BR112021011939A2 - Anticorpo que se liga a cd3, anticorpos que se ligam a cd3 e tyrp-1, polinucleotídeo isolado, célula hospedeira, método para produzir um anticorpo que se liga a cd3, composição farmacêutica e usos do anticorpo - Google Patents

Abstract

anticorpo que se liga a cd3, anticorpos que se ligam a cd3 e tyrp-1, polinucleotídeo isolado, célula hospedeira, método para produzir um anticorpo que se liga a cd3, composição farmacêutica e usos do anticorpo. a presente invenção geralmente se refere a anticorpos que se ligam a cd3, incluindo anticorpos multiespecíficos, por exemplo, para ativação de células t. além disso, a presente invenção refere-se a polinucleotídeos que codificam tais anticorpos, e vetores e células hospedeiras compreendendo tais polinucleotídeos. a invenção também se refere a métodos para produzir anticorpos e a métodos para usá-los no tratamento de doenças.

Description

“ANTICORPO QUE SE LIGA A CD3, ANTICORPOS QUE SE LIGAM A CD3 E TYRP-1, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA PRODUZIR UM ANTICORPO QUE SE LIGA A CD3, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USOS DO ANTICORPO”

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção geralmente se refere a anticorpos que se ligam a CD3, incluindo anticorpos multiespecíficos, por exemplo, para ativação de células T. Além disso, a presente invenção refere-se a polinucleotídeos que codificam tais anticorpos, e vetores e células hospedeiras compreendendo tais polinucleotídeos. A invenção também se refere a métodos para produzir anticorpos e a métodos para usá-los no tratamento de doenças.

ANTECEDENTES

[0002] CD3 (agrupamento de diferenciação 3) é um complexo proteico composto por quatro subunidades, a cadeia CD3γ, a cadeia CD3δ e duas cadeias CD3ɛ. O CD3 se associa ao receptor de células T e à cadeia ζ para gerar um sinal de ativação nos linfócitos T.

[0003] O CD3 foi amplamente explorado como alvo de fármacos.

Os anticorpos monoclonais direcionados a CD3 têm sido usados como terapias imunossupressoras em doenças autoimunes, tais como diabetes tipo I, ou no tratamento de rejeição de transplantes. O anticorpo CD3 muromonab-CD3 (OKT3) foi o primeiro anticorpo monoclonal aprovado para uso clínico em humanos, em 1985.

[0004] Uma aplicação mais recente de anticorpos CD3 é na forma de anticorpos biespecíficos, ligando CD3 por um lado e um antígeno de células tumorais por outro. A ligação simultânea de tal anticorpo a ambos os seus alvos forçará uma interação temporária entre a célula alvo e a célula T, causando a ativação de qualquer célula T citotóxica e subsequente lise da célula alvo.

[0005] Para fins terapêuticos, um requisito importante que os anticorpos têm de cumprir é a estabilidade suficiente tanto in vitro (para armazenamento do fármaco) como in vivo (após administração ao paciente).

[0006] Modificações como a desamidação de asparagina são degradações típicas para anticorpos recombinantes e podem afetar a estabilidade in vitro e as funções biológicas in vivo.

[0007] Dado o tremendo potencial terapêutico dos anticorpos, particularmente anticorpos biespecíficos para a ativação de células T, há uma necessidade de anticorpos CD3 com propriedades otimizadas.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[0008] A presente invenção fornece anticorpos, incluindo anticorpos multiespecíficos (por exemplo, biespecíficos), que se ligam a CD3 e são resistentes à degradação por, por exemplo, desamidação de asparagina e, portanto, particularmente estáveis conforme necessário para fins terapêuticos.

Os anticorpos (multiespecíficos) fornecidos combinam ainda boa eficácia e capacidade de produção com baixa toxicidade e propriedades farmacocinéticas favoráveis.

[0009] Como é mostrado neste documento, os anticorpos, incluindo anticorpos multiespecíficos, que se ligam a CD3, fornecidos pela presente invenção, retêm mais do que cerca de 90% da atividade de ligação a CD3 após 2 semanas em pH 7,4, 37 °C, em relação à atividade de ligação após 2 semanas em pH 6, -80 °C, conforme determinado pela ressonância de plásmon de superfície (SPR).

[00010] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que se liga a CD3, em que o anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno, compreendendo uma região variável da cadeia pesada (VH) que compreende uma região determinante de complementaridade da cadeia pesada (HCDR) 1 da SEQ ID NO: 2, uma HCDR 2 da SEQ ID NO: 3 e uma

HCDR 3 da SEQ ID NO: 5, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade da cadeia leve (LCDR) 1 da SEQ ID NO: 8, uma LCDR 2 da SEQ ID NO: 9 e uma LCDR 3 da SEQ ID NO: 10. Em um aspecto, o VH compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7, e/ou o VL compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11.

[00011] Em um outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo que se liga a CD3, em que o anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno compreendendo uma sequência de VH da SEQ ID NO: 7 e uma sequência de VL da SEQ ID NO: 11.

[00012] Em um aspecto, o primeiro domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab.

[00013] Em um aspecto, o anticorpo compreende um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade.

[00014] Em um aspecto, o anticorpo compreende um segundo e, opcionalmente, um terceiro domínio de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno.

[00015] Em um aspecto, o segundo e/ou, quando presente, o terceiro domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab.

[00016] Em um aspecto, o primeiro domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CH1, particularmente os domínios variáveis VL e VH, da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro.

[00017] Em um aspecto, o segundo e, quando presente, o terceiro domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab convencional.

[00018] Em um aspecto, o segundo e, quando presente, o terceiro domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab, em que, no domínio constante CL, o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat), e o aminoácido na posição 123 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat), e, no domínio constante CH1, o aminoácido na posição 147 é substituído independentemente por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído independentemente por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[00019] Em um aspecto, o primeiro e o segundo domínio de ligação ao antígeno são fundidos um ao outro, opcionalmente por meio de um ligante peptídico.

[00020] Em um aspecto, o primeiro e o segundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, uma molécula Fab e (i) o segundo domínio de ligação ao antígeno é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab do primeiro domínio de ligação ao antígeno, ou (ii) o primeiro domínio de ligação ao antígeno é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab do segundo domínio de ligação ao antígeno.

[00021] Em um aspecto, o primeiro, o segundo e, quando presente, o terceiro domínio de ligação ao antígeno são, cada um, uma molécula Fab e o anticorpo compreende um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade; e em que (i) o segundo domínio de ligação ao antígeno é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab do primeiro domínio de ligação ao antígeno, e o primeiro domínio de ligação ao antígeno é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da primeira subunidade do domínio Fc, ou (ii) o primeiro domínio de ligação ao antígeno é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab do segundo domínio de ligação ao antígeno e o segundo domínio de ligação ao antígeno é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da primeira subunidade do domínio Fc; e o terceiro domínio de ligação ao antígeno, quando presente, é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da segunda subunidade do domínio Fc.

[00022] Em um aspecto, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG, particularmente, IgG1. Em um aspecto, o domínio Fc é um domínio Fc humano.

Em um aspecto, o Fc compreende uma modificação que promove a associação da primeira e da segunda subunidades do domínio Fc. Em algumas modalidades, o domínio Fc compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor Fc e/ou função efetora.

[00023] Em um aspecto, o segundo antígeno é um antígeno de célula alvo, particularmente um antígeno de célula tumoral.

[00024] Em um aspecto, o segundo antígeno é TYRP-1. Em um aspecto, o segundo e, quando presente, o terceiro domínio de ligação ao antígeno compreende um VH compreendendo uma HCDR 1 da SEQ ID NO: 15, uma HCDR 2 da SEQ ID NO: 16 e uma HCDR 3 da SEQ ID NO: 17, e um VL compreendendo uma LCDR 1 da SEQ ID NO: 19, uma LCDR 2 da SEQ ID NO: 20 e uma LCDR 3 da SEQ ID NO: 21. Em um aspecto, o segundo e, quando presente, o terceiro domínio de ligação ao antígeno compreende um VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18, e/ou um VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22.

[00025] Em um aspecto, o segundo antígeno é EGFRvIII. Em um aspecto, o segundo e, quando presente, o terceiro domínio de ligação ao antígeno compreende um VH compreendendo uma HCDR 1 da SEQ ID NO: 85, uma HCDR 2 da SEQ ID NO: 86 e uma HCDR 3 da SEQ ID NO: 87, e um VL compreendendo uma LCDR 1 da SEQ ID NO: 89, uma LCDR 2 da SEQ ID NO: 90 e uma LCDR 3 da SEQ ID NO: 91. Em um aspecto, o segundo e, quando presente, o terceiro domínio de ligação ao antígeno compreende um VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 88, e/ou um VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 92.

[00026] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado que codifica um anticorpo da invenção e uma célula hospedeira compreendendo o polinucleotídeo isolado da invenção.

[00027] Em outro aspecto, é fornecido um método de produção de um anticorpo que se liga a CD3, compreendendo as etapas de (a) cultivar a célula hospedeira da invenção sob condições adequadas para a expressão do anticorpo e, opcionalmente, (b) recuperar o anticorpo. A invenção também abrange um anticorpo que se liga a CD3 produzido pelo método da invenção.

[00028] A invenção fornece ainda uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00029] Também englobados pela invenção estão os métodos de uso do anticorpo e da composição farmacêutica da invenção. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo ou composição farmacêutica de acordo com a invenção para uso como um medicamento. Em um aspecto, é fornecido um anticorpo ou composição farmacêutica de acordo com a invenção para uso no tratamento de uma doença. Em um aspecto específico, a doença é câncer.

[00030] Também é fornecido o uso de um anticorpo ou composição farmacêutica de acordo com a invenção na fabricação de um medicamento, o uso de um anticorpo ou composição farmacêutica de acordo com a invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença, particularmente câncer. A invenção também fornece um método de tratamento de uma doença em um indivíduo, compreendendo administrar ao referido indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo ou composição farmacêutica de acordo com a invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00031] Figura 1. Configurações exemplares dos anticorpos (multiespecíficos) da invenção. (A, D) Ilustração da molécula “1+1CrossMab”.

(B, E) Ilustração da molécula “2+1 Crossfab de IgG” com ordem alternativa de componentes Crossfab e Fab (“invertidos”). (C, F) Ilustração da molécula “2+1 Crossfab de IgG”. (G, K) Ilustração da molécula “1+1 Crossfab de IgG” com ordem alternativa de componentes Crossfab e Fab (“invertidos”). (H, L) Ilustração da molécula “1+1 Crossfab de IgG”. (I, M) Ilustração da molécula “2+1 Crossfab de IgG” com dois CrossFabs. (J, N) Ilustração da molécula “2+1 Crossfab de IgG” com dois CrossFabs e ordem alternativa de componentes Crossfab e Fab (“invertidos”). (O, S) Ilustração da molécula “Fab-Crossfab”. (P, T) Ilustração da molécula “Crossfab-Fab”. (Q, U) Ilustração da molécula “(Fab)2- Crossfab”. (R, V) Ilustração da molécula “Crossfab-(Fab)2”. (W, Y) Ilustração da molécula “Fab-(Crossfab)2”. (X, Z) Ilustração da molécula “(Crossfab)2-Fab”.

Ponto preto: modificação opcional no domínio Fc que promove a heterodimerização. ++, -: aminoácidos de cargas opostas opcionalmente introduzidos nos domínios CH1 e CL. As moléculas Crossfab são descritas como compreendendo uma troca das regiões VH e VL, mas podem - em aspectos em que nenhuma modificação de carga é introduzida nos domínios CH1 e CL - alternativamente compreender uma troca dos domínios CH1 e CL.

[00032] Figura 2. Atividade de ligação relativa de ligantes CD3 originais e otimizados, CD3orig e CD3oti, a CD3 recombinante, conforme medido por SPR em condição sem estresse, após 14 dias a 40 °C, pH 6, ou após 14 dias a 37 °C, pH 7,4 (formato de IgG).

[00033] Figura 3. Ligação de ligantes CD3 originais e otimizados, CD3orig e CD3oti, a células Jurkat NFAT, conforme medido por citometria de fluxo (formato de IgG). Os anticorpos ligados a células Jurkat NFAT foram detectados com um anticorpo secundário específico Fc anti-humano marcado com fluorescência.

[00034] Figura 4. Ilustração esquemática do ensaio de ativação de CD3 usado no Exemplo 3.

[00035] Figura 5. Ativação de Jurkat NFAT com ligantes CD3 originais e otimizados, CD3orig e CD3oti (formato de IgG). As células repórter Jurkat NFAT foram coincubadas com células CHO que expressam anti- PGLALA (CHO-PGLALA) na presença de CD3orig ou CD3oti de IgG PGLALA, ou CD3oti de IgG do tipo selvagem como controle negativo. A ativação de CD3 foi quantificada pela medição da luminescência após 24 h.

[00036] Figura 6. Ilustração esquemática das moléculas de anticorpo biespecífico de células T (TCB) preparadas nos Exemplos. Todas as moléculas de anticorpo TCB testadas foram produzidas como "2+1 Crossfab de IgG, invertidas" com modificações de carga (troca de VH/VL em ligante CD3, modificações de carga em ligantes de antígeno alvo, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K).

[00037] Figura 7. Atividade de ligação relativa de TCBs TYRP1compreendendo ligantes CD3 originais ou otimizados, CD3 orig ou CD3oti, a CD3 recombinante conforme medido por SPR em condição sem estresse, após 14 d a 40 °C, pH 6, ou após 14 d a 37 °C, pH 7,4.

[00038] Figura 8. Atividade de ligação relativa de TCBs TYRP1 compreendendo ligantes CD3 originais ou otimizados, CD3 orig ou CD3oti, ou a IgG de TYRP1 correspondente, ao TYRP1 recombinante medido por SPR em condição sem estresse, após 14 d a 40 °C, pH 6, ou após 14 d a 37 °C, pH 7,4.

[00039] Figura 9. Ligação de TCBs TYRP1 compreendendo ligantes CD3 originais ou otimizados, CD3orig ou CD3oti, a células Jurkat NFAT conforme medido por citometria de fluxo. TCBs ligadas a células Jurkat NFAT foram detectadas com um anticorpo secundário específico Fc anti-humano marcado com fluorescência.

[00040] Figura 10. Ativação de Jurkat NFAT com TCBs TYRP1 compreendendo ligantes CD3 originais ou otimizados. As células repórter Jurkat NFAT foram coincubadas com a linhagem celular de melanoma M150543 na presença de CD3orig de TCB TYRP1 ou CD3oti de TCB TYRP1. A ativação de CD3 na presença de TCBs foi quantificada pela medição da luminescência após 24 h.

[00041] Figura 11. Morte de células tumorais e ativação de células T com TCBs TYRP1 compreendendo ligantes CD3 originais ou otimizados. A morte da linhagem celular de melanoma M150543 após o tratamento com CD3orig de TCB TYRP1 e CD3oti de TCB TYRP1 por PBMCs de três doadores saudáveis diferentes (A-F: doador 1, G-L: doador 2, M-R: doador 3) foi determinada pela liberação de LDH após 24 h (A, G, M) e 48 h (B, H, N).

Em paralelo, a regulação positiva de CD25 (C, E, I, K, O, Q) e CD69 (D, F, J, L, P, R) em células T CD8 (E, F, K, L, Q, R) e CD4 (C, D, I, J, O, P) dentro de PBMCs foi medida por citometria de fluxo como um marcador para ativação de células T após 48 h.

[00042] Figura 12. Ligação específica de EGFRvIII IgG PGLALA.

A ligação específica de anticorpos EGFRvIII IgG PGLALA a EGFRvIII sem reatividade cruzada com EGFRwt foi testada por citometria de fluxo em CHO- EGFRvIII (A), DK-MG positivo para EGFRvIII (B) e EGFRwt expressando MKN-

45 (C). O cetuximabe foi incluído como controle positivo para a expressão de EGFRwt.

[00043] Figura 13. Ativação de CAR J com EGFRvIII IgG PGLALA. As células repórter Jurkat NFAT que expressam anti-PGLALA CAR foram co-incubadas com células DK-MG que expressam EGFRvIII e anticorpos EGFRvIII IgG PGLALA ou DP47 IgG PGLALA como controle negativo. A ativação de células Jurkat NFAT foi quantificada medindo a luminescência após 22 h.

[00044] Figura 14. Ligação de EGFRvIII IgG PGLALA e TCBs correspondentes a EGFRvIII. A ligação específica de ligantes EGFRvIII como IgG PGLALA e convertidos em TCBs para células CHO-EGFRvIII (A) e MKN- 45 (B) foi medida por citometria de fluxo.

[00045] Figura 15. Ativação de Jurkat NFAT com TCBs EGFRvIII.

A ativação de Jurkat NFAT foi determinada como um marcador para o engajamento de CD3 com TCBs EGFRvIII na presença de células DK-MG positivas para EGFRvIII. TCB DP47 foi incluída como controle negativo.

[00046] Figura 16. Lise de células tumorais com TCBs EGFRvIII.

A indução da lise de células tumorais específicas por TCBs EGFRvIII foi determinada após a cocultura com PBMCs isoladas a fresco e células DK-MG positivas para EGFRvIII (A, B) ou células MKN-45 positivas para EGFRwt (C, D) por 24 h (A, C) ou 48 h (B, D).

[00047] Figura 17. Ativação de células T com TCBs EGFRvIII. A indução da ativação de células T por TCBs EGFRvIII foi determinada após a cocultura com PBMCs isoladas a fresco e células DK-MG positivas para EGFRvIII (A, B, E, F) ou células MKN-45 positivas para EGFRwt (C, D, G, H) usando marcadores de ativação CD25 (A, C, E, G) ou CD69 (B, D, F, H) em células T CD4 (AD) ou células T CD8 (EH).

[00048] Figura 18. Liberação de citocinas com TCBs EGFRvIII. A indução de liberação de IFN (A, D), TNF (B, E) e Granzima B (C, F) por TCBs EGFRvIII foi determinada pela cocultura com PBMCs isoladas a fresco e células DK-MG positivas para EGFRvIII (AC) ou células MKN-45 positivas para EGFRwt (DF).

[00049] Figura 19. Ligação específica de EGFRvIII IgG PGLALA de afinidade maturada. A ligação específica de anticorpos EGFRvIII amadurecidos por afinidade a EGFRvIII foi comparada ao ligante EGFRvIII parental em células U87MG-EGFRvIII (A) e na linhagem celular positiva para EGFRwt MKN-45 (B).

[00050] Figura 20. Ativação de Jurkat NFAT por TCBs EGFRvIII.

A ativação de Jurkat NFAT foi determinada como um marcador para o engajamento de CD3 com TCBs EGFRvIII na presença de células DK-MG positivas para EGFRvIII (A), células U87MG-EGFRvIII (B) e células MKN-45 (C). TCB DP47 foi incluída como controle negativo.

[00051] Figura 21. Atividade de ligação relativa de TCBs EGFRvIII compreendendo ligantes CD3 originais ou otimizados, CD3 orig ou CD3oti, a CD3 recombinante conforme medido por SPR em condição sem estresse, após 14 dias a 40 °C, pH 6, ou após 14 dias a 37 °C, pH 7,4.

[00052] Figura 22. Atividade de ligação relativa de TCBs EGFRvIII compreendendo ligantes CD3 originais ou otimizados, CD3 orig ou CD3oti, a EGFRvIII recombinante conforme medido por SPR em condição sem estresse, após 14 d a 40 °C, pH 6, ou após 14 d a 37 °C, pH 7,4.

[00053] Figura 23. Ligação de TCBs EGFRvIII compreendendo ligantes CD3 originais ou otimizados, CD3orig ou CD3oti, a células Jurkat NFAT conforme medido por citometria de fluxo. TCBs ligadas a células Jurkat NFAT foram detectadas com um anticorpo secundário específico Fc anti-humano marcado com fluorescência.

[00054] Figura 24. Ligação de TCBs EGFRvIII compreendendo ligante EGFRvIII P063.056 ou P056.021 a células U87MG-EGFRvIII conforme medido por citometria de fluxo. TCBs ligadas a células U87MG-EGFRvIII foram detectadas com um anticorpo secundário específico Fc anti-humano marcado com fluorescência.

[00055] Figura 25. Lise de células tumorais e ativação de células T com TCBs EGFRvIII. A indução de lise de células tumorais específicas (A, B) e ativação de células T (C, D) por TCBs EGFRvIII foi determinada após a cocultura com PBMCs recém-isoladas e células U87MG-EGFRvIII por 24 h (A, C) ou 48 h (B, D). TCB DP47 foi incluída como controle negativo.

[00056] Figura 26. Ativação de Jurkat NFAT comparando o formato TCB EGFRvIII 2+1 e o formato 1+1. A ativação de Jurkat NFAT foi determinada como um marcador para o engajamento de CD3 com TCB EGFRvIII no formato invertido 2+1 e no formato cabeça-a-cauda 1+1 na presença de células U87MG-EGFRvIII positivas para EGFRvIII.

[00057] Figura 27. Lise de células tumorais e ativação de células T comparando o formato TCB EGFRvIII 2+1 e o formato 1+1. A indução de lise de células tumorais específicas (A, B) e ativação de células T (C, D) por TCB EGFRvIII no formato 2+1 invertido e no formato cabeça-a-cauda 1+1 foi determinada após a cocultura com PBMCs recém-isoladas e células U87MG- EGFRvIII por 24 h (A, C) ou 48 h (B, D).

[00058] Figura 28. Ativação e proliferação de células T com TCBs EGFRvIII. A indução da proliferação de células T (A, C) e a ativação de células T de células T CD4 (A, B) e células T CD8 (C, D) por TCBs EGFRvIII foi determinada após a cocultura de U87MG-EGFRvIII e PBMCs isoladas de doadores saudáveis.

[00059] Figura 29. Lise de células tumorais, ativação de células T e liberação de citocinas com TCBs EGFRvIII. A indução de lise de células tumorais (A, B), ativação de células T (C, D) e liberação de IFN e TNF (E, F)

por TCBs EGFRvIII foi determinada após a cocultura de células U87MG- EGFRvIII com PBMCs. A lise de células tumorais foi medida após 24 horas e 48 horas de tratamento, a ativação de células T e a liberação de citocinas foram medidas após 48 horas.

[00060] Figura 30. Lise de células tumorais, ativação de células T e liberação de citocinas com TCB TYRP-1. A indução da lise de células tumorais (A, B), a ativação de células T (C, D) e a liberação de IFNγ e TNFα (E, F) por TCB TYRP-1 foi determinada após a cocultura com a linhagem celular de melanoma derivada de paciente M150543 com PBMCs. A lise de células tumorais foi medida após 24 horas e 48 horas de tratamento, a ativação de células T e a liberação de citocinas foram medidas após 48 horas.

[00061] Figura 31. Eficácia in vivo de TCB TYRP-1. A linhagem celular de melanoma humano IGR-1 foi injetada por via subcutânea em camundongos NSG humanizados para estudar a inibição do crescimento tumoral em um modelo de xenoenxerto subcutâneo de melanoma. A inibição significativa do crescimento tumoral (TGI) foi observada no grupo TCB TYRP-1 (68% TGI, p = 0,0058 *) em comparação com o grupo veículo.

[00062] Figura 32. Eficácia in vivo de TCB EGFRvIII. A linhagem celular de glioblastoma humano U87-huEGFRvIII foi injetada por via subcutânea em camundongos NSG humanizados para estudar a inibição do crescimento tumoral em um modelo de xenoenxerto subcutâneo de glioblastoma. Um controle significativo do tumor foi observado no grupo TCB EGFRvIII com todos os camundongos atingindo a remissão completa.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. DEFINIÇÕES

[00063] Os termos são usados neste documento como geralmente usados na técnica, a menos que definido de outra forma a seguir.

[00064] Conforme usado neste documento, os termos “primeiro”,

“segundo” ou “terceiro” com respeito aos domínios de ligação ao antígeno, etc., são usados por conveniência de distinguir quando há mais de um de cada tipo de fração. O uso desses termos não tem a intenção de conferir uma ordem ou orientação específica da metade, a menos que explicitamente declarado.

[00065] Os termos "anticorpo anti-CD3" e "um anticorpo que se liga a CD3" referem-se a um anticorpo que é capaz de se ligar a CD3 com afinidade suficiente de tal modo que o anticorpo seja útil como um agente diagnóstico e/ou terapêutico no direcionamento de CD3. Em um aspecto, a extensão da ligação de um anticorpo anti-CD3 a uma proteína não CD3 não relacionada é inferior a cerca de 10% da ligação do anticorpo a CD3, conforme medido, por exemplo, por um radioimunoensaio (RIA). Em certas modalidades, um anticorpo que se liga a CD3 tem uma constante de dissociação (K D) de ≤ 1 μM, ≤ 500 nM, ≤ 200 nM ou ≤ 100 nM. Diz-se que um anticorpo "se liga especificamente" a CD3 quando o anticorpo tem uma K D de 1 μM ou menos, conforme medido, por exemplo, por SPR. Em certos aspectos, um anticorpo anti-CD3 liga-se a um epítopo de CD3 que é conservado entre CD3 de espécies diferentes.

[00066] O termo “anticorpo” é usado neste documento no sentido mais amplo e abrange várias estruturas de anticorpo, incluindo, mas não se limitando a, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpo, contanto que exibam a atividade de ligação ao antígeno desejada.

[00067] Um "fragmento de anticorpo" refere-se a uma molécula diferente de um anticorpo intacto que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não são limitados a, Fv, Fab, Fab', Fab'- SH, F(ab')2; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpos de cadeia simples (por exemplo, scFv e scFab); anticorpos de domínio único e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo. Para uma revisão de certos fragmentos de anticorpo, vide Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005).

[00068] Os termos "anticorpo de comprimento total", "anticorpo intacto" e "anticorpo inteiro" são usados indistintamente neste documento para referirem-se a um anticorpo com uma estrutura substancialmente semelhante a uma estrutura de anticorpo nativo.

[00069] O termo "anticorpo monoclonal", conforme usado neste documento, refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, ou seja, os anticorpos individuais compreendidos na população são idênticos e/ou se ligam ao mesmo epítopo, exceto para possíveis anticorpos variantes, por exemplo, contendo mutações de ocorrência natural ou surgindo durante a produção de uma preparação de anticorpos monoclonais, tais variantes geralmente estando presentes em quantidades menores. Em contraste com as preparações de anticorpos policlonais, que normalmente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpos monoclonais é direcionado contra um único determinante em um antígeno. Assim, o modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser feitos por uma variedade de técnicas, incluindo, mas não se limitando a, método de hibridoma, métodos de DNA recombinante, métodos de exibição em fago e métodos que usam animais transgênicos contendo todos ou parte dos loci de imunoglobulina humana, tais métodos e outros métodos exemplares para a produção de anticorpos monoclonais sendo descritos neste documento.

[00070] Um anticorpo "isolado" é aquele que foi separado de um componente de seu ambiente natural. Em alguns aspectos, um anticorpo é purificado para mais de 95% ou 99% de pureza, conforme determinado por, por exemplo, eletroforese (por exemplo, SDS-PAGE, focalização soelétrica (IEF), eletroforese capilar) ou cromatografia (por exemplo, HPLC de troca iônica ou de reversa fase, cromatografia de afinidade, cromatografia por exclusão de tamanho). Para uma revisão dos métodos de avaliação da pureza do anticorpo, vide, por exemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848: 79-87 (2007). Em alguns aspectos, os anticorpos fornecidos pela presente invenção são anticorpos isolados.

[00071] O termo anticorpo "quimérico" refere-se a um anticorpo no qual uma porção da cadeia pesada e/ou leve é derivada de uma fonte ou espécie particular, enquanto o restante da cadeia pesada e/ou leve é derivado de uma fonte ou espécie diferente.

[00072] Um anticorpo "humanizado" refere-se a um anticorpo quimérico compreendendo resíduos de aminoácidos de CDRs não humanas e resíduos de aminoácidos de FRs humanos. Em certos aspectos, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e normalmente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as CDRs correspondem às de um anticorpo não humano e todos ou substancialmente todos os FRs correspondem aos de um anticorpo humano.

Tais domínios variáveis são referidos neste documento como "região variável humanizada". Um anticorpo humanizado opcionalmente pode compreender pelo menos uma porção de uma região constante de anticorpo derivada de um anticorpo humano. Em alguns aspectos, alguns resíduos de FR em um anticorpo humanizado são substituídos por resíduos correspondentes de um anticorpo não humano (por exemplo, o anticorpo a partir do qual os resíduos de CDR são derivados), por exemplo, para restaurar ou melhorar a especificidade ou afinidade do anticorpo. Uma "forma humanizada" de um anticorpo, por exemplo, de um anticorpo não humano, refere-se a um anticorpo que foi submetido a humanização.

[00073] Um "anticorpo humano" é aquele que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde àquela de um anticorpo produzido por uma célula humana ou humana ou derivada de uma fonte não humana que usa repertórios de anticorpos humanos ou outras sequências de codificação de anticorpos humanos. Essa definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado compreendendo resíduos de ligação ao antígeno não humanos. Em certos aspectos, um anticorpo humano é derivado de um mamífero transgênico não humano, por exemplo, um camundongo, um rato ou um coelho. Em certos aspectos, um anticorpo humano é derivado de uma linhagem celular de hibridoma. Anticorpos ou fragmentos de anticorpo isolados de bibliotecas de anticorpos humanos também são considerados anticorpos humanos ou fragmentos de anticorpo humanos neste documento.

[00074] O termo "domínio de ligação ao antígeno" refere-se à parte de um anticorpo que compreende a área que se liga a e é complementar a parte ou a totalidade de um antígeno. Um domínio de ligação ao antígeno pode ser fornecido por, por exemplo, um ou mais domínios variáveis de anticorpo (também chamados de regiões variáveis de anticorpo). Em aspectos preferidos, um domínio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia leve de anticorpo (VL) e um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo (VH).

[00075] O termo "região variável" ou "domínio variável" refere-se ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo que está envolvida na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo geralmente têm estruturas semelhantes, com cada domínio compreendendo quatro regiões framework (FRs) conservadas e regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Vide, por exemplo, Kindt et al., Kuby Immunology, 6ª ed., WH Freeman & Co., página 91 (2007). Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação ao antígeno. Além disso, os anticorpos que se ligam a um determinado antígeno podem ser isolados usando um domínio VH ou VL de um anticorpo que se liga ao antígeno para rastrear uma biblioteca de domínios VL ou VH complementares, respectivamente. Vide, por exemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150: 880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352: 624-628 (1991). Conforme usado neste documento em relação às sequências de região variável, "numeração de Kabat" refere-se ao sistema de numeração estabelecido por Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).

[00076] Conforme usado neste documento, as posições de aminoácidos de todas as regiões constantes e domínios da cadeia pesada e leve são numeradas de acordo com o sistema de numeração de Kabat descrito em Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), referido neste documento como “numeração de acordo com Kabat” ou “numeração de Kabat”. Especificamente, o sistema de numeração de Kabat (vide páginas 647-660 de Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) é usado para o domínio constante CL da cadeia leve do isótipo kappa e lambda e o sistema de numeração de índice EU de Kabat (vide páginas 661-723) é usado para os domínios constantes da cadeia pesada (CH1, dobradiça, CH2 e CH3), que é esclarecido adicionalmente neste documento por referência a “numeração de acordo com o índice EU de Kabat” ou “numeração do índice EU de Kabat” nesse caso.

[00077] O termo "região hipervariável" ou "HVR", conforme usado neste documento, refere-se a cada uma das regiões de um domínio variável de anticorpo que são hipervariáveis em sequência e que determinam a especificidade de ligação ao antígeno, por exemplo, "regiões determinantes de complementaridade" ("CDRs"). Geralmente, os anticorpos compreendem seis CDRs; três no VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3) e três no VL (LCDR1, LCDR2, LCDR3). CDRs exemplares deste documento incluem: (a) loops (alças) hipervariáveis que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96- 101 (H3) (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)); (b) CDRs que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)); e (c) contatos de antígeno que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) e 93- 101 (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)).

[00078] Salvo indicação em contrário, as CDRs são determinadas de acordo com Kabat et al., supra. Um técnico no assunto entenderá que as designações de CDR também podem ser determinadas de acordo com Chothia, supra, McCallum, supra, ou qualquer outro sistema de nomenclatura cientificamente aceito.

[00079] "Framework" ou "FR" refere-se a resíduos de domínio variável diferentes de regiões determinantes de complementaridade (CDRs). O FR de um domínio variável geralmente consiste em quatro domínios de FR: FR1, FR2, FR3 e FR4. Consequentemente, as sequências de HVR e FR geralmente aparecem na seguinte ordem em VH (ou VL): FR1- HCDR1(LCDR1)-FR2-HCDR2(LCDR2)-FR3-HCDR3(LCDR3)-FR4.

[00080] A menos que indicado de outra forma, os resíduos de CDR e outros resíduos no domínio variável (por exemplo, resíduos de FR) são numerados neste documento de acordo com Kabat et al., supra.

[00081] Um "framework aceitador humano" para os fins deste documento é um framework compreendendo a sequência de aminoácidos de um framework de domínio variável da cadeia leve (VL) ou um framework de domínio variável da cadeia pesada (VH) derivado de um framework de imunoglobulina humana ou um framework de consenso humano, conforme definido abaixo. Um framework aceitador humano "derivado de" um framework de imunoglobulina humana ou um framework de consenso humano pode compreender a mesma sequência de aminoácidos, ou pode conter alterações na sequência de aminoácidos. Em alguns aspectos, o número de alterações de aminoácidos é 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos, ou 2 ou menos. Em alguns aspectos, o framework aceitador humano de VL é idêntico em sequência à sequência de framework de imunoglobulina humana de VL ou sequência de framework de consenso humano.

[00082] Um "framework de consenso humano" é um framework que representa os resíduos de aminoácidos de ocorrência mais comum em uma seleção de sequências de framework de VL ou VH de imunoglobulina humana. Geralmente, a seleção das sequências de VL ou VH de imunoglobulina humana é de um subgrupo de sequências de domínio variável.

Geralmente, o subgrupo de sequências é um subgrupo como em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Edição, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3.

[00083] O termo "molécula de imunoglobulina" neste documento refere-se a uma proteína com a estrutura de um anticorpo de ocorrência natural.

Por exemplo, as imunoglobulinas da classe IgG são glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostas por duas cadeias leves e duas cadeias pesadas que são ligadas por dissulfeto. Do N- ao C- terminal, cada cadeia pesada tem um domínio variável (VH), também chamado de domínio pesado variável ou uma região variável da cadeia pesada, seguido por três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3), também chamados de região constante da cadeia pesada. Da mesma forma, do N- ao C-terminal, cada cadeia leve tem um domínio variável (VL), também chamado de domínio leve variável ou uma região variável da cadeia leve, seguido por um domínio leve constante (CL), também chamado de região constante da cadeia leve. A cadeia pesada de uma imunoglobulina pode ser atribuída a um dos cinco tipos, chamados α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG) ou μ (IgM), alguns dos quais podem ser divididos em subtipos, por exemplo, γ1 (IgG1), γ2 (IgG2), γ3 (IgG3), γ4 (IgG4), α1 (IgA1) e α2 (IgA2). A cadeia leve de uma imunoglobulina pode ser atribuída a uma de dois tipos, chamadas kappa (κ) e lambda (λ), com base na sequência de aminoácidos de seu domínio constante. Uma imunoglobulina consiste essencialmente em duas moléculas Fab e um domínio Fc, ligados por meio da região de dobradiça da imunoglobulina.

[00084] A "classe" de um anticorpo ou imunoglobulina refere-se ao tipo de domínio constante ou região constante possuída por sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias dessas podem ser ainda divididas em subclasses (isótipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Os domínios constantes da cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamados α, δ, ε, γ e μ, respectivamente.

[00085] Uma "molécula Fab" refere-se a uma proteína que consiste no domínio VH e CH1 da cadeia pesada (a "cadeia pesada Fab") e no domínio VL e CL da cadeia leve (a "cadeia leve Fab") de uma imunoglobulina.

[00086] Por uma molécula Fab "cruzada" (também denominada

"Crossfab") entende-se uma molécula Fab em que os domínios variáveis ou os domínios constantes da cadeia pesada e leve Fab são trocados (ou seja, substituídos um pelo outro), ou seja, a molécula Fab cruzada compreende uma cadeia peptídica composta pelo domínio variável da cadeia leve VL e pelo domínio constante da cadeia pesada 1 CH1 (VL-CH1, na direção do terminal Npara C), e uma cadeia peptídica composta pelo domínio variável da cadeia pesada VH e domínio constante da cadeia leve CL (VH-CL, na direção do terminal N para C). Para maior clareza, em uma molécula Fab cruzada em que os domínios variáveis da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são trocados, a cadeia peptídica que compreende o domínio constante da cadeia pesada 1 CH1 é referida neste documento como a "cadeia pesada" da molécula Fab (cruzada). Por outro lado, em uma molécula Fab cruzada em que os domínios constantes da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são trocados, a cadeia peptídica que compreende o domínio variável da cadeia pesada VH é referida neste documento como a "cadeia pesada" da molécula Fab (cruzada).

[00087] Em contraste com isso, por uma molécula Fab "convencional" entende-se uma molécula Fab em seu formato natural, isto é, compreendendo uma cadeia pesada composta pelos domínios variável e constante da cadeia pesada (VH-CH1, na direção do terminal N para C), e uma cadeia leve composta pelos domínios variável e constante da cadeia leve (VL- CL, na direção do terminal N para C).

[00088] O termo "domínio Fc" ou "região Fc" neste documento é usado para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina que contém pelo menos uma porção da região constante. O termo inclui regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Em um aspecto, uma região Fc da cadeia pesada de IgG humana se estende de Cys226, ou de Pro230, até o terminal carboxila da cadeia pesada. No entanto, os anticorpos produzidos por células hospedeiras podem sofrer clivagem pós-

traducionais de um ou mais, particularmente um ou dois, aminoácidos do C-

terminal da cadeia pesada.

Portanto, um anticorpo produzido por uma célula hospedeira pela expressão de uma molécula de ácido nucleico específica que codifica uma cadeia pesada de comprimento total pode incluir a cadeia pesada de comprimento total ou pode incluir uma variante clivada da cadeia pesada de comprimento total.

Este pode ser o caso em que os dois aminoácidos C-

terminais finais da cadeia pesada são glicina (G446) e lisina (K447, numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Portanto, a lisina C-terminal (Lys447), ou a glicina C-terminal (Gly446) e lisina (Lys447), da região Fc, podem ou não estar presentes.

As sequências de aminoácidos das cadeias pesadas incluindo uma região Fc (ou uma subunidade de um domínio Fc, conforme definido neste documento) são denotadas neste documento sem o dipeptídeo de glicina-lisina

C-terminal, se não indicado de outra forma.

Em um aspecto, uma cadeia pesada incluindo uma região Fc (subunidade), conforme especificado neste documento, compreendida em um anticorpo de acordo com a invenção,

compreende um dipeptídeo de glicina-lisina C-terminal adicional (G446 e K447,

numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Em um aspecto, uma cadeia pesada incluindo uma região Fc (subunidade), conforme especificado neste documento, compreendida em um anticorpo de acordo com a invenção,

compreende um resíduo de glicina C-terminal adicional (G446, numeração de acordo com o índice EU de Kabat). A menos que especificado de outra forma neste documento, a numeração de resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante está de acordo com o sistema de numeração EU, também chamado de índice EU, conforme descrito em Kabat et al., Sequences of

Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed.

Public Health Service, National

Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991 (vide também acima). Uma "subunidade" de um domínio Fc, conforme usado neste documento, refere-se a um dos dois polipeptídeos que formam o domínio Fc dimérico, ou seja, um polipeptídeo compreendendo regiões constantes C-terminais de uma cadeia pesada de imunoglobulina, capaz de autoassociação estável. Por exemplo, uma subunidade de um domínio Fc de IgG compreende um domínio constante CH2 de IgG e CH3 de IgG.

[00089] Por "fundido(a)" entende-se que os componentes (por exemplo, uma molécula Fab e uma subunidade do domínio Fc) são ligados por ligações peptídicas, diretamente ou por meio de um ou mais ligantes peptídicos.

[00090] O termo "multiespecífico" significa que o anticorpo é capaz de se ligar especificamente a pelo menos dois determinantes antigênicos distintos. Um anticorpo multiespecífico pode ser, por exemplo, um anticorpo biespecífico. Normalmente, um anticorpo biespecífico compreende dois sítios de ligação ao antígeno, cada um dos quais é específico para um determinante antigênico diferente. Em certos aspectos, o anticorpo multiespecífico (por exemplo, biespecífico) é capaz de ligar simultaneamente dois determinantes antigênicos, particularmente dois determinantes antigênicos expressos em duas células distintas.

[00091] O termo "valente", conforme usado neste documento, denota a presença de um número especificado de sítios de ligação ao antígeno em uma molécula de ligação ao antígeno. Como tal, o termo "ligação monovalente a um antígeno" denota a presença de um (e não mais de um) sítio de ligação ao antígeno específico para o antígeno na molécula de ligação ao antígeno.

[00092] Um "sítio de ligação ao antígeno" refere-se ao sítio, ou seja, um ou mais resíduos de aminoácidos, de uma molécula de ligação ao antígeno que fornece interação com o antígeno. Por exemplo, o sítio de ligação ao antígeno de um anticorpo compreende resíduos de aminoácidos a partir das regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Uma molécula de imunoglobulina nativa normalmente tem dois sítios de ligação ao antígeno, uma molécula Fab normalmente tem um único sítio de ligação ao antígeno.

[00093] Conforme usado neste documento, o termo "determinante antigênico" ou "antígeno" refere-se a um sítio (por exemplo, um trecho contíguo de aminoácidos ou uma configuração conformacional composta de diferentes regiões de aminoácidos não contíguos) em uma macromolécula polipeptídica à qual um domínio de ligação ao antígeno se liga, formando um complexo de domínio de ligação ao antígeno-antígeno. Determinantes antigênicos úteis podem ser encontrados, por exemplo, nas superfícies de células tumorais, nas superfícies de células infectadas por vírus, nas superfícies de outras células doentes, na superfície de células imunes, livres no soro sanguíneo, e/ou na matriz extracelular (ECM). Em um aspecto preferido, o antígeno é uma proteína humana.

[00094] "CD3" refere-se a qualquer CD3 nativo de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos, tais como primatas (por exemplo, humanos), primatas não humanos (por exemplo, macacos cynomolgus) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra forma. O termo abrange CD3 não processado de "comprimento total", bem como qualquer forma de CD3 que resulte do processamento na célula. O termo também abrange variantes de ocorrência natural de CD3, por exemplo, variantes de splicing ou variantes alélicas. Em um aspecto, CD3 é CD3 humano, particularmente a subunidade épsilon de CD3 humano (CD3ε). A sequência de aminoácidos de CD3ε humano é mostrada na SEQ ID NO: 112 (sem peptídeo sinal). Vide também UniProt (www.uniprot.org) nº de acesso.

P07766 (versão 189) ou NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_000724.1.

Em outro aspecto, CD3 é CD3 de cynomolgus (Macaca fascicularis), particularmente CD3ɛ de cynomolgus. A sequência de aminoácidos de CD3ε de cynomolgus é mostrada na SEQ ID NO: 113 (sem peptídeo sinal). Vide também NCBI GenBank nº BAB71849.1. Em certos aspectos, o anticorpo da invenção se liga a um epítopo de CD3 que é conservado entre os antígenos CD3 de diferentes espécies, particularmente CD3 humano e de cynomolgus.

Em aspectos preferidos, o anticorpo se liga a CD3 humano.

[00095] Um "antígeno de célula alvo", conforme usado neste documento, refere-se a um determinante antigênico apresentado na superfície de uma célula alvo, por exemplo, uma célula em um tumor, tal como uma célula cancerosa ou uma célula do estroma tumoral (nesse caso, um "antígeno de célula tumoral”). De preferência, o antígeno de célula alvo não é CD3 e/ou é expresso em uma célula diferente de CD3. Em um aspecto preferido, o antígeno de célula alvo é TYRP-1, particularmente TYRP-1 humano. Em outro aspecto preferido, o antígeno de célula alvo é EGFRvIII, particularmente EGFRvIII humano.

[00096] “TYRP1” ou “TYRP-1” significa proteína relacionada à tirosina 1, que é uma enzima envolvida na síntese de melanina. A forma madura de TYRP1, também originalmente chamada de gp75, é uma glicoproteína transmembranar de 75 kDa. A sequência de TYRP1 humano é mostrada na SEQ ID NO: 114 (sem peptídeo sinal). Vide também a entrada UniProt nº P17643 (versão 185). "TYRP1", conforme usado neste documento, refere-se a qualquer TYRP1 nativo de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos, tais como primatas (por exemplo, humanos), primatas não humanos (por exemplo, macacos cynomolgus) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra forma. O termo abrange TYRP1 não processado de "comprimento total", bem como qualquer forma de TYRP1 que resulte do processamento na célula. O termo também abrange variantes de ocorrência natural de TYRP1, por exemplo, variantes de splicing ou variantes alélicas. Em um aspecto, TYRP1 é TYRP1 humano.

[00097] “EGFRvIII” significa Variante III do Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico, que é um mutante de EGFR, formado por uma deleção do quadro de leitura dos éxons 2-7, levando à deleção de 267 aminoácidos com uma substituição de glicina na junção. A sequência de EGFRvIII humano é mostrada na SEQ ID NO: 115 (sem peptídeo sinal). A sequência de EGFR humano de tipo selvagem é mostrada na SEQ ID NO: 116 (sem peptídeo sinal). Vide também a entrada UniProt nº P00533 (versão 258).

"EGFRvIII", conforme usado neste documento, refere-se a qualquer EGFRvIII nativo de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos, tais como primatas (por exemplo, humanos), primatas não humanos (por exemplo, macacos cynomolgus) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra forma. O termo abrange EGFRvIII não processado de "comprimento total" (mas não EGFR do tipo selvagem), bem como qualquer forma de EGFRvIII que resulte do processamento na célula (por exemplo, EGFRvIII sem peptídeo sinal). Em um aspecto, EGFRvIII é EGFRvIII humano.

[00098] "Afinidade" refere-se à força da soma total de interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A menos que indicado de outra forma, conforme usado neste documento, "afinidade de ligação" refere-se à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, um anticorpo e um antígeno). A afinidade de uma molécula X por seu parceiro Y geralmente pode ser representada pela constante de dissociação (KD). A afinidade pode ser medida por métodos bem estabelecidos conhecidos na técnica, incluindo aqueles descritos neste documento. Um método preferido para medir a afinidade é a ressonância de plásmon de superfície (SPR).

[00099] Um anticorpo "amadurecido por afinidade" refere-se a um anticorpo com uma ou mais alterações em uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs), em comparação com um anticorpo parental que não possui tais alterações, tais alterações resultando em uma melhoria na afinidade do anticorpo para o antígeno.

[000100] "Ligação reduzida", por exemplo, ligação reduzida a um receptor Fc, refere-se a uma diminuição na afinidade para a respectiva interação, conforme medido, por exemplo, por SPR. Para maior clareza, o termo também inclui a redução da afinidade a zero (ou abaixo do limite de detecção do método analítico), ou seja, a abolição completa da interação. Por outro lado, "ligação aumentada" refere-se a um aumento na afinidade de ligação para a respectiva interação.

[000101] "Ativação de células T", conforme usado neste documento, refere-se a uma ou mais respostas celulares de um linfócito T, particularmente um linfócito T citotóxico, selecionado a partir de: proliferação, diferenciação, secreção de citocina, liberação de molécula efetora citotóxica, atividade citotóxica e expressão de marcadores de ativação. Ensaios adequados para medir a ativação de células T são conhecidos na técnica e descritos neste documento.

[000102] Uma "modificação que promove a associação da primeira e da segunda subunidade do domínio Fc" é uma manipulação da espinha dorsal do peptídeo ou as modificações pós-traducionais de uma subunidade do domínio Fc que reduzem ou evitam a associação de um polipeptídeo compreendendo a subunidade do domínio Fc com um polipeptídeo idêntico para formar um homodímero. Uma modificação que promove a associação, conforme usado neste documento, preferencialmente inclui modificações separadas feitas em cada uma das duas subunidades do domínio Fc desejadas para associar (ou seja, a primeira e a segunda subunidade do domínio Fc), em que as modificações são complementares entre si, de modo a promover a associação das duas subunidades do domínio Fc. Por exemplo, uma modificação que promove a associação pode alterar a estrutura ou carga de uma ou ambas as subunidades do domínio Fc de modo a tornar a sua associação estericamente ou eletrostaticamente favorável, respectivamente.

Assim, a (hetero)dimerização ocorre entre um polipeptídeo compreendendo a primeira subunidade do domínio Fc e um polipeptídeo compreendendo a segunda subunidade do domínio Fc, que pode ser não idêntico no sentido de que outros componentes fundidos a cada uma das subunidades (por exemplo, domínios de ligação ao antígeno) não são os mesmos. Em alguns aspectos, a modificação que promove a associação da primeira e da segunda subunidade do domínio Fc compreende uma mutação de aminoácidos no domínio Fc, especificamente uma substituição de aminoácidos. Em um aspecto preferido, a modificação que promove a associação da primeira e da segunda subunidade do domínio Fc compreende uma mutação de aminoácidos separada, especificamente uma substituição de aminoácidos, em cada uma das duas subunidades do domínio Fc.

[000103] O termo "funções efetoras" refere-se às atividades biológicas atribuíveis à região Fc de um anticorpo, que variam com o isótipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem: Ligação a C1q e citotoxicidade dependente de complemento (CDC), ligação ao receptor Fc, citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC), fagocitose celular dependente de anticorpos (ADCP), secreção de citocinas, absorção de antígenos mediada por imunocomplexos por células apresentadoras de antígenos, regulação negativa de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de células B) e ativação de células B.

[000104] Um "receptor Fc de ativação" é um receptor Fc que após o acoplamento por um domínio Fc de um anticorpo desencadeia eventos de sinalização que estimulam a célula portadora do receptor a realizar funções efetoras. Os receptores Fc de ativação humana incluem FcγRIIIa (CD16a), FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32) e FcαRI (CD89).

[000105] A citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) é um mecanismo imunológico que leva à lise de células- alvo revestidas de anticorpos por células imunes efetoras. As células alvo são células às quais os anticorpos ou derivados dos mesmos compreendendo uma região Fc se ligam especificamente, geralmente através da parte da proteína que é do terminal N à região Fc. Conforme usado neste documento, o termo "ADCC reduzida" é definido como uma redução no número de células alvo que são lisadas em um determinado tempo, a uma determinada concentração de anticorpo no meio que circunda as células alvo, pelo mecanismo de ADCC definido acima, e/ou um aumento na concentração de anticorpo no meio em torno das células alvo, necessário para atingir a lise de um determinado número de células alvo em um determinado tempo, pelo mecanismo de ADCC.

A redução na ADCC é relativa à ADCC mediada pelo mesmo anticorpo produzido pelo mesmo tipo de células hospedeiras, usando os mesmos métodos padrão de produção, purificação, formulação e armazenamento (que são conhecidos pelos técnicos no assunto), mas que não foi modificado. Por exemplo, a redução em ADCC mediada por um anticorpo compreendendo em seu domínio Fc uma substituição de aminoácidos que reduz a ADCC, é relativa à ADCC mediada pelo mesmo anticorpo sem essa substituição de aminoácidos no domínio Fc. Os ensaios adequados para medir a ADCC são bem conhecidos na técnica (vide, por exemplo, publicação PCT nº WO 2006/082515 ou publicação PCT nº WO 2012/130831).

[000106] Conforme usado neste documento, os termos "modificar, modificado, modificação" são considerados como incluindo qualquer manipulação da espinha dorsal do peptídeo ou as modificações pós- traducionais de um polipeptídeo de ocorrência natural ou recombinante ou fragmento do mesmo. A modificação inclui modificações da sequência de aminoácidos, do padrão de glicosilação ou do grupo da cadeia lateral de aminoácidos individuais, bem como combinações dessas abordagens.

[000107] O termo "mutação de aminoácidos", conforme usado neste documento, pretende abranger substituições, deleções, inserções e modificações de aminoácidos. Qualquer combinação de substituição, deleção, inserção e modificação pode ser feita para chegar ao construto final, desde que o construto final possua as características desejadas, por exemplo, ligação reduzida a um receptor Fc ou associação aumentada com outro peptídeo. As deleções e inserções de sequência de aminoácidos incluem deleções e inserções de aminoácidos no terminal amino e/ou carbóxi. As mutações de aminoácidos preferidas são substituições de aminoácidos. Com o propósito de alterar, por exemplo, as características de ligação de uma região Fc, substituições não conservativas de aminoácidos, isto é, substituir um aminoácido por outro aminoácido com diferentes propriedades estruturais e/ou químicas, são particularmente preferidas. As substituições de aminoácidos incluem a substituição por aminoácidos de ocorrência não natural ou por derivados de aminoácidos de ocorrência natural dos vinte aminoácidos padrão (por exemplo, 4-hidroxiprolina, 3-metil-histidina, ornitina, homoserina, 5- hidroxilisina). As mutações de aminoácidos podem ser geradas usando métodos genéticos ou químicos bem conhecidos na técnica. Os métodos genéticos podem incluir mutagênese dirigida ao sítio, PCR, síntese de genes e similares. É contemplado que os métodos de alteração do grupo da cadeia lateral de um aminoácido por métodos diferentes da modificação genética, tais como a modificação química, também podem ser úteis. Várias designações podem ser usadas neste documento para indicar a mesma mutação de aminoácido. Por exemplo, uma substituição de prolina na posição 329 do domínio Fc para glicina pode ser indicada como 329G, G329, G 329, P329G ou Pro329Gly.

[000108] "Porcentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos" com relação a uma sequência de polipeptídeo de referência é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência de polipeptídeo de referência, após o alinhamento das sequências e introdução das lacunas, se necessário, para atingir a porcentagem máxima de identidade de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência. O alinhamento para fins de determinação do porcentual de identidade de sequência de aminoácidos pode ser alcançado de várias maneiras que estão dentro da perícia na técnica, por exemplo, usando software de computador disponível publicamente, tal como BLAST, BLAST-2, Clustal W, software Megalign (DNASTAR) ou o pacote de programas FASTA.

Os técnicos no assunto podem determinar os parâmetros apropriados para o alinhamento de sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para atingir o alinhamento máximo ao longo de todo o comprimento das sequências sendo comparadas. Alternativamente, os valores percentuais de identidade podem ser gerados usando o programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2. O programa de computador de comparação de sequência ALIGN-2 foi criado pela Genentech, Inc., e o código-fonte foi arquivado com a documentação do usuário no US Copyright Office, Washington DC, 20559, onde está registrado sob o Copyright Registration dos EUA de nº TXU510087 e é descrito em WO 2001/007611.

[000109] A menos que indicado de outra forma, para fins neste documento, os valores da % de identidade de sequência de aminoácidos são gerados usando o programa ggsearch do pacote FASTA versão 36.3.8c ou posterior com uma matriz de comparação BLOSUM50. O pacote do programa FASTA foi criado por WR Pearson e DJ Lipman (“Improved Tools for Biological Sequence Analysis”, PNAS 85 (1988) 2444-2448), WR Pearson (“Effective protein sequence comparison” Meth. Enzymol. 266 (1996) 227- 258), e Pearson et. al. (Genomics 46 (1997) 24-36) e está disponível ao público em www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml ou www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta. Alternativamente, um servidor público acessível em fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi pode ser usado para comparar as sequências, usando o programa ggsearch (proteína global:proteína) e opções padrão (BLOSUM50; abrir: -10; ext: -2; Ktup = 2) para garantir que um alinhamento global, em vez de local, seja executado. A porcentagem da identidade de aminoácidos é fornecida no cabeçalho de alinhamento de saída.

[000110] O termo "polinucleotídeo" ou "molécula de ácido nucleico" inclui qualquer composto e/ou substância que compreende um polímero de nucleotídeos. Cada nucleotídeo é composto por uma base, especificamente uma base de purina ou pirimidina (ou seja, citosina (C), guanina (G), adenina (A), timina (T) ou uracila (U)), um açúcar (ou seja, desoxirribose ou ribose) e um grupo fosfato. Frequentemente, a molécula de ácido nucleico é descrita pela sequência de bases, em que as referidas bases representam a estrutura primária (estrutura linear) de uma molécula de ácido nucleico. A sequência de bases é normalmente representada de 5' a 3'. Neste documento, o termo molécula de ácido nucleico abrange ácido desoxirribonucleico (DNA) incluindo, por exemplo, DNA complementar (cDNA) e DNA genômico, ácido ribonucleico (RNA), em particular RNA mensageiro (mRNA), formas sintéticas de DNA ou RNA e polímeros mistos compreendendo duas ou mais dessas moléculas. A molécula de ácido nucleico pode ser linear ou circular. Além disso, o termo molécula de ácido nucleico inclui fitas senso e antissenso, bem como formas de fita simples e de fita dupla. Além disso, a molécula de ácido nucleico descrita neste documento pode conter nucleotídeos de ocorrência natural ou não natural. Exemplos de nucleotídeos de ocorrência não natural incluem bases de nucleotídeos modificados com açúcares derivatizados ou ligações da espinha dorsal de fosfato ou resíduos quimicamente modificados. As moléculas de ácido nucleico também abrangem moléculas de DNA e RNA que são adequadas como um vetor para a expressão direta de um anticorpo da invenção in vitro e/ou in vivo, por exemplo, em um hospedeiro ou paciente. Tais vetores de DNA (por exemplo, cDNA) ou RNA (por exemplo, mRNA) podem ser não modificados ou modificados. Por exemplo, o mRNA pode ser modificado quimicamente para intensificar a estabilidade do vetor de RNA e/ou a expressão da molécula codificada para que o mRNA possa ser injetado em um sujeito para gerar o anticorpo in vivo (vide, por exemplo, Stadler et al. (2017) Nature Medicine 23:815-817 ou EP 2 101 823 B1).

[000111] Uma molécula de ácido nucleico "isolada" refere-se a uma molécula de ácido nucleico que foi separada de um componente de seu ambiente natural. Uma molécula de ácido nucleico isolada inclui uma molécula de ácido nucleico contida em células que normalmente contêm a molécula de ácido nucleico, mas a molécula de ácido nucleico está presente de forma extracromossômica ou em uma localização cromossômica que é diferente de sua localização cromossômica natural.

[000112] "Polinucleotídeo isolado (ou ácido nucleico) que codifica um anticorpo" refere-se a uma ou mais moléculas de polinucleotídeo que codificam cadeias pesadas e leves de anticorpo (ou fragmentos do mesmo), incluindo tais moléculas de polinucleotídeo em um único vetor ou vetores separados, e tal(is) molécula(s) de polinucleotídeo presente(s) em um ou mais locais em uma célula hospedeira.

[000113] O termo "vetor", conforme usado neste documento, refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de propagar outro ácido nucleico ao qual está ligada. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico autorreplicante, bem como o vetor incorporado no genoma de uma célula hospedeira na qual foi introduzido. Certos vetores são capazes de direcionar a expressão de ácidos nucleicos aos quais eles estão operativamente ligados. Tais vetores são referidos neste documento como “vetores de expressão”.

[000114] Os termos "célula hospedeira", "linha celular hospedeira" e "cultura de células hospedeiras" são usados indistintamente e referem-se a células nas quais o ácido nucleico exógeno foi introduzido, incluindo a progênie de tais células. As células hospedeiras incluem "transformantes" e "células transformadas", que incluem a célula transformada primária e a progênie dela derivada independentemente do número de passagens. A progênie pode não ser completamente idêntica em conteúdo de ácido nucleico a uma célula parental, mas pode conter mutações. A progênie mutante que tem a mesma função ou atividade biológica como rastreada ou selecionada na célula originalmente transformada está incluída neste documento. Uma célula hospedeira é qualquer tipo de sistema celular que pode ser usado para gerar os anticorpos da presente invenção. As células hospedeiras incluem células em cultura, por exemplo, células cultivadas de mamíferos, tais como células HEK, células CHO, células BHK, células NS0, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de camundongo P3X63, células PER, células PER.C6 ou células de hibridoma, células de levedura, células de inseto, e células vegetais, para citar apenas algumas, mas também células compreendidas em um animal transgênico, planta transgênica ou planta cultivada ou tecido animal. Em um aspecto, a célula hospedeira da invenção é uma célula eucariótica, particularmente uma célula de mamífero.

Em um aspecto, a célula hospedeira não é uma célula dentro de um corpo humano.

[000115] O termo "composição farmacêutica" ou "formulação farmacêutica" refere-se a uma preparação que está em uma forma que permite que a atividade biológica de um ingrediente ativo nela contido seja eficaz e que não contém componentes adicionais que são inaceitavelmente tóxicos para um sujeito qual a composição seria administrada.

[000116] Um "veículo farmaceuticamente aceitável" refere-se a um ingrediente em uma composição ou formulação farmacêutica, diferente de um ingrediente ativo, que não é tóxico para um sujeito. Um veículo farmaceuticamente aceitável inclui, mas não está limitado a, um tampão, excipiente, estabilizador ou conservante.

[000117] Conforme usado neste documento, "tratamento" (e suas variações gramaticais, tais como "tratar" ou "tratando") refere-se à intervenção clínica na tentativa de alterar o curso natural de uma doença no indivíduo a ser tratado e pode ser realizado para profilaxia ou durante o curso de patologia clínica. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem, mas não estão limitados a, prevenção da ocorrência ou recorrência da doença, alívio dos sintomas, diminuição de quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, prevenção da metástase, diminuição da taxa de progressão da doença, melhoria ou paliação do estado da doença e remissão ou melhor prognóstico. Em alguns aspectos, os anticorpos da invenção são usados para atrasar o desenvolvimento de uma doença ou para retardar a progressão de uma doença.

[000118] Um “indivíduo” ou “sujeito” é um mamífero. Os mamíferos incluem, mas não estão limitados a, animais domesticados (por exemplo, vacas, ovelhas, gatos, cães e cavalos), primatas (por exemplo, humanos e primatas não humanos, tais como macacos), coelhos e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Em certos aspectos, o paciente ou indivíduo é um humano.

[000119] Uma "quantidade eficaz" de um agente, por exemplo, uma composição farmacêutica, refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para atingir o resultado terapêutico ou profilático desejado.

[000120] O termo "bula" é usado para referir-se a instruções normalmente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, terapia combinada, contra-indicações e/ou advertências relativas ao uso de tais produtos terapêuticos.

II. COMPOSIÇÕES E MÉTODOS

[000121] A invenção fornece anticorpos que se ligam a CD3, incluindo anticorpos multiespecíficos que se ligam a CD3 e um segundo antígeno. Os anticorpos mostram estabilidade superior, combinada com outras propriedades favoráveis para aplicação terapêutica, por exemplo, no que diz respeito à eficácia e segurança, farmacocinética, bem como capacidade de produção. Os anticorpos da invenção são úteis, por exemplo, para o tratamento de doenças, tais como o câncer.

A. ANTICORPOS ANTI-CD3

[000122] Em um aspecto, a invenção fornece anticorpos que se ligam a CD3. Em um aspecto, são fornecidos anticorpos isolados que se ligam a CD3. Em um aspecto, a invenção fornece anticorpos que se ligam especificamente a CD3. Em certos aspectos, os anticorpos anti-CD3 retêm mais do que cerca de 90% da atividade de ligação a CD3 após 2 semanas a pH 7,4, 37 °C, em relação à atividade de ligação após 2 semanas a pH 6, -80 °C, conforme determinado por ressonância de plásmon de superfície (SPR).

[000123] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que se liga a CD3, em que o anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno, compreendendo uma região variável da cadeia pesada (VH) que compreende uma região determinante de complementaridade da cadeia pesada (HCDR) 1 da SEQ ID NO: 2, uma HCDR 2 da SEQ ID NO: 3 e uma HCDR 3 da SEQ ID NO: 5, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade da cadeia leve (LCDR) 1 da SEQ ID NO: 8, uma LCDR 2 da SEQ ID NO: 9 e uma LCDR 3 da SEQ ID NO: 10.

[000124] Em um aspecto, o anticorpo é um anticorpo humanizado. Em um aspecto, o domínio de ligação ao antígeno é um domínio de ligação ao antígeno humanizado (ou seja, um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo humanizado). Em um aspecto, o VH e/ou o VL é uma região variável humanizada.

[000125] Em um aspecto, o VH e/ou o VL compreende um framework aceitador humano, por exemplo, um framework de imunoglobulina humana ou um framework de consenso humano.

[000126] Em um aspecto, o VH compreende uma ou mais sequências de framework da cadeia pesada (isto é, a sequêncida de FR1, FR2, FR3 e/ou FR4) da sequência da região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 7. Em um aspecto, o VH compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7. Em um aspecto, o VH compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7. Em um aspecto, o VH compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 98% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7. Em certos aspectos, uma sequência VH tendo pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservativas), inserções ou deleções em relação à sequência de referência, mas um anticorpo compreendendo essa sequência retém a capacidade de se ligar a CD3. Em certos aspectos, um total de 1 a 10 aminoácidos foram substituídos, inseridos e/ou deletados na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7. Em certos aspectos, as substituições, inserções ou deleções ocorrem em regiões fora das CDRs (ou seja, nos FRs). Em um aspecto, o VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7. Opcionalmente, o VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7, incluindo modificações pós-traducionais dessa sequência.

[000127] Em um aspecto, o VL compreende uma ou mais sequências de framework da cadeia leve (isto é, a sequêncida de FR1, FR2, FR3 e/ou FR4) da sequência de região variável da cadeia leve da SEQ ID NO:

11. Em um aspecto, o VL compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11. Em um aspecto, o VL compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11. Em um aspecto, o VL compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 98% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11. Em certos aspectos, uma sequência VL tendo pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservativas), inserções ou deleções em relação à sequência de referência, mas um anticorpo compreendendo essa sequência retém a capacidade de se ligar a CD3. Em certos aspectos, um total de 1 a 10 aminoácidos foram substituídos, inseridos e/ou deletados na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11. Em certos aspectos, as substituições, inserções ou deleções ocorrem em regiões fora das CDRs (ou seja, nos FRs). Em um aspecto, o VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11. Opcionalmente, o VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, incluindo modificações pós-traducionais dessa sequência.

[000128] Em um aspecto, o VH compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%

idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7, e o VL compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11. Em um aspecto, o VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e o VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11.

[000129] Em um outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo que se liga a CD3, em que o anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno compreendendo um VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7, e um VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11.

[000130] Em um outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo que se liga a CD3, em que o anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno compreendendo uma sequência de VH da SEQ ID NO: 7 e uma sequência de VL da SEQ ID NO: 11.

[000131] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo que se liga a CD3, em que o anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno compreendendo um VH compreendendo as sequências de CDR da cadeia pesada do VH da SEQ ID NO: 7, e um VL compreendendo as sequências de CDR da cadeia leve do VL da SEQ ID NO: 11.

[000132] Em um outro aspecto, o primeiro domínio de ligação ao antígeno compreende as sequências de aminoácidos de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 do VH da SEQ ID NO: 7 e as sequências de aminoácidos de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 do VL da SEQ ID NO: 11.

[000133] Em um aspecto, o VH compreende as sequências de CDR da cadeia pesada do VH da SEQ ID NO: 7 e um framework de pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de framework do VH da SEQ ID NO: 7. Em um aspecto, o VH compreende as sequências de CDR da cadeia pesada do VH da SEQ ID NO: 7 e um framework de pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de framework do VH da SEQ ID NO: 7. Em outro aspecto, o VH compreende as sequências de CDR da cadeia pesada do VH da SEQ ID NO: 7 e um framework de pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência de framework do VH da SEQ ID NO: 7.

[000134] Em um aspecto, o VL compreende as sequências de CDR da cadeia leve do VL da SEQ ID NO: 11 e umaframework de pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de framework do VL da SEQ ID NO: 11. Em um aspecto, o VL compreende as sequências de CDR da cadeia leve do VL da SEQ ID NO: 11 e um framework de pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de framework do VL da SEQ ID NO: 11. Em outro aspecto, o VL compreende as sequências de CDR da cadeia leve do VL da SEQ ID NO: 11 e um framework de pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência de framework do VL da SEQ ID NO: 11.

[000135] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que se liga a CD3, em que o anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno compreendendo uma sequência de VH, como em qualquer um dos aspectos fornecidos acima, e uma sequência de VL, como em qualquer um dos aspectos fornecidos acima.

[000136] Em um aspecto, o anticorpo compreende uma região constante humana. Em um aspecto, o anticorpo é uma molécula de imunoglobulina compreendendo uma região constante humana, particularmente uma molécula de imunoglobulina da classe IgG compreendendo um domínio CH1, CH2, CH3 e/ou CL humano. Sequências exemplares de domínios constantes humanos são dadas nas SEQ ID NOs 120 e 121 (domínios CL humanos de kappa e lambda, respectivamente) e SEQ ID NO: 122 (domínios constantes da cadeia pesada de IgG1 humana CH1-CH2-

CH3). Em um aspecto, o anticorpo compreende uma região constante da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 120 ou SEQ ID NO: 121, particularmente a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 120. Em um aspecto, o anticorpo compreende uma região constante da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 122.

Particularmente, a região constante da cadeia pesada pode compreender mutações de aminoácidos no domínio Fc conforme descrito neste documento.

[000137] Em um aspecto, o primeiro domínio de ligação ao antígeno compreende uma região constante humana. Em um aspecto, a primeira fração de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região constante humana, particularmente um domínio CH1 e/ou CL humano. Em um aspecto, o primeiro domínio de ligação ao antígeno compreende uma região constante da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 120 ou SEQ ID NO: 121, particularmente a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:

120. Particularmente, a região constante da cadeia leve pode compreender mutações de aminoácidos, conforme descrito neste documento em "modificações de carga" e/ou pode compreender deleção ou substituições de um ou mais (particularmente dois) aminoácidos N terminais se em uma molécula Fab cruzada. Em alguns aspectos, o primeiro domínio de ligação ao antígeno compreende uma região constante da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência do domínio CH1 compreendida na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 122. Particularmente, a região constante da cadeia pesada (especificamente domínio CH1) pode compreender mutações de aminoácidos, conforme descrito neste documento em "modificações de carga".

[000138] Em um aspecto, o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

[000139] Em um aspecto, o anticorpo é um anticorpo de IgG, particularmente, IgG1. Em um aspecto, o anticorpo é um anticorpo de comprimento total.

[000140] Em outro aspecto, o anticorpo é um fragmento de anticorpo selecionado a partir do grupo de uma molécula Fv, uma molécula scFv, uma molécula Fab e uma molécula F(ab')2; particularmente uma molécula Fab. Em outro aspecto, o fragmento de anticorpo é um diacorpo, um triacorpo ou um tetracorpo.

[000141] Em um aspecto, o primeiro domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab. Em um aspecto preferido, o primeiro domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CH1, particularmente os domínios variáveis VL e VH, da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro (ou seja, o primeiro domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab cruzada).

[000142] Em um outro aspecto, o anticorpo de acordo com qualquer um dos aspectos acima pode incorporar qualquer uma das características, isoladamente ou em combinação, conforme descrito nas seções II. A. 1.-8. abaixo.

[000143] Em um aspecto preferido, o anticorpo compreende um domínio Fc, particularmente um domínio Fc de IgG, mais particularmente um domínio Fc de IgG1. Em um aspecto, o domínio Fc é um domínio Fc humano. Em um aspecto, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG 1 humana. O domínio Fc é composto por uma primeira e uma segunda subunidade e pode incorporar qualquer uma das características, individualmente ou em combinação, descritas abaixo em relação às variantes do domínio Fc (seção II.

A. 8.).

[000144] Em outro aspecto preferido, o anticorpo compreende um segundo e opcionalmente um terceiro domínio de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno (isto é, o anticorpo é um anticorpo multiespecífico, como descrito adicionalmente abaixo (seção II. A. 7.).

1. FRAGMENTOS DE ANTICORPO

[000145] Em certos aspectos, um anticorpo fornecido neste documento é um fragmento de anticorpo.

[000146] Em um aspecto, o fragmento de anticorpo é uma molécula Fab, Fab', Fab'-SH ou F(ab')2, em particular uma molécula Fab conforme descrito neste documento. "Molécula Fab '" difere das moléculas Fab pela adição de resíduos no terminal carbóxi do domínio CH1 incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab'-SH são moléculas Fab' em que o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes carrega(m) um grupo tiol livre. O tratamento com pepsina produz uma molécula F(ab') 2 que possui dois sítios de ligação ao antígeno (duas moléculas Fab) e uma parte da região Fc.

[000147] Em outro aspecto, o fragmento de anticorpo é um diacorpo, um triacorpo ou um tetracorpo. “Diacorpos” são fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação ao antígeno que podem ser bivalentes ou biespecíficos. VIde, por exemplo, EP 404.097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003); e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Triacorpos e tetracorpos também são descritos em Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003).

[000148] Em um aspecto adicional, o fragmento de anticorpo é uma molécula Fab de cadeia simples. Uma "molécula Fab de cadeia simples" ou "scFab" é um polipeptídeo que consiste em um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo (VH), um domínio constante da cadeia pesada de anticorpo 1 (CH1), um domínio variável da cadeia leve de anticorpo (VL), um domínio constante da cadeia leve de anticorpo (CL) e um ligante, em que os referidos domínios de anticorpo e o referido ligante têm uma das seguintes ordens na direção do terminal N para o terminal C: a) VH-CH1-ligante-VL-CL, b) VL-CL-ligante-VH-CH1, c) VH-CL-ligante-VL-CH1 ou d) VL-CH1-ligante-VH-CL.

Em particular, o referido ligante é um polipeptídeo de pelo menos 30 aminoácidos, de preferência entre 32 e 50 aminoácidos. As referidas moléculas Fab de cadeia simples são estabilizadas através da ligação dissulfeto natural entre o domínio CL e o domínio CH1. Além disso, essas moléculas Fab de cadeia simples podem ser ainda mais estabilizadas pela geração de ligações dissulfeto intercadeia por meio da inserção de resíduos de cisteína (por exemplo, posição 44 na cadeia pesada variável e posição 100 na cadeia leve variável de acordo com a numeração de Kabat).

[000149] Em outro aspecto, o fragmento de anticorpo é um fragmento variável de cadeia simples (scFv). Um "fragmento variável de cadeia única" ou "scFv" é uma proteína de fusão dos domínios variáveis das cadeias pesada (VH) e leve (VL) de um anticorpo, conectada por um ligante. Em particular, o ligante é um polipeptídeo curto de 10 a 25 aminoácidos e é geralmente rico em glicina para flexibilidade, bem como serina ou treonina para solubilidade, e pode conectar o terminal de VH com o terminal C do VL, ou vice-versa. Essa proteína retém a especificidade do anticorpo original, apesar da remoção das regiões constantes e da introdução do ligante. Para uma revisão dos fragmentos scFv, vide, por exemplo, Plückthun, em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., (Springer-Verlag, Nova York), pp. 269-315 (1994); vide também WO 93/16185;

e Patentes dos EUA de nºs 5.571.894 e 5.587.458.

[000150] Em outro aspecto, o fragmento de anticorpo é um anticorpo de domínio único. "Anticorpos de domínio único" são fragmentos de anticorpo que compreendem todo ou uma parte do domínio variável da cadeia pesada ou todo ou uma parte do domínio variável da cadeia leve de um anticorpo. Em certos aspectos, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; vide, por exemplo, Patente dos EUA de nº 6.248.516 B1).

[000151] Os fragmentos de anticorpo podem ser feitos por várias técnicas, incluindo, mas não se limitando a, digestão proteolítica de um anticorpo intacto, bem como produção recombinante por células hospedeiras recombinantes (por exemplo, E. coli), conforme descrito neste documento.

2. ANTICORPOS HUMANIZADOS

[000152] Em certos aspectos, um anticorpo fornecido neste documento é um anticorpo humanizado. Normalmente, um anticorpo não humano é humanizado para reduzir a imunogenicidade para humanos, enquanto retém a especificidade e afinidade do anticorpo não humano parental.

Geralmente, um anticorpo humanizado compreende um ou mais domínios variáveis nos quais as CDRs (ou porções das mesmas) são derivadas de um anticorpo não humano e os FRs (ou porções dos mesmos) são derivados de sequências de anticorpos humanos. Um anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante humana. Em alguns aspectos, alguns resíduos de FR em um anticorpo humanizado são substituídos por resíduos correspondentes de um anticorpo não humano (por exemplo, o anticorpo a partir do qual os resíduos de CDR são derivados), por exemplo, para restaurar ou melhorar a especificidade ou afinidade do anticorpo.

[000153] Anticorpos humanizados e métodos para produzi-los são revisados, por exemplo, em Almagro e Fransson, Front. Biosci. 13:1619- 1633 (2008), e são adicionalmente descritos, por exemplo, em Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); Patentes dos EUA de nºs 5.821.337, 7.527.791,

6.982.321 e 7.087.409; Kashmiri et al., Methods 36: 25-34 (2005) (descrevendo enxerto de região determinante de especificidade (SDR)); Padlan, Mol.

Immunol. 28: 489-498 (1991) (descrevendo “recapeamento”); Dall’Acqua et al., Methods 36: 43-60 (2005) (descrevendo “embaralhamento de FR”); e Osbourn et al., Methods 36: 61-68 (2005) e Klimka et al., Br. J. Cancer, 83: 252-260 (2000) (descrevendo a abordagem de "seleção guiada" para embaralhamento de FR).

[000154] As regiões estruturais humanas que podem ser usadas para humanização incluem, mas não estão limitadas a: regiões estruturais selecionadas usando o método de “melhor ajuste” (vide, por exemplo, Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993)); regiões estruturais derivadas da sequência de consenso de anticorpos humanos de um subgrupo particular de regiões variáveis de cadeia leve ou pesada (vide, por exemplo, Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); e Presta et. al., J.

Immunol., 151:2623 (1993)); regiões estruturais maduras (mutadas somaticamente) humanas ou regiões estruturais da linhagem germinativa humana (vide, por exemplo, Almagro e Fransson, Front. Biosci., 13:1619-1633 (2008)); e regiões estruturais derivadas da triagem de bibliotecas de FR (vide, por exemplo, Baca et al., J. Biol. Chem., 272:10678-10684 (1997) e Rosok et al., J. Biol. Chem., 271:22611-22618 (1996)).

3. VARIANTES DE GLICOSILAÇÃO

[000155] Em certos aspectos, um anticorpo fornecido neste documento é alterado para aumentar ou diminuir a extensão em que o anticorpo é glicosilado. A adição ou deleção de sítios de glicosilação a um anticorpo pode ser convenientemente realizada alterando a sequência de aminoácidos de tal modo que um ou mais sítios de glicosilação sejam criados ou removidos.

[000156] Quando o anticorpo compreende uma região Fc, o oligossacarídeo a ela ligado pode ser alterado. Os anticorpos nativos produzidos por células de mamíferos normalmente compreendem um oligossacarídeo biantenário ramificado que é geralmente ligado por uma ligação N a Asn297 do domínio CH2 da região Fc. Vide, por exemplo, Wright et al., TIBTECH, 15:26-32 (1997). O oligossacarídeo pode incluir vários carboidratos, por exemplo, manose, N-acetil-glucosamina (GlcNAc), galactose e ácido siálico, bem como uma fucose ligada a uma GlcNAc na "haste" da estrutura do oligossacarídeo biantenário. Em alguns aspectos, as modificações do oligossacarídeo em um anticorpo da invenção podem ser feitas a fim de criar variantes de anticorpo com certas propriedades melhoradas.

[000157] Em um aspecto, as variantes de anticorpo são fornecidas com um oligossacarídeo não fucosilado, isto é, uma estrutura de oligossacarídeo que não tem fucose ligada (direta ou indiretamente) a uma região Fc. Tal oligossacarídeo não fucosilado (também referido como oligossacarídeo "afucosilado") é particularmente um oligossacarídeo ligado a N que não possui um resíduo de fucose ligado ao primeiro GlcNAc na haste da estrutura do oligossacarídeo biantenário. Em um aspecto, as variantes do anticorpo são fornecidas com uma proporção aumentada de oligossacarídeos não fucosilados na região Fc em comparação com um anticorpo nativo ou parental. Por exemplo, a proporção de oligossacarídeos não fucosilados pode ser pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 80% ou mesmo cerca de 100% (ou seja, nenhum oligossacarídeo fucosilado está presente). A porcentagem de oligossacarídeos não fucosilados é a quantidade (média) de oligossacarídeos sem resíduos de fucose, em relação à soma de todos os oligossacarídeos ligados a Asn 297 (por exemplo, estruturas complexas, híbridas e de alta manose) conforme medido por espectrometria de massa MALDI-TOF, como descrito em WO 2006/082515, por exemplo. Asn297 refere-se ao resíduo de asparagina localizado próximo da posição 297 na região Fc (numeração EU dos resíduos da região Fc); no entanto, Asn297 também pode estar localizado a cerca de ± 3 aminoácidos a montante ou a jusante da posição 297, ou seja, entre as posições 294 e 300, devido a pequenas variações de sequência em anticorpos.

Tais anticorpos com uma proporção aumentada de oligossacarídeos não fucosilados na região Fc podem ter uma ligação ao receptor FcγRIIIa melhorada e/ou função efetora melhorada, em particular função ADCC melhorada. Vide, por exemplo, US 2003/0157108; US 2004/0093621.

[000158] Exemplos de linhagens celulares capazes de produzir anticorpos com fucosilação reduzida incluem células Lec13 CHO deficientes em fucosilação de proteína (Ripka et al.,Arch. Biochem. Biophys.

249:533-545 (1986); US 2003/0157108; e WO 2004/056312, especialmente no Exemplo 11), e linhagens celulares nocaute, tais como gene alfa-1,6- fucosiltransferase, FUT8, células CHO nocaute (vide, por exemplo, Yamane- Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87:614-622 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol.

Bioeng., 94 (4):680-688 (2006); e WO 2003/085107), ou células com atividade reduzida ou abolida de uma síntese de GDP-fucose ou proteína transportadora (vide, por exemplo, US2004259150, US2005031613, US2004132140, US2004110282).

[000159] Em um aspecto adicional, as variantes de anticorpo são fornecidas com oligossacarídeos bissetados, por exemplo, em que um oligossacarídeo biantenário ligado à região Fc do anticorpo é bissectado por GlcNAc. Tais variantes de anticorpo podem ter fucosilação reduzida e/ou função ADCC melhorada como descrito acima. Exemplos de tais variantes de anticorpos são descritos, por exemplo, em Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999); Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006); WO 99/54342; WO 2004/065540, WO 2003/011878.

[000160] Variantes de anticorpo com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo ligado à região Fc também são fornecidas.

Tais variantes de anticorpos podem ter uma função CDC aprimorada. Tais variantes de anticorpo são descritas, por exemplo, no documento WO 1997/30087; WO 1998/58964; e WO 1999/22764.

4. VARIANTES DE ANTICORPO MANIPULADAS COM CISTEÍNA

[000161] Em certos aspectos, pode ser desejável criar anticorpos modificados com cisteína, por exemplo, anticorpos THIOMABTM, nos quais um ou mais resíduos de um anticorpo são substituídos por resíduos de cisteína. Em aspectos preferidos, os resíduos substituídos ocorrem em sítios acessíveis do anticorpo. Ao substituir esses resíduos por cisteína, os grupos tiol reativos são posicionados em sítios acessíveis do anticorpo e podem ser usados para conjugar o anticorpo a outras frações, tais como frações de fármaco ou frações de ligante-fármaco, para criar um imunoconjugado, conforme descrito mais adiante neste documento. Os anticorpos manipulados com cisteína podem ser gerados conforme descrito, por exemplo, nas Patentes dos EUA de nº 7.521.541, 8.30.930, 7.855.275, 9.000.130, ou em WO

2016040856.

5. DERIVADOS DE ANTICORPO

[000162] Em certos aspectos, um anticorpo fornecido neste documento pode ser modificado adicionalmente para conter frações não proteicas adicionais que são conhecidas na técnica e prontamente disponíveis.

As frações adequadas para derivatização do anticorpo incluem, mas não estão limitadas a, polímeros solúveis em água. Exemplos não limitantes de polímeros solúveis em água incluem, mas não estão limitados a, polietilenoglicol (PEG),

copolímeros de etilenoglicol/propilenoglicol, carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anidrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros ou copolímeros aleatórios) e dextrano ou poli(n-vinil pirrolidona)polietilenoglicol, homopolímeros de propropilenoglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol), álcool polivinílico e misturas dos mesmos. O polietilenoglicol propionaldeído pode apresentar vantagens na fabricação devido à sua estabilidade em água.

O polímero pode ter qualquer peso molecular e pode ser ramificado ou não ramificado. O número de polímeros ligados ao anticorpo pode variar, e se mais de um polímero estiver ligado, eles podem ser moléculas iguais ou diferentes.

Em geral, o número e/ou tipo de polímeros usados para derivatização pode ser determinado com base em considerações, incluindo, mas não se limitando a, as propriedades ou funções particulares do anticorpo a serem melhoradas, se o derivado de anticorpo será usado em uma terapia sob condições definidas, etc.

6. IMUNOCONJUGADOS

[000163] A invenção também fornece imunoconjugados compreendendo um anticorpo anti-CD3 conjugado neste documento (quimicamente ligado) a um ou mais agentes terapêuticos, tais como agentes citotóxicos, agentes quimioterápicos, fármacos, agentes inibidores de crescimento, toxinas (por exemplo, toxinas de proteínas, toxinas enzimaticamente ativas de bactérias, origem fúngica, vegetal ou animal, ou fragmentos das mesmas) ou isótopos radioativos.

[000164] Em um aspecto, um imunoconjugado é um conjugado anticorpo-fármaco (ADC) no qual um anticorpo é conjugado a um ou mais dos agentes terapêuticos mencionados acima. O anticorpo é normalmente conectado a um ou mais dos agentes terapêuticos usando ligantes. Uma visão geral da tecnologia ADC, incluindo exemplos de agentes terapêuticos e fármacos e ligantes é apresentada em Pharmacol Review 68:3-19 (2016).

[000165] Em outro aspecto, um imunoconjugado compreende um anticorpo da invenção conjugado a uma toxina enzimaticamente ativa ou fragmento da mesma, incluindo, mas não se limitando a cadeia A da difteria, fragmentos ativos não vinculativos da toxina da difteria, cadeia da exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia da ricina A, cadeia da abrina A, cadeia da modecina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de dianthin, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos.

[000166] Em outro aspecto, um imunoconjugado compreende um anticorpo da invenção conjugado a um átomo radioativo para formar um radioconjugado. Uma variedade de isótopos radioativos está disponível para a produção de radioconjugados. Os exemplos incluem At 211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu. Quando o radioconjugado é usado para detecção, pode compreender um átomo radioativo para estudos cintilográficos, por exemplo Tc99m ou I123, ou um marcador de spin para imagem de ressonância magnética nuclear (NMR) (também conhecida como imagem de ressonância magnética, MRI), tal como I123, I131, In111, F19, C13, N15, O17, gadolínio, manganês ou ferro.

[000167] Conjugados de um anticorpo e agente citotóxico podem ser feitos usando uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncional, tais como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como HCl de adipimidato de dimetila), ésteres ativos (tais como suberato de disuccinimidil), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis(p- azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tais como bis-(p-

diazôniobenzoil)-etilenodiamina), di-isocianatos (tais como tolueno 2,6-di- isocianato) e compostos de flúor bis-ativos (tais como 1,5-difluoro-2, 4- dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina de ricina pode ser preparada conforme descrito em Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987). Ácido 1- isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminapenta-acético marcado com carbono 14 (MX-DTPA) é um agente quelante exemplar para a conjugação de radionuclotídeos ao anticorpo. Vide WO 94/11026. O ligante pode ser um "ligante clivável", facilitando a liberação de um fármaco citotóxico na célula. Por exemplo, um ligante lábil a ácidos, ligante sensível a peptidase, ligante fotolábil, ligante dimetílico ou ligante contendo dissulfeto (Chari et al., Cancer Res., 52:127-131 (1992); Patente dos EUA de nº 5.208.020) podem ser usados.

[000168] Os imunuoconjugados ou ADCs deste documento contemplam expressamente, mas não estão limitados a, tais conjugados preparados com reagentes de reticulação incluindo, mas não se limitando a, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC e sulfo-SMPB, e SVSB (succinimidil-(4- vinilsulfona)benzoato) que estão comercialmente disponíveis (por exemplo, da Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EUA).

7. ANTICORPOS MULTIESPECÍFICOS

[000169] Em certos aspectos, um anticorpo fornecido neste documento é um anticorpo multiespecífico, particularmente um anticorpo biespecífico. Anticorpos multiespecíficos são anticorpos monoclonais que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois determinantes antigênicos diferentes (por exemplo, duas proteínas diferentes ou dois epítopos diferentes na mesma proteína). Em certos aspectos, o anticorpo multiespecífico tem três ou mais especificidades de ligação. Em certos aspectos, uma das especificidades de ligação é para CD3 e a outra especificidade é para qualquer outro antígeno. Em certos aspectos, os anticorpos multiespecíficos podem se ligar a dois (ou mais) epítopos diferentes de CD3. Os anticorpos multiespecíficos (por exemplo, biespecíficos) também podem ser usados para localizar agentes citotóxicos ou células em células que expressam CD3. Os anticorpos multiespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpo.

[000170] As técnicas para a produção de anticorpos multiespecíficos incluem, mas não estão limitados a, coexpressão recombinante de dois pares da cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina com especificidades diferentes (vide Milstein e Cuello, Nature 305:537 (1983)) e engenharia "protuberância-em-buraco” (vide, por exemplo, Patente dos EUA de nº 5.731.168, e Atwell et al., J. Mol. Biol. 270: 26 (1997)). Os anticorpos multiespecíficos também podem ser produzidos por engenharia de efeitos de direção eletrostática para a produção de moléculas heterodiméricas Fc de anticorpos (vide, por exemplo, WO 2009/089004); reticulação de dois ou mais anticorpos ou fragmentos (vide, por exemplo, Patente dos EUA de nº 4.676.980 e Brennan et al., Science, 229:81 (1985)); usando zíperes de leucina para produzir anticorpos biespecíficos (vide, por exemplo, Kostelny et al., J.

Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) e WO 2011/034605); usando a tecnologia de cadeia leve comum para contornar o problema de pareamento incorreto da cadeia leve (vide, por exemplo, WO 98/50431); usando tecnologia de "diacorpo" para fazer fragmentos de anticorpo biespecíficos (vide, por exemplo, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); e usando dímeros Fv (sFv) de cadeia simples (vide, por exemplo, Gruber et al., J.

Immunol., 152: 5368 (1994)); e preparando anticorpos triespecíficos como descrito, por exemplo, em Tutt et al. J. Immunol. 147:60 (1991).

[000171] Anticorpos modificados com três ou mais sítios de ligação ao antígeno, incluindo, por exemplo, "anticorpos Octopus" ou DVD-Ig também estão incluídos neste documento (vide, por exemplo, WO 2001/77342 e WO 2008/024715). Outros exemplos de anticorpos multiespecíficos com três ou mais sítios de ligação ao antígeno podem ser encontrados em WO 2010/115589, WO 2010/112193, WO 2010/136172, WO 2010/145792 e WO 2013/026831. O anticorpo multiespecífico ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo também inclui um "FAb de ação dupla" ou "DAF" compreendendo um sítio de ligação ao antígeno que se liga a CD3, bem como outro antígeno diferente, ou dois epítopos diferentes de CD3 (vide, por exemplo, US 2008/0069820 e WO 2015/095539).

[000172] Os anticorpos multiespecíficos também podem ser fornecidos em uma forma assimétrica com um cruzamento de domínio em um ou mais braços de ligação da mesma especificidade de antígeno (a chamada tecnologia "CrossMab"), ou seja, trocando os domínios VH/VL (vide, por exemplo, WO 2009/080252 e WO 2015/150447), os domínios CH1/CL (vide por exemplo, WO 2009/080253) ou os braços Fab completos (vide, por exemplo, WO 2009/080251, WO 2016/016299, vide também Schaefer et al., PNAS, 108 (2011) 1187-1191, e Klein at al., MAbs 8 (2016) 1010-20). Braços Fab assimétricos também podem ser modificados pela introdução de mutações de aminoácidos carregados ou não carregados em interfaces de domínio para direcionar o emparelhamento de Fab correto. Vide, por exemplo, WO 2016/172485.

[000173] Vários outros formatos moleculares para anticorpos multiespecíficos são conhecidos na técnica e estão incluídos neste documento (vide, por exemplo, Spiess et al., Mol Immunol 67 (2015) 95-106).

[000174] Um tipo particular de anticorpos multiespecíficos, também incluído neste documento, são anticorpos biespecíficos modificados para se ligarem simultaneamente a um antígeno de superfície em uma célula alvo, por exemplo, uma célula tumoral, e a um componente invariante de ativação do complexo receptor de células T (TCR), tal como CD3, para redirecionamento de células T para matar células alvo. Portanto, em aspectos preferidos, um anticorpo fornecido neste documento é um anticorpo multiespecífico, particularmente um anticorpo biespecífico, em que uma das especificidades de ligação é para CD3 e a outra é para o antígeno de célula alvo.

[000175] Exemplos de formatos de anticorpos biespecíficos que podem ser úteis para este propósito incluem, mas não estão limitados a, as chamadas moléculas "BiTE" (engajador de células T biespecíficas) em que duas moléculas scFv são fundidas por um ligante flexível (vide, por exemplo, WO 2004/106381, WO 2005/061547, WO 2007/042261 e WO 2008/119567, Nagorsen e Bäuerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)); diacorpos (Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 (1996)) e derivados dos mesmos, tais como diacorpos em tandem (“TandAb”; Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-56 (1999)); moléculas "DART" (redirecionamento de afinidade dupla) que são baseadas no formato de diacorpo, mas apresentam uma ponte dissulfeto no terminal C para estabilização adicional (Johnson et al., J Mol Biol 399, 436-449 (2010)), e os chamados triomabs, que são moléculas IgG de camundongo/rato híbridas inteiras (revisado em Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)). Formatos de anticorpos biespecíficos de células T particulares incluídos neste documento são descritos em WO 2013/026833, WO 2013/026839, WO 2016/020309; Bacac et al., Oncoimmunology 5 (8) (2016) e1203498.

[000176] Os aspectos preferidos dos anticorpos multiespecíficos da presente invenção são descritos a seguir.

[000177] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que se liga a CD3, compreendendo um primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga a CD3, conforme descrito neste documento, e compreendendo um segundo e opcionalmente um terceiro domínio de ligação a antígeno que se ligam a um segundo antígeno.

[000178] De acordo com aspectos preferidos da invenção, os domínios de ligação ao antígeno compreendidos no anticorpo são moléculas Fab (isto é, domínios de ligação ao antígeno compostos por uma cadeia pesada e uma cadeia leve, cada um compreendendo um domínio variável e um domínio constante). Em um aspecto, o primeiro, o segundo e/ou, quando presente, o terceiro domínio de ligação ao antígeno são uma molécula Fab. Em um aspecto, a referida molécula Fab é humana. Em um aspecto preferido, a referida molécula Fab é humanizada. Em ainda outro aspecto, a referida molécula Fab compreende domínios constantes da cadeia pesada e leve humana.

[000179] De preferência, pelo menos um dos domínios de ligação ao antígeno é uma molécula Fab cruzada. Tal modificação reduz o pareamento incorreto das cadeias pesadas e leves de diferentes moléculas Fab, melhorando assim o rendimento e a pureza do anticorpo (multiespecífico) da invenção na produção recombinante. Em uma molécula Fab cruzada preferida útil para o anticorpo (multiespecífico) da invenção, os domínios variáveis da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab (VL e VH, respectivamente) são trocados. Mesmo com esta troca de domínio, no entanto, a preparação do anticorpo (multiespecífico) pode compreender certos produtos colaterais devido a uma chamada interação do tipo Bence Jones entre cadeias pesadas e leves pareadas incorretamente (vide Schaefer et al., PNAS, 108 (2011) 11187-11191). Para reduzir ainda mais o pareamento incorreto das cadeias pesadas e leves de moléculas Fab diferentes e, assim, aumentar a pureza e o rendimento do anticorpo desejado (multiespecífico), aminoácidos carregados com cargas opostas podem ser introduzidos em posições de aminoácidos específicas nos domínios CH1 e CL da molécula Fab que se liga ao primeiro antígeno (CD3), ou da(s) molécula(s) Fab que se liga(m) ao segundo antígeno (por exemplo, um antígeno de célula alvo, tal como TYRP-1 ou EGFRvIII), conforme descrito adicionalmente neste documento. As modificações de carga são feitas na(s) molécula(s) Fab convencional(is) compreendida(s) no anticorpo (multiespecífico) (tal como mostrado, por exemplo, nas Figuras 1 AC, GJ), ou na(s) molécula(s) Fab cruzadas de VH/VL compreendidas no anticorpo (multiespecífico) (tal como mostrado, por exemplo, na Figura 1 D-F, K-N) (mas não em ambas). Em aspectos preferidos, as modificações de carga são feitas na(s) molécula(s) Fab convencional(s) compreendida(s) no anticorpo (multiespecífico) (que em aspectos preferenciais se liga(m) ao segundo antígeno, por exemplo, um antígeno de célula alvo, tal como TYRP-1 ou EGFRvIII).

[000180] Em um aspecto preferido de acordo com a invenção, o anticorpo (multiespecífico) é capaz de se ligar simultaneamente ao primeiro antígeno (isto é, CD3) e ao segundo antígeno (por exemplo, um antígeno alvo, tal como TYRP-1 ou EGFRvIII). Em um aspecto, o anticorpo (multiespecífico) é capaz de reticular uma célula T e uma célula alvo por ligação simultânea a CD3 e um antígeno de célula alvo. Em um aspecto ainda mais preferido, tal ligação simultânea resulta na lise da célula alvo, particularmente uma célula tumoral que expressa um antígeno de célula alvo (por exemplo, TYRP-1 ou EGFRvIII).

Em um aspecto, essa ligação simultânea resulta na ativação da célula T. Em outros aspectos, essa ligação simultânea resulta em uma resposta celular de um linfócito T, particularmente um linfócito T citotóxico, selecionado a partir do grupo de: proliferação, diferenciação, secreção de citocina, liberação de molécula efetora citotóxica, atividade citotóxica e expressão de marcadores de ativação. Em um aspecto, a ligação do anticorpo (multiespecífico) a CD3 sem ligação simultânea ao antígeno de célula alvo não resulta na ativação da célula T.

[000181] Em um aspecto, o anticorpo (multiespecífico) é capaz de redirecionar a atividade citotóxica de uma célula T para uma célula alvo. Em um aspecto preferido, o referido redirecionamento é independente da apresentação de antígeno peptídico mediada por MHC pela célula alvo e/ou especificidade da célula T.

[000182] De preferência, uma célula T de acordo com qualquer um dos aspectos da invenção é uma célula T citotóxica. Em alguns aspectos, a célula T é uma célula T CD4+ ou CD8+, particularmente uma célula T CD8+.

a) PRIMEIRO DOMÍNIO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO

[000183] O anticorpo (multiespecífico) da invenção compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno (o primeiro domínio de ligação ao antígeno) que se liga a CD3. Em aspectos preferidos, CD3 é CD3 humano (SEQ ID NO: 112) ou CD3 de cynomolgus (SEQ ID NO: 113), mais particularmente CD3 humano. Em um aspecto, o primeiro domínio de ligação ao antígeno é reativo cruzado para (isto é, liga-se especificamente a) CD3 humano e de cynomolgus. Em alguns aspectos, CD3 é a subunidade épsilon de CD3 (CD3 épsilon).

[000184] Em um aspecto preferido, o anticorpo (multiespecífico) compreende não mais do que um domínio de ligação ao antígeno que se liga a CD3. Em um aspecto, o anticorpo (multiespecífico) fornece ligação monovalente a CD3.

[000185] Em um aspecto, o domínio de ligação ao antígeno que se liga a CD3 é um fragmento de anticorpo selecionado a partir do grupo de uma molécula Fv, uma molécula scFv, uma molécula Fab e uma molécula F(ab')2. Em um aspecto preferido, o domínio de ligação ao antígeno que se liga a CD3 é uma molécula Fab.

[000186] Em aspectos preferidos, o domínio de ligação ao antígeno que se liga a CD3 é uma molécula Fab cruzada, conforme descrito neste documento, ou seja, uma molécula Fab em que os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CH1 e CL das cadeias pesada e leve Fab são trocados/substituídos um pelo outro. Em tais aspectos, o(s) domínio(s) de ligação ao antígeno que se liga(m) ao segundo antígeno (por exemplo, um antígeno de célula alvo, tal como TYRP-1 ou EGFRvIII) é de preferência uma molécula Fab convencional. Em aspectos onde há mais de um domínio de ligação ao antígeno, particularmente molécula Fab, que se liga a um segundo antígeno compreendido no anticorpo (multiespecífico), o domínio de ligação ao antígeno que se liga a CD3 é preferencialmente uma molécula Fab cruzada e o domínio de ligação ao antígeno que se liga ao segundo antígeno é uma molécula Fab convencional.

[000187] Em aspectos alternativos, o domínio de ligação ao antígeno que se liga a CD3 é uma molécula Fab convencional. Em tais aspectos, o(s) domínio(s) de ligação ao antígeno que se liga(m) ao segundo antígeno (por exemplo, um antígeno de célula alvo, tal como TYRP-1 ou EGFRvIII) é uma molécula Fab cruzada, conforme descrito neste documento, ou seja, uma molécula Fab em que os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CH1 e CL das cadeias pesada e leve Fab são trocados/substituídos um pelo outro. Em aspectos onde há mais de um domínio de ligação ao antígeno, particularmente a molécula Fab, que se liga a CD3 compreendido no anticorpo (multiespecífico), o domínio de ligação ao antígeno que se liga ao segundo antígeno é preferencialmente uma molécula Fab cruzada e os domínios de ligação ao antígeno que se ligam a CD3 são moléculas Fab convencionais.

[000188] Em aspectos preferidos, o primeiro domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab, em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CH1, particularmente os domínios variáveis VL e VH, da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro (isto é, de acordo com tal aspecto, o primeiro domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab cruzada, em que os domínios variáveis ou constantes da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são trocados). Em um tal aspecto, o segundo (e o terceiro, se houver) domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab convencional.

[000189] Em um aspecto, não mais do que um domínio de ligação ao antígeno que se liga a CD3 está presente no anticorpo (multiespecífico) (isto é, o anticorpo fornece ligação monovalente a CD3).

b) SEGUNDO (E TERCEIRO) DOMÍNIO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO

[000190] Em certos aspectos, o anticorpo (multiespecífico) da invenção compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, particularmente uma molécula Fab, que se liga a um segundo antígeno. O segundo antígeno preferencialmente não é CD3, isto é, diferente de CD3. Em um aspecto, o segundo antígeno é um antígeno expresso em uma célula diferente de CD3 (por exemplo, expresso em uma célula diferente de uma célula T). Em um aspecto, o segundo antígeno é um antígeno de célula alvo, particularmente um antígeno de célula tumoral. Em um aspecto específico, o segundo antígeno é TYRP-1. Em outro aspecto específico, o segundo antígeno é EGFRvIII. O segundo domínio de ligação ao antígeno é capaz de direcionar o anticorpo (multiespecífico) para um sítio alvo, por exemplo, para um tipo específico de célula tumoral que expressa o segundo antígeno.

[000191] Em um aspecto, o domínio de ligação ao antígeno que se liga ao segundo antígeno é um fragmento de anticorpo selecionado a partir do grupo de uma molécula Fv, uma molécula scFv, uma molécula Fab e uma molécula F(ab')2. Em um aspecto preferido, o domínio de ligação ao antígeno que se liga ao segundo antígeno é uma molécula Fab.

[000192] Em certos aspectos, o anticorpo (multiespecífico)

compreende dois domínios de ligação ao antígeno, particularmente moléculas Fab, que se ligam ao segundo antígeno. Em um tal aspecto preferido, cada um desses domínios de ligação ao antígeno se liga ao mesmo determinante antigénico. Em um aspecto ainda mais preferido, todos esses domínios de ligação ao antígeno são idênticos, ou seja, eles têm o mesmo formato molecular (por exemplo, molécula Fab convencional ou cruzada) e compreendem as mesmas sequências de aminoácidos, incluindo as mesmas substituições de aminoácidos no domínio CH1 e CL, conforme descrito neste documento (se houver). Em um aspecto, o anticorpo (multiespecífico) compreende não mais do que dois domínios de ligação ao antígeno, particularmente moléculas Fab, que se ligam ao segundo antígeno.

[000193] Em aspectos preferidos, o(s) domínio(s) de ligação ao antígeno que se liga(m) ao segundo antígeno é(são) uma molécula Fab convencional. Em tais aspectos, o(s) domínio(s) de ligação ao antígeno que se liga(m) a CD3 é(são) uma molécula Fab cruzada, conforme descrito neste documento, ou seja, uma molécula Fab, em que os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CH1 e CL das cadeias pesada e leve Fab são trocados/substituídos um pelo outro.

[000194] Em aspectos alternativos, o(s) domínio(s) de ligação ao antígeno que se liga(m) ao segundo antígeno é(são) uma molécula Fab cruzada, conforme descrito neste documento, ou seja, uma molécula Fab em que os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CH1 e CL das cadeias pesadas e leves Fab são trocados/substituídos um pelo outro. Em tais aspectos, o(s) domínio(s) de ligação ao antígeno que se liga(m) a CD3 é(são) uma molécula Fab convencional.

[000195] Em um aspecto, o segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno compreende uma região constante humana. Em um aspecto, o segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab compreendendo uma região constante humana, particularmente um domínio CH1 e/ou CL humano.

Sequências exemplares de domínios constantes humanos são dadas nas SEQ ID NOs 120 e 121 (domínios CL humanos de kappa e lambda, respectivamente) e SEQ ID NO: 122 (domínios constantes da cadeia pesada de IgG1 humana CH1-CH2-CH3). Em um aspecto, o segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno compreende uma região constante da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 120 ou SEQ ID NO: 121, particularmente a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 120. Particularmente, a região constante da cadeia leve pode compreender mutações de aminoácidos, conforme descrito neste documento em "modificações de carga" e/ou pode compreender deleção ou substituições de um ou mais (particularmente dois) aminoácidos N terminais se em uma molécula Fab cruzada. Em alguns aspectos, o segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno compreende uma região constante da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência do domínio CH1 compreendida na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 122. Particularmente, a região constante da cadeia pesada (especificamente domínio CH1) pode compreender mutações de aminoácidos, conforme descrito neste documento em "modificações de carga".

TYRP-1

[000196] Em aspectos preferidos, o segundo antígeno é TYRP-1, particularmente TYRP-1 humano (SEQ ID NO: 114).

[000197] Em um aspecto, o segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) que compreende uma região determinante de complementaridade da cadeia pesada (HCDR) 1 da SEQ ID NO: 15, uma HCDR 2 da SEQ ID NO: 16 e uma HCDR 3 da SEQ ID NO: 17 e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade da cadeia leve (LCDR) 1 da SEQ ID NO: 19, uma LCDR 2 da SEQ ID NO: 20 e uma LCDR 3 da SEQ ID NO: 21.

[000198] Em um aspecto, o segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno é (derivado de) um anticorpo humanizado. Em um aspecto, o segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno é um domínio de ligação ao antígeno humanizado (ou seja, um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo humanizado). Em um aspecto, o VH e/ou VL do segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno é uma região variável humanizada.

[000199] Em um aspecto, o VH e/ou o VL do segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno compreende um framework aceitador humano, por exemplo, um framework de imunoglobulina humana ou um framework de consenso humano.

[000200] Em um aspecto, o VH do segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno compreende uma ou mais sequências de framework da cadeia pesada (isto é, a sequência de FR1, FR2, FR3 e/ou FR4) da SEQ ID NO: 18. Em um aspecto, o VH compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18. Em um aspecto, o VH compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18. Em um aspecto, o VH compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 98% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18. Em certos aspectos, uma sequência de VH tendo pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservativas), inserções ou deleções em relação à sequência de referência, mas um anticorpo compreendendo essa sequência retém a capacidade de se ligar a TYRP-1. Em certos aspectos, um total de 1 a 10 aminoácidos foram substituídos, inseridos e/ou deletados na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18. Em certos aspectos, as substituições, inserções ou deleções ocorrem em regiões fora das CDRs (ou seja, nos FRs). Em um aspecto, o VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18. Opcionalmente, o VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18, incluindo modificações pós-traducionais dessa sequência.

[000201] Em um aspecto, o VL do segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno compreende uma ou mais sequências de framework da cadeia leve (isto é, a sequência de FR1, FR2, FR3 e/ou FR4) da SEQ ID NO: 22. Em um aspecto, o VL compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22. Em um aspecto, o VL compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22. Em um aspecto, o VL compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 98% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22. Em certos aspectos, uma sequência de VL tendo pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservativas), inserções ou deleções em relação à sequência de referência, mas um anticorpo compreendendo essa sequência retém a capacidade de se ligar a TYRP-1. Em certos aspectos, um total de 1 a 10 aminoácidos foram substituídos, inseridos e/ou deletados na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22. Em certos aspectos, as substituições, inserções ou deleções ocorrem em regiões fora das CDRs (ou seja, nos FRs). Em um aspecto, o VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22. Opcionalmente, o

VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22, incluindo modificações pós-traducionais dessa sequência.

[000202] Em um aspecto, o VH do segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18, e o VL do segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22. Em um aspecto, o VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18 e o VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22.

[000203] Em um outro aspecto, o segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno compreende um VH que compreende a sequência da SEQ ID NO: 18 e um VL que compreende a sequência da SEQ ID NO: 22.

[000204] Em um outro aspecto, o segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno compreende uma sequência de VH da SEQ ID NO: 18 e uma sequência de VL da SEQ ID NO: 22.

[000205] Em outro aspecto, o segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno compreende um VH que compreende as sequências de CDR da cadeia pesada do VH da SEQ ID NO: 18 e um VL que compreende as sequências de CDR da cadeia leve do VL da SEQ ID NO:

22.

[000206] Em um aspecto adicional, o segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno compreende as sequências de aminoácidos de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 do VH da SEQ ID NO: 18 e as sequências de aminoácidos de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 do VL da SEQ ID NO:

22.

[000207] Em um aspecto, o VH do segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno compreende as sequências de CDR da cadeia pesada do VH da SEQ ID NO: 18 e um framework de pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de framework do VH da SEQ ID NO: 18. Em um aspecto, o VH compreende as sequências de CDR da cadeia pesada do VH da SEQ ID NO: 18 e um framework de pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de framework do VH da SEQ ID NO: 18. Em outro aspecto, o VH compreende as sequências de CDR da cadeia pesada do VH da SEQ ID NO: 18 e um framework de pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência de framework do VH da SEQ ID NO: 18.

[000208] Em um aspecto, o VL do segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno compreende as sequências de CDR da cadeia leve do VL da SEQ ID NO: 22 e um framework de pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de framework do VL da SEQ ID NO: 22. Em um aspecto, o VL compreende as sequências de CDR da cadeia leve do VL da SEQ ID NO: 22 e um framework de pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de framework do VL da SEQ ID NO: 22. Em outro aspecto, o VL compreende as sequências de CDR da cadeia leve do VL da SEQ ID NO: 22 e um framework de pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência de framework do VL da SEQ ID NO: 22.

EGFRVIII

[000209] Em aspectos preferidos, o segundo antígeno é EGFRvIII, particularmente EGFRvIII humano (SEQ ID NO: 115).

[000210] Em um aspecto, o segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementariedade da cadeia pesada (HCDR) 1 da SEQ ID NO: 85, uma HCDR 2 da SEQ ID NO: 86, e uma HCDR 3 da SEQ ID NO: 87, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade da cadeia leve (LCDR) 1 da SEQ ID NO: 89, uma LCDR 2 da SEQ ID NO: 90, e uma LCDR 3 da SEQ ID NO: 91.

[000211] Em um aspecto, o segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno é (derivado de) um anticorpo humanizado. Em um aspecto, o segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno é um domínio de ligação ao antígeno humanizado (ou seja, um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo humanizado). Em um aspecto, o VH e/ou VL do segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno é uma região variável humanizada.

[000212] Em um aspecto, o VH e/ou o VL do segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno compreende um framework aceitador humano, por exemplo, um framework de imunoglobulina humana ou um framework de consenso humano.

[000213] Em um aspecto, o VH do segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno compreende uma ou mais sequências de framework da cadeia pesada (isto é, a sequêncida de FR1, FR2, FR3 e/ou FR4) da SEQ ID NO: 88. Em um aspecto, o VH compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 88. Em um aspecto, o VH compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 88. Em um aspecto, o VH compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 98% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 88. Em certos aspectos, uma sequência VH tendo pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservativas), inserções ou deleções em relação à sequência de referência, mas um anticorpo compreendendo essa sequência retém a capacidade de se ligar a EGFRvIII. Em certos aspectos, um total de 1 a 10 aminoácidos foram substituídos, inseridos e/ou deletados na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 88. Em certos aspectos, as substituições, inserções ou deleções ocorrem em regiões fora das CDRs (ou seja, nos FRs). Em um aspecto, o VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 88. Opcionalmente, o VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 88, incluindo modificações pós-traducionais dessa sequência.

[000214] Em um aspecto, o VL do segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno compreende uma ou mais sequências de framework da cadeia leve (isto é, a sequêncida de FR1, FR2, FR3 e/ou FR4) da SEQ ID NO: 92. Em um aspecto, o VL compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 92. Em um aspecto, o VL compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 92. Em um aspecto, o VL compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 98% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 92. Em certos aspectos, uma sequência VL com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservativas), inserções ou deleções em relação à sequência de referência, mas um anticorpo compreendendo essa sequência retém a capacidade de se ligar a EGFRvIII. Em certos aspectos, um total de 1 a 10 aminoácidos foram substituídos, inseridos e/ou deletados na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 92. Em certos aspectos, as substituições, inserções ou deleções ocorrem em regiões fora das CDRs (ou seja, nos FRs). Em um aspecto, o VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 92. Opcionalmente, o

VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 92, incluindo modificações pós-traducionais dessa sequência.

[000215] Em um aspecto, o VH do segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 88, e o VL do segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 92. Em um aspecto, o VH compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 88 e o VL compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 92.

[000216] Em um outro aspecto, o segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno compreende um VH que compreende a sequência da SEQ ID NO: 88 e um VL que compreende a sequência da SEQ ID NO: 92.

[000217] Em um outro aspecto, o segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno compreende uma sequência de VH da SEQ ID NO: 88 e uma sequência de VL da SEQ ID NO: 92.

[000218] Em outro aspecto, o segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno compreende um VH que compreende as sequências de CDR da cadeia pesada do VH da SEQ ID NO: 88 e um VL que compreende as sequências de CDR da cadeia leve do VL da SEQ ID NO:

92.

[000219] Em um aspecto adicional, o segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno compreende as sequências de aminoácidos de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 do VH da SEQ ID NO: 88 e as sequências de aminoácidos de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 do VL da SEQ ID NO:

92.

[000220] Em um aspecto, o VH do segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno compreende as sequências de CDR da cadeia pesada do VH da SEQ ID NO: 88 e um framework de pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de framework do VH da SEQ ID NO: 88. Em um aspecto, o VH compreende as sequências de CDR da cadeia pesada do VH da SEQ ID NO: 88 e um framework de pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de framework do VH da SEQ ID NO: 88. Em outro aspecto, o VH compreende as sequências de CDR da cadeia pesada do VH da SEQ ID NO: 88 e um framework de pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência de framework do VH da SEQ ID NO: 88.

[000221] Em um aspecto, o VL do segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno compreende as sequências de CDR da cadeia leve do VL da SEQ ID NO: 92 e um framework de pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de framework do VL da SEQ ID NO: 92. Em um aspecto, o VL compreende as sequências de CDR da cadeia leve do VL da SEQ ID NO: 92 e um framework de pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de framework do VL da SEQ ID NO: 92. Em outro aspecto, o VL compreende as sequências de CDR da cadeia leve do VL da SEQ ID NO: 92 e um framework de pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência de framework do VL da SEQ ID NO: 92.

[000222] Em aspectos alternativos, o segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno compreende uma sequência de VH como em qualquer um dos aspectos fornecidos nesta seção acima em relação a EGFRvIII, e uma sequência de VL como em qualquer um dos aspectos fornecidos nesta seção acima em relação a EGFRvIII, mas com base nas seguintes sequências (ordenadas em linhas) em vez das SEQ ID NOs 85

(HCDR1), 86 (HCDR2), 87 (HCDR3), 88 (VH), 89 (LCDR1), 90 (LCDR2), 91 (LCDR3) e 92 (VL): HCDR1 HCDR2 HCDR3 VH LCDR1 LCDR2 LCDR3 VL

SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 37 NO: 38 NO: 39 NO: 40 NO: 41 NO: 42 NO: 43 NO: 44

SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 45 NO: 46 NO: 47 NO: 48 NO: 49 NO: 50 NO: 51 NO: 52

SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 53 NO: 54 NO: 55 NO: 56 NO: 57 NO: 58 NO: 59 NO: 60

SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 61 NO: 62 NO: 63 NO: 64 NO: 65 NO: 66 NO: 67 NO: 68

SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 69 NO: 70 NO: 71 NO: 72 NO: 73 NO: 74 NO: 75 NO: 76

SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 77 NO: 78 NO: 79 NO: 80 NO: 81 NO: 82 NO: 83 NO: 84

SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 93 NO: 94 NO: 95 NO: 96 NO: 97 NO: 98 NO: 99 NO: 100

SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 101 NO: 102 NO: 103 NO: 104 NO: 105 NO: 106 NO: 107 NO: 108

[000223] Em um aspecto, o segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno compreende uma sequência de VH, como em qualquer um dos aspectos fornecidos nesta seção acima, e uma sequência de VL, como em qualquer um dos aspectos fornecidos nesta seção acima. ANTICORPOS ANTI-TYRP-1 E ANTI-EGFRVIII

[000224] A invenção também fornece um anticorpo que se liga a TYRP-1, compreendendo uma sequência de VH como em qualquer um dos aspectos fornecidos nesta seção acima em relação a TYRP-1, e uma sequência de VL como em qualquer um dos aspectos fornecidos nesta seção acima em relação a TYRP-1 (por exemplo, um anticorpo que se liga a TYRP-1 compreendendo uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade da cadeia pesada (HCDR) 1 da SEQ ID NO: 15, uma HCDR 2 da SEQ ID NO: 16 e uma HCDR 3 da SEQ ID NO: 17 e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade da cadeia leve (LCDR) 1 da SEQ ID NO:

19, uma LCDR 2 da SEQ ID NO: 20 e uma LCDR 3 da SEQ ID NO: 21; ou um anticorpo que se liga a TYRP-1 compreendendo um VH compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 18 e um VL compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 22).

[000225] A invenção também fornece um anticorpo que se liga a EGFRvIII, compreendendo uma sequência de VH como em qualquer um dos aspectos fornecidos nesta seção acima em relação a EGFRvIII, e uma sequência de VL como em qualquer um dos aspectos fornecidos nesta seção acima em relação a EGFRvIII (por exemplo, um anticorpo que se liga a EGFRvIII compreendendo uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade da cadeia pesada (HCDR) 1 da SEQ ID NO: 85, uma HCDR 2 da SEQ ID NO: 86 e uma HCDR 3 da SEQ ID NO: 87, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade da cadeia leve (LCDR) 1 da SEQ ID NO: 89, uma LCDR 2 da SEQ ID NO: 90 e uma LCDR 3 da SEQ ID NO: 91; ou um anticorpo que se liga a TYRP-1 compreendendo um VH compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 88 e um VL compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 92).

[000226] Em um aspecto adicional, os anticorpos que se ligam a TYRP-1 ou EGFRvIII de acordo com qualquer um dos aspectos acima podem incorporar qualquer uma das características, isoladamente ou em combinação, conforme descrito em relação ao anticorpo que se liga a CD3 (a menos que claramente específico para o anticorpo anti-CD3, tal como as sequências de ligação).

c) MODIFICAÇÕES DE CARGA

[000227] O anticorpo (multiespecífico) da invenção pode compreender substituições de aminoácidos em moléculas Fab compreendidas no mesmo que são particularmente eficientes na redução do pareamento incorreto das cadeias leves com cadeias pesadas não correspondentes (produtos colaterais do tipo Bence-Jones), que podem ocorrer na produção de anticorpos multiespecíficos à base de Fab com uma troca de VH/VL em um (ou mais, no caso de moléculas compreendendo mais de duas moléculas Fab de ligação ao antígeno) de seus braços de ligação (vide também publicação PCT nº WO 2015/150447, particularmente a exemplos, neste documento incorporados por referência em sua totalidade). A razão de um anticorpo desejado (multiespecífico) em comparação com produtos colaterais indesejados, em particular produtos colaterais do tipo Bence Jones que ocorrem em anticorpos multiespecíficos com uma troca de domínio VH/VL em um de seus braços de ligação, pode ser melhorada pela introdução de aminoácidos carregados com cargas opostas em posições de aminoácidos específicas nos domínios CH1 e CL (às vezes referidos neste documento como "modificações de carga").

[000228] Por conseguinte, em alguns aspectos, em que o primeiro e o segundo (e, quando presente, o terceiro) domínio de ligação ao antígeno do anticorpo (multiespecífico) são ambos moléculas Fab e, em um dos domínios de ligação ao antígeno (particularmente o primeiro domínio de ligação ao antígeno), o domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro, i) no domínio constante CL do segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído por um aminoácido carregado positivamente (numeração de acordo com Kabat), e em que, no domínio constante CH1 do segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 ou o aminoácido na posição 213 é substituído por um aminoácido carregado negativamente (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); ou ii) no domínio constante CL do primeiro domínio de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído por um aminoácido carregado positivamente (numeração de acordo com Kabat), e em que, no domínio constante CH1 do primeiro domínio de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 ou o aminoácido na posição 213 é substituído por um aminoácido carregado negativamente (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[000229] O anticorpo (multiespecífico) não compreende ambas as modificações mencionadas em i) e ii). Os domínios constantes CL e CH1 do domínio de ligação ao antígeno tendo a troca de VH/VL não são substituídos um pelo outro (isto é, permanecem inalterados).

[000230] Em um aspecto mais específico, i) no domínio constante CL do segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat), e, no domínio constante CH1 do segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 ou o aminoácido na posição 213 é substituído independentemente por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); ou ii) no domínio constante CL do primeiro domínio de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat), e, no domínio constante CH1 do primeiro domínio de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 ou o aminoácido na posição 213 é substituído independentemente por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[000231] Em um tal aspecto, no domínio constante CL do segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat), e, no domínio constante CH1 do segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 ou o aminoácido na posição 213 é substituído independentemente por ácido glutâmico (E), ou aspártico ácido (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[000232] Em um outro aspecto, no domínio constante CL do segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat), e, no domínio constante CH1 do segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é substituído independentemente por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[000233] Em um aspecto preferido, no domínio constante CL do segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat), e, no domínio constante CH1 do segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é substituído independentemente por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído independentemente por ácido glutâmico (E), ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[000234] Em um aspecto mais preferido, no domínio constante CL do segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat), e, no domínio constante CH1 do segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[000235] Em um aspecto ainda mais preferido, no domínio constante CL do segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por arginina (R) (numeração de acordo com Kabat), e, no domínio constante CH1 do segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[000236] Em aspectos preferidos, se as substituições de aminoácidos de acordo com os aspectos acima forem feitas no domínio constante CL e no domínio constante CH1 do segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno, o domínio constante CL do segundo (e, onde presente, o terceiro) domínio de ligação ao antígeno é do isótipo kappa.

[000237] Alternativamente, as substituições de aminoácidos de acordo com os aspectos acima podem ser feitas no domínio constante CL e no domínio constante CH1 do primeiro domínio de ligação ao antígeno em vez de no domínio constante CL e no domínio constante CH1 do segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno. Em tais aspectos preferidos, o domínio constante CL do primeiro domínio de ligação ao antígeno é do isótipo kappa.

[000238] Por conseguinte, em um aspecto, no domínio constante CL do primeiro domínio de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat), e, no domínio constante CH1 do primeiro domínio de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 ou o aminoácido na posição 213 é substituído independentemente por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[000239] Em um outro aspecto, no domínio constante CL do primeiro domínio de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat), e, no domínio constante CH1 do primeiro domínio de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é substituído independentemente por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[000240] Em ainda outro aspecto, no domínio constante CL do primeiro domínio de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat), e, no domínio constante CH1 do primeiro domínio de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é substituído independentemente por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído independentemente por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com índice EU de Kabat).

[000241] Em um aspecto, no domínio constante CL do primeiro domínio de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat), e, no domínio constante CH1 do primeiro domínio de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por glutâmico ácido (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[000242] Em outro aspecto, no domínio constante CL do primeiro domínio de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por arginina (R) (numeração de acordo com Kabat), e, no domínio constante CH1 do primeiro domínio de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por glutâmico ácido (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[000243] Em um aspecto preferido, o anticorpo (multiespecífico) da invenção compreende (a) um primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga a CD3, em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab, em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro, e que compreende um região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade da cadeia pesada (HCDR) 1 da SEQ ID NO: 2, uma HCDR

2 da SEQ ID NO: 3 e uma HCDR 3 da SEQ ID NO: 5 e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade da cadeia leve (LCDR) 1 da SEQ ID NO: 8, uma LCDR 2 da SEQ ID NO: 9 e uma LCDR 3 da SEQ ID NO: 10, e (b) um segundo e opcionalmente um terceiro domínio de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno; em que, no domínio constante CL do segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em um aspecto preferido, independentemente por lisina (K) ou arginina (R)) e o aminoácido na posição 123 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) (em um aspecto preferido, independentemente por lisina (K) ou arginina (R)), e, no domínio constante CH1 do segundo (e, quando presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno, o aminoácido na posição 147 é substituído independentemente por ácido glutâmico (E), ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído independentemente por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

d) FORMATOS DE ANTICORPOS MULTIESPECÍFICOS

[000244] O anticorpo (multiespecífico) de acordo com a presente invenção pode ter uma variedade de configurações. Configurações exemplares são representadas na Figura 1.

[000245] Em aspectos preferidos, os domínios de ligação ao antígeno compreendidos no anticorpo (multiespecífico) são moléculas Fab. Em tais aspectos, o primeiro, segundo, terceiro etc. domínio de ligação ao antígeno pode ser referido neste documento como primeira, segunda, terceira, etc.

molécula Fab, respectivamente.

[000246] Em um aspecto, o primeiro e o segundo domínio de ligação ao antígeno do anticorpo (multiespecífico) são fundidos um ao outro, opcionalmente por meio de um ligante peptídico. Em aspectos preferidos, o primeiro e o segundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, uma molécula Fab. Em um tal aspecto, o primeiro domínio de ligação ao antígeno é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab do segundo domínio de ligação ao antígeno. Em outro tal aspecto, o segundo domínio de ligação ao antígeno é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab do primeiro domínio de ligação ao antígeno. Em aspectos em que (i) o primeiro domínio de ligação ao antígeno é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab do segundo domínio de ligação ao antígeno ou (ii) o segundo domínio de ligação ao antígeno é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab do primeiro domínio de ligação ao antígeno, adicionalmente a cadeia leve Fab do primeiro domínio de ligação ao antígeno e a cadeia leve Fab do segundo domínio de ligação ao antígeno podem ser fundidas entre si, opcionalmente por meio de um ligante peptídico.

[000247] Um anticorpo (multiespecífico) com um único domínio de ligação ao antígeno (tal como uma molécula Fab) capaz de ligação específica a um segundo antígeno, por exemplo, um antígeno de célula alvo, tal como TYRP-1 ou EGFRvIII, (por exemplo, conforme mostrado na Figura 1A, D, G, H, K, L) é útil, particularmente nos casos em que a internalização do segundo antígeno é esperada após a ligação de um domínio de ligação ao antígeno de alta afinidade. Em tais casos, a presença de mais de um domínio de ligação ao antígeno específico para o segundo antígeno pode intensificar a internalização do segundo antígeno, reduzindo assim sua disponibilidade.

[000248] Em outros casos, no entanto, será vantajoso ter um anticorpo (multiespecífico) compreendendo dois ou mais domínios de ligação de antígeno (tais como moléculas Fab) específicos para um segundo antígeno, por exemplo, um antígeno de célula alvo (vide exemplos mostrados na Figura 1B, 1C, 1E, 1F, 1I, 1J, 1M ou 1N), por exemplo, para otimizar o direcionamento para o sítio alvo ou para permitir a reticulação de antígenos de células alvo.

[000249] Consequentemente, em aspectos preferidos, o anticorpo (multiespecífico) de acordo com a presente invenção compreende um terceiro domínio de ligação ao antígeno.

[000250] Em um aspecto, o terceiro domínio de ligação ao antígeno se liga ao segundo antígeno, por exemplo, um antígeno de célula alvo, tal como TYRP-1 ou EGFRvIII. Em um aspecto, o terceiro domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab.

[000251] Em um aspecto, o terceiro domínio de antígeno é idêntico ao segundo domínio de ligação ao antígeno.

[000252] Em alguns aspectos, o terceiro e o segundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, uma molécula Fab, e o terceiro domínio de ligação ao antígeno é idêntico ao segundo domínio de ligação ao antígeno.

Assim, nestes aspectos, o segundo e o terceiro domínio de ligação ao antígeno compreendem as mesmas sequências de aminoácidos da cadeia pesada e leve e têm o mesmo arranjo de domínios (isto é, convencional ou cruzado).

Além disso, nestes aspectos, o terceiro domínio de ligação ao antígeno compreende as mesmas substituições de aminoácidos, se houver, conforme o segundo domínio de ligação ao antígeno. Por exemplo, as substituições de aminoácidos descritas neste documento como "modificações de carga" serão feitas no domínio constante CL e no domínio constante CH1 de cada um do segundo domínio de ligação ao antígeno e do terceiro domínio de ligação ao antígeno. Alternativamente, as referidas substituições de aminoácidos podem ser feitas no domínio constante CL e no domínio constante CH1 do primeiro domínio de ligação ao antígeno (que, em aspectos preferenciais, também é uma molécula Fab), mas não no domínio constante CL e no domínio constante CH1 do segundo domínio de ligação ao antígeno e do terceiro domínio de ligação ao antígeno.

[000253] Como o segundo domínio de ligação ao antígeno, o terceiro domínio de ligação ao antígeno é preferencialmente uma molécula Fab convencional. Aspectos em que o segundo e o terceiro domínio de ligação ao antígeno são moléculas Fab cruzadas (e o primeiro domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab convencional) são, no entanto, também contemplados. Assim, em aspectos preferenciais, o segundo e o terceiro domínio de ligação ao antígeno são, cada um, uma molécula Fab convencional, e o primeiro domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab cruzada, conforme descrito neste documento, ou seja, uma molécula Fab em que os domínios variáveis VH e VL ou os domínios CL e CH1 das cadeias pesada e leve Fab são trocados/substituídos um pelo outro. Em outros aspectos, o segundo e o terceiro domínio de ligação ao antígeno são, cada um, uma molécula Fab cruzada, e o primeiro domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab convencional.

[000254] Se um terceiro domínio de ligação de antígeno estiver presente, em um aspecto preferido, o primeiro domínio de ligação ao antígeno se liga a CD3, e o segundo e terceiro domínio de ligação ao antígeno se ligam a um segundo antígeno, particularmente um antígeno de célula alvo, tal como TYRP-1 ou EGFRvIII.

[000255] Em aspectos preferidos, o anticorpo (multiespecífico) da invenção compreende um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade. A primeira e a segunda subunidade do domínio Fc são capazes de associação estável.

[000256] O anticorpo (multiespecífico) de acordo com a invenção pode ter configurações diferentes, isto é, o primeiro, segundo (e opcionalmente terceiro) domínio de ligação ao antígeno podem ser fundidos um ao outro e ao domínio Fc de maneiras diferentes. Os componentes podem ser fundidos uns aos outros diretamente ou, de preferência, por meio de um ou mais ligantes peptídicos adequados. Quando a fusão de uma molécula Fab é ao terminal N de uma subunidade do domínio Fc, ela é normalmente através de uma região de dobradiça de imunoglobulina.

[000257] Em alguns aspectos, o primeiro e o segundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, uma molécula Fab, e o primeiro domínio de ligação ao antígeno é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da primeira ou da segunda subunidade do domínio Fc. Em tais aspectos, o segundo domínio de ligação ao antígeno pode ser fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab do primeiro domínio de ligação ao antígeno, ou ao terminal N da outra das subunidades do domínio Fc. Em tais aspectos preferidos, o segundo domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab convencional e o primeiro domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab cruzada, conforme descrito neste documento, ou seja, uma molécula Fab em que os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CL e CH1 das cadeias pesada e leve Fab são trocados/substituídos um pelo outro. Em outros tais aspectos, o segundo domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab cruzada e o primeiro domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab convencional.

[000258] Em um aspecto, o primeiro e o segundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, uma molécula Fab, o primeiro domínio de ligação ao antígeno é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da primeira ou da segunda subunidade do domínio Fc, e o segundo domínio de ligação ao antígeno é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab do primeiro domínio de ligação ao antígeno.

Em um aspecto específico, o anticorpo (multiespecífico) consiste essencialmente na primeira e na segunda molécula Fab, o domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade e, opcionalmente, um ou mais ligantes peptídicos, em que a segunda molécula Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, e a primeira molécula Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da primeiro ou segunda subunidade do domínio Fc. Tal configuração é esquematicamente representada nas Figuras 1G e 1K (com o primeiro domínio de ligação ao antígeno nestes exemplos sendo uma molécula Fab cruzada de VH/VL). Opcionalmente, a cadeia leve Fab da primeira molécula Fab e a cadeia leve Fab da segunda molécula Fab podem, adicionalmente, ser fundidas entre si.

[000259] Em outro aspecto, o primeiro e o segundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, uma molécula Fab, e o primeiro e o segundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, fundidos no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N de uma das subunidades do domínio Fc.

Em um aspecto específico, o anticorpo (multiespecífico) consiste essencialmente na primeira e na segunda molécula Fab, o domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade e, opcionalmente, um ou mais ligantes peptídicos, em que a primeira e a segunda molécula Fab são cada uma fundidas no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N de uma das subunidades do domínio Fc. Tal configuração é esquematicamente representada nas Figuras 1A e 1D (nestes exemplos com o primeiro domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab cruzada de VH/VL e o segundo domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional). A primeira e a segunda molécula Fab podem ser fundidas com o domínio Fc diretamente ou através de um ligante peptídico. Em um aspecto preferido, a primeira e a segunda molécula Fab são, cada uma, fundidas ao domínio Fc através de uma região de dobradiça de imunoglobulina. Em um aspecto específico, a região de dobradiça de imunoglobulina é uma região de dobradiça de IgG1 humana, particularmente onde o domínio Fc é um domínio Fc de IgG1.

[000260] Em alguns aspectos, o primeiro e o segundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, uma molécula Fab, e o segundo domínio de ligação ao antígeno é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da primeira ou da segunda subunidade do domínio Fc. Em tais aspectos, o primeiro domínio de ligação ao antígeno pode ser fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab do primeiro domínio de ligação ao antígeno ou (como descrito acima) ao terminal N da outra uma das subunidades do domínio Fc. Em tais aspectos preferidos, o referido segundo domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab convencional, e o primeiro domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab cruzada, conforme descrito neste documento, ou seja, uma molécula Fab em que os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CL e CH1 das cadeias pesada e leve Fab são trocados/substituídos um pelo outro. Em outros tais aspectos, o referido segundo domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab cruzada e o primeiro domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab convencional.

[000261] Em um aspecto, o primeiro e o segundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, uma molécula Fab, o segundo domínio de ligação ao antígeno é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da primeira ou da segunda subunidade do domínio Fc, e o primeiro domínio de ligação ao antígeno é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab do segundo domínio de ligação ao antígeno.

Em um aspecto específico, o anticorpo (multiespecífico) consiste essencialmente na primeira e na segunda molécula Fab, o domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade e, opcionalmente, um ou mais ligantes peptídicos, em que a primeira molécula Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab, e a segunda molécula Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da primeira ou segunda subunidade do domínio Fc. Tal configuração é esquematicamente representada nas Figuras 1H e 1L (nestes exemplos com o primeiro domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab cruzada de VH/VL e o segundo domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional). Opcionalmente, a cadeia leve Fab da primeira molécula Fab e a cadeia leve Fab da segunda molécula Fab podem, adicionalmente, ser fundidas entre si.

[000262] Em alguns aspectos, um terceiro domínio de ligação ao antígeno, particularmente uma terceira molécula Fab, é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da primeira ou segunda subunidade do domínio Fc. Em tais aspectos preferidos, os referidos segundo e terceiro domínios de ligação ao antígeno são, cada um, uma molécula Fab convencional, e o primeiro domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab cruzada, conforme descrito neste documento, ou seja, uma molécula Fab em que os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CL e CH1 das cadeias pesada e leve Fab são trocados/substituídos entre si. Em outros tais aspectos, os referidos segundo e terceiro domínios de ligação ao antígeno são cada um uma molécula Fab cruzada, e o primeiro domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab convencional.

[000263] Em um tal aspecto preferido, o primeiro e o terceiro domínio de ligação ao antígeno são, cada um, fundidos no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N de uma das subunidades do domínio Fc, e o segundo domínio de ligação ao antígeno é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab. Em um aspecto específico, o anticorpo (multiespecífico) consiste essencialmente na primeira, na segunda e na terceira molécula Fab, o domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade e, opcionalmente, um ou mais ligantes peptídicos, em que a segunda molécula Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, e a primeira molécula Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da primeira subunidade do domínio Fc, e em que a terceira molécula Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da segunda subunidade do domínio Fc. Tal configuração é esquematicamente representada nas Figuras 1B e 1E (nestes exemplos com o primeiro domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab cruzada de VH/VL e o segundo e terceiro domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional) e Figuras 1J e 1N (nestes exemplos com o primeiro domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional, e o segundo e terceiro domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab cruzada de VH/VL). A primeira e a terceira molécula Fab podem ser fundidas ao domínio Fc diretamente ou através de um ligante peptídico. Em um aspecto preferido, a primeira e a terceira molécula Fab são, cada uma, fundidas ao domínio Fc através de uma região de dobradiça de imunoglobulina. Em um aspecto específico, a região de dobradiça de imunoglobulina é uma região de dobradiça de IgG1 humana, particularmente onde o domínio Fc é um domínio Fc de IgG 1.

Opcionalmente, a cadeia leve Fab da primeira molécula Fab e a cadeia leve Fab da segunda molécula Fab podem, adicionalmente, ser fundidas entre si.

[000264] Em outro tal aspecto, o segundo e terceiro domínio de ligação ao antígeno são, cada um, fundidos no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N de uma das subunidades do domínio Fc, e o primeiro domínio de ligação ao antígeno é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab do segundo domínio de ligação ao antígeno. Em um aspecto específico, o anticorpo (multiespecífico) consiste essencialmente na primeira, na segunda e na terceira molécula Fab, o domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade e, opcionalmente, um ou mais ligantes peptídicos, em que a primeira molécula Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab, e a segunda molécula Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da primeira subunidade do domínio Fc, e em que a terceira molécula Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da segunda subunidade do domínio Fc. Tal configuração é esquematicamente representada nas Figuras 1C e 1F (nestes exemplos com o primeiro domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab cruzada de VH/VL e o segundo e terceiro domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional) e nas Figuras 1I e 1M (nestes exemplos com o primeiro domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional, e o segundo e terceiro domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab cruzada de VH/VL). A segunda e a terceira molécula Fab podem ser fundidas ao domínio Fc diretamente ou através de um ligante peptídico. Em um aspecto preferido, a segunda e a terceira molécula Fab são, cada uma, fundidas ao domínio Fc através de uma região de dobradiça de imunoglobulina. Em um aspecto específico, a região de dobradiça de imunoglobulina é uma região de dobradiça de IgG 1 humana, particularmente onde o domínio Fc é um domínio Fc de IgG1. Opcionalmente, a cadeia leve Fab da primeira molécula Fab e a cadeia leve Fab da segunda molécula Fab podem, adicionalmente, ser fundidas entre si.

[000265] Nas configurações do anticorpo (multiespecífico), em que uma molécula Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N de cada uma das subunidades do domínio Fc através de uma região de dobradiça de imunoglobulina, as duas moléculas Fab, as regiões de dobradiça e o domínio Fc formam essencialmente uma molécula de imunoglobulina. Em um aspecto preferido, a molécula de imunoglobulina é uma imunoglobulina da classe IgG. Em um aspecto ainda mais preferido, a imunoglobulina é uma imunoglobulina da subclasse IgG1. Em outro aspecto, a imunoglobulina é uma imunoglobulina da subclasse IgG 4. Em um outro aspecto preferido, a imunoglobulina é uma imunoglobulina humana. Em outros aspectos, a imunoglobulina é uma imunoglobulina quimérica ou uma imunoglobulina humanizada. Em um aspecto, a imunoglobulina compreende uma região constante humana, particularmente uma região Fc humana.

[000266] Em alguns dos anticorpos (multiespecíficos) da invenção, a cadeia leve Fab da primeira molécula Fab e a cadeia leve Fab da segunda molécula Fab são fundidas entre si, opcionalmente por meio de um ligante peptídico. Dependendo da configuração da primeira e da segunda molécula Fab, a cadeia leve Fab da primeira molécula Fab pode ser fundida em seu terminal C ao terminal N da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab, ou a cadeia leve Fab da segunda molécula Fab pode ser fundida em seu terminal C ao terminal N da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab. A fusão das cadeias leves Fab da primeira e da segunda molécula Fab reduz ainda o pareamento incorreto das cadeias pesadas e leves Fab não combinadas e também reduz o número de plasmídeos necessários para a expressão de alguns dos anticorpos (multiespecíficos) da invenção.

[000267] Os domínios de ligação ao antígeno podem ser fundidos ao domínio Fc ou entre si, diretamente ou através de um ligante peptídico, compreendendo um ou mais aminoácidos, normalmente cerca de 2- 20 aminoácidos. Os ligantes peptídicos são conhecidos na técnica e são descritos neste documento. Os ligantes peptídicos não imunogênicos adequados incluem, por exemplo, ligantes peptídicos (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n ou

G4(SG4)n. "N" é geralmente um número inteiro de 1 a 10, normalmente de 2 a 4.

Em um aspecto, o referido ligante peptídico tem um comprimento de pelo menos 5 aminoácidos, em um aspecto, um comprimento de 5 a 100, em um aspecto adicional, de 10 a 50 aminoácidos. Em um aspecto, o referido ligante peptídico é (GxS)n ou (GxS)nGm com G = glicina, S = serina, e (x = 3, n = 3, 4, 5 ou 6, e m = 0, 1, 2 ou 3) ou (x = 4, n = 2, 3, 4 ou 5 e m = 0, 1, 2 ou 3), em um aspecto x = 4 e n = 2 ou 3, em um aspecto adicional x = 4 e n = 2. Em um aspecto, o referido ligante peptídico é (G4S)2. Um ligante peptídico particularmente adequado para fundir as cadeias leves Fab da primeira e da segunda molécula Fab entre si é (G4S)2. Um ligante peptídico exemplar adequado para conectar as cadeias pesadas Fab do primeiro e do segundo fragmentos Fab compreende a sequência (D)-(G4S)2 (SEQ ID NOs 118 e 119).

Outro tal ligante adequado compreende a sequência (G4S)4. Além disso, os ligantes podem compreender (uma porção de) uma região de dobradiça de imunoglobulina. Particularmente, quando uma molécula Fab é fundida ao terminal N de uma subunidade do domínio Fc, ela pode ser fundida através de uma região de dobradiça de imunoglobulina ou uma porção da mesma, com ou sem um ligante peptídico adicional.

[000268] Em certos aspectos, o anticorpo (multiespecífico) de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo, em que a região variável da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab (isto é, a primeira molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab cruzada, em que a região variável da cadeia pesada é substituída por uma região variável da cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VL(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4)), e um polipeptídeo em que a cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(- CH4)). Em alguns aspectos, o anticorpo (multiespecífico) compreende ainda um polipeptídeo, em que a região variável da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VH (1)-CL(1)) e o polipeptídeo de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VL (2)-CL(2)). Em certos aspectos, os polipeptídeos são covalentemente ligados, por exemplo, por uma ligação dissulfeto.

[000269] Em certos aspectos, o anticorpo (multiespecífico) de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo, em que a região variável da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (ou seja, a primeira molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab cruzada, em que a região constante da cadeia pesada é substituída por uma região constante da cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VH(1)-CL(1)-CH2-CH3(-CH4)), e um polipeptídeo, em que a cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(- CH4)). Em alguns aspectos, o anticorpo (multiespecífico) compreende ainda um polipeptídeo, em que a região variável da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab (VL (1)-CH1(1)) e o polipeptídeo da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VL(2)-CL(2)). Em certos aspectos, os polipeptídeos são covalentemente ligados, por exemplo, por uma ligação dissulfeto.

[000270] Em alguns aspectos, o anticorpo (multiespecífico) compreende um polipeptídeo, em que a região variável da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab (ou seja, a primeira molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab cruzada, em que a região variável da cadeia pesada é substituída por uma região variável da cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carbóxi-

terminal com a cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VL(1)-CH1(1)-VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4)). Em outros aspectos, o anticorpo (multiespecífico) compreende um polipeptídeo, em que a cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região variável da cadeia leve Fab da primeira molécula

Fab que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab (ou seja, a primeira molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab cruzada, em que a região variável da cadeia pesada é substituída por uma região variável da cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carbóxi-

terminal com uma subunidade do domínio Fc (VH(2)-CH1(2)-VL(1)-CH1(1)-CH2-

CH3(-CH4)). Em alguns destes aspectos, o anticorpo (multiespecífico)

compreende ainda um polipeptídeo cruzado da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab, em que a região variável da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VH(1)-CL(1)), e o polipeptídeo da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VL (2)-CL(2)). Em outros destes aspectos, o anticorpo (multiespecífico) compreende ainda um polipeptídeo, em que a região variável da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab que, por sua vez,

compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com o polipeptídeo da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VH(1)-CL(1)-VL(2)-CL(2)), ou um polipeptídeo, em que o polipeptídeo da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região variável da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VL(2)-CL(2)-VH(1)-CL(1)), conforme apropriado. O anticorpo (multiespecífico) de acordo com estes aspectos pode compreender ainda (i) um polipeptídeo da subunidade do domínio Fc (CH2-CH3(-CH4)), ou (ii) um polipeptídeo, em que a cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4)) e o polipeptídeo da cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab (VL(3)-CL(3)). Em certos aspectos, os polipeptídeos são covalentemente ligados, por exemplo, por uma ligação dissulfeto.

[000271] Em alguns aspectos, o anticorpo (multiespecífico) compreende um polipeptídeo, em que a região variável da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (ou seja, a primeira molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab cruzada, em que a região constante da cadeia pesada é substituída por uma região constante da cadeia leve), que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carbóxi- terminal com a cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab, que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VH(1)-CL(1)-VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4)). Em outros aspectos, o anticorpo (multiespecífico) compreende um polipeptídeo, em que a cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região variável da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carbóxi-

terminal com a região constante da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab

(ou seja, a primeira molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab cruzada, em que a região constante da cadeia pesada é substituída por uma região constante da cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VH(2)-CH1(2)-

VH(1)-CL(1)-CH2-CH3(-CH4)). Em alguns destes aspectos, o anticorpo

(multiespecífico) compreende ainda um polipeptídeo cruzado da cadeia leve

Fab da primeira molécula Fab, em que a região variável da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab (VL (1)-

CH1(1)), e o polipeptídeo da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VL(2)-

CL(2)). Em outros destes aspectos, o anticorpo (multiespecífico) compreende ainda um polipeptídeo, em que a região variável da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, que, por sua vez,

compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com o polipeptídeo da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VL(1)-CH1(1)-VL(2)-CL(2)), ou um polipeptídeo, em que o polipeptídeo Fab da cadeia leve da segunda molécula

Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região variável da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia leve

Fab da primeira molécula Fab (VL(2)-CL(2)-VH(1)-CL(1)), conforme apropriado.

O anticorpo (multiespecífico) de acordo com estes aspectos pode compreender ainda (i) um polipeptídeo da subunidade do domínio Fc (CH2-CH3(-CH4)), ou

(ii) um polipeptídeo, em que a cadeia pesada Fab de uma terceira molécula

Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com uma subunidade do domínio Fc (VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4)) e o polipeptídeo da cadeia leve

Fab de uma terceira molécula Fab (VL(3)-CL(3)). Em certos aspectos, os polipeptídeos são covalentemente ligados, por exemplo, por uma ligação dissulfeto.

[000272] Em certos aspectos, o anticorpo (multiespecífico) não compreende um domínio Fc. Em tais aspectos preferidos, os referidos segundo e, se presente, terceiro domínios de ligação ao antígeno são, cada um, uma molécula Fab convencional, e o primeiro domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab cruzada, conforme descrito neste documento, ou seja, uma molécula Fab em que os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CL e CH1 das cadeias pesada e leve Fab são trocados/substituídos um pelo outro. Em outros de tais aspectos, os referidos segundo e, se presente, terceiro domínios de ligação ao antígeno são, cada um, uma molécula Fab cruzada, e o primeiro domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab convencional.

[000273] Em um tal aspecto, o anticorpo (multiespecífico) consiste essencialmente no primeiro e no segundo domínio de ligação ao antígeno e, opcionalmente, um ou mais ligantes peptídicos, em que o primeiro e o segundo domínio de ligação ao antígeno são ambas moléculas Fab e o segundo domínio de ligação ao antígeno é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab do primeiro domínio de ligação ao antígeno. Tal configuração é esquematicamente representada nas Figuras 1O e 1S (nestes exemplos com o primeiro domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab cruzada de VH/VL e o segundo domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional).

[000274] Em outro tal aspecto, o anticorpo (multiespecífico) consiste essencialmente no primeiro e no segundo domínio de ligação ao antígeno e, opcionalmente, um ou mais ligantes peptídicos, em que o primeiro e o segundo domínio de ligação ao antígeno são ambas moléculas Fab, e o primeiro domínio de ligação ao antígeno é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab do segundo domínio de ligação ao antígeno. Tal configuração é esquematicamente representada nas Figuras 1P e 1T (nestes exemplos com o primeiro domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab cruzada de VH/VL e o segundo domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional).

[000275] Em alguns aspectos, a segunda molécula Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, e o anticorpo (multiespecífico) compreende ainda um terceiro domínio de ligação ao antígeno, particularmente uma terceira molécula Fab, em que a referida terceira molécula Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab. Em certos desses aspectos, o anticorpo (multiespecífico) consiste essencialmente na primeira, na segunda e na terceira molécula Fab e, opcionalmente, um ou mais ligantes peptídicos, em que a segunda molécula Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada Fab para o terminal N da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, e a terceira molécula Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab. Tal configuração é esquematicamente representada nas Figuras 1Q e 1U (nestes exemplos com o primeiro domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab cruzada de VH/VL e o segundo e o terceiro domínio de ligação ao antígeno sendo cada um uma molécula Fab convencional), ou Figuras 1X e 1Z (nestes exemplos com o primeiro domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional e o segundo e o terceiro domínio de ligação ao antígeno sendo cada um uma molécula Fab cruzada de VH/VL).

[000276] Em alguns aspectos, a primeira molécula Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab, e o anticorpo (multiespecífico) compreende ainda um terceiro domínio de ligação ao antígeno, particularmente uma terceira molécula Fab, em que a referida terceira molécula Fab é fundida no terminal N da cadeia pesada Fab ao terminal C da cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab. Em certos desses aspectos, o anticorpo (multiespecífico) consiste essencialmente na primeira, na segunda e na terceira molécula Fab e, opcionalmente, um ou mais ligantes peptídicos, em que a primeira molécula Fab é fundida no terminal C da cadeia pesada Fab para o terminal N da cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab, e a terceira molécula Fab é fundida no terminal N da cadeia pesada Fab ao terminal C da cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab. Tal configuração é esquematicamente representada nas Figuras 1R e 1V (nestes exemplos com o primeiro domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab cruzada de VH/VL e o segundo e o terceiro domínio de ligação ao antígeno sendo cada um uma molécula Fab convencional), ou Figuras 1W e 1Y (nestes exemplos com o primeiro domínio de ligação ao antígeno sendo uma molécula Fab convencional e o segundo e o terceiro domínio de ligação ao antígeno sendo cada um uma molécula Fab cruzada de VH/VL).

[000277] Em certos aspectos, o anticorpo (multiespecífico) de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo, em que a cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi- terminal com a região variável da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab, que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab (ou seja, a primeira molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab cruzada, em que a região variável da cadeia pesada é substituída por uma região variável da cadeia leve) (VH(2)-CH1(2)-VL(1)-CH1(1)). Em alguns aspectos, o anticorpo (multiespecífico) compreende ainda um polipeptídeo, em que a região variável da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VH(1)-CL(1)) e o polipeptídeo de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VL(2)-CL(2)).

[000278] Em certos aspectos, o anticorpo (multiespecífico) de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo, em que a região variável da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab (isto é, a primeira molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab cruzada, em que a região variável da cadeia pesada é substituída por uma região variável da cadeia leve), que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (VL(1)-CH1(1)-VH(2)-CH1(2)). Em alguns aspectos, o anticorpo (multiespecífico) compreende ainda um polipeptídeo, em que a região variável da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VH(1)-CL(1)) e o polipeptídeo de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VL(2)-CL(2)).

[000279] Em certos aspectos, o anticorpo (multiespecífico) de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo, em que a cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi- terminal com a região variável da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (ou seja, a primeira molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab cruzada, em que a região constante da cadeia pesada é substituída por uma região constante da cadeia leve) (VH(2)-CH1(2)-VH(1)-CL(1). Em alguns aspectos, o anticorpo (multiespecífico) compreende ainda um polipeptídeo, em que a região variável da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab (VL(1)-CH1(1)) e o polipeptídeo da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VL(2)-CL(2)).

[000280] Em certos aspectos, o anticorpo (multiespecífico) de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo, em que a região variável da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (ou seja, a primeira molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab cruzada, em que a região constante da cadeia pesada é substituída por uma região constante da cadeia leve), que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (VH(1)-CL(1)-VH(2)-CH1(2)). Em alguns aspectos, o anticorpo (multiespecífico) compreende ainda um polipeptídeo, em que a região variável da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab (VL(1)-CH1(1)) e o polipeptídeo da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VL(2)-CL(2)).

[000281] Em certos aspectos, o anticorpo (multiespecífico) de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo, em que a cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi- terminal com a cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab, que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região variável da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab, que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab (ou seja, a primeira molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab cruzada, em que a região variável da cadeia pesada é substituída por uma região variável de cadeia leve) (VH(3)-CH1(3)-VH(2)-CH1(2)- VL(1)-CH1(1)). Em alguns aspectos, o anticorpo (multiespecífico) compreende ainda um polipeptídeo, em que a região variável da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VH (1)-CL(1)) e o polipeptídeo de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VL(2)-CL(2)). Em alguns aspectos, o anticorpo (multiespecífico) compreende ainda o polipeptídeo da cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab (VL (3)-CL(3)).

[000282] Em certos aspectos, o anticorpo (multiespecífico) de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo, em que a cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi- terminal com a cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab, que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região variável da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab, que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (ou seja, a primeira molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab cruzada, em que a região constante da cadeia pesada é substituída por uma região constante da cadeia leve) (VH(3)-CH1(3)-VH(2)- CH1(2)-VH(1)-CL(1)). Em alguns aspectos, o anticorpo (multiespecífico) compreende ainda um polipeptídeo, em que a região variável da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi- terminal com a região constante da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab (VL(1)-CH1(1)) e o polipeptídeo da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VL(2)-CL(2)). Em alguns aspectos, o anticorpo (multiespecífico) compreende ainda o polipeptídeo da cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab (VL(3)-CL(3)).

[000283] Em certos aspectos, o anticorpo (multiespecífico) de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo em que a região variável da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab (isto é, a primeira molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab cruzada, em que a região variável da cadeia pesada é substituída por uma região variável da cadeia leve), que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab, que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab (VL (1)- CH1(1)-VH(2)-CH1(2)-VH(3)-CH1(3)). Em alguns aspectos, o anticorpo (multiespecífico) compreende ainda um polipeptídeo, em que a região variável da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VH(1)-CL(1)) e o polipeptídeo de cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VL(2)-CL(2)). Em alguns aspectos, o anticorpo (multiespecífico) compreende ainda o polipeptídeo da cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab (VL(3)-CL(3)).

[000284] Em certos aspectos, o anticorpo (multiespecífico) de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo, em que a região variável da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (ou seja, a primeira molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab cruzada, em que a região constante da cadeia pesada é substituída por uma região constante da cadeia leve), que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab, que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab (VH(1)-CL(1)-VH(2)-CH1(2)-VH(3)-CH1(3)). Em alguns aspectos, o anticorpo (multiespecífico) compreende ainda um polipeptídeo, em que a região variável da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab (VL(1)-CH1(1)) e o polipeptídeo da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VL(2)-CL(2)). Em alguns aspectos, o anticorpo (multiespecífico) compreende ainda o polipeptídeo da cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab (VL(3)-CL(3)).

[000285] Em certos aspectos, o anticorpo (multiespecífico) de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo, em que a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi- terminal com a região variável da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab, que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab cruzada, em que a região variável da cadeia pesada é substituída por uma região variável da cadeia leve), que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carbóxi- terminal com a região variável da cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab, que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab (ou seja, a terceira molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab cruzada, em que a região variável da cadeia pesada é substituída por uma região variável da cadeia leve)) (VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)-VL(3)-CH1(3)). Em alguns aspectos, o anticorpo (multiespecífico) compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável da cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VH(2)-CL(2)) e o polipeptídeo da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VL(1)-CL(1)). Em alguns aspectos, o anticorpo (multiespecífico) compreende ainda um polipeptídeo, em que a região variável da cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab (VH(3)-CL(3)).

[000286] Em certos aspectos, o anticorpo (multiespecífico) de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo, em que a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi- terminal com a região variável da cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab, que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab cruzada, em que a região constante da cadeia pesada é substituída por uma região constante da cadeia leve), que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carbóxi- terminal com a região variável da cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab, que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab (ou seja, a terceira molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab cruzada, em que a região constante da cadeia pesada é substituída por uma região constante da cadeia leve) (VH(1)-CH1(1)-VH(2)-CL(2)-VH(3)-CL(3)). Em alguns aspectos, o anticorpo (multiespecífico) compreende ainda um polipeptídeo, em que a região variável da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (VL(2)-CH1(2)) e o polipeptídeo da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VL(1)-CL(1)). Em alguns aspectos, o anticorpo (multiespecífico) compreende ainda um polipeptídeo, em que a região variável da cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab (VL(3)-CH1(3)).

[000287] Em certos aspectos, o anticorpo (multiespecífico) de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo, em que a região variável da cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab (isto é, a terceira molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab cruzada, em que a região variável da cadeia pesada é substituída por uma região variável da cadeia leve), que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região variável da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab, que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (isto é, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab cruzada, em que a região variável da cadeia pesada é substituída por uma região variável da cadeia leve), que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab (VL(3)-CH1(3)-VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)). Em alguns aspectos, o anticorpo (multiespecífico) compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável da cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (VH(2)-CL(2)) e o polipeptídeo da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VL(1)-CL(1)). Em alguns aspectos, o anticorpo (multiespecífico) compreende ainda um polipeptídeo, em que a região variável da cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab (VH(3)-CL(3)).

[000288] Em certos aspectos, o anticorpo (multiespecífico) de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo, em que a região variável da cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab (isto é, a terceira molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab cruzada, em que a região constante da cadeia pesada é substituída por uma região constante da cadeia leve), que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região variável da cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab, que, por sua vez, compartilha uma ligação ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab (ou seja, a segunda molécula Fab compreende uma cadeia pesada Fab cruzada, em que a região constante da cadeia pesada é substituída por uma região constante da cadeia leve), que, por sua vez, compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a cadeia pesada Fab da primeira molécula Fab (VH(3)-CL(3)-VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1)). Em alguns aspectos, o anticorpo (multiespecífico) compreende ainda um polipeptídeo, em que a região variável da cadeia leve Fab da segunda molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia pesada Fab da segunda molécula Fab (VL(2)-CH1(2)) e o polipeptídeo da cadeia leve Fab da primeira molécula Fab (VL (1)-CL(1)). Em alguns aspectos, o anticorpo (multiespecífico) compreende ainda um polipeptídeo, em que a região variável da cadeia leve Fab de uma terceira molécula Fab compartilha uma ligação peptídica carbóxi-terminal com a região constante da cadeia pesada Fab de uma terceira molécula Fab (VL (3)-CH1(3)).

[000289] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo (multiespecífico) que compreende a) um primeiro domínio de ligação a antígeno que se liga a CD3, em que o primeiro domínio de ligação a antígeno é uma molécula Fab, em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CH1 da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro, e que compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade da cadeia pesada (HCDR) 1 da SEQ ID NO: 2, uma HCDR 2 da SEQ ID NO: 3 e uma HCDR 3 da SEQ ID NO: 5 e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade da cadeia leve (LCDR) 1 da SEQ ID NO: 8, uma LCDR 2 da SEQ ID NO: 9 e uma LCDR 3 da SEQ ID NO: 10;

b) um segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, particularmente um antígeno de célula alvo, mais particularmente TYRP-1 ou EGFRvIII, em que o segundo domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab (convencional); c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade; em que (i) o primeiro domínio de ligação ao antígeno em a) é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab do segundo domínio de ligação ao antígeno em b), e o segundo domínio de ligação ao antígeno em b) é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N de uma das subunidades do domínio Fc em c), ou (ii) o segundo domínio de ligação ao antígeno em b) é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab do primeiro domínio de ligação ao antígeno em a), e o primeiro domínio de ligação ao antígeno em a) é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N de uma das subunidades do domínio Fc em c).

[000290] Em um aspecto preferido, a invenção fornece um anticorpo (multiespecífico) compreendendo a) um primeiro domínio de ligação a antígeno que se liga a CD3, em que o primeiro domínio de ligação a antígeno é uma molécula Fab, em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CH1 da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro, e que compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade da cadeia pesada (HCDR) 1 da SEQ ID NO: 2, uma HCDR 2 da SEQ ID NO: 3 e uma HCDR 3 da SEQ ID NO: 5 e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade da cadeia leve (LCDR) 1 da SEQ ID NO:

8, uma LCDR 2 da SEQ ID NO: 9 e uma LCDR 3 da SEQ ID NO: 10; b) um segundo e um terceiro domínio de ligação ao antígeno que se ligam a um segundo antígeno, particularmente um antígeno de célula alvo, mais particularmente TYRP-1 ou EGFRvIII, em que o segundo e o terceiro domínio de ligação ao antígeno são, cada um, uma molécula Fab (convencional); e c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade; em que (i) o primeiro domínio de ligação ao antígeno em a) é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab do segundo domínio de ligação ao antígeno em b), e o segundo domínio de ligação ao antígeno em b) e o terceiro domínio de ligação ao antígeno em b) são, cada um, fundidos no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N de uma das subunidades do domínio Fc em c), ou (ii) o segundo domínio de ligação ao antígeno em b) é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab do primeiro domínio de ligação ao antígeno em a), e o primeiro domínio de ligação ao antígeno em a) e o terceiro domínio de ligação ao antígeno em b) são, cada um, fundidos no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N de uma das subunidades do domínio Fc em c).

[000291] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo (multiespecífico) que compreende a) um primeiro domínio de ligação a antígeno que se liga a CD3, em que o primeiro domínio de ligação a antígeno é uma molécula Fab, em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CH1 da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro, e que compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade da cadeia pesada (HCDR) 1 da SEQ ID NO: 2, uma HCDR 2 da SEQ ID NO: 3 e uma HCDR 3 da SEQ ID NO: 5 e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade da cadeia leve (LCDR) 1 da SEQ ID NO: 8, uma LCDR 2 da SEQ ID NO: 9 e uma LCDR 3 da SEQ ID NO: 10; b) um segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, particularmente um antígeno de célula alvo, mais particularmente TYRP-1 ou EGFRvIII, em que o segundo domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab (convencional); c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade; em que (i) o primeiro domínio de ligação ao antígeno em a) e o segundo domínio de ligação ao antígeno em b) são, cada um, fundidos no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N de uma das subunidades do domínio Fc em c).

[000292] Em todas as diferentes configurações do anticorpo (multiespecífico) de acordo com a invenção, as substituições de aminoácidos ("modificações de carga") descritas neste documento, se presentes, podem estar nos domínios CH1 e CL do segundo e (se presente) terceiro domínio de ligação ao antígeno/molécula Fab, ou nos domínios CH1 e CL do primeiro domínio de ligação ao antígeno/molécula Fab. De preferência, eles estão nos domínios CH1 e CL do segundo e (se presente) terceiro domínio de ligação ao antígeno/molécula Fab. De acordo com o conceito da invenção, se as substituições de aminoácidos descritas neste documento forem feitas no segundo (e, se presente, no terceiro) domínio de ligação ao antígeno/molécula Fab, nenhuma dessas substituições de aminoácidos é feita no primeiro domínio de ligação ao antígeno/molécula Fab. Por outro lado, se as substituições de aminoácidos, conforme descritas neste documento, são feitas no primeiro domínio de ligação ao antígeno/molécula Fab, nenhuma dessas substituições de aminoácidos é feita no segundo (e, se presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno/molécula Fab. As substituições de aminoácidos são preferencialmente feitas em anticorpos (multiespecíficos) compreendendo uma molécula Fab, em que os domínios variáveis VL e VH1 da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro.

[000293] Em aspectos preferidos do anticorpo (multiespecífico) de acordo com a invenção, particularmente em que as substituições de aminoácidos, conforme descritas neste documento, são feitas no segundo (e, se presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno/molécula Fab, o domínio constante CL da segunda (e, se presente, terceira) molécula Fab é do isótipo kappa. Em outros aspectos do anticorpo (multiespecífico) de acordo com a invenção, particularmente em que as substituições de aminoácidos, conforme descritas neste documento, são feitas no primeiro domínio de ligação ao antígeno/molécula Fab, o domínio constante CL do primeiro domínio de ligação ao antígeno/molécula Fab é do isótipo kappa. Em alguns aspectos, o domínio constante CL do segundo (e, se presente, terceiro) domínio de ligação ao antígeno/molécula Fab e o domínio constante CL do primeiro domínio de ligação ao antígeno/molécula Fab são do isótipo kappa.

[000294] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo (multiespecífico) que compreende a) um primeiro domínio de ligação a antígeno que se liga a CD3, em que o primeiro domínio de ligação a antígeno é uma molécula Fab, em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro, e que compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade da cadeia pesada (HCDR) 1 da SEQ ID NO: 2, uma HCDR

2 da SEQ ID NO: 3 e uma HCDR 3 da SEQ ID NO: 5, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade da cadeia leve (LCDR) 1 da SEQ ID NO: 8, uma LCDR 2 da SEQ ID NO: 9 e uma LCDR 3 da SEQ ID NO: 10;

b) um segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, particularmente um antígeno de célula alvo, mais particularmente TYRP-1 ou EGFRvIII, em que o segundo domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab (convencional);

c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade;

em que, no domínio constante CL do segundo domínio de ligação ao antígeno em b), o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K)

(numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat)

(mais preferencialmente por arginina (R)), e em que, no domínio constante CH1 do segundo domínio de ligação ao antígeno em b), o aminoácido na posição

147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice

EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico

(E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que

(i) o primeiro domínio de ligação ao antígeno em a) é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab do segundo domínio de ligação ao antígeno em b), e o segundo domínio de ligação ao antígeno em b) é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N de uma das subunidades do domínio Fc em c), ou

(ii) o segundo domínio de ligação ao antígeno em b) é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada

Fab do primeiro domínio de ligação ao antígeno em a), e o primeiro domínio de ligação ao antígeno em a) é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N de uma das subunidades do domínio Fc em c).

[000295] Em um aspecto preferido, a invenção fornece um anticorpo (multiespecífico) compreendendo a) um primeiro domínio de ligação a antígeno que se liga a CD3, em que o primeiro domínio de ligação a antígeno é uma molécula Fab, em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro, e que compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade da cadeia pesada (HCDR) 1 da SEQ ID NO: 2, uma HCDR 2 da SEQ ID NO: 3 e uma HCDR 3 da SEQ ID NO: 5, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade da cadeia leve (LCDR) 1 da SEQ ID NO: 8, uma LCDR 2 da SEQ ID NO: 9 e uma LCDR 3 da SEQ ID NO: 10; b) um segundo e um terceiro domínio de ligação ao antígeno que se ligam a um segundo antígeno, particularmente um antígeno de célula alvo, mais particularmente TYRP-1 ou EGFRvIII, em que o segundo e o terceiro domínio de ligação ao antígeno são, cada um, uma molécula Fab (convencional); e c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade; em que, no domínio constante CL do segundo domínio de ligação ao antígeno em b) e no terceiro domínio de ligação ao antígeno em b), o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais preferencialmente por arginina (R)), e em que, no domínio constante CH1 do segundo domínio de ligação ao antígeno em b) e no terceiro domínio de ligação ao antígeno em b),

o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que (i) o primeiro domínio de ligação ao antígeno em a) é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab do segundo domínio de ligação ao antígeno em b), e o segundo domínio de ligação ao antígeno em b) e o terceiro domínio de ligação ao antígeno em b) são, cada um, fundidos no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N de uma das subunidades do domínio Fc em c), ou (ii) o segundo domínio de ligação ao antígeno em b) é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab do primeiro domínio de ligação ao antígeno em a), e o primeiro domínio de ligação ao antígeno em a) e o terceiro domínio de ligação ao antígeno em b) são, cada um, fundidos no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N de uma das subunidades do domínio Fc em c).

[000296] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo (multiespecífico) que compreende a) um primeiro domínio de ligação a antígeno que se liga a CD3, em que o primeiro domínio de ligação a antígeno é uma molécula Fab, em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro, e que compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade da cadeia pesada (HCDR) 1 da SEQ ID NO: 2, uma HCDR 2 da SEQ ID NO: 3 e uma HCDR 3 da SEQ ID NO: 5, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade da cadeia leve (LCDR) 1 da SEQ ID NO: 8, uma LCDR 2 da SEQ ID NO: 9 e uma LCDR 3 da SEQ ID NO: 10; b) um segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, particularmente um antígeno de célula alvo, mais particularmente TYRP-1 ou EGFRvIII, em que o segundo domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab (convencional); c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade; em que, no domínio constante CL do segundo domínio de ligação ao antígeno em b), o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais preferencialmente por arginina (R)), e em que, no domínio constante CH1 do segundo domínio de ligação ao antígeno em b), o aminoácido na posição 147 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno em a) e o segundo domínio de ligação ao antígeno em b) são, cada um, fundidos no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N de uma das subunidades do domínio Fc em c).

[000297] De acordo com qualquer um dos aspectos acima, os componentes do anticorpo (multiespecífico) (por exemplo, moléculas Fab, domínio Fc) podem ser fundidos diretamente ou através de vários ligantes, particularmente ligantes peptídicos compreendendo um ou mais aminoácidos, normalmente cerca de 2-20 aminoácidos, que são descritos neste documento ou são conhecidos na técnica. Os ligantes peptídicos não imunogênicos adequados incluem, por exemplo, ligantes peptídicos (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n ou G4(SG4)n, em que n é geralmente um número inteiro de 1 a 10, normalmente de

2 a 4.

[000298] Em um aspecto preferido, a invenção fornece um anticorpo (multiespecífico) compreendendo a) um primeiro domínio de ligação a antígeno que se liga a CD3, em que o primeiro domínio de ligação a antígeno é uma molécula Fab, em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro, e que compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade da cadeia pesada (HCDR) 1 da SEQ ID NO: 2, uma HCDR 2 da SEQ ID NO: 3 e uma HCDR 3 da SEQ ID NO: 5, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade da cadeia leve (LCDR) 1 da SEQ ID NO: 8, uma LCDR 2 da SEQ ID NO: 9 e uma LCDR 3 da SEQ ID NO: 10; b) um segundo e um terceiro domínio de ligação ao antígeno que se ligam ao TYRP-1, em que o segundo e o terceiro domínio de ligação ao antígeno são, cada um, uma molécula Fab (convencional), e que compreendem uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade da cadeia pesada (HCDR) 1 da SEQ ID NO: 15, uma HCDR 2 da SEQ ID NO: 16 e uma HCDR 3 da SEQ ID NO: 17, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade da cadeia leve (LCDR) 1 da SEQ ID NO: 19, uma LCDR 2 da SEQ ID NO: 20 e uma LCDR 3 da SEQ ID NO: 21; c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade; em que no domínio constante CL do segundo e do terceiro domínio de ligação ao antígeno em b), o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais preferencialmente por arginina (R)), e em que, no domínio constante CH1 do segundo e do terceiro domínio de ligação ao antígeno em b), o aminoácido na posição 147 é substituído por glutâmico ácido (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que adicionalmente o segundo domínio de ligação ao antígeno em b) é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab do primeiro domínio de ligação ao antígeno em a) e o primeiro domínio de ligação ao antígeno em a) e o terceiro domínio de ligação ao antígeno em b) são, cada um, fundidos no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N de uma das subunidades do domínio Fc em c).

[000299] Em um outro aspecto preferido, a invenção fornece um anticorpo (multiespecífico) que compreende a) um primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga a CD3, em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab, em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro, e que compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7, e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11; b) um segundo e um terceiro domínio de ligação ao antígeno que se ligam a TYRP-1, em que o segundo e o terceiro domínio de ligação ao antígeno são, cada um, uma molécula Fab (convencional), e que compreendem uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22;

c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade; em que no domínio constante CL do segundo e do terceiro domínio de ligação ao antígeno em b), o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais preferencialmente por arginina (R)), e em que, no domínio constante CH1 do segundo e do terceiro domínio de ligação ao antígeno em b), o aminoácido na posição 147 é substituído por glutâmico ácido (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que adicionalmente o segundo domínio de ligação ao antígeno em b) é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab do primeiro domínio de ligação ao antígeno em a) e o primeiro domínio de ligação ao antígeno em a) e o terceiro domínio de ligação ao antígeno em b) são, cada um, fundidos no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N de uma das subunidades do domínio Fc em c).

[000300] Em um aspecto preferido, a invenção fornece um anticorpo (multiespecífico) compreendendo a) um primeiro domínio de ligação a antígeno que se liga a CD3, em que o primeiro domínio de ligação a antígeno é uma molécula Fab, em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro, e que compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade da cadeia pesada (HCDR) 1 da SEQ ID NO: 2, uma HCDR 2 da SEQ ID NO: 3 e uma HCDR 3 da SEQ ID NO: 5, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade da cadeia leve (LCDR) 1 da SEQ ID NO: 8, uma LCDR 2 da SEQ ID NO: 9 e uma LCDR 3 da SEQ ID NO: 10;

b) um segundo e um terceiro domínio de ligação ao antígeno que se ligam a EGFRvIII, em que o segundo e o terceiro domínio de ligação ao antígeno são, cada um, uma molécula Fab (convencional), e que compreendem uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante de complementaridade da cadeia pesada (HCDR) 1 da SEQ ID NO: 85, uma HCDR 2 da SEQ ID NO: 86 e uma HCDR 3 da SEQ ID

NO: 87, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma região determinante de complementaridade da cadeia leve (LCDR) 1 da SEQ ID NO:

89, uma LCDR 2 da SEQ ID NO: 90 e uma LCDR 3 da SEQ ID NO: 91;

c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade;

em que no domínio constante CL do segundo e do terceiro domínio de ligação ao antígeno em b), o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina

(K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat)

(mais preferencialmente por arginina (R)), e em que, no domínio constante CH1 do segundo e do terceiro domínio de ligação ao antígeno em b), o aminoácido na posição 147 é substituído por glutâmico ácido (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat);

e em que adicionalmente o segundo domínio de ligação ao antígeno em b) é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab do primeiro domínio de ligação ao antígeno em a) e o primeiro domínio de ligação ao antígeno em a) e o terceiro domínio de ligação ao antígeno em b) são, cada um, fundidos no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N de uma das subunidades do domínio Fc em c).

[000301] Em um outro aspecto preferido, a invenção fornece um anticorpo (multiespecífico) que compreende a) um primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga a CD3, em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno é uma molécula Fab, em que os domínios variáveis VL e VH da cadeia leve Fab e da cadeia pesada Fab são substituídos um pelo outro, e que compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7, e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11; b) um segundo e um terceiro domínio de ligação ao antígeno que se ligam a EGFRvIII, em que o segundo e o terceiro domínio de ligação ao antígeno são, cada um, uma molécula Fab (convencional), e que compreendem uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 88 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 92; c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade; em que no domínio constante CL do segundo e do terceiro domínio de ligação ao antígeno em b), o aminoácido na posição 124 é substituído por lisina (K) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído por lisina (K) ou arginina (R) (numeração de acordo com Kabat) (mais preferencialmente por arginina (R)), e em que, no domínio constante CH1 do segundo e do terceiro domínio de ligação ao antígeno em b), o aminoácido na posição 147 é substituído por glutâmico ácido (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído por ácido glutâmico (E) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); e em que adicionalmente o segundo domínio de ligação ao antígeno em b) é fundido no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N da cadeia pesada Fab do primeiro domínio de ligação ao antígeno em a) e o primeiro domínio de ligação ao antígeno em a) e o terceiro domínio de ligação ao antígeno em b) são, cada um, fundidos no terminal C da cadeia pesada Fab ao terminal N de uma das subunidades do domínio Fc em c).

[000302] Em um aspecto de acordo com estes aspectos da invenção, na primeira subunidade do domínio Fc, o resíduo de treonina na posição 366 é substituído por um resíduo de triptofano (T366W), e, na segunda subunidade do domínio Fc, o resíduo de tirosina na posição 407 é substituído por um resíduo de valina (Y407V), e, opcionalmente, o resíduo de treonina na posição 366 é substituído por um resíduo de serina (T366S) e o resíduo de leucina na posição 368 é substituído por um resíduo de alanina (L368A) (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[000303] Em um aspecto adicional de acordo com estes aspectos da invenção, na primeira subunidade do domínio Fc, adicionalmente, o resíduo de serina na posição 354 é substituído por um resíduo de cisteína (S354C) ou o resíduo de ácido glutâmico na posição 356 é substituído por um resíduo de cisteína (E356C) (particularmente o resíduo de serina na posição 354 é substituído por um resíduo de cisteína), e, na segunda subunidade do domínio Fc, adicionalmente, o resíduo de tirosina na posição 349 é substituído por um resíduo de cisteína (Y349C) (numerações de acordo com índice EU de Kabat).

[000304] Em ainda um outro aspecto de acordo com estes aspectos da invenção, em cada uma da primeira e segunda subunidade do domínio Fc, o resíduo de leucina na posição 234 é substituído por um resíduo de alanina (L234A), o resíduo de leucina na posição 235 é substituído com um resíduo de alanina (L235A) e o resíduo de prolina na posição 329 é substituído por um resíduo de glicina (P329G) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[000305] Ainda em um aspecto adicional de acordo com estes aspectos da invenção, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG1 humana.

[000306] Em um aspecto específico preferido, o anticorpo (multiespecífico) compreende um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 23, um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 24, um polipeptídeo (particularmente dois polipeptídeos) compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 25, e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 27.

Em outro aspecto específico preferido, o anticorpo (multiespecífico) compreende um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24, um polipeptídeo (particularmente dois polipeptídeos) compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25 e um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27.

[000307] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo (multiespecífico) que se liga a CD3 e TYRP-1, que compreende um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 23, um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 24, um polipeptídeo (particularmente dois polipeptídeos) compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 25, e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 27. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo (multiespecífico) que se liga a CD3 e TYRP-1, compreendendo um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24, um polipeptídeo (particularmente dois polipeptídeos) compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25, e um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:

27.

[000308] Em um outro aspecto específico preferido, o anticorpo (multiespecífico) compreende um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 109, um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 110, um polipeptídeo (particularmente dois polipeptídeos) compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 111, e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 27. Em um aspecto específico adicional, o anticorpo (multiespecífico) compreende um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 109, um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 110, um polipeptídeo (particularmente dois polipeptídeos) compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 111 e um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27.

[000309] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo (multiespecífico) que se liga a CD3 e EGFRvIII, que compreende um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 109, um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 110, um polipeptídeo (particularmente dois polipeptídeos) compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 111, e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 27. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo (multiespecífico) que se liga a CD3 e EGFRvIII, que compreende um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 109, um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 110, um polipeptídeo (particularmente dois polipeptídeos) compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 111 e um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27.

8. VARIANTES DO DOMÍNIO FC

[000310] Em aspectos preferidos, o anticorpo (multiespecífico) da invenção compreende um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade.

[000311] O domínio Fc do anticorpo (multiespecífico) consiste em um par de cadeias polipeptídicas compreendendo domínios da cadeia pesada de uma molécula de imunoglobulina. Por exemplo, o domínio Fc de uma molécula de imunoglobulina G (IgG) é um dímero, cada subunidade do qual compreende os domínios constantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de IgG.

As duas subunidades do domínio Fc são capazes de associação estável uma com a outra. Em um aspecto, o anticorpo (multiespecífico) da invenção compreende não mais do que um domínio Fc.

[000312] Em um aspecto, o domínio Fc do anticorpo (multiespecífico) é um domínio Fc de IgG. Em um aspecto preferido, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG1. Em um aspecto, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG4. Em um aspecto mais específico, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG4 compreendendo uma substituição de aminoácidos na posição S228 (numeração de índice EU de Kabat), particularmente a substituição de aminoácidos S228P. Essa substituição de aminoácidos reduz a troca do braço Fab in vivo de anticorpos IgG4 (vide Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)). Em um outro aspecto preferido, o domínio Fc é um domínio Fc humano. Em um aspecto ainda mais preferido, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG1 humana. Uma sequência exemplar de uma região Fc de IgG1 humana é fornecida na SEQ ID NO: 117.

a) MODIFICAÇÕES DO DOMÍNIO FC PROMOVENDO A HETERODIMERIZAÇÃO

[000313] Os anticorpos (multiespecíficos) de acordo com a invenção compreendem diferentes domínios de ligação ao antígeno, que podem ser fundidos a uma ou outra das duas subunidades do domínio Fc, portanto, as duas subunidades do domínio Fc são normalmente compreendidas em duas cadeias polipeptídicas não idênticas. A coexpressão recombinante desses polipeptídeos e subsequente dimerização leva a várias combinações possíveis dos dois polipeptídeos. Para melhorar o rendimento e a pureza de anticorpos (multiespecíficos) na produção recombinante, será assim vantajoso introduzir no domínio Fc do anticorpo (multiespecífico) uma modificação que promove a associação dos polipeptídeos desejados.

[000314] Consequentemente, em aspectos preferidos, o domínio Fc do anticorpo (multiespecífico) de acordo com a invenção compreende uma modificação que promove a associação da primeira e da segunda subunidade do domínio Fc. O sítio da interação proteína-proteína mais extensa entre as duas subunidades de um domínio Fc de IgG humana está no domínio CH3 do domínio Fc. Assim, em um aspecto, a referida modificação está no domínio CH3 do domínio Fc.

[000315] Existem várias abordagens para modificações no domínio CH3 do domínio Fc a fim de reforçar a heterodimerização, que estão bem descritas, por exemplo, em WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012058768, WO 2013157954, WO

2013096291. Normalmente, em todas essas abordagens, o domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc e o domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc são ambos modificados de maneira complementar, de modo que cada domínio CH3 (ou a cadeia pesada que o compreende) não pode mais homodimerizar consigo mesmo, mas é forçado a heterodimerizar com o outro domínio CH3 com modificação complementar (de modo que o primeiro e o segundo domínio CH3 heterodimerizam e nenhum homodímero entre os dois primeiros ou os dois segundos domínios CH3 é formado). Estas diferentes abordagens para heterodimerização de cadeia pesada melhorada são contempladas como diferentes alternativas em combinação com as modificações da cadeia pesada-leve (por exemplo, troca/substituição de VH e VL em um braço de ligação e a introdução de substituições de aminoácidos carregados com cargas opostas na interface do CH1/CL) no anticorpo (multiespecífico) que reduz o pareamento incorreto da cadeia pesada/leve e produtos secundários do tipo Bence Jones.

[000316] Em um aspecto específico, a referida modificação que promove a associação da primeira e da segunda subunidades do domínio

Fc é uma modificação chamada de "protuberância-em-buraco" (knob-into-hole), que compreende uma modificação de "protuberância" em uma das duas subunidades do domínio Fc e uma modificação de “buraco” na outra das duas subunidades do domínio Fc.

[000317] A tecnologia protuberância-em-buraco é descrita por exemplo, em US 5.731.168; US 7.695.936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) e Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). Geralmente, o método envolve a introdução de uma protuberância ("knob") na interface de um primeiro polipeptídeo e um buraco correspondente ("hole") na interface de um segundo polipeptídeo, de tal modo que a protuberância pode ser posicionada no buraco de tal modo a promover a formação de heterodímeros e impedir a formação de homodímeros. As protuberâncias são construídas substituindo pequenas cadeias laterais de aminoácidos da interface do primeiro polipeptídeo por cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). Buracos compensatórios de tamanho idêntico ou semelhante às protuberâncias são criados na interface do segundo polipeptídeo, substituindo grandes cadeias laterais de aminoácidos por outras menores (por exemplo, alanina ou treonina).

[000318] Por conseguinte, em um aspecto preferido, no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc do anticorpo (multiespecífico), um resíduo de aminoácidos é substituído por um resíduo de aminoácidos com um volume de cadeia lateral maior, gerando assim uma protuberância dentro do CH3 domínio da primeira subunidade que é posicionável em um buraco dentro do domínio CH3 da segunda subunidade, e no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc, um resíduo de aminoácidos é substituído por um resíduo de aminoácidos com um volume de cadeia lateral menor, gerando assim um buraco dentro do domínio CH3 da segunda subunidade dentro da qual a protuberância dentro do domínio CH3 da primeira subunidade é posicionável.

[000319] De preferência, o referido resíduo de aminoácidos com um volume de cadeia lateral maior é selecionado a partir do grupo que consiste em arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) e triptofano (W).

[000320] De preferência, o referido resíduo de aminoácidos com um volume de cadeia lateral menor é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina (A), serina(s), treonina (T) e valina (V).

[000321] A protuberância e o buraco podem ser feitos alterando o ácido nucleico que codifica os polipeptídeos, por exemplo, por mutagênese específica para o sítio ou por síntese de peptídeos.

[000322] Em um aspecto específico, na (o domínio CH3 de) primeira subunidade do domínio Fc (a subunidade "protuberâncias"), o resíduo de treonina na posição 366 é substituído por um resíduo de triptofano (T366W), e na (o domínio CH3 de) segunda subunidade do domínio Fc (a subunidade "buracos"), o resíduo de tirosina na posição 407 é substituído por um resíduo de valina (Y407V). Em um aspecto, na segunda subunidade do domínio Fc, adicionalmente, o resíduo de treonina na posição 366 é substituído por um resíduo de serina (T366S) e o resíduo de leucina na posição 368 é substituído por um resíduo de alanina (L368A) (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[000323] Em ainda um aspecto adicional, na primeira subunidade do domínio Fc, adicionalmente, o resíduo de serina na posição 354 é substituído por um resíduo de cisteína (S354C) ou o resíduo de ácido glutâmico na posição 356 é substituído por um resíduo de cisteína (E356C) (particularmente o resíduo de serina na posição 354 é substituído por um resíduo de cisteína), e na segunda subunidade do domínio Fc, adicionalmente, o resíduo de tirosina na posição 349 é substituído por um resíduo de cisteína (Y349C) (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). A introdução desses dois resíduos de cisteína resulta na formação de uma ponte dissulfeto entre as duas subunidades do domínio Fc, estabilizando ainda mais o dímero (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).

[000324] Em um aspecto preferido, a primeira subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos S354C e T366W e a segunda subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos Y349C, T366S, L368A e Y407V (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[000325] Em um aspecto preferido, o domínio de ligação ao antígeno que se liga a CD3 é fundido (opcionalmente por meio do segundo domínio de ligação ao antígeno, que se liga a um segundo antígeno e/ou a um ligante peptídico) à primeira subunidade do domínio Fc (compreendendo a modificação "protuberância"). Sem desejar ser limitado pela teoria, a fusão do domínio de ligação ao antígeno que liga CD3 à subunidade contendo protuberância do domínio Fc irá (adicionalmente) minimizar a geração de anticorpos compreendendo dois domínios de ligação ao antígeno que se ligam a CD3 (choque estérico de dois polipeptídeos contendo protuberância).

[000326] Outras técnicas de modificação de CH3 para impor a heterodimerização são contempladas como alternativas de acordo com a invenção e são descritas, por exemplo, em WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291.

[000327] Em um aspecto, a abordagem de heterodimerização descrita em EP 1870459 é usada alternativamente. Essa abordagem é baseada na introdução de aminoácidos carregados com cargas opostas em posições de aminoácidos específicas na interface do domínio CH3/CH3 entre as duas subunidades do domínio Fc. Um aspecto particular para o anticorpo (multiespecífico) da invenção são as mutações de aminoácidos R409D; K370E em um dos dois domínios CH3 (do domínio Fc) e mutações de aminoácidos D399K; E357K no outro dos domínios CH3 do domínio Fc (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[000328] Em outro aspecto, o anticorpo (multiespecífico) da invenção compreende a mutação de aminoácidos T366W no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc, as mutações de aminoácidos T366S, L368A, Y407V no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc, as mutações de aminoácidos R409D; K370E no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc e mutações de aminoácidos D399K; E357K no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[000329] Em outro aspecto, o anticorpo (multiespecífico) da invenção compreende as mutações de aminoácidos S354C, T366W no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc,as mutações de aminoácidos Y349C, T366S, L368A, Y407V no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc, ou o referido anticorpo (multiespecífico) compreende as mutações de aminoácidos Y349C, T366W no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc, as mutações de aminoácidos S354C, T366S, L368A, Y407V nos domínios CH3 da segunda subunidade do domínio Fc, as mutações de aminoácidos R409D; K370E no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc e as mutações de aminoácidos D399K; E357K no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc (todas as numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[000330] Em um aspecto, a abordagem de heterodimerização descrita em WO 2013/157953 é usada alternativamente. Em um aspecto, um primeiro domínio CH3 compreende a mutação de aminoácidos T366K e um segundo domínio CH3 compreende a mutação de aminoácidos L351D (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em um outro aspecto, o primeiro domínio CH3 compreende adicionalmente a mutação de aminoácidos L351K. Em um outro aspecto, o segundo domínio CH3 compreende adicionalmente uma mutação de aminoácidos selecionada a partir de Y349E, Y349D e L368E (particularmente L368E) (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[000331] Em um aspecto, a abordagem de heterodimerização descrita em WO 2012/058768 é usada alternativamente. Em um aspecto, um primeiro domínio CH3 compreende as mutações de aminoácidos L351Y, Y407A e um segundo domínio CH3 compreende as mutações de aminoácidos T366A, K409F. Em um outro aspecto, o segundo domínio CH3 compreende uma outra mutação de aminoácido na posição T411, D399, S400, F405, N390 ou K392, por exemplo, selecionada a partir de a) T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E ou T411W, b) D399R, D399W, D399Y ou D399K, c) S400E, S400D, S400R, ou S400K, d) F405I, F405M, F405T, F405S, F405V ou F405W, e) N390R, N390K or N390D, f) K392V, K392M, K392R, K392L, K392F ou K392E (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em um outro aspecto, um primeiro domínio CH3 compreende as mutações de aminoácidos L351Y, Y407A e um segundo domínio CH3 compreende as mutações de aminoácidos T366V, K409F. Em um outro aspecto, um primeiro domínio CH3 compreende a mutação de aminoácidos Y407A e um segundo domínio CH3 compreende as mutações de aminoácidos T366A, K409F. Em um outro aspecto, o segundo domínio CH3 compreende adicionalmente as mutações de aminoácidos K392E, T411E, D399R e S400R (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[000332] Em um aspecto, a abordagem de heterodimerização descrita em WO 2011/143545 é usada alternativamente, por exemplo, com a modificação de aminoácidos em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste em 368 e 409 (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[000333] Em um aspecto, a abordagem de heterodimerização descrita em WO 2011/090762, que também usa a tecnologia de "protuberância- em-buraco" descrita acima, é usada alternativamente. Em um aspecto, um primeiro domínio CH3 compreende a mutação de aminoácidos T366W e um segundo domínio CH3 compreende a mutação de aminoácidos Y407A. Em um aspecto, um primeiro domínio CH3 compreende a mutação de aminoácidos T366Y e um segundo domínio CH3 compreende a mutação de aminoácidos Y407T (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[000334] Em um aspecto, o anticorpo (multiespecífico) ou seu domínio Fc é da subclasse IgG2 e a abordagem de heterodimerização descrita em WO 2010/129304 é usada alternativamente.

[000335] Em um aspecto alternativo, uma modificação que promove a associação da primeira e da segunda subunidades do domínio Fc compreende uma modificação que medeia os efeitos de direcionamento eletrostático, por exemplo, conforme descrito na publicação PCT WO 2009/089004. Geralmente, esse método envolve a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos na interface das duas subunidades do domínio Fc por resíduos de aminoácidos carregados de modo que a formação de homodímeros se torne eletrostaticamente desfavorável, mas a heterodimerização eletrostaticamente favorável. Em um tal aspecto, um primeiro domínio CH3 compreende a substituição de aminoácidos de K392 ou N392 por um aminoácido carregado negativamente (por exemplo, ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D), particularmente K392D ou N392D) e um segundo domínio CH3 compreende a substituição de aminoácidos de D399, E356, D356 ou E357 por um aminoácido carregado positivamente (por exemplo, lisina (K) ou arginina (R), particularmente D399K, E356K, D356K ou E357K, e mais particularmente D399K e E356K). Em um outro aspecto, o primeiro domínio CH3 compreende ainda a substituição de aminoácidos de K409 ou

R409 por um aminoácido carregado negativamente (por exemplo, ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D), particularmente K409D ou R409D). Em um outro aspecto, o primeiro domínio CH3 compreende adicionalmente ou alternativamente a substituição de aminoácidos de K439 e/ou K370 por um aminoácido carregado negativamente (por exemplo, ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D)) (todas as numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[000336] Em ainda um aspecto adicional, a abordagem de heterodimerização descrita em WO 2007/147901 é usada alternativamente. Em um aspecto, um primeiro domínio CH3 compreende as mutações de aminoácidos K253E, D282K e K322D e um segundo domínio CH3 compreende as mutações de aminoácidos D239K, E240K e K292D (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[000337] Em ainda outro aspecto, a abordagem de heterodimerização descrita em WO 2007/110205 pode ser usada alternativamente.

[000338] Em um aspecto, a primeira subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos K392D e K409D, e a segunda subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos D356K e D399K (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

b) MODIFICAÇÕES DO DOMÍNIO FC REDUZINDO A LIGAÇÃO AO RECEPTOR FC E/OU

FUNÇÃO EFETORA

[000339] O domínio Fc confere ao anticorpo (multiespecífico) propriedades farmacocinéticas favoráveis, incluindo uma meia-vida sérica longa que contribui para uma boa acumulação no tecido alvo e uma razão de distribuição tecido-sangue favorável. Ao mesmo tempo, ele pode, no entanto, levar ao direcionamento indesejável do anticorpo (multiespecífico) para células que expressam receptores Fc em vez de para as células portadoras de antígeno preferidas. Além disso, a coativação das vias de sinalização do receptor Fc pode levar à liberação de citocinas que, em combinação com as propriedades de ativação de células T e a meia-vida longa do anticorpo (multiespecífico), resulta na ativação excessiva de receptores de citocinas e efeitos colaterais graves após administração sistêmica. A ativação de células imunes (portadoras do receptor Fc) diferentes das células T pode até reduzir a eficácia do anticorpo (multiespecífico) devido à destruição potencial de células T, por exemplo, por células NK.

[000340] Consequentemente, em aspectos preferidos, o domínio Fc do anticorpo (multiespecífico) de acordo com a invenção exibe afinidade de ligação reduzida para um receptor Fc e/ou função efetora reduzida, em comparação com um domínio Fc de IgG1 nativo. Em um tal aspecto, o domínio Fc (ou o anticorpo (multiespecífico) compreendendo o referido domínio Fc) exibe menos de 50%, particularmente menos de 20%, mais particularmente menos de 10% e mais particularmente menos de 5% da afinidade de ligação a um receptor Fc, em comparação com um domínio Fc de IgG 1 nativo (ou um anticorpo (multiespecífico) compreendendo um domínio Fc de IgG 1 nativo) e/ou menos de 50%, particularmente menos de 20%, mais particularmente menos de 10% e mais particularmente menos de 5% da função efetora, em comparação com um domínio Fc de IgG1 nativo (ou um anticorpo (multiespecífico) compreendendo um domínio Fc de IgG1 nativo). Em um aspecto, o domínio Fc (ou o anticorpo (multiespecífico) compreendendo o referido domínio Fc) não se liga substancialmente a um receptor Fc e/ou induz a função efetora. Em um aspecto preferido, o receptor Fc é um receptor Fcγ.

Em um aspecto, o receptor Fc é um receptor Fc humano. Em um aspecto, o receptor Fc é um receptor Fc ativador. Em um aspecto específico, o receptor Fc é um receptor Fcγ humano de ativação, mais especificamente FcγRIIIa, FcγRI ou FcγRIIa humano, mais especificamente FcγRIIIa humano. Em um aspecto, a função efetora é uma ou mais selecionadas a partir do grupo de CDC, ADCC, ADCP e secreção de citocina. Em um aspecto preferido, a função efetora é ADCC. Em um aspecto, o domínio do domínio Fc exibe afinidade de ligação substancialmente semelhante ao receptor Fc neonatal (FcRn), em comparação com um domínio do domínio Fc de IgG1 nativo. A ligação substancialmente semelhante ao FcRn é alcançada quando o domínio Fc (ou o anticorpo (multiespecífico) compreendendo o referido domínio Fc) exibe mais do que cerca de 70%, particularmente mais do que cerca de 80%, mais particularmente mais do que cerca de 90% da afinidade de ligação de um domínio Fc de IgG1 nativo (ou o anticorpo (multiespecífico) compreendendo um domínio Fc de IgG1 nativo) ao FcRn.

[000341] Em certos aspectos, o domínio Fc é modificado para ter afinidade de ligação reduzida a um receptor Fc e/ou função efetora reduzida, em comparação com um domínio Fc não modificado. Em aspectos preferidos, o domínio Fc do anticorpo (multiespecífico) compreende uma ou mais mutações de aminoácidos que reduzem a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor Fc e/ou função efetora. Normalmente, a mesma mutação de um ou mais aminoácidos está presente em cada uma das duas subunidades do domínio Fc. Em um aspecto, a mutação de aminoácidos reduz a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor Fc. Em um aspecto, a mutação de aminoácidso reduz a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor Fc em pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes ou pelo menos 10 vezes. Em aspectos onde há mais de uma mutação de aminoácidos que reduz a afinidade de ligação do domínio Fc ao receptor Fc, a combinação dessas mutações de aminoácidos pode reduzir a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor Fc em pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, ou mesmo pelo menos 50 vezes. Em um aspecto, o anticorpo (multiespecífico) compreendendo um domínio Fc modificado exibe menos que 20%, particularmente menos que 10%,

mais particularmente menos que 5% da afinidade de ligação a um receptor Fc em comparação com um anticorpo (multiespecífico) compreendendo um domínio Fc não modificado. Em um aspecto preferido, o receptor Fc é um receptor Fcγ. Em alguns aspectos, o receptor Fc é um receptor Fc humano. Em alguns aspectos, o receptor Fc é um receptor Fc ativador. Em um aspecto específico, o receptor Fc é um receptor Fcγ humano de ativação, mais especificamente FcγRIIIa, FcγRI ou FcγRIIa humano, mais especificamente FcγRIIIa humano. De preferência, a ligação a cada um desses receptores é reduzida. Em alguns aspectos, a afinidade de ligação a um componente do complemento, especificamente a afinidade de ligação a C1q, também é reduzida. Em um aspecto, a afinidade de ligação ao receptor Fc neonatal (FcRn) não é reduzida. A ligação substancialmente semelhante ao FcRn, ou seja, preservação da afinidade de ligação do domínio Fc ao referido receptor, é alcançada quando o domínio Fc (ou o anticorpo (multiespecífico) compreendendo o referido domínio Fc) exibe mais do que cerca de 70% da afinidade de ligação de uma forma não manipulada do domínio Fc (ou o anticorpo (multiespecífico) compreendendo a referida forma não manipulada do domínio Fc) ao FcRn. O domínio Fc, ou anticorpos (multiespecíficos) da invenção compreendendo o referido domínio Fc, podem exibir mais do que cerca de 80% e ainda mais do que cerca de 90% de tal afinidade. Em certos aspectos, o domínio Fc do anticorpo (multiespecífico) é modificado para ter função efetora reduzida, em comparação com um domínio Fc não modificado.

A função efetora reduzida pode incluir, mas não está limitada a, um ou mais dos seguintes: citotoxicidade dependente de complemento (CDC) reduzida, citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC) reduzida, fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP) reduzida, secreção de citocinas reduzida, captação de antígenos mediada por imunocomplexos pelas células apresentadoras de antígenos reduzida, ligação a células NK reduzida,

ligação a macrófagos reduzida, ligação a monócitos reduzida, ligação a células polimorfonucleares reduzida, sinalização direta induzindo apoptose reduzida, reticulação de anticorpos ligados a alvos reduzida, maturação das células dendríticas reduzida ou iniciação das células T reduzida. Em um aspecto, a função efetora reduzida é uma ou mais das selecionadas do grupo de CDC reduzida, ADCC reduzida, ADCP reduzida e secreção de citocina reduzida. Em um aspecto preferido, a função efetora reduzida é ADCC reduzida. Em um aspecto, a ADCC reduzida é inferior a 20% da ADCC induzida por um domínio Fc não manipulado (ou um anticorpo (multiespecífico) compreendendo um domínio Fc não manipulado).

[000342] Em um aspecto, a mutação de aminoácidos que reduz a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor Fc e/ou função efetora é uma substituição de aminoácidos. Em um aspecto, o domínio Fc compreende uma substituição de aminoácidos em uma posição selecionada a partir do grupo de E233, L234, L235, N297, P331 e P329 (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em um aspecto mais específico, o domínio Fc compreende uma substituição de aminoácidos em uma posição selecionada a partir do grupo de L234, L235 e P329 (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em alguns aspectos, o domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos L234A e L235A (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em um tal aspecto, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG 1, particularmente um domínio Fc de IgG1 humana. Em um aspecto, o domínio Fc compreende uma substituição de aminoácidos na posição P329. Em um aspecto mais específico, a substituição de aminoácidos é P329A ou P329G, particularmente P329G (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em um aspecto, o domínio Fc compreende uma substituição de aminoácidos na posição P329 e uma outra substituição de aminoácidos em uma posição selecionada a partir de E233, L234, L235, N297 e P331 (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em um aspecto mais específico, a outra substituição de aminoácidos é E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D ou P331S. Em aspectos preferidos, o domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos nas posições P329, L234 e L235 (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em aspectos mais preferidos, o domínio Fc compreende as mutações de aminoácidos L234A, L235A e P329G (“P329G LALA”, “PGLALA” ou “LALAPG”). Especificamente, em aspectos preferidos, cada subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos L234A, L235A e P329G (numeração do índice EU de Kabat), ou seja, em cada uma da primeira e segunda subunidade do domínio Fc, o resíduo de leucina na posição 234 é substituído por um resíduo de alanina (L234A), o resíduo de leucina na posição 235 é substituído por um resíduo de alanina (L235A) e o resíduo de prolina na posição 329 é substituído por um resíduo de glicina (P329G) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[000343] Em um tal aspecto, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG1, particularmente um domínio Fc de IgG1 humana. A combinação “P329G LALA” de substituições de aminoácidos quase completamente abole a ligação ao receptor Fcγ (bem como complemento) de um domínio Fc de IgG 1 humana, conforme descrito na publicação PCT nº WO 2012/130831, que é incorporada neste documento por referência em sua totalidade. WO 2012/130831 também descreve métodos de preparação de tais domínios Fc mutantes e métodos para determinar suas propriedades, tais como ligação ao receptor Fc ou funções efetoras.

[000344] Os anticorpos IgG4 exibem afinidade de ligação reduzida aos receptores Fc e funções efetoras reduzidas em comparação com os anticorpos IgG1. Portanto, em alguns aspectos, o domínio Fc dos anticorpos (multiespecíficos) da invenção é um domínio Fc de IgG 4, particularmente um domínio Fc de IgG4 humana. Em um aspecto, o domínio Fc de IgG4 compreende uma substituição de aminoácidos na posição S228, especificamente a substituição de aminoácidos S228P (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Para reduzir ainda mais sua afinidade de ligação a um receptor Fc e/ou sua função efetora, em um aspecto, o domínio Fc de IgG 4 compreende uma substituição de aminoácidos na posição L235, especificamente a substituição de aminoácidos L235E (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em outro aspecto, o domínio Fc de IgG 4 compreende uma substituição de aminoácidos na posição P329, especificamente a substituição de aminoácidos P329G (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Em um aspecto preferido, o domínio Fc de IgG 4 compreende as substituições de aminoácidos nas posições S228, L235 e P329, especificamente as substituições de aminoácidos S228P, L235E e P329G (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Tais mutantes do domínio Fc de IgG4 e suas propriedades de ligação ao receptor Fcγ são descritos na publicação PCT nº WO 2012/130831, incorporada neste documento por referência em sua totalidade.

[000345] Em um aspecto preferido, o domínio Fc que exibe afinidade de ligação reduzida a um receptor Fc e/ou função efetora reduzida, em comparação com um domínio Fc de IgG1 nativo, é um domínio Fc de IgG1 humana compreendendo as substituições de aminoácidos L234A, L235A e opcionalmente P329G, ou um domínio Fc de IgG 4 humana compreendendo as substituições de aminoácidos S228P, L235E e opcionalmente P329G (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[000346] Em certos aspectos, a N-glicosilação do domínio Fc foi eliminada. Em um tal aspecto, o domínio Fc compreende uma mutação de aminoácidos na posição N297, particularmente uma substituição de aminoácidos substituindo asparagina por alanina (N297A) ou ácido aspártico (N297D) (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

[000347] Além dos domínios Fc descritos acima e na publicação PCT nº WO 2012/130831, os domínios Fc com ligação ao receptor Fc e/ou função efetora reduzidas também incluem aqueles com substituição de um ou mais dos resíduos do domínio Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (Patente dos EUA de nº 6.737.056) (numerações de acordo com o índice EU de Kabat). Tais mutantes Fc incluem mutantes Fc com substituições em duas ou mais posições de aminoácidos 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo o denominado mutante Fc "DANA" com substituição dos resíduos 265 e 297 por alanina (Patente dos EUA de nº 7.332.581).

[000348] Os domínios Fc mutantes podem ser preparados por deleção, substituição, inserção ou modificação de aminoácidos usando métodos genéticos ou químicos bem conhecidos na técnica. Os métodos genéticos podem incluir mutagênese específica para o sítio da sequência de DNA codificadora, PCR, síntese de genes e similares. As alterações corretas de nucleotídeos podem ser verificadas, por exemplo, por sequenciamento.

[000349] A ligação a receptores Fc pode ser facilmente determinada, por exemplo, por ELISA, ou por Ressonância de plásmon de Superfície (SPR) usando instrumentação padrão, tal como um instrumento BIAcore (GE Healthcare), e receptores Fc, tais como podem ser obtidos por expressão recombinante. Alternativamente, a afinidade de ligação de domínios Fc ou anticorpos (multiespecíficos) compreendendo um domínio Fc para receptores Fc pode ser avaliada usando linhagens celulares conhecidas por expressarem receptores Fc particulares, tais como células NK humanas que expressam o receptor FcγIIIa.

[000350] A função efetora de um domínio Fc, ou um anticorpo (multiespecífico) compreendendo um domínio Fc, pode ser medida por métodos conhecidos na técnica. Exemplos de ensaios in vitro para avaliar a atividade ADCC de uma molécula de interesse são descritos na Patente dos

EUA de nº 5.500.362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) e Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); Patente dos EUA de nº 5.821.337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351- 1361 (1987). Alternativamente, ensaios não radioativos podem ser empregados (vide, por exemplo, ensaio de citotoxicidade não radioativa ACTI™ para citometria de fluxo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); e ensaio de citotoxicidade não radioativo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI)). Células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células Natural Killer (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como o divulgado em Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998).

[000351] Em alguns aspectos, a ligação do domínio Fc a um componente do complemento, especificamente a C1q, é reduzida. Por conseguinte, em alguns aspectos, nos quais o domínio Fc é modificado para ter função efetora reduzida, a referida função efetora reduzida inclui CDC reduzida.

Os ensaios de ligação a C1q podem ser realizados para determinar se o domínio Fc, ou o anticorpo (multiespecífico) que compreende o domínio Fc, é capaz de se ligar a C1q e, portanto, ter atividade CDC. Vide, por exemplo, ELISA de ligação a C1q e C3c em WO 2006/029879 e WO 2005/100402. Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio de CDC pode ser realizado (vide, por exemplo, Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); e Cragg e Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).

[000352] A ligação ao FcRn e as determinações de eliminação/meia-vida in vivo também podem ser realizadas usando métodos conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Petkova, SB et al., Int'l. Immunol. 18 (12):1759-1769 (2006); WO 2013/120929).

B. POLINUCLEOTÍDEOS

[000353] A invenção fornece ainda um polinucleotídeo isolado que codifica um anticorpo da invenção. O referido polinucleotídeo isolado pode ser um único polinucleotídeo ou uma pluralidade de polinucleotídeos.

[000354] Os polinucleotídeos que codificam os anticorpos (multiespecíficos) da invenção podem ser expressos como um único polinucleotídeo que codifica o anticorpo inteiro ou como polinucleotídeos múltiplos (por exemplo, dois ou mais) que são coexpressos. Os polipeptídeos codificados por polinucleotídeos que são coexpressos podem se associar através de, por exemplo, ligações dissulfeto ou outros meios para formar um anticorpo funcional. Por exemplo, a porção da cadeia leve de um anticorpo pode ser codificada por um polinucleotídeo separado da porção do anticorpo que compreende a cadeia pesada do anticorpo. Quando coexpressos, os polipeptídeos da cadeia pesada irão se associar aos polipeptídeos da cadeia leve para formar o anticorpo. Em outro exemplo, a porção do anticorpo que compreende uma das duas subunidades do domínio Fc e, opcionalmente (parte de) uma ou mais moléculas Fab podem ser codificadas por um polinucleotídeo separado da porção do anticorpo que compreende a outra das duas subunidades do domínio Fc e opcionalmente (parte de) uma molécula Fab. Quando coexpressas, as subunidades do domínio Fc irão se associar para formar o domínio Fc.

[000355] Em alguns aspectos, o polinucleotídeo isolado codifica toda a molécula de anticorpo de acordo com a invenção, conforme descrito neste documento. Em outros aspectos, o polinucleotídeo isolado codifica um polipeptídeo compreendido no anticorpo de acordo com a invenção, conforme descrito neste documento.

[000356] Em certos aspectos, o polinucleotídeo ou ácido nucleico é DNA. Em outros aspectos, um polinucleotídeo da presente invenção é RNA, por exemplo, na forma de RNA mensageiro (mRNA). O RNA da presente invenção pode ser de cadeia simples ou de cadeia dupla.

C. MÉTODOS RECOMBINANTES

[000357] Os anticorpos da invenção podem ser obtidos, por exemplo, por síntese de peptídeos em estado sólido (por exemplo, síntese em fase sólida de Merrifield) ou produção recombinante. Para a produção recombinante, um ou mais polinucleotídeos que codificam o anticorpo, por exemplo, como descrito acima, são isolados e inseridos em um ou mais vetores para posterior clonagem e/ou expressão em uma célula hospedeira. Tal polinucleotídeo pode ser facilmente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais. Em um aspecto, um vetor, particularmente um vetor de expressão, compreendendo o polinucleotídeo (isto é, um único polinucleotídeo ou uma pluralidade de polinucleotídeos) da invenção é fornecido. Os métodos que são bem conhecidos pelos técnicos no assunto podem ser usados para construir vetores de expressão contendo a sequência de codificação de um anticorpo juntamente com sinais de controle de transcrição/tradução apropriados. Esses métodos incluem técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas e recombinação genética/recombinação in vivo. Vide, por exemplo, as técnicas descritas em Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); e Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates e Wiley Interscience, N.Y (1989). O vetor de expressão pode ser parte de um plasmídeo, vírus ou pode ser um fragmento de ácido nucleico. O vetor de expressão inclui um cassete de expressão no qual o polinucleotídeo que codifica o anticorpo (isto é, a região de codificação) é clonado em associação operável com um promotor e/ou outros elementos de controle de transcrição ou tradução. Conforme usado neste documento, uma "região de codificação" é uma porção de ácido nucleico que consiste em códons traduzidos em aminoácidos. Embora um "códon de parada" (TAG, TGA ou TAA) não seja traduzido em um aminoácido, ele pode ser considerado parte de uma região de codificação, se presente, mas quaisquer sequências de flanqueamento, por exemplo, promotores, sítios de ligação ao ribossomo, terminadores transcricionais, íntrons, regiões 5' e 3' não traduzidas e similares, não fazem parte de uma região de codificação. Duas ou mais regiões de codificação podem estar presentes em um único construto de polinucleotídeo, por exemplo, em um único vetor, ou em construtos de polinucleotídeo separados, por exemplo, em vetores separados (diferentes).

Além disso, qualquer vetor pode conter uma única região de codificação, ou pode compreender duas ou mais regiões de codificação, por exemplo, um vetor da presente invenção pode codificar um ou mais polipeptídeos, que são pós ou cotraducionais separados nas proteínas finais por meio de clivagem proteolítica.

Além disso, um vetor, polinucleotídeo ou ácido nucleico da invenção pode codificar regiões de codificação heterólogas, fundidas ou não fundidas a um polinucleotídeo que codifica o anticorpo da invenção, ou variante ou derivado do mesmo. As regiões de codificação heterólogas incluem, sem limitação, elementos ou motivos especializados, tais como um peptídeo sinal secretor ou um domínio funcional heterólogo. Uma associação operável é quando uma região codificadora para um produto gênico, por exemplo, um polipeptídeo, está associada a uma ou mais sequências regulatórias de tal modo a colocar a expressão do produto gênico sob a influência ou controle da(s) sequência(s) reguladora(s). Dois fragmentos de DNA (tais como uma região codificadora de polipeptídeo e um promotor associado a ela) são "operativamente associados" se a indução da função do promotor resultar na transcrição do mRNA que codifica o produto gênico desejado e se a natureza da ligação entre os dois fragmentos de DNA não interfere com a capacidade das sequências reguladoras de expressão de dirigir a expressão do produto gênico ou interfere com a capacidade do molde de DNA de ser transcrito. Assim, uma região promotora seria operacionalmente associada a um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo se o promotor fosse capaz de efetuar a transcrição desse ácido nucleico. O promotor pode ser um promotor específico da célula que dirige a transcrição substancial do DNA apenas em células predeterminadas.

Outros elementos de controle da transcrição, além de um promotor, por exemplo, intensificadores, operadores, repressores e sinais de terminação da transcrição, podem ser operacionalmente associados ao polinucleotídeo para direcionar a transcrição específica da célula. Promotores adequados e outras regiões de controle da transcrição são divulgados neste documento. Uma variedade de regiões de controle de transcrição é conhecida pelos técnicos no assunto. Essas incluem, sem limitação, regiões de controle de transcrição, que funcionam em células de vertebrados, tais como, mas não se limitando a, segmentos promotores e intensificadores de citomegalovírus (por exemplo, o promotor inicial imediato, em conjunto com o íntron-A), vírus símio 40 (por exemplo o promotor inicial) e retrovírus (tal como, por exemplo, vírus do sarcoma de Rous). Outras regiões de controle de transcrição incluem aquelas derivadas de genes de vertebrados, tais como actina, proteína de choque térmico, hormônio de crescimento bovino e β-globina de coelho, bem como outras sequências capazes de controlar a expressão de genes em células eucarióticas. As regiões de controle de transcrição adequadas adicionais incluem promotores e intensificadores específicos de tecido, bem como promotores indutíveis (por exemplo, promotores indutíveis por tetraciclinas). Da mesma forma, uma variedade de elementos de controle de tradução é conhecida por aqueles técnicos no assunto. Esses incluem, mas não estão limitados a, sítios de ligação ao ribossomo, códons de iniciação e terminação da tradução e elementos derivados de sistemas virais (particularmente um sítio de entrada do ribossomo interno, ou IRES, também referido como uma sequência CITE). O cassete de expressão também pode incluir outras características, tais como uma origem de replicação e/ou elementos de integração cromossômica, tais como repetições terminais longas retrovirais (LTRs) ou repetições terminais invertidas (ITRs) virais adeno-associadas (AAV).

[000358] As regiões de codificação de polinucleotídeo e ácido nucleico da presente invenção podem ser associadas a regiões de codificação adicionais que codificam peptídeos secretores ou sinal, que dirigem a secreção de um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo da presente invenção.

Por exemplo, se a secreção do anticorpo for desejada, o DNA que codifica uma sequência sinal pode ser colocado a montante do ácido nucleico que codifica um anticorpo da invenção ou um fragmento do mesmo. De acordo com a hipótese de sinal, as proteínas segregadas por células de mamíferos têm um peptídeo sinal ou sequência líder secretora que são clivados da proteína madura assim que a exportação da cadeia protéica em crescimento através do retículo endoplasmático rugoso foi iniciada. Aqueles técnicos no assunto estão cientes de que os polipeptídeos secretados por células de vertebrados geralmente têm um peptídeo sinal fundido ao terminal N do polipeptídeo, que é clivado do polipeptídeo traduzido para produzir uma forma secretada ou "madura" do polipeptídeo. Em certos aspectos, o peptídeo sinal nativo, por exemplo, uma cadeia pesada de imunoglobulina ou peptídeo sinal da cadeia leve é usado, ou um derivado funcional dessa sequência que retém a capacidade de dirigir a secreção do polipeptídeo que está operacionalmente associado a ele. Alternativamente, um peptídeo sinal de mamífero heterólogo, ou um derivado funcional do mesmo, pode ser usado. Por exemplo, a sequência líder do tipo selvagem pode ser substituída pela sequência líder do ativador do plasminogênio de tecido humano (TPA) ou β-glucuronidase de camundongo.

[000359] O DNA que codifica uma sequência proteica curta que pode ser usada para facilitar a purificação posterior (por exemplo, um marcador de histidina) ou auxiliar na marcação do anticorpo pode ser incluído dentro ou nas extremidades do polinucleotídeo que codifica o anticorpo (fragmento).

[000360] Em um aspecto adicional, é fornecida uma célula hospedeira compreendendo um polinucleotídeo (isto é, um único polinucleotídeo ou uma pluralidade de polinucleotídeos) da invenção. Em certos aspectos, é fornecida uma célula hospedeira compreendendo um vetor da invenção. Os polinucleotídeos e vetores podem incorporar qualquer uma das características, individualmente ou em combinação, descritas neste documento em relação aos polinucleotídeos e vetores, respectivamente. Em um tal aspecto, uma célula hospedeira compreende (por exemplo, foi transformada ou transfectada com) um ou mais vetores compreendendo um ou mais polinucleotídeos que codificam (parte de) um anticorpo da invenção.

Conforme usado neste documento, o termo "célula hospedeira" refere-se a qualquer tipo de sistema celular que pode ser modificado para gerar o anticorpo da invenção ou fragmentos do mesmo. As células hospedeiras adequadas para replicação e para suportar a expressão de anticorpos são bem conhecidas na técnica. Tais células podem ser transfectadas ou transduzidas conforme apropriado com o vetor de expressão particular e grandes quantidades de células contendo vetor podem ser cultivadas para semear fermentadores em grande escala para obter quantidades suficientes do anticorpo para aplicações clínicas. As células hospedeiras adequadas incluem micro-organismos procarióticos, tais como E. coli, ou várias células eucarióticas, tais como células de ovário de hamster chinês (CHO), células de inseto ou similares. Por exemplo, os polipeptídeos podem ser produzidos em bactérias, em particular quando a glicosilação não é necessária. Após a expressão, o polipeptídeo pode ser isolado a partir da pasta de células bacterianas em uma fração solúvel e pode ser posteriormente purificado. Além de procariotos, micróbios eucarióticos, tais como fungos filamentosos ou leveduras, são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vetores que codificam polipeptídeos, incluindo cepas de fungos e leveduras cujas vias de glicosilação foram "humanizadas", resultando na produção de um polipeptídeo com um ou padrão de glicosilação totalmente humano. Vide Gerngross, T.U., Nat. Biotech.

22:1409-1414 (2004); e Li, H. et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006). As células hospedeiras adequadas para a expressão de polipeptídeos (glicosilados) também são derivadas de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados). Exemplos de células de invertebrados incluem células de plantas e de insetos. Numerosas cepas de baculovirais foram identificadas, as quais podem ser usadas em conjunto com células de inseto, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda. As culturas de células vegetais também podem ser usadas como hospedeiros. Vide, por exemplo Patentes dos EUA de nºs 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 e

6.417.429 (descrevendo a tecnologia PLANTIBODIESTM para a produção de anticorpos em plantas transgênicas). As células de vertebrados podem também ser usadas como hospedeiros. Por exemplo, linhagens celulares de mamíferos que são adaptadas para crescer em suspensão podem ser úteis. Outros exemplos de linhagens celulares hospedeiras de mamífero úteis são a linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7); linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293T como descrito, por exemplo, em Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)), células de rim de hamster bebê (BHK), células de Sertoli de camundongo (células TM4 como descrito, por exemplo, em Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)), células de rim de macaco (CV1), células de rim de macaco verde africano (VERO-76), células de carcinoma cervical humano (HELA), células de rim canino (MDCK), células do fígado de rato búfalo (BRL 3A), células do pulmão humano (W138), células do fígado humano (Hep G2), células do tumor mamário de camundongo (MMT 060562), células TRI (como descrito, por exemplo, em Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)), células MRC 5 e células FS4. Outras linhagens celulares hospedeiras de mamíferos úteis incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células CHO dhfr- (Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)); e linhagens celulares de mieloma, tais como YO, NS0, P3X63 e Sp2/0. Para uma revisão de certas linhagens celulares hospedeiras de mamíferos adequadas para a produção de proteínas, vide, por exemplo, Yazaki e Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003). As células hospedeiras incluem células cultivadas, por exemplo, células cultivadas de mamíferos, células de levedura, células de inseto, células bacterianas e células vegetais, para citar apenas algumas, mas também células compreendidas em um animal transgênico, planta transgênica ou planta cultivada ou tecido animal. Em um aspecto, a célula hospedeira é uma célula eucariótica, particularmente uma célula de mamífero, tal como uma célula de ovário de hamster chinês (CHO), uma célula de rim embrionário humano (HEK) ou uma célula linfoide (por exemplo, Y0, NS0, célula Sp20). Em um aspecto, a célula hospedeira não é uma célula dentro de um corpo humano.

[000361] As tecnologias padrão são conhecidas na técnica para expressar genes estranhos nestes sistemas. As células que expressam um polipeptídeo compreendendo a cadeia pesada ou leve de um domínio de ligação ao antígeno, tal como um anticorpo, podem ser modificados de modo a também expressarem a outra das cadeias do anticorpo, de tal modo que o produto expresso seja um anticorpo que tem uma cadeia pesada e uma cadeia leve.

[000362] Em um aspecto, é fornecido um método de produção de um anticorpo de acordo com a invenção, em que o método compreende cultivar uma célula hospedeira compreendendo um polinucleotídeo que codifica o anticorpo, conforme fornecido neste documento, sob condições adequadas para a expressão do anticorpo e, opcionalmente, recuperar o anticorpo da célula hospedeira (ou meio de cultura de células hospedeiras).

[000363] Os componentes do anticorpo (multiespecífico) da invenção podem ser geneticamente fundidos entre si. O anticorpo (multiespecífico) pode ser modificado de tal modo que seus componentes sejam fundidos diretamente entre si ou indiretamente por meio de uma sequência de ligante. A composição e o comprimento do ligante podem ser determinados de acordo com métodos bem conhecidos na técnica e podem ser testados quanto à eficácia. Exemplos de sequências de ligante entre diferentes componentes de anticorpos (multiespecíficos) são fornecidos neste documento.

Se desejado, sequências adicionais também podem ser incluídas para incorporar um sítio de clivagem para separar os componentes individuais da fusão, por exemplo, uma sequência de reconhecimento de endopeptidase.

[000364] Os anticorpos preparados conforme descrito neste documento podem ser purificados por técnicas conhecidas na técnica, tais como cromatografia líquida de alto desempenho, cromatografia de troca iônica, eletroforese em gel, cromatografia de afinidade, cromatografia por exclusão de tamanho e similares. As condições reais usadas para purificar uma proteína particular dependerão, em parte, de fatores, tais como carga líquida, hidrofobicidade, hidrofilia, etc., e serão evidentes para os técnicos no assunto.

Para purificação por cromatografia de afinidade, um anticorpo, ligante, receptor ou antígeno pode ser usado ao qual o anticorpo se liga. Por exemplo, para purificação por cromatografia de afinidade de anticorpos da invenção, uma matriz com proteína A ou proteína G pode ser usada. A cromatografia de afinidade sequencial de Proteína A ou G e a cromatografia por exclusão de tamanho podem ser usadas para isolar um anticorpo essencialmente conforme descrito nos Exemplos. A pureza do anticorpo pode ser determinada por qualquer um de uma variedade de métodos analíticos bem conhecidos, incluindo eletroforese em gel, cromatografia líquida de alta pressão e similares.

D. ENSAIOS

[000365] Os anticorpos fornecidos neste documento podem ser identificados, rastreados ou caracterizados por suas propriedades físicas/químicas e/ou atividades biológicas por vários ensaios conhecidos na técnica.

1. ENSAIOS DE LIGAÇÃO

[000366] A ligação (afinidade) do anticorpo a um receptor Fc ou um antígeno alvo pode ser determinada, por exemplo, por ressonância de plásmon de superfície (SPR), usando instrumentação padrão, tal como um instrumento BIAcore (GE Healthcare), e receptores ou proteínas alvo, como podem ser obtidos por expressão recombinante. Alternativamente, a ligação de anticorpos a diferentes receptores ou antígenos alvo pode ser avaliada usando linhagens celulares que expressam o receptor particular ou antígeno alvo, por exemplo, por citometria de fluxo (FACS). Um aspecto ilustrativo e exemplar específico para medir a atividade de ligação a CD3 é descrito a seguir.

[000367] Em um aspecto, a atividade de ligação a CD3 é determinada por SPR da seguinte forma:

[000368] A SPR é realizada em um instrumento Biacore T200 (GE Healthcare). O anticorpo de captura anti-Fab (GE Healthcare, #28958325) é imobilizado em um Chip Sensorial CM5 Série S (GE Healthcare) usando química de acoplamento de amina padrão, em uma densidade de superfície de 4000 - 6000 unidades de ressonância (UR). Como tampão de execução e de diluição, é usado HBS-P+ (HEPES a 10 mM, NaCl a 150 mM, pH 7,4, surfactante P20 a 0,05%). Os anticorpos CD3 com uma concentração de 2 µg/ml (em His a 20 mM, NaCl a 140 mM, pH 6,0) são injetados durante cerca de 60 s a uma taxa de fluxo de 5 µl/min. O antígeno CD3 usado é um heterodímero de ectodomínios CD3 delta e CD3 épsilon fundidos a um domínio Fc humano com modificações "protuberância-em-buraco" e um marcador Avi no terminal C (vide SEQ ID NOs 28 e 29). O antígeno CD3 é injetado a uma concentração de 10 µg/ml por 120 s e a dissociação é monitorada a uma taxa de fluxo de 5 µl/min por cerca de 120 s. A superfície do chip é regenerada por duas injeções consecutivas de glicina a 10 mM, pH 2,1, por cerca de 60 s cada.

As diferenças de índice de refração em massa são corrigidas subtraindo injeções em branco e subtraindo a resposta obtida da célula de fluxo do controle em branco. Para avaliação, a resposta de ligação é obtida 5 segundos após o final da injeção. Para normalizar o sinal de ligação, a ligação a CD3 é dividida pela resposta de anti-Fab (o sinal (UR) obtido na captura do anticorpo CD3 no anticorpo anti-Fab imobilizado). A atividade de ligação a CD3 de um anticorpo após um determinado tratamento, em relação à atividade de ligação a CD3 do anticorpo após um tratamento diferente (também referida como concentração ativa relativa (RAC)), é calculada por referência à atividade de ligação de uma amostra do anticorpo após o determinado tratamento à atividade de ligação de uma amostra correspondente do anticorpo após o tratamento diferente.

2. ENSAIOS DE ATIVIDADE

[000369] A atividade biológica dos anticorpos (multiespecíficos) da invenção pode ser medida por vários ensaios, conforme descrito nos Exemplos. As atividades biológicas podem incluir, por exemplo, a indução da proliferação de células T, a indução da sinalização em células T, a indução da expressão de marcadores de ativação em células T, a indução da secreção de citocinas por células T, a indução da lise de células alvo, tais como células tumorais, e a indução da regressão do tumor e/ou a melhoria da sobrevida.

E. COMPOSIÇÕES, FORMULAÇÕES E VIAS DE ADMINISTRAÇÃO

[000370] Em um aspecto adicional, a invenção fornece composições farmacêuticas compreendendo qualquer um dos anticorpos fornecidos neste documento, por exemplo, para uso em qualquer um dos métodos terapêuticos abaixo. Em um aspecto, uma composição farmacêutica compreende um anticorpo de acordo com a invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em outro aspecto, uma composição farmacêutica compreende um anticorpo de acordo com a invenção e pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, conforme descrito abaixo.

[000371] É fornecido ainda um método de produção de um anticorpo da invenção em uma forma adequada para administração in vivo, o método compreendendo (a) obter um anticorpo de acordo com a invenção, e (b) formular o anticorpo com pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável, em que uma preparação de anticorpo é formulada para administração in vivo.

[000372] As composições farmacêuticas da presente invenção compreendem uma quantidade eficaz de anticorpo dissolvido ou disperso em um veículo farmaceuticamente aceitável. A frase "farmaceuticamente aceitável" refere-se a entidades moleculares e composições que geralmente não são tóxicas para os destinatários nas dosagens e concentrações usadas, ou seja, não produzem uma reação adversa, alérgica ou outra reação adversa quando administradas a um animal, tal como, por exemplo, um humano, conforme apropriado. A preparação de uma composição farmacêutica que contém um anticorpo e opcionalmente um ingrediente ativo adicional será conhecida pelos técnicos no assunto à luz da presente divulgação, conforme exemplificado por Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª Ed. Mack Printing Company, 1990, incorporado neste documento por referência. Além disso, para a administração em animais (por exemplo,

humanos), será entendido que as preparações devem atender aos padrões de esterilidade, pirogenicidade, segurança geral e pureza, conforme exigido pelo Office of Biological Standards da FDA ou autoridades correspondentes em outros países. As composições preferidas são formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Conforme usado neste documento, "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui todos e quaisquer solventes, tampões, meios de dispersão, revestimentos, surfactantes, antioxidantes, conservantes (por exemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotônicos, agentes de retardamento de absorção, sais, conservantes, antioxidantes, proteínas, fármacos, estabilizadores de fármacos, polímeros, géis, ligantes, excipientes, agentes de desintegração, lubrificantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, corantes, tais como materiais e combinações dos mesmos, como seria conhecido por um técnico no assunto (vide, para exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329, incorporado neste documento por referência). Exceto na medida em que qualquer veículo convencional seja incompatível com o ingrediente ativo, seu uso nas composições farmacêuticas é contemplado.

[000373] Um anticorpo da invenção (e qualquer agente terapêutico adicional) pode ser administrado por qualquer meio adequado, incluindo parenteral, intrapulmonar e intranasal e, se desejado, para tratamento local, administração intralesional. As infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. A dosagem pode ser por qualquer via adequada, por exemplo, por injeções, tais como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte se a administração é breve ou crônica.

[000374] As composições parentéricas incluem aquelas concebidas para administração por injeção,por exemplo, injeção subcutânea,

intradérmica, intralesional, intravenosa, intra-arterial intramuscular, intratecal ou intraperitoneal.

Para injeção, os anticorpos da invenção podem ser formulados em soluções aquosas, particularmente em tampões fisiologicamente compatíveis, tais como solução de Hanks, solução de Ringer ou tampão salino fisiológico.

A solução pode conter agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão.

Alternativamente, os anticorpos podem estar na forma em pó para constituição com um veículo adequado, por exemplo, água estéril apirogênica, antes do uso.

As soluções injetáveis estéreis são preparadas incorporando os anticorpos da invenção na quantidade necessária no solvente apropriado com vários dos outros ingredientes enumerados abaixo, conforme necessário.

A esterilidade pode ser facilmente alcançada, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéreis.

Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando os vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e/ou os outros ingredientes.

No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, suspensões ou emulsões, os métodos preferidos de preparação são técnicas de secagem a vácuo ou de liofilização que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de um meio líquido filtrado previamente estéril do mesmo.

O meio líquido deve ser adequadamente tamponado se necessário e o diluente líquido primeiro tornado isotônico antes da injeção com solução salina ou glicose suficiente.

A composição deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento, e preservada contra a ação contaminante de micro-organismos, tais como bactérias e fungos.

Será entendido que a contaminação com endotoxina deve ser mantida minimamente a um nível seguro, por exemplo, menos de 0,5 ng/mg de proteína.

Os veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, mas não estão limitados a:

tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzilamônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquilparabenos, tais como metil ou propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipéptidos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, tais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal, tais como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou surfactantes não iônicos, tais como polietilenoglicol (PEG). As suspensões aquosas para injeção podem conter compostos que aumentam a viscosidade da suspensão, tais como carboximetilcelulose de sódio, sorbitol, dextrano ou similares.

Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizadores ou agentes adequados que aumentam a solubilidade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas. Além disso, as suspensões dos compostos ativos podem ser preparadas como suspensões de injeção oleosa apropriadas. Os solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem óleos graxos, tais como óleo de gergelim, ou ésteres de ácidos graxos sintéticos, tais como travas de etila ou triglicerídeos, ou lipossomas.

[000375] Os ingredientes ativos podem ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de liberação de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, albumina microesferas, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences (18ª Ed. Mack Printing Company, 1990). Preparações de liberação sustentada podem ser preparadas. Os exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o polipéptido, cujas matrizes estão na forma de artigos moldados, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Em aspectos particulares, a absorção prolongada de uma composição injetável pode ser provocada pelo uso nas composições de agentes que retardam a absorção, tais como, por exemplo, monoestearato de alumínio, gelatina ou combinações dos mesmos.

[000376] Além das composições descritas anteriormente, os anticorpos também podem ser formulados como uma preparação de depósito.

Tais formulações de ação prolongada podem ser administradas por implantação (por exemplo, subcutaneamente ou intramuscularmente) ou por injeção intramuscular. Assim, por exemplo, os anticorpos podem ser formulados com materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (por exemplo, como uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de troca iônica, ou como derivados moderadamente solúveis, por exemplo, como um sal moderadamente solúvel.

[000377] As composições farmacêuticas compreendendo os anticorpos da invenção podem ser fabricadas por meio de processos convencionais de mistura, dissolução, emulsificação, encapsulação, aprisionamento ou liofilização. As composições farmacêuticas podem ser formuladas de maneira convencional usando um ou mais veículos, diluentes, excipientes ou auxiliares fisiologicamente aceitáveis que facilitam o processamento das proteínas em preparações que podem ser usadas farmaceuticamente. A formulação adequada depende da via de administração escolhida.

[000378] Os anticorpos podem ser formulados em uma composição em uma forma de ácido ou base livre, neutra ou de sal. Os sais farmaceuticamente aceitáveis são sais que retêm substancialmente a atividade biológica do ácido ou base livre. Esses incluem os sais de adição de ácido, por exemplo, aqueles formados com os grupos amino livres de uma composição proteica, ou que são formados com ácidos inorgânicos, tais como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos, tais como ácido acético, oxálico, tartárico ou mandélico. Os sais formados com os grupos carboxila livres também podem ser derivados de bases inorgânicas, tais como, por exemplo, sódio, potássio, amônio, cálcio ou hidróxidos férricos; ou tais bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina ou procaína. Os sais farmacêuticos tendem a ser mais solúveis em solventes aquosos e outros solventes próticos do que as formas de base livre correspondentes.

F. MÉTODOS RECOMBINANTES E COMPOSIÇÕES

[000379] Qualquer um dos anticorpos fornecidos neste documento pode ser usado em métodos terapêuticos. Os anticorpos da invenção podem ser usados como agentes imunoterapêuticos, por exemplo, no tratamento de cânceres.

[000380] Para uso em métodos terapêuticos, os anticorpos da invenção seriam formulados, dosados e administrados em uma forma consistente com as boas práticas médicas. Fatores a serem considerados neste contexto incluem o distúrbio específico a ser tratado, o mamífero específico a ser tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa do distúrbio, o sítio de liberação do agente, o método de administração, o agendamento da administração, e outros fatores conhecidos pelos médicos.

[000381] Em um aspecto, são fornecidos anticorpos da invenção para uso como um medicamento. Em outros aspectos, são fornecidos anticorpos da invenção para uso no tratamento de uma doença. Em certos aspectos, são fornecidos anticorpos da invenção para uso em um método de tratamento. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo da invenção para uso no tratamento de uma doença em um indivíduo em necessidade do mesmo.

Em certos aspectos, a invenção fornece um anticorpo para uso em um método de tratamento de um indivíduo com uma doença, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo. Em certos aspectos, a doença a ser tratada é um distúrbio proliferativo. Em um aspecto preferido, a doença é o câncer. Em certos aspectos, o método compreende ainda administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, um agente anticâncer, se a doença a ser tratada for câncer. Em outros aspectos, a invenção fornece um anticorpo da invenção para uso na indução de lise de uma célula alvo, particularmente uma célula tumoral. Em certos aspectos, a invenção fornece um anticorpo da invenção para uso em um método de indução de lise de uma célula alvo, particularmente uma célula tumoral, em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo para induzir a lise de uma célula alvo. Um "indivíduo" de acordo com qualquer um dos aspectos acima é um mamífero, de preferência um ser humano.

[000382] Em um aspecto adicional, a invenção fornece o uso de um anticorpo da invenção na fabricação ou preparação de um medicamento.

Em um aspecto, o medicamento é para o tratamento de uma doença em um indivíduo em necessidade do mesmo. Em um aspecto adicional, o medicamento é para uso em um método de tratamento de uma doença, compreendendo administrar a um indivíduo com a doença uma quantidade eficaz do medicamento. Em certos aspectos, a doença a ser tratada é um distúrbio proliferativo. Em um aspecto preferido, a doença é o câncer. Em um aspecto, o método compreende ainda administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, um agente anticâncer, se a doença a ser tratada for câncer. Em um aspecto adicional, o medicamento é para induzir a lise de uma célula alvo, particularmente uma célula tumoral. Em ainda um aspecto adicional, o medicamento é para uso em um método para induzir a lise de uma célula alvo, particularmente uma célula tumoral, em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do medicamento para induzir a lise de uma célula alvo. Um "indivíduo" de acordo com qualquer um dos aspectos acima pode ser um mamífero, de preferência um humano.

[000383] Em um outro aspecto, a invenção fornece um método para tratar uma doença. Em um aspecto, o método compreende administrar a um indivíduo com tal doença uma quantidade eficaz de um anticorpo da invenção. Em um aspecto, uma composição é administrada ao referido indivíduo, compreendendo o anticorpo da invenção em uma forma farmaceuticamente aceitável. Em certos aspectos, a doença a ser tratada é um distúrbio proliferativo. Em um aspecto preferido, a doença é o câncer. Em certos aspectos, o método compreende ainda administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, um agente anticâncer, se a doença a ser tratada for câncer. Um "indivíduo" de acordo com qualquer um dos aspectos acima pode ser um mamífero, de preferência um humano.

[000384] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para induzir a lise de uma célula alvo, particularmente uma célula tumoral. Em um aspecto, o método compreende colocar uma célula alvo em contato com um anticorpo da invenção na presença de uma célula T, particularmente uma célula T citotóxica. Em um aspecto adicional, é fornecido um método para induzir a lise de uma célula alvo, particularmente uma célula tumoral, em um indivíduo. Em um tal aspecto, o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo da invenção para induzir a lise de uma célula alvo. Em um aspecto, um “indivíduo” é um ser humano.

[000385] Em certos aspectos, a doença a ser tratada é um distúrbio proliferativo, particularmente câncer. Exemplos não limitantes de cânceres incluem câncer de bexiga, câncer de cérebro, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pâncreas, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, câncer uterino, câncer cervical, câncer endometrial, câncer de esôfago, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer retal, câncer gástrico, câncer de próstata, câncer de sangue, câncer de pele, carcinoma de células escamosas, câncer ósseo e câncer de rim. Outros distúrbios de proliferação celular que podem ser tratados usando um anticorpo da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, neoplasias localizadas em: abdômen, osso, mama, sistema digestivo, fígado, pâncreas, peritônio, glândulas endócrinas (adrenal, paratireóide, pituitária, testículos, ovário, timo, tireoide), olho, cabeça e pescoço, sistema nervoso (central e periférico), sistema linfático, pélvico, pele, tecidos moles, baço, região torácica e sistema urogenital. Também estão incluídas doenças ou lesões pré-cancerosas e metástases de câncer. Em certos aspectos, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de rim, câncer de bexiga, câncer de pele, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer de mama, câncer de cérebro, câncer de cabeça e pescoço e câncer de próstata. Em um aspecto, em particular em que o anticorpo é um anticorpo multiespecífico que se liga a TYRP-1 como o segundo antígeno, o câncer é um câncer que expressa TYRP-1. Em um aspecto, em particular em que o anticorpo é um anticorpo multiespecífico que se liga a TYRP-1 como o segundo antígeno, o câncer é um câncer de pele, em particular um melanoma. Em um aspecto, em particular em que o anticorpo é um anticorpo multiespecífico que se liga a EGFRvIII como o segundo antígeno, o câncer é um câncer que expressa EGFRvIII. Em um aspecto, em particular em que o anticorpo é um anticorpo multiespecífico que se liga a EGFRvIII como o segundo antígeno, o câncer é um câncer cerebral, em particular um glioblastoma. Um técnico no assunto reconhece prontamente que, em muitos casos, o anticorpo pode não fornecer uma cura, mas pode fornecer apenas um benefício parcial. Em alguns aspectos, uma mudança fisiológica com algum benefício também é considerada terapeuticamente benéfica. Assim, em alguns aspectos, uma quantidade de anticorpo que proporciona uma alteração fisiológica é considerada uma "quantidade eficaz". O sujeito, paciente ou indivíduo em necessidade de tratamento é normalmente um mamífero, mais especificamente um humano.

[000386] Em alguns aspectos, uma quantidade eficaz de um anticorpo da invenção é administrada a um indivíduo para o tratamento da doença.

[000387] Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem apropriada de um anticorpo da invenção (quando usado isoladamente ou em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos adicionais) dependerá do tipo de doença a ser tratada, da via de administração, do peso corporal do paciente, o tipo de anticorpo, a gravidade e o curso da doença, se o anticorpo é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, intervenções terapêuticas anteriores ou simultâneas, o histórico clínico do paciente e a resposta ao anticorpo e a critério do médico assistente. O médico responsável pela administração irá, em qualquer caso, determinar a concentração do(s) ingrediente(s) ativo(s) em uma composição e a(s) dose(s) apropriada(s) para o sujeito individual. Vários esquemas de dosagem incluindo, mas não se limitando a, administrações únicas ou múltiplas ao longo de vários pontos de tempo, administração em bolus e infusão de pulso são contemplados neste documento.

[000388] O anticorpo é adequadamente administrado ao paciente de uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos.

Dependendo do tipo e gravidade da doença, cerca de 1 µg/kg a 15 mg/kg (por exemplo, 0,1 mg/kg - 10 mg/kg) de anticorpo pode ser uma dosagem candidata inicial para administração ao paciente, seja, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas, ou por infusão contínua.

Uma dosagem diária típica pode variar de cerca de 1 µg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima.

Para administrações repetidas durante vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento geralmente seria mantido até que ocorra a supressão desejada dos sintomas da doença.

Uma dosagem exemplar do anticorpo estaria na faixa de cerca de 0,005 mg/kg a cerca de 10 mg/kg.

Em outros exemplos não limitantes, uma dose também pode compreender cerca de

1 µg/kg de peso corporal, cerca de 5 µg/kg de peso corporal, cerca de 10 µg/kg de peso corporal, cerca de 50 µg/kg de peso corporal, cerca de 100 µg/kg peso corporal, cerca de 200 µg/kg de peso corporal, cerca de 350 µg/kg de peso corporal, cerca de 500 µg/kg de peso corporal, cerca de 1 mg/kg de peso corporal, cerca de 5 mg/kg de peso corporal, cerca de 10 mg/kg de peso corporal, cerca de 50 mg/kg de peso corporal, cerca de 100 mg/kg de peso corporal, cerca de 200 mg/kg de peso corporal, cerca de 350 mg/kg de peso corporal, cerca de 500 mg/kg de peso corporal, a cerca de 1000 mg/kg de peso corporal mais por administração, e qualquer faixa derivável aí.

Em exemplos não limitantes de uma faixa derivável dos números listados neste documento,

uma faixa de cerca de 5 mg/kg de peso corporal a cerca de 100 mg/kg de peso corporal, cerca de 5 mg/kg de peso corporal a cerca de 500 mg/kg de peso corporal, etc., podem ser administrados com base nos números descritos acima.

Assim, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer combinação das mesmas) podem ser administradas ao paciente.

Tais doses podem ser administradas intermitentemente, por exemplo, a cada semana ou a cada três semanas (por exemplo, de tal modo que o paciente receba de cerca de duas a cerca de vinte ou, por exemplo, cerca de seis doses do anticorpo). Pode ser administrada uma dose de carga inicial mais alta, seguida por uma ou mais doses mais baixas. No entanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais.

[000389] Os anticorpos da invenção serão geralmente usados em uma quantidade eficaz para atingir o propósito pretendido. Para uso no tratamento ou prevenção de uma condição da doença, os anticorpos da invenção, ou composições farmacêuticas dos mesmos, são administrados ou aplicados em uma quantidade eficaz.

[000390] Para administração sistêmica, uma dose eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios in vitro, tais como ensaios de cultura de células. Uma dose pode então ser formulada em modelos animais para atingir uma faixa de concentração circulante que inclui a IC 50 conforme determinado na cultura de células. Tais informações podem ser usadas para determinar com mais precisão as doses úteis em humanos.

[000391] As dosagens iniciais também podem ser estimadas a partir de dados in vivo, por exemplo, modelos animais, usando técnicas que são bem conhecidas na técnica.

[000392] A quantidade de dosagem e o intervalo podem ser ajustados individualmente para fornecer níveis plasmáticos dos anticorpos que são suficientes para manter o efeito terapêutico. As dosagens usuais do paciente para administração por injeção variam de cerca de 0,1 a 50 mg/kg/dia, normalmente de cerca de 0,5 a 1 mg/kg/dia. Os níveis plasmáticos terapeuticamente eficazes podem ser alcançados pela administração de doses múltiplas a cada dia. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por HPLC.

[000393] Uma dose eficaz dos anticorpos da invenção irá geralmente fornecer benefícios terapêuticos sem causar toxicidade substancial.

A toxicidade e a eficácia terapêutica de um anticorpo podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em cultura de células ou animais experimentais. Ensaios de cultura de células e estudos em animais podem ser usados para determinar a LD50 (a dose letal para 50% de uma população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% de uma população). A razão da dose entre os efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico, que pode ser expresso como a razão LD50/ED50. Os anticorpos que exibem grandes índices terapêuticos são preferidos. Em um aspecto, o anticorpo de acordo com a presente invenção exibe um alto índice terapêutico. Os dados obtidos a partir de ensaios de cultura de células e estudos em animais podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagens adequadas para uso em humanos. A dosagem encontra-se preferencialmente dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro dessa faixa dependendo de uma variedade de fatores, por exemplo, a forma de dosagem empregada, a via de administração usada, a condição do sujeito e similares. A formulação exata, a via de administração e a dosagem podem ser escolhidas pelo médico individual tendo em vista da condição do paciente (vide, por exemplo, Fingl et al., 1975, em: The Pharmacological Basis of Therapeutics, cap. 1, pág. 1, incorporado neste documento por referência em sua totalidade).

[000394] O médico assistente para pacientes tratados com anticorpos da invenção saberia como e quando terminar, interromper ou ajustar a administração devido à toxicidade, disfunção orgânica e similares. Por outro lado, o médico assistente também saberia ajustar o tratamento para níveis mais elevados se a resposta clínica não fosse adequada (impedindo a toxicidade). A magnitude de uma dose administrada no tratamento do distúrbio de interesse irá variar com a gravidade da condição a ser tratada, com a via de administração e similares. A gravidade da condição pode, por exemplo, ser avaliada, em parte, por métodos padrão de avaliação prognóstica. Além disso, a dose e talvez a frequência da dose também irão variar de acordo com a idade, peso corporal e resposta do paciente individual.

[000395] Os anticorpos da invenção podem ser administrados em combinação com um ou mais outros agentes em terapia. Por exemplo, um anticorpo da invenção pode ser coadministrado com pelo menos um agente terapêutico adicional. O termo "agente terapêutico" abrange qualquer agente administrado para tratar um sintoma ou doença em um indivíduo em necessidade de tal tratamento. Tal agente terapêutico adicional pode compreender quaisquer ingredientes ativos adequados para a doença particular a ser tratada, de preferência aqueles com atividades complementares que não afetam adversamente umas às outras. Em certos aspectos, um agente terapêutico adicional é um agente imunomodulador, um agente citostático, um inibidor da adesão celular, um agente citotóxico, um ativador da apoptose celular ou um agente que aumenta a sensibilidade das células a indutores apoptóticos. Em um aspecto preferido, o agente terapêutico adicional é um agente anticâncer, por exemplo, um disruptor de microtúbulos, um antimetabólito, um inibidor de topoisomerase, um intercalador de DNA, um agente alquilante, uma terapia hormonal, um inibidor de quinase, um antagonista de receptor, um ativador da apoptose de células tumorais, ou um agente antiangiogênico.

[000396] Tais outros agentes estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido. A quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de anticorpo usado, do tipo de distúrbio ou tratamento e de outros fatores discutidos acima. Os anticorpos são geralmente usados nas mesmas dosagens e com as vias de administração conforme descrito neste documento, ou cerca de 1 a 99% das dosagens descritas neste documento, ou em qualquer dosagem e por qualquer via que seja empiricamente/clinicamente determinada como apropriada.

[000397] Tais terapias de combinação observadas acima englobam a administração combinada (onde dois ou mais agentes terapêuticos são incluídos nas mesmas ou em composições separadas) e administração separada, em cujo caso, a administração do anticorpo da invenção pode ocorrer antes, simultaneamente e/ou após a administração do agente terapêutico adicional e/ou adjuvante. Os anticorpos da invenção também podem ser usados em combinação com terapia de radiação.

G. ARTIGOS DE FABRICAÇÃO

[000398] Em outro aspecto da invenção, é fornecido um artigo de fabricação contendo materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico dos distúrbios descritos acima. O artigo de manufatura compreende um recipiente e um rótulo ou bula no recipiente ou associado a ele.

Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, bolsas de solução IV, etc. Os recipientes podem ser formados de uma variedade de materiais, tais como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é por si só ou combinada com outra composição eficaz para tratar, prevenir e/ou diagnosticar a condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco tendo uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica).

Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo da invenção. O rótulo ou bula indica que a composição é usada para tratar a condição de escolha. Além disso, o artigo de fabricação pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição contida no mesmo, em que a composição compreende um anticorpo da invenção; e (b) um segundo recipiente com uma composição contida no mesmo, em que a composição compreende um outro agente citotóxico ou terapêutico. O artigo de fabricação neste aspecto da invenção pode compreender ainda uma bula indicando que as composições podem ser usadas para tratar uma condição particular. Alternativamente, ou adicionalmente, o artigo de fabricação pode compreender ainda um segundo (ou terceiro) recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

H. MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA DIAGNÓSTICO E DETECÇÃO

[000399] Em certos aspectos, qualquer um dos anticorpos fornecidos neste documento é útil para detectar a presença de seu alvo (por exemplo, CD3, TYRP-1, EGFRvIII) em uma amostra biológica. O termo "detecção", conforme usado neste documento, abrange a detecção quantitativa ou qualitativa. Em certos aspectos, uma amostra biológica compreende uma célula ou tecido, tal como o tecido da próstata.

[000400] Em um aspecto, é fornecido um anticorpo de acordo com a invenção para uso em um método de diagnóstico ou detecção. Em um aspecto adicional, é fornecido um método de detecção da presença de CD3, TYRP-1 ou EGFRvIII em uma amostra biológica. Em certos aspectos, o método compreende colocar a amostra biológica em contato com um anticorpo da presente invenção sob condições permissivas para a ligação do anticorpo a CD3, TYRP-1 ou EGFRvIII e detectar se um complexo é formado entre o anticorpo e CD3, TYRP- 1 ou EGFRvIII. Tal método pode ser um método in vitro ou in vivo. Em um aspecto, um anticorpo da invenção é usado para selecionar indivíduos elegíveis para terapia com um anticorpo que se liga a CD3, TYRP-1 e/ou EGFRvIII, por exemplo, onde CD3, TYRP-1 e/ou EGFRvIII é um biomarcador para seleção de pacientes.

[000401] Distúrbios exemplares que podem ser diagnosticados usando um anticorpo da invenção incluem câncer, particularmente câncer de pele ou câncer cerebral.

[000402] Em certos aspectos, é fornecido um anticorpo de acordo com a presente invenção, em que o anticorpo é marcado. Os marcadores incluem, mas não estão limitados a, marcadores ou frações que são detectados diretamente (tais como fluorescentes, cromóforos, elétron- denso, quimioluminescente e marcadores radioativos), bem como frações, tais como enzimas ou ligantes, que são detectadas indiretamente, por exemplo, por meio de uma reação enzimática ou interação molecular. Marcadores exemplares incluem, mas não estão limitados a, radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H e 131I, fluoróforos, tais como quelatos de terras raras ou fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansila, umbeliferona, luceriferases, por exemplo, luciferase do pirilampo e luciferase bacteriana (Patente dos EUA de nº 4.737.456), luciferina, 2,3-di-hidroftalazinedionas, peroxidase de rábano (HRP), fosfatase alcalina, β-galactosidase, glucoamilase, lisozima, sacarídeo oxidases, por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase, e glicose-6-fosfato desidrogenase, oxidases heterocíclicas, tais como uricase e xantina oxidase, juntamente com uma enzima que emprega peróxido de hidrogênio para oxidar um precursor de corante, tal como HRP, lactoperoxidase, ou microperoxidase, biotina/avidina, marcadores de spin, marcadores de bacteriófago, radicais livres estáveis e similares.

III. SEQUÊNCIAS

SEQ Sequência de aminoácidos

ID NO HCDR1 de TYAMN 1 CD3orig HCDR1 de SYAMN 2 CD3oti HCDR2 de RIRSKYNNYATYYADSVKG 3 CD3orig/CD3o ti

SEQ Sequência de aminoácidos

ID NO HCDR3 de HGNFGNSYVSWFAY 4 CD3orig HCDR3 de HTTFPSSYVSYYGY 5 CD3oti Vh de EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVR 6 CD3orig QAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDS

KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYW

GQGTLVTVSS VH de EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFQFSSYAMNWVR 7 CD3oti QAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDS

KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHTTFPSSYVSYYGYWG

QGTLVTVSS LCDR1 de GSSTGAVTTSNYAN 8 CD3orig/CD3o ti LCDR2 de GTNKRAP 9 CD3orig/CD3o ti LCDR3 de ALWYSNLWV 10 CD3orig/CD3o ti VL de QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQ 11 CD3orig/CD3o EKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLS ti GAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL HC de IgG EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVR 12 de CD3orig QAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDS

KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYW GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP HC de IgG EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFQFSSYAMNWVR 13 de CD3oti QAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDS

KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHTTFPSSYVSYYGYWG QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP PCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSP

SEQ Sequência de aminoácidos

ID NO LC de IgG QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQ 14 de EKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLS CD3orig/CD3o GAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLRTVAAPSV ti FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL

QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA

CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC HCDR1 de DYFLH 15 TYRP1 HCDR2 de WINPDNGNTVYAQKFQG 16 TYRP1 HCDR3 de RDYTYEKAALDY 17 TYRP1 VH de QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDYFLHWVRQ 18 TYRP1 APGQGLEWMGWINPDNGNTVYAQKFQGRVTMTADTSTS

TVYMELSSLRSEDTAVYYCTRRDYTYEKAALDYWGQGTL

VTVSS LCDR1 de RASGNIYNYLA 19 TYRP1 LCDR2 de DAKTLAD 20 TYRP1 LCDR3 de QHFWSLPFT 21 TYRP1 VL de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASGNIYNYLAWYQQKP 22 TYRP1 GKVPKLLIYDAKTLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPE

DVATYYCQHFWSLPFTFGQGTKLEIK VH- QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDYFLHWVRQ 23 CH1(EE) de APGQGLEWMGWINPDNGNTVYAQKFQGRVTMTADTSTS TYRP1 – TVYMELSSLRSEDTAVYYCTRRDYTYEKAALDYWGQGTL VL-CH1 de VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPE CD3orig/CD3o PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS ti – Fc SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGG (protuberânc GSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANW ia, PGLALA) VQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALT

LSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDE LTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSP

SEQ Sequência de aminoácidos

ID NO VH-CH1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDYFLHWVRQ 24 (EE) de APGQGLEWMGWINPDNGNTVYAQKFQGRVTMTADTSTS TYRP1 –Fc TVYMELSSLRSEDTAVYYCTRRDYTYEKAALDYWGQGTL (buraco, VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPE PGLALA) PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS

SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQV CTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCS

VMHEALHNHYTQKSLSLSP VL-CL(RK) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASGNIYNYLAWYQQKP 25 de TYRP1 GKVPKLLIYDAKTLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPE

DVATYYCQHFWSLPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPS DRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH

QGLSSPVTKSFNRGEC VH-CL de EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVR 26 CD3orig QAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDS

KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYW GQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL

SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC VH-CL de EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFQFSSYAMNWVR 27 CD3oti QAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDS

KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHTTFPSSYVSYYGYWG QGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS

STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Haste QDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQH 28 épsilon de NDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYP CD3 RGSKPEDANFYLYLRARVSENCVDEQLYFQGGSPKSADK humano – THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV Fc VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY (protuberânc RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK ia) – Avi GQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAV

EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSGGLNDIFE

AQKIEWHE Haste delta FKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKR 29 de CD3 ILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCRSEQLYFQGD humano – KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC Fc (buraco) VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST – Avi YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA

KGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSGGLNDIFE AQKIEWHE

SEQ Sequência de aminoácidos

ID NO Haste QDGNEEMGSITQTPYQVSISGTTVILTCSQHLGSEAQWQ 30 épsilon de HNGKNKEDSGDRLFLPEFSEMEQSGYYVCYPRGSNPED CD3 de ASHHLYLKARVSENCVDEQLYFQGGSPKSADKTHTCPPC Cynomolgus PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE – Fc DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV (protuberânc LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV ia) – Avi YTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP

ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS

VMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSGGLNDIFEAQKIEWHE Haste delta FKIPVEELEDRVFVKCNTSVTWVEGTVGTLLTNNTRLDLG 31 de CD3 de KRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESAVQVHYRMSQNCVDEQL Cynomolgus YFQGGSPKSADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD – Fc TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK (buraco) – TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA Avi LPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSC

AVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL VSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS

PGKSGGLNDIFEAQKIEWHE ECD de QFPRQCATVEALRSGMCCPDLSPVSGPGTDRCGSSSGR 32 TYRP1 GRCEAVTADSRPHSPQYPHDGRDDREVWPLRFFNRTCH humano – CNGNFSGHNCGTCRPGWRGAACDQRVLIVRRNLLDLSK Fc EEKNHFVRALDMAKRTTHPLFVIATRRSEEILGPDGNTPQ (protuberânc FENISIYNYFVWTHYYSVKKTFLGVGQESFGEVDFSHEGP ia) – Avi AFLTWHRYHLLRLEKDMQEMLQEPSFSLPYWNFATGKNV

CDICTDDLMGSRSNFDSTLISPNSVFSQWRVVCDSLEDY DTLGTLCNSTEDGPIRRNPAGNVARPMVQRLPEPQDVAQ CLEVGLFDTPPFYSNSTNSFRNTVEGYSDPTGKYDPAVR SLHNLAHLFLNGTGGQTHLSPNDPIFVLLHTFTDAVFDEW LRRYNADISTFPLENAPIGHNRQYNMVPFWPPVTNTEMF VTAPDNLGYTYEIQWPSREFSVPEGSDKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGKSGGLNDIFEAQKIEWHE

SEQ Sequência de aminoácidos

ID NO ECD de QFPRECATVEALRSGMCCPDLSPMSGPGTDRCGSSSGR 33 TYRP1 de GRCEAVTADSRPHSPRYPHDGRDDREVWPLRFFNRTCH Cynomolgus CNGNFSGHNCGTCRPGWRGAACDQRVLVVRRNLLDLSK – Fc EEKNHFVRALDMAKRTTHPLFVIATRRSEEILGPDGNTPQ (protuberânc FENISIYNYFVWTHYYSVKKTFLGAGQESFGEVDFSHEGP ia) – Avi AFLTWHRYHLLRLEKDMQEMLQEPSFSLPYWNFATGKNV

CDICTDDLMGSRSNFDSTLISPNSVFSQWRVVCDSLEDY DTLGTLCNSTESGPIRRNPAGNVARPMVQRLPEPQDVAQ CLEVGLFDTPPFYSNSTNSFRNTVEGYSDPTGKYDPAVR SLHNLAHLFLNGTGGQTHLSPNDPIFVLLHTFTDAVFDEW LRRYNADISTFPLENAPIGHNRQYNMVPFWPPVTNTEMF VTAPDNLGYTYEVQWPSREFSVPGSDKTHTCPPCPAPEA AGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE

ALHNHYTQKSLSLSPGKSGGLNDIFEAQKIEWHE ECD de QFPRECANIEALRRGVCCPDLLPSSGPGTDPCGSSSGRG 34 TYRP1 de RCVAVIADSRPHSRHYPHDGKDDREAWPLRFFNRTCQC camundong NDNFSGHNCGTCRPGWRGAACNQKILTVRRNLLDLSPEE o – Fc KSHFVRALDMAKRTTHPQFVIATRRLEDILGPDGNTPQFE (protuberânc NISVYNYFVWTHYYSVKKTFLGTGQESFGDVDFSHEGPA ia) – Avi FLTWHRYHLLQLERDMQEMLQEPSFSLPYWNFATGKNV

CDVCTDDLMGSRSNFDSTLISPNSVFSQWRVVCESLEEY DTLGTLCNSTEGGPIRRNPAGNVGRPAVQRLPEPQDVTQ CLEVRVFDTPPFYSNSTDSFRNTVEGYSAPTGKYDPAVR SLHNLAHLFLNGTGGQTHLSPNDPIFVLLHTFTDAVFDEW LRRYNADISTFPLENAPIGHNRQYNMVPFWPPVTNTEMF VTAPDNLGYAYEVQWPGQEFTVSEGSDKTHTCPPCPAP EAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH

EALHNHYTQKSLSLSPGKSGGLNDIFEAQKIEWHE Fc (buraco) DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT 35

CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISK AKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSP

SEQ Sequência de aminoácidos

ID NO ECD de LEEKKGNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKC 36 EGFRvIII – EGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHI Avi – His LPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPE

NRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSL KEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRG ENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRG RECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCT GRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKY ADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSVDG

GSPTPPTPGGGSGLNDIFEAQKIEWHEARAHHHHHH HCDR1 de SYWIA 37 EGFRvIII P056.021 HCDR2 de VIHPYDSDTRYSPSFQG 38 EGFRvIII P056.021 HCDR3 de VSRSSYAFDY 39 EGFRvIII P056.021 VH de EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFDSYWIAWVRQ 40 EGFRvIII MPGKGLEWMGVIHPYDSDTRYSPSFQGQVTISADKSIST P056.021 AYLQWSSLKASDTAMYYCARVSRSSYAFDYWGQGTLVT

VSS LCDR1 de KSSQSVLYSSNNKNYLA 41 EGFRvIII P056.021 LCDR2 de WASTRES 42 EGFRvIII P056.021 LCDR3 de QQVHSGPPVT 43 EGFRvIII P056.021 VL de DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLA 44 EGFRvIII WYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTL P056.021 TISSLQAEDVAVYYCQQVHSGPPVTFGQGTKVEIK HCDR1 de NYWIG 45 EGFRvIII P056.052 HCDR2 de TIYPGDSDRRYSPSFQG 46 EGFRvIII P056.052 HCDR3 de VSRSSYAFDY 47 EGFRvIII P056.052 VH de EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYTFMNYWIGWVRQ 48 EGFRvIII MPGKGLEWMGTIYPGDSDRRYSPSFQGQVTLSADKSIST P056.052 AYLQWSSLKASDTAMYYCARVSRSSYAFDYWGQGTLVT

VSS

SEQ Sequência de aminoácidos

ID NO LCDR1 de KSSQSVLYSSNNKNYLA 49 EGFRvIII P056.052 LCDR2 de WASTRES 50 EGFRvIII P056.052 LCDR3 de QQVHSGPPVT 51 EGFRvIII P056.052 VL de DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLA 52 EGFRvIII WYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTL P056.052 TISSLQAEDVAVYYCQQVHSGPPVTFGQGTKVEIK HCDR1 de SIWIH 53 EGFRvIII P047.019 HCDR2 de TIYPGDSDTRYSPSFQG 54 EGFRvIII P047.019 HCDR3 de TGPGLAFDY 55 EGFRvIII P047.019 VH de EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFPSIWIHWVRQ 56 EGFRvIII MPGKGLEWMGTIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSIST P047.019 AYLQWSSLKASDTAMYYCARTGPGLAFDYWGQGTLVTV

SS LCDR1 de KSSQSVLYSSNNKNYLA 57 EGFRvIII P047.019 LCDR2 de WASTRES 58 EGFRvIII P047.019 LCDR3 de QQSYSTPIT 59 EGFRvIII P047.019 VL de DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLA 60 EGFRvIII WYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTL P047.019 TISSLQAEDVAVYYCQQSYSTPITFGQGTKVEIK HCDR1 de NYWIA 61 EGFRvIII P057.012 HCDR2 de IIYPDDSDTRYSPSFQG 62 EGFRvIII P057.012 HCDR3 de ATNIASGGYFDY 63 EGFRvIII P057.012 VH de EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFANYWIAWVRQ 64 EGFRvIII MPGKGLEWMGIIYPDDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTA P057.012 YLQWSSLKASDTAMYYCARATNIASGGYFDYWGQGTLVT

VSS

SEQ Sequência de aminoácidos

ID NO LCDR1 de KSSQSVLWNSNNKNYLA 65 EGFRvIII P057.012 LCDR2 de WASKRES 66 EGFRvIII P057.012 LCDR3 de QQSYSAPIT 67 EGFRvIII P057.012 VL de DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLWNSNNKNYLA 68 EGFRvIII WYQQKPGQPPKLLIYWASKRESGVPDRFSGSGSGTDFT P057.012 LTISSLQAEDVAVYYCQQSYSAPITFGQGTKVEIK HCDR1 de RRWIA 69 EGFRvIII P057.011 HCDR2 de IIYPGDSDTRYSPSFQG 70 EGFRvIII P057.011 HCDR3 de ATNIASGGYFDY 71 EGFRvIII P057.011 VH de EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYNFGRRWIAWVRQ 72 EGFRvIII MPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTA P057.011 YLQWSSLKASDTAMYYCARATNIASGGYFDYWGQGTLVT

VSS LCDR1 de KSSQSVLWNSNNKNYLA 73 EGFRvIII P057.011 LCDR2 de WASKRES 74 EGFRvIII P057.011 LCDR3 de QQSYSAPIT 75 EGFRvIII P057.011 VL de DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLWNSNNKNYLA 76 EGFRvIII WYQQKPGQPPKLLIYWASKRESGVPDRFSGSGSGTDFT P057.011 LTISSLQAEDVAVYYCQQSYSAPITFGQGTKVEIK HCDR1 de NNWIA 77 EGFRvIII P056.027 HCDR2 de VIYPGDSDKRYSPSFQG 78 EGFRvIII P056.027 HCDR3 de VSRSSYAFDY 79 EGFRvIII P056.027 VH de EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYTFGNNWIAWVRQ 80 EGFRvIII MPGKGLEWMGVIYPGDSDKRYSPSFQGQVTISADKSIST P056.027 AYLQWSSLKASDTAMYYCARVSRSSYAFDYWGQGTLVT

VSS

SEQ Sequência de aminoácidos

ID NO LCDR1 de KSSQSVLYSSNNKNYLA 81 EGFRvIII P056.027 LCDR2 de WASTRES 82 EGFRvIII P056.027 LCDR3 de QQVHSGPPVT 83 EGFRvIII P056.027 VL de DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLA 84 EGFRvIII WYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTL P056.027 TISSLQAEDVAVYYCQQVHSGPPVTFGQGTKVEIK HCDR1 de SYWIA 85 EGFRvIII P063.056 HCDR2 de VIHPYDSDTRYSPSFQG 86 EGFRvIII P063.056 HCDR3 de VSRSSYAFDY 87 EGFRvIII P063.056 VH de EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFDSYWIAWVRQ 88 EGFRvIII MPGKGLEWMGVIHPYDSDTRYSPSFQGQVTISADKSIST P063.056 AYLQWSSLKASDTAMYYCARVSRSSYAFDYWGQGTLVT

VSS LCDR1 de KSSQSVLYSSNNKNYLA 89 EGFRvIII P063.056 LCDR2 de WASTRES 90 EGFRvIII P063.056 LCDR3 de QQQRDGPPVT 91 EGFRvIII P063.056 VL de DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLA 92 EGFRvIII WYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTL P063.056 TISSLQAEDVAVYYCQQQRDGPPVTFGQGTKVEIK HCDR1 de SYWIA 93 EGFRvIII P064.078 HCDR2 de VIHPYDSDTRYSPSFQG 94 EGFRvIII P064.078 HCDR3 de VSRLSYALDY 95 EGFRvIII P064.078 VH de EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFDSYWIAWVRQ 96 EGFRvIII MPGKGLEWMGVIHPYDSDTRYSPSFQGQVTISADKSIST P064.078 AYLQWSSLKASDTAMYYCARVSRLSYALDYWGQGTLVT

VSS

SEQ Sequência de aminoácidos

ID NO LCDR1 de KSSQSVLYSSNNKNYLA 97 EGFRvIII P064.078 LCDR2 de WASTRES 98 EGFRvIII P064.078 LCDR3 de QQVHSGPPVT 99 EGFRvIII P064.078 VL de DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLA 100 EGFRvIII WYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTL P064.078 TISSLQAEDVAVYYCQQVHSGPPVTFGQGTKVEIK HCDR1 de SYWIA 101 EGFRvIII P065.036 HCDR2 de VIHPYDSDTRYSPSFQG 102 EGFRvIII P065.036 HCDR3 de VSRSSYALDY 103 EGFRvIII P065.036 VH de EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFDSYWIAWVRQ 104 EGFRvIII MPGKGLEWMGVIHPYDSDTRYSPSFQGQVTISADKSIST P065.036 AYLQWSSLKASDTAMYYCARVSRSSYALDYWGQGTLVT

VSS LCDR1 de KSSQSVLYSSNNKNYLA 105 EGFRvIII P065.036 LCDR2 de WASTRES 106 EGFRvIII P065.036 LCDR3 de QQVYSGPPVT 107 EGFRvIII P065.036 VL de DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLA 108 EGFRvIII WYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTL P065.036 TISSLQAEDVAVYYCQQVYSGPPVTFGQGTKVEIK

SEQ Sequência de aminoácidos

ID NO VH- EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFDSYWIAWVRQ 109 CH1(EE) de MPGKGLEWMGVIHPYDSDTRYSPSFQGQVTISADKSIST EGFRvIII – AYLQWSSLKASDTAMYYCARVSRSSYAFDYWGQGTLVT VL-CH1 de VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPV CD3orig/CD3o TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL ti – Fc GTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGS (protuberânc QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQ ia, PGLALA) EKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLS

GAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELT KNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY

TQKSLSLSP VH- EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFDSYWIAWVRQ 110 CH1(EE) de MPGKGLEWMGVIHPYDSDTRYSPSFQGQVTISADKSIST EGFRvIII – AYLQWSSLKASDTAMYYCARVSRSSYAFDYWGQGTLVT Fc (buraco, VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPV PGLALA) TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL

GTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAP EAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTL PPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH

EALHNHYTQKSLSLSP VL-CL(RK) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLA 111 de EGFRvIII WYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTL

TISSLQAEDVAVYYCQQQRDGPPVTFGQGTKVEIKRTVAA PSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV

YACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC VH-CL de EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVR 26 CD3orig QAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDS

KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYW GQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL

SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC VH-CL de EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFQFSSYAMNWVR 27 CD3oti QAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDS

KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHTTFPSSYVSYYGYWG QGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ Sequência de aminoácidos

ID NO CD3 QDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQH 112 humano NDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYP

RGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICIT GGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKER

PPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI CD3 de QDGNEEMGSITQTPYQVSISGTTVILTCSQHLGSEAQWQ 113 cynomolgus HNGKNKEDSGDRLFLPEFSEMEQSGYYVCYPRGSNPED

ASHHLYLKARVCENCMEMDVMAVATIVIVDICITLGLLLLVY YWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNP

DYEPIRKGQQDLYSGLNQRRI TYRP1 QFPRQCATVEALRSGMCCPDLSPVSGPGTDRCGSSSGR 114 humano GRCEAVTADSRPHSPQYPHDGRDDREVWPLRFFNRTCH

CNGNFSGHNCGTCRPGWRGAACDQRVLIVRRNLLDLSK EEKNHFVRALDMAKRTTHPLFVIATRRSEEILGPDGNTPQ FENISIYNYFVWTHYYSVKKTFLGVGQESFGEVDFSHEGP AFLTWHRYHLLRLEKDMQEMLQEPSFSLPYWNFATGKNV CDICTDDLMGSRSNFDSTLISPNSVFSQWRVVCDSLEDY DTLGTLCNSTEDGPIRRNPAGNVARPMVQRLPEPQDVAQ CLEVGLFDTPPFYSNSTNSFRNTVEGYSDPTGKYDPAVR SLHNLAHLFLNGTGGQTHLSPNDPIFVLLHTFTDAVFDEW LRRYNADISTFPLENAPIGHNRQYNMVPFWPPVTNTEMF VTAPDNLGYTYEIQWPSREFSVPEIIAIAVVGALLLVALIFG TASYLIRARRSMDEANQPLLTDQYQCYAEEYEKLQNPNQ

SVV EGFRvIII LEEKKGNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKC 115 humano EGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHI

LPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPE NRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSL KEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRG ENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRG RECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCT GRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKY ADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATG MVGALLLLLVVALGIGLFMRRRHIVRKRTLRRLLQERELVE PLTPSGEAPNQALLRILKETEFKKIKVLGSGAFGTVYKGLW IPEGEKVKIPVAIKELREATSPKANKEILDEAYVMASVDNP HVCRLLGICLTSTVQLITQLMPFGCLLDYVREHKDNIGSQY LLNWCVQIAKGMNYLEDRRLVHRDLAARNVLVKTPQHVKI TDFGLAKLLGAEEKEYHAEGGKVPIKWMALESILHRIYTH QSDVWSYGVTVWELMTFGSKPYDGIPASEISSILEKGERL PQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARD PQRYLVIQGDERMHLPSPTDSNFYRALMDEEDMDDVVDA DEYLIPQQGFFSSPSTSRTPLLSSLSATSNNSTVACIDRNG LQSCPIKEDSFLQRYSSDPTGALTEDSIDDTFLPVPEYINQ SVPKRPAGSVQNPVYHNQPLNPAPSRDPHYQDPHSTAV GNPEYLNTVQPTCVNSTFDSPAHWAQKGSHQISLDNPDY QQDFFPKEAKPNGIFKGSTAENAEYLRVAPQSSEFIGA

SEQ Sequência de aminoácidos

ID NO EGFR LEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLG 116 humano NLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQI

IRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRNLQEILHG AVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSDFLSNMSMDFQNHLG SCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSGRC RGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCK DTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYV VTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCN GIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDS FTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFE NLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIIS GNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQ VCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLL EGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQ CAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHL CHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLV VALGIGLFMRRRHIVRKRTLRRLLQERELVEPLTPSGEAP NQALLRILKETEFKKIKVLGSGAFGTVYKGLWIPEGEKVKI PVAIKELREATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGIC LTSTVQLITQLMPFGCLLDYVREHKDNIGSQYLLNWCVQI AKGMNYLEDRRLVHRDLAARNVLVKTPQHVKITDFGLAKL LGAEEKEYHAEGGKVPIKWMALESILHRIYTHQSDVWSYG VTVWELMTFGSKPYDGIPASEISSILEKGERLPQPPICTIDV YMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQG DERMHLPSPTDSNFYRALMDEEDMDDVVDADEYLIPQQG FFSSPSTSRTPLLSSLSATSNNSTVACIDRNGLQSCPIKED SFLQRYSSDPTGALTEDSIDDTFLPVPEYINQSVPKRPAG SVQNPVYHNQPLNPAPSRDPHYQDPHSTAVGNPEYLNT VQPTCVNSTFDSPAHWAQKGSHQISLDNPDYQQDFFPKE

AKPNGIFKGSTAENAEYLRVAPQSSEFIGA região Fc de DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT 117 hIgG1 CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS

TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW

QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP ligante GGGGSGGGGS 118 ligante DGGGGSGGGGS 119 Domínio CL RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ 120 humano WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY kappa EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Domínio CL QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVA 121 humano WKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWK lambda SHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

SEQ Sequência de aminoácidos

ID NO Região ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS 122 constante WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ da cadeia TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG pesada de GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN IgG1 WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL humana NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS (CH1-CH2- RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT CH3) TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL

HNHYTQKSLSLSP IV. EXEMPLOS

[000403] A seguir estão exemplos de métodos e composições da invenção. Entende-se que vários outros aspectos podem ser praticados, dada a descrição geral fornecida acima.

EXEMPLO 1 - GERAÇÃO DE LIGANTE CD3 OTIMIZADO

[000404] A partir de um ligante CD3 descrito anteriormente (vide, por exemplo, WO 2014/131712, incorporado neste documento por referência), denominado "CD3orig" e compreendendo as sequências de VH e VL da SEQ ID NOs 6 e 11, respectivamente, foi objetivado otimizar as propriedades desse ligante pela remoção de dois motivos da sequência de desamidação de asparagina nas posições de Kabat 97 e 100 da CDR3 da cadeia pesada.

[000405] Para este fim, foi gerada uma biblioteca de anticorpos, adequada para exibição em fagos, da cadeia pesada com ambas as asparaginas na posição Kabat 97 e 100 removidas e, além disso, os CDRs H1, H2 e H3 randomizados para compensar a perda de afinidade causada pela substituição de Asn97 e Asn100 por meio de um processo de maturação por afinidade.

[000406] Essa biblioteca foi colocada em um fago filamentoso por meio da fusão com a proteína de revestimento menor p3 (Marks et al., (1991) J Mol Biol 222, 581-597) e selecionada para ligação a CD3ɛ recombinante.

[000407] 10 clones candidatos foram identificados na triagem inicial, mostrando ligação aceitável no antígeno recombinante conforme medido por SPR como fragmentos Fab (produzidos em E. coli).

[000408] Apenas um desses clones, no entanto, mostrou atividade de ligação aceitável a células que expressam CD3, conforme medido por citometria de fluxo após a conversão para o formato de IgG.

[000409] O clone selecionado, denominado "CD3oti" neste documento e compreendendo as sequências de VH e VL da SEQ ID NOs 7 e 11, respectivamente, foi ainda avaliado e convertido em formato biespecífico, conforme descrito a seguir.

EXEMPLO 2 - LIGAÇÃO DO LIGANTE CD3 OTIMIZADO A CD3 LIGAÇÃO A CD3 RECOMBINANTE

[000410] A ligação a CD3 recombinante foi determinada por ressonância de plásmon de superfície (SPR) para o ligante CD3 otimizado "CD3oti" e o ligante CD3 original "CD3orig", ambos no formato de IgG1 humana com mutações P329G L234A L235A ("PGLALA", numeração EU) na região Fc (SEQ ID NOs 12 e 14 (CD3orig) e SEQ ID NOs 13 e 14 (CD3oti)).

[000411] A fim de avaliar o efeito da remoção do sítio de desamidação e seu efeito na estabilidade dos anticorpos, a ligação do ligante CD3 original e otimizado a CD3 recombinante foi testada após estresse de temperatura por 14 dias a 37 °C ou 40 °C. Amostras armazenadas a -80 °C foram usadas como referência. As amostras de referência e as amostras submetidas a estresse a 40 °C estavam em His a 20 mM, NaCl a 140 mM, pH 6,0, e as amostras submetidas a estresse a 37 °C em PBS, pH 7,4, todas a uma concentração de 1,2-1,3 mg/ml. Após o período de estresse (14 dias), as amostras em PBS foram dialisadas de volta para His a 20 mM, NaCl a 140 mM, pH 6,0 para análise posterior.

[000412] A concentração ativa relativa (RAC) das amostras foi determinada por SPR como segue.

[000413] A SPR foi realizada em um instrumento Biacore T200 (GE Healthcare). Anticorpo de captura anti-Fab (GE Healthcare, # 28958325) foi imobilizado em um Chip Sensoria CM5 Série S (GE Healthcare) usando química de acoplamento de amina padrão, resultando em uma densidade de superfície de 4000 - 6000 unidades de ressonância (UR). Como tampão de execução e de diluição, foi usado HBS-P+ (HEPES a 10 mM, NaCl a 150 mM, pH 7,4, surfactante P20 a 0,05%). Os anticorpos CD3 com uma concentração de 2 µg/ml foram injetados durante 60 s a uma taxa de fluxo de 5 µl/min. O antígeno CD3 (vide abaixo) foi injetado a uma concentração de 10 µg/ml por 120 s e a dissociação foi monitorada a uma taxa de fluxo de 5 µl/min por 120 s. A superfície do chip foi regenerada por duas injeções consecutivas de glicina a 10 mM, pH 2,1, por 60 s cada. As diferenças do índice de refração em massa foram corrigidas subtraindo injeções em branco e subtraindo a resposta obtida da célula de fluxo de controle em branco. Para avaliação, a resposta de ligação foi obtida 5 segundos após o final da injeção. Para normalizar o sinal de ligação, a ligação de CD3 foi dividida pela resposta anti- Fab (o sinal (UR) obtido após a captura do anticorpo CD3 no anticorpo anti-Fab imobilizado). A concentração ativa relativa foi calculada referenciando cada amostra com estresse de temperatura à amostra sem estresse correspondente.

[000414] O antígeno usado foi um heterodímero de ectodomínios CD3 delta e CD3 épsilon fundidos a um domínio Fc humano com modificações protuberância-em-buraco e um marcador Avi no terminal C (vide SEQ ID NOs 28 e 29).

[000415] Os resultados deste experimento são mostrados na Figura 2. Como pode ser visto, o ligante CD3 otimizado, CD3 oti, mostrou uma ligação fortemente melhorada a CD3 após estresse de temperatura (2 semanas a 37 °C, pH 7,4) em comparação com o ligante CD3 original, CD3 orig. Esse resultado demonstra que a remoção do sítio de desamidação foi bem-sucedida e rendeu um anticorpo com propriedades de estabilidade superiores, relevantes para a meia-vida in vivo, bem como a formulação do anticorpo em pH neutro.

LIGAÇÃO A CD3 EM CÉLULAS JURKAT

[000416] A ligação a CD3 na linhagem de células T repórter humanas Jurkat NFAT foi determinada por FACS para o ligante CD3 otimizado "CD3oti" e o ligante CD3 original "CD3orig", ambos no formato de IgG1 humana com mutações P329G L234A L235A ("PGLALA", numeração EU) na região Fc (SEQ ID NOs 12 e 14 (CD3orig) e SEQ ID NOs 13 e 14 (CD3oti)).

[000417] As células repórter Jurkat-NFAT (GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P; Promega # CS176501) são uma linhagem celular repórter de leucemia linfática aguda humana com um promotor NFAT, expressando CD3 humano. As células foram cultivadas em RPMI1640, 2 g/l de glicose, 2 g/l de NaHCO3, 10% de FCS, 25 mM de HEPES, 2 mM de L- glutamina, 1 x NEAA, 1 x piruvato de sódio a 0,1-0,5 mio células por ml. Uma concentração final de 200 µg por ml de higromicina B foi adicionada sempre que as células foram passadas.

[000418] Para o ensaio de ligação, as células Jurkat NFAT foram colhidas, lavadas com PBS e ressuspensas em tampão FACS. A coloração do anticorpo foi realizada em uma placa de fundo redondo de 96 poços. Portanto, 100.000 a 200.000 células foram semeadas por poço. A placa foi centrifugada durante 4 min a 400 xg e o sobrenadante foi removido. Os anticorpos de teste foram diluídos em tampão FACS e 20 µl da solução de anticorpo foram adicionados às células por 30 min a 4 °C. Para remover o anticorpo não ligado, as células foram lavadas duas vezes com tampão FACS antes da adição do anticorpo secundário diluído (Fragmento Fcg de IgG anti- humana de cabra específico para fragmento AffiniPure F(ab')2 conjugado com PE; Jackson ImmunoResearch # 109-116-170). Após 30 min de incubação a 4

°C, o anticorpo secundário não ligado foi removido por lavagem. Antes da medição, as células foram ressuspensas em 200 µl de tampão FACS e depois analisadas por citometria de fluxo usando um dispositivo BD Canto II.

[000419] Conforme mostrado na Figura 3, o ligante CD3 otimizado “CD3oti” e o ligante CD3 original “CD3orig” ligaram-se comparativamente bem a CD3 em células Jurkat.

EXEMPLO 3 - ATIVIDADE FUNCIONAL DO LIGANTE CD3 OTIMIZADO

[000420] A atividade funcional do ligante CD3 otimizado “CD3oti” foi testada em um ensaio de células repórter Jurkat e comparada com a atividade do ligante CD3 original “CD3orig”. Para testar a atividade funcional das IgGs, células CHO expressando anti-PGLALA foram coincubadas com células repórter Jurkat NFAT na presença de concentrações crescentes de CD3oti de IgG1 PGLALA humano ou CD3orig de IgG1 PGLALA humano. A ativação de CD3 nas células repórter Jurkat NFAT após a reticulação de células T induz a produção de luciferase e a luminescência pode ser medida como um marcador de ativação. O CD3orig de IgG1 do tipo selvagem humano foi incluído como controle negativo que não pode se ligar a células CHO que expressam anti-PGLALA e, portanto, não pode ser reticulado em células Jurkat NFAT. Uma ilustração esquemática do ensaio é fornecida na Figura 4.

[000421] As células CHO que expressam anti-PGLALA são células CHO-K1 modificadas para expressar em sua superfície um anticorpo que se liga especificamente a Fc(PGLALA) de IgG 1 humana (vide WO 2017/072210, neste documento incorporado por referência). Essas células foram cultivadas em meio DMEM/F12 contendo 5% de FCS + 1% de GluMax.

As células repórter Jurkat NFAT são conforme descrito no Exemplo 2.

[000422] Após a ligação simultânea do CD3 huIgG1 PGLALA ao anti-PGLALA expresso em CHO e CD3 expresso em células repórter Jurkat- NFAT, o promotor NFAT é ativado e leva à expressão da luciferase ativa do pirilampo. A intensidade do sinal de luminescência (obtido após a adição do substrato de luciferase) é proporcional à intensidade da ativação e sinalização de CD3. As células repórter Jurkat-NFAT crescem em suspensão e foram cultivadas em RPMI1640, 2 g/l de glicose, 2 g/l de NaHCO3, 10% de FCS, 25 mM de HEPES, 2 mM de L-glutamina, 1 x NEAA, 1 x piruvato de sódio a 0,1 - 0,5 mio células por ml, 200 µg por ml higromicina. Para o ensaio, as células CHO foram colhidas e a viabilidade determinada usando ViCell. 30.000 células alvo/poço foram semeadas em uma placa de 96 poços de fundo plano e parede branca (Greiner bio-one # 655098) em 100 l meio e 50 µl/poço de anticorpos diluídos ou meio (para controles) foram adicionados às células CHO.

Posteriormente, as células repórter Jurkat-NFAT foram colhidas e a viabilidade avaliada usando ViCell. As células foram ressuspensas a 1,2 mio células/ml em meio de cultura celular sem higromicina B e adicionadas às células CHO a

60.000 células/poço (50 µl/poço) para obter uma razão efetor-para-alvo final (E: T) de 2:1 e um volume final de 200 µl por poço. Então, 4 l de GloSensor (Promega # E1291) foram adicionados a cada poço (2% do volume final). As células foram incubadas por 24 h a 37 °C em uma incubadora umidificada. No final do tempo de incubação, a luminescência foi detectada usando TECAN Spark a 10M.

[000423] Como mostrado na Figura 5, o ligante CD3 otimizado, CD3oti, teve uma atividade semelhante em células Jurkat NFAT após reticulação como CD3orig.

EXEMPLO 4 - GERAÇÃO DE ANTICORPO BIESPECÍFICO DE CÉLULAS T COMPREENDENDO LIGANTE CD3 OTIMIZADO TCB DE TYRP1

[000424] O ligante CD3 otimizado identificado no Exemplo 1 ("CD3oti", SEQ ID NOs 7 (VH) e 11 (VL)) foi usado para gerar um anticorpo biespecífico de células T (TCB) direcionado a CD3 e TYRP1 ("TCB de TYRP1").

[000425] O ligante TYRP1 compreendido nesse TCB foi gerado por humanização do ligante TYRP1 "TA99" (vide as entradas do GenBank AXQ57811 e AXQ57813 para a cadeia pesada e leve, respectivamente) e compreende as sequências da região variável da cadeia pesada e leve mostradas nas SEQ ID NOs 18 e 22, respectivamente.

[000426] Uma ilustração esquemática da molécula de TCB é fornecida na Figura 6, e suas sequências completas são fornecidas nas SEQ ID NOs 23, 24, 25 e 27.

[000427] Uma molécula análoga com as sequências de ligação a CD3 originais também foi preparada (SEQ ID NOs 23, 24, 25 e 26).

[000428] Moléculas biespecíficas foram geradas por transfecção transitória de células HEK293 EBNA. As células foram transfectadas com os vetores de expressão correspondentes em uma razão de 1:2:1:1 ("cadeia pesada do vetor (VH-CH1-VL-CH1-CH2-CH3)": “Cadeia leve do vetor (VL-CL)”: “Cadeia pesada do vetor (VH-CH1-CH2-CH3)”: "Cadeia leve do vetor (VH-CL)") As células foram centrifugadas e o meio foi substituído por meio CD CHO pré-aquecido (Thermo Fisher, # 10743029). Os vetores de expressão foram misturados em meio CD CHO, PEI (polietilenimina, Polysciences, # 23966-1) foi adicionado, a solução agitada com vórtex e incubada por 10 minutos à temperatura ambiente. Posteriormente, as células (2 mio/ml) foram misturadas com a solução de vetor/PEI, transferidas para um frasco e incubadas por 3 horas a 37 °C em uma incubadora com agitação com 5% de atmosfera de CO2. Após a incubação, foi adicionado meio Excell com suplementos (80% do volume total). Um dia após a transfecção, foram adicionados suplementos (alimentação, 12% do volume total). Os sobrenadantes celulares foram colhidos após 7 dias por centrifugação e filtração subsequente (filtro de 0,2 μm).

[000429] As proteínas foram purificadas a partir de sobrenadantes de cultura de células filtradas por métodos padrão. Em suma, as proteínas contendo Fc foram purificadas a partir de sobrenadantes de cultura de células por cromatografia de afinidade de Proteína A (MabSelect Sure, GE Healthcare: tampão de equilíbrio: citrato de sódio a 20 mM, fosfato de sódio a 20 mM, pH 7,5; tampão de eluição: citrato de sódio a 20 mM, NaCl a 100 mM, glicina a 100 mM, pH 3,0). A eluição foi alcançada em pH 3,0 seguida por neutralização imediata do pH da amostra. A proteína foi concentrada por centrifugação (Millipore Amicon® ULTRA-15 (# UFC903096)) e a proteína agregada foi separada da proteína monomérica por cromatografia por exclusão de tamanho (Superdex 200, GE Healthcare) em histidina a 20 mM, cloreto de sódio a 140 mM, pH 6,0.

[000430] A concentração de proteínas purificadas foi determinada medindo a absorção a 280 nm usando o coeficiente de extinção de massa calculado com base na sequência de aminoácidos de acordo com Pace et al. (1995), Protein Science 4, 2411-23. A pureza e o peso molecular das proteínas foram analisados por CE-SDS na presença e ausência de um agente redutor usando um LabChipGXII (Perkin Elmer) (Tabela 1). A determinação do conteúdo agregado foi realizada por cromatografia de HPLC a 25 °C usando coluna analítica por exclusão de tamanho (TSKgel G3000 SW XL ou UP-SW3000) equilibrada em tampão de execução (K2HPO4 a 25 mM, NaCl a 125 mM, L-monocloridrato de arginina a 200 mM, pH 6,7, ou KH 2PO4 a 200 mM, KCl a 250 mM, pH 6,2, respectivamente) (Tabela 2).

TABELA 1. ANÁLISES CE-SDS (NÃO REDUZIDAS) DE TCBS TYRP1. Molécula Pico # Tamanho [kDa] Pureza [%] TCB TYRP1 CD3oti 1 221 100 TCB TYRP1 CD3orig 1 206 100

TABELA 2. PRODUÇÃO RESUMIDA E PURIFICAÇÃO DE TCBS TYRP1. Título Rendimento SEC analítico Molécula Recuperação [%] [mg/l] [mg/l] (HMW/Monômero/LMW) [%] TCB TYRP1 114 20 22,8 0,5/98,6/0,9 CD3oti TCB TYRP1 72 12 8,7 0/97,5/2,5 CD3orig EXEMPLO 5 - LIGAÇÃO DE ANTICORPO BIESPECÍFICO DE CÉLULAS T COMPREENDENDO LIGANTE CD3 OTIMIZADO A CD3 E TYRP1 LIGAÇÃO A CD3 RECOMBINANTE

[000431] A ligação do TCB TYRP1 a CD3 recombinante foi avaliada por SPR, usando os TCBs com as sequências de ligação a CD3 otimizadas (TCB TYRP1 CD3oti) ou originais (TCB TYRP1 CD3orig).

[000432] Os experimentos de SPR foram realizados em um Biacore T200 com HBS-EP como tampão de execução (HEPES a 0,01 M, pH 7,4, NaCl a 0,15 M, 0,05% (v/v) de Surfactante P20 (GE Healthcare)).

[000433] TCB TYRP1 foi capturado em uma superfície do chip sensorial CM5 com um anticorpo imobilizado que se liga especificamente a Fc(PGLALA) de IgG1 humana (PGLALA) (vide WO 2017/072210, neste documento incorporado por referência). O anticorpo de captura foi acoplado à superfície do chip sensorial por imobilização direta de cerca de 8700 unidades de ressonância (UR) a pH 5,0 usando o kit de acoplamento de amina padrão (GE Healthcare). As moléculas de TCB foram capturadas por 30 s a 5 nM com um fluxo de 10 μl/min.

[000434] Os antígenos humanos e de cynomolgus (vide abaixo) foram passados a uma concentração de 12,35 - 3000 nM com um fluxo de 30 μl/min através das células de fluxo ao longo de 240 s. A fase de dissociação foi monitorada por 240 s e desencadeada pela troca da solução de amostra para HBS-EP. A superfície do chip foi regenerada após cada ciclo usando uma injeção de glicina a 10 mM, pH 2,0, por 30 s.

[000435] Os antígenos usados foram heterodímeros de ectodomínios CD3 delta e CD3 épsilon humanos ou de cynomolgus fundidos a um domínio Fc humano com modificações protuberância-em-buraco e um marcador Avi no terminal C (vide SEQ ID NOs 28 e 29 (CD3 humano) e SEQ ID NOs 30 e 31 (CD3 de cynomolgus)).

[000436] As diferenças do índice de refração em massa foram corrigidas subtraindo a resposta obtida na célula de fluxo de referência (sem TCB capturado). As constantes de afinidade foram derivadas das constantes de velocidade cinética ajustando-se a uma ligação Langmuir de 1:1 usando o software BIAeval (GE Healthcare).

[000437] Os valores de KD para ligação a CD3 humano e de cynomolgus foram determinados como 50 nM e 20 nM, respectivamente, para TCB TYRP1 CD3oti e foram semelhantes aos do TCB TYRP1 CD3orig (50 nM e 40 nM, respectivamente).

[000438] Isso mostra que em condição sem estresse ambos os TCBs, compreendendo CD3oti ou CD3orig, ligaram-se comparativamente bem a CD3 recombinante.

[000439] A ligação do TCB TYRP1 a CD3 humano recombinante também foi avaliada após estresse de temperatura por 14 dias a 37 °C ou 40 °C, usando os TCBs com as sequências de ligação a CD3 otimizadas ou originais. O experimento foi realizado conforme descrito no Exemplo 2 acima, usando TCB em vez de moléculas de IgG.

[000440] Os resultados deste experimento são mostrados na Figura 7.

[000441] Como pode ser visto na Figura 7, o TCB compreendendo o ligante CD3 otimizado, CD3 oti, mostrou ligação fortemente melhorada a CD3 após estresse (2 semanas a 37 °C, pH 7,4) em comparação com o TCB que compreende o ligante CD3 original, CD3orig. Esse resultado confirma que as propriedades melhoradas do ligante CD3 otimizado (vide Exemplo 2) são mantidas no nível de TCB.

LIGAÇÃO A TYRP1 RECOMBINANTE

[000442] A ligação a TYRP1 recombinante foi avaliada por SPR, usando fragmentos Fab de TYRP1 preparados por digestão com plasmina do anticorpo correspondente.

[000443] Os experimentos de SPR foram realizados em um Biacore T200 com HBS-EP como tampão de execução (HEPES a 0,01 M, pH 7,4, NaCl a 0,15 M, 0,05% (v/v) de Surfactante P20 (GE Healthcare)).

[000444] Um anticorpo que se liga especificamente a (PGLALA)Fc de IgG1 humana (vide WO 2017/072210, neste documento incorporado por referência) foi acoplado diretamente em um chip sensorial CM5 a pH 5,0 usando o kit de acoplamento de amina padrão (GE Healthcare). Os antígenos (vide abaixo) foram capturados com uma taxa de fluxo de 10 l/min por 30 s. Uma série de diluição de 3 vezes dos fragmentos Fab TYRP1 foi passada nas células de fluxo em 30l/min por 180 s para registrar a fase de associação. A fase de dissociação foi monitorada por 180 s ou 1200 s e desencadeada pela mudança da solução de amostra para HBS-EP. A superfície do chip foi regenerada após cada ciclo usando uma injeção de glicina a 10 mM, pH 2, por 30 s a 30 µl/min.

[000445] Os antígenos usados foram fusões monoméricas do domínio extracelular TYRP1 humano, de cynomolgus ou de camundongo (ECD) para um domínio Fc humano com modificações protuberância-em-buraco (e PGLALA) e um marcador Avi no terminal C (vide SEQ ID NOs 32 e 35 (TYRP1 humano), SEQ ID NOs 33 e 35 (TYRP1 de cynomolgus) ou SEQ ID NOs 34 e 35 (TYRP1 de camundongo)).

[000446] As diferenças do índice de refração em massa foram corrigidas subtraindo a resposta obtida na célula de fluxo de referência

(nenhum antígeno capturado). As constantes de afinidade (K D) foram derivadas das constantes de velocidade cinética ajustando-se a uma ligação Langmuir de 1:1 usando o software BIAeval (GE Healthcare).

[000447] Os valores de K D para ligação ao TYRP1 humano, de cynomolgus e de camundongo foram determinados como 130 pM, 180 pM e 530 pM, respectivamente, e eram semelhantes aos do anticorpo parental TA99 (90 pM, 120 pM e 310 pM, respectivamente).

[000448] A ligação do TCB TYRP1 ao TYRP1 recombinante também foi avaliada após estresse de temperatura por 14 dias a 37 °C ou 40 °C, usando os TCBs com as sequências de ligação a CD3 otimizadas ou originais.

[000449] O experimento foi realizado conforme descrito acima para a ligação a CD3, usando TYRP1 recombinante (Sino Biologicals) como antígeno.

[000450] Os resultados deste experimento são mostrados na Figura 8. Eles confirmam que a ligação ao TYRP1 humano para ambos os TCBs (bem como para o ligante TYRP1 correspondente no formato de IgG) não é afetada por condições de estresse.

LIGAÇÃO A CD3 EM CÉLULAS JURKAT

[000451] A ligação a CD3 na linhagem de células T repórter humanas Jurkat NFAT foi determinada por FACS para TCBs TYRP1 compreendendo o ligante CD3 otimizado "CD3 oti" ou o ligante CD3 original "CD3orig", conforme descrito acima no Exemplo 2.

[000452] Conforme mostrado na Figura 9, o TCB compreendendo o ligante CD3 otimizado “CD3 oti ” se liga a CD3 em células Jurkat pelo menos comparativamente bem ao TCB que compreende o ligante CD3 original “CD3 orig”.

EXEMPLO 6 - ATIVIDADE FUNCIONAL DO ANTICORPO BIESPECÍFICO DE CÉLULAS T COMPREENDENDO LIGANTE CD3 OTIMIZADO ATIVAÇÃO DE CD3

[000453] Os TCBs TYRP1 contendo o ligante CD3 otimizado, CD3oti, ou o ligante CD3 original, CD3orig, (Exemplo 4) foram testados no ensaio de células repórter Jurkat NFAT (vide Exemplo 3) na presença de células de melanoma positivas para TYRP1 M150543 (linhagem celular de melanoma primário, obtida do banco de células dermatológicas da Universidade de Zurique).

[000454] Após a ligação simultânea de TCB TYRP1 a células alvo positivas para TYRP1 e antígeno CD3 (expresso em células repórter Jurkat-NFAT), o promotor NFAT é ativado e leva à expressão da luciferase do pirilampo ativo. A intensidade do sinal de luminescência (obtido após a adição do substrato de luciferase) é proporcional à intensidade da ativação e sinalização de CD3. O ensaio foi realizado conforme descrito no Exemplo 3, usando M150543 em vez de células CHO que expressam anti-PGLALA.

[000455] Como visto para as IgGs (Exemplo 3), ambos os TCBs contendo CD3oti ou CD3orig tinham uma atividade funcional semelhante nas células repórter Jurkat NFAT e induziu a ativação de CD3 de uma maneira dependente da concentração (Figura 10).

MORTE DE CÉLULAS ALVO

[000456] Em uma próxima etapa, ambas as moléculas de TCB foram testadas em um ensaio de morte de células tumorais com PBMCs humanas recém-isoladas de três doadores diferentes, coincubadas com a linhagem celular de melanoma humano M150543. A lise das células tumorais foi determinada pela liberação de LDH após 24 he 48 h. A ativação de células T CD4 e CD8 foi analisada por regulação positiva de CD69 e CD25 em ambos os subconjuntos de células após 48 h.

[000457] Em suma, as células alvo foram colhidas com tripsina/EDTA, lavadas e plaqueadas a uma densidade de 30.000 células/poço usando placas de 96 poços de fundo plano. As células foram deixadas aderir durante a noite. As células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram preparadas por centrifugação de densidade Histopaque de sangue fresco obtido de doadores humanos saudáveis. Sangue fresco foi diluído com PBS estéril e colocado em camadas sobre gradiente Histopaque (Sigma # H8889).

Após centrifugação (450 xg, 30 minutos, temperatura ambiente), o plasma acima da interfase contendo PBMC foi descartado e as PBMCs transferidas para um novo tubo Falcon posteriormente preenchido com 50 ml de PBS. A mistura foi centrifugada (400 xg, 10 minutos, temperatura ambiente), o sobrenadante descartado e o grânulo de PBMC lavado duas vezes com PBS estéril (etapas de centrifugação 350 xg, 10 minutos). A população de PBMC resultante foi contada automaticamente (ViCell) e armazenada em meio RPMI1640 contendo 10% de FCS e 1% de L-alanil-L-glutamina (Biochrom # K0302) a 37 °C, 5% de CO2 na incubadora de células até o uso posterior (não mais do que 24 h). Para o ensaio de morte, os anticorpos foram adicionados nas concentrações indicadas em triplicado. As PBMCs foram adicionadas às células alvo na razão efetor-para-alvo final (E:T) de 10:1. A morte de células alvo foi avaliada após 24 h de incubação a 37 °C, 5% de CO 2 por quantificação de LDH liberado em sobrenadantes celulares por células apotióticas/necróticas (kit de detecção de LDH, Roche Applied Science #11 644 793 001). A lise máxima das células alvo (= 100%) foi alcançada por incubação das células alvo com Triton X-100 a 1%. Lise mínima (= 0%) refere-se a células alvo coincubadas com células efetoras sem construto biespecífico.

[000458] A ativação de células T CD8 e CD4 após a morte de células T de células alvo mediada pelo TCB foi avaliada por citometria de fluxo usando anticorpos que reconhecem os marcadores de ativação de células T

CD25 (marcador de ativação tardia) e CD69 (marcador de ativação precoce).

Após 48 h de incubação, as PBMCs foram transferidas para uma placa de 96 poços de fundo redondo, centrifugados a 350 xg por 5 min e lavadas duas vezes com tampão FACS. A coloração de superfície para CD4 APC (BioLegend # 300514), CD8 FITC (BioLegend # 344704), CD25 BV421 (BioLegend # 302630) e CD69 PE (BioLegend # 310906) foi realizada de acordo com as indicações dos fornecedores. As células foram lavadas duas vezes com 150 µl/poço de tampão FACS e fixadas por 15 min a 4 °C usando 100 µl/poço de tampão de fixação (BD #554655). Após centrifugação, as amostras foram ressuspensas em 200 µl/poço de tampão FACS. As amostras foram analisadas em BD FACS Fortessa.

[000459] Em todos os três doadores, ambos os TCBs, compreendendo o ligante CD3 otimizado ou original, induziu a ativação das células T e a lise das células tumorais de uma maneira comparável (Figura 11).

Os valores de EC50 da lise de células tumorais para todos os três doadores após 48 h estão em suma na Tabela 3.

TABELA 3. SUMÁRIO DOS VALORES DE EC50 DA MORTE DE CÉLULAS TUMORAIS COM TCBS DE TYRP1 EM 48 H. TCB TYRP1 (CD3oti) TCB TYRP1 (CD3orig) Doador de EC50 (intervalo de confiança de EC50 (intervalo de confiança de

PBMC 95%) 95%) Doador 1 0,31 nM (0,17 a 0,55) 0,44 nM (0,28 a 0,70) Doador 2 0,03 nM (0,02 a 0,06) 0,05 nM (0,02 a 0,09) Doador 3 0,08 nM (0,07 a 0,1) 0,14 nM (0,11 a 0,18) EXEMPLO 7 - ESTUDO DE PK COM ANTICORPOS BIESPECÍFICOS DE CÉLULAS T EM

CAMUNDONGOS

[000460] A farmacocinética (PK) do TCB TYRP1 com diferentes ligantes CD3 (CD3orig e CD3oti) foi estudada após administração em bolus intravenosa de 1 mg/kg para FcRn humano transgênico (linha32,

homozigoto) e camundongos nocaute para FcRn (Cepa do Jackson Laboratory números 003982 e 014565) (n=3/cepa/composto de teste). Amostras de sangue em série foram retiradas de camundongos transgênicos humanos (tg) FcRn até 672 h (9 amostras por camundongo de 5 min a 672 h após a dose) e até 96 h em camundongos nocaute (ko) FcRn (8 amostras por camundongo de 5 min a 96 h após a dose). O soro foi preparado e armazenado congelado até a análise. As amostras de soro de camundongo foram analisadas com um método ECLIA genérico específico para o domínio CH1/kappa Ig/Fab humano usando o instrumento cobas® e411 (Roche) sob condições não BPL. A avaliação farmacocinética foi conduzida usando análise não compartimental padrão.

[000461] Os resultados deste estudo são apresentados na Tabela 4. Isso indica que a modificação das CDRs não deu origem a outra responsabilidade de sequência, que afetaria a depuração do anticorpo. CD3 oti é tão bom quanto CD3orig em termos de meia-vida sérica, embora tenha o benefício adicional de maior estabilidade de CDR.

TABELA 4. DADOS DE DEPURAÇÃO EM CAMUNDONGOS HUFCRN TG E CAMUNDONGOS FCRN KO (ML/DIA/KG; MÉDIA E (CV)). Linhagem de TCB de TYRP1 TCB de TYRP1 camundongo (CD3orig) (CD3oti) tg32 de hFcRn 8,82 (10,0) 6,68 (12,5) ko de FcRn 66,4 (16,2) 65,0 (6,5) EXEMPLO 8 - GERAÇÃO DE UM OUTRO ANTICORPO BIESPECÍFICO DE CÉLULAS T COMPREENDENDO LIGANTE CD3 OTIMIZADO

[000462] O ligante CD3 otimizado identificado no Exemplo 1 ("CD3oti", SEQ ID NOs 7 (VH) e 11 (VL)) foi usado para gerar um anticorpo biespecífico de células T (TCB) direcionado a CD3 e EGFRvIII ("TCB EGFRvIII").

[000463] O ligante EGFRvIII compreendido nesse TCB

(P063.056) foi derivado de exibição em fagos seguida por maturação de afinidade (vide abaixo) e compreende as sequências da região variável da cadeia pesada e leve mostradas nas SEQ ID NOs 88 e 92, respectivamente.

[000464] Uma ilustração esquemática da molécula de TCB é fornecida na Figura 6, e suas sequências completas são fornecidas nas SEQ ID NOs 109, 110, 111 e 27.

[000465] Uma molécula análoga com as sequências de ligação a CD3 originais também foi preparada (SEQ ID NOs 109, 110, 111 e 26).

[000466] Moléculas biespecíficas foram geradas por transfecção transitória de células HEK293 EBNA, purificadas e analisadas como descrito acima no Exemplo 4.

[000467] Além disso, os anticorpos EGFRvIII derivados da exibição em fagos foram produzidos no formato de IgG1 humana de maneira análoga (transfecção das células HEK EBNA com os vetores de expressão para as cadeias pesadas e leves de IgG, em uma razão de 1:1), para uso conforme descrito abaixo.

[000468] Todos os construtos de IgGs e TCB foram purificados em qualidade comparável com um teor de monômero acima de 95%, conforme determinado por cromatografia por exclusão de tamanho.

SELEÇÃO DE ANTICORPO EGFRVIII

[000469] Os anticorpos EGFRvIII foram derivados da exibição em fago e maturação por afinidade. Anticorpos mostrando ligação de alta afinidade e especificidade para EGFRvIII (P056.021 (SEQ ID NOs 40 e 44), P056.052 (SEQ ID NOs 48 e 52), P047.019 (SEQ ID NOs 56 e 60), P057.012 (SEQ ID NOs 64 e 68), P057.011 (SEQ ID NOs 72 e 76), P056.027 (SEQ ID NOs 80 e 84)) foram testados quanto à ligação a EGFRvIII expresso na superfície celular usando células CHO que expressam de forma estável

EGFRvIII e a linhagem celular DK-MG de glioblastoma humano positiva para EGFRvIII. Para confirmar a especificidade e excluir a reatividade cruzada para EGFR do tipo selvagem (EGFRwt), os anticorpos selecionados foram testados quanto à ligação à linhagem de células tumorais humanas positivas para EGFRwt MKN-45 (Figura 12). O cetuximabe foi incluído como controle positivo para ligação a EGFRwt e a IgG de DP47 não direcionada como controle negativo. Todos os anticorpos selecionados ligaram-se especificamente a EGFRvIII sem reatividade cruzada com EGFRwt e foram considerados para posterior caracterização.

[000470] Em uma próxima etapa, a atividade funcional desses anticorpos EGFRvIII como de IgG1 PGLALA (formato de IgG1 humana com mutações P329G L234A L235A ("PGLALA", numeração EU) na região Fc) foi avaliada em células DK-MG coincubadas com células repórter Jurkat NFAT que expressam um receptor de antígeno quimérico anti-PGLALA (CAR) medindo a luminescência (ensaio de CAR J, vide o pedido PCT nº PCT/EP2018/086038, incorporado neste documento por referência em sua totalidade). DP47 IgG1 PGLALA foi incluído como controle negativo. Todos os anticorpos EGFRvIII testados induziram forte ativação das células repórter Jurkat NFAT que expressam CAR (Figura 13). Todos os anticorpos EGFRvIII testados, exceto para P047.019, que mostrou a ligação e ativação mais fracas, foram selecionados para conversão no formato de TCB (com CD orig como ligante CD3).

[000471] A ligação dos anticorpos EGFRvIII selecionados convertidos no formato de TCB às células CHO-EGFRvIII foi comparada à ligação das IgGs correspondentes (Figura 14) para confirmar que a conversão no formato de TCB não tem impacto nas capacidades de ligação dos anticorpos EGFRvIII. A maioria dos clones EGFRvIII testados reteve sua capacidade de se ligar a EGFRvIII após a conversão no formato de TCB;

apenas o clone P057.011 mostrou ligação ligeiramente reduzida a EGFRvIII no formato de TCB em comparação com a IgG correspondente (Tabela 5).

TABELA 5. LIGAÇÃO DE IGG E TCB DE EGFRVIII A CHO-EGFRVIII (EC50). Clone de EGFRvIII EC50 de IgG (nM) EC50 de TCB (nM) P056.021 16,5 13,0 P056.027 13,1 15,9 P056.052 18,2 19,5 P057.012 3,0 5,5 P057.011 5,3 12,8

[000472] Subsequentemente, a atividade funcional dos TCBs EGFRvIII foi testada em um ensaio de células repórter Jurkat NFAT em células DK-MG positivas para EGFRvIII (Figura 15). Todos os TCBs EGFRvIII testados tiveram atividade no ensaio de células repórter Jurkat NFAT com P056.021 sendo o mais potente, seguido por P056.027, P056.052 e P057.012 que tiveram atividade semelhante, e P057.011 que teve a atividade mais baixa. Em seguida, os TCBs EGFRvIII foram testados em um ensaio de lise de células tumorais com PBMCs cocultivadas com células DK-MG ou MKN-45 para excluir a reatividade cruzada dos TCBs EGFRvIII para EGFRwt (Figura 16). Neste ensaio, além da lise das células tumorais, a ativação das células T (Figura 17) e a liberação de citocinas (Figura 18) foram medidas como leituras adicionais.

Como visto no ensaio de células repórter anterior, TCB EGFRvIII P056.021 teve a maior atividade em células positivas para EGFRvIII sem ter qualquer atividade em células positivas para EGFRwt. TCB EGFRvIII P057.011 mostrou atividade inespecífica em células EGFRwt e foi, portanto, excluído. Os TCBs EGFRvIII P056.027, P056.052 e P057.012 tiveram atividade comparável. Com base nesses resultados, os ligantes EGFRvIII P056.021 e P057.012 foram selecionados para uma rodada adicional de maturação de afinidade.

[000473] Nenhum bom ligante pôde ser derivado de

P057.012 (resultados não mostrados). A afinidade e a especificidade para EGFRvIII de ligantes EGFRvIII selecionados derivados de P056.021, conforme determinado por SPR, são mostradas na Tabela 6.

TABELA 6. AFINIDADE E ESPECIFICIDADE PARA EGFRVIII DE LIGANTES EGFRVIII SELECIONADOS CONFORME DETERMINADO POR SPR. Ligante Especificidade Ligação a EGFRvIII (sem ligação a EGFRwt) (KD [nM]) P056.021 (parental) sim 35 P063.056 sim 10 P064.078 não 15 P065.036 não 10

[000474] Ligantes EGFRvIII amadurecidos por afinidade (P063.056 (SEQ ID NOs 88 e 92), P064.078 (SEQ ID NOs 96 e 100), P065.036 (SEQ ID NOs 104 e 108)) também foram comparados ao ligante parental para ligação específica a EGFRvIII em células U87MG-EGFRvIII e MKN-45 (Figura 19). O melhor ligante EGFRvIII em termos de afinidade e especificidade para EGFRvIII, P063.056, foi selecionado para conversão no formato de TCB com CD3orig ou CD3oti como ligante CD3.

[000475] A atividade funcional do TCB EGFRvIII P063.056 (com CD3oti ou CD3orig) foi comparada com o TCB EGFRvIII P056.021 parental no ensaio de células repórter Jurkat NFAT em células U87MG-EGFRvIII, DK- MG e MKN-45 (Figura 20). Todos os três TCBs induzem ativação específica de Jurkat NFAT apenas na presença de células positivas para EGFRvIII. O TCB EGFRvIII P063.056 teve uma atividade ligeiramente maior do que o TCB EGFRvIII P056.021 parental.

MÉTODOS RESSONÂNCIA DE PLÁSMON DE SUPERFÍCIE

[000476] A afinidade dos anticorpos EGFRvIII para EGFRvIII foi determinada por ressonância de plásmon de superfície em Biacore T200 com HBS-EP como tampão de execução (HEPES a 0,01 M, pH 7,4, NaCl a

0,15 M, 0,005% (v/v) de Surfactante P20; GE Healthcare) a 25 °C. IgGs PGLALA anti-EGFRvIII foram capturadas por 30 s a 25 nM com um anticorpo que se liga especificamente a Fc(PGLALA) de IgG 1 humana (vide WO 2017/072210, neste documento incorporado por referência) imobilizada em um chip CM5. O antígeno EGFRvIII-ECD avi his (vide abaixo, Exemplo 9) foi passado a uma concentração de 12,4-1000 nM com um fluxo de 30 μl/min através de todas as células de fluxo ao longo de 200 s. A fase de dissociação foi monitorada por 300 s e desencadeada pela troca da solução de amostra para HBS-EP. A superfície do chip foi regenerada após cada ciclo usando duas injeções de glicina a 10 mM, pH 2,0, por 30 s. As diferenças do índice de refração em massa foram corrigidas subtraindo a resposta obtida na célula de fluxo de referência. As constantes de afinidade foram derivadas das constantes de velocidade cinética ajustando-se a uma ligação Langmuir de 1:1 usando o software BIAeval (GE Healthcare).

[000477] Para a determinação da especificidade, os antígenos EGFRvIII e EGFRwt ECD foram capturados com um anti-his (Penta His, Qiagen) imobilizado em um chip CM5 por 40 s a 100 nM. Uma única injeção de anticorpos anti-EGFRvIII a 500 nM por 60 s foi realizada, antes da regeneração com glicina a 10 mM, pH 2,0 por 60 s. Unidades de resposta acima de 50 foram observadas para ligação a EGFRvIII. Respostas acima de 5 unidades de resposta (UR) foram consideradas positivas para ligação ao EGFRwt e IgGs foram categorizadas como específicas com resposta abaixo de 5 UR para EGFRwt.

LINHAGENS CELULARES

[000478] As células repórter Jurkat-NFAT (GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P; Promega # CS176501) são uma linhagem celular repórter de leucemia linfática aguda humana com um promotor NFAT, expressando CD3 humano. As células foram cultivadas em RPMI1640, 2g/l de glucose, 2 g/l de NaHCO3, 10% de FCS, HEPES a 25 mM, 1% de Glutamax, 1 x de NEAA, 1 x de sódio-piruvato a 0,1-0,5 células mio por ml. Uma concentração final de 200 µg por ml de higromicina B foi adicionada sempre que as células foram passadas.

[000479] As células Jurkat NFAT com PGLALA CAR foram geradas internamente. A linhagem original de células (Jurkat NFAT; Signosis) é uma linhagem de células repórter de leucemia linfática aguda humanas com um promotor NFAT levando à expressão da luciferase após ativação por meio de CD3 humano. Elas foram modificadas para expressar um receptor de antígeno quimérico capaz de reconhecer a mutação P293G LALA. Quando cultivadas, as células crescem em suspensão em RPMI1640 suplementado com 10% de FCS e 1% de glutamina e mantidas entre 0,4-1,5 mio células por ml.

[000480] As células CHO-EGFRvIII foram geradas internamente. As células CHO-K1 foram transduzidas de forma estável com EGFRvIII. As células foram cultivadas em meio DMEM/F12 contendo 5% de FCS, 1% de GlutaMAX e 6 g/ml de puromicina.

[000481] DK-MG (DSMZ #ACC 277) é uma linhagem de células de glioblastoma humano. As células DK-MG foram enriquecidas por classificação de células para a expressão de EGFRvIII. As células foram cultivadas em RPMI 1860, 10% de FCS e 1% de GlutaMAX.

[000482] U87MG-EGFRvIII (ATCC HTB-14) é uma linhagem de células de glioblastoma humano que foi transduzida de forma estável com EGFRvIII. As células foram cultivadas em DMEM, 10% de FCS e 1% de GlutaMAX.

[000483] MKN-45 (DSMZ ACC 409) é uma célula de adenocarcinoma gástrico humano que expressa altos níveis de EGFRwt. As células foram cultivadas em RPMI1640 avançado contendo 2% de FCS e 1%

de GlutaMAX.

LIGAÇÃO AO ALVO POR CITOMETRIA DE FLUXO

[000484] As células usadas para experimentos de ligação foram colhidas, lavadas com PBS e ressuspensas em tampão FACS. A coloração do anticorpo foi realizada em uma placa de fundo redondo de 96 poços. As células foram colhidas, contadas e 100.000 a 200.000 células foram semeadas por poço. A placa foi centrifugada durante 4 min a 400 xg e o sobrenadante foi removido. Os anticorpos de teste foram diluídos em tampão FACS e 20 µl da solução de anticorpo foram adicionados às células por 30 min a 4 °C. Para remover o anticorpo não ligado, as células foram lavadas duas vezes com tampão FACS antes da adição do anticorpo secundário diluído Fragmento Fcg de IgG anti-humana de cabra específico para fragmento AffiniPure F(ab')2 conjugado com PE (Jackson ImmunoResearch, # 109-116- 170 ou # 109-116-098). Após 30 min de incubação a 4 °C, o anticorpo secundário não ligado foi removido por lavagem. Antes da medição, as células foram ressuspensas em 200 µl de tampão FACS e analisadas por citometria de fluxo usando BD Canto II ou BD FACS Fortessa.

ENSAIO DE CÉLULAS REPÓRTER CAR J NFAT COM IGGS PGLALA EGFRVIII

[000485] A potência das IgGs PGLALA EGFRvIII para induzir a ativação de células T foi avaliada usando o ensaio de células repórter CAR J NFAT. O princípio do ensaio é cocultivar células efetoras modificadas por Jurkat-NFAT com células cancerosas que expressam o antígeno tumoral.

Somente após a ligação simultânea das IgGs ao CAR através da mutação PGLALA e do antígeno alvo EGFRvIII, o promotor NFAT é ativado e leva ao aumento da expressão da luciferase nas células efetoras Jurkat. Após a adição de um substrato adequado, a luciferase Firefly ativa leva à emissão de luminescência, que pode ser medida como um sinal de ativação mediada por CAR. Em suma, as células alvo foram colhidas e a viabilidade determinada.

30.000 células alvo/poço foram semeadas em uma placa de 96 poços de parede branca de fundo plano (Greiner bio-one, # 655098) em 100 l de meio um dia antes do início do ensaio. No dia seguinte, o meio foi removido e 25 µl/poço de anticorpos diluídos ou meio (para controles) foram adicionados às células alvo. Posteriormente, as células repórter Jurkat-NFAT foram colhidas e a viabilidade avaliada usando ViCell. As células foram ressuspensas a 1,5 mio células/ml em meio de cultura de células e adicionadas às células tumorais a

75.000 células/poço (50 µl/poço) para obter uma razão efetor-para-alvo final (E: T) de 2,5:1 e um volume final de 75 µl por poço. Então 4 l de GloSensor (Promega, # E1291) foram adicionados a cada poço (2% do volume final). As células foram incubadas por 24 h a 37 °C em uma incubadora umidificada. No final do tempo de incubação, as placas foram adaptadas à temperatura ambiente (cerca de 15 min). Então 25 l/poço de Luciferase One-Glo (Promega, # E6120) foram adicionados e a placa foi incubada por 15 min no escuro antes da luminescência ser detectada usando Spark TECAN.

ENSAIO DE CÉLULAS REPÓRTER JURKAT NFAT COM TCB EGFRVIII

[000486] A capacidade de TCB EGFRvIII com o ligante CD3 otimizado ou CD3 original para induzir a reticulação de células T e subsequentemente a ativação de células T foi avaliada usando células positivas para EGFRvIII e células repórter Jurkat-NFAT. Após a ligação simultânea de TCB EGFRvIII a células alvo positivas para EGFRvIII e antígeno CD3 (expresso em células repórter Jurkat-NFAT), o promotor NFAT é ativado e leva à expressão da luciferase ativa do pirilampo. A intensidade do sinal de luminescência (obtido após a adição do substrato de luciferase) é proporcional à intensidade da ativação e sinalização de CD3. Para o ensaio, as células alvo foram colhidas e a viabilidade determinada. 30.000 células alvo/poço foram semeadas em uma placa de 96 poços de parede branca de fundo plano (Greiner bio-one, # 655098) em 100 l de meio e 50 µl/poço de anticorpos diluídos ou meio (para controles) foram adicionados às células alvo.

Posteriormente, as células repórter Jurkat-NFAT foram colhidas e a viabilidade avaliada usando ViCell. As células foram ressuspensas a 1,2 mio células/ml em meio de cultura de células sem higromicina B e adicionadas às células tumorais a 60.000 células/poço (50 µl/poço) para obter uma razão efetor-para-alvo final (E:T) de 2:1 e um volume final de 200 µl por poço. Então 4 l de GloSensor (Promega, # E1291) foram adicionados a cada poço (2% do volume final). As células foram incubadas por 24 h a 37 °C em uma incubadora umidificada. No final do tempo de incubação, a luminescência foi detectada usando Spark TECAN.

MORTE DE CÉLULAS TUMORAIS MEDIADA POR CÉLULAS T

[000487] As células alvo foram colhidas com tripsina/EDTA, lavadas e plaqueadas a uma densidade de 30.000 células/poço usando placas de 96 poços de fundo plano. As células foram deixadas aderir durante a noite.

As células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram preparadas por centrifugação de densidade Histopaque de sangue fresco obtido de doadores humanos saudáveis. Sangue fresco foi diluído com PBS estéril e colocado em camadas sobre gradiente Histopaque (Sigma, # H8889). Após centrifugação (450 xg, 30 minutos, temperatura ambiente), o plasma acima da interfase contendo PBMC foi descartado e as PBMCs transferidas em um novo tubo falcon posteriormente preenchido com 50 ml de PBS. A mistura foi centrifugada (400 xg, 10 minutos, temperatura ambiente), o sobrenadante descartado e o grânulo de PBMC lavado duas vezes com PBS estéril (etapas de centrifugação 350 xg, 10 minutos). A população de PBMC resultante foi contada automaticamente (ViCell) e armazenada em meio RPMI1640 contendo 10% de FCS e 1% de GlutaMAX a 37 °C, 5% de CO2 na incubadora de células até uso posterior (não mais do que 24 h). Para o ensaio de morte, o anticorpo foi adicionado nas concentrações indicadas em triplicados. As PBMCs foram adicionadas às células alvo na proporção efetor-para-alvo final (E:T) de 10:1. A morte de células alvo foi avaliada após 24 h de incubação a 37 °C, 5% de CO 2 por quantificação de LDH liberado em sobrenadantes celulares por células apoptóticas/necróticas (kit de detecção de LDH, Roche Applied Science, #11 644 793 001). A lise máxima das células alvo (= 100%) foi alcançada por incubação das células alvo com Triton X-100 a 1%. Lise mínima (= 0%) refere- se a células alvo coincubadas com células efetoras sem construto biespecífico.

[000488] A ativação de células T CD8 e CD4 após a morte de células T de células alvo mediada pelo TCB foi avaliada por citometria de fluxo usando anticorpos que reconhecem os marcadores de ativação de células T CD25 (marcador de ativação tardia) e CD69 (marcador de ativação precoce).

Após 48 h de incubação, as PBMCs foram transferidas para uma placa de 96 poços de fundo redondo, centrifugados a 350 xg por 5 min e lavadas duas vezes com tampão FACS. A coloração de superfície para CD4 APC (BioLegend, # 300514), CD8 FITC (BioLegend, # 344704), CD25 BV421 (BioLegend, # 302630) e CD69 PE (BioLegend, # 310906) foi realizada de acordo com as indicações dos fornecedores. As células foram lavadas duas vezes com 150 µl/poço de tampão FACS e fixadas por 15 min a 4 °C usando 100 µl/poço de tampão de fixação (BD, #554655). Após centrifugação, as amostras foram ressuspensas em 200 µl/poço de tampão FACS. As amostras foram analisadas em BD FACS Fortessa.

[000489] A secreção de citocinas no sobrenadante foi medida por citometria de fluxo, usando o arranjo de esferas citométrico (CBA) de acordo com as instruções do fabricante, mas em vez de 50 µl de esferas e amostra apenas 25 µl de sobrenadante e esferas foram usados. Os seguintes kits CBA (BD Biosciences) foram usados: Conjunto FLEX CBA de interferon gama humano (IFNγ), Conjunto Flex CBA de Granzima ß humana e Conjunto Flex CBA de TNF humano. As amostras foram medidas usando o BD FACS

Canto II ou BD FACS Fortessa e as análises foram realizadas usando o Software Diva (BD Biosciences).

EXEMPLO 9 - LIGAÇÃO DE ANTICORPO BIESPECÍFICO DE CÉLULAS T COMPREENDENDO LIGANTE CD3 OTIMIZADO A CD3 E EGFRVIII LIGAÇÃO A CD3 RECOMBINANTE

[000490] A ligação do TCB EGFRvIII a CD3 recombinante foi avaliada por SPR, usando os TCBs com as sequências de ligação a CD3 otimizadas (TCB EGFRvIII CD3oti) ou originais (TCB EGFRvIII CD3orig), conforme descrito para TCB TYRP1 no Exemplo 5 acima. O anticorpo de captura foi acoplado à superfície do chip sensorial por imobilização direta de cerca de 5200 unidades de ressonância (UR) a pH 5,0 usando o kit de acoplamento de amina padrão (GE Healthcare) e as moléculas de TCB foram capturadas por 30 s a 20 nM com um fluxo de 10 μl/min.

[000491] Os valores de KD para ligação a CD3 humano e de cynomolgus foram determinados como 30 nM e 20 nM, respectivamente, para TCB TYRP1 CD3oti, e foram semelhantes aos do TCB TYRP1 CD3orig (40 nM e 30 nM, respectivamente).

[000492] Isso mostra que em condição sem estresse ambos os TCBs, compreendendo CD3oti ou CD3orig, ligaram-se comparativamente bem a CD3 recombinante.

[000493] A ligação do TCB EGFRvIII a CD3 humano recombinante também foi avaliada após estresse de temperatura por 14 dias a 37 °C ou 40 °C, usando os TCBs com as sequências de ligação a CD3 otimizadas ou originais. O experimento foi realizado conforme descrito no Exemplo 2 acima, usando TCB em vez de moléculas de IgG.

[000494] Os resultados deste experimento são mostrados na Figura 21.

[000495] Como pode ser visto na Figura 21, o TCB compreendendo o ligante CD3 otimizado, CD3 oti, mostrou ligação fortemente melhorada a CD3 após estresse (2 semanas a 37 °C, pH 7,4) em comparação com o TCB que compreende o ligante CD3 original, CD3 orig. Esse resultado novamente confirma que as propriedades melhoradas do ligante CD3 otimizado (vide Exemplo 2) são mantidas no nível de TCB.

LIGAÇÃO A EGFRVIII RECOMBINANTE

[000496] A ligação dos TCBs EGFRvIII a EGFRvIII recombinante foi avaliada por SPR.

[000497] Os experimentos de SPR foram realizados em um Biacore T200 com HBS-EP como tampão de execução (HEPES a 0,01 M, pH 7,4, NaCl a 0,15 M, 0,05% (v/v) de Surfactante P20 (GE Healthcare)).

[000498] Um anticorpo anti-Fc (GE Healthcare) foi acoplado diretamente em um chip sensorial CM5 a pH 5,0 usando o kit de acoplamento de amina padrão (GE Healthcare). TCB EGFRvIII (5 nM) foi capturado com uma taxa de fluxo de 10 l/min por 30 s. Uma série de diluição de 3 vezes do antígeno EGFRvIII foi passada nas células de fluxo a 30 l/min por 200 s para registrar a fase de associação. A fase de dissociação foi monitorada por 300 s e desencadeada pela troca da solução de amostra para HBS-EP. A superfície do chip foi regenerada após cada ciclo usando uma injeção de MgCL 2 a 3 M por 30 s a 20 µl/min.

[000499] O antígeno usado contém o domínio extracelular de EGFRvIII humano fundido a um marcador Avi e um marcador His no terminal C (EGFRvIII-ECD avi his; SEQ ID NO: 36).

[000500] As diferenças do índice de refração em massa foram corrigidas subtraindo a resposta obtida na célula de fluxo de referência (sem TCB capturado). As constantes de afinidade (KD) foram derivadas das constantes de velocidade cinética ajustando-se a uma ligação Langmuir de 1:1 usando o software BIAeval (GE Healthcare). A constante de avidez aparente

KD foi aproximada por análise cinética através das constantes de taxa usando um ajuste de ligação 1:1 nesta interação 2:1.

[000501] Os valores de KD (afinidade) para ligação a EGFRvIII humano foram determinados como 6 nM para ambos TCB EGFRvIII compreendendo CD3oti ou CD3orig.

[000502] A ligação do TCB EGFRvIII a EGFRvIII recombinante também foi avaliada após estresse de temperatura por 14 dias a 37 °C ou 40 °C, usando os TCBs com as sequências de ligação a CD3 otimizadas ou originais. O experimento foi realizado conforme descrito acima no Exemplo 5, usando EGFRvIII-ECD avi his como antígeno (vide acima).

[000503] Os resultados deste experimento são mostrados na Figura 22. Eles confirmam que a ligação a EGFRvIII humano para ambos os TCBs não é afetada por condições de estresse.

LIGAÇÃO A CD3 EM CÉLULAS JURKAT

[000504] A ligação a CD3 na linhagem de células T repórter humanas Jurkat NFAT foi determinada por FACS para TCB EGFRvIIIs compreendendo o ligante CD3 otimizado "CD3oti" ou o ligante CD3 original "CD3orig", conforme descrito acima no Exemplo 2.

[000505] Conforme mostrado na Figura 23, os TCBs compreendendo o ligante CD3 otimizado "CD3oti" ou o ligante CD3 original "CD3orig" ligou-se comparativamente bem a CD3 em células Jurkat.

LIGAÇÃO A EGFRVIII EM CÉLULAS U87MG-EGFRVIII

[000506] A ligação a EGFRvIII na linhagem celular de glioblastoma humano U87MG-EGFRvIII foi determinada por FACS para TCB EGFRvIIIs compreendendo o ligante EGFRvIII P063.056 com CD3 oti ou CD3orig, ou o clone EGFRvIII P056.021 com CD3orig. O ligante EGFRvIII P063.056 foi incluído também no formato de IgG.

[000507] Como mostrado na Figura 24, todos os três TCBs se ligam com alta afinidade a EGFRvIII expresso nas células U87MG-EGFRvIII e a ligação não é prejudicada pela conversão no formato de TCB.

EXEMPLO 10 - ATIVIDADE FUNCIONAL DO ANTICORPO BIESPECÍFICO DE CÉLULAS T COMPREENDENDO LIGANTE CD3 OTIMIZADO ATIVAÇÃO DE CD3

[000508] Os TCBs EGFRvIII contendo o ligante EGFRvIII selecionado (P063.056) e o ligante CD3 otimizado, CD3 oti, ou o ligante CD3 original, CD3orig, foram testados no ensaio de células repórter Jurkat NFAT na presença de células de glioblastoma positivas para EGFRvIII DK-MG, U87MG - huEGFRvIII e células positivas para EGFRwt MKN45, como descrito acima no Exemplo 8.

[000509] Como visto para as IgGs (Exemplo 3), ambos os TCBs contendo CD3oti ou CD3orig tinham uma atividade funcional semelhante nas células repórter Jurkat NFAT e induziram a ativação de CD3 de uma maneira dependente da concentração (Figura 20).

MORTE DE CÉLULAS ALVO

[000510] Os TCBs EGFRvIII contendo o ligante EGFRvIII selecionado (P063.056) e o ligante CD3 otimizado, CD3 oti, ou o ligante CD3 original, CD3orig, foram comparados ao TCB EGFRvIII contendo o ligante EGFRvIII parental P056.021 e o ligante CD3, CD3 orig, em um experimento de morte de células tumorais na presença da linhagem celular de glioblastoma U87MG-EGFRvIII e PBMCs, como descrito acima no Exemplo 8. Como visto nas células repórter Jurkat NFAT, a atividade funcional dos TCBs com CD3 oti ou CD3orig é semelhante no que diz respeito à indução da lise de células tumorais e ativação de células T CD4 e CD8, conforme medido pela regulação positiva de CD69 (Figura 25).

[000511] Além disso, a atividade funcional do TCB EGFRvIII com o ligante EGFRvIII P063.056 e o ligante CD3 otimizado, CD3 oti, no

"formato 2+1" (conforme ilustrado na Figura 6) foi comparada a um TCB EGFRvIII com o mesmo EGFRvIII e ligante CD3 no "formato cabeça-a-cauda 1+1" (representado esquematicamente na Figura 1G). Esses dois TCBs EGFRvIII foram testados no ensaio de células repórter Jurkat NFAT e em um ensaio de morte de células tumorais com a linhagem celular de glioblastoma U87MG-EGFRvIII, conforme descrito no Exemplo 8. O TCB EGFRvIII no formato 2+1 teve uma atividade funcional superior tanto na ativação de CD3 medida no ensaio de células repórter Jurkat NFAT (Figura 26) quanto na indução de morte de células tumorais e ativação de células T no ensaio de morte com PBMCs (Figura 27).

EXEMPLO 11 - CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS DE CÉLULAS T COMPREENDENDO LIGANTE CD3 OTIMIZADO

PROLIFERAÇÃO E ATIVAÇÃO DE CÉLULAS T POR TCB EGFRVIII

[000512] A atividade funcional dos TCBs EGFRvIII contendo o ligante EGFR selecionado (P063.056) e o ligante CD3 otimizado, CD3 oti, ou o ligante CD3 original, CD3orig, foi comparada com o TCB EGFRvIII contendo o ligante EGFRvIII parental P056.021 e o ligante CD3 CD3 orig em um ensaio de proliferação de células T em células U87MG-EGFRvIII (Figura 28). Todos os três TCBs induziram forte proliferação e ativação de células T CD4 e células T CD8. O TCB P063.056 EGFRvIII com CD3oti teve uma atividade maior do que os outros dois TCBs EGFRvIII.

LISE DE CÉLULAS TUMORAIS POR TCB EGFRVIII

[000513] Em seguida, o TCB EGFRvIII contendo o ligante EGFR selecionado (P063.056) e o ligante CD3 otimizado, CD3 oti, e o TCB EGFRvIII contendo os ligantes EGFRvIII parentais P056.021 e o ligante CD3 CD3orig foram testados em um ensaio de lise de células tumorais com PBMCs cocultivadas com células DK-MG (Figura 29). Nesse ensaio, além da lise das células tumorais, a ativação das células T e a liberação de citocinas foram medidas como leituras adicionais. Como visto antes, o TCB EGFRvIII P063.056 com CD3oti teve uma atividade maior do que o TCB EGFRvIII P056.021 com CD3orig no que diz respeito à lise de células tumorais, ativação de células T e liberação de IFNγ e TNFα.

ATIVAÇÃO DE CÉLULAS T E LISE DE CÉLULAS TUMORAIS POR TCB TYRP1

[000514] A propriedade funcional de TCB TYRP1 para induzir a liberação de citocinas foi testada pelo cocultivo da linhagem celular de melanoma primário M150543 com PBMCs isoladas de um doador saudável. A lise de células tumorais mediada por células T por meio de TCB TYRP1 foi analisada após 24 h e 48 h de tratamento (Figura 30). A liberação de IFNγ e TNFα no sobrenadante, bem como a ativação de células T CD4 e CD8 foi analisada após 48 h de tratamento. O TCB TYRP1 foi capaz de induzir potente lise de células tumorais logo após 24 h. Isso foi acompanhado por uma forte ativação de células T CD4 e CD8, determinada pela regulação positiva de CD25, bem como liberação significativa de IFNγ e TNFα.

MÉTODOS ISOLAMENTO DE PBMC

[000515] As células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram preparadas por centrifugação de densidade Histopaque de sangue fresco obtido de doadores humanos saudáveis. Sangue fresco foi diluído com PBS estéril e colocado em camadas sobre gradiente Histopaque (Sigma, # H8889). Após centrifugação (450 xg, 30 minutos, temperatura ambiente), o plasma acima da interfase contendo PBMC foi descartado e as PBMCs transferidas em um novo tubo falcon posteriormente preenchido com 50 ml de PBS. A mistura foi centrifugada (400 xg, 10 minutos, temperatura ambiente), o sobrenadante descartado e o grânulo de PBMC lavado duas vezes com PBS estéril (etapas de centrifugação 350 xg, 10 minutos). A população de PBMC resultante foi contada automaticamente (ViCell) e armazenada em meio RPMI1640 contendo 10% de FCS e 1% de GlutaMAX a 37 °C, 5% de CO2 na incubadora de células até uso posterior (não mais do que 24 h) ou congelada e armazenada em nitrogênio líquido até uso posterior. No dia anterior ao uso, as PBMCs congeladas foram descongeladas e cultivadas durante a noite em meio a 37 °C.

PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS T

[000516] Em suma, as células alvo foram colhidas, contadas e lavadas duas vezes com PBS. As células foram ressuspensas a 5 mio células por ml em PBS. As células foram coradas com o corante de proliferação celular eFluor 670 (eBioscience, # 65-0840-85) com uma concentração final de 5 µM por 10 min a 37 °C. Para parar a reação de coloração, 4 volumes de meio de cultura de células completo frio foram adicionados à suspensão de células e incubados por 5 min a 4 °C e, em seguida, lavados três vezes com meio. As células alvo marcadas foram contadas e ajustadas a 0,1 mio células por ml em RPMI1640, 10% de FCS e 1% de GlutaMax. 10.000 células alvo por poço foram semeadas em uma placa de 96 poços. Em seguida, o tratamento foi adicionado nas concentrações indicadas e no final 100.000 PBMCs isoladas de um doador saudável foram adicionadas por poço. As células foram incubadas por 5 dias a 37 °C, em seguida, as PBMCs foram colhidas e coradas com CD3 BUV395 (BioLegend, # 563548), CD4 PE (BioLegend, # 300508), CD8 APC (BioLegend, # 344722), CD25 PE/Cy7 (BioLegend, # 302612). A proliferação foi determinada pela diluição do corante eFluor 670 em células T CD4 e células T CD8 medidas por citometria de fluxo (FACS Fortessa, BD Bioscience) e ativação de células T CD4 e CD8 medindo a regulação positiva de CD25.

MORTE DE CÉLULAS TUMORAIS MEDIADA POR CÉLULAS T

[000517] As células alvo foram colhidas com tripsina/EDTA, lavadas e plaqueadas a uma densidade de 30.000 células/poço usando placas de 96 poços de fundo plano. As células foram deixadas aderir durante a noite.

Para o ensaio de morte, os anticorpos foram adicionados nas concentrações indicadas em triplicado. As PBMCs foram adicionadas às células alvo na proporção efetor-para-alvo final (E:T) de 10:1. A morte de células alvo foi avaliada após 24 h de incubação a 37 °C, 5% de CO2 por quantificação de LDH liberado em sobrenadantes celulares por células apoptóticas/necróticas (kit de detecção de LDH, Roche Applied Science, #11 644 793 001). A lise máxima das células alvo (= 100%) foi alcançada por incubação das células alvo com Triton X-100 a 1%. Lise mínima (= 0%) refere-se a células alvo coincubadas com células efetoras sem construto biespecífico.

ATIVAÇÃO DE CÉLULA T

[000518] A ativação de células T CD8 e CD4 após a morte de células T de células alvo mediada pelo TCB foi avaliada por citometria de fluxo usando anticorpos que reconhecem os marcadores de ativação de células T CD25 (marcador de ativação tardia) e CD69 (marcador de ativação precoce).

Após 48 h de incubação, as PBMCs foram transferidas para uma placa de 96 poços de fundo redondo, centrifugados a 350 xg por 5 min e lavadas duas vezes com tampão FACS. A coloração da superfície para CD4 APC (BioLegend, # 300514), CD8 FITC (# 344704, BioLegend), CD25 BV421 (BioLegend, # 302630) e CD69 PE (BioLegend, # 310906) foi realizada de acordo com as indicações dos fornecedores. As células foram lavadas duas vezes com 150 µl/poço de tampão FACS e fixadas por 15 min a 4 °C usando 100 µl/poço de tampão de fixação (BD, #554655). Após centrifugação, as amostras foram ressuspensas em 200 µl/poço de tampão FACS. As amostras foram analisadas em BD FACS Fortessa.

SECREÇÃO DE CITOCINA

[000519] A secreção de citocinas no sobrenadante foi medida por citometria de fluxo, usando o arranjo de esferas citométrico (CBA) de acordo com as instruções do fabricante, mas em vez de 50 µl de esferas e amostra apenas 25 µl de sobrenadante e esferas foram usados. Os seguintes kits CBA (BD Biosciences) foram usados: Conjunto Flex CBA de interferon gama humano (IFNγ) e Conjunto Flex CBA de TNF humano. As amostras foram medidas usando o BD FACS Canto II ou BD FACS Fortessa e as análises foram realizadas usando o Software Diva (BD Biosciences).

EXEMPLO 13 - EFICÁCIA IN VIVO DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS DE CÉLULAS T COMPREENDENDO LIGANTE CD3 OTIMIZADO

[000520] O TCB TYRP1 (compreendendo o ligante CD3 otimizado identificado no Exemplo 1) foi testado quanto à sua eficácia antitumoral em um modelo de xenoenxerto de camundongo de uma linhagem celular de tumor humano, o modelo de xenoenxerto de melanoma IGR-1.

[000521] As células IGR-1 (melanoma humano) foram cultivadas em meio DMEM contendo 10% de FCS (Sigma). As células foram cultivadas a 37 °C em uma atmosfera saturada de água a 5% de CO 2. A passagem 6 foi usada para transplante. A viabilidade celular foi de 96,7%.

2x106 células por animal foram injetadas por via subcutânea em 100 µl de meio de cultura de células RPMI (Gibco) no flanco de camundongos usando uma seringa de tuberculina de 1 ml (BD Biosciences, Alemanha).

[000522] Camundongos fêmeas NSG totalmente humanizados (Roche Glycart AG, Suíça) foram mantidos sob condição livre de patógenos específicos com ciclos diários de 12 h de luz/12 h de escuridão de acordo com as diretrizes comprometidas (GV-Solas; Felasa; TierschG). O protocolo do estudo experimental foi revisado e aprovado pelo governo local (ZH223/2017). O monitoramento contínuo da saúde foi realizado em uma base regular.

[000523] Os camundongos foram injetados por via subcutânea no dia 0 do estudo com 2x106 células IGR-1, randomizados e pesados. Vinte dias após a injeção de células tumorais (volume tumoral> 200 mm3), os camundongos foram injetados iv com 10 µg (0,5 mg/kg) de TCB TYRP1 duas vezes por semana durante cinco semanas. Todos os camundongos foram injetados iv com 200 µl da solução apropriada. Os camundongos no grupo de veículo foram injetados com tampão histidina e o grupo de tratamento com o construto de TCB TYRP1. Para obter a quantidade adequada de anticorpo por 200 µl, as soluções estoque foram diluídas com tampão histidina quando necessário. O tamanho do tumor foi medido com um paquímetro três vezes por semana e plotado com o software GrahPad Prism como volume em mm3 +/- SEM. A análise estatística foi realizada com o software JMP12.

[000524] A Figura 31 mostra que TCB TYRP1 mediou eficácia significativa em termos de inibição do crescimento tumoral em comparação com o grupo de veículo (68% TGI, p = 0,0058 *).

[000525] O TCB EGFRvIII (compreendendo o ligante CD3 otimizado identificado no Exemplo 1) foi igualmente testado quanto à sua eficácia antitumoral em um modelo de xenoenxerto de camundongo de uma linhagem de células tumorais humanas, o modelo de xenoenxerto de glioblastoma U87-EGFRvIII.

[000526] As células U87 (glioblastoma humano) foram originalmente obtidas da ATCC (Manassas, EUA) e estavelmente transfectadas para expressar a proteína EGFRvIII humana (Roche Glycart AG, Suíça). Após a expansão, as células foram depositadas no banco de células interno da Roche Glycart. A linhagem de células U87-EGFRvIII foi cultivada em meio DMEM contendo 10% de FCS (Sigma) e 0,5 µg/ml de Puromicina (Invitrogen).

As células foram cultivadas a 37 °C em uma atmosfera saturada de água a 5% de CO2. A passagem 8 foi usada para transplante. A viabilidade celular foi de 94,7%. 5x105 células por animal foram injetadas subcutaneamente em 100 µl de meio de cultura de células RPMI (Gibco) no flanco de camundongos usando uma seringa de tuberculina de 1 ml (BD Biosciences, Alemanha).

[000527] Camundongos fêmeas NSG totalmente humanizados (Roche Glycart AG, Suíça) foram mantidos sob condição livre de patógenos específicos com ciclos diários de 12 h de luz/12 h de escuridão de acordo com as diretrizes comprometidas (GV-Solas; Felasa; TierschG). O protocolo do estudo experimental foi revisado e aprovado pelo governo local (ZH223/2017). O monitoramento contínuo da saúde foi realizado em uma base regular.

[000528] Os camundongos foram injetados por via subcutânea no dia 0 do estudo com 5x105 de células U87-EGFRvIII, randomizados e pesados. Duas semanas após a injeção das células tumorais (volume do tumor > 200 mm3), os camundongos foram injectados iv com 10 ug (0,5 mg/kg) de TCB EGFRvIII duas vezes por semana durante três semanas.

Todos os camundongos foram injetados iv com 200 µl da solução apropriada.

Os camundongos no grupo de veículo foram injetados com tampão histidina e o grupo de tratamento com o construto de TCB EGFRvIII. Para obter a quantidade adequada de anticorpo por 200 µl, as soluções estoque foram diluídas com tampão histidina quando necessário. O tamanho do tumor foi medido com um paquímetro três vezes por semana e plotado com o software GrahPad Prism como volume em mm3 +/- SEM.

[000529] A Figura 32 mostra que TCB EGFRvIII mediou eficácia significativa em termos de controle de crescimento tumoral com todos os camundongos alcançando remissão completa.

EXEMPLO 12 - ESTUDO DE PK COM TCB EGFRVIII EM CAMUNDONGOS

[000530] A farmacocinética (PK) do TCB EGFRvIII compreendendo o ligante CD3 otimizado, CD3oti, foi estudada após administração em bolus intravenoso de 1 mg/kg para FcRn humano transgênico (linha32, homozigoto) e camundongos NOD-SCID. Amostras de sangue em série foram retiradas de camundongos transgênicos humanos (tg) FcRn e camundongos NOD-SCID até 672 h (9 amostras por camundongo de 5 min a 672 h após a dose). Amostras de soro de camundongos tratados com TCB EGFRvIII foram analisadas usando um ensaio imunossorvente ligado a enzima específico (ELISA) em condições não BPL. A captura de TCB EGFRvIII foi feita com antígeno EGFRvIII biotinilado (huEGFRvIII his biotina) em placas de microtitulação revestidas com estreptavidina- (SA-MTP). O TCB EGFRvIII ligado foi detectado com anticorpo monoclonal marcado com digoxigenina contra Fc(PGLALA) de IgG1 humana (vide Exemplo 3) seguido pela adição de um anticorpo de detecção secundário anti-digoxigenina-POD. Os sinais foram gerados pela adição de substrato de peroxidase (ABTS). O intervalo de calibração foi de 2,35 ng/ml a 150 ng/ml com 2,5 ng/ml sendo o limite inferior de quantificação (LLOQ).

[000531] Os resultados deste estudo são mostrados na Tabela 7. O perfil de PK de TCB EGFRvIII está dentro da faixa esperada para ambas as cepas de camundongos testados. Isso indica que a modificação das CDRs do ligante CD3 não deu origem a outra responsabilidade de sequência, que afetaria a depuração do anticorpo.

TABELA 7. DADOS DE DEPURAÇÃO EM CAMUNDONGOS HUFCRN TG E CAMUNDONGOS NOD-SCID (ML/DIA/KG; MÉDIA). Linhagem de camundongo TCB EGFRvIII (CD3oti) tg32 de hFcRn 12,4 NOD-SCID 10,1

[000532] Embora a invenção anterior tenha sido descrita com algum detalhe por meio de ilustração e exemplo para fins de clareza de compreensão, as descrições e exemplos não devem ser interpretados como limitando o escopo da invenção. As divulgações de toda a literatura científica e de patente citadas neste documento estão expressamente incorporadas em sua totalidade por referência.

Claims (34)

REIVINDICAÇÕES

1. ANTICORPO QUE SE LIGA A CD3, caracterizado pelo anticorpo compreender (a) um primeiro domínio de ligação ao antígeno, compreendendo uma região variável da cadeia pesada (VH) que compreende uma região determinante complementar da cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 2, uma HCDR 2 de SEQ ID NO: 3 e uma HCDR 3 de SEQ ID NO: 5 e uma região variável da cadeia leve (VL) que compreende uma região determinante de complementaridade da cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 8, uma LCDR 2 de SEQ ID NO: 9 e uma LCDR 3 de SEQ ID NO: 10; e (b) um segundo e, opcionalmente, um terceiro domínio de ligação ao antígeno que liga TYRP-1.

2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo VH do primeiro domínio de ligação ao antígeno compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7, e/ou o VL do primeiro domínio de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11.

3. ANTICORPO QUE SE LIGA A CD3 E TYRP-1, caracterizado por compreender (a) um primeiro domínio de ligação ao antígeno compreendendo uma sequência VH da SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 11; e (b) um segundo e, opcionalmente, um terceiro domínio de ligação ao antígeno que liga TYRP-1.

4. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo primeiro domínio de ligação ao antígeno ser uma molécula Fab.

5. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por compreender um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidades.

6. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo segundo e/ou, quando presente, o terceiro domínio de ligação ao antígeno ser uma molécula Fab.

7. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo primeiro domínio de ligação ao antígeno ser uma molécula Fab em que os domínios variáveis VL e VH ou os domínios constantes CL e CH1, particularmente os domínios variáveis VL e VH, da cadeia leve Fab e a cadeia pesada Fab são substituídos uns pelos outros.

8. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo segundo e, quando presente, o terceiro domínio de ligação ao antígeno ser uma molécula Fab convencional.

9. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo segundo e, quando presente, o terceiro domínio de ligação ao antígeno ser uma molécula Fab em que, no domínio constante CL, o aminoácido na posição 124 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat) e o aminoácido na posição 123 é substituído independentemente por lisina (K), arginina (R) ou histidina (H) (numeração de acordo com Kabat), e no domínio constante CH1, o aminoácido na posição 147 é substituído independentemente por ácido glutâmico (E) ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat) e o aminoácido na posição 213 é substituído independentemente por ácido glutâmico (E), ou ácido aspártico (D) (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

10. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo primeiro e o segundo domínio de ligação ao antígeno serem fundidos um ao outro, opcionalmente por meio de um ligante peptídico.

11. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo primeiro e o segundo domínio de ligação ao antígeno serem, cada um, uma molécula Fab e (i) o segundo domínio de ligação ao antígeno ser fundido no C-terminal de Fab da cadeia pesada ao N-terminal de Fab da cadeia pesada do primeiro domínio de ligação ao antígeno, ou (ii) o primeiro domínio de ligação ao antígeno ser fundido no C- terminal de Fab da cadeia pesada ao N-terminal de Fab da cadeia pesada do segundo domínio de ligação ao antígeno.

12. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo primeiro, o segundo e, quando presente, o terceiro domínio de ligação ao antígeno serem, cada um, uma molécula Fab e o anticorpo compreender um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidades; e em que (i) o segundo domínio de ligação ao antígeno é fundido no C-terminal de Fab da cadeia pesada ao N- terminal de Fab da cadeia pesada do primeiro domínio de ligação ao antígeno e o primeiro domínio de ligação ao antígeno é fundido no C-terminal de Fab da cadeia pesada ao N-terminal de Fab da primeira subunidade do domínio Fc, ou (ii) o primeiro domínio de ligação ao antígeno é fundido no C-terminal de Fab da cadeia pesada ao N-terminal de Fab da cadeia pesada do segundo domínio de ligação ao antígeno e o segundo domínio de ligação ao antígeno são fundidos no C-terminal de Fab da cadeia pesada ao N-terminal da primeira subunidade do domínio Fc; e o terceiro domínio de ligação ao antígeno, quando presente, é fundido no C-terminal de Fab da cadeia pesada ao N- terminal da segunda subunidade do domínio Fc.

13. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 12,

caracterizado pelo anticorpo consistir no primeiro, segundo e terceiro domínios de ligação ao antígeno, domínio FC e, opcionalmente, um ou mais ligantes peptídicos, em que o segundo domínio de ligação ao antígeno é fundido no C- terminal da Fab da cadeia pesada ao N-terminal da Fab da cadeia pesada do primeiro domínio de ligação ao antígeno, e o primeiro domínio de ligação ao antígeno é fundido no C-terminal de Fab da cadeia pesada ao N-terminal da primeira subunidade do domínio FC e, em que o terceiro domínio de ligação ao antígeno é fundido no C-terminal de Fab da cadeia pesada ao N-terminal da segunda subunidade do domínio Fc.

14. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 13, caracterizado pelo domínio Fc ser uma IgG, particularmente uma IgG1, domínio Fc.

15. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 14, caracterizado pelo domínio Fc ser um domínio Fc humano.

16. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 15, caracterizado pelo domínio Fc ser um domínio Fc IgG1 humano.

17. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 16, caracterizado pelo Fc compreender uma modificação que promove a associação da primeira e da segunda subunidades do domínio Fc.

18. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 17, caracterizado por, no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc, um resíduo de aminoácido ser substituído por um resíduo de aminoácido tendo um volume de cadeia lateral maior, gerando uma protuberância dentro do domínio CH3 da primeira subunidade que é posicionável na cavidade dentro do domínio CH3 da segunda subunidade e, no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc, um resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido tendo um volume de cadeia lateral menor, gerando uma cavidade dentro do domínio CH3 da segunda subunidade dentro da qual a protuberância do domínio CH3 da primeira subunidade é posicionável.

19. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 18, caracterizado por, na primeira subunidade do domínio Fc, o resíduo de treonina na posição 366 ser substituído por um resíduo de triptofano (T366W) e, na segunda subunidade do domínio Fc, o resíduo de treonina na posição 407 ser substituído por um resíduo de valina (Y407V); e em que opcionalmente (a) na segunda subunidade do domínio Fc, adicionalmente, o resíduo de treonina na posição 366 é substituído por um resíduo de serina (T366S) e o resíduo de leucina na posição 368 ser substituído por um resíduo de alanina (L368A); e/ou (b) na primeira subunidade do domínio Fc, adicionalmente, o resíduo de serina na posição 354 é substituído por um resíduo de cisteína (S354C) ou o resíduo de ácido glutâmico na posição 356 é substituído por um resíduo de cisteína (E356C), e na segunda subunidade do domínio Fc, adicionalmente, o resíduo de tirosina na posição 349 é substituído por um resíduo de cisteína (Y349C) (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

20. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 19, caracterizado pelo domínio Fc compreender uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor Fc e/ou função efetora.

21. ANTICORPO, de acordo com as reivindicações 5 a 20, caracterizado pelo domínio Fc compreender uma substituição do aminoácido na posição selecionada a partir do grupo E233, L234, L235, N297, P331 e P329, particularmente uma posição selecionada a partir do grupo L234, L235 e P329 (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

22. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 21, caracterizado por cada subunidade do domínio Fc compreender as substituições de aminoácidos L234A, L235A e P329G (numerações de acordo com o índice EU de Kabat).

23. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo segundo e, quando presente, o terceiro domínio de ligação ao antígeno compreender um VH compreendendo uma HCDR 1 da SEQ ID NO: 15, uma HCDR 2 da SEQ ID NO: 16 e uma HCDR 3 da SEQ ID NO: 17, e um VL compreendendo uma LCDR 1 da SEQ ID NO: 19, uma LCDR 2 da SEQ ID NO: 20 e uma LCDR 3 da SEQ ID NO: 21.

24. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo segundo e, quando presente, o terceiro domínio de ligação ao antígeno compreender um VH que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100 % idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18, e/ou um VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22.

25. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado por compreender um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 23, um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 24, um polipeptídeo (particularmente dois polipeptídeos) compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 25 e um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 27.

26. POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, caracterizado por codificar o anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 25.

27. CÉLULA HOSPEDEIRA, caracterizada por compreender o polinucleotídeo isolado, conforme definido na reivindicação 26.

28. MÉTODO PARA PRODUZIR UM ANTICORPO QUE SE LIGA A CD3, caracterizado por compreender as etapas de (a) cultura da célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 27, sob condições adequadas para a expressão do anticorpo e, opcionalmente, (b) recuperação do anticorpo.

29. ANTICORPO QUE SE LIGA A CD3 E TYRP-1, caracterizado por ser produzido pelo método, conforme definido na reivindicação 28.

30. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender o anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 25 ou 29, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

31. USO DO ANTICORPO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 25 ou 29, ou da composição farmacêutica, conforme definida na reivindicação 30, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento.

32. USO DO ANTICORPO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 25 ou 29, ou da composição farmacêutica, conforme definida na reivindicação 30, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer.

33. USO, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo câncer ser um câncer expressando TYRP-1.

34. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 33, caracterizado pelo câncer ser um câncer de pele, em particular um melanoma.