BRPI0509217B1

BRPI0509217B1 - Derivados de oligossacarídeo alginato, seu uso e seu processo de preparação, e composição farmacêutica

Info

Publication number: BRPI0509217B1
Application number: BRPI0509217-5A
Authority: BR
Inventors: Meiyu Geng; Xianliang Xin; Guangqiang Sun; Guan Huashi; Yang Zhao
Original assignee: Ocean University Of China
Priority date: 2004-03-24
Filing date: 2005-02-25
Publication date: 2020-09-24
Also published as: EA200601756A1; US8835403B2; US20070254848A1; EP1736160A1; MA28971B1; EP1736160B1; BRPI0509217A; US10213456B2; ES2552218T3; AU2005223923A1; US20150105344A1; KR100844918B1; WO2005089776A1; BRPI0509217A8; NO341226B1; EA011417B1; NO20064825L; CA2561873A1; PL1736160T3; ZA200608813B

Abstract

derivados de oligossacarídeo alginato, processo para preparação dos mesmos, uso e composição farmacêutica. o presente estudo fornece um oligossacarídeo alginato e seus derivados com grau de polimerização variando de 2 a 22. o oligossacarídeo alginato é composto de ácido manurônico ligado a ácido (beta)-d-manurônico por ligações glicídicas 1,4. os derivados com terminal reduzido na posição 1 do radical carboxila pode ser preparado por degradação oxidativa. o presente estudo também fornece um processo para preparar o oligossacarídeo alginato e seus derivados, que inclui os procedimentos em que uma solução de alginato é reagida por 2 a 6 h em um autoclave a ph 2-6 e temperatura de 100-120°c, e o ph é ajustado para 7 após a reação ser interrompida, após o que o oligossacarídeo resultante é oxidado na presença de um oxidante para obter um produto da degradação oxidativa. o oligossacarídeo alginato e seus derivados deste método podem ser usados na manufatura de um medicamente para a profilaxia e tratamento de ad e diabetes.

Description

DERIVADOS DE OLIGOSSACARÍDEO ALGINATO, SEU USO E SEU PROCESSO DE PREPARAÇÃO, E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA

Campo Técnico

[0001] Oligossacarídeo alginato. A presente constatação está relacionada a um oligossacarídeo alginato e seus derivados, sua preparação, e seu uso no tratamento do Mal de Alzheimer (AD) e diabetes.

Antecedentes da Técnica

[0002] MD e diabetes são atualmente enfermidades comuns e de alta prevalência que ameaçam seriamente a saúde dos seres humanos. Sua incidência vem crescendo com o aumento da população de idosos. Portanto a profilaxia e o tratamento dessas enfermidades se fazem cada vez mais urgentes.

[0003] As atuais drogas para prevenção e cura para o AD dificilmente virão a revolucionar o tratamento do AD devido à sua limitação como meros aliviadores de sintomas e seus severos efeitos colaterais. As drogas comumente usadas para o diabetes são principalmente a insulina e os anti-hiperglicemiantes orais, muitos dos quais trazem desvantagens como uso inconveniente e toxicidade. Em particular, não existe droga eficaz para o tratamento do diabetes tipo 2. Foi constatado que a ocorrência do AD e do diabetes tipo 2 está relacionada à deposição de beta-amilóide (ßA) e amilina (IAAP), com subseqüente fibrinogênese e aumento dos radicais livres, o que traz à tona o fato de que o beta-amilóide e a amilina se tornam alvo para a profilaxia e tratamento dessas doenças.

[0004] β-D-manurônico Alginatos, principal componente da parede celular das algas marrons, são ânions polissacarídeos lineares compostos de ácido β-D-manurônico (ManA) e ácido α-L-glucorônico (GulA) conectados por 1-4 ligações glicídicas. O Alginato faz parte dos alto-polímeros com um peso molecular maior que 104 a 106 de fontes abundantes. O alginato tem sido amplamente aplicado na indústria alimentícia, engenharia química, medicina,etc. Estudos recentes têm revelado que o alginato tem diversas bioatividades. No entanto, suas aplicações como uma droga está, até certo ponto, limitada pelo seu grande peso molecular. Portanto, o oligossacarídeo degradado do alginato por diversos métodos é altamente valioso para o estudo da química e biologia dos glicossacarídeos, bem como para o desenvolvimento de drogas baseadas em sacarídeos. Os métodos para degradar o alginato incluem degradação enzimática, química e física, contudo, a necessidade de enzimas específicas torna limitada a aplicação de degradação enzimática. A degradação física, normalmente utilizada em conjunto com outros métodos, dificilmente consegue fornecer oligossacarídeos com peso molecular menor de 50.000Da. A degradação química utilizada nos polissacarídeos inclui hidrólise ácida e degradação oxidativa. A hidrólise ácida está limitada em sua capacidade a conseguir oligossacarídeos com peso molecular de 4000 ou menos, quando conduzida sob condições normais de temperatura e pressão.

Descrição da Invenção

[0005] Através de estudos profundos dos pesquisadores, com o intuito de resolver os problemas acima descritos, constatatou-se que um oligossacarídeo alginato com peso molecular de 4000 ou menos pode ser obtido por hidrólise ácida em alta temperatura e sob alta pressão, e seus derivados cujo terminal reduzido na posição 1 seja um radical carboxila pode ser preparado na presença de oxidantes. A constatação acima é a base desse novo método.

[0006] O presente método fornece um oligossacarídeo alginato e seus derivados com baixo peso molecular, ou sais farmaceuticamente aceitáveis, e provê um método para produção dos mesmos. Fornece também um medicamento para a profilaxia e tratamento do AD e diabetes compreendendo o oligossacarídeo alginato de baixo peso molecular ou sais farmaceuticamente aceitáveis dele derivados acima mencionados.

[0007] O presente método se refere a um oligossacarídeo alginato de baixo peso molecular ou sais farmaceuticamente aceitáveis dele derivados. O oligossacarídeo mencionado é composto de ácido β-D-manurônico conectado por ligações glicídicas α-1,4,

onde “n” representa 0 ou qualquer inteiro entre 1 e 19.

[0008] No presente método, um exemplo de derivado do oligossacarídeo alginato acima é um composto representado pela fórmula (II), na qual o terminal reduzido na posição um é um radical carboxila,

onde “n” representa 0 ou qualquer inteiro entre 0 e 19.

[0009] Na fórmulas (I) e (II) acima, n está preferencialmente entre 2 e 10, e mais preferencialmente ainda entre 4 e 8. A razão pela qual os efeitos biológicos de tetrassacarídeos a dodecassacarídeos (preferencialmente hexassacarídeos a decassacarídeos) são melhores ainda não está bem clara, o que pode ser devido por sua propensão a ser reconhecido e aceito pelas células.

[00010] Os derivados do polissacarídeo alginato também incluem, por exemplo, os derivados nos quais uma parte dos grupos hidroxila no ácido manurônico são sulfatados.

[00011] Os sais farmaceuticamente aceitáveis do oligossacarídeo alginato e derivados acima descritos podem ser, por exemplo, sais de sódio, potássio, cálcio, magnésio e similares. Os sais de sódio são preferidos. Os sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser preparados por métodos convencionais.

[00012] A presente invenção também se refere a um processo para preparar o alginato oligossacarídeo e derivados acima descritos, que se caracteriza pelo fato de que uma solução de alginato é posta para reagir por cerca de 2 a 6h em uma autoclave em pH 2-6 e temperatura de cerca de 100-120°C; após a qual o valor do pH é reajustado para cerca de 7. O produto da degradação oxidativa é obtido pela adição de um oxidante à solução de oligossacarídeo alginato.

[00013] Em uma preparação preferencial do método, uma solução aquosa a 0,5~5% de alginato sódico é aquecida por quatro horas em uma autoclave a pH 4 e temperatura de 110°C. Após completada a reação, o reagente é aspirado e resfriado, então o pH é ajustado a 7 pela adição de uma Solução NaOH. Mantendo uma agitação, o filtrado é lentamente despejado em álcool industrial com 4 vezes o volume do filtrado e repousa por um dia para permitir a precipitação. O precipitado no álcool é filtrado com aspiração até secar, e é desidratado com etanol absoluto. Um bolo de filtro branco é obtido e seco em um forno a 60°C para formar um alginato polissacarídeo bruto. O alginato oligossacarídeo bruto é formulado a uma solução a 10%, e precipitado com uma solução de 95% de etanol. O precipitado é lavado com etanol absoluto, seco e formulado a uma solução a 5%. A solução é filtrada através de um filme a 3μm para remover impurezas, e então dessalinizado em uma coluna Bio-Gel-P6 (1,6×180) com NH4HCO3 0,2mol/L como fase móvel e o produto é coletado em etapas múltiplas. O extrato do lavado é medido pelo método sulfato-carbazol. Os componentes, incluindo sacarídeos, são coletados, concentrados sob pressão reduzida e dessalinizados, e finalmente liofilizados para fornecer o oligossacarídeo alginato.

[00014] A preparação dos derivados representados na fórmula (II) se faz da seguinte maneira: Após a solução de alginato acima ser reagida por 2 a 6h em uma autoclave a pH 2~6 em temperatura de 100~120°C, um oxidante é adicionado para reagir durante 15min a 2h ainda em temperatura de 100~120°C. Na manufatura do método, 25 mL de sulfato de cobre a 5% é adicionado a 50 mL de NaOH (aq) a 10%, misturado imediatamente e logo completado com 40 mL da solução de oligossacarídeo alginato. A mistura resultante é aquecida em banho-maria até não restar nenhum pó vermelho precipitado. A mistura é centrifugada para remover os precipitados. Algum sobrenadante é retirado e adicionado a álcool industrial que deve ter 4 vezes o volume do sobrenadante e repousa por um dia para permitir precipitação. O precipitado é filtrado por aspiração até secar, desidratado repetidamente com etanol absoluto, e seco em um forno a 60°C. A separação se procede de acordo com o mesmo método do oligossacarídeo da fórmula (I).

[00015] A invenção também fornece uma composição farmacêutica contendo uma quantidade eficaz de tal oligossacarídeo alginato ou seus derivados ou de sais farmaceuticamente aceitáveis formados a partir deles, bem como veículos farmaceuticamente aceitáveis.

[00016] A composição farmacêutica pode ser usada como um medicamento para profilaxia e tratamento do AD.

[00017] Além do mais, a composição farmacêutica pode ser usada também como um inibidor da formação de fibras protéicas β-amilóticas e promover desagregação dessas fibras.

[00018] A composição farmacêutica também pode ser um medicamento para a profilaxia e tratamento do diabetes.

[00019] Ainda mais, a composição farmacêutica pode ser usada como um inibidor de formação de fibras e inibidor de polipeptídeos nas ilhotas pancreáticas. Tendo em vista a atual dificuldade relacionada à falta de drogas eficazes para a profilaxia e tratamento do AD e diabetes, é especialmente importante que o oligossacarídeo alginato da presente invenção seja utilizado na fabricação de um medicamento para a profilaxia e tratamento de AD e diabetes.

Descrição dos Desenhos

[00020] A figura 1 mostra a curva de eluição do oligossacarídeo alginato de acordo com a presente invenção separada por uma coluna Bio-Gel-P6 após hidrólise ácida.

[00021] A figura 2 mostra o espectro MALDI-TOF do oligossacarídeo alginato de acordo com a presente invenção.

[00022] A figura 3 mostra a curva de eluição do produto da oxidação oxidativa do oligossacarídeo alginato separado por uma coluna Bio-Gel-P6.

[00023] A figura 4 mostra o espectro MALDI-TOF do produto da degradação oxidativa do oligossacarídeo alginato (modo positivo).

[00024] A figura 5 mostra o efeito do oligossacarídeo alginato, de acordo com a presente invenção sobre, a latência de AD induzida por Aβ1-40 em camundongos.

[00025] A figura 6 mostra o efeito do oligossacarídeo alginato, de acordo com a presente invenção, no número de erros dos camundongos com AD induzido por Aβ1-40.

[00026] A figura 7 mostra os efeitos protetores do oligossacarídeo alginato, de acordo com a presente invenção, em células SH-SY5Y afetadas por Aβ1-40.

[00027] A figura 8 mostra os efeitos protetores do oligossacarídeo alginato, de acordo com a presente invenção, em células SH-SY5Y afetadas por Aβ1-40

[00028] A figura 9 mostra os efeitos inibidores do oligossacarídeo alginato, de acordo com a presente invenção, na formação normal e heparina-induzida de fibrina da Aβ1-40.

[00029] A figura 10 mostra o efeito desestabilizador do oligossacarídeo alginato, de acordo com a presente invenção, em fibrina Αβ1-40.

[00030] A figura 11 mostra os efeitos do oligossacarídeo alginato, de acordo com a presente invenção, na conformação de solução Αβ1-40 a 250μg/mL.

[00031] A figura 12 mostra os efeitos do oligossacarídeo alginato, de acordo com a presente invenção, em células NIT afetadas por IAAP.

[00032] A figura 13 mostra o efeito da mistura do produto da degradação oxidativa do alginato oligossacarídeo, de acordo com a presente invenção, na latência de camundongos com AD induzida ou Aβ1-40 testada com o labirinto de água de Morris.

[00033] A figura 14 mostra o efeito da mistura do produto da degradação oxidativa do alginato oligossacarídeo, de acordo com a presente invenção, na distância nadada de camundongos com AD induzida ou Aβ1-40 testada com o labirinto de água de Morris.

[00034] A figura 15 mostra o efeito da mistura do produto da degradação oxidativa do alginato oligossacarídeo, de acordo com a presente invenção, no primeiro tempo de chegada à base original de camundongos com AD induzida ou Aβ1-40 testada com o labirinto de água de Morris.

[00035] A figura 16 mostra o efeito da mistura do produto da degradação oxidativa do alginato oligossacarídeo, de acordo com a presente invenção, no número de cruzamentos da primeira base de camundongos com AD induzida ou Aβ1-40 testada com o labirinto de água de Morris.

[00036] A figura 17 mostra os efeitos protetores da mistura do produto da degradação oxidativa do alginato oligossacarídeo, de acordo com a presente invenção, em células NIT afetadas por IAAP.

Concretizações 1 Preparação do oligossacarídeo alginato

[00037] Adiciona-se 1g de sódio polimananuronato (peso molecular médio de 8,235Da, fornecido por Lantai Pharm LTD, Ocean University of China) à água destilada formando uma solução a 1%, com pH 4 ajustado por HCl, colocado em uma autoclave e aquecido a 110°C por 4h. Após o resfriamento, ajusta-se o pH da solução para 7 com NaOH (aq.). Revolvendo-o, o filtrado é lentamente despejado em álcool industrial que deve ter 4 vezes o volume do filtrado e repousa por um dia para precipitar. O precipitado no álcool é filtrado por aspiração até secar, e é desidratado por lavagem com etanol absoluto. Um bolo branco de filtrado é obtido e secado em um forno a 60°C para fornecer um oligossacarídeo alginato cru.

[00038] O alginato oligossacarídeo cru é formulado a uma solução a 10%, e precipitado com uma solução de 95% de etanol. O precipitado é lavado com etanol absoluto, seco e formulado a uma solução a 5%. A solução é filtrada através de um filme a 3μm para remover impurezas, e então dessalinizado em uma coluna Bio-Gel-P6 (1,6×180cm) com NH4HCO3 0,2mol/L como fase móvel e o produto é coletado em etapas múltiplas. O extrato do lavado é medido pelo método sulfato-carbazol e os componentes, incluindo sacarídeos, são coletados, concentrados sob pressão reduzida em uma coluna G-10. O componente do volume exterior é posteriormente separado por uma coluna Bio-Gel-P10 (1.6x180cm) e liofilizados para fornecer uma série de oligossacarídeos alginatos (figura 1).

2 Preparo do produto da degradação oxidativa do oligossacarídeo alginato

[00039] Formulam-se 5g do oligossacarídeo alginato acima preparado em uma solução a 5%. Adicionam-se 25 mL de sulfato de cobre a 5% a 50 mL de NaOH (aq) a 10%, misturado imediatamente e logo completado com 40 mL de solução de oligossacarídeo alginato. A mistura resultante é aquecida em banho-maria até não restar nenhum pó vermelho precipitado. A mistura é centrifugada para remover os precipitados. Algum sobrenadante é retirado e adicionado a uma solução de NaOH (aq.) a 10% e sulfato de cobre a 5% de acordo com a razão acima para checar se existe pó vermelho precipitado. Se negativo, o sobrenadante é adicionado a álcool industrial que deve ter 4 vezes o volume do sobrenadante e repousa por um dia para permitir precipitação. O precipitado é filtrado por aspiração até secar, desidratado repetidamente com etanol absoluto, e seco em um forno a 60°C. Dessa maneira, um produto bruto do oligossacarídeo alginato é obtido.

[00040] O alginato oligossacarídeo bruto é formulado a uma solução a 10%, e precipitado com uma solução de 95% de etanol. O precipitado é lavado com etanol absoluto, seco e formulado a uma solução a 5%. A solução é filtrada através de um filme a 3μm para remover impurezas, e então dessalinizado em uma coluna Bio-Gel-P6 (1,6x180) com NH4HCO3 0,2mol/L como fase móvel e o produto é coletado em passos múltiplos. O extrato do lavado é medido pelo método sulfato-carbazol. Os componentes, incluindo sacarídeos, são coletados, concentrados sob pressão reduzida e dessalinizados em uma coluna G-10. O componente do volume exterior posteriormente é separado por uma coluna G-10 e liofilizados para fornecer uma série de produtos da degradação oxidativa (figura 2).

3. Identificação da estrutura do oligossacarídeo alginato

[00041] A estrutura dos oligossacarídeos contidas na fração obtida pela preparação do oligossacarídeo alginato estão identificadas. Está confirmado que esses oligossacarídeos são compostos de ácido β-D-manurônico ligados por ligações glicídicas 1,4. A fórmula estrutural é:

onde n representa 0 ou qualquer inteiro entre 1 e 19.

[00042] Daqui para a frente, a fração que está a cerca de 292 mL do lavado (a fração etiquetada como “6” na figura 1, daqui por diante denominada Componente 6) será tomada como exemplo para ilustrar a análise estrutural dos oligossacarídeos acima.

3.1 Espectrograma de absorção ultravioleta

[00043] A fração do oligossacarídeo a cerca 292 mL do lavado é diluída para uma concentração, e escaneada a 190-400nm com um espectrofotômetro UV-2102 UV-VIS. Constatatou-se que não houve nenhum pico de absorção específica na região de ultravioleta, indicando que a estrutura é livre de ligações duplas conjugadas. No entanto, picos de absorção não específicos aparecem a 190~200nm. Dessa forma, durante a dessalinização do oligossacarídeo, ele pode ser detectado on-line na região ultravioleta acima.

3.2 análise do espectro infravermelho

[00044] Pesa-se 0,5mg do oligossacarídeo infravermelho é determinado com o espectrômetro infravermelho inteligente NEXUS-470 com esferas KBr. Os picos a 3420.79 cm-1, 3214.64 cm-1, e 2924.61 cm-1 são atribuíveis à alongamento simétrico das vibrações do grupo hidroxila; o pico a 1600.25 cm-1 é atribuível ao alongamento simétrico das vibrações do grupo carbonila do carboxilato; o pico a 1406.54 cm-1 é atribuído à deformação assimétrica da vibração do grupo hidroxila; o pico a 1146.42 cm-1 é atribuível ao alongamento simétrico das vibrações da ligação C-O do grupo carboxila; o pico a 1045.77 cm-1 é atribuível ao alongamento assimétrico das vibrações do éter anidro; e o pico a 804.02 cm-1 é atribuível ao alongamento assimétrico das vibrações do esqueleto cíclico do ácido manurônico. Está indicado que tal composto contém grupo carboxila, grupo hidroxila e esqueleto cíclico do ácido manurônico.

3.3 Análise de EM

[00045] A análise de EM é realizada com espectrômetro de massa BIFLEX II tipo MALDI-TOF (Bruker Daltonics Co.). Como visto pelo espectro (figura 2, tabela 1), o pico de m/z 1073.9 é o pico iônico molecular [M-H]-1; o pico de m/z 1096.6 é [M+Na-2H]-1; o pico de m/z 1028.0 é [M-H2O-CO-H]-1; o pico de m/z 821.2 é [M-ManA-CH2O-2H2O-H]-1; m/z 704.3 é [M-2ManA-H2O-H]-1; m/z 634.4 é [M-2ManA-2(CH2O)-CO-H]-1; o pico de m/z 536.5 é [M-2H]2-; e o pico de m/z 357.4 é [M-3H]3-. No espectro ESI-MS da fração oligossacarídica acima, O pico iônico molecular é m/z 1073.9, indicando que seu peso molecular é 1074.

3.4 Espectrografia de ressonância nuclear magnética do oligossacarídeo alginato.

[00046] RMN 1H e RMN 13C do oligossacarídeo alginato representado pela fórmula (I) (n=4) são obtidos através do espectrômetro JNM-ECP600 RMN. Os resultados são vistosa nas tabelas 2 e 3.

[00047] De acordo com o resultado da análise acima, Confirma-se que o oligossacarídeo alginato nas frações acima é um hexassacarídeo manurônico com a seguinte estrutura (Ia):

3.5 Determinação do conteúdo do ácido manurônico no oligossacarídeo alginato (espectroscopia RMN-1H)

[00048] A composição do oligossacarídeo alginato é determinada por RMN- 1H de alta-resolução para quantificar a razão entre ácido manurônico e ácido hialurônico (M/G) no oligossacarídeo alginato de acordo com a intensidade do sinal do próton de carbono anomérico. Pesam-se 3 a 5 mg de amostra seca, dissolve-se em D2O a pD neutro e adiciona-se 0.3 mg de EDTA. A amostra é determinada por espectrômetro Bruker DPX-300 RMN. O espectro é relatado a 70°C, de forma que o pico de D2O esteja longe da região de ressonância protônica anomérica. O sinal de intensidade relativa é expresso pela integral da área de pico. Os resultados indicam que sinais H-1 do radical M aparecem a 4.64 ppm e 4.66 ppm (a saber, sinais H-1 do radical M em sequências MM e MG, respectivamente); todos os sinais H-1 radical G aparecem a 5.05 ppm (pico duplo). O conteúdo relativo de M e G na amostra pode ser expresso pela intensidade de seus respectivos picos H-1, segundo a seguinte equação:

na qual, I representa a intensidade de pico, expressa pela integral da área de pico.

[00049] O conteúdo relativo de ácido D-manurônico na amosta é 98,07% pelo método acima, indicando que o oligossacarídeo alginato é composto principalmente por ácido manurônico.

4 Identificação da estrutura do produto da degradação oxidativa do oligossacarídeo alginato

[00050] A estrutura do oligossacarídeo produto da degradação oxidativa na fração obtida pela preparação do produto da degradação oxidativa do oligossacarídeo alginato foi identificada. Está confirmado que o produto da degradação oxidativa é um derivado do oligossacarídeo alginato composto de ácido β-D-manurônico ligado por ligações glicídicas 1,4, nas quais o terminal reduzido na posição 1 é um radical carboxila. A fórmula estrutural é:

em que n representa 0 ou qualquer inteiro entre 0 e 19.

[00051] O componente 6 é tomado como exemplo para ilustrar a análise da estrutura dos oligossacarídeos produtos da degradação oxidativa acima.

4.1 Espectrograma de absorção ultravioleta

[00052] Uma quantidade apropriada de produto da degradação oxidativa é diluída em uma certa concentração com água destilada,e escaneada com um espectrofotômetro Shimdzu UV-260 UV (190nm~700nm) em comprimento de onda total. Não aparece nenhum pico de absorção específico nas regiões de luz visível ou ultravioleta.

4.2 Análise do espectro infravermelho

[00053] O espectro infravermelho do produto da degradação oxidativa do oligossacarídeo alginato é determinado pelo espectrômetro infravermelho inteligente NICOLE NEXUS-470. Os resultados são apresentados na tabela 4.e 4.

4.3 Análise de RMN-1H

[00054] Os espectros RMN-1H e RMN-13C do produto da degradação oxidativa são obtidos em um espectrômetro RMN Bruker Auance DPX-300. Como visto no espectro RMN-1H, é formado principalmente pelos sinais de seis átomos de hidrogênio no ácido β-D-manurônico.
Após o padrão de acoplamento de cada sinal ser atribuído, encontra-se que o produto da degradação oxidativa do oligossacarídeo alginato é formado principalmente de ácido manurônico. Se o terminal reduzido na posição 1 é grupo aldeído, mudanças químicas de H-1 α e H-1 β deveriam ser 5,11 ppm e 4,81 ppm, respectivamente. Como o terminal reduzido na posição 1 do oligossacarídeo alginato é oxidado a grupo carboxila desde grupo aldeído, H-1 desaparece, portanto, sinais a 5,11 ppm e 4,81 ppm desaparecem. Como visto no espectro RMN-13C, ele é formado principalmente de sinais de seis átomos de carbono no ácido β-D-manurônico. Após o padrão de acoplamento de cada sinal ser atribuído, encontra-se que a molécula intermediaria é formada principalmente de ácido manurônico. Comparado com o espectro do intermediário, o sinal do terminal reduzido C-1 do ácido manurônico (94 ppm) desaparece. O sinal do terminal reduzido C-1 (175.81 ppm) muda em direção ao campo baixo. A razão disso é que o terminal reduzido na posição 1 do oligossacarídeo alginato é oxidado a grupo carboxila desde grupo aldeído e mudança química de C-1 é modificada de cerca de 94 ppm do grupo aldeído para 175,81 ppm do grupo carboxila.

4.4 Análise EM

[00055] Análise EM é realizada com um espectrômetro de massa BIFLEX III tipo MALDI-TOF (Bruker Daltonics Co.). Os resultados são apresentados na figura 4. Como visto na figura 4, o pico de m/z 1113.7 é [M+Na]+1; o pico de m/z 1113.7 é [M-O+Na]+1; o pico de m/z 1083.7 é [M-CH2O+Na]+1; o pico de m/z 1067.6 é [M -CH2O-O +Na]+1; o pico de m/z 1053.6 é [M-2(CH2O)+Na]+1; o pico de m/z 979.6 é [M-3(CH2O)-CO2+Na]+1; e o pico de m/z 921.6 é [M-4(CH2O)-CO2-CO+Na]+1. A análise EM do produto da degradação oxidativa do oligossacarídeo alginato é demonstrado na tabela 5.
Tabela 5 análise EM do produto da degradação oxidativa do oligossacarídeo alginato

[00056] No espectro MALDI-TOF do produto da degradação oxidativa do oligossacarídeo alginato, o pico de m/z 1113.7 é [M+Na]+1, indicando que o peso molecular do produto da degradação oxidativa do oligossacarídeo alginato é 1090.7. O peso molecular aumentou dezesseis comparado com o do oligossacarídeo alginato hidrolisado por ácido (M=1075), isto é, um átomo de oxigênio é adicionado à molécula, do que se pode considerar que o oligossacarídeo alginato é oxidado durante a preparação.

[00057] De acordo com os resultados da análise acima, a estrutura do produto da degradação oxidativa do oligossacarídeo alginato é a fórmula (IIa):

5 Avaliação do oligossacarídeo alginato no mal de Alzheimer (AD)

[00058] Um 6-mero separado com coluna Bio-Gel-P6 é usado como um exemplo para mostrar sua atividade. Logo, o oligossacarídeo alginato será referido como “6-mero” nos experimentos seguintes.

5.1 Efeitos do 6-mero em Camundongos com AD induzida por Aß1-40

[00059] Camundongos machos Balb/c (18-22g, adquiridos do Laboratório Central da Universidade Shandong) foram pesados e randomicamente divididos em seis grupos da seguinte maneira: Um grupo controle, um grupo modelo, um grupo tratado com baixa concentração (15 mg/kg) de 6-mero, um grupo tratado com média concentração (30 mg/kg) de 6-mero, um grupo tratado com alta concentração (60 mg/kg) de 6-mero, e um grupo tratado com Huperzine A (HBY, com concentração de 0.2mg/kg). Os camundongos receberam administração oral da droga correspondente no dia 3 pós-agrupamento. As drogas foram administradas uma vez ao dia consecutivamente com uma dosagem de 0.5 mL/20g até o experimento ser completado. Os camundongos dos grupos controle e modelo foram receberam simultaneamente uma quantidade equivalente de solução salina fisiológica.

[00060] No 8° dia após a administração das drogas, os camundongos foram injetados com Αβ1-40 envelhecido, exceto o grupo veículo, como método de referência (Jhoo JH et al.'β-amyloid (1-42)-induced learning e memory deficits in camundongos: involvement of oxidative burdens in the hippocamppus e cerebral cortex. Behavioural Brain Research (2004) 155: 185-196) para grupos controle e modelo a induzir o modelo de AD. Uma solução de Αβ1-40 envelhecido foi injetado no ventrículo cerebral direito. Os resultados das tentativas de aquisição testados com o labirinto de água de evidenciam que camundongos tratados com Α-β apresentam uma latência de escape mais longa (P<0,05, P<0,01), comparados com os grupos controle e modelo, indicando que o modelo de camundongos com AD foi estabelecido (figura 6). Contudo, no 1° dia de teste, esta latência de escape alongada é encurtada em todos os grupos tratados com droga, exceto no grupo tratado com 6-mero 15mg/kg. A latência de escape do grupo tratado com 6-mero 60mg/kg teve significância estatística comparado com o grupo modelo (P<0.05). Nos 2° e 3° dias de teste, a latência de escape de todos os grupos tratados com drogas encurtou, dos quais os grupos tratados com 6-mero 60mg/kg e HBY tiveram significância estatística comparado com o grupo modelo (P<0,05).

#p<0,05, ##p<0,01 vs controle; *p<0.05 vs modelo

[00061] No 4° dia do teste do labirinto de água de Morris, a plataforma original foi removida e o percentual de tempo que os camundongos ficavam na fase da plataforma original dentro de 60s foi anotada. Os resultados demonstram que os camundongos no grupo modelo exibiam menor bias de latência muito inferior ao grupo controle (P<0,05), e a bias da latência se elevava significativamente após a administração de 6-mero comparando com o grupo modelo (P<0,05) (tabela 7).

# P < 0,05 vs controle; * P < 0,05 vs modelo

[00062] No 25° dia após a injeção de Αβ, os camundongos foram treinados para tarefas de esquiva passiva por passo. Na tarefa, cada camundongo, é colocado no compartimento iluminado do aparelho, olhando para fora do compartimento escuro, e a porta foi aberta, permitindo acesso ao compartimento escuro. Uma vez que o camundongo entra no compartimento escuro, ele recebe um eletrochoque inescapável nas patas (36V) através de uma grade de aço inoxidável no assoalho. O teste é similarmente realizado após 24h. A entrada de cada camundongo na câmara escura (latência por passo, teste máximo limitado a 3min) e o número de entradas no compartimento escuro (número de erros) foi anotado.

[00063] Os resultados da tarefa de esquiva passiva por etapa estão demonstrados na figuras 5 e 6. Cada grupo tinha 8 animais. Os dados foram apresentados como média±SE. O símbolo # significa diferença comparada com o grupo controle (P<0,05). * significa diferença significativa comparada com o grupo modelo (P<0,05). A latência por etapa dos grupos tratados com Aβ1-40 foi encurtada (P<0,01) e o número de erros aumentou (P<0.05) comparando com o do grupo controle, indicando o estabelecimento bem-sucedido de camundongos com AD. Contudo, a latência por etapa foi significativamente prolongada em grupos tratados com 30 e 60mg/kg de 6-mero e HBY, e o número de erros foi significativamente reduzido em grupos tratados com 30 e 60mg/kg de 6-mero e HBY, indicando que o 6-mero tem função de melhorar significativamente o aprendizado e atividade de memória em modelos induzidos por Aβ1-40.

Efeito do 6-mero nos indicadores bioquímicos cerebrais de camundongos com induzidos por Aβ

[00064] Após o teste de comportamento, os ratos foram decapitados. O córtex Cerebral e o hipocampo foram dissecados imediatamente em gelo, e preservados a -80°C após congelamento rápido em nitrogênio líquido por 1 hora. MDA, SOD, GSH-PX, Na+, K+-ATPase, AchE e atividade CHAT nas regiões cerebrais foram determinadas usando kits respectivos. Os homogenatos de córtex cerebral e hipocampo foram preparados com solução salina com a uma concentração final de 10% e 5%. Os sobrenadantes foram obtidos após centrifugação a 3600rpm para testar MDA, CuZn-SOD, GSH-PX, Na+K+-ATPase, AchE, e atividade CHAT. A atividade de ChAT foi determinado com método de isótopo etiquetado. Os outros índices e quantidade total de proteínas foram testados com seus respectivos kits fornecidos pelo Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute.

(1) Efeitos do 6-mero na atividade ChAT em camundongos com AD

[00065] A atividade ChAT no córtex cerebral foi diminuída marcadamente após tratamento com Ap, ao comparar com o grupo controle (p<0,05). Contudo, sua atividade aumentou após o tratamento com 6-mero e HBY, onde efeitos curativos de 6-mero a 30 mg/kg e 60mg/kg e HBY tiveram significância estatística (tabela 8).

# P < 0,05 vs controle; *P < 0,05, ** P < 0,01 vs modelo

(2) Efeito do 6-mero na atividade SOD camundongos com AD

[00066] A atividade SOD no cérebro é diminuída após o tratamento com Ap, mas não tem significância estatística ao comparar com o grupo controle. Sua atividade é significantemente aumentada no córtex cerebral e hipocampo após tratamento com 6-mero em uma dosagem de 60mg/kg, indicando que o mecanismo de efeito do 6-mero no AD está relacionado ao melhoramento da atividade antioxidante (tabela 9).

* P < 0,05 vs modelo

(3) Efeitos do 6-mero no conteúdo de MDA de camundongos com AD

[00067] O conteúdo de MDA no córtex cerebral e hipocampo não tem no diferença significante ao comparar com o grupo controle. Seu conteúdo diminui no cérebro após o tratamento de HBY e 6-mero na dosagem de 30 mg/kg e 60mg/kg, indicando que eles não melhoraram a resposta a oxidação ou danos de radicais livres no cérebro e proteger o cérebro de danos oxidativos (tabela 10).

* P < 0,05, ** P < 0,01 vs modelo

(4) Efeitos do 6-mero na atividade de GSH-PX de camundongos com AD

[00068] A atividade de GSH-PX no córtex cerebral e hipocampo diminui após uso de Aβ com diferença significante ao grupo controle in hipocampo(p < 0.05). Sua atividade aumenta no córtex cerebral após o tratamento de 6-mero, onde a atividade é significativamente diferente após o tratamento do oligossacarídeo alginato na dosagem de 60mg/kg e HBY (p < 0.05). Os resultados são apresentados in tabela 11.

#P < 0,05 vs controle; * P < 0,05 vs modelo

(5) Efeitos de 6-mero na atividade de Na+, K+-ATPase de camundongos com AD

[00069] A atividade de Na+, K+-ATPase no córtex cerebral e hipocampo é significativamente diminuída após tratamento com Aβ ao comparar com o grupo controle, indicando que Aβ significativamente afetou o metabolismo energético de neurônios no cérebro. Contudo, sua atividade está marcadamente aumentada após o tratamento do oligossacarídeo alginato em três dosagens diferentes, onde a atividade é significativamente aumentada após o tratamento de 60 mg/kg no hipocampo ao comparar com HBY, indicando que a melhora do nível do metabolismo energético no cérebro pode ser um dos mecanismos do oligossacarídeo alginato para proteger as funções cerebrais e anti-AD. Os resultados são apresentados na tabela 12.

# P < 0,05 vs controle; * P < 0,05 vs modelo

5.2 Efeitos protetores do 6-mero em neurônios afetados por AP in vitro

[00070] Neurônios primários do córtex cerebral de rato foram cultivados segundo método de Referência (Banker GA, et a/.'Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res, 1977, 126:397-425). Células cultivadas por 1 semana foram usadas neste experimento. No 8o dia as células foram pré-tratadas com séries de concentrações de 6-mero (concentração final de 0,10,50,100 μg/mL) por 24 h, seguido da adição de Aβ25-35 envelhecido (Primeiramente resolvido em água destilada com concentração de 1mg/mL, então colocada para repousar a 37°C por 7 dias para envelhecer o Aβ25-35 e armazenada a -20°C para uso) com concentração final de 30 μM. Após 24 h a 37°C, 10 μl of MTT com concentração de 5 mg/mL foi adicionado. Após 4 h a 37°C, o sobrenadante foi removido e 150μl de DMSO adicionado. Então a absorbância a 570nm (630nm como referência) é anotada com um leitor ELISA (Rainbow, TECAN, Áustria).

[00071] Constatatou-se que após os neurônios primários serem incubados com 30 μM de Aβ25-35 envelhecido, a redução do MTT é marcadamente diminuida e a taxa de sobrevivencia das células significativamente reduzida a 54,5 ± 8,9%(P<0,001) após o tratamento com Ap25-35 envelhecido. 6-mero na dose de 10, 50, 100μg/mL poderia aumentar significativamente a sobrevida das células afetadas por Aβ25-35 de maneira dose-dependente (a taxa de sobrevivência é 72,0 ±11,2%, 77,1 ± 8,1% e 82,3 ± 11,6% respectivamente).

[00072] 6-mero tem um similar efeito protetor em linhagem de célula neural SH-SY5Y como o neurônio primário. SH-SY5Y afetado com 30 μM de Aβ25-35 envelhecido (figura 7) e 2 μM de Aβ1-40 (figura 8) por 48 h poderia induzir uma série de mudanças, por exemplo, dano às células, reduzido número de células, ocorrência de células redondas e células de suspenção. Após, a taxa de sobrevivência das células é reduzida a 73,3 ± 9.4% e 64,1 ±2,5% respectivamente. Contudo, o oligossacarídeo alginato na dosagem de 50 e 100μg/mL poderia inibir significativamente a neurotoxicidade do Aβ, por exemplo, ta ocorrência de suspensão de células é reduzida e a taxa de sobrevivencia aumentada.

[00073] Os experimentos acima revelam que 6-mero poderia encurtar a latência de escape e aumentar o número de cruzamentos da plataforma original e encurtar o tempo de chegada na plataforma original em camundongos com AD induzido por Aβ1-40, implicando em melhora do seu comportamento. Isso ocorre in vivo assim como os efeitos protetores in vitro nos neurônios primário e linhagens de célula neural sugerem que 6-mero tem atividade anti-AD.

6. Estudo do mecanismo de ação do 6-mero no AD 6.1 Efeitos do 6-mero na apoptose de linhagens de célula SH-SY5Y induzida por Aβ25-35

[00074] Células SH-SY5Y são incubadas em placas 6-well em uma densidade de 2x105 células per welle. O dia após semear, as células são pré-tratadas com diferentes concentrações (0, 50, 100 μg/mL) de 6-mero por 24 h, seguido da adição de 30 μM de Ap25-35 envelhecido (adquirido de Sigma. Co.). após 48 h a 37°C, células são digeridas, coletadas, lavadas, centrifugadas a 1200 rpm e incubadas com 200 mL de uma mistura de 5 mg/mL de propidium iodide (Hyclone Co.) e 100 U/mL RNase(Hyclone Co.). Então as células são medidas por citometria de fluxo(BD Co., US), com 8000 células por amostra

[00075] Encontra-se que SH-SY5Y células estimuladas com 30μM A β25-35 envelhecido por 48h mostrando 24.8±1.9% células hypodiploides. Contudo, pré-tratamento com 50 e 100 μg/mL 6-mero por 24 h significativamente suprimiu apoptose induzida por Aβ25-35envelhecido , e a percentagem observada de células hipodiploides são 10,2 ± 1,3% e 5,1 ± 0,7%, respectivamente.

[00076] Além do mais, constatatou-se que 6-mero também significativamente interrompe a cascata de apoptose ao reverter a sobrecarga de íon cálcio intracelular e acúmulo de ROS, dessa forma e por regular para cima a expressão de Bcl-2 e regular para baixo a expressão de P53 e Caspase-3 induzida por Aβ. Todos esses fatores contribuem para o potencial terapêutico do 6-mero no tratamento da AD.

6.2 Mecanismo molecular de 6-mero na toxicidade antineuronal de Aβ (1) Efeitos do 6-mero na formação de fibrina de Aβ1-40

[00077] Aβ1-40 fresco é incubado puro ou com 6-mero (concentração final de 10, 50, e 100μg/mL, respectivamente) a 37°C por 24 h, e após incubação, Th-T é adicionado e a intensidade de fluorescência é monitorada a Em=450nm e Ex=480nm.

[00078] Os resultados mostram que 6-mero (na dosagem de 10,50,100μg/mL) consegue inibir o acúmulo de Aβ1-40, onde o efeito inibitório de 6-mero a 100μg/mL é mais óbvio. A intensidade de fluorescência é 10,46±0,94, 9,18±1,32 e 7,81±1,38 (p<0,05, 0,05 e 0,001), respectivamente. Os mesmos efeitos de 6-mero na formação de fibrina de Aβ1-40 são estudados com TEM (figura 9), indicando que 6-mero pode inibir significativamente a a formação de fibrina de Aβ1-40. Ainda, constatatou-se que 6-mero mostra efeito inibitório significante na formação de fibrina de Aβ1-40 facilitado por heparina usando TEM. Na figura 9, A mostra o resultado da incubação com Aβ1-40 puro por 24h; B mostra o resultado da incubação com uma mistura de Aβ1-40 e heparina 24h; C mostra o resultado da incubação com uma mistura de Aβ1-40 e 6-mero por 24h; D mostra o resultado da incubação com uma mistura de Aβ1-40, heparina e 6-mero por 24h; E mostra o resultado da incubação com Aβ1-40 puro por 48h; F mostra o resultado da incubação com uma mistura de Aβ1-40 e heparina por 48h; G mostra o resultado da incubação com uma mistura de Aβ1-40 e 6-mero por 48h; e H mostra o resultado da incubação com uma mistura de Aβ1-40, heparina e 6-mero por 48h.

(2) Efeitos do 6-mero na desestabilização de fibrina Aβ1-40.

[00079] Uma solução de água destilada e Aβ1-40 a 1 mg/mL é envelhecida a 37°C por 7d, após o qual é exposta a 6-mero por 3 dias. A amostra, tingida com acetato de urânio e TEM(JEM 1200EX), revela que Aβ1-40 puro leva à formação de fibras longas e torcidas após envelhecer por 7 dias (figura 10A). Na presença de heparina por um período adicional de 24 h, as fibras longas e torcidas se tornam mais densas e longas comparadas àquelas formadas na ausência de heparina (figura 10B). Notavelmente, na presença de 6-mero por um período adicional de 3 dias, as fibras longas e agregadas Aβ são transformadas em fibras pequenas e irregulares (figura 10C). Esses achados sugerem que 6-mero é capaz de reverter fibrinas Aβ preformadas, destacando a ação desestabilizante do 6-mero em fibrinas Αβ preformadas e portanto uma potencial intervenção terapêutica.

(3) Efeitos do 6-mero na conformação de Aβ1-40

[00080] O espectro CD (J-500A, JASCO, Japan) de Aβ1-40 monomérico (250μg/mL em TBS (100mM Tris, 50mM NaCl, pH7.4)) incubado a 37°C por 12 h é caracterizado principalmente por uma estrutura secundária β-sheet (figura 11A). A exposição simultânea de Aβ1-40 monomérico a 6-mero (100μg/mL) por 12 h previne a formação de folha β-pregueada (figura 11C). Contudo, heparina significativamente acelera a transição conformacional para estrutura β-sheet (figura 11B).

(4) Interação entre 6-mero e AB

[00081] A técnica SPR (BIAcore X, Uppsala, Sweden) é usada para caracterizar a interação de 6-mero e AB. Diferentes graus de AB1-40 envelhecido (por 0,0,5,1,2,4,6d a 37°C) em solução HBS EP buffer (0,01 MHEPES, 150 mmol/L NaCl, 3,4 mmol/L EDTA-Na2, 0,005vol% T ween-20, pH 7,4) com 5 concentrações são corridas pelo chip sensor imobilizado 6-mero. A taxa de fluxo é de5 μL/min, e o volume de injeção é 10 μl. O sensorgrama de ligação é anotado e o chip sensor é regenerado com 2M NaCl.

[00082] Constatatou-se que todas as graduações diferentes de AB1-40 envelhecido podem se ligar a 6-mero. A afinidade de ligação é mais fraca para AB1-40 fresco e 6-mero com um valor Kd de 6.85E-07 M. A afinidade de ligação aumenta com o grau de envelhecimento (valores de Kd são 1.07E-07,9,06E-08,5.43E-08,2.15E-08,1.45E-08 M, respectivamente), e se tornam essencialmente estáveis após envelhecer or 2 dias.

[00083] Estudos posteriores revelaram que 6-mero se liga à extensão total do AB através do His13~Lys16, e se liga ao AB25-35 através do Ser26~Lys28. A ligação do 6-mero com AB fresco pode contribuir para sua inibição na fibrinogênese de Αβ. A ligação de 6-mero com Aβ envelhecido pode contribuir para a desestabilização de fibrinas Aβ.

[00084] Os estudos acima revelam que os mecanismos moleculares são atribuidos ao fato de que 6-mero impede todo o processo fibrinogenético e particularmente desmonta as fibrinas Aβ preformadas. Esses resultados indicam que 6-mero, atuando como um antagonista total de cascata aβ, é um candidato profilático e terapêutico potencial para o AD, o que fornece a prova do princípio para uma nova estratégia para o tratamento de AD.

7. Estudo do 6-mero em modelos de diabetes 7.1 Efeitos protetores do 6-mero células beta pancreáticas afetadas por amilina in vitro

[00085] A linhagem NIT de células beta pancreáticas humanas é cultivada em meio DMEM contendo 10% FBS. As células são incubadas em placas 96-well em densidade de 1×104 células/well. O dia após a semeadura, elas são pré-tratadas com concentrações variadas de 6-mero (concentração final de 0, 10, 50, 100 μg/mL) por 24 h, seguido da adição de amilin envelhecido com uma concentração final de 30 μΜ. Após 48 h a 37°C, a sobrevivência das células é medida pelo método MITT.

[00086] Os resultados mostram que o 6-mero poderia aumentar a sobrevida das células afetadas por amilin de maneira dose-dependente (figura 12). Cada grupo tem 6 animais. Os dados são mostrados como média±SE. ## significa diferença estatística comparando com o grupo controle (p<0,01). * e ** significam diferença estatística comparando com o grupo tratado com IAPP (p<0,05 e p<0,01). Os dados sugerem que o 6-mero tem efeitos protetores em células beta pancreáticas afetadas por amilina.

7.2 Efeitos do 6-mero em camundongos diabéticos por indução por estreptozocina (STZ) in vivo

[00087] Sessenta camundongos NIH machos (pesando 18-22g) foram randomicamente dividos em grupos controle, modelo, tratados com 50, 150, 450mg/kg de 6-mero e tratado com 5mg/kg dimetildiguanida. Os camundongos foram injetados intraperitonealmente com 150mg/kg STZ exceto o grupo controle no 1o dia. Então os camundongos receberam as drogas devidas consecutivamente por 10 dias sendo os globos oculares perfurados para extração sangüínea no 11o dia. O sangue extraído foi utilizado para medição da concentração de glicose. A concentração em cada grupo tratado com 6-mero grupo é significativamente inferior que aquela no grupo modelo, indicando que o 6-mero tem efeito terapêutico em camundongos diabéticos induzido por STZ (tabela 13).

### P < 0,05 vs controle; * P < 0,05, **p<0,01 vs modelo

[00088] Os mesmos experimentos foram conduzidos com 2-mer até 22-mer puro ou sua mistura ou seus produtos de degradação oxidativa. Os resultados são similares àqueles do 6-mero indicando uma atividade potencial no AD e diabetes. As figuras 13 a 16 mostram os resultados comportamentais da mistura de produtos da degradação oxidativa do oligossacarídeo alginato injetados no cérebro de camundongos com AD induzido por AP1-40. Cada grupo tem 8 animais.
Os dados são apresentados como média±SE. Os símbolos # e ## significam diferença estatística comparando com o grupo controle (p<0,05, p<0,01), e *e ** significam diferença estatística comparando com o grupo modelo (p<0,05, p<0,01). Os dados revelam que a mistura dos produtos da degradação oxidativa dos oligossacarídeos podem melhorar significativamente o aprendizado e habilidade de memória de camundongos com AD. A figura 17 mostra os resultados protetores da mistura de produtos da degradação oxidativa dos oligossacarídeos alginatos na linhagem NIT de células beta pancreáticas afetadas por IAAp (amilina). Cada grupo tem 6 animais. Os dados estão apresentados como média±SD. O símbolo ## significa diferença estatística comparando com o grupo controle (p<0,01), e * e ** significam diferença estatística comparando com o grupo modelo (p<0,05, p<0,01). Os dados revelam que a mistura de produtos da degradação oxidativa dos oligossacarídeos alginatos têm um efeito preventivo e curativo significante no diabetes.

8 Análise estatística.

[00089] Os dados foram analizados estatisticamente utilizando o software Statview, apresentados como média±SE e comparados pela análise de variância (ANOVA)

[00090] Com base nos resultados acima, a composição farmacêutica contendo uma quantidade eficaz do ácido manurônico, oligossacarídeos alginatos e veículos farmaceuticamente aceitáveis pode ser preparada. A dita composição farmacêutica inclui um inibidor de formação de fibrinas de proteína amilóide-β e um inibidor de formação de fibrinas de proteína amilóide de ilhota. O oligossacarídeo alginato de acordo com o presente estudo tem um importante valor na preparação de drogas para a profilaxia e tratamento de AD e diabetes.

Claims

Derivados de oligossacarídeo alginato ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, caracterizados pelo fato de que apresentam a Fórmula (II), ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, sendo que o oligossacarídeo alginato é composto de ácido β-D-manurônico ligado por ligações α-1,4 glicosídicas:
na qual n representa 0 ou um número inteiro de 1 a 19.
Derivados de oligossacarídeo alginato, ou seus sais farmaceuticamente , de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo fato de que n é 2 a 12.
Derivados de oligossacarídeo , ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo fato de que n é 4 a 8.
Processo para preparação dos derivados de oligossacarídeo , ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:
uma solução aquosa de alginato reage por 2 a 6 h em uma autoclave em pH 2 a 6 e uma temperatura de 100 a 120°C;
após a referida reação de hidrólise ser interrompida, o valor de pH é ajustado para 7; e
um oxidante é adicionado e reage por 15 min a 2 h a uma temperatura de 100 a 120°C.
Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o referido alginato é alginato sódico, e a referida reação de hidrólise ácida é realizada por 4 h sob a condição de pH 4 e 110°C.
Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que após o ajuste do pH para 7, álcool é adicionado para gerar um precipitado; o precipitado é filtrado com aspiração, desidratado, seco e dessalinizado.
Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o referido oxidante é hidróxido de cobre e reagida por 30 min a uma temperatura de 100°C.
Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que contém uma quantidade eficaz de derivados de oligossacarídeo de ácido manurônico, ou de seus sais farmaceuticamente aceitáveis, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, e veículos farmaceuticamente aceitáveis.
Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que é qualquer uma selecionada do grupo que consiste em um medicamento para profilaxia e tratamento da Mal de Alzheimer, um inibidor de formação de fibrinas de proteína amilóide-β, um medicamento para profilaxia e tratamento do diabetes, um inibidor de formação de fibrinas de proteína amilóide de ilhota e um promotor de desagregamento de fibrinas.
Uso de um oligossacarídeo alginato representado pela Fórmula (I),
na qual n representa 0 ou um número inteiro de 1 a 19,
ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos,
sendo que o oligossacarídeo alginato é composto de ácido β-D-manurônico ligado por ligações α-1,4 glicosídicas,
o referido uso sendo caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para profilaxia e tratamento de Mal de Alzheimer, como um inibidor de formação de fibrinas de proteína amilóide-β, para profilaxia e tratamento do diabetes, como um inibidor de formação de fibrinas de proteína amilóide de ilhota e como promotor de desagregamento de fibrinas.