BR112021010238A2

BR112021010238A2 - Anticorpos anti-cd28 x anti-cd22 biespecíficos e usos dos mesmos

Info

Publication number: BR112021010238A2
Application number: BR112021010238-8A
Authority: BR
Inventors: Andrew J. Murphy; Dimitris SKOKOS; Janelle Waite; Erica ULLMAN; Aynur HERMANN; Eric Smith; Kara Olson; Joyce Wei; George D. Yancopoulos
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 2018-12-19
Filing date: 2019-12-18
Publication date: 2021-08-24
Also published as: MA54540A; KR20210104836A; CN113164598A; CA3124168A1; US20230174652A1; US20200239576A1; AU2019405747A1; CL2021001630A1; EA202191580A1; EP3897715A1; MX2021007497A; JP2022510964A; WO2020132066A1; IL283945A; US11396544B2; CO2021009004A2; WO2020132066A8

Abstract

ANTICORPOS ANTI-CD28 X ANTI-CD22 BIESPECÍFICOS E USOS DOS MESMOS. A presente invenção fornece moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas compreendendo um primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao CD28 humano e uma segunda molécula de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao CD-22 humano. Em certas modalidades, as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção são capazes de inibir o crescimento de tumores que expressam CD-22, tais como os linfomas de células B. As moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno da invenção são úteis para o tratamento de doenças e distúrbios em que uma resposta imune alvejada a supra-regulada ou induzida é desejada e / ou terapeuticamente benéfica.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTI- CORPOS ANTI-CD28 X ANTI-CD22 BIESPECÍFICOS E USOS DOS MESMOS".

PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido Provisório U.S. No. 62/781.689, depositado em 19 de dezembro de 2018, todo o conteúdo do qual está incorporado por referência neste documento.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[0002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequência, que foi submetida eletronicamente no formato ASCII e está incorporada por meio disso por referência em sua totalidade. A dita cópia ASCII, cria- da em 16 de dezembro de 2019, é denominada 118003 49220 SL.txt e é 104.353 bytes de tamanho.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0003] A presente invenção se refere a moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que se ligam a CD28 e uma molécula alvo, tal como CD22, e métodos de uso das mesmas.

ANTECEDENTES

[0004] CD28 é uma proteína transmembrana tipo | expressa na superfície das células T, que tem um único domínio extracelular tipo Ig- V montado como um homodímero. CD28 é o receptor para as proteí- nas CD80 (B7.1) e CD86 (B7.2) e é ativado por CD80 ou CD86 ex- presso em células apresentadoras de antígeno (APCs). A ligação de CD28 a CD80 ou CD86 fornece sinais coestimulaórios importantes pa- ra a ativação e sobrevivência de células T. A estimulação de células T através do CD28, além do receptor de células T (TOR), fornece um sinal potente para a produção de várias interleucinas. O CD28 também potencializa os sinais celulares, tais como as vias controladas pelo fa- tor de transcrição NFKB após a ativação do TCR. O cossinal de CD28 é importante para a ativação eficaz de células T, tais como diferencia- ção, proliferação, liberação de citocina e morte celular.

[0005] Anticorpos anti-CD28 têm sido propostos para fins terapêu- ticos envolvendo a ativação de células T. Um anticorpo anti-CD28 par- ticular, TGN1412 (superagonista anti-CD28), foi usado em um ensaio clínico em 2006. Seis voluntários saudáveis foram administrados intra- venosamente com TGN1412 (superagonista anti-CD28) em uma dose de 0,1 mg / kg. Em duas horas, todos os seis pacientes tiveram res- postas inflamatórias significativas (tempestade de citocina), e todos os pacientes tiveram falência de múltiplos órgãos em dezesseis horas. Os indivíduos foram tratados com corticosteróides e os níveis de citocina voltaram aos níveis normais em 2-3 dias. A dose inicial de 0,1 mg / kg em um estudo de Fase 1 (associado a CRS) foi baseada em um múlti- plo de 500 vezes de cinomolgo "NOAEL" de 50 mg / kg (Suntharalin- gam, et al., Cytokine Storm in a Phase 1 Trial of the Anti-CD28 Mono- clonal Antibody TGN1412, NEJM 355:1018-1028 (2006)). Infelizmente, o TGN1412 induziu uma tempestade de citocina, que não foi prevista por estudos de toxicologia em macacos cynomolgus ou estudos de PBMC humana ex vivo.

[0006] CD22 (também conhecido como Siglec-2), um membro da família Siglec, reconhece especificamente o ácido siálico a2,6 e é uma proteína transmembrana expressa preferencialmente em linfócitos B (células B).

[0007] O CD22 tem inúmeras funções atribuídas, incluindo, por exemplo, homeostase das células B, sobrevivência e migração das células B, atenuação da sinalização de TLR e CD40 e inibição da sina- lização do receptor de células B (BCR) por meio de recrutamento de fosfatases contendo o domínio SH2 por fosforilação de motivos de ini- bição com base em imuno-receptor tirosina (ITIMs) na região citoplas- mática, bem como facilitação da adesão entre células B e outros tipos de células.

[0008] O CD22 não é encontrado na superfície das células B du- rante os estágios iniciais de desenvolvimento, nem é expresso em cé- lulas-tronco. No entanto, 60-70% de todos os linfomas e leucemias de células B expressam CD22.

[0009] Um anticorpo anti-CD22 para o tratamento de linfomas e leucemias de células B foi investigado. No entanto, o anticorpo mono- clonal Epratuzumab teve sucesso limitado. (Grant, et a/. (2013) Cancer 119 (21): 10.1002 / cncr.28299)

[0010] Consequentemente, existe uma necessidade na técnica de anticorpos anti-CD22 melhorados. Existe também a necessidade de um anticorpo anti-CD28 que seja seguro para uso em uma composi- ção farmacêutica. Além disso, moléculas de ligação ao antígeno bies- pecíficas que se ligam a CD28 e um antígeno alvo (como CD22) seri- am úteis em configurações terapêuticas em que o alvejamento especií- fico e a morte mediada por células T de células que expressam o antí- geno alvo são desejados.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0011] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece mo- léculas de ligação ao antígeno biespecíficas que se ligam a CD28 e um antígeno alvo. De acordo com certas modalidades exemplificativas, as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas se ligam a CD28 e CD22; tais moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas também são referidas neste documento como "moléculas biespecíficas anti- CD28 / anti-CD22". A porção anti-CD22 da molécula biespecífica anti- CD28 / anti-CD22 é útil para alvejar células cancerígenas que expres- sam CD22 (por exemplo, uma célula B cancerígenas) e a porção anti- CD28 da molécula biespecífica é útil para ativar células T. A ligação simultânea de CD22 em uma célula cancerígenas e CD28 em uma cé- lula T facilita a morte dirigida (lise celular) da célula cancerígena alve-

jada pela célula T ativada, por exemplo, após a ativação de TCR da célula T. As moléculas biespecíficas anti-CD28 / anti-CD22 da inven- ção são, portanto, úteis, inter alia, para o tratamento de doenças e dis- túrbios relacionados a ou causados por tumores que expressam CD22 (por exemplo, um distúrbio proliferativo de células B, por exemplo, um linfoma de células B, por exemplo, linfoma difuso de grandes células B (DLBCL, linfoma folicular (FL), um linfoma de zona marginal).

[0012] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas de acor- do com este aspecto da presente invenção compreendem um primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD28 humano e um segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga es- pecificamente a CD22. A presente invenção inclui moléculas biespecí- ficas anti-CD28 / anti-CD22 (por exemplo, anticorpos biespecíficos) em que cada domínio de ligação ao antígeno compreende uma região va- riável de cadeia pesada (HCVR) emparelhada com uma região variá- vel de cadeia leve (LCVR). Em certas modalidades exemplificativas da invenção, o domínio de ligação ao antígeno anti-CD28 e o domínio de ligação ao antígeno anti-CD22 compreendem, cada um, HCVRs dife- rentes e distintas emparelhadas com uma LCVR comum.

[0013] A presente invenção fornece moléculas biespecíficas anti- CD28 / anti-CD22, em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD28 compreende qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR conforme estabelecido na Tabe- la 6. O primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especifi- camente ao CD28 também pode compreender qualquer uma das se- quências de aminoácidos de LCVR conforme estabelecido na Tabela

6. De acordo com certas modalidades, o primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao CD28 compreende qual- quer um dos pares de sequência de aminoácidos HCVR / LOCVR con- forme estabelecido na Tabela 6. A presente invenção também fornece moléculas biespecíficas anti-CD28 / anti-CD22, em que o primeiro do- mínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD28 compreende qualquer uma das sequências de aminoácidos CDR1- CDR2-CDR3 de cadeia pesada conforme estabelecido na Tabela 6, e / ou qualquer uma das sequências de aminoácidos CDR1-CDR2-CDR3 de cadeia leve conforme estabelecido na Tabela 6.

[0014] De acordo com certas modalidades, a presente invenção também fornece moléculas biespecíficas anti-CD28 / anti-CD22, em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especifica- mente a CD28 compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR) tendo a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 28 e 26 ou uma sequência subs- tancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo me- nos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de se- quência.

[0015] A presente invenção também fornece moléculas biespecíifi- cas anti-CD28 / anti-CD22, em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD28 compreende uma região variável de cadeia leve (LCVR) com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, ou uma sequência semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[0016] A presente invenção também fornece moléculas biespecíifi- cas anti-CD28 / anti-CD22, em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD28 compreende um par de sequências de aminoácidos HCVR e LOCVR (HCVR / LOCVR) seleciona- do a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 28/10 e 26/10.

[0017] A presente invenção também fornece moléculas biespecíifi- cas anti-CD28 / anti-CD22, em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD28 compreende um domínio

CDR3 de cadeia pesada (HCDR3) tendo uma sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 32, ou uma sequência substancialmente seme- lhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; e um domínio CDR3 de cadeia leve (LCDR3) tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[0018] Em certas modalidades, o primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD28 compreende o par de sequência de aminoácidos HCDR3 / LCDR3 de SEQ ID NOs: 32/16.

[0019] A presente invenção também fornece moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas anti-CD28 / anti-CD22, em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao CD28 compreende um domínio CDR1 de cadeia pesada (HCDR1) com a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, ou uma sequência subs- tancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo me- nos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de se- quência; um domínio CDR2 de cadeia pesada (HCDR2) tendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, ou uma sequência subs- tancialmente semelhante desta tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequên- cia; um domínio CDR1 (LCDR1) de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; e um domínio CDR2 (LCDR2) de cadeia leve tendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 14, ou uma sequência substancialmente seme- lhante desta tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[0020] Certas moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas anti- CD28 / anti-CD22 exemplificativas não limitantes da invenção, incluem um primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especifica- mente a CD28 compreendendo domínios HCDR1I-HCDR2-HCDR3- LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectivamente, tendo a sequência de ami- noácidos de: SEQ ID NOs: 28-30-32-12-14-16.

[0021] A presente invenção também fornece moléculas biespecíifi- cas anti-CD28 / anti-CD22, em que o segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD22 compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR) tendo a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2 e 18, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[0022] A presente invenção também fornece moléculas biespecíifi- cas anti-CD28 / anti-CD22, em que o segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD22 compreende uma região variável de cadeia leve (LCVR) tendo a sequência de aminoácidos se- lecionada de SEQ ID NO: 10, ou uma sequência semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[0023] A presente invenção também fornece moléculas biespecíifi- cas anti-CD28 / anti-CD22, em que o segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD22 compreende um par de sequências de aminoácidos HCVR e LOCVR (HCVR / LOCVR) seleciona- do a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2/10 e 18/10.

[0024] A presente invenção também fornece moléculas biespecíifi- cas anti-CD28 / anti-CD22, em que o segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD22 compreende um domínio CDR3 (HCDR3) de cadeia pesada com uma sequência de aminoáci-

dos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 8 e 24, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; e um domínio CDR3 de cadeia leve (LCDR3) tendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 16, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[0025] Em certas modalidades, o segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD22 compreende um par de sequência de aminoácidos HCDR3 / LCDR3 selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 8/16, e 24/16.

[0026] A presente invenção também fornece moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas anti-CD28 / anti-CD22, em que o segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD22 compreende um domínio CDR1 (HCDR1) de cadeia pesada com a se- quência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4 e 20, ou uma sequência substancialmente semelhante aos mesmos tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; um domínio CDR2 (HCDR2) de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 6 e 22, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos pelo menos 99% de identidade de sequência; um domínio CDR1 (LCDR1) de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; e um domínio CDR2 (LCDR2) de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de iden- tidade de sequência.

[0027] Certas moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas anti- CD28 / anti-CD22 exemplificativas não limitativas da invenção, incluem um segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga especifica- mente a CD22 compreendendo domínios HCDR1I-HCDR2-HCDR3- LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectivamente, tendo as sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 4-6-8-12-14-16 e 20-22-24-12-14-16.

[0028] Em uma modalidade relacionada, a invenção inclui molécu- las de ligação ao antígeno biespecíficas anti-CD28 / anti-CD22, em que o segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga especifica- mente a CD22 compreende os domínios CDR de cadeia pesada e leve contidos nas sequências da região variável de cadeia pesada e leve (HCVR / LCVR) selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2/10 e 18/10.

[0029] Em outro aspecto, a presente invenção fornece moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de HCVR, LOVR ou CDR das moléculas de ligação ao antígeno biespecí- ficas anti-cCD28 / anti-CD22 divulgadas neste documento, incluindo moléculas de ácido nucleico compreendendo as sequências de polinu- cleotídeo conforme estabelecidas na Tabela 7 neste documento, bem como moléculas de ácido nucleico compreendendo duas ou mais das sequências de polinucleotídeo conforme estabelecidas na Tabela 7 em qualquer combinação ou arranjo funcional das mesmas. Os vetores de expressão recombinantes que transportam os ácidos nucleicos da in- venção e as células hospedeiras nas quais esses vetores foram intro- duzidos também são abrangidos pela invenção, assim como os méto- dos de produzir os anticorpos cultivando as células hospedeiras em condições que permitem a produção dos anticorpos e recuperação dos anticorpos produzidos.

[0030] A presente invenção inclui moléculas de ligação ao antíge- no biespecíficas anti-CD28 / anti-CD22, em que qualquer um dos do- mínios de ligação ao antígeno acima mencionados que se ligam espe- cificamente a CD28 são combinados, conectados ou de outra forma associados a qualquer um dos domínios de ligação ao antígeno men- cionados que ligam especificamente CD22 para formar uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que liga a CD28 e CD22.

[0031] A presente invenção inclui moléculas de ligação ao antíge- no biespecíficas anti-CD28 / anti-CD22 tendo um padrão de glicosila- ção modificado. Em algumas aplicações, a modificação para remover sítios de glicosilação indesejáveis pode ser útil, ou um anticorpo sem uma fração de frutose presente na cadeia de oligossacarídeo, por exemplo, para aumentar a função de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) (ver Shield et a/. (2002) JBC 277: 26733). Em outras aplicações, a modificação da galactosilação pode ser feita a fim de modificar a citotoxicidade dependente do complemento (CDC).

[0032] Em outro aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-CD28 / anti-CD22 conforme divulgado neste docu- mento e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em um aspecto re- lacionado, a invenção caracteriza uma composição que é uma combi- nação de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-CD28 / anti-CD22 e um segundo agente terapêutico. Em uma modalidade, o segundo agente terapêutico é qualquer agente que é vantajosamente combinado com uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica an- ti-CD28 / anti-CD22. Agentes exemplificativos que podem ser vantajo- samente combinados com uma molécula de ligação ao antígeno bies- pecífica anti-CD28 / anti-CD22 são discutidos em detalhes em outro lugar neste documento.

[0033] Ainda em outro aspecto, a invenção fornece métodos tera- pêuticos para direcionar / matar células que expressam CD22 usando uma molécula de ligação ao antígeno biespecífico anti-CD28 / anti- CD22 da invenção, em que os métodos terapêuticos compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composi- ção farmacêutica que compreende uma molécula de ligação ao antí- geno biespecífica anti-CD28 / anti-CD22 da invenção a um indivíduo em necessidade do mesmo.

[0034] A presente invenção também inclui o uso de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-CD28 / anti-CD22 da invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou distúrbio relacionado ou causado por expressão de CD22.

[0035] Ainda em outro aspecto, a invenção fornece métodos tera- pêuticos para direcionar / matar células cancerígenas que expressam CD22 usando uma molécula de ligação ao antígeno biespecífico anti- CD28 / anti-CD22 da invenção, em que a molécula de ligação ao antí- geno biespecífico anti-CD28 / anti-CD22 é combinada com outras mo- léculas de ligação ao antígeno biespecíficas antitumorais que se ligam ao CD3 (por exemplo, anti-CD28 / anti-CD22 combinado com anticor- pos anti-CD3 / anti-CD20).

[0036] Ainda em outro aspecto, a invenção fornece métodos tera- pêuticos para alvejar / matar células cancerígenas que expressam CD22 usando uma molécula de ligação ao antígeno biespecífico anti- CD28 / anti-CD22 da invenção, em que a molécula de ligação ao antí- geno biespecífico anti-CD28 / anti-CD22 é combinada com um inibidor de ponto de verificação alvejando PD-1, PD-L1 ou CTLA-4 (por exem- plo, anti-CD28 / anti-CD-22 combinado com anticorpos anti-PD-1). Por exemplo, em certas modalidades, os anticorpos anti-CD28 / anti-CD22 da invenção podem ser combinados com agentes que alvejam PD-1,

tais como Pembrolizumab (Keytruda&), Nivolumab (OpdivoO) ou Cemiplimab (LibtayoO). Em certas modalidades, os anticorpos anti- CD28 / anti-CD22 da invenção podem ser combinados com agentes que alvejam PD-L1, tais como Atezolizumab (Tecentrig&), Avelumab (BavencioO) ou Durvalumab (Imfinzi&). Em certas modalidades, os anticorpos anti-CD28 / anti-CD22 da invenção podem ser combinados com agentes que alvejam CTLA-A, tal como Ipilimumab (YervoyO).

[0037] Ainda em outro aspecto, a invenção fornece métodos tera- pêuticos para alvejar / matar células cancerígenas que expressam CD22 usando uma molécula de ligação ao antígeno biespecífico anti- CD28 / anti-CD22 da invenção, em que a molécula de ligação ao antí- geno biespecífico anti-CD28 / anti-CD22 é combinada com outras mo- léculas de ligação ao antígeno biespecíficas antitumorais que se ligam a CD3 (por exemplo, anti-CD28 / anti-CD22 combinado com anticorpos biespecíficos anti-CD3 / anti-CD20, por exemplo, REGN1979 (Ver US

9.657.102, em que o braço anti-CD20 compreende o par de aminoáci- dos HCVR / LCVR de SEQ ID NOs: 1242/1258 e o braço anti-CD3 compreende o par de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1250/1258)) e / ou um inibidor de ponto de verificação alvejando PD- 1, PD-L1 ou CTLA-4 (por exemplo, anti-CD28 / anti-CD22 combinado com anticorpos anti- PD-1). Por exemplo, em certas modalidades, os anticorpos anti-CD28 / anti-CD22 da invenção podem ser combinados com agentes que alve- jam PD-1, tais como Pembrolizumab (KeytrudaO), Nivolumab (Opdi- voO) ou Cemiplimab (LibtayoO, ver, por exemplo, US 9.987.500, em que cemiplimab compreende o par de aminoácidos HCVR / LCVR de SEQ ID NOs: 162/170)). Em certas modalidades, os anticorpos anti- CD28 / anti-CD22 da invenção podem ser combinados com agentes que alvejam PD-L1, tais como Atezolizumab (Tecentrig&), Avelumab (BavencioO) ou Durvalumab (Imfinzi&). Em certas modalidades, os anticorpos anti-CD28 / anti-CD22 da invenção podem ser combinados com agentes que alvejam CTLA-A, tal como Ipilimumab (YervoyO).

[0038] Outras modalidades ficarão evidentes a partir de uma revi- são da descrição detalhada que se segue.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0039] A Figura 1 é um conjunto de gráficos que representam a ligação de anticorpos biespecíficos anti-CD28 / anti-CD22 a células T CD4 + humanas que expressam CD28 e células alvo que expressam CD22 humano na superfície celular.

[0040] As Figuras 2A e 2B são um conjunto de gráficos que mos- tram que os anticorpos biespecíficos anti-CD28 / anti-CD22 mostram um aumento na produção de Luciferase na presença de estimulação de células T primárias e expressão alvo de CD22. A Figura 2A é um conjunto de gráficos que representam a ativação de células T repórter projetadas co-incubadas com HEK293 / hoD20, HEK293 / hcp20 / hCD22 ou células negativas Raji / CD80 e CD86, além de 200pM constante REGN1945 (um controle de isotipo hlgG4 negativo), con- forme avaliado pela produção de luciferase. A Figura 2B é um conjun- to de gráficos que representam a ativação de células T repórter proje- tadas co-incubadas com HEK293 / hnoD20, HEK293 / hoD20 / hoD22 ou células negativas Raji / CD80 e CD86, além de REGN2281 cons- tante 200pM (anti-CD20 x anti -CD3), conforme avaliado pela produ- ção de luciferase.

[0041] As Figuras 3A e 3B são um conjunto de gráficos que re- presentam que os anticorpos biespecíficos anti-CD28 / anti-CD22 au- mentam a produção de IL-2 na presença de estimulação primária de células T e expressão alvo de CD22. Mais especificamente, a Figura 3A é um conjunto de gráficos que representam a ativação de células T CD4* co-incubadas com HEK293 / hoD20, HEK293 / hnoD20 / hoD22 ou células negativas Raji / CD80 e CD86 na presença de REGN1945 constante 2nM (isotipo hlgG4 controle), conforme avaliado pela produ-

ção de |L-2. A Figura 3B é um conjunto de gráficos que representam a ativação de células T CD4* co-incubadas com HEK293 / hCD20, HEK293 / hoD20 / hoD22 ou células negativas Raji / CD80 e CD86 na presença de REGN2281 constante 2nM (anti-CD20 x anti -CD3), con- forme avaliado pela produção de IL-2.

[0042] A Figura 4 é um conjunto de gráficos que mostram que uma combinação de REGN5837 com cemiplimab aumenta a liberação de IL-2 acima do tratamento com REGN5837 sozinho em células pro- jetadas para expressar PD-L1.

[0043] A Figura 5A é um conjunto de gráficos que mostram que uma combinação de REGN5837 com cemiplimab aumenta a liberação de IL-2 na presença de células NALMG6 projetadas para expressar PD- L1.

[0044] A Figura 5B é um conjunto de gráficos que mostram que uma combinação de REGN5837 com cemiplimab aumenta a liberação de IL-2 acima do tratamento com REGN5837 sozinho em células RAJI projetadas para expressar PD-L1.

[0045] A Figura 6 é um gráfico que mostra que o tratamento de camundongos NSG com tumores NALM-6-Luc com REGN5837 na presença de REGN1979 (anti-CD20 x anti-CD3) está associado a su- pressão tumoral significativa. Resumidamente, camundongos NSG (n = 6 a9 por grupo) foram enxertados com PBMC humana, em seguida, implantados com células de leucemia de células B NALM-6-luc 12 dias após o enxerto (dia 0). Os camundongos foram administrados com 4 mg / kg de REGN5837 + 0,04 mg / kg de REGN1979 (círculos hachu- rados), 0,4 mg / kg de REGN5837 + 0,04 mg / kg de REGN1979 (tri- ângulos verticais fechados), 0,04 mg / kg de REGN5837 + 0,04 mg / kg de REGN1979 (diamantes), 4 mg / kg de não TAAXCD28 + 0,04 mg / kg de REGN1979 (quadrados), 4 mg / kg de REGN5837 + 0,4 mg / kg de não TAAXCD3 (círculos abertos), ou 4 mg / kg de não TAAXCD28 +

0,4 mg / kg de não -TAAXCD3 (triângulos invertidos fechados) nos dias 8, 15 e 22 pós-implantação (setas). O crescimento do tumor foi monito- rado por imagem bioluminescente do volume do tumor nos dias 6, 10, 14, 17, 20 e 23 pós-implantação. Os dados combinados são expressos como a média + SEM do grupo. A significância estatística foi determi- nada usando ANOVA a dois fatores com o teste post hoc de Tukey. Os seguintes símbolos foram usados para indicar diferenças estatistica- mente significativas em relação ao controle não TAAXCD28 + não TAAxCDB3: *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001.

[0046] As Figuras 7A-7C são gráficos que mostram que REGN1979 ativou e direcionou células T humanas para matar células Nalm6 de uma maneira dependente da dose. Mais especificamente, a Figura 7A é um gráfico representando a sobrevivência percentual de células Nalm6 na presença dos anticorpos indicados. A Figura 7B é um gráfico representando a porcentagem de células CD8 + que ex- pressam CD25 (CD25 +) na presença dos anticorpos indicados. A Fi- gura 7C é um gráfico representando a proliferação de células CD25 + CD8 + avaliada por diluição de violeta CellTrace na presença dos anti- corpos indicados.

[0047] As Figuras 8A, 8B e 8C são gráficos que mostram que REGN1979 ativou e direcionou células T humanas para matar células WSU-DLCL2 de uma maneira dependente da dose. Mais especifica- mente, a Figura 8A é um gráfico representando a sobrevivência per- centual de células WSU-DLCL?2 na presença dos anticorpos indicados. A Figura 8B é um gráfico representando a porcentagem de células CD8 + que expressam CD25 (CD25+) na presença dos anticorpos in- dicados. A Figura 8C é um gráfico representando a proliferação de células CD8 +, expressa como % dividida, na presença dos anticorpos indicados.

[0048] A Figura 9 é um conjunto de gráficos que mostram que em ensaios com células PBMC humanas e células WSU-DLCL?, REGN1979 induziu a liberação de citocinas humanas, IL-2, IL-4, IL-6 e IL-10. A liberação de citocina observada com REGN1979 foi aumenta- da na presença de uma concentração fixa de CD22 X CD28 em com- paração com a liberação de citocina induzida por REGN1979 sozinho.

[0049] As Figuras 10A-10E são gráficos que mostram que REGN1979 ativou e direcionou células T humanas para esgotar NHL de uma maneira dependente da dose. A adição de uma concentração fixa de anticorpos biespecíficos CD22xCD28 a REGN1979 aumentou a eficácia citotóxica (EC50) de REGN1979 2,3 e 3,5 vezes em compara- ção ao REGN1979 com anticorpo de controle CD28 de 1 braço ou sem controle coestimulatório. A lise de células alvo observada mediada por REGN1979 foi associada à ativação e proliferação de células T, con- forme medido pela supra-regulação de CD25 em células CD8 + e CD4 + ou diluição de violeta CellTrace, respectivamente. Mais especifica- mente, a Figura 10A é um gráfico representando a sobrevivência per- centual de células NHL da medula óssea do paciente na presença dos anticorpos indicados. A Figura 10B é um gráfico representando a por- centagem de células CD8 + que expressam CD25 (CD25 +) na pre- sença dos anticorpos indicados. A Figura 10C é um gráfico represen- tando a proliferação de células CD8 + avaliada por diluição de violeta CellTrace na presença dos anticorpos indicados. A Figura 10D é um gráfico representando a porcentagem de células CD4 + que expres- sam CD25 (CD25 +) na presença dos anticorpos indicados. A Figura 10E é um gráfico representando a proliferação de células CD4+ avali- ada por diluição de violeta CellTrace na presença dos anticorpos indi- cados.

[0050] As Figuras 11A-11E são gráficos que mostram que REGN5837 aumenta a potência da citotoxicidade mediada por REGN1979, expressão de superfície celular de CD25 e proliferação de células T de uma maneira dependente da concentração. Resumida- mente, as células WSU-DLCL?2 foram incubadas com PBMC humana enriquecida com linfócitos em uma razão de célula alvo para PBMC de 1:5 e com anti-CD20xCD3 (REGN1979) em uma faixa de concentra- ções (4,8fM a 10NM) como um único agente (isto é, sem REGN5837) ou na presença de concentrações fixas de REGN5837 (variando de 0,01 a 15 ug / mL) por 72 horas a 37ºC. Uma condição sem REGN1979 contém REGN5837 sozinho na concentração indicada e é representada graficamente como 0,04 pM. As células viáveis foram detectadas por citometria de fluxo usando coloração de células VIVAS / MORTAS (11A). Corante Violet Cell Tracker e um coquetel de fenoti- pagem de anticorpos marcados com fluoróforo para CD2, CD4, CD8 e CD25 foram usados para detectar a ativação de células T (medida como expressão de CD25; 11B, 11D) e proliferação de células T CD4* e CD8 * por fluxo citometria (11C, 11E).

[0051] Mais especificamente, a Figura 11A é um gráfico que re- presenta a % de células mortas com as concentrações indicadas de REGNB5837. A Figura 11B é um gráfico representando a porcentagem de células CD25 + CD4 + com as concentrações indicadas de REGNB5837. A Figura 11C é um gráfico representando a proliferação de células CD4 + avaliada por diluição de violeta CellTrace com as concentrações indicadas de REGN5837. A Figura 11D é um gráfico representando a porcentagem de células CD25 + CD8 +. A Figura 11E é um gráfico representando a proliferação de células CD8 + avali- ada por diluição de violeta CellTrace com as concentrações indicadas de REGN5837.

[0052] As Figuras 12A-12G são gráficos que mostram que REGN5837 aumenta a potência e os níveis máximos de liberação de citocina mediada por REGN1979 de células T humanas de uma ma- neira dependente da concentração na presença de células de linfoma de células B WSU-DLCL2. Resumidamente, as células WSU-DLCL2 foram incubadas com PBMC humana enriquecida com linfócitos em uma razão de célula alvo para PBMC de 1:5 e com anti-CD20xCD3 (REGN1979) em uma faixa de concentrações (4,8fM a 10nNM) como um único agente (isto é, sem REGN5837) ou na presença de concen- trações fixas de REGN5837 (variando de 0,01 a 15 ug / mL) por 72 horas a 37ºC. Uma condição sem REGN1979 contém REGN5837 so- zinho na concentração indicada e é representada graficamente como 0,04 pM. Os sobrenadantes foram avaliados quanto à liberação de ci- tocina de (12A) I1L-2, (12B) I1L-4, (12C) I1L-6, (12D) 11-10, (12E) TNF-a, (12F) IFN-y, and (12G) IL-17a usando um kit de citocina humana Th1 / Th2/Th17 BD Cytometric Bead Array.

[0053] Mais especificamente, a Figura 12A é um gráfico represen- tando o nível de IL-2 liberado de células T humanas na presença de células WSU-DLCL2 com as concentrações indicadas de REGN5837. A Figura 12B é um gráfico representando o nível de IL-4 liberado de células T humanas na presença de células WSU-DLCL?2 células WSU- DLCL?2 com as concentrações indicadas de REGN5837. A Figura 12C é um gráfico representando o nível de IL-6 liberado de células T hu- manas na presença de células WSU-DLCL?2 células WSU-DLCL2 com as concentrações indicadas de REGN5837. A Figura 12D é um gráfico representando o nível de IL-10 liberado de células T humanas na pre- sença de células WSU-DLCL?2 células WSU-DLCL2 com as concentra- ções indicadas de REGN5837. A Figura 12E é um gráfico represen- tando o nível de TNF-1 liberado de células T humanas na presença de células WSU-DLCL?2 células WSU-DLCL2 com as concentrações indi- cadas de REGN5837. A Figura 12F é um gráfico representando o ní- vel de IFN-) liberado de células T humanas na presença de células WSU-DLCL?2 células WSU-DLCL2 com as concentrações indicadas de REGNB5837. A Figura 12G é um gráfico representando o nível de |L-

171 liberado de células T humanas na presença de células WSU- DLCL2 células WSU-DLCL2 com as concentrações indicadas de REGNB5837.

[0054] As Figuras 13A e 13B são gráficos que mostram que o tra- tamento de camundongos NSG carregando tumores WSU-DLCL2 com REGNB5837 na presença de 0,4 ou 4 mg / kg de REGN1979 está asso- ciado a supressão tumoral significativa. Resumidamente, camundon- gos NSG fêmeas (n = 6 a 7 por grupo) foram implantados com uma mistura 1:1 de células de linfoma de células B WSU-DLCL2 e PBMC humana (dia 0). Os camundongos foram administrados com combina- ções de 1 mg / kg de REGN5837 e 0,4 mg / kg (13A) ou 4 mg / kg (13B) de REGN1979 (ou controles sem ponte) nos dias 1, 8 e 15 pós- implantação (setas). O crescimento do tumor foi monitorado por medi- ção do paquímetro nos dias 7, 10, 14, 16, 28, 31, 35, 38, 43, 46, 49, 53, 57 e 63 pós-implantação. Os dados combinados são expressos como a média + SEM do grupo. A significância estatística foi determi- nada usando ANOVA a dois fatores com o teste post hoc de Tukey. Os seguintes símbolos foram usados para indicar diferenças estatistica- mente significativas entre os grupos: *, p<0,05; **, p <0,01; **, p<0,001; ****, p<0,0001. Os asteriscos indicam significância estatística entre a monoterapia REGN1979 e o controle de isotipo, as marcas hash indicam significância entre a combinação de REGN5837 com REGN1979 e controle de isotipo, e os acentos circunflexos indicam significância entre a monoterapia REGN1979 e a combinação de REGN5837 com REGN1979.

[0055] Mais especificamente, a Figura 13A é um gráfico represen- tando o crescimento do tumor em camundongos administrados com 1 mg / kg de REGN5837 e 0,4 mg / kg de REGN1979 (ou controles sem ponte, não TAAXCD3). A Figura 13B é um gráfico representando o crescimento do tumor em camundongos administrados com 1 mg / kg de REGN5837 e 4 mg / kg de (ou controles sem ponte, não TAAXCD3).

[0056] A Figura 14 é um gráfico que mostra que o tratamento de camundongos NSG que carregam tumores WSU-DLCL2 com REGN5837 na presença de doses subeficazes de REGN1979 está associado a uma sobrevida significativamente maior do que monotera- pia REGN5837 ou REGN1979. Resumidamente, camundongos NSG fêmeas (n = 6 a 7 por grupo) foram implantados com uma mistura 1:1 de células de linfoma de célula B WSU-DLCL2 e PBMC humana (dia 0). Os camundongos foram administrados com combinações de REGN5837 e REGN1979 ou controles nos dias 1, 8 e 15 pós- implantação (setas). A significância estatística foi determinada usando um teste de Mantel-Cox. Os seguintes símbolos foram usados para indicar diferenças estatisticamente significativas entre os grupos: *, p<0,05; ***, p<0,001. Sinais de intercalação indicam significância esta- tística em comparação com o controle de isotipo, asteriscos indicam significância em comparação com monoterapia de 0,4 mg / kg de REGN1979 e marcas hash indicam significância em comparação com monoterapia de 4 mg / kg de REGN1979.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0057] Antes da presente invenção ser descrita, deve-se entender que esta invenção não está limitada a métodos particulares e condi- ções experimentais descritos, uma vez que tais métodos e condições podem variar. Também deve-se entender que a terminologia usada neste documento tem a finalidade de descrever modalidades específi- cas apenas e não pretende limitar o escopo da presente invenção, o qual será limitado somente pelas reivindicações anexas.

[0058] A menos que definido de outra forma, todos os termos téc- nicos e científicos utilizados aqui têm o mesmo significado conforme comumente entendido por um versado na técnica à qual esta invenção pertence. Conforme usada neste documento, a expressão "cerca de", quando utilizada em referência a um valor numérico particular citado, significa que o valor pode variar do valor indicado em não mais que 1%. Por exemplo, como usada neste documento, a expressão "cerca de 100" inclui 99 e 101 e todos os valores entre (por exemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc.).

[0059] Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferi- dos são agora descritos. Todas as patentes, publicações de pedidos de patente e não patentes mencionadas neste relatório descritivo são incorporadas por referência neste documento na sua totalidade. Definições

[0060] A expressão "CD28", como usada neste documento, refere- se a um antígeno que é expresso nas células T como um receptor co- estimulatório. CD28 humano compreende a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 74, e / ou tendo a sequência de aminoácidos conforme estabelecido no No. de acesso NCBI NP 006130.1. Todas as referências a proteínas, polipeptídeos e frag- mentos de proteína neste documento referem-se à versão humana da respectiva proteína, polipeptídeo ou fragmento de proteína, a menos que explicitamente especificadas como sendo de uma espécie não humana. Assim, a expressão "CD28" significa CD28 humano, a menos que especificado como sendo de uma espécie não humana, por exemplo, "CD28 de camundongo", "CD28 de macaco", etc.

[0061] Conforme usado neste documento, "um anticorpo que se liga a CD28" ou um "anticorpo anti-CD28" inclui anticorpos e fragmen- tos de ligação ao antígeno dos mesmos que reconhecem especifica- mente um CD28 monomérico, bem como anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que reconhecem especificamente um

CD28 dimérico. Os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno da presente invenção podem ligar CD28 solúvel e / ou CD28 expresso na superfície celular. CD28 solúvel inclui proteínas CD28 naturais, bem como variantes de proteína CD28 recombinante, tais como, por exem- plo, construtos CD28 monoméricos e diméricos, que não possuem um domínio transmembrana ou de outra forma não estão associados com uma membrana celular.

[0062] Conforme usada neste documento, a expressão "CD28 ex- presso na superfície celular" significa uma ou mais proteína(s) CD28 que é / são expressa(s) na superfície de uma célula in vitro ou in vivo, de modo que pelo menos uma porção de uma proteína CD28 seja ex- posta ao lado extracelular da membrana celular e seja acessível a uma porção de ligação ao antígeno de um anticorpo. "CD28 expresso na superfície celular" inclui proteínas CD28 contidas no contexto de um receptor coestimuldor de célula T funcional na membrana de uma célu- la. A expressão "CD28 expresso na superfície celular" inclui a proteína CD28 expressa como parte de um homodímero na superfície de uma célula. Um "CD28 expresso na superfície celular" pode compreender ou consistir em uma proteína CD28 expressa na superfície de uma cé- lula que normalmente expressa a proteína CD28. Alternativamente, "CD28 expresso na superfície celular" pode compreender ou consistir em proteína CD28 expressa na superfície de uma célula que normal- mente não expressa CD28 humano em sua superfície, mas foi artifici- almente projetada para expressar CD28 em sua superfície.

[0063] Conforme usada neste documento, a expressão "anticorpo anti-CD28" inclui anticorpos monovalentes com uma única especifici- dade, bem como anticorpos biespecíficos compreendendo um primeiro braço que se liga a CD28 e um segundo braço que se liga a um se- gundo antígeno (alvo), em que o braço anti- CD28 compreende qual- quer uma das sequências de HCVR / LCVR ou CDR conforme estabe-

lecido na Tabela 1 neste documento. Exemplos de anticorpos biespe- cíficos anti-CD28 são descritos em outro lugar neste documento. A ex- pressão "molécula de ligação ao antígeno" inclui anticorpos e fragmen- tos de anticorpos de ligação ao antígeno incluindo, por exemplo, anti- corpos biespecíficos.

[0064] O termo "CD22", conforme usado neste documento, refere- se à proteína CD22 humana, a menos que especificada como sendo de uma espécie não humana (por exemplo, "CD22 de camundongo", "CD22 de macaco", etc.). A proteína CD22 humana tem a sequência de aminoácidos apresentada no número de acesso CAA42006. A se- quência de CD22 ecto humano recombinante (D20-R687) com uma etiqueta de hexa-histidina myc myc ("hexa-histidina" divulgada como SEQ ID NO: 60) é mostrada no número de acesso NP 001762.2 e também como SEQ ID NO: 50. O ectodomínio hoD22 (D20-R687).hFc, também pode ser adquirido da R&D Systems, Catálogo ft 1968-SL-

050.

[0065] Conforme usado neste documento, "um anticorpo que se liga a CD22" ou um "anticorpo anti-CD22" inclui anticorpos e fragmen- tos de ligação ao antígeno dos mesmos que podem ligar CD22 solúvel e / ou CD22 expresso na superfície celular. O CD22 solúvel inclui pro- teínas CD22 naturais, bem como variantes da proteína CD22 recombi- nante tal como, por exemplo, construtos de CD22, que não possuem um domínio transmembrana ou não estão associadas a uma membra- na celular.

[0066] Conforme usada neste documento, a expressão "anticorpo anti-CD22" inclui anticorpos monovalentes com uma única especifici- dade, bem como anticorpos biespecíficos compreendendo um primeiro braço que se liga a CD22 e um segundo braço que se liga a um se- gundo antígeno (alvo), em que o braço anti- CD22 compreende qual- quer uma das sequências de HCVR / LCVR ou CDR conforme estabe-

lecido na Tabela 1 neste documento. Exemplos de anticorpos biespe- cíficos anti-CD22 são descritos em outro lugar neste documento. A ex- pressão "molécula de ligação ao antígeno" inclui anticorpos e fragmen- tos de anticorpos de ligação ao antígeno incluindo, por exemplo, anti- corpos biespecíficos.

[0067] A expressão "molécula de ligação ao antígeno" inclui anti- corpos e fragmentos de anticorpos de ligação ao antígeno, incluindo, por exemplo, anticorpos biespecíficos.

[0068] O termo "anticorpo", conforme usado neste documento, significa qualquer molécula de ligação ao antígeno ou complexo mole- cular compreendendo pelo menos uma região determinante de com- plementaridade (CDR) que se liga especificamente ou interage com um antígeno particular (por exemplo, CD28). O termo "anticorpo" inclui moléculas de imunoglobulina compreendendo quatro cadeias de poli- peptídeo, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interliga- das por ligações de dissulfeto, bem como multímeros das mesmas (por exemplo, IgM). Cada cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada (aqui abreviada como HCVR ou VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada compreende três domínios, ChH1, CH2 e Cr3. Cada cadeia leve com- preende uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como LCVR ou VL) e uma região constante de cadeia leve. A região cons- tante de cadeia leve compreende um domínio (C.L1). As regiões Vx e V. podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, de- signadas regiões que determinam complementaridade (CDRs), interca- ladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR). Cada Vu e Vi é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas do terminal amino até o terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Em diferentes mo- dalidades da invenção, as FRs do anticorpo anti-CD28 ou anticorpo anti-CD22 (ou porção de ligação ao antígeno dos mesmos) podem ser idênticas às sequências da linhagem germinativa humana ou podem ser modificadas natural ou artificialmente. Uma sequência de consen- so de aminoácidos pode ser definida com base em uma análise lado a lado de duas ou mais CDRs.

[0069] O termo "anticorpo", como utilizado neste documento, tam- bém inclui fragmentos de ligação ao antígeno de moléculas de anticor- po completas. As expressões "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo, "fragmento de ligação ao antígeno" de um anticorpo e seme- lhantes, conforme usadas neste documento, incluem qualquer polipep- tídeo ou glicoproteína de ocorrência natural, obtido enzimaticamente, sintético ou geneticamente modificado que se liga especificamente a um antígeno para formar um complexo. Os fragmentos de ligação ao antígeno de um anticorpo podem ser derivados, por exemplo, de mo- léculas de anticorpo completas usando quaisquer técnicas padrões adequadas, tais como digestão proteolítica ou técnicas de engenharia genética recombinante envolvendo a manipulação e expressão de DNA codificador de anticorpos variáveis e opcionalmente domínios constantes. Tal DNA é conhecido e / ou está prontamente disponível de, por exemplo, fontes comerciais, bibliotecas de DNA (incluindo, por exemplo, bibliotecas de anticorpo fago) ou pode ser sintetizado. O DNA pode ser sequenciado e manipulado quimicamente ou usando técnicas de biologia molecular, por exemplo, para organizar um ou mais domínios variáveis e / ou constantes em uma configuração ade- quada ou para introduzir códons, criar resíduos de cisteína, modificar, adicionar ou eliminar aminoácidos etc.

[0070] Exemplos não limitativos de fragmentos de ligação ao antí- geno incluem: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) frag- mentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv de cadeia simples (scFv); (vi) fragmentos de dAb; e (vii) unidades de reconhecimento mínimo que consistem nos resíduos de aminoácidos que mimetizam a região hipervariável de um anticorpo (por exemplo, uma região deter- minante de complementaridade isolada (CDR), tal como um peptídeo CDR3) ou um peptídeo FR3-CDR3-FR4 restrito. Outras moléculas projetadas, tais como anticorpos de domínio específico, anticorpos de domínio único, anticorpos com domínio deletado, anticorpos quiméri- cos, anticorpos enxertados com CDR, diacorpos, triacorpos, tetra- corpos, minicorpos, nanocorpos (por exemplo, nanocorpos monova- lentes, nanocorpos bivalentes, etc.), pequenos imunofarmacêuticos modulares (SMIPs) e domínios IQNAR variáveis de tubarão, também estão englobados na expressão "fragmento de ligação ao antígeno", conforme usado neste documento.

[0071] Um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo compreenderá tipicamente pelo menos um domínio variável. O domí- nio variável pode ser de qualquer tamanho ou composição de aminoá- cidos e geralmente compreenderá pelo menos uma CDR que é adja- cente a ou em estrutura com uma ou mais sequências estruturais. Nos fragmentos de ligação ao antígeno que têm um domínio Vx associado a um domínio V. , os domínios Vx e Vi podem estar situados um em relação ao outro em qualquer arranjo adequado. Por exemplo, a região variável pode ser dimérica e conter dímeros VH-Vn, Vu-VL ou Vi-VL Alternativamente, o fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo pode conter um domínio Vx ou V. .

[0072] Em certas modalidades, um fragmento de ligação ao antí- geno de um anticorpo pode conter pelo menos um domínio variável covalentemente ligado a pelo menos um domínio constante. As confi- gurações exemplificativas não limitativas de domínios variáveis e cons- tantes que podem ser encontradas dentro de um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo da presente invenção incluem: VH-Cn1; (ii) VA-Cn2; (iii) Vi-CnH3; (iv) Vi-Cn1-CH2; (v) Vir-CH1-CH2-CnH3; (vi) Vu-

CH2-Cn3; (vii) VH-Cr; (viii) VI-CH1; (ix) Vl-CH2; (x) VI-CH3; (xi) Vi-Cn1- Cn2; (xii) Vl-CH1-CH2-CrH3; (xiii) Vl-CH2-CnH3; e (xiv) Vl-C1. Em qualquer configuração de domínios variáveis e constantes, incluindo qualquer uma das configurações exemplificativas listadas acima, os domínios variáveis e constantes podem ser diretamente ligados um ao outro ou podem ser ligados por uma região de dobradiça ou ligante total ou parcial. Uma região de dobradiça pode consistir em pelo menos 2 (por exemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 ou mais) aminoácidos que resultam em uma ligação flexível ou semiflexível entre domínios variáveis e / ou constantes adjacentes em uma única molécula de polipeptídeo. Além disso, um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo pode compreender um homodímero ou heterodímero (ou outro multímero) de qualquer uma das configurações de domínio variável e constante listadas acima em associação não covalente uma com a outra e / ou com um ou mais domínios monoméricos Vx ou V. (por exemplo, por ligação(ões) de dissulfeto.

[0073] Como com as moléculas de anticorpo completo, os frag- mentos de ligação ao antígeno podem ser monoespecíficos ou multi- específicos (por exemplo, biespecíficos). Um fragmento de ligação ao antígeno multiespecífico de um anticorpo compreenderá tipicamente pelo menos dois domínios variáveis diferentes, em que cada domínio variável é capaz de se ligar especificamente a um antígeno separado ou a um epítopo diferente no mesmo antígeno. Qualquer formato de anticorpo multiespecífico, incluindo os formatos de anticorpo biespecií- fico exemplificativos divulgados neste documento, pode ser adaptado para uso no contexto de um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo da presente invenção usando técnicas de rotina disponíveis na técnica.

[0074] Os anticorpos da presente invenção podem funcionar atra- vés da citotoxicidade dependente do complemento (CDC) ou citotoxi-

cidade mediada por células dependentes do anticorpo (ADCC). "Cito- toxicidade dependente de complemento" (CDC) refere-se a lise de cé- lulas que expressam antígeno por um anticorpo da invenção na pre- sença de complemento. "Citotoxicidade mediada por células depen- dentes de anticorpos" (ADCC) refere-se a uma reação mediada por células em que células citotóxicas não específicas que expressam re- ceptores Fc (FcRs) (por exemplo, células Exterminadoras Naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) reconhecem o anticorpo ligado em uma célula alvo e, por meio disso, levam à lise da célula alvo. CDC e ADCC podem ser medidas usando ensaios que são bem conhecidos e disponíveis na técnica. (Ver, por exemplo, Patentes U.S. Nos.

5.500.362 e 5.821.337, e Clynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656). A região constante de um anticorpo é importante na capacidade de um anticorpo de fixar complemento e mediar a citotoxi- cidade dependente de células. Assim, o isotipo de um anticorpo pode ser selecionado com base em se é desejável que o anticorpo medie a citotoxicidade.

[0075] Em certas modalidades da invenção, os anticorpos anti- CD28 e / ou anticorpos anti-CD22 da invenção (monoespecíficos ou biespecíficos) são anticorpos humanos. A expressão "anticorpo huma- no", conforme usada neste documento, pretende incluir anticorpos tendo regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imu- noglobulina da linhagem germinativa humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou es- pecífica do sítio in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo, nas CDRs e em particular na CDR3. No entanto, a expressão "anticor- po humano", conforme usada neste documento, não pretende incluir anticorpos nos quais as sequências de CDR derivadas da linhagem germinativa de outra espécie de mamífero, tal como um camundongo, foram enxertadas em sequências de estrutura humana.

[0076] Os anticorpos da invenção podem, em algumas modalida- des, ser anticorpos humanos recombinantes. A expressão "anticorpo humano recombinante", conforme usada neste documento, pretende incluir todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos expressos utilizando um vetor de expressão recombinante transfecta- do em uma célula hospedeira (descritos mais a seguir), anticorpos iso- lados de uma biblioteca de anticorpos humanos combinatória recombi- nante (descritos ainda a seguir), anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico para genes de imuno- globulina humana (ver, por exemplo, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolve processamento de se- quências de genes de imunoglobulina humana para outras sequências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões variá- veis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da li- nhagem germinativa humana. Em certas modalidades, no entanto, tais anticorpos humanos recombinantes são indivíduos a mutagênese in vitro ou, quando é usado um animal transgênico para sequências de |g humana, mutagênese somática in vivo) e assim as sequências de aminoácidos das regiões Vi e V. dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas de e relacionadas com as sequên- cias de linhagem germinativa humana V+n e V., pode não existir natu- ralmente dentro do repertório da linhagem germinativa de anticorpos humanos in vivo.

[0077] Os anticorpos humanos podem existir em duas formas que estão associadas à heterogeneidade da dobradiça. Em uma forma, uma molécula de imunoglobulina compreende um construto de quatro cadeias estável de aproximadamente 150 a 160 kDa, no qual os díme- ros são mantidos juntos por uma ligação de dissulfeto de cadeia pesa- da intercadeias. Em uma segunda forma, os dímeros não estão liga- dos através de ligações de dissulfeto intercadeias e é formada uma molécula de cerca de 75 a 80 kDa composta por uma cadeia leve e pesada acoplada covalentemente (meio anticorpo). Essas formas são extremamente difíceis de separar, mesmo após a purificação por afini- dade.

[0078] A frequência da aparência da segunda forma em vários iso- tipos de IgG intactos é devido a, mas não limitada a, diferenças estru- turais associadas ao isotipo da região de dobradiça do anticorpo. Uma substituição de único aminoácido na região de dobradiça da dobradiça de IgG4 humana pode reduzir significativamente a aparência da se- gunda forma (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) a ní- veis tipicamente observados utilizando uma dobradiça de I9G1 huma- na. A presente invenção abrange anticorpos com uma ou mais muta- ções na dobradiça, região CH2 ou CH3 que podem ser desejáveis, por exemplo, na produção, para melhorar o rendimento da forma de anti- corpo desejada.

[0079] Os anticorpos da invenção podem ser anticorpos isolados. Um "anticorpo isolado", conforme usado neste documento, significa um anticorpo que foi identificado e separado e / ou recuperado de pelo menos um componente do seu ambiente natural. Por exemplo, um an- ticorpo que foi separado ou removido de pelo menos um componente de um organismo, ou de um tecido ou célula em que o anticorpo existe naturalmente ou é naturalmente produzido, é um "anticorpo isolado" para os fins da presente invenção. Um anticorpo isolado também inclui um anticorpo in situ dentro de uma célula recombinante. Anticorpos isolados são anticorpos que foram submetidos a pelo menos uma eta- pa de purificação ou isolamento. De acordo com certas modalidades,

um anticorpo isolado pode estar substancialmente isento de outro ma- terial celular e / ou produtos químicos.

[0080] A presente invenção também inclui anticorpos de um braço que se ligam a CD28 e / ou CD22. Conforme usado neste documento, um "anticorpo de um braço" significa uma molécula de ligação ao antí- geno compreendendo uma cadeia pesada de anticorpo simples e uma cadeia leve de anticorpo simples. Os anticorpos de um braço da pre- sente invenção podem compreender qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR / LCVR ou CDR conforme estabelecido na Ta- bela 1.

[0081] Os anticorpos anti-CD28 e / ou anticorpos anti-CD22 neste documento, ou os domínios de ligação ao antígeno dos mesmos, po- dem compreender uma ou mais substituições, inserções e / ou dele- ções de aminoácidos na estrutura e / ou regiões CDR de domínios va- riáveis de cadeia pesada e leve em comparação com as sequências de linhagem germinativa correspondentes a partir das quais as proteí- nas de ligação ao antígeno ou domínios de ligação ao antígeno foram derivados. Tais mutações podem ser prontamente determinadas com- parando as sequências de aminoácidos divulgadas neste documento com as sequências da linhagem germinal disponíveis, por exemplo, nas bases de dados de sequências de anticorpos públicas. A presente invenção inclui anticorpos e os domínios de ligação ao antígeno dos mesmos, que são derivados de qualquer uma das sequências de ami- noácidos divulgadas neste documento, em que um ou mais aminoáci- dos dentro de uma ou mais regiões estruturais e / ou CDR são muta- das no(s) resíduo(s) correspondente(s) da sequência da linhagem germinativa a partir da qual o anticorpo foi derivado, ou no(s) resí- duo(s) correspondente(s) de outra sequência da linhagem germinativa humana, ou em uma substituição conservativa de aminoácidos do(s) resíduo(s) da linhagem germinativa correspondente (tais alterações de sequência são referidas neste documento coletivamente como "muta- ções da linhagem germinativa"). Um versado na técnica, começando com as sequências da região variável de cadeia pesada e leve descri- tas neste documento, pode facilmente produzir inúmeros anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno que compreendem uma ou mais mutações da linhagem germinativa individuais ou combinações dos mesmos.

Em certas modalidades, todos os resíduos de estrutura e / ou CDR dentro dos domínios Vu e/ou VL são mutados de volta para os resíduos encontrados na sequência da linhagem germinativa original da qual o anticorpo foi derivado.

Em outras modalidades, apenas cer- tos resíduos são mutados de volta para a sequência da linhagem ger- minativa original, por exemplo, apenas os resíduos mutados encontra- dos nos primeiros 8 aminoácidos do FR1 ou nos últimos 8 aminoáci- dos do FRA4, ou apenas os resíduos mutados encontrados na CDR1, CDR?2 ou CDR3. Em outras modalidades, um ou mais do(s) resíduo(s) de estrutura e / ou CDR são mutados para o(s) resíduo(s) correspon- dente(s) de uma sequência de linhagem germinativa diferente (isto é, uma sequência de linhagem germinativa que é diferente da sequência de linhagem germinativa da qual o anticorpo foi originalmente deriva- do). Além disso, anticorpos ou os domínios de ligação ao antígeno dos mesmos da presente invenção, podem conter qualquer combinação de duas ou mais mutações da linhagem germinativa nas das regiões de estrutura e / ou CDR, por exemplo, em que certos resíduos individuais são mutados para o resíduo correspondente de uma sequência da |i- nhagem germinativa particular, enquanto certos outros resíduos que diferem da sequência da linhagem germinativa original são mantidos ou são mutados para o resíduo correspondente de uma sequência di- ferente da linhagem germinativa.

Uma vez obtidos, os anticorpos ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que contêm uma ou mais mutações da linhagem germinativa podem ser facilmente testa-

dos quanto a uma ou mais propriedades desejadas, tais como especi- ficidade de ligação melhorada, maior afinidade de ligação, proprieda- des biológicas antagonísticas ou agonísticas intensificadas ou aumen- tadas (conforme o caso pode ser), imunogenicidade reduzida, etc. Os anticorpos ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, ob- tidos desta maneira geral estão incluídos na presente invenção.

[0082] A presente invenção também inclui anticorpos anti-CD28 e / ou anticorpos anti-CD22 e moléculas de ligação ao antígeno compre- endendo variantes de qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR e / ou CDR divulgadas neste documento. Variantes exemplificativas incluídas neste aspecto da invenção incluem variantes de qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR, LOCVR e / ou CDR divulgadas neste documento tendo uma ou mais substituições conservativas. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos anti- CD28 e moléculas de ligação ao antígeno tendo sequências de ami- noácidos de HCVR, LCVR e / ou CDR com, por exemplo, 10 ou me- nos, 8 ou menos, 6 ou menos, 4 ou menos, etc. substituições conser- vativas de aminoácidos em relação a qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR e / ou CDR estabelecidas na Tabela 6 neste documento.

[0083] O termo "epítopo" refere-se a um determinante antigênico que interage com um sítio de ligação de antígeno específico na região variável de uma molécula de anticorpo conhecida como parátopo. Um único antígeno pode ter mais de um epítopo. Assim, diferentes anti- corpos podem se ligar a diferentes áreas de um antígeno e podem ter diferentes efeitos biológicos. Os epítopos podem ser conformacionais ou lineares. Um epítopo conformacional é produzido por aminoidos espacialmente justapostos de diferentes segmentos da cadeia polipep- tídica linear. Um epítopo linear é aquele produzido por resíduos de aminoácidos adjacentes em uma cadeia polipeptídica. Em certas cir-

cunstâncias, um epítopo pode incluir frações de sacarídeos, grupos fosforil ou grupos sulfonil no antígeno.

[0084] O termo "identidade substancial" ou "substancialmente idêntico", quando se refere a um ácido nucleico ou fragmento deste indica que, quando idealmente alinhado com inserções ou deleções de nucleotídeos apropriados com outro ácido nucleico (ou a sua cadeia complementar), existe uma identidade de sequência nucleotídica em pelo menos cerca de 95% e mais preferivelmente pelo menos cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% das bases de nucleotídeos, conforme medido por qualquer algoritmo bem conhecido de identidade de sequência, tal como FASTA, BLAST ou Gap, como discutido a seguir. Uma molécula de ácido nucleico com identidade substancial para uma molécula de ácido nucleico de referência pode, em certos casos, codificar um poli- peptídeo que tem a mesma ou substancialmente semelhante sequên- cia de aminoácidos que o polipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico de referência.

[0085] Conforme aplicado aos polipeptídeos, o termo "similaridade substancial" ou "substancialmente semelhante" significa que duas se- quências de peptídeos, quando alinhadas de forma otimizada, como pelos programas GAP ou BESTFIT usando pesos de lacuna padrão, compartilham pelo menos 95% de identidade de sequência, ainda mais preferencialmente pelo menos 98% ou 99% de identidade de se- quência. Preferivelmente, as posições de resíduos que não são idênti- cos diferem por substituições de aminoácidos conservativas. Uma "substituição conservativa de aminoácido" é aquela em que um resí- duo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido ten- do uma cadeia lateral (grupo R) com propriedades químicas semelhan- tes (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substitui- ção conservativa de aminoácidos não altera substancialmente as pro- priedades funcionais de uma proteína. Nos casos em que duas ou mais sequências de aminoácidos diferem umas das outras por substi- tuições conservativas, a porcentagem de identidade de sequência ou grau de semelhança pode ser ajustada para cima para corrigir a natu- reza conservativa da substituição. Os meios para realizar este ajuste são bem conhecidos pelos versados na técnica. Ver, por exemplo, Pe- arson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Exemplos de grupos de aminoácidos que possuem cadeias laterais com propriedades quími- cas semelhantes incluem (1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadeias laterais de hidroxil alifáticas: serina e treonina; (3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; (4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e tripto- fano; (5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina e histidina; (6) cadei- as laterais acídicas: aspartato e glutamato, e (7) cadeias laterais con- tendo enxofre são cisteína e metionina. Os grupos de substituição conservativa de aminoácidos preferidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato e asparagina-glutamina. Alternativamente, uma substituição conserva- tiva é qualquer mudança tendo um valor positivo na matriz de verossi- milhança logarítmica PAM250 divulgada em Gonnet et al (1992) Sci- ence 256: 1443-1445. Uma substituição "moderadamente conservati- va" é qualquer alteração tendo um valor não negativo na matriz de ve- rossimilhança logarítmica de PAM250.

[0086] A semelhança de sequência para polipeptídeos, que tam- bém é referida como identidade de sequência, é tipicamente medida usando software de análise de sequência. O software de análise de proteínas combina sequências semelhantes usando medidas de seme- lhanças atribuídas a várias substituições, deleções e outras modifica- ções, incluindo substituições conservativas de aminoácidos. Por exemplo, o software GCG contém programas como Gap e Bestfit que podem ser usados com parâmetros padrão para determinar a homolo-

gia de sequência ou identidade de sequência entre polipeptídeos inti- mamente relacionados, tais como polipeptídeos homólogos de diferen- tes espécies de organismos ou entre uma proteína de tipo selvagem e uma muteína da mesma. Ver, por exemplo, GCG Versão 6.1. As se- quências de polipeptídeo também podem ser comparadas usando FASTA usando padrão ou parâmetros recomendados, um programa no GCG Versão 6.1. O FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) for- nece alinhamentos e percentagem de identidade de sequência das regiões da melhor sobreposição entre as sequências de consulta e pesquisa (Pearson (2000) supra). Outro algoritmo preferido quando se compara uma sequência da invenção com uma base de dados con- tendo um grande número de sequências de organismos diferentes é o programa de computador BLAST, especialmente BLASTP ou TBLASTN, usando parâmetros padrões. Ver, por exemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 and Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402.

[0087] Os termos "distúrbio proliferativo celular" e "distúrbio prolife- rativo" referem-se a distúrbios que estão associados com algum grau de proliferação celular anormal que se beneficiaria do tratamento com moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas anti-CD28 / anti-CD22 ou método da invenção. Isso inclui distúrbios crônicos e agudos, inclu- indo aquelas condições patológicas que predispõem o mamífero ao distúrbio em questão. Em uma modalidade, o distúrbio proliferativo ce- lular é o câncer, a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamen- te caracterizada por crescimento / proliferação celular desregulada.

[0088] O termo "tumor", conforme usado neste documento, refere- se a todo o crescimento e proliferação de células neoplásicas, malig- nas ou benignas, e a todas as células e tecidos pré-cancerígenos e cancerígenos. As expressões "câncer", "cancerígeno", "distúrbio proli- ferativo celular", "distúrbio proliferativo" e "tumor" não são mutuamente exclusivos, conforme referido neste documento.

[0089] Um "distúrbio proliferativo de células B" inclui linfoma de Hodgkin, linfoma não Hodgkin (NHL), como NHL agressivo, NHL agressivo recorrente, NHL de baixo grau / folicular, NHL linfocítico pe- queno (SL), NHL de grau intermediário / folicular, NHL difuso de grau intermediário, NHL imunoblástico de alto grau, NHL linfoblástico de alto grau, NHL de células pequenas não clivadas de alto grau, NHL de doença volumosa, NHL indolente incluindo NHL indolente recidivante e NHL indolente refratário ao rituximabe; NHL refratário, NHL indolente refratário, linfoma de células do manto, linfoma relacionado à AIDS e macroglobulinemia de Waldenstrom, doença de Hodgkin com predo- mínio de linfócitos (LPHD), linfoma linfocítico pequeno (SLL), leucemia linfocítica crônica (CLL); leucemia, incluindo leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia de células capilares, leucemia mieloblástica crônica; e outras malgnidades hema- tológicas.

[0090] A expressão "linfoma não Hodgkin" ou "NHL", conforme usada neste documento, refere-se a um câncer do sistema linfático diferente dos linfomas de Hodgkin. Os linfomas de Hodgkin geralmente podem ser distinguidos dos linfomas não Hodgkin pela presença de células de Reed-Sternberg nos linfomas de Hodgkin e pela ausência dessas células nos linfomas não Hodgkin. Exemplos de linfomas não Hodgkin abrangidos pelo termo, conforme usado neste documento, incluem qualquer um que seria identificado como tal por um versado na técnica (por exemplo, um oncologista ou patologista) de acordo com esquemas de classificação conhecidos na técnica, como o Revi- sed European - Esquema American Lymphoma (REAL) conforme des- crito em Color Atlas of Clinical Hematology (3º edição), A. Victor Ho- ffbrand e John E. Pettit (eds.) (Harcourt Publishers Ltd., 2000). Veja, em particular, as listas nas FIGS. 11,57, 11,58 e 11,59. Exemplos mais específicos incluem, mas não estão limitados a, NHL recidivante ou refratário, NHL de baixo grau de linha de frente, NHL de estágio 111 / IV, NHL resistente à quimioterapia, leucemia linfoblástica precursora B e / ou linfoma, linfoma linfocítico pequeno, leucemia linfocítica crônica de células B e / ou leucemia prolinfocítica e / ou linfoma linfocítico peque- no, linfoma prolinfocítico de células B, imunocitoma e / ou linfoma lin- foplasmocitário, linfoma linfoplasmocitário, linfoma de células B de zo- na marginal, linfoma de zona marginal esplênica, zona marginal de lin- foma extranodal - linfoma MALT , leucemia de células pilosas, plasmo- citoma e / ou mieloma de células plasmáticas, linfoma folicular / de baixo grau, NHL de grau intermediário / folicular, linfoma de células do manto, linfoma do centro folicular (folicular), NHL difuso de grau inter- mediário, linfoma difuso de grandes células B, NHL agressivo (incluin- do NHL agressivo de linha de frente e NHL recidivante agressivo), NHL recidivante ou refratário ao transplante de células-tronco autólo- gas, linfoma de grandes células B mediastinal primário, linfoma de efu- são primário, NHL imunoblástico de alto grau, NHL linfoblástico de alto grau, NHL de células pequenas não clivadas de alto grau, doença vo- lumosa NHL, linfoma de Burkitt, leucemia linfocítica granular grande precursora (periférica), micose fungóide e / ou síndrome de Sezary, linfomas de pele (cutâneos), linfoma de células grandes anaplásico, linfoma angiocêntrico.

Moléculas de Ligação ao antígeno Biespecíficas

[0091] Os anticorpos da presente invenção podem ser monoespe- cíficos, biespecíficos ou multiespecíficos. Os anticorpos multiespeciífi- cos podem ser específicos para diferentes epítopos de um polipeptí- deo alvo ou podem conter domínios de ligação ao antígeno específicos para mais de um polipeptídeo alvo. Ver, por exemplo, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et a/., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-

244. Os anticorpos anti-CD28 e / ou anticorpos anti-CD22 da presente invenção podem ser ligados ou coexpressos com outra molécula fun- cional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína. Por exemplo, um anti- corpo ou fragmento do mesmo pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outra forma) a uma ou mais outras entidades molecu- lares, tal como outro anticorpo ou fragmento de anticorpo para produzir um anticorpo biespecífico ou um multiespecífico com uma segunda especificidade de ligação.

[0092] O uso das expressões "anticorpo anti-CD28" e / ou "anti- corpo anti-CD-22" aqui se destina a incluir anticorpos anti-CD28 mo- noespeciíficos e / ou anticorpos anti-CD22 monoespecíficos, bem como anticorpos biespecíficos compreendendo um braço de ligação a CD28 ou braço de ligação a CD22 e um braço que se liga a um antígeno al- vo. Assim, a presente invenção inclui anticorpos biespecíficos em que um braço de uma imunoglobulina se liga a CD28 ou CD22 humano e o outro braço da imunoglobulina é específico para um antígeno alvo. O antígeno alvo que o outro braço do anticorpo biespecífico CD28 ou CD22 liga pode ser qualquer antígeno expresso na ou na vizinhança de uma célula, tecido, órgão, micro-organismo ou vírus, contra o qual uma resposta imune alvejada é desejada. O braço de ligação a CD28 pode compreender qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR / LOCVR ou CDR conforme estabelecido na Tabela 1 neste do- cumento. O braço de ligação a CD22 pode compreender qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR / LCVR ou CDR conforme estabelecido na Tabela 1 neste documento. Em certas modalidades, o braço de ligação a CD28 se liga a CD28 humano e induz a proliferação de células T humanas.

[0093] No contexto de anticorpos biespecíficos da presente inven- ção, em que um braço do anticorpo se liga a CD28 e o outro braço se liga a um antígeno alvo, o antígeno alvo pode ser um antígeno associ-

ado a tumor, tal como o CD22.

[0094] De acordo com certas modalidades exemplificativas, a pre- sente invenção inclui moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno que se ligam especificamente a CD28 e CD22. Tais moléculas podem ser referidas neste documento como, por exemplo, "anti-CD28 / anti-CD22" ou "anti-CD28xCD22" ou "CD28xCD22" ou "anti-CD22 / anti-CD28" ou "anti-CD22xCD28", ou moléculas biespecíficas "CD22xCD28", ou "aCcCD22 x aCD28", ou "aCD28 x aCD22", ou outra terminologia seme- lhante.

[0095] De acordo com certas modalidades exemplificativas, as mo- léculas biespecíficas de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpo biespecífico) podem ter um braço efetor e um braço de alvejamento. O braço efetor pode ser o primeiro domínio de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpo anti-CD28) que se liga aos antígenos nas células efetoras (por exemplo, células T). O braço de alvejamento pode ser o segundo domínio de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpo anti- CD22) que se liga aos antígenos nas células alvo (por exemplo, célu- las tumorais). De acordo com certas modalidades exemplificativas, o braço efetor se liga a CD28 e o braço de alvejamento se liga a CD22. O anti-CD28 / CD22 biespecífico pode fornecer sinal coestimulatório para células efetoras (por exemplo, células T). O braço efetor não tem efeito para estimular as células T sem agrupamento. O braço efetor sozinho tem pouco efeito para estimular as células T, a menos que em combinação com o braço de alvejamento. O braço de alvejamento de tumor pode ter especificidade de tumor imperfeita. O antígeno que é o alvo do braço de alvejamento (por exemplo, CD22) pode ser expresso em uma fração de células tumorais. A especificidade do braço de alve- jamento do tumor pode ser aumentada pela sobreposição com a com- binação com moléculas biespecífica de ligação ao antígeno anti-CD3 (por exemplo, anticorpo biespecífico anti-CD3 / CD20).

[0096] Conforme usada neste documento, a expressão "molécula de ligação ao antígeno" significa uma proteína, polipeptídeo ou com- plexo molecular compreendendo ou consistindo em pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) que sozinha, ou em combinação com uma ou mais regiões CDRs e / ou de estrutura (FRs) adicionais, se liga especificamente a um antígeno particular. Em certas modalidades, uma molécula de ligação ao antígeno é um anticorpo ou um fragmento de um anticorpo, uma vez que esses termos são defini- dos em outro lugar neste documento.

[0097] Como utilizado neste documento, a expressão "molécula de ligação ao antígeno biespecífica" significa uma proteína, polipeptídeo ou complexo molecular compreendendo pelo menos um primeiro do- mínio de ligação ao antígeno e um segundo domínio de ligação ao an- tígeno. Cada domínio de ligação ao antígeno dentro da molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende pelo menos uma CDR que sozinha, ou em combinação com uma ou mais CDRs e / ou FRs adicionais, se liga especificamente a um antígeno particular. No con- texto da presente invenção, o primeiro domínio de ligação ao antígeno se liga especificamente a um primeiro antígeno (por exemplo, CD28), e o segundo domínio de ligação ao antígeno se liga especificamente a um segundo antígeno distinto (por exemplo, CD22).

[0098] Em certas modalidades exemplificativas da presente inven- ção, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é um anticorpo biespecífico. Cada domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo biespecífico compreende um domínio variável da cadeia pesada (HCVR) e um domínio variável da cadeia leve (LCVR). No contexto de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo um primeiro e um segundo domínio de ligação ao antígeno (por exemplo, um anticorpo biespecífico), as CDRs do primeiro domínio de ligação ao antígeno podem ser designadas com o prefixo "D1" e as CDRs do se-

gundo domínio de ligação ao antígeno podem ser designadas com o prefixo "D2". Assim, as CDRs do primeiro domínio de ligação ao antí- geno podem ser referidas aqui como D1-HCDR1, D1-HCDR?2 e D1- HCDR3; e as CDRs do segundo domínio de ligação ao antígeno po- dem ser referidas aqui como D2-HCDR1, D2-HCDR?2 e D2-HCDR3.

[0099] O primeiro domínio de ligação ao antígeno e o segundo domínio de ligação ao antígeno podem ser direta ou indiretamente co- nectados um ao outro para formar uma molécula de ligação ao antíge- no biespecífica da presente invenção. Alternativamente, o primeiro domínio de ligação ao antígeno e o segundo domínio de ligação ao antígeno podem, cada um, ser conectado a um domínio de multimeri- zação separado. A associação de um domínio de multimerização com outro domínio de multimerização facilita a associação entre os dois domínios de ligação ao antígeno, formando por meio disso uma molé- cula de ligação ao antígeno biespecífica. Conforme usado neste do- cumento, um "domínio de multimerização" é qualquer macromolécula, proteína, polipeptídeo, peptídeo ou aminoácido que tem a capacidade de se associar a um segundo domínio de multimerização da mesma estrutura ou constituição ou semelhante. Por exemplo, um domínio de multimerização pode ser um polipeptídeo compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina. Um exemplo não limitativo de um componente de multimerização é uma porção Fc de uma imunoglobulina (compre- endendo um domínio CHh2-CrH3), por exemplo, um domínio Fc de uma IgG selecionada dos isotipos de I9G1, IgG2, IgG3 e I9gG4, bem como qualquer alotipo dentro de cada grupo de isotipo.

[00100] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da pre- sente invenção compreenderão tipicamente dois domínios de multime- rização, por exemplo, dois domínios Fc que são cada um individual- mente parte de uma cadeia pesada de anticorpo separada. O primeiro e o segundo domínios de multimerização podem ser do mesmo isotipo de IgG, tal como, por exemplo, I9G1 / IgG1, IgG2 / I9gG2 e 1964 / I9G4. Alternativamente, o primeiro e o segundo domínios de multimerização podem ser de diferentes isotipos de IgG, tais como, por exemplo, I9G1 1 19G2, I9G1 / I9G4, I9G2 / I9GA, etc.

[00101] Em certas modalidades, o domínio de multimerização é um fragmento Fc ou uma sequência de aminoácidos de 1 a cerca de 200 aminoácidos de comprimento contendo pelo menos um resíduo de cis- teína. Em outras modalidades, o domínio de multimerização é um resí- duo de cisteína ou um peptídeo curto contendo cisteína. Outros domí- nios de multimerização incluem peptídeos ou polipeptídeos compreen- dendo ou consistindo em um zíper de leucina, um motivo de hélice- alça ou um motivo de espiral enrolada.

[00102] “Qualquer formato ou tecnologia de anticorpo biespecífico pode ser usado para fazer as moléculas de ligação ao antígeno bies- pecíficas da presente invenção. Por exemplo, um anticorpo ou frag- mento do mesmo tendo uma primeira especificidade de ligação ao an- tígeno pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outra forma) a uma ou mais outras entidades moleculares, tal como outro anticorpo ou fragmento de anticorpo tendo uma segunda especificidade de liga- ção ao antígeno para produzir uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica. Formatos biespecíficos exemplificativos específicos que podem ser usados no contexto da presente invenção incluem, sem |li- mitação, por exemplo, formatos biespecíficos de diacorpos ou basea- dos em scFv, fusões de IgG-scFv, Ig de domínio variável duplo (OVO), Quadroma, botões em furos, cadeia leve comum (por exemplo, cadeia leve comum com botões em furos, etc.), corpo CrossMab, CrossFab (SEEO), zíper de leucina, Ouobody, IgG1 / IgG2, Fab de ação dupla (OAF) -IlgG e formatos biespecíficos de Mab? (ver, por exemplo, Klein et al. 2012, mAbs 4: 6, 1-11 e referências citadas nele, para uma revi-

são dos formatos anteriores).

[00103] No contexto de moléculas de ligação ao antígeno biespecií- ficas da presente invenção, os domínios de multimerização, por exem- plo, domínios Fc, podem compreender uma ou mais alterações de aminoácidos (por exemplo, inserções, deleções ou substituições) em comparação com o tipo selvagem, versão de ocorrência natural do domínio Fc. Por exemplo, a invenção inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas compreendendo uma ou mais modificações no domínio Fc que resulta em um domínio Fc modificado com uma intera- ção de ligação modificada (por exemplo, aumentada ou diminuída) en- tre Fc e FCRn. Em uma modalidade, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende uma modificação em uma região CH2 ou uma CH3, em que a modificação aumenta a afinidade do domínio Fc para FcRn em um ambiente acídico (por exemplo, em um endossoma onde o pH varia de cerca de 5,5 a cerca de 6,0). Exemplos não limitativos de tais modificações Fc incluem, por exemplo, uma modificação na posição 250 (por exemplo, E ou Q); 250 e 428 (por exemplo, L ou F); 252 (por exemplo, LN/FIW ou T), 254 (por exemplo, S ou T) e 256 (por exemplo, S/R/Q/EID ou T); ou uma modificação na posição 428 e / ou 433 (por exemplo, UR/S/P/Q ou K) e / ou 434 (por exemplo, H/F ou V); ou uma modificação na posição 250 e / ou 428; ou uma modificação na posição 307 ou 308 (por exemplo, 308F, V308F) e 434. Em uma modalidade, a modificação compreende uma modificação 428L (por exemplo, M428L) e 4348 (por exemplo, N434S); uma modificação 428L, 2591 (por exemplo, V2591) e 308F (por exemplo, V308F); uma modificação 433K (por exemplo, H433K) e uma 434 (por exemplo, 434Y); uma modificação 252, 254 e 256 (por exemplo, 252Y, 254T e 256E); uma modificação 250Q e 428L (por exemplo, T250Q e M428L); e uma modificação 307 e / ou 308 (por exemplo, 308F ou 308P).

[00104] A presente invenção também inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas compreendendo um primeiro domínio CH3 de imunoglobulina e um segundo domínio CH3 de lg, em que o primeiro e segundo domínios Cx3 de lg diferem um do outro em pelo menos um aminoácido e em que pelo menos uma diferença de aminoácido reduz a ligação do anticorpo biespecífico à Proteína A em comparação com um anticorpo biespecífico sem a diferença de aminoácido. Em uma modalidade, o primeiro domínio Ig CH3 de lg se liga à Proteína Ae o segundo domínio lg Cx3 contém uma mutação que reduz ou elimina a ligação da Proteína A, tal como uma modificação de H95R (pela nume- ração de éxon IMGT; H435R por numeração EU). O segundo Cr3 po- de ainda compreender uma modificação Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Modificações adicionais que podem ser encontradas no segundo CH3 incluem: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M e V821 (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M e V4221 por EU) no caso de anticorpos I9G1; N44S, K52N e V821 (IMGT; N384S, K392N e V4221 por EU) no caso de anticorpos I9G2; e Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q e V821 (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q e V4221 por EU) no caso de anticorpos I1gG4.

[00105] Em certas modalidades, o domínio Fc pode ser quimérico, combinando sequências Fc derivadas de mais de um isotipo de imu- noglobulina. Por exemplo, um domínio Fc quimérico pode compreen- der parte ou a totalidade de uma sequência Crx2 derivada de uma regi- ão Cr2 de IgG1 humana, IgG2 humana ou IgG4 humana, e parte ou a totalidade de uma sequência Cx3 derivada de uma IgG1 humana, IgG2 humana ou IgG4 humana. Um domínio Fc quimérico também pode conter uma região de dobradiça quimérica. Por exemplo, uma dobradi- ça quimérica pode compreender uma sequência de "dobradiça superi- or", derivada de uma região de dobradiça de IgG1 humana, IgG2 hu- mana ou IgG4 humana, combinada com uma sequência de "dobradiça inferior", derivada de uma região de dobradiça de I9gG1 humana, IgG2 humana ou IgG4 humana. Um exemplo particular de um domínio Fc quimérico que pode ser incluído em qualquer uma das moléculas de ligação ao antígeno estabelecidas neste documento compreende, do terminal N ao C: [I9gG4 Cr1] - [dobradiça superior de I9G4] - [dobradiça inferior de I9G2] - [[9G4 CH2] - [I[9G4 Cr3]. Outro exemplo de um do- mínio Fc quimérico que pode ser incluído em qualquer uma das molé- culas de ligação ao antígeno aqui estabelecidas compreende, do ter- minal N- a C-: [[9G1Cn1] - [dobradiça superior de I9G1] - [dobradiça inferior de I9G2] - [[9G4 Cr2] - [[9G1 Cr3]. Estes e outros exemplos de domínios Fc quiméricos que podem ser incluídos em qualquer uma das moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção são des- critos em WO2014 / 022540A1, cujo conteúdo completo é incorporado por referência neste documento. Os domínios Fc quiméricos tendo es- tes arranjos estruturais gerais, e variantes dos mesmos, podem ter a ligação ao receptor Fc alterada, que por sua vez afeta a função efetora de Fc.

Variantes de Sequência

[00106] Os anticorpos e moléculas de ligação ao antígeno biespecí- ficas da presente invenção podem compreender uma ou mais substi- tuições, inserções e / ou deleções de aminoácidos nas regiões de es- trutura e / ou CDR dos domínios variáveis da cadeia pesada e leve em comparação com as sequências de linhagem germinativa correspon- dentes dos quais os domínios de ligação ao antígeno individuais foram derivados. Tais mutações podem ser prontamente determinadas com- parando as sequências de aminoácidos divulgadas neste documento com as sequências da linhagem germinativa disponíveis, por exemplo, nas bases de dados de sequências de anticorpos públicas. As molécu- las de ligação ao antígeno da presente invenção podem compreender domínios de ligação ao antígeno que são derivados de qualquer uma das sequências de aminoácidos exemplificativas divulgadas neste do-

cumento, em que um ou mais aminoácidos dentro de uma ou mais re- giões de estrutura e / ou CDR são mutadas para o(s) resíduo(s) cor- respondente(s) da sequência da linhagem germinativa da qual o anti- corpo foi derivado, ou ao(s) resíduo(s) correspondente(s) de outra se- quência da linhagem germinativa humana, ou a uma substituição con- servativa de aminoácidos do(s) resíduo(s) da linhagem germinativa correspondente (tais alterações de sequência são referidas neste do- cumento coletivamente como "mutações da linhagem germinativa"). Um versado na técnica, começando com as sequências da região va- riável da cadeia pesada e leve descritas neste documento, pode facil- mente produzir inúmeros anticorpos e fragmentos de ligação ao antí- geno que compreendem uma ou mais mutações da linhagem germina- tiva individuais ou combinações dos mesmos.

Em certas modalidades, todos os resíduos de estrutura e / ou CDR dentro dos domínios V" e/ ou V. são mutados de volta para os resíduos encontrados na sequên- cia da linhagem germinativa original da qual o domínio de ligação ao antígeno foi originalmente derivado.

Em outras modalidades, apenas certos resíduos são mutados de volta para a sequência da linhagem germinativa original, por exemplo, apenas os resíduos mutados encon- trados nos primeiros 8 aminoácidos do FR1 ou nos últimos 8 aminoá- cidos do FRA4, ou apenas os resíduos mutados encontrados na CDR1, CDR?2 ou CDR3. Em outras modalidades, um ou mais do(s) resíduo(s) de estrutura e / ou CDR são mutados para o(s) resíduo(s) correspon- dente(s) de uma sequência de linhagem germinativa diferente (isto é, uma sequência de linhagem germinativa que é diferente da sequência de linhagem germinativa da qual o domínio de ligação ao antígeno foi originalmente derivado). Além disso, os domínios de ligação ao antí- geno podem conter qualquer combinação de duas ou mais mutações da linhagem germinativa dentro das regiões de estrutura e / ou CDR, por exemplo, em que certos resíduos individuais são mutados para o resíduo correspondente de uma sequência da linhagem germinativa particular, enquanto certos outros resíduos que diferem da sequência da linhagem germinativa original são mantidos ou são mutados para o resíduo correspondente de uma sequência diferente da linhagem ger- minativa. Uma vez obtidos, domínios de ligação ao antígeno que con- têm uma ou mais mutações da linhagem germinativa podem ser facil- mente testados quanto uma ou mais propriedades desejadas, tais co- mo especificidade de ligação melhorada, maior afinidade de ligação, propriedades biológicas antagonísticas ou agonísticas intensificadas ou aumentadas (conforme o caso pode ser), imunogenicidade reduzi- da, etc. Moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas compreenden- do um ou mais domínios de ligação ao antígeno obtidos desta maneira geral estão incluídas na presente invenção.

[00107] A presente invenção também inclui moléculas de ligação ao antígeno em que um ou ambos os domínios de ligação ao antígeno compreendem variantes de qualquer uma das sequências de aminoá- cidos de HCVR, LOCVR e / ou CDR divulgadas neste documento tendo uma ou mais substituições conservativas. Por exemplo, a presente in- venção inclui moléculas de ligação ao antígeno compreendendo um domínio de ligação ao antígeno com sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR e / ou CDR com, por exemplo, 10 ou menos, 8 ou me- nos, 6 ou menos, 4 ou menos, etc. substituições conservativas de aminoácidos em relação a qualquer uma das sequências de aminoáci- dos de HCVR, LCVR e / ou CDR divulgadas neste documento. Uma "substituição conservativa de aminoácido" é aquela em que um resí- duo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido ten- do uma cadeia lateral (grupo R) com propriedades químicas semelhan- tes (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substitui- ção conservativa de aminoácidos não altera substancialmente as pro- priedades funcionais de uma proteína. Exemplos de grupos de amino-

ácidos que têm cadeias laterais com propriedades químicas semelhan- tes incluem (1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leuci- na e isoleucina; (2) cadeias laterais de hidroxil alifáticas: serina e treo- nina; (3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; (4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e triptofano; (5) ca- deias laterais básicas: lisina, arginina e histidina; (6) cadeias laterais acídicas: aspartato e glutamato, e (7) cadeias laterais contendo enxo- fre são cisteína e metionina. Os grupos de substituição conservativa de aminoácidos preferidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina- tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato e aspara- gina-glutamina. Alternativamente, uma substituição conservativa é qualquer alteração que tenha um valor positivo na matriz de verossimi- lhança logarítmica de PAM250 divulgada em Gonnet et al. (1992) Sci- ence 256: 1443-1445. Uma substituição "moderadamente conservati- va" é qualquer alteração tendo um valor não negativo na matriz de ve- rossimilhança logarítmica de PAM250.

[00108] A presente invenção também inclui moléculas de ligação ao antígeno compreendendo um domínio de ligação ao antígeno com uma sequência de aminoácidos de HCVR, LCVR e / ou CDR que é substancialmente idêntica a qualquer uma das sequências de aminoá- cidos de HCVR, LCVR e / ou CDR divulgadas neste documento. A ex- pressão "identidade substancial" ou "substancialmente idêntica", quando se refere a uma sequência de aminoácidos, significa que duas sequências de aminoácidos, quando alinhadas de forma otimizada, tal como pelos programas GAP ou BESTFIT usando pesos de lacuna pa- drão, compartilham pelo menos 95% de identidade de sequência, ain- da mais preferencialmente pelo menos 98% ou 99% de identidade de sequência. Preferivelmente, as posições de resíduos que não são idênticos diferem por substituições de aminoácidos conservativas. Nos casos em que duas ou mais sequências de aminoácidos diferem umas das outras por substituições conservativas, a porcentagem de identi- dade de sequência ou grau de semelhança pode ser ajustada para ci- ma para corrigir a natureza conservativa da substituição. Os meios pa- ra realizar este ajuste são bem conhecidos pelos versados na técnica. Ver, por exemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331.

[00109] A semelhança de sequência para polipeptídeos, que tam- bém é referida como identidade de sequência, é tipicamente medida usando software de análise de sequência. O software de análise de proteínas combina sequências semelhantes usando medidas de seme- lhanças atribuídas a várias substituições, deleções e outras modifica- ções, incluindo substituições conservativas de aminoácidos. Por exemplo, o software GCG contém programas tais como Gap e Bestfit que podem ser usados com parâmetros padrões para determinar a homologia de sequência ou identidade de sequência entre polipeptí- deos intimamente relacionados, tais como polipeptídeos homólogos de diferentes espécies de organismos ou entre uma proteína de tipo sel- vagem e uma muteína dos mesmos. Ver, por exemplo, GCG Versão

6.1. As sequências de polipeptídeo também podem ser comparadas usando FASTA usando padrão ou parâmetros recomendados, um pro- grama no GCG Versão 6.1. O FASTA (por exemplo, FASTA2 e FAS- TA3) fornece alinhamentos e percentagem de identidade de sequência das regiões da melhor sobreposição entre as sequências de consulta e pesquisa (Pearson (2000) supra). Outro algoritmo preferido quando se compara uma sequência da invenção com uma base de dados con- tendo um grande número de sequências de organismos diferentes é o programa de computador BLAST, especialmente BLASTP ou TBLASTN, usando parâmetros padrões. Ver, por exemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 and Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402. Ligação Dependente de pH

[00110] A presente invenção inclui moléculas de ligação ao antíge- no biespecíficas anti-CD28 / anti-CD22, com características de ligação dependentes do pH. Por exemplo, um anticorpo anti-CD28 da presente invenção pode exibir ligação reduzida a CD28 em pH acídico em com- paração com pH neutro. Alternativamente, os anticorpos anti-CD22 da invenção podem exibir ligação intensificada a CD22 em pH acídico em comparação com pH neutro. A expressão "pH acídico" inclui valores de pH inferiores a cerca de 6,2, por exemplo, cerca de 6,0, 5,95, 5,9, 5,85, 5,8, 5,75, 5,7, 5,65, 5,6, 5,55, 5,5, 5,45, 5,4, 5,35, 5,3, 5,25, 5,2, 5,15, 5,1, 5,05, 5,0 ou menos. Conforme usada neste documento, a expressão "pH neutro" significa um pH de cerca de 7,0 a cerca de 7,4. A expressão "pH neutro" inclui valores de pH de cerca de 7,0, 7,05, 7,1,7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 1,385 €7A.

[00111] Em certos casos, "ligação reduzida ... em pH acídico em comparação com pH neutro" é expressa em termos de uma razão do valor Kp da ligação do anticorpo ao seu antígeno em pH acídico para o valor Kp da ligação do anticorpo ao seu antígeno em pH neutro (ou vi- ce-versa). Por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo pode ser considerado como exibindo "ligação reduzi- da a CD28 em pH acídico em comparação com pH neutro" para os fins da presente invenção se o anticorpo ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo exibir uma razão de Kp acídica/ neutra de cerca de 3,0 ou superior. Em certas modalidades exemplificativas, a razão Kp acídica / neutra para um anticorpo ou fragmento de ligação ao antíge- no da presente invenção pode ser cerca de 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 20,0. 25,0, 30,0, 40,0, 50,0, 60,0, 70,0, 100,0 ou superior.

[00112] — Anticorpos com características de ligação dependentes do pH podem ser obtidos, por exemplo, classificando uma população de anticorpos para ligação reduzida (ou intensificada) a um antígeno par- ticular em pH ácido em comparação com o pH neutro. Adicionalmente, modificações do domínio de ligação ao antígeno ao nível de aminoáci- dos podem originar anticorpos com características dependentes do pH. Por exemplo, substituindo um ou mais aminoácidos de um domínio de ligação ao antígeno (por exemplo, dentro de uma CDR) com um resíduo de histidina, pode ser obtido um anticorpo com ligação ao an- tígeno reduzida em pH acídico relativo a pH neutro.

Anticorpos Compreendendo Variantes Fc

[00113] De acordo com certas modalidades da presente invenção, moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas anti-CD28 / anti-CD22 são fornecidas compreendendo um domínio Fc compreendendo uma ou mais mutações que aumentam ou diminuem a ligação do anticorpo ao receptor FcRn, por exemplo, em pH acídico em comparação com pH neutro. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos que compreendem uma mutação na região Ch2 ou CH3 do domínio Fc, em que a(s) mutação(ões) aumenta(m) a afinidade do domínio Fc para FcRn em um ambiente acídico (por exemplo, em um endossoma onde o pH varia de cerca de 5,5 a cerca de 6,0). Tais mutações podem re- sultar em um aumento da meia vida no soro do anticorpo quando ad- ministrado a um animal. Exemplos não limitativos de tais modificações Fc incluem, por exemplo, uma modificação na posição 250 (por exem- plo, E ou Q); 250 e 428 (por exemplo, L ou F); 252 (por exemplo, L / Y 1 F/W ouT), 254 (por exemplo, S ou T) e 256 (por exemplo, S/R/Q/E/D ou T); ou uma modificação na posição 428 e / ou 433 (por exemplo, H/IL/R/S/P/Q ou K) e / ou 434 (por exemplo, H / F ou Y); ou uma modificação na posição 250 e / ou 428; ou uma modificação na posição 307 e / ou 308 (por exemplo, 308F, V308F) e 434. Em uma modalidade, a modificação compreende uma modificação 428L (por exemplo, M428L) e 4348 (por exemplo, N434S); uma modificação

428L, 259| (por exemplo, V259I) e 308F (por exemplo, V308F); uma modificação 433K (por exemplo, H433K) e uma 434 (por exemplo, 434Y); uma modificação 252, 254 e 256 (por exemplo, 252Y, 254T e 256E); uma modificação 250Q e 428L (por exemplo, T250Q e M428L); e uma modificação 307 e / ou 308 (por exemplo, 308F ou 308P).

[00114] Por exemplo, a presente invenção inclui moléculas de liga- ção ao antígeno biespecíficas anti-CD28 / anti-CD22, compreendendo um domínio Fc compreendendo um ou mais pares ou grupos de muta- ções selecionadas a partir do grupo que consiste em: 250Q e 248L (por exemplo, T250Q e M248L); 252Y, 254T e 256E (por exemplo, M252Y, S254T e T256E); 428L e 4348 (por exemplo, M428L e N4348); e 433K e 434F (por exemplo, H433K e N434F). Todas as combinações possíveis das mutações do domínio Fc anteriores e ou- tras mutações dentro dos domínios variáveis do anticorpo aqui divul- gados neste documento estão contempladas no escopo da presente invenção. Características Biológicas dos anticorpos e Moléculas de Ligação ao Antígeno Biespecíficos

[00115] A presente invenção inclui anticorpos e fragmentos de liga- ção ao antígeno dos mesmos que se ligam a CD28 e /ou CD22 huma- no com alta afinidade. A presente invenção também inclui anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam a CD28 e /ou CD22 humano com afinidade média ou baixa, dependendo do contexto tera- pêutico e das propriedades de alvejamento específicas que são dese- jadas. Por exemplo, no contexto de uma molécula de ligação ao antí- geno biespecífico, em que um braço se liga a CD28 e outro braço se liga a um antígeno alvo (por exemplo, CD22), pode ser desejável que o braço de ligação ao antígeno alvo se ligue ao antígeno alvo com alta afinidade enquanto o braço anti-CD28 se ligue ao CD28 com afinidade apenas moderada ou baixa. Desta forma, o alvejamento preferencial da molécula de ligação ao antígeno a células que expressam o antíge- no alvo pode ser alcançado, evitando a ligação de CD28 geral / não alvejado e os consequentes efeitos colaterais adversos associados a ela.

[00116] De acordo com certas modalidades, a presente invenção inclui anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno de anticorpos que se ligam a CD22 humano (por exemplo, a 25ºC) com um Kp de menos de cerca de 15 nM conforme medido por ressonância plasmô- nica de superfície, por exemplo, usando um formato de ensaio confor- me definido no Exemplo 5 neste documento. Em certas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno da presente in- venção se ligam ao CD22 humano com um Kp de menos que cerca de nM, menos que cerca de 14 nM, menos que cerca de 13 nM, me- nos que cerca de 12 nM, menos que cerca de 11 nM, menos do que cerca de 10 nM, menos do que cerca de 9 nM, menos do que cerca de 8 nM, menos do que cerca de 7 nM, menos do que cerca de 6 nM, menos do que cerca de 5 nM, menos do que cerca de 4 nM, menos do que cerca de 3 nM, menos do que cerca de 2 nM, ou menos do que cerca de 1 nM, conforme medido pela ressonância plasmônica de su- perfície, por exemplo, usando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 5 neste documento, ou um ensaio substancialmente se- melhante.

[00117] De acordo com certas modalidades, a presente invenção inclui anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno de anticorpos que se ligam a CD22 de macaco (por exemplo, a 25ºC) com uma Kp de menos que cerca de 60 uM conforme medido por ressonância plasmônica de superfície, por exemplo, usando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 5 neste documento. Em certas modali- dades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno da presen- te invenção ligam CD22 de macaco com uma Kp de menos que cerca de 60 uM, menos que cerca de 59 uM, menos que cerca de 58 uM, menos que cerca de 57 uM, menos do que cerca de 56 uM, menos do que cerca de 55 uM, menos do que cerca de 54 uM, menos do que cerca de 53 uM, menos do que cerca de 52 uM, menos do que cerca de 51 uM, menos do que cerca de 50 uM, menos do que cerca de 49 uM, menos do que cerca de 48 uM, menos do que cerca de 47 uM, menos do que cerca de 46 uM, menos do que cerca de 45 uM, menos do que cerca de 44 uM, menos do que cerca de 43 uM, menos do que cerca de 42 uM, menos do que cerca de 41 uM, menos do que cerca de 40 uM, menos do que cerca de 39 uM, menos do que cerca de 38 uM, menos do que cerca de 37 uM, menos do que cerca de 36 uM, menos do que cerca de 35 uM, menos do que cerca de 34 uM, menos do que cerca de 33 uM, menos do que cerca de 32 uM, menos do que cerca de 31 uM, menos do que cerca de 30 uM, menos do que cerca de 25 uM, menos do que cerca de 20 uM, menos do que cerca de 15 UM, ou menos do que cerca de 10 uM, conforme medido pela resso- nância plasmônica de superfície, por exemplo, usando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 5 neste documento, ou um en- saio substancialmente semelhante.

[00118] De acordo com certas modalidades, a presente invenção inclui anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno de anticorpos que se ligam a CD28 humano (por exemplo, a 25ºC) com um Kp de menos que cerca de 45 uM conforme medido por ressonância plasmô- nica de superfície, por exemplo, usando um formato de ensaio confor- me definido no Exemplo 5 neste documento. Em certas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno da presente in- venção se ligam ao CD28 humano com um Kp de menos que cerca de 45 uM, menos que cerca de 44 uM, menos que cerca de 43 uM, me- nos que cerca de 42 uM, menos do que cerca de 41 uM, menos do que cerca de 40 uM, menos do que cerca de 39 uM, menos do que cerca de 38 uM, menos do que cerca de 37 uM, menos do que cerca de 36 uM, menos do que cerca de 35 uM, menos do que cerca de 34 UM, menos do que cerca de 33 uM, menos do que cerca de 32 uM, menos do que cerca de 31 uM, menos do que cerca de 30 uM, menos do que cerca de 25 uM, menos do que cerca de 20 uM, menos do que cerca de 15 uM, menos do que cerca de 10 uM, conforme medido pela ressonância plasmônica de superfície, por exemplo, usando um forma- to de ensaio conforme definido no Exemplo 5 neste documento, ou um ensaio substancialmente semelhante.

[00119] A presente invenção também inclui anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam ao CD22 humano com uma meia-vida dissociativa (t/2) maior que cerca de 7,5 minutos, conforme medido pela ressonância plasmônica de superfície a 25ºC, por exemplo, usando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 5 neste documento, ou um ensaio substancialmente seme- lhante. Em certas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de liga- ção ao antígeno da presente invenção ligam CD22 humano com um t/> maior do que cerca de 7 minutos, maior do que cerca de 10 minu- tos, maior do que cerca de 15 minutos, maior do que cerca de 20 mi- nutos, maior do que cerca de 25 minutos, maior do que cerca de 30 minutos, maior do que cerca de 35 minutos, maior do que cerca de 40 minutos, maior do que cerca de 45 minutos, maior do que cerca de 50 minutos, maior do que cerca de 55 minutos, maior do que cerca de 60 minutos, maior do que cerca de 65 minutos, maior do que cerca de 70 minutos, maior do que cerca de 75 minutos, ou maior do que cerca de 100 minutos, conforme medido pela ressonância plasmônica de super- fície a 25ºC, por exemplo, usando um formato de ensaio conforme de- finido no Exemplo 5 neste documento, ou um ensaio substancialmente semelhante.

[00120] A presente invenção também inclui anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam ao CD22 de macaco com uma meia-vida dissociativa (t/2) maior que cerca de 4,3 minutos, conforme medido pela ressonância plasmônica de superfície a 37ºC, por exemplo, usando um formato de ensaio conforme definido nos exemplos neste documento, ou um ensaio substancialmente seme- lhante. Em certas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de liga- ção ao antígeno da presente invenção ligam CD28 com um té maior do que cerca de 4 minutos, maior do que cerca de 5 minutos, maior do que cerca de 6 minutos, maior do que cerca de 7 minutos, maior do que cerca de 8 minutos, maior do que cerca de 9 minutos, maior do que cerca de 10 minutos, maior do que cerca de 15 minutos, maior do que cerca de 20 minutos, maior do que cerca de 25 minutos, maior do que cerca de 30 minutos, maior do que cerca de 35 minutos, maior do que cerca de 40 minutos, maior de cerca de 45 minutos, ou mais de cerca de 50 minutos, conforme medido pela ressonância plasmônica de superfície a 25ºC, por exemplo, usando um formato de ensaio con- forme definido no Exemplo 5 neste documento, ou um ensaio substan- cialmente semelhante.

[00121] A presente invenção também inclui anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam ao CD28 humano com uma meia-vida dissociativa (t/2) maior que cerca de 2,3 minutos, conforme medido pela ressonância plasmônica de superfície a 25ºC, por exemplo, usando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 5 neste documento, ou um ensaio substancialmente seme- lhante. Em certas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de liga- ção ao antígeno da presente invenção ligam CD28 com um té maior do que cerca de 2 minutos, maior do que cerca de 5 minutos, maior do que cerca de 10 minutos, maior do que cerca de 20 minutos, maior do que cerca de 30 minutos, maior do que cerca de 40 minutos, maior do que cerca de 50 minutos, maior do que cerca de 60 minutos, maior do que cerca de 70 minutos, maior do que cerca de 80 minutos, maior do que cerca de 90 minutos, maior do que cerca de 100 minutos, maior do que cerca de 200 minutos, maior do que cerca de 300 minutos, maior do que cerca de 400 minutos, maior do que cerca de 500 minu- tos, maior do que cerca de 600 minutos, maior do que cerca de 700 minutos, maior do que cerca de 800 minutos, maior do que cerca de 900 minutos, maior do que cerca de 1000 minutos, ou maior do que cerca de 1200 minutos, conforme medido pela ressonância plasmônica de superfície a 25ºC ou 37ºC, por exemplo, usando um formato de en- saio conforme definido nos exemplos neste documento, ou um ensaio substancialmente semelhante.

[00122] A presente invenção também inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas (por exemplo, anticorpos biespecíficos) que são capazes de se ligar a CD28 humano e CD22 humano e de macaco. De acordo com certas modalidades, as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção interagem especificamente com células que expressam CD28 e / ou CD22. A extensão em que uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica se liga a células que expressam CD28 e / ou CD22 pode ser avaliada por classificação de células ati- vadas por fluorescência (FACS), conforme ilustrado no Exemplo 6 nes- te documento. Por exemplo, a presente invenção inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que se ligam especificamente a li- nhas de células humanas ou células de cinomolgo que expressam CD28, mas não CD22 (por exemplo, células T) e linhagens de células humanas ou células de cinomolgo que expressam CD22, mas não CD28 (por exemplo, células B ou células Nalm6). A presente invenção inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que se ligam a qualquer uma das células e linhagens celulares acima mencionadas com um valor de ECs5o de cerca de 1,3x10* a cerca de 2,3x10º M, ou menos, conforme determinado usando um ensaio FACS conforme es- tabelecido no Exemplo 6 ou um ensaio substancialmente semelhante.

[00123] A presente invenção inclui moléculas de ligação ao antíge- no biespecíficas (por exemplo, anticorpos biespecíficos) que são ca- pazes de se ligar a CD28 humano e CD22 humano. De acordo com certas modalidades, as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção interagem especificamente com células que expressam CD28 e / ou CD22. A extensão em que uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica se liga a células que expressam CD28 e / ou CD22 pode ser avaliada por citometria de fluxo, conforme ilustrado no Exemplo 7 neste documento. Por exemplo, a presente invenção inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que se ligam especifi- camente a células humanas que expressam CD28, mas não CD22 (por exemplo, células T) e linhagens de células humanas que expres- sam CD22, mas não CD28 (por exemplo, células HEK293 transduzi- das com CD22 humano e células Raji B geneticamente modificadas para excluir CD80 e CD86). A presente invenção inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que se ligam a qualquer uma das células e linhagens celulares acima mencionadas com um valor de ECso de cerca de 1,14x10º a cerca de 9,76 x10º M ou menos, con- forme determinado por citometria de fluxo conforme estabelecido no Exemplo 7 ou um ensaio substancialmente semelhante.

[00124] A presente invenção também fornece moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas anti-CD28 / anti-CD22 que induzem ou au- mentam a potência do extermínio mediada por células T CD20xCD3 de células tumorais. Por exemplo, a presente invenção inclui anticor- pos anti-CD28xCD22 que induzem ou aumentam a potência da morte mediada por células T CD20xCD3 de células tumorais com um ECrso de menos que cerca de 1,48x10"ºM, conforme medido em um ensaio de extermínio celular de tumor mediado por células T in vitro, por exemplo, usando o formato de ensaio conforme definido no Exemplo 8 neste documento (por exemplo, avaliando a extensão da morte de cé- lulas Raji por PBMCs humanos na presença de anticorpos anti- CD20xCD3 e anti-CD28xCD22), ou um ensaio substancialmente se- melhante. Em certas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de |i- gação ao antígeno da presente invenção induzem a extermínio de cé- lulas tumorais mediada por células T (por exemplo, extermínio media- do por PBMC de células Raji) com um valor de EC50 de menos que cerca de 150 pM, menos que cerca de 100 pM, menos do que cerca de 75 pM, menos do que cerca de 50 PM, menos do que cerca de 25 PM, menos do que cerca de 10 pM, menos do que cerca de 5,0 pM, menos do que cerca de 4,0 pM, menos do que cerca de 3,0 pM, me- nos do que cerca de 2,5 pM, menos do que cerca de 2,0 pM, ou me- nos do que cerca de 1,5 pM, conforme medido por um ensaio de ex- termínio de células tumorais mediada por células T in vitro, por exem- plo, usando o formato de ensaio conforme definido no Exemplo 8 nes- te documento, ou um ensaio substancialmente semelhante.

[00125] A presente invenção também inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas anti-CD28 / anti-CD22 que exibem uma ou mais características selecionadas a partir do grupo que consiste em: ativa- ção de células T, indução da liberação de IL-2, indução da supra- regulação de CD25 + em PBMCs humanos; e aumento da citotoxici- dade mediada por células T humanas em linhagens celulares que ex- pressam CD22 (ver, por exemplo, Exemplo 9 neste documento). À presente invenção também inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecífica anti-CD28 / anti-CD22 que aumentam a morte de células tumorais que expressam CD22 quando combinadas com um anticorpo biespecífico que se liga a CD20 e CD3, tal como, mas não limitado a, REGN1979. A presente invenção também inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecífico anti-CD28 / anti-CD22 que aumentam o ex-

termínio de células tumorais que expressam CD22 quando combina- das com um anticorpo que se liga a PD-1, tal como, mas não limitado a, cemiplimabe. (Veja os Exemplos 10-15). Mapeamento de Epítopo e Tecnologias Relacionadas

[00126] O epítopo em CD28 e / ou CD22 ao qual as moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção se ligam pode consistir em uma única sequência contígua de 3 ou mais (por exemplo, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais) aminoácidos de uma proteína CD28 ou uma CD?22. Alternativamente, o epítopo pode consistir em uma pluralidade de aminoácidos não contíguos (ou se- quências de aminoácidos) de CD28 ou CD22. Os anticorpos da inven- ção podem interagir com aminoácidos contidos em um monômero CD28, ou podem interagir com aminoácidos em duas cadeias CD28 diferentes de um dímero CD28. O termo "epítopo", conforme usado neste documento, refere-se a um determinante antigênico que interage com um sítio de ligação de antígeno específico na região variável de uma molécula de anticorpo conhecida como parátopo. Um único antí- geno pode ter mais de um epítopo. Assim, diferentes anticorpos po- dem se ligar a diferentes áreas de um antígeno e podem ter diferentes efeitos biológicos. Os epítopos podem ser conformacionais ou linea- res. Um epítopo conformacional é produzido por aminoidos espacial- mente justapostos de diferentes segmentos da cadeia polipeptídica linear. Um epítopo linear é aquele produzido por resíduos de aminoá- cidos adjacentes em uma cadeia polipeptídica. Em certas circunstân- cias, um epítopo pode incluir frações de sacarídeos, grupos fosforil ou grupos sulfonil no antígeno.

[00127] Várias técnicas conhecidas pelos versados na técnica po- dem ser usadas para determinar se um domínio de ligação ao antíge- no de um anticorpo "interage com um ou mais aminoácidos" em um polipeptídeo ou proteína. Técnicas exemplificativas que podem ser usadas para determinar um epítopo ou domínio de ligação de um anti- corpo particular ou domínio de ligação ao antígeno incluem, por exem- plo, ensaio de bloqueio cruzado de rotina, tal como o descrito em Anti- bodies, Harlow e Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY), mutagênese pontual (por exemplo, mutagênese de varredura de alanina, mutagênese de varredura de arginina, etc.), análise de man- chas de peptídeo (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248: 443-463), proteção de protease e análise de clivagem de peptídeo. Além disso, podem ser empregados métodos, tais como excisão de epítopo, extra- ção de epítopo e modificação química de antígenos (Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496). Outro método que pode ser usado para identificar os aminoácidos dentro de um polipeptídeo com o qual um anticorpo interage é a troca de hidrogênio / deutério detectada por es- pectrometria de massa. Em termos gerais, o método de troca hidrogê- nio / deutério envolve a marcação da proteína de interesse pelo deuté- rio, seguida da ligação do anticorpo à proteína marcada com deutério. Em seguida, o complexo proteína / anticorpo é transferido para água para permitir que a troca de hidrogênio-deutério ocorra em todos os resíduos, exceto para os resíduos protegidos pelo anticorpo (que per- manecem marcados com deutério). Após a dissociação do anticorpo, a proteína alvo é submetida à clivagem por protease e análise de espec- trometria de massa, revelando por meio disso os resíduos marcados com deutério que correspondem aos aminoácidos específicos com os quais o anticorpo interage. Ver, por exemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A. A análise da estrutura de cristal de raios-X também pode ser usada para identificar os aminoácidos em um polipeptídeo com o qual um anticorpo interage.

[00128] A presente invenção inclui ainda anticorpos anti-CD28 e anti-CD22 que se ligam ao mesmo epítopo como qualquer um dos an-

ticorpos exemplificativos específicos descritos neste documento (por exemplo, anticorpos compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácidos conforme estabelecido na Tabela 6 neste documento).

[00129] De acordo com certas modalidades, a presente invenção fornece anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno de anticorpos que se ligam a um epítopo em CD22 humano compreendendo um ou mais aminoácidos de SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 e / ou SEQ ID NO: 36 conforme determinado por troca de hidrogênio / deutério detec- tada por espectrometria de massa conforme estabelecido nos Exem- plos 3e 4.

[00130] Da mesma forma, a presente invenção também inclui anti- corpos anti-CD28 e / ou anti-CD22 que competem pela ligação a CD28 e / ou CD22 com qualquer um dos anticorpos exemplificativos especí- ficos descritos neste documento (por exemplo, anticorpos compreen- dendo qualquer uma das sequências de aminoácidos conforme esta- belecido em Tabela 6 neste documento).

[00131] A presente invenção também inclui moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas compreendendo um primeiro domínio de liga- ção ao antígeno que se liga especificamente a CD28 humano e um segundo fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamen- te a CD22 humano, em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno se liga ao mesmo epítopo em CD28 como qualquer um dos domínios de ligação ao antígeno específicos de CD28 exemplificativos especiífi- cos descritos neste documento e / ou em que o segundo domínio de ligação ao antígeno se liga ao mesmo epítopo em CD22 como qual- quer um dos domínios de ligação ao antígeno específicos de CD22 exemplificativos específicos descritos neste documento.

[00132] Da mesma forma, a presente invenção também inclui molé- culas de ligação ao antígeno biespecíficas compreendendo um primei- ro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD28 humano, e um segundo fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD22 humano, em que o primeiro domínio de liga- ção ao antígeno compete pela ligação a CD28 com qualquer um dos domínios de ligação ao antígeno específicos de CD28 exemplificativos específicos descritos neste documento, e / ou em que o segundo do- mínio de ligação ao antígeno compete pela ligação a CD22 com qual- quer um dos domínios de ligação ao antígeno específicos de CD22 exemplificativos específicos descritos neste documento.

[00133] Pode-se facilmente determinar se uma molécula de ligação ao antígeno particular (por exemplo, anticorpo) ou domínio de ligação ao antígeno do mesmo se liga ao mesmo epítopo ou compete pela |li- gação com uma molécula de ligação ao antígeno de referência da pre- sente invenção usando métodos de rotina conhecidos na técnica. Por exemplo, para determinar se um anticorpo de teste se liga ao mesmo epítopo em CD28 (ou CD22) como uma molécula de ligação ao antí- geno biespecífica de referência da presente invenção, a molécula bi- específica de referência é primeiro deixada se ligar a uma proteína CD28 (ou proteína CD22). Em seguida, é avaliada a capacidade de um anticorpo de teste de se ligar à molécula CD28 (ou CD22). Se o anticorpo de teste for capaz de se ligar a CD28 (ou CD22) após a liga- ção de saturação com a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de referência, pode-se concluir que o anticorpo de teste se liga a um epítopo diferente de CD28 (ou CD22) do que a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de referência. Por outro lado, se o anticorpo de teste não for capaz de se ligar à molécula CD28 (ou CD22) após a |li- gação de saturação com a molécula de ligação ao antígeno biespeciífi- ca de referência, então o anticorpo de teste pode se ligar ao mesmo epítopo de CD28 (ou CD22) como o epítopo ligado pela molécula de ligação ao antígeno biespecífica de referência da invenção. Experiên- cias de rotina adicional (por exemplo, análises de mutação e ligação de peptídeo) podem então ser realizadas para confirmar se a falta ob- servada de ligação do anticorpo de teste é de fato devido à ligação ao mesmo epítopo que a molécula de ligação ao antígeno biespecífico de referência ou se o bloqueio estérico (ou outro fenômeno) é responsá- vel pela falta de ligação observada. Experiências deste tipo podem ser realizadas usando ELISA, RIA, Biacore, citometria de fluxo ou qual- quer outro ensaio quantitativo ou qualitativo de ligação ao anticorpo disponível na técnica. De acordo com certas modalidades da presente invenção, duas proteínas de ligação ao antígeno se ligam ao mesmo epítopo (ou sobreposição) se, por exemplo, um excesso de 1, 5, 10, 20 ou 100 vezes de uma proteína de ligação ao antígeno inibe a ligação da outra em pelo menos 50%, mas de preferência 75%, 90% ou mes- mo 99%, conforme medido em um ensaio de ligação competitiva (ver, por exemplo, Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502). Alter- nativamente, duas proteínas de ligação ao antígeno são consideradas como ligando-se ao mesmo epítopo se essencialmente todas as muta- ções de aminoácidos no antígeno que reduzem ou eliminam a ligação de uma proteína de ligação ao antígeno reduzem ou eliminam a liga- ção da outra. Duas proteínas de ligação ao antígeno são consideradas como tendo "epítopos de sobreposição" se apenas um subconjunto das mutações de aminoácidos que reduzem ou eliminam a ligação de uma proteína de ligação ao antígeno reduzem ou eliminam a ligação da outra.

[00134] Para determinar se um anticorpo ou domínio de ligação ao antígeno do mesmo compete pela ligação com uma molécula de liga- ção ao antígeno de referência, a metodologia de ligação acima descri- ta é realizada em duas orientações: Em uma primeira orientação, a molécula de ligação ao antígeno de referência pode se ligar a uma proteína CD28 (ou proteína CD22) em condições de saturação segui- da pela avaliação da ligação do anticorpo de teste à molécula CD28

(ou CD22). Em uma segunda orientação, o anticorpo de teste pode se ligar a uma molécula CD28 (ou CD22) em condições de saturação, seguido pela avaliação da ligação da molécula de ligação ao antígeno de referência à molécula CD28 (ou CD22). Se, em ambas as orienta- ções, apenas a primeira (saturação) molécula de ligação ao antígeno for capaz de se ligar à molécula CD28 (ou CD22), então conclui-se que o anticorpo de teste e a molécula de ligação ao antígeno de refe- rência competem pela ligação a CD28 (ou CD22). Como será aprecia- do por um versado na técnica, um anticorpo que compete pela ligação com uma molécula de ligação ao antígeno de referência pode não ne- cessariamente se ligar ao mesmo epítopo que o anticorpo de referên- cia, mas pode bloquear estericamente a ligação do anticorpo de refe- rência por ligar um epítopo sobreposto ou adjacente.

Preparação de domínios de ligação ao antígeno e construção de moléculas biespecíficas

[00135] Os domínios de ligação ao antígeno específicos para antí- genos particulares podem ser preparados por qualquer tecnologia de geração de anticorpos conhecida na técnica. Uma vez obtidos, dois domínios de ligação ao antígeno diferentes, específicos para dois antí- genos diferentes (por exemplo, CD28 e CD22), podem ser apropria- damente arranjados um em relação ao outro para produzir uma molé- cula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção usando métodos de rotina. (Uma discussão de formatos de anticorpos biespe- cíficos exemplificativos que podem ser usados para construir as molé- culas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção é for- necida em outro lugar neste documento). Em certas modalidades, um ou mais dos componentes individuais (por exemplo, cadeias pesadas e leves) das moléculas de ligação ao antígeno multiespecíficas da in- venção são derivados de anticorpos quiméricos, humanizados ou to- talmente humanos. Os métodos para produzir tais anticorpos são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, uma ou mais das cadeias pesa- das e / ou leves das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção podem ser preparadas usando a tecnologia VELO- CIMMUNETY . Usando a tecnologia VELOCIMMUNETMY (ou qualquer outra tecnologia de geração de anticorpo humano), anticorpos quimé- ricos de alta afinidade para um antígeno particular (por exemplo, CD28 ou CD22) são inicialmente isolados tendo uma região variável humana e uma região constante de camundongo. Os anticorpos são caracteri- zados e selecionados pelas características desejáveis, incluindo afini- dade, seletividade, epítopo, etc. As regiões constantes de camundon- go são substituídas por uma região constante humana desejada para gerar cadeias pesadas e / ou leves totalmente humanas que podem ser incorporadas nas moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção.

[00136] Animais geneticamente modificados podem ser usados pa- ra produzir moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas humanas. Por exemplo, um camundongo geneticamente modificado pode ser usado que é incapaz de reorganizar e expressar uma sequência variá- vel de cadeia leve de imunoglobulina de camundongo endógena, em que o camundongo expressa apenas um ou dois domínios variáveis de cadeia leve humana codificados por sequências de imunoglobulina humana operacionalmente ligadas ao gene constante kappa de ca- mundongo no locus kappa de camundongo endógeno. Tais camun- dongos geneticamente modificados podem ser usados para produzir moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas totalmente humanas compreendendo duas cadeias pesadas diferentes que se associam a uma cadeia leve idêntica que compreende um domínio variável deriva- do de um de dois segmentos genéticos de região variável da cadeia leve humana diferentes. (Ver, por exemplo, US 2011/0195454, todo o conteúdo do qual é incorporado por referência neste documento, para uma discussão detalhada de tais camundongos modificados e seu uso para produzir moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas). Bioequivalentes

[00137] A presente invenção abrange moléculas de ligação ao antí- geno tendo sequências de aminoácidos que variam daquelas dos anti- corpos descritos, mas que retêm a capacidade de se ligar a CD28 e / ou CD22. Essas moléculas variantes podem compreender uma ou mais adições, deleções ou substituições de aminoácidos quando com- paradas com a sequência parental, mas exibem atividade biológica que é essencialmente equivalente à das moléculas de ligação ao antí- geno biespecíficas descritas. Da mesma forma, as moléculas de liga- ção ao antígeno que codificam as sequências de DNA da presente in- venção abrangem sequências que compreendem uma ou mais adi- ções, deleções ou substituições de nucleotídeos quando comparadas com a sequência divulgada, mas que codificam uma molécula de liga- ção ao antígeno que é essencialmente bioequivalente às moléculas de ligação ao antígeno descritas da invenção. Exemplos de tais aminoá- cidos variantes e sequências de DNA são discutidos acima.

[00138] A presente invenção inclui moléculas de ligação ao antíge- no que são bioequivalentes a qualquer uma das moléculas de ligação ao antígeno exemplificativas estabelecidas neste documento. Duas proteínas de ligação ao antígeno, ou anticorpos, são consideradas bi- oequivalentes se, por exemplo, forem equivalentes farmacêuticos ou alternativas farmacêuticas cuja taxa e extensão de absorção não mos- tram uma diferença significativa quando administradas na mesma dose molar em condições experimentais semelhantes, tanto dose única quanto doses múltiplas. Alguns anticorpos serão considerados equiva- lentes ou alternativas farmacêuticas se forem equivalentes na exten- são da sua absorção, mas não na sua taxa de absorção e ainda pude- rem ser considerados bioequivalentes porque tais diferenças na taxa de absorção são intencionais e são refletidas na rotulagem, não são essenciais para a obtenção de concentrações efetivas de fármaco no corpo, por exemplo, no uso crônico e são consideradas clinicamente insignificantes para o produto de fármaco estudado.

[00139] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação ao antíge- no são bioequivalentes se não houver diferenças clinicamente signifi- cativas em sua segurança, pureza e potência.

[00140] Em uma modalidade, duas proteínas de ligao ao antigio são bioequivalentes se um paciente puder ser comutado uma ou mais ve- zes entre o produto de referência e o produto biológico sem um au- mento esperado no risco de efeitos adversos, incluindo uma alteração clinicamente significativa na imunogenicidade ou eficácia diminuída, em comparação com a continuação da terapêutica sem essa mudan- ça.

[00141] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação ao antíge- no são bioequivalentes se ambas atuam por um mecanismo ou meca- nismos de ação comuns para a condição ou condições de uso, na me- dida em que tais mecanismos sejam conhecidos.

[00142] —Bioequivalência pode ser demonstrada por métodos in vivo e in vitro. Medidas de bioequivalência incluem, por exemplo, (a) testes in vivo em humanos ou outros mamíferos nos quais a concentração do anticorpo ou de seus metabólitos é medida em sangue, plasma, soro ou outro fluido biológico em função do tempo; (b) um teste in vivo que foi correlacionado com e é razoavelmente preditivo de dados de bio- disponibilidade in vivo humanos; (c) um teste in vivo em humanos ou outros mamíferos nos quais o efeito farmacológico agudo apropriado do anticorpo (ou de seu alvo) é medido em função do tempo; e (d) em um experimento clínico bem controlado que estabece segurança, efi- cácia ou biodisponibilidade ou bioequivalência de um anticorpo.

[00143] Variantes bioequivalentes das moléculas de ligação ao an-

tígeno biespecíficas exemplificativas estabelecidas neste documento podem ser construídas, por exemplo, fazendo várias substituições de resíduos ou sequências ou deletando resíduos ou sequências termi- nais ou internos não necessários para a atividade biológica. Por exemplo, resíduos de cisteína não essenciais para a atividade biológi- ca podem ser deletados ou substituídos por outros aminoácidos para prevenir a formação de ligações de dissulfeto intramoleculares desne- cessárias ou incorretas após renaturação. Em outros contextos, anti- corpos bioequivalentes podem incluir as moléculas de ligação ao antí- geno biespecíficas exemplificativas apresentadas neste documento, compreendendo alterações de aminoácidos que modificam as caracte- rísticas de glicosilação das moléculas, por exemplo, mutações que eliminam ou removem a glicosilação. Seletividade de Espécies e Reatividade Cruzada de Espécies

[00144] A presente invenção, de acordo com certas modalidades, fornece moléculas de ligação ao antígeno que se ligam ao CD28 hu- mano, mas não ao CD28 de outras espécies. A presente invenção também fornece moléculas de ligação ao antígeno que se ligam ao CD22 humano, mas não ao CD22? de outras espécies. A presente in- venção também inclui moléculas de ligação ao antígeno que se ligam ao CD28 humano e ao CD28 de uma ou mais espécies não humanas; e / ou moléculas de ligação ao antígeno que se ligam ao CD22 huma- no e ao CD22 de uma ou mais espécies não humanas.

[00145] De acordo com certas modalidades exemplificativas da in- venção, são fornecidas moléculas de ligação ao antígeno que se ligam a CD28 humano e / ou CD22 humano e podem se ligar ou não, con- forme seja o caso, a um ou mais de CD28 e / ou CD22 de camundon- go, rato, porquinho-da-índia, hamster, gerbo, porco, gato, cão, coelho, cabra, ovelha, vaca, cavalo, camelo, cinimolgo, sagúi, reso ou chim- panzé. Por exemplo, em uma modalidade exemplificativa particular da presente invenção, moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas são fornecidas compreendendo um primeiro domínio de ligação ao antíge- no que se liga a CD28 humano e cinomolgo CD28, e um segundo do- mínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD22 hu- mano. Imunoconjugados

[00146] A presente invenção abrange moléculas de ligação ao antí- geno conjugadas a uma fração terapêutica ("imunoconjugado"), como uma citotoxina, um fármaco quimioterapêutico, um imunossupressor ou um radioisótopo. Os agentes citotóxicos incluem qualquer agente que seja prejudicial às células. Exemplos de agentes citotóxicos e agentes quimioterapêuticos adequados para formar imunoconjugados são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, WO 05/103081, cujo conteúdo completo é incorporado neste documento por referência). Formulação e Administração Terapêutica

[00147] A presente invenção fornece composições farmacêuticas compreendendo as moléculas de ligação ao antígeno da presente in- venção. As composições farmacêuticas da invenção são formuladas com veículos, excipientes e outros agentes adequados que proporcio- nam uma melhor transferência, distribuição, tolerância e semelhantes. Inúmeras formulações apropriadas podem ser encontradas no formulá- rio conhecido por toda a química farmacêuticos: Remington's Pharma- ceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas for- mulações incluem, por exemplo, pós, pastas, pomadas, geleias, ceras, óleos, lipídeos, vesículas contendo lipídeo (catiônicos ou aniônicos) (como LIPOFECTINTY, Life Technologies, Carlsbad, CA), conjugados de DNA, pastas de absorção anidras, emulsões óleo em água e água em óleo, emulsões carbowax (polietilenoglicóis de vários pesos mole- culares), géis semissólidos e misturas semissólidas contendo car- bowax. Ver também Powell et al. "Compendium of excipients for paren-

teral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.

[00148] A dose da molécula de ligação ao antígeno administrada a um paciente pode variar dependendo da idade e do tamanho do paci- ente, doença alvo, condições, via de administração e semelhantes. À dose preferida é tipicamente calculada de acordo com o peso corporal ou área de superfície corporal. Quando uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presente invenção é usada para fins terapêu- ticos em um paciente adulto, pode ser vantajoso administrar por via intravenosa a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da presen- te invenção normalmente em uma dose única de cerca de 0,01 a cerca de 20 mg / kg de peso corporal, mais preferencialmente cerca de 0,02 a cerca de 7, cerca de 0,03 a cerca de 5, ou cerca de 0,05 a cerca de 3 mg / kg de peso corporal. Dependendo da gravidade da condição, a frequência e a duração do tratamento podem ser ajustadas. As dosa- gens eficazes e programações para a administração de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica podem ser determinados empiri- camente; por exemplo, o progresso do paciente pode ser monitorado por avaliação periódica e a dose ajustada em conformidade. Além dis- so, o escalonamento interespécies de dosagens pode ser realizado usando métodos bem conhecidos na técnica (por exemplo, Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351).

[00149] Vários sistemas de distribuição são conhecidos e podem ser usados para administrar a composição farmacêutica da invenção, por exemplo, encapsulação em lipossomas, micropartículas, microcáp- sulas, células recombinantes capazes de expressar os vírus mutantes, endocitose mediada por receptor (ver, por exemplo, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Os métodos de introdução incluem, mas não se limitam a, vias intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, in- travenosa, subcutânea, intranasal, epidural e oral. A composição pode ser administrada por qualquer via conveniente, por exemplo, por infu-

são ou injeção de bolo, por absorção através de revestimentos epiteli- ais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, mucosa retal e intes- tinal, etc.) e pode ser administrada junto com outros agentes biologi- camente ativos. A administração pode ser sistêmica ou local.

[00150] Uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada subcutânea ou intravenosamente com uma agulha e seringa padrões. Além disso, no que diz respeito a administração sub- cutânea, um dispositivo de administração tipo caneta tem prontamente aplicações na administração de uma composição farmacêutica da pre- sente invenção. Esse dispositivo de administração tipo caneta pode ser reutilizável ou descartável. Um dispositivo de administração tipo caneta reutilizável geralmente utiliza um cartucho substituível que con- tém uma composição farmacêutica. Uma vez que toda a composição farmacêutica dentro do cartucho foi administrada e o cartucho é vazio, o cartucho vazio pode ser prontamente descartado e substituído por um novo cartucho que contém a composição farmacêutica. O dispositi- vo de administração tipo caneta pode então ser reutilizado. Em um dispositivo de administração tipo caneta descartável, não há cartucho substituível. Pelo contrário, o dispositivo de administração tipo caneta descartável vem pré-carregado com a composição farmacêutica man- tida em um reservatório dentro do dispositivo. Uma vez que o reserva- tório é esvaziado da composição farmacêutica, todo o dispositivo é descartado.

[00151] Inúmeros dispositivos de administração e autoinjetor tipo caneta reutilizáveis têm aplicações na administração subcutânea de uma composição farmacêutica da presente invenção. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a AUTOPENTY (Owen Mumford, Inc., Woodstock, Reino Unido), caneta DISETRONICTY (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Suíça), caneta HUMALOG MIX 75/25'Y, caneta HUMALOG"Y, caneta HUMALIN 70/307Y (Eli Lilly and Co., Indianapo-

T4/174 lis, IN), NOVOPENTY |, Il e Ill (Novo Nordisk, Copenhagen, Dinamar- ca), NOVOPEN JUNIOR'Y (Novo Nordisk, Copenhagen, Dinamarca), caneta BD'Y (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPENTY, OP- TIPEN PROTY, OPTIPEN STARLET'!Y e OPTICLIK'Y (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Alemanha), para citar apenas alguns. Exemplos de disposi- tivos de administração tipo caneta descartáveis tendo aplicações na distribuição subcutânea de uma composição farmacêutica da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, caneta SOLOSTARTY (sanofi-aventis), a FLEXPENTY (Novo Nordisk) e a KWIKPENTY (Eli Lilly), o Autoinjector SURECLICKTY (Amgen, Thousand Oaks, CA), o PENLET'Y (Haselmeier, Stuttgart, Alemanha), o EPIPEN (Dey, LP) e o HUMIRATY Pen (Abbott Labs, Abbott Park IL), para citar apenas al- guns.

[00152] Em certas situações, a composição farmacêutica pode ser administrada em um sistema de liberação controlada. Em uma modali- dade, uma bomba pode ser usada (ver Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). Em outra modalidade, materiais poliméricos podem ser usados; ver, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Flóri- da. Ainda em outra modalidade, um sistema de liberação controlada pode ser colocado na proximidade do alvo da composição, exigindo assim apenas uma fração da dose sistêmica (ver, por exemplo, Good- son, 1984, em Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138). Outros sistemas de liberação controlada são discuti- dos na revisão por Langer, 1990, Science 249:1527-1533.

[00153] As preparações injetáveis podem incluir formas de dosa- gem para injeções intravenosas, subcutâneas, intracutâneas e intra- musculares, infusões gota a gota, etc. Estas preparações injetáveis podem ser preparadas por métodos publicamente conhecidos. Por exemplo, as preparações injetáveis podem ser preparadas, por exem-

plo, por dissolução, suspensão ou emulsificação do anticorpo ou seu sal descrito acima em um meio aquoso estéril ou um meio oleoso con- vencionalmente usado para injeções. Como meio aquoso para inje- ções, existem, por exemplo, salina fisiológica, uma solução isotônica contendo glicose e outros agentes auxiliares, etc., que podem ser usa- dos em combinação com um agente solubilizante apropriado, tais co- mo um álcool (por exemplo, etanol), um poliálcool (por exemplo, propi- leno glicol, polietileno glicol), um tensoativo não iônico [por exemplo, polissorbato 80, HCO-50 (aduto de polioxietileno (50 mol) de óleo de rícino hidrogenado)], etc. Como meio oleoso, são empregados, por exemplo, óleo de gergelim, óleo de soja, etc., que podem ser usados em combinação com um agente solubilizante, tal como benzoato de benzil, álcool benzílico, etc. A injeção assim preparada é preferivel- mente preenchida em uma ampola apropriada.

[00154] Vantajosamente, as composições farmacêuticas para uso oral ou parenteral descritas anteriormente são preparadas em formas de dosagem em uma dose unitária adequada para ajustar uma dose dos ingredientes ativos. Essas formas de dosagem em uma dose uni- tária incluem, por exemplo, comprimidos, pílulas, cápsulas, injeções (ampolas), supositórios, etc. A quantidade do anticorpo supracitado contido é geralmente cerca de 5 a cerca de 500 mg por forma de do- sagem em uma dose unitária; especialmente na forma de injeção, é preferido que o anticorpo acima mencionado esteja contido em cerca de 5 a cerca de 100 mg e em cerca de 10 a cerca de 250 mg para as outras formas de dosagem. Usos Terapêuticos das Mmoléculas de Ligação ao Antígeno

[00155] A presente invenção inclui métodos que compreendem a administração a um indivíduo em necessidade de uma composição terapêutica compreendendo um anticorpo anti-CD28 ou uma molécula de ligação ao antígeno biespecífico que se liga especificamente a

CD28 e um antígeno alvo (por exemplo, CD22). A composição tera- pêutica pode compreender qualquer um dos anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas conforme divulgado neste docu- mento e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Como usada neste documento, a expressão "um indivíduo em necessidade" significa um animal humano ou não humano que exibe um ou mais sin- tomas ou indícios de câncer (por exemplo, um indivíduo que expressa um tumor ou sofre de qualquer um dos cânceres mencionados abaixo neste documento), ou que de outra forma se beneficiariam de uma ini- bição ou redução na atividade de CD22 ou uma depleção de células CD22 +.

[00156] Os anticorpos e moléculas de ligação ao antígeno biespecí- ficas da invenção (e composições terapêuticas compreendendo os mesmos) são úteis, inter alia, para o tratamento de qualquer doença ou distúrbio em que a estimulação, ativação e / ou alvejamento de uma resposta imune seria benéfica. Em particular, as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas anti-CD28/anti-CD22 da presente invenção podem ser usadas para o tratamento, prevenção e / ou melhoria de qualquer doença ou distúrbio associados ou mediados pela expressão ou atividade de CD22 ou proliferação de células CD22+. O mecanismo de ação pelo qual os métodos terapêuticos da invenção são alcança- dos inclui o extermínio das células que expressam CD22 na presença de células efetoras, por exemplo, células T. As células que expressam CD22 que podem ser inibidas ou exterminadas usando as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção incluem, por exem- plo, células B cancerígenas.

[00157] As moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção podem ser usadas para tratar, por exemplo, tumores primários e / ou metastáticos que surgem no sangue, medula óssea, nódulos linfáticos (por exemplo, timo, baço), câncer de colon, fígado, pulmão, mama,

TTINTA renal, sistema nervoso central e câncer de bexiga. De acordo com cer- tas modalidades exemplificativas, as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção são usadas para tratar um distúr- bio proliferativo de células B.

[00158] A presente invenção também inclui métodos para o trata- mento de câncer residual em um indivíduo. Conforme usado neste do- cumento, o termo "câncer residual" significa a existência ou persistên- cia de uma ou mais células cancerígenas em um indivíduo após o tra- tamento com uma terapia anticâncer.

[00159] De acordo com certos aspectos, a presente invenção forne- ce métodos para o tratamento de uma doença ou distúrbio associado à expressão de CD22 (por exemplo, um distúrbio proliferativo de células B) compreendendo a administração de uma ou mais das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas descritas em outro lugar neste do- cumento a um indivíduo após o indivíduo demonstrar não ser respon- sivo a outros tipos de terapias anticâncer. Por exemplo, a presente in- venção inclui métodos para o tratamento de um distúrbio proliferativo de células B compreendendo a administração de uma molécula de li- gação ao antígeno biespecífico anti-CD28 / anti-CD22 a um paciente 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 1 semana, 2 semanas, 3 se- manas ou 4 semanas, 2 meses, 4 meses, 6 meses, 8 meses, | ano ou mais após o indivíduo ter recebido o tratamento padrão para pacientes que sofrem de câncer, por exemplo, um distúrbio proliferativo de célula B. Em outros aspectos, uma molécula de ligação ao antígeno biespecií- fica da invenção (uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-CD28 / anti-CD22) compreendendo um domínio Fc de IgG4 é ini- cialmente administrada a um indivíduo em um ou mais pontos de tem- po (por exemplo, para fornecer esgotamento inicial de células de cân- cer de próstata), seguido pela administração de uma molécula de liga- ção ao antígeno biespecífica equivalente compreendendo um domínio

IgG diferente, como um domínio Fc de IgG1, em pontos de tempo sub- sequentes. Prevê-se que os anticorpos anti-CD28 / anti-CD22 da in- venção podem ser usados em combinação com outras moléculas de ligação ao antígeno biespecífica, tal como com um anticorpo biespecí- fico anti-CD20 / anti-CD3. Também se prevê que os anticorpos biespe- cíficos da invenção serão usados em combinação com inibidores de ponto de verificação, por exemplo, aqueles que alvejam PD-1 e CTLA- 4, e outros alvos. Pode ser vantajoso combinar dois anticorpos biespe- cíficos que alvejam o mesmo antígeno tumoral (por exemplo, CD22), mas com um dos biespecíficos alvejando o CD3 nas células T e o ou- tro biespecífico alvejando uma molécula coestimulatória como o CD28. Esta combinação pode ser usada sozinha para aumentar o extermínio de células tumorais ou pode ser usada em combinação com um inibi- dor de ponto de verificação. Terapias e Formulações de Combinação

[00160] A presente invenção inclui composições e formulações te- rapêuticas compreendendo qualquer um dos anticorpos exemplares e moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas descritas neste docu- mento em combinação com um ou mais componentes terapeuticamen- te ativos adicionais e métodos de tratamento compreendendo a admi- nistração de tais combinações a indivíduos em necessidade dos mes- mos.

[00161] Agentes terapêuticos adicionais exemplificativos que po- dem ser combinados ou administrados em combinação com uma mo- lécula de ligação ao antígeno da presente invenção incluem, por exemplo, quimioterapia, radioterapia, inibidores de ponto de verifica- ção que alvejam PD-1 (por exemplo, um anticorpo anti-PD-1 tais como pembrolizumabe, nivolumabe ou cemiplimabe, ver US 9.987.500, HCVR / LCVR de SEQ ID NOs 162/170), CTLA-4, LAG3, TIM3 e ou- tros, anticorpos bivalentes agonistas coestimulatórios que visam molé-

culas como GITR, OX40, 4 -1BB, e outros, anticorpos biespecíficos CD3x (Ver, por exemplo, US9,657,102 (REGN1979), WO2017 / 053856A1, WO2014 / 047231A1, WO2018 / 067331A1 e WO2018 / 058001A1), outros anticorpos que alvejam CD22 X CD3, CD22 X CD28, ou que alvejam CD20 X CD3 e outros anticorpos biespecíficos coestimulatórios CD28x.

[00162] Outros agentes que podem ser administrados de forma be- néfica em combinação com anticorpos da invenção incluem, por exemplo, tamoxifeno, inibidores de aromatase e inibidores de citoci- nas, incluindo inibidores de citocinas de pequenas moléculas e anti- corpos que se ligam a citocinas, como IL-1, IL-2, IL -3, IL-4, IL-5, IL-6, I1L-8, IL-9, IL-11, 11-12, I1L-13, I1L-17, 11-18 ou seus respectivos recepto- res. As composições farmacêuticas da presente invenção (por exem- plo, composições farmacêuticas compreendendo uma molécula de |i- gação ao antígeno biespecífica anti-CD28 / anti-CD22 conforme divul- gado neste documento) também podem ser administradas como parte de um regime terapêutico compreendendo uma ou mais combinações terapêuticas selecionadas de "ICE *": ifosfamida (por exemplo, Ifex€), carboplatina (por exemplo, Paraplatin&), etoposídeo (por exemplo, EtopophosO, ToposarO, VePesidO, VP-16); "DHAP": dexametasona (por exemplo, DecadronO), citarabina (por exemplo, Cytosar-UG, cito- sina arabinósido, ara-C), cisplatina (por exemplo, Platinol&-AQ); e "ESHAP": etoposídeo (por exemplo, Etopophos&, ToposarO, VePe- sidO&, VP-16), metilprednisolona (por exemplo, MedrolO), citarabina em alta dose, cisplatina (por exemplo, PlatinolO&-AQ).

[00163] A presente invenção também inclui combinações terapêuti- cas compreendendo qualquer uma das moléculas de ligação ao antí- geno mencionadas neste documento e um inibidor de um ou mais de VEGF, Ang2, DLL4, EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EGFRvIIIl, cMet, IGF1 R, B-raf, PDGFR-o, PDGFR-I3, FOLH1, PRLR, STEAP1, STE-

AP2, TMPRSS2, MSLN, CAS9, uroplakin, ou qualquer uma das citoci- nas acima mencionadas, em que o inibidor é um aptâmero, uma molé- cula antissentido, uma ribozima, um siRNA, um pepticorpo, um nano- corpo ou um fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmento Fab; fra- gmento F(ab'), ; fragmento Fd; fragmento Fv; scFv; fragmento dAb; ou outras moléculas projetadas, como diacorpos, triacorpos, tetracorpos, minicorpos e unidades de reconhecimento mínimo). As moléculas de ligação ao antígeno da invenção também podem ser administradas e / ou coformuladas em combinação com antivirais, antibióticos, analgési- cos, corticosteróides e / ou NSAIDs. As moléculas de ligação ao antí- geno da invenção também podem ser administradas como parte de um regime de tratamento que também inclui tratamento com radiação e / ou quimioterapia convencional, ou tratamento com um produto bio- lógico, incluindo inibidores de ponto de verificação ou outros anticor- pos biespecíficos.

[00164] A presente invenção inclui composições e formulações te- rapêuticas compreendendo qualquer uma das moléculas de ligação ao antígeno descritas neste documento em combinação com um ou mais agentes quimioterápicos. Exemplos de agentes quimioterapêuticos in- cluem agentes alquilantes, tais como tiotepa e ciclosfosfamida (Cyto- xan T“); sulfonatos de alquil, tais como busulfan, improsulfan e piposul- fan; aziridinas, tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e ure- dopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietileno- melamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolome- lamina; mostardas de nitrogênio tais como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, pred- nimustina, trofosfamida, mostarda de uracila; nitrosureias, tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimus- tina; antibióticos, tais como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina,

azasserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubi- cina, detorrubicina, lorrubicina, 6-diazo-5-0x0-oxicina, luborrubicina- eubicinolubicina-eubicinolubicina-eubicina-S-eubicinorubicina-5- eubicina-doubicina-do-eubicinorubicina-5-eubicina-do-eubicina-S- eubicinorubicina, 6-diazoubicina-eubicina-do-eubicina, 6-diazoubicina- eubicina-do-eubicina. , marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenóli- co, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidi- na, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabólitos, tais como me- totrexato e 5-fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico, tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de puri- na, tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuri- dina; andrógenos, tais como calusterona, propionato de dromostanolo- na, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenais, tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reforçador de ácido fólico, como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo aldofosfamida; ácido aminolevu- línico; amsacrina; bestrabucil; bisantrene; edatraxato; defofamina; de- mecolcine; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; etoglucida; ni- trato de gálio; hidroxiureia; lentinan; lonidamina; mitoguazona; mito- xantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenameto; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etil-hidrazida; procarbazina; PSKTY; razoxano; si- zofiran; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2"- triclo- rotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobro- nitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclo- fosfamida; tiotepa; taxanos, por exemplo , paclitaxel (Taxol Tv“, Bristol- Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) e docetaxel (Taxotere T“; Aventis Antony, França); clorambucil; gencitabina; 6-tioguanina; mer-

captopurina; metotrexato; análogos de platina, tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposido (VP-16); ifosfamida; mito- micina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; umbigo; novantrona; teniposida; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinóico; esperamicinas; capecitabina; e sais, ácidos ou deriva- dos farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos anteriores. Também incluídos nesta definição estão os agentes anti-hormonais que atuam para regular ou inibir a ação hormonal em cânceres, como anti-estrogênios, incluindo por exemplo tamoxifeno, raloxifeno, inibido- res da aromatase 4(5)-imidazóis, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxi- feno, LY117018, onapristona e toremifeno (Fareston); e antiandrogê- nios, tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida e gose- relina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos anteriores.

[00165] O(s) componente(s) terapeuticamente ativo(s) adiciona(is) pode(m) ser administrado(s) imediatamente antes, simultaneamente ou logo após a administração de uma molécula de ligação ao antígeno da presente invenção; (para os fins da presente divulgação, tais regi- mes de administração são considerados a administração de uma mo- lécula de ligação ao antígeno "em combinação com" um componente terapeuticamente ativo adicional).

[00166] A presente invenção inclui composições farmacêuticas nas quais uma molécula de ligação ao antígeno da presente invenção é coformulada com um ou mais dos componentes terapeuticamente ati- vos adicionais conforme descrito em outro lugar neste documento. Regimes de Administração

[00167] De acordo com certas modalidades da presente invenção, doses múltiplas de uma molécula de ligação ao antígeno (por exemplo, um anticorpo anti-CD28 ou uma molécula de ligação ao antígeno bies-

pecífica que liga especificamente CD22 e CD28) podem ser adminis- tradas a um indivíduo por um curso de tempo definido. Os métodos de acordo com este aspecto da invenção compreendem a administração sequencial a um indivíduo em necessidade de doses múltiplas de uma molécula de ligação ao antígeno da invenção. Conforme usado neste documento, "administração sequencial" significa que cada dose de uma molécula de ligação ao antígeno é administrada ao indivíduo em um ponto diferente no tempo, por exemplo, em dias diferentes separa- dos por um intervalo predeterminado (por exemplo, horas, dias, sema- nas ou meses). A presente invenção inclui métodos que compreendem a administração sequencial ao paciente de uma única dose inicial de uma molécula de ligação ao antígeno, seguida por uma ou mais doses secundárias da molécula de ligação ao antígeno e, opcionalmente, se- guida por uma ou mais doses terciárias da molécula de ligação ao an- tígeno.

[00168] As expressões "dose inicial", "doses secundárias" e "doses terciárias" referem-se à sequência temporal de administração da molé- cula de ligação ao antígeno da invenção. Assim, a "dose inicia" é a dose que é administrada no início do regime de tratamento (também referida como a "dose de linha de base"); as "doses secundárias" são as doses administradas após a dose inicial; e as "doses terciárias" são as doses administradas após as doses secundárias. As doses inicial, secundária e terciária podem conter a mesma quantidade da molécula de ligação ao antígeno, mas geralmente podem diferir umas das ou- tras em termos de frequência de administração. Em certas modalida- des, no entanto, a quantidade de uma molécula de ligação ao antígeno contida nas doses inicial, secundária e / ou terciária varia uma da outra (por exemplo, ajustada para cima ou para baixo conforme apropriado) durante o curso do tratamento. Em certas modalidades, duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 4 ou 5) doses são administradas no início do regi-

me de tratamento como "doses de carga" seguidas por doses subse- quentes que são administradas em uma base menos frequente (por exemplo, "doses de manutenção").

[00169] Em uma modalidade exemplificativa da presente invenção, cada dose secundária e / ou terciária é administrada 1 a 26 (por exemplo, 1, 17, 2, 2/2, 3, 312, 4, 4/2, 5, 572, 6, 672, 7, 772, 8, 872, 9, 9%, 10, 10%, 11, 11%, 12, 12%, 13, 13%, 14, 14%, 15, 15%, 16, 16%, 17, 17%, 18, 187, 19, 19%, 20, 20%, 21, 21%, 22, 22%, 23, 232, 24, 24%, 25, 2572, 26, 267 ou mais) semanas após a dose imediatamente ante- rior. A frase "a dose imediatamente anterior", conforme usada neste documento, significa, em uma sequência de administrações múltiplas, a dose da molécula de ligação ao antígeno que é administrada a um paciente antes da administração da dose seguinte na sequência sem doses de intervenção.

[00170] Os métodos de acordo com este aspecto da invenção po- dem compreender administrar a um paciente qualquer número de do- ses secundárias e / ou terciárias de uma molécula de ligação ao antí- geno (por exemplo, um anticorpo anti-CD28 ou uma molécula de liga- ção ao antígeno biespecífica que liga especificamente CD22 e CD28). Por exemplo, em certas modalidades, apenas uma única dose secun- dária é administrada ao paciente. Em outras modalidades, duas ou mais doses secundárias (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais) são administradas ao paciente. Da mesma forma, em certas modalidades, apenas uma única dose terciária é administrada ao paciente. Em ou- tras modalidades, duas ou mais doses (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8 ou mais) terciárias são administradas ao paciente.

[00171] Em modalidades que envolvem múltiplas doses secundá- rias, cada dose secundária pode ser administrada na mesma frequên- cia que as outras doses secundárias. Por exemplo, cada dose secun- dária pode ser administrada ao paciente 1 a 2 semanas após a dose imediatamente anterior. Do mesmo modo, em modalidades que envol- vem múltiplas doses terciárias, cada dose terciária pode ser adminis- trada na mesma frequência que as outras doses terciárias. Por exem- plo, cada dose terciária pode ser administrada ao paciente 2 a 4 se- manas após a dose imediatamente anterior. Alternativamente, a fre- quência na qual as doses secundárias e / ou terciárias são administra- das a um paciente pode variar ao longo do regime de tratamento. À frequência de administração também pode ser ajustada durante o cur- so do tratamento por um médico, dependendo das necessidades do paciente individual após o exame clínico.

[00172] Em uma modalidade, a molécula de ligação ao antígeno (por exemplo, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que se liga especificamente a CD22 e CD28) é administrada a um indiví- duo como uma dose com base no peso. Uma "dose com base no pe- so" (por exemplo, uma dose em mg / kg) é uma dose do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou da molécula de |li- gação ao antígeno biespecífica que mudará dependendo do peso do indivíduo.

[00173] Em outramodalidade, um anticorpo ou o fragmento de liga- ção ao antígeno do mesmo ou uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica é administrado a um indivíduo como uma dose fixa. Uma "dose fixa" (por exemplo, uma dose em mg) significa que uma dose do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou a mo- lécula de ligação ao antígeno biespecífica é usada para todos os indi- víduos, independentemente de quaisquer fatores específicos relacio- nados ao indivíduo, tal como peso. Em uma modalidade particular, uma dose fixa de um anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção é com base em um peso ou idade predeterminado.

[00174] Em geral, uma dose adequada da molécula de ligação ao antígeno da invenção pode estar na faixa de cerca de 0,001 a cerca de 200,0 miligramas por quilograma de peso corporal do receptor, geral- mente na faixa de cerca de 1 a 50 mg por quilograma de peso corpo- ral. Por exemplo, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou a molécula de ligação ao antígeno biespecífica podem ser administrados em cerca de 0,1 mg / kg, cerca de 0,2 mg / kg, cerca de 0,5 mg / kg, cerca de 1 mg / kg, cerca de 1,5 mg / kg, cerca de 2 mg / kg, cerca de 3 mg / kg, cerca de 5 mg / kg, cerca de 10 mg / kg, cerca de 15 mg / kg, cerca de 20 mg / kg, cerca de 25 mg / kg, cerca de 30 mg / kg, cerca de 40 mg / kg, cerca de 50 mg / kg por dose única. Va- lores e faixas intermediárias aos valores citados também se destinam a fazer parte desta invenção.

[00175] Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antí- geno da invenção é administrada como uma dose fixa entre cerca de mg a cerca de 2.500 mg. Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno da invenção é administrada como uma dose fixa de cerca de 25 mg, cerca de 30 mg, cerca de 50 mg, cerca de 75 mg, cerca de 100 mg, cerca de 125 mg, cerca de 150 mg, cerca de 175 mg, 200 mg, cerca de 225 mg, cerca de 250 mg, cerca de 275 mg, cerca de 300 mg, cerca de 325 mg, cerca de 350 mg, cerca de 375 mg, cerca de 400 mg, cerca de 425 mg, cerca de 450 mg, cerca de 475 mg, cerca de 500 mg, cerca de 525 mg, cerca de 550 mg, cerca de 575 mg, cerca de 600 mg, cerca de 625 mg, cerca de 650 mg, cer- ca de 675 mg, cerca de 700 mg, cerca de 725 mg, cerca de 750 mg, cerca de 775 mg, cerca de 800 mg, cerca de 825 mg, cerca de 850 mg, cerca de 875 mg, cerca de 900 mg, cerca de 925 mg, cerca de 950 mg, cerca de 975 mg, cerca de 1.000 mg, cerca de 1.500 mg, cer- ca de 2.000 mg ou cerca de 2.500 mg. Valores e faixas intermediárias aos valores citados também se destinam a fazer parte desta invenção.

Usos Diagnósticos dos Anticorpos

[00176] Os anticorpos biespecíficos da presente invenção também podem ser usados para detectar e / ou medir CD28 ou CD22, ou célu- las que expressam CD28 ou CD22 em uma amostra, por exemplo, pa- ra fins de diagnóstico. Por exemplo, um anticorpo anti-CD28 x anti- CD22, ou fragmento do mesmo, pode ser usado para diagnosticar uma condição ou doença caracterizada por expressão aberrante (por exemplo, superexpressão, subexpressão, falta de expressão, etc.) de CD28 ou CD22. Ensaios diagnósticos exemplificativos para CD28 ou CD22 podem compreender, por exemplo, o contato de uma amostra, obtida de um paciente, com um anticorpo da invenção, em que o anti- corpo é marcado com um marcador detectável ou molécula repórter. Alternativamente, um anticorpo não marcado pode ser usado em apli- cações de diagnóstico em combinação com um anticorpo secundário que é ele próprio marcado de forma detectável. O marcador detectável ou molécula repórter pode ser um radioisótopo, como ?H, *1ºC, 32P, *S, ou 1?5I; uma porção fluorescente ou quimioluminescente, tal como iso- tiocianato de fluoresceína ou rodamina; ou uma enzima como fosfa- tase alcalina, beta-galactosidase, peroxidase de rábano ou luciferase. Ensaios exemplificativos específicos que podem ser usados para de- tectar ou medir CD28 ou CD22 em uma amostra incluem ensaio imu- noabsorvente ligado à enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA) e clas- sificação de células ativadas por fluorescência (FACS). As amostras que podem ser usadas em ensaios de diagnóstico de CD28 ou CD22 de acordo com a presente invenção incluem qualquer tecido ou amos- tra de fluido obtida de um paciente que contém quantidades detectá- veis de proteína CD28 ou CD22, ou fragmentos da mesma, em condi- ções normais ou patológicas. Geralmente, os níveis de CD28 ou CD22 em uma amostra particular obtida de um paciente saudável (por exemplo, um paciente não afetado por uma doença ou condição asso-

ciada a níveis ou atividade anormais de CD28 ou CD22) serão medi- dos para estabelecer inicialmente um nível de linha de base ou padrão de CD28 ou CD22. Este nível de linha de base de CD28 ou CD22 po- de então ser comparado com os níveis de CD28 ou CD22 medidos em amostras obtidas de indivíduos com suspeita de ter uma doença ou condição relacionada a CD28 ou CD22.

EXEMPLOS

[00177] Os seguintes exemplos são apresentados de modo a forne- cer aos versados na técnica uma divulgação e descrição completas de como preparar e usar os métodos e composições da invenção e não se destinam a limitar o escopo do que os inventores consideram como sua invenção. Esforços têm sido feitos para garantir a precisão com relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), mas alguns erros e desvios experimentais devem ser considera- dos. A menos que indicado de outra forma, as partes são partes em peso, peso molecular é o peso molecular médio, temperatura é em graus centígrados e pressão é atmosférica ou próxima à atmosférica. Exemplo 1. Construção de Anticorpos anti-CD22xCD28 Geração de Anticorpos anti-CD28

[00178] Os anticorpos anti-CD28 foram obtidos pela imunização de um camundongo VELOCIMMUNEOPO (isto é, um camundongo projetado compreendendo DNA que codifica as regiões variáveis da cadeia leve e pesada de imunoglobulina humana) com a proteína CD28 humana fundida à porção Fc de IgG2a de camundongo, ou com células que expressam CD28 ou com DNA que codifica CD28. A resposta imune do anticorpo foi monitorada por um imunoensaio específico de CD28. Quando uma resposta imune desejada foi alcançada, os esplenócitos foram colhidos e fundidos com células de mieloma de camundongo para preservar sua viabilidade e formar linhas de células de hibridoma. As linhas de células de hibridoma foram rastreadas e selecionadas pa-

ra identificar linhagens de células que produzem anticorpos especiífi- cos de CD28. Usando esta técnica, vários anticorpos quiméricos anti- CD28 (isto é, anticorpos que possuem domínios variáveis humanos e domínios constantes de camundongo) foram obtidos. Além disso, di- versos anticorpos anti-CD28 totalmente humanos foram isolados dire- tamente de células B -positivas de antígeno sem fusão com células de mieloma, conforme descrito em US 2007 / 0280945A1.

[00179] Certas propriedades biológicas dos anticorpos anti-CD28 exemplificativos gerados de acordo com os métodos deste Exemplo são descritas em detalhes nos Exemplos apresentados abaixo. Geração de Anticorpos anti-CD22

[00180] Os anticorpos anti-CD22 foram obtidos imunizando um ca- mundongo geneticamente modificado (um camundongo VELO- CIMMUNEG, ver acima) com um antígeno CD22 humano (por exem- plo, Ver hOD22 ecto (D20-R687).hFc, R&D Systems, Catálogo f 1968- SL-050 ; Acesso tt CAA42006 (Ver também, Figura 3), ou por imuniza- ção de um camundongo manipulado compreendendo DNA que codifi- ca regiões variáveis de cadeia pesada e leve kappa de imunoglobulina humana com um antígeno CD22 humano.

[00181] Após a imunização, os esplenócitos foram colhidos de cada camundongo quanto (1) fundidos com células de mieloma de camun- dongo para preservar sua viabilidade e formar células de hibridoma e classificados para especificidade CD22, quanto (2) células B classifi- cadas (conforme descrito em US 2007 / 0280945A1) usando um frag- mento CD22 humano como o reagente de classificação que se liga e identifica anticorpos reativos (células B antígeno-positivas).

[00182] Os anticorpos quiméricos para CD22 foram inicialmente iso- lados tendo uma região variável humana e uma região constante de camundongo. Os anticorpos foram caracterizados e selecionados pe- las características desejáveis, incluindo afinidade, seletividade, etc.

Se necessário, as regiões constantes de camundongo foram substituí- das com uma região constante humana desejada, por exemplo, região constante de IgG4 ou IgG1 de tipo selvagem ou modificada, para gerar um anticorpo anti-CD22 totalmente humano. Embora a região cons- tante selecionada possa variar de acordo com o uso específico, as ca- racterísticas de ligação de antígeno de alta afinidade e especificidade de alvo residem na região variável. Geração de Anticorpos Biespecíficos que Ligam CD28 e CD22

[00183] Anticorpos biespecíficos compreendendo um domínio de ligação específico anti-Cd22 e um domínio de ligação específico anti- CD28 foram construídos usando metodologias padrões, em que o do- mínio de ligação ao antígeno anti-CD22 e o domínio de ligação ao an- tígeno anti-CD28 compreendem cada um HCVRs diferentes e distintos emparelhados com um LCVR comum. Em alguns casos, os anticorpos biespecíficos foram construídos utilizando uma cadeia pesada de um anticorpo anti-CD28, uma cadeia pesada de um anticorpo anti-CD22 e uma cadeia leve comum (ver Tabela 1).

[00184] Os anticorpos biespecíficos criados de acordo com o pre- sente Exemplo compreendem dois domínios de ligação ao antígeno separados (isto é, braços de ligação). O primeiro domínio de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada deri- vada de um anticorpo anti-CD28 ("CD28-VH") e o segundo domínio de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesa- da derivada de um anticorpo anti-CD22 ("CD22 -VH "). Tanto o anti- CD22 quanto o anti-CD28 compartilham uma cadeia leve comum. O emparelhamento CD28-VH / CD22-VH cria domínios de ligação ao an- tígeno que reconhecem especificamente CD28 em células T e CD22 em células tumorais.

Exemplo 2. Sequências de Aminoácidos e Ácidos Nucleicos de Região Variável de Cadeia Pesada e Leve

[00185] A Tabela 1 apresenta os identificadores de sequência de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada e leve e CDRs de anticorpos anti-CD22 selecionados da invenção. Os identificadores de sequência de ácido nucleico correspondentes são apresentados na Tabela 2.

[00186] A Tabela3 apresenta os identificadores de sequência de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada e leve (HCVR e LCVR), CDRs de anticorpos anti-CD28 selecionados da invenção. Os identificadores de sequência de ácido nucleico correspondentes são apresentados na Tabela 4. Tabela 3: Identificadores de Sequência de Aminoácidos do Anticorpo CD28 Designação de anticorpos | HCVR HCDR1 |HCDR2 |HCDR3 |LCVR LCDRI1 |LCDR2 |LCDR3

[00187] Um sumário das partes componentes dos vários anticorpos biespecíficos anti-CD22xanti-CD28 cons- truídos é apresentado na Tabela 5. As Tabelas 6 e 7 listam a HCVR, LCVR, CDRs e identificadores de sequên- cia de cadeia pesada e leve dos anticorpos biespeciíficos. Tabela 5: Sumário das Partes Componentes de Anticorpos Biespecíficos Anti-CD22 x Anti-CD28 8 Identificador de An- Região Variável da = : 3 ticorpo Biespecífico Cadeia Leve Comum P

[00188] A Tabela6 mostra os identificadores de sequência de aminoácidos para os anticorpos biespecíficos anti-CD22 x anti-CD28 exemplificados neste documento. Os identificadores de sequência de ácido nucleico cor- respondentes são apresentados na Tabela 7.

Exemplo 3: Mapeamento de epítopo de ligação de REGN5837 a CD22 por troca de hidrogênio e deutério

[00189] O mapeamento de epítopo de troca H/ D com espectrome- tria de massa (HDX-MS) foi realizado para determinar os resíduos de aminoácidos de CD22 (CD22 humano recombinante, SEQ ID NO: 50) interagindo com H4sH33037P2 (Ver Tabela 1, par de HCVR / LOCVR de SEQ ID NO: 2/10) (anticorpo monoclonal anti-hCD22; anticorpo an- ti-hoCD22 parental de REGN5837). Uma descrição geral do método de troca H / D é apresentada, por exemplo, em Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267 (2): 252-259; e Engen e Smith (2001) Anal. Chem. 73: 256A-265A.

[00190] Os experimentos de HDX-MS foram realizados em uma pla- taforma HDX / MS integrada, consistindo em um sistema Leaptec HDX PAL para a marcação e finalização de deutério, um Waters Acquity M- Class (gerenciador de solvente auxiliar) para a digestão e carregamen- to de amostras, um Waters Acquity Classe M (gerenciador de solvente pBinary) para o gradiente analítico e espectrômetro de massa Thermo Q Exactive HF para medição de massa de peptídeo.

[00191] A solução de marcação foi preparada como tampão PBS em D2O a pD 7,0 (tampão fosfato 10 mM, NaCl 140 mM e KCI 3mM, equivalente a pH 7,4 a 25ºC). Para marcação de deutério, 11 ul de CD22.mmH (REGNS5140 (SEQ ID NO: 50), 56,7 UM) ou CD22.mmH pré-misturado com H4sH33037P2 (Ver acima) na razão molar de 1:0,6 (complexo Ag-Ab) foram incubados a 20ºC com 44 yuL de solução de marcação de D2O para vários pontos de tempo em duplicatas (por exemplo, controle não deuterado = O segundo; marcado com deutério por 5 minutos e 10 minutos). A reação de deuteração foi finalizada pe- la adição de 55 ul de tampão de finalização pré-resfriado (0,5 M de TCEP-HCI, 8 M de ureia e 1% de ácido fórmico) a cada amostra para uma incubação de 5 minutos a 20ºC. A amostra finalizada foi então injetada em um Waters HDX Manager para digestão em linha de pep- sina / protease XIIl. Os peptídeos digeridos foram separados por uma coluna C8 (1,0 mm x 50 mm, NovaBioassays) com um gradiente de 13 minutos de 10% -32% B (fase móvel A: 0,5% de ácido fórmico em água, fase móvel B: 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila). Os peptí- deos eluídos foram analisados por espectrometria de massa Q Exacti- ve HF em LC-MS / MS ou modo LC-MS.

[00192] Os dados LC-MS / MS da amostra CD22 não deuterada foram pesquisados em um banco de dados incluindo CD22? e sua se- quência aleatória usando o mecanismo de busca Byonic (Protein Me- trics). Os parâmetros de pesquisa (em ELN) foram definidos como pa- drão usando digestão enzimática não específica e glicosilação humana como modificação de variável comum. A lista de peptídeos identifica- dos foi então importada para o software HDX Workbench (versão 3.3) para calcular a captação de deutério de cada peptídeo detectado por LC-MS de todas as amostras deuteradas. Para um dado peptídeo, a massa centróide (massa média ponderada pela intensidade) em cada ponto de tempo foi usada para calcular a absorção de deutério (D)e a porcentagem de absorção de deutério (% D) (ver abaixo). Captação de Deutério . Massa média (deuterada) - Mas- (captação D) — samédia (não deuterada) Captação de D para o peptídeo Porcentagem de captação . em cada ponto de tempo X 100% de deutério (% D) " Máxima absorção de D do peptí- deo (definido em ELN)

[00193] Um total de 427 peptídeos de hoD22.mmH (SEQ ID NO: 50) foram identificados a partir de nOCD22.mmH sozinho e hoD22.mmH em complexo com H4sH33037P2 (par de HCVR / LCVR de SEQ ID NOs: 2/10) amostras, representando 92,0% de cobertura de sequência de hcD22. Qualquer peptídeo que exibiu um valor de captação de D de percentagem diferencial acima de 5% foi definido como protegido signifi- cativamente na Tabela 8). Para hOCD22.mmH, os peptídeos correspon- dentes aos aminoácidos 481-505 (NVQYAPRDVRVRKIKPLSEI- HSGNS; SEQ ID NO: 57) e 523-537 (FWEKNGRLLGKESQLNF; SEQ ID NO: 58) foram significativamente protegidos por H4sH33037P2.

Tabela 8: Peptídeos CD22.mmH selecionados com proteção significativa mediante ligação a H4sH33037P2 LL E pj Lo 1 | | ReensTAo — | eeeNSTo = =

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Exemplo 4: Mapeamento de Epítopo de Ligação de H4sH33041P2 a CD22 por Troca de Hidrogênio e Deutério

[00194] O mapeamento de epítopos de troca H / D com espectro- metria de massa (HDX-MS) foi realizado para determinar os resíduos de aminoácidos de CD22 (CD22 humano recombinante, SEQ ID NO: 50) interagindo com H4sH33041P2 (anticorpo monoclonal anti-hocD22 tendo um par de HCVR / LCVR das SEQ ID NOs: 18/10), o anti-hCD22 parental de REGN5838). Uma descrição geral do método de troca H / D é apresentada, por exemplo, em Ehring (1999) Analytical Biochemis- try 267 (2): 252-259; e Engen e Smith (2001) Anal. Chem. 73: 256A- 265A.

[00195] Os experimentos de HDX-MS foram realizados em uma pla- taforma HDX / MS integrada, consistindo em um sistema Leaptec HDX PAL para a marcação e finalização de deutério, um Waters Acquity M- Class (gerenciador de solvente auxiliar) para a digestão e carregamen- to de amostras, um Waters Acquity Classe M (gerenciador de solvente uBinary) para o gradiente analítico e espectrômetro de massa Thermo Q Exactive HF para medição de massa de peptídeo.

[00196] A solução de marcação foi preparada como tampão PBS em D2O a pD 7,0 (tampão fosfato 10 MM, NaCl 140 mM e KCI 3mM, equivalente a pH 7,4 a 25ºC). Para marcação de deutério, 11 ul de CD22.mmH (REGN5140 (SEQ ID NO: 50), 56,7 UM) ou CD22.mmH pré-misturados com H4sH33041P2 (Ver acima) na razão molar de 1:0,6 (complexo Ag-Ab) foram incubados a 20ºC com 44 yuL de solução de marcação de D2O para vários pontos de tempo em duplicatas (por exemplo, controle não deuterado = O segundo; marcado com deutério por 5 minutos e 10 minutos). A reação de deuteração foi finalizada pela adição de 55 ul de tampão de finalização pré-resfriado (0,5 M de TCEP-HCI, 8 M de ureia e 1% de ácido fórmico) a cada amostra para uma incubação de 5 minutos a 20ºC. A amostra finalizada foi então injetada em um Waters HDX Manager para digestão em linha de pep- sina / protease XIll. Os peptídeos digeridos foram separados por uma coluna C8 (1,0 mm x 50 mm, NovaBioassays) com um gradiente de 13 minutos de 10% -32% B (fase móvel A: 0,5% de ácido fórmico em água, fase móvel B: 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila). Os peptí- deos eluídos foram analisados por espectrometria de massa Q Exacti- ve HF em LC-MS / MS ou modo LC-MS.

[00197] Os dados LC-MS / MS da amostra CD22 não deuterada foram pesquisados em um banco de dados incluindo CD22 e sua se- quência aleatória usando o mecanismo de busca Byonic (Protein Me- trics). Os parâmetros de pesquisa (em ELN) foram definidos como pa- drão usando digestão enzimática não específica e glicosilação humana como modificação de variável comum. A lista de peptídeos identifica- dos foi então importada para o software HDX Workbench (versão 3.3) para calcular a captação de deutério de cada peptídeo detectado por LC-MS de todas as amostras deuteradas. Para um dado peptídeo, a massa centróide (massa média ponderada pela intensidade) em cada ponto de tempo foi usada para calcular a absorção de deutério (D) e a porcentagem de absorção de deutério (% D) conforme apresentado abaixo. Captação de Deutério . Massa média (deuterada) - Mas- (captação D) - sa média (não deuterada) Captação de D para o peptídeo Porcentagem de captação . em cada ponto de tempo X 100% de deutério (% D) - Máxima absorção de D do peptí- deo (definido em ELN)

[00198] Um total de 454 peptídeos de hoD22.mmH (SEQ ID NO: 50) foram identificados a partir de nOD22.mmH sozinho e hoD22.mmH em complexo com amostras de H4sH33041P2, representando 90,5% de cobertura de sequência de hoD22. Qualquer peptídeo que exibiu um valor de captação de D de percentagem diferencial acima de 5% foi definido como protegido significativamente.

Para hoD22.mmH, os peptídeos correspondentes aos aminoácidos 246-277 (CEVSSSN- PEYTTVSWLKDGTSLKKQNTFTLNL; SEQ ID NO: 59) foram significa- tivamente protegidos por H4sH33041P2. A Tabela 9 fornece os resul- tados de peptídeos selecionados com proteção significativa após a li- gação a H4sH33041P2.

Tabela 9: Peptídeos CD22.mmH selecionados com proteção significativa após a ligação a H4sH33041P2

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Exemplo 5: Afinidades de Ligação Derivadas de Ressonância Plasmônica de Superfície e Constantes Cinéticas de Anticorpos Biespecíficos CD22 xCD28

[00199] Constantes de dissociação de equilíbrio (valoresKp) para hCcD22.mmH (SEQ ID NO: 50) e mfCD22.mmH (SEQ ID NO: 51) de ligação a mAb biespecífico anti-CD22xCD28 purificado ou mAb paren- tal bivalente anti-CD22 (Ver Tabela 1, mAB33037P2; HCVR / LOVR: SEQ ID NOs: 2/10) e mAb33041P2; HCVR / LOCVR: SEQ ID NOs: 18/10) foram determinados usando um biossensor de ressonância plasmônica de superfície em tempo real usando um instrumento Biaco- re T-200 ou Biacore 4000. A superfície do sensor CM5 Biacore foi de- rivatizada por acoplamento de amina com um anticorpo monoclonal Fc anti-humano camundongo (REGN2567: HCVR / LCVR: SEQ ID NOs: 33/34) para capturar mAbs parental anti-CD22xCD28 biespecífico ou anti-CD22 parental purificado (ver Tabela 1 e 2 para mAb33037P2 e mMAb33041P2). Este estudo de ligação Biacore foi realizado em um tampão composto por HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCI 0,45 M, EDTA 3 MM, 0,05% v / v Surfactante P20 (tampão de corrida HBS-EP). Dife- rentes concentrações de hCD22 (SEQ ID NO: 50) e míCD22 (SEQ ID NO: 51) com uma etiqueta de hexa-histidina myc.myc C-terminal ("he- xa-histidina" divulgada como SEQ ID NO: 60) preparada em tampão de execução HBS-EP (variando de 90 nM a 3,33 ou 0,37 nM, diluições de 3 vezes) foram injetados sobre a superfície capturada de mAb a uma vazão de 30 ul / minuto. A associação de CD22.mmH (SEQ ID NO: 50) ao anticorpo monoclonal capturado foi monitorada por 5 minu- tos e a dissociação de CD22.mmH em tampão de corrida HBS-EP foi monitorada por 10 minutos. Todos os experimentos de cinética de liga- ção foram realizados a 25ºC. As constantes de taxa de associação ci- nética (ka) e dissociação (ka) foram determinadas ajustando os sen- sorgramas em tempo real a um modelo de ligação 1:1 usando o sof-

tware de ajuste de curva Scrubber 2.0c. As constantes de equilíbrio de dissociação de ligação (Kp) e as meias-vidas dissociativas (t/2) foram calculadas a partir das constantes de taxa cinética como: Ko (M) = kal ka, e 6/2 (min) = 0,693/ka /60

[00200] “Parâmetros cinéticos de ligação para ligação de CD22 hu- mano e cyno a mAbs purificados a 25ºC são mostrados abaixo nas Tabelas 10-12.

[00201] Constantes de dissociação de equilíbrio (valores Kp) para hCcD28.mmH (SEQ ID NO: 54) mAb biespecífico anti-CD22xCD28 puri- ficado ou mAb parental bivalente anti-CD28 (Ver Tabelas 3 e 4 para MAb14226P2) foram determinadas usando um biossensor de resso- nância plasmônica de superfície em tempo real usando um instrumen- to Biacore T-200. A superfície do sensor CM4 Biacore foi derivatizada por acoplamento de amina com um anticorpo monoclonal Fc camun- dongo anti humano (REGN2567; HCVR / LCVR SEQ ID NOs: 33/34) para capturar purificado anti-CD22xCD28 biespecífico ou anti-CD28 parental mAb (ver acima). Este estudo de ligação Biacore foi realizado em um tampão composto por HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, 0,05% v / v Surfactante P20 (tampão de corrida HBS- EP). Diferentes concentrações de hocD28 com uma etiqueta de hexa- histidina C-terminal myc.myc ("hexa-histidina" divulgadas como SEQ ID NO: 60) preparadas em tampão de corrida HBS-EP (variando de 600 nM a 2,47 nM, diluições de 3 vezes) foram injetadas sobre a su- perfície capturada de mAb a uma vazão de 50 uL / minuto. A associa- ção de CD28.mmH (SEQ ID NO: 54) ao anticorpo monoclonal captura- do foi monitorada por 5 minutos e a dissociação de CD28.mmH em tampão de corrida HBS-EP foi monitorada por 10 minutos. Todos os experimentos de cinética de ligação foram realizados a 25ºC. As cons- tantes de taxa de associação cinética (ka) e dissociação (ka) foram de- terminadas ajustando os sensorgramas em tempo real a um modelo de ligação 1:1 usando o software de ajuste de curva Scrubber 2.0c. As constantes de equilíbrio de dissociação de ligação (Kp) e as meias- vidas dissociativas (t/4) foram calculadas a partir das constantes de taxa cinética como: Ko (M) = kal ka, e 6/2 (min) = 0,693/ka /60

[00202] “Parâmetros cinéticos de ligação para ligação de CD28 hu- mano a mAbs purificados a 25ºC são mostrados abaixo na Tabela 13.

Tabela 10: Cinética de ligação de CD22.mmH humano ao mAb biespecífico anti-CD22xCD28 a 25ºC REGN5837 REGN5837-L3 MAb CD22xCD28 | 379,1 + 2,4 100,5 1,70E +05 | 1,49E-03 | 8,75E-09 H4sH33037P2 | H4asH33037P2-L2 | mAb CD22 358,3 + 2,0 192,6 1,95E + 05 | 1,48E-03 | 7,60E-09 REGN5838 REGN5838-L4 MAb CD22xCD28 | 475,3 + 5,3 2,11E + 04 | 3,02E + 04 | 1,43E-08 HasH33041P2 | H4asH33041P2-L2 | mAb CD22 581,7 + 1,9 |615 “| [205E+04/1,93E-04 |9,43E-09 |59,8 | Tabela 11: Cinética de Ligação de CD22.mmH de macaco (XP 005588899.1) ao mAb biespecífico anti-CD22xCD28 a 25ºC Ha4sH33037P2 | HasH33037P2-L2 | mAb CD22 423,8 + 3,6 112,8 6,55E + 04 | 2,66E-03 | 4,06E-08 HasH33041P2 | H4sH33041P2-L2 | mAb CD22 500,9 + 0,9 6,83E + 03 | 2,91E-04 | 4,26E-08 a Tabela 12: Cinética de ligação de CD22.mmH de macaco (EHH59463.1) ao mAb biespecífico anti-CD22xCD28 a 25ºC o = E -

Exemplo 6. Especificidade de Ligação de Anticorpos Biespeciífi- cos Anti-CD28 e Anti-CD22xCD28 às Linhagens Celulares Alvo (Nalm6), Linhagens Celulares Efetoras (Jurkat) e Células T e B de Macaco Cinomolgo Usando Citometria de Fluxo

[00203] A análise de citometria de fluxo foi utilizada para determinar a ligação de anticorpos biespecíficos CD22xCD28 a células Nalm6 que expressam CD22 humano e células Jurkat que expressam CD28 hu- mano e a células T (CD28 +) e B (CD22 +) de macaco cinomolgo. Re- sumidamente, 1 x 10º células / poço foram incubadas por 30 minutos a 4ºC com uma diluição em série de anticorpos biespecíficos CD22xCD28 ou H4sH15260P (um anticorpo IgG4 humano de controle de isotipo que se liga a um antígeno humano sem reatividade cruzada com CD28 humano ou cinomolgo ou CD22), variando de 133 nM a 61 pM para células Jurkat e Nalm6. PBMCs de macaco cinomolgo foram incuba- dos com uma única concentração de 67 nM de anticorpo. Após a incu- bação, as células foram lavadas duas vezes com PBS frio contendo 1% de FBS filtrado e um anticorpo secundário anti-humano conjugado com PE foi adicionado às células e incubado por mais 30 minutos. Um coquetel de anticorpo de fenotipagem adicional (anti-CD2, anti-CD20, anti-CD16, anti-CD14) foi adicionado aos poços com PBCMs de maca- co cinomolgo. Os poços não contendo anticorpos ou apenas secundá- rios foram usados como controle.

[00204] Após a incubação com o anticorpo secundário, as células fo- ram lavadas, ressuspensas em 200 uL de PBS frio contendo 1% de FBS filtrado e analisadas por citometria de fluxo em um BD LSR Fortessa. As células T de macaco cinomolgo foram identificadas como CD2 + / CD16- e as células B como CD20 +. Os valores de ECs5o para ligação FACS foram calculados usando análise de regressão não linear de 4 parâmetros no software Prism.

[00205] A Tabela 14 fornece os dados de ligação de anticorpos bi-

específicos CD22xCD28 à superfície de linhagens celulares que ex- pressam CD22 conforme determinado por citometria de fluxo. A Tabela 14 também fornece os dados de ligação de anticorpos biespecíficos CD22xCD28 à superfície de linhas celulares que expressam CD28 humano conforme determinado por citometria de fluxo.

[00206] REGNB5837 ligado ao valor de EC5so das células Nalm6 de 1,3E-08M. REGN5838 ligado ao valor de EC50 das células Nalm6 de 1,8E-08M. O anticorpo de controle de isotipo não exibiu nenhuma liga- ção a linhagens celulares que expressam CD22.

[00207] "REGN5837 ligado ao valor de ECso das células Jurkat de 2,1E-08M. REGN5838 ligado ao valor de ECso das células Jurkat de 2,3E-08M. O anticorpo de controle de isotipo não exibiu nenhuma liga- ção a linhagens celulares que expressam CD28.

[00208] A Tabela15 fornece a ligação de dados de anticorpos bies- pecíficos CD22xCD28 à superfície de células T e B de macaco cino- molgo (origem cambojana), conforme determinado por citometria de fluxo.

[00209] “REGNS5837 se ligou a células B de 12 de 12 e células T de 11 de 12 macacos cinomolgo testados. A ligação às células B CD20 + variou de 12,6-30,3 vezes em relação às secundárias, com uma medi- ana de 15,7 vezes. A ligação às células T CD2 + / CD16- variou de 1,2 a 5,2 vezes em relação às secundárias, com uma mediana de 3,5 ve- zes. A ligação positiva foi definida como maior do que 1,2 vezes em relação à secundária. REGN5838 se ligou a células B de 12 de 12 e células T de 11 de 12 macacos cinomolgo testados. A ligação às célu- las B CD20 + variou de 6,5-13,5 vezes em relação às secundárias, com uma mediana de 9,3 vezes. A ligação às células T CD2 + / CD16- variou de 1,2 a 4,7 vezes em relação às secundárias, com uma media- na de 3,8 vezes. A ligação positiva foi definida como maior do que 1,2 vezes em relação à secundária. O anticorpo de controle de isotipo não exibiu nenhuma ligação a células T ou B de cinomolgo. Tabela 14: Resultados de ligação e quantidade de vezes de ligação para experimentos de citometria de fluxo em células alvo e efetoras projetadas. Anticorpo PiD Jurkat Jurkat Nalm6 Nalm6 FACS [M] Quantidade de | FACS [M] Quantidade de vezes de FACS vezes de FACS REGNSAST 2150 1958 REGNSSO8 2950 18Es Controle de isotipo | Sem ligação Sem ligação Tabela 15: Resultados de quantidade de vezes de ligação para expe- rimentos de citometria de fluxo em células T e B de cinomolgo (origem cambojana). Ligação de células B (quantidade de | Ligação de células T (quantidade de vezes em relação ao secundário) vezes em relação ao secundário) Controle Controle REGN5837 | REGN5838 | Iso REGN5837 | REGN5838 | Iso mr Ts eo) e e rs e e Exemplo 7. Especificidade de Ligação de Anticorpos Biespeciífi- cos Anti-CD28 e Anti-CD22xCD28 para Células T CD4 + Humanas e Células Alvo Projetadas Usando Citometria de Fluxo

[00210] A análise de citometria de fluxo foi usada para investigar a ligação de CD22 x CD28 biespecífico (REGN5837; REGN5838) e anti-

corpos de controle para células efetoras que expressam CD28 humano (células T CD4* humanas) e células alvo que expressam CD22 huma- no (células B HEK293 / hoD20 / hoD22 e Raji / CD80 e CD86 negati- vas). As células HEK293 / hoD20 foram incluídas como uma linhagem celular negativa para CD28 e CD22.

[00211] Células T CD4* humanas foram isoladas de células mono- nucleares de sangue periférico humano (PBMCs) obtidas a partir de pacotes de leucócitos de um doador saudável. O isolamento de PBMC foi realizado por centrifugação em gradiente de densidade usando tu- bos SepMate "" de 50 mL seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante. Resumidamente, 15 mL de Ficoll-Paque PLUS foram colo- cados em tubos SepMate de 50 mL, seguido pela adição de 30 mL de leucócitos diluídos 1:2 com D-PBS + FBS a 2%. As etapas subsequen- tes foram seguidas de acordo com o protocolo do fabricante do SepMate. As células T CD4* foram subsequentemente isoladas de PBMC usando kits de CD4 Microbead humanos da Miltenyi Biotec se- guindo as instruções do fabricante. As células T CD4* isoladas foram congeladas em FBS contendo 10% de DMSO a uma concentração de x108 células por frasco.

[00212] As células alvo, incluindo uma linhagem celular HEK293 e células B Raji humanas, foram preparadas como se segue.

[00213] Uma linhagem celular HEK293 estável (ATCC, f CRL- 1573) que expressa CD20 humano (aminoácidos M1 a P297 do núme- ro de acesso NP 068769.2) foi transduzida com CD22 humano (ami- noácidos M1 a A847 do número de acesso NP 001762.2). Células po- sitivas de CD22 humano foram isoladas por separação de células ati- vadas por fluorescência (FACS) e clonadas individualmente. A linha- gem celular clonal resultante (HEK293 / hnoD20 / hoD22 clone E4) foi mantida em DMEM + 10% + P / S/G + NEAA suplementado com 500 g/mL G418.

[00214] CélulasB Raji humanas (ATCC ft CCL-86), que expressam endogenamente CD20, CD22, receptores Fc gama (FcJR), CD80 e CD86 na superfície celular foram geneticamente modificadas por dele- ção de CD80 e CD86 usando a tecnologia CRIPSR. CD80 e CD86 são ligantes conhecidos para CD28. As células negativas Raji / CD80 e CDB86 projetadas foram mantidas em RPMI + FBS a 10% + penicilina + estreptomicina + glutamina suplementado com HEPES e piruvato de sódio.

[00215] As células foram manchadas como se segue.

[00216] Resumidamente, células T CD4 + humanas, HEK293 / hcD20, HEK293 / hoD20 / hoD22 e células negativas Raji / CD80 e CD86 foram ressuspensas em tampão de manchamento contendo D- PBS + 2% FBS. As células Raji foram incubadas com IgG de camun- dongo (concentração final de 625 mg / mL) para bloquear os recepto- res Fc Gama endógenos). Resumidamente, em uma placa de 96 po- ços, 2x10º células / poço foram incubadas por 30-60 minutos a 4ºC com diluições em série de anticorpos, variando de 6,1 pM a 100 nM. Foi incluída uma amostra de controle negativo sem anticorpo. As célu- las foram lavadas uma vez com tampão de coloração frio e incubadas durante 30-45 minutos com anticorpo secundário anti-humano marca- do com aloficocianina (APC). Após a incubação, as células foram lava- das uma vez com tampão D-PBS frio sem FBS e incubadas com man- chamento verde em células mortas fixáveis LIVE / DEAD (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante para discriminar entre célu- las vivas e mortas. As células foram então fixadas em BD Cytofix Buf- fer de acordo com as instruções do fabricante, lavadas, ressuspensas em tampão de manchamento e analisadas por citometria de fluxo em um citômetro de fluxo iQue Screener. Para determinações de ECrso, os valores de intensidade de fluorescência média geométrica (MFI) foram analisados usando uma equação logística de quatro parâmetros sobre uma curva de resposta de 9 pontos usando GraphPad Prism. A quan- tidade de vezes de ligação foi calculada usando a seguinte equação: Quantidade de vezes de ligação = — valor geométrico máximo de MFI na faixa de dosagem testada Valor geométrico MFI de fundo [OnM]

[00217] A capacidade de os anticorpos biespecíficos CD22 x CD28 se ligarem a CD22 e CD28 humanos foi avaliada em células T CD4* humanas primárias e células modificadas superexpressando CD22 (HEK293 / hnoD20 / hoD22) ou endogenamente (Raji / CD80 e CD86 negativo) por citometria de fluxo. Uma linhagem celular negativa foi incluída como controle (HEK293 / hoD20).

[00218] Os valores de ECso/ quantidade de vezes de ligação estão sumarizados na Figura 1 e na Tabela 16.

Tabela 16: Resultados de EC5o e quantidade de vezes de ligação para experimentos de citometria de fluxo em células T CD4* humanas e células alvo projetadas: Anticorpos HEK293 / hcD20 HEK293 / hcD20 Raji / CD80 e CD86 negativa | Células T CD4* humanas 1 hcp22 ECso [M] | Quantidade de | EC5so [M] Quantidade de | EC5so [M] Quantidade de | EC5so [M] Quantidade de vezes de ligação vezes de ligação vezes de ligação vezes de ligação REGN5838 No ago O] 1,14E-08 | 34,90 1,49E-08 |81,74 10,63 Controle CD28 de 1,05 ND 1,11 ND 1,07 NC 10,97 um braço = - Abreviações: NC = não calculável (denotado para curvas nas quais a ligação não atingiu a saturação); ND = não de- P terminado

Tabela 16. EC5o tabulado e valores de quantidade de vezes de ligação de anticorpos para células T CD4* humanas e linhas de células modifi- cadas, como HEK293 / hoD20, HEK293 / hoD20 / hoD22 ou Raji / CDB80 e células B negativas para CD86.

[00219] Conforme esperado, nenhum dos anticorpos CD28, paren- tais (REGN5705; HCVR / LCVR SEQ ID NOs: 35/36) ou seus formatos biespecíficos (REGN5837, REGN5838 e controle CD28 de um braço (SEQ ID NO: 48) se ligaram a células HEK293 / hoD20 negativas. Uma ligação fraca, aproximadamente 1,8x na concentração mais alta, foi detectada com o anticorpo de controle de isotipo devido à ligação não específica (Figura 1 e Tabela 16).

[00220] — A ligação de anticorpos anti-CD22 x anti-CD28 foi observada em HEK293/hCD20/hCD22, (16,44x para REGN5837 e 34,9x para REGN5838 com um ECs, de aproximadamente 11,4nM) e em células negativas Raji / CD80 e CD86 (38,35x para REGN5837 com um ECrs, de aproximadamente 9,76NM e 81,74x para REGN5838 com um ECsº de aproximadamente 14,9NM). Não foi detectada nenhuma ligação significativa com o CD28 de um braço e controle de isotipo (Figura 1 e Tabela 16).

[00221] A ligação de anticorpos alvejando CD28 humano foi detec- tada em células T CD4* humanas primárias. O anticorpo CD28 paren- tal, REGN5705, ligou-se a 37,48X com uma ECso de aproximadamente 4,13 nM em relação ao o fundo, enquanto os anticorpos biespecíficos, REGN5837, REGN5838 e o controle de um braço mostraram uma |i- gação de 9,25x, 10,63x e 10,97x, respectivamente. Conforme espera- do, o controle de isotipo não se ligou às células (Figura 1 e Tabela 16). Exemplo 8. A Coestimulação de Anticorpo Biespecífico Anti- CD22xCD28 Intensifica a Citotoxicidade Alvejada, a Ativação de Células T e a Liberação de Citocinas por Anticorpos Biespecíficos Anti-CD20xCD3

[00222] A intensificação de CD22xCD28 de extermínio alvejado de CD20xCD3 foi avaliada em um ensaio de citotoxicidade de 96 horas alvejando células Raji projetadas para não ter expressão de CD80 e CD86 (Raji-80 / 86DKO). Resumidamente, PBMCs humanas foram semeadas em meio RPMI suplementado a 1x10º células / mL e incu- badas durante a noite a 37ºC, a fim de enriquecer linfócitos pela de- pleção de macrófagos aderentes, células dendríticas e alguns monóci- tos. No dia seguinte, as células Raji-80 / 88DKO foram marcadas com 1uM do corante de rastreamento fluorescente CFDA-SE e as PBMC naive esgotadas de células aderentes foram marcadas com 1uM do corante de rastreamento fluorescente CellTrace Violet. Células alvo marcadas e PBMC (razão de célula efetora / alvo 10:1) foram co- incubadas uma diluição em série de anticorpo biespecífico CD20xCD3, REGN1979, tendo um braço de cadeia pesada compreendido por SEQ ID NO: 42, o outro braço de cadeia pesada compreendido por SEQ ID NO: 43 e a cadeia leve de SEQ ID NO: 44), (faixa de concentração: 5 NM a 0,64pM) e uma concentração fixa de moléculas coestimulatórias CD22xCD28 REGN5837 ou REGN5838, controle de 1 braço CD28 biespecífico (REGN5678) ou controle de isotipo IgG4s (H4sH10154P3, um controle de isotipo tendo um par de HCVR / LCVR de SEQ ID NOs: 37/38) a 2,5 ug / ml (16,7 nM) por 96 horas a 37ºC. As células foram colhidas das placas e analisadas por FACS em um FACS BD LSRFor- tessa-X20. Para a análise FACS, as células foram manchadas com um corante reativo Fixable Live / Dead Far Red (Invitrogen). Contagem de

20.000 grânulos foram adicionados a cada poço imediatamente antes da análise FACS e 10.000 grânulos foram coletados para cada amos- tra. Para a avaliação da especificidade de extermínio, as células foram bloqueadas em populações marcadas com CFDA-SE vivas. A porcen- tagem da população viva foi registrada e usada para o cálculo da so- brevivência.

[00223] A ativação de células T foi avaliada incubando células com anticorpos conjugados diretamente em CD2, CD4, CD8 e CD25. À porcentagem de células CD8 + que expressam CD25 foi relatada co- mo a medida da ativação de células T. Adicionalmente, à medida que as células T proliferam, CellTraceViolet é diluído, levando a MFI inferi- or conforme medido por FACS. A proliferação de células T foi, portan- to, relatada como uma diminuição no MFI de CellTraceViolet em célu- las T CD8 +. Os valores de ECrso para células Raji alvo sem expressão e ligação de CD80 e CD86 foram calculados usando análise de re- gressão não linear de 4 parâmetros no software Prism.

[00224] Os sobrenadantes deste ensaio foram coletados para análi- se dos níveis de citocina. As concentrações de IL 17a, IFNy, TNFa, IL- 10, IL-6, IL-4 e IL-2 foram analisadas usando um kit Cytometric Bead Array (CBA) seguindo as instruções do fabricante. Os níveis de citoci- na foram interpolados a partir das curvas geradas pelos padrões do kit e relatados como pg / mL. Os níveis máximos de citocina foram calcu- lados usando análise de regressão não linear de 4 parâmetros no sof- tware Prism.

[00225] Os resultados dos ensaios para avaliar a capacidade do anticorpo biespecífico anti-cCD20xCD3 REGN1979 (ver acima) de in- duzir células T humanas não estimuladas a exterminar células alvo que expressam CD20 e CD22 humanos em combinação com um anti- corpo coestimulatório CD22xCD28 ou CD28 de 1 braço ou anticorpos de controle de isotipo foram testados.

[00226] REGN1979 ativou e direcionou células T humanas para es- gotar células Raji sem expressão de CD80 e CD86 de uma maneira dependente da dose. A adição de uma concentração fixa de anticorpos biespecíficos CD22xCD28 a REGN1979 aumentou a eficácia citotóxica (EC5so) de REGN1979 3,5-6,4 vezes em comparação com REGN1979 com CD28 de 1 braço ou anticorpos de controle de isotipo (Tabela 17).

[00227] A lise de células alvo observada mediada por REGN1979 foi associada à ativação e proliferação de células T, conforme medido pela supra-regulação de CD25 em células CD8 + ou diluição de violeta CellTrace, respectivamente. A adição de uma concentração fixa de anticorpos biespecíficos CD22xCD28 a REGN1979 aumentou a potên- cia da ativação e proliferação de células T induzida por REGN1979 2,1 a 2,6 vezes e 7,4-8,4 vezes, respectivamente, quando comparado com REGN1979 com CD28 de 1 braço ou anticorpos de controle de isotipo (Tabela 17).

[00228] REGN1979 induziu a liberação de citocinas humanas. À citocina liberada observada com REGN1979 em combinação com anti- corpos biespecíficos CD22xCD28 foi aumentada na presença de uma concentração fixa de moléculas coestimulatórias de CD22xCD28 com uma concentração fixa de CD28 de 1 braço ou anticorpos de controle de isotipo (Tabela 18).

[00229] Em sumário, a coestimulação aumentou a potência da cito- toxicidade alvejada, ativação de células T e liberação de citocina quando comparada ao que foi observado com CD20xCD3 em combi- nação com anticorpos de controle.

Tabela 17: Valores de ECs5o para citotoxicidade e ativação de células T (média de 3 experimentos) Divisão de células T (CellTrace MFI de célu- Extermínio de Célula Ativação de células T (CD8 + / CD25 +) las CD8 +) Quantidade de vezes de ECso em compa- Quantidade de vezes de ECso Quantidade de vezes de ECso Anticorpo ECso [M] ração com IgG4s ECs5o [M] em comparação com IgG4s ECs5o [M] em comparação com IgG4s [coasdetbraço [6seto [OE [aaeett [10 [amem 12 Tabela 18: Liberação de citocina (pg / ml) [ REGN5837 REGN5838 CD28 de 1 braço — | Iso de IgG4s S :

RR E E A

Exemplo 9: Bioensaios para Anticorpos Biespecíficos CD22

[00230] A ativação de células T é alcançada estimulando receptores de células T (TOR) que reconhecem peptídeos específicos apresenta- dos por proteínas do complexo principal de histocompatibilidade classe | ou Il (MHCI ou MHCII) em células apresentadoras de antígenos (APC) (Goldrath et a/. 1999). Um TCR ativado, por sua vez, inicia uma cascata de eventos de sinalização que podem ser monitorados por genes repórter impulsionados por vários fatores de transcrição, como proteína ativadora 1 (AP-1), Fator Nuclear de células T ativadas (NFAT) ou fator Nuclear de aumento de cadeia leve kappa de células B ativadas (NFB). A resposta da célula T é então refinada por meio do envolvimento de co-receptores expressos tanto constitutivamente quanto indutivelmente nas células T, tais como CD28, CTLA-4 (Proteí- na 4 Associada a Linfócitos T Citotóxicos), PD-1 (Extermínio Celular Programado da Proteína 1 ), LAG-3 (Gene de Ativação de Linfócitos 3) ou outras moléculas (Sharpe et al. 2002). A molécula coestimulatória, CD?28, é ativada por seus ligantes endógenos, CD80 ou CD86 expres- sos em APCs. O CD28 potencializa os sinais celulares, tais como as vias controladas pelo fator de transcrição NFIJB após a ativação do TCR. O cossinal de CD28 é importante para a ativação eficaz de célu- las T, tais como diferenciação, proliferação, liberação de citocina e ex- termínio celular (Smeets et al. 2012).

[00231] Os anticorpos biespecíficos anti-CD22xCD28 foram carac- terizados em um bioensaio repórter baseado em luciferase e um en- saio funcional de IL-2 usando células T CD4* humanas primárias. Ensaio repórter baseado em luciferase:

[00232] Um ensaio repórter baseado em luciferase de células T / APC (células apresentadoras de antígeno) foi desenvolvido para avali- ar o efeito da ativação de CD28 na atividade de NF'JB após o envol- vimento com anticorpos biespecíficos anti-CD28 x anti-CD22.

Engenharia de células T repórter:

[00233] “Uma linhagem de células T repórter clonal foi projetada pe- la transdução de células T Jurkat humanas imortais (ATCC t TIB-152) com um repórter de lentivírus NFB-Luciferase (NFIB-Luc) (da Qia- gen) de acordo com as instruções do fabricante. A linhagem repórter clonal (Jurkat / NFB-Luc clone 1C11) foi mantida em RPMI + FBS a 10% + penicilina + estreptomicina + glutamina suplementada com 1ug / mL de puromicina. Engenharia de APCs:

[00234] Uma linhagem celular HEK293 estável (ATCC, f CRL- 1573) que expressa CD20 humano (aminoácidos M1 a P297 do núme- ro de acesso NP 068769.2) foi transduzida com CD22 humano (ami- noácidos M1 a A847 do número de acesso NP 001762.2). Células po- sitivas de CD22 humano foram isoladas por classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) e clonadas individualmente. A |i- nhagem celular clonal resultante (HEK293 / hnoD20 / hoD22 clone E4) foi mantida em DMEM + 10% + P /S/G+NEAA suplementado com 500ug / mL G418.

[00235] CélulasB Raji humanas (ATCC ft CCL-86), que expressam endogenamente CD20, CD22, receptores Fc gama (FcJR), CD80 e CD86 na superfície celular foram geneticamente modificadas por dele- ção de CD80 e CD86 usando a tecnologia CRIPSR. CD80 e CD86 são ligantes conhecidos para CD28. As células negativas Raji / CD80 e CDB86 projetadas foram mantidas em RPMI + FBS a 10% + penicilina + estreptomicina + glutamina suplementado com HEPES e piruvato de sódio. Estimulação de células T/ APC:

[00236] Neste experimento, as células T repórter projetadas foram estimuladas por meio de dois anticorpos biespecíficos. A primeira es- timulação é administrada por um anticorpo biespecífico de ativação de células T REGN2281, um anticorpo anti-CD20 X anti-CD3 com um braço de cadeia pesada compreendido por SEQ ID NO: 39, um braço de cadeia pesada compreendido por SEQ ID NO: 40 e um braço de cadeia leve de SEQ ID NO: 41), alvejando moléculas CD3 em células T repórter projetadas e CD20 em HEK293 ou em células B Raji / CD80 e CD86 negativas. A primeira estimulação contorna a necessidade de ativação de TCRs por seus ligantes naturais, que são peptídeos espe- cíficos exibidos nas moléculas de MHC. A segunda estimulação é con- duzida por um anticorpo biespecífico CD28 (isto é, um anticorpo bies- pecífico anti-CD28 x anti-CD22). Este anticorpo imita a ativação de CD28 em células T por seus ligantes, CD80 / CD86, expressos em APCs. Ele interage com CD28 em células T e CD22 em células HEK293 ou em células B negativas Raji / CD80 e CD86 e conduz a ativação de CD28 em células T repórter projetadas. A ativação simul- tânea de TCR e CD28 leva a atividade transcricional intensificada de NFB, que aumenta a produção do gene repórter, luciferase. Configuração do Ensaio de Luciferase:

[00237] —"RPMI1640 suplementado com 10% de FBS e P/S/G foi usado como o meio de ensaio para preparar suspensões de células e diluições de anticorpos para a classificação de anticorpos biespecíficos anti-CD22 x anti-CD28.

[00238] Um dia antes da classificação, as células T repórter proje- tadas foram cultivadas a 0,5x 10º células / mL em meio de cultura ce- lular. Anticorpos biespecíficos anti-CD28 x anti-CD22 diluídos em série 1:3 e controles foram testados na presença de 200pM REGN2281 (an- ti-CD20 x anti-CD3, ver acima) ou REGN1945 constante (um controle de isotipo hlgG4 tendo um par de HOCVR / LOCVR das SEQ ID NOs: 45/46). A diluição de 10 pontos variou entre 15 pM a 100 nM com a diluição final não contendo anticorpos CD28.

[00239] Os reagentes foram adicionados na seguinte ordem: 1)

Uma concentração fixa de 200pbM REGN2281 final (anti-CD20 x anti- CD3, ver acima) ou REGN1945 (controle de isotipo hlgG4, ver acima) foi adicionada a cada poço em placas de fundo plano branco de 96 poços; 2) Células HEK293 ressuspensas a 4 x 10º células / mL (con- centração final de células 1 x10º células / poço) ou células B negativas Raji / CD80 e CD86 a 2 x106 células / mL (concentração final de célu- las 5 x10º células / poço) foram adicionados às placas corresponden- tes; 3) Anticorpos diluídos em série foram adicionados aos poços cor- respondentes; 4) As células T repórter cultivadas durante a noite foram ressuspensas a 2 x10%/ mL e adicionadas às placas com uma concen- tração final de 5 x10º células / poço. As placas foram incubadas por 4- 6 horas a 37ºC/5% de CO», antes da adição de 100uL do reagente ONE-GIo "" (Promega) para lisar as células e detectar a atividade da luciferase. A luz emitida foi capturada em unidades de luz relativa (RLU) em um leitor de placas multi-rótulo Envision (PerkinElmer). To- das as diluições em série foram testadas em duplicata.

[00240] Os valores de EC5so dos anticorpos foram determinados ajustando os dados a uma equação logística de quatro parâmetros ao longo de uma curva de resposta a dose de 10 pontos usando o softwa- re GraphPad Prism'Y, A quantidade de vezes de indução foi calculada usando a seguinte equação: Quantidade de vezes de — Valor médio máximo de RLU na faixa de dose testada indução = Valor médio de RLU de fundo [OnM] Ensaio funcional de IL-2 usando células T CD4* humanas primárias:

[00241] Um ensaio funcional primário de células T CD4* / APC foi desenvolvido para avaliar o efeito da ativação de CD28 na produção de IL-2 após envolvimento com anticorpos biespecíficos anti-CD22 x anti-CD28. Isolamento primário de células T CD4 + humanas:

[00242] Células mononucleares de sangue periférico humano

(PBMCs) foram isoladas de pacotes de leucócitos de um doador sau- dável. O isolamento de PBMC foi realizado por centrifugação em gra- diente de densidade usando tubos SepMate "Y de 50 mL seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante. Resumidamente, 15 mL de FicollPaque PLUS foram colocados em tubos SepMate de 50 mL, se- guido pela adição de 30 mL de leucócitos diluídos 1:2 com D-PBS + FBS a 2%. As etapas subsequentes foram seguidas de acordo com o protocolo do fabricante do SepMate. As células T CD4* foram subse- quentemente isoladas de PBMC usando kits de CD4 Microbead huma- nos da Miltenyi Biotec seguindo as instruções do fabricante. As células T CD4* isoladas foram congeladas em FBS contendo 10% de DMSO a uma concentração de 5 x10º células por frasco.

Liberação de IL-2 a partir de células T CD4* primárias tratadas com anticorpos CD28:

[00243] Neste ensaio, as células T CD4* primárias são ativadas através da reticulação de CD3 em sua superfície usando anticorpo bi- específico anti-CD20 x anti-CD3 (REGN2281, ver acima) em combina- ção com células HEK293 projetadas para expressar CD20 humano ou com células Raji expressando CD20 endógeno, onde CD80 e CD86 foram silenciados usando a tecnologia CRISPR (células negativas Raji / CD80 e CDB86). A ligação do braço CD20 de REGN2281 a células que expressam CD20 conduz o agrupamento do receptor CD3, forne- cendo o primeiro sinal necessário para a estimulação de células T. Im- portantemente, em alguns casos, a co-cultura de leucócitos primários com células geneticamente distintas leva à incompatibilidade de de- terminantes alogênicos e resulta na ativação de células T. Isso pode fornecer um estímulo primário suficiente na ausência de adição exóge- na de anticorpo biespecífico anti-CD20 x anti-CD3. Independentemen- te do estímulo primário, para detectar a liberação quantificável de IL-2, a coestimulação, que pode ser fornecida pela reticulação de moléculas de CD28, é necessária. Aqui, um anticorpo biespecífico CD28 (isto é, um anticorpo biespecífico anti-CD28 x anti-CD22) interage com CD28 em células T CD4* e CD22 em células HEK293 / hocD20 ou RAJI / CD80 e CD86 negativas e conduz a ativação de agrupamento de CD28. O envolvimento de TCR e CD28 combinado leva a uma produ- ção intensificada de IL-2, que é liberada no meio de cultura celular. IL- 2 é detectada e quantificada a partir do sobrenadante da célula usando um kit AlphaLisa homogêneo, sem lavagem, da PerkinElmer.

[00244] Células T CD4* humanas previamente isoladas e congela- das foram descongeladas no dia do ensaio em meio de estimulação (meio de cultura celular X-VIVO 15 suplementado com 10% de FBS, HEPES, NaPyr, NEAA e 0,01 mM de BME contendo 50 U / ml de ben- zonase nuclease). As células foram centrifugadas a 1.200 rom por 10 minutos, ressuspensas em meio de estimulação e plaqueadas em pla- cas de fundo redondo de 96 poços a uma concentração de 1 x10º cé- lulas / poço. Células HEK293 projetadas para expressar CD20 humano sozinho ou em combinação com CD22 humano, foram tratadas com 15 ug / mL de Mitomicina C em meio de estimulação primária a uma con- centração de 10 x 10º células / mL. As células Raji / CD80 e CD86 ne- gativas foram tratadas com 20 ug / mL de Mitomicina C em meio de estimulação primária na concentração de 10x 10º células / mL. Após incubação por 1 hora a 37ºC, 5% de CO;>, células HEK293 e Raji foram lavadas 3 vezes com D-PBS contendo 2% de FBS e adicionadas aos poços contendo células T CD4* a uma concentração final de 1 x 10º células por células HEK293 de poço ou 5 x10º células por poço para células negativas Raji / CD80 e CD86. Subsequentemente, anticorpos biespecíficos ou de controle anti-CD28 x anti-CD22 diluídos em série 1:3, variando de 15pM a 100nM, foram adicionados aos poços na pre- sença de REGN2281 2nM (anti-CD20 x anti-CD3) ou REGN1945 (um controle de isotipo hlgG4 negativo, veja acima). O ponto final da dilui-

ção de 10 pontos não continha nenhum anticorpo CD28. Após as pla- cas serem incubadas por 72 horas a 37ºC, 5% de CO,» foram centrifu- gados para sedimentar as células e 40 ul do sobrenadante do meio foram coletados. A partir disto, 5 uL foram testados em um ensaio Al- PphaLISA de IL-2 humana de acordo com o protocolo do fabricante. As medições foram adquiridas no leitor de placas multi-rótulo Envision e os valores brutos de RFU (unidades de fluorescência relativa) foram plotados. Todas as diluições em série foram testadas em duplicata.

[00245] Os valores de EC5so dos anticorpos foram determinados ajustando os dados a uma equação logística de quatro parâmetros ao longo de uma curva de resposta a dose de 10 pontos usando o softwa- re GraphPad Prism'Y, A quantidade de vezes de indução foi calculada usando a seguinte equação: Quantidade de vezes de Valor médio máximo de RFU na faixa de dose testada indução = Valores médios de RFU de fundo [OnM] Sumário dos resultados e conclusões: Ensaio repórter baseado em luciferase:

[00246] A capacidade dos anticorpos biespecíficos anti-CD22 x anti- CD28 de fornecer coestimulação através de CD28 em células T na au- sência ou presença de expressão alvo de CD22 foi avaliada em um bioensaio baseado em célula repórter usando atividade de luciferase como uma leitura.

[00247] As curvas de ativação são mostradas na Figura 2(AeB), os valores de ECs5o e de vezes de indução estão sumarizados na Tabe- la 19 e 20 para células T repórter projetadas co-incubadas com células HEK293 / hoD20 ou HEK293 / hoD20 / hoD22 além de 200pM cons- tante REGN1945 (controle de isotipo hIgG4) ou REGN2281 (anti-CD20 x anti-CD3).

[00248] “Quando as células T repórter e APCs derivadas de HEK293 foram tratadas com REGN1945 200pM, nenhum dos anticorpos bies-

pecíficos CD28 mostrou um aumento na atividade da luciferase na au- sência de estimulação de TCR, independentemente da linhagem de HEK293 usada no ensaio. A ativação da luciferase aumentada foi ob- servada apenas para o anticorpo CD28 parental (REGN5705) com cé- lulas HEK293 / hoD20 (2,18x) e células HEK293 / hoD20 / hoD22 (2,05x). O CD28 de um braço e o anticorpo de controle de isotipo não deram origem em resposta a luciferase neste cenário (Tabela 19 e Fi- gura 2).

[00249] “Quando as células T repórter e APCs derivadas de HEK293 foram tratadas com 200pM REGN2281, ambos os anticorpos biespecií- ficos anti-CD22 x anti-CD28 (REGN5837 e REGN5838) induziram uma forte atividade de luciferase com células HEK293 que expressam CD?22, indicado pelo aumento de valores de ECso e de quantidade de vezes de indução. O anticorpo de controle CD28 de um braço e o anti- corpo CD28 parental (REGN5705; ver HCVR / LCVR SEQ ID NOs: 35/36) mostraram atividades semelhantes em ambas as linhagens de HEK293. O anticorpo de controle de isotipo não deu origem a uma resposta a luciferase neste cenário (Tabela 20 e Figura 2).

[00250] — Quando as células T repórter e Raji / CD80 e CD86 negati- vas foram tratadas com 200pM REGN1945, os anticorpos biespeciífi- cos anti-CD22 x anti-CD28 (REGN5837 e REGN5838) e o anticorpo CD28 parental induziram a atividade de luciferase, enquanto o anticor- po de controle CD28 de um braço e o controle de isotipo não mostra- ram atividade (Tabela 19 e Figura 2).

[00251] Quando as células T repórter e Raji / CD80 e CD86 negati- vas foram tratadas com 200pM REGN2281, todos os anticorpos bies- pecíficos CD28 (REGN5837 e REGN5838) e o anticorpo de controle CD28 de um braço, incluindo o anticorpo CD28 parental, induziram a atividade de luciferase. Os valores de ECso podem ser determinados apenas para anti-CD22 x anti-CD28 e o anticorpo CD28 parental, mas não para o controle CD28 de um braço devido a uma falha em atingir os níveis de saturação. Não foi detectada nenhuma ativação com o controle de isotipo (Tabela 20 e Figura 2). Ensaio funcional de IL-2 usando células T CD4* humanas primárias:

[00252] A capacidade dos anticorpos biespecíficos anti-CD22 x anti- CD28 de fornecer coestimulação através de CD28 em células T na au- sência ou presença de expressão alvo de CD22 foi avaliada em um ensaio de células T CD4* primárias funcionais medindo a produção de citocina IL-2.

[00253] As curvas de ativação são mostradas na Figura 3 (Ae B), ECs5o e os valores de quantidade de vezes de indução estão sumariza- dos na Tabela 21 para células T CD4* co-incubadas com HEK293 / hcD20, HEK293 / hnoD20 / hoD22, ou Raji / CD80 e células negativas CDB86 na presença de REGN1945 2 nM constante (controle de isotipo hlgG4) ou REGN2281 (anti-CD20 x anti-CD3).

[00254] Não foi observada nenhuma liberação mensurável de IL-2 em poços contendo células HEK293 / hoD20 ou HEK293 / hocD20 / CD22 com quantidades constantes de REGN1945, devido à ausência de estimulação alogênica de células T primárias suficiente (Figura 3). A liberação de IL-2 foi, no entanto, detectada em poços contendo célu- las negativas Raji / CD80 e CD86 com quantidades constantes de REGN1945, devido a uma resposta alogênica significativa fornecendo estímulo primário suficiente, mesmo na ausência de agrupamento de CD3 mediado por anticorpos (Figura 3 e Tabela 21).

[00255] Níveis mensuráveis de IL-2 foram detectados em amostras contendo células HEK293 / hnoD20 ou HEK293 / hocD20 / CD22 quan- do uma concentração constante de REGN2281 2nM e CD28 mab pa- rental (REGN5705, ver acima) foi adicionada. Ao contrário do mMAb CD28 bivalente, a liberação de IL2 não foi drasticamente intensificada quando mAbs biespecíficos anti-CD22 x anti-CD28 são adicionados a poços contendo células HEK293 / hnoD20 e REGN2281. Foi apenas na presença de células HEK293 / hnoD20 / CD22 e REGN2281 que os mAbs biespecíficos anti-CD22 x anti-CD28 intensificaram significati- vamente a liberação de IL-2 (Figura 3 e Tabela 22).

[00256] As tabelas 19-22 são apresentadas a seguir.

[00257] A Tabela 19 apresenta os valores máximos tabulados de ECs5so e quantidade de vezes de indução da atividade da luciferase em células T manipuladas co-incubadas com HEK293/hcD20, HEK293/ hCcD20/hCD22 ou RAJI/CD80 e células negativas CD86 e REGN1945 200pM constante (controle de isotipo).

[00258] A Tabela 20 apresenta os valores tabulados máximos de ECs5o e quantidade de vezes de indução da atividade de luciferase em células T manipuladas co-incubadas com HEK293 / hoD20, HEK293 / hCD20/hCD22 ou células negativas Raj//CD80 e CD86 e REGN2281 200pM constante (anti-CD20 x anti-CD3).

[00259] A Tabela 21 apresenta os valores tabulados máximos de ECs5o, e quantidade de vezes de indução da liberação de IL-2 de célu- las T CD4* co-incubadas com HEK293 / hocD20, HEK293 / hop20 / hCD22, ou RAJI / CD80 e células negativas CD86 e REGN1945 2nM constante (controle de isotipo).

[00260] Tabela 22. Apresenta os valores tabulados máximos de ECs5o, e quantidade de vezes de indução de liberação de IL-2 de célu- las T CD4* co-incubadas com HEK293 / hocD20, HEK293 / hop20 / hCD22, ou Raji / CD80 e células negativas CD86 e REGN2281 2nM constante (anti-CD20 x anti-CD3).

Tabela 19: Valores máximos de ECrso, e quantidade de vezes de indução da atividade de luciferase em células T repórter proje- tadas na ausência de estimulação de TOR com REGN1945 200pM (controle de isotipo): Anticorpos HEK293 / hcD20 HEK293 / hcD20 / hcD22 Raji / CD80 e CD86 negativa ECso [M] | Quantidade de | RLU ECs5o [M] Quantidade de | RLU ECs5o [M] Quantidade de | RLU vezes de indução | máx. vezes de indução | máx. vezes de indução | máx. REGN5705 6,23E- 24980 |8,45E-09 25060 |7,88E-09 33180 o Abreviações: ND = não determinado = Tabela 20: Valores máximos de ECso, e quantidade de vezes de indução da atividade de luciferase em células T repórter S »” projetadas na presença de estimulação de TOR com 200pM REGN2281 (aCD20 x aCD3): 3

Tabela 21: Valores máximos de ECso, e quantidade de vezes de indução da liberação de IL-2 de Tells CD4* hu- manos primários na presença de REGN1945 2 nM (Controle de Isotipo). ECso [M] | Quantidade RFU máx. | ECso [M] | Quantidade RFU máx.

Tabela 22: Valores máximos de ECs5o, e quantidade de vezes de indução da liberação de IL-2 de células T CD4* humanas primárias na presença de REGN2281 2 nM (aCD20 x aCD3). Anticorpos | HEK293/hCD20 HEK293 / hcD20 / hcD22 Raji / CD80 e CD86 negativa EC50 | Quantidade de | RFU máx.

EC50 [M] | Quantidade RFU máx.

EC50 [M] | Quantidade de | RFU máx.

IM] vezes de indu- de vezes de vezes de indução ção indução REGN5837 1,21E+04 — [2,35E-10 [55,61 1,01E +05 | 4,66E-11 2,40E + 05 REGN5838 1,31E-04 6,85E-10 | 53,73 9,63E+04 |8,93E-11 2,54E-05 REGN5705 |2,23E- 4,07E-09 4,51E-11 o9 30,80 6,89E + 04 32,24 5,74E + 04 6,15 2,49E + O5 CD28 de um | NC NC NC o braço 19,45 3,99E-04 6,85 1,89E-04 4,45 1,79E + O5 E Controle de x isotipo 1,22 2,22E + 03 1,00 3,20E + 03 1,00 4,54E + 04 Abreviações: NC = não calculável (denotado para curvas nas quais a ligação não atingiu a saturação); ND = não determinado.

Exemplo 10: O efeito de uma Combinação de Anticorpo anti-CD22 X anti-CD28 mais Cemiplimabe na Liberação de IL-2 de Células Projetadas para Expressar PD-L1 Materiais e Métodos Engenharia de APCs: Células RAJI

[00261] RAJI é uma linhagem celular de linfócitos B isolada de um macho de 11 anos de idade em (ATCCO CCL-86 "Y). RAJI é mantida em RPM! + FBS a 10% + P/S/G+ NaPyr + HEPES.

Raji CD80 e CD86 negativa

[00262] A expressão de CD80 e CD86 em células RAJI foi elimina- da usando o sistema CRISPR / Cas9.

Clone NALM6 G5

[00263] O clone NALM6 é uma linhagem celular de leucemia linfo- blástica aguda (ALL) isolada de um homem de 19 anos em [clone NALMG6 G5 (ATCC, & CRL-3273)]. As células NALM6 são mantidas em RPMI + FBS a 10% + P/S/G.

WSU-DLCL2

[00264] WSU-DLCL?2 é uma linhagem celular DLBCL humana isola- da do derrame pleural de um macho caucasiano de 41 anos de idade (Leibnitz Institute-DSMZ, Cat. tt ACC 575).

Linhagens celulares projetadas PD-L1

[00265] As linhas celulares NALM-6, RAJI CD80 e CD86 negativas (RAJI / CD80-CD86-) e WSU-DLCL?2 foram geneticamente modificadas para expressar de forma estável PD-L1 humana (aminoácidos M1- T290 do número de acesso NP 054862.1). As linhagens celulares re- sultantes NALM6 / PD-L1, RAJI / CD80-CD86- / PD-L1 e WSU-DLCL2 / PD-L1 foram mantidas em seus respectivos meios, suplementados com 0,5ug / mL de puromicina para RAJI / CD80-CD86 -, e 1ug / mL de puromicina para células NALM-6 / PD-L1 e WSU-DLCL?2 / PD-L1.

Ensaios de Ativação de Células T para Proliferação de Células Te Liberação de IL-2

[00266] O efeito de REGN5837 na liberação de IL-2 foi avaliado usando células T primárias humanas e linhas celulares de linfoma de células B humanas alogênicas [NALM-6, NALM-6 / PD-L1, RAJI / CD80-CD86-, RAJI / CD80-CD86 - / PD-L1, WSU-DLCL2, WSU- DLCL2 / PD-L1]) na presença de uma concentração fixa de cemipli- mabe. A co-cultura de leucócitos primários com células geneticamente distintas leva à incompatibilidade de determinantes alogênicos e pode resultar na ativação de células T. Para ensaios usando células NALM- 6 e RAJI / CD80-CD86- (+/- PD-L1), os ensaios de ativação de células T foram realizados com células T primárias humanas enriquecidas de 3 doadores, enquanto os ensaios utilizando células WSU-DLCL?2 (+/- PD-L1) usaram células T de 1 doador. Isolamento de células T usadas em Ensaios de ativação de célu- las T para testar o tratamento de combinação REGN5837 + REGN2810.

[00267] Para experimentos utilizando células NALM-6 e RAJI / CD80-CD86-, células T CD3 + foram isoladas de PBMC de 3 doadores (555109, 555130 e 555131), enquanto PBMC de um doador (555175) foi usada para ensaios com células WSU-DLCL2. Para o doador 555109, as PBMC foram isoladas do sangue periférico usando centri- fugação em gradiente de densidade. Resumidamente, 15ml de Ficoll- Paque PLUS são adicionados a tubos cônicos de 50ml e, subsequen- temente, 30ml de sangue diluído 1:1 com PBS contendo 2% de FBS são colocados em camadas por cima. Após uma centrifugação de 30 minutos a 400 xg, com o freio desligado, a camada de células mono- nucleares é transferida para um tubo novo, diluída 5x com PBS con- tendo 2% de FBS e centrifugada por 8 minutos a 300 x g. Para o doa- dor 555130, 555131 e 555175, PBMCs foram isolados de sangue peri-

férico de doadores saudáveis usando EasySep Direct Human PBMC Isolation Kit da Stem Cell Technologies e seguindo o protocolo do fa- bricante. PBMCs isoladas foram congeladas em FBS contendo 10% de DMSO. Para o isolamento de células T CD3 +, frascos congelados de PBMC foram descongelados em banho-maria 37C e diluídos em meio de estimulação (meio de cultura de células X-VIVO 15 suplemen- tado com 10% de FBS, HEPES, NaPyr, NEAA e 0,01 mM de BME) contendo 50 Nuclease de benzonase U / ml. As células foram centrifu- gadas a 1.200 rpm por 10 minutos, ressuspensas em tampão EasySep e isoladas usando o kit StemCell Technologies EasySep T-Cell Isola- tion, seguindo o protocolo do fabricante. Liberação de IL-2 a partir de células T CD3* primárias tratadas com anticorpos CD28: Ensaio de ativação de células T com células humanas OVCAR-3, PEO1, NALM-6, RAJI / CD80-CD86- e WSU-DLCL?2 (+/- PD-L1)

[00268] Células T CD3 +, ressuspensas em meio de estimulação (meio de cultura de células X-VIVO 15 suplementado com 10% de FBS, HEPES, NaPyr, NEAA e 0,01 mM de BME), foram plaqueadas em placas de fundo redondo de 96 poços a uma concentração de 1x10º células /poços. Células NALM-6, RAJI / CD80-CD86-, WSU- DLCL2 com ou sem PD-L1 (+/- PD-L1) foram tratadas com 20 ug / mL (RAJI) ou 15 ug / mL (NALM-6 e WSU-DLCL2), de mitomicina C para interromper a proliferação. Após incubação por 1 hora a 37ºC, 5% de CO?, as células tratadas com mitomicina C foram lavadas 3 vezes com D-PBS contendo 2% de FBS, seguido por ressuspensão em meio de estimulação. Células NALM-6, RAJI / CD80-CD86- e células WSU- DLCL?2 (+/- PD-L1) foram adicionadas a poços contendo células T CD3 + a uma concentração final de 2,5x10º células / poço para células RAJI e WSU-DLCL?2 e 5x10º para células NALM-6. Uma concentração cons- tante de cemiplimabe ou controle de IgG4" de não ligação (20 nM) foi adicionada aos poços. Em ensaios usando células WSU-DLCL2 (+/- PD-L1), uma concentração constante de belatacept (hCTLAA4.hlgG1) ou controle de IgG1 não ligado (5O0nM) foi adicionada aos poços. Sub- sequentemente, anticorpo de controle REGN5837 ou um não TAAxCDZ28 foi titulado de 3,1pM a 200nM em uma série de diluição 1:4 para células NALM-6 (+/- PD-L1) e de 0,6pM a 1000nM em uma série de diluição 1:6 para células WSU-DLCL2 e RAJI / CD80-CD86- (+/- PD-L1) e adicionado aos poços. O ponto final da curva de concentra- ção de 10 pontos não continha anticorpo de controle REGN5837 ou não TAAXCD28. Após incubar as placas por 72h (WSU-DLCL?2 (+/- PD-L1)) ou 96h (NALM-6 e RAJI / CD80-CD86- (+/- PD-L1)) a 37ºC, 5% CO?2, 50 ul do sobrenadante do meio foi coletado para medir a liberação de IL-2.

[00269] Para a liberação de I|L-2, 5 ul de sobrenadante foram tes- tados usando o kit IL-2 AIphaLISA humano de acordo com o protocolo do fabricante. As medições de IL-2 foram adquiridas no leitor de placas multilabel da Perkin Elmer Envision. Uma curva padrão de concentra- ções de IL-2 conhecida foi incluída e usada para derivar os valores de pg / ml.

[00270] Todas as diluições em série foram testadas em triplicata para liberação de IL-2. Os valores de EC50 para os anticorpos foram determinados a partir de uma equação logística de 4 parâmetros ao longo de uma curva de resposta a dose de 10 pontos usando o softwa- re GraphPad Prism "“. Os níveis máximos de liberação de IL-2 são dados como a resposta máxima média detectada na faixa de dosagem testada. Adicionalmente, os dados relatados para ensaios usando cé- lulas WSU-DLCL?2 incluem os valores de IL-2 gerados na ausência ou presença de anticorpo titulado 1000 nM, a fim de capturar a diminuição em IL-2 observada com o aumento da concentração de anticorpo não TAAxCD28.

Sumário dos resultados e conclusões: Ensaio funcional de IL-2 usando células T CD3+ humanas primárias:

[00271] A capacidade dos anticorpos biespecíficos anti-CD22 x anti- CD28 de fornecer coestimulação através de CD28 em células T na presença de linhas de células de linfócitos B, que expressam CD22 endogenamente, foi avaliada em um ensaio funcional de células T CD3+ primárias medindo a produção de citocina IL-2.

[00272] As curvas de ativação são mostradas nas Figuras 5A e 5B para células T incubadas com NALM-6 (+/- PD-L1) (Figura 5A) ou RAJI / CD80-CD86- (+/- PD-L1) (Figura 5B). Os valores de EC50 e Max IL-2 estão resumidos na Tabela 23A para células T CD3 + incubadas com células NALM-6 (+/- PD-L1) e na Tabela 23B para células T CD3+ in- cubadas com RAJI / CD80-CD86- (+/- PD-L1) na presença de controle de isotipo de hlgG4º 20 nM constante ou cemiplimabe. Para células T CD3 + incubadas com células WSU-DLCL?2 (+/- PD-L1), as curvas de ativação são mostradas na Figura 4. Os valores de EC50 e IL-2 (rela- tados para REGN5837 ou não TAAXCD28 OnM ou 1000nM) são suma- rizados na Tabela 24 para células T incubadas com células WSU- DLCL?2 (+/- PD-L1) na presença de qualquer controle de isotipo hlgG4" 20nM constante ou cemiplimabe e na presença de controle de isotipo hlgG1 50nM constante ou do receptor CTLA-4, belatacept.

[00273] Na presença de células T primárias humanas e das linha- gens celulares de linfócitos de células B alogênicas RAJI / CD80- CD86- e NALM-6, REGN5837 mediou aumentos dependentes da con- centração na liberação de |L-2. O anticorpo de controle não TAAxCD28 aumenta ligeiramente a IL-2 em altas concentrações de anticorpos. Na ausência de PD-L1 em células RAJI / CD80-CD86- ou NALM-6, a adição de cemiplimabe 20 nM não tem impacto na libera- ção de IL-2. Na presença de células RAJI / CD80-CD86- ou NALM-6 expressando PD-L1, o máximo de IL-2 liberado em resposta ao trata-

mento com REGN5837 sozinho é reduzido, em comparação com célu- las T incubadas com células que expressam não-PD-L1. A adição de cemiplimabe intensifica minimamente a liberação de IL-2 mediada por REGN5837 em condições com células NALM-6 / PD-L1, enquanto aumenta significativamente a liberação de IL-2 na presença de células RAJI / CD80-CD86- / PD-L1, para níveis observados em condições com células RAJI / CD80-CD86-, sem PD-L1.

[00274] Na presença de células T primárias humanas e da linhagem celular de linfócitos de células B alogênicas WSU-DLCL?2, não foi ob- servado nenhum aumento dependente da concentração na liberação de IL-2. O anticorpo de controle não TAAXCD28, por outro lado, foi ob- servado diminuir a liberação de IL-2 de uma maneira dependente da concentração. Ao contrário das células NALM-6 e RAJI / CD80-CD86, que expressam pouco ou nenhum ligante CD28, a linha celular WSU- DLCL?2 é conhecida por expressar ligantes CD28. Como o braço de ligação de CD28 de REGN5837 e, portanto, o braço de CD28 do anti- corpo não TAAXCD28, é conhecido por competir com ligantes CD28 pela ligação a CD28, o anticorpo de controle não TAAXCD28 bloqueia a ativação de CD28 pelo ligante CD28 expresso nas células WSU- DLCL2, levando à diminuição da liberação de IL-2. Ao contrário do controle não TAAXCD28, a IL-2 não é diminuída pelo REGN5837, de- vido à sua capacidade de ancorar nas células WSU-DLCL2 por meio de seu braço de ligação de CD22, permitindo que se comporte de for- ma semelhante aos ligantes de CD28, essencialmente substituindo-os. Na presença de células WSU-DLCL?2 / PD-L1, a liberação basal de |IL- 2 é diminuída em comparação com células WSU-DLCL?2 que não ex- pressam PD-L1. A adição de REGN5837 sozinho, na ausência de cemiplimabe, leva a uma ligeira intensificação da liberação de IL-2. Após a adição de cemiplimabe 20nM, a atividade basal é intensificada e pode ser intensificada um pouco ainda mais com uma titulação de dose de REGN5837, tornando a liberação máxima de IL-2 maior para a combinação de REGN5837 e cemiplimabe, em comparação com qualquer tratamento sozinho. Conforme observado com as células WSU-DLCL?2, a incubação de células WSU-DLCL2 / PD-L1 na presen- ça de não TAAXCD28 leva a menores níveis de |L-2, independente- mente se cemiplimabe ou o controle de isotipo hlgG4º está presente. Para explorar ainda mais o impacto que a expressão do ligante CD28 tem no mascaramento do impacto do REGN5837, o receptor solúvel de CTLA-4 belatacept, ou um controle de isotipo compatível com hlgG1, foi adicionado a 50 nM. O belatacept se liga com alta afinidade aos ligantes CD28, CD80 e CDB86, e bloqueia sua interação e, portan- to, a ativação do CD28. Na presença de Belatacept 50 nM, a liberação basal de IL-2 é drasticamente reduzida, devido à incapacidade dos li- gantes de CD28 de se ligar a CD28 e fornecer sinalização coestimula- tória. Nessas condições, REGN5837 ainda é capaz de envolver CD28 e fornecer co-estimulação, observada pela intensificação dependente da dose de liberação de IL-2. Embora a adição de cemiplimabe 20nM, por si só, não aumente a liberação de IL-2 na presença de belatacept, a combinação de cemiplimabe com doses crescentes de REGN5837 aumenta a liberação máxima de IL-2, em comparação com REGN5837 sozinho, na presença de células projetadas para sobre-expressar PD- L1.

Tabela 23A: Combinação de REGN5837 com Cemiplimab Intensifica a Liberação de IL-2 Acima do Tratamento de REGN5837 Sozinho em Células NALM-6 Projetadas para Expressar PD-L1

Célias pimárics = 4 NALM-6 (+/- PD-L1) Max [pg/ml] REGN5837 Cemiplimab 199.50 8.22E-10 NALM-6 hige4" 217.80 7T.54E-10 Dosdora Não rTAAxCDag — IPEMiPlimabi — 2177 | s55109 hlgG4 24,74 causst REGN5837 Cemiplimab 68.34 7.42E-10 NALM-6/ hige4? 40.26 6.70E-10 hPD-L1 . Cemiplimab 10.07 [ND | Não | = -TAA x CD28 hige4 71.80 Cemiplimab 281.00 8.31E-10 NALM-6 REGNS837 hlgG4" 261.30 7.18E-10 Não -TAAX CD28 Cemlplimab 27.51 ão E nes | 2516 Cemiplimab 123.20 7.50E-10 é REGN5837 E CNS? | NALM6/ |Reense | hige4 75.29 8.72E-10 hPD-L1 Não -TAA x CD28 Cemiplimab 10.29 ão 1 OS higea” REGN5837 Cemiplimab| 294.20 | 9.96E-10 hlgG4 264.90 1.05E-09 NALM-6 Cemiplimab 21.13 o” a nGa | DS REGN5837 Cemiplimab 90.17 8.57E-10 NALM-G/ higG4" | some | sose1o hPD-L1 - Cemiplimab 11.35 Não = TAAKCDAS hlge4 ND: Não determinado porque não foi observada uma resposta depen- dente da concentração.

Tabela 23B: Combinação de REGN5837 com Cemiplimab Intensifica a Liberação de IL-2 Acima do Tratamento de REGN5837 Sozinho em Células RAJ! / CD80 CD86' Projetadas para Expressar PD-L1

Células primárias — RaJ1/CDS0'CDS6' (+/- PD-L1) Max pg/ml! | ECso [M] Cemiplimab| “ 1258.00 1.41E-10 RAJ|/CD80" REGNSES? hige4" 1149.00 1.28E-10 Doadora CDR6 Não -TAAx CD28 Cemiplimab 503.70 I555 higG4' 454.90 9.49E-08 550 REGNSES7 Cemiplimab] — 910.70 1.87E-10 RAJ|/CD8O' hs" | 23060 | 386E11 CDR6/PD-L1 Não - 518.80 e O he 8.20E-06 Cemiplimab 791.90 9.31E-11 RAJ|/CD80 REGNSES? hige4" 711.60 5.04E-11 cDB6 . Cemiplimab 489.70 N: - [E o TAAX CD28 he" 370.00 Células T REGN5837 Cemiplimab 664.30 6.15E-11 RAJ|/CD80 higG4 182.10 5.24E-11 cres/PDL1i | q - Cemiplimab| — 426.80 e ne | 8529 | 724508 REGN5837 Cemiplimab] “437,40 1.268E-10 RAJI/CD8U hige4" 426.10 9.31E-11 Doadoa — CP86 Não .TAAx CD28 162.20 $ 975.08 555131 hige4 156.60 7.92E-08 Células T REGN5837 Cemiplimab 406.00 3.168E-10 RAJI/CD8U hige4 132.40 2.58E-10 CDBG/PD-L1 Não - Cemiplimab 94.94 NC > TARX CDA higea? 37.24 NC NC: Não calculado porque os dados não se ajustam a uma equação logística de 4 parâmetros.

Tabela 24: Combinação de REGN5837 com Cemiplimab Intensifica a Liberação de IL-2 Acima do tratamento de REGN5837 Sozinho em Células WSU-DLCL2 que expressam PD-L1

. . 1-2 a 100nM 11-22 0nM Células primáies — nsu pica (s/-PD-L1) [pg/ml] ng/ml] | ECso [MI] 165o IM) | REGNSS37 [cemiplmab] 227635 | 321769 [| | no | wsuvico | hos | 228428 | 246254 | | no | Doadora | 1 Taca [Ss Teiess asseas | estão ST rear [A ren A wsv- | nos | 20084 | 12481 [130812] DICLZ/PDLI | nã rAAxCDas — [2emblmab| —66iz | 44451 [| Jasreos : | ne | 1547 | srt | | no | | Recs [ERES aaa e eee Doadora — RAJV/CDSO | nes | 1809866 | 7166 146612) CDss . |Cemipimab| — 50233 | 16455 | Ne] Cânas t+ | e raanenas EE a ni e sOnM | É Rsenssr [ema E RA EA Relatacept | RAIV/CDSO | noes | 23623 | 519 33062 CDBS/PD-L1 | não raaxcoas [esmo ARO AA e —— 2 [ hesa | 1a4ao | 172 [no [ ND: Não determinado porque não foi observada uma resposta depen- dente da concentração. NC: Não calculado porque os dados não se ajustam a uma equação logística de 4 parâmetros. Exemplo 11. Eficácia Antitumoral da administração de REGN5837 na Presença e Ausência de REGN1979 Introdução

[00275] REGN5837 é um anticorpo biespecífico baseado em Ig9G4 humana (bsAb) projetado para alvejar NHLs de células B (por exem- plo, DLBCL) através da ponte de células B CD22*com células T CD28 *. O "sinal 2" fornecido por REGN5837, em combinação com outros agentes que fornecem "sinal 1" (por exemplo, administração de um sinal por meio de estimulação de células T primárias por meio de agrupamento de TCR ou CD3), tal como o anticorpo biespecífico CD20xCD3 (bsAb) REGN1979, pode fornecer ativação de células T amplificada e extermínio mediado por células T de NHLs de células B, aprofundando a resposta ao CD20xCD3. Além disso, REGN5837 pode fornecer maior eficácia em pacientes que não respondem à monotera- pia com CD20xCD3.

[00276] Os estudos descritos abaixo avaliaram a eficácia antitumo- ral do CD22xCD28 bsAb REGN5837, na presença ou ausência de uma dose subeficaz de CD20xCD3 bsAb (REGN1979), administrado a camundongos NSG imunodeficientes carregando 8 dias, tumores de leucemia de células B estabelecidos.

[00277] Resumidamente, camundongos (n = 6 a 9 por grupo) foram intraperitonealmente (IP) enxertados com células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) e intravenosamente (IV) implanta- dos 12 dias depois com células humanas de leucemia de células B NALM-6, que foram projetadas para expressar luciferase para permitir a imagem de bioluminescência (NALM-6-luc). A eficácia antitumoral de REGN5837 a 0,04, 0,4 e 4 mg / kg, em combinação com uma dose fixa de 0,04 mg / kg de REGN1979, foi comparada a monoterapias de REGN5837 e REGN1979 e a bsAbs de controle de IgG4PPYA sem pon- te. Os camundongos receberam doses de anticorpos por injeção intra- peritoneal (IP) 8, 15 e 22 dias após a implantação de células NALM-6- luc. A carga tumoral foi avaliada duas vezes por semana ao longo da duração do experimento.

Materiais e Métodos Linhagens Celulares Derivadas de Humano

[00278] —NALM-6-luc: A linhagem celular NALM-6 é uma linhagem celular de leucemia linfoblástica aguda isolada de um paciente macho de 19 anos (DSMZ, cat tt ACC 128); esta linhagem foi modificada com o lentivírus EF1a-Luciferase-2A-GFP-Puro (GenTarget) para facilitar a imagem do crescimento de células tumorais in vivo.

[00279] — PBMC: PBMC humanas foram obtidas da ReachBio, Cat.

0500-401, donor f 0180905 (experimento de crescimento do tumor) e 0180621 (experimento de anticorpo sérico) Projeto Experimental Sistema de Teste

[00280] “Camundongos NSG fêmeas (idade de 8-9 semanas de ida- de) foram usados em todos os experimentos. Todos os camundongos foram enxertados IP com PBMC humana e, em seguida, implantados IV com células de leucemia de células B NALM-6-luc 12 dias após o enxerto. O projeto experimental é detalhado na Tabela 25. O cresci- mento do tumor foi monitorado por imagens de bioluminescência duas vezes por semana ao longo da duração do estudo. Para todos os ex- perimentos, os camundongos foram alojados na instalação de animal Regeneron em condições padrões. Todos os experimentos com ani- mais foram realizados de acordo com as diretrizes do Comitê Instituci- onal de Cuidados e Uso de Animais da Regeneron. Enxerto de camundongos NSG

[00281] “Camundongos NSG imunodeficientes fêmeas foram enxer- tados IP com 4x10” PBMC humana. Os níveis de células T foram veri- ficados 11 dias após o enxerto por coleta retro-orbital de sangue e avaliação da porcentagem de células CD45* humanas em todas as células vivas no sangue total por citometria de fluxo; os níveis de en- xerto variaram de 0,16 a 16% de células hoD45*. Camundongos NSG enxertados com PBMC foram subsequentemente implantados com células NALM-6-luc. Condições de Cultura NALM-6-Luc e Implantação de Tumor

[00282] A linhagem celular NALM-6 foi modificada com lentivírus EF1a-Luciferase-2A-GFP-Puro (GenTarget) para facilitar a imagem do crescimento de células tumorais in vivo. A linhagem celular foi mantida em RPMI com FBS a 10% suplementado com PSG (penicilina, estrep- tomicina e glutamina) e sob seleção com puromicina.

[00283] As células NALM-6-luc foram coletadas por centrifugação e ressuspensas em PBS a 2,5x107 células / mL. Camundongos NSG fo- ram injetados IV com 200 ul (5x10º células) de células NALM-6-luc no dia 12 pós-enxerto com PBMC. Dosagem de Anticorpos para Medição de Tumor

[00284] Antes da dosagem com artigos ou controles de teste, os camundongos foram atribuídos aos grupos, estratificados de acordo com a carga do tumor e os níveis de enxerto de células T.

Os anticor- pos (REGN5837, REGN1979, REGN5671 [bsAb de controle sem pon- te não TAAXCD28] ou H4sH17664D [bsAb de controle sem ponte não TAAxCD3]) foram administrados como monoterapia ou em combina- ção por injeção |P nos dias 8, 15 e 22 após -implantação (para eficácia in vivo) nas doses indicadas na Tabela 25.

Tabela 25: Projeto Experimental para Avaliar o Crescimento do Tumor N por Grupo | Dose de REGN5837 | Dose de REGN1979 ou | Programação de Dosa- | Volumes de Tumor de ou não TAAXCD28 não TAAXCD3 gem de Ab (injeção IP) Dias Medidos REGN5837 4 mg/kg + REGN1979 REGN5837 0,4 mg / kg + REGN1979 Dias 8, 15 e 22 pós- REGN5837 0,04 moi kg 0.04 ma / k implantação d a Dias 6, 10, 14, 17, 20 e ” | m: Implantação e ceêlulas + REGN1979 9/9 piantas: 23 pós-implantação — NALM-6-luc REGNS5837 + não TAAXCD3 E 4 mg/kg Não TAAXCD28 + REGN1979 [8 | 4 mg/kg É Não TAAXCD28 + Não & 4 mg/kg 32 TAAXCD3 R º Um camundongo desse grupo morreu no início do experimento e foi excluído.

Essas mortes não foram devido a car- ga tumoral e provavelmente não foram relacionadas à dosagem com artigos de teste, já que um camundongo morreu no grupo de controle

Medição do Tumor e Ponto Final Designado

[00285] Os camundongos implantados com tumores NALM-6-luc foram fotografados duas vezes por semana usando um instrumento IVIS Spectrum, e os dados foram analisados usando o software Living Image. Antes da imagem, os camundongos foram injetados IP com substrato de luciferina. Após dez minutos, os camundongos foram anestesiados com isoflurano e a bioluminescência (fluxo total, expres- so em fótons por segundo [p / s]) quantificada. O experimento foi en- cerrado quando os camundongos começaram a exibir sinais de doen- ça do enxerto contra hospedeiro (GVHD) (avaliada como perda de pe- so 2 20%) de acordo com os padrões IACUC. Análise Estatística do Crescimento do Tumor

[00286] Os resultados do volume do tumor ao longo do tempo foram analisados usando uma análise de variânça a 2 variáveis (ANOVA) seguida pelo teste post hoc de Tukey para comparações múltiplas. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando p<0,05. As análises estatísticas foram realizadas usando o software GraphPad Prism (versão 8).

RESULTADOS Eficácia Antitumoral da administração de REGN5837 na Presença e Ausência de REGN1979 Camundongos NSG imunodeficientes com tumores NALM-6-luc receberam injeções IP de anticorpos ou controles sem ponte con- forme descrito acima.

[00287] Em camundongos com tumor, o tratamento com 0,04, 0,4 e 4 mg / kg de REGN5837 na presença de 0,04 mg / kg de REGN1979 resultou na supressão estatisticamente significativa do crescimento do tumor em comparação com bsAbs de controle sem ponte (não TAAXxCD28 e não TAAxCD3 bsAbs) no dia 23 pós-implantação (p<0,05, p0,01 e po,001, respectivamente) (Figura 6). No dia 20 pós-

implantação, foi observada supressão significativa do crescimento do tumor para os grupos de 0,4 e 4 mg / kg (p<0,05 para ambos os gru- pos). Nem monoterapia de REGN5837 (4 mg / kg) nem REGN1979 (0,04 mg / kg) reduziu significativamente o crescimento do tumor em comparação com bsAbs de controle sem ponte. Nenhuma diferença entre qualquer dose de combinação REGN5837 + REGN1979 e qual- quer monoterapia bsAb alcançou significância estatística. O cresci- mento rápido do tumor foi observado após a dosagem com bsAbs de controle sem ponte ao longo do período de dosagem, e todos os ca- mundongos foram sacrificados no dia 23. Em todos os grupos, GVHD foi observado em pelo menos um camundongo no final do experimento (avaliado como 220% de redução no peso).

[00288] Em um experimento independente usando um conjunto di- ferente de camundongos, o sangue foi coletado nos seguintes pontos de tempo para determinar as concentrações de anticorpos no soro: | e 4 horas pós-dose no dia 7, 1 hora pré-dose e 4 horas pós-dose nos dias 14 e 21 e uma vez ao dia 29. As concentrações mínimas de anti- corpos no soro durante o período de dosagem foram determinadas 1 hora antes da dosagem nos dias 14 e 21. A administração de doses de REGN5837 de 0,04, 0,4 e 4 mg / kg na presença de 0,04 mg / kg de REGN1979 foi associada a concentrações mínimas de REGN5837 no soro variando abaixo do limite de quantificação (BLQ) a 0,1, 1,6 a 2,3, e 16,5 a 21,1 ug / mL, respectivamente. As concentrações mínimas de REGN1979 no soro foram BLQ em todos os casos (dados não mostra- dos).

CONCLUSÕES

[00289] “Doses de 0,04,0,4e4mg/kgde REGN5837 na presença de 0,04 mg / kg de REGN1979 foram eficazes na supressão do cres- cimento do tumor de leucemia de células B NALM-6 em camundongos. Não foi observada nenhuma supressão tumoral significativa com mo-

noterapia de 4 mg / kg de REGN5837 ou 0,04 mg / kg de REGN1979 em relação ao controle. Exemplo 12: Citotoxicidade baseada em FACS em anticorpo bies- pecífico coestimulatório de células CD22 + PBMC +/- CD22xCD28 humano (CD22xCD28 fixo, CD20xCD3 titulado) Materiais e Métodos

[00290] A intensificação de CD22xCD28 de extermínio alvejado a CD20xCD3 foi avaliada em um ensaio de citotoxicidade de 96 horas alvejando as células Nalm6 ou WSU-DLCL2. Resumidamente, PBMCs humanas foram semeadas em meio RPMI suplementado a 1x10º célu- las / mL e incubadas durante a noite a 37ºC, a fim de enriquecer linfó- citos pela depleção de macrófagos aderentes, células dendríticas e alguns monócitos. No dia seguinte, as células Nalm6 ou WSU-DLCL2 foram marcadas com 1uM do corante de rastreamento fluorescente CFDA-SE e as PBMC naive esgotadas de células aderentes foram marcadas com 1uM do corante de rastreamento fluorescente CellTrace Violet. Células alvo marcadas e PBMC (razão de célula efetora / alvo 4:1 para Nalm6, 5:1 para WSU-DLCL2) foram co-incubadas a uma di- luição em série do anticorpo biespecífico CD20xCD3 REGN1979 (faixa de concentração: 5 nM a 0,64pM) com ou sem uma concentração fixa de CD22xCD28 REGN5837 a 2,5 ug / ml (16,7 NM). No ensaio alve- jando as células Nalm6, foi adicionada uma quantidade constante de CD22xCD28 REGNB5838, controle de 1 braço CD28 biespecífico (REGN5678) ou controle de isotipo IgG4s (H4sH10154P3) a 2,5 ug / ml (16,7 nM). Após incubação durante 96 horas a 37ºC, as células fo- ram colhidas das placas e analisadas por FACS em um FACS BD LSRFortessa-X20. Para a análise FACS, as células foram manchadas com um corante reativo Fixable Live / Dead Far Red (Invitrogen). Con- tagem de 20.000 grânulos foram adicionados a cada poço imediata- mente antes da análise FACS e 10.000 grânulos foram coletados para cada amostra. Para a avaliação da especificidade de extermínio, as células foram bloqueadas em populações marcadas com CFDA-SE vivas. A porcentagem ou número de células alvo vivas foi registrada e usada para o cálculo de sobrevivência.

[00291] A ativação de células T foi avaliada incubando células com anticorpos conjugados diretamente em CD2, CD4, CD8 e CD25. À porcentagem de células CD8 + que expressam CD25 foi relatada co- mo a medida da ativação de células T. Adicionalmente, à medida que as células T proliferam, CellTraceViolet é diluído, levando a MFI inferi- or conforme medido por FACS. A proliferação de células T foi, portan- to, relatada como uma diminuição no MFI de CellTraceViolet em célu- las T CD8 +, ou como a porcentagem de células CD8 + que tinham MFI CellTraceViolet diminuído.

[00292] Os sobrenadantes deste ensaio foram coletados para análi- se dos níveis de citocina. As concentrações de IL 17a, IFNy, TNFa, IL- 10, IL-6, IL-4 e IL-2 foram analisadas usando um kit Cytometric Bead Array (CBA) seguindo as instruções do fabricante. Os níveis de citoci- na foram interpolados a partir das curvas geradas pelos padrões do kit e relatados como pg / mL. Os valores de EC50 para extermínio de cé- lulas alvo, ativação de células T, proliferação e níveis de citocina e ní- veis máximos de citocina foram calculados usando análise de regres- são não linear de 4 parâmetros no software Prism. Resultados, sumário e conclusões:

[00293] O anticorpo biespecífico anti-cCD20xCD3 REGN1979 foi tes- tado quanto à sua capacidade de induzir células T humanas naive a exterminar células alvo que expressam CD20 e CD22 humano em combinação com um anticorpo coestimulatório CD22xCD28 ou CD28 de 1 braço ou anticorpos de controle de isotipo.

[00294] “REGN1979 ativou e direcionou células T humanas para ex- terminar células Nalm6 (Figura 7) ou WSU-DLCL?2 (Figura 8) de uma maneira dependente da dose. A adição de uma concentração fixa de anticorpos biespecíficos CD22xCD28 a REGN1979 intensificou a efi- cácia citotóxica (EC50) de REGN1979 contra células Nalm6 4,7-5,2 vezes em comparação com REGN1979 com CD28 de 1 braço ou anti- corpos de controle de isotipo (Tabela 26) ou 17,5 vezes contra células WSU-DLCL2 quando comparado com REGN1979 sozinho (Tabela 27).

[00295] A lise de células alvo observada mediada por REGN1979 foi associada à ativação e proliferação de células T, conforme medido pela supra-regulação de CD25 em células CD8 + ou diluição de violeta CellTrace, respectivamente (Figura 7, Figura 8). A adição de uma con- centração fixa de anticorpos biespecíficos CD22xCD28 a REGN1979 intensificou a potência da ativação e proliferação de células T induzida por REGN1979 na presença de células Nalm6 2,3-2,6 vezes e 5,4-7,1 vezes, respectivamente, em comparação com REGN1979 com CD28 de 1 braço ou isotipo anticorpos de controle (Tabela 26), ou 8,2 e 16,1 vezes na presença de células WSU-DLCL2 quando comparado com REGN1979 sozinho (Tabela 27).

[00296] Em ensaios com células PBMC e WSU-DLCL2 humanas, REGN1979 induziu a liberação de citocinas humanas. A liberação de citocina observada com REGN1979 foi intensificada na presença de uma concentração fixa de um CD22xCD28 em comparação com a libe- ração de citocina induzida por REGN1979 sozinho (Tabela 28, Figura 9).

[00297] Em sumário, a coestimulação aumentou a potência da cito- toxicidade alvejada, ativação de células T e liberação de citocina quando comparada ao que foi observado com CD20xCD3 em combi- nação com anticorpos de controle ou sozinho.

Sumário de dados tabulados: Tabela 26: Valores de EC50 para citotoxicidade e ativação de células T com alvos Nalm6 (1 experimento) Proliferação de células T (CellTrace MFI Quantidade de vezes de EC50 Quantidade de vezes de EC50 Quantidade de vezes de EC50 " Tabela 27: Valores de EC50 para citotoxicidade e ativação de células T com alvos WSU-DLCL?2 (média de 2 ex- Z perimentos) 3 Quantidade de vezes de Quantidade de vezes de EC50 em comparação com EC50 em comparação com Quantidade de vezes de EC50 em Ab EC50 [M] REGN1979 apenas EC50 [M] | REGN1979 apenas EC50 [M] | comparação com REGN1979 apenas

Tabela 28: Liberação de citocina a partir do ensaio de citotoxici- dade de WSU-DLCL2 (média de 2 experimentos) CO ssa a Exemplo 13: Citotoxicidade baseada em FACS em NHL + PBMC +/- CD22xCD28 stim (CD22xCD28 fixo, CD20xCD3 titulado) Procedimento Experimental

[00298] A intensificação de CD22xCD28 do extermínio alvejado de CD20xCD3 foi avaliada em um ensaio de citotoxicidade de 96 horas direcionado a células NHL isoladas de biópsia primária de paciente com NHL com PBMC autólogas na presença de células estromais hu- manas (HS-5). Resumidamente, células HS-5 foram semeadas em

5.000 células por poço em uma placa de 96 poços de fundo plano e foram incubadas durante a noite. No dia seguinte, PBMC do paciente NHL foi marcada com 1 uM do corante de rastreamento fluorescente CellTrace Violet. A medula óssea e PBMC marcadas (razão de célula efetora / alvo 10:1) foram semeadas nos poços com células do estroma e co-incubadas com uma diluição em série do anticorpo biespecífico CD20xCD3 REGN1979 (faixa de concentração: 6,7 nM a 10,7 pM) e uma concentração fixa de moléculas coestimulatórias de CD22xCD28 REGN5837 ou CD28 de controle de 1 braço biespecífico (REGN5678) a 2,5 ug / ml (16,7 nM) durante 96 horas a 37ºC. As células foram co- lhidas das placas e analisadas por FACS em um FACS BD LSRFor- tessa-X20. Para a análise FACS, as células foram manchadas com um coquetel de anticorpos (CD45, CD19, CD4, CD8, CD25) e corante rea- tivo Live/ Dead próximo ao IR (Invitrogen). Contagem de 20.000 grânu- los foram adicionados a cada poço imediatamente antes da análise FACS e 10.000 grânulos foram coletados para cada amostra. Para a avaliação da especificidade de extermínio, as células alvo foram blo- queadas na população de CD45 + violeta negativa CD19 + viva. A so- brevivência foi calculada com base no número de células alvo em po- ços tratados normalizados para o número de células alvo em poços não tratados.

[00299] As células T foram bloqueadas como populações de CD4 + ou CD8 + marcadas com violeta CD45 + vivas. A porcentagem de cé- lulas CD8 + e CD4+ que expressam CD25 foi relatada como a medida da ativação de células T. Adicionalmente, à medida que as células T proliferam, CellTraceViolet é diluído, levando a MFI inferior conforme medido por FACS. A proliferação de células T foi, portanto, relatada como uma diminuição no MFI de

CellTraceViolet em células T CD8 + e CD4 +.

[00300] Os valores de EC50 para extermínio de alvo e ativação e proliferação de células T foram calculados usando análise de regres- são não linear de 4 parâmetros no software Prism. Sumário dos resultados e conclusões:

[00301] O anticorpo biespecífico anti-cCD20xCD3 REGN1979 foi tes- tado quanto à sua capacidade de induzir células T autólogas naive pa- ra exterminar células NHL da medula óssea do paciente em combina- ção com um anticorpo coestimulatório CD22xCD28 ou anticorpos de controle CD28 de 1 braço.

[00302] “REGN1979 ativou e direcionou as células T humanas para esgotar o NHL de uma maneira dependente da dose. A adição de uma concentração fixa de anticorpos biespecíficos CD22xCD28 a REGN1979 intensificou a eficácia citotóxica (EC50) de REGN1979 2,3 e 3,5 vezes em comparação ao REGN1979 com anticorpo de controle CD28 de 1 braço ou sem controle coestimulatório (Tabela 29).

[00303] A lise de células alvo observada mediada por REGN1979 foi associada à ativação e proliferação de células T, conforme medido pela supra-regulação de CD25 em células CD8 + e CD4 + ou diluição de violeta CellTrace, respectivamente. A adição de uma concentração fixa de anticorpos biespecíficos CD22xCD28 a REGN1979 intensificou a potência da ativação e proliferação de células T induzida por REGN1979 2,8 a 4,2 vezes e 2,8-4,8 vezes, respectivamente, em comparação com REGN1979 com CD28 de 1 braço ou sem controle coestimulatório (Tabela 29 e Figura 10).

[00304] Em sumário, a coestimulação aumentou a potência da cito- toxicidade alvejada e ativação de células T quando comparada ao que foi observado com CD20xCD3 em combinação com anticorpos de con- trole.

Sumário de dados tabulados: Tabela 29: Valores de EC50 para citotoxicidade e ativação de células T

EEE Extermínio (CD25 +) EC50 [M] de células T) EC50 [M] Ab de célula células Células T mM [Goat [aos etuencner | cemestens | CD8 T CD4 1,80E-11 |[4,01E-11 |2,95E-11 | 4,71E-11 4,13E-11 braço 2,72E-11 |[3,77E-11 |2,74E-11 |[4,27E-11 3,93E-11 tímulo Exemplo 14. Caracterização in vitro e avaliação in vivo da eficácia antitumoral de REGN5837 sozinho e em combinação com REGN1979 em um modelo de linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) Materiais e Métodos - Introdução aos Estudos e Sumário dos Re- sultados Estudos in vitro e in vivo foram conduzidos para avaliar:

[00305] (1) a capacidade de REGN5837 de intensificar a ativação de células T primárias por ponte de células T CD28* com células alvo CD22*. A ativação de células T foi avaliada usando citotoxicidade con- tra células alvo, expressão de marcadores de superfície celular de ati- vação de células T, proliferação de células T e níveis de liberação de citocina como leituras. Os experimentos foram realizados na presença ou ausência de REGN1979, um bsAb CD20xCD3 que faz a ponte en- tre as moléculas CD3 nas células T e as células alvo CD20* e leva à ativação das células T.

[00306] (2)a eficácia antitumoral do bsAb CD22xCD28 REGN5837, na presença ou ausência de 0,4 ou 4 mg / kg de REGN1979, adminis- trado a camundongos NSG imunodeficientes que carregam tumores DLBCL.

[00307] REGN5837 e REGN1979 foram testados em combinação em uma faixa de concentrações para avaliar o efeito de REGN5837 na citotoxicidade de células T mediada por REGN1979 contra uma linhagem celular DLBCL humana (WSU-DLCL2), supra-regulação de um marcador de ativação tardia de células T (CD25), proliferação de células T e libe- ração de citocina de células T humanas primárias. REGN5837 intensi- ficou a potência de REGN1979 para mediar a citotoxicidade de células T, expressão de superfície celular CD25 em células T CD4* e CD8' , e proliferação de células T CD4* e CD8* de uma maneira dependente da concentração. Da mesma forma, REGN5837 intensificou a potência de REGN1979 para mediar a liberação de citocina de uma maneira de- pendente da concentração. Em concentrações que variam de 77,2pDM a 100nM, REGN5837 aumentou a potência da citotoxicidade de célu- las T mediada por REGN1979 contra células-alvo; em concentrações que variam de 77,2pM a 2,78nNM, REGN5837 aumentou a potência de ativação e proliferação de células T mediada por REGN1979, mas concentrações mais altas de REGN5837 não aumentaram ainda mais a potência de REGN1979 (Tabela 30). A quantidade máxima de ex- termínio de células alvo mediada por REGN1979 e proliferação de cé- lulas T não aumentou substancialmente após a adição de REGN5837, enquanto REGN5837 aumentou os níveis máximos de liberação medi- ada por REGN1979 de IL-2, IL-4, IL-6, IL- 10, TNF-a, IFN-y e I1L-17a de uma maneira dependente da concentração.

[00308] —“Camundongos NSG imunodeficientes (n = 6 a 7 por grupo) foram implantados por via subcutânea (SC) com uma razão de 1:1 de células WSU-DLCL2 e PBMC humana. A eficácia antitumoral de REGN5837 a 1 mg / kg, em combinação com uma dose de 0,4 ou 4 mg / kg de REGN1979, foi comparada a monoterapias de REGN5837 e REGN1979 e os bsAbs de controle de IgG4P-PYA sem ponte. Os ca- mundongos receberam doses de anticorpos por injeção intraperitoneal (IP) 1, 8 e 15 dias após a implantação de células WSU-DLCL?2. O tra-

tamento com 1 mg / kg de REGN5837 na presença de 0,4 ou 4 mg / kg de REGN1979 resultou na supressão estatisticamente significativa do crescimento do tumor WSU-DLCL2 em comparação com monoterapias REGN5837 ou REGN1979 e bsAbs de controle sem ponte no dia 28 pós-implantação. A monoterapia de REGN1979 resultou em supressão modesta do crescimento do tumor, enquanto a monoterapia de REGNB5837 não teve efeito em relação ao controle sem ponte.

[00309] Em sumário, quando REGN5837 e REGN1979 foram testa- dos em combinação em uma faixa de concentrações in vitro, REGN5837 intensificou a potência de REGN1979 para mediar a ativação de célu- las T humanas na presença de células CD22* WSU-DLCL?2. Os níveis máximos de liberação de citocina mediada por REGN1979, mas não a citotoxicidade, ativação de células T ou proliferação, foram aumenta- dos na presença de REGN5837. In vivo, 1 mg / kg de REGN5837 na presença de 0,4 ou 4 mg / kg de REGN1979 foi eficaz na supressão do crescimento tumoral de linfoma de células B WSU-DLCL2 em camun- dongos em relação a monoterapia de REGN5837 ou REGN1979 sozi- nho.

Tabela 30: Sumário do efeito de REGN5837 na ativação de células T mediada por REGN1979 (medida por citotoxici- dade contra células alvo, expressão de CD25 e proliferação de células T) usando PBMC humana E anna fuer [azedo [asen [Tm o eDa” ( 0025) eng" (4 025) S No a a ci a a ? [cuaniado de vers de mutans ES] 195 ra ar Tr Tas º REGN1979 foi testado em uma faixa de concentração de 4,8fM a 10nM b Quantidade de vezes em que ECro foi calculado como ECs5so (sem REGN5837) / ECso([M] REGN5837)

EXEMPLO 15: AVALIAÇÃO DO EFEITO DE REGN5837 NA ATIVA- ÇÃO DE CÉLULAS T HUMANAS MEDIADA POR REGN1979 E TESTE DE REGN5837 E REGN1979 EM COMBINAÇÃO EM UMA FAIXA DE CONCENTRAÇÕES NA PRESENÇA DE CÉLULAS WSU- DLCL?2.

[00310] Estudos in vitro e in vivo foram realizados para avaliar a efi- cácia antitumoral do bsAb CD22xCD28 humano REGNB5837, na pre- sença ou ausência de uma dose subeficaz de um bsAb CD20xCD3 humano (REGN1979), em camundongos NSG após implantação com Células PBMC e WSU-DLCL2 humanas medindo os seguintes parâ- metros: a) citotoxicidade de células T contra células alvo CD22*; b) supra-regulação de CD25 na superfície celular de células T CD4* e CD8*, um marcador de ativação de células T; c) proliferação de células T; d) liberação de citocina (IL-4, IL-2, IL-6, IL-10, TNF-a, IFN-y e IL- 17A) Materiais e Métodos Linhagens celulares

[00311] "WSU-DLCL2: WSU-DLCL?2 é uma linhagem celular DLBCL humana isolada da efusão pleural de um macho caucasiano de 41 anos de idade (Leibnitz Institute-DSMZ, Cat. % ACC 575).

PBMC humana

[00312] Para citotoxicidade, ativação de células T, proliferação de células T e ensaios de liberação de citocina, leucopaques de doadores humanos foram obtidos do New York Blood Center (doador % 1500A).

[00313] Para experimentos em camundongos in vivo, PBMC huma- na foi obtida da ReachBio (Cat. % 0500-401).

Projeto Experimental

[00314] REGN5837 e REGN1979 foram testados em combinação em uma faixa de concentrações para avaliar o efeito de REGN5837 na citotoxicidade de células T mediada por REGN1979 contra células

WSU-DLCL?2, proliferação de células T, expressão de superfície celular de um marcador de ativação tardia de células T (CD25) e liberação de citocina de células T humanas. A porcentagem de extermínio de célu- las alvo, ativação de células T e proliferação de células T foram deter- minadas conforme descrito neste documento.

[00315] A eficácia antitumoral de REGN5837 sozinho e em combi- nação com REGN1979 em um modelo de DLBCL usando células WSU-DLCL?2 e PBMC foi avaliada conforme descrito neste documento. Ver Tabela 31. Avaliação in vitro do Efeito de REGN5837 na Potência de REGN1979 para Mediar a ativação de Células T Isolamento de Células T Primárias Humanas

[00316] Células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) foram isoladas de um pacote de leucócitos de doador saudá- vel por meio de centrifugação em gradiente de densidade usando tu- bos SepMate "" de 50 mL seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante. Resumidamente, 15 mL de FicollIPaque PLUS foram colo- cados em tubos de SepMate de 50 mL, seguido pela adição de 30 mL de sangue total diluído 1:2 com D-PBS. Os tubos foram centrifugados à temperatura ambiente a 1.200 x g durante 10 minutos com o travão desligado. A camada superior, contendo plasma e PBMC, foi decanta- da em um tubo novo. As etapas subsequentes foram seguidas de acordo com o protocolo do fabricante do SepMate. PBMC isolada foi congelada em FBS contendo 10% de DMSO a uma concentração de 250x10º células / mL em criotubos de 5 mL. PBMC foi descongelada em banho-maria a 37 º e ressuspensa em meio de estimulação (meio de cultura de células X-VIVO 15 suplementado com FBS 10%, HEPES, NaPyr, NEAA e BME 0,01 mM) contendo nuclease de benzo- nase 50 U / mL a 10 mL por 100 milhões de PBMC e centrifugada a 300 xg por 10 minutos. As células T CD3* foram isoladas de PBMC peletizada usando um kit de isolamento de células T CD3* humanas EasySep" da StemCell Technologies seguindo as instruções reco- mendadas pelo fabricante. Ensaios de ativação de células T baseados em citometria de fluxo usando PBMC

[00317] A capacidade de REGN5837 de intensificar a ativação de células T mediada por estímulo primário alogênico ou com "sinal 1" fornecido por REGN1979, foi avaliada usando células alvo WSU- DLCL2 e PBMC humanas como células efetoras. PBMC foram enri- quecidos em linfócitos conforme descrito neste documento. As células alvo e efetoras foram incubadas com o artigo de teste e anticorpos de controle conforme aqui descrito neste documento. A citometria de fluxo foi realizada para avaliar a citotoxicidade das células T, proliferação e supra-regulação de marcadores de ativação das células T, conforme descrito neste documento. Adicionalmente, o efeito de REGN5837 na liberação de citocina mediada por REGN1979 foi avaliado conforme descrito neste documento. Um bsAb não TAAXxCD28 (contendo um braço de ligação a CD28 idêntico ao REGN5837 e um braço de não ligação) foi testado como um controle de não ponte para REGN5837. Enriquecimento de Linfócitos de PBMC

[00318] PBMC humana foi semeada em meio completo (meio de cultura de células RPMI suplementado com FBS a 10%, penicilina- estreptomicina-glutamina) a 1x10º células / mL e incubada durante a noite a 37ºC para enriquecimento de linfócitos pela depleção de célu- las aderentes, como macrófagos, células dendríticas e alguns monóci- tos. Incubação de PBMC e Células Alvo com Artigos de Teste

[00319] — PBMC enriquecida com linfócitos foi colhida e marcada com 1UM de corante de rastreamento fluorescente Violet Cell Tracker. As células alvo WSU-DLCL2 foram marcadas com 1UuM do corante fluo-

rescente Vybrant CFDA-SE.

[00320] Subsequentemente, PBMC marcada com corante foi seme- ada em placas de 96 poços de fundo redondo com células alvo mar- cadas com corante a uma razão de 5:1 (WSU-DLCL2a 5x10º células alvo / poço).

[00321] PBMC plaqueada e células alvo foram incubadas por 72 horas a 37ºC com artigos de teste ou seus respectivos controles em concentrações finais variando de 12,9pM a 100nM (REGN5837 ou não TAAxXCD28) e 4,8fM a 10nM (REGN1979 ou não TAAXCD3). Análise por Citometria de Fluxo

[00322] Após a incubação com artigos e controles de teste, as célu- las marcadas com corante foram manchadas com manchamento LIVE / DEAD e com um coquetel de anticorpos marcados com fluoróforo pa- ra CD2, CD4, CD8 e CD25. Grânulos de contagem (20 uL por poço) foram adicionados imediatamente antes da análise da amostra em um citômetro de fluxo BD Celesta. Os dados de citometria de fluxo foram usados para determinar a sobrevivência das células alvo, proliferação de células T e supra-regulação de marcadores de ativação de células T. Os valores de EC5o foram determinados a partir de uma equação logística de quatro parâmetros ao longo de uma curva de resposta a dose de 9 pontos usando o software GraphPad Prism. As respostas máximas para citotoxicidade, ativação de células T (supra-regulação de CD25) e proliferação foram determinadas como o platô de resposta máxima gerada pelo ajuste da curva de Prisma. A mudança relativa em ECsoºo em comparação com o controle foi calculada como EC50no REGN5837/ EC5SO0(m] REGN5837, E a Mudança relativa na liberação máxima de citocina foi calculada como Max(mreGNS837 /(MaxNno REGNS5837. Sobrevivência de Célula Alvo

[00323] A porcentagem de células alvo viáveis em cada condição experimental foi calculada como o número de células alvo / poço mar-

cadas com CFDA-SE vivas normalizadas para o número de grânulos coletados / poço. A porcentagem de sobrevivência da célula alvo foi determinada como a razão do número de células alvo viáveis em qual- quer condição experimental sobre o número de células alvo viáveis na condição de controle sem anticorpo (células alvo na presença de PBMC apenas).

[00324] A porcentagem de citotoxicidade contra células alvo em ca- da condição experimental, quando relatada desta maneira, foi determi- nada como 100 menos a porcentagem de sobrevivência (calculada conforme descrito acima). Expressão de CD25 em Células T CD4* e CD8*

[00325] A supra-regulação de CD25 (um marcador de células T ati- vadas tardiamente) foi avaliada acoplando em células vivas, CD2* e CD4 * ou CD8*. Foi relatada a porcentagem de células T ativadas que expressam CD25 de células T totais que expressam CD4 ou CDB8. Proliferação de Células T CD4* e CD8*

[00326] A proliferação de células T CD4* e CD8 * primárias foi ava- liada usando citometria de fluxo, calculando a porcentagem de células divididas do total de células T CD4* e CD8 *. A intensidade de fluo- rescência das células manchadas com Violet Cell Tracker foi usada como uma leitura da divisão celular, já que a intensidade de fluores- cência de cada célula diminui a um fator de 2 a cada rodada de divi- são. Análise de Liberação de Citocina

[00327] Os níveis de citocinas (IL-4, IL-2, IL-6, IL-10, TNF-a, IFN-y e IL-17A) em sobrenadantes de cultura celular foram quantificados usando um Kit de citocinas BD Cytometric Bead Array Human Th1 / Th2 / Th1i7 de acordo com as instruções do fabricante. Modelo in vivo de DLBCL Usando Xenoenxertos de Células WSU- DLCL2

[00328] —“Camundongos NSG fêmeas foram usados em todos os ex- perimentos. Todos os camundongos foram implantados SC com célu- las de linfoma de células B WSU-DLCL?2 e dosados IP com anticorpos. O crescimento do tumor foi medido usando parquímetros diversas ve- zes por semana ao longo da duração do estudo. Para todos os expe- rimentos, os camundongos foram alojados na instalação de animal Regeneron em condições padrões. Todos os experimentos foram rea- lizados de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuida- dos e Uso de Animais (IACUC) na Regeneron. Condições de cultura de célula WSU-DLCL?2 e implantação de tu- mor

[00329] A linhagem celular WSU-DLCL?2 foi obtida do Leibnitz Insti- tute-DSMZ e mantida em meio RPMI-1640 com FBS a 10% suplemen- tado com penicilina, estreptomicina, glutamina e HEPES 1 mM.

[00330] Células WSU-DLCL2 (3x10º células) foram coletadas e mis- turadas com 5x10º PBMCs e ressuspensas em uma mistura 1:1 de PBS e GFR Matrigel. Camundongos NSG fêmeas foram injetados SC com 100 uL da mistura de células no flanco direito. Dosagem de Anticorpos para Medição de Tumor

[00331] Antes da dosagem com artigos ou controles de teste, os camundongos foram atribuídos aos grupos, estratificados de acordo com a carga do tumor e os níveis de enxerto de células T.

[00332] Os anticorpos (REGN5837, REGN1979, REGN5671 [bsAb de controle sem ponte não TAAXCD28] ou H4sH17664D [bsAb de con- trole sem ponte não TAAXCD3]) foram administrados como monotera- pia ou em combinação por injeção IP nos dias 1, 8, e 15 após implan- tação nas doses indicadas na Tabela 31.

Tabela 31: Projeto Experimental para Avaliação do Crescimento e Sobrevivência do Tumor N por| Dose de REGN5837 | Dose de REGN1979 | Programação de Dosa-| Volumes de Tumor de Grupo | ou não TAAXCD28 ou não TAAXCD3 gem de BsAb (injeção IP) | Dias Medidos REGN5837 7 0,4 mg / kg + REGN1979 REGN5837 + REGNI979 7 4 mg/kg Dias 1, 8 e 15 pós-| Dias 7,10, 14,16, 28, 31, REGN5837 + não TAAXCD3 1 mg/kg 4 molkg implantação de células|35,38,43,46,49,53,57e WSU-DLCL2 63 pós-implantaçã Não TAAXCD28 + REGNT979 [e 0,4 mg / kg posimplantação Não TAAXCD28 + REGN1979 [6 4 mg/kg Não TAAXCD28 + Não TAAXCD3 4 mg/kg s oo & º? Um camundongo morreu durante o experimento e foi excluído. 3

RD Medição do Tumor e Ponto Final Designado

[00333] O crescimento do tumor foi monitorado ao longo do tempo usando medições do parquímetro do diâmetro X e Y do tumor (medições perpendiculares de comprimento e largura). O volume do tumor foi calculado (X * Y * [X/2], onde X é o diâmetro mais curto). Os camundongos foram sacrificados quando o tumor atingiu o ponto final do tumor designado (diâmetro do tumor > 20 mm ou ulceração do tumor). Este ponto final foi de acordo com os padrões do IA- CUuc.

Análise Estatística de Crescimento e Sobrevivência do Tumor

[00334] Os resultados do volume do tumor ao longo do tempo foram analisados usando uma análise de variânça a 2 variáveis (ANOVA) seguida pelo teste post hoc de Tukey para comparações múltiplas. Os resultados de sobrevivência ao longo do tempo foram analisados usando um teste de Mantel-Cox em todos os grupos, e outros testes de Mantel-Cox foram executados para comparações individuais entre os grupos. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando p<0,05. As análises estatísticas foram realizadas usando Gra- phPad Prism 8.

RESULTADOS Efeito de REGN5837 na Capacidade de REGN1979 de Mediar a Ci- totoxicidade de Células T Contra Células Alvo WSU-DLCL? e Libe- ração de Citocina de PBMC Humana

[00335] “REGN5837 e REGN1979 foram testados em combinação em uma faixa de concentrações para avaliar o efeito de REGN5837 na citotoxicidade mediada por REGN1979 contra células WSU-DLCL?, ativação de células T, proliferação de células T e liberação de citocina de células T de PBMC humanaas, conforme descrito anteriormente. À Tabela 30 mostra o efeito de REGN5837 na citotoxicidade mediada por REGN1979 contra células WSU-DLCL?2, ativação de células T e proliferação de células T. Os resultados numéricos de 2 doadores hu- manos que demonstram o efeito de REGN5837 na liberação de citoci- na estão sumarizados na Tabela 32. Efeito de REGN5837 na citotoxicidade mediada por REGN1979 e proliferação de células T humanas

[00336] O efeito de crescentes concentrações de REGN5837 na potência (ECso) e eficácia (resposta máxima) de REGN1979 foi avalia- do avaliando a citotoxicidade mediada por REGN1979 contra células alvo WSU-DLCL?2, ativação de células T mediada por REGN1979 e proliferação mediada por REGN1979 de células T CD4* e CD8 * hu- manas de PBMC humana. REGN5837 intensificou a potência de REGN1979 para mediar a citotoxicidade contra células WSU-DLCL?2, ativação de células T (medida como expressão de CD25 em células T CD4 * e CD8 *) e proliferação de células T CD4* e CD8 * de uma ma- neira dependente da concentração. Em concentrações que variam de 77,2pPM a 100nM, REGN5837 aumentou a potência da citotoxicidade de células T mediada por REGN1979 contra células alvo; em concen- trações que variam de 77,2pM a 2,78nNM, REGN5837 aumentou a po- tência de ativação e proliferação de células T mediada por REGN1979, mas concentrações mais altas de REGN5837 não aumentaram ainda mais a potência de REGN1979. Esses dados são representados grafi- camente na Figura 11 e na Tabela 30. Liberação de Citocina Mediada por REGN1979 de PBMC Humana na Presença de REGN5837

[00337] O efeito do aumento das concentrações de REGN5837 na potência e resposta máxima da liberação de citocina mediada por REGN1979 de PBMC humana foi avaliado. Na presença de células PBMC e WSU-DLCL2 humanas, concentrações crescentes de REGNB5837 intensificaram os níveis máximos de liberação mediada por REGN1979 de 1IL-2, IL-4, IL-6, 11-10, TNF-a, IFN-y, e IL-17A de uma maneira dependente da concentração (Figura 12). Além disso, concen- trações crescentes de REGN5837 mostraram uma tendência de au- mentar a potência de REGN1979 para mediar a liberação de citocina. Os valores de ECr5o, níveis máximos de citocina e aumento relativo acima dos níveis de citocina de fundo (sem REGN5837) mediados por REGN1979 estão sumarizados na Figura 12 e na Tabela 32.

Tabela 32 o [rr Juros [axo [amet mA jo

S o z ? | auantidade de vezes de mudanes (BRR) [ 10 a o Le fire o o amo dao o emo

[1555 Trena Tara Tam Treme de

[qarido de vems de dans ERAS [BR ER Rg º REGN1979 foi testado em uma faixa de concentração de 4,8fM a 10nM ” CKR máxima foi relatada como o platô máximo determinado pelo ajuste da curva PRISM. º* Quantidade de vezes de mudança no nível máximo de citocina no soro foram calculadas como Max CKR ([M] REGN5837) / MAX CKR (sem REGNS5837) a Abrev: CKR, liberação de citocina; NC, não calculado porque os níveis de liberação de citocina não atingiram a saturação na faixa de con- NS centrações de REGN1979 testadas, ou uma curva de resposta a dose não pode ser ajustada. 3

Eficácia Antitumoral da Administração de REGN5837 na Presença e Ausência de Doses Subeficazes de REGN1979

[00338] Os camundongos NSG imunodeficientes carregando tumo- res WSU-DLCL2 receberam injeções IP de anticorpos ou controles sem ponte conforme descrito anteriormente neste documento.

[00339] “Em camundongos que carregam tumor, o tratamento com 1 mg / kg de REGN5837 na presença de 0,4 ou 4 mg / kg de REGN1979 resultou na supressão estatisticamente significativa do crescimento do tumor em comparação com bsAbs de controle sem ponte (não TAAxCD28 e não TAAXCD3 bsAbs) no dia 28 (6 dias após a dose final de anticorpo (Figura 13A e 13B). A combinação de 1 mg / kg de REGN5837 e 0,4 mg / kg de REGN1979 resultou em uma redução significativa no volume do tumor em relação à monoterapia de REGN1979 no dia 46.

[00340] A monoterapia de REGN1979 de 0,4 e 4 mg / kg resultou em supressão modesta do tumor em relação aos controles sem ponte no dia 28, enquanto a monoterapia de REGN5837 não teve efeito. O crescimento rápido do tumor foi observado após a dosagem com bsAbs de controle sem ponte ao longo do período de dosagem, e to- dos os camundongos sofreram eutanásia no dia 125.

[00341] Um teste de Mantel-Cox detectou diferenças estatistica- mente significativas na sobrevivência em todos os grupos (p = 0,0001), e testes adicionais de Mantel-Cox foram realizados para comparações entre os grupos. Um aumento significativo na sobrevivência foi obser- vado para camundongos dosados com 1 mg / kg de REGN5837 em combinação com 0,4 ou 4 mg / kg de REGN1979 (85% e 70% de so- brevivência, respectivamente) em comparação com camundongos do- sados com anticorpos de controle sem ponte (sem sobrevivência) (Fi- gura 14).

[00342] Além disso, um aumento significativo na sobrevida foi ob-

servado para camundongos tratados com 1 mg / kg de REGN5837 em combinação com 0,4 ou 4 mg / kg de REGN1979 em comparação com camundongos tratados com monoterapia tanto de REGN5837 quanto REGN1979.

[00343] A presente invenção não deve ser limitada no seu escopo pelas modalidades específicas descritas neste documento. De fato, várias modificações da invenção, além das descritas neste documento, ficarão evidentes aos versados na técnica a partir da descrição anterior e das figuras anexas. Tais modificações são destinada a cair no esco- po das reivindicações anexas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Molécula de ligação ao antígeno biespecífica isolada, ca- racterizada pelo fato de que compreende: a) um primeiro domínio de ligação ao antígeno (D1) que se liga ao CD28 humano; e b) um segundo domínio de ligação ao antígeno (D2) que se liga especificamente ao CD22 humano em uma célula tumoral alvo.

2. Molécula de ligação ao antígeno biespecífica isolada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o segun- do domínio de ligação ao antígeno (D2) se liga a um epítopo em CD22 humano compreendendo um ou mais aminoácidos de SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58 e / ou SEQ ID NO: 59.

3. Molécula de ligação ao antígeno biespecífica isolada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação ao antígeno biespecífica se liga a CD22 humano com um Kp de menos que cerca de 15 nM, conforme medido pela res- sonância de plasmônica de superfície a 25ºC.

4. Molécula de ligação ao antígeno biespecífica isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação ao antígeno biespecífica se liga ao CD22 de Macaca fascicularis com um Kp de menos que cerca de 60 uM, conforme medido por ressonância de plasmônica de superfície a 25ºC.

5. Molécula de ligação ao antígeno biespecífica isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação ao antígeno biespecífica se liga a CD28 humano com um Kp de menos de cerca de 45 uM, conforme medido pela ressonância plasmônica de superfície a 25ºC.

6. Molécula de ligação ao antígeno biespecífico isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação ao antígeno biespecífico se liga à superfície das células que expressam CD28 humano com um ECrso de menos que cerca de 1x10 M conforme medido por um ensaio de liga- ção FACS in vitro.

7. Molécula de ligação ao antígeno biespecífico isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação ao antígeno biespecífico se liga à superfície das células que expressam CD22 humano com um ECrso de menos que cerca de 1x108 M conforme medido por um ensaio de liga- ção FACS in vitro.

8. Molécula de ligação ao antígeno biespecífico isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação ao antígeno biespecífico demonstra um efeito coestimulatório quando usado em combinação com um anti- corpo biespecífico anti-CD20xCD3.

9. Molécula de ligação ao antígeno biespecífica isolada, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o efeito coestimulatório é um ou mais dos seguintes: (ativação de células T, indução da liberação de IL-2, indução da supra-regulação de CD25 + em PBMCs humanas; e aumento da citotoxicidade mediada por célu- las T humanas em linhagens celulares que expressam CD22.

10. Molécula de ligação ao antígeno biespecífica isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que o primeiro domínio de ligação ao antígeno (D1) com- preende: a) três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) contidas em uma região variável de cadeia pesada (HCVR) compreendendo o aminoácido de SEQ ID NO: 26; e b) três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) contidas em uma região va- riável de cadeia leve (LCVR) compreendendo a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 10.

11. Molécula de ligação ao antígeno biespecífica isola- da, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que compreende: a) uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 28, uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 30 e uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32.

12. Molécula de ligação ao antígeno biespecífica isola- da, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que compreende: a) um LCDR1 compreendendo a sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 12, um LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 e um LCDR3 compreendendo a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16.

13. Molécula de ligação ao antígeno biespecífica isolada, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o primeiro domínio de ligação ao antígeno compreende: a) um conjunto de CDRs de HCVR (HCDR1, HCDR?2, HCDR3), o conjunto compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 28, 30 e 32 e um conjunto de CDRs de LCVR (LCDR1, LCDR2, LCDR3), o conjunto compreendendo as sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 12, 14 e 16.

14. Molécula de ligação ao antígeno biespecífica isola- da, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o primeiro domínio de ligação ao antígeno compreende um par de HCVR / LCVR compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 26/10.

15. Molécula de ligação ao antígeno biespecífica isola- da, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracte- rizada pelo fato de que o segundo domínio de ligação ao antígeno compreende: a) três HCDRs contidas em um HCVR compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consis- te em SEQID NO: 2e 18; e b) três LCDRs contidas em um LOCVR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

16. Molécula de ligação ao antígeno biespecífica isola- da, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o segundo domínio de ligação ao antígeno compreende: a) uma HCDR1 compreendendo uma sequência de ami- noácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 4e20; b) uma HCDR2 compreendendo uma sequência de ami- noácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 6e22e c) uma HCDR3 compreendendo uma sequência de ami- noácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 8e24.

17. Molécula de ligação ao antígeno biespecífica isola- da, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o segundo domínio de ligação ao antígeno compreende: a) um LCDR1 compreendendo a sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 12, um LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 e um LCDR3 compreendendo a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16.

18. Molécula de ligação ao antígeno biespecífica isola- da, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o segundo domínio de ligação ao antígeno compreende: a) um conjunto de CDRs de HCVR (HCDR1, HCDR?2, HCDR3), o conjunto compreendendo sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4, 6,8; e 20, 22, 24; e um conjunto de CDRs de LCVR (LCDR1, LCDR2, LCDR3), o conjunto compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 12, 14,16.

19. Molécula de ligação ao antígeno biespecífica isola- da, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracte- rizada pelo fato de que compreende: a) um primeiro domínio de ligação ao antígeno que com- preende HCVR CDRs compreendendo sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 28, 30, 32, e LCOVR CDRs compreendendo se- quências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 12, 14, 16; e b) um segundo domínio de ligação ao antígeno que com- preende HCVR CDRs compreendendo sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 4, 6, 8, e LCOVR CDRs compreendendo sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 12, 14, 16.

20. Molécula de ligação ao antígeno biespecífica isola- da, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracte- rizada pelo fato de que compreende: a) um primeiro domínio de ligação ao antígeno que com- preende HCDRs compreendendo sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 28, 30, 32, e LCDRs compreendendo sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 12, 14, 16; e b) um segundo domínio de ligação ao antígeno que com- preende HCDRs compreendendo sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 20, 22, 24, e LCDRs compreendendo sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 12, 14,16.

21. Molécula de ligação ao antígeno biespecífica isola-

da, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracte- rizada pelo fato de que compreende: a) um primeiro domínio de ligação ao antígeno que com- preende um par de HCVR / LCVR compreendendo sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 26/10; e b) um segundo domínio de ligação ao antígeno que com- preende um par de HCVR / LCVR compreendendo sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2/10.

22. Molécula de ligação ao antígeno biespecífica isola- da, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracte- rizada pelo fato de que a) um primeiro domínio de ligação ao antígeno compre- ende um par de HCVR / LCVR compreendendo sequências de ami- noácidos de SEQ ID NOs: 26/10; e b) um segundo domínio de ligação ao antígeno compre- ende um par de HCVR / LCVR compreendendo sequências de ami- noácidos de SEQ ID NOs: 18/10.

23. Molécula de ligação ao antígeno biespecífica isolada que compete pela ligação ao CD22, ou se liga ao mesmo epítopo no CD22 como um anticorpo de referência, caracterizada pelo fato de que o anticorpo de referência compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno tendo um par de HCVR / LCVR que compreen- de as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 26/10 e um se- gundo domínio de ligação ao antígeno tendo um par de HCVR / LCVR compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 2/10 ou 18/10.

24 Molécula de ligação ao antígeno biespecífica isolada que compete pela ligação a CD28 humano, ou se liga ao mesmo epítopo em CD28 humano como um anticorpo de referência, carac- terizada pelo fato de que o anticorpo de referência compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno tendo um par de HCVR / LCVR compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 26/10 e um segundo domínio de ligação ao antígeno tendo um par de HCVR / LCVR compreendendo as sequências de aminoáci- dos de SEQ ID NOs: 2/10, ou 18/10.

25. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ligação ao antígeno biespeciífica, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 24, e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

26. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo biespecífico, como definido em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 24.

27. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico como definido na reivindicação 26.

28. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor de expressão como definido na reivindicação 27.

29. Método de inibição de um distúrbio proliferativo de célu- las B em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar um anticorpo biespecífico isolado como definido em qual- quer uma das reivindicações 1 a 24 ou uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 25 ao indivíduo, inibindo assim o cres- cimento do linfoma de células B no indivíduo.

30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracteriza- do pelo fato de que compreende ainda administrar um segundo agente terapêutico ao indivíduo.

31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracteriza- do pelo fato de que o segundo agente terapêutico compreende um agente antitumoral, radioterapia, um conjugado de fármaco de anticor- po, um anticorpo biespecífico conjugado a um agente antitumoral, um inibidor de ponto de verificação ou combinações dos mesmos.

32. Método tratar um paciente que sofre de distúrbio proli- ferativo de células B ou de outra malignidade de células que expres- sam CD22, caracterizado pelo fato de que compreende administrar um anticorpo biespecífico isolado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 24 ou uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 25 ao indivíduo, tratando por meio disso o paciente que sofre de um linfoma de células B ou de outra malignidade de célu- la que expressa CD-22.

33. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracteriza- do pelo fato de que compreende ainda administrar um segundo agente terapêutico ao indivíduo.

34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracteriza- do pelo fato de que o segundo agente terapêutico compreende um agente antitumoral, radioterapia, um conjugado de fármaco de anticor- po, um anticorpo biespecífico conjugado com um agente antitumoral, um inibidor de ponto de verificação ou combinações dos mesmos.

35. Método, de acordo com a reivindicação 31 ou 34, carac- terizado pelo fato de que o segundo agente terapêutico é um anticorpo biespecífico diferente compreendendo um primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga ao mesmo antígeno alvo de tumor e um segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga a CD3 nas células T.