BRPI0015031B1 - método para prover uma planta transgênica capaz de expressar um anticorpo com galactosilação terminal e método para obtenção de uma glicoproteína desejada ou fragmento funcional da mesma - Google Patents

Abstract

"planta, método para prover uma planta transgênica capaz de expressar uma proteína recombinante com a capacidade de estender um glicano n-ligado com galactose, uso de uma planta, método para obter uma glicoproteína desejada ou seu fragmento funcional, glicoproteína derivada de uma planta ou seu fragmento funcional, uso de uma glicoproteína ou seu fragmento funcional, e, composição farmacêutica". a invenção diz respeito ao campo de processamento de glicoproteína em plantas transgênicas usado como fatores de baixo custo e em fábricas livres de contaminação para a produção de proteínas biofarmacêuticas recombinantes ou composições farmacêuticas que incluam estas proteínas. a invenção proporciona uma planta que compreenda uma enzima funcional de mamíferos que fornece a biossíntese de n-glicano que normalmente não se faz presente nas plantas, dita planta adicionalmente compreendendo pelo menos uma segunda proteína de mamíferos ou seu fragmento funcional que normalmente não está presente nas plantas.

Description

“MÉTODO PARA PROVER UMA PLANTA TRANSGÊNICA CAPAZ DE EXPRESSAR UM ANTICORPO COM GALACTOSILAÇÃO TERMINAL E MÉTODO PARA OBTENÇÃO DE UMA GLICOPROTEÍNA DESEJADA OU FRAGMENTO FUNCIONAL DA MESMA” [001] A invenção diz respeito ao campo de processamento de glicoproteína em plantas transgênicas usadas como fábricas econômicas e livres de contaminação para a produção de substâncias proteináceas úteis, tais como proteínas biofarmacêuticas recombinantes ou composições (farmacêuticas) que compreendem estas proteínas.

[002] A criação de proteínas recombinantes como, por exemplo, medicamentos ou composições farmacêuticas através de agricultura fármaco-molecular constitui uma das principais atrações das plantas transgênicas; é também o domínio onde sua utilização é mais bem aceita pela opinião pública. Além do rendimento e do custo favorável que podem ser esperados da produção de campo de proteínas recombinantes, as plantas transgênicas apresentam certas vantagens sobre outros sistemas de produção, tais como bactérias, leveduras e células de animais. De fato, elas são destituídas de vírus que possam ser perigosos para os humanos, e podem acumular as proteínas de interesse em seus “órgãos de armazenagem”, tais como as sementes ou os tubérculos. Isto facilita sua manipulação, seu transporte e sua armazenagem em temperatura ambiente, enquanto propicia a possibilidade de subsequente extração de acordo com as necessidades. Além disso, a planta transgênica, ou algumas de suas partes, pode ser utilizada como vetor de medicamentos ou de vacinas. Em 1996, a equipe de Charles Arntzen (Boyce Thompson Institute for Plant Research, Cornell University, New York) demonstrou a produção de uma vacina recombinante contra a enterotoxina termolábil do Escherichia coli pela batata. Sua eficácia foi demonstrada em camundongos e através de experimentações clínicas realizadas em voluntários que tinham consumido de 50 a 100 gramas de batatas transgênicas cruas durante um período de seis meses. Outra equipe, em Loma Linda, na Califórnia, testou com sucesso em camundongos uma vacina contra a cólera formada na batata. A vacinação tradicional contra os germes responsáveis por enteropatias é considerada como “muito dispendiosa” para ser implementada de uma maneira geral nos países em desenvolvimento. No entanto, a produção de vacinas orais, por exemplo, não mais na batata, mas na banana, deve, a um custo muito baixo, possibilitar a implementação geral da vacinação contra diarréias de origem bacteriana, que causam a morte de três milhões de crianças a cada ano. Nos países desenvolvidos, pode-se imaginar que as crianças devem certamente preferir uma vacina de banana ou de morango à agulha do médico. De um modo mais geral, a farmacêutica molecular poderia permitir aos países em desenvolvimento produzir, a baixo custo, quantidades substanciais de proteínas terapêuticas utilizando as capacidades de sua agricultura, sem que seja necessário investir em fábricas farmacêuticas. Embora as vantagens das plantas como fábricas de substâncias proteináceas serem explicadas na maioria das vezes à luz de biofarmacêuticos, as plantas são também úteis para a produção de outras proteínas, por exemplo enzimas industriais e similares, por causa de sua capacidade de glicosilação, conduzindo, por exemplo, à estabilidade mais elevada. Hoje, a utilização de plantas para a produção de proteínas ou glicoproteínas para uso terapêutico tem ido amplamente além do domínio da ficção científica, uma vez que a soja, o tabaco, a batata, o arroz ou a colza têm sido o objeto de pesquisas para a produção de vacinas, proteínas ou peptídeos de mamíferos, tais como: anticorpos monoclonais, antígenos de vacinas, enzimas, tais como a lipase gástrica canina, citocinas, tais como o fator de crescimento epidérmico, interleucinas 2 e 4, eritropoietina, encefalinas, interferon e albumina sérica, para a maior parte de origem humana. Algumas destas proteínas já têm provado sua eficácia em voluntários humanos, porém, sua imunogenicidade potencial e seu possível caráter alergênico ainda restringem seu desenvolvimento. Várias proteínas heterólogas têm sido produzidas com sucesso nas plantas. Entre estas proteínas estão os anticorpos monoclonais, os hormônios, os antígenos de vacinas, as enzimas e as proteínas do sangue (Dieryck et ai, 1997; Florack et al., 1995; Ma et al., 1995; Matsumoto et al., 1163; Saito et al., 1991; Thanavala et al., 1995). Uma principal limitação das plantas, compartilhada com outros sistemas de expressão heterólogos como bactérias, leveduras e células de insetos, é seu perfil de glicosilação diferente em comparação com os mamíferos. Ao contrário das bactérias, tendo nenhum glicano N-ligado, e da levedura, tendo apenas glicanos de alta manose, as plantas são capazes de produzir proteínas com glicanos N-ligados complexos. As glicoproteínas das plantas têm glicanos N-ligados complexos contendo uma fucose de núcleo a1,3 ligada e resíduos de xilose β1,2 ligada não encontrados nos mamíferos (Lerouge et al., 1998) (Figura 1). O núcleo de N-glicanos das plantas pode, como nos mamíferos, ser substituído por 2 resíduos GlcNAc1, que são transferidos por N-acetilglicosaminiltransferase I e II (Schachter, 1991), embora sua aparência varie (Rayon et al., 1999). Os N-glicanos de algumas glicoproteínas de plantas contêm, além disso, um epítopo de LewisA (Fucccl ,4(Gaipi ,3)GlcNAc] (Fitchette Laine et al., 1997; Melo et al., 1997). No entanto, as glicoproteínas das plantas carecem da galactose característica (NeuAcoc2,6Gaipi ,4) contendo os N-glicanos complexos encontrados em mamíferos, enquanto também a fucose de núcleo a1,6 ligada nunca é encontrada (figura 1; Schachter, 1991). Um anticorpo monoclonal de camundongos produzido nas plantas de tabaco (Ma et al., 1995) tem uma N-glicosilação vegetal típica. 40% de glicanos de alta manose e 60% de glicanos complexos contendo xilose, fucose e 0,1 ou 2 resíduos terminais GlcNAc (Cabanes Macheteau et ai, 1999).

[003] Em suma, as análises de glicoproteínas das plantas têm indicado que várias etapas nas trajetórias da glicosilação de plantas e mamíferos são muito semelhantes, senão idênticas. Existem, no entanto, também diferenças claras, particularmente na síntese de glicanos complexos. Os glicanos complexos das plantas são geralmente muito menores e contêm xilose beta-1,2 ou resíduos de fucose alfa-1,3 ligados ao núcleo Man3 (GlcNAc)2. Tais resíduos na glicoproteína são conhecidos como sendo altamente imunogênicos. Isto causará problemas quanto a certas aplicações de proteínas recombinantes que carregam estes açúcares. Além disso, embora comum e frequentemente essencial nas glicoproteínas de mamíferos, o ácido siálico nunca foi encontrado nos glicanos das plantas. Isto é particularmente relevante, uma vez que experiências têm mostrado que a ausência de ácido siálico terminal nas cadeias laterais glicosídicas pode dramaticamente reduzir a atividade biológica in vivo. Muito provavelmente, os asialoglicoproteína-receptores no fígado podem ligar-se à asialoglicoproteína e, dessa forma, causar uma depuração da glicoproteína da circulação, que é refletida em uma meia-vida metabólica reduzida e baixa bioatividade in vivo.

[004] A invenção provê uma planta compreendendo uma enzima funcional de mamífero que fornece a biossíntese de N-glicanos que normalmente não estão presentes nas plantas. É especialmente o caráter de “planta” dos glicanos que torna as glicoproteínas produzidas nas plantas menos adequadas para uso farmacêutico. Este caráter de “planta” confere características antigênicas e imunogênicas indesejáveis à glicoproteína em questão, o que requerería uma estratégia destinada a evitar a imunogenicidade das glicoproteínas produzidas por plantas transgênicas. O objetivo da estratégia é modificar o genoma das células vegetais de uma maneira tal que elas amadureçam suas proteínas como as células humanas fariam. Numerosos genes de glicosil transferases de mamíferos já foram clonados, o que não é o caso nas plantas. Em vista da facilidade de transformação dos sistemas vegetais, a tentação é forte para “complementar” o aparelho de Golgi das plantas mediante glicosil transferases de mamíferos a fim de “humanizar” ou “mamiferizar” os glicanos das glicoproteínas que eles produzem. O sucesso de tal estratégia, contudo, não é evidente. Em particular, a galactosilação e a subsequente sialilação das glicoproteínas recombinantes em uma célula vegetal depende não apenas da transferência e da expressão do gene da galactosila e da sialila transferase: estas enzimas estranhas devem ser também ativas na célula vegetal, sem efeitos prejudiciais para a célula da planta, e por último, mas não menos importante, sem efeitos prejudiciais para a planta transgênica como um todo.

[005] Para mamiferizar a glicosilação da planta para a produção de glicoproteínas feitas sob medida nas plantas, uma xilosiltransferase e fucosiltransferase podem ser eliminadas e pelo menos uma das diversas glicosiltransferases de mamíferos deve ser expressa. Proporcionar as eliminações das xilosiltransferase e fucosiltransferase e, dessa forma, reduzir o potencial da glicosilação indesejável das plantas, é uma opção exequível porque, por exemplo, um mutante de Arabidopsis thaliana mutado no gene que codifica a N-acetilglicosaminiltransferase I foi completamente viável (Von Schaewen et ai, 1993). Como a N-acetilglicosaminiltransferase I é a enzima que inicia a formação dos glicanos complexos (Schachter, 1991), esta planta carece completamente dos glicanos complexos contendo xilose e fucose.

[006] Em uma forma de realização preferida, a invenção provê uma planta que compreende uma proteína funcional (de mamífero), por exemplo um transportador ou uma enzima que proporciona a biossíntese do N-glicano que normalmente não está presente em plantas que adicionalmente compreendam pelo menos uma segunda proteína de mamíferos ou seu fragmento funcional que não esteja normalmente presente nas plantas. É propiciado pela invenção produzir nas plantas uma glicoproteína desejada tendo um padrão de glicosilação do tipo mamífero, pelo menos em que a referida glicoproteína seja galactosilada. Novamente, as glicoproteínas desejadas podem ser qualquer glicoproteína útil para a qual a glicosilação semelhante à de mamífero seja relevante.

[007] Em uma forma de realização preferida, a invenção fornece uma planta de acordo com a invenção, em que a referida enzima funcional de mamíferos provendo a biossíntese de N-glicano, que normalmente não está presente nas plantas, compreende β1,4-galactosiltransferase (humana). Uma importante enzima de mamífero que está faltando nas plantas é esta β1,4-galactosiltransferase. Os cDNAs que codificam esta enzima foram clonados de várias espécies de mamíferos (Masri et al., 1988; Schaper et al., 1986). A enzima transfere a galactose do doador de açúcar ativado UDP-Gal na ligação β1,4 para os resíduos GlcNAc nos glicanos N-ligados e outros (figura 1). Estes resíduos de galactose têm desempenhado um papel importante na funcionalidade, por exemplo, de anticorpos (Boyd et al., 1995). A β1,4-galactosiltransferase foi recentemente introduzida em culturas celulares de insetos (Hollister et al., 1998; Jarvis e Finn, 1996) para estender a trajetória da N-glicosilação de células de insetos Sf9 na cultura celular, possibilitando a infecção destas culturas com um vetor de expressão de baculovírus compreendendo um ácido nucléico que codifica uma proteína heteróloga. Foi mostrado que os glicanos N-ligados da proteína heteróloga foram, em alguma extensão, mais extensivamente processados, permitindo a produção das glicoproteínas recombinantes galactosiladas nas ditas culturas celulares de insetos. Ainda, a introdução da enzima em uma cultura de suspensão celular do tabaco resultou na produção de glicanos N-ligados galactosilados (Palacpac et al., 1999) de proteínas endógenas. No entanto, nenhuma glicoproteína heteróloga foi produzida nestas culturas celulares de plantas, muito menos que tais proteínas heterólogas seriam de fato galactosiladas na cultura celular. Além disso, até hoje nenhuma planta transgênica compreendendo padrões de glicosilação de mamíferos foi apresentada na técnica. Muitos mutantes de glicosilação existem nas linhagens celulares de mamíferos (Stanley e Loffe, 1995; Stanley et al., 1996). Entretanto, mutações similares em organismos completos causam disfunções mais ou menos sérias destes organismos (Asano et al., 1997;

Herman e Hovitz, 1999; Loffe e Stanley, 1994). É quanto a isto, em geral, ainda esperado que a expressão de β1,4-galactosiltransferase em um todo maior do que as células sozinhas (tal como em um tecido coesivo ou organismo total) também conduzirá à tal disfunção, por exemplo durante a embriogênese e/ou organogênese. De fato, nenhum relato foi feito até agora de que um organismo não de mamífero completamente desenvolvido, tal como um inseto ou uma planta, tenha sido apresentado tendo a capacidade de estender um glicano N-ligado, pelo menos não pela adição de uma galactose. A partir de muitos organismos multicelulares eucarióticos, linhagens celulares imortalizadas, tais como CHO, Sf9 e linhagens celulares de hibridomas, têm sido geradas. Estas linhagens celulares têm sido cultivadas por muitas gerações, podendo carregar muitas mutações e carecer ou ter perdido muitas características que são essenciais para o funcionamento dos organismos intactos dos quais elas são derivadas. Para ilustrar esta última citação, o fato de que estas linhagens celulares imortalizadas não podem ser regeneradas nos organismos intactos completos mostra que importantes trajetórias de sinalização e componentes envolvidos na comunicação célula-célula estão faltando nestas linhagens celulares imortalizadas. É conhecido da literatura que o maquinismo de glicosilação N-ligada das linhagens celulares eucarióticas imortalizadas, tais como as células CHO (Stanley e Loffe, 1995; Stanley etal., 1996) ou as linhagens celulares de insetos Sf (Jarvis e Finn, 1996; Hollister et ai, 1998), pode ser modificado sem ter efeitos negativos óbvios sobre a viabilidade destas linhagens celulares, enquanto, em contraste, mutações semelhantes em organismos completos causam mais ou menos disfunções sérias do organismo (Aseno et ai, 1997; Herman e Horvitz, 1999; Loffe e Stanley, 1994). De fato, nenhum relato foi feito de que a glicosilação N-ligada pode ser estendida, de uma maneira tal que os glicanos N-ligados sejam formados, o que naturalmente não ocorre em células eucarióticas que possuem a potência para regenerar-se em organismos viáveis.

Aparentemente, em comparação com as células normais, as linhagens celulares imortalizadas são flexíveis e tolerantes a novos tipos não normais de glicosilação N-ligada, mas carecem da capacidade para desenvolver-se em organismos intactos.

[008] Ainda, a modificação do maquinismo da N-glicosilação das células BY2 do tabaco imortalizadas foi relatada. A introdução de GaIT nesta linhagem celular resulta na produção de glicanos N-ligados galactosilados de proteínas endógenas (Palacpac et ai, 1999). No entanto, as células desta linhagem celular BY2 não podem ser regeneradas nas plantas viáveis do tabaco. Além disso, e como descrito em outra parte neste pedido de patente, a maior população foi um glicano do tipo híbrido anormal (GlcNAc2Man5GlcNAcGal), sugerindo ação prematura da galactosiltransferase introduzida e uma morfologia de Golgi anormal e localização da galactosiltransferase na linhagem celular BY2. Isto provê evidência adicional de que estas linhagens celulares são significativamente diferentes das células normais da planta do tabaco.

[009] Nenhum relatório foi feito até agora, em que um organismo não mamífero completamente desenvolvido, tal como um inseto ou planta, tenha sido apresentado como tendo a capacidade de estender um glicano N-ligado, pelo menos não pela adição de uma galactose.

[010] Surpreendentemente, a invenção agora provê um organismo não mamífero, uma planta tendo sido dotada de uma enzima de mamífero (funcional) proporcionando a biossíntese de N-glicano que normalmente não está presente nas plantas, dessa forma, por exemplo, proporcionando a capacidade de estender um glicano N-ligado mediante a adição de uma galactose. Em uma forma de realização preferida, a invenção provê tal planta em que a dita enzima apresenta expressão estável. É ainda fornecido que, além da dita segunda proteína de mamífero, uma terceira proteína de mamífero seja expressa por uma planta, conforme é proporcionado pela invenção. A parte experimental provê uma planta, que compreende um ácido nucléico que codifica tanto um anticorpo de cadeia leve e pesada quanto seu fragmento (funcional). Naturalmente, não é necessário que uma proteína completa seja expressa, a invenção também provê uma planta de acordo com a invenção expressando apenas um fragmento, preferivelmente um fragmento funcional da referida segunda glicoproteína de mamífero, o dito fragmento tendo pelo menos uma atividade da proteína completa e ainda sendo caracterizado, por exemplo, por uma cadeia truncada de polipeptídeos, ou um glicano não completamente estendido, por exemplo apenas estendido com galactose. Em uma forma de realização preferida, a invenção proporciona uma planta de acordo com a invenção, em que dita segunda proteína de mamífero ou seu fragmento funcional compreende um glicano N-ligado estendido que seja destituído de xilose e/ou de fucose. Como pode ser observado da Figura 3, as glicoproteínas galactosiladas derivadas de plantas podem ainda conter resíduos de xilose e fucose.

[011] Isto contrasta com as glicoproteínas galactosiladas derivadas da cultura celular da planta (Palacpac et al., 1999), em que estas glicoproteínas são essencialmente destituídas de resíduos de xilose e de fucose. Nas culturas celulares de plantas, este é um resultado da ação da β1,4-galactosiltransferase sobre glicanos N-ligados imaturos, resultando em glicanos N-ligados do ‘tipo híbrido’ galactosilados não naturais, em que a manosidase II de Golgi e a N-acetilglicosaminiltransferase II não podem realizar mais sua função. Em uma forma de realização preferida, a β1,4-galactosiltransferase é para isso expressa nas plantas de maneira tal que a enzima atua no aparelho de Golgi sobre os substratos naturais (Figura 5). Isto significa após a ação da N-acetilglicosaminiltransferase I, da manosidase II de Golgi e da N-acetilglicosaminiltransferase II (e nas plantas, contanto que estas enzimas não fiquem inibidas de outra maneira, após ou durante a ação da xilosiltransferase e da fucosilstransferase). A presente invenção fornece uma planta em que a galactosilação é essencialmente natural, como ocorre nos mamíferos.

[012] A transmembrana citoplasmática N-terminal e a região tronco de glicosiltransferases determinam a localização da enzima no ER ou membrana de Golgi. Para prover a glicosilação natural ou desejável, as glicosiltransferases podem ser expressas nas plantas como elas ocorrem nos mamíferos, mas podem também ser expressas como uma proteína de fusão entre duas, ou parte das duas, glicosiltransferases diferentes. Neste caso, a localização é determinada por uma enzima e a atividade catalítica por uma segunda enzima. Como exemplo, uma fusão entre a transmembrana citoplasmática e a região tronco da xilosiltransferase da planta e o domínio catalítico da galactosiltransferase de mamíferos, provendo uma enzima com atividade de galactosiltransferase e localização da xilosiltransferase.

[013] Caso seja desejado ainda separar as glicoproteínas que compreendam glicano N-ligado estendido que é destituído de xilose e/ou de fucose, ou para produzi-los de uma maneira mais purificada, várias possibilidades são abertas. Para uma, vários tipos de técnicas de separação existem, tais como a purificação por (imuno)afinidade ou a cromatografia de exclusão por tamanho ou a eletroforese, para mediar a purificação requerida. Além disso, outra opção é usar como material de partida plantas em que os genes responsáveis pela adição de xilose e/ou de fucose sejam eliminados.

[014] Em outra modalidade, a invenção provê uma planta de acordo com a invenção, em que o dito glicano N-ligado compreendendo galactose ainda compreende ácido siálico a ele adicionado. Em particular, a transferência de genes codificando para as sialila transferases, enzimas que catalisam a adição de ácido siálico sobre o glicano, em sistemas vegetais conduz a glicoproteínas ainda mais estáveis durante a utilização in vivo e, consequentemente, mais bem adaptadas a uma possível terapia. A invenção inclusive provê a transferência de uma trajetória de biossíntese de ácido siálico para as plantas. Nesta invenção, quando da referência a plantas, o espectro completo de plantas variando de algas a árvores é intencionado, a menos que de outra forma especificado. As plantas em geral carecem de ácido siálico, um resíduo de açúcar necessário para a função intensificada de certas glicoproteínas como anticorpos e hormônios, em seus glicanos N-ligados, e também os substratos para a sialilação nunca foram observados. A invenção provê plantas que possuem a capacidade de produzir glicanos N-ligados contendo NeuAc em suas proteínas. Para estabelecer isto, até 5 diferentes genes heterólogos são expressos nas plantas (ver Tabela 1). Para se prover plantas com a capacidade biossintética para produzir ácido siálico, genes que codificam até cinco enzimas que atuam na trajetória da biossíntese do ácido siálico são transformados em plantas. Estas enzimas de origem bacteriana e de mamíferos são conhecidas: GlcNAc-2 epimerase, NeuAc sintase, CMP-NeuAc sintetase, transportador CMP-NeuAc e NeuAc transferase. Todos os genes codificando as enzimas são, caso desejado, fornecidos com uma marcação (FLAG) para seguir a expressão e são transformados em, por exemplo, tabaco e milho.

[015] Em outra forma de realização preferida, a invenção provê uma planta de acordo com a invenção, em que o dito glicano N-ligante que compreende galactose ainda compreende ou é estendido com ácido glicurônico, glicuronil, sulfato, sulfona, fucose ou outro composto capaz de estender galactose ligada à dita galactose. Isto é particularmente relevante, uma vez que os experimentos têm mostrado que a ausência de ácido siálico terminal nas cadeias laterais glicosídicas pode, em geral, reduzir dramaticamente a atividade biológica in vivo. Muito provavelmente, os receptores de asialoglicoproteína no fígado podem se ligar à asialoglicoproteína e, dessa forma, causar uma depuração da glicoproteína da circulação, o que se reflete em uma meia vida metabólica reduzida e baixa bioatividade in vivo. A presença de, por exemplo, GlcA ou outro grupo extensor, exceto ácido siálico, tem o mesmo efeito da presença de ácido siálico, ou seja, impede a ligação de uma proteína assim modificada ao receptor de asialoglicoproteína, por exemplo, das células do fígado, dessa forma efetivamente aumentando a meia-vida, e assim o tempo de depuração de tais proteínas quando usadas como substância terapêutica, isto é, como composição farmacêutica. A invenção, assim, provê um organismo derivado, aqui em particular uma glicoproteína derivada de planta ou seu fragmento funcional compreendendo um glicano N-ligado estendido pelo menos compreendendo galactose, a dita galactose ainda estendida com um composto capaz de estender-se com galactose, tal como Glca, para funcionar de uma maneira semelhante ao ácido siálico. Por exemplo, a invenção provê plantas que têm a capacidade de produzir glicanos N-ligados contendo GlcA ou suas proteínas. Para estabelecer isto, um gene codificando, por exemplo, glicuroniltransferase (Terayama et al., PNAS 94: 60936098, 1997) é expresso nas plantas de acordo com a invenção, usando métodos conhecidos na técnica ou aqui apresentados.

[016] Neste aspecto, a invenção não fica limitada às plantas, mas também provê outros organismos como animais, fungos ou leveduras, ou linhagens celulares como as linhagens celulares de mamíferos ou as linhagens celulares de insetos com a capacidade de produzir uma glicloproteína (essencialmente não sialiada) de acordo com a invenção, em que o dito glicano N-ligado compreendendo galactose é ainda compreendido ou estendido com, por exemplo, ácido glicurônico ligado à galactose, o que, em essência, tem o mesmo efeito que a presença de ácido siálico. A invenção não fica limitada à extensão da galactose por ácido glicurônico, o que tem essencialmente o mesmo efeito da presença de ácido siálico no fato de que ele aumenta a meia-vida biológica e o tempo de depuração. Igualmente, sulfato, fucose ou qualquer outro composto podem ser ligados à galactose, dessa forma estendendo o grupo carboidrato, mediante expressão de uma sulfotransferase, fucosiltransferase ou outra enzima que transfira sulfato, fucose ou outro composto para resíduos de galactose, e podem ser usados para aumentar a meia-vida. A invenção, assim, provê um método para aumentar a meia-vida ou melhorar o tempo de depuração de uma composição farmacêutica que compreende como componente ativo uma glicoproteína, compreendendo a prover dita glicoproteína com um composto, ligado à galactose, que substitui ou proporciona a função do ácido siálico e, assim, proporciona pelo menos reatividade reduzida com um receptor de asialoglicoproteína, preferivelmente em que o dito receptor esteja pelo menos presente em uma célula do fígado. Ainda, mais de um composto pode ser transferido para galactose, por exemplo o ácido glicurônico que é estendido pelo sulfato pela expressão de uma sulfotransferase que transfere sulfato para ácido glicurônico. A invenção não fica limitada àqueles casos em que a extensão de galactose por outros compostos diferentes do ácido siálico tenha o mesmo efeito da extensão com ácido siálico. A extensão da galactose por outros compostos que não o ácido siálico pode ter uma função por si própria, por exemplo na interação com outros compostos, células ou organismos. Além disso, ela tem a vantagem de que os componentes, de outra forma estendidos pelo ácido siálico, mas agora, por exemplo, com ácido glicurônico, ou sulfato de grupos de fucose, para esse caso, podem facilmente ser reconhecidos e, assim, distinguidos dos compostos endógenos semelhantes estendidos com ácido siálico. Por exemplo, uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína glicosilada, tal como um hormônio de glicoproteína, ou eritropoietina (EPO), normalmente fornecida com ácido siálico, mas agora com, por exemplo, uma sulfona ou ácido glicurônico, pode facilmente ser reconhecida, facilitando a detecção dos compostos estranhos. Como um exemplo, a Figura 6 mostra que as plantas do tabaco que expressam a β1,4 galactosiltransferase humana e a β1,3 glicuroniltransferase de ratos, formam a estrutura desejada GlcApi,Ga1 em suas glicoproteínas, como é claramente mostrado pela ligação de um anticorpo específico (anticorpo monoclonal 412 de camundongos) à estrutura GlcApi ,Ga1.

[017] Estender a galactose com outros compostos que não o ácido siálico também pode ter vantagens para a produção de proteínas recombinantes nas plantas. Isso pode tornar a glicoproteína ou o glicano da glicoproteína mais estável por impedir que as galactosidases e/ou outras glicosidases degradem o N-glicano. Pode-se, assim procedendo, aumentar a galactosilação. Isso pode também ser útil em um procedimento de purificação, por exemplo para facilitar a purificação por afinidade pelos anticorpos específicos, lectinas ou outros compostos. Se desejável, o composto pelo qual a galactose é estendida ou ainda compreendida pode, após purificação da glicoproteína recombinante, ser removido, por exemplo, por uma glicosidase, sulfatase, fosfatase específicas ou outras enzimas adequadas específicas.

[018] Em outra forma de realização preferida, a invenção provê uma planta de acordo com a invenção, em que dito glicano N-ligado compreendendo galactose ainda compreende outros resíduos de açúcar não diretamente ligados à galactose, por exemplo fucose ligada a alfa1,6 do núcleo ou acetilglicosamina N-ligada (GlcNAc) a betai ,4 ou betai ,6. Para estabelecer isto, um gene ou genes codificando, por exemplo, a fucosiltransferase alfa1,6 do núcleo e/ou a GlcNAc transferase III, GlcNAc transferase IV, GlcNAc transferase V e/ou a GlcNAc transferase VI, são expressos nas plantas de acordo com a invenção, usando-se métodos conhecidos na técnica ou aqui apresentados.

[019] Em geral, neste relatório é provido um método para adaptar a glicosilação N-ligada para a produção de glicoproteínas heterólogas em espécies de plantas com plantas típicas como padrões de glicosilação semelhantes àqueles apresentados na Figura 1, isto é, que carecem das proteínas típicas de mamíferos envolvidas na glicosilação N-ligada, tal como, mas não limitadas a, betai ,4-galactosiltransferases e glicuronil transferases.

[020] A geração de plantas estavelmente transformadas, que produzem glicoproteínas adaptadas de interesse comercial, pode ser estabelecida por inoculação das células ou tecidos de plantas com cepas de Agrobacterium contendo um vetor (binário) que compreende tanto sequências de nucleotídeos codificando as enzimas modificadoras por N-glicosilação quanto os genes que codificam glicoproteínas heterólogas de interesse comercial. Alternativamente, plantas estavelmente transformadas que produzem glicoproteínas adaptadas de interesse comercial podem ser geradas por inoculação simultânea (co-transformação) de duas ou mais cepas de Agrobacterium, cada uma carregando um vetor que compreende sequências de nucleotídeos codificando as enzimas modificadoras por N-glicosilação ou sequências de nucleotídeos codificando glicoproteínas de interesse comercial. Alternativamente, plantas estavelmente transformadas que produzem glicoproteínas adaptadas de interesse comercial podem ser geradas mediante cruzamento(s) (múltiplos) de plantas com N-glicosilação modificada com plantas que expressem as sequências de nucleotídeos codificando as proteínas de interesse comercial. Em todos estes procedimentos, o vetor pode também compreender uma sequência de nucleotídeos que confere resistência contra um agente de seleção. De modo a obter satisfatoriamente a expressão das proteínas envolvidas na N-glicosilação e das glicoproteínas ou polipeptídeos de interesse comercial, as sequências de nucleotídeos podem ser adaptadas ao maquinismo específico da transcrição e da translação da planta hospedeira, como é conhecido pelas pessoas versadas na técnica. Por exemplo, as mutações silenciosas nas regiões de codificação podem ser introduzidas para melhorar a utilização do códon, e promotores específicos podem ser usados para conduzir a expressão dos ditos genes nos tecidos relevantes das plantas. Os promotores que são desenvolvidamente regulados, ou que podem ser induzidos à vontade, podem ser usados para garantir a expressão no tempo apropriado, por exemplo apenas após os tecidos das plantas terem sido colhidos do campo e colocados em condições controladas. Em todos estes casos, a escolha dos cassetes de expressão da glicosilação modificando as proteínas e das glicoproteínas de interesse comercial deve ser tal que eles se expressem nas mesmas células para possibilitar as modificações pós-translacionais desejadas à referida glicoproteína.

[021] Na descrição detalhada, a invenção provê uma planta como aqui anteriormente definida de acordo com a invenção, que compreende uma planta de tabaco ou pelo menos uma planta relacionada ao gênero Nicotiana, porém o uso para a invenção de outras plantas transformáveis com relativa facilidade, tais como Arabidopsis thaliana ou Zea Mays, ou plantas a elas relacionadas, também é particularmente provido. Para a produção de glicoproteínas recombinantes, o uso de lentilha d’água oferece vantagens específicas. As plantas são, em geral, pequenas e se reproduzem assexuadamente através de enxerto vegetativo. Não obstante, a maior parte das espécies de lentilha d’água possui todos os tecidos e órgãos de plantas muito maiores, incluindo raízes, caules, flores, sementes e folhagens. As lentilhas d’água podem ser cultivadas a preço baixo e muito rapidamente como uma planta flutuante livre sobre a superfície de soluções líquidas simples, da qual elas podem facilmente ser colhidas. Elas podem também ser cultivadas em água residual rica em nutrientes, produzindo produtos valiosos enquanto, simultaneamente, limpa a água residual para reutilização. Particularmente de importância para aplicações farmacêuticas, as lentilhas d’água podem ser cultivadas dentro de casa sob condições contidas e controladas. As lentilhas d’água estavelmente transformadas podem, por exemplo, ser regeneradas dos tecidos ou células após a (co)inoculação com cepas de Agrobacterium contendo, cada uma, o vetor (binário) que compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos de interesse que codificam a N-glicosilação, modificando enzimas e/ou genes que codificam as glicoproteínas heterólogas comercialmente interessantes. A planta das lentilhas d’água pode, por exemplo, compreender o gênero Spirodella, o gênero Wolffia, o gênero Wolfiella ou o gênero Lemna, Lemna minor, Lemna miniscula e Lemna gibba.

[022] A expressão nos frutos de tomate também oferece vantagens específicas. Os tomates podem ser facilmente cultivados em estufas sob condições contidas e controladas, e a biomassa do fruto de tomate pode ser colhida continuamente durante todo o ano, em quantidades enormes. A fração aquosa contendo as glicoproteínas de interesse podem ser facilmente separadas do restante dos frutos de tomate, o que permite purificação mais fácil da glicoproteína. As expressões em órgãos de armazenamento de outras culturas, incluindo, mas não limitados a, núcleo do milho, tubérculos da batata e sementes da colza ou do girassol, são também alternativas atrativas que proporcionam biomassa imensa em órgãos para os quais a tecnologia de colheita e de processamento sejam adequadas.

[023] Aqui, a invenção proporciona um método para prover uma planta transgênica, tal como Nicotiana, Arabdopsis, thaliana ou milho, batata, tomate ou lentilha d’água transgênica, que é capaz de expressar uma proteína recombinante, com a capacidade adicional desejada para estender um glicano N-ligado com galactose, compreendendo cruzar a dita planta transgênica com uma planta de acordo com a invenção, compreendendo pelo menos uma proteína funcional de mamífero, como por exemplo, um transportador ou uma enzima provendo a biossíntese de N-glicano, que normalmente não está presente nas plantas, colhendo-se a progênie do dito cruzamento e selecionando a planta da progênie desejada que expressa a dita proteína recombinante e que expressa uma enzima funcional (de mamífero) envolvida na biossíntese de N-glicano semelhante à de mamífero, que normalmente não está presente nas plantas. Em uma forma de realização preferida, a invenção provê um método de acordo com a invenção que compreende ainda selecionar uma planta progênie desejada expressando a dita proteína recombinante compreendendo um glicano N-ligado estendido compreendendo pelo menos galactose. Na descrição detalhada, uma descrição adicional de um método de acordo com a invenção é fornecida usando-se plantas do tabaco e seus cruzamentos, como um exemplo.

[024] Com o dito método conforme fornecido pela invenção, a invenção também fornece uma planta que expressa a dita proteína recombinante e que expressa uma enzima funcional (de mamífero) envolvida na biossíntese de N-glicano semelhante a mamífero, que normalmente não está presente nas plantas. Agora que tal planta é fornecida, a invenção também proporciona o uso de uma planta transgênica para produzir uma glicoproteína desejada ou seu fragmento funcional, particularmente em que a referida glicoproteína ou seu fragmento funcional compreende um glicano N-ligado estendido compreendendo pelo menos galactose.

[025] A invenção adicionalmente provê um método para obter uma glicoproteína desejada, ou seu fragmento funcional, compreendendo por exemplo um glicano N-ligado estendido compreendendo pelo menos galactose, que compreende o cultivo de uma planta de acordo com a invenção, até que a dita planta tenha alcançado um estágio que possa ser colhida, por exemplo quando biomassa suficiente tenha crescido para possibilitar uma colheita proveitosa, seguida pela colheita da referida planta com técnicas estabelecidas conhecidas na prática e fracionamento da dita planta por meio de técnicas estabelecidas na prática para obter material de planta fracionado, e pelo menos isolamento parcial das dita glicoproteína do material da referida planta fracionada. Na descrição detalhada (ver, por exemplo, a figura 4) é ainda explicado que um anticorpo que tenha sido fornecido com um glicano N-ligado estendido, compreendendo pelo menos galactose, é fornecido.

[026] A invenção, assim, provê uma glicoproteína derivada de plantas ou seu fragmento funcional compreendendo um glicano N-ligado estendido pelo menos compreendendo galactose, por exemplo obtido por um método conforme explicado acima. Tal glicoproteína derivada de plantas com um glicano estendido compreendendo pelo menos galactose pode essencialmente ser qualquer glicoproteína desejada que possa ser expressa em uma planta. Por exemplo, anticorpos, FSH, TSH e outras glicoproteínas hormonais, EPO como outros hormônios, entitripsina ou lipase como enzimas, NCAM como moléculas de aderência celular ou colágeno podem ser produzidos nas plantas e podem ser providos com padrões de glicosilação essencialmente de mamíferos. A expressão de tais proteínas pode ser realizada mediante o uso de um método conhecido na técnica. Por exemplo, por expressão estável através da transformação mediada por Agrobacterium, eletroporação ou bombardeamento de partículas, mas também por expressão transiente usando um PVX semelhante a vetor de vírus ou outro método, glicosiltransferases, ou uma outra biossíntese de glicano estendendo a proteína, e/ou a dita glicoproteína pode ser expressa sob controle de um promotor específico para facilitar a expressão em certos tecidos ou órgãos.

[027] Com isto, a invenção também provê o uso de tal glicoproteína derivada de plantas ou de seu fragmento funcional, de acordo com a invenção, para a produção de uma composição farmacêutica, como por exemplo para o tratamento de um paciente com um anticorpo, um hormônio, um antígeno de vacina, uma enzima ou semelhantes. Tal composição farmacêutica que compreende uma glicoproteína ou seu fragmento funcional é agora também provida. A invenção é ainda explicada na descrição detalhada, mas não está limitada a ela.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[028] Uma importante enzima envolvida na biossíntese de N-glicano de mamífero, que não está presente nas plantas, é a β1,4-galactosiltransferase. Aqui, quanto a isto, a expressão estável de β1,4-galactosiltransferase nas plantas de tabaco é descrita. A fisiologia destas plantas não é obviamente alterada pela introdução da β1,4-galactosiltransferase e a característica é hereditária. Os cruzamentos de uma planta de tabaco expressando β1,4-galactosiltransferase com uma planta expressando a cadeia pesada e leve de um anticorpo de camundongo produziu anticorpo tendo galactose terminal em quantidades semelhantes aos anticorpos produzidos por hibridomas. Aqui é assim mostrado que a enzima estranha pode ser introduzida com sucesso nas plantas. Um aumento claro nas glicoproteínas contendo galactose é observado. Além disso, esta característica é hereditária e não existe qualquer diferença fenotípica visível entre as plantas da galactosiltransferase e as do tipo selvagem. Um anticorpo monoclonal de camundongo produzido nestas plantas possui um grau de galactoses terminais comparável com o anticorpo produzido por hibridoma. Isto mostra que não apenas as proteínas endógenas se tornam galactosiladas, mas também uma proteína de mamífero recombinantemente expressa.

MATERIAIS E MÉTODOS

Transformação de plasmídeos e plantas.

[029] Um vetor de transformação de uma planta contendo β1,4-galactosiltransferase humana foi construído como segue: um fragmento BamHI/Xbal de 1,4 kb de pcDNAI-GaIT (Aoki et ai, 1992; Yamaguchi e Fukuda, 1995) foi ligado nos sítios correspondentes de pUC19. Subsequentemente, este fragmento foi re-isolado usando-se os sítios circundantes Kpnl e Hincll e clonado no sítio Kpnl e Smal de pRAP33 (denominado pRAP33-HgalT). Usando-se os sítios Ascl e Pacl, o cassete terminador cDNA-Nos do promotor CaMV35S de pRAP33-HgalT foi clonado no vetor binário pBINPLUS (van Engelen etal., 1995). As modificações ao protocolo publicado são: Após incubação com A. tum., discos de folhas foram incubados por três dias em meio contendo 1 mg/ml de NAA e 0,2 mg/ml de BAP, e o uso de 0,25 mg/ml de cefotaxima e vancomicina para inibir o crescimento bacteriano no meio indutor dos calos e dos brotos. 25 brotos enraizados foram transferidos do meio in vitro para o solo e, após várias semanas, o material das folhas destas plantas foi analisado.

Northern blotting [030] O nível de RN A da βΐ ,4-galactosiltransferase nas plantas transgênicas foi analisado por northern blotting (Sambrook et ai, 1989). O RNA foi isolado das folhas das plantas transgênicas e de controle, conforme descrito (De Vries et ai, 1991). Dez pg de RNA total foram usados por amostra. O sobrenadante marcado (biof) foi híbridizado com um fragmento Sstl/Xhol rotulado [32P]dATP, contendo o cDNA GaIT completo, isolado de pBINPLUS-HgalT.

Análise da glicoproteína [031] Extratos proteicos totaís do tabaco foram preparados mediante moagem das folhas em nitrogênio líquido. O material moído foi diluído por 10 vezes em tampão de carga de SDS-PAGE (20 mM de Tris-HGI, pH 6,8, 6% de glicerol, 0,4% de SDS, 20 mM de DDT, 2,5 mg/ml de azul de bromofenol). Após a incubação a ΙΟΟ'Ο por 5 minutos, o material insolúvel foi pelletizado. Os sobrenadantes (12,5 μΙ/amostra) foram corridos em 10% de SDS-PAGE e transferidos para marcação (btotted) em nitrocelulose. Os sobrenadantes marcados (bíots) foram bloqueados durante a noite em Tween-20 a 0,5% em TBS e incubadas por 2 horas com RCAisa (Ricinus Communis Agglutinin, Sigma) (1 pg/ml) conjugado com peroxidase, em TBS-0,1% Tween-20. Os sobrenadantes marcados (blots) foram lavados 4 vezes por 10 minutos em TBS-0,1% Tween-20 e incubados com substrato western blotting Lumi-Light (Roche) e analisadas em um lumianalisador (Roche). Um anticorpo políclonal de coelho direcionado contra a peroxidase de raiz-forte (HRP, RockIand I mm uno Chemicals) foi fragmentado em reativídade em relação a xilose e fucose dos glicanos de plantas complexas mediante cromatografia de afinidade com fosfolipase de veneno de abelhas de acordo com Faye et ai., 1993. Um anticorpo anti-LewisA de coelho foi preparado como descrito (Fitchette Laine et al, 1997). Os sobrenadantes marcados (blots) foram bloqueados com 2% de leite em pó em TBS e incubados no mesmo tampão com antí-HRP, antí-xilose, antí-fucose ou antí-LewisA. Como anticorpo secundário, o anti-camundongo de carneiro conjugado com HRP alcalino foi usado e a detecção se deu como descrito acima.

Cruzamentos de plantas [032] Mgr48 (Smant et al., 1997) é um IgG monoclonal de camundongo que foi expresso em plantas do tabaco. O construto usado para a transformação foi idêntico ao anticorpo monoclonal 21C5 expresso no tabaco (van Engelen et ai, 1994), As flores das plantas selecionadas do tabaco com alta expressão de β1,4-galactosiItransferase foram polinizadas com plantas que expressam o anticorpo Mgr48. A geração F1 foi semeada e as plantas foram tríadas quanto à expressão foliar do anticorpo por anti-camundongo de carneiro conjugado de HRP híbridizado por sobrenadantes marcados (blot) de western e quanto à expressão da galactosilt ransf erase por RCA, conforme descrito acima.

Purificação do IgG 1 do tabaco [033] Folhas do tabaco recém colhidas foram moídas em nitrogênio líquido. Para 50 g do material de planta em pó, foram acrescentados 250 ml de PBS, contendo MaaSaOs a 10 mM, EDTA a 0,5 mM, PMSF a 0,5 mM e 5 g de polivinilpolipirrolida. Após embeber por 1 hora (girando em 4Ό), o material insolúvel foi removido por centrifugação (15 minutos, 15000 gt 4¾). O sobrenadante foi incubado durante a noite (girando a 4¾) com 1 ml de contas de proteína G-agarose, As contas foram coletadas em uma coluna e lavadas com 10 volumes de PBS. A proteína ligada foi eluída com glicina a 0,1 M, pH 2,7 e imediatamente levada a pH neutro por mistura com Tris 1M, pH 9,0 (50 μΙ por ml de eluato). O anticorpo purificado foi quantificado por comparação da ligação do antí-camundongo de carneiro conjugado com HRP à cadeia pesada em uma western blot com Mgr48 de concentração conhecida purificada do meio de hibridoma (Smant et al., 1997).

[034] O Mgr48 do hibridoma e o Mgr48 produzido da planta foram corridos em SDS-PAGE a 10% e transferidos para marcação (biotted} como descrito acima. A detecção com RCA foi como descrito acima, Para a detecção do anticorpo, os sobrenadantes marcados (blots) foram hibridizados com anti-camundongo de carneiro conjugado com HRP e detectados com substrato de western blotting Lumi-Light como descrito acima.

Resultados Proteínas endógenas de galactosilatos de β1,4-galactosiltransferase humana em Nicotiana tobacum.

[035] β1,4-galactosiltransferase humana (Masri et ai, 1988) foi introduzida em plantas do tabaco por transformação de discos de folha mediada por Agrobacterium, do plasmídeo pBINPLUS-HgaIT contendo um cDNA que inclui uma sequência codificadora completa. Vinte e cinco plantas selecionadas quanto à resistência à canamicina foram analisadas quanto aos níveis de mRNA por hibridização northern (figura 2A). As mesmas plantas foram analisadas pela RCA120 (Ricinus Cummunis Agglutinin) de lectina de ligação a galactose. A RCA se liga ao produto de reação de β1,4-Θ3ΐΤ (Ga^1,4GlcNAc) mas também aos outros resíduos terminais de galactose β-ligada. A RCA se liga a uma ou mais proteínas de elevado peso molecular isoladas de plantas de tabaco de controle não transgênicas (Fig. 2B). Provavelmente, estas são proteínas de Arabinogalactan ou semelhantes. Sabe-se que a RCA se liga às proteínas de Arabinogalactan (Schindler et ai, 1995). Em várias das plantas transformadas com β1,4-galactosiltransferase humana, além disso, a ligação da RCA a uma mancha (smear) de proteínas é observada. Isto indica que, nestas plantas, muitas proteínas contêm resíduos terminais de galactose β-ligada. Existe uma boa correlação entre 0 nível de expressão da RNA da galactosiltransferase e a reatividade da RCA das plantas transgênicas. A β1,4-galactosiltransferase humana expressa em plantas transgênicas é, portanto, capaz de galactosilar as glicoproteínas endógenas nas plantas do tabaco. Como se sabe que os N-glicanos galactosilados são fracos aceptores de xilosil- e fucosiltransferase das plantas (Johnson e Chrispeels, 1987), a influência da expressão de β1,4- galactosiItransferase na ocorrência do epítopo de xilose e da fucose foi pesquisada por anticorpos específicos. Um anticorpo policlonaí anti-HRP de coelho que reage tanto com o epítopo da xilose quanto da fucose, apresenta uma clara diferença em ligar-se à proteína isolada tanto das plantas de controle quanto das transgênicas (Figura 3). O anticorpo recombinantemente produzido é eficientemente galactosiiado [036] O efeito da expressão de p1,4-galactosiltransferase sobre uma proteína recombinantemente expressa foi pesquisado. Três plantas do tabaco que expressavam a β1,4-galactosÍltransferase (n® GalT6, GaITS e GaIT 15 da Figura 2) foram selecionadas para cruzar com uma planta de tabaco que expressava um anticorpo monoclonal de camundongo. Esta planta, que expressava mgr48 monoclonal (Smant et aí,, 1997), foi previamente gerada em nosso laboratório. As flores das três plantas foram polinizadas com mgr48. Da geração F1 12 plantas progêníe de cada cruzamento foram analisadas quanto à expressão tanto do anticorpo quanto da β1,4-galactosiltransferase pelo método descrito em materiais e métodos. Dos cruzamentos GalT6xmgr48 e GaIT 15xmgr48, nenhuma planta foi observada tanto com a expressão de Mgr48 quanto de GaIT, Várias foram observadas no cruzamento GalT8xmgr48. Duas destas plantas (n^ 11 e 12) foram selecionadas para outra análise.

[037] Usando a afinidade da proteína G, o anticorpo foi isolado das plantas de tabaco que expressavam mgr48 e das duas plantas selecionadas que expressavam tanto mgr48 quanto β1,4-galactosiltransferase. Iguais quantidades de anticorpo isolado íoram corridas em um gel proteico e transferidas para marcação {biotted}, A ligação do IgG anti-eamundongo de carneiro e da RCA a mgr48 das células do hibrídoma, do tabaco e dos cruzamentos GalT8xmgr48-11 e 12 foi comparada (Figura 4). O IgG anti-camundongo de carneiro ligou-se tanto à cadeia pesada quanto à leve de todos os quatro anticorpos isolados. A RCA, em contraste, ligou-se ao anticorpo produzido por hibridoma e por planta GaIT, mas não ao anticorpo produzido nas plantas expressando apenas mgr48. Quando a ligação do IgG anti-camundongo de carneiro e da RCA à cadeia pesada do anticorpo é quantificada, a relação relativa de RCA (ligação da RCA/ligação do IgG anti-camundongo de carneiro) para GalT8xmgr48-11 e 12 é respectivamente de 1,27 e de 1,63 vez maior do que a relação do anticorpo produzido por hibridoma. Isto mostra que a ligação da RCA aos glicanos do anticorpo produzido nas plantas GaIT é ainda mais elevada do que para o anticorpo produzido por hibridoma. Embora o mgr48 da galactosilação do hibridoma não seja quantificada, isto é uma forte indicação de que a galactosilação do anticorpo produzido nestas plantas é muito eficiente.

Construto de vetores de expressão das plantas com cDNA’s codificando uma 2,6-sialiltransferase, β 1,3-glicuroniltransferase e β 1,4-galactosiltransferase.

[038] O vetor da β 1,4-galactosiltransferase disponível não estava em um formato adequado para facilmente combinar-se com os clones de a2,6-sialiltransferase e β1,3-glicuroniltransferase. Portanto, mediante o uso da PCR, a região codificadora do cDNA de β 1,4-galactosiltransferase, cDNA de α 2,6-sialiltransferase e do cDNA de β 1,3-glicuroniltransferase foi clonada em vetores de expressão das plantas. Os construtos são feitos de modo que a galactosiltransferase seja combinada ou com sialiltransferase ou glucuroniltransferase em um vetor, de modo a permitir a expressão simultânea das enzimas em plantas transgênicas após apenas uma transformação. A expressão da galactosiltransferase é controlada pelo promotor 35S, enquanto a expressão de sialiltransferase e de glicuroniltransferase é controlada pelo promotor 2’.

[039] Existe uma necessidade de uma fonte acessível e padronizada de FSH para fins terapêuticos e diagnósticos, que seja garantida como sendo livre da atividade de LH.

[040] As preparações de FSH normalmente são derivadas das pituitárias de ovinos ou de porcinos, que sempre implicam a presença de (traços de) LH e o risco de contaminação com proteínas semelhantes a príons. A substituição do FSH recombinante produzido pelas plantas por FSH derivado do cérebro pode ser um bom método de eliminar estes problemas. No entanto, a produção de glicoproteínas animais bioativas nas plantas, especialmente para fins terapêuticos, requer a modificação das cadeias laterais do açúcar específico das plantas em um tipo de glicanos de mamíferos. A invenção proporciona bFSH recombinante mediante infecção de plantas do tabaco estavelmente transformadas capaz de formar tipo de glicanos de mamífero, com o Vírus Mosaico do Tabaco TMV recombinante contendo os genes para bFSH ou bFSHR.

Construto de bFSH de cadeia única (sc) em vetor bluescript pKS (+), construto de sc-bFSH-TMV e sc-bFSH-HIS-TMV

[041] De modo a contornar a necessidade de expressão simultânea de dois genes separados de subunidades de bFSH-alfa e bFSH-beta nas plantas, decidimos construir um gene de fusão de bFSH. Por PCR de sobreposição, nós fundimos a extremidade carboxila da subunidade beta à extremidade amino da subunidade alfa (sem um ligante). Além disso, construímos uma segunda versão de sc-bFSH carregando um rótulo 6x HIS no C-terminal da subunidade alfa, que nos permitirá purificar a proteína recombinante da planta. Ambos os construtos sc-bFSH e sc-bFSH-HIS, foram subclonadas no vetor de clonagem pKS(+) bluescript. A justeza dos clones foi confirmada por análise das sequências.

[042] Sc-bFSH foi subclonado no vetor TMV. Dois clones positivos foram escolhidos para produzir transcritos in vitro e inocular as plantas de N. Bentahamiana. Após uns poucos dias, as plantas apresentaram sintomas típicos de infecção viral, que sugeriram a capacidade infecciosa dos clones TMV recombinantes. De modo a testar se o RNA de sc-bFSH é estavelmente expresso nas folhas sistemicamente infectadas, 8 dias após a inoculação o RNA foi isolado das folhas de N. benthamiana infectadas e uma reação em cadeia da polimerase de transcriptase reversa, usando iniciadores específicos de bFSH, foi realizada. Em todos os casos obtivemos um fragmento de PCR do tamanho esperado, indicando a estabilidade do nosso construto de Sc-bFSH-TMV. Os extratos das plantas infectadas são usados para análises de western blot e ELISA, para determinar se Sc-bFSH é expresso e apropriadamente duplicado.

Abreviaturas usadas: [043] GlcNAc, N-acetilglicosamina; Fuc, fucose; Gal, galactose; GaIT, β1,4-galactosiltransferase; RCA, Ricinus Cummunis Agglutinin; tabelas.

TABELA 1: ENZIMAS DA TRAJETÓRIA DA BIOSSÍNTESE DO ÁCIDO SIÁLICO

Leoendas das Figuras Figura 1 [044] As principais diferenças entre os glicanos N-ligados complexos de mamíferos e de plantas. Os traçados são glicanos N-ligados típicos. Numerosas variações, tanto estendidas quanto truncadas, ocorrem nos mamíferos e nas plantas.

Figura 2 [045] Comparação dos níveis de RN A e produto de β1,4-galactosíltransferase. Painel superior: Northern biot de RNA total isolado de 25 plantas transgênícas, incluindo uma planta de controle não transformada (0), detectada com uma sonda de β1,4-galactosíltransferase humana. Painel inferior: Western blot da mesma planta hibridizada com RCA para detectar os resíduos terminais de galactose nas glicoproteínas. M indica o marcador de peso molecular.

Figura 3 [046] Western biot mostrando a ligação da lectina e do anticorpo à proteína isolada de uma planta do tipo selvagem e de β1,4-galactosiltransíerase (ns 8 da figura 2). A: RCA como na figura 2, B: anticorpo anti-HRP (detectando tanto xilose quanto fucose), C: anticorpo anti-xilose, D: anticorpo anti-fucose.

Figura 4 [047] Western biot mostrando ligação de RCA e de igC anti-camundongo de carneiro a anticorpo purificado produzido em cultura de hibridoma (Hyb), plantas do tabaco (planta) e plantas do tabaco co-expressando β 1,4-galactosiItransferase (GalT11 e GaIT 12). H.C.: cadeia pesada, L.C.: cadeia leve.

Figura 5 [048] Culturas celulares do tabaco expressando galactosiItransferase produzem N-glicanos híbridos não naturais, enquanto as plantas do tabaco expressando galactosiltransferase têm galactosilação natural, como os mamíferos. Para adquirir galactosilação natural, a galactosiltransferase deve atuar após a manosidase II e a GlcNAcTransferase II.

Figura 6 [049] Western blot mostrando a expressão da estrutura de ΘΙοΑβΙ ,3Gal no tabaco transgênico, mediante ligação de um anticorpo (412) direcionado contra a estrutura de ácido glicurônico-galactose (GlcApi ,3Gal), à proteína isolada de 8 plantas expressando β1,4-galactosiltransferase humana e β1,3-glicuroniltransferase de ratos e uma planta de controle tipo selvagem (-).

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REIVINDICAÇÕES

Claims (3)

1. Método para prover uma planta transgênica capaz de expressar um anticorpo com galactosilação terminal CARACTERIZADO por compreender as etapas de: (i) cruzar uma primeira planta transgênica que expressa uma beta 1,4-galactosiItransferase de mamífero com uma segunda planta transgênica que expressa um anticorpo de interesse; (ii) colher a progênie do dito cruzamento; e (III) selecionar uma planta progênie desejada que expresse o anticorpo de interesse com extensões terminais de galactose.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pela dita planta compreender uma planta de tabaco.

3. Método para obtenção de uma glicoproteína desejada ou fragmento funcional da mesma CARACTERIZADO por compreender as etapas de: (a) cultivar a planta obtida na etapa (ií) do método como definido na reivindicação 1 até que a dita planta tenha atingido um período de colheita; (b) colher e fracionar a dita planta da etapa (a) para obter material de planta fracionado; e (c) Isolar a dita glicoproteína do dito material de planta fracionado da etapa (b).