizando a transformação padrão e técnicas de regeneração também pode ser realizada para os propósitos de transformar plantas de cultura (Gelvin and Schilperoort, 1995, Plant Molecular Biology Manual, 2nd Edition, Dordrecht: Kluwer Academic Publ. ISBN 0-7923-2731 -4; Glick and Thompson (1993) Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, ISBN 0-8493-5164-2). A transformação de milho ou outras plantas monocotiledôneas pode ser realizada utilizando, por exemplo, uma técnica descrita em US 5.591.616. A transformação de plantas utilizando o bombardeamento de partículas, absorção de DNA mediada por polietileno glicol ou através da técnica de fibra de carbonato de silício é descrita, por exemplo, por Freeling & Walbot (1993) "The maize handbook" ISBN 3-540-97826-7, Springer Verlag New York.

[145] Os níveis de expressão dos genes expressos são determinados por coloração GUS, quantificação de luminescência ou fluorescência, RT-PCR ou abundância proteica (detecção por anticorpos específicos) utilizando os protocolos na técnica. A coloração GUS é realizada ao incubar os materiais vegetais em solução GUS [100 mM de NaHPO4, 10 mM de EDTA, 0,05% de Triton X100, 0,025% de solução X-Gluc (ácido 5- bromo-4-cloro -3-indolil-beta-D-glucurônico dissolvido em DMSO), 10% de metanol, pH 7,0] a 37°C durante 16 a 24 horas. Os tecidos vegetais são infiltrados a vácuo 2 vezes durante 15 minutos para ajudar a obter uma coloração uniforme. As análises de atividades de luciferase são realizadas como descrito acima (exemplos 2 e 3.3).

[146] Em comparação com as construções de gene repórter sem NEENA apenas com o promotor p-ZmKG86 semente-específico, as moléculas de NEENA mediam o aumento vigoroso e tecido-específico na expressão genética em plantas.

EXEMPLO 7: ANÁLISES QUANTITATIVAS DE ATIVIDADE DE NEENA EM PLANTAS MONOCOTILEDÔNEAS

[147] Esse exemplo descreve a análise de sequências de NEENA com a SEQ ID NO 1 e 2 em plantas de milho. 7.1 CONSTRUÇÃO DE VETOR

[148] Para analisar as sequências de NEENA com SEQ ID NO 1 e 2 em plantas monocotiledôneas de maneira quantitativa, um vetor de expressão baseado em pUC que abriga um cassete de expressão composto do promotor semente-específico p-KG86 de monocotiledônea sem NEENA de Z. mais foi combinado com uma sequência de codificação do gene da luciferase de vaga- lume (LUC) (Promega, Madison, Wl, USA) seguido pelo terminador transcricional de nopalina sintase (NOS). O DNA genômico foi extraído de tecido verde de A. thaliana utilizando o Qiagen DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Os fragmentos de DNA genômico contendo as moléculas de NEENA foram isolados por reação em cadeia da polimerase convencional (PCR). Os primers são projetados com base na sequência genômica de A. thaliana com uma grande quantidade de candidatos a NEENA. A reação compreende 2 conjuntos de primers (Tabela 11A) e seguiu o protocolo descrirto por Phusion High Fidelity DNA Polymerase (Cat No F-540L, New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) utilizando os seguintes primers: TABELA 11A: SEQUÊNCIAS DE PRIMERS

[149] A amplificação durante a PCR e a purificação dos produtos de amplificação foram realizadas como detalhado acima (exemplo 1.2). Após uma digestão de restrição de DNA com endonucleases de restrição MIuI (10 U/μL) e Ascl (10 U/μL), os produtos digeridos são purificados com o Kit de Extração de Gel Qiagen (Qiagen, Hilden, Germany).

[150] Os fragmentos de NEENA de PCR (veja acima) são clonados separadamente a montante da sequência de codificação de luciferase de vaga-lume utilizando sítios de restrição Ascl. A reação produz um vetor binário com o promotor p-KG86, a sequência de codificação de luciferase de vaga-lume c-LUC e o terminador t-nos e cinco vetores que abrigam a SEQ ID NO1 e NO2, imediatamente a montante da sequência de codificação de luciferase de vaga-lume (Tabela 12A), para isso a combinação com a SEQ ID NO1 é determinada como exemplificativa (SEQ ID NO 87). Exceto para a variação de SEQ ID NO2, a sequência nucleotídica é idêntica em todos os vetores (Tabela 12A). Os vetores resultantes estão resumidos na tabela 12A, com as moléculas de promotor possuindo o prefixo p, as sequências de codificação possuindo o prefixo c, e as moléculas de terminador possuindo o prefixo t. TABELA 12A: VETORES DE EXPRESSÃO VEGETAL

[151] Os vetores resultantes foram usados para analisar as moléculas de NEENA nos experimentos descritos abaixo (Exemplo 7.2). 7.2 GERAÇÃO DE PLANTAS DE MILHO TRANSGÊNICAS

[152] A germinação de milho, propagação, preparação de A. tumefaciens e inoculações foram realizadas como anteriormente descrito (WO2006136596, US20090249514) com a exceção que as construções RTP5679, RTP5683 e RTP5684 (cp. exemplo 7.1) continham um gene AHAS modificado conduzido pelo promotor de ubiquitina de milho p-Ubi, mediando a tolerância a herbicidas de imidazolinona para seleção. 7.3 SEQUÊNCIAS DE NEENA MEDIAM O AUMENTO VIGOROSO E TECIDO-ESPECÍFICO DE EXPRESSÃO GENÉTICA EM PLANTAS DE MILHO

[153] As amostras de tecido foram coletadas de plantas transgênicas geradas de folhas e grãos.

[154] As amostras de tecido foram processadas e analisadas como descrito acima (cp. exemplo 3.3).

[155] Em comparação com a construção de gene repórter sem NEENA apenas com o promotor p-KG86 semente-específico, as moléculas de NEENA testadas (SEQ ID NO1 e NO2) mediam aumentos vigorosos na expressão genética em grãos (Figura 4a). Em contrapartida, nenhuma alteração significativa em atividade de Luciferase mediada por moléculas de NEENA (SEQ ID NO1 e NO2) poderia ser detectada em folhas de milho (Figura 4b).

EXEMPLO 8: ANÁLISE QUANTITATIVA DE ATIVIDADE DE SEQUÊNCIAS DE NEENA COM SEQ ID NO 1 E 2 EM PLANTAS DE ARROZ 8.1 CONSTRUÇÃO DE VETOR

[156] Para analisar as sequências de NEENA com a SEQ ID NO 1 e 2 em plantas de arroz de maneira quantitativa, os vetores pENTR/B LJK1, LJK19 e LJK20 (comparar com o exemplo 1.3) foram combinados com um vetor de destino que abriga o promotor PRO0090 de arroz semente-preferido a montante do sítio de recombinação utilizando a recombinação sítio-específica (reação LR) de acordo com o manual do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) Gateway. As reações produziram um vetor binário com o promotor PRO0090, a sequência de codificação de luciferase de vaga-lume c-LUC e o terminador t-nos bem como 2 vetores que abrigam a SEQ ID NO1 e NO2 imediatamente a montante da sequência de codificação de luciferase de vaga- lume (Tabela 13). Exceto para a variação de SEQ ID NO 2, a sequência nucleotídica é idêntica nos vetores (tabela 13). Os vetores resultantes estão resumidos na tabela 13, com as moléculas de promotor possuindo o prefixo p, as sequências de codificação possuindo o prefixo c, e as moléculas de terminador possuindo o prefixo t. TABELA 13: VETORES DE EXPRESSÃO VEGETAL

[157] Os vetores resultantes foram usados para analisar as moléculas de NEENA nos experimentos descritos abaixo (Exemplo 8.2). 8.2 GERAÇÃO DE PLANTAS DE ARROZ TRANSGÊNICAS

[158] O Agrobacterium contendo o respectivo vetor de expressão foi usado para transformar as plantas de Oryza sativa. As sementes secas maduras do cultivar de arroz japonica Nipponbare foram descascadas. A esterilização foi realizada por incubação durante um minuto em 70% de etanol, seguida por 30 minutos em 0,2% de HgCb, seguida por 6 lavagens de 15 minutos com água destilada estéril. As sementes estéreis foram então germinadas em um meio contendo 2,4-D (meio de indução de calo). Após a incubação no escuro durante quatro semanas, os calos embriogênicos derivados de escutelo foram excisados e propagados no mesmo meio. Após duas semanas, os calos foram multiplicados ou propagados por subcultura no mesmo meio durante mais 2 semanas. Os pedaços de calos embriogênicos foram subcultivados em meio fresco 3 dias antes do cocultivo (para estimular a atividade de divisão celular).

[159] A cepa de Agrobacterium LBA4404 contendo o respectivo vetor de expressão foi usada para o cocultivo. Agrobacterium foi inoculado em meio AB com os antibióticos adequados e cultivada durante 3 dias a 28°C. As bactérias foram então coletadas e suspensas em meio de cocultivo líquido a uma densidade (OD600) de cerca de 1. A suspensão foi então transferida para uma placa de Petri e os calos imersos na suspensão durante 15 minutos. Os tecidos do calo foram então secos com um papel filtro e transformados em meio de cocultivo solidificado e incubados durante 3 dias no escuro a 25°C. Os calos cocultivados se desenvolveram em meio contendo 2,4-D durante 4 semanas no escuro a 28°C na presença de um agente de seleção. Durante esse período, ilhas de calos resistentes de crescimento rápido foram desenvolvidas. Após a transferência desse material para um meio de regeneração e incubação na luz, o potencial embriogênico foi liberado e os brotos se desenvolveram nas próximas quatro a cinco semanas. Os brotos foram excisados dos calos e incubados durante 2 a 3 semanas em um meio contendo auxina a partir do qual esses foram transferidos para o solo. Os brotos endurecidos foram se desenvolveram sob alta umidade e alguns dias em uma estufa.

[160] Aproximadamente 35 transformantes de arroz TO independentes foram gerados para uma construção. Os transformantes primários foram transferidos de uma câmara de cultura de tecido para uma estufa. Após uma análise PCR quantitativa para verificar o número de cópias do inserto de T-DNA, apenas plantas transgênicas de cópia única que exibem tolerância ao agente de seleção foram mantidas para a colheita de semente T1. As sementes foram então colhidas três a cinco meses após o transplante. O método produziu transformantes de local único em uma taxa de mais de 50 % (Aldemita and Hodges1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994). 8.3 SEQUÊNCIAS DE NEENA MEDIAM O AUMENTO VIGOROSO E TECIDO-ESPECÍFICO DE EXPRESSÃO GENÉTICA EM PLANTAS DE ARROZ

[161] As amostras de tecido foram coletadas das plantas transgênicas geradas de folhas e sementes. As amostras de tecido foram processadas e analisadas como descrito acima (cp. exemplo 3.3).

[162] Em comparação com a construção de gene repórter sem NEENA apenas com o promotor p-PRO0090 semente-específico, as moléculas de NEENA testadas (SEQ ID NO1 e NO2) mediaram aumentos vigorosos na expressão genética em sementes (Figura 5a). em contrapartida, nenhuma alteração significativa em atividade de Luciferase mediada por moléculas de NEENA (SEQ ID NO1 e NO2) poderia ser detectado em folhas de arroz (Figura 5b).

LEGENDAS DAS FIGURAS:

[163] Figura 1: Análise de expressão de gene repórter de Luciferase em cotilédones de plantas de A. thaliana estavelmente transformados de construção sem NEENA (LJK134) e contendo NEENA (LJK71 - LJK90) representando as moléculas putativas de NEENA que são derivadas de genes semente-preferidos expressos sob o controle do promotor p-AtPXR. Os valores de expressão são mostrados em relação à construção de controle sem NEENA (LJK134 = 1).

[164] Figura 2: Gráficos de barras da atividade de gene repórter da luciferase mostrada como unidades de luz relativa (RLU) de linhagens de planta de colza de semente oleaginosa transgênicas independentes que abrigam as construções de gene repórter sem NEENA (LJK148) ou contendo NEENA que representam as moléculas de NEENA de genes semente-preferidos expressos (LJK156 - LJK162) sob o controle do promotor p-AtPXR e após a normalização contra o teor de proteína de cada amostra. Os valores de expressão de plantas que abrigam as construções contendo NEENA são mostrados em relação às plantas que expressam a construção de controle sem NEENA (LJK148) (valores médios, tecidos de 20 plantas transgênicas analisadas independentes). A) semente, B) tecido foliar, C) flores

[165] Figura 3: Gráficos de barras da atividade de gene repórter da luciferase mostrada como unidades de luz relativa (RLU) de linhagens de planta de soja transgênicas independentes que abrigam as construções de gene repórter sem NEENA (LJK148) ou contendo NEENA representando as moléculas de NEENA de genes semente-preferidos expressos (LJK156 - LJK161) sob o controle do promotor p-AtPXR e após a normalização contra o teor de proteína de cada amostra. Os valores de expressão de plantas que abrigam as construções contendo NEENA são mostrados em relação às plantas que expressam a construção de controle sem NEENA (LJK148) (valores médios, tecidos de 10 plantas transgênicas analisadas independentes). A) semente, B) tecido foliar, C) flores

[166] Figura 4: Gráfico de barras da atividade de gene repórter da luciferase mostrada como unidades de luz relativa (RLU) de linhagens de planta de milho transgênicas independentes que abrigam as construções de gene repórter sem NEENA (RTP5679) ou contendo NEENA representando as moléculas de NEENA de genes semente-preferidos expressos (RTP5683 - RTP5684) sob o controle do promotor p-KG86 e após a normalização contra o teor proteico de cada amostra (valores calculados, tecidos de 15 plantas transgênicas independentes analisadas). A) sementes, B) tecido foliar.

Claims

1. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM PROMOTOR VEGETAL, semente-específico e/ou semente-preferencial, caracterizado por compreender ligar funcionalmente a um promotor uma molécula de ácido nucleico que aumenta a expressão de ácido nucleico (NEENA) heteróloga ao dito promotor que compreende: a molécula de ácido nucleico que possui uma sequência como definida na SEQ ID NO: 5.

2. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA PLANTA, ou parte da mesma, comparado com uma respectiva planta de controle ou parte da mesma, com expressão semente-específica e/ou semente-preferencial aumentada de uma ou mais moléculas de ácido nucleico, caracterizado por compreender as etapas de: (a) introduzir na planta ou parte da mesma um NEENA que compreende uma molécula de ácido nucleico, conforme definida na reivindicação 1, e (b) ligar funcionalmente o dito um NEENA a um promotor semente- específico e/ou semente-preferencial e a uma molécula de ácido nucleico que está sob o controle do dito promotor semente-específico e/ou semente- preferencial, em que o NEENA é heterólogo à dita molécula de ácido nucleico, e em que o dito NEENA está funcionalmente ligado a um promotor semente-específico e/ou semente-preferencial de 2.500 pb ou menos distante do sítio de início de transcrição da dita molécula de ácido nucleico heteróloga.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por compreender as etapas de: (a) introduzir um NEENA que compreende uma molécula de ácido nucleico, conforme definida na reivindicação 1, em uma planta ou parte da mesma, e (b) integrar o dito NEENA no genoma da dita planta ou parte da mesma em que o dito NEENA é funcionalmente ligado a um ácido nucleico semente-específico e/ou semente-preferencial expresso endógeno heterólogo ao dito NEENA e, opcionalmente, (c) regenerar uma planta ou parte da mesma que compreende o dito NEENA da dita célula transformada.

4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 3, caracterizado por compreender as etapas de: (a) fornecer uma construção de expressão que compreende um NEENA que compreende uma molécula de ácido nucleico, conforme definida na reivindicação 1, funcionalmente ligada a um promotor semente-específico e/ou semente-preferencial e a uma ou mais moléculas de ácido nucleico, sendo que a última é heteróloga ao dito NEENA e que está sob o controle do dito promotor semente-específico e/ou semente-preferencial, e (b) integrar a dita construção de expressão que compreende o dito NEENA no genoma da dita planta ou parte da mesma e, opcionalmente, (c) regenerar uma planta ou parte da mesma que compreende a dita uma ou mais construções de expressão da dita planta transformada ou parte da mesma.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo dito NEENA ser funcionalmente ligado a um promotor semente-específico e/ou semente-preferencial a montante do sítio de início de tradução da molécula de ácido nucleico cuja expressão está sob o controle do dito promotor semente-específico e/ou semente-preferencial.

6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo dito NEENA ser funcionalmente ligado a um promotor semente-específico e/ou semente-preferencial dentro da 5'UTR da molécula de ácido nucleico cuja expressão está sob o controle do dito promotor semente- específico e/ou semente-preferencial.

7. CONSTRUÇÃO, de expressão recombinante, caracterizada por compreender um NEENA que compreende a molécula de ácido nucleico que possui uma sequência como definida na SEQ ID NO: 5, em que o dito NEENA está funcionalmente ligado a um ou mais promotores semente-específicos e/ou semente-preferenciais e uma ou mais moléculas de ácido nucleico expressas, em que tanto o promotor como a molécula de ácido nucleico expressa são heterólogas ao dito NEENA, em que o dito NEENA está funcionalmente ligado a um promotor semente-específico e/ou semente-preferencial de 2.500 pb ou menos distante do sítio de início de transcrição da dita molécula de ácido nucleico heteróloga, em que a quantidade de RNA do respectivo ácido nucleico ou a taxa de síntese de RNA ou a estabilidade do RNA em uma planta é aumentada 50% ou mais quando comparada a uma planta controle de mesma idade cultivada nas mesmas condições que compreende o mesmo promotor semente específico e/ou semente-preferencial, o último não estando funcionalmente ligado a um NEENA da invenção.

8. VETOR, de expressão recombinante, caracterizado por compreender uma ou mais construções de expressão recombinantes, conforme definidas na reivindicação 7.

9. MICRORGANISMO TRANSGÊNICO, caracterizado por compreender um vetor de expressão recombinante, conforme definido na reivindicação 8, ou uma construção de expressão recombinante, conforme definida na reivindicação 7.

10. MICRORGANISMO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por ser selecionado ou derivado a partir do grupo que consiste em bactérias, fungos ou leveduras.

11. USO DO NEENA selecionado a partir do grupo de: (1) a molécula de ácido nucleico que possui uma sequência como definida na SEQ ID NO: 5, caracterizado por ser para aumentar a expressão em plantas ou partes das mesmas, em que a quantidade de RNA do respectivo ácido nucleico ou a taxa de síntese de RNA ou a estabilidade do RNA em uma planta é aumentada 50% ou mais quando comparada a uma planta controle de mesma idade cultivada nas mesmas condições que compreende o mesmo promotor semente específico e/ou semente-preferencial, o último não estando funcionalmente ligado a um NEENA da invenção.

12. USO DA CONSTRUÇÃO RECOMBINANTE OU VETOR RECOMBINANTE, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 7 a 8, caracterizado por ser para aumentar a expressão em plantas ou partes das mesmas, em que a quantidade de RNA do respectivo ácido nucleico ou a taxa de síntese de RNA ou a estabilidade do RNA em uma planta é aumentada 50% ou mais quando comparada a uma planta controle de mesma idade cultivada nas mesmas condições que compreende o mesmo promotor semente específico e/ou semente-preferencial, o último não estando funcionalmente ligado a um NEENA da invenção.