BRPI0213411B1 - dna codificando uma proteína de metabolização de herbicida, seu uso, vetor e micro-organismo transgênico compreendendo o mesmo, métodos de produção de um transformante, da referida proteína, de obtenção e detecção do referido dna e de identificação de uma célula compreendendo o referido dna - Google Patents

dna codificando uma proteína de metabolização de herbicida, seu uso, vetor e micro-organismo transgênico compreendendo o mesmo, métodos de produção de um transformante, da referida proteína, de obtenção e detecção do referido dna e de identificação de uma célula compreendendo o referido dna

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BRPI0213411B1
BRPI0213411B1 BRPI0213411A BR0213411A BRPI0213411B1 BR PI0213411 B1 BRPI0213411 B1 BR PI0213411B1 BR PI0213411 A BRPI0213411 A BR PI0213411A BR 0213411 A BR0213411 A BR 0213411A BR PI0213411 B1 BRPI0213411 B1 BR PI0213411B1
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dna
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Fujio Mukumoto
Hiroki Nakajima
Masanao Takaishi
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Sumitomo Chemical Co
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Abstract

"proteína de metabolização de herbicida, seu gene e uso". a presente invenção provê, por exemplo, dna codificando uma proteína de metabolização de herbicida selecionada do grupo de proteína abaixo. tal dna pode, por exemplo, ser empregado para produzir plantas herbicidamente resistentes. <grupo de proteína> uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na seq id no: 1, 2, 3, 108, 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 ou 224, uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (11) em um composto da fórmula (111) e compreendendo uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da seq id no: 1, 2, 3, 108, 159, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 ou 224 ou uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da seq id no: 160, 215, 216, 218, 222 ou 224.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DNA CODIFICANDO UMA PROTEÍNA DE METABOLIZAÇÃO DE HERBICIDA, SEU USO, VETOR E MICRO-ORGANISMO TRANSGÊNICO COMPREENDENDO O MESMO, MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE UM TRANSFORMANTE, DA REFERIDA PROTEÍNA, DE OBTENÇÃO E DETECÇÃO DO REFERIDO DNA E DE IDENTIFICAÇÃO DE UMA CÉLULA COMPREENDENDO O REFERIDO DNA".
CAMPO DA TÉCNICA A presente invenção refere-se a uma proteína tendo a habilidade de metabolizar um composto herbicida (proteína de metabolização de herbicida), um seu gene e seu uso.
TÉCNICA ANTERIOR
Os herbicidas são utilizados em uma quantidade necessária de solução diluída quando aplicados. Há situações onde quantidades extras sobram. Há situações onde o herbicida aplicado, após sua aplicação por um momento, permanece no resíduo do solo ou planta. Originalmente, dado que a segurança de tais herbicidas foi checada, tais pequenas quantidades de soluções que sobram ou resíduos apresentaram pequenos efeitos ao meio ambiente e às plantações cultivadas posteriormente. No entanto, se houver um método onde o composto herbicida contido seja convertido em um de atividade herbicida menor, então por exemplo, podem ser realizados tratamentos para inativar as soluções que sobraram ou os resíduos descritos acima conforme necessário.
Ainda, no caso de uso do herbicida, há situações onde era difícil distinguir plantas cultivadas de ervas daninhas de espécies aliadas para seletivamente controlar apenas ervas daninhas. Então, há um desejo de se desenvolver um novo método para conferir resistência herbicida a uma planta alvo.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
Sob tais circunstâncias, os presentes inventores estudaram intensivamente e, como resultado, constataram que um composto herbicida do tipo inibidor de protoporfirinogênio oxidase (daqui em diante algumas vezes referida como "PPO") pode ser convertido ao ser reagido com uma proteína particular em um composto de atividade herbicida menor, o que resultou na conclusão da presente invenção.
Isto é, a presente invenção provê: 1- Um DNA codificando uma proteína de metabolização de her- bicida, onde a dita proteína é selecionada do grupo consistindo em: (A1) uma proteína compreendendo a sequência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:1; (A2) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:2; (A3) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:3; (A4) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 108; (A5) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II): em um composto da fórmula (III): e compreendendo uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:108; (A6) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III) e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:108; (A11) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 159; (A12) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 160; (A13) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 136; (A14) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO; 137; (A15) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 138; (A16) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 215; (A17) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 216; (A18) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 217; (A19) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 218; (A20) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 219; (A21) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 220; (A22) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 221; (A23) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 222; (A24) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 223; (A25) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 224; (Α26) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 80% de identidade de se-qüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:219, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:221 ou SEQ ID NO:223 ou uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:218, SEQ ID NO:222 ou SEQ ID NO:224; (A27) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:218, SEQ ID NO:219, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:221, SEQ ID NO:222, SEQ ID NO:223 ou SEQ ID NO:224; e (A28) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por um DNA amplificável através de uma reação de cadeia de polimerase com um iniciador compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 124 a 128, um iniciador compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO:129 e como um molde um DNA cromossômico de Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces testaceus, Streptomyces achromogenes, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces thermocoerules-cens, Streptomyces nogalater, Streptomyces tsusimaensis, Streptomyces glomerochromogenes, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces or-natus, Streptomyces griseus, Streptomyces lanatus, Streptomyces misawa-nensis, Streptomyces pallidus, Streptomyces roseorubens, Streptomyces rutgersensis, Streptomyces steffisburgensis ou Saccharopolyspora taberi; 2- Um DNA compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em: (a1) a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 6; (a2) a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 7; (a3) a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 8; (a4) a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 109; (a5) a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 139; (a6) a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 140; (a7) a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 141; (a8) a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 142; (a9) a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 143; (a10) a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 225; (a11) a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 226; (a12) a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 227; (a13) a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 228; (a14) a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 229; (a15) a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 230; (a16) a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 231; (a17) a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 232; (a18) a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 233; (a19) a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 234; (a20) uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido de uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), a dita seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 ou SEQ ID NO:109; e (a21) uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido de uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), a dita seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 233 ou SEQ ID NO: 234; 3- O DNA de acordo com 1 acima compreendendo uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido da dita proteína, onde o uso do códon na dita seqüência de nucleotídeo está dentro da faixa de mais ou menos 4% do uso de códon em genes das espécies de uma célula hospedeira na qual o DNA é introduzido e o teor de GC da dita seqüência de nucleotídeo é pelo menos 40% e no máximo 60%; 4- Um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 214; 5- Um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 368; 6- Um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 393; 7- Um DNA onde um DNA tendo uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de sinal de trânsito de organela intracelular é ligado a montante do DNA de acordo com 1 acima em estrutura; 8- Um DNA onde o DNA de acordo com 1 acima e um promotor funcional em uma célula hospedeira estão operavelmente ligados; 9- Um vetor compreendendo o DNA de acordo com 1 acima; 10- Um método de produção de um vetor compreendendo uma etapa de inserção do DNA de acordo com 1 acima em um vetor replicável em uma célula hospedeira; 11- Um transformante onde o DNA de acordo com 1 acima é in- traduzido em uma célula hospedeira; 12- O transformante de acordo com 11 acima, onde a célula hospedeira é uma célula de microorganismo ou uma célula de planta; 13- Um método de produção de um transformante compreendendo uma etapa de introdução em uma célula hospedeira do DNA de acordo com 1 acima; 14- Um método de produção de uma proteína tendo a habilidade de converter um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (lll), o dito método compreendendo as etapas de cultura do transformante de acordo com 11 acima e recuperação da dita proteína produzida; 15- Uso do DNA de acordo com 1 acima para produção de uma proteína tendo a habilidade de converter um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (lll); 16- Um método de conceder a uma planta resistência a um herbicida, o dito método compreendendo uma etapa de introdução na e expressão em uma célula de planta do DNA de acordo com 1 acima; 17- Um polinucleotídeo tendo uma seqüência de nucleotídeo parcial de um DNA de acordo com 1 acima ou uma seqüência de nucleotídeo complementar à dita seqüência de nucleotídeo parcial; 18- Um método de detecção de um DNA codificando uma proteína tendo a habilidade de converter um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (lll), o dito método compreendendo uma etapa de detecção de um DNA ao qual uma sonda é hibridizada em uma hibridização usando como a sonda o DNA de acordo com 1 acima ou o polinucleotídeo de acordo com 17 acima; 19- Um método de detecção de um DNA codificando uma proteína tendo a habilidade de converter um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (lll), o dito método compreendendo uma etapa de detecção de um DNA amplificado em uma reação de cadeia de polimerase com o polinucleotídeo de acordo com 17 acima como um iniciador; 20- O método de acordo com 19 acima, onde pelo menos um dos iniciadores é selecionado do grupo consistindo em um polinucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma das SEQ ID Nos: 124 a 128 e um polinucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 129; 21- Um método de obtenção de um DNA codificando uma proteína tendo a habilidade de converter um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), o dito método compreendendo um etapa de recuperação do DNA detectado através do método de acordo com 18 ou 19 acima; 22- Método de avaliação de uma célula tendo um DNA codificando uma proteína tendo a habilidade de converter um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), o dito método compreendendo uma etapa de detecção do dito DNA a partir de uma célula de teste através do método de acordo com 18 ou 19 acima; 23- Proteína de metabolização de herbicida selecionada do grupo consistindo em: (A1) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:1; (A2) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:2; (A3) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:3; (A4) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 108; (A5) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III) e compreendendo uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:108; (A6) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III) e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:108; (A11) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 159; (A12) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 160; (A13) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 136; (A14) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 137; (A15) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 138; (A16) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 215; (A17) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 216; (A18) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 217; (A19) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 218; (A20) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 219; (A21) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 220; (A22) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 221; (A23) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 222; (A24) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 223; (A25) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 224; (A26) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:136, SEQ ID N0.137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:219, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:221 ou SEQ ID NO:223 ou uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:218, SEQ ID NO:222 ou SEQ ID NO:224; (A27) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID N0.159, SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:218, SEQ ID NO:219, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:221, SEQ ID NO:222, SEQ ID NO:223 ou SEQ ID NO:224; e (A28) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por um DNA amplificável através de uma reação de cadeia de polimerase com um iniciador compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma das SEQ ID Nos: 124 a 128, um iniciador compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SE ID NO:129 e como um molde um DNA cromossômico de Streptomy- ces phaeochromogenes, Streptomyces testaceus, Streptomyces achromo-genes, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces thermocoerulescens, Streptomyces nogalater, Streptomyces tsusimaensis, Streptomyces glome-rochromogenes, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces ornatus, Streptomyces griseus, Streptomyces tanatus, Streptomyces misawanensis, Streptomyces pallidus, Streptomyces roseorubens, Streptomyces rutgersen-sis, Streptomyces steffisburgensis ou Saccharopolyspora taberi; 24- Um anticorpo de reconhecimento de uma proteína de meta-bolização de herbicida selecionada do grupo consistindo em: (A1) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:1; (A2) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:2; (A3) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:3; (A4) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 108; (A5) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III) e compreendendo uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:108; (A6) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III) e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:108; (A11) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 159; (A12) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 160; (A13) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 136; (A14) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 137; (A15) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 138; (A16) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 215; (A17) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 216; (A18) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 217; (A19) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 218; (A20) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 219; (A21) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 220; (A22) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 221; (A23) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 222; (A24) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 223; (A25) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 224; (A26) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO.217, SEQ ID NO:219, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:221 ou SEQ ID NO:223 ou uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:218, SEQ ID NO:222 ou SEQ ID NO:224; (A27) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:218, SEQ ID NO:219, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:221, SEQ ID NO:222, SEQ ID NO:223 ou SEQ ID NO:224; e (A28) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por um DNA amplificável através de uma reação de cadeia de polimerase com um iniciador compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma das SEQ ID Nos: 124 a 128, um iniciador compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO:129 e como um molde um DNA cromossômico de Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces testaceus, Streptomyces achromogenes, Streptomyces gríseofuscus, Streptomyces thermocoerules-cens, Streptomyces nogalater, Streptomyces tsusimaensis, Streptomyces glomerochromogenes, Streptomyces oüvochromogenes, Streptomyces or-natus, Streptomyces griseus, Streptomyces lanatus, Streptomyces misawa-nensis, Streptomyces pallidus, Streptomyces roseorubens, Streptomyces rutgersensis, Streptomyces steffisburgensis ou Saccharopolyspora taberi; 25- Método de detecção de uma proteína de metabolização de herbicida, o dito método compreendendo: (1) uma etapa de contato de uma substância de teste com um anticorpo de reconhecimento da dita proteína e; (2) uma etapa de detecção de um complexo da dita proteína e dito anticorpo que surge a partir do dito contato; onde a dita proteína é selecionada do grupo consistindo em: (A1) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:1; (A2) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:2; (A3) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:3; (A4) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:108; (A5) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III) e compreendendo uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:108; (A6) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III) e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:108; (A11) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 159; (Α12) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 160; (A13) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 136; (A14) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 137; (A15) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 138; (A16) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 215; (A17) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 216; (A18) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 217; (A19) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 218; (A20) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 219; (A21) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 220; (A22) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 221; (A23) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 222; (A24) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 223; (A25) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 224; (A26) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 80% de identidade de se- qüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:219, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:221 ou SEQ ID NO:223 ou uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:218, SEQ ID NO:222 ou SEQ ID NO:224; (A27) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:218, SEQ ID NO:219, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:221, SEQ ID NO:222, SEQ ID NO:223 ou SEQ ID NO:224; e (A28) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por um DNA amplificável através de uma reação de cadeia de polimerase com um iniciador compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma das SEQ ID Nos: 124 a 128, um iniciador compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 129 e como um molde um DNA cromossômico de Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces testaceus, Streptomyces achromogenes, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces thermocoerules-cens, Streptomyces nogalater, Streptomyces tsusimaensis, Streptomyces glomerochromogenes, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces or-natus, Streptomyces griseus, Streptomyces lanatus, Streptomyces misawa-nensis, Streptomyces pallidus, Streptomyces roseorubens, Streptomyces rutgersensis, Streptomyces steffisburgensis ou Saccharopolyspora taberí; 26- Um estojo de detecção ou análise compreendendo o anticorpo de acordo com 24 acima; 27- Um DNA codificando uma ferredoxina selecionada do grupo consistindo em: (B1) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoaci-do mostrada na SEQ ID NO: 12; (B2) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoaci-do mostrada na SEQ ID NO: 13; (B3) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoaci-do mostrada na SEQ ID NO: 14; (B4) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoaci-do mostrada na SEQ ID NO: 111; (B5) uma ferredoxina compreendendo uma seqüência de amino-acido tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO 14 ou SEQ ID NO: 111; (B6) uma ferredoxina compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO 14 ou SEQ ID NO: 111; (B7) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 149; (B8) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 150; (B9) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 151; (B10) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 152; (B11) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 153; (B12) uma ferredoxina compreendendo uma seqüência de ami- noacido tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma sequência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251 ou SEQ ID NO: 253 ou uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 252 ou SEQ ID NO: 254; (B13) uma ferredoxina compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 253 ou SEQ ID NO: 254; (B14) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 245; (B15) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 247; (B16) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 248; (B17) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 249; (B18) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 250; (B19) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 251; (B20) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 252; (B21) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 253; e (Β22) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 254; 28- DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em: (b1) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 15; (b2) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 16; (b3) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 17; (b4) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 112; (b5) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 154; (b6) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 155; (b7) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 156; (b8) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 157; (b9) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 158; (b10) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 255; (b11) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 257; (b12) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 258; (b13) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 259; (b14) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 260; (b15) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 261; (b16) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 262; (b17) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 263; (b18) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 264; e (b19) uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO: 263 ou SEQ ID NO: 264; 29- Um vetor compreendendo um DNA de acordo com 28 acima; 30- Transformante onde o DNA de acordo com 28 acima é introduzido em uma célula hospedeira; 31- Ferredoxina selecionada do grupo consistindo em: (B1) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoaci-do mostrada na SEQ ID NO: 12; (B2) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoaci-do mostrada na SEQ ID NO: 13; (B3) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoaci-do mostrada na SEQ ID NO: 14; (B4) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoaci-do mostrada na SEQ ID NO: 111; (B5) uma ferredoxina compreendendo uma seqüência de amino-acido tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO 14 ou SEQ ID NO: 111; (B6) uma ferredoxina compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 12, SEQIDNO: 13, SEQ ID NO 14 ou SEQ ID NO: 111; (B7) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoaci-do mostrada na SEQ ID NO: 149; (B8) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoaci-do mostrada na SEQ ID NO: 150; (B9) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoaci-do mostrada na SEQ ID NO: 151; (B10) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoa-cido mostrada na SEQ ID NO: 152; (B11) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoa-cido mostrada na SEQ ID NO: 153; (B12) uma ferredoxina compreendendo uma seqüência de ami-noacido tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251 ou SEQ ID NO: 253 ou uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 252 ou SEQ ID NO: 254; (B13) uma ferredoxina compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 253 ou SEQ ID NO: 254; (B14) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 245; (B15) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 247; (Β16) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 248; (B17) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 249; (B18) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 250; (B19) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 251; (B20) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 252; (B21) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 253; e (B22) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 254; 32- Um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em: (ab1) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 9; (ab2) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 10; (ab3) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 11; (ab4) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 110; (ab5) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 144; (ab6) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 145; (ab7) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 146; (ab8) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 147; (ab9) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 148; (ab10) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 235; (ab11) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 236; (ab12) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 237; (ab13) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 238; (ab14) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 239; (ab15) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 240; (ab16) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 241; (ab17) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 242; (ab18) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 243; e (ab19) uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 244; 33- Um vetor compreendendo o DNA de acordo com 32 acima; 34- Um transformante onde o DNA de acordo com 32 acima é introduzido em uma célula hospedeira; 35- Um transformante de acordo com 34 acima, onde a célula hospedeira é uma célula de microorganismo ou uma célula de planta; 36- Método de produção de um transformante compreendendo uma etapa de introdução em uma célula hospedeira do DNA de acordo com 32 acima; 37- Método de produção de uma proteína tendo a habilidade de converter um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), o dito método compreendendo uma etapa de cultura do transformante de acordo com 34 acima e recuperação da dita proteína produzida; 38- Método de controle de ervas daninhas compreendendo uma etapa de aplicação de um composto a uma área de cultivo de uma planta expressando pelo menos uma proteína de metabolização de herbicida selecionada do grupo consistindo em: (A1) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:1; (A2) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:2; (A3) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:3; (A4) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:108; (A5) uma proteína tendo uma habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III) e compreendendo uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO: 108; (A6) uma proteína tendo uma habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III) e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por uma seqüência de nu-cleotídeo tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:108; (A7) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (lll), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por um DNA que hibridiza, sob condições estringentes, em um DNA compreendendo uma seqüência de nu-cleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 108; (A8) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por um DNA amplificável através de uma reação de cadeia de polimerase com um iniciador compreendendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO:129, um iniciador compreendendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 124 a 128, e como um molde um cromossoma de um microorganismo pertencente a Streptomyces ou Saccharopolyspora\ (A9) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 4; (A11) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 159; (A12) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 160; (A13) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 136; (A14) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 137; (A15) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 138; (A16) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 215; (A17) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 216; (A18) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 217; (A19) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 218; (Α20) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 219; (A21) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 220; (A22) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 221; (A23) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 222; (A24) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 223; (A25) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 224; (A26) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:219, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:221 ou SEQ ID NO:238 ou uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:218, SEQ ID NO:222 ou SEQ ID NO:224; e (A27) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:218, SEQ ID NO:219, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:221, SEQ ID NO:222, SEQ ID NO:223 ou SEQ ID NO:224; onde o dito composto é um composto da fórmula (I): onde na fórmula (I) G representa um grupo mostrado em qualquer um dos G-1 a G-9 que seguem: onde em G-1 a G-9: X representa um átomo de oxigênio ou átomo de enxofre; Y representa um átomo de oxigênio ou átomo de enxofre; R1 representa a um átomo de hidrogênio ou átomo de halogênio; R2 representa um átomo de hidrogênio, grupo CrC8 alquila, grupo CrC8 haloalquila, átomo de halogênio, grupo hidroxila, grupo -OR9, grupo -SH, grupo -S(0)pR9, - grupo COR9, grupo -CO2R9, grupo -C(0)SR9, grupo -C(0)NR11R12, grupo -CONH2, grupo -CHO, grupo -CR9=NOR18, grupo -CH=CR19C02R9, grupo -CH2CHR19C02R9, grupo -C02N=CR13R14, grupo nitro, grupo ciano, grupo -NHS02R15, grupo -NHS02NHR15, grupo -NR9R20, grupo -NH2 ou grupo fenila que pode ser substituído por um ou mais grupos C1-C4 alquila que podem ser iguais ou diferentes; p representa 0, 1 ou 2; R3 representa grupo C1-C2 alquila, grupo CrC2 haloalquila, grupo -OCH3, grupo -SCH3, grupo -OCHF2, átomo de halogênio, grupo ciano, grupo nitro ou grupo C1-C3 alcóxi substituído com um grupo fenila que pode ser substituído no anel com pelo menos um substituinte selecionado de um átomo de halogênio, grupo C1-C3 alquila, grupo C1-C3 haloalquila, grupo OR28, grupo NR11R28, grupo SR28, grupo ciano, grupo C02R28 e grupo nitro; R4 representa um átomo de hidrogênio, grupo C1-C3 alquila ou grupo C-1-C3 haloalquila; R5 representa um átomo de hidrogênio, grupo C1-C3 alquila, grupo C1-C3 haloalquila, grupo ciclopropila, grupo vinila, grupo C2 alquinila, grupo ciano, grupo-C(0)R2°, grupo -C02R2°, grupo -C(O)NR20R21, grupo -CHR16R17CN, grupo -CR16R17C(0)R2°, grupo -C16R17C02R2°, grupo -CR16R17C(O)NR20R21, grupo -CHR16OH, grupo -CHR16OC(0)R20 ou grupo -OCHR16OC(O)NR20R21, ou quando G representa G-2 ou G-6, R4 e R5 podem representar grupo C=0 junto com o átomo de carbono ao qual estão ligados; R6 representa grupo CrC6 alquila, CrCe grupo haloalquila, grupo C2-C6 alcoxialquila, grupo C3-C6alquenila ou grupo C3-C6 alquinila; R7 representa a átomo de hidrogênio, grupo CrC6 alquila, grupo C1-C6 haloalquila, átomo de halogênio, grupo -S(0)2(CrC6 alquila) ou grupo -C(=0)R22; R8 representa um átomo de hidrogênio, grupo CrC8 alquila, grupo C3-C8 cicloalquila, grupo C3-C8 alquenila, grupo C3-C8 alquinila, grupo Cr Ce haloalquila, grupo C2-C8 alcoxialquila, grupo C3-C8 alcoxialcoxialquila, grupo C3-C8 haloalquinila, grupo C3-C8 haloalquenila, grupo CrC8 alquilsul-fonila, grupo CrC8 haloalquilsulfonila, grupo C3-C8 alcoxicarbonilalquila, grupo -S(0)2NH(CrC8 alquila), grupo -C(0)R23 ou grupo benzila que pode ser substituído com R24 no anel fenila; R9 representa grupo C-i-C8 alquila, grupo C3-C8 cicloalquila, grupo C3-C8 alquenila, grupo C3-C8 alquinila, grupo CrC8 haloalquila, grupo C2-C8 alcoxialquila, grupo C2-C8 alquiltioalquila, grupo C2-C8 alquilsulfinilalquila, grupo C2-C8 alquilsulfonilalquila, grupo C4-C8 alcoxialcoxialquila, grupo C4-C8 cicloalquilalquila, grupo C4-C8 cicloalcoxialquila, grupo C4-C8 alqueniloxial-quila, grupo C4-C8 alquiniloxialquila, grupo C3-C8 haloalcoxialquila, grupo C4-C8 haloalqueniloxialquila, grupo C4-C8 haloalquiniloxialquila, grupo C4-C8 ci-cloalquiltioalquila, grupo C4-C8 alqueniltioalquila, grupo C4-C8 alquiniltioal-quila, grupo CrC4 alquila substituído com um grupo fenóxi que pode ser substituído no anel com pelo menos um substituinte selecionado de um átomo de halogênio, grupo CrC3 alquila e grupo haloalquila grupo CrC4 alquila substituído com um grupo benzilóxi que pode ser substituído no anel com pelo menos um substituinte selecionado de um átomo de halogênio, grupo CrC3 alquila e grupo CrC3 haloalquila, grupo C4-C8 trialquilsirilalquila, grupo C2-C8 cianoalquila, grupo C3-C8 halocicloalquila, grupo C3-C8 haloalquenila, grupo C5-C8 alcoxialquenila, grupo Cs-C8 haloalcoxialquenila, grupo C5-C8 alquiltioalquenila, grupo C3-C8 haloalquinila, grupo Cs-C8 alcoxialqui-nila, grupo C5-C8 haloalcoxialquinila, grupo C5-C8 alquiltioalquinila, grupo C2-C8 alquilcarbonila, grupo benzila que pode ser substituído no anel com pelo menos um substituinte selecionado de um átomo de halogênio, grupo Ci-C3 alquila, CrC3 haloalquila grupo, grupo -OR28, -NR11R28 grupo, grupo -SR28, grupo ciano, grupo -C02R28 e grupo nitro, grupo -CR16R17COR10, grupo -CR16R17C02R2°, grupo -CR16R17P(O)(OR10)2, - grupo CR16R17P(S)(OR10)2, grupo -CR16R17C(0)NR11R12, grupo -CR16R17C(0)NH2, - grupo C(=CR26R27) COR10, grupo -C(=CR26R27)C02R2°, grupo -C(=CR26R27)P(O)(OR10)2, - grupo C(=CR26R27)P(S)(OR10)2, grupo -C(=CR26R27)C(0)NR11R12, grupo -C(=CR26 R27)C(0)NH2, ou qualquer um dos anéis mostrados em Q-1 a Q-7: que pode ser substituído no anel com pelo menos um substi-tuinte selecionado de um átomo de halogênio, grupo CrC6 alquila, grupo Ci-Ce haloalquila, grupo C2-C6 alquenila, grupo C2-C6 haioalquenila, grupo C2-C6 alquinila, grupo C3-C6 haloalquinila, grupo C2-Cs alcoxialquila, grupo -OR28, grupo -SR28, grupo -NR11R28, grupo C3-C8 alcoxicarbonilalquila, grupo C2-C4 carboxialquila, grupo -C02R28 e grupo ciano; R10 representa um grupo CrC6 alquila, grupo C2-C6 alquenila, grupo C3-C6 alquinila, grupo tetraidrofuraniIa;
Rn e R13 representam independentemente um átomo de hidrogênio ou grupo CrC4 alquila; R12 representa grupo CrC6 alquila, grupo C3-C6 cícloalquila, grupo C3-C6 alquenila, grupo C3-C6 alquinila, grupo C2-C6 alcoxialquila, grupo CrC6 haloalquila, grupo C3-C6 haioalquenila, grupo C3-C6 haloalquinila, grupo fenila que pode ser substituído no anel com pelo menos um substituinte selecionado de um átomo de halogênio, grupo C-1-C4 alquila e grupo CrC4 alcóxi ou grupo -CR16R17C02R25; ou, R11 e R12 juntos podem representar -(CH2)5-, -(ΟΗ2)4- ou -CH2CH2OCH2CH2-, ou nesse caso o anel resultante pode ser substituído com um substituinte selecionado de um grupo CrC3 alquila, um grupo fenila e grupo benzila; R14 representa um grupo C1-C4 alquila ou grupo fenila que pode ser substituído no anel com um substituinte selecionado de um átomo de halogênio, grupo C1-C3 alquila e grupo C1-C3 haloalquila; ou, R13 e R14 podem representar um grupo C3-C8 cícloalquila junto com o átomo de carbono ao qual eles estão ligados; R15 representa grupo C1-C4 alquila, grupo C1-C4 haloalquila ou grupo C3-C6 alquenila; R16 e R17 independentemente representam um átomo de hidrogênio ou grupo C-1-C4 alquila, grupo C-1-C4 haloalquila, grupo C2-C4 alquenila, grupo C2-C4 haloalquenila, grupo C2-C4 alquinila, grupo C3-C4 haloalquinila; ou, R16 e R17 podem representar grupo C3-C6 cicloalquila com o átomo de carbono ao qual eles estão ligados, ou o anel desse modo formado pode ser substituído com pelo menos um substituinte selecionado de um átomo de halogênio, um grupo C1-C3 alquila e C1-C3 grupo haloalquila; R18 representa um átomo de hidrogênio, grupo C1-C6 alquila, grupo C3-C6 alquenila ou grupo C3-C6 alquinila; R19 representa um átomo de hidrogênio, grupo C1-C4 alquila ou átomo de halogênio, R20 representa um átomo de hidrogênio, grupo C-i-C6 alquila, grupo C3-C6 cicloalquila, grupo C3-C6 alquenila, grupo C3-C6 alquinila, grupo C2-C6 alcoxialquila, grupo CrC6 haloalquila, grupo C3-C6 haloalquenila, grupo C3-C6 haloalquinila, grupo fenila que pode ser substituído no anel com pelo menos um substituinte selecionado de um átomo de halogênio, grupo C1-C4 alquila e grupo -OR28 ou grupo -CR16R17C02R25; R21 representa um átomo de hidrogênio, grupo C1-C2 alquila ou grupo -C02(Ci-C4 alquila); R22 representa um átomo de hidrogênio, grupo C1-C6 alquila, grupo CrC6 alcóxi ou grupo NH(CrC6 alquila); R23 representa grupo C1-C6 alquila, grupo C1-C6 haloalquila, grupo C-i-C6 alcóxi, grupo NH(Ci-C6 alquila), grupo benzila, C2-C8 grupo dial-quilamino ou grupo fenila que pode ser substituído com R24; R24 representa grupo CrC6 alquila, 1 a 2 átomos de halogênio, grupo CrC6 alcóxi ou grupo CF3; R25 representa grupo CrC6 alquila, grupo CVCis haloalquila, grupo C3-C6 alquenila, grupo C3-C6 haloalquenila, grupo C3-C6 alquinila ou grupo C3-C6 haloalquinila; R26 e R27 representam cada um independentemente um átomo de hidrogênio, grupo C1-C4 alquila, grupo C1-C4 haloalquila, grupo C2-C4 alquenila, grupo C2-C4 haloalquenila, grupo C2-C4 alquinila, grupo C3-C4 halo- alquinila, grupo -OR28, grupo -NHR28 ou - grupo SR28; ou, R26 e R27 podem representar grupo C3-C8 cicloalquila com o átomo de carbono ao qual eles estão ligados, ou cada um do anel desse modo formado pode ser substituído com pelo menos um substituinte selecionado de um átomo de halogênio, grupo CrC3 alquila e grupo Ci-C3 haloal-quila; e, R28 representa um átomo de hidrogênio, grupo C1-C6 alquila, grupo C1-C6 haloalquila, grupo C3-C6 alquenila, grupo C3-C6 haloalquenila, grupo C3-C6 alquinila, grupo C3-C6 haloalquinila, grupo C2-C4 carboxialquila, grupo C3-C3 alcoxicarrbonilalquila, grupo C3-C8 haloalcoxicarrbonilalquila, grupo C5-C9 alqueniloxicabonilalquila, grupo C5-C9 haloalqueniloxicarbonilal-quila, grupo C5-C9 alquiniloxicarbonilalquila, grupo C5-C9 haloalquiniloxicar-bonilalquila, grupo C5-C9 cicloalcoxicarbonilalquila ou grupo C5-C9 halociclo-alcoxicarbonilalquila; 39- Um método de controle de ervas daninhas compreendendo uma etapa de aplicação de um composto a uma área de cultivo de uma planta expressando pelo menos uma proteína selecionada do grupo consistindo em: (A1) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:1; (A2) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:2; (A3) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:3; (A4) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:108; (A5) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III) e compreendendo uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:108; (A6) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III) e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:108; (A11) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 159; (A12) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 160; (A13) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 136; (A14) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 137; (A15) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 138; (A16) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 215; (A17) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 216; (A18) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 217; (A19) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 218; (A20) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 219; (A21) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 220; (A22) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 221; (Α23) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 222; (A24) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 223; (A25) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 224; (A26) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:219, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:221 ou SEQ ID NO:223 ou uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:218, SEQ ID NO:222 ou SEQ ID NO:224; (A27) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:136, SEQ ID N0.137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:218, SEQ ID NO:219, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:221, SEQ ID NO:222, SEQ ID NO:223 ou SEQ ID NO:224; e (A28) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por um DNA amplificável através de uma reação de cadeia de polimerase com um iniciador compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma das SEQ ID Nos: 124 a 128, um iniciador compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO:129 e como um molde um DNA cromossômico de Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces testaceus, Streptomyces achromogenes, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces thermocoerules-cens, Streptomyces nogalater, Steptomyces tsusimaensis, Streptomyces glomerochromogenes, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces or-natus, Streptomyces griseus, Streptomyces lanatus, Streptomyces misawa-nensis, Streptomyces pallidus, Streptomyces roseorubens, Streptomyces rutgersensis, Streptomyces steffisburgensis ou Saccharopolyspora taberi; 40- Um método de avaliação da resistência de uma célula a um composto da fórmula (I), o dito método compreendendo: (1) uma etapa de contato do dito composto com uma célula expressando pelo menos uma proteína de metabolização de herbicida selecionada do grupo consistindo em: (A1) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:1; (A2) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:2; (A3) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:3; (A4) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 108; (A5) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III) e compreendendo uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:108; (A6) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III) e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:108; (A7) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por um DNA que hibridiza, sob condições estringentes, em um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 108; (A8) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por um DNA amplificável através de uma reação de cadeia de polimerase com um iniciador compreendendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO:129, um iniciador compreendendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 124 a 128, e como um molde um cromossoma de um microorganismo pertencente a Streptomyces ou Saccharopolyspora-, (A9) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 4; (A11) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 159; (A12) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 160; (A13) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 136; (A14) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO; 137; (A15) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 138; (A16) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 215; (A17) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 216; (A18) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 217; (A19) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 218; (A20) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 219; (A21) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 220; (A22) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 221 ; (A23) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 222; (A24) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 223; (A25) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 224; (A26) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:219, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:221 ou SEQ ID NO:223 ou uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:218, SEQ ID NO:222 ou SEQ ID NO:224; e (Α27) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:218, SEQ ID NO:219, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:221, SEQ ID NO:222, SEQ ID NO:223 ou SEQ ID NO:224; e (2) uma etapa de avaliação do grau de dano à célula que contatou o composto na etapa (1) acima; 41- Um método de acordo com 40 acima, onde a célula é uma célula de microorganismo ou uma célula de planta; 42- Um método de seleção de uma célula resistente a um composto da fórmula (I), o dito método compreendendo uma etapa de seleção de uma célula baseado na resistência avaliada no método de acordo com 40 acima; 43- Célula resistente a herbicida selecionada através do método de acordo com 42 acima, ou sua cultura; 44- Método de avaliação da resistência de uma planta a um composto da fórmula (I), o dito método compreendendo: (1) uma etapa de contato do dito composto com uma planta expressando pelo menos uma proteína de metabolização de herbicida selecionada do grupo consistindo em: (A1) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:1; (A2) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:2; (A3) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:3; (A4) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:108; (A5) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III) e compreendendo uma sequência de aminoacido tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:108; (A6) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:108; (A7) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por um DNA que hibridiza, sob condições estringentes, em um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 108; (A8) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por um DNA amplificável através de uma reação de cadeia de polimerase com um iniciador compreendendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID N0.129, um iniciador compreendendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 124 a 128, e como um molde um cromossoma de um microorganismo pertencente a Streptomyces ou Saccharopolyspora\ (A9) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoaci- do mostrada na SEQ ID NO: 4; (A11) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 159; (A12) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 160; (A13) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 136; (A14) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 137; (A15) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 138; (A16) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 215; (A17) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 216; (A18) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 217; (A19) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 218; (A20) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 219; (A21) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 220; (A22) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 221; (A23) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 222; (A24) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 223; (A25) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 224; (A26) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 80% de identidade de se-qüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:219, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:221 ou SEQ ID NO:223 ou uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:216, SEQ ID N0.218, SEQ ID NO:222 ou SEQ ID NO:224; e (A27) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:218, SEQ ID NO:219, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:221, SEQ ID NO:222, SEQ ID NO:223 ou SEQ ID NO:224; e (2) uma etapa de avaliação do grau de dano à planta que contatou o composto na etapa (1) acima; 45- Um método de seleção de uma planta resistente a um composto da fórmula (I), o dito método compreendendo uma etapa de seleção de uma planta com base na resistência avaliada no método de acordo com 44 acima; 46- Planta herbicidamente resistente selecionada do método de acordo com 45 acima, ou sua progênie; 47- Método de tratamento de um composto da fórmula (I), o dito método compreendendo reação do dito composto na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron com pelo menos uma proteína de metabolização de herbicida selecionada do grupo consis- tindo em: (A1) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:1; (A2) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:2; (A3) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NOS; (A4) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 108; (A5) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:1, SEQ ID NOS, SEQ ID NOS ou SEQ ID NO:108; (A6) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:1, SEQ ID NOS, SEQ ID NOS ou SEQ ID NO:108; (A7) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por um DNA que hibridiza, sob condições estringentes, em um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 108; (A8) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por um DNA amplificável através de uma reação de cadeia de polimerase com um iniciador compreendendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID N0.129, um iniciador compreendendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 124 a 128, e como um molde um cromossoma de um microorganismo pertencente a Streptomyces ou Saccharopolyspora', (A9) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 4; (A11) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 159; (A12) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 160; (A13) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 136; (A14) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 137; (A15) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 138; (A16) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 215; (A17) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 216; (A18) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 217; (A19) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 218; (A20) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 219; (A21) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 220; (A22) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 221; (Α23) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 222; (A24) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 223; (A25) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 224; (A26) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:219, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:221 ou SEQ ID NO:223 ou uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:218, SEQ ID NO:222 ou SEQ ID NO:224; e (A27) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:218, SEQ ID NO:219, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:221, SEQ ID NO:222, SEQ ID NO:223 ou SEQ ID NO:224; 48- O método de acordo com 47 acima, onde há reação do composto com a proteína de metabolização de herbicida através de contato do composto com um transformante onde um DNA codificando a proteína de metabolização de herbicida é introduzido em uma célula hospedeira em uma posição que permite sua expressão na dita célula; 49- Uso para tratamento do composto da fórmula (I) de uma proteína de metabolização de herbicida selecionada do grupo consistindo em: (A1) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:1; (A2) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:2; (A3) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:3; (A4) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 108; (A5) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III) e compreendendo uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:108; (A6) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III) e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:108; (A7) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por um DNA que hibridiza, sob condições estringentes, em um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 108; (Α8) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por um DNA amplificável através de uma reação de cadeia de polimerase com um iniciador compreendendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 129, um iniciador compreendendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 124 a 128, e como um molde um cromossoma de um microorganismo pertencente a Streptomyces ou Saccharopolyspora\ (A9) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 4; (A11) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 159; (A12) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 160; (A13) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 136; (A14) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 137; (A15) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 138; (A16) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 215; (A17) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 216; (A18) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 217; (A19) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 218; (A20) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 219; (A21) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 220; (A22) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 221; (A23) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 222; (A24) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 223; (A25) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 224; (A26) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:219, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:221 ou SEQ ID NO:223 ou uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:218, SEQ ID NO:222 ou SEQ ID NO:224; e (A27) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:218, SEQ ID NO:219, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:221, SEQ ID NO:222, SEQ ID NO:223 ou SEQ ID NO:224; 50- Uso para tratamento de um composto da fórmula (I) de um polinucleotídeo codificando uma proteína de metabolização de herbicida se- lecionada do grupo consistindo em: (A1) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:1; (A2) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:2; (A3) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:3; (A4) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 108; (A5) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:108; (A6) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:108; (A7) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por um DNA que hibridiza, sob condições estringentes, em um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 108; (A8) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma sequência de aminoacido codificada por um DNA amplificável através de uma reação de cadeia de polimerase com um iniciador compreendendo uma sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 129, um iniciador compreendendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 124 a 128, e como um molde um cromossoma de um microorganismo pertencente a Streptomyces ou Saccharopolyspora\ (A9) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 4; (A11) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 159; (A12) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 160; (A13) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 136; (A14) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 137; (A15) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 138; (A16) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 215; (A17) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 216; (A18) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 217; (A19) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 218; (A20) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 219; (A21) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 220; (A22) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 221; (Α23) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 222; (A24) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 223; (A25) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 224; (A26) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:219, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:221 ou SEQ ID N0.223 ou uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:218, SEQ ID NO:222 ou SEQ ID NO:224; e (A27) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:216, SEQ ID N0.217, SEQ ID N0.218, SEQ ID NO:219, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:221, SEQ ID N0.222, SEQ ID NO:223 ou SEQ ID N0.224.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra o sítio de anelamento dos iniciadores de PCR utilizados para se obter o DNA (A1) da presente invenção e o DNA (B1) da presente invenção. Cada um dos números refere-se ao número da SEQ ID mostrando a seqüência de nucleotídeo dos iniciadores. As setas mostram os sítios de anelamento dos iniciadores de oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada com o seu número de SEQ ID e a direção de extensão da reação de DNA polimerase dos iniciadores. As linhas pontilhadas representam o DNA amplificado através de PCR utilizando os iniciadores. A linha grossa representa a região adjacente ao sítio de inserção de DNA do vetor utilizado para produzira biblioteca de DNA cromossômico. A Figura 2 mostra o sítio de anelamento dos iniciadores de PCR utilizados para se obter o DNA (A2) da presente invenção e o DNA (B2) da presente invenção. Cada um dos números refere-se ao número da SEQ ID mostrando a seqüência de nucleotídeo dos iniciadores. As setas mostram os sítios de anelamento dos iniciadores de oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada com o seu número de SEQ ID e a direção de extensão da reação de DNA polimerase dos iniciadores. As linhas pontilhadas representam o DNA amplificado através de PCR utilizando os iniciadores. A linha grossa representa a região adjacente ao sítio de inserção de DNA do vetor utilizado para produzir a biblioteca de DNA cromossômico. A Figura 3 mostra o sítio de anelamento dos iniciadores de PCR utilizados para se obter o DNA (A4) da presente invenção e o DNA (B4) da presente invenção. Cada um dos números refere-se ao número da SEQ ID mostrando a seqüência de nucleotídeo dos iniciadores. As setas mostram os sítios de anelamento dos iniciadores de oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada com o seu número de SEQ ID e a direção de extensão da reação de DNA polimerase dos iniciadores. As linhas pontilhadas representam o DNA amplificado através de PCR utilizando os iniciadores. A linha grossa representa a região adjacente ao sítio de inserção de DNA do vetor utilizado para produzir a biblioteca de DNA cromossômico. No entanto, o iniciador de oligonucleotídeo representado por 57 é um iniciador que anela para a região adjacente ao sítio de inserção de DNA do vetor utilizado para produzir a biblioteca de DNA cromossômico e falha em anelar com o DNA (A4) da presente invenção. A Figura 4 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pKSN2. A Figura 5 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pCRrSt12. A Figura 6 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pCR657ET. A Figura 7 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pCR657FET. A Figura 8 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pCR657Bs. A Figura 9 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pCR657FBs. A Figura 10 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pUCrSt12. A Figura 11 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pUCrSt657. A Figura 12 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pUCrSt657F. A Figura 13 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pl)CCR16G6-p/t. A Figura 14 mostra a estrutura do ligante Notl-EcoRI produzido através de anelamento do oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nu-cleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 89 e na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 90. A Figura 15 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pUCCRI 6G6-p/tA. A Figura 16 mostra a estrutura do ligante Hindlll-Notl produzido através de anelamento do oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 91 e na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 92. A Figura 17 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pNdG6-ΔΤ. A Figura 18 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pSUM-NdG6-rSt657. A Figura 19 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pSUM-NdG6-rSt657F. A Figura 20 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pKFrSt12. A Figura 21 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pKFrSt12- 657. A Figura 22 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pKFrSt12- 657F. A Figura 23 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pSUM-NdG6-rSt12-657. A Figura 24 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pSUM-NdG6-rSt12-657F. A Figura 25 mostra a estrutura do iigante Hindlll-Notl-EcoRI produzido através de anelamento do oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 98 e na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 99. A Figura 26 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pBI121S. A Figura 27 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pBI-NdG6- rSt-657. A Figura 28 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pBI-NdG6- rSt-657F. A Figura 29 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pBI-NdG6- rSt12-657. A Figura 30 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pBI-NdG6- rSt12-657F. A Figura 31 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pCR923Sp. A Figura 32 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pNdG6- rSt12. A Figura 33 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pSUM-NdG6-rSt-923. A Figura 34 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pKFrSt12- 923. A Figura 35 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pSUM-NdG6-rSt12-923. A Figura 36 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pBI-NdG6- rSt-923. A Figura 37 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pBI-NdG6- rSt12-923. A Figura 38 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pCR671 ET. A Figura 39 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pCR671Bs. A Figura 40 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pUCrSt671. A Figura 41 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pSUM-NdG6-rSt-671. A Figura 42 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pKFrSt12- 671. A Figura 43 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pSUM-NdG6-rSt12-671. A Figura 44 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pBI-NdG6- rSt-671. A Figura 45 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pBI-NdG6- rSt12-671. A Figura 46 mostra os resultados obtidos através de detecção com eletroforese de gel de agarose do DNA amplificado através de PCR usando como iniciador o oligonucleotídeo tendo uma seqüência de nucleotí-deo parcial do DNA (A) da presente invenção. As faixas 1, 7, 8, 12, 19, 26, 27, 32, 37, 42 e 47 representam a eletroforese de um marcador de DNA (digestão φ174/Haelll). As outras faixas representam a eletroforese da amostra mostrada nas Tabelas 20 e 21. A Figura 47 mostra a estrutura do ligante produzido através de anelamento do oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 134 e a seqüência de nucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 135. A Figura 48 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pUCrSt657soja. A Figura 49 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pSUM-NdG6-rSt-657soja. A Figura 50 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pKFrSt12- 657soja A Figura 51 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pSUM-NdG6-rSt12-657soja. A Figura 52 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pBI-NdG6-rSt-657soja. A Figura 53 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pBI-NdG6-rSt12-657soja. A Figura 54 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pUCrStl 584soja. A Figura 55 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pSUM-NdG6-rSt-1584soja. A Figura 56 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pKFrSt12- 1584soja. A Figura 57 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pSUM-NdG6-rSt12-1584soja. A Figura 58 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pBI-NdG6-rSt-1584soja. A Figura 59 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pBI-NdG6-rSt12-1584soja. A Figura 60 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pUCrSt1609soja. A Figura 61 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pSUM-NdG6-rSt-1609soja. A Figura 62 mostra a estrutura do ligante EcoT22l-12aa-EcoT22l produzido através de anelamento do oligonucleotídeo consistindo na se-qüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 402 e na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 403. A Figura 63 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pUCrSt12- 1609soja. A Figura 64 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pSUM-NdG6-rSt12-1609soja. A Figura 65 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pBI-NdG6-rSt-1609soja. A Figura 66 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pBI-NdG6-rSt12-1609soja.
As abreviações descritas nas figuras acima são explicadas abaixo: DNA A1 :o DNA (A1) da presente invenção DNA A2:o DNA (A2) da presente invenção DNA A3: o DNA (A3) da presente invenção DNA A4:o DNA (A4) da presente invenção DNA B1:o DNA (B1) da presente invenção DNA B2:o DNA (B2) da presente invenção DNA B4:a DNA (B4) da presente invenção DNA A1S:o DNA (A1 )S da presente invenção DNA A23S:o DNA (A23)S da presente invenção DNA A25S:o DNA (A25)S da presente invenção tac pipromotor tac rmB t:terminador rmB
ColE1 ori:a origem de replicação do plasmídeo ColE1 Ampr:o gene de resistência à ampicilina RuBPCssCTP: a seqüência de nucieotídeo codificando o peptí-deo de trânsito de cloroplasto da subunidade pequena de ribulose-1,5-bifosfato carboxilase de soja (cv. Jack). 12aa:a seqüência de nucieotídeo codificando os 12 aminoacidos de uma proteína madura seguindo o peptídeo de trânsito de cloroplasto da subunidade pequena de ribulose-1,5-bifosfato carboxilase de soja (cv. Jack). Kmr:gene de resistência à canamicina F1 ori:origem de replicação do plasmídeo F1 CR16G6p: promotor CR16G6 CR16t:terminador CR16 CR16tA:DNA onde a seqüência de nucieotídeo a jusante do sítio de restrição da enzima de restrição Seal é removida do terminador CR16 CR16G6pA:DNA onde a seqüência de nucieotídeo a montante do sítio de restrição da enzima de restrição Ndel é removida do terminador CR16G6 NOSp:promotor do gene de nopalina sintase NPTIkgene de resistência à canamicina NOSt.terminador do gene de nopalina sintase GUS:gene de β-glicuronidase RB:a sequência da borda direita do T-DNA
LB:a seqüência da borda esquerda do T-DNA
Ndel, Hindlil, BspHI, EcoRI, BamHi, EcoT221, Sphl, Kpnl, Saci, Bglll, Notl, Seal: os sítios de restrição da respectiva enzima de restrição.
MELHOR MODO DE REALIZAR A INVENÇÃO A presente invenção é explicada em detalhes abaixo. A proteína de metabolização de herbicida selecionada do grupo de proteína que segue (daqui em diante algumas vezes referida como "a proteína (A) da presente invenção" tem a habilidade de converter o composto da fórmula (II) (daqui em diante algumas vezes referido como "composto (II)") no composto da fórmula (III) (daqui em diante algumas vezes referido como "composto (III)”). < grupo de proteína > (A1) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:1; (A2) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:2; (A3) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:3; (A4) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 108; (A5) uma proteína tendo uma habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III) e compreendendo uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:108; (A6) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:108; (A11) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 159; (A12) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 160; (A13) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 136; (A14) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 137; (A15) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 138; (A16) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 215; (A17) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 216; (A18) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 217; (A19) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 218; (A20) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 219; (A21) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 220; (A22) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 221; (A23) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 222; (A24) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 223; (A25) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 224; (A26) uma proteína tendo uma habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:219, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:221 ou SEQ ID NO:223 ou uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:218, SEQ ID NO:222 ou SEQ ID NO:224; (A27) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:218, SEQ ID NO:219, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO-.221, SEQ ID NO:222, SEQ ID NO:223 ou SEQ ID NO:224; e (A28) uma proteína tendo uma habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por um DNA amplifi-cável através de uma reação de cadeia de polimerase com um iniciador compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma das SEQ ID Nos: 124 a 128, um iniciador compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 129 e como um molde um DNA cromossô-mico de Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces testaceus, Strep-tomyces achromogenes, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces thermo- coerulescens, Streptomyces nogalater, Streptomyces tsusimaensis, Strepto-myces glomerochromogenes, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces ornatus, Streptomyces griseus, Streptomyces lanatus, Streptomyces mi-sawanensis, Streptomyces pallidus, Streptomyces roseorubens, Streptomyces rutgersensis, Streptomyces steffisburgensis ou Saccharopolyspora taberi.
Como exemplos específicos da proteína (A) da presente invenção, são mencionados: uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:1 (daqui em diante algumas vezes referida como "proteína (A1) da presente invenção"; uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 2 (daqui em diante algumas vezes referida como "proteína (A2) da presente invenção "); uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 3 (daqui em diante algumas vezes referida como "proteína (A3) da presente invenção "); uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 108 (daqui em diante algumas vezes referida como "proteína (A4) da presente invenção "); uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 159 (daqui em diante algumas vezes referida como "proteína (A11) da presente invenção "); uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 160 (daqui em diante algumas vezes referida como "proteína (A12) da presente invenção "); uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 136 (daqui em diante algumas vezes referida como "proteína (A13) da presente invenção ”); uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 137 (daqui em diante algumas vezes referida como "proteína (A14) da presente invenção "); uma proteína compreendendo a sequência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 138 (daqui em diante algumas vezes referida como "proteína (A15) da presente invenção "); uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 215 (daqui em diante algumas vezes referida como "proteína (A16) da presente invenção "); uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 216 (daqui em diante algumas vezes referida como "proteína (A17) da presente invenção "); uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 217 (daqui em diante algumas vezes referida como "proteína (A18) da presente invenção "); uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 218 (daqui em diante algumas vezes referida como "proteína (A19) da presente invenção "); uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 219 (daqui em diante algumas vezes referida como "proteína (A20) da presente invenção "); uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 220 (daqui em diante algumas vezes referida como "proteína (A21) da presente invenção "); uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 221 (daqui em diante algumas vezes referida como "proteína (A22) da presente invenção "); uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 222 (daqui em diante algumas vezes referida como "proteína (A23) da presente invenção "); uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 223 (daqui em diante algumas vezes referida como "proteína (A24) da presente invenção "); e uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 224 (daqui em diante algumas vezes referida como "proteína (A25) da presente invenção ").
Por exemplo, reagindo o composto herbicida do tipo inibidor de PPO da fórmula (I) (daqui em diante algumas vezes referido como "composto (1)" com a proteína (A) da presente invenção, é possível converter o composto em um composto com atividade herbicida menor.
Ainda, no tratamento para converter o composto (I) em um composto de uma atividade herbicida menor pode ser utilizada uma proteína de metabolização de herbicida selecionada do grupo que segue (daqui em diante algumas vezes referida como "proteína (A) da presente invenção"): <grupo de proteína>: (A1) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:1; (A2) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:2; (A3) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:3; (A4) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:108; (A5) uma proteína tendo uma habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (lll), e compreendendo uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:108; (A6) uma proteína tendo uma habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (lll), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por uma seqüência de nu-cleotídeo tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:108; (Α7) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por um DNA que hibridiza, sob condições estringentes, em um DNA compreendendo uma seqüência de nu-cleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:108; (A8) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por um DNA amplificável através de uma reação de cadeia de polimerase com um iniciador compreendendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO:129, um iniciador compreendendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 124 a 128, e como um molde um cromossoma de um microorganismo pertencente a Streptomyces ou Saccharopolyspora; (A9) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 4; (A11) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 159; (A12) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 160; (A13) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 136; (A14) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 137; (A15) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 138; (A16) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 215; (A17) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 216; (Α18) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 217; (A19) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 218; (A20) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 219; (A21) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 220; (A22) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 221; (A23) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 222; (A24) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 223; (A25) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 224; (A26) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:219, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:221 ou SEQ ID NO:223 ou uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:218, SEQ ID NO:222 ou SEQ ID NO:224; e (A27) uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:218, SEQ ID NO:219, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:221, SEQ ID NO:222, SEQ ID NO:223 ou SEQ ID NO:224.
Como exemplos da presente proteína (A), pode ser mencionada a proteína A da presente invenção, conforme acima descrito. Ainda, como outros exemplo, podem ser mencionadas: uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:4 (daqui em diante algumas vezes referida como "presente proteína (A9)") e uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:5 (daqui em diante algumas vezes referida como "presente proteína (A10)").
Na seqüência de aminoacido da proteína mostrada em (A5), (A6), (A7), (A8), (A26), (A27) ou (A28) nos grupos de proteína acima, as diferenças que podem ser observadas a partir das seqüências de aminoacido mostradas na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 108, 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 ou 224 são tais como deleção, substituição e adição de certos aminoacidos. Tais diferenças incluem, por exemplo, a deleção do processamento que a proteína acima compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 1,2, 3, 108, 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 ou 224 recebe dentro da célula. Ainda, é incluída uma variação polimórfica que acontece naturalmente resultante da diferença entre tal como espécies, indivíduo ou similar do organismo de onde a proteína é derivada; deleções, substituições e adições de aminoacido que surgem de mutações genéticas artificialmente introduzidas através de por exemplo um método de mutagênese direcionada ao sítio, e método de mutagênese aleatório, um tratamento mutagênico e similar. O número de aminoacidos que sofrem tais deleções, substituições e adições pode estar dentro da faixa onde a presente proteína (A) pode desenvolver a habilidade de converter o composto (II) no composto (III). Ainda, como uma substituição do aminoacido podem ser mencionados, por exemplo, substituições para um aminoacido que é similar em hidrofobicida-de, carga, pK, característica estéreo-estrutural, ou similar. Como tais substituições, especificamente, por exemplo, são mencionadas substituições dentro dos grupos de: (1) glicina e alanina; (2) valina, isoleucina e leucina; (3) ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina e glutamina; (4) serina e treoni-na; (5) lisina e arginina; (6) fenilalanina e tirosina; e similar.
Ainda, na presente proteína (A), é preferido que a cisteína presente na posição alinhando com a cisteína do aminoacido número 357 na seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:1 seja conservada (não sofrendo uma deleção ou substituição): exemplos de tal cisteína incluem a cisteína mostrada no aminoacido número 350 na seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:2, a cisteína mostrada no aminoacido número 344 na seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:3, a cisteína mostrada no aminoacido número 360 na seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 108, a cisteína mostrada no aminoacido número 359 na seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:4, a cisteína mostrada no aminoacido número 355 na seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:5, a cisteína mostrada no aminoacido número 358 na seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:159, a cisteína mostrada no aminoacido número 374 na seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:160, a cisteína mostrada no aminoacido número 351 na seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 136, a cisteína mostrada no aminoacido número 358 na seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:137, a cisteína mostrada no aminoacido número 358 na seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 138, a cisteína mostrada no aminoacido número 347 na seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:222, a cisteína mostrada no aminoacido número 347 na seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO:224 e similar.
Como métodos de artificialmente causar tais deleções, adições ou substituições de aminoacido (daqui em diante algumas vezes coletivamente referidas como "modificação de aminoacido"), por exemplo, é mencionado um método compreendendo as etapas de realizar mutagênese direcionada ao local no DNA codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 108, 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 ou 224, e então permitindo a expressão de tal DNA através de um método convencional. Como o método de mutagênese direcionada ao local, por exemplo, é mencionado um método que utiliza mutações "amber" (Método Gapped Duplex, Nucleic Acids Res., 12, 9441-9456 (1984)), um método através de PCR utilizando iniciadores para introdução de uma mutação e similar. Ainda, como métodos de artificialmente modificar aminoacidos, por exemplo, é mencionado um método compreendendo as etapas de realizar mutagênese aleatória no DNA codificando qualquer uma das seqüências de aminoacido mostradas na SEQ ID NO: 1,2, 3, 108, 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 ou 224 e então permitir a expressão de tal DNA através de um método convencional. Como o método de mutagênese aleatória, por exemplo, é mencionado o método de realização de PCR utilizando o DNA codificando qualquer uma das seqüências de aminoacido acima como um molde e utilizando um par de iniciador que pode ser amplificado para o comprimento completo de cada um do DNA, sob a condição onde a concentração de cada um de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, utilizados como substrato, é diferente da comum ou sob a condição onde a concentração de Mg2+ que promove a reação de polimerase é aumentada para mais do que comum. Como tais métodos de PCR, por exemplo, é mencionado o método descrito em Method in Molecular Biology, (31), 1994, 97-112. Ainda, pode ser mencionado o método descrito no pedido de patente PCT WO 00/09682.
Na presente invenção, "identidade de seqüência" refere-se à homologia e identidade entre duas seqüências de nucleotídeo ou duas seqüências de aminoacido. Tal "identidade de seqüência" pode ser determinada comparando as duas seqüências, cada uma alinhada em um estado ótimo, em toda a região das seqüências de teste. Desse modo, adições ou de- leções (por exemplo, lacunas) podem ser utilizadas no alinhamento ótimo das seqüências de acido nucléico ou seqüências de aminoacido de teste. Tal identidade de seqüência pode ser calculada através da etapa de produção do alinhamento conduzido através de uma análise de homologia usando um programa tal como FASTA (Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 4, 2444-2448 (1988)), BLAST (Altschul e outros, Journal of Molecular Biolo-gy, 215, 403-410 (1990)), CLUSTAL W (Thompson, Higgins & Gibson, Nucleic Acid Research, 22,4673-4680 (1994a)) e similar. Tais programas, por exemplo, podem ser tipicamente utilizados na webpage (http://www.ddbj.nig.ac.jp) do Banco de Dados de DNA do Japão (o banco de dados internacional operado dentro do Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan). Ainda, a identidade de seqüência pode ser determinada utilizando um software de análise de seqüência comercialmente disponível. Especificamente por exemplo, ela pode ser calculada produzindo um alinhamento conduzido através de uma análise de homologia através do método Lipman-Pearson (Lipman, D.J. e Pearson, W.R., Science, 227, 1435-1441, (1985)) utilizando GENETYX-WIN Ver.5 (Software Development Company, Ltd.).
Como a "condição estringente" descrita em (A7), podem ser mencionadas, por exemplo, as condições sob as quais um híbrido é formado a 45°C em uma solução contendo 6xSSC (deixar a solução contendo 1,5M de NaCI e 0,15M de citrato de trissódio ser 10xSSC) e então o híbrido é lavado a 50°C com 2xSSC (Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6) em uma hibridização realizada de acordo com o método convencional descrito tal como em Sambrook, J., Frisch, E.F., e Maniatis, T.; Molecular Cloning 2a Edição, Cold Spring Harbor Press. A concentração de sal na etapa de lavagem pode ser selecionada, por exemplo, das condições de 2 x SSC (condição de baixa estringência) até as condições de 0,2 x SSC (condições de alta estringência). Uma temperatura na etapa de lavagem pode ser selecionada, por exemplo, da temperatura ambiente (condição de baixa estringência) a 65°C (condição de alta estringência). Alternativamente, ambas concentração de sal e temperatura podem ser mudadas.
Como um DNA que "hibridiza, sob condições estringentes, para um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 108", especificamente, por exemplo, pode ser mencionado um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 108, 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 ou 224, um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 6, 7, 8, 78, 84, 109, 139, 140, 141, 142, 143, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233 ou 234, e similar. Pode ser mencionado um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos cerca de 60% de identidade com uma seqüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 6, 7, 8, 78, 84, 109, 139, 140, 141, 142, 143, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231,232, 233 ou 234. O peso molecular da presente proteína (A) é cerca de 30.000 a 60.000 e é tipicamente cerca de 40.000 a 50.000 (comparável a, por exemplo, uma proteína consistindo na seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 108, 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 ou 224), como o peso molecular identificado por uma eletroforese de gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida (daqui em diante referida como "SDS-PAGE"). Ainda, a presente proteína (A), contanto que a habilidade de converter o composto (II) no composto (III) não seja eliminada, pode ser utilizada como uma proteína à qual a seqüência de aminoacido é adicionada a montante do seu terminal amino ou a jusante do seu terminal carbóxi.
Como o marcador da habilidade da presente proteína (A) em metabolizar o composto herbicida do tipo inibidor de PPO da fórmula (I) pode ser mencionada a habilidade em converter o composto (II) no composto (III). Tal habilidade, pode exemplo, pode ser confirmada através de reação do composto (II) com a presente proteína (A) na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron tal como coenzima NADPH e através de detecção do composto (III) produzido. O "sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron" refere-se a um sistema onde uma reação de cadeia redox acontece e um elétron é transferido do doador de elétron para a presente proteína (A). Como o doador de elétron, por exemplo, são mencionadas as coenzimas NADPH, NADH e similar. Por exemplo, as proteínas que podem constituir o sistema de transporte de elétron de NADPH para a presente proteína (A), são mencionadas a ferredoxina e a ferredoxina-NADP+ redutase, NADPH-citocroma P-450 redutase e similar.
Para confirmar a habilidade de conversão do composto (II) no composto (III), por exemplo, uma solução de reação de cerca de pH 7, compreendendo a presente proteína (A), β-NADPH, ferredoxina, ferredoxina-NADP+ redutase e composto (II) marcado com um radioisótopo, é incubada em cerca de 30°C por cerca de 10 minutos a 1 hora. Subseqüentemente, após tornar a solução de reação ácido adicionando ácido clorídrico, ela é extraída com acetato de etila. Após submeter a camada de acetato de etila recuperada à cromatografia de camada fina (daqui em diante referida como TLC"), autorradiografia é realizada e a habilidade de converter o composto (II) no composto (III) pode ser confirmada através da detecção do composto (III) marcado.
Para preparar a presente proteína (A), por exemplo, primeiro o DNA codificando a presente proteína (A) (daqui em diante, algumas vezes, coletivamente referida como "DNA (A) presente") é obtido de acordo com os métodos de engenharia genética convencionais (por exemplo, os métodos descritos em Sambrook, J., Frisch, E.F., Maniatis, T.; Molecular Cloning 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory press).
Como exemplos do DNA (A) presente, pode ser mencionado um DNA codificando a proteína (A) da presente invenção (daqui em diante algumas vezes referida como "DNA (A) da presente invenção". Como exemplos específicos de DNA (A) da presente invenção podem ser mencionados: um DNA codificando uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 1 (daqui em diante algumas vezes referida como "DNA (A1) da presente invenção"); um DNA codificando uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 2 (daqui em diante algumas vezes referida como "DNA (A2) da presente invenção"); um DNA codificando uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 3 (daqui em diante algumas vezes referida como "DNA (A3) da presente invenção"); um DNA codificando uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 108 (daqui em diante algumas vezes referida como "DNA (A4) da presente invenção"); um DNA codificando uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 159 (daqui em diante algumas vezes referida como "DNA (A11) da presente invenção"); um DNA codificando uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 160 (daqui em diante algumas vezes referida como "DNA (A12) da presente invenção"); um DNA codificando uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 136 (daqui em diante algumas vezes referida como "DNA (A13) da presente invenção"); um DNA codificando uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 137 (daqui em diante algumas vezes referida como "DNA (A14) da presente invenção”); um DNA codificando uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 138 (daqui em diante algumas vezes referida como "DNA (A15) da presente invenção"); um DNA codificando uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 215 (daqui em diante algumas vezes referida como "DNA (A16) da presente invenção"); um DNA codificando uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 216 (daqui em diante algumas vezes referida como "DNA (A17) da presente invenção"); um DNA codificando uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 217 (daqui em diante algumas ve- zes referida como "DNA (A18) da presente invenção"); um DNA codificando uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 218 (daqui em diante algumas vezes referida como "DNA (A19) da presente invenção"); um DNA codificando uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 219 (daqui em diante algumas vezes referida como "DNA (A20) da presente invenção"); um DNA codificando uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 220 (daqui em diante algumas vezes referida como "DNA (A21) da presente invenção"); um DNA codificando uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 221 (daqui em diante algumas vezes referida como "DNA (A22) da presente invenção"); um DNA codificando uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 222 (daqui em diante algumas vezes referidacomo "DNA (A23) da presente invenção"); um DNA codificando uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 223 (daqui em diante algumas vezes referida como "DNA (A24) da presente invenção"); um DNA codificando uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 224 (daqui em diante algumas vezes referida como "DNA (A25) da presente invenção"); e similar.
Ainda como exemplos mais específicos do DNA (A) da presente invenção podem ser mencionados: um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 6; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 9; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 7; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ IDNO:10; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 8; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 11; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 109; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 110; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 139; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 144; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 140; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 145; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 141; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 146; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 142; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 147; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 143; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 148; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 225; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 235; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 226; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 236; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 227; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 237; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 228; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 238; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 229; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 239; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 230; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 240; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 231; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 241; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 232; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 242; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 233; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 243; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 234; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 244; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ IDNO:214; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 368; um DNA compreendendo a seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 393; um DNA codificando uma proteína tendo a habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 6, 7, 8 ou 109; um DNA codificando uma proteína tendo uma habilidade de converter na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron um composto da fórmula (II) em um composto da fórmula (III), e tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 139, 140, 141, 142, 143, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231,232, 233 ou 234; e similar.
Ainda, como exemplos do DNA (A) presente, além do DNA (A) da presente invenção, podem ser mencionados: um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo codificando uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 4 (daqui em diante referida algumas vezes como "presente DNA (A9)"); um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 78; um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo codificando uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 5 (daqui em diante referida algumas vezes como "presente DNA (A10)"); um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 84; um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 85; e similar. O DNA (A) presente, por exemplo, pode ser um DNA clonado da natureza e pode ser um DNA onde uma deleção, substituição ou adição de nucleotídeo(s) foi introduzida no DNA clonado da natureza através de tal método de mutagênese direcionado ao local, um método de mutagênese aleatório, e pode ser um DNA artificialmente sintetizado. Subseqüentemente, a presente proteína (A) pode ser produzida ou obtida através de expressão do DNA (A) presente de acordo com métodos de engenharia genética convencionais. Desse modo, a presente proteína (A) pode ser preparada. O DNA (A) presente pode ser preparado, por exemplo, através dos métodos que seguem. Primeiro, DNA cromossômico é preparado através de métodos de engenharia genética convencionais, tal como aqueles descritos em Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2- Edição (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; e Current Protocols in Molecular Biology (1987), John Wiley & Sons, Incorporated, a partir de microorganismos pertencentes a Streptomyces, tal como Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces testaceus, Strepotomyces achromogenes, Streptomyces gri-seolus, Streptomyces carbophilus, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces thermocoerulescens, Streptomyces nogalater, Streptomyces tsusimaensis, Streptomyces glomerochromogenes, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces ornatus, Streptomyces griseus, Streptomyces lanatus, Streptomyces misawanensis, Streptomyces pallidus, Streptomyces roseorubens, Streptomyces rutgersensis e Streptomyces steffisburgensis, e mais especifi-camente, Streptomyces phaeochromogenes IF012898, Streptomyces testaceus ATCC21469, Streptomyces achromogenes IFO 12735, Streptomyces griseolus ATCC11796, Streptomyces carbophilus SANK62585, Streptomyces griseofuscus IFO 12870t, Streptomyces thermocoerulescens IFO 14273t, Streptomyces nogalater IFO 13445, Streptomyces tsusimaensis IFO 13782, Streptomyces glomerochromogenes IFO 13673t, Streptomyces olivochromo-genes IFO 12444, Streptomyces ornatus IFO 13069t, Streptomyces griseus ATCC 10137, Streptomyces griseus IFO 13849T, Streptomyces lanatus IFO 12787T, Streptomyces misawanensis IFO 13855T, Streptomyces pallidus IFO 13434T, Streptomyces roseorubens IFO 13682T, Streptomyces rutger-sensis IFO 15875T e Streptomyces steffisburgensis IFO 13446T, e similar; ou microorganismos pertencentes a Saccharopolyspora, tal como Saccharo-polyspora taberi, mais especificamente, Saccharopolyspora taberi JCM 9383t e similar. Em seguida, após digestão parcial do DNA cromossômico com uma enzima de restrição tal como Sau3AI, um DNA de cerca de 2 kb é recuperado. O DNA recuperado é clonado em um vetor de acordo com os métodos de engenharia genética convencionais descritos em "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a Edição" (1989), Cold Spring Harbor Labo-ratory Press; e "Current Protocols in Molecular Biology" (1987), John Wiley & Sons, Incorporated. Como o vetor, especificamente, por exemplo, podem ser utilizados pUC 119 (TaKaRa Shuzo Company), pTVA 118N (Takara Shuzo Company), pBluescript II (Toyobo Company), pCR2.1-TOPO (Invitrogen), pTrc99A (Amersham Pharmacia Biotech Company), pKK331-1A (Amersham Pharmacia Biotech Company), e similar. Uma biblioteca de DNA cromossômico pode ser obtida através de extração do plasmídeo do clone obtido. O DNA (A) presente pode ser obtido através de hibridização de uma sonda com a biblioteca de DNA cromossômico obtida sob as condições descritas abaixo, e através de detecção e recuperação do DNA que se liga especificamente com a sonda. A sonda pode ser um DNA consistindo em cerca de pelo menos 20 nucleotídeos compreendendo a seqüência de nu-cleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 1, 2, 3 ou 108. Como exemplos específicos do DNA que pode ser utilizado como sondas pode ser mencionado um DNA compreendendo um ácido nucléico mostrado em qualquer uma da SEQ ID NO: 6, 7, 8 ou 109; um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo parcial da seqüência de ácido nucléico mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 6, 7, 8 ou 109; um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo complementará dita seqüência de nucleotídeo parcial; e similar. O DNA utilizado como sonda é marcado com um radioisótopo, coloração fluorescente ou similar. Para marcar o DNA com um radioisótopo, por exemplo, pode ser utilizado o Random Labeling Kit da Boehringer ou Takara Shuzo Company. Ainda, um DNA marcado com 32P pode ser preparado realizando PCR. O DNA a ser utilizado para sonda é utilizado como o molde. O dCTP tipicamente utilizado na solução de reação de PCR é trocado com (a-32P)dCTP. Ainda, quando DNA for marcado com coloração fluorescente, por exemplo, pode ser utilizado o DIG-High Prime DNA labeling and Detection Starter Kit II (Roche Company).
Um exemplo específico de preparação da sonda é explicado a seguir. Por exemplo, um DNA marcado com digoxigenina, compreendendo o comprimento completo da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 6, pode ser obtido utilizando o DNA cromossômico preparado a partir de Streptomyces phaeochromogenes IF012898 conforme acima descrito ou uma biblioteca de DNA cromossômico como um molde, utilizando como ini-ciadores um oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 93 e um oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 94, e conduzindo PCR conforme descrito nos exemplos descritos abaixo com, por exemplo, o Kit PCR DIG Probe synthesis (Roche Diagnostics GmbH) de acordo com o manual anexo. Similarmente, um DNA marcado com digoxigenina, compreendendo a seqüência de nucleotídeo do ácido nucléico 57 para o nucleotídeo 730 mostrado na SEQ ID NO: 6 pode ser obtida utilizando o DNA cromossômico preparado a partir de Streptomyces phaeochromogenes IF012898 conforme acima descrito ou biblioteca de DNA cromossômica como o molde. Como iniciadores, a PCR é conduzida com um oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 130 e um oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 131. Ainda, DNA marcado com digoxigenina, compreendendo o comprimento completo da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 7, pode ser obtido utili- zando o DNA cromossômico preparado a partir de Saccharopolyspora taberi JCM 9383t conforme acima descrito ou biblioteca de DNA cromossômico como o molde. Como iniciadores, a PCR é conduzida com um oligonucleotí-deo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 61 e um oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 62. Ainda, um DNA marcado com digoxigenina, compreendendo o comprimento completo da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 8 pode ser obtido utilizando o DNA cromossômico preparado a partir de Streptomyces testaceus ATCC21469 conforme descrito acima ou biblioteca de DNA cromossômico com o molde. Como iniciadores, a PCR é conduzida com um oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 70 e um oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 71. Ainda, um DNA marcado com digoxigenina, compreendendo a seqüência de nucleotídeo do nucleotídeo 21 ao nucleotídeo 691 mostrado na SEQ ID NO: 8, pode ser obtido utilizando o DNA cromossômico preparado a partir de Streptomyces testaceus ATCC21469 conforme acima descrito ou uma biblioteca de DNA cromossômico como o molde. Como iniciadores, a PCR é conduzida com um oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 132 e um oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 133.
Os métodos através dos quais uma sonda é permitida hibridizar com a biblioteca de DNA cromossômico podem incluir hibridização de colônia e hibridização de placa, e um método apropriado pode ser selecionado, que seja compatível com o tipo de vetor usado na preparação de biblioteca. Quando a biblioteca utilizada é construída com o uso de vetores de plasmí-deo, hibridização de colônia é conduzida. Especificamente primeiro, os transformantes são obtidos introduzindo o DNA da biblioteca em microorganismo onde o vetor do plasmídeo utilizado para construir a biblioteca é repli-cável. Os transformantes obtidos são diluídos e espalhados em uma placa de ágar e culturados até a colônia aparecer. Quando um vetor de fago é utilizado para construir a biblioteca, a hibridização de placa é conduzida. Espe- cificamente, primeiro, o microorganismo onde o vetor do fago utilizado para produzir a biblioteca é replicável é misturado com o fago da biblioteca, sob as condições onde infecção é possível. A mistura é então ainda misturada com ágar macio. Esta mistura é então espalhada em uma placa de ágar. Subseqüentemente, a mistura é culturada até que placas apareçam.
Em seguida, no caso de qualquer uma das hibridizações acima, uma membrana é posta na superfície da placa de ágar onde a cultura acima foi conduzida e as colônias dos transformantes ou as partículas do fago nas placas são transferidas para a membrana. Após tratamento alcalino da membrana, há um tratamento de neutralização. O DNA eluído a partir dos transformantes ou das partículas de fago é então fixado na membrana. Mais especificamente, por exemplo, no caso de hibridização de placa, as partículas do fago são absorvidas na membrana pondo uma membrana de nitroce-lulose ou uma membrana de náilon, especificamente, por exemplo, Hybond-N+ (Amersham Pharmacia Biotech Company) na placa de ágar e esperando por 1 minuto. A membrana é embebida em uma solução alcalina (1,5M de NaCI e 0,5N de NaOH) por cerca de 3 minutos para dissolver as partículas de fago e eluir o DNA do fago sobre a membrana. A membrana é então embebida em solução de neutralização (1,5M de NaCI e 0,5M tampão de tris-HCI pH 7,5) por cerca de 5 minutos. Após lavagem da membrana em solução de lavagem (0,3M de NaCI, 30 mM de citrato de sódio, 0,2M de tampão de tris-HCI pH 7,5) por cerca de 5 minutos, por exemplo, o DNA do fago é fixado sobre a membrana através de incubação por volta de 80°C por cerca de 90 minutos in vacuo.
Utilizando a membrana preparada desta maneira, a hibridização é realizada com o DNA acima como uma sonda. A hibridização pode ser conduzida, por exemplo, de acordo com a descrição em "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a Edição (1989)" Cold Spring Harbor Laboratory Press", e similar.
Embora várias condições de temperatura e reagentes sejam valiosos para realizar a hibridização, a membrana preparada conforme acima descrito é embebida com e mantida por 1 hora a 4 horas a 42°C a 65°C em uma solução de pré-hibridização, a qual é preparada em uma razão a partir de 50 μΙ; A 200 μΙ por 1 cm2 da membrana. A solução de pré-hibridização, por exemplo, pode conter 450 mM a 900 mM de NaCI e 45 mM a 90 mM de citrato de sódio, contém dodecil sulfato de sódio (daqui em diante referido como "SDS") em uma concentração de 0,1% a 1,0%, e contém DNA não-específico desnaturado em uma concentração a partir de 0 pg/ml a 200 μς/ιηΙ, e pode algumas vezes conter albumina, ficol, e polivinil pirrolidonas, cada um em uma concentração de 0% a 0,2%. Subseqüentemente, por exemplo, a membrana é embebida com e mantida por 12 horas a 20 horas a 42°C a 65°C em uma solução de hibridização, a qual é preparada em uma razão a partir de 50 μΐη a 200 μΙ por 1 cm2 da membrana. A solução de hibridização é, por exemplo, uma mistura da solução de pré-hibridização, a qual pode conter 450 mM a 900 mM de NaCI e 45 mM a 90 mM de citrato de sódio, contém SDS em uma concentração de 0,1% a 1,0%, e contém DNA não-específico desnaturado em uma concentração a partir de 0 pg/ml a 200 pg/ml, e pode algumas vezes conter albumina, ficol e polivinil pirrolidonas, cada um em uma concentração de 0% a 0,2% com a sonda obtida com o método de preparação descrito acima (em uma quantidade relativa de 1,0x104 cpm a 2,0x106 cpm por 1 cm2 da membrana). Subseqüentemente, a membrana é removida e uma lavagem de 5 minutos a 15 minutos é conduzida cerca de 2 a 4 vezes, utilizando uma solução de lavagem de 42°C a 65°C que contém 15 mM a 300 mM de NaCI, 1,5 mM a 30 mM de citrato de sódio e 0,1% a 1,00% de SDS. Ainda, após enxágüe suave com solução 2xSSC (300 mM de NaCI e 30 mM de citrato de sódio), a membrana é seca. Ao detectar a posição da sonda na membrana ao submeter a membrana à auto-radiografia, a posição do DNA hibridizando para a sonda utilizada na membrana é identificada. Alternativamente, pré-hibridização e hibridização podem ser conduzidas com o uso de um kit de hibridização comercialmente disponível, tal como com o uso de solução de hibridização contida no DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II (Roche). Após hibridização, por exemplo, a membrana é lavada duas vezes por 5 minutos em temperatura ambiente em 2xSSC contendo 0,1% de SDS, seguido por lavagem duas vezes por 15 minutos a 65°C em 0,5xSSC contendo 0,1% de SDS. A posição dos DNAs na membrana de hibridização com a sonda utilizada é detectada, tratando por sua vez a membrana lavada com a solução de detecção contida no kit e detectando a posição da sonda na membrana.
Os clones correspondendo às posições dos DNAs detectados na membrana são identificados no meio de ágar original, e podem ser pegos para isolar clones carregando esses DNAs. O DNA (A) presente obtido de acordo com acima pode ser clo-nada em um vetor de acordo com métodos de engenharia genética convencionais descritos em "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a Edição" (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, "Current Protocols in Molecular Biology" (1987), John Wiley & Sons Incorporated, e similar. Como o vetor, especificamente, por exemplo, podem ser utilizados pUCA119 (Takara Shu-zo Company), pTVA118N (Takara Shuzo Company), pBluescriptll (Toyobo Company), pCR2.1-TOPO (Invitrogen Company), pTrc99A (Pharmacia Company), pKK331-1A (Pharmacia Company) e similar.
Ainda, a seqüência de nucleotídeo do DNA (A) presente obtido de acordo com a descrição acima pode ser analisado através do método de terminador didesóxi descrito em F. Sanger, S. Nicklen, A.R. Coulson, Proce-eding of National Academy of Science U.S.A. (1977) 74:5463-5467. Na preparação da amostra para análise de seqüência de nucleotídeo, um reagente comercialmente disponível pode ser utilizado, tal como o ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit da Perkin Elmer Company. O DNA (A) presente pode ser também preparado como segue. O DNA (A) presente pode ser amplificado conduzindo PCR. PCR pode utilizar como um molde o DNA cromossômico ou biblioteca de DNA cromossô-mico preparada conforme descrito acima a partir de microorganismos pertencentes a Streptomyces, tal como Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces testaceus, Streptomyces achromogenes, Streptomyces gríse-olus, Streptomyces carbophilus, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces thermocoerulescens, Streptomyces nogalater, Streptomyces tsusimaensis, Streptomyces glomerochromogenes, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces ornatus, Streptomyces griseus, Streptomyces lanatus, Streptomyces misawanensis, Streptomyces pallidus, Streptomyces roseoru-bens, Streptomyces rutgersensis e Streptomyces steffisburgensis, e mais especificamente, Streptomyces phaeochromogenes IF012898, Streptomyces testaceus ATCC21469, Streptomyces achromogenes IFO 12735, Streptomyces griseolus ATCC11796, Streptomyces carbophilus SANK62585, Streptomyces griseofuscus IFO 12870t, Streptomyces thermocoerulescens IFO 14273t, Streptomyces nogalater IFO 13445, Streptomyces tsusimaensis IFO 13782, Streptomyces glomerochromogenes IFO 13673t, Streptomyces olivochromogenes IFO 12444, Streptomyces ornatus IFO 13069t, Streptomyces griseus ATCC 10137, Streptomyces griseus IFO 13849T, Streptomyces lanatus IFO 12787T, Streptomyces misawanensis IFO 13855T, Streptomyces pallidus IFO 13434T, Steptomyces roseorubens IFO 13682T, Strepto-myces rutgersensis IFO 15875T e Streptomyces steffisburgensis IFO 13446T, e similar; ou microorganismos pertencendo a Saccharopolyspora, tal como Saccharopolyspora taberi, mais especificamente, Saccharopolyspora taberi JCM 9383t e similar. A PCR pode também utilizar um oligonucleotídeo compreendendo pelo menos cerca de 20 nucleotídeos do terminal 5' da seqüên-cia de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 108, 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 ou 224, com um oligonucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeo complementar a pelo menos cerca de 20 nucleotídeos adjacentes ao terminal 3’ ou a jusante do terminal 3' da seqüência de nucleotídeo codificando qualquer uma das se-qüências de aminoacido acima. A PCR pode ser conduzida sob as condições descritas abaixo. No lado terminal 5' do iniciador utilizado para a PCR conforme acima descrito, uma seqüência de reconhecimento de enzima de restrição pode ser adicionada.
Mais especificamente, por exemplo, um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 1, um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 6, ou similar podem ser preparados conduzin- do PCR utilizando como o molde o DNA cromossômico ou biblioteca de DNA cromossômico preparada a partir de Streptomyces phaeochromogenes IF012898 e utilizando como iniciadores um oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 51 e um oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO:52. Alternativamente, um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 9 (contendo uma seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 1) pode ser amplificado conduzindo PCR utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 51 e um oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 53.
Por exemplo, um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 2, um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 7, ou similar, pode ser preparado conduzindo PCR utilizando como o molde o DNA cromossômico ou biblioteca de DNA cromossômico preparada a partir de Saccharopolyspora taberi JCM 9383t e utilizando como iniciadores um oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 61 e um oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 62. Alternativamente, um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 10 (contendo uma seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 2) pode ser amplificado conduzindo PCR utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 61 e um oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 63.
Por exemplo, um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 108, um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 109, ou similar pode ser preparado conduzindo PCR utilizando como o molde o DNA cromossômico ou biblioteca de DNA cromossômico prepara- da a partir de Streptomyces achromogenes IFO 12735 e utilizando como iniciadores um oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 119 e um oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 120. Alternativamente, um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 110 (contendo uma seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 108) pode ser amplificado conduzindo PCR utilizando como iniciadores os oligonucleotídeos compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 119 e um oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 121.
Por exemplo, um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 144 (contendo uma seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 159) pode ser preparado conduzindo PCR utilizando como o molde o DNA cromossô-mico ou biblioteca de DNA cromossômico preparada a partir de Streptomyces nogalater IFO 13445 e utilizando como iniciadores um oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 165 e um oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 166.
Por exemplo, um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 145 (contendo uma seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 160) pode ser preparado conduzindo PCR utilizando como o molde o DNA cromossômico ou biblioteca de DNA cromossômico preparada a partir de Streptomyces tsusimaensis IFO 13782 e utilizando como iniciadores um oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 171 e um oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 172.
Por exemplo, um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 146 (contendo uma seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 136) pode ser preparado conduzindo PCR utilizando como o molde o DNA cromossô- mico ou biblioteca de DNA cromossômico preparada a partir de Streptomy-ces thermocoerulescens IF014273t e utilizando como iniciadores um oligo-nucleotídeo compreendendo a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 177 e um oligonucleotídeo compreendendo a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 178.
Por exemplo, um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 147 (contendo uma seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 137) pode ser preparado conduzindo PCR utilizando como o molde o DNA cromossômico ou biblioteca de DNA cromossômico preparada a partir de Streptomy-ces glomerochromogenes IF013673t e utilizando como iniciadores um oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 183 e um oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 184.
Por exemplo, um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 148 (contendo uma seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 138) pode ser preparado conduzindo PCR utilizando como o molde o DNA cromossômico ou biblioteca de DNA cromossômico preparada a partir de Streptomy-ces olivochromogenes IFO 12444 e utilizando como iniciadores um oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 184 e um oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 185.
Quando utilizando como o molde a biblioteca de DNA onde o DNA cromossômico é introduzido no vetor, por exemplo, o DNA (A) presente pode ser também amplificado conduzindo CPR utilizando como iniciadores um oligonucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeo selecionada a partir de uma seqüência de nucleotídeo codificando qualquer uma das seqüências de aminoacido mostradas na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 108, 159, 160, 136, 137 ou 138 (por exemplo, um oligonucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeo de pelo menos cerca de 20 nucleotídeos do lado terminal 5' da seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 1) e um oligonucleotídeo de pelo menos cerca de 20 nucleotídeos compreendendo uma seqüência de nucleotí-deo complementar à seqüência de nucleotídeo adjacente ao local de inserção de DNA do vetor utilizado para construir a biblioteca. No lado do terminal 5' do iniciador utilizado para PCR conforme acima descrito, uma seqüência de reconhecimento de enzima de restrição pode ser adicionada.
Como as condições para tal PCR acima descrita, especificamente por exemplo, pode ser mencionada a condição de manutenção 97°C por 2 minutos, então repetição por 10 ciclos de um ciclo que inclui manutenção em 97°C por 15 segundos, seguido por 65°C por 30 segundos, então 72°C por 2 minutos; então condução por 15 ciclos de um ciclo que inclui manter 97°C por 15 segundos, seguido por 68°C por 30 segundos e seguido por 72°C por 2 minutos (adição de 20 segundos a cada ciclo de cada vez); e então mantendo 72°C por 7 minutos. A PCR pode utilizar uma solução de reação de 50 μΙ, contendo 50 ng de DNA cromossômico, contendo 300 nM de cada um dos 2 iniciadores em tais pares descritos acima, contendo 5,0 μΙ de mistura dNTP (uma mistura de 2,0 mM de cada um dos 4 tipos de dNTPs), contendo 5,0 μΙ de tampão 10xExpand HF (contendo MgC^, Roche Molecular Biochemicals Company) e contendo 0,75μΙ de Mistura de enzima Expand HiFi (Roche Molecular Biochemicals Company).
Alternativamente, pode ser mencionada a condição de manutenção de 97°C por 2 minutos, então repetição por 30 ciclos de um ciclo que inclui 97°C por 15 segundos, seguido por 60°C por 30 segundos, e seguido por 72°C por 90 segundos, e então mantendo a solução de reação a 72°C por 4 minutos. A PCR pode utilizar uma solução de reação de 50 μΙ contendo 250 ng de DNA cromossômico, contendo 200 nM de cada um dos 2 iniciadores em tais pares descritos acima, contendo 5,0 μΙ de mistura dNTP (uma mistura de 2,5 mM de cada um dos 4 tipos de dNTPs), contendo 5,0 μΙ de tampão 10x Extaq HF (contendo MgCb, Takara Shuzo Company) e contendo 0,5μΙ de ExTaq Polymerase (Takara Shuzo Company).
Alternativamente, por exemplo, oligonucleotídeos podem ser produzidos e preparados para uso como iniciadores, com base na seqüência de nucleotídeo de uma região à qual a identidade de seqüência é particularmente alta na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 6, 7, 8 ou 109. O DNA (A) presente pode ser também obtido conduzindo PCR utilizando os oligonucleotídeo como iniciadores e um DNA cromossômico ou biblioteca de DNA cromossômico. O DNA cromossômico ou biblioteca de DNA cromossômico pode ser preparado conforme acima descrito para microorganismos pertencentes a Streptomyces, tal como Streptomyces phaeochromo-genes, Streptomyces testaceus, Streptomyces achromogenes, Streptomyces griseolus, Streptomyces carbophilus, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces thermocoerulescens, Streptomyces nogalater, Streptomyces tsusima-ensis, Streptomyces gtomerochromogenes, Streptomyces olivochromoge-nes, Streptomyces ornatus, Streptomyces griseus, Streptomyces lanatus, Streptomyces misawanensis, Streptomyces pallidus, Streptomyces roseoru-bens, Streptomyces rutgersensis e Streptomyces steffisburgensis, e mais especificamente, Streptomyces phaeochromogenes IF012898, Streptomyces testaceus ATCC21469, Streptomyces achromogenes IFO 12735, Streptomyces griseolus ATCC11796, Streptomyces carbophilus SANK62585, Streptomyces griseofuscus IFO 12870t, Streptomyces thermocoerulescens IFO 14273t, Streptomyces nogalater IFO 13445, Streptomyces tsusimaensis IFO 13782, Streptomyces gtomerochromogenes IFO 13673t, Streptomyces olivochromogenes IFO 12444, Streptomyces ornatus IFO 13069t, Streptomyces griseus ATCC 10137, Streptomyces griseus IFO 13849T, Streptomyces lanatus IFO 12787T, Streptomyces misawanensis IFO 13855T, Streptomyces pallidus IFO 13434T, Streptomyces roseorubens IFO 13682T, Streptomyces rutgersensis IFO 15875T e Streptomyces steffisburgensis IFO 13446T, e similar; ou microorganismos pertencentes a Saccharopolyspora, tal como Saccharopolyspora taberi, mais especificamente, Saccharopolyspora taberi JCM 9383t e similar. Como a "região para a qual a identidade de seqüência é particularmente alta na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 6, 7, 8 ou 109", por exemplo, é mencionada a região correspondendo à região mostrada com cada um dos nucleotídeos 290 a 315, 458 a 485, 496 a 525 ou 1046 a 1073 na se- qüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 6. Como os iniciadores construídos com base em tais regiões da seqüência de nucleotídeo, por exemplo, pode ser mencionado um iniciador compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 124 a 129. SEQ ID NO: 124; baseada na seqüência de nucleotídeo da região correspondendo à região mostrada com os nucleotídeos 290 a 315 acima; SEQ ID NO: 125; baseada na seqüência de nucleotídeo da região correspondendo à região mostrada com os nucleotídeos 458 a 485 acima; SEQ ID NO: 126; baseada na seqüência de nucleotídeo da região correspondendo à região mostrada com os nucleotídeos 458 a 485 acima; SEQ ID NO: 127; baseada na seqüência de nucleotídeo da região correspondendo à região mostrada com os nucleotídeos 496 a 525 acima; SEQ ID NO: 128; baseada na seqüência de nucleotídeo da região correspondendo à região mostrada com os nucleotídeos 496 a 525 acima; e SEQ ID NO: 129; baseada na seqüência de nucleotídeo da região correspondendo à região mostrada com os nucleotídeos 1046 a 1073 acima.
Por exemplo, um DNA de aproximadamente 800 pb é amplificado utilizando como iniciadores o par do oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 124 e o oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 129. Um DNA de aproximadamente 600 pb é amplificado utilizando como iniciadores o par dos oligonucleotídeos compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 125 e o oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 129. Um DNA de aproximadamente 600 pb é amplificado utilizando como iniciadores o par do oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 126 e o oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nu-cleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 129. Um DNA de aproximadamente 580 pb é amplificado utilizando como iniciadores o par de oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 127 e o oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de oligonucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 129. Ainda, um DNA de aproximadamente 580 pb é amplificado utilizando como iniciadores o par do oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 128 e o oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 129.
Como as condições para PCR, especificamente por exemplo, é mencionada a condição de manutenção de 95°C por 1 minuto; repetição por 30 ciclos de um ciclo que inclui manutenção de 94°C por 15 segundos, seguido por 60°C por 30 segundos, e seguido por 72°C por 1 minuto; e então manutenção a 72°C por 5 minutos. Pode ser utilizada a solução de reação de 25 μΙ contendo 10 ng de DNA cromossômico, contendo 200 nM de cada um dos 2 iniciadores, contendo 0,5 μΙ de mistura de dNTP (uma mistura de 10 mM de cada um dos 4 tipos de dNTPS), contendo 5 μΙ de tampão de reação de PCR genômico 5xGC, contendo 5 μΙ de GC-Melt 5M e contendo 0,5 μΙ de mistura de polimerase genômica Advantage-GC (Clontech Company).
Ao recuperar o DNA amplificado conforme acima descrito, um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo parcial do DNA (A) presente pode ser obtido. Em seguida, com base na seqüência de nucleotídeo possuída pelo "DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo parcial do DNA (A) presente" obtido, é projetado e preparado um oligonucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeo parcial de pelo menos cerca de 20 nucleotídeos da dita seqüência de nucleotídeo ou um oligonucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeo complementar à seqüência de nucleotídeo parcial de pelo menos cerca de 20 nucleotídeos da dita seqüência de nucleotídeo. Um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo parcial do DNA (A) presente se estendendo a jusante do terminal 3' ou a montante do terminal 5’ do "DNA compreendendo uma se- qüência de nucleotídeo parcial do DNA (A) presente" obtido conforme acima descrito pode ser obtido conduzindo PCR. O PCR pode utilizar como inicia-dores um par de um oligonucleotídeo preparado conforme descrito acima com base na sequência de nucleotídeo do "DNA compreendendo uma se-qüência de nucleotídeo parcial do DNA (A) presente" e um oligonucleotídeo de pelo menos cerca de 20 nucleotídeos compreendendo uma seqüência de nucleotídeo da região adjacente ao sítio de inserção de DNA do vetor utilizado para construir a biblioteca acima ou um oligonucleotídeo de pelo menos cerca de 20 pb compreendendo uma seqüência de nucleotídeo complementar a tal seqüência de nucleotídeo dele. A PCR pode, por exemplo, utilizar como o molde a biblioteca de DNA cromossômico preparada a partir de microorganismos que têm a habilidade de converter o composto (II) no composto (III), conforme acima descrito. Ao conectar tal DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo parcial do DNA (A) presente, pode ser obtido o DNA (A) presente. Em tal método de produção, pode ser utilizado um kit comercialmente disponível, tal como o Universal Genome Walker (Clontech Company). Alternativamente, o DNA (A) presente pode ser obtido conduzindo PCR através de preparação de iniciadores com base na seqüência de nucleotídeo de comprimento completo do DNA (A) presente obtida conectando as seqüências de nucleotídeo parciais do DNA (A) presente conforme acima descrito, utilizando tais iniciadores e utilizando como o molde a biblioteca de DNA cromossômico conforme acima descrito.
Por exemplo, um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 316 a 1048 da SEQ ID NO: 139 (uma seqüência de nucleotídeo parcial da seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 159) pode ser preparado conduzindo PCR ao utilizar como o molde o DNA cromossômico ou a biblioteca de DNA cromossômico preparada a partir de Streptomyces nogalater IFO 13445 e utilizando como iniciadores um oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 124 e um oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 129. Um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo estendida a jusante do terminal 3' ou a montante do seu terminal 5' é obtido de acordo com a descrição acima baseado na seqüência de nucleotídeo do DNA obtido. Um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 144 (contendo uma seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 159 e a seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 149) pode ser obtido conectando o DNA resultante.
Por exemplo, um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 364 a 1096 da SEQ ID NO: 140 (uma seqüência de nucleotídeo parcial da seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 160) pode ser preparado conduzindo PCR ao utilizar como o molde o DNA cromossômico ou a biblioteca de DNA cromossômico preparada a partir de Streptomyces tsusimaen-sis IFO 13782 e utilizando como iniciadores um oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 124 e um oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 129. Um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo estendida a jusante do terminal 3' ou a montante do seu terminal 5' é obtido de acordo com a descrição acima baseado na seqüência de nucleotídeo do DNA obtido. Um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 145 (contendo uma seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 150 e a seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 160) pode ser obtido conectando o DNA resultante.
Por exemplo, um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 295 a 1027 da SEQ ID NO: 141 (uma seqüência de nucleotídeo parcial da seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 136) pode ser preparado conduzindo PCR ao utilizar como o molde o DNA cromossômico ou a biblioteca de DNA cromossômico preparada a partir de Streptomyces thermocoe-rulessins IFO 14273t e utilizando como iniciadores um oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 124 e um oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 129. Um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo estendida a jusante do terminal 3' ou a montante do seu terminal 5' é obtido de acordo com a descrição acima baseado na seqüência de nucleotídeo do DNA obtido. Um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 146 (contendo uma seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 136 e a seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 151) pode ser obtido conectando o DNA resultante.
Por exemplo, um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 316 a 1048 da SEQ ID NO: 142 (uma seqüência de nucleotídeo parcial da seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 137) pode ser preparado conduzindo PCR ao utilizar como o molde o DNA cromossômíco ou a biblioteca de DNA cromossômico preparada a partir de Streptomyces glomero-chromogenes IFO 13673t e utilizando como iniciadores um oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 124 e um oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 129. Um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo estendida a jusante do terminal 3' ou a montante do seu terminal 5' é obtido de acordo com a descrição acima baseado na seqüência de nucleotídeo do DNA obtido. Um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 147 (contendo uma seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 137 e a seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 152) pode ser obtido conectando o DNA resultante.
Por exemplo, um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 316 a 1048 da SEQ ID NO: 143 (uma seqüência de nucleotídeo parcial da seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 138) pode ser preparado conduzindo PCR ao utilizar como o molde o DNA cromossômico ou a biblioteca de DNA cromossômico preparada a partir de Streptomyces olivochro- mogenes IFO 12444 e utilizando como iniciadores um oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 124 e um oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 129. Um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo estendida a jusante do terminal 3’ ou a montante do seu terminal 5’ é obtido de acordo com a descrição acima baseado na seqüência de nucleotídeo do DNA obtido. Um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 148 (contendo uma seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 138 e a seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 153) pode ser obtido conectando o DNA resultante.
Por exemplo, um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 289 a 1015 da SEQ ID NO: 232 (uma seqüência de nucleotídeo parcial da seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 222) pode ser preparado conduzindo PCR ao utilizar como o molde o DNA cromossômico ou a biblioteca de DNA cromossômico preparada a partir de Streptomyces roseorubens IFO 13682T e utilizando como iniciadores um oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 124 e um oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 129. Um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo estendida a jusante do terminal 3' ou a montante do seu terminal 5' é obtido de acordo com a descrição acima baseado na seqüência de nucleotídeo do DNA obtido. Um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 242 (contendo uma seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 232 e a seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 252) pode ser obtido conectando o DNA resultante.
Por exemplo, um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 289 a 1015 da SEQ ID NO: 234 (uma seqüência de nucleotídeo parcial da seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 224) pode ser preparado conduzindo PCR ao utilizar como o molde o DNA cromossômico ou a biblioteca de DNA cromossômico preparada a partir de Streptomyces steffísbur-gensis IFO 13446T e utilizando como iniciadores um oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 124 e um oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 129. Um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo estendida a jusante do terminal 3' ou a montante do seu terminal 5' é obtido de acordo com a descrição acima baseado na seqüência de nucleotídeo do DNA obtido. Um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 244 (contendo uma seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 234 e a seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 254) pode ser obtido conectando o DNA resultante. O DNA (A) presente obtido utilizando a PCR descrita acima pode ser clonado em um vetor através de um método de acordo com métodos de engenharia genética convencionais descritos em "Molecular Cloning: A La-boratory Manual 2a Edição" (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, "Current Protocols in Molecular Biology" (1987), John Wiley & Sons, Incorpo-rated e similar. Especificamente por exemplo, a clonagem pode ser conduzida utilizando vetores de plasmídeo tal como pBluescriptll da Strategene Company ou um vetor de plasmídeo contido no TA Cloning Kit da Invitrogen Company.
Ainda, o DNA (A) presente pode ser preparado, por exemplo, conforme descrito abaixo. Primeiro, uma seqüência de nucleotídeo é designada. A seqüência de nucleotídeo codifica uma seqüência de aminoacido de uma proteína codificada pelo DNA (A) presente. A seqüência de nucleotídeo tem um teor de GC de no máximo 60% e pelo menos 40%, de preferência no máximo 55% e pelo menos 45%. O uso do códon na seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido da proteína acima está dentro da faixa de mais ou menos 4% do uso de códon em genes das espécies de uma célula hospedeira na qual o DNA (A) presente é introduzido. Ao preparar um DNA tendo a seqüência de nucleotídeo construída de acordo com métodos de engenharia genética convencionais, o DNA (A) presente pode ser obtida.
Por exemplo, pode ser construída da maneira descrita abaixo, uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 1) da proteína (A1) da presente invenção e tendo um teor de GC de no máximo 55% e pelo menos 45%, onde o uso do códon na seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido da proteína acima está dentro da faixa de mais ou menos 4% do uso de códon em genes de soja. Primeiro, por exemplo, o uso do códon (Tabela 22 e Tabela 23) na seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 6) codificando a seqüência de aminoacido da proteína (A1) da presente invenção que pode ser obtida a partir de Streptomyces phaeochromogenes IF012898 e uso do códon de soja (Tabela 24 e Tabela 25) são comparados. Com base nos resultados da comparação, substituições de nucleotídeo são adicionadas à seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 6, de modo que o teor de GC é no máximo 55% e pelo menos 45% e o uso do códon está dentro da faixa de mais ou menos 4% do uso de códon de soja. Como tal substituição de nucleotídeo, é selecionada uma substituição de nucleotídeo que não resulta em uma substituição de aminoacido. Por exemplo, o uso do códon CTG codificando leucina é 1,22% em genes de soja e 7,09% na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 6. Desse modo, por exemplo, cada um dos códons de CTG começando dos nucleotídeos 106, 163, 181, 226, 289, 292, 544, 1111 e 1210 da seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 6 é substituído para códons CTT; cada um dos códons CTG começando dos nucleotídeos 211, 547 e 1084 é substituído para códons CTA; o códon CTG começando do nucleotídeo 334 é substituído para o códon TTA; cada um dos códons CTG começando dos nucleotídeos 664, 718, 733, 772, 835, 1120 e 1141 é substituído para um códon TTG; e o códon CTG começando do nucleotídeo 787 é substituído para um códon TTA. Uma seqüência de uma seqüência de nucleotídeo construída de tal maneira é descrita na SEQ ID NO: 214, o uso códon nela é mostrado na Tabela 26 e na Tabela 27. Na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 214, por exemplo, o uso do códon CTG codifican- do leucina é 1,71% e está dentro da faixa de mais ou menos 4% do uso de códon (1,22%) para soja. O DNA compreendendo a sequência de nucleotí-deo mostrada na SEQ ID NO: 214 pode ser preparado introduzindo substituições de nucleotídeo no DNA tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 6, de acordo com os métodos de mutagênese direcionados ao sítio descritos tal como em Sambrook, J., Frisch, E.F. e Maniatis, T.; Molecular Cloning 2a Edição, Cold Spring Harbor Press. Alternativamente, o DNA tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 214 pode ser preparado através de um método de síntese de DNA empregando a PCR descrita no Exemplo 46 abaixo.
Similarmente, a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 368 é um exemplo de construção de uma seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 222) da proteína (A23) da presente invenção e tendo um teor de GC de no máximo 55% e pelo menos 45%, onde o uso do códon na seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido da proteína acima está dentro da faixa de mais ou menos 4% com o uso do códon para genes de soja. Ainda, a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 393 é um exemplo de construção de uma seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 224) da proteína (A25) da presente invenção e tendo um teor de GC de no máximo 55% e pelo menos 45%, onde o uso do códon na seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido da proteína acima está dentro da faixa de mais ou menos 4% com o uso de códon para genes de soja. O DNA (A) presente obtido de tal maneira pode ser clonada em um vetor de acordo com métodos de engenharia genética convencionais descrito tal como em Sambrook, J., Frisch, E.F. e Maniatis, T.; "Molecular Cloning 2a Edição" (1989), Cold Spring Harbor Press; "Current Protocols in Molecular Biology" (1987), John Wiley & Sons, Incorporated e similar. Como o vetor, especificamente, por exemplo, pode ser utilizado pUC 119 (TaKaRa Shuzo Company) pTVA 118N (Takara Shuzo Company), pBluescript II (Toyobo Company), pCR2.1-TOPO (Invitrogen), pTrc99A (Pharmacia Com- pany), pKK331-1A (Pharmacia Company), e similar.
Ainda, a seqüência de nucleotídeo do DNA (A) presente obtida de tal maneira pode ser analisada através do método de terminador didesóxi descrito em F. Sanger, S. Nicklen, A.R. Coulson, Proceeding of National Academy of Science U.S.A. (1977) 74:5463-5467. A habilidade em metabolizar o composto herbicida do tipo inibidor de PPO da fórmula (I) da presente proteína (A), que é codificada pelo DNA (A) presente obtido de tal maneira descrita acima, pode ser confirmada com a habilidade de converter o composto (II) no composto (III) como um marcador da maneira descrita abaixo. Primeiro, conforme descrito abaixo, o dito DNA é inserido em um vetor de modo que ele é conectado a jusante de um promotor que pode funcionar na célula hospedeira e que é introduzido em uma célula hospedeira para se obter um transformante. Em seguida, a cultura do transformante ou o extrato obtido da ruptura da cultura é reagido com o composto (II) na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron, tal como coenzíma NADPH. Os produtos de reação resultantes dela são analisados para detectar o composto (III). Desse modo, pode ser detectado um transformante tendo a habilidade de metabolizar o composto (II) e produzir o composto (III), e pode ser determinado que tal transformante carrega o DNA (A) presente codificando a proteína tendo tal habilidade. Mais especificamente, por exemplo, são preparados 30 μΙ de uma solução de reação consistindo em um tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,0) compreendendo a cultura ou extrato do transformante acima, um doador de elétron tal como β-NADPH em uma concentração final de cerca de 2 mM, ferredoxina derivada de espinafre em uma concentração final de cerca de 2 mg/ml, ferredoxina redutase em uma concentração final de cerca de 0,1 U/ml e 3 ppm do composto (II) marcado com um radioisótopo. A solução de reação é incubada por volta de 30°C a 40°C por 10 minutos a 1 hora. Após tal incubação, 3 μΙ de HCI 2N e 90 μΙ de acetato de etila são adicionados, agitados e centrifugados a 8.000 g para recuperar o sobrenadante. Após secar o sobrenadante em vácuo, o resíduo é dissolvido em acetato de etila e a solução obtida é desenvolvida em uma placa de TLC de gel. A placa de TLC é analisada através de radioautografia. Ao identificar os pontos correspondendo ao composto (III) marcados com um radioisótopo, pode ser confirmada a habilidade em converter o composto (II) no composto (III).
Um DNA codificando uma proteína tendo a habilidade de converter o composto (II) no composto (III) ou um microorganismo tendo tal DNA pode ser ainda pesquisado conduzindo a hibridização ou PCR conforme acima descrito, utilizando o DNA (A) da presente invenção ou o polinucleotí-deo compreendendo uma seqüência de nucleotídeo parcial do dito DNA ou uma seqüência de nucleotídeo complementar à seqüência de nucleotídeo parcial.
Especificamente, por exemplo, a hibridização conforme acima descrito é conduzida e o DNA para o qual uma sonda é hibridizada é identificado. A hibridização é realizada com o uso do DNA (A) da presente invenção ou um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeo parcial do DNA (A) da presente invenção de uma seqüência de nucleotídeo complementar à seqüência de nucleotídeo parcial como uma sonda, e DNA genômico derivado de um microorganismo natural, por exemplo, microorganismos pertencentes a streptomyces tal como Streptomyces phaeochromo-genes, Streptomyces testaceus, Streptomyces achromogenes, Streptomyces griseolus, Streptomyces carbophilus, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces thermocoerulescens, Streptomyces nogalater, Streptomyces tsusimaen-sis, Streptomyces glomerochromogenes, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces ornatus, Streptomyces griseus, Streptomyces lanatus, Streptomyces misawanensis, Streptomyces pallidus, Streptomyces roseorubens, Streptomyces rutgersensis e Streptomyces steffisburgensis', microorganismos pertencentes a Saccharopolyspora tal como Saccharopolyspora taberr, e similar. Como exemplos específicos de DNA que podem ser utilizados como a sonda, pode ser mencionado um DNA compreendendo o comprimento completo da seqüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 6, 7, 8, 109, 139, 140, 141, 142, 143, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233 ou 234; um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 57 a 730 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 6; um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 21 a 691 da seqüência de nucleotí-deo mostrada na SEQ ID NO: 8 e similar.
Alternativamente, PCR pode ser conduzida conforme acima descrito e o DNA amplificado pode ser detectado. A PCR utiliza um polinucleotí-deo compreendendo uma seqüência de nucleotídeo parcial do DNA (A) da presente invenção ou uma seqüência de nucleotídeo complementar à seqüência de nucleotídeo parcial. A PCR utiliza como molde o DNA genômico derivado de um microorganismo natural, por exemplo, microorganismos pertencentes a streptomyces tal como Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces testaceus, Streptomyces achromogenes, Streptomyces grise-olus, Streptomyces carbophilus, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces thermocoerulescens, Streptomyces nogalater, Streptomyces tsusimaensis, Streptomyces glomerochromogenes, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces ornatus, Streptomyces gríseus, Streptomyces lanatus, Streptomyces misawanensis, Streptomyces pallidus, Streptomyces roseoru-bens, Streptomyces rutgersensis e Streptomyces steffisburgensis; microorganismos pertencentes a Saccharopolyspora tal como Saccharopolyspora taberi; e similar. Como os iniciadores, podem ser mencionados iniciadores que foram construídos com base na seqüência de nucleotídeo da "região para a qual a identidade de seqüência é particularmente alta na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 6, 7, 8 ou 109" conforme acima descrito. Como exemplos mais específicos dos iniciadores, são mencionados pares de um iniciador compreendendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma das SEQ ID NO: 124 to 128 e um iniciador compreendendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 129. O DNA detectado de tal maneira é recuperado. Quando o DNA recuperado não contém a seqüência de nucleotídeo de comprimento completo do DNA (A) presente, tal DNA é utilizado e transformado em um DNA correspondendo à seqüência de nucleotídeo de comprimento completo de uma maneira descrita acima. O DNA obtido é introduzido em uma célula hospedeira para produzir um transformante. A habilidade em converter o composto (II) no composto (III) da proteína codificada pelo DNA introduzido no transformante pode ser avaliada utilizando a cultura do transformante obtido e medindo a habilidade em converter o composto (II) no composto (III) de uma maneira descrita acima.
Para expressar o DNA (A) presente em uma célula hospedeira, o DNA (A) presente é introduzido na célula hospedeira em uma posição que permite sua expressão da dita célula. Por introduzir o DNA (A) presente em uma "posição que permite sua expressão" se quer dizer que o DNA (A) presente é introduzido em uma célula hospedeira de modo que ele é posto em uma posição adjacente a uma seqüência de nucleotídeo direcionada à transcrição e tradução da sua seqüência de nucleotídeo (isto é, por exemplo, uma seqüência de nucleotídeo que promove a produção da presente proteína (A) e um RNA codificando a presente proteína (A)).
Para introduzir o DNA (A) presente em uma célula hospedeira de modo que ela seja posto em uma posição que permita sua expressão, por exemplo, um DNA onde o DNA (A) presente e um promotor funcional na célula hospedeira estão operavelmente ligados é introduzido na célula hospedeira. O termo "operavelmente ligado" aqui significa uma condição na qual o DNA (A) presente está ligado a um promotor de modo que ele é expresso sob o controle do promotor, quando o DNA é introduzido em uma célula hospedeira.
Quando a célula hospedeira é uma célula de microorganismo, como um promotor funcional, por exemplo, pode ser mencionado o promotor de operon de lactose de E. coli, promotor de operon de triptofano de E. coli, o promotor de fago T7 ou promotores artificiais funcionais em E. coli tal como promotor tac ou o promotor trc e similar. Ainda, pode ser utilizado o promotor originalmente presente a montante do DNA (A) presente no cromossoma do microorganismo pertencente a Streptomyces ou Saccharopo-lyspora.
Quando uma célula hospedeira é uma célula de planta, como um promotor funcional, por exemplo, são mencionados promotores constitutivos promotor do gene de octopina de sintase; promotores derivados de vírus de planta tal como derivados 19S e 35S derivados do vírus mosaico da couve-flor; promotores induzíveis tal como promotor do gene de fenilalanina amô-nia-liase, promotor do gene de chalcona sintase e promotor do gene de proteína relacionado à patogênese; o promotor de planta descrito na Publicação de Patente Japonesa Não-examinada NQ 2000-166577. Ainda, um termina-dor funcional em uma célula de planta pode ser conectado ao DNA onde o promotor funcional em uma célula de planta e o DNA (A) presente estão operavelmente ligados. Nesse caso, é geralmente preferido que o termina-dor seja conectado a montante do DNA (A) presente. Como o terminador funcional, por exemplo, são mencionados os terminadores constitutivos derivados de T-DNA mencionados tal como o terminador do gene de nopalina sintetase (NOS); terminadores derivados de vírus de planta tal como terminadores do vírus allium GV1 ou GV2; o terminador de planta descrito na Publicação de Patente Japonesa Não-examinada No. 2000-166577; e similar.
Quando introduzindo o DNA (A) presente de modo que o DNA seja posto em uma posição que permita sua expressão, por exemplo, pode ser utilizado um DNA tendo uma sequência de nucleotídeo codificando um sinal de trânsito para uma organela intracelular, ligado a montante do DNA (A) presente, de modo que estruturas de leitura estejam em estrutura. Por estar ligado "de modo que as estruturas de leitura estejam em estrutura" se quer dizer que a estrutura de leitura da seqüência do sinal de trânsito para uma organela intracelular e a estrutura de leitura do DNA (A) presente estão conectadas para formarem uma estrutura de leitura contínua. Como uma seqüência de sinal de trânsito provendo a transição e localização de uma proteína em uma organela intracelular em uma célula de planta, por exemplo, pode ser mencionado um sinal de trânsito derivado de um precursor ci-toplásmico de uma proteína localizada no cloroplasto de uma planta conforme descrito na Patente U.S. No. 5.717.084, as seqüências quiméricas formadas de uma variedade de seqüências de sinal de trânsito descritas na Patente U.S. No. RE36449. Mais especificamente, é mencionado o peptídeo bifosfato carboxilase de soja, que pode ser obtida de acordo com o método descrito no Exemplo 15 abaixo.
Tipicamente, o DNA (A) presente, o DNA (A) presente à qual o DNA tendo uma sequência de nucleotídeo codificando um sinal de trânsito para uma organela intracelular está conectado conforme acima descrito, ou um DNA onde tal DNA está operavelmente ligado a um promotor funcional na célula hospedeira, podem ser, cada um, inseridos em um vetor utilizável em uma célula hospedeira e esse é introduzido na célula hospedeira. Quando utilizando um vetor já possuindo um promotor funcional na célula hospedeira, o DNA (A) presente pode ser inserido a jusante de um promotor presente no vetor de modo que o dito promotor e o DNA (A) presente podem ser operavelmente ligados.
Como o vetor, especificamente quando utilizando E. coli como a célula hospedeira, por exemplo, podem de ser mencionados pUC 119 (TaKaRa Shuzo Company), pTVA 118N (Takara Shuzo Company), pBlues-cript II (Strategene Company), pCR2.1-TOPO (Invitrogen), pTrc99A (Amer-sham Pharmacia Biotech Company), pKK331-1A (Amersham Pharmacia Bi-otech Company), pET11d (Novagen) e similar. Ao utilizar um vetor contendo um marcador seletivo (por exemplo, genes conferindo resistência a um antibiótico tal como gene de resistência à canamicina, gene de resistência à ne-omicina, e similar), é conveniente que o transformante no qual o presente DNA é introduzido possa ser selecionado com o fenótipo do marcador seletivo como um indicador.
Como o método de introdução do DNA (A) presente ou um vetor contendo o DNA (A) presente em uma célula hospedeira, pode ser mencionado o método descrito em Shin Seikagaku Zikken Kouza (Nippon-Seikagaku-Kai eds., Tokyo Kagaku Dozin), Vol. 17, Biseibutu-Zikken-Hou quando a célula hospedeira é um microorganismo, por exemplo, E. coli, Ba-cillus subtilis, Bacillus brevis, Pseudomonas sp., Zymomonas sp., bactérias de ácido láctico, bactérias de ácido acético, Staphylococcus sp., Streptomy-ces sp., Saccharopolyspora sp. ou levedura tal como Saccharomyces cere- Alternativamente, por exemplo, pode ser utilizado o método de cloreto de cálcio descrito em Sambrook, J., Frisch, E.F., e Maniatis, T.; "Molecular Clo-ning 2a Edição", Cold Spring Harbor Press (Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989) ou em "Current Protocols in Molecular Biology" (1987), John Wiley & Sons, Incorporated ou o método de incorporação descrito em "Methods in Electroporation: Gene Pulser / E. coli Pulser System", Bio-Rad Laboratories (1993). O transformante no qual o DNA (A) presente ou vetor contendo o DNA (A) presente foi introduzido, por exemplo, pode ser selecionado através de seleção quanto ao fenótipo do marcador seletivo contido no vetor ao qual o DNA (A) presente foi inserido conforme acima descrito como um indicador. Ainda, se o transformante contém o DNA (A) presente ou um vetor contendo o DNA (A) presente pode ser confirmado através da preparação do DNA a partir do transformante então condução com o DNA preparado de métodos de análise de engenharia genética descritos em, por exemplo, "Molecular Cloning 2a Edição", Cold Spring Harbor Press (Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989) (tal como confirmação de locais de enzima de restrição, seqüenciamento de DNA, hibridizações Southern, PCR e similar).
Quando a célula hospedeira é uma célula de planta, tipos de planta podem ser mencionados, por exemplo, dicotiledôneas tal como tabaco, algodão, semente de colza, beterraba, arabidopsis, canola, linho, girassol, batata, alfafa, alface, banana, soja, ervilha, legume, pinha, choupo, maçã, uva, laranja, limão, outras frutas cítricas, amêndoa, noz e outras sementes; monocotiledôneas tal como milho, arroz, trigo, cevada, aveia, sorgo, cana-de-açúcar e grama; e similar. Como a célula na qual o DNA (A) presente é introduzida aqui podem ser utilizadas tecido de planta, corpo de planta, células culturadas, sementes e similar.
Como métodos de introdução do DNA (A) presente ou do vetor contendo o DNA (A) presente em uma célula hospedeira, são mencionados métodos tal como infecção com Agrobacterium (Publicação de Patente Examinada Japonesa No. 2-58917) e Publicação de Patente Japonesa não-examinada No. 60-70080), eletroforação em protoplasto (Publicação de Pa- tente Japonesa não-examinada No. 60-251887 e Publicação de Patente Japonesa não-examinada No. 5-68575) ou método de pistola de partícula (Publicação de Patente Japonesa não-examinada No. 5-508316 e Publicação de Patente Japonesa não-examinada No. 63.258525).
Em tais casos, por exemplo, o transformante no qual o presente DNA foi introduzido pode ser selecionado com o fenótipo de um marcador seletivo como um indicador, através da introdução em uma célula de planta ao mesmo tempo com o vetor contendo o DNA (A) presente, um marcador seletivo selecionado do gene de higromicina fosfotransferase, do gene de neomicina fosfotransferase e do gene cloranfenicol acetiltransferase. O gene de marcador seletivo e o DNA (A) presente podem ser inseridos no mesmo vetor e introduzidos. Um vetor compreendendo o gene marcador seletivo e um vetor compreendendo o DNA (A) presente podem ser também introduzidos ao mesmo tempo. Um transformante no qual o DNA (A) presente foi introduzido pode ser também selecionado através de cultura com um meio contendo o composto herbicida do tipo inibidor de PPO da fórmula (I) e através de isolamento de um clone multiplicável dele. Se o transformante contém o DNA (A) presente pode ser confirmado preparando o DNA a partir do transformante e então conduzindo com o DNA preparado de métodos de análise de engenharia genética descritos em, por exemplo, "Molecular Clo-ning 2a Edição", Cold Spring Harbor Press (Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989) (tal como confirmação de locais de enzima de restrição, seqüenciamento de DNA, hibridizações Southern, PCR e similar). O DNA (A) presente introduzido na célula de planta pode ser mantido em locais na célula outros que não o DNA contido no núcleo, ao ser inserido no DNA contido em organelas intracelulares tal como cloroplasto. A partir da célula de planta transformada obtida de tal maneira, uma planta transgênica na qual o DNA (A) presente foi introduzido pode ser obtida, através de regeneração do corpo de uma planta através do método de cultura de célula de planta descrito em Shokubutu-ldenshi-Sosa-Manual: Transgenic-Shokubutu-No-Tukurikata (Uchimiya, Kodansha-Scientific, 1990), pp. 27-55. Ainda, um tipo de planta transgênica na qual o DNA (A) presente foi introduzida pode ser produzido combinando o tipo alvo da planta com a planta transgênica na qual o DNA (A) presente foi introduzido, de modo que o DNA (A) presente é introduzido em um cromossoma do tipo alvo de planta.
Especificamente, por exemplo, arroz ou Arabidopsis tendo introduzido nela o DNA (A) presente e expressando a presente proteína (A) pode ser obtido através do método descrito em Model-Shokubutu-No-Jikken-Protocol: Ine, Shiroinunazuna-Hen (Supervisors: Koh SHIMAMOTO e Kiyo-taka OKADA, Shujun-sha, 1996), capítulo quatro. Ainda, pode ser obtida uma soja tendo introduzido nela o DNA (A) presente e expressando a presente proteína (A) através de uma introdução em um embrião somático de soja com uma pistola de partícula de acordo com o método descrito na Publicação de Patente Japonesa Não-examinada No. 3-291501. Da mesma maneira, um milho tendo introduzido nele o DNA (A) presente e expressando a presente proteína (A) pode ser obtido através de uma introdução no embrião somático de milho com uma pistola de partícula de acordo com o método descrito por Fromm, M.E. e outros., Bio/Technology, 8; p 838 (1990). Trigo tendo introduzido nele o DNA (A) presente e expressando a presente proteína (A) pode ser obtido introduzindo o gene em "scutellum" imaturo de trigo estéril-culturado com uma pistola de partícula de acordo com um método convencional descrito por TAKUMI e outros., Journal of Breeding Society (1995), 44: Extra Vol. 1, p 57. Da mesma maneira, cevada tendo introduzido nela o DNA (A) presente e expressando a presente proteína (A) pode ser obtida através de introdução em "scutellum" imaturo de cevada estéril-culturado com uma pistola de partícula de acordo com o método convencional descrito por HAGIO, et al., Journal of Breeding Society (1995), 44; Extra Vol. 1, p 67. O transformante tendo introduzido nela o DNA (A) presente e expressando a presente proteína (A) pode reduzir o dano à planta pelo composto (I), convertendo o dito composto herbicida em um composto de atividade herbicida inferior dentro de suas células. Especificamente, por exemplo, ao espalhar o microorganismo expressando a presente proteína (A) na área de cultivo da planta cultivada desejada antes da semeadura das se- mentes da planta desejada, o composto herbicida remanescente no solo pode ser metabolizado e o dano à planta desejada pode ser reduzido. Ainda, tendo a variedade desejada de planta para expressar a presente proteína (A), a habilidade em metabolizar o composto herbicida do tipo inibidor de PPO da fórmula (I) em um composto de atividade menor é conferida à dita planta. Como resultado, o dano à planta a partir do composto herbicida na planta é reduzido e resistência ao dito composto é conferida. A presente proteína (A) pode ser preparada, por exemplo, cultu-rando uma célula compreendendo o DNA (A) presente. Como tal célula, é mencionado um microorganismo expressando o DNA (A) presente e tendo a habilidade de produzir a presente proteína (A), tal cepa de microorganismo sendo isolada da natureza compreendendo o DNA (A) presente, cepas mu-tantes derivadas da cepa natural através de tratamento com agentes ou raios ultravioleta ou similar. Mais especificamente, por exemplo, são mencionados microorganismos pertencentes a Streptomyces, tal como Streptomyces phaeochromogenes IF012898, Streptomyces testaceus ATCC21469, Streptomyces achromogenes IFO 12735, Streptomyces grise-olus ATCC11796, Streptomyces carbophilus SANK62585, Streptomyces gri-seofuscus IFO 12870t, Streptomyces thermocoerutescens IFO 14273t, Streptomyces nogalater IFO 13445, Streptomyces tsusimaensis IFO 13782, Streptomyces glomerochromogenes IFO 13673t, Streptomyces olivochromo-genes IFO 12444, Streptomyces ornatus IFO 13069t, Streptomyces griseus ATCC 10137, Streptomyces griseus IFO 13849T, Streptomyces ianatus IFO 12787T, Streptomyces misawanensis IFO 13855T, Streptomyces pallidus IFO 13434T, Streptomyces roseorubens IFO 13682T, Streptomyces rutger-sensis IFO 15875T e Streptomyces steffisburgensis IFO 13446T, e similar; ou microorganismos pertencentes a Saccharopolyspora, tal como Saccharo-polyspora taberi JCM 9383t e similar. Ainda, pode ser mencionado um transformante onde o DNA (A) presente ou um vetor contendo o DNA (A) presente foi introduzido. Especificamente, por exemplo, é mencionado um transformante onde o DNA (A) presente operavelmente ligado a um promotor tac, promotor trc, promotor lac ou promotor de fago t7 é introduzido em E. coli. Como exemplos mais específicos, é mencionado JM109/pKSN657 de E.coli, JM109/pKSN657F de E.coli, JM109/pKSN923 de E.coli, JM109/pKSN 923F de E.coli, JM109/pKSN11796 de E.coli, JM109/pKSN11796F de E.coli, JM109/pKSN671 de E.coli, JM109/pKSN671F de E.coli, JM109/pKSNSCA de E.coli, JM109/pKSN646 de E.coli, JM109/pKSN646F de E.coli, JM109/pKSN849AF de E.coli, JM109/pKSN1618F de E.coli, JM109/pKSN 474F de E.coli, JM109/pKSN1491AF de E.coli, JM109/pKSN1555AF de E.coli, JM109/pKSN1584F de E.coli, JM109/pKSN1609F de E.coli e similar, descritos nos exemplos abaixo.
Como um meio para cultura dos microorganismos acima compreendendo o DNA (A) presente, pode ser utilizado qualquer um daqueles geralmente empregados para cultura de um microorganismo que contém fontes de carbono e fontes de nitrogênio, sais orgânicos e inorgânicos conforme apropriado. Um composto que é um precursor para heme, tal como ácido aminolevulínico, pode ser adicionado.
Como a fonte de carbono, por exemplo, são mencionados saca-rídeos tal como glicose, frutose, sacarose e dextrina; álcoois de açúcar tal como glicerol e sorbitol; e ácido orgânicos tal como ácido fumárico, ácido cítrico e ácido pirúvico; e similar. A quantidade de fontes de carbono listadas acima a ser adicionada a um meio é geralmente cerca de 0,1% (p/v) a cerca de 10% (p/v) com base na quantidade total do meio.
Como a fonte de nitrogênio, por exemplo, são mencionados sais de amônio de ácidos inorgânicos tal como cloreto de amônio, sulfato de amônio e fosfato de amônio; sais de amônio de ácidos orgânicos tal como fumarato de amônio e citrato de amônio; fontes de nitrogênio orgânicas, tal como extrato de came, extrato de levedura, extrato de malte, pó de soja, licor de milho, pó de semente de algodão, levedura seca, hidrolisato de caserna; bem como aminoacidos. Dentre esses listados acima, sais de amônio de ácidos orgânicos, fontes de nitrogênio orgânico e aminoacidos podem ser empregados principalmente também como fontes de carbono. A quantidade de fontes de nitrogênio a ser adicionada é geralmente cerca de 0,1% (p/v) a cerca de 10% (p/v) com base na quantidade total do meio.
Como o sal inorgânico, por exemplo, são mencionados fosfatos tal como fosfato de potássio, fosfato de dipotássio, fosfato de sódio, fosfato de dissódio; cloretos tal como cloreto de potássio, cloreto de sódio, hexai-drato de cloreto de cobalto; sulfatos tal como sulfato de magnésio, heptai-drato de sulfato ferroso, heptaidrato de sulfato de zinco, triidrato de sulfato de manganês; e similar. A quantidade a ser adicionada é geralmente cerca de 0,0001% a cerca de 1% (p/v) com base na quantidade total do meio.
No caso de cultura de um transformante retendo o DNA (A) presente conectado a jusante de um promotor de fato T7 e um DNA onde a se-qüência de nucleotídeo codificando a T7 RNA polimerase (lisógeno λϋΕ3) é conectada a jusante de um promotor lac UV5, tipicamente, uma pequena quantidade de, por exemplo, isopropil-β -D-tiogalactosídeo (daqui em diante referido como "IPTG") pode ser adicionada como um indutor para indução da produção da presente proteína (A). IPTG pode ser também adicionado ao meio no caso de cultura de um transformante tendo introduzido nele um DNA onde o DNA (A) presente está operavelmente ligadO a um tipo de promotor que é induzido por lactose, tal como promotor tac, promotor trc e promotor lac.
Um microorganismo compreendendo o DNA (A) presente pode ser cultivado de acordo com um método geralmente empregado para cultu-rar um microorganismo, incluindo um cultivo de fase líquida tal como cultivo com agitação giratória, um cultivo de agitação recíproca, uma fermentação em pote (cultivo do fermentador em pote) e um cultivo em tanque; ou um cultivo de fase sólida. Quando um fermentador de pote é empregado, ar asséptico deve ser introduzido do fermentador de pote geralmente em uma taxa de aeração de cerca de 0,1 a cerca de 2 vezes o volume de fluido da cultura por minuto. A temperatura na qual o cultivo é realizado pode variar em uma faixa que permita que o microorganismos cresça, e geralmente varie a partir de cerca de 15°C a cerca de 40°C, e o pH do meio varie a partir de cerca de 6 a cerca de 8. O tempo de cultivo pode variar dependendo das condições de cultivo, e é geralmente cerca de 1 dia a cerca de 10 dias. A presente proteína (A) produzida por um microorganismo com- preendendo o DNA (A) presente, por exemplo, pode ser utilizada em várias formas no tratamento do composto herbicida do tipo de inibição de PPO da fórmula (I), tal como uma cultura de um microorganismo produzindo a presente proteína (A), uma célula de um microorganismo produzindo a presente proteína (A), um material obtido através de tratamento de tal célula, um extrato sem célula de um microorganismo, uma proteína grosseiramente purificada, uma proteína purificada e similar. Um material obtido através de tratamento de uma célula descrita acima inclui, por exemplo, uma célula liofiliza-da, uma célula seca com acetona, uma célula moída, um autolisato de uma célula, uma célula ultra-sonicamente tratada, uma célula tratada com álcali, uma célula tratada com solvente orgânico e similar. Alternativamente, a presente proteína (A) em qualquer uma das várias formas descritas acima pode ser imobilizada de acordo com métodos conhecidos tal como um método de ligação de apoio empregando uma adsorção em um veículo inorgânico tal como uma sílica-gel ou um material cerâmico, um derivado de polissacarí-deo tal como DEAE-celulose, um polímero sintetizado tal como Amberite IRA-935 (Marca Registrada, fabricado pela Rohm e Haas) e similar, e um método de inclusão empregando uma inclusão em uma matriz de rede de um polímero tal como uma poliacrilamida, um gel de polissacarídeo contendo enxofre (por exemplo, gel de carragenina), um gel de ácido algínico, um gel de ágar e similar, e então usado no tratamento do composto herbicida descrito acima.
Como métodos de purificação da presente proteína (A) a partir de uma cultura de um microorganismo compreendendo o DNA (A) presente, podem ser empregados métodos convencionais utilizados em uma purificação de proteína. Por exemplo, pode ser mencionado o método que segue.
Primeiro, células são colhidas de uma cultura de um microorganismo através de centrifugação ou similar, e então fisicamente rompidas através de um tratamento ultra-sônico, um tratamento DYNOMILL, um tratamento FRENCH PRESS e similar, ou rompidas quimicamente utilizando um tensoativo ou uma enzima de lise de célula tal como lisozimas. A partir do lisato resultante desse modo obtido, materiais insolúveis são removidos através de centrifugação, filtragem de membrana ou similar para preparar um extrato sem célula, o qual é então fracionado através de um meio apropriado para separação e purificação, tal como uma cromatografia de troca de cátion, uma cromatografia de troca de ânion, uma cromatografia hidrofóbica, uma cromatografia de filtragem de gel e similar, desse modo purificando a presente proteína (A). Materiais de apoio empregados em tal cromatografia incluem, por exemplo, um apoio de resina tal como celulose, dextrano ou agarose conectado a um grupo carboximetila (CM), um grupo dietilaminoetila (DEAE), um grupo fenila ou um grupo butila. Uma coluna comercialmente disponível já embalada com qualquer apoio tal como Q-Sepharose FF, Phenyl-Sepharose HP, PD-10 e HiLoad 26/10 Q Sepharose HP (Marca Registrada, da Amersham Pharmacia Biotech), TSK-gel G3000SW (Marca registrada, TOSOH CORPORATION) pode ser também empregada.
Um exemplo de purificação da presente proteína (A) é dado. Células de um microorganismo produzindo a presente proteína (A) são colhidas através de centrifugação, e então suspensas em um tampão tal como 0,1 M de fosfato de potássio (pH 7,0). A suspensão é tratada ultra-sonicamente para romper as células, e o lisato resultante desse modo obtido é centrifugado em cerca de 40.000 g por cerca de 30 minutos para se obter um sobrenadante, o qual é então centrifugado a 150.000 g por cerca de 1 hora para recuperar o sobrenadante (o extrato sem célula). O extrato sem célula obtido é submetido a fracionamento de sulfato de amônio para se obter a fração que é solúvel na presença de 45% de sulfato de amônio saturado e precipita a 55% de sulfato de amônio saturado. Após o solvente da fração ser trocado com um tampão não contendo nenhum sulfato de amônio, tal como fosfato de potássio 1M, utilizando uma coluna PD10 (Amersham Pharmacia Biotech Company), a fração resultante é carregada, por exemplo, em uma coluna HiLoad 26/10 Q Sepharose HP (Amersham Pharmacia Biotech Company). A coluna é eluída com 20 mM de bitrispropano com um gradiente linear de NaCI para se obter uma série de frações de eluato. As frações mostrando atividade na conversão do composto (II) no composto (III) na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron, tal como coenzima NADPH, são recuperadas. Em seguida, após troca do tampão nas frações através de utilização, por exemplo, da coluna PD10 (Amersham Pharmacia Biotech Company), as frações recuperadas são carregadas em uma Cerâmica Bio-Scale, por exemplo, Hidroxiapatita, coluna do Tipo I CHT10-I (BioRad Company). Após lavagem da coluna com Tampão A (2 mM de tampão de fosfato de potássio contendo 1,5 mM de CaCI2; pH 7,0), a coluna é eluída com Tampão A com um gradiente linear de Tampão B (100 mM de tampão de fosfato de potássio contendo 0,03 mM de CaCh) para se obter uma série de frações de eluato. As frações mostrando atividade na conversão do composto (II) no composto (III) na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron, tal como coenzima NADPH, são recuperadas. Após troca do tampão nas frações utilizando, por exemplo, a coluna PD10 (Amersham Pharmacia Biotech Company), as frações recuperadas são concentradas através de, por exemplo, ultrafiltragem (unidade de filtro microcon microcon-30; Millipore Company). A fração resultante é injetada, por exemplo, em uma coluna HiLoad 16/60 Superdex 75pg column (Amersham Pharmacia Biotech Company) e eluída com 0,05M e um tampão de fosfato de potássio contendo 0,15M de NaCI (pH 7,0) para se obter uma série de frações de eluato. As frações mostrando atividade na conversão do composto (II) em composto (III) na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron, tal como a coenzima NADPH, são recuperadas. A presente proteína (A) pode ser purificada através de uma separação com SDS-PAGE conforme necessário.
Ao purificar a proteína (A) da presente invenção da maneira descrita acima, seguido por utilização da proteína (A) da presente invenção como uma antígeno imune, pode ser produzido um anticorpo reconhecendo a proteína (A) da presente invenção (daqui em diante referida como "o anticorpo (A) da presente invenção").
Especificamente, por exemplo, um animal é imunizado com a presente proteína (A) purificada da maneira descrita acima, como um antígeno. Por exemplo, para imunizar um animal tal como um camundongo, hamster, porquinho-da-índia, galinha, rato, coelho, cachorro e similar, o antí-geno é administrado pelo menos uma vez, utilizando um método convencional de imunização descrito em, por exemplo, W.H. Newsome, J. Assoe. Off. Anal. Chem. 70(6) 1025-1027 (1987). Como o programa de administração, por exemplo, é mencionada uma administração de 2 ou 3 vezes em intervalos de 7 a 30 dias, de preferência, intervalos de 12 a 16 dias. A dose é, por exemplo, a partir de cerca de 0,05 mg a 2 mg do antígeno para cada administração. A via de administração pode ser selecionada de administração subeutânea, administração intracutânea, administração intraperitoneal, administração intravenosa e administração intramuscular e uma injeção dada intravenosamente, intra-abdominalmente ou subeutaneamente é uma forma de administração típica. O antígeno é tipicamente usado após ser dissolvido em um tampão adequado, por exemplo, tampão de fosfato de sódio ou solução salina fisiológica contendo pelo menos um tipo de adjuvante geralmente usado tal como adjuvante de Freund completo (uma mistura de Aracel A, Bayol F e bacilus da tubercoluse morto), RAS [sistema de adjuvante MPL (lipídeo A monofosforila) + TDM (dicorinomicolato sintético)) + CWS (esqueleto de parede celular)] ou hidróxido de alumínio. No entanto, dependendo da via ou condições de administração, os adjuvantes descritos acima podem não ser usados. O "adjuvante" é uma substância que quando da administração com o antígeno aumenta uma reação imune não-especificamente contra o antígeno. Após criação do animal administrado com o antígeno por 0,5 a 4 meses, uma pequena quantidade de sangue é amostrada, por exemplo, de uma veia da orelha do animal e medida quanto à título de anticorpo. Quando o título do anticorpo é aumentado, então o antígeno é ainda administrado por uma número de vezes apropriado, dependendo dos casos. Por exemplo, o antígeno pode ser administrado por um ou mais vezes em uma dose de cerca de 100 pg a 1000 pg. Um ou dois meses após a última administração, sangue é coletado de uma maneira comum do animal imunizado. Tendo o sangue fracionado através de técnicas convencionais tal como precipitação através de centrifugação ou com sulfato de amônio ou com polietileno glicol, cromatografia tal como cromatografia de filtragem de gel, cromatografia de troca de íon e cromatografia de afinidade, e similar, o presente anticorpo (A) da invenção pode ser obtido como uma anti-soro policlonal. Ainda, o anti-soro pode ser incubado, por exemplo, a 56°C por 30 minutos para inativar o sistema de complemento.
Alternativamente, um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoacido parcial da proteína (A) da presente invenção é sintetizado quimicamente e administrado como um antígeno imune a um animal, com isso produzindo o presente anticorpo (A) da presente invenção. Como a se-qüência de aminoacido de um polipeptídeo empregado como um antígeno imune, uma seqüência de aminoacido que tem a menor homologia possível com a seqüência de aminoacido de outras proteínas é selecionada de se-qüências de aminoacido da proteína (A) da presente invenção. Um polipetí-deo tendo um comprimento de 10 aminoacidos a 15 aminoacidos consistindo na seqüência de aminoacido selecionada é sintetizado quimicamente através de um método convencional e reticulado, por exemplo, com uma proteína veículo tal como hemocianina de Limulus plyhemus usando MBS e similar e então usado para imunizar um animal tal como um coelho conforme acima descrito. O anticorpo resultante (A) da presente invenção é então trazido em contato com uma amostra de teste, e então um complexo da proteína na amostra de teste com o anticorpo descrito acima é detectado através de um método imunológico convencional, desse modo detecção da proteína (A) da presente invenção ou um polipeptídeo compreendendo um aminoacido parcial dela na amostra. Especificamente, por exemplo, é possível avaliar a presença da proteína (A) da presente invenção ou quantificar a proteína (A) da presente invenção na amostra de teste examinada através de uma análise western blot utilizando o anticorpo (A) da presente invenção mostrada no Exemplo 45 ou 73 descrito abaixo.
Ainda, por exemplo, uma célula expressando a proteína (A) da presente invenção pode ser detectada, através de contato do anticorpo (A) da presente invenção com uma célula de teste ou uma amostra de teste preparada a partir da célula de teste seguido por detecção de um complexo do anticorpo acima e da proteína na célula de teste ou uma amostra de teste preparada a partir da célula de teste, de acordo com métodos de imunológi-ca convencionais. Através da detecção da célula expressando a proteína (A) da presente invenção desse modo, é também possível selecionar de uma variedade de células uma célula expressando a proteína (A) da presente invenção. É também possível clonar ou selecionar um clone contendo a proteína (A) da presente invenção com o uso do anticorpo (A) da presente invenção. Por exemplo, uma biblioteca genômica pode ser produzida através de extração do DNA genômico de uma célula que expressa a proteína (A) da presente invenção seguido por inserção do DNA genômico em um vetor de expressão. A biblioteca genômica é introduzida em uma célula. A partir do grupo de célula obtido, uma célula expressando a proteína (A) da presente invenção é selecionada com o uso do anticorpo (A) da presente invenção da maneira descrita acima.
Um kit compreendendo o anticorpo (A) da presente invenção pode ser utilizado para detectar a proteína (A) da presente invenção conforme acima descrito ou para analisar, detectar ou procurar por uma célula expressando a proteína (A) da presente invenção. O kit da presente invenção pode conter os reagentes necessários para os métodos de análise acima, outros que não o anticorpo (A) da presente invenção, e pode ter tal reagente usado junto com o anticorpo (A) da presente invenção.
Reagindo um composto herbicida do tipo inibidor de PPO da fórmula (I) na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron, tal como uma coenzima NADPH, com a presente proteína (A), o composto acima é metabolizado e é convertido em um composto de atividade herbicida menor. Especificamente, por exemplo, reagindo o composto (II) na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron, tal como coenzima NADPH, com a presente proteína (A), o composto (II) é convertido no composto (III), o que mostra substancialmente falta de qualquer atividade herbicida. Um exemplo de proteína (A) em tais casos é a proteína (A) da presente invenção. Uma variação da presente proteína (A) pode ser utilizada e variações múltiplas podem ser utilizadas juntas. O composto da fórmula (I) é um composto tendo uma estrutura uracila. Como exemplos específicos, pode ser mencionado o composto (II) ou um composto de qualquer uma das fórmulas (IV) a (IX) (daqui em diante referidos respectivamente como um composto (IV) a composto (IX)). É possível sintetizar o composto (II) e o composto (IX) de acordo com o método descrito na Publicação de Patente Japonesa Não-examinada No. 2000-319264, composto (IV) e composto (V) de acordo com o método descrito na Patente U.S. No. 5183492, composto (VI) de acordo com o método descrito na Patente U.S. No. 5674810, composto (VII) de acordo com o método descrito na Publicação de Patente Japonesa Não-examinada No. 3-204865 e composto (VIII) de acordo com o método descrito na Publicação de Patente Japonesa Não-examinada No. 6-321941.
Ainda, como exemplos específicos do composto da fórmula (I), pode ser mencionado um composto de qualquer uma das fórmulas (X) a (XVII) (daqui em diante respectivamente referidos como composto (X) e composto (XVII)).
Os compostos que podem ser um substrato da reação de meta-bolização pela presente proteína (A) podem ser selecionados ao ter o composto presente em uma reação onde o composto (II) marcado com um radi-oisótopo é reagido com a presente proteína (A), na presença de um sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron, tal como coenzima NADPH, e detecção como um marcador da inibição competitiva da reação de conversão pela presente proteína (A) do composto (II) marcado para o composto (III) marcado. Quando testando quanto à presença da inibição competitiva de um composto de teste, o composto de teste é tipicamente adicionado para perfazer uma concentração molar a partir de 1 a 100 vezes do composto (II) marcado. A reação onde o composto (I) é reagido com a presente proteína (A) pode ser conduzida, por exemplo, em um tampão aquoso contendo sais de ácidos inorgânicos tal como um fosfato de metal alcalino tal como fosfato de sódio e fosfato de potássio; ou sais de ácidos orgânicos tal como acetato de metal alcalino tal como acetato de sódio e acetato de potássio; ou similar. A concentração do composto da fórmula (I) em uma solução de reação de metabolização é tipicamente no máximo cerca de 30% (p/v) e de preferência cerca de 0,001% (p/v) a 20% (p/v). A quantidade do sistema de transporte de elétron contendo o doador de elétron, tal como NADPH, ou da presente proteína (A) pode variar, por exemplo, dependendo do tempo de reação. A temperatura de reação é escolhida da faixa de tipicamente entre cerca de 10°C a 70°C, e é de preferência cerca de 20°C a 50°C. O pH da solução de reação é escolhido da faixa de tipicamente a partir de cerca de 4 a 12, e é de preferência cerca de 5 a 10. O tempo de reação pode variar conforme desejado, e é tipicamente a partir de cerca de 1 hora a 10 dias.
Ainda, a reação onde o composto (I) é reagido com a presente proteína (A) pode ser conduzida em uma célula compreendendo o DNA (A) presente. Como as células compreendendo o DNA (A) presente, por exemplo, é mencionado um microorganismo tendo a habilidade em expressar o DNA (A) presente e produzir a presente proteína (A), tal como, uma cepa desses microorganismos isolada da natureza compreendendo o DNA (A) presente, uma cepa mutante derivada de cepa de microorganismo através de tratamento com agentes químicos ou raios ultravioleta, uma célula de microorganismo transformada onde o DNA (A) presente ou um vetor contendo o DNA (A) presente é introduzido em uma célula hospedeira. Ainda, é mencionada uma célula de planta transformada na qual o DNA (A) presente é introduzido ou uma célula de uma planta transformada na qual o DNA (A) presente é introduzido. Em tais casos, o composto da fórmula (I) pode ser diretamente aplicado a uma célula compreendendo o DNA (A) presente ou pode ser adicionado ao meio de cultura da célula ou o solo que entra em contato com a célula, de modo a entrar na célula. O sistema de transporte de elétron contendo o doador de elétron, tal como NADPH, pode ser o sistema originalmente presente na célula e pode ser adicionado do exterior da célula. O metabolismo do composto (I) pela presente proteína (A) pode ser confirmado, por exemplo, através de detecção do composto produzido através do metabolismo do composto (I). Especificamente, por exemplo, o composto (III) produzido a partir do composto de metabolização (II) pode ser detectado com a análise de HPLC ou análise de TLC, descrita acima.
Ainda, o metabolismo do composto (l) pela presente proteína (A) pode ser confirmado com base no fato de que a atividade herbicida na solução de reação após o composto (I) ser reagido com a presente proteína (A) é comparativamente menor do que no caso onde o composto (I) não é reagido com a presente proteína (A). Como um método de teste da atividade herbicida, por exemplo, é mencionado um método onde as soluções de reação acima são aplicadas a ervas daninhas tal como erva de quinteiro (Echi-nochloa crus-galli), erva-preta (Alopercurus myosuroides), ipoméia de folha de hera (Ipomoea hederacea) e folha de veludo (Abutilon theophrasti), e os efeito herbicidas são examinados; ou um método onde as ervas daninhas são cultivadas em amostras de solo às quais as soluções de reação acima são aplicadas e os efeitos herbicidas são examinados; e similar. Ainda, é mencionado um método onde as soluções de reação acima podem ser pol-vilhadas sobre um disco de folha obtido de uma planta e a presença de dano à planta (branqueamento) causado pela solução de reação é examinada.
Ainda, o metabolismo do composto (I) da presente proteína (A) pode ser confirmado através de detecção como um marcador, da atividade de inibição de PPO na solução de reação após o composto (I) ser reagido com a presente proteína (A), que é comparativamente menor do que a atividade na solução de reação onde o composto (I) não é reagido com a presente proteína (A). PPO é uma enzima que catalisa a conversão de proto-porfirinogeno IX em protoporfirina IX (daqui em diante referida como "PPIX"). Por exemplo, após adição das soluções de reação acima a um sistema de reação de PPO, protoporfirinogeno IX, que é um substrato de PPO, é adicionado e incubado por cerca de 1 a 2 horas a 30°C no escuro. Subseqüente- mente, a quantidade de PPIX em cada uma das soluções incubadas é medida, utilizando uma HPLC ou similar. Quando a quantidade de PPIX no sistema para o qual a solução de reação após o composto (I) ser reagido com a presente proteína (A) é adicionada é mais do que a quantidade de PPIX no sistema para o qual a solução de reação onde o composto (I) não é reagido com a presente proteína (A) é adicionada, é determinado que o composto (I) foi metabolizado pela presente proteína (A). Como PPO, pode ser utilizada uma proteína purificada de plantas e similar ou fração de cloroplasto extraída de uma planta. Quanto utilizando as frações de cloroplasto, ácido aminole-vulínico pode ser utilizado no sistema de reação de PPO, ao invés de proto-porfirinogeno IX. Ácido aminolevulínico é o precursor de protoporfirinogeno IX no curso de biossíntese de heme-clorofila. Um exemplo mais específico é dado no Exemplo 42 abaixo.
Reagindo com a presente proteína (A) de tal maneira, pode ser conduzido um tratamento do composto herbicida do tipo inibidor de PPO da fórmula (I), o que resulta na metabolização e conversão do composto em um composto de atividade herbicida menor. O dano à planta do dito composto pode ser reduzido através do tratamento onde o dito composto que foi espalhado na área de cultivo de uma planta, especificamente, por exemplo, o composto que foi espalhado sobre a área de cultivo de uma planta e permanece no resíduo da planta ou solo ou similar, é reagido com a presente proteína (A).
Como o "sistema de transporte de elétron contendo o doador de elétron" que pode ser utilizado para reagir o composto (I) com a presente proteína (A), por exemplo, pode ser mencionado um sistema contendo NADPH, ferredoxina e ferredoxina-NADP+ redutase.
Como um método de apresentação do "sistema de transporte de elétron contendo um doador de elétron" em um sistema para reação do composto (I) com a presente proteína (A), por exemplo, é mencionado um método de adição ao sistema de reação acima, NADPH, ferredoxina derivada de uma planta tal como espinafre e ferredoxina-NADP+ redutase derivada de uma planta tal como espinafre. Ainda, pode ser adicionada ao dito siste- ma de reação uma fração contendo um componente funcional para o sistema de transporte de elétron no sistema de reação da presente proteína (A), que pode ser preparada a partir de um microorganismo tal como E. coli. A fim de preparar tal fração, por exemplo, após as células serem colhidas de uma cultura de um microorganismo através de centrifugação ou similar, as células são rompidas fisicamente através de um tratamento ultra-sônico, um tratamento DYNOMILL, um tratamento FRENCH PRESS e similar, ou rompidas quimicamente utilizando um tensoativo ou uma enzima de lise de célula tal como lisozima. A partir do lisato resultante desse modo obtido, materiais insolúveis são removidos através de centrifugação, filtragem em membrana ou similar para preparar um extrato sem célula. O extrato sem célula pode ser utilizado na troca do sistema de transporte de elétron pela ferredo-xina acima como a fração contendo um componente funcional no sistema de reação da presente proteína (A). Ainda, quando um sistema que pode transportar um elétron de um doador de elétron para a presente proteína (A) está presente em tal célula, como com o caso onde a reação da presente proteína (A) com o composto (I) é conduzida em uma célula tal como um microorganismo ou uma célula de planta, nenhum sistema de transporte de elétron pode ser de uma nova maneira adicionado.
Como a ferredoxina, por exemplo, pode ser utilizada uma ferre-doxina derivada de microorganismos pertencentes a Streptomyces, tal como Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces testaceus, Streptomyces achromogenes, Streptomyces griseolus, Streptomyces thermocoerulescens, Streptomyces nogalater, Streptomyces tsusimaensis, Streptomyces glome-rochromogenes, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces ornatus, Streptomyces griseus, Streptomyces lanatus, Streptomyces misawanensis, Streptomyces pallidus, Streptomyces roseorubens, Streptomyces rutgersen-sis e Streptomyces steffisburgensis, e mais especificamente, Streptomyces phaeochromogenes IF012898, Streptomyces testaceus ATCC21469, Streptomyces achromogenes IFO 12735, Streptomyces griseolus ATCC11796, Streptomyces thermocoerulescens IFO 14273t, Streptomyces nogalater IFO 13445, Streptomyces tsusimaensis IFO 13782, Streptomyces glomerochro- mogenes IFO 13673t, Streptomyces olivochromogenes IFO 12444, Streptomyces ornatus IFO 13069t, Streptomyces griseus ATCC 10137, Streptomyces griseus IFO 13849T, Streptomyces lanatus IFO 12787T, Streptomyces misawanensis IFO 13855T, Streptomyces pallidus IFO 13434T, Streptomyces roseorubens IFO 13682T, Streptomyces rutgersensis IFO 15875T e Streptomyces steffisburgensis IFO 13446T, e similar; ou microorganismos pertencentes a Saccharopolyspora, tal como Saccharopolys-pora taberi, mais especificamente, Saccharopolyspora taberi JCM 9383t e similar (daqui em diante algumas vezes referida coletivamente como "presente proteína (B)"). Especificamente, por exemplo, pode ser mencionada uma ferredoxina selecionada do grupo de proteína abaixo (daqui em diante algumas vezes referida como a "proteína (B) da presente invenção"). < grupo de proteína > (B1) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoaci-do mostrada na SEQ ID NO: 12 (daqui em diante algumas vezes referida como a "proteína (B1) da presente invenção); (B2) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoaci-do mostrada na SEQ ID NO: 13 (daqui em diante algumas vezes referida como a "proteína (B2) da presente invenção); (B3) uma proteína compreendendo uma seqüência de amínoa-cido mostrada na SEQ ID NO: 14 (daqui em diante algumas vezes referida como a "proteína (B3) da presente invenção); (B4) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoaci-do mostrada na SEQ ID NO: 111 (daqui em diante algumas vezes referida como a "proteína (B4) da presente invenção); (B5) uma ferredoxina compreendendo uma seqüência de ami-noacido tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO 14 ou SEQ ID NO: 111; (B6) uma ferredoxina compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO 14 ou SEQ ID NO: 111; (B7) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoaci-do mostrada na SEQ ID NO: 149 (daqui em diante algumas vezes referida como a "proteína (B7) da presente invenção); (B8) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 150 (daqui em diante algumas vezes referida como a "proteína (B8) da presente invenção); (B9) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 151 (daqui em diante algumas vezes referida como a "proteína (B9) da presente invenção); (B10) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 152 (daqui em diante algumas vezes referida como a "proteína (B10) da presente invenção); (B11) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 153 (daqui em diante algumas vezes referida como a "proteína (B11) da presente invenção); (B12) uma ferredoxina compreendendo uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251 ou SEQ ID NO: 253 ou uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com qualquer uma da seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 252 ou SEQ ID NO: 254; (B13) uma ferredoxina compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com qualquer seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 253 ou SEQ ID NO: 254; (B14) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 245; (B15) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 247; (B16) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 248; (B17) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 249; (B18) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 250; (B19) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 251; (B20) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 252; (B21) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 253; e (B22) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 254.
Um DNA codificando a presente proteína (B) (daqui em diante algumas vezes referida como o "DNA (B) presente" pode ser obtido de acordo com métodos de engenharia genética convencionais descritos em Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a Edição (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Current Protocols in Molecular Biology (1987), John Wiley & Sons, Incorporated e similar, com base nas seqüências de nucleotídeo codificando as seqüências de aminoacido da proteína (B) da presente invenção mostradas na SEQ IDNO: 12, 13, 14, 111, 149, 150, 151, 152, 153, 245, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253 ou 254.
Como o DNA codificando a proteína (B) da presente invenção (daqui em diante algumas vezes referida coletivamente como o "DNA (B) da presente invenção", é mencionado um DNA codificando uma proteína compreendendo uma se- qüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 12 (daqui em diante algumas vezes referida como o "DNA (B1) da presente invenção); um DNA codificando uma proteína compreendendo uma se-qüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 13 (daqui em diante algumas vezes referida como o "DNA (B2) da presente invenção); um DNA codificando uma proteína compreendendo uma se-qüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 14 (daqui em diante algumas vezes referida como o "DNA (B3) da presente invenção); um DNA codificando uma proteína compreendendo uma se-qüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 111 (daqui em diante algumas vezes referida como o "DNA (B4) da presente invenção); um DNA codificando uma ferredoxina compreendendo uma se-qüência de aminoacido tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO 14 ou SEQ ID NO: 111; um DNA codificando uma ferredoxina compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO 14 ou SEQ ID NO: 111; um DNA codificando uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 149 (daqui em diante algumas vezes referida como o "DNA (B7) da presente invenção); um DNA codificando uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 150 (daqui em diante algumas vezes referida como o "DNA (B8) da presente invenção); um DNA codificando uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 151 (daqui em diante algumas vezes referida como o "DNA (B9) da presente invenção); um DNA codificando uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 152 (daqui em diante al- gumas vezes referida como a "(B10) de DNA da presente invenção); um DNA codificando uma proteína compreendendo uma se-qüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 153 (daqui em diante algumas vezes referida como a "(B11) de DNA da presente invenção); um DNA codificando uma ferredoxina compreendendo uma se-qüência de aminoacido tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251 ou SEQ ID NO: 253 ou uma seqüência de aminoacido tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 252 ou SEQ ID NO: 254; um DNA codificando uma ferredoxina compreendendo uma seqüência de aminoacido codificada por uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 253 ou SEQ ID NO: 254; um DNA codificando uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 245; um DNA codificando uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 247; um DNA codificando uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 248; um DNA codificando uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 249; um DNA codificando uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 250; um DNA codificando uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 251; um DNA codificando uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 252; um DNA codificando uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 253; e um DNA codificando uma proteína compreendendo a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 254.
Como exemplos mais específicos do DNA (B) da presente invenção, pode ser mencionado um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 15, 16, 17, 112, 154, 155, 156, 157, 158, 255, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263 ou 264, ou um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com uma seqüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 15, 16, 17, 112, 154, 155, 156, 157, 158, 255, 257, 258, 259, 260, 261,262, 263 ou 264.
Tal DNA pode ser preparado conduzindo métodos onde PCR é conduzido com DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo parcial das suas seqüências de nucleotídeo como iniciadores ou métodos de hibri-dização onde tal DNA é usado como sondas, de acordo com as condições descritas acima nos métodos de preparação do DNA (A) presente.
Especificamente, por exemplo, um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 12 ou um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 15, pode ser preparado conduzindo PCR utilizando como molde o DNA cromossômico ou a biblioteca de DNA cromossômico preparada a partir de Streptomyces phaeochromogenes IF012898 e utilizando como iniciadores um oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 150 e um oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 53.
Ainda, um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 13 ou um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 16 pode ser preparado conduzindo PCR utilizando como o molde o DNA cromossômico ou biblioteca de DNA cromossômico preparada a partir de Saccharopolyspora taberi JCM 9383t e utilizando como iniciadores um oligo-nucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 106 e um oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 63.
Ainda, um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 14 ou um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 17 pode ser preparado conduzindo PCR utilizando como o molde o DNA cromossômico ou biblioteca de DNA cromossômico preparada a partir de Streptomyces testaceus ATCC21469 e utilizando como iniciadores um oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 107 e um oligonucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 72.
Ainda, por exemplo, o DNA (B) da presente invenção pode ser obtido através de hibridização com uma biblioteca de DNA cromossômico de um DNA consistindo em cerca de pelo menos 20 nucleotídeos compreendendo a seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoacido mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 12, 13, 14, 111, 149, 150, 151, 152 ou 153 como uma sonda sob as condições descritas acima, seguido por detecção e recuperação do DNA que se liga especificamente à dita sonda. A biblioteca de DNA cromossômico pode ser preparada conforme descrito acima para microorganismos pertencentes a Streptomyces tal como Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces testaceus, Streptomyces achromogenes, Streptomyces thermocoerulescens, Streptomyces nogalater, Streptomyces tsusimaensis, Streptomyces glomerochromogenes, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces ornatus, Streptomyces griseus, Streptomyces tanatus, Streptomyces misawanensis, Streptomyces pallidus, Streptomyces roseorubens, Streptomyces rutgersensis e Streptomyces ste-ffisburgensis, e mais especificamente, Streptomyces phaeochromogenes IF012898, Streptomyces testaceus ATCC21469, Streptomyces achromoge-nes IFO 12735, Streptomyces thermocoerulescens IFO 14273t, Streptomyces nogalater IFO 13445, Streptomyces tsusimaensis IFO 13782, Streptomyces glomerochromogenes IFO 13673t, Streptomyces olivochromogenes IFO 12444, Streptomyces ornatus IFO 13069t, Streptomyces griseus ATCC 10137, Streptomyces griseus IFO 13849T, Streptomyces lanatus IFO 12787T, Streptomyces misawanensis IFO 13855T, Streptomyces pallidus IFO 13434T, Streptomyces roseorubens IFO 13682T, Streptomyces rutger-sensis IFO 15875T e Streptomyces steffisburgensis IFO 13446T, e similar; ou microorganismos pertencentes a Saccharopolyspora, tal como Saccharo-polyspora taberi, mais especificamente, Saccharopolyspora taberi JCM 9383t e similar. Como exemplos específicos do DNA que pode ser utilizado como sondas é mencionado um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma da SEQ ID NO: 15, 16, 17, 112, 154, 155, 156, 157, 158, 255, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263 ou 264; DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo parcial de tais seqüências de nucleotídeo; ou um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo complementar às ditas seqüências de nucleotídeo parciais.
Para expressar o DNA (B) presente com uma célula hospedeira, por exemplo, um DNA onde o DNA (B) presente e um promotor funcional em uma célula hospedeira estão operavelmente ligados é preparado de acordo com métodos de engenharia genética convencionais descritos em "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a Edição (1989)", Cold Spring Harbor La-boratory Press; "Current Protocols in Molecular Biology (1987)", John Wiley & Sons, Incorporated e similar, e é introduzido em uma célula hospedeira. Se o transformante obtido contém o DNA (B) presente pode ser confirmado através da preparação do DNA a partir do transformante e então conduzindo com o DNA preparado de métodos de análise de engenharia genética descrito em, por exemplo, "Molecular Cloning 2a Edição", Cold Spring Harbor Press (Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989) (tal como confirmação de locais de enzima de restrição, seqüenciamento de DNA, hibridiza-ções Southern, PCRe similar). 0 DNA (Β) presente e o DNA (A) presente podem ser expressos na mesma célula, introduzindo em uma célula compreendendo o DNA (A) presente o DNA, onde o DNA (B) presente e um promotor funcional em uma célula hospedeira são operavalmente ligados. A presente proteína (B) pode ser preparada, por exemplo, através de cultura de uma célula compreendendo o DNA (B) presente. Como tal célula é mencionada um microorganismo expressando o DNA (B) presente e tendo a habilidade de produzir a presente proteína (B), tal como cepa de microorganismo isolada da natureza compreendendo o DNA (B) presente, cepas mutantes derivadas da dita cepa natural através de tratamento com agentes ou raios ultravioleta ou similar. Por exemplo, são mencionados microorganismos pertencentes a Streptomyces tal como Streptomyces phaeo-chromogenes, Streptomyces testaceus, Streptomyces achromogenes, Streptomyces gríseolus, Streptomyces thermocoerulescens, Streptomyces nogalater, Streptomyces tsusimaensis, Streptomyces glomerochromogenes, Streptomyces oiivochromogenes, Streptomyces ornatus, Streptomyces gri-seus, Streptomyces lanatus, Streptomyces misawanensis, Streptomyces pallidus, Streptomyces roseorubens, Streptomyces rutgersensis e Streptomyces steffisburgensis, e mais especificamente, Streptomyces phaeochro-mogenes IF012898, Streptomyces testaceus ATCC21469, Streptomyces achromogenes IFO 12735, Streptomyces gríseolus ATCC11796, Streptomyces thermocoerulescens IFO 14273t, Streptomyces nogalater IFO 13445, Streptomyces tsusimaensis IFO 13782, Streptomyces glomerochromogenes IFO 13673t, Streptomyces olivochromogenes IFO 12444, Streptomyces ornatus IFO 13069t, Streptomyces griseus ATCC 10137, Streptomyces griseus IFO 13849T, Streptomyces lanatus IFO 12787T, Streptomyces misawanensis IFO 13855T, Streptomyces pallidus IFO 13434T, Streptomyces roseorubens IFO 13682T, Streptomyces rutgersensis IFO 15875T e Streptomyces steffisburgensis IFO 13446T, e similar; ou microorganismos pertencentes a Saccharopolyspora, tal como Saccharopolyspora taberi, mais especificamente, Saccharopolyspora taberi JCM 9383t e similar. Ainda, pode ser mencionado um transformante onde o DNA (B) presente foi introduzida. Especifi- camente, por exemplo, é mencionado um transformante onde o DNA (B) presente operavelmente ligado a um promotor tac, promotor trc, promotor lac ou promotor de fago T7 foi introduzido em E. coli. Como exemplos mais específicos, são mencionados JM109/pKSN657FD de E.coli, JM109/pKSN923 FD de E.coli, JM109/pKSN671FD de E.coli e similar descritos nos exemplos abaixo. O microorganismo compreendendo o DNA (B) presente pode ser cultivado de acordo com um método empregado geralmente para culturar um microorganismos, e mais especificamente, conduzido de acordo com as condições descritas acima nos métodos de cultura dos microorganismos compreendendo o DNA (A) presente. A presente proteína (B) produzida pelo microorganismo compreendendo o DNA (B) presente, por exemplo, pode ser utilizada em várias formas no sistema de reação da presente proteína (A), tal como uma cultura de um microorganismo produzindo a presente proteína (B), uma célula de um microorganismo produzindo a presente proteína (B), um material obtido através de tratamento de tal célula, um extrato sem célula de um microorganismos, uma proteína grosseiramente purificada, uma proteína purificada e similar. Um material obtido através do tratamento de uma célula descrita acima inclui, por exemplo, uma célula liofilizada, uma célula seca com acetona, uma célula moída, um autolisato de célula, uma célula ultra-sonicamente tratada, uma célula tratada com álcali, uma célula tratada com solvente orgânico e similar. Alternativamente, a presente proteína (B) em qualquer uma das várias formas descritas acima pode ser imobilizada de acordo com métodos conhecidos tal como um método de ligação de apoio empregando uma adsorção em um polímero sintetizado e similar, e um método de infusão empregando uma inclusão em uma matriz de rede de um polímero, e então usada no sistema de reação da presente proteína (A).
Como métodos de purificação da presente proteína (B) a partir de uma cultura de um microorganismo compreendendo o DNA (B) presente, podem ser empregados métodos convencionais utilizados em uma purificação de proteína. Por exemplo, pode ser mencionado o método que segue.
Primeiro, células são colhidas de uma cultura de um microorganismo através de centrifugação ou similar, e então fisicamente rompidas através de um tratamento ultrassônico, ou rompidas quimicamente utilizando um tensoativo ou uma enzima de lise de célula tal como lisozimas. A partir do lisato resultante desse modo obtido, materiais insolúveis são removidos através de centrifugação, filtragem de membrana ou similar para preparar um extrato sem célula, o qual é então fracionado através de um meio apropriado para separação e purificação, tal como uma cromatografia de troca de cátion, uma cromatografia de troca de ânion, uma cromatografia hidrofóbica, uma cromatografia de filtragem de gel e similar, desse modo purificando a presente proteína (B). Através de separação da fração desse modo obtida com um SDS-PAGE, a presente proteína (B) pode ser ainda purificada. A função da presente proteína (B) como ferredoxina pode ser confirmada como uma função do transportador de elétron da ferredoxina-NADP+ redutase para a presente proteína (A) no sistema de reação onde o composto (I) é reagido com a presente proteína (A). Especificamente, por exemplo, pode haver uma confirmação através da adição da presente proteína (B) com NADPH, ferradoxina-NADP+ redutase e a presente proteína (A) ao sistema de reação onde o composto (I) é reagido com a presente proteína (A), seguido por detecção da conversão do composto (II) no composto (III).
No método de controle de ervas daninhas da presente invenção, o composto (I) é aplicado à área de cultivo de uma planta expressando a presente proteína (A). Tal planta pode expressar uma variação da presente proteína (A) ou pode expressar variações múltiplas da presente proteína (A). Como a presente proteína (A), por exemplo, pode ser mencionada a proteína (A) da presente invenção. Plantas expressando a presente proteína (A) podem ser obtidas como uma planta transgênica na qual o DNA (A) presente foi introduzido. Tal introdução envolve introdução do DNA (A) presente em uma célula de planta da maneira descrita acima de modo que o DNA é posto em uma posição que permite sua expressão, seguida por regeneração de uma planta a partir da célula transformada obtida. O DNA (A) presente intro- duzido na célula de planta pode ter ligado a montante dela uma seqüência de nucleotídeo codificando um sinal de trânsito para uma organela intracelular, de modo que estruturas de leitura estão em estrutura. A planta tendo introduzido nela o DNA (A) presente e expressando a presente proteína (A) metaboliza o composto (I), dentro de suas células, em um composto de atividade herbicida menor. Como resultado, o dano à planta por parte do composto herbicida na planta é reduzido e resistência ao dito composto é conferida. Desse modo, a planta tendo introduzido nela o DNA (A) presente e expressando a presente proteína (A) pode crescer bem mesmo em um caso onde o composto (I) é aplicado à sua área de cultivo. Ervas daninhas outras que não a planta tendo introduzido nela o DNA (A) presente e expressando a presente proteína (A) podem ser removidas eficazmente através do cultivo da dita planta e aplicando a composição herbicida acima à área de cultivo. É possível melhorar o rendimento da planta acima, melhorar a qualidade, reduzir a quantidade de herbicida utilizado e economizar trabalho. A avaliação de resistência da célula expressando a presente proteína (A) ao composto da fórmula (I) ou uma composição herbicida compreendendo o dito composto pode ser realizado contatando a célula expressando o gene codificando a presente proteína (A) com o dito composto ou a dita composição herbicida e avaliando o grau de dano à célula.
Especificamente, para avaliar a resistência de uma célula de microorganismo expressando a presente proteína (A) ao composto (I) ou a composição herbicida compreendendo o composto (I), uma E. coli transformada expressando PPO de planta e a presente proteína (A) pode ser preparada. Tal preparação envolve adicionalmente introdução do DNA (A) presente em, por exemplo, uma E. coli transformada que pode ser utilizada para avaliar a inibição da atividade de PPO e foi descrita no pedido de patente Japonês No. 11-102534. Mais especificamente, uma E. coli transformada onde um gene de PPO de planta descrito na Patente U.S. No. 5939602 ou similar é operavelmente introduzido na cepa BT3 de E. coli e expressando o gene de PPO. A cepa BT3 de E. coli tem um defeito no gene de PPO e não tem nenhuma habilidade de proliferação, conforme descrito no F. Yamamo-to, H. Inokuti, H. Ozaki, (1988) Japanese Journal of Genetics, Vol. 63, pg. 237-249. A resistência ao composto ou à composição herbicida pode ser avaliada através de cultivo da E. coli transformada resultante com agitação por cerca de 18 a 24 horas a 37°C em meio de cultura líquido contendo o composto (I) ou a composição herbicida compreendendo o dito composto em uma quantidade a partir de 0 a 1,0 ppm e medindo a proliferação da dita E. coli transformada com uma densidade ótica de 600 nm. Como a presente proteína (A), por exemplo, pode ser mencionada a proteína (A) da presente invenção.
Como um método de avaliação do grau de resistência de uma planta expressando a presente proteína (A) ao composto da fórmula (I) ou uma composição herbicida compreendendo o dito composto, é mencionado um método de aplicação da composição herbicida à planta e medição do grau de crescimento da planta. Para confirmação mais quantitativa, por exemplo, primeiro, pedaços de folhas da planta são mergulhados em soluções aquosas contendo o composto (I) em várias concentrações, ou as soluções aquosas do composto (I) são pulverizadas sobre pedaços de folhas da planta, em seguida por deixá-las descansar em um meio de ágar na luz em temperatura ambiente. Após vários dias, clorofila é extraída das folhas da planta de acordo com o método descrito por Mackenney, G., J. Biol. Chem., 140; p 315 (1941) para determinar o teor de clorofila. Especificamente, por exemplo, as folhas da planta são pegas e são partidas igualmente em 2 pedaços ao longo da veia principal. A composição herbicida é espalhada sobre toda a superfície de um dos pedaços de folha. O outro pedaço de folha é deixado sem tratamento. Esses pedaços de folha são postos em meio MS contendo 0,8% de ágar e deixados descansar na luz em temperatura ambiente por 7 dias. Então, cada pedaço de folha é moído com pilão em 5 ml de solução de acetona 80% aquosa para extrair clorofila. O líquido do extrato é diluído 10 vezes com solução de acetona aquosa a 80% e a absorbância é medida a 750 nm, 663 nm e 645 nm para calcular o teor de clorofila total de acordo com o método descrito por Mackenney G. J. Biol. Chem. (1941) 140, ρ. 315. Ο grau de resistência ao composto (I) pode ser comparativamente avaliado mostrando em percentuais o teor de clorofila total do pedaço de folha tratado com o teor de clorofila total do pedaço de folha não-tratado. Como a presente proteína (A), por exemplo, a proteína (A) da presente invenção pode ser mencionada.
Com base no método acima de avaliação do grau de resistência ao composto (I) ou uma composição herbicida compreendendo o composto (I), pode ser selecionada uma planta ou uma célula de planta mostrando uma resistência ao composto (I) ou uma composição herbicida compreendendo o composto (I). Por exemplo, é selecionada uma planta onde nenhum dano pode ser visto a partir da pulverização do composto (I) ou uma composição herbicida compreendendo o composto à área de cultivo da planta, ou célula de planta que continuamente cresce através de cultura na presença do composto (I). Especificamente, por exemplo, solo é embalado em um pote plástico tendo, por exemplo, um diâmetro de 10 cm e uma profundidade de 10 cm. As sementes da planta são semeadas e cultivadas em uma estufa. Uma emulsão é preparada misturando 5 partes de uma composição herbicida compreendendo o composto (I), 6 partes de sorpol3005X (Toho Chemicals) e 89 partes de xileno. Uma certa quantidade dela foi diluída com água contendo 0,1% (v/v) de um agente de espessamento em uma proporção de 1000L por 1 hectare e foi espalhada uniformemente com uma pistola de pulverização sobre todos os lados da folhagem acima da planta cultivada no pote acima. Após cultivo das plantas por 16 dias em uma estufa, o dano às plantas é investigado. As plantas onde o dano não é observado ou as plantas onde o dano é reduzido podem ser selecionadas. Ainda, plantas da progênie podem ser obtidas combinando tais plantas selecionadas.
EXEMPLOS A presente invenção é explicada em mais detalhes com os Exemplos abaixo, mas a presente invenção não é limitada a tais exemplos.
A HPLC para análise de conteúdo nos Exemplo 1, 41 e 42 e purificação de fração do composto foram realizadas sob as condições mostradas abaixoV (Condição de análise HPLC 1) coluna:SUMIPAX ODS 211 (Sumika Chemical Analysis Service) temperatura da coluna:35° C taxa de fluxo: 1 ml/min comprimento de onda de detecção: UV 254 nm eluente A:0,01 % de solução aquosa de TFA eluente B: acetonitrila condições de eluição: A amostra é injetada na coluna equilibrada com uma mistura de solvente de 90% de eluente A e 10% de eluente B. A mistura de solvente de 90% do eluente A e 10% de eluente B é então fluida por 5 minutos. Isso é seguido fluindo uma mistura de solvente de eluente A e eluente B por 20 minutos, enquanto aumentando a proporção de eluente B de 10% para 90%. Uma mistura de solvente de 10% de eluente A e 90% de eluente B é então fluida por 8 minutos.
Exemplo 1 O Metabolismo do Composto (II) por um microorganismo (l)Metabolismo do composto (II) Os vários microorganismos mostrados nas Tabelas 1 e 2 cresceram em meio ágar ISP2 (1,0% (p/v) de extrato de malte, 0,4% de (p/v), 0,4% (p/v) de glicose, 2,0% (p/v) de ágar, pH 7,3). Um "loopful" de cada microorganismo foi adicionado ao meio TGY (0,5% (p/v) de triptona, 0,5% (p/v) de extrato de levedura, 0,1% (p/v) de glicose, 0,01% (p/v) de KH2PO4, pH 7,0) e incubado com agitação a 30° C por 2 a 4 dias. Um décimo de mililitro (0,1 ml) da cultura obtida foi incubado com agitação em 3 ml de meio de cultura de esporulação (0,1% (p/v) de extrato de carne, (0,2% (p/v) de triptose, 1% de glicose, pH 7,1) contendo 0 composto (II) a 100 ppm por 7 a 8 dias a 30° C. Cinqüenta microlitros (50 μΙ) de HCI 2N foram adicionados à cultura resultante e isso foi extraído com 3 ml de acetato de etila. A camada de acetato de etila obtida foi analisada em HPLC. A concentração de composto (II) foi reduzida (tempo de retenção de coluna de 23,9 minutos), e novos picos foram detectados para os compostos em tempos de retenção de 21,6 minutos e 22,2 minutos (cada um referindo-se ao metabólito (I) e metabólito (II).
Os resultados são mostrados nas Tabelas 1 e 2. Tabela 1 Tabela 2 (2) Determinação da estrutura de cada metabólito (I) e meta- bólito (II) Um estoque congelado de Streptomyces griseus ATCC11429 foi adicionado a 3 ml de um meio de cultura de microorganismo de (0,7% (p/v) de polipeptona, 0,5% (p/v) de extrato de levedura, 1,0% (p/v) de glicose, 0,5% (p/v) de KHP204, pH 7,2) e incubado com agitação em um tubo de teste da noite para 0 dia para se obter uma pré-cultura. Tal pré-cultura foi adicionada a 300 ml do meio de microorganismo contendo o composto (II) em uma concentração de 100 ppm. Este foi dividido em 100 tubos de teste pequenos a 3 ml cada e incubados com agitação a 30°C por 6 dias. Após 250 ml de tal cultura terem sido ajustados para um pH2 através da adição de HCI, ela foi extraída com 250 ml de acetato de etila. Os solventes foram removidos da camada de acetato de etila. O resíduo foi dissolvido em 3 ml de acetona e pulverizado em uma placa de TLC de sílica-gel (placa de TLC de sílica-gel 6OF254, 20 cm x 20 cm, 0,25 mm de espessura, Merck Company). A placa de TLC foi desenvolvida com uma mistura 5:7:1 (v/v) de tolueno, ácido fómnico e formiato de etila. O valor Rf por volta de 0,58 da sílica-gel foi tomado. Tais conteúdos da placa de TLC foram extraídos com acetona. A acetona foi removida da camada de extração. O resíduo foi dissolvido em 10 ml de acetonitrila e fracionado com HPLC. As frações contendo apenas o metabólito (I) e metabólito (II) foram recuperadas para se obter 3,7 mg de metabólitos (daqui em diante referidos como "metabólito A").
Análise de espectrometria de massa do metabólito A foi conduzida. O metabólito A tinha uma massa que foi 14 vezes menor que o composto (II). Ainda, a partir da análise de H-RMN, foi determinado que o metabólito (A) FOI um composto tendo a estrutura mostrada na fórmula (III). (3) Teste de atividade herbicida do composto (III) Solo foi embalado em um pote de plástico redondo tendo um diâmetro de 10 cm e profundidade de 10 cm. Erva-de-quinteiro, erva preta, ipoméia de folha de hera foram semeadas e cultivadas em uma estufa por 10 dias. Cinco (5) partes do composto de teste, 6 partes de sorpol3005X (Toho Chemical Company) e 89 partes de xileno foram todas misturadas para produzir uma emulsão. Uma certa quantidade deles foi diluída com água contendo 0,1% (v/v) de um agente de adesão em uma proporção de 1000L por 1 hectare e foi espalhada uniformemente com uma pistola de pulverização em todos os lados da folha da parte superior da planta cultivada no pote acima. Após cultivo das plantas por 16 dias em uma estufa, a atividade herbicida do composto de teste foi investigada. Os resultados são mostrados na Tabela 3.
Tabela 3 Solo foi embalado em um pote de plástico redondo tendo um diâmetro de 10 cm e profundidade de 10 cm. Erva-de-quinteiro, erva preta, ipoméia de folha de hera foram semeadas. Cinco partes (5) do composto de teste, 6 partes de sorpol3005X (Toho Chemical Company) e 89 partes de xileno foram todas misturadas para produzir uma emulsão. Uma certa quantidade delas foi diluída com água contendo 0,1% (v/v) de um agente de adesão em uma proporção de 1000L por 1 hectare e foram espalhadas uniformemente com uma pistola de pulverização sobre a superfície do solo. Após cultivo das plantas por 19 dias em uma estufa, a atividade herbicida foi investigada. Os resultados são mostrados na Tabela 4.
Tabela 4 Nas tabelas 3 e 4 acima, a resistência da atividade herbicida é mostrada em etapas como 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10. O número "0" representa situações onde a condição de germinação ou vegetação no momento do exame da planta utilizada para o teste foi comparada com e não mostrou totalmente ou substancialmente nenhuma diferença com aquela de aplicação não-tratada. O número "10" representa situações onde a planta murchou completamente ou os brotos ou vegetação foi completamente suprimida. EXEMPLO 2Preparação da Proteína (A1) da Presente Invenção (1) Preparação de extrato de célula bruto Um estoque congelado de Streptomyces phaeochromogenes IF012898 foi adicionado a 100 ml de meio A (0,1%(p/v) de glicose, 0,5%(p/v) de triptona, 0,5%(p/v) de extrato de levedura, 0,1%(p/v) de hidro-genofosfato de dipotássio, pH7,0) em um frasco triangular de 500 ml e incubado com agitação giratória a 30°C por 1 dia para se obter uma pré-cultura. Oito mililitros (8 ml) da pré-cultura foram adicionados a 200 ml de um meio A e foram incubados com agitação giratória em um frasco fosco de 500 ml a 30°C por 2 dias. Péletes de célula foram recuperados através de centrifuga-ção (3.000 g, 5 minutos) da cultura resultante. Esses péletes de célula foram suspensos em 100 ml de meio B (1% (p/v) de glicose, 0,1% de extrato de carne, 0,2% (p/v) de triptose) contendo o composto (II) a 100 ppm e foram incubados com agitação recíproca em um frasco Sakaguchi de 500 ml por 16 horas a 30°C. Os péletes de célula foram recuperados através de centri-fugação (3.000 g, 5 minutos) de 10L da cultura resultante. Os péletes de célula resultantes foram lavados duas vezes com 1L de tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,0) para prover 162 g dos péletes de célula.
Esses péletes de célula foram suspensos em 0,1 M de tampão de fosfato de potássio (pH 7,0) a 2 ml para 1 g dos péletes de célula, e 1 mM de PMSF, 5 mM de HCI benzamidina, 1mM de EDTA e 1 mM de ditiotritol foram adicionados a eles. Uma solução de lisato de célula foi obtida rompendo duas vezes repetitivamente a suspensão com uma prensa French (1000 kg/cm2) (Ohtake Seisakusho). Após centrifugação da solução de lisato de célula (40.000 xg, 30 minutos), o sobrenadante foi recuperado e centrifugado por 1 hora a 150.000 xg para recuperar o sobrenadante (daqui em diante referido como o "extrato de célula bruto"). (2) Determinação da habilidade em converter o composto (II) no composto (III) Foram preparados 30 μΙ de uma solução de reação de 0,1M de tampão de fosfato de potássio (pH 7,0) contendo 3 ppm de composto (II) marcado com 14C, 2,4 mM de β-NADPH (daqui em diante referido como "componente A") (Oriental Yeast Company), 0,5 mg/ml de ferredoxina derivada de espinafre (daqui em diante referida como "componente B") (Sigma Company), 1 U/ml de ferredoxina redutase (daqui em diante referida como "componente C") (Sigma Company) e 18 μΙ de extrato de célula bruto recuperado no Exemplo 2(1). A solução de reação foi mantida a 30°C por uma hora. Ainda, foi preparada e mantida similarmente uma solução de reação não tendo nenhuma adição de pelo menos um componente utilizado na composição da solução de reação acima, selecionado do componente A, componente B e componente C. Três microlitros (3 μΙ) de HCI 2N e 90 μΙ de acetato de etila foram adicionados e misturados em cada uma das reações de solução após a manutenção. As soluções de reação resultantes foram centrifugadas a 8.000xg para recuperar 75 μΙ da camada de acetato de etila. Após secagem das camadas de acetato de etila sob pressão reduzida, o resíduo foi dissolvido em 6,0 μΙ de acetato de etila. Cinco microlitros (5,0 μΙ) dele foram pingados em uma placa de TLC (placa de TLC de sílica-gel 6OF254 20 cm x 20 cm, 0,25 mm de espessura, Merck Company). A placa de TLC foi desenvolvida com uma mistura 6:1:2 de clorofórmio, ácido acético e acetato de etila por cerca de 1 hora. Os solventes foram então deixados evaporar. A placa de TLC foi exposta da noite para o dia a uma placa de imagem (Fuji Film Company). Em seguida, a placa de imagem foi analisada em um Image Analyzer BAS2000 (Fuji Film Company). A presença de um ponto correspondendo ao composto (III) marcado com 14C foi examinada (valor Rf de 0,24 e 0,29). Os resultados são mostrados na Tabela 5.
Tabela 5 (3) Fracionamento do extrato de célula bruto Sulfato de amônio foi adicionado ao extrato de célula bruto no Exemplo 2(1) para perfazer uma solução de 45%. Após agitação em condições de resfriamento, o sobrenadante foi recuperado através de centrifuga-ção por 10 minutos a 12.000xg. Após adição de sulfato de amônio ao sobrenadante obtido para perfazer 55% de saturação e agitação em condição de resfriamento, um pélete foi recuperado através de centrifugação por 10 minutos a 12.000xg. O pélete foi dissolvido com 27,5 ml de tampão bistrispro-pano 20 mM (pH 7,0). Esta solução foi submetida a uma coluna PD10 (Amersham Pharmacia Company) e eluída com 20 mM de tampão de bis-trispropano (pH 7,0) para recuperar 38,5 ml de frações contendo proteínas (daqui em diante referida como "fração de sulfato de amônio de 45-55%"). (4) Isolamento da proteína (A1) da presente invenção A fração de sulfato de amônio de 45-55% preparada no Exemplo 2(3) foi injetada em uma coluna HiLoad26/10 Q Sepharose HP (Amersham Pharmacia Company). Em seguida, após fluir 106 ml de tampão de bistrispro-pano 20 mM (pH 7,0) na coluna, 20 mM de tampão bistrispropano foram fluidos com um gradiente linear de NaCI (gradiente de NaCI foi 0,001415M/minuto, a faixa de concentração de NaCI foi de 0M a 0,375M, a taxa de fluxo foi 3 ml/minuto) para uma recuperação de frações de 25 ml de fração eluindo em uma concentração de NaCI a partir de 0,21 M a 0,22M. Ainda, as frações recuperadas foram submetidas a uma coluna PD10 (Amersham Pharmacia Biotech Company) e eluídas com 20 mM de tampão de bistrispropano (pH 7,0) para recuperar as frações contendo proteína.
As frações recuperadas foram submetidas a uma coluna PD10 (Amersham Pharmacia Biotech Company) com a eluição com Tampão A (tampão de fosfato de potássio 2 mM contendo 1,5 mM de NaCI, pH 7,0) a fim de recuperar as frações contendo proteína. Em seguida, as frações foram injetadas em uma coluna de Hidroxiapatita de Cerâmica do Tipo 1 Bio-scale CHT10-I (BioRad Company). Trinta mililitros (30 ml) de Tampão A foram fluidos para uma coluna. Subseqüentemente, o Tampão A foi fluido com um gradiente linear de Tampão B (100 mM de tampão de fosfato de potássio contendo 0,03 mM de NaCI; o gradiente linear começou a 100% de Tampão A para aumentar para 50% o Tampão B durante um período de 100 minutos, a taxa de fluxo foi 2 ml/minuto) para recuperação de fração das frações elu-índo em uma concentração de Tampão B a partir de 17% a 20%. Ainda, as frações recuperadas foram submetidas a uma coluna PD10 (Amersham Pharmacia Biotech Company) e eluídas com 0,05M de tampão de fosfato de potássio (pH 7,0) para recuperar as frações contendo proteína.
As frações recuperadas foram concentradas 20 vezes usando uma membrana de ultrafiltragem (Microcon YM-30, Millipore Company) e injetadas em uma coluna HiLoad 16/60 Superdex 75pg (Amersham Pharmacia Biotech Company). Cinquenta milimolares (50mM) de tampão de fosfato de potássio contendo 0,15M de NaCI (pH 7,0) estavam fluindo (taxa de fluxo de 1 ml/minuto) na coluna. A eluição foi fracionada a 2 ml cada. As frações eluindo em volumes de eluição a partir de 56 ml a 66 ml foram cada fração recuperada. A proteína contida em cada uma das frações foi analisada com uma SDS-PAGE de 10%-20%.
Ao invés do extrato de célula bruto na solução de reação descrita no Exemplo 2(2), as frações recuperadas foram adicionadas e mantidas na presença do componente A, componente B, componente C e composto (II) marcado com 14C, similarmente ao Exemplo 2(2). As soluções de reação após a manutenção foram analisadas com TLC para examinar a intensidade dos pontos correspondendo ao composto (II) marcado com 14C. A proteína movendo para a posição para 47kDa no SDS-PAGE acima foi observada ter sua flutuação nas concentrações das faixas das frações adicionadas por sua vez para serem paralelas com as flutuações da intensidade dos pontos correspondendo ao composto (III). A dita proteína foi recuperada de gel de SDS-PAGE e foi submetida a uma análise de sequência de aminoacido com um seqüenciador de proteína (Applied Biosystems Company, Procise 494HT, método de líquido pulsado). Como resultado, a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 18 foi provida. Ainda, após digestão da proteína acima com tripsina, o material de digestão obtido foi analisado em um espectrômetro de massa (ThermoQuest Company, lon Trap Mass Spectro-meter LCQ, coluna: LC Packings Company PepMap C18 75μΐτι x 150mm, solvente A: 0,1% de H0Ac-H20, solvente B: 0,1% de HOAc-metanol, gradiente: um gradiente linear começando em uma eluição com uma mistura de 95% de solvente A e 5% de solvente B e aumentando para uma concentração de 100% de solvente B durante 30 minutos, taxa de fluxo: 0,2 μΙ/minuto). Como resultado, a seqüência mostrada na SEQ ID NO: 19 foi provida).
Exemplo 30btenção do DNA (A1) da presente invenção (1) Preparação do DNA cromossômico de Streptomyces phaeochromogenes IF012898 Streptomyces phaeochromogenes IF012898 foi incubado com agitação a 30°C por 1 dia a 3 dias em 50 ml de meio YEME (0,3% (p/v) de extrato de levedura, 0,5% (p/v) de bacto-peptona, 0,3% (p/v) de extrato de malte, 1,0% (p/v) de glicose, 34% (p/v) de sacarose e 0,2% (v/v) de 2,5M de MgCI2.6H20). As células foram recuperadas. As células obtidas foram suspensas em meio YEME contendo 1,4% (p/v) de glicina e 60 mM de EDTA e ainda incubadas com agitação por um dia. As células foram recuperadas do meio de cultura. Após lavagem uma vez com água destilada, elas foram res-suspensas em tampão (100 mM de Tris-HCI (pH 8,0), 100 mM de EDTA, 10 mM de NaCI) a 1 ml por 200 mg das células. Duzentos microgramas por mililitro (200 μg/ml) de lisozima branca de ovo foram adicionados. A suspensão de célula foi incubada com agitação a 30°C por uma hora. Ainda, 0,5% de SDS e 1 mg/ml de Proteinase K foram adicionados. A suspensão celular foi incubada a 55°C por 3 horas. A suspensão celular foi extraída duas vezes com uma mistura de fenol, clorofórmio e álcool isoamílico para recuperar cada uma das camadas aquosas. Em seguida, houve uma extração com mistura de clorofórmio e álcool isoamílico para recuperar a camada aquosa. O DNA cromossômico foi obtido através de precipitação de etanol a partir da camada aquosa. (2) Preparação da biblioteca de DNA cromossômico de Streptomyces phaeochromogenes IF012898 Novecentos e quarenta e três nanogramas (943 ng) do DNA cromossômico preparado no Exemplo 3(1) foram digeridos com 1 unidade de enzima de restrição Sau3AI a 37°C por 60 minutos. A solução de digestão obtida foi separada com 0,7% de eletroforese de gel de agarose. O DNA de cerca de 2,0 kpb foi recuperado a partir do gel. O DNA foi purificado com um kit de purificação Prep-A-GeneR DNA (Bio-Rad company) de acordo com as instruções anexadas ao dito kit para se obter 10 μΙ da solução contendo o DNA alvo. Um microlitro (1 μΙ) da solução de DNA, 98 ng de vetor de plas-mídeo pUC118 digerido com a enzima de restrição BamHI e tratada com desfosforilação e 11 μΙ da solução I do Kit de ligação Ver. 2 (Takara Shuzo Company) foram misturados e incubados da noite para o dia a 16°C. DH5a de E. coli foi transformada utilizando 5 μΙ da solução de ligação. A E. coli foi culturada com agitação da noite para o dia a 30°C. A partir do meio de cultura obtida, a E. coli foi recuperada. O plasmídeo foi extraído para prover a biblioteca de DNA cromossômico. (3) Isolamento do DNA (A1) da presente invenção PCR foi conduzida utilizando como molde o DNA cromossômico preparado no Exemplo 3(1) (Figura 1). Como os iniciadores, foi utilizado o par de um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 35 e então oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 36 (daqui em diante referido como o "par de inicia-dor 1"). A seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 35 foi construída com base em uma seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 18. Ainda, a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 36 foi construída com base em uma seqüência de nucleotídeo complementar à seqüência de nucleotídeo codificando a se- qüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 19. A solução de reação de PCR perfazia 25 μΙ através da adição de 2 iniciadores cada um perfazendo 200 nM, 250 ng do DNA cromossômico acima, 0,5 pde mistura de dNTP (uma mistura de 10 mM de cada um dos 4 tipos de dNTP); Clontech Com-pany), 5 μΙ de tampão de reação de PCR genômico 5xGC (Clontech Com-pany), 1,1 μΙ de 25 mM de Mg(OAc)2, 5 μΙ de GC-Melt 5M (Clontech Com-pany) e 0,5 μΙ de mistura de polimerase genômica GC-Advantage (Clontech Company) e água destilada. As condições de reação de PCR foram manutenção de 95°C por 1 minuto, repetição de 30 ciclos de um ciclo que incluía manutenção a 94°C por 15 segundos, seguido por 60°C por 30 segundos, seguido por 72°C por 1 minuto, e então mantendo 72°C por 5 minutos. Após a manutenção, a solução de reação foi submetida a eletroforese de gel de agarose a 4%. A área de gel contendo o DNA de cerca de 150 pb foi recuperada. O DNA foi recuperado a partir do gel recuperado utilizando um kit de extração de gel QIAquick (Qiagen Company) de acordo com as instruções anexas. O DNA obtido foi ligado ao vetor de clonagem TA pCR2.1 (Invitro-gen Company) de acordo com as instruções anexas ao dito vetor e foi introduzido em PTO10F'de E. coli. O DNA do plasmídeo foi preparado a partir do transformante de E. coli obtido utilizando o Kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen Company). Uma reação de seqüenciamento foi conduzida com kit de reação Dye terminator cycle sequencing FS ready (Applied Biosystems Ja-pan Company) de acordo com as instruções anexadas ao dito kit, utilizando como iniciadores o iniciador -21M13 (Applied Biosystems Japan Company) e iniciador M13Rev (Applied Biosystems Japan Company). A reação de seqüenciamento utilizou o DNA de plasmídeo obtido como o molde. Os produtos de reação foram analisados com um seqüenciador de DNA 373A (Applied Biosystems Japan Company). Como resultado, a seqüência de nucleotí-deo mostrada nos nucleotídeo 36 a 132 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 9 foi provida. A dita seqüência de nucleotídeo codificou a seqüência de aminoacido mostrada em aminoacidos 12 a 23 da seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 18. Com relação a isso, foi esperado que o dito DNA codificasse uma parte da proteína (A1) da presente in- venção.
Em seguida, PCR foi conduzida similar à acima com mistura de polimerase genômica Advantage-GC (Clontech Company) e utilizando o DNA cromossômico preparado no Exemplo 3(2) como o molde. Foi utilizado como iniciadores um par de um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nu-cleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 37 com um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 38 (daqui em diante referido como "par de iniciador 2") ou um par de um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 39 com um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 40 (daqui em diante referido como "par de iniciador 3").
Em seguida, foi amplificado através de PCR um DNA tendo uma seqüência de nucleotídeo onde o terminal 3’ se estende além do nucleotídeo mostrado como nucleotídeo 132 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 9. A PCR foi conduzida utilizando como molde a solução da solução de reação obtida com o uso do par de iniciador 2 e utilizando como iniciadores um par do oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 41 e o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 38 (daqui em diante referido como "par de iniciador 4"). Similarmente, foi amplificado através de PCR um DNA tendo uma seqüência de nucleotídeo onde o terminal 5' se estende para além do nucleotídeo mostrado como nucleotídeo 36 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 9. A PCR foi conduzida utilizando como o molde a solução da solução de reação obtida com o uso do par de iniciador 3 e utilizando como iniciadores um par do oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 42 e o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 40 (daqui em diante referido como "par de iniciador 5"). O DNA de 2 kpb amplificado com o uso de par de iniciador 4 e o DNA de 150 pb amplificado com o uso do par de iniciador 5 são clonados em um vetor de clonagem TA pCR2.1, similar ao acima. O DNA de plasmídeo foi preparado a partir do transformante de E. coli obtido, utilizando o Kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen Company). Uma reação de seqüenciamento foi conduzida com o kit de reação Dye terminator cycle se-quencing FS ready (Applied Biosystems Japan Company) de acordo com as instruções anexas ao dito kit, utilizando como iniciadores o iniciador -21M13 (Applied Biosystems Japan Company), iniciador M13Rev (Applied Biosystems Japan Company) e os oligonucleotídeos mostrados na SEQ ID NO: 43-50. A reação de seqüenciamento utilizou o DNA de plasmídeo obtido como o molde. Os produtos de reação foram analisados com um seqüenciador de DNA 373A (Applied Biosystems Japan Company). Como resultado de seqüenciamento da seqüência de nucleotídeo do DNA de 2 kpb amplificado usando o par de iniciador 4, a seqüência de nucleotídeo mostrada nos nu-cleotídeos 133 a 1439 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 9 foi provida. Ainda, como resultado do seqüenciamento da seqüência de nucleotídeo do DNA de 150 pb amplificado utilizando o par de iniciador 5, a seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 1 a 35 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 9 foi provida. Como resultado da conexão para se obter as seqüências de nucleotídeo, a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 9 foi obtida. Dois quadros de leitura abertos (ORF) estavam presentes na dita seqüência de nucleotídeo. Desse modo, havia contida uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 6) consistindo em 1227 nucleotídeos (inclusive do códon de parada) e codificando um resíduo de 408 aminoacidos bem como uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 15) consistindo em 201 nucleotídeos (inclusive do códon de parada) e codificando um resíduo de 66 aminoacidos. O peso molecular da proteína consistindo na seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 1) codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 6 foi calculado como sendo 45213 Da. Ainda, a seqüência de aminoacido codificada pela dita seqüência de nucleotídeo continha a seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 18) determinada a partir do seqüenciamento de aminoacido a partir do terminal N da proteína (A1) da presente invenção e a seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 19) determinada a partir do seqüenciamento do aminoacido dos fragmentos de digestão de tripsina com a análise de espectrômetro de massa. O peso molecular da proteína consistindo na seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 12) codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 15 foi calculado como sendo 6818Da.
Exemplo 4Expressão da proteína (A1) da presente invenção em E. coli (1) Produção de E. coli transformada tendo a proteína (A1) da presente invenção PCR foi conduzida utilizando como molde o DNA cromossômico preparado a partir de Streptomyces phaeochromogenes IF012898 no Exemplo 3(1) e utilizando o Sistema Expand High Fidelity PCR (Roche Molecular Biochemicals Company). Como os iniciadores, foi utilizado o par de um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 51 e um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 52 (daqui em diante referido como "par de iniciador 19") ou um par de um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 51 e um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 53 (daqui em diante referido como "par de iniciador 20"). A solução de reação de PCR perfazia 50 μΙ através da adição de 2 iniciadores cada um perfazendo 300 nM, 50 ng do DNA cromossômico acima, 5,0 μΙ de mistura de dNTP (uma mistura de 2,0mM de cada um dos 4 tipos de dNTP), 5,0 μΙ de tampão 10x HF Expand (contendo MgCI2) e 0,75 μΙ de mistura de enzima Expand HiFi e água destilada. As condições de reação da PCR foram manutenção de 97°C por minutos; repetição de 10 ciclos de um ciclo que incluía manutenção a 97°C por 15 segundos, seguido por 65°C por 30 segundos e seguido por 72°C por 2 minutos; então condução de 15 ciclos de um ciclo que incluía manutenção a 97°C por 15 segundos, seguido por 68°C por 30 segundos e seguido por 72°C por 2 minutos (onde 20 segundos foram adicionados à manutenção a 72°C para cada ciclo); e então manutenção a 72°C por 7 minutos. Após a manutenção, a solução de reação foi submetida a 1 % de eletroforese de gel de agarose. A área de gel contendo o DNA de cerca de 1,2kbp foi recuperada do gel que foi submetido à solução de reação utilizando o par de iniciador 19. A área de gel contendo o DNA de cerca de 1,5 kpb foi recuperada do gel que foi submetido à solução de reação utilizando o par de iniciador 20. O DNA foi purificado a partir de cada um dos géis recuperados utilizando um kit de estração de gel QIAquick (Qiagen Company) de acordo com as instruções anexas. O DNA obtido foi ligado ao vetor de clonagem TA pCR2.1 (Invitrogen Company) de acordo com as instruções anexas ao dito vetor e foi introduzido em PTO10F'de E. coli. O DNA do plasmídeo foi preparado a partir do transformante de E. coli obtido utilizando o Kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen Company). Reações de seqüenciamento foram conduzidas com o Kit de reação Dye terminator cycle sequencing FS ready (Applied Biosystems Japan Company) de acordo com as instruções anexadas ao dito kit, utilizando como iniciadores o iniciador -21M13 (Applied Biosystems Japan Company) e iniciador M13Rev (Applied Biosystems Japan Company), o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 43 e o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 46.
As reações de seqüenciamento utilizaram o DNA de plasmídeo obtido como o molde. Os produtos de reação foram analisados com um se-qüenciador de DNA 373A (Applied Biosystems Japan Company). Com base nos resultados, o plasmídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 6 foi chamado pCR657 e o plasmídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 9 foi chamado pCR657F.
Ainda, o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 134 e o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 135 foram analisados juntos para proverem um ligante (Figura 47). O plasmídeo pKSN24R2 (Akiyoshi-ShibaTa M. e outros, Eur. J. Biochem. 224: P335(1994)) foi digerido com Hindlll e Xmnl. O ligante foi inserido no DNA obtido de cerca de 3 kb. O plasmídeo obtido foi chamado pKSN (Figura 4).
Em seguida, cada um dos plasmídeos pCR657 e pCR657F foi digerido com as enzimas de restrição Ndel e Hindlll. Os produtos de digestão foram submetidos à eletroforese de gel de agarose. A área de gel contendo um DNA de cerca de 1,2 kpb foi cortada do gel submetido aos produtos de digestão de pCR657. A área de gel contendo um DNA de cerca de 1,5 kpb foi cortada do gel submetido aos produtos de digestão de pCR657F. O DNA foi purificado de cada um dos géis recuperados utilizando o kit de extração de QIAquick gel (Qiagen Company) de acordo com instruções anexas. Cada um do DNA obtido e o plasmídeo pKSN2 digerido com Ndel e Hindlll foram ligados com o Kit de ligação Ver. 1 (Takara Shuzo Company) de acordo com as instruções anexas ao dito kit e introduzidos em JM109 de E. coli. O DNA de plasmídeo foi preparado a partir de transformantes de E. coli obtidos. As suas estruturas foram analisadas. O plasmídeo contendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 6, onde o DNA de cerca de 1,2 kpb codificando a proteína (A1) da presente invenção é inserido entre o sítio Ndel e o sítio Hindlll de pKSN2, foi chamado pKSN657. Ainda, o plasmídeo contendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 9, onde o DNA de cerca de 1,5 kpb codificando a proteína (A1) da presente invenção é inserido entre o sítio Ndel e o sítio Hindlll de pKSN2 foi chamado pKSN657F. Cada um dos plasmídeos acima de pKSN657 e pKSN657F foi introduzido em JM109 de E. coli. Os transformantes de E. coli obtidos foram chamados, respectivamente, JM109/pKSN657 e JM109/pKSN657F. Ainda, o plasmídeo pKSN2 foi introduzido em JM109 de E. coli. O transformante de E. coli foi chamado JM109/pKSN2. (2) Expressão da proteína (A1) da presente invenção em E. colie recuperação da dita proteína JM109/pKSN657, JM109/pKSN657F e JM109/pKSN2 de E. coli foram cada um culturados da noite para o dia a 37°C em 10 ml de meio TB (1,2% (p/v) de triptona, 2,4% (p/v) de extrato de levedura, 0,4% (p/v) de gli-cerol, 17 mM de diidrogenofosfato de potássio, 72 mM de hidrogenofosfato de dipotássio) contendo 50 pg/ml de ampicilina. Um mililitro (1 ml) do meio de cultura obtido foi transferido para 100 ml de meio TB contendo 50 μg/ml de ampicilina e culturado a 26° C. Quando o OD660 atingiu cerca de 0,5, ácido 5-aminolevulínico foi adicionado para a concentração final de 500 μΜ, e a cultura foi continuada. Trinta (30) minutos depois, IPTG foi adicionado para uma concentração final de 1 mM, e houve ainda cultura por 17 horas.
As células foram recuperadas de cada um dos meios de cultura, lavadas com 0,1 M de tampão tris-HCI (pH 7,5) e suspensas em 10 ml do tampão acima contendo 1 mM de PMSF. As suspensões celulares obtidas foram submetidas 6 vezes a um sonificador (Sonifier (Branson Sonic Power Company)) a 3 minutos cada sob as condições de saída de 3, ciclo de serviço 30%, a fim de se obter as soluções de lisato de célula. Após centrifuga-ção das soluções de lisato de célula (1.200 xg, 5 minutos) os sobrenadantes foram recuperados e centrifugados (150.000 xg, 70 minutos) para recuperar as frações de sobrenadante (daqui em diante, a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN657 é referida como "extratos de pKSN657 de E. coh", a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN657F de E. coli é referida como "extrato de pKSN657F de E. coh", e a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN2 de E. coli é referida como "extrato de pKSN2 de E. colí). Um microlitro (1 μΙ) das frações de sobrenadante acima foi analisado em SDS-PAGE de 15% a 25% e tingido com Comassie Blue (daqui em diante referido como "CBB"). Como resultado, faixas notavelmente mais intensas foram detectadas em ambos extrato de pKSN657 de E. coli e pKSN657F de E. coli do que o extrato de pKSN2 de E. coli, nos locais de eletroforese correspondentes ao peso molecular de 47 kDa. Uma faixa mais intensa foi detectada em extrato de pKSN657F de E. coli do que no extrato de pKSN657 de E. coli. Foi mostrado que JM109/pKSN657F de E. coli expressou a proteína (A1) da presente invenção em um grau maior do que o JM109/pKSN657 de E. coli. (3) Detecção da habilidade em converter o composto (II) no composto (III) Soluções de reação de 30 μΙ foram preparadas e mantidas por 1 hora a 30° C. As soluções de reação consistiam em um tampão de fosfato de potássio 0,1M (pH 7,0) contendo 3 ppm de composto (II) marcado com 14C, 2 mM de β-NADPH (daqui em diante referido como "componente A") (Oriental Yeast Company), 0,2 mg/ml de uma ferredoxina derivada de espinafre (daqui em diante referida como "componente B") (Sigma Company), 1 U/ml de ferredoxina redutase (daqui em diante referida como "componente C") (Sigma Company) e 18 μΐ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 4(2). Ainda, foram preparadas e mantidas soluções de reação similares não tendo nenhuma adição de pelo menos um componente utilizado na composição da solução de reação acima, selecionada do componente A, componente B e componente C. Três microlitros (3 μΙ) de HCI 2N e 90 μΙ de acetato de etila foram adicionados e misturados a cada uma das soluções de reação após a manutenção. As soluções de reação resultantes foram centrifugadas a 8.000xg para recuperar 75 μΙ da camada de acetato de etila. Após secagem das camadas de acetato de etila sob pressão reduzida, o resíduo foi dissolvido em 6,0 μΙ de acetato de etila. Cinco microlitros (5,0 μΙ) dele foram pingados em uma placa de TLC (placa de TLC de sílica-gel 6OF254 de 20 cm x 20 cm, 0,25 mm de espessura, Merck Company). A placa de TLC foi desenvolvida com uma mistura 6:1:2 de clorofórmio, ácido acético e acetato de etila por cerca de 1 hora. Os solventes foram então deixados evaporar. A placa de TLC foi exposta da noite para o dia a uma placa de imagem (Fuji Film Company). Em seguida, a placa de imagem foi analisada em um Image Analyzer BAS2000 (Fuji Film Company). A presença de um ponto correspondendo ao composto (III) marcado com 14C foi examinada (valor Rf de 0,24 e 0,29). Os resultados são mostrados na Tabela 6.
Tabela 6 Exemplo 5Preparação da proteína (A2) da presente invenção (1) Preparação do extrato de célula bruto Um estoque congelado de Saccharopolyspora taberí JCM 9383t foi adicionado a 100 ml de meio A (0,1%(p/v) de glicose, 0,5%(p/v) de tripto-na, 0,5%(p/v) de extrato de levedura, 0,1%(p/v) de hidrogenofosfato de di-potássio, pH7,0) em um tubo de teste de 10 ml e incubado com agitação giratória a 30°C por 1 dia para se obter uma pré-cultura. Oito mililitros (8 ml) da pré-cultura foram adicionados a 200 ml de um meio A e foram girados culturados em um frasco fosco de 500 ml a 30°C por 2 dias. Péletes de célula foram recuperados através de centrifugação (3.000 xg, 10 minutos) de 10 L da cultura resultante. Esses péletes de célula foram suspensos em 100 ml de meio B (1% (p/v) de glicose, 0,1% de extrato de carne, 0,2% (p/v) de triptose) contendo o composto (II) a 100 ppm e foram incubados com agitação recíproca em um frasco Sakaguchi de 500 ml por 20 horas a 30°C. Os péletes de célula foram recuperados através de centrifugação (3.000 xg, 10 minutos) de 10L da cultura resultante. Os péletes de célula resultantes foram lavados duas vezes com 1L de tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,0) para prover 119 g dos péletes de célula.
Esses péletes de célula foram suspensos em 0,1 M de tampão de fosfato de potássio (pH 7,0) a 2 ml de 1 g dos péletes de célula. Um milimo-lar de (1mM) PMSF, 5 mM de HCI de benzamidina, 1mM de EDTA, 3 pg/ml de leupeptina, 3 pg/ml de pepstatina e 1 mM de ditiotritol foram adicionados a eles. Uma solução de lisato de célula foi obtida rompendo duas vezes repetitivamente a suspensão com uma prensa French (1000 kg/cm2) (Ohtake Seisakusho). Após centrifugação da solução de lisato de célula (40.000 xg, 30 minutos), o sobrenadante foi recuperado e centrifugado por 1 hora a 150.000xg para recuperar o sobrenadante (daqui em diante referido como o "extrato de célula bruto"). (2) Determinação da habilidade de conversão do composto (II) no composto (III) Foram preparados 30 μΙ de uma solução de reação de 0,1 M de tampão de fosfato de potássio (pH 7,0) contendo 3 ppm de composto (II) marcado com UC, 2,4 mM de β-NADPH (daqui em diante referido como "componente A") (Oriental Yeast Company), 0,5 mg/ml de ferredoxina derivada de espinafre (daqui em diante referida como "componente B") (Sigma Company), 1 U/ml de ferredoxina redutase (daqui em diante referida como "componente C") (Sigma Company) e 18 μΙ de extrato de célula bruto recuperado no Exemplo 5(1). A solução de reação foi mantida a 30°C por uma hora. Ainda, foi preparada e mantida similarmente uma solução de reação não tendo nenhuma adição de pelo menos um componente utilizado na composição da solução de reação acima, selecionado do componente A, componente B e componente C. Três microlitros (3 μΙ) de HCI 2N e 90 μΙ de acetato de etila foram adicionados e misturados em cada uma das soluções de reação após a manutenção. As soluções de reação resultantes foram centrifugadas a 8.000xg para recuperar 75 μΙ da camada de acetato de etila. Após secagem das camadas de acetato de etila sob pressão reduzida, o resíduo foi dissolvido em 6,0 μΙ de acetato de etila. Cinco microlitros (5,0 μΙ) dele foram pingados em uma placa de TLC (placa de TLC de sílica-gel 6OF254 20 cm x 20 cm, 0,25 mm de espessura, Merck Company). A placa de TLC foi desenvolvida com uma mistura 6:1:2 de clorofórmio, ácido acético e acetato de etila por cerca de 1 hora. Os solventes foram então deixados evaporar. A placa de TLC foi exposta da noite para 0 dia a uma placa de imagem (Fuji Film Company). Em seguida, a placa de imagem foi analisada em um Image Analyzer BAS2000 (Fuji Filme Company). A presença de um ponto correspondendo ao composto (III) marcado com 14C foi examinada (valor Rf de 0,24 e 0,29). Os resultados são mostrados na Tabela 7.
Tabela 7 (3) Fracionamento do extrato de célula bruto Sulfato de amônio foi adicionado ao extrato de célula bruto no Exemplo 5(1) para perfazer uma solução de 45%. Após agitação em condições de resfriamento, o sobrenadante foi recuperado através de centrifuga-ção por 10 minutos a 12.000xg. Após adição de sulfato de amônio ao sobrenadante obtido para perfazer 55% de saturação e agitação em condição de resfriamento, um pélete foi recuperado através de centrifugação por 10 minutos a 12.000xg. O pélete foi dissolvido com 32,5 ml de tampão bistrispro-pano 20 mM (pH 7,0). Esta solução foi submetida a uma coluna PD10 (Amersham Pharmacia Company) e eluída com 20 mM de tampão de bis-trispropano (pH 7,0) para recuperar 45,5 ml de frações contendo proteínas (daqui em diante referida como "fração de sulfato de amônio de 45-55%"). (4) Isolamento da proteína (A2) da presente invenção A fração de sulfato de amônio de 45-55% preparada no Exemplo 5(3) foi injetada em uma coluna HiLoad26/10 Q Sepharose HP (Amersham Pharmacia Company). Em seguida, após fluir 100 ml de tampão de bistris-propano 20 mM (pH 7,0) na coluna, 20 mM de tampão bistrispropano foram fluidos com um gradiente linear de NaCI (gradiente de NaCI foi 0,004M/minuto, a faixa de concentração de NaCI foi de 0M a 0,5M, a taxa de fluxo foi 8 ml/minuto) para uma recuperação de fração de 30 ml de frações eluindo em uma concentração de NaCI a partir de 0,25M a 0,26M. Ainda, as frações recuperadas foram submetidas a uma coluna PD10 (Amersham Pharmacia Biotech Company) e eluídas com 20 mM de tampão de bistrispropano (pH 7,0) para recuperar as frações contendo proteína.
As frações recuperadas foram submetidas a uma coluna PD10 (Amersham Pharmacia Biotech Company) com a eluição com Tampão A (tampão de fosfato de potássio 2 mM contendo 1,5 mM de NaCI, pH 7,0) a fim de recuperar as frações contendo proteína. Em seguida, as frações foram injetadas em uma coluna de Hidroxiapatita de Cerâmica do Tipo 1 Bio-scale CHT10-I (BioRad Company). Vinte mililitros (20 ml) de Tampão A foram fluidos para a coluna. Subseqüentemente, o Tampão A foi fluido com um gradiente linear de Tampão B (100 mM de tampão de fosfato de potássio contendo 0,03 mM de NaCI; o gradiente linear começou a 100% de Tampão A para aumentar para 50% do Tampão B durante um período de 100 minutos, a taxa de fluxo foi 2 ml/minuto) para recuperação de fração a 10 ml das frações eluindo em uma concentração de Tampão B a partir de 23% a 25%. Ainda, as frações recuperadas foram submetidas a uma coluna PD10 (Amersham Pharmacia Biotech Company) e eluídas com 0,05M de tampão de fosfato de potássio (pH 7,0) para recuperar as frações contendo proteína.
As frações recuperadas foram concentradas para cerca de 770 μΙ usando uma membrana de ultrafiltragem (Microcon YM-30, Millipore Company) e injetadas em uma coluna HiLoad 16/60 Superdex 75pg (Amersham Pharmacia Biotech Company). Cinqüenta milimolares (50mM) de tampão de fosfato de potássio contendo 0,15M de NaCI (pH 7,0) estavam fluindo (taxa de fluxo de 1 ml/minuto) na coluna. A eluição foi fracionada em 2 ml cada. As frações eluindo em volumes de eluição de mais ou menos 61 ml foram recuperadas. A proteína contida em cada uma das frações foi analisada com uma SDS-PAGE de 10%-20%.
Ao invés do extrato de célula bruto na solução de reação descrita no Exemplo 5(2), as frações recuperadas foram adicionadas e mantidas na presença do componente A, componente B, componente C e composto (III) marcado com 14C, similarmente ao Exemplo 5(2). As soluções de reação após a manutenção foram analisadas com TLC para examinar a intensidade dos pontos correspondendo ao composto (II) marcado com 14C. A proteína movendo para a posição para 47kDa no SDS-PAGE acima foi observada ter sua flutuação nas concentrações das faixas das frações adicionadas por sua vez para serem paralelas com as flutuações da intensidade dos pontos correspondendo ao composto (III). A dita proteína foi recuperada de gel de SDS-PAGE e foi submetida a uma análise de seqüência de aminoacido com um seqüenciador de proteína (Applied Biosystems Company, Procise 494HT, método de líquido pulsado) para seqüenciar a seqüência de aminoacido Nterminal. Como resultado, a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 20 foi provida. Ainda, após digestão da proteína acima com trip-sina, o material de digestão obtido foi analisado em um espectrômetro de massa (ThermoQuest Company, lon Trap Mass Spectrometer LCQ, coluna: LC Packings Company PepMap C18 75μΐτι x 150mm, solvente A: 0,1% de HOAC-H2O, solvente B: 0,1% de HOAc-metanol, gradiente: um gradiente linear começando em uma eluição com uma mistura de 95% de solvente A e 5% de solvente B e aumentando para uma concentração de 100% de solvente B durante 30 minutos, taxa de fluxo: 0,2 μΙ/minuto). Como resultado, a seqüência mostrada na SEQ ID NO: 21 foi provida).
Exemplo 60btenção do DNA (A2) da presente invenção (1) Preparação do DNA cromossômico de Saccharopolyspo-ra taberi JCM 9383t Saccharopolyspora taberi JCM 9383t foi culturado com agitação a 30°C por 1 dia a 3 dias em 50 ml de meio YEME (0,3% (p/v) de extrato de levedura, 0,5% (p/v) de bacto-peptona, 0,3% (p/v) de extrato de malte, 1,0% (p/v) de glicose, 34% (p/v) de sacarose e 0,2% (v/v) de 2,5M de l\y|gCI2.6H20). As células foram recuperadas. As células obtidas foram suspensas em meio YEME contendo 1,4% (p/v) de glicina e 60 mM de EDTA e ainda incubadas com agitação por um dia. As células foram recuperadas do meio de cultura. Após lavagem uma vez com água destilada, elas foram res-suspensas em tampão (100 mM de Tris-HCI (pH 8,0), 100 mM de EDTA, 10 mM de NaCI) a 1 ml por 200 mg dos péletes de célula. Duzentos microgra-mas por mililitro (200 pg/ml) de lisozima branca de ovo foram adicionados. A suspensão de célula foi agitada a 30°C por uma hora. Ainda, 0,5% de SDS e 1 mg/ml de Proteinase K foram adicionados. A suspensão celular foi incubada a 55°C por 3 horas. A suspensão celular foi extraída duas vezes com uma mistura defenol. clorofórmio, álcool isoamílico para recuperar cada uma das camadas aquosas. Em seguida, houve uma extração com mistura de clorofórmio, álcool isoamílico para recuperar a camada aquosa. O DNA cromossômico foi obtido através de precipitação de etanol da camada aquosa. (2) Preparação da biblioteca de DNA cromossômico de Saccharopolyspora taberi JCM 9383t Dezenove nanogramas (19 ng) do DNA cromossômico preparado no Exemplo 5(1) foram digeridos com 0,78U de enzima de restrição Sau3AI a 37°C por 60 minutos. A solução de digestão obtida foi separada com 1% de eletroforese de gel de agarose. O DNA de cerca de 2,0 kpb foi recuperado a partir do gel. O DNA foi purificado com um Kit de extração de gel QIAquick (Qiagen Company) de acordo com as instruções anexadas ao dito kit e foi concentrado com uma precipitação de etanol para se obter 10 μΙ da solução contendo o DNA alvo. Oito microlitros (8 μΙ) da solução de DNA, 100 ng de vetor de plasmídeo pUC118 digerido com a enzima de restrição BamHI e tratado com desfosforilação e 12 μΙ da solução I do Kit de Ligação Ver. 2 (Takara Shuzo Company) foram misturados e incubados da noite para o dia a 16°C. DH5a de E. coSi foi transformado com solução de ligação. Os transformantes de E. coli foram culturados da noite para o dia a 37°C em um meio ágar LB contendo 50 mg/l de ampicilina. As colônias obtidas foram recuperadas de um meio de ágar. Os plasmídeos foram extraídos e foram chamados como a biblioteca de DNA cromossômico. (3) Isolamento do DNA (A2) da presente invenção PCR foi conduzida utilizando como molde o DNA cromossômico preparado no Exemplo 6(1) como o molde com sistema Expand HiFi PCR (Boehringer Manheim Company) (Figura 2). Como os iniciadores, foi utilizado o par de um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 54 e um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 55 (daqui em diante referido como o "par de inicia-dor 6"). A seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 54 foi construída com base em uma seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido N terminal mostrada na SEQ ID NO: 20. Ainda, a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 55 foi construída com base em uma seqüência de nucleotídeo complementar à seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoacido interna mostrada na SEQ ID NO: 21. A solução de reação de PCR perfazia 25 μΙ através da adição de 300 ng do DNA cromossômico acima, os 2 iniciadores perfaziam, cada um, 7,5 pmol, 0,2 μΙ de mistura de dNTP (uma mistura de 2 mM de cada um dos 4 tipos de dNTP); 2,5 μΙ de tampão 100x (contendo MgCI2), 0,19 μΙ de mistura de enzima HiFi e água destilada. As condições de reação de PCR foram manu- tenção de 97°C por 2 minutos, repetição de 10 ciclos de um ciclo que incluía manutenção a 97°C por 15 segundos, seguido por 65°C por 30 segundos e seguido por 72°C por 1 minuto; então conduzindo 15 ciclos de um ciclo que incluída manutenção a 97°C por 15 segundos, seguido por 65°C por 30 segundos e seguido por 72°C por 1 minuto (onde 20 segundos foi adicionado à manutenção a 72°C para cada ciclo); e mantendo 72°C por 7 minutos. Após a manutenção, a solução de reação foi submetida à eletroforese de gel de agarose a 2%. A área de gel contendo o DNA de cerca de 800 pb foi recuperada. O DNA foi purificado a partir do gel recuperado utilizando um Kit de extração de gel QIAquick (Qiagen Company) de acordo com as instruções anexas. O DNA obtido foi ligado ao vetor de clonagem TA pCRIl-TOPO (In-vitrogen Company) de acordo com as instruções anexas ao dito vetor e foi introduzido em TOP10F'de E. coli. O DNA do plasmídeo foi preparado a partir do transformante de E. coli obtido utilizando Qiagen Tip20 (Qiagen Company). Uma reação de seqüenciamento foi conduzida com o kit de reação Dye terminator cycle sequencing FS ready (Applied Biosystems Japan Company) de acordo com as instruções anexadas ao dito kit, utilizando como iniciadores o iniciador -21M13 (Applied Biosystems Japan Company) e inici-ador M13Rev (Applied Biosystems Japan Company). Os produtos de reação foram analisados com um seqüenciador de DNA 373A (Applied Biosystems Japan Company). Como resultado, a seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 36 a 819 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 10 foi provida. Os nucleotídeos 37-60 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 10 codificaram uma parte da seqüência de amino-acido mostrada na SEQ ID NO: 20. Com relação a isso, foi esperado que o dito DNA codificasse uma parte da proteína (A2) da presente invenção.
Em seguida, PCR foi conduzida utilizando o DNA cromossômico preparado no Exemplo 6(2) como o molde e similar ao sistema de PCR Ex-pand HiFi acima. Foi utilizado como iniciadores, um par de um oligonucleotí-deo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 56 com um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 57 (daqui em diante referido como "par de iniciador 7"). Ao conduzir a PCR com tais iniciadores, foi amplificado um DNA tendo uma seqüência de nucle-otídeo onde o terminal 5' se estende para além do nucleotídeo mostrado como nucleotídeo 36 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO:10. Ainda, foi utilizado como iniciadores um par de um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 58 com um oligonucleotídeo tendo a seqüência mostrada na SEQ ID NO: 59 (daqui em diante referido como par "8"). Ao conduzir a PCR com tais iniciadores, foi amplificado um DNA tendo uma seqüência de nucleotídeo onde o terminal 3' se prolonga além do nucleotídeo mostrado como nucleotídeo 819 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 10. Cada um do DNA de 1,3 kb amplificado com o uso do par de iniciador 7 e o DNA de 0,4 kb amplificado com o uso do par de iniciador 8 foi clonado em um vetor de clonagem TA pCRIl-TOPO. O DNA de plasmídeo foi preparado a partir do transfor-mante de E. coli obtido, utilizando Qiagen Tip 20 (Qiagen Company). Uma reação de seqüenciamento foi conduzida com o kit de reação Dye terminator cycle sequencing FS ready (Applied Biosystems Japan Company) de acordo com as instruções anexas ao dito kit, utilizando como iniciadores o iniciador-21M13 (Applied Biosystems Japan Company), iniciador M13Rev (Applied Biosystems Japan Company) e os oligonucleotídeos mostrados na SEQ ID NO: 60. Os produtos de reação foram analisados com um seqüenciador de DNA 373A (Applied Biosystems Japan Company). Como resultado de seqüenciamento da seqüência de nucleotídeo do DNA de 1,3 kpb amplificado usando o par de iniciador 7, a seqüência de nucleotídeo mostrada nos nu-cleotídeos 1 a 35 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 10 foi provida. Ainda, como resultado do seqüenciamento da seqüência de nu-cieotídeo do DNA de 0,4 kb amplificado utilizando o par de iniciador 8, a seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 819 a 1415 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 10 foi provida. Como resultado da conexão para se obter seqüências de nucleotídeo, a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 10 foi obtida. Dois quadros de leitura abertos (ORF) estavam presentes na dita seqüência de nucleotídeo. Desse modo, estava contida uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 7) consistindo em 1206 nucleotídeos (inclusive do códon de parada) e codificando um resíduo de 401 aminoacidos bem como uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 16) consistindo em 198 nucleotídeos (inclusive do códon de parada) e codificando um resíduo de 65 aminoacidos. O peso molecular da proteína consistindo na seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 1) codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 7 foi calculado como sendo 43983 Da. Ainda, a seqüência de aminoacido codificada pela dita seqüência de nucleotídeo continha a seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 20) determinada a partir do seqüenciamento de aminoacido a partir do terminal N da proteína (A2) da presente invenção e a seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 21) determinada a partir do seqüenciamento da análise de es-pectrômetro de massa com fragmentos de digestão de tripsina. O peso molecular da proteína consistindo na seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 13) codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 16 foi calculado como sendo 6707 Da.
Exemplo 7Expressão da proteína (A2) da presente invenção em E. coli (1) Produção de E. coli transformada tendo a proteína (A2) da presente invenção PCR foi conduzida utilizando como molde o DNA cromossômico preparado a partir de Saccharopolyspora taberi JCM 9383t no Exemplo 6(1) e utilizando o sistema Expand HiFi PCR (Boehringer Manheim Company). Como os iniciadores, foi utilizado o par de um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 61 e um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 62 (daqui em diante referido como "par de iniciador 21") ou um par de um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 61 e um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 63 (daqui em diante referido como "par de iniciador 22"). A solução de reação de PCR perfazia 50 μΙ através da adição de 2 iniciadores cada um perfazendo 300 nM, 50 ng do DNA cromossômico acima, 5,0 μΙ de mistura de dNTP (uma mistura de 2,0mM de cada um dos 4 tipos de dNTP), 5,0 μΙ de tampão 10x HF Expand (contendo MgCh) e 0,75 μΙ de mistura de enzima Expand HiFi e água destilada. As condições de reação da PCR foram mantidas a 97°C por minutos; repetição de 10 ciclos de um ciclo que incluía manutenção a 97°C por 15 segundos, seguido por 60°C por 30 segundos e seguido por 72°C por 1 minuto; então condução de 15 ciclos de um ciclo que incluía manutenção a 97°C por 15 segundos, seguido por 60°C por 30 segundos e seguido por 72°C por 1 minuto (onde 20 segundos foram adicionados à manutenção a 72°C para cada ciclo); e então manutenção a 72°C por 7 minutos. Após a manutenção, a solução de reação foi submetida a 1% de eletro-forese de gel de agarose. A área de gel contendo o DNA de cerca de 1,2kpb foi recuperada do gel que foi submetido à solução de reação utilizando o par de iniciador 21. A área de gel contendo o DNA de cerca de 1,4 kpb foi recuperada do gel que foi submetido à solução de reação utilizando o par de iniciador 22. O DNA foi purificado a partir de cada um dos géis recuperados utilizando um Kit de extração de gel QIAquick (Qiagen Company) de acordo com as instruções anexas. O DNA obtido foi ligado ao vetor de clonagem pCRIl-TOPO (Invitrogen Company) de acordo com as instruções anexas ao dito vetor e foi introduzido em TOP10F'de E. coli. O DNA do plasmídeo foi preparado a partir dos transformantes de E. coli obtidos utilizando o Qiagen Tip20 (Qiagen Company). Em seguida, reações de seqüenciamento foram conduzidas com o Kit de reação Dye terminator cycle sequencing FS ready (Applied Biosystems Japan Company) de acordo com as instruções anexadas ao dito kit, utilizando como iniciadores o iniciador -21M13 (Applied Biosystems Japan Company), iniciador M13Rev (Applied Biosystems Japan Company), o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 56 e o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 64. Os produtos de reação foram analisados com um seqüenciador de DNA 373A (Applied Biosystems Japan Company). Com base nos resultados, o plasmídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 7 foi chamado pCR923 e o plasmídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 10 foi chamado pCR923F.
Em seguida, cada um dos plasmídeos pCR923 e pCR923F foi digerido com as enzimas de restrição Ndel e Hindlll. Os produtos de digestão foram submetidos à eletroforese de gel de agarose. A área de gel contendo um DNA de cerca de 1,2 kpb foi cortada do gel submetido aos produtos de digestão de pCR923. A área de gel contendo um DNA de cerca de 1,4 kpb foi cortada do gel submetido aos produtos de digestão de pCR923F. O DNA foi purificado de cada um dos géis recuperados utilizando o Kit de extração de gel QIAquick (Qiagen Company) de acordo com instruções anexas. Cada um do DNA obtido e o plasmídeo pKSN2 digerido com Ndel e Hindlll foram ligados com o Kit de ligação Ver. 1 (Takara Shuzo Company) de acordo com as instruções anexas ao dito kit e introduzidos em JM109 de E. coli. O DNA de plasmídeo foi preparado a partir de transformantes de E. coli obtidos. As suas estruturas foram analisadas. O plasmídeo contendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 7, onde o DNA de cerca de 1,2 kpb codificando a proteína (A2) da presente invenção é inserido entre o sítio Ndel e o sítio Hindlll de pKSN2, foi chamado pKSN923. Ainda, o plasmídeo contendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 10, onde o DNA de cerca de 1,4 kpb codificando a proteína (A2) da presente invenção é inserido entre o sítio Ndel e o sítio Hindlll de pKSN2 foi chamado pKSN923F. Cada um dos plasmídeos acima de pKSN923 e pKSN923F foi introduzido em JM109 de E. coli. Os transformantes de E. coli obtidos foram chamados, respectivamente, JM109/pKSN923 e JM109/pKSN923F. Ainda, o plasmídeo pKSN2 foi introduzido em JM109 de E. coli. O transformante de E. coli foi chamado JM109/pKSN2. (2) Expressão da proteína (A2) da presente invenção em E. coli e recuperação da dita proteína JM109/pKSN657 e JM109/pKSN657F e JM109/pKSN2 de E. coli foram cada um culturados da noite para o dia a 37°C em 10 ml de meio TB (1,2% (p/v) de triptona, 2,4% (p/v) de extrato de levedura, 0,4% (p/v) de gli-cerol, 17 mM de diidrogenofosfato de potássio, 72 mM de hidrogenofosfato de dipotássio) contendo 50 pg/ml de ampicilina. Um mililitro (1 ml) do meio de cultura obtido foi transferido para 100 ml de meio TB contendo 50 pg/ml de ampicilina e culturado a 26° C. Quando o QD660 atingiu cerca de 0,5, ácido 5-aminolevulínico foi adicionado para a concentração final de 500 μΜ, e a cultura foi continuada. Trinta (30) minutos depois, IPTG foi adicionado para uma concentração final de 1 mM, e houve ainda cultura por 17 horas.
As células foram recuperadas de cada um dos meios de cultura, lavadas com 0,1 M de tampão tris-HCI (pH 7,5) e suspensas em 10 ml do tampão acima contendo 1 mM de PMSF. As suspensões celulares obtidas foram submetidas 6 vezes a um sonificador (Sonifier (Branson Sonic Power Company)) a 3 minutos cada sob as condições de saída de 3, ciclo de serviço 30%, a fim de se obter as soluções de lisato de célula. Após centrifugação das soluções de lisato de célula (1.200 xg, 5 minutos) os sobrenadantes foram recuperados e centrifugados (150.000 xg, 70 minutos) para recuperar as frações de sobrena-dante (daqui em diante, a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN923 de E. coli é referida como "extrato de pKSN923 de E. coli", a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN923F de E. coli é referida como "extrato de pKSN923F de E. coli”, e a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN2 de E. coli é referida como "extrato de pKSN2 de E. coli). Um microlitro (1 μΙ) das frações de sobrenadante acima foi analisado em SDS-PAGE de 15% a 25% e tingido com CBB. Como resultado, faixas notavelmente mais intensas foram detectadas em ambos extrato de pKSN923 de E. coli e pKSN923F de E. coli do que o extrato de pKSN2 de E. coli, nos locais de eletroforese correspondentes ao peso molecular de 47 kDa. Foi confirmado que JM109/pKSN923 de E. coli e JM109/pKSN923F expressaram a proteína (A2) da presente invenção. (3) Detecção da habilidade em converter o composto (II) no composto (III) Soluções de reação de 30 μΙ foram preparadas e mantidas por 10 minutos a 30° C. As soluções de reação consistiam em um tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,0) contendo 3 ppm de composto (II) marcado com 14C, 2 mM de β-NADPH (daqui em diante referido como "componente A") (Oriental Yeast Company), 0,2 mg/ml de uma ferredoxina derivada de espinafre (daqui em diante referida como "componente B") (Sigma Company), 1 U/ml de ferredoxina redutase (daqui em diante referida como "componente C") (Sigma Company) e 18 μΙ da fração de sobrenadante recupera- da no Exemplo 7(2). Ainda, foram preparadas e mantidas soluções de reação similares não tendo nenhuma adição de pelo menos um componente utilizado na composição da solução de reação acima, selecionada do componente A, componente B e componente C. Três microlitros (3 μΙ) de HCI 2N e 90 μΙ de acetato de etila foram adicionados e misturados a cada uma das soluções de reação após a manutenção. As soluções de reação resultantes foram centrifugadas a 8.000xg para recuperar 75 μΙ da camada de acetato de etila. Após secagem das camadas de acetato de etila sob pressão reduzida, o resíduo foi dissolvido em 6,0 μΙ de acetato de etila. Cinco microlitros (5,0 μΙ) dele foram pingados em uma placa de TLC (placa de TLC de sílica-gel 6OF254 de 20 cm x 20 cm, 0,25 mm de espessura, Merck Company). A placa de TLC foi desenvolvida com uma mistura 6:1:2 de clorofórmio, ácido acético e acetato de etila por cerca de 1 hora. Os solventes foram então deixados evaporar. A placa de TLC foi exposta da noite para o dia a uma placa de imagem (Fuji Film Company). Em seguida, a placa de imagem foi analisada em um Image Analyzer BAS2000 (Fuji Film Company). A presença de um ponto correspondendo ao composto (III) marcado com 14C foi examinada (valor Rf de 0,24 e 0,29). Os resultados são mostrados na Tabela 8.
Tabela 8 Exemplo 8Preparação da presente proteína (A10) (1) Preparação do extrato de célula bruto Um estoque congelado de Streptomyces griseolus ATCC 11796 foi adicionado a 250 ml de meio B (1%(p/v) de glicose, 0,1%(p/v) de extrato de carne, 0,2%(p/v) de triptose) em um frasco fosco de 500 ml e incubado com agitação giratória a 30°C por 3 dias para se obter uma pré-cultura. Quarenta mililitros (40 ml) da pré-cultura foram adicionados a 400 ml de meio B e foram incubados com agitação giratória em um frasco triangular de 1L a 30°C por 24 horas. Após parada da cultura, a cultura foi deixada assentar. Duzentos e vinte mililitros (220 ml) do sobrenadante foram removidos. Duzentos e vinte mililitros (220 ml) de meio fresco similarmente preparado foram adicionados aos 220 ml restantes do meio de cultura para perfazer 440 ml. O composto (II) foi adicionado a ele para perfazer 100 ppm. As células foram incubadas com agitação giratória no frasco triangular de 1L a 30°C por 40 horas. Péletes de célula foram recuperados através de centrifugação (3.000 g, 5 minutos) 2,6 L da cultura resultante. Os péletes de célula resultantes foram lavados com 1L de tampão PIPES-NaOH (pH 6,8) para prover 26 g de péletes de célula.
Esses péletes de célula foram suspensos em tampão de PIPES-NaOH 0,1 M (pH 6,8) a 3 ml para 1 g dos péletes de célula, e um mM de PMSF, 5 mM de HCI de benzamidina, 1mM de EDTA, 3 μg/ml de leupeptina, 3 pg/ml de pepstatina A e 1 mM de ditiotritol foram adicionados a eles. Uma solução de lisato de célula foi obtida rompendo duas vezes repetitivamente a suspensão com uma prensa French (1000 kg/cm2) (Ohtake Seisakusho). Após centrifugação da solução de lisato de célula (40.000 xg, 30 minutos), o sobrenadante foi recuperado e centrifugado por 1 hora a 150.000 xg para recuperar o sobrenadante (daqui em diante referido como o "extrato de célula bruto"). (2) Determinação da habilidade de conversão do composto (II) no composto (III) Foram preparados 30 μΙ de uma solução de reação de 0,1 M de tampão de fosfato de potássio (pH 7,0) contendo 3 ppm de composto (II) marcado com 14C, 2,4 mM de β-NADPH (daqui em diante referido como "componente A") (Oriental Yeast Company), 0,5 mg/ml de uma ferredoxina derivada de espinafre (daqui em diante referida como "componente B") (Sigma Company), 1 U/ml de ferredoxina redutase (daqui em diante referida como "componente C") (Sigma Company) e 18 μΙ de extrato de célula bruto recuperado no Exemplo 8(1). A solução de reação foi mantida a 30°C por uma hora. Ainda, foi preparada e mantida similarmente uma solução de reação não tendo nenhuma adição de pelo menos um componente utilizado na composição da solução de reação acima, selecionado do componente A, componente B e componente C. Três microlitros (3 μΙ) de HCI 2N e 90 μΙ de acetato de etila foram adicionados e misturados em cada uma das reações de solução após a manutenção. As soluções de reação resultantes foram centrifugadas a 8.000xg para recuperar 75 μ! da camada de acetato de etila. Após secagem das camadas de acetato de etila sob pressão reduzida, o resíduo foi dissolvido em 6,0 μΙ de acetato de etila. Cinco microlitros (5,0 μΙ) dele foram pingados em uma placa de TLC (placa de TLC de sílica-gel 6OF254 20 cm x 20 cm, 0,25 mm de espessura, Merck Company). A placa de TLC foi desenvolvida com uma mistura 6:1:2 de clorofórmio, ácido acético e acetato de etila por cerca de 1 hora. Os solventes foram então deixados evaporar. A placa de TLC foi exposta da noite para o dia a uma placa de imagem (Fuji Film Company). Em seguida, a placa de imagem foi analisada em um Image Analyzer BAS2000 (Fuji Film Company). A presença de um ponto correspondendo ao composto (III) marcado com 14C foi examinada (valor Rf de 0,24 e 0,29). Os resultados são mostrados na Tabela 9.
Tabela 9 (3) Fracionamento do extrato de célula bruto Sulfato de amônio foi adicionado ao extrato de célula bruto no Exemplo 8(1) para perfazer uma solução de 45%. Após agitação em condições de resfriamento, o sobrenadante foi recuperado através de centrifuga-ção por 10 minutos a 12.000 xg. Após adição de sulfato de amônio ao sobrenadante obtido para perfazer 55% de saturação e agitação em condição de resfriamento, uma pélete foi recuperada através de centrifugação por 10 minutos a 12.000 xg. O pélete foi dissolvido com tampão bistrispropano 20 mM (pH 7,0) para perfazer 10 ml. Esta solução foi submetida a uma coluna PD10 (Amersham Pharmacia Company) e eluída com 20 mM de tampão de bistrispropano (pH 7,0) para recuperar 14 ml de frações contendo proteínas (daqui em diante referida como "fração de sulfato de amônio de 45-55%"). (4) Isolamento da presente proteína (A10) A fração de sulfato de amônio de 45-55% preparada no Exemplo 8(3) foi injetada em uma coluna MonoQ HR 10/10 (Amersham Pharmacia Company). Em seguida, após fluir 16 ml de tampão de bistrispropano 20 mM (pH 7,0) na coluna, 20 mM de tampão bistrispropano foram fluidos com um gradiente linear de NaCI (gradiente de NaCI foi 0,00625M/minuto, a faixa de concentração de NaCI foi de 0M a 0,5M, a taxa de fluxo foi 4 ml/minuto) para uma recuperação de fração de 15 ml de frações eluindo em uma concentração de NaCI a partir de 0,28M a 0,31 M. Ainda, as frações recuperadas foram submetidas a uma coluna PD10 (Amersham Pharmacia Biotech Company) e eluídas com 20 mM de tampão de bistrispropano (pH 7,0) para recuperar as frações contendo proteína.
As frações recuperadas foram submetidas a uma coluna PD10 (Amersham Pharmacia Biotech Company) com a eluição com Tampão A (tampão de fosfato de potássio 2 mM contendo 1,5 mM de NaCI, pH 7,0) a fim de recuperar as frações contendo proteína. Em seguida, as frações foram injetadas em uma coluna de Hidroxiapatita de Cerâmica do Tipo 1 Bio-scale CHT10-I (BioRad Company). Cinqüenta mililitros (50 ml) de Tampão A foram fluidos para a coluna. Subseqüentemente, o Tampão A foi fluido com um gradiente linear de Tampão B (100 mM de tampão de fosfato de potássio contendo 0,03 mM de NaCI; o gradiente linear começou a 100% de Tampão A para aumentar para 50% do Tampão B durante um período de 40 minutos, a taxa de fluxo foi 5 ml/minuto) para recuperação de fração das frações eluindo em uma concentração de Tampão B a partir de 16% a 31%. Ainda, as frações recuperadas foram submetidas a uma coluna PD10 (Amersham Pharmacia Biotech Company) e eluídas com 0,05M de tampão de fosfato de potássio (pH 7,0) para recuperar as frações contendo proteína. A proteína contida em cada uma das frações foi analisada em SDS-PAGE a 10%-20%.
Ao invés do extrato de célula bruto na solução de reação descrita no Exemplo 8(2), as frações recuperadas foram adicionadas e mantidas na presença do componente A, componente B, componente C e composto (II) marcado com 14C, similarmente ao Exemplo 8(2). As soluções de reação após a manutenção foram analisadas com TLC para examinar a intensidade dos pontos correspondendo ao composto (II) marcado com 14C. A proteína movendo para a posição para 47kDa no SDS-PAGE acima foi observada ter sua flutuação nas concentrações das faixas das frações adicionadas por sua vez para serem paralelas com as flutuações da intensidade dos pontos correspondendo ao composto (III). A dita proteína foi recuperada de gel de SDS-PAGE e digerida com tripsina. O material de digestão obtido foi analisado em um espectrômetro de massa (ThermoQuest Company, lon Trap Mass Spectrometer LCQ, coluna: LC Packings Company PepMap C18 75pm x 150mm, solvente A: 0,1% de HOAC-H2O, solvente B: 0,1% de HOAc-metanol, gradiente: um gradiente linear começando em uma eluição com uma mistura de 95% de solvente A e 5% de solvente B e aumentando para uma concentração de 100% de solvente B durante 30 minutos, taxa de fluxo: 0,2 μΙ/minuto). Como resultado, a seqüência de aminoacido mostrada em cada uma e qualquer uma da SEQ ID NO: 22-34 foi provida.
Exemplo 9Preparação do DNA cromossômico de Strepto-myces Griseolus ATCC 11796 Streptomyces Griseolus ATCC 11796 foi culturado com agitação a 30°C por 1 dia a 3 dias em 50 ml de meio YEME (0,3% (p/v) de extrato de levedura, 0,5% (p/v) de bacto-peptona, 0,3% (p/v) de extrato de malte, 1,0% (p/v) de glicose, 34% (p/v) de sacarose e 0,2% (v/v) de 2,5M de MgCl2.6H20). As células foram recuperadas. As células obtidas foram suspensas em meio YEME contendo 1,4% (p/v) de glicina e 60 mM de EDTA e ainda incubadas com agitação por um dia. As células foram recuperadas do meio de cultura. Após lavagem uma vez com água destilada, elas foram ressuspensas em tampão (100 mM de Tris-HCI (pH 8,0), 100 mM de EDTA, 10 mM de NaCI) a 1 ml por 200 mg dos péletes de célula. Duzentos microgramas por mililitro (200 pg/ml) de lisozima branca de ovo foram adicionados. A suspensão dè célula foi agitada a 30°C por uma hora. Ainda, 0,5% de SDS e 1 mg/ml de Proteinase K foram adicionados. A suspensão celular foi incubada a 55°C por 3 horas. A suspensão celular foi extraída duas vezes com uma mistura de fenol, clorofórmio, álcool isoamílico para recuperar cada uma das camadas aquosas. Em seguida, houve uma extração com mistura de clorofórmio, álcool isoamílico para recuperar a camada aquosa. O DNA cromossômico foi obtido através de precipitação de etanol da camada aquosa.
Exemplo lOObtenção de um DNA codificando o presente DNA (A10) e expressão em E. coli (1) Produção de E. coli transformada tendo o presente DNA PCR foi conduzida utilizando como molde o DNA cromossômico preparado a partir de Streptomyces griseolus ATCC 11796 no Exemplo 9 e utilizando o Sistema Expand High Fidelity PCR (Roche Molecular Biochemi-cal Company). Como os iniciadores, foi utilizado o par de um oligonucleotí-deo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 79 e um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 80 (daqui em diante referido como "par de iniciador 23") ou um par de um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 79 e um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 81 (daqui em diante referido como "par de iniciador 24"). A solução de reação de PCR perfazia 50 μΙ através da adição de 2 iniciadores cada um perfazendo 300 nM, 50 ng do DNA cromossômico acima, 5,0 μΙ de mistura de dNTP (uma mistura de 2,0mM de cada um dos 4 tipos de dNTP), 5,0 μΙ de tampão 10x Expand HF (contendo MgCI2) e 0,75 μΙ de mistura de enzima Expand HiFi e água destilada. As condições de reação da PCR eram manutenção de 97°C por 2 minutos; repetição de 10 ciclos de um ciclo que incluía manutenção a 97°C por 15 segundos, seguido por 650C por 30 segundos e seguido por 72°C por 2 minutos; então condução de 15 ciclos de um ciclo que incluía manutenção a 97°C por 15 segundos, seguido por 68°C por 30 segundos e seguido por 72°C por 1 minuto (onde 20 segundos foram adicionados à manutenção a 72°C para cada ciclo); e então manutenção a 72°C por 7 minutos. Após a manutenção, cada uma das soluções de reação foi submetida a 1% de eletroforese de gel de agarose. A área de gel contendo o DNA de cerca de 1,2kbp foi recuperada do gel que foi submetido à solução de reação utilizando o par de iniciador 23. A área de gel contendo o DNA de cerca de 1,5 kpb foi recuperada do gel que foi submetido à solução de reação utilizando o par de iniciador 24. O DNA foi purificado a partir de cada um dos géis recuperados utilizando um Kit de extração de gel QIAquick (Qiagen Company) de acordo com as instruções anexas. O DNA obtido foi ligado ao vetor de clonagem pCR2,1-TOPO (Invitrogen Company) de acordo com as instruções anexas ao dito vetor e foi introduzido em TOP10F'de E. coli. O DNA do plasmídeo foi preparado a partir dos transformantes de E. coli obtidos utilizando o kit Qiaprep Spin Miniprer (Qiagen Company). Em seguida, reações de seqüenciamento foram conduzidas com o Kit de reação Dye terminator cycle sequencing FS ready (Applied Biosystems Japan Company) de acordo com as instruções anexadas ao dito kit, utilizando como iniciadores o iniciador -21M13 (Applied Biosystems Japan Company) e iniciador M13Rev (Applied Biosystems Japan Company), o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 82 e o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 83. As reações de seqüenciamento utilizaram o DNA de plasmídeo obtido como o molde. Os produtos de reação foram analisados com um seqüenciador de DNA 373A (Applied Biosystems Japan Company). Com base nos resultados, o plasmídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 84 foi chamado pCR11796 e o plasmídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 85 foi chamado pCR11796F. Dois quadros de lei- tura abertos (ORF) estavam presentes na dita seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 85. Desse modo, havia contida uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 84) consistindo em 1221 nucleotídeos (inclusive do códon de parada) e codificando um resíduo de 406 aminoacidos (a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 5) e uma seqüência de nucleotídeo consistindo em 210 nucleotídeos (inclusive do códon de parada) e codificando um resíduo de 69 aminoacidos.
Em seguida, cada um dos plasmídeos pCR11796 e pCR11796F foi digerido com as enzimas de restrição Ndel e Hindlll. Os produtos de digestão foram submetidos à eletroforese de gel de agarose. A área de gel contendo um DNA de cerca de 1,2 kpb foi cortada do gel submetido aos produtos de digestão de pCR11796. A área de gel contendo um DNA de cerca de 1,5 kpb foi cortada do gel submetido aos produtos de digestão de pCR11796F. O DNA foi purificado de cada um dos géis recuperados utilizando o kit de extração de gel rápida Qiagen (Qiagen Company) de acordo com instrução anexas. Cada um do DNA obtido e o plasmídeo pKSN2 digerido com Ndel e Hindlll foram ligados com o Kit de ligação Ver. 1 (Takara Shuzo Company) de acordo com as instruções anexas ao dito kit e introduzidos em JM109 de E. coli. O DNA de plasmídeo foi preparado a partir de transformantes de E. coli obtidos. As suas estruturas foram analisadas. O plasmídeo contendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 84, onde o DNA de cerca de 1,2 kpb codificando a presente proteína (A10) é inserido entre o sítio Ndel e o sítio Hindlll de pKSN2 foi chamado pKSN11796. Ainda, o plasmídeo contendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 85, onde o DNA de cerca de 1,5 kpb codificando a presente proteína (A10) é inserido entre o sítio Ndel e o sítio Hindlll de pKSN2 foi chamado pKSN11796F. Cada um dos plasmídeos acima de pKSN11796 e pKSN11796F foi introduzido em JM109 de E. coli. Os transformantes de E. coli obtidos foram chamados, respectivamente, JM109/pKSN11796 e JM109/pKSN11796F. Ainda, o plasmídeo pKSN2 foi introduzido em JM109 de E. coli. O transformante de E. coli foi chamado JM109/pKSN2. (2) Expressão da presente proteína (A10) em E. coli e recu- peração da dita proteína JM109/pKSN11796, JM109/pKSN1176F e JM109/pKSN2 de E. coli foram cada um culturados da noite para o dia a 37°C em 10 ml de meio TB (1,2% (p/v) de triptona, 2,4% (p/v) de extrato de levedura, 0,4% (p/v) de glicerol, 17 mM de diidrogenofosfato de potássio, 72 mM de hidrogenofosfato de dipotássio) contendo 50 pg/ml de ampicilina. Um mililitro (1 ml) do meio de cultura obtido foi transferido para 100 ml de meio TB contendo 50 pg/ml de ampicilina e culturado a 26° C. Quando o OD660 atingiu cerca de 0,5, ácido 5-aminolevulínico foi adicionado para a concentração final de 500 μΜ, e a cultura foi continuada. Trinta (30) minutos depois, IPTG foi adicionado para uma concentração final de 1 mM, e houve ainda cultura por 17 horas.
As células foram recuperadas de cada um dos meios de cultura, lavadas com 0,1 M de tampão tris-HCI (pH 7,5) e suspensas em 10 ml do tampão acima contendo 1 mM de PMSF. As suspensões celulares obtidas foram submetidas 6 vezes a um sonificador (Sonifier (Branson Sonic Power Company)) a 3 minutos cada sob as condições de saída de 3, ciclo de serviço 30%, a fim de se obter as soluções de lisato de célula. Após centrifuga-ção das soluções de lisato de célula (1.200 xg, 5 minutos) os sobrenadantes foram recuperados e centrifugados (150.000 xg, 70 minutos) para recuperar as frações de sobrenadante (daqui em diante, a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN11796 é referida como "extrato de pKSN11796 de E. coli', a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN11796F de E. coli é referida como "extrato de pKSN11796 de E. coli', e a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN2 de E. coli é referida como "extrato de pKSN2 de E. coli). Um microlitro (1 μΙ) das frações de sobrenadante acima foi analisado em SDS-PAGE de 15% a 25% e tingido com Comassie Blue (daqui em diante referido como "CBB"). Como resultado, faixas notavelmente mais intensas foram detectadas em ambos extrato de pKSN11796 de E. coli e pKSN11796 F de E. coli do que o extrato de pKSN2 de E. coli, nos locais de eletroforese correspondentes ao peso molecular de 47 kDa. Uma faixa mais intensa foi detectada em extrato de pKSN11796F de E. coli do que no ex- trato de pKSN11796 de E. coli. Foi mostrado que JM109/pKSN11796F de E. coli expressou a presente proteína (A10) em um grau maior do que o JM109/pKSN11796 de E. coli. (3) Detecção da habilidade em converter o composto (II) no composto (III) Soluções de reação de 30 μΙ foram preparadas e mantidas por 1 hora a 30° C. As soluções de reação consistiam em um tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,0) contendo 3 ppm de composto (II) marcado com 14C, 2 mM de β-NADPH (daqui em diante referido como "componente A") (Oriental Yeast Company), 2 mg/ml de uma ferredoxina derivada de espinafre (daqui em diante referida como "componente B") (Sigma Company), 0,1 U/ml de ferredoxina redutase (daqui em diante referida como "componente C") (Sigma Company) e 18 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 10(2). Ainda, foram preparadas e mantidas soluções de reação similares não tendo nenhuma adição de pelo menos um componente utilizado na composição da solução de reação acima, selecionado do componente A, componente B e componente C. Três microlitros (3 μΙ) de HCI 2N e 90 μΙ de acetato de etila foram adicionados e misturados a cada uma das soluções de reação após a manutenção. As soluções de reação resultantes foram centrifugadas a 8.000xg para recuperar 75 μΙ da camada de acetato de etila. Após secagem das camadas de acetato de etila sob pressão reduzida, o resíduo foi dissolvido em 6,0 μΙ de acetato de etila. Cinco microlitros (5,0 μΙ) dele foram pingados em uma placa de TLC (placa de TLC de sílica-gel 6OF254 de 20 cm x 20 cm, 0,25 mm de espessura, Merck Company). A placa de TLC foi desenvolvida com uma mistura 6:1:2 de clorofórmio, ácido acético e acetato de etila por cerca de 1 hora. Os solventes foram então deixados evaporar. A placa de TLC foi exposta da noite para o dia a uma placa de imagem (Fuji Film Company). Em seguida, a placa de imagem foi analisada em um Image Analyzer BAS2000 (Fuji Film Company). A presença de um ponto correspondendo ao composto (III) marcado com 14C foi examinada (valor Rf de 0,24 e 0,29). Os resultados são mostrados na Tabela 10.
Tabela 10 Exemplo HObtenção do DNA (A3) da presente invenção (1) Preparação do DNA cromossômico de Streptomyces tes-taceus ATCC21469 Streptomyces testaceus ATCC21469 foi incubado com agitação a 30°C por 1 dia a 3 dias em 50 ml de meio YEME (0,3% (p/v) de extrato de levedura, 0,5% (p/v) de bactopeptona, 0,3% (p/v) de extrato de malte, 1,0% (p/v) de glicose, 34% (p/v) de sacarose e 0,2% (v/v) de 2,5M de MgCI2.6H20). As células foram recuperadas. As células obtidas foram suspensas em meio YEME contendo 1,4% (p/v) de glicina e 60 mM de EDTA e ainda incubadas com agitação por um dia. As células foram recuperadas do meio de cultura. Após lavagem uma vez com água destilada, elas foram res-suspensas em tampão (100 mM de Tris-HCI (pH 8,0), 100 mM de EDTA, 10 mM de NaCI) a 1 ml por 200 mg das células. Duzentos microgramas por mililitro (200 pg/ml) de lisozima branca de ovo foram adicionados. A suspensão de célula agitada a 30°C por uma hora. Ainda, 0,5% de SDS e 1 mg/ml de Proteinase K foram adicionados. A suspensão celular foi incubada a 55°C por 3 horas. A suspensão celular foi extraída duas vezes com uma mistura de fenol, clorofórmio e álcool isoamílico para recuperar cada uma das cama- das aquosas. Em seguida, houve uma extração com mistura de clorofórmio, álcool isoamílico para recuperar a camada aquosa. O DNA cromossômico foi obtido através de precipitação de etanol a partir da camada aquosa. (2) Isolamento de DNA (A3) da presente invenção PCR foi conduzida utilizando o DNA cromossômico preparado no Exemplo 11(1) como molde. Como os iniciadores, foi utilizado o par de um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 65 e um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 66 (daqui em diante referido como o "par de iniciador 9"). A solução de reação de PCR perfazia 50 μΙ através da adição de 250 ng do DNA cromossômico acima, os 2 iniciadores cada um perfazendo 200 nM, 4 μΙ de mistura de dNTP (uma mistura de 2,5 mM de cada um dos 4 tipos de dNTP), 5 μΙ de tampão 10x ExTaq, 0,5 μΙ de ExTaq polimerase (Takara Shuzo Com-pany) e água destilada. As condições de reação de PCR eram manutenção de 95°C por 1 minuto, repetição de 30 ciclos de um ciclo que incluía manutenção a 97°C por 15 segundos, seguido por 60°C por 30 segundos e seguido por 72°C por 90 segundos; e então manutenção a 72°C por 4 minutos. Após a manutenção, a solução de reação foi submetida à eletroforese de gel de agarose a 0,8%. A área de gel contendo o DNA de cerca de 1,4 kpb foi recuperada. O DNA foi purificado a partir do gel recuperado utilizando um Kit de extração de gel QIAquick (Qiagen Company) de acordo com as instruções anexas. O DNA obtido foi ligado ao vetor de clonagem TA pCR2.1 (In-vitrogen Company) de acordo com as instruções anexas ao dito vetor e foi introduzido em TOP10F'de E. coli. O DNA do plasmídeo foi preparado a partir do transformante de E. coli obtido utilizando o Kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen Company). Uma reação de seqüenciamento foi conduzida com o Kit de reação Dye terminator cycle sequencing FS ready (Applied Biosystems Japan Company) de acordo com as instruções anexadas ao dito kit, utilizando como iniciadores o oligonucletídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 67 e o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nu-cleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 68. As reações de seqüenciamento utilizaram o plasmídeo obtido como o molde. Os produtos de reação foram ana- lisados com um seqüenciador de DNA 373A (Applied Biosystems Japan Company). Como resultado, a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 69 foi provida. Dois quadros de leitura abertos (ORF) estavam presentes na dita seqüência de nucleotídeo. Desse modo, havia contida uma seqüência de nucleotídeo consistindo em 1188 nucleotídeos (inclusive do códon de parada) e codificando um resíduo de 395 aminoacidos bem como uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 17) consistindo em 195 nucleotídeos (inclusive do códon de parada) e codificando um resíduo de 64 aminoacidos. O peso molecular da seqüência de aminoacido codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 17 foi calculado como sendo 6666 Da.
Exemplo 12Expressão da proteína (A3) da presente invenção em E. coli (1) Produção de E. coli transformada tendo o DNA (A3) da presente invenção PCR foi conduzida utilizando como molde o DNA cromossômico preparado no Exemplo 11(1) e utilizando ExTaq polimerase (Takara Shuzo Company) sob condições similares às acima. Como os iniciadores, foi utilizado o par de um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 70 e um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 71 (daqui em diante referido como "par de iniciador 10") ou um par de um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 70 e um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 72 (daqui em diante referido como "par de iniciador 11"). O DNA de 1,2 kb amplificado utilizando o par de iniciador 10 e o DNA de 1,5 kpb amplificado utilizando o par de iniciador 11 foram clonados em um vetor de clonagem TA pCR2.1 de acordo com os métodos acima. O DNA de plasmídeo foi preparado a partir de transforman-tes de E. coli obtidos, utilizando o Kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen Company). Reações de seqüenciamento foram conduzidas com o Kit de reação Dye terminator cycle sequencing FS ready (Applied Biosystems Japan Company) de acordo com as instruções anexadas ao dito kit, utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 67 e o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 68. As reações de seqüenciamento utilizaram o DNA de plasmídeo obtido como o molde. Os produtos de reação foram analisados com um seqüenciador de DNA 373A (Applied Biosystems Japan Company). Como resultado, o plasmídeo tendo o plasmídeo clonado com o DNA amplificado pelo par de iniciador 10 foi confirmado ter a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 8. O plasmídeo clonado com o DNA amplificado através do par de iniciador 11 foi confirmado ter a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 11. Dois quadros de leitura abertos (ORF) estavam presentes na dita seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 11. Desse modo, havia contida uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 8) consistindo em 1188 nucleotídeos (inclusive do códon de parada) e codificando um resíduo de 395 aminoacidos e uma seqüência de nucleotídeo consistindo em 195 nucleotídeos (inclusive do códon de parada) e codificando um resíduo de 64 aminoacidos. O peso molecular da proteína consistindo na seqüência de aminoacido codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 8 foi calculado como sendo 43752 Da. Com os plasmídeos obtidos, o plasmídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 8 foi chamado pCR671 e o plasmídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 11 foi chamado pCR671F.
Em seguida, cada um dos plasmídeos pCR671 e pCR671F foi digerido com as enzimas de restrição Ndel e Hindlll. Os produtos de digestão foram submetidos à eletroforese de gel de agarose. A área de gel contendo um DNA de cerca de 1,2 kpb foi cortada do gel submetido aos produtos de digestão de pCR671. A área de gel contendo um DNA de cerca de 1,5 kpb foi cortada do gel submetido aos produtos de digestão de pCR671F. O DNA foi purificado de cada um dos géis recuperados utilizando o kit de extração de gel rápida Qiagen (Qiagen Company) de acordo com instrução anexas. Cada um do DNA obtido e o plasmídeo pKSN2 digerido com Ndel e Hindlll foram ligados com o Kit de ligação Ver. 1 (Takara Shuzo Company) de acordo com as instruções anexas ao dito kit e introduzidos em JM109 de E. coli. Ο DNA de plasmídeo foi preparado a partir de transformantes de E. coli obtidos. As suas estruturas foram analisadas. O plasmídeo contendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 8, onde o DNA de cerca de 1200 pb codificando a proteína (A3) da presente invenção é inserido entre o sítio Ndel e o sítio Hindlll de pKSN2, foi chamado pKSN671. Ainda, o plasmídeo contendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 11, onde o DNA de cerca de 1400 pb codificando a proteína (A3) da presente invenção é inserido entre o sítio Ndel e o sítio Hindlll de pKSN2 foi chamado pKSN671F. Cada um dos plasmídeos acima de pKSN671 e pKSN671F foi introduzido em JM109 de E. coli. Os transformantes de E. coli obtidos foram chamados, respectivamente, JM109/pKSN671 e JM109/pKSN671F. O trans-formante de E. coli foi chamado JM109/pKSN2. (2) Expressão da proteína (A3) da presente invenção em E. coli e recuperação da dita proteína JM109/pKSN671, JM109/pKSN671 F e JM109/pKSN2 de E. coli foram, cada um, culturados da noite para o dia a 37°C em 10 ml de meio TB (1,2% (p/v) de triptona, 2,4% (p/v) de extrato de levedura, 0,4% (p/v) de gli-cerol, 17 mM de diidrogenofosfato de potássio, 72 mM de hidrogenofosfato de dipotássio) contendo 50 pg/ml de ampicilina. Um mililitro (1 ml) do meio de cultura obtido foi transferido para 100 ml de meio TB contendo 50 pg/ml de ampicilina e culturado a 26° C. Quando o OD660 atingiu cerca de 0,5, ácido 5-aminolevulínico foi adicionado para a concentração final de 500 μΜ, e a cultura foi continuada. Trinta (30) minutos depois, IPTG foi adicionado para uma concentração final de 1 mM, e houve ainda cultura por 17 horas.
As células foram recuperadas de cada um dos meios de cultura, lavadas com 0,1 M de tampão tris-HCI (pH 7,5) e suspensas em 10 ml do tampão acima contendo 1 mM de PMSF. As suspensões celulares obtidas foram submetidas 6 vezes a um sonificador (Sonifier (Branson Sonic Power Company)) a 3 minutos cada sob as condições de saída de 3, ciclo de serviço 30%, a fim de se obter as soluções de lisato de célula. Após centrifuga-ção das soluções de lisato de célula (1.200 xg, 5 minutos) os sobrenadantes foram recuperados e centrifugados (150.000 xg, 70 minutos) para recuperar as frações de sobrenadante (daqui em diante, a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN671 é referida como "extrato de pKSN671 de E. coir, a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN671F de E. coli é referida como "extrato de pKSN671F de E colP', e a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN2 de E. coli é referida como "extrato de pKSN2 de E. co/Γ). (3) Detecção da habilidade em converter o composto (II) no composto (III) Soluções de reação de 30 μΙ foram preparadas e mantidas por 1 hora a 30° C. As soluções de reação consistiam em um tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,0) contendo 3 ppm de composto (II) marcado com 14C, 2 mM de β-NADPH (daqui em diante referido como "componente A") (Oriental Yeast Company), 0,2 mg/ml de uma ferredoxina derivada de espinafre (daqui em diante referida como "componente B") (Sigma Company), 1 U/ml de ferredoxina redutase (daqui em diante referida como "componente C") (Sigma Company) e 18 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 12(2). Ainda, foram preparadas e mantidas soluções de reação similares não tendo nenhuma adição de pelo menos um componente utilizado na composição da solução de reação acima, selecionada do componente A, componente B e componente C. Três microlitros (3 μΙ) de HCI 2N e 90 μΙ de acetato de etila foram adicionados e misturados a cada uma das soluções de reação após a manutenção. As soluções de reação resultantes foram centrifugadas a 8.000xg para recuperar 75 μΙ da camada de acetato de etila. Após secagem das camadas de acetato de etila sob pressão reduzida, o resíduo foi dissolvido em 6,0 μΙ de acetato de etila. Cinco microlitros (5,0 μΙ) dele foram pingados em uma placa de TLC (placa de TLC de sílica-gel 6OF254 de 20 cm x 20 cm, 0,25 mm de espessura, Merck Company). A placa de TLC foi desenvolvida com uma mistura 6:1:2 de clorofórmio, ácido acético e acetato de etila por cerca de 1 hora. Os solventes foram então deixados evaporar. A placa de TLC foi exposta da noite para 0 dia a uma placa de imagem (Fuji Film Company). Em seguida, a placa de imagem foi analisada em um Image Analyzer BAS2000 (Fuji Film Company). A presença de um ponto correspondendo ao composto (III) marcado com 14C foi examinada (valor Rf de 0,24 e 0,29). Os resultados são mostrados na Tabela 11.
Tabela 11 Exemplo 130btenção do presente DNA (A9) (1) Preparação do DNA cromossômico de Streptomyces carbophilus SANK62585 Streptomyces carbophilus SANK62585 (FERM BP-1145) foi incubado com agitação a 30°C por 1 dia em 50 ml de meio YEME (0,3% (p/v) de extrato de levedura, 0,5% (p/v) de bacto-peptona, 0,3% (p/v) de extrato de malte, 1,0% (p/v) de glicose, 34% (p/v) de sacarose e 0,2% (v/v) de 2,5M de MgCl2.6H20). As células foram recuperadas. As células obtidas foram suspensas em meio YEME contendo 1,4% (p/v) de glicina e 60 mM de EDTA e ainda incubadas com agitação por um dia. As células foram recuperadas do meio de cultura. Após lavagem uma vez com água destilada, elas foram ressuspensas em tampão (100 mM de Tris-HCI (pH 8,0), 100 mM de EDTA, 10 mM de NaCI) a 1 ml por 200 mg das células. Duzentos microgramas por mililitro (200 pg/ml) de lisozima branca de ovo foram adicionados. A suspensão de célula agitada a 30°C por uma hora. Ainda, 0,5% de SDS e 1 mg/ml de Proteinase K foram adicionados. A suspensão celular foi incubada a 55°C por 3 horas. A suspensão celular foi extraída duas vezes com uma mistura de fenol. clorofórmio, álcool isoamílico para recuperar cada uma das camadas aquosas. Em seguida, houve uma extração com mistura de clorofórmio, álcool isoamílico para recuperar a camada aquosa. O DNA cromossômico foi obtido através de precipitação de etanol a partir da camada aquosa. (2) Isolamento da presente DNA (A9) PCR foi conduzida utilizando como o molde o DNA cromossômico preparado no Exemplo 13(1). Como os iniciadores, foi utilizado o par de um oligonucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 74 e um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 75 (daqui em diante referido como o "par de iniciador 12") ou o par de um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 76 e um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 77 (daqui em diante referido como "par de iniciador 13"). A solução de reação de PCR perfazia 50 μΙ através da adição de 2 iniciadores cada um perfazendo 200 nM, 250 ng do DNA cromossômico acima, 4 μΙ de mistura de dNTP (uma mistura de 2,5 mM de cada um dos 4 tipos de dNTP), 5 μΙ de tampão 10x ExTaq, 0,5 μΙ de ExTaq polimerase (Takara Shuzo Company) e água destilada. As condições de reação de PCR eram manutenção de 95°C por 2 minutos, repetição de 30 ciclos de um ciclo que incluía manutenção a 97°C por 15 segundos, seguido por 60°C por 30 segundos e seguido por 72°C por 90 segundos; e então manutenção a 72°C por 4 minutos. Após a manutenção, a solução de reação foi submetida à eletroforese de gel de agarose a 0,8%. A área de gel contendo o DNA de cerca de 500 pb foi recuperada do gel submetido à solução de reação de PCR utilizando o par de iniciador 12. A área de gel contendo o DNA de cerca de 800 pb foi recuperada do gel submetido à solução de reação de PCR utilizando o par de iniciador 13. O DNA foi purificado a partir de cada um dos géis recuperados utilizando um Kit de extração de gel QIAquick (Qiagen Company) de acordo com as instruções anexas. O DNA obtido foi ligado ao vetor de clonagem TA pCR2.1 (Invitrogen Company) de acordo com as instruções anexas ao dito vetor e foi introduzido em TOP10F'de E. coli. O DNA do plasmídeo foi preparado a partir do transformante de E. coli obtido utili- zando o Kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen Company). Uma reação de se-qüenciamento foi conduzida com o Kit de reação Dye terminator cycle se-quencing FS ready (Applied Biosystems Japan Company) de acordo com as instruções anexadas ao dito kit, utilizando como iniciadores o oligonucleotí-deo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 67 e o oli-gonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 68. A reação de seqüenciamento utilizou o DNA de plasmídeo obtido como o molde. Os produtos de reação foram analisados com um seqüenciador de DNA 373A (Applied Biosystems Japan Company). Como resultado, a seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 1 a 498 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 78 foi provida pelo DNA obtido através de PCR utilizando o par de iniciador 12. A seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 469 a 1233 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 78 foi provida pelo DNA obtido através de PCR utilizando o par de iniciador 13. O plasmídeo tendo a seqüência de nucleotídeo de nucleotídeos 1 a 498 mostrada na SEQ ID NO: 78 foi chamado pCRSCAI. O plasmídeo tendo a seqüência de nucleotídeo de nucleotídeos 469 a 1233 mostrada na SEQ ID NO: 78 foi chamado pCRSCA2.
Exemplo 14Expressão da presente proteína (A9) em E. coli (1) Produção de uma E. coli transformada tendo o DNA (A9) presente Com os plasmídeos obtidos no Exemplo 13(2), o plasmídeo pCRSCAI acima foi digerido com Ndel e Ncol e pCRSCA2 foi digerido com Ndel e Ncol. Os produtos de digestão foram submetidos à eletroforese de gel de agarose. A área de gel contendo um DNA de cerca de 500 pb foi cortada do gel submetido aos produtos de digestão de pCRSCA2. A área de gel contendo um DNA de cerca de 800 pb foi cortada do gel submetido aos produtos de digestão de pCRSCA2. O DNA foi purificado a partir de cada um dos géis recuperados utilizando o Kit de extração de gel QIAquick (Qiagen Company) de acordo com as instruções anexas. Os 2 tipos de DNA obtidos foram ligados juntos com o plasmídeo pKSN2 digerido com Ndel e Hindlll, utilizando o kit de ligação Ver. 1 (Takara Shuzo Company) de acordo com as instruções anexadas ao dito kit e introduzido em JM109 de E. coli. O DNA de plasmídeo foi preparado a partir dos transformante de E. coli obtidos. A sua estrutura foi analisada. O plasmídeo contendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 78, onde o DNA codificando a presente proteína (A9) é inserido entre o sítio Ndel e o sítio Hindlll de pKSN2 foi chamado pKSNSCA. (2) Expressão da presente proteína (A9) em E. coli e recuperação da dita proteína JM109/pKSNSCA foi culturado da noite para o dia a 37°C em 10 ml de meio TB (1,2% (p/v) de triptona, 2,4% (p/v) de extrato de levedura, 0,4% (p/v) de glicerol, 17 mM de diidrogenofosfato de potássio, 72 mM de hidrogenofosfato de dipotássio) contendo 50 μg/ml de ampicilina. Meio de cultura obtido foi transferido para 100 ml de meio TB contendo 50 μg/ml de ampicilina e culturado a 26° C, de modo que o OD660 era cerca de 0,2. Quando o OD660 atingiu cerca de 2,0, ácido 5-aminolevulínico foi adicionado para a concentração final de 500 μΜ, e a cultura foi continuada. Trinta (30) minutos depois, IPTG foi adicionado para uma concentração final de 200 μΜ e houve ainda cultura por 5 horas.
As células foram recuperadas de cada um dos meios de cultura, lavadas com 0,1 M de tampão tris-HCI (pH 7,5) e suspensas em 10 ml do tampão acima contendo 1 mM de PMSF. As suspensões celulares obtidas foram submetidas 6 vezes a um sonificador (Sonifier (Branson Sonic Power Company)) a 3 minutos cada sob as condições de saída de 3, ciclo de serviço 30%, a fim de se obter as soluções de lisato de célula. Após centrifuga-ção das soluções de lisato de célula (1.200 xg, 5 minutos) os sobrenadantes foram recuperados e centrifugados (150.000 xg, 70 minutos) para recuperar as frações de sobrenadante (daqui em diante, a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSNCSA é referida como "extrato de pKSNCSA de E. coli'). (3) Detecção da habilidade em converter o composto (II) no composto (III) Soluções de reação de 30 μΙ foram preparadas e mantidas por 10 minutos a 30° C. As soluções de reação consistiam em um tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,0) contendo 3 ppm de composto (II) marcado com 14C, 2 mM de β-NADPH (daqui em diante referido como "componente A") (Oriental Yeast Company), 0,2 mg/ml de uma ferredoxina derivada de espinafre (daqui em diante referida como "componente B") (Sigma Company), 0,1 U/ml de ferredoxina redutase (daqui em diante referida como "componente C") (Sigma Company) e 18 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 14(2). Ainda, foram preparadas e mantidas soluções de reação similares não tendo nenhuma adição de pelo menos um componente utilizado na composição da solução de reação acima, selecionado do componente A, componente B e componente C. Três microlitros (3 μΙ) de HCI 2N e 90 μΙ de acetato de etila foram adicionados e agitados a cada uma das soluções de reação após a manutenção. As soluções de reação resultantes foram centrifugadas a 8.000xg para recuperar 75 μΙ da camada de acetato de etila. Após secagem das camadas de acetato de etila sob pressão reduzida, o resíduo foi dissolvido em 6,0 μΙ de acetato de etila. Cinco microlitros (5,0 μΙ) dele foram pingados em uma placa de TLC de sílica-gel (placa de TLC de sílica-gel 6OF254 de 20 cm x 20 cm, 0,25 mm de espessura, Merck Company). A placa de TLC foi desenvolvida com uma mistura 6:1:2 de clorofórmio, ácido acético e acetato de etila por cerca de 1 hora. Os solventes foram então deixados evaporar. A placa de TLC foi exposta da noite para o dia a uma placa de imagem (Fuji Film Company). Em seguida, a placa de imagem foi analisada em um Image Analyzer BAS2000 (Fuji Film Company). A presença de um ponto correspondendo ao composto (III) marcado com 14C foi examinada (valor Rf de 0,24 e 0,29). Os resultados são mostrados na Tabela 12.
Tabela 12 Exemplo 15lsolamento do Gene de RuBPC de soja Após semear soja (cv. Jack), a soja foi cultivada a 27°C por 30 dias e as folhas foram reunidas. Dois décimos de grama (0,2 g) a 0,3 g das folhas reunidas foram congelados com nitrogênio líquido e foram moídos com um pilão. Subseqüentemente, o RNA total foi extraído do produto moído de acordo com o manual anexo ao solvente de extração de RNA ISOGEN (Nippon Gene Company). Ainda, cDNA foi sintetizado com o uso do Supers-cript First-strand Synthesis System para RT-PCR (Invitrogen Company), realizando os procedimentos de acordo com o manual anexo. Especificamente, um 1°CDNA de filamento foi sintetizado utilizando o iniciador Oligo(dT)i2-ie fornecido pelo kit como um iniciador e o RNA de soja total como o molde e adicionando a ele a transcriptase reversa fornecida pelo kit. Em seguida, é amplificado através de PCR um DNA codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto da subunidade pequena de ribulose-1,5-bifosfato carboxilase (daqui em diante a ribulose-1,5-bifosfato carboxilase é referida como "RuBPC") de soja (cv. Jack) seguido pelos 12 aminoacidos de uma proteína madura (daqui em diante, o peptídeo de trânsito de cloroplasto da subunidade pequena de RuBPC de soja (cv. Jack) é algumas vezes referido como "rSt"; e o DNA codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto da subunidade pequena de RuBPC de soja (cv. Jack) seguido pelos 12 aminoacidos de uma proteína madura é referido como "o presente DNA rSt12"). A PCR utilizou o cDNA obtido como um molde e como iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 86 e o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 87. O PCR utilizou polimerase LA Taq (Takara Shuzo Company). A PCR foi realizada mantendo uma vez a 94°C por 3 minutos; conduzindo 30 ciclos de um ciclo que incluía manutenção a 98°C por 25 segundos e então 68°C por 1 minuto; e mantendo uma vez 72°C por 10 minutos. Plasmídeo pCRrSt12 (Figura 5) foi obtido através de inserção do DNA amplificado no sítio de clonagem do produto de PCR do plasmídeo pCR2.1 (Invitrogen Company). Em seguida, o plasmídeo foi introduzido nas células competentes da cepa JM109 de E. coli e as cepas resistentes à ampicilina foram selecionadas. Ainda, a seqüência de nucleotídeo do plasmídeo contida nas cepas resis- tentes à ampicilina foi determinada utilizando o kit de Reação Imediata FD de Seqüenciamento de Ciclo de Terminação de Corante (PE Applied Bi-osystems Company) e o seqüenciador de DNA (PE Applied Biosystems Company). Como resultado, a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 88 foi provida. Foi confirmado que o plasmídeo pCRrSt12 continha o presente DNA de rSt12.
Exemplo 16Construção de um Plasmídeo de Expressão de Cloroplasto Contendo o DNA (A1) da Presente Invenção para Introdução Direta (1) Isolamento do DNA (A1) da presente invenção Um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 6 foi amplificado através de PCR. PCR foi conduzida utilizando como o molde o DNA genômico de Actinomyces Streptomyces phae-ochromogenes IF012898 e utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 93 e o oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 94. Ainda, um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 9 foi amplificado através de PCR. PCR foi realizada utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 93 e a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 95. A dita PCR utilizou o Sistema Expand High Fidelity PCR (Boehringer Company). Ela foi conduzida após manter uma vez a 97°C por 2 minutos; condução de 10 ciclos de um ciclo que incluía manutenção a 97°C por 15 segundos, seguido por 60°C por 30 segundos e seguido por 72°C por 1 minuto; então condução de 15 ciclos de um ciclo que incluía manutenção a 97°C por 15 segundos, seguido por 60°C por 30 segundos e seguido por 72°C por 1 minuto (onde 20 segundos foram adicionados à manutenção a 72°C para cada ciclo); e então manutenção a 72°C por 7 minutos. Plasmídeos pCR657ET (Figura 6) e pCR657FET (Figura 7) foram produzidos inserindo o DNA amplificado na região de clonagem do produto de PCR de pCR2.1 (Invitrogen Company). Ainda, outra maneira que não utilizando o oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostra- da na SEQ ID NO: 96 e o oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nu-cleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 94, plasmídeo pCR657Bs (Figura 8) foi obtido com os procedimentos similares ao método descrito acima. Ainda, outra maneira que não utilizando o oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 96 e o oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 97, plasmídeo pCR657FBs (Figura 9) foi obtido com procedimentos similares ao método descrito acima. Em seguida, os plasmídeos foram introduzidos em células competentes DH5a de E. coli (Takara Shuzo Company) e as células resistentes à ampicilina foram selecionadas. Ainda, as seqüências de nucleotídeo dos plasmídeos contidos nas cepas resistentes à ampicilina foram determinadas utilizando o Kit de Reação Imediata de Seqüenciamento de Ciclo de Terminador de Corante 2,0 (PE Applied Biosystems Company) e seqüencia-dor de DNA 3100 (PE Applied Biosystems Company). Como resultado, foi confirmado que os plasmídeos pCR657ET e pCR657Bs têm a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 6. Foi confirmado que os plasmídeos pCR657FET e pCR657Bs têm a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 9. (2) Construção de um plasmídeo de expressão de cloroplas-to tendo o DNA (A1) da presente invenção para introdução direta - (parte 1) Um plasmídeo contendo um DNA quimérico onde o DNA (A1) da presente invenção foi conectado imediatamente após a seqüência de nucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto da subunidade pequena de RuBPC de soja (cv. Jack) (daqui em diante algumas vezes referida como a "seqüência codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto") sem uma mudança de estruturas nos códons foi construído como um plasmídeo para introdução na DNA (A1) da presente invenção em uma planta com o método de pistola de partícula.
Primeiro, pCRrSt12 foi digerido com a enzima de restrição Hin-dlll e Kpnl. O DNA compreendendo a presente rSt12DNA foi isolado. Ainda, um DNA de cerca de 2640 pb foi obtido removendo um DNA de cerca de 40 pb do vetor de plasmídeo pUC19 (Takara Shuzo Company) com uma digestão com as enzimas de restrição Hindlll e Kpnl. Em seguida, o terminal 5’ do DNA foi desfosforilado com uma alcalina fosfatase de intestino de bezerro (Takara Shuzo Company). O DNA contendo o presente rSt12DNA, obtido de pCRrSt12, foi inserido nele para se obter pUCrSt12 (Figura 10). Em seguida, DNA compreendendo a presente DNA (A1) da presente invenção foi isolado digerindo cada um dos plasmídeos pCR657ET e pCR657FET com as enzimas de restrição EcoT221 e Saci. Cada um do DNA obtido foi inserido entre o sítio de restrição EcoT221 e o sítio de restrição Saci de pUCrSt12 para se obter os plasmídeos pUCrSt657 (Figura 11) e pUCrSt657F (Figura 12) contendo o DNA quimérico onde o DNA (A1) da presente invenção foi conectado imediatamente após a seqüência de nucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto da subunidade pequena de RuBPC de soja (cv. Jack) sem uma mudança de estruturas nos códons. pB1CR16G6PT (descrito na patente Japonesa não-examinada 2000-166577) foi digerido com a enzima de restrição EcoRI para isolar um DNA de cerca de 3 kb. (Daqui em diante, o promotor contido no DNA descrito na patente Japonesa não-examinada acima é referido como o "promotor CR16G6". Ainda, o terminador contido no DNA descrito na patente Japonesa não-examinada acima é referido como o "terminador CR16". Após digestão do vetor do plasmídeo pUC19 (Takara Shuzo Company) com a enzima de restrição EcoRI, o terminal 5' do dito DNA foi desfosforilado com alcalina fosfatase de intestino de bezerro (Takara Shuzo Company). O DNA de 3 kb derivado de pBICR16GPT foi inserido nele para se obter o plasmídeo pUCCR16G6-p/t (Figura 13). pUCCR16G6-p/t foi digerido com as enzimas de restrição Hindlll e Seal para isolar um DNA compreendendo o promotor CR16G6. Ainda, através de digestão do vetor de plasmídeo pUC19 (Takara Shuzo Company) com as enzimas de restrição Hindlll e EcoRI, um DNA de 51 pb foi removido e o DNA restante consistindo em 2635 pb foi obtido. Em seguida, o terminal 5' do dito DNA foi desfosforilado com alcalina fosfatase de intestino de bezerro (Takara Shuzo Company). O DNA acima compreendendo o promotor CR16G6 obtido de pUCCR16G6-p/t e um ligante Notl-EcoRI (Figura 14) obtido do anelamento do oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 89 com o oligonucleotídeo consistindo na seqüência de oligonucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 90 foram inseridos nela para se obter pUCCRI 2G6-p/tA (Figura 15). pUCCR12G6-p/tA foi digerido com as enzimas de restrição Ndel e EcoRI para isolar um DNA tendo uma seqüência de nucleotídeo parcial do terminador CR16t. Ainda, o vetor de plasmídeo pUC19 (Takara Shuzo Company) foi digerido com as enzimas de restrição Hindlll e EcoRI para se obter um DNA de 2635 pb. O terminal 5' do dito DNA foi desfosforilado com alcalina fosfatase de intestino de bezerro (Takara Shuzo Company). O DNA acima tendo uma seqüência de nucleotídeo parcial do terminador CR16t obtido de pUCCRI 2G6-p/tA e um ligante de Hindlll-Notl (Figura 16) obtido através de anelamento do oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 91 com o oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 92 foram inseridos nele para se obter pNdG6-At (Figura 17).
Em seguida, através de digestão de cada um dos plasmídeos pUCrSt657 e pUCr657F com as enzimas de restrição BamHI e Saci, foi isolado o DNA compreendendo um DNA quimérico onde o DNA (A1) da presente invenção foi imediatamente conectada após a seqüência de nucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC de soja sem uma mudança de estrutura nos códons. O DNA foi inserido entre o sítio da enzima de restrição de Bglll e o sítio da enzima de restrição de Saci de plasmídeo pNdG6-AT para se obter cada um do plasmídeo pSUM-NdG6-rSt-657 (Figura 18) e plasmídeo pSUM-NdG6-rSt-657F (Figura 19). (3) Construção de um plasmídeo de expressão de cloroplasto tendo a presente DNA (A1) para introdução direta - parte (2) Um plasmídeo contendo um DNA quimérico onde o DNA (A1) da presente invenção foi conectada imediatamente após a seqüência de nucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto da subunidade pequena de RuBPC de soja (cv. Jack) e codificando em seguida 12 aminoaci- dos da proteína madura, sem uma mudança de estruturas nos códons foi construído como um plasmídeo para introdução do DNA (A1) da presente invenção em uma planta com o método de pistola de partícula. Primeiro, após digestão do vetor de plasmídeo pKF19 (Takara Shuzo Company) com a enzima de restrição BspHI, os terminais do DNA tiveram a extremidade cega através da adição de nucleotídeos à lacuna de filamento duplo, utilizando DNA KOD polimerase (Toyobo Corporation). O plasmídeo pKF19ABs foi obtido através de autociclização do DNA resultante com ligase de DNA T4. O pCRrSt12 obtido no Exemplo 1 foi digerido com a enzima de restrição Hindlll e Kpnl. O cDNA compreendendo o presente rSt12DNA foi isolado. O plasmídeo pKF19A Bs foi digerido com as enzimas de restrição Hindlll e Kpnl para se obter um DNA de cerca de 2160 pb. Os terminais 5' do dito DNA foram desfosforilados com alcalina fosfatase de intestino de bezerro (Takara Shuzo Company). O DNA compreendendo o presente rSt12DNA obtido de pCRrSt12 foi inserido nele para se obter pKFrSt12 (Figura 20). Em seguida, os plasmídeos pCR657Bs e pCR657FBs obtidos nos Exemplos 16(1) foram cada um digeridos com as enzimas de restrição BspHI e Saci para isolar DNA compreendendo o DNA (A1) da presente invenção. Cada um desses DNA foi inserido entre o sítio de restrição de BspHI e o sítio de restrição de Saci do plasmídeo pKFrSt12 para se obter o plasmídeo pKFrSt12-657 (Figura 21) e plasmídeo pKFrSt12-657F (Figura 22), que continham um DNA quimérico onde o DNA (A1) da presente invenção foi conectada imediatamente após a seqüência de nucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC (cv. Jack) de soja e codificando em seguida 12 aminoacidos da proteína madura, sem uma mudança de estruturas nos códons.
Em seguida, cada um dos plasmídeos pKFrStl 2-657E pKFrSt12-657F foi digerido com BamHI e Saci para se obter DNA compreendendo o DNA (A1) da presente invenção. Cada um desses DNA foi inserido entre o sítio de restrição de Bglll e o sítio de restrição de Saci do plasmídeo pNdG6-ΔΤ obtido no Exemplo 16(2) para se obter os plasmídeos pSUM-NdG6-rSt12-657 (Figura 23) e pSUM-NdG6-rSt12-657F (Figura 24), onde o DNA quimérico, onde o DNA (A1) da presente invenção foi conectada imediatamente após a seqüência de nucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC de soja (cv. Jack) e codificando em seguida 12 aminoacidos da proteína madura, sem uma mudança de estruturas nos códons, foi conectado a jusante do promotor CR16G6.
Exemplo 17lntrodução do DNA (A1) da presente invenção em soja (1) Preparação de embriões somáticos proliferativos Após mergulhar vagens de soja (cultivar: Fayette e Jack) em solução a 1% de hipoclorito de sódio para esterilizar, as sementes imaturas foram retiradas. O revestimento da semente foi esfoliado da semente para remover o embrião imaturo tendo um diâmetro de 2 a 5 mm. O eixo embriônico do embrião imaturo obtido foi excisado com um escalpe para preparar o cotilédone imaturo. O cotilédone imaturo foi dividido em 2 partes de cotilédone. Cada parte de cotilédone foi posta no meio de desenvolvimento de embrião somático, respectivamente. O meio de desenvolvimento de embrião somático era um meio solidificado onde 0,2% (p/v) de Gelrite foi adicionado ao meio Murashi-Skoog (descrito em Murashige T. e Skoog F., Physi-ol. Plant (1962) 15, p. 473; daqui em diante referido como "meio MS") que foi ajustado para um pH de 7,0 e que tinha 180 μΜ de 2,4-D e 30 g/L de saca-rose adicionados a ele. Cerca de 1 mês após a colocação, o embrião globular formado foi transplantado para o meio de crescimento de embrião somático. O meio de crescimento de embrião somático era um meio solidificado onde 0,2% (p/v) de Gelrite foi adicionado ao meio MS que foi ajustado para pH 5,8 e que tinha 90 μΜ de 2,4-D e 30 g/L de sacarose adicionados a ele. O embrião globular foi então transplantado para meio de crescimento de embrião somático 5 a 8 vezes em intervalos de 2 a 3 semanas. Cada uma das condições de cultura utilizando o meio de desenvolvimento de embrião somático acima e o meio de crescimento de embrião somático era 23 horas de luz com 1 hora de escuro e 23 a 25°C durante todo o dia. (2) Introdução do gene em embriões somáticos proliferativos Após o embrião globular obtido no Exemplo 17(1) ser transplantado para o meio de crescimento de embrião somático fresco e culturado por 2 a 3 dias, o embrião globular foi utilizado para introduzir o gene. Os plasmí-deos pSUM-NdG6-rSt657, pSUM-NdG6-rSt657F, pSUM-NdG6-rSt12657 e pSUM-NdG6-rSt12657F foram revestidos sobre partículas de ouro de um diâmetro de 1,0 μιτι para conduzir a introdução do gene empregando o método de pistola de partícula. A quantidade do plasmídeo era 1,66 pg por 1 mg as partículas de ouro. Após introdução do gene, o embrião foi culturado mais 2 a 3 dias. Cada uma das condições de cultura era de 23 horas de luz com 1 hora de escuro e 23 a 25°C durante todo o dia. (3) Seleção de um embrião somático com higromicina O embrião globular após introdução do gene obtido no Exemplo 17(2) foi transplantado para um meio de seleção de embrião somático. O meio de seleção do embrião somático era um meio solidificado onde 0,2% (p/v) de Gelrite e 15 mg/L de higromicina foram adicionados ao meio MS que foi ajustado para pH 5,8 e que tinha 90 μΜ de 2,4-D e 30 g/L de sacarose adicionados a ele. O embrião globular sobrevivente foi então transplantado para meio de seleção de embrião somático fresco 5 a 8 vezes em intervalos de 2 a 3 semanas. Nesse momento, o meio de seleção de embrião somático era um meio solidificado onde 0,2% (p/v) de Gelrite e 30 mg/L de higromicina foram adicionados ao meio MS que foi ajustado para pH 5,8 e que tinha 90 μΜ de 2,4-D e 30 g/L de sacarose adicionados a ele. Cada uma das condições de cultura utilizando o meio de seleção de embrião somático acima era 23 horas de luz com 1 hora de escuro e 23 a 25°C durante todo o dia. (4) Seleção de embrião somático com composto (II) O embrião globular após introdução do gene obtido no Exemplo 17(2) foi transplantado para um meio de seleção de embrião somático. O meio de seleção do embrião somático era um meio solidificado onde 0,2% (p/v) de Gelrite e 0,1 mg/L do composto (II) foram adicionados ao meio MS que foi ajustado para pH 5,8 e que tinha 90 μΜ de 2,4-D e 30 g/L de sacarose adicionados a ele. O embrião globular sobrevivente foi então transplantado para meio de seleção de embrião somático fresco 5 a 8 vezes em inter- valos de 2 a 3 semanas. Nesse momento, o meio de seleção de embrião somático era um meio solidificado onde 0,2% (p/v) de Gelrite e 30 mg/L de composto (II) foram adicionados ao meio MS que foi ajustado para pH 5,8 e que tinha 90 μΜ de 2,4-D e 30 g/L de sacarose adicionados a ele. Cada uma das condições de cultura utilizando o meio de seleção de embrião somático acima era 23 horas de luz com 1 hora de escuro e 23 a 25°C durante todo o dia. (5) Regeneração de planta a partir do embrião somático Os embriões globulares selecionados no Exemplo 17(3) ou 17(4) são transplantados para o meio de desenvolvimento e são culturados por 4 semanas em 23 horas de luz com 1 hora de escuro e a 23 a 25°C durante todo o dia. O meio de desenvolvimento é um meio solidificado onde 0,8% (p/v) de ágar (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., uso para culturas de tecido de planta) é adicionado ao meio MS que é ajustado para pH 5,8 e que tem 60 g/L de maltose adicionados a ele. Embriões do tipo cotilédone coloridos de amarelo são obtidos 6 a 8 semanas a seguir. Esses embriões do tipo cotilédone são transplantados para o meio de germinação e culturados por 2 semanas. O meio de germinação é um meio solidificado onde 0,2% (p/v) de Gelrite foi adicionado ao meio MS que é ajustado para pH 5,8 e tem 30 g/L de sacarose adicionados a ele. Como resultado, pode ser obtida uma soja que desenvolveu folhas e tem raízes. (6) Aclimação e cultivo da planta regenerada A soja obtida no Exemplo 17(5) é transplantada para o solo de jardim e aclimatada em uma câmara de incubação de 23 horas de luz com 1 hora de escuro e 23 a 25°C durante todo o dia. Duas (2) semanas mais tarde, a planta enraizada é transferida para um pote tendo um diâmetro de 9 cm e cultivada em temperatura ambiente. As condições de cultivo em temperatura ambiente são condições de luz natural a 23°C a 25°C durante todo o dia. Dois a quatro (2 a 4) meses mais tarde, as sementes de soja são colhidas. (7) Avaliação da resistência ao composto herbicida (II) Folhas da planta regenerada são colhidas e são divididas igual- mente em 2 pedaços ao longo da veia principal. O composto (II) é espalhado sobre toda a superfície de um dos pedaços de folha. O outro pedaço de folha é deixado sem tratamento. Esses pedaços de folha são postos em meio MS contendo 0,8% de ágar e deixados descansar em temperatura ambiente por 7 dias em lugar iluminado. Então, cada pedaço de folha é moído com pilar em 5 ml de 80% de solução de acetona aquosa para extrair clorofila. O líquido do extrato é diluído 10 vezes com 80% de solução de acetona aquosa e a absorbância é medida a 750 nm, 663 nm e 645 nm para calcular o teor de clorofila total de acordo com o método descrito por Mackenney G., J. Biol. Chem. (1941) 140, p 315. O grau de resistência ao composto (II) pode ser comparativamente avaliado mostrando em porcentagens o teor de clorofila total do pedaço de folha tratado com o teor de clorofila total do pedaço de folha não-tratado.
Ainda, solo é embalado em um pote plástico tendo um diâmetro de 10 cm e uma profundidade de 10 cm. As sementes da planta acima descrita são semeadas e cultivadas em uma estufa. Uma emulsão é preparada misturando 5 partes do composto (II), 6 partes de Sorpol3005X (Toho Chemicals) e 89 partes de xileno. Uma certa quantidade dele foi diluída com água contendo 0,1% (v/v) de um agente de adesão em uma proporção de 1000L por 1 hectare e é espalhado uniformemente com uma pistola de pulverização sobre todos os lados da folhagem a partir da parte superior da planta cultivada nos potes acima. Após cultivo das plantas por 16 dias em uma estufa, o dano às plantas é investigado, e a resistência ao composto (II) é avaliada.
Exemplo 18Construção de um plasmídeo de expressão de cloroplasto tendo o DNA (A1) da presente invenção para Introdução de Agrobacterium Um plasmídeo para introdução do DNA (A1) na presente invenção em uma planta com o método de agrobacterium foi construído. Primeiro, após o vetor pBI121 de plasmídeo binário (Clontech Company) ter sido digerido com a enzima de restrição Notl, os terminais do DNA tiveram a extremidade cega através da adição de nucleotídeos à lacuna de filamento duplo, utilizando DNA polimerase I (Takara Shuzo Corporation). A ligase de DNA T4 foi utilizada para autociclização. Após o plasmídeo obtido ter sido digerido com a enzima de restrição EcoRI, os terminais do DNA tiveram a extremidade cega através da adição de nucleotídeos à lacuna de filamento duplo, utilizando DNA polimerase (Takara Shuzo Corporation). A T4 DNA ligase foi utilizada para autociclização para se obter o plasmídeo ρΒΙ121Δ NotIEcoRI. Após digestão do plasmídeo com Hindlll, os terminais 5’ do DNA obtido foram desfosforilados com alcalina fosfatase de intestino de bezerro (Takara Shuzo Company). O ligante Hindlll-Notl-EcoRI (Figura 25) obtido através de anelamento do oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 98 com o oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 99 foi inserido nele. O vetor de plasmídeo binário pBI121S (Figura 26) foi obtido através de autociclização. O dito plasmídeo tem uma estrutura onde o ligante Hindlll-Notl-EcoRI foi inserido em uma direção onde o sítio de restrição de Hindlll, o sítio de restrição de Notl e o sítio de restrição EcoRI estão alinhados por sua vez a partir de um local próximo ao gene de β-glucuronidase.
Em seguida, cada um dos plasmídeos pSUM-NdG6-rSt-657 e pSUM-NdG6-rSt-657F foi digerido com as enzimas de restrição Hindlll e EcoRI, para se obter a partir de cada um deles um DNA quimérico onde o DNA (A1) da presente invenção foi conectado imediatamente após a seqüência de nucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC (cv. Jack) de soja sem uma mudança de estruturas nos códons. Esses DNA foram inseridos entre o sítio de restrição Hindlll e o sítio de restrição de EcoRI do vetor de plasmídeo binário pBI121 para se obter os plasmídeos pBI-NdG6-rSt-657 (Figura 27) e pBI-NdG6-rSt-657F (Figura 28). Ainda, cada um dos plasmídeos acima pSUM-NdG6-rSt12-657 e pSUM-NdG6-rSt12-657F foi digerido com as enzimas de restrição Hindlll e EcoRI, para se obter de cada um deles um DNA quimérico onde o DNA (A1) da presente invenção foi conectado imediatamente após a seqüência de nucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC (cv. Jack) de soja e codificando em seguida 12 aminoacidos da proteína madura, sem uma mudança de estruturas nos códons. Esses DNA foram inseridos entre o sítio de restrição Hindlll e o sítio de restrição EcoRI do vetor de plasmídeo binário acima pB1121S para se obter o plasmídeo pBI-NdG6-rSt12-657 (Figura 29) e pBI-NdG6-rSt12-657F (Figura 30).
Exemplo 19 Introdução do DNA (A1) da presente invenção em tabaco O DNA (A1) da presente invenção foi introduzido em tabaco com o método de agrobacterium, utilizando o plasmídeo pBI-NdG6-rSt-657, plasmídeo pBI-NdG6-rSt-657F, plasmídeo pBI-NdG6-rSt12-657 e plasmídeo pBI-NdG6-rSt12-657F, obtidos no Exemplo 18.
Primeiro, os plasmídeos pBI-NdG6-rSt-657, pBI-NdG6-rSt-657F, pBI-NdG6-rSt12-657 e pBI-NdG6-rSt12-657F foram introduzidos em Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Clontech Company), respectivamente. As cepas de agrobacterium transformadas carregando pBI-NdG6-rSt-657, pBI-NdG6-rSt-657F, pBI-NdG6-rSt12-657 ou pBI-NdG6-rSt12-657F foram isoladas através de cultura dos transformantes resultantes em meio de ágar LB (0,5% de extrato de levedura, 1,0% de Bacto triptona, 0,5% de NaCI) contendo 300 mg/L de estreptomicina, 100 mg/L de rifampicina e 25 mg/L de canamicina e através de seleção das colônias resistentes.
Então, de acordo com o método descrito no Manual for Gene Manipulation of Plant (de Hirofumi UCHIMIYA, Kodan-sha Scientific, 1992), o gene foi introduzido no tabaco. Cepas de agrobacterium carregando os plasmídeos acima foram cada uma culturadas a 28°C da noite para o dia em meio LB contendo 300 mg/L de estreptomicina, 100 mg/mL de rifampicina e 25 mg/ml de canamicina, e então pedaços de folha de tabaco (cepa SR1 de tabaco Nicotiana) culturados esterilmente foram mergulhados no meio de cultura líquido. Os pedaços de folha foram plantados e culturados em temperatura ambiente por 2 dias na luz no meio ágar MS (sais inorgânicos MS, vitaminas MS, 3% de sacarose e 0,8% de ágar; descritos em Murashige T. e Skoog F., Physiol. Plant (1962) 15, p. 473) contendo 0,1 mg/L de ácido naf-taleno acético e 1,0 mg/mL de benzil aminopurina. Então, os pedaços de folha foram lavados com água esterilizada e culturados por 7 dias em meio de ágar MS contendo 0,1 mg/mL de ácido acético naftaleno, 1,0 mg/L de benzil aminopurina e 500 mg/mL de cefotaxima. Em seguida, os pedaços de folha foram transplantados e culturados em meio de ágar MS contendo 0,1 mg/mL de ácido acético naftaleno, 1,0 mg/L de benzil aminopurina, 500 mg/L de cefotaxima e 100 mg/L de canamicina. A cultura foi realizada continuamente por 4 meses enquanto transplantando os pedaços de folha para meio fresco da mesma composição em intervalos de 4 semanas. Nesse momento, os brotos não-fixados se desenvolvendo dos pedaços de folha foram transplantados e enraizados em meio de ágar MS contendo 300 mg/L de cefotaxima e 500 mg/L de canamicina para se obter corpos regenerados. Os corpos regenerados foram transplantados para e culturados em meio de ágar MS contendo 50 mg/L de canamicina para se obter, respectivamente, um tabaco transgênico ao qual a região de T-DNA de pBI-NdG6-rSt-657, pBI-NdG6-rSt-657F, pBI-NdG6-rSt12-657 ou pBI-NdG6-rSt12-657F foi introduzida.
Ainda, o plasmídeo pB1121 obtido no Exemplo 18 foi introduzido no tabaco com o método de agrobacterium. Uma cepa de agrobacterium transformada carregando pBI121 foi isolada similarmente como acima, exceto pela utilização do plasmídeo pBI121S ao invés de pBI-NdG6-rSt-657, pBI-NdG6-rSt-657F, pBI-NdG6-rSt12-657 e pBI-NdG6-rSt12-657F. Em seguida, um tabaco transgênico ao qual a região de T-DNA do plasmídeo pB1121S foi introduzida foi obtido similarmente como acima, utilizando o dito agrobacterium transformado.
Três (3) folhas foram tomadas de tabaco transgênico. Cada folha foi dividida em 4 pedaços onde cada pedaço era de 5 a 7 mm de largura. Cada um dos pedaços de folha foi plantado em meio ágar MS contendo 0,1 mg/L do composto (I) e culturado na luz em temperatura ambiente. No dia 7 de cultura, o dano herbicida de cada um dos pedaços de folha foi observado. Os pedaços de folha derivadas de tabaco ao qual o DNA de controle (região de T-DNA de plasmídeo pB!121S) foi introduzido ficaram brancos e mur-chos. Em contraste, os pedaços de folha derivada de tabaco ao qual o DNA (Α1) da presente invenção (a região T-DNA do plasmídeo pBI-NdG6-rSt-657, plasmídeo pBI-NdG6-rSt12-657, pBI-NdG6-rSt-657F ou pBI-NdG6-rSt12-657F) foi introduzido cresceram continuamente.
Exemplo 20lntrodução do DNA da presente invenção em uma planta Os plasmídeos foram construídos para introdução do DNA (A2) da presente invenção com o método de pistola de partícula e o método de agrobacterium. Primeiro, o DNA (A2) da presente invenção tendo a seqüên-cia de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 7 foi amplificado através de PCR. A PCR foi conduzida utilizando como o molde o DNA genômico de Ac-tinomyces Saccharopolyspora taberi JCM9383t e utilizando os iniciadores do oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 100 e o oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 101. A dita PCR utilizou o Sistema Expand High Fidelity PCR (Boehringer Company). Foi conduzida após manutenção uma vez a 97°C por 2 minutos; repetindo 10 ciclos de um ciclo que incluía manutenção a 97°C por 15 segundos, seguido por 60°C por 30 segundos e seguido por 72°C por 60 segundos; e então condução de 15 ciclos de um ciclo que incluída manutenção de 97°C por 15 segundos, seguido por 60°C por 30 segundos e seguido por 72°C por 1 minuto (onde 20 segundos foram adicionados para a manutenção a 72°C para cada ciclo); e então mantendo a 72°C por 7 minutos. Plasmídeos pCR923Sp (Figura 31) foram produzidos inserindo o DNA amplificado na região de clonagem de produto de PCR de pCR2.1-TOPO (Invitrogen Company). Em seguida, o plasmídeo foi introduzido em células competentes JM109 de E. coli (Takara Shuzo Company) e as células resistentes à ampicilina foram selecionadas. Ainda, as seqüências de nucleotídeo dos plasmídeos contidos nas cepas resistentes à ampicilina foram determinadas utilizando o kit de Reação Imediata de Seqüenciamento de Ciclo de Terminador de Corante v. 2.0 (PE Applied Biosystems Company) e seqüenciador de DNA 373S (PE Applied Siosystems Company). Como resultado, foi confirmado que o plasmídeo pCR923Sp tem a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 7. O plasmídeo pKFrSt12, produzido no Exemplo 16(3), foi digerido com as enzimas de restrição BamHI e Saci para isolar um DNA compreendendo o presente rSt12DNA. O dito DNA foi inserido entre o sítio de restrição Bglll e o sítio de restrição Saci de pNdG6-AT obtido no Exemplo 16(2) para se obter o plasmídeo pNdG6-rSt12 (Figura 32). O plasmídeo pCR923Sp foi digerido com as enzimas de restrição Sphl e Kpnl para se obter o DNA compreendendo o DNA (2) da presente invenção. O plasmídeo pNdG6-rSt12 foi digerido com as enzimas de restrição Sphl e Kpnl para remover o DNA codificando os 12 aminoacidos da proteína madura da subuni-dade pequena de RuBPC de soja (cv. Jack). Neste lugar, o DNA acima contendo o DNA (A2) da presente invenção obtida do plasmídeo pCR923Sp foi inserida para se obter pSUM-NdG6-rSt-923 (Figura 33) onde o promotor CR16G6 tem conectada a jusante dele o DNA quimérico onde o dito DNA foi conectado imediatamente após a seqüência codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC (cv. Jack) de soja, sem uma mudança de estrutura nos códons.
Em seguida, o plasmídeo pCR923Sp foi digerido com a enzima de restrição Sphl. Após cegar as extremidades do DNA obtido com DNA KOD polimerase, o dito DNA é ainda digerido com a enzima de restrição Kpnl para isolar um DNA contendo o DNA (A2) da presente invenção. O plasmídeo pKFrSt12 produzido no Exemplo 16(3) foi digerido com a enzima de restrição BspHI. Após cegar as extremidades do DNA obtido com DNA KOD polimerase, o dito DNA é ainda digerido com a enzima de restrição Kpnl para remover o DNA de cerca de 20 pb. Nesse lugar, o DNA acima contendo o DNA (A2) da presente invenção obtida do plasmídeo pCR923Sp foi inserida para se obter o plasmídeo pKFrStl 2-923 (Figura 34) compreendendo o DNA quimérico onde o DNA (A2) da presente invenção foi conectada imediatamente após a seqüência de nucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto da subunidade pequena de RuBPC (cv. Jack) de soja e codificando em seguida os 12 aminoacidos da proteína madura, sem uma mudança nas estruturas nos códons. pKFrStl 2-923 foi digerido com as enzimas de restrição Sphl e Kpnl para se obter o DNA quimérico onde o DNA (A2) da presente invenção e o DNA codificando os 12 primeiros amino-acidos da proteína madura de subunidade pequena de RuBPC (cv. Jack) de soja são conectados. O plasmídeo pNdG6-rSt12 foi digerido com as enzimas de restrição Sphl e Kpnl para remover o DNA codificando os 12 aminoacidos da proteína madura da subunidade pequena de RuBPC (cv. Jack) de soja. Nesse lugar, o DNA quimérico acima obtido do plasmídeo pKFrStl 2-923 foi inserido para se obter o plasmídeo pSUM-NdG6-rSt12-923 (Figura 35) onde o promotor CR16G6 tem conectado a jusante dele o DNA quimérico onde o dito DNA contendo o DNA (A2) da presente invenção foi conectado imediatamente após a se-qüência codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC (cv. Jack) de soja e codificando em seguida 12 aminoacidos da proteína madura, sem uma mudança de estrutura nos códons. O DNA (A2) da presente invenção foi introduzido na soja com o método de pistola de partícula com os procedimentos idênticos ao método descrito no Exemplo 17, utilizando os plasmídeos pSUM-NdG6-rSt-923 e pSUM-NdG6-rSt12-923 obtidos. O plasmídeo pSUM-NdG6-rSt-923 acima foi digerido com as enzimas de restrição Hindlll e EcoRI para isolar o DNA compreendendo o DNA quimérico onde o dito DNA contendo o DNA (A2) da presente invenção foi imediatamente conectado após a seqüência codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC (cv. Jack) de soja, sem uma mudança na estrutura dos códons. Como na produção de pBI-NdG6-rSt657 no Exemplo 18, o DNA acima contendo o DNA quimérico obtido do plasmídeo pSUM-NdG6-rSt-923 foi inserido entre o sítio de restrição de Hindlll e o sítio de restrição de EcoRI do vetor binário pBI121S para se obter pBI-NdG6-rSt-923 (Figura 36). Ainda, o plasmídeo pSUM-NdG6-rSt12-923 acima foi digerido com Hindlll e EcoRI, para isolar o DNA contendo o DNA quimérico onde o dito DNA contendo o DNA (A2) da presente invenção foi conectado imediatamente após a seqüência codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC (cv. Jack) de soja e codificando em seguida 12 aminoacidos da proteína madura, sem uma mudança de estrutura nos códons. O DNA quimérico obtido de pSUM-NdG6-rSt12-923 foi inserido entre o sítio de restrição de Hindlll e o sítio de restrição de EcoRl do vetor binário pBI121S para se obter pBI-NdG6-rSt12-923 (Figura 37).
Cada um dos plasmídeos pBI-NdG6-rSt-923 e pBI-NdG6-rSt12-923 foi introduzido em Agrobacterium tumefaciens LBA4404. Os transfor-mantes resultantes foram culturados em meio LB contendo 300 μ9/ηιΙ de estreptomicina, 100 pg/ml de rifampicina e 25 pg/ml de canamicina. Os transformantes foram selecionados para isolar cepas de agrobacterium carregando pBI-NdG6-rSt-923 ou pBI-NdG6-rSt12-923.
Pedaços de folha de tabaco esterilmente culturado foram infectados com cada uma da cepa de agrobacterium carregando pBI-NdG6-rSt-923 e a cepa de agrobacterium carregando pBI-NdG6-rSt12-923. Tabacos onde o DNA (A2) da presente invenção foi introduzido foram obtidos sob os procedimentos similares aos métodos descritos no Exemplo 19.
Três (3) folhas foram tomadas do tabaco transgênico obtido. Cada folha foi dividida em 4 pedaços onde cada pedaço tinha 5 a 7 mm de largura. Cada um dos pedaços de folha foi plantado em meio ágar MS contendo 0,1 mg/mL do composto (II) e culturado na luz em temperatura ambiente. No dia 7 de cultura, o dano herbicida de cada um dos pedaços de folha foi observado. Os pedaços de folha derivada de tabaco ao qual o DNA de controle (região de T-DNA de plasmídeo pBI121S) foi introduzido ficaram brancos e murchos. Em contraste, os pedaços de folha derivada de tabaco ao qual o DNA (A2) da presente invenção (a região de T-DNA do plasmídeo pBI-NdG6-rSt923 ou plasmídeo pBI-NdG6-rSt12-923) foi introduzido cresceram continuamente.
Exemplo 21 Introdução do DNA (A3) da presente invenção em tabaco Plasmídeos foram construídos para introdução do DNA (A3) da presente invenção em uma planta com o método de pistola de partícula e com o método de agrobacterium.
Primeiro, o DNA (A3) da presente invenção tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 8 foi amplificada através de PCR. A PCR foi realizada utilizando como o molde o DNA genômico de Actinomyces Streptomyces testaceus ATCC21469 e utilizando como iniciadores o oligo-nucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 102 e o oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 103. A dita PCR utilizou o Sistema Expand High Fide-lity PCR (Boehringer Company). Foi realizada após manutenção uma vez a 97°C por 2 minutos; repetindo 10 ciclos de um ciclo que incluída manutenção a 97°C por 15 segundos, seguido por 60°C por 30 segundos e seguido por 72°C por 1 minuto; então conduzindo 15 ciclos de um ciclo que incluía manutenção a 97°C por 15 segundos, seguido por 60°C por 30 segundos e seguido por 72°C por 1 minuto (onde 20 segundos foram adicionados à manutenção a 72°C para cada ciclo); e então manutenção uma vez a 72°C por 7 minutos. O plasmídeo pCR671ET (Figura 38) foi produzido inserindo o DNA amplificado na região de clonagem do produto de PCR de pCR2.1 (In-vitrogen Company). Ainda, o plasmídeo pCR671Bs (Figura 39) foi obtido com os procedimentos similares ao método descrito acima, exceto utilizando como os iniciadores de PCR, o oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 104 e o oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 103. Em seguida, os plasmídeos foram introduzidos em células competentes JM109 de E. coli (Takara Shuzo Company) e as células resistentes à ampicilina foram selecionadas. Ainda, as seqüências de nucleotídeo dos plasmídeos contidos nas cepas resistentes à ampicilina foram determinadas utilizando o BigDye Ter-minator Cycle Sequencing Ready Reaction kit v2.0 (PE Applied Biosystems Company) e o seqüenciador de DNA 3100 (PE Applied Biosystems Company). Como resultado, foi confirmado que os plasmídeos pCR671ET e pCR671Bs têm a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 8. O plasmídeo pCR671ET foi digerido com as enzimas de restrição EcoT22l e Kpnl para isolar o DNA compreendendo o DNA (A3) da presente invenção. O dito DNA foi inserido entre o sítio de restrição de EcoT221 e o sítio de restrição de Kpnl para se obter o plasmídeo pUCrSt671 (Figura 40) compreendendo o DNA quimérico onde o DNA (A3) da presente invenção foi conectada imediatamente após a seqüência codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC (cv. Jack) de soja, sem uma mudança de estrutura nos códons. O plasmídeo pUCrSt671 foi digerido com as enzimas de restrição Nhel e Kpnl para isolar DNA compreendendo o DNA (A3) da presente invenção. O plasmídeo pNdG6-rSt12, obtido no Exemplo 16(2), foi digerido com as enzimas de restrição Nhel e Kpnl para remover DNA de cerca de 89 pb. Nesse lugar, o DNA acima contendo o DNA (A3) da presente invenção obtido do plasmídeo NdG6-rSt-671 (Figura 41) onde o promotor CR16G6 tem conectado a jusante dele o DNA quimérico onde o DNA (A3) da presente invenção foi conectada imediatamente após a seqüência codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC (cv. Jack) de soja e codificando, sem uma mudança de estrutura nos códons. O plasmídeo pCR671Bs foi digerido com as enzimas de restrição BspHI e Kpnl para isolar um DNA compreendendo o DNA (A3) da presente invenção. O dito DNA foi inserido entre o sítio de restrição de BspHI e o sítio de restrição de Kpnl para de pKFrSt12 obtido no Exemplo 16(3) para se obter o plasmídeo pKFrStl 2-671 (Figura 42) contendo o DNA quimérico onde o DNA (A3) da presente invenção foi conectada imediatamente após a seqüência codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC (cv. Jack) de soja e codificando em seguida 12 aminoaci-dos da proteína madura, sem uma mudança de estrutura nos códons. O plasmídeo pNdG6-rSt12 obtido no Exemplo 20 foi digerido com as enzimas de restrição Nhel e Kpnl para remover DNA de cerca de 80 pb. Nesse lugar, o DNA acima contendo o DNA (A3) da presente invenção obtida do plasmídeo pKFrSt12-671 foi inserido para se obter pSUM-NdG6-rSt12-671 (Figura 43) onde o promotor CR16G6 tem conectado a jusante dele o DNA quimérico onde o DNA (A3) da presente invenção foi conectado imediatamente após a seqüência codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC (cv. Jack) de soja e codificando a seguir 12 ami-noacidos da proteína madura, sem uma mudança de estrutura nos códons. O DNA (Α3) da presente invenção foi introduzido na soja com o método de pistola de partícula com procedimentos similares ao método descrito no Exemplo 7, utilizando os plasmídeos obtidos pSUM-NdG6-rSt-671 e pSUM-NdG6-rSt12-671. O plasmídeo pSUM-NdG6-rSt-671 acima foi digerido com as enzimas de restrição Hindlll e EcoRI para isolar o DNA quimérico onde o DNA (A3) da presente invenção foi conectado imediatamente após a seqüência codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC (cv. Jack), sem uma mudança de estrutura nos códons. O DNA acima contendo o DNA quimérico obtido do plasmídeo pSUM-NdG6-rSt-671 foi inserido entre o sítio de restrição de Hindlll e o sítio de restrição de EcoRI de plasmídeo de vetor binário pBI121 obtido no Exemplo 18, para obter se pBI-NdG6-rSt-671 (Figura 44). Ainda, o plasmídeo pSUM-NdG6-rSt12-671 acima foi digerido com as enzimas de restrição Hindlll e EcoRI, para isolar o DNA contendo o DNA quimérico onde o dito DNA contendo a (A3) da presente invenção foi conectado imediatamente após a seqüência codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC (cv. Jack) de soja e codificando em seguida 12 aminoacidos da proteína madura, sem uma mudança de estrutura nos códons. O DNA quimérico obtido de pSUM-NdG6-rSt12-671 foi inserido entre o sítio de restrição de Hindlll e o sítio de restrição de EcoRI do vetor binário pBI121S para se obter pBI-NdG6-rSt12-671 (Figura 45).
Cada um dos plasmídeos pBI-NdG6-rSt-671 e pBI-NdG6-rSt12-671 foi introduzido em Agrobacterium tumefadens LBA4404. Os transfor-mantes resultantes foram culturados em meio LB contendo 300 pg/ml de estreptomicina, 100 μg/ml de rifampicina e 25 μg/ml de canamicina. Os transformantes foram selecionados para isolar cepas de agrobacterium carregando pBI-NdG6-rSt-671 ou pBI-NdG6-rSt12-671.
Pedaços de folha de tabaco esterilmente culturado foram infectados com cada uma da cepa de agrobacterium carregando pBI-NdG6-rSt-671 e a cepa de agrobacterium carregando pBI-NdG6-rSt12-671. Tabacos onde o DNA (A3) da presente invenção foi introduzida foram obtidos sob os procedimentos similares aos métodos descritos no Exemplo 19.
Três (3) folhas foram tomadas do tabaco transgênico obtido. Cada folha é dividida em 4 pedaços onde cada pedaço tinha 5 a 7 mm de largura. Cada um dos pedaços de folha foi plantado em meio ágar MS contendo 0,1 mg/mL do composto (II) e culturado na luz em temperatura ambiente. No dia 7 de cultura, o dano herbicida de cada um dos pedaços de folha foi observado.
Exemplo 22Expressão da proteína (B1) da presente invenção em E. coli (1) Produção de uma E. coli transformada do DNA (B1) da presente invenção PCR foi conduzida utilizando como molde o DNA cromossômico preparado a partir de Streptomyces phaeochromogenes IF012898 no Exemplo 3(1). A solução de reação de PCR perfazia 50 μΙ através da adição de 300 ng do DNA cromossômico acima, 4 μΙ de mistura de dNTP (uma mistura de 2,5 mM de cada um dos 4 tipos de dNTP), 5 μΙ de tampão 10x ExTaq, 0,5 μΙ de polimerase ExTaq (Takara Shuzo Company), água destilada e 200 nM de cada um do oligonucleotídeo tendo a sequência de nucleotí-deo mostrada na SEQ ID NO: 105 e o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 53. As condições de reação da PCR eram após manutenção a 97°C por 2 minutos; repetição de 25 ciclos de um ciclo que incluía manutenção a 97°C por 15 segundos, seguido por 60°C por 30 segundos e seguido por 72°C por 90 segundos; então manutenção a 72°C por 4 minutos. A solução de reação após a manutenção e o vetor pCR2.1-TOPO (Invitrogen Company) foram ligados de acordo com as instruções anexas ao dito vetor e foram introduzidos em TOP10F'de E. coli. Os DNA do plasmídeo foram preparados a partir dos transformantes de E. coli obtidos utilizando o Kit QIAPrep Spin Miniprep (Qiagen Company). Reações de seqüenciamento foram conduzidas com o Kit de reação Dye terminator cycle sequencing FS ready (Applied Biosystems Japan Company) de acordo com as instruções anexadas ao dito kit, utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 67 e o oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 68. As reações de seqüenciamento utilizaram o DNA de plasmídeo obtido como o molde. Os produtos de reação foram analisados com um seqüenciador de DNA 373A (Applied Biosystems Japan Company). Com base nos resultados, o plasmídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 15 foi chamado pCR657FD.
Em seguida, pCR657FD foi digerido com as enzimas de restrição Ndel e Hindlll. Os produtos de digestão foram submetidos à eletroforese de gel de agarose. A área de gel contendo um DNA de cerca de 200 kpb foi cortada do gel. O DNA foi purificado de cada um dos géis recuperados utilizando o Kit de extração de gel QIAquick (Qiagen Company) de acordo com instrução anexas. O DNA obtido e o plasmídeo pKSN2 digerido com Ndel e Hindlll foram ligados com o Kit de ligação Ver. 1 (Takara Shuzo Company) de acordo com as instruções anexas ao dito kit e introduzidos em JM109 de E. coli. O DNA de plasmídeo foi preparado a partir de transformantes de £. coli obtidos. As suas estruturas foram analisadas. O plasmídeo contendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 15, onde o DNA de cerca de 200 pb codificando a proteína (B1) da presente invenção é inserido entre o sítio Ndel e o sítio Hindlll de pKSN2, foi chamado pKSN657FD. O plasmídeo pKSN657FD foi introduzido em JM109 de E. coli. Os transformantes de E. coli obtidos foram chamados JM109/pKSN657FD. Ainda, o plasmídeo pKSN2 foi introduzido em JM109 de E. coli. O transformante de E. coli foi chamado JM109/pKSN2. (2) Expressão da proteína (B1) da presente invenção em E. coli e recuperação da dita proteína JM109/pKSN657FD de E. coli e JM109/pKSN2 de E. coli foram cada um culturados da noite para o dia a 37°C em 10 ml de meio TB (1,2% (p/v) de triptona, 2,4% (p/v) de extrato de levedura, 0,4% (p/v) de glicerol, 17 mM de diidrogenofosfato de potássio, 72 mM de hidrogenofosfato de dipo-tássio) contendo 50 pg/ml de ampicilina. Um mililitro (1 ml) do meio de cultura obtido foi transferido para 100 ml de meio TB contendo 50 pg/ml de ampicilina e culturado a 26° C. Trinta (30) minutos depois, IPTG foi adicionado para uma concentração final de 1 mM, e houve ainda cultura por 17 horas.
As células foram recuperadas de cada um dos meios de cultura, lavadas com 0,1M de tampão tris-HCI (pH 7,5) e suspensas em 10 ml do tampão acima contendo 1 mM de PMSF. As suspensões celulares obtidas foram submetidas 6 vezes a um sonificador (Sonifier (Branson Sonic Power Company)) a 3 minutos cada sob as condições de saída de 3, ciclo de serviço 30%, a fim de se obter as soluções de lisato de célula. Após centrifuga-ção das soluções de lisato de célula (1.200 xg, 5 minutos) os sobrenadantes foram recuperados e centrifugados (150.000 xg, 70 minutos) para recuperar as frações de sobrenadante (daqui em diante, a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN657FD é referida como "extrato de pKSN657FD de E. coir, a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN2 de E. coli é referida como "extrato de pKSN2 de E. coli". Um microlitro (1 μΙ) das frações de sobrenadante acima foi analisado em SDS-PAGE de 15% a 25% e tingido com CBB. Como resultado, faixas notavelmente mais intensas foram identificadas no extrato de pKSN657FD de E. coli do que no extrato de pKSN2 de E. coli, nos locais de eletroforese correspondendo ao peso molecular de 7 kDa. Foi mostrado que JM109/pKSN657FD expressava a proteína (B1) da presente invenção. (3) Uso da proteína (B1) da presente invenção para um sistema de reação de conversão do composto (II) no composto (III) Soluções de reação de 30 μΙ foram preparadas e mantidas por 1 hora a 30° C. As soluções de reação consistiam em um tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,0) contendo 3 ppm de composto (II) marcado com 14C, 2 mM de β-NADPH (daqui em diante referido como "componente A") (Oriental Yeast Company), 9 μΙ do extrato de pKSN657FD obtido no Exemplo 22(2), 0,1 U/ml de ferredoxina redutase (daqui em diante referida como "componente C") (Sigma Company) e 15 μΙ do extrato de pKSN657F de E. coli recuperado no Exemplo 4(2) (daqui em diante referido como o "componente D". Ainda, foram preparadas soluções de reação onde 2 mg/ml de ferredoxina derivada de espinafre (daqui em diante referida como "componente B") (Sigma Company) foram adicionados no lugar do extrato de pKSN657FD de E. coli e uma solução de reação onde nada tinha sido adicionado no lugar do extrato de pKSN657FD de E. coli.Tais soluções de reação foram mantidas similarmente. Três microlitros (3 μΙ) de HCI2N e 90 μΙ de acetato de etila foram adicionados e misturados a cada uma das soluções de reação após a manutenção. As soluções de reação resultantes foram centrifugadas a 8.000xg para recuperar 75 μΙ da camada de acetato de etila. Após secagem das camadas de acetato de etila sob pressão reduzida, o resíduo foi dissolvido em 6,0 μΙ de acetato de etila. Cinco microlitros (5,0 μΙ) dele foram pingados em uma placa de TLC (placa de TLC de sílica-gel 6OF254 de 20 cm x 20 cm, 0,25 mm de espessura, Merck Company). A placa de TLC foi desenvolvida com uma mistura 6:1:2 de clorofórmio, ácido acético e acetato de etila por cerca de 1 hora. Os solventes foram então deixados evaporar. A placa de TLC foi exposta da noite para 0 dia a uma placa de imagem (Fuji Film Company). Em seguida, a placa de imagem foi analisada em um Image Analyzer BAS2000 (Fuji Film Company). A presença de um ponto correspondendo ao composto (III) marcado com 14C foi examinada (valor Rf de 0,24 e 0,29). Os resultados são mostrados na Tabela 13.
Tabela 13 Exemplo 23Expressão da proteína (B2) da presente invenção em E. coli (1) Produção de uma E. coli transformada do DNA (B2) da presente invenção PCR foi conduzida utilizando como molde o DNA cromossômico preparado a partir de Saccharopolyspora taberi JCM9383t no Exemplo 6(1). A solução de reação de PCR perfazia 50 μΙ através da adição de 300 ng do DNA cromossômico acima, 4 μΙ de mistura de dNTP (uma mistura de 2,5 mM de cada um dos 4 tipos de dNTP), 5 μΙ de tampão 10x HF ExTaq, 0,5 μΙ de polimerase ExTaq (Takara Shuzo Company), água destilada e 200 nM de cada um do oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 106 e o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 63. As condições de reação da PCR são após manutenção a 97°C por 2 minutos; repetição de 25 ciclos de um ciclo que incluía manutenção a 97°C por 15 segundos, seguido por 60°C por 30 segundos e seguido por 72°C por 90 segundos; então manutenção a 72°C por 4 minutos. A solução de reação após a manutenção e o vetor pCR2.1-TOPO (Invitrogen Company) foram ligados de acordo com as instruções anexas ao dito vetor e introduzidos em TOP10F'de E. coli. Os DNA do plasmídeo são preparados a partir dos transformantes de E. coli obtidos utilizando o Kit Ql-APrep Spin Miniprep (Qiagen Company). Reações de seqüenciamento são conduzidas com o Kit de reação Dye terminator cycle sequencing FS ready (Applied Biosystems Japan Company) de acordo com as instruções anexadas ao dito kit, utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 67 e o oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 68. As reações de seqüenciamento utilizaram o DNA de plasmídeo obtido como o molde. Os produtos de reação são analisados com um seqüenciador de DNA 373A (Applied Biosystems Japan Company). Com base nos resultados, o plasmídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 16 é chamado pCR923FD.
Em seguida, plasmídeo pCR923FD é digerido com as enzimas de restrição Ndel e Hindlll. Os produtos de digestão são submetidos à ele-troforese de gel de agarose. A área de gel contendo um DNA de cerca de 200 kpb é cortada do gel. O DNA é purificado dos géis recuperados utilizando o kit de extração de gel rápida QIA (Qiagen Company) de acordo com instrução anexas. O DNA obtido e o plasmídeo pKSN2 digerido com Ndel e Hindlll são ligados com o Kit de ligação Ver. 1 (Takara Shuzo Company) de acordo com as instruções anexas ao dito kit e introduzidos em JM109 de E. coli. Os DNA de plasmídeo são preparados a partir de transformantes de E. coli obtidos. As suas estruturas foram analisadas. O plasmídeo contendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 16, onde o DNA de cerca de 200 pb codificando a proteína (B2) da presente invenção é inserido entre o sítio Ndel e o sítio Hindlll de pKSN2, foi chamado pKSN923FD. O plasmídeo pKSN923FD foi introduzido em JM109 de £. coli. Os transfor-mantes de £. coli obtidos foram chamados JM109/pKSN923FD. Ainda, o plasmídeo pKSN2 foi introduzido em JM109 de E. coli. O transformante de E. coli foi chamado JM109/pKSN2. (2) Expressão da proteína (B2) da presente invenção em E. coli e recuperação da dita proteína JM109/pKSN923FD de E. coli e JM109/pKSN2 de E. coli são cada um culturados da noite para o dia a 37°C em 10 ml de meio TB (1,2% (p/v) de triptona, 2,4% (p/v) de extrato de levedura, 0,4% (p/v) de glicerol, 17 mM de diidrogenofosfato de potássio, 72 mM de hidrogenofosfato de dipo-tássio) contendo 50 pg/ml de ampicilina. Um mililitro (1 ml) do meio de cultura obtido foi transferido para 100 ml de meio TB contendo 50 pg/ml de ampicilina e culturado a 26° C. Trinta (30) minutos após o OD660 ter atingido cerca de 0,5, IPTG é adicionado para uma concentração final de 1 mM, e há ainda cultura por 20 horas.
As células foram recuperadas de cada um dos meios de cultura, lavadas com 0,1 M de tampão tris-HCI (pH 7,5) e suspensas em 10 ml do dito tampão contendo 1 mM de PMSF. As suspensões celulares obtidas foram submetidas 6 vezes a um sonificador (Sonifier (Branson Sonic Power Com-pany)) a 3 minutos cada sob as condições de saída de 3, ciclo de serviço 30%, a fim de se obter as soluções de lisato de célula. Após centrifugação das soluções de lisato de célula (1.200 xg, 5 minutos) os sobrenadantes foram recuperados e centrifugados (150.000 xg, 70 minutos) para recuperaras frações de sobrenadante (daqui em diante, a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN923FD é referida como "extrato de pKSN923FD de E. coli", a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN2 de E. coli é referida como "extrato de pKSN2 de E. coli". Um microlitro (1 μΙ) das frações de sobrenadante acima é analisado em SDS-PAGE de 15% a 25% e tingido com CBB.
Através de detecção de faixas notavelmente mais intensas no extrato de pKSN923FD de E. coli do que no extrato de pKSN2 de E. coli, nos locais de eletroforese correspondendo ao peso molecular de 7 kDa, é possível confirmar a expressão da proteína (B2) da presente invenção. (3) Uso da proteína (B2) da presente invenção para um sistema de reação de conversão do composto (II) no composto (III) Soluções de reação de 30 μΙ são preparadas e mantidas por 10 minutos a 30° C. As soluções de reação consistiam em um tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,0) contendo 3 ppm de composto (II) marcado com 14C, 2 mM de β-NADPH (daqui em diante referido como "componente A") (Oriental Yeast Company), 9 μΙ do extrato de pKSN923FD recuperado no Exemplo 23(3), 0,1 U/ml de ferredoxina redutase (daqui em diante referida como "componente C") (Sigma Company) e 15 μΙ do extrato de pKSN657F de E. coli recuperado no Exemplo 4(2) (daqui em diante referido como o "componente D". Ainda, são preparadas soluções de reação onde 2 mg/ml de ferredoxina derivada de espinafre (daqui em diante referida como "componente B") (Sigma Company) são adicionados no lugar do extrato de pKSN923FD de E. coli e uma solução de reação onde nada tinha sido adicionado no lugar do extrato de pKSN923FD de E. co//'.Tais soluções de reação são mantidas similarmente. Três microlitros (3 μΙ) de HCI 2N e 90 μΙ de acetato de etila são adicionados e misturados a cada uma das soluções de reação após a manutenção. As soluções de reação resultantes são centrifugadas a 8.000xg para recuperar 75 μΙ da camada de acetato de etila. Após secagem das camadas de acetato de etila sob pressão reduzida, o resíduo é dissolvido em 6,0 μΙ de acetato de etila. Cinco microlitros (5,0 μΙ) dele foram pingados em uma placa de TLC (placa de TLC de sílica-gel 6OF254 de 20 cm x 20 cm, 0,25 mm de espessura, Merck Company). A placa de TLC é desenvolvida com uma mistura 6:1:2 de clorofórmio, ácido acético e acetato de etila por cerca de 1 hora. Os solventes foram então deixados evaporar. A placa de TLC foi exposta da noite para o dia a uma placa de imagem (Fuji Film Company). Em seguida, a placa de imagem foi analisada em um Image Analyzer BAS2000 (Fuji Film Company). A presença de um ponto corres- pondendo ao composto (III) marcado com 14C foi examinada (valor Rf de 0,24 e 0,29). Ao confirmar que o composto (III) é produzido na reação incluindo o componente A, extrato de pKSN923FD de E. coli, componente C e componente D, pode ser confirmado que a proteína (B2) da presente invenção pode ser usada ao invés da ferredoxina derivada de espinafre em um sistema de reação de conversão do composto (II) no composto (III).
Exemplo 24Expressão da proteína (B3) da presente invenção em E. coli (1) Produção de uma E. coli transformada do DNA (B3) da presente invenção PCR foi conduzida similarmente aos métodos descritos no Exemplo 23(1), exceto pela utilização como o molde do DNA cromossômico preparado a partir de Streptomyces testaceus ATCC 21469 no Exemplo 11(1) e utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 107 e o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 72. O plasmídeo pCR671FD tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 17 é obtido similarmente ao método descrito no Exemplo 23(1) utilizando a solução de reação obtida.
Em seguida, utilizando o dito plasmídeo, plasmídeo pK5N671FD no qual o DNA (B3) é inserido entre o local NDel e local Hindlll ou pK5N2 é obtido similarmente ao método descrito no Exemplo 23(1). Por introdução do plamídeo em E. Coli JM109, E. Coli JM109/pK5N671FD tendo o DNA (B3) da presente invenção pode ser obtido. (2) Expressão da proteína (B3) da presente invenção em E. colie recuperação da dita proteína Utilizando JM109/pKSN671FD de E. coli, frações de sobrena-dante (daqui em diante referidas como "extrato de pKSN671FD de £. colF') são recuperadas similarmente o método descrito no Exemplo 23(2). Um mi-crolitro (1 μΙ) das frações de sobrenadante acima é analisado em uma SDS-PAGE de 15% a 25% e tingido com CBB. Como resultado, através da detecção de faixas notavelmente mais intensas em extrato de pKSN671FD de E. coli do que em extrato de pKSN2 de E. coli, no local de eletroforese correspondendo ao peso molecular de 7 kDa, é possível confirmara expressão da proteína (B3) da presente invenção em E. coli. (3) Uso da proteína (B3) da presente invenção para um sistema de reação de conversão do composto (II) no composto (III) Exceto pelo uso de extrato de pKSN671FD de E. coli recuperado do Exemplo 24(2), o ponto correspondendo ao composto (III) marcado com 14C (valores Rf 0,24 e 0,29) é confirmado similarmente ao método descrito no Exemplo 23(3). Através da confirmação de que o composto (III) é produzido na reação incluindo o componente A, extrato de pKSN671 FD de E. coli, componente C e componente D, pode ser confirmado que a proteína (B3) da presente invenção pode ser usada ao invés da ferredoxina derivada de espinafre em um sistema de reação de conversão do composto (II) no composto (III).
Exemplo 25Preparação da proteína (A4) da presente invenção (l)Preparação do extrato de célula bruto Um estoque congelado de Streptomyces achromogenes IF012735 foi adicionado a 10 ml de meio A (0,1%(p/v) de glicose, 0,5%(p/v) de triptona, 0,5%(p/v) de extrato de levedura, 0,1%(p/v) de hidrogeno fosfato de dipotássio, pH 7,0) em um tubo de teste grande e incubado com agitação a 30°C por 1 dia para se obter uma pré-cultura. Oito mililitros (8 ml) da pré-cultura foram adicionados a 200 ml de um meio A e foram incubados com agitação giratória em um frasco fosco de 500 ml a 30°C por 2 dias. Péletes de célula foram recuperados através de centrifugação (3.000 g, 10 minutos) da cultura resultante. Esses péletes de célula foram suspensos em 100 ml de meio B (1% (p/v) de glicose, 0,1% de extrato de carne, 0,2% (p/v) de tríptose) contendo o composto (II) a 100 ppm e foram incubados com agitação recíproca em um frasco Sakaguchi de 500 ml por 20 horas a 30°C. Os péletes de célula foram recuperados através de centrifugação (3.000 xg, 10 minutos) de 2L da cultura resultante. Os péletes de célula resultantes foram lavados duas vezes com 1L de tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,0) para prover 136 g dos péletes de célula.
Esses péletes de célula foram suspensos em 0,1 M de tampão de fosfato de potássio (pH 7,0) a 1 ml a 2 ml para 1 g dos péletes de célula. Um milimolar (1 mM) de PMSF, 5 mM de HCI benzamidina, 1mM de EDTA, 3 pg/ml de leupeptina, 3 pg/ml de pepstatina e 1 mM de ditiotritol foram adicionados à suspensão de célula. Uma solução de lisato de célula foi obtida rompendo duas vezes repetitivamente a suspensão com uma prensa French (1000 kg/cm2) (Ohtake Seisakusho). Após centrifugação da solução de lisato de célula (40.000 xg, 30 minutos), o sobrenadante foi recuperado e centrifugado por 1 hora a 150.000 xg para recuperar o sobrenadante (daqui em diante referido como o "extrato de célula bruto"). (2) Determinação da habilidade em converter o composto (II) no composto (III) Foram preparados 30 μΙ de uma solução de reação consistindo em 0,1 M de tampão de fosfato de potássio (pH 7,0) contendo 3 ppm de composto (II) marcado com 14C, 2,4 mM de β-NADPH (daqui em diante referido como "componente A") (Oriental Yeast Company), 0,5 mg/ml de ferre-doxina derivada de espinafre (daqui em diante referida como "componente B") (Sigma Company), 1 U/ml de ferredoxina redutase (daqui em diante referida como "componente C") (Sigma Company) e 15 μΙ de extrato de célula bruto recuperado no Exemplo 25(1). A solução de reação foi mantida a 30°C por uma hora. Ainda, foi preparada e mantida similarmente uma solução de reação não tendo nenhuma adição de pelo menos um componente utilizado na composição da solução de reação acima, selecionado do componente A, componente B e componente C. Três microlitros (3 μΙ) de HCI 2N e 90 μΙ de acetato de etila foram adicionados e misturados em cada uma das reações de solução após a manutenção. As soluções de reação resultantes foram centrifugadas a 8.000xg para recuperar 75 μΙ da camada de acetato de etila. Após secagem das camadas de acetato de etila sob pressão reduzida, o resíduo foi dissolvido em 6,0 μΙ de acetato de etila. Cinco microlitros (5,0 μΙ) dele foram pingados em uma placa de TLC (placa de TLC de sílica-gel 60F254 20 cm x 20 cm, 0,25 mm de espessura, Merck Company). A placa de TLC foi desenvolvida com uma mistura 6:1:2 de clorofórmio, ácido acético e acetato de etila por cerca de 1 hora. Os solventes foram então deixados evaporar. A placa de TLC foi exposta da noite para o dia a uma placa de imagem (Fuji Film Company). Em seguida, a placa de imagem foi analisada em um Image Analyzer BAS2000 (Fuji Film Company). A presença de um ponto correspondendo ao composto (III) marcado com 14C foi examinada (valor Rf de 0,24 e 0,29). Os resultados são mostrados na Tabela 14.
Tabela 14 (3) Fracionamento do extrato de célula bruto Sulfato de amônio foi adicionado ao extrato de célula bruto obtido no Exemplo 25(1) para perfazer 45% de saturação. Após agitar em condições de resfriamento, o sobrenadante foi recuperado através de centrifu-gação por 30 minutos a 12.000 xg. Após adição de sulfato de amônio ao sobrenadante obtido para perfazer 55% de saturação e agitação em condições de resfriamento, um pélete foi recuperado através de centrifugação por 10 minutos a 12.000xg. O pélete foi dissolvido com 12,5 ml de tampão de bis-trispropano 20 mM (pH 7,0). Esta solução foi submetida a uma coluna PD10 (Amersham Pharmacia Company) e eluída com 20 mM de tampão bistris-propano (pH 7,0) para recuperar 17,5 ml de frações contendo proteínas (daqui em diante referida como "fração de sulfato de amônio a 45-55%"). (4) Isolamento da proteína (A4) da presente invenção A fração de sulfato de amônio a 45%-55% preparada no Exemplo 25(3) foi injetada em uma coluna HiLoad26/10 Q Sepharose HP (Amersham Pharmacia Company). Em seguida, após fluírem 100 ml de 20 mM de tampão bistrispropano (pH 7,0) na coluna, 20 mM de tampão bistrispropano foram deixados fluir com um gradiente linear de NaCI (gradiente de NaCI foi 0,004M/minuto, a faixa de concentração de NaCI foi de OM a 1M, a taxa de fluxo foi 4 ml/min) para recuperação de fração de 30 ml de frações eluindo na concentração de NaCI de 0,12M a 0,165M. Ainda, as frações recuperadas foram submetidas a uma coluna PD10 (Amersham Pharmacia Biotech Company) e eluídas com 20 mM de tampão de bistrispropano (pH 7,0) para recuperar as frações contendo proteína.
As frações recuperadas foram submetidas a uma coluna PD10 (Amersham Pharmacia Biotech Company) com a eluição com Tampão A (2 mM de tampão de fosfato de potássio contendo 1,5 mM de NaCI, pH 7,0), a fim de recuperar as frações contendo proteína. Em seguida, as frações foram injetadas em uma coluna de Hidroxiapatita de Cerâmica do Tipo 1 Bio-scale CHT10-I (BioRad Company). Vinte mililitros (20 ml) de Tampão A foram fluidos para a coluna. Subseqüentemente, o Tampão A foi fluido com um gradiente linear de Tampão B (100 mM de tampão de fosfato de potássio contendo 0,03 mM de NaCI; o gradiente linear começou a 100% de Tampão A para aumentar para 50% o Tampão B durante um período de 100 minutos, a taxa de fluxo foi 2 ml/minuto) para recuperação de fração das frações eluindo em uma concentração de Tampão B a partir de 4% a 6%. Ainda, as frações recuperadas foram submetidas a uma coluna PD10 (Amersham Pharmacia Biotech Company) e eluídas com 0,05M de tampão de fosfato de potássio (pH 7,0) para recuperar as frações contendo proteína.
Uma quantidade similar de tampão de fosfato de potássio 0,05M (pH 7,0) contendo 2,0M de sulfato de amônio foi adicionada e misturada nas frações recuperadas. As frações recuperadas foram então injetadas em uma coluna RESOURSE PHE (Amersham Pharmacia Biotech Company). Após deixar fluir 5 ml de tampão de fosfato de potássio 0,05M (pH 7,0) contendo sulfato de amônio 1 Μ, o tampão de fosfato de potássio 0,05M (pH 7,0) foi fluido em um gradiente linear de sulfato de amônio (o gradiente da concentração de sulfato de amônio era 0,1M/minuto, a faixa de concentração de NaCI foi 1M a 0M, a taxa de fluxo foi 2 ml/min) para recuperação de fração da fração eluindo com uma concentração de sulfato de amonio a partir de cerca de 0,4M a 0,5M. A proteína contida em cada uma das frações foi analisada em uma SDS-PAGE de 10%-20%.
Ao invés do extrato de célula bruto nas soluções de reação descritas no Exemplo 25(2), as frações recuperadas foram adicionadas e mantidas na presença de componente A, componente B, componente C e composto (II) marcado com 14C, similarmente ao Exemplo 25(2). As soluções de reação após manutenção foram analisadas através de TLC para examinar a intensidade dos pontos correspondendo ao composto (III) marcado com 14C. A dita proteína mudando para um local de cerca de 45 kDa na SDS-PAGE acima foi recuperada a partir do gel e foi submetida a uma análise de se-qüência de aminoacido com um seqüenciador de proteína (Applied Biosys-tems Company, Procise 494HT, método de líquido pulsado) para seqüênciar a seqüência de aminoacido N-terminal. Como resultado, a seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 113 foi provida.
Exemplo 260btenção do DNA (A4) da presente invenção (1) Preparação do DNA cromossômico de Streptomyces achromogenes IFO 12735 Streptomyces achromogenes IFO 12735 culturado com agitação a 30°C por 1 dia a 3 dias em 50 ml de meio YEME (0,3% (p/v) de extrato de levedura, 0,5% (p/v) de bacto-peptona, 0,3% (p/v) de extrato de malte, 1,0% (p/v) de glicose, 34% (p/v) de sacarose e 0,2% (v/v) de 2,5M de MgCI2.6H20). As células foram recuperadas. As células obtidas foram suspensas em meio YEME contendo 1,4% (p/v) de glicina e 60 mM de EDTA e ainda incubadas com agitação por um dia. As células foram recuperadas do meio de cultura. Após lavagem uma vez com água destilada, elas foram ressuspensas em tampão (100 mM de Tris-HCI (pH 8,0), 100 mM de EDTA, 10 mM de NaCI) a 1 ml por 200 mg das células. Duzentos microgramas por mililitro (200 pg/ml) de lísozima branca de ovo foram adicionados. A suspensão de célula agitada a 30°C por uma hora. Ainda, 0,5% de SDS e 1 mg/ml de Proteinase K foram adicionados. A suspensão celular foi incubada a 55°C por 3 horas. A suspensão celular foi extraída duas vezes com uma mistura de fenol. clorofórmio. álcool isoamílico para recuperar cada uma das camadas aquosas. Em seguida, houve uma extração com mistura de clorofórmio, álcool isoamílico para recuperar a camada aquosa. O DNA cromossômico foi obtido através de precipitação de etanol a partir da camada aquosa. (2) Preparação da biblioteca de DNA cromossômico de Streptomyces achromogenes IFO 12735 Trinta e oito microgramas (38 pg) do DNA cromossômico preparado no Exemplo 26(1) foram digeridos com 3,2U de enzima de restrição Sau3A1 a 37°C por 60 minutos. A solução de digestão obtida foi separada com eletroforese de gel de agarose a 1%. O DNA de cerca de 2,0 kpb foi recuperado do gel. O DNA foi purificado com o Kit de extração de gel QIA-quick (Qiagen Company) de acordo com as instruções anexas ao dito kit foi concentrado com uma precipitação de etanol para se obter 20 μΙ da solução contendo o DNA alvo. Oito microlitros (8 μΙ) da solução de DNA, 100 ng de vetor de plasmídeo pUC118 digerido com a enzima de restrição BamHI e tratado com desfosforilação e 16 μΙ da solução I do Kit de Ligação Ver. 2 (Takara Shuzo Company) foram misturados e mantidos por 3 horas a 16°C. DH5a de E. coli foi transformado utilizando a solução de ligação e foi espalhado em um meio de ágar LB contendo 50 mg/l de ampicilina para cultura da noite para o dia a 37°C. As colônias obtidas foram recuperadas a partir de um meio de ágar. O plasmídeo foi extraído. Os plasmídeos obtidos foram chamados biblioteca de DNA cromossômico. (3) Isolamento de DNA (A4) da presente invenção PCR foi conduzida utilizando o DNA cromossômico preparado no Exemplo 26(2) como o molde. Como os iniciadores, foi utilizado o par de um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 114 e um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 57. A seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 114 foi construída com base na seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 113. O Sistema Expand HiFi PCR (Boehringer Manheim Company) foi utilizado para preparar a solução de reação. A solução de reação de PCR perfazia 25 μΙ através da adição de 2,5 μΙ da biblioteca de DNA cromossomico, os 2 iniciadores cada um perfazendo 7,5 pmoles, 0,2 μΙ de mistura de dNTP (uma mistura de 2 mM de cada um dos 4 tipos de dNTP), 0,2 μΙ de tampão 10x (contendo MgCI2), 0,38 μΙ de mistura de enzima Ex-pand HiFi e água destilada. As condições de reação de PCR eram manutenção a 95°C por 2 minutos, repetição de 10 ciclos de um ciclo que incluía manutenção a 97°C por 15 segundos, seguido por 65°C por 30 segundos e seguido por 72°C por 1 minuto; e então condução de 15 ciclos de um ciclo que incluía manutenção a 97°C por 15 segundos, seguido por 65°C por 30 segundos e seguido por 72°C por 1 minuto (onde 20 segundos foram adicionados para a manutenção a 72°C para cada ciclo); e então mantendo 72°C por 7 minutos. Após a manutenção, 2,5 μΙ da solução de reação foram utilizados como uma solução de molde para realização de PCR por uma segunda vez. Como os iniciadores, foi utilizado o par de um oligonucleotídeo tendo a se-qüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 115 e um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 57. A seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 115 foi construída com base na seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 113. Similar ao método acima, o Sistema Expand HiFi PCR (Boehringer Manheim Company) foi utilizado para realizar PCR. A solução de reação após a manutenção foi submetida à eletroforese de gel de agarose a 2%. A área de gel contendo o DNA de cerca de 800 pb foi recuperada. O DNA foi purificado a partir do gel recuperado utilizando o kit de extração rápida de gel QIA (Qiagen Company) de acordo com as instruções anexas. O DNA obtido foi ligado ao vetor de clonagem TA pCRIl-TOPO (Invitrogen Company) de acordo com as instruções anexas ao dito vetor e foi introduzido em TOP10F' de E. coli. O DNA do plasmídeo foi preparado a partir do transformante de E. coli, utilizando Qiagen Tip20 (Qiagen Company). Uma reação de seqüen-ciamento foi realizada com o Kit de reação Big Dye terminator cycle sequen-cing FS ready (Applied Biosystems Japan Company) de acordo com as instruções anexas ao dito kit, utilizando um iniciador tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 67 e um iniciador tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 68. O plasmídeo obtido foi utilizado como um molde na reação de seqüenciamento. Os produtos de reação fo- ram analisados com um seqüenciador de DNA 3100 (PE Applied Biosystems Company). Como resultado, a seqüência de nucleotídeo mostrada nos nu-cleotídeos 57 a 832 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 110 foi provida. Na seqüência de nucleotídeo provida, os nucleotídeos 58-60 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 110 codificavam 20 aminoacidos na seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 113.
Em seguida, PCR foi realizada com o Sistema Expand HiFi PCR (Boehringer Manheim Company) sob as condições descritas acima, utilizando como um molde a biblioteca de DNA cromossômico preparada no Exemplo 26(2). Como os iniciadores, foi utilizado um par de iniciador do oligonu-cleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 116 e o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 59. O DNA amplificado de cerca de 1,4 kpb foi clonado no vetor de clonagem pCRIl-TOPO. O DNA de plasmídeo foi preparado a partir de trans-formantes de E. coli obtidos, utilizando Qiagen Tip20 (Qiagen Company). Uma reação de seqüenciamento foi realizada com o Kit de reação Big Dye terminator cycle sequencing FS ready (Applied Biosystems Japan Company) de acordo com as instruções anexas ao dito kit, utilizando um iniciador tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 67 e um iniciador tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 68. O plasmídeo obtido foi utilizado como um molde na reação de seqüenciamento. Os produtos de reação foram analisados com um seqüenciador de DNA 3100 (PE Applied Biosystems Company). Como resultado, a seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 1 a 58 na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 110 foi provida. A clonagem do DNA estendendo-se a jusante a partir do terminal 3' do nucleotídeo mostrado como nucleotídeo 832 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 110 foi realizada. Especificamente, 13 pg do DNA cromossômico de Streptomyces achromogenes IFO 12735 preparado no Exemplo 26(1) foram digeridos da noite para o dia com 200 U da enzima de restrição Hinclll a 37°C. Após extração de fenol, o DNA foi purificado através da precipitação de etanol. O DNA obtido foi usado para produzir 20 μΙ de uma solução aquosa. Quatro microlitros (4 μΙ) dele, 1,9 μΙ de 15 μΜ de Genome Walker Adaptor, 1,6 μΙ de tampão de ligação 10x e 0,5 μΙ de T4 li-gase 6υ/μΙ foram misturados e mantidos da noite para o dia a 16° C. Após isso, houve uma manutenção a 70°C por 5 minutos e uma adição de 72 μΙ de água destilada para prover uma biblioteca de Genome Walker. PCR foi realizada utilizando a dita biblioteca como um molde. Uma solução de reação de PCR perfazendo 50 μΙ foi provida através da adição de 1 μΙ da biblioteca de Genome Walker e iniciador AP1 (provido com o kit Universal Genome Walker) e o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 117 a cada quantidade de 200 nM, adição de 1 μΙ de mistura de dNTP (uma mistura de 10 mM de cada um dos 4 tipos de dNTPs), 10 μΙ de tampão de PCR genômico 5xGC, 2,2 μΙ de Mg(OAc)2 25 mM, 10 μΙ de GC-Melt 5M e 1 μΙ de mistura de polimerase genômica de GC-Advantage e adição de água destilada. As condições de reação de PCR eram após manutenção 95°C por 1 minuto; conduzindo 7 ciclos de um ciclo que incluía manutenção a 94°C por 10 segundos e então 72°C por 3 minutos; 36 ciclos de um ciclo que incluía manutenção a 94°C por 10 segundos e então 68°C por 3 minutos; e manutenção a 68°C por 7 minutos. A solução de reação após a manutenção foi diluída 50 vezes com água destilada. Os produtos de PCR foram construídos como os primeiros produtos de PCR e foram utilizados como um molde para realizar uma outra PCR. A PCR perfazendo 50 μΙ foi provida através da adição de 1 μΙ dos primeiros produtos de PCR e iniciador AP2 (fornecido com o kit Universal Genome Walker) e o oligonucleotídeo mostrado na SEQ ID NO: 118 para cada quantidade a 200 nM, adição de 1 μΙ de mistura de dNTP (uma mistura de 10 mM de cada um dos 4 tipos de dNTPs), 10 μΙ de tampão de PCR genômico 5xGC, 2,2 μΙ de Mg(OAc)2 25 mM, 10 μΙ de GC-Melt 5M e 1 μΙ de mistura de polimerase genômica de GC-Advantage e adição de água destilada. As condições de reação de PCR eram após manutenção 95°C por 1 minuto; conduzindo 5 ciclos de um ciclo que incluía manutenção a 94°C por 10 segundos e então 72°C por 3 minutos; 20 ciclos de um ciclo que incluía manutenção a 94°C por 10 segundos e então 68°C por 3 minutos; e manutenção a 68°C por 7 minutos. A solução de reação após a manutenção foi submetida à eletroforese de gel de agarose. A área de gel contendo o DNA de cerca de 1300 pb foi recuperada. O DNA foi purificado a partir do gel recuperado utilizando o kit de extração de gel rápida QIA (Qiagen Company) de acordo com as instruções anexas. O DNA obtido foi ligado ao vetor de clonagem pCRIl-TOPO (Invitro-gen Company) de acordo com as instruções anexas ao dito vetor e foi introduzido em TOP10F’ de E. coli. O DNA do plasmídeo foi preparado a partir de transformante de E. coli utilizando Qiagen Tip20 (Qiagen Company). Uma reação de seqüenciamento foi realizada com o Kit de reação Big Dye termi-nator cycle sequencing FS ready (Applied Biosystems Japan Company) de acordo com as instruções anexas ao dito kit, utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo mostrado na SEQ ID NO: 67 e o oligonucleotídeo mostrado na SEQ ID NO: 68. O plasmídeo obtido foi utilizado como um molde na reação de seqüenciamento. Os produtos de reação foram analisados com um seqüenciador de DNA 3100 (Applied Biosystems Japan Company). Como resultado, a seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 644 a 1454 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 110 foi provida. Como resultado da conexão de todas as seqüências de nucleotídeo analisadas, a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 110 foi provida. Dois quadros de leitura abertos (ORF) estavam presentes na dita seqüência de nucleotídeo. Desse modo, havia contida uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 109) consistindo em 1236 nucleotídeos (inclusive do códon de parada) e codificando um resíduo de 411 aminoacidos (SEQ ID NO: 108) e uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 112) consistindo em 192 nucleotídeos (inclusive do códon de parada) e codificando um resíduo de 63 aminoacidos (SEQ ID NO: 111). O peso molecular da proteína consistindo na seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 108) codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 109 foi calculado como sendo 45465 Da. Ainda, a seqüência de aminoacido codificada pela dita seqüência de nucleotídeo continha a seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 113) determinada a partir do seqüenciamento de aminoacido a partir do terminal N da proteína (A4) da presente invenção. O peso molecular da proteína consistindo na seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 111) codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 112 foi calculado como sendo 6871 Da.
Exemplo 27Expressão da proteína (A4) da presente invenção em E. coli (1) Produção de uma E. coli transformada tendo DNA (A4) da presente invenção PCR foi conduzida utilizando como molde o DNA cromossômico preparado a partir de Streptomyces achromogenes IFO 12735 no Exemplo 26(1) e utilizando o Sistema Expand HiFi PCR (Boehringer Manheim Com-pany). Como os iniciadores, foi utilizado o par de um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 119 e um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 120 (daqui em diante referido como "par de iniciador 25") ou um par de um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 119 e um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 121 (daqui em diante referido como "par de iniciador 26"). A solução de reação de PCR perfazia 50 μΙ através da adição de 2 iniciadores cada um perfazendo 300 nM, 50 ng do DNA cromossômico acima, 5,0 μΙ de mistura de dNTP (uma mistura de 2,0mM de cada um dos 4 tipos de dNTP), 5,0 μΙ de tampão 10x HF Expand (contendo MgCI2) e 0,75 μΙ de mistura de enzima Expand HiFi e água destilada. As condições de reação de PCR eram manutenção de 97°C por 2 minutos; repetição de 10 ciclos de um ciclo que incluía manutenção a 97°C por 15 segundos, seguido por 60°C por 30 segundos e seguido por 72°C por 1 minuto; então condução de 15 ciclos de um ciclo que incluía manutenção a 97°C por 15 segundos, seguido por 60°C por 30 segundos e seguido por 72°C por 1 minuto (onde 20 segundos foram adicionados à manutenção a 72°C para cada ciclo); e então manutenção a 72°C por 7 minutos. Após a manutenção, a solução de reação foi submetida a 1% de eletroforese de gel de agarose. A área de gel contendo o DNA de cerca de 1,3kbp foi recuperada do gel que foi submetido à solução de reação utilizando o par de iniciador 25. A área de gel contendo o DNA de cerca de 1,6 kpb foi recuperada do gel que foi submetido à solução de reação utilizando o par de iniciador 26. O DNA foi purificado a partir de cada um dos géis recuperados utilizando um kit de extração de gel rápida QIA (Qiagen Company) de acordo com as instruções anexas. O DNA obtido foi ligado ao vetor de clonagem pCRIl-TOPO (Invitrogen Company) de acordo com as instruções anexas ao dito vetor e foi introduzido em TOP10F'de E. coli. O DNA do plasmídeo foi preparado a partir de transformantes de E. coli obtidos utilizando o Kit Qiagen Tip 20 (Qiagen Company). Em seguida, reações de se-qüenciamento foram conduzidas com o Kit de reação Big Dye terminator cycle sequencing FS ready (Applied Biosystems Japan Company) de acordo com as instruções anexadas ao dito kit, utilizando como iniciadores os oligo-nucleotídeos mostrados nas SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 122 e SEQ ID NO: 123. As reações de seqüenciamento utilizaram o DNA de plasmídeo obtido como o molde. Os produtos de reação foram analisados com um seqüenciador de DNA 3100 (Applied Biosystems Japan Company). Com base nos resultados, o plasmídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 109 foi chamado pCR646 e o plasmídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 110 foi chamado PCR646F.
Em seguida, cada um dos plasmídeos pCR646 e pCR646F foi digerido com as enzimas de restrição Ndel e Hindlll. Os produtos de digestão foram submetidos à eletroforese de gel de agarose. A área de gel contendo um DNA de cerca de 1,3 kpb foi cortada do gel submetido aos produtos de digestão de pCR646. A área de gel contendo um DNA de cerca de 1,6 kpb foi cortada do gel submetido aos produtos de digestão de pCR646F. O DNA foi purificado de cada um dos géis recuperados utilizando o kit de extração de gel rápida QIA (Qiagen Company) de acordo com instruções anexas. Cada um do DNA obtido e o plasmídeo pKSN2 digerido com Ndel e Hindlll foram ligados com o Kit de ligação Ver. 1 (Takara Shuzo Company) de acordo com as instruções anexas ao dito kit e introduzidos em JM109 de E. coli. O DNA de plasmídeo foi preparado a partir de transformantes de E. coli obtidos. As suas estruturas foram analisadas. O plasmídeo contendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 109, onde o DNA de cerca de 1,3 kpb codificando a proteína (A4) da presente invenção é inserido entre o sítio Ndel e o sítio Hindlll de pKSN2 foi chamado pKSN646. Ainda, o plasmídeo contendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 110, onde o DNA de cerca de 1,6 kpb codificando a proteína (A4) da presente invenção é inserido entre o sítio Ndel e o sítio Hindlll de pKSN2 foi chamado pKSN646F. Cada um dos plasmídeos acima de pKSN646 e pKSN646F foi introduzido em JM109 de E. coli. Os transformantes de E. coli obtidos foram chamados, respectivamente, JM109/pKSN646 e JM109/pKSN646F. Ainda, o plasmídeo pKSN2 foi introduzido em JM109 de E. coli. O transformante de E. coli foi chamado JM109/pKSN2. (2) Expressão da proteína (A4) da presente invenção em E. coli e recuperação da dita proteína JM109/pKSN646, JM109/pKSN646F e JM109/pKSN2 de E. coli foram cada um culturados da noite para o dia a 37°C em 10 ml de meio TB (1,2% (p/v) de triptona, 2,4% (p/v) de extrato de levedura, 0,4% (p/v) de gli-cerol, 17 mM de diidrogenofosfato de potássio, 72 mM de hidrogenofosfato de dipotássio) contendo 50 pg/ml de ampicilina. Um mililitro (1 ml) do meio de cultura obtido foi transferido para 100 ml de meio TB contendo 50 pg/ml de ampicilina e culturado a 26° C. Quando o OD660 atinge cerca de 0,5, ácido 5-aminolevulínico é adicionado para a concentração final de 500 μΜ, e a cultura é continuada. Trinta (30) minutos depois, IPTG foi adicionado para uma concentração final de 1 mM, e houve ainda cultura por 17 horas.
As células são recuperadas de cada um dos meios de cultura, lavadas com 0,1 M de tampão tris-HCI (pH 7,5) e suspensas em 10 ml do tampão acima contendo 1 mM de PMSF. As suspensões celulares obtidas são submetidas 6 vezes a um sonificador (Sonifier (Branson Sonic Power Company)) a 3 minutos cada sob as condições de saída de 3, ciclo de serviço 30%, a fim de se obter as soluções de lisato de célula. Após centrifuga-ção das soluções de lisato de célula (1.200 xg, 5 minutos) os sobrenadantes foram recuperados e centrifugados (150.000 xg, 70 minutos) para recuperar as frações de sobrenadante (daqui em diante, a fração de sobrenadante ob- tida de JM109/pKSN646 é referida como "extrato de pKSN646 de E. col/”, a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN646F de E. coli é referida como "extrato de pKSN646F de E. coli", e a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN2 de E. coli é referida como "extrato de pKSN2 de E. coli). Um microlitro (1 μΙ) das frações de sobrenadante acima é analisado em SDS-PAGE de 15% a 25% e tingido com CBB. Como resultado, através da detecção de faixas notavelmente mais intensas em ambos extratos de pKSN646 de E. coli e pKSN646F de E. coli do que o extrato de pKSN2 de E. coli, nos locais de eletroforese correspondentes ao peso molecular de 45 kDa, foi confirmado que a proteína (A4) da presente invenção é expressa em E. coli. (3) Detecção da habilidade em converter o composto (il) no composto (III) Soluções de reação de 30 μΙ foram preparadas e mantidas por 10 minutos a 30° C. As soluções de reação consistiam em um tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,0) contendo 3 ppm de composto (II) marcado com 14C, 2 mM de β-NADPH (daqui em diante referido como "componente A") (Oriental Yeast Company), 2 mg/ml de uma ferredoxina derivada de espinafre (daqui em diante referida como "componente B") (Sigma Company), 0,1 U/ml de ferredoxina redutase (daqui em diante referida como "componente C") (Sigma Company) e 18 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 27(2). Ainda, são preparadas e mantidas soluções de reação similares não tendo nenhuma adição de pelo menos um componente utilizado na composição da solução de reação acima, selecionado do componente A, componente B e componente C. Três microlitros (3 μΙ) de HCI 2N e 90 μΙ de acetato de etila foram adicionados e misturados a cada uma das soluções de reação após a manutenção. As soluções de reação resultantes são centrifugadas a 8.000xg para recuperar 75 μΙ da camada de acetato de etila. Após secagem das camadas de acetato de etila sob pressão reduzida, o resíduo é dissolvido em 6,0 μΙ de acetato de etila. Cinco microlitros (5,0 μΙ) dele são pingados em uma placa de TLC (placa de TLC de sílica-gel 6OF254 de 20 cm x 20 cm, 0,25 mm de espessura, Merck Company). A placa de TLC é desenvolvida com uma mistura 6:1:2 de clorofórmio, ácido acético e acetato de etila por cerca de 1 hora. Os solventes são então deixados evaporar. A placa de TLC foi exposta da noite para o dia a uma placa de imagem (Fuji Film Company). Em seguida, a placa de imagem foi analisada em um Image Analyzer BAS2000 (Fuji Film Company). A presença de um ponto correspondendo ao composto (III) marcado com 14C foi examinada (valor Rf de 0,24 e 0,29). A produção do composto (III) nas soluções de reação contendo o componente A, componente B, componente C e extrato de pKSN646 de E. coli, ou em soluções de reação contendo o componente A, componente B, componente C e extrato de pKSN646F de E. coli pode ser confirmada.
Exemplo 28Relação de identidade de seqüência para a proteína da presente invenção A identidade de seqüência relacionada às proteínas da presente invenção e o DNA da presente invenção foi analisada utilizando GENETYX-WIN Ver. 5 (Software Development Company). Os alinhamentos foram produzidos realizando análise de homologia com o método Lipman-Pearson (Lipman, D.J. e Pearson, W.R., Science, 227, 1435-1441, (1985)).
Com relação às seqüências de aminoacido das proteínas (A1) a (A4) da presente invenção, foram determinadas as identidades de seqüência uma para a outra e para proteínas conhecidas da homologia mais alta. Os resultados são mostrados na Tabela 15.
Tabela 15 * a identidade de seqüência é mostrada na parte superior e o número de acesso da proteína provida no banco de dados Entrez (fornecido pela Center for Biotechnology Information, http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/ Entrez/) é mostrado na parte inferior.
Com relação às seqüências de nucleotídeo do DNA (A1) da presente invenção tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 6, o DNA (A2) da presente invenção tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 7, o DNA (A3) da presente invenção tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 8 e o DNA (A4) da presente invenção tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 109, foram determinadas as identidades de seqüência uma para a outra e para genes conhecidos da homologia mais alta. Os resultados são mostrados na Tabela 16.
Tabela 16 * a identidade de seqüência é mostrada na parte superior e o número de acesso do gene provido no banco de dados Entrez (fornecido pela Center for Biotechnology Information, http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/) é mostrado na parte inferior.
Com relação às seqüências de aminoacido das proteínas (B1) a (B4) da presente invenção, foram determinadas as identidades de seqüência uma para a outra e para proteínas conhecidas da homologia mais alta. Os resultados são mostrados na Tabela 17.
Tabela 17 * a identidade de seqüência é mostrada na parte superior e o número de acesso da proteína provida no banco de dados Entrez (fornecido pela Center for Biotechnology Information, http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/ Entrez/) é mostrado na parte inferior.
Com relação às seqüências de nucleotídeo do DNA (B1) da presente invenção tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 15, o DNA (B2) da presente invenção tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 16, o DNA (B3) da presente invenção tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 17 e o DNA (B4) da presente invenção tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 112, foram determinadas as identidades de seqüência uma para a outra e para genes conhecidos da homologia mais alta. Os resultados são mostrados na Tabela 18.
Tabela 18 * a identidade de seqüência é mostrada na parte superior e o número de acesso do gene provido no banco de dados Entrez (fornecido pela Center for Biotechnology Information, http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/) é mostrado na parte inferior.
Exemplo 29PCR utilizando um oligonucleotídeo tendo uma seqüência de nucleotídeo parcial do DNA (A) da presente invenção como um iniciador PCR foi realizada utilizando como um molde cada um de: DNA cromossômico de Streptomyces phaeochromogenes IFO 12898 preparado no Exemplo 2; o DNA cromossômico de Saccharopolyspora taberi JCM 9383t preparado no Exemplo 5; o DNA cromossômico de Streptomyces gri-seolus ATCC 11796 preparado no Exemplo 9; o DNA cromossômico de Streptomyces testaceus ATCC 21469 preparado no Exemplo 11; o DNA cromossômico de Streptomyces achromogenes IFO 12735 preparado no Exemplo 26; e cada um do DNA cromossômico de Streptomyces griseofus-cus IFO 12870t, Streptomyces thermocoerulescens IFO 14273t e Streptomyces nogalater IFO 13445 preparados similarmente ao método descrito no Exemplo 2. Como os iniciadores, os 5 pares de iniciador mostrados na Tabela 19 foram utilizados. O tamanho previsto do DNA amplificado através de PCR utilizando cada um dos pares de base com base na seqüência de nu-cieotídeo mostrada na SEQ ID NO: 6 é mostrado na Tabela 19.
Tabela 19 A solução de reação de PCR perfazia 25 μΙ através da adição de 200 nM de cada um dos 2 iniciadores do par mostrado na Tabela 19, adição de 10 ng do DNA cromossômico, 0,5 pde mistura de dNTP (uma mistura de 10 mM de cada um dos 4 tipos de dNTP), 5 μΙ de tampão de PCR genômico 5xG, 1,1 μΙ de 25 mM de Mg(OAc)2, 5 μΙ de GC-Melt 5M e 0,5 μΙ de mistura de polimerase genômica GC-Advantage e adição de água. As condições de reação de PCR eram manutenção de 95°C por 1 minuto, repetição de 30 ciclos de um ciclo que incluía manutenção a 94°C por 15 segundos, seguido por 60°C por 30 segundos, seguido por 72°C por 1 minuto, e então mantendo 72°C por 5 minutos. Cada uma das soluções de reação após a manutenção foi analisada com uma eletroforese de gel de agarose a 3%. Os resultados são mostrados na Figura 46 e Tabela 20 e Tabela 21. A amplificação do tamanho previsto do DNA foi observada em cada um ou todos os casos com os pares de iniciador 14, 15, 16, 17 e 18 bem como nos casos de utilização de DNA cromossômico preparado a partir de qualquer uma das cepas como molde.
Tabela 20 *"+" representa que o tamanho previsto do DNA foi detectado e representa que não havia nenhuma detecção.
Tabela 21 * "+" representa que o tamanho previsto do DNA foi detectado e representa que não havia nenhuma detecção.
Exemplo 30 Hibridização utilizando como uma sonda um DNA consistindo em uma seqüência de nucleotídeo parcial do DNA (A) presente e o DNA (A) da presente invenção (1) Preparação de uma sonda DNA consistindo em uma seqüência de nucleotídeo parcial do DNA (A1) da presente invenção ou uma seqüência de nucleotídeo parcial do DNA (A1) da presente invenção foi produzido como uma sonda marcada com digoxigenina (sonda marcada com DIG). PCR foi realizada com o Kit PCR DIG Probe synthesis (Roche Diagnostics GmbH Company) de acordo com o manual anexo utilizando como molde o DNA cromossômico de Streptomyces phaeochromogenes IFO 12898 preparado no Exemplo 3 e utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo consistindo na sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 93 e o oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 94. A solução de reação de PCR perfazia 50 μΙ através da adição de 2 iniciadores cada um perfazendo 200 nM, adição de 50 ng do DNA cromossômico, 2,5 pde mistura de dNTP (uma mistura de 2,0 mM de cada um dos 4 tipos de dNTP), 2,5 μΙ de mistura DIG de PCR (uma mistura de 2,0 mM de cada um dos 4 tipos de dNTP marcado com DIG), 5 μΙ de tampão de PCR 10x e 0,75 μΙ sw mistura de enzima Expand HiFi e adição de água destilada. As condições de reação eram após manutenção de 95°C por 2 minutos, repetição de 10 ciclos de um ciclo que incluía manutenção a 95°C por 10 segundos, seguido por 60°C por 30 segundos, seguido por 72°C por 2 minutos, e então condução de 15 ciclos de um ciclo que incluía manutenção a 95°C por 10 segundos, seguido por 60°C por 30 segundos e seguido por 72°C por 2 minutos (onde 20 segundos foram adicionados para a manutenção a 72°C para cada ciclo); e então manutenção a 72°C por 7 minutos. A solução de reação após a manutenção foi submetida à eletroforese de gel de agarose a 1%. Como resultado, amplificação de um DNA de cerca de 1,3 kb foi confirmada. O DNA amplificado foi recuperado para se obter um DNA marcado com digoxigenina, e tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 6. Sob um método similar, PCR foi realizada utilizando como um molde o DNA cromossômico de Streptomyces phaeochromogenes IFO 12898 e utilizando como os iniciadores o oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 130 e o nucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 131. O DNA amplificado através da dita PCR foi recuperado para se obter um DNA marcado com digoxigenina e tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 57 a 730 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 6.
Sob um método similar, PCS foi realizada utilizando como um molde o DNA cromossômico de Saccharopolyspora taberi JCM 9393t preparado no Exemplo 6 e utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 61 e a seqüên-cia de nucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 62. O DNA amplificado através da dita PCR foi recuperado para se obter um DNA marcado com digoxigenina e tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 7.
Ainda, sob um método similar, PCR foi realizada utilizando como o molde o DNA cromossômico de Streptomyces testaceus ATCC 21469 preparado no Exemplo 11 e utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 70 e a seqüência de oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 71. O DNA amplificado através da dita PCR foi recuperado para se obter um DNA marcado com digoxigenina e tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 8. Ainda, PCR foi realizada utilizando o DNA cromossômico acima mencionado como o molde e utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo consistindo na seqüência mostrada na SEQ ID NO: 132 e o oligonucleotídeo consistindo na seqüência mostrada na SEQ ID NO: 133. O DNA amplificado pela dita PCR foi recuperado para se obter um DNA marcado com digoxigenina e tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 21 a 691 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 8. (2) Hibridização dot-blot Cada um do DNA de pKSN657 preparado no Exemplo 4 (o DNA compreendendo o DNA (A1) da presente invenção)), o DNA de pKSN923 preparado no Exemplo 7 (o DNA compreendendo o DNA (A2) da presente invenção)), o DNA de pKSN671 preparado no Exemplo 12 (o DNA compreendendo o DNA (A3) da presente invenção), o DNA de pKSNSCA preparado no Exemplo 14 (o DNA compreendendo a presente DNA (A9)) e o DNA de pKSN11796 preparado no Exemplo 10 (o DNA compreendendo a presente DNA (A10)) foi manchado em uma membrana de náilon Hybond N+ (Amer- sham Pharmacia Company) para perfazer 100 ng e 10 ng. Luz ultravioleta foi direcionada às membranas obtidas com transiluminador por 5 minutos. O DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II (Ro-che Diagnostics GmbH Company) foi utilizado para a hibridização e detecção de acordo com o manual em anexo. Como as sondas, cada um dos DNA marcados com digoxigenina e produzidos no Exemplo 30(1) que foram mantidos a 100°C por 5 minutos e então rapidamente resfriados em gelo (daqui em diante referidos como "sonda marcada com DIG") foi utilizado. A membrana manchada acima foi agitada a 42°C por 30 minutos em 2,0 ml de DIGEasyHyb que tinha sido fornecido com o dito kit. Em seguida, 2,0 ml de Dig Easy Hyb, 5,0 μΙ de sondas marcadas com DIG e a membrana foram postos em uma bolsa plástica para hibridização e mantidos a 42°C por 18 horas. A membrana foi recuperada, foi agitada duas vezes com 2xSSC contendo 0,1% de SDS por 5 minutos em temperatura ambiente e foi então agitada duas vezes em 0,5xSSC contendo 0,1% de SDS a 65°C por 15 minutos. Subseqüentemente, a membrana foi agitada em 50 ml de tampão de lavagem por 2 minutos, então agitada em 50 ml de solução de bloqueio em temperatura ambiente por 30 minutos, então agitada em 2,0 ml de solução de anticorpo por 30 minutos, e então agitada duas vezes em 50 ml de tampão de lavagem por 15 minutos. Ainda, após agitar em 50 ml de tampão de detecção por 5 minutos, a membrana foi posta em uma bolsa de hibridização com 2,0 ml de solução Color Substrate e mantida em temperatura ambiente por 18 horas. Um sinal foi detectado em cada um dos casos de condução de hibridização com cada um dos reagentes de 10 ng e 100 ng de cada pKSN657, pKSN923, pKSN671, pKSNSCA e pKSN11796.
Exemplo 310btenção do DNA (A11) da presente invenção (1) Preparação de DNA cromossômico de Streptomyces no-galator IF013445 Streptomyces nogalator IF013445 foi cultivado com agitação a 30°C por 3 dias em 50 ml de meio YGY (0,5% (p/v) de extrato de levedura, 0,5% (p/v) de triptona, 0,1% (p/v) de glicose e 0,1% (p/v) de Κ2ΗΡ04, pH 7,0). As células foram recuperadas. As células obtidas foram suspensas em meio YGY contendo 1,4% (p/v) de glicina e 60 mM de EDTA e incubadas mais com agitação por um dia. As células foram recuperadas do meio de cultura. Após lavagem uma vez com água destilada, elas foram suspensas em 3,5 ml de Tampão B1 (50 mM de Tris-HCI (pH 8,0), 50 mM de EDTA, 0,5% de Tween-20 e 0,5% de Triton X-100). Oitenta microlitros (80 μΙ) de uma solução de lisozima 100 μg/ml e 100 μΙ de Protease Qiagen (600mAU/ml, Qiagen Company) foram adicionados à suspensão e mantidos a 37°C por uma hora. Em seguida, 1,2 ml de Tampão B2 (HCI de guanidina 3M e 20% de tween-20) foi adicionado, misturado e mantido a 50°C por 30 minutos. A solução de lisato de célula obtida adicionada ao fragmento genômico 100G Qiagen (Qiagen Company) equalizou em Tampão QBT (750 mM de NaCI, 50 mM de MOPS (pH 7,0), 15% de isopropanol e 0,15% de Triton X-100). Em seguida, após o fragmento ter sido lavado duas vezes com 7,5 ml de Tampão QC (50 mM de MOPS (pH 7,0) e 15% de isopropanol), o DNA foi eluído fluindo 5 ml de Tampão QF (1,25 M de NaCI, 50 mM de Tris HCI (pH 8,5), 15% de isopropanol). Três mililitros e meio (3,5 ml) de isopropanol foram misturados na solução de DNA obtida para precipitar e recuperar o DNA cromossômico. Após lavagem com 70% de etanol, o DNA cromossômico recuperado foi dissolvido em 1 ml de tampão TB. (2) Isolamento de DNA tendo uma seqüência de nucleotídeo parcial de DNA (A11) da presente invenção PCR foi conduzida utilizando como molde o DNA cromossômico preparado no Exemplo 31(1) e utilizando o par de iniciador 14, de acordo com o método descrito no Exemplo 29. O DNA amplificado foi ligado ao vetor de clonagem pCRIl-TOPO (Invitrogen Company) de acordo com as instruções anexadas ao dito vetor e foi então introduzido em TOP10F'de E. coli. O DNA do plasmídeo foi preparado a partir do transformante de E. coli obtido utilizando Qiagen Tip20 (Qiagen Company). Uma reação de seqüenciamento foi conduzida com o Kit de reação Dye terminator cycle sequencing FS ready (Applied Biosystems Japan Company) de acordo com as instruções anexadas ao dito kit, utilizando um iniciador tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 57 e um iniciador tendo a seqüência de nucleotí- deo mostrada na SEQ ID NO: 59. A reação de seqüência utilizou o plasmí-deo obtido como um molde. Os produtos de reação foram analisados com um seqüenciador de DNA 3100 (Applied Biosystems Japan Company). Como resultado, a seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeo 316 a 1048 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 139 foi provida.
Ainda, o DNA cromossômico preparado no Exemplo 31(1) foi digerido com a enzima de restrição Pvull. Uma biblioteca Walker de genoma foi produzida utilizando o DNA obtido, de acordo com o método descrito no Exemplo 26(3). PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3) para se obter os primeiros produtos de PCR, utilizando a biblioteca obtida como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 161 como iniciador AP1 (Kit Universal Genome Walker (Clontech Company)). Em seguida, PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3), utilizando os primeiros produtos de PCR como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 162 e iniciador AP2 (Universal Genome Walker Kit (Clontech Company)). A seqüência de nucleotídeo do DNA obtido foi analisada. A seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 1 a 330 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 144 foi provida.
Ainda, o DNA cromossômico preparado no Exemplo 31(1) foi digerido com a enzima de restrição Hincll. Uma biblioteca de Walker de genoma foi produzida utilizando o DNA obtido, de acordo com o método descrito no Exemplo 26(3). PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3) para se obter os primeiros produtos de PCR, utilizando a biblioteca obtida como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 163 e iniciador AP1 (Kit Universal Genome Walker (Clontech Company)). Em seguida, PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3), utilizando os primeiros produtos de PCR como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 164 e iniciador AP2 (Uni- versai Genome Walker Kit (Clontech Company)). A seqüência de nucleotí-deo do DNA obtido foi analisada. A seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 983 a 1449 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 144 foi provida. (3) Análise de seqüência de DNA (A11) da presente invenção A seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 144 foi obtida conectando as seqüências de nucleotídeo providas pelo DNA obtido no Exemplo 31(2). Dois quadros de leitura abertos (ORF) estavam presentes. Desse modo, ela continha uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 139) consistindo em 1230 nucleotídeos (inclusive do códon de parada) e codificando um resíduo de 409 aminoacidos (SEQ ID NO: 159) e uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 154) consistindo em 207 nucleotídeos (inclusive do códon de parada) e codificando um resíduo de 68 aminoacidos (SEQ ID NO: 149). O peso molecular da proteína consistindo na seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 159) codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 139 foi calculado como sendo 45177 Da. Ainda, o peso molecular da proteína consistindo na seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 149) codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 154 foi calculado como sendo 7147 Da.
Exemplo 32Expressão da proteína (A11) da presente invenção em E. coli (1) Produção de uma E. coli transformada tendo o DNA (A11) da presente invenção PCR foi conduzida utilizando como um molde o DNA cromossô-mico preparado a partir de Streptomyces nogalator IF013445 no Exemplo 31(1) e utilizando o Sistema Expand HiFi PCR (Boehringer Manheim Company). Como os iniciadores, foi utilizado o par de um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 165 e um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 166. A composição de solução de reação e a manutenção eram similares às condições descritas no Exemplo 27(1). A solução de reação após a manutenção foi submetida à eletroforese de gel de agarose a 1%. A área de gel contendo o DNA de cerca de 1,5kpb foi recuperado. O DNA foi purificado a partir do gel recuperado utilizando um kit de extração de gel rápida QIA (Qiagen Company) de acordo com as instruções anexas. O DNA obtido foi ligado ao vetor de clonagem pCRIl-TOPO (Invitrogen Company) de acordo com as instruções anexas ao dito vetor e foi introduzido em TOP10F'de E. coli. O DNA do plasmídeo foi preparado a partir de transformantes de E. coli obtidos utilizando o Qiagen Tip 20 (Qiagen Company). Reações de seqüenciamento foram conduzidas com o Kit de reação Dye terminator cycle sequencing FS ready (Applied Biosystems Japan Company) de acordo com as instruções anexadas ao dito kit, utilizando como iniciadores os oligonucleotídeos tendo as seqüências de nucleotídeo mostradas nas, respectivamente, SEQ ID NOs: 57, 59 e 186. As reações de seqüenciamento utilizaram o DNA de plasmídeo obtido como o molde. Os produtos de reação foram analisados com um seqüenciador de DNA 3100 (Applied Biosystems Japan Company). Com base nos resultados, o plasmídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 144 foi chamado pCR849AF.
Em seguida, pCR849AF foi digerido com as enzimas de restrição Ndel e Hindlll. Os produtos de digestão foram submetidos à eletroforese de gel de agarose. A área de gel contendo um DNA de cerca de 1,5 kpb foi cortada do gel. O DNA foi purificado de cada um dos géis recuperados utilizando o kit de extração de gel rápida QIA (Qiagen Company) de acordo com instruções anexas. O DNA obtido e o plasmídeo pKSN2 digerido com Ndel e Hindlll foram ligados com o Kit de ligação Ver. 2 (Takara Shuzo Company) de acordo com as instruções anexas ao dito kit e introduzidos em JM109 de E. coli. O DNA de plasmídeo foi preparado a partir de transformantes de E. coli obtidos. As suas estruturas foram analisadas. O plasmídeo contendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 144, onde o DNA de cerca de 1,5 kpb codificando a proteína (A11) da presente invenção é inserido entre o sítio Ndel e o sítio Hindlll de pKSN2 foi chamado pKSN646. O plasmídeo pKSN849AF foi introduzido em JM109 de E. coli. O transformante de E. coli obtido foi chamado JM109/pKSN849AF. Ainda, o plasmídeo pKSN2 foi introduzido em JM109 de E. coli. O transformante de E. coli obtido foi chamado JM109/pKSN2. (2) Expressão da proteína (A11) da presente invenção em E. coli e recuperação da dita proteína Similarmente ao Exemplo 4(2), cada um de JM109/pKSN849AF e JM109/pKSN2 de E. coli foi culturado. As células foram recuperadas. As soluções de lisato de célula foram preparadas. Sob o método descrito no Exemplo 4(2), frações de sobrenadante foram preparadas a partir das soluções de lisato de célula (daqui em diante a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN849AF é referida como "extrato de JM109/pKSN849AF de E. coli' e a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN2 é referida como extrato de "pKSN2 de E. coli'). (3) Detecção da habilidade em converter o composto (II) no composto (III) Soluções de reação de 30 μ! foram preparadas e mantidas por 10 minutos a 30° C. As soluções de reação consistiam em um tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,0) contendo 3 ppm de composto (II) marcado com 14C, 2 mM de β-NADPH (daqui em diante referido como "componente A") (Oriental Yeast Company), 2 mg/ml de uma ferredoxina derivada de espinafre (daqui em diante referida como "componente B") (Sigma Company), 0,1 U/ml de ferredoxina redutase (daqui em diante referida como "componente C") (Sigma Company) e 23 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 32(2). Similarmente ao Exemplo 4(3), as soluções de reação após a manutenção foram extraídas com acetato de etila e as camadas extraídas foram analisadas através de TLC. Após o desenvolvimento da placa de TLC, a presença de um ponto sobre ela correspondendo ao composto (III) marcado com 14C foi examinada (valor Rf de 0,24 e 0,29). Um ponto correspondendo ao composto (III) foi detectado a partir da solução de reação contendo extrato de pKSN849AF de E. coli. Em contraste, tal ponto não era detectado da solução de reação contendo extrato de pKSN2 de E. coli.
Exemplo 330btenção do DNA (A12) da presente invenção (1) Preparação de DNA cromossômico de Streptomyces tsu-simaensis IFO 13782 Sob o método descrito no Exemplo 31(1), o DNA cromossômico de Streptomyces tsusimaensis IFO 13782 foi preparado. (2) Isolamento de DNA tendo uma sequência de nucleotídeo parcial de DNA (A12) da presente invenção PCR foi conduzida utilizando como molde o DNA cromossômico preparado a partir de Streptomyces tsusimaensis IFO 13782 preparado no Exemplo 33(1) e utilizando o par de iniciador 14, de acordo com o método descrito no Exemplo 29. Similarmente ao Exemplo 31(2), o DNA amplificado foi clonado para o vetor de clonagem pCRIl-TOPO (Invitrogen Company). A sua seqüência de nucleotídeo foi analisada. Como resultado, a seqüência de nucleotídeo mostrada em nucleotídeos 364 a 1096 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 140 foi provida.
Ainda, o DNA cromossômico preparado no Exemplo 33(1) foi digerido com a enzima de restrição Smal. Uma biblioteca Walker de genoma foi produzida utilizando o DNA obtido, de acordo com o método descrito no Exemplo 26(3). PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3) para se obter os primeiros produtos de PCR, utilizando a biblioteca obtida como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 167 como iniciador AP1. Em seguida, PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3), utilizando os primeiros produtos de PCR como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 168 e iniciador AP2. A seqüência de nucleotídeo do DNA obtido foi analisada. A seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 1 a 392 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 145 foi provida.
Ainda, o DNA cromossômico preparado no Exemplo 33(1) foi digerido com a enzima de restrição Pvull. Uma biblioteca Walker de genoma foi produzida utilizando o DNA obtido, de acordo com o método descrito no Exemplo 26(3). PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3) para se obter os primeiros produtos de PCR, utilizando a biblioteca obtida como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 169 e iniciador AP1. Em seguida, PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3), utilizando os primeiros produtos de PCR como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 170 e iniciador AP2. A seqüência de nucleotídeo do DNA obtido foi analisada. A seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 1048 a 1480 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 145 foi provida. (3) Análise de seqüência de DNA (A12) da presente invenção A seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 145 foi obtida conectando as seqüências de nucleotídeo providas pelo DNA obtido no Exemplo 33(2). Dois quadros de leitura abertos (ORF) estavam presentes na dita seqüência de nucleotídeo. Desse modo, ela continha uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 140) consistindo em 1278 nucleotídeos (inclusive do códon de parada) e codificando um resíduo de 425 aminoacidos (SEQ ID NO: 160) e uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 155) consistindo em 198 nucleotídeos (inclusive do códon de parada) e codificando um resíduo de 65 aminoacidos (SEQ ID NO: 150). O peso molecular da proteína consistindo na seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 160) codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 140 foi calculado como sendo 46549 Da. Ainda, o peso molecular da proteína consistindo na seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 150) codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 155 foi calculado como sendo 6510 Da.
Exemplo 34Expressão do DNA (A12) da presente invenção em E. coli (1) Produção de uma E. coli transformada tendo o DNA (A12) da presente invenção PCR foi conduzida similarmente ao Exemplo 32(1), exceto usando como um molde o DNA cromossômico preparado a partir de Streptomyces tsusimaensis IFO 13782 no Exemplo 33(1) e utilizando como os iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 171 e um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 172. Similarmente ao Exemplo 32(1), o DNA foi purificado a partir da solução de reação de PCR e clonado no vetor de cio- nagem pCRIl-TOPO (Invitrogen Company). A seqüência de nucleotídeo do DNA de plasmídeo obtido foi analisada com oligonucleotídeos tendo as se-qüências de nucleotídeo mostradas, respectivamente, nas SEQ ID NOs: 57, 59, 171, 172 e 187. Com base nos resultados obtidos, o plasmídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 145 foi chamada pCR1618F. Similarmente ao Exemplo 32(1), pCR1618F foi digerido com as enzimas de restrição Ndel e Hindlll. Um DNA de cerca de 1,5 kpb foi purificado a partir dos produtos de digestão. O DNA obtido e o plasmídeo pKSN2 digerido com Ndel e Hindlll foram ligados para se obter um plasmídeo contendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 145, onde o DNA codificando a proteína (A12) da presente invenção é inserido entre o sítio Ndel e o sítio Hindlll de pKSN2 (daqui em diante referido como "pKSN1618F''). O dito plasmídeo foi introduzido em JM109 de E. coli. O transformante de E. coli obtido foi chamado JM109/pKSN1618F. (2) Expressão da proteína (A12) da presente invenção em E. coli e recuperação da dita proteína Similarmente ao Exemplo 4(2), cada um de JM109/pKSN1618F e JM109/pKSN2 de E. coli foi culturado. As células foram recuperadas. As soluções de lisato de célula foram preparadas. Sob o método descrito no Exemplo 4(2), frações de sobrenadante foram preparadas a partir das soluções de lisato de célula (daqui em diante a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN1618F é referido como "extrato de JM109/pKSN1618F de E. coir e a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN2 é referida como "extrato de pKSN2 de E. colF'). (3) Detecção da habilidade em converter o composto (II) no composto (III) Soluções de reação de 30 μΙ foram preparadas e mantidas por 10 minutos a 30° C. Exceto pelo uso das frações de sobrenadante recuperadas no Exemplo 34(2) (extrato pKSN1618F de E. coli ou extrato de pKSN2 de E. coli), as soluções de reação foram preparadas similarmente ao Exemplo 32(3). As soluções de reação após a manutenção foram extraídas com acetato de etila e as camadas extraídas foram analisadas através de TLC.
Após o desenvolvimento da placa de TLC, a presença de um ponto sobre ela correspondendo ao composto (III) marcado com 14C foi examinada (valor Rf de 0,24 e 0,29). Um ponto correspondendo ao composto (III) foi detectado a partir da solução de reação contendo extrato de pKSN1618F de E. coli. Em contraste, tal ponto não era detectado da solução de reação contendo extrato de pKSN2 de E. coli.
Exemplo 350btenção do DNA (A13) da presente invenção (1) Preparação de DNA cromossômico de Streptomyces thermocoerulesces IFO 14273t Sob o método descrito no Exemplo 31(1), o DNA cromossômico de Streptomyces thermocoerulesces IFO 14273tfoi preparado. (2) Isolamento de DNA tendo uma sequência de nucleotídeo parcial do DNA (A13) da presente invenção PCR foi conduzida utilizando como molde o DNA cromossômico de Streptomyces thermocoerulesces IFO 14273t preparado no Exemplo 35(1) e utilizando o par de iniciador 14, de acordo com o método descrito no Exemplo 29. Similarmente ao Exemplo 31(2), o DNA amplificado foi clonado para o vetor de clonagem pCRIl-TOPO (Invitrogen Company). A sua sequência de nucleotídeo foi analisada. Como resultado, a seqüência de nucleotídeo mostrada em nucleotídeos 295 a 1027 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 141 foi provida.
Ainda, o DNA cromossômico preparado no Exemplo 35(1) foi digerido com a enzima de restrição Hincll. Uma biblioteca Walker de genoma foi produzida utilizando o DNA obtido, de acordo com o método descrito no Exemplo 26(3). PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3) para se obter os primeiros produtos de PCR, utilizando a biblioteca obtida como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 173 como iniciador AP1. Em seguida, PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3), utilizando os primeiros produtos de PCR como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 174 e iniciador AP2. A seqüência de nucleotídeo do DNA obtido foi analisada. A seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 1 a 370 da seqüência de nucleo-tídeo mostrada na SEQ ID NO: 146 foi provida.
Ainda, o DNA cromossômico preparado no Exemplo 35(1) foi digerido com a enzima de restrição Smal. Uma biblioteca Walker de genoma foi produzida utilizando o DNA obtido, de acordo com o método descrito no Exemplo 26(3). PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3) para se obter os primeiros produtos de PCR, utilizando a biblioteca obtida como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 175 e iniciador AP1. Em seguida, PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3), utilizando os primeiros produtos de PCR como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 176 e iniciador AP2. A seqüência de nucleotídeo do DNA obtido foi analisada. A seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 960 a 1473 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 146 foi provida. (3) Análise de seqüência de DNA (A13) da presente invenção A seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 146 foi obtida conectando as seqüências de nucleotídeo providas pelo DNA obtido no Exemplo 35(2). Dois quadros de leitura abertos (ORF) estavam presentes na dita seqüência de nucleotídeo. Desse modo, ela continha uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 141) consistindo em 1209 nucleotídeos (inclusive do códon de parada) e codificando um resíduo de 402 aminoacidos (SEQ ID NO: 136) e uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 156) consistindo em 252 nucleotídeos (inclusive do códon de parada) e codificando um resíduo de 83 aminoacidos (SEQ ID NO: 151). O peso molecular da proteína consistindo na seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 136) codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 141 foi calculado como sendo 44629 Da. Ainda, o peso molecular da proteína consistindo na seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 151) codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 156 foi calculado como sendo 8635 Da.
Exemplo 36Expressão do DNA (A13) da presente invenção em E. coli (1) Produção de uma E. co/i transformada tendo o DNA (A13) da presente invenção PCR foi conduzida similarmente ao Exemplo 32(1), exceto usando como um molde o DNA cromossômico preparado a partir de Streptomy-ces thermocoerulesces IFO 14273t no Exemplo 35(1) e utilizando como os iniciadores o olígonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 177 e um olígonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 178. Similarmente ao Exemplo 32(1), o DNA foi purificado a partir da solução de reação de PCR e clonado no vetor de clonagem pCRIl-TOPO (Invitrogen Company). A seqüência de nucleotídeo do DNA de plasmídeo obtido foi analisada com oligonucleotídeos tendo as se-qüências de nucleotídeo mostradas, respectivamente, nas SEQ ID NOs: 57, 59, 173, 175 e 188. Com base nos resultados obtidos, o plasmídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 146 foi chamada pCR474F. Similarmente ao Exemplo 32(1), pCR474F foi digerido com as enzimas de restrição Ndel e Hindlll. Um DNA de cerca de 1,5 kpb foi purificado a partir dos produtos de digestão. O DNA obtido e o plasmídeo pKSN2 digerido com Ndel e Hindlll foram ligados para se obter um plasmídeo contendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 146, onde o DNA codificando a proteína (A13) da presente invenção é inserido entre o sítio Ndel e o sítio Hindlll de pKSN2 (daqui em diante referido como "pKSN474F"). O dito plasmídeo foi introduzido em JM109 de E. coli. O transformante de E. coli obtido foi chamado JM109/pKSN474F. (2) Expressão da proteína (A13) da presente invenção em E. coli e recuperação da dita proteína Similarmente ao Exemplo 4(2), cada um de JM109/pKSN474F e JM109/pKSN2 de E. coli foi culturado. As células foram recuperadas. As soluções de lisato de célula foram preparadas. Sob o método descrito no Exemplo 4(2), frações de sobrenadante foram preparadas a partir das soluções de lisato de célula (daqui em diante a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN474F de E. coli é referido como "extrato de JM109/pKSN474F de E. coir e a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN2 é referida como "extrato de pKSN2 de E. cotí'). (3) Detecção da habilidade em converter o composto (II) no composto (III) Soluções de reação de 30 μΙ foram preparadas e mantidas por 10 minutos a 30° C.
Exceto pelo uso das frações de sobrenadante recuperadas no Exemplo 36(2) (extrato pKSN474F de E. coli ou extrato de pKSN2 de E. coli), as soluções de reação foram preparadas similarmente ao Exemplo 32(3). As soluções de reação após a manutenção foram extraídas com acetato de etila e as camadas extraídas foram analisadas através de TLC. Após o desenvolvimento da placa de TLC, a presença de um ponto sobre ela correspondendo ao composto (III) marcado com 14C foi examinada (valor Rf de 0,24 e 0,29). Um ponto correspondendo ao composto (III) foi detectado a partir da solução de reação contendo extrato de pKSN474F de E. coli. Em contraste, tal ponto não era detectado da solução de reação contendo extrato de pKSN2 de E. coli.
Exemplo 370btenção do DNA (A14) da presente invenção (1) Preparação de DNA cromossômico de Streptomyces thermocorulesces IFO 14273t Sob o método descrito no Exemplo 31(1), o DNA cromossômico de Streptomyces glomerochromogenes IFO 13673t foi preparado. (2) Isolamento de DNA tendo uma seqüência de nucleotídeo parcial do DNA (A13) da presente invenção PCR foi conduzida utilizando como o molde o DNA cromossômico de Streptomyces glomerochromogenes IFO 13673t preparado no Exemplo 37(1) e utilizando o par de iniciador 14, de acordo com o método descrito no Exemplo 29. Similarmente ao Exemplo 31(2), o DNA amplificado foi clo-nado para o vetor de clonagem pCRIl-TOPO (Invitrogen Company). A sua seqüência de nucleotídeo foi analisada. Como resultado, a seqüência de nucleotídeo mostrada em nucleotídeos 316 a 1048 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ 1D NO: 142 foi provida.
Ainda, o DNA cromossômico preparado no Exemplo 37(1) foi di- gerido com a enzima de restrição Smal. Uma biblioteca Walker de genoma foi produzida utilizando o DNA obtido, de acordo com o método descrito no Exemplo 26(3). PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3) para se obter os primeiros produtos de PCR, utilizando a biblioteca obtida como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüêncía de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 179 como iniciador AP1. Em seguida, PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3), utilizando os primeiros produtos de PCR como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 180 e iniciador AP2. A seqüêncía de nucleotídeo do DNA obtido foi analisada. A seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 1 a 330 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 147 foi provida.
Ainda, o DNA cromossômico preparado no Exemplo 37(1) foi digerido com a enzima de restrição Hincll. Uma biblioteca Walker de genoma foi produzida utilizando o DNA obtido, de acordo com o método descrito no Exemplo 26(3). PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3) para se obter os primeiros produtos de PCR, utilizando a biblioteca obtida como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 181 e iniciador AP1. Em seguida, PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3), utilizando os primeiros produtos de PCR como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 182 e iniciador AP2. A seqüência de nucleotídeo do DNA obtido foi analisada. A seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 982 a 1449 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 147 foi provida. (3) Análise de seqüência de DNA (A14) da presente invenção A seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 147 foi obtida conectando as seqüências de nucleotídeo providas pelo DNA obtido no Exemplo 37(2). Dois quadros de leitura abertos (ORF) estavam presentes na dita seqüência de nucleotídeo. Desse modo, ela continha uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 142) consistindo em 1230 nucleotídeos (inclusive do códon de parada) e codificando um resíduo de 409 aminoacidos (SEQ ID NO: 137) e uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 157) consistindo em 207 nucleotídeos (inclusive do códon de parada) e codificando um resíduo de 68 aminoacidos (SEQ ID NO: 152). O peso molecular da proteína consistindo na seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 137) codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 142 foi calculado como sendo 45089 Da. Ainda, o peso molecular da proteína consistindo na seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 152) codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 157 foi calculado como sendo 7174Da.
Exemplo 38Expressão do DNA (A14) da presente invenção em E. coli (1) Produção de uma E. coli transformada tendo o DNA (A14) da presente invenção PCR foi conduzida similarmente ao Exemplo 32(1), exceto usando como um molde o DNA cromossômico preparado de Streptomyces glo-merochromogenes IFO 13673t preparado no Exemplo 37(1) e utilizando como os iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 183 e um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 184. Similarmente ao Exemplo 32(1), o DNA foi purificado a partir da solução de reação de PCR e clonado no vetor de clonagem pCRIl-TOPO (Invitrogen Company). A seqüência de nucleotídeo do DNA de plasmídeo obtido foi analisada com oligonucleotídeos tendo as seqüências de nucleotídeo mostradas, respectivamente, nas SEQ ID NOs: 57, 59 e 189. Com base nos resultados obtidos, o plasmídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 147 foi chamada pCR1491AF. Similarmente ao Exemplo 32(1), pCR1491AF foi digerido com as enzimas de restrição Ndel e Hindlll. Um DNA de cerca de 1,5 kpb foi purificado a partir dos produtos de digestão. O DNA obtido e o plasmídeo de pKSN2 digerido com Ndel e Hindlll foram ligados para se obter um plasmídeo contendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 147, onde o DNA codificando a proteína (A14) da presente invenção é inserido entre o sítio Ndel e o sítio Hindlll de pKSN2 (daqui em diante referido como "pKSN1491AF"). O dito plasmídeo foi introduzido em JM109 de E. coli. O transformante de E. coli obtido foi chamado JM109/pKSN1491AF. (2) Expressão da proteína (A14) da presente invenção em E. coli e recuperação da dita proteína Similarmente ao Exemplo 4(2), cada um de JM109/pKSN1491AF e JM109/pKSN2 de E. coli foi culturado. As células foram recuperadas. As soluções de lisato de célula foram preparadas. Sob o método descrito no Exemplo 4(2), frações de sobrenadante foram preparadas a partir das soluções de lisato de célula (daqui em diante a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN1491AF de E. coli é referido como "extrato pKSN1491AF de E. coir e a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN2 é referida como "extrato de pKSN2 de E. coli'). (3) Detecção da habilidade em converter o composto (II) no composto (III) Soluções de reação de 30 μΙ foram preparadas e mantidas por 10 minutos a 30° C. Exceto pelo uso das frações de sobrenadante recuperadas no Exemplo 38(2) (extrato de pKSN1491AF de E. coli ou extrato de pKSN2 de E. coli), as soluções de reação foram preparadas similarmente ao Exemplo 32(3). As soluções de reação após a manutenção foram extraídas com acetato de etila e as camadas extraídas foram analisadas através de TLC. Após o desenvolvimento da placa de TLC, a presença de um ponto sobre ela correspondendo ao composto (III) marcado com 14C foi examinada (valor Rf de 0,24 e 0,29). Um ponto correspondendo ao composto (III) foi detectado a partir da solução de reação contendo extrato de pKSN1491AF de E. coli. Em contraste, tal ponto não era detectado da solução de reação contendo extrato de pKSN2 de E. coli.
Exemplo 390btenção do DNA (A15) da presente invenção (1) Preparação de DNA cromossômico de Streptomyces oli-vochromogenes IFO 12444 Sob o método descrito no Exemplo 31(1), o DNA cromossômico de Streptomyces olivochromogenes IFO 12444 foi preparado. (2) Isolamento de DNA tendo uma seqüência de nucleotídeo parcial de DNA (A15) da presente invenção PCR foi conduzida utilizando como o molde o DNA cromossômi-co de Streptomyces olivochromogenes IFO 12444 preparado no Exemplo 39(1) e utilizando o par de iniciador 14, de acordo com o método descrito no Exemplo 29. Similarmente ao Exemplo 31(2), o DNA amplificado foi clonado para o vetor de clonagem pCRIl-TOPO (Invitrogen Company). A sua se-qüência de nucleotídeo foi analisada. Como resultado, a seqüência de nu-cleotídeo mostrada em nucleotídeos 316 a 1048 da seqüência de nucleotí-deo mostrada na SEQ ID NO: 143 foi provida.
Ainda, o DNA cromossômico preparado no Exemplo 37(1) foi digerido com a enzima de restrição Smal. Uma biblioteca Walker de genoma foi produzida utilizando o DNA obtido, de acordo com o método descrito no Exemplo 26(3). PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3) para se obter os primeiros produtos de PCR, utilizando o DNA obtido como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 179 como iniciador AP1. Em seguida, PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3), utilizando os primeiros produtos de PCR como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 180 e iniciador AP2. A seqüência de nucleotídeo do DNA obtido foi analisada. A seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 1 a 330 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 148 foi provida.
Ainda, o DNA cromossômico preparado no Exemplo 39(1) foi digerido com a enzima de restrição Smal. Uma biblioteca Walker de genoma foi produzida utilizando o DNA obtido, de acordo com o método descrito no Exemplo 26(3). PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3) para se obter os primeiros produtos de PCR, utilizando a biblioteca obtida como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 181 e iniciador AP1. Em seguida, PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3), utilizando os primeiros produtos de PCR como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 182 e iniciador AP2. A seqüência de nucleotídeo do DNA obtido foi analisada. A seqüência de nu- cleotídeo mostrada nos nucleotídeos 982 a 1449 da seqüência de nucleotí-deo mostrada na SEQ ID NO: 148 foi provida. (3) Análise de seqüência de DNA (A15) da presente invenção A seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 148 foi obtida conectando as seqüências de nucleotídeo providas pelo DNA obtido no Exemplo 39(2). Dois quadros de leitura abertos (ORF) estavam presentes na dita seqüência de nucleotídeo. Desse modo, ela continha uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 143) consistindo em 1230 nucleotídeos (inclusive do códon de parada) e codificando um resíduo de 409 aminoacidos (SEQ ID NO: 138) e uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 158) consistindo em 207 nucleotídeos (inclusive do códon de parada) e codificando um resíduo de 68 aminoacidos (SEQ ID NO: 153). O peso molecular da proteína consistindo na seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 138) codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 143 foi calculado como sendo 45116 Da. Ainda, o peso molecular da proteína consistindo na seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 153) codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 158 foi calculado como sendo 7179Da.
Exemplo 40Expressão do DNA (A15) da presente invenção em E. coli (1) Produção de uma E. coli transformada tendo o DNA (A15) da presente invenção PCR foi conduzida similarmente ao Exemplo 32(1), exceto usando como um molde o DNA cromossômico preparado de Streptomyces olivo-chromogenes IFO 12444 preparado no Exemplo 39(1) e utilizando como os iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 184 e um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 185. Similarmente ao Exemplo 32(1), o DNA foi purificado a partir da solução de reação de PCR e clonado no vetor de clonagem pCRIl-TOPO (Invitrogen Company). A seqüência de nucleotídeo do DNA de plasmídeo obtido foi analisada com oligonucleotídeos tendo as seqüências de nucleotídeo mostradas, respectivamente, nas SEQ ID NOs: 57, 59 e 189. Com base nos resultados obtidos, o plasmídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 148 foi chamada pCR1555AF. Similarmente ao Exemplo 32(1), pCR1555AF foi digerido com as enzimas de restrição Ndel e Hindlll. Um DNA de cerca de 1,5 kpb foi purificado a partir dos produtos de digestão. O DNA obtido e o plasmídeo de pKSN2 digerido com Ndel e Hindlll foram ligados para se obter um plasmídeo contendo a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 148, onde o DNA codificando a proteína (A15) da presente invenção é inserido entre o sítio Ndel e o sítio Hindlll de pKSN2 (daqui em diante referido como "pKSN1555AF"). O dito plasmídeo foi introduzido em JM109 de E. coli. O transformante de E. coli obtido foi chamado JM109/pKSN1555AF. (2) Expressão da proteína (A15) da presente invenção em E. coli e recuperação da dita proteína Similarmente ao Exemplo 4(2), cada um de JM109/pKSN1555AF e JM109/pKSN2 de E. coli foi culturado. As células foram recuperadas. As soluções de lisato de célula foram preparadas. Sob o método descrito no Exemplo 4(2), frações de sobrenadante foram preparadas a partir das soluções de lisato de célula (daqui em diante a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN1555AF de E. coli é referida como "extrato de pKSN1555AF de E. coli' e a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN2 é referida como "extrato de pKSN2 de E. coli'). (3) Detecção da habilidade em converter o composto (II) no composto (III) Soluções de reação de 30 μΙ foram preparadas e mantidas por 10 minutos a 30° C. Exceto pelo uso das frações de sobrenadante recuperadas no Exemplo 40(2) (extrato de pKSN1555AF de E. coli ou extrato de pKSN2 de E. coli), as soluções de reação foram preparadas similarmente ao Exemplo 32(3). As soluções de reação após a manutenção foram extraídas com acetato de etila e as camadas extraídas foram analisadas através de TLC. Após o desenvolvimento da placa de TLC, a presença de um ponto sobre ela correspondendo ao composto (III) marcado com 14C foi examinada (valor Rf de 0,24 e 0,29). Um ponto correspondendo ao composto (III) foi detectado a partir da solução de reação contendo extrato de pKSN1555AF de E. coli. Em contraste, tal ponto não era detectado da solução de reação contendo extrato de pKSN2 de E. coli.
Exemplo 41 Metabolismo de compostos pela proteína (A1) da presente invenção (1) Preparação de frações de plastídeo Cem gramas (100 g) de sementes verdes de rabanete (Takii Se-ed) foram semeadas em um guardanapo de laboratório de papel umedecido em uma bandeja, cultivadas a 25°C por 6 dias no escuro e então cultivadas por 4 horas sob uma lâmpada fluorescente. Trinta gramas (30 g) dos cotilé-dones recém-gerados foram moídos com um homogeneizador Nissei AM-8 (Nihonseiki Seisakusho; 18.000 a 20.000 rpm, 4°C, 5 segundos) em tampão de rompimento (1 mM de cloreto de magnésio, 20 mM de N-tris (hidroxime-til)metil-2-aminoetanossulfonato, 10 mM de N-2-hidroxietilpiperidina-N'-2-etanossulfonato, 0,5 mM de EDTA, 5 mM de cisteína, 0,5 M de sacarose; pH 7,7). A solução de lisato de célula obtida foi passada por 4 camadas de gaze de náilon. A solução obtida foi centrifugada (13.170xg, 4°C, 1 minuto). As frações de resíduo obtidas foram suspensas com 60 ml de tampão de rompimento e centrifugadas (2.640xg, 4°C, 2 minutos). As frações de resíduo foram ressuspensas em 10 ml de tampão de rompimento, foram postas em camada com o tampão de alta densidade (1 mM de cloreto de magnésio, 20 mM de N-tris (hidroximetil)-metil-2-aminoetanossulfonato, 30 mM de N-2-hidroxietilpiperidina-N'-2-etanossulfonato, 0,5 mM de EDTA, 5 mM de cisteína, 0,6 M de sacarose; pH 7,7) em um tubo de centrífuga e foram centrifugadas (657xg, 4°C, 15 minutos). Os resíduos foram suspensos em 3 ml de tampão de suspensão (1 mM de cloreto de magnésio, 200 mM de N-tris(hidroximetil)metil-2-aminoetanossulfonato, 30 mM de Ν-2-hidroxietílpipe-ridina-N’-2-etanossulfonato, 0,5 mM de EDTA; pH 7,7) e foram chamados fração de plasmídeo. (2) Metabolismo do composto (XII) pela proteína (A1) da presente invenção Foram preparados 100 μΙ de uma solução de reação de 50 mM de tampão de fosfato de potássio (pH 7,0) contendo 5 ppm do composto (XII), 3 mM de β-NADPH (daqui em diante referido como "componente A") (Oriental Yeast Company), 1 mg/ml de uma ferredoxina derivada de espinafre (daqui em diante referida como "componente B") (Sigma Company), 0,15 U/ml de ferredoxina redutase (daqui em diante referida como "componente C") (Sigma Company) e 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 4(2). A solução de reação foi mantida a 30°C por 10 minutos. Ainda, foram preparados e mantidos similarmente 100 μΙ de uma solução de reação de um tampão de fosfato de potássio (pH 7,0) não tendo nenhuma adição de pelo menos um composto utilizado na composição da solução de reação acima, selecionado de componente A, componente B e componente Cea fração de sobrenadante preparada no Exemplo 4(2). Dez microlitros (10 μΙ) de HCI 2N e 500 μΙ de acetato de etila foram adicionados e misturados a cada uma das soluções de reação após a manutenção. As soluções de reação resultantes são centrifugadas a 8.000xg para recuperar 490 μΙ da camada de acetato de etila. Após secagem das camadas de acetato de etila sob pressão reduzida, o resíduo é dissolvido em 100 μΙ de 50 mM de tampão de fosfato de potássio (pH 7,0). Quarenta microlitros (40 μΙ) das soluções de fração (daqui em diante, a solução de fração derivada da solução de reação contendo componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 4(2) é referida como "solução (A1) de metabolismo (XII)"; ainda, a solução de fração derivada da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 4(2) é referida como "solução (A1) de controle (XII)") foram analisados em HPLC. Comparado com a concentração do composto (XII) detectado da solução (A1) de controle (XII), a concentração do composto (XII) detectado da solução (A1) de metabolismo (XII) era menor. Ainda, um pico, que não foi detectado a partir da solução (A1) de controle (XII), foi detectado a partir da solução (A1) de metabolismo (XIII). Espectrometria de massa foi realizada para o composto contido em tal pico. A massa do composto contido em tal pico era 14 vezes menor do que a massa do composto (XII).
Vinte microlitros (20 μΙ) de uma diluição de 32 vezes da solução (Α1) de metabolismo (XII) e 60 μΙ da fração de plasmídeo preparada no Exemplo 41(1) foram misturados. Nas condições de escuro, 20 μΙ da solução de substrato (10 mM de trifosfato de adenosina, 5 mM de ácido aminolevulí-nico, 4 mM de glutationa redutase e 0,6 mM de NAD+; pH 6,5; daqui em diante, tal solução de substrato é referida como "solução de substrato de PPO") foram adicionados e mantidos a 30°C por 1,5 hora. Ainda, ao invés dos ditos 20 μΙ da diluição de 32 vezes da solução (A1) de metabolismo de (XII), uma solução de reação à qual 20 μΙ da diluição de 32 vezes da solução (A1) de metabolismo de (XII) foram adicionados foi preparada, e a solução de substrato de PPO foi adicionada e mantida similarmente. Trezentos mi-crolitros (30 μΙ) de uma mistura de sulfóxido de dimetila-metanol (sulfóxido de dimetilarmetanol = 7:3) foram adicionados a cada uma das soluções de reação após a manutenção e centrifugados (8000xg, 4°C, 10 minutos). Os sobrenadantes foram recuperados e foram submetidos à análise HPC de fase reversa sob as condições de análise abaixo para medir a quantidade de PPIX. A quantidade de PPIX na solução de reação à qual a solução (A1) de metabolismo de (XII) foi adicionada era maior do que a quantidade de PPIX na solução de reação à qual a solução (A1) de controle de (XII) foi adicionada. (Condição de análise de HPLC) Coluna: SUMIPAX ODS212 (Sumika Chemical Analysis Service) Taxa de fluxo: 2 ml/minuto Comprimento de onda de detecção: fluorescência Ex: 410 nm Em: 630 nm Eluente: mistura de 95:5 de metanol e 1M de acetato de amônio (PH 5,7) (3) Metabolismo do composto (XIII) pela proteína (A1) da presente invenção Exceto pelo uso de 5 ppm do composto (XIII) ao invés do uso de 5 ppm do composto (XII), as soluções de reação foram preparadas e mantidas similarmente ao método descrito no Exemplo 41(2). Similarmente ao Exemplo 41(2), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi extraída com acetato de etila e os resíduos obtidos foram dissolvidos em 100 μΙ de sulfóxido de dimetila. As soluções obtidas (daqui em diante, a solução derivada da solução de reação contendo o componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 4(2) é referida como "solução (A1) de metabolismo de (XIII)"; ainda, a solução derivada da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada do Exemplo 4(2) é referida como "solução (A1) de controle de (XIII)") foram analisadas em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XIII) detectado da solução (A1) de controle de (XIII), a concentração do composto (XIII) detectado da solução (A1) de metabolismo de (XIII) era menor. Ainda um pico, que não era detectado da solução (A1) de controle de (XIII), foi detectado da solução (A1) de metabolismo de (XIII). Espectrometria de massa foi realizada para o composto contido em tal pico. A massa do composto contido em tal pico era 14 vezes menor do que a massa do composto (XIII).
Vinte microlitros (20 μΙ) de uma diluição de 128 vezes da solução (A1) de metabolismo de (XIII) e 60 μΙ da fração de plasmídeo foram misturados. Nas condições de escuro, 20 μΙ da solução de PPO foram adicionados e mantidos a 30°C por 1,5 hora. Ainda, ao invés dos ditos 20 μΙ da diluição de 128 vezes da solução (A1) de metabolismo de (XIII), uma solução de reação à qual 20 μΙ da diluição de 128 vezes da solução (A1) de controle (XIII) foram adicionados foi preparada, e a solução de substrato de PPO foi adicionada e mantida similarmente. Similar ao Exemplo 41(2), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi preparada e submetida a análise de HPLC de fase reversa sob a condição de análise 2 acima para medir a quantidade de PPIX. A quantidade de PPIX na solução de reação à qual a solução (A1) de metabolismo de (XIII) foi adicionada era maior do que a quantidade de PPIX na solução de reação à qual a solução (A1) de controle de (XIII) foi adicionada. (4) Metabolismo do composto (XVI) pela proteína (A1) da presente invenção Exceto pelo uso de 12,5 ppm do composto (XVI) ao invés do uso de 5 ppm do composto (XII), as soluções de reação foram preparadas e mantidas similarmente ao método descrito no Exemplo 41(2). Similarmente ao Exemplo 41 (2), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi extraída com acetato de etila e os resíduos obtidos foram dissolvidos em 200 μΙ de tampão de fosfato de potássio 50 mM (pH 7,0). As soluções obtidas (daqui em diante, a solução derivada da solução de reação contendo o componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 4(2) é referida como "solução (A1) de metabolismo de (XVI)"; ainda, a solução derivada da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada do Exemplo 4(2) é referida como "solução (A1) de controle de (XVI)") foram analisadas em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XVI) detectado da solução (A1) de controle de (XVI), a concentração do composto (XVI) detectado da solução (A1) de metabolismo de (XVI) era menor. Ainda um pico, que não era detectado da solução (A1) de controle de (XVI), foi detectado da solução (A1) de metabolismo de (XVI).
Vinte microlitros (20 μΙ) de uma diluição de 8 vezes da solução (A1) de metabolismo de (XVI) e 60 μΙ da fração de plasmídeo foram misturados. Nas condições de escuro, 20 μΙ da solução de PPO foram adicionados e mantidos a 30°C por 1,5 hora. Ainda, ao invés dos ditos 20 μΙ da diluição de 8 vezes da solução (A1) de metabolismo de (XVI), uma solução de reação à qual 20 μΙ da diluição de 8 vezes da solução (A1) de controle (XII) foram adicionados foi preparada, e a solução de substrato de PPO foi adicionada e mantida similarmente. Similar ao Exemplo 41(2), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi preparada e submetida à análise de HPLC de fase reversa sob a condição de análise 2 acima para medir a quantidade de PPIX. A quantidade de PPIX na solução de reação à qual a solução (A1) de metabolismo de (XVI) foi adicionada era maior do que a quantidade de PPIX na solução de reação à qual a solução (A1) de controle de (XVI) foi adicionada. (5) Metabolismo do composto (XVII) pela proteína (A1) da presente invenção Exceto pelo uso de 12,5 ppm do composto (XVII) ao invés do uso de 5 ppm do composto (XII), as soluções de reação foram preparadas e mantidas similarmente ao método descrito no Exemplo 41 (2). Similarmente ao Exemplo 41(2), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi extraída com acetato de etila e os resíduos obtidos foram dissolvidos em 200 μΙ de tampão de fosfato de potássio 50 mM (pH 7,0). As soluções obtidas (daqui em diante, a solução derivada da solução de reação contendo o componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 4(2) é referida como "solução (A1) de metabolismo de (XVII)"; ainda, a solução derivada da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada do Exemplo 4(2) é referida como "solução (A1) de controle de (XVII)'') foram analisadas em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XVII) detectado da solução (A1) de controle de (XVII), a concentração do composto (XVII) detectado da solução (A1) de metabolismo de (XVII) era menor. Ainda um pico, que não era detectado da solução (A1) de controle de (XVII), foi detectado da solução (A1) de metabolismo de (XVII).
Vinte microlitros (20 μΙ) de uma diluição de 32 vezes da solução (A1) de metabolismo de (XVII) e 60 μΙ da fração de plasmídeo foram misturados. Nas condições de escuro, 20 μΙ da solução de substrato PPO foram adicionados e mantidos a 30°C por 1,5 hora. Ainda, ao invés dos ditos 20 μΙ da diluição de 32 vezes da solução (A1) de metabolismo de (XVII), uma solução de reação à qual 20 μΙ da diluição de 32 vezes da solução (A1) de controle (XVII) foram adicionados foi preparada, e a solução de substrato de PPO foi adicionada e mantida similarmente. Similar ao Exemplo 41(2), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi preparada e submetida a análise de HPLC de fase reversa sob a condição de análise 2 acima para medir a quantidade de PPIX. A quantidade de PPIX na solução de reação à qual a solução (A1) de metabolismo de (XVII) foi adicionada era maior do que a quantidade de PPIX na solução de reação à qual a solução (A1) de controle de (XVII) foi adicionada. (6) Metabolismo do composto (VI) pela proteína (A1) da presente invenção JM109/pKSN657Fde E. coli foi culturado da noite para o dia a 37°C em 3 ml de meio TB contendo 50 pg/ml de ampicilina. Um mililitro (1 ml) do meio de cultura obtido foi transferido para 100 ml de meio TB contendo 50 pg/ml de ampicilina e culturado a 260 C. Quando OD660 atingiu cerca de 0,5, ácido 5-aminolevulínico foi adicionado para a concentração final de 500 μΜ, e a cultura foi continuada. Trinta (30) minutos depois, IPTG foi adicionado para uma concentração final de 1mM, e foi ainda culturada por mais 20 horas.
As células foram recuperadas do meio de cultura, lavadas com tampão de tris-HCI 0,1 M (pH 7,5) e suspensas em 10 ml de tampão de Tris-HCI 0,1 M contendo 1% de glicose. O composto (VI) foi adicionado à suspensão de célula obtida para uma concentração final de 100 ppm e que foi incubada com agitação a 30°C. Em cada uma de 0 horas após e 1 dia após o início da agitação, 2 ml da suspensão de célula foram fracionados. Cin-qüenta microlitros (50 μΙ) de HCI 2N foram adicionados a cada uma e elas foram extraídas com 2 ml de acetato de etila. As camadas obtidas de acetato de etila foram analisadas em HPLC sob a condição de reação 1. Comparado com a concentração do composto (VI) detectado a partir da camada de acetato de etila preparada a partir da suspensão de célula a 0 hora após o início da agitação, a concentração do composto (VI) detectado a partir da camada de acetato de etila preparada a partir da suspensão de célula no dia 1 após o início da agitação era menor. Ainda um pico, que não foi detectado a partir da camada de acetato de etila preparada a partir da suspensão de célula a 0 horas após o início da agitação, foi detectado a partir da camada de acetato de etila preparada a partir da suspensão de célula no dia 1 após o início da agitação. Espectrometria de massa do composto contido no dito pico foi realizada. A massa do composto contido no dito pico era 14 vezes menor do que a massa do composto (VI). (7) Metabolismo do composto (VIII) pela presente proteína (A1) Exceto pelo uso do composto (VIII) ao invés do composto (VI), foram realizadas de acordo com o método descrito no Exemplo 41 (6), uma cultura de JM109/pKSN657F, preparação da solução de suspensão de célula, incubação com agitação da solução de suspensão celular à qual o composto (VIII) foi adicionado, preparação de reagente a partir da solução de suspensão celular e análise HPLC dos reagentes. Comparado com a concentração do composto (VIII) detectado a partir da camada de acetato de etila preparada a partir da suspensão de célula em 0 hora após o início da agitação, a concentração do composto (VIII) detectado a partir da camada de acetato de etila preparada a partir da suspensão de célula no dia 1 após o início da agitação era menor. Ainda dois picos, que não foram detectados a partir da camada de acetato de etila preparada a partir da suspensão de célula a 0 horas após o início da agitação, foram detectados a partir da camada de acetato de etila preparada a partir da suspensão de célula no dia 1 após o início da agitação. Espectrometria de massa dos compostos contidos nos ditos picos foi realizada. A massa do composto contido em um dos ditos picos era 14 vezes menor e a massa do composto contido no outro pico era 28 vezes menor do que a massa do composto (VIII). (8) Metabolismo do composto (X) pela proteína (A1) da presente invenção Exceto pelo uso do composto (X) ao invés do composto (VI), foram realizados de acordo com o método descrito no Exemplo 41(6), uma cultura de JM109/pKSN657F de E. coli, preparação da solução de suspensão de célula, cultura com agitação da solução de suspensão celular à qual o composto (X) foi adicionado, preparação de reagente a partir da solução de suspensão celular e análise HPLC dos reagentes. Comparado com a concentração do composto (X) detectado a partir da camada de acetato de etila preparada a partir da suspensão de célula em 0 hora após o início da agitação, a concentração do composto (XI) detectado a partir da camada de acetato de etila preparada a partir da suspensão de célula no dia 1 após o início da agitação era menor. Ainda dois picos, que não foram detectados a partir da camada de acetato de etila preparada a partir da suspensão de célula a 0 hora após o início da agitação, foram detectados a partir da camada de acetato de etila preparada a partir da suspensão de célula no dia 1 após o início da agitação. Espectrometria de massa dos compostos contidos nos ditos picos foi realizada. A massa do composto contido em um dos ditos picos era 40 vezes menor e a massa do composto contido no outro pico era 54 vezes menor do que a massa do composto (X). (9) Metabolismo do composto (XI) pela proteína (A1) da presente invenção Exceto pelo uso do composto (XI) ao invés do composto (VI), foram realizadas de acordo com o método descrito no Exemplo 41(6), uma cultura de JM109/pKSN657F de E. coli, preparação da solução de suspensão de célula, cultura com agitação da solução de suspensão celular à qual o composto (XI) foi adicionado, preparação de reagente a partir da solução de suspensão celular e análise HPLC dos reagentes. Comparado com a concentração do composto (XI) detectado a partir da camada de acetato de etila preparada a partir da suspensão de célula em 0 hora após o início da agitação, a concentração do composto (XI) detectado a partir da camada de acetato de etila preparada a partir da suspensão de célula no dia 1 após o início da agitação era menor. Ainda dois picos, que não foram detectados a partir da camada de acetato de etila preparada a partir da suspensão de célula a 0 hora após o início da agitação, foram detectados a partir da camada de acetato de etila preparada a partir da suspensão de célula no dia 1 após o início da agitação. Espectrometria de massa dos compostos contidos nos ditos picos foi realizada. A massa do composto contido em um dos ditos picos era 14 vezes menor e a massa do composto contido no outro pico era 16 vezes menor do que a massa do composto (XI).
Exemplo 42Metabolismo de compostos pela proteína (A11) da presente invenção (1) Metabolismo do composto (x) pelo composto (A11) da presente invenção JM109/pKSN849AF de E. coli e JM109/pKSN2 de E. coli foi cul-turado da noite para o dia a 37°C em 3 ml da cultura de TB contendo 50 μς/ml de ampicilina. Um mililitro (1 ml) dos meios de cultura obtidos foi transferido para 100 ml de meio TB contendo 50 pg/ml de ampicilina e cultu-rado a 26o C. Quando OD660 atingiu cerca de 0,5, ácido 5-aminolevulínico foi adicionado para a concentração final de 500 μΜ, e a cultura foi continuada. Trinta (30) minutos depois, IPTG foi adicionado para uma concentração final de 1mM, e foi ainda culturada por mais 18 horas.
As células foram recuperadas do meio de cultura, lavadas com tampão de tris-HCI 0,1 M (pH 7,5) e suspensas em 10 ml de tampão de Tris-HCI 0,1 M contendo 1% de glicose. O composto (X) foi adicionado à suspensão de célula obtida para uma concentração final de 25 ppm e que foi incubada com agitação a 30°C. Em cada uma de 0 horas após e 4 dias após o início da agitação, 2 ml da suspensão de célula foram fracionados. Cin-qüenta microlitros (50 μΙ) de HCI 2N foram adicionados a cada uma e elas foram extraídas com 2 ml de acetato de etila. As camadas obtidas de acetato de etila obtidas foram analisadas em HPLC sob a condição de reação 1. Comparado com a concentração do composto (X) detectado a partir da camada de acetato de etila preparada a partir da suspensão de célula de JM109/pKSN2, a concentração do composto (X) detectado a partir da camada de acetato de etila preparada a partir da suspensão de célula de JM109/pKSN849AF era menor. Ainda 3 picos, que não foram detectados a partir da camada de acetato de etila preparada a partir da suspensão de célula de JM109/pKSN2, foram detectados a partir da camada de acetato de etila preparada a partir da suspensão de célula de JM109/pKSN849AF. Dos 3 picos, o tempo de eluição na HPLC de 1 dos picos combinava com o tempo de eluição de um pico de um composto que tem uma massa de 40 vezes menor do que o composto (X) detectado no Exemplo 41(8). Ainda, o tempo de eluição na HPLC de um outro pico combinava com o tempo de eluição de um pico de um composto que tem uma massa 54 vezes menor do que o composto (X) detectado no Exemplo 41(8).
Após secagem, respectiva mente, 1 ml da camada de acetato de etila preparada a partir da suspensão de célula de JM109/pKSN2 e 1 ml de camada de acetato de etila preparada a partir da suspensão de célula de JM109/pKSN849AF, os resíduos foram dissolvidos em 1 ml de sulfóxido de dimetila (daqui em diante a solução derivada da camada de acetato de etila preparada a partir de JM109/pKSN849AF é referida como "solução de (A11) de metabolismo de (X)"; ainda, a solução derivada da camada de acetato de etila preparada a partir da suspensão de célula de JM109/pKSN2 é referida como "solução de (A11) de controle de (X)".
Vinte microlitros (20 μΙ) de uma diluição de 128 vezes da solução de (A11) de metabolismo de (X) e 60 μΙ da fração de plasmídeo foram misturados. Nas condições de escuro, 20 μΙ da solução de substrato PPO foram adicionados e mantidos a 30°C por 1,5 hora. Ainda, ao invés dos ditos 20 μΙ da diluição de 128 vezes da solução de (A1) de metabolismo de (X), uma solução de reação à qual 20 μΙ da diluição de 128 vezes da solução de (A1) de controle (X) foram adicionados foi preparada, e a solução de substrato de PPO foi adicionada e mantida similarmente. Similar ao Exemplo 41(2), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi preparada e submetida à análise de HPLC de fase reversa sob a condição de análise 2 acima para medir a quantidade de PPIX. A quantidade de PPIX na solução de reação à qual a solução de (A11) de metabolismo de (X) foi adicionada era maior do que a quantidade de PPIX na solução de reação à qual a solução de (A11) de controle de (X) foi adicionada. (2) Metabolismo do composto (XII) pela proteína (A11) da presente invenção Exceto pela utilização de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 32(2) ao invés de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 4(2), as soluções de reação foram preparadas e mantidas de acordo com o método descrito no Exemplo 41(2). Similarmente ao Exemplo 41(2), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi extraída com acetato de etila e o resíduo obtido foi dissolvido em 100 μΙ de tampão de fosfato de potássio 50 mM (pH 7,0). As soluções obtidas (daqui em diante, a solução derivada da solução de reação contendo o componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 32(2) é referida como "solução de (A11) de metabolismo de (XII)"; ainda, a solução derivada da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada do Exemplo 32(2) é referida como "solução de (A11) de controle de (XII)") foram analisadas em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XII) detectado da solução de (A11) de controle de (XII), a concentração do composto (XVI) detectado da solução de (A11) de metabolismo de (XII) era menor. Ainda um pico, que não era detectado da solução de (A11) de controle de (XII), foi detectado da solução de (A11) de metabolismo de (XII). O tempo de eluição do dito pico em HPLC combinou com um tempo de eluição de um pico de um composto onde a massa é 14 vezes menos do que o dito composto (XII) detectado da solução de (A1) de metabolismo de (XII) no Exemplo 41(2). (3) Metabolismo do composto (XIII) pela proteína (A11) da presente invenção Exceto pela utilização de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 32(2) ao invés de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 4(2), as soluções de reação foram preparadas e mantidas de acordo com o método descrito no Exemplo 41(3). Similarmente ao Exemplo 41(2), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi extraída com acetato de etila e o resíduo obtido foi dissolvido em 100 μΙ de sulfóxido de dimetila. As soluções obtidas (daqui em diante, a solução derivada da solução de reação contendo o componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 32(2) é referida como "solução de (A11) de metabolismo de (XIII)"; ainda, a solução derivada da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada do Exemplo 32(2) é referida como "solução de (A11) de controle de (XIII)") foram analisadas em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XIII) detectado da solução de (A11) de controle de (XIII), a concentração do composto (XII) detectado da solução de (A11) de metabolismo de (XIII) era menor. Ainda um pico, que não era detectado da solução de (A11) de controle de (XIII), foi detectado da solução de (A11) de metabolismo de (XIII). O tempo de eluição do dito pico em HPLC combinou com um tempo de eluição de um pico de um composto onde a massa é 14 vezes menos do que o dito composto (XIII) detectado da solução de (A11) de metabolismo de (XIII) no Exemplo 41(3). (4) Metabolismo do composto (XVI) pela proteína (A11) da presente invenção Exceto pela utilização de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 32(2) ao invés de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 4(2), as soluções de reação foram preparadas e mantidas de acordo com o método descrito no Exemplo 41(4). Similarmente ao Exemplo 41(2), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi extraída com acetato de etila e o resíduo obtido foi dissolvido em 200 μΙ de tampão de fosfato de potássio 50 mM (pH 7,0). As soluções obtidas (daqui em diante, a solução derivada da solução de reação contendo o componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 32(2) é referida como "solução de (A11) de metabolismo de (XVI)"; ainda, a solução derivada da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada do Exemplo 32(2) é referida como "solução de (A11) de controle de (XVI)") foram analisadas em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XVI) detectado da solução de (A11) de controle de (XVI), a concentração do composto (XVI) detectado da solução de (A11) de metabolismo de (XVI) era menor. Ainda um pico, que não era detectado da solução de (A11) de controle de (XVI), foi detectado da solução de (A11) de metabolismo de (XVI). O tempo de eluição do dito pico em HPLC combinou com um tempo de eluição de um pico de um composto no Exemplo 41(4) que foi detectado da solução de (A11) de metabolismo de (XVI) e não detectado na solução de (A11) de controle de (XVI). (5) Metabolismo do composto (XVII) pela proteína (A11) da presente invenção Exceto pela utilização de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 32(2) ao invés de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 4(2), as soluções de reação foram preparadas e mantidas de acordo com o método descrito no Exemplo 41(5). Similarmente ao Exemplo 41(2), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi extraída com acetato de etila e o resíduo obtido foi dissolvido em 200 μΙ de tampão de fosfato de potássio 50 mM (pH 7,0). As soluções obtidas (daqui em diante, a solução derivada da solução de reação contendo o componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 32(2) é referida como "solução de (A11) de metabolismo de (XVII)"; ainda, a solução derivada da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada do Exemplo 32(2) é referida como "solução de (A11) de controle de (XVII)") foram analisadas em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XVII) detectado da solução de (A11) de controle de (XVII), a concentração do composto (XVII) detectado da solução de (A11) de metabolismo de (XVII) era menor. Ainda um pico, que não era detectado da solução de (A11) de controle de (XVII), foi detectado da solução de (A11) de metabolismo de (XVII). O tempo de eluição do dito pico em HPLC combinou com um tempo de eluição de um pico no Exemplo 41(5) que foi detectado da solução de (A11) de metabolismo de (XVII) e não detectado na solução de (A1) de controle de (XVII).
Exemplo 43Metabolismo de compostos pela proteína (A2), (A3), (A12), (A13), (A14) ou (A15) da presente invenção ou a presente proteína (A10) (1) Metabolismo do composto (XII) pela proteína (A2) da presente invenção Exceto pela utilização de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 7(2) ao invés de 20 μΙ da fração de sobrenadante recu- perada no Exemplo 4(2), as soluções de reação foram preparadas e mantidas de acordo com o método descrito no Exemplo 41(2). Similarmente ao Exemplo 41 (2), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi extraída com acetato de etila e o resíduo obtido foi dissolvido em 100 μΙ de tampão de fosfato de potássio 50 mM (pH 7,0). As soluções obtidas (daqui em diante, a solução derivada da solução de reação contendo o componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 7(2) é referida como "solução de (A2) de metabolismo de (XII)"; ainda, a solução derivada da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada do Exemplo 7(2) é referida como "solução de (A2) de controle de (XII)") foram analisadas em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XII) detectado da solução de (A2) de controle de (XII), a concentração do composto (XII) detectado da solução de (A2) de metabolismo de (XII) era menor. Ainda um pico, que não era detectado da solução de (A2) de controle de (XII), foi detectado da solução de (A2) de metabolismo de (XII). O tempo de eluição do dito pico em HPLC combinou com um tempo de eluição de um pico de um composto onde a massa é 14 vezes menor do que o dito composto (XII) detectado da solução de (A1) de metabolismo de (XII) no Exemplo 41(2). (2) Metabolismo do composto (XII) pela proteína (A3) da presente invenção Exceto pela utilização de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 12(2) ao invés de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 4(2), as soluções de reação foram preparadas e mantidas de acordo com o método descrito no Exemplo 41(2). Similarmente ao Exemplo 41(2), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi extraída com acetato de etila e o resíduo obtido foi dissolvido em 100 μΙ de tampão de fosfato de potássio 50 mM (pH 7,0). As soluções obtidas (daqui em diante, a solução derivada da solução de reação contendo o componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recupe- rada no Exemplo 12(2) é referida como "solução de (A3) de metabolismo de (XII)"; ainda, a solução derivada da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 7(2) é referida como "solução de (A3) de controle de (XII)") foram analisadas em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XII) detectado da solução de (A3) de controle de (XII), a concentração do composto (XII) detectado da solução de (A3) de metabolismo de (XII) era menor. Ainda um pico, que não era detectado da solução de (A3) de controle de (XII), foi detectado da solução de (A3) de metabolismo de (XII). O tempo de eluição do dito pico em HPLC combinou com um tempo de eluição de um pico de um composto onde a massa é 14 vezes menor do que o dito composto (XII) detectado a partir da solução de (A1) do metabolismo de (XII) no Exemplo 41(2). (3) Metabolismo do composto (XII) pela proteína (A10) da presente invenção Exceto pela utilização de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 10(2) ao invés de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 4(2), as soluções de reação foram preparadas e mantidas de acordo com o método descrito no Exemplo 41(2). Similarmente ao Exemplo 41(2), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi extraída com acetato de etila e o resíduo obtido foi dissolvido em 100 μΙ de tampão de fosfato de potássio 50 mM (pH 7,0). As soluções obtidas (daqui em diante, a solução derivada da solução de reação contendo o componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 10(2) é referida como "solução de (A10) de metabolismo de (XII)"; ainda, a solução derivada da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 12(3) é referida como "solução de (A10) de controle de (XII)") foram analisadas em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XII) detectado da solução de (A10) de controle de (XII), a con- centração do composto (XII) detectado da solução de (A10) de metabolismo de (XII) era menor. Ainda um pico, que não era detectado da solução de (A10) de controle de (XII), foi detectado da solução de (A10) de metabolismo de (XII). O tempo de eluição do dito pico em HPLC combinou com um tempo de eluição de um pico de um composto onde a massa é 14 vezes menor do que o dito composto (XII) detectado a partir da solução de (A1) de metabolismo de (XII) no Exemplo 41(2). (4) Metabolismo do composto (XII) pela proteína (A12) da presente invenção Exceto pela utilização de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 34(2) ao invés de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 4(2), as soluções de reação foram preparadas e mantidas de acordo com o método descrito no Exemplo 41(2). Similarmente ao Exemplo 41(2), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi extraída com acetato de etila e o resíduo obtido foi dissolvido em 100 μΙ de tampão de fosfato de potássio 50 mM (pH 7,0). As soluções obtidas (daqui em diante, a solução derivada da solução de reação contendo o componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 34(2) é referida como "solução de (A12) de metabolismo de (XII)"; ainda, a solução derivada da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 34(2) é referida como "solução de (A12) de controle de (XII)") foram analisadas em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XII) detectado da solução de (A12) de controle de (XII), a concentração do composto (XII) detectado da solução de (A12) de metabolismo de (XII) era menor. Ainda um pico, que não era detectado da solução de (A12) de controle de (XII), foi detectado da solução de (A12) de metabolismo de (XII). O tempo de eluição do dito pico em HPLC combinou com um tempo de eluição de um pico de um composto onde a massa é 14 vezes menor do que o dito composto (XII) detectado a partir da solução de (A1) de metabolismo de (XII) no Exemplo 41(2). (5) Metabolismo do composto (XII) pela proteína (A13) da presente invenção Exceto pela utilização de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 36(2) ao invés de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 4(2), as soluções de reação foram preparadas e mantidas de acordo com o método descrito no Exemplo 41(2). Similarmente ao Exemplo 41(2), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi extraída com acetato de etila e o resíduo obtido foi dissolvido em 100 μΙ de tampão de fosfato de potássio 50 mM (pH 7,0). As soluções obtidas (daqui em diante, a solução derivada da solução de reação contendo o componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 36(2) é referida como "solução de (A13) de metabolismo de (XII)"; ainda, a solução derivada da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 36(2) é referida como "solução de (A13) de controle de (XII)") foram analisadas em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XII) detectado da solução de (A13) de controle de (XII), a concentração do composto (XII) detectado da solução de (A13) de metabolismo de (XII) era menor. Ainda um pico, que não era detectado da solução de (A13) de controle de (XII), foi detectado da solução de (A13) de metabolismo de (XII). O tempo de eluição do dito pico em HPLC combinou com um tempo de eluição de um pico de um composto onde a massa é 14 vezes menor do que o dito composto (XII) detectado a partir da solução de (A1) de metabolismo de (XII) no Exemplo 41(2). (6) Metabolismo do composto (XII) pela proteína (A14) da presente invenção Exceto pela utilização de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 38(2) ao invés de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 4(2), as soluções de reação foram preparadas e mantidas de acordo com o método descrito no Exemplo 41(2). Similarmente ao Exemplo 41(2), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi extraída com acetato de etila e o resíduo obtido foi dissolvido em 100 μΙ de tampão de fosfato de potássio 50 mM (pH 7,0). As soluções obtidas (daqui em diante, a solução derivada da solução de reação contendo o componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 38(2) é referida como "solução de (A14) de metabolismo de (XII)"; ainda, a solução derivada da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 38(2) é referida como "solução de (A14) de controle de (XII)") foram analisadas em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XII) detectado da solução de (A14) de controle de (XII), a concentração do composto (XII) detectado da solução de (A14) de metabolismo de (XII) era menor. Ainda um pico, que não era detectado da solução de (A14) de controle de (XII), foi detectado da solução de (A14) de metabolismo de (XII). O tempo de eluição do dito pico em HPLC combinou com um tempo de eluição de um pico de um composto onde a massa é 14 vezes menor do que o dito composto (XII) detectado a partir da solução de (A1) de metabolismo de (XII) no Exemplo 41(2). (7) Metabolismo do composto (Xli) pela proteína (A15) da presente invenção Exceto pela utilização de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 40(2) ao invés de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 4(2), as soluções de reação foram preparadas e mantidas de acordo com o método descrito no Exemplo 41(2). Similarmente ao Exemplo 41(2), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi extraída com acetato de etila e o resíduo obtido foi dissolvido em 100 μΙ de tampão de fosfato de potássio 50 mM (pH 7,0). As soluções obtidas (daqui em diante, a solução derivada da solução de reação contendo o componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 40(2) é referida como "solução de (A15) de metabolismo de (XII)"; ainda, a solução derivada da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e ne- nhuma fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 40(2) é referida como "solução de (A15) de controle de (XII)") foram analisadas em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XII) detectado da solução de (A15) de controle de (XII), a concentração do composto (XII) detectado da solução de (A15) de metabolismo de (XII) era menor. Ainda um pico, que não era detectado da solução de (A15) de controle de (XII), foi detectado da solução de (A15) de metabolismo de (XII). O tempo de eluição do dito pico em HPLC combinou com um tempo de eluição de um pico de um composto onde a massa é 14 vezes menor do que o dito composto (XII) detectado a partir da solução de (A1) de metabolismo de (XII) no Exemplo 41(2). (8) Metabolismo do composto (XIII) pela proteína (A2) da presente Invenção Exceto pela utilização de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 7(2) ao invés de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 4(2), as soluções de reação foram preparadas e mantidas de acordo com o método descrito no Exemplo 41(3). Similarmente ao Exemplo 41(2), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi extraída com acetato de etila e o resíduo obtido foi dissolvido em 100 μΙ de sulfóxido de dimetila. As soluções obtidas (daqui em diante, a solução derivada da solução de reação contendo o componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 7(2) é referida como "solução de (A2) de metabolismo de (XIII)"; ainda, a solução derivada da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 7(2) é referida como "solução de (A2) de controle de (XIII)") foram analisadas em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XIII) detectado da solução de (A2) de controle de (XIII), a concentração do composto (XIII) detectado da solução de (A2) de metabolismo de (XIII) era menor. Ainda um pico, que não era detectado da solução de (A2) de controle de (XIII), foi detectado da solução de (A2) de metabolismo de (XIII). O tempo de eluição do dito pico em HPLC combinou com um tempo de eluição de um pico de um composto onde a massa é 14 vezes menor do que o dito composto (XIII) detectado a partir da solução de (A1) de metabolismo de (XIII) no Exemplo 41(3). (9) Metabolismo do composto (XIII) pela proteína (A3) da presente invenção Exceto pela utilização de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 12(2) ao invés de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 4(2), as soluções de reação foram preparadas e mantidas de acordo com o método descrito no Exemplo 41(3). Similarmente ao Exemplo 41(2), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi extraída com acetato de etila e o resíduo obtido foi dissolvido em 100 μΙ de sulfóxido de dimetila. As soluções obtidas (daqui em diante, a solução derivada da solução de reação contendo o componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 12(2) é referida como "solução de (A3) de metabolismo de (XIII)"; ainda, a solução derivada da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 12(2) é referida como "solução de (A3) de controle de (XIII)") foram analisadas em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XIII) detectado da solução de (A3) de controle de (XIII), a concentração do composto (XIII) detectado da solução de (A3) de metabolismo de (XII) era menor. Ainda um pico, que não era detectado da solução de (A3) de controle de (XII), foi detectado da solução de (A3) de metabolismo de (XII). O tempo de eluição do dito pico em HPLC combinou com um tempo de eluição de um pico de um composto onde a massa é 14 vezes menor do que o dito composto (XIII) detectado a partir da solução de (A1) de metabolismo de (XIII) no Exemplo 41(3). (10) Metabolismo do composto (XIII) pela proteína (A10) da presente invenção Exceto pela utilização de 20 μΙ da fração de sobrenadante recu- perada no Exemplo 10(2) ao invés de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 4(2), as soluções de reação foram preparadas e mantidas de acordo com o método descrito no Exemplo 41(3). Similarmente ao Exemplo 41(2), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi extraída com acetato de etila e o resíduo obtido foi dissolvido em 100 μΙ de sulfóxido de dimetila. As soluções obtidas (daqui em diante, a solução derivada da solução de reação contendo o componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 10(2) é referida como "solução de (A10) de metabolismo de (XIII)"; ainda, a solução derivada da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 10(2) é referida como "solução de (A10) de controle de (XIII)") foram analisadas em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XIII) detectado da solução de (A10) de controle de (XIII), a concentração do composto (XIII) detectado da solução de (A10) de metabolismo de (XIII) era menor. Ainda um pico, que não era detectado da solução de (A10) de controle de (XIII), foi detectado da solução de (A10) de metabolismo de (XIII). O tempo de eluição do dito pico em HPLC combinou com um tempo de eluição de um pico de um composto onde a massa é 14 vezes menor do que o dito composto (XIII) detectado a partir da solução de (A1) de metabolismo de (XIII) no Exemplo 41(3). (11) Metabolismo do composto (XIII) pela proteína (A12) da presente invenção Exceto pela utilização de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 34(2) ao invés de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 4(2), as soluções de reação foram preparadas e mantidas de acordo com o método descrito no Exemplo 41(3). Similarmente ao Exemplo 41(2), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi extraída com acetato de etila e o resíduo obtido foi dissolvido em 100 μΙ de sulfóxido de dimetila. As soluções obtidas (daqui em diante, a solução derivada da solução de reação contendo o componente A, componente B, com- ponente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 34(2) é referida como "solução de (A12) de metabolismo de (XIII)"; ainda, a solução derivada da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 34(2) é referida como "solução de (A12) de controle de (XIII)") foram analisadas em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XIII) detectado da solução de (A12) de controle de (XIII), a concentração do composto (XIII) detectado da solução de (A12) de metabolismo de (XIII) era menor. Ainda um pico, que não era detectado da solução de (A12) de controle de (XIII), foi detectado da solução de (A12) de metabolismo de (XIII). O tempo de eluição do dito pico em HPLC combinou com um tempo de eluição de um pico de um composto onde a massa é 14 vezes menor do que o dito composto (XIII) detectado a partir da solução de (A1) de metabolismo de (XIII) no Exemplo 41(3). (12) Metabolismo do composto (XIII) pela proteína (A13) da presente invenção Exceto pela utilização de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 36(2) ao invés de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 4(2), as soluções de reação foram preparadas e mantidas de acordo com o método descrito no Exemplo 41(3). Similarmente ao Exemplo 41(2), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi extraída com acetato de etila e o resíduo obtido foi dissolvido em 100 μΙ de sulfóxido de dimetila. As soluções obtidas (daqui em diante, a solução derivada da solução de reação contendo o componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 36(2) é referida como "solução de (A13) de metabolismo de (XIII)"; ainda, a solução derivada da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 36(2) é referida como "solução de (A13) de controle de (XIII)") foram analisadas em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XIII) detectado da solução de (A13) de controle de (XIII), a concentração do composto (XIII) detectado da solução de (A13) de metabolismo de (XIII) era menor. Ainda um pico, que não era detectado da solução de (A13) de controle de (XIII), foi detectado da solução de (A13) de metabolismo de (XIII). O tempo de eluição do dito pico em HPLC combinou com um tempo de eluição de um pico de um composto onde a massa é 14 vezes menor do que o dito composto (XIII) detectado a partir da solução de (A1) de metabolismo de (XIII) no Exemplo 41(3). (13) Metabolismo do composto (XIII) pela proteína (A14) da presente invenção Exceto pela utilização de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 38(2) ao invés de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 4(2), as soluções de reação foram preparadas e mantidas de acordo com o método descrito no Exemplo 41(3). Similarmente ao Exemplo 41(2), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi extraída com acetato de etila e o resíduo obtido foi dissolvido em 100 μΙ de sulfóxido de dimetila. As soluções obtidas (daqui em diante, a solução derivada da solução de reação contendo o componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 38(2) é referida como "solução de (A14) de metabolismo de (Xlll)"; ainda, a solução derivada da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 38(2) é referida como "solução de (A14) de controle de (XIII)") foram analisadas em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XIII) detectado da solução de (A14) de controle de (XIII), a concentração do composto (XIII) detectado da solução de (A14) de metabolismo de (XIII) era menor. Ainda um pico, que não era detectado da solução de (A14) de controle de (XIII), foi detectado da solução de (A14) de metabolismo de (XIII). O tempo de eluição do dito pico em HPLC combinou com um tempo de eluição de um pico de um composto onde a massa é 14 vezes menor do que o dito composto (XIII) detectado a partir da solução de (A1) de metabolismo de (XIII) no Exemplo 41(3). (14) Metabolismo do composto (XIII) pela proteína (A15) da presente invenção Exceto pela utilização de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 40(2) ao invés de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 4(2), as soluções de reação foram preparadas e mantidas de acordo com o método descrito no Exemplo 41(3). Similarmente ao Exemplo 41(2), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi extraída com acetato de etila e o resíduo obtido foi dissolvido em 100 μΙ de sulfóxido de dimetila. As soluções obtidas (daqui em diante, a solução derivada da solução de reação contendo o componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 40(2) é referida como "solução de (A15) de metabolismo de (XIII)"; ainda, a solução derivada da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 40(2) é referida como "solução de (A15) de controle de (XIII)") foram analisadas em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XIII) detectado da solução de (A15) de controle de (XIII), a concentração do composto (XIII) detectado da solução de (A15) de metabolismo de (XIII) era menor. Ainda um pico, que não era detectado da solução de (A15) de controle de (XIII), foi detectado da solução de (A15) de metabolismo de (XIII). O tempo de eluição do dito pico em HPLC combinou com um tempo de eluição de um pico de um composto onde a massa é 14 vezes menor do que o dito composto (XIII) detectado a partir da solução de (A1) de metabolismo de (XIII) no Exemplo 41(3).
Exemplo 44Preparação do anticorpo (A) da presente invenção reconhecendo a proteína (A1) da presente invenção (daqui em diante referido como "(A1) de anticorpo da presente invenção") (1) Preparação do extrato de uma E. coli expressando a proteína (A1) da presente invenção De acordo com o método descrito no Exemplo 4(2), JM109/pKSN 657F de E. coli, que expressa a proteína (A1) da presente invenção, foi pré-culturado da noite para o dia e então culturado em IL de meio TB contendo 50 pg/ml de ampicilina. Após reconhecimento e rompimento das células, frações de sobrenadante (extrato de pKSN657F de E. coli) foram preparadas a partir da solução de lisato de célula obtida. (2) Purificação da proteína (A1) da presente invenção A proteína (A1) da presente invenção foi purificada de acordo com o método descrito no Exemplo 2(4) submetendo a fração de sobrenadante obtida no Exemplo 44(1) (extrato de pKSN657F de E. coli) por sua vez à coluna Hiload Hil_oad26/10 Q Sepharose HP e em seguida a uma coluna tipo I, Bio-Scale Ceramic Hidroxyapatite, coluna CHT10-1. As frações purificadas foram analisadas em SDS-PAGE de 10% a 20%, para confirmar que essas eram frações apenas da proteína (A1) da presente invenção. (3) Preparação de anticorpo (A1) da presente invenção A proteína (A1) da presente invenção preparada no Exemplo 44(2) foi dissolvida em tampão de fosfato de potássio 0,05M (pH 7,0) de modo que a concentração era 1 mg/ml. Quarenta microlitros (40 μΙ) de Sistema Adjuvante RAS (MPL (monofosforila Lepídio A) + TDM (Dicorinomico-lato de Trealose Sintético) + CWS (Esqueleto de Parede Celular) (Sigma Company) já incubados a 42°C até 43°C foram adicionados e bem-misturados em 2 ml da solução obtida. A mistura obtida foi administrada, respectivamente, a coelhos brancos Neo-zelandeses (fêmea, 14 semanas de vida, média de 2,4 kg) a 1 ml por coelho. Desse modo, 100 μΙ foram injetados subcutaneamente em 10 locais no dorso. Cerca de 1/2 da quantidade da primeira administração foi administrada após cada uma das 3 semanas e 5 semanas. Durante esse tempo, o título do anticorpo foi medido através de amostragem de sangue da veia da orelha do coelho. Uma vez que o título de anticorpo aumentou após a terceira administração, o coelho imunizado em 2 semanas após a terceira administração foi exsanguinado a partir do pescoço. O sangue obtido foi adicionado a um Tubo Separapit (Sekisui Chemical Company), incubado a 37°C por 2 horas e foi então centrifugado (3000 rpm, 20 minutos, temperatura ambiente). O anti-soro (contendo ο (A1) anticorpo da presente invenção) foi obtido através de recuperação do sobrenadante.
Exemplo 45Detecção da presente proteína pelo anticorpo (A1) da presente invenção e detecção de uma célula expressando a presente proteína Um imunoblot foi realizado usando a (A1) de anticorpo da presente invenção obtido no Exemplo 44 com cada um dos extratos de E. coli. Houve uma eletroforese de poliacrilamida SDS (40 mA, 1 hora) de: extrato de pKSN657F de E. coli obtido no Exemplo 4(2) (contendo cerca de 0,5 pmol da proteína (A1) da presente invenção, contendo cerca de 0,78 mg de proteína); o extrato de pKSN2 de E. coli obtido no Exemplo 4(2) (contendo cerca de 0,78 mg de proteína) o extrato de pKSN923F de E. coli obtido no Exemplo 7(2) (contendo cerca de 2 pmoles da proteína (A2) da presente invenção); o extrato de pKSN671F de E. coli obtido no Exemplo 12(2) (contendo cerca de 2 pmoles da proteína (A3) da presente invenção); o extrato de pKSN646F de E. coli obtido no Exemplo 27(2) (contendo cerca de 2 pmoles da proteína (A4) da presente invenção); o extrato de pKSN11796F de E. coli obtido no Exemplo 10(2) (contendo cerca de 2 pmoles da presente proteína (A10)); o extrato de pKSNSCA de E. coli obtido no Exemplo 14(2) (contendo cerca de 2 pmoles da presente proteína (A9)); o extrato de pKSN849AF de E. coli obtido no Exemplo 32(2) (contendo cerca de 2 pmoles da presente proteína (A11)); o extrato de pKSN1618F de E. coli obtido no Exemplo 34(2) (contendo cerca de 2 pmoles da presente proteína (A12)); o extrato de pKSN474F de E. coli obtido no Exemplo 36(2) (contendo cerca de 2 pmoles da proteína (A13) da presente invenção); e o extrato de pKSN1491AF de E. coli obtido no Exemplo 38(2) (contendo cerca de 2 pmoles da proteína (A14) da presente invenção); o extrato de pKSN1555AF de E. coli obtido no Exemplo 40(2) (contendo cerca de 2 pmoles da proteína (A15) da presente invenção). Uma membrana de PVDF foi posta no gel. As proteínas no gel foram transferidas para a membrana de PVDF através de um tratamento com um dispositivo de manchamento BioRad a 4°C, 30V por 2 horas, enquanto na condição de serem embebidas em tampão de transferência (25 mM de Tris, 192 mM de glicina, 10% de metanol). Após lavagem com solução de TBS + Tween 20 (50 mM de Tris-HCI (pH 7,5), 200 mM de NaCI, 0,05% de Tween 20, a membrana de PVDF obtida foi incubada por 30 minutos em solução de TBS + Tween 20 contendo 3% de BSA e foi então utilizada para uma reação com o anti-soro acima diluído 30.000 vezes por 30 minutos em solução de TBS + Tween 20 contendo 3% de BSA. Após a reação, a membrana de PVDF foi lavada duas vezes com solução de TBS + Tween 20. A membrana de PVDF foi então utilizada para uma reação em solução de TBS + Tween 20 contendo 3% de BSA por 30 minutos com uma diluição de 3000 vezes de IgG anti-soro de cabra anti-coelho marcado com alcalina fosfatase (Santa Cruz Biotechnology Company). Após a reação, a membrana de PVDF foi lavada duas vezes com solução de TBS + Tween 20 e foi embebida em solução de NBT-BCIP (Sigma Company). Foi detectada uma mancha para uma faixa correspondendo a cada uma das proteínas (A1), (A2), (A3), (A4), (A11), (A12), (A13), (A14) e (A15) da presente invenção bem como as presentes proteínas (A9) e (A10). Nenhuma faixa tingida foi detectada com o reagente de extrato de pKSN2 de E. coli (contendo cerca de 0,78 mg de proteína) obtido no Exemplo 4(2).
Exemplo 46Preparação e expressão de DNA (A1) da presente invenção onde o uso de códon foi ajustado para expressão em soja (daqui em diante referida como "DNA (A1)S da presente invenção) (1) Preparação de DNA (A1)S da presente invenção PCR foi realizada com DNA polimerase Pyrobest (Takara Shuzo Company) de acordo com o manual anexo, utilizando um iniciador tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 192 e um iniciador tendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 213. Uma alíquota do produto de PCR obtido foi utilizada como um molde para uma PCR realizada similarmente utilizando um iniciador tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 191 e um iniciador tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 212. Ainda, uma alíquota desse produto de PCR foi utilizada como um molde para uma PCR realizada similarmente utilizando um iniciador tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 190 e um iniciador tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 211. A solução de reação obtida foi chamada solução de reação 1. PCR foi realizada com o DNA polimerase Pyrobest (Takara Shu-zo Company) de acordo com o manual anexo, utilizando um iniciador tendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 195 e um iniciador tendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 210. Uma alíquota do produto de PCR obtido foi utilizada como um molde para uma PCR realizada similarmente utilizando um iniciador tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 194 e um iniciador tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 209. Ainda, uma alíquota desse produto de PCR foi utilizada como um molde para uma PCR realizada similarmente utilizando um iniciador tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 193 e um iniciador tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 208. A solução de reação obtida foi chamada solução de reação 2. PCR foi realizada com o DNA polimerase Pyrobest (Takara Shu-zo Company) de acordo com o manual anexo, utilizando um iniciador tendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 198 e um iniciador tendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 207. Uma alíquota do produto de PCR obtido foi utilizada como um molde para uma PCR realizada similarmente utilizando um iniciador tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 197 e um iniciador tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 206. Ainda, uma alíquota desse produto de PCR foi utilizada como um molde para uma PCR realizada similarmente utilizando um iniciador tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 196 e um iniciador tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 205. A solução de reação obtida foi chamada solução de reação 3. PCR foi realizada com o DNA polimerase Pyrobest (Takara Shu-zo Company) de acordo com o manual anexo, utilizando um iniciador tendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 201 e um iniciador tendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 204. Uma alíquota do produto de PCR obtido foi utilizada como um molde para uma PCR realizada similarmente utilizando um iniciador tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 200 e um iniciador tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 203. Ainda, uma alíquota desse produto de PCR foi utilizada como um molde para uma PCR realizada similarmente utilizando um iniciador tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 199 e um iniciador tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 202. A solução de reação obtida foi chamada solução de reação 4.
As soluções de reação 1 a 4 obtidas de tal maneira foram misturadas. PCR foi realizada com o DNA polimerase Pyrobest (Takara Shuzo Company) de acordo com o manual anexo, utilizando como um molde uma alíquota da sua mistura e utilizando um iniciador tendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 190 e um iniciador tendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 202. A seqüência de nucleotídeo do DNA amplificado foi confirmada. Foi obtido um DNA tendo uma seqüência onde a seqüência de nucleotídeo 5'-cat-3' é conectada a montante do terminal 5' e a seqüência de nucleotídeo 5'-aagctt-3' é conectada a jusante do terminal 3' da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 214. O uso de códon do DNA (A1) da presente invenção tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 6 (teor de GC de 70,58%) é mostrado na Tabela 22 e Tabela 23. O uso de códon de soja (teor de GC de 46,12%, Códon Usage Database publicado pela Kazusa DNA Research Institute (http//:www.kazusa.or.jp/codon)) é mostrado na Tabela 24 e Tabela 25. O uso de códon do DNA (A1) da presente invenção tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 214 (teor de GC de 51,59%) é mostrado na Tabela 26 e Tabela 27.
Tabela 22 Tabela 22 (Continuação) Tabela 23 Tabela 24 Tabela 25 Tabela 26 Tabela 27 (2) Produção de uma E. coli transformada tendo a proteína (A1)S da presente invenção O DNA tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 214 obtida no Exemplo 46(1) foi digerido com as enzimas de restrição Ndel e Hindlll. O DNA obtido e o plasmídeo pKSN2 digerido com Ndel e Hindlll foram ligados para se obter um plasmídeo onde o DNA tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 214 é inserido entre o sítio Ndel e o sítio Hindlll de pKSN2 (daqui em diante referido como "pKSN657 soja"). O dito plasmídeo foi introduzido em JM109 de E. coli. O transfor-mante de E. coli obtido foi chamado JM109/pKSN657soja. (3) Expressão da proteína (A1) da presente invenção em £. coli e recuperação da dita proteína Similarmente ao Exemplo 4(2), cada um do JM109/pKSN657soja de E. coli obtido no Exemplo 46(2) e JM109/pKSN657 de E. coli obtido no Exemplo 4(1) foi culturado. As células foram recuperadas. As soluções de lisato de célula foram preparadas. Sob o método descrito no Exemplo 4(2), frações de sobrenadante foram preparadas das soluções de lisato de célula (daqui em diante a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN657soja de E. coli é referida como "extrato de pKSN849soja de E. coli' e a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN657 de E. coli é referida como "extrato de pKSN657 de E. coli"). A quantidade de P450 por quantidade de proteína contida em extrato de pKSN657soja de E. coli foi comparada e era maior do que a quantidade de P450 por quantidade de proteína contida em extrato de PKSN657 de E. coli.
Exemplo 47lntrodução do DNA (A1) da presente invenção em uma planta (1) Construção de um plasmídeo expressando cloroplasto contendo o DNA (A1) da presente invenção para introdução direta - parte I
Um plasmídeo contendo um DNA quimérico onde o DNA (A1)S da presente invenção foi conectado imediatamente após a seqüência de nucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC de soja (cv. Jack) sem uma mudança de estruturas nos códons foi construído como um plasmídeo para introdução do DNA (A1 )S da presente invenção em uma planta com o método de pistola de partícula.
Primeiro, DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 214 foi amplificado através de PCR. A PCR foi realizada utilizando como um molde pKSN657soja obtido no Exemplo 46(2) e utilizando como iniciadores um oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 394 e um oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 395. A PCR utilizou KOD-plus (Toyobo Company). A PCR aconteceu após condução de uma manutenção a 94°C por 2 minutos; 30 ciclos de um ciclo que incluía manutenção a 94°C por 30 segundos, seguido por 50°C por 30 segundos, e seguido por 68°C por 60 segundos; e uma manutenção final a 68°C por 30 segundos. O DNA amplificado foi recuperado e purificado com MagExtractor-PCR & Gel-Clean up (Toyobo Company) realizando os procedimentos de acordo com o manual anexo. Após digestão do DNA purificado com enzimas de restrição EcoT221 e Saci, o DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 214 foi recuperado. Após digestão do plasmídeo pUCrSt657 obtido no Exemplo 16(2) com as enzimas de restrição EcoT221 e Saci, foi isolado um DNA de cerca de 2,0 kpb tendo uma seqüência de nucleotídeo derivada de pUC19 e uma seqüência codificando um peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC de soja (cv. Jack). O DNA obtido e o DNA acima compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 214 foram ligados para se obter pUCrSt657soja (Figura 48) contendo um DNA quimérico onde o DNA (A1 )S da presente invenção foi conectado imediatamente após a seqüência de nucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC de soja (cv. Jack) sem uma mudança de quadros nos códons. O plasmídeo pUCrSt657soja obtido foi digerido com as enzimas de restrição BamHI e Saci para isolar um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 214. O dito DNA foi inseri- do entre o sítio da enzima de restrição de Bglll e o sítio da enzima de restrição de Saci de plasmídeo pNdG6-AT obtido no Exemplo 16(2) para se obter pSUM-NdG6-rSt-657soja (Figura 49) onde o promotor CR16G6 tem conectado a jusante o DNA quimérico onde o DNA (A1 )S da presente invenção foi conectado imediatamente após a seqüência de nucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC de soja (cv. Jack) sem uma mudança nos quadros nos códons.
Em seguida, o plasmídeo foi introduzido em células competentes DH5a de E. coli (Takara Shuzo Company) e as células resistentes à ampici-lina foram selecionadas. Ainda, as seqüências de nucleotídeo dos plasmí-deos contidos nas cepas resistentes à ampicilina selecionadas foram determinadas utilizando o kit de reação BigDye Terminator Cycle Sequencing Re-ady v3.0 (PE Applied Biosystems Company) e seqüenciador de DNA 3100 (PE Applied Biosystems Company). Como resultado, foi confirmado que o plasmídeo pSUM-NdG6-rSt-657soja tinha a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 214. (2) Construção de um plasmídeo de expressão de cloroplasto tendo o DNA (A1)S da presente invenção para introdução direta -parte (2) Um plasmídeo foi construído para introdução do DNA (A1)S da presente invenção em uma planta com um método de pistola de partícula. O plasmídeo continha um DNA quimérico onde o DNA (A1)S da presente invenção foi conectado imediatamente após as seqüências de nucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC de soja (cv. Jack) e codificando em seguida 12 aminoacidos da proteína madura, sem uma mudança de quadros nos códons. Primeiro, DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 214 foi amplificado através de PCR. A PCR foi realizada utilizando como um molde pKSN657soja obtido no Exemplo 46(2) e utilizando como iniciadores um oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 395 e um oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 396. A PCR utilizou KOD-plus (Toyobo Com- pany). A PCR aconteceu após condução de uma manutenção a 94°C por 2 minutos; 25 ciclos de um ciclo que incluía manutenção a 94°C por 30 segundos, seguido por 46°C por 30 segundos, e seguido por 68°C por 60 segundos; e uma manutenção final a 68°C por 3 minutos. O DNA amplificado foi recuperado e purificado com MagExtractor-PCR & Gel-Clean up (Toyobo Company) realizando os procedimentos de acordo com o manual anexo. Após digestão do DNA purificado com enzima de restrição Saci, o DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostra na SEQ ID NO: 214 foi recuperado. O plasmídeo pKFrStl 2-657 obtido no Exemplo 16(3) foi digerido com enzima de restrição BspHI. O DNA teve a extremidade cega e o terminal 5’ foi desfosforilado utilizando o TaKaRa BKLKit (Takara Shuzo Company) de acordo com o manual anexo. Em seguida, após o DNA ter sido digerido com a enzima de restrição Saci, o DNA derivado do plasmídeo pKFrSt12 foi isolado. O dito DNA foi ligado com o DNA que foi digerido com Saci e que compreende a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 214, a fim de se obter o plasmídeo pKFrSt12-657soja (Figura 50) contendo o DNA quimérico onde o DNA (A1 )S da presente invenção foi conectada imediatamente após a seqüência de nucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC de soja (cv. Jack) e codificando em seguida 12 aminoacidos da proteína madura, sem uma mudança de quadros nos códons. O plasmídeo de pKFrSt12-657soja obtido foi digerido com as enzimas de restrição BamHI e Saci para isolar DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 214. O dito DNA foi inserido entre o sítio de enzima de restrição de Bglll e o sítio da enzima de restrição de Saci do plasmídeo pNdG6-AT para se obter o plasmídeo de pSUM-NdG6-rSt12-657soja (Figura 51) onde o promotor CR16G6 foi conectado a jusante do DNA quimérico onde o dito DNA foi conectado imediatamente após a seqüência de nucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC de soja (cv. Jack), sem uma mudança de quadros nos códons.
Em seguida, o plasmídeo foi introduzido em células competentes DH5a de E. coli (Takara Shuzo Company) e as células resistentes à ampici-lina foram selecionadas. Ainda, as seqüências de nucleotídeo dos plasmí-deos contidos nas cepas resistentes à ampicilina selecionadas foram determinadas utilizando o kit de reação BigDye Terminator Cycle Sequencing Re-ady v3.0 (PE Applied Biosystems Company) e seqüenciador de DNA 3100 (PE Applied Biosystems Company). Como resultado, foi confirmado que o plasmídeo pSUM-NdG6-rSt12-657soja tinha a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 214. (3) Introdução do DNA (A1)S da presente invenção em soja Os embriões globulares de soja (cultivar: Fayette e Jack) foram preparados de acordo com o método descrito no Exemplo 17(1), exceto pela substituição da fonte de vitamina do meio MS com a fonte de vitamina do meio B5 (O. L. Gamborg e outros, Exp. Cell Res. (1986) 50, p. 151). O embrião globular obtido foi transplantado em um meio de crescimento de embrião somático fresco e culturado por 2 a 3 dias. De acordo com o método descrito no Exemplo 17(2), o plasmídeo pSUM-NdG6-rSt-657soja construído no Exemplo 47(1) ou pSUM-NdG6-rSt12-657soja construído no Exemplo 47(2) foi introduzido nos ditos embriões globulares. (4) Seleção de embrião somático com higromicina Seleção através de higromicina de um embrião globular após a introdução do gene obtido no Exemplo 47(3) foi realizada de acordo com o método descrito no Exemplo 17(3), exceto pela substituição da fonte de vitamina do meio MS com a fonte de vitamina do meio B5. No entanto, após o segundo transplante, um meio ao qual 0,2% (p/v) de Gelrite foi adicionado ou um meio líquido ao qual nenhum Gelrite foi adicionado foi utilizado como o meio de seleção de embrião somático. No caso do meio líquido, a cultura tinha 90 revoluções por minuto suaves. (5) Seleção de embrião somático com o composto (II) Seleção através do composto (II) de um embrião globular após a introdução do gene obtido no Exemplo 47(3) é realizada de acordo com o método descrito no Exemplo 17(4), exceto pela substituição da fonte de vi- tamina de meio MS com a fonte de vitamina de meio B5. (6) Regeneração de planta a partir de embrião somático, aclimação e cultivo De acordo com o método descrito no Exemplo 17(5), a regeneração de planta é realizada a partir de embriões globulares selecionados no Exemplo 47(4) ou 47(5). No entanto, a concentração de ágar no meio de desenvolvimento é ajustada para 0,8% (p/v) ou 1,0% (p/v). Ainda, a fonte de vitamina do meio MS do meio de germinação é substituída com a fonte de vitamina do meio B5. A planta com raízes e folhas desenvolvidas sofre a aclimação e cultivo de acordo com o método descrito no Exemplo 17(6) e é colhida. (7) Avaliação da resistência ao composto herbicida (II) O grau de resistência contra o composto (II) da planta regenerada obtida no Exemplo 47(6) é avaliado de acordo com o método descrito no Exemplo 17(4). (8) Construção de um plasmídeo de expressão de cloroplas-to tendo o DNA (A1)S da presente invenção para introdução agrobacte-rium Um plasmídeo para introdução do DNA (A1)S da presente invenção em uma planta com o método de agrobacterium é construído. O plasmídeo pSUM-NdG6-rSt-657soja foi digerido com a enzima de restrição Notl, para se obter um DNA quimérico onde o DNA (A1)S da presente invenção foi conectado imediatamente após a seqüência de nucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC de soja (cv. Jack), sem uma mudança de quadros nos códons. O dito DNA foi inserido no sítio de restrição de Notl do vetor de plasmídeo binário pBI121S obtido no Exemplo 18 para se obter o plasmídeo pBI-NdG6-rSt-657soja (Figura 52). Ainda, o plasmídeo de pSUM-NdG6-rSt12-657soja foi digerido com a enzima de restrição Notl, para isolar um DNA quimérico onde o DNA (A1)S da presente invenção foi conectado imediatamente após a seqüência de nucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC de soja (cv. Jack) e codificando em se- guida 12 aminoacidos da proteína madura, sem uma mudança de estruturas nos códons. Tal DNA foi inserido no sítio de restrição de Notl do vetor de plasmídeo binário pNI121S para se obter o plasmídeo pBI-NdG6-rSt12-657soja (Figura 53). (9) Introdução do DNA (A1)S da presente invenção em tabaco O DNA (A1)S da presente invenção foi introduzido em tabaco com o método de agrobacterium, utilizando os plasmídeos pBI-NdG6-rSt-657soja e pBI-NdG6-rSt12-657soja obtidos no Exemplo 47(8).
Primeiro, de acordo com o método descrito no Exemplo 19, cada um dos plasmídeos pBI-NdG6-rSt-657soja e pBI-NdG6-rSt12-657soja foi introduzido em Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Clontech Company). O agrobacterium transgênico carregando pBI-NdG6-rSt-657soja ou pBI-NdG6-rSt12-657soja foi isolado.
Em seguida, exceto pela cultura da noite para o dia do agrobacterium transgênico carregando o plasmídeo acima a 30°C em meio líquido contendo 25 mg/L de canamicina, os ditos agrobacterium foram utilizados para introduzir genes em tabaco de acordo com o método descrito no Exemplo 19. Foram obtidos, respectivamente, tabacos transgênicos que têm incorporada a região de T-DNA de pBI-NdG6-rSt-657soja ou pBI-NdG6-rSt12-657soja. (10) Avaliação de resistência utilizando um pedaço de folha de tabaco transgênico de DNA (A1)S da presente invenção As folhas foram tomadas de 35 tabacos transgênicos obtidos no Exemplo 47(9). Cada folha foi dividida em pedaços onde cada pedaço era de 5 a 7 mm de largura. Os pedaços de folha foram plantados em meio ágar MS contendo 0, 0,05, 0,1 ou 0,2 mg/mL do composto (II) e culturados na luz em temperatura ambiente. No dia 11 de cultura, o dano herbicida de cada um dos pedaços de folha foi observado. Ainda, pedaços de folha foram plantados em meios ágar de MS contendo 0, 0,01, 0,02, 0,05 ou 0,1 mg/mL do composto (XII) e culturados na luz em temperatura ambiente. No dia 7 de cultura, o dano herbicida de cada um dos pedaços de folha foi observado.
Como controle, 20 pedaços de folha de tabaco ao qual nenhuma introdução genética foi realizada (daqui em diante referido como "tabaco do tipo selvagem") foram utilizados em cada concentração. Um nível médio para cada grupo foi determinado pelo nível de 1 ponto para um pedaço de folha que continuamente cresce, 0,5 ponto para um pedaço de folha murcha metade onde dano químico foi observado, e 0 ponto para um pedaço de folha que ficou branco e murcho. Os pedaços de folha do tabaco ao qual o DNA (A1 )S da presente invenção (a região de T-DNA do plasmídeo pBI-NdG6-rSt-657soja ou pBI-NdG6-rSt12-657soja) foi introduzido proveram um nível mais alto do que o tabaco do tipo selvagem com cada um do composto (II) e composto (XII).
Exemplo 48 Obtenção do DNA (A16) da presente invenção (1) Preparação de DNA cromossômico de Streptomyces or-natus IFO 13069t Sob o método descrito no Exemplo 31(1), o DNA cromossômico de Streptomyces ornatus IFO 13069t foi preparado. (3) Isolamento de DNA tendo uma seqüência de nucleotídeo parcial do DNA (A11) da presente invenção PCR foi realizada utilizando como o molde o DNA cromossômico preparado a partir de Streptomyces ornatus IFO 13069t no Exemplo 48(1) e utilizando o par de iniciador 14, de acordo com o método descrito no Exemplo 29. Similarmente ao Exemplo 31(2), o DNA amplificado foi clonado no vetor de clonagem pCRIl-TOPO (Invitrogen Company). A sua seqüência foi analisada. Como resultado, a seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucle-otídeos 343 a 1069 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 225 foi provida.
Ainda, o DNA cromossômico preparado no Exemplo 48(1) foi digerido com a enzima de restrição Pvull. Uma biblioteca de genoma walker foi produzida utilizando o DNA obtido, de acordo com o método descrito no Exemplo 26(3). PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3) para se obter os primeiros produtos de PCR, utilizando a biblioteca obtida como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 265 e iniciador AP1. Em seguida, PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3), utilizando os primeiros produtos de PCR como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266 e iniciador AP2. A seqüência de nucleotídeo do DNA obtido foi analisada. A seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 1 a 501 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 235 foi provida.
Ainda, DNA cromossômico preparado no Exemplo 48(1) foi digerido com a enzima de restrição Pvull. Uma biblioteca de genoma walker foi produzida utilizando o DNA obtido, de acordo com o método descrito no Exemplo 26(3). PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3) para se obter os primeiros produtos de PCR, utilizando a biblioteca obtida como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 267 e iniciador AP1. Em seguida, PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3), utilizando os primeiros produtos de PCR como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 268 e iniciador AP2. A seqüência de nucleotídeo do DNA obtido foi analisada. A seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 1044 a 1454 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 235 foi provida. (3) Análise de seqüência do DNA (A16) da presente invenção A seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 235 foi obtida conectando as seqüências de nucleotídeo providas pelo DNA obtido no Exemplo 48(2). Dois quadros de leitura abertos (ORF) estavam presentes na dita seqüência de nucleotídeo. Desse modo, estava contida uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 225) consistindo em 1251 nucleotídeos (inclusive do códon de parada) e codificando um residuo de 416 aminoacidos (SEQ ID NO: 215) e uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 255) consistindo em 198 nucleotídeos (inclusive o códon de parada) e codificando um resíduo de 65 aminoacidos (SEQ ID NO: 245). O peso molecular da proteína consistindo na seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 215) codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 225 foi calculado como sendo 46013 Da. Ainda, o peso molecular da proteína consistindo na se-qüência de aminoacido (SEQ ID NO: 245) codificada pela sequência de nu-cleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 255 foi calculado como sendo 6768 Da.
Exemplo 49Expressão do DNA (A16) da presente invenção em E. coli (1) Produção de E. coli transformada tendo o DNA (A16) da presente invenção PCR foi realizada utilizando o GeneAmp High Fidelity PCR System (Applied Biosystems Japan Company) e utilizando como o molde o DNA cromossômico preparado a partir de Streptomyces ornatus IFO 13069t no Exemplo 48(1). Como os iniciadores, foi utilizado um pardo oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 269 e o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 286. A solução de reação de PCR perfazia 50 μΙ através da adição dos 2 iniciadores cada um perfazendo 200 nM, 50 ng do DNA cromossômico acima, 5,0 μΙ de mistura de dNTP (uma mistura de 2,0 mM de cada um dos 4 tipos de dNTP; Clontech Company), 5,0 μΙ de tampão 10x (contendo MgCI2) e 0,5 μΙ de mistura de enzima GeneAmp HF e adicionando água destilada. As condições de reação da PCR foram após manutenção a 97°C por 15 segundos, repetição de 10 ciclos de um ciclo que inbluía manutenção a 97°C por 15 segundos, seguido por 60°C por 30 segundos, e seguido por 72°C por 90 segundos; então realização de 15 ciclos de um ciclo que incluía manutenção a 97°C por 15 segundos, seguido por 60°C por 30 segundos e seguido por 72°C por 90 segundos (onde 20 segundos foram adicionados para a manutenção a 72°C para cada ciclo); e então manutenção a 72°C por 7 minutos. Similarmente ao Exemplo 32(1), o DNA foi purificado a partir da solução de reação de PCR e clonado no vetor de clonagem pCRIl-TOPO (Invitrogen Company). A seqüência de nucleotídeo do DNA de plasmídeo obtido foi analisada utilizando como iniciadores os oligonucleotídeos tendo as seqüên-cias de nucleotídeo mostradas, respectivamente, nas SEQ ID NOs: 57, 59, 267, 286 e 288. Com base nos resultados obtidos, o plasmídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 235 foi chamado pCR452F. Similarmente ao Exemplo 32(1), pCR452F foi digerido com as enzimas de restrição Ndel e Hindlll. Um DNA de cerca de 15 kpb foi purificado a partir dos produtos de digestão. O DNA obtido e o plasmídeo de pKSN2 digerido com Ndel e Hinlll foram ligados para se obter um plasmídeo contendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 235, onde o DNA codificando a proteína (A16) da presente invenção é inserida entre o sítio Ndel e o sítio Hindlll de pKSN2 (daqui em diante referido como ’pKSN452F”). O dito plasmídeo foi introduzido em JM109 de E. coli. O transformante de E. coli obtido foi chamado JM109/pKSN452F. (2) Expressão da proteína (A16) da presente invenção em E. coli e recuperação da dita proteína Similarmente ao Exemplo 4(2), cada um de JM109/pKSN452F e JM109/pKSN2 de E coli foi culturado. As células foram recuperadas. As soluções de lisato de célula foram recuperadas. Sob o método descrito no Exemplo 4(2), as frações de sobrenadante foram preparadas das soluções de lisato de célula (daqui em diante, a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN452F de E. coli é referida como "extrato de pKSN452F de E. co/f e a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN2 de E. coli é referida como "extrato de pKSN2 de E. coir. (3) Detecção da habilidade em converter o composto (II) no composto (III) Similarmente ao Exemplo 32(3), soluções de reação de 30 μΙ foram preparadas e mantidas por 10 minutos a 30°C. No entanto, como a fração de sobrenadante, a fração de sobrenadante preparada no Exemplo 49(2) (extrato de pKSN452F de E. coli ou extrato de pKSN2) foi utilizada. As soluções de reação após a manutenção foram extraídas com acetato de etila e as camadas extraídas foram analisadas com TLC. Após desenvolvimento da placa de TLC, a presença de um ponto sobre ela correspondendo ao composto (III) marcado com 14C foi examinada (valor Rf 0,24 e 0,29). Um ponto correspondendo ao composto (III) foi detectado a partir da solução de reação contendo extrato de pKSN452F de E. coli. Em contraste, tal ponto não foi detectado da solução de reação contendo o extrato de pKSN2 de E. coli.
Exemplo 50 Obtenção do DNA (A17) da presente invenção (1) Preparação do DNA cromossômico de Streptomyces griseus ATCC 10137 Sob o método descrito no Exemplo 31(1), o DNA cromossômico de Streptomyces griseus ATCC 10137 foi preparado. (2) Isolamento de DNA tendo uma seqüência de nucleotídeo parcial do DNA (A17) da presente invenção PCR foi realizada utilizando como o molde o DNA cromossômico de Streptomyces griseus ATCC 10137 preparado no Exemplo 50(1) e utilizando o par de iniciador 14, de acordo com o método descrito no Exemplo 29. Similarmente ao Exemplo 31(2), o DNA amplificado foi clonado no vetor de clonagem pCRIl-TOPO (Invitrogen Company). A sua seqüência de nucleotídeo foi analisada. Como resultado, a seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 343 a 1069 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 226 foi provida.
Ainda, o DNA cromossômico preparado no Exemplo 50(1) foi digerido com a enzima de restrição Smal. Uma biblioteca de genoma walker foi produzida utilizando o DNA obtido, de acordo com o método descrito no Exemplo 26(3). PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3) para se obter os primeiros produtos de PCR, utilizando a biblioteca obtida como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 270 e iniciador AP1. Em seguida, PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3), utilizando os primeiros produtos de PCR como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 271 e iniciador AP2. A seqüência de nucleotídeo do DNA obtido foi analisada. A seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 1 a 361 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 236 foi provida.
Ainda, DNA cromossômico preparado no Exemplo 50(1) foi digerido com a enzima de restrição Pvull. Uma biblioteca de genoma walker foi produzida utilizando o DNA obtido, de acordo com o método descrito no Exemplo 26(3). PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3) para se obter os primeiros produtos de PCR, utilizando a biblioteca obtida como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 272 e iniciador AP1. Em seguida, PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3), utilizando os primeiros produtos de PCR como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 273 e iniciador AP2. A seqüência de nucleotídeo do DNA obtido foi analisada. A seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 1035 a 1454 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 236 foi provida. (3) Análise de seqüência do DNA (A17) da presente invenção A seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 236 foi obtida conectando as seqüências de nucleotídeo providas pelo DNA obtido no Exemplo 50(2). Dois quadros de leitura abertos (ORF) estavam presentes na dita seqüência de nucleotídeo. Desse modo, estava contida uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 226) consistindo em 1251 nucleotídeos (inclusive do códon de parada) e codificando um resíduo de 416 aminoacidos (SEQ ID NO: 216) e uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 256) consistindo em 198 nucleotídeos (inclusive o códon de parada) e codificando um resíduo de 65 aminoacidos (SEQ ID NO: 246). O peso molecular da proteína consistindo na seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 216) codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 226 foi calculado como sendo 46082 Da. Ainda, o peso molecular da proteína consistindo na seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 246) codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 256 foi calculado como sendo 6768 Da. A seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 256 é 100% idêntica à seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 255. A seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 246 é 100% idêntica à seqüência de aminoacido mostrada na SEQ ID NO: 245.
Exemplo 51 Expressão do DNA (A17) da presente invenção em E. coli (1) Produção de uma E. coli transformada tendo o DNA (A17) da presente invenção PCR foi realizada similarmente ao Exemplo 32(1), exceto pelo uso como um molde do DNA cromossômico preparado a partir de Streptomyces griseus ATCC 10137 no Exemplo 50(1) e utilizando com os iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 274 e um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 275. Similarmente ao Exemplo 32(1), o DNA foi purificado a partir da solução de reação de PCR e clonado no vetor de clonagem pCRIl-TOPO (Invitrogen Company). A seqüência de nucleotídeo do DNA de plasmídeo obtido foi seqüenciada utilizando como iniciadores os oligonucleotídeos tendo as seqüências de nucleotídeo mostradas, respectivamente, na SEQ ID NOS: 57, 59, 274, 276 e 277. Com base nos resultados obtidos, o plasmídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 236 foi chamado pCR608F. Similarmente ao Exemplo 32(1), pCR608F foi digerido com as enzimas de restrição Ndel e Hindlll. Um DNA de cerca de 1,5 kpb foi purificado a partir dos produtos de digestão. O DNA obtido e o plasmídeo de pKSN2 digerido com Ndel e Hindlll foram ligados para se obter um plasmídeo contendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 236, onde o DNA codificando a proteína (A17) da presente invenção é inserido entre o sítio Ndel e o sítio Hindlll de pKSN2 (daqui em diante referido como "pKSN608F"). O dito plasmídeo foi introduzido em JM109 de E. coli. O transformante de E. coli obtido foi chamado JM109/pKSN608F. (2) Expressão da proteína (A17) da presente invenção em E. coli e recuperação da dita proteína Similarmente ao Exemplo 4(2), cada um de JM109/pKSN608F e JM109/pKSN2 E. coli foi culturado. As células foram recuperadas. As soluções de lisato de célula foram recuperadas. Sob o método descrito no Exemplo 4(2), as frações de sobrenadante foram preparadas das soluções de lisato de célula (daqui em diante, a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN608F de E. coli é referida como "extrato de pKSN608F de E. coir e a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN2 de E. coli é referida como "extrato de pKSN2 de E. coli'. (3) Detecção da habilidade em converter o composto (II) no composto (III) Similarmente ao Exemplo 32(3), soluções de reação de 30 μΙ foram preparadas e mantidas por 10 minutos a 30°C. No entanto, como a fração de sobrenadante, a fração de sobrenadante preparada no Exemplo 51(2) (extrato de pKSN608F de E. coli ou extrato de pKSN2 de E. coli) foi utilizada. As soluções de reação após a manutenção foram extraídas com acetato de etila e as camadas extraídas foram analisadas com TLC. Após desenvolvimento da placa de TLC, a presença de um ponto sobre ela correspondendo ao composto (III) marcado com 14C foi examinada (valor Rf 0,24 e 0,29). Um ponto correspondendo ao composto (III) foi detectado a partir da solução de reação contendo extrato de pKSN608F de E. coli. Em contraste, tal ponto não foi detectado da solução de reação contendo o extrato de pKSN2 de E. coli.
Exemplo 52 Obtenção do DNA (A18) da presente invenção (1) Preparação do DNA cromossômico de Streptomyces achromogenes IFO 12735 Sob o método descrito no Exemplo 31(1), o DNA cromossômico de Streptomyces achromogenes IFO 12735 foi preparado. (2) Isolamento de DNA tendo uma seqüência de nucleotídeo parcial do DNA (A18) da presente invenção PCR foi realizada utilizando como o molde o DNA cromossômico de Streptomyces achromogenes IFO 12735 preparado no Exemplo 52(1) e utilizando o par de iniciador 17, de acordo com o método descrito no Exemplo 29. Similarmente ao Exemplo 31(2), o DNA amplificado foi clonado no vetor de clonagem pCRIl-TOPO (Invitrogen Company). A sua seqüência de nucleotídeo foi analisada. Como resultado, a seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 526 a 1048 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 227 foi provida.
Ainda, o DNA cromossômico preparado no Exemplo 52(1) foi digerido com a enzima de restrição Hincll. Uma biblioteca de genoma walker foi produzida utilizando o DNA obtido, de acordo com o método descrito no Exemplo 26(3). PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3) para se obter os primeiros produtos de PCR, utilizando a biblioteca obtida como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 278 e iniciador AP1. Em seguida, PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3), utilizando os primeiros produtos de PCR como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 279 e iniciador AP2. A seqüência de nucleotídeo do DNA obtido foi analisada. A seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 1 a 600 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 237 foi provida.
Ainda, DNA cromossômico preparado no Exemplo 52(1) foi digerido com a enzima de restrição Bali. Uma biblioteca de genoma walker foi produzida utilizando o DNA obtido, de acordo com o método descrito no Exemplo 26(3). PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3) para se obter os primeiros produtos de PCR, utilizando a biblioteca obtida como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 163 e iniciador AP1. Em seguida, PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3), utilizando os primeiros produtos de PCR como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 164 e iniciador AP2. A seqüência de nucleotídeo do DNA obtido foi analisada. A seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 983 a 1449 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 237 foi provida. (3) Análise de seqüência do DNA (A18) da presente invenção A seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 237 foi obtida conectando as seqüências de nucleotídeo providas pelo DNA obtido no Exemplo 52(2). Dois quadros de leitura abertos (ORF) estavam presentes na dita seqüência de nucleotídeo. Desse modo, estava contida uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 227) consistindo em 1230 nucleotídeos (inclusive do códon de parada) e codificando um resíduo de 409 aminoacidos (SEQ ID NO: 217) e uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 257) consistindo em 207 nucleotídeos (inclusive o códon de parada) e codificando um resíduo de 68 aminoacidos (SEQ ID NO: 247). O peso molecular da proteína consistindo na seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 217) codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 227 foi calculado como sendo 45099 Da. O peso molecular da proteína consistindo na seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 247) codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 257 foi calculado como sendo 7193 Da.
Exemplo 53Expressão do DNA (A18) da presente invenção em E. coli (1) Produção de uma E. coli transformada tendo o DNA (A18) da presente invenção PCR foi realizada similarmente ao Exemplo 49(1), exceto pelo uso como um molde do DNA cromossômico preparado a partir de Streptomyces achromogenes IFO 12735 no Exemplo 52(1) e utilizando como os iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 183 e um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 280. Similarmente ao Exemplo 32(1), o DNA foi purificado a partir da solução de reação de PCR e clonado no vetor de clonagem pCRIl-TOPO (Invitrogen Company). A seqüência de nucleotídeo do DNA de plasmídeo obtido foi analisada utilizando como iniciadores os oligo-nucleotídeos tendo as seqüências de nucleotídeo mostradas, respectivamente, nas SEQ ID NOS: 67, 68, 163, 279 e 281. Com base nos resultados obtidos, o plasmídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 237 foi chamado pCR646BF. Similarmente ao Exemplo 32(1), pCR646BF foi digerido com as enzimas de restrição Ndel e Hindlll. Um DNA de cerca de 1,5 kpb foi purificado a partir dos produtos de digestão. O DNA obtido e o plasmídeo de pKSN2 digerido com Ndel e Hindlll foram ligados para se obter um plasmídeo contendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 237, onde o DNA codificando a proteína (A18) da presente invenção é inserido entre o sítio Ndel e o sítio Hindlll de pKSN2 (daqui em diante referido como "pKSN646BF"). O dito plasmídeo foi introduzido em JM109 de E. coli. O transformante de E. coli obtido foi chamado JM109/pKSN646BF. (2) Expressão da proteína (A18) da presente invenção em E. coli e recuperação da dita proteína Similarmente ao Exemplo 4(2), cada um de JM109/pKSN464BF e JM109/pKSN2 de E. coli foi culturado. As células foram recuperadas. As soluções de lisato de célula foram preparadas. Sob o método descrito no Exemplo 4(2), as frações de sobrenadante foram preparadas das soluções de lisato de célula (daqui em diante, a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN646BF de E. coli ê referida como "extrato de pKSN6462F de E coli" e a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN2 de E. coli é referida como "extrato de pKSN2 de E. colP'. (3) Detecção da habilidade em converter o composto (II) no composto (III) Similarmente ao Exemplo 32(3), soluções de reação de 30 μΙ foram preparadas e mantidas por 10 minutos a 30°C. No entanto, como a fração de sobrenadante, a fração de sobrenadante preparada no Exemplo 53(2) (extrato de pKSN646BF de E. coli ou extrato de pKSN2 de E. coli) foi utilizada. As soluções de reação após a manutenção foram extraídas com acetato de etila e as camadas extraídas foram analisadas com TLC. Após desenvolvimento da placa de TLC, a presença de um ponto sobre ela correspondendo ao composto (III) marcado com 14C foi examinada (valor Rf 0,24 e 0,29). Um ponto correspondendo ao composto (III) foi detectado a partir da solução de reação contendo extrato de pKSN646BF de E. coli. Em contraste, tal ponto não foi detectado da solução de reação contendo o extrato de pKSN2 de E. coli.
Exemplo 54 Obtenção do DNA (A19) da presente invenção (1) Preparação do DNA cromossômico de Streptomyces griseus IFO 13849T
Sob o método descrito no Exemplo 31(1), o DNA cromossômico de Streptomyces griseus IFO 13849T foi preparado. (2) Isolamento de DNA tendo uma seqüência de nucleotídeo parcial do DNA (A19) da presente invenção PCR foi realizada utilizando como o molde o DNA cromossômico de Streptomyces griseus IFO 13849T preparado no Exemplo 54(1) e utili- zando o par de iniciador 14, de acordo com o método descrito no Exemplo 29. Similarmente ao Exemplo 31(2), o DNA amplificado foi clonado no vetor de clonagem pCRIl-TOPO (Invitrogen Company). A sua seqüência de nucle-otídeo foi analisada. Como resultado, a seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 343 a 1069 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 228 foi provida.
Ainda, o DNA cromossômico preparado no Exemplo 54(1) foi digerido com a enzima de restrição Smal. Uma biblioteca de genoma walker foi produzida utilizando o DNA obtido, de acordo com o método descrito no Exemplo 26(3). PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3) para se obter os primeiros produtos de PCR, utilizando a biblioteca obtida como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 282 e iniciador AP1. Em seguida, PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3), utilizando os primeiros produtos de PCR como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 283 e iniciador AP2. A seqüência de nucleotídeo do DNA obtido foi analisada. A seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 1 a 358 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 238 foi provida.
Ainda, DNA cromossômico preparado no Exemplo 54(1) foi digerido com a enzima de restrição Hincll. Uma biblioteca de genoma walker foi produzida utilizando o DNA obtido, de acordo com o método descrito no Exemplo 26(3). PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3) para se obter os primeiros produtos de PCR, utilizando a biblioteca obtida como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 284 e iniciador AP1. Em seguida, PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3), utilizando os primeiros produtos de PCR como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 285 e iniciador AP2. A seqüência de nucleotídeo do DNA obtido foi analisada. A seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 1005 a 1454 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 238 foi provida. (3) Análise de seqüência do DNA (A18) da presente invenção A seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 238 foi obtida conectando as seqüências de nucleotídeo providas pelo DNA obtido no Exemplo 54(2). Dois quadros de leitura abertos (ORF) estavam presentes na dita seqüência de nucleotídeo. Desse modo, estava contida uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 228) consistindo em 1251 nucleotídeos (inclusive do códon de parada) e codificando um resíduo de 416 aminoacidos (SEQ ID NO: 218) e uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 258) consistindo em 156 nucleotídeos (inclusive o códon de parada) e codificando um resíduo de 51 aminoacidos (SEQ ID NO: 248). O peso molecular da proteína consistindo na seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 218) codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 228 foi calculado como sendo 45903 Da. O peso molecular da proteína consistindo na seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 248) codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 258 foi calculado como sendo 5175Da.
Exemplo 55Expressão do DNA (A19) da presente invenção em E. coli (1) Produção de uma E. coli transformada tendo o DNA (A19) da presente invenção PCR foi realizada similarmente ao Exemplo 49(1), exceto pelo uso como um molde do DNA cromossômico preparado a partir de Streptomyces griseus IFO 13849T no Exemplo 54(1) e utilizando com os iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 286 e um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 287. Similarmente ao Exemplo 32(1), o DNA foi purificado a partir da solução de reação de PCR e clonado no vetor de clonagem pCRIl-TOPO (Invitrogen Company). A seqüência de nucleotídeo do DNA de plasmídeo obtido foi analisada utilizando como iniciadores os oligo-nucleotídeos tendo as seqüências de nucleotídeo mostradas, respectivamente, nas SEQ ID NOs: 57, 59, 284, 286 e 288. Com base nos resultados obtidos, o plasmídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 238 foi chamado pCR1502F. Similarmente ao Exemplo 32(1), pCR1502F foi digerido com as enzimas de restrição Ndel e Hindlll. Um DNA de cerca de 1,5 kpb foi purificado a partir dos produtos de digestão. O DNA obtido e o plasmídeo de pKSN2 digerido com Ndel e Hindlll foram ligados para se obter um plasmídeo contendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 238, onde o DNA codificando a proteína (A19) da presente invenção é inserido entre o sítio Ndel e o sítio Hindlll de pKSN2 (daqui em diante referido como "pKSN1502F"). O dito plasmídeo foi introduzido em JM109 de E. coli. O transformante de E. coli obtido foi chamado JM109/pKSN1502F. (2) Expressão da proteína (A18) da presente invenção em E. coli e recuperação da dita proteína Similarmente ao Exemplo 4(2), cada um de JM109/pKSN1502F e JM109/pKSN2 de E. coli foi culturado. As células foram recuperadas. As soluções de lisato de célula foram preparadas. Sob o método descrito no Exemplo 4(2), as frações de sobrenadante foram preparadas das soluções de lisato de célula (daqui em diante, a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN1502F de E. coli é referida como "extrato de pKSNi502F de E. coli" e a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN2 de E. coli é referida como "extrato de pKSN2 de E coli". (3) Detecção da habilidade em converter o composto (II) no composto (III) Similarmente ao Exemplo 32(3), soluções de reação de 30 μΙ foram preparadas e mantidas por 10 minutos a 30°C. No entanto, como a fração de sobrenadante, a fração de sobrenadante preparada no Exemplo 55(2) (extrato de pKSN1502F de E. coli ou extrato de pKSN2 de E. coli) foi utilizada. As soluções de reação após a manutenção foram extraídas com acetato de etila e as camadas extraídas foram analisadas com TLC. Após desenvolvimento da placa de TLC, a presença de um ponto sobre ela correspondendo ao composto (III) marcado com 14C foi examinada (valor Rf 0,24 e 0,29). Um ponto correspondendo ao composto (III) foi detectado a partir da solução de reação contendo extrato de pKSN1502F de E. coli. Em contraste, tal ponto não foi detectado da solução de reação contendo o extrato de pKSN2 de E. coli.
Exemplo 56 Obtenção do DNA (A20) da presente invenção (1) Preparação do DNA cromossômico de Streptomyces la-natus IFO 12787T
Sob o método descrito no Exemplo 31(1), o DNA cromossômico de Streptomyces tanatus IFO 12787T foi preparado. (2) Isolamento de DNA tendo uma seqüência de nucleotídeo parcial do DNA (A20) da presente invenção PCR foi realizada utilizando como o molde o DNA cromossômico de Streptomyces tanatus IFO 12787T preparado no Exemplo 56(1) e utilizando o par de iniciador 14, de acordo com o método descrito no Exemplo 29. Similarmente ao Exemplo 31(2), o DNA amplificado foi clonado no vetor de clonagem pCRIl-TOPO (Invitrogen Company). A sua seqüência de nucleotídeo foi analisada. Como resultado, a seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 304 a 1036 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 229 foi provida.
Ainda, o DNA cromossômico preparado no Exemplo 56(1) foi digerido com a enzima de restrição Pmacl. Uma biblioteca de genoma walker foi produzida utilizando o DNA obtido, de acordo com o método descrito no Exemplo 26(3). PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3) para se obter os primeiros produtos de PCR, utilizando a biblioteca obtida como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 278 e iniciador AP1. Em seguida, PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3), utilizando os primeiros produtos de PCR como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 289 e iniciador AP2. A seqüência de nucleotídeo do DNA obtido foi analisada. A seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 1 a 318 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 239 foi provida.
Ainda, o DNA cromossômico preparado no Exemplo 56(1) foi digerido com a enzima de restrição Stul. Uma biblioteca de genoma walker foi produzida utilizando o DNA obtido, de acordo com o método descrito no Exemplo 26(3). PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3) para se obter os primeiros produtos de PCR, utilizando a biblioteca obtida como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQID NO: 290 e iniciador AP1. Em seguida, PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3), utilizando os primeiros produtos de PCR como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 291 e iniciador AP2. A seqüência de nucleotídeo do DNA obtido foi analisada. A seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 969 a 1461 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 239 foi provida. (3) Análise de seqüência do DNA (A20) da presente invenção A seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 239 foi obtida conectando as seqüências de nucleotídeo providas pelo DNA obtido no Exemplo 56(2). Dois quadros de leitura abertos (ORF) estavam presentes na dita seqüência de nucleotídeo. Desse modo, estava contida uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 229) consistindo em 1218 nucleotídeos (inclusive do códon de parada) e codificando um resíduo de 405 aminoacidos (SEQ ID NO: 219) e uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 259) consistindo em 231 nucleotídeos (inclusive o códon de parada) e codificando um resíduo de 76 aminoacidos (SEQ ID NO: 249). O peso molecular da proteína consistindo na seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 219) codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 229 foi calculado como sendo 45071 Da. O peso molecular da proteína consistindo na seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 249) codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 259 foi calculado como sendo 7816Da.
Exemplo 57Expressão do DNA (A20) da presente invenção em E. coli (1) Produção de uma E. coli transformada tendo o DNA (A20) da presente invenção PCR foi realizada similarmente ao Exemplo 49(1), exceto pelo uso como um molde do DNA cromossômico preparado a partir de Streptomyces lanatus IFO 12787T no Exemplo 56(1) e utilizando como os iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 292 e um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 293. Similarmente ao Exemplo 32(1), o DNA foi purificado a partir da solução de reação de PCR e clonado no vetor de clonagem pCRIl-TOPO (Invitrogen Company). A seqüência de nucleotídeo do DNA de plasmídeo obtido foi analisada utilizando como iniciadores os oligo-nucleotídeos tendo as seqüências de nucleotídeo mostradas, respectivamente, nas SEQ ID NOs: 67, 68, 188, 278 e 290. Com base nos resultados obtidos, o plasmídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 239 foi chamado pCR1525F. Similarmente ao Exemplo 32(1), pCR1525F foi digerido com as enzimas de restrição Ndel e Hindlll. Um DNA de cerca de 1,5 kpb foi purificado a partir dos produtos de digestão. O DNA obtido e o plasmídeo de pKSN2 digerido com Ndel e Hindlll foram ligados para se obter um plasmídeo contendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 239, onde o DNA codificando a proteína (A20) da presente invenção é inserido entre o sítio Ndel e o sítio Hindlll de pKSN2 (daqui em diante referido como "pKSN1525F"). O dito plasmídeo foi introduzido em JM109 de E. coli. O transformante de E. coli obtido foi chamado JM109/pKSN1525F. (2) Expressão da proteína (A20) da presente invenção em E. coli e recuperação da dita proteína Similarmente ao Exemplo 4(2), cada um de JM109/pKSN1525F e JM109/pKSN2 de E. coli foi culturado. As células foram recuperadas. As soluções de lisato de célula foram preparadas. Sob o método descrito no Exemplo 4(2), as frações de sobrenadante foram preparadas das soluções de lisato de célula (daqui em diante, a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN1525F de E. coli é referida como "extrato de pKSN1525F de E. coli' e a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN2 de E. coli é referida como "extrato de pKSN2 de E. coli'. (3) Detecção da habilidade em converter o composto (II) no composto (III) Similarmente ao Exemplo 32(3), soluções de reação de 30 μΙ foram preparadas e mantidas por 10 minutos a 30°C. No entanto, como a fração de sobrenadante, a fração de sobrenadante preparada no Exemplo 57(2) (extrato de pKSN1525F de E. coli ou extrato de pKSN2 de E. coli) foi utilizada. As soluções de reação após a manutenção foram extraídas com acetato de etila e as camadas extraídas foram analisadas com TLC. Após desenvolvimento da placa de TLC, a presença de um ponto sobre ela correspondendo ao composto (III) marcado com 14C foi examinada (valor Rf 0,24 e 0,29). Um ponto correspondendo ao composto (III) foi detectado a partir da solução de reação contendo extrato de pKSN1525F de E. coli. Em contraste, tal ponto não foi detectado da solução de reação contendo o extrato de pKSN2 de E. coli.
Exemplo 58 Obtenção do DNA (A21) da presente invenção (1) Preparação do DNA cromossômico de Streptomyces mi-sawanensis IFO 13855T
Sob o método descrito no Exemplo 31(1), o DNA cromossômico de Streptomyces misawanensis IFO 13855T foi preparado. (2) Isolamento de DNA tendo uma seqüência de nucleotídeo parcial do DNA (A21) da presente invenção PCR foi realizada utilizando como o molde o DNA cromossômico de Streptomyces misawanensis IFO 13855T preparado no Exemplo 58(1) e utilizando o par de iniciador 14, de acordo com o método descrito no Exemplo 29. Similarmente ao Exemplo 31(2), o DNA amplificado foi clonado no vetor de clonagem pCRIl-TOPO (Invitrogen Company). A sua seqüência de nucleotídeo foi analisada. Como resultado, a seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 328 a 1063 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 230 foi provida.
Ainda, o DNA cromossômico preparado no Exemplo 58(1) foi digerido com a enzima de restrição Smal. Uma biblioteca de genoma walker foi produzida utilizando o DNA obtido, de acordo com o método descrito no Exemplo 26(3). PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3) para se obter os primeiros produtos de PCR, utilizando a biblioteca obtida como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 294 e iniciador AP1. Em seguida, PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3), utilizando os pri- meiros produtos de PCR como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 295 e iniciador AP2. A seqüência de nucleotídeo do DNA obtido foi analisada. A seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 1 a 341 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 240 foi provida.
Ainda, DNA cromossômico preparado no Exemplo 58(1) foi digerido com a enzima de restrição Hincll. Uma biblioteca de genoma walker foi produzida utilizando o DNA obtido, de acordo com o método descrito no Exemplo 26(3). PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3) para se obter os primeiros produtos de PCR, utilizando a biblioteca obtida como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 296 e iniciador AP1. Em seguida, PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3), utilizando os primeiros produtos de PCR como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 297 e iniciador AP2. A seqüência de nucleotídeo do DNA obtido foi analisada. A seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 1017 a 1458 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 240 foi provida. (3) Análise de seqüência do DNA (A21) da presente invenção A seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 240 foi obtida conectando as seqüências de nucleotídeo providas pelo DNA obtido no Exemplo 58(2). Dois quadros de leitura abertos (ORF) estavam presentes na dita seqüência de nucleotídeo. Desse modo, havia contida uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 230) consistindo em 1245 nucleotídeos (inclusive do códon de parada) e codificando um resíduo de 414 aminoacidos (SEQ ID NO: 220) e uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 260) consistindo em 201 nucleotídeos (inclusive o códon de parada) e codificando um resíduo de 66 aminoacidos (SEQ ID NO: 250). O peso molecular da proteína consistindo na seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 220) codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 230 foi calculado como sendo 45806Da. O peso molecular da proteína consistindo na seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 250) codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 260 foi calculado como sendo 6712Da.
Exemplo 59Expressão do DNA (A21) da presente invenção em E. coli (1) Produção de uma E. coli transformada tendo o DNA (A21) da presente invenção PCR foi realizada similarmente ao Exemplo 32(1), exceto pelo uso como um molde do DNA cromossômico preparado a partir de Streptomyces misawanensis IFO 13855T no Exemplo 58(1) e utilizando com os iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 298 e um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 299. Similarmente ao Exemplo 32(1), o DNA foi purificado a partir da solução de reação de PCR e clonado no vetor de clonagem pCRIl-TOPO (Invitrogen Company). A seqüência de nucleotídeo do DNA de plasmídeo obtido foi analisada utilizando como iniciadores os oligo-nucleotídeos tendo as seqüências de nucleotídeo mostradas, respectivamente, nas SEQ ID NOs: 57, 59, 296, 298 e 300. Com base nos resultados obtidos, o plasmídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 240 foi chamado pCR1543BF. Similarmente ao Exemplo 32(1), pCR1543BF foi digerido com as enzimas de restrição Ndel e Hindlll. Um DNA de cerca de 1,5 kpb foi purificado a partir dos produtos de digestão. O DNA obtido e o plasmídeo de pKSN2 digerido com Ndel e Hindlll foram ligados para se obter um plasmídeo contendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 240, onde o DNA codificando a proteína (A21) da presente invenção é inserido entre o sítio Ndel e o sítio Hindlll de pKSN2 (daqui em diante referido como "pKSN1543BF"). O dito plasmídeo foi introduzido em JM109 de E. coli. O transformante de E. coli obtido foi chamado JM109/pKSN1543BF. (2) Expressão da proteína (A21) da presente invenção em E. coli e recuperação da dita proteína Similarmente ao Exemplo 4(2), cada um de JM109/pKSN1543BF e JM109/pKSN2 de E. coli foi culturado. As células foram recuperadas. As soluções de lisato de célula foram preparadas. Sob o método descrito no Exemplo 4(2), as frações de sobrenadante foram preparadas das soluções de lisato de célula (daqui em diante, a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN1543BF de E. coli é referida como "extrato de pKSN1543F de E. coir e a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN2 de E. coli é referida como "extrato de pKSN2 de E. coli'. (3) Detecção da habilidade em converter o composto (II) no composto (III) Similarmente ao Exemplo 32(3), soluções de reação de 30 μΙ foram preparadas e mantidas por 10 minutos a 30°C. No entanto, como a fração de sobrenadante, a fração de sobrenadante preparada no Exemplo 59(2) (extrato de pKSN1543BF de E. coli ou extrato de pKSN2 de E. coli) foi utilizada. As soluções de reação após a manutenção foram extraídas com acetato de etila e as camadas extraídas foram analisadas com TLC. Após desenvolvimento da placa de TLC, a presença de um ponto sobre ela correspondendo ao composto (III) marcado com 14C foi examinada (valor Rf 0,24 e 0,29). Um ponto correspondendo ao composto (III) foi detectado a partir da solução de reação contendo extrato de pKSN1543BF de E. coli. Em contraste, tal ponto não foi detectado da solução de reação contendo o extrato de pKSN2 de E. coli.
Exemplo 60 Obtenção do DNA (A22) da presente invenção (1) Preparação do DNA cromossômico de Streptomyces pallidus IFO 13434T
Sob o método descrito no Exemplo 31(1), o DNA cromossômico de Streptomyces pallidus IFO 13434T foi preparado. (2) Isolamento de DNA tendo uma seqüência de nucleotídeo parcial do DNA (A22) da presente invenção PCR foi realizada utilizando como o molde o DNA cromossômico de Streptomyces pallidus IFO 13434T preparado no Exemplo 60(1) e utilizando o par de iniciador 15, de acordo com o método descrito no Exemplo 29. Similarmente ao Exemplo 31(2), o DNA amplificado foi clonado no vetor de clonagem pCRIl-TOPO (Invitrogen Company). A sua seqüência de nucleotídeo foi analisada. Como resultado, a seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 483 a 1048 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 231 foi provida.
Ainda, o DNA cromossômico preparado no Exemplo 60(1) foi digerido com a enzima de restrição Smal. Uma biblioteca de genoma walker foi produzida utilizando o DNA obtido, de acordo com o método descrito no Exemplo 26(3). PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3) para se obter os primeiros produtos de PCR, utilizando a biblioteca obtida como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 301 e iniciador AP1. Em seguida, PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3), utilizando os primeiros produtos de PCR como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 302 e iniciador AP2. A seqüência de nucleotídeo do DNA obtido foi analisada. A seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 68 a 516 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 241 foi provida.
Ainda, DNA cromossômico preparado no Exemplo 60(1) foi digerido com a enzima de restrição Hincll. Uma biblioteca de genoma walker foi produzida utilizando o DNA obtido, de acordo com o método descrito no Exemplo 26(3). PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3) para se obter os primeiros produtos de PCR, utilizando a biblioteca obtida como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 302 e iniciador AP1. Em seguida, PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3), utilizando os primeiros produtos de PCR como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 303 e iniciador AP2. A seqüência de nucleotídeo do DNA obtido foi analisada. A seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 1 a 270 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 241 foi provida.
Ainda, o DNA cromossômico preparado no Exemplo 60(1) foi digerido com a enzima de restrição Hincll. Uma biblioteca de genoma walker foi produzida utilizando o DNA obtido, de acordo com o método descrito no Exemplo 26(3). PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3) para se obter os primeiros produtos de PCR, utilizando a biblioteca obtida como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 304 e iniciador AP1. Em seguida, PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3), utilizando os primeiros produtos de PCR como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 305 e iniciador AP2. A seqüência de nucleotídeo do DNA obtido foi analisada. A seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 982 a 1448 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 241 foi provida. (3) Análise de seqüência do DNA (A22) da presente invenção A seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 241 foi obtida conectando as seqüências de nucleotídeo providas pelo DNA obtido no Exemplo 60(2). Dois quadros de leitura abertos (ORF) estavam presentes na dita seqüência de nucleotídeo. Desse modo, havia contida uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 231) consistindo em 1230 nucleotídeos (inclusive do códon de parada) e codificando um resíduo de 409 aminoacidos (SEQ ID NO: 221) e uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 261) consistindo em 195 nucleotídeos (inclusive o códon de parada) e codificando um resíduo de 64 aminoacidos (SEQ ID NO: 251). O peso molecular da proteína consistindo na seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 221) codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 231 foi calculado como sendo 45050Da. O peso molecular da proteína consistindo na seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 251) codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 261 foi calculado como sendo 6914Da.
Exemplo 61 Expressão do DNA (A22) da presente invenção em E. coli (1) Produção de uma E. coli transformada tendo o DNA (A22) da presente invenção PCR foi realizada similarmente ao Exemplo 32(1), exceto pelo uso como um molde do DNA cromossômico preparado a partir de Streptomyces pallidus IFO 13434T no Exemplo 60(1) e utilizando com os iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 306 e um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 307. Similarmente ao Exemplo 32(1), o DNA foi purificado a partir da solução de reação de PCR e clonado no vetor de clonagem pCRIl-TOPO (Invitrogen Company). A sequência de nucleotídeo do DNA de plasmídeo obtido foi analisada utilizando como iniciadores os oligo-nucleotídeos tendo as sequências de nucleotídeo mostradas, respectivamente, nas SEQ ID NOs: 67, 68 e 308. Com base nos resultados obtidos, o plasmídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 241 foi chamado pCR1558BF. Similarmente ao Exemplo 32(1), pCR1558BF foi digerido com as enzimas de restrição Ndel e Hindlll. Um DNA de cerca de 1,5 kpb foi purificado a partir dos produtos de digestão. O DNA obtido e o plasmídeo de pKSN2 digerido com Ndel e Hindlll foram ligados para se obter um plasmídeo contendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 241, onde o DNA codificando a proteína (A22) da presente invenção é inserido entre o sítio Ndel e o sítio Hindlll de pKSN2 (daqui em diante referido como "pKSN1558BF"). O dito plasmídeo foi introduzido em JM109 de E. coli. O transformante de E. coli obtido foi chamado JM109/pKSN1558BF. (2) Expressão da proteína (A22) da presente invenção em E. colie recuperação da dita proteína Similarmente ao Exemplo 4(2), cada um de JM109/pKSN1558BF e JM109/pKSN2 de E. coli foi culturado. As células foram recuperadas. As soluções de lisato de célula foram preparadas. Sob o método descrito no Exemplo 4(2), as frações de sobrenadante foram preparadas das soluções de lisato de célula (daqui em diante, a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN1558BF de E. coli é referida como "extrato de pKSN1558F de E. coli' e a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN2 de E. coli é referida como "extrato de pKSN2 de E. coir. (3) Detecção da habilidade em converter o composto (II) no composto (III) Similarmente ao Exemplo 32(3), soluções de reação de 30 μΙ foram preparadas e mantidas por 10 minutos a 30°C. No entanto, como a fração de sobrenadante, a fração de sobrenadante preparada no Exemplo 61(2) (extrato de pKSN1558BF de E. coli ou extrato de pKSN2 de E. coli) foi utilizada. As soluções de reação após a manutenção foram extraídas com acetato de etila e as camadas extraídas foram analisadas com TLC. Após desenvolvimento da placa de TLC, a presença de um ponto sobre ela correspondendo ao composto (III) marcado com 14C foi examinada (valor Rf 0,24 e 0,29). Um ponto correspondendo ao composto (III) foi detectado a partir da solução de reação contendo extrato de pKSN1558BF de E. coli. Em contraste, tal ponto não foi detectado da solução de reação contendo o extrato de pKSN2 de E. coli.
Exemplo 62 Obtenção do DNA (A23) da presente invenção (1) Preparação do DNA cromossômico de Streptomyces ro-seorubens IFO 13682T
Sob o método descrito no Exemplo 31(1), o DNA cromossômico de Streptomyces roseorubens IFO 13682T foi preparado. (2) Isolamento de DNA tendo uma seqüência de nucleotídeo parcial do DNA (A23) da presente invenção PCR foi realizada utilizando como o molde o DNA cromossômico de Streptomyces roseorubens IFO 13682T preparado no Exemplo 62(1) e utilizando o par de iniciador 14, de acordo com o método descrito no Exemplo 29. Similarmente ao Exemplo 31(2), o DNA amplificado foi clonado no vetor de clonagem pCRIl-TOPO (Invitrogen Company). A sua seqüência de nucleotídeo foi analisada. Como resultado, a seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 289 a 1015 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 232 foi provida.
Ainda, o DNA cromossômico preparado no Exemplo 62(1) foi digerido com a enzima de restrição Smal. Uma biblioteca de genoma walker foi produzida utilizando o DNA obtido, de acordo com o método descrito no Exemplo 26(3). PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3) para se obter os primeiros produtos de PCR, utilizando a biblioteca obtida como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 309 e iniciador AP1. Em seguida, PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3), utilizando os primeiros produtos de PCR como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 310 e iniciador AP2. A seqüência de nucleotídeo do DNA obtido foi analisada. A seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 1 a 354 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 242 foi provida.
Ainda, DNA cromossômico preparado no Exemplo 62(1) foi digerido com a enzima de restrição Pvull. Uma biblioteca de genoma walker foi produzida utilizando o DNA obtido, de acordo com o método descrito no Exemplo 26(3). PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3) para se obter os primeiros produtos de PCR, utilizando a biblioteca obtida como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 311 e iniciador AP1. Em seguida, PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3), utilizando os primeiros produtos de PCR como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 312 e iniciador AP2. A seqüência de nucleotídeo do DNA obtido foi analisada. A seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 966 a 1411 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 242 foi provida. (3) Análise de seqüência do DNA (A23) da presente invenção A seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 242 foi obtida conectando as seqüências de nucleotídeo providas pelo DNA obtido no Exemplo 62(2). Dois quadros de leitura abertos (ORF) estavam presentes na dita seqüência de nucleotídeo. Desse modo, estava contida uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 232) consistindo em 1197 nucleotídeos (inclusive do códon de parada) e codificando um resíduo de 398 aminoacidos (SEQ ID NO: 222) e uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 262) consistindo em 201 nucleotídeos (inclusive o códon de parada) e codificando um resíduo de 66 aminoacidos (SEQ ID NO: 252). O peso molecular da proteína consistindo na seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 222) codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 232 foi calculado como sendo 43624Da. O peso molecular da proteína consistindo na seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 252) codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 262 foi calculado como sendo 6797Da.
Exemplo 63Expressão do DNA (A23) da presente invenção em E. coli (1) Produção de uma E. coli transformada tendo o DNA (A23) da presente invenção PCR foi realizada similarmente ao Exemplo 49(1), exceto pelo uso como um molde do DNA cromossômico preparado a partir de Streptomyces roseorubens IFO 13682T no Exemplo 62(1) e utilizando com os iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 313 e um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 314. Similarmente ao Exemplo 32(1), o DNA foi purificado a partir da solução de reação de PCR e clonado no vetor de clonagem pCRIl-TOPO (Invitrogen Company). A seqüência de nucleotídeo do DNA de plasmídeo obtido foi analisada utilizando como iniciadores os oligo-nucleotídeos tendo as seqüências de nucleotídeo mostradas, respectivamente, nas SEQ ID NOs: 67, 68, 309, 311 e 315. Com base nos resultados obtidos, o plasmídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 242 foi chamado pCR1584F. Similarmente ao Exemplo 32(1), pCR1584F foi digerido com as enzimas de restrição Ndel e Hindlll. Um DNA de cerca de 1,5 kpb foi purificado a partir dos produtos de digestão. O DNA obtido e o plasmídeo de pKSN2 digerido com Ndel e Hindlll foram ligados para se obter um plasmídeo contendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 242, onde o DNA codificando a proteína (A23) da presente invenção é inserido entre o sítio Ndel e o sítio Hindlll de pKSN2 (daqui em diante referido como "pKSN1584F"). O dito plasmídeo foi introduzido em JM109 de E. coli. O transformante de E. coli obtido foi chamado JM109/pKSN1584F. (2) Expressão da proteína (A23) da presente invenção em E. coli e recuperação da dita proteína Similarmente ao Exemplo 4(2), cada um de JM109/pKSN1584F e JM109/pKSN2 de E. coli foi culturado. As células foram recuperadas. As soluções de lisato de célula foram preparadas. Sob o método descrito no Exemplo 4(2), as frações de sobrenadante foram preparadas das soluções de lisato de célula (daqui em diante, a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN1584F de E. coli é referida como "extrato de pKSN1584F de E. coli’ e a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN2 de E. coli é referida como ("extrato de pKSN2 de E. coli"). (3) Detecção da habilidade em converter o composto (II) no composto (III) Similarmente ao Exemplo 32(3), soluções de reação de 30 μΙ foram preparadas e mantidas por 10 minutos a 30°C. No entanto, como a fração de sobrenadante, a fração de sobrenadante preparada no Exemplo 63(2) (extrato de pKSN1584F de E. coli ou extrato de pKSN2 de E. coli) foi utilizada. As soluções de reação após a manutenção foram extraídas com acetato de etila e as camadas extraídas foram analisadas com TLC. Após desenvolvimento da placa de TLC, a presença de um ponto sobre ela correspondendo ao composto (III) marcado com 14C foi examinada (valor Rf 0,24 e 0,29). Um ponto correspondendo ao composto (III) foi detectado a partir da solução de reação contendo extrato de pKSN1584F de E. coli. Em contraste, tal ponto não foi detectado da solução de reação contendo o extrato de pKSN2 de E. coli.
Exemplo 64 Obtenção do DNA (A24) da presente invenção (1) Preparação do DNA cromossômico de Streptomyces ru-tgersensis IFO 15875T
Sob o método descrito no Exemplo 31(1), o DNA cromossômico de Streptomyces rutgersensis IFO 15875T foi preparado. (2) Isolamento de DNA tendo uma seqüência de nucleotídeo parcial do DNA (A24) da presente invenção PCR foi realizada utilizando como o molde o DNA cromossômico de Streptomyces rutgersensis IFO 15875T preparado no Exemplo 64(1) e utilizando o par de iniciador 14, de acordo com o método descrito no Exemplo 29. Similarmente ao Exemplo 31(2), o DNA amplificado foi clonado no vetor de clonagem pCRIl-TOPO (Invitrogen Company). A sua seqüência de nucleotídeo foi analisada. Como resultado, a seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 322 a 1057 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 233 foi provida.
Ainda, o DNA cromossômico preparado no Exemplo 64(1) foi digerido com a enzima de restrição Smal. Uma biblioteca de genoma walker foi produzida utilizando o DNA obtido, de acordo com o método descrito no Exemplo 26(3). PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3) para se obter os primeiros produtos de PCR, utilizando a biblioteca obtida como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 316 e iniciador AP1. Em seguida, PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3), utilizando os primeiros produtos de PCR como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 317 e iniciador AP2. A seqüência de nucleotídeo do DNA obtido foi analisada. A seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 1 a 384 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 243 foi provida.
Ainda, o DNA cromossômico preparado no Exemplo 64(1) foi digerido com a enzima de restrição Nael. Uma biblioteca de genoma walker foi produzida utilizando o DNA obtido, de acordo com o método descrito no Exemplo 26(3). PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3) para se obter os primeiros produtos de PCR, utilizando a biblioteca obtida como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 318 e iniciador AP1. Em seguida, PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3), utilizando os primeiros produtos de PCR como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 319 e iniciador AP2. A seqüência de nucleotídeo do DNA obtido foi analisada. A seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 992 a 1466 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 243 foi provida. (3) Análise de seqüência do DNA (A24) da presente invenção A seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 243 foi obtida conectando as seqüências de nucleotídeo providas pelo DNA obtido no Exemplo 64(2). Dois quadros de leitura abertos (ORF) estavam presentes na dita seqüência de nucleotídeo. Desse modo, estava contida uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 233) consistindo em 1245 nucleotídeos (in- clusive do códon de parada) e codificando um resíduo de 414 aminoacidos (SEQ ID NO: 223) e uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 263) consistindo em 198 nucleotídeos (inclusive o códon de parada) e codificando um resíduo de 65 aminoacidos (SEQ ID NO: 253). O peso molecular da proteína consistindo na seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 223) codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 233 foi calculado como sendo 45830Da. O peso molecular da proteína consistindo na seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 253) codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 263 foi calculado como sendo 7034Da.
Exemplo 65Expressão do DNA (A24) da presente invenção em E. coli (1) Produção de uma E. coli transformada tendo o DNA (A24) da presente invenção PCR foi realizada similarmente ao Exemplo 49(1), exceto pelo uso como um molde do DNA cromossômico preparado a partir de Strepto-myces rutgersensis IFO 15875T no Exemplo 64(1) e utilizando como os ini-ciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 320 e um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 321. Similarmente ao Exemplo 32(1), o DNA foi purificado a partir da solução de reação de PCR e clonado no vetor de clonagem pCRIl-TOPO (Invitrogen Company). A seqüência de nucleotídeo do DNA de plasmídeo obtido foi seqüenciada utilizando como iniciadores os oligonucleotídeos tendo as seqüências de nucleotídeo mostradas, respectivamente, nas SEQ ID NOs: 67, 68 e 332. Com base nos resultados obtidos, o plasmídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 243 foi chamado pCR1589BF. Similarmente ao Exemplo 32(1), pCR1589B foi digerido com as enzimas de restrição Ndel e Hindlll. Um DNA de cerca de 1,5 kpb foi purificado a partir dos produtos de digestão. O DNA obtido e o plasmídeo de pKSN2 digerido com Ndel e Hindlll foram ligados para se obter um plasmídeo contendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 243, onde o DNA codificando a proteína (A24) da presente invenção é inserido entre o sítio Ndel e o sítio Hindlll de pKSN2 (daqui em diante referi- do como "pKSN1589BF"). O dito plasmídeo foi introduzido em JM109 de E. coli. O transformante de E. coli obtido foi chamado JM109/pKSN1589BF. (2) Expressão da proteína (A24) da presente invenção em E. coli e recuperação da dita proteína Similarmente ao Exemplo 4(2), cada um de JM109/pKSN1589BF e JM109/pKSN2 de E coli foi culturado. As células foram recuperadas. As soluções de lisato de célula foram preparadas. Sob o método descrito no Exemplo 4(2), as frações de sobrenadante foram preparadas das soluções de lisato de célula (daqui em diante, a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN1589BF de £. coli é referida como "extrato de pKSN1589BF de E. colP' e a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN2 de E coli é referida como "extrato de pKSN2 de E. co//”. (3) Detecção da habilidade em converter o composto (II) no composto (III) Similarmente ao Exemplo 32(3), soluções de reação de 30 μΙ foram preparadas e mantidas por 10 minutos a 30°C. No entanto, como a fração de sobrenadante, a fração de sobrenadante preparada no Exemplo 65(2) (extrato de pKSN1589BF de E. coli ou extrato de pKSN2 de E. coli) foi utilizada. As soluções de reação após a manutenção foram extraídas com acetato de etila e as camadas extraídas foram analisadas com TLC. Após desenvolvimento da placa de TLC, a presença de um ponto sobre ela correspondendo ao composto (III) marcado com 14C foi examinada (valor Rf 0,24 e 0,29). Um ponto correspondendo ao composto (III) foi detectado a partir da solução de reação contendo extrato de pKSN1589BF de E. coli. Em contraste, tal ponto não foi detectado da solução de reação contendo o extrato de pKSN2 de E. coli.
Exemplo 66 Obtenção do DNA (A25) da presente invenção (1) Preparação do DNA cromossômico de Streptomyces ste-ffisburgensis IFO 13446T
Sob o método descrito no Exemplo 31(1), o DNA cromossômico de Streptomyces steffisburgensis IFO 13446T foi preparado. (2) Isolamento de DNA tendo uma seqüência de nucleotídeo parcial do DNA (A25) da presente invenção PCR foi realizada utilizando como o molde o DNA cromossômico de Streptomyces steffisburgensis IFO 13446T preparado no Exemplo 66(1) e utilizando o par de iniciador 14, de acordo com o método descrito no Exemplo 29. Similarmente ao Exemplo 31(2), o DNA amplificado foi clonado no vetor de clonagem pCRIl-TOPO (Invitrogen Company). A sua seqüência de nucleotídeo foi analisada. Como resultado, a seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 289 a 1015 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 234 foi provida.
Ainda, o DNA cromossômico preparado no Exemplo 66(1) foi digerido com a enzima de restrição Smal. Uma biblioteca de genoma walker foi produzida utilizando o DNA obtido, de acordo com o método descrito no Exemplo 26(3). PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3) para se obter os primeiros produtos de PCR, utilizando a biblioteca obtida como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 323 e iniciador AP1. Em seguida, PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3), utilizando os primeiros produtos de PCR como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 324 e iniciador AP2. A seqüência de nucleotídeo do DNA obtido foi analisada. A seqüência de nucleotídeo mostrada nos nucleotídeos 1 a 303 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 244 foi provida.
Ainda, o DNA cromossômico preparado no Exemplo 66(1) foi digerido com a enzima de restrição Pmacl. Uma biblioteca de genoma walker foi produzida utilizando o DNA obtido, de acordo com o método descrito no Exemplo 26(3). PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3) para se obter os primeiros produtos de PCR, utilizando a biblioteca obtida como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 311 e iniciador AP1. Em seguida, PCR foi realizada sob as condições descritas no Exemplo 26(3), utilizando os primeiros produtos de PCR como o molde e utilizando o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 325 e iniciador AP2. A seqüência de nucleotídeo do DNA obtido foi analisada. A seqüência de nu-cleotídeo mostrada nos nucleotídeos 966 a 1411 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 244 foi provida. (3) Análise de seqüência do DNA (A25) da presente invenção A seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 244 foi obtida conectando as seqüências de nucleotídeo providas pelo DNA obtido no Exemplo 66(2). Dois quadros de leitura abertos (ORF) estavam presentes na dita seqüência de nucleotídeo. Desse modo, estava contida uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 234) consistindo em 1197 nucleotídeos (inclusive do códon de parada) e codificando um resíduo de 398 aminoacidos (SEQ ID NO: 224) e uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 264) consistindo em 201 nucleotídeos (inclusive o códon de parada) e codificando um resíduo de 66 aminoacidos (SEQ ID NO: 254). O peso molecular da proteína consistindo na seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 224) codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 234 foi calculado como sendo 44175Da. O peso molecular da proteína consistindo na seqüência de aminoacido (SEQ ID NO: 254) codificada pela seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 264 foi calculado como sendo 6685Da.
Exemplo 67Expressão do DNA (A25) da presente invenção em E. coli (1) Produção de uma E. coli transformada tendo o DNA (A25) da presente invenção PCR foi realizada similarmente ao Exemplo 49(1), exceto pelo uso como um molde do DNA cromossômico preparado a partir de Strepto-myces steffisburgensis IFO 13446T no Exemplo 66(1) e utilizando como os iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 326 e um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 327. Similarmente ao Exemplo 32(1), o DNA foi purificado a partir da solução de reação de PCR e clonado no vetor de clonagem pCRIl-TOPO (Invitrogen Company). A seqüência de nucleotídeo do DNA de plasmídeo obtido foi seqüenciada utilizando como iniciadores os oligonucleotídeos tendo as seqüências de nucleotídeo mostradas, respecti- vamente, nas SEQ ID NOs: 67, 68, 311, 315 e 323. Com base nos resultados obtidos, o plasmídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 244 foi chamado pCR1609F. Similarmente ao Exemplo 32(1), pCR1609F foi digerido com as enzimas de restrição Ndel e Hindlll. Um DNA de cerca de 1,5 kpb foi purificado a partir dos produtos de digestão. O DNA obtido e o plasmídeo de pKSN2 digerido com Ndel e Hindlll foram ligados para se obter um plasmídeo contendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 244, onde o DNA codificando a proteína (A25) da presente invenção é inserido entre o sítio Ndel e o sítio Hindlll de pKSN2 (daqui em diante referido como "pKSN1609F”). O dito plasmídeo foi introduzido em JM109 de E. coli. O transformante de E. coli obtido foi chamado JM109/pKSN1609F. (2) Expressão da proteína (A25) da presente invenção em E. coli e recuperação da dita proteína Similarmente ao Exemplo 4(2), cada um de JM109/pKSN11609F e JM109/pKSN2 de E. coli foi culturado. As células foram recuperadas. As soluções de lisato de célula foram preparadas. Sob o método descrito no Exemplo 4(2), as frações de sobrenadante foram preparadas das soluções de lisato de célula (daqui em diante, a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN1609F de E. coli é referida como "extrato de pKSN1609F de E. coh" e a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN2 de E. coli é referida como "extrato de pKSN2 de E. coir. (3) Detecção da habilidade em converter o composto (II) no composto (III) Similarmente ao Exemplo 32(3), soluções de reação de 30 μΙ foram preparadas e mantidas por 10 minutos a 30°C. No entanto, como a fração de sobrenadante, a fração de sobrenadante preparada no Exemplo 67(2) (extrato de pKSN1609F de E. coli ou extrato de pKSN2 de E. coli) foi utilizada. As soluções de reação após a manutenção foram extraídas com acetato de etila e as camadas extraídas foram analisadas com TLC. Após desenvolvimento da placa de TLC, a presença de um ponto sobre ela correspondendo ao composto (III) marcado com 14C foi examinada (valor Rf 0,24 e 0,29). Um ponto correspondendo ao composto (III) foi detectado a partir da solução de reação contendo extrato de pKSN1609F de E. coli. Em contraste, tal ponto não foi detectado da solução de reação contendo o extrato de pKSN2 de E. coli.
Exemplo 68Metabolismo de compostos pela proteína (A16), (A17), (A18), (A19), (A20), (A21), (A22), (A23), (A24) ou (A25) da presente invenção (1) Metabolismo do composto (XII) pela proteína (A16) da presente invenção Foram preparados 100 μΙ de uma solução de reação de 50 mM de tampão de fosfato de potássio (pH 7,0) contendo 12,5 ppm do composto (XII), 3 mM de β-NADPH (daqui em diante referido como "componente A") (Oriental Yeast Company), 1 mg/ml de uma ferredoxina derivada de espinafre (daqui em diante referida como "componente B") (Sigma Company), 0,15 U/ml de ferredoxina redutase (daqui em diante referida como "componente C") (Sigma Company) e 20 μΐ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 49(2). A solução de reação foi mantida a 30°C por 10 minutos. Ainda, foram preparados e mantidos similarmente 100 μΙ de uma solução de reação de um tampão de fosfato de potássio de 50mM (pH 7,0) não tendo nenhuma adição de pelo menos um composto utilizado na composição da solução de reação acima, selecionado de componente A, componente B, componente Cea fração de sobrenadante preparada no Exemplo 49(2). Cinco microlitros (5 μΙ) de HCI 2N e 100 μΙ de acetato de etila foram adicionados e misturados a cada uma das soluções de reação após a manutenção. O sobrenadante centrifugado a 8.000xg foi filtrado com uma unidade de filtro de 0,22 μΐη UltraFree (Milipore Company). Quarenta microlitros (40 μΙ) do filtrado líquido (daqui em diante, o filtrado líquido derivado da solução de reação contendo componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 4(2) é referido como "solução de (A16) de metabolismo de (XII)"; ainda, o filtrado líquido derivado da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 49(2) é referido como "solução de (A16) de controle de (XII)") foram analisados em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XII) detectado da solução de (A16) de controle de (XII), a concentração do composto (XII) detectado da solução de (A16) de metabolismo de (XII) foi menor. Ainda, um pico, que não foi detectado a partir da solução de (A16) de controle de (XII), foi detectado a partir da solução de (A16) de metabolismo de (XII). O tempo de eluição do dito pico na HPLC combinava com um tempo de eluição de um pico de um composto onde a massa é 14 vezes menor do que o dito composto (XII) detectado a partir da solução de (A1) de metabolismo de (XII) no Exemplo 41(2). (2) Metabolismo do composto (XII) pela proteína (A17) da presente invenção Exceto pela utilização de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 51(2) ao invés de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 49(2), a solução de reação foi preparada e mantida de acordo com o método descrito no Exemplo 68(1). Similarmente ao Exemplo 68(1), a solução de reação após a manutenção foi preparada. Quarenta mi-crolitros (40 μΙ) do filtrado líquido obtido (daqui em diante, o filtrado líquido derivado da solução de reação contendo o componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 51(2) é referido como "solução de (A17) de metabolismo de (XII)"; ainda, o filtrado líquido derivado da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada do Exemplo 51(2) é referido como "solução de (A17) de controle de (XII)") foram analisados em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XII) detectado da solução de (A17) de controle de (XII), a concentração do composto (XII) detectado da solução de (A17) de metabolismo de (XII) foi menor. Ainda um pico, que não foi detectado da solução de (A17) de controle de (XII), foi detectado da solução de (A17) de metabolismo de (XII). O tempo de eluição do dito pico em HPLC combinou com um tempo de eluição de um pico de um composto onde a massa é 14 vezes menos do que o dito composto (XII) detectado da solução de (A1) de metabolismo de (XII) no Exemplo 41(2). (3) Metabolismo do composto (XII) pela proteína (A18) da presente invenção Exceto pela utilização de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 53(2) ao invés de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 49(2), a solução de reação foi preparada e mantida de acordo com o método descrito no Exemplo 68(1). Similarmente ao Exemplo 68(1), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi preparada. Quarenta microlitros (40 μΙ) do filtrado líquido obtido (daqui em diante, o filtrado líquido derivado da solução de reação contendo o componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 53(2) é referido como "solução de (A18) de metabolismo de (XII)"; ainda, o filtrado líquido derivado da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada do Exemplo 53(2) é referido como "solução de (A18) de controle de (XII)") foram analisados em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XII) detectado da solução de (A18) de controle de (XII), a concentração do composto (XII) detectado da solução de (A18) de metabolismo de (XII) foi menor. Ainda um pico, que não foi detectado da solução de (A18) de controle de (XII), foi detectado da solução de (A18) de metabolismo de (XII). O tempo de eluição do dito pico em HPLC combinou com um tempo de eluição de um pico de um composto onde a massa é 14 vezes menos do que o dito composto (XII) detectado da solução de (A1) de metabolismo de (XII) no Exemplo 41(2). (4) Metabolismo do composto (XII) pela proteína (A19) da presente invenção Exceto pela utilização de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 55(2) ao invés de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 49(2), a solução de reação foi preparada e mantida de acordo com o método descrito no Exemplo 68(1). Similarmente ao Exemplo 68(1), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi preparada.
Quarenta microlitros (40 μΙ) do filtrado líquido obtido (daqui em diante, o filtrado líquido derivado da solução de reação contendo o componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 55(2) é referido como "solução de (A19) de metabolismo de (XII)"; ainda, o filtrado líquido derivado da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada do Exemplo 55(2) é referido como "solução de (A19) de controle de (XII)") foram analisados em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XII) detectado da solução de (A19) de controle de (XII), a concentração do composto (XII) detectado da solução de (A19) de metabolismo de (XII) foi menor. Ainda um pico, que não foi detectado da solução de (A19) de controle de (XII), foi detectado da solução de (A19) de metabolismo de (XII). O tempo de eluição do dito pico em HPLC combinou com um tempo de eluição de um pico de um composto onde a massa é 14 vezes menos do que o dito composto (XII) detectado da solução de (A1) de metabolismo de (XII) no Exemplo 41(2). (5) Metabolismo do composto (XII) pela proteína (A20) da presente invenção Exceto pela utilização de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 57(2) ao invés de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 49(2), a solução de reação foi preparada e mantida de acordo com o método descrito no Exemplo 68(1). Similarmente ao Exemplo 68(1), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi preparada. Quarenta microlitros (40 μΙ) do filtrado líquido obtido (daqui em diante, o filtrado líquido derivado da solução de reação contendo o componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 57(2) é referido como "solução de (A20) de metabolismo de (XII)"; ainda, o filtrado líquido derivado da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada do Exemplo 57(2) é referido como "solução de (A20) de controle de (XII)") foram analisados em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XII) detectado da solução de (A20) de controle de (XII), a concentração do composto (XII) detectado da solução de (A20) de metabolismo de (XII) foi menor. Ainda um pico, que não foi detectado da solução de (A20) de controle de (XII), foi detectado da solução de (A20) de metabolismo de (XII). O tempo de eluição do dito pico em HPLC combinou com um tempo de eluição de um pico de um composto onde a massa é 14 vezes menos do que o dito composto (XII) detectado da solução de (A1) de metabolismo de (XII) no Exemplo 41(2). (6) Metabolismo do composto (XII) pela proteína (A21) da presente invenção Exceto pela utilização de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 59(2) ao invés de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 49(2), a solução de reação foi preparada e mantida de acordo com o método descrito no Exemplo 68(1). Similarmente ao Exemplo 68(1), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi preparada. Quarenta microlitros (40 μΙ) do filtrado líquido obtido (daqui em diante, o filtrado líquido derivado da solução de reação contendo o componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 59(2) é referido como "solução de (A21) de metabolismo de (XII)"; ainda, o filtrado líquido derivado da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada do Exemplo 59(2) é referido como "solução de (A21) de controle de (XII)") foram analisados em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XII) detectado da solução de (A21) de controle de (XII), a concentração do composto (XII) detectado da solução de (A21) de metabolismo de (XII) foi menor. Ainda um pico, que não foi detectado da solução de (A21) de controle de (XII), foi detectado da solução de (A21) de metabolismo de (XII). O tempo de eluição do dito pico em HPLC combinou com um tempo de eluição de um pico de um composto onde a massa é 14 vezes menos do que o dito composto (XII) detectado da solução de (A1) de metabolismo de (XII) no Exemplo 41(2). (7) Metabolismo do composto (XII) pela proteína (A22) da presente invenção Exceto pela utilização de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 61(2) ao invés de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 49(2), a solução de reação foi preparada e mantida de acordo com o método descrito no Exemplo 68(1). Similarmente ao Exemplo 68(1), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi preparada. Quarenta microlitros (40 μΙ) do filtrado líquido obtido (daqui em diante, o filtrado líquido derivado da solução de reação contendo o componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 61(2) é referido como "solução de (A22) de metabolismo de (XII)"; ainda, o filtrado líquido derivado da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada do Exemplo 61(2) é referido como "solução de (A22) de controle de (XII)") foram analisados em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XII) detectado da solução de (A22) de controle de (XII), a concentração do composto (XII) detectado da solução de (A22) de metabolismo de (XII) foi menor. Ainda um pico, que não foi detectado da solução de (A22) de controle de (XII), foi detectado da solução de (A22) de metabolismo de (XII). O tempo de eluição do dito pico em HPLC combinou com um tempo de eluição de um pico de um composto onde a massa é 14 vezes menos do que o dito composto (XII) detectado da solução de (A1) de metabolismo de (XII) no Exemplo 41(2). (8) Metabolismo do composto (XII) pela proteína (A23) da presente invenção Exceto pela utilização de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 63(2) ao invés de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 49(2), a solução de reação foi preparada e mantida de acordo com o método descrito no Exemplo 68(1). Similarmente ao Exemplo 68(1), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi preparada.
Quarenta microlitros (40 μΙ) do filtrado líquido obtido (daqui em diante, o filtrado líquido derivado da solução de reação contendo o componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 63(2) é referido como "solução de (A23) de metabolismo de (XII)"; ainda, o filtrado liquido derivado da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada do Exemplo 63(2) é referido como "solução de (A23) de controle de (XII)") foram analisados em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XII) detectado da solução de (A23) de controle de (XII), a concentração do composto (XII) detectado da solução de (A23) de metabolismo de (XII) foi menor. Ainda um pico, que não foi detectado da solução de (A23) de controle de (XII), foi detectado da solução de (A23) de metabolismo de (XII). O tempo de eluição do dito pico em HPLC combinou com um tempo de eluição de um pico de um composto onde a massa é 14 vezes menos do que o dito composto (XII) detectado da solução de (A1) de metabolismo de (XII) no Exemplo 41(2). (9) Metabolismo do composto (XII) pela proteína (A24) da presente invenção Exceto pela utilização de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 65(2) ao invés de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 49(2), a solução de reação foi preparada e mantida de acordo com o método descrito no Exemplo 68(1). Similarmente ao Exemplo 68(1), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi preparada. Quarenta microlitros (40 μΙ) do filtrado líquido obtido (daqui em diante, o filtrado líquido derivado da solução de reação contendo o componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 65(2) é referido como "solução de (A24) de metabolismo de (XII)"; ainda, o filtrado líquido derivado da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada do Exemplo 65(2) é referido como "solução de (A24) de controle de (XII)") foram analisados em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XII) detectado da solução de (A24) de controle de (XII), a concentração do composto (XII) detectado da solução de (A24) de metabolismo de (XII) foi menor. Ainda um pico, que não foi detectado da solução de (A24) de controle de (XII), foi detectado da solução de (A24) de metabolismo de (XII). O tempo de eluição do dito pico em HPLC combinou com um tempo de eluição de um pico de um composto onde a massa é 14 vezes menos do que o dito composto (XII) detectado da solução de (A1) de metabolismo de (XII) no Exemplo 41(2). (10) Metabolismo do composto (XII) pela proteína (A25) da presente invenção Exceto pela utilização de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 67(2) ao invés de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 49(2), a solução de reação foi preparada e mantida de acordo com o método descrito no Exemplo 68(1). Similarmente ao Exemplo 68(1), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi preparada. Quarenta microlitros (40 μΙ) do filtrado líquido obtido (daqui em diante, o filtrado líquido derivado da solução de reação contendo o componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 61(2) é referido como "solução de (A25) de metabolismo de (XII)"; ainda, o filtrado líquido derivado da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada do Exemplo 67(2) é referido como "solução de (A25) de controle de (XII)") foram analisados em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XII) detectado da solução de (A25) de controle de (XII), a concentração do composto (XII) detectado da solução de (A25) de metabolismo de (XII) foi menor. Ainda um pico, que não foi detectado da solução de (A25) de controle de (XII), foi detectado da solução de (A25) de metabolismo de (XII). O tempo de eluição do dito pico em HPLC combinou com um tempo de eluição de um pico de um composto onde a massa é 14 vezes menos do que o dito composto (XII) detectado da solução de (A1) de metabolismo de (XI!) no Exemplo 41(2). (11) Metabolismo do composto (XIII) pela proteína (A17) da presente invenção Exceto pela utilização de 12,5 ppm de composto (XIII) ao invés de 12,5 ppm do composto (XII), a solução de reação foi preparada e mantida de acordo com o método descrito no Exemplo 68(2). Similarmente ao Exemplo 68(1), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi preparada. Quarenta microlitros (40 μΙ) do filtrado líquido obtido (daqui em diante, o filtrado líquido derivado da solução de reação contendo o componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 51(2) é referido como "solução de (A17) de metabolismo de (XIII)"; ainda, o filtrado líquido derivado da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada do Exemplo 51(2) é referido como "solução de (A17) de controle de (XIII)") foram analisados em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XIII) detectado da solução de (A17) de controle de (XIII), a concentração do composto (XIII) detectado da solução de (A17) de metabolismo de (XIII) foi menor. Ainda um pico, que não foi detectado da solução de (A17) de controle de (XIII), foi detectado da solução de (A17) de metabolismo de (XIII). O tempo de eluição do dito pico em HPLC combinou com um tempo de eluição de um pico de um composto onde a massa é 14 vezes menos do que o dito composto (XIII) detectado da solução de (A1) de metabolismo de (XIII) no Exemplo 41(3). (12) Metabolismo do composto (XIII) pela proteína (A18) da presente invenção Exceto pela utilização de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 53(2) ao invés de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 51(2), a solução de reação foi preparada e mantida de acordo com o método descrito no Exemplo 68(1). Similarmente ao Exemplo 68(1), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi preparada. Quarenta microlitros (40 μΙ) do filtrado líquido obtido (daqui em diante, o fil- trado líquido derivado da solução de reação contendo o componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 53(2) é referido como "solução de (A18) de metabolismo de (XIII)"; ainda, o filtrado líquido derivado da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada do Exemplo 53(2) é referido como "solução de (A18) de controle de (XIII)") foram analisados em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XIII) detectado da solução de (A18) de controle de (XIII), a concentração do composto (XIII) detectado da solução de (A18) de metabolismo de (XIII) foi menor. Ainda um pico, que não foi detectado da solução de (A18) de controle de (XIII), foi detectado da solução de (A18) de metabolismo de (XIII). O tempo de eluição do dito pico em HPLC combinou com um tempo de eluição de um pico de um composto onde a massa é 14 vezes menos do que o dito composto (XIII) detectado da solução de (A1) de metabolismo de (XIII) no Exemplo 41(3). (13) Metabolismo do composto (XIII) peia proteína (A19) da presente invenção Exceto pela utilização de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 55(2) ao invés de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 51(2), a solução de reação foi preparada e mantida de acordo com o método descrito no Exemplo 68(1). Similarmente ao Exemplo 68(1), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi preparada. Quarenta microlitros (40 μΙ) do filtrado líquido obtido (daqui em diante, o filtrado líquido derivado da solução de reação contendo o componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 55(2) é referido como "solução de (A19) de metabolismo de (XIII)"; ainda, o filtrado líquido derivado da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada do Exemplo 55(2) é referido como "solução de (A19) de controle de (XIII)") foram analisados em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XIII) detectado da solução de (A19) de controle de (XIII), a concentração do composto (XIII) detectado da solução de (A19) de metabolismo de (XIII) foi menor. Ainda um pico, que não foi detectado da solução de (A19) de controle de (XIII), foi detectado da solução de (A19) de metabolismo de (XIII). O tempo de eluição do dito pico em HPLC combinou com um tempo de eluição de um pico de um composto onde a massa é 14 vezes menos do que o dito composto (XIII) detectado da solução de (A1) de metabolismo de (XIII) no Exemplo 41(3). (14) Metabolismo do composto (XIII) pela proteína (A20) da presente invenção Exceto pela utilização de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 57(2) ao invés de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 51(2), a solução de reação foi preparada e mantida de acordo com o método descrito no Exemplo 68(1). Similarmente ao Exemplo 68(1), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi preparada. Quarenta microlitros (40 μΙ) do filtrado líquido obtido (daqui em diante, o filtrado líquido derivado da solução de reação contendo o componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 57(2) é referido como "solução de (A20) de metabolismo de (XIII)"; ainda, o filtrado líquido derivado da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada do Exemplo 57(2) é referido como "solução de (A20) de controle de (XIII)") foram analisados em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XIII) detectado da solução de (A20) de controle de (XIII), a concentração do composto (XIII) detectado da solução de (A20) de metabolismo de (XIII) foi menor. Ainda um pico, que não foi detectado da solução de (A20) de controle de (XIII), foi detectado da solução de (A20) de metabolismo de (XIII). O tempo de eluição do dito pico em HPLC combinou com um tempo de eluição de um pico de um composto onde a massa é 14 vezes menos do que o dito composto (XIII) detectado da solução de (A1) de metabolismo de (XIII) no Exemplo 41(3). (15) Metabolismo do composto (XIII) pela proteína (A21) da presente invenção Exceto pela utilização de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 59(2) ao invés de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 51(2), a solução de reação foi preparada e mantida de acordo com o método descrito no Exemplo 68(1). Similarmente ao Exemplo 68(1), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi preparada. Quarenta microlitros (40 μΙ) do filtrado líquido obtido (daqui em diante, o filtrado líquido derivado da solução de reação contendo o componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 59(2) é referido como "solução de (A21) de metabolismo de (XIII)"; ainda, o filtrado líquido derivado da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada do Exemplo 59(2) é referido como "solução de (A21) de controle de (XIII)") foram analisados em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XIII) detectado da solução de (A21) de controle de (XIII), a concentração do composto (XIII) detectado da solução de (A21) de metabolismo de (XIII) foi menor. Ainda um pico, que não foi detectado da solução de (A21) de controle de (XIII), foi detectado da solução de (A21) de metabolismo de (XIII). O tempo de eluição do dito pico em HPLC combinou com um tempo de eluição de um pico de um composto onde a massa é 14 vezes menos do que o dito composto (XIII) detectado da solução de (A1) de metabolismo de (XIII) no Exemplo 41(3). (16) Metabolismo do composto (XIII) pela proteína (A23) da presente invenção Exceto pela utilização de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 63(2) ao invés de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 51(2), a solução de reação foi preparada e mantida de acordo com o método descrito no Exemplo 68(1). Similarmente ao Exemplo 68(1), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi preparada. Quarenta microlitros (40 μΙ) do filtrado líquido obtido (daqui em diante, o fil- trado líquido derivado da solução de reação contendo o componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 63(2) é referido como "solução de (A23) de metabolismo de (XIII)"; ainda, o filtrado líquido derivado da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada do Exemplo 63(2) é referido como "solução de (A23) de controle de (XIII)") foram analisados em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XIII) detectado da solução de (A23) de controle de (XIII), a concentração do composto (XIII) detectado da solução de (A23) de metabolismo de (XIII) foi menor. Ainda um pico, que não foi detectado da solução de (A23) de controle de (XIII), foi detectado da solução de (A23) de metabolismo de (XIII). O tempo de eluição do dito pico em HPLC combinou com um tempo de eluição de um pico de um composto onde a massa é 14 vezes menos do que o dito composto (XIII) detectado da solução de (A1) de metabolismo de (XIII) no Exemplo 41(3). (17) Metabolismo do composto (XIII) pela proteína (A25) da presente invenção Exceto pela utilização de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 67(2) ao invés de 20 μΙ da fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 51(2), a solução de reação foi preparada e mantida de acordo com o método descrito no Exemplo 68(1). Similarmente ao Exemplo 68(1), cada uma das soluções de reação após a manutenção foi preparada. Quarenta microlitros (40 μΙ) do filtrado líquido obtido (daqui em diante, o filtrado líquido derivado da solução de reação contendo o componente A, componente B, componente C e 20 μΙ de fração de sobrenadante recuperada no Exemplo 67(2) é referido como "solução de (A25) de metabolismo de (XIII)"; ainda, o filtrado líquido derivado da solução de reação não contendo nenhum componente A, nenhum componente B, nenhum componente C e nenhuma fração de sobrenadante recuperada do Exemplo 67(2) é referido como "solução de (A25) de controle de (XIII)") foram analisados em HPLC sob a condição de análise 1 acima. Comparado com a concentração do composto (XIII) detectado da solução de (A25) de controle de (XIII), a concentração do composto (XIII) detectado da solução de (A25) de metabolismo de (XIII) foi menor. Ainda um pico, que não foi detectado da solução de (A25) de controle de (XIII), foi detectado da solução de (A25) de metabolismo de (XIII). O tempo de eluição do dito pico em HPLC combinou com um tempo de eluição de um pico de um composto onde a massa é 14 vezes menos do que o dito composto (XIII) detectado da solução de (A1) de metabolismo de (XIII) no Exemplo 41(3).
Exemplo 69Hibridização onde o DNA (A1), (A2), (A3) ou (A4) da presente invenção foi uma sonda (1) Preparação de uma sonda PCR foi realizada de acordo com o método descrito no Exemplo 30(1). No entanto, como o molde, 10 ng do DNA cromossômico de Strepto-myces achromogenes IFO 12735 preparado no Exemplo 26(1) foram utilizados ao invés dos ditos 50 ng do DNA cromossômico de Streptomyces phae-ochromogenes IF012898 preparado no Exemplo 3(1). Como os iniciadores, foi utilizado um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 328 e o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 329. O DNA amplificado pela dita PCR foi recuperado para produzir uma sonda tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 109 marcada com digoxigenina (daqui em diante referida como "sonda de (A4) marcada com DIG"). (2) Preparação da solução de plasmídeo PCR foi realizada utilizando a mistura de polimerase genômica Advantage-GC (Clontech Company) e utilizando como o molde o DNA cromossômico de Streptomyces nogalator IF013445 preparado no Exempl 31(1). Como os iniciadores, foi utilizado o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 330 e o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 331. A solução de reação de PCR perfazia 50 μΙ através da adição de 2 iniciadores cada um perfazendo 200 nM, 10 ng do DNA cromossômico, 4,0 pde mistura de dNTP (uma mistura de 2,5 mM de cada um dos 4 tipos de dNTP; Clontech Com- pany), 10,0 μΙ de tampão 5xGC, 2,2 μΙ de 25 mM de Mg(OAc)2, 10,0 μΙ de GC-Melt 5 M e 1,0 μΙ de mistura de polimerase genômica Advantage-GC (Clontech Company) e água destilada. As condições de reação da PCR foram após manutenção de 94°C por 1 minuto, repetição de 7 ciclos de um ciclo que incluía manutenção a 94°C por 10 segundos e então 72°C por 3 minutos; repetição de 36 ciclos de um ciclo que incluía 94°C por 10 segundos e então 67°C por 3 minutos, e então manutenção a 67°C por 7 minutos. O DNA foi purificado a partir da solução de reação de PCR com o Kit de purificação QIAquick PCR (Qiagen Company) de acordo com as instruções anexas ao dito kit. O DNA obtido foi ligado ao vetor TA de clonagem pCR2.1 (Invitrogen Company), de acordo com o manual anexo, e foi introduzido em TOP10F' de E. coli (Invitrogen Company). O DNA do plasmídeo foi preparado a partir do transformante de E. coli obtido, utilizando o Kit QIAPrep Spin Miniprep (Qiagen Company) para se obter a uma solução de plasmídeo contendo o DNA (A11) da presente invenção.
Similarmente, PCR foi realizada utilizando como o molde o DNA cromossômico de Streptomyces tsusimaensis IFO 13782 preparado no Exemplo 33(1) e utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo a se-qüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 332 e o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 333. O DNA obtido através da PCR foi ligado ao vetor similar ao acima. E. coli foi então transformada. O plasmídeo foi preparado a partir do transformante de E. coli obtido para se obter uma solução de plasmídeo contendo o DNA (A12) da presente invenção.
Similarmente, PCR foi realizada utilizando como o molde o DNA cromossômico de Streptomyces thermocoerulesces IFO 14273t preparado no Exemplo 35(1) e utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 331 e o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 334. O DNA obtido através da PCR foi ligado ao vetor similar ao acima. E. coli foi então transformada. O plasmídeo foi preparado a partir do transformante de E. coli obtido para se obter uma solução de plasmídeo contendo o DNA (A13) da presente invenção.
Similarmente, PCR foi realizada utilizando como o molde o DNA cromossômico de Streptomyces glomerochromogenes IFO 13673t preparado no Exemplo 37(1) e utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 330 e o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 331. O DNA obtido através da PCR foi ligado ao vetor similar ao acima. E. coli foi então transformada. O plasmídeo foi preparado a partir do transformante de E. coli obtido para se obter uma solução de plasmídeo contendo o DNA (A14) da presente invenção.
Similarmente, PCR foi realizada utilizando como o molde o DNA cromossômico de Streptomyces olivochromogenes IFO 12444 preparado no Exemplo 39(1) e utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 330 e o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 331. O DNA obtido através da PCR foi ligado ao vetor similar ao acima. E. coli foi então transformada. O plasmídeo foi preparado a partir do transformante de E. coli obtido para se obter uma solução de plasmídeo contendo o DNA (A15) da presente invenção.
Similarmente, PCR foi realizada utilizando como o molde o DNA cromossômico de Streptomyces ornatus IFO 13069t preparado no Exemplo 48(1) e utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 335 e o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 336. O DNA obtido através da PCR foi ligado ao vetor similar ao acima. E. coli foi então transformada. O plasmídeo foi preparado a partir do transformante de E. coli obtido para se obter uma solução de plasmídeo contendo o DNA (A16) da presente invenção.
Similarmente, PCR foi realizada utilizando como o molde o DNA cromossômico de Streptomyces griseus ATCC 10137 preparado no Exemplo 50(1) e utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 335 e o oligonucleotídeo tendo a se- qüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 336. O DNA obtido através da PCR foi ligado ao vetor similar ao acima. E. coli foi então transformada. O plasmídeo foi preparado a partir do transformante de E. coli obtido para se obter uma solução de plasmídeo contendo o DNA (A17) da presente invenção.
Similarmente, PCR foi realizada utilizando como o molde o DNA cromossômico de Streptomyces achromogenes IFO 12735 preparado no Exemplo 52(1) e utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo a se-qüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 330 e o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 331. O DNA obtido através da PCR foi ligado ao vetor similar ao acima. E. coli foi então transformada. O plasmídeo foi preparado a partir do transformante de E. coli obtido para se obter uma solução de plasmídeo contendo o DNA (A18) da presente invenção.
Similarmente, PCR foi realizada utilizando como o molde o DNA cromossômico de Streptomyces griseus IFO 13849T preparado no Exemplo 54(1) e utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 333 e o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 335. O DNA obtido através da PCR foi ligado ao vetor similar ao acima. E. coli foi então transformada. O plasmídeo foi preparado a partir do transformante de E. coli obtido para se obter uma solução de plasmídeo contendo o DNA (A19) da presente invenção.
Similarmente, PCR foi realizada utilizando como o molde o DNA cromossômico de Streptomyces lanatus IFO 12787T preparado no Exemplo 56(1) e utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 331 e o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 337. O DNA obtido através da PCR foi ligado ao vetor similar ao acima. E. coli foi então transformada. O plasmídeo foi preparado a partir do transformante de E. coli obtido para se obter uma solução de plasmídeo contendo o DNA (A20) da presente invenção.
Similarmente, PCR foi realizada utilizando como o molde o DNA cromossômico de Streptomyces misawanensis IFO 13855T preparado no Exemplo 58(1) e utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo a se-qüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 331 e o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 338. O DNA obtido através da PCR foi ligado ao vetor similar ao acima. E. coli foi então transformada. O plasmídeo foi preparado a partir do transformante de E. coli obtido para se obter uma solução de plasmídeo contendo o DNA (A21) da presente invenção.
Similarmente, PCR foi realizada utilizando como o molde o DNA cromossômico de Streptomyces roseorubens IFO 13682T preparado no Exemplo 62(1) e utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 331 e o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 339. O DNA obtido através da PCR foi ligado ao vetor similar ao acima. E. coli foi então transformada. O plasmídeo foi preparado a partir do transformante de E. coli obtido para se obter uma solução de plasmídeo contendo o DNA (A23) da presente invenção.
Similarmente, PCR foi realizada utilizando como o molde o DNA cromossômico de Streptomyces steffisburgensis IFO 13446T preparado no Exemplo 66(1) e utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 331 e o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 339. O DNA obtido através da PCR foi ligado ao vetor similar ao acima. E. coli foi então transformada. O plasmídeo foi preparado a partir do transformante de E. coli obtido para se obter uma solução de plasmídeo contendo o DNA (A25) da presente invenção.
Ainda, similarmente, PCR foi realizada utilizando como o molde o DNA cromossômico de Streptomyces pallidus IFO 13434T preparado no Exemplo 60(1) e utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 340 e o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 341. O DNA obtido através da PCR foi ligado ao vetor similar ao acima. E. coli foi então transformada. O plasmídeo foi preparado a partir do transformante de E. coli obtido para se obter uma solução de plasmídeo contendo o DNA (A22) da presente invenção.
Similarmente, PCR foi realizada utilizando como o molde o DNA cromossômico de Streptomyces rutgersensis IFO 15875T preparado no Exemplo 64(1) e utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo a se-qüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 342 e o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 343. O DNA obtido através da PCR foi ligado ao vetor similar ao acima. E. coli foi então transformada. O plasmídeo foi preparado a partir do transformante de E. coli obtido para se obter uma solução de plasmídeo contendo o DNA (A24) da presente invenção. (2) Hibridização dot-blot Cerca de 100 ng e 10 ng de cada um dos plasmídeos preparados no Exemplo 69(2) foi manchado em uma Membrana de náilon Hybond N+ (Amersham Bioscience Company). Os plasmídeos eram: o DNA de plasmídeo contendo o DNA (A11) da presente invenção, o DNA de plasmídeo contendo o DNA (A12) da presente invenção, o DNA de plasmídeo contendo o DNA (A13) da presente invenção, o DNA de plasmídeo contendo o DNA (A14) da presente invenção, o DNA de plasmídeo contendo o DNA (A15) da presente invenção, o DNA de plasmídeo contendo o DNA (A16) da presente invenção, o DNA de plasmídeo contendo o DNA (A17) da presente invenção, o DNA de plasmídeo contendo o DNA (A18) da presente invenção, o DNA de plasmídeo contendo o DNA (A19) da presente invenção, o DNA de plasmídeo contendo o DNA (A20) da presente invenção, um DNA de plasmídeo contendo o DNA (A21) da presente invenção, o DNA de plasmídeo contendo o DNA (A23) da presente invenção e o DNA de plasmídeo contendo o DNA (A25) da presente invenção. Luz ultravioleta foi direcionada às membranas obtidas com um transiluminador por 5 minutos.
Hibridização e detecção foram realizadas de acordo com o método descrito no Exemplo 30(2). As sondas preparadas no Exemplo 30(1) foram mantidas a 100°C por 5 minutos e então resfriadas em gelo. Como as sondas, foi utilizado o DNA tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 6 marcada com digoxigenina (daqui em diante referidas como "sonda de (A1) marcada com DIG"), o DNA tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 7 marcada com digoxigenina (daqui em diante referidas como "sonda de (A2) marcada com DIG"), o DNA tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 8 marcada com digoxigenina (daqui em diante referida como "sonda de (A3) marcada com DIG") ou a sonda de (A4) marcada com DIG produzida no Exemplo 69(1). Nos casos de utilização de qualquer uma da sonda (A1), (A2), (A3) ou (A4) marcada com DIG para hibridização, um sinal foi detectado para cada um dos reagentes dos 10 ng e 100 ng de cada um do DNA de plasmídeo acima.
Ainda, simiiarmente, cerca de 10 ng e 100 ng de cada um do DNA de plasmídeo contendo o DNA (A22) da presente invenção preparada no Exemplo 69(2) e o DNA de plasmídeo contendo o DNA (A24) da presente invenção são manchados em uma membrana de náilon Hybond N+ (Amer-sham Bioscience Company). Hibridização e detecção são realizadas de acordo com o Exemplo 30(2).
Exemplo 70Preparação de DNA (A23) da presente invenção onde o uso de códon foi ajustado para expressão em soja (daqui em diante referida como " DNA (A23)S da presente invenção) (1) Preparação do DNA (A23)S da presente invenção PCR foi realizada com DNA polimerase Pyrobest (Takara Shuzo Company) de acordo com o manual anexo, utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 346 e um oligonucleotídeo tendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 367. Uma alíquota do produto de PCR obtido foi utilizada como um molde para uma PCR realizada similarmente utilizando um iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 345 e oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 366. Ainda, uma alíquota desse produto de PCR foi utilizada como um molde para uma PCR realizada similarmente utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 344 e um iniciador tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 365. A solução de reação obtida foi chamada solução de reação 1.
Ainda, PCR foi realizada com o DNA polimerase Pyrobest (Taka-ra Shuzo Company) de acordo com o manual anexo, utilizando como inicia-dores o oligonucleotídeo tendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 349 e o oligonucleotídeo tendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 364. Uma alíquota do produto de PCR obtido foi utilizada como um molde para uma PCR realizada similarmente utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 348 e o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 363. Ainda, uma alíquota desse produto de PCR foi utilizada como um molde para uma PCR realizada similarmente utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 347 e oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 362. A solução de reação obtida foi chamada solução de reação 2.
Ainda, PCR foi realizada com o DNA polimerase Pyrobest (Taka-ra Shuzo Company) de acordo com o manual anexo, utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 352 e um oligonucleotídeo tendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 361. Uma alíquota do produto de PCR obtido foi utilizada como um molde para uma PCR realizada similarmente utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 351 e um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 360. Ainda, uma alíquota desse produto de PCR foi utilizada como um molde para uma PCR realizada similarmente utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 350 e um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 359. A solução de reação obtida foi chamada solução de reação 3.
Ainda, PCRfoi realizada com o DNA polimerase Pyrobest (Taka-ra Shuzo Company) de acordo com o manual anexo, utilizando como inicia-dores o oligonucleotídeo tendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 355 e oligonucleotídeo tendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 358. Uma alíquota do produto de PCR obtido foi utilizada como um molde para uma PCR realizada similarmente utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 354 e oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 357. Ainda, uma alíquota desse produto de PCR foi utilizada como um molde para uma PCR realizada similarmente utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 353 e oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 356. A solução de reação obtida foi chamada solução de reação 4.
As soluções de reação 1 a 4 obtidas de tal maneira foram misturadas. PCR foi realizada com o DNA polimerase Pyrobest (Takara Shuzo Company) de acordo com o manual anexo, utilizando como um molde uma alíquota da sua mistura e utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 344 e oligonucleotídeo tendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 356. A seqüência de nucleotídeo do DNA amplificado foi confirmada. Foi obtido um DNA tendo uma seqüência onde a seqüência de nucleotídeo 5'-cat-3' é conectada a montante do terminal 5' e a seqüência de nucleotídeo 5'-aagctt-3' é conectada a jusante do terminal 3' da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 368. O uso de códon do DNA (A23) da presente invenção tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 232 (teor de GC de 73,10%) é mostrado na Tabela 28 e Tabela 29. O uso de códon de soja (teor de GC de 46,12%) é mostrado na Tabela 24 e Tabela 25. O uso de códon do DNA (A23) da presente invenção tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 368 (teor de GC de 52,38%) é mostrado na Tabela 30 e Tabela 31.
Tabela 28 Tabela 29 Tabela 30 Tabela 31 (2) Produção de uma E. coli transformada tendo a proteína (A23)S da presente invenção O DNA tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 368 obtida no Exemplo 70(1) foi digerido com as enzimas de restrição Ndel e Hindlll. O DNA obtido e o plasmídeo pKSN2 digerido com Ndel e Hindlll foram ligados para se obter um plasmídeo onde o DNA tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 368 é inserido entre o sítio Ndel e o sítio Hindlll de pKSN2 (daqui em diante referido como "pKSN1584soja"). O dito plasmídeo foi introduzido em JM109 de E. coli. O transformante de E. coli obtido foi chamado JM109/pKSN1584soja. (3) Expressão da proteína (A23)S da presente invenção em E. colie recuperação da dita proteína Similarmente ao Exemplo 4(2), cada um de JM109/pKSN1584soja de E. coli obtido no Exemplo 70(2) e JM109/pKSN1584F de E. coli obtidos no Exemplo 63(1) foi culturado. As células foram recuperadas. Soluções de lisato de célula foram preparadas. Sob o método descrito no Exemplo 4(2), frações de sobrenadante foram preparadas a partir das soluções de lisato de célula (daqui em diante a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN1584soja de E. coli é referida como "extrato de pKSN1584soja de E. coir e a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN1584F de E. coli é referida como "extrato de pKSN1584F de E. coli"). A quantidade de P450 por quantidade de proteína contida em extrato de pKSN1584soja foi comparada com e foi maior do que a quantidade de P450 pela quantidade de proteína contida em extrato de pKSN1584F de E. coli.
Exemplo 71 Preparação e Expressão do DNA (A25) da presente invenção onde o uso de códon foi ajustado para expressão em soja (daqui em diante referida como " DNA (A25)S da presente invenção") (1) Preparação do DNA (A25)S da presente invenção PCR foi realizada com DNA polimerase Pyrobest (Takara Shuzo Company) de acordo com o manual anexo, utilizando como iniciador o oligo-nucleotídeo tendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 371 e o oligonucleotídeo tendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 392. Uma alíquota do produto de PCR obtido foi utilizada como um molde para uma PCR realizada similarmente utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 370 e um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 319. Ainda, uma alíquota desse produto de PCR foi utilizada como um molde para uma PCR realizada similarmente utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 369 e oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 390. A solução de reação obtida foi chamada solução de reação 1.
Ainda, PCR foi realizada com o DNA polimerase Pyrobest (Taka-ra Shuzo Company) de acordo com o manual anexo, utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 374 e o oligonucleotídeo tendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 389. Uma alíquota do produto de PCR obtido foi utilizada como um molde para uma PCR realizada similarmente utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 373 e oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 383. Ainda, uma alíquota desse produto de PCR foi utilizada como um molde para uma PCR realizada similarmente utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 372 e oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 387. A solução de reação obtida foi chamada solução de reação 2.
Ainda, PCR foi realizada com o DNA polimerase Pyrobest (Taka-ra Shuzo Company) de acordo com o manual anexo, utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 377 e oligonucleotídeo tendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 386. Uma alíquota do produto de PCR obtido foi utilizada como um molde para uma PCR realizada similarmente utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mos- trada na SEQ ID NO: 376 e oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotí-deo mostrada na SEQ ID NO: 385. Ainda, uma alíquota desse produto de PCR foi utilizada como um molde para uma PCR realizada similarmente utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 375 e oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 384. A solução de reação obtida foi chamada solução de reação 3.
Ainda, PCR foi realizada com o DNA polimerase Pyrobest (Taka-ra Shuzo Company) de acordo com o manual anexo, utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 380 e oligonucleotídeo tendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 383. Uma alíquota do produto de PCR obtido foi utilizada como um molde para uma PCR realizada similarmente utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 379 e o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 382. Ainda, uma alíquota desse produto de PCR foi utilizada como um molde para uma PCR realizada similarmente utilizando iniciadores o oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 378 e oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 381. A solução de reação obtida foi chamada solução de reação 4.
As soluções de reação 1 a 4 obtidas de tal maneira foram misturadas. PCR foi realizada com o DNA polimerase Pyrobest (Takara Shuzo Company) de acordo com o manual anexo, utilizando como um molde uma alíquota da sua mistura e utilizando como iniciadores o oligonucleotídeo tendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 369 e oligonucleotídeo tendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 381. A seqüência de nucleotídeo do DNA amplificado foi confirmada. Foi obtido um DNA tendo uma seqüência onde a seqüência de nucleotídeo 5’-cat-3' é conectada a montante do terminal 5' e a seqüência de nucleotídeo 5'-aagctt-3' é conectada a jusante do terminal 3’ da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 393. O uso de códon do DNA (A25) da presente invenção tendo a se-qüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 234 (teor de GC de 71,93%) é mostrado na Tabela 32 e Tabela 33. O uso de códon de soja (teor de GC de 46,12%) é mostrado na Tabela 24 e Tabela 25. O uso de códon do DNA (A25)S da presente invenção tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 393 (teor de GC de 52,05%) é mostrado na Tabela 34 e Tabela 35.
Tabela 32 Tabela 33 Tabela 33 (Continuação) Tabela 34 Tabela 35 (2) Produção de uma E. coli transformada tendo a proteína (A25)S da presente invenção O DNA tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 393 obtida no Exemplo 71(1) foi digerido com as enzimas de restrição Ndel e Hindlll. O DNA obtido e o plasmídeo de pKSN2 digerido com Ndel e Hindlll foram ligados para se obter um plasmídeo onde o DNA tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 393 é inserido entre o sítio Ndel e o sítio Hindlll de pKSN2 (daqui em diante referido como "pKSN1609soja"). O dito plasmídeo foi introduzido em JM109 de E. coli. O transformante de E. coli obtido foi chamado JM109/pKSN1609soja. (3) Expressão da proteína (A25)S da presente invenção em E. coli e recuperação da dita proteína Similarmente ao Exemplo 4(2), cada um de JM109/pKSN1609soja de E. coli obtido no Exemplo 71(2) e JM109/pKSN109F de E. coli obtidos no Exemplo 67(1) foi culturado. As células foram recuperadas. Soluções de lisato de célula foram preparadas. Sob o método descrito no Exemplo 4(2), frações de sobrenadante foram preparadas a partir das soluções de lisato de célula (daqui em diante a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN1609soja de E. colié referida como "extrato de pKSN1609soja de E. coir e a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN1609F de E. coli é referida como "extrato de pKSN1609F de E. co//”). A quantidade de P450 por quantidade de proteína contida em extrato de pKSN1609soja foi comparada com e foi maior do que a quantidade de P450 pela quantidade de proteína contida em extrato de pKSN1609F.
Exemplo 72Preparação do Anticorpo (A) da presente invenção de reconhecimento da proteína (A25) da presente invenção (daqui em diante referida como "(A25) de anticorpo da presente invenção") (1) Preparação do extrato de uma E. coli expressando a proteína (A25) da presente invenção De acordo com o método descrito no Exemplo 4(2), JM109/pKSN 1609soja de E. coli, produzido no Exemplo 71(2), foi pré-culturado da noite para o dia. O meio de cultura obtido foi inoculado para 1L de meio TB contendo 50 pg/ml de ampicilina e culturado a 26o C. Então ácido 5-aminolevulínico foi adicionado para a concentração final de 500 μΜ, e IPTG foi adicionado para uma concentração final de 1 mM, e que foi adicionalmente culturado. As células foram recuperadas do meio de cultura, foram lavadas com 0,05M de Tampão Tris-HCI (pH 7,5) e então suspensos em 100 ml do dito tampão contendo PMSF 1 mM. O meio de cultura de célula obtido foi submetido 3 vezes a um sonificador (Sonifier (Branson Sonic Power Company)) em 10 minutos cada um sob as condições de produção de 5, ciclo de serviço 30%, a fim de se obter as soluções de lisato de célula. Após centrifugação das soluções de lisato de célula (9.000 xg, 10 minutos) os so-brenadantes foram recuperados e centrifugados (200.000 xg, 70 minutos) para recuperar as frações de sobrenadante (daqui a fração de sobrenadante obtida de JM109/pKSN1609soja de E. coli é referido como "extrato de pKSN1609soja de £. coir. (2) Purificação da proteína (A25) da presente invenção A fração sobrenadante obtida no Exemplo 72(1) (extrato de pKSN1609soja de E. coli) foi injetada em uma coluna Hiload HiLoad16/10 Q Sepharose HP (Amersham Bioscience Company). Em seguida, após deixar fluir 40 ml de tampão de bistrispropano 20 mM (pH 7,0) na coluna, tampão de bistrispropano 20 mM foi deixado fluir com um gradiente linear de NaCI (o gradiente de NaCI foi 0,00125M/minuto, a faixa de concentração de NaCI foi de 0M a 0,375M, a taxa de fluxo foi 3 ml/min) para recuperação de fração de 10 ml de frações eluindo na concentração de NaCI a partir de 0.088M a 0.100M.
As frações recuperadas foram submetidas a uma coluna PD10 (Amersham Bioscience Company) e eluída com 20 mM de tampão de bistrispropano (pH 7,0) para recuperar as frações contendo proteína. Em seguida, as frações foram injetadas em uma MonoQ HR 10/10 (Amersham Bioscience Company). Dezesseis mililitros (16 ml) de tampão de bistrispropano foram fluidos para a coluna. Em seguida, 20 mM de tampão de bistrispropano foram fluidos com um gradiente linear de NaCI (o gradiente de NaCI foi 0,001042M/minuto, a faixa de concentração de NaCI foi de 0M a 0,25 M, a taxa de fluxo foi 4 ml/minuto) para recuperação de fração de 8 ml de frações eluindo na concentração de NaCI a partir de 0,060 M a 0,069 M.
As frações recuperadas foram diluídas 2,5 vezes com tampão de bistrispropano 20 mM (pH 7,0) e injetadas em uma coluna MonoQ HR 5/5 (Amersham Bioscience Company). Em seguida, após deixar fluir 2 ml de tampão de bistrispropano 20 mM (pH 7,0) na coluna, tampão de bistrispropano 20 mM foi deixado fluir com um gradiente linear de NaCI (o gradiente de NaCI foi 0,008333M/minuto, a faixa de concentração de NaCI foi de 0M a 0,25M, a taxa de fluxo foi 1 ml/min) para recuperação de fração de 0,5 ml de frações eluindo na concentração de NaCI a partir de 0,073M a 0,077M.
As frações purificadas dessa maneira foram analisadas com SDS-PAGE utilizando um "PAG mini Daiichi 10/20" (Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.) para confirmar que aquelas frações foram frações que continham principalmente a proteína (A15) da presente invenção. (3) Preparação da (A25) de anticorpo da presente invenção A preparação do anticorpo da presente invenção foi realizada de acordo com o método descrito no Exemplo 44(3). No entanto, ao invés de utilizar a proteína (A1) da presente invenção, a proteína (A25) da presente invenção obtido no Exemplo 72(2) foi utilizada para se obter o antisoro contendo a (A25) de anticorpo da presente invenção.
Exemplo 73Detecção da proteína da presente invenção pela (A25) de anticorpo da presente invenção Um imunoblot foi realizado usando (A25) da presente invenção obtida no Exemplo 72(3) com cada um dos extratos de E. coli. Houve uma eletroforese de poliacrilamida SDS (40 mA, 1 hora) de: extrato de pKSN452F de E. coli obtido no Exemplo 49(2) (contendo cerca de 2 pmoles da proteína (A16) da presente invenção: o extrato de pKSN608F de E. coli obtido no Exemplo 51(2) (contendo cerca de 2 pmoles da proteína (A17) da presente invenção): o extrato de pKSN646BF de E. coli obtido no Exemplo 53(2) (contendo cerca de 2 pmoles da proteína (A18) da presente invenção); o extrato de pKSN1502F de E. coli obtido no Exemplo 55(2) (contendo cerca de 2 pmoles da proteína (A19) da presente invenção; o extrato de pKSN1525F de E. coli obtido no Exemplo 57(2) (contendo cerca de 2 pmoles da proteína (A20) da presente invenção; o extrato de pKSN1543BF de E. coli obtido no Exemplo 59(2) (contendo cerca de 2 pmoles da proteína (A21) (da presente invenção); o extrato de pKSN1558BF de E. coli obtido no Exemplo 61(2) (contendo cerca de 2 pmoles da proteína (A22) da presente invenção); o extrato de pKSN1584F de E. coli obtido no Exemplo 63(2) (contendo cerca de 2 pmoles da proteína (A23) da presente invenção); o extrato de pKSN1589BF de E. coli obtido no Exemplo 65(2) (contendo cerca de 2 pmoles da proteína (A24) da presente invenção); o extrato de pKSN1609F de E. coli obtido no Exemplo 67(2) (contendo cerca de 0,5 pmol da proteína (A25) da presente invenção); o extrato de pKSN1584soja de E. coli obtido no Exemplo 70(3) (contendo cerca de 2 pmoles da proteína (A23) da presente invenção); o extrato de pKSN1609soja de E. coli obtido no Exemplo 71(3) (contendo cerca de 0,5 pmol da proteína (A25) da presente invenção); e o extrato de pKSN2 obtido no Exemplo 67(2) (contendo cerca de 0,8 mg de proteína). As proteínas no dito gel foram transferidas para a membrana de PVDF de acordo com o método descrito no Exemplo 45. A membrana de PDVF obtida no Exemplo 45 (daqui em diante referida como "membrana (A) de PDVF") e a membrana obtida a partir do método acima (daqui em diante referida como "membrana (B) de PDVF") foram reagidas com o anti-soro obtido no Exemplo 72(3), de acordo com o método descrito no Exemplo 45. Subseqüentemente, foi realizada uma reação com um anticorpo secundário, uma lavagem e tingimento de acordo com o método descrito no Exemplo 45. Os tingimentos para as faixas correspondendo às proteínas (A1), (A2), (A3), (A4), (A11), (A12), (A13), (A14) e (A15) da presente invenção bem como as presentes proteínas (A9) e (A10) foram detectados na membrana (A) de PDVF. Os tingimentos para faixas correspondentes às proteínas (A16), (A17), (A18), (A19), (A20), (A21), (A22), (A23), (A24) e (A25) foram detectadas na membrana (B) de PDVF. Nenhuma faixa tingida foi detectada com o reagente de extrato de pKSN2 de E. coli obtido no Exemplo 4(2) (contendo 0,78 mg de proteína) da membrana (A) de PDVF e com o reagente de extrato de pKSN2 de E. coli obtido no Exemplo 67(2) (contendo 0,8 mg de proteína) da membrana (B) de PDVF.
Exemplo 74lntrodução do DNA (A23) da presente invenção em uma planta (1) Construção de um plasmídeo expressando cloroplasto contendo o DNA (A23)S da presente invenção para introdução direta -parte 1 Um plasmídeo contendo um DNA quimérico onde o DNA (A23)S da presente invenção foi conectada imediatamente após a seqüência de nu-cleotídeo codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC de soja (cv. Jack) sem uma mudança de estruturas nos códons foi construído como um plasmídeo para introdução do DNA (A23)S da presente invenção em uma planta com o método de pistola de partícula.
Primeiro, DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 398 foi amplificado através de PCR. A PCR foi realizada utilizando como um molde pKSN1584soja obtido no Exemplo 70(2) e utilizando como iniciadores um oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 397 e um oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 398. A PCR utilizou KOD-plus (Toyobo Company). A PCR aconteceu após condução de uma manutenção a 94°C por 2 minutos; 20 ciclos de um ciclo que incluía manutenção a 94°C por 30 segundos, seguido por 53°C por 30 segundos, e seguido por 68°C por 90 segundos; e uma manutenção final a 68°C por 3 segundos. O DNA amplificado foi recuperado e purificado com MagExtractor-PCR & Gel-Clean up (Toyobo Company) realizando os procedimentos de acordo com o manual anexo. Tratando o DNA obtido com TaKaRa BKLKit (Takara Shuzo Company) de acordo com o manual anexo, o DNA teve a extremidade cega e teve o terminal 5' fosforilado. Um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 368 foi recuperado. Após digestão do plasmídeo pUC19 (Takara Shuzo Company) com Smal, o terminal 5' foi desfosforilado com alcalina fosfatase de intestino de bezerro (Takara Shuzo Company). Um plasmídeo foi produzido ligando o DNA desfosforilado resultante e o DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 368. Após digestão do plasmídeo obtido com as enzimas de restrição EcoT22l e Saci, o DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 368 foi recuperado. Após digestão do plasmídeo pUCrSt657 obtido no Exemplo 16(2) com as enzimas de restrição EcoT22l e Saci, foi isolado um DNA de cerca de 2,9 kpb tendo uma seqüência de nucleotídeo derivada de pUC19 e uma seqüência codificando um peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC de soja (cv. Jack). O DNA obtido e o DNA acima compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 368 foram ligados para se obter pUCrSt1584soja (Figura 54) contendo um DNA quimérico onde o DNA (A23)S da presente invenção foi conectada imediatamente após a seqüência de nucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC de soja (cv. Jack) sem uma mudança de estrutu- ras nos códons. O plasmídeo pUCrStl 584soja obtido foi digerido com as enzimas de restrição BamHI e Saci para isolar um DNA compreendendo uma se-qüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 368. O dito DNA foi inserido entre o sítio de restrição de Bglll e o sítio de restrição de Saci de plasmídeo pNdG6-AT obtido no Exemplo 16(2) para se obter pSUM-NdG6-rSt-1584soja (Figura 55) onde o promotor CR16G6 tem conectado a jusante o DNA quimérico onde o dito DNA foi conectado imediatamente após a se-qüência de nucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC de soja (cv. Jack) sem uma mudança nas estruturas nos códons.
Em seguida, o plasmídeo foi introduzido em células competentes DH5a de E. coli (Takara Shuzo Company) e as células resistentes à ampici-lina foram selecionadas. Ainda, as seqüências de nucleotídeo dos plasmí-deos contidos nas cepas resistentes à ampicilina foram determinadas utilizando o Kit de reação BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready v3.0 (PE Applied Biosystems Company) e seqüenciador de DNA 3100 (PE Applied Biosystems Company). Como resultado, foi confirmado que o plasmídeo pSUM-NdG6-rSt-1584soja tem a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 368. (2) Construção de um plasmídeo de expressão de cloroplasto tendo o DNA (A23) da presente invenção para introdução direta - parte (2) Um plasmídeo foi construído para introdução do DNA (A23)S da presente invenção em uma planta com o método de pistola de partícula. O plasmídeo continha um DNA quimérico onde o DNA (A23)S da presente invenção foi conectado imediatamente após as seqüências de nucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC de soja (cv. Jack) e codificando em seguida 12 aminoacidos da proteína madura, sem uma mudança de estruturas nos códons. Primeiro, DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 368 foi amplificado através de PCR. A PCR foi realizada utilizando como um molde pKSN1584soja obtido no Exemplo 70 e utilizando como iniciadores um oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 399 e um oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 398. A PCR utilizou KOD-plus (Toyobo Com-pany). A PCR aconteceu após condução de uma manutenção a 94°C por 2 minutos; 25 ciclos de um ciclo que incluía manutenção a 94°C por 30 segundos, seguido por 46°C por 30 segundos, e seguido por 68°C por 90 segundos; e uma manutenção final a 68°C por 3 segundos. O DNA amplificado foi recuperado e purificado com MagExtractor-PCR & Gel-Clean up (Toyobo Company) realizando os procedimentos de acordo com o manual anexo. Tratando o DNA obtido com TaKaRa BKLKit (Takara Shuzo Company) de acordo com o manual anexo, o DNA teve a extremidade cega e teve o terminal 5' fosforilado. Um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 368 foi recuperado. Após digestão do plasmídeo pKF19ABs obtido no Exemplo 15(3) com Smal, o terminal 5'foi desfosforilado com alcalina fosfatase de intestino de bezerro (Takara Shuzo Company). Um plasmídeo foi produzido ligando o DNA desfosforilado resultante e o DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 368. Após digestão do plasmídeo obtido com as enzimas de restrição BspHI e Saci, o DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 368 foi recuperado. Em seguida, o plasmídeo pKFrStl2-657 obtido no Exemplo 16(3) foi digerido com as enzimas de restrição BspHI e Saci para isolar o DNA derivado do plasmídeo pKFrSt12. O dito DNA foi ligado com o DNA que foi digerido com as enzimas de restrição Saci e BspHI e que compreende a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 368, a fim de se obter o plasmídeo pKFrSt12-1584soja (Figura 56) contendo o DNA quimérico onde o DNA (A23) da presente invenção foi conectado imediatamente após a seqüência de nucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC de soja (cv. Jack) codificando em seguida 12 aminoacidos da proteína madura, sem uma mudança de estruturas nos códons. O plasmídeo pKFrSt12-1584soja obtido foi digerido com as en- zimas de restrição BamHI e Saci para isolar um DNA compreendendo a se-qüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 368. O dito DNA foi inserido entre o sítio de restrição de Bglll e o sítio de restrição de Saci de plasmí-deo pNdG6-AT se obter pSUM-NdG6-rSt-1584soja (Figura 57) onde o promotor CR16G6 tem conectado a jusante o DNA quimérico onde o dito DNA foi conectado imediatamente após a seqüência de nucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC de soja (cv. Jack) sem uma mudança nas estruturas nos códons.
Em seguida, o plasmídeo foi introduzido em células competentes DH5a de E. coli (Takara Shuzo Company) e as células resistentes à ampici-lina foram selecionadas. Ainda, as seqüências de nucleotídeo dos plasmí-deos contidos nas cepas resistentes à ampicilina foram determinadas utilizando o Kit de reação BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready v3.0 (PE Applied Biosystems Company) e seqüenciador de DNA 3100 (PE Applied Biosystems Company). Como resultado, foi confirmado que o plasmídeo pSUM-NdG6-rSt-1584soja tem a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 368. (3) Introdução do DNA (A23)S da presente invenção em soja Os embriões globulares de soja (cultivar: Fayette e Jack) foram preparados de acordo com o método descrito no Exemplo 47(3). O embrião globular obtido foi transplantado em meio de crescimento de embrião somático fresco e culturado por 2 a 3 dias. O plasmídeo pSUM-NdG6-rSt-1584soja produzido no Exemplo 74(1) ou o plasmídeo pSUM-NdG6-rSt12-1584soja produzido no Exemplo 74(2) foi introduzido nesses embriões globulares de acordo com o método descrito no Exemplo 17(2). (4) Seleção de embrião somático com higromicina Seleção através da higromicina de um embrião globular após a introdução do gene, obtido no Exemplo 74(3), é realizada de acordo com o método descrito no Exemplo 47(4). (5) Seleção de embrião somático com composto (II) Seleção pelo composto (II) de um embrião globular após a intro- dução do gene, obtido no Exemplo 74(3), é realizada de acordo com o método descrito no Exemplo 47(5). (6) Regeneração de planta a partir do embrião somático, aclimação e cultivo De acordo com o método descrito no Exemplo 47(6), a regeneração de planta é realizada a partir de embriões globulares selecionados no Exemplo 74(4) ou 74(5). A planta com raízes e folhas desenvolvidas sofre a aclimação e cultivo de acordo com o método descrito no Exemplo 17(6) e é colhida. (7) Avaliação da resistência ao composto herbicida (II) O grau de resistência contra o composto (II) da planta regenerada obtida no Exemplo 74(6) é avaliado de acordo com o método descrito no Exemplo 17(4). (8) Construção de um plasmídeo de expressão de cloroplas-to tendo o DNA (A23)S da presente invenção para introdução agrobac-terium Um plasmídeo para introdução do DNA (A23)S da presente invenção em uma planta com o método de agrobacterium é construído. O plasmídeo pSUM-NdG6-rSt-1584soja foi digerido com as enzimas de restrição Hindlll e EcoRI, para isolar o DNA quimérico onde o DNA (A23)S da presente invenção foi conectada imediatamente após a seqüência de nucle-otídeo codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC de soja (cv. Jack) sem uma mudança de estruturas nos códons. O dito DNA foi inserido entre o sítio de restrição de Hindlll e o sítio de restrição de EcoRI do vetor de plasmídeo binário pBI121S obtido no Exemplo 18 para se obter o plasmídeo pBI-NdG6-rSt-1584soja (Figura 58). Ainda, o plasmídeo de pSUM-NdG6-rSt12-1584soja foi digerido com a enzima de restrição Notl, para isolar um DNA quimérico onde o DNA (A23)S da presente invenção foi conectada imediatamente após as seqüências de nu-cleotídeo codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC de soja (cv. Jack) e codificando em seguida 12 aminoa-cidos da proteína madura, sem uma mudança de estruturas nos códons. Tal DNA foi inserido no sítio de restrição de Hindlll e sítio de restrição de EcoRI do vetor de plasmídeo binário pBI121S para se obter o plasmídeo pBI-NdG6-rSt12-1584soja (Figura 59). (9) Introdução do DNA (A23)S da presente invenção em tabaco O DNA (A23)S da presente invenção foi introduzido em tabaco com o método de agrobacterium, utilizando os plasmídeos pBI-NdG6-rSt-1584soja e pBI-NdG6-rSt12-1584soja obtidos no Exemplo 74(8).
Primeiro, de acordo com o método descrito no Exemplo 19, cada um dos plasmídeos pBI-NdG6-rSt-1584soja e pBI-NdG6-rSt12-1584soja foi introduzido em Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Clontech Company). Cada um do agrobacterium transgênico carregando pBI-NdG6-rSt-1584soja ou pBI-NdG6-rSt12-1584soja foi isolado.
Em seguida, os ditos agrobacterium carregando os plasmídeos são usados para introduzir genes em tabaco de acordo com o método descrito no Exemplo 47(9) para se obter, respectivamente, tabacos transgênicos que incorporaram a região de T-DNA de pBI-NdG6-rSt-1584soja ou pBI-NdG6-rSt12-1584soja. (10) Avaliação de resistência utilizando um pedaço de folha de tabaco transgênico de DNA (A23)S da presente invenção As folhas foram tomadas de 35 tabacos transgênicos obtidos no Exemplo 74(9). Cada folha é dividida em pedaços onde cada pedaço é de 5 a 7 mm de largura. Os pedaços de folha foram plantados em meio ágar MS contendo o composto (II) ou composto (XII) e culturados na luz em temperatura ambiente. Após vários dias de cultura, o dano herbicida de cada um dos pedaços de folha é observado. Como controle, pedaços de folha de tabaco do tipo selvagem são utilizadas. A resistência do tabaco transgênico é avaliada classificando os pedaços de folha que crescem continuamente, pedaços de folha que têm dano químico, e pedaços de folha que ficaram brancos e murcharam.
Exemplo 75lntrodução do DNA (A25)S da presente invenção em uma planta (1) Construção de um plasmídeo expressando cloroplasto contendo o DNA (A25)S da presente invenção para introdução direta -parte 1 Um plasmídeo contendo um DNA quimérico onde o DNA (A25)S da presente invenção foi conectada imediatamente após a seqüência de nu-cleotídeo codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC de soja (cv. Jack) sem uma mudança de estruturas nos códons foi construído como um plasmídeo para introdução do DNA (A25)S da presente invenção em uma planta com o método de pistola de partícula.
Primeiro, DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 393 foi amplificado através de PCR. A PCR foi realizada utilizando como um molde pKSN1609soja obtido no Exemplo 71(2) e utilizando como iniciadores um oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 400 e um oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 401. A PCR utilizou KOD-plus (Toyobo Company). A PCR aconteceu após condução de uma manutenção a 94°C por 2 minutos; 20 ciclos de um ciclo que incluía manutenção a 94°C por 30 segundos, seguido por 53°C por 30 segundos, e seguido por 68°C por 90 segundos; e uma manutenção final a 68°C por 3 minutos. O DNA amplificado foi recuperado e purificado com MagExtractor-PCR & Gel-Clean up (Toyobo Company) realizando os procedimentos de acordo com o manual anexo. Tratando o DNA obtido com TaKaRa BKLKit (Takara Shuzo Company) de acordo com o manual anexo, o DNA teve a extremidade cega e teve o terminal 5' fosforilado. Um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 393 foi recuperado. Após digestão do plasmídeo pUC19 (Takara Shuzo Company) com Smal, o terminal 5' foi desfosforilado com alcalina fosfatase de intestino de bezerro (Takara Shuzo Company). Um plasmídeo foi produzido ligando o DNA desfosforilado resultante e o DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 393. Após digestão do plasmídeo obtido com as enzimas de restrição EcoT22l e Saci, o DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 393 foi recuperado. Após digestão do plasmídeo pUCrSt657 obtido no Exemplo 16(2) com as enzimas de restrição EcoT22l e Saci, foi isolado um DNA de cerca de 2,9 kpb tendo uma seqüência de nucleotídeo derivada de pUC19 e uma seqüência codificando um peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC de soja (cv. Jack). O DNA obtido e o DNA acima compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 393 foram ligados para se obter pUCrSt1609soja (Figura 60) contendo um DNA quimérico onde o DNA (A25)S da presente invenção foi conectada imediatamente após a seqüência de nucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC de soja (cv. Jack) sem uma mudança de estruturas nos códons. O plasmídeo pUCrSt1609soja obtido foi digerido com as enzimas de restrição BamHI e Saci para isolar um DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 393. O dito DNA foi inserido entre o sítio de restrição de Bglll e o sítio de restrição de Saci de plasmídeo pNdG6-AT para se obter o plasmídeo pSUM-NdG6-rSt-1609soja (Figura 61) onde o promotor CR16G6 tem conectado a jusante o DNA quimérico onde o dito DNA foi conectado imediatamente após a seqüência de nucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC de soja (cv. Jack) sem uma mudança nas estruturas nos códons.
Em seguida, o plasmídeo foi introduzido em células competentes DH5a de E. coli (Takara Shuzo Company) e as células resistentes à ampici-lina foram selecionadas. Ainda, as seqüências de nucleotídeo dos plasmí-deos contidos nas cepas resistentes à ampicilina foram determinadas utilizando o Kit de reação BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready v3.0 (PE Applied Biosystems Company) e seqüenciador de DNA 3100 (PE Applied Biosystems Company). Como resultado, foi confirmado que o plasmídeo pSUM-NdG6-rSt-1609soja tem a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 393. (2) Construção de um plasmídeo de expressão de cloroplasto tendo o DNA (A25)S da presente invenção para introdução direta - parte (2) Um plasmídeo foi construído para introdução do DNA (A25)S da presente invenção em uma planta com o método de pistola de partícula. O plasmídeo continha um DNA quimérico onde o DNA (A25)S da presente invenção foi conectado imediatamente após as seqüências de nucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC de soja (cv. Jack) e codificando em seguida 12 aminoacidos da proteína madura, sem uma mudança de estruturas nos códons. Primeiro, plasmídeo pUCrSt1609soja obtido no Exemplo 75(1) tem inserido em seu sítio de restrição de EcoT22l o ligante EcoT221-12aa-EcoT221 (Figura 62) obtido através de anelamento do oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 402 e o oligonucleotídeo consistindo na seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 403. Foi obtido o plasmídeo pUCrSt12-1609soja (Figura 63) contendo o DNA quimérico onde o DNA (A25)S da presente invenção foi conectada imediatamente após as seqüências de nucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC de soja (cv. Jack) e codificando em seguida 12 aminoacidos da proteína madura, sem uma mudança de estruturas nos códons. O plasmídeo pUCrSt12-1609soja obtido foi digerido com as enzimas de restrição BamHI e Saci para isolar um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 393. O dito DNA foi inserido entre o sítio de restrição de Bglll e o sítio de restrição de Saci de plasmídeo pNdG6-AT, obtido no Exemplo 16(2), para se obter o plasmídeo pSUM-NdG6-rSt-1609soja (Figura 64) onde o promotor CR16G6 tem conectado a jusante o DNA quimérico onde o dito DNA foi conectado imediatamente após a seqüência de nucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC de soja (cv. Jack) sem uma mudança nas estruturas nos códons.
Em seguida, o plasmídeo foi introduzido em células competentes DH5a de E. coli (Takara Shuzo Company) e as células resistentes à ampici-lina foram selecionadas. Ainda, as seqüências de nucleotídeo dos plasmí- deos contidos nas cepas resistentes à ampicilina foram determinadas utilizando o Kit de reação BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready v3.0 (PE Applied Biosystems Company) e seqüenciador de DNA 3100 (PE Applied Biosystems Company). Como resultado, foi confirmado que o plasmídeo pSUM-NdG6-rSt-1609soja tem a seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 393. (3) Introdução do DNA (A23)S da presente invenção em soja Os embriões globulares de soja (cultivar: Fayette e Jack) foram preparados de acordo com o método descrito no Exemplo 47(3). O embrião globular obtido foi transplantado em meio de crescimento de embrião somático fresco e culturado por 2 a 3 dias. O plasmídeo pSUM-NdG6-rSt-1609soja produzido no Exemplo 75(1) ou o plasmídeo pSUM-NdG6-rSt12-1609soja produzido no Exemplo 75(2) foi introduzido nesses embriões globulares de acordo com o método descrito no Exemplo 17(2). (4) Seleção de embrião somático com higromicina Seleção através da higromicina de um embrião globular após a introdução do gene, obtido no Exemplo 75(3), é realizada de acordo com o método descrito no Exemplo 47(4). (5) Seleção de embrião somático com composto (II) Seleção pelo composto (II) de um embrião globular após a introdução do gene, obtido no Exemplo 75(3), é realizada de acordo com o método descrito no Exemplo 47(5). (6) Regeneração de planta a partir do embrião somático, aclimação e cultivo De acordo com o método descrito no Exemplo 47(6), a regeneração de planta é realizada a partir de embriões globulares selecionados no Exemplo 74(4) ou 74(5). A planta com raízes e folhas desenvolvidas sofre a aclimação e cultivo de acordo com o método descrito no Exemplo 17(6) e é colhida. (7) Avaliação da resistência ao composto herbicida (II) O grau de resistência contra o composto (II) da planta regenera- da obtida no Exemplo 75(6) é avaliado de acordo com o método descrito no Exemplo 17(4). (8) Construção de um plasmídeo de expressão de cloroplas-to tendo o DNA (A25)S da presente invenção para introdução agrobac-terium Um plasmídeo para introdução do DNA (A25)S da presente invenção em uma planta com o método de agrobacterium é construído. O plasmídeo pSUM-NdG6-rSt-1609soja foi digerido com as enzimas de restrição Hindlll e EcoRI, para isolar o DNA quimérico onde o DNA (A25)S da presente invenção foi conectada imediatamente após a seqüência de nucle-otídeo codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC de soja (cv. Jack) sem uma mudança de estruturas nos códons. O dito DNA foi inserido entre o sítio de restrição de Hindlll e o sítio de restrição de EcoRI do vetor de plasmídeo binário pBH21S obtido no Exemplo 18 para se obter o plasmídeo pBI-NdG6-rSt-1609soja (Figura 65). Ainda, o plasmídeo de pSUM-NdG6-rSt12-1609soja foi digerido com a enzima de restrição Notl, para isolar um DNA quimérico onde o DNA (A25)S da presente invenção foi conectada imediatamente após as seqüências de nu-cleotídeo codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto de subunidade pequena de RuBPC de soja (cv. Jack) e codificando em seguida 12 aminoa-cidos da proteína madura, sem uma mudança de estruturas nos códons. Tal DNA foi inserido no sítio de restrição de Hindlll e sítio de restrição de EcoRI do vetor de plasmídeo binário pBI121S acima para se obter os plasmídeos pBI-NdG6-rSt12-1609soja (Figura 66). (9) Introdução do DNA (A23)S da presente invenção em tabaco O DNA (A25)S da presente invenção foi introduzido em tabaco com o método de agrobacterium, utilizando os plasmídeos pBI-NdG6-rSt-1609soja e pBI-NdG6-rSt12-1609soja obtidos no Exemplo 75(8).
Primeiro, de acordo com o método descrito no Exemplo 19, cada um dos plasmídeos pBI-NdG6-rSt-1609soja e pBI-NdG6-rSt12-1609soja foi introduzido em Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Clontech Company).
Cada um dos agrobacterium transgênicos carregando pBI-NdG6-rSt-1609soja ou pBI-NdG6-rSt12-1609soja foi isolado.
Em seguida, os ditos agrobacterium carregando os plasmídeos são usados para introduzir genes em tabaco de acordo com o método descrito no Exemplo 47(9) para se obter, respectivamente, tabacos transgênicos que incorporaram a região de T-DNA de pBI-NdG6-rSt-1609soja ou pBI-NdG6-rSt12-1609soja. (10) Avaliação de resistência utilizando um pedaço de folha de tabaco transgênico de DNA (A25)S da presente invenção As folhas são tomadas dos tabacos transgênicos obtidos no Exemplo 75(9). Tais folhas são utilizadas para avaliar a resistência do tabaco transgênico contra o composto (II) ou composto (XII) de acordo com o método do Exemplo 74(10).
APLICABILIDADE INDUSTRIAL
Com a presente invenção é possível prover uma proteína tendo a habilidade de metabolizar um composto herbicida de inibição de PPO e converter tal composto em um composto de atividade herbicida menor; um DNA codificando tal proteína; e uma planta resistente a um composto herbicida expressando tal proteína.
TEXTO LIVRE DE SEQÜÊNCIA SEQ ID NO: 35 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 36 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 37 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 38 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 39 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 40 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 41 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 42 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 43 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 44 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 45 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 46 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 47 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 48 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 49 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 50 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 51 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 52 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 53 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 54 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 55 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 56 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 57 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 58 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 59 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 60 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 61 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 62 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 63 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 64 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 65 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 66 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 67 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 68 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 70 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 71 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 72 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 73 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 74 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 75 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 76 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 77 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 79 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 80 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 81 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 82 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 83 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 86 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 87 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 89 Ligante de oligonucleotídeo construído para construção de vetor de expressão SEQ ID NO: 90 Ligante de oligonucleotídeo construído para construção de vetor de expressão SEQ ID NO: 91 Ligante de oligonucleotídeo construído para construção de vetor de expressão SEQ ID NO: 92 Ligante de oligonucleotídeo construído para construção de vetor de expressão SEQ ID NO: 93 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 94 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 95 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 96 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 97 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 98 Ligante de oligonucleotídeo construído para construção de vetor de expressão SEQ ID NO: 99 Ligante de oligonucleotídeo construído para construção de vetor de expressão SEQ ID NO: 100 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 101 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 102 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 103 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 104 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 105 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 106 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 107 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 114 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 115 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 116 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 117 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 118 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 119 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 120 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 121 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 122 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 123 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 124 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 125 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 126 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 127 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 128 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 129 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 130 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 131 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 132 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 133 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 134 Ligante de oligonucleotídeo construído para construção de vetor de expressão SEQ ID NO: 135 Ligante de oligonucleotídeo construído para construção de vetor de expressão SEQ ID NO: 161 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 162 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 163 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 164 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 165 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 166 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 167 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 168 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 169 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 170 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 171 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 172 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 173 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 174 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 175 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 176 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 177 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 178 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 179 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 180 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 181 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 182 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 183 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 184 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 185 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 186 Iniciador de oligonucleotídeo construído para seqüenciamento de DNA SEQ ID NO: 187 Iniciador de oligonucleotídeo construído para seqüenciamento de DNA SEQ ID NO: 188 Iniciador de oligonucleotídeo construído para seqüenciamento de DNA SEQ ID NO: 189 Iniciador de oligonucleotídeo construído para seqüenciamento de DNA SEQ ID NO: 190 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 191 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 192 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 193 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 194 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 195 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 196 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 197 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 198 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 199 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 200 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 201 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 202 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 203 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 204 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 205 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 206 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 207 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 208 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 209 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 210 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 211 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 212 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 213 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 214 Polinucleotídeo construído codificando a seqüência de aminoacido da SEQ ID No. 1 SEQ ID NO: 265 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 266 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 267 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 268 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 269 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 270 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 271 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 272 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 273 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 274 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 275 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 276 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para seqüenciamento de DNA SEQ ID NO: 277 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para seqüenciamento de DNA SEQ ID NO: 278 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 279 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 280 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 281 Iniciador de oligonucleotídeo construído para seqüenciamento de DNA SEQ ID NO: 282 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 283 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 284 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 285 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 286 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 287 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 288 Iniciador de oligonucleotídeo construído para seqüenciamento de DNA SEQ ID NO: 289 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 290 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 291 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 292 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 293 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 294 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 295 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 296 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 297 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 298 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 299 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 300 Iniciador de oligonucleotídeo construído para seqüenciamento de DNA SEQ ID NO: 301 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 302 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 303 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 304 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 305 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 306 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 307 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 308 Iniciador de oligonucleotídeo construído para seqüenciamento de DNA SEQ ID NO: 309 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 310 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 311 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 312 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 313 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 314 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQIDNO: 315 Iniciador de oligonucleotídeo construído para seqüenciamento de DNA SEQIDNO: 316 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQIDNO: 317 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQIDNO: 318 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQIDNO: 319 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 320 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 321 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 322 Iniciador de oligonucleotídeo construído para seqüenciamento de DNA SEQ ID NO: 323 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 324 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 325 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 326 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 327 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 328 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 329 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 330 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 331 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 332 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 333 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 334 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 335 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 336 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 337 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 338 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 339 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 340 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 341 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 342 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 343 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 344 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 345 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 346 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 347 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 348 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 349 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 350 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 351 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 352 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 353 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 354 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 355 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 356 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 357 Iniciadorde oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 358 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 359 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 360 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 361 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 362 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 363 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 364 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 365 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 366 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 367 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 368 Polinucleotídeo construído codificando a seqüêncía de aminoacido da SEQ ID No.222 SEQ ID NO: 369 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 370 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 371 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 372 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 373 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 374 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 375 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 376 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 377 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 378 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 379 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 380 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 381 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 382 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 383 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 384 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 385 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 386 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 387 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 388 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 389 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 390 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 391 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 392 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 393 Polinucleotídeo construído codificando a seqüência de aminoacido da SEQ ID No.224 SEQ ID NO: 394 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 395 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 396 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 397 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 398 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO: 399 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID N0:400 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO:401 Iniciador de oligonucleotídeo construído para PCR SEQ ID NO:402 Ligante de oligonucleotídeo construído para construção de vetor de expressão SEQ ID NO:403 Ligante de oligonucleotídeo construído para construção de vetor de expressão.

Claims (12)

1. DNA, caracterizado pelo fato de que codifica uma proteína de metabolização de herbicida do tipo inibidor de PPO tendo a habilidade de converter um composto da fórmula {II): em um composto da fórmula (III): em que a sequência de nucleotídeo codificante é selecionada do grupo consistindo nas sequências de nucleotídeos mostradas nas SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 368 e SEQ ID NO: 393, e em que a sequência de nucleotídeos é derivada de espécies de Streptomyces com o uso de códons ajustado para expressão em soja.
2. Construção de DNA, caracterizada pelo fato de que consiste em (a) uma sequência de nucleotídeos codificando uma sequência sinal de trânsito de cloroplasto, e (b) uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo na sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 368 e SEQ ID NO: 393, e em que a sequência de nucleotídeos citada em (a) é ligada a montante da sequência de nucleotídeos citada em (b) no mesmo quadro de leitura.
3. Construção de DNA, caracterizada pelo fato de que consiste em uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo na sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 368 e SEQ ID NO: 393, e um promotor funcional em uma célula hospedeira ope-ravelmente ligado.
4. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende uma construção de DNA como definida na reivindicação 2 ou 3.
5. Micro-organismo transgênico, caracterizado pelo fato de que compreende o DNA ou construção de DNA como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
6. Método de produção de um transformante, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de introdução em uma célula hospedeira do DNA ou construção de DNA como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
7. Método de produção de uma proteína como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar o microorganismo transgênico como definido na reivindicação 5 ou um transformante compreendendo o DNA ou a construção de DNA como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e recuperar a dita proteína produzida.
8. Uso do DNA como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para produção de uma proteína uma proteína de metabo-lização de herbicida do tipo inibidor de PPO como definida na reivindicação 1.
9. Método de detecção de um DNA codificando uma proteína de metabolização de herbicida do tipo inibidor de PPO como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de detecção de um DNA ao qual uma sonda é hibridizada em uma hibridização Dot-blot usando como sonda o DNA como definido na reivindicação 1 ou uma sequência de nucleotídeo complementar à referida sequência de nucleotídeo parcial, em que na hibridização Dot-blot a membrana resultante recuperada é agitada duas vezes em SSC 2x contendo 0,1% de SDS por 5 minutos a temperatura ambiente e então agitada duas vezes em SSC 0,5x contendo 0,1% de SDS a 65 °C por 15 minutos.
10. Método de detecção de um DNA codificando uma proteína de metabolização de herbicida do tipo inibidor de PPO como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de detecção de um DNA amplificado em uma reação de cadeia de polimerase com uma sequência de polinucleotídeo ou uma sequência de nucleotídeo complementar à referida sequência de nucleotídeo, como iniciadores, em que os iniciadores são pedaços de um iniciador selecionado do grupo consistindo em polinucleotídeos de SEQ ID NO: 124 a 128 e SEQ ID NO: 129.
11. Método de obtenção de um DNA codificando uma proteína de metabolização de herbicida do tipo inibidor de PPO como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a recuperação do DNA detectado através do método como definido na reivindicação 10.
12. Método de identificação de uma célula tendo um DNA codificando uma proteína de metabolização de herbicida do tipo inibidor de PPO como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de detecção do dito DNA a partir de uma célula de teste através do método como definido na reivindicação 10.
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