BRPI0002655B1 - "bactérias corineformes produtoras de l-lisina e processo para a produção de l-lisina em cultura por fermentação de bactérias corineformes" - Google Patents
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Abstract
patente de invenção: <b>"corynebacteria produzindo l-lisina e processo para a preparação de l-lisina"<d>. a invenção refere-se a produção de cepas de produção de l-lisina de corynebacteria com gene lyse amplificado (gene carreador de exportação de lisina), onde cepas de genes adicionais escolhidos do grupo compreendendo o gene dapa (gene diidro dipicolinato sintase), o gene lysc (gene aspartato cinase), o gene dapb (gene diidro dipicolinato redutase) e o gene pyc, mas especialmente o gene dapa e o gene lysc (gene aspartato cinase), são amplificados e, em particular, superexpressos, e a um processo para a preparação de l-lisina.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "BACTÉRIAS CORINEFORMES PRODUTORAS DE L-LISINA E PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE L-LISINA EM CULTURA POR FERMENTAÇÃO DE BACTÉRIAS CORINEFORMES". A invenção se refere a cepas produzindo L-lisina de corynebacteria com gene lysE amplificado (gene carreador de exportação de lisina), em cujas cepas genes adicionais, selecionados do grupo compreendendo o gene dapA (gene diidrodipicolinato sintase), o gene lysC (gene aspartato cinase), o gene dapB (gene diidrodipicolinato redutase) e o gene pyc, mas especialmente o gene dapA e o gene lysC (gene aspartato cinase), são amplificados e, em particular, superexpressos, e a um processo para a preparação de L-lisina.
Estado da Técnica L-lisina é um L-aminoácido comercialmente importante que é especialmente usado como um aditivo de alimentação em nutrição animal. A necessidade tem sido estavelmente crescente em anos recentes. L-lisina é preparada através de um processo de fermentação com cepas produzindo L-lisina de corynebacteria, especialmente Corynebac-terium glutamicon. Devido à grande importância deste produto, tentativas são constantemente feitas para aperfeiçoar o processo preparativo. Aperfeiçoamentos para o processo podem refere-se a medidas envolvendo a tecnologia de fermentação, por exemplo, agitação e suprimento de oxigênio, ou a composição dos meios nutrientes, por exemplo, a concentração de açúcar durante fermentação, ou o trabalho para a forma de produto, por exemplo, por cromatografia de troca de íons, ou as intrínsecas características de produtividade do próprio microorganismo (sic).
As características de produtividade destes microorganismos são aperfeiçoadas através do uso de processos de mutagênese, seleção e escolha mutante para render cepas que são resistentes a antimetabólitos, por exemplo, S-(2-amino etil) cisteína, ou auxotróficas para aminoácidos, por exemplo, L-leucina, e produzem L-lisina.
Processos de tecnologia de DNA recombinante também têm sido usados por alguns anos de modo a aperfeiçoar-se cepas produtoras de L-lisina de Corynebacterium glutamicum através de amplificação de genes de biosíntese individuais e estudo de efeito sobre produção de L-lisina.
Assim, EP-A-0 088 166 reporta o aumento em produtividade, após amplificação, de um fragmento de DNA conferindo resistência a ami-noetil cisteína. EP-B-0 387 527 reporta o aumento em produtividade, após amplificação, de um alelo lysC codificando para uma aspartato (sic) cinase resistente - retroaiimentação. EP-B-0 197 335 reporta o aumento em produtividade, após amplificação, do gene dapA codificando para diidrodipicoli-nato sintase. EP-A-0 219 027 reporta o aumento em produtividade, após amplificação, do gene asd codificando para aspartato semialdeído desidro-genase. Pisabarro et al. (Journal of Bacterioíogy 175(9), 2743-2749 (1993)) descreve o gene dapB codificando para diidrodipicolinato redutase. O efeito da amplificação de genes de metabolismo primário sobre produção de L-lisina também foi estudado. Assim, EP-A-0 219 027 reporta o aumento em produtividade, após amplificação, do gene aspC codificando para aspartato aminotransferase. EP-B-0 143 195 e EP-B-0 358 940 reportam o aumento em produtividade, após amplificação, do gene ppc codificando para fosfoenol piruvato carboxiíase. Offenlegungsschrift DE-A-198 31 609 reporta o aumento em produtividade, após amplificação, do gene pyc codificando piruvato carboxiíase.
Finalmente, Offenlegungsschrift DE-A-195 48 222 descreve que uma atividade aumentada do carreador de exportação de L-lisina codificado pelo gene lysE promove produção de lisina.
Em adição a estas tentativas para amplificar um gene individual, tentativas também foram feitas para amplificar dois ou mais genes simultaneamente e pelo que aperfeiçoar produção de L-lisina em corynebactería. Assim, Offenlegungsschrift DE-A-38 23 451 reporta o aumento em produtividade, após simultânea amplificação, do gene asd e o gene dapA de Esche-richia coli. Offenlegungsschrift DE-A-39 43 117 mostra o aumento em produtividade, após simultânea amplificação, de um alelo lysC codificando um resistente - retroaiimentação (sic) e do gene dapA por meio de plasmídio pJC50. EP-A-0 841 395 particularmente reporta o aumento em produtivida- de, após simultânea amplificação, de um alelo lysC codificando para um (sic) resistente - retroalimentação e do gene dapB; ainda aperfeiçoamentos podem ser obtidos através de adicional amplificação dos genes dapB, lysA e ddh. EP-A-0 854 189 descreve o aumento em produtividade, após simultânea amplificação, de um alelo lysC codificando um (sic) resistente - retroalimentação e dos genes dapA, dapB, lysA e aspC. EP-A-0 857 784 particularmente reporta o aumento em produtividade, após simultânea amplificação, de um alelo lysC codificando para um (sic) resistente - retroalimentação e do gene lysA; ainda um aperfeiçoamento pode ser obtido através de amplificação adicional do gene ppc. É claro a partir dos muitos processos descritos na técnica que há uma necessidade do desenvolvimento de novas abordagens e pelo aperfeiçoamento de processos existentes para produção de lisina com corynebacteria.
Objetivo da invenção O objetivo da invenção consiste no uso de novas medidas para provimento de aperfeiçoadas cepas de produção de L-lisina de corynebacteria.
Descrição da Invenção L-lisina é um L-aminoácido comercialmente importante que é usado especialmente como um aditivo de alimentação em nutrição animal. — Quando L-lisina ou lisina é mencionada no texto que se segue, é entendida como significando não somente a base mas também os sais — apropriados, por exemplo, cioridrato de lisina ou sulfato de lisina. A invenção provê cepas produzindo L-lisina de gene lysE amplificado de corynebacteria (gene carreador exportador de lisina), onde elas adicionalmente contêm genes escolhidos do grupo compreendendo o gene dapA (gene diidrodipicolinato sintase), o gene íysC (gene aspartato cinase), o gene dapB (gene diidrodipicolinato redutase) e o gene pyc (gene piruvato carboxilase), mas especialmente o gene dapA e o gene lysC, que, individualmente ou juntos, são amplificados e, preferivelmente, superexpressos. A nova seqüência de DNA localizada à montante (extremidade 5'} do gene dapB também foi verificada carrear a região -35 do promotor dapB e é vantajosa para a expressão do gene dapB. Ela é mostrada como SEQ ID NO:1.
Um DNA correspondente capaz de replicação, com a seqüência de nucleotídios mostrada em SEQ ID NO:1, é por isso também reivindicado. A invenção também provê as mutações MC20 ou MA16 do promotor dapA mostrado em SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:6, depositadas sob DSM12868 e DSM12867, respectivamente. A invenção também provê cepas produzindo L-lisina de coryne-bacteria com gene lysE amplificado, onde adicionalmente os genes dapA e dapB são simultaneamente amplificados e, em particular, superexpressos.
Finalmente, a invenção também provê cepas produzindo L-lisina de corynebacteria com gene lysE amplificado, onde adicionalmente os genes dapA e lysC são simultaneamente amplificados e, em particular, superexpressos.
Neste contexto, o termo "amplificação " descreve o aumento na atividade intracelular, em um microorganismo, de uma ou mais enzimas que são codificadas pelo DNA apropriado, através de aumento de número de cópias do gene(s), usando um promotor forte ou usando um gene codificando uma enzima apropriada com uma alta atividade, e opcionalmente combinando estas medidas.
Um processo para a preparação de L-iisina através da fermentação destas corynebactérias é também reivindicado.
Os microorganismos que a presente invenção provê podem preparar L-lisina a partir de glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaços, amido ou celulose ou a partir de glicerol e etanol, especialmente de glicose ou sacarose. Os ditos microorganismos são corynebacteria, especialmente do gênero Corynebacterium. As espécies Corynebacterium glutami-cum podem ser mencionadas em particular no gênero Corynebacterium, sendo conhecido por aqueles versados na técnica por sua habilidade em produzir aminoácidos. Estas espécies incluem cepas tipo selvagem tais como Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Brevibacterium flavum ATCC14067, Corynebacterium melassecola ATCC17965 e cepas ou mu-tantes derivados das mesmas. Exemplos de mutantes produzindo L-lisina de corynebacteria são (sic): Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709 Brevibacterium flavum FERM-P 1708 Brevibacterium lactofermenium FERM-P 1712 Brevibacterium flavum FERM-P 6463 Brevibacterium flavum FERM-P 6464 Corynebacterium glutamicum DSM5714 Corynebacterium giutamicum DSM12866 Offenlegungsschrift DE-A-195 48 222 mostra o efeito vantajoso de superexpressão do gene lysE sobre a produção de L-íisina. A expressão amplificada adicional (sic) do gene dapB ou gene pyc, ou em particular uma expressão adicionalmente amplificado de um alelo lysC codificando um aspartato cinase resistente - retroalímentação, ou em particular uma expressão adicionalmente amplificada do gene dapA, aperfeiçoa produção de L-lisina.
Os inventores também verificaram que, para uma dada superexpressão do gene lysE, a expressão adicional mente amplificada, simultânea, dos genes dapA e dapB ainda ocasiona vantagens para produção de L-lisina.
Um DNA correspondente capaz de replicação, com a sequência de nucleotídios mostrada em SEQ ID NO:1, é por isso também reivindicado.
Para uma dada superexpressão do gene lysE, a expressão adicionalmente amplificada, simultânea, do alelo dapA (sic) e lysC é também vantajosa.
Uma amplificação (superexpressão ) é obtida, por exemplo, através de aumento de número de cópias dos genes apropriados ou mutação de promotor e região reguladora ou o sítio de ligação de ribossoma localizado à montante do gene estrutural. Cassetes de expressão incorporados à montante do gene estrutural trabalham da mesma maneira. Promotores induzíveis adicionalmente tornam possível aumentar-se a expressão no curso da formação de L-lisina por fermentação. Medidas para prolongamento da vida do ARN-m também aperfeiçoam a expressão. Além disso, a atividade de enzima é também aperfeiçoada através de prevenção de degradação da proteína enzima, os genes ou construções de gene tanto estando localizadas em piasmídios (vetores lançadores) de número de cópia variável ou sendo integradas e amplificadas no cromossoma. Alternativamente, também é possível obter-se uma superexpressão dos genes em questão através de mudança da composição dos meios e a técnica de cultura.
Aqueles versados na técnica encontrarão instruções relevantes inter alia em Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), Guerrero et aí. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya and Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), EP-0 472 869, US 4 601 893, Schwarzer and Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)), Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), LaBarre et al. (Journal of bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), pedido de patente W096/15246, Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)), Japanese Offenlegungsschrift JP-A-10-229891, Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)) ou o handbook "Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington DC, USA, 1981) e livros textos bem conhecidos sobre genética e biologia molecular.
Os genes de Corynebacterium glutamicum usados de acordo com a invenção são descritos e podem ser isolados, preparados ou sintetizados através de processos conhecidos.
Processos de mutagênese localizada são descritos inter alia por Higuchi et al. (Nucleic Acids Research 16:7351-7367 (1988)) ou por Silver et al. No Handbook por Innis, Glefand and sninsky (eds.) intitulado PCR Stra-tegies (Academic Press, London, UK, 1995).
A primeira etapa em isolamento de um gene de interesse a partir de C.glutamicum é construir uma biblioteca de genes deste microorganismo (sic) em por exemplo, E.coli ou opcionalmente também em C.glutamicum. A construção das bibliotecas de genes é documentada em livros texto genericamente bem conhecidos e manuais. Exemplos que podem ser mencionados são o livro texto por Winnacker intitulado From Genes to Clones, Intro-duction to Gene Technology (Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990), ou o manual por Sambrook et al intitulado Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Bathe et al. (Molecular and General Genetics 252:255-265 (1996)) descreve uma biblioteca de genes de C.glutamicum ATCC13032 que foi construída usando-se vetor cosmídio SuperCos I (Wahl et al., Proceedings of the National Acade-my of Sciences USA, 84:2160-2164 (1987)) em E.coli K-12 NM554 (Raleigh et al., Nucleic Acids Research 16:1563-1575 (1988)). Bórmann et al..(Molecular Microbiology 6(3), 317-326) por sua vez descreve uma biblioteca de genes de C.glutamicum ATCC13032 usando-se cosmídio pHC79 (Hohn and Colfins, Gene 11, 291-298 (1980)). Uma biblioteca de genes de C.glutamicum em E.coli também pode ser construída usando-se plasmídios como pBR322 (Bolívar, Life Sciences 25, 807-818 (1979)) ou pUC19 (Norrander et al., Gene, 26: 101-106 (1983)). Da mesma maneira é também possível usar-se vetores lançadores tais como pJC1 (Cremer et al., Molecular and General Genetics 220, 478-480 (1990)) ou pEC5 (Eikmanns et al., Gene 102, 93-98 (1991)), que replica em E.coli e C.glutamicum. Cepas de-fectivas - recombinação e/ou -restrição são hospedeiros particularmente apropriados, um exemplo sendo a cepa E.coli DHSamcr, que foi descrita por Grant et al. (Proceeedings of the National Academy of Sciences USA 87, 4645-4649 (1990)). Outros exemplos são as C.glutamicum defectiva - restrição cepas RM3 e RM4, que são descritas por Scháfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60(2), 756-759 (1994)). A biblioteca de genes é então transferida para uma cepa indicadora por transformação (Hanahan, Journal of Molecular Biology 166, 557-580 (1983)) ou eletroporação (Tauch et al., FEMS Microbiological Letters, 123:343-347 (1994)). As características da cepa indicadora são que ela possui uma mutação no gene de interesse que causa um fenótipo detectá-vel, por exemplo, auxotrofia. As cepas indicadoras ou mutantes são obtení- veis de fontes publicadas ou coleções de cepas, por exemplo, o Genetic Stock Center of Yale University (New Haven, Connecticut, USA), ou se necessário são especialmente preparadas. Um exemplo de uma tal cepa indicadora que pode ser mencionada é a E.coli cepa RDA8 requerendo ácido meso diamino pimélico (Richaud et al., C.R. Acad. Sei, Paris Ser. III 293: 507-512 (1981)), que transporta uma mutação (dapA::Mu) no gene dapA.
Após transformação da cepa indicadora com um plasmídio re-combinante carreando o gene de interesse, e expressão do gene em questão, a cepa indicadora torna-se prototrófica em relação à característica apropriada. Se o fragmento de DNA clonado confere resistência, por exemplo, a um anti-metabólito como S-(2-amino etil) cisteína, a cepa indicadora carreando o plasmídio recombinante pode ser identificada por seleção sobre meios nutrientes apropriadamente suplementados.
Se a sequência de nucleotídios da região de gene de interesse é conhecida ou obtenível de um banco de dados, o DNA cromossômico pode ser isolado através de processos conhecidos, por exemplo, como descrito por Eikmanns et al. (Microbiology 140, 1817-1828 (1994)), e o gene em questão pode ser sintetizado pela reação de cadeia polimerase (PCR) usando-se iniciadores apropriados e clonado em um vetor plasmídio apropriado, por exemplo, pCRHTOPO de Invitrogen (Groningen, The Nether-lands). Um resumo de metodologia PCR pode ser encontrado no livro por Newton and Grahan intitulado PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Hei-delberg, Germany, 1994).
Exemplos de bancos de dados públicos acessíveis para sequências de nucleotídios são aqueles do European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Germany) ou aquele do National Center for Biotechnology Information (NCBI, Behesda (sic), MD, USA). O isolamento e clonagem do gene lysE de C.glutamicum ATCC13032, junto com a sequência de nucleotídios, são descritos em Offenlegungsschrift DE-A-195 48 222. O isolamento, clonagem e sequenciamento do gene dapA de várias cepas de C.glutamicum são descritos por Cremer et al. (Molecular and General Genetics 220:478-480 (1990)), por Pisabarro et al. (Journal of Bacterioíogy 175:2743-2749 (1993)} e por Bonnassie et al. (Nucleic Acids Research 18, 6421 (1990)). A seqüência de nucleotídios do gene dapA é obtenível sob o número de acesso X53993. O isolamento, clonagem e sequenciamento do gene dapB de Brevibacterium lactofermentum são descritos por Pisabarro et al. (Journal of Bacterioíogy 175: 2743-2749 (1993)). A sequência de nucleotídios do gene dapB é obtenível sob o número de acesso X67737. O isolamento, clonagem e sequenciamento do gene lysC e de alelos lysC codificando para uma aspartato cinase resistente - retroalimen-tação são reportados por vários autores (sic). Assim Kalinowski et al. (Molecular and General Genetics 224: 317-324 (1990)) reporta o alelo lysC de C.glutamicum cepa DM58-1. DE-A-39 43 117 reporta a clonagem do alelo lysC de C.glutamicum cepa MH20. Follettie et al. (Journal of Bacterio-logy 175: 4096-4103 (1993)) reporta o alelo lysC de C.flavum cepa N13, que é chamado ask na dita publicação. Kalinowski et al. (Molecular Microbiology 5, 1197-1204 (1991)) reporta o gene lysC de C.glutamicum ATCC13032. As seqüências de nucleotídios do gene lysC e de vários alelos lysC são obteníveis interalia sob números de acesso X57226 e E06826.
Os genes obtidos desta maneira podem ser então incorporados interalia em vetores píasmídios, por exemplo, pJC1 (Cremer et al., Molecular and General Genetics 220, 478-480 (1990)) ou pEC5 (Eikmanns et al., Gene 102, 93-98 (1991)), individualmente ou em combinações apropriadas, transferidos para cepas desejadas de corynebacteria, por exemplo, a cepa MH20-22B (Schrumpf et aí., Applied Microbiology and Biotechnology 37: 566-571 (1992)), por transformação , por exemplo, como em Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), ou eletropo-ração, por exemplo, como em Dunican and Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)}, e expressos. A cepa a ser escolhida também pode ser igualmente transformada com dois vetores píasmídios, cada um contendo o gene ou genes em questão, pelo que obtendo-se a expressão amplificada simultaneamente, vantajosa, de dois ou mais genes em adição à amplifica- ção conhecida do gene lysE.
Exemplos de tais cepas são: a cepa MH20-22B/pJC33/pEC7lysE, onde os genes lysE e lysC são expressos com amplificação simultânea, ou a cepa MH20-22B/pJC50/pEC7lysE, onde os genes lysE, lysC e dapA são expressos com amplificação simultânea, ou a cepa MH20-22B/pJC23/pEC7lysE, onde os genes lysE e dapA são expressos com amplificação simultânea, ou a cepa MH20-22B/pJC23/pEC7dapBlysE, onde os genes lysE, dapA e dapB são expressos com amplificação simultânea.
Os microorganismos preparados de acordo com a invenção podem ser cultivados para produção de L-lisina continuamente ou descontinu-amente através de processo de batelada, o processo de batelada de alimentação ou o processo de batelada de alimentação repetida. Um resumo de processos de cultivo conhecidos são (sic) providos no livro texto por Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik {Bioprocess Technology 1. Introduction to Bioengeneering )(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) ou no livro texto por Storhas (Bioreaktoren und pe-riphere Einmrichtungen (Bioreators and Perrpheral Equipment)(Vieweg Verlag, Bruswick/Wiesbaden, 1994)). O meio de cultura a ser usado tem apropriadamente de satisfazer as demandas dos microorganismos particulares. Descrições de meios de cultura para vários microorganismos podem ser encontradas no manual "Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington DC, USA, 1981), Fontes de carbono que podem ser usadas são açúcares e carboidratos, por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaços, amido e celulose, óleos e gorduras, por exemplo, óleo de soja, óleo de girassol, óleo de amendoin e gordura de côco, ácidos graxos, por exemplo, ácido paimítico, ácido esteárico e ácido linoléico, alcoóis, por exemplo, glicerol e etanol, e ácidos orgânicos, por exemplo, ácido acético. Estas substâncias podem ser usadas individualmente ou como uma mistura. Fontes de nitrogênio que podem ser usadas são compostos contendo nitrogênio orgânico tais como peptonas, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, licor de molho de milho, farinha de soja e uréia, ou compostos inorgânicos tais como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio. As fontes de nitrogênio podem ser usadas individualmente ou como uma mistura. Fontes de fósforo que podem ser usadas são diidrogeno fosfato de potássio ou hidrogeno fosfato de di-potássio ou os correspondentes sais de sódio. O meio de cultura também tem de conter sais de metais, por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato de ferro, que são necessários para crescimento. Finalmente, substâncias promotoras de crescimento essenciais tais como aminoácidos e vitaminas podem ser usadas em adição às substâncias mencionadas acima. Os ditos materiais de alimentação podem ser adicionados à cultura todos de uma vez ou alimentados apropriadamente durante o cultivo. O pH da cuitura é controlado através do uso apropriado de compostos básicos tais como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou amônia, ou compostos ácidos tais como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico. Formação de espuma pode ser controlada usando-se antiespumantes tais como poliglicol ésteres de ácido graxo. A estabilidade de plasmídios pode ser mantida através de opcionalmente adição de substâncias atuando seletivamente apropriadas, por exemplo, antibióticos, ao meio. Condições aeró-bicas são mantidas pela introdução de oxigênio ou misturas gasosas contendo oxigênio, por exemplo, ar, na cultura. A temperatura da cultura é normalmente 20°C a 45°C e preferivelmente 25°C a 40°C. A cultura é continuada até formação de L-lisina ter atingido um máximo. Este objetivo é normalmente obtido dentro de 10 horas a 160 horas. A concentração de L-lisina formada pode ser determinada com o auxílio de analisadores de,aminoácidos por meio de cromatografia de troca de íons e reação pós-coluna com deteção com ninhydrin, como descrito por Spackmann et al. (Analytical Chemistry 30, 1190 (1958)).
Os seguintes microorganismos foram depositados no Deutsche Sammlung für Mikrorganismen (sic) und Zellkulturen (German Collection of Microorganisms (sic) and Cell Cultures (DSMZ), Brunswick, Germany) sob os termos do Tratado de Budapeste: Escherichia colí K-12 cepa DH5a/pEC7lysE como DSM12871. Escherichia coli K-12 cepa DH5oc/pEC7dapBlysE como DSM12875 Corynebacterium glutamicum cepa DSM5715/pJC23 como DSM12869 Corynebacterium glutamicum cepa DSM5715aecD::dapA(MA16) como DSM12867 Corynebacterium glutamicum cepa DSM5715aecD::dapA(MC20) como DSM12868 Exemplos Exemplo 1 Preparação do DNA codificando IvsE DNA cromossômico foi isolado da cepa ATCC13032 através de processos convencionais (Eikmanns et al., Microbiology 140: 1817-1828 (1994)). A reação de cadeia poiimerase (PCR) foi usada para amplificar um fragmento de DNA carreando o gene^ysEX^ seguintes oligonucleotídios iniciador foram escolhidos para a PCR nas bases da sequência de qene lysE conhecidas parafllutamicjjioi_(VrliiC et af., Molecular Microbiology 22(5), 815-826 (1996))(número de acesso X96471): LysBaml: 5' CTC GAG AGC (GGA TCC) GCG CTG ACT CAC C 3' LysBam2: 5’ GGA GAG TAC GGC (GGA TCC) ACC GTG ACC 3' Os iniciadores mostrados foram sintetizados por MWG Biotech (Ebersberg, Germany) e a PCR foi realizada pelo processo PCR padrão de Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Aca-demic Press). Os iniciadores tornaram possível amplificação de um fragmento de DNA de aproximadamente 1,1 kb carreando o gene lysE. Os iniciadores também contêm a seqüência para o sítio de divagem da endonucle-ase de restrição BamHI, que é indicada por parênteses na seqüência de nucleotídios mostrada acima. O fragmento de DNA amplificado de aproximadamente 1,1 kb, carreando o gene lysE, foi identificado por meio de eletroforese em gel aga-rose 0,8%, isolado do gel e purificado com o QIAquick Gel Extraction Kit (cat. No. 28704) de Qiagen (sic) (Hilden, Germany). O fragmento foi então ligado por meio de T4 DNA (igase de Boehringer Mannheim (Mannheim, Germany) ao vetor pUC18 (Norrander et al.T Gene (26) 101-106 (1983)). Isto foi feito através de inteira divagem de vetor pUC18 com a endonuclease de restrição Smal e tratando-o com fosfatase alcalina (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany). A mistura de ligação foi transformada para a E.coli cepa DH5a (Hanahan, em: DNA cloning. A practical approach. Vol. í. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA). Células carreando plasmídio foram selecionadas por revestimento da mistura de transformação sobre ágar LB (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) que foi suplementado com 50 mg/l de ampicilina. DNA de plasmídio foi isolado de um transformante e checado por tratamento com a enzima de restrição BamHI seguido por eletroforese de gel agarose. O plasmídio foi chamado pUC18lysE.
Exemplo 2 Preparação de dapB DNA cromossômico foi isolado de Corynebacterium glutamicum cepa ATCC13032 como indicado no Exemplo 1. A seqüência do gene dapB como tal de Corynebacterium glutamicum é conhecida (número de acesso X67737). Entretanto, a seqüência de DNA publicada compreende somente 56bp a montante da partida de tradução, de modo que a extremidade 5' a montante da partida de tradução foi adicionalmente sequenciada. O sequenciamento foi realizado com plasmídio pJC25 (EP-B-0 435 132) usando-se um oligonucleotídio inicíador que liga-se na região da seqüência dapB conhecida (número de acesso X67737). A seqüência do iniciador de sequenciamento usado foi: 5' GAA CGC CAA CCT TGA TTC C 3' O sequenciamento foi realizado pelo processo de terminação de cadeia descrito por Sanger et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, (74), 5463-5467 (1977). A reação de sequenciamento foi realizada com o auxílio do AutoRead Sequencing Kit (Pharmacia, Freiburg). A análise eletroforética e deteção dos produtos de sequenciamento foram realizadas com o A.L.F.DNA sequencer de Pharmacia (Freiburg, Germany). A seqüência de DNA obtida foi usada para escolher-se um segundo iniciador de modo a obter-se ainda dados de sequência à montante da partida de tradução. O seguinte iniciador foi escolhido para este propósito: 5' TT TGC CGC GT TGG GTT 5' (sic) A reação de seqüenciamento foi realizada como descrito acima. A nova seqüência à montante do gene dapB é mostrada como SEQ ID NO:1. A seqüência incluindo a seqüência de nucleotídios do gene dapB é mostrada como SEQ ID NO:2. A reação de cadeia polimerase foi usada para amplificar o gene dapB. Para este propósito, dois oligonucleotídios iniciadores, escolhidos nas bases da seqüência de DNA conhecida do gene dapB, foram sintetizados por MWG Biotech: P-dap: 5' (AAG CTT) AGG TTG TAG GCG TTG AGC 3’ dapall: 5’ TTA ACT TGT TCG GCC ACA GC 3' O iniciador 5’ (iniciador P-dap) contém um sítio de divagem Hin-d111 que é indicado por parênteses na seqüência mostrada acima. A PCR foi realizada como no Exemplo 1. Um fragmento de DNA de aproximadamente 1,1 kb, que transporta o gene dapB e contém um sítio de divagem para a endonuclease de restrição Hindíll em uma' extremidade, foi amplificado desta maneira. O fragmento de PCR obtido foi purificado a partir de gel aga-rose 0,8% (QIAquick Gel Extraction Kit de Qiagen, Hilden, Germany) e clo-nado no vetor de clonagem pCR2.1T0P0 (Invitrogen, Leek, The Nether-lands) com o TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen, Leek, The Netherlands, cat. Ν° Κ4550-01). A mistura de Jigação foi transformada para E.coli cepa TOP10F’ de Invitrogen, a mistura de transformação foi revestida sobre agar LB contendo canamicina (50mg/l), IPTG (0r16mM) e X-Gal (64mg/l) e colônias brancas, resistentes à canamicina foram isoladas. DNA plasmídio foi isolado de um transformante com o auxílio do QIAprep Spin Miniprep Kit de Qiagen e verificado por divagem com a enzima de restrição Hindlíl seguido por eletroforese com gel agarose. A seqüência de DNA do fragmento de DNA amplificado foi verificada por sequenciamento. A seqüência do produto de PCR combina com a seqüência mostrada em SEQ ID NO:1. O plasmídio obtido foi chamado pCR2.1TOPOdapB.
Exemplo 3 Clonagem de IvsE no vetor pEC7 O fragmento carreando lysE de plasmídio pUC18lysE (Exemplo 1) foi inserido no vetor pEC7 como descrito abaixo. Vetor pEC7 é baseado em E.coli - C.glutamicum vetor lançador pEC5 (Eikmanns et ai., Gene 102: 93-98 (1991)). O sítio de divagem BamHI não-localizado no poliligador foi removido do plasmídio pEC5 da seguinte maneira: Plasmídio pEC5 foi par-ciafmente clivado com a enzima de restrição BamHI. O fragmento de DNA de aproximadamente 7,2 kb foi isolado do gel agarose e as extremidades salientando-se foram enchidas com Klenow polimerase (Boehringer Man-nheim). O fragmento de DNA resultante foi ligado (T4 ligase, Boehringer Mannheím). A mistura de ligação foi transformada para E.coli cepa DH5a e colônias resistentes a cloranfenicol foram isoladas sobre agar LB contendo cloranfenicol (50mg/l). DNA plasmídio foi isolado de um transformante (QIAprep Spin Miniprep Kit de Qiagen) e verificado por divagem de restrição com as enzimas de restrição BamHI e Pstl. 0 plasmídio resultante foi chamado pEC6, Plasmídio pEÇ6 foi inteiramente clivado com a enzima de restrição Xhol. Um fragmento de DNA transportando o termínador trp foi ligado ao fragmento de DNA vetor (T4 ligase, Boehringer Mannheim). A mistura de ligação foi transformada para E.coli cepa DH5a e colônias resistentes à canamicina foram isoladas sobre agar LB contendo canamicina (50mg/l). DNA plasmídio foi isolado da um transformante (QIAprep Spin Miniprep Kit de Qiagen) e verificado por divagem de restrição com as enzimas de restrição BamHI e Xhol. O plasmídio resultante foi chamado pEC7.
Plasmídio pUC18lysE descrito no Exemplo 1 foi inteiramente digerido com a enzima de restrição BamHI e o fragmento BamHI de 1,1 kb carreando o gene lysE foi isolado como no Exemplo 1. O vetor pEC7 foi da mesma maneira inteiramente clivado com a enzima de restrição BamHI e tratado com fosfatase alcalina. O fragmento de vetor BamHI e o fragmento BamHI lysE foram ligados (Rapid DNA Ligation Kit, Boehrínger Mannheim) e transformados para E.coli cepa DH5a. Transformantes carreando plasmídio foram selecionados sobre agar LB contendo cloranfenicol (10mg/l). DNA plasmídio foi isolado (QIAprep Spin Miniprep Kit, Qiagen) e verificado por divagem de restrição com a enzima BamHI. O plasmídio resultante foi chamado pEC7lysE (Figura 1). A cepa obtida por transformação de plasmídio pEC7lysE para E.coli cepa DH5a foi chamada DH5a/pEC7lysE.
Exemplo 4 Clonagem de dapB no vetor pEC7 Um fragmento de DNA de aproximadamente 1,1 kb carreando o gene dapB foi isolado de plasmídio pCR2.1TOPOdapB (do Exemplo 2). Para este propósito, plasmídio pCR2.1TOPOdapB foi inteiramente digerido com a enzima de restrição Hindlll e o fragmento de DNA de aproximadamente 1,1 kb carreando o gene dapB foi isolado. O fragmento de DNA carreando dapB obtido foi ligado ao vetor pEC7 (Exemplo 3)(T4 DNA ligase, Boehrínger Mannheim), que foi inteiramente digerido com a enzima de restrição Hindlll e tratado com fosfatase alcalina (sic)(Boehringer Mannheim). A mistura de ligação foi transformada para E.coli cepa DH5a e colônias resistentes a canamicina foram isoladas sobre agar LB contendo canamicina (50mg/l). DNA plasmídio foi isolado de um transformante (QIAprep Spin Miniprep Kit de Qiagen) e verificado por cfivagem de restrição com a enzima de restrição Hindlll. O plasmídio resultante foi chamado pEC7dapB (Figura 2). A cepa de Escherichia coli obtida foi chamada DH5a/pEC7dapB.
Exemplo 5 Preparação de um píasmídio simultaneamente contendo dapB e IvsE O gene dapB foi isolado como um fragmento Hindlll de plasmí-dio pCR2.1TOPOdapB contendo o gene dapB de C.glutamicum ATCC13032. Para assim fazer, o píasmídio foi inteiramente digerido com a enzima de restrição Hindlll e o fragmento de DNA carreando dapB foi isolado de gel agarose 0,8% (QIAquick Gel Extractíon Kit, Qiagen). Vetor pEC7 (Exemplo 3) também foi inteiramente digerido com a enzima de restrição Hindlll e tratado com fosfatase alcalina. O fragmento de 1,1 kb contendo dapB foi ligado ao fragmento de vetor linear resultante (T4 ligase, Boehrin-ger Mannheim) e a mistura de ligação foi transformada para E.coli cepa DH5a. Transformantes carreando píasmídio foram selecionados sobre agar LB contendo cloranfenicol (10mg/l). DNA píasmídio foi isolado (QIAprep Spin Miniprep Kit, Qiagen, Hilden, Germany) e verificado por divagem de restrição com a enzima de restrição Hindlll. O píasmídio resultante foi chamado pEC7lysEdapB. Este plas-mídio é capaz de replicação autônoma em Escherichia coli e em Coryne-bacterium e confere resistência ao antibiótico cloranfenicol sobre seu hospedeiro.
Como mostrado na Figura 3, píasmídio pEC7lysEdapB simultaneamente contém o gene dapB, que codifica diidro picolinato (sic) redutase, e o gene lysE, que codifica o exportador de lisina. A cepa obtida por transformação da E.coli cepa DH5a com pEC7lysEdapB foi chamada DH5a/pEC7lysEdapB.
Exemplo 6 Transformação da cepa MH20-22B com plasmídios pJC1. pJC33 e pJC50 Píasmídio pJC1 é um píasmídio capaz de replicação em Esche-ríchia coli e Corynebacterium glutamicum (Cremer et al., Molecular and General Genetics 220: 478-480 (1990)). Píasmídio pJC33 (Creme et aí., Applied and Environmental Microbiology 57(6), 1746-1752 (1991)), que transporta o gene lysC(Fbr) de C.glutamicum cepa MH20-22B, é derivado do mesmo.
Plasmídio pJC50 é também baseado em vetor pJC1 e transporta o gene lysC(FBR) de C.glutamicum MH20-22B e o gerítf dapA çle C.glutamicum ATCC13032 (DE-A-39 43 117).
Plasmídios pJC1, pJC33 e pJCSO foram introduzidos na cepa MH20-22B através do processo de eletroporação (Haynes and Britz, FEMS Microbiology Letters (61) 329-334 (1989)), A C.giutamicum cepa MH20-22B é um produtor de lisina resistente a AEC depositado sob a número DSM5715.
Os transformantes obtidos por meio de eletroporação foram isolados sobre agar seleção (agar LBHIS (18,5g/l de caldo de infusão cére-bro-coração, sorbitol 0,5M, 5g/l de bacto triptona, 2,5g/f de extrato de levedura bacto, 5g/l de NaCI, 18g/l de agar bacto)) contendo 15mg/l de canami-cina. DNA plasmídio foi isolado pelos processos convencionais (Peters-Wendisch et al., Microbiology 144, 915-927 (1998)), clivado com endonu-cleases (sic) de restrição apropriadas e verificado. As cepas obtidas foram chamadas MH20-22B/pJC1, MH20-22B/pJC33 e MH20-22B/pJC50.
Exemplo 7 Transformação com plasmídios pEC7lvsE e pEC7dapBlvsE
As cepas preparadas no Exemplo 6 foram subsequentemente providas com um segundo plasmídio. Plasmídios pEC7lysE e pEC7dapBlysE foram introduzidos através do processo de eletroporação nas cepas MH20-22B/pJC1, MH20-22B/pJC33 e MH20-22B/pJC50 descritas.
As bactérias transformadas são selecionadas nas bases da resistência a antibiótico dos plasmídios que elas contêm. Os transformantes obtidos por meio de eletroporação foram isolados sobre agar seleção (agar LBHIS contendo 15mg/l de canamicina e 7,5mg/i de cloranfenicol), DNA de plasmídio foi isolado, clivado com endonucleases (sic) de restrição apropriadas e verificado.
Exemplo 8 Preparação de lisina As várias cepas de C.glutamicum obtidas no Exemplo 7 foram cultivadas em um meio nutriente apropriado para produção de lisina e o teor de lisina do sobrenadante de cultura foi determinado.
Isto foi feito através da primeira incubação de várias cepas sobre pfacas de agar com os antibióticos apropriados (agar cérebro - coração contendo canamidna (25mg/l), cloranfenícol (10mg/l)) por 24 horas a 33°C. Estas culturas de placa agar foram usadas para inocular uma pré-cultura (10mi de meio em um frasco cônico de 100ml). Meio completo Cglll foi usado como o meio de pré-cultura. Canamicina (25mg/l) e cloranfenícol (10mg/l) foram adicionados. A pré-cultura foi incubada por 24 horas a 33°C em um agitador a 240rpm. Esta pré-cultura foi usada para inocular uma cultura principal para render uma OD inicial (660nm) de 0,2 OD. Meio MM foi usado para a cultura principal.
Meio MM CSL (licor de infusão de milho) 5 g/l MOPS 20 g/l Glicose 50 g/l (autoclavar separadamente) Sais: (NH4)2S04 25 g/l KH2P04 0,1 g/l MgS04*7H20 1,0 g/l CaCI2*2H20 10 mg/l FeS04*7H20 10 mg/l MnS04*H20 5,0 mg/l Biotina 0,3 mg/l (filtrada - estéril) Tiamina *HCI 0,2 mg/l (filtrada - estéril) CaC03 25 g/l CSL, MOPS e a solução de sal são ajustados para pH 7 com amônia aquosa e autoclavada. O substrato estéril e soluções de vitamina e o CaC03 autoclavado - seco foram então adicionados.
Cultivo é realizado em um volume de 10ml em um frasco cônico de 100ml com defletores. Canamicina (25mg/l) e cloranfenícol (10mg/l) foram adicionados. Cultivo procedeu a 33°C e 80% de umidade relativa.
Após 48 horas a OD foi medida em um comprimento de onda de 660 nm com um Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Munich). A quantidade e lisina formada foi determinada com um analisador de aminoá-cidos de Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Germany) por meio de cromato-grafia de troca de íons e derivação de pós-cotuna com deteção de ninhydrin. O teor de glicose foi determinado com um analisador de açúcar de Skalar Analytik GmbH (Erkeíenz, Germany), Os resultados experimentais são mostrados na Tabela 1.
Tabela 1 Linhagem Gene OD Lisina-HCI ___________________ (660) g/l DSM5715/pJCI/j5EC7lysE lysE 9,1 11,1 '^SM5715/pJC33/pEC71 lysÉ ’ lysE, lysC ' 8,7 12,2 DSM5715/pJC50/pEC71 lysE . lysE, lysC, dapA 9,1 12,7 DSM5715/pjd23^)EC71lysE lysE, dapA 10,2 [ 13,3 DSM5715/pJC23/pEC7dapBlysE lysE, dapA, 10,9\j 15,4 j dapB ______________^ j Exemplo 9 Clonagem do genje aecD>to vetor pUC18 O plasmídeo pSIR21 (Rossol, Dissertação, Universidade Biele-feld, 1992) foi completamente clivado com as enzimas Bglll e EcoRV e o fragmento de DNA de 1,4 Kb de comprimento, o qual contém o gen aecD (número de acesso M89931) (Rossol e Pühler, Journal of Bacteriology, 174 (9), 2968 - 2977 (1992)) isolado a partir de C. glütamicum ATCC 13032. O fragmento de DNA isolado foi ligado com o plasmídeo pUC18, que fora completamente digerido com as enzimas BamHI e Smal, com auxílio da li-gase de DNA de T4, tal como descrito em Sambrook et al. (Molecular Clo-ning: a Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). A batelada de ligação foi transformada na cepa de E. coli DH5a. A seleção dos transformantes ocorreu sobre placas de Cérebro-Coração com 100 mg/L de ampicilina. De uma colônia, isolou-se o DNA de plasmídeo. O plasmídeo obtido foi denominado pUC18::aecD.
Exemplo 10 Clonagem do gene daoA no plasmídeo pSP72 Um fragmento cie gen dapA é isolado a partir do plasmídeo pJC20 (Cremer, J. Dissertação 1989, Universidade de Düsseldorf) como fragmento de Sphl-BamHI. O vetor pSP72 (Promega Corporation, EUA) foi completamente clivado com as enzimas Sphl e BamHI e tratado com fosfa-tase alcalina. Nesse vetor, o fragmento que porta dapA foi ligado com o auxílio da ligase de DNA de T4. O DNA foi transformado na cepa de E. coli XL1 Blue (Buliock, Fernandez e Short, BioTechniques (5), 376-379 (1987)). A seleção dos transformantes ocorreu sobre meio LB com 100 mg/L de am-picilina. A partir de um transformante, isolou-se o DNA de plasmídeo e designou-se como pSP72::dapA.
Exemplo 11 Mutagênese do promotor dapA e preparação dos plasmídeos pSP72::dapA (MC2Q1 e pSP72::dapA (MA16) Para a mutagênese do setor de promotor, utilizou-se o kit de mutagênese sítio-dirigida Quickhange da firma Stratagene. Foram estabelecidos os seguintes iniciadores com base na presente seqüência de dapA e foram utilizados para a a mutagênese: Para a preparação de p$P72::dapA (MC20) Iniciador dap1 para MC20 CCA AAT GAG AGA TGG TAA CCT TGA ACT CTA TGA GCA Iniciador dap2 para MC20 GTG CTC ATA GAG TTC AAG GTT ACC ATC TTC CCT CAT
TTG G
Para a preparação de pSP72::dapA (MA16) Iniciador dap3 para MA16 CCA AAT GAG GGA AGA AGG TAT AAT TGA ACT CTA TGA
GCA
Iniciador dap4 para MA16 GTG CTC ATA GAG TTC AAT TAT ACC TTC TTC CCT CAT
TTG G A reação de PCR ocorreu tal como indicado pelo fabricante (Stratagene) do kit de mutagênese sítio-dirigida Quickhange e sob aplicação do plasmídeo pSP72::dapA (a partir do Exemplo 10) como molde.
Ocorreu a transformação das bateladas de mutagènse na cepa de E. coli XL1-Blue. A seleção dos transformantes ocorreu sobre meio com 100 mg/L de carbenicilina. A partir de um transformante, isolou-se o DMA de plasmídeo, por digestão com BstEII, controiou-se a supressão do sítio de corte de BstEII. Plasmídeos, que não mais portam qualquer sítio de corte de BstEII, apresentavam a mutação desejada.
Os plasmídeos obtidos foram transformados nos mutantes RDA8 de E. coli defeituosos de dapA. As bateladas de transformação foram pla-queadas sobre LB com 100 mg/L de carbenicilina, a fim de se testar a com-plementação da mutação de dapA. A partir de cada um dos transformantes, isolou-se DNA e os plasmídeos obtidos foram denominados pSP72::dapA (MC20) e pSP72::dapA (MA16). Ocorreu o seqüenciamento dos plasmídeos sob aplicação do iniciador de seqüenciamento universal e reverso, de acordo com o método de ruptura de cadeias descrito em Sanger et al., Procee-dings of National Academy of Sciences of the USA, (74) 5463-5467 (1977). A reação de seqüenciamento foi realizada com auxílio do kit de seqüenciamento AutoRead (Pharmacia, Freiburg). A análise eletroforética e a detecção dos produtos de seqüenciamento foi realizada com o seqüenciador de DNAdeA.L.F. (Pharmacia, Freiburg).
Exemplo 12 Preparação dos plasmídeos pK19mobsacBaecD::dap19 (MC201 e pK19mobsacBaecD::dap19 (MA16) (Transclonaqem dos fragmentos muta-genisados) Os plasmídeos pSP72::dapA (MC20) e pSP72::dapA (MA16) (a partir do Exemplo 11) foram completamente cortados com as enzimas de restrição Pvull e Smal. Os fragmentos de Pvull-Smal de 1.450 pb de comprimento, que portam o gene dapA com o promotor mutado MC20 ou MA16, foram ligados com a ligase de DNA de T4 no vetor pUC18::aecD cortado com Stul (a partir do Exemplo 9). A batelada de ligação foi transformada na cepa de E. coli DH5a. A seleção dos transformantes ocorreu sobre meio LB com 100 mg/L de ampicilina. A partir de cada um dos transformantes, isolou-se DNA de plasmídeo. Dessa maneira, obteve-se os plasmídeos pUC18aecD::dapA (MC20) e pUC18aecD::dapA (MA16).
Os plasmídeos pUC18aecD::dapA (MC20) e pUC18aecD::dapA (MA16) clivados parcialmente com a enzima de restrição EcoRI e completamente com a enzima Sall, a fim de se obter o fragmento que porta aecD::dapA (MA16) ou aecD::dapA (MC20) de 3,0 Kb de comprimento. O fragmento foi ligado, com auxílio da ligase de DNA de T4, ao vetor pK19mobsacB cortado e tratado com fosfatase alcalina (Schàfer et al., Gene (145) 69-73 (1994)). A batelada de ligação foi transformada na cepa de E. coli DH5 (Hanahan (1985), Em: DNA ctoning. A practicaí approach. Vol. I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, EUA). A seleção dos transformantes ocorreu sobre meio LB com 50 mg/L de kanamicina. A partir de cada um dos transformantes, isolou-se o DNA de plasmídeo. Dessa maneira, obtêve-se os plasmídeos pK19mobsacBaecD::dapA (MC20) e pK19mobsacBaecD::dapA (MA16). O DNA de plasmídeo foi transformado na cepa de E. coli S17-1 (Simon, Priefer e Prühler, Bio/Technology, (1) 784-791 (1983)). A seleção dos transformantes ocorreu sobre meio LB com 50 mg/L de canamicina. A partir de cada um dos transformantes, isolou-se e testou-se o DNA de plasmídeo. As cepas obtidas foram denominadas 317-1/pK19mobsacBaecD::dapA(MC20) e S17- 1/pK19mobsacBaecD: :dapA(MA16).
Exemplo 13 Preparação das cepas de C. glutamicum DSM5715aecD::dapA (MC20) e DSM5715aecD;:dapA (MC16) Os plasmídeos pK19mobsacBaecD::dapA(MC20) e pK19mobsacBaecD::dapA(MC16) foram transferidos com o método da conjugação (Schàrfer et al., Journal of Bacteriology, (172) 1663-1666 (1990)) de S17-1/pK19mobsacBaecD::dapA(MC20) e S17- 1/pK19mobsacBaecD::dapA(MC16) (a partir do Exemplo 12) para a cepa DSM5715 de C. glutamicum. Para a seleção dos transconjugados, foran> plaqueadas as bateladas de conjugação sobre meio de Cérebro-Coração com ácido naíixidínico e canamicina. Os transconjugados obtidos foram incubados durante uma noite em 10 mL de meio de Cérebro-Coração. A seguir, foram plaqueadas alíquotas sobre placas contendo sacarose (agar de Cérebro-Coração com 10% de sacarose), a fim de selecionar sobre a perda de sensibilidade à sacarose. Cíones resistentes à sacarose foram isolados e novamente testados sobre placas de agar contendo cloranfenicol e canami-cina (meio de Cérebro-Coração com 15 mg/L de canamicina e meio de Cérebro-Coração com 10 mg/L de cloranfenicol), Foram isoladas colônias, que apresentavam o seguinte fenótipo: resistente à sacarose sensíveis à canamicina sensíveis ao cloranfenicol. A inserção do fragmento de gen de dapA no gen de aecD foi testada com o método do Southern-Bíot (Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Exemplo 14 Preparação das cepas de C. glutamicum DSM5715aecD::dapA (MC20VpEC7 1 vsE,_____DSM5715aecD::dapA_________(MC16VpEC71 vsE. DSM5715aecD::dapA (MC20)/pEC7. DSM5715aecD::dapA (MC16VpEC7 e DSM5715/PEC7. O gene lysE está presente, tal como descrito no Exemplo 3, no vetor pEC7. Esse plasmídeo pEC71ysE, bem como o plasmídeo pEC7, foi introduzido, por meio de eletroporação (Haynes 1989, FEMS Microbiology Letters 61 329-334) nas cepas DSM5715aecD::dapA (MC20), DSM5715aecD::dapA (MA16) e DSM5715 (a partir do Exemplo 13), a fim de se obter DSM5715aecD::dapA (MC20)/pEC7lysE, DSM5715aecD::dapA (MA16)/pEC7lysE, DSM5715aecD::dapA (MC20)/pEC7, DSM5715aecD::dapA (MA16)/pEC7 e DSM5715/pEC7 de C. glutamicum. A seleção dos transformantes ocorreu sobre agar de Cérebro-Coração com 25 mg/L de canamicina. A partir de cada um dos transformantes, isolou-se e testou-se o DNA de plasmídeo.
Dessa maneira, obteve-se as cepas DSM5715aecD::dapA (MC20)/pEC7lysE, DSM5715aecD::dapA (MA16)/pEC7lysE, DSM5715aecD::dapA (MC20)/pEC7, DSM5715aecD::dapA (MA16)/pEC7 e DSM5715/pEC7.
Exemplo 15 Preparação de Usina com as cepas preparadas no Exemplo 14 As cepas DSM5715aecD::dapA (MC20)/pEC7lysE, DSM5715aecD::dapA (MA16)/pEC7lysE, DSM5715aecD::dapA (MC20)/pEC7, DSM5715aecD::dapA (MA16)/pEC7 e DSM5715/pEC7 foram cultivadas, tal corrio descrito no Exemplo 8, depois de pré-cultivo em meio Cgllí (Kase & Nakayama, Agricultura! and Biological Chemistry 36 (9) 1611-1621 (1972)), no meio de produção MM. Depois de 48 horas de incubação, foi determinada a densidade óptica à 660 nmea concentração de L-lisina formada.
Na Tabela 2, está representado o resultado do teste.
Tabela 2 Figuras: As seguintes figuras estão em anexo: Figura 1: Plasmídio pEC7lysE Figura 2: plamídio pEC7dapB Figura 3: plasmídio pEC7dapB!ysE
As abreviações usadas nas Figuras são definidas como se segue: Cm: gene de resistência cloranfenicol dapB: gene dapB de C.glutamicum lysE: gene lysE de C.glutamicum pyc: gene pyc de C.glutamicum OriE: origem codificada - plasmídio de replicação de E.coli pBL: fragmento de DNA de plasmídio pBL1 EcoRI: sítio de divagem da enzima de restrição EcoRI
EcoRV: sítio de divagem da enzima de restrição EcoRV
Hincll: sítio de divagem da enzima de restrição Hincll Hindlll: sítio de divagem da enzima de restrição Hindlll Kpnl: sítio de divagem da enzima de restrição Kpnl Sall: sítio de divagem da enzima de restrição Sa11 Smaf: sítio de divagem da enzima de restrição Smal Sphl: sítio de divagem da enzima de restrição Sphl Pvull: sítio de divagem da enzima de restrição Pvull BamHI: sítio de divagem da enzima de restrição BamHI
Claims (10)
1. Bactérias corineformes produtoras de L-lisina, caracterizadas pelo fato de que apresentam um gene lysE superexpresso, nas quais o gene dapA também é superexpresso, o promotor do gene dapA apresentando as seqüências representadas na SEQ ID NO 5 (mutação MC20) ou SEQ ID NO 6 (mutação MA16)
2. Bactérias corineformes de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que o gene dapB é superexpresso.
3. Bactérias corineformes de acordo com a reivindicação 2, caracterizadas pelo fato de que o gene dapB, que adicionalmente contém a região 5' antes do sítio de iniciação de tradução deste gene, representada na SEQ ID NO:1, é superexpresso.
4. Bactérias corineformes de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que o gene dapB ou o gene LysC é superexpresso.
5. Processo para a produção de L-lisina em cultura por fermentação de bactérias corineformes, caracterizado pelo fato de que se utiliza as bactérias como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que se utiliza uma cepa transformada por um ou mais vetor(es) plasmídico(s), e o(s) vetor(es) plasmídico(s) apresenta(m) as seqüências nucleotídicas para os genes a serem superexpressos.
7. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que se utiliza uma cepa transformada por um vetor plasmídico e o vetor plasmídico apresenta as seqüências nucleotídicas para os genes dapA, lysC e lysE.
8. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que os genes superexpressados são integrados no cromossomo das bactérias utilizadas.
9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8, caracterizado pelo fato de que se utiliza bactérias do gênero Corynebacte-rium glutamicum.
10. Processo para a produção de L-lisina por fermentação de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 9, caracterizado pelo fato de que são realizadas as seguintes etapas: a) fermentação das bactérias produtoras de L-lisina, como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, b) concentração da L-lisina no meio ou nas células das bactérias, e c) isolamento da L-lisina.
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