RU2800802C2

RU2800802C2 - Donecoprid as a neuroprotective agent in the treatment of neurodegerative diseases

Info

Publication number: RU2800802C2
Application number: RU2021107724A
Authority: RU
Inventors: Патрик Даллемань; Кристоф РОШЭ; Сильви КЛАЭСЕН
Original assignee: Юниверсите Де Кан Норманди; Энститю Насьональ Де Ля Сантэ Э Де Ля Решерш Медикаль (Инсерм); Сантр Насьональ Де Ля Решерш Сьентифик; Юниверсите Де Монпелье
Priority date: 2018-09-28
Filing date: 2019-09-27
Publication date: 2023-07-28

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention relates to the use of a compound of formula (I), as well as its acid salts, as a neuroprotective agent in the prevention of a neurodegenerative disease selected from Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, amyotrophic lateral sclerosis and neurodegenerative disease caused by ischemia or traumatic brain injury. In the general formula (I), X represents a halogen atom (Hal), where (Hal) represents fluorine, chlorine, bromine or iodine; Y represents an oxygen atom; m, n, r and s have the value 1; R is a straight or branched C1-C5 alkyl group; R' is C3-C10 cycloalkyl.

EFFECT: obtaining an agent for the treatment of neurodegerative diseases.

10 cl, 18 dwg, 6 tbl, 9 ex

Description

Настоящее изобретение касается лечения нейродегенеративных заболеваний.The present invention relates to the treatment of neurodegenerative diseases.

Нейродегенеративные заболевания являются заболеваниями, вызванными коллапсом нейронной сети нервной цепи, основанным на систематической дегенерации и нарушении связей нейроцитов, и среди них известны различные трудноизлечимые заболевания, такие как болезнь Альцгеймера (БА), болезнь Паркинсона, деменция с тельцами Леви, сосудистая деменция и проблемы, связанные со старением, включая (i) некогнитивную нейродегенерацию, (ii) некогнитивную нервно-мышечную дегенерацию и (iii) моторно-сенсорную нейродегенерацию, болезнь Хантингтона, заболевания двигательных нейронов, включая боковой амиотрофический склероз (БАС), синдром Дауна, кортикобазальную ганглионарную дегенерацию, множественную системную атрофию, церебральную атрофию, оливопонтоцеребеллярную атрофию, надъядерный паралич, атаксию Фридрейха, спиноцеребеллярную атаксию 2 типа, лобно-височную дегенерацию (ЛВД) и первичную прогрессирующую афазию.Neurodegenerative diseases are diseases caused by the collapse of the neural network of the nerve circuit based on the systematic degeneration and disruption of neurocyte connections, and among them, various intractable diseases are known, such as Alzheimer's disease (AD), Parkinson's disease, Lewy body dementia, vascular dementia and problems, associated with aging, including (i) non-cognitive neurodegeneration, (ii) non-cognitive neuromuscular degeneration, and (iii) motor-sensory neurodegeneration, Huntington's disease, motor neuron diseases, including amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Down's syndrome, corticobasal ganglionic degeneration, multiple system atrophy, cerebral atrophy, olivopontocerebellar atrophy, supranuclear palsy, Friedreich's ataxia, type 2 spinocerebellar ataxia, frontotemporal degeneration (FTD), and primary progressive aphasia.

Клинические симптомы нейродегенеративных заболеваний варьируются от незначительных до тяжелых, в зависимости от заболевания. К ним относятся тремор, ригидность, акинезия, гипокинезия, брадикинезия, нарушение рефлекторного изменения позы, вегетативная дистония, пропульсия, нарушение походки, депрессия, апатия, спутанность сознания, нарушение обучения, дефицит памяти, когнитивные нарушения, амиотрофия, дистрофия мышечной ткани, нарушение функции плечевого пояса, нарушение артикуляции, дисфагия, нарушение дыхания, онемение, паралич и деменция, которые представляют большие трудности для повседневной активности.Clinical symptoms of neurodegenerative diseases range from mild to severe, depending on the disease. These include tremor, rigidity, akinesia, hypokinesia, bradykinesia, impaired reflex posture, autonomic dystonia, propulsion, gait disturbance, depression, apathy, confusion, learning impairment, memory deficit, cognitive impairment, amyotrophy, muscle tissue dystrophy, dysfunction shoulder girdle, articulation disorders, dysphagia, respiratory failure, numbness, paralysis and dementia, which present great difficulties for daily activities.

Нейродегенеративная гибель - сложный механизм, вероятно обусловленный наличием множества молекулярных групп, которые вызывают нейродегенеративные заболевания, когда возникают проблемы с их экспрессией, активностью и/или регуляцией. Это может объяснять то, почему до сих пор не было разработано эффективных методов ингибирования или обеспечения регресса нейродегенерации.Neurodegenerative death is a complex mechanism, probably due to the presence of many molecular groups that cause neurodegenerative diseases when there are problems with their expression, activity and/or regulation. This may explain why effective methods have not yet been developed to inhibit or reverse neurodegeneration.

Помимо лечения для удаления причинных факторов таких заболеваний, важно также восстановить (реконструировать) нейронную сеть. Например, отмечалось, что при болезни Альцгеймера, причиной которой была признана цитотоксичность β-амилоидного пептида, как атрофия нейритов, так и сокращение синапсов запускают ухудшение нервной функции, и наоборот, даже после такого запуска нейроциты, которые не полностью разрушены или выжили без дегенерации, могут быть восстановлены, если их можно активировать с распространением нейритов для восстановления синапсов.In addition to treatment to remove the causative factors of such diseases, it is also important to restore (reconstruct) the neural network. For example, in Alzheimer's disease, for which β-amyloid peptide cytotoxicity has been identified as the cause, both neurite atrophy and synaptic contraction have been noted to trigger deterioration in neural function, and vice versa, even after such triggering, neurocytes that are not completely destroyed or survived without degeneration, can be repaired if they can be activated with neurite outgrowth to repair synapses.

Таким образом, существует настоятельная потребность в новых средствах, способных защищать нейриты, но также способных увеличивать рост нейритов и стимулировать образование новых синапсов, как для предотвращения, так и для лечения нейродегенеративных заболеваний.Thus, there is an urgent need for new agents capable of protecting neurites, but also capable of increasing neurite outgrowth and stimulating the formation of new synapses, both for the prevention and treatment of neurodegenerative diseases.

Настоящее изобретение удовлетворяет эту потребность.The present invention satisfies this need.

Действительно, настоящее изобретение является результатом того неожиданного открытия авторов изобретения, что соединение Донекоприд, раскрытое в международной заявке WO 2014195593, обладает нейропротекторной активностью, поскольку оно способно, помимо снижения гиперфосфорилирования тау-белка, увеличивать рост нейритов, поддерживать частоту синапсов, а наиболее важно и неожиданно - способствовать формированию новых синапсов.Indeed, the present invention is the result of the unexpected discovery of the inventors that the compound Donekoprid disclosed in international application WO 2014195593 has neuroprotective activity, since it is able, in addition to reducing hyperphosphorylation of tau protein, to increase neurite outgrowth, maintain synapse frequency, and most importantly, unexpectedly - to promote the formation of new synapses.

Благодаря этому общему и эффективному защитному влиянию на нейриты соединение Донекоприд является очень многообещающим нейропротекторным средством для предотвращения и/или лечения любого нейродегенеративного заболевания, включающего дегенерацию нейритов.Due to this general and effective protective effect on neurites, the Donecoprid compound is a very promising neuroprotective agent for the prevention and/or treatment of any neurodegenerative disease involving neurite degeneration.

Этот эффект был дополнительно подтвержден большим рядом соединений общей формулы (I), приведенной ниже, на многочисленных моделях нейродегенеративных заболеваний, в частности на моделях болезни Альцгеймера, моделях болезни Паркинсона, моделях бокового амиотрофического склероза, моделях болезни Хантингтона и моделях нейродегенеративных заболеваний, вызванных ишемией или черепно-мозговой травмой.This effect was further confirmed by a large number of compounds of general formula (I) below in numerous models of neurodegenerative diseases, in particular in models of Alzheimer's disease, models of Parkinson's disease, models of amyotrophic lateral sclerosis, models of Huntington's disease and models of neurodegenerative diseases caused by ischemia or traumatic brain injury.

Таким образом, настоящее изобретение относится к соединению следующей формулы (I):Thus, the present invention relates to a compound of the following formula (I):

где:Where:

X представляет собойX represents

атом водорода, илиa hydrogen atom, or

атом галогена (Hal), где (Hal) представляет собой фтор, хлор, бром или йод, илиa halogen atom (Hal), where (Hal) is fluorine, chlorine, bromine, or iodine, or

C_p(Hal)_2p+1полигалогеноалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, где p = 1, 2, 3 или 4, (Hal) имеет такое же значение, как указано выше;C _p (Hal) _2p+1 straight or branched polyhaloalkyl group, where p = 1, 2, 3 or 4, (Hal) has the same meaning as above;

Y представляет собойY represents

атом кислорода, илиan oxygen atom, or

атом серы, илиa sulfur atom, or

радикал N-R’’, где R’’ представляет собой атом водорода, радикал -OH, радикал -OA, где A представляет собой C₁-C₆ алкильную группу с прямой или разветвленной цепью, в частности, где A представляет собой метильную группу, или C_qH_2q+1алкильный радикал с прямой или разветвленной цепью, где q = 1, 2, 3 или 4;radical N-R'', where R'' represents a hydrogen atom, radical -OH, radical -OA, where A represents a C ₁ -C ₆ alkyl group with a straight or branched chain, in particular, where A represents a methyl group , or C _q H _2q+1 straight or branched alkyl radical, where q = 1, 2, 3 or 4;

m представляет собой целое число, выбранное из 1, 2 и 3;m is an integer selected from 1, 2 and 3;

n представляет собой целое число, выбранное из 0, 1, 2 и 3;n is an integer selected from 0, 1, 2 and 3;

r и s представляют собой целые числа, значения которых: r = s = 0; или r = s = 1; или r = s = 2; или r = 0 и s = 1; или, наконец, r = 0 и s = 2;r and s are integers whose values are: r = s = 0; or r = s = 1; or r = s = 2; or r = 0 and s = 1; or finally r = 0 and s = 2;

R представляет собойR represents

атом водорода, илиa hydrogen atom, or

C₁-C₅ алкильную группу с прямой или разветвленной цепью, способную нести один или несколько атомов F;a C ₁ -C ₅ straight or branched chain alkyl group capable of bearing one or more F atoms;

R’ представляет собойR' represents

С₁-С₆ алкильный радикал с разветвленной цепью, илиC ₁ -C ₆ branched chain alkyl radical, or

C₃-C₁₀ циклоалкильную или C₅-C₁₃ бициклическую группу, способную нести одну или несколько R-групп и иметь атом кислорода, или атом азота, который может быть замещен группой R, или атом серы или радикал -SO₂- или -SO-,a C ₃ -C ₁₀ cycloalkyl or C ₅ -C ₁₃ bicyclic group capable of bearing one or more R groups and having an oxygen atom or a nitrogen atom which may be substituted by an R group, or a sulfur atom or a -SO ₂ - or - radical SO-,

а также к его энантиомерам или диастереоизомерам и его рацемическим соединениям, его кислым солям, его гидратам или продуктам его сольватации;as well as its enantiomers or diastereoisomers and its racemic compounds, its acid salts, its hydrates or its solvation products;

для использования в качестве нейропротекторного агента при профилактике и/или лечении нейродегенеративного заболевания.for use as a neuroprotective agent in the prevention and/or treatment of a neurodegenerative disease.

Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention

СоединенияConnections

Соединение, используемое в контексте изобретения, представляет собой соединение следующей формулы (I):The compound used in the context of the invention is a compound of the following formula (I):

где:Where:

X представляет собойX represents

атом водорода, илиa hydrogen atom, or

C_p(Hal)_2p+1 полигалогеноалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, где p = 1, 2, 3 или 4, (Hal) имеет такое же значение, как указано выше;C _p (Hal) _2p+1 straight or branched polyhaloalkyl group, where p = 1, 2, 3 or 4, (Hal) has the same meaning as above;

Y представляет собойY represents

атом кислорода, илиan oxygen atom, or

атом серы, илиa sulfur atom, or

R представляет собойR represents

атом водорода, илиa hydrogen atom, or

R’ представляет собойR' represents

а также его энантиомеры или диастереоизомеры и его рацемические соединения, его кислотные соли, его гидраты или продукты его сольватации.as well as its enantiomers or diastereoisomers and its racemic compounds, its acid salts, its hydrates or its solvation products.

В одном конкретном варианте осуществления в формуле (I) Y представляет собойIn one particular embodiment, in formula (I), Y is

атом кислорода, илиan oxygen atom, or

атом серы, илиa sulfur atom, or

радикал N-R’’, где R’’ представляет собой атом водорода, радикал -OH, или C_qH_2q+1алкильный радикал с прямой или разветвленной цепью, где q = 1, 2, 3 или 4.an N-R'' radical, where R'' is a hydrogen atom, an -OH radical, or a C _q H _2q+1 straight or branched chain alkyl radical, where q = 1, 2, 3, or 4.

В конкретном варианте осуществления в формуле (I) X представляет собой атом галогена, в частности хлор или фтор, более предпочтительно хлор, наиболее предпочтительно фтор.In a particular embodiment, in formula (I), X represents a halogen atom, in particular chlorine or fluorine, more preferably chlorine, most preferably fluorine.

В другом конкретном варианте осуществления в формуле (I) Y представляет собой атом кислорода.In another specific embodiment, in formula (I), Y represents an oxygen atom.

В другом конкретном варианте осуществления в формуле (I) все из m, n, r и s имеют значение 1.In another specific embodiment, in formula (I), m, n, r, and s are all 1.

В другом конкретном варианте осуществления в формуле (I) R представляет собой H, CH₃, CH₂CH₃ или CH₂-CH₂F. Предпочтительно R представляет собой CH₃.In another specific embodiment, in formula (I), R is H, CH ₃ , CH ₂ CH ₃ or CH ₂ -CH ₂ F. Preferably R is CH ₃ .

В другом конкретном варианте осуществления в формуле (I) R’ представляет собой радикал, выбранный из группы, состоящей из радикалов циклопропила, циклобутила, циклопентила, циклогексила, циклогептила, 4-пиперидина и –CH₂NHSO₂CH₃. В другом конкретном варианте осуществления в формуле (I) R’ представляет собой радикал, выбранный из группы, состоящей из радикалов циклопропила, циклобутила, циклопентила, циклогексила, 4-пиперидина и –CH₂NHSO₂CH₃. Предпочтительно в формуле (I) R’ представляет собой радикал, выбранный из группы, состоящей из радикалов циклопропила, циклобутила, циклопентила, циклогексила, циклогептила и 4-пиперидина. Предпочтительно в формуле (I) R’ представляет собой радикал, выбранный из группы, состоящей из радикалов циклопропила, циклобутила, циклопентила, циклогексила и 4-пиперидина. Более предпочтительно R’ представляет собой C₄-C₇циклоалкильный радикал. Еще более предпочтительно R’ представляет собой циклопентильный радикал, циклогексильный радикал, циклогептильный радикал или 2-пиперидиновый радикал. Более предпочтительно R’ представляет собой циклопентильный радикал. Еще более предпочтительно R’ представляет собой циклогексильный радикал. Еще более предпочтительно R’ представляет собой 2-пиперидиновый радикал. Наиболее предпочтительно R’ представляет собой циклогептильный радикал.In another specific embodiment, in formula (I), R' is a radical selected from the group consisting of cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, 4-piperidine and -CH ₂ NHSO ₂ CH ₃ radicals. In another specific embodiment, in formula (I), R' is a radical selected from the group consisting of cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, 4-piperidine and -CH ₂ NHSO ₂ CH ₃ radicals. Preferably, in formula (I), R' is a radical selected from the group consisting of cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl and 4-piperidine radicals. Preferably, in formula (I), R' is a radical selected from the group consisting of cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl and 4-piperidine radicals. More preferably R' is a C ₄ -C ₇ cycloalkyl radical. Still more preferably R' is a cyclopentyl radical, a cyclohexyl radical, a cycloheptyl radical or a 2-piperidine radical. More preferably R' is a cyclopentyl radical. Even more preferably R' is a cyclohexyl radical. Even more preferably R' is a 2-piperidine radical. Most preferably R' is a cycloheptyl radical.

В другом конкретном варианте осуществления в формуле (I) R представляет собой CH₃, а R’ представляет собой C₄-C₇ циклоалкильный радикал, в частности циклогексильный радикал. В другом конкретном варианте осуществления в формуле (I) R представляет собой CH₃, а R’ представляет собой C₄-C₇ циклоалкильный радикал, в частности циклопентильный радикал. В другом конкретном варианте осуществления в формуле (I) R представляет собой CH₃, а R представляет собой C₄-C₇ циклоалкильный радикал, в частности радикал 2-пиперидина. В другом конкретном варианте осуществления в формуле (I) R представляет собой CH₃, а R’ представляет собой C₄-C₇ циклоалкильный радикал, в частности циклогептильный радикал.In another particular embodiment, in formula (I), R is CH ₃ and R' is a C ₄ -C ₇ cycloalkyl radical, in particular a cyclohexyl radical. In another particular embodiment, in formula (I), R is CH ₃ and R' is a C ₄ -C ₇ cycloalkyl radical, in particular a cyclopentyl radical. In another particular embodiment, in formula (I), R is CH ₃ and R is a C ₄ -C ₇ cycloalkyl radical, in particular a 2-piperidine radical. In another particular embodiment, in formula (I), R is CH ₃ and R' is a C ₄ -C ₇ cycloalkyl radical, in particular a cycloheptyl radical.

В особо предпочтительном варианте осуществления в формуле (I) X представляет собой хлор, Y представляет собой атом кислорода, все из m, n, r и s имеют значение 1, R представляет собой CH₃, а R’ представляет собой циклогексильный радикал. Другими словами, в особо предпочтительном варианте осуществления соединение, используемое в контексте изобретения, представляет собой соединение донекоприда следующей формулы (II):In a particularly preferred embodiment in formula (I), X is chlorine, Y is an oxygen atom, m, n, r and s are all 1, R is CH ₃ and R' is a cyclohexyl radical. In other words, in a particularly preferred embodiment, the compound used in the context of the invention is a donecoprid compound of the following formula (II):

(II). (II).

В другом особо предпочтительном варианте осуществления в формуле (I) X представляет собой фтор, Y представляет собой атом кислорода, все из m, n, r и s имеют значение 1, R представляет собой CH₃, а R’ представляет собой циклогексильный радикал. Другими словами, в особо предпочтительном варианте осуществления соединение, используемое в контексте изобретения, представляет собой соединение флукоприда следующей формулы (III):In another particularly preferred embodiment, in formula (I), X is fluorine, Y is an oxygen atom, m, n, r and s are all 1, R is CH ₃ and R' is a cyclohexyl radical. In other words, in a particularly preferred embodiment, the compound used in the context of the invention is a flucopride compound of the following formula (III):

(III). (III).

В другом особо предпочтительном варианте в формуле (I) X представляет собой хлор, Y представляет собой атом кислорода, все из m, n, r и s имеют значение 1, R представляет собой CH₃, а R’ представляет собой 2-пиперидиновый радикал. Другими словами, в особо предпочтительном варианте осуществления соединение, используемое в контексте изобретения, представляет собой соединение MR31176 следующей формулы (IV):In another particularly preferred embodiment in formula (I), X is chlorine, Y is an oxygen atom, m, n, r and s are all 1, R is CH ₃ and R' is a 2-piperidine radical. In other words, in a particularly preferred embodiment, the compound used in the context of the invention is the MR31176 compound of the following formula (IV):

(IV). (IV).

В другом особо предпочтительном варианте осуществления в формуле (I) X представляет собой фтор, Y представляет собой атом кислорода, все из m, n, r и s имеют значение 1, R представляет собой CH₃, а R’ представляет собой циклопентильный радикал. Другими словами, в особо предпочтительном варианте осуществления соединение, используемое в контексте изобретения, представляет собой соединение MR33583 следующей формулы (V):In another particularly preferred embodiment, in formula (I), X is fluorine, Y is an oxygen atom, m, n, r and s are all 1, R is CH ₃ and R' is a cyclopentyl radical. In other words, in a particularly preferred embodiment, the compound used in the context of the invention is the MR33583 compound of the following formula (V):

(V). (V).

В другом особо предпочтительном варианте осуществления в формуле (I) X представляет собой хлор, Y представляет собой атом кислорода, все из m, n, r и s имеют значение 1, R представляет собой CH₃, а R’ представляет собой циклопентильный радикал. Другими словами, в особо предпочтительном варианте осуществления соединение, используемое в контексте изобретения, представляет собой соединение MR31172 следующей формулы (VI):In another particularly preferred embodiment in formula (I), X is chlorine, Y is an oxygen atom, m, n, r and s are all 1, R is CH ₃ and R' is a cyclopentyl radical. In other words, in a particularly preferred embodiment, the compound used in the context of the invention is the MR31172 compound of the following formula (VI):

(VI). (VI).

В другом особо предпочтительном варианте осуществления в формуле (I) X представляет собой фтор, Y представляет собой атом кислорода, все из m, n, r и s имеют значение 1, R представляет собой CH₃, а R’ представляет собой циклогептильный радикал. Другими словами, в особо предпочтительном варианте осуществления соединение, используемое в контексте изобретения, представляет собой соединение MR36014 следующей формулы (VII):In another particularly preferred embodiment, in formula (I), X is fluorine, Y is an oxygen atom, m, n, r and s are all 1, R is CH ₃ and R' is a cycloheptyl radical. In other words, in a particularly preferred embodiment, the compound used in the context of the invention is the MR36014 compound of the following formula (VII):

(VII). (VII).

В другом наиболее предпочтительном варианте осуществления в формуле (I) X представляет собой хлор, Y представляет собой атом кислорода, все из m, n, r и s имеют значение 1, R представляет собой CH₃, а R’ представляет собой циклогептильный радикал. Другими словами, в особо предпочтительном варианте осуществления соединение, используемое в контексте изобретения, представляет собой соединение MR31192 следующей формулы (VIII):In another most preferred embodiment, in formula (I), X is chlorine, Y is an oxygen atom, m, n, r and s are all 1, R is CH ₃ and R' is a cycloheptyl radical. In other words, in a particularly preferred embodiment, the compound used in the context of the invention is the MR31192 compound of the following formula (VIII):

(VIII). (VII).

В другом конкретном варианте осуществления X представляет собой хлор, Y представляет собой радикал NR’’, где R’’ представляет собой радикал –O-A, где A представляет собой метильную группу, все из m, n, r и s имеют значение 1, R представляет собой CH₃, а R’ представляет собой циклогексильный радикал. Другими словами, в конкретном варианте осуществления соединение, используемое в контексте изобретения, представляет собой соединение 2-хлор-4-[[2-[1-(циклогексилметил)-4-пиперидил]этил]-N-метоксикарбонимидоил]-5-метоксианилин.In another specific embodiment, X is chlorine, Y is an NR'' radical, where R'' is a –OA radical, where A is a methyl group, m, n, r and s are all 1, R is is CH ₃ and R' is a cyclohexyl radical. In other words, in a particular embodiment, the compound used in the context of the invention is 2-chloro-4-[[2-[1-(cyclohexylmethyl)-4-piperidyl]ethyl]-N-methoxycarbonimidoyl]-5-methoxyaniline.

В конкретных вариантах осуществления используются кислотные соли определенных выше соединений. В более конкретном варианте осуществления указанные кислотные соли представляют собой фумараты или дигидрохлораты.In specific embodiments, acid salts of the compounds defined above are used. In a more specific embodiment, said acid salts are fumarates or dihydrochlorates.

Более конкретно в особо предпочтительном варианте осуществления соединение, используемое в контексте изобретения, представляет собой фумарат донекоприда (т.е. соединения указанной выше формулы (II)), в частности донекоприда фумарат гидрат.More specifically, in a particularly preferred embodiment, the compound used in the context of the invention is donecopride fumarate (ie the compound of formula (II) above), in particular donecopride fumarate hydrate.

В другом особо предпочтительном варианте осуществления соединение, используемое в контексте изобретения, представляет собой фумарат флуокоприда (т.е. соединения указанной выше формулы (III)).In another particularly preferred embodiment, the compound used in the context of the invention is fluocopride fumarate (ie the compounds of the above formula (III)).

В другом особо предпочтительном варианте осуществления соединение, используемое в контексте изобретения, представляет собой дигидрохлорат MR31176 (т.е. соединения указанной выше формулы (IV)), в частности дигидрохлорат дигидрат.In another particularly preferred embodiment, the compound used in the context of the invention is MR31176 dihydrochlorate (ie the compounds of formula (IV) above), in particular dihydrochlorate dihydrate.

В другом особо предпочтительном варианте осуществления соединение, используемое в контексте изобретения, представляет собой фумарат MR33583 (т.е. соединения формулы (V), приведенной выше).In another particularly preferred embodiment, the compound used in the context of the invention is MR33583 fumarate (ie a compound of formula (V) above).

В другом особо предпочтительном варианте осуществления соединение, используемое в контексте изобретения, представляет собой фумарат MR31172 (т.е. соединения формулы (VI), приведенной выше).In another particularly preferred embodiment, the compound used in the context of the invention is MR31172 fumarate (ie a compound of formula (VI) above).

В другом особо предпочтительном варианте осуществления соединение, используемое в контексте изобретения, представляет собой фумарат MR36014 (т.е. соединения формулы (VII), приведенной выше).In another particularly preferred embodiment, the compound used in the context of the invention is MR36014 fumarate (ie a compound of formula (VII) above).

В другом особо предпочтительном варианте осуществления соединение, используемое в контексте изобретения, представляет собой фумарат MR31192 (т.е. соединения формулы (VIII), приведенной выше).In another particularly preferred embodiment, the compound used in the context of the invention is MR31192 fumarate (ie a compound of formula (VIII) above).

Нейродегенеративное заболеваниеneurodegenerative disease

Под «нейродегенеративным заболеванием» в настоящем изобретении подразумевается заболевание, вызванное коллапсом нейронной сети нервной цепи, основанным на систематической дегенерации и нарушения связей нейроцитов.By "neurodegenerative disease" in the present invention is meant a disease caused by the collapse of the neural network of the nerve circuit, based on the systematic degeneration and disruption of the connections of neurocytes.

Как объясняется выше, авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что донекоприд проявляет общее и эффективное протекторное (защитное) действие в отношении нейритов. Благодаря этому общему нейропротекторному эффекту донекоприд можно использовать в качестве нейропротекторного агента для предотвращения и/или лечения любого нейродегенеративного заболевания.As explained above, the present inventors have demonstrated that donecoprid exhibits a general and effective neurite protective effect. Due to this overall neuroprotective effect, donecoprid can be used as a neuroprotective agent to prevent and/or treat any neurodegenerative disease.

Авторы изобретения дополнительно подтвердили этот эффект для большого количества соединений общей формулы (I), приведенной выше, в частности для соединений, конкретно определенных в разделе «Соединения» выше, на многочисленных моделях нейродегенеративных заболеваний, в частности на моделях болезни Альцгеймера, моделях болезни Паркинсона, моделях бокового амиотрофического склероза, моделях болезни Хантингтона и моделях нейродегенеративных заболеваний, вызванных ишемией или черепно-мозговыми травмами.The inventors further confirmed this effect for a large number of compounds of general formula (I) above, in particular for compounds specifically defined in the "Compounds" section above, in numerous models of neurodegenerative diseases, in particular in models of Alzheimer's disease, models of Parkinson's disease, models of amyotrophic lateral sclerosis, models of Huntington's disease and models of neurodegenerative diseases caused by ischemia or traumatic brain injury.

Примеры нейродегенеративных заболеваний включают болезнь Альцгеймера (БА), болезнь Паркинсона, деменцию с тельцами Леви, сосудистую деменцию и проблемы, связанные со старением, включая (i) некогнитивную нейродегенерацию, (ii) некогнитивную нейромышечную дегенерацию и (iii) моторно-сенсорную нейродегенерацию, болезнь Хантингтона, заболевания двигательных нейронов, включая боковой амиотрофический склероз (БАС), синдром Дауна, кортикобазальную ганглионарную дегенерацию, множественную системную атрофию, церебральную атрофию, оливопонтоцеребеллярную атрофию, надъядерный паралич, атаксию Фридрейха, спиноцеребеллярную атаксию 2 типа, лобно-височные дегенерации (ЛВД) и первичную прогрессирующую афазию. Examples of neurodegenerative diseases include Alzheimer's disease (AD), Parkinson's disease, Lewy body dementia, vascular dementia, and problems associated with aging, including (i) non-cognitive neurodegeneration, (ii) non-cognitive neuromuscular degeneration, and (iii) motor-sensory neurodegeneration, disease Huntington, motor neuron diseases including amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Down syndrome, corticobasal ganglion degeneration, multiple system atrophy, cerebral atrophy, olivopontocerebellar atrophy, supranuclear palsy, Friedreich's ataxia, spinocerebellar ataxia type 2, frontotemporal degenerations (FTD), and primary progressive aphasia.

В одном конкретном варианте осуществления нейродегенеративное заболевание выбрано из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, болезни Хантингтона, множественной системной атрофии, заболеваний двигательных нейронов, включая боковой амиотрофический склероз, синдрома Дауна и лобно-височной дегенерации.In one specific embodiment, the neurodegenerative disease is selected from the group consisting of Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, multiple system atrophy, motor neuron diseases including amyotrophic lateral sclerosis, Down syndrome, and frontotemporal degeneration.

В одном более конкретном варианте нейродегенеративное заболевание выбрано из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, болезни Хантингтона и бокового амиотрофического склероза.In one more specific embodiment, the neurodegenerative disease is selected from the group consisting of Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, and amyotrophic lateral sclerosis.

В другом варианте осуществления нейродегенеративное заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера.In another embodiment, the neurodegenerative disease is Alzheimer's disease.

В альтернативном варианте осуществления нейродегенеративное заболевание представляет собой нейродегенеративное заболевание, не являющееся болезнью Альцгеймера.In an alternative embodiment, the neurodegenerative disease is a non-Alzheimer's neurodegenerative disease.

В указанном альтернативном варианте осуществления нейродегенеративное заболевание выбрано из группы, состоящей из болезни Паркинсона, болезни Хантингтона и бокового амиотрофического склероза.In said alternative embodiment, the neurodegenerative disease is selected from the group consisting of Parkinson's disease, Huntington's disease, and amyotrophic lateral sclerosis.

Медицинские показанияMedical indications

Настоящее изобретение относится к соединению, определенному в разделе «Соединения» выше, предназначенному для использования в качестве нейропротекторного агента для профилактики и/или лечения нейродегенеративного заболевания, как определено в разделе «Нейродегенеративное заболевание» выше.The present invention relates to a compound defined in the Compounds section above for use as a neuroprotective agent for the prevention and/or treatment of a neurodegenerative disease as defined in the Neurodegenerative Disease section above.

Настоящее изобретение также относится к применению соединения, определенного в разделе «Соединения» выше, для получения нейропротекторного агента для профилактики и/или лечения нейродегенеративного заболевания, определенного в разделе «Нейродегенеративное заболевание» выше.The present invention also relates to the use of a compound as defined in the Compounds section above for the preparation of a neuroprotective agent for the prevention and/or treatment of a neurodegenerative disease as defined in the Neurodegenerative Disease section above.

Настоящее изобретение также относится к способу предотвращения и/или лечения нейродегенеративного заболевания, определенного в разделе «Нейродегенеративное заболевание» выше, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения, определенного в разделе «Соединения» выше, в качестве нейропротекторного агента.The present invention also relates to a method for preventing and/or treating a neurodegenerative disease as defined in the Neurodegenerative Disease section above, comprising administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of a compound as defined in the Compounds section above as a neuroprotective agent.

Настоящее изобретение также относится к способу нейропротекции у субъекта, страдающего нейродегенеративным заболеванием или подверженного риску развития нейродегенеративного заболевания, определенного в разделе «Нейродегенеративное заболевание» выше, включающему введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества соединения, определенного в разделе «Соединения» выше.The present invention also relates to a method of neuroprotection in a subject suffering from or at risk of developing a neurodegenerative disease as defined in the "Neurodegenerative Disease" section above, comprising administering to said subject a therapeutically effective amount of a compound as defined in the "Compounds" section above.

В соответствии с изобретением термин «субъект» или «субъект, нуждающийся в этом» предназначен для обозначения человека или млекопитающего, не являющегося человеком, страдающего или вероятно страдающего нейродегенеративным заболеванием, определенным в разделе «Нейродегенеративные заболевания» выше.In accordance with the invention, the term "subject" or "subject in need thereof" is intended to refer to a human or non-human mammal suffering from or likely to suffer from a neurodegenerative disease as defined in the Neurodegenerative Diseases section above.

В контексте изобретения термин «лечение» означает индукцию регресса, облегчение или ингибирование развития расстройства или состояния, к которому применяется такой термин, или одного или нескольких симптомов такого расстройства или состояния.In the context of the invention, the term "treatment" means the induction of regression, alleviation or inhibition of the development of the disorder or condition to which such a term applies, or one or more symptoms of such a disorder or condition.

В контексте изобретения термин «предотвращение» или «профилактика» означает отсрочку или предотвращение проявления расстройства или состояния, к которому применяется такой термин, или одного или нескольких симптомов такого расстройства или состояния.In the context of the invention, the term "prevention" or "prophylaxis" means delaying or preventing the manifestation of the disorder or condition to which such term applies, or one or more symptoms of such a disorder or condition.

Под «нейропротекцией» в настоящей заявке подразумевается предотвращение или ингибирование дегенеративных эффектов и восстановление целостности нейронов в центральной нервной системе, в частности предотвращение или ингибирование дегенерации нейронов.By "neuroprotection" is meant herein the prevention or inhibition of degenerative effects and restoration of the integrity of neurons in the central nervous system, in particular the prevention or inhibition of neuronal degeneration.

Под «нейропротекторным агентом» в настоящей заявке подразумевается агент, способный к нейропротекции, как определено выше.By "neuroprotective agent" in this application is meant an agent capable of neuroprotection as defined above.

Авторы изобретения, более конкретно, продемонстрировали, что соединения, используемые в контексте изобретения, способны увеличивать рост нейритов, поддерживать частоту синапсов, уменьшать гиперфосфорилирование тау-белка и/или способствовать образованию новых синапсов.More specifically, the inventors have demonstrated that the compounds used in the context of the invention are able to increase neurite outgrowth, maintain synapse frequency, reduce tau hyperphosphorylation, and/or promote the formation of new synapses.

Соответственно, в конкретном варианте осуществления соединение, определенное в разделе «Соединения» выше, предназначено для увеличения роста нейритов.Accordingly, in a particular embodiment, the compound defined in the "Compounds" section above is for enhancing neurite outgrowth.

Настоящее изобретение также относится к способу увеличения роста нейритов у субъекта, страдающего нейродегенеративным заболеванием или подверженного риску развития нейродегенеративного заболевания, определенного в разделе «Нейродегенеративное заболевание» выше, включающему введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества соединения, определенного в разделе «Соединения» выше.The present invention also relates to a method for increasing neurite outgrowth in a subject suffering from or at risk of developing a neurodegenerative disease as defined in the "Neurodegenerative Disease" section above, comprising administering to said subject a therapeutically effective amount of a compound as defined in the "Compounds" section above.

Под «ростом нейритов» в настоящей заявке подразумевается процесс удлинения любого отростка из тела клетки нейрона и связанный с ним генезис синапсов.By "growth of neurites" in this application is meant the process of elongation of any process from the cell body of a neuron and the associated genesis of synapses.

Под «усилением роста нейритов» в настоящей заявке подразумевается, что рост нейритов повышается (т.е. становится более эффективным, быстрым или длительным), предпочтительно статистически значимо повышается, когда применяют представляющее интерес соединение, по сравнению с ростом нейритов, наблюдаемым в тех же условиях, но без применения интересующего соединения. Предпочтительно рост нейритов увеличивается по меньшей мере на 120% по сравнению с ростом нейритов, наблюдаемым в тех же условиях, но без применения представляющего интерес соединения.By "enhancing neurite outgrowth" is meant herein that neurite outgrowth is increased (i.e., becomes more efficient, rapid, or sustained), preferably statistically significantly increased, when the compound of interest is used, compared to the neurite outgrowth observed in the same conditions, but without using the compound of interest. Preferably, neurite outgrowth is increased by at least 120% compared to neurite outgrowth observed under the same conditions but without the compound of interest.

В другом конкретном варианте осуществления соединение, определенное в разделе «Соединения» выше, предназначено для поддержания частоты синапсов.In another specific embodiment, the compound defined in the "Compounds" section above is for maintaining synapse frequency.

Другой объект по настоящему изобретению относится к способу поддержания частоты синапсов у субъекта, страдающего нейродегенеративным заболеванием или подверженного риску развития нейродегенеративого заболевания, определенного в разделе «Нейродегенеративное заболевание» выше, включающему введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества соединения, определенного в разделе «Соединения» выше.Another object of the present invention relates to a method of maintaining the frequency of synapses in a subject suffering from a neurodegenerative disease or at risk of developing a neurodegenerative disease, as defined in the Neurodegenerative Disease section above, comprising administering to said subject a therapeutically effective amount of a compound defined in the Compounds section above.

Под «частотой синапсов» в настоящей заявке понимается отношение количества синапсов к количеству нейронов.Under the "frequency of synapses" in this application refers to the ratio of the number of synapses to the number of neurons.

Под «поддержанием частоты синапсов» в настоящей заявке подразумевается, что частота синапсов аналогична (то есть статистически значимо не отличается) при применении интересующего соединения, по сравнению с частотой синапсов, наблюдаемой в контрольных условиях, таких как те же условия, но без применения представляющего интерес соединения, или при состояниях, где нейроны не подвергаются воздействию нейродегенеративных факторов.By "maintaining the frequency of synapses" in this application is meant that the frequency of synapses is similar (i.e., not statistically significantly different) when using the compound of interest, compared with the frequency of synapses observed under control conditions, such as the same conditions, but without using the compound of interest connections, or in conditions where neurons are not exposed to neurodegenerative factors.

В другом конкретном варианте осуществления соединение, определенное в разделе «Соединения» выше, предназначено для стимуляции образования новых синапсов.In another specific embodiment, the compound defined in the "Compounds" section above is for stimulating the formation of new synapses.

Другой объект по настоящему изобретению относится к способу стимуляции образования новых синапсов у субъекта, страдающего нейродегенеративным заболеванием или подверженного риску развития нейродегенеративного заболевания, определенного выше в разделе «Нейродегенеративное заболевание», включающему введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества соединения, определенного в разделе «Соединения» выше.Another object of the present invention relates to a method of stimulating the formation of new synapses in a subject suffering from a neurodegenerative disease or at risk of developing a neurodegenerative disease as defined above in the "Neurodegenerative Disease" section, comprising administering to said subject a therapeutically effective amount of a compound as defined in the "Compounds" section above. .

Под «стимуляцией образования новых синапсов» в настоящей заявке подразумевается, что количество вновь образованных синапсов выше, предпочтительно статистически значимо выше, когда применяют представляющее интерес соединение, по сравнению с количеством вновь образованных синапсов, наблюдаемых в тех же условиях, но без применения интересующего соединения. Предпочтительно образование новых синапсов увеличивается по меньшей мере на 120% по сравнению с образованием новых синапсов, наблюдаемых в тех же условиях, но без применения интересующего соединения.By "stimulating the formation of new synapses" is meant here that the number of newly formed synapses is higher, preferably statistically significantly higher, when the compound of interest is used, compared to the number of newly formed synapses observed under the same conditions but without the use of the compound of interest. Preferably, the formation of new synapses is increased by at least 120% compared to the formation of new synapses observed under the same conditions but without the use of the compound of interest.

В другом конкретном варианте осуществления соединение, определенное в разделе «Соединения» выше, предназначено для уменьшения гиперфосфорилирования тау-белка.In another specific embodiment, the compound defined in the "Compounds" section above is for reducing tau hyperphosphorylation.

Другой объект по настоящему изобретению относится к способу снижения фосфорилирования тау-белка у субъекта, страдающего нейродегенеративным заболеванием или подверженного риску развития нейродегенеративного заболевания, определенного в разделе «Нейродегенеративное заболевание» выше, включающему введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества соединения, определенного в разделе «Соединения» выше.Another aspect of the present invention relates to a method for reducing tau protein phosphorylation in a subject suffering from or at risk of developing a neurodegenerative disease as defined in the "Neurodegenerative Disease" section above, comprising administering to said subject a therapeutically effective amount of a compound as defined in the "Compounds" section. higher.

Под «гиперфосфорилированием тау-белка» в настоящей заявке подразумевается аномально высокое фосфорилирование тау-белка, в частности аномальное фосфорилирование тау-белка по меньшей мере в одном из остатков Thr39, Ser46, Thr50, Ser68, Thr69, Thr71, Ser113, Thr153, Thr175, Thr181, Ser184, Ser185, Ser191, Ser198, Ser199, Ser202, Thr205, Ser208, Ser210, Thr212, Ser214, Thr217, Thr231, Ser235, Ser237, Ser238, Ser241, Ser258, Ser262, Ser285, Ser289, Ser305, Ser324, Ser352, Ser356, Tyr394, Ser396, Ser400, Thr403, Ser404, Ser409, Ser412, Ser413, Thr414, Ser416, Ser422, Ser433 и Ser435.By "tau hyperphosphorylation" is meant herein abnormally high tau phosphorylation, in particular abnormal tau phosphorylation at least one of Thr39, Ser46, Thr50, Ser68, Thr69, Thr71, Ser113, Thr153, Thr175, Thr181, Ser184, Ser185, Ser191, Ser198, Ser199, Ser202, Thr205, Ser208, Ser210, Thr212, Ser214, Thr217, Thr231, Ser235, Ser237, Ser238, Ser241, Ser258, Ser262, Ser285, Ser289, Ser305, Ser324, Ser3 52, Ser356, Tyr394, Ser396, Ser400, Thr403, Ser404, Ser409, Ser412, Ser413, Thr414, Ser416, Ser422, Ser433 and Ser435.

Под «уменьшением гиперфосфорилирования тау-белка» в настоящей заявке подразумевается, что по меньшей мере один из остатков Thr39, Ser46, Thr50, Ser68, Thr69, Thr71, Ser113, Thr153, Thr175, Thr181, Ser184, Ser185, Ser191, Ser198, Ser199, Ser202, Thr205, Ser208, Ser210, Thr212, Ser214, Thr217, Thr231, Ser235, Ser237, Ser238, Ser241, Ser258, Ser262, Ser285, Ser289, Ser305, Ser324, Ser352, Ser356, Tyr394, Ser396, Ser400, Thr403, Ser404, Ser409, Ser412, Ser413, Thr414, Ser416, Ser422, Ser433 и Ser435, в частности один из остатков Ser212 и Thr214 тау-белка, не подвергается аномальному фосфорилированию при применении представляющего интерес соединения, тогда как указанный остаток аномально фосфорилируется в тех же условиях, но без применения представляющего интерес соединения. By "reducing tau hyperphosphorylation" in this application is meant that at least one of Thr39, Ser46, Thr50, Ser68, Thr69, Thr71, Ser113, Thr153, Thr175, Thr181, Ser184, Ser185, Ser191, Ser198, Ser199, Ser202, Thr205, Ser208, Ser210, Thr212, Ser214, Thr217, Thr231, Ser235, Ser237, Ser238, Ser241, Ser258, Ser262, Ser285, Ser289, Ser305, Ser324, Ser352, Ser356, Tyr394, Ser396, Ser400, Thr403, Ser 404, Ser409, Ser412, Ser413, Thr414, Ser416, Ser422, Ser433, and Ser435, in particular one of the residues Ser212 and Thr214 of the tau protein, do not undergo abnormal phosphorylation when the compound of interest is used, while said residue is abnormally phosphorylated under the same conditions, but without using the compound of interest.

Под «терапевтически эффективным количеством» в настоящей заявке подразумевается достаточное количество соединения для действия в качестве нейропротекторного агента при лечении и/или предотвращении нейродегенеративного заболевания с разумным соотношением польза/риск, применимым к любому лечению. Однако следует понимать, что общее ежедневное использование соединений по настоящему изобретению будет определяться лечащим врачом в рамках здравого медицинского суждения. Конкретный терапевтически эффективный уровень дозы для любого конкретного субъекта будет зависеть от множества факторов, включая заболевание, которое лечат, и тяжесть нарушения, активность конкретных используемых соединений, возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и рацион субъекта, время введения, путь введения и уровень экскреции конкретных используемых соединений, продолжительность лечения, лекарства, применяемые в комбинации или одновременно с конкретными применяемыми соединениями, и подобные факторы, хорошо известные в области медицины. Например, специалисту в данной области техники известно, что следует начинать применение соединений с уровней дозы ниже тех, которые требуются для достижения необходимого терапевтического эффекта, и постепенно увеличивать дозу до тех пор, пока необходимый эффект не будет достигнут.By "therapeutically effective amount" is meant herein a sufficient amount of a compound to act as a neuroprotective agent in the treatment and/or prevention of a neurodegenerative disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to any treatment. However, it should be understood that the total daily use of the compounds of the present invention will be determined by the attending physician within the framework of sound medical judgment. The specific therapeutically effective dose level for any particular subject will depend on a variety of factors, including the disease being treated and the severity of the disorder, the potency of the particular compounds used, age, body weight, general health, sex and diet of the subject, time of administration, route of administration, and the level of excretion of the specific compounds used, the duration of treatment, the drugs used in combination with or simultaneously with the specific compounds used, and similar factors well known in the medical field. For example, one skilled in the art will recognize that one should start using compounds at dose levels below those required to achieve the desired therapeutic effect and gradually increase the dose until the desired effect is achieved.

Соединения, используемые в контексте изобретения, можно применять в форме фармацевтической композиции, включающей фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества и, при необходимости, матрицы с замедленным высвобождением, такие как биоразлагаемые полимеры, для получения терапевтических композиций.The compounds used in the context of the invention can be used in the form of a pharmaceutical composition, including pharmaceutically acceptable excipients and, if necessary, sustained release matrices, such as biodegradable polymers, to obtain therapeutic compositions.

«Фармацевтически» или «фармацевтически приемлемый» относится к молекулярным объектам и композициям, которые не вызывают неблагоприятных, аллергических или других нежелательных реакций при введении млекопитающему, в частности человеку, в зависимости от ситуации. Фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество относится к нетоксичному твердому, полутвердому или жидкому наполнителю, разбавителю, инкапсулирующему материалу или добавочному веществу любого типа."Pharmaceutical" or "pharmaceutically acceptable" refers to molecular entities and compositions that do not cause adverse, allergic or other undesirable reactions when administered to a mammal, in particular a human, as the case may be. A pharmaceutically acceptable carrier or excipient refers to a non-toxic solid, semi-solid or liquid excipient, diluent, encapsulating material or additive of any type.

Форма фармацевтических композиций, включая соединения, используемые в контексте изобретения, и способ введения, естественно, зависят от состояния, которое необходимо лечить, тяжести заболевания, возраста, массы тела и пола пациента и т.д.The form of the pharmaceutical compositions, including the compounds used in the context of the invention, and the route of administration, of course, depend on the condition to be treated, the severity of the disease, the age, body weight and sex of the patient, and so on.

Соединения, используемые в контексте изобретения, могут быть включены в состав для местного, перорального, парентерального, интраназального, внутривенного, внутримышечного, подкожного или внутриглазного введения и т.п. В одном конкретном варианте осуществления соединение, используемое в контексте изобретения, применяют перорально.The compounds used in the context of the invention may be formulated for topical, oral, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous or intraocular administration, and the like. In one particular embodiment, the compound used in the context of the invention is administered orally.

В альтернативном варианте фармацевтические композиции, включающие соединения, используемые в контексте изобретения, могут содержать носители, которые фармацевтически приемлемы для состава, который можно вводить путем инъекции. Это могут быть, в частности, изотонические, стерильные, солевые растворы (мононатрий- или динатрий фосфат, хлорид натрия, калия, кальция или магния и т.п., или смеси таких солей) или сухие, особенно лиофилизированные, композиции, которые при добавлении, в зависимости от необходимости, стерильной воды или физиологического раствора, позволяют получать растворы для инъекций.Alternatively, pharmaceutical compositions comprising the compounds used in the context of the invention may contain carriers which are pharmaceutically acceptable for the formulation to be administered by injection. These may in particular be isotonic, sterile, saline solutions (monosodium or disodium phosphate, sodium, potassium, calcium or magnesium chloride, etc., or mixtures of such salts) or dry, especially lyophilized, compositions which, when added , depending on the need, sterile water or saline, allow to obtain solutions for injection.

Для приготовления фармацевтических композиций эффективное количество соединений, используемых в контексте изобретения, может быть растворено или диспергировано в фармацевтически приемлемом носителе или водной среде.For the preparation of pharmaceutical compositions, an effective amount of the compounds used in the context of the invention may be dissolved or dispersed in a pharmaceutically acceptable carrier or aqueous medium.

Фармацевтические формы, подходящие для инъекционного применения, включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для немедленного приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий. Во всех случаях форма должна быть стерильной и должна быть жидкой до такой степени, чтобы ее можно было легко набрать с помощью шприца. Она должна быть стабильной в условиях производства и хранения, и должна быть защищена от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибки.Pharmaceutical forms suitable for injectable use include sterile aqueous solutions or dispersions and sterile powders for the immediate preparation of sterile injectable solutions or dispersions. In all cases, the form must be sterile and must be fluid to the extent that it can be easily filled with a syringe. It must be stable under the conditions of manufacture and storage, and must be protected from the contaminating action of microorganisms such as bacteria and fungi.

Носитель может быть растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси. Подходящую текучесть можно поддерживать, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания необходимого размера частиц в случае дисперсии и использования поверхностно-активных веществ, стабилизирующих агентов, криопротекторов или антиоксидантов. Предотвращать действие микроорганизмов можно с помощью антибактериальных и противогрибковых средств. Во многих случаях будет предпочтительно включать изотонические агенты, например сахара или хлорид натрия.The carrier may be a solvent or dispersion medium containing, for example, water, ethanol, polyol (eg glycerol, propylene glycol, liquid polyethylene glycol, etc.) and suitable mixtures thereof. Suitable fluidity can be maintained, for example, by using a coating such as lecithin, by maintaining the required particle size in the case of a dispersion, and by using surfactants, stabilizing agents, cryoprotectants or antioxidants. To prevent the action of microorganisms, you can use antibacterial and antifungal agents. In many cases, it will be preferable to include isotonic agents, such as sugars or sodium chloride.

Стерильные растворы для инъекций готовят путем включения активных соединений в необходимом количестве в соответствующий растворитель с несколькими другими ингредиентами, перечисленными выше, если это требуется, с последующей стерилизацией фильтрованием. Обычно дисперсии готовят путем включения различных стерилизованных активных ингредиентов в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций предпочтительными способами приготовления являются способы вакуумной сушки и лиофилизации, которые дают порошок активного ингредиента плюс любого дополнительного необходимого ингредиента из их раствора, предварительно стерилизованного фильтрованием.Sterile injectable solutions are prepared by incorporating the active compounds in the required amount in the appropriate solvent with several of the other ingredients listed above, if required, followed by filtered sterilization. Generally, dispersions are prepared by incorporating the various sterilized active ingredients into a sterile vehicle which contains the basic dispersion medium and the other necessary ingredients listed above. In the case of sterile powders for the preparation of sterile injectable solutions, the preferred methods of preparation are vacuum drying and lyophilization methods, which yield a powder of the active ingredient plus any additional required ingredient from their previously sterile filtered solution.

После приготовления растворы будут вводить способом, совместимым с лекарственным препаратом, и в таком количестве, которое является терапевтически эффективным. Композиции легко вводят в различных лекарственных формах, таких как типы растворов для инъекций, описанные выше, но также можно использовать капсулы для высвобождения лекарственного средства и тому подобное.Once prepared, the solutions will be administered in a manner compatible with the drug and in such amount as is therapeutically effective. The compositions are readily administered in various dosage forms such as the types of injections described above, but drug release capsules and the like can also be used.

Для парентерального введения в водном растворе, например, раствор должен быть соответствующим образом забуферен, если это необходимо, и жидкий разбавитель сначала должен быть сделан изотоническим с помощью достаточного количества физиологического раствора или глюкозы. Эти конкретные водные растворы особенно хорошо подходят для внутривенного, внутримышечного, подкожного и интраперитонеального введения. В связи с этим, стерильные водные среды, которые можно использовать, известны специалистам в данной области техники в свете настоящего изобретения. Например, одну дозу можно растворить в 1 мл изотонического раствора NaCl и либо добавить к 1000 мл жидкости для гиподермоклизиса, либо ввести в предполагаемое место инфузии (см., например, «Remington’s Pharmaceutical Sciences» 15-е издание, стр. 1035-1038 и 1570-1580). В зависимости от состояния пациента, которого лечат, обязательно будет некоторое изменение дозировки. Лицо, ответственное за введение, в любом случае определит подходящую дозу для каждого отдельного субъекта.For parenteral administration in aqueous solution, for example, the solution should be suitably buffered if necessary and the liquid diluent first made isotonic with sufficient saline or glucose. These particular aqueous solutions are particularly well suited for intravenous, intramuscular, subcutaneous and intraperitoneal administration. In this regard, sterile aqueous media that can be used are known to those skilled in the art in light of the present invention. For example, one dose may be dissolved in 1 ml of isotonic NaCl solution and either added to 1000 ml of hypodermolysis fluid or administered at the intended site of infusion (see, for example, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th edition, pp. 1035-1038 and 1570-1580). Depending on the condition of the patient being treated, there will necessarily be some variation in dosage. The person responsible for administration will in any case determine the appropriate dose for each individual subject.

Соединение, используемое в контексте изобретения, обычно можно вводить перорально, например в форме таблеток, капсул, микрокапсул, порошков, гранул, сиропов, растворов или суспензий, принимаемых пероральным или сублингвальным путем.The compound used in the context of the invention can generally be administered orally, for example in the form of tablets, capsules, microcapsules, powders, granules, syrups, solutions or suspensions taken orally or sublingually.

В одном конкретном варианте осуществления соединение, используемое в контексте изобретения, подходящим образом применяют перорально в суточной дозе от 1 до 20 мг/кг массы тела, в частности в суточной дозе 2 мг/кг.In one specific embodiment, the compound used in the context of the invention is suitably administered orally at a daily dose of 1 to 20 mg/kg of body weight, in particular at a daily dose of 2 mg/kg.

В другом конкретном варианте осуществления соединения, используемые в контексте изобретения, подходящим образом применяют перорально, два раза в неделю, в дозе от 1 до 20 мг/кг массы тела, в частности в дозе 1 мг/кг два раза в неделю. In another specific embodiment, the compounds used in the context of the invention are suitably administered orally, twice a week, at a dose of 1 to 20 mg/kg of body weight, in particular at a dose of 1 mg/kg twice a week.

Согласно другому конкретному варианту осуществления соединение, используемое в контексте изобретения, применяют в дозах от 10 до 1000 мг в сутки, предпочтительно в дозах от 0,2 до 2 мг 5 раз в сутки.According to another specific embodiment, the compound used in the context of the invention is used in doses of 10 to 1000 mg per day, preferably in doses of 0.2 to 2 mg 5 times a day.

Настоящее изобретение будет дополнительно проиллюстрировано приведенными ниже фигурами и примерами.The present invention will be further illustrated by the following figures and examples.

Краткое описание фигурBrief description of the figures

Фиг. 1: Влияние MR31193 на выживание нейронов MAP-2 (A), общую нейритную сеть (B), длину нейритов, нормализованную на количество нейронов (C), и на фосфорилирование тау-белка (AT100) (D) в первичной культуре нейронов гиппокампа, поврежденных Aβ 1-42. Результаты выражены в процентах от контроля как среднее значение ± SEM (n = 4-6 на группу). Односторонний дисперсионный анализ с последующим тестом методом наименьшей значимой разницы по Фишеру. *p <0,05 считали значимым.Fig. 1: Effect of MR31193 on MAP-2 neuronal survival (A), total neuritic network (B), neurite length normalized to number of neurons (C), and tau protein (AT100) phosphorylation (D) in primary culture of hippocampal neurons, damaged Aβ 1-42. Results are expressed as percentage of control as mean ± SEM (n = 4-6 per group). One-way analysis of variance followed by a Fisher least significant difference test. *p<0.05 was considered significant.

Фиг. 2: Влияние MR31193 на сохранение синапсов нейронов MAP-2 в первичной культуре нейронов гиппокампа, поврежденных Aβ 1-42. Результаты выражены в процентах от контроля как среднее значение ± SEM (n = 4-6 на группу). Односторонний дисперсионный анализ с последующим тестом методом наименьшей значимой разницы по Фишеру. *p <0,05 считали значимым.Fig. 2: Effect of MR31193 on synapse retention of MAP-2 neurons in a primary culture of hippocampal neurons damaged by Aβ 1-42. Results are expressed as percentage of control as mean ± SEM (n = 4-6 per group). One-way analysis of variance followed by a Fisher least significant difference test. *p<0.05 was considered significant.

Фиг. 3: Влияние MR31176 на выживание нейронов MAP-2 (A), общую нейритную сеть (B), длину нейритов, нормализованную на количество нейронов (C), и на фосфорилирование тау-белка (AT100) (D) в первичной культуре нейронов гиппокампа, поврежденных Aβ 1-42. Результаты выражены в процентах от контроля как среднее значение ± SEM (n = 4-6 на группу). Односторонний дисперсионный анализ с последующим тестом методом наименьшей значимой разницы по Фишеру. *p <0,05 считали значимым.Fig. 3: Effect of MR31176 on MAP-2 neuronal survival (A), total neuritic network (B), neurite length normalized to number of neurons (C), and tau protein (AT100) phosphorylation (D) in primary culture of hippocampal neurons, damaged Aβ 1-42. Results are expressed as percentage of control as mean ± SEM (n = 4-6 per group). One-way analysis of variance followed by a Fisher least significant difference test. *p<0.05 was considered significant.

Фиг. 4: Влияние MR31176 на сохранение синапсов нейронов MAP-2 в первичной культуре нейронов гиппокампа, поврежденных Aβ 1-42. Результаты выражены в процентах от контроля как среднее значение ± SEM (n = 4-6 на группу). Односторонний дисперсионный анализ с последующим тестом методом наименьшей значимой разницы по Фишеру. *p <0,05 считали значимым.Fig. 4: Effect of MR31176 on synapse retention of MAP-2 neurons in a primary culture of hippocampal neurons damaged by Aβ 1-42. Results are expressed as percentage of control as mean ± SEM (n = 4-6 per group). One-way analysis of variance followed by a Fisher least significant difference test. *p<0.05 was considered significant.

Фиг. 5: Влияние MR31192 на выживание нейронов MAP-2 (A), общую нейритную сеть (B), длину нейритов, нормализованную на количество нейронов (C), и на фосфорилирование тау-белка (AT100) (D) в первичной культуре нейронов гиппокампа, поврежденных Aβ 1-42. Результаты выражены в процентах от контроля как среднее значение ± SEM (n = 4-6 на группу). Односторонний дисперсионный анализ с последующим тестом методом наименьшей значимой разницы по Фишеру. *p <0,05 считали значимым.Fig. 5: Effect of MR31192 on MAP-2 neuronal survival (A), total neuritic network (B), neurite length normalized to number of neurons (C), and tau protein (AT100) phosphorylation (D) in primary culture of hippocampal neurons, damaged Aβ 1-42. Results are expressed as percentage of control as mean ± SEM (n = 4-6 per group). One-way analysis of variance followed by a Fisher least significant difference test. *p<0.05 was considered significant.

Фиг. 6. Влияние MR31192 на сохранение синапсов нейронов MAP-2 в первичной культуре нейронов гиппокампа, поврежденных Aβ 1-42. Результаты выражены в процентах от контроля как среднее значение ± SEM (n = 4-6 на группу). Односторонний дисперсионный анализ с последующим тестом методом наименьшей значимой разницы по Фишеру. *p <0,05 считали значимым.Fig. Fig. 6. Effect of MR31192 on synapse retention of MAP-2 neurons in a primary culture of hippocampal neurons damaged by Aβ 1-42. Results are expressed as percentage of control as mean ± SEM (n = 4-6 per group). One-way analysis of variance followed by a Fisher least significant difference test. *p<0.05 was considered significant.

Фиг. 7: Влияние MR33583 на выживание нейронов MAP-2 (A), общую нейритную сеть (B), длину нейритов, нормализованную по количеству нейронов (C), и на фосфорилирование тау-белка (AT100) (D) в первичной культуре нейронов гиппокампа, поврежденных Aβ 1-42. Результаты выражены в процентах от контроля как среднее значение ± SEM (n = 4-6 на группу). Односторонний дисперсионный анализ с последующим тестом методом наименьшей значимой разницы по Фишеру. *p <0,05 считали значимым.Fig. 7: Effect of MR33583 on MAP-2 neuronal survival (A), total neuritic network (B), neurite length normalized by number of neurons (C), and tau protein (AT100) phosphorylation (D) in primary culture of hippocampal neurons, damaged Aβ 1-42. Results are expressed as percentage of control as mean ± SEM (n = 4-6 per group). One-way analysis of variance followed by a Fisher least significant difference test. *p<0.05 was considered significant.

Фиг. 8: Влияние MR33583 на сохранение синапсов нейронов MAP-2 в первичной культуре нейронов гиппокампа, поврежденных Aβ 1-42. Результаты выражены в процентах от контроля как среднее значение ± SEM (n = 4-6 на группу). Односторонний дисперсионный анализ с последующим тестом методом наименьшей значимой разницы по Фишеру. *p <0,05 считали значимым.Fig. 8: Effect of MR33583 on synapse retention of MAP-2 neurons in a primary culture of hippocampal neurons damaged by Aβ 1-42. Results are expressed as percentage of control as mean ± SEM (n = 4-6 per group). One-way analysis of variance followed by a Fisher least significant difference test. *p<0.05 was considered significant.

Фиг. 9: Влияние MR31192 или донепезила на выживание нейронов MAP-2 (A), общую нейритную сеть (B), длину нейритов, нормализованную по количеству нейронов (C), и на фосфорилирование тау-белка (AT100) (D) в первичной культуре нейронов гиппокампа, поврежденных Aβ 1-42. Результаты выражены в процентах от контроля как среднее ± SEM (n = 4-6 на группу). Односторонний дисперсионный анализ с последующим тестом методом наименьшей значимой разницы по Фишеру. *p <0,05 считали значимым.Fig. 9: Effect of MR31192 or donepezil on MAP-2 neuronal survival (A), total neuritic network (B), neurite length normalized by number of neurons (C), and tau protein (AT100) phosphorylation (D) in primary neuronal culture hippocampus damaged by Aβ 1-42. Results are expressed as percentage of control as mean ± SEM (n = 4-6 per group). One-way analysis of variance followed by a Fisher least significant difference test. *p<0.05 was considered significant.

Фиг. 10: Влияние MR31192 или донепезила на сохранение синапсов нейронов MAP-2 в первичной культуре нейронов гиппокампа, поврежденных Aβ 1-42. Результаты выражены в процентах от контроля как среднее значение ± SEM (n = 4-6 на группу). Односторонний дисперсионный анализ с последующим тестом методом наименьшей значимой разницы по Фишеру. *p <0,05 считали значимым.Fig. 10: Effect of MR31192 or donepezil on synapse retention of MAP-2 neurons in a primary culture of hippocampal neurons damaged by Aβ 1-42. Results are expressed as percentage of control as mean ± SEM (n = 4-6 per group). One-way analysis of variance followed by a Fisher least significant difference test. *p<0.05 was considered significant.

Фиг. 11: Влияние MR36014 или донепезила на выживание нейронов MAP-2 (A), общую нейритную сеть (B), длину нейритов, нормализованную на количество нейронов (C), и на фосфорилирование тау-белка (AT100) (D) в первичной культуре нейронов гиппокампа, поврежденных Aβ 1-42. Результаты выражены в процентах от контроля как среднее значение ± SEM (n = 4-6 на группу). Односторонний дисперсионный анализ с последующим тестом методом наименьшей значимой разницы по Фишеру. *p <0,05 считали значимым.Fig. 11: Effect of MR36014 or donepezil on MAP-2 neuronal survival (A), total neuritic network (B), neurite length normalized to number of neurons (C), and tau (AT100) phosphorylation (D) in primary neuronal culture hippocampus damaged by Aβ 1-42. Results are expressed as percentage of control as mean ± SEM (n = 4-6 per group). One-way analysis of variance followed by a Fisher least significant difference test. *p<0.05 was considered significant.

Фиг. 12: Влияние MR36014 или донепезила на сохранение синапсов нейронов MAP-2 в первичной культуре нейронов гиппокампа, поврежденных Aβ 1-42. Результаты выражены в процентах от контроля как среднее значение ± SEM (n = 4-6 на группу). Односторонний дисперсионный анализ с последующим тестом методом наименьшей значимой разницы по Фишеру. *p <0,05 считали значимым.Fig. 12: Effect of MR36014 or donepezil on synapse retention of MAP-2 neurons in a primary culture of Aβ 1-42 damaged hippocampal neurons. Results are expressed as percentage of control as mean ± SEM (n = 4-6 per group). One-way analysis of variance followed by a Fisher least significant difference test. *p<0.05 was considered significant.

Фиг. 13: Влияние MR36014 на выживание TH-нейронов (A), на общую нейритную сеть TH-нейронов (B) и на агрегацию aSyn в TH-нейронах (C) в первичной культуре мезэнцефальных нейронов, поврежденных MPP+. Результаты выражены в процентах от контроля как среднее значение ± SEM (n = 4-6 на группу). Односторонний дисперсионный анализ с последующим тестом методом наименьшей значимой разницы по Фишеру. *p <0,05 считали значимым.Fig. 13: Effect of MR36014 on TH neuron survival (A), on the total neuritic network of TH neurons (B) and on aSyn aggregation in TH neurons (C) in a primary culture of MPP+ damaged mesencephalic neurons. Results are expressed as percentage of control as mean ± SEM (n = 4-6 per group). One-way analysis of variance followed by a Fisher least significant difference test. *p<0.05 was considered significant.

Фиг. 14: Влияние MR33583 на выживание TH-нейронов (A), на общую нейритную сеть TH-нейронов (B) и на агрегацию aSyn в TH-нейронах (C) в первичной культуре мезэнцефальных нейронов, поврежденных MPP+. Результаты выражены в процентах от контроля как среднее значение ± SEM (n = 4-6 на группу). Односторонний дисперсионный анализ с последующим тестом методом наименьшей значимой разницы по Фишеру. *p <0,05 считали значимым.Fig. 14: Effect of MR33583 on TH neuron survival (A), on the total neuritic network of TH neurons (B) and on aSyn aggregation in TH neurons (C) in a primary culture of MPP+ damaged mesencephalic neurons. Results are expressed as percentage of control as mean ± SEM (n = 4-6 per group). One-way analysis of variance followed by a Fisher least significant difference test. *p<0.05 was considered significant.

Фиг. 15: Влияние MR36014 (A-B) и MR33583 (C-D) на выживание нейронов MAP-2 (A-C)) и защиту общей нейритной сети (B-D)) в первичной культуре кортикальных нейронов, поврежденных глутаматом. Результаты выражены в процентах от контроля как среднее значение ± SEM (n = 4-6 на группу). Односторонний дисперсионный анализ с последующим тестом методом наименьшей значимой разницы по Фишеру. *p <0,05 считали значимым.Fig. 15: Effect of MR36014 (A-B) and MR33583 (C-D) on MAP-2 neuron survival (A-C)) and protection of the total neural network (B-D)) in a primary culture of glutamate-damaged cortical neurons. Results are expressed as percentage of control as mean ± SEM (n = 4-6 per group). One-way analysis of variance followed by a Fisher least significant difference test. *p<0.05 was considered significant.

Фиг. 16: Влияние MR36014 на выживание (A) и нейритную сеть (B, C) в двигательных нейронах спинного мозга после повреждения глутаматом. Результаты выражены в процентах от контроля и показывают среднее значение ± SEM (100% = CT, без соединения). Односторонний дисперсионный анализ с последующим тестом методом наименьшей значимой разницы по Фишеру, n = 4-6. p <0,05 считали значимым.Fig. 16: Effect of MR36014 on survival (A) and neuritic network (B, C) in spinal cord motor neurons after glutamate injury. Results are expressed as a percentage of control and show the mean ± SEM (100% = CT, no compound). One-way analysis of variance followed by Fisher least significant difference test, n = 4-6. p<0.05 was considered significant.

Фиг. 17: Влияние MR33583 на выживание (A), нейритную сеть (B, C) и на цитоплазматическую транслокацию TDP-43 (D) в двигательных нейронах спинного мозга после повреждения глутаматом. Результаты выражены в процентах от контроля и показывают среднее значение ± SEM (100% = CT, без соединения). Односторонний дисперсионный анализ с последующим тестом методом наименьшей значимой разницы по Фишеру, n = 4-6. p <0,05 считали значимым.Fig. 17: Effect of MR33583 on survival (A), neuritic network (B, C), and cytoplasmic translocation of TDP-43 (D) in spinal cord motor neurons after glutamate injury. Results are expressed as a percentage of control and show the mean ± SEM (100% = CT, no compound). One-way analysis of variance followed by Fisher least significant difference test, n = 4-6. p<0.05 was considered significant.

Фиг. 18: Влияние MR33583 на выживание ГАМКергических нейронов в первичной культуре мезэнцефальных клеток после депривации факторов роста (ДФР). Результаты выражены в процентах от контроля и показывают среднее значение ± SEM (100% = CT, без соединения). Односторонний дисперсионный анализ с последующим тестом методом наименьшей значимой разницы по Фишеру, n = 4-6. p <0,05 считали значимым.Fig. 18: Effect of MR33583 on survival of GABAergic neurons in primary culture of mesencephalic cells after growth factor deprivation (GFR). Results are expressed as a percentage of control and show the mean ± SEM (100% = CT, no compound). One-way analysis of variance followed by Fisher least significant difference test, n = 4-6. p<0.05 was considered significant.

ПримерыExamples

Пример 1Example 1

В этом примере показано влияние донекоприда на первичные нейроны гиппокампа крысы, поврежденные Aβ (24-часовое воздействие).This example shows the effect of donecoprid on Aβ-damaged primary rat hippocampal neurons (24-hour exposure).

Болезнь Альцгеймера (БА) - это нейродегенеративное заболевание, которое поражает в основном людей старше 65 лет, страдающих от различных клинических симптомов, таких как прогрессирующее снижение мышления, речи и способности к обучению. Все больше данных из различных источников указывает на олигомеры Aβ (AβO)/протофибриллы как предполагаемые токсичные частицы в патогенезе БА.Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disease that mainly affects people over the age of 65 who suffer from a variety of clinical symptoms such as a progressive decline in thinking, speech, and learning ability. A growing body of evidence from various sources points to Aβ (AβO) oligomers/protofibrils as putative toxic particles in the pathogenesis of AD.

Создавая раствор AβO и варьируя концентрацию и время воздействия AβO, можно воспроизвести ранние эффекты (окислительный стресс) и долгосрочное развитие структурных изменений (гибель нейронов).By creating an AβO solution and varying the concentration and time of exposure to AβO, it is possible to reproduce the early effects (oxidative stress) and the long-term development of structural changes (neuronal death).

Модель, использованная в настоящем примере, с применением раствора Aβ пептида, содержащего AβO (точно измеренного с помощью автоматического вестерн-блоттинга), воспроизводила основные нейропатологические особенности БА.The model used in this example, using a solution of Aβ peptide containing AβO (accurately measured by automatic Western blotting), reproduced the main neuropathological features of AD.

Целью этого исследования была оценка эффектов одного тестируемого соединения (фумарата донекоприда в нескольких концентрациях) в отношении первичных нейронов гиппокампа крыс, поврежденных Aβ (24-часовое воздействие). Донепезил следующей формулы:The aim of this study was to evaluate the effects of one test compound (multiple concentrations of donecoprid fumarate) on Aβ-damaged primary rat hippocampal neurons (24-hour exposure). Donepezil of the following formula:

(одна концентрация) использовали в качестве эталонного тестируемого соединения.(one concentration) was used as the reference test compound.

Материалы и методыMaterials and methods

Первичная культура нейронов гиппокампаPrimary culture of hippocampal neurons

Нейроны гиппокампа крыс культивировали, как описано Callizot et al. (2013) J. Neurosci. Res. 91706-716. Беременных самок крыс со сроком гестации 17 дней (крысы Wistar; Janvier Labs, Франция) умерщвляли с использованием глубокой анестезии в камере CO₂ с последующей цервикальной дислокацией. Затем эмбрионы извлекали из матки и немедленно помещали в ледяную среду L15 Лейбовица с 2% раствором пенициллина (10000 Ед/мл) и стрептомицина (10 мг/ мл) (ПС) и 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА). Нейроны гиппокампа обрабатывали в течение 20 мин при 37°C раствором трипсин-ЭДТА с конечной концентрацией 0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА. Диссоциацию останавливали добавлением модифицированной по Дульбекко среды Игла (DMEM) с 4,5 г/л глюкозы, содержащей ДНКазу I сорта II (конечная концентрация 0,5 мг/мл) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС). Клетки механически диссоциировали посредством трех принудительных пропусканий через кончик 10 мл пипетки, а затем центрифугировали при 515 x g в течение 10 минут при 4°C. Надосадочную жидкость удаляли, а осадок ресуспендировали в определенной культуральной среде, состоящей из нейробазальной среды с 2% раствором добавки B27, 2 ммоль/л L-глутамина, 2% раствора ПС и 10 нг/мл нейротрофического фактора головного мозга (BDNF). Жизнеспособные клетки подсчитывали на цитометре Нойбауэра с использованием теста исключения трипанового синего. Клетки высевали с плотностью 20000 на лунку в 96-луночные планшеты, предварительно покрытые поли-L-лизином, и культивировали при 37°C в инкубаторе в среде воздух (95%) - CO₂ (5%). Питательную среду меняли каждые 2 дня.Rat hippocampal neurons were cultured as described by Callizot et al. (2013) J. Neurosci. Res. 91706-716. Pregnant female rats gestating at 17 days (Wistar rats; Janvier Labs, France) were euthanized using deep anesthesia in a CO ₂ chamber followed by cervical dislocation. The embryos were then removed from the uterus and immediately placed in ice-cold L15 Leibovitz medium with 2% solution of penicillin (10,000 U/ml) and streptomycin (10 mg/ml) (PS) and 1% bovine serum albumin (BSA). Hippocampal neurons were treated for 20 min at 37°C with a trypsin-EDTA solution with a final concentration of 0.05% trypsin and 0.02% EDTA. Dissociation was stopped by adding Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/l glucose containing DNase I grade II (final concentration 0.5 mg/ml) and 10% fetal calf serum (FBS). The cells were mechanically dissociated by three forced passes through the tip of a 10 ml pipette and then centrifuged at 515 xg for 10 minutes at 4°C. The supernatant was removed and the pellet was resuspended in defined culture medium consisting of neurobasal medium with 2% B27 supplement solution, 2 mmol/l L-glutamine, 2% PS solution, and 10 ng/ml brain-derived neurotrophic factor (BDNF). Viable cells were counted on a Neubauer cytometer using a trypan blue exclusion test. Cells were seeded at a density of 20,000 per well in 96-well plates precoated with poly-L-lysine and cultured at 37° C. in an air (95%)-CO ₂ (5%) incubator. The nutrient medium was changed every 2 days.

Донекоприд и воздействие Aβ1-42 человекаDonecoprid and exposure to human Aβ1-42

Нейроны гиппокампа обрабатывали растворами Aβ (см. ниже) через 17 дней культивирования. Получение Aβ1-42 осуществляли в соответствии с процедурой, описанной Callizot et al. (2013) J. Neurosci. Res. 91706-716. Вкратце, пептид Aβ1-42 растворяли в указанной выше культуральной среде при начальной концентрации 40 мкМ. Этот раствор осторожно перемешивали в течение 3 дней при 37°C в темноте и сразу же использовали после того, как он был должным образом разбавлен в культуральной среде до используемых концентраций (20 мкМ (планшет 1) или 2,5 мкМ (планшет 2), что соответствует 2 мкМ или 0,25 мкМ олигомеров (AβO), соответственно).Hippocampal neurons were treated with Aβ solutions (see below) after 17 days of culture. Getting Aβ1-42 was carried out in accordance with the procedure described by Callizot et al. (2013) J. Neurosci. Res. 91706-716. Briefly, the Aβ1-42 peptide was dissolved in the above culture medium at an initial concentration of 40 μM. This solution was stirred gently for 3 days at 37° C. in the dark and used immediately after it was properly diluted in culture medium to the concentrations used (20 µM (plate 1) or 2.5 µM (plate 2), which corresponds to 2 μM or 0.25 μM oligomers (AβO), respectively).

Донекоприда фумарат растворяли в культуральной среде и предварительно инкубировали за 1 час до нанесения Aβ. Препарат Aβ1-42 добавляли до конечной концентрации 20 или 2,5 мкМ (= 2 мкМ или 0,25 мкМ AβO, при оценке с помощью автоматического вестерн-блоттинга), при разведении в контрольной среде в присутствии донекоприда.Donecoprid fumarate was dissolved in the culture medium and pre-incubated 1 hour before application of Aβ. Aβ1-42 preparation was added to a final concentration of 20 or 2.5 μM (= 2 μM or 0.25 μM AβO, as assessed by automated Western blotting), when diluted in control medium in the presence of donecopride.

Организация чашек с культуройOrganization of culture dishes

Донекоприда фумарат (Donecopride) тестировали на одной культуре в 96-луночном планшете (6 лунок на условия). Соединение предварительно инкубировали за час до нанесения Aβ. Оценивали следующие условия:Donecopride fumarate (Donecopride) was tested in a single culture in a 96-well plate (6 wells per condition). The compound was pre-incubated one hour before application of Aβ. The following conditions were evaluated:

Планшет 1 (MAP-2 / Тау)Tablet 1 (MAP-2/Tau) Планшет 2 (PSD95 / SYN)Tablet 2 (PSD95/SYN) Контроль (Растворитель)Control (Solvent) Контроль (Растворитель)Control (Solvent) + Aβ (20 мкМ 24 часа) / растворитель+ Aβ (20 μM 24 hours) / solvent + Aβ (2,5 мкМ 24 часа) / растворитель+ Aβ (2.5 μM 24 hours) / solvent + Aβ (20 мкМ 24 часа) / Донекоприд (1 мкМ)+ Aβ (20 μM 24 hours) / Donecoprid (1 μM) + Aβ (2,5 мкМ 24 часа) / Донекоприд (1 мкМ)+ Aβ (2.5 μM 24 hours) / Donecoprid (1 μM) + Aβ (20 мкМ 24 часа) / Донекоприд (500 нМ)+ Aβ (20 µM 24 hours) / Donecoprid (500 nM) + Aβ (2,5 мкМ 24 часа) / Донекоприд (500 нМ)+ Aβ (2.5 μM 24 hours) / Donecoprid (500 nM) + Aβ (20 мкМ 24 часа) / Донекоприд (100 нМ)+ Aβ (20 μM 24 hours) / Donecoprid (100 nM) + Aβ (2,5 мкМ 24 часа) / Донекоприд (100 нМ)+ Aβ (2.5 μM 24 hours) / Donecoprid (100 nM) + Aβ (20 мкМ 24 часа) / Донекоприд (50 нМ)+ Aβ (20 µM 24 hours) / Donecoprid (50 nM) + Aβ (2,5 мкМ 24 часа) / Донекоприд (50 нМ)+ Aβ (2.5 μM 24 hours) / Donecoprid (50 nM) + Aβ (20 мкМ 24 часа) / Донекоприд (10 нМ)+ Aβ (20 μM 24 hours) / Donecoprid (10 nM) + Aβ (2,5 мкМ 24 часа) / Донекоприд (10 нМ)+ Aβ (2.5 μM 24 hours) / Donecoprid (10 nM) + Aβ (20 мкМ 24 часа) / Донекоприд (5 нМ)+ Aβ (20 μM 24 hours) / Donecoprid (5 nM) + Aβ (2,5 мкМ 24 часа) / Донекоприд (5 нМ)+ Aβ (2.5 μM 24 hours) / Donecoprid (5 nM) + Aβ (20 мкМ 24 часа) / Донекоприд (1 нМ)+ Aβ (20 μM 24 hours) / Donecoprid (1 nM) + Aβ (2,5 мкМ 24 часа) / Донекоприд (1 нМ)+ Aβ (2.5 μM 24 hours) / Donecoprid (1 nM) + Aβ (20 мкМ 24 часа) / Донепезил (1 мкМ)+ Aβ (20 μM 24 hours) / Donepezil (1 μM) + Aβ (2,5 мкМ 24 часа) / Донепезил (1 мкМ)+ Aβ (2.5 μM 24 hours) / Donepezil (1 μM)

Оценка конечной точкиEndpoint evaluation

Планшет 1: ВЫЖИВАНИЕ, НЕЙРИТНАЯ СЕТЬ И ОЦЕНКА ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ ТАУ-БЕЛКАPlate 1: SURVIVAL, NEURITE NETWORK AND ASSESSMENT OF TAU PROTEIN PHOSPHORYLATION

Через 24 часа после интоксикации нейроны гиппокампа фиксировали холодным раствором этанола (95%) и уксусной кислоты (5%) в течение 5 минут при -20°C. После пермеабилизации 0,1% сапонином клетки инкубировали в течение 2 часов с:24 hours after intoxication, hippocampal neurons were fixed with a cold solution of ethanol (95%) and acetic acid (5%) for 5 minutes at -20°C. After permeabilization with 0.1% saponin, cells were incubated for 2 hours with:

a) куриными поликлональными антителами к белку 2, ассоциированному с микротрубочками (MAP-2), разведенными до 1/1000 в ФБР, содержащем 1% эмбриональной телячьей сыворотки и 0,1% сапонина (это антитело позволяет специфически окрашивать тела нейрональных клеток и нейритов; и позволяют изучать гибель нейронных клеток и нейритную сеть).a) chicken polyclonal antibodies to microtubule-associated protein 2 (MAP-2) diluted to 1/1000 in PBS containing 1% fetal bovine serum and 0.1% saponin (this antibody allows specific staining of neuronal cell bodies and neurites; and allow studying the death of neuron cells and the neural network).

b) мышиным моноклональным антителом против фосфо-тау-белка (AT100) при разведении 1/400 в ФБР, содержащем 1% эмбриональной телячьей сыворотки и 0,1% сапонина.b) mouse monoclonal antibody against phospho-tau protein (AT100) at a dilution of 1/400 in PBS containing 1% fetal bovine serum and 0.1% saponin.

Эти антитела были выявлены с помощью козьих антител к IgG мышей с Alexa Fluor 488 и козьих антител к куриным IgG с Alexa Fluor 568 в разведении 1/400 в ФБР, содержащем 1% ЭТС, 0,1% сапонина, в течение 1 часа при комнатной температуре.These antibodies were detected using goat anti-mouse IgG with Alexa Fluor 488 and goat anti-chicken IgG with Alexa Fluor 568 at 1/400 dilution in PBS containing 1% FBS, 0.1% saponin for 1 hour at room temperature. temperature.

Для каждого условия с помощью ImageXpress (Molecular Devices) при 20-кратном увеличении было сделано 30 снимков (представляющих всю площадь лунки) на лунку. Все изображения были сделаны с одинаковыми параметрами получения. Анализы проводили автоматически с применением Custom Module Editor (Molecular Devices).For each condition, 30 images (representing the entire well area) were taken per well using ImageXpress (Molecular Devices) at 20x magnification. All images were taken with the same acquisition parameters. Analyzes were performed automatically using the Custom Module Editor (Molecular Devices).

Оценивали следующие конечные точки:The following endpoints were evaluated:

- Общее количество нейронов (выживание нейронов, количество МАР-2-положительных нейронов);- Total number of neurons (survival of neurons, number of MAP-2-positive neurons);

- Нейритная сеть (в мкм МАР-2-положительных нейронов);- Neuritic network (in µm MAP-2-positive neurons);

- Площадь тау в нейронах (мкм², перекрывание с MAP-2-положительными нейронами).- Tau area in neurons (µm², overlap with MAP-2 positive neurons).

Планшет 2: ОЦЕНКА СИНАПСОВTablet 2: SYNAPSE ASSESSMENT

а) мышиным моноклональным антителом против постсинаптического уплотнения 95 кДа (PSD95) при разведении 1/100 в ФБР, содержащем 1% эмбриональной телячьей сыворотки и 0,1% сапонина;a) 95 kDa mouse anti-post-synaptic compaction monoclonal antibody (PSD95) at 1/100 dilution in PBS containing 1% fetal bovine serum and 0.1% saponin;

b) кроличьими поликлональными антителами против синаптофизина (SYN) в разведении 1/100 в ФБР, содержащем 1% эмбриональной телячьей сыворотки и 0,1% сапонина.b) rabbit polyclonal antibodies against synaptophysin (SYN) at a dilution of 1/100 in PBS containing 1% fetal bovine serum and 0.1% saponin.

Эти антитела проявляли с помощью козьих антител против IgG мыши Alexa Fluor 488 и козьих антител против кроличьих IgG Alexa Fluor 568 в разведении 1/400 в ФБР, содержащем 1% ЭТС, 0,1% сапонина, в течение 1 часа при комнатной температуре.These antibodies were expressed with goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 and goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568 at 1/400 dilution in PBS containing 1% FTS, 0.1% saponin for 1 hour at room temperature.

Для каждого условия было сделано 40 снимков на лунку с помощью ImageXpress (Molecular Devices) с 40-кратным увеличением. Все изображения были сделаны с одинаковыми параметрами получения.For each condition, 40 images per well were taken using ImageXpress (Molecular Devices) at 40x magnification. All images were taken with the same acquisition parameters.

Оценку синапсов выполняли автоматически с помощью Custom Module Editor (Molecular Devices).Synaptic evaluation was performed automatically using the Custom Module Editor (Molecular Devices).

- Общее количество синапсов (перекрывание между PSD95/SYN).- Total number of synapses (overlap between PSD95/SYN).

Статистический анализStatistical analysis

Все значения выражены как среднее ± SEM. Статистический анализ был выполнен с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом методом защищенной наименьшей значимой разницы по Фишеру, p <0,05 считали значимым.All values are expressed as mean ± SEM. Statistical analysis was performed by one-way ANOVA followed by Fisher's protected least significant difference test, p<0.05 was considered significant.

Графики и статистический анализ для различных условий были выполнены с использованием программного обеспечения GraphPad Prism версии 7.04. *p <0,05 считали значимым.Graphs and statistical analyzes for various conditions were performed using GraphPad Prism version 7.04 software. *p<0.05 was considered significant.

Результатыresults

Влияние донекоприда на выживание и нейритную сеть МАР-2 нейронов гиппокампа и на гиперфосфорилирование тау-белка.The effect of donecoprid on the survival and neuritic network of MAP-2 hippocampal neurons and on tau hyperphosphorylation.

Выживание нейроновSurvival of neurons

Влияние донекоприда на выживание МАР-2 нейронов в первичной культуре нейронов гиппокампа показано в таблице 1 ниже.The effect of donecoprid on the survival of MAP-2 neurons in primary culture of hippocampal neurons is shown in Table 1 below.

Таблица 1. MAP-2 нейроны (% от контроля)Table 1. MAP-2 neurons (% of control)

MAP-2 нейроны (% от контроля)MAP-2 neurons (% of control) Среднее значениеAverage value Стандартная ошибка
среднегоstandard error
middle nn КонтрольControl 100100 55 66 + Aβ 1-42 (20 мкМ)+ Aβ 1-42 (20 μM) 7070 22 66 + Донекоприд (1 нМ)+ Donecoprid (1 nM) 7070 22 55 + Донекоприд (5 нМ)+ Donecoprid (5 nM) 6969 22 66 + Донекоприд (10 нМ)+ Donecoprid (10 nM) 7373 22 55 + Донекоприд (50 нМ)+ Donecoprid (50 nM) 7474 22 55 + Донекоприд (100 нМ)+ Donecoprid (100 nM) 78*78* 11 44 + Донекоприд (500 нМ)+ Donecoprid (500 nM) 79*79* 11 55 + Донекоприд (1 мкМ)+ Donecoprid (1 µM) 62*62* 22 55 + Донепезил (1 мкМ)+ Donepezil (1 µM) 82*82* 22 55

*: p <0,05 по сравнению с Aβ1-42, при определении с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом методом наименьшей значимой разницы по Фишеру.*: p<0.05 compared to Aβ1-42, as determined using one-way ANOVA followed by Fisher least significant difference test.

После применения Aβ пептида имела место существенная потеря нейронов MAP-2. Донепезил, используемый здесь в качестве положительного контроля, был способен в существенной степени защищать нейроны от гибели. Две дозы донекоприда (100 нМ и 500 нМ) оказывали нейропротекторное действие в той же степени, что и донепезил.Significant loss of MAP-2 neurons occurred after application of the Aβ peptide. Donepezil, used here as a positive control, was able to substantially protect neurons from death. Two doses of donecoprid (100 nM and 500 nM) were neuroprotective to the same extent as donepezil.

Нейритная сеть Neuritic network

Влияние донекоприда на нейритную сеть МАР-2 нейронов в первичной культуре нейронов гиппокампа показано в таблице 2 ниже.The effect of donecoprid on the neuritic network of MAP-2 neurons in a primary culture of hippocampal neurons is shown in Table 2 below.

Таблица 2. Нейритная сеть MAP-2 (% от контроля)Table 2. MAP-2 neural network (% of control)

MAP-2 нейритная сеть (% от контроля)MAP-2 neural network (% of control) Среднее значениеAverage value Стандартная ошибка
среднегоstandard error
middle nn КонтрольControl 100100 22 66 + Aβ 1-42 (20 мкМ)+ Aβ 1-42 (20 μM) 6363 11 66 + Донекоприд (1 нМ)+ Donecoprid (1 nM) 6464 22 55 + Донекоприд (5 нМ)+ Donecoprid (5 nM) 6969 22 66 + Донекоприд (10 нМ)+ Donecoprid (10 nM) 6868 22 55 + Донекоприд (50 нМ)+ Donecoprid (50 nM) 71*71* 33 55 + Донекоприд (100 нМ)+ Donecoprid (100 nM) 73*73* 11 55 + Донекоприд (500 нМ)+ Donecoprid (500 nM) 79*79* 33 66 + Донекоприд (1 мкМ)+ Donecoprid (1 µM) 76*76* 22 66 + Донепезил (1 мкМ)+ Donepezil (1 µM) 92*92* 33 55

*: p <0,05 по сравнению с Aβ1-42, определенным с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом методом наименьшей значимой разницы по Фишеру.*: p<0.05 compared to Aβ1-42 determined using one-way analysis of variance followed by Fisher least significant difference test.

Общая нейритная сеть сильно сократилась при повреждении Aβ 1-42. Донепезил в значительной степени сохранил почти всю нейритную сеть. Четыре дозы донекоприда (50 нМ, 100 нМ, 500 нМ и 1 мкМ) также оказали защитное действие на нейритную сеть.The total neuritic network was greatly reduced when Aβ 1-42 was damaged. Donepezil largely retained almost the entire neuritic network. Four doses of donecoprid (50 nM, 100 nM, 500 nM and 1 μM) also had a protective effect on the neuritic network.

Нейритная сеть пропорциональна количеству нейронов в культуре. Полная нейритная сеть была нормализована на количество нейронов, чтобы определить среднюю длину нейрита на нейрон. Соответствующие результаты показаны в таблице 3 ниже.The neural network is proportional to the number of neurons in the culture. The complete neuritic network was normalized to the number of neurons to determine the average neurite length per neuron. The corresponding results are shown in Table 3 below.

Таблица 3. Нейритная сеть/нейроны MAP-2 (% от контроля)Table 3. MAP-2 neural network/neurons (% of control)

Нейритная сеть / MAP-2 нейроны (% от контроля)Neuritic network / MAP-2 neurons (% of control) Среднее значениеAverage value Стандартная ошибка
среднегоstandard error
middle nn КонтрольControl 100100 66 66 + Aβ 1-42 (20 мкМ)+ Aβ 1-42 (20 μM) 9090 33 66 + Донекоприд (1 нМ)+ Donecoprid (1 nM) 9090 33 44 + Донекоприд (5 нМ)+ Donecoprid (5 nM) 9999 22 66 + Донекоприд (10 нМ)+ Donecoprid (10 nM) 9696 33 44 + Донекоприд (50 нМ)+ Donecoprid (50 nM) 9191 55 44 + Донекоприд (100 нМ)+ Donecoprid (100 nM) 9393 11 44 + Донекоприд (500 нМ)+ Donecoprid (500 nM) 100100 44 55 + Донекоприд (1 мкМ)+ Donecoprid (1 µM) 124*124* 55 55

Эта корректировка показала, что длина нейритов на нейрон была больше в присутствии донепезила и донекоприда (1 мкМ), что позволило предположить, что эти два соединения влияли на рост нейритов.This adjustment showed that neurite length per neuron was greater in the presence of donepezil and donecopride (1 μM), suggesting that these two compounds affected neurite outgrowth.

Фосфорилирование тау-белкаPhosphorylation of tau protein

Влияние донекоприда на фосфорилирование тау-белка (AT100) в нейронах MAP-2 в первичной культуре нейронов гиппокампа показано в таблице 4 ниже.The effect of donecoprid on tau protein (AT100) phosphorylation in MAP-2 neurons in a primary culture of hippocampal neurons is shown in Table 4 below.

Таблица 4. Площадь тау-белка (AT100)/нейроны (% от контроля)Table 4. Tau protein area (AT100)/neurons (% of control)

Площадь тау-белка (AT100)/нейроны (% от контроля)Tau protein area (AT100)/neurons (% of control) Среднее значениеAverage value Стандартная ошибка
среднегоstandard error
middle nn КонтрольControl 100100 44 55 + Aβ 1-42 (20 мкМ)+ Aβ 1-42 (20 μM) 200200 11eleven 55 + Донекоприд (1 нМ)+ Donecoprid (1 nM) 204204 77 44 + Донекоприд (5 нМ)+ Donecoprid (5 nM) 201201 88 55 + Донекоприд (10 нМ)+ Donecoprid (10 nM) 175175 11eleven 44 + Донекоприд (50 нМ)+ Donecoprid (50 nM) 161*161* 1212 55 + Донекоприд (100 нМ)+ Donecoprid (100 nM) 154*154* 66 33 + Донекоприд (500 нМ)+ Donecoprid (500 nM) 152*152* 88 44 + Донекоприд (1 мкМ)+ Donecoprid (1 µM) 198198 88 55 + Донепезил (1 мкМ)+ Donepezil (1 µM) 151*151* 66 44

При применении Aβ 1-42 наблюдалось гиперфосфорилирование тау-белка (на AT100). Донепезил в значительной степени уменьшал это гиперфосфорилирование. Аналогичным образом, донекоприд (50 нМ, 100 нМ, 500 нМ) в значительной степени снижал гиперфосфорилирование тау-белка дозозависимым образом.When using Aβ 1-42, hyperphosphorylation of tau protein (on AT100) was observed. Donepezil significantly reduced this hyperphosphorylation. Similarly, donecoprid (50 nM, 100 nM, 500 nM) significantly reduced tau hyperphosphorylation in a dose-dependent manner.

Влияние донекоприда на синапсы в первичной культуре нейронов гиппокампаEffect of donecopride on synapses in primary culture of hippocampal neurons

Для оценки образования синапсов изучали распределение PSD-95, постсинаптического маркера, и синаптофизина, пресинаптического маркера. Структуру, положительную при окрашивании как на PSD-95, так и на синаптофизин, рассматривали как синапс.To evaluate synapse formation, the distribution of PSD-95, a postsynaptic marker, and synaptophysin, a presynaptic marker, was studied. A structure positive for both PSD-95 and synaptophysin staining was considered a synapse.

Влияние донекоприда на эти синапсы показано в таблице 5 ниже.The effect of donecopride on these synapses is shown in Table 5 below.

Таблица 5. Число синапсов (% от контроля)Table 5. Number of synapses (% of control)

Число синапсов (% от контроля)Number of synapses (% of control) Среднее значениеAverage value Стандартная ошибка
среднегоstandard error
middle nn КонтрольControl 100*100* 66 55 + Aβ 1-42 (20 мкМ)+ Aβ 1-42 (20 μM) 6767 44 66 + Донекоприд (1 нМ)+ Donecoprid (1 nM) 6969 55 44 + Донекоприд (5 нМ)+ Donecoprid (5 nM) 83*83* 33 55 + Донекоприд (10 нМ)+ Donecoprid (10 nM) 87*87* 77 55 + Донекоприд (50 нМ)+ Donecoprid (50 nM) 91*91* 33 66 + Донекоприд (100 нМ)+ Donecoprid (100 nM) 93*93* 33 44 + Донекоприд (500 нМ)+ Donecoprid (500 nM) 94*94* 55 44 + Донекоприд (1 мкМ)+ Donecoprid (1 µM) 85*85* 44 55 + Донепезил (1 мкМ)+ Donepezil (1 µM) 88*88* 66 55

Стресс, возникающий в результате применения Aβ 1-42, вызывал уменьшение числа синапсов (как ранее было показано Callizot et al. (2013) J. Neurosci. Res. 91: 706-716).The stress resulting from the use of Aβ 1-42 caused a decrease in the number of synapses (as previously shown by Callizot et al. (2013) J. Neurosci. Res. 91: 706-716).

Донепезил уменьшал потерю синапсов. Аналогичным образом, донекоприд был способен сохранять количество синапсов дозозависимым образом (от 5 нМ до 1 мкМ). Интересно, что этот эффект наблюдался и при низкой дозе соединения (5 нМ). Этот эффект усиливался с увеличением дозы.Donepezil reduced the loss of synapses. Similarly, donecoprid was able to maintain the number of synapses in a dose-dependent manner (from 5 nM to 1 μM). Interestingly, this effect was also observed at a low dose of the compound (5 nM). This effect increased with increasing dose.

Из-за повреждения, вызванного пептидом Aβ 1-42, число нейронов снижалось в экспериментальных условиях, что привело к уменьшению числа синапсов. Поэтому, чтобы оценить число синапсов на нейрон, количество синапсов нормализовали на количество нейронов для групп контроля, Aβ 1-42, донекоприда (500 нМ, состоянию, показывающему наибольшее количество синапсов) и донепезила.Due to damage caused by the Aβ 1-42 peptide, the number of neurons decreased under experimental conditions, resulting in a decrease in the number of synapses. Therefore, to estimate the number of synapses per neuron, the number of synapses was normalized to the number of neurons for the control groups, Aβ 1-42, donecoprid (500 nM, the state showing the most synapses) and donepezil.

Эта корректировка показала, что только донекоприд в значительной степени способствовал образованию новых синапсов, в то время как донепезил не оказывал такого эффекта.This adjustment showed that only donecoprid significantly contributed to the formation of new synapses, while donepezil had no such effect.

ЗаключениеConclusion

Настоящее исследование показывает, что донекоприд оказывает благотворное влияние на выживание нейронов и нейритную сеть нейронов гиппокампа, поврежденных пептидом Aβ 1-42, на модели болезни Альцгеймера in vitro.The present study demonstrates that donecoprid has a beneficial effect on neuronal survival and the neuritic network of hippocampal neurons damaged by Aβ 1-42 peptide in an in vitro model of Alzheimer's disease.

Более того, Донекоприд был способен снижать гиперфосфорилирование тау-белка на участке AT100 и был способен в значительной степени стимулировать образование новых синапсов.Moreover, Donecoprid was able to reduce tau protein hyperphosphorylation at the AT100 site and was able to significantly stimulate the formation of new synapses.

Эффект донекоприда был сильнее, чем у донепезила, что позволяет предположить, что это соединение является интересным лекарственным средством-кандидатом для использования в качестве нейропротекторного агента, в частности для лечения нейродегенеративных заболеваний.The effect of donecoprid was stronger than that of donepezil, suggesting that this compound is an interesting drug candidate for use as a neuroprotective agent, in particular for the treatment of neurodegenerative diseases.

Пример 2Example 2

Настоящий пример демонстрирует, что соединения по настоящему изобретению могут улучшать когнитивные функции мышей на модели БА in vivo.This example demonstrates that the compounds of the present invention can improve the cognitive function of mice in an in vivo model of AD.

Для этой цели эффективность двух соединений (фумарата донекоприда и фумарата флукоприда) исследовали с использованием мышей C57Bl6/J дикого типа, у которых выполняли интрацеребровентрикулярную инъекцию олигомеров Aβ1-42 (AβO).For this purpose, the efficacy of two compounds (donecoprid fumarate and flucoprid fumarate) was investigated using wild-type C57Bl6/J mice given intracerebroventricular injection of Aβ1-42 (AβO) oligomers.

Соединения вводили перорально (через желудочный зонд) в трех различных дозах. Когнитивные способности оценивали с помощью теста Y-лабиринта, теста распознавания новых объектов и теста водного лабиринта Морриса. В конце когнитивных испытаний всех животных умерщвляли, брали образцы крови и головного мозга для дальнейших анализов ex-vivo.Compounds were administered orally (through a gastric tube) in three different doses. Cognitive ability was assessed using a Y-maze test, a novel object recognition test, and a Morris water maze test. At the end of cognitive testing, all animals were sacrificed, blood and brain samples were taken for further ex-vivo analyses.

Схематическое изображение экспериментаSchematic representation of the experiment

Вкратце, 144 самцов мышей C57Bl6/J (в возрасте 3 месяцев) получали и помещали (от 4 до 5 на клетку) в карантин в течение 7 дней или более. Испытуемые соединения вводили перорально (через желудочный зонд) один раз в день в различных концентрациях от дня -1 до дня +17.Briefly, 144 male C57Bl6/J mice (aged 3 months) were received and quarantined (4 to 5 per cage) for 7 days or more. Test compounds were administered orally (by gavage) once a day at various concentrations from day -1 to day +17.

В день 0 мыши получали однократную интрацеребровентрикулярную (ИЦВ) инъекцию контрольного растворителя или AβO.On day 0, mice received a single intracerebroventricular (ICV) injection of vehicle control or AβO.

На день +4 (то есть через четыре дня после индукции заболевания) пространственную рабочую память оценивали с помощью теста Y-лабиринта.On day +4 (ie, four days after disease induction), spatial working memory was assessed using a Y-maze test.

С дня +3 до дня +14 с помощью теста MWM (водного лабиринта Морриса) исследовали способность к обучению и долговременную память.From day +3 to day +14, learning ability and long-term memory were examined using the MWM (Morris Water Maze) test.

В дни +15 / +16 опознающую память исследовали с помощью теста распознавания новых объектов (NOR).On days +15/+16, recognition memory was examined using the New Object Recognition (NOR) test.

Животных умерщвляли на +17 день, и ткани готовили для дальнейших анализов ex-vivo.Animals were sacrificed on day +17 and tissues were prepared for further ex-vivo analyses.

Описание экспериментальных группDescription of experimental groups

В исследовании приняли участие 144 мыши, разделенные на 12 экспериментальных групп, по 12 мышей в каждой экспериментальной группе. Все животные получали однократную (и одностороннюю) внутривенную инъекцию растворителя или AβO в общем объеме 1 мкл.The study involved 144 mice, divided into 12 experimental groups, 12 mice in each experimental group. All animals received a single (and unilateral) intravenous injection of vehicle or AβO in a total volume of 1 µl.

Различные экспериментальные группы определяли следующим образом:The different experimental groups were defined as follows:

- ГРУППА A (Контроль с растворителем): растворитель перорально и инъекция растворителя методом ИЦВ (n = 12)- GROUP A (Volume control): oral solvent and solvent injection by ICV (n = 12)

- ГРУППА B (Контроль с AβO): растворитель перорально и инъекция AβO методом ИЦВ (n = 12)- GROUP B (Control with AβO): oral vehicle and AβO injection by ICV method (n = 12)

- ГРУППА C (Положительный контроль): субхроническое пероральное применение донепезила и инъекция AβO методом ИЦВ (n = 12)- GROUP C (Positive control): subchronic oral donepezil and AβO injection by ICV method (n = 12)

- ГРУППА D (Контроль с донекопридом): перорально донекоприд (9 мг/кг) и инъекция растворителя методом ИЦВ (n = 12)- GROUP D (Donecoprid control): oral donecoprid (9 mg/kg) and vehicle injection by ICV method (n = 12)

- ГРУППА E (Контроль с флукопридом): перорально флукоприд (9 мг/кг) и инъекция растворителя методом ИЦВ (n = 12)- GROUP E (flucopride control): oral flucopride (9 mg/kg) and vehicle injection by ICV method (n = 12)

- ГРУППА F (Лечение донекопридом): перорально донекоприд (1 мг/кг) и инъекция AβO методом ИЦВ (n = 12)- GROUP F (Treatment with donecoprid): oral donecoprid (1 mg/kg) and AβO injection by ICV method (n = 12)

- ГРУППА G (Лечение донекопридом): перорально донекоприд (3 мг/кг) и инъекция AβO методом ИЦВ (n = 12)- GROUP G (Treatment with donecoprid): oral donecoprid (3 mg/kg) and AβO injection by ICV method (n = 12)

- ГРУППА H (Лечение донекопридом): перорально донекоприд (9 мг/кг) и инъекция AβO методом ИЦВ (n = 12)- GROUP H (Donecoprid treatment): oral donecoprid (9 mg/kg) and AβO injection by ICV method (n = 12)

- ГРУППА I (Лечение флукопридом): перорально флукоприд (1 мг/кг) и инъекция AβO методом ИЦВ (n = 12)- GROUP I (Treatment with flucopride): oral flucopride (1 mg/kg) and AβO injection by ICV method (n = 12)

- ГРУППА J (Лечение флукопридом): перорально флукоприд (3 мг/кг) и инъекция AβO методом ИЦВ (n = 12)- GROUP J (Treatment with flucopride): oral flucopride (3 mg/kg) and AβO injection by ICV method (n = 12)

- ГРУППА K (Лечение флукопридом): перорально флукоприд (9 мг/кг) и инъекция AβO методом ИЦВ (n = 12)- GROUP K (Treatment with flucopride): oral flucopride (9 mg/kg) and AβO injection by ICV method (n = 12)

- ГРУППА L (Положительный контроль): интраперитонеальная инъекция донепезила в дни испытаний и инъекция AβO методом ИЦВ (n = 12)- GROUP L (Positive control): donepezil intraperitoneal injection on test days and AβO injection by ICV method (n = 12)

Поскольку в день можно было осуществить интрацеребровентрикулярные инъекции максимум 24 мышам, исследование было проведено в шести независимых циклах. В каждый цикл включал по две мыши из всех групп.Since a maximum of 24 mice could be intracerebroventricularly injected per day, the study was conducted in six independent cycles. Each cycle included two mice from all groups.

Экспериментальные процедурыExperimental Procedures

Содержание животныхAnimal keeping

Получение 144 мышей-самцов C57Bl6/J (от Janvier, Франция) (возраст 3 месяца). При получении животных помещали на карантин на срок 7 дней и более.Preparation of 144 male C57Bl6/J mice (from Janvier, France) (age 3 months). Upon receipt, the animals were placed in quarantine for a period of 7 days or more.

Мышей содержали при стандартной температуре (22±2°C) и в условиях с контролируемой освещенностью и влажностью (свет включали с 8:00 до 20:00; влажность 55 ± 10%) с неограниченным доступом к пище и воде. Мышей помещали в группы и наблюдали дважды в день силами лабораторного персонала (8:00 и 16:00). В случае 2 или более серьезных проблем общего состояния здоровья пораженную мышь умерщвляли. Критерии неприемлемого состояния здоровья были следующими: отсутствие спонтанных движений и неспособность пить или есть в течение 24-часового периода наблюдения, потеря массы тела более 12%, массивное кровотечение, спонтанное воспаление (общие наблюдения за кожей и глазами мышей) или отсутствие частей тела.Mice were kept at standard temperature (22 ± 2°C) and under controlled lighting and humidity conditions (lights on from 8:00 to 20:00; humidity 55 ± 10%) with unlimited access to food and water. Mice were placed in groups and observed twice a day by laboratory personnel (8:00 and 16:00). In case of 2 or more serious general health problems, the affected mouse was euthanized. The criteria for unacceptable health status were as follows: no spontaneous movement and inability to drink or eat during the 24-hour observation period, more than 12% body weight loss, massive bleeding, spontaneous inflammation (common observations of the skin and eyes of mice), or missing body parts.

В течение всей процедуры мышей взвешивали 3 раза (т.е. до лечения и на 8-й день и 17-й день).During the entire procedure, mice were weighed 3 times (ie before treatment and on the 8th day and 17th day).

Хранение, приготовления состава и дозировка соединенийStorage, composition preparation and dosage of compounds

Для перорального применения донекоприд и флукоприд готовили путем солюбилизации в 0,9% NaCl. Дозирование соединения (общий объем 200 мкл) начинали за день до индукции заболевания (посредством инъекции AβO методом ИЦВ) и проводили в течение 19 дней подряд.For oral administration, donecopride and flucopride were prepared by solubilization in 0.9% NaCl. Dosing of the compound (total volume 200 μl) was started the day before the induction of the disease (by injection of AβO by the ICV method) and was carried out for 19 consecutive days.

Стереотаксическая инъекцияStereotactic injection

Однократная интрацеребровентрикулярная инъекция 144 мышам растворителя или AβO (максимум 24 мыши в день, все мыши были рандомизированы): под анестезией (интраперитонеальная инъекция смеси кетамина/ксилазина в дозе 110 и 15 мг/кг соответственно) AβO (1 мкл) или растворитель (1 мкл) вводили в правый боковой желудочек. Инъекции производили с помощью 10 мкл микрошприцев Hamilton, снабженных иглой 26-го размера. Процедуру завершали подкожной инъекцией метакама (обезболивание) в дозе 5 мг/кг. Затем животных по отдельности помещали в их домашнюю клетку, и клетку помещали в обогреваемый шкаф до полного выздоровления животного. За животными тщательно наблюдали, чтобы контролировать выздоровление после анестезии.Single intracerebroventricular injection of 144 mice with vehicle or AβO (maximum 24 mice per day, all mice were randomized): under anesthesia (intraperitoneal injection of a mixture of ketamine/xylazine at a dose of 110 and 15 mg/kg, respectively) AβO (1 µl) or vehicle (1 µl ) was injected into the right lateral ventricle. Injections were made using 10 μl Hamilton microsyringes equipped with a 26-gauge needle. The procedure was completed with a subcutaneous injection of metacam (pain relief) at a dose of 5 mg/kg. The animals were then individually placed in their home cage and the cage was placed in a heated cabinet until the animal recovered completely. Animals were closely monitored to monitor recovery after anesthesia.

Приготовление AβO: Aβ1-42 получали от Bachem (ссылка H1368) (номер серии: 1052301). Получение стабильных олигомеров Aβ1-42 выполняли, как описано у Garcia et al. (2010) J. Neurosci. 30: 7516-7527. Олигомерный препарат (обозначенный как серия № 2016-14) содержал смесь стабильных тримеров и тетрамеров Aβ1-42, а также мономерных форм пептида. Все используемые препараты олигомеров ранее были охарактеризованы с точки зрения состава олигомеров и нейротоксичности in vitro.Preparation of AβO: Aβ1-42 was obtained from Bachem (ref. H1368) (batch number: 1052301). Preparation of stable Aβ1-42 oligomers was performed as described by Garcia et al. (2010) J. Neurosci. 30:7516-7527. The oligomer preparation (designated batch #2016-14) contained a mixture of Aβ1-42 stable trimers and tetramers, as well as monomeric forms of the peptide. All oligomer preparations used have previously been characterized in terms of oligomer composition and in vitro neurotoxicity.

Когнитивный тест, тест Y-лабиринтаCognitive test, Y-maze test

6 независимых испытаний с участием в каждом 24 мышей (т.е. по 2 мыши из каждой экспериментальной группы) всего для 144 мышей в день +4 - поведенческие тесты были выполнены через 1 час после введения дозы.6 independent trials each involving 24 mice (ie 2 mice from each experimental group) for a total of 144 mice per day +4 - behavioral tests were performed 1 hour after dosing.

Этот тест оценивает пространственную рабочую память, которая в основном обеспечивается префронтальной корой (рабочая память) и гиппокампом (пространственный компонент). См. Yoon et al. (2008) Learn Mem. 15: 97-105 и Spellman et al. (2015) Nature 522: 309-314 для различных компонентов.This test evaluates spatial working memory, which is mainly provided by the prefrontal cortex (working memory) and the hippocampus (spatial component). See Yoon et al. (2008) Learn Mem. 15:97-105 and Spellman et al. (2015) Nature 522: 309-314 for various components.

Префронтальная кора отвечает за рабочую память грызунов, приматов и человека.The prefrontal cortex is responsible for working memory in rodents, primates, and humans.

Измерение спонтанного чередования поведения широко используется поведенческими фармакологами для оценки пространственной рабочей памяти, компонента кратковременной памяти. В своей простейшей форме спонтанное чередование поведения включает тенденцию мышей чередовать их обычный не закрепленный в памяти выбор конечностей при последовательных возможностях.The measurement of spontaneous alternation of behavior is widely used by behavioral pharmacologists to assess spatial working memory, a component of working memory. In its simplest form, spontaneous alternation of behavior involves the tendency of mice to alternate their usual non-memorized limb choices at successive opportunities.

Этот тест успешно применялся при использовании инфузии AβO методом ИЦВ для индукции когнитивного дефицита (Garcia et al. (2010) J. Neurosci. 30: 7516-7527).This test has been successfully applied using AβO infusion by the ICV method to induce cognitive deficits (Garcia et al. (2010) J. Neurosci. 30: 7516-7527).

Подробный протокол: Эффективность непосредственной пространственной рабочей памяти оценивали путем регистрации спонтанного чередующегося поведения в Y-лабиринте. Лабиринт был сделан из непрозрачного оргстекла, и каждый из трех рукавов имел длину 40 см, высоту 14 см, ширину 10 см, и они были расположены под равными углами. Аппарат помещают в испытательную комнату с однородным освещением, чтобы получить 12-15 люкс во всех рукавах, а также в центральной зоне. Мышей помещают в середину одного рукава и позволяют свободно исследовать лабиринт в течение 5-минутного сеанса. Серии входов в рукава регистрируют на видео (программное обеспечение Smart v3.0, Bioseb), и вход в рукав считают завершенным, когда задние лапы мыши полностью помещаются в рукаве. Чередование определяют как последовательные входы в 3 рукава на перекрывающихся наборах триплетов. Процент чередования рассчитывают как отношение фактического общего количества чередований к возможным чередованиям, определяемое как количество входов в рукав минус 2, умноженное на 100. Двигательную активность также регистрировали и оценивали на этом этапе (например, мотивационный индекс) путем мониторинга средней скорости и общего расстояния.Detailed protocol: Immediate spatial working memory performance was assessed by recording spontaneous alternating behavior in the Y-maze. The labyrinth was made of opaque plexiglass, and each of the three arms was 40 cm long, 14 cm high, 10 cm wide, and they were placed at equal angles. The apparatus is placed in a test room with uniform illumination to obtain 12-15 lux in all arms as well as in the central area. Mice are placed in the middle of one sleeve and allowed to freely explore the maze for a 5-minute session. A series of arm entries are recorded on video (Smart v3.0 software, Bioseb) and arm entry is considered complete when the mouse's hind legs are completely contained in the arm. Interleaving is defined as consecutive entries into 3 arms on overlapping sets of triplets. The percentage of alternation is calculated as the ratio of the actual total number of alternations to the possible alternations, defined as the number of arm entries minus 2 times 100. The locomotor activity was also recorded and assessed at this stage (eg, motivational index) by monitoring the average speed and total distance.

Анализ данных: для статистического анализа использовали компьютерное программное обеспечение Graphpad/Prism. Был проведен непараметрический дисперсионный анализ (критерий Краскела-Уоллиса), за которым применяли непараметрические U-критерии Манна-Уитни для сравнения между группами. Статистически значимыми считали значения с р <0,05. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего.Data Analysis: Graphpad/Prism computer software was used for statistical analysis. A non-parametric analysis of variance (Kruskal-Wallis test) was performed, followed by non-parametric Mann-Whitney U-tests for comparison between groups. Values with p <0.05 were considered statistically significant. Data are presented as mean ± standard error of the mean.

Когнитивное тестирование, анализ NORCognitive testing, NOR analysis

6 независимых испытаний с участием 24 мышей в каждом (т.е. по 2 мыши из каждой экспериментальной группы), всего 144 мыши в день +4 - поведенческие тесты были выполнены через 1 час после введения дозы.6 independent trials with 24 mice each (ie 2 mice from each experimental group), total 144 mice per day +4 - behavioral tests were performed 1 hour post-dose.

Этот испытание оценивает опознающую память для предметов, и его человеческим эквивалентом является визуальное парное сравнение (VPC) (Wallace et al. (2015) Handb. Exp. Pharmacol. 228: 27-57). Распознавание объекта опосредуется периринальной корой у грызунов (Albasser et al. (2009) Behav. Neurosci. 123: 115-124), приматов (Zeamer et al. (2015) Dev. Cogn. Neurosci. 11: 31-41) и людей (Watson & Lee (2013) J. Neurosci. 33: 4192-4200).This test assesses recognition memory for items and its human equivalent is visual pair comparison (VPC) (Wallace et al. (2015) Handb. Exp. Pharmacol. 228: 27-57). Object recognition is mediated by the perirhinal cortex in rodents (Albasser et al. (2009) Behav. Neurosci. 123: 115-124), primates (Zeamer et al. (2015) Dev. Cogn. Neurosci. 11: 31-41) and humans ( Watson & Lee (2013) J Neurosci 33: 4192-4200).

Ранее было продемонстрировано, что интрацеребровентрикулярная инъекция AβO у мышей приводит к нарушениям в задаче распознавания нового объекта, и этот эффект является обратимым при использовании ингибитора ацетилхолинэстеразы донепезила, который показал защитный эффект у человека в отношении цитопротективного и нейропротекторного пептида митохондриального происхождения.It has been previously demonstrated that intracerebroventricular injection of AβO in mice results in impairments in the novel object recognition task, and this effect is reversible with the acetylcholinesterase inhibitor donepezil, which has shown a protective effect in humans against a cytoprotective and neuroprotective peptide of mitochondrial origin.

Подробный протокол: за день до когнитивного теста (то есть в день +15) мышей приучали в течение 10-минутного испытания, в течение которого их помещали в пустое открытое поле. В день когнитивного теста (то есть день +16) животных помещали в одно и то же открытое поле, и им позволяли свободно исследовать два идентичных объекта в течение пяти минут (испытание запоминания). Затем животных возвращали в домашнюю клетку на пять минут между испытаниями. Во время испытания запоминания животным позволяли исследовать два разных объекта: один знакомый и один новый объект. В течение этого времени экспериментатор, вне зависимости от лечения, регистрировал время, в течение которого мышь активно исследует каждый объект. Все испытания записывали на видео (программное обеспечение Smart v3.0, Bioseb). Затем генерировали индекс различения: Индекс различения = (время исследования нового объекта - время исследования знакомого объекта) / общее время исследования.Detailed Protocol: The day before the cognitive test (ie, day +15), mice were habituated for a 10-minute trial during which they were placed in an empty open field. On the day of the cognitive test (ie, day +16), the animals were placed in the same open field and allowed to freely explore two identical objects for five minutes (memory test). The animals were then returned to their home cage for five minutes between trials. During the memory test, the animals were allowed to explore two different objects: one familiar and one new object. During this time, the experimenter, regardless of treatment, recorded the time during which the mouse actively explored each object. All tests were recorded on video (Smart v3.0 software, Bioseb). Then a discrimination index was generated: Discrimination index = (time of research of a new object - time of research of a familiar object) / total time of research.

Анализ данных: для статистического анализа использовали компьютерное программное обеспечение Graphpad/Prism. Для сравнения между группами использовали непараметрический дисперсионный анализ (критерий Краскела-Уоллиса), после чего применяли непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Значения p<0,05 считали статистически значимыми. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего.Data Analysis: Graphpad/Prism computer software was used for statistical analysis. For comparison between groups, a non-parametric analysis of variance (Kruskal-Wallis test) was used, followed by a non-parametric Mann-Whitney U-test. p<0.05 values were considered statistically significant. Data are presented as mean ± standard error of the mean.

Когнитивное тестирование, анализ MWMCognitive testing, MWM analysis

Проводили 6 независимых испытаний с участием по 24 мыши в каждом (т.е. по 2 мыши из каждой экспериментальной группы), всего 144 мыши в день +4.Conducted 6 independent trials involving 24 mice each (ie 2 mice from each experimental group), a total of 144 mice per day +4.

Память пространственного ориентирования - это процесс, который проверяет способность запоминать пространственные ориентиры для определения местоположения. Она опосредуется гиппокампом у грызунов (Broadbent et al. (2006) Learn Mem. 13: 187-191) и у человека (Bartsch et al. (2010) Science 328: 1412-1415). Использовалась задача виртуального водного лабиринта. Этот тест также включает обучающий компонент.Spatial memory is a process that tests the ability to remember spatial landmarks to determine location. It is mediated by the hippocampus in rodents (Broadbent et al. (2006) Learn Mem. 13: 187-191) and in humans (Bartsch et al. (2010) Science 328: 1412-1415). The task of a virtual water maze was used. This test also includes a learning component.

Инъекция AβO методом ИЦВ у мышей вызывает дефицит памяти пространственного ориентирования в водном лабиринте Морриса (Garcia et al. (2010) J. Neurosci. 30: 7516-7527).Injection of AβO by the ICV method in mice causes spatial orientation memory deficits in the Morris water maze (Garcia et al. (2010) J. Neurosci. 30: 7516-7527).

Подробный протокол: испытания приучения (видимая платформа) - водный лабиринт Морриса (MWM) выполняли, как описано у Garcia et al. (2010) J. Neurosci. 30: 7516-7527. Экспериментальное устройство состоит из круглого резервуара для воды (диаметр = 100 см; высота = 50 см), содержащего воду при 21°C с глубиной 25 см, сделанную непрозрачной путем добавления водной акриловой эмульсии, чтобы закрыть вид под поверхностью воды. Используют платформу (диаметр = 10 см), помещаемую в середине квадранта. Бассейн располагают в испытательной комнате, равномерно освещенной на уровне 100 люкс. Путь плавания животных фиксируют с помощью системы видеонаблюдения. Мышей помещают в экспериментальную комнату не менее чем на 30 минут до тестирования, чтобы они могли адаптироваться к условиям экспериментальной комнаты. Перед навигацией по местоположению осуществляют переход к видимой платформе для оценки зрительных и двигательных способностей всех мышей. Мышей подвергают 4 испытаниям по 60 секунд в день (в течение 2 дней подряд) с интервалом между испытаниями не менее 1 часа. Как только мыши находят платформу, их оставляют одних на платформе еще на 30 секунд. В комнате нет дополнительных ориентиров. Положение платформы и начальные точки случайным образом распределяют по всем 4 квадрантам бассейна. Мышей, которые не могут найти платформу через 60 секунд, направляют к ее местоположению и помещают на платформу на 30 секунд.Detailed Protocol: Habituation Trials (Visible Platform) - Morris Water Maze (MWM) were performed as described in Garcia et al. (2010) J. Neurosci. 30:7516-7527. The experimental device consists of a circular water tank (diameter = 100 cm; height = 50 cm) containing water at 21°C with a depth of 25 cm, made opaque by adding an aqueous acrylic emulsion to obscure the view below the surface of the water. Use a platform (diameter = 10 cm) placed in the middle of the quadrant. The pool is placed in a test room uniformly lit at 100 lux. The swimming path of the animals is recorded using a video surveillance system. Mice are placed in the experimental room for at least 30 minutes prior to testing to allow them to adapt to the conditions of the experimental room. Prior to location navigation, a transition to a visible platform was performed to assess the visual and motor abilities of all mice. Mice are subjected to 4 trials of 60 seconds per day (for 2 consecutive days) with an interval between trials of at least 1 hour. Once the mice find the platform, they are left alone on the platform for another 30 seconds. There are no additional landmarks in the room. The position of the platform and starting points are randomly distributed over all 4 quadrants of the pool. Mice that cannot find the platform after 60 seconds are directed to its location and placed on the platform for 30 seconds.

Испытания запоминания (обучающие испытания со скрытой платформой) - их выполняют в течение 5 дней подряд и используют для достижения устойчивых показателей латентности спасения (т.е. требуемого для спасения времени). Мышей помещают в экспериментальную комнату не менее чем на 30 минут до тестирования, чтобы они могли адаптироваться к условиям экспериментальной комнаты. Скрытую платформу погружают на 1 см ниже поверхности воды и помещают в середине одного квадранта. Бассейн располагают в испытательной комнате, равномерно освещенной 100 люкс и содержащей различные заметные визуальные подсказки. Пути плавания, расстояние плавания, скорость плавания и тигмотаксис регистрируют с помощью системы видеонаблюдения. Мышей подвергают 4 испытаниям по 60 секунд в день с интервалом между испытаниями не менее 1 часа. Мышам позволяют свободно плавать в течение 60 секунд, оставляют одних еще на 30 секунд на скрытой платформе, а затем возвращают в их домашнюю клетку в течение интервала между испытаниями. Начальные позиции (установленные на границе квадрантов) выбирают случайным образом для каждого животного. В каждом испытании регистрируют время, необходимое для спасения на скрытую платформу. Мышей, которые не могут найти платформу через 60 секунд, направляют на платформу и помещают на нее на 30 секунд, прежде чем их возвращают в домашнюю клетку.Memory trials (hidden platform training trials) - these are performed for 5 consecutive days and are used to achieve robust rescue latency (i.e., time required to rescue). Mice are placed in the experimental room for at least 30 minutes prior to testing to allow them to adapt to the conditions of the experimental room. The hidden platform is immersed 1 cm below the surface of the water and placed in the middle of one quadrant. The pool is placed in a test room that is uniformly lit at 100 lux and contains various prominent visual cues. Swimming paths, swimming distance, swimming speed and thigmotaxis are recorded using a video surveillance system. Mice are subjected to 4 trials of 60 seconds per day with an interval between trials of at least 1 hour. The mice are allowed to swim freely for 60 seconds, left alone for another 30 seconds on a hidden platform, and then returned to their home cage during the test interval. Starting positions (set at the border of the quadrants) are chosen randomly for each animal. In each trial, the time required to escape to a hidden platform is recorded. Mice that cannot find the platform after 60 seconds are directed to the platform and placed on it for 30 seconds before being returned to their home cage.

Испытания на сохранение в памяти (поисковые испытания, без платформы) - их проводят через два дня после последней тренировки. Мышей снова акклиматизируют в экспериментальной комнате не менее чем за 30 минут до тестирования. Платформу удаляют, и каждому животному позволяют свободно плавать в течение 60 секунд. Во время испытания время, проведенное в целевом квадранте, время, проведенное в противоположном квадранте, и пересечения места прежнего расположения платформы измеряют и контролируют с помощью видеорегистратора.Memory retention tests (exploratory tests, no platform) - these are carried out two days after the last training session. Mice are acclimatized again in the experimental room at least 30 minutes prior to testing. The platform is removed and each animal is allowed to swim freely for 60 seconds. During the test, time spent in the target quadrant, time spent in the opposite quadrant, and crossings of the platform's former location are measured and monitored by a video recorder.

Анализ данных: для статистического анализа используют компьютерное программное обеспечение Graphpad/Prism. Для сравнения между группами используют непараметрический дисперсионный анализ (критерий Краскела-Уоллиса), а затем непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Значения с p <0,05 считают статистически значимыми. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего.Data analysis: The computer software Graphpad/Prism is used for statistical analysis. For comparison between groups, a non-parametric analysis of variance (Kruskal-Wallis test) is used, followed by a non-parametric Mann-Whitney U-test. Values with p<0.05 are considered statistically significant. Data are presented as mean ± standard error of the mean.

Отбор образцов тканиSampling of tissue

Мышей умерщвляли на +17 день.Mice were sacrificed on day +17.

Сбор образцов крови: под анестезией у мышей брали кровь. Приблизительно 600 мкл цельной крови забирали из полой вены с помощью шприца на 1 мл. Кровь собирали в пробирки BD Microtainer K2E (каталожный номер 365975) или микропробирки Sarstedt LiHe (каталожный номер 41.1503.005). Пробирки осторожно переворачивали, и образцы помещали на лед. Микроконтейнеры центрифугировали 5 мин при 4°C, 8600 g. Приблизительно 250 мкл плазмы переносили в пробирки Эппендорфа и замораживали при -80°C для дальнейших анализов.Collection of blood samples: mice were bled under anesthesia. Approximately 600 μl of whole blood was withdrawn from the vena cava using a 1 ml syringe. Blood was collected in BD Microtainer K2E tubes (catalog number 365975) or Sarstedt LiHe microtubes (catalog number 41.1503.005). The tubes were carefully inverted and the samples were placed on ice. The microcontainers were centrifuged for 5 min at 4°C, 8600 g. Approximately 250 μl of plasma was transferred into Eppendorf tubes and frozen at -80°C for further analysis.

Сбор образцов головного мозга: после сбора крови у мышей проводили внутрисердечную флэш-перфузию с 0,9% физиологическим раствором. Удаляли весь мозг и разделяли полушария. Контралатеральное левое полушарие мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при -80°C для дальнейшего анализа (т.е. оценки воздействия соединения). Ипсилатеральное правое полушарие использовали для выделения гиппокампа, префронтальной коры, и коры. Все структуры головного мозга изолировали на охлажденной подложке и мгновенно замораживали в жидком азоте.Collection of brain samples: After blood collection, mice were subjected to intracardiac flash perfusion with 0.9% saline. The entire brain was removed and the hemispheres were separated. The contralateral left hemisphere was flash frozen in liquid nitrogen and stored at -80° C. for further analysis (i.e. evaluation of compound exposure). The ipsilateral right hemisphere was used to isolate the hippocampus, prefrontal cortex, and cortex. All brain structures were isolated on a chilled substrate and flash-frozen in liquid nitrogen.

Результатыresults

Влияние соединений по изобретению на пространственную рабочую память.Effect of compounds of the invention on spatial working memory.

Чтобы определить влияние донекоприда и флукоприда на пространственную рабочую память мышей, через четыре дня после инъекции растворителя или AβO методом ИЦВ выполняли испытание с Y-лабиринтом. В течение 5 минут испытания животным позволяли исследовать устройство Y-образного лабиринта, и оценивали чередующееся поведение, как описано в экспериментальных процедурах.To determine the effect of donecopride and flucopride on the spatial working memory of mice, a Y-maze test was performed by the ICV method four days after solvent or AβO injection. During the 5 minutes of the test, the animals were allowed to explore the Y-maze design and alternating behavior was assessed as described in the experimental procedures.

Мыши из группы с контрольным растворителем (Группа A) показали нормальное поведение при исследовании Y-лабиринта с чередующимся поведением 68,0 ± 3,0%. Эти результаты согласуются с предыдущими наблюдениями аналогичных контрольных групп (см. Garcia et al. (2010) J. Neurosci. 30: 7516-7527).Mice from the vehicle control group (Group A) showed normal behavior in the Y-maze with an alternating behavior of 68.0 ± 3.0%. These results are consistent with previous observations from similar control groups (see Garcia et al. (2010) J. Neurosci. 30: 7516-7527).

Как и ожидалось, однократная инъекция AβO методом ИЦВ (Группа B) привела к значительному ухудшению (p = 0,0026) когнитивных функций в тесте Y-лабиринта по сравнению с контрольными мышами, которым был введен растворитель, лишь с 54,0 ± 2,0% чередований.As expected, a single injection of AβO by the ICV method (Group B) resulted in a significant deterioration (p = 0.0026) in cognitive performance in the Y-maze test compared to vehicle-injected control mice, with only 54.0 ± 2. 0% interleaves.

Мыши в группе положительного контроля, которым перорально вводили донепезил и осуществляли инъекцию AβO методом ИЦВ (группа C), были неотличимы от контрольных мышей (чередующееся поведение 66,1 ± 1,8%) и статистически отличались (p = 0,0011) от мышей, которым вводили AβO. Мыши в группе положительного контроля, получавшие интраперитонеально (остро) дозу донепезила и инъекцию AβO методом ИЦВ (Группа L), статистически отличались от контрольных мышей (p = 0,0278; чередующееся поведение 60,8 ± 1,9%), а также статистически отличались (p = 0,0421) от мышей, которым вводили AβO. Mice in the positive control group treated with donepezil orally and injected with AβO by the ICV method (Group C) were indistinguishable from control mice (alternating behavior 66.1 ± 1.8%) and statistically different (p = 0.0011) from mice , which were injected with AβO. Mice in the positive control group treated with an intraperitoneal (acute) dose of donepezil and injection of AβO by the ICV method (Group L) were statistically different from control mice (p = 0.0278; alternating behavior 60.8 ± 1.9%) and differed (p = 0.0421) from mice treated with AβO.

Мыши, у которых применяли донекоприд (9 мг/кг/сутки) и вводили растворитель методом ИЦВ (группа D), демонстрировали чередующееся поведение 59,3 ± 4,0%, не отличающееся от контрольных мышей (p = 0,2640) и от мышей, которым вводили AβO (р = 0,5371).Mice treated with donecoprid (9 mg/kg/day) and injected with vehicle by the ICV method (group D) showed an alternating behavior of 59.3 ± 4.0%, not different from control mice (p = 0.2640) and from mice injected with AβO (p = 0.5371).

Мыши, у которых применяли флукоприд (9 мг/кг/сутки) и вводили растворитель методом ИЦВ (группа E), демонстрировали чередующееся поведение 63,1 ± 2,3%, не отличающееся от контрольных мышей (p = 0,1166) и отличающееся от мышей, которым вводили AβO (p = 0,0111).Mice treated with flucopride (9 mg/kg/day) and injected with vehicle by the ICV method (Group E) exhibited an alternating behavior of 63.1 ± 2.3%, no different from control mice (p = 0.1166) and different from mice injected with AβO (p = 0.0111).

Мышам вводили возрастающие дозы донекоприда (1, 3 и 9 мг/кг/сутки) и вводили AβO методом ИЦВ (группы F, G и H соответственно). В дозе 3 мг/кг/сутки донекоприд подавлял AβO-индуцированное нарушение пространственной рабочей памяти. Действительно, мыши из группы G показали чередующееся поведение 65,5 ± 4,4%, не отличающееся от контрольных мышей (p = 0,5543) и отличающееся от мышей, которым вводили AβO (p = 0,0137). В дозе 1 мг/кг/сутки донекоприд не оказывал влияния на AβO-индуцированное нарушение пространственной рабочей памяти, поскольку эти мыши демонстрировали чередующееся поведение на 56,6 ± 3,7%, отличающееся от контрольных мышей (p = 0,0488) и не отличающееся от мышей, которым вводили AβO (p = 0,6859). Из-за более высокой гетерогенности мыши из Группы H (получавшие донекоприд в дозе 9 мг/кг/сутки) демонстрировали промежуточный фенотип с чередующимся поведением 64,3 ± 5,1%, не отличающимся от поведения контрольных мышей (p = 0,5994) и также не отличающимся от поведения мышей, которым вводили AβO (p = 0,1316).Mice were treated with increasing doses of donecoprid (1, 3 and 9 mg/kg/day) and administered with AβO by the ICV method (groups F, G and H, respectively). At a dose of 3 mg/kg/day, donecoprid suppressed AβO-induced impairment of spatial working memory. Indeed, mice from group G showed an alternating behavior of 65.5 ± 4.4%, not different from control mice (p = 0.5543) and different from mice injected with AβO (p = 0.0137). At a dose of 1 mg/kg/day, donecoprid had no effect on AβO-induced impairment of spatial working memory, as these mice exhibited alternating behavior 56.6 ± 3.7% different from control mice (p = 0.0488) and did not different from mice injected with AβO (p = 0.6859). Due to higher heterogeneity, Group H mice (treated with donecoprid at 9 mg/kg/day) showed an intermediate phenotype with an alternating behavior of 64.3 ± 5.1%, not different from that of control mice (p = 0.5994) and also not different from the behavior of mice injected with AβO (p = 0.1316).

Мышам вводили возрастающие дозы флукоприда (1, 3 и 9 мг/кг/сутки) и вводили AβO методом ИЦВ (группы I, J и K, соответственно). В дозах 1 и 3 мг/кг/сутки флукоприд ингибировал AβO-индуцированное нарушение пространственной рабочей памяти. Действительно, мыши из групп I и J демонстрировали чередующееся поведение 67,1 ± 2,7% и 65,3 ± 4,1% соответственно, не отличаясь от контрольных мышей (p = 0,9754 и p = 0,6936 для групп I и J, соответственно) и отличаясь от мышей, которым вводили AβO (p = 0,0029 и p = 0,0454, для групп I и J, соответственно). Напротив, в дозе 9 мг/кг/сутки флукоприд не обеспечивал защиту мышей от индуцированного AβO нарушения пространственной рабочей памяти. Действительно, мыши из группы K демонстрировали чередующееся поведение 59,1 ± 3,0%, отличающееся от контрольных мышей (p = 0,0290), но не отличающееся от мышей, которым вводили AβO (р = 0,2346).Mice were treated with increasing doses of flucopride (1, 3 and 9 mg/kg/day) and administered with AβO by the ICV method (groups I, J and K, respectively). At doses of 1 and 3 mg/kg/day, flucopride inhibited AβO-induced impairment of spatial working memory. Indeed, mice from groups I and J exhibited alternating behavior of 67.1 ± 2.7% and 65.3 ± 4.1%, respectively, not differing from control mice (p = 0.9754 and p = 0.6936 for groups I and J, respectively) and different from AβO-treated mice (p = 0.0029 and p = 0.0454, for groups I and J, respectively). In contrast, at a dose of 9 mg/kg/day, flucopride did not protect mice against AβO-induced impairment of spatial working memory. Indeed, group K mice exhibited an alternating behavior of 59.1 ± 3.0% different from control mice (p = 0.0290) but not different from mice injected with AβO (p = 0.2346).

Влияние соединений по изобретению на способность к обучению и долговременную память.Effect of compounds of the invention on learning ability and long-term memory.

Чтобы определить влияние соединений по настоящему изобретению на способность к обучению и долговременную память, тест MWM выполняли с дня +3 до дня +14 после инъекции растворителя или AβO методом ИЦВ.To determine the effect of the compounds of the present invention on learning ability and long-term memory, the MWM test was performed from day +3 to day +14 after solvent or AβO injection by the ICV method.

Испытание адаптацииAdaptation test

На первом этапе (испытания приучения, проведенные в дни +3 и +4 после инфузии растворителя или AβO методом ИЦВ) мышей обучали выходить из воды на видимую платформу при отсутствии других визуальных подсказок. Во время этих испытаний регистрировали латентность спасения, расстояние плавания и скорость плавания. Не было существенной разницы между группами по латентности спасения. Не выявлено никакой разницы в скорости или расстоянии плавания.In the first stage (learning trials conducted on days +3 and +4 after infusion of solvent or AβO by the ICV method), mice were trained to exit the water onto a visible platform in the absence of other visual cues. During these tests, rescue latency, swimming distance, and swimming speed were recorded. There was no significant difference between groups in rescue latency. There was no difference in swimming speed or distance.

В целом, эти данные позволяют предположить, что лечение не повлияло ни на физические возможности, ни на мотивацию мышей к спасению из воды.Overall, these data suggest that the treatment did not affect either the physical abilities or the motivation of the mice to escape from the water.

Испытания обученияLearning trials

Способность к обучению мышей контролировали в течение пяти дней подряд (от дня +7 до дня +11 после инфузии растворителя или AβO методом ИЦВ). Животные выполняли 4 испытания в день и были обучены определять местонахождение скрытой платформы с помощью визуальных подсказок. Во время этих испытаний обучения регистрировали латентность спасения, расстояние плавания и скорость плавания.The learning ability of mice was monitored for five consecutive days (from day +7 to day +11 after infusion of solvent or AβO by the ICV method). The animals performed 4 trials per day and were trained to locate the hidden platform using visual cues. During these training trials, rescue latency, swimming distance, and swimming speed were recorded.

Статистически значимой разницы в средней латентности спасения между группами в начале испытаний не было выявлено. Все группы тогда проявили некоторую степень обучения.There was no statistically significant difference in mean rescue latency between groups at baseline. All groups then displayed some degree of learning.

Мыши из группы контрольного растворителя (Группа A) эффективно выучили локализацию платформы, и после пяти дней обучения (день 5) у них обнаруживалась средняя латентность спасения 11,7 ± 1,5 секунд (p = 0,00031 по сравнению с днем 1). Напротив, мыши, которым вводили AβO (Группа B), продемонстрировали нарушенное поведение, в результате которого средняя латентность спасения составила 17,3 ± 2,0 секунд после пяти дней обучения (p = 0,4537, не отличается от дня 1, и p = 0,00293, значительно отличается от контрольных мышей).Mice in the solvent control group (Group A) effectively learned platform localization and after five days of training (Day 5) showed a mean escape latency of 11.7 ± 1.5 seconds (p = 0.00031 compared to Day 1). In contrast, mice injected with AβO (Group B) exhibited aberrant behavior resulting in a mean escape latency of 17.3 ± 2.0 seconds after five days of training (p = 0.4537, not different from day 1, and p = 0.00293, significantly different from control mice).

Мыши, которым субхронически вводили донепезил (перорально) и вводили AβO методом ИЦВ (Группа C), эффективно выучивали локализацию платформы. После пяти дней обучения (5-й день) средняя латентность спасения составила 14,7 ± 1,9 секунд (p = 0,09593 по сравнению с 1-м днем). На 5 день их показатели не отличались от контрольных мышей (p = 0,2188) и не отличались от мышей, которым вводили AβO (p = 0,3477).Mice subchronically treated with donepezil (oral) and administered with AβO by the ICV method (Group C) effectively learned platform localization. After five days of training (Day 5), the mean rescue latency was 14.7 ± 1.9 seconds (p = 0.09593 compared to Day 1). At day 5, their scores did not differ from control mice (p = 0.2188) and did not differ from AβO treated mice (p = 0.3477).

Мыши, получившие острую дозу (в день тестирования) донепезила (итраперитонеально) и инъекцию AβO методом ИЦВ (Группа L), эффективно выучивали локализацию платформы. После пяти дней тренировок (5-й день) средняя латентность спасения составила 13,4 ± 1,5 секунд (p = 0,01573 по сравнению с 1-м днем). На 5 день их показатели не отличались от контрольных мышей (p = 0,4187) и не отличались от мышей, которым вводили AβO (p = 0,1272).Mice given an acute dose (on the day of testing) of donepezil (ip) and injection of AβO by the ICV method (Group L) effectively learned platform localization. After five days of training (day 5), the mean rescue latency was 13.4 ± 1.5 seconds (p = 0.01573 compared to day 1). At day 5, their scores did not differ from control mice (p = 0.4187) and did not differ from AβO treated mice (p = 0.1272).

Мыши, которым вводили дозу донекоприда (9 мг/кг/сутки) или флукоприда (9 мг/кг/сутки день), и вводили растворитель методом ИЦВ (Группы D и E, соответственно), демонстрировали нормальные когнитивные способности. После пяти дней обучения (день 5) у мышей, которым вводили дозу донекоприда, наблюдалась средняя латентность спасения 13,0 ± 1,7 секунд (p = 0,01778 по сравнению с днем 1). На 5 день их показатели не отличались от контрольных мышей (p = 0,5476) и не отличались от мышей, которым вводили AβO (p = 0,10731). После пяти дней обучения (день 5) у мышей, которым вводили флукоприд, средняя латентность спасения составила 16,3 ± 2,0 секунд (p = 0,04439 по сравнению с днем 1). На 5 день их показатели (по неизвестным причинам) отличались от контрольных мышей (p = 0,06709) и не отличались от мышей, которым вводили AβO (p = 0,7235). Следует отметить, что на 4-й день группа флукоприда продемонстрировала среднюю латентность спасения 14,2 ± 1,9 секунд, не отличаясь от контрольных мышей (p = 0,7933) и не отличаясь от мышей, которым вводили AβO (p = 0,1225).Mice dosed with donecopride (9 mg/kg/day) or flucopride (9 mg/kg/day/day) and vehicle-administered by the ICV method (Groups D and E, respectively) exhibited normal cognition. After five days of training (day 5), mice dosed with donecoprid had a mean rescue latency of 13.0 ± 1.7 seconds (p = 0.01778 compared to day 1). At day 5, their scores did not differ from control mice (p = 0.5476) and did not differ from AβO treated mice (p = 0.10731). After five days of training (day 5), flucopride-treated mice had a mean rescue latency of 16.3 ± 2.0 seconds (p = 0.04439 compared to day 1). At day 5, their performance (for unknown reasons) differed from control mice (p = 0.06709) and did not differ from AβO treated mice (p = 0.7235). Of note, on day 4, the flucopride group showed a mean rescue latency of 14.2 ± 1.9 seconds, not different from control mice (p = 0.7933) and not different from mice injected with AβO (p = 0, 1225).

Мышам вводили возрастающие дозы донекоприда, и вводили AβO методом ИЦВ (Группы F, G и H). Присутствие донекоприда (в дозе 3 мг/кг/сутки) приводило к улучшению способности к обучению мышей по сравнению с мышами, которым вводили AβO. Действительно, у мышей из Группы G средняя латентность спасения составила 12,7 ± 1,5 секунд (p = 0,02933 по сравнению с днем 1) после пяти дней обучения. Их характеристики не отличались от контрольных мышей (p = 0,6284), но отличались от мышей, которым вводили AβO (p = 0,07381).Mice were dosed with increasing doses of donecoprid and AβO was administered by the ICV method (Groups F, G and H). The presence of donecoprid (at a dose of 3 mg/kg/day) resulted in improved learning ability of mice compared to AβO-treated mice. Indeed, Group G mice had a mean rescue latency of 12.7 ± 1.5 seconds (p = 0.02933 versus day 1) after five days of training. Their characteristics did not differ from control mice (p = 0.6284) but differed from mice injected with AβO (p = 0.07381).

Мышам вводили возрастающие дозы флукоприда, и вводили AβO методом ИЦВ (Группы I, J и K). Присутствие флукоприда (в дозе 1 и 3 мг/кг/сутки) привело к улучшению обучаемости мышей по сравнению с мышами, которым вводили AβO, тогда как соединение в дозе 9 мг/кг/сутки не оказывало влияния. У мышей, которым вводили флукоприд в дозе 1 мг/кг/сутки, средняя латентность спасения составила 13,1 ± 1,1 секунд (p = 0,03759 по сравнению с днем 1) после пяти дней обучения. Их характеристики не отличались от контрольных мышей (p = 0,4367), но отличались от мышей, которым вводили AβO (p = 0,07422). Аналогичным образом, мыши, которым вводили флукоприд в дозе 3 мг/кг/сутки, показали среднюю латентность спасения 12,5 ± 1,1 секунд (p = 0,00146 по сравнению с днем 1) после пяти дней обучения. Их характеристики не отличались от контрольных мышей (p = 0,6477), но отличались от мышей, которым вводили AβO (p = 0,04328).Mice were dosed with increasing doses of flucopride and AβO was administered by the ICV method (Groups I, J and K). The presence of flucopride (at 1 and 3 mg/kg/day) resulted in improved learning ability in mice compared to AβO-treated mice, while the compound at 9 mg/kg/day had no effect. Mice treated with flucopride at 1 mg/kg/day had a mean rescue latency of 13.1 ± 1.1 seconds (p = 0.03759 versus day 1) after five days of training. Their characteristics did not differ from control mice (p = 0.4367) but differed from mice injected with AβO (p = 0.07422). Similarly, mice treated with flucopride at 3 mg/kg/day showed a mean rescue latency of 12.5 ± 1.1 seconds (p = 0.00146 versus day 1) after five days of training. Their characteristics did not differ from control mice (p = 0.6477) but differed from mice injected with AβO (p = 0.04328).

Поисковые испытанияSearch trials

Эффективность долговременной памяти определяли через четыре дня после последней тренировки и через 14 дней после инъекции растворителя или AβO методом ИЦВ. Платформу удаляли, и каждому животному давали свободно плавать в течение 60 секунд. Во время поискового испытания определяли время, проведенное в различных квадрантах бассейна, количество пересечений прежнего местоположения платформы и время первого такого пересечения (то есть латентность до цели). Во время поисковых испытаний не наблюдалось разницы в скорости плавания между группами, что свидетельствует о нормальных физических возможностях и мотивации.The effectiveness of long-term memory was determined four days after the last training and 14 days after the injection of the solvent or AβO by the ICV method. The platform was removed and each animal was allowed to swim freely for 60 seconds. During the search test, the time spent in the various quadrants of the basin, the number of crossings of the former location of the platform, and the time of the first such crossing (ie, latency to the target) were determined. During the exploratory trials, there was no difference in swimming speed between the groups, indicating normal physical abilities and motivation.

Количество пересечений - Мыши из группы контроля с растворителем (Группа А) продемонстрировали нормальное поведение со средним числом пересечений 5,3 ± 0,6 (фиг. 3). Эти результаты согласуются с предыдущими наблюдениями аналогичных контрольных групп. Как и ожидалось, однократная инъекция AβO методом ИЦВ (Группа B) привела к значительному ухудшению когнитивных функций по сравнению с мышами, которым вводили контрольный растворитель, со снижением среднего числа пересечений до 2,2 ± 0,4 (p = 0,0010 по сравнению с контрольными мышами).Number of crossings - Mice in the vehicle control group (Group A) showed normal behavior with a mean number of crossings of 5.3 ± 0.6 (FIG. 3). These results are consistent with previous observations from similar control groups. As expected, a single injection of AβO by the ICV method (Group B) resulted in a significant deterioration in cognitive performance compared to mice injected with the control solvent, with a reduction in the mean number of crossings to 2.2 ± 0.4 (p = 0.0010 vs. with control mice).

Мыши, которым субхронически вводили донепезил (перорально) и вводили AβO методом ИЦВ (группа C), демонстрировали улучшенное поведение со средним числом пересечений 3,7 ± 0,4. Эти мыши не отличались от мышей с контрольным растворителем (p = 0,0502) и значимо отличались от мышей, которым вводили AβO (p = 0,0214). Аналогичным образом, мыши, получавшие острую дозу (в день испытания) донепезила (интраперитонеально) и инъекцию AβO методом ИЦВ (группа L), продемонстрировали улучшенное поведение со средним числом пересечений 3,8 ± 0,4. Эти мыши не отличались от мышей с контрольным растворителем (p = 0,0857) и значимо отличались от мышей, которым вводили AβO (p = 0,0159).Mice subchronically treated with donepezil (oral) and treated with AβO by the ICV method (Group C) showed improved behavior with a mean crossover number of 3.7 ± 0.4. These mice were indistinguishable from vehicle control mice (p = 0.0502) and significantly different from AβO treated mice (p = 0.0214). Similarly, mice treated with an acute dose (on the day of the trial) of donepezil (ip) and injection of AβO by the ICV method (group L) showed improved behavior with a mean crossover number of 3.8 ± 0.4. These mice were indistinguishable from vehicle control mice (p = 0.0857) and significantly different from AβO treated mice (p = 0.0159).

Мыши, получавшие дозу донекоприда (9 мг/кг/сутки) или флукоприда (9 мг/кг/сутки) при введении растворителя (группы D и E, соответственно), продемонстрировали нормальные когнитивные способности со средним числом пересечений 4,6 ± 0,5 и 4,6 ± 0,7. Эти мыши не отличались от контрольных мышей с применением растворителя (p = 0,4003 и p = 0,3945 для донекоприда и флукоприда, соответственно) и значимо отличались от мышей, которым вводили AβO (p = 0,0026 и p = 0,0077 для донекоприда и флукоприда, соответственно).Mice treated with a dose of donecopride (9 mg/kg/day) or flucopride (9 mg/kg/day) with vehicle administration (groups D and E, respectively) demonstrated normal cognition with a mean crossover number of 4.6 ± 0.5 and 4.6 ± 0.7. These mice did not differ from vehicle control mice (p = 0.4003 and p = 0.3945 for donecopride and flucopride, respectively) and were significantly different from AβO treated mice (p = 0.0026 and p = 0.0077 for donecopride and flucopride, respectively).

Мышам вводили возрастающие дозы донекоприда и вводили AβO методом ИЦВ (Группы F, G и H). Присутствие донекоприда (во всех дозах) приводило к ингибированию AβO-индуцированного нарушения долговременной памяти, оцениваемого по количеству пересечений. Максимальный эффект достигался при дозе 3 мг/кг/сутки (Группа G). Действительно, эти мыши демонстрировали нормальное поведение со средним числом пересечений 5,1 ± 0,6, не отличаясь от контрольных мышей с растворителем (p = 0,6575) и значимо отличаясь от мышей, которым вводили AβO (p = 0,0018).Mice were treated with increasing doses of donecoprid and administered with AβO by the ICV method (Groups F, G and H). The presence of donecoprid (at all doses) resulted in the inhibition of AβO-induced impairment of long-term memory, as measured by the number of intersections. The maximum effect was achieved at a dose of 3 mg/kg/day (Group G). Indeed, these mice exhibited normal behavior with a mean crossing number of 5.1 ± 0.6, not different from vehicle control mice (p = 0.6575) and significantly different from AβO injected mice (p = 0.0018).

Мышам вводили увеличивающиеся дозы флукоприда и вводили AβO методом ИЦВ (группы I, J и K). Присутствие флукоприда (во всех дозах) приводило к ингибированию AβO-индуцированного нарушения долговременной памяти, оцениваемого по количеству пересечений. Максимальный эффект достигался при дозе 3 мг/кг/сутки (Группа J). Действительно, эти мыши демонстрировали нормальное поведение со средним числом пересечений 4,1 ± 0,6, не отличаясь от контрольных мышей с растворителем (p = 0,1668) и значимо отличаясь от мышей, которым вводили AβO (p = 0,0242).Mice were treated with increasing doses of flucopride and administered with AβO by the ICV method (Groups I, J and K). The presence of flucopride (at all doses) led to the inhibition of AβO-induced impairment of long-term memory, as measured by the number of intersections. The maximum effect was achieved at a dose of 3 mg/kg/day (Group J). Indeed, these mice exhibited normal behavior with a mean intersection number of 4.1 ± 0.6, not different from vehicle control mice (p = 0.1668) and significantly different from mice injected with AβO (p = 0.0242).

Латентность до цели. Мыши из контрольной группы с растворителем (Группа A) демонстрировали нормальное поведение со средней латентностью до цели (т.е. временем достижения цели) 12,0 ± 1,9 секунд. Эти результаты согласуются с предыдущими наблюдениями аналогичных контрольных групп. Как и ожидалось, однократная инъекция AβO методом ИЦВ (Группа B) привела к значительному ухудшению когнитивных функций по сравнению с контрольными мышами, которым вводили растворитель, с увеличенной средней латентностью до цели 24,4 ± 4,7 с (p = 0,0074 по сравнению с контрольными мышами).Latency to target. Mice in the vehicle control group (Group A) exhibited normal behavior with a mean latency to target (ie, time to target) of 12.0 ± 1.9 seconds. These results are consistent with previous observations from similar control groups. As expected, a single injection of AβO by the ICV method (Group B) resulted in significant cognitive impairment compared to vehicle-injected control mice, with an increased mean latency to target of 24.4 ± 4.7 s (p = 0.0074 on compared to control mice).

Мыши, которым субхронически вводили донепезил (перорально) и вводили AβO методом ИЦВ (группа C), демонстрировали улучшенное поведение со средней латентностью до цели 14,6 ± 2,7 секунд. Эти мыши не отличались от контрольных мышей с растворителем (p = 0,6860) и значимо отличались от мышей, которым вводили AβO (p = 0,0272). Аналогичным образом, мыши, получившие острую дозу (в день тестирования) донепезила (интраперитонеально) и интрацеребровентрикулярную инъекцию AβO (группа L), показали улучшенное поведение со средней латентностью до цели 13,3 ± 2,3 секунд. Эти мыши не отличались от контрольных мышей с растворителем (p = 0,9264) и значимо отличались от мышей, которым вводили AβO (p = 0,0028).Mice subchronically treated with donepezil (oral) and treated with AβO by the ICV method (Group C) showed improved behavior with a mean latency to target of 14.6 ± 2.7 seconds. These mice did not differ from vehicle control mice (p = 0.6860) and were significantly different from AβO treated mice (p = 0.0272). Similarly, mice given an acute dose (on test day) of donepezil (ip) and an intracerebroventricular injection of AβO (group L) showed improved behavior with a mean latency to target of 13.3 ± 2.3 seconds. These mice did not differ from vehicle control mice (p = 0.9264) and were significantly different from AβO treated mice (p = 0.0028).

Было обнаружено, что мыши, которым вводили дозу донекоприда (9 мг/кг/сутки) или флукоприда (9 мг/кг/день) с использованием растворителя (Группы D и E, соответственно), демонстрировали нормальные когнитивные способности со средней латентностью до цели 7,2 ± 1,5 секунд и 12,0 ± 2,1 секунд. Эти мыши не отличались от контрольных мышей с растворителем (p = 0,0524 и p = 0,7582 для донекоприда и флукоприда, соответственно) и значимо отличались от мышей, которым вводили AβO (p = 0,0017 и p = 0,0082 для донекоприда и флукоприда, соответственно).Mice dosed with either donecopride (9 mg/kg/day) or flucopride (9 mg/kg/day) using vehicle (Groups D and E, respectively) were found to exhibit normal cognition with a moderate latency to target 7 .2 ± 1.5 seconds and 12.0 ± 2.1 seconds. These mice did not differ from vehicle control mice (p = 0.0524 and p = 0.7582 for donecopride and flucopride, respectively) and were significantly different from AβO treated mice (p = 0.0017 and p = 0.0082 for donecopride and flucopride, respectively).

Мышам вводили возрастающие дозы донекоприда и вводили AβO методом ИЦВ (группы F, G и H). Присутствие донекоприда (во всех дозах) приводило к ингибированию AβO-индуцированного нарушения долговременной памяти, оцениваемого с использованием показателя латентности до цели. Максимальный эффект достигался при дозе 1 мг/кг/сутки (Группа F). Действительно, эти мыши демонстрировали нормальное поведение со средней латентностью до цели 9,3 ± 1,4 секунд, не отличаясь от контрольных мышей с растворителем (p = 0,2548) и значимо отличаясь от мышей, которым вводили AβO (p = 0,0005).Mice were treated with increasing doses of donecoprid and administered with AβO by the ICV method (Groups F, G and H). The presence of donecoprid (at all doses) resulted in the inhibition of AβO-induced long-term memory impairment, as measured using the target latency score. The maximum effect was achieved at a dose of 1 mg/kg/day (Group F). Indeed, these mice exhibited normal behavior with an average latency to a target of 9.3 ± 1.4 seconds, not different from vehicle control mice (p = 0.2548) and significantly different from AβO injected mice (p = 0.0005 ).

Мышам вводили увеличивающиеся дозы флукоприда и вводили AβO методом ИЦВ (Группы I, J и K). Присутствие флукоприда (только в дозе 9 мг/кг) приводило к ингибированию AβO-индуцированного нарушения долговременной памяти, оцениваемого с использованием показателя латентности до цели. Действительно, мыши из Группы К показали обычное поведение со средней латентностью до цели 10,7 ± 1,9 секунд, не отличаясь от контрольных мышей с растворителем (p = 0,6891) и значимо отличаясь от мышей, которым вводили AβO (p = 0,0031).Mice were treated with increasing doses of flucopride and administered with AβO by the ICV method (Groups I, J and K). The presence of flucopride (only at a dose of 9 mg/kg) resulted in the inhibition of AβO-induced impairment of long-term memory, assessed using a target latency score. Indeed, Group K mice showed normal behavior with a mean latency to a target of 10.7 ± 1.9 seconds, not different from vehicle control mice (p = 0.6891) and significantly different from mice injected with AβO (p = 0 .0031).

Время в квадранте. Мыши из контрольной группы с растворителем (Группа A) провели значительно больше времени в целевом квадранте (p <0,0001 по сравнению с временем, проведенным в противоположном квадранте). Эти результаты согласуются с предыдущими наблюдениями аналогичных контрольных групп. Как и ожидалось, однократная инъекция AβO методом ИЦВ (Группа B) привела к значительному ухудшению когнитивных функций по сравнению с контрольными мышами с растворителем, при этом в противоположном квадранте было проведено больше времени, чем в целевом квадранте (p = 0,0779, при сравнении времени, проведенного в целевом и противоположном квадранте). Субхроническое или острое введение донепезила (группы C и L) не помогло улучшить AβO-индуцированное нарушение долговременной памяти при оценке времени, проведенного в целевом и противоположном квадрантах. Аналогичным образом, донекоприд и флукоприд не улучшили разницу для квадрантов при поисковом испытании.Time in a quadrant. Vehicle control mice (Group A) spent significantly more time in the target quadrant (p < 0.0001 compared to time spent in the opposite quadrant). These results are consistent with previous observations from similar control groups. As expected, a single injection of AβO by the ICV method (Group B) resulted in significant cognitive impairment compared to vehicle control mice, with more time spent in the opposite quadrant than in the target quadrant (p = 0.0779, when compared time spent in the target and opposite quadrant). Subchronic or acute administration of donepezil (groups C and L) did not improve AβO-induced long-term memory impairment when assessing time spent in the target and opposite quadrants. Similarly, donecopride and flucopride did not improve quadrant difference in the exploratory trial.

Влияние соединений по изобретению на опознающую память Effect of compounds of the invention on recognition memory

Чтобы определить влияние тестовых соединений на опознающую память, выполняли тест NOR через 16 дней после инъекции растворителя или AβO методом ИЦВ. Поведенческие испытания выполняли, как описано в экспериментальных процедурах.To determine the effect of test compounds on recognition memory, a NOR test was performed 16 days after solvent or AβO injection by the ICV method. Behavioral tests were performed as described in the experimental procedures.

Мыши из контрольной группы с растворителем (Группа А) демонстрировали нормальное поведение со средним индексом различения 0,35 ± 0,04. Эти результаты согласуются с предыдущими наблюдениями аналогичных контрольных групп. Как и ожидалось, однократная инъекция AβO методом ИЦВ (Группа B) привела к значительному ухудшению (p <0,0001) когнитивных функций по сравнению с контрольными мышами с растворителем; со средним индексом различения -0,01 ± 0,03; мыши, которым вводили AβO, не могли различать новые и знакомые объекты.Mice from the vehicle control group (Group A) exhibited normal behavior with an average discrimination index of 0.35 ± 0.04. These results are consistent with previous observations from similar control groups. As expected, a single injection of AβO by the ICV method (Group B) resulted in a significant deterioration (p < 0.0001) in cognitive performance compared to vehicle control mice; with an average discrimination index of -0.01 ± 0.03; mice injected with AβO could not distinguish between new and familiar objects.

Мыши, которым субхронически вводили донепезил (перорально) и AβO (ИЦВ) (группа C), проявляли нормальное поведение со средним индексом различения 0,29 ± 0,09. Эти мыши не отличались от контрольных мышей с растворителем (p = 0,7439) и значимо отличались от мышей, которым вводили AβO (p = 0,0192).Mice subchronically treated with donepezil (oral) and AβO (ICV) (Group C) exhibited normal behavior with a mean discrimination index of 0.29 ± 0.09. These mice were indistinguishable from vehicle control mice (p = 0.7439) and significantly different from AβO treated mice (p = 0.0192).

Мыши, получившие острую дозу (в день испытания) донепезила (интраперитонеально) и инъекцию AβO методом ИЦВ (Группа L), показали нормальное поведение со средним индексом различения 0,30 ± 0,07. Эти мыши не отличались от контрольных мышей с растворителем (p = 0,9158) и значимо отличались от мышей, которым вводили AβO (p = 0,0030).Mice given an acute dose (on the day of the test) of donepezil (ip) and injection of AβO by the ICV method (Group L) showed normal behavior with a mean discrimination index of 0.30 ± 0.07. These mice did not differ from vehicle control mice (p = 0.9158) and were significantly different from AβO treated mice (p = 0.0030).

Было обнаружено, что мыши, которым вводили дозу донекоприда (9 мг/кг/сутки) или флукоприда (9 мг/кг/сутки) в присутствии растворителя (Группы D и E, соответственно), демонстрировали нормальные когнитивные способности со средним индексом различения 0,29 ± 0,04 и 0,36 ± 0,06. Эти мыши не отличались от контрольных мышей с растворителем (p = 0,3071 и p = 0,8205 для донекоприда и флукоприда, соответственно) и значимо отличались от мышей, которым вводили AβO (p = 0,0007 и p = 0,0003 для донекоприда и флукоприда, соответственно).Mice dosed with donecopride (9 mg/kg/day) or flucopride (9 mg/kg/day) in the presence of vehicle (Groups D and E, respectively) were found to exhibit normal cognition with an average discrimination index of 0. 29 ± 0.04 and 0.36 ± 0.06. These mice did not differ from vehicle control mice (p = 0.3071 and p = 0.8205 for donecopride and flucopride, respectively) and were significantly different from AβO treated mice (p = 0.0007 and p = 0.0003 for donecopride and flucopride, respectively).

Мышам вводили возрастающие дозы донекоприда и вводили AβO методом ИЦВ (группы F, G и H). Присутствие донекоприда (во всех дозах) приводило к дозозависимому ингибированию AβO-индуцированного нарушения опознающей памяти. Максимальный эффект достигался при дозе 9 мг/кг/сутки (Группа H). Действительно, эти мыши демонстрировали нормальное поведение со средним индексом различения 0,43 ± 0,06, не отличаясь от контрольных мышей с растворителем (p = 0,3440) и значительно отличаясь от мышей, которым вводили AβO (p = 0,0003).Mice were treated with increasing doses of donecoprid and administered with AβO by the ICV method (Groups F, G and H). The presence of donecoprid (at all doses) resulted in a dose-dependent inhibition of AβO-induced impairment of recognition memory. The maximum effect was achieved at a dose of 9 mg/kg/day (Group H). Indeed, these mice exhibited normal behavior with a mean discrimination index of 0.43 ± 0.06, not different from vehicle control mice (p = 0.3440) and significantly different from mice injected with AβO (p = 0.0003).

Мышам вводили возрастающие дозы флукоприда и вводили AβO методом ИЦВ (Группы I, J и K). Присутствие флукоприда (во всех дозах) приводило к дозозависимому ингибированию (колоколообразная кривая) AβO-индуцированного нарушения опознающей памяти. Максимальный эффект достигался при дозе 3 мг/кг/сутки (Группа J). Действительно, эти мыши демонстрировали нормальное поведение со средним индексом различения 0,46 ± 0,05, не отличавшимся от контрольных мышей с растворителем (p = 0,1039) и значительно отличавшимся от мышей, которым вводили AβO (p = 0,0003).Mice were dosed with increasing doses of flucopride and administered with AβO by the ICV method (Groups I, J and K). The presence of flucopride (at all doses) resulted in a dose-dependent inhibition (bell curve) of AβO-induced impairment of recognition memory. The maximum effect was achieved at a dose of 3 mg/kg/day (Group J). Indeed, these mice exhibited normal behavior with a mean discrimination index of 0.46 ± 0.05, not different from vehicle control mice (p = 0.1039) and significantly different from AβO treated mice (p = 0.0003).

ЗаключениеConclusion

В целом, эти данные убедительно свидетельствуют о том, что и Донекоприд, и Флукоприд улучшают когнитивные способности мышей, которым вводили AβO.Overall, these data strongly suggest that both Donecoprid and Flucopride improve cognitive performance in AβO-treated mice.

Пример 3Example 3

В этом примере показаны антиамнестические, антиамилоидные и противовоспалительные эффекты донекоприда и флукоприда при хроническом введении на модели болезни Альцгеймера у мышей 5XFAD.This example shows the anti-amnesic, anti-amyloid, and anti-inflammatory effects of donecopride and flucopride when administered chronically in a 5XFAD mouse model of Alzheimer's disease.

Обоснование исследованияResearch Rationale

Целью исследования была оценка потенциального антиамнестического, антиамилоидного и противовоспалительного эффекта донекоприда и флукоприда при хроническом введении на мышиной модели болезни Альцгеймера.The aim of the study was to evaluate the potential anti-amnesic, anti-amyloid and anti-inflammatory effects of donecopride and flucopride when administered chronically in a mouse model of Alzheimer's disease.

Используемая мышиная модель представляла собой линию 5XFAD (обозначаемый в лаборатории Джексона как «B6SJL-Tg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax», инвентарный номер MMRRC: 34840-JAX или «B6.Cg-Tg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax», инвентарный номер MMRRC: 34848-JAX).The mouse model used was the 5XFAD strain (referred to in the Jackson lab as "B6SJL-Tg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax", MMRRC accession number: 34840-JAX or "B6.Cg-Tg(APPSwFlLon,PSEN1* M146L*L286V-6799Vas/Mmjax", MMRRC part number: 34848-JAX).

Эти трансгенные мыши 5XFAD сверхэкспрессируют мутантный человеческий APP (695) со шведской (K670N, M671L), флоридской (I716V) и лондонской (V717I) мутациями семейной болезни Альцгеймера (FAD) вместе с человеческим PS1, несущим две мутации FAD, M146L и L286V. Оба трансгена регулируются мышиным промотором Thy1, обеспечивая сверхэкспрессию в головном мозге. Мыши 5XFAD воспроизводят основные черты амилоидной патологии при болезни Альцгеймера и представляют собой полезную модель нейродегенерации, индуцированной внутринерональным Aβ42, и образования амилоидных бляшек.These 5XFAD transgenic mice overexpress mutant human APP (695) with Swedish (K670N, M671L), Florida (I716V) and London (V717I) familial Alzheimer's disease (FAD) mutations along with human PS1 carrying two FAD mutations, M146L and L286V. Both transgenes are regulated by the mouse Thy1 promoter, allowing for overexpression in the brain. 5XFAD mice reproduce the main features of the amyloid pathology in Alzheimer's disease and represent a useful model for intraneronal Aβ42-induced neurodegeneration and amyloid plaque formation.

Методы и дизайн экспериментаExperimental methods and design

МышиMice

Эксперименты на животных проводили в соответствии с Директивой Совета Европейских Сообществ от 24 ноября 1986 (86/609/EEC). Были предприняты все усилия, чтобы свести к минимуму страдания животных и уменьшить количество используемых мышей. Получение мышей 5XFAD описано у Oakley et al. (2006) J. Neurosci. 26: 10129-10140. Эти трансгенные мыши сверхэкспрессируют как человеческий APP (695), несущий шведскую (K670N, M671L), флоридскую (I716V) и лондонскую (V717I) мутации семейной болезни Альцгеймера (FAD), так и человеческий пресенилин 1 (PS1), несущий две мутации FAD M146L и L286V. Экспрессия обоих трансгенов регулируется нейронально-специфическими элементами мышиного промотора Thy1. Линию 5XFAD (генетический фон B6/SJL) поддерживали путем скрещивания гемизиготных трансгенных мышей с производителями B6/SJL F1. Линию 5XFAD (генетический фон C57BL/6J) поддерживали путем скрещивания гемизиготных трансгенных мышей с производителями C57BL/6J F1. Все животные были генотипированы с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК хвоста. Трансгенных мышей и мышей дикого типа разводили в собственном виварии, они имели доступ к пище и воде без ограничений и содержались при 12-часовом цикле свет-темнота при 22–24°C. В этом исследовании использовали самок мышей 5XFAD. Для каждого эксперимента возраст мышей указан в месяцах (с двухнедельным диапазоном).Animal experiments were carried out in accordance with the Directive of the Council of the European Communities of November 24, 1986 (86/609/EEC). Every effort has been made to minimize animal suffering and reduce the number of mice used. Getting mice 5XFAD described in Oakley et al. (2006) J. Neurosci. 26:10129-10140. These transgenic mice overexpress both human APP (695), carrying the Swedish (K670N, M671L), Florida (I716V), and London (V717I) familial Alzheimer's disease (FAD) mutations, and human presenilin 1 (PS1), carrying two FAD M146L mutations. and L286V. The expression of both transgenes is regulated by neuron-specific elements of the mouse Thy1 promoter. The 5XFAD line (B6/SJL genetic background) was maintained by crossing hemizygous transgenic mice with B6/SJL F1 sires. The 5XFAD line (C57BL/6J genetic background) was maintained by crossing hemizygous transgenic mice with C57BL/6J F1 sires. All animals were genotyped by PCR using tail genomic DNA. Transgenic and wild-type mice were bred in our own vivarium, had access to food and water without restrictions, and were kept under a 12-hour light-dark cycle at 22–24°C. In this study, female 5XFAD mice were used. For each experiment, the age of the mice is given in months (with a two-week range).

ЛекарстваMedications

Донекоприд (донекоприда фумарат, MR 31155) и флукоприд (флукоприда фумарат, MR 31193) были синтезированы в CERMN, Кан, Франция.Donecopride (donecopride fumarate, MR 31155) and flucopride (flucopride fumarate, MR 31193) were synthesized at CERMN, Caen, France.

RS 67333 (1-(4-амино-5-хлор-2-метоксифенил)-3-(1-бутил-4-пиперидинил)-1-пропанон) был использован в качестве эталонного агониста рецептора 5-HT4 и был получен у Tocris Bioscience (R&D Systems Europe, Лилль, Франция).RS 67333 (1-(4-amino-5-chloro-2-methoxyphenyl)-3-(1-butyl-4-piperidinyl)-1-propanone) was used as a reference 5-HT4 receptor agonist and was obtained from Tocris Bioscience (R&D Systems Europe, Lille, France).

Соединения ресуспендировали в ДМСО (37,5 мкг/мкл, хранили при -20°C) и перед введением готовили свежий раствор 1:250 в 0,9% NaCl. Раствор носителя (0,9% NaCl, 0,4% ДМСО) использовали в качестве контроля.Compounds were resuspended in DMSO (37.5 μg/μl, stored at -20°C) and a fresh 1:250 solution in 0.9% NaCl was prepared before administration. Carrier solution (0.9% NaCl, 0.4% DMSO) was used as a control.

Лечение животныхAnimal treatment

Мыши 5XFAD получали хроническое лечение лекарствами или растворителем в соответствии с 2 различными протоколами. В каждом эксперименте лекарства или растворитель вводили интраперитонеально два раза в неделю (1 мг/кг). В «Протоколе 1» мышей (n = 6-7 мышей в группе) лечили соединениями в течение двух месяцев в возрасте с 2 до 4 месяцев. В «Протоколе 2» мышей (n = 7) лечили соединениями в течение трех месяцев в возрасте с 1 до 4 месяцев. В конце каждого протокола мышей анестезировали смесью 100 мг/кг кетамина и 10 мг/кг ксилазина в физиологическом растворе и транскардиально перфузировали ФБР. Мозг быстро изолировали на льду, удаляли обонятельные луковицы и мозжечок, и разделяли два полушария. Одно полушарие замораживали на сухом льду и хранили при -80°C для биохимического анализа, а другое полушарие фиксировали в 4% ПФА для иммуногистохимии (IHC).5XFAD mice received chronic drug or vehicle treatment according to 2 different protocols. In each experiment, drugs or solvent were administered intraperitoneally twice a week (1 mg/kg). In "Protocol 1" mice (n=6-7 mice per group) were treated with the compounds for two months from 2 to 4 months of age. In "Protocol 2", mice (n=7) were treated with the compounds for three months from 1 to 4 months of age. At the end of each protocol, mice were anesthetized with a mixture of 100 mg/kg ketamine and 10 mg/kg xylazine in saline and transcardially perfused with PBS. The brain was quickly isolated on ice, the olfactory bulbs and cerebellum were removed, and the two hemispheres were separated. One hemisphere was frozen on dry ice and stored at -80°C for biochemical analysis, and the other hemisphere was fixed in 4% PFA for immunohistochemistry (IHC).

Сбор цереброспинальной жидкости (ЦСЖ)Collection of cerebrospinal fluid (CSF)

Мышей анестезировали и помещали на стереотаксический инструмент. Кожу шеи разрезали, подкожную клетчатку и мышцы отделяли с помощью микро-ретракторов (Fine Science Tools, Гейдельберг, Германия). Затем мышей укладывали так, чтобы голова составляла угол около 135° с телом (Liu и Duff (2008) J. Vis. Exp. 10: 960). Для прокалывания твердой мозговой оболочки большой цистерны использовали капиллярную трубку (боросиликатное стекло, B100-75-10, Sutter Instruments, Новато, Калифорния, США). ЦСЖ собирали за счет капиллярных сил и переносили в микропробирки на 0,5 мл, немедленно замораживали на сухом льду и хранили при -80°C до использования. После размораживания образцы нагревали при 60°C в течение 5 минут, как описано в международной заявке WO 2008/009868, и анализировали без дальнейших циклов замораживания-размораживания.Mice were anesthetized and placed on a stereotaxic instrument. Neck skin was cut, subcutaneous tissue and muscles were separated using micro-retractors (Fine Science Tools, Heidelberg, Germany). The mice were then positioned so that the head made an angle of about 135° with the body (Liu and Duff (2008) J. Vis. Exp. 10: 960). A capillary tube (borosilicate glass, B100-75-10, Sutter Instruments, Novato, CA, USA) was used to pierce the dura mater of the cisterna magna. CSF was collected by capillary action and transferred to 0.5 ml microtubes, immediately frozen on dry ice and stored at -80° C. until use. After thawing, the samples were heated at 60° C. for 5 minutes as described in WO 2008/009868 and analyzed without further freeze-thaw cycles.

Приготовление экстракта головного мозгаPreparation of brain extract

Полушария головного мозга, лобную кору и гиппокамп мышей 5XFAD и контрольных мышей размораживали, взвешивали и гомогенизировали в 4 объемах трис-физиологического раствора (50 мМ трис-HCl pH = 7,4, 150 мМ NaCl) с коктейлем ингибиторов протеазы (Roche Applied Science, Мелан, Франция). Полученные гомогенаты центрифугировали при 54000 x g в течение 20 минут, надосадочную жидкость («растворимую фракцию») собирали и разделяли на аликвоты для хранения при -80°C. Осадок ресуспендировали кратковременной обработкой ультразвуком в 10 объемах 6 М гуанидин-HCl в 50 мМ трис-HCl, pH = 7,6 и снова центрифугировали при 26 500 x g в течение 20 минут. Надосадочную жидкость («нерастворимую фракцию») разделяли на аликвоты и хранили при -80°C (Morishima-Kawashima et al. (2000) Am. J. Pathol. 157: 2093-2099).The cerebral hemispheres, frontal cortex, and hippocampus of 5XFAD and control mice were thawed, weighed, and homogenized in 4 volumes of Tris saline (50 mM Tris-HCl pH=7.4, 150 mM NaCl) with a cocktail of protease inhibitors (Roche Applied Science, Melan, France). The obtained homogenates were centrifuged at 54000 x g for 20 minutes, the supernatant ("soluble fraction") was collected and divided into aliquots for storage at -80°C. The pellet was resuspended by short sonication with 10 volumes of 6 M guanidine-HCl in 50 mM Tris-HCl, pH=7.6 and centrifuged again at 26,500 xg for 20 minutes. The supernatant ("insoluble fraction") was aliquoted and stored at -80°C (Morishima-Kawashima et al. (2000) Am. J. Pathol. 157: 2093-2099).

Количественное определение Aβ₄₀ и Aβ₄₂ Quantification of Aβ ₄₀ and Aβ ₄₂

Наборы ИФА от IBL International (Гамбург, Германия) для дозировки Aβ₄₀ (набор для анализа на β-амилоид (1-40) человека, #27713) или Aβ₄₂ (набор для анализа на β-амилоид (1-42) человека, #27719) использовали в соответствии с инструкциями производителя. Реакции регистрировали при 620 нм и 450 нм с использованием счетчика люминесценции Infinite 2000. Полученные значения были нормализованы к концентрации белка в каждом образце, измеренной бицинхониновым методом (Sigma-Aldrich).ELISA kits from IBL International (Hamburg, Germany) for dosing Aβ ₄₀ (human β-amyloid (1-40) assay kit, #27713) or Aβ ₄₂ (human β-amyloid (1-42) assay kit, #27719) were used according to the manufacturer's instructions. Reactions were recorded at 620 nm and 450 nm using an Infinite 2000 luminescence counter. The values obtained were normalized to the protein concentration in each sample, measured by the bicinchonin method (Sigma-Aldrich).

ИммуногистохимияImmunohistochemistry

Срезы толщиной 30 микрометров готовили с помощью вибратома (Microm HM 650V, Thermo Scientific, Сен-Эрблен, Франция) и хранили в криопротекторной среде при -20°C. Для маркировки амилоидных бляшек свободно плавающие срезы тканей лобной коры, гиппокампа и энторинальной коры (координаты от брегмы: лобная кора = 1,98 мм, гиппокамп = -1,94 мм, энторинальная кора = -3,08 мм) тщательно промывали в ФБР, а затем инкубировали в блокирующем растворе (фБР; 3% БСА; 0,1% Triton X-100) в течение 1 часа. Срезы окрашивали красителем Хехста (1:1000, Life Technologies, Saint Aubin, Франция) в течение 15 минут для обнаружения ядер клеток, а затем свежеприготовленным раствором тиофлавина T (# T3516-5G, Sigma-Aldrich) (конечная концентрация: 0,01 мг/мл в блокирующем буфере) в течение 15 минут. После промывания в 70% этаноле в течение 5 минут образцы помещали на полилизиновые предметные стекла с покровными стеклами. Для окрашивания GFAP (глиальный фибриллярный кислый белок) свободно плавающие срезы мозга блокировали, как и раньше, и инкубировали с поликлональными кроличьими анти-GFAP (1:1000, Z0334, Dako, Лез-Юлис, Франция) при 4°C в течение ночи. После окрашивания тиофлавином Т и промывания 70% этанолом на 2 часа добавляли вторичные козьи антитела к IgG кролика с Alexafluor 594 (1: 1000, A11012, Life Technologies). Промывание ФБР и установку выполняли, как описано ранее.Sections 30 micrometers thick were prepared using a vibratome (Microm HM 650V, Thermo Scientific, Saint-Herblain, France) and stored in a cryoprotective medium at -20°C. For labeling of amyloid plaques, free-floating tissue sections of the frontal cortex, hippocampus, and entorhinal cortex (coordinates from bregma: frontal cortex = 1.98 mm, hippocampus = -1.94 mm, entorhinal cortex = -3.08 mm) were thoroughly washed in PBS, and then incubated in blocking solution (PBS; 3% BSA; 0.1% Triton X-100) for 1 hour. Sections were stained with Hoechst's stain (1:1000, Life Technologies, Saint Aubin, France) for 15 minutes to detect cell nuclei, and then with freshly prepared thioflavin T solution (#T3516-5G, Sigma-Aldrich) (final concentration: 0.01 mg /ml in blocking buffer) for 15 minutes. After washing in 70% ethanol for 5 minutes, the samples were placed on polylysine glass slides with coverslips. For GFAP (glial fibrillar acidic protein) staining, free-floating brain sections were blocked as before and incubated with polyclonal rabbit anti-GFAP (1:1000, Z0334, Dako, Les Ulis, France) at 4°C overnight. After staining with thioflavin T and washing with 70% ethanol for 2 hours, secondary goat anti-rabbit IgG with Alexafluor 594 (1:1000, A11012, Life Technologies) was added. Washing with PBS and installation was performed as previously described.

Получение и анализ изображенийImage Acquisition and Analysis

Изображения получали с помощью микроскопа AxioImager Z1 (Carl Zeiss S.A.S., Марли-ле-Руа, Франция). Анализ окрашивания тиофлавином Т проводили вслепую, и данные представлены как среднее количество частиц на мм² в двух-трех срезах ткани из одной и той же области мозга/животного (программное обеспечение Image J). Экспрессия GFAP была количественно определена с использованием программного обеспечения Image J, и результаты выражены в долях площади.Images were obtained using an AxioImager Z1 microscope (Carl Zeiss SAS, Marly-le-Roi, France). Thioflavin T staining analysis was blinded and data are presented as mean particles per mm ² in two to three tissue sections from the same brain/animal region (Image J software). GFAP expression was quantified using Image J software and the results are expressed as area fractions.

Тест распознавания нового объектаNew object recognition test

Когнитивные способности мышей проверяли с помощью теста на распознавание новых объектов (NOR) (Bevins и Besheer (2006) Nat. Protoc. 1: 1306-1311). Во время медикаментозного лечения до начала теста животных интенсивно обрабатывали. Каждый день мышам позволяли знакомиться с испытательной комнатой в течение как минимум 1 часа перед испытанием. Испытание проводили в боксе из оргстекла (ширина 35 см, длина 20 см, высота 20 см), помещенном в тускло освещенную комнату. В день 1 и 2 каждую мышь приучали к пустому боксу в течение 10 минут в сутки. На 3-й день два объекта (сконструированные из пластиковых игрушек) были помещены в клетку на расстоянии 5 см от противоположных стен. Во время тренировки каждое животное помещали между двумя объектами лицом к стене, а затем им позволяли исследовать объекты в течение 5 минут. Затем мышей возвращали в их домашнюю клетку и через 24 часа проходили 5-минутную экспериментальную сессию, в которой один из двух (знакомых) объектов был заменен новым (незнакомым). Весь эксперимент регистрировали на видео, и исследование объекта [время контактирования носа мыши с объектом или время обнюхивания объекта на расстоянии ≤ 1 см] измеряли вслепую. Учитывали два параметра: (1) время исследования (в секундах), затраченное животным при взаимодействии с двумя знакомыми объектами во время сеанса обучения; и (2) время исследования, потраченное животным при взаимодействии с новым объектом, по отношению к общему времени исследования ([новый/(знакомый + новый)] × 100) во время испытания. Также был рассчитан индекс различения ([новый - знакомый]/[знакомый + новый]).The cognitive abilities of mice were tested using the novel object recognition (NOR) test (Bevins and Besheer (2006) Nat. Protoc. 1: 1306-1311). During drug treatment, the animals were intensively treated prior to the start of the test. Each day, mice were allowed to explore the test room for at least 1 hour prior to testing. The test was carried out in a Plexiglas box (width 35 cm, length 20 cm, height 20 cm) placed in a dimly lit room. On days 1 and 2, each mouse was accustomed to an empty box for 10 minutes per day. On day 3, two objects (constructed from plastic toys) were placed in a cage 5 cm away from opposite walls. During training, each animal was placed between two objects facing a wall and then allowed to explore the objects for 5 minutes. The mice were then returned to their home cage and 24 hours later underwent a 5-minute experimental session in which one of the two (familiar) objects was replaced by a new (unfamiliar) one. The entire experiment was recorded on video, and the examination of the object [time of contact of the mouse nose with the object or time of sniffing the object at a distance of ≤ 1 cm] was measured blindly. Two parameters were taken into account: (1) exploration time (in seconds) spent by the animal when interacting with two familiar objects during the training session; and (2) exploration time spent by the animal interacting with the novel object relative to total exploration time ([new/(familiar + new)] x 100) during the trial. The distinction index ([new - familiar]/[familiar + new]) was also calculated.

Статистический анализStatistical analysis

Все значения выражены как среднее значение ± SEM. Значимые эффекты лечения определяли с помощью анализа ANOVA с последующим апостериорным тестом Тьюки в случае нескольких групп сравнения. Во всех остальных случаях использовали непарный t-критерий Стьюдента. Для всех статистических тестов достоверными считали значения с р<0,05. Анализ выполняли с помощью GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, Ла-Хойя, Калифорния).All values are expressed as mean ± SEM. Significant treatment effects were determined by ANOVA analysis followed by Tukey's post hoc test for multiple comparison groups. In all other cases, unpaired Student's t-test was used. For all statistical tests, values with p<0.05 were considered significant. Analysis was performed using GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Результатыresults

Влияние донекоприда и флукоприда на амилоидную нагрузку в мозге 5XFADEffect of donecopride and flucopride on amyloid load in the brain 5XFAD

В этом исследовании использовали 27 самок мышей 5XFAD (генетический фон B6/SJL). Мышам вводили растворитель или соединения (1 мг/кг) интраперитонеально дважды в неделю в течение двух месяцев в возрасте с 2 до 4 месяцев.27 female 5XFAD mice (B6/SJL genetic background) were used in this study. Mice were injected with vehicle or compounds (1 mg/kg) intraperitoneally twice a week for two months from 2 to 4 months of age.

Aβ₄₀ и Aβ₄₂ определяли количественно в экстракте головного мозга в растворимой и нерастворимой фракциях. Результаты выражены в % от растворителя.Aβ ₄₀ and Aβ ₄₂ were quantified in the brain extract in soluble and insoluble fractions. Results are expressed as % of solvent.

Полученные результаты представлены в Таблице 6 ниже:The results obtained are presented in Table 6 below:

Таблица 6. Уровни Aβ₄₀ и Aβ₄₂ (% от контроля)Table 6. Levels of Aβ ₄₀ and Aβ ₄₂ (% of control)

Растворимая фракцияSoluble fraction Нерастворимая фракцияInsoluble fraction Aβ₄₀ _Aβ40 SEMSEM nn Aβ₄₀ _Aβ40 SEMSEM nn РастворительSolvent 100,00100.00 11,3811.38 77 100,00100.00 14,5614.56 77 ДонекопридDonecoprid 110,18110.18 10,6810.68 77 79,9779.97 6,406.40 77 ФлукопридFlucopride 110,51110.51 16,6716.67 77 97,1697.16 10,4310.43 77 Aβ₄₂ _Aβ42 SEMSEM nn Aβ₄₂ _Aβ42 SEMSEM nn РастворительSolvent 100,00100.00 11,2611.26 66 100,00100.00 6,706.70 77 ДонекопридDonecoprid 65,93*65.93* 8,368.36 77 67,85*67.85* 12,5912.59 66 ФлукопридFlucopride 30,19****30.19**** 8,048.04 77 73,1673.16 4,624.62 77

*: p <0,05 по сравнению с растворителем, определено односторонним дисперсионным анализом с последующим тестом Тьюки.*: p < 0.05 vs vehicle, determined by one-way ANOVA followed by Tukey's test.

Значения групп растворителя, представленные в таблице 6, были следующими:The solvent group values presented in Table 6 were as follows:

растворимая фракция:soluble fraction:

- Aβ₄₀ = 9,48 ± 1,08 мкг/мг белка,- Aβ ₄₀ = 9.48 ± 1.08 µg/mg protein,

- Aβ₄₂ = 0,24 ± 0,03 мкг/мг белка;- Aβ ₄₂ = 0.24 ± 0.03 µg/mg protein;

нерастворимая фракция:insoluble fraction:

- Aβ₄₀ = 0,68 ± 0,10 мкг/мг белка,- Aβ ₄₀ = 0.68 ± 0.10 µg/mg protein,

- Aβ₄₂ = 10,84 ± 0,73 мкг/мг белка.- Aβ ₄₂ = 10.84 ± 0.73 µg/mg protein.

Антиамилоидный эффект. В растворимой фракции мозга мышей 5XFAD хроническое введение донекоприда и флукоприда (1 мг/кг два раза в неделю) позволило значительно снизить уровни Aβ₄₂ (*p <0,05 по сравнению с растворителем для донекоприда и ****p <0,0001 по сравнению с растворителем для флукоприда, при определении односторонним дисперсионным анализом с последующим тестом Тьюки) без каких-либо изменений уровней Aβ₄₀. Аналогичным образом, в нерастворимой фракции донекоприд снижал нагрузку Aβ₄₂ в мозге мышей (*p <0,05 по сравнению с растворителем, при определении с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом Тьюки). Оба препарата не повлияли на уровни нерастворимого Aβ₄₀.anti-amyloid effect. In the soluble brain fraction of 5XFAD mice, chronic administration of donecopride and flucopride (1 mg/kg twice weekly) significantly reduced Aβ ₄₂ levels (*p < 0.05 compared to vehicle for donecopride and ****p < 0.0001 compared to the solvent for flucopride, as determined by one-way ANOVA followed by Tukey's test) without any change in Aβ ₄₀ levels. Similarly, in the insoluble fraction, donecoprid reduced the Aβ ₄₂ load in the mouse brain (*p<0.05 compared to vehicle, as determined by one-way ANOVA followed by Tukey's test). Both drugs did not affect the levels of insoluble Aβ ₄₀ .

Влияние донекоприда и флукоприда на память, амилоидную нагрузку в цереброспинальной жидкости, амилоидные бляшки и астроглиоз у мышей 5XFAD.Effects of donecopride and flucopride on memory, cerebrospinal fluid amyloid load, amyloid plaques, and astrogliosis in 5XFAD mice.

В этом исследовании использовали 28 самок мышей 5XFAD (генетический фон C57BL/6J). Мышам вводили растворитель или соединения (1 мг/кг) интраперитонеально дважды в неделю в течение трех месяцев в возрасте с 1 до 4 месяцев.This study used 28 female 5XFAD mice (genetic background C57BL/6J). Mice were injected with vehicle or compounds (1 mg/kg) intraperitoneally twice a week for three months from 1 to 4 months of age.

В конце лечения у мышей оценивали долговременную память в испытании распознавания нового объекта (NOR). Межсессионный интервал составлял 24 часа. Поскольку ни одна мышь не смогла исследовать любой из двух объектов или исследовать оба объекта менее чем за 10 секунд во время сеанса обучения, все мыши были включены в анализ данных.At the end of treatment, the mice were assessed for long-term memory in the Novel Object Recognition (NOR) test. The intersession interval was 24 hours. Since no mice were able to explore either of the two objects or explore both objects in less than 10 seconds during the training session, all mice were included in the data analysis.

Антиамнестический эффект. Самкам 5XFAD и однопометникам дикого типа в возрасте одного месяца вводили RS 67333, растворитель, донекоприд или флукоприд (1 мг/ кг, два раза в неделю в течение 3 месяцев), а затем оценивали опознающую память с помощью теста распознавания нового объекта (NOR). Сеансы приучения начинали через 3 дня после окончания лечения, чтобы избежать влияния острых эффектов. Интервал между тренировкой и испытанием составлял 24 часа. У мышей, которым вводили растворитель, наблюдались нарушения памяти, и они не могли отличить новый объект от знакомого, о чем свидетельствуют сходное время исследования и незначительный индекс различения. Лечение RS 67333 устраняло когнитивные нарушения, на что указывает более высокий процент времени, посвященный исследованию нового объекта по сравнению с мышами, получавшими растворитель (** p <0,01 по сравнению с знакомым объектом, при определении двухфакторным дисперсионным анализом ANOVA с последующим тестом Сидака). Аналогичным образом, хроническое применение донекоприда и флукоприда позволяло предотвратить изменение памяти (**p<0,01 по сравнению со знакомым объектом для донекоприда, *p<0,05 по сравнению со знакомым объектом для флукоприда, при определении с помощью двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA с последующим тестом Сидака). Индекс различения в 3 группах, получавших соединение, отличался от нуля, т.е. случайного уровня (определяемого непарным t-критерием Стьюдента). Общее время исследования во время сеанса обучения существенно не различалось в четырех группах, что указывает на то, что улучшение опознающей памяти у мышей 5XFAD, получавших донекоприд или флукоприд, не является следствием увеличения исследовательской активности.Antiamnestic effect. 5XFAD females and wild-type littermates at one month of age were injected with RS 67333, vehicle, donecopride or flucopride (1 mg/kg, twice a week for 3 months) and then assessed recognition memory using the New Object Recognition (NOR) test. The training sessions were started 3 days after the end of the treatment to avoid the influence of acute effects. The interval between training and testing was 24 hours. The solvent-injected mice exhibited memory impairment and were unable to distinguish between a new object and a familiar one, as evidenced by a similar study time and a non-significant discrimination index. Treatment with RS 67333 reversed cognitive impairment, as indicated by a higher percentage of time devoted to exploration of the novel object compared to vehicle-treated mice (**p<0.01 vs. familiar object, as determined by two-way ANOVA followed by Sidak's test ). Similarly, chronic use of donecopride and flucopride prevented memory alteration (**p<0.01 vs. familiar target for donecopride, *p<0.05 vs. familiar target for flucopride, as determined by two-way ANOVA followed by the Sidak test). The difference index in the 3 groups treated with the compound was different from zero, ie. random level (determined by unpaired Student's t-test). The total study time during the training session did not differ significantly between the four groups, indicating that the improvement in recognition memory in 5XFAD mice treated with donecoprid or flucopride was not due to increased exploratory activity.

Амилоидная нагрузка в цереброспинальной жидкости. Концентрация Aβ₄₂ в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) мышей 5XFAD, получавших RS 67333, донекоприд или флукоприд (1 мг/кг, два раза в неделю в течение 3 месяцев), существенно не отличалась по сравнению с контролем, что указывает на то, что хроническая стимуляция рецептора 5-HT4 не влияла на уровни амилоида в цереброспинальной жидкости (при определении односторонним дисперсионным анализом ANOVA с последующим тестом Тьюки).Amyloid load in cerebrospinal fluid. The concentration of Aβ ₄₂ in the cerebrospinal fluid (CSF) of 5XFAD mice treated with RS 67333, donecoprid, or flucopride (1 mg/kg, twice a week for 3 months) was not significantly different from control, indicating that chronic 5-HT4 receptor stimulation did not affect cerebrospinal fluid amyloid levels (as determined by one-way ANOVA followed by Tukey's test).

Антиамилоидный эффект. Фронтальная кора, гиппокамп и энторинальная кора были проанализированы как репрезентативные области мозга мышей 5XFAD (фронтальный, средний и каудальный срезы) и областей мозга человека, которые на ранней стадии поражены болезнью Альцгеймера и сильно обогащены амилоидными отложениями.anti-amyloid effect. The frontal cortex, hippocampus, and entorhinal cortex were analyzed as representative brain regions of 5XFAD mice (frontal, middle, and caudal slices) and human brain regions that are early-stage affected by Alzheimer's disease and highly enriched in amyloid deposits.

Лечение донекопридом (1 мг/кг, два раза в неделю в течение 3 месяцев) значительно уменьшило количество амилоидных бляшек по сравнению с растворителем во фронтальной коре головного мозга (уменьшение на 16 ± 3%, **p <0,01 по сравнению с растворителем) и в энторинальной коре головного мозга (снижение на 24 ± 4%, **p <0,01 по сравнению с растворителем). После лечения флукопридом (1 мг/кг, дважды в неделю в течение 3 месяцев) в энторинальной коре также наблюдалось значительное снижение количества бляшек с уменьшением на 28 ± 6% по сравнению с контролем (**p <0,01 по сравнению с растворителем). После лечения RS 67333 (1 мг/кг дважды в неделю в течение 3 месяцев) значительного эффекта не наблюдалось ни в лобной, ни в энторинальной коре. Число амилоидных бляшек в гиппокампе мышей 5XFAD, получавших RS 67333, донекоприд или флукоприд (1 мг/кг, два раза в неделю в течение 3 месяцев), существенно не отличалось от контроля. Статистические данные определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом Тьюки.Treatment with donecoprid (1 mg/kg, twice weekly for 3 months) significantly reduced the number of amyloid plaques compared to solvent in the frontal cortex (16 ± 3% reduction, **p < 0.01 compared to solvent ) and in the entorhinal cortex (24 ± 4% reduction, **p < 0.01 compared to vehicle). After treatment with flucopride (1 mg/kg, twice a week for 3 months), the entorhinal cortex also showed a significant reduction in the number of plaques with a decrease of 28 ± 6% compared with control (**p < 0.01 compared with vehicle) . After treatment with RS 67333 (1 mg/kg twice a week for 3 months), no significant effect was observed in either the frontal or entorhinal cortex. The number of amyloid plaques in the hippocampus of 5XFAD mice treated with RS 67333, donecopride or flucopride (1 mg/kg, twice a week for 3 months) did not differ significantly from control. Statistical data were determined using one-way ANOVA followed by Tukey's test.

Противовоспалительный эффект. Иммуногистохимическая оценка астроглии (с антителом против GFAP, глиального фибриллярного кислого белка) показала, что длительное лечение донекопридом и RS 67333 (1 мг/кг, два раза в неделю в течение 3 месяцев) значительно уменьшало астроглиоз (54 ± 10% и 62 ± 6% снижение окрашивания GFAP в срезах энторинальной коры головного мозга получавших лечение животных по сравнению с контрольными, получавшими растворитель, соответственно; *p <0,01 по сравнению с растворителем). В энторинальной коре лечение флукопридом (1 мг/кг, дважды в неделю в течение 3 месяцев) вызвало снижение окрашивания GFAP на 51 ± 5%, что было близко к значимости (p = 0,06). Однако окрашивание GFAP в лобной коре или гиппокампе мышей 5XFAD, получавших RS 67333, донекоприд или флукоприд (1 мг/кг, два раза в неделю в течение 3 месяцев), существенно не отличалось по сравнению с контролем. Статистические данные определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом Тьюки.Anti-inflammatory effect. Immunohistochemical evaluation of astroglia (with an antibody against GFAP, glial fibrillar acidic protein) showed that long-term treatment with donecopride and RS 67333 (1 mg/kg, twice a week for 3 months) significantly reduced astrogliosis (54 ± 10% and 62 ± 6 % reduction in GFAP staining in entorhinal cortex sections of treated animals compared to vehicle-treated controls, respectively; *p<0.01 vs. vehicle). In the entorhinal cortex, treatment with flucopride (1 mg/kg, twice weekly for 3 months) caused a 51 ± 5% reduction in GFAP staining, which was close to significant (p = 0.06). However, GFAP staining in the frontal cortex or hippocampus of 5XFAD mice treated with RS 67333, donecoprid or flucopride (1 mg/kg, twice a week for 3 months) was not significantly different compared to controls. Statistical data were determined using one-way ANOVA followed by Tukey's test.

ЗаключениеConclusion

Исследование демонстрирует, что донекоприд и флукоприд проявляют антиамилоидные эффекты (снижение уровней Aβ₄₂ и амилоидных бляшек) и противовоспалительные эффекты (уменьшение астроглиоза) при хроническом введении мышам 5XFAD, на трансгенной мышиной модели болезни Альцгеймера. Эти эффекты наиболее заметны в энторинальной и лобной коре. Более того, хроническое введение донекоприда и флукоприда может оказывать антиамнестический эффект и предотвращать появление дефицита памяти у мышей 5XFAD.The study demonstrates that donecopride and flucopride exhibit anti-amyloid effects (decrease in Aβ ₄₂ levels and amyloid plaques) and anti-inflammatory effects (decrease in astrogliosis) when chronically administered to mice with 5XFAD, in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. These effects are most prominent in the entorhinal and frontal cortices. Moreover, chronic administration of donecopride and flucopride may have an anti-amnestic effect and prevent the onset of memory deficits in 5XFAD mice.

Все эти эффекты сравнимы, а иногда и более выражены, чем эффекты RS 67333 (агониста рецептора 5-HT4, выбранного в качестве препарата сравнения), что указывает на то, что донекоприд и флукоприд являются многообещающими препаратами против болезни Альцгеймера.All of these effects are comparable to, and sometimes more pronounced than, those of RS 67333 (the 5-HT4 receptor agonist chosen as the comparator), indicating that donecopride and flucopride are promising drugs against Alzheimer's disease.

Пример 4Example 4

В этом примере раскрывается нейропротекторный эффект множества соединений общей формулы (I), определенной выше, в отношении нейронов гиппокампа, интоксицированных олигомерами амилоидных пептидов.This example discloses the neuroprotective effect of a plurality of compounds of general formula (I) as defined above on hippocampal neurons intoxicated with amyloid peptide oligomers.

Материалы и методыMaterials and methods

Нейроны гиппокампа крыс культивировали, как описано Callizot et al. (2013) J. Neurosci. Res. 91: 706-716. Вкратце, беременных самок крыс со сроком беременности 17 дней (Rats Wistar; Janvier Labs France) умерщвляли с использованием глубокой анестезии в камере с CO₂ и цервикальной дислокации. Затем эмбрионы извлекали из матки и немедленно помещали в ледяную среду L15 Лейбовица с 2% раствором пенициллина (10000 Ед/мл) и стрептомицина (10 мг/мл) (ПС) и 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА). Гиппокамп обрабатывали в течение 20 мин при 37°C раствором трипсин-ЭДТА с конечной концентрацией 0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА. Диссоциацию останавливали добавлением модифицированной по Дульбекко среды Игла (DMEM) с 4,5 г/л глюкозы, содержащей ДНКазу I сорта II (конечная концентрация 0,5 мг/мл) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС). Клетки механически диссоциировали тремя принудительными пропусканиями через кончик 10 мл пипетки.Rat hippocampal neurons were cultured as described by Callizot et al. (2013) J. Neurosci. Res. 91:706-716. Briefly, 17 day pregnant female rats (Rats Wistar; Janvier Labs France) were euthanized using deep anesthesia in a CO ₂ chamber and cervical dislocation. The embryos were then removed from the uterus and immediately placed in ice-cold L15 Leibovitz medium with 2% penicillin (10,000 U/ml) and streptomycin (10 mg/ml) (PS) and 1% bovine serum albumin (BSA). The hippocampus was treated for 20 min at 37°C with trypsin-EDTA solution with a final concentration of 0.05% trypsin and 0.02% EDTA. Dissociation was stopped by adding Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/l glucose containing DNase I grade II (final concentration 0.5 mg/ml) and 10% fetal calf serum (FBS). Cells were mechanically dissociated by three forced passes through the tip of a 10 ml pipette.

Затем клетки центрифугировали при 515 x g в течение 10 минут при 4°C. Надосадочную жидкость удаляли, а осадок ресуспендировали в определенной культуральной среде, состоящей из нейробазальной среды с 2% раствором добавки B27, 2 ммоль/л L-глутамина, 2% раствором ПС и 10 нг/мл нейротрофического фактора головного мозга (BDNF). Жизнеспособные клетки подсчитывали на цитометре Нойбауэра с использованием теста исключения трипанового синего. Клетки высевали с плотностью 20000 на лунку в 96-луночные планшеты, предварительно покрытые поли-L-лизином, и культивировали при 37°C в инкубаторе в среде воздух (95%) - CO₂ (5%).The cells were then centrifuged at 515 xg for 10 minutes at 4°C. The supernatant was removed and the pellet was resuspended in defined culture medium consisting of neurobasal medium with 2% B27 supplement solution, 2 mmol/l L-glutamine, 2% PS solution, and 10 ng/ml brain-derived neurotrophic factor (BDNF). Viable cells were counted on a Neubauer cytometer using a trypan blue exclusion test. Cells were seeded at a density of 20,000 per well in 96-well plates precoated with poly-L-lysine and cultured at 37° C. in an air (95%)-CO ₂ (5%) incubator.

Питательную среду меняли каждые 2 дня. Для 96-луночных планшетов использовали только 60 лунок. Лунки первой и последней линий и рядов не использовали (во избежание краевого эффекта) и заполняли стерильной водой.The nutrient medium was changed every 2 days. For 96-well plates, only 60 wells were used. The wells of the first and last lines and rows were not used (to avoid edge effect) and filled with sterile water.

Тестируемые соединения и воздействие Aβ_1-42 человекаTest Compounds and Exposure to Human Aβ _1-42

Тестируемые соединения: Были протестированы следующие соединения:Test Compounds: The following compounds were tested:

- MR31193- MR31193

- MR31176- MR31176

- MR31192, и- MR31192, and

- MR33583- MR33583

Предварительная инкубация: на 17 день культивирования соединения растворяли в культуральной среде и предварительно инкубировали с первичными нейронами гиппокампа в течение 1 часа перед воздействием Aβ_1-42.Pre-incubation: On day 17 of culture, compounds were dissolved in culture medium and pre-incubated with primary hippocampal neurons for 1 hour prior to exposure to Aβ _1-42 .

Повреждение: нейроны гиппокампа подвергали воздействию растворов Aβ (см. ниже) через 17 дней культивирования. Получение Aβ_1-42 было выполнено в соответствии с процедурой, описанной Callizot et al. (2013) J. Neurosci. Res. 91: 706-716. Партия Aβ_1-42, использованная в этом исследовании, содержит 10% олигомеров (количественная оценка по WB, проведенная в Combes et al. (2015) J. Neurosci. Res. 93: 633-643). Вкратце, пептид Aβ_1-42 растворяли в указанной выше культуральной среде при начальной концентрации 40 мкмоль/л. Этот раствор осторожно перемешивали в течение 3 дней при 37°C в темноте и сразу же использовали после того, как он был должным образом разбавлен в культуральной среде до используемых концентраций (20 мкмоль/л или 2,5 мкмоль/л, что соответствует 2 мкмоль/л или 0,25 мкмоль/л олигомеров (AβO), соответственно). Препарат Aβ_1-42 добавляли до конечной концентрации 20 или 2,5 мкмоль/л (2 мкмоль/л или 0,25 мкмоль/л AβO, соответственно, при определении автоматическим WB), при разведении в контрольной среде в присутствии соединений.Damage: Hippocampal neurons were exposed to Aβ solutions (see below) after 17 days of culture. Getting Aβ _1-42 was performed in accordance with the procedure described by Callizot et al. (2013) J. Neurosci. Res. 91:706-716. The Aβ _1-42 batch used in this study contained 10% oligomers (WB quantification by Combes et al. (2015) J. Neurosci. Res. 93: 633-643). Briefly, the Aβ _1-42 peptide was dissolved in the above culture medium at an initial concentration of 40 μmol/l. This solution was gently stirred for 3 days at 37°C in the dark and used immediately after it had been properly diluted in culture medium to the concentrations used (20 µmol/l or 2.5 µmol/l corresponding to 2 µmol /l or 0.25 µmol/l oligomers (AβO), respectively). Aβ _1-42 preparation was added to a final concentration of 20 or 2.5 µmol/l (2 µmol/l or 0.25 µmol/l AβO, respectively, as determined by automatic WB), when diluted in control medium in the presence of compounds.

Конечная оценкаfinal score

Через 24 часа после интоксикации надосадочную жидкость отбирали и немедленно замораживали для будущего анализа. Её хранили при -20°C до 6 месяцев. Затем нейроны гиппокампа фиксировали холодным раствором этанола (95%) и уксусной кислоты (5%) в течение 5 мин при -20°C. Их снова дважды промывали ФБР, затем повышали проницаемость и блокировали неспецифические участки с использованием раствора ФБР, содержащего 0,1% сапонина и 1% ЭТС, в течение 15 мин при комнатной температуре.24 hours after intoxication, the supernatant was collected and immediately frozen for future analysis. It was stored at -20°C for up to 6 months. Then the hippocampal neurons were fixed with a cold solution of ethanol (95%) and acetic acid (5%) for 5 min at -20°C. They were again washed twice with PBS, then the permeability was increased and non-specific sites were blocked using a PBS solution containing 0.1% saponin and 1% ETS for 15 min at room temperature.

Иммуноокрашивание: MAP-2/AT100 - После фиксации и пермеабилизации клетки инкубировали в течение 2 часов с:Immunostaining: MAP-2/AT100 - After fixation and permeabilization, cells were incubated for 2 hours with:

- куриным поликлональным антителом к белку 2, ассоциированному с микротрубочками (MAP-2), при разведении 1/1000 в ФБР, содержащем 1% эмбриональной телячьей сыворотки и 0,1% сапонина (это антитело специфически окрашивает тела клеток и нейриты, что позволяет изучать гибель нейрональных клеток и нейритную сеть); и- chicken polyclonal antibody to microtubule-associated protein 2 (MAP-2), at a dilution of 1/1000 in PBS containing 1% fetal calf serum and 0.1% saponin (this antibody specifically stains cell bodies and neurites, which allows you to study death of neuronal cells and neuritic network); And

- мышиным моноклональным антителом против фосфо-тау-белка (AT100) при разведении 1/100 в ФБР, содержащем 1% эмбриональной телячьей сыворотки и 0,1% сапонина.- mouse monoclonal antibody against phospho-tau protein (AT100) at a dilution of 1/100 in PBS containing 1% fetal calf serum and 0.1% saponin.

Эти антитела выявляли с помощью козьих антител к IgG мыши с Alexa Fluor 488 и козьих антител к куриным IgG с Alexa Fluor 568 в разведении 1/400 в ФБР, содержащем 1% ЭТС, 0,1% сапонина, в течение 1 часа при комнатной температуре.These antibodies were detected using goat anti-mouse IgG with Alexa Fluor 488 and goat anti-chicken IgG with Alexa Fluor 568 at 1/400 dilution in PBS containing 1% FTS, 0.1% saponin for 1 hour at room temperature. .

Для каждого условия с помощью ImageXpress® (Molecular Devices) с 20-кратным увеличением было сделано 30 снимков (представляющих всю площадь лунки) на лунку. Все изображения были созданы с использованием одних и тех же параметров сбора данных. Анализ изображений проводили напрямую и автоматически с помощью Custom Module Editor® (Molecular Devices). Были исследованы следующие показания:For each condition, 30 images (representing the entire well area) per well were taken using ImageXpress® (Molecular Devices) at 20x magnification. All images were created using the same data acquisition settings. Image analysis was performed directly and automatically using the Custom Module Editor® (Molecular Devices). The following indications were investigated:

- Общее количество нейронов (выживание нейронов, количество МАР-2-положительных нейронов)- Total number of neurons (survival of neurons, number of MAP-2 positive neurons)

- Нейритная сеть (в мкм MAP-2-положительных нейронов)- Neuritic network (in µm MAP-2 positive neurons)

- Площадь AT100 (мкм², перекрывание с МАР-2-положительными нейронами).- AT100 area (µm², overlap with MAP-2 positive neurons).

Иммуноокрашивание: PSD95 и SYN - после фиксации и пермеабилизации клетки инкубировали в течение 2 часов с:Immunostaining: PSD95 and SYN - after fixation and permeabilization, cells were incubated for 2 hours with:

- мышиным моноклональным антителом против постсинаптического уплотнения 95 кДа (PSD95) при разведении 1/200 в ФБР, содержащем 1% эмбриональной телячьей сыворотки и 0,1% сапонина;- mouse monoclonal antibody against postsynaptic compaction 95 kDa (PSD95) at a dilution of 1/200 in PBS containing 1% fetal calf serum and 0.1% saponin;

- кроличьими поликлональными антителами против синаптофизина (SYN) в разведении 1/100 в ФБР, содержащем 1% эмбриональной телячьей сыворотки и 0,1% сапонина.- rabbit polyclonal antibodies against synaptophysin (SYN) at a dilution of 1/100 in PBS containing 1% fetal calf serum and 0.1% saponin.

Эти антитела выявляли с помощью козьих антител против IgG мыши с Alexa Fluor 488 и козьих антител против кроличьих IgG с Alexa Fluor 568 в разведении 1/400 в ФБР, содержащем 1% ЭТС, 0,1% сапонина, в течение 1 часа при комнатной температуре.These antibodies were detected with goat anti-mouse IgG with Alexa Fluor 488 and goat anti-rabbit IgG with Alexa Fluor 568 at 1/400 dilution in PBS containing 1% FTS, 0.1% saponin for 1 hour at room temperature. .

Для каждого условия было сделано 40 снимков на лунку с помощью ImageXpress (Molecular Devices) с 40-кратным увеличением. Все изображения были сделаны в одинаковых условиях. Оценку синапсов выполняли автоматически с помощью Custom module editor® (Molecular Devices). Были оценены следующие конечные точки:For each condition, 40 images per well were taken using ImageXpress (Molecular Devices) at 40x magnification. All images were taken under the same conditions. Synaptic evaluation was performed automatically using the Custom module editor® (Molecular Devices). The following endpoints were evaluated:

- Количество синапсов (перекрывание между PSD95/SYN)- Number of synapses (overlap between PSD95/SYN)

Статистический анализStatistical analysis

Все значения выражены как среднее значение ± SEM (стандартная ошибка среднего). Статистический анализ был выполнен с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом Даннета или наименьшей значимой разницы по Фишеру. p <0,05 считали значимым.All values are expressed as mean ± SEM (standard error of the mean). Statistical analysis was performed using one-way ANOVA followed by Dunnett's test or Fisher's least significant difference. p<0.05 was considered significant.

Результатыresults

Были получены следующие результаты.The following results were obtained.

- MR31193 продемонстрировал сильный нейропротекторный эффект (выживание, нейритная и синаптическая сеть). Как видно на фиг. 1 и 2, этот эффект соответствует колоколообразной кривой с максимальным эффектом, наблюдаемым при концентрации 100 нМ для выживания и нейритной сети (фиг. 1A-C). Максимальное влияние на сеть синапсов было получено при более низких концентрациях (от 5 до 100 нМ, фиг. 2). Также наблюдался значительный эффект в отношении гиперфосфорилирования тау-белка с максимальным эффектом при 50 нМ (см. фиг. 1D).- MR31193 showed a strong neuroprotective effect (survival, neuritic and synaptic network). As seen in FIG. 1 and 2, this effect follows a bell-shaped curve with the maximum effect observed at 100 nM for survival and neuritic network (FIGS. 1A-C). The maximum effect on the network of synapses was obtained at lower concentrations (from 5 to 100 nM, Fig. 2). There was also a significant effect on tau hyperphosphorylation, with a maximum effect at 50 nM (see FIG. 1D).

- Как видно на фиг. 3 и 4, MR31176 демонстрирует нейропротекторный эффект при высоких концентрациях (выживание, нейритная и синаптическая сеть). Значительное влияние на гиперфосфорилирование тау-белка также наблюдалось при высоких концентрациях (см. фиг. 3D).- As seen in FIG. 3 and 4, MR31176 shows a neuroprotective effect at high concentrations (survival, neuritic and synaptic network). A significant effect on tau hyperphosphorylation was also observed at high concentrations (see Fig. 3D).

- Как видно на фиг. 5 и 6, MR31192 демонстрирует очень сильный нейропротекторный эффект при очень низких дозах (например, 1-5 нМ для выживания, см. фиг. 5A). Очень сильный эффект также наблюдался в отношении нейритной сети при каждой испытанной дозе (см. фиг. 5B). Это соединение даже показало нейротрофический эффект (оно вызывало рост нейритов), как это видно на фиг. 5C. Количество синапсов также увеличивалось при низких дозах (1-5 нМ, см. фиг. 6). Также наблюдался важный эффект в отношении гиперфосфорилирования тау-белка (см. фиг. 5D).- As seen in FIG. 5 and 6, MR31192 shows a very strong neuroprotective effect at very low doses (eg 1-5 nM for survival, see FIG. 5A). A very strong effect was also observed on the neuritic network at each dose tested (see FIG. 5B). This compound even showed a neurotrophic effect (it caused neurite outgrowth) as seen in FIG. 5C. The number of synapses also increased at low doses (1-5 nM, see Fig. 6). An important effect on tau hyperphosphorylation was also observed (see FIG. 5D).

- Нейропротекторный эффект, соответствующий колоколообразной кривой, также наблюдался у MR33583 (см. фиг. 7 и 8). Активные концентрации были выше 50-500 нМ. Сильный эффект на нейритную сеть наблюдался почти при каждой испытанной дозе (см. фиг. 7B). Колоколообразный эффект также наблюдался в отношении гиперфосфорилирования тау-белка с максимальным эффектом при 50-100 нМ (см. фиг. 7D).- Neuroprotective effect corresponding to the bell curve was also observed in MR33583 (see Fig. 7 and 8). Active concentrations were above 50-500 nM. A strong effect on the neural network was observed at almost every dose tested (see Fig. 7B). A bell-shaped effect was also observed for tau hyperphosphorylation, with a maximum effect at 50-100 nM (see Fig. 7D).

Эти результаты подтверждают, что все испытанные соединения общей формулы (I) являются нейропротекторными агентами, причем соединения MR31193, MR31192 и MR33583 особенно эффективны.These results confirm that all compounds of general formula (I) tested are neuroprotective agents, with compounds MR31193, MR31192 and MR33583 being particularly effective.

Пример 5Example 5

В этом примере показаны нейропротекторные эффекты соединений MR31192 и MR36014.This example shows the neuroprotective effects of compounds MR31192 and MR36014.

Материалы и методыMaterials and methods

Нейроны гиппокампа крыс культивировали, как описано Callizot et al. (2013) J. Neurosci. Res. 91: 706-716. Вкратце, беременных самок крыс со сроком беременности 17 дней (Rats Wistar; Janvier Labs France) умерщвляли с использованием глубокой анестезии в камере с CO₂ и цервикальной дислокации. Затем эмбрионы извлекали из матки и немедленно помещали в ледяную среду L15 Лейбовица с 2% раствором пенициллина (10000 Ед/мл) и стрептомицина (10 мг/мл) (ПС) и 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА). Гиппокамп обрабатывали в течение 20 мин при 37°C раствором трипсин-ЭДТА с конечной концентрацией 0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА. Диссоциацию останавливали добавлением модифицированной по Дульбекко среды Игла (DMEM) с 4,5 г/л глюкозы, содержащей ДНКазу I сорта II (конечная концентрация 0,5 мг/мл) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС). Клетки механически диссоциировали тремя принудительными пропусканиями через кончик пипетки на 10 мл.Rat hippocampal neurons were cultured as described by Callizot et al. (2013) J. Neurosci. Res. 91:706-716. Briefly, 17 day pregnant female rats (Rats Wistar; Janvier Labs France) were euthanized using deep anesthesia in a CO ₂ chamber and cervical dislocation. The embryos were then removed from the uterus and immediately placed in ice-cold L15 Leibovitz medium with 2% penicillin (10,000 U/ml) and streptomycin (10 mg/ml) (PS) and 1% bovine serum albumin (BSA). The hippocampus was treated for 20 min at 37°C with trypsin-EDTA solution with a final concentration of 0.05% trypsin and 0.02% EDTA. Dissociation was stopped by adding Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/l glucose containing DNase I grade II (final concentration 0.5 mg/ml) and 10% fetal calf serum (FBS). Cells were mechanically dissociated by three forced passes through a 10 ml pipette tip.

Питательную среду меняли каждые 2 дня. Для 96-луночных планшетов использовали только 60 лунок. Лунки первой и последней линий и рядов не использовали (во избежание краевого эффекта), и их заполняли стерильной водой.The nutrient medium was changed every 2 days. For 96-well plates, only 60 wells were used. The wells of the first and last lines and rows were not used (to avoid edge effect) and were filled with sterile water.

- MR31192,- MR31192,

- MR36014, и- MR36014, and

- Донепезил.- Donepezil.

Предварительная инкубация: на 17 день культивирования соединения растворяли в питательной среде и предварительно инкубировали с первичными нейронами гиппокампа в течение 1 часа перед воздействием Aβ_1-42.Pre-incubation: On day 17 of culture, compounds were dissolved in culture medium and pre-incubated with primary hippocampal neurons for 1 hour prior to exposure to Aβ _1-42 .

Повреждение: Нейроны гиппокампа подвергали воздействию растворов Aβ (см. ниже) через 17 дней культивирования. Aβ_1-42 получали в соответствии с процедурой, описанной Callizot et al. (2013) J. Neurosci. Res. 91: 706-716. Партия Aβ1-42, использованная в этом исследовании, содержит 10% олигомеров (количественная оценка WB, проведенная в Combes et al. (2015) J. Neurosci. Res. 93: 633-643). Вкратце, пептид Aβ_1-42 растворяли в указанной выше культуральной среде при начальной концентрации 40 мкмоль/л. Этот раствор осторожно перемешивали в течение 3 дней при 37°C в темноте и сразу же использовали после того, как он был должным образом разбавлен в культуральной среде до используемых концентраций (20 мкмоль/л или 2,5 мкмоль/л, что соответствует 2 мкмоль/л или 0,25 мкмоль/л олигомеров (AβO), соответственно). Препарат Aβ_1-42 добавляли до конечной концентрации 20 или 2,5 мкмоль/л, (соответственно 2 мкмоль/л или 0,25 мкмоль/л AβO, при определении автоматическим WB), при разведении в контрольной среде в присутствии соединений.Damage: Hippocampal neurons were exposed to Aβ solutions (see below) after 17 days of culture. Aβ _1-42 was obtained in accordance with the procedure described by Callizot et al. (2013) J. Neurosci. Res. 91:706-716. The Aβ1-42 batch used in this study contains 10% oligomers (WB quantification by Combes et al. (2015) J. Neurosci. Res. 93: 633-643). Briefly, the Aβ _1-42 peptide was dissolved in the above culture medium at an initial concentration of 40 μmol/l. This solution was gently stirred for 3 days at 37°C in the dark and used immediately after it had been properly diluted in culture medium to the concentrations used (20 µmol/l or 2.5 µmol/l corresponding to 2 µmol /l or 0.25 µmol/l oligomers (AβO), respectively). Aβ _1-42 preparation was added to a final concentration of 20 or 2.5 µmol/l, (respectively 2 µmol/l or 0.25 µmol/l AβO, as determined by automatic WB), when diluted in control medium in the presence of compounds.

Конечная оценкаfinal score

Через 24 часа после интоксикации надосадочную жидкость отбирали и немедленно замораживали для будущего анализа. Её хранили при -20°C до 6 месяцев. Затем нейроны гиппокампа фиксировали холодным раствором этанола (95%) и уксусной кислоты (5%) в течение 5 мин при -20°C. Их снова дважды промывали ФБР, затем повышали проницаемость и блокировали неспецифическое связывание с использованием раствора ФБР, содержащего 0,1% сапонина и 1% ЭТС, в течение 15 мин при комнатной температуре.24 hours after intoxication, the supernatant was collected and immediately frozen for future analysis. It was stored at -20°C for up to 6 months. Then the hippocampal neurons were fixed with a cold solution of ethanol (95%) and acetic acid (5%) for 5 min at -20°C. They were again washed twice with PBS, then permeated and non-specific binding was blocked using a PBS solution containing 0.1% saponin and 1% ETS for 15 min at room temperature.

Иммуноокрашивание: MAP-2 / AT100 - После фиксации и пермеабилизации клетки инкубировали в течение 2 часов с:Immunostaining: MAP-2/AT100 - After fixation and permeabilization, cells were incubated for 2 hours with:

Эти антитела были выявлены с помощью козьих антител к IgG мыши с Alexa Fluor 488 и козьих антител к куриным IgG с Alexa Fluor 568 в разведении 1/400 в ФБР, содержащем 1% ЭТС, 0,1% сапонина, в течение 1 часа при комнатной температуре.These antibodies were detected using goat anti-mouse IgG with Alexa Fluor 488 and goat anti-chicken IgG with Alexa Fluor 568 at 1/400 dilution in PBS containing 1% FTS, 0.1% saponin for 1 hour at room temperature. temperature.

- Нейритная сеть (в мкм MAP-2-положительных нейронов);- Neuritic network (in µm MAP-2 positive neurons);

Эти антитела были выявлены с помощью козьих антител против IgG мыши с Alexa Fluor 488 и козьих антител против кроличьих IgG с Alexa Fluor 568 в разведении 1/400 в ФБР, содержащем 1% ЭТС, 0,1% сапонина, в течение 1 часа при комнатной температуре.These antibodies were detected using goat anti-mouse IgG with Alexa Fluor 488 and goat anti-rabbit IgG with Alexa Fluor 568 at 1/400 dilution in PBS containing 1% FBS, 0.1% saponin for 1 hour at room temperature. temperature.

Для каждого условия было сделано 40 снимков на лунку с помощью ImageXpress (Molecular Devices) с 40-кратным увеличением. Все изображения были сделаны в одинаковых условиях. Оценку синапсов выполняли автоматически с помощью Custom module editor® (Molecular Devices). Оценивали следующие конечные точки:For each condition, 40 images per well were taken using ImageXpress (Molecular Devices) at 40x magnification. All images were taken under the same conditions. Synaptic evaluation was performed automatically using the Custom module editor® (Molecular Devices). The following endpoints were evaluated:

Статистический анализStatistical analysis

Результатыresults

Как видно на фиг. 9 и 10, соединение MR31192 является активным до концентрации 500 пМ (выживание и нейритная сеть, см. фиг. 9A, B, C), а также наблюдалось значительное снижение гиперфосфорилирования тау-белка (см. фиг. 9D) при 100 пМ. Нейропротекторное влияние на синапсы далее наблюдалось при 500 пМ (см. фиг. 10). Соответственно, соединение MR31192 эффективно при очень низких дозах, в частности, при дозах ниже 100 нМ (от 100 до 500 пМ). В этих очень низких дозах MR31192 проявляет нейропротекторный эффект, аналогичный тому, который наблюдается у донепезила, но при 1 мкМ.As seen in FIG. 9 and 10, MR31192 is active up to a concentration of 500 pM (survival and neuritic network, see Fig. 9A, B, C), and there was also a significant decrease in tau protein hyperphosphorylation (see Fig. 9D) at 100 pM. A neuroprotective effect on synapses was further observed at 500 pM (see Fig. 10). Accordingly, compound MR31192 is effective at very low doses, in particular at doses below 100 nM (100 to 500 pM). At these very low doses, MR31192 exhibits a neuroprotective effect similar to that seen with donepezil, but at 1 μM.

Как видно на фиг. 11 и 12, соединение MR36014 (фтористый аналог MR31192) демонстрирует нейропротекторный профиль, аналогичный тому, который получен с MR31192 при дозах в области нМ. Нейропротекторный эффект также наблюдался при дозах в области пМ. Этот эффект особенно важен для выживания и нейритной сети (см. фиг. 11A, B, C) и для гиперфосфорилирования тау-белка (см. фиг. 11D). Влияние на синапсы является значимым до концентрации 50 пМ (см. фиг. 12). В этих очень низких дозах MR36014 проявляет нейропротекторный эффект, почти эквивалентный тому, который наблюдается у донепезила, но при 1 мкМ.As seen in FIG. 11 and 12, compound MR36014 (the fluoride analogue of MR31192) exhibits a neuroprotective profile similar to that obtained with MR31192 at doses in the nM region. A neuroprotective effect was also observed at doses in the PM region. This effect is especially important for survival and neuritic network (see Fig. 11A, B, C) and for tau hyperphosphorylation (see Fig. 11D). The effect on synapses is significant up to a concentration of 50 pM (see Fig. 12). At these very low doses, MR36014 exhibits a neuroprotective effect almost equivalent to that seen with donepezil, but at 1 μM.

Соответственно, оба соединения активны в очень низких дозах (как в дозах в области нМ, так и в дозах в области пМ), что особенно интересно для предотвращения потенциальной токсичности и/или побочных эффектов.Accordingly, both compounds are active at very low doses (both in the nM region and in the nM region), which is of particular interest in preventing potential toxicity and/or side effects.

Пример 6Example 6

В этом примере показаны нейропротекторные эффекты MR36014 и MR33583 в отношении дофаминергических TH-положительных нейронов, поврежденных MPP+.This example shows the neuroprotective effects of MR36014 and MR33583 on dopaminergic TH-positive neurons damaged by MPP+.

Болезнь Паркинсона (БП) - распространенное нейродегенеративное двигательное расстройство, которым страдает около 1% населения старше 70 лет. Это второе по распространенности нейродегенеративное заболевание после болезни Альцгеймера. У пациентов, страдающих БП, в 70% случаев в качестве первого симптома проявляются симптомы двигательной нестабильности с тремором покоя. Другие клинические симптомы включают ригидность, брадикинезию и постуральную нестабильность, и часто включают когнитивные нарушения, депрессию и расстройства сна.Parkinson's disease (PD) is a common neurodegenerative movement disorder that affects about 1% of the population over 70 years of age. It is the second most common neurodegenerative disease after Alzheimer's disease. In patients suffering from PD, in 70% of cases, symptoms of motor instability with rest tremor appear as the first symptom. Other clinical symptoms include rigidity, bradykinesia, and postural instability, and often include cognitive impairment, depression, and sleep disturbances.

Хотя патологические механизмы, приводящие к дегенерации черной субстанции (SN), могут быть множественными, несколько путей считаются центральными: агрегация белков, связанная с протеасомными нарушениями, дисфункция митохондрий (также вызванная специфическими DA-токсинами) и нарушение высвобождения дофамина (DA). Although the pathological mechanisms leading to substantia nigra (SN) degeneration may be multiple, several pathways are thought to be central: protein aggregation associated with proteasome disorders, mitochondrial dysfunction (also caused by specific DA toxins), and impaired dopamine (DA) release.

Как подтверждают Dauer и Przedborski (2003) Neuron 39: 889-909, токсины, специфичные для дофаминергических нейронов (DA-токсины), в частности 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (MPTP, пролекарство нейротоксина MPP+), 6-гидроксидофамин (6-OHDA) или ротенон, вызывают паркинсонизм у людей. Эти токсины в основном используются учеными для экспериментального моделирования патологии у животных. Любые вещества, снижающие нейротоксичность DA-токсинов, могут быть полезны в качестве нового терапевтического агента для лечения или профилактики БП.As confirmed by Dauer and Przedborski (2003) Neuron 39: 889-909, dopaminergic neuron-specific toxins (DA-toxins), in particular 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP, prodrug neurotoxin MPP+), 6-hydroxydopamine (6-OHDA), or rotenone cause parkinsonism in humans. These toxins are mainly used by scientists for experimental modeling of pathology in animals. Any substance that reduces the neurotoxicity of DA toxins may be useful as a new therapeutic agent for the treatment or prevention of PD.

Целью настоящего исследования было изучение нейропротекторного влияния MR36014 и MR33583 (в 4 концентрациях) на дофаминергические TH-положительные нейроны, поврежденные MPP+. Тестируемые соединения предварительно инкубировали в течение 1 часа перед применением MPP+ (4 мкМ в течение 48 часов). Исследовали нейропротекторный эффект (выживание и нейритная сеть) тестируемых соединений. Кроме того, было изучено влияние на накопление альфа-синуклеина в цитоплазме.The aim of this study was to investigate the neuroprotective effects of MR36014 and MR33583 (at 4 concentrations) on dopaminergic TH-positive neurons damaged by MPP+. Test compounds were pre-incubated for 1 hour before using MPP+ (4 μM for 48 hours). The neuroprotective effect (survival and neuritic network) of the test compounds was investigated. In addition, the effect on the accumulation of alpha-synuclein in the cytoplasm was studied.

Материалы и методыMaterials and methods

Первичная культура мезэнцефальных нейроновPrimary culture of mesencephalic neurons

Все эксперименты проводили в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Национального института здравоохранения и действующими правилами Европейского Союза (Директива 2010/63/EU). Номер договора: A1301310.All experiments were carried out in accordance with the Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals of the National Institutes of Health and the current regulations of the European Union (Directive 2010/63/EU). Contract number: A1301310.

Дофаминергические нейроны крыс культивировали, как описано Callizot et al. (2019) PLoS One 14: e0215277 и Visanji et al. (2008) FASEB J. 22: 2488-2497. Вкратце, беременных крыс-самок (Wistar) с 15-дневным сроком беременности умерщвляли с использованием глубокой анестезии в камере с CO₂ и цервикальной дислокации. Средний мозг, полученный от 15-дневных эмбрионов крыс (Janvier, Франция), препарировали под микроскопом. Эмбриональный средний мозг удаляли и помещали в ледяную среду Лейбовица (L15), содержащую 2% пенициллин-стрептомицин (ПС) и 1% бычий сывороточный альбумин (БСА). Вентральная часть мезэнцефалического изгиба, область развивающегося мозга, богатая дофаминергическими нейронами, была использована для клеточных препаратов.Rat dopaminergic neurons were cultured as described by Callizot et al. (2019) PLoS One 14: e0215277 and Visanji et al. (2008) FASEB J. 22: 2488-2497. Briefly, pregnant female rats (Wistar) at 15 days of gestation were euthanized using deep anesthesia in a CO ₂ chamber and cervical dislocation. The midbrain obtained from 15-day-old rat embryos (Janvier, France) was dissected under a microscope. The fetal midbrain was removed and placed in ice-cold Leibovitz medium (L15) containing 2% penicillin-streptomycin (PS) and 1% bovine serum albumin (BSA). The ventral part of the mesencephalic flexure, an area of the developing brain rich in dopaminergic neurons, has been used for cell preparations.

Средний мозг диссоциировали трипсинизацией в течение 20 минут при 37°C (раствор с конечной концентрацией 0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА). Реакцию останавливали добавлением модифицированной по Дульбекко среды Игла (DMEM), содержащей ДНКазу I сорта II (0,5 мг/мл) и 10% эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС). Затем клетки механически диссоциировали путем 3 пропусканий через пипетку на 10 мл. Затем клетки центрифугировали при 180 x g в течение 10 мин при 4°C на слое БСА (3,5%) в среде L15. Надосадочную жидкость удаляли, а осадок клеток ресуспендировали в определенной культуральной среде, состоящей из нейробазальной среды с добавлением B27 (2%), L-глутамина (2 мМ), 2% раствора ПС, 10 нг/мл нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) и 1 нг/мл глиального нейротрофического фактора (GDNF). Жизнеспособные клетки подсчитывали на цитометре Нейбауэра с использованием теста исключения трипанового синего. Клетки высевали при плотности 40 000 клеток/лунку в 96-луночные планшеты (предварительно покрытые поли-L-лизином) и выдерживали в увлажненном инкубаторе при 37°C в атмосфере 5% CO₂/95% воздуха. Половину среды меняли каждые 2 дня на свежую среду.The midbrain was dissociated by trypsinization for 20 minutes at 37°C (solution with a final concentration of 0.05% trypsin and 0.02% EDTA). The reaction was stopped by adding Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) containing DNase I grade II (0.5 mg/ml) and 10% fetal calf serum (FBS). The cells were then mechanically dissociated by 3 passes through a 10 ml pipette. The cells were then centrifuged at 180 xg for 10 min at 4°C on a layer of BSA (3.5%) in L15 medium. The supernatant was removed and the cell pellet was resuspended in a defined culture medium consisting of neurobasal medium supplemented with B27 (2%), L-glutamine (2 mM), 2% PS solution, 10 ng/ml brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and 1 ng/ml glial neurotrophic factor (GDNF). Viable cells were counted on a Neubauer cytometer using the trypan blue exclusion test. Cells were seeded at a density of 40,000 cells/well in 96-well plates (pre-coated with poly-L-lysine) and maintained in a humidified incubator at 37° C. in 5% CO ₂ /95% air. Half of the medium was changed every 2 days to fresh medium.

Вкратце, на 6 день культивирования среду удаляли и добавляли свежую среду с тестируемыми соединениями или без них, и с MPP+ или без него на 48 часов, при разведении в контрольной среде. Было оценено 6 лунок на одно условие.Briefly, on day 6 of culture, the medium was removed and fresh medium was added with or without test compounds and with or without MPP+ for 48 hours, when diluted in control medium. 6 holes were evaluated per condition.

Испытуемые соединения и воздействие MPP+Test compounds and exposure to MPP+

Предварительная инкубация: на 6 день культивирования соединения разбавляли в культуральной среде и предварительно инкубировали с первичными дофаминергическими нейронами в течение 1 часа перед воздействием MPP+.Pre-incubation: On culture day 6, compounds were diluted in culture medium and pre-incubated with primary dopaminergic neurons for 1 hour prior to MPP+ exposure.

Повреждение: через 1 час после инкубации испытуемых соединений добавляли MPP+ до конечной концентрации 4 мкМ, при разбавлении в культуральной среде в присутствии соединений в течение 48 часов.Damage: 1 hour after the incubation of the test compounds, MPP+ was added to a final concentration of 4 μM, diluted in culture medium in the presence of the compounds for 48 hours.

Организация планшетов с культуройOrganization of culture plates

Испытуемые соединения тестировали в 96-луночном планшете (n = 6 лунок для культивирования на условие). MR36014 и MR33583 предварительно инкубировали в течение 1 часа перед интоксикацией MPP +. Оценивали следующие условия:Test compounds were tested in a 96-well plate (n = 6 culture wells per condition). MR36014 and MR33583 were pre-incubated for 1 hour prior to MPP+ intoxication. The following conditions were evaluated:

ПЛАНШЕТ 1 (TН/α-syn)TABLET 1 (TH/α-syn) Контроль (растворитель)Control (solvent) + MPP+ (4 мкМ, 48 часов) / растворитель+ MPP+ (4 μM, 48 hours) / solvent + MPP+ (4 мкМ, 48 часов) / MR36014 500 пМ+ MPP+ (4 µM, 48 hours) / MR36014 500 pM + MPP+ (4 мкМ, 48 часов) / MR36014 1 нМ+ MPP+ (4 μM, 48 hours) / MR36014 1 nM + MPP+ (4 мкМ, 48 часов) / MR36014 5 нМ+ MPP+ (4 µM, 48 hours) / MR36014 5 nM + MPP+ (4 мкМ, 48 часов) / MR36014 10 нМ+ MPP+ (4 µM, 48 hours) / MR36014 10 nM + MPP+ (4 мкМ, 48 часов) / MR33583 500 пМ+ MPP+ (4 µM, 48 hours) / MR33583 500 pM + MPP+ (4 мкМ, 48 часов) / MR33583 1 нМ+ MPP+ (4 µM, 48 hours) / MR33583 1 nM + MPP+ (4 мкМ, 48 часов) / MR33583 5 нМ+ MPP+ (4 µM, 48 hours) / MR33583 5 nM + MPP+ (4 мкМ, 48 часов) / MR33583 10 нМ+ MPP+ (4 µM, 48 hours) / MR33583 10 nM

Конечная оценкаfinal score

После 48 часов интоксикации надосадочную жидкость клеточных культур отделяли и немедленно замораживали для дальнейшего анализа. Клетки фиксировали раствором 4% параформальдегида в ФБР, pH = 7,3, в течение 20 минут при комнатной температуре. Клетки дважды промывали ФБР. Проницаемость клеточной мембраны и блокирование неспецифического связывания проводили с использованием раствора ФБР, содержащего 0,1% сапонина и 1% ЭТС, в течение 15 минут при комнатной температуре.After 48 hours of intoxication, the cell culture supernatant was separated and immediately frozen for further analysis. The cells were fixed with a solution of 4% paraformaldehyde in PBS, pH = 7.3, for 20 minutes at room temperature. Cells were washed twice with PBS. Cell membrane permeability and blocking of non-specific binding was performed using a PBS solution containing 0.1% saponin and 1% ETS for 15 minutes at room temperature.

Иммуноокрашивание: TH и α-syn. Культуры инкубировали с:Immunostaining: TH and α-syn. Cultures were incubated with:

- моноклональными антителами против тирозингидроксилазы (TH), полученными у мышей, при разведении 1/10 000 в ФБР, содержащем 1% ЭТС, 0,1% сапонина, в течение 2 часов при комнатной температуре.- monoclonal antibodies against tyrosine hydroxylase (TH), obtained from mice, at a dilution of 1/10,000 in PBS containing 1% ETS, 0.1% saponin, for 2 hours at room temperature.

- поликлональными антителами против альфа-синуклеина (α-syn), полученными у кроликов при разведении 1/200 в ФБР, содержащем 1% ЭТС, 0,1% сапонина, в течение 2 часов при комнатной температуре.- polyclonal antibodies against alpha-synuclein (α-syn), obtained from rabbits at a dilution of 1/200 in PBS containing 1% ETS, 0.1% saponin, for 2 hours at room temperature.

Эти антитела были выявлены с помощью козьих антител против IgG мыши с Alexa Fluor 488 в разведении 1/800 и с помощью козьих антител против кроличьих IgG с Alexa Fluor 568 в разведении 1/400 в ФБР, содержащем 1% ЭТС, 0,1% сапонина, в течение 1 часа при комнатной температуре.These antibodies were detected with goat anti-mouse IgG with Alexa Fluor 488 at 1/800 dilution and with goat anti-rabbit IgG with Alexa Fluor 568 at 1/400 dilution in PBS containing 1% ETS, 0.1% saponin , for 1 hour at room temperature.

Автоматический компьютерный анализ - для каждого условия автоматически делали 20 снимков (представляющих всю область лунки) с помощью ImageXpress® (Molecular Devices) при 10-кратном увеличении (20 снимков) с использованием тех же параметров сбора данных. Анализ изображений проводили напрямую и автоматически с помощью Custom Module Editor® (Molecular Devices). Оценивали следующие показания:Automated Computer Analysis - For each condition, 20 images (representing the entire well area) were automatically taken with ImageXpress® (Molecular Devices) at 10x magnification (20 images) using the same acquisition settings. Image analysis was performed directly and automatically using the Custom Module Editor® (Molecular Devices). The following indications were evaluated:

- Анализ общего количества TH-нейронов (TH-положительные нейроны),- Analysis of the total number of TH-neurons (TH-positive neurons),

- общая нейритная сеть TH-положительных нейронов (в мкм)- total neuritic network of TH-positive neurons (in µm)

- агрегация α-syn (площадь перекрывания между окрашиванием TH и α-syn, в мкм²).- α-syn aggregation (overlap area between TH and α-syn staining, in µm²).

Статистический анализStatistical analysis

Результатыresults

Влияние MR36014 на выживание, нейритную сеть и агрегацию α-syn TH-нейронов после повреждения MPP+.Effect of MR36014 on survival, neuritic network, and aggregation of α-syn TH neurons after MPP+ injury.

Применение MPP+ вызвало явную нейротоксичность для дофаминергических нейронов, о чем свидетельствует снижение выживания (фиг. 13A), потеря нейритной сети (фиг. 13B) и патологическое накопление α-syn (фиг. 13C), как показано ранее (Callizot et al. др. (2019) PLoS One 14: e0215277).Application of MPP+ caused overt neurotoxicity to dopaminergic neurons, as evidenced by reduced survival (Fig. 13A), loss of the neural network (Fig. 13B), and pathological accumulation of α-syn (Fig. 13C), as shown previously (Callizot et al. et al. (2019) PLoS One 14: e0215277).

Применение MR36014 оказало сильное общее нейропротекторное влияние на TH-нейроны, поскольку это соединение улучшило выживание TH-нейронов (с 1 нМ до 10 нМ), защитило их нейритную сеть (все исследованные дозы) и уменьшило накопление α- syn (все исследованные дозы). The use of MR36014 had a strong overall neuroprotective effect on TH neurons, as this compound improved the survival of TH neurons (from 1 nM to 10 nM), protected their neuritic network (all doses tested), and decreased α-syn accumulation (all doses tested).

Влияние MR33583 на выживание, нейритную сеть и агрегацию α-syn TH-нейронов после повреждения MPP+.Effect of MR33583 on survival, neuritic network, and aggregation of α-syn TH neurons after MPP+ injury.

После повреждения MPP+ MR33583 улучшил выживание нейронов (100 нМ, см. фиг. 14A) и частично защитил нейритную сеть (от 10 нМ до 100 нМ, см. фиг. 14B). Положительный эффект MR33583 также наблюдался в отношении агрегации α-syn (50 нМ и 100 нМ, см. фиг. 14C).After MPP+ injury, MR33583 improved neuronal survival (100 nM, see Fig. 14A) and partially protected the neuritic network (10 nM to 100 nM, see Fig. 14B). A positive effect of MR33583 was also observed on α-syn aggregation (50 nM and 100 nM, see Fig. 14C).

ОбсуждениеDiscussion

Целью исследования было изучение нейропротекторных эффектов MR36014 и MR33583 на модели болезни Паркинсона in vitro.The aim of the study was to investigate the neuroprotective effects of MR36014 and MR33583 in an in vitro model of Parkinson's disease.

Это исследование показывает, что:This study shows that:

- оба соединения противодействуют токсичности MPP+ для дофаминергических нейронов;- both compounds counteract the toxicity of MPP+ to dopaminergic neurons;

- MR36014 более эффективен, чем MR33583, так как это соединение показало более высокую эффективность в повышении выживания TH-нейронов;- MR36014 is more effective than MR33583 as this compound has been shown to be more effective in increasing the survival of TH neurons;

- MR36014 был активен при более низких дозах, чем MR33583.- MR36014 was active at lower doses than MR33583.

В целом, это исследование показало, что MR36014 и MR33583 являются интересными кандидатами в качестве лекарств от болезни Паркинсона, и что MR36014 более активен, чем MR33583.Overall, this study showed that MR36014 and MR33583 are interesting drug candidates for Parkinson's disease, and that MR36014 is more active than MR33583.

Пример 7Example 7

В этом примере раскрыта оценка нейропротекторных эффектов соединений MR36014 и MR33583 в отношении первичных корковых нейронов крыс после глутаматного повреждения.This example discloses an assessment of the neuroprotective effects of compounds MR36014 and MR33583 on rat primary cortical neurons following glutamate damage.

Глутаматергическая система и, в частности, рецепторы NMDA (глутаматергические рецепторы) играют важную роль в процессах обучения и памяти. Синаптическая пластичность может регулироваться передачей сигналов рецептора NMDA. Однако чрезмерная активация рецепторов NMDA и глутаматергическая эксцитотоксичность являются обычным патологическим признаком нейродегенеративных заболеваний (Lewerenz и Maher (2015) Front Neurosci. 9: 469).The glutamatergic system and in particular the NMDA receptors (glutamatergic receptors) play an important role in learning and memory processes. Synaptic plasticity can be regulated by NMDA receptor signaling. However, excessive activation of NMDA receptors and glutamatergic excitotoxicity are common pathological features of neurodegenerative diseases (Lewerenz and Maher (2015) Front Neurosci. 9: 469).

Эксайтотоксичность глутамата связана с острым неврологическим повреждением в результате ишемии и черепно-мозговой травмы, а также с хронической нейродегенерацией при болезни Альцгеймера (БА) и болезни Хантингтона (БХ). Эксайтотоксическая гибель нейронов из-за чрезмерной активации NMDAR способствует чрезмерному притоку кальция (Ca²⁺) в клетку. Это вызывает ряд реакций, приводящих к гибели клеток, включая повышенный окислительный стресс, неадекватную активацию протеаз, таких как кальпаин, нарушение регуляции Са²⁺-зависимых путей, повреждение митохондрий и апоптотический каскад.Glutamate excitotoxicity is associated with acute neurological damage resulting from ischemia and traumatic brain injury, as well as chronic neurodegeneration in Alzheimer's disease (AD) and Huntington's disease (HD). Excitotoxic death of neurons due to excessive activation of NMDAR promotes excessive influx of calcium (Ca ²⁺ ) into the cell. This causes a number of reactions leading to cell death, including increased oxidative stress, inappropriate activation of proteases such as calpain, dysregulation of Ca ²⁺ -dependent pathways, mitochondrial damage, and an apoptotic cascade.

С этой точки зрения, раннее фармакологическое лечение веществами, снижающими эксайтотоксичность глутамата, может представлять собой очень хороший вариант для улучшения выживания нейронов (и улучшения когнитивной функции), и может представлять интересную терапевтическую стратегию для пациентов с диагнозом болезни Альцгеймера (Wang и Reddy (2017) J. Alzheimers Dis. 57: 1041-1048).From this perspective, early pharmacological treatment with agents that reduce glutamate excitotoxicity may represent a very good option for improving neuronal survival (and improving cognitive function), and may represent an interesting therapeutic strategy for patients diagnosed with Alzheimer's disease (Wang and Reddy (2017) J. Alzheimers Dis. 57: 1041-1048).

В настоящем исследовании оценивали нейропротекторный эффект MR36014 и MR33583 (в 4 концентрациях) в отношении первичных корковых нейронов крыс после глутаматного повреждения. Перед применением глутамата испытуемые соединения предварительно инкубировали в течение 1 часа (20 мкМ в течение 20 минут). Исследовали нейропротекторный эффект (выживание и нейритная сеть) испытуемых соединений.The present study evaluated the neuroprotective effect of MR36014 and MR33583 (at 4 concentrations) on rat primary cortical neurons after glutamate damage. Before applying glutamate, test compounds were pre-incubated for 1 hour (20 μM for 20 minutes). The neuroprotective effect (survival and neuritic network) of the test compounds was investigated.

Материалы и методыMaterials and methods

Первичная культура кортикальных нейроновPrimary culture of cortical neurons

Кортикальные нейроны крыс культивировали, как описано Callizot et al. (2013) J. Neurosci. Res. 91: 706-716. Беременных крыс-самок (Wistar) с 15-дневным сроком беременности умерщвляли с использованием глубокой анестезии в камере с CO₂ и цервикальной дислокации. Вкратце, эмбрионы собирали и немедленно помещали в ледяную среду L15 Лейбовица с 2% раствором пенициллина (10000 Ед/мл) и стрептомицина (10 мг/мл) (ПС) и 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА). Кортекс обрабатывали в течение 20 мин при 37°C раствором трипсин-ЭДТА с конечной концентрацией 0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА. Диссоциацию останавливали добавлением модифицированной по Дульбекко среды Игла (DMEM) с 4,5 г/л глюкозы, содержащей ДНКазу I сорта II (конечная концентрация 0,5 мг/мл) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС). Клетки механически диссоциировали тремя принудительными пропусканиями через кончик пипетки на 10 мл. Затем клетки центрифугировали при 515 x g в течение 10 минут при 4°C. Надосадочную жидкость удаляли, а осадок ресуспендировали в определенной культуральной среде, состоящей из нейробазальной среды с 2% раствором добавки B27, 2 ммоль/л L-глутамина, 2% раствором ПС и 10 нг/мл нейротрофического фактора головного мозга (BDNF). Жизнеспособные клетки подсчитывали на цитометре Нойбауэра с использованием теста исключения трипанового синего.Rat cortical neurons were cultured as described by Callizot et al. (2013) J. Neurosci. Res. 91:706-716. Pregnant female rats (Wistar) at 15 days of gestation were euthanized using deep anesthesia in a CO ₂ chamber and cervical dislocation. Briefly, embryos were harvested and immediately placed in ice-cold L15 Leibovitz medium with 2% penicillin (10,000 U/ml) and streptomycin (10 mg/ml) (PS) and 1% bovine serum albumin (BSA). The cortex was treated for 20 min at 37°C with a trypsin-EDTA solution with a final concentration of 0.05% trypsin and 0.02% EDTA. Dissociation was stopped by adding Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/l glucose containing DNase I grade II (final concentration 0.5 mg/ml) and 10% fetal calf serum (FBS). Cells were mechanically dissociated by three forced passes through a 10 ml pipette tip. The cells were then centrifuged at 515 xg for 10 minutes at 4°C. The supernatant was removed and the pellet was resuspended in defined culture medium consisting of neurobasal medium with 2% B27 supplement solution, 2 mmol/l L-glutamine, 2% PS solution, and 10 ng/ml brain-derived neurotrophic factor (BDNF). Viable cells were counted on a Neubauer cytometer using a trypan blue exclusion test.

Клетки высевали с плотностью 25000 на лунку в 96-луночные планшеты, предварительно покрытые поли-L-лизином, и культивировали при 37°C в инкубаторе воздух (95%) - CO₂ (5%).Cells were seeded at a density of 25,000 per well in 96-well plates pre-coated with poly-L-lysine and cultured at 37° C. in an air (95%) - CO ₂ (5%) incubator.

Чтобы избежать краевого эффекта, в исследовании не использовали первую и последнюю линии, а также первый и последний ряды планшета. Пустые лунки заполняли водой.To avoid edge effects, the study did not use the first and last lines, and the first and last rows of the plate. The empty wells were filled with water.

Среду меняли каждые 2 дня. Кортикальные нейроны повреждали растворами Aβ (см. ниже) после 11 дней культивирования.The medium was changed every 2 days. Cortical neurons were damaged with Aβ solutions (see below) after 11 days of culture.

Тестируемые соединения и воздействие глутаматаTest compounds and exposure to glutamate

Предварительная инкубация: на 13 день культивирования соединения растворяли в культуральной среде и предварительно инкубировали с первичными кортикальными нейронами в течение 1 часа перед воздействием глутамата.Pre-incubation: On day 13 of culture, compounds were dissolved in culture medium and pre-incubated with primary cortical neurons for 1 hour prior to glutamate exposure.

Повреждение: через 1 час после инкубации тестируемого соединения добавляли глутамат до конечной концентрации 20 мкМ, при разведении в контрольной среде, все еще в присутствии тестируемых соединений, в течение 20 минут. Через 20 минут глутамат вымывали и добавляли свежую культуральную среду с тестируемыми соединениями на дополнительные 48 часов.Damage: 1 hour after test compound incubation, glutamate was added to a final concentration of 20 μM, diluted in control medium, still in the presence of test compounds, for 20 minutes. After 20 minutes, the glutamate was washed out and fresh culture medium with test compounds was added for an additional 48 hours.

Испытуемые соединения тестировали в 96-луночном планшете (n = 6 лунок для культивирования на условие). Оценивали следующие условия:Test compounds were tested in a 96-well plate (n = 6 culture wells per condition). The following conditions were evaluated:

ПЛАНШЕТ 1 (MAP-2)TABLET 1 (MAP-2) Контроль (растворитель)Control (solvent) + Глутамат (20 мкМ, 20 минут) / растворитель+ Glutamate (20 µM, 20 minutes) / diluent + Глутамат (20 мкМ, 20 минут) / MR36014 500 пМ+ Glutamate (20 µM, 20 minutes) / MR36014 500 pM + Глутамат (20 мкМ, 20 минут) / MR36014 1 нМ+ Glutamate (20 µM, 20 minutes) / MR36014 1 nM + Глутамат (20 мкМ, 20 минут) / MR36014 5 нМ+ Glutamate (20 µM, 20 minutes) / MR36014 5 nM + Глутамат (20 мкМ, 20 минут) / MR36014 10 нМ+ Glutamate (20 µM, 20 minutes) / MR36014 10 nM + Глутамат (20 мкМ, 20 минут) / MR33583 1 нМ+ Glutamate (20 µM, 20 minutes) / MR33583 1 nM + Глутамат (20 мкМ, 20 минут) / MR33583 10 нМ+ Glutamate (20 µM, 20 minutes) / MR33583 10 nM + Глутамат (20 мкМ, 20 минут) / MR33583 50 нМ+ Glutamate (20 µM, 20 minutes) / MR33583 50 nM + Глутамат (20 мкМ, 20 минут) / MR33583 100 нМ+ Glutamate (20 µM, 20 minutes) / MR33583 100 nM

Конечная оценкаfinal score

Иммуноокрашивание: MAP-2 (выживание и нейритная сеть) - через 48 часов после интоксикации надосадочную жидкость от клеточной культуры удаляли и немедленно замораживали для будущего анализа. Клетки фиксировали холодным раствором этанола (95%) и уксусной кислоты (5%) в течение 5 мин при -20°C. Клетки дважды промывали ФБР. Клетки пермеабилизировали, а неспецифическое связывание блокировали раствором ФБР, содержащим 0,1% сапонина и 1% ЭТС, в течение 15 минут при комнатной температуре.Immunostaining: MAP-2 (survival and neuritic network) - 48 hours after intoxication, the supernatant from the cell culture was removed and immediately frozen for future analysis. Cells were fixed with a cold solution of ethanol (95%) and acetic acid (5%) for 5 min at -20°C. Cells were washed twice with PBS. Cells were permeabilized and non-specific binding was blocked with a PBS solution containing 0.1% saponin and 1% ETS for 15 minutes at room temperature.

Культуры инкубировали в течение 2 часов с мышиным моноклональным антителом против белка, ассоциированного с микротрубочками 2 (MAP-2), в разведении 1/400, в ФБР, содержащем 1% эмбриональной телячьей сыворотки и 0,1% сапонина. Это антитело выявляли с помощью козьего антитела к IgG мыши с Alexa Fluor 488 (разведение 1/400) в ФБР, содержащем 1% ЭТС, 0,1% сапонина, в течение 1 часа при комнатной температуре. MAP-2 представляет собой нейрональный маркер, присутствующий в телах клеток и нейритах нейронов, который позволяет изучать выживание нейронов и длину нейритной сети.Cultures were incubated for 2 hours with a 1/400 dilution of mouse monoclonal antibody against microtubule associated protein 2 (MAP-2) in PBS containing 1% fetal bovine serum and 0.1% saponin. This antibody was detected with goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 (1/400 dilution) in PBS containing 1% FTS, 0.1% saponin for 1 hour at room temperature. MAP-2 is a neuronal marker present in the cell bodies and neurites of neurons that allows the study of neuronal survival and the length of the neuritic network.

Автоматический компьютерный анализ - для каждого условия с помощью ImageXpress® (Molecular Devices) с 20-кратным увеличением будет выполнено 30 снимков (репрезентативных для всей площади лунки) на лунку. Все изображения будут созданы с использованием одних и тех же параметров получения. Анализ изображений будет выполняться автоматически и напрямую с помощью Custom Module Editor® (Molecular Devices).Automated Computer Analysis - For each condition ImageXpress® (Molecular Devices) at 20x magnification will take 30 images (representative of the entire well area) per well. All images will be generated using the same acquisition options. Image analysis will be performed automatically and directly using the Custom Module Editor® (Molecular Devices).

Будут исследованы следующие показания:The following indications will be investigated:

- Общее выживание нейронов (MAP-2-положительные, число) (данные будут выражены в виде среднего числа нейронов из 30 изображений на лунку).- Total neuronal survival (MAP-2-positive, number) (data will be expressed as the average number of neurons from 30 images per well).

- Общая сеть нейритов (MAP-2 в мкм) (данные будут выражены в виде среднего значения нейронов из 30 изображений на лунку).- Total neurite network (MAP-2 in µm) (data will be expressed as the mean of neurons from 30 images per well).

Статистический анализStatistical analysis

Результатыresults

Влияние MR36014 и MR33583 на кортикальные нейроны, поврежденные глутаматомEffect of MR36014 and MR33583 on cortical neurons damaged by glutamate

Глутаматергическое повреждение вызвало потерю кортикальных нейронов (фиг. 15A и 15C; 32% гибель нейронов) и сокращение общей нейритной сети (фиг. 15B и 15D; 38% потеря нейритов).Glutamatergic damage caused loss of cortical neurons (FIGS. 15A and 15C; 32% neuronal death) and reduction of the total neuronal network (FIGS. 15B and 15D; 38% loss of neurites).

Выживание нейронов. MR36014, добавленный за 1 час до глутамата и оставленный в течение 48 часов после применения глутамата, значительно защищал корковые нейроны от гибели при концентрации 1 нМ (см. фиг. 15A). В тех же экспериментальных условиях MR33583 значительно защищал кортикальные нейроны от гибели при 50 нМ и 100 нМ (см. фиг. 15C).Survival of neurons. MR36014 added 1 hour before glutamate and left for 48 hours after glutamate administration significantly protected cortical neurons from death at a concentration of 1 nM (see Fig. 15A). Under the same experimental conditions, MR33583 significantly protected cortical neurons from death at 50 nM and 100 nM (see Fig. 15C).

Нейритная сеть. Все протестированные концентрации MR36014 (от 500 пМ до 10 нМ) в значительной степени защищали сеть нейритов с максимальным эффектом при 1 нМ (см. фиг. 15B). MR33583 в значительной степени защищал нейритную сеть от 1 до 100 нМ. Эффект соответствовал колоколообразной кривой с максимальным эффектом при 50 нМ (см. фиг. 15D).Neuritic network. All concentrations of MR36014 tested (from 500 pM to 10 nM) significantly protected the neurite network, with a maximum effect at 1 nM (see Fig. 15B). MR33583 significantly protected the neuritic network from 1 to 100 nM. The effect followed a bell curve with a maximum effect at 50 nM (see Fig. 15D).

ОбсуждениеDiscussion

Целью исследования было изучение нейропротекторных эффектов MR36014 и MR33583 на модели нейронального стресса in vitro, вызванного глутаматергической эксайтотоксичностью. Глутаматергический стресс является патологическим признаком, присутствующим при различных неврологических заболеваниях, включая болезнь Альцгеймера и церебральную ишемию.The aim of the study was to investigate the neuroprotective effects of MR36014 and MR33583 in an in vitro model of neuronal stress caused by glutamatergic excitotoxicity. Glutamatergic stress is a pathological feature present in various neurological diseases, including Alzheimer's disease and cerebral ischemia.

По результатам исследования можно сделать вывод, что:According to the results of the study, it can be concluded that:

- оба соединения противодействуют токсичности глутамата для нейронов коры головного мозга;- both compounds counteract the toxicity of glutamate to the neurons of the cerebral cortex;

- MR36014 и MR33583 показали аналогичную эффективность, хотя MR36014 был активен при более низкой дозе (в отношении выживаемости нейронов).- MR36014 and MR33583 showed similar efficacy, although MR36014 was active at a lower dose (in terms of neuronal survival).

В целом, это исследование показывает, что MR36014 и MR33583 являются интересными кандидатами в качестве лекарств от неврологических заболеваний, связанных с глутаматергическим стрессом.Overall, this study shows that MR36014 and MR33583 are interesting drug candidates for neurological diseases associated with glutamatergic stress.

Пример 8Example 8

В этом примере раскрывается оценка нейропротекторных эффектов MR36014 и MR33583 в отношении первичных кортикальных нейронов крыс после глутаматного повреждения.This example discloses an assessment of the neuroprotective effects of MR36014 and MR33583 on primary rat cortical neurons after glutamate damage.

Боковой амиотрофический склероз (БАС) - это фатальное заболевание, характеризующееся началом с небольшой очаговой слабостью, обычно в конечностях, но иногда и в бульбарных мышцах, которая прогрессирует до паралича почти всех скелетных мышц. Существует значительное клинико-патологическое и генетическое совпадение между БАС и лобно-височной долевой деменцией (ЛВП). При БАС смерть от паралича дыхания обычно наступает в течение пяти лет. Клеточная патология является очаговой с самого начала и распространяется по схеме, предполагающей последовательное вовлечение смежных популяций нейронов. Гибель моторных нейронов происходит в сочетании с отложением агрегированных белков в моторных нейронах и олигодендроцитах и нейровоспалением.Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal disease characterized by onset with mild focal weakness, usually in the limbs but occasionally in the bulbar muscles, which progresses to paralysis of almost all skeletal muscles. There is significant clinicopathological and genetic overlap between ALS and frontotemporal lobar dementia (FTL). In ALS, death from respiratory paralysis usually occurs within five years. Cellular pathology is focal from the very beginning and spreads according to a pattern that involves the sequential involvement of adjacent populations of neurons. The death of motor neurons occurs in combination with the deposition of aggregated proteins in motor neurons and oligodendrocytes and neuroinflammation.

Сложная патофизиология БАС представляет собой множество потенциальных терапевтических мишеней. Несмотря на то, что был исследован широкий спектр агентов, только Рилузол (Рилутек®), антиглутаматергический препарат, продемонстрировал устойчивую эффективность, и является единственным одобренным препаратом для лечения этого заболевания. Однако преимущества рилузола скромны - он продлевает выживание пациентов с БАС на несколько месяцев (~7%) с минимальным влиянием на функциональные показатели.The complex pathophysiology of ALS presents many potential therapeutic targets. Although a wide range of agents have been investigated, only Riluzole (Rilutek®), an anti-glutamatergic drug, has shown sustained efficacy and is the only approved drug for the treatment of this disease. However, the benefits of riluzole are modest - it prolongs the survival of ALS patients by several months (~7%) with minimal impact on functional performance.

Хотя точные молекулярные пути, вызывающие гибель моторных нейронов при БАС, остаются неизвестными, некоторые возможные механизмы включают: (а) глутамат-опосредованную эксайтотоксичность; (b) снижение нейротрофических факторов (BDNF, GDNF…); (с) митохондриальные изменения и окислительные повреждения; (d) аномалии белков цитоскелета, приводящие к атрофии и гибели нейронов.Although the exact molecular pathways that cause motor neuron death in ALS remain unknown, some possible mechanisms include: (a) glutamate-mediated excitotoxicity; (b) reduction of neurotrophic factors (BDNF, GDNF…); (c) mitochondrial changes and oxidative damage; (d) abnormalities of cytoskeletal proteins leading to atrophy and death of neurons.

Было показано, что TDP-43 (транзактивный ДНК-связывающий белок 43 кДа) накапливается в цитоплазме моторных нейронов в большинстве случаев БАС. TDP43 представляет собой ядерный РНК-связывающий белок, участвующий в нескольких аспектах процессинга РНК, который активно перемещается между ядром и цитоплазмой.TDP-43 (43 kDa transactive DNA-binding protein) has been shown to accumulate in the cytoplasm of motor neurons in most cases of ALS. TDP43 is a nuclear RNA-binding protein involved in several aspects of RNA processing that actively moves between the nucleus and the cytoplasm.

Целью настоящего исследования была оценка влияния MR36014 и MR33583 (в 4 концентрациях) на первичный спинномозговой моторный нейрон (MN) после повреждения глутаматом.The aim of this study was to evaluate the effect of MR36014 and MR33583 (at 4 concentrations) on the primary spinal motor neuron (MN) after glutamate damage.

Материалы и методыMaterials and methods

Первичная культура спинальных моторных нейроновPrimary culture of spinal motor neurons

Все эксперименты проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Национального института здравоохранения и действующими правилами Европейского Союза (Директива 2010/63/EU). Номер договора: A1301310.All experiments were carried out in accordance with the Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals of the National Institutes of Health and the current regulations of the European Union (Directive 2010/63/EU). Contract number: A1301310.

Моторные нейроны спинного мозга (MN) крыс культивировали, как описано Martinou et al. (1992) Neuron. 8:737-744 и Wang et al. (2013) Hum. Mol. Genet. 22:4706-4719. Вкратце, беременных самок крыс со сроком беременности 14 дней (Rats Wistar; Janvier Labs, France) умерщвляли с использованием глубокой анестезии в камере с CO₂ и цервикальной дислокации. Затем эмбрионы извлекали из матки и немедленно помещали в ледяную среду L15 Лейбовица с 2% раствором пенициллина (10000 Ед/мл) и стрептомицина (10 мг/мл) (ПС) и 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА). Spinal cord motor neurons (MN) from rats were cultured as described by Martinou et al. (1992) Neuron. 8:737-744 and Wang et al. (2013) Hum. Mol. Genet. 22:4706-4719. Briefly, 14 days pregnant female rats (Rats Wistar; Janvier Labs, France) were euthanized using deep anesthesia in a CO ₂ chamber and cervical dislocation. The embryos were then removed from the uterus and immediately placed in ice-cold L15 Leibovitz medium with 2% penicillin (10,000 U/ml) and streptomycin (10 mg/ml) (PS) and 1% bovine serum albumin (BSA).

Спинной мозг обрабатывали в течение 20 мин при 37°C раствором трипсин-ЭДТА с конечной концентрацией 0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА. Диссоциацию останавливали добавлением модифицированной по Дульбекко среды Игла (DMEM) с 4,5 г/л глюкозы, содержащей ДНКазу I сорта II (конечная концентрация 0,5 мг/мл) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС). Клетки механически диссоциировали тремя принудительными пропусканиями через кончик пипетки на 10 мл. Затем клетки центрифугировали при 515 x g в течение 10 минут при 4°C. Надосадочную жидкость удаляли, а осадок ресуспендировали в определенной культуральной среде, состоящей из нейробазальной среды с 2% раствором добавки B27, 2 ммоль/л L-глутамина, 2% раствором ПС и 10 нг/мл нейротрофического фактора головного мозга (BDNF). Жизнеспособные клетки подсчитывали на цитометре Нойбауэра с использованием теста исключения трипанового синего. Клетки высевали с плотностью 20 000 на лунку в 96-луночные планшеты, предварительно покрытые поли-L-лизином, и культивировали при 37°C в инкубаторе в среде воздух (95%) - CO₂ (5%).The spinal cord was treated for 20 min at 37°C with trypsin-EDTA solution with a final concentration of 0.05% trypsin and 0.02% EDTA. Dissociation was stopped by adding Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/l glucose containing DNase I grade II (final concentration 0.5 mg/ml) and 10% fetal calf serum (FBS). Cells were mechanically dissociated by three forced passes through a 10 ml pipette tip. The cells were then centrifuged at 515 xg for 10 minutes at 4°C. The supernatant was removed and the pellet was resuspended in defined culture medium consisting of neurobasal medium with 2% B27 supplement solution, 2 mmol/l L-glutamine, 2% PS solution, and 10 ng/ml brain-derived neurotrophic factor (BDNF). Viable cells were counted on a Neubauer cytometer using a trypan blue exclusion test. Cells were seeded at a density of 20,000 per well in 96-well plates pre-coated with poly-L-lysine and cultured at 37°C in an air (95%)-CO ₂ (5%) incubator.

Среду меняли каждые 2 дня. Лунки первых линий и рядов не использовали для посева (во избежание краевого эффекта) и заполняли стерильной водой. Моторные нейроны повреждали глутаматом после 13 дней культивирования.The medium was changed every 2 days. The wells of the first lines and rows were not used for inoculation (to avoid edge effect) and were filled with sterile water. Motor neurons were damaged by glutamate after 13 days of culture.

Глутаматное повреждение: на 13 день культивирования и после 1 часа предварительной инкубации добавляли глутамат до конечной концентрации 5 мкМ, разведенной в контрольной среде, все еще в присутствии соединений, в течение 20 минут. Через 20 минут глутамат вымывали и добавляли свежую культуральную среду с соединениями еще на 24 часа.Glutamate damage: On day 13 of culture and after 1 hour of pre-incubation, glutamate was added to a final concentration of 5 μM, diluted in control medium, still in the presence of compounds, for 20 minutes. After 20 minutes, the glutamate was washed out and fresh culture medium with compounds was added for another 24 hours.

Испытуемые соединения тестировали в 96-луночном планшете (n = 6 лунок для культивирования на условие).Test compounds were tested in a 96-well plate (n = 6 culture wells per condition).

Оценивали следующие условия:The following conditions were evaluated:

ПЛАНШЕТ 1 (MAP-2 / TDP-43) моторные нейроныTABLET 1 (MAP-2 / TDP-43) motor neurons Контроль (растворитель)Control (solvent) + Глутамат (5 мкМ, 20 минут) / растворитель+ Glutamate (5 µM, 20 minutes) / diluent + Глутамат (5 мкМ, 20 минут) / MR36014 (500 пМ)+ Glutamate (5 µM, 20 minutes) / MR36014 (500 pM) + Глутамат (5 мкМ, 20 минут) / MR36014 (1 нМ)+ Glutamate (5 μM, 20 minutes) / MR36014 (1 nM) + Глутамат (5 мкМ, 20 минут) / MR36014 (5 нМ)+ Glutamate (5 µM, 20 minutes) / MR36014 (5 nM) + Глутамат (5 мкМ, 20 минут) / MR36014 (10 нМ)+ Glutamate (5 µM, 20 minutes) / MR36014 (10 nM) + Глутамат (5 мкМ, 20 минут) / MR33583 (1 нМ)+ Glutamate (5 μM, 20 minutes) / MR33583 (1 nM) + Глутамат (5 мкМ, 20 минут) / MR33583 (10 нМ)+ Glutamate (5 µM, 20 minutes) / MR33583 (10 nM) + Глутамат (5 мкМ, 20 минут) / MR33583 (50 нМ)+ Glutamate (5 µM, 20 minutes) / MR33583 (50 nM) + Глутамат (5 мкМ, 20 минут) / MR33583 (10 нМ)+ Glutamate (5 µM, 20 minutes) / MR33583 (10 nM)

Конечная оценкаfinal score

Через 24 часа после интоксикации надосадочную жидкость отделяли и немедленно замораживали для дальнейшего анализа. Клетки фиксировали холодным раствором этанола (95%) и уксусной кислоты (5%) в течение 5 мин при -20°C. После пермеабилизации 0,1% сапонином клетки инкубировали в течение 2 часов с:24 hours after intoxication, the supernatant was separated and immediately frozen for further analysis. Cells were fixed with a cold solution of ethanol (95%) and acetic acid (5%) for 5 min at -20°C. After permeabilization with 0.1% saponin, cells were incubated for 2 hours with:

- мышиным моноклональным антителом против ассоциированного с микротрубочками белка 2 (MAP-2) при разведении 1/400 в ФБР, содержащем 1% эмбриональной телячьей сыворотки и 0,1% сапонина. Это антитело выявляли с помощью козьего антитела против IgG мыши с Alexa Fluor 488 в разведении 1/400 в ФБР, содержащем 1% ЭТС, 0,1% сапонина, в течение 1 часа при комнатной температуре.- mouse monoclonal antibody against microtubule associated protein 2 (MAP-2) at a dilution of 1/400 in PBS containing 1% fetal calf serum and 0.1% saponin. This antibody was detected with goat anti-mouse IgG with Alexa Fluor 488 at 1/400 dilution in PBS containing 1% FTS, 0.1% saponin for 1 hour at room temperature.

- кроличьими поликлональными антителами против ядерного транзактивного ДНК-связывающего белка 43 (TDP-43) при разведении 1/100 в ФБР, содержащем 1% эмбриональной телячьей сыворотки и 0,1% сапонина. Антитело против TDP-43 было выявлено с помощью козьего антитела к IgG кролика с Alexa Fluor 568 в разведении 1/400 в ФБР, содержащем 1% ЭТС, 0,1% сапонина, в течение 1 часа при комнатной температуре.- rabbit polyclonal antibodies against nuclear transactive DNA-binding protein 43 (TDP-43) at a dilution of 1/100 in PBS containing 1% fetal calf serum and 0.1% saponin. Anti-TDP-43 was detected with goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568 at 1/400 dilution in PBS containing 1% FTS, 0.1% saponin for 1 hour at room temperature.

Для каждого условия с помощью ImageXpress® (Molecular Devices) с 20-кратным увеличением с использованием тех же параметров сбора данных было автоматически сделано 30 снимков (представляющих всю площадь лунки) на лунку. Анализ изображений проводили напрямую и автоматически с помощью Custom Module Editor® (Molecular Devices).For each condition, ImageXpress® (Molecular Devices) at 20x magnification using the same acquisition settings automatically took 30 images (representing the entire well area) per well. Image analysis was performed directly and automatically using the Custom Module Editor® (Molecular Devices).

Конечный анализEnd Analysis

Следующие конечные точки оценивали автоматически:The following endpoints were evaluated automatically:

- Анализ выживания нейронов (окрашивание MAP-2, количество нейронов);- Analysis of neuronal survival (MAP-2 staining, number of neurons);

- Анализ нейритной сети (окрашивание MAP-2, общая длина нейритов в мкм);- Neuritic network analysis (MAP-2 staining, total neurite length in µm);

- Анализ нейритной сети / нейронов (нейронная сеть/ количество нейронов MAP-2);- Analysis of the neural network / neurons (neural network / number of neurons MAP-2);

- Анализ цитоплазматического TDP-43 в MAP-2-положительных нейронах (перекрывание между MAP-2 и цитоплазматическим TDP-43 в мкм²).- Analysis of cytoplasmic TDP-43 in MAP-2 positive neurons (overlap between MAP-2 and cytoplasmic TDP-43 in µm²).

Статистический анализStatistical analysis

Все значения выражены как среднее значение ± SEM (стандартная ошибка среднего). Статистический анализ был выполнен с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим применением метода наименьшей значимой разницы по Фишеру. p <0,05 считали значимым.All values are expressed as mean ± SEM (standard error of the mean). Statistical analysis was performed using one-way analysis of variance followed by the Fisher least significant difference method. p<0.05 was considered significant.

Результатыresults

Эффекты MR36014 в первичной культуре спинальных моторных нейронов, поврежденных глутаматомEffects of MR36014 in primary culture of spinal motor neurons damaged by glutamate

Выживание нейронов. Потеря больших MAP-2 моторных нейронов спинного мозга после применения глутамата (42% гибели нейронов) (фиг. 16A). При 500 пМ и 1 нМ MR36014 значительно улучшал выживание спинальных моторных нейронов.Survival of neurons. Loss of large spinal cord MAP-2 motor neurons after glutamate administration (42% neuronal death) (Fig. 16A). At 500 pM and 1 nM, MR36014 significantly improved spinal motor neuron survival.

Нейритная сеть. Нейритная сеть была сильно уменьшена после повреждения глутаматом (46% потери нейритов, фиг. 16B). MR36014 значительно защищал нейритную сеть при 500 пМ и 1 нМ. Длина нейритной сети пропорциональна количеству нейронов. Отношение «длина нейритной сети»/ «количество нейронов» было рассчитано для оценки средней длины нейрита на нейрон. MR36014 не изменял это соотношение (фиг. 16C).Neuritic network. The neuritic network was greatly reduced after glutamate injury (46% loss of neurites, Fig. 16B). MR36014 significantly protected the neuritic network at 500 pM and 1 nM. The length of the neural network is proportional to the number of neurons. The neuritic network length/number of neurons ratio was calculated to estimate the average neurite length per neuron. MR36014 did not change this ratio (Fig. 16C).

Эффекты MR33583 в первичной культуре спинальных моторных нейронов, поврежденных глутаматомEffects of MR33583 in primary culture of spinal motor neurons damaged by glutamate

Выживание нейронов. На фиг. 17 показано, что после применения глутамата отмечалась потеря больших MAP-2 моторных нейронов позвоночника (фиг. 17A). MR33583 (добавленный за 1 час до глутамата и оставленный на 24 часа после повреждения) проявлял дозозависимый нейропротекторный эффект (от 10 до 100 нМ).Survival of neurons. In FIG. 17 shows that there was a loss of large spinal MAP-2 motor neurons following glutamate administration (FIG. 17A). MR33583 (added 1 hour before glutamate and left 24 hours after injury) showed a dose-dependent neuroprotective effect (10 to 100 nM).

Нейритная сеть. Как показано на фиг. 17, нейритная сеть сильно сократилась после повреждения глутаматом (фиг. 17B). MR33583 значительно защищал нейритную сеть от 10 до 100 нМ дозозависимым образом. MR36014 не изменял это соотношение (фиг. 17C).Neuritic network. As shown in FIG. 17, the neural network was greatly reduced after glutamate damage (Fig. 17B). MR33583 significantly protected the neuritic network from 10 to 100 nM in a dose dependent manner. MR36014 did not change this ratio (Fig. 17C).

TDP43. При наивысшей дозе MR33583 (100 нМ) снижал сигнал TDP43 в цитоплазме спинальных моторных нейронов (фиг. 17D).TDP43. At the highest dose, MR33583 (100 nM) reduced the TDP43 signal in the cytoplasm of spinal motor neurons (Fig. 17D).

ОбсуждениеDiscussion

Целью этого исследования была оценка нейропротекторных эффектов двух соединений, MR36014 и MR33583, на модели бокового амиотрофического склероза in vitro, основанной на первичной культуре моторных нейронов спинного мозга, поврежденных глутаматом.The aim of this study was to evaluate the neuroprotective effects of two compounds, MR36014 and MR33583, in an in vitro model of amyotrophic lateral sclerosis based on a primary culture of glutamate-damaged spinal cord motor neurons.

Результаты этого исследования показывают, что:The results of this study show that:

- MR36014 обеспечивает явный нейропротекторный эффект при 500 пМ и 1 нМ, поскольку он улучшает выживание нейронов и защищает нейритную сеть.- MR36014 provides a clear neuroprotective effect at 500 pM and 1 nM as it improves neuronal survival and protects the neural network.

- MR33583 продемонстрировал явный нейропротекторный эффект в отношении всех параметров (выживание нейронов, сохранение нейритной сети и накопление цитоплазматического TDP43).- MR33583 showed a clear neuroprotective effect on all parameters (neuronal survival, neuritic network preservation, and cytoplasmic TDP43 accumulation).

В целом, эти результаты показывают, что MR36014 и MR33583 были способны опосредовать нейропротекцию моторных нейронов спинного мозга, и они являются потенциальными кандидатами в качестве лекарств от бокового амиотрофического склероза.Overall, these results indicate that MR36014 and MR33583 were able to mediate neuroprotection of spinal cord motor neurons, and they are potential drug candidates for amyotrophic lateral sclerosis.

Пример 9Example 9

В этом примере показана оценка нейропротекторного действия MR33583 на первичные ГАМКергические нейроны крысы в условиях депривации фактора роста.This example shows the evaluation of the neuroprotective effect of MR33583 on primary rat GABAergic neurons under conditions of growth factor deprivation.

БХ (болезнь Хантингтона) - аутосомно-доминантное наследственное нейродегенеративное заболевание, поражающее примерно 4–10 из 10 000 у представителей европеоидной расы. Головной мозг при БХ характеризуется потерей MSN (средних шипиковых нейронов) полосатого тела, увеличением желудочков и соответствующей атрофией вышележащей коры. ГАМКергические (γ-аминомасляная кислота) клетки являются наиболее многочисленным типом нейрональных клеток полосатого тела (90–95% у крыс и более 85% у людей), наряду с несколькими небольшими популяциями интернейронов (Wictorin (1992) Prog. Neurobiol. 38: 611-639). MSN характеризуются экспрессией фермента GAD64. Они принимают основную часть входных сигналов в полосатое тело, получая афференты от коры, таламуса и среднего мозга, а также являются основным выходным нейроном полосатого тела, проецируясь в различные области ЦНС (центральной нервной системы), включая бледный шар и черную субстанцию. Как таковые, они образуют сложные нейронные петли в базальных ганглиях, которые важны для контроля действий, познания и эмоций (Nakano et al. (2000) J. Neurol. 247 (Suppl. 5): v1-v15).HD (Huntington's disease) is an autosomal dominant inherited neurodegenerative disease that affects approximately 4–10 out of 10,000 Caucasians. The brain in HD is characterized by loss of MSNs (middle spiny neurons) of the striatum, enlargement of the ventricles, and associated atrophy of the overlying cortex. GABAergic (γ-aminobutyric acid) cells are the most abundant striatal neuronal cell type (90–95% in rats and over 85% in humans), along with several small populations of interneurons (Wictorin (1992) Prog. Neurobiol. 38:611- 639). MSNs are characterized by the expression of the GAD64 enzyme. They receive the bulk of inputs to the striatum, receiving afferents from the cortex, thalamus, and midbrain, and are also the main output striatal neuron, projecting to various areas of the CNS (central nervous system), including the globus pallidus and substantia nigra. As such, they form complex neural loops in the basal ganglia that are important in the control of action, cognition, and emotion (Nakano et al. (2000) J. Neurol. 247 (Suppl. 5): v1-v15).

Важность факторов роста и их уменьшение при нейродегенеративных заболеваниях (таких как БА, БП или БХ) часто упоминается как одна из множества причин этих патологий. Генетическая, а также фармакологическая депривация BDNF или GDNF ухудшает обучение и память и приводит к гибели нейронов (Yamada et al. (2003) J. Pharmacol. Sci. 91: 267-270). Модель депривации фактора роста была охарактеризована в нескольких типах нейрональных клеток, таких как первичная культура нейронов грызунов (Atabay et al. (1996) J. Neurosci. Res. 43: 465-475), человеческих SK-N-SH и SH-SY5Y клеток нейробластомы (Ba et al. (2003) J. Neurosci. Methods 123: 11-22; Russo et al. (2004) Brain Res. 1009: 40-53).The importance of growth factors and their reduction in neurodegenerative diseases (such as AD, PD or HD) is often cited as one of the many causes of these pathologies. Genetic as well as pharmacological deprivation of BDNF or GDNF impairs learning and memory and results in neuronal death (Yamada et al. (2003) J. Pharmacol. Sci. 91: 267-270). The growth factor deprivation model has been characterized in several neuronal cell types such as primary culture of rodent neurons (Atabay et al. (1996) J. Neurosci. Res. 43: 465-475), human SK-N-SH and SH-SY5Y cells neuroblastomas (Ba et al. (2003) J. Neurosci. Methods 123: 11-22; Russo et al. (2004) Brain Res. 1009: 40-53).

В этих условиях с депривацией фактора роста серьезная потеря жизнеспособности происходит из-за апоптотической гибели клеток, обнаруживаемой по значительному усилению параметров, связанных с апоптозом, включая расщепленную каспазу-3, PARP и H2A.X. Кроме того, было показано, что экспрессия гена и белка антиапоптотического Bcl-2 снижается, тогда как экспрессия проапоптотического Bax повышается. Кроме того, было показано, что депривация нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) запускает пути клеточной гибели за счет активации каспаз благодаря усилению передачи сигналов p75NTR (Yu et al. (2008) J. Neurosci. 28: 7467-7475).Under these conditions with growth factor deprivation, a severe loss of viability occurs due to apoptotic cell death, detectable by a significant increase in parameters associated with apoptosis, including cleaved caspase-3, PARP and H2A.X. In addition, it has been shown that the expression of the anti-apoptotic Bcl-2 gene and protein is reduced, while the expression of the pro-apoptotic Bax is increased. In addition, deprivation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) has been shown to trigger cell death pathways by activating caspases through increased p75NTR signaling (Yu et al. (2008) J. Neurosci. 28: 7467-7475).

Интересно, что мыши Bdnf-/- также обнаруживают структурно-специфические нейроанатомические изменения и поведенческие аномалии. Они демонстрируют пониженную сложность дендритов и плотность шипов в коре и гиппокампе и в еще большей степени в полосатом теле, где 90% пораженных клеток являются ГАМКергическими MSN (Rauskolb et al. (2010) J. Neurosci.30: 1739-1749).Interestingly, Bdnf -/- mice also exhibit structure-specific neuroanatomical changes and behavioral abnormalities. They show reduced dendritic complexity and spine density in the cortex and hippocampus, and even more so in the striatum, where 90% of affected cells are GABAergic MSNs (Rauskolb et al. (2010) J. Neurosci. 30: 1739-1749).

Целью этого исследования было изучение нейропротекторного эффекта MR33583 (в 4 концентрациях) в отношении выживания полосатого тела после депривации фактора роста (депривации BDNF и GDNF), на модели болезни Хантингтона in vitro.The aim of this study was to investigate the neuroprotective effect of MR33583 (at 4 concentrations) on striatal survival after growth factor deprivation (BDNF and GDNF deprivation) in an in vitro model of Huntington's disease.

Материалы и методыMaterials and methods

Первичная культура ГАМКергических нейроновPrimary culture of GABAergic neurons

Все эксперименты были проведены в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Национального института здравоохранения и действующими правилами Европейского Союза (Директива 2010/63/EU). Номер договора: A1301310.All experiments were carried out in accordance with the Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals of the National Institutes of Health and the current regulations of the European Union (Directive 2010/63/EU). Contract number: A1301310.

MSN полосатого тела крысы культивировали, как описано Ivkovic et al. (1999) J. Neurosci. 19: 5409-5419 и Schinelli et al. (1988) J. Neurochem. 50: 1900–1907. Вкратце, беременных самок крыс с 15-дневной беременностью умерщвляли с использованием глубокой анестезии в камере с CO₂ и цервикальной дислокации. Эмбрионы собирали и немедленно помещали в ледяную среду L15 Лейбовица с 2% раствором пенициллина (10000 Ед/мл) и стрептомицина (10 мг/мл) (ПС) и 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА). Для приготовления клеток использовали только ограниченную вентральная часть мезэнцефалического изгиба, поскольку это область развивающегося мозга, богатая клетками MSN. Эти участки обрабатывали в течение 20 мин при 37°C раствором трипсин-ЭДТА с конечной концентрацией 0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА. Диссоциацию останавливали добавлением модифицированной по Дульбекко среды Игла (DMEM) с 4,5 г/л глюкозы, содержащей ДНКазу I сорта II (конечная концентрация 0,5 мг/мл) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС). Клетки механически диссоциировали тремя принудительными пропусканиями через кончик пипетки на 10 мл. Затем клетки центрифугировали при 180 x g в течение 10 минут при комнатной температуре на слое БСА (3,5%) в среде L15. Надосадочную жидкость удаляли, а осадок клеток ресуспендировали в определенной культуральной среде, состоящей из нейробазальной среды с добавлением B27 (2%), L-глутамина (2 мМ), 1% раствора ПС, BDNF (10 нг/мл) и GDNF (1 нг/мл). Жизнеспособные клетки подсчитывали на цитометре Нейбауэра с использованием теста исключения трипанового синего. Клетки высевали с плотностью 40000 клеток/лунку в 96-луночные планшеты (лунки были предварительно покрыты поли-L-лизином) и культивировали при 37°C в инкубаторе воздух (95%)/CO₂ (5%). Rat striatal MSN were cultured as described by Ivkovic et al. (1999) J. Neurosci. 19: 5409-5419 and Schinelli et al. (1988) J. Neurochem. 50: 1900–1907. Briefly, 15 day pregnant female rats were euthanized using deep anesthesia in a CO ₂ chamber and cervical dislocation. Embryos were harvested and immediately placed in ice-cold L15 Leibovitz medium with 2% penicillin (10,000 U/ml) and streptomycin (10 mg/ml) (PS) and 1% bovine serum albumin (BSA). Only a limited ventral portion of the mesencephalic flexure was used for cell preparation, as this is an area of the developing brain rich in MSN cells. These areas were treated for 20 min at 37°C with a trypsin-EDTA solution with a final concentration of 0.05% trypsin and 0.02% EDTA. Dissociation was stopped by adding Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/l glucose containing DNase I grade II (final concentration 0.5 mg/ml) and 10% fetal calf serum (FBS). Cells were mechanically dissociated by three forced passes through a 10 ml pipette tip. The cells were then centrifuged at 180 xg for 10 minutes at room temperature on a bed of BSA (3.5%) in L15 medium. The supernatant was removed and the cell pellet was resuspended in a specific culture medium consisting of neurobasal medium supplemented with B27 (2%), L-glutamine (2 mM), 1% PS solution, BDNF (10 ng/ml) and GDNF (1 ng /ml). Viable cells were counted on a Neubauer cytometer using the trypan blue exclusion test. Cells were seeded at a density of 40,000 cells/well in 96-well plates (the wells were pre-coated with poly-L-lysine) and cultured at 37° C. in an air (95%)/CO ₂ (5%) incubator.

Чтобы избежать краевого эффекта, в исследовании не использовали первую и последнюю линии, а также первый и последний ряды планшета. Пустые лунки заполняли водой. Среду меняли каждые 2 дня.To avoid edge effects, the study did not use the first and last lines, and the first and last rows of the plate. The empty wells were filled with water. The medium was changed every 2 days.

Тестируемые соединения и депривация факторов ростаTest Compounds and Deprivation of Growth Factors

Предварительная инкубация: на 13 день культивирования тестируемое соединение разводили в культуральной среде и предварительно инкубировали с ГАМКергическими нейронами в течение 1 часа перед депривацией факторов роста (BDNF и GDNF).Pre-incubation: On day 13 of culture, test compound was diluted in culture medium and pre-incubated with GABAergic neurons for 1 hour prior to deprivation of growth factors (BDNF and GDNF).

Депривация факторов роста: через 1 час после инкубации с тестируемым соединением половину среды заменяли средой, лишенной факторов роста. Депривацию применяли на 96 часов.Deprivation of growth factors: 1 hour after incubation with the test compound, half of the medium was replaced with medium devoid of growth factors. Deprivation was applied for 96 hours.

ПЛАНШЕТ 1 (GAD67)TABLET 1 (GAD67) Контроль (растворитель)Control (solvent) + Депривация факторов роста/ растворитель+ Deprivation of growth factors/solvent + Депривация факторов роста/ MR33583 (1 нМ)+ Deprivation of growth factors / MR33583 (1 nM) + Депривация факторов роста/ MR33583 (10 нМ)+ Deprivation of growth factors / MR33583 (10 nM) + Депривация факторов роста/ MR33583 (50 нМ)+ Deprivation of growth factors / MR33583 (50 nM) + Депривация факторов роста/ MR33583 (10 нМ)+ Deprivation of growth factors / MR33583 (10 nM)

Конечная оценкаfinal score

Через 96 часов после депривации факторов роста надосадочную жидкость клеточной культуры отделяли и немедленно замораживали для будущего анализа. Клетки фиксировали холодным раствором этанола (95%) и уксусной кислоты (5%) в течение 5 мин при -20°C. Клетки дважды промывали ФБР и затем повышали проницаемость. Неспецифическое связывание блокировали раствором ФБР, содержащим 0,1% сапонина и 1% ЭТС, в течение 15 мин при комнатной температуре.96 hours after growth factor deprivation, the cell culture supernatant was separated and immediately frozen for future analysis. Cells were fixed with a cold solution of ethanol (95%) and acetic acid (5%) for 5 min at -20°C. Cells were washed twice with PBS and then permeated. Nonspecific binding was blocked with a PBS solution containing 0.1% saponin and 1% ETS for 15 min at room temperature.

Иммуноокрашивание: GAD67 (выживание). Культуры инкубировали в течение 2 часов с мышиным моноклональным антителом против GAD67 при разведении 1/200 в ФБР, содержащем 1% эмбриональной телячьей сыворотки и 0,1% сапонина (это антитело специфически окрашивает ГАМКергические нейроны). Это антитело выявляли с помощью козьего антитела против IgG мыши с Alexa Fluor 488 (разведение 1/400) в ФБР, содержащем 1% ЭТС, 0,1% сапонина, в течение 1 часа при комнатной температуре.Immunostaining: GAD67 (survival). Cultures were incubated for 2 hours with a 1/200 dilution of mouse anti-GAD67 monoclonal antibody in PBS containing 1% fetal calf serum and 0.1% saponin (this antibody specifically stains GABAergic neurons). This antibody was detected with goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 (1/400 dilution) in PBS containing 1% FTS, 0.1% saponin for 1 hour at room temperature.

Автоматический компьютерный анализ - для каждого условия с помощью ImageXpress® (Molecular Devices) с 20-кратным увеличением было сделано 30 снимков (представляющих всю площадь лунки) на лунку. Все изображения были созданы с использованием одних и тех же параметров сбора данных. Анализ изображений проводили напрямую и автоматически с помощью Custom Module Editor® (Molecular Devices).Automated Computer Analysis - For each condition, 30 images (representing the entire well area) were taken per well using ImageXpress® (Molecular Devices) at 20x magnification. All images were created using the same data acquisition settings. Image analysis was performed directly and automatically using the Custom Module Editor® (Molecular Devices).

Следующие данные были исследованы: Анализ выживания MSN (окрашивание GAD67, количество ГАМКергических нейронов).The following data were examined: MSN survival analysis (GAD67 staining, number of GABAergic neurons).

Статистический анализStatistical analysis

Результатыresults

Влияние MR33583 на первичную культуру ГАМКергических нейронов, подвергнутых стрессу путем депривации факторов ростаEffect of MR33583 on Primary Culture of GABAergic Neurons Stressed by Growth Factor Deprivation

Выживание нейронов. Потеря больших GAD-67-положительных ГАМКергических нейронов последовала за депривацией факторов роста (фиг. 18).Survival of neurons. The loss of large GAD-67 positive GABAergic neurons followed deprivation of growth factors (Fig. 18).

MR33583 (50 нМ) оказывал значительный нейропротекторный эффект, что подтверждалось улучшением выживания ГАМКергических нейронов.MR33583 (50 nM) had a significant neuroprotective effect, as evidenced by improved survival of GABAergic neurons.

ОбсуждениеDiscussion

В целом, эти результаты показывают, что MR33583 способен вызывать нейропротекторные эффекты (50 нМ) в ГАМКергических нейронах и что он может быть потенциальным лекарством от болезни Хантингтона.Overall, these results indicate that MR33583 is able to induce neuroprotective effects (50 nM) in GABAergic neurons and that it may be a potential drug for Huntington's disease.

Claims

1. Применение соединения следующей формулы (I):1. Use of a compound of the following formula (I):

где:Where:

X представляет собой атом галогена (Hal), где (Hal) представляет собой фтор, хлор, бром или йод;X represents a halogen atom (Hal), where (Hal) represents fluorine, chlorine, bromine or iodine;

Y представляет собой атом кислорода;Y represents an oxygen atom;

m, n, r и s имеют значение 1;m, n, r and s have the value 1;

R представляет собой С₁-С₅ алкильную группу с прямой или разветвленной цепью;R represents a C ₁ -C ₅ straight or branched chain alkyl group;

R' представляет собой С₃-С₁₀ циклоалкил, а также его кислотных солей в качестве нейропротекторного агента при профилактике нейродегенеративного заболевания,R' represents C ₃ -C ₁₀ cycloalkyl, as well as its acid salts as a neuroprotective agent in the prevention of neurodegenerative disease,

где указанные кислотные соли представляют собой фумараты, иwhere said acid salts are fumarates, and

где нейродегенеративное заболевание выбрано из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, болезни Хантингтона, бокового амиотрофического склероза и нейродегенеративного заболевания, вызванного ишемией или черепно-мозговой травмой.where the neurodegenerative disease is selected from the group consisting of Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, amyotrophic lateral sclerosis and neurodegenerative disease caused by ischemia or traumatic brain injury.

2. Применение по п. 1, где R в формуле (I) представляет собой СН₃ или СН₂СН₃.2. Use according to claim 1, wherein R in formula (I) is CH ₃ or CH ₂ CH ₃ .

3. Применение по п. 1 или 2, где R' в формуле (I) представляет собой радикал, выбранный из группы, состоящей из радикалов циклопропила, циклобутила, циклопентила, циклогексила, циклогептила и 4-пиперидина.3. Use according to claim 1 or 2, wherein R' in formula (I) is a radical selected from the group consisting of cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl and 4-piperidine radicals.

4. Применение по пп. 1-3, где R в формуле (I) представляет собой метильный радикал, a R' - циклоалкильный радикал С₄-С₇.4. Application according to paragraphs. 1-3, where R in the formula (I) represents a methyl radical, and R' is a C ₄ -C ₇ cycloalkyl radical.

5. Применение по любому из пп. 1-4, где соединение представляет собой соединение донекоприд следующей формулы (II):5. Application according to any one of paragraphs. 1-4, wherein the compound is a donecoprid compound of the following formula (II):

6. Применение по любому из пп. 1-4, где соединение представляет собой соединение флукоприд следующей формулы (III):6. Application according to any one of paragraphs. 1-4, where the compound is a flucopride compound of the following formula (III):

7. Применение по любому из пп. 1-4, где соединение представляет собой соединение MR31192 следующей формулы (VIII):7. Application according to any one of paragraphs. 1-4, where the compound is an MR31192 compound of the following formula (VIII):

8. Применение по любому из пп. 1-4, где соединение представляет собой соединение MR33583 следующей формулы (V):8. Application according to any one of paragraphs. 1-4, where the compound is an MR33583 compound of the following formula (V):

9. Применение по любому из пп. 1-4, где соединение представляет собой соединение MR360149. Application according to any one of paragraphs. 1-4 where the connection is an MR36014 connection

следующей формулы (VII):the following formula (VII):

10. Применение по любому из пп. 1-4, где соединение представляет собой соединение MR31176 следующей формулы (IV):10. Application according to any one of paragraphs. 1-4, where the compound is an MR31176 compound of the following formula (IV):