BR112021008798A2 - método para precipitar fitase - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA PRECIPITAR FITASE. Na presente invenção é revelado um processo para eficazmente precipitar fitase como um complexo com um poliânion, bem como composições compreendendo fitase e um poliânion, e um método para fabricar tais composições.

Description

MÉTODO PARA PRECIPITAR FITASE Campo da invenção

[001] A presente invenção diz respeito ao campo da produção de proteínas e, particularmente, à concentração de fitase e a composições compreendendo fitase. Antecedentes

[002] As enzimas fitase (mio-inositol-hexaquisfosfato fosfohidrolases; EC

3.1.3.8 e 3.1.3.26) são um grupo de enzimas fosfatase que catalisam a hidrólise de ácido fítico (mio-inositol-hexaquisfosfato, também conhecido como inositol polifosfato, ou fitato quando na forma de sal) encontrado em plantas, especialmente em grãos e sementes oleaginosas. A maioria (50-70%) do fosfato dietético está ligada ao ácido fítico com baixa disponibilidade para animais não ruminantes.

[003] As fitases são capazes de degradar o fitato (mio-inositol- hexaquisfosfato), o que resulta na liberação de fósforo inorgânico. Simultaneamente, compostos ligados ao fitato também são liberados. Assim, as fitases podem ser usadas para potencializar o valor nutricional de alimentos ao liberar fosfato inorgânico e outros nutrientes a partir do fitato. Na alimentação animal, os alimentos suplementados com fitase também auxiliam a diminuir o impacto ambiental da agricultura, uma vez que o fósforo ligado ao fitato pode ser utilizado pelo animal, o que reduz a quantidade de fósforo mineral a ser adicionada e as excreções de fósforo ao esterco.

[004] As fitases mais comercialmente disponíveis são as fosfatases ácidas de histidina (HAPs). Elas são, além disso, divididas em 6-fitases (principalmente fitases bacterianas que iniciam a desfosforilação do ácido fítico na posição 6‘) e 3-fitases (principalmente fitases fúngicas que iniciam a desfosforilação do ácido fítico na posição 3’) com base na posição do fósforo que eles principalmente hidrolasam primeiro (geralmente referindo-se à configuração D da molécula).

[005] A precipitação de proteínas é comumente usada no processamento posterior de produtos biológicos para concentrar e purificar proteínas de várias impurezas. A precipitação de proteínas é um processo em que uma proteína é separada de uma solução como um sólido, alterando a solubilidade da proteína com a adição de um reagente específico. As forças eletrostáticas repulsivas entre as proteínas são manipuladas pelo reagente para favorecer a geração de agregados de proteína de tamanho submicroscópico. Os agregados crescem e aderem uns aos outros formando eventualmente partículas microscópicas de precipitado amorfo sem estrutura bem ordenada ou, em um caso especial, partículas cristalinas tendo estrutura bem ordenada. Se a concentração de sólidos for alta o suficiente, essas partículas podem ser vistas a olho nu como, por exemplo, nebulosidade, turbidez, flocos ou sedimentos no líquido. Sumário

[006] Os inventores descobriram surpreendentemente que a fitase pode ser precipitada por um método simples, que é aplicável na produção de fitase em grande escala. O método pode ser usado, por exemplo, para precipitar e concentrar a fitase do caldo de fermentação de descarte, e para separar a fitase de outros componentes presentes no caldo de fermentação de descarte. Além disso, o método pode ser aplicado para fabricar composições de fitase concentradas. O complexo fitase-poliânion formado pelo presente método é estável, o que torna possível, por exemplo, lavar o complexo fitase-poliânion. Após a precipitação, também é possível formular o complexo fitase-poliânion em várias formulações. O precipitado também pode ser reconstituído em um produto líquido em condições selecionadas.

[007] De acordo com um primeiro aspecto da invenção, é fornecido um método para precipitar fitase compreendendo i. fornecer um meio aquoso compreendendo fitase; e ii. adicionar um poliânion.

[008] O presente método é muito rápido, econômico e eficaz, e resolve problemas relacionados aos métodos anteriores que envolvem ultrafiltração ou outras etapas de purificação para aumentar a concentração de fitase. Assim, a presente invenção simplifica a produção de composições de fitase.

[009] Sem estar ligada a qualquer teoria particular, a invenção é baseada na descoberta de que a fitase é capaz de formar um complexo com poliânions, resultando na precipitação controlada e eficaz de fitase. A formação do complexo pode ser controlada pela seleção das condições, tais como concentração, o tipo de poliânion, força iônica e pH. Essa presente invenção pode ser utilizada na produção de produtos contendo fitase, por exemplo, ao precipitar a fitase a partir do caldo de fermentação de descarte, deixando outros componentes em uma forma solúvel. O complexo fitase-poliânion precipitado é estável, permitindo, por exemplo, a concentração e lavagem para aumentar ainda mais a pureza sem diminuição acentuada no rendimento. Vantajosamente, o complexo fitase-poliânion precipitado com o presente método também pode ser dissolvido após precipitação com excelente rendimento. Além disso, o precipitado fornece fitase em uma forma muito estável e ainda permite a desidratação e reconstituição sem mudanças significativas em atividade ou rendimento específico.

[010] De acordo com um segundo aspecto da invenção, é fornecido um método para preparar uma composição de fitase compreendendo i. fornecer um meio aquoso compreendendo fitase;

ii. adicionar um poliânion para precipitar a fitase como um complexo de fitase e poliânion; e iii. recuperar a fitase precipitada para obter a composição de fitase.

[011] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecido um método para preparar uma composição de fitase compreendendo: i. fornecer um meio aquoso compreendendo fitase; ii. adicionar um poliânion para precipitar a fitase; e iii. recuperar a fitase precipitada para obter a composição de fitase.

[012] De acordo com o terceiro aspecto da invenção, é fornecida uma composição de fitase compreendendo fitase complexada com um poliânion.

[013] De acordo com o quarto aspecto, é fornecida uma composição de fitase compreendendo fitase e um poliânion.

[014] De acordo com um aspecto, é fornecido um suplemento alimentar que compreende uma composição de fitase do terceiro ou quarto aspecto e, opcionalmente, pelo menos uma enzima adicional. Figuras

[015] A Figura 1 é um diagrama mostrando o efeito de cloreto de sódio e alginato de sódio na precipitação de proteína fitase de E. coli.

[016] A Figura 2 é um diagrama mostrando a formação de permeado durante a colheita de fitase precipitada por microfiltração.

[017] A Figura 3 é um diagrama mostrando o fluxo de permeado durante a colheita de fitase precipitada por microfiltração.

[018] A Figura 4 é um diagrama mostrando a altura relativa do nível da superfície de precipitado durante o experimento de deposição.

[019] A Figura 5 é um diagrama mostrando as atividades de fitase residuais de formulações líquidas de fitase de E. coli durante o armazenamento à temperatura de 37 °C.

[020] A Figura 6 é um diagrama mostrando as atividades de fitase residuais de formulações em pó de fitase de E. coli durante o armazenamento à temperatura de 40 °C.

[021] A Figura 7 é um diagrama mostrando o aprimoramento de recuperação no teste de peletização quando as formulações de polieletrólito precipitado e de pó de fitase secas por pulverização são comparadas com os produtos comerciais de fitase seca sem precipitação de polieletrólito. Para a recuperação, a atividade enzimática analisada em pellets de alimentos após o tratamento térmico por condicionamento em diferentes temperaturas antes da peletização é comparada com a atividade enzimática no farelo de alimentos sem tratamento térmico e peletização.

[022] A Figura 8 é um diagrama mostrando o efeito da razão fitase:mg de composto polianiônico e diferentes compostos polianiônicos em atividade de fitase solúvel. Descrição detalhada

[023] Em uma modalidade, o meio aquoso compreendendo fitase compreende caldo de fermentação, preferencialmente caldo de fermentação de descarte clarificado.

[024] Em outra modalidade, o meio aquoso compreendendo fitase é caldo de fermentação, preferencialmente caldo de fermentação de descarte clarificado.

[025] Em uma modalidade, o caldo de fermentação de descarte clarificado é obtido pela clarificação do caldo de fermentação de descarte a partir da produção recombinante da fitase.

[026] Em uma modalidade, em que o meio aquoso compreendendo fitase compreende caldo de fermentação clarificado, caldo de fermentação de descarte, caldo de fermentação de descarte e clarificado ou uma combinação dos mesmos.

[027] Em uma modalidade, em que o teor de matéria seca do meio aquoso compreendendo fitase sem sólidos está entre 0,1 - 25% p/p antes de adicionar o poliânion.

[028] Em outra modalidade, o teor de matéria seca do meio aquoso compreendendo fitase sem sólidos é selecionado a partir da faixa de 0,1-25% p/p, tal como 0,1-20, 0,1-15, 0,1-10, 1-20, 1-15, 1-10, 2-20, 2-15, 2-10, 3-20, 3- 15, 3-10, 3-9, 3-8, 4-15, 4-10, 4-9 ou 4-8% p/p. Em uma modalidade, o teor de matéria seca refere-se à matéria seca presente na solução aquosa compreendendo fitase sem calcular o efeito do poliânion adicionado.

[029] Em uma modalidade, o meio aquoso compreendendo fitase não contém CaCl2, ou a concentração de CaCl2 está abaixo de 5 mM, 2 mM ou 1 mM.

[030] Em uma modalidade, o pH é ajustado para 3-5 para potencializar a precipitação de fitase.

[031] Em uma modalidade, o pH é ajustado para um valor selecionado a partir da faixa de 3-5. O pH pode ser ajustado para o pH selecionado antes da adição do poliânion. Em outra modalidade, o pH é ajustado para o valor selecionado após a adição do poliânion. Preferencialmente, o pH é mantido próximo do valor selecionado até o final da precipitação.

[032] Em uma modalidade, o pH é ajustado e opcionalmente mantido na faixa de 3-5, tal como 3-4,9, 3-4,8, 3-4,7, 3-4,6, 3-4,5, 3-4,4, 3-4,3,3-4,2, 3-4,1, 3- 4, 3-3,9, 3-3,8, 3,1-4,9, 4,8, 3,1-4,7, 3,1-4,6, 3,1-4,5, 3,1-4,4, 3,1-4,3, 3,1-4,2, 3,1 -4,1, 3,1-4, 3,1-3,9, 3,8, 3,2-4,9, 3,2-4,8, 3,2-4,7, 3,2-4,6, 3,2-4,5, 3,2-4,4, 3,2-4,3, 3,2-4,2, 3,2-4,1, 4, 3,2- 3,9, 3,2-3,8, 3,3-4,9, 3,3-4,8, 3,3-4,7, 3,3-4,6, 3,3-4,5, 3,3- 4,4, 3,3-4,3, 4,2, 3,3-4,1,3,3-4, 3,3-3,9 ou 3,3-3,8, ou em cerca de 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9 ou 5.

[033] Em uma modalidade, o poliânion é um sal de poliânion, preferencialmente um sal de Na do poliânion. Alternativamente, o poliânion é um sal com outro monovalente, como um sal de K.

[034] Em uma modalidade, o poliânion é ácido algínico, ácido péctico, ácido hialurônico, ácido fítico, ou um sal de tal ácido polianiônico, ou qualquer combinação dos mesmos.

[035] Em uma modalidade, o poliânion é um sal polianiônico. Em uma modalidade, o poliânion é alginato de Na, polipectato de Na, hialuronato de Na, fitato de Na ou uma combinação dos mesmos, ou uma combinação do sal polianiônico com pelo menos um poliânion.

[036] Em uma modalidade, o sal do ácido polianiônico é adicionado em uma forma sólida ou como uma solução aquosa à solução aquosa compreendendo fitase.

[037] Em uma modalidade, o sal de poliânion é adicionado em uma forma sólida à solução aquosa compreendendo fitase.

[038] Em uma modalidade, o método compreende controlar o pH, mantendo-o na faixa de 3-5, preferencialmente na faixa de 3,1-4, após a adição do poliânion. Em uma modalidade, a fitase precipitada é lavada.

[039] Em uma modalidade, a fitase precipitada, opcionalmente lavada, é desidratada para obter um produto seco.

[040] Em uma modalidade, o produto seco está na forma de um pellet, extrudado, grânulo, pó ou um produto revestido.

[041] Em uma modalidade, a desidratação é feita por técnica de secagem de proteína conhecida no estado da técnica, incluindo, mas não se limitando a secagem por pulverização, secagem por congelamento, secagem a vácuo, evaporação, revestimento por pulverização, granulação ou extrusão. Opcionalmente, a fitase precipitada é suplementada com um aditivo de secagem antes da secagem. Os aditivos de secagem adequados incluem, mas não estão limitados a açúcares como trealose, álcoois de açúcar, sais e polímeros como polietilenoglicol, como PEG 4000. No entanto, o precipitado formado pelo presente método é adequado para secagem também sem um aditivo de secagem, devido à boa estabilidade do complexo precipitado.

[042] Em uma modalidade, a fitase precipitada, opcionalmente lavada, é adequada para ser usada em composições que são reticuladas, imobilizadas ou encapsuladas usando técnicas conhecidas no estado da técnica.

[043] Em uma modalidade, a fitase precipitada, opcionalmente lavada, é adequada para ser usada como tal ou, pelo menos, em forma parcialmente dissolvida em composições sólidas ou líquidas diluídas ou comprimidas, incluindo, mas não se limitando a soluções, suspensões, emulsões, semissólidos, sólidos, pastas, pellets, bolos, géis, comprimidos, filmes ou revestimentos tendo certas propriedades direcionadas como, por exemplo, reologia, viscosidade ou liberação de enzima controlada usando técnicas conhecidas no estado da técnica.

[044] Em uma modalidade, o método compreende dissolver a fitase precipitada para obter um produto líquido. Tal produto líquido compreende assim a fitase e o poliânion selecionado usado na precipitação.

[045] Em uma modalidade, o método compreende dissolver o produto seco. Isto é vantajoso para obter um produto reconstituído tendo uma concentração elevada.

[046] Em uma modalidade, a razão de fitase para poliânion expressa como FTU:mg de poliânion é selecionada a partir da faixa de 500-15000.

[047] Em uma modalidade, a razão expressa como FTU:mg de poliânion é selecionada a partir da faixa de 500-15000, 1000-14000, 1500-13000 ou 2000-

12000.

[048] Em uma modalidade, a quantidade do poliânion adicionado é de 0,001 - 2% p/p com base no teor de matéria seca.

[049] Em uma modalidade, o poliânion é adicionado em uma quantidade de 0,001-2, 0,005-2, 0,01-2, 0,1-2, 0,001 -1,5, 0,005-1,5, 0,01 -1,5, 0,1-1,5, 0,001- 1, 0,005-1, 0,01-1 ou 0,1-1% p/p com base no teor de matéria seca.

[050] Em uma modalidade, o poliânion é um ácido algínico, um ácido péctico, um ácido hialurônico, um ácido fítico ou um sal de tal ácido, preferencialmente um sal com um cátion monovalente.

[051] Em outra modalidade, o poliânion é uma combinação de ácido fítico ou seu sal juntamente com um poliânion selecionado a partir de ácido algínico, ácido péctico, ácido hialurônico ou um sal de tal ácido. É preferencial usar um poliânion adicional quando o ácido fítico, ou o seu sal, é usado para manter o complexo fitase-poliânion estável por mais tempo. Isto é particularmente útil ao precipitar a fitase com ácido fítico ou seu sal em condições em que a fitase tem atividade enzimática.

[052] Em uma modalidade, o sal é um sal de alginato, um sal de polipectato, um sal de hialuronato, um sal de fitato ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o referido sal é um sal de Na, sal de K, sal de NH4 ou sal de Ca, preferencialmente um sal de Na.

[053] Em uma modalidade, a composição é um produto líquido ou um produto seco.

[054] Em uma modalidade, a fitase precipitada é colhida por sedimentação, decantação, centrifugação, filtração ou uma combinação das mesmas. A fitase precipitada é preferencialmente colhida em um pequeno volume. Isso permite recuperar a fitase precipitada em uma alta concentração e atividade específica.

[055] Vantajosamente, a precipitação e/ou concentração de fitase por meio do presente método oferece uma maneira simples de aprimorar a eficiência de custo na produção de produtos de fitase concentrados comparados com os métodos de concentração atuais por ultrafiltração que não remove impurezas de alto peso molecular. O precipitado pode ser opcionalmente lavado e, em seguida, dissolvido ao aumentar a força iônica do meio acima de 0,25 M e ajustar o pH acima de 4. Isto é particularmente útil para a fabricação de composições em que a formulação final é líquida. Tal líquido de precipitado dissolvido ou suspensão de precipitado sem a etapa de dissolução são ambos igualmente úteis para desidratar, por exemplo, com secagem por pulverização, se o produto seco for a formulação final desejada.

[056] Em uma modalidade, a força iônica do meio aquoso compreendendo fitase está abaixo de 0,25 M antes da adição do poliânion.

[057] Em uma modalidade, a força iônica é mantida abaixo de 0,25 M após a adição de poliânion para manter a fitase em forma não solúvel.

[058] Em uma modalidade, dissolver a fitase precipitada é realizado na presença de CaCl2. A adição de CaCl2 à fitase precipitada é vantajosa porque dissolve o complexo fitase-alginato em concentrações abaixo de 0,25 M, como mostrado no Exemplo 24. Em uma modalidade, CaCl2 é adicionado para dissolver a fitase precipitada, preferencialmente em uma quantidade de 70 mM, 40 mM ou menos, e mais preferencialmente em uma quantidade de pelo menos 10 mM, 20 mM ou 30 mM. CaCl2 é um agente vantajoso em comparação com outros sais, como cloreto de sódio ou sulfato de sódio, porque os outros sais são necessários em concentrações muito mais altas, como 250 mM, para solubilizar a fitase precipitada.

[059] Em uma modalidade, a fitase é uma fitase recombinante.

[060] Em uma modalidade, a fitase é fitase de E. coli, fitase de Aspergillus ou fitase de Buttiauxella, preferencialmente uma fitase com atividade de degradação de fitato.

[061] Em uma modalidade, pelo menos um componente da composição de fitase, preferencialmente a enzima fitase, tem uma característica estrutural ou física diferente comparada a um componente natural correspondente do qual pelo menos um componente é derivado. Em uma modalidade, a característica é o tamanho uniforme, a dispersão homogênea na composição, a glicosilação não nativa, a estabilidade não nativa, o nível de produção ou a pureza. Em uma modalidade, a composição de fitase compreende um complexo fitase-poliânion. Esse complexo não ocorre em um ambiente natural de fitases. No entanto, na presente invenção é possível obter um tal complexo. Os fatores que contribuem para a formação do complexo são a concentração de fitase e poliânion, pH, força iônica e temperatura.

[062] Em uma modalidade, a fitase é uma fitase bacteriana, preferencialmente uma fitase bacteriana recombinante expressa em uma célula hospedeira heteróloga.

[063] Em uma modalidade, a fitase é uma 6-fitase tendo atividade enzimática para 6-fos, preferencialmente uma variante de proteína manipulada, fitase quimérica ou híbrida. Em outra modalidade, a fitase híbrida compreende fitases que são manipuladas para conter elementos de duas ou mais fitases. Em uma modalidade, a fitase é uma fitase fúngica, preferencialmente uma fitase fúngica recombinante expressa em uma célula hospedeira heteróloga.

[064] Em uma modalidade, a fitase é uma 3-fitase, preferencialmente uma variante de proteína manipulada, fitase quimérica ou híbrida. Em outra modalidade, a fitase híbrida compreende fitases que são manipuladas para conter elementos de duas ou mais fitases.

[065] Em uma modalidade, o poliânion é selecionado de modo que seja capaz de formar um complexo fitase-poliânion reversível. Os exemplos preferenciais de poliânions adequados são ácido algínico, um ácido péctico, um ácido hialurônico, e ácido fítico ou um sal do ácido ou qualquer combinação dos mesmos. Estes e outros poliânions também podem ser encontrados, por exemplo, em polissacarídeos, gomas ou hidrogéis de ocorrência natural, como goma xantana, goma arábica, heparina ou carragenina, ou compostos sintéticos tendo funções ou características correspondentes.

[066] Em uma modalidade, o pH da solução aquosa de fitase é ajustado para 3-5 antes da adição do poliânion.

[067] Em uma modalidade, o pH é controlado após a adição de poliânion, ao ajustar e/ou mantê-lo em 3-5.

[068] Em uma modalidade, o poliânion é adicionado como uma solução aquosa tamponada. Em uma modalidade, a solução é tamponada para pH selecionado a partir da faixa de 3-5.

[069] Em uma modalidade, a fitase precipitada é recuperada por microfiltração, filtração de correia, centrifugação, filtração de fluxo cruzado dinâmico, sedimentação ou qualquer combinação dos mesmos. Preferencialmente, a fitase precipitada é recuperada por microfiltração ou centrifugação.

[070] Uma vez que o complexo fitase-poliânion obtido com o presente método é estável, é possível lavar a fitase precipitada. Assim, é possível usar o método para remover outros componentes presentes, por exemplo, em um caldo de fermentação de descarte para o qual a fitase é produzida em produção recombinante. Por exemplo, macromoléculas como proteínas diferentes de fitase, carboidratos e resíduos celulares podem ser removidas por lavagem. Mesmo componentes de pequenas moléculas presentes no caldo de fermentação de descarte podem ser removidos por lavagem. A lavagem também é vantajosa para remover eficazmente o material microbiológico da composição de fitase.

[071] Em uma modalidade, a solução aquosa compreendendo fitase contém sobrenadante reciclado obtido pela concentração de fitase e recuperação do sobrenadante a ser usado como o sobrenadante reciclado.

[072] Em uma modalidade, a lavagem é realizada usando uma solução tampão tendo pH e/ou força iônica próximos ao pH e/ou força iônica usada na etapa de precipitação.

[073] Em uma modalidade, a força iônica da solução de lavagem é inferior à usada na precipitação da fitase.

[074] Em uma modalidade, o pH da solução de lavagem tendo força iônica abaixo de 0,25 M é inferior ou superior ao usado na etapa de precipitação. Preferencialmente, o pH é superior ou inferior em pelo menos 1 unidade de pH, tal como 1,5 ou 2 unidades de pH.

[075] Em uma modalidade, o pH é controlado ao ajustá-lo para um valor selecionado a partir de uma faixa adequada para a precipitação de uma determinada fitase. Isto pode ser determinado pelo técnico no assunto realizando o presente método em vários valores de pH e calculando o rendimento da precipitação e/ou atividade específica em cada pH. O Exemplo 2 fornece um exemplo de cálculo do rendimento de precipitação. A faixa adequada pode então ser selecionada com base, por exemplo, no rendimento desejado e/ou atividade específica obtida em um dado pH.

[076] Em uma modalidade, a atividade enzimática de fitase é determinada usando o método revelado no Exemplo 1.

[077] Em uma modalidade, o método é um método em escala industrial.

[078] Em uma modalidade, o método é realizado na sequência especificada em uma reivindicação, aspecto ou modalidade.

[079] Em uma modalidade, o FTU é determinado de acordo com a ISO 30024:2009(E).

Exemplos EXEMPLO 1 - Materiais de enzima fitase e métodos analíticos

[080] Os materiais enzimáticos usados para a precipitação de polieletrólitos eram diferentes fontes de fitase, e uma fitase de E. coli, uma fitase de Aspergillus e uma fitase de Buttiauxella. Todas essas fitases foram expressas em fungo Trichoderma reesei. Precipitações de fitase de E. coli ou fitase de Aspergillus foram iniciadas usando caldos clarificados de fermentação usados ou concentrados dos mesmos, contendo conservante para prevenir contaminações microbianas, de várias fermentações diferentes de proteína fitase. Os caldos de fermentação usados foram clarificados por filtração e concentrados com membrana de ultrafiltração de 10 kDa para aumentar a concentração de proteína. Precipitação de fitase de Buttiauxella foi feita usando enzima líquida purificada a partir de grânulos secos como material de partida. A atividade enzimática da proteína foi medida como a liberação de fosfato inorgânico a partir de fitato de sódio (0,98% (p/v) fitato a 37 °C em tampão de acetato de sódio a 250 mM em pH 5,50 por 60 min (atividade FTU; ISO 30024:2009(E) Alimentos para animais - Determinação de atividade de fitase). A concentração de proteína foi medida com ensaio de proteína Bio-Rad que é baseado na mudança de cor do corante azul brilhante Coomassie G-250 em resposta a várias concentrações de proteína. O corante azul Coomassie liga-se principalmente a resíduos de ácidos básicos e aromáticos, especialmente arginina. Os reagentes usados para o ensaio foram Bio-Rad Protein Assays Dye Reagent Concentrate (Bio-Rad No. 500-0006) e padrão de proteína gama globulina bovina (Bio-Rad Protein Assay Standard I. Nº 500-0005). EXEMPLO 2 - Formação de complexo fitase-alginato reversível por precipitação de polieletrólito em processo em batelada

[081] Quatro precipitações em batelada foram feitas usando concentrados de fitase de E. coli como material enzimático.

Três destes foram precipitações em batelada repetidas onde soluções de reagente contendo poliânion tamponado foram preparadas adicionando tampão de acetato de sódio a 1 M (pH nominal 3,6) e alginato de sódio seco em água de torneira.

Em uma das precipitações em batelada, foi usado citrato de sódio como tampão em vez de acetato de sódio.

O pó de alginato seco foi deixado dissolver e as soluções de reagentes foram armazenadas em ambiente frio durante a noite.

No dia seguinte, o concentrado de enzima fitase foi adicionado às soluções de reagentes à temperatura ambiente durante agitação adequada com um agitador magnético, ao mesmo tempo o complexo fitase-alginato se formou rapidamente.

Isso foi observado como um precipitado pesado, ligeiramente semelhante a fibra e quase branco que se formou durante a adição de fitase.

As precipitações continuaram por uma hora em ambiente frio.

Em seguida, foram retiradas amostras para análise das atividades enzimáticas.

As condições de precipitação e os rendimentos de atividade finais são representados na tabela 1. As quantidades necessárias de água de torneira e de concentrado foram calculadas de forma que a razão FTU:mg de alginato de sódio de destino e os teores de matéria seca calculados fossem alcançados.

Os rendimentos de precipitação foram calculados com base na atividade de fitase solúvel analisada nos sobrenadantes após a separação do precipitado por centrifugação em comparação com a atividade total.

Estes resultados mostram que a fitase pode ser precipitada a partir do concentrado do caldo de fermentação de descarte clarificado com alto rendimento usando alginato como precipitante polianiônico.

Tabela 1. Condições de precipitação e rendimentos de quatro bateladas de precipitação de fitase de E. coli.

Batelada de Volume Acetato Alginato Razão Matéria Rendimento precipitação (mL) de sódio de sódio FTU:mg de seca de (M) (%, p/p) alginato calculada precipitação de sódio (% p/p) (%) de destino 1 1.500 0,05 0,17 10000 5,1 76 2 1.500 0,05 0,17 10000 5,1 75 3 2.000 0,05 0,18 10000 5,0 81 4 1.000 * 0,20 10000 6,0 77 * Em vez de tampão de acetato de sódio a 0,05 M, a batelada continha 1% (p/p) de citrato trissódico di-hidratado e 0,7% de ácido cítrico anidro. EXEMPLO 3 - Efeito de força iônica no rendimento de fitase precipitada

[082] Os experimentos foram realizados usando concentrados de fitase de E. coli como material enzimático. Para estudar o efeito de força iônica e do alginato de sódio no rendimento de precipitação, uma série de experimentos de precipitação foram realizados à temperatura ambiente. Os experimentos foram feitos em tubos de 15 mL e os volumes totais dos experimentos eram de 10 mL. As soluções de reagentes foram preparadas misturando cloreto de sódio a 5 M, 0,4% (p/p) de alginato de sódio e água de torneira em tubos. Metade dos experimentos foi realizada com alginato de sódio e a outra metade sem alginato de sódio. 2 mL de concentrado de fitase foram adicionados aos tubos e misturados imediatamente para permitir a formação do complexo. Os experimentos foram feitos sem ajuste de pH. O pH medido variou de 4,3 a 4,7. As concentrações de proteína solúvel e total resultantes foram determinadas. As condições de precipitação finais e os rendimentos são representados na tabela 2 e ilustrados graficamente na figura 1. Os rendimentos de precipitação foram calculados com base na concentração de proteína solúvel em sobrenadantes em comparação com a concentração de proteína total. Estes resultados mostram claramente um forte efeito de precipitação de baixa força iônica e alginato de sódio adicionado. Tabela 2. Efeito de força iônica e alginato de sódio na precipitação de proteína fitase de E. coli. NaCI Na-alginato Rendimento de Experimento Observações (mM) (% p/v) precipitação (%) 1 250 0 solução clara 0 2 125 0 solução clara 0 3 63 0 solução clara 0 4 25 0 solução clara 0 5 0 0 suspensão precipitada 42 6 250 0,2 solução clara 0 7 125 0,2 suspensão precipitada 44 8 63 0,2 precipitado pesado 76 9 25 0,2 precipitado pesado 84 10 0 0,2 precipitado pesado 84 EXEMPLO 4 - Precipitação diretamente do caldo de fermentação de descarte clarificado

[083] As precipitações em batelada foram feitas usando caldo de fermentação de descarte clarificado de fitase de E. coli como material enzimático. Usando o método no exemplo 2, duas precipitações em batelada em escala de 2000 mL repetidas foram feitas para estudar a precipitação diretamente a partir do caldo de fermentação de descarte clarificado contendo apenas conservante adicionado para ver um efeito da concentração de fitase e da qualidade do material de partida no rendimento de fitase precipitada. Nessas precipitações também foram usados diferentes tipos de alginato de sódio e razão FTU:mg de alginato de sódio. As condições de precipitação e os rendimentos de atividade finais são representados na tabela 3. As quantidades necessárias de água de torneira e de concentrado foram calculadas de forma que a razão FTU:mg de alginato de sódio de destino e os teores de matéria seca calculados fossem alcançados. Os rendimentos de precipitação foram calculados com base nas atividades enzimáticas solúveis em sobrenadantes em comparação com a atividade de fitase total. Estes resultados mostram que a precipitação de polieletrólitos diretamente do caldo de fermentação de descarte clarificado é possível com alto rendimento. Tabela 3. Condições de precipitação e rendimentos de duas bateladas de precipitação de polieletrólitos de E. coli. Matéria Rendimento Razão FTU:mg de Batelada de Acetato seca de alginato de sódio de precipitação de sódio calculada precipitação destino (M) (% p/p) (%) 5 0,05 4.000 2,1 96 6 0,05 4.000 2,1 88 EXEMPLO 5 - Precipitação durante a concentração

[084] As precipitações em batelada foram feitas usando caldo de fermentação de descarte clarificado de fitase de E. coli como material enzimático. Usando a mesma razão FTU:mg de alginato de sódio como no exemplo 2, a precipitação foi realizada simultaneamente com a etapa de ultrafiltração que é normalmente usada para concentrar proteínas de caldos de fermentação usados clarificados. Isto foi continuado com troca de tampão e duas etapas de lavagem. As diferentes etapas são representadas na tabela 4. O primeiro alginato de sódio seco foi adicionado lentamente ao caldo de fermentação de descarte clarificado durante agitação adequada com agitador magnético. A formação do precipitado começou durante a adição de alginato de sódio e foi deixada para prosseguir nas próximas etapas. O caldo de fermentação de descarte clarificado contendo o precipitado de alginato de fitase foi concentrado por ultrafiltração. Quando a concentração de 1,5 vezes foi atingida, a etapa de diafiltração foi iniciada pela adição de tampão de acetato de sódio a 40 mM (pH nominal 3,6) lentamente ao retentado durante agitação adequada com agitador magnético. A diafiltração foi continuada até a concentração de 1,3 vezes ser atingida. Na etapa seguinte, foi feita uma dupla lavagem usando água de torneira. Na última etapa, a lavagem dupla foi feita por microfiltração. O objetivo desta etapa era eliminar outras proteínas e compostos de alto peso molecular e manter a fitase dentro da membrana como um complexo sólido. O rendimento de fitase calculado deste teste combinado de precipitação, concentração e colheita foi de 72% analisado com base na atividade no retentado após a microfiltração. A atividade de fitase específica foi 40% maior no retentado final do que no caldo de fermentação de descarte clarificado. Estes resultados mostram que a precipitação de alginato pode ser feita simultaneamente com a ultrafiltração. Tabela 4. Descrição das etapas de filtração durante a concentração e lavagem do precipitado de fitase de E. coli. Membrana Fator de Etapa Solução adicionada MWCO concentração 1 Ultrafiltração 10 kDa 1,5x Acetato de amônio 2 Diafiltração 10 kDa 1,3x a 40 mM 3 Lavagem 10 kDa água de torneira 1,1x Lavagem e 4 0,2 µm água de torneira 1,9x microfiltração EXEMPLO 6 - Colheita de precipitados por microfiltração

[085] Os materiais dos exemplos 2 e 4 foram usados em cinco testes de colheita de precipitados diferentes. A colheita foi feita por microfiltração usando dois cassetes Sartorius Vivaflow 200 tendo membranas PES de 0,2 µm ou membranas Pellicon de 0,2 µm. O objetivo era manter os complexos fitase- alginato dentro da membrana e remover o máximo possível do excesso de sobrenadante contendo outras proteínas e compostos de alto peso molecular. As colheitas foram feitas em temperatura ambiente. Durante a colheita, foi usada uma agitação adequada com um agitador magnético para o retentado. Durante a colheita, o fluxo de permeado foi monitorado e a colheita continuou até que cerca de 4 vezes o fator de concentração fosse atingido. As formações de permeado e fluxos de permeado são ilustrados graficamente na figura 2 e na figura 3. Em dois dos testes de colheita também foi realizada a etapa de lavagem do precipitado colhido. As condições de colheita e os rendimentos são representados na tabela 5. Os rendimentos de precipitados foram calculados com base nas atividades enzimáticas solúveis em permeados. Estes resultados mostram que a microfiltração é um método viável para colher e concentrar o precipitado de fitase. Esses resultados também mostram que a lavagem do precipitado coletado é possível. Tabela 5. Condições de colheita e rendimentos de precipitados de fitase de E. coli usando microfiltração. Experimento Material Cassete Etapa de Fator de Rendimento de de colheita precipitado usado lavagem concentração precipitado (%) concentrad Sartorius não 4,0 1 82 o concentrad Sartorius sim 3,5 2 o 82 3 concentrad Sartorius sim 3,6 84 o 4 filtrado Pellicon não 3,9 70 5 filtrado Pellicon não 4,1 70 EXEMPLO 7 - Colheita de precipitados por filtração com correia a vácuo

[086] O material para os testes de colheita foi preparado usando o método do exemplo 2. Neste exemplo, em vez de alginato de sódio seco, foi usada uma solução estoque de 0,4% (p/p) de alginato de sódio. As condições de precipitação finais foram: 0,19% (p/p) de alginato de sódio, tampão de acetato de sódio a 0,05 M. A razão FTU:mg de alginato de sódio de destino foi de 10000 e os teores de matéria seca calculado foi de 5,2% (p/p). As quantidades necessárias de água de torneira e de concentrado foram calculadas de forma que a razão FTU:mg de alginato de sódio de destino e os teores de matéria seca calculados foram alcançados. O rendimento de precipitação calculado desta batelada foi analisado em 75% com base na atividade solúvel no filtrado.

[087] Dois experimentos de colheita de precipitado foram realizados. A colheita foi realizada com dispositivo de teste de filtração com correia a vácuo: BHS-nutsche (BHS-Filtration Inc.). A área de filtração usada era de 56 cm 2 e o pano de filtro usado era polipropileno (8 μm). Terra diatomácea foi usada como auxiliar de filtragem. Os materiais filtrados e os líquidos de lavagem usados foram resfriados a cerca de 10 °C antes da filtração.

[088] No primeiro teste de colheita, 5 g de auxiliar de filtragem foram misturados a 50 mL de pasta de fitase precipitada. Esta suspensão foi filtrada com o dispositivo de teste usando uma pressão de -0,5 barg (-50 kPag). Após 0’50 min, 40 mL de filtrado foi alcançado. Após a filtração, a torta formada foi desidratada. O rendimento de fitase precipitada calculado deste teste de colheita foi analisado em 66% com base na atividade precipitada na torta de filtro desidratada.

[089] No segundo teste de colheita, 2,5 g de auxiliar de filtragem foram misturados a 50 mL de pasta de fitase precipitada. Esta suspensão foi filtrada com o dispositivo de teste usando uma pressão de -0,5 barg (-50 kPag). Após 3’30 min, 40 mL de filtrado foi alcançado. Após a filtração a torta formada foi lavada usando 10 mL de água de torneira e desidratado. A torta formada foi coletada e feita novamente em pasta: 8,5 g de torta desidratada foram misturados com 10 g de 3,1% (p/p) de solução de NaCl para dissolver a fitase precipitada. Esta solução foi filtrada sem auxiliar de filtragem adicional com dispositivo de teste usando pressão de -0,5 barg. O bolo formado foi desidratado. O rendimento de fitase calculado deste teste de colheita foi analisado em 48% com base na atividade solúvel no filtrado final.

[090] Estes resultados mostram que a colheita de fitase precipitada com filtração com correia a vácuo foi possível com terra diatomácea como auxiliar de filtragem. O precipitado também poderia ser dissolvido e separado do auxiliar de filtragem. EXEMPLO 8 - Colheita de precipitados por centrifugação

[091] Usando o método no exemplo 2, foi feita uma precipitação em batelada. O material precipitado era um concentrado de fitase de E. coli. As condições de precipitação usadas foram as mesmas das bateladas 1 e 2 no exemplo 2. O rendimento de precipitação calculado desta batelada foi analisado em 71% com base na atividade solúvel no sobrenadante. Essa fitase de E. coli precipitada foi usada no experimento de colheita de precipitado.

[092] A colheita foi realizada por centrifugação. Para colheita, a pasta do precipitado foi dividida em dois frascos de centrifugação que foram centrifugados a 4000 rpm por 10 minutos. Após centrifugação, os sobrenadantes em excesso foram removidos. Isso foi repetido duas vezes para coletar todo o precipitado. Após centrifugação 4% (p/p) de Na2SO4 foi adicionado e misturado à massa precipitada. O sal e os precipitados foram misturados e dissolvidos em ambiente frio durante a noite. Após a dissolução, as soluções foram reunidas e analisadas. O rendimento de precipitação calculado da centrifugação foi analisado em 72% com base na atividade do líquido solubilizado. Estes resultados mostram que a recuperação do precipitado de fitase por centrifugação é um método viável.

EXEMPLO 9 - Colheita de precipitados por sedimentação

[093] O mesmo material de partida do exemplo 8 foi usado também neste experimento de colheita de precipitado. A sedimentação foi usada como método de colheita para o precipitado. 1 litro de pasta de fitase precipitada foi colocado em um frasco de armazenamento sem mistura. O precipitado foi deixado assentar no frasco em ambiente frio. A deposição foi observada medindo a altura do nível da superfície do precipitado. A deposição continuou por 9 dias e depois disso o sobrenadante em excesso foi removido. A deposição é ilustrada graficamente na figura 4. Para dissolver o precipitado, 4% (p/p) de Na 2SO4 foi adicionado e misturado ao precipitado coletado. O sal e o precipitado foram deixados dissolver em ambiente frio durante a noite. O rendimento de precipitação total calculado da sedimentação foi de 98%, mas o nível de concentração de atividade da solução de fitase-alginato solubilizada foi de apenas 38% em comparação com a solução recebida no exemplo 8. Estes resultados mostram que a recuperação do precipitado de fitase por sedimentação é possível. EXEMPLO 10 - Colheita de precipitados por filtração de fluxo cruzado dinâmico

[094] O material para os experimentos de colheita foi preparado usando o mesmo método do exemplo 7. Para experimentos de colheita, foi utilizado o Dynamic Crossflow Simulator DCF 152/s. O material de teste foi ressuspenso e colocado em um vaso de alimentação resfriado e agitado. O resfriamento foi ajustado para aplicar temperatura de operação de 5 °C para todos os testes. A matriz de teste para os testes de colheita é representada na tabela 6. Com as condições testadas, não foi possível colher a precipitação de fitase a partir da pasta. Os permeados obtidos a partir dos testes 1-3 eram turvos e tinham quase a mesma aparência que a pasta de alimentação. Durante esses testes, muito provavelmente uma reação eletroquímica, causada pelo potencial zeta do material cerâmico, destruiu o complexo fitase-poliânion mediante contato. Isso permitiu que as moléculas individuais passassem pelos poros do disco de cerâmica em forma solúvel e reconstruíssem o complexo sólido posteriormente. Além do disco de cerâmica, um disco de aço inoxidável com corte de 1,3 µm foi testado, mas não aprimorou a clareza do permeado. Testes com menor tensão de cisalhamento (300 rpm) também foram realizados durante os ensaios, mas nenhum aprimoramento na turbidez do permeado foi alcançado. Estes resultados mostram a formação reversível de complexos com base em carga de fitase e poliânion e a importância da seleção de material e técnica para a separação sólido-líquido. Tabela 6. Matriz de teste do experimento de colheita de precipitado com filtração de fluxo cruzado dinâmico. Velocidade Ensai Porosidade Condições de Material base de rotação o do disco (nm) processo (rpm) 1 200 AI2O3 4-5 °C 2 30 TiO2 TMP (pressão 3 7 MgAl2O4 transmembranar) 930 4 1300 312L de aço 0,3-1,2 bar inoxidável EXEMPLO 11 - Reciclagem de sobrenadante

[095] Os sobrenadantes coletados a partir das precipitações dos exemplos 8 e 9 foram usados neste teste. O material precipitado era um concentrado de fitase de E. coli. O objetivo desses testes foi estudar se o sobrenadante a partir da precipitação de fitase-poliânion pode ser usado como diluente na próxima precipitação de fitase. Foram feitos um total de oito testes de precipitação usando dois sobrenadantes diferentes. Além disso, foi feita uma precipitação de referência sem sobrenadante usando o método do exemplo 2, bateladas 1 e 2.

Em vez de alginato de sódio seco, foi usado 1% de solução estoque de alginato de sódio para fazer as soluções de reagentes.

A mesma quantidade de concentrado da precipitação de referência foi usada em todos os testes de reciclagem de sobrenadante.

As condições de teste e resultados finais são representados na Tabela 7. A precipitação foi observada durante a adição de concentrado apenas se também fosse adicionado alginato de sódio ao teste.

Isso indica que não há mais alginato de sódio nos sobrenadantes após a separação de precipitado de fitase-poliânion pois o alginato de sódio é necessário para ser adicionado novamente para induzir a precipitação de fitase.

A análise de atividade foi feita a partir de amostras precipitadas.

Estes resultados mostram que o sobrenadante a partir da precipitação de fitase pode ser reciclado e usado novamente na próxima precipitação em batelada para fazer a solução de reagente.

Nos testes de reciclagem 1, 2, 7 e 8 não foram observadas precipitações devido à falta de poliânion no sobrenadante reciclado.

Tabela 7. Condições experimentais de reciclagem do sobrenadante em testes de precipitação.

Atividade (%) Composição da Alginato Acetato Teste de Sobrenadante de FTU solução de de sódio de sódio reciclagem do solúvel da reagente (%, p/p) (M) atividade total sem 1 sobrenadante exemplo 9 nd nd precipitação sem 2 sobrenadante exemplo 8 nd nd precipitação sobrenadante e 3 exemplo 9 0,18 nd 42 alginato de sódio sobrenadante e 4 exemplo 8 0,18 nd 41 alginato de sódio sobrenadante, 5 alginato de sódio exemplo 9 0,18 0,05 53 e tampão 6 sobrenadante, exemplo 8 0,18 0,05 51 alginato de sódio e tampão sobrenadante e sem 7 exemplo 9 nd 0,05 tampão precipitação sobrenadante e sem 8 exemplo 8 nd 0,05 tampão precipitação água de torneira, alginato de sódio 9 0,18 nd 33 e tampão (referência) EXEMPLO 12 - Preparação de produto líquido

[096] O material do exemplo 8 colhido por centrifugação foi usado como um material de partida para a preparação das formulações líquidas estabilizadas 1 e 2 do complexo fitase-alginato. Para a formulação 3, o material precipitado foi retirado da batelada 4 do exemplo 2. O precipitado foi colhido por sedimentação.

[097] Para preparar formulações, pós secos de sulfato de sódio, sorbitol, ácido cítrico e citrato trissódico e 35% (p/p) de solução de benzoato de sódio foram adicionados aos precipitados colhidos e solubilizados. Dois dos produtos líquidos foram formulados com sorbitol e um sem sorbitol. As soluções foram misturadas com agitador magnético completamente antes do armazenamento a frio. As condições de formulação finais são apresentadas na tabela 8. As atividades dessas formulações foram iguais ou superiores em comparação com o produto de fitase líquido comercial sem tratamento de precipitação de polieletrólito usado como referência. A atividade enzimática da formulação 1 foi 1,5x superior em comparação com a referência e a concentração de atividade da formulação 2 foi 1,1x superior à referência. A concentração de atividade da formulação 3 estava no mesmo nível que na referência. Esses resultados mostram que, usando a fitase precipitada, é possível aumentar a concentração da enzima em produtos líquidos.

Tabela 8. Condições de formulação de produtos líquidos preparados de fitase de E. coli precipitada.

Precipitado Sulfato de Ácido Benzoato Alginato Sorbitol Citrato Formulação solubilizado sódio (%, cítrico de sódio de sódio pH (%, p/p) trissódico (%) p/p) (%, p/p) (%, p/p) (%, p/p) (%, p/p) 1 91,2 3,9 0,0 0,5 2,7 0,3 1,0 4,7 2 72,0 4,0 19,7 0,5 2,2 0,4 0,8 4,7 3 72,4 3,9 19,7 0,5 2,3 0,3 0,9 4,3 EXEMPLO 13 - Preparação de produto líquido

[098] Retentados de experimentos de colheita de microfiltração no exemplo 6 foram usados como material de partida em testes de secagem por pulverização para produzir produto seco de complexo sólido de fitase-alginato. Um Buchi Mini Spray Dryer B-290 foi usado para a secagem da amostra. Seis diferentes secagens por pulverização foram realizadas. O aditivo de secagem, PEG 4000 ou trealose, foi usado em três desses experimentos. O aditivo foi adicionado imediatamente antes da secagem por pulverização. O PEG foi adicionado como 50% (p/p) de líquido à solução de precipitado colhido durante agitação adequada. A trealose foi adicionada como pó seco à solução de precipitado durante agitação adequada. As quantidades de solução de precipitado com ou sem aditivos alimentados ao secador por pulverização variaram de 570 g a 760 g. Durante a secagem por pulverização, a solução precipitada foi mantida em temperatura ambiente sob agitação adequada. Durante a secagem por pulverização, a temperatura de entrada foi mantida próxima a 130 °C e o valor de bomba próximo a 30% de modo que a temperatura de saída ficasse próxima a 75 °C. Os teores de matéria seca e atividade foram analisados a partir de soluções precipitadas e pós secos por pulverização final para calcular os rendimentos de secagem. Todas as secagens foram bem- sucedidas e não ocorreram dificuldades durante as secagens. As condições e resultados de secagem e pulverização finais são representados na Tabela 9. Estes resultados mostram que o material precipitado pode ser formulado para secar produtos por secagem por pulverização com ou sem aditivos de secagem. Tabela 9. Condições de secagem por pulverização e rendimentos de fitase de E. coli precipitada. Amostra Perda de Rendimento Material a partir Aditivo de Matéria seca de material para de secagem de secagem em pó (%, p/p) secagem câmara (%) (%) 1 Colheita 1 95,7 37 86 2 Colheita 2 95,9 38 86 1% (p/p) 3 Colheita 3 94,9 31 100 PEG 4000 2% (p/p) 4 Colheita 3 95,8 27 100 PEG 4000 5 Colheita 4 94,6 64 90 1% (p/p) 6 Colheita 5 95,1 56 91 trealose EXEMPLO 14 - Estabilidade de armazenamento de produto líquido (complexo solúvel)

[099] As formulações do exemplo 12 foram tomadas sob estudo de estabilidade de armazenamento acelerado. O tempo de armazenamento foi de 8 semanas. Para o estudo de estabilidade, cada um dos líquidos formulados foi dividido em tubos falcon de 15 mL fechados com tampas, 5 mL de líquido por tubo. Um tubo foi preparado para cada ponto de tempo de armazenamento. Todos os tubos de amostra foram colocados em uma câmara climática a 37 °C. A partir de cada ponto de tempo, um tubo de amostra foi levado ao freezer antes da análise de atividade. As atividades de fitase de cada ponto de tempo de armazenamento foram comparadas com a atividade de fitase do ponto de partida. Produto de fitase líquido comercial sem tratamento de precipitação de polieletrólito armazenado da mesma maneira foi usado como uma referência. Os níveis de concentração de atividade das formulações estudadas variaram. A concentração de atividade da formulação 1 foi 1,5x superior em comparação com a referência e a concentração de atividade da formulação 2 foi 1,1x superior a referência. A atividade enzimática da formulação 3 estava no mesmo nível que a referência. Os resultados de estabilidade são ilustrados graficamente na figura

5. Os resultados mostram estabilidade aprimorada quando o complexo fitase- poliânion foi formulado para um produto líquido em comparação com o produto de referência sem formação de complexo. EXEMPLO 15 - Estabilidade de armazenamento de produto seco (complexo sólido)

[0100] Usando o método no exemplo 2, foi preparada uma série de precipitações em batelada de 2 L. O material precipitado era um concentrado de fitase de E. coli. As condições de precipitação usadas foram as seguintes: Tampão de acetato de sódio a 0,05 M, 0,46% (p/p) de alginato de sódio, razão 4000 FTU:mg de alginato de sódio, matéria seca calculada 5,2%. Após a precipitação, essas bateladas foram combinadas e o excesso de parte líquida foi removido para receber a pasta de precipitado tendo 12,3% de matéria seca. Esta pasta foi seca por pulverização usando o método no exemplo 13, exceto que nenhum aditivo de secagem foi usado. Durante a secagem por pulverização, a temperatura de entrada foi mantida próxima a 132 °C e o valor de bomba próximo a 34% de modo que a temperatura de saída ficasse próxima a 75 °C. A atividade e os teores de matéria seca foram analisados a partir da solução de precipitado e do pó seco por pulverização final para calcular os rendimentos de secagem. A matéria seca em pó foi de 96,1% e o rendimento de secagem foi de 100%. Este produto seco foi submetido a um estudo de estabilidade de armazenamento acelerado. O tempo de armazenamento foi de 8 semanas. Para o estudo de estabilidade, o pó seco foi dividido em tubos falcon de 50 mL fechados com tampas, 8-10 g em cada tubo. Para cada ponto de armazenamento, um tubo foi preparado. Todos os tubos de amostra foram colocados em uma câmara climática a 40 °C. A partir de cada momento, um tubo de amostra foi levado ao freezer antes da análise de atividade. As atividades de fitase de cada ponto de tempo de armazenamento foram comparadas com a atividade de fitase do ponto de partida. Os resultados de estabilidade são ilustrados graficamente na figura 6. Estes resultados mostram estabilidade aprimorada quando o complexo fitase-poliânion foi formulado para produto seco: a curva que mostra a atividade residual em pontos de tempo diferentes foi 19% maior após armazenamento de 8 semanas a 40 °C em comparação com os produtos de fitase secos comerciais de referência sem precipitação/formação de complexo estudados da mesma maneira. EXEMPLO 16 - Teste de peletização

[0101] As amostras de pó seco 1, 2, 3 e 4 de experimentos de secagem por pulverização no exemplo 13 foram usadas para estudar a estabilidade ao calor por testes de peletização padronizados em um instituto independente (Instituto Tecnológico Dinamarquês, Kolding, Dinamarca). Os artigos de teste foram misturados em farelo de alimentos, que foram tratados em um condicionador com vapor de água quente, resultando em diferentes temperaturas de farelo de alimentos antes da peletização. As recuperações foram calculadas a partir das atividades enzimáticas analisadas nos pellets após o tratamento térmico em comparação com a atividade enzimática no farelo de alimentos sem condicionamento e peletização. Estas recuperações foram comparadas com o produto comercial de fitase seco sem precipitação/formação de complexo testado da mesma maneira. As porcentagens de aprimoramento de recuperação são representadas graficamente na figura 7. Estes resultados mostram que a estabilidade térmica em pellets após o tratamento em temperaturas de condicionamento mais altas pode ser aumentada usando polieletrólito precipitado e fitase seca por pulverização. EXEMPLO 17 - Precipitação usando diferentes tipos de alginato de sódio

[0102] O efeito de diferentes alginatos de sódio na precipitação de fitase de E. coli foi estudado. Uma série de experimentos de precipitação em batelada foram realizados usando cinco produtos diferentes de alginato de sódio: um da Fluka (71238), um da Sigma (W201502) e três da FMC (Manucol DH, Manucol DH MCLDHP e Manucol LD). Para as precipitações em batelada, as soluções de reagente foram preparadas adicionando tampão de acetato de sódio a 1 M (pH nominal 3,6) e alginato de sódio seco em água de torneira. Os pós secos foram deixados dissolver e as soluções de reagentes foram armazenadas em ambiente frio durante a noite. O concentrado de fitase foi adicionado às soluções de reagentes à temperatura ambiente durante agitação adequada com um agitador magnético, e deixado precipitar a frio por 1 hora. As quantidades necessárias de água de torneira e de concentrado foram calculadas de forma que a razão 10.000 FTU:mg de composto polianiônico de destino e os teores de matéria seca calculados de 5,2% foram alcançados. As condições de precipitação finais foram: 0,17% (p/p) de alginato de sódio e acetato de sódio a 0,05 M. Após a precipitação, as atividades enzimáticas solúveis foram determinadas para calcular o rendimento de precipitação. Os resultados são representados na tabela 10. Esses resultados mostram que diferentes tipos de alginato de sódio têm efeitos diferentes no rendimento de precipitação. Tabela 10. Efeito de diferentes tipos de alginato de sódio na atividade de fitase solúvel e rendimento de precipitação. Atividade Rendimento de Razão enzimática solúvel Alginato de sódio usado pH (FTU:mg de alginato precipitação de atividade total de sódio) (%) (%) Fluka (71238) 4,15 10.680 21 79

Sigma (W201502) 4,17 10.859 27 73 Manucol DH (FMC) 4,29 10.794 6 94 4,15 10.973 74 Manucol DH (FMC) 26 Manucol LD (FMC) 4,26 10.842 6 94 EXEMPLO 18 - Triagem de razão certa de fitase e composto polianiônico

[0103] O efeito da razão FTU: mg de composto polianiônico com diferentes compostos polianiônicos foi estudado. Uma série de experimentos de precipitação em batelada de 2 g foram efetuados usando concentrado de fitase de E. coli. Os compostos polianiônicos estudados foram alginato de sódio, hialuronato de sódio e polipectato de sódio. As razões estudadas variaram de

1.200 a 9.800. Para precipitações em batelada, as soluções de reagentes foram preparadas em tubos Eppendorf de 2 mL adicionando tampão de acetato de sódio a 1 M (pH nominal 3,6) e solução estoque de compostos polianiônicos selecionados à água de torneira. As soluções de estoque polianiônicas usadas foram: 2% (p/p) de alginato de sódio, 2% (p/p) de polipectato de sódio, 0,5% (p/p) de hialuronato de sódio. O concentrado de fitase foi adicionado às soluções de reagentes à temperatura ambiente e misturado em vórtex adequadamente, ao mesmo tempo o complexo polianiônico-fitase se formou rapidamente. As quantidades necessárias de água de torneira e de concentrado foram calculadas de forma que a razão FTU:mg de composto polianiônico de destino e os teores de matéria seca calculados foram alcançados. A concentração final de acetato de sódio em todos os experimentos foi de 0,05 M. As condições finais de precipitação e os rendimentos de atividade são representados na tabela 11 e as curvas de atividade solúvel são ilustradas graficamente na figura 8. Os rendimentos de precipitação foram calculados com base nas atividades de fitase solúveis em sobrenadantes. Estes resultados mostram que a fitase pode ser precipitada com todos os poliânions estudados e o rendimento de precipitado pode ser aprimorado ao alterar a razão FTU:mg de composto polianiônico.

Tabela 11. Efeito de diferentes razões FTU: mg de composto polianiônico e composto polianiônico diferente no rendimento de precipitação de fitase de E. coli. Matéria Rendimento de Experimento Poliânion Razão Composto seca precipitação de triagem (%, p/p) (FTU:mg de polianiônico calculada (%) poliânion) (%, p/p) 1 0,90 1.900 alginato de sódio 5,9 96 2 0,60 2.800 alginato de sódio 5,6 100 3 0,45 3.800 alginato de sódio 5,5 100 4 0,36 4.600 alginato de sódio 5,3 100 5 0,30 5.700 alginato de sódio 5,3 98 6 0,26 6.400 alginato de sódio 5,3 94 7 0,23 7.200 alginato de sódio 5,2 89 8 0,18 9.400 alginato de sódio 5,2 74 polipectato de 9 1,44 4.800 5,6 72 sódio polipectato de 10 1,20 5.700 5,4 60 sódio polipectato de 11 1,03 6.500 5,3 57 sódio hialuronato de 12 1,45 5.400 5,3 88 sódio hialuronato de 13 1,22 6.300 5,2 79 sódio hialuronato de 14 1,02 7.700 5,3 71 sódio hialuronato de 15 0,90 8.600 5,2 66 sódio hialuronato de 16 0,80 9.800 5,2 57 sódio EXEMPLO 19 - Precipitação usando ácido fítico como composto polianiônico sozinho e em combinação com alginato de sódio

[0104] O ácido fítico - substrato de fitase - foi estudado como composto polianiônico para verificar seu potencial de precipitação de fitase. Também foi estudada a precipitação usando combinação de alginato de sódio e ácido fítico. Uma série de experimentos de precipitação em batelada de 2 g foram efetuados usando concentrado de fitase de E. coli.

Para precipitações em batelada, as soluções de reagentes foram preparadas em tubos Eppendorf de 2 mL adicionando tampão de acetato de sódio a 1 M (pH nominal 3,6) e solução estoque de compostos polianiônicos selecionados à água de torneira.

As soluções de estoque polianiônicas usadas foram: 2% (p/p) de alginato de sódio e 5% (p/p) de ácido fítico.

O concentrado de fitase foi adicionado às soluções de reagentes resfriadas em banho de gelo e agitado adequadamente, ao mesmo tempo o complexo polianiônico-fitase se formou rapidamente.

As quantidades necessárias de água de torneira e de concentrado foram calculadas de forma que a razão FTU:mg de composto polianiônico de destino e os teores de matéria seca calculados foram alcançados.

A concentração final de acetato de sódio em todos os experimentos foi de 0,05 M.

As condições finais de precipitação e os rendimentos são representados na tabela 12. Os rendimentos de precipitação foram calculados com base na concentração de proteína solúvel em sobrenadantes em comparação com a concentração de proteína total.

Esses resultados mostram que a fitase pode ser precipitada com a combinação dos poliânions estudados.

Eles também mostram precipitação transiente de fitase se o ácido fítico for usado sozinho como poliânion precipitante nas condições estudadas.

Tabela 12. Condições de precipitação e rendimentos de seis bateladas de precipitação de fitase de E. coli.

Razão Matéria Experim Alginato Ácido Total de (FTU:mg Rendimento de seca ento de de sódio fítico poliânions (%, de pH precipitação calculada triagem (%, p/p) (%, p/p) p/p) poliânion (%) (%, p/p) s totais) precipitação 17 1,46 1,46 1.200 1,74 5,2 transitória 18 1,26 0,20 1,46 1.200 3,90 5,3 60,8 19 1,46 1,46 1.200 4,35 5,3 49,0 precipitação 20 0,88 0,88 2.000 2,02 5,2 transiente 21 0,78 0,10 0,88 2.000 4,05 5,2 64,5 22 0,89 0,89 2.000 4,32 5,2 62,9 EXEMPLO 20 - Efeito do fator de diluição do concentrado no rendimento de fitase precipitada

[0105] O efeito da diluição do concentrado de fitase na precipitação de fitase foi estudado. Uma série de experimentos de precipitação em batelada de 2 g foram efetuados usando concentrado de fitase de E. coli. As precipitações foram feitas usando alginato de sódio como composto polianiônico e a razão FTU:mg de alginato de sódio foi 4000. Para precipitações em batelada, as soluções de reagentes foram preparadas em tubos Eppendorf de 2 mL adicionando tampão de acetato de sódio a 1 M (pH nominal 3,6) e 2% (p/p) de solução estoque de alginato de sódio à água de torneira. O concentrado de fitase foi adicionado às soluções de reagentes à temperatura ambiente e misturado em vórtex adequadamente, ao mesmo tempo o complexo fitase-poliânion se formou rapidamente. As quantidades necessárias de água de torneira e de concentrado foram calculadas de forma que a razão FTU:mg de composto polianiônico de destino e os teores de matéria seca calculados foram alcançados. As condições de precipitação e os rendimentos de atividade finais são representados na tabela 13. Os rendimentos de precipitação foram calculados com base nas atividades de fitase solúveis em sobrenadantes. Esses resultados mostram que o rendimento da precipitação pode ser aumentado ainda mais com o aumento da diluição do concentrado de fitase, o que significa menor teor de matéria seca na precipitação. Tabela 13. Efeito de diluição de concentrados de fitase de E. coli em atividade de fitase solúvel na precipitação de polieletrólitos. Matéria Alginato de Acetato Atividade Rendimento de Experimento seca total sódio (%, de sódio enzimática solúvel precipitação (%)

calculada p/p) (M) de atividade total (%) (%) (%) 11 11,5 0,96 0,05 3,0 97,0 12 9,9 0,80 0,05 1,5 98,5 13 8,2 0,68 0,05 0,9 99,1 14 7,0 0,58 0,05 0,5 99,5 15 6,2 0,52 0,05 0,3 99,7 16 5,5 0,45 0,05 0,2 99,8 EXEMPLO 21 - Efeito do fator de diluição do concentrado sobre o nível de atividade e pureza do produto final líquido formulado

[0106] Foi estudado o efeito de diluição do concentrado de fitase até certo nível de matéria seca sobre a atividade e a pureza dos produtos finais líquidos formulados. Primeiro, uma série de precipitações em batelada de 40 g foram preparadas usando concentrado de fitase de E. coli. O alginato de sódio foi usado como composto polianiônico e a razão FTU:mg de alginato de sódio de destino foi 4000. Para precipitações em batelada, as soluções de reagentes foram preparadas adicionando tampão de acetato de sódio a 1 M (pH nominal 3,6) e 2% (p/p) de solução estoque de alginato de sódio à água de torneira. O concentrado de fitase foi adicionado às soluções de reagentes à temperatura ambiente e agitado adequadamente com agitador magnético, ao mesmo tempo o complexo polianiônico-fitase se formou rapidamente. As quantidades necessárias de água de torneira e de concentrado foram calculadas de forma que a razão FTU:mg de alginato de sódio de destino e os teores de matéria seca calculados foram alcançados. As condições de precipitação finais são representadas na tabela 14. Tabela 14. Condições de experimento de precipitações em batelada de fitase de E. coli. Alginato de sódio Acetato de sódio Matéria seca calculada Experimento (%, p/p) (M) (%, p/p) 17 0,82 0,05 9,7 18 0,69 0,05 8,1 19 0,58 0,05 7,0

20 0,51 0,05 6,2

[0107] Os próximos precipitados foram colhidos por centrifugação. Após a centrifugação, tanto quanto possível do sobrenadante foi removido. Depois disso, os precipitados de fitase-alginato foram dissolvidos pela adição de sulfato de sódio seco e sorbitol seco de modo que as condições de formulação finais de 4% (p/p) de sulfato de sódio e 20% (p/p) de sorbitol foram alcançadas. Os precipitados foram deixados dissolver em ambiente frio durante a noite sob agitação. Experimentos com teor de matéria seca mais baixos, o que também significa maiores diluições, foram mais fáceis de dissolver. As atividades de fitase e as concentrações de proteína foram analisadas a partir dos líquidos formulados finais. Para o nível de atividade relativa, as atividades (como FTU/g) das formulações 2, 3 e 4 foram comparadas com a atividade da formulação 1. Para o fator de purificação do produto, os valores de FTU/mg de proteína calculados foram comparados com o valor de FTU/mg de proteína do produto de fitase líquido comercial sem tratamento de precipitação de polieletrólito. As condições de formulação finais e purificação de produto são representados na tabela 15. Esses resultados mostram que produtos mais concentrados são possíveis de serem alcançados com maior pureza ao otimizar a diluição do concentrado de fitase. Tabela 15. Condições de formulação de precipitados de fitase de E. coli dissolvidos. Matéria seca de Sulfato de Nível de Fator de Sorbitol (%, Formulação precipitação (%, sódio (%, atividade purificação do p/p) p/p) p/p) relativo (%) produto 4 9,7 4,0 20,1 100 2,8 5 8,1 4,0 20,4 82 2,4 6 7,0 4,0 20,0 76 2,2 7 6,2 4,0 20,1 57 2,1 EXEMPLO 22 - Precipitação de fitase bacteriana diferente

[0108] O potencial do alginato de sódio para precipitar outra fitase bacteriana foi estudado. A fitase de Buttiauxella foi usada como material enzimático de partida. A fim de preparar a fitase líquida adequada para precipitação, 1 g de grânulo seco foi suspenso em 10 g de solução tampão de acetato de sódio a 25 mM em pH 4. O líquido foi separado e purificado por filtração em gel usando o mesmo tampão de acetato de sódio. Após essa batelada, a precipitação foi iniciada pela adição de 2% (p/p) de solução de alginato de sódio aos poucos a 5 g de material enzimático purificado. A quantidade de alginato de sódio adicionado foi medida e o aparecimento da solução foi observado durante a adição de alginato de sódio. Os resultados são representados na tabela 16. Tabela 16. Aparência física da precipitação de fitase de Buttiauxella durante a adição de alginato de sódio. Fitase em acetato de sódio a Alginato de Razão FTU:mg de 25 mM em pH 4 após sódio (%, alginato de sódio Aparência visual filtração em gel p/p) de destino (%, p/p) 99,8 0,004 8.000 nebuloso 99,8 0,005 7.000 ligeiramente turvo 99,8 0,005 6.000 ligeiramente turvo 99,7 0,006 5.000 turvo 99,6 0,007 4.000 completamente turvo 99,5 0,010 3.000 completamente turvo partículas de 99,3 0,015 2.000 precipitado visíveis + completamente turvas

[0109] A adição de alginato de sódio foi interrompida quando foram observadas partículas de precipitado visíveis. Amostras para análise de atividade foram retiradas desta solução precipitada final. As condições de precipitação e os rendimentos de atividade enzimática finais são representados na tabela 17. O rendimento de precipitação foi calculado com base na atividade enzimática solúvel em sobrenadante em comparação com a atividade total. Estes resultados mostram que o alginato de sódio pode ser usado com sucesso para precipitar outra fitase bacteriana então usada na maioria dos experimentos. Tabela 17. Condições de experimento e rendimento de precipitação da precipitação da batelada de fitase de Buttiauxella. Fitase em acetato de sódio a 25 Razão FTU:mg de Rendimento de mM em pH 4 após filtração em Alginato de alginato de sódio de gel sódio (%, p/p) precipitação (%) destino (%, p/p) 99,3 0,015 2.000 85 EXEMPLO 23 - Precipitação de fitase fúngica

[0110] O potencial do alginato de sódio para precipitar outra fitase fúngica foi estudado. Quatro precipitações em batelada foram feitas usando concentrados de fitase de Aspergillus como material enzimático de partida. As precipitações foram feitas em tubos de 15 mL e os volumes totais das precipitações eram de 10 mL. As soluções de reagentes foram preparadas misturando tampão de acetato de sódio a 1 M (pH nominal 3,6), 2% (p/p) de solução estoque de alginato de sódio e água de torneira em tubos. O concentrado de fitase foi adicionado às soluções de reagentes à temperatura ambiente e misturado em vórtex adequadamente, para permitir a formação do complexo. As quantidades necessárias de água de torneira e de concentrado foram calculadas de forma que a razão FTU:mg de alginato de sódio de destino e os teores de matéria seca calculados fossem alcançados. As condições de precipitação finais e os rendimentos de atividade enzimática finais são representados na tabela 18. Os rendimentos de precipitação foram calculados com base nas atividades de fitase solúveis em sobrenadantes. Estes resultados mostram que a precipitação com alginato de sódio pode ser usada com sucesso para precipitar também fitases fúngicas. Tabela 18. Condições de experimento e rendimentos de precipitação das precipitações da batelada de fitase de Aspergillus.

Experimento Razão FTU:mg Rendimento de de alginato de Matéria seca Alginato de Acetato de de precipitação sódio de calculada (%, sódio (%, p/p) sódio (M) precipitação de fitase destino p/p) (%) fúngica 1 0,36 0,05 2.000 3,6 26,2 2 0,18 0,05 4.000 3,5 18,4 3 0,21 0,05 2.000 2,0 55,1 4 0,10 0,05 4.000 2,0 12,2 EXEMPLO 24 - Dissolução de complexo fitase-alginato com cloreto de cálcio

[0111] A precipitação de fitase de E.Coli foi feita de maneira semelhante à descrita no Exemplo 4. O precipitado foi colhido por sedimentação. Neste exemplo, a dissolução do precipitado colhido foi feita usando CaCl2 em vez de Na2SO4 que foi usado nos exemplos anteriores de dissolução de precipitado. Para dissolver o precipitado colhido, o cloreto de cálcio di-hidratado seco foi adicionado e misturado ao precipitado colhido com e sem outros aditivos para atingir as condições experimentais finais mostradas na tabela 19 abaixo. Tabela 19. Condições de experimento de precipitados de fitase de E. coli dissolvidos. Precipitado Citrato de fitase- trissódico alginato CaCl2 di- colhido % X2H2O % hidratado Sorbitol Benzoato- Experimento (p/p) (p/p) % (p/p) (%, p/p) Na % (p/p) pH Observação dissolvido, 21 98,2 0,7 0,37 5,3 um pouco de gel dissolvido, 22 96,3 0,7 2,0 0,35 4,7 viscoso dissolvido, 23 91,5 0,4 2,1 5,0 0,37 4,8 viscoso 24 92,4 0,4 1,0 5,1 0,37 4,6 dissolvido,

um pouco de gel, viscoso

[0112] Estes resultados mostram que o precipitado de fitase-alginato se dissolve ainda mais eficazmente pela adição de cloreto de cálcio em comparação com sulfato de sódio ou cloreto de sódio usado como sal de dissolução. Alta viscosidade e gel observada nos líquidos do experimento indicam gelificação de alginato induzida por Ca2+ nestas condições de dissolução do complexo fitase- alginato. Existência de Ca2+ é, portanto, considerada benéfica na formulação líquida no caso de haver uma necessidade de prevenir a re-precipitação de fitase como complexo com alginato. Ao mesmo tempo, esses resultados mostram que CaCl2 não pode ser usado como um precipitante de alginato ligado à fitase como usado com outras enzimas no estado da técnica. Pelo contrário, CaCl 2 funciona como agente de dissolução no caso de fitase. Esses resultados indicam que a existência de Ca2+ na fase de precipitação de fitase podem levar à precipitação ineficaz ou podem impedir completamente a precipitação de fitase.

[0113] Diferentes aspectos e modalidades exemplares não vinculativas da presente invenção foram ilustradas anteriormente. As modalidades são usadas meramente para explicar aspectos ou etapas selecionados que podem ser utilizados ao implementar a presente invenção. Algumas modalidades podem ser apresentadas na presente invenção apenas com uma referência a um certo aspecto da invenção. Deve ser apreciado que as modalidades também podem ser aplicadas a outros aspectos da presente invenção. Consequentemente, qualquer combinação apropriada das modalidades e dos aspectos pode ser formada. Qualquer combinação de aspectos ou modalidades, conforme divulgado na presente invenção também pode ser feita sem pelo menos uma característica não essencial revelada em um aspecto ou modalidade.

Claims (19)

REIVINDICAÇÕES

1. Um método para precipitar fitase, compreendendo i. fornecer um meio aquoso compreendendo fitase; e ii. adicionar poliânion.

2. O método da reivindicação 1, em que o meio aquoso compreendendo fitase compreende caldo de fermentação.

3. O método da reivindicação 1, em que o meio aquoso compreendendo fitase compreende caldo de fermentação clarificado, caldo de fermentação de descarte, caldo de fermentação de descarte e clarificado ou uma combinação dos mesmos.

4. O método das reivindicações 1-3, em que o teor de matéria seca do meio aquoso compreendendo fitase sem sólidos está entre 0,1 - 25% p/p antes da etapa ii.

5. O método das reivindicações 1-4, compreendendo ajustar o pH a 3-5 para potencializar a precipitação de fitase.

6. O método das reivindicações 1-5, em que o poliânion é ácido algínico, ácido péctico, ácido hialurônico, ácido fítico, um sal de tal ácido polianiônico, ou qualquer combinação dos mesmos.

7. O método da reivindicação 6, em que o sal do ácido polianiônico é adicionado em uma forma sólida ou como uma solução aquosa à solução aquosa compreendendo fitase.

8. Um método para preparar uma composição de fitase, compreendendo i. fornecer um meio aquoso compreendendo fitase; ii. adicionar um poliânion para precipitar a fitase como um complexo de fitase e poliânion; e iii. recuperar a fitase precipitada para obter a composição de fitase.

9. O método da reivindicação 8, compreendendo lavar a fitase precipitada.

10. O método das reivindicações 8-9, em que a fitase precipitada, opcionalmente lavada, é desidratada para obter um produto seco.

11. O método das reivindicações 8-10, compreendendo dissolver a fitase precipitada para obter um produto líquido.

12. O método das reivindicações 8-11, compreendendo desidratar a fitase precipitada, opcionalmente lavada, para obter um produto seco.

13. O método da reivindicação 12, compreendendo dissolver o produto seco para obter um produto reconstituído.

14. O método das reivindicações 1-13, em que a razão de fitase para poliânion expressa como FTU:mg de poliânion é selecionada a partir da faixa de 500-15000.

15. O método das reivindicações 1-14, em que a quantidade do poliânion adicionado é selecionada a partir da faixa de 0,001 - 2% p/p com base no teor de matéria seca.

16. Uma composição de fitase compreendendo fitase complexada com um poliânion.

17. A composição de fitase da reivindicação 16, em que o poliânion é um sal de alginato, um sal de polipectato, um sal de fitato, um sal de hialuronato ou qualquer combinação dos mesmos.

18. A composição de fitase das reivindicações 16-17, em que a composição é um produto líquido ou um produto seco.

19. Uma composição de fitase compreendendo fitase e um poliânion.