BR112021004489A2

BR112021004489A2 - métodos de tratamento de toxicidade relacionada à imunoterapia usando um antagonista de gm-csf

Info

Publication number: BR112021004489A2
Application number: BR112021004489-2A
Authority: BR
Inventors: Cameron DURRANT; Dale Chappell
Original assignee: Humanigen, Inc.
Priority date: 2018-09-10
Filing date: 2019-09-10
Publication date: 2021-07-20
Also published as: CA3111804A1; AU2019340662A1; EP3849572A2; SG11202102317PA; WO2020055932A9; KR20210075090A; JP2022517461A; EP3849572A4; WO2020055932A2; CN113164520A; IL281243A; WO2020055932A3; MX2021002856A

Abstract

MÉTODOS DE TRATAMENTO DE TOXICIDADE RELACIONADA À IMUNOTERAPIA USANDO UM ANTAGONISTA DE GM-CSF. São fornecidos métodos para neutralização e/ou remoção de GM-CSF humano em um indivíduo necessitado, que compreendem a administração ao indivíduo de células CAR-T que possuem um knockout do gene de GM-CSF (células CAR-T GM-CSFk/o). Também são fornecidos métodos para inativação do gene GM-CSF ou knockout de GM-CSF (KO) em uma célula, que compreendem a edição direcionada do genoma ou silenciamento do gene GM-CSF. Também são fornecidos métodos para a prevenção/tratamento de toxicidade relacionada à imunoterapia, que compreendem a administração ao indivíduo de células CAR-T que possuem uma inativação do gene GM-CSF ou knockout de GM-CSF (células CAR-T GM-CSFk/o), em que o gene GM-CSF é inativado ou sofre knockout e/ou um antagonista de GM-CSF recombinante. São fornecidos métodos para a redução de um nível de uma citocina ou quimiocina diferente de GM-CSF em um indivíduo que possui toxicidade relacionada à imunoterapia, que compreendem a administração ao indivíduo de um antagonista de hGM-CSF recombinante. Também são fornecidos métodos para o tratamento ou prevenção de toxicidade relacionada à imunoterapia em um indivíduo, que compreendem a administração ao indivíduo de células T que expressam receptor de antígeno quimérico (células CAR-T), as células CAR-T possuindo um knockout do gene de GM-CSF (células CAR-T GM-CSFk/o). Também são fornecidos métodos para prevenção ou redução da ruptura da barreira hematencefálica em um indivíduo tratado com imunoterapia, o método compreendendo a administração de células CAR-T que possuem um knockout do gene de GM-CSF (células CAR-T GM-CSFk/o) ao indivíduo.

Description

MÉTODOS DE TRATAMENTO DE TOXICIDADE RELACIONADA À IMUNOTERAPIA USANDO UM ANTAGONISTA DE GM-CSF REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Esse pedido é um pedido de continuação-em-parte do Pedido U.S. Nº 16/283.694, depositado em 22 de fevereiro de 2019, que é um pedido de continuação-em-parte do Pedido U.S. Nº 16/248.762, depositado em 15 de janeiro de 2019, que é um pedido de continuação-em-parte do Pedido U.S. Nº 16/204.220, depositado em 29 de novembro de 2018, que é um pedido de continuação-em-parte do Pedido U.S. Nº 16/149.346, depositado em 2 de outubro de 2018, que reivindica prioridade para os Pedidos U.S. Provisórios Nos 62/567.187, depositado em 2 de outubro de 2017 e 62/729.043, depositado em 10 de setembro de 2018, e esse pedido reivindica prioridade para o Pedido PCT Nº PCT/US2018/053933, depositado em 2 de outubro de 2018, que são incorporados nesse relatório descritivo por referência.

CAMPO DA REVELAÇÃO

[0002] A invenção está relacionada aos métodos para neutralização e/ou remoção de GM-CSF humano em um indivíduo necessitado, o método compreendendo a administração ao indivíduo de células CAR-T que possuem um knockout do gene de GM-CSF (células CAR-T GM-CSFk/o). A invenção também está relacionada aos métodos para inativação do gene GM-CSF ou knockout de GM-CSF (KO) em uma célula, que compreendem a edição direcionada do genoma ou silenciamento do gene GM- CSF. A invenção ainda está relacionada aos métodos para a prevenção/redução da toxicidade relacionada à imunoterapia, o método compreendendo a administração ao indivíduo de células CAR-T que possuem uma inativação do gene GM-CSF ou knockout de GM-CSF (células CAR-T GM-CSFk/o), em que o gene GM-CSF é inativado ou sofre knockout pelos métodos.

[0003] A invenção está relacionada aos métodos para a redução da ruptura da barreira hematencefálica em um indivíduo tratado com imunoterapia, os métodos compreendendo a administração de um antagonista de GM-CSF recombinante ao indivíduo. A invenção também está relacionada aos métodos para preservação da integridade da barreira hematencefálica em um indivíduo tratado com imunoterapia, os métodos compreendendo a administração de um antagonista de hGM-CSF recombinante ao indivíduo. A invenção ainda está relacionada aos métodos para diminuição ou prevenção de neuroinflamação induzida por terapia com células CAR-T em um indivíduo necessitado, o método compreendendo a administração de um antagonista de GM-CSF recombinante ao indivíduo. A invenção está relacionada aos métodos para redução da taxa de recidiva ou prevenção da ocorrência de recidiva do tumor em um indivíduo tratado com imunoterapia na ausência de uma incidência de toxicidade relacionada à imunoterapia. A invenção também está relacionada aos métodos para redução da taxa de recidiva ou prevenção da ocorrência de recidiva do tumor em um indivíduo tratado com imunoterapia na presença de uma incidência de toxicidade relacionada à imunoterapia. A invenção ainda está relacionada aos métodos para a redução de um nível de uma citocina ou quimiocina diferente de GM- CSF em um indivíduo que possui uma incidência de toxicidade relacionada à imunoterapia, os métodos compreendendo a administração de um antagonista de GM-CSF recombinante ao indivíduo. A invenção também está relacionada aos métodos para o tratamento ou prevenção de toxicidade relacionada à imunoterapia em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de células T que expressam receptor de antígeno quimérico (células CAR-T), as células CAR-T possuindo um knockout do gene de GM-CSF (células CAR- T GM-CSFk/o), e um antagonista de hGM-CSF recombinante. A revelação nesse relatório descritivo também fornece métodos de inibição ou redução da incidência e/ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia em um indivíduo, o método compreendendo a administração de um antagonista de GM-CSF recombinante ao indivíduo.

FUNDAMENTOS

[0004] O fator estimulante de colônia de granulócitos- macrófagos (GM-CSF) é uma citocina secretada por vários tipos de células, incluindo macrófagos, células T, mastócitos, células natural killer, células endoteliais e fibroblastos. GM-CSF estimula a diferenciação de granulócitos e de monócitos. Monócitos, por sua vez, migram para dentro do tecido e amadurecem em macrófagos e células dendríticas. Dessa forma, a secreção de GM-CSF leva a um aumento rápido nos números de macrófagos. GM-CSF também está envolvido na resposta inflamatória no Sistema Nervoso Central (SNC) causando influxo de monócitos e macrófagos derivados do sangue, e na ativação de astrócitos e microglia. Toxicidades relacionadas ao sistema imune compreendem respostas imunes potencialmente fatais que ocorrem como resultado dos níveis altos de ativação imune que ocorre por diferentes imunoterapias. A toxicidade relacionada ao sistema imune é atualmente uma complicação importante para a aplicação de imunoterapias em pacientes com câncer. A terapia com célula T do receptor de antígeno quimérico (CAR-T) emergiu como uma terapia inédita e potencialmente revolucionária para tratar câncer. Com base em respostas sem precedentes em malignidades de célula B, dois produtos de célula CAR-T direcionada a CD19 (CART19) foram aprovados pelo FDA (“Food and Drug Administration” - agência governamental americana que regula e fiscaliza a fabricação de comestíveis, drogas e cosméticos) em 2017. No entanto, a aplicação mais ampla da terapia com células CAR-T está limitada pela emergência de toxicidades únicas e potencialmente fatais. Estas incluem o desenvolvimento de síndrome de liberação de citocinas (CRS) e neurotoxicidade (NT). Até 50% dos pacientes tratados com células CART19 desenvolvem CRS ou NT de grau 3 ou maior e várias mortes foram relatadas. Essas toxicidades estão associadas com hospitalização prolongada, estadias na unidade de terapia intensiva (UTI), e os efeitos de longo prazo da NT são desconhecidos. Dessa forma, o controle dessas toxicidades relacionadas à célula CART19 é imperativo para diminuir a morbidade, mortalidade, duração de hospitalização, admissões em UTI, necessidade de cuidados de suporte e os custos indiretos significantes associados à terapia com células CAR-T. É claro que permanece uma necessidade crítica por métodos de prevenção e tratamento de toxicidade relacionada ao sistema imune. Um método ideal irá minimizar o risco dessas complicações potencialmente fatais, sem afetar a eficácia da imunoterapia e poderia potencialmente até mesmo aumentar a eficácia ao prmitir, por exemplo, dosagem aumentada segura de compostos imunoterapêuticos e/ou uma expansão de células T.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0005] Em um aspecto, essa invenção fornece métodos para neutralização e/ou remoção de GM-CSF humano em um indivíduo necessitado, o método compreendendo a administração ao indivíduo de células CAR-T que possuem um knockout do gene de GM-CSF (células CAR-T GM-CSFk/o).

[0006] Em outro aspecto, essa invenção fornece métodos para inativação do gene GM-CSF ou knockout de GM-CSF (KO) em uma célula, que compreendem a edição direcionada do genoma ou silenciamento do gene GM-CSF.

[0007] Em um aspecto adicional, essa invenção fornece métodos para a prevenção/redução da toxicidade relacionada à imunoterapia, o método compreendendo a administração ao indivíduo de células CAR-T que possuem uma inativação do gene GM-CSF ou knockout de GM-CSF (células CAR-T GM-CSFk/o), em que o gene GM-CSF é inativado ou sofre knockout pelos métodos descritos nesse relatório descritivo.

[0008] Em um aspecto, essa invenção fornece métodos para a redução da ruptura da barreira hematencefálica em um indivíduo tratado com imunoterapia, os métodos compreendendo a administração de um antagonista de GM-CSF recombinante ao indivíduo.

[0009] Em outro aspecto, essa invenção fornece métodos para preservação da integridade da barreira hematencefálica em um indivíduo tratado com imunoterapia, os métodos compreendendo a administração de um antagonista de hGM-CSF recombinante ao indivíduo.

[0010] Ainda em outro aspecto, essa invenção fornece métodos para diminuição ou prevenção de neuroinflamação induzida por terapia com células CAR-T em um indivíduo necessitado, o método compreendendo a administração de um antagonista de GM-CSF recombinante ao indivíduo.

[0011] Em outro aspecto, essa invenção fornece métodos para prevenção ou redução da ruptura da barreira hematencefálica em um indivíduo tratado com imunoterapia, o método compreendendo a administração de células CAR-T que possuem um knockout do gene de GM-CSF (células CAR-T GM- CSFk/o) ao indivíduo.

[0012] Em um aspecto, essa invenção fornece métodos para redução da taxa de recidiva ou prevenção ou retardo da ocorrência de recidiva do tumor em um indivíduo tratado com imunoterapia na ausência de uma incidência de toxicidade relacionada à imunoterapia, o método compreendendo a administração ao indivíduo de um antagonista de hGM-CSF recombinante. Em um aspecto relacionado, essa invenção fornece métodos para redução da taxa de recidiva ou prevenção da ocorrência de recidiva do tumor em um indivíduo tratado com imunoterapia na presença de uma incidência de toxicidade relacionada à imunoterapia, o método compreendendo a administração ao indivíduo de um antagonista de hGM-CSF recombinante.

[0013] Em outro aspecto, essa invenção fornece um método de redução de um nível de uma citocina ou quimiocina diferente de GM-CSF em um indivíduo que possui uma incidência de toxicidade relacionada à imunoterapia, o método compreendendo a administração ao indivíduo de um antagonista de hGM-CSF recombinante, em que o nível da citocina ou quimiocina é reduzido, comparado com o nível desta em um indivíduo durante a incidência de toxicidade relacionada à imunoterapia.

[0014] Em um aspecto adicional, essa invenção fornece um método para prevenção ou redução da toxicidade relacionada à imunoterapia em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de células T que expressam receptor de antígeno quimérico (células CAR-T), as células CAR-T possuindo seus genes GM-CSF ‘knocked-out’ (células CAR-T GM-CSFk/o), e um antagonista de hGM-CSF recombinante. As células CAR-T GM-CSFk/o podem ser administradas em combinação com um antagonista de hGM-CSF (um antagonista de hGM-CSF recombinante).

[0015] Em um aspecto, é revelado nesse relatório descritivo um método de inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia em um indivíduo, o método compreendendo a etapa de administração de um antagonista de hGM-CSF recombinante ao indivíduo.

[0016] Em um aspecto relacionado, a referida imunoterapia compreende transferência adotiva de células, administração de anticorpos monoclonais, administração de citocinas ou quimiocinas, administração de uma vacina contra câncer, terapias de comprometimento de células T, ou qualquer combinação destas.

[0017] Em outro aspecto, a transferência adotiva de células compreende a administração de células T que expressam receptor de antígeno quimérico (células T CAR), células T com receptor de célula T (TCR) modificado, linfócitos infiltrantes no tumor (TIL), células natural killer com receptor de antígeno quimérico (CAR) modificado ou células dendríticas, ou qualquer combinação destas. Em um aspecto relacionado, o anticorpo monoclonal é selecionado de um grupo que compreende: anticorpos anti-CD3, anti-CD52, anti-PD1, anti-PD-L1, anti-CTLA4, anti-CD20, anti-BCMA, anticorpos biespecíficos, ou anticorpos biespecíficos de engajamento de célula T (BiTE), ou qualquer combinação destes. Em um aspecto relacionado, as citocinas são selecionadas de um grupo que compreende: IFNα, IFNβ, IFNγ, IFNλ, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21, IL-11, IL-12, IL-18, GM-CSF, TNFα, ou qualquer combinação destas.

[0018] Em outro aspecto, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende a redução da concentração de pelo menos um fator associado à inflamação no soro, líquido tecidual ou no LCR do indivíduo. Em um aspecto relacionado, o fator associado à inflamação é selecionado de um grupo que compreende: proteína C-reativa, GM-CSF, IL-1, IL-2, sIL2Rα, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IP10, IL-15, MCP-1 (também conhecida como CCL2), MIG, MIP1β, IFNγ, CX3CR1 ou TNFα, ou qualquer combinação destes. Em outro aspecto, a administração de antagonista de GM-CSF recombinante não reduz a eficácia da referida imunoterapia. Em outro aspecto, a administração de antagonista de GM-CSF recombinante aumenta a eficácia da referida imunoterapia. Em outro aspecto, a administração de antagonista de GM-CSF recombinante ocorre antes, concomitantemente ou depois da imunoterapia. Em um aspecto relacionado, o antagonista de GM-CSF recombinante é co- administrado com corticosteróides, anticorpos anti-IL-6, tocilizumab, anticorpos anti-IL-1, ciclosporina, antiepilépticos, benzodiazepinas, acetazolamida, terapia de hiperventilação ou terapia hiperosmolar, ou qualquer combinação destes.

[0019] Em outro aspecto, a toxicidade relacionada à imunoterapia compreende uma doença, dano ou mau funcionamento cerebral. Em um aspecto relacionado, a doença,

dano ou mau funcionamento cerebral compreende NT relacionada à célula CAR-T ou síndrome de encefalopatia relacionada à célula CAR-T (CRES). Em um aspecto relacionado, a inibição ou redução da incidência de uma doença, dano ou mau funcionamento cerebral compreende a redução de dores de cabeça, delírio, ansiedade, tremor, atividade convulsiva, confusão, alterações na vigília, alucinações, disfasia, ataxia, apraxia, paralisia do nervo facial, fraqueza motora, convulsões, convulsões com EEG não convulsivo, níveis alterado de consciência, coma, ativação endotelial, extravasamento vascular, coagulação intravascular, ou qualquer combinação destes no indivíduo. Em outro aspecto, a toxicidade relacionada à imunoterapia compreende Síndrome de Liberação de Citocinas (CRS) induzida por CAR-T. Em um aspecto relacionado, a inibição ou redução da incidência de CRS compreende a redução de ou inibição de, sem limitação, febre alta, mialgia, náuseas, hipotensão, hipóxia ou choque, ou uma combinação destes. Em um aspecto relacionado, a toxicidade relacionada à imunoterapia é potencialmente fatal.

[0020] Em outro aspecto, a concentração sérica de ANG2 ou VWF, ou a proporção de ANG2:ANG1 no soro do indivíduo é reduzida. Em um aspecto relacionado, o indivíduo possui uma temperatura corporal acima de 38°C, uma concentração sérica de IL-6 > 16 pg/ml, ou uma concentração sérica de MCP-1 acima de 1.300 pg/ml durante as primeiras 36 horas após infusão das referidas células CAR-T. Em um aspecto relacionado, o indivíduo está predisposto para ter a referida doença, dano ou mau funcionamento cerebral. Em um aspecto relacionado, o indivíduo possui uma proporção de ANG2:ANG1 no soro acima de

1 antes da infusão das referidas células CAR-T.

[0021] Em outro aspecto, a toxicidade relacionada à imunoterapia compreende linfohistiocitose hemofagocítica (HLH) ou síndrome de ativação de macrófagos (MAS). Em um aspecto relacionado, a inibição ou redução da incidência de HLH ou MAS compreende o aumento do tempo de sobrevida e/ou do tempo até recidiva, redução da ativação de macrófagos, redução da ativação de células T, redução da concentração de IFNγ na circulação periférica, ou redução da concentração de GM-CSF na circulação periférica, ou qualquer combinação destes.

[0022] Em outro aspecto, o indivíduo se apresenta com febre, esplenomegalia, citopenias que envolvem duas ou mais linhagens, hipertrigliceridemia, hipofibrinogenemia, hemofagocitose, atividade de célula NK baixa ou ausente, concentração sérica de ferritina acima de 500 U/ml, ou concentração sérica de CD25 solúvel acima de 2.400 U/ml, ou qualquer combinação destes. Em um aspecto relacionado, o indivíduo está predisposto para adquirir HLH ou MAS. Em um aspecto relacionado, o indivíduo carrega uma mutação em um gene selecionado de: PRF1, UNC13D, STX11, STXBP2 ou RAB27A, ou possui expressão reduzida de perforina, ou qualquer combinação destes.

[0023] Em uma modalidade, o antagonista de GM-CSF é um anticorpo anti-hGM-CSF. Em outra modalidade, o anticorpo anti-hGM-CSF bloqueia a ligação de hGM-CSF à subunidade alfa do receptor de hGM-CSF. Em outra modalidade, o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo policlonal. Em outra modalidade, o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo monoclonal. Em outra modalidade, o anticorpo anti-hGM-CSF é um fragmento de anticorpo que é um Fab, um Fab', um F(ab')2, um scFv ou um dAB.

Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal anti- hGM-CSF, o Fv de cadeia única e o Fab podem ser gerados na galinha; anticorpos IgY de galinha são equivalentes aviários de anticorpos IgG de mamíferos (Park e cols., Biotechnology Letters (2005) 27: 289-295; Finley e cols., Appl.

Environ.

Microbiol., maio de 2006, páginas 3.343–3.349). Anticorpos IgY de galinha possuem as seguintes vantagens: avidez maior, ou seja, força de ligação global entre um anticorpo e um antígeno, maior especificidade (menos reatividade cruzada com proteínas de mamíferos que não o imunógeno); alto rendimento na gema do ovo, e background menor (a diferença estrutural na região Fc de IgY e IgG resulta em menos coloração falsa-positiva). Em outra modalidade, o anticorpo anti-hGM-CSF pode ser de camelídeo, por exemplo, um domínio variável único derivado DE lhama em anticorpos de cadeia pesada desprovidos de cadeias leves (também denominados sdAbs, VHHs e Nanobodies®); o domínio VHH (cerca de 15 kDa) é o menor sítio de reconhecimento de antígeno conhecido que ocorre em mamíferos que possui capacidade e afinidades de ligação plenas (equivalentes aos anticorpos convencionais) (Garaicoechea e cols. (2015) PLoS ONE 10(8): e0133665; Arbabi-Ghahroudi M. (2017) Front.

Immunol. 8:1589; Wu e cols., Translational Oncology (2018) 11, 366–373). Em outra modalidade, o fragmento de anticorpo é conjugado a polietileno glicol.

Em outra modalidade, o anticorpo anti- hGM-CSF possui uma afinidade que varia de cerca de 5 pM até cerca de 50 pM.

Em outra modalidade, o anticorpo anti-hGM- CSF é um anticorpo neutralizante.

Em outra modalidade, o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo recombinante ou quimérico. Em outra modalidade, o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo humano. Em outra modalidade, o anticorpo anti- hGM-CSF compreende uma região variável humana. Em outra modalidade, o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região variável humana modificada geneticamente. Em outra modalidade o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região variável humanizada. Em outra modalidade, o anticorpo anti- hGM-CSF compreende uma região variável humana modificada geneticamente. Em outra modalidade o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região variável humanizada.

[0024] Em uma modalidade, o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região constante da cadeia leve humana. Em outra modalidade, o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região constante da cadeia pesada humana. Em outra modalidade, a região constante da cadeia pesada humana é uma cadeia gama. Em outra modalidade, o anticorpo anti-hGM-CSF se liga ao mesmo epitopo que o anticorpo quimérico 19/2. Em outra modalidade, o anticorpo anti-hGM-CSF compreende a CDR3 da região VH e CDR3 da região VL do anticorpo quimérico 19/2. Em outra modalidade, o anticorpo anti-GM-CSF compreende as CDR1, CDR2 e CDR3 da região VH e da região VL do anticorpo quimérico 19/2.

[0025] Em uma modalidade, o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende um determinante de especificidade de ligação à CDR3 RQRFPY ou RDRFPY, um segmento-J e um segmento-V, em que o segmento-J compreende pelo menos 95% de identidade para JH4 humano (YFDYWGQGTLVTVSS) e o segmento-V compreende pelo menos 90% de identidade para uma sequência VH1 1-02 ou VH1 1-03 da linhagem germinativa humana; ou uma região variável da cadeia pesada que compreende um determinante de especificidade de ligação à CDR3 que compreende RQRFPY. Em outra modalidade, o segmento-J compreende YFDYWGQGTLVTVSS. Em outra modalidade, a CDR3 compreende RQRFPYYFDY ou RDRFPYYFDY. Em outra modalidade, a CDR1 ou CDR2 da região variável da cadeia pesada pode ser uma sequência VH1 da linhagem germinativa humana; ou tanto a CDR1 quanto a CDR2 podem ser VH1 da linhagem germinativa humana. Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma CDR1 ou CDR2 da região variável da cadeia pesada, ou tanto CDR1 quanto CDR2, como mostrado em uma região VH apresentada na Figura 1. Em outra modalidade, o anticorpo anti-hGM-CSF possui um segmento-V que possui uma sequência do segmento-V de VH mostrada na Figura 1. Em outra modalidade, a VH que possui a sequência de VH#1, VH#2, VH#3, VH#4 ou VH#5 apresentada na Figura 1.

[0026] Em outra modalidade, o anticorpo anti-hGM-CSF, por exemplo, que possui uma região variável da cadeia pesada como descrito no parágrafo acima, compreende uma região variável da cadeia leve que compreende um determinante de especificidade de ligação à CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos FNK ou FNR.

[0027] Em outra modalidade, o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região VL que compreende uma CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos FNK ou FNR. Em uma modalidade, o anticorpo anti-GM-CSF compreende uma região JK4 da linhagem germinativa humana. Em outra modalidade, a CDR3 da região VL do anticorpo compreende QQFN(K/R)SPLT. Em outra modalidade, o anticorpo anti-GM-CSF compreende uma região VL que compreende uma CDR3 que compreende QQFNKSPLT. Em outra modalidade, a região VL compreende uma CDR1 ou uma

CDR2, ou tanto uma CDR1 quanto uma CDR2, de uma região VL mostrada na Figura 1. Em outra modalidade, a região VL compreende um segmento-V que possui pelo menos 95% de identidade para a sequência do segmento-V VKIIIA27 como mostrada na Figura 1. Em outra modalidade, a região VL possui a sequência de VK#1, VK#2, VK#3 ou VK#4 apresentada na Figura

1.

[0028] Em uma modalidade, o anticorpo anti-hGM-CSF possui um determinante de especificidade de ligação à CDR3 da região VH RQRFPY ou RDRFPY e uma região VL que possui uma CDR3 que compreende QQFNKSPLT. Em outra modalidade, o anticorpo anti- hGM-CSF possui uma sequência da região VH apresentada na Figura 1 e uma sequência da região VL apresentada na Figura

1. Em outra modalidade, as sequências de aminoácidos da região VH ou da região VL, ou tanto da região VH quanto da região VL compreendem uma metionina no terminal-N. Em outra modalidade, o antagonista de GM-CSF é selecionado do grupo que compreende um anticorpo anti-receptor de hGM-CSF ou subunidade do receptor ou um receptor de GM-CSF solúvel, um mimético de anticorpo de citocromo b562, um análogo do peptídeo hGM-CSF, uma adnectina, um mimético de anticorpo de arcabouço de lipocalina, um mimético de anticorpo de calixareno e um peptidomimético de ligação do tipo anticorpo.

[0029] Em uma modalidade, é revelado nesse relatório descritivo um método de aumento da eficácia de imunoterapia com CAR-T em um indivíduo, o método compreendendo uma etapa de administração de um antagonista de hGM-CSF recombinante ao indivíduo, em que a referida administração aumenta a eficácia de imunoterapia com CAR-T no referido indivíduo. Em outra modalidade, a referida administração de um antagonista de hGM-CSF recombinante ocorre antes, concomitantemente ou depois da referida imunoterapia com CAR-T. Em outra modalidade, a referida eficácia aumentada compreende expansão aumentada de células CAR-T, número reduzido de células supressoras derivadas do sistema mielóide (MDSC) que inibem a função de célula T, sinergia com um inibidor do ponto de verificação, ou qualquer combinação destes. Em outra modalidade, a referida expansão aumentada de células CAR-T compreende pelo menos um aumento de 50% comparado com um controle. Em outra modalidade, a referida expansão aumentada de células CAR-T compreende pelo menos uma expansão de log de um quarto, comparada com um controle. Em outra modalidade, a referida expansão aumentada de células compreende pelo menos uma expansão de log de metade, comparada com um controle. Em outra modalidade, a referida expansão aumentada de células compreende pelo menos uma expansão de um log, comparada com um controle. Em outra modalidade, a referida expansão aumentada de células compreende uma expansão maior do que de um log, comparada com um controle.

[0030] Em uma modalidade, o antagonista de hGM-CSF compreende um anticorpo neutralizante. Em outra modalidade, o anticorpo neutralizante é um anticorpo monoclonal.

[0031] Em uma modalidade, é revelado nesse relatório descritivo um método de inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à CAR-T em um indivíduo, o método compreendendo uma etapa de administração de um antagonista de hGM-CSF recombinante ao indivíduo, em que a referida administração inibe ou reduz a incidência ou a severidade da toxicidade relacionada à CAR-T no referido indivíduo. Em uma modalidade, a referida toxicidade relacionada à CAR-T compreende NT, CRS, ou uma combinação destes. Em uma modalidade, os métodos terapêuticos fornecidos nesse relatório descritivo evitam e tratam CRS uma NT em um indivíduo necessitado. Em algumas modalidades, a NT relacionada à célula CAR-T é reduzida por cerca de 50%, comparada com uma redução na NT em um indivíduo tratado com células CAR-T e um anticorpo de controle. Em várias modalidades, o antagonista de hGM-CSF recombinante é um anticorpo neutralizante de hGM-CSF de acordo com modalidades descritas nesse relatório descritivo.

[0032] Em outra modalidade, a referida inibição ou redução da incidência de CRS compreende o aumento do tempo de sobrevida e/ou do tempo até recidiva, redução da ativação de macrófagos, redução da ativação de células T, ou redução da concentração de hGM-CSF circulante, ou qualquer combinação destes. Em outra modalidade, o referido indivíduo se apresenta com febre (com ou sem calafrios, mal-estar, fadiga, anorexia, mialgia, artralgia, náuseas, vômitos, dor de cabeça, erupção cutânea, diarréia, taquipnéia, hipoxemia, hipóxia, choque, taquicardia cardiovascular, pressão do pulso ampliada, hipotensão, extravasamento capilar, débito cardíaco inicial aumentado, débito cardíaco tardio diminuído, dímero-D elevado, hipofibrinogenemia com ou sem sangramento, azotemia, transaminite, hiperbilirrubinemia, alterações do estado mental, confusão, delírio, afasia franca, alucinações, tremor, dismetria, marcha alterada, convulsões, falência de órgãos, ou qualquer combinação destes.

[0033] Em outra modalidade, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à CAR-

T compreende a prevenção do surgimento de toxicidade relacionada à CAR-T.

[0034] Em outra modalidade, é revelado nesse relatório descritivo um método de bloqueio ou redução da expressão de GM-CSF em uma célula, que compreende o knocking-out ou o silenciamento da expressão gênica de GM-CSF em uma célula. Em uma modalidade, o bloqueio ou redução da expressão de GM- CSF compreende RNA interferente curto (siRNA), CRISPR, RNAi, interferência de RNA DNA-dirigida (ddRNAi), que é uma técnica de silenciamento gênico que usa construções de DNA para ativar as vias endógenas de interferência de RNA (RNAi) de uma célula animal, ou edição direcionada do genoma com nucleases efetoras modificadas geneticamente do tipo ativadoras da transcrição (TALENs), ou seja, proteínas artificiais compostas por um domínio de ligação ao DNA sequência-específico customizável fundido a uma nuclease que cliva DNA de uma forma não-sequência-específica (Joung e Sander, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., janeiro de 2013; 14 (1): 49–55), que é incorporado nesse relatório descritivo em sua totalidade por referência. Em uma modalidade, a célula é uma célula CAR-T.

[0035] Em uma modalidade, o indivíduo é um humano.

[0036] Em uma modalidade, é revelado nesse relatório descritivo um antagonista de hGM-CSF para uso em um método de inibição ou redução da incidência ou severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia em um indivíduo, o método compreendendo uma etapa de administração de um antagonista de hGM-CSF recombinante ao indivíduo. Em uma modalidade, é revelada nesse relatório descritivo uma composição farmacêutica que compreende um antagonista anti-

hGM-CSF.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0037] A Figura 1 fornece sequências VH e VL exemplares de anticorpos anti-GM-CSF.

[0038] As Figuras 2A-2B ilustra a ligação de GM-CSF ao Ab1 (Figura 2A) ou Ab2 (Figura 2B) determinadas por análise por ressonância de plásmon de superfície a 37°C (Biacore 3000). Ab1 e Ab2 foram capturados em anticorpos policlonais anti-Fab imobilizados no chip Biacore. Diferentes concentrações de GM-CSF foram injetadas sobre a superfície, como indicado. Análise de ajuste global foi realizada pressupondo uma interação 1:1 usando o software Scrubber2.

[0039] As Figuras 3A-3B ilustram a ligação de Ab1 e Ab2 ao GM-CSF glicosilado (Figura 3A) e não glicosilado (Figura 3B). A ligação ao GM-CSF glicosilado expresso por células 293 humanas ou GM-CSF não glicosilado expresso em E. coli foi determinada por ELISA. Resultados representativos de um único experimento são mostrados (exp 1). Diluições de duas vezes de Ab1 e Ab2 partindo de 1.500 ng/ml foram aplicadas a poços revestidos com GM-CSF. Cada ponto representa média ± erro-padrão para determinações em triplicata. O ajuste da curva sigmóide foi realizado usando o Software Prism 5.0 (Graphpad).

[0040] As Figuras 4A-4B ilustra ELISA de competição que demonstra ligação de Ab1 e Ab2 a um epitopo compartilhado. Placas de ELISA revestidas com 50 ng/poço de GM-CSF recombinante foram incubadas com várias concentrações de anticorpo (Ab2, Ab1 ou anticorpo de controle de isótipo) junto com 50 nM de Ab2 biotinilado. A ligação ao anticorpo biotinilado foi avaliada usando conjugado neutravidina-HRP.

CA competição pela ligação ao GM-CSF foi por 1 hora (Figura 4A) ou por 18 horas (Figura 4B). Cada ponto representa média ± erro-padrão para determinações em triplicata. O ajuste da curva sigmóide foi realizado usando o Software Prism 5.0 (Graphpad).

[0041] A Figura 5 ilustra a inibição de expressão de IL- 8 induzida por GM-CSF. Várias quantidades de cada anticorpo foram incubadas com 0,5 ng/ml de GM-CSF e incubadas com células U937 por 16 horas. IL-8 secretada no sobrenadante da cultura foi determinada por ELISA.

[0042] A Figura 6 ilustra a inibição dose-dependente de CD11b estimulado por GM-CSF em granulócitos humanos por anticorpo anti-GM-CSF.

[0043] A Figura 7 ilustra a inibição dose-dependente de HLA-DR induzida por GM-CSF em monócitos/macrófagos primários humanos CD14+ por anticorpo anti-GM-CSF.

[0044] A Figura 8 ilustra o psímiol de GM-CSF (Fator Inflamatório Mielóide) como uma citocina crucial na atividade relacionada à CAR-T e na estimulação de proliferação de células sanguíneas brancas, que é um traço característico em certas leucemias, por exemplo, leucemia mielóide aguda (AML).

[0045] A Figura 9 ilustra a inibição de proliferação de células TF-1 humanas GM-CSF-dependente (eritroleucemia humana) por neutralização de GM-CSF humano com anticorpo anti-GM-CSF. KB003 é um anticorpo monoclonal recombinante projetado para visar e neutralizar GM-CSF humano. KB002 é um anticorpo monoclonal quimérico camundongo/humano que visa e neutraliza hGM-CSF.

[0046] A Figura 10 é uma representação de um receptor de antígeno quimérico.

[0047] A Figura 11 ilustra que a terapia com CAR-T19 resulta em taxas de resposta elevadas em ALL refratária recidivada. Os dados mostram desfechos históricos em ALL R/R e desfechos em ALL R/R após terapia com CAR-T19 (Maude, e cols. NEJM 2014).

[0048] A Figura 12 ilustra evidências que mostram uma ligação de GM-CSF significante com NT. Os níveis de GM-CSF se correlacionam com efeitos adversos sérios após terapia com células CAR-T. Os níveis de GM-CSF precedem e modulam outras citocinas além da IL-15. GM-CSF elevado está claramente associado com NT ≥ grau 3. IL-2 é símionas outra citocina com essa associação.

[0049] A Figura 13 ilustra uma evolução temporal estimada de CRS e NT após terapia com células CAR-T CD19. O momento do surgimento dos sintomas e da severidade da CRS depende do agente de indução, tipo de câncer, idade do paciente, e da magnitude da ativação de células imunes. O surgimento dos sintomas de CRS relacionada à CAR-T tipicamente ocorre dias até ocasionalmente semanas após a infusão de células T, coincidindo com expansão máxima de células T. Similar à CRS associada com terapia com mAb, a CRS associada com terapias adotivas de células T foi associada consistentemente com IFNγ, IL-6, TNFα, IL-1, IL-2, IL-6, GM-CSF, IL-10, IL-8 e IL-5 elevadas. Não existe nenhum relacionamento claro de dose-resposta de células CAR-T para CRS, mas doses muito altas de células T podem resultar em surgimento precoce de sintomas.

[0050] A Figura 14 ilustra que GM-CSF é um iniciador- chave dos efeitos adversos de CAR-T. A figura retrata o psímiol central de GM-CSF em CRS e NT. Perforina permite que granzimas penetrem na membrana da célula tumoral. GM-CSF produzido por CAR-T recruta células mielóides CCR2+ para o local do tumor, que produzem CCL2 (MCP1). CCL2 reforça positivamente sua própria produção por recrutamento de células mielóides CCR2+. IL-1 e IL-6 das células mielóides formam outra alça de feedback positivo com CAR-T por indução da produção de GM-CSF. Fosfatidil-serina é exposta como resultado da destruição da membrana celular por perforina e granzima. Fosfatidil-serina estimula a produção por células mielóides de CCL2, IL-1, IL-6, e outros efetores inflamatórios. O desfecho final dessa alça de feedback de auto-reforço resulta em ativação endotelial, permeabilidade vascular e, por fim, CRS e NT. Além disso, evidências em modelo animal mostram que camundongos com knockout de GM-CSF não exibem sinais de CRS, mas camundongos com knockout de IL-6 ainda podem desenvolver CRS. O k/o do receptor de GM- CSF por células mielóides CCR2+ anula a cascata em modelos de neuroinflamação (Sentman, e cols., J. Immunol.; Coxford, e cols. Immunity 2015 (43) 510-514; Ishii e cols., Blood 2016 128: 3.358; Teachey, e cols. Cancer Discov. 6 de junho de 2016 (6): 664-679; Lee, e cols., Blood 2016 124: 2: 188; Barrett, e cols., Blood 2016: 128-654, cada um deles incorporado em sua totalidade nesse relatório descritivo por referência).

[0051] As Figuras 15a-15g ilustram que células T com knockout de GM-CSF CRISPR exibem expressão reduzida de GM- CSF, mas níveis similares de outras citocinas e degranulação. a. Geração de CAR-Ts com knockout de GM-CSF (veja o Exemplo 6).

[0052] As Figuras 16a-16i ilustram que o anticorpo neutralizante de GM-CSF de acordo com modalidades descritas nesse relatório descritivo não inibe morte mediada por CAR- T, proliferação ou produção de citocina, mas neutraliza com sucesso GM-CSF (veja o Exemplo 7).

[0053] As Figuras 17a-17b ilustram o protocolo e resultados de um modelo em camundongo de CRS humana (Exemplo 5).

[0054] As Figuras 18a-18c ilustram a eficácia de CAR-T em um modelo de xenoenxerto em combinação com um anticorpo neutralizante de GM-CSF de acordo com modalidades descritas nesse relatório descritivo. Foi demonstrado que o anticorpo neutralizante de GM-CSF não inibe a eficácia de CAR-T in vivo (veja o Exemplo 8).

[0055] A Figura 19 ilustra dados pré-clínicos in vitro e in vivo que mostram que um anticorpo neutralizante de GM-CSF de acordo com modalidades descritas nesse relatório descritivo não prejudicou o impacto de CAR-T sobre a sobrevida. O anticorpo neutralizante de GM-CSF não impede função de célula CAR-T in vivo na ausência de PBMCs. A sobrevida foi similar para CAR-T + controle e CAR-T + anticorpo neutralizante de GM-CSF (veja o Exemplo 9).

[0056] As Figuras 20a-20b ilustram dados pré-clínicos in vitro e in vivo que mostram que um anticorpo neutralizante de GM-CSF de acordo com modalidades descritas nesse relatório descritivo aumenta a expansão de CAR-T. O anticorpo neutralizante de GM-CSF aumenta a morte de células de câncer por CAR-T in vitro. A neutralização por anticorpo de GM-CSF aumenta a proliferação de células CAR-T na presença de PBMCs. A proliferação de CAR-T foi aumentada pelo anticorpo neutralizante de GM-CSF na presença de PBMCs (ela não foi afetada sem PBMCs). O anticorpo anti-GM-CSF não inibiu a degranulação de CAR-T, produção intracelular de GM-CSF ou a produção de IL-2 (veja o Exemplo 10).

[0057] A Figura 21 ilustra que a expansão de CAR-T está associada com taxa de resposta global aumentada. AUC (área sob a curva) de CAR definida como níveis cumulativos de células CAR+/µl de sangue ao longo dos primeiros 28 dias pós-administração de CAR-T. Valores P calculados por teste de soma de ranques de Wilcoxon (Neelapu, e cols. ICML 2017 Resumo 8) (veja o Exemplo 11).

[0058] A Figura 22 ilustra um protocolo de estudo para anticorpo neutralizante de GM-CSF de acordo com modalidades descritas nesse relatório descritivo (veja o Exemplo 12). CRS e NT devem ser avaliadas diariamente enquanto hospitalizadas e na consulta clínica pelos primeiros 30 dias. Indivíduos elegíveis para receber anticorpo neutralizante de GM-CSF nos dias -1, +1 e +3 de tratamento com CAR-T. Dosagem adicional pode ser contemplada terminando pelo menos no dia

7. Avaliação do tumor a ser realizada no nível de base e nos meses 1, 3, 6, 9, 12, 18 e 24. Amostras de sangue (PBMC e soro) nos dias -5, -1, 0, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 21, 28, 90, 180, 270 e 360 (veja o Exemplo 12).

[0059] As Figuras 23A-24B ilustram que a depleção de GM- CSF aumenta a expansão de células CAR-T. A Fig. 23A ilustra uma expansão de células CAR-T GM-CSFk/o ex vivo aumentada, comparada com células CAR-T de controle. A Fig. 23B ilustra uma proliferação de células CAR-T mais robusta após tratamento com um anticorpo neutralizante de GM-CSF de acordo com modalidades descritas nesse relatório descritivo (veja o Exemplo 13).

[0060] A Figura 24 ilustra um perfil de segurança do anticorpo neutralizante de GM-CSF de acordo com modalidades descritas nesse relatório descritivo (veja o Exemplo 14).

[0061] As Figuras 25A-25D ilustram que o anticorpo neutralizante de GM-CSF quando adicionado à terapia com células CAR-T demonstra uma redução de 90% na neuroinflamação em modelo pré-clínico em camundongo. A Fig. 25A ilustra dados de MRI (hiperintensidade em T1 indicativa de BBB ruptura e neuroinflamação) nos quais cérebros de camundongos são protegidos de neuroinflamação após administração de células CAR-T e anticorpo neutralizante de GM-CSF de acordo com modalidades descritas nesse relatório descritivo, comparados com cérebros de camundongos que mostram sinais de neurotoxicidade após administração de células CAR-T e um anticorpo de controle (fileira superior) e comparados com cérebros de camundongos não tratados (nível de base) (fileira inferior). A Fig. 25B ilustra quantitativamente o aumento percentual de hiperintensidade em T1 desde o nível de base: houve um aumento percentual de aproximadamente 10% na hiperintensidade em T1 do cérebro desde o nível de base em camundongos administrados com CAR-T e anticorpo neutralizante de GM-CSF de acordo com modalidades descritas nesse relatório descritivo, comparado com o aumento ligeiramente acima de 100% em camundongos que receberam a administração de células CAR-T e anticorpo de controle. Como mostrado no gráfico comparativo, o aumento de aproximadamente 10% na hiperintensidade em T1 do cérebro desde o nível de base em camundongos administrados com a CAR-T e anticorpo neutralizante de GM-CSF é uma redução de

90% na neuroinflamação, como medida por hiperintensidade em T1 do cérebro desde o nível de base, comparada com a quantidade de neuroinflamação presente em camundongos que receberam células CAR-T e anticorpo de controle. As Figs. 25C-25D mostram que, comparados com camundongos não tratados (que tinham 500.000 a 1,5 M células leucêmicas) e CAR-T mais anticorpo de controle (que tinham entre 15.000 e 100.000 células leucêmicas), o tratamento com CAR-T mais anticorpo neutralizante de GM-CSF de acordo com modalidades descritas nesse relatório descritivo levou a uma redução significante no número de células leucêmicas (diminuídas até entre 500 e

5.000 células) com controle global da doença aumentado (veja o Exemplo 15).

[0062] As Figuras 26A-26I mostram que o bloqueio de GM- CSF ajuda a controlar toxicidades de CART19 e aumenta a eficácia. A Fig. 26A mostra que CART19 e CART19 tratada com Lenzilumab são igualmente eficazes em desfechos de sobrevida em um modelo de recidiva de NALM6 com carga tumoral elevada, comparado com UTD (células T não transduzidas) (7-8 camundongos por grupo, n=2). As Figs. 26B-26D mostram que CRS controlada por Lenzilumab e anticorpo anti-GM-CSF de camundongo induziu perda de peso, neutralizou GM-CSF humano sérico e reduziu a expressão de MCP-1 sérico de camundongo (proteína quimioatraente de monócitos-1) em um modelo de CART19 CRS/NT de xenoenxerto de ALL primária (3 camundongos por grupo, * p < 0,05). A Fig. 26E mostra que Lenzilumab e anticorpo anti-GM-CSF de camundongo reduziram inflamação cerebral, como mostrado por MRI em um modelo de CART19 CRS/NT de xenoenxerto de ALL primária (3 camundongos por grupo, * p < 0,05, ** p < 0,01). As Figs. 26F-26G mostram uma eficácia aumentada de camundongos tratados com CART19 + Lenzilumab, comparados com camundongos tratados com anticorpo anti-GM- CSF de camundongo, ou seja, CART19 + anticorpo anti-hGM-CSF, mostraram carga leucêmica no cérebro CD19+ reduzida e reduziram a percentagem de macrófagos do cérebro em um modelo de CART19 CRS/NT de xenoenxerto de ALL primária (3 camundongos por grupo). A Fig. 26H mostra que o K/O de CRISPR Cas9 de GM-CSF reduz sua expressão por meio de coloração intracelular em CART19 e UTD com estimulação de NALM6 (experimento representativo, n = 2). A Fig. 26I mostra que CART19 e CART19 com K/O de GM-CSF controlam a carga tumoral melhor do que UTD, e uma eficácia aumentada de células CART19 com K/O de GM/CSF que controla a carga tumoral ligeiramente melhor do que CART19 em um modelo de recidiva de NALM6 com carga tumoral elevada (6 camundongos por grupo, * p < 0,05, **** p < 0,0001). Barras de erro SEM.

[0063] As Figuras 27A-27D mostram que a neutralização de GM-CSF in vitro aumenta a proliferação de células CAR-T na presença de monócitos e não prejudica função efetora de células CAR-T. A Fig. 27A retrata graficamente neutralização por Lenzilumab (um anticorpo neutralizante de hGM-CSF) de hGM-CSF produzido por célula CAR-T in vitro, comparado com tratamento com controle de isótipo, como testado por multiplex após 3 dias de cultura com CART19 em meio isoladamente ou CART19 cocultivada com NALM6, n = 2 experimentos, 2 réplicas por experimento, experimento representativo retratado, *** p < 0,001 entre tratamento com Lenzilumab e com controle de isótipo, teste t, média ± SEM. A Fig. 27B mostra graficamente que o tratamento com anticorpo neutralizante de hGM-CSF não inibiu a habilidade de células

CAR-T para proliferar, como testado por ensaio de proliferação de CSFE por citometria de fluxo de células CD3 vivas, n = 3 doadores, 2 réplicas por doador, experimento representativo no ponto do tempo de 3 dias retratado, ns p > 0,05 entre tratamento com Lenzilumab e com controle de isótipo, teste t, média ± SEM. Isoladamente: CART19 em meio isoladamente, MOLM13: CART19+MOLM13, PMA/ION: CART19 mais 5 ng/ml de PMA e 0,1 µg/ml de ION, NALM6: CART19+NALM6. A Fig. 27C retrata graficamente o aumento por Lenzilumab da proliferação de CART19 por neutralização de hGM-CSF, comparado com controle de isótipo tratado com CART19 quando cocultivada com monócitos humanos, n = 3 doadores no ponto do tempo de 3 dias, 2 réplicas por doador, **** p < 0,0001, média ± SEM. A Fig. 27D mostra graficamente que o tratamento com Lenzilumab não inibiu a citotoxicidade de CART19 ou células T não transduzidas (UTD), quando cultivadas com NALM6, n = 3 doadores, 2 réplicas por doador, experimento representativo no ponto do tempo de 48 horas retratado, ns p > 0,05 entre tratamento com Lenzilumab e com controle de isótipo, teste t, média ± SEM.

[0064] As Figuras 28A-28F demonstram que a neutralização de GM-CSF in vivo aumenta a atividade antitumoral de célula CAR-T (ou seja, morte da célula tumoral) em modelos de xenoenxerto. A Fig. 28 A ilustra os esquemas experimentais: camundongos NSG foram injetadas com a linhagem de célula CD19+ luciferase+ NALM6 (1 x 106 células por camundongo I.V). Quatro a seis dias mais tarde, os camundongos foram submetidos a exames de imagem, randomizados, e receberam 1- 1,5 x 106 CAR-T19 ou número equivalente de células totais de células UTD de controle no dia seguinte com Lenzilumab ou

IgG de controle (10 mg/kg, dada IP diariamente por 10 dias, começando no dia da injeção de CAR-T). Os camundongos foram acompanhados com imageamento serial por bioluminescência para avaliar a carga de doença começando no dia 7 pós-injeção de células CAR-T e foram acompanhados para sobrevida global.

O sangramento da veia da cauda foi realizado 7-8 dias após injeção de células CAR-T.

A Fig. 28B retrata a neutralização por Lenzilumab de hGMCSF sérico produzido por CAR-T in vivo, comparado com tratamento com controle de isótipo, como testado por Singleplex de hGM-CSF, n = 2 experimentos, 7-8 camundongos por grupo, experimento representativo, soro do dia 8 pós-injeção de células CAR-T/UTD, *** p < 0,001 entre tratamento com Lenzilumab e com controle de isótipo, teste t, média ± SEM.

A Fig. 28C retrata graficamente que CAR-Ts tratadas com Lenzilumab in vivo são igualmente eficazes no controle da carga tumoral, comparadas com CAR-Ts tratadas com controle de isótipo em um modelo de xenoenxerto de recidiva de ALL com carga tumoral elevada, dia 7 pós-injeção de CAR-T, n = 2 experimentos, 7-8 camundongos por grupo, experimento representativo retratado, *** p < 0,001, * p < 0,05, ns p > 0,05, teste t, média ± SEM.

A Fig. 28 D retrata imagens do camundongo da Fig. 28C.

A Fig. 28E ilustra os esquemas experimentais: camundongos NSG foram injetadas com os blastos derivados de pacientes com ALL (1 x 106 células por camundongo I.V). Os camundongos foram sangrados serialmente e, quando as células CD19+ > 1/µl, os camundongos foram randomizados para receber 2,5 x 106 CART19 com Lenzilumab ou IgG de controle (10 mg/kg, dados IP diariamente por 10 dias, começando no dia da injeção de CAR-T). Os camundongos foram acompanhados com sangramento serial da veia da cauda para avaliar a carga de doença começando dia 14 pós-injeção de células CAR-T e foram acompanhados para sobrevida global. A Fig. 28F retrata graficamente que o tratamento com Lenzilumab com terapia com CAR-T resulta em controle mais sustentado da carga tumoral ao longo do tempo em um modelo de xenoenxerto de leucemia linfoblástica aguda (ALL) primária, comparado com tratamento com controle de isótipo com terapia com CAR-T, 6 camundongos por grupo, ** p < 0,01, * p < 0,05, ns p > 0,05, teste t, média ± SEM.

[0065] As Figuras 29A-29E demonstram que células CAR-T com knockout de GM-CSF CRISPR exibem expressão reduzida de GM-CSF, níveis similares de citocinas e quimiocinas cruciais, e atividade antitumoral aumentada. A Fig. 29A ilustra que a CART19 CRISPR Cas9 GM-CSFk/o exibe produção reduzida de GM-CSF, comparada com CART19 do tipo selvagem, mas a produção e degranulação de outra citocina não são inibidas pela ruptura do gene GM-CSF, CART19 e CART19 GM- CSFk/o estimuladas com NALM6, n = 3 experimentos, 2 réplicas por experimento, *** p < 0,001, * p < 0,05, ns p > 0,05 comparando CART19 GM-CSFk/o e CART19, teste t, média ± SEM. A Fig. 29B ilustra que CAR-T GM-CSFk/o possuem GM-CSF humano sérico reduzido in vivo, comparadas com tratamento com CAR- T, como testado por multiplex, 5-6 camundongos por grupo (4- 6 no momento do sangramento, 8 dias pós-injeção de células CAR-T), **** p < 0,0001, *** p < 0,001 entre CART19 GM-CSFk/o e CART19 do tipo selvagem, teste t, média ± SEM. A Fig. 29C ilustra que CART19 GM-CSFk/o in vivo aumenta a sobrevida global comparada com CART19 do tipo selvagem em um modelo de xenoenxerto de recidiva de ALL com carga tumoral elevada que utiliza uma linhagem de célula NALM6, 5-6 camundongos por grupo, ** p < 0,01, log-rank. As Figs. 29D-29E mostram citocinas e quimiocinas humanas (Fig. 29D) e de camundongo (Fig. 29E) de multiplex do soro, diferentes de hGM-CSF, não exibem diferenças estatísticas entre a CART19 GM-CSFk/o e CART19 do tipo selvagem, implicando ainda mais que citocinas e quimiocinas de células T críticas não são depletadas de forma adversa por redução da expressão de GM-CSF, 5-6 camundongos por grupo (4-6 no momento do sangramento), **** p < 0,0001, teste t.

[0066] As Figuras 30A-30D ilustram um modelo de xenoenxerto derivado de paciente para neuroinflamação e síndrome de liberação de citocinas. A Fig. 30A mostra os esquemas experimentais: Os camundongos receberam 1-3 x 106 blastos primários derivados do sangue periférico de pacientes com ALL primária. Os camundongos foram monitorados quanto ao enxerto por aproximadamente 10-13 semanas por meio de sangramento da veia da cauda. Quando células CD19+ no soro eram ≥ 10 células/µl, os camundongos receberam CART19 (2-5 x 106 células) e começaram terapia com anticorpo por um total de 10 dias, como indicado. Os camundongos foram pesados diariamente como uma medida de seu bem-estar. MRIs dos cérebros dos camundongos foram realizadas 5-6 dias pós- injeção de CART19 e sangramento da veia da cauda para análise de citocina/quimiocina e células T foi realizado 4-11 dias pós-injeção de CART19, 2 experimentos independentes. A Fig. 30B ilustra que uma combinação de neutralização de GM-CSF com CART19 é igualmente eficaz que anticorpos de controle de isótipo combinados com CART19 no controle da carga de CD19+ de células de ALL, experimento representativo, 3 camundongos por grupo, 11 dias pós-injeção de CART19, * p < 0,05 entre neutralização de GM-CSF + CART19 e controle de isótipo + CART19, teste t, média ± SEM. A Fig. 30C ilustra dados de MRI do cérebro que mostram que a terapia com CART19 exibe intensificação em T1, sugestiva de ruptura da barreira hematencefálica do cérebro e possível edema. Três camundongos por grupo, 5-6 dias pós-injeção de CART19, imagem representativa. A Fig. 30D ilustra xenoenxertos de ALL primária com carga tumoral elevada tratados com CART19 exibem infiltração de células CD3 humanas do cérebro, comparados com controles de PDX não tratados. Três camundongos por grupo, imagem representativa.

[0067] A Figura 31 mostra as vias canônicas alteradas em cérebros de xenoenxertos derivados de paciente após tratamento com células CART19. Caixas vermelhas indicam supra-regulação de genes em camundongos tratados com CART19 mais controle de isótipo, comparados com os xenoenxertos derivados de paciente não tratados.

[0068] As Figuras 32A-32D demonstram que a neutralização de GM-CSF in vivo melhora CRS após terapia com CART19 em um modelo de xenoenxerto. A Fig. 32A mostra que Lenzilumab e anticorpo anti-GM-CSF de camundongo evitam a perda de peso induzida por CRS, comparados com camundongos tratados com CART19 e anticorpos de controle de isótipo, 3 camundongos por grupo, Anova de Duas Vias, média ± SEM. A Fig. 32B mostra que GM-CSF humano era neutralizado em xenoenxertos derivados de paciente tratados com Lenzilumab e anticorpo neutralizante de GM-CSF de camundongo, 3 camundongos por grupo, *** p < 0,001, * p < 0,05, teste t, média ± SEM. A Fig. 32C mostra o mapa de calor de citocina/quimiocina humana (soro coletado 11 dias após injeção de CART19) que exibe aumentos em citocinas e quimiocinas típicos de CRS após tratamento com CART19. A neutralização de GMCSF resulta em uma diminuição significante em várias citocinas e quimiocinas, comparados com camundongos tratados com CART19 e anticorpos de controle de isótipo, incluindo várias citocinas e quimiocinas associadas ao sistema mielóide, como indicado no painel, 3 camundongos por grupo, soro do dia 11 pós-injeção de CART19, *** p < 0,001, ** p < 0,01, * p < 0,05, que compara camundongos tratados com anticorpo neutralizante de GM-CSF e camundongos tratados com controle de isótipo que receberam terapia com células CAR-T, teste t. A Fig. 32D mostra o mapa de calor de citocina/quimiocina de camundongo (soro coletado 11 dias após injeção de CART19) que exibe aumento em citocinas e quimiocinas de camundongo típico de CRS após tratamento com CART19. A neutralização de GM-CSF resulta em uma diminuição significante em várias citocinas e quimiocinas, comparado com o tratamento com CART19 com anticorpos de controle, incluindo várias citocinas e quimiocinas de diferenciação mielóide, como indicado no painel, 3 camundongos por grupo, soro do dia 11 pós-injeção de CART19, * p < 0,05, que compara camundongos tratados com anticorpo neutralizante de GM-CSF e camundongos tratados com controle de isótipo que receberam terapia com células CAR-T, teste t.

[0069] As Figuras 33A-33D demonstram que a neutralização de GM-CSF in vivo melhora a neuroinflamação após terapia com CART19 em um modelo de xenoenxerto. As Figs 33A-33B retratam MRI com hiperintensidade em T1 por gadolínio (mm cúbicos) mostrou que a neutralização de GM-CSF ajudou a reduzir a inflamação cerebral, ruptura da barreira hematencefálica, e possível edema, comparado com controle de isótipo; (A) imagens representativas, (33B) 3 camundongos por grupo, ** p < 0,01, * p < 0,05, ANOVA de Uma Via, média ± DP. A Fig. 33C mostra que células T CD3 humanas estavam presentes no cérebro após tratamento com terapia com CART19. A neutralização de GM-CSF resultou em uma tendência para infiltração diminuída de CD3 no cérebro, como testado por citometria de fluxo nos hemisférios cerebrais, 3 camundongos por grupo, média ± SEM. A Fig. 33D retrata macrófagos brilhantes CD11b+ estavam diminuídos nos cérebros de camundongos que recebem neutralização de GM-CSF durante terapia com CAR-T, comparado com controle de isótipo durante terapia com CAR-T, como testado por citometria de fluxo nos hemisférios cerebrais, 3 camundongos por grupo, média ± SEM.

[0070] As Figuras 34A-34B ilustram a geração de células CART19 GM-CSFk/o. A Fig. 34A mostra os esquemas experimentais; a Fig. 34B mostra a sequência de gRNA e sequências iniciadoras para a geração de CART19 GM-CSFk/o. Para gerar células CART19 GM-CSFk/o, gRNA foi clonado em um vetor de lentivírus Cas9 sob o controle de um promotor U6 e usado para produção de lentivírus. Células T derivadas de doadores normais foram estimuladas com microesferas de CD3/CD28 e transduzidas de forma dupla com vírus CAR19 e vírus CRISPR/Cas9 24 horas mais tarde. A remoção das microesferas magnéticas de CD3/CD28 foi realizada no Dia +6, e células CART19 GM-CSFk/o ou células CART19 de controle foram criopreservadas no Dia 8.

[0071] A Figura 35 mostra um fluxograma para procedimentos usados no sequenciamento de RNA. Os dados da base binária foram convertidos em Fastq usando o software

Bcl2fastq Illumina. As sequências adaptadoras foram removidas usando Trimmomatic, e FastQC foi usado para verificar a qualidade. Os últimos genomas humanos (GRCh38) e de camundongo (GRCm38) de referência foram baixados de NCBI. Arquivos de índice do genoma foram gerados usando STAR, e as leituras finais pareadas foram msímioadas para o genoma para cada condição. HTSeq foi usado para gerar contagens de expressão para cada gene, e DeSeq2 foi usado para calcular expressão diferencial. A ontologia gênica foi avaliada usando Enrichr.

[0072] A Figura 36 mostra que camundongos tratados com Lenzilumab mais célula CAR-T possuem sobrevida comparável, comparado com camundongos tratados com anticorpo de controle de isótipo mais célula CAR-T em um modelo de xenoenxerto de recidiva de ALL com carga tumoral elevada. n = 2 experimentos, 7-8 camundongos por grupo, experimento representativo retratado, **** p < 0,0001, *** p < 0,001, * p < 0,05, log-rank.

[0073] A Figura 37 mostra uma sequência TIDE representativa para verificar alteração do genoma nas células CAR-T com knockout de GM-CSF CRISPR Cas9. n = 2 experimentos, experimento representativo retratado.

[0074] A Figura 38 mostra que células CAR-T com knockout de GM-CSF in vivo mostram controle ligeiramente aumentado da carga tumoral, comparadas com células CAR-T do tipo selvagem em um modelo de xenoenxerto de recidiva de ALL com carga tumoral elevada. Dias pós-injeção de células CAR-T listados no eixo-x, 5-6 camundongos por grupo (2 permaneciam no grupo de UTD no dia 13), experimento representativo retratado, **** p < 0,0001, * p < 0,05, ANOVA de Duas Vias, média ±

SEM.

[0075] A Figura 39 demonstra um modelo de xenoenxerto derivado de paciente para neuroinflamação e CRS com tratamento e CART19+ anticorpo anti-hGM-CSF. Xenoenxertos de ALL primária com carga tumoral elevada tratados com tratamento com CART19 + anticorpo anti-hGM-CSF mostram infiltração de células CD3 humanas do cérebro (Figura 39), comparados com controles de PDX não tratados (Figura 30D). Três camundongos por grupo, imagem representativa.

[0076] As Figuras 40A-40B mostram que a integridade da BBB está preservada e a neuroinflamação é significantemente reduzida após terapia com CAR-T e Lenzilumab. A Fig. 40A mostra microscopia confocal que mostra claramente em imagens de alta resolução que, após terapia com CAR-T, a BBB está significantemente prejudicada e mostra manutenção da integridade da BBB com terapia com CAR-T e Lenzilumab. A Fig. 40B é adaptada de Santomasso, B.D., e cols., publicado Online Primeiro em 7 de junho de 2018; DOI (Identificador de Objeto Digital): 10.1158/2159-8290.CD-17-1319, e é incorporado por referência em sua totalidade, mostra níveis altos de proteína no LCR (como mostrado nos dados de Santomasso) é uma indicação de ruptura da BBB e extravasamento de proteína para dentro do SNC.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0077] O presente tema pode ser compreendido mais imediatamente por referência à descrição detalhada seguinte que forma uma parte dessa revelação. Deve ser subentendido que essa revelação não está limitada aos produtos, métodos, condições ou parâmetros específicos descritos e/ou mostrados nesse relatório descritivo, e que a terminologia usada nesse relatório descritivo tem o objetivo de descrever modalidades particulares símionas como exemplo e não visa ser limitante da revelação reivindicada. Toxicidade relacionada à imunoterapia

[0078] Aqueles habilitados na técnica compreenderiam que o termo “toxicidade relacionada à imunoterapia” se refere a um espectro de sintomas inflamatórios resultantes de níveis altos de ativação imune. Diferentes tipos de toxicidade estão associados com diferentes abordagens de imunoterapia. Em algumas modalidades, a toxicidade relacionada à imunoterapia compreende síndrome de extravasamento capilar, doença cardíaca, doença respiratória, síndrome de encefalopatia relacionada às células T-CAR (CRES), neurotoxicidade, colite, convulsões, síndrome de liberação de citocinas (CRS), tempestade de citocinas, fração de ejeção ventricular esquerda diminuída, diarréia, coagulação intravascular disseminada, edema, encefalopatia, exantema, sangramento gastrintestinal, perfuração gastrintestinal, linfohistiocitose hemofagocítica (HLH), hepatose, hipertensão, hipofisite, eventos adversos relacionados ao sistema imune, imunohepatite, imunodeficiências, isquemia, toxicidade hepática, síndrome de ativação de macrófagos (MAS), efusões pleurais, efusões pericárdicas, pneumonite, poliartrite, síndrome de encefalopatia posterior reversível (PRES), hipertensão pulmonar, tromboembolismo e transaminite.

[0079] Embora diferentes tipos de toxicidades difiram em sua fisiopatologia e manifestações clínicas, elas estão normalmente associadas a um aumento em fatores associados à inflamação, por exemplo, proteína C-reativa, GM-CSF, IL-1,

IL-2, sIL-2Rα, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IP10, IL-15, MCP-1 (também conhecida como CCL2), MIG, MIP-1β, IFNγ, CX3CR1 ou TNFα.

Aqueles habilitados na técnica compreenderiam que, em algumas modalidades, o termo “fator associado à inflamação” compreende moléculas, pequenas moléculas, peptídeos, transcritos gênicos, oligonucleotídeos, proteínas, hormônios e biomarcadores que são afetados durante a inflamação.

Aqueles habilitados na técnica compreenderiam que sistemas afetados durante a inflamação compreendem supra-regulação, infra-regulação, ativação, desativação, ou qualquer tipo de modificação molecular.

A concentração sérica de fatores associados à inflamação, por exemplo, citocinas, pode ser usada como um indicador de toxicidades relacionadas à imunoterapia, e pode ser expressa como razão de aumento, aumento percentual (%), aumento líquido ou taxa de alteração nos níveis ou concentração de citocina.

A concentração de fatores associados à inflamação em fluidos corporais diferentes do soro também pode ser usada como indicadores de toxicidades relacionadas à imunoterapia.

Em algumas modalidades, níveis ou concentrações absolutas de citocina acima de certo nível ou concentração podem ser uma indicação de um indivíduo que apresenta ou está prestes a apresentar uma toxicidade relacionada à imunoterapia.

Em outra modalidade, níveis ou concentrações absolutas de citocina em certo nível, por exemplo, um nível ou concentração normalmente encontrada em um indivíduo de controle, podem ser uma indicação de um método para inibição ou redução da incidência de uma toxicidade relacionada à imunoterapia em um indivíduo.

Aqueles habilitados na técnica compreenderiam que o termo “nível de citocina” pode englobar uma medição da concentração, uma medição da razão de alteração, uma medição da alteração percentual (%), ou uma medição da taxa de alteração. Além disso, os métodos para a medição de citocinas no sangue, líquido cefalorraquidiano (LCR), saliva, soro, urina e plasma são bem conhecidos na técnica.

[0080] Diversas abordagens foram elaboradas para classificar o tipo de neurotoxicidade e gerenciá-la de acordo. Essas classificações se baseiam em sintomas clínicos e biológicos, como febre, hipotensão, hipóxia, toxicidade a órgãos, disfunção cardíaca, disfunção respiratória, disfunção gastrintestinal, disfunção hepática, disfunção renal, coagulopatia, presença de convulsão, pressão intracraniana, tônus muscular, desempenho motor, níveis de ferritina e hematofagocitose. Similarmente, cada tipo de neurotoxicidade pode ser graduado de acordo com sua severidade. A Tabela 1A (retirada de “Cellular Therapy Implementation: the MDACC Approach”, P. Kebriaei, 24 de fevereiro de 2017) revela um método para a graduação de neurotoxicidade de acordo com sua severidade em Grau 1, Grau 2, Grau 3 e Grau 4. No entanto, alguns dos sintomas apresentados anteriormente não estão tipicamente associados à neurotoxicidade (Lee, e cols., Blood 2014; 124: 1.88-195, que é incorporado em sua totalidade nesse relatório descritivo por referência).

Tabela 1A: Método para a graduação de neurotoxicidade - Critérios para eventos adversos (CTCAE). Sintoma ou sinal Grau 1 Grau 2 Grau 3 Grau 4 Potencialmente fatal Sonolência necessitando de Nível de Torpor / moderada, Obtundação ou intervenção consciência sonolência leve limitando ADL estupor urgente ou instrumental ventilação mecânica Potencialmente fatal Desorientação Desorientação necessitando de Orientação / Desorientação moderada, severa, limitando de intervenção Confusão leve / confusão limitando ADL cuidados pessoais urgente ou instrumental ADL ventilação mecânica Limitação de Potencialmente ADL / Limitação leve Limitação cuidados pessoais fatal Encefalopatia de ADL instrumental ADL ADL necessitando de

Sintoma ou sinal Grau 1 Grau 2 Grau 3 Grau 4 intervenção urgente ou ventilação mecânica Disfasia receptiva Disfasia com ou expressiva Disfasia que déficit moderado severa, prejudicando não prejudica a na habilidade Fala a habilidade para - habilidade para para se ler, escrever ou se se comunicar comunicar comunicar de forma espontaneamente inteligível Potencialmente Convulsão breve Múltiplas fatal; parcial; sem Convulsão breve convulsões, símiosar Convulsão convulsões perda de generalizada de intervenção repetitivas consciência médica prolongadas Incontinente ou Incontinência fraqueza motora intestinal/urinária;

Sintoma ou sinal Grau 1 Grau 2 Grau 3 Grau 4 Fraqueza que limita cuidados pessoais ADL, incapacitante Crítico (obtundido; estado Grau de Severo (1-2), epiléptico neurotoxicidade papiledema grau 1 e convulsivo; pelo “MD Leve (7-9) Moderado (3-6) 2 com pressão de fraqueza motora, Anderson Cancer abertura do LCR (op) papiledema de Center” (MDACC) < 20 mm Hg grau 3, 4 e 5, de 10 pontos op do LCR ≥ 20 mm Hg, edema cerebral)

[0081] Pacientes com temperatura corporal acima de 38,9°C, concentração sérica de IL-6 acima de 16 pg/ml ou concentração sérica de MCP-1 (também conhecida como CCL2) acima de 1.343,5 pg/ml nas primeiras 36 horas após infusão da imunoterapia tinham probabilidades maiores de desenvolver neurotoxicidade severa (Gust, e cols. Cancer Discov. 12 de outubro de 2017).

[0082] CRS é uma condição séria e um efeito adverso potencialmente fatal por causa da regulação anormal de citocina e, dessa forma, inflamação severa. Sintomas podem incluir, sem limitação, febre, frequência cardíaca e respiração alteradas, náuseas, vômitos e convulsões. CRS pode ser graduada por avaliação de sintomas e suas severidades como, por exemplo: CRS de Grau 1: Febre, sintomas constitucionais; CRS de Grau 2: Hipotensão – responde a líquidos ou um pressor em dose baixa, Hipóxia - responde a O2 < 40%, toxicidade de órgãos; grau 2; CRS de Grau 3: Hipotensão – exige múltiplos pressores ou pressores em alta dose, Hipóxia– exige O2 ≥ 40%, Toxicidade de órgãos – grau 3, grau 4 transaminite; CRS de Grau 4: Ventilação mecânica, Toxicidade de órgãos – grau 4, excluindo transaminite (Lee, e cols., Blood 2014; 124: 188-195, que é incorporado em sua totalidade nesse relatório descritivo por referência).

[0083] CRES pode ser graduada, por exemplo, por combinação de avaliação neurológica com outros parâmetros como, por exemplo, papiledema, pressão de abertura do LCR, avaliação de imageamento, e a presença de convulsões e fraqueza motora. Um método para a graduação de CRES é descrito em Neelapu e cols., Nat. Rev. Clin. Oncol. 15 (1):47-62 (2018) (Epub. 19 de setembro de 2017), que é incorporado em sua totalidade nesse relatório descritivo por referência.

A Tabela 1B (rerirada de Neelapu e cols., Nat.

Rev.

Clin.

Oncol. 15 (1): 47-62 (2018)) revela um método para a graduação de CRES de acordo com sua severidade em Grau 1, Grau 2, Grau 3 e Grau 4.

Tabela 1B: Método para a graduação de CRES.

Em CARTOX-10, um ponto é atribuído para cada uma das seguintes tarefas realizadas corretamente: orientação para ano, mês, cidade, hospital e Presidente/Primeiro-Ministro do país de residência (1 ponto para cada); citar três objetos (1 ponto para cada); escrever uma frase-padrão; contar para trás de 100 em dezenas.

Sintoma ou sinal Grau 1 Grau 2 Grau 3 Grau 4 Paciente em condição Pontuação da crítica, e/ou 7–9 (deficiência 3–6 (deficiência 0–2 (deficiência avaliação obtundido e não leve) moderada) severa) (por CARTOX-10) pode realizada avaliação de tarefas Papiledema em Papiledema em Estágio 3–5, ou Pressão Estágio 1–2, ou pressão de intracraniana NA NA pressão de abertura do LCR elevada abertura do LCR ≥ 20 mmHg, ou < 20 mmHg edema cerebral

Sintoma ou sinal Grau 1 Grau 2 Grau 3 Grau 4 Convulsões Convulsão generalizadas, parcial, ou ou estado convulsões não Convulsões ou epiléptico NA NA convulsivas no fraqueza motora convulsivo ou EEG com resposta não convulsivo, à ou nova fraqueza benzodiazepina motora

[0084] As manifestações de NT, CRS e CRES podem incluir encefalopatia, dores de cabeça, delírio, ansiedade, tremor, atividade convulsiva, confusão, alterações na vigília, nível de consciência diminuído, alucinações, disfasia, afasia, ataxia, apraxia, paralisia do nervo facial, fraqueza motora, convulsões, convulsões com EEG não convulsivo, edema cerebral e coma. CRES está associada com concentrações elevadas de citocinas circulantes, como proteína C-reativa, GM-CSF, IL-1, IL-2, sIL2Rα, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IP10, IL-15, MCP-1, MIG, MIP1β, IFNγ, CX3CR1 e TNFα.

[0085] O gradiente de concentração de citocina entre soro e LCR observado em condições normais é reduzido ou perdido durante CRES. Adicionalmente, células T CAR e concentrações elevadas de proteína são observadas no LCR de pacientes e são correlacionadas com a severidade da condição. Tudo isso indica uma disfunção da barreira hematencefálica após imunoterapia. A permeabilidade vascular aumentada pode ser parcialmente explicada por concentrações aumentadas de ANG2 e proporção aumentada de ANG2:ANG1 em pacientes com neurotoxicidade. Embora ANG1 induza a quiescência da célula endotelial, ANG2 causa ativação da célula endotelial e permeabilidade microvascular. Foi relatado que pacientes com ativação endotelial aumentada antes da imunoterapia têm probabilidade maior de sofrerem neurotoxicidade (Gust, e cols. Cancer Discov., 12 de outubro de 2017).

[0086] A linfohistiocitose hemofagocítica (HLH) compreende hiperinflamação severa causada por proliferação descontrolada de linfócitos e macrófagos benignos que secretam quantidades elevadas de citocinas inflamatórias. Em algumas modalidades, HLH pode ser classificada como uma das síndromes de tempestade de citocinas. Em algumas modalidades, HLH ocorre após forte ativação imunológica, por exemplo, infecções sistêmicas, imunodeficiência, malignidades ou imunoterapia. Em algumas modalidades, o termo “HLH” pode ser usado de forma intercambiável com os termos “linfohistiocitose hemofagocítica”, “síndrome hemofagocítica”, ou “síndrome hemofagocítica”, todos tendo as mesmas qualidades e significados.

[0087] A HLH primária compreende um distúrbio autossômico recessivo heterogêneo. Pacientes com mutações homozigotas em um de vários genes exibem perda de função de proteínas envolvidas na exocitose do grânulo citolítico. Em algumas modalidades, HLH pode se apresentar na infância com fator desencadeante mínimo ou ausente. A HLH secundária, ou HLH adquirida, ocorre após forte ativação imunológica, como aquela que ocorre com infecção sistêmica, imunodeficiência, uma malignidade subjacente, ou imunoterapias. Ambas as formas de HLH são caracterizadas por uma ativação impressionante de linfócitos T e macrófagos normais, que leva invariavelmente a alterações clínicas e hematológicas e morte na ausência de tratamento.

[0088] Em algumas modalidades, HLH pode ser iniciada por infecções virais, EBV, CMV, parvovírus, HSV, VZV, HHV8, HIV, influenza, hepatite A, hepatite B, hepatite C, infecções bacterianas, bastonetes gram-negativos, espécies de Mycoplasma e Mycobacterium tuberculosis, infecções parasitárias, espécies de Plasmodium, espécies de Leishmania, espécies de Toxoplasma, infecções fúngicas, espécies criptocócicas, espécies de Candida e espécies de Pneumocystis, entre outros.

[0089] A síndrome de ativação de macrófagos (MAS) compreende uma condição que compreende ativação e proliferação descontroladas de macrófagos, e linfócitos T, com um aumento acentuado nos níveis de citocinas circulantes, por exemplo, IFNγ e GM-CSF. MAS está intimamente relacionada com HLH secundária. As manifestações de MAS incluem febre alta, hepatoesplenomegalia, linfadenopatia, pancitopenia, disfunção hepática, coagulação intravascular disseminada, hemofagocitose, hipofibrinogenemia, hiperferritinemia e hipertrigliceridemia.

[0090] A CRS compreende uma resposta imune não antígeno- específica similar àquela encontrada em infecção severa. CRS é caracterizada por qualquer um ou todos os seguintes sintomas: febre com ou sem calafrios, mal-estar, fadiga, anorexia, mialgias, artralgias, náuseas, vômitos, dor de cabeça, erupção cutânea, diarréia, taquipnéia, hipoxemia, hipóxia, choque, taquicardia cardiovascular, pressão do pulso ampliada, hipotensão, extravasamento capilar, débito cardíaco aumentado (precoce), débito cardíaco potencialmente diminuído (tardio), dímero-D elevado, hipofibrinogenemia com ou sem sangramento, azotemia, transaminite, hiperbilirrubinemia, dor de cabeça, alterações do estado mental, confusão, delírio, dificuldade para encontrar palavras ou afasia franca, alucinações, tremor, dismetria, marcha alterada, convulsões, falência de órgãos, falência multiórgãos. Também foram relatadas mortes. Foi relatado que CRS severa ocorre em até 60% dos pacientes que recebem CAR- T19.

[0091] A tempestade de citocinas compreende uma reação imune que consiste em uma alça de feedback positivo entre citocinas e células sanguíneas brancas, com níveis altamente elevados de várias citocinas. O termo “tempestade de citocinas” pode ser usado de forma intercambiável com os termos “cascata de citocinas” e “hipercitocinemia”, todos tendo as mesmas qualidades e significados. Em algumas modalidades, uma tempestade de citocinas é caracterizada por liberação de IL-2 e linfoproliferação. A tempestade de citocinas leva a complicações potencialmente fatais, incluindo disfunção cardíaca, síndrome de sofrimento respiratório do adulto, toxicidade neurológica, insuficiência renal e/ou hepática, e coagulação intravascular disseminada.

[0092] Como observado, a terapia com células CAR-T está atualmente limitada pelo risco de neurotoxicidade e CRS potencialmente fatais. Símiosar do gerenciamento ativo, todos os responsivos à CAR-T apresentam algum grau de CRS. Até 50% dos pacientes tratados com CD19 CAR-T possuem pelo menos CRS ou neurotoxicidade de Grau 3. Os níveis de GM-CSF e a expansão de células T são os fatores mais associados à CRS e neurotoxicidade de Grau 3 ou maior.

[0093] A redução ou eliminação da CRS e neurotoxicidade em imunoterapias como, por exemplo, terapia com células CAR- T, é de grande valor e é crucial para determinar o que conduz ou exacerba a assinatura da resposta inflamatória de CAR-T. Embora muitas citocinas, moléculas de sinalização e tipos de células estejam envolvidos nessa via, GM-CSF é aquela citocina que parece ser o centro da via. Normalmente indetectável no soro humano, ele é central para a alça de feedback positivo cíclica que dirige a inflamação aos extremos das tempestades de citocinas e ativação da célula endotelial. A neurotoxicidade e as tempestades de citocinas não são o resultado de uma liberação simultânea de citocinas, mas sim uma cascata de inflamação iniciada por GM-CSF resultando no tráfego e recrutamento de células mielóides para o local do tumor. Essas células mielóides produzem as citocinas observadas em CRS e neurotoxicidade, perpetuando a cascata inflamatória. Fator estimulante de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF)

[0094] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “fator estimulante de colônias de granulócitos-macrófagos” (GM-CSF) se refere a uma glicoproteína pequena, de ocorrência natural, com ligações dissulfeto internas que possuem um peso molecular de aproximadamente 23 kDa. Em algumas modalidades, GM-CSF se refere ao GM-CSF humano. Em algumas modalidades, GM-CSF se refere ao GM-CSF não-humano. Em humanos, ele é codificado por um gene localizado dentro do agrupamento de citocina no cromossomo humano 5. As sequências do gene e proteína humanos são conhecidas. A proteína possui uma sequência sinalizadora do terminal-N e um domínio de ligação ao receptor do terminal-C (Rasko e Gough Em: “The Cytokine Handbook”, A. Thomson, e cols., Academic Press, Nova York (1994) páginas 349-369). Sua estrutura tridimensional é similar àquela das interleucinas, embora as sequências de aminoácidos não sejam similares. GM-CSF é produzido em resposta a diversos mediadores inflamatórios por células mesenquimais presentes no ambiente hematopoiético e em locais periféricos de inflamação. GM-CSF é capaz de estimular a produção de granulócitos neutrofílicos, macrófagos, e colônias mistas de granulócitos-macrófagos a partir de células da medula óssea e pode estimular a formação de colônias de eosinófilos a partir de células progenitoras fetais do fígado. GM-CSF também pode estimular algumas atividades funcionais em granulócitos e macrófagos maduros. GM-CSF, uma citocina presente no microambiente da medula óssea, recruta células dendríticas inflamatórias derivadas de monócitos, estimula a secreção de níveis altos de IL-6 e CCL2/MCP-1, e leva a uma alça de feedback, que recruta mais monócitos, células dendríticas inflamatórias para locais inflamatórios.

[0095] Como observado, CRS envolve o aumento de várias citocinas e quimiocinas, incluindo IFN-γ, IL-6, IL-8, CCL2 (MCP-1), CCL3 (MIP1α) e GM-CSF. (Teachey, D. e cols. (junho de 2016), Cancer Discovery, CD-16-0040; Morgan R., e cols., (abril 2010), Molecular Therapy). IL-6, uma das citocinas inflamatórias cruciais, não é produzida por células CAR-T (Barrett, D. e cols. (2016), Blood). Ao invés disso, ela é produzida por células mielóides, que são recrutadas para o local do tumor. GM-CSF medeia esse recrutamento, o que induz a produção de quimiocinas que ativa células mielóides e faz com que elas trafeguem até o local do tumor. Níveis elevados de GM-CSF servem tanto como um biomarcador preditivo para CRS quanto como um indicador de sua severidade. Mais do que um componente crítico da cascata da inflamação, GM-CSF é o iniciador-chave, responsável tanto por CRS quanto por NT. Como descrito nesse relatório descritivo, estudos in vivo com o uso de modelos murídeos indicam que o silenciamento genético de GM-CSF evita a tempestade de citocinas – embora ainda mantendo a eficácia de CAR-T. Camundongos com knockout de GM-CSF possuem níveis normais de INF-γ, IL-6, IL-10, CCL2

(MCP1), CCL3/4 (MIG-1) in vivo e não desenvolvem CRS (Sentman, M.-L., e cols. (2016), The Journal of Immunology, 197(12), 4.674-4.685). Modelos de CAR-T com knockout de GM- CSF recrutam menos células NK, células CD8, células mielóides e neutrófilos para o local do tumor em comparação com CAR-T GM-CSF+.

[0096] O termo “receptor solúvel do fator estimulante de colônia de granulócitos-macrófagos” (sGM-CSFR) se refere a um receptor não ligado à membrana que se liga ao GM-CSF, mas não transduz um sinal quando ligado ao ligante.

[0097] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “antagonista peptídico de GM-CSF” se refere a um peptídeo que interage com GM-CSF, ou seu receptor, para reduzir ou bloquear (parcial ou completamente) a transdução de sinal que de outro modo resultaria da ligação de GM-CSF ao seu receptor cognato expresso em células. Antagonistas de GM-CSF podem atuar por redução da quantidade de ligante de GM-CSF disponível para se ligar ao receptor (por exemplo, anticorpos que, uma vez ligados ao GM-CSF, aumentam a taxa de depuração de GM-CSF) ou evitam que o ligante se ligue ao seu receptor por ligação ao GM-CSF ou ao receptor (por exemplo, anticorpos neutralizantes). Antagonistas de GM-CSF também podem incluir outros inibidores peptídicos, que podem incluir polipeptídeos que se ligam ao GM-CSF ou ao seu receptor para inibir parcial ou completamente a sinalização. Um antagonista peptídico de GM-CSF pode ser, por exemplo, um anticorpo; um ligante natural ou sintético do receptor de GM-CSF que antagoniza GM-CSF, ou outros polipeptídeos. Um ensaio exemplar para detectar atividade antagonista de GM- CSF é fornecido no Exemplo 1. Tipicamente, um antagonista peptídico de GM-CSF, por exemplo, um anticorpo neutralizante, possui uma EC50 de 10 nM ou menos.

[0098] O termo “antagonista de GM-CSF purificado”, como usado nesse relatório descritivo, se refere a um antagonista de GM-CSF que é substancialmente ou basicamente livre de componentes que normalmente o acompanham como encontrado em seu estado nativo. Por exemplo, um antagonista de GM-CSF, por exemplo, um anticorpo anti-GM-CSF que é purificado do sangue ou plasma, é substancialmente livre de outros componentes do sangue ou plasma, por exemplo, outras moléculas de imunoglobulina. A pureza e homogeneidade são tipicamente determinadas com o uso de técnicas de química analítica como, por exemplo, eletroforese em gel de poliacrilamida ou cromatografia líquida de alta eficiência. Uma proteína que é a espécie predominante presente em uma preparação é substancialmente purificada. Tipicamente, “purificada” significa que a proteína é pelo menos 85% pura, mais preferivelmente pelo menos 95% pura e, principalmente, pelo menos 99% pura em relação aos componentes com os quais a proteína ocorre naturalmente. Anticorpos

[0099] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “anticorpo” se refere a uma proteína funcionalmente definida como uma proteína de ligação e estruturalmente definida como compreendendo uma sequência de aminoácidos que é reconhecida por aqueles habilitados na técnica como sendo derivada da região framework de um gene codificador de imunoglobulina de um animal que produz anticorpos. Um anticorpo pode consistir em um ou mais polipeptídeos substancialmente codificados por genes de imunoglobulina ou fragmentos de genes de imunoglobulina. Os genes de imunoglobulina reconhecidos incluem os genes da região constante kappa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon e mu, bem como diversos genes região variável de imunoglobulina. As cadeias leves são classificadas como kappa ou lambda. Heavy cadeias são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou épsilon, que, por sua vez, definem as classes de imunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.

[00100] Uma unidade estrutural de imunoglobulina (anticorpo) típica sabidamente compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto por dois pares de cadeias polipeptídicas idênticas, cada par tendo uma cadeia “leve” (cerca de 25 kD) e uma cadeia “pesada” (cerca de 50-70 kD). O terminal-N de cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos primariamente responsáveis por reconhecimento de antígeno. Os termos “cadeia leve variável” (VL) e “cadeia pesada variável” (VH) se referem a essas cadeias leves e pesadas, respectivamente.

[00101] O termo “anticorpo” inclui fragmentos de anticorpo que retêm especificidade de ligação. Por exemplo, há diversos fragmentos de anticorpo bem caracterizados. Dessa forma, por exemplo, pepsina digere o terminal-C de um anticorpo nas ligações dissulfeto na região de dobradiça para produzir F(ab')2, um dímero de Fab que é, ele próprio, uma cadeia leve unida a VH-CH1 por uma ligação dissulfeto. O F(ab')2 pode ser reduzido sob condições suaves para quebrar a ligação dissulfeto na região de dobradiça convertendo, dessa forma, o dímero de (Fab')2 em um monômero de Fab'. O monômero de Fab' é basicamente um Fab com parte da região de dobradiça (veja, “Fundamental Immunology”, W.E. Paul, ed.,

Raven Press, N.Y. (1993), para uma descrição mais detalhada de outros fragmentos de anticorpo). Embora vários fragmentos de anticorpo sejam definidos em termos da digestão de um anticorpo intacto, aqueles habilitados na técnica observarão que fragmentos podem ser sintetizados de novo quimicamente ou por utilização de metodologia de DNA recombinante. Dessa forma, o termo “anticorpo”, como usado nesse relatório descritivo, também inclui fragmentos de anticorpo produzidos pela modificação de anticorpos inteiros ou sintetizados com o uso de metodologias de DNA recombinante.

[00102] Anticorpos incluem dímeros como, por exemplo, dímeros VH-VL, dímeros de VH ou dímeros de VL, incluindo anticorpos de cadeia única (anticorpos que existem como uma cadeia polipeptídica única), por exemplo, anticorpos Fv de cadeia única (sFv ou scFv), nos quais uma região variável pesada e uma região variável leve são unidas juntas (diretamente ou por meio de um ligante peptídico) para formar um polipeptídeo contínuo. O anticorpo Fv de cadeia única é um heterodímero VH-VL ligado covalentemente que pode ser expresso por um ácido nucleico que inclui sequências codificadoras de VH e VL unidas diretamente ou unidas por um ligante codificador de peptídeo (por exemplo, Huston, e cols. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85: 5.879-5.883, 1988). Embora a VH e VL estejam conectadas entre elas como uma cadeia polipeptídica única, os domínios VH e VL se associam não covalentemente. Alternativamente, o anticorpo pode ser outro fragmento, por exemplo, um Fv estabilizado por dissulfeto (dsFv). Outros fragmentos também podem ser gerados, incluindo a utilização de técnicas recombinantes. Os anticorpos scFv e várias outras estruturas convertem as cadeias polipeptídicas leves e pesadas naturalmente agregadas, mas quimicamente separadas, de uma região V de anticorpo em uma molécula que se enovela em uma estrutura tridimensional substancialmente similar à estrutura de um sítio de ligação ao antígeno e são conhecidos por aqueles habilitados na técnica (veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos

5.091.513, 5.132.405 e 4.956.778). Em algumas modalidades, anticorpos incluem aqueles que foram apresentados em fago ou gerados por tecnologia recombinante usando vetores nos quais as cadeias são secretadas como proteínas solúveis, por exemplo, scFv, Fv, Fab, (Fab')2, ou geradas por tecnologia recombinante usando vetores nos quais as cadeias são secretadas como proteínas solúveis. Anticorpos para uso na invenção também podem incluir dianticorpos e minianticorpos.

[00103] Os anticorpos da invenção também incluem dímeros de cadeia pesada, por exemplo, anticorpos de camelídeos. Como a região VH de uma IgG de dímero de cadeia pesada em um camelídeo não precisa fazer interações hidrofóbicas com uma cadeia leve, a região na cadeia pesada que normalmente faz contato com uma cadeia leve é alterada para resíduos de aminoácidos hidrofílicos em um camelídeo. Domínios VH de IgGs de dímero de cadeia pesada são denominados domínios VHH. Anticorpos para uso na presente invenção incluem anticorpos de domínio único (dAbs) e nanocorpos (veja, por exemplo, Cortez-Retamozo, e cols., Cancer Res. 64: 2.853-2.857, 2004).

[00104] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “região V” se refere a um domínio da região variável de anticorpo que compreende os segmentos de Framework 1, CDR1, Framework 2, CDR2 e Framework 3, incluindo CDR3 e Framework

4, cujos segmentos são adicionados ao segmento-V como consequência de rearranjo dos genes da região V da cadeia pesada e cadeia leve durante a diferenciação de célula B. O termo “segmento-V”, como usado nesse relatório descritivo, se refere à região da região V (cadeia pesada ou leve) que é codificada por um gene V. O segmento-V da região variável da cadeia pesada codifica FR1-CDR1-FR2-CDR2 e FR3. Para os objetivos dessa invenção, o segmento-V da região variável da cadeia leve é definido como se estendendo de FR3 até CDR3.

[00105] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “segmento-J” se refere a uma subsequência da região variável codificada que compreende uma porção do terminal-C de uma CDR3 e a FR4. Um segmento-J endógeno é codificado por um gene-J de imunoglobulina.

[00106] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “região determinante de complementaridade (CDR)” se refere às três regiões hipervariáveis em cada cadeia que interrompem as quatro regiões “framework” estabelecidas pelas regiões variáveis da cadeia leve e pesada. As CDRs são primariamente responsáveis pela ligação a um epitopo de um antígeno. As CDRs de cada cadeia são tipicamente denominadas CDR1, CDR2 e CDR3, numeradas sequencialmente partindo do terminal-N, e também são tipicamente identificadas pela cadeia na qual a CDR particular está localizada. Dessa forma, por exemplo, uma CDR3 de VH está localizada no domínio variável da cadeia pesada do anticorpo na qual é encontrada, enquanto uma CDR1 de VL é a CDR1 do domínio variável da cadeia leve do anticorpo na qual ela é encontrada.

[00107] As sequências das regiões framework de cadeias leves ou pesadas diferentes são relativamente conservadas dentro de uma espécie. A região framework de um anticorpo, que consiste nas regiões framework combinadas das cadeias leves e pesadas constituintes, serve para posicionar e alinhar as CDRs no espaço tridimensional.

[00108] As sequências de aminoácidos das CDRs e regiões framework podem ser determinadas usando várias definições bem conhecidas na técnica, por exemplo, Kabat, Chothia, banco de dados internacional de ImMunoGeneTics (IMGT) e AbM (veja, por exemplo, Johnson e cols., supra; Chothia & Lesk, 1987, “Canonical Structures for the Hypervariable Regions of Immunoglobulins”. J. Mol. Biol. 196, 901-917; Chothia C. e cols., 1989, “Conformations of Immunoglobulin Hypervariable Regions”. Nature 342, 877-883; Chothia C. e cols., 1992, “Structural Repertoire of the Human VH Segments”, J. Mol. Biol. 227, 799-817; Al-Lazikani e cols., J. Mol. Biol 1997, 273 (4)). Definições de sítios de combinação de antígenos também são descritas nos seguintes: Ruiz e cols., “IMGT, the International ImMunoGeneTics Database”. Nucleic Acids Res., 28, 219–221 (2000); e Lefranc, M.-P. “IMGT, the International ImMunoGeneTics Database”. Nucleic Acids Res. Jan 1; 29 (1): 207-9 (2001); MacCallum e cols., “Antibody-Antigen Interactions: Contact Analysis and Binding Site Topography”, J. Mol. Biol., 262 (5), 732-745 (1996); e Martin e cols., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 9.268–9.272 (1989); Martin, e cols., Methods Enzymol., 203, 121–153, (1991); Pedersen e cols., Immunomethods, 1, 126, (1992); e Rees e cols., In Sternberg M.J.E. (ed.), “Protein Structure Prediction”. Oxford University Press, Oxford, 141–172 1996).

[00109] O termo “epitopo” ou “determinante antigênico” se refere a um sítio em um antígeno ao qual um anticorpo se liga. Epitopos podem ser formados tanto por aminoácidos contíguos quanto por aminoácidos não contíguos justapostos por enovelamento terciário de uma proteína. Epitopos formados por aminoácidos contíguos são tipicamente retidos na exposição a solventes desnaturantes, enquanto epitopos formados por enovelamento terciário são tipicamente perdidos com o tratamento com solventes desnaturantes. Um epitopo tipicamente inclui pelo menos 3 e, mais normalmente, pelo menos 5 ou 8-10 aminoácidos em uma conformação espacial única. Métodos de determinação da conformação espacial de epitopos incluem, por exemplo, cristalografia de raios-X e ressonância magnética nuclear bidimensional. Veja, por exemplo, “Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology”, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed (1996).

[00110] O termo “determinante de especificidade de ligação” ou “BSD”, como usado no contexto da presente invenção, se refere à sequência de aminoácidos contíguos ou não contíguos mínima dentro de uma região CDR necessária para a determinação da especificidade de ligação de um anticorpo. Na presente invenção, os determinantes de especificidade de ligação mínimos residem dentro de uma porção ou do comprimento total das sequências de CDR3 das cadeias pesadas e leves do anticorpo.

[00111] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “anticorpo anti-GM-CSF” ou “anticorpo contra GM-CSF” são usados de forma intercambiável para se referirem a um anticorpo que se liga ao GM-CSF e inibe a ligação e ativação do receptor de GM-CSF. Esses anticorpos podem ser identificados com o uso de qualquer um entre diversos ensaios reconhecidos na técnica que avaliam a ligação e/ou função de

GM-CSF. Por exemplo, ensaios de ligação como, por exemplo, ensaios ELISA, que medem a inibição da ligação de GM-CSF à subunidade alfa do receptor, podem ser usados. Ensaios baseados em células para sinalização do receptor de GM-CSF, por exemplo, ensaios que determinam a taxa de proliferação de uma linhagem de célula GM-CSF-dependente em resposta a uma quantidade limitante de GM-CSF, também são convenientemente empregados, bem como ensaios que medem quantidades de produção de citocina, por exemplo, produção de IL-8, em resposta à exposição ao GM-CSF.

[00112] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “anticorpo neutralizante” se refere a um anticorpo que se liga ao GM-CSF e inibe a sinalização pelo receptor de GM- CSF, ou evita a ligação de GM-CSF ao seu receptor.

[00113] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “fator estimulante de colônias de granulócitos-macrófagos humano” (hGM-CSF) se refere a uma glicoproteína de ocorrência natural pequena com ligações dissulfeto internas que possui um peso molecular de aproximadamente 23 kDa; a fonte e o alvo do GM-CSF são humanos; dessa forma, o anticorpo anti- hGM-CSF, como descrito em modalidades nesse relatório descritivo, se liga somente ao GM-CSF humano e de primata, mas não ao de camundongo, rato e a outro GM-CSF de mamífero. Os anticorpos contra hGM-CSF, como descritos em modalidades nesse relatório descritivo, neutralizam GM-CSF humano. Em algumas modalidades, o hGM-CSF em humanos é codificado por um gene localizado dentro do agrupamento de citocina no cromossomo humano 5. As sequências do gene e proteína humanos são conhecidas. A proteína possui uma sequência sinalizadora do terminal-N e um domínio de ligação ao receptor do terminal-C (Rasko e Gough Em: “The Cytokine Handbook”, A. Thomson, e cols., Academic Press, Nova York (1994) páginas 349-369). Sua estrutura tridimensional é similar àquela das interleucinas, embora as sequências de aminoácidos não sejam similares. GM-CSF é produzido em resposta a diversos mediadores inflamatórios presentes no ambiente hematopoiético e em locais periféricos de inflamação. GM-CSF é capaz de estimular a produção de granulócitos neutrofílicos, macrófagos e colônias mistas de granulócitos- macrófagos a partir de células da medula óssea e pode estimular a formação de colônias de eosinófilos a partir de células progenitoras fetais do fígado. GM-CSF também pode estimular algumas atividades funcionais em granulócitos e macrófagos maduros e inibe a apoptose de granulócitos e macrófagos.

[00114] O termo “constante de dissociação de equilíbrio” ou “afinidade” abreviada (KD) se refere à constante da taxa de dissociação (kd, tempo-1) dividida pela constante da taxa de associação (ka, tempo-1 M-1). Constantes de dissociação de equilíbrio podem ser medidas com o uso de qualquer método conhecido na técnica. Os anticorpos da presente invenção são anticorpos de alta afinidade. Esses anticorpos possuem uma afinidade monovalente melhor (menor) do que cerca de 10 nM e, frequentemente, melhor do que cerca de 500 pM ou melhor do que cerca de 50 pM, como determinada por análise por ressonância de plásmon de superfície realizada a 37°C. Dessa forma, em algumas modalidades, os anticorpos da invenção possuem uma afinidade (como medida usando ressonância de plásmon de superfície), de menos do que 50 pM, tipicamente menos do que cerca de 25 pM, ou até mesmo de menos do que 10 pM.

[00115] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-GM-CSF da invenção possui uma taxa de dissociação lenta, com uma constante da taxa de dissociação (kd) determinada por análise por ressonância de plásmon de superfície a 37°C para a interação monovalente com GM-CSF de menos do eu aproximadamente 10-4 s-1, preferivelmente menos do que 5 x 10- 5 s-1 e, principalmente, menos do que 10-5 s-1.

[00116] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “anticorpo quimérico” se refere a uma molécula de imunoglobulina na qual (a) a região constante, ou uma porção desta, é alterada, substituída ou trocada de modo que o sítio de ligação ao antígeno (região variável) seja ligado a uma região constante de uma classe, função efetora e/ou espécie diferente ou alterada, ou uma molécula inteiramente diferente que confere novas propriedades ao anticorpo quimérico, por exemplo, uma enzima, toxina, hormônio, fator de crescimento, fármaco etc.; ou (b) a região variável, ou uma porção desta, é alterada, substituída ou trocada com uma região variável, ou porção desta, que possui uma especificidade de antígeno diferente ou alterada; ou com sequências correspondentes de outra espécie ou de outra classe ou subclasse de anticorpo.

[00117] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “anticorpo humanizado” se refere a uma molécula de imunoglobulina na qual CDRs de um anticorpo doador são enxertadas sobre sequências framework humanas. Anticorpos humanizados também podem compreender resíduos de origem do doador nas sequências framework. O anticorpo humanizado também pode compreender pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina humana. Anticorpos humanizados também podem compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo receptor nem na CDR ou sequências framework importadas. A humanização pode ser realizada com o uso de métodos conhecidos na técnica (por exemplo, Jones e cols., Nature 321: 522-525; 1986; Riechmann e cols., Nature 332: 323-327, 1988; Verhoeyen e cols., Science 239: 1.534-1.536, 1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596, 1992; Patente U.S. Nº 4.816.567), incluindo técnicas como, por exemplo, “super-humanização” de anticorpos (Tan e cols., J. Immunol. 169: 1.119, 2002) e “ressurgimento” (por exemplo, Staelens e cols., Mol. Immunol. 43: 1.243, 2006; e Roguska e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 969, 1994).

[00118] Um anticorpo “ΗUMANEERED®”, no contexto dessa invenção, se refere a um anticorpo humano modificado geneticamente que possui uma especificidade de ligação de um anticorpo de referência. Um anticorpo humano modificado geneticamente para uso nessa invenção possui uma molécula de imunoglobulina que contém sequência mínima derivada de uma imunoglobulina doadora. Em algumas modalidades, o anticorpo humano modificado geneticamente pode reter símionas o determinante de especificidade de ligação mínimo essencial das regiões CDR3 de um anticorpo de referência. Tipicamente, um anticorpo humano modificado geneticamente é modificado geneticamente por união de uma sequência de DNA que codifica um determinante de especificidade de ligação (BSD) da região CDR3 da cadeia pesada do anticorpo de referência para sequência do segmento VH humano e um BSD da CDR3 da cadeia leve do anticorpo de referência para uma sequência do segmento VL humano. Um “BSD” se refere a uma região CDR3-

FR4, ou uma porção dessa região, que medeia a especificidade de ligação. Um determinante de especificidade de ligação, portanto, pode ser uma CDR3-FR4, uma CDR3, um determinante de especificidade de ligação mínimo essencial de uma CDR3 (que se refere a qualquer região menor do que a CDR3 que confere especificidade de ligação quando presente na região V de um anticorpo), o segmento-D (com relação a uma região da cadeia pesada), ou outras regiões de CDR3-FR4 que conferem a especificidade de ligação de um anticorpo de referência. Métodos para a modificação por engenharia genética de anticorpos humanos são fornecidos na Publicação de Pedido de Patente U.S. Nº 20050255552 e Publicação de Pedido de Patente U.S. Nº 20060134098.

[00119] O termo “anticorpo humano”, como usado nesse relatório descritivo, se refere a um anticorpo que é substancialmente humano, ou seja, possui regiões FR e, frequentemente, regiões CDR, de m sistema imune humano. Consequentemente, o termo inclui anticorpos humanizados e humaneered, bem como anticorpos isolados de camundongos reconstituídos com um sistema imune humano e anticorpos isolados de bibliotecas de apresentação.

[00120] O termo “heterólogo”, quando usado com referência às porções de um ácido nucleico, indica que o ácido nucleico compreende duas ou mais subsequências que não são normalmente encontradas no mesmo relacionamento entre elas na natureza. Por exemplo, o ácido nucleico é tipicamente produzido recombinantemente, tendo duas ou mais sequências, por exemplo, de genes não relacionados dispostos para fazer um novo ácido nucleico funcional. Similarmente, uma proteína heteróloga frequentemente irá se referir a duas ou mais subsequências que não são encontradas no mesmo relacionamento entre elas na natureza.

[00121] O termo “recombinante”, quando usado com referência, por exemplo, a uma célula, ou ácido nucleico, proteína ou vetor, indica que a célula, ácido nucleico, proteína ou vetor, foi modificado pela introdução de um ácido nucleico ou proteína heteróloga ou a alteração de um ácido nucleico ou proteína nativa, ou que a célula é derivada de uma célula assim modificada. Dessa forma, por exemplo, células recombinantes expressam genes que não são encontrados dentro da forma nativa (não recombinante) da célula ou expressam genes nativos que, de outro modo, são anormalmente expressos, subexpressos ou não expressos de forma alguma. O termo “ácido nucleico recombinante”, como usado nesse relatório descritivo, significa ácido nucleico, originalmente formado in vitro, em geral, pela manipulação de ácido nucleico, por exemplo, usando polimerases e endonucleases, em uma forma não encontrada normalmente na natureza. Dessa forma, a ligação operável de sequências diferentes é obtida. Dessa forma, um ácido nucleico isolado, em uma forma linear, ou um vetor de expressão formado in vitro por ligação de moléculas de DNA que não estão normalmente unidas, são, ambos, considerados recombinantes para os objetivos dessa invenção. Subentende-se que, após um ácido nucleico recombinante ser feito e reintroduzido em uma célula ou organismo hospedeiro, ele irá replicar não recombinantemente, ou seja, usando o maquinário celular in vivo da célula hospedeira, ao invés de manipulações in vitro; no entanto, esses ácidos nucleicos, uma vez produzidos recombinantemente, embora subsequentemente replicados não recombinantemente, ainda são considerados recombinantes para os objetivos da invenção. Similarmente, uma “proteína recombinante” é uma proteína feita com o uso de técnicas recombinantes, ou seja, por meio da expressão de um ácido nucleico recombinante.

[00122] A frase “se liga especificamente (ou seletivamente)” a um anticorpo ou é “especificamente (ou seletivamente) imunorreativo com”, se refere a uma reação de ligação na qual o anticorpo se liga ao antígeno de interesse. No contexto dessa invenção, o anticorpo tipicamente se liga ao antígeno, por exemplo, GM-CSF, com uma afinidade de 500 nM ou menos, e possui uma afinidade de 5.000 nM ou maior, para outros antígenos.

[00123] Os termos “idênticos” ou “percentual de identidade”, no contexto de duas ou mais sequências de polipeptídeos (ou de ácidos nucleicos), se referem a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas ou possuem uma percentagem especificada de resíduos de aminoácidos (ou nucleotídeos) que são os mesmos (ou seja, cerca de 60% de identidade, preferivelmente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade em relação a uma região especificada, quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima sobre uma janela de comparação ou região designada), como medida usando algoritmos de comparação de sequências BLAST ou BLAST 2.0 com parâmetros-padrão descritos abaixo, ou por alinhamento manual e inspeção visual (veja, por exemplo, a página na Internet do NCBI). Essas sequências são então ditas como sendo “substancialmente idênticas”. O termo “sequências substancialmente idênticas” também inclui sequências que possuem deleções e/ou adições, bem como aquelas que possuem substituições, bem como variantes de ocorrência natural, por exemplo, variantes polimórficas ou alélicas, e variantes feitas pelo Homem. Como descrito abaixo, os algoritmos preferidos podem considerar lacunas (gaps) e semelhantes. De preferência, a identidade de sequência de proteína existe sobre uma região que é tem menos cerca de 25 aminoácidos de comprimento ou, mais preferivelmente, sobre uma região que tem 50-100 aminoácidos = de comprimento, ou sobre o comprimento de uma proteína.

[00124] O termo “janela de comparação”, como usado nesse relatório descritivo, inclui referência a um segmento de uma das diversas posições contíguas selecionadas do grupo que consiste tipicamente em de 20 a 600, normalmente cerca de 50 até cerca de 200, mais normalmente cerca de 100 até cerca de 150, na qual uma sequência pode se comparada com uma sequência de referência do mesmo número de posições contíguas após as duas sequências serem otimamente alinhadas. Métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. O alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser feito, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), pela pesquisa pelo método de similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85: 2.444 (1988), por implementações computadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA na Suíte de Programas Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por alinhamento manual e inspeção visual (veja, por exemplo, “Current Protocols in Molecular Biology” (Ausubel e cols., eds. 1995 suplemento)).

[00125] Uma indicação de que dois polipeptídeos são substancialmente idênticos é que o primeiro polipeptídeo reage imunologicamente de forma cruzada com os anticorpos provocados contra o segundo polipeptídeo. Dessa forma, um polipeptídeo é tipicamente substancialmente idêntico a um segundo polipeptídeo, por exemplo, em que os dois peptídeos diferem somente por substituições conservativas.

[00126] Exemplos preferidos de algoritmos que são adequados para a determinação do percentual de identidade de sequência e similaridade de sequência incluem os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul e cols., Nuc. Acids Res. 25: 3.389-3.402 (1977) e Altschul e cols., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). BLAST e BLAST 2.0 são usados, com os parâmetros descritos nesse relatório descritivo, para determinar o percentual de identidade de sequência para os ácidos nucleicos e proteínas da invenção. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeos) usa como padrões um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 e uma comparação de ambas as fitas. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como padrões um comprimento de palavra de 3, e expectativa (E) de 10, e uma matriz de pontuação BLOSUM62 (veja Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10.915 (1989)), alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5 , N = -4, e uma comparação de ambas as fitas.

[00127] Os termos “isolado”, “purificado” ou “biologicamente puro” se referem ao material que é substancialmente ou basicamente livre de componentes que normalmente o acompanham como encontrados em seu estado nativo. A pureza e homogeneidade são tipicamente determinadas com o uso de técnicas de química analítica como, por exemplo, eletroforese em gel de poliacrilamida ou cromatografia líquida de alta eficiência. Uma proteína que é a espécie predominante presente em uma preparação é substancialmente purificada. O termo “purificado” em algumas modalidades denota que uma proteína dá origem a basicamente uma banda no gel eletroforético. De preferência, isso significa que a proteína é pelo menos 85% pura, mais preferivelmente pelo menos 95% pura e, principalmente, pelo menos 99% pura.

[00128] Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo para se referirem a um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos se aplicam aos polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos consistem em um mimético químico artificial de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, bem como aos polímeros de aminoácidos de ocorrência natural, aqueles que contêm resíduos modificados, e polímeros de aminoácidos de ocorrência não natural.

[00129] O termo “aminoácido” se refere aos aminoácidos de ocorrência natural e sintéticos, bem como aos análogos de aminoácidos e miméticos de aminoácidos que funcionam similarmente aos aminoácidos de ocorrência natural. Aminoácidos de ocorrência natural são aqueles codificados pelo código genético, bem como aqueles aminoácidos que são modificados posteriormente, por exemplo, hidroxiprolina, γ- carboxiglutamato e O-fosfoserina. Análogos de aminoácidos se referem aos compostos que possuem a mesma estrutura química básica que um aminoácido de ocorrência natural, por exemplo, um carbono-α que é ligado a um hidrogênio, um grupo carboxil, um grupo amino e um grupo R, por exemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfônio. Esses análogos podem ser grupos R modificados (por exemplo, norleucina) ou arcabouços peptídicos modificados, mas retêm a mesma estrutura química básica que um aminoácido de ocorrência natural. Miméticos de aminoácidos se referem aos compostos químicas que possuem uma estrutura que é diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funciona similarmente a um aminoácido de ocorrência natural.

[00130] Aminoácidos podem ser citados nesse relatório descritivo por seus símbolos de três letras comumente conhecidos ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela IUPAC (“IUB Biochemical Nomenclature Commission”). Nucleotídeos, da mesma forma, podem ser citados por seus códigos de uma única letra comumente aceitos.

[00131] O termo “variantes modificadas conservativamente” se aplica às sequências tanto de aminoácidos quanto de ácidos nucleicos. Com relação às sequências de ácidos nucleicos particulares, variantes modificadas conservativamente se referem àqueles ácidos nucleicos que codificam sequências de aminoácidos idênticas ou basicamente idênticas, ou nas quais o ácido nucleico não codifica uma sequência de aminoácidos, a sequências basicamente idênticas ou associadas, por exemplo, sequências naturalmente contíguas. Por causa da degeneração do código genético, um grande número de ácidos nucleicos funcionalmente idênticos codifica a maioria das proteínas. Por exemplo, todos os códons GCA, GCC, GCG e GCU codificam o aminoácido alanina. Dessa forma, em cada posição onde uma alanina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado para outro dos códons correspondentes descritos, sem alteração do polipeptídeo codificado. Essas variações de ácidos nucleicos são “variações silenciosas”, que consistem em uma espécie de variações conservativamente modificadas. Cada sequência de ácidos nucleicos nesse relatório descritivo que codifica um polipeptídeo também descreve variações silenciosas do ácido nucleico. Aqueles habilitados na técnica reconhecerão que, em certos contextos, cada códon em um ácido nucleico (exceto AUG, que é habitualmente o único códon para metionina, e TGG, que é habitualmente o único códon para triptofano) pode ser modificado para gerar uma molécula funcionalmente idêntica. Consequentemente, variações frequentemente silenciosas de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo são implícitas em uma sequência descrita com relação ao produto da expressão, mas não com relação às reais sequências de sonda.

[00132] Como em relação às sequências de aminoácidos, aqueles habilitados na técnica reconhecerão que substituições, deleções ou adições individuais a uma sequência de ácidos nucleicos, peptídeos, polipeptídeos ou proteína que altera, adiciona ou deleta um único aminoácido ou uma pequena percentagem de aminoácidos na sequência codificada é uma “variante modificada conservativamente”, em que a alteração resulta na substituição de um aminoácido com um aminoácido quimicamente similar. Tabelas de substituições conservativas e matrizes de substituição como, por exemplo,

BLOSUM, que fornecem aminoácidos funcionalmente similares são bem conhecidas na técnica. Essas variantes modificadas conservativamente são adicionais e não excluem variantes polimórficas, homólogos interespécies e alelos da invenção. Substituições conservativas típicas entre elas incluem: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); e 8) Cisteína (C), Metionina (M) (veja, por exemplo, Creighton, “Proteins” (1984)). Métodos para a prevenção ou tratamento de uma toxicidade relacionada à imunoterapia

[00133] Em algumas modalidades, são revelados nesse relatório descritivo métodos de inibição da toxicidade relacionada à imunoterapia em um indivíduo. Em algumas modalidades, nesse relatório descritivo, são revelados métodos de redução da incidência de toxicidade relacionada à imunoterapia em um indivíduo. Em algumas modalidades, são revelados nesse relatório descritivo métodos de neutralização de hGM-CSF. Em algumas modalidades, os métodos compreendem uma etapa de administração de um antagonista de hGM-CSF recombinante ao indivíduo. Em algumas modalidades, o método compreende o silenciamento do gene hGM-CSF. Em algumas modalidades, o método compreende o knockout do gene hGM-CSF. Métodos de silenciamento gênico e knockout gênico são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica, e podem incluir, sem limitação, interferência de RNA (RNAi), CRISPR, RNA interferente curto (siRNA), interferência de RNA

DNA-dirigida (ddRNAi), edição direcionada do genoma com nucleases efetoras modificadas geneticamente do tipo ativadoras da transcrição (TALENs) ou outras técnicas adequadas. Técnicas de edição gênica para o knockout de GM-CSF: GM- CSFk/o

[00134] Em algumas modalidades, técnicas de edição gênica são usadas para o knockout da expressão de GM-CSF. A edição gênica é obtida por liberação de uma endonuclease (incluindo, sem limitação, Fok1 ou Cas9) que corta o DNA para um segmento sítio-específico do código genético. A endonuclease corta o DNA, o que desencadeia mecanismos de reparo de DNA endógeno.

[00135] Aqueles habilitados na técnica reconheceriam que qualquer método que obtenha clivagem de DNA cromossômico sítio-específica que então desencadeia reparo de DNA endógeno resultaria na mesma modificação direcionada do genoma. A modificação direcionada do genoma não seria diferente se a sítio-especificidade fosse determinada por um guia de RNA, guia de DNA ou por proteínas de ligação ao DNA ou qual endonuclease fosse usada para obter o corte de DNA. Um exemplo de sítio-especificidade guiada por um RNA inclui, sem limitação, CRISPR/Cas9. Um exemplo de sítio- especificidade guiada por DNA inclui, sem limitação, endonuclease flap 1 (FEN-1). Exemplos de proteínas de ligação ao DNA usadas para obter sítio-especificidade inclui, sem limitação, proteínas Dedo de zinco (ZFNs), efetoras do tipo ativadoras transcricional (TALENS), endonucleases teleguiadas, incluindo ARCUS, meganucleases etc.

[00136] Outros métodos que podem ser usados para o silenciamento gênico são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica e podem incluir, sem limitação, interferência de RNA (RNAi), RNA interferente curto (siRNA), interferência de RNA DNA-dirigida (ddRNAi).

[00137] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método para inativação do gene GM-CSF ou knockout de GM-CSF (KO) em uma célula, que compreende a edição direcionada do genoma ou o silenciamento do gene GM-CSF. Em uma modalidade do método fornecido, a edição direcionada do genoma compreende uma endonuclease, em que a endonuclease é uma enzima de restrição Fok1 ou uma endonuclease flap 1 (FEN-1). Em outra modalidade, a endonuclease é uma proteína associada a CRISPR Cas9 9 (Cas9). Em algumas modalidades, o gene GM- CSF é inativado por CRISPR/Cas9, que visa e edita GM-CSF no Éxon 1, Éxon 2, Éxon 3 ou Éxon 4. Em modalidades adicionais, a inativação do gene GM-CSF compreende CRISPR/Cas9 e visa e edita GM-CSF no Éxon 3. Em uma modalidade, a inativação do gene GM-CSF compreende CRISPR/Cas9 e visa e edita GM-CSF no Éxon 1. Em uma modalidade, a inativação do gene GM-CSF compreende múltiplas enzimas CRISPR/Cas9, em que cada enzima Cas9 visa e edita uma sequência diferente de GM-CSF no Éxon 1, Éxon 2, Éxon 3 ou Éxon 4. Em modalidades particulares, a inativação do gene GM-CSF compreende o direcionamento a CRISPR/Cas9 e knockout/inativação do gene GM-CSF. Em outro aspecto dos métodos fornecidos para inativação do gene GM- CSF ou knockout de GM-CSF (KO), os métodos ainda compreendem o tratamento de células T primárias com ácido valpróico para aumentar o knockout/inativação bialélica. Em um aspecto dos métodos fornecidos para inativação do gene GM-CSF/knockout gênico, a edição direcionada do genoma compreende proteínas Dedo de zinco (ZnF). Em um aspecto adicional, a edição direcionada do genoma compreende efetores do tipo ativador transcricional (TALENS). Em uma modalidade, a edição direcionada do genoma compreende uma endonuclease teleguiada, em que a endonuclease teleguiada é uma ARC nuclease (ARCUS) ou uma meganuclease. Em modalidades particulares desses métodos fornecidos nesse relatório descritivo, a célula é uma célula T CAR. Em outra modalidade, a célula T CAR é uma célula CAR-T CD19. Em uma modalidade, o silenciamento do gene GM-CSF é selecionado do grupo que consiste em interferência de RNA (RNAi), RNA interferente curto (siRNA) e interferência de RNA DNA-dirigida (ddRNAi). Método para a prevenção ou tratamento de uma toxicidade relacionada à imunoterapia

[00138] Em algumas modalidades, o método compreende a administração de células CAR-T que foram modificadas para expressar níveis menores de GM-CSF por meio do silenciamento do gene GM-CSF ou knockout do gene de GM-CSF. Métodos de silenciamento gênico e knockout gênico são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica, e podem incluir, sem limitação, RNAi, CRISPR, siRNA, ddRNAi, TALENs, Dedo de zinco, endonucleases teleguiadas e meganucleases ou outras técnicas adequadas.

[00139] Em algumas modalidades, a administração de células CAR-T com gene de GM-CSF silenciado ou com knockout desse gene evita ou reduz significantemente a incidência e/ou a severidade de CRS e NT. Em algumas modalidades, a administração de células CAR-T com gene de GM-CSF silenciado ou com knockout desse gene evita ou reduz significantemente a ruptura da BBB. Em algumas modalidades, a administração de células CAR-T com gene de GM-CSF silenciado ou com knockout desse gene evita ou reduz significantemente a ativação e tráfego de células mielóides CD14+ para dentro do SNC. Em algumas modalidades, a administração de células CAR-T com gene de GM-CSF silenciado ou com knockout desse gene resulta em níveis menores de citocinas sistêmicas IL-3, IL-5, IP10, KC, MCP-1, MIP-1a, MIP-1b, M-CSF, MIP-2, MIG, VEGF, IL-1ra, IL-1b, IL-6, IL-12p40, IL12p70, IL-RA, M-CSF e G-CSF do que aqueles observados quando células CAR-T do tipo selvagem são administradas.

[00140] Em algumas modalidades, a administração de células CAR-T com gene de GM-CSF silenciado ou com knockout desse gene ocorre com um antagonista de GM-CSF recombinante que ainda reduz a incidência ou severidade de CRS, NT e ainda evita ou reduz a ruptura da BBB, e ainda evita ou reduz a ativação e tráfego de células mielóides CD14+ para dentro do SNC, e ainda evita ou reduz os níveis sistêmicos de citocinas de IL-3, IL-5, IP10, KC, MCP-1, MIP-1a, MIP-1b, M-CSF, MIP- 2, MIG, VEGF, IL-1ra, IL-1b, IL-6, IL-12p40, IL12p70, IL1- RA, M-CSF e G-CSF do que aqueles observados quando células CAR-T do tipo selvagem são administradas. Métodos para o aumento da eficácia de terapia adotiva de células

[00141] Em algumas modalidades, o método compreende a administração de células CAR-T que foram modificadas para expressar níveis menores de GM-CSF por meio do silenciamento do gene GM-CSF ou knockout do gene de GM-CSF. Em algumas modalidades, células CAR-T com gene de GM-CSF silenciado ou com knockout desse gene são menos diferenciadas após expansão e incluem uma percentagem maior de memória de célula-tronco naïve, e características de memória central após expansão versus células CAR-T do tipo selvagem. Em algumas modalidades, células CAR-T com gene de GM-CSF silenciado ou com knockout desse gene não expressam FAS ou expressam níveis menores de FAS do que células CAR-T do tipo selvagem. Em algumas modalidades, células CAR-T com gene de GM-CSF silenciado ou com knockout desse gene são mais resistentes à morte celular induzida por ativação (AICD), mais resistentes à senescência, e mais resistentes à anergia, comparadas com células CAR-T do tipo selvagem. Em algumas modalidades, células CAR-T com gene de GM-CSF silenciado ou com knockout desse gene resultam em níveis menores de formação de MDSC e melhor expansão e persistência de células CAR-T, comparadas com células CAR-T do tipo selvagem. Em algumas modalidades, a administração de células CAR-T com gene de GM-CSF silenciado ou com knockout desse gene exibem expansão e persistência maiores do que células CAR-T do tipo selvagem. Em algumas modalidades, células CAR-T com gene de GM-CSF silenciado ou com knockout desse gene demonstram um nível maior de respostas objetivas (respostas completas e respostas parciais), comparadas com células CAR-T do tipo selvagem. Em algumas modalidades, células CAR-T com gene de GM-CSF silenciado ou com knockout desse gene demonstram um nível menor de recidiva em 6 meses, 12 meses e 24 meses, comparadas com células CAR-T do tipo selvagem. Em algumas modalidades, células CAR-T com gene de GM-CSF silenciado ou com knockout desse gene demonstram um nível aumentado de sobrevida livre de progressão e/ou sobrevida global, comparadas com células CAR-T do tipo selvagem.

[00142] Em algumas modalidades, a administração de células CAR-T com gene de GM-CSF silenciado ou com knockout desse gene ocorre com um antagonista de GM-CSF recombinante que aumenta ainda mais a expansão, persistência, resistência à senescência e resistência à anergia. Em outras modalidades, a administração de células CAR-T com gene de GM-CSF silenciado ou com knockout desse gene com um antagonista de GM-CSF recombinante reduz ainda mais a formação de MDSC. Em outras modalidades, a administração de células CAR-T com gene de GM-CSF silenciado ou com knockout desse gene com um antagonista de GM-CSF recombinante aumenta ainda mais respostas objetivas (respostas completas e respostas parciais), níveis menores de recidiva em 6 meses, 12 meses e 24 meses e demonstra um nível aumentado de sobrevida livre de progressão e/ou sobrevida global.

[00143] Em algumas modalidades, as células CAR-T são células CAR-T CD19; em outras modalidades, as células CAR-T são células CAR-T BMCA, em outras modalidades as células CAR-T são células CAR-T duplas CD19/CD22. Em outras modalidades, as células CAR-T são células CAR-T duplas CD19/CD20.

[00144] Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende a redução da ativação imune. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende a melhora de síndrome de extravasamento capilar. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende a melhora de uma disfunção cardíaca. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende a melhora de encefalopatia. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende o alívio de colite. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende a inibição de convulsões. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende a melhora de CRS. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende a melhora de neurotoxicidade. Em várias modalidades, a neurotoxicidade relacionada às células CAR- em um indivíduo é reduzida por cerca de 90%, comparada com uma redução na neurotoxicidade em um indivíduo tratado com células CAR-T e um anticorpo de controle. Em certas modalidades, o antagonista de GM-CSF recombinante é um anticorpo, em particular, um anticorpo neutralizante de GM- CSF de acordo com modalidades descritas nesse relatório descritivo, incluindo o Exemplo 15.

[00145] Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende a redução de tempestade de citocinas sintomas. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende o aumento da fração de ejeção ventricular esquerda deficiente. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende a melhora de diarréia. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende a melhora de coagulação intravascular disseminada.

[00146] Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende a redução de edema. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende o alívio de exantema. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende a redução de sangramento gastrintestinal. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende o tratamento de a perfuração gastrintestinal. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende o tratamento de linfohistiocitose hemofagocítica (HLH). Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende o tratamento de hepatose. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende a redução de hipotensão. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende a redução de hipofisite.

[00147] Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende a inibição de eventos adversos relacionados ao sistema imune. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende a redução de imunohepatite. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende a redução de imunodeficiências. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende o tratamento de isquemia. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende a redução de toxicidade hepática. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende o tratamento de síndrome de ativação de macrófagos (MAS). Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende a redução de neurotoxicidade sintomas.

[00148] Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende a redução de efusões pleurais. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende a redução de efusões pericárdicas. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende a redução de pneumonite.

[00149] Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende a redução de poliartrite. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende o tratamento de síndrome de encefalopatia posterior reversível (PRES). Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende a redução de hipertensão pulmonar. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende o tratamento de tromboembolismo. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende a redução de transaminite. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende a redução do grau de CRES, neurotoxicidade (NT) e/ou síndrome de liberação de citocinas (CRS) em um paciente. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende a melhora da pontuação de CARTOX-10 de um paciente.

[00150] Em um aspecto, essa invenção ainda fornece um método para o tratamento ou prevenção de toxicidade relacionada à imunoterapia em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de células T que expressam receptor de antígeno quimérico (células CAR-T), as células CAR-T possuindo um knockout do gene de GM-CSF (células CAR-T GM-CSFk/o), e um antagonista de hGM-CSF recombinante, como demonstrado nos Exemplos 6 e 20-21. Em algumas modalidades, as células CAR-T GM-CSFk/o expressam um nível reduzido de GM-CSF, comparado com um nível de expressão de GM-CSF por células CAR-T do tipo selvagem.

Em certas modalidades, as células CAR-T GM-CSFk/o expressam um nível de uma ou mais citocinas e/ou quimiocinas que é menor ou equivalente a um nível das (uma ou mais) citocinas e/ou quimiocinas expresso por células CAR-T do tipo selvagem.

Em modalidades particulares, as (uma ou mais) citocinas consistem em uma citocina humana selecionada do grupo que consiste em IFN-γ, GRO, MDC, IL-2, IL-3, IL-5, IL-7, IP-10, CD107a, TNF-a e VEGF.

Em algumas modalidades as (uma ou mais) citocinas são selecionadas do grupo que consiste em IFN-γ, IL-1a, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL7, IL-9, IL-10, IL- 12p40, IL-12p70, ILF, IL-13, LIX, IL-15, IP-10, KC, MCP-1, MIP-1a, MIP-1b, M-CSF MIP-2, MIG, RANTES, e TNF-a, eotaxina, G-CSF e uma combinação destes.

Em várias modalidades, o antagonista de GM-CSF recombinante é um antagonista de hGM- CSF.

Em algumas modalidades, o antagonista de GM-CSF recombinante é um anticorpo anti-GM-CSF.

Em modalidades particulares, o anticorpo anti-GM-CSF se liga a um GM-CSF humano.

Em outras modalidades, o anticorpo anti-GM-CSF se liga a um GM-CSF de primata.

Em várias modalidades, o anticorpo anti-GM-CSF se liga a um GM-CSF de mamífero.

Em algumas modalidades, o anticorpo anti-GM-CSF é um anticorpo anti-hGM-CSF.

Em certas modalidades, o anticorpo anti-hGM- CSF é um anticorpo monoclonal.

Em várias modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF é um fragmento de anticorpo que é um Fab, um Fab', um F(ab')2, um scFv ou um dAB.

Em algumas modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo neutralizante de GM-CSF humano.

Em certas modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo recombinante ou quimérico. Em várias modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo humano. Em algumas modalidades, as células CAR-T são células CAR-T CD19. Em modalidades particulares, as células CAR-T GM-CSFk/o aumentam a atividade antitumoral do antagonista de hGM-CSF recombinante. Em modalidades específicas, as células CAR-T GM-CSFk/o aumentam a sobrevida global do indivíduo, comparada com a sobrevida em um indivíduo tratado por administração de células CAR-T do tipo selvagem. Em modalidades particulares, a administração ao indivíduo das células CAR-T que possuem um knockout do gene de GM-CSF (células CAR-T GM-CSFk/o) e um antagonista de hGM- CSF recombinante é um tratamento durável para a prevenção ou tratamento de uma toxicidade relacionada à imunoterapia, por exemplo, CRS, neurotoxicidade e neuroinflamação. Em algumas modalidades, o indivíduo possui câncer. Em várias modalidades, o câncer é leucemia linfoblástica aguda. Métodos para a remoção de GM-CSF humano de um indivíduo

[00151] Em um aspecto, essa invenção fornece um método para neutralização e/ou remoção de GM-CSF humano em um indivíduo necessitado, o método compreendendo a administração ao indivíduo de células CAR-T que possuem um knockout do gene de GM-CSF (células CAR-T GM-CSFk/o).

[00152] Em uma modalidade desse método, o método ainda compreende a administração de um antagonista de hGM-CSF recombinante ao indivíduo. Em modalidades particulares, o antagonista de GM-CSF recombinante é um antagonista de hGM- CSF. Em algumas modalidades, o antagonista de GM-CSF recombinante é um anticorpo anti-GM-CSF. Em outra modalidade, o anticorpo anti-hGM-CSF é um fragmento de anticorpo que é um Fab, um Fab', um F(ab')2, um scFv ou um dAB. Em uma modalidade, o anticorpo anti-hGM-CSF possui uma sequência da região VH apresentada na Figura 1 e uma sequência da região VL apresentada na Figura 1. Em outra modalidade, as sequências de aminoácidos da região VH ou da região VL, ou tanto da região VH quanto da região VL compreendem uma metionina no terminal-N. Em uma modalidade adicional, o antagonista de hGM-CSF é selecionado do grupo que compreende um anticorpo anti-receptor de hGM-CSF ou um receptor de hGM-CSF solúvel ou subunidade do receptor, um mimético de anticorpo de citocromo b562, um análogo do peptídeo hGM-CSF, uma adnectina, um mimético de anticorpo de arcabouço de lipocalina, um mimético de anticorpo de calixareno e um peptidomimético de ligação do tipo anticorpo. Em outra modalidade, o receptor de hGM-CSF solúvel compreende uma proteína de fusão receptor de hGM-CSF solúvel-Fc. Em uma modalidade adicional, o GM-CSF é GM-CSF derivado de CAR T ou um GM-CSF não derivado de CAR T. Em algumas modalidades, o indivíduo possui uma incidência de toxicidade relacionada à imunoterapia. Métodos para a redução da ruptura da barreira hematencefálica e para preservação/manutenção da integridade da BBB

[00153] Em um aspecto, essa invenção fornece um método para a redução da ruptura da barreira hematencefálica em um indivíduo tratado com imunoterapia, o método compreendendo a administração de um antagonista de GM-CSF recombinante ao indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo possui uma incidência de toxicidade relacionada à imunoterapia.

[00154] Em certas modalidades, a imunoterapia compreende transferência adotiva de células, administração de anticorpos monoclonais, administração de citocinas, administração de uma vacina contra câncer, terapias de comprometimento de células T, ou qualquer combinação destas. Em várias modalidades, a transferência adotiva de células compreende a administração de células T que expressam receptor de antígeno quimérico (células T CAR), células T com receptor de célula T (TCR) modificado, linfócitos infiltrantes no tumor (TIL), células natural killer com receptor de antígeno quimérico (CAR) modificado ou células dendríticas, ou qualquer combinação destas. Em modalidades particulares, as células T CAR são células CAR-T CD19.

[00155] Em modalidades adicionais, o antagonista de GM- CSF recombinante é um antagonista de hGM-CSF. Em algumas modalidades, o antagonista de GM-CSF recombinante é um anticorpo anti-GM-CSF. Em várias modalidades, o anticorpo anti-GM-CSF se liga ao GM-CSF de mamífero. Em certas modalidades, o anticorpo anti-GM-CSF se liga ao GM-CSF de primata. Em algumas modalidades, o primata é um macaco, um babuíno, um macaco do gênero macaca, um chimpanzé, um gorila, um lêmure, um lóris, um társio, um gálago, um potto, um sifaka, em indri, em aye-ayes um orangotango ou um humano.

[00156] Em modalidades particulares, o anticorpo anti- GM-CSF é um anticorpo anti-hGM-CSF. Em várias modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF se liga ao GM-CSF humano. Em certas modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo monoclonal. Em várias modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF é um fragmento de anticorpo que é um Fab, um Fab', um F(ab')2, um scFv ou um dAB. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- hGM-CSF é um anticorpo neutralizante de GM-CSF humano. Em modalidades adicionais, o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo recombinante ou quimérico. Em modalidades adicionais, o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo humano. Em modalidades particulares, o anticorpo anti-hGM-CSF se liga ao mesmo epitopo que o anticorpo quimérico 19/2. Em modalidades mais particulares, o anticorpo anti-hGM-CSF compreende a CDR3 da região VH e a CDR3 da região VL do anticorpo quimérico 19/2. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF é administrado antes, concomitantemente ou depois da imunoterapia, ou uma combinação destes.

[00157] Em várias modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF compreende as CDR1, CDR2 e CDR3 da região VH e da região VL do anticorpo quimérico 19/2. Em certas modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região VH que compreende um determinante de especificidade de ligação à CDR3 RQRFPY ou RDRFPY, um segmento-J e um segmento-V, em que o segmento-J compreende pelo menos 95% de identidade para JH4 humano (YFD YWGQGTL VTVSS) e o segmento-V compreende pelo menos 90% de identidade para uma sequência VH1 1-02 ou VH1 1-03 da linhagem germinativa humana; ou uma região VH que compreende um determinante de especificidade de ligação à CDR3 RQRFPY. Em algumas modalidades, o segmento-J compreende YFDYWGQGTLVTVSS. Em certas modalidades, a CDR3 compreende RQRFPYYFDY ou RDRFPYYFDY. Em modalidades adicionais, a CDR1 da região VH é uma CDR1 de VH1 da linhagem germinativa humana; a CDR2 da região VL é uma CDR2 de VH1 da linhagem germinativa humana; ou tanto a CDR1 quanto a CDR2 são de uma sequência VH1 da linhagem germinativa humana. Ainda em outras modalidades adicionais, o anticorpo anti- hGM-CSF compreende uma CDR1 de VH, ou uma CDR2 de VH, ou tanto uma CDR1 de VH quanto uma CDR2 de VH, como mostrado em uma região VH apresentada na Figura 1. Em algumas modalidades, a sequência do segmento-V possui uma sequência do segmento-V de VH mostrada na Figura 1. Em várias modalidades, o VH possui a sequência de VH#1, VH#2, VH#3, VH#4 ou VH#5 apresentada na Figura 1. Em certas modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região VL que compreende uma CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos FNK ou FNR.

[00158] Em modalidades adicionais, o anticorpo anti-hGM- CSF compreende uma região JK4 da linhagem germinativa humana. Em modalidades particulares, a CDR3 da região VL compreende QQFN(K/R)SPL. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-hGM- CSF compreende uma região VL que compreende uma CDR3 que compreende QQFNKSPLT. Em modalidades particulares, a região VL compreende uma CDR1 ou uma CDR2, ou tanto uma CDR1 quanto uma CDR2 de uma região VL mostrada na Figura 1. Em certas modalidades, a região VL compreende um segmento-V que possui pelo menos 95% de identidade para a sequência do segmento-V de VKIII A27 como mostrada na Figura 1. Em várias modalidades, a região VL possui a sequência de VK# 1, VK#2, VK#3 ou VK#4 apresentada na Figura 1. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF possui um determinante de especificidade de ligação à CDR3 da região VH RQRFPY ou RDRFPY e uma região VL que possui uma CDR3 que compreende QQFNKSPLT. Em modalidades adicionais, o anticorpo anti-hGM- CSF possui uma sequência da região VH apresentada na Figura 1 e uma sequência da região VL apresentada na Figura 1. Ainda em outras modalidades adicionais, as sequências de aminoácidos da região VH ou da região VL, ou tanto da região

VH quanto da região VL compreendem uma metionina no terminal- N.

[00159] Em várias modalidades, o antagonista de hGM-CSF é selecionado do grupo que compreende um anticorpo anti- receptor de hGM-CSF ou um receptor de hGM-CSF solúvel, um mimético de anticorpo de citocromo b562, um análogo do peptídeo hGM-CSF, uma adnectina, um mimético de anticorpo de arcabouço de lipocalina, um mimético de anticorpo de calixareno e um peptidomimético de ligação do tipo anticorpo. Em modalidades particulares, a toxicidade relacionada à imunoterapia é toxicidade relacionada à CAR-T. Em modalidades mais particulares, a toxicidade relacionada à CAR-T é síndrome de liberação de citocinas, neurotoxicidade, neuroinflamação, ou uma combinação destas.

[00160] Em outro aspecto, essa invenção fornece um método para preservação da integridade da barreira hematencefálica em um indivíduo tratado com imunoterapia, o método compreendendo a administração de um antagonista de hGM-CSF recombinante ao indivíduo.

[00161] Em um aspecto adicional, essa invenção fornece métodos para prevenção ou redução da ruptura da barreira hematencefálica em um indivíduo tratado com imunoterapia, o método compreendendo a administração de células CAR-T que possuem um knockout do gene de GM-CSF (células CAR-T GM- CSFk/o) ao indivíduo.

[00162] Em uma modalidade dos métodos fornecidos, o antagonista de hGM-CSF recombinante é um anticorpo anti-GM- CSF. Em outra modalidade, o anticorpo anti-GM-CSF se liga ao GM-CSF de mamífero. Ainda em outra modalidade, o anticorpo anti-GM-CSF se liga ao GM-CSF de primata. Em uma modalidade adicional, o primata é um macaco, um babuíno, um macaco do gênero macaca, um chimpanzé, um gorila, um lêmure, um lóris, um társio, um gálago, um potto, um sifaka, em indri, em aye- ayes um orangotango ou um humano.

[00163] Em uma modalidade particular dos métodos fornecidos, o anticorpo anti-GM-CSF é um anticorpo anti-hGM- CSF. Em uma modalidade adicional particular, o anticorpo anti-hGM-CSF se liga ao GM-CSF humano. Ainda em outra modalidade adicional, o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo monoclonal. Em uma modalidade particular, o anticorpo anti-hGM-CSF é um fragmento de anticorpo que é um Fab, um Fab', um F(ab')2, um scFv ou um dAB. Em uma modalidade, o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo neutralizante de GM-CSF humano. Em outra modalidade, o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo recombinante ou quimérico. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo humano. Em certas modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF se liga ao mesmo epitopo que o anticorpo quimérico 19/2. Em várias modalidades, o anticorpo anti-hGM- CSF compreende a CDR3 da região VH e a CDR3 da região VL do anticorpo quimérico 19/2. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF é administrado antes, concomitantemente ou depois da imunoterapia, ou uma combinação destes.

[00164] Em uma modalidade dos métodos fornecidos, o anticorpo anti-hGM-CSF compreende as CDR1, CDR2 e CDR3 da região VH e da região VL do anticorpo quimérico 19/2. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região VH que compreende um determinante de especificidade de ligação à CDR3 RQRFPY ou RDRFPY, um segmento-J e um segmento-V, em que o segmento-J compreende pelo menos 95% de identidade para JH4 humano (YFD YWGQGTL VTVSS) e o segmento- V compreende pelo menos 90% de identidade para uma sequência VH1 1-02 ou VH1 1-03 da linhagem germinativa humana; ou uma região VH que compreende um determinante de especificidade de ligação à CDR3 RQRFPY.

Em certas modalidades, o segmento- J compreende YFDYWGQGTLVTVSS.

Em modalidades particulares, a CDR3 compreende RQRFPYYFDY ou RDRFPYYFDY.

Em algumas modalidades, a CDR1 da região VH é uma CDR1 de VH1 da linhagem germinativa humana; a CDR2 da região VL é uma CDR2 de VH1 da linhagem germinativa humana; ou tanto a CDR1 quanto a CDR2 são de uma sequência VH1 da linhagem germinativa humana.

Em uma modalidade particular, o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma CDR1 de VH, ou uma CDR2 de VH, ou tanto uma CDR1 de VH quanto uma CDR2 de VH, como mostrado em uma região VH apresentada na Figura 1. Em uma modalidade, a sequência do segmento-V possui uma sequência do segmento-V de VH mostrada na Figura 1. Em algumas modalidades, o VH possui a sequência de VH#1, VH#2, VH#3, VH#4 ou VH#5 apresentada na Figura 1. Em várias modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região VL que compreende uma CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos FNK ou FNR.

Em certas modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região JK4 da linhagem germinativa humana.

Em uma modalidade, a CDR3 da região VL compreende QQFN(K/R)SPL.

Em certas modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região VL que compreende uma CDR3 que compreende QQFNKSPLT.

Em algumas modalidades, a região VL compreende uma CDR1 ou uma CDR2, ou tanto uma CDR1 quanto uma CDR2 de uma região VL mostrada na Figura 1. Em várias modalidades, a região VL compreende um segmento-V que possui pelo menos 95% de identidade para a sequência do segmento-V de VKIII A27 como mostrada na Figura 1. Em modalidades particulares, a região VL possui a sequência de VK# 1, VK#2, VK#3 ou VK#4 apresentada na Figura 1. Em modalidades particulares, o anticorpo anti- hGM-CSF possui um determinante de especificidade de ligação à CDR3 da região VH RQRFPY ou RDRFPY e uma região VL que possui uma CDR3 que compreende QQFNKSPLT. Em modalidades adicionais, o anticorpo anti-hGM-CSF possui uma sequência da região VH apresentada na Figura 1 e uma sequência da região VL apresentada na Figura 1. Em algumas modalidades, as sequências de aminoácidos da região VH ou da região VL, ou tanto da região VH quanto da região VL compreendem uma metionina no terminal-N. Em certas modalidades, o antagonista de hGM-CSF é selecionado do grupo que compreende um anticorpo anti-receptor de hGM-CSF ou um receptor de hGM- CSF solúvel, um mimético de anticorpo de citocromo b562, um análogo do peptídeo hGM-CSF, uma adnectina, um mimético de anticorpo de arcabouço de lipocalina, um mimético de anticorpo de calixareno e um peptidomimético de ligação do tipo anticorpo. Em uma modalidade particular dos métodos fornecidos, o indivíduo possui uma toxicidade relacionada à imunoterapia. Em uma modalidade adicional, a toxicidade relacionada à imunoterapia é toxicidade relacionada à CAR- T. Em modalidades adicionais, a toxicidade relacionada à CAR-T é síndrome de liberação de citocinas, neurotoxicidade, neuroinflamação, ou uma combinação destas.

[00165] Em um aspecto adicional, essa invenção fornece um método para diminuição ou prevenção de neuroinflamação induzida por terapia com células CAR-T em um indivíduo necessitado, o método compreendendo a administração de um antagonista de GM-CSF recombinante ao indivíduo.

[00166] Em algumas modalidades, a administração do antagonista de GM-CSF recombinante reduz a ruptura da barreira hematencefálica mantendo, dessa forma, sua integridade. Em modalidades particulares, a redução da ruptura da barreira hematencefálica diminui ou evita um influxo de citocinas pró-inflamatórias para dentro do sistema nervoso central. Em várias modalidades, as citocinas pró-inflamatórias são selecionadas do grupo que consiste em IP-10, IL-2, IL-3, IL-5, IL-1Ra, VEGF, TNF-a, FGF-2, IFN-γ, IL-12p40, IL-12p70, sCD40L, MDC, MCP-1, MIP-1a, MIP-1b ou uma combinação destas. Em certas modalidades, as citocinas pró-inflamatórias são selecionadas do grupo que consiste em IL-1a, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-6, IL-9, IL-10, IP-10, KC, MCP- 1, MIP ou uma combinação destas. Em modalidades particulares, a neuroinflamação no indivíduo é diminuída por 75% a 95%, comparado com um indivíduo tratado com terapia com células CAR-T e um anticorpo de controle. Em várias modalidades, a diminuição de 75% a 95% na neuroinflamação é similar à neuroinflamação em um indivíduo de controle não tratado. Em algumas modalidades, o indivíduo é administrado com células T que expressam receptor de antígeno quimérico (células T CAR). Em certas modalidades, o indivíduo é administrado com células T com receptor de célula T (TCR) modificado, linfócitos infiltrantes no tumor (TIL), células natural killer com receptor de antígeno quimérico (CAR) modificado ou células dendríticas, ou qualquer combinação destas. Em modalidades particulares, as células T CAR são células CAR- T CD19. Em várias modalidades, o antagonista de GM-CSF recombinante é um antagonista de hGM-CSF. Em certas modalidades, o antagonista de GM-CSF recombinante é um anticorpo anti-GM-CSF. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-GM-CSF se liga ao GM-CSF de mamífero. Em modalidades adicionais, o anticorpo anti-GM-CSF se liga ao GM-CSF de primata. Em algumas modalidades, o primata é um macaco, um babuíno, um macaco do gênero macaca, um chimpanzé, um gorila, um lêmure, um lóris, um társio, um gálago, um potto, um sifaka, em indri, em aye-ayes um orangotango ou um humano. Em uma modalidade, o anticorpo anti-GM-CSF é um anticorpo anti-hGM-CSF. Em outra modalidade, o anticorpo anti-hGM-CSF se liga ao GM-CSF humano. Em uma modalidade adicional, o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo monoclonal. Ainda em outra modalidade adicional, o anticorpo anti-hGM-CSF é um fragmento de anticorpo que é um Fab, um Fab', um F(ab')2, um scFv ou um dAB. Em modalidades particulares, anticorpo anti- hGM-CSF é um anticorpo neutralizante de GM-CSF humano.

[00167] Em várias modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo recombinante ou quimérico. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo humano. Em modalidades particulares, o anticorpo anti-hGM-CSF se liga ao mesmo epitopo que o anticorpo quimérico 19/2. Em modalidades adicionais, o anticorpo anti-hGM-CSF compreende a CDR3 da região VH e a CDR3 da região VL do anticorpo quimérico 19/2. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- hGM-CSF é administrado antes, concomitantemente ou depois da imunoterapia, ou uma combinação destes.

[00168] Ainda em outras modalidades adicionais, o anticorpo anti-hGM-CSF compreende as CDR1, CDR2 e CDR3 da região VH e da região VL do anticorpo quimérico 19/2. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região VH que compreende um determinante de especificidade de ligação à CDR3 RQRFPY ou RDRFPY, um segmento-J e um segmento-V, em que o segmento-J compreende pelo menos 95% de identidade para JH4 humano (YFD YWGQGTL VTVSS) e o segmento- V compreende pelo menos 90% de identidade para uma sequência VH1 1-02 ou VH1 1-03 da linhagem germinativa humana; ou uma região VH que compreende um determinante de especificidade de ligação à CDR3 RQRFPY Em várias modalidades, o segmento- J compreende YFDYWGQGTLVTVSS.

[00169] Em modalidades particulares, a CDR3 compreende RQRFPYYFDY ou RDRFPYYFDY. Em algumas modalidades, a CDR1 da região VH é uma CDR1 de VH1 da linhagem germinativa humana; a CDR2 da região VL é uma CDR2 de VH1 da linhagem germinativa humana; ou tanto a CDR1 quanto a CDR2 são de uma sequência VH1 da linhagem germinativa humana. Em várias modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma CDR1 de VH, ou uma CDR2 de VH, ou tanto uma CDR1 de VH quanto uma CDR2 de VH, como mostrado em uma região VH apresentada na Figura 1. Em certas modalidades, a sequência do segmento-V possui uma sequência do segmento-V de VH mostrada na Figura 1. Em modalidades particulares, o VH possui a sequência de VH#1, VH#2, VH#3, VH#4 ou VH#5 apresentada na Figura 1. Em modalidades adicionais, o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região VL que compreende uma CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos FNK ou FNR. Ainda em outras modalidades adicionais, o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região JK4 da linhagem germinativa humana. Em algumas modalidades, a CDR3 da região VL compreende QQFN(K/R)SPL. Em certas modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região VL que compreende uma CDR3 que compreende QQFNKSPLT. Em várias modalidades, a região VL compreende uma CDR1 ou uma CDR2, ou tanto uma CDR1 quanto uma CDR2 de uma região VL mostrada na Figura 1. Em modalidades adicionais, a região VL compreende um segmento-V que possui pelo menos 95% de identidade para a sequência do segmento-V de VKIII A27 como mostrada na Figura 1. Ainda em outras modalidades adicionais, a região VL possui a sequência de VK# 1, VK#2, VK#3 ou VK#4 apresentada na Figura 1.

[00170] Em certas modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF possui um determinante de especificidade de ligação à CDR3 da região VH RQRFPY ou RDRFPY e uma região VL que possui uma CDR3 que compreende QQFNKSPLT. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF possui uma sequência da região VH apresentada na Figura 1 e uma sequência da região VL apresentada na Figura 1. Em várias modalidades, as sequências de aminoácidos da região VH ou da região VL, ou tanto da VH quanto da região VL compreendem uma metionina no terminal-N.

[00171] Em modalidades adicionais, o antagonista de hGM- CSF é selecionado do grupo que compreende um anticorpo anti- receptor de hGM-CSF ou um receptor de hGM-CSF solúvel, um mimético de anticorpo de citocromo b562, um análogo do peptídeo hGM-CSF, uma adnectina, um mimético de anticorpo de arcabouço de lipocalina, um mimético de anticorpo de calixareno e um peptidomimético de ligação do tipo anticorpo. Em algumas modalidades. o indivíduo ainda possui uma toxicidade relacionada à CAR-T selecionada de síndrome de liberação de citocinas, neurotoxicidade, ou uma combinação destas. Métodos para redução da taxa de recidiva ou de prevenção de sua ocorrência

[00172] Em um aspecto, essa invenção fornece um método para redução da taxa de recidiva ou prevenção da ocorrência de recidiva do tumor em um indivíduo tratado com imunoterapia, o método compreendendo a administração ao indivíduo de um antagonista de GM-CSF recombinante. Em algumas modalidades, a redução da taxa de recidiva ou a prevenção da ocorrência de recidiva do tumor no indivíduo ocorre na ausência de uma incidência de toxicidade relacionada à imunoterapia. Em certas modalidades, a redução da taxa de recidiva ou a prevenção da ocorrência de recidiva do tumor no indivíduo ocorre na presença de uma incidência de toxicidade relacionada à imunoterapia. Em algumas modalidades, o antagonista de GM-CSF recombinante é um antagonista de hGM-CSF. Em várias modalidades, o antagonista de GM-CSF recombinante é um anticorpo anti-GM-CSF. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-GM-CSF se liga a um GM-CSF humano. Em certas modalidades, o anticorpo anti-GM-CSF se liga a um GM-CSF de primata. Em várias modalidades, o primata é selecionado de um macaco, um babuíno, um macaco do gênero macaca, um chimpanzé, um gorila, um lêmure, um lóris, um társio, um gálago, um potto, um sifaka, em indri, em aye- ayes ou um orangotango. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-GM-CSF se liga a um GM-CSF de mamífero.

[00173] Em modalidades particulares, o anticorpo anti- GM-CSF é um anticorpo anti-hGM-CSF. Como descrito acima, o anticorpo anti-GM-CSF é um anticorpo monoclonal. Em outra modalidade, o anticorpo anti-hGM-CSF é um fragmento de anticorpo que é um Fab, um Fab', um F(ab')2, um scFv ou um dAB. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo neutralizante de GM-CSF humano. Em certas modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo recombinante ou quimérico. Em várias modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo humano. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF se liga ao mesmo epitopo que o anticorpo quimérico 19/2. Em certas modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF compreende a CDR3 da região VH e a CDR3 da região VL do anticorpo quimérico 19/2. Em várias modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF compreende as CDR1, CDR2 e CDR3 da região VH e da região VL do anticorpo quimérico 19/2. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- hGM-CSF compreende uma região VH que compreende um determinante de especificidade de ligação à CDR3 RQRFPY ou RDRFPY, um segmento-J e um segmento-V, em que o segmento-J compreende pelo menos 95% de identidade para JH4 humano (YFD YWGQGTL VTVSS) e o segmento-V compreende pelo menos 90% de identidade para uma sequência VH1 1-02 ou VH1 1-03 da linhagem germinativa humana; ou uma região VH que compreende um determinante de especificidade de ligação à CDR3 RQRFPY. Em modalidades particulares, o segmento-J compreende YFDYWGQGTLVTVSS. Em modalidades adicionais, a CDR3 compreende RQRFPYYFDY ou RDRFPYYFDY. Em algumas modalidades, a CDR1 da região VH é uma CDR1 de VH1 da linhagem germinativa humana; a CDR2 da região VL é uma CDR2 de VH1 da linhagem germinativa humana; ou tanto a CDR1 quanto a CDR2 são de uma sequência VH1 da linhagem germinativa humana.

[00174] Em certas modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma CDR1 de VH, ou uma CDR2 de VH, ou tanto uma CDR1 de VH quanto uma CDR2 de VH, como mostrado em uma região VH apresentada na Figura 1. Em várias modalidades, a sequência do segmento-V possui uma sequência do segmento-V de VH mostrada na Figura 1. Em certas modalidades, o VH possui a sequência de VH#1, VH#2, VH#3, VH#4 ou VH#5 apresentada na Figura 1. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região VL que compreende uma CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos FNK ou FNR. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região JK4 da linhagem germinativa humana. Em certas modalidades, a CDR3 da região VL compreende QQFN(K/R)SPLT. Em várias modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região VL que compreende uma CDR3 que compreende QQFNKSPLT. Em algumas modalidades, a região VL compreende uma CDR1 ou uma CDR2, ou tanto uma CDR1 quanto uma CDR2 de uma região VL mostrada na Figura 1. Em modalidades particulares, a região VL compreende um segmento-V que possui pelo menos 95% de identidade para a sequência do segmento-V de VKIII A27 como mostrada na Figura 1. Em algumas modalidades, a região VL possui a sequência de VK# 1, VK#2, VK#3 ou VK#4 apresentada na Figura 1. Em certas modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF possui um determinante de especificidade de ligação à CDR3 da região VH RQRFPY ou RDRFPY e uma região VL que possui uma CDR3 que compreende QQFNKSPLT. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF possui uma sequência da região VH apresentada na Figura 1 e uma sequência da região VL apresentada na Figura 1. Em outras modalidades, as sequências de aminoácidos da região VH ou da região VL, ou tanto da região VH quanto da região VL compreendem uma metionina no terminal-N.

[00175] Em algumas modalidades, o antagonista de hGM-CSF é selecionado do grupo que compreende um anticorpo anti-

receptor de hGM-CSF ou um receptor de hGM-CSF solúvel, um mimético de anticorpo de citocromo b562, um análogo do peptídeo hGM-CSF, uma adnectina, um mimético de anticorpo de arcabouço de lipocalina, um mimético de anticorpo de calixareno e um peptidomimético de ligação do tipo anticorpo. Em certas modalidades, as células CAR-T são células CAR-T CD19. Em modalidades particulares, a toxicidade relacionada à imunoterapia é toxicidade relacionada à CAR-T. Em algumas modalidades, a toxicidade relacionada à CAR-T é CRS, NT ou neuroinflamação.

[00176] Em modalidades particulares, a ocorrência da recidiva do tumor é reduzida de 50% para 100% nos primeiros três meses de um ano após administração do antagonista de GM-CSF recombinante, comparada com a ocorrência da recidiva do tumor em um indivíduo tratado com imunoterapia e não administrado com um antagonista de GM-CSF recombinante. Em certas modalidades, a ocorrência da recidiva do tumor é reduzida de 50% para 95% nos primeiros seis meses após administração do antagonista de GM-CSF recombinante. Em várias modalidades, a ocorrência da recidiva do tumor é reduzida de 50% para 90% no primeiro ano após administração do antagonista de GM-CSF recombinante. Em algumas modalidades, a ocorrência da recidiva do tumor é evitada por longo prazo. Como usado nesse relatório descritivo, o termo “de longo prazo” significa durante um período de tempo estendido de pelo menos um ano, ou seja, 12 meses, desde a última data de tratamento com um antagonista de hGM-CSF recombinante. Em algumas modalidades, o antagonista de hGM- CSF recombinante é um anticorpo neutralizante de hGM-CSF. Em várias modalidades, o antagonista de hGM-CSF recombinante é um anticorpo anti-hGM-CSF, por exemplo, Lenzilumab. Em certas modalidades, a ocorrência da recidiva do tumor é evitada por 12-36 meses. Em algumas modalidades, a ocorrência da recidiva do tumor é evitada “completamente” (100%), o que, como usado nesse relatório descritivo, significa que não há recorrência do tumor por pelo menos 12 meses, desde a última data de tratamento com um antagonista de hGM-CSF recombinante. Em certas modalidades, o indivíduo possui leucemia linfoblástica aguda.

[00177] Em várias modalidades dos métodos fornecidos nesse relatório descritivo para redução da taxa de recidiva ou prevenção da ocorrência de recidiva do tumor em um indivíduo tratado com imunoterapia, o indivíduo possui um “câncer refratário” que, como usado nesse relatório descritivo, é (a) uma malignidade (também chamada “câncer” ou um “tumor” nesse relatório descritivo) para o qual a cirurgia é ineficaz e é (b) inicialmente não responsivo ou resistente ao tratamento, em que o tratamento é quimioterapia, radiação ou uma combinação destes, ou é (b) uma malignidade que se torna ou se tornou não responsivo aos tratamentos mencionados anteriormente. Em algumas modalidades, o indivíduo possui um câncer “recidivado” que, como usado nesse relatório descritivo, é um câncer que respondeu ao tratamento, mas retornou. Em modalidades particulares, o câncer refratário ou o câncer recidivado é linfoma não-Hodgkin (NHL). Em várias modalidades, o câncer refratário ou o câncer recidivado é linfoma não-Hodgkin (NHL). Em certas modalidades, o câncer refratário é linfoma não-Hodgkin de célula B agressivo refratário. Em algumas modalidades, o câncer refratário ou o câncer recidivado é linfoma de célula B refratário à quimioterapia.

Em várias modalidades, o câncer refratário ou o câncer recidivado é câncer de próstata hormônio-refratário.

Em certas modalidades, o câncer refratário ou o câncer recidivado é um câncer pediátrico.

Em algumas modalidades, o câncer pediátrico refratário ou o câncer pediátrico recidivado é neuroblastoma.

Em modalidades particulares, o câncer pediátrico refratário ou o câncer pediátrico recidivado é uma leucemia pediátrica selecionada do grupo que consiste em leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mielógena aguda (AML) ou uma leucemia pediátrica incomum que é leucemia mielomonocítica juvenil ou leucemia mielóide crônica.

Em certas modalidades, o câncer refratário ou o câncer recidivado é um câncer ósseo pediátrico.

Em algumas modalidades, o câncer refratário ou o câncer recidivado é um câncer adrenal.

Em várias modalidades, o câncer refratário ou o câncer recidivado é um câncer de mama.

Em certas modalidades, o câncer refratário ou o câncer recidivado é um câncer do cólon, câncer retal ou câncer cólon-retal.

Em modalidades particulares, o câncer refratário ou o câncer recidivado é um linfoma de célula T.

Em algumas modalidades, o câncer refratário ou o câncer recidivado é um câncer da cabeça e pescoço.

Em algumas modalidades, o câncer refratário ou o câncer recidivado é um câncer do cérebro e/ou da medula espinhal incluindo, sem limitação, glioma ou glioblastoma.

Em modalidades adicionais, o câncer refratário ou o câncer recidivado é um tumor de tecido ósseo ou mole incluindo, sem limitação, um condrossarcoma.

Em várias modalidades, o câncer refratário ou o câncer recidivado é um câncer ósseo.

Em algumas modalidades, o câncer refratário ou o câncer recidivado é câncer esofágico.

Em certas modalidades, o câncer refratário ou o câncer recidivado é um câncer da vesícula biliar.

Em algumas modalidades, o câncer refratário ou o câncer recidivado é um câncer renal.

Em várias modalidades, o câncer refratário ou o câncer recidivado é melanoma.

Em algumas modalidades, o câncer refratário ou o câncer recidivado é um câncer ovariano.

Em certas modalidades, o câncer refratário ou o câncer recidivado é um câncer pancreático.

Em algumas modalidades, o câncer refratário ou o câncer recidivado é um câncer da pele selecionado de um carcinoma de célula basal, um carcinoma de célula escamosa ou um melanoma.

Em várias modalidades, o câncer refratário ou o câncer recidivado é um câncer de pulmão.

Em algumas modalidades, o câncer refratário ou o câncer recidivado é um câncer da glândula salivar.

Em modalidades adicionais, o câncer refratário ou o câncer recidivado é um câncer de músculo liso uterino.

Em algumas modalidades, o câncer refratário ou o câncer recidivado é um câncer testicular.

Em várias modalidades, o câncer refratário ou o câncer recidivado é um câncer do estômago ou um câncer gastrintestinal.

Em certas modalidades, o câncer refratário ou o câncer recidivado é um câncer da bexiga.

Em modalidades adicionais, o câncer refratário ou o câncer recidivado é uma neoplasia do tecido adiposo.

Em algumas modalidades, o câncer pediátrico refratário ou o câncer pediátrico recidivado é um adenocarcinoma.

Em certas modalidades, o câncer refratário ou o câncer recidivado é um timoma.

Em várias modalidades, o câncer refratário ou o câncer recidivado é um angiossarcoma, ou seja, um câncer do revestimento interno de vasos sanguíneos, que pode ocorrer em qualquer parte do corpo incluindo, sem limitação, pele, mama, fígado, baço e tecido profundo, ou seja, tumores localizados profundamente. Em algumas modalidades, o câncer refratário ou o câncer recidivado é uma metástase de qualquer um dos cânceres refratários ou oS cânceres recidivados mencionados anteriormente.

[00178] Em algumas modalidades, a imunoterapia é uma imunoterapia de ativação. Em algumas modalidades, a imunoterapia é fornecida como um tratamento do câncer. Em algumas modalidades, a imunoterapia compreende transferência adotiva de células.

[00179] Em algumas modalidades, a transferência adotiva de células compreende a administração de uma célula T que expressa receptor de antígeno quimérico (célula T CAR). Aqueles habilitados na técnica compreenderiam que CARs são um tipo de receptor direcionado ao antígeno composto por domínios de sinalização intracelulares de célula T fundidos a porções de ligação ao tumor extracelulares, mais comumente fragmentos variáveis de cadeia única (scFvs) de anticorpos monoclonais. CARs reconhecem diretamente antígenos da superfície celular, independente de apresentação mediada por MHC, permitindo o uso de uma construção de receptor única específica para certo antígeno em todos os pacientes. CARs iniciais fundiam domínios de reconhecimento de antígeno à cadeia de ativação de CD3ζ do complexo receptor de célula T (TCR). Embora essas CARs de primeira-geração induzissem função efetora de célula T in vitro, elas eram amplamente limitadas por eficácia antitumoral pobre in vivo. As iterações de CAR subsequentes incluíram sinais coestimulantes secundários em tandem com CD3ζ, incluindo domínios intracelulares de CD28 ou diversas moléculas da família do receptor de TNF como, por exemplo, 4-1BB (CD137) e OX40 (CD134). Além disso, receptores de terceira-geração incluem dois sinais coestimulantes além de CD3ζ, mais comumente de CD28 e 4-1BB. CARs de segunda e terceira-geração aumentam dramaticamente a eficácia antitumoral, em alguns casos induzindo remissões completas em pacientes com câncer avançado. Em uma modalidade, uma célula T CAR é uma célula imunorresponsiva modificada para expressar CARs, que é ativada quando CARs se ligam ao seu antígeno.

[00180] Em uma modalidade, uma célula T CAR é uma célula imunorresponsiva que compreende um receptor de antígeno, que é ativado quando seu receptor se liga ao seu antígeno. Em uma modalidade, as células T CAR usadas nas composições e métodos como revelados nesse relatório descritivo são células T CAR de primeira-geração. Em outra modalidade, as células T CAR usadas nas composições e métodos como revelados nesse relatório descritivo são células T CAR de segunda- geração. Em outra modalidade, as células T CAR usadas nas composições e métodos como revelados nesse relatório descritivo são células T CAR de terceira-geração. Em outra modalidade, as células T CAR usadas nas composições e métodos como revelados nesse relatório descritivo são células T CAR de quarta-geração.

[00181] Em algumas modalidades, a transferência adotiva de células compreende a administração de células T com receptor de célula T (TCR) modificado. Aqueles habilitados na técnica compreenderiam que células T com TCR modificado são fabricadas por isolamento de células T de tecido tumoral e isolamento de suas cadeias TCRα e TCRβ. Essas TCRα e TCRβ são posteriormente clonadas e transfectadas em células T isoladas do sangue periférico, que então expressam TCRα e TCRβ por células T que reconhecem o tumor.

[00182] Em algumas modalidades, a transferência adotiva de células compreende a administração de linfócitos infiltrantes do tumor (TIL). Em algumas modalidades, a transferência adotiva de células compreende a administração de células NK modificadas com receptor de antígeno quimérico (CAR). Aqueles habilitados na técnica compreenderiam que células NK modificadas com CAR compreendem células NK isoladas do paciente ou NK modificada geneticamente disponível comercialmente para expressar uma CAR que reconhece uma proteína tumor-específica.

[00183] Em algumas modalidades, a transferência adotiva de células compreende a administração de células dendríticas.

[00184] Em algumas modalidades, a imunoterapia compreende a administração de anticorpos monoclonais. Em algumas modalidades, os anticorpos monoclonais se aderem a proteínas específicas em células de câncer, sinalizando as células, dessa forma, para que o sistema imune a encontrem e a destruam. Em algumas modalidades, os anticorpos monoclonais funcionam por inibição de pontos de verificação imune impedindo, dessa forma, a inibição do sistema imune por células de câncer. Em algumas modalidades, os anticorpos monoclonais aumentam a utilidade de CAR-T para apresentar sinergia com inibidores do ponto de verificação.

[00185] Em algumas modalidades, o anticorpo visa uma proteína selecionada do grupo que compreende: 5AC, 5T4, quinase do tipo receptor de activina- 1, AGS-22M6, alfa-

fetoproteína, angiopoietina 2, angiopoietina 3, B7-H3, BAFF, BCMA, C242 antígeno, CA-125, anidrase carbônica 9, CCR4, CD125, CD152, CD184, CD19, CD2, CD20, CD200, CD22, CD221, CD23, CD25, CD27, CD274, CD276, CD28, CD3, CD30, CD33, CD37, CD38, CD4, CD40, CD41, CD44 v6, CD49b, CD5, CD51, CD52, CD54, CD56, CD6, CD70, CD74, CD79B, CD80, CEA, CFD, CGRP, ch4D5, CLDN18.2, fator de aglomeração A, CSF1R, CSF2, CTGF, CTLA- 4, DLL3, DLL4, DPP4, DR5, EGFL7, EGFR, endoglina, EpCAM, receptor de efrina A3, episialina, ERBB3 (HER3), FAP, FGF 23, fibrina II, cadeia beta, domínio extra de fibronectina- B, folato hidrolase, receptor de folato, receptor de Frizzled, GCGR, gangliosídeo, gangliosídeo GD3, GDF-8, glipicano 3, GM-CSF, receptor de cadeia-α de GM-CSF, GPNMB, GUCY2C, HER1, HER2/neu, HGF, HHGFR, complexo de histona, receptor quinase de fator de dispersão humana, TNF humano, ICOSL, IFN-α, IGF1, IGF2, IGHE, IL-17A, IL-13, IL1A, IL-2, IL-6, receptor de IL-6, IL-8, IL-9, ILGF2, integrina α4, integrina α5β1, integrina α7 β7, integrina αvβ3, IP10, KIR2D, KLRC1, antígeno de Lewis-Y, MAGE-A, MCP-1, mesotelina, MIF, MIG, MIP1β, MS4A1, MSLN, MUC1, mucina CanAg, ácido N- glicolilneuramínico, NOGO-A, Notch 1, receptor de Notch, NRP1, OX-40, PD-1, PDCD1, PDGF-R α, co-transportador de fosfato-sódio, fosfatidil-serina, receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas beta, células de carcinoma prostático, RHD, RON, RTN4, SDC1, sIL2Rα, SLAMF7, SOST, esfingosina-1-fosfato, Staphylococcus aureus, STEAP1, TAG- 72, receptor de célula T, TEM1, tenascina C, TFPI, TGF beta 1, TGF beta 2, TGF-β, membro 4 da superfamília de TNFR, TNF- α, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRP-1, TRP-2, TSLP, antígeno tumoral CTAA16.88, glicosilação tumor-específica de MUC1, transdutor do sinal cálcio associado ao 2, receptor TWEAK, TYRP1 (glicoproteína 75), VEGFA, VEGFR-1, VEGFR2, vimentina e VWF.

[00186] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo biespecífico. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo biespecífico de engajamento de célula T (BiTE). Em algumas modalidades, o anticorpo é selecionado de um grupo que compreende: ipilimumab, nivolumab, pembrolizumab, atezolizumab, avelumab, durvalumab, rituximab, TGN1412, alemtuzumab, OKT3 ou qualquer combinação destes.

[00187] Em algumas modalidades, a imunoterapia compreende a administração de citocinas. Aqueles habilitados na técnica compreenderiam que citocinas podem ser administradas a fim de intensificar o sistema imune para atacar o tumor por aumento de seu reconhecimento e morte por células imunes citotóxicas. Em algumas modalidades, a citocina é selecionada de um grupo que compreende: IFNα, IFNβ, IFNγ, IFNλ, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21, IL- 11, IL-12, IL-18, GM-CSF, TNFα, ou qualquer combinação destas.

[00188] Em algumas modalidades, a imunoterapia compreende a administração de inibidores do ponto de verificação imune. Aqueles habilitados na técnica compreenderiam que pontos de verificação imune são proteínas da membrana que impedem que as células T ataquem as células que as expressam. Pontos de verificação imune são frequentemente expressos por células de câncer evitando, dessa forma, que células T as ataquem. Em algumas modalidades, as proteínas do ponto de verificação compreendem PD-1/PD-L1 e CTLA-4/B7-1/B7-2. Foi demonstrado que o bloqueio de proteínas do ponto de verificação destrava a inibição de células T para atacar e matar células de câncer. Em algumas modalidades, os inibidores do ponto de verificação são selecionados de um grupo que compreende moléculas que bloqueiam CTLA-4, PD-1 ou PD-L1. Em algumas modalidades, os inibidores do ponto de verificação são anticorpos ou partes destes.

[00189] Em algumas modalidades, a imunoterapia compreende a administração de polissacarídeos. Aqueles habilitados na técnica compreenderiam que certos polissacarídeos encontrados no cogumelo intensificam o sistema imune e suas propriedades anticâncer. Em algumas modalidades, polissacarídeos são beta-glucanos ou lentinan.

[00190] Em algumas modalidades, a imunoterapia compreende a administração de uma vacina contra câncer. Aqueles habilitados na técnica compreenderiam que uma vacina contra câncer expõe o sistema imune a um antígeno câncer- específico e um adjuvante. Em algumas modalidades, a vacina contra câncer é selecionada de um grupo que compreende: sipuleucel-T, GVAX, ADXS11-001, ADXS31-001, ADXS31-164, vacina ALVAC-CEA, Vacina AC, talimogeno laherparepvec, BiovaxID, Prostvac, CDX110, CDX1307, CDX1401, CimaVax-EGF, CV9104, DNDN, NeuVax, Ae-37, GRNVAC, tarmogens, GI-4000, GI- 6207, GI-6301, Terapia ImPACT, IMA901, hepcortespenlisimut- L, Stimuvax, DCVax-L, DCVax-Direct, Próstata DCVax, CBLI, Cvac, RGSH4K, SCIB1, NCT01758328 e PVX-410. Métodos para a redução de um nível de uma citocina ou quimiocina diferente de GM-CSF

[00191] Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende a diminuição da concentração de pelo menos um fator associado à inflamação em um fluido corporal.

Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende a diminuição da concentração de pelo menos um fator associado à inflamação no soro.

Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende a diminuição da concentração de pelo menos um fator associado à inflamação no líquido cefalorraquidiano (LCR). Em algumas modalidades, são revelados nesse relatório descritivo métodos para a diminuição da concentração de pelo menos um fator associado à inflamação no soro.

Em algumas modalidades, são revelados nesse relatório descritivo métodos para a diminuição da concentração de pelo menos um fator associado à inflamação em um líquido tecidual.

Em algumas modalidades, são revelados nesse relatório descritivo métodos para a diminuição da concentração de pelo menos um fator associado à inflamação no LCR.

Em algumas modalidades, a concentração de pelo menos um fator associado à inflamação no soro é diminuída.

Em algumas modalidades, a concentração de pelo menos um fator associado à inflamação em um líquido tecidual é diminuída.

Em algumas modalidades, a concentração de pelo menos um fator associado à inflamação no LCR é diminuída.

Aqueles habilitados na técnica compreenderiam que a diminuição da concentração de um fator associado à inflamação compreende a diminuição ou inibição da produção do referido fator associado à inflamação em um indivíduo, ou a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia em um indivíduo.

Em outra modalidade, a diminuição ou inibição da produção de um fator associado à inflamação compreende o tratamento de toxicidade relacionada à imunoterapia. Em outra modalidade, a diminuição ou inibição da produção de um fator associado à inflamação compreende a prevenção da toxicidade relacionada à imunoterapia. Em outra modalidade, a diminuição ou inibição da produção de um fator associado à inflamação níveis compreende o alívio de toxicidade relacionada à imunoterapia. Em outra modalidade, a diminuição ou inibição da produção de um fator associado à inflamação compreende a melhora de toxicidade relacionada à imunoterapia.

[00192] Em algumas modalidades, o fator associado à inflamação é uma citocina. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende a diminuição da concentração de pelo menos uma citocina no soro. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou da severidade da toxicidade relacionada à imunoterapia compreende a diminuição da concentração de pelo menos uma citocina no LCR.

[00193] Em algumas modalidades, a citocina é hGM-CSF. Em algumas modalidades, a citocina é interleucina (IL)-1β. Em algumas modalidades, a citocina é IL-2. Em algumas modalidades, a citocina é sIL2Rα. Em algumas modalidades, a citocina é IL-5. Em algumas modalidades, a citocina é IL-6. Em algumas modalidades, a citocina é IL-8. Em algumas modalidades, a citocina é IL-10. Em algumas modalidades, a citocina é IP10. Em algumas modalidades, a citocina é IL-13. Em algumas modalidades, a citocina é IL-15. Em algumas modalidades, a citocina é fator de necrose tumoral α (TNFα).

Em algumas modalidades, a citocina é interferon γ (IFNγ). Em algumas modalidades, a citocina é monocina induzida por interferon-gama (MIG). Em algumas modalidades, a citocina é proteína inflamatória de macrófago (MIP) 1β. Em algumas modalidades, a citocina é proteína C-reativa. Em algumas modalidades, a diminuição ou inibição da produção de níveis de citocinas compreende a diminuição ou inibição da produção de uma citocina. Em algumas modalidades, a diminuição ou inibição da produção de níveis de citocinas compreende a diminuição ou inibição da produção de pelo menos uma citocina. Em algumas modalidades, a diminuição ou inibição da produção de níveis de citocinas compreende a diminuição ou inibição da produção de diversas citocinas.

[00194] Em um aspecto, essa invenção fornece um método de redução de um nível de uma citocina ou quimiocina diferente de GM-CSF em um indivíduo que possui uma incidência de toxicidade relacionada à imunoterapia, o método compreendendo a administração ao indivíduo de um antagonista de hGM-CSF recombinante, em que o nível da citocina ou quimiocina é reduzido, comparado com o nível desta em um indivíduo administrado com um anticorpo de controle de isótipo durante a incidência de toxicidade relacionada à imunoterapia. Em algumas modalidades, a imunoterapia compreende transferência adotiva de células, administração de anticorpos monoclonais, administração de uma vacina contra câncer, terapias de comprometimento de células T, ou qualquer combinação destas. Em certas modalidades, a transferência adotiva de células compreende a administração de células T que expressam receptor de antígeno quimérico (células T CAR), células T com receptor de célula T (TCR)

modificado, linfócitos infiltrantes no tumor (TIL), células natural killer com receptor de antígeno quimérico (CAR) modificado ou células dendríticas, ou qualquer combinação destas. Em algumas modalidades, as células CAR-T são células CAR-T CD19. Em certas modalidades, o antagonista de GM-CSF recombinante é um antagonista de hGM-CSF. Em várias modalidades, o antagonista de GM-CSF recombinante é um anticorpo anti-GM-CSF. Em modalidades particulares, o anticorpo anti-GM-CSF se liga a um GM-CSF humano. Em outras modalidades, o anticorpo anti-GM-CSF se liga a um GM-CSF de primata, como descrito acima. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-GM-CSF se liga a um GM-CSF de mamífero. Em certas modalidades, o anticorpo anti-GM-CSF é um anticorpo anti-hGM-CSF. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-hGM- CSF é um anticorpo monoclonal. Em várias modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF é um fragmento de anticorpo que é um Fab, um Fab', um F(ab')2, um scFv ou um dAB. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo neutralizante de GM-CSF humano. Em certas modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo recombinante ou quimérico. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo humano. Em modalidades particulares, a citocina ou quimiocina é uma citocina ou quimiocina humana selecionada do grupo que consiste em IP-10, IL-2, IL-3, IL- 5, IL-1Ra, VEGF, TNF-a, FGF-2, IFN-γ, IL-12p40, IL-12p70, sCD40L, MDC, MCP-1, MIP-1a, MIP-1b ou uma combinação destas, como demonstrado no Exemplo 22.

[00195] Em algumas modalidades, a citocina ou quimiocina é selecionada do grupo que consiste em IL-1a, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-6, IL-9, IL-10, IP-10, KC, MCP-1, MIP ou uma combinação destas (veja o Exemplo 22). Em certas modalidades, o indivíduo possui leucemia linfoblástica aguda.

[00196] Em uma modalidade, os métodos revelados nesse relatório descritivo não afetam a eficácia da imunoterapia. Em outra modalidade, os métodos revelados nesse relatório descritivo reduzem a eficácia da imunoterapia por menos do que cerca de 5%. Em outra modalidade, os métodos revelados nesse relatório descritivo reduzem a eficácia da imunoterapia por menos do que cerca de 10%. Em outra modalidade, os métodos revelados nesse relatório descritivo reduzem a eficácia da imunoterapia por menos do que cerca de 15%. Em outra modalidade, os métodos revelados nesse relatório descritivo reduzem a eficácia da imunoterapia por menos do que cerca de 20%. Em outra modalidade, os métodos revelados nesse relatório descritivo reduzem a eficácia da imunoterapia por menos do que cerca de 50%.

[00197] Em uma modalidade, os métodos descritos nesse relatório descritivo aumentam a eficácia da imunoterapia. Em uma modalidade, o aumento da eficácia permite a melhora do gerenciamento clínico, desfechos do paciente e índice terapêutico da imunoterapia. Em outra modalidade, a eficácia aumentada permite a administração de doses maiores de imunoterapia. Em outra modalidade, a eficácia aumentada reduz a duração da hospitalização e tratamentos adicionais e monitoramento. Em uma modalidade, a imunoterapia compreende CAR-T.

[00198] Qualquer método de quantificação da citotoxicidade apropriado pode ser usado para determinar se a eficácia da imunoterapia permanece substancialmente inalterada. Por exemplo, a citotoxicidade pode ser quantificada usando um ensaio baseado em cultura de células como, por exemplo, os ensaios citotóxicos descritos nos Exemplos. Os ensaios de citotoxicidade podem empregar corantes que coram preferencialmente o DNA de células mortas. Em outros casos, podem ser usados ensaios fluorescentes e luminescentes que medem o número relativo de células vivas e mortas em uma população de células. Para esses ensaios, atividades de protease servem como marcadores para viabilidade celular e toxicidade celular, e um peptídeo permeável à célula marcado gera sinais fluorescentes são proporcionais ao número de células viáveis na amostra. Em outra modalidade, uma medição da citotoxicidade pode ser qualitativa. Em outra modalidade, uma medição da citotoxicidade pode ser quantitativa.

[00199] Em uma modalidade, a referida eficácia aumentada compreende expansão aumentada de células CAR-T, número e/ou atividade reduzida de células supressoras derivadas do sistema mielóide (MDSC) que inibem a função de célula T, sinergia com um inibidor do ponto de verificação, ou qualquer combinação destes. Em outra modalidade, a referida expansão aumentada de células CAR-T compreende pelo menos um aumento de 50% comparado com um controle. Em outra modalidade, a referida expansão aumentada de células CAR-T compreende pelo menos uma expansão de log de um quarto, comparada com um controle. Em outra modalidade, a referida expansão aumentada de células compreende pelo menos uma expansão de log de metade, comparada com um controle. Em outra modalidade, a referida expansão aumentada de células compreende pelo menos uma expansão de um log, comparada com um controle. Em outra modalidade, a referida expansão aumentada de células compreende uma expansão maior do que de um log, comparada com um controle.

[00200] Em uma modalidade, a toxicidade relacionada à imunoterapia aparece entre 2 dias a 4 semanas após a administração da imunoterapia. Em uma modalidade, a toxicidade relacionada à imunoterapia aparece entre 0 a 2 dias após a administração da imunoterapia. Em algumas modalidades, o antagonista de hGM-CSF é administrado aos indivíduos ao mesmo tempo que a imunoterapia como profilaxia. Em outra modalidade, o antagonista de hGM-CSF é administrado aos indivíduos 0-2 dias após a administração da imunoterapia. Em outra modalidade, o antagonista de hGM-CSF é administrado aos indivíduos 2-3 dias após a administração da imunoterapia. Em outra modalidade, o antagonista de hGM-CSF é administrado aos indivíduos 7 dias após a administração da imunoterapia. Em outra modalidade, o antagonista de hGM-CSF é administrado aos indivíduos 10 dias após a administração da imunoterapia. Em outra modalidade, o antagonista de hGM-CSF é administrado aos indivíduos 14 dias após a administração da imunoterapia. Em outra modalidade, o antagonista de hGM-CSF é administrado aos indivíduos 2-14 dias após a administração da imunoterapia.

[00201] Em outra modalidade, o antagonista de hGM-CSF é administrado aos indivíduos 2-3 horas após a administração da imunoterapia. Em outra modalidade, o antagonista de hGM- CSF é administrado aos indivíduos 7 horas após a administração da imunoterapia. Em outra modalidade, o antagonista de hGM-CSF é administrado aos indivíduos 10 horas após a administração da imunoterapia. Em outra modalidade, o antagonista de GM-CSF é administrado aos indivíduos 14 horas após a administração da imunoterapia. Em outra modalidade, o antagonista de hGM-CSF é administrado aos indivíduos 2-14 horas após a administração da imunoterapia.

[00202] Em uma modalidade alternativa, o antagonista de hGM-CSF é administrado aos indivíduos antes da imunoterapia como profilaxia. Em outra modalidade, o antagonista de hGM- CSF é administrado aos indivíduos 1 dia antes da administração da imunoterapia. Em outra modalidade, o antagonista de hGM-CSF é administrado aos indivíduos 2-3 dias antes da administração da imunoterapia. Em outra modalidade, o antagonista de hGM-CSF é administrado aos indivíduos 7 dias antes da administração da imunoterapia. Em outra modalidade, o antagonista de hGM-CSF é administrado aos indivíduos 10 dias antes da administração da imunoterapia. Em outra modalidade, o antagonista de hGM-CSF é administrado aos indivíduos 14 dias antes da administração da imunoterapia. Em outra modalidade, o antagonista de hGM- CSF é administrado aos indivíduos 2-14 dias antes da administração da imunoterapia.

[00203] Em outra modalidade, o antagonista de hGM-CSF é administrado aos indivíduos 2-3 horas antes da administração da imunoterapia. Em outra modalidade, o antagonista de hGM- CSF é administrado aos indivíduos 7 horas antes da administração da imunoterapia. Em outra modalidade, o antagonista de hGM-CSF é administrado aos indivíduos 10 horas antes da administração da imunoterapia. Em outra modalidade, o antagonista de hGM-CSF é administrado aos indivíduos 14 horas antes da administração da imunoterapia. Em outra modalidade, o antagonista de hGM-CSF é administrado aos indivíduos 2-14 horas antes da administração da imunoterapia.

[00204] Em outra modalidade, o antagonista de hGM-CSF pode ser administrado tersímiouticamente, após a toxicidade relacionada à imunoterapia ter ocorrido. Em uma modalidade, o antagonista de hGM-CSF pode ser administrado após os processos fisiopatológicos que levam ou que confirmam o começo da toxicidade relacionada à imunoterapia serem detectados. Em uma modalidade, o antagonista de hGM-CSF pode terminar os processos fisiopatológicos e evitar suas sequelas. Em algumas modalidades, os processos fisiopatológicos compreendem pelo menos um dos seguintes: concentrações aumentadas de citocina no soro, concentrações aumentadas de citocina no LCR, proteína C-reativa (CRP) aumentada no soro, ferritina aumentada no soro, IL-6 aumentada no soro, ativação endotelial, coagulação intravascular disseminada (DIC), concentração sérica aumentada de ANG2, proporção aumentada de ANG2:ANG1 no soro, presença de células T CAR no LCR, concentração sérica aumentada de fator de Von Willebrand (VWF), extravasamento da barreira hematencefálica (BBB), ou qualquer combinação destes.

[00205] Em outra modalidade, o antagonista de hGM-CSF pode ser administrado tersímiouticamente, em vários pontos do tempo. Em outra modalidade, a administração do antagonista de hGM-CSF é pelo menos em dois pontos do tempo. Em outra modalidade, a administração do antagonista de hGM-CSF é pelo menos em três pontos do tempo.

[00206] Em uma modalidade, o antagonista de hGM-CSF é administrado uma vez. Em outra modalidade, o antagonista de hGM-CSF é administrado duas vezes. Em outra modalidade, o antagonista de hGM-CSF é administrado três vezes. Em outra modalidade, o antagonista de hGM-CSF é administrado quatro vezes. Em outra modalidade, o antagonista de hGM-CSF é administrado pelo menos quatro vezes. Em outra modalidade, o antagonista de hGM-CSF é administrado mais do que quatro vezes.

[00207] Aqueles habilitados na técnica compreenderiam que a toxicidade relacionada à imunoterapia é gerenciada por diferentes tratamentos. Em algumas modalidades, o antagonista de hGM-CSF é co-administrado com outros tratamentos. Em algumas modalidades, outros tratamentos são selecionados de um grupo que compreende: terapia de citocina direcionada, terapia anti‑IL‑6, corticosteróides, tocilizumab, siltuximab, vasopressores em dose baixa, agentes inotrópicos, oxigênio suplementar, diurese, toracocentese, antiepilépticos, benzodiazepinas, levetiracetam, fenobarbital, hiperventilação, terapia hiperosmolar e terapias padronizadas para toxicidade específica para órgãos.

[00208] Em algumas modalidades, a toxicidade relacionada à imunoterapia compreende uma doença, dano ou mau funcionamento cerebral. Em algumas modalidades, a toxicidade relacionada à imunoterapia compreende NT relacionada às células T CAR. Em algumas modalidades, a toxicidade relacionada à imunoterapia compreende síndrome de encefalopatia (CRES) relacionada às células T CAR. Em algumas modalidades, são fornecidos nesse relatório descritivo métodos para inibição ou redução da incidência de uma doença, dano ou mau funcionamento cerebral.

[00209] Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de CRES compreende a melhora de dores de cabeça. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de CRES compreende o alívio de delírio. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de CRES compreende a redução de ansiedade. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de CRES compreende a redução de tremores. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de CRES compreende a diminuição da atividade convulsiva. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de CRES compreende a diminuição de confusão. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de CRES compreende a redução de alterações na vigília.

[00210] Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de CRES compreende a redução de alucinações. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de CRES compreende a redução de disfasia. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de CRES compreende a redução de ataxia. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de CRES compreende a redução de apraxia. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de CRES compreende a melhora de paralisia do nervo facial. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de CRES compreende a redução de fraqueza motora. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de CRES compreende a redução de convulsões. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de CRES compreende a redução de convulsões com EEG não convulsivo. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou severidade de CRES compreende a melhora da recuperação de coma.

[00211] Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência ou severidade de CRES compreende a redução da ativação endotelial. Aqueles habilitados na técnica compreenderiam que a ativação endotelial é um estado inflamatório e pró-coagulante de células endoteliais caracterizada por interações aumentadas com leucócitos.

[00212] Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de CRES compreende a redução de extravasamento vascular. O termo “extravasamento vascular” pode ser usado de forma intercambiável com os termos “síndrome de extravasamento vascular” e “síndrome de extravasamento capilar”, todos tendo as mesmas qualidades e significados. Aqueles habilitados na técnica compreenderiam que o extravasamento vascular está associado com células endoteliais que são separadas permitindo um extravasamento de plasma e migração transendotelial de células inflamatórias para dentro de tecidos corporais, resultando em danos a tecidos e órgãos. Além disso, neutrófilos podem causar oclusão microcirculatória, levando à perfusão tecidual diminuída. Em algumas modalidades, a redução da incidência de CRES compreende a redução de coagulação intravascular.

[00213] Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de CRES compreende a redução da concentração de pelo menos uma citocina circulante. Em algumas modalidades, a citocina é selecionada de um grupo que compreende: hGM- CSF, IFNγ, IL-1, IL-15, IL-6, IL-8, IL-10 e IL-2. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de CRES compreende a redução de concentração sérica de ANG2. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de CRES compreende a redução de proporção de ANG2:ANG1 no soro.

[00214] Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de CRES compreende a redução do grau de CRES. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de CRES compreende a melhora da pontuação de CARTOX-10. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de CRES compreende a redução de uma elevação na pressão intracraniana. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de CRES compreende a redução de convulsões. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de CRES compreende a redução de fraqueza motora.

[00215] Em algumas modalidades, a toxicidade relacionada à imunoterapia compreende CRS relacionada às células T CAR. Em algumas modalidades, são fornecidos nesse relatório descritivo métodos para inibição ou redução da incidência ou severidade de CRS e/ou NT.

[00216] Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de CRS ou NT compreende, sem limitação, a melhora da febre (com ou sem calafrios, mal-estar, fadiga, anorexia, mialgia, artralgia, náuseas, vômitos, dor de cabeça, erupção cutânea, diarréia, taquipnéia, hipoxemia, hipóxia, choque, taquicardia cardiovascular, pressão do pulso ampliada, hipotensão, extravasamento capilar, débito cardíaco inicial aumentado, débito cardíaco tardio diminuído, dímero-D elevado, hipofibrinogenemia com ou sem sangramento, azotemia, transaminite, hiperbilirrubinemia, alterações do estado mental, confusão, delírio, afasia franca, alucinações, tremor, dismetria, marcha alterada, convulsões, falência de órgãos, ou qualquer combinação destes, ou qualquer outro sintoma ou característica conhecida na técnica como estando associada com CRS.

[00217] Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de CRS compreende a redução da concentração de pelo menos uma citocina circulante. Em algumas modalidades, a citocina é selecionada de um grupo que compreende: GM-CSF, IFNγ, IL-1, IL-15, IL-6, IL-8, IL-10 e IL-2.

[00218] Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de CRS compreende a redução do grau de CRS. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de NT compreende a redução do grau de NT. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de CRS compreende a melhora da pontuação de CARTOX-10. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de NT compreende a melhora da pontuação de CARTOX-10. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de CRS compreende a redução da pressão intracraniana elevada. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de CRS compreende a redução de convulsões. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de CRS compreende a redução de fraqueza motora. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de NT ou CRS compreende a inibição ou redução da incidência até menos do que 60%. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de NT ou CRS compreende a inibição ou redução da incidência até menos do que 50%. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de NT ou CRS compreende a inibição ou redução da incidência até menos do que 40%. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de NT ou CRS compreende a inibição ou redução da incidência até menos do que 30%. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de NT ou CRS compreende a inibição ou redução da incidência até menos do que 20% dos pacientes. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de NT ou CRS compreende a eliminação de NT ou CRS.

[00219] Em algumas modalidades, o indivíduo possui CRS e/ou NT de Grau 1. Em algumas modalidades, o indivíduo possui CRS e/ou NT de Grau 2. Em algumas modalidades, o indivíduo possui CRS e/ou NT de Grau 3. Em algumas modalidades, o indivíduo possui CRS e/ou NT de Grau 4. Em algumas modalidades, o indivíduo possui qualquer combinação dos acima.

[00220] Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de NT ou CRS compreende a redução do grau de CRS, do grau de NT, ou ambos. Em algumas modalidades, o grau é reduzido até ≤ 3 NT e/ou CRS em 95% dos pacientes.

[00221] Em algumas modalidades, o indivíduo possui uma temperatura corporal acima de 37°C após administração da imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo possui uma temperatura corporal acima de 38°C após administração da imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo possui uma temperatura corporal acima de 39°C após administração da imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo possui uma temperatura corporal acima de 40°C após administração da imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo possui uma temperatura corporal acima de 41°C após administração da imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo possui uma temperatura corporal acima de 42°C após administração da imunoterapia.

[00222] Em algumas modalidades, o indivíduo possui concentração sérica de IL-6 acima de 10 pg/ml após administração da imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo possui concentração sérica de IL-6 acima de 12 pg/ml após administração da imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo possui concentração sérica de IL-6 acima de 14 pg/ml após administração da imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo possui concentração sérica de IL-6 acima de 16 pg/ml após administração da imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo possui concentração sérica de IL-6 acima de 18 pg/ml após administração da imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo possui concentração sérica de IL-6 acima de 20 pg/ml após administração da imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo possui concentração sérica de IL-6 acima de 22 pg/ml após administração da imunoterapia.

[00223] Em algumas modalidades, o indivíduo possui uma concentração sérica de MCP-1 acima de 200 pg/ml após administração da imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo possui uma concentração sérica de MCP-1 acima de 400 pg/ml após administração da imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo possui uma concentração sérica de MCP-1 acima de 600 pg/ml após administração da imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo possui uma concentração sérica de MCP-1 acima de 800 pg/ml após administração da imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo possui uma concentração sérica de MCP-1 acima de 1.000 pg/ml após administração da imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo possui uma concentração sérica de MCP-1 acima de

1.200 pg/ml após administração da imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo possui uma concentração sérica de

MCP-1 acima de 1.400 pg/ml após administração da imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo possui uma concentração sérica de MCP-1 acima de 1.600 pg/ml após administração da imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo possui uma concentração sérica de MCP-1 acima de

1.800 pg/ml após administração da imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo possui uma concentração sérica de MCP-1 acima de 2.000 pg/ml após administração da imunoterapia.

[00224] Em algumas modalidades, o indivíduo possui CRES de Grau 1. Em algumas modalidades, o indivíduo possui CRES de Grau 2. Em algumas modalidades, o indivíduo possui CRES de Grau 3. Em algumas modalidades, o indivíduo possui CRES de Grau 4.

[00225] Em algumas modalidades, o indivíduo está predisposto para ter uma doença, dano ou mau funcionamento cerebral antes da imunoterapia. Em algumas modalidades, a predisposição é genética. Em algumas modalidades, a predisposição é adquirida. Em algumas modalidades, a predisposição diz respeito a uma condição médica existente. Em algumas modalidades, a predisposição é diagnosticada antes da imunoterapia. Em algumas modalidades, a predisposição não é diagnosticada. Em algumas modalidades, o indivíduo passa por avaliações médicas a fim de determinar a predisposição para adquirir uma doença, dano ou mau funcionamento cerebral relacionado à imunoterapia antes da imunoterapia.

[00226] Em algumas modalidades, as avaliações médicas compreendem a determinação da concentração de ANG1 em um fluido corporal. Em algumas modalidades, as avaliações médicas compreendem a determinação da concentração de ANG1 no soro. Em algumas modalidades, as avaliações médicas compreendem a determinação da concentração de ANG2 em um fluido corporal. Em algumas modalidades, as avaliações médicas compreendem a determinação da concentração de ANG2 no soro. Em algumas modalidades, as avaliações médicas compreendem o cálculo da proporção de ANG2:ANG1 no soro. Em algumas modalidades, indivíduos com proporção de ANG2:ANG1 no soro acima de 0,5 antes da imunoterapia estão predispostos à CRES. Em algumas modalidades, indivíduos com proporção de ANG2:ANG1 no soro acima de 0,7 antes da imunoterapia estão predispostos à CRES. Em algumas modalidades, indivíduos com proporção de ANG2:ANG1 no soro acima de 0,9 antes da imunoterapia estão predispostos à CRES. Em algumas modalidades, indivíduos com proporção de ANG2:ANG1 no soro acima de 1 antes da imunoterapia estão predispostos à CRES. Em algumas modalidades, indivíduos com proporção de ANG2:ANG1 no soro acima de 1,1 antes da imunoterapia estão predispostos à CRES. Em algumas modalidades, indivíduos com proporção de ANG2:ANG1 no soro acima de 1,3 antes da imunoterapia estão predispostos à CRES. Em algumas modalidades, indivíduos com proporção de ANG2:ANG1 no soro acima de 1,5 antes da imunoterapia estão predispostos à CRES.

[00227] Em algumas modalidades, toxicidade relacionada à imunoterapia compreende linfohistiocitose hemofagocítica (HLH). Em algumas modalidades, toxicidade relacionada à imunoterapia compreende síndrome de ativação de macrófagos (MAS). Em algumas modalidades, são fornecidos nesse relatório descritivo métodos para inibição ou redução da incidência de HLH. Em algumas modalidades, são fornecidos nesse relatório descritivo métodos para inibição ou redução da incidência de MAS.

[00228] Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de HLH compreende o aumento da sobrevida do indivíduo. Em algumas modalidades, a inibição da redução da incidência de HLH compreende o aumento do tempo até recidiva. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de MAS compreende o aumento da sobrevida do indivíduo. Em algumas modalidades, a inibição da redução da incidência de MAS compreende o aumento do tempo até recidiva.

[00229] Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de HLH ou MAS compreende a inibição da ativação e/ou proliferação de macrófagos. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de HLH ou MAS compreende a inibição da ativação e/ou proliferação de linfócitos T. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de HLH ou MAS compreende a redução da concentração de IFNγ circulante. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da incidência de HLH ou MAS compreende a redução da concentração de GM-CSF circulante.

[00230] Em algumas modalidades, o indivíduo se apresenta com febre após imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo se apresenta com esplenomegalia após imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo se apresenta com citopenia após imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo se apresenta com citopenia em duas ou mais linhagens de células após imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo se apresenta com hipertrigliceridemia após imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo se apresenta com hipofibrinogenemia após imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo se apresenta com hemofagocitose após imunoterapia. Em algumas modalidades, hemofagocitose é observada na medula óssea. Em algumas modalidades, o indivíduo se apresenta com atividade de célula NK baixa após imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo se apresenta com atividade de NK ausente após imunoterapia.

[00231] Em algumas modalidades, o indivíduo se apresenta com concentrações séricas de ferritina acima de 100 U/ml após imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo se apresenta com concentrações séricas de ferritina acima de 300 U/ml após imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo se apresenta com concentrações séricas de ferritina acima de 500 U/ml após imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo se apresenta com concentrações séricas de ferritina acima de 700 U/ml após imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo se apresenta com concentrações séricas de ferritina acima de 900 U/ml após imunoterapia.

[00232] Em algumas modalidades, o indivíduo se apresenta com concentração sérica de CD25 solúvel acima de 1.200 U/ml após imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo se apresenta com concentração sérica de CD25 solúvel acima de

1.500 U/ml após imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo se apresenta com concentração sérica de CD25 solúvel acima de 1.800 U/ml após imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo se apresenta com concentração sérica de CD25 solúvel acima de 2.000 U/ml após imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo se apresenta com concentração sérica de CD25 solúvel acima de 2.200 U/ml após imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo se apresenta com concentração sérica de CD25 solúvel acima de

2.400 U/ml após imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo se apresenta com concentração sérica de CD25 solúvel acima de 2.700 U/ml após imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo se apresenta com concentração sérica de CD25 solúvel acima de 3.000 U/ml após imunoterapia.

[00233] Em algumas modalidades, o indivíduo está predisposto para ter HLH. Em algumas modalidades, a predisposição é genética. Em algumas modalidades, a predisposição diz respeito a uma condição médica existente. Aqueles habilitados na técnica compreenderiam que HLH esporádica foi associada com diversas mutações genéticas. Em algumas modalidades, o indivíduo carrega uma mutação em um gene selecionado de PRF1, UNC13D, STX11, STXBP2 ou RAB27A, ou qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, o indivíduo possui expressão reduzida ou ausente de perforina. Antagonistas de hGM-CSF

[00234] Antagonistas de hGM-CSF adequados para uso seletivamente interferem com a indução de sinalização pelo receptor de hGM-CSF por causar uma redução na ligação de hGM-CSF ao receptor. Esses antagonistas podem incluir anticorpos que se ligam ao receptor de hGM-CSF, anticorpos que se ligam ao hGM-CSF, análogos de GM-CSF como, por exemplo, E21R, e outras proteínas ou pequenas moléculas que competem pela ligação de hGM-CSF ao seu receptor ou inibem a sinalização que normalmente resulta da ligação do ligante ao receptor.

[00235] Em muitas modalidades, o antagonista de hGM-CSF usado na invenção é um polipeptídeo, por exemplo, um anticorpo anti-hGM-CSF, um anticorpo anti-receptor de hGM- CSF, um receptor de hGM-CSF solúvel, ou a um polipeptídeo GM-CSF modificado que compete pela ligação com hGM-CSF a um receptor, mas é inativo. Essas proteínas são frequentemente produzidas usando tecnologia de expressão recombinante. Esses métodos são amplamente conhecidos na técnica. Métodos gerais de biologia molecular, incluindo métodos de expressão, podem ser encontrados, por exemplo, em manuais de instrução, por exemplo, Sambrook e Russell (2001) “Molecular Cloning: A laboratory manual”, 3ª Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press; “Current Protocols in Molecular Biology” (2006) John Wiley e Sons ISBN: 0-471-50338-X.

[00236] Diversos sistemas de expressão de proteína baseados em células procarióticas e/ou eucarióticas podem ser empregados para produzir uma proteína antagonista de hGM-CSF. Muitos desses sistemas são amplamente disponíveis por fornecedores comerciais. Anticorpos contra hGM-CSF

[00237] Os anticorpos contra hGM-CSF da presente invenção são anticorpos que se ligam com alta afinidade ao hGM-CSF e são antagonistas de hGM-CSF. Os anticorpos compreendem regiões variáveis com um grau elevado de identidade para sequências VH e VL da linhagem germinativa humana. Em modalidades preferidas, a sequência de BSD em CDRH3 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de aminoácidos RQRFPY ou RDRFPY. O BSD em CDRL3 compreende FNK ou FNR.

[00238] São geradas regiões-V completas nas quais o BSD forma parte da CDR3 e sequências adicionais são usadas para completar a CDR3 e adicionar uma sequência FR4. Tipicamente, a porção da CDR3 excluindo o BSD e a FR4 completa são compostas por sequências da linhagem germinativa humana. Em algumas modalidades, a sequência de CDR3-FR4 excluindo o BSD difere de sequências da linhagem germinativa humana por no máximo 2 aminoácidos em cada cadeia. Em algumas modalidades, o segmento-J compreende um segmento-J da linhagem germinativa humana. Sequências da linhagem germinativa humana podem ser determinadas, por exemplo, por meio do banco de dados internacional de ImMunoGeneTics (IMGT) disponível publicamente e “V-base” (na Internet em vbase.mrc- cpe.cam.ac.uk).

[00239] O repertório de segmento-V da linhagem germinativa humana consiste em 51 regiões-V da cadeia pesada, 40 segmentos-V da cadeia leve K e 31 segmentos-V da cadeia leve λ, totalizando 3.621 pares de regiões-V da linhagem germinativa e, além disso, há variantes alélicas estáveis para a maioria desses segmentos-V, mas a contribuição dessas variantes para a diversidade estrutural do repertório da linhagem germinativa é limitada. As sequências de todos os genes de segmento-V da linhagem germinativa humana são conhecidas e podem ser acessadas no banco de dados “V-base”, fornecido pelo “MRC Centre for Protein Engineering”, Cambridge, Reino Unido (veja também Chothia e cols., 1992, J. Mol. Biol. 227: 776-798; Tomlinson e cols., 1995, EMBO J. 14: 4.628-4.638; e Williams e cols., 1996, J. Mol. Biol. 264: 220-232).

[00240] Anticorpos ou fragmentos de anticorpos como descritos nesse relatório descritivo podem ser expressos em sistemas microbianos procarióticos ou eucarióticos ou nas células de eucariotas superiores como, por exemplo, células de mamíferos.

[00241] Um anticorpo que é empregado na invenção pode estar em qualquer formato. Por exemplo, em algumas modalidades, o anticorpo pode ser um anticorpo completo, incluindo uma região constante, por exemplo, uma região constante humana, ou pode ser um fragmento ou derivado de um anticorpo completo, por exemplo, um Fd, um Fab, Fab’, F(ab’)2, scFv, Fv, um fragmento Fv ou um anticorpo de domínio único, por exemplo, um nanocorpo ou um anticorpo de camelídeo. Esses anticorpos podem adicionalmente ser modificados recombinantemente geneticamente por métodos bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Como observado acima, esses anticorpos podem ser produzidos com o uso de técnicas conhecidas.

[00242] Em algumas modalidades, o antagonista de hGM-CSF é um anticorpo que se liga ao hGM-CSF ou um anticorpo que se liga ao receptor de hGM-CSF α ou à subunidade β. Os anticorpos podem ser provocados contra proteínas hGM-CSF (ou receptor de hGM-CSF), ou fragmentos, ou produzidos recombinantemente. Anticorpos para GM-CSF para uso na invenção podem ser neutralizantes ou podem ser anticorpos não neutralizantes que se ligam ao GM-CSF e aumentam a taxa de depuração in vivo de hGM-CSF, de modo que o nível de hGM- CSF na circulação seja reduzido. Frequentemente, o anticorpo para hGM-CSF é um anticorpo neutralizante.

[00243] Métodos de preparação de anticorpos policlonais são conhecidos por aqueles habilitados na técnica (por exemplo, Harlow & Lane, “Antibodies, A Laboratory Manual” (1988); “Methods in Immunology”). Anticorpos policlonais podem ser despertados em um mamífero por uma ou mais injeções de um agente imunizante e, se desejado, um adjuvante. O agente imunizante inclui um GM-CSF ou proteína do receptor de GM-CSF, por exemplo, um GM-CSF humano ou proteína do receptor de GM-CSF, ou fragmento deste.

[00244] Em algumas modalidades, um anticorpo contra GM- CSF para uso na invenção é purificado do plasma humano. Nessas modalidades, o anticorpo contra GM-CSF é tipicamente um anticorpo policlonal que é isolado de outros anticorpos presentes no plasma humano. Um procedimento de isolamento desse tipo pode ser realizado, por exemplo, usando técnicas conhecidas, por exemplo, cromatografia de afinidade.

[00245] Em algumas modalidades, o antagonista de GM-CSF é um anticorpo monoclonal. Anticorpos monoclonais podem ser preparados com o uso de métodos de hibridoma, tais como aqueles descritos por Kohler & Milstein, Nature 256: 495 (1975). Em um método de hibridoma, um camundongo, hamster, ou outro animal hospedeiro apropriado, é tipicamente imunizado com um agente imunizante, por exemplo, GM-CSF humano, para provocar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente ao agente imunizante. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. O agente imunizante preferivelmente inclui proteína GM-CSF humana, fragmentos desta, ou proteína de fusão desta.

[00246] Anticorpos monoclonais humanos podem ser produzidos com o uso de várias metodologias conhecidas na técnica, incluindo bibliotecas de apresentação em fago (Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227: 381 (1991); Marks e cols., J. Mol. Biol. 222: 581 (1991)). As técnicas de Cole e cols. e Boerner e cols. também estão disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos (Cole e cols.,

“Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy”, página 77 (1985) e Boerner e cols., J. Immunol. 147 (1): 86-95 (1991)). Similarmente, anticorpos humanos podem ser feitos por introdução de loci de imunoglobulina humana em animais transgênicos, por exemplo, camundongos nos quais os genes endógenos de imunoglobulina foram inativados parcial ou completamente. Mediante desafio, a produção de anticorpo humano é observada, que se parece intimamente com aquela observada em humanos em todos os sentidos, incluindo rearranjo gênico, montagem e repertório de anticorpos. Essa abordagem é descrita, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos

5.545.807, 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425,

5.661.016, e nas seguintes publicações científicas: Marks e cols., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg e cols., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-13 (1994); Fishwild e cols., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); Lonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995).

[00247] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-GM- CSF são anticorpos monoclonais quiméricos ou humanizados. Como observado supra, formas de anticorpos humanizados são imunoglobulinas quiméricas nas quais resíduos de uma região determinante de complementaridade (CDR) de anticorpo humano são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana como, por exemplo, camundongo, rato ou coelho, que possui a especificidade, afinidade e capacidade desejadas.

[00248] Em algumas modalidades da invenção, o anticorpo é adicionalmente modificado geneticamente para imunogenicidade reduzida, por exemplo, de modo que o anticorpo seja adequado para administração repetida. Métodos para a geração de anticorpos com imunogenicidade reduzida incluem procedimentos de humanização/humaneering e técnicas de modificação como, por exemplo, desimunização, nas quais um anticorpo é ainda modificado geneticamente, por exemplo, em uma ou mais regiões framework, para remover epitopos de célula T.

[00249] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo Humaneered. Um anticorpo Humaneered é um anticorpo humano modificado geneticamente que possui uma especificidade de ligação de um anticorpo de referência, obtido por união de uma sequência de DNA que codifica um determinante de especificidade de ligação (BSD) da região CDR3 da cadeia pesada do anticorpo de referência a uma sequência do segmento VH humano e um BSD da CDR3 da cadeia leve do anticorpo de referência a uma sequência do segmento VL humano. Métodos para Humaneering são fornecidos na Publicação de Pedido de Patente U.S. Nº 20050255552 e Publicação de Pedido de Patente U.S. Nº 20060134098. Métodos para secreção sem sinal de fragmentos de anticorpo por E. coli são descritos no Pedido de Patente U.S. 20070020685.

[00250] Um anticorpo pode ainda ser desimunizado para remover um ou mais epitopos de célula T preditos da região V de um anticorpo. Esses procedimentos são descritos, por exemplo, em WO 00/34317.

[00251] A região constante da cadeia pesada é frequentemente uma região constante da cadeia gama, por exemplo, uma região constante gama-1, gama-2, gama-3 ou gama-

4. Em algumas modalidades, por exemplo, quando o anticorpo é um fragmento, o anticorpo pode ser conjugado a outra molécula, por exemplo, para fornecer uma meia-vida in vivo estendida como, por exemplo, um polietileno glicol (peguilação) ou albumina sérica. Exemplos de PEGuilação de fragmentos de anticorpo são fornecidos em Knight e cols. (2004) Platelets 15: 409 (para abciximab); Pedley e cols. (1994) Br. J. Cancer 70: 1126 (para um anticorpo anti-CEA) Chapman e cols. (1999) Nature Biotech. 17: 780.

[00252] Um anticorpo para uso na invenção se liga ao hGM- CSF ou receptor de hGM-CSF. Qualquer uma de diversas técnicas pode ser usada para determinar a especificidade de ligação do anticorpo. Veja, por exemplo, Harlow & Lane, “Antibodies, A Laboratory Manual” (1988) para uma descrição de formatos e condições de imunoensaios que podem ser usados para determinar a imunorreatividade específica de um anticorpo.

[00253] Um anticorpo exemplar adequado para uso com a presente invenção é cl9/2 (um anticorpo de camundongo/humano quimérico anti-hGM-CSF). Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal que compete pela ligação ao mesmo epitopo que cl9/2, ou que se liga ao mesmo epitopo que cl9/2, é usado. A habilidade de um anticorpo particular para reconhecer o mesmo epitopo que outro anticorpo é tipicamente determinada pela habilidade do primeiro anticorpo para inibir competitivamente a ligação do segundo anticorpo ao antígeno. Qualquer um de diversos ensaios de ligação competitiva pode ser usado para medir a competição entre dois anticorpos pelo mesmo antígeno. Por exemplo, um ensaio ELISA em sanduiche pode ser usado para essa finalidade. Este é realizado por utilização de um anticorpo de captura para revestir a superfície de um poço. Uma concentração subsaturante de antígeno marcado é então adicionada à superfície de captura. Essa proteína se ligará ao anticorpo por meio de uma interação anticorpo-epitopo específica. Após lavagem, um segundo anticorpo, que foi ligado covalentemente a uma porção detectável (por exemplo, HRP, com o anticorpo marcado sendo definido como o anticorpo de detecção), é adicionado ao ELISA. Se esse anticorpo reconhece o mesmo epitopo que o anticorpo de captura, ele será incapaz de se ligar à proteína-alvo, já que aquele epitopo particular não estará mais disponível para ligação. Se, no entanto, esse segundo anticorpo reconhece um epitopo diferente na proteína-alvo, ele será capaz de se ligar e essa ligação pode ser detectada por quantificação do nível de atividade (e, portanto, ligada ao anticorpo) usando um substrato relevante. O nível de fundo é definido por utilização de um único anticorpo tanto como anticorpo de captura quanto como anticorpo de detecção, enquanto o sinal máximo pode ser estabelecido por captura com um anticorpo antígeno- específico e detecção com um anticorpo para o tag no antígeno. Por utilização dos sinais de fundo e máximos como referências, os anticorpos podem ser avaliados de forma apreada para determinar especificidade de epitopo.

[00254] Um primeiro anticorpo é considerado que inibe competitivamente a ligação de um segundo anticorpo se a ligação do segundo anticorpo ao antígeno é reduzida por pelo menos 30%, normalmente pelo menos cerca de 40%, 50%, 60% ou 75% e, frequentemente, por pelo menos cerca de 90%, na presença do primeiro anticorpo usando qualquer um dos ensaios descritos acima.

[00255] Em algumas modalidades da invenção, é empregado um anticorpo que compete com a ligação ou se liga ao mesmo epitopo que um anticorpo conhecido, por exemplo, cl9/2.

Métodos de msímioamento de epitopos são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, uma abordagem para a localização de regiões funcionalmente ativas do fator estimulante de colônia de granulócitos-macrófagos (hGM-CSF) humano é msímioar os epitopos reconhecidos por neutralização de anticorpos monoclonais anti-hGM-CSF. Por exemplo, o epitopo ao qual cl9/2 (que possui as mesmas regiões variáveis que o anticorpo neutralizante LMM 102) se liga foi definido usando fragmentos proteolíticos obtidos por digestão enzimática de hGM-CSF sintetizado por bactérias (Dempsey, e cols., Hybridoma 9: 545-558, 1990). O fracionamento por RP-HPLC de um digesto tríptico resultou na identificação de um peptídeo “tríptico central” imunorreativo que contém 66 aminoácidos (52% da proteína). Digestão adicional desse “centro tríptico” com V8 protease de S. aureus produziu um produto de hGM-CSF imunorreativo único que compreende dois peptídeos, resíduos 86-93 e 112-127, ligados por uma ligação dissulfeto entre os resíduos 88 e 121. Os peptídeos individuais não eram reconhecidos pelo anticorpo.

[00256] Em algumas modalidades, os anticorpos adequados para uso com a presente invenção possuem uma ligação de alta afinidade para GM-CSF humano ou receptor de hGM-CSF. A ligação de alta afinidade entre um anticorpo e um antígeno existe se a constante de dissociação (KD) do anticorpo é < cerca de 10 nM, tipicamente < 1 nM e, preferivelmente, < 100 pM. Em algumas modalidades, o anticorpo possui uma taxa de dissociação de cerca de 10-4 por segundo ou melhor.

[00257] Diversos métodos podem ser usados para determinar a afinidade de ligação de um anticorpo por seu antígeno- alvo, por exemplo, ensaios por ressonância de plásmon de superfície, ensaios de saturação, ou imunoensaios como, por exemplo, ELISA ou RIA, como são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Um método exemplar para a determinação da afinidade de ligação é por análise por ressonância de plásmon de superfície em um instrumento BIAcore™ 2000 (Biacore AB, Freiburg, Alemanha) usando chips sensores CM5, como descrito por Krinner e cols., (2007) Mol. Immunol. Fevereiro; 44 (5):916-25. (Epub. Maio de 2006 H)).

[00258] Em algumas modalidades, os antagonistas de hGM- CSF são anticorpos neutralizantes para hGM-CSF, seu receptor ou sua subunidade do receptor, que se ligam de uma forma que interfere com a ligação de hGM-CSF ao seu receptor ou subunidade do receptor. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-hGM-CSF para uso na invenção inibe a ligação à subunidade alfa do receptor de hGM-CSF. Um anticorpo desse tipo pode, por exemplo, se ligar ao hGM-CSF na região onde hGM-CSF se liga ao receptor e, dessa forma, inibir a ligação. Em outras modalidades, o anticorpo anti-hGM-CSF inibe o funcionamento de hGM-CSF sem bloquear sua ligação à subunidade alfa do receptor de hGM-CSF. II. Cadeias Pesadas

[00259] Uma cadeia pesada de um anticorpo anti-hGM-CSF da invenção compreende uma região V da cadeia pesada que compreende os seguintes elementos: 1) sequências do segmento-V da cadeia pesada humana que compreendem FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3; 2) uma região CDRH3 que compreende a sequência de aminoácidos R(Q/D)RFPY; 3) uma FR4 contribuída por um segmento do gene-J da linhagem germinativa humana.

Exemplos de sequências do segmento-V que dão suporte à ligação ao hGM-CSF em combinação com um segmento CDR3-FR4 descrito acima junto com uma região VL complementar são mostrados na Figura 1. Os segmentos-V podem ser, por exemplo, da subclasse VH1 humana. Em algumas modalidades, o segmento- V é um segmento da subclasse VH1 humana que possui um grau elevado de identidade de sequência de aminoácidos, por exemplo, pelo menos 80%, 85, ou 90% ou mais de identidade, para o segmento-VH1 1-02 ou VH1 1-03 da linhagem germinativa. Em algumas modalidades, o segmento-V difere por, no máximo, 15 resíduos de VH1 1-02 ou VH1 1-03 e, preferivelmente, no máximo 7 resíduos.

[00260] A sequência FR4 dos anticorpos da invenção é fornecida por um segmento do gene JH1, JH3, JH4, JH5 ou JH6 da linhagem germinativa humana, ou uma sequência que possui um grau elevado de identidade de sequência de aminoácidos para um segmento JH da linhagem germinativa humana. Em algumas modalidades, o segmento-J é uma sequência JH4 da linhagem germinativa humana.

[00261] A CDRH3 também compreende sequências que são derivadas de um segmento-J humano. Tipicamente, a sequência de CDRH3-FR4 excluindo o BSD difere por, no máximo, 2 aminoácidos de um segmento-J da linhagem germinativa humana. Em modalidades típicas, as sequências do segmento-J em CDRH3 são do mesmo segmento-J usado para as sequências FR4. Dessa forma, em algumas modalidades, a região CDRH3-FR4 compreende o BSD e um gene segmento JH4 completo da linhagem germinativa humana. Uma combinação exemplar de sequências CDRH3 e FR4 é mostrada abaixo, na qual o BSD está em negrito e os resíduos de JH4 do segmento-J da linhagem germinativa humana estão sublinhados:

[00262] Em algumas modalidades, um anticorpo da invenção compreende um segmento-V que possui pelo menos 90% de identidade, ou pelo menos 91%, 92% 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade para o segmento VH 1-02 ou VH1-03 da linhagem germinativa; ou para um dos segmentos-V das regiões VH mostradas na Figura 1, por exemplo, uma porção do segmento-V de VH#1, VH#2, VH#3, VH#4 ou VH#5.

[00263] Em algumas modalidades, o segmento-V da região VH possui uma CDR1 e/ou CDR2, como mostrado na Figura 1. Por exemplo, um anticorpo da invenção pode ter uma CDR1 que possui a sequência GYYMH ou NYYIH; ou uma CDR2 que possui a sequência WINPNSGGTNYAQKFQG ou WINAGNGNTKYSQKFQG.

[00264] Em modalidades particulares, um anticorpo possui tanto uma CDR1 quanto uma CDR2 de um dos segmentos-V da região VH mostrados na Figura 1 e uma CDR3 que compreende R(Q/D)RFPY, por exemplo, RDRFPYYFDY ou RQRFPYYFDY. Dessa forma, em algumas modalidades, um anticorpo anti-GM-CSF da invenção pode, por exemplo, ter uma CDR3-FR4 que possui a sequência R(Q/D)RFPYYFDYWGQGTLVTVSS e uma CDR1 e/ou CDR2, como mostrada na Figura 1.

[00265] Em algumas modalidades, uma região VH de um anticorpo da invenção possui uma CDR3 que possui um determinante de especificidade de ligação R(Q/D)RFPY, uma CDR2 de uma VH1 da linhagem germinativa humana segmento ou uma CDR1 de uma VH1 da linhagem germinativa humana. Em algumas modalidades, tanto a CDR1 quanto a CDR2 são de segmentos VH1 da linhagem germinativa humana.

III. Cadeias leves

[00266] Uma cadeia leve de um anticorpo anti-hGM-CSF da invenção compreende uma região V da cadeia leve que compreende os seguintes elementos: 1) sequências do segmento-V da cadeia leve humana que compreendem FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3; 2) uma região CDRL3 que compreende a sequência FNK ou FNR, por exemplo, QQFNRSPLT ou QQFNKSPLT; 3) uma FR4 contribuída por um segmento do gene-J da linhagem germinativa humana.

[00267] A região VL compreende um segmento-V V-lambda ou V-kappa. Um exemplo de uma sequência V-kappa que dá suporte à ligação em combinação com uma região VH complementar é fornecido na Figura 1.

[00268] A sequência de CDR3 da região VL compreende uma sequência derivada do segmento-J. Em modalidades típicas, as sequências do segmento-J em CDRL3 são do mesmo segmento-J usado para FR4. Dessa forma, a sequência, em algumas modalidades, pode diferir por, no máximo, 2 aminoácidos do segmento-V de linhagem germinativa humana kappa e sequências do segmento-J. Em algumas modalidades, a região CDRL3-FR4 compreende o BSD e o segmento completo do gene JK4 da linhagem germinativa humana. São mostradas abaixo combinações CDRL3-FR4 exemplares para cadeias kappa, nas quais o determinante de especificidade de ligação mínimo essencial é mostrado em negrito e sequências JK4 estão sublinhadas: CDR3

QQFNRSPLTFGGGTKVEIK QQFNKSPLTFGGGTKVEIK

[00269] Os segmentos V-kappa são tipicamente da subclasse VKIII. Em algumas modalidades, os segmentos possuem pelo menos 80% de identidade de sequência para uma subclasse de VKIII da linhagem germinativa humana, por exemplo, pelo menos 80% de identidade para a sequência VKIIIA27 da linhagem germinativa humana. Em algumas modalidades, o segmento V- kappa pode diferir por, no máximo, 18 resíduos de VKIIIA27. Em outras modalidades, o segmento-V da região VL de um anticorpo da invenção possui pelo menos 85% de identidade, ou pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade para a sequência do segmento-V de kappa humana de uma região VL mostrada na Figura 1, por exemplo, a sequência do segmento-V de VK#1, VK#2, VK#3 ou VK#4.

[00270] Em algumas modalidades, a região variável é composta por sequências do gene-V humano. Por exemplo, uma sequência da região variável pode ter pelo menos 80% de identidade, ou pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 96% de identidade, pelo menos 97% de identidade, pelo menos 98% de identidade, ou pelo menos 99% de identidade, ou maior, com uma sequência do gene-V linhagem germinativa humana.

[00271] Em algumas modalidades, o segmento-V da região VL possui uma CDR1 e/ou CDR2, como mostrado na Figura 1. Por exemplo, um anticorpo da invenção pode ter uma sequência de CDR1 de RASQSVGTNVA ou RASQSIGSNLA; ou uma sequência de CDR2 STSSRAT.

[00272] Em modalidades particulares, um anticorpo anti- GM-CSF da invenção pode ter uma CDR1 e uma CDR2 em uma combinação como mostrada em um dos segmentos-V das regiões

VL apresentadas na Figura 1 e uma sequência de CDR3 que compreende FNK ou FNR, por exemplo, a CDR3 pode ser QQFNKSPLT ou QQFNRSPLT. Em algumas modalidades, um anticorpo contra GM-CSF desse tipo pode compreender uma região FR4 que é FGGGTKVEIK. Dessa forma, um anticorpo anti-GM-CSF da invenção pode compreender, por exemplo, tanto a CDR1 quanto a CDR2 de uma das regiões VL mostradas na Figura 1 e uma região CDR3-FR4 que é FGGGTKVEIK. IV. Preparação de anticorpos contra hGM-CSF

[00273] Um anticorpo da invenção pode compreender qualquer uma das regiões VH VH#1, VH#2, VH#3, VH#4 ou VH#5, como mostrado na Figura 1. Em algumas modalidades, um anticorpo da invenção pode compreender qualquer uma das regiões VL VK#1, VK#2, VK#3 ou VK#4, como mostrado na Figura

1. Em algumas modalidades, o anticorpo possui uma região VH VH#1, VH#2, VH#3, VH#4 ou VH#5, como mostrado na Figura 1; e uma região VL VK#1, VK#2, VK#3 ou VK#4, como mostrado na Figura 1, como descrito, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos

8.168.183 e 9.017.674, cada uma delas incorporada nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade.

[00274] Um anticorpo pode ser testado para confirmar que o anticorpo retém a atividade de antagonismo de atividade de hGM-CSF. A atividade antagonista pode ser determinada usando qualquer um de diversos desfechos, incluindo ensaios de proliferação. Anticorpos neutralizantes e outros antagonistas de hGM-CSF podem ser identificados ou avaliados usando diversos ensaios que avaliam a função de hGM-CSF. Por exemplo, ensaios baseados em células para sinalização do receptor de hGM-CSF, por exemplo, ensaios que determinam a taxa de proliferação de uma linhagem de célula hGM-CSF-

dependente em resposta a uma quantidade limitante de hGM- CSF, são convenientemente usados. A linhagem de célula TF-1 humana é adequada para uso em um ensaio desse tipo. Veja, Krinner e cols., (2007) Mol. Immunol. Em algumas modalidades, os anticorpos neutralizantes da invenção inibem a proliferação de células TF-1 estimulada por hGM-CSF por pelo menos 50%, quando é usada uma concentração de hGM-CSF que estimula 90% da proliferação máxima de células TF-1. Dessa forma, tipicamente, um anticorpo neutralizante, ou outro antagonista de hGM-CSF para uso na invenção, possui uma EC50 de menos do que 10 nM (por exemplo, Tabela 2). Ensaios adicionais adequados para uso na identificação de anticorpos neutralizantes adequados para uso com a presente invenção serão bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Em outras modalidades, os anticorpos neutralizantes inibem proliferação estimulada por hGM-CSF por pelo menos cerca de 75%, 80%, 90%, 95% ou 100%, da atividade antagonista do anticorpo quimérico cl9/2, por exemplo, WO 03/068920, que possui as regiões variáveis do anticorpo monoclonal de camundongo LMM102 e as CDRs.

[00275] Um anticorpo quimérico exemplar adequado para uso como um antagonista de hGM-CSF é cl9/2. O anticorpo cl9/2 se liga ao hGM-CSF com uma afinidade de ligação monovalente de cerca de 10 pM, como determinada por análise por ressonância de plásmon de superfície. As sequências da região variável da cadeia pesada e leve do anticorpo cl9/2 são conhecidas (por exemplo, WO 03/068920). As CDRs, como definidas de acordo com Kabat, são: CDRH1 DYNIH; CDRH2 YIAPYSGGTGYNQEFKN;

CDRH3 RDRFPYYFDY; CDRL1 KASQNVGSNVA; CDRL2 SASYRSG; CDRL3 QQFNRSPLT.

[00276] As CDRs também podem ser determinadas com o uso de outras definições bem conhecidas na técnica, por exemplo, Chothia, banco de dados internacional de ImMunoGeneTics (IMGT) e AbM.

[00277] Em algumas modalidades, um anticorpo usado na invenção compete pela ligação ou se liga ao mesmo epitopo que cl9/2. O epitopo de GM-CSF reconhecido por cl9/2 foi identificado como um produto que possui dois peptídeos, resíduos 86-93 e resíduos 112-127, ligados por uma ligação dissulfeto entre os resíduos 88 e 121. O anticorpo cl9/2 inibe a proliferação GM-CSF-dependente de uma linhagem de células de leucemia humana TF-1 com uma EC50 de 30 pM quando as células são estimuladas com 0,5 ng/ml de GM-CSF. Em algumas modalidades, o anticorpo usado na invenção se liga ao mesmo epitopo que cl9/2.

[00278] Um anticorpo para administração, por exemplo, cl9/2, pode ser adicionalmente Humaneered. Por exemplo, o anticorpo cl9/2 pode ainda ser modificado geneticamente para conter segmentos do gene-V humano.

[00279] Um anticorpo de alta afinidade pode ser identificado usando ensaios bem conhecidos para determinar atividade e afinidade de ligação. Essas técnicas incluem ensaios ELISA, bem como determinações da ligação que empregam ressonância de plásmon de superfície ou interferometria. Por exemplo, as afinidades podem ser determinadas por interferometria de biocamada usando um biossensor ForteBio

(Mountain View, CA) Octet. Um anticorpo da invenção tipicamente se liga com afinidade similar às formas tanto glicosiladas quanto não glicosiladas de hGM-CSF.

[00280] Os anticorpos da invenção competem com o anticorpo cl9/2 pela ligação ao hGM-CSF. A habilidade de um anticorpo descrito nesse relatório descritivo para bloquear ou competir com o anticorpo cl9/2 pela ligação ao hGM-CSF indica que o anticorpo se liga ao mesmo epitopo que o anticorpo cl9/2 ou a um epitopo que está próximo, por exemplo, sobreposto, ao epitopo que é ligado pelo anticorpo cl9/2. Em outras modalidades, um anticorpo descrito nesse relatório descritivo, por exemplo, um anticorpo que compreende uma combinação de região VH e região VL, como mostrado na tabela fornecida na Figura 1, pode ser usado como um anticorpo de referência para avaliar se outro anticorpo compete pela ligação ao hGM-CSF. Um anticorpo de teste é considerado que inibe competitivamente a ligação de um anticorpo de referência se a ligação do anticorpo de referência ao antígeno é reduzida por pelo menos 30%, normalmente pelo menos cerca de 40%, 50%, 60% ou 75% e, frequentemente, por pelo menos cerca de 90%, na presença do anticorpo de teste. Muitos ensaios podem ser empregados para avaliar a ligação, incluindo ELISA, bem como outros ensaios, por exemplo, imunoblots. Em algumas modalidades, um anticorpo da invenção possui uma taxa de dissociação que é pelo menos 2 a 3 vezes mais lenta do que um anticorpo monoclonal quimérico cl9/2 de referência testado sob as mesmas condições, mas possui uma potência que é pelo menos 6-10 vezes maior do que aquela do anticorpo de referência na atividade neutralizante de hGM-CSF em um ensaio baseado em células que mede a atividade de hGM-CSF.

[00281] Métodos para o isolamento de anticorpos com sequências da região V perto de sequências da linhagem germinativa humana foram descritos previamente (Publicações de Pedidos de Patente U.S. Nos 20050255552 e 20060134098). Bibliotecas de anticorpos podem ser expressas em uma célula hospedeira adequada, incluindo células de mamíferos, células de levedura ou células procarióticas. Para expressão em alguns sistemas de células, um peptídeo sinalizador pode ser introduzido no terminal-N para dirigir a secreção para o meio extracelular. Anticorpos podem ser secretados de células bacterianas como, por exemplo, E. coli, com ou sem um peptídeo sinalizador. Métodos para secreção sem sinal de fragmentos de anticorpo de E. coli são descritos no Pedido de Patente U.S. 20070020685.

[00282] Em algumas modalidades, é gerado um anticorpo de ligação ao hGM-CSF da invenção em que um anticorpo que possui uma CDR de uma das regiões-VH da invenção mostradas na Figura 1 é combinado com um anticorpo que possui uma CDR de uma das regiões-VL mostradas na Figura 1, e expresso em qualquer um dos diversos formatos em um sistema de expressão adequado. Dessa forma, o anticorpo pode ser expresso como um scFv, Fab, Fab′ (contendo uma sequência de dobradiça de imunoglobulina), F(ab′)2, (formado por formação de ligação dissulfeto entre as sequências de dobradiça de duas moléculas Fab′), imunoglobulina inteira ou imunoglobulina truncada ou como uma proteína de fusão em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, dentro da célula hospedeira ou por secreção. Um resíduo de metionina pode opcionalmente estar presente no terminal-N, por exemplo, em polipeptídeos produzidos em sistemas de expressão sem sinal. Cada uma das regiões-VH descritas nesse relatório descritivo pode ser pareada com cada uma das regiões-VL para gerar um anticorpo anti-hGM-CSF. Em uma modalidade, uma proteína de fusão compreende um anticorpo de ligação anti-hGM-CSF da invenção ou um fragmento deste (em exemplos não limitantes, um fragmento de anticorpo anti-hGM-CSF é um Fab, um Fab', um F(ab')2, um scFv ou um dAB), e transferrina humana, em que a transferrina humana é fundida ao anticorpo na extremidade da região constante da cadeia pesada 1 (CH1), após a dobradiça, ou após CH3, como descrito em Shin, S-U., e cols. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 92, páginas 2.820-2.824, 1995, que é incorporado nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade.

[00283] Combinações exemplares de cadeias pesadas e leves são mostradas na tabela fornecida na Figura 1. Em algumas modalidades, a região VL do anticorpo, por exemplo, VK#1, VK#2, VK#3 ou VK#4 da Figura 1, é combinada com uma região constante kappa humana para formar a cadeia leve completa. Além disso, em algumas modalidades, a região VH é combinada com regiões constantes gama humanas-1. Qualquer alótipo gama-1 adequado pode ser escolhido, por exemplo, o alótipo- f. Dessa forma, em algumas modalidades, o anticorpo é uma IgG, por exemplo, que possui um alótipo-f, que possui uma VH selecionada de VH#1, VH#2, VH#3, VH#4 ou VH#5 (Figura 1), e uma VL selecionada de VK#1, VK#2, VK#3 ou VK#4 (Figura 1).

[00284] Os anticorpos da invenção inibem a ativação do receptor de hGM-CSF, por exemplo, por inibição de ligação de hGM-CSF ao receptor, e exibem ligação de alta afinidade ao hGM-CSF, por exemplo, 500 pM. Em algumas modalidades, o anticorpo possui uma constante de dissociação de cerca de 10-4 por segundo ou menos. Sem se prender a uma teoria, um anticorpo com uma constante de dissociação mais lenta fornece benefício terapêutico aumentado. Por exemplo, um anticorpo da invenção que possui uma off-rate três vezes mais lenta do que o anticorpo cl9/2, produziu uma atividade neutralizante de hGM-CSF 10 vezes mais potente, por exemplo, em um ensaio baseado em células, por exemplo, produção de IL-8 (veja, por exemplo, Exemplo 2).

[00285] Anticorpos podem ser produzidos com o uso de qualquer um de diversos sistemas de expressão, incluindo sistemas de expressão tanto procarióticos quanto eucarióticos. Em algumas modalidades, o sistema de expressão é uma expressão em célula de mamífero, por exemplo, um sistema de expressão em célula CHO. Muitos desses sistemas são amplamente disponíveis por fornecedores comerciais. Em modalidades nas quais um anticorpo compreende tanto uma região VH quanto uma região VL, as regiões VH e VL podem ser expressas usando um único vetor, por exemplo, em uma unidade de expressão dicistrônica, ou sob o controle de promotores diferentes. Em outras modalidades, a região VH e a região VL podem ser expressas com o uso de vetores separados. Uma região VH ou uma região VL, como descritas nesse relatório descritivo, pode opcionalmente compreender uma metionina no terminal-N.

[00286] Um anticorpo da invenção pode ser produzido em qualquer um de diversos formatos, incluindo como um Fab, um Fab', um F(ab')2, um scFv ou um dAB. Um anticorpo da invenção também pode incluir uma região constante humana. A região constante da cadeia leve pode ser uma região constante kappa ou lambda humana. A região constante da cadeia pesada é frequentemente uma região constante da cadeia gama, por exemplo, uma região constante gama-1, gama-2, gama-3 ou gama-

4. Em outras modalidades, o anticorpo pode ser uma IgA.

[00287] Em algumas modalidades da invenção, a região VL do anticorpo, por exemplo, VK#1, VK#2, VK#3 ou VK#4 da Figura 1, é combinada com uma região constante kappa humana (por exemplo, ID. DE SEQ. Nº: 10) para formar a cadeia leve completa.

[00288] Em algumas modalidades da invenção, a região VH é combinada com uma região constante gama-1 humana. Qualquer alótipo-f gama-1 adequado pode ser escolhido, por exemplo, o alótipo-f. Dessa forma, em algumas modalidades, o anticorpo é uma IgG que possui uma região constante de alótipo-f, por exemplo, ID. DE SEQ. Nº: 11, que possui uma VH selecionada de VH#1, VH#2, VH#3, VH#4 ou VH#5 (Figura 1). Em algumas modalidades, o anticorpo possui uma VL selecionada de VK#1, VK#2, VK#3 ou VK#4 (Figura 1). Em modalidades particulares, o anticorpo possui uma região constante kappa como apresentada no ID. DE SEQ. Nº: 10, e uma região constante da cadeia pesada como apresentada no ID. DE SEQ. Nº: 11, em que as regiões variáveis da cadeia pesada e leve compreendem uma das seguintes combinações das sequências apresentadas na Figura 1: a) VH#2, VK#3; b) VH#1, VK#3; c) VH#3, VK#1; d) VH#3, VL#3; e) VH#4, VK#4; f) VH#4, VK#2; g) VH#5, VK#1; h) VH#5, VK#2; i) VH#3, VK#4; ou j) VH#3, VL#3).

[00289] Em algumas modalidades, por exemplo, quando o anticorpo é um fragmento, o anticorpo pode ser conjugado a outra molécula, por exemplo, polietileno glicol (PEGuilação) ou albumina sérica, para fornecer uma meia-vida in vivo estendida. Exemplos de PEGuilação de fragmentos de anticorpo são fornecidos em Knight e cols. Platelets 15: 409, 2004 (para abciximab); Pedley e cols., Br. J. Cancer 70: 1.126, 1994 (para um anticorpo anti-CEA); Chapman e cols., Nature Biotech. 17: 780, 1999; e Humphreys, e cols., Protein Eng. Des. 20: 227, 2007).

[00290] Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção estão na forma de um fragmento Fab'. Uma cadeia leve de comprimento total é gerada por fusão de uma região VL à região constante kappa ou lambda humana. Qualquer região constante pode ser usada para qualquer cadeia leve; no entanto, em modalidades típicas, uma região constante kappa é usada em combinação com uma região variável V-kappa e uma região constante lambda é usada com uma região variável V- lambda.

[00291] A cadeia pesada do Fab′ é um fragmento Fd′ gerado por fusão de uma região VH da invenção às sequências da região constante da cadeia pesada humana, o primeiro domínio constante (CH1) e região de dobradiça. As sequências da região constante da cadeia pesada podem ser de qualquer uma das classes de imunoglobulina, mas é frequentemente de uma IgG, e podem ser de uma IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Os anticorpos Fab' da invenção também podem ser sequências híbridas, por exemplo, uma sequência de dobradiça pode ser de uma subclasse de imunoglobulina e o domínio CH1 pode ser de uma subclasse diferente. V. Administração de anticorpos anti-hGM-CSF para o tratamento de doenças nas quais GM-CSF é um alvo.

[00292] A invenção também fornece métodos de tratamento de um paciente que possui uma doença que envolve hGM-CSF na qual é desejável inibir a atividade de hGM-CSF, ou seja, na qual hGM-CSF é um alvo terapêutico.

Em algumas modalidades, esse paciente possui uma doença inflamatória crônica, por exemplo, artrite, por exemplo, artrite reumatóide, artrite psoriática, espondilite anquilosante, artrite idiopática juvenil, doença de Still de surgimento sistêmico e outras doenças inflamatórias das articulações; doenças inflamatórias do intestino, por exemplo, colite ulcerativa, doença de Crohn, síndrome de Barrett, ileíte, enterite, esofagite eosinofílica e enteropatia sensível ao glúten; distúrbios inflamatórios do sistema respiratório, por exemplo, asma, asma eosinofílica, síndrome de sofrimento respiratório do adulto, rinite alérgica, silicose, doença pulmonar obstrutiva crônica, hipersensibilidade doenças pulmonares, doença pulmonar intersticial, doença pulmonar parenquimatosa difusa, bronquiectasia; doenças inflamatórias da pele, incluindo psoríase, esclerodermia e dermatoses inflamatórias, por exemplo, eczema, dermatite atópica, urticária e prurido; distúrbios que envolvem inflamação do sistema nervoso central e periférico, incluindo esclerose múltipla, polineuropatia desmielinizante idiopática, síndrome de Guillain-Barré, polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica, neurofibromatose e doenças neurodegenerativas, por exemplo, doença de Alzheimer.

Várias outras doenças inflamatórias podem ser tratadas com o uso dos métodos da invenção.

Estas incluem lúpus eritematoso sistêmico, doença renal mediada pelo sistema imune, por exemplo, glomerulonefrite e espondiloartropatias; e doenças com um componente inflamatório crônico indesejável, por exemplo, esclerose sistêmica, miopatias inflamatórias idiopáticas, síndrome de Sjögren, vasculite, sarcoidose, tireoidite, gota, otite, conjuntivite, sinusite, sarcoidose, síndrome de Behcet, síndrome linfoproliferativa autoimune (ou ALPS, também conhecida como síndrome de Canale-Smith), distúrbio leucoproliferativo autoimune associado a Ras (ou RALD), síndrome de Noonan, doenças hepatobiliares como, por exemplo, hepatite, cirrose biliar primária, hepatite granulomatosa e colangite esclerosante.

Em algumas modalidades, o paciente possui inflamação após lesão do sistema cardiovascular.

Várias outras doenças inflamatórias incluem doença de Kawasaki, doença de Castleman multicêntrica, tuberculose e colecistite crônica.

Doenças inflamatórias crônicas adicionais são descritas, por exemplo, em “Harrison’s Principles of Internal Medicine”, 12ª Edição, Wilson, e cols., eds., McGraw-Hill, Inc.). Em algumas modalidades, um paciente tratado com um anticorpo possui um câncer no qual GM-CSF contribui para o crescimento do tumor ou da célula de câncer incluindo, sem limitação, por exemplo, leucemia mielóide aguda, neurofibromatose plexiforme, síndrome linfoproliferativa autoimune (ou ALPS, também conhecida como síndrome de Canale-Smith), distúrbio leucoproliferativo autoimune associado a Ras (ou RALD), síndrome de Noonan, leucemia mielomonocítica crônica, leucemia mielomonocítica juvenil e leucemia mielóide aguda.

Em algumas modalidades, um paciente tratado com um anticorpo da invenção possui, ou está em risco de insuficiência cardíaca, por exemplo, em consequência de lesão isquêmica do sistema cardiovascular como, por exemplo, doença cardíaca isquêmica, acidente vascular encefálico e aterosclerose.

Em algumas modalidades, um paciente tratado com um anticorpo da invenção possui asma. Em algumas modalidades, um paciente tratado com um anticorpo da invenção possui doença de Alzheimer. Em algumas modalidades, um paciente tratado com um anticorpo da invenção possui osteopenia, por exemplo, osteoporose. Em algumas modalidades, um paciente tratado com um anticorpo da invenção possui púrpura trombocitopênica. Em algumas modalidades, o paciente possui diabetes Tipo I ou Tipo II. Em algumas modalidades, um paciente pode ter mais de uma doença na qual GM-CSF é um alvo terapêutico, por exemplo, um paciente pode ter artrite reumatóide e insuficiência cardíaca, ou osteoporose e artrite reumatóide etc.

[00293] Dois outros exemplos de anticorpo neutralizante anti-GM-CSF são o anticorpo humano ElO e o anticorpo humano G9 descritos em Li e cols., (2006) PNAS 103 (10): 3.557-

3.562. ElO e G9 são anticorpos da classe de IgG. ElO possui uma afinidade de ligação de 870 pM para GM-CSF e G9 possui uma afinidade de 14 pM para GM-CSF. Ambos os anticorpos são específicos para ligação ao GM-CSF humano e exibem forte atividade neutralizante, como avaliada com a ensaio de proliferação de células TF1.

[00294] Um anticorpo neutralizante anti-GM-CSF exemplar adicional é o anticorpo MT203 descrito por Krinner e cols., (Mol. Immunol. 44: 916-25, 2007; Epub. Maio de 2006 112006). MT203 é um anticorpo da classe de IgG1 que se liga ao GM-CSF com afinidade picomolar. O anticorpo mostra atividade inibidora potente, como avaliada por ensaio de proliferação de células TF-1 e sua habilidade para bloquear a produção de IL-8 em células U937.

[00295] Anticorpos adequados adicionais para uso com a presente invenção serão conhecidos por aqueles habilitados na técnica.

[00296] Antagonistas de hGM-CSF que são anticorpos anti- receptor de hGM-CSF também podem ser empregados com os métodos da presente revelação. Esses antagonistas de hGM-CSF incluem anticorpos para a cadeia alfa ou cadeia beta do receptor de hGM-CSF. Um anticorpo anti-receptor de hGM-CSF empregado na invenção pode estar em qualquer formato de anticorpo, como explicado acima, por exemplo, anticorpo intacto, quimérico, monoclonal, policlonal, fragmento de anticorpo, anticorpo humanizado, anticorpo Humaneered e semelhantes. Exemplos de anticorpos anti-receptor de hGM- CSF, por exemplo, anticorpos neutralizantes, de alta afinidade, adequados para uso na invenção são conhecidos (veja, por exemplo, Patente U.S. 5.747.032 e Nicola e cols., Blood 82: 1.724, 1993). Antagonistas de GM-CSF não anticorpo

[00297] Outras proteínas que podem interferir com a interação produtiva de hGM-CSF com seu receptor incluem proteínas hGM-CSF mutantes e proteínas secretadas que compreendem pelo menos parte da porção extracelular de uma ou de ambas as cadeias do receptor de hGM-CSF que se ligam ao hGM-CSF e competem com a ligação ao receptor da superfície celular. Por exemplo, um antagonista do receptor de hGM-CSF solúvel pode ser preparado por fusão da região codificadora da cadeia alfa de sGM-CSFR com as regiões CH2-CH3 da IgG2a murídea. Um receptor de hGM-CSF solúvel exemplar é descrito por Raines e cols. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:

8.203. Um exemplo de uma proteína de fusão de cadeia alfa de GM-CSFR-Fc é fornecido, por exemplo, em Brown e cols. (1995)

Blood 85: 1.488. Em algumas modalidades, o componente Fc de uma fusão desse tipo pode ser modificado geneticamente para modular a ligação, por exemplo, para aumentar a ligação, ao receptor Fc.

[00298] Outros antagonistas de hGM-CSF incluem mutantes de hGM-CSF. Por exemplo, hGM-CSF que possui uma mutação do resíduo de aminoácido 21 de hGM-CSF para Arginina ou Lisina (E21R ou E21K) descrito por Hercus e cols. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5.838, 1994 demonstrou ter atividade in vivo na prevenção da disseminação de células de leucemia hGM-CSF- dependentes em modelos de xenoenxerto em camundongo (Iversen e cols. Blood 90: 4.910, 1997). Como observado por aqueles habilitados na técnica, esses antagonistas podem incluir variantes modificadas conservativamente de hGM-CSF que possuem substituições, por exemplo, a substituição anotada no resíduo de aminoácido 21, ou variantes de hGM-CSF que possuem, por exemplo, análogos de aminoácidos para prolongar a meia-vida.

[00299] Em algumas modalidades, o antagonista de hGM-CSF pode ser um peptídeo. Por exemplo, um antagonista de peptídeo de hGM-CSF pode ser um peptídeo projetado para mimetizar estruturalmente as posições de resíduos específicos nas hélices B e C de GM-CSF humano que estão implicadas na ligação e bioatividade do receptor (por exemplo, Monfardini e cols., J. Biol. Chem. 271: 2.966-2.971, 1996).

[00300] Em outras modalidades, o antagonista de hGM-CSF é um “mimético de anticorpo” que visa e se liga ao antígeno de uma forma similar aos anticorpos. Alguns desses “miméticos de anticorpo” usam arcabouços de proteína não imunoglobulina como frameworks de proteína alternativos para as regiões variáveis de anticorpos.

Por exemplo, Ku e cols. (Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

U.S.A. 92 (14): 6.552-6.556 (1995)) revelam uma alternativa aos anticorpos baseados em citocromo b562 na qual duas das alças de citocromo b562 foram randomizadas e selecionadas para ligação contra albumina sérica bovina.

Foi verificado que os mutantes individuais se ligam seletivamente com BSA similarmente aos anticorpos anti-BSA.

As Patentes U.S.

Nos 6.818.418 e 7.115.396 revelam um mimético de anticorpo que apresenta um arcabouço de proteína de fibronectina ou do tipo fibronectina e pelo menos uma alça variável.

Conhecidas como Adnectinas, esses miméticos de anticorpo baseados em fibronectina exibem muitas das mesmas características de anticorpos naturais ou modificados geneticamente, incluindo alta afinidade e especificidade para o ligante visado.

A estrutura desses miméticos de anticorpo baseados em fibronectina é similar à estrutura da região variável da cadeia pesada de IgG.

Portanto, esse miméticos exibem propriedades de ligação ao antígeno similares na natureza e afinidade àquelas de anticorpos nativos.

Além disso, esses miméticos de anticorpo baseados em fibronectina exibem certos benefícios em relação aos anticorpos e fragmentos de anticorpo.

Por exemplo, esses miméticos de anticorpo não se baseiam em ligações dissulfeto para estabilidade de enovelamento nativa, e são, portanto, estáveis sob condições que normalmente degradariam anticorpos.

Além disso, na medida em que a estrutura desses miméticos de anticorpo baseados em fibronectina é similar àquela da cadeia pesada de IgG, o processo para randomização e embaralhamento da alça pode ser empregado in vitro, ou seja, similar ao processo de maturação de afinidade de anticorpos in vivo.

[00301] Beste e cols. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (5): 1.898-1.903 (1999)) revelam um mimético de anticorpo baseado em um arcabouço de lipocalina (Anticalina®). Lipocalinas são compostas por um barril-β com quatro alças hipervariáveis no terminal da proteína. As alças foram submetidas à mutagênese aleatória e selecionadas quanto à ligação com, por exemplo, fluoresceína. Três variantes exibiram ligação específica com fluoresceína, com uma variante exibindo ligação similar àquela de um anticorpo anti-fluoresceína. Análise adicional revelou que todas as posições randomizadas são variáveis, indicando que Anticalina seria adequada para ser usada como uma alternativa aos anticorpos. Dessa forma, Anticalinas são pequenos peptídeos de cadeia única, tipicamente entre 160 e 180 resíduos, que fornecem várias vantagens em relação aos anticorpos, incluindo custo de produção diminuído, estabilidade aumentada ao armazenamento e reação imunológica diminuída.

[00302] A Patente U.S. Nº 5.770.380 revela um mimético de anticorpo sintético com o uso do arcabouço orgânico rígido, não peptídico, de calixareno, anexado com múltiplas alças variáveis de peptídeos usadas como sítios de ligação. Todas as alças de peptídeo se projetam do mesmo lado geometricamente do calixareno, com relação entre elas. Por causa dessa confirmação geométrica, todas as alças estão disponíveis para ligação, aumentando a afinidade de ligação a um ligante. No entanto, em comparação com outros miméticos de anticorpo, o mimético de anticorpo baseado em calixareno não consiste exclusivamente em um peptídeo e, portanto, é menos vulnerável ao ataque por enzimas proteases. O arcabouço também não consiste puramente em um peptídeo, DNA ou RNA, o que significa que esse mimético de anticorpo é relativamente estável em condições ambientais extremas e possui uma vida- útil longa. Além disso, como o mimético de anticorpo baseado em calixareno é relativamente pequeno, é menos provável que produza uma resposta imunogênica.

[00303] Murali e cols. (Cell. Mol. Biol. 49 (2): 209-216 (2003)) descrevem uma metodologia para a redução de anticorpos em peptidomiméticos menores, eles denominam “peptidomiméticos de ligação do tipo anticorpo” (ABiP) que também podem ser úteis como uma alternativa aos anticorpos.

[00304] Além dos frameworks de proteína não imunoglobulina, as propriedades do anticorpo também foram mimetizadas em compostos que compreendem moléculas de RNA e oligômeros não naturais (por exemplo, inibidores de protease, benzodiazepinas, derivados de purina e miméticos de dobra-beta). Consequentemente, antagonistas de GM-CSF não anticorpo também podem incluir esses compostos. Administração terapêutica

[00305] Em algumas modalidades, os métodos da presente revelação compreendem a administração de um antagonista de hGM-CSF (por exemplo, um anticorpo anti-hGM-CSF) como uma composição farmacêutica a um indivíduo que possui uma CRS ou uma tempestade de citocinas. Em algumas modalidades, o antagonista de hGM-CSF é administrado em uma quantidade tersímiouticamente eficaz usando um regime de dosagem adequado para o tratamento da doença.

[00306] Em algumas modalidades, uma quantidade tersímiouticamente eficaz é uma quantidade que interrompe pelo menos parcialmente a condição ou seus sintomas. Por exemplo, uma quantidade tersímiouticamente eficaz pode interromper a ativação imune, pode diminuir os níveis de citocinas circulantes, pode diminuir a ativação de células T, ou pode melhorar febre, mal-estar, fadiga, anorexia, mialgias, artralgias, náuseas, vômitos, dor de cabeça, erupção cutânea, náuseas, vômitos, diarréia, taquipnéia, hipoxemia, taquicardia cardiovascular, pressão do pulso ampliada, hipotensão, débito cardíaco aumentado (precoce), débito cardíaco potencialmente diminuído (tardio), dímero-D elevado, hipofibrinogenemia com ou sem sangramento, azotemia, transaminite, hiperbilirrubinemia, dor de cabeça, alterações do estado mental, confusão, delírio, dificuldade para encontrar palavras ou afasia franca, alucinações, tremor, dismetria, marcha alterada ou convulsões.

[00307] Os métodos da invenção compreendem a administração de um anticorpo anti-hGM-CSF como uma composição farmacêutica a um paciente em uma quantidade tersímiouticamente eficaz com o uso de um regime de dosagem adequado para o tratamento da doença. A composição pode ser formulada para uso em vários sistemas de liberação de fármacos. Um ou mais excipientes ou carreadores fisiologicamente aceitáveis também podem ser incluídos nas composições para formulação adequada. Formulações adequadas para uso na presente invenção são encontradas sem Remington: “The Science and Practice of Pharmacy”, 21ª Edição, Philadelphia, PA. Lippincott Williams & Wilkins, 2005. Para um breve resumo de métodos para liberação de fármacos, veja, Langer, Science 249: 1.527-1.533 (1990).

[00308] O anticorpo anti-hGM-CSF para uso nos métodos da invenção é fornecido em uma solução adequada para injeção no paciente, por exemplo, uma solução aquosa isotônica estéril para injeção. O anticorpo é dissolvido ou suspendo em uma concentração adequada em um carreador aceitável. Em algumas modalidades, o carreador é aquoso, por exemplo, água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato e semelhantes. As composições podem conter substâncias farmacêuticas auxiliares como necessário para se aproximar das condições fisiológicas, por exemplo, agentes de ajuste do pH e de tamponamento, agentes de ajuste da tonicidade e semelhantes.

[00309] As composições farmacêuticas da invenção são administradas a um paciente, por exemplo, um paciente que possui osteopenia, artrite reumatóide, artrite idiopática juvenil, doença de Still de surgimento sistêmico, asma, asma eosinofílica, esofagite eosinofílica, esclerose múltipla, psoríase, dermatite atópica, neurofibromatose plexiforme, síndrome linfoproliferativa autoimune (ou ALPS, também conhecida como síndrome de Canale-Smith), distúrbio leucoproliferativo autoimune associado a Ras (ou RALD), síndrome de Noonan, leucemia mielomonocítica crônica, leucemia mielomonocítica juvenil, leucemia mielóide aguda, doença de Castleman multicêntrica, doença pulmonar obstrutiva crônica, doença pulmonar intersticial, doença pulmonar parenquimatosa difusa, púrpura trombocitopênica idiopática, doença de Alzheimer, insuficiência cardíaca, doença de Kawasaki, dano cardíaco em decorrência de um evento isquêmico, ou diabetes, em uma quantidade suficiente para curar ou pelo menos interromper parcialmente a doença ou sintomas da doença e suas complicações. Uma quantidade adequada para que isso seja obtido é definida como uma “dose tersímiouticamente eficaz”. Uma dose tersímiouticamente eficaz é determinada por monitoramento de uma resposta do paciente à terapia. Padrões típicos indicativos de uma dose tersímiouticamente eficaz incluem melhora de sintomas da doença no paciente. Quantidades eficazes para esse uso dependerão da severidade da doença e do estado geral da saúde do paciente, incluindo outros fatores como, por exemplo, idade, peso, sexo, via de administração etc. Administrações únicas ou múltiplas do anticorpo podem ser feiras, dependendo da dosagem e frequência como necessárias e toleradas pelo paciente. Em qualquer evento, os métodos fornecem uma quantidade suficiente de anticorpo anti-hGM-CSF para tratar eficazmente o paciente.

[00310] O anticorpo pode ser administrado isoladamente, ou em combinação com outras terapias para tratar a doença de interesse.

[00311] O anticorpo pode ser administrado por injeção ou infusão por meio de qualquer via adequada incluindo, sem limitação, vias intravenosa, subcutânea, intramuscular ou intrsímioritoneal. Em algumas modalidades, o anticorpo pode ser administrado por insuflação. Em uma modalidade exemplar, o anticorpo pode ser armazenado a 10 mg/ml em solução salina aquosa isotônica estéril para injeção a 4°C e é diluído em 100 ml ou 200 ml de cloreto de sódio 0,9% para injeção antes da administração ao paciente. O anticorpo é administrado por infusão intravenosa ao longo do período de 1 hora em uma dose entre 0,2 e 10 mg/kg. Em outras modalidades, o anticorpo é administrado, por exemplo, por infusão intravenosa ao longo de um período entre 15 minutos e 2 horas. Ainda em outras modalidades, o procedimento de administração é por meio de injeção subcutânea ou intramuscular.

[00312] Em algumas modalidades, o antagonista de hGM- CSF, por exemplo, um anticorpo anti-hGM-CSF, é administrado por uma via periespinhal. A administração periespinhal envolve a liberação anatomicamente localizada realizada de modo a colocar a molécula terapêutica diretamente nas vizinhanças da medula no momento da administração inicial. A administração periespinhal é descrita, por exemplo, na Patente U.S. Nº 7.214.658 e em Tobinick & Gross, J. Neuroinflamation 5: 2, 2008.

[00313] A dose de antagonista de hGM-CSF é escolhida a fim de fornecer terapia eficaz para um indivíduo que foi diagnosticado com CRS ou tempestade de citocinas. A dose está tipicamente na faixa de cerca de 0,1 mg/kg de peso corporal até cerca de 50 mg/kg de peso corporal ou na faixa de cerca de 1 mg até cerca de 2 g por paciente. A dose está frequentemente na faixa de cerca de 1 até cerca de 20 mg/kg ou aproximadamente cerca de 50 mg até cerca de 2.000 mg / paciente. A dose pode ser repetida em uma frequência apropriada que pode estar na faixa de uma vez por dia até uma vez a cada três meses, dependendo da farmacocinética do antagonista (por exemplo, meia-vida do anticorpo na circulação) e da resposta farmacodinâmica (por exemplo, da duração do efeito terapêutico do anticorpo). Em algumas modalidades, nas quais o antagonista é um anticorpo ou fragmento de anticorpo modificado, a meia-vida in vivo é entre cerca de 7 e cerca de 25 dias e a dosagem do anticorpo é repetida entre uma vez por semana e uma vez a cada 3 meses. Em outras modalidades, o anticorpo é administrado aproximadamente uma vez por mês.

[00314] Uma região VH e/ou região VL da invenção também pode ser usada para fins diagnósticos. Por exemplo, uma região VH e/ou VL pode ser usada para análise clínica, por exemplo, detecção de níveis de GM-CSF em um paciente. Uma região VH ou VL da invenção também pode ser usada, por exemplo, para produzir anticorpos anti-Id.

[00315] Salvo definição em contrário nesse relatório descritivo, os termos científicos e técnicos usados em conexão com o presente pedido deve ter os significados que são comumente subentendidos por aqueles habilitados na técnica. Além disso, salvo quando exigido de outro modo pelo contexto, os termos no singular devem incluir pluralidades e os termos no plural devem incluir o singular.

[00316] Em uma modalidade, o termo “tratamento” compreende tratamento terapêutico e “prevenção” compreende medidas profiláticas ou preventivas, em que o objetivo é evitar ou reduzir a condição ou distúrbio patológico visado, como descrito acima anteriormente. Dessa forma, em uma modalidade, o tratamento pode incluir afetar ou curar diretamente, a supressão, inibição, prevenção, redução da severidade, retardo do surgimento, redução de sintomas associados com a doença, distúrbio ou condição, ou uma combinação destes. Dessa forma, em uma modalidade, “tratamento”, “melhora” e “alívio” se referem, inter alia, ao retardo da progressão, expedição da remissão, indução de remissão, aumento de remissão, aceleração da recuperação, aumento da eficácia ou diminuição da resistência a terapêuticas alternativas, ou uma combinação destes. Em uma modalidade, “prevenção” se refere, inter alia, ao retardo do surgimento de sintomas, prevenção de recidiva de uma doença,

uma diminuição do número ou frequência de episódios de recidiva, aumento da latência entre episódios sintomáticos, ou uma combinação destes. Em uma modalidade, “supressão” ou “inibição”, se refere, inter alia, à redução da severidade de sintomas, redução da severidade de um episódio agudo, redução do número de sintomas, redução da incidência de sintomas relacionados à doença, redução da latência de sintomas, melhora dos sintomas, redução de sintomas secundários, redução de infecções secundárias, prolongamento da sobrevida do paciente, ou uma combinação destes.

[00317] Na presente revelação, as formas no singular “um”, “uma”, “o” e “a” incluem a referência no plural, e referência a um valor numérico particular inclui pelo menos aquele valor particular, a menos que o contexto indique claramente o contrário. O termo “pluralidade”, como usado nesse relatório descritivo, significa mais do que um. Quando uma faixa de valores é expressa, outra modalidade inclui desde aquele valor particular e/ou até o outro valor particular.

[00318] Similarmente, quando valores são expressos como aproximações, pelo uso do antecedente “cerca de”, subentende-se que o valor particular forma outra modalidade. Todas as faixas são inclusivas e combináveis. Em algumas modalidades, o termo “cerca de”, se refere a um desvio entre 0,0001-5% do número ou faixa de números indicada. Em algumas modalidades, o termo “cerca de”, se refere a um desvio entre 1-10% do número ou faixa de números indicada. Em algumas modalidades, o termo “cerca de”, se refere a um desvio de até 25% do número ou faixa de números indicada. O termo “compreende” significa e engloba todos os elementos listados, mas também pode incluir elementos adicionais, inominados, e pode ser usado de forma intercambiável com os termos “engloba”, “inclui” ou “contém”, todos tendo as mesmas qualidades e significados. O termo “que consiste em” significa que é composto pelos elementos ou etapas citadas, e pode ser usado de forma intercambiável com os termos “composto por”, todos tendo as mesmas qualidades e significados.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 - Anticorpos Humaneered exemplares para GM-CSF

[00319] Um painel de moléculas Fab’ modificadas geneticamente com a especificidade de cl9/2 foi gerado a partir de bibliotecas de segmentos-V humanos concentrada em epitopo, como descrito nas Publicações de Pedidos de Patente U.S. Nos 20060134098 e 20050255552. Foram construídas bibliotecas concentradas em epitopo a partir de sequências da biblioteca de segmentos-V humanos ligadas a uma região CDR3-FR4 que contém sequências de BSD em CDRH3 e CDRL3 junto com sequências do segmento-J da linhagem germinativa humana. Para a cadeia pesada, a sequência JH4 da linhagem germinativa humana foi usada, e para a cadeia leve, foi usada a sequência JK4 da linhagem germinativa humana.

[00320] Foram selecionadas regiões-V Humaneered de comprimento total de uma biblioteca Vh1-restrita que davam suporte à ligação ao GM-CSF humano recombinante. A biblioteca de V-kappa “de comprimento total” foi usada como uma base para a construção de bibliotecas de “cassetes”, como descrito na Publicação de Pedido de Patente U.S. Nº 20060134098, nas quais somente parte do segmento-V do anticorpo cl9/2 murídeo foi inicialmente substituída por uma biblioteca de sequências humanas. Dois tipos de cassetes foram construídos. Cassetes para as cadeias V-kappa foram feitas por PCR em ponte com sequências comuns superpostas dentro da região framework 2. Dessa forma, bibliotecas de cassetes humanos “dianteiros” e “centrais” foram construídas para o isótipo III de V-kappa humana. Cassetes de V-kappa humana III que davam suporte à ligação ao GM-CSF foram identificados por ensaio de ligação por elevação de colônia e classificados de acordo com afinidade em ELISA. Os cassetes “dianteiros” e “centrais” de V-kappa humana foram fundidos juntos por PCR em ponte para reconstruir uma região V-kappa totalmente humana que dava suporte à atividade de ligação de GM-CSF. Os Fabs Humaneered, dessa forma, consistem em regiões V-pesada e V-kappa Humaneered que dão suporte à ligação ao GM-CSF humano.

[00321] A atividade de ligação foi determinada por análise por ressonância de plásmon de superfície (SPR). GM- CSF biotinilado foi capturado em um chip biossensor CM5 revestido com estreptavidina. Fragmentos Fab Humaneered expressos por E. coli foram diluídos até uma concentração de partida de 30 nM em 10 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 0,1 mg/ml de BSA e 0,005% de P20 em pH 7,4. Cada Fab foi diluído 4 vezes usando uma série de diluições de 3 vezes e cada concentração foi testada duas vezes a 37°C para determinar a cinética de ligação com as diferentes superfícies de densidade de antígeno. Os dados de todas as três superfícies foram ajustados globalmente para extrair as constantes de dissociação.

[00322] As cinéticas de ligação foram analisadas por ressonância de plásmon de superfície (SPR) em Biacore 3000.

Antígeno de GM-CSF humano recombinante foi biotinilado e imobilizado em um chip sensor CM5 revestido com estreptavidina. As amostras de Fab foram diluídas até uma concentração de partida de 3 nM e processadas em uma série de diluições de 3 vezes. Os ensaios foram processados em 10 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 0,1 mg/ml de BSA e 0,005% de p20 em pH 7,4 e 37°C. Cada concentração foi testada duas vezes. Ensaios de ligação a Fab' foram processados em duas superfícies de densidade de antígeno fornecendo conjuntos de dados em duplicata. A afinidade média (KD) para cada um de 6 vários clones de Fab Humaneered anti-GM-CSF, calculada usando um modelo de ligação de Langmuir de 1:1, é mostrada na Tabela 2.

[00323] Fabs foram testados quanto à neutralização de GM- CSF usando um ensaio de proliferação de células TF-1. A proliferação GM-CSF-dependente de células TF-1 humanas foi medida após incubação por 4 dias com 0,5 ng/ml de GM-CSF usando um ensaio de MTS (Cell Titer 96, Promega) para determinar células viáveis. Todos os Fabs inibiram a proliferação celular nesse ensaio, indicando que estes são anticorpos neutralizantes. Há uma boa correlação entre afinidades relativas dos Fabs anti-GM-CSF e EC50 no ensaio baseado em células. Anticorpos anti-GM-CSF com afinidades monovalentes na faixa 18 pM - 104 pM demonstram neutralização eficaz de GM-CSF no ensaio baseado em células.

[00324] Sequências da região V anti-GM-CSF modificadas geneticamente exemplares são mostradas na Figura 1.

[00325] Tabela 2: Afinidade de Fabs anti-GM-CSF determinada por análise por ressonância de plásmon de superfície em comparação com atividade (EC50) em um ensaio de proliferação de células TF-1 GM-CSF dependente. Fab Afinidade de ligação EC50 (pM) no ensaio monovalente de proliferação de determinada por SPR células TF-1 (pM) 94 18 165 104 19 239 77 29 404 92 58 539 42 104 3.200 44 81 7.000 EXEMPLO 2 - Avaliação de um anticorpo humanizado contra GM-

CSF

[00326] Esse exemplo avalia a atividade de ligação e potência biológica de um anticorpo humanizado anti-GM-CSF em um ensaio baseado em células em comparação com um anticorpo IgG1k quimérico (Ab2) que possui regiões variáveis do anticorpo de camundongo LMM102 (Nice e cols., Growth Factors 3: 159, 1990). Ab1 é um anticorpo IgG1k humanizado contra GM-CSF que possui regiões constantes idênticas ao Ab2. Análise por ressonância de plásmon de superfície a ligação de GM-CSF humano ao Ab1 e Ab2

[00327] Análise por ressonância de plásmon de superfície foi usada para comparar a cinética de ligação e afinidades monovalentes para a interação de Ab1 e Ab2 com GM-CSF glicosilado humano usando um instrumento Biacore 3000. Ab1 ou Ab2 foi capturado sobre a superfície do chip Biacore usando F(ab’)2 policlonal anti-humano. GM-CSF humano recombinante glicosilado expresso por células 293 humanas foi usado como o analito. As constantes cinéticas foram determinadas em 2 experimentos independentes (veja as Figuras 2A-2B e Tabela 3). Os resultados mostram que GM-CSF se ligou ao Ab2 e Ab1 com afinidade monovalente comparável nesse experimento. No entanto, Ab1 teve uma “on-rate” duas vezes mais lenta do que Ab2, mas uma “off-rate” que era aproximadamente três vezes mais lenta. Tabela 3: Constantes cinéticas a 37°C determinadas pela análise por ressonância de plásmon de superfície nas Figuras 2A-2B; constante de associação (ka), constante de dissociação (kd) e afinidade calculada (KD) são mostradas. ka (M-1s-1) kd (s-1) KD (pM) Ab2 7,20 x 105 2,2 x 10-5 30,5 Ab1 2,86 x 105 7,20 x 10-6 25,1

[00328] GM-CSF é naturalmente glicosilado em ambos os sítios de glicosilação, ligado ao N e ligado ao O, embora a glicosilação não seja necessária para a atividade biológica. A fim de determinar se a glicosilação de GM-CSF afeta a ligação de Ab1 ou Ab2, os anticorpos foram comparados em um ELISA usando GM-CSF recombinante de duas fontes diferentes; GM-CSF expresso em E. coli (não glicosilado) e GM-CSF expresso por células 293 humanas (glicosilado). Os resultados nas Figuras 3A-3B e Tabela 4 mostraram que ambos os anticorpos se ligarão ao GM-CSF glicosilado e não glicosilado com atividades equivalentes. Os dois anticorpos também demonstram valores de EC50 comparáveis nesse ensaio. Tabela 4. Resumo da EC50 para ligação de Ab2 e Ab1 ao GM-CSF humano de duas fontes diferentes determinada por ELISA. A ligação ao GM-CSF recombinante por células 293 humanas (glicosilado) ou por E. coli (não glicosilado) foi determinada por dois experimentos independentes. O

Experimento 1 é mostrado nas Figuras 3A-3B. Não glicosilado Não glicosilado Glicosilado (experimento 1) (experimento 2) (experimento 1) Ab2 400 pM 433 pM 387 pM Ab1 373 pM 440 pM 413 pM

[00329] Ab1 é um anticorpo humanizado que foi derivado das regiões variáveis de camundongo presentes em Ab2. Ab1 foi testado para especificidade de epitopo sobreposta (Ab2) por ELISA de competição.

[00330] Ab2 biotinilado foi preparado com o uso de técnicas conhecidas. A biotinilação não afetou a ligação de Ab2 ao GM-CSF, como determinado por ELISA. No ensaio, Ab2 ou Ab1 foi adicionado em concentrações variáveis com uma quantidade fixa de Ab2 biotinilado. A detecção de Ab2 biotinilado foi testada na presença de competidor Ab ou Ab1 não marcado (Figuras 4A-4B). Tanto Ab1 quanto Ab2 competiram com Ab2 biotinilado pela ligação ao GM-CSF indicando, dessa forma, ligação ao mesmo epitopo. Ab1 competiu mais eficazmente pela ligação ao GM-CSF do que Ab2, consistente com a cinética de dissociação mais lenta para Ab1, quando comparado com Ab2, por análise por ressonância de plásmon de superfície. Neutralização de atividade de GM-CSF por Ab1 e Ab2

[00331] Um ensaio baseado em células para neutralização de atividade de GM-CSF foi empregado para avaliar a potência biológica. O ensaio mede a secreção de IL-8 por células U937 induzida com GM-CSF. IL-8 secretada no sobrenadante da cultura é determinada por ELISA após indução por 16 horas com 0,5 ng/ml de GM-CSF derivado de E. coli.

[00332] Uma comparação da atividade neutralizante de Ab1 e Ab2 nesse ensaio é mostrada em um ensaio representativo na Figura 5. Em três experimentos independentes, Ab1 inibiu a atividade de GM-CSF mais eficazmente do que Ab2, quando se compara a IC50 (Tabela 5). Tabela 5. Comparação da IC50 para inibição da expressão de IL-8 induzida por GM-CSF. Dados de três experimentos independentes mostrados na Figura 5 e IC50 média são expressos em ng/ml e nM. Experimento Ab2 Ab2 (nM) Ab1 Ab1 (nM) (ng/ml) (ng/ml) A 363 2,4 31,3 0,21 B 514 3,4 92,5 0,62 C 343 2,2 20,7 0,14 Média 407 2,7 48,2 0,32 Sumário

[00333] O Ab1 Humaneered se ligou ao GM-CSF com uma constante de ligação em equilíbrio (KD) calculada de 25 pM. Ab2 se ligou ao GM-CSF com uma KD de 30,5 pM. Ab2 mostrou uma constante de associação (ka) duas vezes maior do que Ab1 para GM-CSF, enquanto Ab1 mostrou uma cinética de dissociação (kd) três vezes mais lenta do que Ab2. Ab2 e Ab1 mostraram atividade de ligação similar para GM-CSF glicosilado e não glicosilado em um ELISA de ligação ao antígeno. Um ELISA de competição confirmou que ambos os anticorpos competiam pelo mesmo epitopo; Ab1 mostrou atividade de ligação competitiva maior do que Ab2. Além disso, Ab1 mostrou neutralização maior da atividade de GM-CSF do que Ab2 em um ensaio de indução de IL-8 induzida por GM-CSF. EXEMPLO 3 - Administração de um anticorpo neutralizante anti-GM-CSF em um modelo em camundongo de toxicidade relacionada à imunoterapia

[00334] Um modelo em camundongo de toxicidade relacionada à imunoterapia pode ser usado para mostrar a eficácia de um anticorpo anti-GM-CSF para prevenção e tratamento de toxicidade relacionada à imunoterapia. Em um modelo de toxicidade relacionada à imunoterapia, camundongos são injetados com células T CAR em doses que provocam toxicidade. Por exemplo, van der Stegen e cols. (J. Immunol. 191: 4.589-

4.598 (2013)), incorporado nesse relatório descritivo por referência, descrevem um modelo de CRS induzida pela injeção i.p. de uma dose única de 30 x 106 células denominadas células T T4+. Células T T4+ são células T modificadas geneticamente que expressam o receptor de Ag quimérico (CAR) T1E28z. Células T modificadas geneticamente para expressar T1E28z são ativadas por células que expressam dímeros baseados em ErbB1 e ErbB4- e heterodímero ErbB2/3.

[00335] Para avaliar a eficácia de anticorpos anti-GM- CSF para prevenção e tratamento de CRS, os camundongos serão divididos em grupos (n = 10), cada grupo recebendo: a) uma única injeção i.p. de solução salina; b) uma injeção i.p. de 30 x 106 células T T4+; c) uma injeção i.p. de 30 x 106 células T T4+ e 0,25 mg de injeção intravenosa (i.v.) de anticorpo monoclonal anti-GM-CSF 22E9 (um anticorpo anti-GM- CSF de camundongo recombinante de rato) co-administrada com células T T4+; d) uma injeção i.p. de 30 x 106 células T T4+ e 0,25 mg de administração intranasal (i.n.) de anticorpo anti-GM-CSF 22E9 co-administrada com células T T4+; e) uma injeção i.p. de 30 x 106 células T T4+ e 0,25 mg i.v. de anticorpo anti-GM-CSF 22E9 6 horas antes da administração das células T T4+; f) uma injeção i.p. de 30 x 106 células T

T4+ e 0,25 mg i.n. de anticorpo anti-GM-CSF 22E9 6 horas antes da administração de células T T4+; g) uma injeção i.p. de 30 x 106 células T T4+ e 0,25 mg i.v. de anticorpo anti- GM-CSF 22E9 2 horas após administração das células T T4+; ou h) uma injeção i.p. de 30 x 106 células T T4+ e 0,25 mg i.n. de anticorpo anti-GM-CSF 22E9 2 horas após administração das células T T4+. Doses adicionais, tempos de administração e vias de administração serão avaliados.

[00336] A fim de avaliar o efeito do anticorpo anti-GM- CSF 22E9, órgãos serão coletados de camundongos, fixados em formalina, e submetidos à análise histopatológica. Sangue será coletado e as concentrações de IFNγ humano, IL-2 humana, e IL-6, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17, IFNγ e TNFα de camundongo serão avaliadas por métodos bem descritos na literatura, por exemplo, ensaio ELISA. O peso, comportamento e manifestações clínicas dos camundongos serão observados. EXEMPLO 4 - Efeito do anticorpo anti-GM-CSF sobre imunoterapia

[00337] Um modelo em camundongo pode ser usado para mostrar que antagonistas de GM-CSF não afetam negativamente a eficácia de imunoterapia do câncer. Camundongos SCID bege podem ser inoculados com uma linhagem de célula de câncer e tratados com um agente imunoterapêutico que sabidamente induz CRS, como células T T4+, com ou sem um anticorpo anti- GM-CSF.

[00338] Para avaliar se os anticorpos anti-GM-CSF afetam a eficácia da imunoterapia, os camundongos serão divididos em grupos (n = 10), cada grupo recebendo: a) uma injeção subcutânea (s.c.) de 30 x 106 células SKOV3; b) uma injeção s.c. de 30 x 106 células SKOV3 e uma injeção i.p. de 30 x 106 células T T4+; ou c) um implante s.c. de 30 x 106 células SKOV3, uma injeção i.p. de 30 x 106 células T T4+ e uma injeção i.v. de 0,25 mg de anticorpo anti-GM-CSF 22E9.

[00339] A fim de avaliar o efeito do anticorpo anti-GM- CSF 22E9 sobre a eficácia das células T T4+, o tamanho do tumor será medido a cada quatro dias por compasso de calibre, e o volume tumoral calculado pela fórmula: 0,5 x (diâmetro maior) x (diâmetro menor)2. O peso, comportamento e manifestações clínicas dos camundongos serão observados. Ao final do experimento, os animais serão sacrificados, e os tecidos tumorais coletados e pesados. EXEMPLO 5 - Modelo em camundongo de CRS humana

[00340] Um modelo em camundongo para CRS para investigação dos efeitos de um anticorpo monoclonal humanizado anti-GM-CSF no tratamento ou prevenção de CRS foi desenvolvido (Figura 17a-17b).

[00341] Método: O modelo usado é um modelo de AML primária. Camundongos NSG-S imunocomprometidos que eram adicionalmente transgênicos para SCF, IL-3 e GM-CSF humanos foram enxertados com blastos de AML derivados de pacientes com AML que eram CD123-positivos. Após 2-4 semanas, eles foram sangrados para confirmar o enxerto e obtenção de carga de doença elevada. Os camundongos foram então tratados com doses altas de CAR-T123 a 1 x 106 células, que são 10 vezes maiores do que as doses estudadas previamente.

[00342] Resultados: Foi observado que dentro de 1-2 semanas após injeção de células CAR-T, esses camundongos desenvolveram uma enfermidade caracterizada por fraqueza, emagrecimento, corpos encurvados, retraimento e resposta motora pobre. Os camundongos por fim morreram em decorrência de sua doença dentro de 7-10 dias. Os sintomas se correlacionam com expansão maciça de células T nos camundongos e com elevação de múltiplas citocinas humanas, por exemplo, IL-6, MIP 1α, IFN-γ, TNFα, GM-CSF, MIP1β e IL- 2, e em um padrão que se assemelha com aquele que é observado em CRS humana após terapia com células CAR-T. A razão de alteração de GM-CSF foi significantemente maior do que de outras citocinas. (Figura 17 a-b). EXEMPLO 6 - Geração de CAR-Ts com knockout de GM-CSF

[00343] Células T com knockout de GM-CSF CRISPR forem gerados e foi demonstrado que exibem expressão reduzida de GM-CSF, mas níveis similares de outras citocinas e degranulação, o que demonstrava funcionalidade de célula imune (veja as Figs. 15a-15g). EXEMPLO 7 - Anticorpo neutralizante anti-GM-CSF não inibe morte mediada por CAR-T, proliferação ou produção de citocina, mas neutraliza GM-CSF

[00344] O anticorpo neutralizante anti-GM-CSF não inibe a morte mediada por CAR-T, proliferação ou produção de citocina, mas neutraliza com sucesso GM-CSF (veja as Figs. 16a-16i). EXEMPLO 8 - Anticorpo neutralizante anti-GM-CSF não inibe a eficácia de CAR-T in vivo

[00345] O anticorpo humanizado monoclonal anti-GM-CSF, um anticorpo neutralizante de hGM-CSF, não inibe eficácia de CAR-T in vivo (Fig. 18a-18c). Eficácia de CAR-T em um modelo de xenoenxerto em combinação com um anticorpo neutralizante anti-GM-CSF de acordo com modalidades descritas nesse relatório descritivo. Como mostrado na Fig. 18a, camundongos NSG foram injetadas com células NALM-6-GFP/Luciferase

(humanas, sangue periférico de leucemia pré-célula B) e imageamento bioluminescente (BLI0 foi realizado para confirmar crescimento tumoral. Os camundongos foram tratados com (1) anticorpo anti-GM-CSF (10 mg/kg diariamente por dez dias) e (a) CART19 ou (b) células T humanas não transduzidas (UTD) 1 x 106 células ou (2) anticorpo IgG de controle (10 mg/kg diariamente por dez dias) e (a) CART19 ou (b) células T humanas não transduzidas (UTD) 1 x 106 células. As Figs. 18b e 18c demonstram que o anticorpo neutralizante anti-GM- CSF não inibiu a eficácia de CAR-T in vivo. EXEMPLO 9 - Anticorpo neutralizante anti-GM-CSF não prejudica o impacto de CAR-T sobre a sobrevida

[00346] Dados pré-clínicos in vitro e in vivo demonstram que anticorpo neutralizante anti-GM-CSF (um anticorpo monoclonal humanizado anti-GM-CSF) não prejudica o impacto de CAR-T sobre a sobrevida em modelos em camundongo. (Fig. 19).

[00347] O anticorpo neutralizante anti-GM-CSF não impede a função de célula CAR-T in vivo na ausência de PBMCs. A sobrevida demonstrou ser similar para CAR-T + controle e CAR-T + anticorpo neutralizante anti-GM-CSF. EXEMPLO 10 - Anticorpo neutralizante anti-GM-CSF pode amentar a expansão de CART-T

[00348] Dados pré-clínicos in vitro e in vivo demonstram que o anticorpo neutralizante anti-GM-CSF (um anticorpo monoclonal humanizado anti-GM-CSF) pode aumentar a expansão de CAR-T (Fig. 20). O anticorpo neutralizante anti-GM-CSF pode aumentar a morte de células de câncer in vitro por CAR- T. O anticorpo aumenta a proliferação de células CAR-T e poderia aumentar a eficácia. A proliferação de CAR-T foi aumentada pelo anticorpo neutralizante de GM-CSF na presença de PBMCs (ela não foi afetada sem PBMCs). O anticorpo não inibiu a degranulação, produção intracelular de GM-CSF ou produção de IL-2. EXEMPLO 11 - Expansão de CAR-T associada com taxa de resposta global aumentada

[00349] A expansão de CAR-T se associava com taxa de resposta global aumentada (Fig. 21). AUC (área sob a curva) de CAR definida como níveis cumulativos de células CAR+/µl do sangue ao longo dos primeiros 28 dias pós-administração de CAR-T. Valores P calculados por teste de soma de ranques de Wilcoxon. (Neelapu, e cols. ICML 2017 Resumo 8). EXEMPLO 12 - Protocolo de estudo para um anticorpo neutralizante anti-GM-CSF de acordo com modalidades descritas nesse relatório descritivo

[00350] Protocolo de estudo para um anticorpo neutralizante anti-GM-CSF (um anticorpo monoclonal humanizado anti-GM-CSF) de acordo com modalidades descritas nesse relatório descritivo (veja a Fig. 22). CRS e NT devem ser avaliadas diariamente enquanto hospitalizadas e na consulta clínica pelos primeiros 30 dias. Indivíduos elegíveis para receber anticorpo neutralizante de GM-CSF nos dias -1, +1 e +3 de tratamento com CAR-T. Avaliação do tumor a ser realizada no nível de base e nos meses 1, 3, 6, 9, 12, 18 e 24. Amostras de sangue (PBMC e soro) dias -5, -1, 0, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 21, 28, 90, 180, 270 e 360. EXEMPLO 13 - A depleção de GM-CSF aumenta a expansão de células CAR-T

[00351] A depleção de GM-CSF aumenta a expansão de células CAR-T (Fig. 23A-23B). A Fig. 23A mostra expansão de células CAR-T GM-CSFk/o ex vivo aumentada, comparada com células CAR-T de controle. A Fig. 23b demonstra proliferação mais robusta após in vivo tratamento com um anticorpo neutralizante anti-GM-CSF (um anticorpo monoclonal humanizado anti-GM-CSF) de acordo com modalidades descritas nesse relatório descritivo. EXEMPLO 14 Perfil de segurança de um Ab neutralizante anti-GM-CSF em > 100 pacientes humanos*

[00352] Fase I: Dose única, escalonamento de dose em voluntários adultos saudáveis. Os objetivos foram analisar a Segurança/tolerabilidade, PK e Imunogenicidade.

[00353] Inclusão/dose: (n = 12); 3 / 1 mg/kg; 3 / 3 mg/kg; 3 / 10 mg/kg; 3 / placebo.

[00354] Resultados de segurança: Perfil de segurança limpo: Nenhum efeito adverso sério (SAE) relacionado ao fármaco; Não imunogênico.

[00355] Fase II: 1) Dose nas semanas 0, 2, 4, 8, 12 em pacientes com artrite reumatóide. Os objetivos foram analisar a Eficácia, Segurança/tolerabilidade, PK e Imunogenicidade.

[00356] Inclusão/dose: (n = 9); 7 / 600 mg;

2 / placebo.

[00357] Resultados de segurança: Perfil de segurança limpo: Nenhum efeito adverso sério (SAE) relacionado ao fármaco; Não imunogênico.

[00358] 2) Dose nas semanas 0, 2, 4, 8, 12, 16 20 em pacientes com asma severa. Os objetivos foram analisar a Eficácia, Segurança/tolerabilidade, PK e Imunogenicidade.

[00359] Inclusão/dose: (n = 160); 78 / 400 mg; 82 / placebo.

[00360] Resultados de segurança: Perfil de segurança limpo: Nenhum efeito adverso sério (SAE) relacionado ao fármaco; Não imunogênico; * 94 pacientes nos estudos retratados acima, mais 12 pacientes em experimento de Fase I de CMML em andamento, em que o fármaco é bem tolerado; um adicional de 76 pacientes recebeu uma versão quimérica de um Ab neutralizante de GM- CSF (KB002) e mostrou um perfil de segurança similar.

[00361] Todos os estudos randomizados, duplo-cegos, controlados por placebo, administração IV (veja a Figura 24). EXEMPLO 15 - Efeito de anticorpo anti-GM-CSF sobre atividade e toxicidade de CART

[00362] O estudo investigará o efeito do bloqueio de GMCSF com anticorpo anti-GM-CSF sobre atividade e toxicidade de células T com receptor de antígeno quimérico (CART). Isso pode ser obtido por meio desses dois AIMS: AIM#1: Investigar o efeito do bloqueio de GMCSF com anticorpo anti-GM-CSF sobre funções efetoras de células CART; AIM#2: Estudar o efeito do bloqueio de GMCSF com anticorpo anti-GM-CSF sobre a redução da síndrome de liberação de citocinas após Estratégia de pesquisa de terapia de células CART. Os seguintes experimentos são propostos: Estudos in vitro da combinação de quatro doses diferentes do bloqueio de GMCSF com anticorpo anti-GM-CSF com células CART (produção de citocina (30 Plex Lumiex, incluindo GM- CSF, IL-2, INF-gama, IL-6, IL-8, MCP-1), morte antígeno- específica, degranulação, proliferação e exaustão), na presença ou ausência de células mielóides usando o modelo: CART19 contra ALL;

[00363] Estudos in vivo da combinação de doses diferentes do bloqueio de GMCSF com anticorpo anti-GM-CSF (com e sem bloqueio de GMCSF murídeo) com células CART, usando dois modelos: Xenoenxertos enxertados de linhagem de célula CD19- positiva (NALM6), tratados com CART19 com ou sem anticorpo anti-GM-CSF; e Xenoenxertos derivados de paciente com ALL primária, e depois tratados com CART19 com ou sem anticorpo anti-GM-CSF.

[00364] Os camundongos serão dosados i.p com 10 mg/kg de anticorpo anti-GM-CSF imediatamente antes da implantação de células CART e 10 mg/kg/dia por 10 dias. Os camundongos serão acompanhados quanto à resposta do tumor e sobrevida. Sangramentos retro-orbitários serão obtidos começando uma semana após terapia de células CART e semanalmente posteriormente. Carga de doença, cinética da expansão de células T, expressão de marcadores de exaustão e níveis de citocinas (30 Plex) serão analisados. Ao término do experimento, baços e medula ósseas serão coletados e analisados quanto às características do tumor e números de células CAR-T.

[00365] Estudos in vivo da combinação do bloqueio de GMCSF com anticorpo anti-GM-CSF (com ou sem bloqueio de GMCSF murídeo) com células CART em modelos de CRS (nesse modelo, doses altas de células CART serão usadas para provocar CRS), na presença de PBMCs, usando o seguinte modelo: Xenoenxertos derivados de paciente com ALL primária, e depois tratados com CART19, com ou sem anticorpo anti-GM- CSF.

[00366] Os camundongos serão dosados i.p. com 10 mg/kg de anticorpo anti-GM-CSF imediatamente antes da implantação de células CART e 10 mg/kg/dia por 10 dias. Os camundongos serão acompanhados quanto à resposta do tumor, sintomas de toxicidade de CRS e sobrevida. Sangramentos retro-orbitários serão obtidos no nível de base, 2 dias pós, uma semana pós- terapia de células CART e semanalmente posteriormente. Carga de doença, cinética da expansão de células T, expressão de marcadores de exaustão e níveis de citocinas (30 Plex) serão analisados. Ao término do experimento, baços e medula ósseas serão coletados e analisados quanto às características do tumor e números de células CAR-T. Ensaios de neurotoxicidade in vivo

[00367] Usando modelos discutidos no #3 acima, os camundongos serão submetidos a exames de imagem com MRI enquanto doentes para avaliar o desenvolvimento de neurotoxicidade após terapia de células CART. As imagens serão comparadas entre camundongos que receberam células CART e anticorpo anti-GM-CSF vs. anticorpo de controle. Serão realizados experimentos repetidos. Os camundongos serão sacrificados 14 dias após células CART nesses experimentos repetidos. Tecido cerebral será analisado para citocinas com ensaios Multiplex, quanto à presença de monócitos, células T humanas, e quanto à integridade da barreira hematencefálica por IHC, fluxo e microscopia. EXEMPLO 16 - Anticorpo neutralizante anti-hGM-CSF reduz neuroinflamação na neurotoxicidade relacionada às células CAR-T (NT)

[00368] Há uma intensa argumentação científica que implica GM-CSF como essencial para o início da síndrome de liberação de citocinas (CRS), neurotoxicidade (NT) e da cascata inflamatória observada após o início da terapia com células CAR-T. A hipótese estudada é que o bloqueio de GM- CSF solúvel com o anticorpo neutralizante (Lenzilumab) irá abolir ou evitar o surgimento e severidade tanto de CRS quanto de NT observadas com terapia com células CAR-T. Com destaque, a atividade de células CAR-T deve ser preservada ou aumentada, se possível. O design experimental testa os efeitos do bloqueio de GM-CSF com anticorpo anti-GM-CSF (Lenzilumab) sobre funções efetoras de células CAR-T, eficácia de CAR-T em um modelo de xenoenxerto de tumor, desenvolvimento de CRS em um modelo de xenoenxerto de CRS e o desenvolvimento de NT usando imageamento por MRI e análise volumétrica para quantificar a neuroinflamação observada com terapia com células CAR-T. Experimentos in vitro e in vivo com CAR-T +/- Lenzilumab tanto na presença quanto na ausência de PBMCs humanas foram estudados (veja os Exemplos 9 e 10, Figs. 19 e 20a-20b). Métodos

[00369] Estudos in vitro foram realizados para avaliar a combinação de anticorpo neutralizante de GM-CSF Lenzilumab com células CAR-T CD19+ humanas sobre a morte antígeno- específica, degranulação, proliferação e exaustão na presença ou ausência de PBMCs humanas.

[00370] Para avaliar o impacto do anticorpo anti-GM-CSF (Lenzilumab) sobre a proliferação e eficácia de células CAR- T, foram feitos subsequentemente estudos in vivo usando o seguinte modelo (com e sem bloqueio de GM-CSF murídeo):

[00371] Experimentos de controle de efetor/alvo: Xenoenxertos enxertados de linhagem de célula CD19-positiva (NALM6), tratados com CART19 com ou sem anticorpo anti-GM- CSF (Lenzilumab) na ausência de PBMCs humanas.

[00372] Camundongos NSG foram dosados i.p. com 10 mg/kg de anticorpo anti-GM-CSF (Lenzilumab) imediatamente antes da implantação de célula CAR-T e na mesma dose a cada dia posteriormente por 10 dias e acompanhados para avaliar a resposta do tumor e sobrevida. Sangramentos retro-orbitários foram obtidos começando uma semana após terapia com células CAR-T e semanalmente posteriormente. Carga de doença, cinética da expansão de células T, expressão de marcadores de exaustão e níveis de citocinas (30 Plex) também foram analisados. Ao término do experimento, baços e medula ósseas foram coletados e analisados quanto às características do tumor e números de células CAR-T. Experimentos de CRS/NT: Xenoenxertos derivados de paciente com ALL primária, subsequentemente tratados com CART19 com ou sem Lenzilumab na presença de PBMCs humanas:

[00373] Para avaliar o impacto de Lenzilumab sobre a interrupção ou prevenção do surgimento e severidade de CRS e NT induzidas por CAR-T, foram realizados estudos in vivo com células CAR-T humanas (com e sem bloqueio de GM-CSF murídeo) em um modelo de CRS (no qual doses altas de células CAR-T foram usadas para provocar CRS) na presença de PBMCs usando xenoenxertos derivados de paciente com ALL primária, tratados com CART19 com e sem Lenzilumab. Camundongos NSG foram dosados i.p. com 10 mg/kg de Lenzilumab imediatamente antes da implantação de célula CAR-T e a cada dia posteriormente por 10 dias. Os camundongos foram acompanhados quanto à resposta do tumor, sobrevida, sintomas de CRS e NT. Foram feitas varreduras por MRI do cérebro no nível de base, durante e ao final da terapia com células CAR-T e foi realizada análise volumétrica para avaliar e quantificar neuroinflamação e hiperintensidade em T1 na MRI através dos braços de tratamento. O peso corporal e sangramentos retro-orbitários foram obtidos no nível de base, 2 dias pós, uma semana pós-terapia com células CAR-T e semanalmente posteriormente. Carga de doença, cinética da expansão de células T, expressão de marcadores de exaustão e níveis de citocinas (30 Plex) foram analisados. Ao término do experimento, baços e medula ósseas foram coletados e analisados quanto às características do tumor e números de células CAR-T. Resultados Modelo in vitro

[00374] Nesse experimento, o impacto de neutralização de

GM-CSF com Lenzilumab sobre funções efetoras de células CAR- T foi investigado. Foi demonstrado que GM-CSF é secretado por células CAR-T em níveis muito altos (acima de 1.500 pg/ml) e o uso de Lenzilumab neutralizou completamente GM- CSF, mas não inibiu a degranulação de CAR-T, produção intracelular de GM-CSF ou produção de IL2. Além disso, Lenzilumab não inibiu a proliferação de CAR-T antígeno- específica ou morte de CAR-T. Proporções efetor-para-alvo (E:T) foram similares com CAR-T + Lenzilumab vs. CAR-T + anticorpo de controle, p=ns (Figuras 16a-16d e 16j). Modelos in vivo: Experimentos de controle de efetor/alvo:

[00375] Para estudar o efeito de Lenzilumab sobre a função de célula CART19 in vivo, enxertamos camundongos NOD- SCID-g-/- imunocomprometidos com a linhagem de célula de ALL NALM6 CD19+ na ausência de PBMCs humanas. O tratamento com CART19 combinada com Lenzilumab resultou em atividade antitumoral potente e sobrevida global aumentada, similar à CART19 com anticorpo de controle, símiosar da neutralização completa dos níveis de GM-CSF nesses camundongos, indicando que GM-CSF não prejudica a atividade de células CAR-T in vivo na ausência de PBMCs (Figuras 16f e 16g). Experimentos de CRS e NT:

[00376] Com o uso de blastos de ALL humana, CAR-T CD19 humana e PBMCs humanas, foi verificado que Lenzilumab em combinação com terapia com células CAR-T reduz a neuroinflamação por aproximadamente 90%, comparado com CAR- T isoladamente, como avaliado por hiperintensidade quantitativa em T1 na MRI. Esse é um achado memorável e a primeira vez que foi demonstrado in vivo que a neuroinflamação causada por terapia com células CAR-T pode ser abolida eficazmente.

Imagens de MRI após terapia com Lenzilumab mais células CAR-T foram similares às varreduras no nível de base pré-tratamento, em contraste nítido com imagens de MRI após terapia com anticorpo de controle mais células CAR-T que mostravam inflamação aumentada acentuadamente.

Além disso, uma diminuição em células mielóides foi observada nos cérebros de camundongos tratados com Lenzilumab mais CAR-T, comparados com camundongos tratados com CAR-T e anticorpo de controle.

Esse achado é consistente com dados relatados em experimentos clínicos com terapia com células CAR-T CD19 nos quais foi observado um aumento nas células mielóides no LCR de pacientes com neurotoxicidade severa com grau > 3. Além disso, foi verificado que Lenzilumab em combinação com terapia com células CAR-T reduz o surgimento e severidade de CRS, comparado com CAR-T mais anticorpo de controle.

Esse achado é apoiado pela redução estatisticamente significante no peso corporal observada em camundongos tratados com CAR-T mais controle, o marcador mais objetivo e sintoma patognomônico de CRS observado in vivo.

Em camundongos tratados com Lenzilumab mais CAR-T, o peso corporal foi mantido nos níveis basais, comparado com CAR-T mais controle (p < 0,05). Além disso, camundongos tratados com CAR-T mais anticorpo de controle exibiram sintomas físicos consistentes com CRS, incluindo postura encurvada, retraimento e fraqueza, enquanto camundongos tratados com CAR-T mais Lenzilumab pareciam saudáveis.

Com destaque, Lenzilumab mais CAR-T também demonstra um aumento significante de 5 vezes na proliferação de células CAR-T, comparadas com CAR-T mais controle nesses experimentos de CRS/NT que incluíram PBMCs. Foi demonstrado previamente em experimentos clínicos com várias terapias com células CAR-T CD19 que a proliferação ou expansão aumentada de CAR-T se correlaciona com eficácia aumentada (incluindo ORR, CR), sugerindo que Lenzilumab pode aumentar potencialmente a resposta antitumoral. Esse achado pode ser explicado, em parte, por uma diminuição na expansão e tráfego de MDSC que sabidamente são promulgados por GM- CSF. Por fim, a combinação de Lenzilumab mais CAR-T resulta em controle leucêmico significantemente melhor, como quantificado por citometria de fluxo comparado com CAR-T e anticorpo de controle. Comparado com camundongos não tratados (que tinham 500.000 a 1,5 M de células leucêmicas) e CAR-T mais anticorpo de controle (que tinham entre 15.000 e 100.000 células leucêmicas), o tratamento com CAR-T mais Lenzilumab levou a uma redução significante no número de células leucêmicas (diminuídas até entre 500 e 5.000 células) com controle global da doença aumentado (veja as Figuras 25A-25D).

[00377] As imagens de MRI na Fig. 25A mostram uma melhora nítida na neurotoxicidade (NT) (neuroinflamação) nos cérebros de camundongos administrados com células CAR-T e anticorpo neutralizante anti-GM-CSF de acordo com modalidades descritas nesse relatório descritivo. Em contraste, os cérebros de camundongos administrados com células CAR-T e um anticorpo de controle mostraram sinais de neurotoxicidade nas imagens de MRI. A Fig. 25B ilustra graficamente que a NT estava reduzida por 90% nos camundongos do Grupo 1, comparada com a NT aumentada em camundongos do Grupo 2. A extensão da melhora quantitativa (90% de redução na NT) após a administração da células CAR-T e anticorpo neutralizante anti-GM-CSF de acordo com modalidades descritas nesse relatório descritivo foi um achado inesperado. Conclusões

[00378] Anticorpo anti-GM-CSF (Lenzilumab), quando combinado com terapia com células CAR-T, demonstra o potencial para evitar o surgimento e severidade de CRS e NT aumentando, ao mesmo tempo, a expansão/proliferação de CAR- T e o controle leucêmico global in vivo usando blastos de ALL humana, CAR-T CD19 humana e PBMCs humanas. Essa é a primeira vez que foi demonstrado que a neurotoxicidade induzida por CAR-T pode ser abolida in vivo. São planejados experimentos clínicos cruciais com Lenzilumab em combinação com terapia com células CAR-T para validar esses achados de segurança e eficácia aumentadas. EXEMPLO 17 - Bloqueio de GM-CSF durante terapia com célula T com receptor de antígeno quimérico reduz a síndrome de liberação de citocinas e neurotoxicidade e pode aumentar suas funções efetoras

[00379] Símiosar de sua eficácia, a terapia de células T com receptor de antígeno quimérico (CART) é limitada pelo desenvolvimento de síndrome de liberação de citocinas (CRS) e neurotoxicidade (NT). Embora a CRS esteja relacionada à elevação extrema de citocinas e expansão maciça de células T, os mecanismos exatos para NT ainda não foram elucidados. Estudos preliminares sugerem que NT talvez seja mediada por células mielóides que cruzam a barreira hematencefálica. Isso é apoiado pela análise correlativa por experimentos centrais sobre CART19 nos quais os números de células CD14+ estavam aumentadas no líquido cefalorraquidiano de pacientes que desenvolveram NT severa (Locke e cols., ASH 2017). Portanto, o objetivo desse estudo foi investigar o psímiol da neutralização de GM-CSF na prevenção de CRS e NT após terapia de células CART por meio de controle de monócitos.

[00380] Primeiro, o efeito do bloqueio de GM-CSF sobre as funções efetoras de células CART foi investigado. Aqui, foi usado o anticorpo neutralizante de GM-CSF humano (Lenzilumab, Humanigen, Burlingame, Califórnia) que demonstrou ser seguro em experimentos clínicos de Fase II. Lenzilumab (10 µg/kg) neutraliza GM-CSF quando células CART19 são estimuladas com a linhagem de células de leucemia linfoblástica aguda (ALL) NALM6 CD19+ Luciferase+, mas não prejudica a função de célula CART in vitro. Foi verificado que macrófagos associados a malignidades reduzem a proliferação de CART. A neutralização de GM-CSF com Lenzilumab resulta em proliferação aumentada de células CART antígeno-específicas na presença de monócitos. Para confirmar isso in vivo, camundongos NOD-SCID-g-/- foram enxertados com cargas de doença elevadas de NALM6 e tratados com doses baixas de CART19 ou células T de controle (para induzir recidiva do tumor), em combinação com Lenzilumab ou anticorpo de controle de isótipo. A combinação de CART19 e Lenzilumab resultou em atividade antitumoral significante e benefício de sobrevida global, comparada com células T de controle (Fig. 26A), similar aos camundongos tratados com CART19 combinada com anticorpo de controle de isótipo, indicando que a neutralização de GM-CSF não prejudica a atividade de células CART in vivo. Essa atividade antitumoral foi validada em um modelo de xenoenxerto de ALL derivada de paciente.

[00381] A seguir, foi explorado o impacto da neutralização de GM-CSF sobre toxicidades relacionadas à célula CART em um novo modelo de xenoenxerto derivado de paciente. Aqui, camundongos NOD-SCID-g-/- foram enxertados com blastos leucêmicos (1-3 x 106 células) derivados de pacientes com ALL recidivada de alto risco. Os camundongos foram então tratados com doses altas de células CART19 (2-5 x 106 por via intravenosa). Cinco dias após tratamento com CART19, os camundongos começaram a desenvolver fraqueza motora progressiva, corpos encurvados e perda de peso que se correlacionavam com elevação maciça de níveis circulantes de citocinas humanas. O imageamento por ressonância magnética (MRI) do cérebro durante essa síndrome mostrou intensificação difusa e edema, associados com infiltração de células CART no sistema nervoso central (SNC) e células mielóides murídeas ativadas. Isso é similar ao que foi relatado em experimentos clínicos com CART19 em pacientes com NT severa. A combinação de CART19, Lenzilumab (para neutralizar GM-CS humano) e anticorpo de bloqueio de GM-CSF murídeo (para neutralizar GM-CSF de camundongo) resultou na prevenção de perda de peso (Fig. 26B), diminuição de citocinas mielóides críticas (Figs. 26C-26D), redução de edema cerebral (Fig. 26E), controle leucêmico aumentado da doença no cérebro (Figs. 26F), e redução de macrófagos do cérebro (Fig. 26G).

[00382] Finalmente, foi formulada a hipótese de que a ruptura de GM-CSF por meio da edição gênica de CRISPR/Cas9 durante o processo de fabricação de células CART resultaria em células CART funcionais com secreção reduzida de GM-CSF.

RNA-guia direcionado ao éxon 3 do gene GM-CSF foi projetado e células CART19 GM-CSFk/o foram geradas. Os dados preliminares sugerem que essas CARTs produzem significantemente menos GM-CSF mediante ativação, mas continuam a exibir produção similar de outras citocinas e exibem funções efetoras normais in vitro (Fig. 26H). Com o uso do modelo de xenoenxerto de recidiva de NALM6 com carga tumoral elevada como descrito acima, células CART19 GM-CSFk/o resultaram em controle ligeiramente aumentado da doença, comparadas com células CART19 (Fig. 26I).

[00383] Dessa forma, a modulação do comportamento da célula mielóide por meio do bloqueio de GM-CSF pode ajudar a controlar toxicidades mediadas por CART e pode reduzir suas características imunossupressoras para aumentar o controle leucêmico. Esses estudos iluminam uma nova abordagem para abolir NT e CRS por meio da neutralização de GM-CSF que também potencialmente aumenta funções de célula CART. Com base nesses resultados, foi projetado um experimento clínico de Fase II com o uso de Lenzilumab como uma modalidade para evitar toxicidades relacionada à CART em pacientes com linfoma de célula B grande difuso. EXEMPLO 18 - Neutralização de GM-CSF in vitro aumenta a proliferação de células CAR-T na presença de monócitos e não prejudica a função efetora de células CAR-T Linhagens de células e células primárias

[00384] A linhagem de célula NALM6 foi adquirida de ATCC, Manassas, VA, EUA, e a linhagem de célula MOLM13 foi um presente de “Jelinek Laboratory” na “Mayo Clinic” (adquirida de DSMZ, Braunschweig, Alemanha). Essas linhagens de células foram transduzidas com um lentivírus luciferase-ZsGreen

(Addgene, Cambridge, MA, EUA) e separadas até 100% de pureza. As linhagens de células foram cultivadas em R10 (feito com RPMI 1640 (Gibco, Gaithersburg, MD, EUA), Soro Bovino Fetal 10% (FBS, Millipore Sigma, Ontário, Canadá), e Penicilina- Estreptomicina-Glutamina 1% (Gibco, Gaithersburg, MD, EUA). Células primárias foram obtidas da “Mayo Clinic Biobank” para pacientes com leucemia aguda sob um protocolo aprovado pelo “Mayo Clinic Institutional Review Board” (IRB). O de DNA recombinante no laboratório foi aprovado pelo “Mayo Clinic Institutional Biosafety Committee” (IBC). Células primárias e células CAR-T

[00385] Células mononucleares (PBMC) do sangue periférico foram isoladas de cones de aferese do sangue de doador normal sem identificação obtidos sob um protocolo aprovado pelo IRB de “Mayo Clinic”, usando tubos SepMate (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canadá). Células T foram separadas com microesferas magnéticas de seleção negativa usando “EasySepTM Human T Cell Isolation Kit” (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canadá). Monócitos foram isolados usando um “Human Monocyte Isolation Kit” de Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha, que isola monócitos CD14+. Células primárias foram cultivadas em Meio de Célula T feito com X-Vivo 15 (Lonza, Walkersville, MD, EUA) suplementado com albumina sérica humana 10% (Corning, NY, EUA) e Penicilina-Estreptomicina-Glutamina 1% (Gibco, Gaithersburg, MD, EUA). Células CART19 foram geradas por meio da transdução lentiviral de células T de doador normal como descrito nesse relatório descritivo abaixo. Construções de CART19 de segunda-geração foram sintetizadas de novo (IDT) e clonadas em um lentivírus de terceira-geração sob o controle do promotor EF-1α.

O fragmento variável da região da cadeia única dirigido a CD19 foi derivado do clone FMC63. Uma construção de CAR de segunda-geração coestimulada com 4- 1BB (FMC63-41BBz) foi sintetizada e usada para esses experimentos.

Partículas lentivirais foram geradas por meio da transfecção transitória de plasmídeo em células produtoras de vírus 293T (presente de “Ikeda Lab.”, “Mayo Clinic”), na presença de Lipofectamina 3000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), VSV-G e plasmídeos de empacotamento (Addgene, Cambridge, MA, EUA). Células T isoladas de doadores normais foram estimuladas usando “Cell Therapy Systems Dynabeads CD3/CD28” (Life Technologies, Oslo, Noruega) em uma proporção de 1:3 e depois transduzidas com partículas lentivirais 24 horas após estimulação em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 3,0. Para determinar titulações e subsequentemente MOI, após as partículas lentivirais terem sido concentradas, as titulações foram determinadas por transdução de 1 x 105 células T primárias em 100 µl de meio de célula T com 50 µl de lentivírus.

Primeiro, células T foram estimuladas com microesferas de CD3/CD28 e depois transduzidas com partículas lentivirais 24 horas mais tarde.

A transdução foi realizada em triplicatas e em diluições seriais.

Meio de célula T fresco foi adicionado um dia mais tarde.

Dois dias mais tarde, as células foram coletadas, lavadas duas vezes com PBS, e a expressão de CAR em células T foi determinada por citometria de fluxo.

As titulações foram determinadas com base na percentagem de células CAR- positivas (percentagem de contagem de células CAR+ x célula T na transdução x a diluição / volume específico) e expressas como unidades de transdução/ml (TU/ml). A remoção das microesferas magnéticas foi realizada no Dia 6 e células CAR-T foram coletadas e criopreservadas no Dia 8 para experimentos futuros. As células CAR-T foram descongeladas e ficaram em repouso em meio de célula T 12 horas antes do seu uso em experimentos. Anticorpo neutralizante de GM-CSF e controles de isótipo

[00386] Lenzilumab (Humanigen, Burlingame, CA), um anticorpo neutralizante de hGM-CSF de acordo com modalidades descritas nesse relatório descritivo e como descrito nas Patentes U.S. Nos 8.168.183 e 9.017.674, cada uma delas incorporada nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade, é um novo anticorpo monoclonal Humaneered®, primeiro na classe, que neutraliza GM-CSF humano. Para experimentos in vitro, Lenzilumab ou controle de isótipo de IgG1 humana InVivoMAb (BioXCell, West Lebanon, NH, EUA), 10 µg/ml, foi usado. Para experimentos in vivo, 10 mg/kg de Lenzilumab ou controle de isótipo foram injetados por via intrsímioritoneal diariamente por 10 dias começando no dia de injeção de CART19. Em alguns experimentos, anticorpo neutralizante anti-GM-CSF de camundongo (InVivoMAb anti-GM- CSF de camundongo, BioXCel, West Lebanon, NH, EUA) ou o controle de isótipo correspondente (controle de isótipo de IgG2a de rato InVivoMAb BioXCel, West Lebanon, NH, EUA) também foi usado, como indicado nos esquemas experimentais. Experimentos funcionais de células T

[00387] Ensaios de citocina foram realizados 24 ou 72 horas após uma cocultura de células CAR-T com seus alvos em uma proporção de 1:1, como indicado. “Human High Sensitivity T Cell Magnetic Bead Panel” (Millipore Sigma, Ontário, Canadá), “Milliplex Human Cytokine/Chemokine MAGNETIC BEAD

Premixed 38 Plex Kit” (Millipore Sigma, Ontário, Canadá) ou “Milliplex Mouse Cytokine/Chemokine MAGNETIC BEAD Premixed 32 Plex Kit” (Millipore Sigma, Ontário, Canadá) foram realizados em sobrenadantes coletados desses experimentos ou soro, como indicado.

Este foi analisado usando Luminex (Millipore Sigma, Ontário, Canadá). Análise de citocina intracelular e ensaios de degranulação de células T foram realizados após incubação de células CAR-T com alvos em uma proporção de 1:5 por 4 horas, na presença de monensina (BioLegend, San Diego, CA, EUA), hCD49d (BD Biosciences, San Diego, CA, EUA) e hCD28 (BD Biosciences, San Diego, CA, EUA). Após 4 horas, as células foram coletadas e coloração intracelular foi realizada após coloração de superfície, seguida por fixação e permeabilização com meios de fixação A e B (Life Technologies, Oslo, Noruega). Para ensaios de proliferação, células efetoras (CART19) marcadas com CFSE (Life Technologies, Oslo, Noruega), e células-alvo irradiadas foram cocultivadas em uma proporção de 1:1. Em alguns experimentos, monócitos CD14+ foram adicionados à cocultura em uma proporção de 1:1:1, como indicado.

As células foram cocultivadas por 3-5 dias, como indicado no experimento específico, e depois as células foram coletadas e coradas na superfície com anti-hCD3 (eBioscience, San Diego, CA, EUA) e “LIVE/DEAD™ Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit” (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) foi realizado.

PMA/ionomicina (Millipore Sigma, Ontário, Canadá) foi usado como um estimulante não específico positivo de células T, em concentrações diferentes, como indicado nos experimentos específicos.

Para ensaios de morte, a linhagem de célula de ALL CD19+ Luciferase+ NALM6 ou as células MOLM13 de controle

CD19- Luciferase+ foram incubadas nas proporções indicadas com células efetoras T por 24, 48 ou 72 horas, como listado no experimento específico. A morte foi calculada por imageamento por bioluminescência em uma câmera “Xenogen IVIS-200 Spectrum” (PerkinElmer, Hopkinton, MA, EUA) como uma medição de células vivas residuais. As amostras foram tratadas com 1 µl de D-luciferina (30 µg/ml) por 100 µl de volume de amostra (Gold Biotechnology, St. Louis, MO, EUA), por 10 minutos antes do imageamento. Citometria de fluxo multiparamétrica

[00388] Anticorpos anti-humanos e anti-camundongo foram adquiridos de Biolegend, eBioscience ou BD Biosciences (San Diego, CA, EUA). As células foram isoladas de cultura in vitro ou do sangue periférico de animais. Após “BD FACS Lyse” (BD Biosciences, San Diego, CA, EUA), elas foram lavadas duas vezes em solução salina tamponada com fosfato suplementada com FBS 2% (Millipore Sigma, Ontário, Canadá) e azida de sódio 1% (Ricca Chemical, Arlington, TX, EUA) e coradas a 4 °C. Para quantificação do número de células, microesferas Countbright (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) foram usadas de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Em todas as análises, a população de interesse foi separada com base em características diretas vs. dispersão lateral, seguido por separação de singleto, e células vivas foram separadas após coloração com “LIVE/DEAD™ Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit” (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). A expressão de superfície de CAR foi detectada por coloração com um anticorpo F(ab’)2 anti-camundongo de cabra (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Citometria de fluxo foi realizada em citômetros de três lasers, Canto II (BD Biosciences, San Diego, CA, EUA) e CytoFLEX (Beckman Coulter, Chaska, MN, EUA). Análises foram realizadas usando o software FlowJo X10.0.7r2 (Ashland, OR, EUA) e o software Kaluza 2.0 (Beckman Coulter, Chaska, MN, EUA). Resultados

[00389] Se a neutralização de GM-CSF após terapia com células CAR-T tiver que ser utilizada como uma estratégia para evitar CRS e neurotoxicidade, ela não deve inibir a eficácia da célula CAR-T. Portanto, os experimentos iniciais visavam investigar o impacto da neutralização de GM-CSF sobre funções efetoras de células CAR-T. Células CART19 foram cocultivadas com ou sem a linhagem de célula de ALL NALM6 CD19+ na presença de Lenzilumab (anticorpo neutralizante de hGM-CSF) ou um controle de isótipo (IgG). Foi estabelecido que Lenzilumab, mas não o anticorpo IgG de controle, era, na verdade, capaz de neutralizar completamente hGM-CSF (Figura 27A), mas não inibiu uma proliferação de células CAR-T antígeno-específica (Figura 27B). Quando células CART19 foram cocultivadas com a linhagem de célula NALM6 CD19+ na presença de monócitos, Lenzilumab em combinação com CART19 demonstrou um aumento exponencial na proliferação de CART19 antígeno-específica, comparado com CART19 mais controle de isótipo IgG (P < 0,0001, Figura 27C). Para investigar a citotoxicidade CAR-T-específica, células T CART19 ou UTD de controle foram cultivadas com a linhagem de célula NALM6 luciferase+ CD19+ e tratadas com anticorpo de controle de isótipo ou anticorpo neutralizante de GM-CSF (Figura 27D). O tratamento com anticorpo neutralizante de GM-CSF não inibiu a habilidade de células CAR-T para matar células NALM6-alvo

(Figura 27D). No geral, esses resultados indicam que Lenzilumab não inibe a função de célula CAR-T in vitro e aumenta a proliferação de células CART19 na presença de monócitos, sugerindo que a neutralização de GM-CSF pode aumentar a eficácia mediada por células CAR-T. EXEMPLO 19 - Neutralização de GM-CSF in vivo aumenta a atividade antitumoral de célula CAR-T em modelos de xenoenxerto Modelos em camundongo de xenoenxerto

[00390] Machos e fêmeas de camundongos NOD-SCID-IL2rγ−/− (NSG) com 8-12 semanas de idade foram cruzados e cuidados dentro do “Department of Comparative Medicine” na “Mayo Clinic” sob um protocolo de procriação aprovado pelo “Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee” (IACUC). Os camundongos foram mantidos em um espaço de barreira animal que é aprovado pelo IBC para experimentos de nível BSL2+. Xenoenxertos da linhagem de célula NALM6

[00391] A linhagem de célula de ALL NALM6 CD19+, luciferase+, foi usada para estabelecer xenoenxertos de ALL, sob um protocolo aprovado pelo IACUC. Aqui, 1 x 106 células foram injetadas por via intravenosa (IV) por meio de uma injeção na veia da cauda. Quatro-seis dias após injeção, os camundongos foram submetidos a imageamento bioluminescente usando uma câmera “Xenogen IVIS-200 Spectrum” (PerkinElmer, Hopkinton, MA, EUA), para confirmar o enxerto. O imageamento foi realizado 10 minutos após a injeção intrsímioritoneal (IP) de 10 µl/g de D-luciferina (15 mg/ml, Gold Biotechnology, St. Louis, MO, EUA). Os camundongos foram então randomizados com base em seu imageamento bioluminescente para receber tratamentos diferentes, como descritos nos experimentos específicos. Tipicamente, 1-1,5 x 106 células CAR-T (e um equivalente e do número total de células T de células T não transduzidas (UTD)) foram injetadas IV por camundongo. A eficiência de transdução de células CAR-T foi tipicamente de aproximadamente 50%. Por exemplo, com uma eficiência de transdução de células CAR-T de 50%, camundongos que receberam 1,5 x 106 células CAR-T receberam 3 milhões de células T totais, e os camundongos de UTD correspondentes receberam 3 x 106 UTD. Foi realizado imageamento semanal para avaliar e acompanhar a carga de doença. Imagens bioluminescentes foram adquiridas usando uma câmera “Xenogen IVIS-200 Spectrum” (PerkinElmer, Hopkinton, MA, EUA) e analisadas usando Living Image versão 4.4 (Caliper LifeSciences, PerkinElmer). O sangramento da veia da cauda foi feito 7-8 dias após injeção de células CAR-T para avaliar a expansão de células T e citocinas e quimiocinas e, subsequentemente, como necessário. Sangue periférico de camundongo foi submetido à lise de células sanguíneas vermelhas usando “BD FACS Lyse” (BD Biosciences, San Diego, CA, EUA), e depois usado para estudos citométricos de fluxo. Camundongos tratados com anticorpo começaram a terapia diária com anticorpo (10 mg/kg de Lenzilumab ou controle de isótipo) IP no mesmo dia da terapia de células CART por um total de 10 dias. RNA-Seq em tecido cerebral de camundongo

[00392] RNA foi isolado usando “miRNeasy Micro Kit” (Qiagen, Gaithersburg, MD, EUA) e tratado com “RNase-Free DNase Set” (Qiagen, Gaithersburg, MD, EUA). RNA-seq foi realizado em um Illumina HTSeq 4000 (Illumina, San Diego, CA, EUA) pelo “Genome Analysis Core” na “Mayo Clinic”. Os dados da base binária foram convertidos em Fastq usando o software Bcl2fastq Illumina. As sequências adaptadoras foram removidas usando Trimmomatic, como descrito por Bolger, A.M., e cols., Bioinformatics. 2014; 30 (15): 2.114-2.120.

10.1093/bioinformatics/btu170, que é incorporado nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade, e FastQC, como descrito por Leggett R.M., e cols., Front Genet. 2013; 4: 288. Pré-publicado em 02 de janeiro de 2014 como DOI 10.3389/fgene.2013.00288, que é incorporado nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade, foi usado para verificar a qualidade. Os últimos genomas humanos (GRCh38) e de camundongo (GRCm38) de referência foram baixados de NCBI. Arquivos de índice do genoma foram gerados usando STAR, como descrito por Dobin A., e cols., Bioinformatics. 2013; 29 (1): 15-21.

10.1093/bioinformatics/bts635, que é incorporado nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade, e as leituras finais pareadas foram msímioadas para o genoma para cada condição. HTSeq, como descrito por Anders S, e cols., Bioinformatics. 2015; 31 (2): 166-169. Pré-publicado em 28 de setembro de 2014 como DOI 10.1093/bioinformatics/btu638, que é incorporado nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade, foi usado para gerar contagens de expressão para cada gene, e DeSeq238, como descrito por Love MI, e cols., Genome Biol. 2014; 15 (12): 550. Pré-publicado em 18 de dezembro de 2014 como DOI 10.1186/s13059-014-0550- 8, que é incorporado nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade, foi usado para calcular a expressão diferencial. A ontologia gênica foi avaliada usando Enrichr, como descrito por Kuleshov M.V. e cols.,

Nucleic Acids Research 2016; 44 (W1): W90-W97.

10.1093/nar/gkw377, que é incorporado nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade. A Figura 35 resume as etapas detalhadas acima. Os dados de sequenciamento de RNA estão disponíveis no “Gene Expression Omnibus” sob o Número de acesso GSE121591. Estatística

[00393] Prism Graph Pad (La Jolla, CA, EUA) e Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, EUA) foram usados para analisar os dados. As altas concentrações de citocina no mapa de calor foram normalizadas para “1” e concentrações baixas normalizadas para “0” por meio de Prism. Testes estatísticos são descritos nas legendas da figura. Resultados

[00394] Para confirmar que a depleção de GM-CSF não inibe funções efetoras de CART19, o psímiol da neutralização de GM-CSF com Lenzilumab sobre a atividade antitumoral de CART19 foi investigado em modelos de xenoenxerto. Primeiro, foi usado um modelo de recidiva destinado a investigar vigorosamente se a atividade antitumoral de células CART19 era impactada por neutralização de GM-CSF. Camundongos NOD/SCID/interleucina-2 null para receptor gama (NSG) foram injetados com 1 x 106 células NALM6 luciferase+ e depois imagens foram adquiridas 6 dias mais tarde, permitindo tempo suficiente para que os camundongos obtivessem cargas tumorais muito elevadas. Os camundongos foram randomizados para receber uma única injeção de células CART19 ou UTD e 10 dias de anticorpo de controle de isótipo ou Lenzilumab (Figura 28A). O ensaio de GM-CSF no soro coletado 8 dias após injeção de CART19 revelou que Lenzilumab neutraliza com sucesso GM-CSF no contexto da terapia com CART19 (Figura 28B). O imageamento por bioluminescência uma semana após injeção de CART19 mostrou que CART19 em combinação com Lenzilumab controlou eficazmente leucemia nesse modelo de recidiva com carga tumoral elevada e significantemente melhor do que células UTD de controle (Figuras 28C-28D). O tratamento com CART19 em combinação com Lenzilumab resultou em atividade antitumoral potente e sobrevida global aumentada, similar à CART19 com anticorpo de controle, símiosar da neutralização dos níveis de GM-CSF, indicando que GM-CSF não prejudica a atividade de células CAR-T in vivo (Figura 36). Segundo, esses experimentos foram realizados em um modelo de xenoenxerto de ALL primária derivado de paciente, na presença de PBMCs humanas, na medida em que isso representa um modelo heterogêneo mais relevante.

Após quimioterapia de condicionamento com bussulfan, camundongos foram injetados com blastos derivados de pacientes com ALL recidivada.

Os camundongos foram monitorados quanto ao enxerto por várias semanas por meio de sangramentos seriais da veia da cauda e, quando os blastos CD19+ no sangue eram de aproximadamente 1/µl, os camundongos foram randomizados para receber tratamento com CART19 em combinação com PBMCs com Lenzilumab mais um anticorpo neutralizante anti-GM-CSF de camundongo ou anticorpos IgG de controle de isótipo começando no dia da injeção de CART 19 por 10 dias (Figura 28E). Nesse modelo de xenoenxerto de ALL primária, a neutralização de GM-CSF em combinação com terapia com CART19 resultou em uma melhora significante no controle leucêmico da doença sustentado ao longo do tempo por pelo menos 35 dias pós-administração de CART19, comparado com

CART19 mais controle de isótipo (Figura 28F). Isso sugere que a neutralização de GM-CSF pode participar na redução de recidivas e no aumento de respostas completas duráveis após terapia com células CART19. EXEMPLO 20 - Geração de CART19 GM-CSFk/o

[00395] Um RNA-guia (gRNA) que visa o éxon 3 de GM-CSF humano foi selecionado por meio de avaliação de gRNAs previamente relatados como tendo alta eficiência para GM-CSF humano, como descrito em Sanjana N.E. e cols., “Improved Vectors and Genome-Wide Libraries for CRISPR Screening”. Nature Methods. 2014; 11 (8): 783-784. Pré-publicado em 31 de julho de 2014 como DOI 10.1038/nmeth.3047, que é incorporado nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade. Esse gRNA foi ordenado em uma construção de lentivírus de terceira-geração CAS9 (lentiCRISPRv2), controlado sob um promotor U6 (GenScript, Township, NJ, EUA). Partículas lentivirais que codificam essa construção foram produzidas como descrito acima. Células T foram transduzidas de forma dupla com lentivírus CAR19 e GM-CSFgRNA- lentiCRISPRv2, 24 horas após estimulação com microesferas de CD3/CD28. A expansão de células CAR-T foi então continuada como descrito acima. Para analisar a eficiência do direcionamento a GM-CSF, DNA genômico foi extraído das células CART19 GM-CSFk/o usando o “PureLink Genomic DNA Mini Kit” (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). O DNA de interesse foi amplificado por PCR usando “Choice Taq Blue Mastermix” (Thomas Scientific, Minneapolis, MN, EUA) e extraído em gel usando “QIAquick Gel Extraction Kit” (Qiagen, Germantown, MD, EUA) para determinar a edição. Amplicons de PCR foram enviados para sequenciamento Eurofins (Louisville, KY, EUA)

e a frequência de modificação de alelos foi calculada usando TIDE (“Tracking de Indels by Decomposition”) um método que exige símiornas duas reações de PCR paralelas, seguidas por um par de análises padronizadas de sequenciamento capilar; os dois traçados de sequenciamento resultantes são então analisados usando software especialmente projetado que é fornecido como uma ferramenta web simples e como código R disponível em tide.nki.nl, como descrito por Brinkman E.K., e cols., “Easy Quantitative Assessment of Genome Editing by Sequence Trace Decomposition”. Nucleic Acids Research. 2014; 42 (22): e168. Pré-publicado em 11 de outubro de 2014 como DOI 10.1093/nar/gku936, que é incorporado nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade. A Fig. 34B descreve a sequência de gRNA e sequências iniciadoras, e a Fig. 34A(i)-34A(iii) retrata os esquemas para a geração de esquemas de CART19 GM-CSFk/o. EXEMPLO 21 - Células CAR-T com knockout de GM-CSF CRISPR exibem expressão reduzida de GM-CSF, níveis similares de citocinas e quimiocinas cruciais e atividade antitumoral aumentada

[00396] Para excluir de forma confiável qualquer participação de GM-CSF crítico na função de célula CAR-T, o gene GM-CSF foi rompido durante fabricação de célula CAR-T usando um gRNA que foi relatado como gerador de knockout de alta eficiência e é clonado em um arcabouço de lentivírus CRISPR, como descrito por Sanjana N.E., e cols., Nature Methods. 2014; 11 (8): 783-784. Pré-publicado em 31 de julho de 2014 como DOI 10.1038/nmeth.3047, que é incorporado nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade. Usando esse gRNA, obtivemos em torno de 60% de eficiência de knockout em células CART19 (Figura 37). Quando células CAR- T foram estimuladas com a linhagem de célula NALM6 CD19+, células CAR-T GM-CSFk/o produziram estatisticamente significantemente menos GM-CSF, comparadas com CART19 com um lócus de GM-CSF do tipo selvagem (“células CART19 do tipo selvagem”). O knockout de GM-CSF em células CAR-T não prejudicou a produção de outras citocinas de célula T cruciais, incluindo IFN-γ, IL-2, ou degranulação de célula CAR-T antígeno-específica (CD107a) (Figura 29A), mas exibiu expressão reduzida de GM-CSF (Figura 29B). Para confirmar que células CAR-T GM-CSFk/o continuam a exibir funções normais, sua eficácia in vivo no modelo de xenoenxerto de ALL recidivada com carga tumoral elevada foi testada (como descrito na Figura 28A). Nesse modelo de xenoenxerto, a utilização de CART19 GM-CSFk/o, ao invés de CART19 do tipo selvagem, reduziu acentuadamente os níveis séricos de GM-CSF humano em 7 dias após tratamento com CART19 (Figura 29B). Dados de imageamento por bioluminescência implicaram que células CART19 GM-CSFk/o exibem controle leucêmico aumentado, comparadas com CART19 nesse modelo (Figura 38). Com destaque, células CART19 GM-CSFk/o demonstraram melhora significante na sobrevida global, comparadas com células CART19 do tipo selvagem (Figura 29C). GM-CSF humano estava estatisticamente significantemente diminuído por meio de teste t nas células CART19 GM-CSFk/o, comparadas com CART19 do tipo selvagem (Figura 29D). O GM-CSF de camundongo visualmente parece aumentado, embora isso não seja estatisticamente significante por meio de teste t (P = 0,472367) (Figura 29E). Essa ausência de redução de GM-CSF de camundongo não é necessariamente surpreendente, na medida em que as células

CART19 GM-CSFk/o (que são humanas) são as únicas células dentro do camundongo que possuem o knockout e, dessa forma, GMCSF de camundongo provavelmente não seria afetado diretamente.

Por inspeção visual, IP-10 de camundongo, uma quimiocina que atrai vários tipos de células, incluindo células T e monócitos, parece paradoxalmente aumentada em CART19 GM-CSFk/o, comparada com CART19, mas isso também não é estatisticamente significante, P = 0,4877 por teste t (Figura 29E). Por inspeção visual, MIP1α de camundongo (uma citocina inflamatória importante na atração de neutrófilos) e M-CSF de camundongo (uma citocina crítica na diferenciação de macrófagos) parecem reduzidas, embora de forma não estatisticamente significante com P = 0,2437 e P = 0,3619 (Figura 29E). IL-1b de camundongo, uma citocina inflamatória crítica produzida por macrófagos, e IL-15 de camundongo, uma citocina produzida por macrófagos que auxilia na proliferação de células NK, parecem reduzidas em CART19 GMCSFk/o, comparada com CART19 (Figura 29E) com valores P de P = 0,0741 e P = 0,0900, respectivamente (Figura 29E). Citocinas humanas de célula T críticas não foram inibidas por GM-CSFk/o (Figura 29D). Deve ser enfatizado que esses xenoenxertos foram produzidos com cargas elevadas da linhagem de célula NALM6, e nosso modelo de CRS/NI (Figuras 30A-30D, 31, 32A-32D e 33A-33D) exige o uso de células de ALL primária a serem geradas.

Dessa forma, os perfis de citocina não surpreendentemente diferem entre os dois modelos, na medida em que os xenoenxertos de NALM6 (Figuras 29A-29E) não desenvolvem CRS ou NI.

Em conjunto, no contexto de um modelo de NALM6 com carga tumoral elevada sem CRS, os resultados de Figuras 29A-29E confirmam as Figuras 27A-27D e 28A-28F, indicando que a depleção de GM-CSF não prejudica citocinas ou quimiocinas normais que são críticas para eficácia de funções de CAR-T. Além disso, os resultados nas Figuras 29A-29E indicam que CART GM-CSFk/o pode representar uma opção terapêutica para controle de GM-CSF “embutido” como uma modificação durante a fabricação de célula CAR-T. EXEMPLO 22 - Modelo de xenoenxerto derivado de paciente para neuroinflamação (NI) e síndrome de liberação de citocinas / neutralização de GM-CSF in vivo melhora a síndrome de liberação de citocinas e a neuroinflamação após terapia com CART19 em um modelo de xenoenxerto Xenoenxertos de ALL primária derivada de paciente

[00397] Para estabelecer xenoenxertos de ALL primária, camundongos NSG primeiro receberam 30 mg/kg de bussulfan IP (Selleckchem, Houston, TX, EUA). No dia seguinte, os camundongos foram injetados com 2,5 x 106 blastos primários derivados do sangue periférico de pacientes com ALL recidivada ou refratária. Os camundongos foram monitorados quanto ao enxerto por aproximadamente 10-13 semanas. Quando células CD19+ eram observadas consistentemente no sangue (aproximadamente 1 célula/µl), eles foram randomizados para receber diferentes tratamentos de CART19 (2,5 x 106 células IV) e PBMCs derivadas do mesmo doador (1 x 105 células IV) com ou sem terapia com anticorpo (10 mg/kg de Lenzilumab ou controle de isótipo IP por um total de 10 dias, começando no dia que receberam terapia com células CAR-T). Os camundongos foram monitorados periodicamente quanto à carga leucêmica por meio de sangramento da veia da cauda. Xenoenxertos de ALL primária derivado de paciente para CRS/NI

[00398] Similar aos experimentos acima, os camundongos foram injetados IP com 30 mg/kg de bussulfan (Selleckchem, Houston, TX, EUA). No dia seguinte, camundongos receberam 1- 3 x 106 blastos primários derivados do sangue periférico de pacientes com ALL recidivada. Os camundongos foram monitorados quanto ao enxerto por aproximadamente 10-13 semanas por meio de sangramento da veia da cauda. Quando as células CD19+ no soro eram ≥ 10 células/µl, os camundongos receberam CART19 (2-5 x 106 células IV) e começaram terapia com anticorpo por um total de 10 dias, como indicado. Os camundongos foram pesados diariamente como uma medição de seu bem-estar. MRIs dos cérebros dos camundongos foram realizadas 5-6 dias pós-injeção de CART19 e sangramento da veia da cauda para análise de citocina/quimiocina e células T foi realizado 4-11 dias pós-injeção de CART19. Aquisição de MRI

[00399] Um sistema de MRI de pequeno animal de diâmetro interno vertical Bruker Avance II 7 Tesla (Bruker Biospin) foi usado para aquisição de imagens para avaliar a permeabilidade vascular do sistema nervoso central (SNC). Anestesia por inalação foi induzida e mantida por meio de isoflurano 3 a 4%. A frequência respiratória foi monitorada durante as seções de aquisição usando um sistema de monitoramento de sinais vitais compatível com MRI (Modelo 1030; SA Instruments, Stony Brook, NY). Os camundongos receberam uma injeção IP de gadolínio usando dosagem baseada no peso de 100 mg/kg e, após um retardo-padrão de 15 min, uma sequência spin-echo de aquisição de volume ponderada em T1 foi usada (tempo de repetição = 150 ms, tempo de echo = 8 ms, campo de visão: 32 mm x 19,2 mm x 19,2 mm, matriz: 160 x 96 x 96; número de médias = 1) para obter imagens ponderadas em T1. Alterações de MRI realçadas por gadolínio eram indicativas de ruptura da barreira hematencefálica.24 Análise volumétrica foi realizada usando o pacote de programas Analyze desenvolvido pelo “Biomedical Imaging Resource” na “Mayo Clinic”. Resultados

[00400] Nesse modelo, camundongos NSG condicionados foram enxertados com blastos de ALL primária e monitorados quanto ao enxerto por várias semanas até que desenvolvessem carga de doença elevada (Figura 30A). Quando o nível de CD19+ blastos no sangue periférico era > 10/µl, os camundongos foram randomizados para receber diferentes tratamentos, como indicado (Figura 30A). O tratamento com CART19 (com anticorpos IgG de controle ou com anticorpos neutralizantes de GM-CSF) erradicou com sucesso a doença (Figura 30B). Dentro de 4-6 dias após tratamento com CART19, os camundongos começaram a desenvolver fraqueza motora, corpos encurvados e perda de peso progressiva; sintomas consistentes com CRS e NI. Isso foi associado com elevação de citocinas e quimiocinas séricas cruciais 4-11 dias pós-injeção de CART19, similar ao que é observado na CRS humana após terapia com células CAR-T (incluindo GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, IL-10, IL-12, IL-13, IL-2, IL-3, IP-10, MDC, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β humanos, e IL-6, GM-CSF, IL-4, IL-9, IP-10, MCP-1 e MIG de camundongo). Esses camundongos tratados com CART19 também desenvolveram NI, como indicado por análises por MRI do cérebro que revelam intensificação em T1 anormal, sugestiva de ruptura da barreira hematencefálica e possivelmente edema cerebral (Figura 30C), junto com análise citométrica de fluxo dos cérebros coletados que revela infiltração de células

CART19 humanas (Figura 30D). Além disso, análises por RNA- seq de cortes do cérebro colhidos de camundongos que desenvolveram esses sinais de NI mostraram supra-regulação significante de genes que regulam o receptor de célula T, CD226, receptores de citocina, ativação de células T imunes, tráfego de células T e diferenciação de células T e células mielóides (Figura 31, Tabela 6). Tabela 6: Tabela de vias canônicas alteradas em cérebros de xenoenxertos derivados de paciente após tratamento com células CART19 em formato tabular.

Via canônica Valor P Genes ajustado Regulação da 9,45E-14 IFITM1, ITGB2, ICAM3, CD3G, resposta PTPN22, CD3E, ITGAL, SAMHD1, imune SLA2, CD3D, ITGB7, SLAMF6, (G0:0050776) B2M, NPDC1, CD96, BTN3A1, ITGA4, SH2D1A, HLA-B, HLA-C, BTN3A2, HLA-A, CD8B, SELL, CD8A, CD226, CD247, CLEC2D, HCST, BIRC3 Via de 1,36E-12 IFITM1, SP100, TRADD, ITGB2, sinalização IL2RG, OASL, CNN2, IL18RAP, mediada por RIPK1, CCR5, IL12RB1, B2M, citocina GPB1, IL6R, JAK3, CCR2, IL32, (G0:0019221) ANXA1, IL4R, TGFB1, IL10RB, IL10RA, STAT2, PRKCD, HLA-B, HLA-C, IL16, HLA-A, TNFRSF1B, CD4, IRF3, OAS2, IL2RB, FAS, TNFRSF25, LCP1, P4HB, IL7R, MAP3K14, CD44, IL18R1, IRF9,

MYD88, BIRC3 Complexo 1,30E-11 ZAP70, CD4, CD6, CD88, CD8A, receptor de CD3G, CD247, CD3E, CD3D, célula T CARD11 (G0:0042101) Ativação de 2,07E-11 ITK, RHOH, CD3G, NLRC3, célula T PTPN22, CD3E, SLA2, CD3D, (G0:0042110) CD2, ZAP70, CD4, PTPRC, CD88, CD8A, LCK, CD28, LCP1, LAT Regulação da 2,46E-10 PTPN22, LAX1, CCDCD88B, CD2, ativação de CD4, LCK, SIT1, TBX21, TIGIT, célula T JAK3, LAT, PAG1, CCR2 (G0:0050863) Via de 4,35E-08 ITK, BTN3A1, TRAC, WAS, CD3G, sinalização PTPN22, BTN3A2, CD3E, CD3D, do receptor ZAP70, CD4, PTPRC, LCK, de célula T GRAP2, LCP2, CD247, CAR11, (G0:0050852) LAT, PAG1 Regulação 1,5750E-07 GBP5, ANXA1, TGFB1, CYBA, positiva da PTPN22, PARK7, TMEM173, produção de CCDC88B, MAVS, CD6, IRF3, citocina CD28, RIPK1, SLAMF6, CD46, (G0:0001819) IL12RB1, TIGIT, IL6R, CARD11, MYD88, CCR2 Diferenciação 2,36E-07 ZAP70, CD4, ANXA1, PTPRC, de célula T CD8A, RHOH, PTPN22, CD3D (G0:0030217) Atividade do 2,43E-07 IL4R, IL10RB, IL10RA,IL2RG, receptor de CD4, CXCR3, IL2RB, CCR5, citocina IL12RB1, IL7R, IL6R, CD44,

(G0:0004896) CCR2 Via de 3,27E-07 IFITM1, SP100, IRF3, OAS2, sinalização STAT2, HLA-B, HLA-A, SAMHD1, de interferon IRF9, MYD88, OASL tipo I (G0:0060337) Resposta à 0,0004679 SIGIRR, IFITM1, SP100, HCLS1, citocina RIPK1, PTPN7, IKBKE, IL6R, (G0:0034097) JAK3, IL18R1, MYD88, AES Regulação da 0,001452 GBPS, GFI1, STAT2, ADAM8, resposta NLRC3, PTPN22, SAMHD1, BIRC3 imune inata (G0:0045088) Regulação da 0,003843 CD2, MAVS, CYBA, NLRC3, produção de PTPN22, RIPK1, SLAMF1 fator de necrose tumoral (G0:0032680) Ligação ao 0,102397 LCK, CD3G, CD3E receptor de célula T (G0:0042608) Via de 0,0124059 SHARPIN, TRADD, CASP4, RIPK1, sinalização TRAF1, BIRC3 mediada por regulação do fator de necrose tumoral

(G0:0010803) Regulação 0,0376647 CD4, HCLS1, RIPK1, EVI2B positiva da diferenciação de leucócito mielóide (G0:0002736)

[00401] Com o uso do modelo de xenoenxerto derivado de paciente para NI e CRS mostrado na Figura 30A, o efeito de neutralização de GM-CSF sobre toxicidades de CART19 foi investigado. Para excluir o efeito de confusão de GM-CSF de camundongo, os camundongos receberam células CART19 em combinação com 10 dias de terapia com anticorpo contra GM- CSF (10 mg/kg de Lenzilumab e 10 mg/kg de anticorpo neutralizante anti-GM-CSF de camundongo) ou anticorpos de controle de isótipo. A terapia com anticorpo neutralizante de GM-CSF reduziu estatisticamente significantemente a perda de peso induzida por CRS após terapia com CART19 (Figura 32A). A análise de citocinas e quimiocinas 11 dias após terapia com células CART19 mostrou que GM-CSF humano era neutralizado pelo anticorpo (Figura 32B). Além disso, a neutralização de GM-CSF resultou em redução significante de várias citocinas e quimiocinas humanas (IP-10, IL-3, IL-2, IL-1Ra, IL-12p40, VEGF, GM-CSF) (Figura 32C) e de camundongo (MIG, MCP-1, KC, IP-10) (Figura 32D). A proteína induzida por interferon-gama (IP-10, CXCL10) é produzida por monócitos, entre outros tipos de células, e serve como um quimioatraente para vários tipos de células, incluindo monócitos, macrófagos e células T. IL-3 participa na diferenciação do progenitor mielóide. IL-2 é uma citocina de célula T crucial. O antagonista do receptor de interleucina- 1 (IL-1Ra) inibe IL-1 (IL-1 é produzida por macrófagos e é uma família de citocinas inflamatórias críticas). IL-12p40 é uma subunidade de IL-12, que é produzida por macrófagos, entre outros tipos de células, e pode encorajar a diferenciação Th1. O fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) encoraja a formação de vasos sanguíneos. Monocina induzida por interferon-gama (MIG, CXCL9) é um quimioatraente de células T. A proteína quimioatraente de monócitos 1 (MCP-1, CCL2) atrai monócitos, células T e células dendríticas. KC (CXCL1) é produzida por macrófagos, entre outros tipos de células, e atrai células mielóides como, por exemplo, neutrófilos. Também houve uma redução não significante estatisticamente de várias outras citocinas e quimiocinas humanas e de camundongo após neutralização de GM-CSF. Isso sugere que GMCSF participa na atividade a jusante de várias citocinas e quimiocinas que são instrumentais na cascata que resulta em CRS e NI.

[00402] MRIs do cérebro 5 dias após tratamento com CAR19 mostraram que a neutralização de GM-CSF reduziu a intensificação em T1 como uma medição de inflamação cerebral, ruptura da barreira hematencefálica, e possivelmente edema, comparada com CART19 mais anticorpos de controle. As imagens de MRI após neutralização de GM-CSF (com Lenzilumab e anticorpo anti-GM-CSF de camundongo) foram similares às varreduras no nível de base pré-tratamento, sugerindo que a neutralização de GM-CSF ajudou eficazmente a abolir a NI associada com terapia com CART19 (Figuras 33A e 33B). Com o uso de blastos de ALL humana e CART19 humana nesse modelo de xenoenxerto derivado de paciente, a neutralização de GM-CSF após CART19 reduziu a neuroinflamação por 75%, comparado com CART19 mais controles de isótipo (Figura 33B). Este é um achado significante e a primeira que foi demonstrado in vivo que a NI causada por CART19 pode ser abolida eficazmente. Células T CD3 humanas estavam presentes no cérebro após terapia com CART19, como testado por citometria de fluxo e, com neutralização de GM-CSF, houve uma diferença na média bruta com redução nas células T CD3 do cérebro, mas não atingiu significância estatística (Figuras 33C, 30D e 39). Finalmente, foi observada uma diferença na média bruta (embora não tenha alcançado significância estatística) com redução de macrófagos brilhantes CD11b+ nos cérebros de camundongos que recebem neutralização de GM-CSF durante terapia com células CAR-T, comparados com controle de isótipo durante terapia com CAR-T (Figura 33D), possivelmente implicando que a neutralização de GM-CSF ajuda a reduzir macrófagos dentro do cérebro.

[00403] Os resultados dos Exemplos 18-19 e 22 demonstram que a neutralização de GM-CSF anula toxicidades após terapia com células CAR-T e pode aumentar sua atividade terapêutica. Especificamente, foi demonstrado que a neutralização de GM- CSF em combinação com terapia com CART19 evita o desenvolvimento de CRS e reduz significantemente a severidade da NI em um modelo de xenoenxerto que utiliza blastos de ALL humana e CART19 humana. A neutralização de GM-CSF resultou em uma redução em quimiocinas associadas ao tráfego mielóide, por exemplo, IP-10, MCP-1, KC e outras citocinas e quimiocinas inflamatórias, e está associada com médias brutas diminuídas (embora não estatisticamente significantes) de infiltração de células T e ativação de células mielóides no cérebro. De maneira intrigante, os experimentos nesse relatório descritivo também sugerem que a inibição de GM-CSF aumenta a proliferação de CART19, a atividade antitumoral e a sobrevida global in vivo. Com base nesses resultados, a neutralização de GM-CSF pode ser considerada como uma estratégia de próxima geração potencial para permitir a imunoterapia com células CAR-T rotineiramente.

[00404] Nos estudos descritos nesse relatório descritivo, a neutralização de GM-CSF com Lenzilumab não prejudicou nenhuma das funções efetoras de CART19 in vitro. Em dois modelos de xenoenxerto diferentes (xenoenxertos de NALM6 e xenoenxertos derivados de paciente), CART19 combinada com Lenzilumab erradicou eficazmente o tumor, símiosar da neutralização de GM-CSF, e melhorou significantemente o controle leucêmico da doença 35 dias pós-tratamento, enquanto CART19 mais controle de isótipo não pode manter controle da doença após 35 dias. Por fim, nos Exemplos 21-22, células CART19 GM-CSFk/o exibiram funções efetoras potentes in vitro e demonstraram sobrevida global significantemente aumentada, comparadas com CART19 in vivo.

[00405] O modelo de CRS e NI descrito nesse relatório descritivo é um modelo de xenoenxerto único e relevante de ALL derivada de paciente para o desenvolvimento de terapias para toxicidades após terapia com células CAR-T humanas. No modelo aqui descrito, os intervalos de tempo entre infusão de células CAR-T até o surgimento de sintomas, alterações cerebrais na MRI, elevação de citocinas e quimiocinas e infiltração de células efetoras para dentro do SNC são todos similares àquele relatados em pacientes que desenvolvem toxicidades após terapia com CART19. Os camundongos desenvolveram sintomas de CRS e NI (perda de peso, declínio na função motora e corpos encurvados). Alterações na MRI do cérebro foram detectadas 4-6 dias após a infusão de células CART19. A captação cerebral por MRI em T1 é sugestiva de ruptura da barreira hematencefálica e possivelmente edema cerebral e é comparável às alterações observadas na MRI do cérebro humano em casos de neurotoxicidade severa, como descrito por Gust e cols. 2017 Cancer Discovery. 2017; 7 (12): 1.404-1.419. Pré-publicado em 2017/10/14 como DOI

10.1158/2159-8290.CD-17-0698, que é incorporado nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade.

[00406] Curiosamente, Gust e cols. 2017 ainda descrevem que a permeabilidade da barreira hematencefálica evitou a proteção do LCR de citocinas sistêmicas, o que induziu estresse de pericitos vasculares e secreção de citocinas de ativação do endotélio, e os pacientes exibiram evidências de ativação endotelial. No modelo de CRS/NI descrito nesse relatório descritivo, foi verificado que GM-CSF estava neutralizada no soro de camundongos que recebem terapia com CART19 com anticorpos neutralizantes de GM-CSF, comparada com CART19 e anticorpos de controle de isótipo. Dessa forma, as células T dentro dos cérebros de camundongo poderiam, elas próprias, fornecer produção de GM-CSF, e GM-CSF sérico, entre outras citocinas e quimiocinas, seria possivelmente capaz de alcançar o LCR. Além disso, as células do endotélio são capazes de produzir GM-CSF, o que pode resultar em um ciclo de exacerbação. NI foi associada com infiltração de células T e ativação de células mielóides no SNC, similar às alterações do LCR em pacientes com neurotoxicidade induzida por CAR-T, bem como em modelos em primata não humano. O nesse modelo descrito relatório descritivo é similar aos modelos de xenoenxerto derivados de paciente relatados previamente nos quais CRS se desenvolveu após terapia com células CAR- T. Um relato recente sugeria que o bloqueio de IL-1 evita NI por meio da depleção de células mielóides. No entanto, o desenvolvimento de NI naquele modelo era retardado e relacionado ao espessamento meníngeo, diferentemente do que foi observado no modelo descrito nesse relatório descritivo e em pacientes que recebem terapia com CART19. Portanto, o modelo descrito nesse relatório descritivo é fornecido como uma forma confiável para investigar novas intervenções para a prevenção e tratamento de CRS e neurotoxicidade após terapia com células CART19. Os resultados descritos nesse relatório descritivo mostram que a neutralização de GM-CSF resulta em uma redução em citocinas e quimiocinas mielóides cruciais e várias citocinas e quimiocinas inflamatórias, sugerindo que GM-CSF é uma citocina crítica na ativação a jusante de várias citocinas e quimiocinas; o bloqueio contribui para uma diminuição nas médias brutas na infiltração de células mielóides e de células T no cérebro/SNC (embora a significância estatística não tenha sido alcançada); e o bloqueio ajuda a reduzir a neuroinflamação de neurotoxicidades aparentes.

[00407] Curiosamente, foi observado um aumento exponencial na proliferação de células CART19, atividade antitumoral aumentada e sobrevida global aumentada com o bloqueio de GM-CSF. Por exemplo, a proliferação de CART19 antígeno-específica na presença de monócitos amentou in vitro após neutralização de GM-CSF. Além disso, em xenoenxertos de ALL derivados de paciente, células CART19 resultaram em um controle da doença mais durável quando combinadas com Lenzilumab. Além disso, foi verificado que células CAR-T GM-CSFk/o eram mais eficazes no controle da leucemia em xenoenxertos de NALM6 e demonstraram sobrevida global aumentada. Embora os mecanismos para as funções efetoras de CART aumentadas após depleção de GM-CSF sejam atualmente incertos, os resultados fornecidos nesse relatório descritivo são consistentes com relatos prévios que indicam que monócitos prejudicam a expansão de células T ex vivo e que macrófagos polarizados M2 inibem a proliferação de CART19 antígeno-específica. Esse é um achado importante, pois, através de experimentos clínicos de CAR- T, a proliferação aumentada de células CAR-T foi consistentemente associada com eficácia e resposta aumentadas (ou seja, taxas de resposta global e completa).

[00408] Sabe-se que células T ativadas produzem GM-CSF. Células T não possuem todas as subunidades para o receptor de GM-CSF e, portanto, em circunstâncias habituais, GM-CSF normalmente não faz feedback em células T diretamente, embora possa fazê-lo sob certas circunstâncias em níveis muito altos. Ao invés disso, esse GM-CSF afeta os comportamentos de vários outros tipos de células, incluindo macrófagos e células dendríticas. A ativação subsequente dessas células resulta nas ações que funcionam para estimular células T como, por exemplo, produção de citocina e apresentação de antígeno. A estimulação de células T pode ainda dirigir a produção de GM-CSF e de outras citocinas para, por sua vez, agirem nos outros tipos de células como macrófagos e células dendríticas, o que dirige o ciclo. Na terapia com células

CAR-T, é provável que o grande número de células T ativadas produzidas ao longo de um intervalo de tempo curto impulsione esse ciclo até uma situação extrema. Os resultados descritos nesse relatório descritivo sugerem que o bloqueio de GM-CSF ajuda a evitar essa hiperestimulação imune, sem prejudicar funções de célula T, na verdade as aumentando. Os mecanismos exatos para funções efetoras de células CAR-T aumentadas após o bloqueio de GM-CSF são incertos.

[00409] Finalmente, os resultados fornecidos nesse relatório descritivo adicionalmente sugerem que o desenvolvimento de células CART19 GM-CSFk/o pode representar uma nova forma de controlar parcialmente a produção de GM- CSF que pode ser incorporada na fabricação atual de célula CAR-T. Esses resultados indicam que essas células funcionam normalmente e poderiam representar uma abordagem terapêutica independente para aumentar a janela terapêutica após terapia com células CAR-T. Um anticorpo anti-GM-CSF, por exemplo, Lenzilumab, é uma solução terapêutica em estágio clínico para neutralizar GM-CSF, abolir tanto CRS quanto neuroinflamação de neurotoxicidades aparentes, e potencialmente aumentar a função de célula CAR-T.

[00410] Os estudos descritos nesse relatório descritivo representam um avanço significante na compreensão e prevenção de toxicidades após terapia com células CAR-T. Esses resultados sugerem fortemente que a modulação do comportamento da célula mielóide por meio do bloqueio de GM- CSF ajuda a controlar toxicidades mediadas por células CAR- T e a reduzir suas características imunossupressoras para aumentar o controle leucêmico. Esses estudos iluminam uma nova abordagem para abolir neuroinflamação e CRS de neurotoxicidades aparentes por meio da neutralização de GM- CSF que também potencialmente aumenta funções de célula CAR- T. EXEMPLO 23 - Administração de um anticorpo monoclonal anti- GM-CSF (Lenzilumab) reduziu significantemente a neuroinflamação causada por terapia com CAR-T e manteve a integridade da barreira hematencefálica em um modelo de xenoenxerto

[00411] Esse estudo pré-clínico foi projetado para replicar com precisão os achados observados em experimentos clínicos de CAR-T e utilizou células de leucemia linfoblástica aguda humana (ALL), CAR-T dirigida ao CD19 humano (CART19), e células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) e realizado em camundongos. Xenoenxertos de ALL primária derivada de paciente

[00412] Xenoenxertos de ALL foram estabelecidos em camundongos basicamente como descrito no Exemplo 22. Aquisição de MRI

[00413] A integridade da BBB pode ser monitorada de forma não invasiva por imageamento por ressonância magnética (MRI). Agentes de contraste para MR (CAs) convencionais que contêm gadolínio são usados em associação com MRI para detectar e quantificar extravasamento pela BBB. Sob circunstâncias normais CAs não atravessam a BBB intacta. No entanto, em função de seu tamanho pequeno CAs extravasam do sangue para dentro do tecido cerebral, até mesmo quando a BBB está parcialmente comprometida.

[00414] MRIs foram adquiridas basicamente como descrito no Exemplo 22. O método de MRI realçada por gadolínio se baseia em imagens ponderadas em T1 feitas antes e depois da injeção de CA, como descrito por Ku, M.C. e cols., Methods Mol. Biol. 2018; 1.718: 395-408. DOI (Identificador de Objeto Digital): 10.1007/978-1-4939-7531-0_23, que é incorporado por referência em sua totalidade, é consistente com aquele usado no presente estudo pré-clínico de Lenzilumab e CART19. Esse método de MRI realçada por gadolínio é útil para investigação da permeabilidade da BBB em modelos em camundongo in vivo e pode ser facilmente aplicado em diversas condições de doença experimentais, incluindo distúrbios de neuroinflamação, ou para avaliar efeitos farmacológicos (in)desejados. Microscopia confocal

[00415] A microscopia confocal foi usada para avaliar deficiência/ruptura da barreira hematencefálica (também chamada “BBB” nesse relatório descritivo). Essa técnica de microscopia usa filtração espacial para eliminar a luz fora- de-foco ou flare em amostras que são mais espessas do que o plano de foco; dessa forma, a microscopia confocal oferece várias vantagens em relação à microscopia óptica convencional, incluindo profundidade de campo controlável, a eliminação de informação fora-de-foco que degrada a imagem e a habilidade para coletar cortes ópticos seriais de amostras espessas. Resultados A integridade da BBB está preservada e a neuroinflamação é significantemente reduzida após terapia com CAR-T e Lenzilumab

[00416] No presente estudo, imagens de MRI feitas no dia 5 revelaram qualitativamente neuroinflamação difusa com terapia com CAR-T, enquanto as imagens de MRI feitas após a combinação de Lenzilumab + CAR-T mostraram significantemente menos neuroinflamação, similar ao grupo de controle não tratado (veja a Fig. 33A). A quantificação de MRI por meio de hiperintensidade em T1 realçada por gadolínio mostrou uma diminuição significante de 75% na neuroinflamação e deficiência da BBB com Lenzilumab + CAR-T vs.

CAR-T + anticorpo de controle (Figura 33A). Além disso, a microscopia confocal mostra claramente em imagens de alta resolução que, após terapia com CAR-T, a BBB está significantemente prejudicada (Figura 40A), o que é consistente com as imagens de MRI que mostraram qualitativamente neuroinflamação difusa com terapia com CAR-T (veja a Fig. 33A). Em contraste, a microscopia confocal mostra manutenção da integridade da BBB com Lenzilumab em combinação com CAR-T (Figura 40A), o que é consistente com as imagens qualitativas e quantitativas de MRI feitas após a combinação de Lenzilumab + CAR-T que mostraram uma redução significante da neuroinflamação, comparada com CAR-T mais controle de isótipo.

A Figura 40A mostra dados da BBB por microscopia confocal.

A Figura 33A é uma MRI quantitativa demonstrativa com o uso de hiperintensidade em T1 realçada por gadolínio, que mostra três grupos de tratamento: não tratados vs.

CART19 + Lenzilumab vs.

CART19 + controle de isótipo.

Os resultados da microscopia confocal são críticos, na medida em que ajudam a explicar a patologia da neuroinflamação induzida por CAR- T.

Esses dados sugerem que, após administração de CAR-T, a BBB fica prejudicada permitindo o influxo maciço de citocinas pró-inflamatórias para dentro do SNC, o que, acredita-se, propaga a neuroinflamação.

Esses dados são consistentes com dados relatados em experimentos clínicos de CAR-T.

No estudo

ZUMA-1 com células T autólogas transduzidas com receptor de antígeno quimérico (CAR) administradas por via intravenosa em uma dose-alvo de 2 x 106 células T CAR anti-CD19/kg (Yescarta), foi observado um aumento significante nas citocinas pró-inflamatórias no SNC em pacientes que desenvolveram neurotoxicidade grau 3+. Os presentes dados de microscopia confocal ajuda a explicar por que e como a adição de Lenzilumab reduz significantemente a neuroinflamação induzida por CAR-T.

[00417] Imagens de MRI mostraram qualitativamente neuroinflamação difusa e deficiência da BBB no dia 5 após administração de terapia com CAR-T (CART19). Quando Lenzilumab é co-administrado com CAR-T, a integridade da BBB é preservada/mantida, e imagens de MRI feitas no dia 5 após a combinação de Lenzilumab + CAR-T mostravam significantemente menos neuroinflamação, similar ao grupo de controle não tratado (veja a Fig. 33A). Além disso, a microscopia confocal revelou que esse resultado é inteiramente consistente com dados de imageamento por MRI que mostram uma redução de 75% na neuroinflamação e deficiência da BBB após Lenzilumab e CAR-T, comparado com CAR-T e anticorpo de controle (o eixo-Y nessa análise é hiperintensidade em T1 realçada por gadolínio). Proliferação de células CART19 exponencialmente aumentada e controle leucêmico da doença significantemente aprimorado após terapia com CART e Lenzilumab

[00418] A administração de Lenzilumab após terapia com CART19 também resultou em um aumento exponencial na proliferação de células CART19 e melhora significante no controle leucêmico da doença sustentado ao longo do tempo por pelo menos 35 dias pós-infusão de CART19, comparado com CART19 mais controle, como descrito no Exemplo 22. Esses resultados sugerem que a neutralização de GM-CSF com um anticorpo monoclonal anti-GM-CSF (Lenzilumab) pode participar na redução de recidivas e no aumento de respostas completas duráveis após terapia com CART19. Esse é um achado significante, considerando que mais do que 50% dos pacientes adultos com linfoma que inicialmente respondem à terapia com CART19 subsequentemente recidivam dentro do primeiro ano de acompanhamento.

[00419] A Fig. 40B (adaptada de Santomasso, B.D., e cols., publicado Online Primeiro em 7 de junho de 2018; DOI (Identificador de Objeto Digital): 10.1158/2159-8290.CD-17- 1319, que é incorporado por referência em sua totalidade), mostra que níveis altos de proteína no LCR (como mostrado nos dados de Santomasso) são uma indicação de ruptura da BBB e extravasamento de proteína para dentro do SNC (por causa da permeabilidade aumentada da barreira sangue-líquido cefalorraquidiano (LCR) durante a neurotoxicidade). Isso mostra que a ruptura da BBB é central para a fisiopatologia de NI e liga os achados do modelo de xenoenxerto fornecido nesse relatório descritivo aos achados clínicos de Santomasso. Em modalidades dos métodos fornecidos nesse relatório descritivo, os métodos ainda compreendem a realização de uma punção lombar (por um médico) e medição dos níveis de proteína/albumina no LCR que poderiam prever a expectativa clínica subsequente do grau de NT e medidas preventivas.

[00420] Embora a invenção apresentada anteriormente tenha sido descrita em algum detalhe como forma de ilustração e exemplo para fins de clareza de compreensão, será imediatamente evidente para aqueles habilitados na técnica à luz dos ensinamentos dessa invenção que certas alterações e modificações podem ser feitas a ela sem se afastar do espírito ou escopo das reivindicações em anexo. EXEMPLO 24 - Tecnologias de edição gênica para o knockout de genes de GM-CSF em células T

[00421] Várias estratégias estão sendo seguidas por vários grupos para incorporar a edição gênica no desenvolvimento de células T com receptor de antígeno quimérico (CAR) de geração seguinte para o tratamento de vários cânceres. A toxicidade severa (síndrome de liberação de citocinas e neurotoxicidade) está associada com terapia de célula T CAR e pode resultar em desfechos pobres para o paciente. Um iniciador-chave no processo de toxicidade parece ser GM-CSF derivado de célula CART.

[00422] A edição gênica (com, por exemplo, nucleases modificadas geneticamente) pode ser usada para o KO de genes GM-CSF em células T e/ou de genes que codificam proteínas essenciais para a expressão gênica de GM-CSF. Nucleases úteis para essa edição do genoma incluem, sem limitação, nucleases CRISPR-associadas (Cas), nucleases de Dedo de zinco (ZFNs), nucleases efetoras do tipo ativador da transcrição (TALE) e endonucleases teleguiadas (HEs), também conhecidas como meganucleases Uso de nuclease de Dedo de Zinco para GM-CSF

[00423] Um gene GM-CSF em células CART pode ser inativado usando tecnologia de Nuclease de Dedo de Zinco (ZFN). Nucleases sequência de DNA-específicas clivam o gene GM- CSF/s e o reparo da quebra de fita dupla de DNA resulta na inativação do/s gene/s. As nucleases sequência-específicas são criadas por combinação de domínios de ligação ao DNA sequência-específicos (dedos de zinco) com um domínio de endonuclease Fok1. A nuclease direcionada atua como um dímero e dois domínios de reconhecimento de DNA diferentes são empregados para fornecer clivagem sítio-específica. A modificação por engenharia genética da endonuclease Fok1 assegura que se formem heterodímeros, e não homodímeros. Dessa forma, a variante obrigatória do heterodímero Fok1-EL fornece um nível maior de especificidade.

[00424] A experiência clínica até hoje com abordagens de KO de genes com o uso da tecnologia de ZFN é limitada. No entanto, em um pequeno estudo de segurança no qual o receptor de CCR5 foi knocked-out usando a tecnologia de ZFN e as células T reintroduzidas em pacientes com HIV, houve uma vantagem de sobrevida notável das células T modificadas vs. não modificadas quando a terapia farmacológica antirretroviral foi interrompida.

[00425] O melhor efeito foi observado quando era obtida ruptura gênica bialélica. Isso sugere que a tecnologia de KO que obtém o maior % de ruptura gênica provavelmente é a mais eficaz (Singh 2017, Tebas 2014). Em alguns tipos de células bialélica humanas, a eficiência de direcionamento é aumentada por superexpressão de RAD51 e tratamento com ácido valpróico (Takayama 2017).

[00426] Os éxons 1-4 do gene de GM-CSF humano podem ser visados com ZFNs que formam pares dentro da região-alvo escolhida. Uma vantagem potencial para o direcionamento perto do códon de início da tradução dentro da sequência de DNA é que isso assegura que o knockout gênico não resulta em um fragmento de proteína grande que ainda é sintetizado. Esses fragmentos de proteína poderiam ter atividades biológicas indesejadas.

[00427] Diversas ferramentas estão disponíveis para a identificação de sítios de nuclease de dedo de zinco (ZFN) potenciais em sequências-alvo específicas. Um exemplo dessas ferramentas pode ser encontrado em: http://bindr.gdcb.iastate.edu/ZiFiT/. Vetores para a expressão de pares de ZFNs identificados dessa forma (para uso no KO do gene GM-CSF) são testados em células humanas que expressam GM-CSF e a eficácia de ruptura gênica para cada par é medida por alterações na produção de GM-CSF dentro de um pool de células. Pares de ZFNs que demonstram a maior redução nos níveis de GM-CSF são escolhidos para testagem em células CART humanas.

[00428] Por exemplo, células T autólogas podem ser transduzidas ex vivo com um vetor viral recombinante Ad5 com replicação deficiente que codifica pares das ZFNs GM-CSF- específicas, resultando na modificação do gene GM-CSF. O vetor só dá suporte à expressão transitória de genes codificados pelo vetor. As duas ZFNs se ligam a uma sequência bp compósita encontrada especificamente na região escolhida para mutagênese (dentro dos éxons 1, 2, 3 ou 4) do gene GM- CSF. A expressão das ZFNs GM-CSF-específicas induz uma quebra de fita dupla no DNA celular que é reparada pelo maquinário celular, levando a inserções ou deleções aleatórias de sequência nas células transduzidas. Essas inserções e deleções rompem a sequência codificadora de GM-CSF causando uma mutação frameshift e terminação da expressão de proteína. A fabricação de célula T/amostra do paciente–específica

[00429] Os indivíduos do estudo são submetidos a uma leucoferese de 10 litros para coletar > 109 células sanguíneas brancas. O produto da leucoferese é enriquecido para células CD4+ por depleção de monócitos por meio de elutriação centrífuga contrafluxo, e por depleção magnética de células T CD8+, ambas com o emprego de um conjunto descartável de uso único de sistema fechado. As células T CD4+ enriquecidas resultantes são ativadas com microesferas paramagnéticas revestidas com mAb anti-CD3/anti-CD28 e transduzidas com vetor que codifica CAR T e vetor que codifica ZFNs. As células são então expandidas e cultivadas em um sistema fechado. A expansão de células T continua após transferência para um Biorreator WAVE para expansão adicional sob condições de perfusão. Ao final do período de cultura, as células são depletadas de microesferas magnéticas, lavadas, concentradas e criopreservadas.

[00430] Células T primárias também podem ser tratadas com outros agentes, por exemplo, ácido valpróico, a fim de aumentar eficiência de direcionamento bialélico das ZFNs. Supostas Sequências de direcionamento

[00431] Éxon 1: ATG TGG CTG CAG AGC CTG CTG CTC TCG GGC; TAC ACC GAC GTC TCG GAC GAC GAG AGC CCG; CTC GCC CAG CCC CAG CAC GCA GCC; GAG CGG GTC GGG GTC GTG CGT CGG.

[00432] Éxon 2: AAT GAA ACA GTA GAA GTC ATC TCA GAA ATG; TTA CTT TGT CAT CTT CAG TAG AGT CTT TAC; GAA GTC ATC TCA GAA ATG TTT GAC; CTT CAG TAG AGT CTT TAC AAA CTG.

[00433] Éxon de design 3: GAG CCG A CC TGC CTA CAG ACC CGC CTG GAG; CTC GGC TGG ACG GAT GTC TGG GCG GAC CTC; GCC TAC AGA CCCGCCT GGA GCT GTA; CGG ATG TCT GGGCGGA CCT CGA CAT.

[00434] Éxon 4 GAA ACT TCC TGT GCA ACC CAG ATT ATC ACC; CTT TGA AGG ACA CGT TGG GTC TAA TAG TGG; TGC AAC CCA GAT TATC ACC TTT GAA; ACG TTG GGT CTA ATAG TGG AAA CTT.

TALENS

[00435] O/s gene/s GM-CSF em células T também pode ser inativado usando nucleases efetoras do tipo ativadoras (TALENS). TALENS são similares às ZFNs, pelo fato de que compreendem um domínio de nuclease Fok1 fundido a um domínio de ligação ao DNA sequência-específico. A nuclease direcionada então faz uma quebra de fita dupla no DNA e o reparo com tendência ao erro (error-prone) cria um gene-alvo mutado. TALENS podem ser facilmente projetadas usando um código simples de proteína-DNA que usa domínios de repetição de TALE de ligação ao DNA (efetores do tipo ativadores transcricionais) para bases individuais em um sítio de ligação. A robustez da TALEN significa que a edição do genoma é um processo confiável e fácil (Reyon D., e cols., 2012 Nat. Biotechnol. Maio de 2012; 30 (5): 460-5. DOI (Identificador de Objeto Digital): 10.1038/nbt.2170, que é incorporado nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade).

[00436] Símionas como exemplos, algumas sequências-alvo de TALE dentro do Éxon 1 do gene de GM-CSF humano são:

1. TGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCTGCAGCATCTCTGCA;

2. TTGGGCACTGTGGCCTGCAGCATCTCTGCACCCGCCCGCTCGCCCAGCCCCA.

[00437] Exemplos de sequências-alvo de TALE no Éxon 4 do gene de GM-CSF humano:

1. TGTGCAACCCAGATTATCACCTTTGAAAGTTTCAAAGAGAACCTGAAGGA;

2. TCCTGTGCAACCCAGATTATCACCTTTGAAAGTTTCAAAGAGAACCTGAA;

3. TTATCACCTTTGAAAGTTTCAAAGAGAACCTGAAGGACTTTCTGCTTGTCA. KO do gene GM-CSF mediado por CRISPR Cas-9 em Células T primárias.

[00438] O sistema Cas-9 CRISPR (repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente espaçadas) é composto por Cas9, uma nuclease guiada por RNA, e um RNA-guia curto (gRNA) que facilita a geração de quebras de DNA sítio-específicas, que são reparadas por mecanismos endógenos à célula. A liberação de RNP Cas9/gRNA às células T primárias humanas resulta em modificação do gene-alvo altamente eficiente. Métodos mediados por CRISPR/Cas9 para o knockout do gene GM- CSF são descritos por protocolos detalhados; veja Oh, S.A., Seki, A., e Rutz, S. (2018) Current Protocols in Immunology, 124, e69. DOI (Identificador de Objeto Digital):

10.1002/cpim.69, e Seki e Rutz, J. Exp. Med. 2018 Vol. 215 Nº 3 985-997, cada um deles incorporado nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade.

[00439] A inativação de GM-CSF por KO gênico tem sido relatada para reduzir a síndrome de liberação de citocinas e neurotoxicidade e aumentar a atividade antitumoral em camundongos com tumor xenoenxerto tratados com CAR T (como descrito por Sterner R.M. e cols., 2018 Blood 2018: Blood- 2018-10-881722; DOI (Identificador de Objeto Digital): https://doi.org/10.1182/blood-2018-10-881722), que é incorporado nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade. Inativação do gene GM-CSF pela abordagem CRISPR visando o Éxon 1 ou 2 ou 3 ou 4.

[00440] Várias construções de Cas9, por exemplo, 3, que visam 3 sequências diferentes dentro do gene GM-CSF podem ser usadas, de modo a assegurar inativação eficiente do gene em todas as amostras (isso é feito facilmente com CRISPR, comparado com outros métodos de edição gênica).

[00441] A frequência elevada de KO bialélico relatada com o uso de Cas9 (como descrito por Zhang, Y., e cols. Methods. Setembro de 2014; 69 (2): 171–178. DOI (Identificador de Objeto Digital): 10.1016/j.ymeth.2014.05.003, que é incorporado nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade. Essa alta frequência de KO bialélico fornece uma possível vantagem. Outras tecnologias de silenciamento gênico para o KO de GM-CSF em células T CAR

[00442] Outros métodos que podem ser usados para o silenciamento gênico são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica e podem incluir, sem limitação, endonucleases teleguiadas (HEs), também conhecidas como meganucleases, interferência de RNA (RNAi), RNA interferente curto (siRNA), interferência de RNA DNA-dirigida (ddRNAi). Combinação do KO do gene GM-CSF em células T CAR e anticorpo neutralizante para GM-CSF não derivado de CAR T.

[00443] A remoção/neutralização de todo o GM-CSF em pacientes exige anticorpo anti-GM-CSF ou anticorpo anti- receptor ou fusão receptor solúvel-Fc usado em combinação com o KO do gene GM-CSF em células CART (são necessárias reivindicações para essas combinações).

[00444] Todas as publicações, números de acesso, patentes e pedidos de patentes citados nesse relatório descritivo são aqui incorporados por referência como se cada um fosse específica e individualmente indicado para ser incorporado por referência. Sequências exemplares da região VH de anticorpos anti- GM-CSF da invenção: ID. DE SEQ. Nº: 1 (VH#1, Figura 1)

[00445] QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEW

MGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCVRRDRFPYYF

DYWGQGTLVTVSS ID. DE SEQ. Nº: 2 (VH#2, Figura 1)

[00446] QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTNYYIHWVRQAPGQRLEW

MGWINAGNGNTKYSQKFQGRVAITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRDRFPYYF

DYWGQGTLVTVSS ID. DE SEQ. Nº: 3 (VH#3, Figura 1)

[00447] QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTNYYIHWVRQAPGQRLEW

MGWINAGNGNTKYSQKFQGRVAITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRQRFPYYF

DYWGQGTLVTVSS ID. DE SEQ. Nº: 4 (VH#4, Figura 1)

[00448] QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTNYYIHWVRQAPGQRLEW

MGWINAGNGNTKYSQKFQGRVAITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRRQRFPYYF

DYWGQGTLVTVSS ID. DE SEQ. Nº: 5 (VH#5, Figura 1)

[00449] QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTNYYIHWVRQAPGQRLEW

MGWINAGNGNTKYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRRQRFPYYF

DYWGQGTLVTVSS Sequências exemplares da região VL de anticorpos anti- GM-CSF da invenção: ID. DE SEQ. Nº: 6 (VK#1, Figura 1)

[00450] EIVLTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVGTNVAWYQQKPGQAPRVL

IYSTSSRATGITDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQFNRSPLTFGGGTKVEI

K ID. DE SEQ. Nº: 7 (VK#2, Figura 1)

[00451] EIVLTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVGTNVAWYQQKPGQAPRVL

IYSTSSRATGITDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQFNKSPLTFGGGTKVEI

K ID. DE SEQ. Nº: 8 (VK#3, Figura 1)

[00452] EIVLTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSIGSNLAWYQQKPGQAPRVL

IYSTSSRATGITDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQFNRSPLTFGGGTKVEI

K ID. DE SEQ. Nº: 9 (VK#4, Figura 1)

[00453] EIVLTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSIGSNLAWYQQKPGQAPRVL

IYSTSSRATGITDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQFNKSPLTFGGGTKVEI

K ID. DE SEQ. Nº: 10 Região constante kappa exemplar

[00454] RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL

QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE

C ID. DE SEQ. Nº: 11 Região constante da cadeia pesada exemplar, alótipo-f:

[00455] ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT

SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKT HTCPPCPSÍMIOLLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método caracterizado por ser usado para neutralização e/ou remoção de GM-CSF humano (hGM-CSF) em um indivíduo tratado com células CAR-T, o método compreendendo a administração ao indivíduo de células CAR-T que possuem uma inativação ou um knockout do gene de GM-CSF (células CAR-T GM-CSFk/o).

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado ainda por compreender a administração de um antagonista de hGM-CSF recombinante ao indivíduo.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o antagonista de hGM-CSF recombinante é um anticorpo anti-hGM-CSF.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um fragmento de anticorpo recombinante que é um Fab, um Fab', um F(ab')2, um scFv, Fv ou um dAB.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF possui uma sequência da região VH apresentada na Figura 1 e uma sequência da região VL apresentada na Figura 1.

6. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que as sequências de aminoácidos da região VH ou da região VL, ou tanto da região VH quanto da região VL compreendem uma metionina no terminal-N.

7. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o antagonista de hGM-CSF é selecionado do grupo que compreende um anticorpo anti- receptor de hGM-CSF ou um receptor de hGM-CSF solúvel ou subunidade do receptor, um mimético de anticorpo de citocromo b562, um análogo do peptídeo hGM-CSF, uma adnectina, um mimético de anticorpo de arcabouço de lipocalina, um mimético de anticorpo de calixareno e um peptidomimético de ligação do tipo anticorpo.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o receptor de hGM-CSF solúvel compreende uma proteína de fusão receptor de hGM-CSF solúvel- Fc.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o GM-CSF é GM-CSF derivada de CAR T e/ou um GM-CSF não derivada de CAR T.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o indivíduo possui uma incidência de toxicidade relacionada à imunoterapia.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado ainda por compreender a administração profilática ao indivíduo de (a) células CAR-T GM-CSFk/o e/ou (b) um antagonista anti-hGM-CSF antes do indivíduo ser tratado com imunoterapia, em que é impedido que o indivíduo desenvolva toxicidade relacionada à imunoterapia após administração profilática de (a) e/ou (b).

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é tratado com imunoterapia, a imunoterapia compreendendo a administração de células CAR-T GM-CSFk/o.

13. Método para inativação do gene GM-CSF ou knockout de GM-CSF (KO) em uma célula, caracterizado por compreender a edição direcionada do genoma ou silenciamento do gene GM- CSF.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13,

caracterizado ainda por compreender uma endonuclease como uma enzima de corte de ácido nucleio.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a endonuclease é uma enzima de restrição Fok1 ou uma endonuclease flap 1 (FEN-1).

16. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a endonuclease é uma proteína associada a CRISPR Cas9 9 (Cas9).

17. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a inativação do gene GM-CSF por CRISPR/Cas9 visa e edita um gene GM-CSF no Éxon 1, Éxon 2, Éxon 3 ou Éxon 4.

18. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a inativação do gene GM-CSF que compreende CRISPR/Cas9 visa e edita o gene GM-CSF no Éxon 3.

19. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a inativação do gene GM-CSF que compreende CRISPR/Cas9 visa e edita o gene GM-CSF no Éxon 1.

20. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a inativação do gene GM-CSF compreende múltiplas enzimas CRISPR/Cas9, em que cada enzima Cas9 visa e edita uma sequência diferente do gene GM-CSF no Éxon 1, Éxon 2, Éxon 3 ou Éxon 4.

21. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a inativação do gene GM-CSF compreende direcionamento a CRISPR/Cas9 e knockout/inativação dos genes GM-CSF.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21,

caracterizado ainda por compreender o tratamento de células T primárias com ácido valproico para aumentar o knockout/inativação do gene bialélico.

23. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a edição direcionada do genoma compreende proteínas de dedo de zinco (ZnF).

24. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a edição direcionada do genoma compreende nucleases efetoras do tipo ativador da transcrição (TALENS).

25. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a edição direcionada do genoma compreende uma endonuclease teleguiada (homing endonuclease), em que a endonuclease teleguiada é uma ARC nuclease (ARCUS) ou uma meganuclease.

26. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a edição direcionada do genoma compreende uma endonuclease flap (FEN-1).

27. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula T CAR.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a célula T CAR é uma célula CAR-T CD19.

29. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a célula T CAR é uma célula CAR-T BCMA.

30. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o silenciamento do gene GM- CSF é selecionado do grupo que consiste em interferência de RNA (RNAi), RNS interferente curto (siRNA) e interferência de RNA DNA-dirigida (ddRNAi).

31. Método para prevenção ou redução da toxicidade relacionada à imunoterapia, o método caracterizado por compreender a administração ao indivíduo de células CAR-T que possuem uma inativação do gene GM-CSF ou knockout de GM- CSF (células CAR-T GM-CSFk/o), em que o gene GM-CSF é inativado ou sofre knockout pelos métodos conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 13-26.

32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a toxicidade relacionada à imunoterapia é uma toxicidade relacionada a CAR-T selecionada de síndrome de liberação de citocinas, neurotoxicidade, ou uma combinação destas.

33. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado ainda por compreender a administração das células T CAR GM-CSF K/O em combinação com um antagonista de hGM-CSF.

34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o antagonista de GM-CSF recombinante é um anticorpo anti-GM-CSF.

35. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um fragmento de anticorpo que é um Fab, um Fab', um F(ab')2, um Fv, um scFv ou um dAB.

36. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF possui uma sequência da região VH apresentada na Figura 1 e uma sequência da região VL apresentada na Figura 1.

37. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que as sequências de aminoácidos da região VH ou da região VL, ou tanto da VH quanto da região VL compreendem uma metionina no terminal-N.

38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o antagonista de hGM-CSF é selecionado do grupo que compreende um anticorpo anti- receptor de hGM-CSF ou um receptor de hGM-CSF solúvel ou subunidade do receptor, um mimético de anticorpo de citocromo b562, um análogo do peptídeo hGM-CSF, uma adnectina, um mimético de anticorpo de arcabouço de lipocalina, um mimético de anticorpo de calixareno e um peptidomimético de ligação do tipo anticorpo.

39. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o receptor de hGM-CSF solúvel compreende uma proteína de fusão receptor de hGM-CSF solúvel- Fc.

40. Método para redução da taxa de recidiva ou prevenção da ocorrência de recidiva do tumor em um indivíduo tratado com imunoterapia, o método caracterizado por compreender a administração ao indivíduo de um antagonista de GM-CSF recombinante.

41. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a referida imunoterapia compreende transferência adotiva de células, administração de anticorpos monoclonais, administração de citocinas, administração de uma vacina contra câncer, terapias de comprometimento de células T, ou qualquer combinação destas.

42. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o indivíduo possui linfoma de célula B grande difuso (DLBCL), linfoma de célula B grande mediastinal primário, linfoma de célula B de alto grau e

DLBCL decorrente de linfoma folicular.

43. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que a transferência adotiva de células compreende a administração de células T que expressam receptor de antígeno quimérico (células T CAR), células T com receptor de célula T (TCR) modificado, linfócitos infiltrantes no tumor (TIL), células natural killer com receptor de antígeno quimérico (CAR) modificado ou células dendríticas, ou qualquer combinação destas.

44. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o antagonista de GM-CSF recombinante é um antagonista de hGM-CSF.

45. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o antagonista de GM-CSF recombinante é um anticorpo anti-GM-CSF.

46. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-GM-CSF se liga a um GM-CSF humano.

47. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-GM-CSF se liga a um GM-CSF de primata.

48. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o primata é selecionado de um macaco, um babuíno, um macaco do gênero macaca, um chimpanzé, um gorila, um lêmure, um lóris, um társio, um gálago, um potto, um sifaka, um indri, um aye-ayes ou um símio.

49. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-GM-CSF se liga a um GM-CSF de mamífero.

50. Método, de acordo com a reivindicação 45,

caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-GM-CSF é um anticorpo anti-hGM-CSF.

51. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo monoclonal.

52. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um fragmento de anticorpo que é um Fab, um Fab', um F(ab')2, um Fv, um scFv ou um dAB.

53. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo neutralizante de GM-CSF humano.

54. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo recombinante, um anticorpo humanizado, anticorpo com CDR enxertada, ou anticorpo quimérico.

55. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo humano.

56. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50-55, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF se liga ao mesmo epítopo que 19/2 quimérico.

57. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50-55, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF compreende a CDR3 da região VH e CDR3 da região VL de 19/2 quimérico.

58. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50-55, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF compreende as CDR1, CDR2 e CDR3 da região VH e da região VL de 19/2 quimérico.

59. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50-55, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região VH que compreende um determinante de especificidade de ligação à CDR3 RQRFPY ou RDRFPY, um segmento-J e um segmento-V, em que o segmento-J compreende pelo menos 95% de identidade para JH4 humano (YFD YWGQGTL VTVSS) e o segmento-V compreende pelo menos 90% de identidade para uma sequência VH1 1-02 ou VH1 1-03 da linhagem germinativa humana; ou uma região VH que compreende um determinante de especificidade de ligação à CDR3 RQRFPY.

60. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que o segmento-J compreende YFDYWGQGTLVTVSS.

61. Método, de acordo a reivindicação 59 ou 60, caracterizado pelo fato de que a CDR3 compreende RQRFPYYFDY ou RDRFPYYFDY.

62. Método, de acordo com a reivindicação 59 ou 60, caracterizado pelo fato de que a CDR1 da região VH é uma VH1 CDR1 da linhagem germinativa humana; a CDR2 da região VH é uma VH1 CDR2 da linhagem germinativa humana; ou tanto a CDR1 quanto CDR2 são de uma sequência VH1 da linhagem germinativa humana.

63. Método, de acordo com a reivindicação 59 ou 60, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma VH CDR1, ou uma VH CDR2, ou tanto uma VH CDR1 quanto uma VH CDR2, como mostrado em uma região VH apresentada na Figura 1.

64. Método, de acordo com a reivindicação 59 ou 60,

caracterizado pelo fato de que a sequência do segmento-V possui uma sequência do segmento-V de VH mostrada na Figura

1.

65. Método, de acordo a reivindicação 59 ou 60, caracterizado pelo fato de que a VH possui a sequência de VH#1, VH#2, VH#3, VH#4 ou VH#5 apresentada na Figura 1.

66. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50-55, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região-VL que compreende uma CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos FNK ou FNR.

67. Método, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região JK4 da linhagem germinativa humana.

68. Método, de acordo com a reivindicação 66 ou 67, caracterizado pelo fato de que a CDR3 da região VL compreende QQFN(K/R)SPLT.

69. Método, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região VL que compreende uma CDR3 que compreende QQFNKSPLT.

70. Método, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que a região VL compreende uma CDR1 ou uma CDR2, ou tanto uma CDR1 quanto uma CDR2 de uma região VL mostrada na Figura 1.

71. Método, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que a região VL compreende um segmento-V que possui pelo menos 95% de identidade para a sequência do segmento-V de VKIII A27 como mostrada na Figura

1.

72. Método, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que a região VL possui a sequência de VK# 1, VK#2, VK#3 ou VK#4 apresentada na Figura 1.

73. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50-55, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF possui um determinante de especificidade de ligação à CDR3 da região VH RQRFPY ou RDRFPY e uma região VL que possui uma CDR3 que compreende QQFNKSPLT.

74. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50-55, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF possui uma sequência da região VH apresentada na Figura 1 e uma sequência da região VL apresentada na Figura 1.

75. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50-55, caracterizado pelo fato de que as sequências de aminoácidos da região VH ou da região VL, ou tanto da VH quanto da região VL compreendem uma metionina no terminal-N.

76. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o antagonista de hGM-CSF é selecionado do grupo que compreende um anticorpo anti- receptor de hGM-CSF ou um receptor de hGM-CSF solúvel, um mimético de anticorpo de citocromo b562, um análogo do peptídeo hGM-CSF, uma adnectina, um mimético de anticorpo de arcabouço de lipocalina, um mimético de anticorpo de calixareno e um peptidomimético de ligação do tipo anticorpo.

77. Método, de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de que o receptor de hGM-CSF solúvel compreende uma proteína de fusão receptor de hGM-CSF solúvel-

Fc.

78. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que as células CAR-T são células CAR-T CD19.

79. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a redução da taxa de recidiva ou a prevenção da ocorrência de recidiva do tumor no indivíduo ocorre na ausência de uma incidência de toxicidade relacionada à imunoterapia.

80. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a redução da taxa de recidiva ou a prevenção da ocorrência de recidiva do tumor no indivíduo ocorre na presença de uma incidência de toxicidade relacionada à imunoterapia.

81. Método, de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que a toxicidade relacionada à imunoterapia é toxicidade relacionada a CAR-T.

82. Método, de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo fato de que a toxicidade relacionada a CAR-T é síndrome de liberação de citocinas, neurotoxicidade ou neuroinflamação.

83. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a ocorrência da recidiva do tumor é reduzida de 50% para 100% nos primeiros três meses de um ano após administração do antagonista de GM-CSF recombinante, comparada com a ocorrência da recidiva do tumor em um indivíduo tratado com imunoterapia e não administrado com um antagonista de GM-CSF recombinante.

84. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a ocorrência da recidiva do tumor é reduzida de 50% para 95% nos primeiros seis meses após administração do antagonista de GM-CSF recombinante.

85. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a ocorrência da recidiva do tumor é evitada por 12-36 meses.

86. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a ocorrência da recidiva do tumor é evitada completamente (100%) por cerca de 10 anos.

87. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o indivíduo possui leucemia linfoblástica aguda.

88. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado ainda por compreender a administração das células T CAR GM-CSF K/O em combinação com um antagonista de hGM-CSF.

89. Método caracterizado por ser usado para a redução de um nível de uma citocina ou quimiocina diferente de GM- CSF em um indivíduo tratado com uma imunoterapia (e que possui uma incidência de toxicidade relacionada à imunoterapia), o método compreendendo a administração ao indivíduo de um antagonista de hGM-CSF recombinante antes ou durante a imunoterapia, em que o nível da citocina ou quimiocina é reduzido, comparado com o nível desta em um indivíduo durante a incidência de toxicidade relacionada à imunoterapia.

90. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que a referida imunoterapia compreende transferência adotiva de células, administração de anticorpos monoclonais, administração de uma vacina contra câncer, terapias de comprometimento de células T, ou qualquer combinação destas.

91. Método, de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que a referida transferência adotiva de células compreende a administração de células T que expressam receptor de antígeno quimérico (células T CAR), células T com receptor de célula T (TCR) modificado, linfócitos infiltrantes no tumor (TIL), células natural killer com receptor de antígeno quimérico (CAR) modificado ou células dendríticas, ou qualquer combinação destas.

92. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que as células CAR-T são células CAR-T CD19 ou células CAR-T BCMA.

93. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que o antagonista de GM-CSF recombinante é um antagonista de hGM-CSF.

94. Método, de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que o antagonista de GM-CSF recombinante é um anticorpo anti-GM-CSF.

95. Método, de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-GM-CSF se liga a um GM-CSF humano.

96. Método, de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-GM-CSF se liga a um GM-CSF de primata.

97. Método, de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-GM-CSF se liga a um GM-CSF de mamífero.

98. Método, de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-GM-CSF é um anticorpo anti-hGM-CSF.

99. Método, de acordo com a reivindicação 94, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo monoclonal.

100. Método, de acordo com a reivindicação 94, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um fragmento de anticorpo que é um Fab, um Fab', um F(ab')2, um Fv, um scFv ou um dAB.

101. Método, de acordo com a reivindicação 94, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo neutralizante de GM-CSF humano.

102. Método, de acordo com a reivindicação 94, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo recombinante, humanizado, com CDR enxertada ou quimérico.

103. Método, de acordo com a reivindicação 94, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo humano.

104. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que a citocina ou quimiocina é uma citocina ou quimiocina humana selecionada do grupo que consiste em IFN-γ, GRO, MDC, IL-2, IL-3, IL-5, IL-7, IP-10, CD107a, TNF-a, IL-1Ra, FGF-2, IL-12p40, IL-12p70, sCD40L, VEGF, MCP-1, MIP-1a, MIP-1b e uma combinação destas.

105. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que a citocina ou quimiocina é selecionada do grupo que consiste em IFN-γ, IL-1a, IL-1b, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL7, IL-9, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, ILF, IL-13, LIX, IL-15, IP-10, KC, MCP-1, MIP-1a, MIP-1b, M-CSF, MIP-2, MIG, RANTES, TNF-a, eotaxina, G-CSF, IL-1Ra, FGF-2, sCD40L, e uma combinação destas.

106. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que o indivíduo possui leucemia linfoblástica aguda, linfoma de célula B grande difuso (DLBCL), linfoma de célula B grande mediastinal primário, linfoma de célula B de alto grau ou DLBCL decorrente de linfoma folicular.

107. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que o antagonista de hGM-CSF é selecionado do grupo que compreende um anticorpo anti- receptor de hGM-CSF ou um receptor de hGM-CSF solúvel ou subunidade do receptor, um mimético de anticorpo de citocromo b562, um análogo do peptídeo hGM-CSF, uma adnectina, um mimético de anticorpo de arcabouço de lipocalina, um mimético de anticorpo de calixareno e um peptidomimético de ligação do tipo anticorpo.

108. Método, de acordo com a reivindicação 107, caracterizado pelo fato de que o receptor de hGM-CSF solúvel compreende uma proteína de fusão receptor de hGM-CSF solúvel- Fc.

109. Método caracterizado por ser usado para o tratamento ou prevenção de toxicidade relacionada à imunoterapia em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de células T que expressam receptor de antígeno quimérico (células CAR-T), as células CAR-T possuindo uma inativação ou um knockout do gene de GM- CSF (células CAR-T GM-CSFk/o).

110. Método, de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo fato de que as células CAR-T GM-CSFk/o expressam um nível reduzido de GM-CSF, comparado com um nível de expressão de GM-CSF por células CAR-T do tipo selvagem.

111. Método, de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo fato de que as células CAR-T GM-CSFk/o expressam um nível de uma ou mais citocinas e/ou quimiocinas que é menor ou equivalente a um nível das (uma ou mais) citocinas e/ou quimiocinas expresso por células CAR-T do tipo selvagem.

112. Método, de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo fato de que as (uma ou mais) citocinas consistem em uma citocina e/ou quimiocina humana selecionada do grupo que consiste em IFN-γ, GRO, MDC, IL-2, IL-3, IL-5, IL-7, IP-10, CD107a, TNF-a, IL-1Ra, FGF-2, IL-12p40, IL- 12p70, sCD40L, VEGF, MCP-1, MIP-1a, MIP-1b e uma combinação destas.

113. Método, de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo fato de que as (uma ou mais) citocinas são selecionadas do grupo que consiste em IFN-γ, IL-1a, IL- 1b, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL7, IL-9, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, ILF, IL-13, LIX, IL-15, IP-10, KC, MCP-1, MIP-1a, MIP-1b, M-CSF, MIP-2, MIG, RANTES, TNF-a, eotaxina, G-CSF, IL-1Ra, FGF-2, sCD40L, e uma combinação destas.

114. Método, de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo fato de que as células CAR-T são células CAR-T CD19 ou células CAR-T BCMA.

115. Método, de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo fato de que as células CAR-T GM-CSFk/o melhoram as taxas de recidivas, comparadas com as taxas de recidivas de um indivíduo tratado com células CAR-T do tipo selvagem.

116. Método, de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo fato de que as células CAR-T GM-CSFk/o aumentam as taxas de resposta objetiva (resposta completa e resposta parcial), comparado com um indivíduo tratado por administração de células CAR-T do tipo selvagem.

117. Método, de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo fato de que as células CAR-T GM-CSFk/o aumentam a sobrevida livre de progressão do indivíduo, comparada com a sobrevida livre de progressão em um indivíduo tratado por administração de células CAR-T do tipo selvagem.

118. Método, de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo fato de que o indivíduo possui leucemia linfoblástica aguda, linfoma de célula B grande difuso (DLBCL), linfoma de célula B grande mediastinal primário, linfoma de célula B de alto grau ou DLBCL decorrente de linfoma folicular.

119. Método, de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo fato de que as células CAR-T GM-CSFk/o aumentam a atividade antitumoral do antagonista de hGM-CSF recombinante.

120. Método, de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo fato de que as células CAR-T GM-CSFk/o aumentam a sobrevida global do indivíduo, comparada com a sobrevida em um indivíduo tratado por administração de células CAR-T do tipo selvagem.

121. Método, de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo fato de que o indivíduo possui leucemia linfoblástica aguda.

122. Método, de acordo com a reivindicação 109, caracterizado ainda por compreender a administração de um antagonista de hGM-CSF recombinante.

123. Método, de acordo com a reivindicação 122,

caracterizado pelo fato de que o antagonista de GM-CSF recombinante é um antagonista de hGM-CSF.

124. Método, de acordo com a reivindicação 122, caracterizado pelo fato de que o antagonista de GM-CSF recombinante é um anticorpo anti-GM-CSF.

125. Método, de acordo com a reivindicação 124, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-GM-CSF se liga a um GM-CSF humano.

126. Método, de acordo com a reivindicação 124, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-GM-CSF se liga a um GM-CSF de primata.

127. Método, de acordo com a reivindicação 124, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-GM-CSF se liga a um GM-CSF de mamífero.

128. Método, de acordo com a reivindicação 124, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-GM-CSF é um anticorpo anti-hGM-CSF.

129. Método, de acordo com a reivindicação 128, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo monoclonal.

130. Método, de acordo com a reivindicação 128, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um fragmento de anticorpo que é um Fab, um Fab', um F(ab')2, um scFv ou um dAB.

131. Método, de acordo com a reivindicação 128, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo neutralizante de GM-CSF humano.

132. Método, de acordo com a reivindicação 128, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo recombinante ou quimérico.

133. Método, de acordo com a reivindicação 128, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo humano.

134. Método, de acordo com a reivindicação 123, caracterizado pelo fato de que o antagonista de hGM-CSF é selecionado do grupo que compreende um anticorpo anti- receptor de hGM-CSF ou um receptor de hGM-CSF solúvel ou subunidade do receptor, um mimético de anticorpo de citocromo b562, um análogo do peptídeo hGM-CSF, uma adnectina, um mimético de anticorpo de arcabouço de lipocalina, um mimético de anticorpo de calixareno e um peptidomimético de ligação do tipo anticorpo.

135. Método, de acordo com a reivindicação 134, caracterizado pelo fato de que o receptor de hGM-CSF solúvel compreende uma proteína de fusão receptor de hGM-CSF solúvel- Fc.

136. Método caracterizado por ser usado para redução da taxa de recidiva ou prevenção da ocorrência de recidiva do tumor em um indivíduo tratado com imunoterapia, o método compreendendo a administração ao indivíduo de um antagonista de hGM-CSF recombinante.

137. Método, de acordo com a reivindicação 136, caracterizado pelo fato de que o indivíduo possui leucemia linfoblástica aguda, linfoma de célula B grande difuso (DLBCL), linfoma de célula B grande mediastinal primário, linfoma de célula B de alto grau ou DLBCL decorrente de linfoma folicular.

138. Método, de acordo com a reivindicação 136, caracterizado pelo fato de que o indivíduo possui um câncer refratário/recidivado que é linfoma não-Hodgkin (NHL) ou linfoma de célula B refratário à quimioterapia.

139. Método, de acordo com a reivindicação 136, caracterizado pelo fato de que o antagonista de GM-CSF recombinante é um antagonista de hGM-CSF.

140. Método, de acordo com a reivindicação 136, caracterizado pelo fato de que o antagonista de GM-CSF recombinante é um anticorpo anti-GM-CSF.

141. Método, de acordo com a reivindicação 136, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-GM-CSF se liga a um GM-CSF humano.

142. Método, de acordo com a reivindicação 136, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-GM-CSF se liga a um GM-CSF de primata.

143. Método, de acordo com a reivindicação 136, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-GM-CSF se liga a um GM-CSF de mamífero.

144. Método, de acordo com a reivindicação 136, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-GM-CSF é um anticorpo anti-hGM-CSF.

145. Método, de acordo com a reivindicação 144, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo monoclonal.

146. Método, de acordo com a reivindicação 144, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um fragmento de anticorpo que é um Fab, um Fab', um F(ab')2, um scFv ou um dAB.

147. Método, de acordo com a reivindicação 144, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo neutralizante de GM-CSF humano.

148. Método, de acordo com a reivindicação 144,

caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo recombinante ou quimérico.

149. Método, de acordo com a reivindicação 144, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo humano.

150. Método, de acordo com a reivindicação 139, caracterizado pelo fato de que o antagonista de hGM-CSF é selecionado do grupo que compreende um anticorpo anti- receptor de hGM-CSF ou um receptor de hGM-CSF solúvel ou subunidade do receptor, um mimético de anticorpo de citocromo b562, um análogo do peptídeo hGM-CSF, uma adnectina, um mimético de anticorpo de arcabouço de lipocalina, um mimético de anticorpo de calixareno e um peptidomimético de ligação do tipo anticorpo.

151. Método, de acordo com a reivindicação 150, caracterizado pelo fato de que o receptor de hGM-CSF solúvel compreende uma proteína de fusão receptor de hGM-CSF solúvel- Fc.

152. Método, de acordo com a reivindicação 136, caracterizado ainda por compreender a administração das células T CAR GM-CSF K/O em combinação com um antagonista de hGM-CSF.

153. Método, de acordo com a reivindicação 139, caracterizado pelo fato de que as células T CAR GM-CSF K/O possuem uma inativação do gene GM-CSF ou knockout de GM-CSF (células CAR-T GM-CSFk/o), em que o gene GM-CSF é inativado ou sofre knockout pelos métodos conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 12-25.

154. Método caracterizado por ser usado para redução de ruptura da barreira hematencefálica em um indivíduo tratado com imunoterapia, o método compreendendo a administração de um antagonista de GM-CSF recombinante ao indivíduo.

155. Método, de acordo com a reivindicação 154, caracterizado pelo fato de que o indivíduo possui uma incidência de toxicidade relacionada à imunoterapia.

156. Método, de acordo com a reivindicação 154, caracterizado pelo fato de que a imunoterapia compreende transferência adotiva de células, administração de anticorpos monoclonais, administração de citocinas, administração de uma vacina contra câncer, terapias de comprometimento de células T, ou qualquer combinação destas.

157. Método, de acordo com a reivindicação 156, caracterizado pelo fato de que a transferência adotiva de células compreende a administração de células T que expressam receptor de antígeno quimérico (células T CAR), células T com receptor de célula T (TCR) modificado, linfócitos infiltrantes no tumor (TIL), células natural killer com receptor de antígeno quimérico (CAR) modificado ou células dendríticas, ou qualquer combinação destas.

158. Método, de acordo com a reivindicação 157, caracterizado pelo fato de que as células T CAR são células CAR-T CD19 ou células CAR-T BCMA.

159. Método, de acordo com a reivindicação 154, caracterizado pelo fato de que o antagonista de GM-CSF recombinante é um antagonista de hGM-CSF.

160. Método, de acordo com a reivindicação 154, caracterizado pelo fato de que o antagonista de GM-CSF recombinante é um anticorpo anti-GM-CSF.

161. Método, de acordo com a reivindicação 160, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-GM-CSF se liga ao GM-CSF de mamífero ou se liga ao GM-CSF de primata.

162. Método, de acordo com a reivindicação 161, caracterizado pelo fato de que o primata é um macaco, um babuíno, um macaco do gênero macaca, um chimpanzé, um gorila, um lêmure, um lóris, um társio, um gálago, um potto, um sifaka, um indri, um aye-ayes, um símio ou um humano.

163. Método, de acordo com a reivindicação 159, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-GM-CSF é um anticorpo anti-hGM-CSF.

164. Método, de acordo com a reivindicação 163, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é administrado antes, concomitantemente ou depois de imunoterapia, ou uma combinação destes.

165. Método, de acordo com a reivindicação 163, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF se liga ao GM-CSF humano.

166. Método, de acordo com a reivindicação 163, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo monoclonal.

167. Método, de acordo com a reivindicação 163, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um fragmento de anticorpo que é um Fab, um Fab', um F(ab')2, um scFv ou um dAB.

168. Método, de acordo com a reivindicação 163, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo neutralizante de GM-CSF humano.

169. Método, de acordo com a reivindicação 163, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo recombinante ou quimérico.

170. Método, de acordo com a reivindicação 163,

caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo humano.

171. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 163-170, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo quimérico 19/2.

172. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 163-170, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF compreende a CDR3 da região VH e CDR3 da região VL do anticorpo quimérico 19/2.

173. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 163-170, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF compreende as CDR1, CDR2 e CDR3 da região VH e da região VL do anticorpo quimérico 19/2.

174. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 163-170, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região VH que compreende um determinante de especificidade de ligação à CDR3 RQRFPY ou RDRFPY, um segmento-J e um segmento-V, em que o segmento-J compreende pelo menos 95% de identidade para JH4 humano (YFD YWGQGTL VTVSS) e o segmento-V compreende pelo menos 90% de identidade para uma sequência VH1 1-02 ou VH1 1-03 da linhagem germinativa humana; ou uma região VH que compreende um determinante de especificidade de ligação à CDR3 RQRFPY.

175. Método, de acordo com a reivindicação 174, caracterizado pelo fato de que o segmento-J compreende YFDYWGQGTLVTVSS.

176. Método, de acordo com a reivindicação 174 ou 175, caracterizado pelo fato de que a CDR3 compreende RQRFPYYFDY ou RDRFPYYFDY.

177. Método, de acordo com a reivindicação 174 ou 175, caracterizado pelo fato de que a CDR1 da região VH é uma VH1 CDR1 da linhagem germinativa humana; a CDR2 da região VL é uma VH1 CDR2 da linhagem germinativa humana; ou tanto a CDR1 quanto CDR2 são de uma sequência VH1 da linhagem germinativa humana.

178. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 174 ou 175, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma VH CDR1, ou uma VH CDR2, ou tanto uma VH CDR1 quanto uma VH CDR2, como mostrado em uma região VH apresentada na Figura 1.

179. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 174 ou 175, caracterizado pelo fato de que a sequência do segmento-V possui uma sequência do segmento-V de VH mostrada na Figura 1.

180. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 174 ou 175, caracterizado pelo fato de que a VH possui a sequência de VH#1, VH#2, VH#3, VH#4 ou VH#5 apresentada na Figura 1.

181. Método, de acordo com a reivindicação 163, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região-VL que compreende uma CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos FNK ou FNR.

182. Método, de acordo com a reivindicação 181, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região JK4 da linhagem germinativa humana.

183. Método, de acordo com a reivindicação 181 ou 182, caracterizado pelo fato de que a CDR3 da região VL compreende QQFN(K/R)SPL.

184. Método, de acordo com a reivindicação 183, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região VL que compreende uma CDR3 que compreende QQFNKSPLT.

185. Método, de acordo com a reivindicação 181, caracterizado pelo fato de que a região VL compreende uma CDR1 ou uma CDR2, ou tanto uma CDR1 quanto uma CDR2 de uma região VL mostrada na Figura 1.

186. Método, de acordo com a reivindicação 181, caracterizado pelo fato de que a região VL compreende um segmento-V que possui pelo menos 95% de identidade para a sequência do segmento-V de VKIII A27 como mostrada na Figura

1.

187. Método, de acordo com a reivindicação 181, caracterizado pelo fato de que a região VL possui a sequência de VK# 1, VK#2, VK#3 ou VK#4 apresentada na Figura 1.

188. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 163-170, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF possui um determinante de especificidade de ligação à CDR3 da região VH RQRFPY ou RDRFPY e uma região VL que possui uma CDR3 que compreende QQFNKSPLT.

189. Método, de acordo com a reivindicação 188, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF possui uma sequência da região VH apresentada na Figura 1 e uma sequência da região VL apresentada na Figura 1.

190. Método, de acordo com a reivindicação 188, caracterizado pelo fato de que as sequências de aminoácidos da região VH ou da região VL, ou tanto da VH quanto da região VL compreendem uma metionina no terminal-N.

191. Método, de acordo com a reivindicação 159, caracterizado pelo fato de que o antagonista de hGM-CSF é selecionado do grupo que compreende um anticorpo anti- receptor de hGM-CSF ou um receptor de hGM-CSF solúvel ou subunidade do receptor, um mimético de anticorpo de citocromo b562, um análogo do peptídeo hGM-CSF, uma adnectina, um mimético de anticorpo de arcabouço de lipocalina, um mimético de anticorpo de calixareno e um peptidomimético de ligação do tipo anticorpo.

192. Método, de acordo com a reivindicação 155, caracterizado pelo fato de que a toxicidade relacionada à imunoterapia é toxicidade relacionada a CAR-T.

193. Método, de acordo com a reivindicação 155, caracterizado pelo fato de que a toxicidade relacionada a CAR-T é síndrome de liberação de citocinas, neurotoxicidade, neuroinflamação, ou uma combinação destas.

194. Método, de acordo com a reivindicação 159, caracterizado pelo fato de que o antagonista de hGM-CSF é selecionado do grupo que compreende um anticorpo anti- receptor de hGM-CSF ou um receptor de hGM-CSF solúvel ou subunidade do receptor, um mimético de anticorpo de citocromo b562, um análogo do peptídeo hGM-CSF, uma adnectina, um mimético de anticorpo de arcabouço de lipocalina, um mimético de anticorpo de calixareno e um peptidomimético de ligação do tipo anticorpo.

195. Método, de acordo com a reivindicação 194, caracterizado pelo fato de que o receptor de hGM-CSF solúvel compreende uma proteína de fusão receptor de hGM-CSF solúvel- Fc.

196. Método caracterizado por ser usado para preservação da integridade da barreira hematencefálica em um indivíduo tratado com imunoterapia, o método compreendendo a administração de um antagonista de hGM-CSF recombinante ao indivíduo.

197. Método, de acordo com a reivindicação 196, caracterizado pelo fato de que o antagonista de hGM-CSF recombinante é um anticorpo anti-GM-CSF.

198. Método, de acordo com a reivindicação 197, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-GM-CSF se liga ao GM-CSF de mamífero ou se liga ao GM-CSF de primata.

199. Método, de acordo com a reivindicação 198, caracterizado pelo fato de que o primata é um macaco, um babuíno, um macaco do gênero macaca, um chimpanzé, um gorila, um lêmure, um lóris, um társio, um gálago, um potto, um sifaka, um indri, um aye-ayes, um símio ou um humano.

200. Método, de acordo com a reivindicação 197, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-GM-CSF é um anticorpo anti-hGM-CSF.

201. Método, de acordo com a reivindicação 200, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é administrado antes, concomitantemente ou depois de imunoterapia, ou uma combinação destes.

202. Método, de acordo com a reivindicação 200, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF se liga ao GM-CSF humano.

203. Método, de acordo com a reivindicação 200, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo monoclonal.

204. Método, de acordo com a reivindicação 200, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um fragmento de anticorpo que é um Fab, um Fab', um F(ab')2, um scFv ou um dAB.

205. Método, de acordo com a reivindicação 200, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo neutralizante de GM-CSF humano.

206. Método, de acordo com a reivindicação 200, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo recombinante ou quimérico.

207. Método, de acordo com a reivindicação 200, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo humano.

208. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 200-207, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo quimérico 19/2.

209. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 200-207, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF compreende a CDR3 da região VH e CDR3 da região VL do anticorpo quimérico 19/2.

210. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 200-207, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF compreende as CDR1, CDR2 e CDR3 da região VH e da região VL do anticorpo quimérico 19/2.

211. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 200-207, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região VH que compreende um determinante de especificidade de ligação à CDR3 RQRFPY ou RDRFPY, um segmento-J e um segmento-V, em que o segmento-J compreende pelo menos 95% de identidade para JH4 humano (YFD YWGQGTL VTVSS) e o segmento-V compreende pelo menos 90% de identidade para uma sequência VH1 1-02 ou VH1 1-03 da linhagem germinativa humana; ou uma região VH que compreende um determinante de especificidade de ligação à CDR3 RQRFPY.

212. Método, de acordo com a reivindicação 211, caracterizado pelo fato de que o segmento-J compreende YFDYWGQGTLVTVSS.

213. Método, de acordo com a reivindicação 211 ou 212, caracterizado pelo fato de que a CDR3 compreende RQRFPYYFDY ou RDRFPYYFDY.

214. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 211 ou 212, caracterizado pelo fato de que a CDR1 da região VH é uma VH1 CDR1 da linhagem germinativa humana; a CDR2 da região VL é uma VH1 CDR2 da linhagem germinativa humana; ou tanto a CDR1 quanto CDR2 são de uma sequência VH1 da linhagem germinativa humana.

215. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 211 ou 212, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma VH CDR1, ou uma VH CDR2, ou tanto uma VH CDR1 quanto uma VH CDR2, como mostrado em uma região VH apresentada na Figura 1.

216. Método, de acordo com a reivindicação 211 ou 212, caracterizado pelo fato de que a sequência do segmento-V possui uma sequência do segmento-V de VH mostrada na Figura

1.

217. Método, de acordo com a reivindicação 211 ou 212, caracterizado pelo fato de que a VH possui a sequência de VH#1, VH#2, VH#3, VH#4 ou VH#5 apresentada na Figura 1.

218. Método, de acordo com a reivindicação 200, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região-VL que compreende uma CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos FNK ou FNR.

219. Método, de acordo com a reivindicação 218, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região JK4 da linhagem germinativa humana.

220. Método, de acordo com a reivindicação 218 ou 219, caracterizado pelo fato de que a CDR3 da região VL compreende QQFN(K/R)SPL.

221. Método, de acordo com a reivindicação 220, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região VL que compreende uma CDR3 que compreende QQFNKSPLT.

222. Método, de acordo com a reivindicação 220, caracterizado pelo fato de que a região VL compreende uma CDR1 ou uma CDR2, ou tanto uma CDR1 quanto uma CDR2 de uma região VL mostrada na Figura 1.

223. Método, de acordo com a reivindicação 218, caracterizado pelo fato de que a região VL compreende um segmento-V que possui pelo menos 95% de identidade para a sequência do segmento-V de VKIII A27 como mostrada na Figura

1.

224. Método, de acordo com a reivindicação 218, caracterizado pelo fato de que a região VL possui a sequência de VK# 1, VK#2, VK#3 ou VK#4 apresentada na Figura 1.

225. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 200-207, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF possui um determinante de especificidade de ligação à CDR3 da região VH RQRFPY ou RDRFPY e uma região VL que possui uma CDR3 que compreende QQFNKSPLT.

226. Método, de acordo com a reivindicação 225, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF possui uma sequência da região VH apresentada na Figura 1 e uma sequência da região VL apresentada na Figura 1.

227. Método, de acordo com a reivindicação 225, caracterizado pelo fato de que as sequências de aminoácidos da região VH ou da região VL, ou tanto da VH quanto da região VL compreendem uma metionina no terminal-N.

228. Método, de acordo com a reivindicação 196, caracterizado pelo fato de que o antagonista de hGM-CSF é selecionado do grupo que compreende um anticorpo anti- receptor de hGM-CSF ou um receptor de hGM-CSF solúvel ou subunidade do receptor, um mimético de anticorpo de citocromo b562, um análogo do peptídeo hGM-CSF, uma adnectina, um mimético de anticorpo de arcabouço de lipocalina, um mimético de anticorpo de calixareno e um peptidomimético de ligação do tipo anticorpo.

229. Método, de acordo com a reivindicação 196, caracterizado pelo fato de que o indivíduo possui uma toxicidade relacionada à imunoterapia.

230. Método, de acordo com a reivindicação 229, caracterizado pelo fato de que a toxicidade relacionada à imunoterapia é toxicidade relacionada a CAR-T.

231. Método, de acordo com a reivindicação 230, caracterizado pelo fato de que a toxicidade relacionada a CAR-T é síndrome de liberação de citocinas, neurotoxicidade, neuroinflamação, ou uma combinação destas.

232. Método, de acordo com a reivindicação 196, caracterizado pelo fato de que o antagonista de hGM-CSF é selecionado do grupo que compreende um anticorpo anti-

receptor de hGM-CSF ou um receptor de hGM-CSF solúvel ou subunidade do receptor, um mimético de anticorpo de citocromo b562, um análogo do peptídeo hGM-CSF, uma adnectina, um mimético de anticorpo de arcabouço de lipocalina, um mimético de anticorpo de calixareno e um peptidomimético de ligação do tipo anticorpo.

233. Método, de acordo com a reivindicação 232, caracterizado pelo fato de que o receptor de hGM-CSF solúvel compreende uma proteína de fusão receptor de hGM-CSF solúvel- Fc.

234. Método caracterizado por ser usado para diminuição ou prevenção de neuroinflamação induzida por terapia com célula CAR-T em um indivíduo necessitado, o método compreendendo a administração de um antagonista de hGM-CSF recombinante ao indivíduo.

235. Método, de acordo com a reivindicação 234, caracterizado pelo fato de que a administração do antagonista de hGM-CSF recombinante reduz a ruptura da barreira hematencefálica mantendo, dessa forma, sua integridade.

236. Método, de acordo com a reivindicação 235, caracterizado pelo fato de que a redução da ruptura da barreira hematencefálica diminui ou evita um influxo de citocinas pró-inflamatórias para dentro do sistema nervoso central.

237. Método, de acordo com a reivindicação 236, caracterizado pelo fato de que a citocina pró-inflamatória é uma citocina humana selecionada do grupo que consiste em IFN-γ, GRO, MDC, IL-2, IL-3, IL-5, IL-7, IP-10, CD107a, TNF- a, IL-1Ra, FGF-2, IL-12p40, IL-12p70, sCD40L, VEGF, MCP-1, MIP-1a, MIP-1b e uma combinação destas.

238. Método, de acordo com a reivindicação 236, caracterizado pelo fato de que as citocinas pró- inflamatórias são selecionadas do grupo que consiste em IFN- γ, IL-1a, IL-1b, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL7, IL-9, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, ILF, IL-13, LIX, IL-15, IP-10, KC, MCP-1, MIP-1a, MIP-1b, M-CSF, MIP-2, MIG, RANTES, TNF- a, eotaxina, G-CSF, IL-1Ra, FGF-2, sCD40L, e uma combinação destas.

239. Método, de acordo com a reivindicação 234, caracterizado pelo fato de que a neuroinflamação no indivíduo é diminuída por 75% a 95%, comparado com um indivíduo tratado com terapia com célula CAR-T e um anticorpo de controle.

240. Método, de acordo com a reivindicação 239, caracterizado pelo fato de que a diminuição de 75% a 95% na neuroinflamação é similar à neuroinflamação em um indivíduo de controle não tratado.

241. Método, de acordo com a reivindicação 234, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com células T que expressam receptor de antígeno quimérico (células T CAR).

242. Método, de acordo com a reivindicação 234, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com células T com receptor de célula T (TCR) modificado, linfócitos infiltrantes no tumor (TIL), células natural killer com receptor de antígeno quimérico (CAR) modificado ou células dendríticas, ou qualquer combinação destas.

243. Método, de acordo com a reivindicação 241, caracterizado pelo fato de que as células T CAR são células CAR-T CD19 ou células CAR-T BCMA.

244. Método, de acordo com a reivindicação 234,

caracterizado pelo fato de que o antagonista de hGM-CSF recombinante é um antagonista de hGM-CSF.

245. Método, de acordo com a reivindicação 234, caracterizado pelo fato de que o antagonista de hGM-CSF recombinante é um anticorpo anti-GM-CSF.

246. Método, de acordo com a reivindicação 245, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-GM-CSF se liga ao GM-CSF de mamífero ou se liga ao GM-CSF de primata.

247. Método, de acordo com a reivindicação 245, caracterizado pelo fato de que o primata é um macaco, um babuíno, um macaco do gênero macaca, um chimpanzé, um gorila, um lêmure, um lóris, um társio, um gálago, um potto, um sifaka, um indri, um aye-ayes, um símio ou um humano.

248. Método, de acordo com a reivindicação 246, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-GM-CSF é um anticorpo anti-hGM-CSF.

249 Método, de acordo com a reivindicação 248, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é administrado antes, concomitantemente ou depois de imunoterapia, ou uma combinação destes.

250. Método, de acordo com a reivindicação 248, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF se liga ao GM-CSF humano.

251. Método, de acordo com a reivindicação 248, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo monoclonal.

252. Método, de acordo com a reivindicação 248, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um fragmento de anticorpo que é um Fab, um Fab', um F(ab')2, um scFv ou um dAB.

253. Método, de acordo com a reivindicação 248, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo neutralizante de GM-CSF humano.

254. Método, de acordo com a reivindicação 248, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo recombinante ou quimérico.

255. Método, de acordo com a reivindicação 248, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo humano.

256. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 248-255, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo quimérico 19/2.

257. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 248-255, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF compreende a CDR3 da região VH e CDR3 da região VL do anticorpo quimérico 19/2.

258. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 248-255, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF compreende as CDR1, CDR2 e CDR3 da região VH e da região VL do anticorpo quimérico 19/2.

259. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 248-255, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região VH que compreende um determinante de especificidade de ligação à CDR3 RQRFPY ou RDRFPY, um segmento-J e um segmento-V, em que o segmento-J compreende pelo menos 95% de identidade para JH4 humano (YFD YWGQGTL VTVSS) e o segmento-V compreende pelo menos 90% de identidade para uma sequência VH1 1-02 ou VH1 1-03 da linhagem germinativa humana; ou uma região VH que compreende um determinante de especificidade de ligação à CDR3 RQRFPY.

260. Método, de acordo com a reivindicação 259, caracterizado pelo fato de que o segmento-J compreende YFDYWGQGTLVTVSS.

261. Método, de acordo com a reivindicação 259 ou 260, caracterizado pelo fato de que a CDR3 compreende RQRFPYYFDY ou RDRFPYYFDY.

262. Método, de acordo com a reivindicação 259 ou 260, caracterizado pelo fato de que a CDR1 da região VH é uma VH1 CDR1 da linhagem germinativa humana; a CDR2 da região VH é uma VH1 CDR2 da linhagem germinativa humana; ou tanto a CDR1 quanto CDR2 são de uma sequência VH1 da linhagem germinativa humana.

263. Método, de acordo com a reivindicação 259 ou 260, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma VH CDR1, ou uma VH CDR2, ou tanto uma VH CDR1 quanto uma VH CDR2, como mostrado em uma região VH apresentada na Figura 1.

264. Método, de acordo com a reivindicação 259 ou 260, caracterizado pelo fato de que a sequência do segmento-V possui uma sequência do segmento-V de VH mostrada na Figura

1.

265. Método, de acordo com a reivindicação 259 ou 260, caracterizado pelo fato de que a VH possui a sequência de VH#1, VH#2, VH#3, VH#4 ou VH#5 apresentada na Figura 1.

266. Método, de acordo com a reivindicação 248, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região-VL que compreende uma CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos FNK ou FNR.

267. Método, de acordo com a reivindicação 248, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região JK4 da linhagem germinativa humana.

268. Método, de acordo com a reivindicação 266 ou 267, caracterizado pelo fato de que a CDR3 da região VL compreende QQFN(K/R)SPL.

269. Método, de acordo com a reivindicação 268, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região VL que compreende uma CDR3 que compreende QQFNKSPLT.

270. Método, de acordo com a reivindicação 268, caracterizado pelo fato de que a região VL compreende uma CDR1 ou uma CDR2, ou tanto uma CDR1 quanto uma CDR2 de uma região VL mostrada na Figura 1.

271. Método, de acordo com a reivindicação 268, caracterizado pelo fato de que a região VL compreende um segmento-V que possui pelo menos 95% de identidade para a sequência do segmento-V de VKIII A27 como mostrada na Figura

1.

272. Método, de acordo com a reivindicação 268, caracterizado pelo fato de que a região VL possui a sequência de VK# 1, VK#2, VK#3 ou VK#4 apresentada na Figura 1.

273. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 248-255, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF possui um determinante de especificidade de ligação à CDR3 da região VH RQRFPY ou RDRFPY e uma região VL que possui uma CDR3 que compreende QQFNKSPLT.

274. Método, de acordo com a reivindicação 273, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF possui uma sequência da região VH apresentada na Figura 1 e uma sequência da região VL apresentada na Figura 1.

275. Método, de acordo com a reivindicação 268, caracterizado pelo fato de que as sequências de aminoácidos da região VH ou da região VL, ou tanto da VH quanto da região VL compreendem uma metionina no terminal-N.

276. Método, de acordo com a reivindicação 234, caracterizado pelo fato de que o antagonista de hGM-CSF é selecionado do grupo que compreende um anticorpo anti- receptor de hGM-CSF ou um receptor de hGM-CSF solúvel ou subunidade do receptor, um mimético de anticorpo de citocromo b562, um análogo do peptídeo hGM-CSF, uma adnectina, um mimético de anticorpo de arcabouço de lipocalina, um mimético de anticorpo de calixareno e um peptidomimético de ligação do tipo anticorpo.

277. Método, de acordo com a reivindicação 234, caracterizado pelo fato de que o indivíduo ainda possui uma toxicidade relacionada a CAR-T selecionada de síndrome de liberação de citocinas, neurotoxicidade, ou uma combinação destas.

278. Método, de acordo com a reivindicação 234, caracterizado pelo fato de que o antagonista de hGM-CSF é selecionado do grupo que compreende um anticorpo anti- receptor de hGM-CSF ou um receptor de hGM-CSF solúvel ou subunidade do receptor, um mimético de anticorpo de citocromo b562, um análogo do peptídeo hGM-CSF, uma adnectina, um mimético de anticorpo de arcabouço de lipocalina, um mimético de anticorpo de calixareno e um peptidomimético de ligação do tipo anticorpo, antagonista de hGM-CSF.

279. Método, de acordo com a reivindicação 278,

caracterizado pelo fato de que o receptor de hGM-CSF solúvel compreende uma proteína de fusão receptor de hGM-CSF solúvel- Fc.

280. Método caracterizado por ser usado para prevenção ou redução da ruptura da barreira hematencefálica em um indivíduo tratado com imunoterapia, o método compreendendo a administração de células CAR-T que possuem um knockout do gene de GM-CSF (células CAR-T GM-CSFk/o) ao indivíduo.

281. Método, de acordo com a reivindicação 280, caracterizado ainda por compreender a administração de um antagonista de hGM-CSF recombinante ao indivíduo.

282. Método, de acordo com a reivindicação 281, caracterizado pelo fato de que o antagonista de GM-CSF recombinante é um antagonista de hGM-CSF.

283. Método, de acordo com a reivindicação 282, caracterizado pelo fato de que o antagonista de GM-CSF recombinante é um anticorpo anti-GM-CSF.

284. Método, de acordo com a reivindicação 283, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um fragmento de anticorpo que é um Fab, um Fab', um F(ab')2, um scFv ou um dAB.

285. Método, de acordo com a reivindicação 283, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF possui uma sequência da região VH apresentada na Figura 1 e uma sequência da região VL apresentada na Figura 1.

286. Método, de acordo com a reivindicação 283, caracterizado pelo fato de que as sequências de aminoácidos da região VH ou da região VL, ou tanto da VH quanto da região VL compreendem uma metionina no terminal-N.

287. Método, de acordo com a reivindicação 282,

caracterizado pelo fato de que o antagonista de hGM-CSF é selecionado do grupo que compreende um anticorpo anti- receptor de hGM-CSF ou um receptor de hGM-CSF solúvel ou subunidade do receptor, um mimético de anticorpo de citocromo b562, um análogo do peptídeo hGM-CSF, uma adnectina, um mimético de anticorpo de arcabouço de lipocalina, um mimético de anticorpo de calixareno e um peptidomimético de ligação do tipo anticorpo.

288. Método, de acordo com a reivindicação 280, caracterizado pelo fato de que o indivíduo ainda possui uma toxicidade relacionada a CAR-T selecionada de síndrome de liberação de citocinas, neurotoxicidade, ou uma combinação destas.

289. Método, de acordo com a reivindicação 282, caracterizado pelo fato de que o antagonista de hGM-CSF é selecionado do grupo que compreende um anticorpo anti- receptor de hGM-CSF ou um receptor de hGM-CSF solúvel ou subunidade do receptor, um mimético de anticorpo de citocromo b562, um análogo do peptídeo hGM-CSF, uma adnectina, um mimético de anticorpo de arcabouço de lipocalina, um mimético de anticorpo de calixareno e um peptidomimético de ligação do tipo anticorpo.

290. Método, de acordo com a reivindicação 289, caracterizado pelo fato de que o receptor de hGM-CSF solúvel compreende uma proteína de fusão receptor de hGM-CSF solúvel- Fc.

291. Método, de acordo com a reivindicação 280, caracterizado ainda por compreender a administração das células T CAR GM-CSF K/O em combinação com um antagonista de hGM-CSF, em que o gene GM-CSF é inativado ou sofre knockout pelos métodos conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 12-25.

292. Método caracterizado por ser usado para o bloqueio ou redução da expressão de hGM-CFS em um indivíduo tratado com imunoterapia para evitar ou tratar toxicidade relacionada à imunoterapia, o método compreendendo a administração ao indivíduo de um antagonista de GM-CSF recombinante.

293. Método, de acordo com a reivindicação 292, caracterizado pelo fato de que a referida imunoterapia compreende a transferência adotiva de células, administração de anticorpos monoclonais, administração de citocinas, administração de uma vacina contra câncer, terapias de comprometimento de células T, ou qualquer combinação destas.

294. Método, de acordo com a reivindicação 293, caracterizado pelo fato de que a transferência adotiva de células compreende a administração de células T que expressam receptor de antígeno quimérico (células T CAR), células T com receptor de célula T (TCR) modificado, linfócitos infiltrantes no tumor (TIL), células natural killer com receptor de antígeno quimérico (CAR) modificado ou células dendríticas, ou qualquer combinação destas.

295. Método, de acordo com a reivindicação 292, caracterizado pelo fato de que o antagonista de GM-CSF recombinante é um antagonista de hGM-CSF.

296. Método, de acordo com a reivindicação 292, caracterizado pelo fato de que o antagonista de GM-CSF recombinante é um anticorpo anti-GM-CSF.

297. Método, de acordo com a reivindicação 292-294, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-GM-CSF se liga a um GM-CSF humano.

298. Método, de acordo com a reivindicação 296, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-GM-CSF se liga a um GM-CSF de primata.

299. Método, de acordo com a reivindicação 298, caracterizado pelo fato de que o primata é selecionado de um macaco, um babuíno, um macaco do gênero macaca, um chimpanzé, um gorila, um lêmure, um lóris, um társio, um gálago, um potto, um sifaka, um indri, um aye-ayes ou um orangotango.

300. Método, de acordo com a reivindicação 296, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-GM-CSF se liga a um GM-CSF de mamífero.

301. Método, de acordo com a reivindicação 296, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-GM-CSF é um anticorpo anti-hGM-CSF.

302. Método, de acordo com a reivindicação 301, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo monoclonal.

303. Método, de acordo com a reivindicação 301, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um fragmento de anticorpo que é um Fab, um Fab', um F(ab')2, um scFv ou um dAB.

304. Método, de acordo com a reivindicação 301, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo neutralizante de GM-CSF humano.

305. Método, de acordo com a reivindicação 301, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo recombinante ou quimérico.

306. Método, de acordo com a reivindicação 301, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF é um anticorpo humano.

307. Método, de acordo com a reivindicação 301 ou 302, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF se liga ao mesmo epítopo que 19/2 quimérico.

308. Método, de acordo com a reivindicação 301 ou 302, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF compreende a CDR3 da região VH e CDR3 da região VL de 19/2 quimérico.

309. Método, de acordo com a reivindicação 301 ou 302, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF compreende as CDR1, CDR2 e CDR3 da região VH e da região VL de 19/2 quimérico.

310. Método, de acordo com a reivindicação 301 ou 302, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região VH que compreende um determinante de especificidade de ligação à CDR3 RQRFPY ou RDRFPY, um segmento-J e um segmento-V, em que o segmento-J compreende pelo menos 95% de identidade para JH4 humano (YFD YWGQGTL VTVSS) e o segmento-V compreende pelo menos 90% de identidade para uma sequência VH1 1-02 ou VH1 1-03 da linhagem germinativa humana; ou uma região VH que compreende um determinante de especificidade de ligação à CDR3 RQRFPY.

311. Método, de acordo com a reivindicação 310, caracterizado pelo fato de que o segmento-J compreende YFDYWGQGTLVTVSS.

312. Método, de acordo com a reivindicação 310 ou 311, caracterizado pelo fato de que a CDR3 compreende RQRFPYYFDY ou RDRFPYYFDY.

313. Método, de acordo com a reivindicação 310 ou 311, caracterizado pelo fato de que a CDR1 da região VH é uma VH1

CDR1 da linhagem germinativa humana; a CDR2 da região VL é uma VH1 CDR2 da linhagem germinativa humana; ou tanto a CDR1 quanto CDR2 são de uma sequência VH1 da linhagem germinativa humana.

314. Método, de acordo com a reivindicação 310 ou 311, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma VH CDR1, ou uma VH CDR2, ou tanto uma VH CDR1 quanto uma VH CDR2, como mostrado em uma região VH apresentada na Figura 1.

315. Método, de acordo com a reivindicação 310 ou 311, caracterizado pelo fato de que a sequência do segmento-V possui uma sequência do segmento-V de VH mostrada na Figura

1.

316. Método, de acordo com a reivindicação 310 ou 311, caracterizado pelo fato de que a VH possui a sequência de VH#1, VH#2, VH#3, VH#4 ou VH#5 apresentada na Figura 1.

317. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 301-306, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região-VL que compreende uma CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos FNK ou FNR.

318. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 313-315, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região JK4 da linhagem germinativa humana.

319. Método, de acordo com a reivindicação 317 ou reivindicação 318, caracterizado pelo fato de que a CDR3 da região VL compreende QQFN(K/R)SPLT.

320. Método, de acordo com a reivindicação 319, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF compreende uma região VL que compreende uma CDR3 que compreende QQFNKSPLT.

321. Método, de acordo com a reivindicação 317, caracterizado pelo fato de que a região VL compreende uma CDR1 ou uma CDR2, ou tanto uma CDR1 quanto uma CDR2 de uma região VL mostrada na Figura 1.

322. Método, de acordo com a reivindicação 317, caracterizado pelo fato de que a região VL compreende um segmento-V que possui pelo menos 95% de identidade para a sequência do segmento-V de VKIII A27 como mostrada na Figura

1.

323. Método, de acordo com a reivindicação 317, caracterizado pelo fato de que a região VL possui a sequência de VK# 1, VK#2, VK#3 ou VK#4 apresentada na Figura 1.

324. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 301-306, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF possui um determinante de especificidade de ligação à CDR3 da região VH RQRFPY ou RDRFPY e uma região VL que possui uma CDR3 que compreende QQFNKSPLT.

325. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 301-306, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hGM-CSF possui uma sequência da região VH apresentada na Figura 1 e uma sequência da região VL apresentada na Figura 1.

326. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 301-306, caracterizado pelo fato de que as sequências de aminoácidos da região VH ou da região VL, ou tanto da VH quanto da região VL compreendem uma metionina no terminal-N.

327. Método, de acordo com a reivindicação 295, caracterizado pelo fato de que o antagonista de hGM-CSF é selecionado do grupo que compreende um anticorpo anti- receptor de hGM-CSF ou um receptor de hGM-CSF solúvel, um mimético de anticorpo de citocromo b562, um análogo do peptídeo hGM-CSF, uma adnectina, um mimético de anticorpo de arcabouço de lipocalina, um mimético de anticorpo de calixareno e um peptidomimético de ligação do tipo anticorpo.

328. Método, de acordo com a reivindicação 327, caracterizado pelo fato de que o receptor de hGM-CSF solúvel compreende uma proteína de fusão receptor de hGM-CSF solúvel- Fc.

329. Método, de acordo com a reivindicação 292, caracterizado pelo fato de que as células CAR-T são células CAR-T CD19.

330. Método, de acordo com a reivindicação 292, caracterizado pelo fato de que o bloqueio ou a redução da expressão de hGM-CFS ainda reduz a taxa de recidiva ou evita a ocorrência de recidiva do tumor no indivíduo, em que a redução da taxa de recidiva ou a prevenção da ocorrência de recidiva do tumor no indivíduo ocorre na ausência de uma incidência de toxicidade relacionada à imunoterapia.

331. Método, de acordo com a reivindicação 329, caracterizado pelo fato de que a redução da taxa de recidiva ou a prevenção da ocorrência de recidiva do tumor no indivíduo ocorre na presença de uma incidência de toxicidade relacionada à imunoterapia.

332. Método, de acordo com a reivindicação 330, caracterizado pelo fato de que a toxicidade relacionada à imunoterapia é toxicidade relacionada a CAR-T.

333. Método, de acordo com a reivindicação 331, caracterizado pelo fato de que a toxicidade relacionada a CAR-T é síndrome de liberação de citocinas, neurotoxicidade ou neuroinflamação.

334. Método, de acordo com a reivindicação 330, caracterizado pelo fato de que a ocorrência da recidiva do tumor é reduzida de 50% para 100% nos primeiros três meses de um ano após administração do antagonista de GM-CSF recombinante, comparada com a ocorrência da recidiva do tumor em um indivíduo tratado com imunoterapia e não administrado com um antagonista de GM-CSF recombinante.

335. Método, de acordo com a reivindicação 330, caracterizado pelo fato de que a ocorrência da recidiva do tumor é reduzida de 50% para 95% nos primeiros seis meses após administração do antagonista de GM-CSF recombinante.

336. Método, de acordo com a reivindicação 330, caracterizado pelo fato de que a ocorrência da recidiva do tumor é reduzida de 50% para 90% no primeiro ano após administração do antagonista de GM-CSF recombinante.

337. Método, de acordo com a reivindicação 330, caracterizado pelo fato de que a ocorrência da recidiva do tumor é evitada por longo prazo.

338. Método, de acordo com a reivindicação 330, caracterizado pelo fato de que a ocorrência da recidiva do tumor é evitada por 12-36 meses.

339. Método, de acordo com a reivindicação 292, caracterizado pelo fato de que a ocorrência da recidiva do tumor é evitada completamente (100%).

340. Método, de acordo com a reivindicação 292, caracterizado pelo fato de que o indivíduo possui leucemia linfoblástica aguda, linfoma de célula B grande difuso (DLBCL), linfoma de célula B grande mediastinal primário, linfoma de célula B de alto grau ou DLBCL decorrente de linfoma folicular.

341. Método, de acordo com a reivindicação 292, caracterizado pelo fato de que o indivíduo possui leucemia linfoblástica aguda.

342. Método, de acordo com a reivindicação 292, caracterizado ainda por compreender a administração de células T CAR GM-CSF K/O em combinação com um antagonista de hGM-CSF, em que o gene GM-CSF é inativado ou sofre knockout por métodos de inativação do gene GM-CSF ou knockout de GM- CSF (KO) em uma célula, que compreendem a edição direcionada do genoma ou silenciamento do gene GM-CSF.