BRPI0520822B1

BRPI0520822B1 - process of increasing the number of inflorescences

Info

Publication number: BRPI0520822B1
Application number: BRPI0520822-0A
Authority: BR
Inventors: Nickolai Alexandrov; Vyacheslav Brover; Peter Mascia; Kenneth A. Feldmann; Cory R. Christensen; Gregory Nadzan
Original assignee: Ceres, Inc.
Priority date: 2005-12-29
Filing date: 2005-12-29
Publication date: 2020-12-22
Also published as: CN101370938B; CA2632947A1; BRPI0520822A2; JP2009521922A; WO2007078286A3; AU2005339695A1; EP1974038A2; WO2007078286A2; BR122017002790B1; CN101370938A

Abstract

SEQUÊNCIAS DE NUCLEOTÍDEOS E POLIPEPTÍDEOS CORRESPONDENTES QUE CONFEREM TAXA DE CRESCIMENTO VEGETAL MODULADA E BIOMASSA EM PLANTAS. A presente invenção refere-se a moléculas de ácidos nucléicos isoladas e seus polipeptídeos codificados correspondentes capazes de conferir a característica de tamanho da planta, crescimento vegetativo, número de órgáos, arquitetura da planta, taxa de crescimento, vigor de plantas jovens, taxa de crescimento, rendimento de frutos e sementes, brotamento e/ou biomassa modulada em plantas. A presente invenção refere-se ainda ao uso destas moléculas de ácidos nuclélcos e de polipeptídeos na produção de plantas transgênicas, células vegetaism materiais vegetais ou sementes de uma planta que possui tamanho da planta, crescimento vegetativo, número de órgáos, arquitetura da planta, taxa de crescimento, vigor de plantas jovens e/ou biomassa que são alterados em relação às plantas do tipo selvagem cultivadas sob condições similares.SEQUENCES OF NUCLEOTIDES AND CORRESPONDING POLYPEPTIDES THAT CONFERRATE MODULATED PLANT GROWTH RATE AND BIOMASS IN PLANTS. The present invention relates to isolated nucleic acid molecules and their corresponding encoded polypeptides capable of conferring the characteristic of plant size, vegetative growth, number of organs, plant architecture, growth rate, young plant vigor, growth rate , fruit and seed yield, budding and / or modulated biomass in plants. The present invention also relates to the use of these nucleic acid molecules and polypeptides in the production of transgenic plants, plant cells, plant material or seeds of a plant that has plant size, vegetative growth, number of organs, plant architecture, rate growth, vigor of young plants and / or biomass that are altered in relation to wild type plants grown under similar conditions.

Description

CAMPO DA INVENÇÃOFIELD OF THE INVENTION

A presente invenção refere-se a moléculas de ácidos nucléicos isoladas e seus polipeptídeos codificados correspondentes capazes de mo- dular a taxa de crescimento vegetal, o crescimento vegetativo, o tamanho de órgãos, a arquitetura, o vigor de plantas jovens e/ou a biomassa em plantas. A presente invenção refere-se ainda ao uso das moléculas de ácidos nucléi- cos e polipeptídeos para a produção de plantas transgênicas, células vege- tais, materiais vegetais ou sementes de uma planta que possuem taxa de crescimento, crescimento vegetativo, número de órgãos, arquitetura, vigor de plantas jovens e/ou biomassa modulada quando comparadas às das plantas do tipo selvagem cultivadas sob condições similares.The present invention relates to isolated nucleic acid molecules and their corresponding encoded polypeptides capable of modulating plant growth rate, vegetative growth, organ size, architecture, young plant vigor and / or biomass on plants. The present invention also relates to the use of nucleic acid molecules and polypeptides for the production of transgenic plants, vegetable cells, plant materials or seeds of a plant that have growth rate, vegetative growth, number of organs, architecture, vigor of young plants and / or modulated biomass when compared to wild type plants grown under similar conditions.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃOBACKGROUND OF THE INVENTION

As plantas melhoradas especificamente para a agricultura, horti- cultura, conversão de biomassa e outras indústrias (por exemplo, indústria de papel, plantas como fábricas de produção para proteínas ou outros com- postos) podem ser obtidas utilizando tecnologias moleculares. Como um exemplo, um grande valor agronômico pode resultar da modulação do tama- nho de uma planta como um todo ou de qualquer um de seus órgãos ou do número de qualquer um de seus órgãos.Plants improved specifically for agriculture, horticulture, biomass conversion and other industries (for example, paper industry, plants such as protein production plants or other compounds) can be obtained using molecular technologies. As an example, great agronomic value can result from the modulation of the size of a plant as a whole or of any of its organs or the number of any of its organs.

Similarmente, a modulação do tamanho e da estatura de uma planta inteira ou de uma parte particular de uma planta ou da taxa de cres- cimento ou do vigor de plantas jovens permite a produção de plantas melhor adequadas para uma indústria particular. Por exemplo, reduções na altura de plantas de cultivo específicas e espécies de árvores podem ser benéficas por permitirem uma colheita mais fácil. Alternativamente, o aumento da altu- ra, da espessura ou do tamanho de órgãos, do número de órgãos pode ser benéfico através do fornecimento de mais biomassa útil para o processa- mento em alimentos, produtos alimentícios, combustíveis e/ou produtos químicos (ver o website do US Department of Energy para Energy Efficiency and Renewable Energy). Outros exemplos de características comercialmen- te desejáveis incluem o aumento do comprimento dos caules florais de flores para muda, o aumento ou a alteração do tamanho e do formato das folhas ou o aumento do tamanho das sementes e/ou dos frutos. As alterações no tamanho dos órgãos, no número de órgãos e da biomassa também resultam em alterações na massa de moléculas constituintes tais como produtos se- cundários e convertem as plantas em fábricas para estes compostos.Similarly, modulating the size and stature of an entire plant or a particular part of a plant or the rate of growth or vigor of young plants allows for the production of plants best suited to a particular industry. For example, reductions in height for specific crop plants and tree species can be beneficial as they allow easier harvesting. Alternatively, increasing the height, thickness or size of organs, the number of organs can be beneficial by providing more biomass useful for processing into food, food products, fuels and / or chemicals (see the US Department of Energy website for Energy Efficiency and Renewable Energy). Other examples of commercially desirable characteristics include increasing the length of the floral stems from flowers to seedlings, increasing or changing the size and shape of the leaves or increasing the size of the seeds and / or fruits. Changes in organ size, number of organs and biomass also result in changes in the mass of constituent molecules such as secondary products and convert plants into factories for these compounds.

A disponibilidade e a manutenção de um fluxo que pode ser reproduzido de alimento e de produtos alimentícios para animais para a ali- mentação de animais e pessoas têm sido uma grande prioridade ao longo da história da civilização humana e se originam na agricultura. Especialistas e pesquisadores nos campos da ciência agronômica, na agricultura, na ciência de plantas de cultivo, na horticultura e na ciência florestal estão até hoje se esforçando constantemente para encontrar e produzir plantas com um maior potencial de alimentação de uma população mundial em crescimento e para garantir um fornecimento de matérias-primas que podem ser reproduzidas. O nível robusto de pesquisa nestes campos de ciência indica o nível de gui- as de importância em cada ambiente geográfico e clima em todos os lugares do mundo no fornecimento de fontes sustentáveis de alimentos, produtos alimentícios, produtos químicos e energia para a população.The availability and maintenance of a reproducible flow of food and animal feed products for the feeding of animals and people has been a high priority throughout the history of human civilization and originates in agriculture. Experts and researchers in the fields of agronomic science, agriculture, crop plant science, horticulture and forest science are to this day constantly striving to find and produce plants with the greatest potential to feed a growing world population and to ensure a supply of reproducible raw materials. The robust level of research in these fields of science indicates the level of important guidelines in each geographical environment and climate everywhere in the world in providing sustainable sources of food, food products, chemicals and energy to the population.

A manipulação do desempenho das plantas de cultivo foi reali- zada convencionalmente durante séculos ao longo do cultivo de plantas. O processo de cultivo é, entretanto, tanto demorado como trabalhoso. Além disso, programas de cultivo apropriados têm que ser especialmente planeja- dos para cada espécie vegetal relevante.The manipulation of the performance of cultivation plants has been carried out conventionally for centuries throughout the cultivation of plants. The cultivation process is, however, both time-consuming and laborious. In addition, appropriate cultivation programs have to be specially planned for each relevant plant species.

Por outro lado, grande progresso tem sido feito na utilização de abordagens genéticas moleculares para a manipulação de plantas para for- necer melhores plantas de cultivo. Através da introdução e da expressão de moléculas de ácidos nucléicos recombinantes em plantas, os pesquisadores estão agora direcionados para o fornecimento para a comunidade de espé- cies vegetais adaptadas para crescerem mais eficientemente e produzirem mais produto independentemente de ambientes geográficos e/ou climáticos exclusivos. Estas novas abordagens possuem a vantagem adicional de não serem limitadas a uma espécie vegetal, mas, ao invés disso, de poderem ser aplicadas a várias espécies vegetais diferentes (Zhang e outros (2004) Plant Physiol. 135: 615).On the other hand, great progress has been made in the use of molecular genetic approaches to plant manipulation to provide better crop plants. Through the introduction and expression of recombinant nucleic acid molecules in plants, researchers are now focused on supplying the community with plant species adapted to grow more efficiently and produce more product regardless of unique geographic and / or climatic environments. These new approaches have the additional advantage of not being limited to one plant species, but, instead, they can be applied to several different plant species (Zhang et al. (2004) Plant Physiol. 135: 615).

Apesar deste progresso, hoje em dia continua havendo uma grande necessidade de processos que podem ser aplicados de forma geral que melhoram o crescimento de plantas florestais e agrícolas para se ade- quarem a necessidades particulares dependendo das condições ambientais específicas. Para esta finalidade, a presente invenção está direcionada à manipulação vantajosa do tamanho das plantas, do número de órgãos, da taxa de crescimento vegetal, da arquitetura vegetal e/ou da biomassa para maximizar os benefícios de várias plantas de cultivo dependendo do benefí- cio procurado e do ambiente particular em que a planta de cultivo tem que crescer, caracterizada pela expressão de moléculas de DNA recombinan- tes nas plantas. Estas moléculas podem ser provenientes da própria planta e simplesmente expressas em um nível maior ou menor ou as moléculas podem ser provenientes de espécies vegetais diferentes.Despite this progress, today there is still a great need for processes that can be applied in a general way that improve the growth of forest and agricultural plants to suit particular needs depending on specific environmental conditions. For this purpose, the present invention is directed to the advantageous manipulation of plant size, number of organs, plant growth rate, plant architecture and / or biomass to maximize the benefits of various cultivation plants depending on the benefit sought and the particular environment in which the cultivation plant has to grow, characterized by the expression of recombinant DNA molecules in the plants. These molecules may come from the plant itself and simply be expressed at a higher or lower level or the molecules may come from different plant species.

SUMÁRIO DA INVENÇÃOSUMMARY OF THE INVENTION

A presente invenção, portanto, refere-se a moléculas de ácidos nucléicos isoladas e a polipeptídeos e ao uso dos mesmos na produção de plantas transgênicas, células vegetais, materiais vegetais ou sementes de plantas que possuem ciclos de vida, particularmente tamanho da planta, crescimento vegetativo, taxa de crescimento vegetal, número de órgãos, ar- quitetura vegetal e/ou biomassa, que são alterados em relação às plantas do tipo selvagem cultivadas sob condições similares ou idênticas.The present invention, therefore, relates to isolated nucleic acid molecules and polypeptides and their use in the production of transgenic plants, plant cells, plant materials or plant seeds that have life cycles, particularly plant size, growth vegetative, plant growth rate, number of organs, plant architecture and / or biomass, which are altered in relation to wild type plants grown under similar or identical conditions.

A não ser que seja definido de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui possuem o mesmo significado que é comumente entendido por um versado na técnica à qual esta invenção per- tence. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS Figura 1. Alinhamento das seqüências de aminoácidos de ho- mólogos de Lead 29 (ME04717), SEQ ID NO. 93. As regiões conservadas estão encerradas dentro de uma caixa. Uma seqüência consenso é mostra- da abaixo do alinhamento. Figura 2. Alinhamento das seqüências de aminoácidos de ho- mólogos de Lead 36 (ME03195), SEQ ID NO. 99. As regiões conservadas estão encerradas dentro de uma caixa. Uma seqüência consenso é mostra- da abaixo do alinhamento. Figura 3. Alinhamento das seqüências de aminoácidos de ho- mólogos de Lead 15 (ME04077), SEQ ID NO. 81. As regiões conservadas estão encerradas dentro de uma caixa. Uma seqüência consenso é mostra- da abaixo do alinhamento. Figura 4. Alinhamento das seqüências de aminoácidos de ho- mólogos de Lead ME04012, SEQ ID NO. 110. As regiões conservadas estão encerradas dentro de uma caixa. Uma seqüência consenso é mostrada a- baixo do alinhamento. Figura 5. Alinhamento das seqüências de aminoácidos de ho- mólogos de Lead Clone 691319, SEQ ID NO. 104. As regiões conservadas estão encerradas dentro de uma caixa. Uma seqüência consenso é mostra- da abaixo do alinhamento.Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used here have the same meaning as is commonly understood by one skilled in the art to which this invention belongs. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES Figure 1. Alignment of amino acid sequences by Lead 29 homologists (ME04717), SEQ ID NO. 93. The conserved regions are enclosed in a box. A consensus string is shown below the alignment. Figure 2. Alignment of amino acid sequences by Lead 36 homologists (ME03195), SEQ ID NO. 99. The conserved regions are enclosed in a box. A consensus string is shown below the alignment. Figure 3. Alignment of amino acid sequences by Lead 15 homologists (ME04077), SEQ ID NO. 81. The conserved regions are enclosed in a box. A consensus string is shown below the alignment. Figure 4. Alignment of amino acid sequences by Lead ME04012 homologists, SEQ ID NO. 110. The conserved regions are enclosed in a box. A consensus sequence is shown below the alignment. Figure 5. Alignment of amino acid sequences by Lead Clone 691319 homologists, SEQ ID NO. 104. The conserved regions are enclosed in a box. A consensus string is shown below the alignment.

DESCRICÀO DETALHADA DA INVENÇÃODETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION 1. A INVENÇÃO1. THE INVENTION

A invenção do presente pedido de patente pode ser descrita por, mas não necessariamente limitada aos exemplos de modalidades a se- guir.The invention of the present patent application can be described by, but not necessarily limited to, examples of modalities to follow.

A presente invenção descreve novas moléculas de ácidos nu- cléicos isoladas, moléculas de ácidos nucléicos que interferem com estas moléculas de ácidos nucléicos, moléculas de ácidos nucléicos que se hibri- dizam com estas moléculas de ácidos nucléicos e moléculas de ácidos nu- cléicos isoladas que codificam a mesma proteína por causa da degeneração do código do DNA. Modalidades adicionais do presente pedido de patente incluem ainda os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácidos nu- cléicos isoladas da presente invenção.The present invention describes new isolated nucleic acid molecules, nucleic acid molecules that interfere with these nucleic acid molecules, nucleic acid molecules that hybridize to these nucleic acid molecules and isolated nucleic acid molecules that encode the same protein because of the degeneration of the DNA code. Additional embodiments of the present patent application further include polypeptides encoded by isolated nucleic acid molecules of the present invention.

Mais particularmente, as moléculas de ácidos nucléicos da pre- sente invenção compreendem: (a) uma seqüência de nucleotídeos que codi- fica uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica a qual- quer um dos Leads 15, 28, 29, 36, ME04012 e Clone 691319, corresponden- tes às SEQ ID Nos. 80, 90, 92, 98, 109 e 103, respectivamente, (b) uma se- qüência de nucleotídeos que é complementar a qualquer uma das seqüên- cias de nucleotídeos de acordo com (a), (c) uma seqüência de nucleotídeos de acordo com qualquer uma das SEQ ID Nos. 80, 90, 92, 98, 109 e 103, (d) uma seqüência de nucleotídeos que está na ordem inversa de qualquer uma das seqüências de nucleotídeos de acordo com (c) quando lida na direção 5' a 3', (e) uma seqüência de nucleotídeos capaz de interferir com qualquer uma das seqüências de nucleotídeos de acordo com (a), (f) uma seqüência de nucleotídeos capaz de formar um duplex de ácidos nucléicos hibridizados com o ácido nucléico de acordo com qualquer um dos parágrafos (a) - (e) a uma temperatura de aproximadamente 40°C até aproximadamente 48°C abaixo de uma temperatura de fusão do duplex de ácidos nucléicos hibridi- zados e (g) uma seqüência de nucleotídeos que codifica qualquer uma das seqüências de aminoácidos dos Leads 15, 28, 29, 36, ME04012 e Clone 691319 correspondentes às SEQ ID Nos. 81, 91, 93, 99, 110 e 104, respec- tivamente.More particularly, the nucleic acid molecules of the present invention comprise: (a) a sequence of nucleotides that encodes a sequence of amino acids that is at least 85% identical to any of Leads 15, 28, 29, 36, ME04012 and Clone 691319, corresponding to SEQ ID Nos. 80, 90, 92, 98, 109 and 103, respectively, (b) a nucleotide sequence that is complementary to any of the nucleotide sequences according to (a), (c) a nucleotide sequence of according to any of SEQ ID Nos. 80, 90, 92, 98, 109 and 103, (d) a nucleotide sequence that is in the inverse order of any of the nucleotide sequences according to (c) when read in the 5 'to 3' direction, (e) a nucleotide sequence capable of interfering with any of the nucleotide sequences according to (a), (f) a nucleotide sequence capable of forming a duplex of nucleic acids hybridized to the nucleic acid according to any of the paragraphs (a ) - (e) at a temperature of approximately 40 ° C to approximately 48 ° C below a melting temperature of the hybridized nucleic acid duplex and (g) a nucleotide sequence that encodes any of the Leads' amino acid sequences 15, 28, 29, 36, ME04012 and Clone 691319 corresponding to SEQ ID Nos. 81, 91, 93, 99, 110 and 104, respectively.

Modalidades adicionais da presente invenção incluem as se- qüências de polipeptídeos e das moléculas de ácidos nucléicos nas SEQ ID Nos. 80, 81,90, 91,92, 93, 98, 99, 109, 110, 103 e 104.Additional embodiments of the present invention include the sequences of polypeptides and nucleic acid molecules in SEQ ID Nos. 80, 81.90, 91.92, 93, 98, 99, 109, 110, 103 and 104.

A presente invenção incorpora ainda um vetor que compreende um primeiro ácido nucléico que possui uma seqüência de nucleotídeos que codifica um sinal de transcrição e/ou de tradução de planta e um segundo ácido nucléico que possui uma seqüência de nucleotídeos de acordo com as moléculas de ácidos nucléicos isoladas da presente invenção. Mais particu- larmente, o primeiro e o segundo ácido nucléicos podem estar ligados de forma operacional. Ainda mais particularmente, o segundo ácido nucléico pode ser endógeno a um primeiro organismo e qualquer outro ácido nucléico no vetor pode ser endógeno a um segundo organismo. Mais particularmente, o primeiro e o segundo organismos podem ser de espécies diferentes.The present invention further incorporates a vector comprising a first nucleic acid that has a nucleotide sequence that encodes a plant transcription and / or translation signal and a second nucleic acid that has a nucleotide sequence according to the acid molecules isolated nucleic acids of the present invention. More particularly, the first and the second nucleic acids can be operationally linked. Even more particularly, the second nucleic acid can be endogenous to a first organism and any other nucleic acid in the vector can be endogenous to a second organism. More particularly, the first and second organisms can be of different species.

Em uma modalidade adicional da presente invenção, uma célu- la hospedeira pode compreender uma molécula de ácido nucléico isolada de acordo com a presente invenção. Mais particularmente, a molécula de ácido nucléico isolada da presente invenção encontrada na célula hospedeira da presente invenção pode ser endógena a um primeiro organismo e pode ser flanqueada por seqüências de nucleotídeos endógenas a um segundo orga- nismo. Ainda, o primeiro e o segundo organismos podem ser de espécies diferentes. Ainda mais particularmente, a célula hospedeira da presente in- venção pode compreender um vetor de acordo com a presente invenção, que por si só compreende moléculas de ácidos nucléicos de acordo com aquelas da presente invenção.In a further embodiment of the present invention, a host cell can comprise an isolated nucleic acid molecule according to the present invention. More particularly, the isolated nucleic acid molecule of the present invention found in the host cell of the present invention can be endogenous to a first organism and can be flanked by nucleotide sequences endogenous to a second organism. In addition, the first and second organisms may be of different species. Even more particularly, the host cell of the present invention can comprise a vector according to the present invention, which alone comprises nucleic acid molecules according to those of the present invention.

Em uma outra modalidade da presente invenção, os polipeptí- deos isolados da presente invenção podem compreender adicionalmente seqüências de aminoácidos que são pelo menos 85% idênticas a qualquer um dos Leads 15, 28, 29, 36, ME04012 e Clone 691319, correspondentes às SEQ ID Nos. 81,91,93, 99, 110 e 104, respectivamente.In another embodiment of the present invention, the isolated polypeptides of the present invention may additionally comprise sequences of amino acids that are at least 85% identical to any of Leads 15, 28, 29, 36, ME04012 and Clone 691319, corresponding to SEQ ID Nos. 81,91,93, 99, 110 and 104, respectively.

Outras modalidades da presente invenção incluem métodos de introdução de um ácido nucléico isolado da presente invenção em uma célu- la hospedeira. Mais particularmente, uma molécula de ácido nucléico isolada da presente invenção pode ser colocada em contato com uma célula hospe- deira sob condições que permitam o transporte do ácido nucléico isolado para dentro da célula hospedeira. Ainda mais particularmente, um vetor que é descrito em uma modalidade anterior da presente invenção, pode ser in- troduzido dentro de uma célula hospedeira através do mesmo método.Other embodiments of the present invention include methods of introducing an isolated nucleic acid of the present invention into a host cell. More particularly, an isolated nucleic acid molecule of the present invention can be brought into contact with a host cell under conditions that permit the transport of the isolated nucleic acid into the host cell. Even more particularly, a vector that is described in an earlier embodiment of the present invention, can be introduced into a host cell using the same method.

Os métodos de detecção estão também disponíveis como mo- dalidades da presente invenção. Particularmente, os métodos para a detec- ção de uma molécula de ácido nucléico de acordo com a presente invenção em uma amostra. Mais particularmente, a molécula de ácido nucléico isolada de acordo com a presente invenção pode ser colocada em contato com uma amostra sob condições que permitam uma comparação da seqüência de nucleotídeos da molécula de ácido nucléico isolada com uma seqüência de nucleotídeos do ácido nucléico na amostra. Os resultados de tal análise po- dem então ser considerados para determinar se a molécula de ácido nucléi- co isolada da presente invenção pode ser detectável e, portanto, está pre- sente dentro da amostra.Detection methods are also available as modalities of the present invention. Particularly, the methods for detecting a nucleic acid molecule according to the present invention in a sample. More particularly, the isolated nucleic acid molecule according to the present invention can be contacted with a sample under conditions that allow a comparison of the nucleotide sequence of the isolated nucleic acid molecule with a nucleotide sequence of the nucleic acid in the sample. The results of such an analysis can then be considered to determine whether the isolated nucleic acid molecule of the present invention can be detectable and is therefore present within the sample.

Uma modalidade adicional da presente invenção compreende uma planta, uma célula vegetal, um material vegetal ou sementes de plantas que compreendem uma molécula de ácido nucléico isolada e/ou um vetor da presente invenção. Mais particularmente, a molécula de ácido nucléico iso- lada da presente invenção pode ser exógena à planta, à célula vegetal, ao material vegetal ou à semente de uma planta.A further embodiment of the present invention comprises a plant, a plant cell, a plant material or plant seeds that comprise an isolated nucleic acid molecule and / or a vector of the present invention. More particularly, the isolated nucleic acid molecule of the present invention can be exogenous to the plant, plant cell, plant material or seed of a plant.

Uma modalidade adicional da presente invenção inclui uma planta regenerada de uma célula vegetal ou semente de acordo com a pre- sente invenção. Mais particularmente, a planta ou as plantas derivadas da planta, da célula vegetal, do material vegetal ou das sementes de uma plan- ta da presente invenção preferencialmente possuem maior tamanho (em um todo ou em parte), maior crescimento vegetativo, maior número de órgãos e/ou maior biomassa (algumas vezes referidos coletivamente posteriormente aqui como maior biomassa), características de letalidade, esterilidade ou ornamentais quando comparadas com uma planta do tipo selvagem cultiva- da sob condições idênticas. Além disso, a planta transgênica pode compre- ender uma primeira molécula de ácido nucléico isolada da presente inven- ção, que codifica uma proteína envolvida na modulação do crescimento e das características fenotípicas e uma segunda molécula de ácido nucléico isolada que codifica um promotor capaz de controlar a expressão em plan- tas, em que o componente modulador do crescimento ou do fenótipo e o promotor estão ligados de forma operacional. Mais preferencialmente, o primeiro ácido nucléico isolado pode ser expresso de forma errada na planta transgênica da presente invenção e a planta transgênica pode exibir caracte- rísticas moduladas quando comparadas com uma planta progenitora isenta do gene, quando a planta transgênica e planta progenitora são cultivadas sob condições ambientais idênticas. Em uma outra modalidade da presente invenção o crescimento e as características fenotípicas moduladas podem ser causados pela inativação de uma seqüência particular, utilizando, por exemplo, um RNA interferente.A further embodiment of the present invention includes a plant regenerated from a plant or seed cell according to the present invention. More particularly, the plant or plants derived from the plant, plant cell, plant material or seeds of a plant of the present invention preferably have a larger size (in whole or in part), greater vegetative growth, greater number of organs and / or greater biomass (sometimes collectively referred to later as greater biomass), lethality, sterility or ornamental characteristics when compared to a wild type plant grown under identical conditions. In addition, the transgenic plant may comprise a first isolated nucleic acid molecule of the present invention, which encodes a protein involved in modulating growth and phenotypic characteristics and a second isolated nucleic acid molecule which encodes a promoter capable of control expression in plants, where the growth or phenotype modulating component and the promoter are operationally linked. More preferably, the first isolated nucleic acid can be expressed incorrectly in the transgenic plant of the present invention and the transgenic plant can exhibit modulated characteristics when compared to a gene-free parent plant, when the transgenic plant and parent plant are grown under identical environmental conditions. In another embodiment of the present invention, growth and modulated phenotypic characteristics can be caused by inactivating a particular sequence, using, for example, an interfering RNA.

Uma modalidade adicional consiste em uma planta, uma célula vegetal, um material vegetal ou uma semente de uma planta de acordo com a presente invenção que compreende uma molécula de ácido nucléico isola- da da presente invenção, em que a planta ou as plantas derivadas da planta, da célula vegetal, do material vegetal ou da semente de uma planta, possu- em o crescimento e as características fenotípicas moduladas quando com- paradas com uma planta do tipo selvagem cultivada sob condições idênticas.An additional embodiment consists of a plant, a plant cell, a plant material or a seed of a plant according to the present invention which comprises a nucleic acid molecule isolated from the present invention, wherein the plant or plants derived from plant, plant cell, plant material or seed of a plant, has growth and modulated phenotypic characteristics when compared to a wild type plant grown under identical conditions.

O polinucleotideo que confere maior biomassa ou vigor pode ser expresso de forma errada na planta transgênica da presente invenção e a planta transgênica pode exibir uma maior biomassa ou vigor quando com- parada com uma planta progenitora isenta do polinucleotideo, quando a planta transgênica e a planta progenitora são cultivadas sob condições am- bientais idênticas. Em uma outra modalidade da presente invenção o fenóti- po de maior biomassa ou vigor pode ser causado pela inativação de uma seqüência particular, utilizando, por exemplo, um RNA interferente.The polynucleotide that confers greater biomass or vigor may be expressed incorrectly in the transgenic plant of the present invention and the transgenic plant may exhibit greater biomass or vigor when compared to a polynucleotide-free parent plant, when the transgenic plant and the plant parent are grown under identical environmental conditions. In another embodiment of the present invention, the phenotype of greater biomass or vigor may be caused by the inactivation of a particular sequence, using, for example, an interfering RNA.

Uma outra modalidade consiste em uma planta, uma célula ve- getal, um material vegetal ou uma semente de uma planta de acordo com a presente invenção que compreende uma molécula de ácido nucléico isolada da presente invenção, em que a planta ou as plantas derivadas da planta, da célula vegetal, do material vegetal ou da semente de uma planta, possuem maior biomassa ou vigor quando comparadas com uma planta do tipo selva- gem cultivada sob condições idênticas.Another embodiment consists of a plant, a plant cell, a plant material or a seed of a plant according to the present invention which comprises a nucleic acid molecule isolated from the present invention, wherein the plant or plants derived from plant, plant cell, plant material or seed of a plant, have greater biomass or vigor when compared to a wild type plant grown under identical conditions.

Uma outra modalidade da presente invenção inclui métodos de aumento da biomassa ou vigor em plantas. Mais particularmente, estes mé- todos compreendem a transformação de uma planta com uma molécula de ácido nucléico isolada de acordo com a presente invenção. Preferencialmen- te, o método é um método de aumento da biomassa ou do vigor na planta transformada, em que a planta é transformada com uma molécula de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo da presente invenção.Another embodiment of the present invention includes methods of increasing biomass or vigor in plants. More particularly, these methods comprise transforming a plant with an isolated nucleic acid molecule according to the present invention. Preferably, the method is a method of increasing the biomass or vigor in the transformed plant, wherein the plant is transformed with a nucleic acid molecule encoding the polypeptide of the present invention.

Os polipeptídeos da presente invenção incluem seqüências consenso. As seqüências consenso são aquelas que são mostradas nas figuras 1-5.The polypeptides of the present invention include consensus sequences. The consensus strings are those shown in figures 1-5.

2. DEFINIÇÕES2. DEFINITIONS

Os termos a seguir são utilizados ao longo de todo este pedido de patente:The following terms are used throughout this patent application:

Biomassa: como utilizado aqui, "biomassa" refere-se ao material biológico útil incluindo um produto de interesse, cujo material deve ser cole- tado e é pretendido para o processamento adicional para isolar ou concen- trar o produto de interesse. "Biomassa" pode compreender o fruto ou partes do mesmo ou sementes, folhas ou caules ou raízes em que estes fazem par- te da planta que é de interesse particular para a finalidade industrial. "Bio- massa", se referindo ao material vegetal, inclui qualquer estrutura ou estrutu- ras de uma planta que contém ou representam o produto de interesse.Biomass: as used here, "biomass" refers to useful biological material including a product of interest, the material of which must be collected and is intended for further processing to isolate or concentrate the product of interest. "Biomass" can comprise the fruit or parts of it or seeds, leaves or stems or roots in which they form part of the plant that is of particular interest for industrial purposes. "Biomass", referring to plant material, includes any structure or structures of a plant that contains or represents the product of interest.

Transformação: os exemplos de meios através dos quais esta pode ser realizada são descritos abaixo e incluem transformação mediada por Agrobacterium (de dicotiledôneas (Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443; Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 2444), de monocotiledôneas (Yamauchi e outros (1996) Planta Mol Biol. 30: 321-9; Xu e outros (1995) Planta Mol. Biol. 27: 237; Yamamoto e outros (1991) Plant Cell 3: 371) e métodos de biolistica (P. Tijessen, "Hybridization with Nucleic Acid Probes" Em Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Bio- logy, P.C. vand der Vliet, ed., c. 1993 by Elsevier, Amsterdã), eletroporação, técnicas in planta e similares. Tal planta contendo o ácido nucléico exógeno é referida aqui como uma To para a planta transgênica primária e como uma TT para a primeira geração.Transformation: examples of the means by which it can be carried out are described below and include Agrobacterium-mediated transformation (of dicotyledons (Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 2444), monocotyledons (Yamauchi et al. (1996) Mol Biol. 30: 321-9; Xu et al. (1995) Mol. Biol. 27: 237; Yamamoto and others (1991) Plant Cell 3: 371) and biolysics methods (P. Tijessen, "Hybridization with Nucleic Acid Probes" In Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, PC vand der Vliet, ed., c. 1993 by Elsevier , Amsterdam), electroporation, in-plant techniques and the like, such a plant containing exogenous nucleic acid is referred to here as a To for the primary transgenic plant and as a TT for the first generation.

Proteínas Comparáveis Funcionalmente ou Homólogos Funcio- nais: este termo descreve as proteínas que possuem pelo menos uma carac- terística funcional em comum. Tais características incluem similaridade de seqüência, atividade bioquímica, similaridade do padrão de transcrição e atividade fenotípica. Tipicamente, as proteínas comparáveis funcionalmente compartilham alguma similaridade de seqüência ou pelo menos uma bio- química. Dentro desta definição, os análogos são considerados como sendo comparáveis funcionalmente. Em adição, as proteínas comparáveis funcio- nalmente compartilham geralmente pelo menos uma atividade bioquímica e/ou fenotípica.Functionally Comparable Proteins or Functional Homologs: this term describes proteins that have at least one functional characteristic in common. Such characteristics include sequence similarity, biochemical activity, similarity of the transcription pattern and phenotypic activity. Typically, functionally comparable proteins share some sequence similarity or at least one biochemistry. Within this definition, analogs are considered to be functionally comparable. In addition, functionally comparable proteins generally share at least one biochemical and / or phenotypic activity.

As proteínas comparáveis funcionalmente darão origem à mesma característica até um grau similar, mas não necessariamente o mesmo. Tipicamente, as proteínas comparáveis fornecem as mesmas carac- terísticas em que a medida quantitativa devida a uma das comparáveis é de pelo menos 20% da outra; mais tipicamente, entre 30 até 40%; ainda mais tipicamente, entre 50-60%; ainda mais tipicamente entre 70 até 80%; ainda mais tipicamente entre 90 até 100% da outra.Functionally comparable proteins will give rise to the same characteristic to a similar degree, but not necessarily the same. Typically, comparable proteins provide the same characteristics in that the quantitative measure due to one of the comparable is at least 20% of the other; more typically, between 30 to 40%; even more typically, between 50-60%; even more typically between 70 to 80%; even more typically between 90 to 100% of the other.

Seqüências heterólogas: "Seqüências heterólogas" são aquelas que não estão ligadas de forma operacional ou não estão contíguas a cada outra na natureza. Por exemplo, um promotor do milho é considerado heteró- logo a uma seqüência de região codificadora de Arabidopsis. Ainda, um pro- motor de um gene que codifica um fator de crescimento do milho é considera- do heterólogo a uma seqüência que codifica o receptor do milho para o fator de crescimento. As seqüências de elementos reguladores, tais como UTRs ou seqüências de término da extremidade 3' que não se originam na natureza do mesmo gene que a seqüência codificadora, são consideradas heterólogas à dita seqüência codificadora. Os elementos ligados de forma operacional na natureza e contíguos a cada outro não são heterólogos a cada outro. Por outro lado, estes mesmos elementos permanecem ligados de forma operacional, mas se tornam heterólogos se a outra seqüência de preenchimento for colo- cada entre eles. Assim, o promotor e as seqüências codificadoras de um gene do milho que expressam um transportador de aminoácidos não são heterólogos um com cada outro, mas o promotor e a seqüência codificadora de um gene do milho ligados de forma operacional de uma nova maneira são heterólogos.Heterologous sequences: "Heterologous sequences" are those that are not operationally linked or are not contiguous to each other in nature. For example, a corn promoter is considered heterologous to an Arabidopsis coding region sequence. Also, a promoter of a gene that encodes a corn growth factor is considered heterologous to a sequence that encodes the corn receptor for the growth factor. Sequences of regulatory elements, such as RTUs or 3 'end termination sequences that do not originate in the nature of the same gene as the coding sequence, are considered to be heterologous to said coding sequence. The elements operationally linked in nature and adjacent to each other are not heterologous to each other. On the other hand, these same elements remain operationally linked, but they become heterologous if the other filling sequence is placed between them. Thus, the promoter and coding sequences for a corn gene that express an amino acid transporter are not heterologous to each other, but the promoter and coding sequence for a corn gene operably linked in a new way are heterologous.

Expressão errada: o termo "expressão errada" refere-se a um aumento ou a um decréscimo na transcrição de uma região codificadora em uma seqüência de RNA complementar quando comparada com a do tipo sel- vagem. Este termo abrange ainda a expressão e/ou a tradução de um gene ou de uma região codificadora ou a inibição de tal transcrição e/ou tradução du- rante um período de tempo diferente quando comparada com a do tipo selva- gem e/ou de uma localização não natural dentro do genoma da planta, incluin- do um gene ou uma região codificadora de uma espécie vegetal diferente ou de um organismo que não é vegetal.Wrong expression: the term "wrong expression" refers to an increase or decrease in the transcription of a coding region in a complementary RNA sequence when compared to that of the wild type. This term also covers the expression and / or translation of a gene or coding region or the inhibition of such transcription and / or translation for a different period of time when compared to that of the wild type and / or an unnatural location within the plant's genome, including a gene or a coding region for a different plant species or an organism that is not plant.

Porcentagem de identidade de seqüência: como utilizado aqui, o termo "porcentagem de identidade de seqüência" refere-se ao grau de i- dentidade entre qualquer seqüência de busca fornecida e uma seqüência de objetivo. Uma seqüência de ácido nucléico ou de aminoácidos de busca é alinhada com uma ou mais seqüências de ácidos nucléicos ou de aminoáci- dos de objetivo utilizando o programa de computador ClustalW (versão 1.83, parâmetros preestabelecidos), que permite que alinhamentos de seqüências de ácidos nucléicos ou de proteínas sejam realizados ao longo de seu com- primento total (alinhamento global).Percentage of sequence identity: As used here, the term "percentage of sequence identity" refers to the degree of identity between any given search string and an objective string. A sequence of nucleic acid or search amino acids is aligned with one or more sequences of nucleic acids or target amino acids using the computer program ClustalW (version 1.83, predefined parameters), which allows alignments of nucleic acid sequences or proteins are carried out over their total length (global alignment).

ClustalW calcula a melhor combinação entre uma seqüência de busca e uma ou mais de objetivo e as alinha de forma que as identidades, as similaridades e as diferenças possam ser determinadas. Espaços de um ou mais resíduos podem ser inseridos dentro de uma seqüência de busca, de uma seqüência de objetivo ou ambas, para maximizar os alinhamentos de seqüências. Para o alinhamento rápido em pares de seqüências de ácidos nucléicos, são utilizados os parâmetros preestabelecidos a seguir: tamanho da frase: 2; tamanho da janela: 4; método de obtenção de escore: porcenta- gem; número de diagonais superiores: 4; e penalidade de espaço: 5. Para o alinhamento múltiplo de seqüências de ácidos nucléicos, são utilizados os parâmetros a seguir: penalidade de abertura de espaço: 10,0; penalidade de extensão de espaço: 5,0; e transições de peso: sim. Para o alinhamento rá- pido em pares de seqüências de proteínas, são utilizados os parâmetros a seguir: tamanho da frase: 1; tamanho da janela: 5; método de obtenção de escore: porcentagem; número de diagonais superiores: 5; penalidade de es- paço: 3. Para o alinhamento múltiplo de seqüências de proteínas, são utili- zados os parâmetros a seguir: matriz de peso: blosum; penalidade de aber- tura de espaço: 10.0; penalidade de extensão de espaço: 0,05; espaços hi- drofílicos: "on"; resíduos hidrofílicos: Gly, Pro, Ser, Asn, Asp, Gin, Glu, Arg e Lys; penalidades de espaço específico ao resíduo: "on". O resultado é um alinhamento de seqüências que reflete a relação entre as seqüências. O ClustalW pode ser realizado, por exemplo, no website do Baylor College of Medicine Search Launcher e no website do European Bioinformatics Institute na World Wide Web.ClustalW calculates the best combination of a search string and one or more objective and aligns them so that identities, similarities and differences can be determined. Spaces of one or more residues can be inserted into a search string, an objective string, or both, to maximize string alignments. For quick alignment in pairs of nucleic acid sequences, the following parameters are used: sentence size: 2; window size: 4; method of obtaining a score: percentage; number of upper diagonals: 4; and space penalty: 5. For multiple alignment of nucleic acid sequences, the following parameters are used: space gap penalty: 10.0; space extension penalty: 5.0; and weight transitions: yes. For quick alignment in pairs of protein sequences, the following parameters are used: sentence size: 1; window size: 5; scoring method: percentage; number of upper diagonals: 5; space penalty: 3. For multiple alignment of protein sequences, the following parameters are used: weight matrix: blosum; space opening penalty: 10.0; space extension penalty: 0.05; hydrophilic spaces: "on"; hydrophilic residues: Gly, Pro, Ser, Asn, Asp, Gin, Glu, Arg and Lys; space-specific penalties for the waste: "on". The result is an alignment of strings that reflects the relationship between the strings. ClustalW can be conducted, for example, on the Baylor College of Medicine Search Launcher website and on the European Bioinformatics Institute website on the World Wide Web.

No caso de buscas de homólogos funcionais, para garantir que uma seqüência de objetivo que possui a mesma função que a seqüência de busca, o alinhamento tem que ser ao longo de pelo menos 80% do compri- mento da seqüência de busca de forma que a maior parte da seqüência de busca seja coberta pela seqüência de objetivo. Para determinar uma porcen- tagem de identidade entre uma seqüência de busca e uma seqüência de objetivo, o ClustalW divide o número de identidades no melhor alinhamento pelo número de resíduos comparados (as posições de espaços são excluí- das) e multiplica por 100. O resultado é a porcentagem de identidade da se- qüência de objetivo em relação à seqüência de busca. É observado que o valor de porcentagem de identidade pode ser arredondado para o decimal mais próximo. Por exemplo, 78,11, 78,12, 78,13 e 78,14 são arredondados para baixo para 78,1, enquanto que 78,15, 78,16, 78,17, 78,18 e 78,19 são arredondados para cima para 78,2.In the case of searches for functional counterparts, to ensure that an objective string that has the same function as the search string, alignment has to be along at least 80% of the length of the search string so that the most of the search string is covered by the objective string. To determine an identity percentage between a search string and an objective string, ClustalW divides the number of identities in the best alignment by the number of residues compared (space positions are excluded) and multiplies by 100. The The result is the percentage of identity of the objective sequence in relation to the search sequence. It is noted that the percent identity value can be rounded to the nearest decimal. For example, 78.11, 78.12, 78.13 and 78.14 are rounded down to 78.1, while 78.15, 78.16, 78.17, 78.18 and 78.19 are rounded up to 78.2.

Regiões Reguladoras: o termo "região reguladora" refere-se às seqüências de nucleotídeos que, quando ligadas de forma operacional a uma seqüência, influenciam no início da transcrição ou no início da tradução ou no término da transcrição da dita seqüência e na taxa dos ditos proces- sos e/ou na estabilidade e/ou mobilidade de um produto da transcrição ou da tradução. Como utilizado aqui, o termo "ligada de forma operacional" refere- se ao posicionamento de uma região reguladora e a dita seqüência para possibilitar a dita influência. As regiões reguladoras incluem, sem limitação, seqüências promotoras, seqüências intensificadoras, elementos de resposta, sítios de reconhecimento de proteínas, elementos que podem ser induzidos, seqüências de ligação a proteínas, regiões não traduzidas a 51 e a 3'(UTRs), sítios de início da transcrição, seqüências de término, seqüências de polia- denilação e introns. As regiões reguladoras podem ser classificadas em du- as categorias, promotores e outras regiões reguladoras.Regulatory Regions: the term "regulatory region" refers to nucleotide sequences that, when operationally linked to a sequence, influence the beginning of transcription or the beginning of translation or the end of transcription of said sequence and the rate of said processes and / or the stability and / or mobility of a transcription or translation product. As used here, the term "operationally linked" refers to the positioning of a regulatory region and the said sequence to enable said influence. Regulatory regions include, without limitation, promoter sequences, enhancer sequences, response elements, protein recognition sites, elements that can be induced, protein binding sequences, untranslated 51 and 3 'regions (RTUs), sites beginning of transcription, ending sequences, polyadenylation sequences and introns. Regulatory regions can be classified into two categories, promoters and other regulatory regions.

Vigor de plantas jovens: como utilizado aqui, "vigor de plantas jovens" refere-se à característica da planta através da qual a planta emerge do solo mais rápido, possui uma taxa de germinação maior (isto é, germina mais rápido), possui um crescimento de plantas jovens mais rápido e maior e/ou germina mais rápido sob condições de frio quando comparadas com a do tipo selvagem ou de controle sob condições similares. O vigor de plantas jovens tem sido freqüentemente definido como compreendendo as proprie- dades de semente que determinam "o potencial para emergência uniforme rápida e desenvolvimento de plantas jovens sob uma faixa ampla de condi- ções de campo". Estringência: "Estringência", como utilizado aqui é uma função do comprimento da sonda de molécula de ácido nucléico, da composição da sonda de molécula de ácido nucléico (conteúdo de G + C), da concentração de sal, da concentração de solvente orgânico e da temperatura de hibridiza- ção e/ou das condições de lavagem. A estringência é tipicamente medida através do parâmetro Tm, que é a temperatura em que 50% das moléculas de ácidos nucléicos complementares no ensaio de hibridização são hibridi- zadas, em termos de um diferencial de temperatura partindo de Tm. As con- dições de alta estringência são aquelas que fornecem uma condição de Tm - 5°C até Tm - 10°C. As condições de estringência média ou moderada são aquelas que fornecem Tm - 20°C até Tm - 29°C. As condições de baixa es- tringência são aquelas que fornecem uma condição de Tm - 40°C até Tm - 48°C. A relação entre as condições de hibridização e Tm (em °C) é expressa na equação matemática: Tm = 81,5 -16,6(logio[Na+]) + 0,41 (%G+C) - (600/N) (I) em que N é o número de nucleotídeos da sonda de molécula de ácido nucléi- co. Esta equação funciona bem para as sondas de 14 até 70 nucleotídeos de comprimento que são idênticas à seqüência alvo. A equação abaixo, para Tm de híbridos de DNA-DNA, é útil para sondas que possuem comprimentos na faixa de 50 até mais de 500 nucleotídeos e para condições que incluem um solvente orgânico (formamida): Tm = 81,5+16,6 log {[Na+]/(1+0,7[Na+])}+ 0,41(%G+C)-500/L 0,63 (% de formamida) (II) em que L representa o número de nucleotídeos na sonda no híbrido (21). A Tm da Equação II é afetada pela natureza do híbrido: para os híbridos de DNA-RNA, a Tm é 10-15°C maior que a calculada; para os híbridos de RNA- RNA, a Tm é 20-25°C maior. Devido ao fato de que a Tm diminui aproxima- damente 1°C para cada 1% de decréscimo na homologia quando uma sonda longa é utilizada (Frischauf e outros (1983) J. Mol Biol, 170: 827-842), as condições de estringência podem ser ajustadas para favorecer a detecção de genes idênticos ou de membros de famílias relacionadas.Young plant vigor: as used here, "young plant vigor" refers to the characteristic of the plant through which the plant emerges from the soil faster, has a higher germination rate (that is, it germinates faster), has a faster and larger growth of young plants and / or germinates faster under cold conditions when compared to wild type or control under similar conditions. The vigor of young plants has often been defined as comprising the seed properties that determine "the potential for rapid uniform emergence and development of young plants under a wide range of field conditions". Stringency: "Stringency" as used here is a function of the length of the nucleic acid molecule probe, the composition of the nucleic acid molecule probe (G + C content), the salt concentration, the concentration of organic solvent and hybridization temperature and / or washing conditions. Stringency is typically measured using the parameter Tm, which is the temperature at which 50% of the complementary nucleic acid molecules in the hybridization assay are hybridized, in terms of a temperature differential starting from Tm. High stringency conditions are those that provide a condition from Tm - 5 ° C to Tm - 10 ° C. Medium or moderate stringency conditions are those that provide Tm - 20 ° C to Tm - 29 ° C. Low stringency conditions are those that provide a condition from Tm - 40 ° C to Tm - 48 ° C. The relationship between the hybridization conditions and Tm (in ° C) is expressed in the mathematical equation: Tm = 81.5 -16.6 (logio [Na +]) + 0.41 (% G + C) - (600 / N ) (I) where N is the nucleotide number of the nucleic acid molecule probe. This equation works well for probes 14 through 70 nucleotides in length that are identical to the target sequence. The equation below, for Tm of DNA-DNA hybrids, is useful for probes that have lengths in the range of 50 to more than 500 nucleotides and for conditions that include an organic solvent (formamide): Tm = 81.5 + 16.6 log {[Na +] / (1 + 0.7 [Na +])} + 0.41 (% G + C) -500 / L 0.63 (% formamide) (II) where L represents the number of nucleotides in the probe in the hybrid (21). The Tm of Equation II is affected by the nature of the hybrid: for DNA-RNA hybrids, the Tm is 10-15 ° C higher than calculated; for RNA-RNA hybrids, the Tm is 20-25 ° C higher. Due to the fact that Tm decreases approximately 1 ° C for each 1% decrease in homology when a long probe is used (Frischauf et al. (1983) J. Mol Biol, 170: 827-842), the conditions of stringency can be adjusted to favor the detection of identical genes or members of related families.

A Equação II é derivada assumindo que a reação está em equi- líbrio. Portanto, as hibridizações de acordo com a presente invenção são mais preferencialmente realizadas sob condições de excesso de sonda e permitindo um tempo suficiente para atingir o equilíbrio. O tempo necessário para atingir o equilíbrio pode ser encurtado através da utilização de um tam- pão de hibridização que inclui um acelerador de hibridização tal como sulfato de dextrano ou um outro polímero de alto volume. A estringência pode ser controlada durante a reação de hibridi- zação ou após a hibridização ter ocorrido, alterando o sal e as condições de temperatura das soluções de lavagem. As fórmulas mostradas anteriormente são igualmente válidas quando utilizadas para computar a estringência de uma solução de lavagem. As estringências preferidas da solução de lava- gem ficam dentro das faixas citadas anteriormente; a alta estringência fica 5- 8°C abaixo da Tm, a estringência média ou moderada fica 26-29°C abaixo da Tm e a baixa estringência fica 45-48°C abaixo da Tm. To: O termo "To" refere-se à planta inteira, a um explante ou a um tecido de calo, inoculado com o meio de transformação. Ti: O termo TT refere-se à progénie da planta To, no caso da transformação da planta inteira ou à planta jovem regenerada no caso da transformação de explantes ou de tecido de calo. T2: O termo T2 refere-se à progénie da planta T,. A progénie T2 é o resultado da autofertilização ou da polinização cruzada de uma planta T-i. T3: O termo T3 refere-se à progénie de segunda geração da planta que é o resultado direto de um experimento de transformação. A pro- génie T3 é o resultado da autofertilização ou da polinização cruzada de uma planta T2.Equation II is derived assuming that the reaction is in balance. Therefore, the hybridizations according to the present invention are most preferably performed under conditions of excess probe and allowing a sufficient time to reach equilibrium. The time required to reach equilibrium can be shortened by using a hybridization buffer that includes a hybridization accelerator such as dextran sulfate or another high volume polymer. The stringency can be controlled during the hybridization reaction or after the hybridization has occurred, changing the salt and the temperature conditions of the washing solutions. The formulas shown above are also valid when used to compute the stringency of a washing solution. The preferred stringency of the washing solution is within the ranges mentioned above; high stringency is 5-8 ° C below Tm, medium or moderate stringency is 26-29 ° C below Tm and low stringency is 45-48 ° C below Tm. To: The term "To" refers to the entire plant, an explant or callus tissue, inoculated with the transformation medium. Ti: The term TT refers to the progeny of the To plant, in the case of transformation of the entire plant, or to the young plant regenerated in the case of transformation of explants or callus tissue. T2: The term T2 refers to the progeny of the T plant ,. The T2 progeny is the result of self-fertilization or cross-pollination of a T-i plant. T3: The term T3 refers to the plant's second generation progeny which is the direct result of a transformation experiment. The T3 seed is the result of self-fertilization or cross-pollination of a T2 plant.

3. CARACTERÍSTICAS IMPORTANTES DOS POLINUCLEOTÍDEOS E DOS POLIPEPTÍDEOS DA INVENÇÃO3. IMPORTANT CHARACTERISTICS OF THE POLYNUCLEOTIDES AND POLYPEPTIDES OF THE INVENTION

As moléculas de ácidos nucléicos e os polipeptídeos da presen- te invenção são interessantes porque quando as moléculas de ácidos nu- cléicos são expressas de forma errada (isto é, quando expressas em uma localização não natural ou em uma quantidade maior ou menor em relação à do tipo selvagem) produzem plantas que exibem biomassa, taxa de cresci- mento ou vigor de plantas jovens modulado quando comparadas com as plantas do tipo selvagem, como é evidenciado pelos resultados de vários experimentos divulgados abaixo. Esta característica pode ser utilizada para explorar ou maximizar os produtos vegetais. Por exemplo, as moléculas de ácidos nucléicos e os polipeptídeos da presente invenção são utilizados para aumentar a expressão de genes que fazem com que a planta tenha biomas- sa, taxa de crescimento ou vigor de plantas jovens modulado.The nucleic acid molecules and polypeptides of the present invention are interesting because when the nucleic acid molecules are expressed in a wrong way (that is, when expressed in an unnatural location or in a greater or lesser amount in relation to the wild type) produce plants that exhibit modulated young plant biomass, growth rate or vigor when compared to wild type plants, as evidenced by the results of several experiments disclosed below. This feature can be used to exploit or maximize plant products. For example, the nucleic acid molecules and polypeptides of the present invention are used to increase the expression of genes that cause the plant to have modulated biomass, growth rate or vigor of young plants.

Devido ao fato de que as seqüências e os métodos divulgados aumentam o crescimento vegetativo e a taxa de crescimento, os métodos divulgados podem ser utilizados para aumentar a produção de biomassa. Por exemplo, as plantas que crescem de forma vegetativa possuem maior produção de biomassa, comparadas com uma planta da mesma espécie que não é modificada geneticamente para um crescimento vegetativo substanci- al. Os exemplos de aumentos na produção de biomassa incluem aumentos de pelo menos 5%, pelo menos 20% ou até pelo menos 50%, quando com- parada com uma quantidade de produção de biomassa por uma planta da mesma espécie que não cresce de forma vegetativa.Due to the fact that the sequences and methods disclosed increase the vegetative growth and the growth rate, the disclosed methods can be used to increase biomass production. For example, plants that grow vegetatively have higher biomass production, compared to a plant of the same species that is not genetically modified for substantial vegetative growth. Examples of increases in biomass production include increases of at least 5%, at least 20% or even at least 50%, when compared to a quantity of biomass production by a plant of the same species that does not grow vegetatively .

A seqüência de Lead 36 da presente invenção e seus homólo- gos funcionais, em particular, fornecem plantas transformadas com maior rendimento, incluindo rendimento de frutos e rendimento por acre de alguma maneira no início da maturidade e uma estatura mais compacta (20%, 30%, 40% ou 60% mais compacta) com caules mais curtos, mas sem biomassa proporcionalmente reduzida. Em tomates, isto resulta em plantas com maior rendimento de frutos em plantas mais compactas. No arroz, isto resulta em plantas com um maior número de brotos. A seqüência de Lead 29 da pre- sente invenção e seus homólogos funcionais, em particular, fornecem plan- tas transformadas com maior rendimento, incluindo rendimento de frutos e rendimento por acre, de alguma maneira no início da maturidade e uma es- tatura mais compacta (20%, 30%, 40% ou 60% mais compacta) com caules mais curtos. Em tomates, isto resulta em plantas com maior rendimento de frutos em plantas mais compactas. No arroz, isto resulta em plantas com um maior número de brotos. As seqüências de Leads 15 e 28 da presente in- venção e seus homólogos funcionais, em particular, fornecem plantas trans- formadas com maior rendimento, incluindo rendimento de frutos e rendimen- to por acre. Em tomates, isto resulta em plantas com maior rendimento de frutos em plantas mais compactas. No arroz, isto resulta em plantas com um maior número de brotos.The Lead 36 sequence of the present invention and its functional counterparts, in particular, provide transformed plants with higher yield, including fruit yield and yield per acre in some early maturity and a more compact stature (20%, 30 %, 40% or 60% more compact) with shorter stems, but without proportionally reduced biomass. In tomatoes, this results in plants with higher fruit yield in more compact plants. In rice, this results in plants with a greater number of sprouts. The Lead 29 sequence of the present invention and its functional counterparts, in particular, provide transformed plants with higher yield, including fruit yield and yield per acre, somehow in early maturity and a more compact stature (20%, 30%, 40% or 60% more compact) with shorter stems. In tomatoes, this results in plants with higher fruit yield in more compact plants. In rice, this results in plants with a greater number of sprouts. The Leads 15 and 28 sequences of the present invention and their functional counterparts, in particular, provide transformed plants with higher yield, including fruit yield and yield per acre. In tomatoes, this results in plants with higher fruit yield in more compact plants. In rice, this results in plants with a greater number of sprouts.

O ciclo de vida das plantas florescendo pode, em geral, ser di- vidido em três fases de crescimento: vegetativo, inflorescência e floral (fase tardia de inflorescência). Na fase vegetativa, o meristema apical dos brotos (SAM) gera folhas que mais tarde garantirão as fontes necessárias para a produção de prole fértil. Após o recebimento dos sinais ambientais e de de- senvolvimento apropriados a planta altera o crescimento para floral ou re- produtivo e o SAM entra na fase de inflorescência (I) e dá origem a uma in- florescência com primórdios florais. Durante esta fase o destino do SAM e dos brotos secundários que surgem nas axilas das folhas é determinado por um conjunto de genes de identidade meristemática, dos quais alguns previ- nem e dos quais alguns promovem o desenvolvimento de meristemas florais. Uma vez estabelecida, a planta entra na fase de inflorescência tardia (Xu e outros (1995) Planta Mol. Biol. ZT. 237) em que os órgãos florais são produzi- dos. Se os sinais ambientais e de desenvolvimento apropriados da planta que mudam o crescimento floral ou reprodutivo forem interrompidos, a planta não será capaz de entrar no crescimento reprodutivo, portanto, manterá o crescimento vegetativo.The life cycle of flowering plants can, in general, be divided into three growth phases: vegetative, inflorescence and floral (late inflorescence phase). In the vegetative phase, the sprout apical meristem (SAM) generates leaves that will later guarantee the necessary sources for the production of fertile offspring. After receiving the appropriate environmental and developmental signs, the plant changes its growth to floral or reproductive and the SAM enters the inflorescence phase (I) and gives rise to flowering with floral beginnings. During this phase, the fate of the SAM and the secondary shoots that appear in the leaf armpits is determined by a set of genes of meristematic identity, of which some prevent and of which some promote the development of floral meristem. Once established, the plant enters the late inflorescence phase (Xu et al. (1995) Planta Mol. Biol. ZT. 237) in which floral organs are produced. If the appropriate environmental and developmental signs of the plant that change floral or reproductive growth are stopped, the plant will not be able to enter reproductive growth, therefore, it will maintain vegetative growth.

O vigor das sementes ou de plantas jovens é uma característica importante que pode influenciar enormemente o crescimento bem-sucedido de uma planta, tal como plantas de cultivo. Condições ambientais adversas, tais como condições de secura, umidade, frio ou calor, podem afetar o ciclo de crescimento de uma planta e o vigor das sementes (isto é, a vitalidade e a resistência sob tais condições podem diferenciar entre o crescimento de plantas de cultivo bem-sucedido ou falho). O vigor de plantas jovens tem sido freqüentemente definido como compreendendo as propriedades de se- mentes que determinam "o potencial para a emergência e o desenvolvimen- to uniformes rápidos de plantas jovens normais sob uma faixa ampla de condições de campo". Assim, seria vantajoso desenvolver sementes de plantas com maior vigor.The vigor of seeds or young plants is an important characteristic that can greatly influence the successful growth of a plant, such as crop plants. Adverse environmental conditions, such as dry, damp, cold or hot conditions, can affect a plant's growth cycle and seed vigor (ie, vitality and resistance under such conditions can differentiate between plant growth from successful or failed cultivation). The vigor of young plants has often been defined as comprising the seed properties that determine "the potential for the rapid emergence and uniform development of normal young plants under a wide range of field conditions". Thus, it would be advantageous to develop plant seeds with greater vigor.

Por exemplo, o maior vigor de plantas jovens seria vantajoso para a produção de plantas de cereais tais como arroz, milho, trigo etc. Para estas plantas de cultivo, o crescimento pode freqüentemente ser retardado ou interrompido através de temperaturas ambientais frias durante a estação de plantio. Em adição, a emergência e o brotamento rápidos do arroz permi- tiriam que os agricultores iniciassem um alagamento mais cedo que pode economizar água e suprimir o crescimento fraco. Os genes associados com o maior vigor de semente e/ou tolerância ao frio no arroz, portanto, têm sido pesquisados para a produção de variedades melhoradas de arroz. Ver, por exemplo, Pinson, S., "Molecular Mapping of Seedling Vigor QTLs in Tropical Rice", USDA Agricultural Research Service, 16 de dezembro de 2000.For example, the greater vigor of young plants would be advantageous for the production of cereal plants such as rice, corn, wheat etc. For these crop plants, growth can often be slowed or stopped by cold ambient temperatures during the planting season. In addition, the rapid emergence and sprouting of rice would allow farmers to start flooding earlier, which can save water and suppress weak growth. The genes associated with increased seed vigor and / or cold tolerance in rice, therefore, have been researched for the production of improved rice varieties. See, for example, Pinson, S., "Molecular Mapping of Seedling Vigor QTLs in Tropical Rice", USDA Agricultural Research Service, December 16, 2000.

O vigor de plantas jovens foi medido através de testes e ensai- os diferentes, incluindo mais tipicamente um teste de tolerância ao frio e um teste de envelhecimento acelerado.The vigor of young plants was measured through tests and different tests, including more typically a cold tolerance test and an accelerated aging test.

Algumas das seqüências de nucleotídeos da invenção codifi- cam fatores de transcrição de hélice-alça básicos (bHCH). Sabe-se que tais fatores de transcrição freqüentemente controlam a expressão de vários ge- nes em uma via. As proteínas básicas/hélice-alça-hélice (BHLH) são uma superfamília de fatores de transcrição que se ligam na forma de dímeros a sítios alvos de DNA específicos. Os fatores de transcrição bHLH foram bem caracterizados em eucariotos sem ser plantas e foram identificados como componentes reguladores importantes em processos biológicos diversos. Muitas funções diferentes foram identificadas para tais proteínas em mamí- feros, incluindo o controle da proliferação celular e a transcrição envolve fre- qüentemente homo- ou heterodimerização. Os membros da família hélice- alça-hélice básica R/B (bHLH) de fatores de transcrição vegetais estão en- volvidos em uma variedade de processos de crescimento e de diferenciação.Some of the nucleotide sequences of the invention encode basic helix-loop transcription factors (bHCH). It is known that such transcription factors often control the expression of several genes in one pathway. Basic proteins / helix-loop-helix (BHLH) are a superfamily of transcription factors that bind in the form of dimers to specific DNA target sites. BHLH transcription factors have been well characterized in eukaryotes other than plants and have been identified as important regulatory components in diverse biological processes. Many different functions have been identified for such proteins in mammals, including the control of cell proliferation and transcription often involves homo- or heterodimerization. Members of the basic R / B helix-helix (bHLH) family of plant transcription factors are involved in a variety of growth and differentiation processes.

Uma hélice-alça-hélice básica (bHLH) é um motivo estrutural de proteína que caracteriza uma família de fatores de transcrição. O motivo é caracterizado por duas α hélices conectadas por uma alça. Os fatores de transcrição deste tipo são tipicamente diméricos, cada um com uma hélice contendo resíduos de aminoácidos básicos que facilitam a ligação do DNA. Uma hélice é tipicamente menor e por causa da flexibilidade da alça permite a dimerização através do dobramento e do empacotamento contra uma ou- tra hélice. A hélice maior contém tipicamente as regiões de ligação com o DNA. As proteínas bHLH tipicamente se ligam com uma seqüência consen- so chamada de um E-box, CANNTG. O E-box canônico é CACGTG, entre- tanto alguns fatores de transcrição bHLH se ligam a seqüências diferentes, que são freqüentemente similares ao E-box. Os fatores de transcrição bHLH são freqüentemente importantes no desenvolvimento ou na atividade celular.A basic helix-loop-helix (bHLH) is a structural protein motif that characterizes a family of transcription factors. The motif is characterized by two α propellers connected by a handle. Transcription factors of this type are typically dimeric, each with a helix containing basic amino acid residues that facilitate DNA binding. A propeller is typically smaller and because of the flexibility of the handle, it allows dimerization by folding and packaging against another propeller. The larger helix typically contains the DNA binding regions. BHLH proteins typically bind with a consensus sequence called an E-box, CANNTG. The canonical E-box is CACGTG, however some bHLH transcription factors bind to different sequences, which are often similar to the E-box. BHLH transcription factors are often important in cell development or activity.

4. OS POLINUCLEOTÍDEOS/POLIPEPTÍDEOS DA INVENÇÃO4. THE POLYNUCLEOTIDS / POLYPEPTIDES OF THE INVENTION

Os polinucleotídeos da presente invenção e as proteínas ex- pressas através da tradução destes polinucleotídeos são apresentados naThe polynucleotides of the present invention and the proteins expressed through the translation of these polynucleotides are shown in

Listagem de Seqüências, especificamente SEQ ID NOS. 80, 81, 90, 91, 92, 93, 98, 99, 109, 110, 103 e 104. A Listagem de Seqüências também consiste em proteínas comparáveis funcionalmente. Os polipeptídeos que compreen- dem uma seqüência dentro dos mesmos e definidos por uma das seqüên- cias consenso podem ser utilizados para as finalidades da invenção, isto é, para produzir plantas transgênicas com biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor de plantas jovens modulado.String Listing, specifically SEQ ID NOS. 80, 81, 90, 91, 92, 93, 98, 99, 109, 110, 103 and 104. The Sequence Listing also consists of functionally comparable proteins. Polypeptides that comprise a sequence within them and defined by one of the consensus sequences can be used for the purposes of the invention, that is, to produce transgenic plants with biomass, growth rate and / or vigor of modulated young plants .

5. USO DOS POLIPEPTÍDEOS PARA A PRODUÇÃO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS5. USE OF POLYPEPTIDS FOR THE PRODUCTION OF TRANSGENIC PLANTS

Para utilizar as seqüências da presente invenção ou uma combi- nação das mesmas ou de partes e/ou mutantes e/ou fusões e/ou variações das mesmas, são preparadas construções de DNA recombinante que com- preendem as seqüências de polinucleotídeos da invenção inseridas em um vetor e que são adequadas para a transformação de células vegetais. A cons- trução pode ser feita utilizando técnicas de DNA recombinante padronizadas (ver, Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Nova York.) e pode ser introduzida na espécie vegetal de interesse, por exemplo, através da trans- formação mediada por Agrobacterium ou através de outros meios de trans- formação, por exemplo, como divulgado abaixo.To use the sequences of the present invention or a combination of them or parts and / or mutants and / or fusions and / or variations thereof, recombinant DNA constructs are prepared that comprise the polynucleotide sequences of the invention inserted in a vector and that are suitable for the transformation of plant cells. Construction can be done using standard recombinant DNA techniques (see, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, New York.) And can be introduced into the plant species of interest, for example, through Agrobacterium-mediated transformation or through other means of transformation, for example, as disclosed below.

A estrutura do vetor pode ser qualquer uma das tipicamente utili- zadas no campo tais como plasmídeos, vírus, cromossomos artificiais, BACs, YACs, PACs e vetores tais como, por exemplo, vetores do tipo ponte ("Shuffle cetors") bactéria-levedura, vetores de fago lambda, vetores de fusão de T-DNA e vetores plasmideais (ver, Shizuya e outros (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89: 8794-8797; Hamilton e outros (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93: 9975-9979; Burke e outros (1987) Science, 236: 806-812; Sternberg N. e outros (1990) Proc Natl Acad Sei U S A., 87: 103-7; Bradshaw e outros (1995) Nucl Acids Res, 23: 4850-4856; Frischauf e outros (1983) J. Mol Biol, 170: 827-842; Huynh e outros, Glover NM (ed) DNA Cloning: A practical Ap- proach, Vol. 1 Oxford: IRL Press (1985); Walden e outros (1990) Mol Cell Biol1: 175-194).The structure of the vector can be any of those typically used in the field such as plasmids, viruses, artificial chromosomes, BACs, YACs, PACs and vectors such as, for example, bacteria-yeast bridging vectors , lambda phage vectors, T-DNA fusion vectors and plasmid vectors (see, Shizuya et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 8794-8797; Hamilton et al. (1996) Proc. Natl Acad. Sci. USA, 93: 9975-9979; Burke et al. (1987) Science, 236: 806-812; Sternberg N. et al. (1990) Proc Natl Acad Sei US A., 87: 103-7; Bradshaw et al. (1995) Nucl Acids Res, 23: 4850-4856; Frischauf et al. (1983) J. Mol Biol, 170: 827-842; Huynh et al., Glover NM (ed) DNA Cloning: A practical Ap-proach, Vol. 1 Oxford: IRL Press (1985); Walden et al (1990) Mol Cell Biol1: 175-194).

Tipicamente, a construção compreende um vetor que contém uma molécula de ácido nucléico da presente invenção com quaisquer se- qüências reguladoras da transcrição e/ou da tradução tais como, por exem- plo, promotores, lITRs e seqüências de término na extremidade 3'. Os veto- res também podem incluir, por exemplo, origens de replicação, regiões de ligação de sustentação (SARs), marcadores, seqüências homólogas e in- trons. O vetor também pode compreender um gene marcador que confere um fenótipo que pode ser selecionado nas células vegetais. O marcador pode preferencialmente codificar uma característica de resistência a bioci- das, particularmente resistência a antibióticos, tal como a resistência, por exemplo, à canamicina, à bleomicina ou à higromicina ou resistência a her- bicidas, tal como resistência, por exemplo, ao glifosato, à clorossulfurona ou à fosfinotricina.Typically, the construct comprises a vector that contains a nucleic acid molecule of the present invention with any transcription and / or translation regulatory sequences such as, for example, promoters, lITRs and termination sequences at the 3 'end. Vectors can also include, for example, origins of replication, support link regions (SARs), markers, homologous sequences and introns. The vector may also comprise a marker gene that confers a phenotype that can be selected from plant cells. The marker can preferably encode a biocide resistance characteristic, particularly resistance to antibiotics, such as resistance, for example, to kanamycin, bleomycin or hygromycin or resistance to herbicides, such as resistance, for example, to glyphosate, chlorosulfurone or phosphinothricin.

Entender-se-á que mais de uma região reguladora pode estar presente em um polinucleotídeo recombinante, por exemplo, introns, in- tensificadores, regiões de ativação a montante, terminadores da transcrição e elementos que podem ser induzidos. Assim, mais de uma região regulado- ra pode estar ligada de forma operacional à dita seqüência.It will be understood that more than one regulatory region may be present in a recombinant polynucleotide, for example, introns, intensifiers, upstream activation regions, transcription terminators and elements that can be induced. Thus, more than one regulatory region can be operationally linked to said sequence.

Para "ligar de forma operacional" uma seqüência promotora a uma seqüência, o sítio de início da tradução do quadro de leitura da tradu- ção da dita seqüência é tipicamente posicionado entre um e aproximada- mente cinqüenta nucleotídeos a jusante do promotor. Um promotor pode, entretanto, estar posicionado tanto quando aproximadamente 5.000 nucleo- tídeos a montante do sítio de início da tradução ou aproximadamente 2.000 nucleotídeos a montante do sítio de início da transcrição. Um promotor com- preende tipicamente pelo menos um promotor central (basal. Um promotor também pode incluir pelo menos um elemento de controle, tal como uma seqüência intensificadora, um elemento a montante ou uma região de ativa- ção a montante (UAR). Por exemplo, um intensificador adequado é um ele- mento regulador em cis (-212 até -154) partindo da região a montante do gene da octopina sintase (ocs). Fromm e outros, The Plant Cell 1: 977-984 (1989).In order to "operationally link" a promoter sequence to a sequence, the translation start site of the translation frame for that sequence is typically positioned between one and approximately fifty nucleotides downstream of the promoter. A promoter may, however, be positioned as much as approximately 5,000 nucleotides upstream of the translation start site or approximately 2,000 nucleotides upstream of the transcription start site. A promoter typically comprises at least one central promoter (baseline. A promoter may also include at least one control element, such as an enhancer sequence, an upstream element or an upstream activation region (UAR). For example, a suitable enhancer is a cis regulatory element (-212 to -154) starting from the region upstream of the octopine synthase (ocs) gene. Fromm et al., The Plant Cell 1: 977-984 (1989).

Um promotor basal é a seqüência mínima necessária para a montagem de um complexo de transcrição necessário para o início da trans- crição. Os promotores basais incluem freqüentemente um elemento "TATA box" que pode estar localizado entre aproximadamente 15 e aproximada- mente 35 nucleotídeos a montante do sítio de início da transcrição. Os pro- motores basais também podem incluir um elemento "CCAAT box" (tipica- mente a seqüência CCAAT) e/ou uma seqüência GGGCG, que pode estar localizada entre aproximadamente 40 e aproximadamente 200 nucleotídeos, tipicamente aproximadamente 60 até aproximadamente 120 nucleotídeos, a montante do sítio de início da transcrição.A basal promoter is the minimum sequence necessary for the assembly of a transcription complex necessary for the initiation of transcription. Baseline promoters often include a "TATA box" element that can be located between approximately 15 and approximately 35 nucleotides upstream of the transcription start site. Baseline promoters can also include a "CCAAT box" element (typically the CCAAT sequence) and / or a GGGCG sequence, which can be located between approximately 40 and approximately 200 nucleotides, typically approximately 60 to approximately 120 nucleotides, a amount of the transcription start site.

A escolha dos promotores que serão incluídos depende de vá- rios fatores, incluindo, mas não limitados à eficiência, à capacidade de sele- ção, à capacidade de indução, ao nível de expressão desejado e à expres- são preferencial na célula ou no tecido. É uma questão de rotina para um versado na técnica modular a expressão de uma seqüência através da sele- ção e do posicionamento de forma apropriada dos promotores e de outras regiões reguladoras em relação à dita seqüência.The choice of promoters to be included depends on a number of factors, including, but not limited to, efficiency, selection capacity, induction capacity, desired expression level and preferential expression in the cell or tissue . It is a matter of routine for one versed in the modular technique to express a sequence by selecting and appropriately positioning promoters and other regulatory regions in relation to that sequence.

Alguns promotores adequados iniciam a transcrição somente ou predominantemente, em certos tipos de células. Por exemplo, um promotor que é predominantemente ativo em um tecido reprodutivo (por exemplo, fru- to, óvulo, pólen, pistilos, gametófito feminino, célula ovo, célula central, nuce- lo, suspensor, célula sinérgida, flores, tecido embrionário, saco embrionário, embrião, zigoto, endosperma, integumento ou revestimento de semente) pode ser utilizado. Assim, como utilizado aqui, um promotor preferencial do tipo celular ou do tecido é um que controla a expressão preferencialmente no tecido alvo, mas que também pode levar a alguma expressão em outros ti- pos de células ou tecidos. Os métodos para a identificação e para a caracte- rização de regiões promotoras no DNA genômico vegetal incluem, por e- xemplo, os descritos nas referências a seguir: Jordano e outros, Plant Cell, 1: 855-866 (1989); Bustos e outros, Plant Cell, 1: 839-854 (1989); Green e outros, EMBO J. 7, 4035-4044 (1988); Meier e outros, Plant Cell, 3, 309-316 (1991); e Zhang e outros, Plant Physiology 110: 1069-1079 (1996).Some suitable promoters initiate transcription only or predominantly, in certain cell types. For example, a promoter that is predominantly active in a reproductive tissue (for example, fruit, egg, pollen, pistils, female gametophyte, egg cell, central cell, nucleus, suspensor, synergistic cell, flowers, embryonic tissue, embryonic sac, embryo, zygote, endosperm, integument or seed coating) can be used. Thus, as used here, a preferential promoter of the cell or tissue type is one that controls expression preferentially in the target tissue, but which can also lead to some expression in other types of cells or tissues. Methods for identifying and characterizing promoter regions in plant genomic DNA include, for example, those described in the following references: Jordano et al., Plant Cell, 1: 855-866 (1989); Bustos et al., Plant Cell, 1: 839-854 (1989); Green et al., EMBO J. 7, 4035-4044 (1988); Meier et al., Plant Cell, 3, 309-316 (1991); and Zhang et al., Plant Physiology 110: 1069-1079 (1996).

Os exemplos de várias classes de promotores são descritos abaixo. Alguns dos promotores indicados abaixo são descritos em maiores detalhes nos Pedidos de Patentes U.S. N— de Série 60/505.689; 60/518.075; 60/544.771; 60/558.869; 60/583.691; 60/619.181; 60/637.140; 10/950.321; 10/957.569; 11/058.689; 11/172.703; 11/208.308; e PCT/US05/23639. Será considerado que um promotor pode satisfazer os cri- térios para uma classificação baseada em sua atividade em uma espécie vegetal e ainda satisfazer os critérios para uma classificação diferente base- ada em sua atividade em uma outra espécie vegetal.Examples of various classes of promoters are described below. Some of the promoters listed below are described in more detail in U.S. Patent Applications No. - Series 60 / 505,689; 60 / 518,075; 60 / 544,771; 60 / 558,869; 60 / 583,691; 60 / 619,181; 60 / 637,140; 10 / 950,321; 10 / 957,569; 11 / 058,689; 11 / 172,703; 11 / 208,308; and PCT / US05 / 23639. It will be considered that a promoter can satisfy the criteria for a classification based on his activity in one plant species and still satisfy the criteria for a different classification based on his activity in another plant species.

Outras Regiões Reguladoras: Uma região não traduzida a 5' (UTR) pode ser incluída nas construções de ácidos nucléicos descritas aqui. Uma UTR a 51 é transcrita, mas não é traduzida e fica entre o sítio de início do produto da transcrição e o códon de início da tradução e pode incluir o nucleotídeo +1. Uma UTR a 3' pode ser posicionada entre o códon de início da tradução e o final do produto da transcrição. As UTRs podem ter funções particulares tal como o aumento da estabilidade do mRNA ou a atenuação da tradução. Os exemplos das UTRs a 3' incluem, mas não estão limitados aos sinais de poliadenilação e às seqüências de término da transcrição, por exemplo, uma seqüência de término da nopalina sintase.Other Regulatory Regions: A 5 'untranslated region (RTU) can be included in the nucleic acid constructions described here. A RTU at 51 is transcribed, but is not translated and lies between the transcription product start site and the translation start codon and can include the +1 nucleotide. A 3 'RTU can be positioned between the translation start codon and the end of the transcription product. RTUs can have particular functions such as increasing mRNA stability or attenuating translation. Examples of 3 'RTUs include, but are not limited to, polyadenylation signals and transcription termination sequences, for example, a nopaline synthase termination sequence.

Vários promotores podem ser utilizados para controlar a ex- pressão dos genes da presente invenção. As seqüências de nucleotídeos de tais promotores são apresentadas nas SEQ ID NOS: 1-79. Algumas dessas podem ser promotores de expressão ampla, outras podem ser mais preferen- ciais a tecidos.Various promoters can be used to control the expression of the genes of the present invention. The nucleotide sequences of such promoters are shown in SEQ ID NOS: 1-79. Some of these may be promoters of broad expression, others may be more preferable to tissues.

Pode-se dizer que um promotor é "de expressão ampla" quando promove a transcrição em muitos, mas não necessariamente todos os teci- dos vegetais ou as células vegetais. Por exemplo, um promotor de expres- são ampla pode promover a transcrição de uma seqüência ligada de forma operacional em um ou mais do broto, ponta do broto (ápice) e folhas, mas fracamente ou de forma alguma em tecidos tais como raízes ou caules. Co- mo um outro exemplo, um promotor de expressão ampla pode promover a transcrição de uma seqüência ligada de forma operacional em um ou mais do caule, broto, ponta do broto (ápice) e folhas, mas pode promover a trans- crição de forma fraca ou nenhuma em tecidos tais como tecidos reprodutivos e sementes em desenvolvimento. Os exemplos não limitantes de promotores de expressão ampla que podem ser incluídos nas construções de ácidos nucléicos fornecidas aqui incluem o p326 (SEQ ID NO: 76), YP0144 (SEQ ID NO: 55), YP0190 (SEQ ID NO: 59), p13879 (SEQ ID NO: 75), YP0050 (SEQ ID NO: 35), p32449 (SEQ ID NO: 77), 21876 (SEQ ID NO: 1), YP0158 (SEQ ID NO: 57), YP0214 (SEQ ID NO: 61), YP0380 (SEQ ID NO: 70), PT0848 (SEQ ID NO: 26) e PT0633 (SEQ ID NO: 7). Exemplos adicionais incluem o promotor 35S do vírus mosaico da couve-flor (CaMV), o promotor da mano- pina sintase (MAS), os promotores 1' ou 21 derivados do T-DNA de Agrobac- terium tumefaciens, o promotor 34S do vírus mosaico da escrofulária, os promotores da actina tal como o promotor da actina do arroz e promotores de ubiquitina tal como o promotor da ubiquitina-1 do milho. Em alguns casos, o promotor 35S de CaMV é excluído da categoria de promotores de expres- são ampla.It can be said that a promoter is "broadly expressed" when it promotes transcription in many, but not necessarily all plant tissues or plant cells. For example, a promoter of broad expression may promote the transcription of a linked sequence operatively on one or more of the bud, tip of the bud (apex) and leaves, but weakly or not at all in tissues such as roots or stems . As another example, a broad-expression promoter can promote the transcription of an operably linked sequence in one or more of the stem, bud, tip of the bud (apex) and leaves, but it can promote transcription in a way weak or none in tissues such as reproductive tissues and developing seeds. Non-limiting examples of broad expression promoters that can be included in the nucleic acid constructs provided here include p326 (SEQ ID NO: 76), YP0144 (SEQ ID NO: 55), YP0190 (SEQ ID NO: 59), p13879 (SEQ ID NO: 75), YP0050 (SEQ ID NO: 35), p32449 (SEQ ID NO: 77), 21876 (SEQ ID NO: 1), YP0158 (SEQ ID NO: 57), YP0214 (SEQ ID NO: 61), YP0380 (SEQ ID NO: 70), PT0848 (SEQ ID NO: 26) and PT0633 (SEQ ID NO: 7). Additional examples include the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter, the mannin synthase promoter (MAS), the 1 'or 21 promoters derived from Agrobacterium tumefaciens T-DNA, the 34S promoter of the virus scrofula mosaic, actin promoters such as the rice actin promoter and ubiquitin promoters such as the corn ubiquitin-1 promoter. In some cases, the CaMV 35S promoter is excluded from the broad expression promoter category.

Os promotores ativos nas raízes controlam a transcrição no te- cido radicular, por exemplo, endoderme radicular, epiderme radicular ou te- cidos vasculares radiculares. Em algumas modalidades, os promotores ati- vos nas raízes são promotores preferenciais de raízes, isto é, controlam a transcrição somente ou predominantemente no tecido radicular. Os promoto- res preferenciais de raiz incluem o YP0128 (SEQ ID NO: 52), YP0275 (SEQ ID NO: 63), PT0625 (SEQ ID NO: 6), PT0660 (SEQ ID NO: 9), PT0683 (SEQ ID NO: 14) e PT0758 (SEQ ID NO: 22). Outros promotores preferenciais de raiz incluem o PT0613 (SEQ ID NO: 5), PT0672 (SEQ ID NO: 11), PT0688 (SEQ ID NO: 15) e PT0837 (SEQ ID NO: 24), que controlam a transcrição primariamente no tecido radicular e até uma menor extensão nos óvulos e/ou nas sementes. Outros exemplos de promotores preferenciais de raiz incluem os subdomínios específicos à raiz do promotor 35S de CaMV (Lam e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 7890-7894 (1989)), promotores es- pecíficos às células de raiz relatados por Conkling e outros, Plant Physiol. 93: 1203-1211 (1990) e o promotor do gene RD2 do tabaco.The promoters active in the roots control transcription in the root tissue, for example, root endoderm, root epidermis or root vascular tissues. In some modalities, promoters active in the roots are preferred root promoters, that is, they control transcription only or predominantly in the root tissue. Preferred root promoters include YP0128 (SEQ ID NO: 52), YP0275 (SEQ ID NO: 63), PT0625 (SEQ ID NO: 6), PT0660 (SEQ ID NO: 9), PT0683 (SEQ ID NO: : 14) and PT0758 (SEQ ID NO: 22). Other preferred root promoters include PT0613 (SEQ ID NO: 5), PT0672 (SEQ ID NO: 11), PT0688 (SEQ ID NO: 15) and PT0837 (SEQ ID NO: 24), which control transcription primarily in tissue root and to a lesser extent in eggs and / or seeds. Other examples of preferred root promoters include the root specific subdomains of the CaMV 35S promoter (Lam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 7890-7894 (1989)), root cell-specific promoters reported by Conkling et al., Plant Physiol. 93: 1203-1211 (1990) and the tobacco RD2 gene promoter.

Em algumas modalidades, os promotores que controlam a transcrição no endosperma em maturação podem ser úteis. A transcrição partindo de um promotor de endosperma em maturação começa tipicamente após a fertilização e ocorre primariamente no tecido do endosperma durante o desenvolvimento das sementes e é tipicamente maior durante a fase de celularização. São mais adequados os promotores que são ativos predomi- nantemente no endosperma em maturação, embora os promotores que tam- bém são ativos em outros tecidos possam algumas vezes ser utilizados. Os exemplos não limitantes de promotores de endosperma em maturação que podem ser incluídos nas construções de ácidos nucléicos fornecidas aqui incluem o promotor da napina, o promotor da Arcelina-5, o promotor do gene da faseolina (Bustos e outros (1989) Plant Cell 1(9): 839-853), o promotor do inibidor da tripsina da soja (Riggs e outros (1989) Plant Cell 1(6): 609-621), o promotor ACP (Baerson e outros (1993) Plant Mol Biol, 22(2): 255-267), o gene da estearoil-ACP dessaturase (Slocombe e outros (1994) Plant Physiol 104(4): 167-176), a subunidade α' da soja do promotor da β-conglicinina (Chen e outros (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83: 8560-8564), o promotor da oleosina (Hong e outros (1997) Plant Mol Biol 34(3): 549-555) e os pro- motores da zeina, tais como o promotor da zeina de 15 kD, o promotor da zeina de 16 kD, o promotor da zeina de 19 kD, o promotor da zeina de 22 kD e o promotor da zeina de 27 kD. São também adequados o promotor Osgt-1 do gene da glutelina-1 do arroz (Zheng e outros (1993) Mol. Cell Biol. 13: 5829-5842), o promotor do gene da beta-amilase e o promotor do gene da hordeína da cevada. Outros promotores do endosperma em maturação incluem o YP0092 (SEQ ID NO: 38), PT0676 (SEQ ID NO: 12) e PT0708 (SEQ ID NO: 17).In some embodiments, promoters that control transcription in the maturing endosperm may be useful. Transcription from a maturing endosperm promoter typically begins after fertilization and occurs primarily in the endosperm tissue during seed development and is typically greater during the cell phase. Promoters that are predominantly active in the maturing endosperm are more suitable, although promoters that are also active in other tissues can sometimes be used. Non-limiting examples of maturing endosperm promoters that can be included in the nucleic acid constructs provided here include the napine promoter, the Arcelin-5 promoter, the phaseolin gene promoter (Bustos et al. (1989) Plant Cell 1 (9): 839-853), the soy trypsin inhibitor promoter (Riggs et al. (1989) Plant Cell 1 (6): 609-621), the ACP promoter (Baerson et al (1993) Plant Mol Biol, 22 (2): 255-267), the stearoyl-ACP desaturase gene (Slocombe et al. (1994) Plant Physiol 104 (4): 167-176), the α 'subunit of the β-conglycinin promoter (Chen et al. (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83: 8560-8564), the oleosin promoter (Hong et al. (1997) Plant Mol Biol 34 (3): 549-555) and the zein promoters, such as the 15 kD zein promoter, the 16 kD zein promoter, the 19 kD zein promoter, the 22 kD zein promoter and the 27 kD zein promoter. Also suitable are the rice glutelin-1 gene Osgt-1 promoter (Zheng et al. (1993) Mol. Cell Biol. 13: 5829-5842), the beta-amylase gene promoter and the hordein gene promoter barley. Other promoters of the maturing endosperm include YP0092 (SEQ ID NO: 38), PT0676 (SEQ ID NO: 12) and PT0708 (SEQ ID NO: 17).

Os promotores que controlam a transcrição nos tecidos de ová- rio tais como a parede do óvulo e o mesocarpo também podem ser úteis, por exemplo, um promotor da poligalacturonidase, o promotor TRX da banana e o promotor da actina do melão. Outros tais promotores que controlam a ex- pressão gênica preferencialmente nos óvulos são YP0007 (SEQ ID NO: 30), YP0111 (SEQ ID NO: 46), YP0092 (SEQ ID NO: 38), YP0103 (SEQ ID NO: 43), YP0028 (SEQ ID NO: 33), YP0121 (SEQ ID NO: 51), YP0008 (SEQ ID NO: 31), YP0039 (SEQ ID NO: 34), YP0115 (SEQ ID NO: 47), YP0119 (SEQ ID NO: 49), YP0120 (SEQ ID NO: 50) e YP0374 (SEQ ID NO: 68).Promoters that control transcription in ovarian tissues such as the egg wall and mesocarp may also be useful, for example, a polygalacturonidase promoter, the banana TRX promoter and the melon actin promoter. Other such promoters that preferentially control gene expression in eggs are YP0007 (SEQ ID NO: 30), YP0111 (SEQ ID NO: 46), YP0092 (SEQ ID NO: 38), YP0103 (SEQ ID NO: 43), YP0028 (SEQ ID NO: 33), YP0121 (SEQ ID NO: 51), YP0008 (SEQ ID NO: 31), YP0039 (SEQ ID NO: 34), YP0115 (SEQ ID NO: 47), YP0119 (SEQ ID NO: 34) : 49), YP0120 (SEQ ID NO: 50) and YP0374 (SEQ ID NO: 68).

Em algumas outras modalidades da presente invenção, os promotores de saco embrionário/endosperma inicial podem ser utilizados com a finalidade de controlar a transcrição da seqüência de interesse nos núcleos polares e/ou na célula central ou em precursores para os núcleos polares, mas não nas células ovo ou nos precursores para as células ovo. São mais adequados os promotores que controlam a expressão somente ou predominantemente nos núcleos polares ou nos precursores para os mes- mos e/ou na célula central. Um padrão de transcrição que se estende dos núcleos polares para o desenvolvimento do endosperma inicial também po- dem ser encontrados com os promotores preferenciais do saco embrioná- rio/endosperma inicial, embora a transcrição tipicamente diminua significati- vamente no desenvolvimento do endosperma tardio durante e após a fase de celularização. A expressão no zigoto ou no embrião em desenvolvimento tipicamente não está presente com os promotores de saco embrioná- rio/endosperma inicial.In some other embodiments of the present invention, embryonic bag / initial endosperm promoters can be used for the purpose of controlling the transcription of the sequence of interest in the polar nuclei and / or in the central cell or in precursors to the polar nuclei, but not in the egg cells or in the precursors to egg cells. Promoters that control expression only or predominantly in the polar nuclei or in the precursors for the same and / or in the central cell are more suitable. A transcription pattern that extends from the polar nuclei to the development of the initial endosperm can also be found with the preferential promoters of the embryonic sac / initial endosperm, although the transcription typically decreases significantly in the development of the late endosperm during and after the cellularization phase. Expression in the zygote or developing embryo is typically not present with early embryonic bag / endosperm promoters.

Os promotores que podem ser adequados incluem os derivados dos genes a seguir: viviparous-1 de Arabidopsis (ver, GenBank No. U93215); atmycl de Arabidopsis (ver, Urao (1996) Plant Mol. Biol., 32: 571-57; Concei- cao (1994) Plant, 5: 493-505); FIE de Arabidopsis (GenBank No. AF129516); MEA de Arabidopsis; FIS2 de Arabidopsis (GenBank No. AF096096); e FIE 1.1 (Patente U.S. N2 6.906.244). Outros promotores que podem ser ade- quados incluem os derivados dos genes a seguir: MAC1 do milho (ver, She- ridan (1996) Genetics, 142: 1009-1020); Cat3 do milho (ver, GenBank No. L05934; Abler (1993) Plant Mol. Biol., 22: 10131-1038). Outros promotores incluem os promotores de Arabidopsis a seguir: YP0039 (SEQ ID NO: 34), YP0101 (SEQ ID NO: 41), YP0102 (SEQ ID NO: 42), YP0110 (SEQ ID NO: 45), YP0117 (SEQ ID NO: 48), YP0119 (SEQ ID NO: 49), YP0137 (SEQ ID NO: 53), DME, YP0285 (SEQ ID NO: 64) e YP0212 (SEQ ID NO: 60). Outros promotores que podem ser úteis incluem os promotores do arroz a seguir: p530c10, pOsFIE2-2, pOsMEA, pOsYp102 e pOsYp285.Promoters that may be suitable include those derived from the following genes: Arabidopsis viviparous-1 (see, GenBank No. U93215); atmycl from Arabidopsis (see, Urao (1996) Plant Mol. Biol., 32: 571-57; Conceicao (1994) Plant, 5: 493-505); Arabidopsis FIE (GenBank No. AF129516); Arabidopsis MEA; Arabidopsis FIS2 (GenBank No. AF096096); and FIE 1.1 (U.S. Patent No. 6,906,244). Other promoters that may be suitable include those derived from the following genes: maize MAC1 (see, She- ridan (1996) Genetics, 142: 1009-1020); Corn cat 3 (see, GenBank No. L05934; Abler (1993) Plant Mol. Biol., 22: 10131-1038). Other promoters include the following Arabidopsis promoters: YP0039 (SEQ ID NO: 34), YP0101 (SEQ ID NO: 41), YP0102 (SEQ ID NO: 42), YP0110 (SEQ ID NO: 45), YP0117 (SEQ ID NO: 45) NO: 48), YP0119 (SEQ ID NO: 49), YP0137 (SEQ ID NO: 53), DME, YP0285 (SEQ ID NO: 64) and YP0212 (SEQ ID NO: 60). Other promoters that may be useful include the following rice promoters: p530c10, pOsFIE2-2, pOsMEA, pOsYp102 and pOsYp285.

Os promotores que controlam preferencialmente a transcrição em células zigóticas após a fertilização podem fornecer expressão preferen- cial no embrião e podem ser úteis para a presente invenção. São mais ade- quados os promotores que controlam preferencialmente a transcrição em embriões em estágio inicial antes do estágio central, mas a expressão no estágio tardio e nos embriões em maturação também é adequada. Os pro- motores preferenciais de embrião incluem o promotor de transferência de lipídeos da cevada (Ltp1) (Plant Cell Rep (2001) 20: 647-654, YP0097 (SEQ ID NO: 40), YP0107 (SEQ ID NO: 44), YP0088 (SEQ ID NO: 37), YP0143 (SEQ ID NO: 54), YP0156 (SEQ ID NO: 56), PT0650 (SEQ ID NO: 8), PT0695 (SEQ ID NO: 16), PT0723 (SEQ ID NO: 19), PT0838 (SEQ ID NO: 25), PT0879 (SEQ ID NO: 28) e PT0740 (SEQ ID NO: 20).Promoters that preferentially control transcription in zygotic cells after fertilization can provide preferential expression in the embryo and may be useful for the present invention. Promoters that preferentially control transcription in embryos in the early stage before the central stage are more suitable, but expression in the late stage and in maturing embryos is also adequate. Preferred embryo promoters include the barley lipid transfer promoter (Ltp1) (Plant Cell Rep (2001) 20: 647-654, YP0097 (SEQ ID NO: 40), YP0107 (SEQ ID NO: 44), YP0088 (SEQ ID NO: 37), YP0143 (SEQ ID NO: 54), YP0156 (SEQ ID NO: 56), PT0650 (SEQ ID NO: 8), PT0695 (SEQ ID NO: 16), PT0723 (SEQ ID NO: : 19), PT0838 (SEQ ID NO: 25), PT0879 (SEQ ID NO: 28) and PT0740 (SEQ ID NO: 20).

Os promotores ativos no tecido fotossintético com a finalidade de transcrição em tecidos verdes tais como folhas e caules são de interesse particular para a presente invenção. São mais adequados os promotores que controlam a expressão somente ou predominantemente em tais tecidos. Os exemplos de tais promotores incluem os promotores da ribulose-1,5- bisfosfato carboxilase (RbcS) tal como o promotor RbcS do lariço oriental (Larix laricinà), o promotor cab6 de pinheiro (Yamamoto e outros (1994) Plant Cell Physiol. 35: 773-778), o promotor do gene Cab-1 do trigo (Fejes e outros (1990) Plant Mol. Biol. 15: 921-932), o promotor CAB-1 do espinafre (Lubberstedt e outros (1994) Plant Physiol. 104: 997-1006), o promotor cab1R do arroz (Luan e outros (1992) Plant Cell 4: 971-981), o promotor da piruvato ortofosfato diquinase (PPDK) do milho (Matsuoka e outros (1993) Proc Natl Acad. Sei USA 90: 9586-9590), o promotor Lhcb1*2 do tabaco (Cerdan e outros (1997) Plant Mol. Biol. 33: 245-255), o promotor do simpor- tador de sacarose-H+ SUC2 de Arabidopsis thaliana (Truernit e outros (1995) Planta 196: 564-570) e os promotores da proteína da membrana tilacóide do espinafre (psaD, psaF, psaE, PC, FNR, atpC, atpD, cab, rbcS). Outros pro- motores que controlam a transcrição nos caules, nas folhas e no tecido ver- de são PT0535 (SEQ ID NO: 3), PT0668 (SEQ ID NO: 2), PT0886 (SEQ ID NO: 29), PR0924 (SEQ ID NO: 78), YP0144 (SEQ ID NO: 55), YP0380 (SEQ ID NO: 70) e PT0585 (SEQ ID NO: 4).Promoters active in photosynthetic tissue for the purpose of transcription into green tissues such as leaves and stems are of particular interest to the present invention. Promoters that control expression only or predominantly in such tissues are more suitable. Examples of such promoters include ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase (RbcS) promoters such as the eastern larch RbcS promoter (Larix laricinà), pine cab6 promoter (Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35 : 773-778), the promoter of the Cab-1 gene in wheat (Fejes et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15: 921-932), the CAB-1 promoter in spinach (Lubberstedt et al. (1994) Plant Physiol 104: 997-1006), the cab1R rice promoter (Luan et al. (1992) Plant Cell 4: 971-981), the corn pyruvate orthophosphate dichinase (PPDK) promoter (Matsuoka et al. (1993) Proc Natl Acad I know USA 90: 9586-9590), the tobacco promoter Lhcb1 * 2 (Cerdan et al (1997) Plant Mol. Biol. 33: 245-255), the promoter of the sucrose-H + SUC2 carrier of Arabidopsis thaliana (Truernit et al. (1995) Planta 196: 564-570) and the promoters of spinach thylakoid membrane protein (psaD, psaF, psaE, PC, FNR, atpC, atpD, cab, rbcS). Other promoters that control transcription in stems, leaves and green tissue are PT0535 (SEQ ID NO: 3), PT0668 (SEQ ID NO: 2), PT0886 (SEQ ID NO: 29), PR0924 (SEQ ID NO: 78), YP0144 (SEQ ID NO: 55), YP0380 (SEQ ID NO: 70) and PT0585 (SEQ ID NO: 4).

Em algumas outras modalidades da presente invenção, podem ser desejados promotores que podem ser induzidos. Os promotores que po- dem ser induzidos controlam a transcrição em resposta a estímulos externos tais como agentes químicos ou estímulos ambientais. Por exemplo, os pro- motores que podem ser induzidos podem conferir transcrição em resposta a hormônios tal como o ácido giberélico ou o etileno ou em resposta à luz ou à seca. Os exemplos de promotores que podem ser induzidos pela seca são YP0380 (SEQ ID NO: 70), PT0848 (SEQ ID NO: 26), YP0381 (SEQ ID NO: 71), YP0337 (SEQ ID NO: 66), YP0337 (SEQ ID NO: 66), PT0633 (SEQ ID NO: 7), YP0374 (SEQ ID NO: 68), PT0710 (SEQ ID NO: 18), YP0356 (SEQ ID NO: 67), YP0385 (SEQ ID NO: 73), YP0396 (SEQ ID NO: 74), YP0384 (SEQ ID NO: 72), YP0384 (SEQ ID NO: 72), PT0688 (SEQ ID NO: 15), YP0286 (SEQ ID NO: 65), YP0377 (SEQ ID NO: 69) e PD1367 (SEQ ID NO: 79). Os exemplos de promotores induzidos pelo nitrogênio são PT0863 (SEQ ID NO: 27), PT0829 (SEQ ID NO: 23), PT0665 (SEQ ID NO: 10) e PT0886 (SEQ ID NO: 29). Um exemplo de um promotor que pode ser indu- zido pela sombra é PR0924 (SEQ ID NO: 78).In some other embodiments of the present invention, promoters that can be induced may be desired. Promoters that can be induced control transcription in response to external stimuli such as chemical agents or environmental stimuli. For example, promoters that can be induced may confer transcription in response to hormones such as gibberellic acid or ethylene or in response to light or drought. Examples of promoters that can be induced by drought are YP0380 (SEQ ID NO: 70), PT0848 (SEQ ID NO: 26), YP0381 (SEQ ID NO: 71), YP0337 (SEQ ID NO: 66), YP0337 (SEQ ID NO: 66), PT0633 (SEQ ID NO: 7), YP0374 (SEQ ID NO: 68), PT0710 (SEQ ID NO: 18), YP0356 (SEQ ID NO: 67), YP0385 (SEQ ID NO: 73) , YP0396 (SEQ ID NO: 74), YP0384 (SEQ ID NO: 72), YP0384 (SEQ ID NO: 72), PT0688 (SEQ ID NO: 15), YP0286 (SEQ ID NO: 65), YP0377 (SEQ ID NO: 65) NO: 69) and PD1367 (SEQ ID NO: 79). Examples of nitrogen-induced promoters are PT0863 (SEQ ID NO: 27), PT0829 (SEQ ID NO: 23), PT0665 (SEQ ID NO: 10) and PT0886 (SEQ ID NO: 29). An example of a promoter that can be induced by shadow is PR0924 (SEQ ID NO: 78).

Outros promotores: outras classes de promotores incluem, mas não estão limitados aos promotores preferenciais à folha, preferenciais ao caule/broto, preferenciais ao calo, preferenciais à célula guarda, tal como PT0678 (SEQ ID NO: 13) e preferenciais à senescência. Os promotores de- nominados YP0086 (SEQ ID NO: 36), YP0188 (SEQ ID NO: 58), YP0263 (SEQ ID NO: 62), PT0758 (SEQ ID NO: 22), PT0743 (SEQ ID NO: 21), PT0829 (SEQ ID NO: 23), YP0119 (SEQ ID NO: 49) e YP0096 (SEQ ID NO: 39), como descrito nos pedidos de patentes referidos anteriormente, também podem ser úteis.Other promoters: other classes of promoters include, but are not limited to, promoters preferred to the leaf, preferred to the stem / bud, preferred to the callus, preferred to the guard cell, such as PT0678 (SEQ ID NO: 13) and preferred to senescence. The promoters named YP0086 (SEQ ID NO: 36), YP0188 (SEQ ID NO: 58), YP0263 (SEQ ID NO: 62), PT0758 (SEQ ID NO: 22), PT0743 (SEQ ID NO: 21), PT0829 (SEQ ID NO: 23), YP0119 (SEQ ID NO: 49) and YP0096 (SEQ ID NO: 39), as described in the aforementioned patent applications, may also be useful.

Alternativamente, a expressão errada pode ser realizada utili- zando um sistema de dois componentes, em que o primeiro componente con- siste em uma planta transgênica que compreende um ativador da transcrição ligado de forma operacional com um promotor e o segundo componente con- siste em uma planta transgênica que compreende uma molécula de ácido nu- cléico da invenção ligada de forma operacional com a seqüência/região de ligação ao alvo do ativador da transcrição. As duas plantas transgênicas são cruzadas e a molécula de ácido nucléico da invenção é expressa na progénie da planta. Em uma outra modalidade alternativa da presente invenção, a ex- pressão errada pode ser realizada possuindo as seqüências do sistema de dois componentes transformadas em uma linhagem de planta transgênica.Alternatively, the wrong expression can be accomplished using a two-component system, in which the first component consists of a transgenic plant that comprises a transcription activator operationally linked with a promoter and the second component consists of a transgenic plant comprising a nucleic acid molecule of the invention operably linked with the target binding sequence / region of the transcription activator. The two transgenic plants are crossed and the nucleic acid molecule of the invention is expressed in the progeny of the plant. In another alternative embodiment of the present invention, the wrong expression can be performed by having the sequences of the two-component system transformed into a transgenic plant strain.

Uma outra alternativa consiste na inibição da expressão de um polipeptídeo modulador da biomassa ou do vigor em uma espécie vegetal de interesse. O termo "expressão" refere-se ao processo de conversão da in- formação genética codificada em um polinucleotídeo em RNA através da transcrição do polinucleotídeo (isto é, através da ação enzimática de uma RNA polimerase) e em proteína, através da tradução do mRNA. "Regulação para mais" ou "ativação" refere-se à regulação que aumenta a produção de produtos da expressão em relação a estados basais ou nativos, enquanto que "regulação para menos" ou "repressão" refere-se à regulação que dimi- nui a produção em relação a estados basais ou nativos.Another alternative is to inhibit the expression of a polypeptide modulating biomass or vigor in a plant species of interest. The term "expression" refers to the process of converting the genetic information encoded in a polynucleotide into RNA through the transcription of the polynucleotide (that is, through the enzymatic action of an RNA polymerase) and into protein, through the translation of the mRNA . "Regulation for more" or "activation" refers to regulation that increases the production of expression products in relation to basal or native states, while "regulation for less" or "repression" refers to regulation that decreases production in relation to basal or native states.

Um número de métodos baseados em ácidos nucléicos, inclu- indo RNA anti-senso, clivagem de RNA direcionada por ribozima e RNA in- terferente (RNAi) também pode ser utilizado para inibir a expressão de prote- ínas nas plantas. A tecnologia anti-senso é um método bem-conhecido. Nes- te método, um segmento de ácido nucléico do gene endógeno é clonado e ligado de forma operacional a um promotor de forma que o filamento anti- senso de RNA é transcrito. O vetor recombinante é então transformado nas plantas, como descrito anteriormente e o filamento anti-senso de RNA é produzido. O segmento de ácido nucléico na precisa não ser a seqüência inteira do gene que será reprimido, mas tipicamente será substancialmente idêntica a pelo menos uma parte do gene endógeno que será reprimido. Ge- ralmente, uma maior homologia pode ser utilizada para compensar o uso de uma seqüência mais curta. Tipicamente, uma seqüência de pelo menos 30 nucleotídeos é utilizada (por exemplo, pelo menos 40, 50, 80, 100, 200, 500 nucleotídeos ou mais).A number of nucleic acid-based methods, including antisense RNA, ribozyme-directed RNA cleavage and interfering RNA (RNAi) can also be used to inhibit the expression of proteins in plants. Antisense technology is a well-known method. In this method, a nucleic acid segment of the endogenous gene is cloned and operationally linked to a promoter so that the antisense RNA strand is transcribed. The recombinant vector is then transformed into the plants, as previously described and the antisense RNA strand is produced. The nucleic acid segment need not be the entire sequence of the gene that will be repressed, but will typically be substantially identical to at least a part of the endogenous gene that will be repressed. Generally, greater homology can be used to compensate for the use of a shorter sequence. Typically, a sequence of at least 30 nucleotides is used (for example, at least 40, 50, 80, 100, 200, 500 nucleotides or more).

Assim, por exemplo, um ácido nucléico isolado fornecido aqui pode ser um ácido nucléico anti-senso a um dos ácidos nucléicos menciona- dos anteriormente que codificam um polipeptideo modulador da biomassa. Um ácido nucléico que diminui o nível de um produto da transcrição ou da tradução de um gene que codifica um polipeptideo que modula a biomassa é transcrito em um ácido nucléico anti-senso similar ou idêntico à seqüência codificadora senso do polipeptideo modulador da biomassa ou da taxa de crescimento. Alternativamente, o produto da transcrição de um ácido nucléi- co isolado pode ser similar ou idêntico à seqüência codificadora senso de um polipeptideo modulador da biomassa ou da taxa de crescimento, mas um RNA que não está poliadenilado, não possui a estrutura de cap a 5‘ ou con- tém um intron que não pode ser processado.Thus, for example, an isolated nucleic acid provided here may be an antisense nucleic acid to one of the aforementioned nucleic acids that encode a biomass modulating polypeptide. A nucleic acid that lowers the level of a transcription or translation product of a gene encoding a biomass-modulating polypeptide is transcribed into an antisense nucleic acid similar or identical to the sense coding sequence of the biomass-modulating polypeptide or rate growth. Alternatively, the transcription product of an isolated nucleic acid can be similar or identical to the sense coding sequence of a polypeptide modulating biomass or growth rate, but an RNA that is not polyadenylated does not have the cap structure at 5 'or contains an intron that cannot be processed.

Em um outro método, um ácido nucléico pode ser transcrito em uma ribozima ou um RNA catalítico, que afeta a expressão de um mRNA. (ver, a Patente U.S. N2 6.423.885). As ribozimas podem ser planejadas para se parearem especificamente com virtualmente qualquer RNA alvo e clivar a estrutura fosfodiéster em uma localização específica, inativando fun- cionalmente assim o RNA alvo. Os ácidos nucléicos heterólogos podem co- dificar robizimas planejadas para clivar produtos da transcrição de mRNA particulares, prevenindo assim a expressão de um polipeptideo. Ribozimas "cabeça de martelo" são úteis para destruir mRNAs particulares, embora várias ribozimas que clivam mRNA nas seqüências de reconhecimento es- pecíficas ao sítio possam ser utilizadas. As ribozimas "cabeça de martelo" clivam os mRNAs nas localizações determinadas pelas regiões flanqueado- ras que formam pares de bases complementares com o mRNA alvo. O único requerimento é que o RNA alvo contenha uma seqüência de nucleotídeos 5'- UG-3'. A construção e a produção de ribozimas "cabeça de martelo" são co- nhecidas na técnica. Ver, por exemplo, a Patente U.S. N2 5.254.678 e a WO 02/46449 e as referências citadas nas mesmas. As seqüências de ribo- zimas "cabeça de martelo" podem estar encerradas dentro de um RNA está- vel tal como um RNA de transferência (tRNA) para aumentar a eficiência de divagem in vivo. Perriman e outros (1995) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 92(13): 6175-6179; de Feyter e Gaudron, Methods in Molecular Biology, Vol. 74, Capítulo 43, "Expressing Ribozymes in Plantas", Editado por Turner, P.C, Humana Press Inc., Totowa, NJ. As RNA endorribonucleases tal como aquela que ocorre naturalmente em Tetrahymena thermophila e que foi des- crita extensivamente por Cech e colaboradores pode ser útil. Ver, por exem- plo, a Patente U.S. N- 4.987.071.In another method, a nucleic acid can be transcribed into a ribozyme or a catalytic RNA, which affects the expression of an mRNA. (see, U.S. Patent No. 6,423,885). Ribozymes can be designed to specifically pair with virtually any target RNA and cleave the phosphodiester structure at a specific location, thereby inactivating the target RNA. Heterologous nucleic acids can codify robizimas designed to cleave particular mRNA transcription products, thus preventing the expression of a polypeptide. "Hammerhead" ribozymes are useful for destroying particular mRNAs, although several ribozymes that cleave mRNA in the site-specific recognition sequences can be used. "Hammerhead" ribozymes cleave mRNAs at locations determined by the flanking regions that form complementary base pairs with the target mRNA. The only requirement is that the target RNA contains a sequence of 5'-UG-3 'nucleotides. The construction and production of "hammerhead" ribozymes are known in the art. See, for example, U.S. Patent No. 5,254,678 and WO 02/46449 and the references cited therein. The "hammerhead" ribozyme strings can be enclosed within a stable RNA such as a transfer RNA (tRNA) to increase the efficiency of dividing in vivo. Perriman et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Know. USA, 92 (13): 6175-6179; by Feyter and Gaudron, Methods in Molecular Biology, Vol. 74, Chapter 43, "Expressing Ribozymes in Plantas", Edited by Turner, P.C, Humana Press Inc., Totowa, NJ. Endoribonuclease RNAs such as the one that occurs naturally in Tetrahymena thermophila and has been described extensively by Cech and colleagues can be useful. See, for example, U.S. Patent No. 4,987,071.

Podem ser utilizados os métodos baseados na interferência de RNA (RNAi). A interferência de RNA é um mecanismo celular para regular a expressão de genes e a replicação de vírus. Acredita-se que este mecanis- mo seja mediado por moléculas de RNA interferentes pequenas de filamento duplo. Uma célula responde a tal RNA de filamento duplo através da destrui- ção do mRNA endógeno que possui a mesma seqüência que o RNA de fila- mento duplo. Os métodos para o planejamento e para a preparação dos RNAs interferentes são conhecidos pelos peritos na técnica; ver, por exem- plo, a WO 99/32619 e a WO 01/75164. Por exemplo, pode ser preparada uma construção que inclui uma seqüência que é transcrita em um RNA inter- ferente. Tal RNA pode ser um que pode se anelar com ele mesmo, por e- xemplo, um RNA de filamento duplo que possui uma estrutura de haste-alça. Um filamento da porção de haste de um RNA de filamento duplo compreen- de uma seqüência que é similar ou idêntica à seqüência codificadora senso do polipeptídeo de interesse e que possui de aproximadamente 10 nucleotí- deos até aproximadamente 2.500 nucleotídeos de comprimento. O compri- mento da seqüência que é similar ou idêntica à seqüência codificadora sen- so pode ser de 10 nucleotídeos até 500 nucleotídeos, de 15 nucleotídeos até 300 nucleotídeos, de 20 nucleotídeos até 100 nucleotídeos ou de 25 nucleo- tídeos até 100 nucleotídeos. O outro filamento da porção de haste de um RNA de filamento duplo compreende uma seqüência anti-senso do polipep- tídeo modulador de biomassa de interesse e pode ter um comprimento que é mais curto, o mesmo ou mais longo que o filamento correspondente da se- qüência senso. A porção de alça de um RNA de filamento duplo pode ser de 10 nucleotídeos até 5.000 nucleotídeos, por exemplo, de 15 nucleotídeos até 1.000 nucleotídeos, de 20 nucleotídeos até 500 nucleotídeos ou de 25 nu- cleotídeos até 200 nucleotídeos. A porção de alça do RNA pode incluir um íntron. Ver, por exemplo, a WO 99/53050.Methods based on RNA interference (RNAi) can be used. RNA interference is a cellular mechanism for regulating gene expression and virus replication. This mechanism is believed to be mediated by small, double-stranded interfering RNA molecules. A cell responds to such a double-stranded RNA by destroying endogenous mRNA that has the same sequence as double-stranded RNA. Methods for planning and preparing interfering RNAs are known to those skilled in the art; see, for example, WO 99/32619 and WO 01/75164. For example, a construct can be prepared that includes a sequence that is transcribed into an interfering RNA. Such an RNA can be one that can ring with itself, for example, a double-stranded RNA that has a stem-loop structure. A strand of the stem portion of a double-stranded RNA comprises a sequence that is similar or identical to the sense coding sequence of the polypeptide of interest and that is approximately 10 nucleotides to approximately 2,500 nucleotides in length. The length of the sequence, which is similar or identical to the coding sequence, can be 10 nucleotides to 500 nucleotides, 15 nucleotides to 300 nucleotides, 20 nucleotides to 100 nucleotides or 25 nucleotides to 100 nucleotides. The other strand of the stem portion of a double-stranded RNA comprises an antisense sequence of the biomass modulator polypeptide of interest and may be of a length that is shorter, the same or longer than the corresponding strand of the sense sequence. The loop portion of a double-stranded RNA can be from 10 nucleotides to 5,000 nucleotides, for example, from 15 nucleotides to 1,000 nucleotides, from 20 nucleotides to 500 nucleotides or from 25 nucleotides to 200 nucleotides. The loop portion of the RNA can include an intron. See, for example, WO 99/53050.

Em alguns métodos baseados em ácidos nucléicos para a inibi- ção da expressão gênica em plantas, um ácido nucléico adequado pode ser um análogo de ácido nucléico. Os análogos de ácido nucléico podem ser modificados no grupamento de base, no grupamento de açúcar ou na estru- tura de fosfato para aumentar, por exemplo, a estabilidade, a hibridização ou a solubilidade do ácido nucléico. As modificações no grupamento de base incluem desoxiuridina para desoxitimidina e 5-metil-2'-desoxicitidina e 5- bromo-2'-desoxicitidina para desoxicitidina. As modificações do grupamento de açúcar incluem a modificação do 2' hidroxila do grupamento de ribose para formar açúcares 2'-O-metila ou 2'-O-alila. A estrutura de desoxiribose fosfato pode ser modificada para produzir ácidos nucléicos de morfolino, em que cada grupamento de base é ligado a um anel morfolino de seis mem- bros ou ácidos nucléicos peptídicos, em que a estrutura de desoxifosfato é substituída por uma estrutura de pseudopeptídeo e as quatro bases são mantidas. Ver, por exemplo, Summerton e Weller, 1997, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 7: 187-195; Hyrup e outros, 1996, Bioorgan. Med. Chem., 4: 5-23. Em adição, a estrutura de desoxifosfato pode ser substituída por, por exemplo, uma estrutura de fosforotioato ou fosforoditioato, uma estrutura de fosforoamidita ou de alquil fosfotriéster.In some nucleic acid-based methods for inhibiting gene expression in plants, a suitable nucleic acid can be a nucleic acid analogue. Nucleic acid analogs can be modified in the base group, sugar group or phosphate structure to increase, for example, the stability, hybridization or solubility of the nucleic acid. Changes in the base group include deoxyuridine for deoxythymidine and 5-methyl-2'-deoxycytidine and 5-bromo-2'-deoxycytidine for deoxycytidine. Modifications of the sugar group include modification of the 2 'hydroxyl of the ribose group to form 2'-O-methyl or 2'-O-ally sugars. The deoxyribose phosphate structure can be modified to produce morpholine nucleic acids, in which each base group is attached to a six-membered morpholine ring or peptide nucleic acids, in which the deoxyphosphate structure is replaced by a pseudopeptide structure. and the four bases are maintained. See, for example, Summerton and Weller, 1997, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 7: 187-195; Hyrup et al., 1996, Bioorgan. Med. Chem., 4: 5-23. In addition, the deoxyphosphate structure can be replaced by, for example, a phosphorothioate or phosphorodithioate structure, a phosphoramidite or alkyl phosphotriester structure.

TransformaçãoTransformation

As moléculas de ácidos nucléicos da presente invenção podem ser introduzidas no genoma ou na célula da planta hospedeira apropriada atra- vés de uma variedade de técnicas. Estas técnicas, capazes de transformar uma ampla variedade de espécies vegetais superiores, são bem-conhecidas e descritas na literatura técnica e científica (ver, por exemplo, Weising e outros (1988) Ann. Rev. Genet., 22: 421 e Christou (1995) Euphytica, 85: 13-27).The nucleic acid molecules of the present invention can be introduced into the genome or cell of the appropriate host plant through a variety of techniques. These techniques, capable of transforming a wide variety of higher plant species, are well known and described in the technical and scientific literature (see, for example, Weising et al. (1988) Ann. Rev. Genet., 22: 421 and Christou ( 1995) Euphytica, 85: 13-27).

Uma variedade de técnicas conhecidas na técnica está disponí- vel para a introdução do DNA em uma célula vegetal hospedeira. Estas téc- nicas incluem a transformação de células vegetais através de injeção (Ne- well (2000)), microinjeção (Griesbach (1987) Plant Sei. 50: 69-77), eletropora- ção de DNA (Fromm e outros (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 5824), PEG (Paszkowski e outros (1984) EMBOJ. 3: 2717), uso de biolística (Klein e outros (1987) Nature 327: 773), fusão de células ou de protoplastos (Willmitzer, L (1993) Transgenic Plants. Em: lotechnology, A Multi-Volume Comprehensive treatise (H.J. Rehm, G. Reed, A. Püler, P. Stadler, eds., Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge) e através de T-DNA utilizando Agro- bacterium tumefaciens (Crit. Rev. Plant. Sei. 4: 1-46; Fromm e outros (1990) Biotechnology 8: 833-844) ou Agrobacterium rhizogenes (Cho e outros (2000) Planta 210:195-204) ou outros hospedeiros bacterianos (Brootghaerts e outros (2005) Nature 433: 629-633), por exemplo.A variety of techniques known in the art are available for introducing DNA into a host plant cell. These techniques include the transformation of plant cells through injection (Newell (2000)), microinjection (Griesbach (1987) Plant Sei. 50: 69-77), DNA electroporation (Fromm et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5824), PEG (Paszkowski et al. (1984) EMBOJ. 3: 2717), use of biolistics (Klein et al. (1987) Nature 327: 773), fusion of cells or protoplasts (Willmitzer, L (1993) Transgenic Plants. In: lotechnology, A Multi-Volume Comprehensive treatise (HJ Rehm, G. Reed, A. Püler, P. Stadler, eds., Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim -New York-Basel-Cambridge) and through T-DNA using Agro-bacterium tumefaciens (Crit. Rev. Plant. Sci. 4: 1-46; Fromm et al. (1990) Biotechnology 8: 833-844) or Agrobacterium rhizogenes (Cho et al. (2000) Plant 210: 195-204) or other bacterial hosts (Brootghaerts et al. (2005) Nature 433: 629-633), for example.

Em adição, um número de métodos de transformação não está- veis que é bem-conhecido na técnica pode ser desejável para a presente invenção. Tais métodos incluem, mas não estão limitados à expressão tran- sitória (Lincoln e outros (1998) Plant Mol. Biol. Rep. 16: 1-4) e à transfecção viral (Lacomme e outros (2001), "Genetically Engineered Viruses" (C.J.A. Ring e E.D. Blair, Eds). Pp. 59-99, BIOS Scientific Publishers, Ltd. Oxford, UK).In addition, a number of non-stable transformation methods that are well known in the art may be desirable for the present invention. Such methods include, but are not limited to, transient expression (Lincoln et al (1998) Plant Mol. Biol. Rep. 16: 1-4) and viral transfection (Lacomme et al (2001), "Genetically Engineered Viruses" (CJA Ring and ED Blair, Eds) Pp. 59-99, BIOS Scientific Publishers, Ltd. Oxford, UK).

As sementes são obtidas partindo das plantas transformadas e utilizadas para testar a estabilidade e a herança. Geralmente, duas ou mais gerações são cultivadas para garantir que a característica fenotípica seja mantida de forma estável e transmitida.The seeds are obtained from the transformed plants and used to test stability and inheritance. Generally, two or more generations are cultivated to ensure that the phenotypic trait is maintained in a stable and transmitted manner.

Um versado na técnica reconhece que após o cassete de ex- pressão ser estavelmente incorporado nas plantas transgênicas e confirma- do como sendo operacional, pode ser introduzido em outras plantas através do cruzamento sexual. Qualquer uma de um número de técnicas de cruza- mento padronizadas pode ser utilizada, dependendo da espécie que será cruzada.One skilled in the art recognizes that after the expression cassette is stably incorporated into transgenic plants and confirmed to be operational, it can be introduced into other plants through sexual crossing. Any of a number of standardized breeding techniques can be used, depending on the species to be crossed.

As moléculas de ácidos nucléicos da presente invenção podem ser utilizadas para conferir a característica de um tempo de florescimento alte- rado.The nucleic acid molecules of the present invention can be used to impart the characteristic of an altered flowering time.

As moléculas de ácidos nucléicos da presente invenção codificam proteínas apropriadas de qualquer organismo, mas são preferencialmente encontradas em plantas, fungos, bactérias ou animais.The nucleic acid molecules of the present invention encode appropriate proteins from any organism, but are preferably found in plants, fungi, bacteria or animals.

Os métodos de acordo com a presente invenção podem ser aplicados em qualquer planta, preferencialmente plantas superiores, que pertencem às classes de Angiospermae e Gymnospermae. As plantas das subclasses das Dicotylodenae e das Monocotyledonae são particularmente adequadas. As plantas dicotiledôneas pertencentes às ordens Magniolales, llliciales, Laurales, Piperales Aristochiales, Nymphaeales, Ranunculales, Pa- peve rales, Sarraceniaceae, Trochodendrales, Hamamelidales, Eucomiales, Leitneriales, Myricales, Fagales, Casuarinales, Caryophyllales, Batales, Polygonales, Plumbaginales, Dilleniales, Theales, Malvales, Urticales, Lecy- thidales, Violates, Salicales, Capparales, Ericales, Diapensales, Ebenales, Primulales, Rosales, Fabales, Podostemales, Haloragales, Myrtales, Corna- les, Proteales, Santales, Rafflesiales, Celastrales, Euphorbiales, Rhamnales, Sapindales, Juglandales, Geraniales, Polygalales, Umbellales, Gentianales, Polemoniales, Lamiales, Plantaginales, Scrophulariales, Campanulales, Ru- biales, Dipsacales e Asterales, por exemplo, também são adequadas. As plantas monocotiledôneas pertencentes às ordens Alismatales, Hydrochari- tales, Najadales, Triuridales, Commelinales, Eriocaulales, Restionales, Poa- les, Juncales, Cype rales, Typhales, Brome Hales, Zingiberales, Arecales, Cy- clanthales, Pandanales, Arales, Lilliales e Orchidales também podem ser úteis nas modalidades da presente invenção. Os exemplos adicionais inclu- em, mas não estão limitados às plantas que pertencem à classe Gymnos- permae que são Pinales, Ginkgoales, Cycadales e Gnetales.The methods according to the present invention can be applied to any plant, preferably superior plants, which belong to the classes of Angiospermae and Gymnospermae. The plants of the Dicotylodenae and Monocotyledonae subclasses are particularly suitable. The dicotyledonous plants belonging to the orders Magniolales, lllliciales, Laurales, Piperales Aristochiales, Nymphaeales, Ranunculales, Papeve rales, Sarraceniaceae, Trochodendrales, Hamamelidales, Eucomiales, Leitneriales, Myricales, Fagales, Plagial, Polygonal, Casual, Polygonal Theales, Malvales, Urticales, Lecy- thidales, Violates, Salicales, Capparales, Ericales, Diapensales, Ebenales, Primulales, Rosales, Fabales, Podostemales, Haloragales, Myrtales, Cornas, Proteales, Santales, Rafflesiales, Celastrales, Euphorbiales, Relas Sapindales, Juglandales, Geraniales, Polygalales, Umbellales, Gentianales, Polemoniales, Lamiales, Plantaginales, Scrophulariales, Campanulales, Rubiales, Dipsacales and Asterales, for example, are also suitable. The monocotyledonous plants belonging to the orders Alismatales, Hydrochariales, Najadales, Triuridales, Commelinales, Eriocaulales, Restionales, Pooles, Juncales, Cype rales, Typhales, Brome Hales, Zingiberales, Arecales, Cyclanthales, Pandanales, Arales, Lilliales and Lilliales Orchidales can also be useful in the embodiments of the present invention. Additional examples include, but are not limited to, plants belonging to the Gymnospermae class which are Pinales, Ginkgoales, Cycadales and Gnetales.

Os métodos da presente invenção são preferencialmente utili- zados em plantas que são importantes ou interessantes para agricultura, horticultura, biomassa para bioconversão e/ou florestamento. Os exemplos não limitantes incluem, por exemplo, tabaco, colza de semente oleosa, be- terraba de açúcar, tomates, pepinos, pimentas, feijões, ervilhas, frutos cítri- cos, abacates, pêssegos, maçãs, pêras, bagas, ameixas, melões, berinjelas, algodão, soja, girassóis, rosas, poinsetia, petúnia, guaiúle, repolhos, espina- fre, alfalfa, alcachofras, cana-de-açúcar, mimosa, Servicea lespedera, milho, trigo, arroz, centeio, cevada, sorgo e gramíneas tal como Panicum virgatum, bambu gigante, capim-de-burro, sorgo bravo ou turfa, painço, cânhamo, ba- nanas, choupos, eucalipto e coníferas. São de interesse as plantas cultiva- das para a produção de energia, as assim chamadas plantas de cultivo para energia, tais como plantas de folhas amplas como alfalfa, cânhamo, tupinam- bu e gramíneas tais como sorgo, Panicum virgatum, sorgo bravo e similares.The methods of the present invention are preferably used on plants that are important or interesting for agriculture, horticulture, biomass for bioconversion and / or forestry. Non-limiting examples include, for example, tobacco, oilseed rape, sugar beet, tomatoes, cucumbers, peppers, beans, peas, citrus fruits, avocados, peaches, apples, pears, berries, plums, melons , eggplants, cotton, soy, sunflowers, roses, poinsettia, petunia, guaiúle, cabbages, spinach, alfalfa, artichokes, sugar cane, mimosa, Servicea lespedera, corn, wheat, rice, rye, barley, sorghum and grasses such as Panicum virgatum, giant bamboo, donkey grass, wild sorghum or peat, millet, hemp, bananas, poplars, eucalyptus and conifers. Of interest are plants grown for energy production, so-called energy growing plants, such as broadleaf plants like alfalfa, hemp, tupinam-bu and grasses such as sorghum, Panicum virgatum, wild sorghum and the like .

Homólogos Abrangidos pela InvençãoCounterparts Covered by the Invention

É sabido na técnica que um ou mais aminoácidos em uma se- qüência podem ser substituídos por outro(s) aminoácido(s), cuja carga e po- laridade são similares àquelas do aminoácido substituído, isto é, uma substi- tuição conservative de aminoácidos, resultando em uma alteração biologi- camente/funcionalmente silenciosa. Os substitutos conservatives para um aminoácido dentro da seqüência de polipeptídeo podem ser selecionados de outros membros da classe à qual o aminoácido pertence. Os aminoácidos podem ser divididos nos quatro grupos a seguir: (1) aminoácidos ácidos (car- regados negativamente), tais como o ácido aspártico e o ácido glutâmico; (2) aminoácidos básicos (carregados positivamente), tais como arginina, histidi- na e lisina; (3) aminoácidos polares neutros, tais como serina, treonina, tiro- sina, asparagina e glutamina; e (4) aminoácidos não polares neutros (hidro- fóbicos) tais como glicina, alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenila- lanina, triptofano, cisteína e metionina.It is known in the art that one or more amino acids in a sequence can be replaced by another (s) amino acid (s), whose charge and polarity are similar to those of the substituted amino acid, that is, a conservative amino acid substitution , resulting in a biologically / functionally silent change. Conservative substitutes for an amino acid within the polypeptide sequence can be selected from other members of the class to which the amino acid belongs. Amino acids can be divided into the following four groups: (1) acidic (negatively charged) amino acids, such as aspartic acid and glutamic acid; (2) basic (positively charged) amino acids, such as arginine, histidine and lysine; (3) neutral polar amino acids, such as serine, threonine, tyrosine, asparagine and glutamine; and (4) neutral (hydrophobic) non-polar amino acids such as glycine, alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylanine, tryptophan, cysteine and methionine.

As moléculas de ácidos nucléicos da presente invenção podem compreender seqüências que diferem daquelas que codificam uma proteína ou um fragmento da mesma selecionadas do grupo que consiste em Leads 15, 28, 29, 36, ME04012 e Clone 691319, SEQ ID Nos. 80, 90, 92, 98, 109 e 103, respectivamente, devido ao fato de que a seqüência de ácido nucléico diferente codifica uma proteína que possui uma ou mais alterações de ami- noácidos conservatives.The nucleic acid molecules of the present invention may comprise sequences that differ from those encoding a protein or a fragment thereof selected from the group consisting of Leads 15, 28, 29, 36, ME04012 and Clone 691319, SEQ ID Nos. 80, 90, 92, 98, 109 and 103, respectively, due to the fact that the different nucleic acid sequence encodes a protein that has one or more conservative amino acid changes.

Os equivalentes biologicamente funcionais dos polipeptídeos ou os fragmentos dos mesmos, da presente invenção podem ter aproximada- mente 10 ou menos alterações de aminoácidos conservatives, mais prefe- rencialmente aproximadamente 7 ou menos alterações de aminoácidos con- servativas e mais preferencialmente aproximadamente 5 ou menos altera- ções de aminoácidos conservativas. Em uma modalidade preferida da pre- sente invenção, o polipeptideo possui entre aproximadamente 5 e aproxima- damente 500 alterações conservativas, mais preferencialmente entre apro- ximadamente 10 e aproximadamente 300 alterações conservativas, ainda mais preferencialmente entre aproximadamente 25 e aproximadamente 150 alterações conservativas e mais preferencialmente entre aproximadamente 5 e aproximadamente 25 alterações conservativas ou entre 1 e aproximada- mente 5 alterações conservativas.The biologically functional equivalents of the polypeptides or fragments thereof, of the present invention may have approximately 10 or less conservative amino acid changes, more preferably approximately 7 or less conservative amino acid changes and more preferably approximately 5 or less changes - Conservative amino acid sections. In a preferred embodiment of the present invention, the polypeptide has between approximately 5 and approximately 500 conservative changes, more preferably between approximately 10 and approximately 300 conservative changes, even more preferably between approximately 25 and approximately 150 conservative changes and more preferably between approximately 5 and approximately 25 conservative changes or between 1 and approximately 5 conservative changes.

Identificação de Moléculas de Ácidos Nucléicos Úteis e Suas Seqüências de Nucleotídeos CorrespondentesIdentification of Useful Nucleic Acid Molecules and Their Corresponding Nucleotide Sequences

As moléculas de ácidos nucléicos e as seqüências de nucleotí- deos das mesmas, da presente invenção foram identificadas através do uso de uma variedade de seleções que podem prever as seqüências de nucleo- tídeos que fornecem plantas com tamanho, crescimento vegetativo, taxa de crescimento, número de órgãos, arquitetura da planta e/ou biomassa altera- da. Uma ou mais das seleções a seguir foram, portanto, utilizadas para a identificação das seqüências de nucleotídeos (e de aminoácidos) da presen- te invenção.The nucleic acid molecules and their nucleotide sequences, of the present invention have been identified through the use of a variety of selections that can predict the nucleotide sequences that provide plants with size, vegetative growth, growth rate, number of organs, plant architecture and / or altered biomass. One or more of the following selections were therefore used to identify the nucleotide (and amino acid) sequences of the present invention.

A presente invenção é adicionalmente exemplificada pelos e- xemplos a seguir. Não é pretendido que os exemplos limitem de forma al- guma o âmbito do presente pedido de patente e seus usos.The present invention is further exemplified by the following examples. The examples are not intended to limit the scope of the present patent application and its uses in any way.

6. EXPERIMENTOS QUE CONFIRMAM A UTILIDADE DOS POLINUCLEO- TÍDEOS E DOS POLIPEPTÍDEOS DA INVENÇÃO6. EXPERIMENTS THAT CONFIRM THE UTILITY OF THE POLYNUCLEOIDS AND POLYPEPTIDES OF THE INVENTION

Protocolos GeraisGeneral Protocols

Transformação de Arabidopsis Mediada por AgrobacteriumAgrobacterium-Mediated Arabidopsis Transformation

Plantas de Arabidopsis thaliana Wassilewskija (WS) do tipo sel- vagem são transformadas com plasmídeos Ti contendo clones na orientação senso em relação ao promotor 35S. Um vetor de plasmídeo Ti útil para estas construções, CRS 338, contém o gene marcador selecionável de planta fos- finotricina acetiltransferase (PAT) construído pela Ceres, que confere resis- tência a herbicida às plantas transformadas.Plants of Arabidopsis thaliana Wassilewskija (WS) of the wild type are transformed with Ti plasmids containing clones in the sense orientation in relation to the 35S promoter. A Ti plasmid vector useful for these constructions, CRS 338, contains the selectable marker gene for phospholothricin acetyltransferase (PAT) built by Ceres, which gives herbicide resistance to transformed plants.

Dez eventos transformados independentemente são tipicamen- te selecionados e avaliados em relação ao seu fenótipo qualitativo na gera- ção TvTen independently transformed events are typically selected and evaluated in relation to their qualitative phenotype in the TV generation

Preparação de Mistura de Solo: O solo 24L SunshineMix #5 (Sun Gro Horticultura, Ltd., Bellevue, WA) é misturado com a vermiculita 16L Therm-O-Rock (Therm-O-Rock West, Inc., Chandler, AZ) em uma misturado- ra de cimento para produzir uma mistura de solo de 60:40. à mistura de solo são adicionados 2 Colheres de Sopa de grânulos Marathon 1% (Hummert, Earth City, MO), 3 Colheres de Sopa de OSMOCOTE® 14-14-14 (Hummert, Earth City, MO) e 1 Colher de Sopa do fertilizante Peters 20-20-20 (J.R. Pe- ters, Inc., Allentown, PA), que são primeiramente adicionados em 11,35 L (3 galões) de água e então adicionados ao solo e mistuados vigorosamente. Geralmente, vasos de 10,16 cm (4 polegadas) de diâmetro são preenchidos com a mistura de solo. Os vasos são então cobertos com 51,61 cm2 (8 pole- gadas quadradas) de rede de náilon.Soil Mix Preparation: SunshineMix # 5 24L soil (Sun Gro Horticultura, Ltd., Bellevue, WA) is mixed with Therm-O-Rock 16L vermiculite (Therm-O-Rock West, Inc., Chandler, AZ) in a cement mixer to produce a 60:40 soil mix. To the soil mixture are added 2 tablespoons of 1% Marathon granules (Hummert, Earth City, MO), 3 tablespoons of OSMOCOTE® 14-14-14 (Hummert, Earth City, MO) and 1 tablespoon of Peters 20-20-20 fertilizer (JR Peters, Inc., Allentown, PA), which are first added in 11.35 L (3 gallons) of water and then added to the soil and mixed vigorously. Generally, pots 10.16 cm (4 inches) in diameter are filled with the soil mixture. The pots are then covered with 51.61 cm2 (8 square inches) of nylon mesh.

Plantio: utilizando uma seringa de 60 mL, 35 mL da mistura de sementes são aspirados. 25 gotas são adicionadas em cada vaso. Cúpulas de propagação translúcidas são colocadas na parte superior dos vasos que são então colocados sob tela para estufa a 55% e subirrigados através da adição de 2,54 cm (1 polegada) de água.Planting: using a 60 mL syringe, 35 mL of the seed mixture is aspirated. 25 drops are added to each vessel. Translucent propagation domes are placed on top of the pots which are then placed under a 55% greenhouse screen and raised by adding 2.54 cm (1 inch) of water.

Manutenção das Plantas: 3 até 4 dias após o plantio, as tampas e a tela para estufa são removidos. As plantas são regadas quando neces- sário. Após 7-10 dias, diminuem-se os vasos para 20 plantas por vaso utili- zando fórceps. Após 2 semanas, todas as plantas são subirrigadas com ferti- lizante Peters a uma taxa de 1 Colher de Sopa por 3,78 L (galão) de água. Quando os "bolts" possuírem aproximadamente 5-10 cm de comprimento, são cortados entre o primeiro nó e a base do caule para induzir "bolts" se- cundários. A infiltração por gotejamento é realizada 6 até 7 dias após o cor- te.Plant Maintenance: 3 to 4 days after planting, the covers and the greenhouse screen are removed. The plants are watered when necessary. After 7-10 days, the pots are reduced to 20 plants per pot using forceps. After 2 weeks, all plants are soaked with Peters fertilizer at a rate of 1 tablespoon per 3.78 L (gallon) of water. When the "bolts" are approximately 5-10 cm long, they are cut between the first knot and the base of the stem to induce secondary "bolts". Drip infiltration is carried out 6 to 7 days after the cut.

Preparação de Agrobacterium: a 150 mL de YEB fresco é adi- cionado 0,1 mL de cada de carbenicilina, espectinomicina e rifampicina (ca- da um à concentração estoque de 100 mg/mL). São obtidos blocos de parti- da de Agrobacterium (bloco de 96 cavidades com culturas de Agrobacterium crescidas até uma D06oo de aproximadamente 1,0) e é inoculado um recipi- ente de cultura por construção através da transferência de 1 mL da cavidade apropriada no bloco de partida. As culturas são então incubadas com agita- ção a 27°C. As culturas são centrifugadas após atingirem uma DOθoo de a- proximadamente 1,0 (aproximadamente 24 horas). 200 mL do meio de infil- tração são adicionados aos péletes ressuspensas de Agrobacterium. O meio de infiltração é preparado através da adição de 2,2 g de sais de MS, 50 g de sacarose e 5 μL de benzilaminopurina a 2 mg/mL em 900 mL de água.Preparation of Agrobacterium: To 150 ml of fresh YEB is added 0.1 ml of each of carbenicillin, spectinomycin and rifampicin (each at a stock concentration of 100 mg / ml). Agrobacterium starting blocks are obtained (96-well block with Agrobacterium cultures grown to a D06oo of approximately 1.0) and a culture vessel is inoculated by construction by transferring 1 ml of the appropriate well in the block of departure. The cultures are then incubated with shaking at 27 ° C. The cultures are centrifuged after reaching a DOθoo of approximately 1.0 (approximately 24 hours). 200 mL of the infiltration medium is added to the resuspended pellets of Agrobacterium. The infiltration medium is prepared by adding 2.2 g of MS salts, 50 g of sucrose and 5 μL of 2 mg / ml benzylaminopurine in 900 ml of water.

Infiltração por Gotejamento: os vasos são invertidos e submer- sos durante 5 minutos de forma que a parte aérea da planta fique na sus- pensão de Agrobacterium. É permitido que as plantas cresçam normalmente e a semente é coletada.Drip infiltration: the pots are inverted and submerged for 5 minutes so that the aerial part of the plant is in the Agrobacterium suspension. The plants are allowed to grow normally and the seed is collected.

Seleção Fenotípica de Alta Transferência de Mutantes com Ex- pressão Errada: a semente é igualmente dispersa em solo saturado com água nos vasos e colocada em um resfriador a 4°C na escuridão durante duas noites para promover uma germinação uniforme. Os vasos são então removidos do resfriador e cobertos com uma tela para estufa a 55% durante 4-5 dias. Os cotiledôneos são completamente expandidos neste estágio. FI- NALE® (Sanofi Aventis, Paris, França) é borrifado sobre as plantas (3 mL de FINALE® diluído em 1,41 L (48 oz.) de água) e isto é reptido a cada 3-4 dias até que fiquem apenas os transformantes.Phenotypic Selection of High Transfer of Mutants with Wrong Expression: the seed is equally dispersed in soil saturated with water in the pots and placed in a cooler at 4 ° C in the dark for two nights to promote uniform germination. The pots are then removed from the cooler and covered with a 55% greenhouse screen for 4-5 days. Cotyledons are fully expanded at this stage. FI- NALE® (Sanofi Aventis, Paris, France) is sprayed on the plants (3 mL of FINALE® diluted in 1.41 L (48 oz.) Of water) and this is repeated every 3-4 days until they are only the transformants.

Seleção: a seleção é realizada rotineiramente em quatro está- gios: Muda, Roseta, Florescência e Senescência.Selection: Selection is carried out routinely in four stages: Muda, Rosette, Florescence and Senescence.

Muda - o período de tempo após os cotiledôneos terem emergi- do, mas antes que a 3â folha verdadeira comece a ser formada.Changes - the period of time after cotyledons have emerged, but before the 3rd real leaf begins to form.

Roseta - o período de tempo partindo da emergência da 3â folha verdadeira até logo antes do "bolt" primário começar a se alongar.Rosette - the period of time from the emergence of the 3rd real leaf until just before the primary "bolt" begins to lengthen.

Florescimento - o período de tempo partindo da emergência do "bolt" primário até o início da senescência (com a exceção de registro do tempo de florescência por si só, a maior parte das observações deve ser feita no estágio em que aproximadamente 50% das flores se abriram).Flowering - the period of time from the emergence of the primary bolt to the start of senescence (with the exception of recording the flowering time alone, most observations should be made at the stage when approximately 50% of the flowers opened).

Senescência - o período de tempo após o início da senescência (com a exceção da "senescência retardada", a maior parte das observações deve ser feita após a planta ter secado completamente). As sementes são então coletadas.Senescence - the period of time after the start of senescence (with the exception of "delayed senescence", most observations should be made after the plant has dried completely). The seeds are then collected.

Seleções: a seleção em relação ao maior tamanho, crescimento vegetativo e/ou biomassa é realizada tirando medidas, especificamente me- didas de T2 foram feitas como a seguir:Selections: the selection in relation to the largest size, vegetative growth and / or biomass is performed by taking measurements, specifically T2 measurements were made as follows:

Dias até Bolt = número de dias entre o plantio das sementes e a emergência da primeira inflorescência.Days to Bolt = number of days between planting the seeds and the emergence of the first inflorescence.

Número de Folhas da Roseta at Bolt = número de folhas da ro- seta presentes no momento da emergência da primeira inflorescência.Number of Rosette Leaves at Bolt = number of leaves of the arrow present at the time of emergence of the first inflorescence.

Área da Roseta = área da roseta no momento da emergência da inflorescência inicial, utilizando a fórmula ((LxW)*3,14)/4.Rosette area = rosette area when the initial inflorescence emerges, using the formula ((LxW) * 3.14) / 4.

Altura = comprimento da inflorescência mais longa partindo da base até o ápice. Esta medida foi feita no término da florescência/início da senescência.Height = length of the longest inflorescence from the base to the summit. This measurement was made at the end of flowering / beginning of senescence.

Espessura da Inflorescência Primária = diâmetro da inflores- cência primária 2,5 cm acima da base. Esta medida foi feita no término da florescência/início da senescência.Primary Inflorescence Thickness = primary inflorescence diameter 2.5 cm above the base. This measurement was made at the end of flowering / beginning of senescence.

Número de Inflorescência = número total de inflorescências úni- cas. Esta medida foi feita no término do florescimento/início da senescência.Inflorescence number = total number of unique inflorescences. This measurement was made at the end of flowering / beginning of senescence.

A PCR foi utilizada para a amplificação do inserto de cDNA na plan- ta T2 escolhida aleatoriamente. Este produto da PCR foi então seqüenciado para confirmar a seqüência nas plantas.PCR was used to amplify the cDNA insert in the T2 plant chosen at random. This PCR product was then sequenced to confirm the sequence in the plants.

RESULTADOS:RESULTS:

As plantas transformadas com os genes de interesse foram sele- cionadas como descrito anteriormente em relação às características de cres- cimento e fenotípicas moduladas. As observações incluem aquelas em relação à planta inteira, assim como a de partes da planta, tais como das raízes e das folhas. As observações para transformantes com cada seqüência de polinucle- otídeos são observadas na Listagem de Seqüências para cada uma das se- qüências de nucleotídeos testadas e para o polipeptideo codificado correspon- dente. As características moduladas (isto é, os fenótipos observados) são ci- tadas através de uma entrada no campo das "características variadas" para cada seqüência respectiva. O "Fenótipo" observado na Listagem de Seqüên- cias para cada seqüência relevante inclui ainda uma citação da utilidade de tal seqüência com base nas observações.Plants transformed with the genes of interest were selected as described above in relation to growth and modulated phenotypic characteristics. Observations include those regarding the entire plant, as well as parts of the plant, such as roots and leaves. The observations for transformants with each sequence of polynucleotides are noted in the Sequence List for each of the nucleotide sequences tested and for the corresponding encoded polypeptide. Modulated characteristics (that is, the observed phenotypes) are cited through an entry in the "varied characteristics" field for each respective sequence. The "Phenotype" observed in the Sequence List for each relevant sequence also includes a quote of the usefulness of that sequence based on the observations.

As observações feitas para os vários transformantes podem ser categorizadas, dependendo do tecido vegetal relevante para a observação e da utilidade da seqüência de nucleotídeos/polipeptídeo utilizada para fazer tal transformante. A Tabela 1 correlaciona as observações abreviadas na listagem de seqüências com as observações feitas para cada transformante (a coluna de "descrição"), o tecido da observação, o fenótipo associado dessa maneira com o transformante e a utilidade conseqüente da seqüência de nucleotídeos inserida e do polipeptideo codificado (a coluna de "tradução").The observations made for the various transformants can be categorized, depending on the plant tissue relevant to the observation and the utility of the nucleotide / polypeptide sequence used to make such a transformant. Table 1 correlates the abbreviated observations in the sequence listing with the observations made for each transformant (the "description" column), the observation tissue, the phenotype associated in this way with the transformant and the consequent utility of the inserted nucleotide sequence and of the encoded polypeptide (the "translation" column).

Para alguns dos polinucleotídeos/polipeptídeos da invenção, a listagem de seqüências inclui ainda (em uma seção de "característica variada") uma indicação de dominante(s) identificado(s) importante(s) e a função corres- pondente do domínio ou identificada através da comparação com bancos de dados pfam disponíveis publicamente. TABELA 1

For some of the polynucleotides / polypeptides of the invention, the sequence listing also includes (in a "varied feature" section) an indication of the identified dominant (s) important and the corresponding function of the domain or identified through comparison with publicly available pfam databases. TABLE 1

Partindo dos resultados relatados na Tabela 1 e na Listagem de Seqüências, pode ser observado que os nucleotídeos/polipeptídeos da inven- ção são úteis, dependendo da respectiva seqüência individual, para a obten- ção de plantas com características de crescimento e fenotípicas modificadas, incluindo: a. a. tamanho da planta modulado, incluindo maior e menor altura ou comprimento; b. b. crescimento vegetativo modulado (maior ou menor); c. c. número de órgãos modulado; d. d. maior biomassa; e. e. esterilidade; f. f. letalidade das plantas jovens; g. g. desenvolvimento ou colheita acelerada das plantas de cultivo; h. h. tempo de florescência acelerado; i. i. tempo de florescência retardado; j. j. senescência retardada; k. k. maior tolerância à seca ou ao estresse; l. I. maior clorofila e capacide fotossintética; m. m. maior conteúdo de antocianina; n. n. maior crescimento de raiz e maior captação de nutrientes; o. o. maior ou menor peso ou tamanho da semente, maior conteúdo de carbono ou nitrogênio da semente; p. p. rendimento de semente/fruto modificado, incluindo maior ou maior conteúdo de fruto; q. q. maior folhagem; r. r. utilidade de produzir produtos nutracêuticos/farmacêuticos nas plan- tas; s. s. letalidade da planta; t. t. menor conteúdo de fibras da semente para fornecer maior digestibi- lidade; u. u. aparência ornamental modificada com folhas, flores, coloração ou folhagem modificada; v. v. esterilidade modificada nas plantas; w. w. maior capacidade de crescer na sombra; x. x. maior tolerância ao estresse biótico; y. y. maior tolerância à densidade e a baixo teor de fertilizante; z. z. maior tolerância a pH alto ou baixo, a teores de nitrogênio ou de fosfato baixos ou altos; aa. aa. maior tolerância ao estresse oxidativo; bb. bb. melhor composição química; cc. cc. formato de folha alterado; dd. dd. maior tolerância ao estresse abiótico; ee. ee. maior tolerância ao estresse ao frio; ff. ff. maior teor de amido; gg. gg. número reduzido ou nenhuma semente; hh. hh. maior resistência da planta; ii. ii. comprimento de flor modificado; jj. jj. inflorescências mais longas; kk. kk. teor de fibras na semente modificado; II. II. formato do fruto modificado; mm. mm. composição do fruto modificada; nn. nn. rendimento de semente modificado; oo. oo. arquitetura da planta modificada, tal como quantidade ou ângulo de ramificação modificado, estrutura da folha modificada ou estrutura da se- mente modificada; e pp. pp. maior fuga da sombra. Exemplo 1: Inicial 28 - ME04701 - Clone 1952 - cDNA 13499809 (SEQ ID NO: 90)Based on the results reported in Table 1 and the Sequence List, it can be observed that the nucleotides / polypeptides of the invention are useful, depending on the respective individual sequence, for obtaining plants with modified growth and phenotypic characteristics, including : a. The. modulated plant size, including greater and lesser height or length; B. B. modulated vegetative growth (greater or lesser); ç. ç. modulated number of organs; d. d. greater biomass; and. and. sterility; f. f. lethality of young plants; g. g. development or accelerated harvest of crop plants; H. H. accelerated flowering time; i. i. delayed flowering time; j. j. delayed senescence; k. k. greater tolerance to drought or stress; l. I. greater chlorophyll and photosynthetic capacitance; m. m. higher anthocyanin content; n. n. greater root growth and greater nutrient uptake; The. The. greater or lesser weight or size of the seed, higher content of carbon or nitrogen in the seed; for. for. modified seed / fruit yield, including higher or higher fruit content; q. q. greater foliage; r. r. utility of producing nutraceutical / pharmaceutical products on the plants; s. s. lethality of the plant; t. t. lower seed fiber content to provide greater digestibility; u. u. modified ornamental appearance with leaves, flowers, coloring or modified foliage; v. v. modified plant sterility; w. w. greater ability to grow in the shade; x. x. greater tolerance to biotic stress; y. y. greater tolerance to density and low fertilizer content; z. z. greater tolerance for high or low pH, low or high nitrogen or phosphate content; aa. aa. greater tolerance to oxidative stress; bb. bb. better chemical composition; cc. cc. altered sheet format; dd. dd. greater tolerance to abiotic stress; and is. and is. greater tolerance to cold stress; ff. ff. higher starch content; gg. gg. reduced number or no seed; hh. hh. greater plant resistance; ii. ii. modified flower length; jj. jj. longer inflorescences; kk. kk. fiber content in the modified seed; II. II. modified fruit shape; mm. mm. modified fruit composition; nn. nn. modified seed yield; oo. oo. modified plant architecture, such as modified quantity or angle of branching, modified leaf structure or modified seed structure; and pp. pp. greater shadow escape. Example 1: Initial 28 - ME04701 - Clone 1952 - cDNA 13499809 (SEQ ID NO: 90)

Análise qualitativa das plantas TyQualitative analysis of Ty plants

Todos os 10 dos eventos produziram rosetas com mais folhas e mais inflorescências que o controle. As plantas eram também ligeiramente menores que o controle (Tabela 1-1). O "controle" transgênico era um conjunto de plantas expressando um 35S::cDNA diferente, mas que não podiam ser dis- tinguidas das do tipo selvagem WS não transformadas. Este método de classifi- cação de fenótipos é típico para o projeto de fenotipagem morfológica em grande 5 escala dos presentes inventores. Tabela 1-1: Fenótipos qualitativos observados nos eventos 35S::cDNA 13499809 Ti

All 10 of the events produced rosettes with more leaves and more inflorescences than the control. The plants were also slightly smaller than the control (Table 1-1). The transgenic "control" was a set of plants expressing a different 35S :: cDNA, but which could not be distinguished from untransformed wild type WS. This method of classifying phenotypes is typical for the large-scale morphological phenotyping project of the present inventors. Table 1-1: Qualitative phenotypes observed in 35S events :: cDNA 13499809 Ti

Análise quantitativa das plantas T?:Quantitative analysis of T? Plants:

Os Eventos ME04701-08 e ME04701-09 foram avaliados em 10 maiores detalhes na geração T2. Estes dois eventos foram selecionados porque possuíam os fenótipos mais vantajosos. Dezoito indivíduos foram plantados e observados em relação a ambos os eventos. As plantas trans- gênicas exibiam um maior número de inflorescências em um nível de 0,05 de significância estatística (Tabela 1-2). As plantas T2 não tinham significati- 15 vamente mais folhas que os controles, ao contrário de Tv ME04701-08 tinha florescimento ligeiramente mais tardio que o controle. ME04701-09 tinha ro- setas significativamente maiores que o controle. Todas as plantas citadas na tabela como ME04701-08 e ME04701-09 eram as progénies de segregação da Tf que exibiam o fenótipo de interesse. Todas as plantas citadas na tabe- 20 la como Controle -08 ou -09 eram as progénies de segregação de T2 que não exibiam o fenótipo e não continham o transgene (controles internos; Ta- bela 1-2).Events ME04701-08 and ME04701-09 were evaluated in 10 major details in generation T2. These two events were selected because they had the most advantageous phenotypes. Eighteen individuals were planted and observed for both events. Transgenic plants exhibited a greater number of inflorescences at a 0.05 level of statistical significance (Table 1-2). The T2 plants did not have significantly more leaves than the controls, unlike Tv ME04701-08, they flowered slightly later than the control. ME04701-09 had significantly larger arrows than the control. All plants mentioned in the table as ME04701-08 and ME04701-09 were the Tf segregation progenies that exhibited the phenotype of interest. All plants cited in Table 20 as Control -08 or -09 were T2-secreting progenies that did not exhibit the phenotype and did not contain the transgene (internal controls; Table 1-2).

As freqüências de segregação das plantas em teste sugerem que cada evento contém um único inserto, que é calculado por um teste de 5 Chi-quadrado (Tabela 1-2 e dados não mostrados).The segregation frequencies of the plants under test suggest that each event contains a single insert, which is calculated by a 5 Chi-square test (Table 1-2 and data not shown).

O aumento no número de inflorescências para os dois eventos era muito menor que o aumento observado quando o promotor 35S era utili- zado para expressar este cDNA (dados não mostrados). Esta evidência sus- tenta adicionalmente a hipótese dos presentes inventores de que o grau de 10 expressão/dosagem do produto gênico é altamente relevante para a intensi- dade do fenótipo observado. Utilizando um promotor com um padrão de ex- pressão diferente, foi possível manter o fenótipo positivo do fenótipo de 35S observado anteriormente, enquanto os aspectos negativos de infertilidade observados anteriormente eram removidos. Evidentemente, o proveito que 15 se obtém é diminuir o fenótipo positivo, embora esse fosse significativamen- te mantido. Tabela 1-2: Fenótipos quantitativos observados nos eventos p326F::cDNA 13499809 T2 (PIT = Espessura da Inflorescência Primária)

The increase in the number of inflorescences for the two events was much less than the increase observed when the 35S promoter was used to express this cDNA (data not shown). This evidence further supports the hypothesis of the present inventors that the degree of expression / dosage of the gene product is highly relevant to the intensity of the observed phenotype. Using a promoter with a different expression pattern, it was possible to maintain the positive phenotype of the 35S phenotype observed previously, while the negative aspects of infertility observed previously were removed. Evidently, the advantage that 15 is obtained is to decrease the positive phenotype, although it was significantly maintained. Table 1-2: Quantitative phenotypes observed in events p326F :: cDNA 13499809 T2 (PIT = Thickness of Primary Inflorescence)

DISCUSSÂO/SUMÁRIO DE LEAD:LEAD DISCUSSION / SUMMARY:

A superexpressão de Lead 28/cDNA 13499809 com um promotor adequa- do resulta em um aumento no número de inflorescências. Como este é uma proteína rica em glicina (GRP), há um efeito provável sobre a estrutura da parede celular que afeta a expansão ou a adesão celular, o posiciona- mento diferente de planos celulares e/ou oportunidades diferentes para o início da inflorescência. Seria interessante combinar este gene com o gene 5 que codifica uma proteína desconhecida com um AP2 que também afeta o crescimento e o desenvolvimento da planta. • Este polinucleotídeo/proteína pode ser um especialmente útil para controlar o número/taxa de divisão celular nos meristemas sem perturbar a morfolo- gia geral da planta. Pode ser desenvolvida em plantas de cultivo com um 10 promotor apropriado para regular o tamanho e a taxa de crescimento de muitos órgãos individuais. Tabela 1-3: - Resultados dos Testes de Campo do Tomate

Overexpression of Lead 28 / cDNA 13499809 with a suitable promoter results in an increase in the number of inflorescences. As this is a protein rich in glycine (GRP), there is a likely effect on the cell wall structure that affects cell expansion or adhesion, different positioning of cell planes and / or different opportunities for inflorescence to start. It would be interesting to combine this gene with gene 5 that encodes an unknown protein with an AP2 that also affects plant growth and development. • This polynucleotide / protein can be an especially useful to control the number / rate of cell division in meristems without disturbing the general morphology of the plant. It can be grown on cultivation plants with an appropriate promoter to regulate the size and growth rate of many individual organs. Table 1-3: - Results of Tomato Field Tests

A maior biomassa vegetativa pode fornecer uma proporção de fon- te:escoadouro e uma maior fixação de carbono em sacarose e amido, le- 15 vando a um maior rendimento. • Mais inflorescências fornecem a oportunidade de mais flores e, portanto, mais sementes. A combinação de maior biomassa e número de inflores- cências pode fornecer um aumento significativo no rendimento. Resultados de Testes de Campo do Tomate O Clone 1952 foi transformado no tomate sob o controle do plasm ideo p326. 4 eventos transgênicos independentes foram selecionados para o teste de campo. Os resultados são mostrados na Tabela 1-3 a seguir. Na média, há um aumento no peso total da planta, no peso do fruto e na porcentagem de frutos vermelhos por planta. O evento 4 não exibiu uma me- lhora no desempenho. Se o evento 4 não for considerado na análise, o peso médio da planta, o peso de fruto e a porcentagem de frutos vermelhos au- mentam cada para aproximadamente 115% do controle. Exemplo 2 Lead 29 - ME04717 - Clone 123905 - cDNA 12562634 (SEQ ID NO: 92) • A expressão ectópica do Ceres cDNA 12562634 sob o controle do promotor 326D induz um número de fenótipos incluindo: o Maior número de inflorescências o Continuação da iniciação da folha da roseta após o florescimento para gerar um número de folhas geral maior. • A expressão errada do Ceres cDNA 12562634 pode ser útil para aumentar a ramificação e o número de inflorescências. Isto pode ter um impacto significativo sobre o número de sementes. Análise qualitativa das plantas T,: Utilizando o promotor 326D, 9 dos 10 eventos produziram rose- tas com mais folhas e mais inflorescências que o controle (Tabela 1). Um dos 9 eventos também tinha defeitos de fertilidade, muito parecido com o que foi observado utilizando o 35S::cDNA 12562634. O "controle" transgênico era um conjunto de plantas expressando construtos diferentes de 35S::cDNA e que não podiam ser distinguidas do tipo selvagem WS não transformado. Este método de classificação dos fenótipos é típico para o projeto de fenotipagem morfológica em grande escala dos presentes inventores. Tabela 2-1: Fenótipos qualitativos observados nos eventos p326D::cDNA 12562634 TÍ (2 eventos com os fenótipos mais vantajosos foram escolhidos pa- ra a avaliação de T2)

The largest vegetative biomass can provide a source ratio: drain and a greater carbon fixation in sucrose and starch, leading to a higher yield. • More inflorescences provide the opportunity for more flowers and therefore more seeds. The combination of greater biomass and number of inflorescences can provide a significant increase in yield. Results of Tomato Field Tests Clone 1952 was transformed into tomatoes under the control of plasmid p326. 4 independent transgenic events were selected for the field test. The results are shown in Table 1-3 below. On average, there is an increase in the total weight of the plant, the weight of the fruit and the percentage of red fruits per plant. Event 4 did not show any improvement in performance. If event 4 is not considered in the analysis, the average weight of the plant, the weight of the fruit and the percentage of red fruits each increase to approximately 115% of the control. Example 2 Lead 29 - ME04717 - Clone 123905 - cDNA 12562634 (SEQ ID NO: 92) • The ectopic expression of Ceres cDNA 12562634 under the control of the 326D promoter induces a number of phenotypes including: o Greater number of inflorescences o Continuation of initiation of rosette leaf after flowering to generate a larger overall leaf number. • The wrong expression of Ceres cDNA 12562634 can be useful to increase the branching and the number of inflorescences. This can have a significant impact on the number of seeds. Qualitative analysis of T plants: Using the 326D promoter, 9 out of 10 events produced roses with more leaves and more inflorescences than the control (Table 1). One of the 9 events also had fertility defects, much like what was observed using the 35S :: cDNA 12562634. The transgenic "control" was a set of plants expressing constructs different from 35S :: cDNA and which could not be distinguished from the wild type unprocessed WS. This method of classifying phenotypes is typical for the large-scale morphological phenotyping project of the present inventors. Table 2-1: Qualitative phenotypes observed in events p326D :: cDNA 12562634 TÍ (2 events with the most advantageous phenotypes were chosen for the T2 evaluation)

Análise quantitativa das plantas Tg:Quantitative analysis of Tg plants:

Os Eventos ME04717-03 e ME04717-05 foram avaliados em maiores detalhes na geração T2. Dezoito indivíduos foram plantados e ob- servados em relação a ambos os eventos. As plantas transgênicas exibiam um maior número de inflorescências até um nível de 0,05 de significância estatística. ME04717-03 também tinha rosetas significativamente maiores que o controle. Todas as plantas citadas na Tabela 2-2 como ME04717-03 e ME04717-05 eram as progénies de segregação da T-i que exibiam 0 fenótipo de interesse. Todas as plantas citadas na Tabela 2-2 como Controle -03 ou - 05 eram as progénies de segregação de T2que não exibiam o fenótipo e não continham o transgene (controles internos; Tabela 2-2).Events ME04717-03 and ME04717-05 were evaluated in greater detail in the T2 generation. Eighteen individuals were planted and observed in relation to both events. Transgenic plants exhibited a greater number of inflorescences up to a level of 0.05 of statistical significance. ME04717-03 also had rosettes significantly larger than the control. All plants cited in Table 2-2 as ME04717-03 and ME04717-05 were the T-i segregation progenies that exhibited the phenotype of interest. All plants cited in Table 2-2 as Control -03 or - 05 were T2-secreting progenies that did not exhibit the phenotype and did not contain the transgene (internal controls; Table 2-2).

As freqüências de segregação das plantas em teste sugerem que cada evento contém um único inserto, que é calculado por um teste de chi-quadrado (dados não mostrados).The segregation frequencies of the plants under test suggest that each event contains a single insert, which is calculated by a chi-square test (data not shown).

Deve ser observado que o aumento no número de inflorescên- cias para os eventos documentados abaixo era menor que o aumento ob- servado nos eventos 35S::cDNA 12532634 (dados não mostrados). Outros eventos de p326D::cDNA 12532634 T2, não mostrados neste relato, conti- nham vários insertos. Algumas das progénies de T2 destes eventos conten- do vários insertos exibiam alguns efeitos negativos (defeitos de fertilidade e nanismo) similares às progénies de T2 dos eventos 35S::cDNA 12532634.It should be noted that the increase in the number of inflorescences for the events documented below was less than the increase observed in events 35S :: cDNA 12532634 (data not shown). Other events from p326D :: cDNA 12532634 T2, not shown in this report, contain several inserts. Some of the T2 progenies of these events containing several inserts exhibited some negative effects (defects in fertility and dwarfism) similar to the T2 progenies of the 35S :: cDNA 12532634 events.

Esta evidência sustenta ainda a hipótese dos presentes inventores de que o grau de expressão/dosagem do produto gênico é altamente relevante para a intensidade do fenótipo observado. Utilizando um novo promotor e criando 5 transgênicos com um único inserto, foi possível manter o fenótipo positivo do fenótipo de 35S observado anteriormente, enquanto que os aspectos observados anteriormente eram removidos. Uma conseqüência da realiza- ção desta meta é uma diminuição do grau do fenótipo positivo, embora este fosse mantido em um nível muito significativo. 10 Tabela 2-2: Fenótipos quantitativos observados nos eventos p326D::cDNA 12562634 T2 (PIT = Espessura da Inflorescência Primária)

SUMÁRIO/DISCUSSÃO DO LEAD: ta. Pode ser desenvolvida em plantas de cultivo com um promotor apropri- ado para regular o tamanho e a taxa de crescimento de muitos órgãos indi- viduais. • A maior biomassa vegetativa pode fornecer uma proporção maior de fon- te:escoadouro e uma maior fixação de carbono em sacarose e amido, le- vando a um maior rendimento. • Mais inflorescências fornecem a oportunidade de mais flores e, portanto, mais sementes. A combinação de maior biomassa e número de inflores- cências pode fornecer uma melhora significativa no rendimento.This evidence also supports the hypothesis of the present inventors that the degree of expression / dosage of the gene product is highly relevant to the intensity of the observed phenotype. Using a new promoter and creating 5 transgenics with a single insert, it was possible to maintain the positive phenotype of the 35S phenotype observed previously, while the aspects previously observed were removed. A consequence of the achievement of this goal is a decrease in the degree of the positive phenotype, although it was maintained at a very significant level. 10 Table 2-2: Quantitative phenotypes observed in events p326D :: cDNA 12562634 T2 (PIT = Primary Inflorescence Thickness)

LEAD SUMMARY / DISCUSSION: ta. It can be developed on cultivation plants with an appropriate promoter to regulate the size and growth rate of many individual organs. • The greater vegetative biomass can provide a greater proportion of source: drain and a greater carbon fixation in sucrose and starch, leading to a higher yield. • More inflorescences provide the opportunity for more flowers and therefore more seeds. The combination of greater biomass and number of inflorescences can provide a significant improvement in yield.

Resultados do Teste de Rendimento do TomateResults of the Tomato Yield Test

O Gene 123905 foi também transferido para o tomate sob o controle do promotor p326. 4 eventos transgênicos independentes foram caracterizados no campo. Um número de eventos independentes foi origi- nalmente avaliado e 4 foram selecionados para análise adicional com base na expressão do gene, na presença de um inserto simples e no fenótipo das plantas observado na estufa. Sementes T2 homozigotas foram plantadas no campo em um planejamento em blocos completo aleatório. Cada evento ti- nha uma linhagem de controle correspondente. Os resultados de peso da planta, do peso total de plantas individuais, de peso total do fruto por planta, da porcentagem de frutos vermelhos por planta e do índice de colheita são mostrados na Tabela 2-3 abaixo. Os resultados indicam que os eventos 1 e 21 tinham uma massa de folha substancialmente reduzida enquanto manti- nham rendimentos comparáveis com os dos controles. Assim, seu índice de colheita aumentou. Estes eventos também aumentaram em relação à por- centagem de frutos vermelhos por planta. O evento 14 tinha maior biomassa e rendimento. Tabela 2-3: Resultados do Teste no Campo do Tomate

Gene 123905 was also transferred to tomatoes under the control of the p326 promoter. 4 independent transgenic events were characterized in the field. A number of independent events were originally evaluated and 4 were selected for further analysis based on the expression of the gene, the presence of a simple insert and the phenotype of the plants observed in the greenhouse. T2 homozygous seeds were planted in the field in a complete randomized block design. Each event had a corresponding control line. The results of plant weight, total weight of individual plants, total fruit weight per plant, percentage of red fruits per plant and the harvest index are shown in Table 2-3 below. The results indicate that events 1 and 21 had a substantially reduced leaf mass while maintaining yields comparable to those of the controls. Thus, its harvest rate has increased. These events also increased in relation to the percentage of red fruits per plant. Event 14 had higher biomass and yield. Table 2-3: Test Results in the Tomato Field

Em resumo, as plantas de tomate transformadas com o gene 123905 tendiam a ter mais ramificações e folhas e mais fruto quando compa- radas com a de controle.In summary, tomato plants transformed with the 123905 gene tended to have more branches and leaves and more fruit when compared to the control plant.

Resultados do Teste de Campo do Arroz: 5 O Gene 123905 foi transformado no cultivar de arroz Kitaake sob o controle de p326. Cinco (5) eventos transgênicos independentes foram avaliados no campo em um planejamento em blocos completo aleatório. As características avaliadas eram brotos por planta, dias até o florescimento, ângulo da folha, altura da planta, biomassa em gramas por planta, rendimen- 10 to em gramas por planta e rendimento do canteiro total em gramas, cujos resultados são mostrados abaixo nas Tabelas 2-4, 2-5 e 2-6. Cada evento resultou em um aumento no número de brotos por planta. Tabela 2-4: - Resultados dos Testes de Campo do Arroz

Vários eventos mostraram reduções significativas em relação à 15 altura. O evento 8-3 exibiu um aumento na algura, na biomassa e no rendi- mento em relação ao controle. Embora geralmente menores no rendimento e com estatura significativamente reduzida, o evento 1 e o evento 12 produ- zem biomassa similar a dos controles indicando um aumento na densidade da biomassa em relação a dos controles. Tabela 2-5: Resultados dos Testes de Campo do Arroz

Observações na estatura reduzida no arroz 5 O Gene 123905 foi transformado no cultivar de arroz Kitaake sob o controle de p326. Foram realizadas medidas para determinar quais internodos eram reduzidos em comprimento, em que o internodo I é o inter- nodo mais acima e o internodo V é o internodo mais abaixo. Nos eventos 1, 4 e 12 que possuem estatura significativamente reduzida em relação à do 10 controle, os internodos III e IV são significativamente reduzidos em compri- mento, enquanto os internodos I e II são reduzidos apenas ligeiramente ou de forma alguma. Tabela 2-6: - Resultados dos Testes de Campo do Arroz

Observações na germinação no arroz 15 As linhagens transgênicas 123905-1 e 123905-12-3 germinam 1 até 2 dias mais rápido que a semente do controle Kitaake. Exemplo 3: Lead 36 - ME03195 - Clone 679923 - cDNA 13594332 (SEQ ID O Clone 679923 na biblioteca de cDNA da soja da Ceres, contém o cDNA 13594332, que codifica um fator de transcrição similar ao do gene LEAFY PETIOLE (LEP) de Arabidopsis. Esta seqüência de proteína contém um domínio AP2. O cDNA foi colocado no Ceres Misexpression Pipeline porque foi determi- nado como sendo um suposto ortólogo de um gene conhecido de Arabidopsis (LEP). Análise qualitativa das plantas Ti: Todos os 5 eventos produziram rosetas maiores com folhas ligeiramente enroladas com pouco até nenhum alongamento dos pecíolos e inflorescências muito curtas comparados com os dos controles. Estas plan- tas tinham também um retardo no tempo de florescência em vários dias e não tinham defeitos de fertilidade (Tabela 3-1). O "controle" transgênico era um conjunto de plantas expressando uma fusão 35S::cDNA diferente e que não podiam ser distinguidas do tipo selvagem WS não transformado. Este método de classificação dos fenótipos é típico para o projeto de fenotipagem morfológica em grande escala dos presentes inventores. Após a coleta das sementes, também era evidente que estas plantas produziam um número de sementes significati- vamente maior em relação ao dos mutantes típicos de sua altura. Tabela 3-1: Fenótipos qualitativos observados nos eventos 35S::cDNA 13594332 Ti

Results of the Rice Field Test: 5 Gene 123905 was transformed into the rice cultivar Kitaake under the control of p326. Five (5) independent transgenic events were evaluated in the field in a complete randomized block design. The evaluated characteristics were shoots per plant, days until flowering, leaf angle, plant height, biomass in grams per plant, yield in grams per plant and total bed yield in grams, the results of which are shown below in the Tables 2-4, 2-5 and 2-6. Each event resulted in an increase in the number of shoots per plant. Table 2-4: - Results of Rice Field Tests

Several events have shown significant reductions in relation to height. Event 8-3 showed an increase in cotton, biomass and yield compared to control. Although generally lower in yield and with significantly reduced stature, event 1 and event 12 produce biomass similar to that of the controls, indicating an increase in the density of the biomass in relation to that of the controls. Table 2-5: Results of Rice Field Tests

Observations on reduced stature in rice 5 Gene 123905 was transformed into the rice cultivar Kitaake under the control of p326. Measures were taken to determine which internodes were reduced in length, where internode I is the uppermost internode and internode V is the lower internode. In events 1, 4 and 12, which are significantly reduced in stature compared to the control 10, internodes III and IV are significantly reduced in length, while internodes I and II are reduced only slightly or in no way. Table 2-6: - Results of Rice Field Tests

Observations on germination in rice 15 The transgenic strains 123905-1 and 123905-12-3 germinate 1 to 2 days faster than the seed of the Kitaake control. Example 3: Lead 36 - ME03195 - Clone 679923 - cDNA 13594332 (SEQ ID Clone 679923 in the Ceres soy cDNA library, contains cDNA 13594332, which encodes a transcription factor similar to the LEAFY PETIOLE (LEP) gene in Arabidopsis This protein sequence contains an AP2 domain The cDNA was placed in the Ceres Misexpression Pipeline because it was determined to be an alleged ortholog of a known Arabidopsis (LEP) gene Qualitative analysis of the Ti plants: All 5 events produced rosettes larger with slightly curled leaves with little to no elongation of petioles and very short inflorescences compared to controls, these plants also had a delay in flowering time by several days and had no fertility defects (Table 3-1). The transgenic "control" was a set of plants expressing a different 35S :: cDNA fusion that could not be distinguished from the wild type untransformed WS. This method of classifying phen optimipos is typical for the large-scale morphological phenotyping project of the present inventors. After collecting the seeds, it was also evident that these plants produced a significantly larger number of seeds in relation to the typical mutants of their height. Table 3-1: Qualitative phenotypes observed in 35S events :: cDNA 13594332 Ti

Análise quantitativa das plantas T% A hipótese original formulada partindo das observações de Ti era que as plantas 35S::cDNA podem ter um índice de colheita significativa- mente maior. Os eventos ME03195-02 e ME03195-04 foram avaliados em maiores detalhes na geração T2 para testar esta hipótese. Dezoito indivíduos foram plantados e observados em relação a ambos os eventos. As freqüên- cias de segregação das plantas em teste sugerem que cada evento contém um único inserto, que é calculado através de um teste de chi-quadrado (da- dos não mostrados). Após análises detalhadas de T2, foi determinado o seguinte em relação aos transgênicos (os resultados abaixo são estatisticamente signifi- cativos em um nível de 0,05 ou melhor através do teste-t a não ser que seja citado de outra maneira): • O tempo de florescência (dias para "bolt") era 5-8 dias depois dos con- troles. • O número de folhas da roseta em "bolt" era maior em aproximadamen- te 2,5 folhas. • A área da roseta era 2-3 vezes maior que a dos controles. • A altura era aproximadamente 1/2 da dos controles. • O peso total da semente não era significativamente diferente do dos controles. • O peso seco total da planta era ligeiramente maior para o evento -04 e não era diferente dos controles para o evento -02. • O índice de colheita era ligeiramente menor que o dos controles. • O dobro de sementes era produzido por altura unitária da planta que nos controles.Quantitative analysis of T% plants The original hypothesis based on Ti observations was that 35S :: cDNA plants may have a significantly higher harvest index. Events ME03195-02 and ME03195-04 were evaluated in greater detail in the T2 generation to test this hypothesis. Eighteen individuals were planted and observed for both events. The segregation frequencies of the plants under test suggest that each event contains a single insert, which is calculated using a chi-square test (data not shown). After detailed T2 analysis, the following was determined for transgenics (the results below are statistically significant at a level of 0.05 or better using the t-test unless otherwise stated): • O flowering time (days for "bolt") was 5-8 days after controls. • The number of leaves on the "bolt" rosette was approximately 2.5 leaves higher. • The area of the rosette was 2-3 times larger than that of the controls. • The height was approximately 1/2 that of the controls. • The total seed weight was not significantly different from that of the controls. • The total dry weight of the plant was slightly higher for the -04 event and was no different from the controls for the -02 event. • The harvest rate was slightly lower than that of the controls. • Double the number of seeds was produced per unit height of the plant than in the controls.

Os detalhes podem ser encontrados nas Tabelas 3-2 e 3-3. Tabela 3-2: Fenótipos quantitativos observados nos eventos p35S::cDNA 13594332 T2

Tabela 3-3: Fenótipos quantitativos observados nos eventos p35S::cDNA 13594332 T2

Cada um dos eventos -02 e -04 tinha três plantas T2 que exibi- am uma forma muito mais grave do fenótipo descrito anteriormente. Estas plantas tinham florescimento prematuro ("bolting") gravemente mais tarde, tinham pouco alongamento das inflorescências e eram quase estéreis. Par- tindo de outros experimentos utilizando estas linhagens de plantas (dados não mostrados), foi determinado que o fenótipo prejudicial é causado por um efeito de dosagem/inserto homozigoto, sugerindo que as plantas he- mi/heterozigotas forneciam uma característica benéfica de maior produção de sementes por altura unitária, mas que as linhagens homozigotas forneci- am o fenótipo negativo. As análises estatísticas dos presentes inventores comparavam os controles internos com as plantas que continham o transge- ne e o fenótipo benéfico. Todas as plantas contendo o transgene com o fe- nótipo prejudicial foram omitidas das análises estatísticas nas Tabelas 3-2 e 3-3. Exemplo 4: ME04012 - Gemini ID 5000F6 (SEQ ID NO: 109) ME04012 contém um clone genômico que codifica um suposto Citocromo P450. A linhagem de planta ME04012 estava sendo analisada em relação à tolerância à seca quando foi observado que 15/20 plantas no even- to -03 exibiam um fenótipo de arquitetura da planta. 6/15 eram uma versão mais fraca exibindo apenas um caule ondulado. 9/15 eram fortes e exibiam um caule ondulado, menor altura e menor ramificação e ângulos do pedicelo. Exemplo 5: Lead 15 - ME04077 - Clone 92459 - cDNA 12561537 (SEQ ID NO: 80) O Clone 92459 na biblioteca de cDNA de Arabidopsis da Ceres, contém o cDNA 12561537, que codifica MADS Affecting Flowering 1 (MAF1) de Arabidopsis. O cDNA foi colocado no Ceres Misexpression Pipeline porque é um fator de transcrição. Os fatores de transcrição são de interesse particular por- que podem afetar muitos genes simultaneamente e, portanto, possuem uma maior probabilidade de produzir um fenótipo alterado em Arabidopsis quando superexpressos. • A expressão ectópica do Ceres cDNA 12561537 sob o controle do promo- tor 35S induz um número de fenótipos incluindo: o Plantas mais altas o Inflorescências mais densas o Rosetas maiores o Maior número de folhas na roseta o Florescimento retardado • A expressão errada do Ceres cDNA 12561537 pode ser útil para aumentar o tamanho/biomassa geral da planta. Análise qualitativa das plantas Ti: Todos os dez eventos tinham florescência tardia, produziam rosetas maiores com mais folhas e inflorescências densas altas comparadas com as dos controles (Tabela 5-1). O “controle" transgênico era um conjunto de plantas diferentes expressando 35S::cDNA que não podiam ser distinguidas do tipo selvagem WS não transformado. Este método de classificação dos fenótipos é típico para o projeto de fenotipagem morfológica em grande escala dos presen- tes inventores. Tabela 5-1: Fenótipos qualitativos observados nos eventos 35S::cDNA 12561537 Ti

Details can be found in Tables 3-2 and 3-3. Table 3-2: Quantitative phenotypes observed in p35S events :: cDNA 13594332 T2

Table 3-3: Quantitative phenotypes observed in p35S events :: cDNA 13594332 T2

Each of the -02 and -04 events had three T2 plants that exhibited a much more severe form of the previously described phenotype. These plants had severely premature flowering ("bolting") later, had little elongation of inflorescences and were almost sterile. From other experiments using these plant strains (data not shown), it was determined that the harmful phenotype is caused by a homozygous dosing / insert effect, suggesting that heme / heterozygous plants provided a beneficial feature of greater production of seeds per unit height, but that homozygous strains provided the negative phenotype. The statistical analyzes of the present inventors compared the internal controls with the plants that contained the transgenic and the beneficial phenotype. All plants containing the transgene with the harmful phenotype were omitted from the statistical analyzes in Tables 3-2 and 3-3. Example 4: ME04012 - Gemini ID 5000F6 (SEQ ID NO: 109) ME04012 contains a genomic clone that encodes an alleged Cytochrome P450. The ME04012 plant line was being analyzed for drought tolerance when it was observed that 15/20 plants in the -03 event exhibited a plant architectural phenotype. 6/15 were a weaker version exhibiting only a wavy stem. 9/15 were strong and exhibited a wavy stem, less height and less ramification and pedicle angles. Example 5: Lead 15 - ME04077 - Clone 92459 - cDNA 12561537 (SEQ ID NO: 80) Clone 92459 in the Ceres Arabidopsis cDNA library, contains the 12561537 cDNA, which codes for Arabidopsis MADS Affecting Flowering 1 (MAF1). The cDNA was placed in the Ceres Misexpression Pipeline because it is a transcription factor. Transcription factors are of particular interest because they can affect many genes simultaneously and, therefore, are more likely to produce an altered phenotype in Arabidopsis when overexpressed. • Ceres cDNA 12561537 ectopic expression under the control of the 35S promoter induces a number of phenotypes including: o Taller plants o Dense inflorescences o Larger rosettes o Greater number of leaves in the rosette o Delayed flowering • Ceres wrong expression cDNA 12561537 may be useful to increase the overall size / biomass of the plant. Qualitative analysis of the Ti plants: All ten events had late flowering, produced larger rosettes with more leaves and high dense inflorescences compared to the controls (Table 5-1). The transgenic “control” was a set of different plants expressing 35S :: cDNA that could not be distinguished from the wild type untransformed WS. This method of classifying phenotypes is typical for the large-scale morphological phenotyping project of the present inventors Table 5-1: Qualitative phenotypes observed in 35S events :: cDNA 12561537 Ti

Análise quantitativa das plantas T?:Quantitative analysis of T? Plants:

Os eventos ME04077-06 e ME04077-10 foram avaliados em maiores detalhes na geração T2. Dezoito indivíduos foram plantados e ob- servados em relação ao evento 06, enquanto 17 indivíduos foram plantados e observados em relação ao evento 10. As plantas transgênicas para ambos os eventos exibiam maior espessura da inflorescência primária, maior núme- ro de folhas da roseta, uma roseta maior e um retardo no tempo de flores- cência em um nível de 0,05 de significância estatística (Tabela 5-2). As plan- tas de ambos os eventos eram visivelmente muito mais altas que as dos controles, mas apenas o evento -10 era quantitativamente mais alto em um nível de 0,05 de significância estatística através do teste t. Se um número maior de controles internos estivesse disponível para o evento -06, este e- vento muito provavelmente se encaixaria sob o mesmo grau de significância através do mesmo teste. Ambos os eventos tinham fertilidade normal. Todas as plantas citadas na Tabela como ME04077-06 e ME04077-10 eram as progénies de segregação do evento Ti que foi confirmado como contendo o transgene em teste. Todas as plantas citadas na Tabela como Controle -06 ou Controle -10 eram as progénies de segregação de T2que não continham o transgene em teste (controles internos).The ME04077-06 and ME04077-10 events were evaluated in greater detail in the T2 generation. Eighteen individuals were planted and observed in relation to event 06, while 17 individuals were planted and observed in relation to event 10. The transgenic plants for both events exhibited greater thickness of primary inflorescence, greater number of rosette leaves, a larger rosette and a delay in flowering time at a level of 0.05 of statistical significance (Table 5-2). The plants for both events were noticeably much higher than those for the controls, but only the -10 event was quantitatively higher at a 0.05 level of statistical significance using the t-test. If a greater number of internal controls were available for the -06 event, this e-wind would most likely fit under the same degree of significance through the same test. Both events had normal fertility. All plants cited in the Table as ME04077-06 and ME04077-10 were the segregation progenies of the Ti event which was confirmed to contain the test transgene. All plants cited in the Table as Control -06 or Control -10 were T2-secreting progenies that did not contain the test transgene (internal controls).

Ambos os eventos produzem significativamente mais sementes que o controle, como seria esperado para uma planta com florescência tar- dia fértil típica.Both events produce significantly more seeds than the control, as would be expected for a typical fertile late flowering plant.

O evento ME04077-06 tinha 12 plantas contendo o transgene que exibiam o fenótipo benéfico e 3 plantas contendo o transgene que pare- ciam ser do tipo selvagem (estas três foram omitidas das análises estatísti- cas na Tabela 5-2). O evento ME04077-10 tinha 9 plantas contendo trans- gene que exibiam o fenótipo benéfico e 1 planta contendo o transgene que parecia ser do tipo selvagem. As análises estatísticas dos presentes invento- 5 res comparavam os controles internos com as plantas com o fenótipo bené- fico que continham o transgene.Event ME04077-06 had 12 plants containing the transgene that exhibited the beneficial phenotype and 3 plants containing the transgene that appeared to be wild type (these three were omitted from the statistical analyzes in Table 5-2). Event ME04077-10 had 9 plants containing transgenes that exhibited the beneficial phenotype and 1 plant containing the transgene that appeared to be wild type. The statistical analyzes of the present inventors compared the internal controls with the plants with the beneficial phenotype that contained the transgene.

As freqüências de segregação do transgene em teste sugerem que cada evento contém um único inserto, que é calculado por um teste de Chi-quadrado. As sementes de T2 segregam 3R:1S para ambos os eventos 10 (dados não mostrados). Tabela 5-2: Fenótipos quantitativos observados nos eventos 35S::cDNA 12561537 T2

SUMÁRIO/DISCUSSÂO DO LEAD: vando a um maior rendimento. • Inflorescências mais altas fornecem a oportunidade de mais flores e, por- tanto, mais sementes. A combinação de maior biomassa e estatura da inflo- rescência pode fornecer um aumento significativo no rendimento. • Inflorescências mais densas podem prevenir contra "ruptura" pelo vento, chuva ou seca. • A vantagem de biomassa e a vantagem de fotossíntese presumida devem ser úteis no milho e na soja. • Este gene/proteína pode ser um especialmente útil para o controle do nú- mero/taxa de divisão celular nos meristemas sem perturbar a morfologia geral da planta. Pode ser desenvolvida em plantas de cultivo com um pro- motor apropriado para regular o tamanho e a taxa de crescimento de mui- tos órgãos individuais. A proteína pode ser útil para criar caules mais robus- tos no milho e prevenir contra a "ruptura". Resultados de Teste no Campo do Tomate Este Lead 15 (clone 92459) foi transformado no tomate sob o controle do plasmídeo p13879. 1 evento transgênico foi selecionado para o teste no campo. Este evento mostra um aumento na biomassa, como mos- trado abaixo nos resultados da Tabela 5-3. Tabela 5-3: Resultados do Teste de Campo do Tomate

Exemplo 6: Determinação de Seqüências Homólogas Funcionais As seqüências "Lead", como descrito anteriormente nos Exem- plos 1 - 5, são utilizadas para a identificação de homólogos funcionais das seqüências iniciais ("lead") e, junto com tais seqüências, são utilizados para determinar uma seqüência consenso para um certo grupo de seqüências inicial e de homólogos funcionais.The frequencies of segregation of the transgene under test suggest that each event contains a single insert, which is calculated by a Chi-square test. T2 seeds secrete 3R: 1S for both events 10 (data not shown). Table 5-2: Quantitative phenotypes observed in 35S events :: cDNA 12561537 T2

SUMMARY / DISCUSSION OF LEAD: leading to greater performance. • Higher inflorescences provide the opportunity for more flowers and therefore more seeds. The combination of greater biomass and height of inflorescence can provide a significant increase in yield. • Dense inflorescences can prevent "rupture" by wind, rain or drought. • The biomass advantage and the presumed photosynthesis advantage should be useful in corn and soy. • This gene / protein can be especially useful for controlling the number / rate of cell division in meristems without disturbing the general morphology of the plant. It can be developed in cultivation plants with an appropriate promoter to regulate the size and growth rate of many individual organs. The protein can be useful to create more robust stems in corn and prevent "breakage". Tomato Field Test Results This Lead 15 (clone 92459) was transformed into the tomato under the control of plasmid p13879. 1 transgenic event was selected for the field test. This event shows an increase in biomass, as shown below in the results in Table 5-3. Table 5-3: Tomato Field Test Results

Example 6: Determination of Functional Homologous Sequences The "Lead" sequences, as previously described in Examples 1 - 5, are used to identify functional homologues of the initial sequences ("lead") and, together with such sequences, are used to determine a consensus sequence for a certain group of initial sequences and functional counterparts.

Uma seqüência de objetivo ("subject") é considerada um homó- logo funcional de uma seqüência de busca se as seqüências de objetivo e de busca codificarem proteínas que possuem uma função e/ou uma ativida- de similar. Um processo conhecido como Reciprocal BLAST (Rivera e ou- tros, Proc.Natl Acad. Sei. USA, 1998, 95: 6239-6244) é utilizado para a iden- tificação de seqüências homólogas funcionais potenciais partindo de bancos de dados consistindo em todas as seqüências peptídicas disponíveis publi- camente e de propriedade, incluindo NR do NCBI e as traduções de peptí- deos dos clones da Ceres.An objective sequence ("subject") is considered a functional homologue of a search sequence if the objective and search sequences encode proteins that have a similar function and / or activity. A process known as Reciprocal BLAST (Rivera et al., Proc.Natl Acad. Sei. USA, 1998, 95: 6239-6244) is used to identify potential functional homologous sequences from databases consisting of all the publicly available and proprietary peptide sequences, including NR from the NCBI and the peptide translations from the Ceres clones.

Antes de começar um processo de Reciprocal BLAST, um poli- peptideo de busca específico é verificado contra todos os peptídeos de suas espécies de fonte utilizando BLAST com a finalidade de identificar polipeptí- deos que possuem identidade de seqüência de 80% ou maior com o polipep- tideo de busca e um comprimento do alinhamento de 85% ou maior ao longo da seqüência mais curta no alinhamento. O polipeptideo de busca e quais- quer dos polipeptídeos identificados mencionados anteriormente são deno- minados como um "cluster". O processo principal de Reciprocal BLAST consiste em duas rodadas de buscas com BLAST; busca para frente e busca para trás. Na etapa de busca para frente, uma seqüência polipeptídica de busca, "polipep- tideo A", da espécie de fonte SA é submetida ao BLAST contra todas as se- qüências de proteínas de uma espécie de interesse. As coincidências princi- pais são determinadas utilizando uma faixa de valor de E de 10'5 e uma faixa de identidade de 35%. Entre as coincidências principais, a seqüência que possui o vaior de E mais baixo é denominada como a melhor coincidência e considerada um homólogo funcional potencial. Qualquer outra coincidência principal que tenha uma identidade de seqüência de 80% ou maior com a melhor coincidência ou com o polipeptídeo de busca original é considerada também um homólogo funcional potencial. Este processo é repetido para todas as espécies de interesse.Before starting a Reciprocal BLAST process, a specific search polypeptide is checked against all peptides from its source species using BLAST in order to identify polypeptides that have a sequence identity of 80% or greater with the polypeptide. - search engine and an alignment length of 85% or greater along the shortest alignment sequence. The search polypeptide and any of the identified polypeptides mentioned above are called a "cluster". The main process of Reciprocal BLAST consists of two rounds of searches with BLAST; search forward and search backward. In the forward search stage, a polypeptide search sequence, "polypeptide A", from the source species SA is submitted to BLAST against all protein sequences of a species of interest. The main matches are determined using a 10'5 E value range and a 35% identity range. Among the main coincidences, the sequence with the lowest E value is called the best coincidence and is considered a potential functional counterpart. Any other major match that has a sequence identity of 80% or greater with the best match or with the original search polypeptide is also considered a potential functional homolog. This process is repeated for all species of interest.

Na rodada de busca para trás, as coincidências principais iden- tificadas na busca para frente de todas as espécies são utilizadas para reali- zar uma busca de BLAST contra todas as seqüências de proteínas ou poli- peptídicas da espécie de fonte SA. Uma coincidência principal proveniente da busca para frente que retornou um polipeptídeo do "cluster" mencionado anteriormente como a melhor coincidência também é considerada como um homólogo funcional potencial.In the backward search round, the main coincidences identified in the forward search for all species are used to perform a BLAST search against all protein or polypeptide sequences of the SA source species. A major match from the forward search that returned a polypeptide from the "cluster" mentioned earlier as the best match is also considered to be a potential functional homolog.

Os homólogos funcionais são identificados através de inspeção manual das seqüências homólogas funcionais potenciais. Os homólogos funcionais representativos são mostrados nas figuras 1-5. Cada figura re- presenta um grupo de seqüência inicial/busca alinhada com as seqüências de objetivo homólogas funcionais identificadas correspondentes. As seqüên- cias inicial e suas seqüências homólogas funcionais correspondentes são alinhadas para a identificação de aminoácidos conservados e para a deter- minação de uma seqüência consenso que contém um resíduo de aminoáci- do que ocorre freqüentemente em posições particulares nas seqüências ali- nhadas, como mostrado nas figuras 1-5.Functional homologues are identified through manual inspection of potential functional homologous sequences. Representative functional counterparts are shown in figures 1-5. Each figure represents an initial sequence / search group aligned with the corresponding identified functional homologous objective sequences. The initial sequences and their corresponding functional homologous sequences are aligned for the identification of conserved amino acids and for the determination of a consensus sequence that contains an amino acid residue that frequently occurs in particular positions in the aligned sequences, such as shown in figures 1-5.

Cada seqüência consenso é então compreendida das regiões ou dos domínios identificados e conservados numerados, com algumas das regiões conservadas sendo separadas por um ou mais resíduos de aminoá- cidos, representados por um traço (-), entre as regiões conservadas.Each consensus sequence is then comprised of the regions or domains identified and numbered conserved, with some of the conserved regions being separated by one or more amino acid residues, represented by a dash (-), between the conserved regions.

Os polipeptídeos úteis da invenção, portanto, incluem cada uma das seqüências inicial e homólogas funcionais mostradas nas figuras 1-5, assim como as seqüências consenso mostradas em tais figuras. A invenção abrange também outros polipeptídeos úteis construídos com base na seqüência con- senso e nas regiões conservadas identificadas. Assim, os polipeptídeos úteis incluem aqueles que compreendem uma ou mais das regiões conservadas numeradas em cada tabela de alinhamento em uma figura individual represen- tada nas figuras 1-5, em que as regiões conservadas podem ser separadas por traços. Os polipeptídeos úteis incluem ainda aqueles que compreendem todas as regiões conservadas numeradas em uma tabela de alinhamento individual selecionada das figuras 1-5, compreendendo alternativamente todas as regiões conservadas numeradas em uma tabela de alinhamento individual e na ordem que é apresentada em uma tabela de alinhamento individual selecionada das figuras 1-5. Os polipeptídeos úteis também incluem aqueles que compreendem todas das regiões conservadas numeradas em uma tabela de alinhamento indi- vidual e na ordem que é apresentada em uma tabela de alinhamento individual selecionada das figuras 1-5, em que as regiões conservadas são separadas por traços, em que cada traço entre duas regiões conservadas adjacentes é com- preendido dos aminoácidos apresentados na tabela de alinhamento para as seqüências inicial e/ou homólogas funcionais nas posições que definem o traço particular. Tais traços na seqüência consenso podem ter um comprimento que varia do comprimento do menor número de traços em uma das seqüências ali- nhadas até o comprimento do maior número de traços em uma das seqüências alinhadas.The useful polypeptides of the invention, therefore, include each of the initial and functional homologous sequences shown in figures 1-5, as well as the consensus sequences shown in such figures. The invention also encompasses other useful polypeptides constructed on the basis of the consensus sequence and the identified conserved regions. Thus, useful polypeptides include those that comprise one or more of the conserved regions numbered in each alignment table in an individual figure represented in figures 1-5, in which the conserved regions can be separated by dashes. Useful polypeptides further include those that comprise all conserved regions numbered in an individual alignment table selected from figures 1-5, alternatively comprising all conserved regions numbered in an individual alignment table and in the order that is presented in an alignment table selected from figures 1-5. Useful polypeptides also include those that comprise all of the conserved regions numbered in an individual alignment table and in the order that is presented in an individual alignment table selected from figures 1-5, in which the conserved regions are separated by dashes, where each trait between two adjacent conserved regions is comprised of the amino acids shown in the alignment table for the initial and / or functional homologous sequences at the positions that define the particular trait. Such strokes in the consensus sequence may have a length that varies from the length of the smallest number of strokes in one of the aligned strings to the length of the largest number of strokes in one of the aligned strings.

Tais polipeptídeos úteis podem também ter um comprimento (um número total de resíduos de aminoácidos) igual ao comprimento identifi- cado para uma seqüência consenso ou um comprimento que varia da se- qüência mais curta até a mais longa em qualquer família fornecida de se- qüências inicial e homólogas funcionais identificadas em uma tabela de ali- nhamento individual selecionada das figuras 1-5.Such useful polypeptides may also have a length (a total number of amino acid residues) equal to the length identified for a consensus sequence or a length that ranges from the shortest to the longest sequence in any given sequence family. initial and functional counterparts identified in an individual alignment table selected from figures 1-5.

A presente invenção abrange ainda nucleotídeos que codificam os polipeptídeos descritos anteriormente, assim como os complementos dos mesmos e incluindo alternativas dos mesmos com base na degeneração do código genético.The present invention also covers nucleotides that encode the polypeptides described above, as well as their complements and including alternatives thereof based on the degeneracy of the genetic code.

A invenção sendo descrita dessa maneira, será evidente para um versado na técnica que várias modificações dos materiais e dos métodos para a prática da invenção podem ser feitas. Tais modificações devem ser consideradas dentro do âmbito da invenção que é definido pelas reivindica- ções em anexo.The invention being described in this way, it will be apparent to one skilled in the art that various modifications of the materials and methods for practicing the invention can be made. Such modifications must be considered within the scope of the invention which is defined by the appended claims.

Cada uma das referências da literatura de patentes e de perió- dicos citadas aqui é expressamente incorporada aqui em sua totalidade a- través de tal citação. REFERÊNCIAS (1) Zhang e outros (2004) Plant Physiol. 135:615. (2) Salomon e outros (1984) EMBO J. 3:141. Herrera-Estrella e outros (1983) EMBOJ. 2:987. (4) Escudero e outros (1996) Plant J. 10:355. (5) Ishida e outros (1996) Nature Biotechnology 14:745. (6) May e outros (1995) Bio/Technology 13:486) (7) Armaleo e outros (1990) Current Genetics 17:97. (8) Smith. T.F. e Waterman, M.S. (1981) Adv. App. Math. 2:482. (9) Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443. (10) Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 2444. (11) Yamauchi e outros (1996) Plant Mol Biol. 30:321 -9. (12) Xu e outros (1995) Plant Mol. Biol. 27:237. (13) Yamamoto e outros (1991) Plant Cell 3:371. (14) P. Tijessen, "Hybridization with Nucleic Acid Probes" Em Labo- ratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, P.C. vand der Vliet, ed., c. 1993 by Elsevier, Amsterdã. (15) Bonner e outros, (1973) J. Mol. Biol. 81:123. (16) Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Nova York. (17) Shizuya e outros (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 8794- 8797. (18) Hamilton e outros (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 9975- 9979. (19) Burke e outros (1987) Science, 236:806-812. (20) Sternberg N. e outros (1990) Proc Natl Acad Sci USA., 87:103- 7. Bradshaw e outros (1995) Nucl Acids Res, 23: 4850-4856. Frischauf e outros (1983) J. Mol Biol, 170: 827-842. Huynh e outros, Glover NM (ed) DNA Cloning: A practical Ap- proach, Vol.1 Oxford: IRL Press (1985). Walden e outros (1990) Mol Cell Biol 1: 175-194. Vissenberg e outros (2005) Plant Cell Physiol 46:192. Husebye e outros (2002) Plant Physiol 128:1180. Plesch e outros (2001) Plant J 28:455. Weising e outros (1988) Ann. Rev. Genet., 22:421. Christou (1995) Euphytica, v. 85, n.1-3:13-27. Newell (2000) Griesbach (1987) Plant Sci. 50:69-77. Fromm e outros (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5824. Paszkowski e outros (1984) EMBOJ. 3:2717. Klein e outros (1987) Nature 327:773. Willmitzer, L. (1993) Transgenic Plants. Em: iotechnology, A Multi- Volume Comprehensive treatise (H.J. Rehm, G. Reed, A. Püler, P. Stadler, eds., Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel- Cambridge). Cnt. Rev. Plant. Sci. 4:1-46. Fromm e outros (1990) Biotechnology 8:833-844. Cho e outros (2000) Planta 210:195-204. Braizghaerts e outros (2005) Nature 433:629-633. Lincoln e outros (1998) Plant Mol. Biol. Rep. 16:1-4. Lacomme e outros (2001), "Genetically Engineered Viruses" (C.J.A. Ring e E.D. Blair, Eds). Pp. 59-99, BIOS Scientific Publi- shers, Ltd. Oxford, UK.Each of the references in the patent and periodical literature cited here is expressly incorporated here in its entirety through such a quote. REFERENCES (1) Zhang et al. (2004) Plant Physiol. 135: 615. (2) Salomon et al. (1984) EMBO J. 3: 141. Herrera-Estrella et al. (1983) EMBOJ. 2: 987. (4) Escudero et al. (1996) Plant J. 10: 355. (5) Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 745. (6) May et al (1995) Bio / Technology 13: 486) (7) Armaleo et al (1990) Current Genetics 17:97. (8) Smith. T.F. and Waterman, M.S. (1981) Adv. App. Math. 2: 482. (9) Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443. (10) Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 2444. (11) Yamauchi et al. (1996) Plant Mol Biol. 30: 321-9. (12) Xu et al. (1995) Plant Mol. Biol. 27: 237. (13) Yamamoto et al. (1991) Plant Cell 3: 371. (14) P. Tijessen, "Hybridization with Nucleic Acid Probes" In Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, P.C. vand der Vliet, ed., C. 1993 by Elsevier, Amsterdam. (15) Bonner et al., (1973) J. Mol. Biol. 81: 123. (16) Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, New York. (17) Shizuya et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 8794-7979. (18) Hamilton et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 9975-9979. (19) Burke et al. (1987) Science, 236: 806-812. (20) Sternberg N. et al (1990) Proc Natl Acad Sci USA., 87: 103- 7. Bradshaw et al (1995) Nucl Acids Res, 23: 4850-4856. Frischauf et al. (1983) J. Mol Biol, 170: 827-842. Huynh et al., Glover NM (ed) DNA Cloning: A practical Approach, Vol.1 Oxford: IRL Press (1985). Walden et al (1990) Mol Cell Biol 1: 175-194. Vissenberg et al. (2005) Plant Cell Physiol 46: 192. Husebye et al. (2002) Plant Physiol 128: 1180. Plesch et al. (2001) Plant J 28: 455. 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Claims

1. Processo de aumento do número de inflorescências caracterizado pelo fato de que o dito processo compreende a introdução em uma célula vegetal de uma molécula de ácido nucléico que compreende uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 92, ou uma sequência de nucleotídeos que codifica as mesmas sequências de aminoácido codificadas pela SEQ ID NO: 92; em que a molécula de ácido nucléico está operacionalmente ligada a uma região reguladora heteróloga; e em que a expressão ectópica da molécula de ácido nucléico em uma planta aumenta o número de inflorescências em relação a uma planta controle na qual a sequência de nucleotídeo não é ectopicamente expressa.1. Process of increasing the number of inflorescences characterized by the fact that said process comprises the introduction into a plant cell of a nucleic acid molecule comprising a sequence of nucleotides according to SEQ ID NO: 92, or a sequence of nucleotides that encode the same amino acid sequences encoded by SEQ ID NO: 92; wherein the nucleic acid molecule is operably linked to a heterologous regulatory region; and in which the ectopic expression of the nucleic acid molecule in a plant increases the number of inflorescences in relation to a control plant in which the nucleotide sequence is not ectopically expressed.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita região reguladora é um promotor selecionado do grupo que consiste em YP0092 (SEQ ID NO: 38), PT0676 (SEQ ID NO: 12), PT0708 (SEQ ID NO: 17), PT0613 (SEQ ID NO: 5), PT0672 (SEQ ID NO: 11), PT0678 (SEQ ID NO: 13), PT0688 (SEQ ID NO: 15), PT0837 (SEQ ID NO: 24), do promotor da "napins", do promotor da Arcelina-5, do promotor do gene da faseolina, do promotor do inibidor da tripsina da soja, do promotor de ACP, do gene da estearoil- ACP dessaturase, da subunidade α' do promotor da β- conglicinina da soja, do promotor da oleosina, do promotor da zeína de 15 kD, do promotor da zeína de 16 kD, do promotor da zeína de 19 kD, do promotor da zeína de 22 kD, do promotor da zeína de 27 kD, do promotor de Osgt-1, do promotor do gene da beta-amilase e do promotor do gene da hordeína da cevada.2. Process according to claim 1, characterized by the fact that said regulatory region is a promoter selected from the group consisting of YP0092 (SEQ ID NO: 38), PT0676 (SEQ ID NO: 12), PT0708 (SEQ ID NO: 17), PT0613 (SEQ ID NO: 5), PT0672 (SEQ ID NO: 11), PT0678 (SEQ ID NO: 13), PT0688 (SEQ ID NO: 15), PT0837 (SEQ ID NO: 24), the "napins" promoter, the Arcelin-5 promoter, the phaseolin gene promoter, the soy trypsin inhibitor promoter, the ACP promoter, the stearoyl-ACP desaturase gene, the α 'subunit of the β- soybean conglycinin, oleosin promoter, 15 kD zein promoter, 16 kD zein promoter, 19 kD zein promoter, 22 kD zein promoter, 27 kD zein promoter , the Osgt-1 promoter, the beta-amylase gene promoter and the barley hordein gene promoter.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita região reguladora é um promotor selecionado do grupo que consiste em p326 (SEO ID NO: 76), YP0144 (SEQ ID NO: 55), YP0190 (SEQ ID NO: 59), p13879 (SEQ ID NO: 75), YP0050 (SEQ ID NO: 35), p32449 (SEQ ID NO: 77), 21876 (SEQ ID NO: 1), YP0158 (SEQ ID NO: 57), YP0214 (SEQ ID NO: 61), YP0380 (SEQ ID NO: 70), PT0848 (SEQ ID NO: 26) e PT633 (SEQ ID NO: 7), do promotor 35S do vírus mosaico da couve-flor (CaMV), do promotor da manopina sintase (MAS), dos promotores 1' ou 2' derivados do T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, do promotor 34S do vírus mosaico da escrofulária, dos promotores da actina tais como o promotor da actina do arroz e dos promotores da ubiquitina tais como o promotor da ubiquitina-1 do milho.3. Process according to claim 1, characterized by the fact that said regulatory region is a promoter selected from the group consisting of p326 (SEO ID NO: 76), YP0144 (SEQ ID NO: 55), YP0190 (SEQ ID NO: 59), p13879 (SEQ ID NO: 75), YP0050 (SEQ ID NO: 35), p32449 (SEQ ID NO: 77), 21876 (SEQ ID NO: 1), YP0158 (SEQ ID NO: 57), YP0214 (SEQ ID NO: 61), YP0380 (SEQ ID NO: 70), PT0848 (SEQ ID NO: 26) and PT633 (SEQ ID NO: 7), from the 35S promoter of the cauliflower mosaic virus (CaMV), the manopin synthase (MAS) promoter, the 1 'or 2' promoters derived from the Agrobacterium tumefaciens T-DNA, the 34S promoter of the scrofular mosaic virus, the actin promoters such as the rice actin promoter and the promoters of rice ubiquitin such as the corn ubiquitin-1 promoter.

4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita região reguladora é um promotor selecionado do grupo que consiste nos promotores da ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase (RbcS) tal como o promotor RbcS do lariço oriental (Larix laricina), o promotor cab6 de pinheiro, o promotor do gene Cab-1 do trigo, o promotor CAB-1 do espinafre, do promotor cab1R do arroz, do promotor da piruvato ortofosfato diquinase (PPDK) do milho, do promotor Lhcb1*2 do tabaco, do promotor do simportador de sacarose-H+ SUC2 de Arabidopsis thaliana e dos promotores da proteína de membrana tilacóide do espinafre (psaD, psaF, psaE, PC, FNR, atpC, atpD, cab, rbcS, PT0535 (SEQ ID NO: 3), PT0668 (SEQ ID NO: 2), PT0886 (SEQ ID NO: 29), PR0924 (SEQ ID NO: 78), YP0144 (SEQ ID NO: 55), YP0380 (SEQ ID NO: 70) e PT0585 (SEQ ID NO: 4).4. Process according to claim 1, characterized by the fact that said regulatory region is a promoter selected from the group consisting of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase (RbcS) promoters such as the RbcS promoter of the eastern larch ( Larix laricina), the pine cab6 promoter, the wheat Cab-1 gene promoter, the spinach CAB-1 promoter, the rice cab1R promoter, the corn pyruvate orthophosphate dichinase (PPDK) promoter, the Lhcb1 * promoter 2 from tobacco, from the Arabidopsis thaliana sucrose-H + SUC2 promoter and from the spinach thylakoid membrane protein promoters (psaD, psaF, psaE, PC, FNR, atpC, atpD, cab, rbcS, PT0535 (SEQ ID NO : 3), PT0668 (SEQ ID NO: 2), PT0886 (SEQ ID NO: 29), PR0924 (SEQ ID NO: 78), YP0144 (SEQ ID NO: 55), YP0380 (SEQ ID NO: 70) and PT0585 (SEQ ID NO: 4).

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos que codifica as mesmas sequências de aminoácidos codificadas pela SEQ ID NO: 92 compreende sequências de nucleotídeos degeneradas da SEQ ID NO: 92.Process according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the nucleotide sequence encoding the same amino acid sequences encoded by SEQ ID NO: 92 comprises degenerate nucleotide sequences from SEQ ID NO: 92.