BRPI0213226B1 - processo de preparação de uma composição farmacêutica sob forma de microesferas com liberação prolongada de um princípio ativo hidrossolúvel, e, microesferas - Google Patents

Abstract

"processo de preparação de uma composição farmacêutica sob forma de microesferas com liberação prolongada de um princípio ativo hidrossolúvel, e microesferas". a presente invenção refere-se a um processo de preparação de uma composição farmacêutica sob forma de microesferas com liberação prolongada de um principio ativo hidrossolúvel, caracterizado pelo fato de que ele compreende a sucessão das etapas seguintes: dissolução do princípio ativo em uma quantidade apropriada de água, emulsificação da solução aquosa do princípio ativo assim obtido com uma solução de um copolímero matricial d,1-lactídeo-co-glicolídeo, de peso molecular médio compreendido entre 40.000 e 80.000 e tendo uma proporção de ácido láctico/ácido glicólico compreendida entre 50/50 e 80/20, dissolvido em um hidrocarboneto clorado, conduzindo a uma primeira emulsão microfina e homogênea, emulsificação da referida primeira emulsão assim obtida em uma fase aquosa externa, contendo um tensoativo, um agente aumentando a viscosidade e um agente osmótico, extração-evaporação do solvente para obter microesferas que se recupera após filtração, lavagem e secagem. a invenção tem igualmente por objeto microesferas, susceptíveis de serem obtidas pela realização deste processo, apresentando uma liberação contínua de princípio ativo durante um período de mais de dois meses, com vantagem durante um período de pelo menos três meses.

Description

“PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA SOB FORMA DE MICROESFERAS COM LIBERAÇÃO PROLONGADA DE UM PRINCÍPIO ATIVO HIDROSSOLÚVEL, E, MICROESFERAS” A presente invenção refere-se a um processo de preparação de uma composição farmacêutica sob a forma de microesferas com liberação prolongada de um princípio ativo hidrossolúvel. A invenção tem igualmente por objeto microesferas susceptíveis de serem obtidas pela realização deste processo, apresentando uma liberação contínua de princípio ativo durante um período de mais de dois meses, vantajosamente de pelo menos três meses.

Numerosas composições farmacêuticas, sob a forma de microesferas à base de polímeros e copolímeros biodegradáveis que contêm compostos farmaceuticamente ativos, e concebidas para uma liberação controlada e prolongada dos referidos compostos, foram descritas em diversos documentos do estado da técnica anterior. Tais composições farmacêuticas apresentam um grande interesse para o tratamento de diversas doenças que necessitam de uma liberação contínua e prolongada de princípio ativo.

No entanto, as formulações desenvolvidas até o presente para a preparação deste tipo de composições apresentam diversos inconvenientes, e poucas dentre as mesmas alcançam o estado dos testes clínicos.

Um dos maiores problemas ligados a estas formulações com liberação prolongada é a liberação de uma grande quantidade de princípio ativo durante as primeiras horas que seguem a administração da composição farmacêutica. Faz-se continuamente referência a uma tal liberação sob o termo de efeito “burst” ou de liberação “burst”. Esta liberação conduz geralmente a um brusco aumento das concentrações plasmáticas do medicamento, o que acarreta, em numerosos casos, problemas toxicológicos inaceitáveis para o ser humano. Esta liberação “burst” conduz igualmente a uma redução da duração da atividade da composição farmacêutica, pelo fato de que a liberação brusca de uma grande quantidade do referido princípio ativo segue-se à administração da composição.

Um segundo problema reside no fato de que se obtém geralmente taxas de encapsulação pouco eficazes usando os processos de microencapsulação habituais, particularmente quando o princípio ativo é um medicamento solúvel em água.

Um terceiro problema que é necessário resolver durante a preparação destas formulações é a instabilidade dos princípios ativos face às condições rigorosas empregadas durante a fabricação das microesferas, tais como temperaturas elevadas ou um contato prolongado do princípio ativo com solventes orgânicos durante a etapa de evaporação do solvente. Vários testes foram empregados a fim de resolver estes diversos problemas. Assim, aditivos tais como os açucares, os óleos, a cera, as proteínas, os polímeros, os sais, ou os ácidos, foram usados na preparação de composições farmacêuticas sob a forma de microesferas. Estes aditivos, que agem como substâncias que retêm o medicamento das microesferas, permitem aumentar a eficácia do processo de microencapsulação e mesmo eventualmente prolongar o princípio ativo durante o processo, desempenhando o papel de agentes estabilizantes.

No entanto, a inclusão destes aditivos nas microesferas pode conduzir a problemas de interação entre os aditivos e o princípio ativo ou a matriz à base de polímeros, induzindo, assim, problemas em matéria de toxocologia e atividade farmacológica do medicamento. Além disso, os aditivos, que retêm o princípio ativo no interior das microesferas durante o processo de fabricação, influem sobre o perfil de liberação do princípio ativo contido nas microesferas, podendo impedir uma liberação contínua do referido princípio ativo após a administração das microesferas.

Outros processos de microencapsulação foram igualmente elaborados a fim de tentar aumentar a eficácia da microencapsulação do princípio ativo no seio das microesferas, ao se basearem na utilização de misturas de solventes orgânicos, no entanto, tais processos conduzem a problemas de estabilidade do princípio ativo no curso do processo de fabricação das microesferas.

Conseqüentemente, havia uma necessidade de elaborar um processo de preparação de uma composição farmacêutica sob a forma de microesferas à base de polímeros e copolímeros biodegradáveis, concebidas para uma liberação prolongada de um princípio ativo hidrossolúvel, que não apresenta os inconvenientes das composições descritas nos documentos do estado da técnica anterior ou das composições desenvolvidas até o presente. A presente invenção vem preencher esta necessidade. O requerente descobriu de modo surpreendente que a elaboração de microesferas, à base de princípio ativo e de copolímero de matriz biodegradável do tipo d,l-lactídeo-co-glicolídeo, que tem um peso molecular específico e uma relação ácido láctico/ácido glicólico específica, por um processo rápido do tipo emulsão múltipla-evaporação de solvente, sem usar um aditivo qualquer ou um agente de modulação como é o caso na patente FR 2 718 642, permitia obter microesferas que apresentam uma liberação contínua e prolongada de princípio ativo por um período de mais de dois meses, ao mesmo tempo em que apresenta um efeito “burst” restrito. Um tal processo de encapsulação, que emprega condições suaves e pouco agressivas para o medicamento, permite, além disso, conservar a estabilidade do referido medicamento e obter uma repartição homogênea do medicamento no seio da microesfera obtida. O princípio físico de emulsão múltipla para encapsular os princípios ativos hidrossolúveis foi notadamente descrito na patente US 3 523 906. De modo geral, em um processo deste tipo por emulsão múltipla E/H/E e evaporação do solvente, o princípio ativo hidrossolúvel é inicialmente solubilizado na fase interna de uma primeira emulsão E/H, depois, em um segundo tempo, esta primeira emulsão é por sua vez emulsificada em uma fase aquosa externa. O requerente descobriu de modo surpreendente que a utilização de um agente osmótico durante a etapa de emulsificação da primeira emulsão na fase aquosa externa permitia obter uma eficácia de encapsulação particularmente elevada por aumento do teor de princípio ativo encapsulado no seio da matriz polimérica e de influir no tamanho das microesferas. O objeto da presente invenção, relativo a um processo de encapsulação rápida, muito eficaz e pouco agressiva para o princípio ativo, permite assim obter microesferas, à base de princípio ativo hidrossolúvel e de copolímero de matriz do tipo d,l-lactídeo-co-glicolídeo, apresentando uma liberação contínua e prolongada de princípio ativo durante um período de mais de dois meses, preferivelmente de pelo menos três meses, enquanto apresentando um efeito “burst” fraco nas horas que seguem a administração da composição. A presente invenção tem, assim, por objeto, um processo de preparação de uma composição farmacêutica sob a forma de microesferas com liberação prolongada de um princípio ativo hidrossolúvel, caracterizado pelo fato de que ele compreende a sucessão das seguintes etapas: dissolução do princípio ativo em uma quantidade apropriada de água, emulsificação da solução aquosa de princípio ativo assim obtida com uma solução de um copolímero de matriz d,l-lactídeo-co-glicolídeo, de peso molecular médio compreendido entre 40 000 e 80 000 e tendo uma proporção ácido láctico/ácido glicólico compreendida entre 50/50 e 80/20, dissolvida em um hidrocarboneto clorado que conduz a uma primeira emulsão microfina e homogênea, o tamanho da referida emulsão sendo vantajosamente inferior a 1 μηι, emulsificação da referida primeira emulsão assim obtida em uma fase aquosa externa que contém um tensoativo, um agente que aumenta a viscosidade e um agente osmótico. extração-evaporação do solvente para obter microesferas que são recuperadas após filtragem, lavagem e secagem.

Outras características e vantagens aparecerão na leitura da descrição detalhada feita acima, notadamente se apoiando em alguns exemplos de emprego particulares. O princípio ativo hidrossolúvel utilizável no quadro do processo de acordo com a presente invenção é vantajosamente escolhido no grupo constituído pelos peptídeos, as proteínas, as vacinas, os antidepressivos, os analgésicos, os anti-inflamatórios e as citoestáticas. De modo ainda mais vantajoso de acordo com a presente invenção, o princípio ativo é o 5-OxoPro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-ProNHEt ou um de seus sais. Este princípio ativo é análogo do hormônio GnRH com atividade agonista.

No quadro do processo de acordo com a presente invenção, a primeira etapa de dissolução do princípio ativo na água para formar uma fase aquosa é realizada sem a adição de nenhuma substância que retém o princípio ativo, nem agente estabilizador da emulsão e sem nenhuma operação destinada a aumentar a viscosidade. Vantajosamente, de acordo com a presente invenção, o princípio ativo é dissolvido na fase aquosa interna sem nenhum aditivo ou adjuvante qualquer.

As concentrações usadas na fase aquosa interna no quadro na presente invenção são fimção da solubilidade do princípio ativo na água, características do referido princípio ativo e da duração que se deseja obter. Vantajosamente, de acordo com a presente invenção, o princípio ativo está presente em uma concentração compreendida entre 0,01 e 95% em peso, vantajosamente entre 0,5 e 40% em peso, em relação ao peso total da fase aquosa interna. A formação da primeira emulsão pode ser notadamente realizada com a ajuda de um aparelho com ultra-sons ou de um homogeneizador. O copolímero de matriz, utilizável de acordo com a presente invenção para preparar microesferas por E/H/E, deve poder ser solubilizado em um solvente volátil apropriado, tal como os alcanos halogenados. Vantajosamente, de acordo com a presente invenção, o solvente é um hidrocarboneto clorado tal qual o cloreto de metileno, o clorofórmio, o cloroetano, o dicloroetano, ou o tricloroetano. De modo ainda mais vantajoso, de acordo com a presente invenção, o hidrocarboneto clorado é o cloreto de metileno. O copolímero de matriz d,l-lactídeo-co-glicolídeo, utilizável no processo de acordo com a presente invenção, apresenta as vantagens acumuladas de ser insolúvel na água, de ser biodegradável (um tal copolímero é absorvido sem se acumular nos órgãos vitais e é finalmente totalmente eliminado), de ser biocompatível com o organismo e de ser perfeitamente tolerado por ele, e finalmente de ter uma resposta inflamatória mínima.

No quadro do processo de acordo com a presente invenção, a solução do copolímero de matriz d,l-lactídeo-co-glicolídeo é obtida por dissolução em um hidrocarboneto tal qual o cloreto de metileno, sem adição de agente modulador de liberação. Com efeito, foi descoberto que a utilização de um agente modulador de liberação não era apropriada para a fabricação de microesferas concebidas para uma liberação sobre um período de tempo de mais de dois meses. A seleção efetuada sobre o copolímero, com um peso molecular específico e uma relação ácido láctico/ácido glicólico específica, combinada com o fato de não usar agente modulador no processo objeto da presente invenção, apresenta assim a vantagem de obter microesferas que apresentam uma liberação contínua e sustentada de princípio ativo durante um período de mais de dois meses, preferivelmente de pelo menos três meses, enquanto apresenta um efeito “burst” restrito nas horas que seguem a administração da composição.

As concentrações do polímero dissolvido na solução orgânica de cloreto de metileno são função do princípio ativo e da velocidade de liberação desejada. Vantajosamente, de acordo com o processo objeto da presente invenção, o copolímero de matriz está presente em uma concentração compreendida entre 5 e 50% em peso, em relação ao peso total da solução constituída do copolímero dissolvido no hidrocarboneto clorado.

De acordo com o processo objeto da presente invenção, a fase aquosa externa contém um tensoativo tal como o polissorbato 80, um agente que aumenta a viscosidade tal como a polivinilpirrolidona e um agente osmótico tal como manitol ou o cloreto de sódio. Vantajosamente, de acordo com a presente invenção, a fase aquosa externa contém uma solução de polissorbato 80, de polivinilpirrolidona e de manitol ou de cloreto de sódio. De modo ainda mais vantajoso de acordo com a presente invenção, a fase aquosa externa contém uma solução de polissorbato 80, de polivinilpirrolidona e de cloreto de sódio.

Vantajosamente de acordo com o processo objeto da presente invenção, o tensoativo está presente em uma concentração compreendida entre 0,1 e 0,5% em peso, o agente que aumenta viscosidade está presente em uma concentração compreendida entre 1 e 25% em peso e o agente osmótico está presente em uma concentração compreendida entre 0,1 e 10% em peso, em relação ao peso total da fase aquosa externa. A composição da fase externa é determinante para a formação da segunda emulsão (emulsificação da primeira emulsão) e ela é conseqüentemente determinante para a fabricação de microesferas. Ela contribui assim para a estabilização rápida das microesferas, ela influi sobre a eficácia de encapsulação dos princípios ativos e constitui um fator essencial para controlar o tamanho das microesferas finais e sua morfologia.

Durante a etapa de extração-evaporação do solvente, o solvente é rapidamente eliminado em temperatura ambiente e sob pressão atmosférica, de acordo com um sistema evaporador contínuo constituído de uma inclinação de comprimento adequado em que escoa, em camada fina, a suspensão de microesferas.

Um tal sistema de evaporação contínua do solvente orgânico, que aumenta e favorece o contato entre a emulsão e o ar, permite obter uma estabilização rápida da matriz polimérica, o que tem como efeito aumentar a estabilização do princípio ativo enquanto aprisionando uma grande porcentagem do referido princípio no meio das microesferas (eficácia de encapsulação) e de conduzir a uma evaporação rápida do solvente, o que tem por efeito a redução do tempo total de realização do processo. A estabilização rápida da matriz polimérica, obtida durante esta etapa de extração-evaporação do solvente orgânico, permite igualmente obter uma repartição homogênea da substância ativa em toda a microesfera (permitindo assim obter uma baixa concentração de princípio ativo encapsulado próximo da superfície da microesfera), contribuindo, assim, para diminuir o fenômeno de liberação “burst" que se segue à administração das microesferas. Além disso, o fato de empregar o processo em temperatura ambiente e sob pressão atmosférica permite evitar problemas tais como a alteração dos produtos termolábeis ou a quebra das microesferas quando se usa vácuo durante a etapa de extração-evaporação.

De modo mais detalhado, o processo de fabricação das microesferas de acordo com presente invenção compreende as seguintes etapas: Uma certa quantidade de princípio ativo é dissolvida em um volume de água. Esta solução se emulsifica com a ajuda de um aparelho de ultra-som, por exemplo, em um volume de cloreto de metileno que contém um copolímero poliláctico-co-glicolídeo, de peso molecular médio compreendido entre 40.000 e 80.000 daltons e tendo uma proporção ácido láctico para ácido glicólico compreendida entre 50/50 e 80/20. A primeira emulsão que resulta dai deve ser micro-fina e homogênea, permitindo assim distribuir o princípio ativo sobre toda a matriz polimérica e assegurando a reprodutibilidade dos diferentes lotes, sem ter a necessidade de usar tensoativos nem outros agentes adjuvantes. Uma vez formada a primeira emulsão, emulsiona-se a mesma, por sua vez, em uma fase externa, constituída por uma solução aquosa de polissorbato 80 como agente de superfície, de polivinilpirrolidona como agente que aumenta a viscosidade e de manitol ou NaCl como agente osmótico, sob agitação durante um curto período. Após esta etapa, a dupla emulsão é diluída com água, e depois faz-se passar a suspensão em condições atmosféricas em um sistema evaporador contínuo constituído por uma inclinação de comprimento adequado em que escoa, em camada fina, a suspensão de microesferas. Este sistema permite favorecer o contato entre a emulsão e a atmosfera, o que reduz a duração de evaporação do solvente orgânico e aumenta a estabilização do princípio ativo. As microesferas obtidas deste modo são em seguida recuperadas por filtragem, lavadas e secadas por liofilização.

As microesferas obtidas de acordo com o processo objeto da presente invenção são microesferas com forte teor em princípio ativo, permitindo a liberação continuamente in vivo do medicamento durante um período de mais de dois meses, preferivelmente de pelos menos 3 meses, com um fraco efeito “bursf’, após uma administração parenteral das microesferas. A presente invenção tem igualmente por objeto microesferas susceptíveis de serem obtidas pela realização do processo de acordo com a presente invenção, que apresentam uma liberação contínua de princípio ativo durante um período de mais de dois meses, vantajosamente durante um período de pelo menos três meses.

Vantajosamente, de acordo com a presente invenção, o princípio ativo está presente com uma concentração compreendida entre 0,5 e 20% em peso, vantajosamente entre 5 e 15% em peso, em relação ao peso total das microesferas.

Vantajosamente, de acordo com a presente invenção, o tamanho das microesferas é inferior a 250 μιη, de modo ainda mais vantajoso inferior a 90 μιη. Este tamanho é adequado para a administração de microesferas.

As microesferas de acordo com a presente invenção são vantajosamente administradas por via parenteral, de modo ainda mais vantajoso sob a forma de injeções intramusculares, intra-arteriais ou no local em que se encontra um tumor. Para uma administração adequada, as microesferas são preferivelmente dispersas em um meio aquoso padrão com agentes dispersantes e agentes isotônicos.

Os exemplos seguintes (estudos in vivo e in vitro) são dados a título não limitativo e ilustram a presente invenção.

Exemplo 1 (comparativo) Lotes de microesferas à base de 5-OxoPro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-ProNHEt acetato são preparados de acordo com o processo de fabricação descrito na publicação Advanced Drug Delivery Reiews, 28 (1997), 43-70, o qual difere do processo objeto da presente invenção. A fabricação das microesferas é realizada por dissolução de uma quantidade apropriada de princípio ativo na água, e depois por uma colocação em emulsão da solução aquosa de princípio ativo assim obtido com uma solução de polilactídeo (100% de lactídeo), de peso molecular médio de 15.000, no cloreto de metileno. A colocação em emulsão é realizada com um agitador, sob agitação vigorosa. Uma vez que a primeira emulsão Ei/H é formada, emulsiona-se por sua vez a fim de obter uma emulsão Ei/H/E2, com uma solução aquosa de álcool polivinílico (0,25%) usando um misturador com grande velocidade. A dupla emulsão que resulta dai é, em seguida, suavemente agitada durante várias horas a fim de evaporar o solvente orgânico. As microesferas são, em seguida, lavadas, recuperadas por centrifugação e liofilizadas. A carga final das microesferas em medicamento é de 9 a 11% em peso.

As principais diferenças entre as microesferas obtidas de acordo com o processo descrito no documento do estado anterior da técnica citada acima e as obtidas de acordo com o processo objeto da presente invenção residem em: a escolha do polímero. No exemplo 1, o polímero usado é um polilactídeo (100% de lactídeo), de peso molecular médio de 15.000. Trata-se de um polímero padrão, de acordo com este documento, para uma liberação prolongada de 5-OxoPro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-ProNHEt acetato sobre um período de três meses. A composição da fase externa aquosa, que é constituída por um álcool polivinílico (0,25%) no exemplo 1. O sistema de evaporação do solvente orgânico. No exemplo 1, a dupla emulsão é agitada durante várias horas.

Exemplo 2 De acordo com o processo de fabricação objeto da presente invenção, o 5-OxoPro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-ProNHEt acetato é dissolvido na água, e depois a solução de princípio ativo é emulsificada com a ajuda de um aparelho de ultra-som, em uma solução de metileno que contém 15% de um copolímero d,l-lactídeo-co-glicolídeo, este copolímero tendo um peso molecular médio de 63.000 daltons (viscosidade inerente de cerca de 0,6 dl/g) e uma proporção do ácido láctico para o ácido glicólico de 75/25. Uma vez que a primeira emulsão é formada, emulsifica-se a mesma com uma solução aquosa de 0,25% de polissorbato 80, de 7% de polivinilpirrolidona e de 5% de manitol sob agitação, usando um agitador de hélices com pás. Após esta etapa, passa-se à dupla emulsão, em condições atmosféricas, sobre um sistema evaporador constituído de uma inclinação de comprimento adequando sobre a qual escoa, em camada fina, a suspensão de microesferas. Com a ajuda de um tal sistema evaporador, o solvente orgânico é rapidamente evaporado, conduzindo a uma rápida estabilização da matriz polimérica. As microesferas são finalmente recuperadas por filtração, lavadas com água e depois secadas por liofilização. A carga final das microesferas em medicamento é de 9 a 11% em peso.

Exemplo 2 bis: Microesferas são elaboradas de acordo com o processo descrito no exemplo 2, usando 5% de cloreto de sódio na fase aquosa externa enquanto agente osmótico, no lugar de 5% de manitol.

Exemplo 3: O estudo da liberação in vitro de 5-OxoPro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-ProNHEt acetato a partir de microesferas preparadas de acordo com os exemplos 1 e 2 é realizado em um tampão fosfato. 25 mg de cada formulação sob forma de microesferas são colocados em suspensão em um meio de liberação composto por 5 ml de tampão fosfato (pH = 7,4), e depois agitados (rotação) durante 4 dias a 37°C. Em diversos instantes, a quantidade de peptídeo liberada foi medida por cromatografia em fase líquida em alta pressão (HPLC).

Os resultados deste estudo são apresentados na tabela 1. Eles demonstram que a composição preparada de acordo com o processo objeto da presente invenção (exemplo 2) apresenta uma liberação “burst” bem inferior à liberação “burst” das composições preparadas de acordo com o processo do estado anterior da técnica do exemplo 1. Assim, 4 dias após o início do estudo, as microesferas do exemplo 2 não liberaram senão 3,4% da quantidade de peptídeo presente nas microesferas, enquanto que as microesferas do exemplo 1 liberaram até 22,6%.

Tabela 1: Exemplo 4 O estudo da liberação in vivo de 5-OxoPro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-ProNHEt acetato a partir das microesferas preparadas de acordo com os exemplos 1, 2 e 2 bis é realizado em ratos.

Para este estudo, os três tipos de microesferas (exemplos 1, 2 e 2 bis) são colocados em suspensão em um excipiente aquoso padrão, antes de proceder à sua administração sub-cutânea no nível de uma zona dorsal previamente raspada em ratos. A dose administrada em cada animal é de 3,6 mg de 5-OxoPro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-ProNHEt acetato microencapsulado. Certos ratos são sacrificados três dias após a administração, enquanto outros são sacrificados sete dias após a administração. Uma vez que os ratos estejam mortos, o lugar de injeção é então excisado, e depois as microesferas restantes no nível do lugar, com o tecido conjuntivo contíguo, são recuperadas. O 5-OxoPro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-ProNHEt acetato fica então extraído, e depois quantificado por cromatografia em fase líquida em alta pressão (HPLC).

Os resultados deste estudo são apresentados na tabela 2. Pode-se constatar que, no fim de três dias, as microesferas do exemplo 1 liberam já 35,3% da quantidade total de peptídeo presente nas microesferas, enquanto que as microesferas do exemplo 2 não liberam senão 20,6%.

Tabela 2 Pode-se assim concluir que os resultados deste estudo in vivo estão de acordo com os resultados obtidos in viíro (exemplo 3) e demonstram que as formulações preparadas de acordo com o processo da presente invenção apresentam uma liberação “burst” muito menor que a liberação “burst” das composições preparadas de acordo com o processo do estado anterior da técnica do exemplo 1.

Exemplo 5: A fim de completar os resultados anteriores (exemplos 3 e 4), um estudo aprofundado da liberação in vivo de princípio ativo durante as primeiras 24 horas após a administração de microesferas foi realizado.

Neste teste, o teor sérico de 5-OxoPro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-ProNHEt acetato é avaliado nos ratos por cromatografia em fase líquida-espectométrica de massa - espectrometria de massa (CL/SM/SM), após a administração sub-cutânea das formulações sob forma de microesferas preparadas de acordo com os exemplos 1 e 2. Assim, 3,6 de 5-OxoPro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-ProNHEt acetato encapsulado são injetados em ratos e, em diversos momentos após a administração, amostras de sangue são retiradas para a avaliação do teor de 5-OxoPro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-ProNHEt acetato no soro.

Os resultados deste estudo são apresentados na figura 1. Assim, uma hora após a administração das microesferas do exemplo 1, a concentração de peptídeo no soro é de 107,8 ^g/l, enquanto que para as microesferas do exemplo 2, a concentração de peptídeo no soro é de 51,8 ^ig/1. Após 2, 3, 4, 8 e 24 horas, as microesferas do exemplo 1 apresentam respectivamente concentrações séricas de 103,7; 50,1; 30,3; 9,5 e 3,8 /xg/1, enquanto que as microesferas do exemplo 2 apresentam respectivamente valores de 28,0; 5,5; 4,5; 9,3 e 1,0 /xg/1 respectivamente.

Assim, os resultados deste estudo estão de acordo com os resultados obtidos pelos exemplos 3 e 4, uma vez que se constata que as microesferas do exemplo 2 liberam menos peptídeo durante as primeiras 24 horas (efeito “burst”) que as microesferas do exemplo 1. Pode-se concluir disso que, quando as microesferas contêm a matriz polimérica de acordo com a presente invenção, e quando são fabricadas usando o processo de acordo com presente invenção, elas apresentam uma liberação “burst” sensivelmente inferior às microesferas preparados de acordo com o processo do estado anterior da técnica após uma administração in vivo.

Exemplo 6: O perfil completo de liberação do 5-OxoPro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-ProNHEt acetato a partir das microesferas preparadas de acordo com o exemplo 2 é estudado nos ratos. O objeto do estudo é demonstrar que, após o fenômeno de liberação “burst” (que acontece sistematicamente, mas que é relativamente fraco em relação a microesferas descritas no estado anterior da técnica), as microesferas obtidas de acordo com o processo da presente invenção liberam o peptídeo em contínuo durante um período de vários meses.

De modo similar ao exemplo 4, as microesferas são colocadas em suspensão em um veículo aquoso padrão para sua administração sub-cutânea ao nível de uma zona dorsal previamente raspada nos ratos. A dose administrada em cada animal é de 3,6 mg de 5-OxoPro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-ProNHEt acetato encapsulado.

Em diversos momentos durante um período de três meses, grupos de ratos são sacrificados, o local de injeção é excisado, e depois as microesferas restantes ao nível do sítio, com o tecido conjuntivo contíguo, são recuperadas. O 5-OxoPro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-ProNHEt acetato permanecendo ao nível do sítio de injeção é então extraído, e depois quantificado por cromatografia em fase líquida em alta pressão (HPLC).

Os resultados deste estudo são apresentados na figura 2. Eles mostram assim que as microesferas liberam o peptídeo continuamente em um período de pelo menos três meses.

Exemplo 7: O estudo da atividade biológica in vivo do 5-OxoPro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-ProNHEt acetato microencapsulado nas microesferas preparadas de acordo com o exemplo 2 e o exemplo 2 bis é realizado aqui. O 5-OxoPro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-ProNHEt acetato é um análogo de agonista que possui o hormônio LH-RH, que estimula a secreção das gonadotrofinas pela hipófise e a esteroidogênese nos órgãos genitais com doses agudas. Todavia, quando ele é administrado de modo crônico, produz-se, paradoxalmente, efeitos inibidores antagonistas sobre a gonadotrofina hipofisária e a esteroidogênese e ovariana. Uma administração inicial de 5-OxoPro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-ProNHEt acetato provoca um brusco aumento das taxas séricas de gonadotrofinas e de hormônios sexuais, mas no caso de uma exposição contínua no medicamento, estas taxas de hormônios diminuem sensivelmente até chegar abaixo dos valores iniciais de base após vários dias de administração, e este fenômeno permanece durante a duração do tratamento.

Em conseqüência, a fim de verificar que a baixa liberação “burst” das formulações fabricadas de acordo com os exemplos 2 e 2 bis não altera sua atividade farmacológica 3,6 mg de 5-OxoPro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-ProNHEt acetato micro-encapsulado nestas microesferas, são injetados por administração sub-cutânea em ratos e, em diversos momentos após a administração, amostras de sangue são retiradas para estimar a testosterona sérica por dosagem radio-imunológica.

Os resultados deste estudo são apresentados na figura 3. Os resultados mostram assim um perfil de testosterona sérica apropriado: um aumento brusco durante os primeiros dias, seguido de uma supressão da concentração plasmática de testosterona, e eles demonstram assim uma atividade biológica correta do peptídeo liberado a partir da formulação de acordo com a presente invenção. O objeto dos exemplos 8 a 10 é mostrar as diversas vantagens que apresentam as microesferas preparadas de acordo com o processo objeto da presente invenção em relação às microesferas preparadas de acordo com o processo descrito na patente FR 2 718 642. As principais diferenças existem entre a presente invenção e a invenção descrita na patente FR 2 718 642 são as seguintes: • Sem agente modulador de liberação utilizado no processo da presente invenção. • Adição de manitol ou de NAC1 enquanto agente osmótico na fase aquosa externa na qual a primeira emulsão é emulsificada. • Seleção de uma faixa de peso molecular (40 000 a 80 000) e de uma proporção ácido láctico/ ácido glicólico (50/50 a 80/20) do copolímero d,l-lactídeo-co-glicolídeo (PLGA) na presente invenção.

Exemplo 8: Efeito do agente de modulação de liberação sobre a liberação in vitro Microesferas são preparadas de acordo com o processo de fabricação descrito no exemplo 2, usando-se, como fase orgânica, uma solução de cloreto de metileno que contém 30% de um copolímero d,l-lactídeo-co-glicolídeo que tem um peso molecular médio de 34.000 daltons (viscosidade inerente de cerca de 0,4 dl/g) e uma proporção do ácido láctico ao ácido glicólico de 50/50 assim como diferentes quantidades (exemplos 8.1. 8.2 e 8.31 de um polifd.l-lactídeo) que tem um peso molecular médio de 2.000 daltons ÍPLA 2.000).

Exemplo 8.1: 0% de PLA 2,000 Exemplo 8.2: 2,5% de PLA 2,000 Exemplo 8.3: 5% de PLA 2,000 A fase aquosa externa é uma solução aquosa composta de 0,25% de polissorbato 80, de 4% de polivimlpirrolidona e de 5% de manitol. A liberação inicial in vitro de 5-OxoPro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-ProNHEt acetato a partir de microesferas preparadas de acordo com os exemplos 8.1, 8.2 e 8.3 é realizada em um tampão fosfato. 25 mg de cada formulação são colocados em suspensão em um meio de liberação composto de 5 ml de tampão fosfato (pH = 7,4), e depois agitadas (rotação) durante 7 dias a 37°C. Em diversos momentos, a quantidade de peptídeo liberada é medida por cromatografia em fase líquida em alta pressão (HPLC). Os resultados são apresentados na tabela 3 seguinte.

Tabela 3 Os resultados mostram, para estes 3 casos de figura 8.1, 8.2 e 8.3, uma liberação “burst” muito fraca e mostram que o agente de modulação (PLA) de liberação tem um efeito de aceleração da liberação do princípio ativo, e isto mesmo em fracas concentrações (2,5%) de PLA que indicam que a utilização deste agente pode não ser adequada para a fabricação de microesferas concebidas para uma liberação prolongada (por um período de três meses).

Exemplo 9: Efeito do agente de modulação de liberação sobre o perfil farmacodinâmlco e seleção do polímero para uma liberação prolongada em três meses O efeito da composição polimérica das microesferas sobre a liberação do princípio ativo é estudado em um estudo farmacodinâmico realizado em ratos. As microesferas são preparadas de acordo com o processo de fabricação descrito no exemplo 2, usando diferentes tipos de polímero: Exemplo 9.1: Mistura de 97,5% de um copolímero d,l-lactídeo-co-glicolídeo que tem um peso molecular médio de 34.000 daltons e uma proporção do ácido láctico ao ácido glicólico de 50/50 e de 2,5% de um poli(d,l-lactídeo) que tem um peso molecular médio de 2.000 daltons (agente de modulação de liberação).

Exemplo 9.2: Copolímero d,l-lactídeo-co-glicolídeo que tem um peso molecular médio de 34.000 daltons e uma proporção do ácido láctico para ácido glicólico de 50/50.

Exemplo 9.3: Copolímero d,l-lactídeo-co-glicolídeo que tem um peso molecular médio de 63.000 daltons e uma proporção do ácido láctico para ácido glicólico de 75/25. O estudo de liberação in vivo do 5-OxoPro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-ProNHEt acetato a partir de microesferas é realizado através de seu efeito farmacológico de supressão das taxas plasmáticas de testosterona.

Os resultados deste estudo são apresentados na figura 4. Os resultados confirmam assim que a presença do agente de modulação de liberação acelera a liberação do princípio ativo e que o agente de modulação de liberação não pode pois ser usado nas formulações muito prolongadas (taxa de testosterona suprimida durante 5 semanas).

Os resultados mostram igualmente que um copolímero d,l-lactídeo-co-glicolídeo que tem um peso molecular médio de 34.000 daltons e uma proporção do ácido láctico para o ácido glicólico de 50/50 pode manter a supressão das taxas de testosterona durante 8 semanas enquanto que um copolímero d,l-lactídeo-co-glicolídeo que tem um peso molecular médio de 63.000 daltons e uma proporção do ácido láctico para ácido glicólico de 75/25 pode manter a castração durante pelo menos três meses.

Exemplo 10: Efeito da adição de um agente osmótico na fase aquosa externa Formulação 10.1: Microesferas são preparadas de acordo com o processo de fabricação descrito no exemplo 2, usando como fase aquosa externa uma solução composta de 0,25% de Polissorbato 80 e de 4% de polivinilpirrolidona.

Formulação 10.2: Microesferas são preparadas de acordo com o processo de fabricação descrito no exemplo 10.1, adicionando-se entre 2,5% e 5% de manitol na fase aquosa externa como agente osmótico.

Formulação 10.3: Microesferas são preparadas de acordo com o processo de fabricação descrito no exemplo 10.1, adicionando-se entre 2,5% e 5% de cloreto de sódio na fase aquosa externa como agente osmótico.

Os resultados do estudo mostrando a influência do agente osmótico na fase aquosa externa são apresentados na tabela 4 seguinte: Tabela 4: Assim, o tamanho e o teor em peptídeo das microesferas dependem da presença do agente osmótico na fase aquosa externa. A adição de manitol ou de NaCl como agente osmótico aumenta a eficácia de encapsulação, ou seja, a porcentagem de princípio ativo microencapsulado (teor). O tipo e a quantidade do agente osmótico adicionado podem igualmente permitir o controle do tamanho das partículas. No quadro na presente invenção, o Nacl é vantajosamente usado como agente osmótico, pois foi evidenciado que, nas condições de agitação e de viscosidade idóenticas, o cloreto de sódio permite uma maior redução do tamanho das partículas que o manitol, sem produzir no entanto uma diminuição da eficácia de encapsulação.

Exemplo 11: Efeito da concentração do agente que aumenta a viscosidade (agente viscosificador) presente na fase aquosa externa sobre o tamanho das partículas Formulação 11.1: Microesferas são preparadas de acordo com o processo descrito no exemplo 2, mas sem princípio ativo, usando como fase aquosa externa uma solução composta de 0,25% de Polissorbato 80,5% de manitol e 6,8% de polivinilpirrolidona.

Formulação 11.2: Microesferas são preparadas de acordo com o processo de fabricação descrito no exemplo 2, mas sem princípio ativo, usando como fase aquosa externa uma solução composta de 0,25% de Polissorbato 80,5% de manitol e 8,0% de polivinilpirrolidona.

Os resultados do estudo mostram a influência do agente viscosificador na fase aquosa externa são apresentados na tabela 5 seguinte: Tabela 5: O exemplo 10,2 elaborado com uma fase aquosa externa composta de 0,25% de Polissorbato 80, 5% de manitol e 4% de polivinilpirrolidona permitia obter um tamanho de partículas de 43,8 μηι. Aumentando-se a concentração de agente viscosificador, pode-se constatar que uma diminuição notável do tamanho das partículas é obtida, como mostrado na tabela 5 acima. Assim, o tamanho das microesferas depende da presença do agente viscosificador na fase aquosa externa, e de sua concentração.

Claims (12)

1. Processo de preparação de uma composição farmacêutica sob forma de microesferas com liberação prolongada de um princípio ativo hidrossolúve), caracterizado pelo fato de compreender a sucessão das etapas seguintes: - dissolver o princípio ativo em uma quantidade apropriada de água, o princípio ativo sendo escolhido do grupo constituído por peplídeos, proteínas, vacinas, antibióticos, and-d opressores, analgésicos, anti- inflamatórios e citoestãticos, - emulsificar a solução aquosa do princípio ativo assim obtida com uma solução de um copolímero matricial d,l-lactídeo-co-glicolídeo de peso molecular médio compreendido entre 40.OCX) e 80.000 e tendo uma proporção de ácido láctico/ ácido glicóltco compreendida entre 50/50 e 80/20, dissolvido em um hidrocarboneio clorado, o hidrocarboneio clorado sendo escolhido dentre cloreto de metileno, clorofórmio, cloroetano, dicloroetano ou tricloroetano, conduzindo a uma primeira emulsão mícrofma e homogênea, - emulsificar a primeira emulsão assim obtida em uma fase aquosa externa, contendo 0,1 a 0,5% em peso de polissorbato 80, 1 a 25°/c em peso de polivinilpinolidona e 0,1 a 10% em peso de manitol ou de cloreto de sódio, - extrair- evaporar o solvente para obter microesferas que se recuperam após filtração, lavagem e secagem.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo feto de que o princípio ativo é o 5-Oxo-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu- Arg-ProNHEt ou um de seus sais.

3. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2. caracterizado pelo feto de que a primeira fase de dissolução do princípio ativo em água para formar uma fase aquosa interna é realizada sem a adição de nenhuma substância que retém o princípio ativo, nem agente estabilizador da emulsão e sem nenhuma operação destinada a aumentar a viscosidade.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o princípio ativo está presente em uma concentração compreendida entre 0,01 e 95% em peso, com vantagem entre 0,5 e 40 % em peso, em relação ao peso total da fase aquosa interna.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o hidrocarboneto clorado é o cloreto de metileno.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que o copolímero matricial está presente a uma concentração compreendida entre 5 e 50 % em peso, em relação ao peso total da solução constituída do copolímero dissolvido em hidrocarboneto clorado.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que a fase aquosa externa contém uma solução de polissorbato 80, polivinilpirrolidona e cloreto de sódio.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que, durante a etapa de extração-evaporação do solvente, o solvente é rapidamente eliminado em temperatura ambiente e sob pressão atmosférica, de acordo com um sistema evaporador contínuo constituído por um declive de comprimento adequado sobre o qual escoa, em camada fina, a suspensão de microesferas.

9. Microesferas susceptíveis de serem obtidas pela realização do processo conforme qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizadas pelo fato de apresentarem uma liberação contínua de princípio ativo durante um período de mais de dois meses, com vantagem em um período de, pelo menos, três meses.

10. Microesferas, de acordo com a reivindicação 9, caracterizadas pelo fato de que o princípio ativo está presente em uma concentração compreendida entre 0,5 e 20 % em peso, com vantagem entre 5 e 15 % em peso, em relação ao peso total das microesferas.

11. Microesferas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 ou 10, caracterizadas pelo fato de que seu tamanho é inferior a 250 μηι, com vantagem inferior a 90 μπι.

12. Microesferas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9, 10 ou 11, caracterizadas pelo fato de que elas são administradas por via parenteral, com vantagem sob forma de injeções intramusculares, sub-cutâneas ou em um local onde se encontra um tumor.