BR112021005952A2 - use of a compound - Google Patents

use of a compound Download PDF

Info

Publication number
BR112021005952A2
BR112021005952A2 BR112021005952-0A BR112021005952A BR112021005952A2 BR 112021005952 A2 BR112021005952 A2 BR 112021005952A2 BR 112021005952 A BR112021005952 A BR 112021005952A BR 112021005952 A2 BR112021005952 A2 BR 112021005952A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
mice
neurons
formula
donecopride
radical
Prior art date
Application number
BR112021005952-0A
Other languages
Portuguese (pt)
Inventor
Patrick Dallemagne
Christophe Rochais
Sylvie Claeysen
Original Assignee
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
Universite De Caen Normandie
Centre National De La Recherche Scientifique
Université De Montpellier
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm), Universite De Caen Normandie, Centre National De La Recherche Scientifique, Université De Montpellier filed Critical Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
Publication of BR112021005952A2 publication Critical patent/BR112021005952A2/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D211/00—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings
    • C07D211/04—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D211/06—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D211/08—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to ring carbon atoms
    • C07D211/18—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
    • C07D211/30—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms with hydrocarbon radicals, substituted by doubly bound oxygen or sulfur atoms or by two oxygen or sulfur atoms singly bound to the same carbon atom
    • C07D211/32—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms with hydrocarbon radicals, substituted by doubly bound oxygen or sulfur atoms or by two oxygen or sulfur atoms singly bound to the same carbon atom by oxygen atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

A presente invenção refere-se a um composto da fórmula (I) para uso como agente neuroprotetor na prevenção e/ou tratamento de doenças neurodegenerativas.The present invention relates to a compound of formula (I) for use as a neuroprotective agent in prevention and/or treatment of neurodegenerative diseases.

Description

“USO DE UM COMPOSTO”"USE OF A COMPOUND"

[001] A presente invenção refere-se ao tratamento de doenças neurodegenerativas.[001] The present invention relates to the treatment of neurodegenerative diseases.

[002] Doenças neurodegenerativas são aquelas que são induzidas pelo colapso da rede neural do circuito nervoso com base na degeneração sistemática e deciduação de neurócitos, sendo conhecidas como diversas doenças intratáveis, tais como mal de Alzheimer (AD), mal de Parkinson, demência de corpos Lewis, demência vascular e problemas associados ao envelhecimento, incluindo (i) neurodegeneração não cognitiva, (ii) degeneração neuromuscular não cognitiva e (iii) neurodegeneração sensorial motora, mal de Huntington, doenças neuronais motoras incluindo esclerose lateral amiotrófica (ALS), síndrome de Down, degeneração gangliônica corticobasal, atrofia de múltiplos sistemas, atrofia cerebral, atrofia olivopontocerebelar, paralisia supranuclear, ataxia de Friedreich, ataxia espinhocerebelar do tipo 2, degenerações frontotemporais (FTD) e afasia progressiva primária.[002] Neurodegenerative diseases are those that are induced by the breakdown of the neural network of the nervous circuit based on systematic degeneration and deciduation of neurocytes, being known as several intractable diseases, such as Alzheimer's disease (AD), Parkinson's disease, dementia of Lewis bodies, vascular dementia and conditions associated with aging, including (i) non-cognitive neurodegeneration, (ii) non-cognitive neuromuscular degeneration and (iii) motor sensory neurodegeneration, Huntington's disease, motor neuronal diseases including amyotrophic lateral sclerosis (ALS) syndrome of Down, corticobasal ganglionic degeneration, multisystem atrophy, cerebral atrophy, olivopontocerebellar atrophy, supranuclear palsy, Friedreich's ataxia, type 2 spinocerebellar ataxia, frontotemporal degenerations (FTD) and primary progressive aphasia.

[003] Sintomas clínicos de doenças neurodegenerativas variam de menores a severas, dependendo da doença. Eles incluem tremor, rigidez, aquinesia, hipoquinesia, bradiquinesia, falhas de reflexos comportamentais, disfunção autonômica, pulsão, perturbações da marcha, depressão, apatia, confusão, alteração do aprendizado, déficits de memória, impedimento cognitivo, amiotrofia, perda muscular, distúrbios da cintura escapular, distúrbios das articulações, disfagia, distúrbios respiratórios, dormência, paralisia e demência, que são barreiras importantes para a realização de atividades diárias.[003] Clinical symptoms of neurodegenerative diseases vary from minor to severe, depending on the disease. They include tremor, rigidity, akinesia, hypokinesia, bradykinesia, behavioral reflex failures, autonomic dysfunction, drive, gait disturbances, depression, apathy, confusion, learning impairment, memory deficits, cognitive impairment, disuse atrophy, muscle wasting, impaired shoulder girdle, joint disorders, dysphagia, respiratory disorders, numbness, paralysis and dementia, which are important barriers to performing daily activities.

[004] A morte neurodegenerativa é um mecanismo complicado, provavelmente devido a diversos grupos moleculares que acionam doenças neurodegenerativas quando ocorrerem problemas na sua expressão, atividade e/ou regulagem. Isso pode explicar por que nenhum método eficaz de inibição ou reversão da neurodegeneração foi estabelecido até hoje.[004] Neurodegenerative death is a complicated mechanism, probably due to several molecular groups that trigger neurodegenerative diseases when there are problems in its expression, activity and/or regulation. This may explain why no effective method of inhibiting or reversing neurodegeneration has been established to date.

[005] Além do tratamento para remoção das causas dessas doenças, é também importante reconstruir a rede neural. Tem sido afirmado, por exemplo, que, em mal de Alzheimer, para o qual foi reconhecida a citotoxicidade de peptídeo amiloide β como causa, a atrofia de neurites e a redução das sinapses acionam a deterioração da função neurológica e, por outro lado, mesmo após esse acionamento, neurócitos que não são totalmente desnaturados ou que sobreviveram sem degeneração podem ser recuperados se puderem ser possivelmente ativados para fornecer neurites para a recuperação das sinapses.[005] In addition to treatment to remove the causes of these diseases, it is also important to rebuild the neural network. It has been argued, for example, that in Alzheimer's disease, for which β amyloid peptide cytotoxicity has been recognized as a cause, neurite atrophy and synapse reduction trigger the deterioration of neurological function and, on the other hand, even after this activation, neurocytes that are not fully denatured or that have survived without degeneration can be retrieved if they can possibly be activated to supply neurites for synapse retrieval.

[006] Existe, portanto, importante necessidade de novos agentes capazes de proteger neurites, mas também capazes de aumentar o crescimento de neurites e promover a formação de novas sinapses, a fim de prevenir e tratar curativamente doenças neurodegenerativas.[006] There is, therefore, an important need for new agents capable of protecting neurites, but also capable of increasing neurite outgrowth and promoting the formation of new synapses, in order to prevent and curatively treat neurodegenerative diseases.

[007] A presente invenção satisfaz essa necessidade.[007] The present invention satisfies this need.

[008] A presente invenção resulta, de fato, da descoberta inesperada dos inventores de que o composto Donecoprida, descrito no pedido internacional WO 2014/195593, possui atividade neuroprotetora, pois é capaz, além de reduzir a hiperfosforilação de Tau, de aumentar o crescimento de neurites para manter a taxa de sinapses e, o que é mais importante e inesperado, promover a formação de novas sinapses.[008] The present invention results, in fact, from the unexpected discovery of the inventors that the compound Donecopride, described in the international application WO 2014/195593, has neuroprotective activity, as it is capable, in addition to reducing Tau hyperphosphorylation, of increasing the neurite outgrowth to maintain the rate of synapses and, most importantly and unexpectedly, promote the formation of new synapses.

[009] Devido a esse efeito protetor geral e eficiente sobre neurites, o composto Donecoprida é um agente neuroprotetor muito promissor para evitar e/ou tratar doenças neurodegenerativas que envolvam a degeneração de neurites.[009] Due to this general and efficient protective effect on neurites, the compound Donecopride is a very promising neuroprotective agent to prevent and/or treat neurodegenerative diseases involving the degeneration of neurites.

[0010] Este efeito foi adicionalmente confirmado com grande quantidade de compostos da fórmula geral (I) abaixo em diversos modelos de doenças neurodegenerativas, particularmente em modelos de mal de Alzheimer, modelos de mal de Parkinson, modelos de esclerose lateral amiotrófica, modelos de mal de Huntington e modelos de doenças neurodegenerativas induzidas por isquemia ou lesões cerebrais traumáticas.[0010] This effect was further confirmed with large amounts of compounds of general formula (I) below in various models of neurodegenerative diseases, particularly in Alzheimer's disease models, Parkinson's disease models, amyotrophic lateral sclerosis models, disease models Huntington's and models of neurodegenerative diseases induced by ischemia or traumatic brain injuries.

[0011] A presente invenção refere-se, portanto, a compostos da fórmula (I) a seguir: em que: - X representa: - um átomo de hidrogênio; - um átomo de halogênio (Hal), em que (Hal) é flúor, cloro, bromo ou iodo; ou - um grupo poli-halogênio alquila Cp(Hal)2p+1 de cadeia linear ou ramificada, em que p = 1, 2, 3 ou 4 (Hal), que possui o mesmo significado indicado acima; - Y representa: - um átomo de oxigênio; - um átomo de enxofre; ou - um radical N-R”, em que R” representa um átomo de hidrogênio, radical -OH, radical -O-A em que A representa um grupo alquila C1- C6 de cadeia linear ou ramificada, particularmente em que A representa um grupo metila ou radical alquila CqH2q+1 de cadeia linear ou ramificada, em que q = 1, 2, 3 ou 4; - m é um número inteiro selecionado a partir de 1, 2 e 3; - n é um número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 2 e 3; - r e s são números inteiros cujos valores são: r=s=0; r=s=1; r=s=2; ou r=0 e s=1; ou, por fim, r=0 e s=2;[0011] The present invention therefore relates to compounds of the formula (I) below: in which: - X represents: - a hydrogen atom; - a halogen atom (Hal), where (Hal) is fluorine, chlorine, bromine or iodine; or - a straight or branched chain Cp(Hal)2p+1 alkyl polyhalogen group, wherein p = 1, 2, 3 or 4 (Hal), having the same meaning as indicated above; - Y represents: - an oxygen atom; - a sulfur atom; or - an NR" radical, where R" represents a hydrogen atom, -OH radical, -OA radical where A represents a straight or branched chain C1-C6 alkyl group, particularly where A represents a methyl group or radical straight or branched chain CqH2q+1 alkyl, wherein q = 1, 2, 3 or 4; - m is an integer selected from 1, 2 and 3; - n is an integer selected from 0, 1, 2 and 3; - r and s are integers whose values are: r=s=0; r=s=1; r=s=2; or r=0 and s=1; or, finally, r=0 and s=2;

- R representa: - um átomo de hidrogênio; ou - um grupo alquila C1-C5 de cadeia linear ou ramificada capaz de conduzir um ou mais átomos de F; - R’ representa: - um radical alquila C1-C6 de cadeia ramificada; ou - um grupo cicloalquila C3-C10 ou bicíclico C5-C13, capaz de conduzir um ou mais grupos R e de possuir um átomo de oxigênio ou átomo de nitrogênio que pode ser substituído por R, átomo de enxofre ou radical -SO2- ou -SO-; bem como seus enantiômeros ou diaestereoisômeros e seus racêmicos, seus sais de ácidos, seus hidratos ou seus produtos de solvatação; para uso como agente neuroprotetor na prevenção e/ou tratamento de doenças neurodegenerativas.- R represents: - a hydrogen atom; or - a straight or branched chain C1-C5 alkyl group capable of carrying one or more F atoms; - R' represents: - a branched-chain C1-C6 alkyl radical; or - a C3-C10 cycloalkyl or C5-C13 bicyclic group, capable of carrying one or more R groups and of having an oxygen atom or nitrogen atom which may be substituted by R, sulfur atom or -SO2- or - radical ONLY-; as well as their enantiomers or diastereoisomers and their racemics, their acid salts, their hydrates or their solvation products; for use as a neuroprotective agent in the prevention and/or treatment of neurodegenerative diseases.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃODETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0012] Compostos:[0012] Compounds:

[0013] O composto utilizado de acordo com a presente invenção é um composto da fórmula (I) a seguir: em que: - X representa: - um átomo de hidrogênio; - um átomo de halogênio (Hal), em que (Hal) é flúor, cloro, bromo ou iodo; ou[0013] The compound used according to the present invention is a compound of the formula (I) below: in which: - X represents: - a hydrogen atom; - a halogen atom (Hal), where (Hal) is fluorine, chlorine, bromine or iodine; or

- um grupo poli-halogênio alquila Cp(Hal)2p+1 de cadeia linear ou ramificada, em que p = 1, 2, 3 ou 4 (Hal), que possui o mesmo significado indicado acima; - Y representa: - um átomo de oxigênio; - um átomo de enxofre; ou - um radical N-R”, em que R” representa um átomo de hidrogênio, radical -OH, radical -O-A em que A representa um grupo alquila C1- C6 de cadeia linear ou ramificada, particularmente em que A representa um grupo metila ou radical alquila CqH2q+1 de cadeia linear ou ramificada, em que q = 1, 2, 3 ou 4; - m é um número inteiro selecionado a partir de 1, 2 e 3; - n é um número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 2 e 3; e - r e s são números inteiros cujos valores são: r=s=0; r=s=1; r=s=2; ou r=0 e s=1; ou, por fim, r=0 e s=2; - R representa: - um átomo de hidrogênio; ou - um grupo alquila C1-C5 de cadeia linear ou ramificada capaz de conduzir um ou mais átomos de F; e - R’ representa: - um radical alquila C1-C6 de cadeia ramificada; ou - um grupo cicloalquila C3-C10 ou bicíclico C5-C13, capaz de conduzir um ou mais grupos R e de possuir um átomo de oxigênio ou átomo de nitrogênio que pode ser substituído por R, átomo de enxofre ou radical -SO2- ou -SO-; bem como seus enantiômeros ou diaestereoisômeros e seus racêmicos, seus sais de ácidos, seus hidratos ou seus produtos de solvatação.- a straight or branched chain Cp(Hal)2p+1 alkyl polyhalogen group, in which p = 1, 2, 3 or 4 (Hal), having the same meaning as indicated above; - Y represents: - an oxygen atom; - a sulfur atom; or - an NR" radical, where R" represents a hydrogen atom, -OH radical, -OA radical where A represents a straight or branched chain C1-C6 alkyl group, particularly where A represents a methyl group or radical straight or branched chain CqH2q+1 alkyl, wherein q = 1, 2, 3 or 4; - m is an integer selected from 1, 2 and 3; - n is an integer selected from 0, 1, 2 and 3; e - r and s are integers whose values are: r=s=0; r=s=1; r=s=2; or r=0 and s=1; or, finally, r=0 and s=2; - R represents: - a hydrogen atom; or - a straight or branched chain C1-C5 alkyl group capable of carrying one or more F atoms; and - R' represents: - a branched-chain C1-C6 alkyl radical; or - a C3-C10 cycloalkyl or C5-C13 bicyclic group, capable of carrying one or more R groups and of having an oxygen atom or nitrogen atom which may be substituted by R, sulfur atom or -SO2- or - radical ONLY-; as well as their enantiomers or diastereoisomers and their racemics, their acid salts, their hydrates or their solvation products.

[0014] Em realização específica, na fórmula (I), Y representa:[0014] In specific embodiment, in formula (I), Y represents:

- um átomo de oxigênio; - um átomo de enxofre; ou - um radical N-R” em que R” representa um átomo de hidrogênio, radical -OH ou um radical alquila CqH2q+1 de cadeia linear ou ramificada, em que q = 1, 2, 3 ou 4.- an oxygen atom; - a sulfur atom; or - an N-R" radical in which R" represents a hydrogen atom, -OH radical or a straight or branched chain CqH2q+1 alkyl radical, in which q = 1, 2, 3 or 4.

[0015] Em realização específica, na fórmula (I), X representa um átomo de halogênio, particularmente cloro ou flúor, mais especificamente cloro, mais especificamente flúor.[0015] In specific embodiment, in formula (I), X represents a halogen atom, particularly chlorine or fluorine, more specifically chlorine, more specifically fluorine.

[0016] Em outra realização específica, na fórmula (I), Y representa um átomo de oxigênio.[0016] In another specific embodiment, in formula (I), Y represents an oxygen atom.

[0017] Em outra realização específica, na fórmula (I), todos dentre m, n, r e s possuem o valor 1.[0017] In another specific realization, in formula (I), all among m, n, r and s have the value 1.

[0018] Em outra realização específica, na fórmula (I), R representa H, CH3, CH2CH3 ou CH2-CH2F. Preferencialmente, R representa CH3.[0018] In another specific embodiment, in formula (I), R represents H, CH3, CH2CH3 or CH2-CH2F. Preferably, R represents CH3.

[0019] Em outra realização específica, na fórmula (I), R’ representa um radical selecionado a partir do grupo que consiste dos radicais ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclo-hexila, ciclo-heptila, 4-piperidina e -CH2NHSO2CH3.[0019] In another specific embodiment, in formula (I), R' represents a radical selected from the group consisting of cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, 4-piperidine and -CH2NHSO2CH3 radicals.

Em outra realização específica, na fórmula (I), R’ representa um radical selecionado a partir do grupo que consiste dos radicais ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclo-hexila, 4-piperidina e -CH2NHSO2CH3. Preferencialmente, na fórmula (I), R’ representa um radical selecionado a partir do grupo que consiste dos radicais ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclo-hexila, ciclo-heptila e 4- piperidina. Preferencialmente, (na fórmula (I), R’ representa um radical selecionado a partir do grupo que consiste dos radicais ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclo-hexila e 4-piperidina. De maior preferência, R’ representa um radical cicloalquila C4-C7. De maior preferência, R’ representa um radical ciclopentila, radical ciclo-hexila, radical ciclo-heptila ou radical 2-piperidina. De maior preferência, R’ representa um radical ciclopentila. De maior preferência, R’In another specific embodiment, in formula (I), R' represents a radical selected from the group consisting of cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, 4-piperidine and -CH2NHSO2CH3 radicals. Preferably, in formula (I), R' represents a radical selected from the group consisting of cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl and 4-piperidine radicals. Preferably, (in formula (I), R' represents a radical selected from the group consisting of cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl and 4-piperidine radicals. More preferably, R' represents a C4-C7 cycloalkyl radical More preferably, R' represents a cyclopentyl radical, cyclohexyl radical, cycloheptyl radical or 2-piperidine radical. More preferably, R' represents a cyclopentyl radical. More preferably, R'

representa um radical ciclo-hexila. De maior preferência, R’ representa um radical 2-piperidina. De preferência superior, R’ representa um radical ciclo- heptila.represents a cyclohexyl radical. More preferably, R' represents a 2-piperidine radical. Most preferably, R' represents a cycloheptyl radical.

[0020] Em outra realização específica, na fórmula (I), R representa CH3 e R’ representa um radical cicloalquila C 4-C7, particularmente um radical ciclo-hexila. Em outra realização específica, na fórmula (I), R representa CH 3 e R’ representa um radical cicloalquila C 4-C7, particularmente um radical ciclopentila. Em outra realização específica, na fórmula (I), R representa CH 3 e R’ representa um radical cicloalquila C 4-C7, particularmente um radical 2-piperidina. Em outra realização específica, na fórmula (I), R representa CH 3 e R’ representa um radical cicloalquila C 4-C7, particularmente um radical ciclo-heptila.[0020] In another specific embodiment, in formula (I), R represents CH3 and R' represents a C 4-C7 cycloalkyl radical, particularly a cyclohexyl radical. In another specific embodiment, in formula (I), R represents CH 3 and R' represents a C 4 -C 7 cycloalkyl radical, particularly a cyclopentyl radical. In another specific embodiment, in formula (I), R represents CH 3 and R' represents a C 4 -C 7 cycloalkyl radical, particularly a 2-piperidine radical. In another specific embodiment, in formula (I), R represents CH 3 and R' represents a C 4 -C 7 cycloalkyl radical, particularly a cycloheptyl radical.

[0021] Em realização particularmente preferida, na fórmula (I), X representa cloro, Y representa um átomo de oxigênio, todos dentre m, n, r e s possuem valor 1, R representa CH3 e R’ representa um radical ciclo-hexila. Em outras palavras, em realização particularmente preferida, o composto utilizado de acordo com a presente invenção é o composto de donecoprida da fórmula (II) a seguir: (II).[0021] In a particularly preferred embodiment, in formula (I), X represents chlorine, Y represents an oxygen atom, all of m, n, r and s have value 1, R represents CH3 and R' represents a cyclohexyl radical. In other words, in a particularly preferred embodiment, the compound used according to the present invention is the donecopride compound of the formula (II) below: (II).

[0022] Em outra realização particularmente preferida, na fórmula (I), X representa flúor, Y representa um átomo de oxigênio, todos dentre m, n, r e s possuem valor 1, R representa CH3 e R’ representa um radical ciclo-hexila.[0022] In another particularly preferred embodiment, in formula (I), X represents fluorine, Y represents an oxygen atom, all of m, n, r and s have value 1, R represents CH3 and R' represents a cyclohexyl radical.

Em outras palavras, em realização particularmente preferida, o composto utilizado de acordo com a presente invenção é o composto de flucoprida da fórmula (III) a seguir:In other words, in a particularly preferred embodiment, the compound used according to the present invention is the flucoprid compound of the formula (III) below:

(III).(III).

[0023] Em outra realização particularmente preferida, na fórmula (I), X representa cloro, Y representa um átomo de oxigênio, todos dentre m, n, r e s possuem valor 1, R representa CH3 e R’ representa um radical 2-piperidina.[0023] In another particularly preferred embodiment, in formula (I), X represents chlorine, Y represents an oxygen atom, all of m, n, r and s have value 1, R represents CH3 and R' represents a 2-piperidine radical.

Em outras palavras, em realização particularmente preferida, o composto utilizado de acordo com a presente invenção é o composto MR31176 da fórmula (IV) a seguir: H3CIn other words, in particularly preferred embodiment, the compound used according to the present invention is the compound MR31176 of the formula (IV) below: H3C

O OO O NHNH

N H2N Cl (IV).N H2N Cl (IV).

[0024] Em outra realização particularmente preferida, na fórmula (I), X representa flúor, Y representa um átomo de oxigênio, todos dentre m, n, r e s possuem valor 1, R representa CH3 e R’ representa um radical ciclopentila.[0024] In another particularly preferred embodiment, in formula (I), X represents fluorine, Y represents an oxygen atom, all of m, n, r and s have value 1, R represents CH3 and R' represents a cyclopentyl radical.

Em outras palavras, em realização particularmente preferida, o composto utilizado de acordo com a presente invenção é o composto MR33583 da fórmula (V) a seguir: H3CIn other words, in particularly preferred embodiment, the compound used according to the present invention is the compound MR33583 of the formula (V) below: H3C

O OO O

N H2N F (V).N H2N F (V).

[0025] Em outra realização particularmente preferida, na fórmula (I), X representa cloro, Y representa um átomo de oxigênio, todos dentre m, n, r e s possuem valor 1, R representa CH3 e R’ representa um radical ciclopentila.[0025] In another particularly preferred embodiment, in formula (I), X represents chlorine, Y represents an oxygen atom, all of m, n, r and s have value 1, R represents CH3 and R' represents a cyclopentyl radical.

Em outras palavras, em realização particularmente preferida, o composto utilizado de acordo com a presente invenção é o composto MR31172 da fórmula (VI) a seguir: H3CIn other words, in particularly preferred embodiment, the compound used according to the present invention is the compound MR31172 of the formula (VI) below: H3C

O OO O

N H2N Cl (VI).N H2N Cl (VI).

[0026] Em outra realização particularmente preferida, na fórmula (I), X representa flúor, Y representa um átomo de oxigênio, todos dentre m, n, r e s possuem valor 1, R representa CH3 e R’ representa um radical ciclo-heptila.[0026] In another particularly preferred embodiment, in formula (I), X represents fluorine, Y represents an oxygen atom, all of m, n, r and s have value 1, R represents CH3 and R' represents a cycloheptyl radical.

Em outras palavras, em realização particularmente preferida, o composto utilizado de acordo com a presente invenção é o composto MR36014 da fórmula (VII) a seguir: H3CIn other words, in particularly preferred embodiment, the compound used according to the present invention is the compound MR36014 of the formula (VII) below: H3C

O OO O

N H2N F (VII).N H2N F (VII).

[0027] Em outra realização de preferência superior, na fórmula (I), X representa cloro, Y representa um átomo de oxigênio, todos dentre m, n, r e s possuem valor 1, R representa CH3 e R’ representa um radical ciclo-heptila. Em outras palavras, em realização particularmente preferida, o composto utilizado de acordo com a presente invenção é o composto MR31192 da fórmula (VII) a seguir: H3C[0027] In another preferably higher embodiment, in formula (I), X represents chlorine, Y represents an oxygen atom, all of m, n, res have value 1, R represents CH3 and R' represents a cycloheptyl radical . In other words, in particularly preferred embodiment, the compound used according to the present invention is the compound MR31192 of the formula (VII) below: H3C

O OO O

N H2N Cl (VIII).N H2N Cl (VIII).

[0028] Em outra realização específica, X representa cloro, Y representa um radical N-R” em que R” representa um radical -O-A em que A representa um grupo metila, todos dentre m, n, r e s possuem o valor 1, R representa CH3 e R’ representa um radical ciclo-hexila. Em outras palavras, em realização específica, o composto utilizado de acordo com a presente invenção é o composto 2-cloro-4-[[2-[1-(ciclo-hexilmetil)-4-piperidil]etil]-N- metoxicarbonimidoil]-5-metoxianilina.[0028] In another specific embodiment, X represents chlorine, Y represents a radical NR" where R" represents a radical -OA where A represents a methyl group, all of m, n, res have the value 1, R represents CH3 and R' represents a cyclohexyl radical. In other words, in specific embodiment, the compound used according to the present invention is the compound 2-chloro-4-[[2-[1-(cyclohexylmethyl)-4-piperidyl]ethyl]-N-methoxycarbonimidoyl] -5-methoxyaniline.

[0029] Em realizações específicas, são utilizados sais de ácidos dos compostos definidos acima. Em realização mais específica, os mencionados sais de ácidos são fumaratos ou dicloridratos.[0029] In specific embodiments, acid salts of the compounds defined above are used. In a more specific embodiment, said acid salts are fumarates or dihydrochlorides.

[0030] Mais especificamente, em realização particularmente preferida, o composto utilizado de acordo com a presente invenção é fumarato de Donecoprida (da fórmula (II) acima), particularmente hidrato fumarato de Donecoprida.More specifically, in particularly preferred embodiment, the compound used according to the present invention is Donecopride fumarate (of formula (II) above), particularly Donecopride fumarate hydrate.

[0031] Em outra realização particularmente preferida, o composto utilizado de acordo com a presente invenção é fumarato de flucoprida (da fórmula (III) acima).[0031] In another particularly preferred embodiment, the compound used according to the present invention is flucopride fumarate (of formula (III) above).

[0032] Em outra realização particularmente preferida, o composto utilizado de acordo com a presente invenção é dicloridrato de MR31176 (da fórmula (IV) acima), particularmente desidrato de dicloridrato.[0032] In another particularly preferred embodiment, the compound used according to the present invention is MR31176 dihydrochloride (of formula (IV) above), particularly dihydrochloride dehydrate.

[0033] Em outra realização particularmente preferida, o composto utilizado de acordo com a presente invenção é fumarato de MR33583 (da fórmula (V) acima).[0033] In another particularly preferred embodiment, the compound used according to the present invention is MR33583 fumarate (of formula (V) above).

[0034] Em outra realização particularmente preferida, o composto utilizado de acordo com a presente invenção é fumarato de MR31172 (da fórmula (VI) acima).[0034] In another particularly preferred embodiment, the compound used according to the present invention is MR31172 fumarate (of formula (VI) above).

[0035] Em outra realização particularmente preferida, o composto utilizado de acordo com a presente invenção é fumarato de MR36014 (da fórmula[0035] In another particularly preferred embodiment, the compound used according to the present invention is MR36014 fumarate (of the formula

(VII) acima).(VII) above).

[0036] Em outra realização particularmente preferida, o composto utilizado de acordo com a presente invenção é fumarato de MR31192 (da fórmula (VIII) acima).[0036] In another particularly preferred embodiment, the compound used according to the present invention is MR31192 fumarate (of formula (VIII) above).

[0037] Doença neurodegenerativa:[0037] Neurodegenerative disease:

[0038] “Doença neurodegenerativa” indica no presente uma doença induzida pelo colapso da rede neural do circuito nervoso com base na degeneração sistemática e deciduação de neurócitos.[0038] "Neurodegenerative disease" indicates at present a disease induced by the collapse of the neural network of the nervous circuit based on systematic degeneration and deciduation of neurocytes.

[0039] Conforme explicado acima, os inventores do presente demonstraram que Donecoprida exibiu efeito protetor geral e eficiente sobre neurites. Devido a esse efeito neuroprotetor geral, Donecoprida pode ser utilizada como agente neuroprotetor para evitar e/ou tratar qualquer doença neurodegenerativa.[0039] As explained above, the present inventors demonstrated that Donecopride exhibited general and efficient protective effect on neurites. Due to this general neuroprotective effect, Donecopride can be used as a neuroprotective agent to prevent and/or treat any neurodegenerative disease.

[0040] Os inventores confirmaram ainda este efeito com grande quantidade de compostos da fórmula geral (I) acima, particularmente os compostos especificamente definidos no capítulo “Compostos” acima, em diversos modelos de doenças neurodegenerativas, particularmente em modelos de mal de Alzheimer, modelos de mal de Parkinson, modelos de esclerose lateral amiotrófica, modelos de mal de Huntington e modelos de doenças neurodegenerativas induzidas por isquemia ou lesões cerebrais traumáticas.[0040] The inventors have further confirmed this effect with large amounts of compounds of the general formula (I) above, particularly the compounds specifically defined in the chapter "Compounds" above, in various models of neurodegenerative diseases, particularly in Alzheimer's disease models, models of Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis models, Huntington's disease models and models of neurodegenerative diseases induced by ischemia or traumatic brain injury.

[0041] Exemplos de doenças neurodegenerativas incluem mal de Alzheimer (AD), mal de Parkinson, demência de corpos Lewis, demência vascular e problemas associados ao envelhecimento, incluindo (i) neurodegeneração não cognitiva, (ii) degeneração neuromuscular não cognitiva e (iii) neurodegeneração sensorial motora, mal de Huntington, doenças neuronais motoras incluindo esclerose lateral amiotrófica (ALS), síndrome de Down, degeneração gangliônica corticobasal, atrofia de múltiplos sistemas, atrofia cerebral, atrofia olivopontocerebelar, paralisia supranuclear, ataxia de[0041] Examples of neurodegenerative diseases include Alzheimer's disease (AD), Parkinson's disease, Lewis body dementia, vascular dementia, and conditions associated with aging, including (i) non-cognitive neurodegeneration, (ii) non-cognitive neuromuscular degeneration, and (iii) ) sensory motor neurodegeneration, Huntington's disease, motor neuronal diseases including amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Down syndrome, corticobasal ganglionic degeneration, multiple systems atrophy, cerebral atrophy, olivopontocerebellar atrophy, supranuclear palsy, ataxia of

Friedreich, ataxia espinhocerebelar do tipo 2, degenerações frontotemporais (FTD) e afasia progressiva primária.Friedreich, type 2 spinocerebellar ataxia, frontotemporal degenerations (FTD) and primary progressive aphasia.

[0042] Em realização específica, a doença neurodegenerativa é selecionada a partir do grupo que consiste em mal de Alzheimer, mal de Parkinson, mal de Huntington, atrofia de múltiplos sistemas, doenças neuronais motoras incluindo esclerose lateral amiotrófica, síndrome de Down e degenerações frontotemporais.In specific embodiment, neurodegenerative disease is selected from the group consisting of Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, multiple systems atrophy, motor neuron diseases including amyotrophic lateral sclerosis, Down syndrome, and frontotemporal degenerations .

[0043] Em realização mais específica, a doença neurodegenerativa é selecionada a partir do grupo que consiste em mal de Alzheimer, mal de Parkinson, mal de Huntington e esclerose lateral amiotrófica.[0043] In more specific embodiment, neurodegenerative disease is selected from the group consisting of Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, and amyotrophic lateral sclerosis.

[0044] Em outra realização, a doença neurodegenerativa é mal de Alzheimer.[0044] In another embodiment, the neurodegenerative disease is Alzheimer's disease.

[0045] Em realização alternativa, a doença neurodegenerativa é doença neurodegenerativa diferente de mal de Alzheimer.[0045] In an alternative embodiment, neurodegenerative disease is neurodegenerative disease other than Alzheimer's disease.

[0046] Na mencionada realização alternativa, a doença neurodegenerativa é selecionada a partir do grupo que consiste em mal de Parkinson, mal de Huntington e esclerose lateral amiotrófica.[0046] In the aforementioned alternative embodiment, neurodegenerative disease is selected from the group consisting of Parkinson's disease, Huntington's disease, and amyotrophic lateral sclerosis.

[0047] Indicações médicas:[0047] Medical indications:

[0048] A presente invenção refere-se a um composto conforme definido no item “Compostos” acima para uso como agente neuroprotetor na prevenção e/ou tratamento de doenças neurodegenerativas conforme definido no item “Doença neurodegenerativa” acima.[0048] The present invention relates to a compound as defined in the item "Compounds" above for use as a neuroprotective agent in the prevention and/or treatment of neurodegenerative diseases as defined in the item "Neurodegenerative disease" above.

[0049] A presente invenção refere-se ainda ao uso de um composto conforme definido no item “Compostos” acima para fabricação de agente neuroprotetor para prevenção e/ou tratamento de doenças neurodegenerativas conforme definido no item “Doença neurodegenerativa” acima.[0049] The present invention further relates to the use of a compound as defined in the item "Compounds" above for manufacturing a neuroprotective agent for the prevention and/or treatment of neurodegenerative diseases as defined in the item "Neurodegenerative disease" above.

[0050] A presente invenção refere-se ainda a um método para evitar e/ou tratar doenças neurodegenerativas conforme definido no item[0050] The present invention further relates to a method for preventing and/or treating neurodegenerative diseases as defined in item

“Doença neurodegenerativa” acima, que compreende a administração a pacientes dele necessitados de quantidade terapeuticamente eficiente de um composto conforme definido no item “Compostos” acima como agente neuroprotetor."Neurodegenerative disease" above, which comprises administering to patients in need thereof a therapeutically effective amount of a compound as defined in the item "Compounds" above as a neuroprotective agent.

[0051] A presente invenção refere-se ainda a um método de neuroproteção em pacientes que sofrem ou se encontram em risco de sofrer de doenças neurodegenerativas conforme definido no item “Doença neurodegenerativa” acima, que compreende a administração aos mencionados pacientes de quantidade terapeuticamente eficiente de um composto conforme definido no item “Compostos” acima.[0051] The present invention further relates to a method of neuroprotection in patients suffering or at risk of suffering from neurodegenerative diseases as defined in the item "Neurodegenerative disease" above, which comprises administering to said patients a therapeutically efficient amount of a compound as defined under “Compounds” above.

[0052] Segundo a presente invenção, o termo “paciente” ou “paciente dele necessitado” indica mamífero humano ou não humano afetado ou propenso a ser afetado por doenças neurodegenerativas conforme definido no item “Doenças neurodegenerativas” acima.[0052] According to the present invention, the term "patient" or "patient in need thereof" indicates human or non-human mammal affected or prone to be affected by neurodegenerative diseases as defined in the item "Neurodegenerative diseases" above.

[0053] No contexto da presente invenção, o termo “tratar” ou “tratamento” indica a reversão, alívio ou inibição do progresso do distúrbio ou condição ao qual esse termo se aplica ou um ou mais sintomas desse distúrbio ou condição.[0053] In the context of the present invention, the term "treat" or "treatment" indicates the reversal, alleviation or inhibition of the progress of the disorder or condition to which that term applies, or one or more symptoms of that disorder or condition.

[0054] No contexto da presente invenção, o termo “prevenir” ou “prevenção” indica retardar ou evitar o início do distúrbio ou condição a que se aplica esse termo ou um ou mais sintomas desse distúrbio ou condição.[0054] In the context of the present invention, the term "prevent" or "prevention" means to delay or prevent the onset of the disorder or condition to which that term or one or more symptoms of that disorder or condition applies.

[0055] “Neuroproteção” indica no presente prevenção ou inibição de efeitos degenerativos e restauração da integridade neuronal no sistema nervoso central, particularmente prevenção ou inibição da degeneração neuronal.[0055] "Neuroprotection" herein indicates prevention or inhibition of degenerative effects and restoration of neuronal integrity in the central nervous system, particularly prevention or inhibition of neuronal degeneration.

[0056] “Agente neuroprotetor” indica no presente um agente capaz de neuroproteção, conforme definido acima.[0056] "Neuroprotective agent" herein indicates an agent capable of neuroprotection as defined above.

[0057] Os inventores demonstraram mais especificamente que os compostos utilizados de acordo com a presente invenção foram capazes de aumentar o crescimento de neurites, manter a taxa de sinapses, reduzir a hiperfosforilação de Tau e/ou promover a formação de novas sinapses.[0057] The inventors more specifically demonstrated that the compounds used according to the present invention were able to increase neurite outgrowth, maintain the rate of synapses, reduce Tau hyperphosphorylation and/or promote the formation of new synapses.

[0058] Consequentemente, em realização específica, o composto conforme definido no item “Compostos” acima destina-se a aumentar o crescimento de neurites.[0058] Consequently, in specific embodiment, the compound as defined in the item "Compounds" above is intended to increase neurite outgrowth.

[0059] A presente invenção também se refere a um método de aumento do crescimento de neurites em pacientes que sofrem ou se encontram em risco de sofrer doenças neurodegenerativas conforme definido no item “Doença neurodegenerativa” acima, que compreende a administração aos mencionados pacientes de quantidade terapeuticamente eficiente de um composto conforme definido no item “Compostos” acima.[0059] The present invention also relates to a method of increasing neurite outgrowth in patients suffering from or at risk of suffering neurodegenerative diseases as defined in the item "Neurodegenerative disease" above, which comprises administering to said patients a quantity therapeutically efficient of a compound as defined under “Compounds” above.

[0060] “Crescimento de neurites” indica no presente o processo de extensão de qualquer projeção do corpo celular de neurônios e a gênese de sinapses associada.[0060] "Nurite outgrowth" indicates in the present the process of extension of any projection of the cell body of neurons and the associated synapse genesis.

[0061] “Aumento do crescimento de neurites” indica no presente que o crescimento de neurites é maior (ou seja, mais eficiente, mais rápido ou mais longo), preferencialmente maior em quantidade estatisticamente significativa, quando o composto de interesse for aplicado em comparação com o crescimento de neurites observado nas mesmas condições, mas sem aplicação do composto de interesse. Preferencialmente, o crescimento de neurites aumenta em pelo menos 120%, em comparação com o crescimento de neurites observado nas mesmas condições, mas sem aplicar o composto de interesse.[0061] "Increased neurite outgrowth" indicates at present that neurite outgrowth is greater (that is, more efficient, faster, or longer), preferably greater in a statistically significant amount, when the compound of interest is applied in comparison with neurite outgrowth observed under the same conditions but without application of the compound of interest. Preferably, neurite outgrowth is increased by at least 120% compared to neurite outgrowth observed under the same conditions but without applying the compound of interest.

[0062] Em outra realização específica, o composto definido no item “Compostos” acima destina-se a manter a taxa de sinapses.[0062] In another specific realization, the compound defined in the item "Compounds" above is intended to maintain the rate of synapses.

[0063] Outro objeto da presente invenção refere-se a um método de manutenção da taxa de sinapses em pacientes que sofrem ou se encontram em risco de sofrer doenças neurodegenerativas conforme definido no item “Doença neurodegenerativa” acima, que compreende a administração aos mencionados pacientes de quantidade terapeuticamente eficiente de um composto conforme definido no item “Compostos” acima.[0063] Another object of the present invention relates to a method of maintaining the rate of synapses in patients who suffer or are at risk of suffering neurodegenerative diseases as defined in the item "Neurodegenerative disease" above, which comprises the administration to said patients of a therapeutically effective amount of a compound as defined under “Compounds” above.

[0064] “Taxa de sinapses” indica no presente a razão entre o número de sinapses e o número de neurônios.[0064] "Rate of synapses" indicates in the present the ratio between the number of synapses and the number of neurons.

[0065] “Manutenção da taxa de sinapses” indica no presente que a taxa de sinapses é similar (ou seja, a diferença não é estatisticamente significativa) quando o composto de interesse for aplicado em comparação com a taxa de sinapses observada em condições de controle, tal como as mesmas condições, mas sem aplicação do composto de interesse ou condições em que os neurônios não enfrentam condições neurodegenerativas.[0065] "Synapse Rate Maintenance" indicates at present that the synapse rate is similar (that is, the difference is not statistically significant) when the compound of interest is applied compared to the observed synapse rate under control conditions , such as the same conditions, but without application of the compound of interest or conditions where neurons do not face neurodegenerative conditions.

[0066] Em outra realização específica, o composto definido no item “Compostos” acima destina-se à promoção da formação de novas sinapses.[0066] In another specific realization, the compound defined in the item "Compounds" above is intended to promote the formation of new synapses.

[0067] Outro objeto da presente invenção refere-se a um método de promoção da formação de novas sinapses em pacientes que sofrem ou se encontram em risco de sofrer de doenças neurodegenerativas conforme definido no item “Doença neurodegenerativa” acima, que compreende a administração aos mencionados pacientes de quantidade terapeuticamente eficiente de um composto conforme definido no item “Compostos” acima.[0067] Another object of the present invention relates to a method of promoting the formation of new synapses in patients who suffer or are at risk of suffering from neurodegenerative diseases as defined in the item "Neurodegenerative disease" above, which comprises administration to mentioned patients of therapeutically effective amount of a compound as defined in the item “Compounds” above.

[0068] “Promoção da formação de novas sinapses” indica no presente que o número de sinapses recém-formadas é maior, preferencialmente maior de forma estatisticamente significativa, quando o composto de interesse for aplicado em comparação com o número de sinapses recém-formadas observadas nas mesmas condições, mas sem aplicar o composto de interesse.[0068] "Promoting the formation of new synapses" indicates at present that the number of newly formed synapses is greater, preferably statistically significantly greater, when the compound of interest is applied compared to the number of newly formed synapses observed under the same conditions, but without applying the compound of interest.

Preferencialmente, a formação de novas sinapses aumenta em pelo menos 120%, em comparação com a formação de novas sinapses observada nas mesmas condições, mas sem aplicar o composto de interesse.Preferably, synapse formation is increased by at least 120% compared to synapse formation observed under the same conditions but without applying the compound of interest.

[0069] Em outra realização específica, o composto definido na seção “Compostos” acima destina-se a reduzir a hiperfosforilação de Tau.[0069] In another specific embodiment, the compound defined in the "Compounds" section above is intended to reduce Tau hyperphosphorylation.

[0070] Outro objeto da presente invenção refere-se a um método de redução da fosforilação de Tau em pacientes que sofrem ou se encontram em risco de sofrer de doenças neurodegenerativas conforme definido no item “Doença Neurodegenerativa” acima, que compreende a administração aos mencionados pacientes de quantidade terapeuticamente eficiente de um composto conforme definido no item “Compostos” acima.[0070] Another object of the present invention relates to a method of reducing Tau phosphorylation in patients who suffer or are at risk of suffering from neurodegenerative diseases as defined in the item "Neurodegenerative Disease" above, which comprises the administration to the aforementioned therapeutically effective amount of a compound as defined under “Compounds” above.

[0071] Por “hiperfosforilação de Tau”, indica-se no presente a fosforilação anormalmente alta da proteína Tau, particularmente a fosforilação anormal da proteína Tau de pelo menos um dentre os resíduos Thr39, Ser46, Thr50, Ser68, Thr69, Thr71, Ser113, Thr153, Thr175, Thr181, Ser184, Ser185, Ser191, Ser198, Ser199, Ser202, Thr205, Ser208, Ser210, Thr212, Ser214, Thr217, Thr231, Ser235, Ser237, Ser238, Ser241, Ser258, Ser262, Ser285, Ser289, Ser305, Ser324, Ser352, Ser356, Tyr394, Ser396, Ser400, Thr403, Ser404, Ser409, Ser412, Ser413, Thr414, Ser416, Ser422, Ser433 e Ser435.[0071] By "Tau hyperphosphorylation" is meant here the abnormally high phosphorylation of the Tau protein, particularly the abnormal phosphorylation of the Tau protein of at least one of residues Thr39, Ser46, Thr50, Ser68, Thr69, Thr71, Ser113 , Thr153, Thr175, Thr181, Ser184, Ser185, Ser191, Ser198, Ser199, Ser202, Thr205, Ser208, Ser210, Thr212, Ser214, Thr217, Thr231, Ser235, Ser237, Ser238, Ser241, Ser258, Ser262, Ser285, Ser289, Ser305 , Ser324, Ser352, Ser356, Tyr394, Ser396, Ser400, Thr403, Ser404, Ser409, Ser412, Ser413, Thr414, Ser416, Ser422, Ser433 and Ser435.

[0072] “Redução da hiperfosforilação de Tau” indica no presente que pelo menos um dentre os resíduos Thr39, Ser46, Thr50, Ser68, Thr69, Thr71, Ser113, Thr153, Thr175, Thr181, Ser184, Ser185, Ser191, Ser198, Ser199, Ser202, Thr205, Ser208, Ser210, Thr212, Ser214, Thr217, Thr231, Ser235, Ser237, Ser238, Ser241, Ser258, Ser262, Ser285, Ser289, Ser305, Ser324, Ser352, Ser356, Tyr394, Ser396, Ser400, Thr403, Ser404, Ser409, Ser412, Ser413, Thr414, Ser416, Ser422, Ser433 e Ser435, particularmente um dos resíduos Ser212 e Thr214 da proteína Tau não é anormalmente fosforilado quando o composto de interesse for aplicado, embora o mencionado resíduo seja anormalmente fosforilado nas mesmas condições, mas sem a aplicação do composto de interesse."Reduction of Tau hyperphosphorylation" indicates herein that at least one of residues Thr39, Ser46, Thr50, Ser68, Thr69, Thr71, Ser113, Thr153, Thr175, Thr181, Ser184, Ser185, Ser191, Ser198, Ser199, Ser202, Thr205, Ser208, Ser210, Thr212, Ser214, Thr217, Thr231, Ser235, Ser237, Ser238, Ser241, Ser258, Ser262, Ser285, Ser289, Ser305, Ser324, Ser352, Ser356, Tyr394, Ser396, Ser400, Thr403, Ser404, Ser409, Ser412, Ser413, Thr414, Ser416, Ser422, Ser433 and Ser435, particularly one of the Tau protein residues Ser212 and Thr214 is not abnormally phosphorylated when the compound of interest is applied, although said residue is abnormally phosphorylated under the same conditions, but without the application of the compound of interest.

[0073] “Quantidade terapeuticamente eficaz” indica no presente quantidade suficiente do composto para agir como agente neuroprotetor no tratamento e/ou prevenção de doenças neurodegenerativas com razão risco- benefício razoável aplicável a qualquer tratamento médico. Compreende-se, entretanto, que o uso diário total dos compostos de acordo com a presente invenção será decidido pelo médico atendente dentro do escopo de julgamento médico adequado. O nível de dosagem terapeuticamente eficaz específico para qualquer paciente em particular dependerá de uma série de fatores que incluem o distúrbio sendo tratado e a severidade do distúrbio, atividade dos compostos específicos empregados, idade, peso do corpo, saúde geral, sexo e alimentação do paciente, tempo de administração, via de administração e taxa de excreção dos compostos específicos empregados, duração do tratamento, drogas utilizadas em combinação ou coincidentes com os compostos específicos empregados e fatores similares bem conhecidos na técnica médica. Encontra- se dentro do estado da técnica, por exemplo, o início de doses dos compostos em níveis inferiores aos necessários para atingir o efeito terapêutico desejado e o aumento gradual da dosagem até que seja atingido o efeito desejado."Therapeutically effective amount" herein indicates sufficient amount of the compound to act as a neuroprotective agent in the treatment and/or prevention of neurodegenerative diseases with a reasonable benefit-risk ratio applicable to any medical treatment. It is understood, however, that the total daily use of the compounds in accordance with the present invention will be decided by the attending physician within the scope of proper medical judgment. The specific therapeutically effective dosage level for any particular patient will depend upon a number of factors including the disorder being treated and the severity of the disorder, activity of the specific compounds employed, age, body weight, general health, sex and diet of the patient. , time of administration, route of administration and excretion rate of the specific compounds employed, duration of treatment, drugs used in combination or coinciding with the specific compounds employed, and similar factors well known in the medical art. It is within the state of the art, for example, to start doses of the compounds at levels below those necessary to achieve the desired therapeutic effect and to gradually increase the dosage until the desired effect is achieved.

[0074] Os compostos utilizados de acordo com a presente invenção podem ser administrados na forma de composição farmacêutica que inclui excipientes farmaceuticamente aceitáveis e, opcionalmente, matrizes de liberação prolongada, tais como polímeros biodegradáveis, para formar composições terapêuticas.[0074] The compounds used according to the present invention can be administered in the form of a pharmaceutical composition that includes pharmaceutically acceptable excipients and, optionally, extended release matrices, such as biodegradable polymers, to form therapeutic compositions.

[0075] “Farmacêutico” ou “farmaceuticamente aceitável” indica composições e entidades moleculares que não produzem reação adversa, alérgica ou outra indesejável quando administradas a mamíferos, especialmente seres humanos, conforme apropriado. Excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável designa carga, diluente, material encapsulante ou auxiliar de formulação sólido, semissólido ou líquido não tóxico de qualquer tipo.[0075] "Pharmaceutical" or "pharmaceutically acceptable" indicates compositions and molecular entities that do not produce an adverse, allergic or other undesirable reaction when administered to mammals, especially humans, as appropriate. Pharmaceutically acceptable excipient or vehicle means non-toxic solid, semi-solid or liquid filler, diluent, encapsulating material or formulation aid of any kind.

[0076] A forma das composições farmacêuticas que incluem os compostos utilizados de acordo com a presente invenção e a via de administração dependem naturalmente da condição a ser tratada, severidade da doença, idade, peso, gênero do paciente etc.[0076] The form of the pharmaceutical compositions that include the compounds used according to the present invention and the route of administration naturally depend on the condition to be treated, disease severity, age, weight, gender of the patient etc.

[0077] Os compostos utilizados de acordo com a presente invenção podem ser formulados para administração tópica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutânea ou intraocular e similares. Em realização específica, o composto utilizado de acordo com a presente invenção é administrado por via oral.The compounds used in accordance with the present invention may be formulated for topical, oral, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous or intraocular administration and the like. In a specific embodiment, the compound used according to the present invention is administered orally.

[0078] Alternativamente, as composições farmacêuticas que incluem os compostos utilizados de acordo com a presente invenção podem conter veículos que são farmaceuticamente aceitáveis para uma formulação capaz de ser injetada. Essas podem ser soluções salinas estéreis, particularmente isotônicas (fosfato monossódico ou dissódico, cloreto de sódio, potássio, cálcio ou magnésio e similares, ou misturas desses sais), ou composições secas, especialmente secas por congelamento que, mediante adição, dependendo do caso, de água esterilizada ou solução salina fisiológica, permitem a constituição de soluções injetáveis.[0078] Alternatively, pharmaceutical compositions that include the compounds used in accordance with the present invention may contain carriers that are pharmaceutically acceptable for a formulation capable of being injected. These can be sterile saline solutions, particularly isotonic (monosodium or disodium phosphate, sodium, potassium, calcium or magnesium chloride and the like, or mixtures of these salts), or dry compositions, especially freeze-dried which, upon addition, depending on the case, of sterilized water or physiological saline solution, allow the constitution of injectable solutions.

[0079] Para preparar composições farmacêuticas, quantidade eficaz dos compostos utilizados de acordo com a presente invenção pode ser dissolvida ou dispersa em meio aquoso ou veículo farmaceuticamente aceitável.[0079] To prepare pharmaceutical compositions, effective amount of the compounds used according to the present invention may be dissolved or dispersed in aqueous medium or pharmaceutically acceptable carrier.

[0080] As formas farmacêuticas apropriadas para uso injetável incluem dispersões ou soluções aquosas estéreis e pós estéreis para preparação extemporânea de dispersões ou soluções injetáveis estéreis. Em todos os casos, a forma deve ser estéril e fluida para que haja fácil aplicação por seringa. A composição deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenagem e preservada contra a ação contaminante de micro-organismos, tais como bactérias e fungos.The pharmaceutical forms suitable for injectable use include sterile aqueous solutions or dispersions and sterile powders for the extemporaneous preparation of sterile injectable dispersions or solutions. In all cases, the form must be sterile and fluid so that it can be easily applied by syringe. The composition must be stable under the conditions of manufacture and storage and preserved against the contaminating action of microorganisms, such as bacteria and fungi.

[0081] O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão que contém, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, polietileno glicol líquido e similares) e suas misturas apropriadas. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, utilizando-se um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersão e utilizando tensoativos, agentes estabilizantes, crioprotetores ou antioxidantes. A prevenção da ação de micro-organismos pode ser causada por agentes antifúngicos e antibacterianos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, tais como açúcares ou cloreto de sódio.[0081] The vehicle can be a solvent or dispersion medium that contains, for example, water, ethanol, polyol (for example, glycerol, propylene glycol, liquid polyethylene glycol and the like) and appropriate mixtures thereof. Proper fluidity can be maintained, for example, by using a coating such as lecithin, by maintaining the required particle size in the case of dispersion and by using surfactants, stabilizing agents, cryoprotectants or antioxidants. The prevention of the action of microorganisms can be caused by antifungal and antibacterial agents. In many cases, it will be preferable to include isotonic agents such as sugars or sodium chloride.

[0082] Soluções injetáveis estéreis são preparadas por meio da incorporação dos compostos ativos na quantidade necessária no solvente apropriado com diversos outros ingredientes indicados acima, conforme o necessário, seguida por esterilização por filtragem. Geralmente, as dispersões são preparadas por meio de incorporação dos diversos ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários a partir dos indicados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento, que geram um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma solução filtrada previamente esterilizada.[0082] Sterile injectable solutions are prepared by incorporating the active compounds in the required amount in the appropriate solvent with various other ingredients listed above, as needed, followed by filter sterilization. Generally, dispersions are prepared by incorporating the various sterilized active ingredients into a sterile vehicle which contains the basic dispersion medium and the required other ingredients from those indicated above. In the case of sterile powders for preparing sterile injectable solutions, the preferred methods of preparation are vacuum drying and freeze drying, which generate a powder of the active ingredient plus any additional desired ingredient from a previously sterilized filtered solution.

[0083] Mediante formulação, as soluções serão administradas de forma compatível com a formulação de dosagem e em quantidade terapeuticamente eficaz. As formulações são facilmente administradas em uma série de formas de dosagem, tais como o tipo de soluções injetáveis descritas acima, mas cápsulas de liberação de drogas e similares também podem ser empregadas.[0083] Upon formulation, the solutions will be administered in a manner compatible with the dosage formulation and in a therapeutically effective amount. The formulations are easily administered in a number of dosage forms, such as the type of injectable solutions described above, but drug release capsules and the like can also be employed.

[0084] Para administração parenteral em solução aquosa, por exemplo, a solução deverá ser adequadamente tamponada, se necessário, e o diluente líquido tornou-se isotônico em primeiro lugar com solução salina ou glicose suficiente. Essas soluções aquosas específicas são especialmente apropriadas para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea e intraperitoneal. Neste particular, meios aquosos estéreis que podem ser empregados serão os conhecidos pelos técnicos no assunto à luz da presente invenção. Uma dosagem poderá ser dissolvida, por exemplo, em 1 ml de solução isotônica de NaCl e adicionada a 1000 ml de fluido de hipodermóclise ou injetada no local de infusão proposto (vide, por exemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 15ª Edição, págs. 1035-1038 e 1570-1580). Alguma variação da dosagem necessariamente ocorrerá, dependendo da condição do paciente sendo tratado. A pessoa responsável pela administração determinará, em qualquer dos casos, a dose apropriada para o paciente individual.[0084] For parenteral administration in aqueous solution, for example, the solution should be adequately buffered, if necessary, and the liquid diluent first made isotonic with saline or sufficient glucose. These specific aqueous solutions are especially suitable for intravenous, intramuscular, subcutaneous and intraperitoneal administration. In this regard, sterile aqueous media that may be employed will be those known to those skilled in the art in light of the present invention. A dosage may be dissolved, for example, in 1 ml of isotonic NaCl solution and added to 1000 ml of hypodermoclysis fluid or injected into the proposed infusion site (see, for example, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Edition, pp. 1035- 1038 and 1570-1580). Some variation in dosage will necessarily occur depending on the condition of the patient being treated. The person responsible for administration will, in any case, determine the appropriate dose for the individual patient.

[0085] O composto utilizado de acordo com a presente invenção pode ser tipicamente administrado por via oral, por exemplo, na forma de pastilhas, cápsulas, microcápsulas, pós, grânulos, xaropes, soluções ou suspensões tomadas por via oral ou sublingual.The compound used according to the present invention can typically be administered orally, for example, in the form of tablets, capsules, microcapsules, powders, granules, syrups, solutions or suspensions taken orally or sublingually.

[0086] Em realização específica, o composto utilizado de acordo com a presente invenção é adequadamente administrado por via oral em dose diária de 1 a 20 mg/kg de peso do corpo, particularmente em dose diária de 2 mg/kg.[0086] In specific embodiment, the compound used according to the present invention is suitably administered orally in daily dose of 1 to 20 mg/kg of body weight, particularly in daily dose of 2 mg/kg.

[0087] Em outra realização específica, os compostos utilizados de acordo com a presente invenção são adequadamente administrados por via oral, duas vezes por semana, em dose de 1 a 20 mg/kg de peso do corpo, particularmente em dose de 1 mg/kg duas vezes por semana.[0087] In another specific embodiment, the compounds used according to the present invention are suitably administered orally, twice a week, at a dose of 1 to 20 mg/kg of body weight, particularly at a dose of 1 mg/ kg twice a week.

[0088] Segundo outra realização específica, o composto utilizado de acordo com a presente invenção é administrado em doses de 10 a 1000 mg por dia, preferencialmente doses de 0,2 a 2 mg, cinco vezes por dia.According to another specific embodiment, the compound used according to the present invention is administered in doses of 10 to 1000 mg per day, preferably doses of 0.2 to 2 mg, five times a day.

[0089] A presente invenção será adicionalmente ilustrada pelas figuras e exemplos abaixo.[0089] The present invention will be further illustrated by the figures and examples below.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURASBRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

[0090] Figura 1: efeito de MR31193 sobre a sobrevivência de neurônios MAP-2 (A), rede de neurites total (B), comprimento de neurites normalizado pelo número de neurônios (C) e sobre a fosforilação de Tau (AT100) (D) em cultivo primário de neurônios hipocampais lesionados com Aβ 1-42. Os resultados são expressos na forma de percentual de controle como média ± desvio padrão (n = 4-6/grupo). ANOVA de uma via foi seguido por teste LSD de Fisher. * p < 0,05 foi considerado significativo.[0090] Figure 1: Effect of MR31193 on the survival of MAP-2 neurons (A), total neurite network (B), neurite length normalized by the number of neurons (C) and on the phosphorylation of Tau (AT100) ( D) in primary culture of Aβ 1-42-injured hippocampal neurons. Results are expressed as percentage of control as mean ± standard deviation (n = 4-6/group). One-way ANOVA was followed by Fisher's LSD test. * p < 0.05 was considered significant.

[0091] Figura 2: efeito de MR31193 sobre a preservação de sinapses de neurônios MAP-2 em cultivo primário de neurônios hipocampais lesionados com Aβ 1-42. Os resultados são expressos na forma de percentual de controle como média ± desvio padrão (n = 4-6/grupo). ANOVA de uma via foi seguido por teste LSD de Fisher. * p < 0,05 foi considerado significativo.[0091] Figure 2: Effect of MR31193 on synapse preservation of MAP-2 neurons in primary culture of Aβ 1-42 injured hippocampal neurons. Results are expressed as percentage of control as mean ± standard deviation (n = 4-6/group). One-way ANOVA was followed by Fisher's LSD test. * p < 0.05 was considered significant.

[0092] Figura 3: efeito de MR31176 sobre a sobrevivência de neurônios MAP-2 (A), rede de neurites total (B), comprimento de neurites normalizado pelo número de neurônios (C) e sobre a fosforilação de Tau (AT100) (D) em cultivo primário de neurônios hipocampais lesionados com Aβ 1-42. Os resultados são expressos na forma de percentual de controle como média ± desvio padrão (n = 4-6/grupo). ANOVA de uma via foi seguido por teste LSD de Fisher. * p < 0,05 foi considerado significativo.[0092] Figure 3: Effect of MR31176 on the survival of MAP-2 neurons (A), total neurite network (B), neurite length normalized by the number of neurons (C) and on Tau phosphorylation (AT100) ( D) in primary culture of Aβ 1-42-injured hippocampal neurons. Results are expressed as percentage of control as mean ± standard deviation (n = 4-6/group). One-way ANOVA was followed by Fisher's LSD test. * p < 0.05 was considered significant.

[0093] Figura 4: efeito de MR31176 sobre a preservação de sinapses de neurônios MAP-2 em cultivo primário de neurônios hipocampais lesionados com Aβ 1-42. Os resultados são expressos na forma de percentual de controle como média ± desvio padrão (n = 4-6/grupo). ANOVA de uma via foi seguido por teste LSD de Fisher. * p < 0,05 foi considerado significativo.[0093] Figure 4: Effect of MR31176 on synapse preservation of MAP-2 neurons in primary culture of Aβ 1-42 injured hippocampal neurons. Results are expressed as percentage of control as mean ± standard deviation (n = 4-6/group). One-way ANOVA was followed by Fisher's LSD test. * p < 0.05 was considered significant.

[0094] Figura 5: efeito de MR31192 sobre a sobrevivência de neurônios MAP-2 (A), rede de neurites total (B), comprimento de neurites normalizado pelo número de neurônios (C) e sobre a fosforilação de Tau (AT100)[0094] Figure 5: Effect of MR31192 on the survival of MAP-2 neurons (A), total neurite network (B), neurite length normalized by the number of neurons (C) and on Tau phosphorylation (AT100)

(D) em cultivo primário de neurônios hipocampais lesionados com Aβ 1-42. Os resultados são expressos na forma de percentual de controle como média ± desvio padrão (n = 4-6/grupo). ANOVA de uma via foi seguido por teste LSD de Fisher. * p < 0,05 foi considerado significativo.(D) in primary culture of Aβ 1-42-injured hippocampal neurons. Results are expressed as percentage of control as mean ± standard deviation (n = 4-6/group). One-way ANOVA was followed by Fisher's LSD test. * p < 0.05 was considered significant.

[0095] Figura 6: efeito de MR31192 sobre a preservação de sinapses de neurônios MAP-2 em cultivo primário de neurônios hipocampais lesionados com Aβ 1-42. Os resultados são expressos na forma de percentual de controle como média ± desvio padrão (n = 4-6/grupo). ANOVA de uma via foi seguido por teste LSD de Fisher. * p < 0,05 foi considerado significativo.[0095] Figure 6: Effect of MR31192 on synapse preservation of MAP-2 neurons in primary culture of Aβ 1-42 injured hippocampal neurons. Results are expressed as percentage of control as mean ± standard deviation (n = 4-6/group). One-way ANOVA was followed by Fisher's LSD test. * p < 0.05 was considered significant.

[0096] Figura 7: efeito de MR33583 sobre a sobrevivência de neurônios MAP-2 (A), rede de neurites total (B), comprimento de neurites normalizado pelo número de neurônios (C) e sobre a fosforilação de Tau (AT100) (D) em cultivo primário de neurônios hipocampais lesionados com Aβ 1-42. Os resultados são expressos na forma de percentual de controle como média ± desvio padrão (n = 4-6/grupo). ANOVA de uma via foi seguido por teste LSD de Fisher. * p < 0,05 foi considerado significativo.[0096] Figure 7: Effect of MR33583 on the survival of MAP-2 neurons (A), total neurite network (B), neurite length normalized by the number of neurons (C) and on Tau phosphorylation (AT100) ( D) in primary culture of Aβ 1-42-injured hippocampal neurons. Results are expressed as percentage of control as mean ± standard deviation (n = 4-6/group). One-way ANOVA was followed by Fisher's LSD test. * p < 0.05 was considered significant.

[0097] Figura 8: efeito de MR33583 sobre a preservação de sinapses de neurônios MAP-2 em cultivo primário de neurônios hipocampais lesionados com Aβ 1-42. Os resultados são expressos na forma de percentual de controle como média ± desvio padrão (n = 4-6/grupo). ANOVA de uma via foi seguido por teste LSD de Fisher. * p < 0,05 foi considerado significativo.[0097] Figure 8: Effect of MR33583 on synapse preservation of MAP-2 neurons in primary culture of Aβ 1-42 injured hippocampal neurons. Results are expressed as percentage of control as mean ± standard deviation (n = 4-6/group). One-way ANOVA was followed by Fisher's LSD test. * p < 0.05 was considered significant.

[0098] Figura 9: efeito de MR31192 sobre a sobrevivência de neurônios MAP-2 (A), rede de neurites total (B), comprimento de neurites normalizado pelo número de neurônios (C) e sobre a fosforilação de Tau (AT100) (D) em cultivo primário de neurônios hipocampais lesionados com Aβ 1-42. Os resultados são expressos na forma de percentual de controle como média ± desvio padrão (n = 4-6/grupo). ANOVA de uma via foi seguido por teste LSD de Fisher. * p < 0,05 foi considerado significativo.[0098] Figure 9: Effect of MR31192 on the survival of MAP-2 neurons (A), total neurite network (B), neurite length normalized by the number of neurons (C) and on Tau phosphorylation (AT100) ( D) in primary culture of Aβ 1-42-injured hippocampal neurons. Results are expressed as percentage of control as mean ± standard deviation (n = 4-6/group). One-way ANOVA was followed by Fisher's LSD test. * p < 0.05 was considered significant.

[0099] Figura 10: efeito de MR31192 ou Donepezil sobre a preservação de sinapses de neurônios MAP-2 em cultivo primário de neurônios hipocampais lesionados com Aβ 1-42. Os resultados são expressos na forma de percentual de controle como média ± desvio padrão (n = 4-6/grupo). ANOVA de uma via foi seguido por teste LSD de Fisher. * p < 0,05 foi considerado significativo.[0099] Figure 10: Effect of MR31192 or Donepezil on synapse preservation of MAP-2 neurons in primary culture of Aβ 1-42 injured hippocampal neurons. Results are expressed as percentage of control as mean ± standard deviation (n = 4-6/group). One-way ANOVA was followed by Fisher's LSD test. * p < 0.05 was considered significant.

[00100] Figura 11: efeito de MR36014 ou Donepezil sobre a sobrevivência de neurônios MAP-2 (A), rede de neurites total (B), comprimento de neurites normalizado pelo número de neurônios (C) e sobre a fosforilação de Tau (AT100) (D) em cultivo primário de neurônios hipocampais lesionados com Aβ 1-42. Os resultados são expressos na forma de percentual de controle como média ± desvio padrão (n = 4-6/grupo). ANOVA de uma via foi seguido por teste LSD de Fisher. * p < 0,05 foi considerado significativo.[00100] Figure 11: Effect of MR36014 or Donepezil on the survival of MAP-2 neurons (A), total neurite network (B), neurite length normalized by the number of neurons (C) and on Tau phosphorylation (AT100 ) (D) in primary culture of Aβ 1-42-injured hippocampal neurons. Results are expressed as percentage of control as mean ± standard deviation (n = 4-6/group). One-way ANOVA was followed by Fisher's LSD test. * p < 0.05 was considered significant.

[00101] Figura 12: efeito de MR36014 ou Donepezil sobre a preservação de sinapses de neurônios MAP-2 em cultivo primário de neurônios hipocampais lesionados com Aβ 1-42. Os resultados são expressos na forma de percentual de controle como média ± desvio padrão (n = 4-6/grupo). ANOVA de uma via foi seguido por teste LSD de Fisher. * p < 0,05 foi considerado significativo.[00101] Figure 12: Effect of MR36014 or Donepezil on synapse preservation of MAP-2 neurons in primary culture of Aβ 1-42 injured hippocampal neurons. Results are expressed as percentage of control as mean ± standard deviation (n = 4-6/group). One-way ANOVA was followed by Fisher's LSD test. * p < 0.05 was considered significant.

[00102] Figura 13: efeito de MR36014 sobre a sobrevivência de neurônios TH (A), sobre a rede de neurites total de neurônios TH (B) e sobre a agregação de aSyn em neurônios TH (C) em cultivo primário de neurônios mesencefálicos lesionados com MPP+. Os resultados são expressos na forma de percentual de controle como média ± desvio padrão (n = 4-6/grupo). ANOVA de uma via foi seguido por teste LSD de Fisher. * p < 0,05 foi considerado significativo.[00102] Figure 13: Effect of MR36014 on the survival of TH neurons (A), on the total neurite network of TH neurons (B) and on aSyn aggregation in TH neurons (C) in primary culture of injured mesencephalic neurons with MPP+. Results are expressed as percentage of control as mean ± standard deviation (n = 4-6/group). One-way ANOVA was followed by Fisher's LSD test. * p < 0.05 was considered significant.

[00103] Figura 14: efeito de MR33583 sobre a sobrevivência de neurônios TH (A), sobre a rede de neurites total de neurônios TH (B) e sobre a agregação de aSyn em neurônios TH (C) em cultivo primário de neurônios mesencefálicos lesionados com MPP+. Os resultados são expressos na forma de percentual de controle como média ± desvio padrão (n = 4-6/grupo). ANOVA de uma via foi seguido por teste LSD de Fisher. * p < 0,05 foi considerado significativo.[00103] Figure 14: Effect of MR33583 on the survival of TH neurons (A), on the total neurite network of TH neurons (B) and on aSyn aggregation in TH neurons (C) in primary culture of injured mesencephalic neurons with MPP+. Results are expressed as percentage of control as mean ± standard deviation (n = 4-6/group). One-way ANOVA was followed by Fisher's LSD test. * p < 0.05 was considered significant.

[00104] Figura 15: efeito de MR36014 (A-B) e MR33583 (C-D) sobre a sobrevivência de neurônios MAP-2 (A-C)) e a proteção da rede de neurites total (B-D)) em cultivo primário de neurônios corticais lesionados com glutamato. Os resultados são expressos na forma de percentual de controle como média ± desvio padrão (n = 4-6/grupo). ANOVA de uma via foi seguido por teste LSD de Fisher. * p < 0,05 foi considerado significativo.[00104] Figure 15: Effect of MR36014 (AB) and MR33583 (CD) on the survival of MAP-2 neurons (AC)) and the protection of the total neurite network (BD)) in primary culture of glutamate-injured cortical neurons . Results are expressed as percentage of control as mean ± standard deviation (n = 4-6/group). One-way ANOVA was followed by Fisher's LSD test. * p < 0.05 was considered significant.

[00105] Figura 16: efeito de MR36014 sobre a sobrevivência (A) e rede de neurites (B, C) em neurônios motores espinhais, após lesão de glutamato. Os resultados são expressos na forma de percentual de controle, exibindo a média ± desvio padrão (100% = CT, sem composto). ANOVA de uma via seguido por teste LSD de Fisher, n = 4-6. p < 0,05 foi considerado significativo.[00105] Figure 16: Effect of MR36014 on survival (A) and neurite network (B, C) in spinal motor neurons after glutamate injury. Results are expressed as percent of control, showing the mean ± standard deviation (100% = CT, no compound). One-way ANOVA followed by Fisher's LSD test, n = 4-6. p < 0.05 was considered significant.

[00106] Figura 17: efeito de MR33583 sobre a sobrevivência (A), a rede de neurites (B, C) e sobre a translocação citosplasmática de TDP-43 (D) em neurônios motores espinhais, após lesão de glutamato. Os resultados são expressos na forma de percentual de controle, exibindo a média ± desvio padrão (100% = CT, sem composto). ANOVA de uma via seguido por teste LSD de Fisher, n = 4-6. p < 0,05 foi considerado significativo.[00106] Figure 17: Effect of MR33583 on survival (A), the neurite network (B, C) and on the cytoplasmic translocation of TDP-43 (D) in spinal motor neurons after glutamate injury. Results are expressed as percent of control, showing the mean ± standard deviation (100% = CT, no compound). One-way ANOVA followed by Fisher's LSD test, n = 4-6. p < 0.05 was considered significant.

[00107] Figura 18: efeito de MR33583 sobre a sobrevivência de neurônios GABAérgica em cultivo primário de células mesencefálicas, após o esgotamento de fatores de crescimento. Os resultados são expressos na forma de percentual de controle, exibindo a média ± desvio padrão (100% = CT, sem composto). ANOVA de uma via seguido por teste LSD de Fisher, n = 4-6. p <[00107] Figure 18: Effect of MR33583 on the survival of GABAergica neurons in primary culture of mesencephalic cells, after depletion of growth factors. Results are expressed as percent of control, showing the mean ± standard deviation (100% = CT, no compound). One-way ANOVA followed by Fisher's LSD test, n = 4-6. p <

0,05 foi considerado significativo.0.05 was considered significant.

EXEMPLOS EXEMPLO 1EXAMPLES EXAMPLE 1

[00108] Este exemplo exibe o efeito de Donecoprida em neurônios hipocampais primários de ratos lesionados com Aβ (exposição por 24 horas).[00108] This example shows the effect of Donecopride on primary hippocampal neurons of rats injured with Aβ (24 hour exposure).

[00109] Mal de Alzheimer (AD) é uma doença neurodegenerativa que afeta principalmente pessoas com mais de 65 anos de idade, que sofrem de diferentes sintomas clínicos, tais como declínio progressivo do raciocínio, linguagem e capacidade de aprendizado. Evidência crescente de diversas fontes indica oligômeros Aβ (AβO)/protofibrilas como supostas substâncias tóxicas na patogênese de AD.[00109] Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disease that mainly affects people over 65 years of age, who suffer from different clinical symptoms such as progressive decline in reasoning, language and learning ability. Growing evidence from diverse sources indicates Aβ (AβO)/protofibril oligomers as supposedly toxic substances in the pathogenesis of AD.

[00110] Com a geração de uma solução de AβO e alteração da concentração e do tempo de exposição a AβO, foi possível reproduzir efeitos iniciais (tensão oxidativa) e o desenvolvimento a longo prazo de alterações estruturais (morte de neurônios).[00110] With the generation of an AβO solution and changing the concentration and time of exposure to AβO, it was possible to reproduce initial effects (oxidative stress) and the long-term development of structural changes (death of neurons).

[00111] O modelo utilizado no presente exemplo, utilizando solução de peptídeo Aβ que contém AβO (medido com precisão por meio de Western Blot automático), reproduziu características neuropatológicas essenciais de AD.[00111] The model used in the present example, using Aβ peptide solution containing AβO (accurately measured by automatic Western Blot), reproduced essential neuropathological characteristics of AD.

[00112] O objeto deste estudo foi avaliar os efeitos de um composto de teste (fumarato de Donecoprida em diversas concentrações) em neurônios hipocampais primários de ratos lesionados com Aβ (exposição por 24 horas).[00112] The object of this study was to evaluate the effects of a test compound (Donecopride fumarate at various concentrations) on primary hippocampal neurons of rats injured with Aβ (exposure for 24 hours).

Donepezil da fórmula a seguir: (uma concentração) foi utilizado como composto de teste de referência.Donepezil of the following formula: (one concentration) was used as the reference test compound.

[00113] Materiais e métodos:[00113] Materials and methods:

[00114] Cultivo primário de neurônios hipocampais:[00114] Primary culture of hippocampal neurons:

[00115] Neurônios hipocampais de ratos foram cultivados conforme descrito por Callizot et al (2013), J. Neurosci. Res. 91: 706-716.[00115] Rat hippocampal neurons were cultured as described by Callizot et al (2013), J. Neurosci. Res. 91: 706-716.

Fêmeas de ratos grávidas com 17 dias de gestação (Ratos Wistar; Janvier Labs, França) foram mortas utilizando anestesia profunda com câmara de CO 2 seguida por deslocamento da cervical. Os fetos foram removidos em seguida do útero e imediatamente colocados em meio Leibovitz L15 gelado com uma solução de 2% de penicilina (10.000 U/ml) e estreptomicina (10 mg/ml) (PS) e 1% de albumina de soro bovino (BSA). Neurônios hipocampais foram tratados por 20 minutos a 37 °C com uma solução de tripsina-EDTA em concentração final de 0,05% de tripsina e 0,02% de EDTA. A dissociação foi suspensa por meio da adição de meio Eagle modificado da Dulbecco (DMEM) com 4,5 g/l de glicose, que contém DNAse I grau II (concentração final de 0,5 mg/ml) e 10% de soro de feto bovino (FCS). As células foram dissociadas mecanicamente por três passagens forçadas através da ponta de uma pipeta de 10 ml e centrifugadas em seguida a 515 x g por 10 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi descartado e a pelota foi novamente suspensa em meio de cultivo definido que consiste em meio neurobasal com solução a 2% de suplemento B27, 2 mmol/l de L-glutamina, 2% de solução de PS e 10 ng/ml de fator neurotrófico cerebral (BDNF). Células viáveis foram contadas em um citômetro de Neubauer, utilizando o teste de exclusão de azul de tripano. Células foram semeadas em densidade de 20.000 por cavidade em placas com 96 cavidades previamente revestidas com poli-L- lisina e cultivadas a 37 °C em um incubador de ar (95%)-CO2 (5%). O meio foi alterado a cada dois dias.Females of pregnant rats at 17 days of gestation (Wistar Rats; Janvier Labs, France) were killed using deep anesthesia with a CO 2 chamber followed by cervical dislocation. The fetuses were then removed from the uterus and immediately placed in ice-cold Leibovitz L15 medium with a solution of 2% penicillin (10,000 U/ml) and streptomycin (10 mg/ml) (PS) and 1% bovine serum albumin ( BSA). Hippocampal neurons were treated for 20 minutes at 37 °C with a trypsin-EDTA solution at a final concentration of 0.05% trypsin and 0.02% EDTA. Dissociation was stopped by the addition of Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/l of glucose, which contains DNAse I grade II (final concentration of 0.5 mg/ml) and 10% serum bovine fetus (FCS). Cells were mechanically dissociated by three forced passages through the tip of a 10 ml pipette and then centrifuged at 515 x g for 10 minutes at 4°C. The supernatant was discarded and the pellet was resuspended in defined culture medium consisting of neurobasal medium with a 2% solution of B27 supplement, 2 mmol/l L-glutamine, 2% PS solution and 10 ng/ml of cerebral neurotrophic factor (BDNF). Viable cells were counted in a Neubauer cytometer using the trypan blue exclusion test. Cells were seeded at a density of 20,000 per well in 96-well plates previously coated with poly-L-lysine and cultured at 37°C in an air (95%)-CO2 (5%) incubator. The medium was changed every two days.

[00116] Donecoprida e exposição a Aβ 1-42 humano:[00116] Donecopride and exposure to human Aβ 1-42:

[00117] Os neurônios hipocampais foram expostos a soluções de[00117] Hippocampal neurons were exposed to solutions of

Aβ (conforme abaixo) após 17 dias de cultivo. A preparação Aβ 1-42 foi elaborada seguindo-se o procedimento descrito por Callizot et al (2013), J.Aβ (as below) after 17 days of cultivation. The Aβ 1-42 preparation was prepared following the procedure described by Callizot et al (2013), J.

Neurosci. Res. 91: 706-716. Resumidamente, o peptídeo Aβ 1-42 foi dissolvido no meio de cultivo definido mencionado acima, em concentração inicial de 40 µM. Esta solução foi suavemente agitada por três dias a 37 °C no escuro e utilizada imediatamente após diluição adequada em meio de cultivo até as concentrações empregadas (20 µM (placa 1) ou 2,5 µM (placa 2) correspondentes a 2 µM ou 0,25 µM de oligômeros (AβO), respectivamente).Neurosci. Res. 91: 706-716. Briefly, the Aβ 1-42 peptide was dissolved in the defined culture medium mentioned above at an initial concentration of 40 µM. This solution was gently shaken for three days at 37 °C in the dark and used immediately after adequate dilution in culture medium to the concentrations employed (20 µM (plate 1) or 2.5 µM (plate 2) corresponding to 2 µM or 0 .25 µM oligomers (AβO), respectively).

[00118] Fumarato de donecoprida foi dissolvido em meio de cultivo e previamente incubado uma hora antes da aplicação de Aβ. A preparação de Aβ 1-42 foi adicionada até concentração final de 20 ou 2,5 µM (= 2 µM ou 0,25 µM de AβO, avaliada por meio de Western Blot automático) diluída em meio controle na presença de Donecoprida.[00118] Donecopride fumarate was dissolved in culture medium and previously incubated one hour before the application of Aβ. The Aβ 1-42 preparation was added to a final concentration of 20 or 2.5 µM (= 2 µM or 0.25 µM of AβO, evaluated by automatic Western Blot) diluted in control medium in the presence of Donecopride.

[00119] Organização de placas de cultivo:[00119] Organization of cultivation plates:

[00120] Fumarato de donecoprida (Donecoprida) foi testado sobre um cultivo em uma placa com 96 cavidades (6 cavidades por condições). O composto foi previamente incubado uma hora antes da aplicação de Aβ. Foram determinadas as condições a seguir: PLACA 1 (MAP-2 / Tau) PLACA 2 (PSD95 / SYN) Controle (Veículo) Controle (Veículo) + Aβ (20 µM 24 h) / veículo + Aβ (2,5 µM 24 h) / veículo + Aβ (20 µM 24 h) / Donecoprida (1 + Aβ (2,5 µM 24 h) / Donecoprida (1 µM) µM) + Aβ (20 µM 24 h) / Donecoprida + Aβ (2,5 µM 24 h) / Donecoprida (500 nM) (500 nM) + Aβ (20 µM 24 h) / Donecoprida + Aβ (2,5 µM 24 h) / Donecoprida (100 nM) (100 nM)[00120] Donecopride fumarate (Donecopride) was tested on a culture in a 96-well plate (6 wells per conditions). The compound was pre-incubated one hour before application of Aβ. The following conditions were determined: PLATE 1 (MAP-2 / Tau) PLATE 2 (PSD95 / SYN) Control (Vehicle) Control (Vehicle) + Aβ (20 µM 24 h) / vehicle + Aβ (2.5 µM 24 h) ) / vehicle + Aβ (20 µM 24 h) / Donecopride (1 + Aβ (2.5 µM 24 h) / Donecopride (1 µM) µM) + Aβ (20 µM 24 h) / Donecopride + Aβ (2.5 µM 24 h) / Donecopride (500 nM) (500 nM) + Aβ (20 µM 24 h) / Donecopride + Aβ (2.5 µM 24 h) / Donecopride (100 nM) (100 nM)

PLACA 1 (MAP-2 / Tau) PLACA 2 (PSD95 / SYN) + Aβ (20 µM 24 h) / Donecoprida (50 + Aβ (2,5 µM 24 h) / Donecoprida (50 nM) nM) + Aβ (20 µM 24 h) / Donecoprida (10 + Aβ (2,5 µM 24 h) / Donecoprida (10 nM) nM) + Aβ (20 µM 24 h) / Donecoprida (5 + Aβ (2,5 µM 24 h) / Donecoprida (5 nM) nM) + Aβ (20 µM 24 h) / Donecoprida (1 + Aβ (2,5 µM 24 h) / Donecoprida (1 nM) nM) + Aβ (2,5 µM 24 h) / Donepezil (1 + Aβ (20 µM 24 h) / Donepezil (1 µM) µM)PLATE 1 (MAP-2 / Tau) PLATE 2 (PSD95 / SYN) + Aβ (20 µM 24 h) / Donecopride (50 + Aβ (2.5 µM 24 h) / Donecopride (50 nM) nM) + Aβ (20 µM 24 h) / Donecopride (10 + Aβ (2.5 µM 24 h) / Donecopride (10 nM) nM) + Aβ (20 µM 24 h) / Donecopride (5 + Aβ (2.5 µM 24 h) / Donecopride (5 nM) nM) + Aβ (20 µM 24 h) / Donecopride (1 + Aβ (2.5 µM 24 h) / Donepezil (1 nM) + Aβ (2.5 µM 24 h) / + Aβ (20 µM 24 h) / Donepezil (1 µM) µM)

[00121] Avaliação de objetivos:[00121] Evaluation of objectives:

[00122] Placa 1: sobrevivência, rede de neurites e avaliação de fosfo tau.[00122] Plate 1: survival, neurite network and phospho tau evaluation.

[00123] Em 24 horas após a intoxicação, os neurônios hipocampais foram fixados por uma solução fria de etanol (95%) e ácido acético (5%) por cinco minutos a -20 °C. Após permeabilização com 0,1% de saponina, as células foram incubadas por duas horas com: a. anticorpo policlonal de galinha antiproteína associada a microtúbulos 2 (MAP-2), diluído a 1/1000 em PBS, que contém 1% de soro de feto bovino e 0,1% de saponina (esse anticorpo permite manchas específicas de corpos de células neuronais e neurites; e permite o estudo da morte de células neuronais e rede de neurites); e b. anticorpo monoclonal de camundongo antifosfo Tau (AT100) em diluição de 1/400 em PBS que contém 1% de soro de feto bovino e 0,1% de saponina.[00123] Within 24 hours of intoxication, the hippocampal neurons were fixed by a cold solution of ethanol (95%) and acetic acid (5%) for five minutes at -20 °C. After permeabilization with 0.1% saponin, cells were incubated for two hours with: a. chicken polyclonal anti microtubule associated protein 2 (MAP-2) antibody, diluted 1/1000 in PBS, which contains 1% fetal bovine serum and 0.1% saponin (this antibody allows specific staining of neuronal cell bodies and neurites; and allows the study of neuronal cell death and neurite network); and b. mouse monoclonal anti-phospho Tau antibody (AT100) at 1/400 dilution in PBS containing 1% fetal bovine serum and 0.1% saponin.

[00124] Esses anticorpos foram revelados com anti-IgG de camundongo de cabra Alexa Flúor 488 e anti-IgG de galinha de cabra Alexa Flúor 568 em diluição 1/400 em PBS contendo 1% de FCS e 0,1% de saponina por uma hora à temperatura ambiente.[00124] These antibodies were revealed with anti-goat mouse IgG Alexa Fluor 488 and anti-goat chicken IgG Alexa Fluor 568 at 1/400 dilution in PBS containing 1% FCS and 0.1% saponin for one hour at room temperature.

[00125] Para cada condição, 30 fotografias (que representam toda a área da cavidade) por cavidade foram tomadas utilizando ImageXpress (Molecular Devices) em ampliação de 20x. Todas as imagens foram tomadas com os mesmos parâmetros de obtenção. As análises foram realizadas automaticamente utilizando Custom Module Editor (Molecular Devices).[00125] For each condition, 30 photographs (which represent the entire cavity area) per cavity were taken using ImageXpress (Molecular Devices) at 20x magnification. All images were taken with the same acquisition parameters. Analyzes were performed automatically using Custom Module Editor (Molecular Devices).

[00126] Foram determinados os objetivos a seguir: - número total de neurônios (sobrevivência de neurônios, número de neurônios positivos para MAP-2); - rede de neurites (em µm de neurônios positivos para MAP- 2); e - área de tau em neurônios (µm2, sobrepostos com neurônios positivos para MAP-2).[00126] The following objectives were determined: - total number of neurons (neuron survival, number of MAP-2 positive neurons); - neurite network (in µm of MAP-2 positive neurons); and - area of tau in neurons (µm2, overlapped with MAP-2 positive neurons).

[00127] Placa 2: avaliação das sinapses.[00127] Plate 2: evaluation of synapses.

[00128] Em 24 horas após a intoxicação, os neurônios hipocampais foram fixados por uma solução fria de etanol (95%) e ácido acético (5%) por cinco minutos a -20 °C. Após permeabilização com 0,1% de saponina, células foram incubadas por duas horas com: a. anticorpo monoclonal de camundongo antipós-sináptico com densidade de 95 kDa (PSD95) em diluição de 1/100 em PBS que contém 1% de soro de feto bovino e 0,1% de saponina; e b. anticorpo policlonal de coelho antissinaptofisina (SYN) em diluição de 1/100 em PBS contendo 1% de soro de feto bovino e 0,1% de saponina.[00128] Within 24 hours after intoxication, the hippocampal neurons were fixed by a cold solution of ethanol (95%) and acetic acid (5%) for five minutes at -20 °C. After permeabilization with 0.1% saponin, cells were incubated for two hours with: a. anti-postsynaptic mouse monoclonal antibody with a density of 95 kDa (PSD95) at 1/100 dilution in PBS containing 1% fetal bovine serum and 0.1% saponin; and b. rabbit polyclonal anti-synaptophysin antibody (SYN) at 1/100 dilution in PBS containing 1% fetal bovine serum and 0.1% saponin.

[00129] Esses anticorpos foram revelados com anti-IgG de camundongo de cabra Alexa Flúor 488 e anti-IgG de coelho de cabra Alexa Flúor[00129] These antibodies were revealed with anti-goat mouse IgG Alexa Fluor 488 and anti-goat rabbit IgG Alexa Fluor

568 em diluição 1/400 em PBS contendo 1% de FCS e 0,1% de saponina por uma hora à temperatura ambiente.568 at 1/400 dilution in PBS containing 1% FCS and 0.1% saponin for one hour at room temperature.

[00130] Para cada condição, 40 fotografias por cavidade foram tomadas utilizando ImageXpress (Molecular Devices) com ampliação de 40x.[00130] For each condition, 40 photographs per cavity were taken using ImageXpress (Molecular Devices) at 40x magnification.

Todas as imagens foram tomadas com os mesmos parâmetros de obtenção.All images were taken with the same acquisition parameters.

[00131] Análise das sinapses foi realizada automaticamente utilizando Custom Module Editor (Molecular Devices).[00131] Synapse analysis was performed automatically using Custom Module Editor (Molecular Devices).

[00132] Foram determinados os objetivos a seguir: - número total de sinapses (sobreposição entre PSD95/SYN).[00132] The following objectives were determined: - total number of synapses (overlapping between PSD95/SYN).

[00133] Análise estatística:[00133] Statistical analysis:

[00134] Todos os valores são expressos na forma de média ± desvio padrão. Realizou-se análise estatística por meio de ANOVA de uma via, seguido por teste PLSD de Fisher, e p < 0,05 foi considerado significativo.[00134] All values are expressed as mean ± standard deviation. Statistical analysis was performed using one-way ANOVA, followed by Fisher's PLSD test, and p < 0.05 was considered significant.

[00135] Gráficos e análises estatísticas das diferentes condições foram realizados utilizando software GraphPad Prism versão 7.04. * p < 0,05 foi considerado significativo.[00135] Graphs and statistical analyzes of the different conditions were performed using GraphPad Prism software version 7.04. * p < 0.05 was considered significant.

[00136] Resultados:[00136] Results:

[00137] Efeitos de Donecoprida sobre a sobrevivência e rede de neurites de neurônios hipocampais MAP-2 e sobre a hiperfosforilação de Tau.[00137] Effects of Donecopride on the survival and neurite network of MAP-2 hippocampal neurons and on Tau hyperphosphorylation.

[00138] Sobrevivência dos neurônios:[00138] Survival of neurons:

[00139] O efeito de Donecoprida sobre a sobrevivência de neurônios MAP-2 em cultivo primário de neurônios hipocampais é exibido na Tabela 1 abaixo.[00139] The effect of Donecopride on the survival of MAP-2 neurons in primary culture of hippocampal neurons is shown in Table 1 below.

TABELA 1TABLE 1

[00140] Neurônios MAP-2 (% de controle): Neurônios MAP-2 (% de controle) Média Desvio padrão n Controle 100 5 6[00140] MAP-2 neurons (% of control): MAP-2 neurons (% of control) Mean Standard deviation n Control 100 5 6

Neurônios MAP-2 (% de controle) Média Desvio padrão n + Aβ 1-42 (20 µM) 70 2 6 + Donecoprida (1 nM) 70 2 5 + Donecoprida (5 nM) 69 2 6 + Donecoprida (10 73 2 5 nM) + Donecoprida (50 74 2 5 nM) + Donecoprida (100 78* 1 4 nM) + Donecoprida (500 79* 1 5 nM) + Donecoprida (1 µM) 62* 2 5 + Donepezil (1 µM) 82* 2 5 * p < 0,05 contra Aβ 1-42, determinado por meio de ANOVA de uma via seguido por teste LSD da Fisher.MAP-2 neurons (% of control) Mean Standard deviation n + Aβ 1-42 (20 µM) 70 2 6 + Donecopride (1 nM) 70 2 5 + Donecopride (5 nM) 69 2 6 + Donecopride (10 73 2 5 nM) + Donepepride (50 74 2 5 nM) + Donepepride (100 78* 1 4 nM) + Donepepride (500 79* 1 5 nM) + Donepepride (1 µM) 62* 2 5 + Donepezil (1 µM) 82* 2 5 * p < 0.05 against Aβ 1-42, determined by one-way ANOVA followed by Fisher's LSD test.

[00141] Perda importante de neurônios MAP-2 foi consecutiva à aplicação do peptídeo Aβ. Donepezil, utilizado no presente como controle positivo, foi capaz de proteger significativamente os neurônios da morte. Duas doses de Donecoprida (100 nM e 500 nM) exerceram efeitos neuroprotetores similares a Donepezil.[00141] Important loss of MAP-2 neurons was consecutive to the application of the Aβ peptide. Donepezil, used at present as a positive control, was able to significantly protect neurons from death. Two doses of Donecopride (100 nM and 500 nM) exerted neuroprotective effects similar to Donepezil.

[00142] Rede de neurites:[00142] Neurite network:

[00143] O efeito de Donecoprida sobre a rede de neurites de neurônios MAP-2 em cultivo primário de neurônios hipocampais é exibido na Tabela 2 abaixo.[00143] The effect of Donecopride on the neurite network of MAP-2 neurons in primary culture of hippocampal neurons is shown in Table 2 below.

TABELA 2TABLE 2

[00144] Rede de neurites de MAP-2 (% do controle): Rede de neurites MAP-2 (% de controle) Média Desvio padrão n Controle 100 2 6 + Aβ 1-42 (20 µM) 63 1 6 + Donecoprida (1 nM) 64 2 5 + Donecoprida (5 nM) 69 2 6 + Donecoprida (10 68 2 5 nM) + Donecoprida (50 71* 3 5 nM) + Donecoprida (100 73* 1 5 nM) + Donecoprida (500 79* 3 6 nM) + Donecoprida (1 µM) 76* 2 6 + Donepezil (1 µM) 92* 3 5 * p < 0,05 contra Aβ 1-42, determinado por meio de ANOVA de uma via seguido por teste LSD da Fisher.[00144] MAP-2 neurite network (% of control): MAP-2 neurite network (% of control) Mean Standard deviation n Control 100 2 6 + Aβ 1-42 (20 µM) 63 1 6 + Donecopride ( 1 nM) 64 2 5 + Donecopride (5 nM) 69 2 6 + Donecopride (10 68 2 5 nM) + Donecopride (50 71* 3 5 nM) + Donecopride (100 73* 1 5 nM) + Donecopride (500 79* 3 6 nM) + Donepezil (1 µM) 76* 2 6 + Donepezil (1 µM) 92* 3 5 * p < 0.05 against Aβ 1-42, determined by one-way ANOVA followed by Fisher's LSD test .

[00145] A rede de neurites total foi severamente contraída mediante lesão de Aβ 1-42. Donepezil foi significativamente preservado em quase toda a rede de neurites. Quatro doses de Donecoprida (50 nM, 100 nM, 500 nM e 1 µM) também exerceram efeitos protetores sobre a rede de neurites.[00145] The total neurite network was severely contracted upon Aβ 1-42 injury. Donepezil was significantly preserved in almost the entire neurite network. Four doses of Donecopride (50 nM, 100 nM, 500 nM and 1 µM) also exerted protective effects on the neurite network.

[00146] A rede de neurites é proporcional ao número de neurônios no cultivo. A rede de neurites total foi normalizada pelo número de neurônios, a fim de determinar o comprimento médio de neurite por neurônios. Os resultados correspondentes são exibidos na Tabela 3 abaixo.[00146] The network of neurites is proportional to the number of neurons in the culture. The total neurite network was normalized by the number of neurons in order to determine the average length of neurite per neuron. The corresponding results are shown in Table 3 below.

TABELA 3TABLE 3

[00147] Rede de neurites/neurônios MAP-2 (% de controle): Rede de neurites/neurônios MAP-2 (% de controle) Média Desvio padrão n Controle 100 6 6 + Aβ 1-42 (20 µM) 90 3 6 + Donecoprida (1 nM) 90 3 4 + Donecoprida (5 nM) 99 2 6 + Donecoprida (10 96 3 4 nM) + Donecoprida (50 91 5 4 nM) + Donecoprida (100 93 1 4 nM) + Donecoprida (500 100 4 5 nM) + Donecoprida (1 µM) 124* 5 5 + Donepezil (1 µM) 113* 4 4 * p < 0,05 contra Aβ 1-42, determinado por meio de ANOVA de uma via seguido por teste LSD da Fisher.[00147] MAP-2 neurite/neuron network (% control): MAP-2 neurite/neuron network (% control) Mean Standard deviation n Control 100 6 6 + Aβ 1-42 (20 µM) 90 3 6 + Donecopride (1 nM) 90 3 4 + Donecopride (5 nM) 99 2 6 + Donecopride (10 96 3 4 nM) + Donecopride (50 91 5 4 nM) + Donecopride (100 93 1 4 nM) + Donecopride (500 100 4 5 nM) + Donepezil (1 µM) 124* 5 5 + Donepezil (1 µM) 113* 4 4 * p < 0.05 against Aβ 1-42, determined by one-way ANOVA followed by Fisher's LSD test .

[00148] Este ajuste demonstrou que o comprimento de neurites por neurônio foi maior na presença de Donepezil e Donecoprida (1 µM), o que sugere que esses dois compostos apresentaram efeito sobre o resultado de neurites.[00148] This adjustment demonstrated that the length of neurites per neuron was greater in the presence of Donepezil and Donecopride (1 µM), which suggests that these two compounds had an effect on the neurite outcome.

[00149] Fosforilação de Tau:[00149] Tau Phosphorylation:

[00150] O efeito de Donecoprida sobre a fosforilação de Tau (AT100) em neurônios MAP-2 em cultivo primário de neurônios hipocampais é exibido na Tabela 4 abaixo.[00150] The effect of Donecopride on Tau phosphorylation (AT100) in MAP-2 neurons in primary cultured hippocampal neurons is shown in Table 4 below.

TABELA 4TABLE 4

[00151] Área de Tau (AT100)/neurônios (% do controle): Área de Tau (AT100)/neurônios (% do controle) Média Desvio padrão n Controle 100 4 5 + Aβ 1-42 (20 µM) 200 11 5 + Donecoprida (1 nM) 204 7 4 + Donecoprida (5 nM) 201 8 5 + Donecoprida (10 175 11 4 nM) + Donecoprida (50 161* 12 5 nM) + Donecoprida (100 154* 6 3 nM) + Donecoprida (500 152* 8 4 nM) + Donecoprida (1 µM) 198 8 5 + Donepezil (1 µM) 151* 6 4 * p < 0,05 contra Aβ 1-42, determinado por meio de ANOVA de uma via seguido por teste LSD de Fisher.[00151] Area of Tau (AT100)/neurons (% of control): Area of Tau (AT100)/neurons (% of control) Mean Standard deviation n Control 100 4 5 + Aβ 1-42 (20 µM) 200 11 5 + Donecopride (1 nM) 204 7 4 + Donecopride (5 nM) 201 8 5 + Donecopride (10 175 11 4 nM) + Donecopride (50 161* 12 5 nM) + Donecopride (100 154* 6 3 nM) + Donecopride ( 500 152* 8 4 nM) + Donepezil (1 µM) 198 8 5 + Donepezil (1 µM) 151* 6 4 * p < 0.05 against Aβ 1-42, determined by one-way ANOVA followed by LSD test of Fisher.

[00152] Hiperfosforilação de Tau (sobre AT100) foi observada em aplicação de Aβ 1-42. Donepezil foi capaz de reduzir significativamente essa hiperfosforilação. De forma similar, Donecoprida (50 nM, 100 nM, 500 nM) reduziu significativamente a hiperfosforilação de Tau de forma dependente da dosagem.[00152] Tau hyperphosphorylation (over AT100) was observed in application of Aβ 1-42. Donepezil was able to significantly reduce this hyperphosphorylation. Similarly, Donecopride (50 nM, 100 nM, 500 nM) significantly reduced Tau hyperphosphorylation in a dose-dependent manner.

[00153] Efeitos de Donecoprida sobre sinapses em cultivo primário de neurônios hipocampais:[00153] Effects of Donecopride on synapses in primary culture of hippocampal neurons:

[00154] Para determinar a formação de sinapses, foi estudada a distribuição de PSD-95, marcador pós-sináptico, e sinaptofisina, marcador pré- sináptico. Estrutura positiva para ambos, manchas de sinaptofisina e PSD-95, foi considerada sinapse.[00154] To determine the formation of synapses, the distribution of PSD-95, postsynaptic marker, and synaptophysin, presynaptic marker, was studied. Positive structure for both synaptophysin and PSD-95 patches was considered synapse.

[00155] O efeito de Donecoprida sobre essas sinapses é exibido na Tabela 5 abaixo.[00155] The effect of Donecopride on these synapses is shown in Table 5 below.

TABELA 5TABLE 5

[00156] Número de sinapses (% do controle): Número de sinapses (% do controle): Média Desvio padrão n Controle 100* 6 5 + Aβ 1-42 (20 µM) 67 4 6 + Donecoprida (1 nM) 69 5 4 + Donecoprida (5 nM) 83* 3 5 + Donecoprida (10 87* 7 5 nM) + Donecoprida (50 91* 3 6 nM) + Donecoprida (100 93* 3 4 nM) + Donecoprida (500 94* 5 4 nM) + Donecoprida (1 µM) 85* 4 5 + Donepezil (1 µM) 88* 6 5 * p < 0,05 contra Aβ 1-42, determinado por meio de ANOVA de uma via seguido por teste LSD da Fisher.[00156] Number of synapses (% of control): Number of synapses (% of control): Mean Standard deviation n Control 100* 6 5 + Aβ 1-42 (20 µM) 67 4 6 + Donecopride (1 nM) 69 5 4 + Donecopride (5 nM) 83* 3 5 + Donecopride (10 87* 7 5 nM) + Donecopride (50 91* 3 6 nM) + Donecopride (100 93* 3 4 nM) + Donecopride (500 94* 5 4 nM ) + Donepezil (1 µM) 85* 4 5 + Donepezil (1 µM) 88* 6 5 * p < 0.05 against Aβ 1-42, determined by one-way ANOVA followed by Fisher's LSD test.

[00157] A tensão resultante da aplicação de Aβ 1-42 causou redução do número de sinapses (conforme exibido anteriormente por Callizot et al (2013), J. Neurosci. Res. 91: 706-716).[00157] The resulting tension from the application of Aβ 1-42 caused a reduction in the number of synapses (as previously shown by Callizot et al (2013), J. Neurosci. Res. 91: 706-716).

[00158] Donepezil reduziu a perda de sinapses. De forma similar, Donecoprida também foi capaz de preservar o número de sinapses, de forma dependente da dosagem (5 nM a 1 µM). De forma interessante, este efeito foi observado em baixa dose do composto (5 nM). Este efeito aumentou com a dosagem.[00158] Donepezil reduced synapse loss. Similarly, Donecopride was also able to preserve the number of synapses, in a dose-dependent manner (5 nM to 1 µM). Interestingly, this effect was seen at low dose of the compound (5 nM). This effect increased with dosage.

[00159] Devido à lesão causada pelo peptídeo Aβ 1-42, o número de neurônios foi reduzido nas condições experimentais, o que gerou redução do número de sinapses. Para estimar o número de sinapses por neurônio, portanto, o número de sinapses foi normalizado pelo número de neurônios para o controle, Aβ 1-42, Donecoprida (500 nM, em que a condição exibe o número mais alto de sinapses) e grupos Donepezil.[00159] Due to the damage caused by the Aβ 1-42 peptide, the number of neurons was reduced in the experimental conditions, which generated a reduction in the number of synapses. To estimate the number of synapses per neuron, therefore, the number of synapses was normalized by the number of neurons for the control, Aβ 1-42, Donecopride (500 nM, where the condition exhibits the highest number of synapses) and Donepezil groups .

[00160] Este ajuste demonstrou que somente Donecoprida promoveu significativamente a formação de novas sinapses enquanto Donepezil não apresentou efeito.[00160] This adjustment demonstrated that only Donepezil significantly promoted the formation of new synapses while Donepezil had no effect.

[00161] Conclusão:[00161] Conclusion:

[00162] O presente estudo indica que Donecoprida possui efeitos benéficos sobre a sobrevivência dos neurônios e a rede de neurites de neurônios hipocampais lesionados com peptídeo Aβ 1-42, que é um modelo in vitro de mal de Alzheimer.[00162] The present study indicates that Donecopride has beneficial effects on the survival of neurons and the neurite network of hippocampal neurons injured with Aβ 1-42 peptide, which is an in vitro model of Alzheimer's disease.

[00163] Além disso, Donecoprida foi capaz de reduzir a hiperfosforilação de Tau sobre o lado AT100 e estimular significativamente a formação de novas sinapses.[00163] In addition, Donecopride was able to reduce Tau hyperphosphorylation on the AT100 side and significantly stimulate the formation of new synapses.

[00164] Os efeitos de Donecoprida foram maiores que os de Donepezil, o que sugere que esse composto é uma possível droga interessante como agente neuroprotetor, particularmente para o tratamento de doenças neurodegenerativas.[00164] The effects of Donecopride were greater than those of Donepezil, suggesting that this compound is a possible interesting drug as a neuroprotective agent, particularly for the treatment of neurodegenerative diseases.

EXEMPLO 2EXAMPLE 2

[00165] O exemplo do presente demonstra que os compostos de acordo com a presente invenção podem aprimorar o desempenho cognitivo dos camundongos em um modelo in vivo de AD/s.[00165] The present example demonstrates that the compounds according to the present invention can improve the cognitive performance of mice in an in vivo model of AD/s.

[00166] Com este propósito, a eficácia de dois compostos (fumarato de Donecoprida e fumarato de Flucoprida) foi pesquisada utilizando camundongos C57BI6/J do tipo selvagem que receberam injeção intracerebroventricular de oligômeros Aβ 1-42 (AβO).[00166] For this purpose, the efficacy of two compounds (Donecopride fumarate and Flucopride fumarate) was investigated using wild-type C57BI6/J mice that received intracerebroventricular injection of Aβ 1-42 (AβO) oligomers.

[00167] Os compostos foram dosados por via oral (alimentação forçada) em três doses diferentes. O desempenho cognitivo foi determinado utilizando o teste de labirinto em Y, o teste de Reconhecimento de Objetos Novos e o teste de labirinto de água Morris. Ao final dos testes cognitivos, todos os animais foram sacrificados e o sangue e o cérebro foram amostrados para análises ex vivo adicionais.[00167] The compounds were dosed orally (forced feeding) in three different doses. Cognitive performance was determined using the Y-maze test, the New Object Recognition test, and the Morris water-maze test. At the end of cognitive testing, all animals were sacrificed and blood and brain were sampled for further ex vivo analyses.

[00168] Representação esquemática do experimento:[00168] Schematic representation of the experiment:

[00169] Resumidamente, 144 camundongos machos C57BI6/J (três meses de idade) foram recebidos e abrigados (4 a 5 por gaiola) em quarentena por sete dias ou mais. Itens de teste foram dosados por via oral (alimentação forçada) uma vez por dia em concentrações diferentes do dia -1 ao dia +17.[00169] Briefly, 144 male C57BI6/J mice (three months of age) were received and housed (4 to 5 per cage) in quarantine for seven days or more. Test items were dosed orally (forced feeding) once a day at different concentrations from day -1 to day +17.

[00170] No dia 0, os camundongos receberam uma única injeção icv de veículo ou AβO.[00170] On day 0, mice received a single icv injection of vehicle or AβO.

[00171] No dia +4 (ou seja, quatro dias após a indução da doença), determinou-se a memória de trabalho espacial utilizando o teste de labirinto em Y.At day +4 (ie four days after disease induction), spatial working memory was determined using the Y-maze test.

[00172] Do dia +3 ao dia +14, as capacidades de aprendizado e a memória de longo prazo foram investigadas no teste MWM.[00172] From day +3 to day +14, learning abilities and long-term memory were investigated in the MWM test.

[00173] Nos dias +15/+16, foi pesquisada a memória de reconhecimento utilizando o teste de Reconhecimento de Objetos Novos (NOR).[00173] On days +15/+16, the recognition memory was searched using the New Object Recognition (NOR) test.

[00174] Os animais foram sacrificados no dia +17 e tecidos foram preparados para análises ex vivo adicionais.Animals were sacrificed on day +17 and tissues were prepared for further ex vivo analyses.

[00175] Descrição dos grupos experimentais:[00175] Description of experimental groups:

[00176] O estudo envolveu, ao todo, 144 camundongos divididos em 12 grupos experimentais com 12 camundongos por grupo experimental.[00176] The study involved a total of 144 mice divided into 12 experimental groups with 12 mice per experimental group.

Todos os animais receberam uma única injeção icv (unilateral) de veículo ou AβO em volume total de 1 µl.All animals received a single icv (unilateral) injection of vehicle or AβO in a total volume of 1 µl.

[00177] Os diferentes grupos experimentais são definidos conforme segue: - GRUPO A (veículo CTRL): veículo oral E injeção icv de veículo (n = 12); - GRUPO B (AβO CTRL): veículo oral E injeção icv de AβO (n = 12); - GRUPO C (CTRL positivo): Donepezil oral subcrônico E injeção icv de AβO (n = 12); - GRUPO D (Donecoprida CTRL): Donecoprida oral (9 mg/kg) E injeção icv de veículo (n = 12); - GRUPO E (Flucoprida CTRL): Flucoprida oral (9 mg/kg) E injeção icv de veículo (n = 12); - GRUPO F (tratado com Donecoprida): Donecoprida oral (1 mg/kg) E injeção icv de AβO (n = 12); - GRUPO G (tratado com Donecoprida): Donecoprida oral (3 mg/kg) E injeção icv de AβO (n = 12); - GRUPO H (tratado com Donecoprida): Donecoprida oral (9 mg/kg) E injeção icv de AβO (n = 12); - GRUPO I (tratado com Flucoprida): Flucoprida oral (1 mg/kg)[00177] The different experimental groups are defined as follows: - GROUP A (CTRL vehicle): oral vehicle AND vehicle icv injection (n = 12); - GROUP B (AβO CTRL): oral vehicle AND icv injection of AβO (n = 12); - GROUP C (CTRL positive): subchronic oral Donepezil AND icv AβO injection (n = 12); - GROUP D (Donecopride CTRL): Oral donecopride (9 mg/kg) and icv vehicle injection (n = 12); - GROUP E (Flucopride CTRL): Oral flucopride (9 mg/kg) and icv vehicle injection (n = 12); - GROUP F (treated with Donecopride): Oral Donecopride (1 mg/kg) AND icv AβO injection (n = 12); - GROUP G (treated with Donecopride): Oral Donecopride (3 mg/kg) AND icv AβO injection (n = 12); - GROUP H (treated with Donecopride): Oral Donecopride (9 mg/kg) AND icv AβO injection (n = 12); - GROUP I (treated with Flucopride): Oral flucopride (1 mg/kg)

E injeção icv de AβO (n = 12); - GRUPO J (tratado com Flucoprida): Flucoprida oral (3 mg/kg) E injeção icv de AβO (n = 12); - GRUPO K (tratado com Flucoprida): Flucoprida oral (9 mg/kg) E injeção icv de AβO (n = 12); e - GRUPO L (CTRL positivo): Donepezil intraperitoneal agudo nos dias de teste E injeção icv de AβO (n = 12).E icv injection of AβO (n = 12); - GROUP J (treated with Flucopride): Oral flucopride (3 mg/kg) AND icv AβO injection (n = 12); - GROUP K (treated with Flucopride): Oral flucopride (9 mg/kg) AND icv AβO injection (n = 12); and - GROUP L (CTRL positive): Acute intraperitoneal Donepezil on test days AND icv AβO injection (n = 12).

[00178] Como, no máximo, 24 camundongos puderam receber injeção icv por dia, o estudo foi realizado em seis conduções independentes.[00178] As a maximum of 24 mice could receive icv injection per day, the study was carried out in six independent conducts.

Dois camundongos de todos os grupos foram incluídos em cada condução.Two mice from all groups were included in each conduction.

[00179] Procedimentos experimentais:[00179] Experimental procedures:

[00180] Abrigo de animais:[00180] Animal Shelter:

[00181] Recebimento de 144 camundongos machos C57BI6/J (da Janvier, França) (três meses de idade). Quando recebidos, os animais foram colocados em quarentena por um período de sete dias ou mais.[00181] Receipt of 144 C57BI6/J male mice (from Janvier, France) (three months of age). When received, animals were quarantined for a period of seven days or more.

[00182] Os camundongos foram abrigados sob temperatura padrão (22 ± 2 °C) e em ambiente com luz e umidade controladas (luzes ligadas das 8 às 20 horas; umidade de 55 ± 10%) com acesso a alimento e água à vontade.[00182] The mice were housed at standard temperature (22 ± 2 °C) and in an environment with controlled light and humidity (lights on from 8 am to 8 pm; humidity of 55 ± 10%) with access to food and water at will.

Os camundongos foram abrigados em grupo e monitorados duas vezes por dia por funcionários de laboratório (às 8 e 16 horas). No caso de dois ou mais problemas significativos na situação geral de saúde, o camundongo afetado foi sacrificado. As definições de situação de saúde inaceitável são as seguintes: ausência de movimentos espontâneos e incapacidade de beber ou alimentar-se durante um período de observação de 24 horas, perda de peso de mais de 12%, sangramento massivo, inflamação espontânea (observações gerais da pele e dos olhos do camundongo) ou perda de anatomia.The mice were group-housed and monitored twice a day by laboratory workers (8am and 4pm). In the case of two or more significant problems in the overall health situation, the affected mouse was euthanized. The definitions of unacceptable health status are as follows: absence of spontaneous movement and inability to drink or eat during a 24-hour observation period, weight loss of more than 12%, massive bleeding, spontaneous inflammation (general observations of mouse skin and eyes) or loss of anatomy.

[00183] Ao longo de todo o procedimento, os camundongos foram pesados por três vezes (ou seja, antes do tratamento e nos dias +8 e +17).[00183] Throughout the entire procedure, mice were weighed three times (ie, before treatment and on days +8 and +17).

[00184] Armazenagem, formulação e dosagem do composto:[00184] Storage, formulation and dosage of the compound:

[00185] Para dosagem por via oral, Donecoprida e Flucoprida foram formuladas por meio de solubilização em NaCl a 0,9%. A dosagem do composto (volume total de 200 µl) foi iniciada um dia antes da indução da doença (por meio de injeção icv de AβO) e realizada por 19 dias consecutivos.[00185] For oral dosing, Donecopride and Flucopride were formulated through solubilization in 0.9% NaCl. Compound dosing (total volume 200 µl) was started one day before disease induction (via icv AβO injection) and performed for 19 consecutive days.

[00186] Injeção estereotáxica:[00186] Stereotactic injection:

[00187] Injeção intracerebroventricular isolada de 144 camundongos com veículo ou AβO (máx. 24 camundongos por dia, todos os camundongos foram aleatorizados): sob anestesia (injeção ip de uma mistura de cetamina/xilasina em dose de 110 e 15 mg/kg, respectivamente), AβO (1 µl) ou veículo (1 µl) foram injetados no ventrículo lateral direito. Foram realizadas injeções utilizando microsseringas Hamilton de 10 µl equipadas com uma agulha de 26 gauge. O procedimento foi encerrado por meio de injeção subcutânea de metacam (analgesia) em dose de 5 mg/kg. Os animais foram colocados individualmente em seguida na sua gaiola de abrigo e a gaiola foi colocada em um gabinete aquecido até que o animal se recupere totalmente. Os animais foram monitorados cuidadosamente para controlar a recuperação após a anestesia.[00187] Isolated intracerebroventricular injection of 144 mice with vehicle or AβO (max. 24 mice per day, all mice were randomized): under anesthesia (ip injection of a mixture of ketamine/xylasine at a dose of 110 and 15 mg/kg, respectively), AβO (1 µl) or vehicle (1 µl) were injected into the right lateral ventricle. Injections were performed using 10 µl Hamilton microsyringes equipped with a 26-gauge needle. The procedure was completed with a subcutaneous injection of metacam (analgesia) at a dose of 5 mg/kg. The animals were then placed individually in their home cage and the cage was placed in a heated cabinet until the animal fully recovered. Animals were carefully monitored to monitor recovery after anesthesia.

[00188] Preparação de AβO: Aβ 1-42 foi obtido por meio da Bachem (ref. H1368) (número do lote: 1052301). A preparação de oligômeros Aβ 1-42 estáveis foi realizada conforme descrito em Garcia et al (2010), J.[00188] Preparation of AβO: Aβ 1-42 was obtained from Bachem (ref. H1368) (batch number: 1052301). The preparation of stable Aβ 1-42 oligomers was performed as described in Garcia et al (2010), J.

Neurosci. 30: 7516-7527. A preparação oligomérica (identificada como Lote n° 2016-14) continha uma mistura de trímeros e tetrâmeros estáveis de Aβ 1-42, bem como formas monoméricas do peptídeo. Todas as preparações oligoméricas utilizadas foram caracterizadas anteriormente em termos de composição de oligômeros e neurotoxicidade in vitro.Neurosci. 30: 7516-7527. The oligomeric preparation (identified as Lot No. 2016-14) contained a mixture of stable Aβ 1-42 trimers and tetramers, as well as monomeric forms of the peptide. All oligomeric preparations used have been previously characterized in terms of oligomer composition and in vitro neurotoxicity.

[00189] Teste de cognição, teste de labirinto Y:[00189] Cognition test, Y-maze test:

[00190] Seis testes independentes que envolvem 24 camundongos cada um (ou seja, 2 camundongos de cada grupo experimental) para um total de 144 camundongos no dia +4 – testes de comportamento foram realizados uma hora após a dosagem.[00190] Six independent tests involving 24 mice each (ie 2 mice from each experimental group) for a total of 144 mice on day +4 - behavioral tests were performed one hour after dosing.

[00191] Este teste determina memória de trabalho espacial que é mediada principalmente pelo córtex pré-frontal (memória de trabalho) e pelo hipocampo (componente espacial). Vide Yoon et al (2008), Learn Mem. 15: 97- 105 e Spellman et al (2015), Nature 522: 309-314 para os componentes diferentes.[00191] This test determines spatial working memory that is mediated mainly by the prefrontal cortex (working memory) and by the hippocampus (spatial component). See Yoon et al (2008), Learn Mem. 15: 97-105 and Spellman et al (2015), Nature 522: 309-314 for the different components.

[00192] O córtex pré-frontal media a memória de trabalho em roedores, primatas e seres humanos.[00192] The prefrontal cortex mediates working memory in rodents, primates and humans.

[00193] A medição do comportamento alternante espontâneo vem sendo amplamente utilizada por farmacologistas comportamentais para determinar a memória de trabalho espacial, um componente da memória de curto prazo. Na sua forma mais simples, o comportamento alternante espontâneo compreende a tendência dos camundongos de alternar sua seleção de braços convencional não reforçada em oportunidades sucessivas.[00193] The measurement of spontaneous alternating behavior has been widely used by behavioral pharmacologists to determine spatial working memory, a component of short-term memory. In its simplest form, spontaneous alternating behavior comprises the tendency of mice to alternate their unreinforced conventional arm selection on successive opportunities.

[00194] Este teste foi implementado com sucesso utilizando infusão icv de AβO para induzir déficits cognitivos (Garcia et al (2010), J.[00194] This test has been successfully implemented using icv infusion of AβO to induce cognitive deficits (Garcia et al (2010), J.

Neurosci. 30: 7516-7527).Neurosci. 30: 7516-7527).

[00195] Protocolo detalhado: o desempenho de memória de trabalho espacial imediato foi determinado por meio do registro de comportamento de alternância espontâneo em um labirinto em Y. O labirinto é feito de Plexiglas opaco e cada um dos três braços possui 40 cm de comprimento, 14 cm de altura, 10 cm de altura e é posicionado em ângulos iguais. O aparelho é colocado em uma sala de teste com iluminação homogênea para obter 12-15 lux em todos os braços e também na zona central. Os camundongos são colocados no meio de um braço e mantidos para explorar livremente o labirinto durante uma sessão de cinco minutos. A série de entradas de braços é gravada em vídeo (software Smart v3.0, Bioseb) e uma entrada de braço é considerada completa quando as patas traseiras do camundongo forem colocadas completamente no braço. A alternância é definida como entradas sucessivas nos três braços sobre conjuntos triplos sobrepostos. O percentual de alternância é calculado como a razão entre o total de alternâncias reais e alternâncias possíveis, definidas como o número de entradas de braços menos 2, multiplicado por 100. A atividade locomotora também é registrada e avaliada durante essa fase (por exemplo, índice motivacional) por meio de monitoramento da velocidade média e da distância total.[00195] Detailed protocol: immediate spatial working memory performance was determined by recording spontaneous alternating behavior in a Y-maze. The maze is made of opaque Plexiglas and each of the three arms is 40 cm long, 14 cm tall, 10 cm tall and is positioned at equal angles. The device is placed in a test room with homogeneous lighting to obtain 12-15 lux in all arms and also in the central zone. Mice are placed in the middle of one arm and kept to freely explore the maze for a five-minute session. The series of arm entries is video-recorded (Smart v3.0 software, Bioseb) and an arm entry is considered complete when the mouse's hind legs are placed completely on the arm. Alternation is defined as successive inputs on the three arms over overlapping triple sets. The alternation percentage is calculated as the ratio of the total actual alternations to possible alternations, defined as the number of arms entries minus 2, multiplied by 100. Locomotor activity is also recorded and evaluated during this phase (eg, index motivational) through monitoring the average speed and the total distance.

[00196] Análise de dados: utiliza-se software de computador Graphpad/Prism para as análises estatísticas. Foi conduzida análise não paramétrica da variação (teste de Kruskal Wallis), seguida por testes U de Mann- Whitney não paramétricos para comparação entre os grupos. Valores p < 0,05 são considerados estatisticamente significativos. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão.[00196] Data analysis: Graphpad/Prism computer software is used for statistical analyses. Non-parametric analysis of variation (Kruskal Wallis test) was conducted, followed by non-parametric Mann-Whitney U tests for comparison between groups. p values < 0.05 are considered statistically significant. Data are presented as mean ± standard deviation.

[00197] Teste de cognição, teste NOR:[00197] Cognition test, NOR test:

[00198] Seis testes independentes que envolvem 24 camundongos cada um (ou seja, 2 camundongos de cada grupo experimental) para um total de 144 camundongos no dia +4 – testes de comportamento foram realizados uma hora após a dosagem.[00198] Six independent tests involving 24 mice each (ie 2 mice from each experimental group) for a total of 144 mice on day +4 - behavioral tests were performed one hour after dosing.

[00199] Este teste determina memória de reconhecimento para os itens e seu equivalente humano é a comparação visual em pares (VPC) (Wallace et al, (2015), Handb. Exp. Pharmacol. 228: 27-57). O reconhecimento do objeto é mediado pelo córtex perirrinal em roedores (Albasser et al (2009), Behav.[00199] This test determines recognition memory for items and its human equivalent is visual pair comparison (VPC) (Wallace et al, (2015), Handb. Exp. Pharmacol. 228: 27-57). Object recognition is mediated by the peririnal cortex in rodents (Albasser et al (2009), Behav.

Neurosci. 123: 115-124), primatas (Zeamer et al (2015), Dev. Cogn. Neurosci.Neurosci. 123: 115-124), primates (Zeamer et al (2015), Dev. Cogn. Neurosci.

11: 31-41) e seres humanos (Watson & Lee (2013), J. Neurosci. 33: 4192-4200).11: 31-41) and humans (Watson & Lee (2013), J. Neurosci. 33: 4192-4200).

[00200] Demonstrou-se anteriormente que injeção intracerebroventricular de AβO em camundongos gera impedimento da tarefa de[00200] It has been previously shown that intracerebroventricular injection of AβO in mice causes impairment of the task of

Reconhecimento de Objetos Novos, é reversível com o inibidor acetilcolina esterase donepezil e exibiu efeito protetor com seres humanos em um peptídeo derivado de mitocôndrias citoprotetor e neuroprotetor.New Object Recognition, it is reversible with the acetylcholine esterase inhibitor donepezil and exhibited a protective effect with humans on a cytoprotective and neuroprotective mitochondrial-derived peptide.

[00201] Protocolo detalhado: um dia antes do teste cognitivo (ou seja, no dia +15), camundongos são habituados durante um teste de dez minutos, durante o qual são colocados em campo aberto vazio. No dia do teste cognitivo (ou seja, dia +16), os animais são colocados no mesmo campo aberto e mantidos para explorar livremente dois objetos idênticos por um teste de cinco minutos (teste de obtenção). Os animais são devolvidos em seguida para a sua gaiola de abrigo por um intervalo entre os testes de cinco minutos. Durante o teste de retenção, permite-se que os animais explorem dois objetos diferentes: um objeto familiar e um novo. Durante esse período, o experimentador, cego para o tratamento, registra o tempo em que o camundongo está explorando ativamente cada objeto. Todos os testes são gravados em vídeo (software Smart v3.0, Bioseb). É gerado em seguida um índice de discriminação: índice de discriminação = (tempo de exploração de objeto novo – tempo de exploração de objeto familiar) / tempo total de exploração.[00201] Detailed protocol: one day before the cognitive test (ie on day +15), mice are habituated during a ten minute test, during which they are placed in an empty open field. On the day of the cognitive test (ie, day +16), animals are placed in the same open field and kept to freely explore two identical objects for a five-minute test (gain test). The animals are then returned to their home cage for a five-minute interval between tests. During the retention test, animals are allowed to explore two different objects: a familiar object and a new one. During this period, the experimenter, blind to the treatment, records the time the mouse is actively exploring each object. All tests are recorded on video (Smart v3.0 software, Bioseb). A discrimination index is then generated: discrimination index = (exploration time of new object – familiar object exploration time) / total exploration time.

[00202] Análise de dados: utiliza-se software de computador Graphpad/Prism para as análises estatísticas. Foi conduzida análise não paramétrica da variação (teste de Kruskal Wallis), seguida por testes U de Mann- Whitney não paramétricos para comparação entre os grupos. Valores p < 0,05 são considerados estatisticamente significativos. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão.[00202] Data analysis: Graphpad/Prism computer software is used for statistical analyses. Non-parametric analysis of variation (Kruskal Wallis test) was conducted, followed by non-parametric Mann-Whitney U tests for comparison between groups. p values < 0.05 are considered statistically significant. Data are presented as mean ± standard deviation.

[00203] Teste de cognição, teste MWM:[00203] Cognition test, MWM test:

[00204] Seis testes independentes que envolvem 24 camundongos cada um (ou seja, 2 camundongos de cada grupo experimental) para um total de 144 camundongos no dia +4.[00204] Six independent tests involving 24 mice each (ie 2 mice from each experimental group) for a total of 144 mice at day +4.

[00205] A memória de referência espacial é um processo que testa a capacidade de lembrar as indicações espaciais para identificar um local. Ela é mediada pelo hipocampo em roedores (Broadbent et al (2006), Learn Mem. 13: 187-191) e em seres humanos (Bartsch et al (2010), Science 328: 1412-1415), utilizando uma tarefa de labirinto de água virtual. Este teste também envolve um componente de aprendizado.[00205] Spatial reference memory is a process that tests the ability to remember spatial indications to identify a location. It is mediated by the hippocampus in rodents (Broadbent et al (2006), Learn Mem. 13: 187-191) and in humans (Bartsch et al (2010), Science 328: 1412-1415) using a maze task. virtual water. This test also involves a learning component.

[00206] Injeção icv de AβO em camundongos induz déficit de memória de referência espacial no Labirinto de Água Morris (Garcia et al (2010), J. Neurosci. 30: 7516-7527).[00206] Icv injection of AβO in mice induces spatial reference memory deficit in the Morris Water Maze (Garcia et al (2010), J. Neurosci. 30: 7516-7527).

[00207] Protocolo detalhado: testes de habituação (plataforma visível) – o labirinto de água Morris (MWM) foi realizado conforme descrito em Garcia et al (2010), J. Neurosci. 30: 7516-7527. O aparelho experimental consiste em um tanque de água circular (diâmetro = 100 cm; altura = 50 cm) contendo água a 21 °C até profundidade de 25 cm e tornado opaco para bloquear a visão para além da superfície da água por meio da adição de uma emulsão acrílica aquosa. Uma plataforma (diâmetro = 10 cm) é utilizada e colocada no ponto intermediário de um quadrante. A piscina está localizada em uma sala de teste, iluminada homogeneamente a 100 lux. O trajeto de nado dos animais é registrado utilizando um sistema de rastreamento por vídeo. Os camundongos são trazidos para a sala experimental pelo menos 30 minutos antes do teste, para permitir aclimatação às condições da sala experimental. Navegação para uma plataforma visível é conduzida antes da navegação no lugar, para avaliar as capacidades visuais e motoras de todos os camundongos. Os camundongos são submetidos a quatro testes de 60 s por dia (durante dois dias consecutivos), com intervalo entre os testes de pelo menos uma hora. Depois de encontrarem a plataforma, os camundongos são mantidos sobre a plataforma por um tempo adicional de 30 s. Não há indicações adicionais na sala. A posição na plataforma e os pontos iniciais são distribuídos aleatoriamente ao longo de todos os quatro quadrantes da piscina. Os camundongos que não conseguirem encontrar a plataforma após 60 segundos são orientados para a sua localização e colocados sobre a plataforma por 30 segundos.[00207] Detailed protocol: habituation tests (visible platform) – the Morris water maze (MWM) was performed as described in Garcia et al (2010), J. Neurosci. 30: 7516-7527. The experimental apparatus consists of a circular water tank (diameter = 100 cm; height = 50 cm) containing water at 21 °C to a depth of 25 cm and made opaque to block vision beyond the water surface by adding an aqueous acrylic emulsion. A platform (diameter = 10 cm) is used and placed at the midpoint of a quadrant. The pool is located in a test room, evenly lit at 100 lux. The animals' swim path is recorded using a video tracking system. Mice are brought into the experimental room at least 30 minutes before testing to allow for acclimatization to experimental room conditions. Navigation to a visible platform is conducted prior to navigation in place, to assess the visual and motor skills of all mice. The mice are submitted to four tests of 60 s per day (for two consecutive days), with an interval between tests of at least one hour. After finding the platform, the mice are kept on the platform for an additional 30 s. There are no additional directions in the room. Platform position and starting points are randomly distributed across all four quadrants of the pool. Mice that cannot find the platform after 60 seconds are guided to their location and placed on the platform for 30 seconds.

[00208] Testes de obtenção de memória (testes de aprendizado com plataforma oculta) são realizados durante cinco dias consecutivos e utilizados para atingir estado estável de latência de escape. Os camundongos são trazidos para a sala experimental por pelo menos 30 minutos antes do teste, para permitir aclimatação às condições da sala experimental. A plataforma oculta é submersa a 1 cm abaixo da superfície da água e colocada no ponto intermediário de um quadrante. A piscina está localizada em uma sala de teste iluminada homogeneamente a 100 lux, contendo diversas orientações visuais proeminentes. Os trajetos de nado, distância de nado, velocidade de nado e tigmotaxia são registrados utilizando-se um sistema de rastreamento por vídeo.[00208] Memory acquisition tests (hidden platform learning tests) are performed for five consecutive days and used to achieve steady state escape latency. Mice are brought into the experimental room for at least 30 minutes before testing to allow for acclimatization to experimental room conditions. The hidden platform is submerged 1 cm below the water surface and placed at the midpoint of a quadrant. The pool is located in a test room, homogeneously lit at 100 lux, containing several prominent visual guidelines. The swimming paths, swimming distance, swimming speed and tigmotaxis are recorded using a video tracking system.

Os camundongos são submetidos a quatro testes de 60 s por dia, com intervalo entre os testes de pelo menos uma hora. Os camundongos são mantidos em nado livre por 60 segundos, isolados por 30 s adicionais sobre a plataforma oculta e devolvidos em seguida para a sua gaiola de abrigo durante o intervalo entre os testes. As posições iniciais (definidas na borda dos quadrantes) são selecionadas aleatoriamente para cada animal. Em cada teste, o tempo necessário para escapar para a plataforma oculta é registrado. Os camundongos que não conseguem encontrar a plataforma após 60 s são orientados e colocados sobre a plataforma por 30 s, antes de serem devolvidos para a sua gaiola de abrigo.The mice are submitted to four tests of 60 s per day, with an interval between tests of at least one hour. The mice are kept free-swimming for 60 seconds, isolated for an additional 30 s on the hidden platform, and then returned to their home cage during the interval between tests. The starting positions (defined at the edge of the quadrants) are randomly selected for each animal. In each test, the time taken to escape to the hidden platform is recorded. Mice that cannot find the platform after 60 s are oriented and placed on the platform for 30 s, before being returned to their home cage.

[00209] Testes de retenção de memória (testes de sonda, sem plataforma): são realizados dois dias após a última sessão de treinamento. Os camundongos são novamente aclimatados para a sala experimental por pelo menos 30 minutos antes do teste. A plataforma é removida e cada animal é mantido em nado livre por 60 segundos. Durante o teste, o tempo passado no quadrante alvo, o tempo passado no quadrante oposto e os cruzamentos sobre o local anterior da plataforma são medidos e monitorados por meio de rastreamento por vídeo.[00209] Memory retention tests (probe tests, without platform): are performed two days after the last training session. The mice are again acclimated to the experimental room for at least 30 minutes before testing. The platform is removed and each animal is kept freestyle for 60 seconds. During testing, time spent in the target quadrant, time spent in the opposite quadrant, and crossings over the previous platform location are measured and monitored using video tracking.

[00210] Análise de dados: utiliza-se software de computador Graphpad/Prism para as análises estatísticas. Foi conduzida análise não paramétrica da variação (teste de Kruskal Wallis), seguida por testes U de Mann- Whitney não paramétricos para comparação entre os grupos. Valores p < 0,05 são considerados estatisticamente significativos. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão.[00210] Data analysis: Graphpad/Prism computer software is used for statistical analyses. Non-parametric analysis of variation (Kruskal Wallis test) was conducted, followed by non-parametric Mann-Whitney U tests for comparison between groups. p values < 0.05 are considered statistically significant. Data are presented as mean ± standard deviation.

[00211] Amostragem de tecidos:[00211] Tissue sampling:

[00212] Os camundongos foram sacrificados no dia +17.[00212] The mice were sacrificed on day +17.

[00213] Coleta de amostras de sangue: mediante anestesia, os camundongos são sangrados. Cerca de 600 µl de sangue integral foram retirados da veia cava com uma seringa de 1 ml. O sangue foi coletado em tubos BD Microtainer K2E (ref. 365975) ou microtubos Sarstedt LiHe (ref.[00213] Collection of blood samples: under anesthesia, mice are bled. About 600 µl of whole blood was drawn from the vena cava with a 1 ml syringe. Blood was collected in BD Microtainer K2E tubes (ref. 365975) or Sarstedt LiHe microtubes (ref.

41.1503.005). Os tubos foram suavemente invertidos e as amostras foram colocadas sobre gelo. Microrrecipientes foram centrifugados por 5 minutos a 4 °C, 8600 g. Cerca de 250 µl de plasma foram transferidos em tubos Eppendorf e congelados a -80 °C para análises adicionais.41,1503,005). Tubes were gently inverted and samples placed on ice. Microcontainers were centrifuged for 5 minutes at 4 °C, 8600 g. About 250 µl of plasma was transferred into Eppendorf tubes and frozen at -80 °C for further analysis.

[00214] Coleta de amostras de sangue: após a coleta de sangue, os camundongos sofreram perfusão flash intracardíaca com solução salina a 0,9%. O cérebro inteiro foi removido e os hemisférios foram separados. O hemisfério esquerdo contralateral foi congelado subitamente em nitrogênio líquido e armazenado a -80 °C para análise adicional (ou seja, exposição de composto). O hemisfério direito ipsilateral foi utilizado para isolar o hipocampo, córtex pré-frontal e o córtex. Todas as estruturas do cérebro foram isoladas sobre suporte resfriado e congeladas subitamente em nitrogênio líquido.[00214] Collection of blood samples: after blood collection, mice underwent intracardiac flash perfusion with 0.9% saline solution. The entire brain was removed and the hemispheres separated. The contralateral left hemisphere was snap frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C for further analysis (ie, compound exposure). The ipsilateral right hemisphere was used to isolate the hippocampus, prefrontal cortex and cortex. All brain structures were isolated on cooled support and snap frozen in liquid nitrogen.

[00215] Resultados:[00215] Results:

[00216] Efeitos dos compostos de acordo com a presente invenção sobre a memória de trabalho espacial:[00216] Effects of compounds according to the present invention on spatial working memory:

[00217] Para determinar o efeito de Donecoprida e Flucoprida sobre a memória de trabalho espacial de camundongos, foi realizado um teste de labirinto em Y quatro dias após a injeção icv de veículo ou AβO. Durante os cinco minutos do teste, permitiu-se que os animais explorassem o dispositivo de labirinto em Y e o comportamento de alternância foi avaliado conforme descrito nos Procedimentos Experimentais.[00217] To determine the effect of Donecopride and Flucopride on the spatial working memory of mice, a Y-maze test was performed four days after icv injection of vehicle or AβO. During the five minutes of the test, the animals were allowed to explore the Y-maze device and the alternation behavior was evaluated as described in the Experimental Procedures.

[00218] Camundongos do grupo controle veículo (Grupo A) exibiram comportamento normal na exploração do labirinto em Y com comportamento de alternância de 68,0 ± 3,0%. Estes resultados estão de acordo com observações anteriores de grupos controle similares (vide Garcia et al (2010), J. Neurosci. 30: 7516-7527).[00218] Mice from the vehicle control group (Group A) exhibited normal behavior in the exploration of the Y-maze with alternating behavior of 68.0 ± 3.0%. These results are in agreement with previous observations from similar control groups (see Garcia et al (2010), J. Neurosci. 30: 7516-7527).

[00219] Conforme o esperado, uma única injeção icv de AβO (Grupo B) resultou em impedimento significativo (p = 0,0026) dos desempenhos cognitivos no teste de labirinto em Y em comparação com camundongos controle veículos, com apenas 54,0 ± 2,0% alternâncias.[00219] As expected, a single icv injection of AβO (Group B) resulted in significant impairment (p = 0.0026) of cognitive performances in the Y-maze test compared to vehicle control mice, with only 54.0 ± 2.0% alternations.

[00220] Camundongos controle positivos, que receberam Donepezil por via oral e injeção icv de AβO (Grupo C) não puderam ser distinguidos de camundongos controle (comportamento de alternância de 66,1 ± 1,8%) e eram estatisticamente diferentes (p = 0,0011) de camundongos que receberam injeção de AβO. Camundongos controle positivos, que receberam dose ip (aguda) de donepezil e injeção icv de AβO (Grupo L) foram estatisticamente diferentes dos camundongos controle (p = 0,0278; comportamento de alternância de 60,8 ± 1,9%) e também estatisticamente diferentes (p = 0,0421) de camundongos com injeção de AβO.[00220] Positive control mice, which received Donepezil orally and icv injection of AβO (Group C) could not be distinguished from control mice (66.1 ± 1.8%) and were statistically different (p = 0.0011) from mice that received AβO injection. Positive control mice, which received ip (acute) dose of donepezil and icv injection of AβO (Group L) were statistically different from control mice (p = 0.0278; alternation behavior of 60.8 ± 1.9%) and also statistically different (p = 0.0421) from mice with AβO injection.

[00221] Camundongos que receberam dose de Donecoprida (9 mg/kg/dia) e injeção de icv com veículo (Grupo D) exibiram comportamento de alternância de 59,3 ± 4,0%, não diferente de camundongos controle (p = 0,2640)[00221] Mice that received a dose of Donecopride (9 mg/kg/day) and injection of icv with vehicle (Group D) exhibited alternation behavior of 59.3 ± 4.0%, not different from control mice (p = 0 .2640)

e não diferentes de camundongos que receberam injeção de AβO (p = 0,5371).and not different from mice that received AβO injection (p = 0.5371).

[00222] Camundongos que receberam dose de Flucoprida (9 mg/kg/dia) e injeção de icv com veículo (Grupo E) exibiram comportamento de alternância de 63,1 ± 2,3%, não diferente de camundongos controle (p = 0,1166) e diferentes de camundongos que receberam injeção de AβO (p = 0,0111).[00222] Mice that received a dose of Flucopride (9 mg/kg/day) and injection of icv with vehicle (Group E) exhibited alternating behavior of 63.1 ± 2.3%, not different from control mice (p = 0 .1166) and different from mice that received AβO injection (p = 0.0111).

[00223] Os camundongos receberam doses crescentes de Donecoprida (1, 3 e 9 mg/kg/dia) e injeção icv de AβO (Grupos F, G e H, respectivamente). Em dose de 3 mg/kg/dia, Donecoprida inibiu o enfraquecimento induzido por AβO da memória de trabalho espacial. De fato, camundongos do Grupo G exibiram comportamento de alternância de 65,5 ± 4,4%, não diferente de camundongos controle (p = 0,5543) e diferente de camundongos que receberam injeção de AβO (p = 0,0137). Em dose de 1 mg/kg/dia, Donecoprida não apresentou efeito sobre o enfraquecimento induzido por AβO de memória de trabalho espacial, pois esses camundongos exibiram comportamento de alternância de 56,6 ± 3,7%, diferente de camundongos controle (p = 0,0488) e não diferente de camundongos que receberam injeção de AβO (p = 0,6859). Devido à heterogeneidade mais alta, camundongos do Grupo H (que receberam dose de Donecoprida de 9 mg/kg/dia) exibiram fenótipo intermediário com comportamento de alternância de 64,3 ± 5,1%, não diferente de camundongos controle (p = 0,5994) e também não diferente de camundongos que receberam injeção de AβO (p = 0,1316).[00223] The mice received increasing doses of Donecopride (1, 3 and 9 mg/kg/day) and icv injection of AβO (Groups F, G and H, respectively). At a dose of 3 mg/kg/day, Donecopride inhibited the AβO-induced impairment of spatial working memory. In fact, Group G mice exhibited alternating behavior of 65.5 ± 4.4%, not different from control mice (p = 0.5543) and different from mice that received AβO injection (p = 0.0137). At a dose of 1 mg/kg/day, Donecopride had no effect on AβO-induced impairment of spatial working memory, as these mice exhibited alternating behavior of 56.6 ± 3.7%, different from control mice (p = 0.0488) and not different from mice that received AβO injection (p = 0.6859). Due to the higher heterogeneity, mice in Group H (which received a dose of 9 mg/kg/day of Donecopride) exhibited an intermediate phenotype with an alternating behavior of 64.3 ± 5.1%, not different from control mice (p = 0 .5994) and also not different from mice that received AβO injection (p = 0.1316).

[00224] Os camundongos receberam doses crescentes de Flucoprida (1, 3 e 9 mg/kg/dia) e injeção icv de AβO (Grupos I, J e K, respectivamente). Em doses de 1 e 3 mg/kg/dia, Flucoprida inibiu o enfraquecimento induzido por AβO da memória de trabalho espacial. De fato, camundongos dos Grupos I e J exibiram comportamento de alternância de 67,1 ± 2,7% e 65,3 ± 4,1%, respectivamente, não diferente de camundongos controle (p = 0,9754 e p = 0,6936 para os grupos I e J, respectivamente) e diferentes de camundongos que receberam injeção de AβO (p = 0,0029 e p = 0,0454, para os grupos I e J, respectivamente). Por outro lado, em dose de 9 mg/kg/dia, Flucoprida deixou de proteger os camundongos contra o enfraquecimento induzido por AβO da memória de trabalho espacial. De fato, os camundongos do Grupo K exibiram comportamento de alternância de 59,1 ± 3,0%, diferente de camundongos controle (p = 0,0290), mas não diferente de camundongos que receberam injeção de AβO (p = 0,2346).[00224] The mice received increasing doses of Flucopride (1, 3 and 9 mg/kg/day) and icv injection of AβO (Groups I, J and K, respectively). At doses of 1 and 3 mg/kg/day, Flucopride inhibited the AβO-induced impairment of spatial working memory. In fact, mice from Groups I and J exhibited alternating behavior of 67.1 ± 2.7% and 65.3 ± 4.1%, respectively, not different from control mice (p = 0.9754 and p = 0.6936 for groups I and J, respectively) and different from mice that received AβO injection (p = 0.0029 and p = 0.0454, for groups I and J, respectively). On the other hand, at a dose of 9 mg/kg/day, Flucopride failed to protect mice against AβO-induced impairment of spatial working memory. In fact, Group K mice exhibited alternating behavior of 59.1 ± 3.0%, different from control mice (p = 0.0290), but not different from mice that received AβO injection (p = 0.2346 ).

[00225] Efeitos dos compostos de acordo com a presente invenção sobre as capacidades de aprendizado e memória de longo prazo:[00225] Effects of compounds according to the present invention on learning and long-term memory abilities:

[00226] Para determinar os efeitos dos compostos de acordo com a presente invenção sobre as capacidades de aprendizado e memória de longo prazo, foi realizado um teste MWM do dia +3 até o dia +14 após injeção icv de veículo ou AβO.[00226] To determine the effects of the compounds according to the present invention on the abilities of learning and long-term memory, a MWM test was performed from day +3 to day +14 after icv injection of vehicle or AβO.

TESTES DE HABITUAÇÃO:HABITATION TESTS:

[00227] Em primeira etapa (testes de habituação realizados nos Dias +3 e +4 após infusão icv de veículo ou AβO), os camundongos foram treinados para escapar da água para uma plataforma visível na ausência de outras indicações visuais. Durante esses testes, a latência de escape, distância de nado e velocidade de nado foram registradas. Não houve diferença significativa entre os grupos em latência de escape. Não foi detectada diferença da velocidade de nado ou distância de nado.[00227] In the first stage (habituation tests performed on Days +3 and +4 after icv infusion of vehicle or AβO), mice were trained to escape the water to a visible platform in the absence of other visual indications. During these tests, escape latency, swim distance and swim speed were recorded. There was no significant difference between groups in escape latency. No difference in swimming speed or swimming distance was detected.

[00228] Em conjunto, esses dados sugerem que o tratamento não afetou a capacidade física, nem a motivação dos camundongos de escapar da água.[00228] Taken together, these data suggest that the treatment did not affect the physical ability or motivation of the mice to escape the water.

TESTES DE APRENDIZADO:LEARNING TESTS:

[00229] As capacidades de aprendizado dos camundongos foram monitoradas durante cinco dias consecutivos (do dia +7 até o dia +11 após infusão icv de veículo ou AβO). Os animais realizaram quatro testes por dia e foram treinados para localizar uma plataforma oculta utilizando indicações visuais. Durante esses testes de aprendizado, a latência de escape, distância de nado e velocidade de nado foram registradas.[00229] The learning abilities of the mice were monitored for five consecutive days (from day +7 to day +11 after icv infusion of vehicle or AβO). Animals performed four tests per day and were trained to locate a hidden platform using visual cues. During these learning tests, escape latency, swim distance and swim speed were recorded.

[00230] Não houve diferença estatisticamente significativa da latência de escape média entre os grupos no início dos testes. Todos os grupos pareceram então exibir algum grau de aprendizado.[00230] There was no statistically significant difference in mean escape latency between groups at baseline. All groups then seemed to exhibit some degree of learning.

[00231] Os camundongos do grupo controle veículo (Grupo A) aprenderam eficientemente a localização da plataforma e, após cinco dias de treinamento (dia 5), exibiram latência de escape média de 11,7 ± 1,5 s (p = 0,00031 em comparação com o dia 1). Por outro lado, os camundongos que receberam injeção de AβO (grupo B) exibiram comportamento enfraquecido, o que resulta em latência de escape média de 17,3 ± 2,0 s após cinco dias de treinamento (p = 0,4537, não diferente do dia 1, e p = 0,00293, significativamente diferente de camundongos controle).[00231] The mice in the vehicle control group (Group A) efficiently learned the location of the platform and, after five days of training (day 5), exhibited a mean escape latency of 11.7 ± 1.5 s (p = 0, 00031 compared to day 1). On the other hand, mice that received AβO injection (group B) exhibited weakened behavior, which results in a mean escape latency of 17.3 ± 2.0 s after five days of training (p = 0.4537, not different from day 1, and p = 0.00293, significantly different from control mice).

[00232] Camundongos que receberam dose subcrônica de donepezil (via oral) e injeção icv de AβO (Grupo C) aprenderam eficientemente a localização da plataforma. Após cinco dias de treinamento (dia 5), eles exibiram latência de escape média de 14,7 ± 1,9 s (p = 0,09593 em comparação com o dia 1). No dia 5, seus desempenhos não foram diferentes de camundongos controle (p = 0,2188) e não foram diferentes de camundongos que receberam injeção de AβO (p = 0,3477).[00232] Mice that received subchronic dose of donepezil (orally) and icv injection of AβO (Group C) efficiently learned the location of the platform. After five days of training (day 5), they exhibited a mean escape latency of 14.7 ± 1.9 s (p = 0.09593 compared to day 1). On day 5, their performance was no different from control mice (p = 0.2188) and not different from mice that received AβO injection (p = 0.3477).

[00233] Camundongos que receberam dose precisa (no dia do teste) de donepezil (intraperitoneal) e injeção icv de AβO (Grupo L) aprenderam eficientemente a localização da plataforma. Após cinco dias de treinamento (dia 5), eles exibiram latência de escape média de 13,4 ± 1,5 s (p = 0,01573 em comparação com o dia 1). No dia 5, seus desempenhos não foram diferentes de camundongos controle (p = 0,4187) e não foram diferentes de camundongos que receberam injeção de AβO (p = 0,1272).[00233] Mice that received precise dose (on test day) of donepezil (intraperitoneal) and icv injection of AβO (Group L) efficiently learned the location of the platform. After five days of training (day 5), they exhibited a mean escape latency of 13.4 ± 1.5 s (p = 0.01573 compared to day 1). On day 5, their performance was no different from control mice (p = 0.4187) and no different from mice that received AβO injection (p = 0.1272).

[00234] Camundongos que receberam dose de Donecoprida (9 mg/kg/dia) ou Flucoprida (9 mg/kg/dia) e injeção de icv com veículo (Grupos D e E, respectivamente) exibiram desempenhos cognitivos normais. Após cinco dias de treinamento (dia 5), camundongos que receberam dose de Donecoprida exibiram latência de escape média de 13,0 ± 1,7 s (p = 0,01778 em comparação com o dia 1). No dia 5, seus desempenhos não foram diferentes de camundongos controle (p = 0,5476) e não foram diferentes de camundongos que receberam injeção de AβO (p = 0,10731). Após cinco dias de treinamento (dia 5), camundongos que receberam dose de Flucoprida exibiram latência de escape média de 16,3 ± 2,0 s (p =0,04439 em comparação com o dia 1). No dia 5, seus desempenhos foram (por razões desconhecidas) diferentes de camundongos controle (p = 0,06709) e não foram diferentes de camundongos que receberam injeção de AβO (p = 0,7235). Merece observação que, no dia 4, Flucoprida exibiu latência de escape média de 14,2 ± 1,9 s, não diferente de camundongos controle (p = 0,7933) e não diferente de camundongos que receberam injeção de AβO (p = 0,1225).Mice that received a dose of Donecopride (9 mg/kg/day) or Flucopride (9 mg/kg/day) and vehicle icv injection (Groups D and E, respectively) exhibited normal cognitive performance. After five days of training (day 5), mice that received a dose of Donecopride exhibited a mean escape latency of 13.0 ± 1.7 s (p = 0.01778 compared to day 1). On day 5, their performance was no different from control mice (p = 0.5476) and not different from mice that received AβO injection (p = 0.10731). After five days of training (day 5), mice that were dosed with Flucopride exhibited a mean escape latency of 16.3 ± 2.0 s (p =0.04439 compared to day 1). On day 5, their performance was (for unknown reasons) different from control mice (p = 0.06709) and not different from mice that received AβO injection (p = 0.7235). It is noteworthy that, on day 4, Flucopride exhibited a mean escape latency of 14.2 ± 1.9 s, not different from control mice (p = 0.7933) and not different from mice that received AβO injection (p = 0 ,1225).

[00235] Os camundongos receberam doses crescentes de Donecoprida e injeção icv de AβO (Grupos F, G e H). A presença de Donecoprida (em dose de 3 mg/kg/dia) resultou em aumento das capacidades de aprendizado dos camundongos em comparação com camundongos que receberam injeção de AβO. De fato, os camundongos do grupo G exibiram latência de escape média de 12,7 ± 1,5 s (p = 0,02933 em comparação com o dia 1) após cinco dias de treinamento. Os seus desempenhos não foram diferentes de camundongos controle (p = 0,6284), mas foram diferentes de camundongos que receberam injeção de AβO (p = 0,07381).[00235] The mice received increasing doses of Donecopride and icv injection of AβO (Groups F, G and H). The presence of Donecopride (at a dose of 3 mg/kg/day) resulted in increased learning abilities of mice compared to mice that received AβO injection. In fact, mice in group G exhibited a mean escape latency of 12.7 ± 1.5 s (p = 0.02933 compared to day 1) after five days of training. Their performances were not different from control mice (p = 0.6284), but they were different from mice that received AβO injection (p = 0.07381).

[00236] Os camundongos receberam doses crescentes de Flucoprida e injeção icv de AβO (Grupos I, J e K). A presença de Flucoprida (em dose de 1 e 3 mg/kg/dia) resultou em aumento das capacidades de aprendizado dos camundongos em comparação com camundongos que receberam injeção de AβO, enquanto o composto em dose de 9 mg/kg/dia não apresentou efeito.[00236] The mice received increasing doses of Flucopride and icv injection of AβO (Groups I, J and K). The presence of Flucopride (at a dose of 1 and 3 mg/kg/day) resulted in an increase in the learning abilities of mice compared to mice that received AβO injection, while the compound at a dose of 9 mg/kg/day did not show It is made.

Os camundongos que receberam dose de Flucoprida de 1 mg/kg/dia exibiram latência de escape média de 13,1 ± 1,1 s (p = 0,03759 em comparação com o dia 1) após cinco dias de treinamento. Seus desempenhos não foram diferentes de camundongos controle (p = 0,4367), mas foram diferentes de camundongos que receberam injeção de AβO (p = 0,07422). De forma similar, camundongos que receberam dose de Flucoprida a 3 mg/kg/dia exibiram latência de escape média de 12,5 ± 1,1 s (p = 0,00146 em comparação com o dia 1) após cinco dias de treinamento. Os seus desempenhos não foram diferentes de camundongos controle (p = 0,6477), mas foram diferentes de camundongos que receberam injeção de AβO (p = 0,04328).Mice that received a 1 mg/kg/day dose of Flucopride exhibited a mean escape latency of 13.1 ± 1.1 s (p = 0.03759 compared to day 1) after five days of training. Their performances were not different from control mice (p = 0.4367), but were different from mice that received AβO injection (p = 0.07422). Similarly, mice given a 3 mg/kg/day dose of Flucopride exhibited a mean escape latency of 12.5 ± 1.1 s (p = 0.00146 compared to day 1) after five days of training. Their performances were not different from control mice (p = 0.6477), but were different from mice that received AβO injection (p = 0.04328).

TESTES DE SONDA:PROBE TESTS:

[00237] O desempenho de memória de longo prazo foi determinado em quatro dias após a última sessão de treinamento e 14 dias após a injeção icv de veículo ou AβO. A plataforma foi removida e cada animal foi mantido em nado livre por 60 seg. Durante o teste de sonda, determinou-se o tempo passado em diversos quadrantes da piscina, o número de cruzamentos sobre o local anterior da plataforma e o tempo no primeiro cruzamento (ou seja, latência até o alvo).[00237] Long-term memory performance was determined at four days after the last training session and 14 days after icv injection of vehicle or AβO. The platform was removed and each animal was kept freestyle for 60 sec. During the probe test, the time spent in different quadrants of the pool, the number of crossings over the previous location of the platform and the time at the first crossing (ie latency to the target) were determined.

Durante o teste de sonda, não se observou diferença da velocidade de nado entre os grupos, o que demonstra motivação e capacidade física normais.During the probe test, there was no difference in swimming speed between the groups, which demonstrates normal motivation and physical capacity.

[00238] Número de cruzamentos: camundongos do grupo controle veículo (Grupo A) exibiram comportamento normal com número médio de cruzamentos de 5,3 ± 0,6 (Figura 3). Estes resultados estão de acordo com observações anteriores de grupos controle similares. Conforme o esperado, uma única injeção icv de AβO (Grupo B) resultou em enfraquecimento significativo do desempenho cognitivo em comparação com camundongos controle veículos, com número de cruzamento médio reduzido de 2,2 ± 0,4 (p = 0,0010 em comparação com camundongos controle).[00238] Number of crossings: mice from the vehicle control group (Group A) exhibited normal behavior with a mean number of crossings of 5.3 ± 0.6 (Figure 3). These results are in agreement with previous observations from similar control groups. As expected, a single icv injection of AβO (Group B) resulted in significant impairment of cognitive performance compared to vehicle control mice, with a reduced mean crossing number of 2.2 ± 0.4 (p = 0.0010 in comparison with control mice).

[00239] Camundongos que receberam dose subcrônica de donepezil (via oral) e injeção icv de AβO (Grupo C) exibiram comportamento aprimorado com número médio de cruzamentos de 3,7 ± 0,4. Estes camundongos não foram diferentes de camundongos controle veículos (p = 0,0502) e foram significativamente diferentes de camundongos que receberam injeção de AβO (p = 0,0214). De forma similar, camundongos que receberam dose aguda (no dia do teste) de donepezil e injeção icv de AβO (Grupo L) exibiram comportamento aprimorado com número médio de cruzamentos de 3,8 ± 0,4. Esses camundongos não foram diferentes de camundongos controle veículos (p = 0,0857) e foram significativamente diferentes de camundongos que receberam injeção de AβO (p = 0,0159).[00239] Mice that received subchronic dose of donepezil (orally) and icv injection of AβO (Group C) exhibited improved behavior with a mean number of crosses of 3.7 ± 0.4. These mice were not different from vehicle control mice (p = 0.0502) and were significantly different from mice that received AβO injection (p = 0.0214). Similarly, mice that received acute dose (on test day) of donepezil and icv injection of AβO (Group L) exhibited improved behavior with a mean number of crosses of 3.8 ± 0.4. These mice were not different from vehicle control mice (p = 0.0857) and were significantly different from mice that received AβO injection (p = 0.0159).

[00240] Camundongos que receberam dose de Donecoprida (9 mg/kg/dia) ou Flucoprida (9 mg/kg/dia) na presença de veículo (Grupos D e E, respectivamente) exibiram desempenhos cognitivos normais com número médio de cruzamentos de 4,6 ± 0,5 e 4,6 ± 0,7. Esses camundongos não foram diferentes de camundongos controle veículos (p = 0,4003 e p = 0,3945 para Donecoprida e Flucoprida, respectivamente) e foram significativamente diferentes de camundongos que receberam injeção de AβO (p = 0,0026 e p = 0,0077 para Donecoprida e Flucoprida, respectivamente).[00240] Mice that received a dose of Donecopride (9 mg/kg/day) or Flucopride (9 mg/kg/day) in the presence of vehicle (Groups D and E, respectively) exhibited normal cognitive performance with a mean number of crosses of 4 .6 ± 0.5 and 4.6 ± 0.7. These mice were not different from vehicle control mice (p = 0.4003 and p = 0.3945 for Donecopride and Flucopride, respectively) and were significantly different from mice that received AβO injection (p = 0.0026 and p = 0.0077 for Donecopride and Flucopride, respectively).

[00241] Os camundongos receberam doses crescentes de Donecoprida e injeção icv de AβO (Grupos F, G e H). A presença de Donecoprida (em todas as doses) resultou em inibição do enfraquecimento induzido por AβO de memória de longo prazo avaliado utilizando-se o número de cruzamentos. O efeito máximo foi atingido para dose de 3 mg/kg/dia (Grupo G). De fato, esses camundongos exibiram comportamento normal com número médio de cruzamentos de 5,1 ± 0,6, não diferente de camundongos controle veículos (p = 0,6575) e significativamente diferente de camundongos que receberam injeção de AβO (p = 0,0018).[00241] The mice received increasing doses of Donecopride and icv injection of AβO (Groups F, G and H). The presence of Donecopride (at all doses) resulted in inhibition of AβO-induced impairment of long-term memory assessed using the number of crosses. The maximum effect was reached at a dose of 3 mg/kg/day (Group G). In fact, these mice exhibited normal behavior with a mean number of crosses of 5.1 ± 0.6, not different from vehicle control mice (p = 0.6575) and significantly different from mice that received AβO injection (p = 0, 0018).

[00242] Os camundongos receberam doses crescentes de Flucoprida e injeção icv de AβO (Grupos I, J e K). A presença de Flucoprida (em todas as doses) resultou em inibição do enfraquecimento induzido por AβO de memória de longo prazo avaliado utilizando-se o número de cruzamentos. O efeito máximo foi atingido para dose de 3 mg/kg/dia (Grupo J). De fato, esses camundongos exibiram comportamento normal com número médio de cruzamentos de 4,1 ± 0,6, não diferente de camundongos controle veículos (p = 0,1668) e significativamente diferente de camundongos que receberam injeção de AβO (p = 0,0242).[00242] The mice received increasing doses of Flucopride and icv injection of AβO (Groups I, J and K). The presence of Flucopride (at all doses) resulted in inhibition of AβO-induced impairment of long-term memory assessed using the number of crosses. The maximum effect was reached at a dose of 3 mg/kg/day (Group J). In fact, these mice exhibited normal behavior with a mean number of crosses of 4.1 ± 0.6, not different from vehicle control mice (p = 0.1668) and significantly different from mice that received AβO injection (p = 0, 0242).

[00243] Latência para o alvo: camundongos do grupo controle veículo (Grupo A) exibiram comportamento normal com latência média para o alvo de 12,0 ± 1,9 s. Estes resultados estão de acordo com observações anteriores de grupos controle similares. Conforme o esperado, uma única injeção icv de AβO (Grupo B) resultou em enfraquecimento significativo do desempenho cognitivo em comparação com camundongos controle veículos, com latência média aumentada para o alvo de 24,4 ± 4,7 s (p = 0,0074 em comparação com camundongos controle).[00243] Latency to target: mice from vehicle control group (Group A) exhibited normal behavior with mean latency to target of 12.0 ± 1.9 s. These results are in agreement with previous observations from similar control groups. As expected, a single icv injection of AβO (Group B) resulted in significant impairment of cognitive performance compared to vehicle control mice, with increased mean latency to the target of 24.4 ± 4.7 s (p = 0.0074 compared to control mice).

[00244] Camundongos que receberam dose subcrônica de donepezil (via oral) e injeção icv de AβO (Grupo C) exibiram comportamento aprimorado com latência média para o alvo de 14,6 ± 2,7 s. Estes camundongos não foram diferentes de camundongos controle veículos (p = 0,6860) e foram significativamente diferentes de camundongos que receberam injeção de AβO (p = 0,0272). De forma similar, camundongos que receberam dose precisa (no dia de teste) de donepezil (ip) e injeção icv de AβO (Grupo L) exibiram comportamento aprimorado com latência média para o alvo de 13,3 ± 2,3 s. Esses camundongos não foram diferentes de camundongos controle veículos (p = 0,9264) e foram significativamente diferentes de camundongos que receberam injeção de AβO (p = 0,0028).[00244] Mice that received subchronic dose of donepezil (orally) and icv injection of AβO (Group C) exhibited improved behavior with mean latency to the target of 14.6 ± 2.7 s. These mice were not different from vehicle control mice (p = 0.6860) and were significantly different from mice that received AβO injection (p = 0.0272). Similarly, mice that received accurate dose (on test day) of donepezil (ip) and icv injection of AβO (Group L) exhibited improved behavior with mean latency to target of 13.3 ± 2.3 s. These mice were not different from vehicle control mice (p = 0.9264) and were significantly different from mice that received AβO injection (p = 0.0028).

[00245] Camundongos que receberam dose de Donecoprida (9 mg/kg/dia) ou Flucoprida (9 mg/kg/dia) na presença de veículo (Grupos D e E, respectivamente) exibiram desempenhos cognitivos normais com latência média para o alvo de 7,2 ± 1,5 s e 12,0 ± 2,1 s. Esses camundongos não foram diferentes de camundongos controle veículos (p = 0,0524 e p = 0,7582 para Donecoprida e Flucoprida, respectivamente) e foram significativamente diferentes de camundongos que receberam injeção de AβO (p = 0,0017 e p = 0,0082 para Donecoprida e Flucoprida, respectivamente).[00245] Mice that received a dose of Donecopride (9 mg/kg/day) or Flucopride (9 mg/kg/day) in the presence of vehicle (Groups D and E, respectively) exhibited normal cognitive performance with mean latency to the target of 7.2 ± 1.5 s and 12.0 ± 2.1 s. These mice were not different from vehicle control mice (p = 0.0524 and p = 0.7582 for Donecopride and Flucopride, respectively) and were significantly different from mice that received AβO injection (p = 0.0017 and p = 0.0082 for Donecopride and Flucopride, respectively).

[00246] Os camundongos receberam doses crescentes de Donecoprida e injeção icv de AβO (Grupos F, G e H). A presença de Donecoprida (em todas as doses) resultou em inibição do enfraquecimento induzido por AβO de memória de longo prazo avaliado utilizando-se a latência para o alvo. O efeito máximo foi atingido para dose de 1 mg/kg/dia (Grupo F). De fato, esses camundongos exibiram comportamento normal com latência média para o alvo de 9,3 ± 1,4 s, não diferente de camundongos controle veículos (p = 0,2548) e significativamente diferente de camundongos que receberam injeção de AβO (p = 0,0005).[00246] The mice received increasing doses of Donecopride and icv injection of AβO (Groups F, G and H). The presence of Donecopride (at all doses) resulted in inhibition of AβO-induced impairment of long-term memory assessed using latency to the target. The maximum effect was reached at a dose of 1 mg/kg/day (Group F). In fact, these mice exhibited normal behavior with a mean latency to target of 9.3 ± 1.4 s, not different from vehicle control mice (p = 0.2548) and significantly different from mice that received AβO injection (p = 0.0005).

[00247] Os camundongos receberam doses crescentes de Flucoprida e injeção icv de AβO (Grupos I, J e K). A presença de Flucoprida (apenas em dose de 9 mg/kg) resultou em inibição do enfraquecimento induzido por AβO de memória de longo prazo avaliado utilizando-se a latência para o alvo.[00247] The mice received increasing doses of Flucoprid and icv injection of AβO (Groups I, J and K). The presence of flucopride (only at a dose of 9 mg/kg) resulted in inhibition of AβO-induced impairment of long-term memory assessed using latency to the target.

De fato, camundongos do Grupo K exibiram comportamento normal com latência média para o alvo de 10,7 ± 1,9 s, não diferente de camundongos controle veículos (p = 0,6891) e significativamente diferente de camundongos que receberam injeção de AβO (p = 0,0031).Indeed, Group K mice exhibited normal behavior with a mean latency to target of 10.7 ± 1.9 s, not different from vehicle control mice (p = 0.6891) and significantly different from mice that received AβO injection ( p = 0.0031).

[00248] Tempo em quadrante: camundongos do grupo controle veículo (Grupo A) passaram significativamente mais tempo no quadrante alvo (p[00248] Time in quadrant: mice in the vehicle control group (Group A) spent significantly more time in the target quadrant (p

< 0,0001 em comparação com o tempo passado no quadrante oposto). Estes resultados estão de acordo com observações anteriores de grupos controle similares. Como esperado, uma única injeção icv de AβO (Grupo B) resultou em enfraquecimento significativo do desempenho cognitivo em comparação com camundongos controle veículos, com mais tempo passado no quadrante oposto que no quadrante alvo (p = 0,0779, quando são comparados os tempos passados no quadrante alvo x oposto). A dosagem aguda ou subcrônica de donepezil (Grupos C e L) deixou de aumentar o enfraquecimento induzido por AβO da memória de longo prazo utilizando o tempo passado nos diferentes quadrantes como leitura. De forma similar, Donecoprida e Flucoprida não aumentaram a frequência do quadrante durante o teste de sonda.< 0.0001 compared to time spent in the opposite quadrant). These results are in agreement with previous observations from similar control groups. As expected, a single icv injection of AβO (Group B) resulted in significant impairment of cognitive performance compared to vehicle control mice, with more time spent in the opposite quadrant than in the target quadrant (p = 0.0779, when times are compared passed in the target x opposite quadrant). Acute or subchronic dosing of donepezil (Groups C and L) failed to increase AβO-induced impairment of long-term memory using time spent in different quadrants as readings. Similarly, Donecopride and Flucopride did not increase the quadrant frequency during probe testing.

[00249] Efeitos dos compostos de acordo com a presente invenção sobre a memória de reconhecimento:[00249] Effects of compounds according to the present invention on recognition memory:

[00250] Para determinar o efeito de itens de teste sobre memória de reconhecimento, realizou-se teste de NOR 16 dias após a injeção icv de veículo ou AβO. Testes de comportamento foram realizados conforme descrito nos procedimentos experimentais.[00250] To determine the effect of test items on recognition memory, a NOR test was performed 16 days after icv injection of vehicle or AβO. Behavior tests were carried out as described in the experimental procedures.

[00251] Camundongos do grupo controle veículo (Grupo A) exibiram comportamento normal com índice de discriminação médio de 0,35 ± 0,04. Estes resultados estão de acordo com observações anteriores de grupos controle similares. Conforme esperado, uma única injeção icv de AβO (Grupo B) resultou em enfraquecimento significativo (p < 0,0001) do desempenho cognitivo em comparação com camundongos controle veículos; com índice de discriminação médio de -0,01 ± 0,03, camundongos que receberam injeção de AβO não foram capazes de discriminar entre os objetos novos e familiares.[00251] Mice from the vehicle control group (Group A) exhibited normal behavior with a mean discrimination index of 0.35 ± 0.04. These results are in agreement with previous observations from similar control groups. As expected, a single icv injection of AβO (Group B) resulted in significant impairment (p < 0.0001) of cognitive performance compared to vehicle control mice; with a mean discrimination index of -0.01 ± 0.03, mice that received AβO injection were not able to discriminate between new and familiar objects.

[00252] Camundongos que receberam dosagem subcrônica de Donepezil (via oral) e injeção icv de AβO (Grupo C) exibiram comportamento normal com índice de discriminação médio de 0,29 ± 0,09. Esses camundongos não foram diferentes de camundongos controle veículos (p = 0,7439) e significativamente diferentes de camundongos que receberam injeção de AβO (p = 0,0192).[00252] Mice that received subchronic dosage of Donepezil (orally) and icv injection of AβO (Group C) exhibited normal behavior with a mean discrimination index of 0.29 ± 0.09. These mice were not different from vehicle control mice (p = 0.7439) and significantly different from mice that received AβO injection (p = 0.0192).

[00253] Camundongos que receberam dosagem aguda (no dia de teste) de Donepezil (ip) e injeção icv de AβO (Grupo L) exibiram comportamento normal com índice de discriminação médio de 0,30 ± 0,07. Esses camundongos não foram diferentes de camundongos controle veículos (p = 0,9158) e foram significativamente diferentes de camundongos que receberam injeção de AβO (p = 0,0030).[00253] Mice that received acute dosing (on the test day) of Donepezil (ip) and icv injection of AβO (Group L) exhibited normal behavior with a mean discrimination index of 0.30 ± 0.07. These mice were not different from vehicle control mice (p = 0.9158) and were significantly different from mice that received AβO injection (p = 0.0030).

[00254] Camundongos que receberam dose de Donecoprida (9 mg/kg/dia) ou Flucoprida (9 mg/kg/dia) na presença de veículo (Grupos D e E, respectivamente) exibiram desempenhos cognitivos normais com índice de discriminação médio de 0,29 ± 0,04 e 0,36 ± 0,06. Esses camundongos não foram diferentes de camundongos controle veículos (p = 0,3071 e p = 0,8205 para Donecoprida e Flucoprida, respectivamente) e foram significativamente diferentes de camundongos que receberam injeção de AβO (p = 0,0007 e p = 0,0003 para Donecoprida e Flucoprida, respectivamente).[00254] Mice that received a dose of Donecopride (9 mg/kg/day) or Flucopride (9 mg/kg/day) in the presence of vehicle (Groups D and E, respectively) exhibited normal cognitive performance with a mean discrimination index of 0 .29 ± 0.04 and 0.36 ± 0.06. These mice were not different from vehicle control mice (p = 0.3071 and p = 0.8205 for Donecopride and Flucopride, respectively) and were significantly different from mice that received AβO injection (p = 0.0007 and p = 0.0003 for Donecopride and Flucopride, respectively).

[00255] Os camundongos receberam doses crescentes de Donecoprida e injeção icv de AβO (Grupos F, G e H). A presença de Donecoprida (em todas as doses) resultou em inibição dependente da dosagem de enfraquecimento induzido por AβO da memória de reconhecimento. O efeito máximo foi atingido para dose de 9 mg/kg/dia (Grupo H). De fato, esses camundongos exibiram comportamento normal com índice de discriminação médio de 0,43 ± 0,06 s, não diferente de camundongos controle veículos (p = 0,3440) e significativamente diferente de camundongos que receberam injeção de AβO (p = 0,0003).[00255] The mice received increasing doses of Donecopride and icv injection of AβO (Groups F, G and H). The presence of Donecopride (at all doses) resulted in dose-dependent inhibition of AβO-induced impairment of recognition memory. The maximum effect was reached at a dose of 9 mg/kg/day (Group H). In fact, these mice exhibited normal behavior with a mean discrimination index of 0.43 ± 0.06 s, not different from vehicle control mice (p = 0.3440) and significantly different from mice that received AβO injection (p = 0 .0003).

[00256] Os camundongos receberam doses crescentes de Flucoprida e injeção icv de AβO (Grupos I, J e K). A presença de Flucoprida (em todas as doses) resultou em inibição dependente da dosagem (curva em forma de sino) de enfraquecimento induzido por AβO da memória de reconhecimento.[00256] The mice received increasing doses of Flucopride and icv injection of AβO (Groups I, J and K). The presence of flucopride (at all doses) resulted in dose-dependent inhibition (bell-shaped curve) of AβO-induced impairment of recognition memory.

O efeito máximo foi atingido para dose de 3 mg/kg/dia (Grupo J). De fato, esses camundongos exibiram comportamento normal com índice de discriminação médio de 0,46 ± 0,05, não diferente de camundongos controle veículos (p = 0,1039) e significativamente diferente de camundongos que receberam injeção de AβO (p = 0,0003).The maximum effect was reached at a dose of 3 mg/kg/day (Group J). In fact, these mice exhibited normal behavior with a mean discrimination index of 0.46 ± 0.05, not different from vehicle control mice (p = 0.1039) and significantly different from mice that received AβO injection (p = 0, 0003).

CONCLUSÃO:CONCLUSION:

[00257] Em conjunto, esses dados apresentam forte sugestão de que Donecoprida e Flucoprida aprimoraram os desempenhos cognitivos de camundongos que receberam AβO.[00257] Taken together, these data strongly suggest that Donecopride and Flucopride improved the cognitive performances of mice that received AβO.

EXEMPLO 3EXAMPLE 3

[00258] Este exemplo exibe os efeitos antiamnésicos, antiamiloides e anti-inflamatórios de Donecoprida e Flucoprida em administração crônica ao modelo de camundongo 5XFAD de mal de Alzheimer.[00258] This example shows the antiamnestic, antiamyloid and anti-inflammatory effects of Donecopride and Flucopride on chronic administration to the 5XFAD mouse model of Alzheimer's disease.

RACIOCÍNIO DO ESTUDO:STUDY REASONING:

[00259] O objetivo do estudo foi avaliar os potenciais efeitos antiamnésicos, antiamiloides e anti-inflamatórios de Donecoprida e Flucoprida em administração crônica em modelo de camundongo de mal de Alzheimer.[00259] The aim of the study was to evaluate the potential antiamnestic, antiamyloid and anti-inflammatory effects of Donecopride and Flucopride in chronic administration in a mouse model of Alzheimer's disease.

[00260] O modelo de camundongo utilizado foi a linhagem 5XFAD (denominada no Jackson Laboratory “B6SJL- Tg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax”, Estoque MMRRC n° 34840-JAX ou “B6.Cg- Tg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax”, Estoque MMRRC n° 34848-JAX).[00260] The mouse model used was the 5XFAD strain (named in the Jackson Laboratory "B6SJL-Tg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax", MMRRC Stock No. 34840-JAX or "B6.Cg-Tg( APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax", MMRRC Stock No. 34848-JAX).

[00261] Esses camundongos transgênicos 5XFAD sobre- expressam APP(695) humano mutante com as mutações de Mal de Alzheimer Familiar (FAD) sueca (K670N, M671L), da Flórida (I716V) e de Londres (V717I)These 5XFAD transgenic mice overexpress mutant human APP(695) with the Swedish Familial Alzheimer's Disease (FAD) (K670N, M671L), Florida (I716V) and London (V717I) mutations

em conjunto com PS1 humano que abriga duas mutações de FAD, M146L e L286V. Esses transgenes são regulados pelo promotor Thy1 de camundongo para dirigir a sobre-expressão no cérebro. Os camundongos 5XFAD recapitulam características importantes da patologia amiloide de Mal de Alzheimer e são um modelo útil de neurodegeneração induzida por Aβ42 intraneuronal e formação de placas amiloides.together with human PS1 which harbors two FAD mutations, M146L and L286V. These transgenes are regulated by the mouse Thy1 promoter to direct overexpression in the brain. The 5XFAD mice recapitulate important features of Alzheimer's amyloid pathology and are a useful model of intraneuronal Aβ42-induced neurodegeneration and amyloid plaque formation.

MÉTODOS E PROJETO EXPERIMENTAL: CAMUNDONGOS:METHODS AND EXPERIMENTAL DESIGN: MICE:

[00262] Os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com a Norma do Conselho das Comunidades Europeias de 24 de novembro de 1986 (86/609/EEC). Todos os esforços foram realizados para minimizar o sofrimento dos animais e reduzir o número de camundongos utilizados. A geração de camundongos 5XFAD foi descrita em Oakley et al (2006), J.[00262] Animal experiments were conducted in accordance with the Regulation of the Council of the European Communities of November 24, 1986 (86/609/EEC). Every effort was made to minimize the suffering of the animals and reduce the number of mice used. The generation of 5XFAD mice was described in Oakley et al (2006), J.

Neurosci. 26: 10129-10140. Esses camundongos transgênicos sobre- expressam APP (695) humano que abriga as mutações de AD familiar (FAD) sueca (K670N, M671L), da Flórida (I716V) e de Londres (V717I) e Presenilina 1 (PS1) humana que abriga as duas mutações de FAD, M146L e L286V. A expressão dos dois transgenes é regulada por elementos específicos neuronais do promotor Thy1 de camundongo. A linhagem 5XFAD (antecedentes genéticos B6/SJL) foi mantida por meio do cruzamento de camundongos transgênicos hemizigóticos com reprodutores B6/SJL F1. A linhagem 5XFAD (antecedentes genéticos C57BL/6J) foi mantida por meio de cruzamento de camundongos transgênicos hemizigóticos com reprodutores C57BL/6J F1. Todos os animais foram genotipificados por meio de PCR utilizando DNA genômico da cauda.Neurosci. 26: 10129-10140. These transgenic mice overexpress human APP (695) that harbors the familial Swedish (K670N, M671L), Florida (I716V) and London (V717I) AD (FAD) mutations and human Presenilin 1 (PS1) that harbors both FAD, M146L and L286V mutations. The expression of the two transgenes is regulated by neuronal specific elements of the mouse Thy1 promoter. The 5XFAD lineage (B6/SJL genetic background) was maintained by crossing transgenic hemizygous mice with B6/SJL F1 sires. The 5XFAD lineage (C57BL/6J genetic background) was maintained by crossing transgenic hemizygous mice with C57BL/6J F1 sires. All animals were genotyped by PCR using genomic tail DNA.

Camundongos transgênicos e do tipo selvagem foram criados em nossas instalações para animais, tiveram acesso a alimentos e água à vontade e foram abrigados em um ciclo de 12 h de luz-escuro a 22-24 °C. Fêmeas de camundongos 5XFAD foram utilizadas neste estudo. Para cada experimento, a idade de camundongos é indicada em meses (com faixa de duas semanas).Transgenic and wild-type mice were bred in our animal facility, had access to food and water at will, and were housed in a 12 h light-dark cycle at 22-24 °C. Female 5XFAD mice were used in this study. For each experiment, the age of mice is indicated in months (with a range of two weeks).

DROGAS:DRUGS:

[00263] Donecoprida (fumarato de Donecoprida, MR 31155) e Flucoprida (fumarato de Flucoprida, MR 31193) foram sintetizadas em CERMN, Caen, França.Donecopride (Donecopride Fumarate, MR 31155) and Flucopride (Flucopride Fumarate, MR 31193) were synthesized at CERMN, Caen, France.

[00264] RS 67333 (1-(4-amino-5-cloro-2-metoxifenil)-3-(1-butil-4- piperidinil)-1-propanona) foi utilizado como agonista receptor de 5-HT4 de referência e foi adquirido da Tocris Bioscience (R&D Systems Europe, Lille, França).RS 67333 (1-(4-amino-5-chloro-2-methoxyphenyl)-3-(1-butyl-4-piperidinyl)-1-propanone) was used as a reference 5-HT4 receptor agonist and was purchased from Tocris Bioscience (R&D Systems Europe, Lille, France).

[00265] Os compostos foram novamente suspensos em DMSO (37,5 µg/µl, armazenado a -20 °C) e recém-diluídos a 1:250 em NaCl a 0,9% antes da administração. Utilizou-se solução de veículo (0,9% de NaCl e 0,4% de DMSO) como controle.Compounds were resuspended in DMSO (37.5 µg/µl, stored at -20°C) and freshly diluted 1:250 in 0.9% NaCl prior to administration. Vehicle solution (0.9% NaCl and 0.4% DMSO) was used as a control.

TRATAMENTO DE ANIMAIS:ANIMAL TREATMENT:

[00266] Camundongos 5XFAD receberam tratamentos crônicos com drogas ou veículo de acordo com dois protocolos diferentes. Em cada experimento, solução de drogas ou veículo foi administrada por via intraperitoneal duas vezes por semana (1 mg/kg). Em “Protocolo 1”, camundongos (n = 6-7 camundongos por grupo) foram tratados com compostos por dois meses, de 2 a 4 meses de idade. Em “Protocolo 2”, camundongos (n = 7) foram tratados com compostos por três meses, de 1 a 4 meses de idade. Ao final de cada protocolo, os camundongos foram anestesiados com uma mistura de 100 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina em solução salina e sofreram perfusão transcardial com PBS. Os cérebros foram rapidamente isolados sobre gelo, os bulbos olfativos e o cerebelo foram removidos e os dois hemisférios foram divididos. Um hemisfério foi congelado sobre gelo seco e armazenado a - 80 °C para análise bioquímica, enquanto o outro foi pós-fixado em PFA a 4% para imuno-histoquímica (IHC).[00266] 5XFAD mice received chronic drug or vehicle treatments according to two different protocols. In each experiment, drug solution or vehicle was administered intraperitoneally twice a week (1 mg/kg). In “Protocol 1”, mice (n = 6-7 mice per group) were treated with compounds for two months, from 2 to 4 months of age. In “Protocol 2”, mice (n = 7) were treated with compounds for three months, from 1 to 4 months of age. At the end of each protocol, mice were anesthetized with a mixture of 100 mg/kg of ketamine and 10 mg/kg of xylazine in saline and underwent transcardial perfusion with PBS. The brains were quickly isolated on ice, the olfactory bulbs and cerebellum were removed, and the two hemispheres were divided. One hemisphere was frozen on dry ice and stored at -80°C for biochemical analysis, while the other was postfixed in 4% PFA for immunohistochemistry (IHC).

COLETA DE FLUIDO CEREBROESPINHAL (CSF):COLLECTION OF CEREBROSPINHAL FLUID (CSF):

[00267] Os camundongos foram anestesiados e montados sobre um instrumento estereotáxico. A pele do pescoço foi cortada e o tecido subcutâneo e os músculos foram separados com o auxílio de microrretratores (Fine Science Tools, Heidelberg, Alemanha). Os camundongos foram deitados em seguida, de forma que a cabeça formasse um ângulo de cerca de 135° com o corpo (Liu e Duff (2008), J. Vis. Exp. 10: 960). Um tubo capilar (vidro de borossilicato, B100-75-10, Sutter Instruments, Novato, Califórnia, Estados Unidos) foi utilizado para puncionar a matéria dura da cisterna magna. CSF foi coletado por meio de ação capilar e transferido para microtubos de 0,5 ml, imediatamente congelados sobre gelo seco e armazenados a -80 °C até a utilização. Após o descongelamento, amostras foram aquecidas a 60 °C por cinco minutos conforme descrito no pedido internacional WO 2008/009868 e analisadas sem ciclos de congelamento-descongelamento adicionais.[00267] The mice were anesthetized and mounted on a stereotaxic instrument. The neck skin was cut and the subcutaneous tissue and muscles were separated with the aid of microretractors (Fine Science Tools, Heidelberg, Germany). The mice were then laid down so that the head formed an angle of about 135° with the body (Liu and Duff (2008), J. Vis. Exp. 10: 960). A capillary tube (borosilicate glass, B100-75-10, Sutter Instruments, Novato, California, USA) was used to punch the hard material from the magna cistern. CSF was collected by capillary action and transferred to 0.5 ml microtubes, immediately frozen on dry ice and stored at -80 °C until use. After thawing, samples were heated at 60 °C for five minutes as described in international application WO 2008/009868 and analyzed without additional freeze-thaw cycles.

PREPARAÇÃO DE EXTRATO CEREBRAL:PREPARATION OF BRAIN EXTRACT:

[00268] Hemisférios cerebrais, córtex frontal e hipocampo de camundongos 5XFAD e controles foram descongelados, pesados e homogeneizados em quatro volumes de solução tris-salina (50 mM de Tris-HCl, pH = 7,4, 150 mM de NaCl) com um coquetel inibidor da protease (Roche Applied Science, Meylan, França). Os homogeneizados resultantes foram centrifugados a 54.000 x g por 20 minutos e os sobrenadantes (a “fração solúvel”) foram coletados e repartidos para armazenagem a -80 °C. As pelotas foram novamente suspensas por meio de rápida sonicação em 10 volumes de 6 M de guanidina HCl em 50 mM de Tris-HCl, pH = 7,6 e novamente centrifugadas a 26.500 x g por 20 minutos. Os sobrenadantes (a “fração insolúvel”) foram parcelados e armazenados a -80 °C (Morishima-Kawashima et al (2000), Am. J. Pathol. 157: 2093-2099).[00268] Cerebral hemispheres, frontal cortex and hippocampus of 5XFAD mice and controls were thawed, weighed and homogenized in four volumes of tris-saline solution (50 mM Tris-HCl, pH = 7.4, 150 mM NaCl) with a protease inhibitor cocktail (Roche Applied Science, Meylan, France). The resulting homogenates were centrifuged at 54,000 x g for 20 minutes and the supernatants (the “soluble fraction”) were collected and distributed for storage at -80 °C. The pellets were resuspended by rapid sonication in 10 volumes of 6 M guanidine HCl in 50 mM Tris-HCl, pH = 7.6 and again centrifuged at 26,500 x g for 20 minutes. Supernatants (the "insoluble fraction") were parceled and stored at -80°C (Morishima-Kawashima et al (2000), Am. J. Pathol. 157: 2093-2099).

QUANTIFICAÇÃO DE A40 E A42:QUANTIFICATION OF A40 AND A42:

[00269] Kits ELISA da IBL International (Hamburgo, Alemanha) para dosagem de A40 (kit de teste de amiloide  humano (1-40), n° 27713) ou A42 (kit de teste de amiloide  humano (1-42), n° 27719) foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante. As reações foram lidas a 620 nm e 450 nm utilizando um contador da luminescência Infinite 2000. Os valores obtidos foram normalizados na concentração de proteína de cada amostra, medida utilizando-se um teste de proteína BCA (Sigma-Aldrich).[00269] ELISA kits from IBL International (Hamburg, Germany) for measuring A40 (human  amyloid test kit (1-40), no. 27713) or A42 (human  amyloid test kit ( 1-42), no. 27719) were used according to the manufacturer's instructions. Reactions were read at 620 nm and 450 nm using an Infinite 2000 luminescence counter. The values obtained were normalized to the protein concentration of each sample, measured using a BCA protein test (Sigma-Aldrich).

IMUNO-HISTOQUÍMICA:IMMUNOHISTOCHEMISTRY:

[00270] Seções com 30 micrômetros de espessura foram cortadas utilizando um vibratomo (Microm HM 650V, Thermo Scientific, Saint Herblain, França) e armazenadas em meio crioprotetor a -20 °C. Para marcação de placas de amiloide, cortes de tecidos em livre fluxo de córtex frontal, hipocampo e córtex entorrinal (coordenadas do bregma: córtex frontal = 1,98 mm, hipocampo = -1,94 mm, córtex entorrinal = -3,08 mm) foram extensamente lavados em PBS e incubados em seguida em solução de bloqueio (PBS; 3% BSA; 0,1% Triton X- 100) por uma hora. Os cortes foram manchados com tintura Hoechst (1:1000, Life Technologies, Saint Aubin, França) por 15 minutos para detectar núcleos celulares e, em seguida, com solução de Tioflavina T recém-preparada (n° T3516-5G, Sigma-Aldrich) (concentração final: 0,01 mg/ml em tampão de bloqueio) por 15 minutos. Após lavagem em etanol a 70% por cinco minutos, as amostras foram montadas sobre lâminas de polilisina com lamelas. Para manchas de GFAP (proteína ácida fibrilar glial), cortes do cérebro em livre flutuação foram bloqueados como anteriormente e incubados com anti-GFAP de coelho policlonal (1:1000, Z0334, Dako, Les Ullis, França) a 4 °C por uma noite.[00270] Sections 30 micrometers thick were cut using a vibratome (Microm HM 650V, Thermo Scientific, Saint Herblain, France) and stored in cryoprotectant medium at -20 °C. For marking amyloid plaques, free-flowing tissue sections of frontal cortex, hippocampus, and entorhinal cortex (bregma coordinates: frontal cortex = 1.98 mm, hippocampus = -1.94 mm, entorhinal cortex = -3.08 mm ) were extensively washed in PBS and then incubated in blocking solution (PBS; 3% BSA; 0.1% Triton X-100) for one hour. The sections were stained with Hoechst dye (1:1000, Life Technologies, Saint Aubin, France) for 15 minutes to detect cell nuclei and then with freshly prepared Thioflavin T solution (No. T3516-5G, Sigma-Aldrich ) (final concentration: 0.01 mg/ml in blocking buffer) for 15 minutes. After washing in 70% ethanol for five minutes, the samples were mounted on polylysine slides with coverslips. For GFAP (glial fibrillary acidic protein) spots, free-floating brain sections were blocked as before and incubated with polyclonal rabbit anti-GFAP (1:1000, Z0334, Dako, Les Ullis, France) at 4°C for one night.

Após manchas com tioflavina T e lavagem com etanol a 70%, o anticorpo anticoelho de cabra Alexafluor 594 secundário (1:1000, A11012, Life Technologies) foi adicionado por duas horas. Lavagens com PBS e montagem foram realizados conforme descrito acima.After staining with thioflavin T and washing with 70% ethanol, Alexafluor 594 secondary goat anti-rabbit antibody (1:1000, A11012, Life Technologies) was added for two hours. PBS washes and assembly were performed as described above.

OBTENÇÃO E ANÁLISE DE IMAGENS:IMAGE OBTAINING AND ANALYSIS:

[00271] Foram obtidas imagens com um microscópio Axiolmager Z1 (Carl Zeiss S. A. S., Marly le Roi, França). Análise de manchas de tioflavina T foi realizada de forma cega e os dados são apresentados como o número médio de partículas por mm2 em dois a três cortes de tecidos da mesma área do cérebro/animal (software Image J). A expressão de GFAP foi quantificada utilizando software Image J e os resultados são expressos na forma de frações de área.[00271] Images were obtained with an Axiolmager Z1 microscope (Carl Zeiss S.A.S., Marly le Roi, France). Thioflavin T spot analysis was performed in a blinded fashion and data are presented as the mean number of particles per mm2 in two to three tissue sections from the same brain/animal area (Image J software). GFAP expression was quantified using Image J software and results are expressed as area fractions.

TESTE DE RECONHECIMENTO DE OBJETOS NOVOS:NEW OBJECT RECOGNITION TEST:

[00272] O desempenho cognitivo de camundongos foi testado utilizando-se o teste de reconhecimento de objetos novos (NOR) (Bevins e Besheer (2006), Nat. Protoc. 1: 1306-1311). Os animais foram extensamente manuseados durante o tratamento com drogas antes do início do teste. A cada dia, permitiu-se que os camundongos se familiarizassem com a sala de teste por pelo menos uma hora antes do teste. O teste foi conduzido em uma caixa Plexiglas (largura: 35 cm, comprimento: 20 cm, altura: 20 cm) colocado em uma sala com iluminação fraca. Nos dias 1 e 2, cada camundongo foi habituado à caixa vazia por 10 min/dia. No dia 3, dois objetos (construídos com brinquedos plásticos) foram posicionados na gaiola, a 5 cm de distância das paredes opostas. Durante a sessão de treinamento, cada animal foi colocado entre os dois objetos, frontal para a parede e, em seguida, foi mantido para explorar os objetos por cinco minutos. Os camundongos foram devolvidos em seguida para a sua gaiola de abrigo e, 24 h mais tarde, passaram por uma sessão de testes de 5 min, na qual um dos dois objetos (familiares) foi substituído por um novo. O experimento completo foi gravado em vídeo e a exploração do objeto (tempo passado pelo nariz do camundongo em contato com o objeto ou farejando-o a uma distância ≤ 1 cm) foi medida de forma cega. Dois parâmetros foram considerados: (1) o tempo de exploração (seg) gasto pelo animal em interação com os dois objetos familiares durante a sessão de treinamento e (2) o tempo de exploração gasto pelo animal em interação com o objeto novo com relação ao tempo total de exploração ([novo/(familiar + novo)] x 100) durante o teste. Foi também calculado um índice de discriminação ([novo – familiar]/[familiar + novo]).[00272] The cognitive performance of mice was tested using the new object recognition test (NOR) (Bevins and Besheer (2006), Nat. Protoc. 1: 1306-1311). Animals were extensively handled during drug treatment prior to initiation of testing. Each day, mice were allowed to familiarize themselves with the testing room for at least an hour before testing. The test was conducted in a Plexiglas box (width: 35 cm, length: 20 cm, height: 20 cm) placed in a dimly lit room. On days 1 and 2, each mouse was habituated to the empty box for 10 min/day. On day 3, two objects (constructed with plastic toys) were placed in the cage, 5 cm away from the opposite walls. During the training session, each animal was placed between the two objects, facing the wall, and then held to explore the objects for five minutes. The mice were then returned to their home cage and, 24 h later, underwent a 5-min testing session in which one of the two (familiar) objects was replaced by a new one. The complete experiment was videotaped and object exploration (time spent by the mouse's nose in contact with the object or sniffing at it at a distance ≤ 1 cm) was measured blindly. Two parameters were considered: (1) the exploration time (sec) spent by the animal interacting with the two familiar objects during the training session and (2) the exploration time spent by the animal interacting with the new object with respect to the total exploration time ([new/(familiar + new)] x 100) during the test. A discrimination index ([new – familiar]/[relative + new]) was also calculated.

ANÁLISE ESTATÍSTICA:STATISTICAL ANALYSIS:

[00273] Todos os valores são expressos na forma de média ± desvio padrão. Efeitos significativos de tratamentos foram determinados por meio de análise ANOVA seguida por testes post hoc de Tukey no caso de diversos grupos comparativos. Em todos os outros casos, utilizou-se o teste t de Student desemparelhado. Para todos os testes estatísticos, P < 0,05 foi considerado significativo. Realizou-se análise com GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, La Jolla CA).[00273] All values are expressed as mean ± standard deviation. Significant treatment effects were determined by ANOVA analysis followed by Tukey post hoc tests in the case of several comparative groups. In all other cases, Student's unpaired t-test was used. For all statistical tests, P < 0.05 was considered significant. Analysis was performed with GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, La Jolla CA).

RESULTADOS:RESULTS:

[00274] Efeitos de Donecoprida e Flucoprida sobre carga de amiloide em cérebros 5XFAD:[00274] Effects of Donecopride and Flucopride on amyloid load in 5XFAD brains:

[00275] 27 fêmeas de camundongos 5XFAD (antecedentes genéticos B6/SJL) foram utilizadas neste estudo. Os camundongos receberam veículo ou compostos (1 mg/kg) por via intraperitoneal, duas vezes por semana por dois meses, de 2 a 4 meses de idade.27 female 5XFAD mice (B6/SJL genetic background) were used in this study. The mice received vehicle or compounds (1 mg/kg) intraperitoneally, twice a week for two months, from 2 to 4 months of age.

[00276] A40 e A42 foram quantificados a partir de extrato cerebral em frações solúveis e insolúveis. Os resultados são expressos em percentual de veículo.[00276] A40 and A42 were quantified from brain extract in soluble and insoluble fractions. Results are expressed as a percentage of vehicle.

[00277] Os resultados obtidos são apresentados na Tabela 6 abaixo. TABELA 6[00277] The results obtained are shown in Table 6 below. TABLE 6

[00278] Níveis de A40 e A42 (% de controles):[00278] Levels of A40 and A42 (% of controls):

Fração solúvel Fração insolúvel A40 Desvio padrão n A40 Desvio padrão n Veículo 100,00 11,38 7 100,00 14,56 7 Donecoprida 110,18 10,68 7 79,97 6,40 7 Flucoprida 110,51 16,67 7 97,16 10,43 7 A42 Desvio padrão n A42 Desvio padrão n Veículo 100,00 11,26 6 100,00 6,70 7 Donecoprida 65,93* 8,36 7 67,85* 12,59 6 Flucoprida 30,19**** 8,04 7 73,16 4,62 7 * p < 0,05 em comparação com o veículo, determinado por meio de ANOVA de uma via seguido por teste de Tukey.Soluble fraction Insoluble fraction A40 Standard deviation n A40 Standard deviation n Vehicle 100.00 11.38 7 100.00 14.56 7 Donecopride 110.18 10.68 7 79.97 6.40 7 Flucopride 110.51 16.67 7 97.16 10.43 7 A42 Standard deviation n A42 Standard deviation n Vehicle 100.00 11.26 6 100.00 6.70 7 Donecoprida 65.93* 8.36 7 67.85 * 12.59 6 Flucopride 30.19**** 8.04 7 73.16 4.62 7 * p < 0.05 compared to vehicle, determined by one-way ANOVA followed by Tukey's test.

[00279] Os valores dos grupos veículo apresentados na Tabela 6 foram os seguintes: - fração solúvel: - A40 = 9,48 ± 1,08 μg/mg de proteína; e - A42 = 0,24 ± 0,03 μg/mg de proteína; - fração insolúvel: - A40 = 0,68 ± 0,10 μg/mg de proteína; e - A42 = 10,84 ± 0,73 μg/mg de proteína.[00279] The values of the vehicle groups presented in Table 6 were as follows: - soluble fraction: - A40 = 9.48 ± 1.08 μg/mg of protein; and - A42 = 0.24 ± 0.03 μg/mg of protein; - insoluble fraction: - A40 = 0.68 ± 0.10 μg/mg of protein; and - A42 = 10.84 ± 0.73 μg/mg of protein.

[00280] Efeito antiamiloide: na fração solúvel de cérebros de camundongos 5XFAD, a administração crônica de Donecoprida e Flucoprida (1 mg/kg, duas vezes por semana) foi capaz de reduzir significativamente os níveis de A42 (*p < 0,05 contra o veículo para Donecoprida e ****p < 0,0001 contra o veículo para Flucoprida, determinado por meio de ANOVA de uma via, seguido por teste de Tukey), sem alteração dos níveis de A40. De forma similar, na fração insolúvel, donecoprida reduziu a carga de A42 nos cérebros dos camundongos (*p < 0,05 contra o veículo, determinado por meio de ANOVA de uma via, seguido pelo teste de Tukey). Os níveis de A40 insolúveis não foram afetados pelas duas drogas.[00280] Anti-amyloid effect: in the soluble fraction of brains of 5XFAD mice, chronic administration of Donecopride and Flucopride (1 mg/kg, twice a week) was able to significantly reduce A42 levels (*p < 0, 05 against vehicle for Donecopride and ****p < 0.0001 against vehicle for Flucopride, determined by means of one-way ANOVA, followed by Tukey test), with no change in A40 levels. Similarly, in the insoluble fraction, donecopride reduced the A42 load in mouse brains (*p < 0.05 against vehicle, determined by one-way ANOVA, followed by Tukey's test). Insoluble A40 levels were not affected by the two drugs.

EFEITOS DE DONECOPRIDA E FLUCOPRIDA SOBRE A MEMÓRIA, CARGA DE AMILOIDES EM CSF, PLACAS DE AMILOIDES E ASTROGLIOSE EM CAMUNDONGOS 5XFAD:EFFECTS OF DONECOPRIDE AND FLUCOPRIDE ON MEMORY, AMYLOID LOADING IN CSF, AMYLOID PLATES AND ASTROGLIOSIS IN 5XFAD MICE:

[00281] 28 fêmeas de camundongos 5XFAD (antecedentes genéticos C57BL/6J) foram utilizadas neste estudo. Os camundongos receberam veículo ou compostos (1 mg/kg) por via intraperitoneal, duas vezes por semana por três meses, de 1 a 4 meses de idade.[00281] 28 female 5XFAD mice (C57BL/6J genetic background) were used in this study. The mice received vehicle or compounds (1 mg/kg) intraperitoneally, twice a week for three months, from 1 to 4 months of age.

[00282] Ao final do tratamento, os camundongos foram avaliados para determinar o desempenho da memória a longo prazo em teste de reconhecimento de objetos novos (NOR). O intervalo entre as sessões foi de 24 horas. Como nenhum camundongo deixou de explorar um dos dois objetos ou explorar os dois objetos por menos de 10 segundos durante a sessão de treinamento, todos os camundongos foram incluídos na análise de dados.[00282] At the end of treatment, mice were evaluated to determine long-term memory performance in new object recognition test (NOR). The interval between sessions was 24 hours. As no mice failed to explore one of the two objects or explore both objects for less than 10 seconds during the training session, all mice were included in the data analysis.

[00283] Efeito antiamnésico: fêmeas 5XFAD com um mês de idade e ninhadas do tipo selvagem foram tratadas com RS 67333, veículo, Donecoprida ou Flucoprida (1 mg/kg, duas vezes por semana por três meses) e a memória de reconhecimento foi determinada com o teste de reconhecimento de objetos novos (NOR). Sessões de habituação foram iniciadas em três dias após o final do tratamento para evitar interferência com efeitos agudos. O intervalo entre a sessão de treinamento e o teste foi de 24 horas. Camundongos tratados com veículo apresentaram desempenho de memória enfraquecido e não foram capazes de discriminar o objeto novo em comparação com o familiar, conforme exibido pelo tempo de exploração similar e pelo índice de discriminação não significativo. O tratamento com RS 67333 reverte o enfraquecimento cognitivo conforme indicado pelo percentual de tempo mais alto dedicado à exploração do objeto novo em comparação com camundongos tratados com veículo (**p < 0,01 contra o objeto familiar, determinado por meio de ANOVA de duas vias seguido por teste de Sidak). De forma similar, tratamentos crônicos de Donecoprida e Flucoprida puderam evitar alteração de memória (**p < 0,01 contra o objeto familiar para Donecoprida, *p < 0,05 contra o objeto familiar para Flucoprida, determinado por meio de ANOVA de duas vias seguido por teste de Sidak). O índice de discriminação dos três grupos tratados com composto foi diferente de zero, o nível de chance (determinado por meio de teste t de Student não emparelhado). O tempo total de exploração durante a sessão de treinamento não diferiu significativamente nos quatro grupos, o que indica que o aprimoramento da memória de reconhecimento em camundongos 5XFAD tratados com Donecoprida ou Flucoprida não é secundário ao aumento da atividade exploratória.[00283] Antiamnestic effect: 1 month old 5XFAD females and wild-type litters were treated with RS 67333, vehicle, Donecopride or Flucopride (1 mg/kg, twice a week for three months) and recognition memory was determined with the new object recognition test (NOR). Habituation sessions were started three days after the end of treatment to avoid interfering with acute effects. The interval between the training session and the test was 24 hours. Vehicle-treated mice exhibited impaired memory performance and were unable to discriminate the new object compared to the familiar, as shown by the similar exploration time and non-significant discrimination index. Treatment with RS 67333 reverses cognitive impairment as indicated by the higher percentage of time spent exploring the new object compared to vehicle-treated mice (**p < 0.01 against the familiar object, determined using ANOVA of two routes followed by Sidak test). Similarly, chronic treatments of Donecopride and Flucopride were able to prevent memory impairment (**p < 0.01 against the familiar object for Donecopride, *p < 0.05 against the familiar object for Flucopride, determined by means of a two-way ANOVA routes followed by Sidak test). The discrimination index of the three compound-treated groups was non-zero, the level of chance (determined using Student's unpaired t-test). The total exploration time during the training session did not differ significantly in the four groups, indicating that the enhancement of recognition memory in 5XFAD mice treated with Donecopride or Flucopride is not secondary to increased exploratory activity.

[00284] Carga de amiloide em CSF: a concentração de A42 em fluido cerebroespinhal (CSF) de camundongos 5XFAD tratados com RS 67333, Donecoprida ou Flucoprida (1 mg/kg, duas vezes por semana por três meses) não foi significativamente diferente em comparação com os controles, o que indica que o estímulo de receptor de 5-HT4 crônico não afetou os níveis de amiloide em CSF (determinados por meio de ANOVA de uma via seguido por teste de Tukey).[00284] Amyloid load in CSF: A42 concentration in cerebrospinal fluid (CSF) of 5XFAD mice treated with RS 67333, Donecopride or Flucopride (1 mg/kg, twice weekly for three months) was not significantly different compared to controls, indicating that chronic 5-HT4 receptor stimulation did not affect amyloid levels in CSF (determined by means of one-way ANOVA followed by Tukey's test).

[00285] Efeito antiamiloide: Córtex frontal, hipocampo e córtex entorrinal foram analisados como áreas representativas do cérebro de camundongo 5XFAD (cortes frontal, médio e traseiro) e de regiões do cérebro humano que são afetadas precocemente pelo mal de Alzheimer e altamente enriquecidas em depósitos de amiloide.[00285] Anti-amyloid effect: Frontal cortex, hippocampus, and entorhinal cortex were analyzed as representative areas of the 5XFAD mouse brain (frontal, middle and rear sections) and human brain regions that are affected early by Alzheimer's disease and highly enriched in deposits of amyloid.

[00286] Tratamento com donecoprida (1 mg/kg, duas vezes por semana por três meses) reduziu significativamente o número de placas de amiloide em comparação com veículo no córtex frontal (redução de 16 ± 3%, **p < 0,01 em comparação com veículo) e em córtex entorrinal (redução de 24 ± 4%, **p < 0,01 em comparação com veículo). Redução significativa do número de placas foi também observada em córtex entorrinal após tratamento com Flucoprida (1 mg/kg, duas vezes por semana por três meses) com redução de 28 ± 6%, com relação ao controle (**p < 0,01 em comparação com veículo). Não foi observado efeito significativo após tratamento com RS 67333 (1 mg/kg, duas vezes por semana por três meses), no córtex frontal nem no córtex entorrinal. O número de placas de amiloide em hipocampo de camundongos 5XFAD tratados com RS 67333, Donecoprida ou Flucoprida (1 mg/kg, duas vezes por semana por três meses) não foi significativamente diferente em comparação com controles. As estatísticas foram determinadas por meio de ANOVA de uma via seguido por teste de Tukey.[00286] Treatment with donecopride (1 mg/kg twice weekly for three months) significantly reduced the number of amyloid plaques compared to vehicle in the frontal cortex (reduction of 16 ± 3%, **p < 0.01 compared to vehicle) and in entorhinal cortex (24 ± 4% reduction, **p < 0.01 compared to vehicle). A significant reduction in the number of plaques was also observed in the entorhinal cortex after treatment with Flucopride (1 mg/kg, twice a week for three months) with a reduction of 28 ± 6%, compared to the control (**p < 0.01 compared to vehicle). No significant effect was observed after treatment with RS 67333 (1 mg/kg, twice a week for three months) in the frontal or entorhinal cortex. The number of amyloid plaques in the hippocampus of 5XFAD mice treated with RS 67333, Donecopride or Flucopride (1 mg/kg, twice weekly for three months) was not significantly different compared to controls. Statistics were determined by one-way ANOVA followed by Tukey test.

[00287] Efeito anti-inflamatório: a determinação imuno- histoquímica de astroglial (anticorpo anti-GFAP, proteína ácida fibrilar glial) demonstrou que tratamentos crônicos com RS 67333 e Donecoprida (1 mg/kg, duas vezes por semana por três meses) reduziu significativamente a astrogliose (54 ± 10% e 62 ± 6% de redução de manchas de GFAP em fatias do cérebro entorrinal de animais tratados em comparação com controles que receberam veículo, respectivamente *p < 0,01 em comparação com veículo). Em córtex entorrinal, tratamento com Flucoprida (1 mg/kg, duas vezes por semana por três meses) induziu redução de 51 ± 5% de manchas de GFAP próxima à significativa (p = 0,06). Manchas de GFAP no córtex frontal ou hipocampo de camundongos 5XFAD, tratadas com RS 67333, Donecoprida ou Flucoprida (1 mg/kg, duas vezes por semana por três meses), entretanto, não foram significativamente diferentes em comparação com os controles. As estatísticas foram determinadas por meio de ANOVA de uma via seguido por teste de Tukey.[00287] Anti-inflammatory effect: immunohistochemical determination of astroglial (anti-GFAP antibody, glial fibrillary acidic protein) demonstrated that chronic treatments with RS 67333 and Donecopride (1 mg/kg, twice a week for three months) reduced significantly to astrogliosis (54 ± 10% and 62 ± 6% reduction of GFAP spots in entorhinal brain slices from treated animals compared to controls receiving vehicle, respectively *p < 0.01 compared to vehicle). In entorhinal cortex, treatment with Flucopride (1 mg/kg, twice a week for three months) induced a 51 ± 5% reduction in GFAP spots close to significant (p = 0.06). GFAP stains in the frontal cortex or hippocampus of 5XFAD mice, treated with RS 67333, Donecopride or Flucopride (1 mg/kg, twice weekly for three months), however, were not significantly different compared to controls. Statistics were determined by one-way ANOVA followed by Tukey test.

CONCLUSÃO:CONCLUSION:

[00288] O estudo demonstra que Donecoprida e Flucoprida exercem efeitos antiamiloides (redução dos níveis de Aβ42 e placa de amiloide) e efeitos anti-inflamatórios (redução da astrogliose) mediante administração crônica a camundongos 5XFAD, que é um modelo de mal de Alzheimer em camundongo transgênico. Estes efeitos são principalmente proeminentes em córtex entorrinal e córtex frontal. Além disso, a administração crônica de Donecoprida e Flucoprida é capaz de exercer efeito antiamnésico e evitar o surgimento de déficits de memória em camundongos 5XFAD.[00288] The study demonstrates that Donecopride and Flucopride exert anti-amyloid effects (reduced levels of Aβ42 and amyloid plaque) and anti-inflammatory effects (reduction of astrogliosis) upon chronic administration to mice 5XFAD, which is a model of Alzheimer's disease in transgenic mouse. These effects are mainly prominent in entorhinal and frontal cortex. Furthermore, the chronic administration of Donecopride and Flucopride is able to exert an antiamnestic effect and prevent the appearance of memory deficits in 5XFAD mice.

[00289] Todos estes efeitos são comparáveis e, às vezes, maiores que os de RS 67333 (agonista receptor de 5-HT4 selecionado como referência), o que indica que Donecoprida e Flucoprida são drogas promissoras contra mal de Alzheimer.[00289] All of these effects are comparable and sometimes greater than those of RS 67333 (5-HT4 receptor agonist selected as the reference), indicating that Donecopride and Flucopride are promising drugs against Alzheimer's disease.

EXEMPLO 4EXAMPLE 4

[00290] Este exemplo descreve o efeito neuroprotetor de diversos compostos da fórmula geral (I) conforme definido acima sobre neurônios hipocampais intoxicados com oligômeros de peptídeos de amiloide.This example describes the neuroprotective effect of various compounds of the general formula (I) as defined above on hippocampal neurons intoxicated with amyloid peptide oligomers.

MATERIAL E MÉTODOS: CULTIVO PRIMÁRIO DE NEURÔNIOS HIPOCAMPAIS:MATERIAL AND METHODS: PRIMARY CULTURE OF HYPOCAMPAL NEURONS:

[00291] Neurônios hipocampais de ratos foram cultivados conforme descrito por Callizot et al (2013), J. Neurosci. Res. 91: 706-716.[00291] Rat hippocampal neurons were cultured as described by Callizot et al (2013), J. Neurosci. Res. 91: 706-716.

Resumidamente, fêmeas de ratos grávidas com 17 dias de gestação (Ratos Wistar; Janvier Labs, França) foram mortas utilizando anestesia profunda com câmara de CO2 e deslocamento da cervical. Os fetos foram removidos em seguida do útero e imediatamente colocados em meio Leibovitz L15 gelado com uma solução de 2% de penicilina (10.000 U/ml) e estreptomicina (10 mg/ml) (PS) e 1% de albumina de soro bovino (BSA). Os hipocampais foram tratados por 20 minutos a 37 °C com uma solução de tripsina-EDTA em concentração final de 0,05% de tripsina e 0,02% de EDTA. A dissociação foi suspensa por meio da adição de meio Eagle modificado da Dulbecco (DMEM) com 4,5 g/l de glicose, que contém DNAse I grau II (concentração final de 0,5 mg/ml) e 10% de soro de feto bovino (FCS). As células foram dissociadas mecanicamente por três passagens forçadas através da ponta de uma pipeta de 10 ml.Briefly, pregnant female rats at 17 days of gestation (Wistar Rats; Janvier Labs, France) were killed using deep anesthesia with a CO2 chamber and cervical dislocation. The fetuses were then removed from the uterus and immediately placed in ice-cold Leibovitz L15 medium with a solution of 2% penicillin (10,000 U/ml) and streptomycin (10 mg/ml) (PS) and 1% bovine serum albumin ( BSA). Hippocampals were treated for 20 minutes at 37 °C with a trypsin-EDTA solution at a final concentration of 0.05% trypsin and 0.02% EDTA. Dissociation was stopped by the addition of Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/l of glucose, which contains DNAse I grade II (final concentration of 0.5 mg/ml) and 10% serum bovine fetus (FCS). Cells were mechanically dissociated by three forced passes through the tip of a 10 ml pipette.

[00292] As células foram centrifugadas a 515 x g por 10 min a 4 °C.[00292] Cells were centrifuged at 515 x g for 10 min at 4 °C.

O sobrenadante foi descartado e a pelota foi novamente suspensa em meio de cultivo definido que consiste em meio neurobasal com solução a 2% de suplemento B27, 2 mmol/l de L-glutamina, 2% de solução de PS e 10 ng/ml de fator neurotrófico cerebral (BDNF). Células viáveis foram contadas em um citômetro de Neubauer, utilizando o teste de exclusão de azul de tripano. Células foram semeadas em densidade de 20.000 por cavidade em placas com 96 cavidades previamente revestidas com poli-L-lisina e cultivadas a 37 °C em um incubador de ar (95%)-CO2 (5%).The supernatant was discarded and the pellet was resuspended in defined culture medium consisting of neurobasal medium with a 2% solution of B27 supplement, 2 mmol/l L-glutamine, 2% PS solution and 10 ng/ml of cerebral neurotrophic factor (BDNF). Viable cells were counted in a Neubauer cytometer using the trypan blue exclusion test. Cells were seeded at a density of 20,000 per well in 96-well plates previously coated with poly-L-lysine and cultured at 37°C in an air (95%)-CO2 (5%) incubator.

[00293] O meio foi alterado a cada dois dias. Para placas com 96 cavidades, apenas 60 cavidades foram utilizadas. As cavidades da primeira e da última linha e coluna não foram utilizadas (para evitar efeito de extremidades) e foram preenchidas com água esterilizada.[00293] The medium was changed every two days. For 96-well plates, only 60 wells were used. The wells of the first and last row and column were not used (to avoid extremity effect) and were filled with sterilized water.

[00294] Compostos de teste e exposição a Aβ 1-42 humano:[00294] Test compounds and exposure to human Aβ 1-42:

[00295] Compostos de teste: foram testados os compostos a seguir: - MR31193; - MR31176; - MR31192; e - MR33583.[00295] Test compounds: the following compounds were tested: - MR31193; - MR31176; - MR31192; and - MR33583.

[00296] Incubação prévia: no dia 17 de cultivo, os compostos foram dissolvidos no meio de cultivo e previamente incubados com neurônios hipocampais primários por uma hora, antes da exposição a Aβ 1-42.[00296] Previous incubation: on day 17 of culture, the compounds were dissolved in the culture medium and previously incubated with primary hippocampal neurons for one hour, before exposure to Aβ 1-42.

[00297] Danos: os neurônios hipocampais foram expostos a soluções de Aβ (conforme abaixo) após 17 dias de cultivo. A preparação Aβ 1- 42 foi realizada seguindo-se o procedimento descrito por Callizot et al (2013), J.[00297] Damage: Hippocampal neurons were exposed to Aβ solutions (as below) after 17 days of culture. The Aβ 1-42 preparation was performed following the procedure described by Callizot et al (2013), J.

Neurosci. Res. 91: 706-716. O número de bateladas do Aβ 1-42 utilizado neste estudo contém 10% de oligômeros (quantificação por meio de WB conforme realizado em Combes et al (2015), J. Neurosci. Res. 93: 633-643).Neurosci. Res. 91: 706-716. The number of batches of Aβ 1-42 used in this study contains 10% of oligomers (quantitation using WB as performed in Combes et al (2015), J. Neurosci. Res. 93: 633-643).

Resumidamente, o peptídeo Aβ 1-42 foi dissolvido no meio de cultivo definido mencionado acima, em concentração inicial de 40 µmol/l. Esta solução foi suavemente agitada por três dias a 37 °C no escuro e utilizado imediatamente após diluição adequada em meio de cultivo até as concentrações utilizadas (20 µmol/l ou 2,5 µmol/l correspondentes a 2 µmol/l ou 0,25 µmol/l de oligômeros (AβO), respectivamente). Adicionou-se preparação de Aβ 1-42 até concentração final de 20 ou 2,5 µmol/l (respectivamente, 2 µmol/l ou 0,25 µmol/l de AβO, determinados por meio de WB automático) diluída em meio controle na presença dos compostos.Briefly, the Aβ 1-42 peptide was dissolved in the defined culture medium mentioned above, at an initial concentration of 40 µmol/l. This solution was gently shaken for three days at 37 °C in the dark and used immediately after adequate dilution in culture medium to the concentrations used (20 µmol/l or 2.5 µmol/l corresponding to 2 µmol/l or 0.25 µmol/l of oligomers (AβO), respectively). Preparation of Aβ 1-42 was added to a final concentration of 20 or 2.5 µmol/l (respectively, 2 µmol/l or 0.25 µmol/l of AβO, determined by automatic WB) diluted in control medium at presence of the compounds.

AVALIAÇÃO DE OBJETIVOS:EVALUATION OF OBJECTIVES:

[00298] Em 24 horas após a intoxicação, os sobrenadantes foram retirados e imediatamente congelados para testes analíticos futuros. Eles foram mantidos a -20 °C por até seis meses. Os neurônios hipocampais foram fixados em seguida por uma solução fria de etanol (95%) e ácido acético (5%) por cinco minutos a -20 °C. Eles foram lavados novamente por duas vezes em PBS, permeabilizados em seguida e os locais não específicos foram bloqueados utilizando solução de PBS contendo 0,1% de saponina e 1% de FCS por 15 minutos à temperatura ambiente.[00298] Within 24 hours of intoxication, the supernatants were removed and immediately frozen for further analytical testing. They were kept at -20 °C for up to six months. Hippocampal neurons were then fixed by a cold solution of ethanol (95%) and acetic acid (5%) for five minutes at -20 °C. They were washed again twice in PBS, then permeabilized and non-specific sites were blocked using a PBS solution containing 0.1% saponin and 1% FCS for 15 minutes at room temperature.

[00299] Imunomanchas: MAP-2 / AT100 – após fixação e permeabilização, as células foram incubadas por duas horas com: - um anticorpo policlonal de galinha antiproteína associada a microtúbulos 2 (MAP-2) em diluição de 1/1000 em PBS contendo 1% de soro de feto bovino e 0,1% de saponina (esse anticorpo mancha especificamente corpos celulares e neurites, permitindo o estudo da morte de células neuronais e da rede de neurites); e - um anticorpo monoclonal de camundongo antifosfo Tau[00299] Immunoblots: MAP-2 / AT100 - after fixation and permeabilization, the cells were incubated for two hours with: - a chicken polyclonal anti-microtubule-associated protein 2 (MAP-2) antibody at a dilution of 1/1000 in PBS containing 1% fetal bovine serum and 0.1% saponin (this antibody specifically stains cell bodies and neurites, allowing the study of neuronal cell death and the neurite network); and - an anti-phospho Tau mouse monoclonal antibody

(AT100) em diluição de 1/100 em PBS que contém 1% de soro de feto bovino e 0,1% de saponina.(AT100) at 1/100 dilution in PBS containing 1% fetal bovine serum and 0.1% saponin.

[00300] Esses anticorpos foram revelados com anti-IgG de camundongo de cabra Alexa Flúor 488 e anti-IgG de galinha de cabra Alexa Flúor 568 em diluição 1/400 em PBS contendo 1% de FCS e 0,1% de saponina por uma hora à temperatura ambiente.These antibodies were revealed with anti-goat mouse IgG Alexa Fluor 488 and anti-goat chicken IgG Alexa Fluor 568 at 1/400 dilution in PBS containing 1% FCS and 0.1% saponin by one hour at room temperature.

[00301] Para cada condição, 30 fotografias (que representam toda a área da cavidade) por cavidade foram tomadas utilizando ImageXpress® (Molecular Devices) com ampliação de 20x. Todas as imagens foram geradas utilizando os mesmos parâmetros de obtenção. A partir das imagens, análises foram realizadas direta e automaticamente utilizando Custom Module Editor® (Molecular Devices). Foram pesquisadas as leituras a seguir: - número total de neurônios (sobrevivência de neurônios, número de neurônios positivos para MAP-2); - rede de neurites (em µm de neurônios positivos para MAP- 2); e - área de AT100 (µm2, sobrepostos com neurônios positivos para MAP-2).[00301] For each condition, 30 photographs (which represent the entire cavity area) per cavity were taken using ImageXpress® (Molecular Devices) at 20x magnification. All images were generated using the same acquisition parameters. From the images, analyzes were performed directly and automatically using Custom Module Editor® (Molecular Devices). The following readings were searched: - total number of neurons (neuron survival, number of MAP-2 positive neurons); - neurite network (in µm of MAP-2 positive neurons); and - AT100 area (µm2, superimposed with MAP-2 positive neurons).

[00302] Imunomanchas: PSD95 e SYN – após fixação e permeabilização, as células foram incubadas por duas horas com: - um anticorpo monoclonal de camundongo antipós-sináptico com densidade de 95 kDa (PSD95) em diluição de 1/200 em PBS que contém 1% de soro de feto bovino e 0,1% de saponina; e - um anticorpo policlonal de coelho antissinaptofisina (SYN) em diluição de 1/100 em PBS contendo 1% de soro de feto bovino e 0,1% de saponina.[00302] Immunoblots: PSD95 and SYN - after fixation and permeabilization, the cells were incubated for two hours with: - an anti-post-synaptic mouse monoclonal antibody with a density of 95 kDa (PSD95) in 1/200 dilution in PBS containing 1% fetal bovine serum and 0.1% saponin; and - a polyclonal rabbit anti-synaptophysin (SYN) antibody at 1/100 dilution in PBS containing 1% fetal bovine serum and 0.1% saponin.

[00303] Esses anticorpos foram revelados com anti-IgG de camundongo de cabra Alexa Flúor 488 e anti-IgG de coelho de cabra Alexa FlúorThese antibodies were revealed with anti-goat mouse IgG Alexa Fluor 488 and anti-goat rabbit IgG Alexa Fluor

568 em diluição 1/400 em PBS contendo 1% de FCS e 0,1% de saponina por uma hora à temperatura ambiente.568 at 1/400 dilution in PBS containing 1% FCS and 0.1% saponin for one hour at room temperature.

[00304] Para cada condição, 40 fotografias por cavidade foram tomadas utilizando ImageXpress (Molecular Devices) com ampliação de 40x.[00304] For each condition, 40 photographs per cavity were taken using ImageXpress (Molecular Devices) at 40x magnification.

Todas as imagens foram tomadas com as mesmas condições. A avaliação das sinapses foi realizada automaticamente utilizando Custom Module Editor® (Molecular Devices). Foram determinados os objetivos a seguir: - número de sinapses (sobreposição entre PSD95/SYN).All images were taken under the same conditions. Synapse evaluation was performed automatically using Custom Module Editor® (Molecular Devices). The following objectives were determined: - number of synapses (overlapping between PSD95/SYN).

[00305] Análise estatística:[00305] Statistical analysis:

[00306] Todos os valores são expressos na forma de média +/- desvio padrão. Realizou-se análise estatística por meio de ANOVA de uma via, seguido por teste de Dunnett ou LSD de Fisher. p < 0,05 foi considerado significativo.[00306] All values are expressed as mean +/- standard deviation. Statistical analysis was performed using one-way ANOVA, followed by Dunnett's or Fisher's LSD test. p < 0.05 was considered significant.

RESULTADOS:RESULTS:

[00307] São obtidos os resultados a seguir: - MR31193 exibe forte efeito neuroprotetor (sobrevivência, neurites e rede sináptica). Como se pode observar nas Figuras 1 e 2, o efeito segue curva em forma de sino com efeito máximo observado sob concentração de 100 nM para sobrevivência e rede de neurites (Figuras 1A-C). O efeito máximo da rede de sinapses foi obtido sob concentrações mais baixas (5 nM a 100 nM, Figura 2). Observou-se também efeito significativo sobre a hiperfosforilação de Tau, com efeito máximo a 50 nM (vide a Figura 1D); - como se pode observar nas Figuras 3 e 4, MR31176 exibe efeito neuroprotetor em altas concentrações (sobrevivência, neurite e rede sináptica). Observou-se também efeito significativo sobre a hiperfosforilação de Tau em alta concentração (vide a Figura 3D); - como se pode observar nas Figuras 5 e 6, MR31192 exibe efeito neuroprotetor muito forte sob doses muito baixas (por exemplo, 1-5 nM para sobrevivência, vide a Figura 5A). Observou-se ainda efeito muito grande sobre a rede de neurites em cada dose testada (vide a Figura 5B). Este composto chegou a exibir efeito neurotrófico (induziu o crescimento neurítico), como se pode observar na Figura 5C. O número de sinapses também aumentou em doses baixas (1-5 nM, vide a Figura 6). Observou-se ainda efeito importante sobre a hiperfosforilação de Tau (vide a Figura 5D); - observou-se ainda efeito neuroprotetor que segue curva em forma de sino com MR33583 (vide as Figuras 7 e 8). As concentrações de ativo foram de mais de 50-500 nM. Observou-se forte efeito sobre a rede de neurites em quase todas as doses testadas (vide a Figura 7B). Observou-se ainda efeito em forma de sino sobre a hiperfosforilação de Tau com efeito máximo a 50-100 nM (vide a Figura 7D).[00307] The following results are obtained: - MR31193 exhibits strong neuroprotective effect (survival, neurites and synaptic network). As can be seen in Figures 1 and 2, the effect follows a bell-shaped curve with maximum effect observed at a concentration of 100 nM for survival and neurite network (Figures 1A-C). The maximum synapse network effect was obtained at lower concentrations (5 nM to 100 nM, Figure 2). There was also a significant effect on Tau hyperphosphorylation, with a maximum effect at 50 nM (see Figure 1D); - as can be seen in Figures 3 and 4, MR31176 exhibits a neuroprotective effect at high concentrations (survival, neuritis and synaptic network). There was also a significant effect on Tau hyperphosphorylation at high concentration (see Figure 3D); - as can be seen in Figures 5 and 6, MR31192 exhibits very strong neuroprotective effect at very low doses (eg 1-5 nM for survival, see Figure 5A). There was also a very large effect on the neurite network at each dose tested (see Figure 5B). This compound even exhibited a neurotrophic effect (induced neuritic growth), as can be seen in Figure 5C. The number of synapses also increased at low doses (1-5 nM, see Figure 6). An important effect on Tau hyperphosphorylation was also observed (see Figure 5D); - there was also a neuroprotective effect that follows a bell-shaped curve with MR33583 (see Figures 7 and 8). Active concentrations were over 50-500 nM. A strong effect on the neurite network was observed at almost all doses tested (see Figure 7B). There was also a bell-shaped effect on Tau hyperphosphorylation with maximum effect at 50-100 nM (see Figure 7D).

[00308] Estes resultados confirmam que todos os compostos da fórmula geral (I) testados são agentes neuroprotetores, em que os compostos MR31193, MR31192 e MR33583 são particularmente eficientes.These results confirm that all the compounds of the general formula (I) tested are neuroprotective agents, where the compounds MR31193, MR31192 and MR33583 are particularly efficient.

EXEMPLO 5 ESTE EXEMPLO EXIBE OS EFEITOS NEUROPROTETORES DOS COMPOSTOS MR31192 E MR36014.EXAMPLE 5 THIS EXAMPLE DISPLAYS THE NEUROPROTECTIVE EFFECTS OF COMPOUNDS MR31192 AND MR36014.

MATERIAL E MÉTODOS:MATERIAL AND METHODS:

[00309] Cultivo primário de neurônios hipocampais:[00309] Primary culture of hippocampal neurons:

[00310] Neurônios hipocampais de ratos foram cultivados conforme descrito por Callizot et al (2013), J. Neurosci. Res. 91: 706-716.[00310] Rat hippocampal neurons were cultured as described by Callizot et al (2013), J. Neurosci. Res. 91: 706-716.

Resumidamente, fêmeas de ratos grávidas com 17 dias de gestação (Ratos Wistar; Janvier Labs, França) foram mortas utilizando anestesia profunda com câmara de CO2 e deslocamento da cervical. Os fetos foram removidos em seguida do útero e imediatamente colocados em meio Leibovitz L15 gelado com uma solução de 2% de penicilina (10.000 U/ml) e estreptomicina (10 mg/ml) (PS) e 1% de albumina de soro bovino (BSA). Os hipocampos foram tratados por 20 minutos a 37 °C com uma solução de tripsina-EDTA em concentração final de 0,05% de tripsina e 0,02% de EDTA. A dissociação foi suspensa por meio da adição de meio Eagle modificado da Dulbecco (DMEM) com 4,5 g/l de glicose, que contém DNAse I grau II (concentração final de 0,5 mg/ml) e 10% de soro de feto bovino (FCS). As células foram dissociadas mecanicamente por três passagens forçadas através da ponta de uma pipeta de 10 ml.Briefly, pregnant female rats at 17 days of gestation (Wistar Rats; Janvier Labs, France) were killed using deep anesthesia with a CO2 chamber and cervical dislocation. The fetuses were then removed from the uterus and immediately placed in ice-cold Leibovitz L15 medium with a solution of 2% penicillin (10,000 U/ml) and streptomycin (10 mg/ml) (PS) and 1% bovine serum albumin ( BSA). Hippocampus were treated for 20 minutes at 37 °C with a trypsin-EDTA solution at a final concentration of 0.05% trypsin and 0.02% EDTA. Dissociation was stopped by the addition of Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/l of glucose, which contains DNAse I grade II (final concentration of 0.5 mg/ml) and 10% serum bovine fetus (FCS). Cells were mechanically dissociated by three forced passes through the tip of a 10 ml pipette.

[00311] As células foram centrifugadas a 515 x g por 10 min a 4 °C.Cells were centrifuged at 515 x g for 10 min at 4 °C.

O sobrenadante foi descartado e a pelota foi novamente suspensa em meio de cultivo definido que consiste em meio neurobasal com solução a 2% de suplemento B27, 2 mmol/l de L-glutamina, 2% de solução de PS e 10 ng/ml de fator neurotrófico cerebral (BDNF). Células viáveis foram contadas em um citômetro de Neubauer, utilizando o teste de exclusão de azul de tripano. Células foram semeadas em densidade de 20.000 por cavidade em placas com 96 cavidades previamente revestidas com poli-L-lisina e cultivadas a 37 °C em um incubador de ar (95%)-CO2 (5%).The supernatant was discarded and the pellet was resuspended in defined culture medium consisting of neurobasal medium with a 2% solution of B27 supplement, 2 mmol/l L-glutamine, 2% PS solution and 10 ng/ml of cerebral neurotrophic factor (BDNF). Viable cells were counted in a Neubauer cytometer using the trypan blue exclusion test. Cells were seeded at a density of 20,000 per well in 96-well plates previously coated with poly-L-lysine and cultured at 37°C in an air (95%)-CO2 (5%) incubator.

[00312] O meio foi alterado a cada dois dias. Para placas com 96 cavidades, apenas 60 cavidades foram utilizadas. As cavidades da primeira e da última linha e coluna não foram utilizadas (para evitar efeito de extremidades) e foram preenchidas com água esterilizada.[00312] The medium was changed every two days. For 96-well plates, only 60 wells were used. The wells of the first and last row and column were not used (to avoid extremity effect) and were filled with sterilized water.

[00313] Compostos de teste e exposição a Aβ 1-42 humano:[00313] Test compounds and exposure to human Aβ 1-42:

[00314] Compostos de teste: foram testados os compostos a seguir: - MR31192; - MR36014; e - Donepezil.Test compounds: the following compounds were tested: - MR31192; - MR36014; and - Donepezil.

[00315] Incubação prévia: no dia 17 de cultivo, os compostos foram dissolvidos no meio de cultivo e previamente incubados com neurônios hipocampais primários por uma hora, antes da exposição a Aβ 1-42.[00315] Previous incubation: on day 17 of culture, the compounds were dissolved in the culture medium and previously incubated with primary hippocampal neurons for one hour, before exposure to Aβ 1-42.

[00316] Danos: os neurônios hipocampais foram expostos a soluções de Aβ (conforme abaixo) após 17 dias de cultivo. A preparação Aβ 1- 42 foi realizada seguindo-se o procedimento descrito por Callizot et al (2013), J.[00316] Damage: Hippocampal neurons were exposed to Aβ solutions (as below) after 17 days of culture. The Aβ 1-42 preparation was performed following the procedure described by Callizot et al (2013), J.

Neurosci. Res. 91: 706-716. O número de bateladas do Aβ 1-42 utilizado neste estudo contém 10% de oligômeros (quantificação por meio de WB conforme realizado em Combes et al (2015), J. Neurosci. Res. 93: 633-643).Neurosci. Res. 91: 706-716. The number of batches of Aβ 1-42 used in this study contains 10% of oligomers (quantitation using WB as performed in Combes et al (2015), J. Neurosci. Res. 93: 633-643).

Resumidamente, o peptídeo Aβ 1-42 foi dissolvido no meio de cultivo definido mencionado acima, em concentração inicial de 40 µmol/l. Esta solução foi suavemente agitada por três dias a 37 °C no escuro e utilizada imediatamente após diluição adequada em meio de cultivo até as concentrações utilizadas (20 µmol/l ou 2,5 µmol/l correspondentes a 2 µmol/l ou 0,25 µmol/l de oligômeros (AβO), respectivamente). Adicionou-se preparação de Aβ 1-42 até concentração final de 20 ou 2,5 µmol/l (respectivamente, 2 µmol/l ou 0,25 µmol/l de AβO, determinados por meio de WB automático) diluída em meio controle na presença dos compostos.Briefly, the Aβ 1-42 peptide was dissolved in the defined culture medium mentioned above, at an initial concentration of 40 µmol/l. This solution was gently shaken for three days at 37 °C in the dark and used immediately after adequate dilution in culture medium to the concentrations used (20 µmol/l or 2.5 µmol/l corresponding to 2 µmol/l or 0.25 µmol/l of oligomers (AβO), respectively). Preparation of Aβ 1-42 was added to a final concentration of 20 or 2.5 µmol/l (respectively, 2 µmol/l or 0.25 µmol/l of AβO, determined by automatic WB) diluted in control medium at presence of the compounds.

AVALIAÇÃO DE OBJETIVOS:EVALUATION OF OBJECTIVES:

[00317] Em 24 horas após a intoxicação, os sobrenadantes foram retirados e imediatamente congelados para testes analíticos futuros. Eles foram mantidos a -20 °C por até seis meses. Os neurônios hipocampais foram fixados em seguida por uma solução fria de etanol (95%) e ácido acético (5%) por cinco minutos a -20 °C. Eles foram lavados novamente por duas vezes em PBS, permeabilizados em seguida e os locais não específicos foram bloqueados utilizando solução de PBS contendo 0,1% de saponina e 1% de FCS por 15 minutos à temperatura ambiente.[00317] Within 24 hours of intoxication, the supernatants were removed and immediately frozen for further analytical testing. They were kept at -20 °C for up to six months. Hippocampal neurons were then fixed by a cold solution of ethanol (95%) and acetic acid (5%) for five minutes at -20 °C. They were washed again twice in PBS, then permeabilized and non-specific sites were blocked using a PBS solution containing 0.1% saponin and 1% FCS for 15 minutes at room temperature.

[00318] Imunomanchas: MAP-2 / AT100 – após fixação e permeabilização, as células foram incubadas por duas horas com: - um anticorpo policlonal de galinha antiproteína associada a microtúbulos 2 (MAP-2) em diluição de 1/1000 em PBS contendo 1% de soro de feto bovino e 0,1% de saponina (esse anticorpo mancha especificamente corpos celulares e neurites, permitindo o estudo da morte de células neuronais e da rede de neurites); e - um anticorpo monoclonal de camundongo antifosfo Tau (AT100) em diluição de 1/100 em PBS que contém 1% de soro de feto bovino e 0,1% de saponina.[00318] Immunoblots: MAP-2 / AT100 - after fixation and permeabilization, the cells were incubated for two hours with: - a polyclonal anti-chicken microtubule-associated protein 2 (MAP-2) antibody in 1/1000 dilution in PBS containing 1% fetal bovine serum and 0.1% saponin (this antibody specifically stains cell bodies and neurites, allowing the study of neuronal cell death and the neurite network); and - a mouse monoclonal anti-phospho Tau antibody (AT100) at 1/100 dilution in PBS containing 1% fetal bovine serum and 0.1% saponin.

[00319] Esses anticorpos foram revelados com anti-IgG de camundongo de cabra Alexa Flúor 488 e anti-IgG de galinha de cabra Alexa Flúor 568 em diluição 1/400 em PBS contendo 1% de FCS e 0,1% de saponina por uma hora à temperatura ambiente.These antibodies were revealed with anti-goat mouse IgG Alexa Fluor 488 and anti-goat chicken IgG Alexa Fluor 568 at 1/400 dilution in PBS containing 1% FCS and 0.1% saponin by one hour at room temperature.

[00320] Para cada condição, 30 fotografias (que representam toda a área da cavidade) por cavidade foram tomadas utilizando ImageXpress® (Molecular Devices) com ampliação de 20x. Todas as imagens foram geradas utilizando os mesmos parâmetros de obtenção. A partir das imagens, análises foram realizadas direta e automaticamente utilizando Custom Module Editor® (Molecular Devices). Foram pesquisadas as leituras a seguir: - número total de neurônios (sobrevivência de neurônios, número de neurônios positivos para MAP-2); - rede de neurites (em µm de neurônios positivos para MAP- 2); e - área de AT100 (µm2, sobrepostos com neurônios positivos para MAP-2).[00320] For each condition, 30 photographs (which represent the entire cavity area) per cavity were taken using ImageXpress® (Molecular Devices) at 20x magnification. All images were generated using the same acquisition parameters. From the images, analyzes were performed directly and automatically using Custom Module Editor® (Molecular Devices). The following readings were searched: - total number of neurons (neuron survival, number of MAP-2 positive neurons); - neurite network (in µm of MAP-2 positive neurons); and - AT100 area (µm2, superimposed with MAP-2 positive neurons).

[00321] Imunomanchas: PSD95 e SYN – após fixação e permeabilização, as células foram incubadas por duas horas com: - um anticorpo monoclonal de camundongo antipós-sináptico com densidade de 95 kDa (PSD95) em diluição de 1/200 em PBS que contém 1% de soro de feto bovino e 0,1% de saponina; e - um anticorpo policlonal de coelho antissinaptofisina (SYN)[00321] Immunoblots: PSD95 and SYN - after fixation and permeabilization, the cells were incubated for two hours with: - an anti-post-synaptic mouse monoclonal antibody with a density of 95 kDa (PSD95) in 1/200 dilution in PBS containing 1% fetal bovine serum and 0.1% saponin; and - a polyclonal rabbit anti-synaptophysin (SYN) antibody

em diluição de 1/100 em PBS contendo 1% de soro de feto bovino e 0,1% de saponina.at 1/100 dilution in PBS containing 1% fetal bovine serum and 0.1% saponin.

[00322] Esses anticorpos foram revelados com anti-IgG de camundongo de cabra Alexa Flúor 488 e anti-IgG de coelho de cabra Alexa Flúor 568 em diluição 1/400 em PBS contendo 1% de FCS e 0,1% de saponina por uma hora à temperatura ambiente.These antibodies were revealed with Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit IgG at 1/400 dilution in PBS containing 1% FCS and 0.1% saponin per hour at room temperature.

[00323] Para cada condição, 40 fotografias por cavidade foram tomadas utilizando ImageXpress (Molecular Devices) com ampliação de 40x.[00323] For each condition, 40 photographs per cavity were taken using ImageXpress (Molecular Devices) at 40x magnification.

Todas as imagens foram tomadas com as mesmas condições. A avaliação das sinapses foi realizada automaticamente utilizando Custom Module Editor® (Molecular Devices). Foram determinados os objetivos a seguir: - número de sinapses (sobreposição entre PSD95/SYN).All images were taken under the same conditions. Synapse evaluation was performed automatically using Custom Module Editor® (Molecular Devices). The following objectives were determined: - number of synapses (overlapping between PSD95/SYN).

[00324] Análise estatística:[00324] Statistical analysis:

[00325] Todos os valores são expressos na forma de média +/- desvio padrão. Realizou-se análise estatística por meio de ANOVA de uma via, seguido por teste de Dunnett ou LSD de Fisher. p < 0,05 foi considerado significativo.[00325] All values are expressed as mean +/- standard deviation. Statistical analysis was performed using one-way ANOVA, followed by Dunnett's or Fisher's LSD test. p < 0.05 was considered significant.

[00326] Resultados:[00326] Results:

[00327] Como se pode observar nas Figuras 9 e 10, o composto MR31192 é ativo até concentração de 500 pM (sobrevivência e rede de neurites, vide as Figuras 9A, B e C) e redução significativa de hiperfosforilação de Tau (vide a Figura 9D) também é observada a 100 pM. Observa-se ainda efeito neuroprotetor sobre as sinapses a 500 pM (vide a Figura 10).[00327] As can be seen in Figures 9 and 10, the compound MR31192 is active up to a concentration of 500 pM (survival and neurite network, see Figures 9A, B and C) and significantly reduced Tau hyperphosphorylation (see Figure 9D) is also seen at 100 pM. There is also a neuroprotective effect on synapses at 500 pM (see Figure 10).

[00328] Consequentemente, o composto MR31192 é eficiente em doses muito baixas, particularmente em doses abaixo de 100 nM (100 pM a 500 pM). Nessas doses muito baixas, o MR31192 exibe efeito neuroprotetor similar ao observado com Donepezil, mas a 1 µM.Consequently, the compound MR31192 is efficient at very low doses, particularly at doses below 100 nM (100 pM to 500 pM). At these very low doses, MR31192 exhibits a neuroprotective effect similar to that seen with Donepezil, but at 1 µM.

[00329] Como se pode observar nas Figuras 11 e 12, o composto[00329] As can be seen in Figures 11 and 12, the compound

MR36014 (análogo de flúor de MR31192) exibe perfil neuroprotetor similar ao obtido com MR31192 em doses nanomolares. Observou-se ainda efeito neuroprotetor em doses picomolares. Este efeito é particularmente significativo para sobrevivência e rede de neurites (vide as Figuras 11A, B e C) e para hiperfosforilação de Tau (vide a Figura 11D). O efeito sobre as sinapses é significativo até concentração de 50 pM (vide a Figura 12). Nessas doses muito baixas, MR36014 exibe efeito neuroprotetor quase equivalente ao observado com Donepezil, mas a 1 µM.MR36014 (fluorine analogue of MR31192) exhibits a neuroprotective profile similar to that obtained with MR31192 at nanomolar doses. A neuroprotective effect was also observed in picomolar doses. This effect is particularly significant for survival and neurite network (see Figures 11A, B and C) and for Tau hyperphosphorylation (see Figure 11D). The effect on synapses is significant up to a concentration of 50 pM (see Figure 12). At these very low doses, MR36014 exhibits a neuroprotective effect almost equivalent to that seen with Donepezil, but at 1 µM.

[00330] Consequentemente, os dois compostos são ativos em doses muito baixas (em doses nanomolares e em doses picomolares), o que é particularmente interessante para evitar potencial toxicidade e/ou efeitos colaterais.[00330] Consequently, the two compounds are active at very low doses (in nanomolar doses and in picomolar doses), which is particularly interesting to avoid potential toxicity and/or side effects.

EXEMPLO 6EXAMPLE 6

[00331] Este exemplo exibe os efeitos neuroprotetores de MR36014 e MR33583 sobre neurônios positivos para TH dopaminérgicos lesionados com MPP+.This example displays the neuroprotective effects of MR36014 and MR33583 on TH-positive dopaminergic neurons injured with MPP+.

[00332] Mal de Parkinson (PD) é um distúrbio dos movimentos neurodegenerativo comum que afeta cerca de 1% da população com idade acima de 70 anos. É a segunda doença neurodegenerativa mais comum, depois do mal de Alzheimer. Os pacientes que sofrem de PD exibem sintomas de instabilidades motoras com tremores em repouso como primeiro sintoma em 70% dos casos. Outros sintomas clínicos são rigidez, bradiquinesia e instabilidade da postura, frequentemente incluindo enfraquecimento cognitivo, depressão e distúrbios do sono.Parkinson's disease (PD) is a common neurodegenerative movement disorder that affects about 1% of the population over the age of 70 years. It is the second most common neurodegenerative disease after Alzheimer's. Patients suffering from PD exhibit symptoms of motor instabilities with tremors at rest as the first symptom in 70% of cases. Other clinical symptoms are stiffness, bradykinesia, and postural instability, often including cognitive impairment, depression, and sleep disturbances.

[00333] Embora os mecanismos patológicos que geram degeneração de substância negra (SN) possam ser muitos, diversos processos são considerados principais: agregação de proteínas ligada a enfraquecimentos proteassomais, distúrbios mitocondriais (também causados por toxinas de DA específicas) e enfraquecimento da liberação de dopamina (DA).[00333] Although the pathological mechanisms that generate degeneration of the substantia nigra (SN) may be many, several processes are considered major: protein aggregation linked to proteasomal weakness, mitochondrial disorders (also caused by specific DA toxins) and weakened release of dopamine (DA).

[00334] Conforme confirmado por Dauer e Przedborski (2003), Neuron 39: 889-909, toxinas específicas de neurônios dopaminérgicos (toxinas de DA), particularmente 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetra-hidropiridina (MPTP, a pró- droga da neurotoxina MPP+), 6-hidroxidopamina (6-OHDA) ou rotenona, causam parkinsonismo em seres humanos. Essas toxinas são muito utilizadas por cientistas para imitar experimentalmente a patologia em animais. Qualquer substância redutora da neurotoxicidade de toxina de DA pode ser útil como agente terapêutico novo para o tratamento ou prevenção de PD.[00334] As confirmed by Dauer and Przedborski (2003), Neuron 39: 889-909, specific toxins of dopaminergic neurons (DA toxins), particularly 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetra- hydropyridine (MPTP, the prodrug of the MPP+ neurotoxin), 6-hydroxydopamine (6-OHDA), or rotenone, cause parkinsonism in humans. These toxins are widely used by scientists to experimentally mimic pathology in animals. Any DA toxin neurotoxicity-reducing substance can be useful as a novel therapeutic agent for the treatment or prevention of PD.

[00335] O objeto do presente estudo foi de investigar o efeito neuroprotetor de MR36014 e MR33583 (em quatro concentrações) sobre neurônios positivos para TH dopaminérgicos lesionados com MPP +. Os compostos de teste foram previamente incubados por uma hora antes da aplicação de MPP+ (4 µM por 48 horas). O efeito neuroprotetor (sobrevivência e rede de neurites) de compostos de teste foi pesquisado. Além disso, o efeito sobre o acúmulo de alfa-sinucleína citoplasmático foi estudado.[00335] The object of the present study was to investigate the neuroprotective effect of MR36014 and MR33583 (at four concentrations) on TH-positive dopaminergic neurons injured with MPP+. Test compounds were previously incubated for one hour before applying MPP+ (4 µM for 48 hours). The neuroprotective effect (survival and neurite network) of test compounds was investigated. Furthermore, the effect on cytoplasmic alpha-synuclein accumulation was studied.

[00336] Materiais e método:[00336] Materials and method:

[00337] Cultivo primário de neurônios mesencefálicos:[00337] Primary culture of mesencephalic neurons:

[00338] Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com o Guia de Uso e Cuidados com Animais de Laboratório do National Institutes of Health e seguiram as regulamentações atuais da União Europeia (Norma 2010/63/EU). Número do contrato: A1301310.[00338] All experiments were conducted in accordance with the National Institutes of Health Laboratory Animal Care and Use Guide and followed current European Union regulations (Standard 2010/63/EU). Contract number: A1301310.

[00339] Neurônios dopaminérgicos de ratos foram cultivados conforme descrito por Callizot et al (2019), PLoS One 14: e0215277 e Visanji et al (2008), FASEB J. 22: 2488-2497. Resumidamente, fêmeas de ratos grávidas (Wistar) com 15 dias de gestação foram mortas utilizando anestesia profunda com câmara de CO2 e deslocamento da cervical. Os mesencéfalos obtidos de embriões de ratos com 15 dias de idade (Janvier, França) foram dissecados sob microscópio. Os mesencéfalos embriônicos foram removidos e colocados em meio gelado de Leibovitz (L15) contendo 2% de penicilina-estreptomicina (PS) e albumina de soro bovino a 1% (BSA). A parte ventral da flexão mesencefálica, região do cérebro em desenvolvimento rica em neurônios dopaminérgicos, foi utilizada para as preparações celulares.[00339] Rat dopaminergic neurons were cultured as described by Callizot et al (2019), PLoS One 14: e0215277 and Visanji et al (2008), FASEB J. 22: 2488-2497. Briefly, pregnant female rats (Wistar) with 15 days of gestation were killed using deep anesthesia with CO2 chamber and cervical dislocation. Midbrains obtained from 15-day-old rat embryos (Janvier, France) were dissected under a microscope. Embryonic midbrains were removed and placed in ice-cold Leibovitz medium (L15) containing 2% penicillin-streptomycin (PS) and 1% bovine serum albumin (BSA). The ventral part of the mesencephalic flexion, a developing brain region rich in dopaminergic neurons, was used for cell preparations.

[00340] Os mesencéfalos foram dissociados por meio de tripsinação por 20 minutos a 37 °C (solução em concentração final de 0,05% de tripsina e 0,02% de EDTA). A reação foi suspensa por meio da adição de meio Eagle modificado da Dulbecco (DMEM) contendo DNAse I grau II (0,5 mg/ml) e soro de feto bovino a 10% (FCS). As células foram dissociadas mecanicamente por três passagens através de uma pipeta de 10 ml. As células foram centrifugadas em seguida a 180 x g por 10 min a 4 °C sobre uma camada de BSA (3,5%) em meio L15. O sobrenadante foi descartado e as pelotas celulares foram novamente suspensas em meio de cultivo definido que consiste em neurobasal suplementado com B27 (2%), L-glutamina (2 mM), solução de PS a 2%, 10 ng/ml de fator neurotrófico cerebral (BDNF) e 1 ng/ml de fator neurotrófico derivado de glial (GDNF). Células viáveis foram contadas em um citômetro de Neubauer, utilizando o teste de exclusão de azul de tripano. As células foram semeadas em densidade de 40.000 células/cavidade em placas com 96 cavidades (previamente revestidas com poli-L-lisina) e mantidas em uma incubadora umidificada a 37 °C em atmosfera de 5% de CO2/95% de ar. A metade do meio foi alterada a cada dois dias com meio novo.[00340] The midbrain were dissociated by trypsination for 20 minutes at 37 °C (solution in final concentration of 0.05% trypsin and 0.02% EDTA). The reaction was stopped by adding Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) containing DNAse I grade II (0.5 mg/ml) and 10% fetal bovine serum (FCS). Cells were mechanically dissociated by three passes through a 10 ml pipette. The cells were then centrifuged at 180 x g for 10 min at 4 °C over a layer of BSA (3.5%) in L15 medium. The supernatant was discarded and the cell pellets were resuspended in defined culture medium consisting of neurobasal supplemented with B27 (2%), L-glutamine (2 mM), 2% PS solution, 10 ng/ml neurotrophic factor (BDNF) and 1 ng/ml of glial-derived neurotrophic factor (GDNF). Viable cells were counted in a Neubauer cytometer using the trypan blue exclusion test. Cells were seeded at a density of 40,000 cells/well in 96-well plates (previously coated with poly-L-lysine) and kept in a humidified incubator at 37°C in an atmosphere of 5% CO2/95% air. Middle half was changed every other day with new medium.

[00341] Resumindo, no dia 6 de cultivo, o meio foi removido e adicionou-se meio novo, com ou sem compostos de teste e com ou sem MPP + por 48 horas diluídos em meio controle. Foram avaliadas seis cavidades por condição.[00341] In summary, on day 6 of culture, the medium was removed and new medium was added, with or without test compounds and with or without MPP + for 48 hours diluted in control medium. Six cavities per condition were evaluated.

[00342] Compostos de teste e exposição de MPP+:[00342] MPP+ Test and Exposure Compounds:

[00343] Incubação prévia: no dia 6 de cultivo, os compostos foram diluídos no meio de cultivo e previamente incubados com neurônios dopaminérgicos primários por uma hora, antes da exposição a MPP+.[00343] Previous incubation: on day 6 of culture, the compounds were diluted in the culture medium and previously incubated with primary dopaminergic neurons for one hour, before exposure to MPP+.

[00344] Danos: em uma hora após compostos de teste, MPP+ foi adicionado a uma concentração final de 4 µM, diluído em meio de cultivo na presença de compostos por 48 horas.[00344] Damage: in one hour after test compounds, MPP+ was added to a final concentration of 4 µM, diluted in culture medium in the presence of compounds for 48 hours.

[00345] Organização de placas de cultivo:[00345] Organization of cultivation plates:

[00346] Compostos de teste foram testados em uma placa com 96 cavidades (n = 6 cavidades de cultivo por condição). MR36014 e MR33583 foram previamente incubados por uma hora antes da intoxicação com MPP+. Foram determinadas as condições a seguir: PLACA 1 (TH/α-syn) Controle (veículo) + MPP+ (4 µM, 48 h) / veículo + MPP+ (4 µM, 48 h) / MR36014 500 pM + MPP+ (4 µM, 48 h) / MR36014 1 nM + MPP+ (4 µM, 48 h) / MR36014 5 nM + MPP+ (4 µM, 48 h) / MR36014 10 nM + MPP+ (4 µM, 48 h) / MR33583 500 pM + MPP+ (4 µM, 48 h) / MR33583 1 nM + MPP+ (4 µM, 48 h) / MR33583 5 nM + MPP+ (4 µM, 48 h) / MR33583 10 nMTest compounds were tested in a 96-well plate (n = 6 culture wells per condition). MR36014 and MR33583 were pre-incubated for one hour before intoxication with MPP+. The following conditions were determined: PLATE 1 (TH/α-syn) Control (vehicle) + MPP+ (4 µM, 48 h) / vehicle + MPP+ (4 µM, 48 h) / MR36014 500 pM + MPP+ (4 µM, 48 h) / MR36014 1 nM + MPP+ (4 µM, 48 h) / MR36014 5 nM + MPP+ (4 µM, 48 h) / MR36014 10 nM + MPP+ (4 µM, 48 h) / MR33583 500 pM + MPP+ (4 µM, 48 h) / MR33583 1 nM + MPP+ (4 µM, 48 h) / MR33583 5 nM + MPP+ (4 µM, 48 h) / MR33583 10 nM

[00347] Avaliação de objetivos:[00347] Evaluation of objectives:

[00348] Após 48 horas de intoxicação, os sobrenadantes de cultivo celular foram retirados e imediatamente congelados para análises futuras. As células foram fixadas por uma solução de paraformaldeído a 4% em PBS, pH = 7,3 por 20 minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas por duas vezes em PBS. Realizou-se permeabilização da membrana celular e bloqueio de locais não específicos utilizando uma solução de PBS contendo 0,1% de saponina e 1% de FCS por 15 minutos à temperatura ambiente.[00348] After 48 hours of intoxication, cell culture supernatants were removed and immediately frozen for further analysis. Cells were fixed by a 4% solution of paraformaldehyde in PBS, pH = 7.3 for 20 minutes at room temperature. Cells were washed twice in PBS. Cell membrane permeabilization and blocking of non-specific sites were performed using a PBS solution containing 0.1% saponin and 1% FCS for 15 minutes at room temperature.

[00349] Imunomanchas: TH e α-syn – os cultivos foram incubados com: - anticorpo monoclonal antitirosina hidroxilase (THF) produzido em camundongos em diluição de 1/10.000 em PBS contendo 1% de FCS e 0,1% de saponina por duas horas à temperatura ambiente; e - anticorpo policlonal antialfa sinucleína (α-syn) produzido em coelhos sob diluição de 1/200 em PBS contendo 1% de FCS e 0,1% de saponina por duas horas à temperatura ambiente.[00349] Immunoblots: TH and α-syn - cultures were incubated with: - monoclonal antibody anti-tyrosine hydroxylase (THF) produced in mice at a dilution of 1/10,000 in PBS containing 1% FCS and 0.1% saponin for two hours at room temperature; and - polyclonal anti-alpha synuclein antibody (α-syn) produced in rabbits at 1/200 dilution in PBS containing 1% FCS and 0.1% saponin for two hours at room temperature.

[00350] Esses anticorpos foram revelados com anti-IgG de camundongo de cabra Alexa Flúor 488 em diluição 1/800 e anti-IgG de coelho de cabra Alexa Flúor 568 em diluição 1/400 em PBS contendo 1% de FCS e 0,1% de saponina por uma hora à temperatura ambiente.These antibodies were revealed with anti-goat mouse IgG Alexa Fluor 488 at 1/800 dilution and anti-goat rabbit IgG Alexa Fluor 568 at 1/400 dilution in PBS containing 1% FCS and 0.1 % saponin for one hour at room temperature.

[00351] Análise computadorizada automática: para cada condição, 20 fotografias (que representam a área total da cavidade) são automaticamente tomadas utilizando ImageXpress® (Molecular Devices) em ampliação de 10x (20 fotografias) utilizando os mesmos parâmetros de obtenção. A partir das imagens, análises foram realizadas direta e automaticamente utilizando Custom Module Editor® (Molecular Devices). Foram medidas as leituras a seguir: - análise do número total de neurônios TH (neurônios positivos para TH); - rede de neurites total de neurônios positivos para TH (em µm); e - agregação de α-syn (área de sobreposição entre TH e manchas de α-syn, em µm2).[00351] Automatic computerized analysis: for each condition, 20 photographs (representing the total cavity area) are automatically taken using ImageXpress® (Molecular Devices) at 10x magnification (20 photographs) using the same acquisition parameters. From the images, analyzes were performed directly and automatically using Custom Module Editor® (Molecular Devices). The following readings were measured: - analysis of the total number of TH neurons (TH positive neurons); - total neurite network of TH-positive neurons (in µm); and - α-syn aggregation (area of overlap between TH and α-syn spots, in µm2).

[00352] Análise estatística:[00352] Statistical analysis:

[00353] Todos os valores são expressos na forma de média +/-[00353] All values are expressed as an average +/-

desvio padrão. Realizou-se análise estatística por meio de ANOVA de uma via, seguido por teste de Dunnett ou LSD de Fisher. p < 0,05 foi considerado significativo.standard deviation. Statistical analysis was performed using one-way ANOVA, followed by Dunnett's or Fisher's LSD test. p < 0.05 was considered significant.

[00354] Resultados:[00354] Results:

[00355] Efeito de MR36014 sobre a sobrevivência, rede de neurites e agregação de α-syn de neurônios TH após lesão com MPP+:[00355] Effect of MR36014 on survival, neurite network and α-syn aggregation of TH neurons after MPP+ injury:

[00356] A aplicação de MPP+ induziu clara neurotoxicidade sobre neurônios dopaminérgicos, conforme observado por sobrevivência reduzida (Figura 13A), perda da rede de neurites (Figura 13B) e acúmulo patológico de α- syn (Figura 13C) conforme exibido anteriormente (Callizot et al (2019), PLoS One 14: e0215277).[00356] The application of MPP+ induced clear neurotoxicity on dopaminergic neurons, as observed by reduced survival (Figure 13A), loss of the neurite network (Figure 13B) and pathological accumulation of α-syn (Figure 13C) as previously shown (Callizot et al (2019), PLoS One 14: e0215277).

[00357] A aplicação de MR36014 apresentou forte efeito neuroprotetor geral sobre neurônios TH, pois esse composto aumentou a sobrevivência de neurônios TH (de 1 nM para 10 nM), protegeu sua rede de neurites (todas as doses pesquisadas) e reduziu o acúmulo de α-syn (todas as doses pesquisadas).[00357] The application of MR36014 showed a strong general neuroprotective effect on TH neurons, as this compound increased the survival of TH neurons (from 1 nM to 10 nM), protected their neurite network (all researched doses) and reduced the accumulation of α-syn (all doses searched).

[00358] Efeito de MR33583 sobre a sobrevivência, rede de neurites e agregação de α-syn de neurônios TH após lesão com MPP+:[00358] Effect of MR33583 on survival, neurite network and α-syn aggregation of TH neurons after MPP+ injury:

[00359] Após lesão de MPP+, MR33583 aumentou a sobrevivência neuronal (100 nM, vide a Figura 14A) e protegeu parcialmente a rede de neurites (de 10 nM para 100 nM, vide a Figura 14B). Observou-se também efeito positivo de MR33583 sobre a agregação de α-syn (50 nM e 100 nM, vide a Figura 14C).After MPP+ injury, MR33583 increased neuronal survival (100 nM, see Figure 14A) and partially protected the neurite network (from 10 nM to 100 nM, see Figure 14B). A positive effect of MR33583 on α-syn aggregation was also observed (50 nM and 100 nM, see Figure 14C).

[00360] Análise:[00360] Analysis:

[00361] O objeto do estudo foi pesquisar os efeitos neuroprotetores de MR36014 e MR33583 em um modelo in vitro de mal de Parkinson.[00361] The object of the study was to investigate the neuroprotective effects of MR36014 and MR33583 in an in vitro model of Parkinson's disease.

[00362] Este estudo demonstra que: - os dois compostos combatem a toxicidade de MPP + sobre neurônios dopaminérgicos;[00362] This study demonstrates that: - the two compounds combat the toxicity of MPP + on dopaminergic neurons;

- MR36014 é mais potente que MR33583, pois esse composto exibiu eficácia mais alta sobre a promoção da sobrevivência de neurônios TH; e - MR36014 foi ativo em doses mais baixas que MR33583.- MR36014 is more potent than MR33583 as this compound exhibited higher efficacy in promoting the survival of TH neurons; and - MR36014 was active at lower doses than MR33583.

[00363] Por fim, este estudo demonstrou que MR36014 e MR33583 são possíveis drogas interessantes para mal de Parkinson e MR36014 é mais ativo que MR33583.Finally, this study demonstrated that MR36014 and MR33583 are possible interesting drugs for Parkinson's disease and MR36014 is more active than MR33583.

EXEMPLO 7EXAMPLE 7

[00364] Este exemplo descreve a avaliação de efeitos neuroprotetores de compostos MR36014 e MR33583 sobre neurônios corticais primários de ratos após lesão por glutamato.[00364] This example describes the evaluation of neuroprotective effects of compounds MR36014 and MR33583 on primary cortical neurons of rats after glutamate injury.

[00365] O sistema glutamatérgico e, particularmente, os receptores de NMDA (receptores glutamatérgicos) possuem papel importante nos processos de aprendizado e memória. A plasticidade sináptica pode ser regulada por meio de sinalização de receptores de NMDA. Ativação excessiva de receptores de NMDA e excitoxicidade glutamatérgica, entretanto, é uma característica patológica comum em doenças neurodegenerativas (Lewerenz e Maher (2015), Front Neurosci. 9: 469).[00365] The glutamatergic system and particularly the NMDA receptors (glutamatergic receptors) play an important role in the processes of learning and memory. Synaptic plasticity can be regulated through NMDA receptor signaling. Excessive activation of NMDA receptors and glutamatergic excitotoxicity, however, is a common pathological feature in neurodegenerative diseases (Lewerenz and Maher (2015), Front Neurosci. 9: 469).

[00366] A excitoxicidade de glutamato foi relacionada a lesões neurológicas agudas de isquemia e lesões cerebrais traumáticas e na neurodegeneração crônica em mal de Alzheimer (AD) e mal de Huntington (HD).[00366] Glutamate excitotoxicity has been linked to acute neurological injuries from ischemia and traumatic brain injuries and to chronic neurodegeneration in Alzheimer's disease (AD) and Huntington's disease (HD).

A morte neuronal excitotóxica por meio de ativação excessiva de NMDAR contribui para o fluxo excessivo de cálcio (Ca2+) para a célula. Isso aciona uma série de reações que resultam em morte celular, incluindo maior tensão oxidativa, ativação inadequada de proteases tais como calpaína, desregulagem de processos relativos a Ca2+, lesões mitocondriais e uma cascata apoptótica.Excitotoxic neuronal death through excessive activation of NMDAR contributes to excessive calcium (Ca2+) flux into the cell. This triggers a series of reactions that result in cell death, including increased oxidative stress, inappropriate activation of proteases such as calpain, dysregulation of processes related to Ca2+, mitochondrial damage, and an apoptotic cascade.

[00367] Desta forma, tratamento farmacológico inicial com substâncias redutoras da excitotoxicidade de glutamato, poderá representar opção muito boa para aumentar a sobrevivência neuronal (e aumentar a função cognitiva) e poderá representar interessante estratégia terapêutica para pacientes diagnosticados com mal de Alzheimer (Wang e Reddy (2017), J.[00367] Thus, initial pharmacological treatment with substances that reduce glutamate excitotoxicity, may represent a very good option to increase neuronal survival (and increase cognitive function) and may represent an interesting therapeutic strategy for patients diagnosed with Alzheimer's disease (Wang and Reddy (2017), J.

Alzheimers Dis. 57: 1041-1048).Alzheimers Dis. 57: 1041-1048).

[00368] O presente estudo determina o efeito neuroprotetor de MR36014 e MR33583 (em quatro concentrações) em neurônios corticais primários de ratos após lesão por glutamato. Os compostos de teste foram previamente incubados por uma hora antes da aplicação de glutamato (20 µM por 20 minutos). O efeito neuroprotetor (sobrevivência e rede de neurites) de compostos de teste foi pesquisado.[00368] The present study determines the neuroprotective effect of MR36014 and MR33583 (at four concentrations) on primary cortical neurons of rats after glutamate injury. Test compounds were pre-incubated for one hour before glutamate application (20 µM for 20 minutes). The neuroprotective effect (survival and neurite network) of test compounds was investigated.

[00369] Materiais e método:[00369] Materials and method:

[00370] Cultivo primário de neurônios corticais:[00370] Primary culture of cortical neurons:

[00371] Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com o Guia de Uso e Cuidados com Animais de Laboratório do National Institutes of Health e seguiram as regulamentações atuais da União Europeia (Norma 2010/63/EU). Número do contrato: A1301310.[00371] All experiments were conducted in accordance with the National Institutes of Health Laboratory Animal Care and Use Guide and followed current European Union regulations (Standard 2010/63/EU). Contract number: A1301310.

[00372] Neurônios corticais de ratos foram cultivados conforme descrito por Callizot et al (2013), J. Neurosci. Res. 91: 706-716. Fêmeas de ratos grávidas (Wistar) com 15 dias de gestação foram mortas utilizando anestesia profunda com câmara de CO2 e deslocamento da cervical. Resumidamente, os fetos foram coletados e imediatamente colocados em meio Leibovitz L15 gelado com uma solução de 2% de penicilina (10.000 U/ml) e estreptomicina (10 mg/ml) (PS) e 1% de albumina de soro bovino (BSA). O córtex foi tratado por 20 minutos a 37 °C com uma solução de tripsina-EDTA em concentração final de 0,05% de tripsina e 0,02% de EDTA. A dissociação foi suspensa por meio da adição de meio Eagle modificado da Dulbecco (DMEM) com 4,5 g/l de glicose, que contém DNAse I grau II (concentração final de 0,5 mg/ml) e 10% de soro de feto bovino (FCS). As células foram dissociadas mecanicamente por três passagens forçadas através da ponta de uma pipeta de 10 ml. As células foram centrifugadas a 515 x g por 10 min a 4 °C. O sobrenadante foi descartado e a pelota foi novamente suspensa em meio de cultivo definido que consiste em meio neurobasal com solução a 2% de suplemento B27, 2 mmol/l de L-glutamina, 2% de solução de PS e 10 ng/ml de fator neurotrófico cerebral (BDNF). Células viáveis foram contadas em um citômetro de Neubauer, utilizando o teste de exclusão de azul de tripano.[00372] Rat cortical neurons were cultured as described by Callizot et al (2013), J. Neurosci. Res. 91: 706-716. Pregnant female rats (Wistar) with 15 days of gestation were killed using deep anesthesia with a CO2 chamber and cervical dislocation. Briefly, fetuses were collected and immediately placed in ice-cold Leibovitz L15 medium with a solution of 2% penicillin (10,000 U/ml) and streptomycin (10 mg/ml) (PS) and 1% bovine serum albumin (BSA) . The cortex was treated for 20 minutes at 37 °C with a trypsin-EDTA solution at a final concentration of 0.05% trypsin and 0.02% EDTA. Dissociation was stopped by the addition of Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/l of glucose, which contains DNAse I grade II (final concentration of 0.5 mg/ml) and 10% serum bovine fetus (FCS). Cells were mechanically dissociated by three forced passes through the tip of a 10 ml pipette. Cells were centrifuged at 515 x g for 10 min at 4 °C. The supernatant was discarded and the pellet was resuspended in defined culture medium consisting of neurobasal medium with a 2% solution of B27 supplement, 2 mmol/l L-glutamine, 2% PS solution and 10 ng/ml of cerebral neurotrophic factor (BDNF). Viable cells were counted in a Neubauer cytometer using the trypan blue exclusion test.

[00373] As células foram semeadas em densidade de 25.000 por cavidade em placas com 96 cavidades previamente revestidas com poli-L-lisina e cultivadas a 37 °C em um incubador de ar (95%)-CO2 (5%).Cells were seeded at a density of 25,000 per well in 96-well plates previously coated with poly-L-lysine and grown at 37°C in an air (95%)-CO2 (5%) incubator.

[00374] Para evitar o efeito de extremidades, as primeira e última colunas, bem como as primeira e última linhas da placa, não foram utilizadas no estudo. Cavidades vazias foram preenchidas com água.[00374] To avoid the effect of ends, the first and last columns, as well as the first and last lines of the plate, were not used in the study. Empty wells were filled with water.

[00375] O meio foi alterado a cada dois dias. Os neurônios corticais foram lesionados com soluções de Aβ (conforme abaixo) após 11 dias de cultivo.[00375] The medium was changed every two days. Cortical neurons were injured with Aβ solutions (as below) after 11 days of culture.

[00376] Compostos de teste e exposição de glutamato:[00376] Test compounds and glutamate exposure:

[00377] Incubação prévia: no dia 13 de cultivo, os compostos foram dissolvidos no meio de cultivo e previamente incubados com neurônios corticais primários por uma hora, antes da exposição a glutamato.[00377] Previous incubation: on day 13 of culture, the compounds were dissolved in the culture medium and previously incubated with primary cortical neurons for one hour, before exposure to glutamate.

[00378] Danos: uma hora após a incubação do composto de teste, adicionou-se glutamato até concentração final de 20 µM diluído em meio de controle, ainda na presença dos compostos de teste por 20 minutos. Após 20 minutos, glutamato foi lavado e meio de cultivo novo com os compostos de teste foi adicionado por mais 48 horas.[00378] Damage: one hour after incubation of the test compound, glutamate was added to a final concentration of 20 µM diluted in control medium, still in the presence of the test compounds for 20 minutes. After 20 minutes, glutamate was washed away and fresh culture medium with test compounds was added for a further 48 hours.

[00379] Organização de placas de cultivo:[00379] Organization of cultivation plates:

[00380] Compostos de teste foram testados em uma placa com 96 cavidades (n = 6 cavidades de cultivo por condição). Foram determinadas as condições a seguir:[00380] Test compounds were tested in a 96-well plate (n = 6 culture wells per condition). The following conditions were determined:

PLACA 1 (MAP-2) Controle (veículo) + Glutamato (20 µM, 20 min) / veículo + Glutamato (20 µM, 20 min) / MR36014 500pM + Glutamato (20 µM, 20 min) / MR36014 1 nM + Glutamato (20 µM, 20 min) / MR36014 5 nM + Glutamato (20 µM, 20 min) / MR36014 10 nM + Glutamato (20 µM, 20 min) / MR33583 1 nM + Glutamato (20 µM, 20 min) / MR33583 10 nM + Glutamato (20 µM, 20 min) / MR33583 50 nM + Glutamato (20 µM, 20 min) / MR33583 100 nMPLATE 1 (MAP-2) Control (vehicle) + Glutamate (20 µM, 20 min) / vehicle + Glutamate (20 µM, 20 min) / MR36014 500pM + Glutamate (20 µM, 20 min) / MR36014 1 nM + Glutamate ( 20 µM, 20 min) / MR36014 5 nM + Glutamate (20 µM, 20 min) / MR36014 10 nM + Glutamate (20 µM, 20 min) / MR33583 1 nM + Glutamate (20 µM, 20 min) / MR33583 10 nM + Glutamate (20 µM, 20 min) / MR33583 50 nM + Glutamate (20 µM, 20 min) / MR33583 100 nM

[00381] Avaliação de objetivos:[00381] Evaluation of objectives:

[00382] Imunomanchas: MAP-2 (sobrevivência e rede de neurites) – em 48 horas após a intoxicação, os sobrenadantes de cultivo celular foram retirados e imediatamente congelados para análises futuras. Células foram fixadas por uma solução fria de etanol (95%) e ácido acético (5%) por cinco minutos a -20 °C. As células foram lavadas por duas vezes em PBS. As células foram permeabilizadas e locais de ligação não específicos foram bloqueados com uma solução de PBS contendo 0,1% de saponina e 1% de FCS por 15 minutos à temperatura ambiente.[00382] Immunoblots: MAP-2 (survival and neurite network) - within 48 hours after intoxication, cell culture supernatants were removed and immediately frozen for further analysis. Cells were fixed by a cold solution of ethanol (95%) and acetic acid (5%) for five minutes at -20 °C. Cells were washed twice in PBS. Cells were permeabilized and non-specific binding sites were blocked with a PBS solution containing 0.1% saponin and 1% FCS for 15 minutes at room temperature.

[00383] Os cultivos foram incubados por duas horas com um anticorpo monoclonal de camundongo antiproteína associada a microtúbulos 2 (MAP-2), em diluição de 1/400, em PBS contendo 1% de soro de feto bovino e 0,1% de saponina. Este anticorpo foi revelado com anti-IgG de camundongo de cabra Alexa Flúor (diluição 1/400) em PBS contendo 1% de FCS e 0,1% de saponina por uma hora à temperatura ambiente. MAP-2 é um marcador neuronal presente nos corpos celulares e neurites de neurônios, que permitem o estudo da sobrevivência neuronal e do comprimento da rede de neurites.[00383] The cultures were incubated for two hours with a mouse monoclonal anti-microtubule-associated protein 2 (MAP-2), at a dilution of 1/400, in PBS containing 1% fetal bovine serum and 0.1% saponin. This antibody was revealed with Alexa Fluorine goat anti-mouse IgG (1/400 dilution) in PBS containing 1% FCS and 0.1% saponin for one hour at room temperature. MAP-2 is a neuronal marker present in the cell bodies and neurites of neurons, which allows the study of neuronal survival and the length of the neurite network.

[00384] Análise computadorizada automática – para cada condição, 30 fotografias (que representam toda a área da cavidade) por cavidade foram tomadas utilizando ImageXpress® (Molecular Devices) com ampliação de 20x. Todas as imagens serão geradas utilizando os mesmos parâmetros de obtenção. A partir das imagens, análises foram realizadas direta e automaticamente utilizando Custom Module Editor® (Molecular Devices).[00384] Automatic computer analysis - for each condition, 30 photographs (representing the entire cavity area) per cavity were taken using ImageXpress® (Molecular Devices) at 20x magnification. All images will be generated using the same acquisition parameters. From the images, analyzes were performed directly and automatically using Custom Module Editor® (Molecular Devices).

[00385] Serão pesquisadas as leituras a seguir: - sobrevivência total de neurônios (positivo para MAP-2, número) (os dados serão expressos em número médio de neurônios de 30 fotografias por cavidade); e - a rede total de neurites (MAP-2 em µm) (os dados serão expressos em média de neurônios de 30 fotografias por cavidade).[00385] The following readings will be searched: - total survival of neurons (positive for MAP-2, number) (data will be expressed in average number of neurons of 30 photographs per well); and - the total network of neurites (MAP-2 in µm) (data will be expressed as an average of neurons from 30 photographs per cavity).

[00386] Análise estatística:[00386] Statistical analysis:

[00387] Todos os valores são expressos na forma de média +/- desvio padrão. Realizou-se análise estatística por meio de ANOVA de uma via, seguido por teste de Dunnett ou LSD de Fisher. p < 0,05 foi considerado significativo.[00387] All values are expressed as mean +/- standard deviation. Statistical analysis was performed using one-way ANOVA, followed by Dunnett's or Fisher's LSD test. p < 0.05 was considered significant.

[00388] Resultados:[00388] Results:

[00389] Efeitos de MR36014 e MR33583 sobre neurônios corticais lesionados com glutamato:[00389] Effects of MR36014 and MR33583 on glutamate-injured cortical neurons:

[00390] A lesão glutamatérgica induziu perda de neurônios corticais (Figuras 15A e 15C; 32% da morte neuronal) e contração da rede de neurites total (Figuras 15B e 15D; 38% de perda de neurites).[00390] The glutamatergic lesion induced loss of cortical neurons (Figures 15A and 15C; 32% of neuronal death) and contraction of the total neurite network (Figures 15B and 15D; 38% of neurite loss).

[00391] Sobrevivência dos neurônios: MR36014, adicionado uma hora antes de glutamato e mantido por 48 horas após a aplicação de glutamato, protegeu significativamente os neurônios corticais contra a morte a 1 nM (vide a Figura 15A). Sob as mesmas condições experimentais, MR33583 protegeu significativamente os neurônios corticais da morte a 50 nM e 100 nM (vide a Figura 15C).[00391] Neuron survival: MR36014, added one hour before glutamate and held for 48 hours after glutamate application, significantly protected cortical neurons against death at 1 nM (see Figure 15A). Under the same experimental conditions, MR33583 significantly protected cortical neurons from death at 50 nM and 100 nM (see Figure 15C).

[00392] Rede de neurites: todas as concentrações testadas de MR36014 (500 pM a 10 nM) protegeram significativamente a rede de neurites com efeito máximo a 1 nM (vide a Figura 15B). MR33583 protegeu significativamente a rede de neurites de 1 nM a 100 nM. O efeito seguiu uma curva com forma de sino com efeito máximo a 50 nM (vide a Figura 15D).Neurite network: All tested concentrations of MR36014 (500 pM to 10 nM) significantly protected the neurite network with maximum effect at 1 nM (see Figure 15B). MR33583 significantly protected the neurite network from 1 nM to 100 nM. The effect followed a bell-shaped curve with maximum effect at 50 nM (see Figure 15D).

[00393] Análise:[00393] Analysis:

[00394] O objetivo do estudo foi pesquisar os efeitos neuroprotetores de MR36014 e MR33583 em um modelo in vitro de tensão neuronal induzida por excitotoxicidade glutamatérgica. A tensão glutamatérgica é uma característica patológica presente em diferentes doenças neurológicas, incluindo mal de Alzheimer e isquemia cerebral.The aim of the study was to investigate the neuroprotective effects of MR36014 and MR33583 in an in vitro model of neuronal stress induced by glutamatergic excitotoxicity. Glutamatergic tension is a pathological feature present in different neurological diseases, including Alzheimer's disease and cerebral ischemia.

[00395] Segundo os resultados do estudo, pode-se concluir que: - os dois compostos combatem a toxicidade de glutamato sobre neurônios corticais; e - MR36014 e MR33583 exibiram eficácia similar, embora MR36014 fosse ativo em dose inferior (sobre a sobrevivência neuronal).[00395] According to the results of the study, it can be concluded that: - the two compounds combat the toxicity of glutamate on cortical neurons; and - MR36014 and MR33583 exhibited similar efficacy, although MR36014 was active at a lower dose (on neuronal survival).

[00396] Por fim, este estudo demonstra que MR36014 e MR33583 são drogas interessantes para doenças neurológicas que envolvem tensão glutamatérgica.[00396] Finally, this study demonstrates that MR36014 and MR33583 are interesting drugs for neurological diseases involving glutamatergic stress.

EXEMPLO 8EXAMPLE 8

[00397] Este exemplo descreve a avaliação de efeitos neuroprotetores de MR36014 e MR33583 sobre neurônios corticais primários de ratos após lesão por glutamato.[00397] This example describes the evaluation of neuroprotective effects of MR36014 and MR33583 on primary cortical neurons of rats after glutamate injury.

[00398] Esclerose lateral amiotrófica (ALS) é um distúrbio fatal caracterizado pelo início sutil de fraqueza focal, tipicamente nos membros, mas às vezes em músculos bulbares, que progride para paralisia de quase todos os músculos do esqueleto. Existe sobreposição genética e clínico-patológica significativa entre ALS e demência lobular frontotemporal (FTLD). Em ALS, morte de paralisia respiratória ocorre tipicamente em até cinco anos. A patologia celular é focal no início e difunde-se em padrão que sugere envolvimento sucessivo de populações neuronais contíguas. A morte de motoneurônios ocorre em conjunto com a deposição de proteínas agregadas em motoneurônios e oligodendrócitos e neuroinflamação.[00398] Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal disorder characterized by the subtle onset of focal weakness, typically in the limbs but sometimes in the bulbar muscles, which progresses to paralysis of almost all skeletal muscles. There is significant genetic and clinicopathological overlap between ALS and frontotemporal lobular dementia (FTLD). In ALS, death from respiratory paralysis typically occurs within five years. Cellular pathology is focal at onset and diffuses in a pattern that suggests successive involvement of contiguous neuronal populations. The death of motoneurons occurs in conjunction with the deposition of aggregated proteins in motoneurons and oligodendrocytes and neuroinflammation.

[00399] A patofisiologia complexa de ALS apresenta muitos alvos terapêuticos potenciais. Embora ampla variedade de agentes tenha sido pesquisada, apenas Riluzol (Rilutek®), uma droga antiglutamatérgica, demonstrou benefício constante e é a única droga aprovada para o tratamento da doença. Os benefícios de Riluzol, entretanto, são pequenos – ele prolonga a sobrevivência de pacientes com ALS por vários meses (cerca de 7%) com efeito mínimo sobre as medidas funcionais.The complex pathophysiology of ALS presents many potential therapeutic targets. Although a wide variety of agents have been researched, only Riluzole (Rilutek®), an anti-glutamatergic drug, has shown continued benefit and is the only drug approved for the treatment of the disease. The benefits of Riluzole, however, are small – it prolongs the survival of patients with ALS by several months (about 7%) with minimal effect on functional measures.

[00400] Embora os processos moleculares precisos que causam a morte de neurônios motores em ALS permaneçam desconhecidos, alguns mecanismos possíveis incluem (a) excitotoxicidade mediada por glutamato; (b) redução de fatores neurotróficos (BDNF, GDNF etc.); (c) alterações mitocondriais e lesões oxidativas; e (d) anormalidades em proteínas do citoesqueleto que resultam em atrofia neuronal e morte.[00400] Although the precise molecular processes that cause the death of motor neurons in ALS remain unknown, some possible mechanisms include (a) glutamate-mediated excitotoxicity; (b) reduction of neurotrophic factors (BDNF, GDNF etc.); (c) mitochondrial alterations and oxidative damage; and (d) abnormalities in cytoskeletal proteins that result in neuronal atrophy and death.

[00401] Demonstrou-se que TDP-43 (proteína de ligação de DNA de elemento de reação de transativação com 43 kDa) acumula-se em citoplasma de neurônios motores na maior parte dos casos de ALS. TDP43 é uma proteína de ligação de RNA nuclear envolvida em diversos aspectos de processamento de RNA que trafega ativamente entre o núcleo e o citoplasma.[00401] TDP-43 (transactivation reaction element DNA binding protein with 43 kDa) has been shown to accumulate in the cytoplasm of motor neurons in most cases of ALS. TDP43 is a nuclear RNA binding protein involved in several aspects of RNA processing that actively travels between the nucleus and cytoplasm.

[00402] O objeto do presente estudo foi avaliar os efeitos de MR36014 e MR33583 (em quatro concentrações) sobre neurônio motor espinhal primário (MN) após lesão de glutamato.[00402] The object of the present study was to evaluate the effects of MR36014 and MR33583 (at four concentrations) on primary spinal motor neuron (MN) after glutamate injury.

[00403] Materiais e método:[00403] Materials and method:

[00404] Cultivo primário de neurônios motores espinhais:[00404] Primary culture of spinal motor neurons:

[00405] Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com o Guia de Uso e Cuidados com Animais de Laboratório do National Institutes of Health e seguiram as regulamentações atuais da União Europeia (Norma 2010/63/EU). Número do contrato: A1301310.[00405] All experiments were conducted in accordance with the National Institutes of Health Laboratory Animal Care and Use Guide and followed current European Union regulations (Standard 2010/63/EU). Contract number: A1301310.

[00406] Neurônios motores (MNs) da medula espinhal de ratos foram cultivados conforme descrito por Martinou et al (1992), Neuron. 8: 737-744 e Wang et al (2013), Hum. Mol. Genet. 22: 4706-4719. Resumidamente, fêmeas de ratos grávidas com 14 dias de gestação (Ratos Wistar; Janvier Labs, França) foram mortas utilizando anestesia profunda com câmara de CO2 e deslocamento da cervical. Os fetos foram removidos em seguida do útero e imediatamente colocados em meio Leibovitz L15 gelado com uma solução de 2% de penicilina (10.000 U/ml) e estreptomicina (10 mg/ml) (PS) e 1% de albumina de soro bovino (BSA).Spinal cord motor neurons (MNs) from rats were cultured as described by Martinou et al (1992), Neuron. 8: 737-744 and Wang et al (2013), Hum. Mol. Genet. 22: 4706-4719. Briefly, 14-day pregnant female rats (Wistar Rats; Janvier Labs, France) were killed using deep anesthesia with a CO2 chamber and cervical dislocation. The fetuses were then removed from the uterus and immediately placed in ice-cold Leibovitz L15 medium with a solution of 2% penicillin (10,000 U/ml) and streptomycin (10 mg/ml) (PS) and 1% bovine serum albumin ( BSA).

[00407] A medula espinhal foi tratada por 20 minutos a 37 °C com uma solução de tripsina-EDTA em concentração final de 0,05% de tripsina e 0,02% de EDTA. A dissociação foi suspensa por meio da adição de meio Eagle modificado da Dulbecco (DMEM) com 4,5 g/l de glicose, que contém DNAse I de grau II (concentração final de 0,5 mg/ml) e 10% de soro de feto bovino (FCS). As células foram dissociadas mecanicamente por três passagens forçadas através da ponta de uma pipeta de 10 ml. As células foram centrifugadas em seguida a 515 x g por 10 min a 4 °C. O sobrenadante foi descartado e a pelota foi novamente suspensa em meio de cultivo definido que consiste em meio neurobasal com solução a 2% de suplemento B27, 2 mmol/l de L-glutamina, 2% de solução de PS e 10 ng/ml de fator neurotrófico cerebral (BDNF). Células viáveis foram contadas em um citômetro de Neubauer, utilizando o teste de exclusão de azul de tripano. As células foram semeadas em densidade deThe spinal cord was treated for 20 minutes at 37 °C with a trypsin-EDTA solution at a final concentration of 0.05% trypsin and 0.02% EDTA. Dissociation was stopped by the addition of Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/l of glucose, which contains DNAse I grade II (final concentration of 0.5 mg/ml) and 10% serum of bovine fetus (FCS). Cells were mechanically dissociated by three forced passes through the tip of a 10 ml pipette. The cells were then centrifuged at 515 x g for 10 min at 4 °C. The supernatant was discarded and the pellet was resuspended in defined culture medium consisting of neurobasal medium with a 2% solution of B27 supplement, 2 mmol/l L-glutamine, 2% PS solution and 10 ng/ml of cerebral neurotrophic factor (BDNF). Viable cells were counted in a Neubauer cytometer using the trypan blue exclusion test. Cells were seeded in density of

20.000 por cavidade em placas com 96 cavidades previamente revestidas com poli-L-lisina e cultivadas a 37 °C em um incubador de ar (95%)-CO2 (5%).20,000 per well in 96-well plates previously coated with poly-L-lysine and grown at 37°C in an air (95%)-CO2 (5%) incubator.

[00408] O meio foi alterado a cada dois dias. As cavidades das primeiras linhas e colunas não foram utilizadas para cultivo (para evitar efeito de extremidades) e preenchidas com água estéril. Os neurônios motores foram lesionados com glutamato após 13 dias de cultivo.[00408] The medium was changed every two days. The cavities of the first rows and columns were not used for cultivation (to avoid extremity effects) and were filled with sterile water. Motor neurons were injured with glutamate after 13 days of culture.

[00409] Compostos de teste e exposição de glutamato:[00409] Test Compounds and Glutamate Exposure:

[00410] Incubação prévia: no dia 13 de cultivo, os compostos foram dissolvidos no meio de cultivo e previamente incubados com neurônios corticais primários por uma hora, antes da exposição a glutamato.[00410] Previous incubation: on day 13 of culture, the compounds were dissolved in the culture medium and previously incubated with primary cortical neurons for one hour, before exposure to glutamate.

[00411] Lesão por glutamina: No dia 13 de cultivo e após uma hora de incubação prévia, adicionou-se glutamato até concentração final de 5 µM diluídos em meio de controle, ainda na presença dos compostos por 20 minutos.[00411] Glutamine lesion: On day 13 of culture and after one hour of previous incubation, glutamate was added to a final concentration of 5 µM diluted in control medium, still in the presence of compounds for 20 minutes.

Após 20 minutos, glutamato foi lavado e meio de cultivo novo com os compostos foi adicionado por mais 24 horas.After 20 minutes, glutamate was washed off and fresh culture medium with the compounds was added for another 24 hours.

[00412] Organização de placas de cultivo:[00412] Organization of cultivation plates:

[00413] Compostos de teste foram testados em uma placa com 96 cavidades (n = 6 cavidades de cultivo por condição).[00413] Test compounds were tested in a 96-well plate (n = 6 culture wells per condition).

[00414] Foram determinadas as condições a seguir: PLACA 1 (MAP-2 / TDP-43) neurônios motores Controle (veículo) + Glutamato (5 µM, 20 min) / veículo + Glutamato (5 µM, 20 min) / MR36014 (500 pM) + Glutamato (5 µM, 20 min) / MR36014 (1 nM) + Glutamato (5 µM, 20 min) / MR36014 (5 nM) + Glutamato (5 µM, 20 min) / MR36014 (10 nM) + Glutamato (5 µM, 20 min) / MR33583 (1 nM)[00414] The following conditions were determined: PLATE 1 (MAP-2 / TDP-43) motor neurons Control (vehicle) + Glutamate (5 µM, 20 min) / vehicle + Glutamate (5 µM, 20 min) / MR36014 ( 500 pM) + Glutamate (5 µM, 20 min) / MR36014 (1 nM) + Glutamate (5 µM, 20 min) / MR36014 (5 nM) + Glutamate (5 µM, 20 min) / MR36014 (10 nM) + Glutamate (5 µM, 20 min) / MR33583 (1 nM)

PLACA 1 (MAP-2 / TDP-43) neurônios motores + Glutamato (5 µM, 20 min) / MR33583 (10 nM) + Glutamato (5 µM, 20 min) / MR33583 (50 nM) + Glutamato (5 µM, 20 min) / MR33583 (10 nM)PLATE 1 (MAP-2 / TDP-43) motor neurons + Glutamate (5 µM, 20 min) / MR33583 (10 nM) + Glutamate (5 µM, 20 min) / MR33583 (50 nM) + Glutamate (5 µM, 20 min) / MR33583 (10 nM)

[00415] Avaliação de objetivos:[00415] Evaluation of objectives:

[00416] Em 24 horas após a intoxicação, os sobrenadantes foram retirados e imediatamente congelados para análise futura. As células foram fixadas por uma solução fria de etanol (95%) e ácido acético (5%) por cinco minutos a -20 °C. Após permeabilização com 0,1% de saponina, as células foram incubadas por duas horas com: - um anticorpo monoclonal de camundongo antiproteína associada a microtúbulos 2 (MAP-2) em diluição de 1/400 em PBS que contém 1% de soro de feto bovino e 0,1% de saponina. Este anticorpo foi revelado com anti-IgG de camundongo de cabra Alexa Flúor 488 na diluição 1/400 em PBS contendo 1% de FCS e 0,1% de saponina por uma hora à temperatura ambiente; e - um anticorpo policlonal de coelho antiproteína de ligação de DNA TAR nuclear 43 (TDP-43) em diluição de 1/100 em PBS contendo 1% de soro de feto bovino e 0,1% de saponina. O anticorpo TDP-43 foi revelado com anticoelho de cabra Alexa Flúor 568 sob diluição de 1/400 em PBS contendo 1% de FCS e 0,1% de saponina por uma hora à temperatura ambiente.[00416] Within 24 hours of intoxication, the supernatants were removed and immediately frozen for further analysis. Cells were fixed by a cold solution of ethanol (95%) and acetic acid (5%) for five minutes at -20°C. After permeabilization with 0.1% saponin, the cells were incubated for two hours with: - a mouse monoclonal anti-microtubule-associated protein 2 (MAP-2) antibody at 1/400 dilution in PBS containing 1% serum bovine fetus and 0.1% saponin. This antibody was revealed with anti-goat mouse IgG Alexa Fluor 488 at 1/400 dilution in PBS containing 1% FCS and 0.1% saponin for one hour at room temperature; and - a polyclonal rabbit anti-nuclear TAR DNA binding protein 43 (TDP-43) antibody at 1/100 dilution in PBS containing 1% fetal bovine serum and 0.1% saponin. Antibody TDP-43 was revealed with goat anti-rabbit Alexa Fluor 568 at 1/400 dilution in PBS containing 1% FCS and 0.1% saponin for one hour at room temperature.

[00417] Para cada condição, 30 fotografias (que representam toda a área da cavidade) por cavidade foram tomadas automaticamente utilizando ImageXpress® (Molecular Devices) com ampliação de 20x, utilizando os mesmos parâmetros de obtenção. A partir das imagens, análises foram realizadas direta e automaticamente utilizando Custom Module Editor® (Molecular Devices).[00417] For each condition, 30 photographs (which represent the entire cavity area) per cavity were taken automatically using ImageXpress® (Molecular Devices) with 20x magnification, using the same obtaining parameters. From the images, analyzes were performed directly and automatically using Custom Module Editor® (Molecular Devices).

[00418] Análise de objetos:[00418] Object Analysis:

[00419] Foram determinados automaticamente os objetivos a seguir: - análise da sobrevivência de neurônios (manchas de MAP-2, número de neurônios); - análise da rede de neurites (manchas de MAP-2, comprimento total de neurites em µm); - análise de rede de neurites/neurônios (rede neuronal/número de neurônios MAP2); e - análise de TDP-43 citoplasmático em neurônios positivos para MAP-2 (sobreposição entre MAP-2 e TDP-43 citoplasmático em µm2).[00419] The following objectives were automatically determined: - analysis of neuron survival (MAP-2 spots, number of neurons); - neurite network analysis (MAP-2 stains, total neurite length in µm); - neurite/neuron network analysis (neural network/number of MAP2 neurons); and - analysis of cytoplasmic TDP-43 in MAP-2 positive neurons (overlapping between MAP-2 and cytoplasmic TDP-43 in µm2).

[00420] Análise estatística:[00420] Statistical analysis:

[00421] Todos os valores são expressos na forma de média +/- desvio padrão. Realizou-se análise estatística por meio de ANOVA de uma via, seguido por teste LSD de Fisher. p < 0,05 foi considerado significativo.[00421] All values are expressed as mean +/- standard deviation. Statistical analysis was performed using one-way ANOVA, followed by Fisher's LSD test. p < 0.05 was considered significant.

[00422] Resultados:[00422] Results:

[00423] Efeitos de MR36014 em cultivo primário de neurônios motores espinhais lesionados com glutamato:[00423] Effects of MR36014 on primary culture of glutamate-injured spinal motor neurons:

[00424] Sobrevivência dos neurônios: perda de neurônios motores espinhais MAP-2 grandes seguiu-se à aplicação de glutamato (42% de morte neuronal) (Figura 16A). A 500 pM e 1 nM, MR36014 aumentou significativamente a sobrevivência dos neurônios motores espinhais.[00424] Neuron survival: loss of large MAP-2 spinal motor neurons followed application of glutamate (42% neuronal death) (Figure 16A). At 500 pM and 1 nM, MR36014 significantly increased the survival of spinal motor neurons.

[00425] Rede de neurites: a rede de neurites foi severamente reduzida mediante lesão de glutamato (perda de neurites de 46%, Figura 16B).[00425] Neurite network: The neurite network was severely reduced by glutamate injury (46% neurite loss, Figure 16B).

MR36014 protegeu significativamente a rede de neurites a 500 pM e 1 nM. O comprimento da rede de neurites é proporcional ao número de neurônios. A razão “comprimento de rede de neurites” / “número de neurônios” foi calculada para estimar o comprimento médio de neurite por neurônio. A razão não foi modificada por MR36014 (Figura 16C).MR36014 significantly protected the neurite network at 500 pM and 1 nM. The length of the network of neurites is proportional to the number of neurons. The ratio “neurite network length” / “number of neurons” was calculated to estimate the average length of neurite per neuron. The ratio was not modified by MR36014 (Figure 16C).

[00426] Efeitos de MR33583 em cultivo primário de neurônios motores espinhais lesionados com glutamato:[00426] Effects of MR33583 on primary culture of glutamate-injured spinal motor neurons:

[00427] Sobrevivência dos neurônios: conforme exibido na Figura 17, perda de neurônios motores espinhais MAP-2 grandes seguiu-se à aplicação de glutamato (Figura 17A). MR33583 (adicionado em uma hora antes de glutamato e mantido por 24 horas após a lesão) exerceu efeito neuroprotetor dependente da dosagem (10 a 100 nM).[00427] Neuron survival: as shown in Figure 17, loss of large MAP-2 spinal motor neurons followed glutamate application (Figure 17A). MR33583 (added one hour before glutamate and maintained for 24 hours after injury) exerted a dose-dependent neuroprotective effect (10 to 100 nM).

[00428] Rede de neurites: conforme exibido na Figura 17, a rede de neurites foi severamente reduzida mediante lesão de glutamato (Figura 17B).[00428] Neurite network: as shown in Figure 17, the neurite network was severely reduced by glutamate injury (Figure 17B).

MR33583 protegeu significativamente a rede de neurites de 10 nM a 100 nM, de forma dependente de dosagem. A razão não foi modificada por MR36014 (Figura 17C).MR33583 significantly protected the neurite network from 10 nM to 100 nM, in a dose-dependent manner. The ratio was not modified by MR36014 (Figure 17C).

[00429] TDP43: na dose mais alta, MR33583 (100 nM) reduziu o sinal de TDP43 no citoplasma de neurônios motores espinhais (Figura 17D).[00429] TDP43: at the highest dose, MR33583 (100 nM) reduced the TDP43 signal in the cytoplasm of spinal motor neurons (Figure 17D).

[00430] Análise:[00430] Analysis:

[00431] O objeto deste estudo foi determinar os efeitos neuroprotetores de dois compostos, MR36014 e MR33583, em um modelo in vitro de esclerose lateral amiotrófica, com base em cultivo primário de neurônios motores da medula espinhal lesionados com glutamato.[00431] The object of this study was to determine the neuroprotective effects of two compounds, MR36014 and MR33583, in an in vitro model of amyotrophic lateral sclerosis, based on primary culture of spinal cord motor neurons injured with glutamate.

[00432] Os resultados deste estudo indicam que: - MR36014 forneceu efeitos neuroprotetores a 500 pM e 1 nM, pois aumentou a sobrevivência neuronal e protegeu a rede de neurites; e - MR33583 exibiu claros efeitos neuroprotetores sobre todos os parâmetros (sobrevivência neuronal, preservação da rede de neurites e acúmulo de TDP43 citoplasmático).[00432] The results of this study indicate that: - MR36014 provided neuroprotective effects at 500 pM and 1 nM, as it increased neuronal survival and protected the neurite network; and - MR33583 exhibited clear neuroprotective effects on all parameters (neural survival, neurite network preservation and cytoplasmic TDP43 accumulation).

[00433] Em conjunto, estes resultados indicam que MR36014 e MR33583 foram capazes de mediar a neuroproteção sobre neurônios motores da medula espinhal e são possíveis drogas potenciais para esclerose lateral amiotrófica.Taken together, these results indicate that MR36014 and MR33583 were able to mediate neuroprotection on spinal cord motor neurons and are possible potential drugs for amyotrophic lateral sclerosis.

EXEMPLO 9EXAMPLE 9

[00434] Este exemplo exibe a avaliação de efeitos neuroprotetores de MR33583 sobre neurônios GABAérgicos primários de ratos sob esgotamento de fator de crescimento.[00434] This example shows the evaluation of neuroprotective effects of MR33583 on primary GABAergic neurons of rats under growth factor depletion.

[00435] HD (mal de Huntington) é uma doença neurodegenerativa hereditária dominante autossomal que afeta cerca de 4-10 em 10.000 na comunidade caucasiana. O cérebro HD é caracterizado pela perda de MSNs (neurônios espinhais médios) do estriato, expansão dos ventrículos e contração correspondente do córtex sobrejacente. As células GABAérgicas (ácido γ- aminobutírico) são o tipo de células neuronais mais populoso do estriato (90- 95% em ratos e mais de 85% em seres humanos), em conjunto com diversas populações pequenas de interneurônios (Wictorin (1992), Prog. Neurobiol. 38: 611-639). MSNs são caracterizados pela sua expressão de enzima GAD64. Eles recebem a maior parte das entradas para o estriato, recebendo aferentes do córtex, tálamo e mesoencéfalo, sendo também o principal neurônio de saída do estriato, que se projeta para diversas regiões do SNC (sistema nervoso central), incluindo o globo pálido e a substância negra. Eles formam, portanto, circuitos neuronais complexos dentro dos gânglios basais que são importantes para o controle de ação, cognição e emoção (Nakano et al (2000), J. Neurol. 247 (supl.[00435] HD (Huntington's disease) is an autosomal dominant inherited neurodegenerative disease that affects about 4-10 in 10,000 in the Caucasian community. The HD brain is characterized by the loss of MSNs (middle spinal neurons) from the striatum, expansion of the ventricles, and corresponding contraction of the overlying cortex. GABAergic (γ-aminobutyric acid) cells are the most populous type of neuronal cell in the striatum (90-95% in rats and more than 85% in humans), together with several small populations of interneurons (Wictorin (1992), Prog. Neurobiol. 38: 611-639). MSNs are characterized by their expression of the GAD64 enzyme. They receive most inputs to the striatum, receiving afferents from the cortex, thalamus and midbrain, and are also the main output neuron of the striatum, which projects to different regions of the CNS (central nervous system), including the globus pallidus and the black substance. They therefore form complex neuronal circuits within the basal ganglia that are important for the control of action, cognition, and emotion (Nakano et al (2000), J. Neurol. 247 (suppl.

5): v1-v15).5): v1-v15).

[00436] A importância dos fatores de crescimento e sua redução nas doenças neurodegenerativas (tais como AD, PD ou HD) é frequentemente considerada uma das diversas causas dessas patologias. Esgotamento genético e farmacológico de BDNF ou GDNF enfraquece o aprendizado e a memória e causa morte neuronal (Yamada et al (2003), J. Pharmacol. Sci. 91: 267-270). O modelo de esgotamento de fator de crescimento foi caracterizado em diversos tipos de células neuronais, tais como cultivo primário de neurônios de roedores[00436] The importance of growth factors and their reduction in neurodegenerative diseases (such as AD, PD or HD) is often considered one of the many causes of these pathologies. Genetic and pharmacological depletion of BDNF or GDNF impairs learning and memory and causes neuronal death (Yamada et al (2003), J. Pharmacol. Sci. 91: 267-270). The growth factor depletion model has been characterized in several types of neuronal cells, such as primary cultured rodent neurons

(Atabay et al (1996), J. Neurosci. Res. 43: 465-475), células de neuroblastoma SK-N-SH e SH-SY5Y humano (Ba et al (2003), J. Neurosci. Methods 123: 11-22; e Russo et al (2004), Brain Res. 1009: 40-53).(Atabay et al (1996), J. Neurosci. Res. 43: 465-475 ), human SK-N-SH and SH-SY5Y neuroblastoma cells (Ba et al (2003), J. Neurosci. Methods 123: 11 -22; and Russo et al (2004), Brain Res. 1009: 40-53).

[00437] Sob essas condições de esgotamento de fator de crescimento, a perda severa de viabilidade deve-se à morte das células apoptóticas, detectada por suprarregulagem significativa dos parâmetros associados apoptóticos, incluindo caspase-3 dividida, PARP e H2A.X. Além disso, demonstrou-se que a expressão de genes e proteínas do Bcl-2 antiapoptótico é infrarregulada, enquanto a do Bax pró-apoptótico foi suprarregulada. Adicionalmente, demonstrou-se que o esgotamento de fator neurotrófico cerebral (BDNF) aciona processos de morte celular por meio da ativação de caspases por aumento da sinalização de p75NTR (Yu et al (2008), J. Neurosci. 28: 7467-7475).[00437] Under these conditions of growth factor depletion, the severe loss of viability is due to the death of apoptotic cells, detected by significant up-regulation of associated apoptotic parameters, including split caspase-3, PARP and H2A.X. Furthermore, it was shown that the expression of anti-apoptotic Bcl-2 genes and proteins is down-regulated, whereas that of pro-apoptotic Bax was up-regulated. Additionally, brain neurotrophic factor (BDNF) depletion has been shown to trigger cell death processes through the activation of caspases by increasing p75NTR signaling (Yu et al (2008), J. Neurosci. 28: 7467-7475) .

[00438] De forma interessante, camundongos Bdnf-/- também demonstram alterações neuroanatômicas específicas de estrutura e anormalidades comportamentais. Eles exibem densidade espinhal e complexidade dendrítica reduzida no córtex e hipocampo e, até um ponto ainda maior, no estriato, onde 90% das células afetadas são MSNs GABAérgicos (Rauskolb et al (2010), J. Neurosci. 30: 1739-1749).[00438] Interestingly, Bdnf-/- mice also demonstrate structure-specific neuroanatomical changes and behavioral abnormalities. They exhibit reduced spinal density and dendritic complexity in the cortex and hippocampus and, to an even greater extent, in the striatum, where 90% of affected cells are GABAergic MSNs (Rauskolb et al (2010), J. Neurosci. 30: 1739-1749) .

[00439] O objeto deste estudo foi pesquisar o efeito neuroprotetor de MR33583 (em quatro concentrações) em MSN de sobrevivência no estriato após esgotamento do fator de crescimento (esgotamento de BDNF e GDNF), que é um modelo in vitro de mal de Huntington.[00439] The object of this study was to investigate the neuroprotective effect of MR33583 (at four concentrations) on survival MSN in the striatum after depletion of growth factor (depletion of BDNF and GDNF), which is an in vitro model of Huntington's disease.

[00440] Materiais e método:[00440] Materials and method:

[00441] Cultivo primário de neurônios GABAérgicos:[00441] Primary culture of GABAergic neurons:

[00442] Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com o Guia de Uso e Cuidados com Animais de Laboratório do National Institutes of Health e seguiram as regulamentações atuais da União Europeia (Norma[00442] All experiments were conducted in accordance with the National Institutes of Health Laboratory Animal Care and Use Guide and followed current European Union regulations (Standard

2010/63/EU). Número do contrato: A1301310.2010/63/EU). Contract number: A1301310.

[00443] MSNs de rato de estriato foram cultivados conforme descrito por Ivkovic et al (1999), J. Neurosci. 19: 5409-5419 e Schinelli et al (1988), J. Neurochem. 50: 1900-1907. Resumidamente, fêmeas de ratos grávidas com 15 dias de gestação foram mortas utilizando anestesia profunda com câmara de CO2 e deslocamento da cervical. Os fetos foram coletados e imediatamente colocados em meio Leibovitz L15 gelado com uma solução de 2% de penicilina (10.000 U/ml) e estreptomicina (10 mg/ml) (PS) e 1% de albumina de soro bovino (BSA). Somente uma parte ventral restrita da flexão mesencefálica foi utilizada para preparação celular, pois esta é a região do cérebro em desenvolvimento rica em células MSN. Essas áreas foram tratadas por 20 minutos a 37 °C com uma solução de tripsina-EDTA em concentração final de 0,05% de tripsina e 0,02% de EDTA. A dissociação foi suspensa por meio da adição de meio Eagle modificado da Dulbecco (DMEM) com 4,5 g/l de glicose, que contém DNAse I grau II (concentração final de 0,5 mg/ml) e 10% de soro de feto bovino (FCS). As células foram dissociadas mecanicamente por três passagens forçadas através da ponta de uma pipeta de 10 ml. As células foram centrifugadas em seguida a 180 x g por 10 min à temperatura ambiente sobre uma camada de BSA (3,5%) em meio L15. O sobrenadante foi descartado e as pelotas celulares foram novamente suspensas em meio de cultivo definido que consiste em neurobasal suplementado com B27 (2%), L-glutamina (2 mM), solução de PS a 1%, BDNF (10 ng/ml) e GDNF (1 ng/ml). Células viáveis foram contadas em um citômetro de Neubauer, utilizando o teste de exclusão de azul de tripano. As células foram semeadas em densidade de 40.000 células/cavidade em placas com 96 cavidades (as cavidades foram previamente revestidas com poli-L-lisina) e cultivadas a 37 °C em um incubador de ar (95%)- CO2 (5%).Striatal rat MSNs were cultured as described by Ivkovic et al (1999), J. Neurosci. 19: 5409-5419 and Schinelli et al (1988), J. Neurochem. 50: 1900-1907. Briefly, 15-day pregnant female rats were killed using deep anesthesia with a CO2 chamber and cervical dislocation. Fetuses were collected and immediately placed in ice-cold Leibovitz L15 medium with a solution of 2% penicillin (10,000 U/ml) and streptomycin (10 mg/ml) (PS) and 1% bovine serum albumin (BSA). Only a restricted ventral part of the midbrain flexion was used for cell preparation, as this is the developing brain region rich in MSN cells. These areas were treated for 20 minutes at 37 °C with a trypsin-EDTA solution at a final concentration of 0.05% trypsin and 0.02% EDTA. Dissociation was stopped by the addition of Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/l of glucose, which contains DNAse I grade II (final concentration of 0.5 mg/ml) and 10% serum bovine fetus (FCS). Cells were mechanically dissociated by three forced passes through the tip of a 10 ml pipette. The cells were then centrifuged at 180 x g for 10 min at room temperature over a layer of BSA (3.5%) in L15 medium. The supernatant was discarded and the cell pellets were resuspended in defined culture medium consisting of neurobasal supplemented with B27 (2%), L-glutamine (2 mM), 1% PS solution, BDNF (10 ng/ml) and GDNF (1 ng/ml). Viable cells were counted in a Neubauer cytometer using the trypan blue exclusion test. Cells were seeded at a density of 40,000 cells/well in 96-well plates (wells were previously coated with poly-L-lysine) and cultured at 37°C in an air (95%)-CO2 (5%) incubator .

[00444] Para evitar efeito de extremidades, as primeira e última colunas, bem como as primeira e última linhas da placa, não foram utilizadas no estudo. Cavidades vazias foram preenchidas com água. O meio foi alterado a cada dois dias.[00444] To avoid the effect of ends, the first and last columns, as well as the first and last lines of the plate, were not used in the study. Empty wells were filled with water. The medium was changed every two days.

[00445] Compostos de teste e esgotamento do fator de crescimento:[00445] Test compounds and growth factor depletion:

[00446] Incubação prévia: no dia 13 de cultivo, o composto de teste foi diluído no meio de cultivo e previamente incubado com neurônios GABAérgicos por uma hora antes do esgotamento de fator de crescimento (BDNF e GDNF).[00446] Previous incubation: on day 13 of culture, the test compound was diluted in the culture medium and previously incubated with GABAergic neurons for one hour before depletion of growth factor (BDNF and GDNF).

[00447] Esgotamento de fator de crescimento: uma hora após a incubação com composto de teste, metade do meio foi alterada com meio isento de fatores de crescimento. O esgotamento foi aplicado por 96 horas.[00447] Depletion of growth factor: one hour after incubation with test compound, half of the medium was changed with medium free of growth factors. Depletion was applied for 96 hours.

[00448] Organização das placas de cultivo:[00448] Organization of cultivation plates:

[00449] Compostos de teste foram testados em uma placa com 96 cavidades (n = 6 cavidades de cultivo por condição). Foram determinadas as condições a seguir: PLACA 1 (GAD67) Controle (veículo) + Esgotamento do fator de crescimento/ veículo + Esgotamento do fator de crescimento/ MR33583 (1 nM) + Esgotamento do fator de crescimento/ MR33583 (10 nM) + Esgotamento do fator de crescimento/ MR33583 (50 nM) + Esgotamento do fator de crescimento/ MR33583 (10 nM)Test compounds were tested in a 96-well plate (n = 6 culture wells per condition). The following conditions were determined: PLATE 1 (GAD67) Control (vehicle) + Depletion of growth factor / vehicle + Depletion of growth factor / MR33583 (1 nM) + Depletion of growth factor / MR33583 (10 nM) + Depletion of growth factor / MR33583 (50 nM) + Depletion of growth factor / MR33583 (10 nM)

[00450] Avaliação de objetivos:[00450] Evaluation of objectives:

[00451] Em 96 horas após o esgotamento do fator de crescimento, o sobrenadante de cultivo celular foi retirado e imediatamente congelado para análise futura. Células foram fixadas por uma solução fria de etanol (95%) e ácido acético (5%) por cinco minutos a -20 °C. As células foram lavadas por duas vezes em PBS e permeabilizadas em seguida. Locais não específicos foram bloqueados com uma solução de PBS contendo 0,1% de saponina e 1% de FCS por 15 minutos à temperatura ambiente.[00451] At 96 hours after the depletion of the growth factor, the cell culture supernatant was removed and immediately frozen for further analysis. Cells were fixed by a cold solution of ethanol (95%) and acetic acid (5%) for five minutes at -20 °C. Cells were washed twice in PBS and then permeabilized. Non-specific sites were blocked with a PBS solution containing 0.1% saponin and 1% FCS for 15 minutes at room temperature.

[00452] Imunomanchas: GAD67 (sobrevivência) – os cultivos foram incubados por duas horas com um anticorpo anti-GAD67 monoclonal de camundongo em diluição de 1/200 em PBS contendo 1% de soro de feto bovino e 0,1% de saponina (este anticorpo mancha especificamente neurônios GABAérgicos). Este anticorpo foi revelado com anti-IgG de camundongo de cabra Alexa Flúor (diluição 1/400) em PBS contendo 1% de FCS e 0,1% de saponina por uma hora à temperatura ambiente.[00452] Immunoblots: GAD67 (survival) - cultures were incubated for two hours with a mouse monoclonal anti-GAD67 antibody at 1/200 dilution in PBS containing 1% fetal bovine serum and 0.1% saponin ( this antibody specifically stains GABAergic neurons). This antibody was revealed with Alexa Fluorine goat anti-mouse IgG (1/400 dilution) in PBS containing 1% FCS and 0.1% saponin for one hour at room temperature.

[00453] Análise computadorizada automática: para cada condição, 30 fotografias (que representam toda a área da cavidade) por cavidade foram tomadas utilizando ImageXpress® (Molecular Devices) com ampliação de 20x.[00453] Automated computer analysis: for each condition, 30 photographs (representing the entire cavity area) per cavity were taken using ImageXpress® (Molecular Devices) at 20x magnification.

Todas as imagens foram geradas utilizando os mesmos parâmetros de obtenção. A partir das imagens, análises foram realizadas direta e automaticamente utilizando Custom Module Editor® (Molecular Devices).All images were generated using the same acquisition parameters. From the images, analyzes were performed directly and automatically using Custom Module Editor® (Molecular Devices).

[00454] Foi pesquisada a leitura a seguir: análise da sobrevivência de MSNs (manchas de GAD67, número de neurônios GABAérgicos).[00454] The following reading was researched: analysis of survival of MSNs (GAD67 spots, number of GABAergic neurons).

[00455] Análise estatística:[00455] Statistical analysis:

[00456] Todos os valores são expressos na forma de média +/- desvio padrão. Realizou-se análise estatística por meio de ANOVA de uma via, seguido por teste LSD de Fisher. p < 0,05 foi considerado significativo.[00456] All values are expressed as mean +/- standard deviation. Statistical analysis was performed using one-way ANOVA, followed by Fisher's LSD test. p < 0.05 was considered significant.

[00457] Resultados:[00457] Results:

[00458] Efeito de MR33583 em cultivo primário de neurônios GABAérgicos fortalecidos pelo esgotamento de fatores de crescimento:[00458] Effect of MR33583 in primary culture of GABAergic neurons strengthened by depletion of growth factors:

[00459] Sobrevivência dos neurônios: perda de neurônios GABAérgicos positivos para GAD-67 grandes seguiu-se ao esgotamento de fatores de crescimento (Figura 18).[00459] Neuron survival: loss of large GAD-67 positive GABAergic neurons followed depletion of growth factors (Figure 18).

[00460] MR33583 (50 nM) exerceu efeito neuroprotetor significativo, demonstrado com o aumento da sobrevivência de neurônios GABAérgicos.[00460] MR33583 (50 nM) exerted a significant neuroprotective effect, demonstrated with increased survival of GABAergic neurons.

[00461] Análise:[00461] Analysis:

[00462] Em conjunto, estes resultados indicam que MR33583 foi capaz de promover efeitos neuroprotetores (50 nM) em neurônios GABAérgicos e poderia ser possível droga potencial para mal de Huntington.Taken together, these results indicate that MR33583 was able to promote neuroprotective effects (50 nM) in GABAergic neurons and could be a potential drug for Huntington's disease.

Claims (16)

REIVINDICAÇÕES 1. USO DE UM COMPOSTO, da fórmula (I) a seguir: , em que: - X representa: - um átomo de hidrogênio; ou - um átomo de halogênio (Hal), em que (Hal) é flúor, cloro, bromo ou iodo; ou - um grupo poli-halogênio alquila Cp(Hal)2p+1 de cadeia linear ou ramificada, em que p = 1, 2, 3 ou 4, (Hal) possuindo o mesmo significado indicado acima; - Y representa: - um átomo de oxigênio; ou - um átomo de enxofre; ou - um radical N-R”, em que R” representa um átomo de hidrogênio, um radical -OH, um radical -O-A em que A representa um grupo alquila C1-C6 de cadeia linear ou ramificada, particularmente em que A representa um grupo metila ou radical alquila CqH2q+1 de cadeia linear ou ramificada, em que q = 1, 2, 3 ou 4; - m é um número inteiro selecionado a partir de 1, 2 e 3; - n é um número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 2 e 3; - r e s são números inteiros cujos valores são: r=s=0; ou r=s=1; ou r=s=2; ou r=0 e s=1; ou, por fim, r=0 e s=2; - R representa:1. USE OF A COMPOUND, of the formula (I) below: , in which: - X represents: - a hydrogen atom; or - a halogen atom (Hal), where (Hal) is fluorine, chlorine, bromine or iodine; or - a straight or branched chain Cp(Hal)2p+1 alkyl polyhalogen group, wherein p = 1, 2, 3 or 4, (Hal) having the same meaning as indicated above; - Y represents: - an oxygen atom; or - a sulfur atom; or - an NR" radical, where R" represents a hydrogen atom, an -OH radical, a -OA radical where A represents a straight or branched chain C1-C6 alkyl group, particularly where A represents a methyl group or straight-chained or branched CqH2q+1 alkyl radical, wherein q = 1, 2, 3 or 4; - m is an integer selected from 1, 2 and 3; - n is an integer selected from 0, 1, 2 and 3; - r and s are integers whose values are: r=s=0; or r=s=1; or r=s=2; or r=0 and s=1; or, finally, r=0 and s=2; - R represents: - um átomo de hidrogênio; ou - um grupo alquila C1-C5 de cadeia linear ou ramificada capaz de conduzir um ou mais átomos de F; - R’ representa: - um radical alquila C1-C6 de cadeia ramificada; ou - um grupo cicloalquila C3-C10 ou bicíclico C5-C13, capaz de conduzir um ou mais grupos R e de possuir um átomo de oxigênio ou átomo de nitrogênio que pode ser substituído por R, ou átomo de enxofre ou um radical -SO2- ou -SO-; bem como seus enantiômeros ou diaestereoisômeros e seus racêmicos, seus sais de ácidos, seus hidratos ou seus produtos de solvatação, sendo o uso do referido composto caracterizado por ser para fabricação de um agente neuroprotetor na prevenção e/ou tratamento de doenças neurodegenerativas.- a hydrogen atom; or - a straight or branched chain C1-C5 alkyl group capable of carrying one or more F atoms; - R' represents: - a branched-chain C1-C6 alkyl radical; or - a C3-C10 cycloalkyl or C5-C13 bicyclic group, capable of carrying one or more R groups and of having an oxygen atom or nitrogen atom which may be substituted by R, or sulfur atom or a -SO2- radical the use-; as well as their enantiomers or diastereoisomers and their racemics, their acid salts, their hydrates or their solvation products, the use of said compound being characterized by being for the manufacture of a neuroprotective agent in the prevention and/or treatment of neurodegenerative diseases. 2. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por Y na fórmula (I) representar: - um átomo de oxigênio; ou - um átomo de enxofre; ou - um radical N-R” em que R” representa um átomo de hidrogênio, um radical -OH ou um radical alquila CqH2q+1 de cadeia linear ou ramificada, em que q = 1, 2, 3 ou 4.Use according to claim 1, characterized in that Y in formula (I) represents: - an oxygen atom; or - a sulfur atom; or - an N-R" radical in which R" represents a hydrogen atom, a -OH radical or a straight or branched chain CqH2q+1 alkyl radical, in which q = 1, 2, 3 or 4. 3. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por X na fórmula (I) representar um átomo de halogênio.Use according to any one of claims 1 to 2, characterized in that X in formula (I) represents a halogen atom. 4. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por Y na fórmula (I) representar um átomo de oxigênio.Use according to any one of claims 1 to 3, characterized in that Y in formula (I) represents an oxygen atom. 5. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por todos dentre m, n, r e s na fórmula (I) possuírem o valor 1.5. USE, according to any one of claims 1 to 4, characterized in that all among m, n, r and s in formula (I) have the value 1. 6. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a6. USE according to any one of claims 1 to 5, caracterizado por R na fórmula (I) representar H, CH3, CH2CH3 ou CH2-CH2F.5, characterized in that R in formula (I) represents H, CH3, CH2CH3 or CH2-CH2F. 7. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por R’ na fórmula (I) representar um radical selecionado a partir do grupo que consiste nos radicais ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclo- hexila, ciclo-heptila e 4-piperidina.Use according to any one of claims 1 to 6, characterized in that R' in formula (I) represents a radical selected from the group consisting of cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl and 4-piperidine. 8. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 7, caracterizado por R na fórmula (I) representar um radical metila e R’ representar um radical cicloalquila C4-C7.Use according to any one of claims 3 to 7, characterized in that R in formula (I) represents a methyl radical and R' represents a C4-C7 cycloalkyl radical. 9. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo composto ser Donecoprida da fórmula (II) a seguir: (II).Use according to any one of claims 1 to 8, characterized in that the compound is Donecopride of the formula (II) below: (II). 10. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo composto ser Flucoprida da fórmula (III) a seguir: (III).Use according to any one of claims 1 to 8, characterized in that the compound is Flucopride of the formula (III) below: (III). 11. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo composto ser MR31192 da fórmula (VIII) a seguir: H3C11. USE according to any one of claims 1 to 8, characterized in that the compound is MR31192 of the formula (VIII) below: H3C O OO O N H2N Cl (VIII).N H2N Cl (VIII). 12. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo composto ser MR33583 da fórmula (V) a seguir:Use according to any one of claims 1 to 8, characterized in that the compound is MR33583 of the formula (V) below: H3CH3C O OO O N H2N F (V).N H2N F (V). 13. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo composto ser MR36014 da fórmula (VII) a seguir: H3CUse according to any one of claims 1 to 8, characterized in that the compound is MR36014 of the formula (VII) below: H3C O OO O N H2N F (VII).N H2N F (VII). 14. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelos mencionados sais de ácidos serem fumaratos ou dicloridratos.Use according to any one of claims 1 to 13, characterized in that said acid salts are fumarates or dihydrochlorides. 15. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pela doença neurodegenerativa ser selecionada a partir do grupo que consiste em mal de Alzheimer, mal de Parkinson, mal de Huntington, atrofia de múltiplos sistemas, doenças neuronais motoras incluindo esclerose lateral amiotrófica, síndrome de Down e degenerações frontotemporais.15. USE according to any one of claims 1 to 14, characterized in that the neurodegenerative disease is selected from the group consisting of Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, multiple systems atrophy, motor neuron diseases including sclerosis amyotrophic lateral, Down syndrome and frontotemporal degenerations. 16. USO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pela doença neurodegenerativa ser selecionada a partir do grupo que consiste em mal de Alzheimer, mal de Parkinson, mal de Huntington e esclerose lateral amiotrófica.16. USE according to claim 15, characterized in that the neurodegenerative disease is selected from the group consisting of Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease and amyotrophic lateral sclerosis.
BR112021005952-0A 2018-09-28 2019-09-27 use of a compound BR112021005952A2 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18306280.1 2018-09-28
EP18306280.1A EP3628660A1 (en) 2018-09-28 2018-09-28 Donecopride and flucopride as neuroprotective agents in the treatment of neurodegenerative diseases
PCT/EP2019/076229 WO2020065028A1 (en) 2018-09-28 2019-09-27 Donecopride as neuroprotective agent in the treatment of neurodegenerative diseases

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112021005952A2 true BR112021005952A2 (en) 2021-06-29

Family

ID=63798921

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112021005952-0A BR112021005952A2 (en) 2018-09-28 2019-09-27 use of a compound

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20220031680A1 (en)
EP (2) EP3628660A1 (en)
JP (1) JP2022511366A (en)
KR (1) KR20210098429A (en)
CN (1) CN113195452A (en)
AU (1) AU2019346024A1 (en)
BR (1) BR112021005952A2 (en)
CA (1) CA3115342A1 (en)
SG (1) SG11202103070VA (en)
WO (1) WO2020065028A1 (en)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7407966B2 (en) * 2004-10-07 2008-08-05 Epix Delaware, Inc. Thienopyridinone compounds and methods of treatment
FR2904113A1 (en) 2006-07-21 2008-01-25 Exonhit Therapeutics S A Sa METHODS AND TOOLS FOR THERAPY OF NEURODEGENERATIVE PATHOLOGIES
FR3006686A1 (en) 2013-06-05 2014-12-12 Univ Caen ACETYLCHOLINESTERASE INHIBITOR COMPOUNDS AND PROMOTING EFFECT OF 5HT4 SEROTONINERGIC RECEPTOR AGONISTS, PROCESSES FOR THEIR PREPARATION AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS CONTAINING SAME

Also Published As

Publication number Publication date
AU2019346024A1 (en) 2021-04-29
SG11202103070VA (en) 2021-04-29
CN113195452A (en) 2021-07-30
EP3856716A1 (en) 2021-08-04
CA3115342A1 (en) 2020-04-02
KR20210098429A (en) 2021-08-10
WO2020065028A1 (en) 2020-04-02
US20220031680A1 (en) 2022-02-03
JP2022511366A (en) 2022-01-31
EP3628660A1 (en) 2020-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Faucher et al. Hippocampal injections of oligomeric amyloid β-peptide (1–42) induce selective working memory deficits and long-lasting alterations of ERK signaling pathway
Rivera et al. Andrographolide recovers cognitive impairment in a natural model of Alzheimer's disease (Octodon degus)
Anand et al. Therapeutics of Alzheimer's disease: Past, present and future
Medrano-Jiménez et al. Malva parviflora extract ameliorates the deleterious effects of a high fat diet on the cognitive deficit in a mouse model of Alzheimer’s disease by restoring microglial function via a PPAR-γ-dependent mechanism
Fossati et al. The carbonic anhydrase inhibitor methazolamide prevents amyloid beta-induced mitochondrial dysfunction and caspase activation protecting neuronal and glial cells in vitro and in the mouse brain
US11197856B2 (en) Bicyclic compounds and methods for their use in treating autism
Faivre et al. D-Ala 2GIP Facilitated Synaptic Plasticity and Reduces Plaque Load in Aged Wild Type Mice and in an Alzheimer's Disease Mouse Model
Long et al. Valproic acid attenuates neuronal loss in the brain of APP/PS1 double transgenic Alzheimer's disease mice model
US10912819B2 (en) Neuroprotective peptides derived from activity-dependent neuroprotective protein for treatment of neurological diseases
US20210038589A1 (en) Uses, compositions and methods
BR112021005932A2 (en) pharmaceutical composition, neuroprotective pharmaceutical combination, acetylcholinesterase inhibitor and 5-ht4 receptor agonist
Siddu et al. Beneficial effects of cysteamine in Thy1-α-Syn mice and induced pluripotent stem cells with a SNCA gene triplication
WO2023078325A1 (en) Application of composition containing edaravone and dexborneol in improving or treating cognitive impairment
Ghoweri et al. Electrophysiological and imaging calcium biomarkers of aging in male and female 5× FAD mice
BR112021005952A2 (en) use of a compound
JP7249433B2 (en) Composition for prevention or treatment of neuroinflammatory disease containing bee venom extract as an active ingredient
RU2800802C2 (en) Donecoprid as a neuroprotective agent in the treatment of neurodegerative diseases
Khan et al. Neuroprotective effects of curcumin and vitamin D3 on scopolamine-induced learning-impaired rat model of Alzheimer’s disease
Wang et al. Neuroprotective Effect of Hydroxysafflor Yellow A on an Alzheimer’s Disease (AD)-Like Mouse Model
McKay et al. Identification of Cinnamein, a Component of Balsam of Tolu/Peru, as a New Ligand of PPARα for Plaque Reduction and Memory Protection in a Mouse Model of Alzheimer’s Disease
Yang et al. Benzene, 1, 2, 4-Trimethoxy-5-(2-Methyl-1-Propen-1-yl) Attenuates D-galactose/AlCl3-induced Cognitive Impairment by Inhibiting Inflammation, Apoptosis, and improving Expression of Memory-Related Proteins
Winston Neuropathological and behavioral changes following repeat mild traumatic brain injury
王昊陽 Drug development of a novel FABP ligand for Parkinson's disease therapy

Legal Events

Date Code Title Description
B06W Patent application suspended after preliminary examination (for patents with searches from other patent authorities) chapter 6.23 patent gazette]