BRPI0606791A2 - métodos de reverter ou prevenir a resistência de uma célula a um agonista do receptor da morte, de triar uma célula quanto a um biomarcador da resistência a um agonista do receptor da morte, de monitorar a resistência a um agonista do receptor da morte em um indivìduo, de induzir seletivamente a apoptose em uma célula alvo expressando um receptor da morte, de tratar de um indivìduo com cáncer, de tratar de um indivìduo com uma doença inflamatória ou autoimune, de bloquear a ligação da proteìna contendo card a um receptor da morte em uma célula, de bloquear a associação de um iap com o receptor da morte e de triar um modulador de uma proteìna contendo card, composição, ácido nucleico isolado, vetor, célula, e, polipeptìdeo isolado - Google Patents

métodos de reverter ou prevenir a resistência de uma célula a um agonista do receptor da morte, de triar uma célula quanto a um biomarcador da resistência a um agonista do receptor da morte, de monitorar a resistência a um agonista do receptor da morte em um indivìduo, de induzir seletivamente a apoptose em uma célula alvo expressando um receptor da morte, de tratar de um indivìduo com cáncer, de tratar de um indivìduo com uma doença inflamatória ou autoimune, de bloquear a ligação da proteìna contendo card a um receptor da morte em uma célula, de bloquear a associação de um iap com o receptor da morte e de triar um modulador de uma proteìna contendo card, composição, ácido nucleico isolado, vetor, célula, e, polipeptìdeo isolado Download PDF

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Abstract

MéTODOS DE REVERTER OU PREVENIR A RESISTêNCIA DE UMA CéLULA A UM AGONISTA DO RECEPTOR DA MORTE, DE TRIAR UMA CéLULA QUANTO A UM BIOMARCADOR DA RESISTêNCIA A UM AGONISTA DO RECEPTOR DA MORTE, DE MONITORAR A RESISTêNCIA A UM AGONISTA DO RECEPTOR DA MORTE EM UM INDIVìDUO, DE INDUZIR SELETIVAMENTE A APOPTOSE EM UMA CéLULA ALVO EXPRESSANDO UM RECEPTOR DA MORTE, DE TRATAR DE UM INDIVìDUO COM CáNCER, DE TRATAR DE UM INDIVìDUO COM UMA DOENçA INFLAMATóRIA OU AUTOIMUNE, DE BLOQUEAR A LIGAçãO DA PROTEìNA CONTENDO CARD A UM RECEPTOR DA MORTE EM UMA CéLULA, DE BLOQUEAR A ASSOCIAçãO DE UM IAP COM O RECEPTOR DA MORTE E DE TRIAR UM MODULADOR DE UMA PROTEINA CONTENDO CARD, COMPOSIçãO, áCIDO NUCLEICO ISOLADO, VETOR, CéLULA, E, POLIPEPTìDEO ISOLADO. é fornecido neste relatório um método de reverter ou prevenir a resistência de células alvo a um agonista dos receptores da morte. São igualmente fornecidos métodos de triagem quanto à resistência a biomarcadores e de monitorar a resistência dos agonistas dos receptores da morte. Igualmente fornecidos são os métodos de seletivamente induzir a apoptose em uma célula alvo, tratando-se de um individuo com câncer, doenças autoimunes ou inflamatórias, compreendendo administrar as composições fornecidas neste relatório. São ainda fornecidas composições compreendendo agentes que modulam as proteínas contendo CARD.

Description

"MÉTODOS DE REVERTER OU PREVENIR A RESISTÊNCIA DE UMA CÉLULA A UM AGONISTA DO RECEPTOR DA MORTE, DE TRIAR UMA CÉLULA QUANTO A UM BIOMARCADOR DA RESISTÊNCIA A UM AGONISTA DO RECEPTOR DA MORTE, DE MONITORAR A 5 RESISTÊNCIA A UM AGONISTA DO RECEPTOR DA MORTE EM UM INDIVÍDUO, DE INDUZIR SELETIVAMENTE A APOPTOSE EM UMA CÉLULA ALVO EXPRESSANDO UM RECEPTOR DA MORTE, DE TRATAR DE UM INDIVÍDUO COM CÂNCER, DE TRATAR DE UM INDIVÍDUO COM UMA DOENÇA INFLAMATÓRIA OU AUTOIMUNE, DE BLOQUEAR A LIGAÇÃO DA PROTEÍNA CONTENDO CARD A UM RECEPTOR DA MORTE EM UMA CÉLULA, DE BLOQUEAR A ASSOCIAÇÃO DE UM IAP COM O RECEPTOR DA MORTE E DE TRIAR UM MODULADOR DE UMA PROTEÍNA CONTENDO CARD, COMPOSIÇÃO, ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, VETOR, CÉLULA, E, POLIPEPTÍDEO ISOLADO"
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. n° 60/649437, depositado em 2 de fevereiro de 2005, o qual fica por este meio aqui incorporado como referência em sua totalidade. DECLARAÇÃO RELATIVAMENTE À PESQUISA FEDERALMENTE
PATROCINADA Esta invenção foi feita com apoio governamental sob as Subvenções n- P50CA83591, P50CA89019 e U19AI056542 concedidas pelos Institutos Nacionais de Saúde. O governo tem certos direitos na invenção.
CAMPO DA INVENÇÃO
A invenção apresentada diz respeito em geral a agentes que inibem a resistência aos agonistas indutores da apoptose dos receptores da morte e ao uso de tais agentes e agonistas e biomarcadores no tratamento do
PI0606791-3câncer e de doenças autoimunes ou inflamatórias.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO O ligando indutor da apoptose relacionada ao TNF (TRAIL), um membro da superfamília do TNF, tem uma forte atividade indutora da apoptose contra as células cancerosas (Wiley, S. R. et al. 1995. Immunity 3: 673-682). Diferente de outros ligandos indutores da morte da superfamília do TNF, tais como o os ligandos TNF-a e Fas, o TRAIL tem sido de particular interesse no desenvolvimento da terapêutica do câncer, já que ele de preferência induz a apoptose das células tumorais, tendo pouco ou nenhum
efeito sobre as células normais (Walczak, H. et al. 1999. Nat Med 5: 157-163). Pelo menos cinco receptores para TRAIL foram identificados, dois dos quais, DR4 (TRAIL-R1) e DR5 (TRAIL-R2) são capazes de transduzir o sinal da apoptose (Walczak, H. et al. 1997. Embo J 16: 5386-5397; Pan, G. et al. 1997. Science 276: 111-113; Chaudhary, P. M. et al. 1997. Immunity 7: 821-830), enquanto os outros três (TRAIL-R3, R4 e OPG) servem como receptores chamariz para bloquear a apoptose mediada pelo TRAIL (Pan, G. et al. 1997. Science 277: 815-818; Marsters, S. A. et al. 1997. Curr Biol 7: 1003-1006; Emery, J. G. et al. 1998. JBiol Chem 273: 14363-14367). Como o Fas e o TNFR1, os segmentos intracelulares de ambos DR4 e DR5 contêm
um domínio de morte e transduzem um sinal da apoptose através de uma via dependente de FADD e caspase 8 (Walczak, H. et al. 1997. Embo J16: 5386-5397; Chaudhary, P. M. et al. 1997. Immunity 7: 821-830; Kuang, A. A. et al. 2000. J Biol Chem 275: 25065-25068). A administração da forma solúvel recombinante do TRAIL em animais experimentais, incluindo camundongos e primatas, induz significativa regressão tumoral sem toxicidade sistêmica
-------- (Walczak, H. et al. 1999. Nat Med 5: 157-163). Entretanto, como foi
observado que o TRAIL elicia efeitos colaterais tais como a toxicidade hepática nos seres humanos, outros agonistas dos receptores de TRAIL foram desenvolvidos.O alvejamento seletivo do DR5 com um único anticorpo anti-DR5 monoclonal agonístico, o TRA-8, e suas versões humanizadas ou humanas, podem eficaz e seletivamente induzir a apoptose das células tumorais. Todas as células cancerosas sensíveis ao TRAIL foram observadas 5 serem suscetíveis à apoptose mediada por TRA-8. Os agentes quimioterápicos podem sinergisticamente intensificar a apoptose mediada pelo TRAIL das células tumorais tanto in vitro quanto in vivo. Por exemplo, a terapia de combinação do TRA-8 com Adriamicina resultou em uma taxa de regressão tumoral completa significativamente mais elevada do que qualquer agente isolado (Buchsbaum, D. J. et al. 2003. Clin Câncer Res 9: 3731-3741). Estes resultados sugerem que agentes quimioterápicos podem regular a transdução de sinal do DR5 ou o limiar de sinalização requerido para induzir a apoptose. O TRA-8 foi selecionado como um candidato para o desenvolvimento como uma terapia do câncer com base nas suas eficácia e segurança. Estudos pré- clínicos indicam que TRA-8 tem uma eficácia anticâncer muito intensa em modelos de xenoenxertos de câncer humano, particularmente em combinação com a quimioterapia (Buchsbaum, D. J. et al. 2003. Clin Câncer Res 9: 3731-3741). Existe outra indicação de que os macacos toleram bem a administração sistêmica do TRA-8. A ligação do TRA-8 ao DR5 dos macacos é semelhante àquela do DR5 humano, e os macacos toleraram doses tão elevadas quanto a dose de 48 mg/kg.
A expressão de um receptor da morte por uma célula alvo, no entanto, não é necessariamente suficiente para tornar a célula suscetível à indução da apoptose por um ligando quanto ao receptor. Como um exemplo, embora a maioria das células cancerosas expressem altos níveis de DR5, elas
não são necessariamente suscetíveis à apoptose induzida por TRA-8, a qual é----------
específica para o DR5 e não reage com os receptores chamarizes. Além disso, as células alvo tais como as células cancerosas podem apresentar resistência a TRA-8 ou outros agentes que induzem a apoptose através dos receptores damorte (por exemplo, DR4 ou DR5). Necessário na técnica é um biomarcador para predizer a resistência e um meio de reduzir a resistência das células alvo aos agonistas dos receptores da morte, tais como TRA-8.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO 5 Em conformidade com a(s) fmalidade(s) desta invenção, como
contido e amplamente descrito neste relatório, esta invenção, em um aspecto, diz respeito a um método de reverter ou prevenir a resistência de uma célula alvo a um agonista do receptor da morte, compreendendo o contato da célula alvo com um modulador de uma ou mais atividades de uma proteína contendo CARD, em que a modulação reverte ou previne a resistência ao agonista.
É aqui fornecido um método de triagem de uma célula para um biomarcador da resistência a um agonista do receptor da morte, compreendendo ensaiar a célula quanto a DDX3total, ou um seu homólogo, em que altos níveis significam resistência ao agonista.É aqui fornecido um método de triagem de uma célula para um
biomarcador da resistência a um agonista do receptor da morte, compreendendo ensaiar a associação do receptor da morte com uma proteína contendo CARD,em que altos níveis de associação significam resistência ao agonista.É aqui fornecido um método de triagem de uma célula para um
biomarcador da resistência a um agonista do receptor da morte, compreendendo: proceder ao contato da célula com o agonista do receptor da morte, b) monitorar a associação fracionária do receptor da morte com uma proteína contendo CARD, em que a associação significa resistência ao agonista.
----------------- É ainda fornecido um método de triagem de uma célula para
um biomarcador da resistência a um agonista do receptor da morte, compreendendo monitorar a associação de uma caspase ou modulador de caspases (por exemplo, cIAPl, cIAP2, XIAP, survivina) com a proteínaI
contendo CARD e comparando-se o nível de associação com uma amostra de células de controle resistentes e não resistentes conhecidas, em que a associação dos IAPs com a proteína contendo CARD em níveis similares àqueles das células resistentes significa resistência ao agonista. Opcionalmente, a célula a ser ensaiada é colocada em pré-contato com um agonista do receptor da morte (por exemplo, anticorpo agonístico).
E aqui fornecido um método de monitorar a resistência a um agonista do receptor da morte em um indivíduo, compreendendo (a) adquirir uma amostra biológica do indivíduo e (b) detectar a associação de uma proteína contendo CARD com um receptor da morte na amostra, a associação indicando resistência.
É ainda fornecido um método de monitorar a resistência a um agonista do receptor da morte em um indivíduo, compreendendo (a) adquirir uma amostra biológica do indivíduo e (b) detectar a associação de uma caspase ou modulador da caspase com uma proteína contendo CARD na amostra, a associação indicando resistência.
Igualmente é fornecido um método de induzir seletivamente a apoptose em uma célula alvo expressando um receptor da morte, compreendendo as etapas de (a) colocar em contato a célula alvo com uma quantidade terapêutica de um agonista do receptor da morte, que especificamente se ligue ao receptor da morte, e (b) administrar à célula alvo uma quantidade terapêutica de um modulador de uma ou mais atividades de uma proteína contendo CARD.
É fornecido um método de tratar de um indivíduo com câncer, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapêutica de (a)
um agonista do~ receptor da morte e (b) um modulador de uma ou mais-------
atividades de uma proteína contendo CARD, em que o modulador reduz a resistência ao agonista do receptor da morte.
Igualmente fornecido é um método de tratar de um indivíduocom uma doença inflamatória ou autoimune, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapêutica de (a) um agonista do receptor da morte e (b) um agente que module uma ou mais atividades de uma proteína contendo CARD, em que o modulador reduza a resistência ao agonista do receptor da morte.
É fornecida aqui uma composição compreendendo (a) um agonista do receptor da morte e (b) um agente que modula uma ou mais atividades de uma proteína contendo CARD, em que o modulador reduz a resistência ao agonista do receptor da morte. É ainda fornecido um ácido nucleico isolado compreendendo
um shRNA, em que o shRNA inibe a expressão de uma proteína contendo CARD.
Igualmente fornecido é um polipeptídeo isolado codificando a proteína contendo CARD ligando a região de um receptor da morte, em que o polipeptídeo compreende menos do que 25 resíduos de aminoácidos.
É ainda fornecido um polipeptídeo isolado compreendendo o receptor da morte ligando o domínio de uma proteína contendo CARD.
Vantagens adicionais do método e das composições descritas serão apresentadas em parte na descrição que segue, e em parte serão 20 entendidas do relatório descritivo, ou podem ser obtidas pela prática do método e das composições apresentadas. As vantagens do método e das composições apresentadas serão entendidas e alcançadas por meio dos elementos e combinações particularmente indicadas nas reivindicações anexas. Deve ficar entendido que tanto a descrição geral acima quanto a seguinte descrição detalhada são exemplos e explanações apenas, e não são
------- restritivas da invenção, como reivindicado. ------ — —
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Os desenhos anexos, que são incorporados e constituem uma parte deste relatório descritivo, ilustram várias modalidades do método ecomposições apresentadas e, juntos com o relatório descritivo, servem para explanar os princípios do método e composições apresentadas.
A Figura 1 apresenta a indução da resistência das células tumorais à apoptose mediada por TRA-8. O painel (A) mostra a análise de citometria de fluxo da expressão da superfície celular de TRAIL-R1 e TRAIL-R2. A linhagem celular do câncer de mama humano, MDA-231, e as linhagens celulares do câncer ovariano humano, UL-3C, foram manchadas com anti-TRAIL-Rl conjugado a CyChrome (2E12) e anti-TRAIL-R2conjugado a PE (2B4), e analisadas por citômetro defluxo FACScan. O painel (B) mostra a suscetibilidade das células MDA-231 e UL-3C à apoptose mediada por TRA-8, 2E12 ou TRAIL. As células foram cultivadas em placa de 96 reservatórios com 1.000 células por reservatório em triplicata, e incubadas com as concentrações indicadas de cada agente indutor da apoptose. Quanto à apoptose induzida por 2E12, 2 ug/ml de IgGl anticamundongo de cabra foram adicionados, e quanto à apoptose induzida por TRAIL, o anticorpo anti-Flag foi adicionado como o reticulador. A viabilidade celular foi determinada após a cultura noturna pelo ensaio de ATPLITE. A viabilidade celular foi determinada pelo percentual das contagens dos reservatórios tratados sobre aquele do controle do meio. Cada ponto representa uma média de triplicatas, e é representativo para pelo menos três experiências independentes. O painel (C) apresenta a suscetibilidade das células tumorais à apoptose mediada por TRA-8 durante a indução da resistência do TRA-8.A indução da resistência do TRA-8 foi iniciada pelo tratamento das células com 1 ng/ml de TRA-8 durante dois dias. As doses de TRA-8 foram dobradas a cada dois dias, até 2.000 ng/ml. Em cada ciclo das doses, a viabilidade celular das células não induzidas e induzidas sob o tratamento com cada dose correspondente, foi determinada pelo ensaio de ATPLITE. Os dados são apresentados como uma média da cultura em triplicata.A Figura 2 mostra a seletividade da resistência do TRA-8 induzida nas células MDA-231 e UL-3C. O painel (A) mostra a apoptose induzida por TRAIL-R2 nas células MDA-231 e UL-3C. Tanto as células MDA231 precursoras e resistentes quanto UL-3C foram tratadas com as concentrações indicadas de TRA-8. O painel(B) mostra a apoptose induzida por TRAIL-R1 nas células MDA-231 e UL-3C. Tanto as células MDA231 precursoras e resistentes quanto UL-3C foram tratadas com as concentrações indicadas de 2E12. O painel (C) mostra a apoptose induzida por TRAIL nas células MDA-231 e UL-3C. Tanto as células MDA231 precursoras e resistentes quanto UL-3C foram tratadas com as concentrações indicadas de TRAIL solúvel recombinante. A viabilidade celular foi determinada após a cultura noturna pelo ensaio de ATPLITE como descrito acima. O painel (D) mostra a manutenção da resistência de TRA-8. Após a indução da resistência do TRA-8, o TRA-8 foi removido. A manutenção da resistência do TRA-8 foi determinada a cada semana após a remoção do TRA-8. As células foram tratadas com 1.000 ng/ml de TRA-8 durante a noite, e a viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de ATPLITE.
A Figura 3 mostra o TRAIL-R2 e a expressão reguladora da apoptose associada nas células resistentes a TRA-8. O painel (A) mostra a análise de Western blot da expressão protéica. Os lisados celulares totais foram separados em SDS-PAGE e submetidos a Western blot. As manchas foram sondadas com 1 ug/ml de anticorpo primário durante a noite e seguidas por anticorpo secundário conjugado a HRP. As proteínas foram reveladas por quimioluminescência de ECL. O painel (B) mostra a análise da disposição do
cDNA das células precursoras e resistentes do MDA231. As disposições do cDNA da membrana para um painel de apoptose humana (painel superior) e genes associados com a sinalização celular (painel inferior) foram comprados da SuperArray, Inc. As sondas de cDNA rotuladas de 32P foram preparadas do RNA total das células precursoras e resistentes de MDA231 e hibridizadascom a disposição de cDNA sobre a mancha. Os perfis de expressão de genes foram analisados com CyClone Phosphor-Imager.
A Figura 4 mostra a ativação da via da caspase e da via da quinase JNK/p38 nas células resistentes a TRA-8. O painel (A) mostra a 5 ativação da caspase deflagrada por TRAIL-R1 e R2. As células precursoras e resistentes de MDA231 foram tratadas com 1.000 ng/ml de TRA-8 (painel da esquerda) ou 2E12 (painel da direita) pelo tempo indicado. O Western blot dos lisados celulares totais foram sondados com anticaspase 8 policlonal (painel superior), anticaspase 3 (painel central) ou anti-PARP (painel inferior). As flechas indicam as proteínas de comprimento completo e clivadas. O painel (B) mostra a ativação da via da quinase de JUK/p38. As células foram tratadas da mesma maneira descrita acima. Os Western blots dos lisados celulares totais foram sondados com JNK policlonal antifosforilado (painel superior) ou p38 antifosforilado (painel inferior). As flechas indicam as proteínas fosforiladas.
A Figura 5 mostra a formação DISC alterada nas células resistentes a TRA-8. O painel (A) mostra o ensaio de co-imunoprecipitação da formação DISC. As células precursoras e resistentes de MDA231 foram tratadas com 1.000 ng/ml de TRA-8 (painel da esquerda) ou 2E12 (painel da direita) pelo tempo indicado. TRAIL-R1 e TRAIL-R2 foram imunoprecipitados com Sepharose 4B conjugada a 2E12 ou 2B4. Os Western blots das proteínas co-imunoprecipitadas e das proteínas celulares totais foram sondadas com anticorpo anti-FADD policlonal (painel superior) ou anticaspase 8 (painel central) ou anticorpo anti-cFLIP (painel inferior). Os painéis (B a E) mostram perfis proteômicos de duas dimensões das proteínas
associadas a TRAIL-R2 das células resistentes a TRA-8. As-células — precursoras e resistentes de MDA231 foram tratadas com 1.000 ng/ml de TRA-8 por quatro horas ou permaneceram sem tratamento como controle. Após a imunoprecipitação de TRAIL-R2 com Sepharose 4B conjugada a 2B4,as proteínas eluídas foram separadas por eletroforese de duas dimensões e manchadas com o tampão de manchamento SYPRO Ruby. Os pontos protéicos diferencialmente expressos como círculos foram identificados pelo software PDQuest. As experiências foram repetidas pelo menos três vezes quanto a um resultado reprodutível.
A Figura 6 mostra a reversão da resistência do TRA-8 pelos agentes quimioterápicos. O painel (A) mostra a suscetibilidade das células resistentes de TRA-8 à apoptose induzida pelo TRA-8 na presença de agentes quimioterápicos. As células resistentes a MDA231 e UL-3C foram tratadas com doses variáveis de TRA-8 na ausência ou presença de 0,1 CM de taxol, 1 VM Adriamicina, 100 VM de cisplatina ou 5 VM de BisVIII. A viabilidade celular foi determinada após a cultura noturna pelo ensaio de ATPLITE. O painel (B) mostra a ativação da cascata de caspase nas células resistentes a TRA-8 pela Adriamicina. As células resistentes a MDA231 foram cultivadas em meio de controle (faixa) ou tratadas com 1.000 ng/ml de TRA-8 e 1 DM de Adriamicina por uma hora (faixa 2) ou quatro horas (faixa 3), ou 1 VM de Adriamicina sozinha ou 1.000 ng/ml de TRA-8 sozinho (faixa 5). Os Western blots dos lisados celulares totais foram sondados com anticorpos monoclonais de caspase anti-humana. O painel (C) mostra o recrutamento de TRAIL-R2 de FADD em células resistentes ao TRA-8. O TRAIL-R2 de células resistentes a MDA231 diferentemente tratadas como indicado acima foi imunoprecipitado com sefarose 4B 2B4. A co-imunoprecipitação de FADD com TRAIL-R2 foi determinada por Western blot sondado com anticorpo anti-FADD.
A Figura 7 mostra a associação de DDX3 com TRAIL-R2. As células precursoras de MDA231 e as células resistentes foram transfectadas com o DDX3 recombinante de comprimento completo. 48 horas" após a ~ transfecção, as células foram tratadas com 500 ng/ml de TRA-8 pelo tempo indicado. As proteínas celulares totais foram sondadas com anticorpo monoclonal anti-His (painel superior), p-actina foi usada como o controle decarga. O ensaio de co-imunoprecipitação do DDX3 recombinante associado com TRAIL-R2 foi determinado usando-se o anticorpo anti-His (painel inferior). Para analisar o DDX3 endógeno associado com TRAIL, as células precursoras de MDA231 e as células resistentes foram tratadas com 500 ng/ml de TRA-8 pelo tempo indicado. TRAIL-R2 foi imunoprecipitado com Sefarose 4Bconjugada a 2B4. As proteínas celulares totais foram sondadas com anticorpos anti-DDX3 monoclonais, 3E2 e 5A6 (painel superior). O DDX3 endógeno co-imunoprecipitado foi sondado com anticorpos anti-DDX3 monoclonais, 3E2 e 5A6 (painel inferior). Os TRAIL-R2 nas células
precursoras e nas células resistentes foram determinados por Western blot com anticorpo policlonal anti-TRAIL-R2.
A Figura 8 mostra o mapeamento da região de interação do DDX3 e TRAIL-R2. A Figura 8A mostras construções de DDX3 deletado. Os cDNAs codificando os DDX3 de comprimento completo e deletado, como
indicado, foram clonados no vetor de expressão pcDNA3.1-HisA. As células 293 foram transfectadas com o DDX3 deletado N-terminal, C-terminal, e DDX3 do tipo selvagem. 48 horas após a transfecção, as expressões de DDX3 recombinante foram detectadas por Western blot usando-se anticorpo anti-His (painel superior). O DDX3 recombinante co-imunoprecipitado com TRAIL-
R2 foi determinado por análise de Western blot usando-se o anticorpo monoclonal anti-His (painel central). Os TRAIL-R2 foram determinados por Western blot com anticorpo policlonal anti-TRAIL-R2 (painel inferior). Faixa 1: não transfecção. Faixas 2 a 5: A2-5 do DDX3 N-terminal. Faixas 6 a 9: A3-6 do DDX3 C-terminal. Faixa 10: o DDX3 de comprimento completo. A
Figura 8B mostra que a interação de DDX3 com TRAIL-R2 é independente no domínio de morte. Os cDNAs codificando os TRAIL-R2 de comprimento completo e o deletado como indicado, foram clonados em um vetor de CMV de transporte. Células3T3 de murino foram cotransfectadas ou com TRAIL-R2 e DDX3 do tipo selvagem ou mutantes. 24 horas mais tarde, a expressãoda superfície celular foi examinada por análise de citometria de fluxo usando-se TRA e anti-mlgGl conjugado a PE. 48 horas após a cotransfecção, os Usados celulares foram imunoprecipitados com TRA-8. DDX3 total (painel superior) e DDX3 associado a TRAIL-R2 (painel central) foram examinados 5 por Western blot usando-se anticorpo anti-His. Faixai: sem transfecção; Faixa 2: DDX3 sozinho; Faixa 3: TRAIL-R2 e DDX3 do tipo selvagem; Faixa 4 a 9: A1-6 de TRAIL-R2e DDX3. Os TRAIL-R2 foram determinados Western Blot com anticorpo policlonal anti-TRAIL-R2 (painel inferior). A Figura 8C mostra os cDNAs codificando os TRAIL-R2 de comprimento completo e truncado como indicado, que foram clonados em um vetor de expressão de promotor dual com GFP como uma proteína repórter. As células 3T3 de murino foram cotransfectadas com TRAIL-R2 e DDX3 ou do tipo selvagem ou mutante. 24 horas mais tarde, a expressão da superfície celular foi examinada por análise de citometria de fluxo usando TRA-8 e anti-mlgGl conjugado a PE. 48 horas após a cotransfecção, os lisados celulares foram imunoprecipitados com TRA-8. Os TRATL-R2 foram determinados por Western Blot com anticorpo policlonal anti-TRAIL-R2 (painel superior). DDX3 total (painel inferior) e DDX3 associado ao TRAIL-R2 (painel central) foram examinados por Western blot com o uso do anticorpo anti-His. Faixa 1: DDX3 sozinho; Faixa 2: ATRAIL-R2-300-330 e DDX3; Faixa 3: AD330 e DDX3; Faixa 4: AD340 e DDX3; Faixa 5: TRAIL-R2 tipo selvagem e DDX3. A Figura 8D mostra o alinhamento de aminoácidos da região de ligação de DDX3 de TRAIL-R2 com DcR2 e DR4. A Figura 8E mostra que DDX3 serve como a ligação entre TRAIL-R2 e cIAPl. As células precursoras MDA231 e As células resistentes a MDA231 foram tratadas com 500 ng/ml de TRA-8 pelo tempo" indicado. TRATL-R2 foi imunoprecipitado com Sefarose 4B conjugada a 2B4. DDX3 foi imunoprecipitado com Sefarose 4B conjugada a 3E4. Western blots do DDX3 total, cIAPl (painel superior), DDX3 co-imunoprecipitado com TRAIL-R2, cIAPl (painel central), DDX3 co-immunoprecipitated com DDX3, cIAPl (painel inferior) foram sondados com 3E4, anticorpo anti-DDX3 monoclonal, e 1C12, anticorpo anti-cIAPl monoclonal. TRAIL-R2 foi determinado por Western Blot com o uso de anticorpo policlonal anti-TRAIL-R2 (painel central).
A Figura 9 mostra a infra-regulação da resistência reversa ao DDX3 à apoptose induzida por TRA-8. A Figura 9A mostra sRNAi-DDX3 eficaz selecionada. As células precursoras MDA231 foram transfectadas com o vetor U6-Entry codificando os alvos sRNAi-DDX3. 48 horas após a transfecção, a expressão de DDX3 foi determinada pela análise de Western blot com o uso de anticorpo anti-DDX3. P-actina foi usada como o controle de carga. A Figura 9B mostra as células resistentes a MDA231 que foram cotransfectadas com o vetor de expressão de GFP e sRNAi-DDX3. 24 horas após a transfecção, as células positivas de GFP foram classificadas por citometria e cultivadas com várias concentrações de TRA-8 durante a noite. As expressões de DDX3 foram detectadas por Western blot com o uso do anticorpo anti-DDX3 (painel superior). TRAIL-R2 foi imunoprecipitado com Sefarose 4B conjugada a 2B4. Os DDX3 associados ao TRAIL-R2 foram sondados com 3E4, anticorpo anti-DDX3 monoclonal (painel central). 24 horas após a transfecção, as células foram tratadas com várias concentrações de TRA-8 durante a noite. A suscetibilidade das células transfectadas à apoptose induzida por TRA-8 foi determinada pelo ensaio de ATPLite. A Figura 9D mostra que as células transfectadas submetendo-se à apoptose foram determinadas pelo manchamento de TÚNEL. A Figura 9E mostra os painéis das células cancerosas que foram transfectadas com controle ou oligo sRNAi-DDX3. 48 horas após a transfecção, a expressão reduzida de DDX3 foi detectada por Western blot com o uso do anticorpo anti-DDX3. p-actina foi usada como o controle de carga. A Figura 9F mostra, 24 horas após a transfecção, as células que foram tratadas com várias concentrações de TRA-8 durante a noite. A suscetibilidade das células transfectadas à apoptoseinduzida por TRA-8 foi determinada pelo ensaio de ATPLite.
A Figura 10 mostra que o motivo de ligação de DDN3 carente de TRAIL-R2 é pró-apoptótico. Células 3T3 de murinos foram cotransfectadas com AD340-TRAIL-R2 e DDX3, TRAIL-R2 do tipo 5 selvagem e DDX3, AT300-330-TRAIL-R2 e DDX3. 24 horas após a transfecção, as células foram tratadas com 500 ng/ml de TRA-8 durante a noite. As células apoptóticas foram determinadas por anticorpo anti-TRAIL-R2 conjugado a PE, anexina V conjugada à biotina em células positivas de GFP com o uso da análise de citometria de fluxo. As células apoptóticas foram apresentadas pelo gráfico de barras de coluna.
A Figura 11 mostra que o DDX3 serve cIPPI de ligação protéica adaptadora ao TRAIL-R2. A Figura 11A mostra o mapeamento de CARD de ligação de cIAPl de DDX3. 293 células foram transfectadas com uma série de DDX3 deletados como indicado (painel superior), os DDX3 N- terminais aa 1-aa 50 deletados (Faixa 1), N-terminais aa 1-aa 100 deletados (Faixa 2), N-terminais aa 1-aa 150 deletados (Faixa 3) e C-terminais aa 350-aa 662 deletados (Faixa 4) e o comprimento completo (Faixa 5). 48 horas após a transfecção, o DDX3 recombinante foi imunoprecipitado com as contas de níquel. cIAPl total (painel central) e cIAPI co-imunoprecipitado foram determinados pela análise de Western blot com o uso de anticorpo monoclonal anti-cIAPl (painel inferior). A Figura 11B mostra a resistência de TRA-8 reversa de CARD carente de DDX3. Quatro linhagens de células tumorais resistentes a TRA-8 foram transfectadas com o vetor adenoviral codificando o DDX3 de comprimento completo (DDX3-FL) ou o DDX3 truncado de CARD (ÁCARD-DDX3). 48 horas após a transfecção, os lisados celulares foranr imunoprecipitados com TRA-8 e seguido por análise de Western blot do DDX3 co- imunoprecipitado (painel superior), e cIAPl (painel central). Os TRAIL-R2 foram determinados por Western Blot com o uso de anticorpo policlonal anti-TRAIL-R2 (painel inferior). A Figura 11C aviabilidade celular determinada pelo ensaio de ATPLite. As células transfectadas foram incubadas com 500 ng/ml de TRA-8 durante a noite.
A Figura 12 mostra os complexos protéicos TRAIL-R2/DDX3/cIAPl que bloqueiam a ativação da caspase-8 e a clivagem dos nas células resistentes ao TRA-8. A Figura 12A mostra complexos protéicos TRAIL- R2/DDX3/cIAPl em células sensíveis e resistentes ao TRA-8. As células MDA231 precursoras (MDA231p) e resistentes induzidas (MDA231r), as células UL-3C precursoras (UL-3Cp) e resistentes induzidas (UL-3Cr) foram tratadas com 500 ng/ml de TRA-8 por oito horas. Os lisados celulares totais foram imunoprecipitados com Sefarose 4B conjugada aos anticorpos 2B4 e anti-TRAIL-R2 e eluídos com glicina-HCL pH2.0 e imediatamente neutralizados com tampão Tris 1M. Placas de ELISA foram revestidas com anticorpo anti-TRAIL-R2 de 2B4 e bloqueadas com 3 % de BSA PBS. Após a incubação com o complexo protéico do co-IP de TRAIL- R2, o TRAIL-R2 foi detectado por anticorpo anti-TRAIL-R2 policlonal conjugado à biotina, seguido por estreptavidina conjugada a HRP. A Figura 12B mostra que DDX3 foi detectado por 3E2 conjugado à biotina, anticorpo anti-DDC3, seguido por estreptavidina conjugada a HRP. A Figura 12C mostra que cIAPl foi detectado por 1C12 conjugado à biotina, anticorpo anti- cIAPl, seguido por estreptavidina conjugada a HRP. A Figura 12D mostra a suscetibilidade diferencial do DDX3 à clivagem mediada pela caspase. DDX3 foi isolado das células indicadas por imunoprecipitação com sefarose 4B conjugada ao anticorpo anti-TRAIL-R2 2B4, e incubada com caspase-2 ou caspase-8 indicadas a 37 °C a partir de 4 horas. A Figura 12E mostra a quantidade de DDX3 que foi medida por ELISA de sanduíche com o uso de 5A6 como anticorpo de captura e~3E2 como anticorpo de detecção. Os resultados são apresentados como percentuais de DDX3 após a clivagem através dos controles não clivados. A Figura 12F mostra o efeito do complexo de DDX3/cIAPl sobre a atividade da caspase 8. DDX3 foi isolado das célulasindicadas por imunoprecipitação com sefarose 4B conjugada ao anticorpo anti-TRAIL-R22B4, e incubado com a caspase-8 humana ativa recombinante na presença de um substrato fluorescente da caspase-8, Ac-IETD-AMC, por 2 horas. A inibição da caspase-8 foi medida por intensidade de fluorescência reduzida. Os resultados são apresentados como percentual da atividade máxima nos reservatórios de controle.
A Figura 13 mostra o papel do domínio rico em serina de DDX3 na regulação da associação e clivagem. O painel (B) mostra DDX3 co-imunoprecipitado por GSK3a (em cima). As células MDA231 sensíveis ao TRA-8 foram tratadas com TRA-8 com ou sem lítio por duas horas. O lisado celular total foi imunoprecipitado com contas anti-GSK3a. As proteínas com GSK3a foram analisadas por Western blot com o uso do anticorpo anti-DDX3. DDX3 fosforilados de GSK3 (B, inferior). O DDX3 recombinante e tau foram usados como os substratos incubados com GSK com ou sem PKA por uma hora. O 32P incorporado foi contado e apresentado como cpm. (C) O GSK3 não consegue fosforilar o DDX3 do mutante Ser90. (D) As células de MDA231 foram transfectadas com DDX3 do tipo selvagem e DDX3 mutante de Ser90. Após o tratamento de TRA-8, a dissociação do DDX3 do DR5 e a clivagem do DDX3 foram determinadas.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
O método e as composições apresentadas podem ser entendidas mais facilmente mediante referência à seguinte descrição detalhada das modalidades particulares e ao Exemplo nelas incluídos e às figuras e à sua descrição anterior e a seguir.
A indução da apoptose mediada pelo receptor da morte das células tumorais é uma abordagenrextremamente promissora para a terapia do câncer. Como na maior parte, senão em todas, das terapias, algumas células alvo são resistentes. Como um exemplo, TRA-8, um único anticorpo anti-DR5 monoclonal agonístico, induz a apoptose das células do câncer humanosem a citotoxicidade de hepatócito (Ichikawa, K. et dl. 2001. Nat Med 7: 954-960), apresenta intensa eficácia anticâncer em modelos de animais (Buchsbaum, D. J. et ai. 2003. Clin Câncer Res 9: 3731-3741), e tem demonstrado segurança nos estudos da toxicidade em primatas não humanos. 5 Assim, o TRA-8 é usado como um exemplo neste relatório, mas outros agentes que induzem a apoptose através da ativação do receptor da morte (por exemplo, DR4 e DR5) podem ser usados nos métodos aqui apresentados. Embora TRA-8 e suas versões humanizadas e humanas se acham sob desenvolvimento clínico como uma terapia anticâncer, algumas linhagens de células tumorais são resistentes à apoptose mediada pelo TRA-8 a despeito dos níveis razoáveis de expressão de DR5. Estas observações sugerem que a resistência não é relacionada à expressão do receptor, mas, ao invés, aos mecanismos de sinalização iniciado pelo DR5. Certamente a apoptose mediada por DR5 pode ser intensificada significativamente pelos agentes quimioterápicos comuns (Ohtsuka, T. e T. Zhou. 2002. J Biol Chem 277: 29294-29303; Ohtsuka, T. D. et al. 2003. Oncogene 22: 2034-2044). São apresentadas composições e métodos para inibir a resistência aos agonistas do receptor da morte mediante o alvejamento de uma família das proteínas contendo CARD que se ligam aos receptores da morte e inibem a ativação da caspase.
Deve ficar entendido que os métodos e composições apresentados não se limitam aos métodos sintéticos específicos, às técnicas analíticas específica, ou a reagentes particulares, a menos que de outra forma especificado, e, como tal, podem variar. Deve também ficar entendido que a 25 terminologia aqui usada é para os fins de descrever formas de realização
---------particulares apenas e não se intenta seja limitativa.
São apresentados materiais, composições e componentes que podem ser usados em combinação, podem ser usados na preparação, ou são produtos dos métodos e composições apresentadas. Estes e outros materiaissão apresentados neste relatório e fica entendido que, quando combinações, subconjuntos, interações, grupos etc. destes materiais sejam apresentados, embora referência específica de cada uma das várias combinações individuais e coletivas e permutações destes compostos possam não ser explicitamente apresentadas, cada um é especificamente considerado e aqui descrito. Por exemplo, se um vetor é apresentado e examinado, e vários componentes de vetor, incluindo os promotores, são examinados, cada uma e todas as combinações e permutações dos promotores e outros componentes de vetores e as modificações que sejam possíveis, são especificamente consideradas, a menos que especificamente indicado em contrário. Assim, se uma classe de moléculas A, B e C for apresentada, bem como uma classe de moléculas D, E e F e um exemplo de uma molécula de combinação, A-D, for apresentado, então, mesmo que cada um não seja individualmente citado, cada um é individual e coletivamente considerado. Assim, neste exemplo, cada uma das combinações A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E e C-F é especificamente considerada e deve ser considerada manifestada da apresentação de A, B e C; D, E e F; e a combinação de exemplo A-D. Da mesma forma, qualquer subconjunto ou combinação destas é também especificamente considerado e apresentado. Assim, por exemplo, os subgrupos de A-E, B-F e C-E são especificamente considerados e devem ser considerados revelados da apresentação de A, B e C; D, E e F; e a combinação A-D de exemplo. Este conceito se aplica a todos os aspectos deste pedido, incluindo, porém não limitando, as etapas nos métodos de produzir e usar as composições apresentadas. Assim, se existir uma variedade de etapas adicionais que possam ser realizadas, fica entendido que cada uma destas etapas adicionais -pode ser realizada com qualquer modalidade específicaõu combinação de modalidades dos métodos apresentados e que cada uma de tais combinações especificamente é levada em conta e deve ser considerada como apresentada.
Uma variedade de seqüências são aqui fornecidas e estas eoutras podem ser encontradas no Genbank, em 'www.pubmed.gov'. Aqueles de experiência na técnica entendem como resolver as discrepâncias e diferenças das seqüências, e ajustar as composições e métodos relacionados a uma seqüência particular a outras seqüências relacionadas. Iniciadores e/ou 5 sondas podem ser projetadas para qualquer seqüência, dada a informação aqui apresentada e conhecida na técnica.
É fornecido um método de reverter ou prevenir uma resistência de uma célula alvo em um agonista do receptor da morte compreendendo o contato da célula alvo com um modulador de uma ou mais atividades de proteínas contendo CARD, em que a modulação inverte ou previne a resistência ao agonista. O método tem utilidade para pesquisa da sinalização da apoptose e tratamento terapêutico de doenças tais como o câncer e distúrbios autoimunes e inflamatórios. Assim, a etapa de proceder ao contato, do método, pode ser realizada in vivo ou in vitro Como usado na totalidade deste relatório, "inverter" ou
"reverter" significa mudar para a posição, direção ou curso opostos, tal como em mudar o curso de uma doença da piora para a melhora. Por exemplo, no caso da resistência do receptor da morte, reverter a resistência de uma célula alvo em um agonista do receptor da morte é tornar a célula menos resistente ao referido agonista. Assim, por exemplo, reverter a resistência de uma célula alvo que seja 100 % resistente pode resultar em que referida célula alvo seja 90 % a 0 % resistente ao agonista do receptor da morte, incluindo 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, e 0 % resistente. Como usado na totalidade deste relatório, "prevenir" significa
impedir, evitar, obviar, interceptar, interromper ou retardar~aíguma coisa de acontecer, especialmente pelo planejamento ou ação antecipados. Por exemplo, no caso da resistência do receptor da morte, para prevenir a resistência de uma célula alvo a um agonista do receptor da morte, é tornar acélula menos capaz de tomar-se resistente ao referido agonista. Assim, por exemplo, a prevenção de 100 % da resistência em uma célula alvo pode resultar em que a referida célula alvo seja apenas de 0 % a 90 % resistente ao agonista do receptor da morte, incluindo 0 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % e 90 % resistente.
"Reverter" ou "prevenir" referem-se a uma mudança na grandeza ou a um retardo em qualquer mudança na grandeza. Assim, no caso da resistência do receptor da morte, "reverter" ou "prevenir" incluem reduzir o curso da resistência ou retardamento crescentes de um aumento na resistência.
Deve ser observado que, como usado neste relatório e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem as referências no plural, a menos que o contexto claramente declare de outra
forma. Assim, por exemplo, a referência a "um polipeptídeo" inclui uma pluralidade de tais polipeptídeos, a referência a "o polipeptídeo" é uma referência a um ou mais polipeptídeos e equivalentes destes conhecidos daqueles habilitados na técnica, e assim por diante.
"Opcional" ou "opcionalmente" significam que o evento, a
circunstância ou o material subseqüentemente descritos podem ou não ocorrer ou estar presentes, e que a descrição inclui exemplos em que o evento, a circunstância ou o material ocorram ou estejam presentes, e exemplos em que não ocorram ou não estejam presentes.
As variações podem ser expressas neste relatório desde
"aproximadamente" um valor particular, e/ou até "aproximadamente" outro valor particularr Quando uma tal variação é expressa; ~ é também especificamente pretendida e considerada a variação a partir daquele valor particular e/ou até o outro valor particular, a menos que o contexto indique especificamente de outra forma. De forma semelhante, quando os valoressejam expressos como aproximações, mediante o uso do antecedente "cerca de", será entendido que o valor particular forma outra modalidade especificamente considerada que se deve considerar apresentada, a menos que o contexto especificamente indique de outra forma. Será ainda entendido que 5 os pontos finais de cada uma das faixas são significativamente tanto em relação ao outro ponto final, quanto independentemente do outro ponto final, a menos que o contexto indique especificamente de outra forma. Finalmente, deve ficar entendo que todos os valores individuais e as sub-faixas de valores contidos dentro de uma faixa explicitamente apresentada, são também especificamente contemplados e devem ser considerados apresentados, a menos que o contexto especificamente indique de outra forma. O acima se aplica independentemente do fato de que, em casos particulares, algumas ou todas estas modalidades sejam explicitamente descritas.
Como usado na totalidade deste relatório, "célula alvo" significa uma célula carregando o receptor da morte alvejado, incluindo, por exemplo, uma célula que expresse DR5 e DR4 e ilustrativamente inclua células anormalmente cultivadas e células tumorais, tais como papilomas e verrugas; câncer de mama, câncer colônico, hepatomas, leucemias, câncer pulmonares, melanoma, mielomas, osteossarcomas, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer prostático, câncer da cabeça e do pescoço, câncer tireóideo, câncer uterino, tumores do cérebro tais como astrocitomas, células imunes ativadas (por exemplo, células ativadas de linfocíticas, linfóides e mielóides), células inflamatórias, células sinoviais da artrite reumatóide, e células viralmente infectadas. In vivo, a célula alvo é uma célula de um indivíduo com uma condição patológica, incluindo aquelas em que a proliferação celular seja anormal ou desregulada, tal como nò câncer e na artrite reumatóide. As células alvo incluem as células humanas, de primatas não humanos, gatos, cães, ratos, camundongos, porquinhos-da-índia, coelhos, cabras, carneiros, vacas, cavalos, galinhas, porcos, sagüis e doninhas, oucélulas de várias linhagens celulares (por exemplo, as células de Jukart).
Por "receptor da morte" denota-se um receptor que inclui a apoptose celular uma vez ligada por um ligando. Os receptores da morte incluem, por exemplo, os membros da superfamília de receptores do fator de necrose tumoral (TNF) tendo os domínios da morte (por exemplo, TNFRI, Fas, DR3, 4,5,6) e os membros da superfamília do receptor de TNF sem os domínio da morte LTbetaR, CD40, CD27, HVEM.
A transdução de sinal através, por exemplo, de DR5, é um mecanismo chave no controle da apoptose mediada por DR5. Um aspecto
comum dos receptores da morte da superfamília de TNFR é que eles todos têm um "domínio da morte" conservado em sua cauda citoplasmática (Zhou, T. et al. 2002. Immunol Res 26: 323-336). É bem estabelecido o fato de que a apoptose mediata por DR5 é iniciada no domínio da morte. A reticulação do DR5 na superfície celular mediante TRAIL ou o anticorpo anti-DR5 agonístico conduz à oligomerização do DR5 que é imediatamente seguida pelo recrutamento de FADD ao domínio da morte de DR5 (Bodmer, J. L. et al. 2000. Nat Cell Biol 2: 241-243; Chaudhary, P. M. et al. 1997. Immunity 7: 821-830; Kuang, A. A. et al. 2000. J Biol Chem 275: 25065-25068; Schneider, P. et al. 1997. Immunity 7: 831-836; Sprick, M. R. et al. 2000. Immunity 12: 599-609). O FADD comprometido no domínio da morte ainda recruta a procaspase 8 e/ou a procaspase 10 iniciadoras para formar um DISC através das interações DD homofílicas (Krammer, P. H. 2000. Nature 407: 789-795). As caspases 8 e 10 ativadas podem ativar a caspase 3 diretamente, ou clivar a proteína Bid contendo BH3 para ativar uma via da apoptose dependente das mitocôndrias através da liberação do citocromo C e ativação da caspase 9 (Desagher; S. e J. C. Martinou. 2000. Trends~eeli Biol 10: 369-— 377; Scaffidi, C. et al. 1998. Embo J 17: 1675-1687). Em seguida à formação do complexo do domínio da morte, várias vias da transdução de sinal são ativadas, tais como a caspase, NF-kB e JNK/p38. A ativação destas vias desinalização leva à regulação da apoptose mediada pelo receptor da morte através da família de proteínas Bcl-2 e IAP.
Por "agonista" denota-se uma substância (molécula, medicamento, proteína etc.) que seja capaz de se combinar com um receptor (por exemplo o receptor da morte) em uma célula e iniciar as mesmas reação ou atividade tipicamente produzidas pela ligação do ligando endógeno (por exemplo, a apoptose). O agonista do presente método pode ser um ligando do receptor da morte. Assim, o agonista pode ser TNF, Ligando Fas ou TRAIL. O agonista pode ainda ser um fragmento destes ligandos compreendendo o domínio de ligação do receptor da morte, de tal modo que o fragmento seja capaz de ligar e ativar o receptor da morte. O agonista pode ainda ser uma proteína de fusão compreendendo o domínio de ligação do receptor da morte, tal que a proteína de fusão seja capaz de ligar e ativar o receptor da morte. O agonista pode ainda ser uma proteína de fusão compreendendo o domínio de ligação do receptor da morte, tal que a proteína de fusão seja capaz de ligar e ativar o receptor da morte. O agonista pode ainda ser um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos com pelo menos 85 % de homologia ao TNF, Fas ou TRAIL, de tal modo que o homólogo seja capaz de ligar e ativar o receptor da morte.
O agonista pode ainda ser um anticorpo indutor da apoptose que se liga ao receptor da morte. O "anticorpo" pode ser um anticorpo monoclonal, policlonal, quimérico, de cadeia única, humanizado, completamente humano, ou qualquer um de seus fragmentos Fab ou F(ab')2. Por "anticorpo indutor da apoptose" denota-se um anticorpo que causa a morte celular programada ou antes ou após a ativação com o uso dos métodos aqui fornecidos. Assim, o agonista do presente método pode ser unranticorpo-específico para um receptor da morte de Fas, TNFR1 ou TRAIL, de tal modo que o anticorpo ative o receptor da morte. O agonista pode ser um anticorpo específico para DR4 ou DR5. O agonista pode ser um anticorpo DR5 tendo amesma especificidade de epítopo, ou secretado por um hibridoma entre camundongos tendo o Número de Acesso da ATCC PTA-1428 (por exemplo, o anticorpo TRA-8), o Número de Acesso da ATCC PTA-1741 (por exemplo, o anticorpo TRA-1), o Número de Acesso da ATCC PTA-1742 (por exemplo o anticorpo TRA-10). O agonista pode ser um anticorpo tendo a mesma especificidade de epítopo, ou secretado pelo hibridoma tendo o Número de Acesso da ATCC PTA-3798 (por exemplo, o anticorpo 2E12).
O receptor de TRAIL alvejado pelo anticorpo do presente método pode ser DR4 ou DR5. Tais receptores são descritos nos pedidos de
patente publicados WO 99/03992, WO 98/35986, WO 98/41629, WO 98/32856, WO 00/66156, WO 98/46642, WO 98/5173, WO 99/02653, WO 99/09165, WO 99/11791, WO 99/12963 e Patente U.S. publicada n5 6.313.269, os quais são todos aqui incorporados como referência em sua totalidade quanto aos receptores apresentados neste relatório. Os anticorpos monoclonais específicos para estes receptores podem ser gerados com o uso de métodos conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Kohler e Milstein, Nature, 256: 495-497 (1975) e Eur. J. Immunol. 6: 511-519 (1976), ambos os quais ficando aqui incorporados como referência em sua totalidade quanto a estes métodos. Ver também os métodos apresentados no pedido de patente publicado WO 01/83560, o qual é aqui incorporado como referência em sua totalidade.
O anticorpo do presente método pode ser um anticorpo conhecido na técnica, incluindo, por exemplo, um anticorpo de DR5 tendo a mesma especificidade de epítopo, ou secretado por um hibridoma entre camundongos tendo o Número de Acesso da ATCC PTA-1428 (por exemplo, o anticorpo TRA-8), o Número de Acesso da ATCC PTA-1741 (por exemplo, o anticorpo TRA-1), o Número de Acesso da ATCC PTA-1742 (por exemplo, o anticorpo TRA-10). Outros exemplos incluem um anticorpo tendo a mesma especificidade de epítopo, ou secretado pelos hibridomas tendo o Número deAcesso da ATCC PTA-3798 (por exemplo, o anticorpo 2E12).
Por "proteína contendo CARD" denota-se uma família de proteínas que contêm um domínio de recrutamento associado à caspase (CARD) e são caracterizadas pela capacidade de se ligarem a um receptor da morte, em que a ligação fica opcionalmente fora do domínio da morte, e modularem a ativação da apoptose pelo domínio da morte do referido receptor da morte. O DDX3 é um membro representativo desta família. As proteínas contendo o CARD incluem as helicases de RNA da família protéica de DEAD-box (SEQ ID NO: 21). A proteína apresentada contendo CARD pode ser, por exemplo, DDX3 (SEQ ID NO: 25, ne de acesso gi: 11344593), ou RIG-1 (ne de acesso gi: 6048564). A proteína contendo CARD pode ainda ser um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos com pelo menos 85 % de homologia a DDX3, mda-5 ou RIG-1.
As helicases de RNA da família protéica de DEAD-box são altamente conservadas das bactérias aos mamíferos, são envolvidas em uma variedade de processos metabólicos envolvendo RNA, e são cruciais para a sobrevivência celular (Heinlein, U. A. 1998. J Pathol 184: 345-347). Todos os membros desta família de proteínas têm um motivo ATPase que é composto da seqüência de aminoácidos característica D-E-A-D (Asp-Glu-Ala-Asp, SEQ ID NO: 21), dando o nome a esta família. Acredita-se geralmente que as proteínas DEAD-box (SEQ ID NO: 21) sejam RNA helicases, como as proteínas de ligação de ácido ribonucleico, necessária para a iniciação da translação, recomposição do RNA, montagem ribossômica, degradação do RNA, estabilidade do mRNA e formação do RNA. Enquanto algumas destas RNA helicases desempenhem um papel crucial na translação dos fatores transcricionais especiais, a superexpressão da algumas é relacionada à carcinogênese. O DDX1 é co-amplificado com N-myc nos neuroblastomas (George, R. E. et ai. 1996. Oncogene 12: 1583-1587; Godbout, R. et al. 1998. JBiol Chem 273: 21161-21168). A RNA helicase,p68, é consistentemente superexpressa nos tumores em comparação com o tecido normal compatibilizado. O p68 acumulado parece ser tornado poli-ubíquo, sugerindo um possível defeito na degradação mediada pelo proteassomo nestes tumores (Causevic, M. et ai. 2001. Oncogene 20: 7734-5 7743), sugerindo que a desregulação da expressão de p68 ocorre prematuramente durante o desenvolvimento do tumor. O rck/p54 da família da proteína/RNA helicase do DEAD-box (SEQ ID NO: 21) pode contribuir para a proliferação celular e a carcinogênese no desenvolvimento dos tumores colorretais humanos no nível translacional mediante o aumento da síntese da proteína c-myc (Hashimoto, K. et al. 2001. Carcinogenesis 22: 1965-1970). O DDX3 é um membro desta família, embora a função de DDX3 da RNA helicase seja desconhecida (Fu, J. J. et al. 2002. Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao (Xangai) 34: 655-661). Foi relatado que o DDX3 pode interagir com a proteína de núcleo de HCV e regular a translação das proteínas virais de HCV (Owsianka, A. M. e A. H. Patel. 1999. Virology 257: 330-3400).
Algumas das RNA helicases contêm um CARD conservado (domínio de recrutamento da caspase; Yoneyama, M. et ai. 2004. Nat Immunol 5: 730-737; Kang, D. C. et al. 2004. Oncogene 23: 1789-1800; Kang, D. C. et al. 2002. Proc Natl Acad Sei U S A 99: 637-642). A hibridização de subtração identificou o gene-5 (mda-5) associado à diferenciação de melanoma como um gene induzido durante a diferenciação, a reversão do câncer e a morte celular programada (apoptose). Este gene contém tanto um domínio de recrutamento da caspase quanto domínios putativos da RNA helicase do grupo de DExH. O Mda-5 pode funcionar como um mediador da inibição do crescimento induzido por IFN e/ou apoptose (Kang, D. C. et al. 2002. Proc Natl Acad Sei U S A 99: 637-642). Um estudo mais recente indica que o nível de mRNA de mda-5 é baixo nos tecidos normais, enquanto a expressão é induzida em um espectro de célulasnormais e cancerosas mediante IFN-beta. A expressão do mda-5 por meio de um adenovírus incompetente de replicação, o Ad.mda-5, induz a apoptose nas células HO-1 como confirmado pelos ensaios morfológicos, bioquímicos e moleculares (Kang, D. C. et al. 2004. Oncogene 23: 1789-1800). O gene I indutível pelo ácido retinóico (RIG-I), que codifica uma RNA helicase DExD/H-box que contém um domínio de recrutamento da caspase, é um regulador essencial da sinalização induzida pelo dsRNA como avaliado pela triagem e ensaios funcionais. Um domínio da helicase com atividade de ATPase intacta foi responsável pela sinalização mediada pelo dsRNA. O
domínio de recrutamento da caspase transmitia sinais de 'jusante', resultando na ativação dos fatores de transcrição NF-kB e IRF-3. A ativação subseqüente dos genes por estes fatores induziu as funções antivirais, incluindo a produção do interferon tipo I (Yoneyama, M. et al. 2004. Nat Immunol 5: 730-737).
As proteínas contendo um domínio de recrutamento associado
à caspase (CARD) foi estabelecido como reguladores chaves da morte celular. O CARD é composto de um feixe alfa-helicoidal conservado na N-terminal dos pró-domínios de certas caspases. Os CARDs podem também ser encontrados em uma variedade de outras proteínas. Como as proteínas do domínio da morte, os CARDs funcionam como motivos da interação de
proteínas hemotípicas que possibilitam as comunicações das proteínas através das interações de CARD/CARD. As proteínas com um CARD podem ser ou pró-apoptóticas ou anti-apoptóticas. As proteínas de CARD pró-apoptóticas incluem certas caspases tais como as caspases 2, 4 e 9, e Apafl, que desempenham importantes papéis na iniciação da apoptose. As proteínas de
CARD anti-apoptóticas representativas incluem cIAPl e cIAP2, que interagem com o CARD das caspases, e inibem a ativação das caspases através do seu domínio BIR. Muitos aspectos da função desta família de proteínas indicam sua utilidade potencial como novos alvos medicamentosos no tratamento do câncer. Várias proteínas contendo CARD são componentescríticos da maquinaria da morte celular conservada, a qual, quando desregulada, promove a oncogênese e contribui proeminentemente para a resistência tumoral à quimioterapia. A Apafl protéica pró-apoptótica, que é inativada em alguns cânceres, é uma proteína de CARD que é indispensável para a apoptose induzida pelas mitocôndrias. Outras proteínas de CARD apoptóticas, tais como as proteínas da família IAP, têm-se mostrado protegerem os tumores contra os estímulos da morte celular e serem super-expressas em certas formas de câncer. Os agentes terapêuticos que ativam ou inibem as proteínas de CARD podem, portanto, ser utilizados como agentes quimiossensíveis ou como moduladores da apoptose quando usados em combinação com a quimioterapia convencional.
A resistência aos agonistas do receptor da morte pode ser atribuída à atividade das proteínas contendo CARD apresentadas. O presente método, portanto, fornece uma composição que modula uma ou mais atividades da proteína contendo CARD para prevenir a referida resistência. Por "modula" denota-se a supra-regulação, a infra-regulação,a ativação, o antagonismo, ou outra alteração na forma ou na função. As "atividades" de uma proteína incluem, por exemplo, a transcrição, a tradução, a translocação intracelular, a secreção, a fosforilação pelas quinases, a clivagem pelas proteases, a ligação homofólica e heterofilica a outras proteínas, a ubiqüidade. Como a atividade da proteína contendo CARD é devida, em parte, à fosforilação nos, ou perto dos, aminoácidos de ligação ao receptor da morte, o modulador fornecido pode ser um inibidor da fosforilação da proteína contendo CARD. Assim, o modulador pode ser um inibidor de uma quinase ou fosfatase. Como um exemplo, o modulador pode ser um inibidor da atividade da glicogênio sintase quinase-3 (GSK-3).
A GSK-3 é uma proteína quinase encontrada em uma variedade de organismos, incluindo de mamíferos. Duas formas de GSK-3 quase idênticas existem: GSK-3a e GSK-3(3. O inibidor pode ser qualquerinibidor de GSK-3 conhecido ou recém descoberto. De forma mais favorável, o inibidor de GSK-3 do método fornecido inibe pelo menos a GSK-3 p. A seqüência de aminoácidos para a GSK-3 p pode ser acessada no número de acesso do Genbank P49841, e a seqüência de nucleotídeos correspondente no número de acesso NM_002093. Para fins experimentais e de pesquisa, pode ser desejável usar um modelo de animal. Por exemplo, a seqüência de GSK-3p de ratos pode ser acessada no número de acesso do Genbank PI8266, e a de camundongos no número de acesso do Genbank AAD39258.
Os inibidores de GSK-3, como aqui usados, são compostos que reduzem direta ou indiretamente o nível de atividade da GSK-3 em uma célula, pela inibição enzimática competitiva ou não competitiva; pela redução dos níveis protéicos, por exemplo por um rompimento genético alvejado, pela redução da transcrição do gene da GSK-3, pelo aumento da instabilidade protéica, etc. Os inibidores podem ser moléculas orgânicas ou inorgânicas pequenas, ácidos nucleicos anti-sentido, anticorpos ou fragmentos deles derivados, etc. Outros inibidores da GSK-3 podem ser encontrados através triagem combinatória ou outras bibliotecas químicas para a inibição da atividade da GSK-3.
Exemplos de inibidores diretos da proteína da GSK-3 incluem o lítio (Li+) (Klein et ai. 1996), o qual potencialmente inibe a atividade da GSK-3 p (Kj = 2 mM), mas não é um inibidor geral de outras proteínas quinases. Os íons de berílio (Be2+) são inibidores mais fortes da GSK-3, inibindo na faixa micromolar. Entretanto, este efeito inibidor não é tão seletivo quanto o do lítio, tendo em vista que ele também inibirá a CDK1 em baixas doses.
Os inibidoresde GSK^3 também incluem a aloisina, aaloisina A, a kenpaullone. A aloisina [7-n-butil-6-(4-metoxifenil)[5H]pirrolo[2,3-b]pirazina] é um inibidor potente, seletivo, de permeação celular e competitivo a ATP de Cdkl/B (IC50 = 700 nM), Cdk5/p35 (IC50 = 1,5 uM) eGSK-3 (IC50 = 920 nM) (Mettey, Y. et al. (2003) J Med Chem. 46(2): 222-236), aqui incorporado como referência em sua totalidade para os preceitos relacionados a esta molécula. A aloisina A [7-n-butil-6-(4-metoxifenil)[5H]pirrolo[2,3-b]pirazina] é um composto de permeação celular 5 que atua como um inibidor potente, seletivo, reversível e competitivo de ATP das quinases dependentes de ciclina, da quinase N-terminal c-Jun (JNK), e da glicogênio sintase quinase-3 (GSK-3) (GSK-3 alfa, IC50 = 500 nM) (GSK-3 beta, IC50 = 1,5 uM) (Mettey, Y. et al. (2003) JMed Chem. 46(2): 222-236), aqui incorporado como referência em sua totalidade quanto aos preceitos relacionados a esta molécula. Kenpaullone (9-bromo-7,12-diidroindolo[3,2-d][l]benzazepin-6(5H)-ona) é um inibidor potente de permeação celular da glicogênio sintase quinase-3b (GSK-3b, IC50 = 230 nM), Lck e quinases dependentes da ciclina (Cdks) (Schultz, C. et al. (1999) J. Med. Chem. 42(15): 2909-2919; Zaharevitz, D. W. et al. (1999) Câncer Res. 59(11): 2566- 2569; Kunick, C. et al. (2004) J. Med. Chem. 47(1): 22-36), os quais são todos aqui incorporados como referência em sua totalidade quanto aos preceitos relacionados a esta molécula.
Vários outros compostos têm sido observados inibirem a GSK-3. A maioria inibe a atividade da quinase através da interação com o sítio de ligação de ATP. Eles incluem as maleiminas Bisindóis e Anilino, alcalóides de Alsisina, Paullones, Indirrubinas e Piraloquinoxalinas. Por exemplo, as Paullones e seu uso na inibição da GSK-3 são descritas, por exemplo, em Kunick, C. et al. J Med Chem. 1 de janeiro de 2004; 47(1): 22-36, o qual é aqui incorporado como referência em sua totalidade quanto a seus preceitos sobre as Paullones. Tais compostos são eficazes nas concentrações nanomolares in vitro e nas micromolares baixas in vivo. Novamente, embora— muitos tenham sido apresentados como sendo potentes, eles não são muito específicos quanto à GSK-3 e comumente inibem as CDKs relacionadas em níveis similares. Entretanto, duas maleimidas estruturalmente distintas(SB216763 e SB415286) foram apresentadas como sendo potentes e têm alta especificidade para com a GSK-3. Elas podem ser usadas em substituição ao lítio como inibidoras da GSK-3 nos estudos celulares. Os membros da classe de compostos denominados granulatimidas ou didemnimidas também foram observados como atuando como inibidores da GSK-3) (pedido de patente internacional WO 99/47522, que é aqui incorporado quanto aos seus preceitos sobre estes compostos).
Alguns inibidores indiretos da GSK-3 incluem a wortmanina, que ativa a proteína quinase B, resultando na fosforilação e inibição da GSK-3. O isoproterenol, que atua principalmente através dos adrenorreceptores beta-3, reduz a atividade da GSK-3 a uma extensão semelhante (aproximadamente 50 %) como insulina (Moule et al. 1997). A p70 S6 quinase e a p90rsk-l também fosforilam a GSK-3 (3, resultando na sua inibição.
A GSK-3 também pode ser seletivamente alvejada com o uso de peptídeos específicos da GSK-3. Por exemplo, freqüentemente reajustado nos linfomas 1 de células T avançados (FRAT1), é um homólogo de mamífero de uma proteína de ligação de GSK3 (GBP). FRATtida (um peptídeo correspondente aos resíduos 188 a 226 deFRATl) se liga à GSK3 e bloqueia a fosforilação catalisada pela GSK3 da Axina e da beta-catenina (Thomas, G. M. et al. FEBSLett. 17 de setembro de 1999 ; 458(2): 247-251).
O inibidor de GSK-3 do método fornecido pode também ser um ácido nucleico funcional. Os ácidos nucleicos funcionais são moléculas de ácido nucleico que têm uma função específica, tal como ligando uma molécula alvo ou catalisando uma reação específica. As moléculas de ácido nucleico funcionais podem ser divididas nas seguintes categorias, que não pretendem ser limitativas. Por exemplo, os ácidos nucleicos funcionais incluem moléculas anti-sentido, aptâmeros, ribozimas, moléculas formadoras de triplex, RNAi, e seqüência de orientação externas. As moléculas funcionaisde ácido nucleico podem atuar como afetores, inibidores, moduladores e estimuladores de uma atividade específica possuída por uma molécula alvo, ou as moléculas funcionais de ácido nucleico podem possuir uma atividade sob nova forma independente de quaisquer outras moléculas.
Como as proteínas contendo CARD podem ser clivadas durante a apoptose induzida pelo receptor da morte, o modulador do presente método pode atuar pela promoção da clivagem da proteína contendo CARD. Como um exemplo, o DDX3 é desassociado do DR5 e clivado durante a apoptose induzida pelo TRA-8 (Figuras 9A e C) em paralelo com o recrutamento de FADD (Figura 9E). Um dos sítios de clivagem para DDX3 é um motivo de DEDD relativamente conservado (SEQ ID NO: 7) entre os resíduos de aminoácido 132 a 135, os quais podem ser clivados pelas caspases 2, 3, 7 ou 10. Assim, o modulador pode ser uma caspase ou um derivado de uma caspase que cliva uma proteína contendo CARD (por exemplo, DDX3).
Como a atividade da proteína contendo CARD é dependente da sua ligação ao receptor da morte, o modulador do presente método pode ser um inibidor da interação entre a proteína contendo CARD e o receptor da morte. Em um exemplo, o modulador é uma substância (medicamento, molécula, polipeptídeo etc.) que liga uma proteína contendo CARD ao sítio de ligação do receptor da morte. Assim, o modulador pode ser um polipeptídeo compreendendo os aminoácidos do receptor da morte correspondente ao sítio de ligação da proteína contendo CARD. Por exemplo, o modulador pode ser um polipeptídeo compreendendo os aminoácidos 250 a 340 de DR5 (SEQ ID NO: 22, n° de acesso gi: 3721878). Assim, o modulador pode compreender a seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 23. O modulador pode ainda ser urrrpolipeptídeo compreendendo um fragmento~da seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 23, de tal modo que o fragmento seja capaz de ligar o DDX3. Como um exemplo, o modulador pode ser um polipeptídeo compreendendo os aminoácidos 280 a 310 de DR5 (SEQ ID NO: 22, nfi deacesso gi: 3721878). Assim, o modulador pode compreender a seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 24. Como outro exemplo, o modulador pode ser um polipeptídeo compreendendo os aminoácidos 300 a 330 de DR5 (SEQ ID NO: 22, n° de acesso gi: 3721878), Assim sendo, o modulador pode 5 compreender a seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 36.
Alternativamente, o modulador pode ser uma substância (medicamento, molécula, polipeptídeo etc.) que liga o sítio de ligação da proteína contendo CARD do receptor da morte sem inibir a apoptose. O modulador pode ser um polipeptídeo compreendendo os aminoácidos 10 correspondentes ao sítio de ligação do receptor da morte da proteína contendo CARD.
O modulador do presente método pode afetar a capacidade de uma proteína contendo CARD para impedir a ativação da apoptose dependente da caspase. O domínio do CARD das proteínas contendo CARD éenvolvido no recrutamento dos inibidores da apoptose (IAP), os quais suprimem a apoptose nas células hospedeiras durante a infecção viral (Crook, N. E. et al. 1993. J Virol 67: 2168-2174). A família dos IAP antagoniza a morte celular pela interação com as caspases maduras, e inibindo a atividade enzimática destas. Oito IAPs distintos de mamíferos foram identificados, incluindo XIAP, c-IAPl, C-IAP2 e ML-IAP/Livin (ver, por exemplo, Ashhab, Y. et al. 2001. FEBS Lett 495: 56-60; Kasof, G. M. e B. C. Gomes. 2001. J Biol Chem 276: 3238-3246; Vucic, D. et al. 2000. Curr Biol 10: 1359-1366, os quais são todos aqui incorporados como referência em sua totalidade, quando relacionados a estas moléculas de IAP). Todos os IAPs contêm um a três domínios de repetição de IAP de baculovírus (BIR) e têm seqüência homóloga (CX2CX16HX6C). Através do domínio de BIR, as moléculas de IAP se ligam e diretamente inibem as caspases (Deveraux, Q. L. e J. C. Reed. 1999. Genes Dev 13: 239-252; Deveraux, Q. L. et al. 1997. Nature 388: 300-304; Deveraux, Q. L. e J. C. Reed. 1999. Genes Dev 13: 239-252, os quais sãotodos aqui incorporados como referência em sua totalidade, quando relacionados à interação dos IAPs e das caspases). As proteínas mitocondriais Smac/DIABLO podem ligar e antagonizar os IAPs (Suzuki, Y. et al. 2001. J Biol Chem 276: 27058-27063) para suprimir a função do IAP (Wieland, I. et 5 al. 2000. Oncol Res 12: 491-500) (As referências citadas são todas incorporadas aqui como referência em sua totalidade, quando relacionadas à inibição dos IAPs). Assim, o modulador do presente método pode ser um inibidor da ligação dependente do CARD. O modulador pode afetar a capacidade de uma proteína contendo CARD para recrutar uma caspase ou modulador de caspase, tal como o IAP. O modulador pode ser uma substância (medicamento, molécula, polipeptídeo, proteína de fusão, anticorpo, fragmento de anticorpo, etc.) que liga uma proteína contendo CARD de tal modo que a proteína contendo CARD tenha ligação e recrutamento reduzidos dos IAPs. O modulador pode ser um fragmento de ligação da proteína contendo CARD de, por exemplo, caspase-1, caspase-2, caspase-4 ou caspase-5, cIAPl, cIAP2, XIAP ou survivina.
O modulador pode ainda ser um inibidor da expressão do gene protéico contendo IAP ou CARD na célula alvo. Existem vários métodos conhecidos de inibir a expressão de uma proteína em uma célula, incluindo as moléculas de formação de triplex, ribozimas, seqüências de orientação externa, moléculas anti-sentido e moléculas de RNAi.
As moléculas anti-sentido são projetadas para interagir com uma molécula alvo de ácido nucleico através do pareamento de base canônico ou não canônico. A interação da molécula anti-sentido e da molécula alvo é projetada para promover a destruição da molécula alvo através, por exemplo,
-----da degradação híbrida de RNA-DNA mediada por RNAseH.
Alternativamente, a molécula anti-sentido é projetada para interromper uma função de processamento que normalmente deva ter lugar sobre a molécula alvo, tal como a transcrição ou a replicação. As moléculas anti-sentido podemser projetadas com base na seqüência da molécula alvo. Numerosos métodos para otimização da eficiência anti-sentido mediante o encontro das regiões mais acessíveis da molécula alvo, existem. Métodos exemplares devem ser as experiências de seleção in vitro e os estudos de modificação do DNA com o uso de DMS e DEPC. É preferível que as moléculas anti-sentido se liguem à molécula alvo com uma constante de dissociação (IQ) menor ou igual a 10-6, 10-8, 10-10 ou 10-12. Uma amostra representativa dos métodos e técnicas que auxiliam no projeto e uso das moléculas anti-sentido pode ser encontrada nas Patentes U.S. 5.135.917, 5.294.533, 5.627.158, 5.641.754, 5.691.317,5.780.607, 5.786.138, 5.849.903, 5.856.103, 5.919.772, 5.955.590, 5.990.088, 5.994.320, 5.998.602, 6.005.095, 6.007.995, 6.013.522, 6.017.898, 6.018.042, 6.025.198, 6.033.910, 6.040.296, 6.046.004, 6.046.319 e 6.057.437, as quais são aqui incorporadas como referência em sua totalidade quanto aos métodos e técnicas concernentes às moléculas anti-sentido.
Os aptâmeros são moléculas que interagem com uma moléculaalvo, preferivelmente de uma maneira específica. Tipicamente os aptâmeros são ácidos nucleicos pequenos variando de 15 a 50 bases de comprimento, que se multiplicam em estruturas secundárias e terciárias definidas, tais como as alças tronco ou quartetos G. Os aptâmeros podem ligar as moléculaspequenas, tais como ATP (Patente U.S. 5.631.146) e teofilina (Patente U.S. 5.580.737), bem como moléculas grandes, tais como a transcriptase reversa (Patente U.S. 5.786.462) e a trombina (patente dos Estados Unidos 5.543.293). Os aptâmeros podem ligar-se muito firmemente com Kss da molécula alvo de menos do que 10"12M. É preferível que os aptâmeros liguem a molécula alvo com um de menos do que IO-6, 10"8, 10"10 ou IO-12. Os aptâmeros podenrligar-se à molécula alvo com um grau muito elevado de especificidade. Por exemplo, foram isolados aptâmeros que têm mais do que uma diferença de duplicação de 10.000 nas afinidades de ligação entre a molécula alvo e outra molécula que difira em apenas uma única posição sobrea molécula (Patente U.S. 5.543.293). É preferível que o aptamero tenha um Kd com a molécula alvo de pelo menos 10, 100, 1000, 10.000 ou 100.000 vezes menor do que o com uma molécula de ligação de base. É preferível, quando realizando a comparação para um polipeptídeo por exemplo, que a molécula de base seja um polipeptídeo diferente. Exemplos representativos de como fazer e usar aptâmeros para ligar uma variedade de diferentes moléculas alvo podem ser encontrados nas Patentes U.S. 5.476.766, 5.503.978, 5.631.146, 5.731.424, 5.780.228, 5.792.613, 5.795.721, 5.846.713, 5.858.660, 5.861.254, 5.864.026, 5.869.641, 5.958.691, 6.001.988, 6.011.020, 6.013.443, 6.020.130, 6.028.186, 6.030.776 e 6.051.698, as quais são aqui incorporadas como referência em sua totalidade, quanto aos métodos e técnicas relacionados aos aptâmeros.
As ribozimas são moléculas de ácido nucleico que são capazes de catalisar uma reação química, ou intramolecular ou intermolecularmente. As ribozimas são assim ácido nucleico catalítico. É preferível que as ribozimas catalisem as reações intermoleculares. Existem vários tipos diferentes de ribozimas que catalisam a nuclease ou as reações do tipo de ácido nucleico polimerase, que se baseiam nas ribozimas encontradas nos sistemas naturais, tais como as ribozimas cabeça de martelo (Patentes U.S.5.334.711, 5.436.330, 5.616.466, 5.633.133, 5.646.020, 5.652.094, 5.712.384, 5.770.715, 5.856.463, 5.861.288, 5.891.683, 5.891.684, 5.985.621, 5.989.908, 5.998.193, 5.998.203; Pedidos de Patente Internacional n- WO 9858058 por Ludwig e Sproat, WO 9858057 por Ludwig e Sproat, e WO 9718312 por Ludwig e Sproat) ribozimas grampo de cabelo (por exemplo, as Patentes U.S. 5.631.115, 5.646.031, 5.683.902, 5.712.384, 5.856.188, 5.866.701, 5.869.339
---------- e 6.022.962), e ribozimas tetraimenas (por exemplo, as Patentes U.S.
5.595.873 e 5.652.107). Existem também várias ribozimas que não são encontradas nos sistemas naturais, mas que têm sido engendradas para catalisar as reações específicas sob nova forma (por exemplo, as Patentes U.S.5.580.967, 5.688.670, 5.807.718 e 5.910.408). As ribozimas preferidas clivam os substratos de RNA ou de DNA e, mais preferível, clivam os substratos de RNA. As ribozimas tipicamente clivam os substratos de ácido nucleico através do reconhecimento e ligação do substrato alvo com a subseqüente clivagem. Este reconhecimento é freqüentemente baseado na maioria das vezes nas interações dos pares de base canônicas ou não canônicas. Esta propriedade torna as ribozimas particularmente bons candidatos para clivagem alvo específica dos ácidos nucleicos, porque o reconhecimento do substrato alvo baseia-se na seqüência de substratos alvo. Exemplos representativos de como produzir e usar as ribozimas para catalisar uma variedade de diferentes reações podem ser encontrados nas Patentes U.S. 5.646.042, 5.693.535, 5.731.295, 5.811.300, 5.837.855, 5.869.253, 5.877.021, 5.877.022, 5.972.699, 5.972.704, 5.989.906 e 6.017.756.
As moléculas triplex que formam ácido nucleico funcional são moléculas que podem interagir ou com ácido nucleico de filamento duplo ou de filamento único. Quando as moléculas triplex interagem com uma região alvo, uma estrutura denominada de um triplex é formada, em que existem três filamentos de DNA formando um complexo dependente tanto do pareamento de base de Watson-Crick quanto de Hoogsteen. As moléculas triplex são preferidas por que elas podem ligar regiões alvo com altas afinidade e especificidade. É preferível que as moléculas formadoras do triplex liguem a molécula alvo com um menor do que 10-6, 10-8, 10-10 ou 10-12. Exemplos representativos de como produzir e usar as moléculas formadoras de triplex para ligar uma variedade de diferentes moléculas alvo podem ser encontrados nas Patentes U.S. 5.176.996, 5.645.985, 5.650.316, 5.683.874, - 5.693.773, 5.834.185, 5.869.246, 5.874.566 e 5.962.426.
Seqüências guias externas (EGSs) são moléculas que se ligam a uma molécula de ácido nucleico alvo formando um complexo, e este complexo é reconhecido por RNase P, o qual cliva a molécula alvo. As EGSspodem ser designadas para especificamente alvejar uma molécula de RNA deescolha. A RNAse P auxilia no processamento do RNA de transferência(tRNA) dentro de uma célula. A RNAse P pode ser recrutada para clivarvirtualmente qualquer seqüência de RNA mediante o uso de uma EGS que faça com que o complexo alvo de RNA:EGS imite o substrato natural detRNA. [WO 92/03566 por Yale, e Forster e Altman, Science 238: 407-409(1990)].
De forma semelhante, a clivagem de RNA dirigida aEGS/RNAse P eucariótica pode ser utilizada para clivar alvos desejados dentro das células eucarióticas [Yuan et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:8006-8010 (1992); WO 93/22434 por Yale; WO 95/24489 por Yale; Yuan eAltman, EMBO J 14: 159-168 (1995), e Carrara et al, Proc. Natl. Acad. Sei.(USA) 92: 2627-2631 (1995)]. Exemplos representativos de como produzir eusar moléculas de EGS para facilitar a clivagem de uma variedade de diferentes moléculas alvo podem ser encontradas nas Patentes U.S. 5.168.053,5.624.824, 5.683.873, 5.728.521, 5.869.248 e 5.877.162.
A expressão de genes pode também ser eficazmente silenciadade uma maneira altamente específica através da interferência do RNA(RNAi). Este silêncio foi originalmente observado com a adição do RNA de filamento duplo (dsRNA) (Fire, A. et ai. (1998) Nature, 391: 806-811;Napoli, C. et al. (1990) Plant Cell 2: 279-289; Hannon, G. J. (2002) Nature,418: 244-251). Uma vez o dsRNA entre em uma célula, ele é clivado por umaenzima semelhante a RNase III, Dicer, em RNAs de interferência pequenos(siRNA) de filamento duplo de 21 a 23 nucleotídeos de comprimento, que contém 2 projeções de nucleotídeos nas extremidades 3' (Elbashir, S. M. et al.(2001) Genes Dev., 15: 188-200; Bernstein, E. et al. (2001) Nature, 409: 363-366; Hammond, S. M. et al. (2000) Nature, 404: 293-296). Em uma etapadependente de ATP, os siRNAs se tornam integrados em um complexoprotéico de múltiplas subunidades, comumente conhecido como o complexosilencioso induzido por RNAi (RISC), que guia os siRNAs para a seqüênciaalvo de RNA (Nykanen, A. et al. (2001) Cell, 107: 309-321). Em algum pontoo duplex de siRNA se desenrola, e parece que o filamento anti-sentidopermanece ligado ao RISC e dirige a degradação da seqüência complementardo mRNA por uma combinação de endo e exonucleases (Martinez, J. et al.(2002) Cell, 110: 563-574). No entanto, o efeito do iRNA ou siRNA ou seuuso não são limitados a qualquer tipo de mecanismo.
O RNA de interferência curto (siRNA) é um RNA de duplofilamento que pode induzir o silenciamento do gene pós-transcricionalespecífico da seqüência, dessa forma reduzindo ou mesmo inibindo aexpressão do gene. Em um exemplo, um siRNA deflagra a degradaçãoespecífica das moléculas de RNA homólogas, tais como os mRNAs, dentro daregião de identidade de seqüências tanto entre o siRNA quanto o RNA. Porexemplo, a WO 02/44321 apresenta siRNAs capazes de degradação específica da seqüência de mRNAs alvo quando pareados em base com as extremidades3' projetando-se, aqui incorporada como referência quanto ao método deproduzir estes siRNAs. O silenciamento dos genes específicos da seqüênciapode ser obtido em células de mamíferos com o uso de RNAs sintéticos defilamento duplo curtos que imitam os siRNAs produzidos pela enzima Dicer (Elbashir, S. M. et al. (2001) Nature, 411: 494-498) (Ui-Tei, K. et al. (2000)FEBS Lett 479: 79-82). o siRNA pode ser sintetizado quimicamente ou invitro ou pode ser o resultado dos RNAs semelhantes a grampo de cabelo defilamento duplo curtos (shRNAs) que são processados nos siRNAs dentro dacélula. Os siRNAs sintéticos são geralmente designados com o uso de algoritmos e um sintetizador de DNA/RNA convencional. Os fornecedoresincluem a Ambion (Austin, Texas), a ChemGenes (Ashland, Massachusetts),"Dharmacon (Lafayette, Colorado), Glen Research (Sterling, Virgínia), MWBBiotech (Esbersberg, Alemanha), Proligo (Boulder, Colorado) e Qiagen(Vento, Países Baixos). O siRNA também pode ser sintetizado in vitro com ouso de kits tais como o Kit de Construção de SiRNA SILENCER® daAmbion. São aqui apresentados quaisquer siRNA designados como descritoacima com base nas seqüências para c-Kit ou SCF. Por exemplo, os siRNAspara expressão dos genes silenciadores de c-Kit são comercialmentedisponíveis (siRNA c-Kit humano SURESILENCING®; Zymed Laboratories,San Francisco, CA).
A produção do siRNA de um vetor é mais comumente feitaatravés da transcrição de um RN A tipo grampo de cabelo curto (shRNAs). Oskits para a produção de vetores compreendendo shRNA acham-se disponíveis, por exemplo, os Kits de Construção GENESUPPRESSOR® da Imgenex e oplasmídeo de RNAi e vetores lentivírus indutíveis BLOCK-IT® da Invitrogen.Acham-se aqui apresentados quaisquer shRNA designados como descritoacima com base nas seqüências para os mediadores inflamatórios aquiapresentados.
Assim sendo, o modulador do presente método pode
compreender siRNA ou shRNA. O modulador pode ser um inibidor daexpressão de genes de cIAPl (acesso n2 gi: 41349435), cIAP2 (acesso n° gi:33946283), XIAP (acesso na gi: 1184319), survivina (acesso nfi gi: 2315862),DDX3 (SEQ ID NO: 25, acesso ns gi: 13514816), mda-5 (acesso n2 gi:
11344593) ou RIG-1 (acesso na gi: 6048564). Assim, o modulador podecompreender um shRNA derivado da seqüência de ácidos nucleicos de DDX3(SEQ ID NO: 25, acesso n2 gi: 13514816). Como um exemplo, o moduladorpode compreender um shRNA codificado pela seqüência de ácidos nucleicosSEQ ID NO: 10, 12, 14 ou 16.
Existem vários reagentes de transfecção que podem ser usados
— para a liberação do siRNA a uma célula, tais como, por exemplo, âLipofetamina 2000 da Invitrogen, o TransIT-TKO da Mirus, e o Reagente deTransfecção de siRNA RiboJuice da Novagen. Entretanto, os reagentes detransfecção geralmente não funcionam in vivo. O siRNA desnudo pode serliberado diretamente dentro da vasculatura de um indivíduo, o que tem avantagem de que nenhuma outra proteína é liberada ou expressa, o que écrítico já que os ácidos nucleicos não são imunogênicos. Existem tambémmétodos de liberar ácidos nucleicos através das barreiras epiteliais tais como a pele, com o uso de alguma forma de energia para romper o epitélio, porexemplo a sonoforese (Patente U.S. 5.421.816, Patente U.S. 5.618.275,Patente U.S. 6.712.805 e Patente U.S. 6.487.447, as quais são todas aquiincorporadas como referência quanto aos preceitos da liberação mediada peloultra-som dos compostos, através da pele). É fornecido um método de triar uma célula quanto a um
biomarcador de resistência a um agonista do receptor da morte,compreendendo ensaiar a célula quanto ao DDX3 total, ou um seu homólogo.É também fornecido um método de triar uma célula quanto a um biomarcadorde resistência a um agonista do receptor da morte, compreendendo ensaiar a associação do receptor da morte com uma proteína contendo CARD, em quealtos níveis de associação significam resistência ao agonista. A associaçãoentre o receptor da morte e a proteína contendo CARD indica resistência aoagonista. Opcionalmente, a célula a ser examinada é colocada em pré-contatocom um agonista do receptor da morte (por exemplo, anticorpo agonístico).Assim, é fornecido um método de triar uma célula quanto a um biomarcadorde resistência a um agonista do receptor da morte, compreendendo colocar emcontato a célula com um agonista do receptor da morte, e monitorar aassociação fracionária do receptor da morte com uma proteína contendoCARD, em que a associação significa resistência ao agonista. Opcionalmente,
25 nos vários métodos que envolvem detectar a associação, pode-se medir adissociação e subtrair a quantidade-dissociada do-total para calcular aquantidade associada.
A etapa de contato do presente método pode ser feita ou invivo ou in vitro. A monitoração da associação entre o receptor da morte e aproteína contendo CARD pode envolver o isolamento de um fragmentoprotéico (por exemplo, o receptor da morte) da(s) célula(s) usando anticorposespecíficos (por exemplo, por imunoprecipitação). Este método pode aindaenvolver a análise do fragmento protéico quanto às proteínas associadas (por exemplo, DDX3) mediante métodos de imunodetecção padrão, tais como oWestern Blot, o radioimunoensaio (RIA), ou ELISA. Estes métodos com baseem anticorpos são bem conhecidos na técnica e são facilmente ajustados acada receptor da morte, proteína contendo CARD, caspase e modulador dacaspase de interesse. Como uma ilustração, o presente método pode compreender o tratamento de uma célula de um indivíduo com anticorpo deTRA-8, isolando a proteína do lisado celular, imunoprecipitando a proteínaDR5, separando DR5 por eletroforese em SDS-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) (condições redutoras ou não redutoras), transferindo a proteínaseparada para uma membrana de nitrocelulose, e usando as técnicas padrão de
Western blot para detectar DDX3 associado com DR5, em que a associação éevidência da resistência ao TRA-8 nessa célula.
É igualmente fornecido um método de triar uma célula quantoa um biomarcador de resistência a um agonista do receptor da mortecompreendendo monitorar a associação de uma caspase ou modulador de caspase (exemplo, cIAPl, cIAP2, XIAP, survivina) com a proteína contendoCARD e comparando-se o nível de associação com uma amostra de células decontrole resistentes e não resistentes conhecidas. A associação de IAPs com aproteína contendo CARD em níveis semelhantes àquele das células resistentessignifica resistência ao agonista. Opcionalmente, a célula a ser examinada é pré-colocada em contato com um agonista do receptor da morte (por exemplo,anticorpo agonístico). " '
Como uma ilustração, o presente método pode compreender otratamento de uma célula de um indivíduo com anticorpo de TRA-8, isolandoa proteína do lisado celular, imunoprecipitando a proteína DDX3, separandoDDX3 por eletroforese em SDS-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)(condições redutoras ou não redutoras), transferindo a proteína separada parauma membrana de nitrocelulose, e usando as técnicas padrão de Western blotpara detectar caspases (por exemplo caspase-1, caspase-2, caspase-4, caspase-5) e IAPs (por exemplo, cIAPl, cIAP2, XIAP, survivina) associado comDDX3, em que a detecção dos IAPs com DDX3 é evidência da resistência aoTRA-8 naquela célula. O nível de associação pode ser comparado com umnível de controle. O nível de controle pode basear-se nas células nãoresistentes. Se o nível de teste for mais elevado do que aquele das células de controle não resistentes, então a resistência é indicada. O nível de controlepode basear-se nas células resistentes, de tal modo que uma similaridade entreos níveis de teste e os níveis de controle indique resistência.
É igualmente fornecido um método de triar quanto a ummodulador de uma proteína contendo CARD. Em particular, é aqui fornecido um tal método de triagem em que o modulador reverte ou previne umaresistência da célula alvo a um agonista do receptor da morte. As etapas dométodo de triagem compreende fazer o contato da proteína contendo CARDcom um agente candidato, e detectando-se uma mudança (por exemplo,decréscimo) em uma ou mais atividades da proteína contendo CARD na presença do agente candidato em comparação com a ausência do agentecandidato, em que a atividade ou a atividades se correlacionam com aresistência da célula alvo ao agonista do receptor da morte. Um decréscimo naatividade ou atividades da proteína contendo CARD indica que o agentecandidato modula a proteína contendo CARD. Este método pode ser modificado para utilizar proteína contendo CARD modificada, incluindo, por
------- exemplo, modificações de ocorrência natural ou modificações de ocorrência
não natural. Tais modificações podem incluir truncações, mutações, proteínasquiméricas, etc. Por exemplo, a seqüência da ácido nucleico para DDX3 éapresentada na SEQ ID NO: 25. Exemplos de mutações de DDX3 incluem assubstituições de adenosina em guanosina nas posições 1842 e 2493 na SEQID NO: 25.
Qualquer número de atividades da proteína contendo CARDpode ser avaliado nos métodos de triagem aqui descritos. Por exemplo, aatividade da proteína contendo CARD pode ser a fosforilação, incluindo, porexemplo, a fosforilação nos, ou perto dos, aminoácidos de ligação ao receptorda morte. Assim, o presente método pode compreender detectar a fosforilaçãoda proteína contendo CARD. Os ensaios com base celular ou livre de célulaspara detectar a fosforilação das proteínas são bem conhecidos na técnica eincluem o uso dos anticorpos, incluindo, por exemplo, a anti-Fosfosserine(Chemicon® AB 1603) (Chemicon, Temecula, CA), anti-Fosfotreonina(Chemicon® AB 1607), e anti-Fosfotirosina (Chemicon® ABI599). Osanticorpos específicos do sítio também podem ser gerados específicos para aforma fosforilada do DDX-3. Os métodos de gerar e usar referidos anticorpossão bem conhecidos na técnica.
Outra atividade da proteína contendo CARD que pode seravaliada nos métodos de triagem aqui descritos é a atividade de ligação. Porexemplo, a atividade da proteína contendo CARD pode ser ligada ao receptorda morte. Assim, o presente método pode compreender detectar a interaçãoentre a proteína contendo CARD e o receptor da morte. A atividade daproteína contendo CARD pode ser a ligação dependente do CARD. Assim, opresente método pode compreender detectar a ligação dependente do CARDa, por exemplo, cIAPl, cIAP2, XIAP, ou survivina. Os métodos para adetecção da ligação à proteína são bem conhecidos na técnica e incluem, porexemplo, a co-imunoprecipitação combinada com os ensaiosimunoabsorventesligados à enzima (ELISAs) ou Westemiylotting. Em outroexemplo, um ensaio de sanduíche pode ser usado, no qual um primeiroanticorpo captura o receptor da morte e em que um segundo anticorpo detectaa proteína contendo CARD. Em outro exemplo, um ensaio de sanduíche podeser usado em que um primeiro anticorpo captura a proteína contendo CARD eem que um segundo anticorpo detecta o receptor da morte.
Ainda aqui fornecidos são os ensaios de triagem em que aatividade avaliada da proteína contendo CARD é a clivagem, incluindo, porexemplo, a clivagem que ocorre durante a apoptose induzida pelo receptor damorte. Assim, o método de triagem pode compreender detectar a clivagem daproteína contendo CARD. Os métodos para a detecção da clivagem daproteína são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, o Westernblotting.
A etapa de contato do método de triagem pode ser feita ou invivo ou in vitro. O método de triagem pode ser ou com base celular ou livrede células. Assim, em um aspecto, a proteína contendo CARD se acha emuma célula alvo. A proteína contendo CARD pode ser de ocorrência naturalna célula ou a célula pode ser geneticamente engendrada para produzir aproteína contendo CARD. Em um método livre de células, a proteínacontendo CARD pode ser modificada para ser ligada a um substrato ou paraformar uma proteína quimérica.
Opcionalmente, o método de triagem pode ainda compreendero contato da célula alvo, ou um sistema não celular compreendendo umreceptor da morte, uma ou mais vezes com um agonista do receptor da morte,e detectar o nível de resistência ao agonista do receptor da morte. O nível deresistência ao agonista do receptor da morte pode ser detectado, por exemplo,pela medida da apoptose, um declínio na apoptose após exposição repetida aoagonista do receptor da morte indicando um aumento na resistência. Métodospara a detecção da apoptose são bem conhecidos na técnica e incluem, porexemplo, reagentes para detectar a rotulagem terminal do~entalhe de dUTPterminal (TÚNEL), a caspase3 ativa, a fosfatidilserina (PS) fosfolipídica dasuperfície celular pela Anexina V. Os reagentes para estes e outros métodospara detectar a apoptose acham-se comercialmente disponíveis.Em geral, os agentes candidatos podem ser identificados degrandes bibliotecas de produtos naturais ou extratos sintéticos (ou semi-sintéticos) ou bibliotecas químicas de acordo com métodos conhecidos natécnica. Aqueles habilitados no campo da descoberta e desenvolvimento de medicamentos entenderão que a fonte precisa dos extratos ou compostos deteste não é crítica para o(s) procedimento(s) de triagem da invenção.Conseqüentemente, virtualmente qualquer número de peptídeos, extratosquímicos ou compostos pode ser examinado com o uso dos métodos deexemplo aqui descritos. Exemplos de tais peptídeos, extratos ou compostos
incluem, sem limitar, os extratos à base de plantas, füngicos, procarióticos oude animais, caldos de fermentação, e compostos sintéticos, bem como amodificação dos compostos existentes. Numerosos métodos se achamtambém disponíveis para gerar a síntese aleatória ou dirigida (por exemplo,semi-síntese ou síntese total) de qualquer número de compostos químicos,
incluindo, mas sem limitar, os compostos à base de sacarídeos, lipídeos,peptídeos, polipeptídeos e ácidos nucleicos. As bibliotecas de compostossintéticos são comercialmente disponíveis, por exemplo, da BrandonAssociates (Merrimack, NH) e Aldrich Chemical (Milwaukee, WI).Alternativamente, as bibliotecas de compostos naturais na forma de extratos
bacterianos, füngicos, de plantas e de animais, acham-se comercialmentedisponíveis de várias fontes, incluindo Biotics (Sussex, Reino Unido), Xenova(Slough, Reino Unido), Harbor Branch Oceangraphics Institute (Ft. Pierce,Fia.), e PharmaMar, U.S.A. (Cambridge, Mass.). Além disso, as bibliotecasnaturais e sinteticamente produzidas são produzidas, se desejável, de acordo
com métodos conhecidos na técnica, por exemplo por métodos padrão de
extração e de fracionamento. Além disso^se desejável, qualquer biblioteca ou----
composto é facilmente modificado com o uso de métodos padrão químicos,físicos ou bioquímicos. Além disso, aqueles habilitados na técnica dadescoberta e desenvolvimento de medicamentoso facilmente entenderão queos métodos para desreplicação (por exemplo, a desreplicação taxonômica, adesreplicação biológica e a desreplicação química, ou qualquer combinaçãodestas) ou eliminação dos replicados ou de repetições de materiais jáconhecidos quanto ao seu efeito sobre uma atividade da proteína contendo CARD, devem ser empregados quando quer que seja possível.
Quando um extrato bruto seja observado ter uma atividadedesejada, outro fracionamento do extrato de derivação positiva é necessáriopara isolar os constituintes químicos responsáveis pelo efeito observado.Assim, o objetivo do processo de extração, fracionamento e purificação é acaracterização e identificação cuidadosas de uma entidade química dentro doextrato bruto tendo uma atividade que estimule ou iniba uma atividade daproteína contendo CARD. Os mesmos ensaios aqui descritos para a detecçãodas atividades nas misturas dos compostos podem se usados para purificar ocomponente ativo e testar seus derivados. Os métodos de fracionamento epurificação de tais extratos heterogêneos são conhecidos na técnica. Sedesejável, os compostos mostrados como sendo agentes úteis para tratamentosão quimicamente modificados de acordo com métodos conhecidos natécnica. Os compostos identificados como sendo de valor terapêutico podemser subseqüentemente analisados com o uso de modelos de animais para doenças ou condições em que seja desejável regular ou imitar uma atividadeda proteína contendo CARD.
É fornecido um método de monitorar a resistência a umagonista do receptor da morte em um indivíduo, compreendendo adquirir umaamostra biológica do indivíduo e detectar a associação de uma proteína contendo CARD com um receptor da morte na amostra, a associação
-------indicando-resistênciar Como descrito acimaro nível de associação pode ser
comparado com um nível de controle.
Como ilustração, o presente método pode compreender oisolamento de uma amostra biológica de um indivíduo, em que o indivíduotenha sido tratado com um anticorpo anti-DR5 terapêutico (por exemplo,TRA-8), isolando-se a proteína da amostra biológica, imunoprecipitando-se aproteína de DR5, separando-se DR5 por eletroforese em SDS-gel depoliacrilamida (SDS-PAGE) (condições redutoras ou não redutoras),transferindo a proteína separada para uma membrana de nitrocelulose, eusando-se anticorpos a DDX3 e as técnicas padrão de Western blot paradetectar DDX3 associado com DR5, em que a associação seja evidência daresistência ao TRA-8 nessa célula.
É fornecido um método de monitorar a resistência a umagonista do receptor da morte em um indivíduo, compreendendo adquirir umaamostra biológica do indivíduo e detectar a associação de uma caspase oumodulador da caspase com uma proteína contendo CARD na amostra, aassociação indicando resistência.
Como uma ilustração, o presente método pode compreender oisolamento de uma amostra biológica de um indivíduo em tratamento com umanticorpo anti-DR5 terapêutico (por exemplo, TRA-8), isolando-se a proteínada amostra biológica, imunoprecipitando-se a proteína de DDX-3, separando-se DDX-3 por eletroforese em SDS-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)(condições redutoras ou não redutoras), transferindo a proteína separada parauma membrana de nitrocelulose, e usando-se as técnicas padrão de Westernblot para detectar as caspases (por exemplo, a caspase 1, caspase-2, caspase-4,caspase-5) e IAPs (por exemplo, cIAPl, cIAP2, XIAP, survivina) associadascom DDX3, em que a detecção de cIAPl com DDX3, por exemplo, sejaevidência da resistência ao TRA-8 naquela célula.
É fornecido um método de monitorar a resistência ao agonista—do receptor da morte em umindivíduo, compreendendoadquirir uma~amostrabiológica do indivíduo e detectar a fosforilação do DDX3. Os métodos paradetectar a fosforilação das proteínas são bem conhecidos na técnica e incluemo uso de anticorpos, incluindo, por exemplo, a anti-Fosfosserina (Chemicon®AB 1603), anti-Fosfotreonina (Chemicon® AB 1607) e anti-Fosfotirosina(Chemicon® ABI599). Os anticorpos específicos do sítio podem também sergerados específicos para a forma fosforilada do DDX-3. Os métodos de gerare usar referidos anticorpos são bem conhecidos na técnica.
É fornecido um método de induzir seletivamente a apoptoseem uma célula alvo expressando um receptor da morte, compreendendo asetapas de colocar em contato a célula alvo com uma quantidade terapêutica deum agonista do receptor da morte, que especificamente se ligue ao receptor damorte, e administrar à célula alvo uma quantidade terapêutica de ummodulador de uma ou mais atividades de uma proteína contendo CARD.
A capacidade de um agonista e um modulador da proteínacontendo CARD, de induzir a apoptose, pode ser confirmada pela cultura decélulas tais como a linhagem Jurkat de células da leucemia humana(American Type Culture n° TIB-152) e a linhagem celular de astrocitomas1321N1 em meio em que a amostra de teste tenha sido adicionada. O índicede sobrevivência pode ser determinado, por exemplo, pelo uso de um ensaiode ATPLITE.
Os métodos e composições aqui fornecidos podem ser usadosno tratamento de doenças associadas com a sobrevivência ou proliferação nãoapropriadas das células, incluindo aquelas atribuíveis à desregulação dossistemas de apoptose no câncer ou em doenças inflamatórias e autoimunes. Asdoenças inflamatórias e autoimunes ilustrativamente incluem o lúpuseritematoso sistêmico, a doença de Hashimoto, a artrite reumatóide, a doençaenxerto-versus-hospedeiro, a síndrome de Sjõgren, a anemia perniciosa, adoença de Addison, esclerodermia, síndrome de Goodpasture, doença de—Grohn, anemia hemolíticaautoimune, esterilidade, miastenia grave, esclerosemúltipla, doença de Basedow, trombopenia púrpura, diabete melito insulino-dependente, alergia, asma, doença atópica, arteriosclerose, miocardite,cardiomiopatia, nefrite glomerular, anemia hipoplástica, rejeição após otransplante de órgãos. Os cânceres incluem numerosas malignidades dospulmões, da próstata, do fígado, dos ovários, do cólon, cérvix, tecidoslinfáticos e das mamas. Assim, as composições e métodos fornecidos podemainda ser usados para alvejar e seletivamente induzir a apoptose nas célulasimunes ativadas, incluindo os linfócitos ativados, as células linfóides, ascélulas mielóides e as células sinoviais reumatóides (incluindo sinoviócitosinflamatórios, sinoviócitos semelhantes a macrófago, sinoviócitossemelhantes a fibroblasto) e nas células viralmente infectadas (incluindoaquelas infectadas com o HIV), por exemplo), contanto que aquelas célulasalvejadas expressem ou possam ser produzidas para expressar os receptoresda morte específicos (isto é, DR4 ou DR5).
É fornecido um método de tratamento de um indivíduo comcâncer ou com uma doença autoimune ou inflamatória, compreendendoadministrar ao indivíduo uma quantidade terapêutica de um agonista doreceptor da morte e um modulador de uma ou mais atividades de umaproteína contendo CARD, em que o modulador reduz a resistência ao agonistado receptor da morte.
Como usada na totalidade deste relatório, uma "quantidadeterapêutica" de um agonista do receptor da morte e/ou modulador da proteína
contendo CARD, é a quantidade suficiente para causar a apoptose na célulaalvo. Como aqui usados, as expressões "quantidade terapêutica"e "quantidadefarmaceuticamente eficaz" são sinônimas. Uma pessoa de experiência natécnica pode facilmente determinar a quantidade terapêutica apropriada.
No tratamento da doença, por exemplo câncer, doenças autoimunes e inflamatórias, as combinações de tratamento podem também serusadas. Por exemplo, os agonistase moduladores da proteína contendo CARDdos métodos e composições fornecidas, podem ser administrados emcombinação com outros agentes terapêuticos. Como aqui usado, um "agenteterapêutico" é um composto ou composição eficazes em melhorar umacondição patológica. A radioterapia pode também ser combinada com ou semoutros agentes terapêuticos. Uma pessoa habilitada na técnica deve adaptar aforma de radioterapia à doença.
Exemplos de agentes terapêuticos incluem os agentesquimioterápicos, agentes antiinflamatórios, Medicamento Anti-ReumáticoModificador da Doença (DMARDs), anticorpos, membros da família do TNF,agentes antivirais, agentes anti-oportunistas, antibióticos, imunossupressores,imunoglobulinas, agentes antimaláricos, agentes da artrite anti-reumatóide,citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento, e compostos anticâncer. Umcomposto anticâncer é um composto ou composição eficazes na inibição ouretenção do desenvolvimento de uma célula de crescimento anormal.Exemplos ilustrativos de compostos anticâncer incluem: bleomicina,carboplatina, clorambucil, cisplatina, colquicina, ciclofosfamida,daunorrubicina, dactinomicina, dietilestilbestrol, doxorrubicina, etoposide, 5-fluorouracil, floxuridina, melfalan, metotrexato, mitomicina, 6-mercaptopurina, teniposide, 6-tioguanina, vincristina e vinblastina. Outrosexemplos de compostos e agentes terapêuticos anticâncer são encontrados noThe Merck Manual of Diagnosis e Therapy, 15â Edição, Berkow et ai, eds.,1987, Rahway, N. J. e Sladek et al. Metabolism and Action of Anti-CancerDrugs, 1987, Powis et al. eds., Taylor e Francis, New York, N.Y.
O inibidor de PKC, a bisindolimaleimida VIII (BisVIII),facilita muito a apoptose mediada por Fas (Zhou, T. et al. 1999. Nat Med 5:42-48). Foi observado que essa ativação sinergísticada via de JNK/p38desempenha um importante papel (Ohtsuka, T. e T. Zhou. 2002. J Biol Chem277: 29294-29303), e que a intensificação da apoptose mediada pelo DR5 portrês agentes quimioterápicos comuns parece ocorrer através de um mecanismosemelhante (Ohtsuka, T., D. et al. 2003. Oncogene 22: 2034-2044). Assim, osmétodos fornecidos podem ainda compreender o uso de compostos indutoresda apoptose, tais como o bisindolilmaleimida VIII (BisVIII) ou outros agentessensibilizantes como o SN-50 ou o LY294002. Assim, os agonistas e osmoduladores da proteína contendo CARD dos métodos e composiçõesfornecidas podem ser combinados com BisVIII. Os agonistas e moduladoresda proteína contendo CARD dos métodos e composições fornecidas podem ainda ser combinados com uma droga antiinflamatória não esteróide (NSAID)(por exemplo, o sulfeto de sulindaco ou outros inibidores de COX-1 ou COX-2).
A terapia usando os agonistas dos métodos e composiçõesfornecidas também podem ser combinada com a terapia usando outros
agonistas. Por exemplo, um anticorpo para DR5 pode ser administrado a umindivíduo em sua necessidade junto, antes ou em seguida à administração deum anticorpo ao DR4. Tal terapia de anticorpos combinados pode ser aindacombinada com a administração de um ou mais dos moduladores da proteínacontendo CARD aqui fornecida, e pode ainda ser combinada com outros
agentes terapêuticos.
É fornecida uma composição compreendendo um agonista doreceptor da morte e um agente que module uma ou mais atividades de umaproteína contendo CARD, em que o modulador reduza a resistência aoagonista do receptor da morte. A composição fornecida pode compreender
ainda um agente terapêutico selecionado do grupo consistindo em um agentequimioterápico, um membro da família do TNF, um agente antiviral, agentesantiinflamatórios, agentes anti-oportunistas, antibióticos, imunossupressores,imunoglobulinas, agentes antimaláricos, agentes da artrite anti-reumatóides,citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento.
Os termos "proteína", "peptídeo", "polipeptídeo" ou "porção
peptídica"são usados intercambiavelmente neste relatório e são aqui usadospara significar dois ou mais aminoácidos ligados por uma ligação peptídica. Otermo "fragmento" é aqui usado para referir-se a uma porção de umpolipeptídeo ou proteína de comprimento completo, tal porção podendo serproduzida por uma reação proteolítica sobre um polipeptídeo, isto é, umpeptídeo produzido após a clivagem de uma ligação peptídica nopolipeptídeo. Deve ser reconhecido que o fragmento não precisanecessariamente ser produzido por uma reação proteolítica, mas pode ser produzido com o uso de métodos de síntese química ou métodos da tecnologiade DNA recombinante, para produzir um polipeptídeo sintético. Deve serreconhecido que os termos "proteína" e "polipeptídeo" não são aqui usadospara sugerir um tamanho ou número particular de aminoácidoscompreendendo a molécula, e que um peptídeo da invenção pode conter até vários resíduos de aminoácido ou mais.
Por "isolado" ou "purificado" denota-se uma composição (porexemplo, um polipeptídeo ou ácido nucleico) que seja substancialmente livrede outros materiais, incluindo materiais com os quais a composição estejanormalmente associada por natureza. Os polipeptídeos da invenção, ou seus fragmentos, podem ser obtidos, por exemplo, por extração de uma fontenatural (por exemplo, fago), por expressão de um ácido nucleicorecombinante codificando o polipeptídeo (por exemplo, em uma célula ou emum sistema de translação livre de células) ou quimicamente sintetizando opolipeptídeo. Além disso, os fragmentos de polipeptídeo podem ser obtidos por qualquer destes métodos, ou por clivagem dos polipeptídeos decomprimento completo. Um fragmento de uma proteína ou polipeptídeo dereferência inclui apenas aminoácidos contíguos da proteína/polipeptídeo dereferência, e é pelo menos um aminoácido mais curto do que a seqüência dereferência.
Quando as proteínas específicas são referidas neste relatório,
as variantes, derivados e~ fragmentos são considerados. As variantes ederivados protéicos são bem entendidos por aqueles de experiência na técnicae podem envolver as modificações das seqüências de aminoácidos. Porexemplo, as modificações das seqüências de aminoácidos tipicamente sesituam dentro de uma ou mais de três classes: variantes substitutivas, deinserção ou de deleção. As inserções incluem fusões terminais de amino e/oucarboxila, bem como inserções entre seqüências de resíduos únicos oumúltiplos de aminoácidos. As inserções ordinariamente serão inserções menores do que aquelas das fusões terminais amino ou carboxila, porexemplo, da ordem de um a quatro resíduos. As deleções são caracterizadaspela remoção de um ou mais resíduos de aminoácidos da seqüência deproteínas. Tipicamente, não mais do que cerca de 2 a 6 resíduos são deletadosem qualquer um sítio dentro da molécula protéica, mas a deleção pode variar de 1 a 30 resíduos. Estas variantes ordinariamente são preparadas pormutagênese específica do sítio dos nucleotídeos no DNA codificando aproteína, desse modo produzindo DNA codificando a variante, e depois dissoexpressando o DNA na cultura celular recombinante. As técnicas paraproduzir mutações de substituição nos sítios predeterminados no DNA tendouma seqüência conhecida são bem conhecidas e incluem, por exemplo, amutagênese do iniciador Ml3 e a mutagênese de PCR. As substituições deaminoácidos são tipicamente de resíduos únicos, mas podem ocorrer emvárias localizações diferentes ao mesmo tempo; as inserções usualmente serãoda ordem de cerca de 1 a 10 resíduos de aminoácidos. As deleções ouinserções preferivelmente são feitas em pares adjacentes, isto é, uma deleçãode 2 resíduos ou inserção de 2 resíduos. As substituições, deleções, inserçõesou qualquer combinação destas podem ser combinadas para se chegar a umaconstrução final. As mutações não devem colocar a seqüência fora da matrizde leitura e, preferivelmente, não criarão regiões complementares que possam produzir estrutura de mRNA secundária, a menos que uma tal mudança naestrutura secundária do mRNA seja desejada. Variantes substitutivas sãoaquelas em que pelo menos um resíduo tenha sido removido e um diferenteresíduo tenha sido introduzido em seu lugar. Tais substituições geralmentefeitas de acordo com a Tabela 1 a seguir são referidas como substituições<table>table see original document page 56</column></row><table>glutamil ou aspartil; ou (d) um resíduo tendo uma cadeia lateral de massa, porexemplo fenilalanina, substitui (ou é substituído por) um não tendo umacadeia lateral, por exemplo glicina, e (e) pelo aumento do número de sítiospara sulfatação e/ou glicosilação. Por exemplo, a substituição de um resíduo de aminoácido por
outro que seja biológica e/ou quimicamente semelhante é conhecida daspessoas habilitadas na técnica como uma substituição conservativa. Porexemplo, uma substituição conservativa deve substituir um resíduohidrofóbico por outro, ou um resíduo polar por outro. As substituições incluem as combinações apresentadas na Tabela 1. As variaçõesconservativamente substituídas de cada seqüência explicitamente apresentada,são incluídas dentro dos polipeptídeos aqui fornecidos.
Tipicamente, as substituições conservativas têm pouco ounenhum impacto sobre a atividade biológica de um polipeptídeo resultante.Em um exemplo particular, uma substituição conservativa é uma substituiçãode aminoácido em um peptídeo que não afete substancialmente a funçãobiológica do peptídeo. Um peptídeo pode incluir uma ou mais substituições deaminoácido, por exemplo de 2 a 10 substituições conservativas, de 2 a 5substituições conservativas, de 4 a 9 substituições conservativas, tal como 2, 5 ou 10 substituições conservativas.
Um polipeptídeo pode ser produzido de modo a conter uma oumais substituições conservativas mediante a manipulação da seqüência denucleotídeos que codifica esse polipeptídeo com o uso, por exemplo, deprocedimentos padrão tais como a mutagênese dirigida ao sítio ou PCR. Alternativamente, um polipeptídeo pode ser produzido de modo a conter umaou mais substituições conservativas mediante o uso de métodos padrão desíntese de peptídeos. Uma varredura da alanina pode ser usada para identificarquais resíduos de aminoácidos em uma proteína pode tolerar uma substituiçãode aminoácido. Em um exemplo, a atividade biológica da proteína não éreduzida em mais do que 25 %, por exemplo não mais do que 20 %, porexemplo não mais do que 10 %, quando a alanina, ou outro aminoácidoconservativo (tal como aqueles listados abaixo), substitui um ou maisaminoácidos nativos.
Informações adicionais acerca das substituições conservativaspodem ser encontradas, entre outros, em Ben-Bassat et al, (J. Bacteriol. 169:751-757, 1987), 0'Regan et al, (Gene 77: 237-251, 1989), Sahin-Toth et al,(Protein Sei. 3: 240-247, 1994), Hochuli et al, (Bio/Technology 6: 1321-1325, 1988) e nos livros de texto padrão de genética e biologia molecular.
A mutagênese substitutiva ou por deleção pode ser empregadapara introduzir sítios para a N-glicosilação (Asn-X-Thr/Ser) ou O-glicosilação(Ser ou Thr). As deleções da cisteína ou de outros resíduos lábeis tambémpodem ser desejáveis. As deleções ou substituições dos sítios de proteólisepotencial, por exemplo Arg, são realizadas, por exemplo, pela deleção de umdos resíduos básicos ou substituindo-se um deles por resíduos de glutaminilou histidil.
Certas derivações pós-translacionais são o resultado da ação decélulas hospedeiras recombinantes sobre o polipeptídeo expresso. Os resíduosde glutaminil e de asparaginil são com freqüência pós-translacionalmentedesamidados nos resíduos correspondentes de glutamil e asparil.Alternativamente, estes resíduos são desamidados sob condições brandamenteacídicas. Outras modificações pós-translacionais incluem a hidroxilação daprolina e da lisina, a fosforilação dos grupos hidroxila dos resíduos seril outreonil, a metilação dos grupos o-amino das cadeias laterais da lisina, argininae histidina [T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties,W. H. Freeman & Co., San Francisco pp 79-86 (1983)], a acetilação da amina~N-terminal e, em alguns casos, a amidação da carboxila C-terminal.
Entende-se que existem numerosos análogos de aminoácido ede peptídeo que podem ser incorporados nas composições apresentadas. Porexemplo, existem numerosos aminoácidos D ou aminoácidos que têm umsubstituinte funcional diferente dos aminoácidos apresentados na Tabela 1. Osestereoisômeros opostos dos peptídeos de ocorrência natural sãoapresentados, assim como os estereoisômeros dos análogos peptídicos. Estesaminoácidos podem ser facilmente incorporados nas cadeias de polipeptídeosmediante a carga de moléculas de tRNA com o aminoácido de escolha eengendrando-se construções genéticas que utilizem, por exemplo, códons deâmbar, para introduzir o aminoácido análogo em uma cadeia de peptídeos emuma meio específico do sítio [Thorson et al, Methods in Molec. Biol. 11: 43-73 (1991), Zoller, Current Opinion in Biotechnology, 3: 348-354 (1992);Ibba, Biotechnology & Genetic Engineering Reviews 13: 197-216 (1995),Cahill et al, TIBS, 14(10): 400-403 (1989); Benner, TIB Tech, 12: 158-163(1994); Ibba e Hennecke, Bio/technology, 12: 678-682 (1994), todos os quaissendo aqui incorporados como referência pelo menos quando ao materialrelacionado aos análogos de aminoácidos].
Podem ser produzidas moléculas que se assemelhem aospolipeptídeos, porém que não sejam conectados através de uma articulaçãopeptídica natural. Por exemplo, as articulações quanto aos aminoácidos ou aosanálogos de aminoácidos podem incluir ~CH2NH~, ~CH2S-, -CH2~CH2-,-CH=CH- (eis e trans), ~COCH2~, -CH(OH)CH2- e -CHH2SO~ (Estas eoutras podem ser encontradas em Spatola, A. F. em Chemistry andBiochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, eds.,Mareei Dekker, New York, p. 267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (Marçode 1983), Vol. 1, Tiragem 3, Peptide Backbone Modifications (generalreview); Morley, Trends Pharm Sei (1980) pp. 463-468; Hudson, D. et ai, Int
-------- J Pept Prot Res 14: 177-185 (1979) (~CH2NH~, CH2CH2~); Spatola et al
Life Sei 38: 1243-1249 (1986) (-CHH2-S); Hann J. Chem. Soe Perkin Trans.1307-1314 (1982) (—CH--CH--, eis e trans); Almquist et al J. Med. Chem.23: 1392-1398 (1980) (~COCH2~); Jennings-White et al. Tetrahedron Lett23: 2533 (1982) (--COCH2--); Szelke et al. Pedido Europeu, EP 45665 CA(1982): 97: 39405 (1982) (--CH(OH)CH2--); Holladay et al. Tetrahedron. Lett24: 4401-4404 (1983) (-C(OH)CH2--); e Hruby Life Sei 31: 189-199 (1982)(~CH2~S~); cada um dos quais sendo aqui incorporado como referência.Uma articulação não peptídica particularmente preferida sendo ~CH2NH~.Fica entendido que os análogos peptídicos podem ter mais do que um átomoentre os átomos de ligação, tais como b-alanina, ácido g-aminobutírico, eoutros.
Os análogos de aminoácidos e análogos e análogos de peptídeofreqüentemente têm propriedades intensificadas ou desejáveis, tais como aprodução mais econômica, maior estabilidade química, propriedadesfarmacológicas intensificadas (meia-vida, absorção, potência, eficácia etc),especificidade alterada (por exemplo, um amplo espectro de atividadesbiológicas), antigenicidade reduzida, e outras. Os aminoácidos D podem serusados para gerar peptídeos mais estáveis, porque os aminoácidos D não sãoreconhecidos pelas peptidases etc. A substituição sistemática de um ou maisaminoácidos de uma seqüência de consenso com um aminoácido D do mesmotipo (por exemplo, a lisina D no lugar da lisina L) pode ser usada para gerarpeptídeos mais estáveis. Os resíduos de cisteína podem ser usados paraciclizar ou ligar dois ou mais peptídeos entre si. Isto pode ser benéfico parasujeitar os peptídeos a conformações particulares. (Rizo e Gierasch Ann. Rev.Biochem. 61: 387 (1992), aqui incorporado como referência).
É entendido que uma maneira de definir qualquer variantes,modificações ou derivados dos genes e proteínas apresentadas neste relatórioé através da definição das variantes, modificação e derivados em termos dehomologia a seqüências específicas conhecidas. Especificamente apresentadassão as variantes dos ácidos nucleicos e polipeptídeos aqui apresentados, osquais têm 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87,88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 por cento de homologia com aseqüência estabelecida ou conhecida. Aqueles de experiência na técnicafacilmente entendem como determinar a homologia de duas proteínas ouácidos nucleicos. Por exemplo, a homologia pode ser calculada após oalinhamento das duas seqüências, de modo que ela esteja em seu nível mais elevado.
Outro meio de calcular a homologia pode ser realizado pelosalgoritmos publicados. O alinhamento ótimo das seqüências para comparaçãopode ser conduzido pelo algoritmo de homologia local de Smith e WatermanAdv. Appl. Math. 2: 482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento da homologia
de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), pela pesquisa quantoao método de similaridade de Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.85: 2444 (1988), pelas implementações computadorizadas destes algoritmos(GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Pacote de Programas de GenéticaWisconsin, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por
inspeção. Estas referências são aqui incorporadas como referência em suatotalidade quanto aos métodos de calcular a homologia.
Os mesmos tipos de homologia podem ser obtidos para osácidos nucleicos mediante, por exemplo, os algoritmos apresentados emZuker, M. Science 244: 48-52, 1989, Jaeger et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA
86: 7706-7710, 1989, Jaeger et al. Methods Enzymol. 183: 281-306, 1989, osquais são aqui incorporados como referência pelo menos quanto ao materialrelacionado ao alinhamento do ácido nucleico.
As composições fornecidas podem ser administradas pelas viasoral, retal, intracisternal, intraventricular, intracraniana, intra-articular,
intravaginal, parenteral (intravenosa, intramuscular ou subeutânea), local
-----------(pós, ungüentos ou gotas), por injeção-intraperitoneal, transdérmica, por
inalação ou como uma pulverização bucal ou nasal. A quantidade exata doanticorpo ou agente terapêutico necessária variará de indivíduo paraindivíduo, dependendo da idade, do peso e das condições gerais do indivíduo,da severidade da doença que esteja sendo tratada, da localização e do tamanhodo tumor, dos compostos particulares usados, do modo de administração, etc.Uma quantidade apropriada pode ser determinada por uma pessoa deexperiência normal na técnica com o uso apenas da experimentação de rotinadada nos preceitos deste relatório. As dosagens únicas típicas do anticorpovariam de 0,1 a 10.000 microgramas, preferível entre 1 e 100 microgramas.As concentrações típicas dos anticorpos em um carreador varia de 0,2 a 2000nanogramas por mililitro liberado. Para injeção em uma articulação, osvolumes de anticorpo e carreador variarão dependendo da articulação, masaproximadamente 0,5 a 10 ml e, de preferência, 1 a 5 ml, são injetados em umjoelho humano e aproximadamente 0,1 a 5 ml, e preferivelmente 1 a 2 ml, notornozelo humano.
A composição ainda pode compreender um carreadorfarmaceuticamente aceitável. Por "farmaceuticamente aceitável" denota-seum material que não seja biologicamente ou de outra forma indesejável, oqual possa ser administrado a um indivíduo junto com o substrato selecionadosem causar efeitos biológicos significativos indesejáveis ou interagir de umamaneira deletéria com qualquer um dos outros componentes da composiçãofarmacêutica em que ele esteja contido.Dependendo do modo de administração pretendido, o
anticorpo ou agente terapêutico pode estar em composições farmacêuticas nasformas de dosagem sólida, semi-sólida ou líquida, tais como, por exemplo,tabletes, supositórios, pílulas, cápsulas, pós, líquidos ou suspensões,preferivelmente na forma de dosagem unitária adequada para administração única de uma dosagem precisa. As composições incluirão uma quantidadeeficaz do substrato selecionador em combinação com" um carreadorfarmaceuticamente aceitável e, além disso, podem incluir outros agentesmedicinais, agentes farmacêuticos, carreadores ou diluentes. Composiçõesadequadas para injeção parenteral podem compreender soluções aquosas ounão aquosas estéreis fisiologicamente aceitáveis, dispersões, suspensões ouemulsões, e pós estéreis para reconstituição em soluções ou dispersõesinjetáveis estéreis. Exemplos de carreadores aquosos e não aquososadequados, diluentes, solventes ou veículos incluem água, etanol, polióis (propileno glicol, polietileno glicol, glicerol e outros), misturas adequadasdestes, óleos vegetais (tais como o azeite) e ésteres orgânicos injetáveis, taiscomo o oleato de etila. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo,pelo uso de um revestimento tal como a lecitina, pela manutenção do tamanhode partícula requerido no caso das dispersões, e pelo uso de tensoativos.
Estas composições também podem conter adjuvantes tais
como agentes preservativos, umectantes, emulsificantes, e de dispensação. Aprevenção da ação dos microorganismos pode ser garantida por vários agentesantibacterianos e antifungicos, por exemplo parabenos, clorobutanol, fenol,ácido sórbico, e outros. Pode também ser desejável incluir agentes isotônicos, por exemplo açúcares, cloreto de sódio e outros. A absorção prolongada daforma farmacêutica injetável pode ser causada pelo uso de agentes deabsorção retardada, por exemplo o monoestearato de alumínio e a gelatina.
As formas de dosagem sólida para administração oral incluemas cápsulas, tabletes, pílulas, pós e grânulos. Em tais formas de dosagem sólida, o composto ativo é misturado com pelo menos um excipiente (oucarreador) costumeiro inerte, tal como o citrato de sódio ou o fosfato dicálcicoou (a) enchedores ou extensores, como, por exemplo, amidos, lactose,sacarose, glicose, manitol e ácido salicílico, (b) aglutinantes, como, porexemplo, carboximetilcelulose, alignatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarose e acácia, (c) umectantes como, por exemplo, glicerol, (d) agentesdesintegrantes, como, por exemplo, ágar-ágar, carbonato cie cálcio, fécula debatata ou de mandioca, ácido algínico, certos silicatos complexos, e carbonatode sódio, (e) retardadores de solução, como, por exemplo, a parafina, (f)aceleradores da absorção, como, por exemplo, os compostos de amônioquaternário, (g) agentes umectantes, como, por exemplo, o álcool cetílico e omonoestearato de glicerol, (h) adsorventes, como, por exemplo, o caulim e abentonita, e (i) lubrificantes, como, por exemplo, talco, estearato de cálcio,estearato de magnésio, polietilenos glicóis sólidos, lauril sulfato de sódio, ou misturas destes. No caso de cápsulas, tabletes e pílulas, as formas de dosagempodem também compreender agentes de tamponamento.
As composições sólidas de um tipo semelhante também podemser empregadas como enchedores em cápsulas de gelatina enchidas macias eduras com o uso de excipientes tais como lactose ou açúcar lácteo, bem comopolietilenoglicóis de elevado pelo molecular, e outros.
As formas sólidas de dosagem, tais como tabletes, drágeas,cápsulas, pílulas e grânulos, podem ser preparadas com revestimentos ecascas, tais como revestimentos entéricos e outros bem conhecidos na técnica.Elas podem conter agentes opacificadores, e podem também ser de composição tal que elas liberem o composto ou compostos ativos em umacerta parte do trato intestinal, de uma maneira retardada. Exemplos decomposições de inclusão que podem ser usadas são as substâncias poliméricase as ceras. Os compostos ativos podem também estar na forma micro-encapsulada, se apropriado, com um ou mais dos excipientes acima mencionados.
As formas de dosagem líquidas para administração oralincluem as emulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixiresfarmaceuticamente aceitáveis. Além dos compostos ativos, as formas dedosagem líquidas podem conter diluentes inertes comumente usados na técnica, tais como água ou outros solventes, agentes solubilizantes, e-------- emulsificantes, como, por exemplo, o-álcool etílico, álcool isopropílico,carbonato de etila, acetato de etila, álcool benzílico, benzoato de benzila,propileno glicol, 1,3-butileno glicol, dimetilformamida, óleos, em particular oóleo de semente de algodão, óleo de amendoim, óleo de germe de milho, óleode oliva, óleo de mamona e óleo de sésamo, glicerol, álcooltetraidrofurfurílico, polietileno glicóis e ésteres de ácidos graxos de sorbitano,ou misturas destas substâncias, etc.
Além de tais diluentes inertes, a composição também pode incluir adjuvantes, tais como os agentes umectantes, agentes emulsificantes ede suspensão, edulcorantes, aromatizantes e agentes de fragrância.
As suspensões, além dos compostos ativos, podem conteragentes de suspensão, como, por exemplo, os álcoois isoestearílicosetoxilados, polioxietileno sorbitol e os ésteres de sorbitano, a celulose microcristalina, metaidroxido de alumínio, bentonita, ágar-ágar e tragacanto,ou misturas destas substâncias, etc.
As composições para administração retal são preferivelmentesupositórios que podem ser preparados pela mistura dos compostos dapresente invenção com excipientes ou carreadores não irritantes adequados,tais como a manteiga de cacau, o polietileno glicol ou uma cera desupositório, que sejam sólidos na temperatura comum, mas líquidos natemperatura do corpo e que, portanto, derretam no reto ou na cavidade vaginale liberem o componente ativo.
As formas de dosagem para administração tópica de umcomposto desta invenção incluem ungüentos, pós, pulverizações e inalantes.O componente ativo é misturado sob condições estéreis com um carreadorfisiologicamente aceitável e quaisquer preservativos, tampões ou propulsores,conforme possa ser necessário. As formulações oftálmicas, ungüentos, pós esoluções são também consideradas como situando-se dentro do escopo destainvenção.
----------- A' expressão "sais;- ésteres, amidas e pró-medicamentosfarmaceuticamente aceitáveis" como aqui usada refere-se àqueles sais decarboxilato, sais de adição de aminoácidos, ésteres, amidas, e pró-medicamentos dos compostos da presente invenção, que se situam dentro doescopo do julgamento médico idôneo, adequados para uso em contato com ostecidos dos indivíduos sem as indevidas toxicidade, irritação, respostaalérgica, etc, em ligação com uma relação razoável de benefício/ risco, eeficaz quando ao seu uso pretendido, bem como as formas zwitteriônicas, quando possível, dos compostos da invenção. O termo "sais" refere-se aossais de adição de ácidos inorgânicos e orgânicos, relativamente não tóxicos,dos compostos da presente invenção. Estes sais podem ser preparados in situdurante o isolamento e a purificação finais dos compostos ou pela reaçãoseparada do composto purificado em sua forma de base livre com um ácido orgânico ou inorgânico adequado, e isolando-se o sal assim formado. Saisrepresentativos incluem os sais bromídricos, clorídricos, de sulfato, bissulfato,nitrato, acetato, oxalato, valerato, oleato, palmitato, estearato, laurato, borato,benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato,tartarato, naftilato, mesilato, glicoeptonato, lactobionato, metano sulfonato elaurilsulfonato, e outros. Estes podem incluir cátions com base nos metaisalcalinos e alcalino-terrosos, tais como o sódio, lítio, potássio, cálcio,magnésio e outros, bem como cátions não tóxicos de amônio, amônioquaternário e amina, incluindo, porém sem limitar, amônio, tetrametilamônio,tetraetilamônio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina,
etilamina, e outros. (Ver, por exemplo, S. M. Barge et ai, "PharmaceuticalSalts" J. Pharm. Sei., 1977, 66: 1-19, que é aqui incorporado comoreferência).
É fornecido um ácido nucleico isolado compreendendo RNAde filamento duplo (dsRNA) para uso na interferência do RNA (RNAi). O dsRNA pode ser RNA de interferência curta (siRNA) ou RNA tipo grampo de
-------- cabelo curto (shRNA). Assim, é fornecido um~ácido nucleico isolado
compreendendo um shRNA, em que o shRNA inibe a expressão de umaproteína contendo CARD. O shRNA pode ser codificado pela seqüência deácido nucleico SEQ ID NO: 10, 12, 14 ou 16.Os ácidos nucleicos apresentados são compostos, por exemplo,de nucleotídeos, análogos de nucleotideos ou substitutos de nucleotídeos.Exemplos não limitativos destas e de outras moléculas são examinados nesterelatório. Entende-se, por exemplo, que, quando um vetor seja expresso emuma célula, o mRNA expresso será tipicamente composto de A, C, G e U. Damesma forma, entende-se, por exemplo, que, se uma molécula anti-sentido forintroduzida em uma célula ou ambiente celular através, por exemplo, deliberação exógena, será vantajoso que a molécula anti-sentido seja compostade análogos de nucleotídeos que reduzam a degradação da molécula anti- sentido no ambiente celular.
Por "ácido nucleico isolado" ou "ácido nucleico purificado"denota-se o DNA que é livre dos genes que, no genoma de ocorrência naturaldo organismo do qual o DNA da invenção seja derivado, flanqueiam o gene.A expressão, portanto, inclui, por exemplo, um DNA recombinante que é incorporado em um vetor, tal como um plasmídeo ou vírus de replicaçãoautônoma; ou incorporado em um DNA genômico de um procariota oueucariota (por exemplo, um transgene); ou que existe como uma moléculaseparada (por exemplo, um cDNA ou um fragmento genômico ou de cDNAproduzido por PCR, digestão de endonuclease de restrição, ou síntese químicaou in vitró). Também inclui um DNA recombinante que é parte de umaseqüência de polipeptídeos adicional codificando um gene híbrido. Aexpressão "ácido nucleico isolado" também se refere a RNA, por exemplouma molécula de mRNA, que é codificada por uma molécula de DNA, ou queé quimicamente sintetizada, ou que é separada ou substancialmente livre depelo menos alguns componentes celulares, por exemplo, outros tipos demoléculas de RNA ou moléculas de polipeptídeos.
É fornecido aqui um vetor compreendendo qualquer dosácidos nucleicos fornecidos neste relatório, operavelmente ligado a umaseqüência de controle de expressão. Promotores preferidos que controlam atranscrição dos vetores nas células hospedeiras de mamíferos podem serobtidos de várias fontes, por exemplo os genomas dos vírus, tais como:polioma, vírus símio 40 (SV40), adenovírus, retrovírus, vírus da hepatite B eo mais preferível o citomegalovírus, ou de promotores heterólogos demamíferos, por exemplo o promotor da actina beta ou o promotor EF1, ou depromotores híbridos ou quiméricos (por exemplo o promotor citomegalovírusfundido ao promotor da actina beta). Os promotores prematuros e tardios dovírus SV40 são convenientemente obtidos como um fragmento de restrição deSV40, o qual também contém a origem viral de SV40 de replicação [Fiers etal, Nature, 273: 113 (1978)]. O promotor prematuro imediato docitomegalovírus humano é convenientemente obtido como um fragmento derestrição HindIII E [Greenway, P. J. et al, Gene 18: 355-360 (1982)].Naturalmente, os promotores da célula hospedeira ou espécies relacionadastambém são úteis neste relatório.
"Intensificador" geralmente se refere a uma seqüência de DNAque funciona em nenhuma distância fixada do sítio de início da transcrição epode ser ou 5' [Laimins, L. et al, Proc. Natl. Acad. Sei. 78: 993 (1981)] ou 3'[Lusky, M. L. et al, Mol. Cell Bio. 3: 1108 (1983)] até a unidade detranscrição. Além disso, os intensificadores podem situar-se dentro de umíntron [Banerji, J. L. et al, Cell 33: 729 (1983)] bem como dentro da própriaseqüência codificadora [Osborne, T. F. et al, Mol. Cell Bio 4: 1293 (1984)].Eles se situam, usualmente, entre 10 e 300 pares de base de comprimento, eeles funcionam em eis. Os intensificadores funcionam para aumentar atranscrição dos promotores próximos. Os intensificadores tambémfreqüentemente contêm elementos de resposta que medeiam a regulação datranscrição. Os promotorespodem também conter elementos de resposta quemedeiam a regulação da transcrição. Os intensificadores freqüentementedeterminam a regulação da expressão de um gene. Embora muitas seqüênciasintensificadoras sejam agora conhecidas dos genes de mamíferos (globina,elastase, albumina, fetoproteína einsulina), tipicamente se usará umintensificador de um vírus de célula eucariótica para expressão geral.Exemplos preferidos são o intensificador de SV40 no lado tardio da origem dereplicação (100 270 pares de base), o intensificador do promotor prematuro do citomegalovírus, o intensificador do polioma no lado tardio da origem dereplicação, e os intensificadores de adenovírus.
O promotor e/ou o intensificador podem ser especificamenteativados ou pela luz ou por eventos químicos específicos que deflagram suafunção. Os sistemas podem ser regulados por reagentes tais como a tetraciclina e a dexametasona, fatores de transcrição sintéticos, auto-clivagemde RNA dirigida (Yen, L. et al. 2004. Nature 431: 471-476), e outrasabordagens. Existem também meios de intensificar a expressão de genes dovetor viral pela exposição à irradiação, tal como a irradiação gama, oualquilação das drogas de quimioterapia.
O promotor e/ou a região intensificadora podem atuar como
um promotor constitutivo e/ou intensificador para maximizar a expressão daregião da unidade de transcrição a ser transcrita. Em certas construções, opromotor e/ou a região intensificadora podem ser ativos em todos os tipos decélula eucariótica, mesmo que ela seja apenas expressa em um tipo particular de célula em um tempo particular. Um promotor preferido deste tipo é opromotor de CMV(650 bases). Outros promotores preferidos são ospromotores de SV40, o citomegalovírus (mais uma seqüência de íntronsligada), beta-actina, fator-1 de alongamento (EF-1) e vetor LTR retro viral.
Foi observado que todos os elementos reguladores específicos podem ser clonados e usados para construir vetores de expressão que sejamseletivamente expressos em tipos celulares específicos tais como as células demelanoma. O promotor da proteína acética fibrilar glial (GFAP) foi usadopara expressar seletivamente genes nas células de origem glial (astrocítica).Os promotores HLA-DR, CD 11c, Fascin e CD68 foram todos usados paraexpressar seletivamente genes nas células apresentando antígenos, incluindoas células macrófagas e dendríricas (Brocker, T. et al. 1997. J Exp Med 185:541-550; Gough, P. J. e Raines, E. W. 2003. Blood 101: 485-491; Cui, Y. etal. 2002. Blood 99: 399-408; Sudowe, S. et al. 2003. Mol Ther 8: 567-575), eelementos promotores dos genes específicos das células dendríticas (taiscomo CD83) podem também provar serem úteis a este respeito (Berchtold, S.et al. 2002. Immunobiology 205: 231-246).
Os vetores de expressão usados nas células hospedeiraseucarióticas (levedura, fungos, insetos, plantas, animais, humanas ou célulasnucleadas) podem também conter seqüências necessárias para o término datranscrição, a qual pode afetar a expressão do mRNA. Estas regiões sãotranscritas como segmentos poliadenilados na porção não transladada daproteína do fator tecidual codificando mRNA. As regiões não transladadas 3'também incluem os sítios de término da transcrição. É preferível que a unidade de transcrição também contenha uma região de poliadenilação. Umbenefício desta região é que ela aumenta a probabilidade de que a unidadetranscrita venha a ser processada e transportada como mRNA. A identificaçãoe o uso dos sinais de poliadenilação nas construções de expressão são bemestabelecidos. É preferível que os sinais homólogos de poliadenilação sejam usados nas construções de transgenes. Em certas unidades de transcrição, aregião de poliadenilação é derivada do sinal de poliadenilação prematuro deSV40 e consiste de cerca de 400 bases. É igualmente preferível que asunidades transcritas contenham outras seqüências padrão isoladas ou emcombinação com a expressão de melhora das seqüência acima, ou estabilidade, da construção.
------------------------------------------------Os vetores virais podem incluir a seqüência de ácidos
nucleicos codificando um produto marcador. Este produto marcador é usadopara determinar se o gene foi liberado à célula e, uma vez liberado, estejasendo expresso. Genes marcadores preferidos incluem o gene lacZ de E. coli,o qual codifica a galactosidase (3, a proteína fluorescente verde (GFP), eluciferase.
Em algumas formas de realização, o marcador pode ser ummarcador selecionável. Exemplos de marcadores selecionáveis adequados5 para as células de mamíferos são a diidrofolato redutase (DHFR), a timidinaquinase, neomicina, análogo G418 da neomicina, higromicina e puromicina.Quando tais marcadores selecionáveis são transferidos com sucesso para umacélula hospedeira de mamífero, a célula hospedeira de mamífero transformadapode sobreviver se colocada sob pressão seletiva. Existem duas categoriasdistintas amplamente usadas dos regimes seletivos. A primeira categoriabaseia-se em um metabolismo de células e no uso de uma linhagem de célulasmutantes que careçam da capacidade de crescerem independentemente de ummeio suplementado. Dois exemplos são: células de DHFR de CHO e célulasLTK de camundongos. Estas células carecem da capacidade de crescer sem aadição de nutrientes tais como a timidina ou a hipoxantina. Tendo em vistaque estas células carecem de certos genes necessários para uma completa viade síntese de nucleotídeos, elas não podem sobreviver, a menos que osnucleotídeos faltantes sejam fornecidos em um meio suplementado. Umaalternativa para suplementar o meio é introduzir um gene DHFR ou TKintacto nas células carentes dos genes respectivos, assim alterando suasexigências de crescimento. As células individuais que não tenham sidotransformadas com o gene DHFR ou TK não serão capazes de sobreviver emmeios não suplementados.
A segunda categoria é a seleção dominante que se refere a um esquema de seleção usado em qualquer tipo de célula e não requer o uso de—uma linhagem-de células mutantes. Estes esquemas tipicamente usam uma—droga de interrupção do crescimento de uma célula hospedeira. Essas células,que têm um novo gene, devem expressar uma proteína conduzindo àresistência da droga e sobreviver à seleção. Exemplos de tal seleçãodominante usam os medicamentos neomicina [Southern, P. e Berg, P., J.Molec. Appl. Genet. 1: 327 (1982)], ácido micofenólico, [Mulligan, R. C. eBerg, P. Science 209: 1422 (1980)] ou higromicina, [Sugden, B. et ai, Mol.Cell. Biol. 5: 410-413 (1985)]. Os três exemplos empregam genes bacterianossob controle eucariótico para comunicar resistência ao medicamento G418apropriado ou à neomicina (geneticina), xgpt (ácido micofenólico) ouhigromicina, respectivamente. Outros incluem o análogo G418 da neomicinae a puromicina.
É fornecida uma célula compreendendo qualquer dos vetoresaqui fornecidos. A célula apresentada pode ser qualquer célula usada paraclonar ou propagar os vetores aqui fornecidos. Assim, a célula pode ser dequalquer cultura celular primária ou linhagem celular estabelecida. O tipo decélula pode ser selecionado por uma pessoa versada na técnica, com base naescolha do vetor e do uso desejado.
É fornecido um polipeptídeo isolado compreendendo a regiãode ligação da proteína contendo CARD de um receptor da morte, em que opolipeptídeo compreende menos do que 25 resíduos de aminoácidos.
Assim, o polipeptídeo fornecido pode ser a região de ligaçãoda proteína contendo CARD do Receptor Fas (acesso n° gi: 119833). Opolipeptídeo fornecido pode ser a região de ligação da proteína contendoCARD de um receptor de TRAIL. Assim, o polipeptídeo fornecido pode ser aregião de ligação da proteína contendo CARD de DR4 (acesso n° gi:21264525). O polipeptídeo fornecido pode ser a região de ligação da proteínacontendo CARD de DR5 (acesso n° gi: 3721878). O polipeptídeo fornecidopode ser um fragmento da seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 22, em queo fragmento se liga a uma proteínacontendo CARD aqui apresentada. Comoum exemplo ilustrativo, o polipeptídeo fornecido pode compreender osaminoácidos 250 a 340 de DR5. Assim, o polipeptídeo pode compreender aseqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 23. O polipeptídeo pode aindacompreender uma seqüência de fragmento de aminoácido SEQ ID NO: 23, detal modo que o fragmento seja capaz de ligar-se ao DDX3. Como umexemplo, o modulador pode ser um polipeptídeo compreendendo osaminoácidos 280 a 310 de DR5. Assim, o modulador pode compreender aseqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 24. Como outro exemplo, omodulador pode ser um polipeptídeo que compreenda os aminoácidos 300 a330 de DR5. Assim, o modulador pode compreender a seqüência deaminoácidos SEQ ID NO: 36. Por "ligar-se" denota-se que o polipeptídeoforma ligações não covalentes (por exemplo, ligações de hidrogênio) com aproteína contendo CARD com suficiente afinidade que possa ser detectadacom métodos bioquímicos padrão. Em um aspecto, o polipeptídeo fornecidose liga a uma proteína contendo CARD com uma afinidade igual ou maior doque o receptor da morte do qual ela seja derivada.
A região de ligação da proteína contendo CARD do receptorda morte tem utilidade como um receptor solúvel para inibição competitiva daligação da proteína contendo CARD. Assim, é fornecido um método debloquear a ligação da proteína contendo CARD a um receptor da morte emuma célula, compreendendo proceder ao contato da célula com umpolipeptídeo codificando a região de sobrevivência de um receptor da morte,como aqui apresentado, ou um seu fragmento que bloqueie a ligação. Etambém fornecido um método de reverter a resistência de uma célula a umagonista do receptor da morte em uma célula, compreendendo o contato dacélula com o polipeptídeo.
É fornecido um polipeptídeo isolado compreendendo odomínio de ligação do receptor da morte de uma proteína contendo CARD. Opolipeptídeo fornecido pode ser o domínio de ligação doreceptor da morte doDDX3 (SEQ ID NO: 25, acesso n° gi: 13514816). O polipeptídeo fornecidopode ser um fragmento da seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 25, em queo fragmento se liga a um receptor da morte aqui apresentado. O DDX3 se ligacom o DR5 aproximadamente nos aminoácidos 200 a 250 e 350 a 400. Assim,o modulador pode ser um polipeptídeo compreendendo os aminoácidos 200 a250 do DDX3, ou seus fragmentos. Deste modo, o modulador podecompreender a seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 37. Assim, o modulador pode ser um polipeptídeo compreendendo os aminoácidos 350 a400 do DDX3, ou seus fragmentos. Deste modo, o modulador podecompreender a seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 38. O polipeptídeofornecido pode ser o domínio de mda-5 de ligação do receptor da morte(acesso n° gi: 11344593). O polipeptídeo fornecido pode ser o domínio de
ligação do receptor da morte de RIG-1 (acesso n° gi: 6048564).
Um polipeptídeo isolado compreendendo o domínio de ligaçãodo receptor da morte de uma proteína contendo CARD tem utilidade comoum inibidor negativo dominante da ligação do receptor da morte pelasproteínas contendo CARD, se o polipeptídeo for incapaz de inibir a apoptose
induzida pelo receptor da morte. Assim sendo, em um aspecto, o polipeptídeoisolado pode não se ligar às caspases ou aos IAPs. O motivo de CARDresponsável por ligar os IAPs deDDX3 situa-se aproximadamente nosaminoácidos 50 a 100. Desta forma, o polipeptídeo fornecido podecompreender o domínio de ligação do receptor da morte deDDX3, mas não
compreender os aminoácidos 50 a 100 de DDX3. Portanto, o modulador podeser um polipeptídeo compreendendo os aminoácidos 200 a 250 e/ou osaminoácidos 350 a 400 do DDX3, mas não compreendendo os aminoácidos50 a 100 do DDX3. Por exemplo, é fornecido um polipeptídeo consistindodos aminoácidos 151a 662 do DDX3. Assim, o modulador pode compreender
um polipeptídeo consistindo da seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 39.
---------- ----------- £m um outro aspecto, o polipeptídeo pode bloquear a
associação das proteínas contendo CARD endogenas com o receptor damorte. Em um outro aspecto, o polipeptídeo pode impedir o recrutamento dosIAPs para o receptor da morte. Em outro aspecto, o polipeptídeo pode nãoinibir o recrutamento de FADD para o receptor da morte. Qualquercombinação destes aspectos é considerada.
A capacidade das proteínas contendo CARD tais como DDX3de inibir a apoptose induzida pelo receptor da morte é, pelo menos em parte,devida ao recrutamento dos IAPs para o receptor da morte pelo domínio deCARD da proteína contendo CARD. Desde modo, é fornecido um método debloquear a associação dos IAPs com um receptor da morte, compreendendocolocar em contato a célula com o polipeptídeo apresentado. Também éfornecido um método de reverter uma resistência da célula a um agonista do receptor da morte, compreendendo o contato da célula com o polipeptídeoapresentado.
As composições aqui apresentadas e as composiçõesnecessárias para realizar os métodos apresentados, podem ser produzidas como uso de qualquer método conhecido da pessoa habilitada na técnica para aquele reagente ou composto particular, a menos que de outra formaespecificamente observado.
Por exemplo, os ácidos nucleicos podem ser produzidos com ouso dos métodos de síntese química padrão ou podem ser produzidos com ouso de métodos enzimáticos ou de qualquer outro método conhecido. Esses métodos podem variar da digestão enzimática padrão seguida pelo isolamentodo fragmento de nucleotídeo [ver, por exemplo, Sambrook et ai, MolecularCloning: A Laboratory Manual, 2â Edição (Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) Capítulos 5 e 6) até os métodospuramente sintéticos, por exemplo pelo método do cianoetil fosforamidita,com o uso de um sintetizador Milligen ou Beckman System IPIus DNA (por— exemplo, o sintetizador automático Modelo 8700 da Milligen-Biosearch,Burlington, MA ou Modelo 380B da ABI). Os métodos sintéticos úteis paraproduzir oligonucleotídeos também são descritos por Ikuta et al., Ann. Rev.Biochem. 53: 323-356 (1984), (métodos de fosfotriéster e fosfitotriéster), epor Narang et ai, Methods Enzymol, 65: 610-620 (1980), (método defosfotriéster). As moléculas de ácido nucleico protéico podem ser produzidascom o uso de métodos conhecidos, tais como aqueles descritos por Nielsen etai, Bioconjug. Chem. 5: 3-7 (1994). Um método de produzir os polipeptídeos apresentados é ligar
dois ou mais peptídeos ou polipeptídeos entre si mediante técnicas da químicaprotéica. Por exemplo, os peptídeos ou polipeptídeos podem serquimicamente sintetizados usando-se equipamento de laboratóriocorrentemente disponível ou da química de Fmoc (9- fluorenilmetiloxicarbonila) ou de Boc (terc-butiloxicarbonila) (AppliedBiosystems, Inc., Foster City, CA). Uma pessoa habilitada na técnica podefacilmente observar que um peptídeo ou polipeptídeo correspondente àsproteínas apresentadas, por exemplo, pode ser sintetizado por reaçõesquímicas padrão. Por exemplo, um peptídeo ou polipeptídeo pode ser sintetizado e não clivado de sua resina de síntese, enquanto o outro fragmentode um peptídeo ou proteína pode ser sintetizado e clivado subseqüentementeda resina, desse modo expondo um grupo terminal que seja funcionalmentebloqueado no outro fragmento. Pelas reações de condensação de peptídeos,estes dois fragmentos podem ser covalentemente unidos através de uma ligação de peptídeo em seus términos carboxila e amino, respectivamente,para formar um anticorpo, ou seu fragmento [Grant, G. A. (1992) SyntheticPeptides: A User Guide. W. H. Freeman and Co., N.Y. (1992); Bodansky, M.e Trost, B., Ed. (1993) Principies ofPeptide Synthesis. Springer-Verlag Inc.,NY, os quais são aqui incorporados como referência pelo menos quanto ao material relacionado à síntese peptídica). Alternativamente, o peptídeo ou opolipeptídeo são independentemente sintetizãxlos in vivo] como aqui descrito.Uma vez isolados, estes peptídeos ou polipeptídeos independentes podem serligados para formar um peptídeo ou seu fragmento através de reações decondensação de peptídeos semelhantes.Por exemplo, a ligação enzimática dos segmentos peptídicosclonados ou sintéticos permite que fragmentos de peptídeos relativamentecurtos sejam unidos para produzir fragmentos de peptídeos maiores,polipeptídeos ou domínios protéicos completos [Abrahmsen, L. et al.,Biochemistry, 30: 4151 (1991)]. Alternativamente, a ligação química nativados peptídeos sintéticos pode ser utilizada para construir sinteticamentegrandes peptídeos ou polipeptídeos dos fragmentos de peptídeos mais curtos.Este método consiste em uma reação química de duas etapas [Dawson et al.Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science, 266: 776-779(1994)]. A primeira etapa é a reação quimiosseletiva de um tioéster peptídicosintético desprotegido com outro segmento peptídico desprotegido contendoum resíduo Cys amino-terminal para dar um intermediário ligado ao tioéstercomo o produto covalente inicial. Sem uma mudança nas condições dereação, este intermediário sofre reação intramolecular espontânea e rápida para formar uma ligação peptídica nativa no sítio de ligação [Baggiolini, M. etal. (1992) FEBSLett. 307: 97-101; Clark-Lewis, I. et al, J. Biol. Chem., 269:16075 (1994); Clark-Lewis, I. et al., Biochemistry, 30: 3128 (1991);Rajarathnam, K. et al., Biochemistry 33: 6623-6630 (1994)].
Alternativamente, os segmentos peptídicos desprotegidos sãoquimicamente ligados, em que a ligação formada entre os segmentospeptídicos, como um resultado da ligação química, é uma ligação não natural(não peptídica) [Schnolzer, M. et al. Science, 256: 221 (1992)]. Esta técnicafoi usada para sintetizar análogos de domínios protéicos, bem como grandesquantidades de proteínas relativamente puras com atividade biológica completa [deLisle Milton, R. C. et al., Techniques in Protein Chemistry IV.Academic Press, New York, pp. 257-267 (1992)]. ~ ~~
Os seguintes exemplos são apresentados abaixo para ilustrar osmétodos e resultados em conformidade com a presente invenção. Não sepretende que estes exemplos sejam inclusivos de todos os aspectos dapresente invenção, mas, ao invés disso, ilustrem métodos e resultadosrepresentativos. Estes exemplos não excluem equivalentes e variações dapresente invenção que sejam evidentes a uma pessoa habilitada na técnica.EXEMPLOS EXEMPLO 1
RESISTÊNCIA INDUTÍVEL DE CÉLULAS TUMORAIS À APOPTOSEMEDIADA POR TRAIL-R2 PELA GERAÇÃO DE UM BLOQUEIO NAFUNÇÃO DO DOMÍNIO DA MORTEMateriais e Métodos
Linhagens Celulares, Anticorpos e Reagentes: A linhagem de
células cancerosas de mamas humanas, MDA-MB-231, foi comprada daAmerican Tissue Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). A linhagem decélulas cancerosas ovarianas humanas, UL-3C, foi obtida. As células forammantidas em DMEM ou RPMI1640 suplementados com 10 % de FCS
inativado pelo calor, 50 fig/ml de estreptomicina e 50 U/ml de penicilina(Cellgro, Mediatec, Inc., Herndon, VA). Anticorpos monoclonais TRAIL-R1anti-humano (clone: 2E12) e TRAIL-R2 anti-humano (clone: TRA-8) foramanteriormente descritos (Ichikawa et al. 2003; Ichikawa et ai. 2001). OTRAIL-R2 anti-humano (clone: 2B4) para os ensaios de citometria de fluxo e
imunoprecipitação foi desenvolvido. O TRAIL solúvel recombinante foicomprado da Alexis Biochemicals (San Diego, CA). Os anticorposanticaspase 3 e anticaspase 8 policlonais foram comprados da BDPharMingen (San Diego, CA). Os anticorpos caspase 2, 3, 8, 9 e 10 anti-humanos monoclonais, e os anticorpos anti-humanos monoclonais Bcl-2, Bcl-
xL, Bax, cIAP-1, cIAP-2, XIAP e survivina foram preparados. Os anticorpos
------------policlonais anti-fosfo-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185), anti-fosfo-p38 MAPK
(Thr180/Tyr182), anti-PARP foram comprados da Cell Signaling Technology,Inc. (Beverly, MA). O anticorpo anti-p-actina foi comprado da Sigma (St.Louis, MO). O anti-FADD foi comprado da Transduction Laboratories(Lexington, KY). O anti-FLIP foi comprado da ProSci Inc. (Poway, CA).Todos os reagentes secundários conjugados à peroxidase de raiz forte (HRP)foram comprados da Southern Biotechnology Associates, Inc. (Birmingham,AL).
Análise de Citometria de Fluxo da expressão da superfície
celular de TRAIL-RI e -R2: IO6 células foram incubadas com 1 |ig/ml de2E12 biotinilado e 1 fig/ml de 2B4 conjugado a PE sobre gelo por 30 minutos.Após lavagem por duas vezes com tampão de GACS (PBS com 5 % de FBS e0,01 % de NaN3), as células foram incubadas com Estreptavidina-Cicromo. 10.000 células viáveis foram analisadas pelo citômetro de fluxo FACScan(BD, CA).
Análise de citotoxicidade da suscetibilidade das célulastumorais à apoptose mediada por TRA-8, 2E12 e TRAIL: As células (1.000células por reservatório) foram semeadas em placas de 96 reservatórios em triplicata com oito concentrações (diluições seriais duplas de 1000 ng/ml) deTRA-8, 2E12 ou TRAIL. A viabilidade celular foi determinada após culturanoturna com o uso do ensaio de ATPLITE de acordo com as instruções dofabricante (Packard Instruments, Meriden, CT). Os resultados sãoapresentados como o percentual de células viáveis nos reservatórios tratados, em comparação com os reservatórios de controle do meio.
Indução da resistência das células tumorais ao TRAIL-R2: Ascélulas (5 X 105/ml) foram incubadas com uma dose de partida de 1 ng/ml deTRA-8 por dois dias. As células foram separadas com meio fresco eincubadas com uma dose dupla de TRA-8 a cada dois dias, até que a dose de TRA-8 alcançasse 2.000 ng/ml. Em cada ciclo de tratamento, a viabilidadecelular-das células não induzidas-(precursoras) e induzidas tratadas com umadose indutora de TRA-8 foi determinada pelo ensaio de ATPLITE.
Clonagem e seqüenciação do TRAIL-R2: Os cDNAs decomprimento completo do TRAIL-R2 foram obtidos pela reação em cadeia dapolimerase (PCR) com o uso da polimerase de revisão de provas do DNA deplatina (Invitrogen). Os cDNAs foram clonados dentro do vetor pCR2.1-TOPO (Invitrogen). Pelo menos cinco clones independentes foramselecionados para seqüenciação.Análise de Western blot das proteínas associadas à apoptose:
As células tumorais (3 xlO6) foram lavadas duas vezes com PBS frio e lisadascom 300 \x\ de tampão de lise contendo Tris 10 mM-HCl (pH 7,6), NaCl 150mM, EDTA 0,5 mM, EGTA 1 mM, 0,1 % de SDS, ortovanadato de sódio 1mM, e uma mistura de inibidores da protease (fluoreto de fenilmetilsulfonila 1 mM, 1 fig/ml de pepstatina A, 2 |j,g/ml de aprotinina). Os lisados foramsonicados por 10 segundos, e centrifugados por 20 minutos em 12.000 g. Oslisados celulares com igual quantidade de proteínas totais foram ebulidos por5 minutos com tampão de amostra de SDS-PAGE. Os lisados celulares totaisforam separados em 8 %, 10 % ou 12 % de SDS-PAGE, e eletroforeticamentetransferidos para membrana de nitrocelulose. As manchas foram bloqueadascom 5 % de leite em pó sem gordura em tampão de TB ST [Tris 20 mM-HCl(pH 7,4), NaCl 500 mM, e 0,1 % de Tween 20) e incubadas com anticorpoprimário em tampão de bloqueio a 4 °C durante a noite. As manchas foramlavadas por três vezes com TBST e sondadas com anticorpos secundáriosconjugados a HRP poro uma hora na temperatura ambiente. Após a lavagempor quatro vezes com TBST, as proteínas sondadas foram visualizadas com ouso do sistema de detecção de Western blotting ECL (Amersham Biosciences,Piscataway, NJ) de acordo com as instruções do fabricante.
Análise da disposição do cDNA da regulação transcricional dos genes associados à apoptose e à sinalização celular. A Disposição deGenes da~Apoptose™Tiumana~~(HS^002)—e—a—Disposição—dos—Genes-PathwayFinder de Transdução de Sinal Humanos (HS-008) foram compradasda SuperArray, Inc (Frederick, MD). O RNA total foi extraído das célulascom o uso do protocolo TRIZOL® (Invitrogen, Carlsbad, CA). As sondas decDNA foram sintetizadas com 32P-dCTP. Os cDNAs nas manchas damembrana foram hibridizados com as sondas rotuladas de 32P-dCTP em 60 °Cdurante a noite. Os perfis de expressão dos genes foram analisados com o usodo CYCLONE PHOSPHOPJMAGER® (Packard Instruments, Meridien, CT). Co-imunoprecipitação de TRAIL-R1 e TRAIL-R2: IO7 células
foram lavadas com PBS gelado, e Usadas por 15 minutos sobre gelo comtampão de lise [1 % de Triton X-100, NaCl 150 mM, 10 % de glicerol, Tris20 mM-HCl (pH 7,5), EDTA 2 mM, PMSF 0,57 mM, e um coquetel inibidorda protease). Os lisados foram então depurados duas vezes por centrifügação a 16.000 g por 10 minutos a 4 °C. A fração solúvel foi incubada com 30 ul deTRA-8 ou Sefarose 4B conjugada com 2B4 a 4 °C durante a noite. Após setelavagens com tampão de lise e três lavagens com Tris 10 mM, as proteínasligadas foram eluídas por ebulição por 3 minutos em tampão de carga deSDS-PAGE e separadas em SDS-PAGE. A presença da caspase 8 e FADD foi determinada pela análise de Western blot.
Eletroforese em gel de poliacrilamida bidimensional:Após aco-imunoprecipitação com Sefarose 4B de 2B4, as proteínas foram eluídas edessalinizadas com acetona, e reconstituídas no tampão de amostra de IEF(Bio-Rad, Hercules, CA). 160 ug de proteínas totais foram carregadas na tira de IPG (Bio-Rad) na temperatura ambiente durante a noite, e depois separadasna Célula PROTEAN IEF® (BioRad). As tiras de proteína foram equilibradascom os Tampões de Equilíbrio ReadyPrep (Bio-Rad), e ainda separadas emgel de SDS-PAGE a 10 %. Após a conclusão, os géis foram fixados com umtampão contendo 10 % de metanol e 7 % de ácido acético, e manchados comtampão de Manchamento Rubi SYPRO® (Bio-Rad). Os géis foramconvertidos em imagem com o uso do Sistema de Formação de imagemDigital VERSADOC® (Bio-Rad) e analisados com o programa PDQUEST®(Bio-Rad).RESULTADOSIndução da resistência seletiva à apoptose mediada porTRAIL-R2: Uma linhagem de células cancerosas de mamas humanas, MDA-231, e uma linhagem de células cancerosas ovarianas humanas, UL-3C, foramselecionadas para indução da resistência ao TRAIL-R2, tendo em vista que elas co-expressavam altos níveis de TRAIL-R1 e R2 da superfície celular,como determinado pela análise de citometria de fluxo de duas cores usando-seanticorpos anti-TRAIL-Rl (2E12) e anti-TRAIL-R2 (2B4) (Figura IA). Duaslinhagens de células tumorais foram suscetíveis à apoptose induzida pelosanticorpos receptores anti-TRAIL agonísticos, 2E12 e TRA-8, bem como
TRAIL como determinado pelo ensaio de citotoxicidade in vitro (Figura 1B),indicando que ambos os receptores para TRAIL são funcionais nas duaslinhagens de células tumorais. Para determinar se estas células tumoraisdesenvolvem resistência da apoptose a TRA-8 após o tratamento, as célulasforam tratadas iniciando-se com uma dose não de apoptose (1 ng/ml) de TRA-
8 por dois dias, e as doses foram então dobradas a cada dois dias até 2.000ng/ml antes da extração do TRA-8. A viabilidade celular foi medida em cadadose tanto nas células tratadas quanto nas não tratadas. Nas doses de TRA-8menores do que 10 ng/ml, não houve nenhuma morte celular significativatanto nas células tratadas quanto nas não tratadas. Quando as doses de TRA-8
foram aumentadas para 50 ng/ml ou mais, uma redução dependente da dosede TRA-8 da viabilidade celular foi observada nas células não tratadas. Aocontrário, não houve nenhuma morte celular significativa nas células tratadasaté 2000 ng/ml (Figura 1C). Estes resultados indicam que o tratamentorepetido das células tumorais com baixas doses de TRA-8 não indutoras da
apoptose induz a resistência da apoptose e que a resistência induzida não édevida a~um processo de~ seleção" pela remoção das células sensíveis àapoptose.
Quatro semanas após a remoção do TRA-8, tanto as célulasprecursoras (MDA-231P, UL-3CP) quanto as células tratadas (MDA-231R,UL-3CR) foram testadas quanto à sua suscetibilidade à apoptose induzida porTRA-8, 2E12 ou TRAIL. Em comparação com quase 100 % de morte celulardas células precursoras após o tratamento com 1.000 ng/ml de TRA-8,nenhuma morte celular significativa foi induzida em ambas as células MDA- 23 IR e UL-3CR com uma faixa de concentrações de TRA-8 (Figura 2A),indicando que as células se tornam altamente resistentes à apoptose induzidapelo TRA-8. Ao contrário, a suscetibilidade das células tumorais resistentesao TRA-8 à apoptose induzida por 2E12 permaneceu imutável (Figura 2B).Embora ao suscetibilidade tenha sido reduzida, as células induzidas resistentes ao TRA-8 ficaram ainda suscetíveis à apoptose mediada porTRAIL (Figura 2C). Estes resultados indicam que a resistência à apoptoseinduzida por TRA-8 é seletiva para TRAIL-R2. Após a remoção do TRA-8,as células permaneceram em um estado resistente ao TRA-8 por pelo menos 3meses, e depois a suscetibilidade foi lentamente restaurada a aproximadamente 30 % dos níveis das células precursoras por quatro meses(Figura 2D), indicando que a resistência induzida ao TRA-8 teve longaduração, porém parcialmente reversível.
A resistência induzida do TRAIL-R2 não é devida à expressãoda superfície celular alterada ou à mutação de TRAIL-R,ou a um defeito intrínseco da apoptose. Que a resistência à apoptose induzida por TRA-8tenha sido seletiva quanto a TRAIL-R2 indica que a expressão do TRAIL-R2pode ser seletivamente reduzida ou uma mutação do TRAIL-R2 pode ocorrerapós a indução da resistência ao TRA-8. Para excluir estas possibilidades, aexpressão da superfície celular de TRAIL-R2 foi examinada, e determinou-se que não houve nenhuma alteração nos níveis de expressão do TRAIL-R2 emambas as células resistentes ao TRA-8 em comparação com ãs suas célulasprecursoras (Figura 3A). Este resultado foi ainda confirmado pela análise deWestern blot, mostrando que os dois isoformas da proteína de TRAIL-R2foram igualmente expressos nas células precursoras e nas resistentes (Figura3A). Os clones de cDNA de comprimento completo do TRAIL-R2 isolado deambas as linhagens de células resistentes foram seqüenciados, e nenhumamutação foi identificada. Estes resultados indicaram que a resistênciainduzida e seletiva ao TRAIL-R2 não é devida às alterações do próprioTRAIL-R2.
A apoptose mediada pelo TRAIL-R2 pode ser regulada porvárias proteínas reguladoras da apoptose, tal como o inibidor da família daapoptose (IAP) (Park et al. 2002; Ng et al. 2002; Roa et al. 2003; Cummins etal. 2004; Li et al. 2004; Bockbrader et al. 2005) e a família de Bcl-2 (Hinz etal. 2000; Rokhlin et al. 2001; Fulda et al. 2002; Carthy et al. 2003; Chawla-Sarkar et al. 2004; Sinicrope et al. 2004). Com o uso de um painel dosanticorpos monoclonais recém-desenvolvidos, os níveis protéicos daexpressão de cIAPl, cIAP2, XIAP, survivina, Bcl-2, Bcl-xL e Bax foramexaminados pela análise de Western blot. Embora MDA231 e UL-3C expressassem níveis variáveis destas proteínas, não houve nenhuma diferençasignificativa entre as células precursoras e as resistentes Figura 3A),indicando que os níveis de expressão destas proteínas são improváveis deserem envolvidos na indução de TRA-8. Uma triagem mais ampla para asalterações transcricionais potenciais entre um painel dos genes associados àapoptose e à sinalização celular, foi realizada com o uso das disposições decDNA da membrana (Sperarray, Frederick, MD), que incluíam mais do que200 genes relacionados à apoptose bem conhecidos (Figura 3B, painelsuperior) e aos genes de sinalização celular (Figura 3B, painel inferior). Umacomparação paralela entre as células precursoras de MDA231 e as resistentes indica que não houve nenhuma alteração significativa no perfil de expressão
------- destes genes após a indução da resistência ao TRA-8.
Bloqueio seletivo da transdução de sinal da apoptose deTRAIL-R2 nas células tumorais resistentes ao TRA-8. A ativação seqüencialda caspase 8 a montante e da caspase a jusante é um evento chave natransdução de sinal da apoptose de TRAIL-R2. Assim, a ativação dependentedo tempo destas duas caspases foi examinada. Como mostrado anteriormente,o tratamento das células MDA231 precursoras sensíveis ao TRA-8 com TRA-8 induziu a ativação da caspase 8 (Figura 4A, painel superior) e da caspase 3 (Figura 4A, painel central) como mostrado pela geração dos fragmentos decaspases clivados após o tratamento com TRA-8. Como um marcador muitosensível da ativação da caspase, o PARP foi rapidamente clivado (Figura 4A,painel inferior). Entretanto, a ativação da caspase 8, da caspase 3, e asubseqüente clivagem do PARP não ocorreu nas células resistentes após o
tratamento com TRA-8. O fracasso da ativação de uma cascata de caspasesnão é devido a um defeito intrínseco nas vias das caspases já que a ativaçãoda caspase de TRAIL-R1 deflagrada por 2E12 não foi prejudicada nas célulasresistentes ao TRA-8 (Figura 4A, painel da esquerda). Estes resultadosindicam que a cascata de caspases associada ao TRAIL-R2 é seletivamente
bloqueada no nível da caspase 8 de montante após a indução da resistência aoTRA-8.
A ativação da via de JNK/quinase p38 dependente da caspase8 desempenha um papel sinergístico crítico na apoptose mediada peloTRAIL-R2 (Ohtsuka et al. 2003; Ohtsuka et al. 2002). A ativação das quinases JNK/p38 foi medida pela análise de Western blot da fosforilação dasquinases JNK/p38 durante o tratamento de TRA-8. Correspondentes àativação da caspase 8, JNK (Figura 4, painel superior) e p38 (Figura 4B,painel inferior) foram rapidamente fosforilados de uma forma dependente dotempo. No entanto, nas células resistentes a TRA-8, apenas 2E12, mas não TRA-8, foi capaz de induzir a fosforilação do JNK/p38, indicando que as vias—- das quinases JNK/p38 também são seletivamente inibidas nas "célulasresistentes a TRA-8.
Bloqueio seletivo da função do domínio da morte de TRAIL-R2nas células tumorais resistentes a TRA-8. Quando FADD e a caspase 8 sãorecrutadas para o domínio da morte de TRAIL-R2 e são os componentesprincipais de DISC, a capacidade de formar um DISC em TRAIL-R1 eTRAIL-R2 foi examinada tanto nas células precursoras quanto nas resistentespelo ensaio de co-imunoprecipitação. Nas células precursoras MDA231, após o tratamento com TRA-8 ou 2E12, existiu um aumento dependente do tempode FADD (Figura 5A, painel superior) e caspase 8 (Figura 5A, painel central),que foram co-imunoprecipitados com TRAIL-R2 (Figura 5A, painel daesquerda) ou TRAIL-R1 (Figura 5A, painel da direita), respectivamente. Nascélulas resistentes a TRA-8, não existiu nenhum FADD nem caspase 8 co- imunoprecipitados com TRAIL-R2 durante a apoptose mediada por TRA-8,mas a co-imunoprecipitação de FADD e caspase 8 com TRAIL-R1 após otratamento de 2E12, não foi afetada. Além disso, para determinar se cFLIP,um competidor inibidor para a caspase 8 ao domínio da morte, desempenhaum papel no bloqueio da formação de DISC, a co-imunoprecipitação do cFLIP com TRAIL-R1 e TRAIL-R2 foi também examinada. Em um padrãosemelhante dependente do tempo, cFLIP foi co-imunoprecipitado comTRAIL-R2 durante a apoptose mediada por TRA-8 nas células precursoras,mas não nas células resistentes (Figura 5A, painel inferior). A co-imunoprecipitação do cFLIP com TRAIL-R1 durante a apoptose mediada por 2E12 não foi diferente entre as células precursoras e resistentes a TRA-8.Uma vez tendo havido níveis semelhantes de expressão da proteína total deFADD, caspase 8 e cFLIP, a falha do recrutamento destas proteínasassociadas ao domínio da morte não foi devida à expressão defeituosa destasproteínas. Estes resultados indicam que a resistência ao TRA-8 induzida é provavelmente devida a um defeito seletivo para TRAIL-R2 recrutar FADD e
— caspase 8 na formação do DISC após o tratamento de TRA-8.
A falha da montagem de DISC no domínio da morte deTRAIL-R2 nas células resistentes a TRA-8 indica que a função e acomposição do complexo protéico de TRAIL-R2 é alterada, em que umaproteína recém-gerada ou funcionalmente alterada pode associar-se comTRAIL-R2 e impedir o recrutamento de FADD e caspase 8 para o domínio damorte de TRAIL-R2. Assim, os perfis proteômicos das proteínas associadas aTRAIL-R2 foram comparados nas células MDA231 precursoras sensíveis aTRA-8 e resistentes a TRA-8 antes e após o tratamento de TRA-8 medianteduas análises proteonômica de dimensão e espectrometria de massa. Asproteínas diferencialmente expressas que foram co-imunoprecipitadas comTRAIL-R2 foram analisadas pelo programa PDQuest, que nos levou afocalizar-nos sobre três pontos de proteínas que foram alterados durante aapoptose mediada por TRA-8 entre as células precursoras e as resistentes(Figura 5B). Os pontos 1 e 2 representando uma massa protéica com um pesomolecular de 50 kDa ou 20 kDa, respectivamente, apareceram apenas nascélulas precursoras MAD-231 após o tratamento com TRA-8, mas não nascélulas não tratadas nem nas células resistentes tratadas com TRA-8,indicando que estas proteínas podem ser recrutadas para o TRAIL-R2 durantea apoptose mediada por TRA-8. Com base no seu peso molecular e no pontoisoelétrico, a proteína no ponto 1 foi confirmada como caspase 8 (Figura 5C),e o ponto 2 como FADD (Figura 5D) pela análise de Western blot. Asproteínas no ponto 3 foram interessantes, porque elas ficaram constantemente associadas com TRAIL-R2 e um deslocamento ocorreu durante a apoptosemediada por TRA-8 de uma proteína de peso molecular mais elevado até umaproteína de peso molecular menor (Figura 5E). Esta conversão pareceu serrelevante para a resistência de TRA-8 induzida, já que ela foi apenasobservada nas células precursoras MDA231 tratadas com TRA-8, mas não nas células resistentes. Além disso, a análise de espectrometria de massa
- identificou que ambos os pontos haviam sido derivados de DDX3, ummembro da família da RNA helicase DEAD-box. Por causa de uma forma depeso molecular mais elevado de DDX3 ser constantemente associada comTRAIL-R2 nas células resistentes a TRA-8, ela pode ser um fator que impeçao recrutamento de FADD e caspase 8 para o domínio da morte de TRAIL-R2.
Reversão da resistência de TRA8 por agentes quimioterápicosOs agentes quimioterápicos intensificam sinergisticamente aapoptose mediada por TRA-8, tanto in vitro quanto in vivo (Ohtsuka et al. 2003; Ohtsuka et al. 2002; Buchsbaum et al. 2003), particularmente naquelascélulas resistentes a TRA-8. Para se determinar se os agentes quimioterápicossão capazes de reverter a resistência ao TRA-8 induzida, o efeito de um grupode agentes quimioterápicos, a Adriamicina, o Texol, a Cisplatina e aBisindolilmaleimida VIII (BisVIII), foi examinado na apoptose mediada por
TRA-8 das células resistentes induzidas. Na presença das concentraçõesindicadas dos agentes quimioterápicos, uma resposta dependente da dose deTRA-8 foi restaurada tanto nas células MDA-231 resistentes ao TRA-8quando nas UL-3C (Figura 6A), indicando que todos os agentesquimioterápicos são capazes de reverter a resistência induzida pelo TRA-8. Aativação da cascata de caspases nas células resistentes MAD-231 após otratamento de combinação com Adriamicina e TRA-8, foi examinada com ouso de um painel de anticorpos anticaspase monoclonais. Como a anticaspase8 (clone: 2F4) e a anticaspase 2 (clone: 2A3) apenas reconhecem as pró-formas das caspases 8 e 2 respectivamente, a ativação das caspases 8 e 2 foi demonstrada pela quantidade reduzida das pró-formas devidas à clivagem. Aanticaspase 9 (Clone: 4B4) e a anti-caspase 3 (clone: 1H6) reconhecem tantoas pró-formas quanto as formas clivadas das caspases 9 e 3, respectivamente,sua ativação foi mostrada pela presença dos fragmentos clivados das caspases9 e 3. O tratamento do agente único sozinho com TRA-8 (Figura 6B, faixa 5) ou Adriamicina (Figura 6B, faixa 4) em 4 horas não induziu qualquer ativação---------- significativa de todas as caspases testadas em comparação~com os controlesnão tratados (Figura 6B, faixai). Ao contrário, a ativação das caspases 2, 9 e 3foi induzida tão cedo quanto uma hora após o tratamento de combinação comAdriamicina e TRA-8 (Figura 6B, faixa 2), a qual foi ainda intensificada noponto do tempo de quatro horas (Figura 6B, faixa 3). A ativação da caspase 8 ficou evidente no ponto do tempo de quatro horas após o tratamento de combinação. Estes resultados indicam que o tratamento com Ariamicina restaurou a cascata de caspases associada com TRAIL-R2 nas células resistentes a TRA-8. Na presença de Ariamicina, o TRA-8 foi capaz de deflagrar o recrutamento de FADD para TRAIL-R2 (Figura 6C, faixas 2 e 3), a função de recrutamento de TRAIL-R2 tendo sido restaurada pelo tratamento de Adriamicina. EXEMPLO 2
PAPEL DO DDX3 NA APOPTOSE MEDIADA POR TRAIL-r2 Materiais e Métodos
Linhagens Celulares, Anticorpos e Reagentes. A linhagem celular do câncer de mamas humano, MDA-MB-231, foi comprada da American Tissue Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). A linhagem
celular do câncer ovariano humano, UL-3C, foi obtida. As células foram mantidas em DMEM ou RPMI1640 suplementados com 10 % de FCS inativado pelo calor, 50 ug/ml de estreptomicina, e 50 U/ml de penicilina (Cellgro, Medi-atec, Inc., Herndon, VA). Anticorpos monoclonais de TRAIL-Rl anti-humano (clone: 2E12) e de TRAIL-R2 anti-humano (clone: TRA-8)
foram anteriormente descritos (Ichikawa et ai, 2003; Ichikawa et al., 2001). TRAIL-R2 anti-humano (clone: 2B4) foi desenvolvido por citometria de fluxo e ensaios de imunoprecipitação. O TRAIL solúvel recombinante foi comprado da Alexis Biochemicals (San Diego, CA). Os anticorpos policlonais anti-caspase 3 e anti-caspase 8 foram comprados da BD
Pharmingen (San Diego, CA). Os anticorpos das caspases 2, 3, 8, 9 e 10 anti-
-------humanos monoclonais, e os anticorpos anti-humanos "monoclonais de Bcl-2,
Bcl-xL, Bax, cIAP-1, cIAP-2, XIAP e survivina foram preparados. O anticorpo anti-PARP foi comprado da Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA). O anticorpo anti-actina-p foi comprado da Sigma. Os anti-FADD foram comprados dos Transduction Laboratories (Lexington, KY). Todos os reagentes secundários conjugados à peroxidase de raiz-forte (HRP) foram comprados da Southern Biotechnology Associates, Inc. (Birmingham, AL). As Caspase-1, Caspase-2, Caspase-3, Caspase-6, Caspase-7, Caspase-8, Caspase-9 e Caspase-10 foram compradas da EMD Biosciences, Inc. (San Diego, CA). Os derivados peptídicos fluorogênicos Ac-Val-Asp-Val-Asp-AMC (Ac-VDVAD-AMC, 260060M001, SEQ ID NO: 40), Ac-Asp-Glu-Val-Asp-amino-4-metilcumarina (Ac-DEVD-AMC, 260031M001, SEQ ID NO: 41), e Ac-carbonil-Ile-Glu-Thr-Asp-7-amido-4-metilcumarina (Z-IETD-AMC, 260042M001, SEQ ID NO: 42) foram comprados da Alexis Biochemicals, San Diego, CA. O inibidor das caspases-2, -3, -8, -10 (FMKSP01) foi comprado da R&D Systems, Inc.
Análise da citotoxicidade da suscetibilidade celular tumoral à apoptose mediada por TRA-8, 2E12 e TRAIL. As células (1.000 células por reservatório) foram semeadas em placas de 96 reservatórios em triplicata com oito concentrações (diluições seriais duplas de 1000 ng/ml) TRA-8, 2E12 ou TRAIL. A viabilidade celular foi determinada após cultura noturna com o uso de um ensaio de ATPLITE® de acordo com instruções do fabricante (Packard Instruments, Meriden, CT). Os resultados são apresentados como o percentual das células viáveis nos reservatórios tratados em comparação com os reservatórios de controle do meio.
Citometria de fluxo. As células (IO6) foram lavadas uma vez com PBS e recolocadas em suspensão em 1 ml de tampão de FACS frio (PBS com 5 % de FBS e 0,01 % de NaN3) contendo o anticorpo primário 1 ng/ml de TRA-8). As células foram manchadas sobre gelo por 60 minutos, depois "lavadas com~3 ml de tampão de FACS~frio, e incubadas com o anticorpo secundário (diluição a 1:100 de IgG anticamundongo de cabra conjugado a PE) em 4 °C por 60 minutos no escuro. Após uma lavagem adicional de 3 ml com tampão de FACS, 10.000 células por amostra foram analisadas porcitometria de fluxo FACSCAN (BD Biosciences, San Jose, CA).
Analise de Western blot das proteínas associadas com a apoptose. Células tumorais (3 x IO6) foram lavadas por duas vezes com PBS frio e Usadas com 300 ul de tampão de lise contendo Tris 10 mM-HCl (pH 5 7,6), NaCl 150 mM, EDTA 0,5 mM, EGTA 1 mM, SDS 0,1 %, ortovanadato de sódio 1 mM, e uma mistura de inibidores da protease (fluoreto de fenilmetilsulfonila 1 mM, 1 fig/ml de pepstatina A, 2 ug/ml de aprotinina). Os lisados celulares foram sonicados por 10 segundos e centrifugados por 20 minutos em 12.000 g. Os lisados celulares com iguais quantidades de
proteínas totais foram ebulidos por 5 minutos com tampão de amostra de SDS-PAGE. Os lisados celulares totais foram separados em 8 %, 10 % ou 12 % de SDS-PAGE, e eletroforeticamente transferidos para uma membrana de nitrocelulose. As manchas foram bloqueadas com 5 % de leite em pó não gorduroso em tampão de TBST (Tris 20 mM-HCl (pH 7,4), NaCl 500 mM, e 0,1 % de Tween 20) e incubadas com anticorpo primário em tampão de bloqueio a 4 °C durante a noite. As manchas foram lavadas por três vezes com TBST e sondadas com anticorpos secundários conjugados a HRP por 1 hora na temperatura ambiente. Depois de serem lavadas por quatro vezes com TBST, as proteínas sondadas foram visualizadas com o uso do sistema de detecção de Western blotting de ECL (Amersham Biosciences) de acordo com as instruções do fabricante.
Subexpressão de DDX3. Uma ferramenta de esquema on-line, BLOOK-iT RNAi Designer (Invitrogen) foi usada para identificar alvos de RN Ai para DDX3. Cinco seqüências alvejadas de shRNA foram selecionadas dos alvos de RNAi de classificação mais elevada 10 de topo (ver Tabela 2).<table>table see original document page 92</column></row><table>j com RNA total extraído das células MDA231 com o uso do seguinte par de
^ iniciadores: iniciador dianteiro de DDX31 com BamHI: 5'-
acggatccaaatgagtcatgtggcagtgga-3' (SEQ ID NO: 29); iniciador reverso DDX3662 com xhol: 5'-ctctcgagcaaagcaggctcagttaccc-3' (SEQ ID NO: 30). Iniciador dianteiro de TRAIL-R21 com Kpnl: 5'-aaaggtaccagccatggaacaacggggacag-3' (SEQ ID NO: 31); iniciador reverso de TRAIL-R2441 com EcoV: 5'-aaagatatcttaggacatggcagagtctgcatt-3' (SEQ ID NO: 32); o fragmento isolado da reação em cadeia da polimerase de DDX3 ficou em matriz dentro do vetor pcDNA3.1 (Invitrogen). O cDNA de TRAIL-
R2 foi clonado no vetor pshutter-CMV. As seqüências corretas foram confirmadas por seqüenciação de DNA.
O plasmídeo de expressão DDX3/pcDNA3.1-His foi gerado pela supressão da seqüência de DDX3 entre os sítios BamHI e xhol. O iniciador dianteiro DDX3151 com BamHI: 5'-
acggatccaaatgttttctggaggcaacactggg-3' (SEQ ID NO: 33); o plasmídeo de expressão TRAIL-R2/pshutter-CMV foi gerado pela supressão da seqüência de TRAIL-R2 com o uso do seguinte iniciador: iniciador reverso TRAIL-R2340 com EcoRV: 5'-aaagatatcttactgtctcagagtctcagtgggatc-3' (SEQ ID NO: 34); o iniciador reverso TRAIL-R2330 com EcoRV e xhol: 5'-
aaagatatcctcgagatttgctggaaccagcagcct-3' (SEQ ID NO. 35).
Construções dos Plasmídeos de Expressão para DDX3 nas Bactérias. O fragmento de DDX3 ou de cIAPl foi introduzido no vetor TOPO 100 (Invitrogen). Os plasmídeos resultantes foram transformados na cepa BL21 (DE3) de E. coli, a qual foi cultivada em meio de LB para as fases
exponenciais e induzida com isopropil-l-tio-P-D-galactopiranosídeo 0,4 mM por 3 horas. As células foram pelotizadas, recolocadas em suspensão em tampão de lise (Tris 30 mM-HCl, pH 7,5, NaCl 0,1 mM, DTT 1 mM, EDTA 0,1 mM, 1 % de Nonidet P-40 e 20 [ig/ml de PMSF), e sonicadas. O sobrenadante, após a centrifugação a 14.000 x g por 15 minutos, foipurificado por coluna de Ni. A concentração protéica foi determinada pelo ensaio de BCA (Pierce, Rockford, IL), e alíquotas foram armazenadas em 80 °C.
Transfecções Transientes de Células 293 ou 3T3. Células 293 5 ou 3T3 foram transfectadas com vetores de expressão usando-se LIPOFECTAMINE® 2000 (Invitrogen, Inc.). Após 24 horas de transfecção, a expressão protéica foi determinada pela análise de Western blot com o uso do anticorpo monoclonal respectivo. Para a análise de co-imunoprecipitação, as células foram Usadas com tampão de lise de imunoprecipitação contendo um coquetel inibidor da protease.
Ensaio de co-imunoprecipitação. O anticorpo anti-DDX3 ou anti-TRAIL-R2 foi conjugado a contas de Sefarose (Sigma). A composição do DISC de TRAIL-R2 foi determinada como segue: 5 xlO6 células (caso não de outra forma indicado) foram tratadas com 500 ng/ml de TRA-8 pelo tempo indicado a37 °C e depois lisadas em tampão de lise de imunoprecipitação (Tris 20 mM-HCl, pH 7,4, NaCl 150 mM, 0,2 % de NONIDET P40, e 10 % de glicerol e coquetel inibidor da protease completa) ou lisadas sem tratamento (condição não estimulada). O DISC de TRAIL-R2 foi então precipitado durante a noite a 4 °C com 30 ul de contas. Após aimunoprecipitação, as contas foram lavadas por quatro vezes com tampão de lise. As contas foram então lavadas por cinco vezes com tampão de Tris 10 mM e recolocadas em suspensão em tampão de carga para as análises de SDS-PAGE e imunomanchamento.
Ensaio da atividade da caspase in vitro. Os ensaios fluorométricos foram conduzidos em placas de fundo transparente de 96 —reservatórios, ~e todas as medições foram realizadas em reservatórios em triplicata. 100 ul de tampão de ensaio (HEPES 10 mM, pH 7,0, NaC150 mM, MgCl2 2 mM, EDTA 5 mM, e DTT 1 mM) foram adicionados. A caspase-8 ativa e os substratos peptídicos (Ac-IETD-AMC) foram adicionados a cadareservatório até uma concentração final de 100 ng/ul. A fração eluída por co-imunoprecipitação foi adicionada para iniciar a reação. A fluorescência de fundo foi medida nos reservatórios contendo o tampão de ensaio, o substrato, e o tampão de lise sem os lisados celulares. As placas de ensaio foram incubadas a 37 °C por 1 hora. A fluorescência foi medida sobre uma leitora de placa de fluorescência (Bio-Tek, Winooski, VT) estabelecida em 355-nm de excitação e 440-nm de emissão.
Ensaio de clivagem da caspase in vitro. A capacidade das caspases de clivar DDX3 foi examinada em um ensaio in vitro. As reações de clivagem realizadas por 30 minutos a 37 °C, incluindo 10 ul da fração eluída do TRAIL-R2 co-IP, 10 ul do tampão de reação [HEPES 10 mM (pH 7,0), NaCl 50 mM, MgCl2 2 mM, EGTA 5 mM, DTT 1 mM, ATP 2 mM), e 5 ul (0,1 U/(j.l) de formas ativas recombinantes de caspases. A clivagem foi determinada por Western blot com anticorpo anti-DDX3.
RESULTADOS
Análise proteômica de uma proteína candidata, DDX3, que causa um bloqueio do domínio da morte do TRAIL-R2 nas células resistentes. A resistência da apoptose espontaneamente desenvolvida ou induzida aos agentes terapêuticos, TRAIL e anticorpos agonísticos, que alveja os receptores da morte, representa um obstáculo principal no tratamento eficaz do câncer com estes agentes. De modo a determinar as composições alternativas dos complexos do domínio da morte de TRAIL-R2 nas células resistentes, os perfis proteômicos das proteínas existentes associadas ao TRAIL-R2 foram comparados nas células MDA231 precursoras sensíveis ao TRA-8 e resistentes ao TRA-8 antes e após o tratamento com TRA-8 pela análise proteômica bidimensional e de "espectrometria de massa. No exame dos géis bidimensionais manchados com rubi SYPRO® (Molecular Probes, Eugene, OR), um ponto protéico de cerca de -80 KDa foi encontrado. A associação desta proteína com TRAIL-R2 bloqueia a formação do DISC deTRAIL-R2, desse modo causando a resistência ao TRA-8. A proteína de -80 kd foi excisada da SDS-PAGE e digerida com tripsina, e as seqüências de peptídeos foram analisadas por espectrometria de massa. As seqüências de aminoácidos protéicos de seis fragmentos digeridos eram 100 % idênticas à 5 seqüência do Genbank de DDX3 humano (Tabela 3), indicando que o DDX3 se desassocia do TRAIL-R2 durante a apoptose induzida por TRA-8 correlacionada com a formação de DISC. Se esta proteína permanecer associada com o complexo protéico associado a TRAIL-R2, ela pode impedir o recrutamento de FADD e causar a falha da formação do DISC. 10 TABELA3
FRAGMENTOS DE DDX3
<table>table see original document page 96</column></row><table>
DDX3 é uma nova proteína associada a TRAIL-R2 na
apoptose mediada pelo TRAIL-R2. Para determinar se DDC3 é de fato associado com TRAIL-R2, o comprimento completo (aa 1 a 662), fragmentoN-terminal (aa 1 a 316), e um fragmento C-terminal (aa 310 a 662) de DDX3 foram clonados em PCDNAIII3.1 com o rótulo 6-His no término N. Estes vetores de expressão foram transfectados nas células precursoras MDA231 para se obter a superexpressão dos mutantes de DDX3 recombinantes de comprimento completo e de deleção. Entretanto, apenas o DDX3 de______comprimento completo, não seus mutantes de deleção .N-teiminais e C-_„
terminais, foi associado com TRAIL-R2 como detectado pela análise de co-imunoprecipitação seguida pela análise de Western blot com o uso do anticorpo anti-6-His (Figura 8A). Estes resultados confirmaram que o DDX3 associado com TRAIL-R2 e sua ligação ao TRAIL-R2 são dependentes docomprimento completo. O DDX3 foi imunoprecipitado com as anti-TRAIL-R2 nas células MDA231. Para ainda confirmar que a associação do DDX3 com TRAIL-R2, o fragmento N-terminal, C-terminal, e as versões de DDX3 de comprimento completo, foram expressas em E. coli. As proteínas foram purificadas e usadas como um antígeno para gerar anticorpos policlonais e um painel de monoclonais contra DDX3. O DDX3 associado com o TRAIL-R2 foi detectado pela análise de co-imunoprecipitação e de Western blot com o uso de anticorpo monoclonal anti-DDX3 de camundongo. Os resultados demonstraram que DDX3 foi co-imunoprecipitado com TRAIL-R2 tanto nas células precursoras não apoptóticas quanto nas resistentes (Figura 7). Houve um decréscimo de DDX3 dependente do tempo nas células sensíveis ao TRA-8, mas não nas células resistentes ao TRA-8 durante a apoptose. Além disso, pela análise de Western blot, um rápido decréscimo e clivagem do DDX3 associado ao TRAIL-R2 durante a apoptose induzida pelo TRA-8 foram observados. Isto indicou que a clivagem do DDX3 é dependente da caspase. Com base nestes resultados, a seqüência de DDX3 foi escrutinada quanto aos sítios de clivagem potenciais no N-terminal, e um motivo de clivagem da caspase relativamente conservada DKSDEDD (SEQ ID NO: 46) foi encontrado nos aminoácidos 129 a 135. É evidente que a clivagem ocorre no
DISC e resulta em um elemento funcional crítico de DDX3 sendo liberado do TRAIL-R2. Os dados foram compatíveis com o último modelo, o que sugere que a caspase iniciada é rapidamente recrutada a TRAIL-R2 e cliva DDX3 facilmente. Além disso, FADD e caspase-8 de associam e recrutam a TRAIL-R2 para formar DISC, o que por sua vez leva à ativação da cascata de caspase correlacionada à clivagem de DDX3 associada a TRAIL-R2, e isto indica que, em certas circunstâncias, o DDX3 é essencial ao programa apoptóticò," ilustrando que o DDX3 se associa com TRAIL-R2 envolveu a resistências à apoptose mediada pelo TRAIL-R2.
Região de interação do mapeamento de DDXS com TRAIL-R2.A fim de melhor se entender a regulação do DDX3 na transdução de sinal mediada pelo TRAIL-R2, a região de DDX3 aproximada que é requerida para ligar TRAIL-R2 foi determinada com o uso das células HEK293A que haviam sido transientemente transfectadas com mutantes de deleção de DDX3 codificando os plasmídeos (Figura 8A). A interação do DDX3 e TRAIL-R2 recombinantes foi determinada por co-imunoprecipitação com o uso de TRA-8. O DDX3 de comprimento completo, DDX3A201-662, ou DDX3A1-400 ligaram-se a TRAIL-R2. Entretanto, nem o DDX3A251-662 nem o DDX3A1-350 puderam ligar-se ao TRAIL-R2 (Figura 8A), e isto indica que DDX3 tem
dois motivos de ligação em TRAIL-R2. Um é localizado no término N (aa 200-250); o outro é adjacente a aa 350-400. A análise de Western blot dos lisados das mesmas células confirmou a produção de quantidades comparáveis de DDX3 do tipo selvagem e fragmentos de deleção de DDX3, os quais excluem as diferenças na expressão protéica como uma explanação
para estes resultados.
DDX3 é permanentemente associado com TRAIL-R2 e se correlaciona com o bloqueio do recrutamento de FADD nas células resistentes de TRA-8, indicando que o DDX3 associado ao TRAIL-R2 impede o recrutamento de FADD. Pode haver uma conexão entre DDX3 e FADD
através de TRAIL-R2. Para testar se DDX3 e FADD compartilham um motivo de ligação comum no domínio da morte de TRAIL-R2 ou os dois motivos de ligação se acham próximos, de modo que o DDX3 pré-envolvido interfira com o recrutamento de FADD, a localização do domínio de ligação do DDX3 no TRAIL-R2 foi determinada. Os vetores codificando o TRAIL-
R2 de comprimento completo, e uma série de deleções de domínios amino-terminais de TRAIL-R2, incluindo a deleção completa do domínio da morte, foram construídos (Figura 8B). Em uma abordagem análoga para avaliar a função do DDX3, e para excluir o TRAIL-R2 humano endógeno, uma linhagem celular de fibroblastos de murinos, NIH3T3, foi escolhida como acélula hospedeira para a co-expressão do TRAIL-R2 e DDX3 humanos. As células 3T3 foram co-transfectadas com os plasmídeos codificando DDX3 rotulado de His e TRAIL-R2 de comprimento completo, DDX3 e uma série de mutantes de deleção de TRAIL-R2, e DDX3 isoladamente. A expressão do TRAIL-R2 da superfície celular foi examinada por citometria de fluxo usando-se o manchamento deTRA-8. Todas as células transfectadas apresentaram níveis similares de TRAIL-R2 da superfície celular (Figura 8B), indicando que a deleção do domínio intracelular não alterou o TRAIL-R2 da superfície celular. Além disso, todas as células transfectadas expressaram níveis semelhantes de DDX3 recombinante, como detectado pela análise de Western blot dos lisados celulares totais usando-se o anticorpo anti-6-his. A associação do DDX3 recombinante com os mutantes de deleção de TRAIL-R2 foi examinada por co-imunoprecipitação com TRA-8 e a análise de Western blot com o anticorpo anti-6-His (Figura 8B). A interação de TRAIL-R2 com DDX3 é independente do domínio da morte do TRAIL-R2. Para ainda definir o motivo de ligação de TRAIL-R2 mais precisamente, outros mutantes de deleção do TRAIL-R2, o D330, e o truncamento de TRAIL-R2 (T300-330) foram construídos (Figura 8C), cotransfectados com DDX3 nas células 3T3, e analisados quanto às suas interações. Os resultados demonstraram que DDX3 não se ligou ao domínio da morte de TRAIL-R2, mas, ao invés, a uma região próxima da membrana (aa 300-330) perto do domínio da morte (aa 340-aa 420) (Figura 8C). Isto indica que DDX3 pode desempenhar um papel diferente a partir das proteínas associadas ao domínio da morte previamente identificadas na sinalização de TRAIL-R2. Além disso, esta região é altamente homóloga com TRAIL-R1 e DcR2 (Figura 8D). Estes dados indicam que DDX3~é uma proteína adaptadora comum com membros da família do receptor da morte.
DDX3 contém CARD. A significância funcional do DDX3 na apoptose mediada por TRAIL-R2 foi a seguir pesquisada mediante análise dapropriedade específica desta molécula. Pelo menos duas RNA helicases da família protéica DEAD box foram recentemente identificadas, que contêm um domínio de recrutamento da caspase (CARD). O CARD, nestas RNA helicases, funciona como um regulador para a apoptose. Como o DDX3 5 desempenha um importante papel na regulação da apoptose mediada pelo TRAIL-R2, o DDX3, um membro das helicases da família protéica DEAD box, pode ter um CARD também, e a função do DDX3 inibidora da apoptose pode ser diretamente dependente do CARD. Assim sendo, a possibilidade de que o DDX3 seja uma proteína de CARD foi examinada. A análise de alinhamento de aminoácidos indica que DDX3 contém um motivo de ação conservado entre aa50 - aa 150, como o fazem o MDA5 e RIGI. O CARD é um motivo de interação homotípica. As proteínas contendo CARD podem interagir uma com a outra através deste domínio. Como DDX3 é uma nova helicase contendo CARD altamente conservado, ele é capaz de interagir com outras proteínas de CARD. cIAPl, uma proteína contendo CARD também, tem sido amplamente considerado como um inibidor da caspase e é recrutado ao TNFRI e TNFRJI para regular a apoptose mediada pelo TNTRI. Se DDX3 é capaz de interagir com cIAPl foi testado com o uso do anticorpo anti-DDX3 ou anti-TRAIL-R2 em uma experiência de co-imunoprecipitação. Foi determinado que o cIAPl pode ser facilmente co-imunoprecipitado com DDX3 e com o complexo de TRAIL-R2 analisado por TRAIL-R2 co-imunoprecipitado e DDX3 co-imunoprecipitado tanto nas células precursoras não tratadas com TRA-8 quanto nas resistentes (Figura 8E). Entretanto, o cIAPl foi rapidamente liberado do complexo de TRAIL-R2-DDX3, e isto se correlacionou com a clivagem de DDX3 nas células precursoras. Ao
-------------------^contrário, o nível de cIAPl aumentou no complexo de TRAIL-R2-DDX3 nas
células resistentes após o tratamento de TRA-8 (Figura 8E). Estes resultados indicam que o DDX3 pode servir como a ligação entre TRAIL-R2 e cIAPl.
Resistência inversa pelo DDX3 de reversão: Para estudar opapel do DDX3 na sinalização do TRAIL-R2, a importância do DDX3 endógeno na apoptose induzida pelo TRA8 foi examinada. Como o DDX3 não decresceu nas células resistentes durante a apoptose induzida por TRA-8, um nível reduzido de expressão do DDX3 pode ser necessário para que as células cancerosas sejam suscetíveis da apoptose. Uma estratégia de RNAi foi empregada para determinar o papel do DDX3 na resistência à apoptose mediada pelo TRAIL-R2. Uma ferramenta de esquema on-line, BLOCK-IT® RNAi Designer (Invitrogen), foi usada para identificar alvos de RNAi para DDX3. Cinco seqüências alvejadas de shRNA foram selecionadas dos alvosde RNAi de classificação mais elevada 10 de topo e clonadas no vetor de entrada BLOCK-IT® U6. Células MDA231 resistentes ao TRA-8 foram transfectadas com cinco construções de RNAi, e os níveis de expressão protéica do DDX3 foram determinados pela análise de Western blot usando-se anticorpo monoclonal anti-DDX3 48 horas após a transfecção. Quatro das cinco construções de RNAi testadas foram inibidores da expressão de DDX3 muito eficazes (mais de 50 % de redução) em comparação com os controles não transfectados ou transfectados com GFP (Figura 9A). A mais eficaz destas construções, a 2, foi selecionada para análise do efeito da reversão do DDX3 na apoptose mediada pelo TRA-8. Para se determinar se a reversão da expressão de DDX3 inverte a suscetibilidade do TRA-8 nas células resistentes ao TRA-8, as células MDA231 resistentes ao TRA-8 foram cotransfectadas com o vetor RNAi (construção 2) e um vetor de expressão de GFP como um indicador das células transfectadas. 48 horas após a transfecção, o DDX3 foi co-imunoprecipitado com TRAIL-R2 e sondado com um anticorpo anti-DDX3. Como esperado, a expressão do DDX3 foi significativamente reduzida enrcomparação com as células de controle (Figura 9B). As células positivas em GFP foram escolhidas e cultivadas com várias concentrações de TRA-8 durante a noite. Com o uso do ensaio de ATPLITE, as células MDA231 transfectadas com GFP e vetores de controle não sofreram deapoptose após o tratamento de TRA-8, indicando que as células haviam conservado resistência ao TRA-8. No entanto, as células cotransfectadas com o RNAi de DDX3 e GFP apresentaram morte celular dependente da dose de TRA-8 (Figura 9C). Usando-se o manchamento TÚNEL, um número significativo de células de reversão de DDX3 foi observado estar experimentando apoptose (Figura 9D). Estes resultados indicam que a infra-regulação da expressão do DDX3 reverte a resistência ao TRA-8. Para ainda determinar o papel causai do DDX3 na apoptose mediada pelo TRAIL-R2, a expressão doDDX3 foi reduzida em um painel de células tumorais e sua suscetibilidade à apoptose induzida pelo TRA-8 analisada. O RNAi de DDX3 reduziu a quantidade de DDX3 endógeno e intensificou a apoptose induzida pelo TRA8 no painel de células tumorais, incluindo algumas células resistentes espontâneas (Figuras 9E-F). Ao contrário, as células transfectadas com um oligonucleotídeo de controle apresentaram expressão de DDX3 normal e permaneceram resistentes à apoptose induzida pelo TRA-8 (Figuras 9E-F). Assim, o DDX3 é um componente crítico do aparelho de transdução de sinal do TRAIL-R2 e é essencial para a resistência à apoptose mediada pelo TRAIL-R2.
TRAIL-R2 sem a região de ligação a DDX3 é pró-apoptótico.
Para testar se o motivo de ligação a DDX3 representa um novo domínio regulador negativo modulando à função do domínio da morte do TRAIL-R2, a função de indução apoptótica do TRAIL-R2 mutante foi comparada ao TRAIL-R2 do tipo selvagem. As células transfectadas com TRAIL-R2 sem o domínio da morte pareceram não responder ao tratamento de TRA-8, mas as células transfectadas com TRAIL-R2 com um domínio de ligação de DDX3 trancado pareceram pró-apoptóticas apresentaram"mais suscetibilidade à apoptose induzida pelo TRA-8 em comparação com as células transfectadas com TRAIL-R2 do tipo selvagem (Figura 10). Houve um efeito inibidor pronunciado do DDX3, que pôde suprimir a apoptose mediada pelo TRAIL-R2. Estas descobertas indicam que o DDX3 é um mediador inibidor da apoptose induzida pelo TRAIL-R2.
DDX3 é uma proteína de CARD que regula a apoptose mediada pelo TRAIL-R2. Para dissecar a sinalização de TRAIL-R2-DDX3-cIAPl, a região necessária para sua ligação ao cIAPl foi avaliada. Como o CARD se acha no término N do DDX3 e é suposto interagir com cIAPl, esta região pode ser responsável por ligar o cIAPl. As células HEK293A foram transfectadas com plasmídeos codificando DDX3, DDX3A51-662, DDX3A101-662, DDX3A151-662 ou DDX3A1-350. Tanto o DDX3 de comprimento completo quanto o deletado C-terminal foram capazes de co-imunoprecipitar cIAPl, o DDX3 com os primeiros 100 aminoácidos deletados foi incapaz de co-imunoprecipitar cIAPl (Figura 11A). Estes resultados confirmam que o CARD N-terminal de DDX3é responsável pelo recrutamento de cIAPl para o complexo de TRAIL-R2. É igualmente indicado que o motivo de ligação do cIAPl se acha localizado nos aminoácidos 50 a 100 do DDX3 em frente do sítio de clivagem, aminoácidos 129 a 135 (DKSDEDD; SEQ ID NO: 46). Se o DDX3 for clivado durante a apoptose mediada pelo TRAIL-R2, o fragmento N-terminal da combinação de DDX3 com cIAPl deve ser desembaraçado do complexo de TRAIL-R2, dessa forma aliviando a inibição do cIAPl para a sinalização da morte. Assim, o DDX3 é um candidato para acoplar o cIAPl e os receptores da morte à resistência da apoptose.
Para ainda evidenciar este conceito, o DDX3 mutante negativo dominante carecendo dos aminoácidos 1 a 150 foi usado. Este DDX3ACARD (DDX3A151-662) mutante falha ao interagir com cIAPl, mas é ainda capaz de ligar-se ao TRATL-R2 (Figura 11B). Assim, se o DDX3A151-662 pode ser um inibidor negativo dominante do DDX3 endógeno mediante a competição com o DDX3 do tipo selvagem ligando-se ao TRAIL-R2, foi avaliado. Células de quatro tipos foram transfectadas com DDX3ACARD. Como aFigura 5B mostra, as células transfectadas com DDX3ACARD apresentaram níveis mais elevados de expressão de DDX3ACARD em comparação com DDX3 endógeno de comprimento completo, sugerindo que o DDX3 truncado seja capaz de competir com o DDX3 endógeno para ligação do TRAIL-R2. 5 Como a Figura 11B mostra, o cIAPl foi co-imunoprecipitado com o DDX3 de comprimento completo, mas não com DDX3ACARD, como analisado por TRAIL-R2-co-IP e sondado por Western blotting com anticorpo anti-DDX3 e anti-cIAPl. Além disso, a suscetibilidade das células transfectadas à apoptose mediada pelo TRA-8 foi examinada com o uso do ensaio de ATPLITE. A expressão do DDX3 recombinante de comprimento completo não alterou a suscetibilidade à apoptose mediada pelo TRA-8 já que todas as células testadas permaneceram resistentes após o tratamento de TRA-8. Entretanto, as células tumorais resistentes ao TRA-8 que expressavam altos níveis de DDX3ACARD recuperaram sua suscetibilidade à apoptose induzida peloTRA-8 após o cIPAl associado ao TRAIL-R2 infra-regulado. Estes dados indicam que a inibição do cIAPl à apoptose induzida por TRA-8 é mediada pelo CARD intacto do DDX3. O DDX3 desprovido do CARD N-terminal pode servir como um negativo dominante que reverte parcialmente a resistência ao TRA-8. A suscetibilidade potencial das células de câncer à apoptose induzida por TRA-8 pode ser regulada pelo nível de DDX3 e cIAPl no complexo associado ao TRAIL-R2.
O complexo de TRAIL-R2-DDX3-cIAPl inibe a ativação da caspase-8. O DDX3 foi quantificado para se triar quais os níveis de DDX3 presentes nas células correlacionadas com o recrutamento e processamento da caspase-8 no DISC de TRAIL-R2. As células precursoras e resistentes
----- MDA23T e UL-3C foram tratadas com TRA-8 por quatro horas7"e o TRAIL-
R2 foi imunoprecipitado com um novo anticorpo monoclonal anti-TRAIL-R2 (clone: 2B4), que reconhece um epítopo de TRAIL-R2 diferente do TRA-8. O complexo de TRAIL-R2/DDX3/cIAPl foi liberado das contas, e o DDX3 ecIAPl associados ao TRAIL-R2 foram submetidos ao imunomanchamento e à análise de ELISA de sanduíche usando-se anticorpo anti-DDX3 e anti-cIAPl. As placas de ELISA foram revestidas com anticorpo anti-TRAIL-R2 2B4 para capturar o TRAIL-R2 imunoprecipitado, e o DDX3 e cIAPl foram medidos por anticorpos monoclonais específicos em relação a DDX3 (3E2) e cIAPl. O tratamento das células tumorais ou sensíveis precursoras ou resistentes induzidas, com TRA-8 não alterou os níveis protéicos de TRAIL-R2 (Figura 12A). Entretanto, os níveis de DDX3 associado a TRAIL-R2 foram significativamente alterados pelo tratamento de TRA-8 nas células tanto sensíveis quanto resistentes. Primeiro, as células resistentes não tratadas expressaram níveis de DDX3 associados a TRAIL-R2 mais elevados em comparação com as células sensíveis não tratadas, como detectado por anticorpo 3E2 anti-DDX3 (Figura 12B). De forma importante, após o tratamento de TRA-8, o DDX3 associado ao TRAIL-R2 foi aumentado significativamente nas células resistentes a TRA-8, mas demonstraram um decréscimo marcante nas células sensíveis. O nível de cIAPl no complexo de TRAIL-R2 também foi alterado no mesmo padrão do DDX3 (Figura 12C). Estes resultados sugerem que o domínio CARD de DDX3 foi liberado por clivagem do complexo de TRAIL-R2 nas células sensíveis a TRA-8 durante a apoptose pela clivagem, ao passo que o DDX3 e o cIAPl de fato foram recrutados mais eficientemente para o TRAIL-R2 após o estímulo do TRA-8 nas células resistentes, em vez de nas células sensíveis.
Para formar DISC funcional, é essencial para as células cancerosas liberarem cIAPl do complexo de TRAIL-R2 para reduzir sua supressão à caspase durante a apoptose induzida por TRA-8. Este processo requer a clivagem do DDX3,"indicando quenesta etapa é importante pafa~ iniciar um circuito de amplificação da apoptose de alimentação. Tendo em vista que a resistência do DDX3 associado a TRAIL-R2, à clivagem, é correlacionada com uma deficiência de formação de DISC nas célulasresistentes, a suscetibilidade à clivagem do DDX3 no complexo TRAIL-R2-DDX3-cIAPl é diferente entre as células precursoras e as resistentes. O potencial de clivagem do DDX3 associado ao TRAIL-R2 por diferentes caspases foi analisado em ambas as células. O complexo de TRAIL-R2- DDX3-cIAPl foi co-imunoprecipitado com anticorpo anti-TRAIL-R2. A fração eluída das contas foi incubada com as caspases-2 e -8 ativas. A clivagem do DDX3 foi detectada pela análise de Western com anticorpo anti-DDX3. Estes resultados na combinação com a análise de ELISA (Figura 12E) demonstrou que a clivagem de DDX3 pela caspase-8 nas células resistentes
foi altamente atenuada em comparação com as células sensíveis, embora a caspase-2 apresentasse potencial de protease similar em ambas as células (Figura 12E). Estes resultados indicam que existe uma diferença funcional no complexo de DDX3 entre as células sensíveis ao TRA-8 e as resistentes. Isto também indica que a deficiência de clivagem do DDX3 pelas caspases iniciais
associadas ao receptor da morte é uma etapa chave no desenvolvimento da resistência ao TRA-8.
Como a clivagem do DDX3 foi inibida nas células resistentes inibidas, promoveu-se um estudo para se determinar a etapa na sinalização da apoptose em que o DDX3 inibe a apoptose mediada pelo TRAIL-R2. O
complexo de DDX3/cIAPl foi previsto inibir a ativação da caspase-8; portanto, a ativação da caspase-8 no complexo de TRAIL-R2-DDX3-cIAPl como um dos primeiros eventos detectáveis após a deflagração do receptor foi examinada. Para avaliar o efeito do complexo de TRAIL-R2-DDX3-cIAPl sobre a ativação da caspase-8, a atividade da caspase foi medida com o uso do
substrato fluorofênico, Ac-IETD-AMC, incubado com a caspase-8 ativa e
--------frações eluídas de DDX3 co-IP das células~~sensíveis precursoras ou"
resistentes induzidas. Uma inibição dependente da dose da atividade da caspase-8 foi observada através de uma ampla faixa de diluições na fração eluída de TRAIL-R2 co-IP das células resistentes em comparação com ascélulas sensíveis. Além disso, o cIAPl purificado também suprimiu a atividade de protease da caspase-8 completamente (Figura 12F). É plausível que o cIAPl associado ao DDX3 seja um inibidor na ativação inicial da caspase-8, desse modo impedindo a clivagem do DDX3. Assim, estes dados forneceram evidência direta de que o DDX3-cIAPl poderia regular a atividade da caspase-8 e indicam que DDX3-cIAPl é um regulador específico da caspase-8 comprometida pelo TRAIL-R2.
O efeito do TRAIL-R2-DDX3-cIAPl sobre a ativação da caspase-8 foi examinado por análise direta da caspase-8 inibida pelo cIAPl em combinação com a clivagem do DDX3 pelo ensaio da caspase, e mostrou que o DDX3-cIAPl também funciona como um novo tipo de inibidor da caspase. O complexo de DDX3-cIAPl é capaz de impedir os sinais pró-apoptóticos do receptor da morte mediante supressão da ativação da caspase-8, dessa forma inibindo a clivagem do DDX3 associado ao TRAIL-R2 pela caspase inicial. Este modelo mostra que o DDX3 protege as células contra a apoptose induzida pelo TRA-8 através do recrutamento do cIAPl, e contribui para o bloqueio das vias de sinalização da morte nas células de câncer. EXEMPLO 3
REGULAÇÃO DA LIGAÇÃO DO DDX3 AO DR5 MEDIANTE A FOSFORILAÇÃO DA SERINA EM UMA REGIÃO N-TERMINAL
A pesquisa da bioinformática conduz à identificação de um domínio rico em serina no DDX3 (SEQ ID NO: 20, correspondente aos aminoácidos 70 a 90 da SEQ ID NO: 26) que é conservado quanto a um substrato potencial de GSK3 (Figura 13A). Em comparação com a P-catenina e à glicogênio sintetase, que são os dois melhores substratos de GSK-3, o
------- DDX3 tem cinco serinas seqüenciais N-terminais ao sítio preparado. Existem
várias linhas que apoiam a evidência de que o DDX3 é um substrato para GSK3: (1) o DDX3 é diretamente associado com GSK3a como demonstrado por co-imunoprecipitação do DDX3 com GSK3a, e o GSK3 é capaz defosforilar o DDX3 (Figura 13B); (2) o GSK3 falha em fosforilar o DDX3 com uma mutação pontual em Ser90 (Figura 13C). (3) O DDX3 mutante de Ser90 apresenta desassociação aumentada do DR5 e clivagem durante a apoptose mediada por TRA-8 (Figura 13D). Estes resultados mostram que o domínio 5 rico em serina no N-terminal do DDX3 desempenha um papel regulador na associação do DDX3 com DR5.
A menos que de outra forma definido, todos os termos técnicos e científicos usados neste relatório têm os mesmos significados comumente entendidos por uma pessoa habilitada na técnica, ao qual o método e ascomposições apresentadas pertencem. Não obstante quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou nos testes dos presentes métodos e composições, os métodos, dispositivos e materiais particularmente úteis são conforme descritos. As publicações aqui citadas e os materiais quanto aos quais elas são citadas, são aqui especificamente incorporadas como referência. Nada aqui deve ser interpretado como uma admissão de que a presente invenção não esteja habilitada a antecipar tais apresentações em virtude de invenção anterior. Nenhuma admissão é feita de que qualquer referência constitua a técnica anterior. O exame das referências estabelece o que seus autores afirmam, e os requerentes se reservam o direito de objetar quanto a precisão e a pertinência dos documentos citados. Será claramente entendido que, embora várias publicações sejam aqui referidas, tal referência não constitui uma admissão de que qualquer destes documentos faz parte do conhecimento geral comum na técnica。Na totalidade da descrição e das reivindicações deste relatório
descritivo, a palavra "compreender" e variações desta palavra, tàisrcòmo "compreendendo" e "compreende", significam "incluindo, mas não limitando", e não se destinam a excluir, por exemplo, outros aditivos, componentes, inteiros ou etapas.Aqueles versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de apurar, o uso de não mais do que a experimentação de rotina, muitos equivalentes às formas de realização específicas dos métodos e composições aqui descritos. Pretende-se que tais equivalentes sejam abrangidos pelas reivindicações anexas. REFERÊNCIAS
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4
<210> 5 <211> 22 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial; nota = construção sintética <400> 5
Thr Ala Ala Phe Leu Leu Pro lie Leu Ser Gln lie lyr Ser Asp Gly
15 10 15
Pro Gly Glu Ala Leu Arg
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial; nota = construção sintética
<400> 6
Gln Tyr Pro lie ser Leu Vai Leu Ala Pro Thr 1 . 5 10
<210> 7
<211> 4
<212> PRT
< 7. i 3 > Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial; nota = construção sintética
<400> 7 A&p Glu Asp Asp
<210> 8
<211> 62
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial; nota = construção sintética
<400> 8
caccaagctt gcgctatatt çctcctcatt tcgaaaaatg aggàggaata tagcgcctcg 50
<210> 9
<211> 62
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
20
1
<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial; nota = construção sintética<table>table see original document page 127</column></row><table><table>table see original document page 128</column></row><table><400> 20
Ser Ser Ph© Gly Ser Arg Ser Asp Ser Arg Gly Lyà Ser Ser Phe Phe
15 10 15
Ser Asp Arg Gly Ser 20
<210> 21 <211> 4 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial; nota = construção sintética
<400> 21 Asp Glu Ala Asp 1
<210> 22
<211> 440
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial; nota = construção sintética
<400> 22
Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lya
X 5 10 15
Arg Hiâ Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro Gly Leu
20 25 30
Arg Vai Pro Lys Thr LôU Vai Leu Vai Vai Ala Ala Vai Leu Leu Leu
35 40 45
Vai Ser Ala GlU S^r Ala Leu Ile Thr Gln Glri Aôp LôU Ala Pro Gln
55 £0
Gln Arg Vai Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro* Ser GlU Gly Leu
70 75 80
Cys Pro Pró Gly His Kie Ile ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser
85 90
Cye Lys Tyr Gly Gln Asp syr Ser Thr Ri 3 Trp Asn Asp Leu Leu Phe
100 105 110
Cye L&u Arg Cys Thr Arg Cya Asp Ser Gly Glu Vai Glu Leu Ser Pro
11S 120
Cye Thx Thr Thr Arg- Asn Thr Vai cys Gln cys Glu Glu Gly Thr Phe
13 0 135 140
Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met Cye Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys
145 150 155 ISO
Pro Arg Gly Met Vai Lys Vai Gly Asp cys 'thr Pro Trp Ser Asp Ile
165 170 175
Glu Cys Vai Hi© Lys Glu ser Gly Thr Lys His Ser Gly Glu Ala Pro
180 185 190
Ala vai Glu Glu Thr Vai Thr Ser Ser Pro Gly Thr Pro Ala Ser Pro
200 205
Cys Ser Leu Ser Gly Ile Ile Ile Gly vai Thr Vai Ala Ala Vai vai
210 215 220
Leu lie vai Ala Vai Phe Vai cys Lys Ser LôU Leu Trp Lys Lys Vai
-225 ____ 230 ---- 235 — - 240
Leu Pro Tyr Leu Lys Gly Ile Cys Ser Gly Gly Gly Qly Asp Pro Glu
245 250 255
Arg Vai Asp Arg ser Ser Gln Arg &ro Gly Ala GlU Asp Asn Vai Leu
260 265 270
Asn Glu Ile Vai Ser Ile Leu Gln Pro Thr Gln Vai Pro GlU Gln Glu
275 280 2ÔS
Môfc Glu Vai Gln Glu Pro Ala Glu Pro Thr Gly Vai Asn Met Leu Ser
290 295 300Pro Gly Glu Ser Glu His Leu íj&u Glu Pro Ala GlU Ala Glu Arg Ser
305 310 315 320
Gln Arg Arg Arg Leu Leu Vai Pro Ala Asa Glu Gly Asp Pro Thr Glu
325 330 335
Tnr I»eu Arg <3la Cys Phe Asp Asp Phe Ala A#p Leu Vai Pro Phe Asp
340 345 350
Ser Trp Glu Pro Leu Met Arg Lye Leu Gly Leu Mét Afip As n Glu lie
355 360 365
Lya Vai Ala Lys Ala Glu Ala Ala Gly His Arg Asp Thr Leu Tyr Thr
370 * 375 330
Met Leu lie Lye Trp Vai Abíí Lys Thr Gly Arg Aep Ala Ser vai Bis
335 390 395 400
Thr Leu Leü Asp Ala Leu Glu Thr Leu Gly Glu Arg Leu Ala Lya Gln
405 410 4X5
Lys lie Glu Asp His Leu Leu Ser Ser Gly foys Phe Met Tyr Leu Glu
420 425 430
Gly Aan. Ala Asp Ser Ala Met Ser
435 440
<210> 23
<211> 90
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial; nota = construção sintética
<400> 23
Gly Gly Gly Gly Asp Pro Glu Arg
X 5
Gly Ala Glu Asp Asn Vai Leu Asn
20
Thr Gln vai Pro Glvi Gln Glu Met
35 40
Thr Gly Vai Aüm Met Lsu Ser Pro
50 55
Fro Ala Glu Ala Glu Arg ser Gln
65 70
ASU. Gly Asp Pro Thr GlU Thr Leu
as
Vai Asp Arg Ser Ser Glai Arg Pro
10 15 Glu Xle Vai Sfcr Xle Leu Gln Pro 25 30 Glu Vai Gln Glu Pro Ala Glu Pro 45
Gly Glu Ser Glu Hiô Leu Leu Glu 60
Arg Arg Arg Leu Lreu Vai Pro ala 75 80
Arg Gln 90
<210> 24
<211> 30
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial; nota = construção sintética
<400> 24
Gln Pro Thr Gln Vai Pro Glu Gln
1 5 Glu Pro Thr Gly Vai Asn Met Leu 20
Glu Met Glu Vai Gln Glu Pro Ala
10 15 Ser Pro Gly Glu Ser Glu 25 30
<210> 25
<211> 3408 __
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial; nota = construção sintética
<400>ctttcccctt actcegctcc cctcfctttcc ctcoctctcc tccccttccç tctgttctct 60
ccfccctcttc ccctcccctc ccccgtccgg ggcactctat attcââgcca ecgtttcctg 120
cttcacaaaa fcggccaccgc aegcgacacc tacggtcacg tggcetgccg ccctetcagt 180
ttcgggaatc tgcctagctc ccactaaggg gaggctacec gcggaagagc gagggcagat 240
tagaceggag aaatcccace âcatctccaa gcccgggaac tgagagagga agaagagtga 300
aggccagtgfe taggaaaaaa aaaaacaaaa acaaaaaaaa cgaaaaacga aagetgagtg 360
catagagttg gaaaggggag cgaatgcgta aggttggaàa ggggggcgaa gaggcctagg 420
ttaacatttt caggcgtctt agecggtgga aagcgggaga cgcaagttct çgcgagatct 480
cgagaactcc gaggctgaga ctagggtttt agcggagagc acgggaagtg tagctcgaga S40
gaactgggac agcatttcgc accctaagct ccaaggcagg actgctaggg gcgacaggac 600
taagtaggaa atcccttgag cttagacctg agggagcgcg cagtagccgg gcagaagtcg 660
ccgcgacagg gaattgcggt gtgagaggga gggcacacgt tgtacgtgct gacgtagccg 720
gctttccage gggtatatta gatccgtggc cgçgoggtgc gctccagagc cgcagttctc 780
ccgtgagagg gccttcgcgg tggaacaaae actcgcttag cagcggaaga ctccgagttc B40
tcggtactct tcagggatga gtcatgtggc agtggaaaat gcgctcgggc tggaccagca 900
gtttgctggc ctagacctga aetctfccaga taatcagagt ggaggaagta cagccagcaa 960
agggcgctat attcctcctc atttaaggaa ccgagaagct actagaggtt eccacgataa 1020
agaeagttca gggtggagtt ctagcaaaga tâaggatgcg tatagcagfet ttggatctcg 1080
tagtgattca agagggaagfc ctagcttctt cagtgatcgt gga&gtggat caaggggaag 1140
gtttgatgat cgtggaegga gtgattacga tggcattggc agccgtggtg acagaagtgg 1200
ctttggcaaa tttgaacgtg gtggaaacag tcgotggtgt gacaaatcag atgaagatga 1260
ttggtcaaaa ccactcccac caagtgaacg cttggaacag gaaetccttt ctggaggcaa 1320
cacfcgggatt aattttgaga aatacgatga cattccagtt gaggcaacag gcaacaactg 1380
tcctccacat attgaaagtt tcagtgatgt tgagatggga gaaattatca tgggaaacat 1440
tgagcttact cgttatacte gcccaactec agtgcaaaag catgctafctc ctatfcâtcaa 1500
agagaaãa.ga gacttgatgg cttgtgceca aacagggtet ggaaaaactg cagcatttct 1560
gttgcccatc ttgagtcaga tttattcaga tggtccaggc gaggctttga gggccatgaa 1620
ggaaaatgga aggtatgggc gccgcaaaca atacccaatc tccttggtat tagcaccaac 1680
gagagagttg gcagtacaga tctacgaaga agcçagaaaa ttttcatacc gâtctagagfc 1740
tcgtcettgc gtggtttatg gcggtgccga tattggtcag cagattcgag acfctggaacg 1800
tggatgecat ttgttagfcag ccactccagg acgtctagtg gatatgatgg aaagaggaaa 1860
gattggatta gacttttgca aatacttggt gttagatgaa gctgategga tgctggatat 1920
ggggtttgag cetcagattc gtagaatagt cgaacaagat actatgcctc caaagggtgt 1980
ccgccacact atgatgttta gtgctacttt tcctaaggaa atacagatgc tggctcgtga 2040
tttctefcagat gaatatatct tcctggctgt aggaagagtt ggctctacct ctgaaaacat 2100
cacacagaaa gtagtttggg tggaagaatc agacaaacgg tcatttctgc ttgacctcct 2160
aaatgcaaca ggcaaggatç çaçtgacctt agtgtttgtg gagaccaaaa agggtgcaga 2220
ttçtctggsg gstttcttat accstgaagg atacgcatgt aecsgcstcc atggagaccg 2280
ttctcagagg gatagagaag aggcccttca ccagctccgc tcaggaaaaa geecaatttt 2340
agtggctaca gcagtagcag caagaggact ggacatttca aatgtgaaac atgttatcaa 2400
tttfcgacttg ccaagtgatà ttgâagaafca tgtacatcgt attggtcgta cgggacgtgt 24S0
aggaaacctt ggcctggcaa cctcattett taacgagagg aacataaata ttactaagga 252 0
tttgttggat ccccttgttg aagctaaaca agaagtgccg tcttggttag aaaacatggc 2580
ttatgaacac cactacaagg geagcagtcg tggacgttct aagagtagca gatttagtgg 2640
agggtttggt gcçagagact accgacaaag tagcggtgcc agçagttcca gcttcagcag 2700
cagccgcgca agcagcagcc gcagtggcgg aggtggccac ggtagcagca gaggatttgg 2760
tggaggtggc tatggaggct tttacaacag tgatggatat ggaggaaatt ataactccca 2820
gggggttgac tggtggggta actgagcctg ctttgcagta ggtcaccctg ccaaacaagc 2880
tãatatggaa accacatgta aettagccag actatacctt gtgtagttcç aagaactcgc 2940
agtaeattac eagctgtgat tctccactga aatttttttt ttaagggagc tcaaggtcac 3 000
aagaagaaat gaaaggaaea atcagcagcc ctgttcagaa ggatcatgct catcfcgtgga 3060
gcaagtgcco ccatgaaatg ccatattttg tgaágaaagt gcatgcagga atatccaggg 3120
agtccagcat gtagtcatgg cagccttagg tattcgagac cgaceaaccc tcctgatgaa 3180
gacáâccata actcatgcag aacttggago gtgatgccca gaagtgtgtg aactggtctg 3240
tgaccacaaa gatgagaacc gcatgctgag attggtggaa tggagatttc agtgagccta 3300
catgcagatg acatggtgac aeccgtgcec agcctgagct gttttcttct ggccctctta 3360
ttacatgaga aaaataaaca cctatgcacc ttggcctcaa aaaaaaaa 3408
<210> 26____
<211> 662
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial; nota = construção sintética
<400>26Met Ser His Vai Ala Vai Glu Asn Ala. I»eu Gly Deu Asp Gln Gln Phe
1 5 10 15
Ala Gly Leu Asp Leu Asn Ser Ser Asp Asn Gln ser Gly Gly Ser Thr
20 25 30
Ala Ser Lys Gly Arg Tyr lie pro Pro Híb Leu Arg Asn Arg Glu Ala
35 40 45
Thr Arg Gly Phe Tyr Asp Lys Asp Ser Ser Gly Trp Ser Ser Ser Lye
50 55 60
Asp Lys Asp Alá Tyr Ser Ser Phe Gly Ser Arg Ser Aap Ser Arg Gly 65 70 75 80
Lys Ser Ser Phe Phe Ser Aap Arg Gly ser Gly Ser Arg Gly Arg Phe
85 90 35
Asp Asp Arg Gly Arg Ser Asp Tyr Asp Gly lie Gly Ser Arg Gly Asp
100 105 110
Arg Ser Gly Phe Gly Lys Phe Glu Arg Gly Gly Asn Ser Arg Trp Cye
115 120 125
Asp Lys Ser Asp Glu A3p Asp Trp Ser Lys Pro Leu Pro Pro Ser Glu
130 135 140
Arg Leu Glu Gln Glu Leu Phe Ser Gly Gly As» Thr Gly He Asn Phe 145 150 155 160
Glu Lys Tyr Aap Asp Ilè Pro Vai Glu Ala Thr Gly Asn Asn Cys Pro
165 170 175
Pro Hía He Glu Ser Phe Ser Asp Vai Glu Met Gly Glu lie He Met
180 185 190
Gly Asn He Glu Leu Thr Arg Tyr Thr Arg Pro Thr Pro Vai Gln Lys
195 200 205
Bis Ala He Pro lie He Lys Glu. Lys Arg Asp Leu Met Ala Cys Ala
210 215 220
Gln Thr Gly Ser Gly Lys Thr Ala Ala Phe Leu Leu Pro He Leu Ser 225 230 235 240
Gln He Tyr Ser A&p Gly Pro Gly Glu Ala Leu Arg Ala Met Lys Glu
245 250 255
AS». Gly Arg Tyr Gly Arg Arg Lys Gln Tyr Pro He Ser Leu Vai Leu
260 265 270
Ala Pro Thr Arg Glu Leu Ala Vai Gln He Tyr Glu Glu Ala Arg Lys
27S 280 285
£he Ser Tyr Arg Ser Arg Vai Arg Pro Cys vai Vai Tyr Gly Gly Ala
290 295 300
Asp Ilè Gly Gln Gln He Arg Asp Leu Glu Arg Gly Cy3 HÍ3 Leu Leu 305 310 315 320
Vai Ala Thr Pro Gly Arg Leu Vai Asp Met Met Glu Arg Gly Lys lie
325 330 335
Gly Leu Asp Phe Cys Lye Tyr Leu Vai Leu Asp Glu Ala Asp Arg Met
340 345 350
Leu Asp Met Gly Phe Glu Pro Gln He Arg Arg He Vai Glu Gln Asp
3SS 3€0 365
Thr Met Pro Pro Lys Gly Vai Arg His Thr Met Met Phe Ser Ala Thr
370 375 380
Phe Pro I^ys Glu He Gln Met Leu Ala Arg Asp Phe Leu Asp Glu Tyr 385 390 395 400
He Phe Leu Ala Vai Gly Arg Vai Gly Ser Thr Ser Glu Asn He Thr
405 410 415
Gln Lys Vai Vai Trp Vai Glu Glu Ser Asp Lys Arg Ser Phe Leu Leu
420 425 430
Asp Leu Leu Asn Ala Thr Gly Lys Asp Ser Leu Thr Leu Vai Phe Vai
435 440 445
Glu Thr Lys Lys Gly Ala Asp Ser Leu Glu Asp Phe Leu Tyr His Glu
4S0 455 460
Gly Tyr Ala Cys Thr Ser He Kie Gly Aep Arg Ser Gln Arg Asp Arg
465 ____________ 470 ___ 475 ________ 480
Glu Glu Ala Leu Ris Gln Phe Arg Ser Gly Lys Ser Pro He Leu Vai
485 490 495
Ala Thr Ala Vai Ala Ala Arg Gly Leu Asp He Ser Asn Vai Lys His
500 505 510
Vai He Aan Phe Asp Leu Pro Ser ASp He Glu Glu Tyr Vai His Arg
S15 520 525
He Gly Arg Thr Gly Arg Vai Gly Asn Leu Gly Lèu Ala Thr Ser Phe 530 535 540Pkô Asn Glu Arg Asn Xle Asn Ile Thr Lys Asp Leu Leu Asp Leu Leu 545 550 555 560
vai Glu Ala Lys Gln Glu Vai Pro Ser Trp Leu Glu Asn Met Ala Tyr
565 570 575
Glu His His Tyr Lys Gly Ser Ser Arg Gly Arg Ser Lys Ser Ser Arg
580 5S5 590
Pne Ser Gly Gly Pne Gly Ala Arg Asp Tyr Arg Gln Ser Ser Gly Ala
S95 600 605
Ser Ser Ser Ser Fhe Ser Ser Ser Arg Ala Ser ser Ser Arg Ser Gly
610 615 620
Gly Gly Gly Eis Gly Ser Ser Arg Gly Phe Gly Gly Gly Gly Tyr Gly $35 630 635 640
Gly Pne Tyr Asn Ser Asp Gly Tyr Gly Gly Asn Tyr Asn Ser Gln Gly
645 650 655
Vai Asp Trp Trp Gly Asn 660
<210> 27 <211> 21 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial; nota = construção sintética <400> 27
ggagaaatta tcatgggaaa c ^1
<210> 28 <211> 21 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial; nota = construção sintética <400> _28
guuacccaug auaãuuucuc c 23*
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial; nota = construção sintética
<400> 29
acggatccaa atgagtcafcg tggcagtgga 30
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial; nota = construção sintética
<400> 30
ctctcgagca aagcaggetc agttaccc 28
<210> 31 <211> 31<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial; nota = construção sintética
<400> 31
aaaggtacca gccatggaac aacggggaca g 31
<210> 32
<211> 33
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<22 3> Descrição da Seqüência Artificial; nota = construção sintética
<400> 32
aaagatatcfc t&ggacatgg cagagtctgc att 33
<210> 33
<211> 34
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial; nota = construção sintética
<400> 33
acggatccaa atgttttotg gaggcaacac tggg 34
<210> 34
<211> 36
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<22 3> Descrição da Seqüência Artificial; nota = construção sintética
<400> 34
a&agafcatct tactgtctca gagfcctcagt gggatc 36
<210> 35
<211> 36
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<22 3> Descrição da Seqüência Artificial; nota = construção sintética
<400> 35
aaagatatcc tcgagatttg ctggaaccag cagcct 3fi
<210> —3-6- ------- ------- -----
<211> 31
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial; nota = construção sintética
<400> 36<image>image see original document page 135</image>Arg Lys Gln Tyr Pro lie Ser Leu Vai Leu Ãla Pro Thx Arg Glu Leu
115 120 125
Ala Vai Gln lie Tyr Glu Glu Ala Arg Lys Phe Sex Tyr Arg Ser Arg
130 135 140
Vai Arg Pro Cys Vai Vai Tyr Gly Gly Ala Asp lie Gly Gln Gln lie 14S 150 1SS 160
Arg Asp Leu Glu Arg Gly Cys Eis Leu Leu Vai Ala Thr Pro Gly Arg
165 170 175
Leu Vai Asp Met Met Glu Arg Gly Lys lie Gly Leu Asp Phe Cys Lys
160 185 190
Tyr Leu Vai Leu Asp Glu Ala Asp Arg Met Leu Asp Méfc Gly Phe Glu
195 200 205
Pro Gln lie Arg Arg lie Vai Glu Gln Asp Thr Met Pro Pro Lys Gly
210 215 220
Vai Arg His Thx Ket Met Phe Ser Ala Thr Phe Pro Lys Glu lie Gln, 225 23 0 235 240
Met Leu Ala Arg Asp Phe Leu Asp Glu Tyr lie Phe Leu Ala vai Gly
245 250 2SS
Arg Vai Gly Ser Thr ser Glu Asa lie Thr Gln Lys vai Vai Trp Vai
260 265 270
Glu Glu Ser Asp Lys Arg Ser Phe Leu Leu Asp Leu Leu asíi Ala Thr
27S 280 285
Gly Lys Asp Ser Leu Thr Leu Vai Phe Vai Glu Thr Lyti Lys Gly Ala
290 29S 300
Asp Ser Leu Glu Asp Phe Leu Tyr His Glu Gly Tyr Ala Cys Thr Ser 305 310 315 320
lie His Gly Asp Arg Ser Gln Arg Asp Arg Glu Glu Ala Leu His Gln
325 " 330 335
Phe Arg ser Gly Lys Ser Pro lie Leu Vai Ala Tar Ala Vai Ala Ala
340 34S 350
Arg Gly Leu Asp lie Ser Asn Vai Lys His Vai He Asn Phe Asp Leu
355 360 365
Pro Ser Asp lie Glu Glu Tyr Vai His Arg lie Gly Arg Thr Gly Arg
370 375 380
Vai Gly Asn Leu Gly Leu Ala Thr ser phe Phê Asn Glu Arg Asn lie 385 390 39S 400
Asn lie Thr Lys Asp Leu Leu Asp Leu Leu Vai Glu Ala Lys Gln Glu
405 410 415
Vai Pro Ser Trp Leu Glu Asn Met Ala Tyr Glu Eis His Tyr Lys Gly
420 425 430
Ser Ser Arg Gly Arg ser Lys Ser Ser Arg Phe Ser Gly Gly Phe Gly
435 440 445
Ala Arg Asp Tyr Arg Gln ser Ser Gly Ala Ser Ser Ser Ser Phe ser
450 455 460
Ser Ser Arg Ala Ser Ser Ser Arg Ser Gly Gly Gly Gly His Gly Ser 465 470 475 480
Ser Arg Gly Phe Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Phe Tyr Asn Ser Asp 485 490 495
Gly Tyr Gly Gly Asn Tyr Asa Ser Gln Gly Vai Asp Trp Trp Gly Asn 500 505 510
<210> 40 <211> 5 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial; nota = construção sintética <400> 40
Vâl Asp Vai Ala Asp
1 5
<210> 41 <211> 4 <212> PRT<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial; nota = construção sintética
<400> 41 Asp Glu Vai Asp 1
<210> 42
<211> 4
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial; nota = construção sintética
<400> 42
lie Glu Thr Mp l
<210> 43 <211> 27 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial; nota = construção sintética <400> 43
Ser Pro Gly Glu Ser Glu His Leu beu Glu Pro Ala Glu Ala Glu Arg
1 5 10 15
Ser Gln Arg Arg Arg Leu Leu Vai Pro Ala Asn
<210> 44 <211> 27 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<22 3> Descrição da Seqüência Artificial; nota = construção sintética <400> 44
Ser Pro Glu Glu Pro Gln Arg Leu Leu Glu Gln Ala Glu Ala Glu Gly
15 10 15
Cys Gln Arg Arg Arg Leu Leu Vai Pro Vai Asn 20 25
<210> 45 <211> 27 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial; nota = construção sintética <400> 45
Ser Pro Gly Glu Ala Gln Cys Leu Leu Gly Pro Ala Glu Ala Glu Gly
1 5 10 15
Ser OXn Arg Arg Arg Leu Leu Vai Pro Ala Asn 20 25<210> 46
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial; nota = construção sintética
<400> 46
Asp Lys ser Asp Glu Asp Asp 1 5

Claims (94)

REIVINDICAÇÕES
1. Método de reverter ou prevenir a resistência de uma célula a um agonista do receptor da morte, caracterizado pelo fato de que compreende colocar em contato uma célula alvo com um modulador de uma ou mais atividades de uma proteína contendo CARD, em que a modulação reverte ou previne a resistência ao agonista.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agonista é selecionado do grupo consistindo de um anticorpo DR5, um anticorpo DR4, Fas, TNF e TRAIL.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o receptor da morte é Fas, TNFR1 ou um receptor de TRAIL.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o receptor de TRAIL é selecionado do grupo consistindo em DR4 e DR5.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o modulador é um inibidor da quinase, um promotor da clivagem deDDX3, um inibidor da ligação dependente do CARD, um inibidor do IAP, ou um inibidor da expressão de DDX3.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o inibidor da expressão de DDX3 é um RNAi, siRNA ou shRNA.
7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína contendo CARD é selecionada do grupo consistindo em DDX3,mda-5 eRIG-1.
8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína contendo CARD é um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos com pelo menos 85 % de homologia ao DDX3, mda-5 eRIG-1.
9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o modulador inibe a ligação da proteína contendo CARD aoreceptor da morte.
10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o modulador aumenta ou reduz a ligação da proteína contendo CARD a uma caspase ou modulador de caspase (IPA).
11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que a caspase é caspase-1, caspase-2, caspase-4 ou caspase-5.
12. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o modulador da caspase é um IAP selecionado do grupo consistindo em cIAP 1, cIAP2, XIAP e survivina.
13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a célula alvo se acha in vitro.
14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula alvo se acha in vivo.
15. Método de triar uma célula quanto a um biomarcador da 15 resistência a um agonista do receptor da morte, caracterizado pelo fato de quecompreende monitorar a associação do receptor da morte e uma proteína contendo CARD, em que a associação significa resistência ao agonista.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que ainda compreende proceder ao pré-contato da célula com o agonista do receptor da morte.
17. Método de triar uma célula quanto a um biomarcador da resistência a um agonista do receptor da morte, caracterizado pelo fato de que compreende monitorar a associação de uma caspase ou modulador de caspase (IAP) com uma proteína contendo CARD, em que a associação dos IAPs com a proteína contendo CARD indica resistência ao agonista.
18. Método de acordo com areivindicação 17, caracterizadopelo fato de que compreende o pré-contato da célula com o agonista do receptor da morte.
19. Método de acordo com as reivindicações 15 ou 17,caracterizado pelo fato de que a proteína contendo CARD é selecionada do grupo consistindo em DDX3, mda-5 e RIG-1.
20. Método de acordo com as reivindicações 15 ou 17, caracterizado pelo fato de que a proteína contendo CARD é o polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos com pelo menos 85 % de homologia aos DDX3, mda-5 eRIG-1.
21. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a caspase é caspase-1, caspase-2, caspase-4 ou caspase-5.
22. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o modulador da caspase é um IAP selecionado do grupoconsistindo em cIAPl, cIAP2, XIAP e survivina.
23. Método de monitorar a resistência a um agonista do receptor da morte em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende (a) adquirir uma amostra biológica do indivíduo, e(b) detectar a associação de uma caspase ou modulador de caspase com DDX3 na amostra, a associação indicando resistência.
24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a caspase é caspase 1, caspase-2, caspase-4 ou caspase-5.
25. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizadopelo fato de que o modulador da caspase é um IAP selecionado do grupo consistindo em cIAPl, cIAP2, XIAP e survivina.
26. Método de monitorar a resistência a um agonista do receptor da morte em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende(a) adquirir uma amostra biológica do indivíduo, e-------------------------(b) detectar a associação da proteína contendo CARD com um receptor da morte na amostra, um nível de associação semelhante àquele de uma célula resistente indicando resistência.
27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que ainda compreende detectar a associação de um IAP com a proteína contendo CARD, um nível de associação entre a proteína contendo IAP e CARD semelhante àquele de uma célula resistente indicando resistência.
28. Método de induzir seletivamente a apoptose em uma célula alvo expressando um receptor da morte, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de(a) colocar a célula alvo em contato com uma quantidade terapêutica de um agonista do receptor da morte, que especificamente se ligueao receptor da morte e induza a apoptose, e(b) administrar à célula alvo uma quantidade terapêutica de um modulador de uma ou mais atividades de uma proteína contendo CARD.
29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o agonista é selecionado do grupo consistindo em umanticorpo DR5, um anticorpo DR4 e TRAIL.
30. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o receptor da morte é Fas, TNFR1, ou um receptor de TRAIL.
31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizadopelo fato de que o receptor de TRAIL é selecionado do grupo consistindo em DR4 e DR5.
32. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o modulador é um inibidor da quinase, um promotor da clivagem de DDX3, um inibidor da ligação dependente do CARD, um ------ inibidor de IAP, ou um inibidor da expressão do DDX3.
33. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o inibidor da expressão do DDX3 é um RN Ai, siRNA ou shRNA.
34. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que as proteínas contendo CARD são selecionadas do grupo consistindo em DDX3, mda-5 e RIG-1.
35. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a proteína contendo CARD é um polipeptídeo tendo umaseqüência de aminoácidos com pelo menos 85 % de homologia ao DDX3, ao mda-5 e ao RIG-1.
36. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o modulador inibe a ligação da proteína contendo CARD ao receptor da morte.
37. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o modulador afeta a ligação da proteína contendo CARD a uma caspase ou modulador de caspase (IAP).
38. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a caspase é caspase-1, caspase-2, caspase-4 ou caspase-5.
39. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o modulador da caspase é um IAP selecionado do grupo consistindo em cIAPl, cIAP2, XIAP e survivina.
40. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a célula se acha in vitro.
41. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato dè que a célula se acha in vivo.
42. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a célula alvo é uma célula de câncer, uma célula sinovial da artrite reumatóide, um linfócito ativado, ou uma célula viralmente infectada.
43. Método de tratar de um indivíduo com—câncer, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapêutica de (a) um agonista do receptor da morte e (b) um modulador de uma ou mais atividades de uma proteína contendo CARD, emque o modulador reduz a resistência ao agonista do receptor da morte.
44. Método de tratar de um indivíduo com uma doença inflamatória ou ãutoimune, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapêutica de (a) um agonista do receptor da morte e (b) um agente que modula uma ou mais atividades de uma proteína contendo CARD, em que o modulador reduz a resistência ao agonista do receptor da morte.
45. Método de acordo com as reivindicações 43 ou 44, caracterizado pelo fato de que o agonista é selecionado do grupo consistindo em um anticorpo de DR5, um anticorpo de DR4, e TRAIL.
46. Método de acordo com as reivindicações 43 ou 44, caracterizado pelo fato de que o receptor da morte é Fas, TNFR1 ou um receptor de TRAIL.
47. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o receptor de TRAIL é selecionado do grupo consistindo em DR4 e DR5.
48. Método de acordo com as reivindicações 43 ou 44, caracterizado pelo fato de que o modulador é um inibidor da quinase, um promotor da clivagem do DDX3, um inibidor do IAP, ou um inibidor da expressão do DDX3 (RNAi).
49. Método de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que o inibidor da expressão do DDX3 é um RNAi, um siRNA ou um shRNA.
50. Método de acordo com as reivindicações 43 ou 44, caracterizado pelo fato de que as proteínas contendo CARD são selecionadas do grupo consistindo em DDX3, mda-5 e RIG-1.
51. Método de acordo com as reivindicações 43 ou 44, caracterizado pelo fato de que a proteína contendo CARD é um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos com pelo menos 85 % de homologia aosDDX3,mda-5 eRIG-1.
52. Método de acordo com as reivindicações 43 ou 44, caracterizado pelo fato de que o modulador inibe a ligação da proteína contendo CARD ao receptor da morte.
53. Método de acordo com as reivindicações 43 ou 44,caracterizado pelo fato de que o modulador aumenta ou reduz a ligação da proteína contendo CARD a uma caspase ou modulador da caspase (IAP).
54. Método de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que a caspase é caspase-1, caspase-2, caspase-4 ou caspase-5.
55. Método de acordo com a reivindicação 53, caracterizadopelo fato de que o modulador da caspase é um IAP selecionado do grupo consistindo em cIAPl, cIAP2, XIAP e survivina.
56. Método de acordo com as reivindicações 43 ou 44, caracterizado pelo fato de que a célula se acha in vitro.
57. Método de acordo com as reivindicações 43 ou 44,caracterizado pelo fato de que a célula se acha in vivo.
58. Método de acordo com as reivindicações 43 ou 44, caracterizado pelo fato de que ainda compreende administrar um agente terapêutico selecionado do grupo consistindo em agentes quimioterápicos, anticorpos, membros da família do TNF, agentes antivirais, agentes antiinflamatórios, agentes anti-oportunísticos, antibióticos, imunossupressores, imunoglobulinas, agentes antimaláricos, agentes anti-artrite reumatóide, citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento.
59. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende (a) um agonista do receptor da morte, e (b) um agente que modula uma oumais atividades de uma proteína contendo CARD, em que o modulador reduz a resistência ao agonista do receptor da morte.
60. Composição de acordo com a reivindicação 59, caracterizada pelo fato de que o agonista é selecionado do grupo consistindoem um anticorpo DR5, um anticorpo DR4, e TRAIL.
61. Composição de acordo com a reivindicação 59, caracterizada pelo fato de que o receptor da morte é Fas, TNFR1, ou um receptor de TRAIL.
62. Composição de acordo com a reivindicação 61,caracterizada pelo fato de que o receptor de TRAIL é selecionado do grupo consistindo em DR4 e DR5.
63. Composição de acordo com a reivindicação 59, caracterizada pelo fato de que o modulador é um inibidor da quinase, um promotor da clivagem do DDX3, um inibidor da ligação dependente do CARD, um inibidor do IAP, ou um inibidor da expressão do DDX3.
64. Composição de acordo com a reivindicação 59, caracterizada pelo fato de que o inibidor da expressão do DDX3 é um RNAi, um siRNA ou um shRNA.
65. Composição de acordo com a reivindicação 59,caracterizada pelo fato de que a proteína contendo CARD é selecionada do grupo consistindo em DDX3, mda-5 e RIG-1.
66. Composição de acordo com a reivindicação 59, caracterizada pelo fato de que a proteína contendo CARD é um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos com pelo menos 85 % de homologia aos DDX3, mda-5 eRIG-1.
67. Composição de acordo com a reivindicação 59, caracterizada pelo fato de que o modulador inibe a ligação da proteína contendo CARD ao receptor da morte.
68. Composição de acordo com a reivindicação 59,"caracterizada pelo fato de que o modulador aumenta ou reduz a ligação dã proteína contendo CARD a uma caspase ou modulador da caspase (IAP).
69. Composição de acordo com a reivindicação 68, caracterizada pelo fato de que a caspase é caspase-1, caspase-2, caspase-4 oucaspase-5.
70. Composição de acordo com a reivindicação 68, caracterizada pelo fato de que o modulador da caspase é um IAP selecionado do grupo consistindo em cIAPl, cIAP2, XIAP e survivina.
71. Composição de acordo com a reivindicação 59,caracterizada pelo fato de que ainda compreende um agente terapêutico selecionado do grupo consistindo em um agente quimioterápico, um membro da superfamília do TNF, um agente antiviral, um agente antiinflamatório, um agente anti-oportunístico, um antibiótico, um imunossupressor, uma imunoglobulina, um agente antimalárico, um agente anti-artrite reumatóide, uma citocina, uma quimiocina e um fator de crescimento.
72. Composição de acordo com a reivindicação 59, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um carreador farmaceuticamente aceitável.
73. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de quecompreende um RNA tipo grampo de cabelo curto (shRNA), em que o shRNA inibe a expressão de uma proteína contendo CARD.
74. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que a proteína contendo CARD é selecionada do grupo consistindo em DDX3, mda-5 e RIG-1.
75. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que a proteína contendo CARD é um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos com pelo menos 85 % de homologia a DDX3, mda-5 eRIG-1.
76. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 73,caracterizado pelo fato de que o RNAi é um RNA tipo grampo de cabelo curto (shRNA) compreendendo as seqüências de ácidos nucleicos SEQ ID NO: 1,2, 3 ou 4.
77. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o ácidonucleico como definido na reivindicação 73, operavelmente articulado a uma seqüência de controle da expressão.
78. Célula, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor como definido na reivindicação 77.
79. Polipeptídeo isolado codificando a região de sobrevivência de um receptor da morte, caracterizado pelo fato de que compreende menos do que 25 resíduos de aminoácido.
80. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que o receptor da morte é Fas, TNFR1, ou um receptor de TRAIL.
81. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que o receptor de TRAIL é selecionado do grupo consistindo em DR4 e DR5.
82. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que o domínio de sobrevivência é um domínio de ligação de proteína contendo CARD.
83. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pelo fato de que o receptor da morte é selecionado do grupo consistindo em um domínio de ligação de DDX3 do domínio de ligação de DR5 e DDX3 de DR4.
84. Método de bloquear a ligação da proteína contendo CARD a um receptor da morte em uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende colocar em contato a célula com o polipeptídeo como definido na reivindicação 79, ou um seu fragmento que bloqueie a ligação.
85. Método de reverter a resistência de uma célula a um "agonistadoreceptorda morteem"uma"célulaT caracterizado^compreende colocar em contato a célula com o polipeptídeo como definido na reivindicação 79.
86. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato de quecompreende o domínio de ligação do receptor da morte de uma proteína contendo CARD.
87. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que a proteína contendo CARD é selecionada do grupo consistindo em DDX3, mda-5 e RIG-1.
88. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que a proteína contendo CARD é o polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos com pelo menos 85 % de homologia aos DDX3, mda-5 eRIG-1.
89. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que não se liga às caspases ou aos IAPs, em que o polipeptídeo bloqueia a associação dos IAPs com o receptor da morte, e em que o polipeptídeo não impede a ligação de FADD ao receptor da morte.
90. Método de bloquear a associação de um IAP com o receptor da morte, caracterizado pelo fato de que compreende colocar em contato a célula com o polipeptídeo como definido na reivindicação 86.
91. Método de reverter a resistência de uma célula a um agonista do receptor da morte, caracterizado pelo fato de que compreende colocar em contato a célula com o polipeptídeo como definido na reivindicação 86.
92. Método de triar um modulador de uma proteína contendo CARD, em que o modulador reverte ou previne a resistência de uma célula alvo a um agonista do receptor da morte, caracterizado pelo fato de que compreende:a. colocar em contato com um agente candidato a proteína contendo CARD, eb. detectar um decréscimo em uma ou mais atividades da proteína contendo CARD na presença do agente candidato em comparação com a ausência do agente candidato, em que a atividade ou atividades secorrelacionam com a resistência da célula alvo ao agonista do receptor da morte,um decréscimo na atividade ou atividades da proteína contendo CARD indicando que o agente candidato modula a proteína contendo CARD.
93. Método de acordo com a reivindicação 92, caracterizado pelo fato de que a proteína contendo CARD se acha em uma célula, em que a célula é ainda colocada em contato por uma ou mais vezes com o agonista do receptor da morte, e em que o nível de resistência ao agonista do receptor da morte é detectado.
94. Método de acordo com a reivindicação 93, caracterizado pelo fato de que o nível de resistência ao agonista do receptor da morte é detectado pela medição da apoptose.
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