BR112020018918A2 - Anticorpos anti-il-27 e usos dos mesmos - Google Patents

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Scott Chappel
Michael GLADSTONE
Bianka Prinz
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Kerry White
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Pamela M. Holland
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Abstract

a presente divulgação refere-se a anticorpos anti-il-27 e porções de ligação a antígeno dos mesmos. a divulgação também se refere a métodos para tratar ou melhorar um ou mais sintomas de uma doença, tal como um câncer, administrando os anticorpos ou porção de ligação a antígeno dos mesmos. a divulgação também se refere a métodos para detectar il-27 em, por exemplo, um indivíduo ou uma amostra.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “ANTI- CORPOS ANTI-IL-27 E USOS DOS MESMOS”.
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US 62/646.496, depositado em 22 de março de 2018, cujo conteúdo inteiro é aqui incorporado por referência.
CAMPO
[002] A presente descrição se refere geralmente a composições e métodos para modular a sinalização de I1L-27. Mais particularmente, a presente descrição se refere a composições imunogênicas (por exem- plo, anticorpos, fragmentos de anticorpos e semelhantes) que se ligam a 1L-27 e modulam a sinalização de IL-27.
FUNDAMENTOS
[003] Nos últimos anos, um crescente corpo de evidências sugere que o sistema imunológico opera como uma barreira significativa para a formação e progressão do tumor. O princípio de que existem células T de ocorrência natural com potencial ou atividade antitumoral em um pa- ciente com câncer racionalizou o desenvolvimento de abordagens imu- noterapêuticas em oncologia. As células imunológicas, como células T, macrófagos e células assassinas naturais, podem exibir atividade anti- tumoral e controlar efetivamente a ocorrência e o crescimento de tumo- res malignos. Antígenos específicos de tumor ou associados podem in- duzir células imunes a reconhecer e eliminar doenças malignas (Chen & Mellman, (2013) Immunity 39(1):1-10). Apesar da existência de res- postas imunes específicas do tumor, os tumores malignos frequente- mente evitam o ataque imune por meio de uma variedade de mecanis- mos imunomodulatórios, resultando na falha em controlar a ocorrência e progressão do tumor (Motz & Coukos, (2013) Immunity 39(1):61-730). De fato, uma marca registrada emergente do câncer é a exploração des- ses mecanismos imunomodulatórios e a desativação das respostas imunes antitumorais, resultando na evasão do tumor e na fuga da morte imunológica (Hanahan and Weinberg (2011) Cell 144(5):646-674).
[004] IL-27 é uma citocina heterodimérica, composta por duas su- bunidades (EBI3 e I1L-27p28). A 11-27 está estruturalmente relacionada às famílias de citocinas IL-12 e IL-6. A 11-27 se liga e medeia a sinaliza- ção por meio de um receptor de heterodímero que consiste em cadeias IL-27Ra (WSX1) e gp130, que medeiam a sinalização predominante- mente por STAT1 e STAT3. Os relatórios iniciais caracterizaram a IL-27 como uma citocina de intensificação imune que suporta a proliferação de células T CD4+, a diferenciação de células T auxiliares (Th) l e a produção de IF N-y, geralmente agindo em conjunto com IL-12. Estudos subsequentes mostraram que a IL-27 exibe funções imunomodulatórias complexas, resultando em efeitos pró-inflamatórios ou anti-inflamató- rios, dependendo do contexto biológico e dos modelos experimentais usados. IL-27 pode conduzir a expressão de diferentes moléculas imu- norregulatórias em células cancerígenas humanas, o que pode suportar o desarranjo local da resposta imune in vivo (Fabbi et al., (2017) Medi- ators Inflamm 3958069. Publicado online em 1 de fevereiro de 2017 doi:
10.1155/2017/3958069 e referências nele contidas).
[005] Apesar dos avanços significativos no tratamento e gerencia- mento do câncer, ainda há uma necessidade contínua de novas e efica- zes terapias para o tratamento e gerenciamento do câncer.
SUMÁRIO DA DESCRIÇÃO
[006] São divulgados aqui anticorpos, ou porções de ligação ao antígeno dos mesmos, que se ligam especificamente a e antagonizam a 11-27 humana (Interleucina 27) com alta afinidade e especificidade. Também são fornecidas moléculas de ácido nucleico que codificam as moléculas de anticorpo, vetores de expressão, células hospedeiras e métodos para produzir as moléculas de anticorpo. Também são forne-
cidas composições farmacêuticas compreendendo as moléculas de an- ticorpo. Os anticorpos anti-IL-27, ou porções de ligação ao antígeno dos mesmos, aqui divulgados podem ser usados (isoladamente ou em com- binação com outros agentes ou procedimentos terapêuticos) para tratar, prevenir e/ou diagnosticar distúrbios, incluindo distúrbios imunológicos e câncer. Assim, composições e métodos para tratamento e/ou diagnós- tico de vários distúrbios, incluindo câncer e distúrbios imunológicos, uti- lizando as moléculas de anticorpo anti-IL-27 são divulgados aqui.
[007] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo exibe pelo menos uma ou mais das seguintes propriedades: (i) se liga à IL-27 humana com uma constante de dissociação de equilíbrio (Kp) de 15 nM ou menos; (ii) bloqueia a ligação de IL-27 ao receptor de IL-27; (iii) inibe ou reduz à fosforilação de STAT1 e/ou STAT3 em uma célula; (iv) inibe ou reduz a inibição da expressão de CD161 em uma célula; (v) inibe ou reduz a expressão de PD-L1 e/ou TIM-3 em uma célula; (vi) induz ou intensifica a secreção mediada por PD-1 de uma ou mais citocinas de uma célula; e (vii) uma combinação de (i)-(vi).
[008] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, se liga à IL-27 humana com uma constante de dissociação de equilíbrio (Kp) de 15 nM ou me- nos.
[009] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, se liga à IL-27 humana recombinante ou à IL-27 murina.
[0010] Em um aspecto, a presente descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, onde o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo tem CDRs de cadeias pe- sadas e leves que são: (i) CDR1 da cadeia pesada é N-GFTFXXXX-C (SEQ ID NO: 408), CDR2 da cadeia pesada é N-ISSSXXYI-C (SEQ ID NO: 409) e a sequência de CDR3 da cadeia pesada é SEQ ID NO: 163; as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve são SEQ ID NOs: 169, 170 e 171, respectivamente; ou (ii) CDR1 da cadeia pesada é N-FTFXXXXMN-C (SEQ ID NO: 410), CDR2 da cadeia pesada é N- XISSSXXYIXYADSVKG-C (SEQ ID NO: 411) e a sequência de CDR3 da cadeia pesada é SEQ ID NO: 166; as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve são SEQ ID NOs: 172, 173 e 174, respectiva- mente.
[0011] Numa modalidade, a CDR1 da cadeia pesada é N- GFTFIS/A/RIS/RIT/NYIG/SI--C (SEQ ID NO: 412) e a CDR2 da cadeia pesada é N -ISSS[S/G]IS/A]YI-C (SEQ ID NO: 413); ou a CDR1 da ca- deia pesada é N-FTFIS/A/RYIS/RUT/YIG/SIMN-C (SEQ IDNO: 414) e à CDR2 da cadeia pesada é N-[ G/SIISSSIS/GIS/ANIILY NADSVKG-C (SEQ ID NO: 415).
[0012] Em outra modalidade, as respectivas CDRs da cadeia pe- sada e da cadeia leve são: (i) as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada são SEQ ID NOs: 161, 162 e 163, respectivamente, e as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve são SEQ ID NOs: 169, 170 e 171, respectivamente; (ii) as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada são SEQ ID NOs: 164, 165 e 166, respectivamente, e as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve são SEQ ID NOs: 172, 173 e 174, respectivamente; (iii) as sequên- cias de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada são SEQ ID NOs: 73, 74 e 75, respectivamente, e as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve são SEQ ID NOs: 81, 82 e 83, respectivamente; (iv) as se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada são SEQ ID NOs: 76,77 e 78, respectivamente, e as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve são SEQ ID NOs: 84, 85 e 86, respectivamente; (v) as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada são SEQ ID NOs: 95, 96 e 97, respectivamente, e as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve são SEQ ID NOs: 103, 104 e 105, respectiva- mente; (vi) as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada são SEQ ID NOs: 98, 99 e 100, respectivamente, e as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve são SEQ ID NOs: 106, 107 e 108, respectivamente; (vii) as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada são SEQ ID NOs: 117, 118 e 119, respectivamente, e as se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve são SEQ ID NOs: 125, 126 e 127, respectivamente; (vili) as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada são SEQ ID NOs: 120, 121 e 122, respecti- vamente, e as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve são SEQ ID NOs: 128, 129 e 130, respectivamente; (ix) as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada são SEQ ID NOs: 139, 140 e 141, respectivamente, e as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da ca- deia leve são SEQ ID NOs: 147, 148 e 149, respectivamente; (x) as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada são SEQ ID NOs: 142, 143 e 144, respectivamente, e as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve são SEQ ID NOs: 150, 151 e 152, res- pectivamente; (xi) as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada são SEQ ID NOs: 51, 52 e 53, respectivamente, e as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve são SEQ ID NOs: 59, 60 e 61, respectivamente; ou (xii) as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada são SEQ ID NOs: 54, 55 e 56, respectivamente, e as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve são SEQ ID NOs: 62, 63 e 64, respectivamente.
[0013] Outro aspecto da presente descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo inclui CDRs da ca- deia pesada e leve que são: (i) CDR1 da cadeia pesada é N-GGSFS- XYX-C (SEQ ID NO: 416), CDR2 da cadeia pesada é N-IDXSGXT-C (SEQ ID NO: 417) e CDR3 da cadeia pesada é N-ARXXXYY[X]=0- 1DSS[X]n=4-6DX-C (SEQ ID NO: 418); e CDR1 da cadeia leve é N-QXX- SXY-C (SEQ ID NO: 419), a CDR2 da cadeia leve é N-DXS-C (SEQ ID NO:420) e CDR3 da cadeia leve é N-QQXXDXPIT-C (SEQ ID NO: 421), respectivamente; ou (ii) CDR1 da cadeia pesada é N-GSFSXYXWS-C (SEQ ID NO: 422), CDR2 da cadeia pesada é N-SIDXSGXTXYNPS- LKS-C (SEQ ID NO: 423), e a sequência de CDR3 da cadeia pesada é N-ARXXXYY[Xh=0-1DSS[X hh=4-6DX-C (SEQ ID NO: 418); e CDR1 da ca- deia leve é N-KASQXXSXYLX-C (SEQ ID NO: 424), CDR2 da cadeia leve é N-DXSNXXT-C (SEQ ID NO: 425), e CDR3 cadeia leve é N- QQXXDXPIT-C (SEQ ID NO: 421), respectivamente.
[0014] Em certas modalidades, (i) a CDR1 da cadeia pesada é N- GGSFSIR/DN[E/Y]-C (SEQ ID NO: 426), a CDR2 da cadeia pesada é N-IDIW /Y ISGII/STTC (SEQ ID NO: 427), a CDR3 da cadeia pesada é N- ARID/LIP/GIM/VNYI-NIDSSIVSTGSV/DLGFIDIV/I--C (SEQ ID NO: 428); e a CDR1 de cadeia leve é NQIS/DIIV/IISIS/NIYC (SEQ ID NO: 429), a CDR2 da cadeia leve é NDIS/AJSC (SEQ ID NO: 430), e a CDR3 da cadeia leve é N-QQ[D/YIIS/D]IDIH/L]PIT-C (SEQ ID NO: 431), res- pectivamente; ou (ii) a cadeia pesada CDR1 é N-GSFS[R/DIY[E/Y MWS- C (SEQ ID NO: 432) a cadeia pesada CDR2 é N- SIDIW/YISGI[I/SITIN/EN NPSLKS-C (SEQ ID NO : 433), a cadeia pesada CDR3 é N-ARID/LIP/GIM/VVNYL-NIDSSIVSTGSV/DLGFIDIV/I--C (SEQ ID NO: 428; e a CDR1 da cadeia leve é N- [Q/R]JASQIS/DIIV/IISIS/NIY LIN/AJ-C (SEQ ID NO: 434), a CDR2 da ca- deia leve é NDIS/AJSNIR/LIA/EITC (SEQ ID NO: 435), e a cadeia leve
CDR3 é N-QQID/YIIS/DIDIH/LIPIT-C (SEQ ID NO: 431), respectiva- mente.
[0015] Em algumas modalidades, (i) as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada são SEQ ID NOs: 229, 230 e 231, respectivamente, e as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve são SEQ ID NOs: 237, 238 e 239, respectivamente; ou (ii) as se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada são SEQ ID NOs: 232, 233 e 234, respectivamente, e as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve são SEQ ID NOs: 240, 241 e 242, respectiva- mente.
[0016] Em certas modalidades, (i) as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada são SEQ ID NOs: 251, 252 e 253, respecti- vamente, e as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve são SEQ ID NOs: 259, 260 e 261, respectivamente; ou (ii) as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada são SEQ ID NOs: 254, 255 e 256, respectivamente, e as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 de ca- deia leve são SEQ ID NOs: 262, 263 e 264, respectivamente.
[0017] Outro aspecto da presente descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo inclui CDRs da ca- deia pesada e leve que são as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada SEQ ID NOs: 23,24 e 25, respectivamente, e sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve SEQ ID NOs: 26, 27 e 28, respectivamente.
[0018] Um aspecto adicional da presente descrição fornece um an- ticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo inclui CDRs das cadeias pesadas e leves que são: (i) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada SEQ ID NOs: 339, 340 e 341, respectiva- mente, e sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve SEQ ID NOs: 347, 348 e 349, respectivamente; ou (ii) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada SEQ ID NOs: 342, 343 e 344, respec- tivamente, e sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve SEQ ID NOs: 350, 351 e 352, respectivamente.
[0019] Outro aspecto da presente descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo inclui CDRs da ca- deia pesada e leve que são: (i) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada SEQ ID NOs: 185, 186 e 187, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve SEQ ID NOs: 193, 194 e 195, respectivamente; ou (ii) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada SEQ ID NOs: 188, 189 e 190, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve SEQ ID NOs: 196, 197 e 198, respectivamente.
[0020] Um aspecto adicional da presente descrição fornece um an- ticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo inclui CDRs das cadeias pesadas e leves que são: (i) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada SEQ ID NOs: 207, 208 e 209, respectiva- mente, e sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve SEQ ID NOs: 215, 216 e 217, respectivamente; ou (ii) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada SEQ ID NOs: 210, 211 e 212, respec- tivamente, e sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve SEQ ID NOs: 218, 219 e 220, respectivamente.
[0021] Um aspecto adicional da presente descrição fornece um an- ticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo inclui CDRs das cadeias pesadas e leves que são: (i) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada SEQ ID NOs: 273, 274 e 275, respectiva- mente, e sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve SEQ ID NOs: 281, 282 e 283, respectivamente; ou (ii) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada SEQ ID NOs: 276, 277 e 278, respec- tivamente, e sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve SEQ ID NOs: 284, 285 e 286, respectivamente.
[0022] Um aspecto da presente descrição fornece um anticorpo mo- noclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 hu- mana, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo inclui CDRs da cadeia pe- sada e leve que são: (i) CDR1 da cadeia pesada é N-GFTFSSYG-C (SEQ ID NO: 361), CDR2 da cadeia pesada é N-IXXDGSXK-C (SEQ ID NO: 436) e CDR3 da cadeia pesada é N-ARXAP[Xh=3-86DV-C (SEQ ID NO: 437)); e CDR1 da cadeia leve é N-QSXSSY-C (SEQ ID NO: 438), CDR2 da cadeia leve é N-XXS-C (SEQ ID NO: 439), e CDR3 da cadeia leve é N-QQXXXXP [Xl =011-C (SEQ ID NO: 440), respectivamente; ou (ii) CDR1 da cadeia pesada é N-FTFSSYGMX-C (SEQ ID NO: 441), CDR2 da cadeia pesada é N-XIXXDGSXKYYXDSVKG-C (SEQ ID NO: 442), e CDR3 da cadeia pesada é N-ARXAP [X]=3-8(SEQ ID NO: 437); e CDR1 da cadeia leve é N-RASQSXSSYLX-C (SEQ ID NO: 443) CDR2 da cadeia leve é N-[Xh=125SS[X hh=3:-4-C (SEQ ID NO: 444), e CDR3 da cadeia leve é N-QQXXXXP[Xh=0-1T-C (SEQ ID NO: 440), respectiva- mente.
[0023] Em certas modalidades (i) a CDR1 da cadeia pesada é N- GFTFSSYG-C (SEQ ID NO: 361), a CDR2 da cadeia pesada é NI [K/W] [Q/Y] DGS [E/N] KC (SEQ ID NO: 445) e a CDR3 da cadeia pesada é N-AR [D/G] AP [WDIY DYY M/EYV] DV-C (SEQ ID NO: 446); e a CDR1 da cadeia leve é N-QS [I/V] SSY-C (SEQ ID NO : 447), a CDR2 da cadeia leve é N- [A/D] [A/S] SC (SEQ ID NO: 448), e a CDR3 da cadeia leve é N-QQ [S/Y] [Y/S] [V/L] [P/Y] P [W/-] TC (SEQ ID NO: 449), respectiva- mente; ou (ii) a CDR1 da cadeia pesada é N-FTFSSYGM [S/H] -C (SEQ ID NO: 450); CDR2 da cadeia pesada é N- [N/V] | [K/W][Q/Y] DGS [E/N] KYY [V/A] DSVKG-C (SEQ ID NO: 451), e CDR3 da cadeia pesada é N- AR [D/G] AP [WDIYDYYM/EYV] DV-C (SEQ ID NO: 446); e a CDR1 da cadeia leve é N-RASQS [I/V] SSYL [N/A] -C (SEQ ID NO: 452), a CDR2 da cadeia leve é N- [AA/D] SS [LQOS/NRAT] -C (SEQ ID NO: 453), e à CDR3 da cadeia leve é N-QQ [S/Y] [(Y/S] [V/L] [P/Y] P [W/-] TC (SEQ ID NO: 449), respectivamente.
[0024] Em algumas modalidades, (i) as sequências de CDRI1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada são SEQ ID NOs: 361, 362 e 363, respectivamente, e as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve são SEQ ID NOs: 369, 370 e 371, respectivamente; ou (ii) as se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada são SEQ ID NOs: 364, 365 e 366, respectivamente, e as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve são SEQ ID NOs: 372, 373 e 374, respectiva- mente.
[0025] Em uma modalidade, (i) as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada são SEQ ID NOs: 383, 384 e 385, respectiva- mente, e as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve são SEQ ID NOs: 391, 392 e 393, respectivamente; ou (ii) as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada são SEQ ID NOs: 386, 387 e 388, respectivamente, e as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da ca- deia leve são SEQ ID NOs: 394, 395 e 396, respectivamente.
[0026] Outro aspecto da presente descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti-
corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo inclui CDRs da ca- deia pesada e leve que são: (i) CDR1 da cadeia pesada é N-GFT- FXXXX-C (SEQ ID NO: 408), CDR2 da cadeia pesada é N-IXXXXXXX- C (SEQ ID NO: 456) e CDR3 da cadeia pesada é N-AR[Xh=6-15DX-C (SEQ ID NO: 458); e CDR1 da cadeia leve é N-QS[Xh=1-35 S[X lh=0-4Y -C (SEQ ID NO: 460), CDR2 da cadeia leve é N-XXS-C (SEQ ID NO: 462), e a CDR3 da cadeia leve é N-QQXXXXP [X]=0-1]-C (SEQ ID NO: 464), respectivamente; ou (ii) CDR1 da cadeia pesada é N-FTFXXXXMX-C (SEQ ID NO: 466), CDR2 da cadeia pesada é N-KIXXXXXXXXYX- DSVKG-C (SEQ ID NO: 468), e CDR3 da cadeia pesada é N-AR[X]n=s- 15DX-C (SEQ ID NO: 470); e a CDR1 da cadeia leve é N-RASQSX- SSYLX-C (SEQ ID NO: 472), a CDR2 da cadeia leve é N-[X lh=1-25 [X Jn=0- 5-C (SEQ ID NO: 474), e a CDR3 da cadeia leve é N-QQXXXXP[X]hn=0- 11-C (SEQ ID NO: 476), respectivamente.
[0027] Em certas modalidades, (i) a CDR1 da cadeia pesada é N- GFTF [S/A/R] [S/R] [TIY] [G/S] -C (SEQ ID NO: 454), CDR2 da cadeia pesada é NI [S/K/W] [S/Q/Y] [S/D] [S/G] [S/A] [Y/E/N] [I/K] -C (SEQ ID NO: 455), e a CDR3 da cadeia pesada é N-AR [DGGRTSYTATA- HNWF/DAPWDIYDYYM/GAPEYV] D [P/V] -C (SEQ ID NO: 457); ea CDR1 da cadeia leve é N-QS [VLF/IV] SS [NNKN/-] YC (SEQ ID NO: 459), a CDR2 da cadeia leve é N- [W/A/D] [A/S] SC (SEQ ID NO: 461), e a CDR3 da cadeia leve é N-QQ [H/S/Y][A/Y/S][S/V/L][A/P/Y]P [P/W/- ]TC (SEQ ID NO: 463), respectivamente; ou (ii) a CDR1 da cadeia pe- sada é N-FTF [S/A/R] [S/R] [T/Y] [G/S] M [N/S/H] -C (SEQ ID NO: 465), a CDR2 da cadeia pesada é N- [G/S/N/V] | [S/K/MW] [S/Q/Y] [S/D] [S/G] [S/A] [IN /E/N] [I/K] [LY ] Y [V/A] DSVKG-C (SEQ ID NO: 467), e a CDR3 da cadeia pesada é N-AR [D/G] [GGRTSYTATA- HNWF/APWDIYDYYM/APEYV]D|[P/V]-C (SEQ ID NO:469); e a CDR1 da cadeia leve é N-RASQS [IV] SSYL [N/A] -C (SEQ ID NO: 471), a CDR2 da cadeia leve é N- [VA/AA/D] S [TRES/SLQS/SNRAT] -C (SEQ
ID NO: 473), e a cadeia leve CDR3 é N-QQ [H/S/Y] [A/Y/S] [S/V/L] [A/P/Y]P [PAW/-] TC (SEQ ID NO: 475), respectivamente.
[0028] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, inibe ou reduz a fosforila- ção de STAT1 e/ou STAT3 em uma célula. Em algumas modalidades, a célula é uma célula imune. Em algumas modalidades, a célula é uma célula cancerígena.
[0029] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, inibe ou reduz a inibição da expressão de CD161 em uma célula (por exemplo, melhora ou alivia a inibição da expressão de CD161 em uma célula). Em algumas moda- lidades, a célula é uma célula imune.
[0030] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, inibe ou reduz a expressão de PD-L1 e/ou TIM-3 mediada por IL-27 em uma célula. Em algumas modalidades, a expressão de PD-L1 é inibida ou reduzida. Em algumas modalidades, a expressão de TIM-3 é inibida ou reduzida. Em algumas modalidades, a expressão de PD-L1 e a expressão de TIM-3 são redu- zidas. Em algumas modalidades, a célula é uma célula imune.
[0031] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, induz ou aumenta a se- creção mediada por PD-1 de uma ou mais citocinas de uma célula. Em algumas modalidades, a uma ou mais citocinas é TNFa. Em algumas modalidades, a uma ou mais citocinas é IL-6. Em algumas modalidades, a uma ou mais citocinas é TNFa e IL-6. Em algumas modalidades, a célula é uma célula imune.
[0032] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo IgG1, IgG2 e I9G3,I9G4 e IgM e IgAl e IgA2 e IgD e IgE. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo
IgG1 ou um anticorpo I9G4. Em algumas modalidades, o anticorpo com- preende uma região constante da cadeia pesada de IgG1 do tipo selva- gem. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região constante da cadeia pesada de IgG4 de tipo selvagem. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende um domínio Fc que compreende pelo menos uma mutação. Em algumas modalidades, o anticorpo com- preende uma região constante da cadeia pesada de IgG1 mutante. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região constante da cadeia pesada de IgG4 mutante. Em algumas modalidades, a região constante da cadeia pesada de IgG4 mutante compreende qualquer uma das substituições S228P, L235E, L235A ou uma combinação dos mesmos, de acordo com à numeração da UE.
[0033] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga substancialmente ao mesmo epítopo em IL-27 que o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades acima mencionadas.
[0034] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga a pelo menos um dos resíduos de aminoácidos que compreen- dem IL-27 ligado pelo anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer um dos modalidades acima mencio- nadas.
[0035] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que uma mutação do epítopo na IL-27 ligada pelo anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo inibe, reduz ou bloqueia a ligação ao anticorpo ou antígeno porção de ligação do mesmo e ao anticorpo ou porção de ligação do antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades mencionadas acima.
[0036] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga a um epítopo na IL-27, em que o epítopo é o mesmo ou é seme- lhante ao epítopo ligado por uma molécula de anticorpo descrita na Ta- bela 12.
[0037] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende CDRs das cadeias pesada e leve selecionadas do grupo que consiste em: (1) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 51, 52 e 53, respectivamente, e sequên- cias de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 59, 60 e 61, respectivamente; (1) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 73, 74 e 75, respectivamente, e sequên- cias de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 81, 82 e 83, respectivamente; (iii) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 95, 96 e 97, respectivamente, e sequên- cias de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 103, 104 e 105, respectivamente; (iv) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 117, 118 e 119, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 125, 126 e 127, respectivamente; (v) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 139, 140 e 141, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 147, 148 e 149, respectivamente;
(vi) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 161, 162 e 163, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 169, 170 e 171, respectivamente;
(vii) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 185, 186 e 187, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 193, 194 e 195, respectivamente;
(viii) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 207, 208 e 209, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 215, 216 e 217, respectivamente;
(ix) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 229, 230 e 231, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 237, 238 e 239, respectivamente;
(x) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 251, 252 e 253, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 259, 260 e 261, respectivamente;
(xi) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 273, 274 e 275, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 281, 282 e 283, respectivamente;
(xii) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 295, 296 e 297, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 303, 304 e 305, respectivamente;
(xiii) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es-
tabelecidas nas SEQ ID NOs: 317, 318 e 319, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 325, 326 e 327, respectivamente; (xiv) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 339, 340 e 341, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 347, 348 e 349, respectivamente; (xv) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 361, 362 e 363, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 369, 370 e 371, respectivamente; e (xvi) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 383, 384 e 385, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 391, 392 e 393, respectivamente.
[0038] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou a porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende CDRs das cadeias pesada e leve, em que as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 161, 162 e 163, respectivamente, e as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da ca- deia leve são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 169, 170 e 171, respecti- vamente.
[0039] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende CDRs das cadeias pesada e leve selecionadas do grupo que consiste em:
(1) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es-
tabelecidas nas SEQ ID NOs: 54, 55 e 56, respectivamente, e sequên-
cias de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID
NOs: 62, 63 e 64, respectivamente;
(1) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es-
tabelecidas nas SEQ ID NOs: 76, 77 e 78, respectivamente, e sequên-
cias de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID
NOs: 84, 85 e 86, respectivamente;
(iii) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada estabeleci-
das nas SEQ ID NOs: 98, 99 e 100, respectivamente, e sequências de
CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs:
106, 107 e 108, respectivamente;
(iv) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es-
tabelecidas nas SEQ ID NOs: 120, 121 e 122, respectivamente, e se-
quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas
SEQ ID NOs: 128, 129 e 130, respectivamente;
(v) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es-
tabelecidas nas SEQ ID NOs: 142, 143 e 144, respectivamente, e se-
quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas
SEQ ID NOs: 150, 151 e 152, respectivamente;
(vi) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es-
tabelecidas nas SEQ ID NOs: 164, 165 e 166, respectivamente, e se-
quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas
SEQ ID NOs: 172, 173 e 174, respectivamente;
(vii) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada es-
tabelecidas nas SEQ ID NOs: 188, 189 e 190, respectivamente, e se-
quências de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas
SEQ ID NOs: 196, 197 e 198, respectivamente;
(viii) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es-
tabelecidas nas SEQ ID NOs: 210, 211 e 212, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 218, 219 e 220, respectivamente;
(ix) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 232, 233 e 234, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 240, 241 e 242, respectivamente;
(x) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 254, 255 e 256, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 262, 263 e 264, respectivamente;
(xi) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 276, 277 e 278, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 284, 285 e 286, respectivamente;
(xii) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 298, 299 e 300, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 306, 307 e 308, respectivamente;
(xiii) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 320, 321 e 322, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 328, 329 e 330, respectivamente;
(xiv) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 342, 343 e 344, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 350, 351 e 352, respectivamente;
(xv) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 364, 365 e 366, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas
SEQ ID NOs: 372, 373 e 374, respectivamente; e (xvi) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 386, 387 e 388, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 394, 395 e 396, respectivamente.
[0040] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou a porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende CDRs das cadeias pesada e leve, em que as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 164, 165 e 166, respectivamente, e as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da ca- deia leve são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 172, 173 e 174, respecti- vamente.
[0041] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende CDRs das cadeias pesadas e leves, em que as sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada são SYSMS (SEQ ID NO:23), YISYDGGSAYYPDTVKG (SEQ ID NO: 24) e HGDYDDDDAMDY (SEQ ID NO: 25), respectivamente, e em que as sequências de aminoácidos da cadeia leve CDR1, CDR2 e CDR3 são RASENIYSYLA (SEQ ID NO: 26), NAETLTE (SEQ ID NO: 27) e QHHYGTPLT (SEQ ID NO: 28), res- pectivamente.
[0042] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende regiões variáveis da cadeia pesada e leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 57, 79, 101, 123, 145, 167, 191, 213,235, 257, 279, 301,323,345, 367 e 389; e em que a região variável da cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos selecio- nada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 65, 87, 109, 131, 153, 175, 199, 221, 243, 265, 287, 309, 331, 353, 375 e 397.
[0043] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende regiões variáveis das cadeias pesada e leve compreendendo sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em: (1) SEQ ID NO: 57 e 65, respectivamente; (1) SEQ ID NO: 79 e 87, respectivamente; (iii) SEQ ID NO: 101 e 109, respectivamente; (iv) SEQ ID NO: 123 e 131, respectivamente; (v) SEQ ID NO: 145 e 153, respectivamente; (vi) SEQ ID NO: 167 e 175, respectivamente; (vii) SEQ ID NO: 191 e 199, respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 213 e 221, respectivamente; (ix) SEQ ID NO: 235 e 243, respectivamente; (x) SEQ ID NO: 257 e 265, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 279 e 287, respectivamente; (xii) SEQ ID NO: 301 e 309, respectivamente; (xiii) SEQ ID NO: 323 e 331, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 345 e 353, respectivamente; (xv) SEQ ID NO: 367 e 375, respectivamente; e (xvi) SEQ ID NO: 389 e 397, respectivamente.
[0044] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende regiões variáveis da cadeia pesada e leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos, que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 57, 79, 101, 123, 145, 167, 191, 213, 235, 257,279,301,323,345, 367 e 389; e em que a região variável da cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 65, 87, 109, 131, 153, 175, 199, 221, 243, 265, 287, 309, 331, 353, 375 e 397.
[0045] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende regiões variáveis das cadeias leve e pesada compreendendo sequências de aminoácidos pelo menos 90% idênticas às sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em: (1) SEQ ID NO: 57 e 65, respectivamente; (1) SEQ ID NO: 79 e 87, respectivamente; (iii) SEQ ID NO: 101 e 109, respectivamente; (iv) SEQ ID NO: 123 e 131, respectivamente; (v) SEQ ID NO: 145 e 153, respectivamente; (vi) SEQ ID NO: 167 e 175, respectivamente; (vii) SEQ ID NO: 191 e 199, respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 213 e 221, respectivamente; (ix) SEQ ID NO: 235 e 243, respectivamente; (x) SEQ ID NO: 257 e 265, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 279 e 287, respectivamente; (xii) SEQ ID NO: 301 e 309, respectivamente;
(xiii) SEQ ID NO: 323 e 331, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 345 e 353, respectivamente; (xv) SEQ ID NO: 367 e 375, respectivamente; e (xvi) SEQ ID NO: 389 e 397, respectivamente.
[0046] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende regiões variáveis das cadeias leve e pesada compreendendo sequências ácidas estabelecidas na SEQ ID NO: 167 e 175, respectivamente.
[0047] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende regiões variáveis das cadeias leve e pesada compreendendo sequências de aminoácidos pelo menos 90% idênticas às sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NO: 167 e 175, respectivamente.
[0048] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 67, 89, 111, 133, 155, 177, 201, 223, 245, 267, 289, 311, 333, 355, 377 e 399; e em que a cadeia leve compreende uma sequên- cia de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 69, 91, 113, 135, 157, 179, 203, 225, 247, 269, 291, 313, 335, 357, 379 e 401.
[0049] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno ao mesmo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à se- quência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 67, 89, 111, 133, 155, 177, 201, 223, 245, 267, 289, 311, 333, 355, 377 e 399; e em que a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoáci- dos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 69, 91, 113, 135, 157, 179, 203, 225, 247, 269, 291, 313, 335, 357, 379 e 401.
[0050] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 71, 93, 115, 137, 159, 181, 205, 227, 249, 271, 293, 315, 337, 359, 381 e 403; e em que a cadeia leve compreende uma sequên- cia de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 69, 91, 113, 135, 157, 179, 203, 225, 247, 269, 291, 313, 335, 357, 379 e 401.
[0051] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno ao mesmo compreende uma cadeia pesada e uma leve, em que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 71,93, 115, 137, 159, 181, 205, 227, 249, 271, 293, 315, 337, 359, 381 e 403; e em que a cadeia leve compreende uma sequência de aminoá- cidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos se- lecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 69, 91, 113, 135, 157, 179, 203, 225, 247, 269, 291, 313, 335, 357, 379 e 401.
[0052] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve compreendendo sequências de ami- noácidos selecionadas do grupo que consiste em: (1) SEQ ID NO: 67 e 69, respectivamente; (1) SEQ ID NO: 89 e 91, respectivamente; (iii) SEQ ID NO: 111 e 113, respectivamente; (iv) SEQ ID NO: 133 e 135, respectivamente; (v) SEQ ID NO: 155 e 157, respectivamente; (vi) SEQ ID NO: 177 e 179, respectivamente; (vii) SEQ ID NO: 201 e 203, respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 223 e 225, respectivamente; (ix) SEQ ID NO: 245 e 247, respectivamente; (x) SEQ ID NO: 267 e 269, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 289 e 291, respectivamente; (xii) SEQ ID NO: 311 e 313, respectivamente; (xiii) SEQ ID NO: 333 e 335, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 355 e 357, respectivamente; (xv) SEQ ID NO: 377 e 379, respectivamente; e (xvi) SEQ ID NO: 399 e 401, respectivamente.
[0053] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve compreendendo sequências de ami- noácidos pelo menos 90% idênticas às sequências de aminoácidos se- lecionadas do grupo que consiste em: (1) SEQ ID NO: 67 e 69, respectivamente; (1) SEQ ID NO: 89 e 91, respectivamente; (iii) SEQ ID NO: 111 e 113, respectivamente; (iv) SEQ ID NO: 133 e 135, respectivamente; (v) SEQ ID NO: 155 e 157, respectivamente; (vi) SEQ ID NO: 177 e 179, respectivamente; (vii) SEQ ID NO: 201 e 203, respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 223 e 225, respectivamente; (ix) SEQ ID NO: 245 e 247, respectivamente; (x) SEQ ID NO: 267 e 269, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 289 e 291, respectivamente; (xii) SEQ ID NO: 311 e 313, respectivamente; (xiii) SEQ ID NO: 333 e 335, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 355 e 357, respectivamente; (xv) SEQ ID NO: 377 e 379, respectivamente; e (xvi) SEQ ID NO: 399 e 401, respectivamente.
[0054] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada e uma leve compreendendo sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em: (1) SEQ ID NO: 71 e 69, respectivamente; (1) SEQ ID NO: 93 e 91, respectivamente; (iii) SEQ ID NO: 115 e 113, respectivamente; (iv) SEQ ID NO: 137 e 135, respectivamente; (v) SEQ ID NO: 159 e 157, respectivamente;
(vi) SEQ ID NO: 181 e 179, respectivamente; (vii) SEQ ID NO: 205 e 203, respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 227 e 225, respectivamente; (ix) SEQ ID NO: 249 e 247, respectivamente; (x) SEQ ID NO: 271 e 269, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 293 e 291, respectivamente; (xii) SEQ ID NO: 315 e 313, respectivamente; (xiii) SEQ ID NO: 337 e 335, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 359 e 357, respectivamente; (xv) SEQ ID NO: 381 e 379, respectivamente; e (xvi) SEQ ID NO: 403 e 401, respectivamente.
[0055] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada e uma leve compreendendo sequências de aminoácidos pelo menos 90% idênticas às sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em: (1) SEQ ID NO: 71 e 69, respectivamente; (1) SEQ ID NO: 93 e 91, respectivamente; (iii) SEQ ID NO: 115 e 113, respectivamente; (iv) SEQ ID NO: 137 e 135, respectivamente; (v) SEQ ID NO: 159 e 157, respectivamente; (vi) SEQ ID NO: 181 e 179, respectivamente; (vii) SEQ ID NO: 205 e 203, respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 227 e 225, respectivamente; (ix) SEQ ID NO: 249 e 247, respectivamente; (x) SEQ ID NO: 271 e 269, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 293 e 291, respectivamente; (xii) SEQ ID NO: 315 e 313, respectivamente;
(xiii) SEQ ID NO: 337 e 335, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 359 e 357, respectivamente; (xv) SEQ ID NO: 381 e 379, respectivamente; e (xvi) SEQ ID NO: 403 e 401, respectivamente.
[0056] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve compreendendo sequências ácidas estabelecidas na SEQ ID NO: 177 e 179, respectivamente.
[0057] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve compreendendo sequências de ami- noácidos pelo menos 90% idênticas às sequências de aminoácidos es- tabelecidas nas SEQ ID NO: 177 e 179, respectivamente.
[0058] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada e uma leve compreendendo sequências ácidas estabe- lecidas na SEQ ID NO: 181 e 179, respectivamente.
[0059] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve compreendendo sequências de ami- noácidos pelo menos 90% idênticas às sequências de aminoácidos es- tabelecidas nas SEQ ID NO: 181 e 179, respectivamente.
[0060] Em algumas modalidades, a descrição fornece um método para inibir ou reduzir a fosforilação de STAT1 e/ou STAT3 em uma cé- lula, o método compreendendo contatar a célula com um anticorpo mo- noclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, fornecido pela descrição, em que o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, inibe ou reduz a fosforilação de STAT1 e/ou STAT3 em uma célula.
[0061] Em algumas modalidades, a descrição fornece um método para inibir ou reduzir a inibição mediada por IL-27 da expressão de CD161 em uma célula, o método compreendendo contatar a célula com um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, fornecido pela descrição, em que o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno, inibe ou reduz a inibição da expressão de CD161 em uma célula.
[0062] Em algumas modalidades, a descrição fornece um método para inibir ou reduzir a expressão mediada por IL-27 de expressão de PD-L1 e/ou TIM-3 em uma célula, o método compreendendo contatar a célula com um anticorpo monoclonal isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, fornecido pela descrição, em que o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, inibe a expressão de PD- L1 e/ou TIM-3 em uma célula.
[0063] Em algumas modalidades, a descrição fornece um método para induzir ou intensificar a secreção de uma ou mais citocinas de uma célula, o método compreendendo contatar a célula com o anticorpo mo- noclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, fornecido pela descrição, em que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, induz ou intensifica a secreção mediada por PD-1 de uma ou mais citocinas de uma célula.
[0064] Em algumas modalidades, a descrição fornece um método para estimular uma resposta imune em um sujeito, o método compreen- dendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente à e antagoniza I1L27 humana, fornecido pelo descrição ou uma composição farmacêutica compreendendo o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo e um transportador farmaceuticamente aceitável.
[0065] Em algumas modalidades, a descrição fornece um método de tratamento de um câncer em um sujeito, o método compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclo- nal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente à e antagoniza IL27, fornecido pela descrição, ou uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou porção de |i- gação ao antígeno do mesmo e um transportador farmaceuticamente aceitável.
[0066] Em algumas modalidades, a descrição fornece um método para estimular uma resposta imune, ou tratamento de um câncer em um sujeito, o método compreendendo administrar ao sujeito uma quanti- dade eficaz de um anticorpo monoclonal isolado, ou fragmento de liga- ção ao antígeno, fornecido pela descrição, ou uma composição farma- cêutica compreendendo o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo e um transportador farmaceuticamente aceitável, em que o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, ou a composi- ção farmacêutica, inibe ou reduz a fosforilação de STAT1 e/ou STAT3 em uma célula, estimulando assim a resposta imune, ou o tratamento do câncer.
[0067] Em algumas modalidades, a descrição fornece um método para estimular uma resposta imune, ou tratamento de um câncer em um sujeito, o método compreendendo administrar ao sujeito uma quanti-
dade eficaz de um anticorpo monoclonal isolado, ou fragmento de liga- ção ao antígeno, fornecido pela descrição, ou uma composição farma- cêutica que compreende o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo e um transportador farmaceuticamente aceitável, em que o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, ou a composi- ção farmacêutica, inibe ou reduz a inibição mediada por IL-27 da ex- pressão de CD161 em uma célula, estimulando assim a resposta imune ou o tratamento do câncer.
[0068] Em algumas modalidades, a descrição fornece um método para estimular uma resposta imune, ou tratamento de um câncer em um sujeito, o método compreendendo administrar ao sujeito uma quanti- dade eficaz de um anticorpo monoclonal isolado, ou fragmento de liga- ção ao antígeno, fornecido pela descrição, ou uma composição farma- cêutica compreendendo o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo e um transportador farmaceuticamente aceitável, em que o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, ou a composi- ção farmacêutica, inibe ou reduz a expressão mediada por IL-27 da ex- pressão de PD-L1 e/ou TIM-3 em uma célula, estimulando assim a res- posta imune ou o tratamento do câncer.
[0069] Em algumas modalidades, a descrição fornece um método para estimular uma resposta imune, ou tratamento de um câncer em um sujeito, o método compreendendo administrar ao sujeito uma quanti- dade eficaz de um anticorpo monoclonal isolado, ou fragmento de liga- ção ao antígeno, fornecido pela descrição, ou uma composição farma- cêutica que compreende o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo e um transportador farmaceuticamente aceitável, em que o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, ou a composi- ção farmacêutica, induz ou intensifica a secreção mediada por PD-1 de uma ou mais citocinas de uma célula, estimulando assim a resposta imune ou o tratamento do câncer.
[0070] Em algumas modalidades, o câncer é escolhido entre câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de células não pequenas), sarcoma, câncer de testículo, câncer de ovário, câncer de pâncreas, câncer de mama (por exemplo, câncer de mama triplo negativo), mela- noma (incluindo, por exemplo, melanoma uveal, etc.), câncer de cabeça e pescoço (por exemplo, câncer de cabeça e pescoço), câncer colorre- tal, câncer de bexiga, câncer de endométrio, câncer de próstata, câncer de tireoide, carcinoma hepatocelular, câncer de estômago, câncer de cérebro, linfoma (por exemplo, DL- BCL), leucemia (por exemplo, AML) ou câncer renal (por exemplo, carcinoma de células renais, por exemplo, carcinoma de células claras renais).
[0071] Em algumas modalidades, a descrição fornece um método de tratamento de câncer em um sujeito, o método compreendendo ad- ministrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga a e antagoniza a IL-27, fornecido pela descrição, em combinação com um ou mais procedimentos ou agentes terapêutico adicionais, em que o se- gundo procedimento ou agente terapêutico é selecionado do grupo que consiste em: uma quimioterapia, uma terapia anticâncer direcionada, in- cluindo, por exemplo, inibidores de tirosina cinase (TKIs), um fármaco oncolítico, um agente citotóxico, uma terapia imunobaseada, uma cito- cina, procedimento cirúrgico, um procedimento de radiação, um ativador de uma molécula coestimulatória, um inibidor de uma molécula inibitó- ria, uma vacina ou uma imunoterapia celular, ou uma combinação dos mesmos.
[0072] Em algumas modalidades, o um ou mais agentes terapêuti- cos adicionais é um antagonista de PD-1, um inibidor de PD-L1, um ini- bidor de TIM-3, um inibidor de LAG-3, um inibidor de TIGIT, um inibidor de CD112R, um inibidor de TAM, um agonista de STING, um agonista de 4-1BB ou uma combinação dos mesmos.
[0073] Em algumas modalidades, o um ou mais agentes terapêuti- cos adicionais é um antagonista de PD-1. Em algumas modalidades, o antagonista de P D-1 é selecionado do grupo que consiste em: PDRO001, nivolumabe, pembrolizumabe, pidilizumabe, MEDIO680, REGN2810, TSR-042, PF-O06801591 e AMP-224.
[0074] Em certas modalidades, o um ou mais agentes terapêuticos adicionais é um inibidor de PD-L1. Em algumas modalidades, o inibidor de PD-L1 é selecionado do grupo que consiste em: FAZO53, Atezolizu- mabe, Avelumabe, Durvalumabe e BMS-936559. Em algumas modali- dades, a descrição fornece um método para intensificar uma ou mais atividades de um anticorpo anti-P D-1 (por exemplo, intensifica a secre- ção de citocinas mediada por P D-1; intensifica a secreção de TNFa me- diada por anti-P D-1; intensifica a secreção de IL-6 mediada por anti-P D- 1 a partir de uma célula exposta a anticorpos anti-PD-1), o método com- preendendo expor uma célula a um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, fornecido pela descrição, simultaneamente ou se- quencialmente a um anti-PD-1 para melhorar uma ou mais atividades do anticorpo anti-PD1.
[0075] Em certas modalidades, a presente descrição fornece uma composição farmacêutica que inclui um anticorpo anti-P D-1 e/ou um an- ticorpo anti-PD-L1 e um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo conforme divulgado neste documento (por exemplo, um anti- corpo anti-IL- 27), e um transportador farmaceuticamente aceitável.
[0076] Em uma modalidade relacionada, a presente descrição for- nece um kit que inclui um anticorpo anti-PD-1 e/ou um anticorpo anti- PD-L1, e um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo conforme divulgado neste documento (por exemplo, um anticorpo anti- IL- 27), para administração simultânea ou sequencial, e instruções para seu uso.
[0077] Em algumas modalidades, um ou mais agentes terapêuticos adicionais é um inibidor TIM-3, opcionalmente em que o inibidor TIM-3 é MGB453 ou TSR-022.
[0078] Em algumas modalidades, o um ou mais agentes terapêuti- cos adicionais é um inibidor de LAG-3, opcionalmente em que o inibidor de LAG-3 é selecionado do grupo que consiste em LAG525, BMS- 986016 e TSR-033.
[0079] Em algumas modalidades, o um ou mais agentes terapêuti- cos adicionais é um inibidor de TIGIT. Em algumas modalidades, o um ou mais agentes terapêuticos adicionais é um inibidor de CD112R. Em algumas modalidades, o um ou mais agentes terapêuticos adicionais é um inibidor de TAM (Axl, Mer, Tyro). Em algumas modalidades, o um ou mais agentes terapêuticos adicionais é um agonista de STING. Em al- gumas modalidades, o um ou mais agentes terapêuticos adicionais é um agonista 4-1BB.
[0080] Em algumas modalidades, a descrição fornece um método de detecção de IL-27 em uma amostra de um sujeito, o método compre- endendo (a) contatar uma amostra do sujeito com um anticorpo de de- tecção sob condições para permitir que o anticorpo de detecção forme um complexo anticorpo de detecção-lL-27, se IL-27 estiver presente na amostra, em que o anticorpo de detecção é um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, fornecido pela descrição; e (b) de- tectar a presença do complexo, se houver, produzido na etapa (a).
[0081] Em algumas modalidades, a descrição fornece um método para detectar um câncer associado à IL-27 em um sujeito, o método compreendendo as etapas de: (a) contatar uma amostra de um sujeito suspeito de ter um câncer associado à IL-27 com um anticorpo de de- tecção sob condições para permitir que o anticorpo de detecção forme um complexo anticorpo de detecção-lL-27, se IL-27 estiver presente na amostra, em que o anticorpo de detecção é um anticorpo ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, fornecido pela descrição; e (b) de- tectar a presença do complexo, se houver, produzido na etapa (a). Em algumas modalidades, o anticorpo de detecção é acoplado a um mar- cador detectável. Em algumas modalidades, o método compreende ainda contatar a amostra com um anticorpo de captura para produzir um complexo compreendendo IL-27 e o anticorpo de captura, se IL-27 esti- ver presente na amostra, em que o anticorpo de captura é um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, fornecido pela descrição.
[0082] Em algumas modalidades, o anticorpo de detecção ou o an- ticorpo de captura compreende CDRs da cadeia pesada e leve, em que as sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pe- sada são SYSMS (SEQ ID NO: 23), YISTYDGGSAYYPDTVKG (SEQ ID NO: 24) e HGDYDDDDAMDY (SEQ ID NO: 25), respectivamente, e em que as sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve são RASENIYSYLA (SEQ ID NO: 26), NAETLTE (SEQ ID NO: 27) e QHHYGTPLT (SEQ ID NO: 28), respectivamente.
[0083] Em algumas modalidades, o anticorpo de detecção ou o an- ticorpo de captura compreende regiões variáveis da cadeia pesada e leve compreendendo sequências de aminoácidos estabelecidas em SEQ ID NO: 1e SEQ ID NO: 3, respectivamente.
[0084] Em algumas modalidades, o anticorpo de captura é imobili- zado em um suporte sólido. Em algumas modalidades, a amostra é con- tatada com o anticorpo de captura antes do anticorpo de detecção. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de fluido corporal. Em algumas modalidades, a amostra de fluido é sangue, soro, plasma, lisa- dos celulares ou lisados de tecido.
[0085] Em algumas modalidades, o câncer é selecionado de carci- noma de células renais (RCC), carcinoma hepatocelular (HCC), câncer de pulmão, câncer gastroesofágico, câncer de ovário, câncer de endo- métrio, melanoma, leucemia e linfoma. Em algumas modalidades, o câncer é carcinoma de células renais (RCC). Em outras modalidades, o câncer é carcinoma hepatocelular (HCC). Em algumas modalidades, o câncer é selecionado de leucemia e linfoma. Em algumas modalidades, o câncer é leucemia mieloide aguda (AML). Definições
[0086] Os termos usados nas reivindicações e no relatório descritivo são definidos conforme estabelecido abaixo, a menos que especificado de outra forma.
[0087] Deve ser notado que, tal como utilizado no relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem referências plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário.
[0088] Como utilizado neste documento, "cerca de" será entendido por pessoas versadas na técnica e variará até certo ponto, dependendo do contexto em que é usado. Se existirem usos do termo que não são claros para os versadas, dado o contexto no qual ele é utilizado, "cerca de" significará até mais ou menos 10% do valor particular.
[0089] Como utilizado neste documento, o termo "agonista" refere- se a qualquer molécula que parcialmente ou totalmente promove, induz, aumenta e/ou ativa uma atividade biológica de um polipeptídeo nativo aqui “divulgado. —Moléculas agonistis adequadas incluem especificamente anticorpos agonistas ou fragmentos de anticorpos, fragmentos ou variantes de sequência de aminoácidos de polipeptídeos, peptídeos ou proteínas nativos. Em algumas modalidades, a ativação na presença do agonista é observada de uma maneira dependente da dose. Em algumas modalidades, o sinal medido (por exemplo, atividade biológica) é pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%,
pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 100% mais alto do que o sinal medido com um controle negativo sob condições comparáveis. Também aqui divulgados, são métodos para identificar agonistas adequados para uso nos métodos da descrição. Por exemplo, esses métodos incluem, mas não estão limitados a, ensaios de ligação, como ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), sistemas Forte BioO e radioimunoensaio (RIA). Esses ensaios determinam a capacidade de um agonista de se ligar ao polipeptídeo de interesse (por exemplo, um receptor ou ligando) e, portanto, indicam a capacidade do agonista de promover, aumentar ou ativar a atividade do polipeptídeo. A eficácia de um agonista também pode ser determinada usando ensaios funcionais, como a capacidade de um agonista de ativar ou promover a função do polipeptídeo. Por exemplo, um ensaio funcional pode compreender contatar um polipeptídeo com uma molécula agonista candidata e medir uma alteração detectável em uma ou mais atividades biológicas normalmente associadas ao polipeptídeo. A potência de um agonista é geralmente definida pelo seu valor de EC5o (concentração necessária para ativar 50% da resposta do agonista). Quanto mais baixo for o valor de EC5o, maior será a potência do agonista e menor será a concentração necessária para ativar a resposta biológica máxima.
[0090] Como utilizado neste documento, o termo "varredura de alanina" refere-se a uma técnica usada para determinar a contribuição de um resíduo de tipo selvagem específico para a estabilidade ou função(ões) (por exemplo, afinidade de ligação) de determinada proteína ou polipeptídeo. A técnica envolve substituir um resíduo de alanina por um resíduo do tipo selvagem em um polipeptídeo, seguido de uma avaliação da estabilidade ou função(ões) (por exemplo, afinidade de ligação) do derivado substituído pela alanina ou polipeptídeo mutante e comparação com o polipeptídeo de tipo selvagem. Técnicas para substituir a alanina por um resíduo do tipo selvagem em um polipeptídeo são conhecidas na técnica.
[0091] O termo "melhoria" refere-se a qualquer resultado terapeuticamente benéfico no tratamento de um estado de doença, por exemplo, câncer, incluindo profilaxia, diminuição da gravidade ou progressão, remissão ou cura da mesma.
[0092] Como utilizado neste documento, o termo "aminoácido" refere-se a aminoácidos naturais e sintéticos, bem como análogos de aminoácidos e miméticos de aminoácidos que funcionam de maneira semelhante aos aminoácidos naturais. Os aminoácidos de ocorrência natural são aqueles codificados pelo código genético, bem como os aminoácidos que são modificados posteriormente, por exemplo, hidroxiprolina, y-carboxiglutamato e O-fosfoserina. Análogos de aminoácidos referem-se a compostos que possuem a mesma estrutura química básica que um aminoácido natural, isto é, um carbono que está ligado a um hidrogênio, um grupo carboxil, um grupo amino e um grupo R, por exemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina e metil sulfônio. Tais análogos têm grupos R modificados (por exemplo, norleucina) ou estruturas peptídicas modificadas, mas retêm a mesma estrutura química básica que um aminoácido de ocorrência natural. Os miméticos de aminoácidos referem-se a compostos químicos que possuem uma estrutura diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funcionam de maneira semelhante a um aminoácido de ocorrência natural.
[0093] Os aminoácidos podem ser aqui referidos pelos seus símbolos de três letras vulgarmente conhecidos ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica
IUPAC-IUB. Os nucleotídeos, da mesma forma, podem ser referidos por seus códigos de letra única comumente aceitos.
[0094] Como utilizado neste documento, uma "substituição de aminoácido" refere-se à substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido “existente em uma sequência de aminoácidos predeterminada (uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de partida) por um segundo resíduo de aminoácido de "substituição" diferente. Uma "inserção de aminoácido" refere-se à incorporação de pelo menos um aminoácido adicional em uma sequência predeterminada de aminoácidos. Enquanto a inserção geralmente consiste na inserção de um ou dois resíduos de aminoácidos, "inserções peptídicas" maiores também podem ser feitas, por exemplo, inserção de cerca de três a cerca de cinco ou até dez, quinze ou vinte resíduos de aminoácidos. O(s) resíduo(s) inserido(s) pode(m) ocorrer naturalmente ou não naturalmente, conforme divulgado acima. Uma "deleção de aminoácidos" refere-se à remoção de pelo menos um resíduo de aminoácido de uma sequência predeterminada de aminoácidos.
[0095] Como utilizado neste documento, o termo "quantidade" ou "nível" é usado no sentido mais amplo e refere-se a uma quantidade, concentração ou abundância de uma substância (por exemplo, um me- tabólito, uma molécula pequena, uma proteína, um mMRNA, um marca- dor). Ao se referir a um metabólito ou molécula pequena (por exemplo, uma fármaco), os termos "quantidade", "nível" e "concentração" são ge- ralmente usados de forma intercambiável e geralmente se referem a uma quantidade detectável em uma amostra biológica. "Níveis eleva- dos" ou "níveis aumentados" refere-se a um aumento na quantidade, concentração ou abundância de uma substância dentro de uma amostra em relação a uma amostra de controle, como um indivíduo ou indivíduos que não sofrem da doença ou distúrbio (por exemplo, câncer) ou um controle interno. Em algumas modalidades, o nível elevado de uma substância (por exemplo, um fármaco) em uma amostra refere-se a um aumento na quantidade da substância de cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% em relação à quanti- dade da substância em uma amostra de controle, conforme determinado pelas técnicas conhecidas na técnica (por exemplo, HPLC). "Níveis re- duzidos" refere-se a uma diminuição na quantidade, concentração ou abundância de uma substância (por exemplo, um fármaco) em um indi- víduo em relação a um controle, como um indivíduo ou indivíduos que não sofrem da doença ou distúrbio (por exemplo, câncer) ou um controle interno. Em algumas modalidades, um nível reduzido é pouca ou ne- nhuma quantidade, concentração ou abundância detectável. Em algu- mas modalidades, o nível reduzido de uma substância (por exemplo, um fármaco) em uma amostra refere-se a uma diminuição na quantidade da substância de cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% em relação à quantidade da substância em uma amostra de controle, conforme determinado pelas técnicas conhe- cidas na técnica (por exemplo, HPLC).
[0096] Ao se referir a uma proteína, MRNA ou marcador, como os descritos aqui, os termos "nível de expressão" ou "nível de expressão" em geral são usados de forma intercambiável e geralmente se referem a uma quantidade detectável de uma proteína, MRNA ou marcador em uma amostra biológica. Em alguns aspectos, uma quantidade detectá- vel ou nível detectável de uma proteína, MRNA ou um marcador está associado a uma probabilidade de resposta a um agente, como os aqui descritos. "Expressão" geralmente se refere ao processo pelo qual as informações contidas em um gene são convertidas nas estruturas (por exemplo, um marcador de proteína, como PD-L1) presente e operando na célula. Portanto, como utilizado neste documento, "expressão" pode se referir à transcrição para um polinucleotídeo, tradução para um poli- peptídeo ou mesmo modificações no polinucleotídeo e/ou polipeptídeo (por exemplo, modificação pós-tradução de um polipeptídeo). Fragmen- tos do polinucleotídeo transcrito, do polipeptídeo traduzido ou modifica- ções de polinucleotídeo e/ou polipeptídeo (por exemplo, modificação pós-tradução de um polipeptídeo) também devem ser considerados ex- pressos se originam de um transcrito gerado por emenda alternativa ou transcrito degradado ou de um processamento pós-tradução do polipep- tídeo, por exemplo, por proteólise. "Genes expressos" incluem aqueles que são transcritos em um polinucleotídeo como mMRNA e depois tradu- zidos em um polipeptídeo e também aqueles que são transcritos em RNA, mas não traduzidos em um polipeptídeo (por exemplo, RNAs de transferência e ribossômicos). “Expressão elevada”, “níveis elevados de expressão” ou “níveis elevados” refere-se a uma expressão aumentada ou níveis aumentados de uma substância dentro de uma amostra em relação a uma amostra de controle, como um indivíduo ou indivíduos que não sofrem da doença ou distúrbio (por exemplo, câncer) ou um controle interno.
Em algumas modalidades, a expressão elevada de uma substância (por exemplo, um marcador de proteína, como PD-L1) em uma amostra refere-se a um aumento na quantidade da substância de cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% em relação à quantidade da substância em uma amostra de controle, conforme determinado pelas técnicas conhecidas na téc- nica (por exemplo, FACS). "Expressão reduzida", "níveis reduzidos de expressão" ou "níveis reduzidos" refere-se a uma redução da expressão ou níveis reduzidos de uma substância (por exemplo, um marcador de proteína) em um indivíduo em relação a um controle, como um indivíduo ou indivíduos que são estão sofrendo da doença ou distúrbio (por exem-
plo, câncer) ou um controle interno. Em algumas modalidades, a expres- são reduzida é pouca ou nenhuma expressão. Em algumas modalida- des, a expressão reduzida de uma substância (por exemplo, um marca- dor de proteína) em uma amostra refere-se a uma redução na quanti- dade da substância de cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% em relação à quantidade da substância em uma amostra de controle, conforme determinado pelas técnicas co- nhecidas na técnica (por exemplo, FACS).
[0097] Como utilizado neste documento, o termo "angiogênese" ou "neovascularização" refere-se ao processo pelo qual novos vasos san- guíneos se desenvolvem a partir de vasos pré-existentes (Varner et al,, (1999) Angiogen. 3:53-60; Mousa et al., (2000) Angiogen. Stim. Inhib. 35:42-44; Kim et al., (2000) Amer. /. Path. 156:1345-1362; Kim et al., (2000) /. Biol. Chem. 275:33920-33928; Kumar et al. (2000) Angiogen- esis: From Molecular to Integrative Pharm. 169-180). Células endoteliais de vasos sanguíneos pré-existentes ou de células-tronco endoteliais cir- culantes (Takahashi et al., (1995) Nat Med. 5:434-438; |Isner et al., (1999) ) . Clin. Invest. 103:1231-1236) tornam-se ativados para migrar, proliferar e se diferenciar em estruturas com lúmens, formando novos vasos sanguíneos, em resposta ao fator de crescimento ou estímulos hormonais, ou condições de hipóxia ou isquêmica. Durante a isquemia, como ocorre no câncer, a necessidade de aumentar a oxigenação e o aporte de nutrientes aparentemente induz a secreção de fatores angio- gênicos pelo tecido afetado; esses fatores estimulam a formação de no- vos vasos sanguíneos. Vários termos adicionais estão relacionados à angiogênese.
[0098] Como utilizado neste documento, o termo "antagonista" re- fere-se a qualquer molécula que bloqueia, inibe ou neutraliza parcial ou totalmente uma atividade biológica de um polipeptídeo nativo aqui divul- gado.
Moléculas antagonistas adequadas incluem especificamente an- ticorpos antagonistas ou fragmentos de anticorpos, fragmentos ou vari- antes de sequência de aminoácidos de polipeptídeos, peptídeos ou pro- teínas nativas.
Em algumas modalidades, a inibição na presença do an- tagonista é observada de uma maneira dependente da dose.
Em algu- mas modalidades, o sinal medido (por exemplo, atividade biológica) é pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 100% mais baixo do que o sinal medido com um controle negativo sob condições comparáveis.
Também aqui divulgados, são métodos para identificar antagonistas adequados para uso nos métodos da descrição.
Por exemplo, esses métodos incluem, mas não estão limitados a, ensaios de ligação, tais como ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), sistemas Forte BioO, radioimunoensaio (RIA), ensaio de Descoberta de Meso Scale (por exemplo, Meso Scale Discovery Electrochemiluminescence ( MSD- ECL) e ensaio Luminexº com base em esferas.
Estes ensaios determi- nam a capacidade de um antagonista de se ligar ao polipeptídeo de in- teresse (por exemplo, um receptor ou ligando) e, portanto, indicam a capacidade do antagonista de inibir, neutralizar ou bloquear a atividade do polipeptídeo.
A eficácia de um antagonista também pode ser deter- minada utilizando ensaios funcionais, como a capacidade de um anta- gonista de inibir a função do polipeptídeo ou de um agonista.
Por exem- plo, um ensaio funcional pode compreender contatar um polipeptídeo com uma molécula antagonista candidata e medir uma alteração detec- tável em uma ou mais atividades biológicas normalmente associadas ao polipeptídeo. A potência de um antagonista geralmente é definida pelo seu valor ICso (concentração necessária para inibir 50% da resposta do agonista). Quanto mais baixo for o valor de IC5o, maior será a potência do antagonista e menor será a concentração necessária para inibir a resposta biológica máxima.
[0099] Como utilizado neste documento, a frase "anticorpo que an- tagoniza a I1L-27 humana, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo" refere-se a um anticorpo que antagoniza pelo menos uma ati- vidade reconhecida pela técnica da I1L-27 humana (por exemplo, ativi- dade biológica da IL-27 e/ou via(s) a jusante mediada pela sinalização de IL-27 ou outra função mediada por IL-27), por exemplo, relacionada a uma diminuição (ou redução) na atividade de IL-27 humana que é pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais. Exemplos adicionais de atividades biológicas de 11-27 e/ou via(s) a ju- sante mediadas por sinalização de IL-27 ou outra função mediada por IL-27 são descritos em detalhes adicionais abaixo e em outros lugares aqui.
[00100] “Como utilizado neste documento, o termo "anticorpo antago- nista anti-IL-27" (denominado indistintamente "anticorpo anti-IL-27") re- fere-se a um anticorpo que se liga especificamente à I1L-27 e inibe a atividade biológica de IL-27 e/ou via(s) a jusante mediada por sinaliza- ção de IL-27 ou outra função mediada por IL-27. Um anticorpo antago- nista anti-IL-27 abrange anticorpos que bloqueiam, antagonizam, supri- mem, inibem ou reduzem uma atividade biológica de I1L-27 (por exem- plo, ligação a ligando, atividade enzimática), incluindo vias a jusante me- diadas pela sinalização ou função de IL-27, como ligação a receptores e/ou indução de uma resposta celular a IL-27 ou seus metabólitos. Em algumas modalidades, um anticorpo antagonista anti-IL-27 fornecido pela descrição se liga à IL-27 humana e evita, bloqueia ou inibe a liga- ção da IL-27 humana ao seu receptor cognato ou normal (por exemplo, receptor IL-27), ou uma ou mais subunidades de receptor (por exemplo, gp130 e/ou IL-27Ra (também conhecido como WSX1/TCCR)). Em al- gumas modalidades, o anticorpo antagonista anti-IL-27 previne, blo- queia ou inibe a ligação de IL-27 humana ao gp130. Em algumas mo- dalidades, o anticorpo antagonista anti-IL-27 impede, bloqueia ou inibe a ligação da I1L-27 humana à IL-27Ra.
Em algumas modalidades, o an- ticorpo antagonista anti-IL-27 previne, bloqueia ou inibe a dimerização de monômeros de IL-27. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IL- 27 se liga especificamente ao monômero EBI3. Em algumas modalida- des, o anticorpo anti-IL-27 se liga especificamente ao monômero |IL- 27p28. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IL-27 se liga especi- ficamente a ambos os monômeros IL-27. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IL-27 se liga especificamente a um epítopo não contíguo compreendendo EBI3 e P28. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IL-27 inibe ou reduz a fosforilação de STAT1 e/ou STAT3 em uma célula.
Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IL-27 inibe ou reduz a inibição da expressão de CD161 em uma célula (por exemplo, melhora ou alivia a inibição mediada por IL-27 da expressão de CD161 em uma célula). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IL-27 inibe ou reduz a expressão de PD-L1 e/ou TIM-3 em uma célula.
Em algumas modali- dades, o anti-IL-27 induz ou intensifica a secreção mediada por PD-1 de uma ou mais citocinas de uma célula.
Em algumas modalidades, um anticorpo antagonista anti-IL-27 se liga à IL-27 humana e estimula ou intensifica uma resposta antitumoral.
Em algumas modalidades, o anti- corpo antagonista anti-IL-27 se liga à IL-27 humana com uma afinidade de 15nM ou menos.
Em algumas modalidades, o anticorpo antagonista anti-IL-27 se liga à IL-27 humana e compreende uma região constante da cadeia pesada de IgG1 de tipo selvagem ou mutante ou uma região constante da cadeia pesada de IgG4 de tipo selvagem ou mutante. Exemplos de anticorpos antagonistas anti-IL-27 são fornecidos aqui.
[00101] “Como utilizado neste documento, o termo "anticorpo" refere- se a um anticorpo inteiro compreendendo dois polipeptídeos de cadeia leve e dois polipeptídeos de cadeia pesada. Anticorpos inteiros incluem diferentes isótipos de anticorpos, incluindo anticorpos IgM, IgG, IgA, IgD e IgE. O termo "anticorpo" inclui um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimerizado ou quimérico, um anticorpo hu- manizado, um anticorpo primatizado, um anticorpo desimunizado e um anticorpo totalmente humano. O anticorpo pode ser produzido ou deri- vado de qualquer uma de uma variedade de espécies, por exemplo, ma- míferos como seres humanos, primatas não humanos (por exemplo, orangotango, babuínos ou chimpanzés), cavalos, gado, porcos, ove- lhas, cabras, cães, gatos, coelhos, porquinhos da índia, gerbos, hams- ters, ratos e camundongos. O anticorpo pode ser um anticorpo purifi- cado ou recombinante. Como utilizado neste documento, o termo "frag- mento de anticorpo", "fragmento de ligação ao antígeno" ou termos se- melhantes se referem a um fragmento de um anticorpo que retém a ca- pacidade de se ligar a um antígeno-alvo (por exemplo, IL-27) e inibe a atividade do antígeno-alvo. Tais fragmentos incluem, por exemplo, um anticorpo de cadeia única, um fragmento Fv de cadeia única (scFv), um fragmento Fd, um fragmento Fab, um fragmento F ab' ou um fragmento F(ab')2. Um fragmento scFv é uma cadeia polipeptídica única que inclui as regiões variáveis da cadeia pesada e leve do anticorpo a partir do qual o scFv é derivado. Além disso, intracorpos, minicorpos, triacorpos e diacorpos também estão incluídos na definição de anticorpo e são compatíveis para uso nos métodos aqui descritos. Ver, por exemplo, Todorovska et al., (2001) /. Immunol. Methods 248(1):47-66; Hudson and Kortt, (1999) /|. Immunol. Methods 231(1):177-189; Poljak, (1994) Structure 2(12):1121-1123; Rondon and Marasco, (1997) Annu. Rev.
Microbiol. 51:257-283, cujas descrições são incorporadas aqui por refe- rência na sua totalidade.
[00102] “Como utilizado neste documento o termo "fragmento de an- ticorpo" também inclui, por exemplo, anticorpos de domínio único, como anticorpos de domínio único camelizados. Ver, por exemplo, Muylder- mans et al., (2001) Trends Biochem. Sci. 26:230-235; Nuttall et al. (2000) Curr. Pharm. Biotech. 1:253-263; Reichmann et al., (1999) /. Immunol. Meth. 231:25-38; publicação de pedido PCT WO 94/04678 e WO 94/25591; e patente US 6.005.079, todos os quais são incorporados aqui por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, a des- crição fornece anticorpos de domínio único compreendendo dois domí- nios VH com modificações de modo que os anticorpos de domínio único sejam formados.
[00103] Em algumas modalidades, um fragmento de ligação ao antí- geno inclui a região variável de um polipeptídeo de cadeia pesada e a região variável de um polipeptídeo de cadeia leve. Em algumas modali- dades, um fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito compreende as CDRs do polipeptídeo da cadeia leve e da cadeia pesada de um an- ticorpo.
[00104] O termo "célula apresentadora de antígeno" ou "APC"é uma célula que exibe antígeno estranho complexado com MHC em sua su- perfície. As células T reconhecem esse complexo usando o receptor de células T (TCR). Exemplos de APCs incluem, entre outras, células B, células dendríticas (DCs), células mononucleares do sangue periférico (PBMC), monócitos (como THP-1), células linfoblastoides B (como CI1IR.A2, 1518 B- LCL) e células dendríticas derivadas de monócitos (DCs). Algumas APCs internalizam antígenos por fagocitose ou por en- docitose mediada por receptor.
[00105] O termo "apresentação de antígeno" refere-se ao processo pelo qual APCs capturam antígenos e permitem seu reconhecimento por células T, por exemplo, como um componente de um conjugado MHC-I e/ou MHC-II.
[00106] Como utilizado neste documento, o termo "apoptose" refere- se ao processo de morte celular programada que ocorre em organismos multicelulares (por exemplo, humanos). Os eventos bioquímicos e mo- leculares altamente regulados que resultam em apoptose podem levar a alterações morfológicas observáveis e características de uma célula, incluindo bolha da membrana, encolhimento do volume celular, conden- sação e fragmentação cromossômica do DNA e deterioração do MRNA. Um método comum para identificar células, incluindo células T, em apo- ptose é expor as células a uma proteína conjugada com fluoróforo (ane- xina V). A anexina V é comumente usada para detectar células apoptó- ticas por sua capacidade de se ligar à fosfatidilserina no folheto externo da membrana plasmática, que é um indicador precoce de que a célula está passando pelo processo de apoptose.
[00107] Como utilizado neste documento, o termo "célula B" (alterna- tivamente "linfócito B") refere-se a um tipo de glóbulo branco do subtipo de linfócito. As células B funcionam no componente da imunidade hu- moral do sistema imunológico adaptativo, secretando anticorpos. As cé- lulas B também apresentam antígeno e secretam citocinas. As células B, ao contrário das outras duas classes de linfócitos, células T e células assassinas naturais, expressam receptores de células B (BCRs) em sua membrana celular. Os BCRs permitem que a célula B se ligue a um antígeno específico, contra o qual iniciará uma resposta de anticorpo.
[00108] Como utilizado neste documento, o termo "liga-se à IL-27 imobilizada", refere-se à capacidade de um anticorpo da descrição de se ligar à IL-27, por exemplo, expressa na superfície de uma célula ou que está ligada a um suporte sólido.
[00109] “Como utilizado neste documento, o termo "anticorpo biespe- cífico" ou "bifuncional" refere-se a um anticorpo híbrido artificial com dois pares diferentes de cadeia pesada/leve e dois sítios de ligação diferen- tes. Anticorpos biespecíficos podem ser produzidos por uma variedade de métodos incluindo fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab”. Ver, por exemplo, Songsivilai & Lachmann, (1990) Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelhy et al., (1992) /. Immunol. 148:1547-
1553.
[00110] Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos é baseada na coexpressão de dois pares de cadeia pe- sada/cadeia leve de imunoglobulina, em que os dois pares cadeia pe- sada/cadeia leve têm especificidades diferentes (Milstein and Cuello, (1983) Nature 305:537-539). Os domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinação anticorpo- antígeno) podem ser fundidos com sequências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão da região variável da cadeia pesada é prefe- rencialmente com um domínio constante da cadeia pesada de imuno- globulina, incluindo pelo menos parte das regiões de dobradiça, CH2 e CH3. Para obter mais detalhes sobre métodos ilustrativos atualmente conhecidos por gerar anticorpos biespecíficos, consulte, por exemplo, Suresh et al., (1986) Methods Enzymol. 121:210; Publicação PCT WO 96/27011; Brennan et al., (1985) Science 229:81; Shalaby etal.,/. Exp. Med. (1992) 175:217-225; Kostelhy et al, (1992) /. Immunol. 148(5):1547-1553; Hollinger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Gruber et al., (1994) /. Immunol. 152:5368; and Tutt et al., (1991) /. Immunol. 147:60. Os anticorpos biespecíficos também in- cluem anticorpos reticulados ou heteroconjugados. Os anticorpos hete- roconjugados podem ser produzidos usando quaisquer métodos conve- nientes de reticulação. Agentes de reticulação adequados são bem co- nhecidos na técnica e são divulgados na Pat. US 4.676.980, juntamente com várias técnicas de reticulação.
[00111] Várias técnicas para fazer e isolar fragmentos de anticorpos biespecíficos diretamente da cultura de células recombinantes também foram descritas. Por exemplo, anticorpos biespecíficos foram produzi- dos usando zíperes de leucina. Ver, por exemplo, Kostelny et al. (1992) J Immunol! 148(5):1547-1553. Os peptídeos de zíper de leucina das pro- teínas Fos e J un podem ser ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes por fusão genética. Os homodímeros de anticorpos podem ser reduzidos na região de dobradiça para formar monômeros e depois reoxidados para formar os heterodímeros de anticorpos. Este método também pode ser utilizado para a produção de homodímeros de anticor- pos. A tecnologia "diacorpo" descrita por Hollinger et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90: 6444-6448 proporcionou um mecanismo alternativo para produzir fragmentos de anticorpos biespecíficos. Os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) por um ligante que é muito curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma ca- deia. Por conseguinte, os domínios VH e VL de um fragmento são for- çados a emparelhar com os domínios complementares VL e VH de outro fragmento, formando assim dois sítios de ligação ao antígeno. Outra es- tratégia para produzir fragmentos de anticorpos biespecíficos pelo uso de dímeros de cadeia simples de Fv (scFv) também foi relatada. Ver, por exemplo, Gruber et al. (1994) | Immunol 152:5368. Alternativa- mente, os anticorpos podem ser "anticorpos lineares", conforme descrito em, por exemplo, Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10):1057-1062. Resumidamente, estes anticorpos compreendem um par de segmentos Fd em tandem (VH-CH1-VH-CH1) que formam um par de regiões de ligação ao antígeno. Os anticorpos lineares podem ser biespecíficos ou monoespecíficos.
[00112] Anticorpos com mais de duas valências (por exemplo, anti- corpos triespecíficos) são contemplados e descritos em, por exemplo, Tutt et al. (1991) | Immunol 147:60.
[00113] A descrição também abrange formas variantes de anticorpos multiespecíficos, como as moléculas de imunoglobulina de domínio va- riável duplo (DVD-lg) descritas em Wu et al. (2007) Nat Biotechnol 25(11): 1290-1297. As moléculas de DVD-lg são projetadas de modo que dois domínios variáveis da cadeia leve (VL) diferentes de dois anti- corpos parentais diferentes sejam ligados em tandem diretamente ou através de um ligante curto por técnicas de DNA recombinante, segui- das pelo domínio constante da cadeia leve. Do mesmo modo, a cadeia pesada compreende dois domínios variáveis da cadeia pesada (VH) di- ferentes ligados em tandem, seguidos pelo domínio constante CH1 e região Fc. Os métodos para produzir moléculas de DVD-lg a partir de dois anticorpos parentais são ainda descritos em, por exemplo, Publica- ção PCT WO 08/024188 e WO 07/024715. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico é uma imunoglobulina Fabs-in-Tandem, na qual a região variável da cadeia leve com uma segunda especificidade é fun- dida à região variável da cadeia pesada de um anticorpo inteiro. Tais anticorpos são descritos em, por exemplo, Publicação de Pedido de P a- tente Internacional WO 2015/103072.
[00114] Como utilizado neste documento, "antígeno de câncer" ou "antígeno de tumor" refere-se a (i) antígenos específicos de tumores, (ii) antígenos associados a tumores, (iii) células que expressam antígenos específicos de tumores, (iv) células que expressam antígenos associados a tumores, (v) antígenos embrionários em tumores, (vi) células tumorais autólogas, (vii) antígenos de membrana específicos de tumores, (viii) antígenos de membrana associados a tumores, (ix) receptores de fatores de crescimento, (x) ligantes de fatores de crescimento, e (xi) qualquer outro tipo de antígeno ou célula ou material apresentador de antígeno que esteja associado a um câncer.
[00115] Como utilizado neste documento, o termo "resposta imune específica de câncer" refere-se à resposta imune induzida pela presença de tumores, células cancerígenas ou antígenos do câncer. Em certas modalidades, a resposta inclui a proliferação de linfócitos específicos do antígeno do câncer. Em certas modalidades, a resposta inclui expressão e suprarregulação de anticorpos e receptores de células T e a formação e liberação de linfocinas, quimiocinas e citocinas. Tanto o sistema imunológico inato quanto o adquirido interagem para iniciar respostas antigênicas contra tumores, células cancerígenas ou antígenos do câncer. Em certas modalidades, a resposta imune específica do câncer é uma resposta das células T.
[00116] O termo "carcinoma" é reconhecido na técnica e refere-se a neoplasias de tecidos epiteliais ou endócrinos, incluindo carcinomas do sistema respiratório, carcinomas do sistema gastrointestinal, carcino- mas do sistema geniturinário, carcinomas testiculares, carcinomas da mama, carcinomas prostáticos, carcinomas do sistema endócrino e me- lanomas. Os anticorpos anti-IL-27 aqui descritos podem ser usados para tratar pacientes que têm, que são suspeitos de ter, ou que podem estar em alto risco de desenvolver qualquer tipo de câncer, incluindo carci- noma renal ou melanoma, ou qualquer doença viral. Carcinomas exem- plificativos incluem aqueles formados a partir de tecido do colo do útero, pulmão, próstata, mama, cabeça e pescoço, cólon e ovário. O termo também inclui carcinossarcomas, que incluem tumores malignos com- postos por tecidos carcinomatosos e sarcomatosos. Um "adenocarci- noma" refere-se a um carcinoma derivado de tecido glandular ou no qual as células tumorais formam estruturas glandulares reconhecíveis.
[00117] Como utilizado neste documento, o termo "CD112R" refere- se a um membro de proteínas do tipo receptor de poliovírus e é um re- ceptor coinibitório de células T humanas. O CD112R é expresso prefe- rencialmente nas células T e inibe os sinais mediados pelos receptores das células T. CD112, amplamente expresso em células apresentado- ras de antígeno e células tumorais, é o ligando para CD112R. CD112R compete com CD226 para se ligar a CD112. A interrupção da interação CD112R — CD112 intensifica a resposta das células T humanas. CD112R como um novo ponto de verificação para células T humanas via interação com CD112. Como utilizado neste documento, o termo "inibidor de CD112R" refere-se a um agente que interrompe, bloqueia ou inibe a função ou atividade biológica de CD112R.
[00118] Como utilizado neste documento, o termo "CD137" (alterna- tivamente "4-1BB'") refere-se a um membro da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral (TNF). 4-1BB é uma molécula de ponto de verificação imune coestimulatória, principalmente para células T ativa- das. A reticulação de CD137 intensifica a proliferação de células T, a secreção de IL-2, a sobrevida e a atividade citolítica. Como utilizado neste documento, o termo "agonista de 4-1BB" se refere a um agente que estimula, induz ou aumenta uma ou mais funções de 4-1BB. Um agonista 4-1BB exemplificativo é Utomilumabe (PF-05082566), um an- ticorpo monoclonal I9G2 totalmente humano que direciona esse 4-1BB para estimular células T.
[00119] Como utilizado neste documento, o termo "CD161" (alterna- tivamente conhecido como subfamília B do receptor do tipo lectina de célula assassina, membro 1 (KLRB1); NK1.1 ou NKR-P1A) refere-se a um membro da superfamília de lectina do tipo C. CD161 é um marcador de células T e a expressão de CD161 foi associada à infiltração de cé- lulas T no microambiente do tumor para vários tipos diferentes de cân- cer. O CD161 é ainda descrito em Fergusson et al., (2014) Cell Reports 9 (3): 1075-1088, que é aqui incorporado por referência em sua totali- dade.
[00120] Como utilizado neste documento, o termo "IL-27" ou "inter- leucina 27" refere-se à citocina IL-27. A 11-27 está relacionada às famí- lias de citocinas IL-6/IL-12 e é uma citocina heterodimérica que compre- ende uma primeira subunidade conhecida como Gene 3 Induzido pelo
Vírus E pstein-Barr (EBI3; também conhecida como subunidade B da IL- 27 e |L- 27B) e uma segunda subunidade conhecida como IL-27p28 (também conhecida como IL30, subunidade a de IL-27 e IL-27A). A IL- 27 é predominantemente sintetizada por células ativadoras de antígeno, incluindo monócitos, células endoteliais e células dendríticas (Jan- kowski et al. (2010) Arch Immunol. Ther. Exp. 58:417-425, Diakowski et al. (2013) Adv. Clin. Exp. Med. (2013) 22(5): 683-691). Embora a IL-27 possa ter efeitos pró-inflamatórios, muitos estudos sugerem um papel importante da IL-27 como agente imunossupressor (Shimizu et al. (2006) J. Immunol. 176:7317-7324, Hisada et al. (2004) Cancer Res. 64:1152-1156, Diakowski (2013) supra). Embora tenha sido inicialmente descrita como um fator que promove a iniciação de respostas Th1, des- cobriu-se posteriormente que a IL-27 desempenha uma função supres- sora de células T limitando respostas Th1, inibindo a diferenciação de células Th2 e Th17 e regulando o desenvolvimento de Tr1 e outras po- pulações de células T regulatórias (Dietrich et al. (2014) J. Immunol. 192:5382-5389). Além de seu papel como imunorregulatório, a IL-27 também regula angiogênese, hematopoiese e osteocalstogênese (Id.).
[00121] AlL-27 sinaliza através de um receptor de citocina tipo | he- terodimérico (o receptor IL-27 ou IL-27R) que compreende uma primeira subunidade conhecida como WSX1 (também conhecida como subuni- dade a do receptor IL-27, IL-27RA, receptor de citocinas de células T Tipo 1 (TCCR) e Receptor de citocina do tipo 1 (CRL1)) e uma segunda subunidade conhecida como gp130 (também conhecida como transdu- tor de sinal de interleucina-6 (ILEST), subunidade de receptor de inter- leucina-6 B (IL-6RB) e receptor de oncostatina M). A gp130 também é uma subunidade receptora para as citocinas da família IL-6 (Liu et al. (2008) Scan.) . Immunol. 68:22-299, Diakowski (2013) supra). A sinali- zação de IL-27 por meio de IL-27R ativa múltiplas cascatas de sinaliza- ção, incluindo as vias J AK-STAT e p38 MAPK.
[00122] Acredita-se também que EBI3 tenha funções biológicas in- dependentes de p28 ou do heterodímero de IL-27. Por exemplo, EBI3 também interage com p35 para formar a citocina heterodimérica IL-35 (Yoshida et al. (2015) Annu. Rev Immunol. 33:417-43) e mostrou ser seletivamente superexpresso em certos tipos de células sem um au- mento correspondente em p28 ou IL-27 (Larousserie et al. (2005) Am. J. Pathol. 166(4):1217-28).
[00123] Uma sequência de aminoácidos de uma proteína humana EBI3 exemplificativa é fornecida na SEQ ID NO: 698 (Sequência de Re- ferência NCBI: NP 005746.2; N-MTPQLLLALVLWASCPPCSGRKG- PPAALTLPRVQCRASRYPIAVDCSWTLPPAPNSTSPVS-
FIATYRLGMAARGHSWPCLQQTPTSTSCTITOVQLFSMAPYVLNVTA VHPWGSSSSFVPFITEHIIKPDPPEGVRLSPLAER- QLQVQWEPPGSWPFPEIFS-
LKYWIRYKRQGAARFHRVGPIEATSFILRAVRPRARYYVQVAAQDLT DYGELSDWSLPATATMSLGK-C). Uma sequência de aminoácidos de uma proteína humana p28 exemplificativa é fornecida na SEQ ID NO: 699 (Sequência de Referência NCBI: NP 663634.2; N-MGQTAGDL- GWRLSLLLLPLLLVQAGVWGFPRPPGRPQLSLQELRREFTVS- LHLARKLLSE-
VRGQAHRFAESHLPGVNLYLLPLGEQLPDVSLTFQAWRRLSDPERL CFISTTLQPFHALLGGLGTQGRWTNMERMQLWAMRLDLRDLQRHL- RFQVLAAGFNLPEE-
EEEEEEEEEEERKGLLPGALGSALQGPAQVSWPQLLSTYRLLHSLEL VLSRAVRELLLLSKAGHSVWPLGFPTLSPQP-C). Uma sequência de aminoácidos de uma proteína WSX1 humana exemplificativa é forne- cida na SEQ ID NO: 700 (Sequência de Referência NCBI: NP 004834.1; N-MRGGRGAPFWLWPLPKLALLPLLWVLFQR- TRPQGSAGPLQCYGVGPLGDLNCSWEPLGDLGA-
PSELHLOSQKYRSNKTQTVAVAAGRSWVAIPREQLTMSDKLLVWGT KAGQPLWPPVFVNLETQMKPNAPRLGPDVDFSEDDPLEATVHWAP- PTW- PSHKVLICQFHYRRCQEAAWTLLEPELKTIPLTPVEIQDLELATGYKVY GRCRMEKEEDLWGEWSPILSFQTPPSAPKDVWVSGNLCGTPGGEE- PLLLWKAPG- PCVQVSYKVWFWVGGRELSPEGITCCCSLIPSGAEWARVSAVNATS WEPLTNLSLVCLDSASAPRSVAVSSIAGSTELLVTWQPGPGE- PLEHVVDWARDGD- PLEKLNWVRLPPGNLSALLPGNFTVGVPYRITVTAVSASGLASASSV WGFREELAPLVGPTLWRLQDAPPGTPAIAWGEVPRHQL- RGHLTHYTLCAQSGTSPSVCMN- VSGNTQSVTLPDLPWGPCELWVTASTIAGQGPPGPILRLHLPDNTLR WKVLPGILFLWGLFLLGCGLSLATSGRCYHLRHKVLPRWVWEKVPD- PANSSSGQPHMEQVPE-
AQPLGDLPILEVEEMEPPPVMESSQPAQATAPLDSGYEKHFLPTPEE LGLLGPPRPQVLA-C). Uma sequência de aminoácidos de uma prote- Ína gp130 humana exemplificativa é fornecida na SEQ ID NO: 701 (Se- quência de Referência NCBI: NP 002175.2; N-MLTLQTWLVQALFI- FLTTESTGELLDPCGYISPESPVVQLHSNFTAVCVLKEK-
CMDYFHVNANYIVWKTNHFTIPKEQYTIINRTASSVTFTDIASLNIQLTC NILTFGQLEQNVYGITIISGLPPEKPKNLSCIVNEGKKMRCEWD- GGRETHLETNFTLKSE- WATHKFADCKAKRDTPTSCTVDYSTVYFVNIEVWVEAENALGKVTSD HINFDPVYKVKPNPPHNLSVINSEELSSILKLTWTNPSIKSVIILKYNI- QYRTK- DASTWSQIPPEDTASTRSSFTVQDLKPFTEYVFRIRCMKEDGKGYWS DWSEEASGITYEDRPSKAPSFWYKIDPSHTQGYRTVQLVWKTL- PPFEANGKILDYEVTLTRW- KSHLQNYTVNATKLTVNLTNDRYLATLTVRNLVGKSDAAVLTIPACDF QATHPVMDLKAFPKDNMLWVEWTTPRESVKKYILEWCVLSDKAP- CITDOWQQEDGTVHRTYL- RGNLAESKCYLITVTPVYADGPGSPESIKAYLKQAPPSKGPTVRTKKV GKNEAVLEWDQLPVDVQNGFIRNYTIFYRTIIGNETAVNVY- DSSHTEYTLSSLTSDTLYMVR- MAAYTDEGGKDGPEFTFTTPKFAQGEIEAIVVPVCLAFLLTTLLGVLF CFNKRDLIKKHIWPNVPDPSKSHIAQWSPHTPPRHNFNSKDQMYSD- GNFTDVSVVEIEANDK- KPFPEDLKSLDLFKKEKINTEGHSSGIGGSSCMSSSRPSISSSDENES SQNTSSTVQYSTVVHSGYRHQVPSVQVFSRSESTQPLLDSEER- PEDLQLVDHVDGGDGILPR- QQYFKQNCSQHESSPDISHFERSKQVSSVNEEDFVRLKQQISDHISQ SCGSGQMKMFQEVSAADAFGPGTEGQVERFETVGMEAATDEG- MPKSYLPQTVRQGGYMPQ-C).
[00124] Como utilizado neste documento, o termo "competir", quando usado no contexto de proteínas de ligação ao antígeno (por exemplo, imunoglobulinas, anticorpos fragmentos de ligação ao antí- geno dos mesmos) que competem pela ligação ao mesmo epítopo, re- fere-se a uma interação entre proteínas de ligação ao antígeno determi- nadas por um ensaio (por exemplo, um ensaio de ligação competitiva; um ensaio de bloqueio cruzado), em que uma proteína de ligação ao antígeno de teste (por exemplo, um anticorpo de teste) inibe (por exem- plo, reduz ou bloqueia) a ligação específica de um antígeno de uma pro- teína de ligação ao antígeno (por exemplo, um anticorpo de referência) a um antígeno comum (por exemplo, IL-27 ou um fragmento do mesmo).
[00125] Uma sequência de polipeptídeo ou aminoácido "derivada de" um polipeptídeo ou proteína designada refere-se à origem do polipeptídeo. De preferência, a sequência de polipeptídeo ou aminoácido que é derivada de uma sequência específica tem uma sequência de aminoácidos que é essencialmente idêntica àquela sequência ou uma porção da mesma, em que a porção consiste em pelo menos 10-20 aminoácidos, preferencialmente pelo menos 20- 30 aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos 30-50 aminoácidos, ou que de outro modo é identificável por um versado na técnica como tendo sua origem na sequência. Os polipeptídeos derivados de outro peptídeo podem ter uma ou mais mutações em relação ao polipeptídeo inicial, por exemplo, um ou mais resíduos de aminoácidos que foram substituídos por outro resíduo de aminoácido ou que tem uma ou mais inserções ou deleções de resíduos de aminoácidos.
[00126] Um polipeptídeo pode compreender uma sequência de aminoácidos que não ocorre naturalmente. Tais variantes têm necessariamente menos de 100% de identidade ou semelhança de sequência com a molécula inicial. Em certas modalidades, a variante terá uma sequência de aminoácidos de cerca de 75% a menos que 100% de identidade ou similaridade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de partida, mais preferencialmente de cerca de 80% a menos que 100%, mais de preferência de cerca de 85% a menos que 100%, mais preferen- cialmente de cerca de 90% a menos que 100% (por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) e mais preferencialmente de cerca de 95% a menos que 100%, por exemplo, ao longo do comprimento da molécula variante.
[00127] Em certas modalidades, há uma diferença de aminoácidos entre uma sequência polipeptídica inicial e a sequência derivada da mesma. A identidade ou semelhança com relação a essa sequência é aqui definida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos na sequência candidata que são idênticos (isto é, o mesmo resíduo) com os resíduos de aminoácidos iniciais, depois de alinhar as sequências e introduzir folgas, se necessário, para alcançar a identidade de sequência percentual máxima. Em certas modalidades, um polipeptídeo consiste em, consiste essencialmente em ou compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de uma sequência estabelecida na Tabela 12. Em certas modalidades, um polipeptídeo inclui uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada de uma sequência estabelecida na Tabela 12. Em certas modalidades, um polipeptídeo inclui uma sequência de aminoácidos contígua pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos contígua selecionada de uma sequência estabelecida na Tabela 12. Em certas modalidades, um polipeptídeo inclui uma sequência de aminoácidos com pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400 ou 500 (ou qualquer número inteiro dentro desses números) aminoácidos contíguos de uma sequência de aminoácidos selecionada de uma sequência estabelecida na Tabela 12.
[00128] Em certas modalidades, os anticorpos da descrição são codificados por uma sequência nucleotídica. As sequências nucleotídicas da invenção podem ser úteis para várias aplicações, incluindo clonagem, terapia genética, expressão e purificação de proteínas, introdução de mutação, vacinação de DNA de um hospedeiro em necessidade do mesmo, geração de anticorpos para, por exemplo, imunização passiva, PCR, iniciador e geração de sonda e semelhantes. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica da invenção compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em, uma sequência nucleotídica selecionada de uma sequência estabelecida na Tabela 12. Em certas modalidades, uma sequência nucleotídica inclui uma sequência nucleotídica pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,
97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência nucleotídica selecionada de uma sequência estabelecida na Tabela 12. Em certas modalidades, uma sequência nucleotídica inclui uma sequência nucletídica contígua pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência nucleotídica contígua selecionada de uma sequência estabelecida na Tabela 12. Em certas modalidades, uma sequência nucleotídica inclui uma sequência nucleotídica com pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400 ou 500 (ou qualquer número inteiro dentro desses números) nucleotídeos contíguos de uma sequência nucleotídica selecionada de uma sequência estabelecida na Tabela 12.
[00129] Também será entendido por um versado na técnica que os anticorpos adequados para uso nos métodos divulgados neste documento podem ser alterados de modo que variem em sequência das sequências naturais ou nativas das quais foram derivadas, mantendo a atividade desejável das sequências nativas. Por exemplo, podem ser feitas substituições de nucleotídeos ou aminoácidos que levam a substituições conservadoras ou alterações em resíduos de aminoácidos "não essenciais". As mutações podem ser introduzidas por técnicas padrão, tais como mutagênese dirigida ao sítio e mutagênese mediada por PCR.
[00130] Os anticorpos adequados para uso nos métodos aqui divulgados podem compreender substituições conservadoras de aminoácidos em um ou mais resíduos de aminoácidos, por exemplo, em resíduos de aminoácidos essenciais ou não essenciais. Uma "substituição conservativa de aminoácidos" é aquela em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral semelhante. As famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica, incluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais apolares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína) prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais ramificadas por beta (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Assim, um resíduo de aminoácido não essencial em um polipeptídeo de ligação é de preferência substituído por outro resíduo de aminoácido da mesma família de cadeias laterais. Em certas modalidades, uma coluna de aminoácidos pode ser substituída por uma coluna estruturalmente semelhante que difere na ordem e/ou composição dos membros da família da cadeia lateral. Alternativamente, em certas modalidades, mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo de toda ou parte de uma sequência de codificação, como por mutagênese por saturação, e os mutantes resultantes podem ser incorporados nos polipeptídeos de ligação da invenção e rastreados quanto à sua capacidade de se ligar ao alvo desejado.
[00131] Como utilizado neste documento, o termo "apresentação cruzada" de antígeno refere-se à apresentação de antígenos proteicos exógenos a células T por meio de moléculas MHC classe | e classe Il em APCs.
[00132] Como utilizado neste documento, o termo "reação cruzada" refere-se à capacidade de um anticorpo da descrição de se ligar à IL-27 de uma espécie diferente. Por exemplo, um anticorpo da presente des- crição que se liga à IL-27 humana também pode se ligar a outras espé- cies de I1L-27. Como utilizado neste documento, a reatividade cruzada é medida detectando uma reatividade específica com antígeno purificado em ensaios de ligação (por exemplo, SPR, ELISA) ou ligando a, ou in- teragindo funcionalmente com células que expressam fisiologicamente IL-27. Os métodos para determinar a reatividade cruzada incluem en- saios de ligação padrão, como descrito aqui, por exemplo, por análise por ressonância plasmônica de superfície (SPR) Biacore"" utilizando um instrumento Biacore"" 2000 SPR (Biacore AB, Uppsala, Sweden), ou técnicas de citometria de fluxo.
[00133] Como utilizado neste documento, o termo "resposta de linfó- citos T citotóxicos (CTL)" refere-se a uma resposta imune induzida por células T citotóxicas. As respostas de CTL são mediadas principalmente por células T CD8*.
[00134] Como utilizado neste documento, o termo "célula dendrítica" ou "DC" refere-se ao tipo de células apresentadoras de antígeno que são leucócitos derivados da medula óssea (BM) e são o tipo mais po- tente de células apresentadoras de antígeno. As DCs são antígenos de captura e processo, convertendo proteínas em peptídeos que são apre- sentados nas moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) reconhecidas pelas células T. DCs são heterogêneas, por exem- plo, DCs mieloides e plasmocitoides; embora todas as DCs sejam ca- pazes de captação, processamento e apresentação de antígenos em células T ingênuas, os subtipos de DC têm marcadores distintos e dife- rem em localização, vias migratórias, função imunológica detalhada e dependência de infecções ou estímulos inflamatórios para sua geração. Durante o desenvolvimento de uma resposta imune adaptativa, o fenó- tipo e a função das DCs desempenham um papel no início da tolerância, memória e diferenciação polarizada de auxiliar T 1 (Th1), Th2 e Th17.
[00135] Como utilizado neste documento, o termo "ativação de célu- las dendríticas" refere-se à transição de células dendríticas imaturas para maduras; e as células dendríticas ativadas abrangem células den- dríticas maduras e células dendríticas no processo de transição, em que a expressão de CD80 e CD86 que induzem sinais coestimulatórios é elevada pelos estímulos de ativação. Células dendríticas humanas ma- duras são células positivas para a expressão de CD40, CD80, CD86 e HLA-classe Il (por exemplo, HLA-DR). Uma célula dendrítica imatura pode ser distinguida de uma célula dendrítica madura, por exemplo, com base em marcadores selecionados do grupo que consiste em CD80 e CD86. Uma célula dendrítica imatura é fracamente positiva e preferen- cialmente negativa para esses marcadores, enquanto uma célula den- drítica madura é positiva. A discriminação de células dendríticas madu- ras é realizada rotineiramente por aqueles versados na técnica, e os respectivos marcadores descritos acima e métodos para medir sua ex- pressão também são bem conhecidos dos versados na técnica.
[00136] Como utilizado neste documento, o termo “ECs57” refere-se à concentração de um anticorpo ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, que induz uma resposta, seja em um ensaio in vitro ou um in vivo, que é 50% da resposta máxima, ou seja, a meio caminho entre a resposta máxima e a linha de base.
[00137] Como utilizado neste documento, o termo "dose eficaz" ou "dosagem eficaz" é definido como uma quantidade suficiente para atin- gir ou pelo menos parcialmente alcançar o efeito desejado. O termo “dose terapeuticamente eficaz” é definido como uma quantidade sufici- ente para curar ou pelo menos parcialmente deter a doença e suas com- plicações num paciente que já sofre da doença. Os valores eficazes para esse uso dependerão da gravidade do distúrbio que está sendo tratado e do estado geral do sistema imunológico do paciente.
[00138] Como utilizado neste documento, o termo "epítopo" ou "de- terminante antigênico" refere-se a um sítio em um antígeno ao qual uma imunoglobulina ou anticorpo se liga especificamente. O termo "mapea- mento de epítopo" refere-se a um processo ou método para identificar o sítio de ligação, ou epítopo, de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, em seu antígeno de proteína alvo. Métodos e técnicas de mapeamento de epítopos são fornecidos aqui. Os epítopos podem ser formados tanto a partir de aminoácidos contíguos como de aminoácidos não contíguos justapostos por dobramento terciário de uma proteína. E pítopos formados de aminoácidos contíguos são tipica- mente retidos na exposição a solventes de desnaturação, enquanto os epítopos formados por dobramento terciário são tipicamente perdidos no tratamento com solventes de desnaturação. Um epítopo inclui tipica- mente pelo menos 3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13, 14 ou 15 aminoácidos em uma conformação espacial única. Os métodos para determinar quais epítopos estão ligados por um determinado anticorpo (isto é, mapea- mento de epítopos) são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, ensaios de imunotransferência e imunoprecipitação, em que peptídeos contíguos ou sobrepostos de IL-27 são testados quanto à re- atividade com o anticorpo anti-IL-27 fornecido. Os métodos para deter- minar a conformação espacial dos epítopos incluem técnicas na técnica e as descritas aqui, por exemplo, cristalografia de raios x e ressonância magnética nuclear bidimensional (ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)).
[00139] Também abrangidos pela presente descrição estão os anti- corpos que se ligam a um epítopo em IL-27 que compreende a totali- dade ou uma porção de um epítopo reconhecido pelos anticorpos espe- cíficos aqui descritos (por exemplo, o mesmo ou uma região sobreposta ou uma região entre ou abrangendo a região).
[00140] Também abrangidos pela presente descrição estão os anti- corpos que se ligam ao mesmo epítopo e/ou anticorpos que competem pela ligação à IL-27 humana com os anticorpos aqui descritos. Os anti- corpos que reconhecem o mesmo epítopo ou competem pela ligação podem ser identificados usando técnicas de rotina. Tais técnicas in- cluem, por exemplo, um imunoensaio, que mostra a capacidade de um anticorpo de bloquear a ligação de outro anticorpo a um antígeno-alvo, isto é, um ensaio de ligação competitivo. A ligação competitiva é deter- minada em um ensaio no qual a imunoglobulina em teste inibe a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum, como o IL-27. Numerosos tipos de ensaios de ligação competitiva são conhe- cidos, por exemplo: rádio-imunoensaio direto ou indireto (RIA) em fase sólida, imunoensaio enzimático direto ou indireto (EIA) em fase sólida, ensaio de competição em sanduíche (ver Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)); solid phase direct biotin-avidin EIA (see Kirkland et al. J. Immunol. 137:3614 (1986)); ensaio marcado direto em fase sólida, ensaio em sanduíche marcado direto em fase sólida (ver Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); solid phase direct label RIA using 1-125 label (ver Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)); EIA direta da biotina-avidina em fase sólida (Cheung etal., Virology 176:546 (1990)); e RIA marcado di- reto. (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)). Tipica- mente, esse ensaio envolve o uso de antígeno purificado ligado a uma superfície sólida ou células contendo um destes, uma imunoglobulina de teste não marcada e uma imunoglobulina de referência marcada. À inibição competitiva é medida através da determinação da quantidade de marcador ligado à superfície ou células sólidas na presença da imu- noglobulina de teste. Normalmente, a imunoglobulina de teste está pre- sente em excesso. Geralmente, quando um anticorpo competidor está presente em excesso, ele inibe a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum em pelo menos 50-55%, 55-60%, 60- 65%, 65-70% 70-75% ou mais.
[00141] Outras técnicas incluem, por exemplo, métodos de mapea- mento de epítopos, como análises de raios-x de cristais de antígeno:
complexos de anticorpos que fornecem resolução atômica do epítopo e espectrometria de massa combinada com a troca de hidrogênio/deutério (H/D) que estuda a conformação e dinâmica das interações antí- geno:anticorpo. Outros métodos monitoram a ligação do anticorpo a fra- gmentos de antígeno ou variações mutadas do antígeno, onde a perda de ligação devido a uma modificação de um resíduo de aminoácido den- tro da sequência de antígeno é frequentemente considerada uma indi- cação de um componente de epítopo. Além disso, métodos combinató- rios computacionais para mapeamento de epítopos também podem ser utilizados. Estes métodos dependem da capacidade do anticorpo de in- teresse em isolar por afinidade peptídeos curtos específicos de bibliote- cas de peptídeos combinados de fagos combinatórios. Os peptídeos são então considerados condutores para a definição do epítopo corres- pondente ao anticorpo utilizado para rastrear a biblioteca de peptídeos. Para o mapeamento de epítopos, também foram desenvolvidos algorit- mos computacionais que demonstram mapear epítopos descontínuos conformacionais.
[00142] Como utilizado neste documento, o termo "funções efetoras mediadas por Fc" ou "funções efetoras de Fc" refere-se às atividades biológicas de um anticorpo que não seja a função e o objetivo principal do anticorpo. Por exemplo, as funções efetoras de um anticorpo agnós- tico terapêutico são outras atividades biológicas que não a ativação da proteína ou via alvo. Exemplos de funções de efeito de anticorpo in- cluem ligação a C1qg e citotoxicidade dependente do complemento; liga- ção ao receptor Fc; citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC); fagocitose; infrarregulação de receptores de super- fície celular (por exemplo, receptor de célula B); falta de ativação de plaquetas que expressam o receptor Fc; e ativação de células B. Muitas funções efetoras começam com a ligação de Fc a um receptor de Fcy.
Em algumas modalidades, o anticorpo alvo de antígeno tumoral tem fun- ção efetora, por exemplo, atividade ADCC. Em algumas modalidades, um anticorpo de direcionamento a antígeno tumoral aqui descrito com- preende uma região constante variante com função efetora aumentada (por exemplo, capacidade aumentada de mediar ADCC) em relação à forma não modificada da região constante.
[00143] Como utilizado neste documento, o termo "receptor Fc" re- fere-se a um polipeptídeo encontrado na superfície das células efetoras imunes, que é ligado pela região Fc de um anticorpo. Em algumas mo- dalidades, o receptor Fc é um receptor Fcy. Existem três subclasses de receptores Fcy, FcyRI (CD64), FeyRII (CD32) e FycRIll (CD16). Todos os quatro isótipos de IgG (I9G1, IgG2, I9G3 e IgG4) se ligam e ativam os receptores Fc FceyRI, FeyRIIA e FCeyRIIA. O FeyRIIB é um receptor inibitório e, portanto, a ligação do anticorpo a esse receptor não ativa o complemento e as respostas celulares. FcyRI é um receptor de alta afi- nidade que se liga à IgG na forma monomérica, enquanto FCyRIIA e FCyRIIA são receptores de baixa afinidade que se ligam à IgG apenas na forma multimérica e têm uma afinidade ligeiramente menor. A ligação de um anticorpo a um receptor Fc e/ou C1q é governada por resíduos ou domínios específicos nas regiões Fc. A ligação também depende dos resíduos localizados na região da dobradiça e na porção CH2 do anti- corpo. Em algumas modalidades, a atividade agonística e/ou terapêu- tica dos anticorpos aqui descritos depende da ligação da região Fc ao receptor Fc (por exemplo, FceyR). Em algumas modalidades, a atividade agonística e/ou terapêutica dos anticorpos aqui descritos é aumentada pela ligação da região Fc ao receptor Fc (por exemplo, FcyR).
[00144] Uma lista de certas sequências do receptor Fc empregadas na presente descrição é estabelecida na Tabela 13 abaixo.
[00145] Como utilizado neste documento, o termo "padrão de glico- silação" é definido como o padrão de unidades de carboidratos que são covalentemente ligadas a uma proteína, mais especificamente a uma proteína de imunoglobulina. Um padrão de glicosilação de um anticorpo heterólogo pode ser caracterizado como sendo substancialmente seme- lhante aos padrões de glicosilação que ocorrem naturalmente em anti- corpos produzidos pela espécie do animal transgênico não humano, quando um versado na técnica reconheceria o padrão de glicosilação do anticorpo heterólogo como sendo mais semelhante ao referido pa- drão de glicosilação nas espécies do animal transgênico não humano do que nas espécies das quais os genes CH do transgene foram deri- vados.
[00146] Como utilizado neste documento, o termo "anticorpo hu- mano" inclui anticorpos com regiões variáveis e constantes (se presen- tes) de sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Os anticorpos humanos da descrição podem incluir resíduos de amino- ácidos não codificados por sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagê- nese aleatória ou específica de sítio in vitro ou por mutação somática in vivo) (Ver, por exemplo Lonberg et al., (1994) Nature 368(6474): 856- 859); Lonberg, (1994) Handbook of E xperimental Pharmacology 113:49- 101; Lonberg & Huszar, (1995) Intern. Rev. Immunol. 13:65-93, and Har- ding & Lonberg, (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546). No entanto, o termo "anticorpo humano" não inclui anticorpos em que as sequências de CDR derivadas da linhagem germinativa de outra espécie de mamí- fero, como um camundongo, foram enxertadas em sequências estrutu- rais humanas (isto é, anticorpos humanizados).
[00147] Como utilizado neste documento, o termo "anticorpo heteró- logo" é definido em relação ao organismo não humano transgênico que produz esse anticorpo. Este termo refere-se a um anticorpo possuindo uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de ácido nucleico codificante correspondente à encontrada em um organismo que não consiste no animal não humano transgênico e geralmente de uma es- pécie diferente da do animal não humano transgênico.
[00148] Os termos "induzindo uma resposta imune" e "intensificando uma resposta imune" são usados indistintamente e referem-se à esti- mulação de uma resposta imune (isto é, passiva ou adaptativa) a um antígeno particular. Os termos "induzir", conforme usados em relação à indução de CDC ou ADCC, referem-se à estimulação de determinados mecanismos de morte celular direta.
[00149] Como utilizado neste documento, o termo "morte celular imu- nogênica" (também conhecida como "apoptose imunogênica" refere-se a uma modalidade de morte celular associada à ativação de uma ou mais vias de sinalização que induzem a expressão e emissão pre-mor- tem de moléculas de padrão molecular associado a danos (DAMPs) (por exemplo, trifosfato de adenosina, ATP) da célula tumoral, resultando no aumento da imunogenicidade da célula tumoral e na morte da célula tumoral de maneira imunogênica (por exemplo, por fagocitose). Como utilizado neste documento, o termo "agente indutor de morte celular imu- nogênico" refere-se a um agente químico, biológico ou farmacológico que induz um processo, caminho ou modalidade de morte celular imu- nogênica.
[00150] Como utilizado neste documento, os termos "inibe", "reduz" ou "bloqueia" (por exemplo, referindo-se à inibição ou redução da fosfo- rilação mediada por IL-27 humana de STAT1 e/ou STAT3 em uma cé- lula) são usados indistintamente e abrangem ambos inibição/bloqueio parcial e completo. A inibição/bloqueio de IL-27 reduz ou altera o nível normal ou o tipo de atividade que ocorre sem inibição ou bloqueio. À inibição e o bloqueio também se destinam a incluir qualquer diminuição mensurável na afinidade de ligação de IL-27 quando em contato com um anticorpo anti-IL-27 em comparação com IL-27 que não está em contato com um anticorpo anti-IL-27, por exemplo, inibe a ligação de IL-
27 em pelo menos cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.
[00151] Como utilizado neste documento, os termos "inibe a angio- gênese", "diminui a angiogênese" e "reduz a angiogênese" referem-se à redução do nível de angiogênese em um tecido a uma quantidade que é de pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou menos do que a quantidade em um tecido de controle correspondente e, mais pre- ferencialmente, está no mesmo nível que é observado em um tecido de controle.
[00152] Como utilizado neste documento, o termo "inibe o cresci- mento" (por exemplo, referente a células) pretende incluir qualquer re- dução mensurável no crescimento de uma célula, por exemplo, a inibi- ção do crescimento de uma célula em pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% ou 100%.
[00153] Como utilizado neste documento, um sujeito "em necessi- dade de prevenção", "em necessidade de tratamento" ou "em necessi- dade de tratamento" refere-se a um que, a critério de um médico apro- priado (por exemplo, médico, enfermeiro ou uma enfermeira no caso de humanos; um veterinário no caso de mamíferos não humanos) se be- neficiaria razoavelmente de um determinado tratamento (como o trata- mento com uma composição compreendendo um anticorpo anti-IL-27).
[00154] O termo "in vivo"; refere-se à processos que ocorrem em um organismo vivo.
[00155] Talcomo aqui utilizado, o termo "anticorpo isolado" destina- se a referir-se a um anticorpo que está substancialmente livre de outros anticorpos com diferentes especificidades antigênicas (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente à IL-27 humana é subs-
tancialmente livre de anticorpos que se ligam especificamente a antíge- nos diferentes de IL-27). Um anticorpo isolado que se liga especifica- mente a um epítopo pode, no entanto, ter reatividade cruzada com ou- tras proteínas IL-27 de diferentes espécies. No entanto, o anticorpo con- tinua a exibir ligação específica à IL-27 humana em um ensaio de liga- ção específica, como aqui descrito. Além disso, um anticorpo isolado é tipicamente substancialmente livre de outro material celular e/ou produ- tos químicos. Em algumas modalidades, uma combinação de anticorpos "isolados" com diferentes especificidades de IL-27 é combinada em uma composição bem definida.
[00156] Como utilizado neste documento, o termo "molécula de ácido nucleico isolada" refere-se a ácidos nucleicos que codificam anticorpos ou porções de anticorpos (por exemplo, Vu, Vi, CDR3) que se ligam à IL-27, destina-se a referir-se a uma molécula de ácido nucleico em que as sequências nucleotídicas que codificam o anticorpo ou porção de an- ticorpo estão livres de outras sequências nucleotídicas que codificam anticorpos ou porções de anticorpo que se ligam a antígenos diferentes de IL-27, cujas outras sequências podem flanquear naturalmente o ácido nucleico no DNA genômico humano. Por exemplo, uma sequência selecionada de uma sequência estabelecida na Tabela 12 corresponde às sequências nucleotídicas que compreendem as regiões variáveis da cadeia pesada (Vx) e da cadeia leve (V.) dos anticorpos monoclonais anti-IL-27 aqui descritos.
[00157] Como utilizado neste documento, "isótipo" refere-se à classe de anticorpos (por exemplo, IgM ou IgG1) que é codificada pelos genes da região constante da cadeia pesada. Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal humano da descrição é do isótipo I9G1. Em algu- mas modalidades, um anticorpo monoclonal humano da descrição é do isótipo I9G2. Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal hu- mano da descrição é do isótipo I9G3. Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal humano da descrição é do isótipo IIG4. Como é aparente para um versado na técnica, a identificação de isótipos de an- ticorpos (por exemplo, IgG1, IgG2, I9G3, I9G4, IgM, IgAl IgA2, IgD e IgE) é rotina na técnica e comumente envolve uma combinação de ali- nhamentos de sequência com anticorpos conhecidos, sequências vari- antes Fc publicadas e sequências conservadas.
[00158] Como utilizado neste documento, o termo "troca de isótipo" refere-se ao fenômeno pelo qual a classe, ou isótipo, de um anticorpo muda de uma classe de Ig para uma das outras classes de lg.
[00159] Como utilizado neste documento, o termo "KD" ou "Kp'"; re- fere-se à constante de dissociação de equilíbrio de uma reação de liga- ção entre um anticorpo e um antígeno. O valor de Kp é uma represen- tação numérica da razão entre a constante de taxa off do anticorpo (kd) e a constante de taxa on do anticorpo (ka). O valor de Kp está inversa- mente relacionado à afinidade de ligação de um anticorpo a um antí- geno. Quanto menor o valor de Kp, maior a afinidade do anticorpo pelo seu antígeno. Afinidade é a força de ligação de uma única molécula ao seu ligando e é normalmente medida e relatada pela constante de dis- sociação de equilíbrio (Kp), que é usada para avaliar e classificar as forças de ordem das interações bimoleculares.
[00160] Como utilizado neste documento, o termo "kd" ou "ka"; (alter- nativamente "koff" ou "kot") destina-se a referir-se à constante de taxa off para a dissociação de um anticorpo de um complexo anticorpo/antí- geno. O valor de kd é uma representação numérica da fração de com- plexos que decaem ou se dissociam por segundo e é expresso em uni- dades s,
[00161] Como utilizado neste documento, o termo "ka" ou "ka"; (alter- nativamente "kon" ou "kon";) destina-se a referir-se à constante de taxa On para a associação de um anticorpo com um antígeno. O valor de ka é uma representação numérica do número de complexos de anti- corpo/antígeno formados por segundo em uma solução 1 molar (1M) de anticorpo e antígeno e é expresso em unidades M's!,
[00162] Como utilizado neste documento, o termo "leucócito" refere- se a um tipo de glóbulo branco envolvido na defesa do corpo contra organismos infecciosos e substâncias estranhas. Os leucócitos são pro- duzidos na medula óssea. Existem 5 tipos principais de glóbulos bran- cos, subdivididos em 2 grupos principais: leucócitos polimorfonucleares (neutrófilos, eosinófilos, basófilos) e leucócitos mononucleares (monó- citos e linfócitos).
[00163] Como utilizado neste documento, o termo "linfócitos" refere- se a um tipo de leucócito ou glóbulo branco que está envolvido nas de- fesas imunológicas do corpo. E xistem dois tipos principais de linfócitos: células B e células T.
[00164] Como utilizado neste documento, os termos "ligado", "fun- dido" ou "fusão" são usados de forma intercambiável. Estes termos re- ferem-se à união de mais dois elementos ou componentes ou domínios, por qualquer meio, incluindo conjugação química ou meio recombi- nante. Os métodos de conjugação química (por exemplo, usando agen- tes de reticulação hetero-bifuncional) são conhecidos na técnica.
[00165] Como utilizado neste documento, "administração local" ou "distribuição local", refere-se à distribuição que não depende do trans- porte da composição ou agente para o tecido ou sítio alvo pretendido através do sistema vascular. Por exemplo, a composição pode ser dis- tribuída por injeção ou implantação da composição ou agente ou por injeção ou implantação de um dispositivo contendo a composição ou agente. Após a administração local na vizinhança de um tecido ou sítio alvo, a composição ou agente, ou um ou mais componentes do mesmo, pode difundir para o sítio ou tecido alvo pretendido.
[00166] Como utilizado neste documento, "moléculas de MHC" re- fere-se a dois tipos de moléculas, MHC classe | e MHC classe Il. As moléculas de MHC classe | apresentam antígeno para células T CD8+ específicas e as moléculas de MHC classe |l apresentam antígeno para células T CD4+ específicas. Os antígenos distribuídos exogenamente às APCs são processados principalmente para associação ao MHC classe Il. Por outro lado, os antígenos distribuídos endogenamente às APCs são processados principalmente para associação ao MHC classe l.
[00167] Como utilizado neste documento, o termo "anticorpo mono- clonal" refere-se a um anticorpo que exibe uma única especificidade e afinidade de ligação para um epítopo específico. Por conseguinte, o termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a um anticorpo que exibe uma especificidade de ligação única e que possui regiões cons- tantes variáveis e opcionais derivadas de sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Em algumas modalidades, os anticor- pos monoclonais humanos são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal não humano transgênico, por exem- plo, um camundongo transgênico, tendo um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada humano e um transgene de cadeia leve fundido a uma célula imortalizada.
[00168] Como utilizado neste documento, o termo "monócito" refere- se a um tipo de leucócito e pode se diferenciar em macrófagos e células dendríticas para efetuar uma resposta imune.
[00169] Como utilizado neste documento, o termo "célula assassina natural (NK)" refere-se a um tipo de linfócito citotóxico. Estes são linfó- citos grandes, geralmente granulares, não T e não B, que matam certas células tumorais e desempenham um importante papel na imunidade inata a vírus e outros patógenos intracelulares, bem como na citotoxici- dade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC).
[00170] Como utilizado neste documento, o termo "ocorrência natu- ral" aplicado a um objeto refere-se ao fato de que um objeto pode ser encontrado na natureza. Por exemplo, uma sequência de polipeptídeos e polinucleotídeos que está presente em um organismo (incluindo vírus) que pode ser isolada de uma fonte natural e que não foi intencional- mente modificada pelo homem no laboratório é de ocorrência natural.
[00171] Como utilizado neste documento, o termo "isótipo não comu- tado" refere-se à classe isotípica de cadeia pesada que é produzida quando não ocorre a troca de isótipo; o gene CH que codifica o isótipo não comutado é tipicamente o primeiro gene CH imediatamente a ju- sante do gene VDJ reorganizado funcionalmente. A troca de isótipo foi classificada como troca de isótipo clássico ou não clássico. A troca de isótipo clássico ocorre por eventos de recombinação que envolvem pelo menos uma região de sequência de troca no transgene. A troca de isó- tipo não clássica pode ocorrer por, por exemplo, recombinação homó- loga entre o. humanos e X, humanos (deleção associada a ô). Meca- nismos alternativos não clássicos de troca, como intertransgene e/ou recombinação intercromossômica, entre outros, podem ocorrer e efe- tuar a troca de isótipo.
[00172] Como utilizado neste documento, o termo "ácido nucleico" refere-se a desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos e polímeros dos mesmos na forma de fita simples ou dupla. A menos que especifi- camente limitado, o termo abrange ácidos nucleicos contendo análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que têm propriedades de ligação semelhantes ao ácido nucleico de referência e são metabolizados de maneira semelhante aos nucleotídeos de ocorrência natural. Salvo indicação em contrário, uma sequência de ácido nucleico específica também inclui implicitamente variantes modificadas conservativamente (por exemplo, substituições de códons degeneradas) e sequências complementares e também a sequência explicitamente indicada.
Especificamente, as substituições de códons degeneradas podem ser alcançadas gerando sequências nas quais a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída por resíduos de base mista e/ou desoxininosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985; and Cassol et al, 1992; Rossolini et al, Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994). Para arginina e leucina, as modificações na segunda base também podem ser conservativas. O termo ácido nucleico é usado de forma intercambiável com o gene, cCDNA e mRNA codificado por um gene.
[00173] Os polinucleotídeos aqui utilizados podem ser compostos de qualquer polirribonucleotídeo ou polideoxribonucleotídeo, que pode ser RNA ou DNA não modificado ou RNA ou DNA modificado. P or exemplo, os polinucleotídeos podem ser compostos de DNA de fita simples e dupla, DNA que é uma mistura de regiões de fita simples e dupla, RNA de fita simples e dupla e RNA que é uma mistura de regiões de fita simples e dupla, moléculas híbridas compreendendo DNA e RNA que podem ser de fita simples ou, mais tipicamente, de fita dupla ou uma mistura de regiões de fita simples e dupla. Além disso, o polinucleotídeo pode ser composto de regiões de fita tripla compreendendo RNA ou DNA ou RNA e DNA. Um polinucleotídeo também pode conter uma ou mais bases modificadas ou espinhas dorsais de DNA ou RNA modificados para estabilidade ou por outros motivos. Bases "modifica- das" incluem, por exemplo, bases tritiladas e bases incomuns, como a inosina. Uma variedade de modificações pode ser feita no DNA e RNA; assim, "polinucleotídeo" abrange formas quimicamente, enzimatica- mente ou metabolicamente modificadas.
[00174] Um ácido nucleico é “operativamente ligado” que é colocado numa relação funcional com outra sequência de ácidos nucleicos. Por exemplo, um promotor ou intensificador está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação se isso afeta a transcrição da sequência.
No que diz respeito às sequências regulatórias da transcrição, operacionalmente ligada significa que as sequências de DNA que estão sendo ligadas são contíguas e, quando necessário, para unir duas regiões codificadoras de proteínas, contíguas e na estrutura de leitura. Para sequências de comutação, operacionalmente ligado indica que as sequências são capazes de efetuar a recombinação de comutação.
[00175] Como utilizado neste documento, "administração parente- ral", "administrado parenteralmente" e outras frases gramaticalmente equivalentes, referem-se a modos de administração que não sejam ad- ministração enteral e tópica, geralmente por injeção, e incluem, sem |i- mitação, intravenosa, intranasal, intraocular, intramuscular, injeção e in- fusão intra-arterial, intratecal, intracapsular, intra-orbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, trans-traqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoidea, intra-espinhal, epidural, in- tracerebral, intracraniana, intracarotídea e intraesternal.
[00176] Como utilizado neste documento, o termo "paciente" inclui sujeitos humanos e outros mamíferos que recebem tratamento profilá- tico ou terapêutico.
[00177] Como utilizado neste documento, o termo "antagonista de PD-1"refere-se a qualquer composto químico ou molécula biológica que inibe a via de sinalização de PD-1 ou que inibe a função de PD-1 em uma célula (por exemplo, uma célula imune). Em algumas modalidades, um antagonista de PD-1 bloqueia a ligação de PD-L1 a PD-1 e/ou PD- L2 a PD-1. Em algumas modalidades, o antagonista de PD-1 se liga especificamente à PD-1. Em algumas modalidades, o antagonista de PD-1 se liga especificamente à PD-L1.
[00178] O termo "identidade percentual", no contexto de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou polipeptídeos, refere-se a duas ou mais sequências ou subsequências que possuem uma porcentagem especificada de nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos iguais,
quando comparados e alinhados para obter a máxima correspondência, conforme medido usando um dos algoritmos de comparação de sequên- cia descritos abaixo (por exemplo, BLASTP e BLASTN ou outros algo- ritmos disponíveis para pessoas habilitadas) ou por inspeção visual. De- pendendo da aplicação, a "identidade percentual" pode existir em uma região da sequência que está sendo comparada, por exemplo, em um domínio funcional ou, alternativamente, em todo o comprimento das duas sequências a serem comparadas. P ara comparação de sequência, tipicamente uma sequência atua como uma sequência de referência a qual as sequências de teste são comparadas. Ao usar um algoritmo de comparação de sequência, as sequências de teste e de referência são inseridas em um computador, as coordenadas de subsequência são de- signadas, se necessário, e os parâmetros do programa de algoritmo de sequência são designados. O algoritmo de comparação de sequência calcula então a percentagem de identidade de sequência para a(s) se- quência(s) de teste relativa à sequência de referência, com base nos parâmetros de programa designados.
[00179] O alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de S mith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981); pelo algoritmo de alinha- mento por homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pela busca do método de similaridade de Pearson e Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), por implementações com- putadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TEASTA no Wisconsin Genetics S oftware Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) ou por inspeção visual (ver geralmente Au- subel et al., infra).
[00180] Um exemplo de um algoritmo que é adequado para determinar a porcentagem de identidade de sequência e similaridade de sequência é o algoritmo BLAST, descrito em Altschul et al., |. Mol. Biol.
215:403-410 (1990). O software para realização de análises BLAST está disponível ao público, através do site do National Center for Biotechnology Information (NCBI).
[00181] Como geralmente utilizado neste documento, "farmaceuti- camente aceitável" refere-se aos compostos, materiais, composições e/ou de formas de dosagem as quais são, no âmbito do julgamento médico, adequadas para uso em contato com os tecidos, órgãos e/ou fluidos corporais dos seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, reação alérgica ou outros problemas ou complica- ções proporcionais com uma razão risco/benefício razoável.
[00182] Como utilizado neste documento, um "transportador farma- ceuticamente aceitável" refere-se a e inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de retardamento de absorção e isotônico e similares que são fisiologicamente compatíveis. As composições podem incluir um sal farmaceuticamente aceitável, por exemplo, um sal de adição de ácido ou um sal de adição de base (ver, por exemplo, Berge et al. (1977) / Pharm Sci 66:1-19).
[00183] Como aqui utilizado, os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usados de forma intercambiável para se referirem a um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos se aplicam a polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos são um mimético químico artificial de um aminoácido correspondente natural, bem como a polímeros de aminoácidos naturais e a um polímero de aminoácidos de ocorrência não natural.
[00184] Como utilizado neste documento, o termo "prevenção", quando usado em relação a uma condição, refere-se à administração de uma composição que reduz a frequência ou atrasa o aparecimento de sintomas de uma condição médica em um sujeito em relação a um sujeito que não receber a composição.
[00185] Como utilizado neste documento, o termo "purificado" ou "isolado" aplicado a qualquer das proteínas (anticorpos ou fragmentos) aqui descritas refere-se a um polipeptídeo que foi separado ou purificado de componentes (por exemplo, proteínas ou outras moléculas biológicas ou orgânicas de ocorrência natural) que o acompanham naturalmente, por exemplo, outras proteínas, lipídeos e ácido nucleico em um procariota que expressa as proteínas. Tipicamente, um polipeptídeo é purificado quando constitui pelo menos 60 (por exemplo, pelo menos 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 97 ou 99) %, em peso, da proteína total numa amostra.
[00186] Como utilizado neste documento, o termo "Proteína de Morte Celular Programada 1" ou "PD-1" refere-se ao polipeptídeo da Proteína de Morte Celular Programada 1, um receptor inibidor imune pertencente à família CD28 e é codificado pelo gene PDCD1 em humanos. Nomes alternativos ou sinônimos para PD-1 incluem: PDCD1, PD1, CD279 e SLEB2.PD-1 é expresso predominantemente em células T previamente ativadas, células B e células mieloides in vivo e se liga a dois ligantes, PD-L1 e PD-L2. O termo "PD-1", como utilizado neste documento, inclui PD-1 humana (hPD-1), variantes, isoformas e homólogos de espécies de hPD-1 e análogos com pelo menos um epítopo comum com hPD-1. A sequência completa de hPD-1 pode ser encontrada no No. de Acessão GenBank AAC51773.
[00187] Como utilizado neste documento, o termo "Ligando de Morte Programada-1" ou "PD-L1" é um dos dois ligantes de glicoproteína da superfície celular para PD-1 (o outro sendo PD-L2) que infrarregula a ativação de células T e a secreção de citocinas após a ligação a PD-1. Nomes e sinônimos alternativos para PD-L1 incluem: PDCD1L1, PDL1, B7H1, B7-4, CD274 e B7-H. O termo "PD-L1", como utilizado neste documento, inclui PD-L1 humano (hPD-L1), variantes, isoformas e homólogos de espécies de hPD-L1 e análogos com pelo menos um epítopo comum com hPD-L1. A sequência completa do hPD-L1 pode ser encontrada no No. de Acessão GenBank Q9NZQ7.
[00188] APD-1é conhecida como uma proteína inibitória imune que regula negativamente os sinais de TCR (Ishida, Y. et al. (1992) EMBO ].11:3887-3895; Blank, C. et al. (Epub 2006 Dec. 29) Immunol. Immu- nother. 56(5):739-745). A interação entre PD-1 e PD-L1 pode atuar como um ponto de verificação imune, o que pode levar a uma diminui- ção na proliferação mediada pelo receptor de células T (Dong et al. (2003) ) . Mol. Med. 81:281-7; Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Im- munother. 54:307-314; Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:5094- 100). A supressão imunológica pode ser revertida inibindo a interação local de PD-1 com PD-L1 ou PD-L2; o efeito é aditivo quando a interação de PD-1 com PD-L2 também é bloqueada (Iwai et al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:12293-7; Brown et al. (2003) ) . Immunol. 170:1257- 66).
[00189] Para vários tipos de câncer, a sobrevida e proliferação do tumor são sustentadas pela modulação do ponto de verificação imune mediada por tumor. Essa modulação pode resultar na interrupção das funções do sistema imunológico anticâncer. Por exemplo, estudos re- centes indicaram que a expressão de ligantes de receptores de ponto de verificação imune, como PD-L1 ou PD-L2, por células tumorais, pode diminuir a atividade do sistema imune no microambiente tumoral e pro- mover a evasão imunológica do câncer suprimindo particularmente cé- lulas T. PD-L1 é abundantemente expresso por uma variedade de cân- ceres humanos (Dong et al., (2002) Nat Med 8:787-789). O receptor para PD-L1, PD-1, é expresso em linfócitos (por exemplo, células T ati- vadas) e normalmente está envolvido na suprarregulação do sistema imunológico e na promoção da autotolerância, principalmente pela su- pressão de células T. No entanto, quando os receptores P D-1 expressos nas células T se ligam aos ligantes PD-L1 cognatos nas células tumo- rais, a supressão resultante das células T contribui para uma resposta imune prejudicada contra o tumor (por exemplo, uma diminuição dos linfócitos infiltrados no tumor ou o estabelecimento de evasão imune por células cancerígenas).
[00190] Em grandes conjuntos de amostras de, por exemplo, câncer de ovário, renal, colorretal, pancreático, hepático e melanoma, foi de- monstrado que a expressão de PD-L1 se correlacionava com um mau prognóstico e reduzia a sobrevida global, independentemente do trata- mento subsequente (ver, por exemplo, Dong et al., (2002) Nat Med 8(8):793-800; Yang et al., (2008) Invest O phthalmo! Vis Sci 49(6):2518- 2525; Ghebeh et al., (2006) Neoplasia 8:190-198; Hamanishi et al, (2007) Proc Nat Acad Sci USA 104:3360-3365; Thompson etal., (2006) Clin Genitourin Cancer 5:206-211; Nomi et al., (2005) Clin Cancer Res 11:2947-2953; Inman et al., (2007) Cancer 109:1499-1505; Shimauchi etal., (2007) Int) Cancer 121:2585-2590; Gao etal., (2009) Clin Cancer Res 15:971-979; Nakanishi et al., (2007) Cancer Immunol Immunother 56:1173-1182; Hino et al., (2010) Cancer 116(7):1757-1766). Da mesma forma, verificou-se que a expressão de PD-1 em linfócitos tumorais marca células T disfuncionais no câncer de mama (Kitano et al., (2017) ESMO Open 2(2):2000150) e melanoma (Kleffel et al., (2015) Cell 162(6):1242-1256). Antagonistas de PD-1, como aqueles que afetam a função do eixo de sinalização PD-1/PD-L1/PD-L2 e/ou interrompem a interação entre PD-1 e PD-L1 e/ou PD-L2, por exemplo, foram desen- volvidos e representam uma nova classe de inibidores antitumorais que funcionam via modulação da interação célula imune-célula tumoral.
[00191] “Como utilizado neste documento, o termo "rearranjado" re- fere-se a uma configuração de um locus de imunoglobulina de cadeia pesada ou cadeia leve, em que um segmento V é posicionado imedia- tamente adjacente a um segmento D-) ou | em uma conformação que codifica essencialmente um domínio Vx or Vi completo, respectiva- mente. Um locus de gene de imunoglobulina reorganizado pode ser identificado por comparação com o DNA da linhagem germinativa; um locus reorganizado terá pelo menos um elemento de homologia heptâ- mero/nonâmero recombinado.
[00192] “Como utilizado neste documento, o termo "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "célula hospedeira") pretende se refe- rira uma célula na qual um vetor de expressão recombinante foi intro- duzido. Deve-se entender que tais termos se referem não apenas à cé- lula em questão, mas também à descendência de uma célula. Como certas modificações podem ocorrer nas gerações seguintes devido a mutações ou influências ambientais, essa descendência não pode, de fato, ser idêntica à célula-mãe, mas ainda está incluída no escopo do termo "célula hospedeira", como utilizado neste documento.
[00193] “Como utilizado neste documento, o termo "anticorpo humano recombinante" inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, como (a) an- ticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou transcromossômico para genes de imunoglobulina hu- mana ou um hibridoma preparado a partir do mesmo, (b) anticorpos iso- lados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anti- corpo, por exemplo, de um transfectoma, (c) anticorpos isolados de uma biblioteca combinatória de anticorpos humanos recombinantes e (d) an- ticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva a junção de sequências de genes de imunoglobulina humana a outras sequências de DNA. Tais anticorpos humanos recom- binantes compreendem regiões variáveis e constantes que utilizam de- terminadas sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa hu- mana são codificadas pelos genes da linhagem germinativa, mas in- cluem rearranjos e mutações subsequentes que ocorrem, por exemplo,
durante a maturação do anticorpo. Como conhecido na técnica (ver, por exemplo, Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9): 1117-1125), a região variável contém o domínio de ligação ao antígeno, que é codificado por vários genes que se reorganizam para formar um anticorpo específico para um antígeno estranho. Além do rearranjo, a região variável pode ser modificada ainda mais por múltiplas alterações simples de aminoá- cidos (denominadas mutação somática ou hipermutação) para aumen- tar a afinidade do anticorpo com o antígeno estranho. A região constante mudará em resposta adicional a um antígeno (isto é, troca de isótipo). Portanto, as moléculas de ácido nucleico reorganizadas e somatica- mente mutadas que codificam os polipeptídeos da imunoglobulina da cadeia leve e da cadeia pesada em resposta a um antígeno não podem ter identidade de sequência com as moléculas originais do ácido nu- cleico, mas serão substancialmente idênticas ou semelhantes (isto é, possuem pelo menos 80% de identidade).
[00194] “Como utilizado neste documento, o termo "anticorpo de refe- rência" (usado de forma intercambiável com "mAb de referência") ou "proteína de ligação ao antígeno de referência" refere-se a um anti- corpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno, que se liga a um epí- topo específico em IL-27 e é usado para estabelecer uma relação entre si e um ou mais anticorpos distintos, em que a relação é a ligação do anticorpo de referência e o um ou mais anticorpos distintos ao mesmo epítopo em IL-27. Como utilizado neste documento, o termo conota um anticorpo anti-IL-27 que é útil em um teste ou ensaio, como os aqui des- critos (por exemplo, um ensaio de ligação competitiva), como concor- rente, em que o ensaio é útil para a descoberta, identificação ou desen- volvimento, de um ou mais anticorpos distintos que se ligam ao mesmo epítopo.
[00195] “Como utilizado neste documento, os termos "ligação especí- fica", "ligação seletiva", "liga seletivamente" e "liga-se especificamente",
referem-se à ligação de anticorpos a um epítopo em um antígeno pre- determinado.
Normalmente, o anticorpo se liga a uma constante de dis- sociação de equilíbrio (Kp) de aproximadamente menos que 10º M, como aproximadamente 107, 108 M, 10º M ou 10º M ou ainda menor quando determinado por tecnologia de ressonância plasmônica de su- perfície (SPR) em um instrumento BIACORE 2000 IL-27 humana recom- binante como analito e o anticorpo como ligando e se liga ao antígeno predeterminado com uma afinidade que é pelo menos duas vezes maior do que sua afinidade para ligação a um antígeno não específico (por exemplo, BSA, caseína) diferente do antígeno predeterminado ou um antígeno intimamente relacionado.
Em certas modalidades, um anti- corpo que se liga especificamente à IL-27 se liga a uma constante de dissociação de equilíbrio (Kp) de aproximadamente menos que 100 nM (107 M), opcionalmente, aproximadamente, menos que 50 nM (5 x 108 M), opcionalmente, aproximadamente menos que 15 nM (1,5 x 10º M), opcionalmente, aproximadamente menos que 10 nM (10 M), opcional- mente, aproximadamente menos que 5 nM (5 x10º M), opcionalmente, aproximadamente menos que 1 nM (10º M), opcionalmente aproxima- damente menos que 0,1 nM (10º M), opcionalmente aproximadamente menos que 0,01 nM (10º! M), ou ainda mais baixo, quando determinado pela tecnologia de ressonância plasmônica de superfície (SPR) em um instrumento BIACORE 2000 usando IL-27 humana recombinante como analito e o anticorpo como ligando, onde a ligação ao antígeno prede- terminado ocorre com uma afinidade que é pelo menos duas vezes maior do que a afinidade do anticorpo para a ligação a um antígeno não específico (por exemplo, BSA, caseína) diferente do antígeno predeter- minado ou um antígeno intimamente relacionado.
As frases “um anti- corpo reconhecendo um antígeno” e “um anticorpo específico para um antígeno” são usadas indistintamente aqui com o termo “um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno”.
[00196] Como utilizado neste documento, o termo "fosforilação STAT1" refere-se à fosforilação do polipeptídeo Transdutor de Sinal e Ativador da Transcrição 1 (STAT1), um fator de transcrição codificado pelo gene STAT1 em humanos. As moléculas STAT são fosforiladas por quinases associadas ao receptor, que causam ativação e dimerização pela formação de homo ou heterodímeros que se translocam para o nú- cleo para atuar como fatores de transcrição. STAT1 pode ser ativado (ou seja, fosforilado) em resposta à sinalização por meio de vários ligan- tes, incluindo IL-27. A sinalização de IL-27 através do IL-27R resulta na fosforilação de STAT1 (pSTAT1). STAT1 tem um papel fundamental na expressão de genes envolvida na sobrevivência da célula, viabilidade ou resposta do patógeno. Métodos para determinar a fosforilação de STAT1 como resultado da sinalização de IL-27 incluem, mas não estão limitados a, análise de citometria de fluxo de células marcadas com an- ticorpos que reconhecem especificamente STAT1 fosforilado (ver, por exemplo, Tochizawa et al., (2006) | Immunol Methods 313(1-2):29-37).
[00197] Como utilizado neste documento, o termo "fosforilação de STAT3" refere-se à fosforilação do polipeptídeo Transdutor de Sinal e Ativador da Transcrição 3 (STAT3), um fator de transcrição codificado pelo gene STAT3 em humanos. STAT3 medeia a expressão de uma variedade de genes em resposta a estímulos celulares e, portanto, de- sempenha um papel fundamental em muitos processos celulares, como crescimento celular e apoptose. Métodos para determinar a fosforilação de STAT3 como resultado da sinalização de I1L-27 incluem, mas não estão limitados a, análise de células ou extratos de células marcados com anticorpos que reconhecem especificamente STAT3 fosforilado (ver, por exemplo, Fursov et al., (2011) Assay Drug Dev Technol 9(4):420-429).
[00198] Como utilizado neste documento, o termo "sequência de troca" refere-se às sequências de DNA responsáveis pela recombina- ção da troca. Uma sequência de "doador de troca", normalmente uma u região de switch, será 5' (isto é, a montante) da região de construção a ser excluída durante a recombinação de troca. A região de “aceitador de troca” estará entre a região de construto a ser excluída e a região constante de substituição (por exemplo, v, e, etc.). Como não há sítio específico onde a recombinação sempre ocorra, a sequência final do gene normalmente não será previsível a partir do construto.
[00199] Como utilizado neste documento, o termo "sujeito" inclui qualquer animal humano ou não humano. Por exemplo, os métodos e composições da presente invenção podem ser utilizados para tratar um sujeito com um distúrbio imunológico. O termo "animal não humano" in- clui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, como primatas não humanos, ovelhas, cães, vacas, galinhas, anfíbios, répteis, etc.
[00200] Para ácidos nucleicos, o termo "homologia substancial" in- dica que dois ácidos nucleicos, ou sequências designadas dos mesmos, quando alinhados e comparados de maneira ideal, são idênticos, com inserções ou deleções de nucleotídeos apropriadas, em pelo menos cerca de 80% dos nucleotídeos, geralmente pelo menos cerca de 90% a 95%, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 98% a 99,5% dos nucleotídeos. Alternativamente, existe uma homologia substancial quando os segmentos hibridam sob condições de hibridação seletiva, para o complemento da cadeia.
[00201] A porcentagem de identidade entre duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequên- cias (isto é, % homologia = % de posições idênticas/* total de posições x 100), levando em consideração o número de folgas e o comprimento de cada folga, que precisa ser introduzida para o alinhamento ideal das duas sequências. A comparação de sequências e a determinação da porcentagem de identidade entre duas sequências podem ser realiza- das usando um algoritmo matemático, conforme descrito nos exemplos não limitativos abaixo.
[00202] A identidade porcentual entre duas sequências nucleotídicas pode ser determinada usando o programa GAP no pacote de software GCG (disponível em http://www.gcg.com), usando uma matriz NWSga- pdna.CMP e uma diferença de peso de 40, 50, 60, 70 ou 80 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. A porcentagem de identidade entre duas sequências nucleotídicas ou aminoácidos também pode ser deter- minada usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (CABIOS, 4: 11-17 (1989)), que foi incorporado ao programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de resíduos de peso PAM120, uma penalidade de compri- mento de folga 12 e uma penalidade de folga de 4. Além disso, a iden- tidade porcentual entre duas sequências de aminoácidos pode ser de- terminada usando o Needleman e Wunsch (/. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)), que foi incorporado ao programa GAP no pacote de software GCG (disponível em http://Www.gcg.com), usando uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de folga de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3,4, 50u 6.
[00203] As sequências de ácido nucleico e proteína da presente des- crição podem ainda ser usadas como uma "sequência de consulta" para executar uma pesquisa em bancos de dados públicos para, por exem- plo, identificar sequências relacionadas. Essas pesquisas podem ser re- alizadas usando os programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Al- tschul, et al. (1990) / . Mol. Biol. 215:403-10. As pesquisas de nucleotí- deos BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, pontua- ção = 100, comprimento de palavra = 12, para obter sequências nucle- otídicas homólogas às moléculas de ácido nucleico da invenção. Pes- quisas de proteína BLAST podem ser realizadas com o programa
XBLAST, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3 para obter se- quências de aminoácido homólogas para as moléculas de proteína da invenção. P ara obter alinhamentos com folgas para fins de comparação, o Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402. Ao utilizar programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros padrões dos respectivos pro- gramas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados. Ver http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
[00204] Os ácidos nucleicos podem estar presentes em células intei- ras, em um lisado celular ou em uma forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. Um ácido nucleico é "isolado" ou "tornado subs- tancialmente puro" quando purificado para longe de outros componen- tes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nu- cleicos ou proteínas celulares, por técnicas-padrão, incluindo trata- mento alcalino/SDS, bandas de CsCl, cromatografia em coluna, aga- rose eletroforese em gel e outros bem conhecidos na técnica. Ver, F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub- lishing and Wiley Interscience, New York (1987).
[00205] As composições de ácido nucleico da presente descrição, embora frequentemente em uma sequência nativa (exceto sítios de res- trição modificados e semelhantes), de CDNA, genômico ou misturas dos mesmos podem ser mutadas, de acordo com técnicas-padrão para for- necer sequências genéticas. Para sequências de codificação, essas mutações podem afetar a sequência de aminoácidos conforme dese- jado. Em particular, são contempladas sequências de DNA substancial- mente homólogas ou derivadas de comutadores V, D,)J, constantes na- tivas e outras sequências descritas neste documento (onde "derivado" indica que uma sequência é idêntica ou modificada a partir de outra se- quência).
[00206] Como utilizado neste documento, o termo "STING" (alterna- tivamente TMEM173) refere-se ao Estimulador de Genes de Interferon, uma proteína que funciona tanto como um sensor citosólico direto de DNA quanto como uma proteína adaptadora. Em humanos, o STING é codificado pelo gene TMEM173. STING desempenha um papel impor- tante na imunidade inata. STING induz a produção de interferon tipo | quando as células são infectadas com patógenos intracelulares, como vírus, micobactérias e parasitas intracelulares. O interferon tipo |, medi- ado por STING, protege as células infectadas e as células próximas da infecção local, ligando-se à mesma célula que a secreta e às células próximas. Um exemplo de sequência de aminoácidos para STING é for- necido pelo banco de dados NCBI Genbank sob o número de acessão NP 001288667.
[00207] O termo "célula T"refere-se a um tipo de glóbulo branco que pode ser diferenciado de outros glóbulos brancos pela presença de um receptor de célula T na superfície celular. Existem vários subconjuntos de células T, incluindo, entre outros, células T auxiliares (também co- nhecidas como células Ty ou células CD4* T) e subtitpos, incluindo cé- lulas TH1, TH2, TH3, TH17, TH9, e Tru, células T citotóxicas (também co- nhecidas como Tc, células CD8*T, linfócitos T citotóxicos, células-T as- sassinas, células T assassinas), células T de memória e subtipos, inclu- indo células T de memória central (células Tcm), células T efetoras de memória (células Tem E Temra), e células T de memória residentes (Trwm), células T regulatórias (também conhecidas como células Treg ou células T supressoras) e subtipos, incluindo células CD4* FOXP3* Treo, células CD4'*FOXP3' Treg, células Tr1, células Th3 e células Tregl7, células T assassinas naturais (também conhecidas como células NKT), células T invariantes associadas à mucosa (MAITs) e células T gama delta (célu- las T yô), incluindo células T Vy9/V52. Qualquer uma ou mais das célu- las T mencionadas ou não mencionadas pode ser o tipo de célula alvo para um método de uso da invenção.
[00208] Como utilizado neste documento, o termo "resposta mediada por células T" refere-se a qualquer resposta mediada por células T, incluindo, mas não se limitando a, células T efetoras (por exemplo, células CD8*) e células T auxiliares (por exemplo, células CD4*). As respostas mediadas por células T incluem, por exemplo, citotoxicidade e proliferação de células T.
[00209] “Como utilizado neste documento, os termos "quantidade te- rapeuticamente eficaz" ou "dose terapeuticamente eficaz", ou termos semelhantes usados aqui, significam uma quantidade de um agente (por exemplo, um anticorpo anti-IL-27 ou um fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo) que irá provocar a resposta biológica ou médica dese- jada (por exemplo, uma melhoria em um ou mais sintomas de um cân- cer).
[00210] Como utilizado neste documento, o termo "receptor TAM" re- fere-se às proteínas tirosina-quinases do receptor TAM (TYRO3, AXL e MER). Os receptores TAM estão envolvidos na regulação da homeos- tase do sistema imunológico. Em um cenário de câncer, os receptores TAM têm um papel regulatório duplo, controlando a iniciação e progres- são do desenvolvimento do tumor e, ao mesmo tempo, as respostas antitumorais associadas de diversas células do sistema imunológico. Uma descrição adicional dos receptores TAM pode ser encontrada em Paolino and Penninger (2016) Cancers 8(97): doi:10.3390/can- cers8100097). Como utilizado neste documento, o termo "inibidor do re- ceptor TAM" ou "inibidor TAM" se refere a um agente que inibe, bloqueia ou reduz a função ou atividade de um receptor TAM.
[00211] Como utilizado neste documento, o termo "TIGIT" ou "imu- norreceptor de células T com domínios Ig e ITIM" refere-se a qualquer TIGIT nativo de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos como primatas (por exemplo, humanos) e roedores (por exemplo, ca- mundongos e ratos), exceto quando indicado. TIGIT também é conhe- cido na técnica como DKFZp667A205, FLJ 39873, V-set e proteína 9 contendo o domínio de imunoglobulina, V-set e proteína 3 contendo o domínio transmembranar, VSIG9, VSTM3 e WUCAM. O termo também abrange variantes de ocorrência natural de TIGIT, por exemplo, varian- tes de emenda ou variantes alélicas. A sequência de aminoácidos de um TIGIT humano exemplificativo pode ser encontrada sob o Número de Acessão UniProt Q495A1.
[00212] Os termos "tratar", "tratando" e "tratamento", como utilizados neste documento, referem-se a medidas terapêuticas ou preventivas aqui descritas. Os métodos de "tratamento" empregam a administração a um sujeito, em necessidade de tal tratamento, um anticorpo humano da presente descrição, por exemplo, um sujeito em necessidade de uma resposta imune intensificada contra um antígeno específico ou um su- jeito que possa finalmente adquirir um tal distúrbio, a fim de prevenir, curar, atrasar, reduzir a gravidade ou melhorar um ou mais sintomas do distúrbio ou distúrbio recorrente, ou para prolongar a sobrevida de um sujeito além do esperado na ausência de tal tratamento.
[00213] Como utilizado neste documento, o termo "microambiente tu- moral" (alternativamente "microambiente cancerígeno"; TME abreviado) refere-se ao ambiente celular ou ambiente em que o tumor ou neoplasia existe, incluindo vasos sanguíneos circundantes, bem como células não cancerígenas, incluindo, mas não limitado a células imunes, fibroblas- tos, células inflamatórias derivadas da medula óssea e linfócitos. As mo- léculas sinalizadoras e a matriz extracelular também compreendem o TME. O tumor e o microambiente circundante estão intimamente relaci- onados e interagem constantemente. Os tumores podem influenciar o microambiente liberando sinais extracelulares, promovendo a angiogê-
nese tumoral e induzindo tolerância imune periférica, enquanto as célu- las imunes no microambiente podem afetar o crescimento e a evolução das células tumorais.
[00214] “Como utilizado neste documento, o termo "não rearranjado" ou "configuração da linhagem germinativa" refere-se à configuração em que o segmento V não é recombinado de modo a ser imediatamente adjacente a um segmento D ou J .
[00215] Como utilizado neste documento, o termo "vetor" pretende se referir a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a um laço de DNA de fita dupla circular na qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no ge- noma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma numa célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bac- terianos com uma origem de replicação bacteriana e vectores de mamí- fero epissômicos). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamíferos não epissômicos) podem ser integrados no genoma de uma célula hos- pedeira após a introdução na célula hospedeira e, desse modo, são re- plicados juntamente com o genoma do hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais es- tão ligados operativamente. Tais vetores são referidos aqui como "veto- res de expressão recombinantes" (ou simplesmente "vetores de expres- são"). Em geral, os vetores de expressão úteis em técnicas de DNA re- combinante estão frequentemente na forma de plasmídeos. No pre- sente relatório descritivo, "plasmídeo" e "vetor" podem ser utilizados de forma intercambiável, pois o plasmídeo é a forma de vetor mais comu- mente usada. No entanto, a invenção pretende incluir outras formas de vetores de expressão, como vetores virais (por exemplo, retrovírus com defeito de replicação, adenovírus e vírus adeno-associados), que ser- vem funções equivalentes.
[00216] Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e ci- entíficos utilizados neste documento têm o mesmo significado como co- mumente entendido por um versado na técnica à qual esta descrição pertence. Métodos e materiais preferidos são descritos a seguir, embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento também possam ser usados na prática ou no teste dos mé- todos e das composições presentemente divulgados. Todas as publica- ções, pedidos de patentes, patentes e outras referências mencionadas neste documento estão incorporadas para referência em suas totalida- des.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00217] FIG.1é uma tabela que fornece dados de afinidade para anticorpos anti-IL-27, conforme indicado. As medições de afinidade fo- ram realizadas usando os métodos ForteBio e Meso Scale Discovery.
[00218] FIG.2é um gráfico que representa a ligação de anticorpos anti-IL-27, como indicado, à IL-27 recombinante ligada à placa, con- forme medido por ELISA.
[00219] FIGS.3A-3E são um gráfico de barras, dois gráficos, um grá- fico de barras e um gráfico, respectivamente. FIG. 3A é um gráfico que representa a inibição da fosforilação de STAT1 mediada por IL-27 em sangue total humano por anticorpos anti-IL-27, conforme indicado, con- forme medido por citometria de fluxo. FIG. 3B é um gráfico que repre- senta a inibição da fosforilação de STAT1 mediada por IL-27 em PBMCs humanas por anticorpos anti-IL-27, conforme indicado, conforme me- dido por citometria de fluxo. FIG. 3C é um gráfico que representa a ini- bição da fosforilação de STAT1 mediada por IL-27 em células U937 por anticorpos anti-IL-27, conforme indicado, conforme medido por citome-
tria de fluxo. FIG. 3D é um gráfico que representa a inibição da fosfori- lação de STAT1 mediada por I1L-27 em células HUT-28 por anticorpos anti-IL-27, conforme indicado, conforme medido por citometria de fluxo. FIG. 3E é um gráfico que mostra que SRF388 inibe pSTAT1 mediado por IL-27 em células T de sangue total humano.
[00220] FIG.4é um gráfico que representa a reversão da inibição da expressão de CD161 mediada por IL-27 em células T por uma faixa de concentrações de anticorpos anti-IL-27, conforme indicado. A expres- são de CD161 foi determinada por citometria de fluxo.
[00221] FIG.5A é um gráfico que representa a extensão de anticor- pos anti-IL-27 para aumentar a secreção mediada por PD-1 de TNFa em PBMCs humanas conforme medido por ELISA. FIG. 5B é um gráfico que representa a extensão de anticorpos anti-IL-27 para aumentar a se- creção mediada por PD-1 de IL-6 em PBMCs humanas conforme me- dido por ELISA. FIG. 5C é um gráfico de pontos que mostra que SRF 388 em combinação com bloqueio de PD-1 leva ao aumento da produção de citocinas em PBMCs de doadores saudáveis e pacientes com RCC (Abreviações: CBA = Arranjo de Esfera Citométrica, IFNy = interferon gama, MSD =Meso Scale Discovery, PBMCs =células mononucleares do sangue periférico, PD-1 = receptor-1 de morte programada, RCC = carcinoma de células renais, TNFa = fator de necrose tumoral alfa). FIG. 5D mostra que IL-27 inibe a produção de citocinas após o bloqueio de PD-1 e é restaurada em combinação com SRF388 (Abreviações: Ctrl = controle, ns = não significativo, PBMCs = células mononucleares de sangue periférico, rhlL-27 =1L-27 humana recombinante). FIG. 5E re- sume a indução de citocinas observada (especificamente, TNF a., IFNy, IL-6 e IL-17A) em cultura de PBMC para vários tipos de células indica- dos, quando tais células foram colocadas em contato com anticorpo SRF388, aanticorpo PD-1 ou uma combinação de anticorpos SRF388 e aPD-1. FIG. 5F mostra o impacto sobre o sinal pSTAT1 em células U937
(linfoma) de várias concentrações dos anticorpos individuais indicados (SRF405, SRF410, SRF411, SRF414, SRF416, SRF536, SRF543, SRF529, SRF381, SRF388 e Ab7). FIG. 5G mostra o impacto sobre o sinal PSTAT1 em PBMCs (células mononucleares do sangue periférico) de várias concentrações desses anticorpos individuais. FIG. 5H mostra o impacto sobre o sinal de CD161 em PBMCs (células mononucleares do sangue periférico) de várias concentrações desses anticorpos indivi- duais. FIG. 51 mostra o impacto sobre o sinal de PD-L1 em linfócitos T CD4 (células CD4) de concentrações variáveis desses anticorpos indi- viduais (excluindo SRF414). FIG. 5) mostra o impacto sobre o sinal de PD-L1 em monócitos de concentrações variáveis desses anticorpos in- dividuais (excluindo SRF529). FIG. 5K mostra o impacto sobre o sinal TIM-3 em monócitos de concentrações variáveis desses anticorpos in- dividuais (excluindo SRF529).
[00222] FIG.6A é um gráfico que representa a inibição da expressão de PD-L1 mediada por IL-27 por tratamento de monócitos humanos com anticorpo anti-IL-27 conforme determinado por citometria de fluxo. FIG. 6B é um gráfico que representa a inibição dependente da dose da ex- pressão de PD-L1 mediada por IL-27 por tratamento de monócitos hu- manos com uma faixa de concentrações de um anticorpo anti-IL-27 que se liga especificamente ao monômero EBI3, conforme determinado por citometria de fluxo. FIG. 6€ é um gráfico que representa a inibição da expressão de TIM3 mediada por IL-27 por tratamento de monócitos hu- manos com anticorpo anti-IL-27 conforme determinado por citometria de fluxo. FIG. 6D é um gráfico que representa a inibição da expressão de PD-L1 mediada por IL-27 por tratamento de células T humanas em re- pouso com anticorpo anti-IL-27 conforme determinado por citometria de fluxo.
[00223] FIG.7Aé um gráfico de pontos que representa o número de nódulos metastáticos B16F10 de superfície pulmonar (nódulos pulmo- nares) de camundongos com tumor B16F 10 tratados com anticorpo anti- IL27 (SRF388), anticorpo de controle de isótipo, aanticorpo WS X-1 ou anticorpos aPD-1 e aCTLA-4 combinados, conforme indicado, con- forme determinado por contagem visual de nódulos de pulmões isolados de camundongos. FIG. 7B fornece um gráfico que representa a cinética de crescimento de tumores B16-Luc bioluminescentes em camundon- gos tratados com anticorpo anti-IL-27 (SRF 388) ou anticorpo de controle de isótipo, conforme determinado por análise de imageamento biolumi- nescente. FIG. 7C mostra uma série de imagens de tecido pulmonar seccionado fixo e corado com hematoxilina e eosina isolada de camun- dongos com tumor B16F 10 tratados com anticorpo anti-IL27 (SRF388), anticorpo de controle de isótipo, anticorpo aWSX-1 ou anticorpos aP D- 1 e aCTLA-4 combinados, conforme indicado. FIG. 7D é um gráfico de pontos que representa a área total do tumor como uma porcentagem de área de tecido total de tecido tumoral B16F10 de tecido pulmonar fixo, seccionado corado com hematoxilina e eosina isolado de camundongos com tumor B16F10 tratados com anticorpo anti-IL27 (SRF388), anti- corpo de controle de isótipo, aanticorpo WS X-1 ou aanticorpos PD-1 e aCTLA-4 combinados, conforme indicado, conforme determinado pelo software de análise de imagem. Uma redução semelhante no número de metástases pulmonares de superfície e área total do tumor foi obser- vada com bloqueio de anticorpos mediado por IL-27RA (WSX-1) e com terapia de combinação anti-PD-1+ anti-CTLA-4.
[00224] —FIG.8A fornece um gráfico de dispersão representando da- dos de microarranjo de genes com uma alteração de expressão > 1,0 log2 mudanças em vezes (pontos pretos) em esplenócitos isolados de camundongos com superexpressão de IL-27 após tratamento com mi- nicírculos de IL-27. FIG. 8B fornece um gráfico que representa o nível de expressão de genes imunomodulatórios selecionados, como indi- cado, em esplenócitos como na FIG. 8A. FIG. 8C mostra que a expres- são ectópica de I1L-27 humana induz a expressão de receptor inibidor em células T murinas in vivo e que SRF388 reduz a expressão de re- ceptor inibidor em células T in vivo após tratamento com minicírculo de IL-27. Camundongos Balb/c fêmeas de seis semanas de idade foram injetados com vetor vazio (controle) ou minicírculo hlL-27. (painéis su- perior esquerdo e direito) PBMCs e (painéis inferior esquerdo e direito) esplenócitos totais foram coletados 5 dias após a transfecção e as cé- lulas foram coradas e analisadas por citometria de fluxo. A expressão dos marcadores indicados foi analisada em células T CD4+ (painéis su- perior esquerdo e inferior esquerdo) e células T CD8+ (painéis superior direito e inferior direito). A análise foi realizada usando o software Flow] o. FIG. 8D mostra que SRF 388 inibe a detecção de I1L-27 humana derivada de minicírculo em plasma murino.
[00225] FIG.9 apresenta um resumo tabulado de propriedades sele- cionadas do anticorpo monoclonal.
[00226] FIG.10A apresenta um gráfico de sequências de anticorpos, com partição de sequência refletindo a numeração NT. FIG. 10B apre- senta um gráfico de sequências de anticorpos (correspondendo ao grá- fico de sequência da FIG. 10A), com a partição de sequência refletindo a numeração ImMunoGeneTics (IMGT). Em ambas as FIG. 10A e FIG. 10B, os aminoácidos destacados nas sequências de CDR mostram mu- tações da sequência codificada pela linhagem germinativa. Como será aparente para o versado na técnica, a numeração do anticorpo, inclu- indo a determinação de sequências de CDR, sequências estruturais, etc., pode ser realizada de uma série de maneiras reconhecidas na téc- nica, incluindo via sistemas de numeração NT e IMGT apresentados na FIG. 10A e FIG. 10B e empregados em outro lugar neste documento.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[00227] A presente descrição fornece, pelo menos em parte, molé- culas de anticorpo que se ligam à I1L-27 humana com alta afinidade e especificidade. Numa modalidade, são divulgados aqui anticorpos hu- manos que se ligam à IL-27. Os termos "IL-27" e "IL27", como utilizados neste documento, referem-se indistintamente à citocina heterodimérica, IL-27, que é composta por duas subunidades distintas, codificadas por dois genes diferentes: gene 3 induzido pelo vírus Epstein-Barr (EBI3) e IL-27p28. A I1L-27 possui propriedades pró- e anti-inflamatórias com di- versos efeitos nas células hematopoiéticas e não hematopoiéticas.
[00228] Por conseguinte, em um aspecto, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antago- niza a IL-27 humana, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo ou a porção de ligação ao antígeno do mesmo exibe pelo menos uma ou mais das seguintes propriedades: (1) se liga à IL-27 humana com uma constante de dissociação de equilíbrio (Kp) igual ou inferior a 15 nM; (ii) bloqueia a ligação de IL-27 ao receptor de IL-27; (iii) inibe ou reduz a fosforilação de STAT1 e/ou STAT3 em uma célula; (iv) inibe ou reduz a inibição mediada por IL-27 da expressão de CD161 numa célula; (v) inibe ou reduz a expressão de PD-L1 e/ou TIM-3 mediada por IL-27 em uma célula; (vi) induz ou intensifica a secreção mediada por PD-1 de uma ou mais citocinas de uma célula; e (vii) uma combinação de (i)-(vi).
[00229] Em outros aspectos, a descrição fornece um anticorpo mo- noclonal ou porção de ligação ao antígeno do mesmo que se liga espe- cificamente à IL-27 humana e inibe ou reduz uma atividade biológica da IL-27 ou sinalização da IL-27.
[00230] Aspectos adicionais da invenção incluem moléculas de ácido nucleico que codificam as moléculas de anticorpo, vetores de expres- são, células hospedeiras e métodos para fazer as moléculas de anti- corpo. Imunoconjugados, moléculas multi- ou biespecíficas e composi- ções farmacêuticas compreendendo as moléculas de anticorpo também são fornecidos. As moléculas de anticorpo anti-IL-27 aqui divulgadas podem ser usadas para tratar, prevenir e/ou diagnosticar distúrbios can- cerígenos ou malignos, por exemplo, tumores sólidos e líquidos (por exemplo, leucemia, por exemplo, linfoma, por exemplo, AML), câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de células não pequenas), câncer de pâncreas, câncer de mama (por exemplo, câncer de mama triplo negativo), melanoma, câncer de testículo, sarcoma, câncer de ca- beça e pescoço (por exemplo, câncer de cabeça e pescoço escamoso), câncer de fígado (por exemplo, carcinoma hepatocelular (HCC)), câncer colorretal, câncer de ovário, câncer no cérebro (por exemplo, glioblas- toma multiforme) ou câncer renal (por exemplo, carcinoma de células renais, por exemplo, carcinoma renal de células claras). Anticorpos anti-IL-27 e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos
[00231] A presente descrição fornece anticorpos, e porções de liga- ção ao antígeno dos mesmos, que se ligam especificamente à e anta- gonizam a IL-27, em particular IL-27 humana. São aqui fornecidos anti- corpos monoclonais isolados ou porção de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente à 11-27 humana, compreendendo CDRs da cadeia pesada e leve e sequências variáveis, conforme esta- belecido na Tabela 12.
[00232] Emalgumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza IL-27 humana, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo exibe pelo menos uma ou mais das seguintes propriedades: (i) se liga à IL-27 humana com uma constante de dissociação de equilíbrio (Kp) de 15 nM ou menos; (ii) bloqueia a ligação de IL-27 ao receptor de IL-27; (iii) inibe ou reduz à fosforilação de STAT1 e/ou STAT3 em uma célula; (iv) inibe ou reduz a inibição da expressão de CD161 em uma célula; (v) inibe ou reduz a expressão de PD-L1 e/ou TIM-3 em uma célula; (vi) induz ou intensifica a secreção mediada por PD-1 de uma ou mais citocinas de uma célula; e (vii) uma combinação de (i)-(vi).
[00233] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, se liga à IL-27 humana com uma constante de dissociação de equilíbrio (Kp) de 15 nM ou me- nos.
[00234] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, se liga à IL-27 humana recombinante ou à IL-27 murina.
[00235] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, inibe ou reduz a fosforila- ção de STAT1 e/ou STAT3 em uma célula. Em algumas modalidades, a célula é uma célula imune. Em algumas modalidades, a célula é uma célula cancerígena.
[00236] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, inibe ou reduz a inibição da expressão de CD161 em uma célula (por exemplo, melhora ou alivia a inibição da expressão de CD161 em uma célula). Em algumas moda- lidades, a célula é uma célula imune.
[00237] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, inibe ou reduz à expressão de PD-L1 e/ou TIM-3 em uma célula. Em algumas modalidades, a ex- pressão de PD-L1 é inibida ou reduzida. Em algumas modalidades, a expressão de TIM-3 é inibida ou reduzida. Em algumas modalidades, a expressão de PD-L1 e a expressão de TIM-3 são reduzidas. Em algu- mas modalidades, a célula é uma célula imune.
[00238] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, induz ou aumenta a se- creção mediada por PD-1 de uma ou mais citocinas de uma célula. Em algumas modalidades, a uma ou mais citocinas é TNFa. Em algumas modalidades, a uma ou mais citocinas é IL-6. Em algumas modalidades, a uma ou mais citocinas é TNFa e IL-6. Em algumas modalidades, a célula é uma célula imune.
[00239] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo IgG1, IgG2 e I9G3,I9G4 e IgM e IgAl e IgA2 e IgD e IgE. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo IgG1 ou um anticorpo I9G4. Em algumas modalidades, o anticorpo com- preende uma região constante da cadeia pesada de IgG1 do tipo selva- gem. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região constante da cadeia pesada de IgG4 de tipo selvagem. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende um domínio Fc que compreende pelo menos uma mutação. Em algumas modalidades, o anticorpo com- preende uma região constante da cadeia pesada de IgG1 mutante. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região constante da cadeia pesada de IgG4 mutante. Em algumas modalidades, a região constante da cadeia pesada de IgG4 mutante compreende qualquer uma das substituições S228P, L235E, L235A ou uma combinação dos mesmos, de acordo com à numeração da UE.
[00240] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga substancialmente ao mesmo epítopo em IL-27 que o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades acima mencionadas.
[00241] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga a pelo menos um dos resíduos de aminoácidos que compreen- dem IL-27 ligado pelo anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer um dos modalidades acima mencio- nadas.
[00242] Emalgumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que uma mutação do epítopo na IL-27 ligada pelo anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo inibe, reduz ou bloqueia a ligação ao anticorpo ou antígeno porção de ligação do mesmo e ao anticorpo ou porção de ligação do antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades mencionadas acima.
[00243] Emalgumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga a um epítopo na IL-27, em que o epítopo é o mesmo ou é seme- lhante ao epítopo ligado por uma molécula de anticorpo descrita na Ta- bela 12.
[00244] Emalgumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende CDRs das cadeias pesada e leve selecionadas do grupo que consiste em: (1) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 51, 52 e 53, respectivamente, e sequên- cias de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 59, 60 e 61, respectivamente; (1) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 73, 74 e 75, respectivamente, e sequên- cias de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID
NOs: 81, 82 e 83, respectivamente; (iii) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 95, 96 e 97, respectivamente, e sequên- cias de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 103, 104 e 105, respectivamente; (iv) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 117, 118 e 119, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 125, 126 e 127, respectivamente; (v) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 139, 140 e 141, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 147, 148 e 149, respectivamente; (vi) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 161, 162 e 163, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 169, 170 e 171, respectivamente; (vii) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 185, 186 e 187, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 193, 194 e 195, respectivamente; (viii) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 207, 208 e 209, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 215, 216 e 217, respectivamente; (ix) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 229, 230 e 231, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 237, 238 e 239, respectivamente;
(x) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 251, 252 e 253, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 259, 260 e 261, respectivamente; (xi) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 273, 274 e 275, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 281, 282 e 283, respectivamente; (xii) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 295, 296 e 297, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 303, 304 e 305, respectivamente; (xiii) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 317, 318 e 319, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 325, 326 e 327, respectivamente; (xiv) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 339, 340 e 341, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 347, 348 e 349, respectivamente; (xv) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 361, 362 e 363, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 369, 370 e 371, respectivamente; e (xvi) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 383, 384 e 385, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 391, 392 e 393, respectivamente.
[00245] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou a porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende CDRs das cadeias pesada e leve, em que as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 161, 162 e 163, respectivamente, e as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da ca- deia leve são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 169, 170 e 171, respecti- vamente.
[00246] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende CDRs das cadeias pesada e leve selecionadas do grupo que consiste em: (1) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 54, 55 e 56, respectivamente, e sequên- cias de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 62, 63 e 64, respectivamente; (1) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 76, 77 e 78, respectivamente, e sequên- cias de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 84, 85 e 86, respectivamente; (iii) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada estabeleci- das nas SEQ ID NOs: 98, 99 e 100, respectivamente, e sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 106, 107 e 108, respectivamente; (iv) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 120, 121 e 122, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 128, 129 e 130, respectivamente; (v) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es-
tabelecidas nas SEQ ID NOs: 142, 143 e 144, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 150, 151 e 152, respectivamente;
(vi) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 164, 165 e 166, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 172, 173 e 174, respectivamente;
(vii) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 188, 189 e 190, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 196, 197 e 198, respectivamente;
(viii) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 210, 211 e 212, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 218, 219 e 220, respectivamente;
(ix) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 232, 233 e 234, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 240, 241 e 242, respectivamente;
(x) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 254, 255 e 256, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 262, 263 e 264, respectivamente;
(xi) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 276, 277 e 278, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 284, 285 e 286, respectivamente;
(xii) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 298, 299 e 300, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas
SEQ ID NOs: 306, 307 e 308, respectivamente; (xiii) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 320, 321 e 322, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 328, 329 e 330, respectivamente; (xiv) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 342, 343 e 344, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 350, 351 e 352, respectivamente; (xv) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 364, 365 e 366, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 372, 373 e 374, respectivamente; e (xvi) sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 386, 387 e 388, respectivamente, e se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 394, 395 e 396, respectivamente.
[00247] Emalgumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou a porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende CDRs das cadeias pesada e leve, em que as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 164, 165 e 166, respectivamente, e as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da ca- deia leve são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 172, 173 e 174, respecti- vamente.
[00248] Emalgumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende CDRs das cadeias pesadas e leves, em que as sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada são SYSMS (SEQ ID NO:23), YISYDGGSAYYPDTVKG (SEQ ID NO: 24) e HGDYDDDDAMDY (SEQ ID NO: 25), respectivamente, e em que as sequências de aminoácidos da cadeia leve CDR1, CDR2 e CDR3 são RASENIYSYLA (SEQ ID NO: 26), NAETLTE (SEQ ID NO: 27) e QHHYGTPLT (SEQ ID NO: 28), res- pectivamente.
[00249] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende regiões variáveis da cadeia pesada e leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 57, 79, 101, 123, 145, 167, 191, 213,235, 257, 279, 301,323,345, 367 e 389; e em que a região variável da cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos selecio- nada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 65, 87, 109, 131, 153, 175, 199, 221, 243, 265, 287, 309, 331, 353, 375 e 397.
[00250] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende regiões variáveis das cadeias pesada e leve compreendendo sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em: (1) SEQ ID NO: 57 e 65, respectivamente; (1) SEQ ID NO: 79 e 87, respectivamente; (iii) SEQ ID NO: 101 e 109, respectivamente; (iv) SEQ ID NO: 123 e 131, respectivamente; (v) SEQ ID NO: 145 e 153, respectivamente; (vi) SEQ ID NO: 167 e 175, respectivamente;
(vii) SEQ ID NO: 191 e 199, respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 213 e 221, respectivamente; (ix) SEQ ID NO: 235 e 243, respectivamente; (x) SEQ ID NO: 257 e 265, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 279 e 287, respectivamente; (xii) SEQ ID NO: 301 e 309, respectivamente; (xiii) SEQ ID NO: 323 e 331, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 345 e 353, respectivamente; (xv) SEQ ID NO: 367 e 375, respectivamente; e (xvi) SEQ ID NO: 389 e 397, respectivamente.
[00251] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a I1L-27 humana, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende regiões variáveis da cadeia pesada e leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos, que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 57, 79, 101, 123, 145, 167, 191, 213, 235, 257,279,301,323,345,367 e 389; e em que a região variável da cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 65, 87, 109, 131, 153, 175, 199, 221, 243, 265, 287, 309, 331, 353, 375 e 397.
[00252] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende regiões variáveis das cadeias leve e pesada compreendendo sequências de aminoácidos pelo menos 90% idênticas às sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em:
(1) SEQ ID NO: 57 e 65, respectivamente; (1) SEQ ID NO: 79 e 87, respectivamente; (iii) SEQ ID NO: 101 e 109, respectivamente; (iv) SEQ ID NO: 123 e 131, respectivamente; (v) SEQ ID NO: 145 e 153, respectivamente; (vi) SEQ ID NO: 167 e 175, respectivamente; (vii) SEQ ID NO: 191 e 199, respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 213 e 221, respectivamente; (ix) SEQ ID NO: 235 e 243, respectivamente; (x) SEQ ID NO: 257 e 265, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 279 e 287, respectivamente; (xii) SEQ ID NO: 301 e 309, respectivamente; (xiii) SEQ ID NO: 323 e 331, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 345 e 353, respectivamente; (xv) SEQ ID NO: 367 e 375, respectivamente; e (xvi) SEQ ID NO: 389 e 397, respectivamente.
[00253] Emalgumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende regiões variáveis das cadeias leve e pesada compreendendo sequências ácidas estabelecidas na SEQ ID NO: 167 e 175, respectivamente.
[00254] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende regiões variáveis das cadeias leve e pesada compreendendo sequências de aminoácidos pelo menos 90% idênticas às sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NO: 167 e 175, respectivamente.
[00255] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 67, 89, 111, 133, 155, 177, 201, 223, 245, 267, 289, 311, 333, 355, 377 e 399; e em que a cadeia leve compreende uma sequên- cia de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 69, 91, 113, 135, 157, 179, 203, 225, 247, 269, 291, 313, 335, 357, 379 e 401.
[00256] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno ao mesmo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à se- quência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 67, 89, 111, 133, 155, 177, 201, 223, 245, 267, 289, 311, 333, 355, 377 e 399; e em que a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoáci- dos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 69, 91, 113, 135, 157, 179, 203, 225, 247, 269, 291, 313, 335, 357, 379 e 401.
[00257] Emalgumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 71, 93, 115, 137, 159, 181, 205, 227, 249, 271, 293, 315,
337, 359, 381 e 403; e em que a cadeia leve compreende uma sequên- cia de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 69, 91, 113, 135, 157, 179, 203, 225, 247, 269, 291, 313, 335, 357, 379 e 401.
[00258] Emalgumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno ao mesmo compreende uma cadeia pesada e uma leve, em que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 71,93, 115, 137, 159, 181, 205, 227, 249, 271, 293, 315, 337, 359, 381 e 403; e em que a cadeia leve compreende uma sequência de aminoá- cidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos se- lecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 69, 91, 113, 135, 157, 179, 203, 225, 247, 269, 291, 313, 335, 357, 379 e 401.
[00259] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve compreendendo sequências de ami- noácidos selecionadas do grupo que consiste em: (1) SEQ ID NO: 67 e 69, respectivamente; (1) SEQ ID NO: 89 e 91, respectivamente; (iii) SEQ ID NO: 111 e 113, respectivamente; (iv) SEQ ID NO: 133 e 135, respectivamente; (v) SEQ ID NO: 155 e 157, respectivamente; (vi) SEQ ID NO: 177 e 179, respectivamente; (vii) SEQ ID NO: 201 e 203, respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 223 e 225, respectivamente;
(ix) SEQ ID NO: 245 e 247, respectivamente; (x) SEQ ID NO: 267 e 269, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 289 e 291, respectivamente; (xii) SEQ ID NO: 311 e 313, respectivamente; (xiii) SEQ ID NO: 333 e 335, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 355 e 357, respectivamente; (xv) SEQ ID NO: 377 e 379, respectivamente; e (xvi) SEQ ID NO: 399 e 401, respectivamente.
[00260] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve compreendendo sequências de ami- noácidos pelo menos 90% idênticas às sequências de aminoácidos se- lecionadas do grupo que consiste em: (1) SEQ ID NO: 67 e 69, respectivamente; (1) SEQ ID NO: 89 e 91, respectivamente; (iii) SEQ ID NO: 111 e 113, respectivamente; (iv) SEQ ID NO: 133 e 135, respectivamente; (v) SEQ ID NO: 155 e 157, respectivamente; (vi) SEQ ID NO: 177 e 179, respectivamente; (vii) SEQ ID NO: 201 e 203, respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 223 e 225, respectivamente; (ix) SEQ ID NO: 245 e 247, respectivamente; (x) SEQ ID NO: 267 e 269, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 289 e 291, respectivamente; (xii) SEQ ID NO: 311 e 313, respectivamente; (xiii) SEQ ID NO: 333 e 335, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 355 e 357, respectivamente; (xv) SEQ ID NO: 377 e 379, respectivamente; e
(xvi) SEQ ID NO: 399 e 401, respectivamente.
[00261] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada e uma leve compreendendo sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em: (1) SEQ ID NO: 71 e 69, respectivamente; (1) SEQ ID NO: 93 e 91, respectivamente; (iii) SEQ ID NO: 115 e 113, respectivamente; (iv) SEQ ID NO: 137 e 135, respectivamente; (v) SEQ ID NO: 159 e 157, respectivamente; (vi) SEQ ID NO: 181 e 179, respectivamente; (vii) SEQ ID NO: 205 e 203, respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 227 e 225, respectivamente; (ix) SEQ ID NO: 249 e 247, respectivamente; (x) SEQ ID NO: 271 e 269, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 293 e 291, respectivamente; (xii) SEQ ID NO: 315 e 313, respectivamente; (xiii) SEQ ID NO: 337 e 335, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 359 e 357, respectivamente; (xv) SEQ ID NO: 381 e 379, respectivamente; e (xvi) SEQ ID NO: 403 e 401, respectivamente.
[00262] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a I1L-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada e uma leve compreendendo sequências de aminoácidos pelo menos 90% idênticas às sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em:
(1) SEQ ID NO: 71 e 69, respectivamente; (1) SEQ ID NO: 93 e 91, respectivamente; (iii) SEQ ID NO: 115 e 113, respectivamente; (iv) SEQ ID NO: 137 e 135, respectivamente; (v) SEQ ID NO: 159 e 157, respectivamente; (vi) SEQ ID NO: 181 e 179, respectivamente; (vii) SEQ ID NO: 205 e 203, respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 227 e 225, respectivamente; (ix) SEQ ID NO: 249 e 247, respectivamente; (x) SEQ ID NO: 271 e 269, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 293 e 291, respectivamente; (xii) SEQ ID NO: 315 e 313, respectivamente; (xiii) SEQ ID NO: 337 e 335, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 359 e 357, respectivamente; (xv) SEQ ID NO: 381 e 379, respectivamente; e (xvi) SEQ ID NO: 403 e 401, respectivamente.
[00263] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve compreendendo sequências ácidas estabelecidas na SEQ ID NO: 177 e 179, respectivamente.
[00264] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve compreendendo sequências de ami- noácidos pelo menos 90% idênticas às sequências de aminoácidos es- tabelecidas nas SEQ ID NO: 177 e 179, respectivamente.
[00265] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada e uma leve compreendendo sequências ácidas estabe- lecidas na SEQ ID NO: 181 e 179, respectivamente.
[00266] Em algumas modalidades, a descrição fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve compreendendo sequências de ami- noácidos pelo menos 90% idênticas às sequências de aminoácidos es- tabelecidas nas SEQ ID NO: 181 e 179, respectivamente. Métodos para a produção de anticorpos anti-IL-27 e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos
[00267] A descrição também apresenta métodos para a produção de qualquer um dos anticorpos anti-IL-27 ou fragmentos de ligação ao an- tígeno dos mesmos aqui descritos. Em algumas modalidades, os méto- dos para a preparação de um anticorpo aqui descrito podem incluir imu- nizar um sujeito (por exemplo, um mamífero não humano) com um imunógeno apropriado. Imunógenos adequados para gerar qualquer um dos anticorpos aqui descritos são estabelecidos aqui. Por exemplo, para gerar um anticorpo que se liga à IL-27, um versado na técnica pode imunizar um sujeito adequado (por exemplo, um mamífero não humano, como um rato, um camundongo, um gerbo, um hamster, um cão, um gato, um porco, uma cabra, um cavalo ou um primata não humano) com IL-27. Em algumas modalidades, um polipeptídeo monômero IL-27 EBI3 humano de comprimento total compreendendo a sequência de aminoá- cidos estabelecida na SEQ ID NO: 97 é usado como o imunógeno. Em algumas modalidades, um polipeptídeo monômero IL-27p28 humano de comprimento total compreendendo a sequência de aminoácidos esta- belecida em SEQ ID NO: 98 é usado como o imunógeno.
[00268] Um sujeito adequado (por exemplo, um mamífero não hu- mano) pode ser imunizado com o antígeno apropriado juntamente com imunizações de reforço subsequentes várias vezes suficientes para pro- vocar a produção de um anticorpo pelo mamífero. O imunógeno pode ser administrado a um sujeito (por exemplo, um mamífero não humano) com um adjuvante. Adjuvantes úteis na produção de um anticorpo em um sujeito incluem, mas não estão limitados a, adjuvantes proteicos; adjuvantes bacterianos, por exemplo, bactérias inteiras (BCG, Coryne- bacterium parvum ou Salmonella minnesota) e componentes bacteria- nos, incluindo espinha dorsal da parede celular, dimerolato de trealose, monofosforil lipídeo A, resíduo extraível com metanol (MER) do bacilo tuberculoso, adjuvante completo ou incompleto de Freund; adjuvantes virais; adjuvantes químicos, por exemplo, hidróxido de alumínio e iodo- acetato e hemisuccinato de colesteril. Outros adjuvantes que podem ser utilizados nos métodos para induzir uma resposta imune incluem, por exemplo, proteínas da toxina do cólera e parapoxvírus. Ver também Bieg et al. (1999) Autoimmunity 31(1):15-24. Ver também, por exemplo, Lodmell et al. (2000) Vaccine 18:1059-1066;) ohnson etal. (1999)/ Med Chem 42:4640-4649; Baldridge et al. (1999) Methods 19:103-107; and Gupta et al. (1995) Vaccine 13(14): 1263-1276.
[00269] Em algumas modalidades, os métodos incluem preparar uma linhagem celular de hibridoma que secreta um anticorpo monoclo- nal que se liga ao imunógeno. Por exemplo, um mamífero adequado, como um camundongo de laboratório, é imunizado com um polipeptídeo IL-27 como descrito acima. As células produtoras de anticorpos (por exemplo, células B do baço) do mamífero imunizado podem ser isoladas dois a quatro dias após pelo menos uma imunização de reforço do imunógeno e depois cultivadas brevemente em cultura antes da fusão com células de uma linhagem celular de mieloma adequada. As células podem ser fundidas na presença de um promotor de fusão, como, por exemplo, vírus vaccinia ou polietileno glicol. As células híbridas obtidas na fusão são clonadas e os clones celulares que secretam os anticorpos desejados são selecionados. Por exemplo, as células do baço de ca- mundongos Balb/c imunizados com um imunógeno adequado podem ser fundidas com células da linhagem celular de mieloma PAI ou com à linhagem celular de mieloma S p2/0-Ag 14. Após a fusão, as células são expandidas em meio de cultura adequado, que é suplementado com um meio de seleção, por exemplo, meio HAT, em intervalos regulares, a fim de impedir que as células normais de mieloma cresçam demais nas cé- lulas de hibridoma desejadas. As células híbridas obtidas são então pes- quisadas quanto à secreção dos anticorpos desejados, por exemplo, um anticorpo que se liga ao IL-27 humano e, em algumas modalidades, um versado pode identificar um anticorpo anti-IL-27 a partir de uma biblio- teca não imune, como descrito em, por exemplo, Patente US 6.300.064 (de Knappik et al.; Morphosys AG) and Schoonbroodt et al. (2005) Nu- cleic Acids Res 33(9):e81.
[00270] Emalgumas modalidades, os métodos aqui descritos podem envolver ou ser usados em conjunto com, por exemplo, tecnologias de exibição de fagos, exibição bacteriana, exibição de superfície de leve- dura, exibição viral eucariótica, exibição de células de mamíferos e téc- nicas de rastreio de anticorpo sem células (por exemplo, exibição ribos- sômica) (ver, por exemplo, Etz et al. (2001) / Bacteriol 183:6924-6935; Cornelis (2000) Curr Opin Biotechnol 11:450-454; Klemm et al. (2000) Microbiology 146:3025-3032; Kieke et al. (1997) Protein Eng 10:1303- 1310; Yeung et al. (2002) Biotechnol Prog 18:212-220; Boder et al. (2000) Methods E nzymology 328:430-444; Grabherr et al. (2001) Comb Chem High Throughput Screen 4:185-192; Michael et al. (1995) Gene Ther2:660-668; P ereboev et al. (2001) ) Virol 75:7107-7113; Schaffitzel et al. (1999) / Immunol Methods 231:119-135; and Hanes et al. (2000) Nat Biotechnol 18: 1287-1292).
[00271] Os métodos para identificar anticorpos utilizando vários mé- todos de exibição de fagos são conhecidos na técnica. Nos métodos de exibição de fagos, os domínios funcionais de anticorpos são apresenta- dos na superfície das partículas de fagos que transportam as sequên- cias de polinucleotídeos que os codificam. Esse fago pode ser utilizado para exibir domínios de anticorpos que se ligam ao antígeno, como Fab, Fv ou fragmentos de anticorpo Fv estabilizados na ligação dissulfeto, expressos a partir de um repertório ou de uma biblioteca combinatória de anticorpos (por exemplo, humano ou murino). Os fagos utilizados nestes métodos são tipicamente fagos filamentosos, tais como fd e M13. Os domínios de ligação ao antígeno são expressos como uma proteína fundida de forma recombinante a qualquer uma das proteínas de reves- timento do fago pill, pVIll ou plX. Ver, por exemplo, Shi et al. (2010) / MB 397:385-396. Exemplos de métodos de exibição de fagos que podem ser utilizados para produzir imunoglobulinas, ou fragmentos dos mes- mos, aqui descritos incluem os divulgados em Brinkman et al. (1995) J Immunol Methods 182:41-50; Ames et al. (1995) / Immunol Methods 184:177-186; Kettleborough et al. (1994) Eur) Immunol 24:952-958; Persic et al. (1997) Gene 187:9-18; Burton et al. (1994) Advances in Immunology 57:191-280; e publicações PCT WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982, e WO 95/20401. Métodos adequados também são descritos em, por exemplo, Patente US 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717;
5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637;
5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 e 5.969.108.
[00272] Em algumas modalidades, as bibliotecas de anticorpos de exibição de fagos podem ser geradas usando mMRNA coletado de célu- las B dos mamíferos imunizados. Por exemplo, uma amostra de células esplênicas compreendendo células B pode ser isolada de camundongos imunizados com polipeptídeo IL-27 como descrito acima. O MRNA pode ser isolado das células e convertido em cDNA usando técnicas padrão de biologia molecular. Veja, por exemplo, Sambrook et al. (1989) “Mo- lecular Cloning: A Laboratory Manual, 2"º Edition,” Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Harlow and Lane (1988), supra; Benny K. C. Lo (2004), supra; and Borrebaek (1995), supra. O CDNA que codifica para as regiões variáveis dos polipeptídeos de ca- deia pesada e cadeia leve de imunoglobulinas é usado para construir a biblioteca de exibição de fagos. Os métodos para gerar essa biblioteca são descritos em, por exemplo, Merz et al. (1995) / Neurosci Methods 62(1-2):213-9; Di Niro et al. (2005) Biochem J 388(Pt 3):889—894; and Engberg et al. (1995) Methods Mol Biol 51:355-376.
[00273] Em algumas modalidades, uma combinação de seleção e rastreio pode ser empregada para identificar um anticorpo de interesse de, por exemplo, uma população de anticorpos derivados de hibridoma ou uma biblioteca de anticorpos de exibição de fagos. Os métodos ade- quados são conhecidos na técnica e são descritos em, por exemplo, Hoogenboom (1997) Trends in Biotechnology 15:62-70; Brinkman etal. (1995), supra; Ames et al. (1995), supra; Kettleborough et al. (1994), supra; Persic et al. (1997), supra; and Burton et al. (1994), supra. Por exemplo, uma pluralidade de vetores de fagemídeos, cada um codifi- cando uma proteína de fusão de uma proteína de revestimento de bac- teriófago (por exemplo, pill, pVIll ou plX de fago M13) e uma região de combinação de antígeno diferente são produzidas usando técnicas pa- drão de biologia molecular e depois introduzidas em uma população de bactérias (por exemplo, E. coli). A expressão do bacteriófago em bacté- rias pode, em algumas modalidades, exigir o uso de um fago auxiliar. Em algumas modalidades, nenhum fago auxiliar é necessário (ver, por exemplo, Chasteen et al., (2006) Nucleic Acids Res 34(21):e145). Os fagos produzidos a partir das bactérias são recuperados e depois con- tatados com, por exemplo, um antígeno-alvo ligado a um suporte sólido (imobilizado). O fago também pode ser contatado com o antígeno em solução, e o complexo é subsequentemente ligado a um suporte sólido.
[00274] Uma subpopulação de anticorpos rastreados usando os mé- todos acima pode ser caracterizada por sua especificidade e afinidade de ligação a um antígeno específico (por exemplo, I1L27 humana) usando qualquer método imunológico ou bioquímico conhecido na téc- nica. Por exemplo, a ligação específica de um anticorpo a IL-27, pode ser determinada, por exemplo, usando métodos imunológicos ou bioquí- micos, tais como, mas não limitados a, um ensaio ELISA, ensaios SPR, ensaio de imunoprecipitação, cromatografia de afinidade e diálise de equilíbrio, como descrito acima. Os imunoensaios que podem ser usa- dos para analisar a ligação imunoespecífica e a reatividade cruzada dos anticorpos incluem, mas não estão limitados a, sistemas de ensaios competitivos e não competitivos usando técnicas como Western blots, RIA, ELISA (ensaio imunossorvente ligado a enzima), imunoensaios em "sanduíche", ensaios de imunoprecipitação, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação, ensaios de fixação de complemento, ensaios imunorradiométricos, imunoensaios fluorescentes e imunoensaios de proteína A. Tais ensaios são rotineiros e bem conhecidos na técnica.
[00275] Entende-se que os métodos acima também podem ser utili- zados para determinar se, por exemplo, um anticorpo anti-IL-27 não se liga a proteínas I1L-27 e/ou IL-27 humanas e/ou de comprimento total.
[00276] Nas modalidades em que as sequências de aminoácidos CDR selecionadas são sequências curtas (por exemplo, menos que 10 a 15 aminoácidos de comprimento), os ácidos nucleicos que codificam as CDRs podem ser quimicamente sintetizados como descrito em, por exemplo, Shiraishi et al. (2007) Nucleic Acids Symposium Series 51(1):129-130 e Patente US 6.995.259. Para uma dada sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo aceitador, a região da sequên- cia de ácido nucleico que codifica as CDRs pode ser substituída pelos ácidos nucleicos sintetizados quimicamente usando técnicas padrão de biologia molecular. As extremidades 5' e 3' dos ácidos nucleicos sinteti- zados quimicamente podem ser sintetizadas para compreender os sítios das enzimas de restrição da extremidade pegajosa para uso na clona- gem dos ácidos nucleicos no ácido nucleico que codifica a região variá- vel do anticorpo doador.
[00277] Emalgumas modalidades, os anticorpos anti-IL-27 aqui des- critos compreendem uma região constante da cadeia pesada alterada que possui função efetora reduzida (ou nenhuma) em relação à sua re- gião constante inalterada correspondente. As funções efetoras que en- volvem a região constante do anticorpo anti-IL-27 podem ser moduladas alterando as propriedades da região constante ou Fc. As funções efeto- ras alteradas incluem, por exemplo, uma modulação em uma ou mais das seguintes atividades: citotoxicidade celular dependente de anti- corpo (ADCC), citotoxicidade dependente de complemento (CDC), apo- ptose, ligação a um ou mais receptores Fc e respostas pró-inflamatórias. A modulação refere-se a um aumento, diminuição ou eliminação de uma atividade da função efetora exibida por um anticorpo sujeito contendo uma região constante alterada em comparação com a atividade da forma inalterada da região constante. Em modalidades particulares, a modulação inclui situações nas quais uma atividade é abolida ou com- pletamente ausente.
[00278] Emuma modalidade, os anticorpos anti-IL-27 aqui descritos compreendem uma região constante de cadeia pesada de IgG4. Numa modalidade, a região constante da cadeia pesada de I9G4 é uma região constante da cadeia pesada de IgG4 do tipo selvagem. Em outra moda- lidade, a região constante de IgG4 compreende uma mutação, por exemplo, um ou ambos de S228P e L235E ou L235A, por exemplo, de acordo com a numeração da UE (Kabat, EA, et al., Supra). Sequências representativas para uso em anticorpos da descrição de regiões cons- tantes de IgG4 de tipo selvagem e mutante são estabelecidas na Tabela
12. Em uma modalidade, os anticorpos anti-IL-27 aqui descritos com- preendem uma região constante IgG1. Numa modalidade, a região constante da cadeia pesada de IgG1 é uma região constante da cadeia pesada de IgG1 do tipo selvagem. Noutra modalidade, a região cons- tante da cadeia pesada de IgG1 compreende uma mutação. S equências representativas para uso em anticorpos da descrição de regiões cons- tantes de IgG4 de tipo selvagem e mutante são estabelecidas na Tabela
12.
[00279] Uma região constante alterada com afinidade de ligação ao FCcR alterada e/ou atividade ADCC e/ou atividade CDC alterada é um polipeptídeo que possui uma atividade de ligação FcR intensificada ou diminuída e/ou atividade ADCC e/ou atividade CDC em comparação com a forma inalterada da região constante. Uma região constante alte- rada que exibe ligação aumentada a um FcR liga pelo menos um FCR com maior afinidade do que o polipeptídeo inalterado. Uma região cons- tante alterada que exibe ligação reduzida a um FCR liga pelo menos um FcR com afinidade menor do que a forma inalterada da região cons- tante. Tais variantes que exibem ligação reduzida a um FCR podem pos- suir pouca ou nenhuma ligação apreciável a um FcR, por exemplo, 0 a 50% (por exemplo, menos que 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22,21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1%) da ligação ao FCR em comparação com o nível de ligação de uma sequên- cia nativa constante de imunoglobulina ou região Fc ao FCR. Da mesma forma, uma região constante alterada que exibe atividade ADCC e/ou CDC modulada pode exibir atividade ADCC e/ou CDC aumentada ou reduzida em comparação com a região constante inalterada. Por exem- plo, em algumas modalidades, o anticorpo anti-IL-27 compreendendo uma região constante alterada pode exibir aproximadamente O a 50% (por exemplo, menos que 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21,20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1%) da atividade ADCC e/ou CDC da forma inalterada da região constante. Um anticorpo anti-IL-27 descrito aqui compreendendo uma região constante alterada exibindo ADCC e/ou CDC reduzido pode exibir atividade ADCC e/ou CDC reduzida ou inexistente.
[00280] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL-27 aqui des- crito exibe função efetora reduzida ou inexistente. Em algumas modali- dades, um anticorpo anti-IL-27 compreende uma região constante hí- brida, ou uma porção da mesma, como uma região constante híbrida G2/G4 (ver, por exemplo, Burton et al. (1992) Adv Immun 51:1-18; Can- field et al. (1991) / Exp Med 173:1483-1491; and Mueller et al. (1997) Mol Immunol! 34(6):441-452). Consulte acima.
[00281] Emalgumas modalidades, um anticorpo anti-IL-27 pode con- ter uma região constante alterada exibindo citotoxicidade dependente de complemento aumentada ou reduzida (CDC). A atividade modulada do CDC pode ser alcançada através da introdução de uma ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácidos em uma região Fc do anticorpo. Ver, por exemplo, patente US 6.194.551. Alternativa ou adicionalmente, os resíduos de cisteína podem ser introduzidos na re- gião Fc, permitindo assim a formação de ligações dissulfeto intercadeia nesta região. O anticorpo homodimérico assim gerado pode ter capaci- dade de internalização melhorada ou reduzida e/ou aumento ou dimi- nuição da morte celular mediada por complemento. Veja, por exemplo, Caron et al. (1992) | Exp Med 176:1191-1195 and Shopes (1992) Im- munol 148:2918-2922; publicação PCT WO 99/51642 and WO
94/29351; Duncan and Winter (1988) Nature 322:738-40; e Patente US
5.648.260 e 5.624.821. Expressão e purificação de anticorpos recombinantes
[00282] Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui descritos podem ser produzidos usando uma variedade de técnicas conhecidas na técnica da biologia molecular e química de proteínas. Por exemplo, um ácido nucleico que codifica um ou ambos os polipeptídeos da cadeia pesada e da cadeia leve de um anticorpo pode ser inserido em um vetor de expressão que contém sequências regulatórias da transcrição e da tradução, que incluem, por exemplo, sequências promotoras, sítios de ligação ribossômica, sequências de início e parada da transcrição, sequências de início e parada da tradu- ção, sinais do terminador da transcrição, sinais de poliadenilação e se- quências intensificadoras ou ativadoras. As sequências regulatórias in- cluem um promotor e sequências de início e parada da transcrição. Além disso, o vetor de expressão pode incluir mais de um sistema de replicação, de modo que possa ser mantido em dois organismos dife- rentes, por exemplo, em células de mamíferos ou insetos para expres- são e em um hospedeiro procariótico para clonagem e amplificação.
[00283] Estão disponíveis vários sistemas vetoriais possíveis para a expressão de polipeptídeos de cadeia pesada e cadeia leve clonados a partir de ácidos nucleicos em células de mamíferos. Uma classe de ve- tores depende da integração das sequências genéticas desejadas no genoma da célula hospedeira. As células que possuem DNA integrado de maneira estável podem ser selecionadas pela introdução simultânea de genes de resistência a fármacos como E. coli gpt (Mulligan and Berg (1981) Proc Natl Acad Sci USA 78:2072) or Tn5 neo (Southern and Berg (1982) Mol Appl Genet 1:327). O gene marcador selecionável pode ser ligado às sequências de genes de DNA a serem expressas ou introdu- zido na mesma célula por cotransfecção (Wigler et al. (1979) Cell 16:77).
Uma segunda classe de vetores utiliza elementos de DNA que conferem capacidades de replicação autônoma a um plasmídeo extracromossô- mico. Esses vetores podem ser derivados de vírus animais, como o pa- pilomavírus bovino (Sarver et al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA, 79:7147), citomegalovírus, polioma vírus (Deans et al. (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:1292), ou vírus SV40 (Lusky and Botchan (1981) Na- ture 293:79).
[00284] Os vetoresde expressão podem ser introduzidos nas células de uma maneira adequada para a expressão subsequente do ácido nu- cleico. O método de introdução é amplamente ditado pelo tipo de célula alvo, discutido abaixo. Métodos exemplificativos incluem precipitação de CaPOu, fusão de lipossomas, lipossomas catiônicos, eletroporação, in- fecção viral, transfecção mediada por dextrano, transfecção mediada por polibeno, fusão de protoplasto e microinjeção direta.
[00285] As células hospedeiras apropriadas para a expressão de an- ticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos incluem cé- lulas de levedura, bactérias, insetos, plantas e mamíferos. De particular interesse são bactérias como E. coli, fungos como Saccharomyces ce- revisiae e Pichia pastoris, células de inseto como SF9, linhagens celu- lares de mamíferos (por exemplo, linhagens celulares humanas), bem como linhagens celulares primárias.
[00286] Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento do mesmo pode ser expresso e purificado de animais transgênicos (por exemplo, mamíferos transgênicos). Por exemplo, um anticorpo pode ser produzido em mamíferos transgênicos não humanos (por exemplo, roe- dores) e isolado do leite, como descrito em, por exemplo, Houdebine (2002) Curr Opin Biotechnol 13(6):625-629; van Kuik-Romeijn et al. (2000) Transgenic Res 9(2):155-159; e Pollock et al. (1999) / Immunol Methods 231(1-2):147-157.
[00287] Os anticorpos e fragmentos dos mesmos podem ser produ- zidos a partir das células cultivando uma célula hospedeira transfor- mada com o vetor de expressão contendo ácido nucleico que codifica os anticorpos ou fragmentos, sob condições e por um período de tempo suficiente para permitir a expressão das proteínas. Tais condições para a expressão da proteína variarão com a escolha do vetor de expressão e da célula hospedeira e serão facilmente verificadas por um versado na técnica através de experimentação de rotina. Por exemplo, os anti- corpos expressos em E. coli podem ser redobrados a partir de corpos de inclusão (ver, por exemplo, Hou et al. (1998) Cytokine 10:319-30). Os sistemas e métodos de expressão bacteriana para a sua utilização são bem conhecidos na técnica (ver Current Protocols in Molecular Bio- logy, Wiley & Sons, and Molecular Cloning--A Laboratory Manual --3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001)). A escolha de códons, vetores de expressão adequados e células hospedeiras ade- quadas variará dependendo de vários fatores e pode ser facilmente oti- mizada conforme necessário. Um anticorpo (ou fragmento do mesmo) aqui descrito pode ser expresso em células de mamíferos ou em outros sistemas de expressão, incluindo, mas não limitado a leveduras, bacu- lovírus e sistemas de expressão in vitro (ver, por exemplo, Kaszubska et al. (2000) Protein Expression and Purification 18:213-220).
[00288] Após a expressão, os anticorpos e fragmentos dos mesmos podem ser isolados. Um anticorpo ou fragmento do mesmo pode ser isolado ou purificado de várias maneiras conhecidas pelos versados na técnica, dependendo de quais outros componentes estão presentes na amostra. Os métodos padrão de purificação incluem técnicas eletrofo- réticas, moleculares, imunológicas e cromatográficas, incluindo croma- tografia de troca iônica, hidrofóbica, de afinidade e HPLC de fase re- versa. Por exemplo, um anticorpo pode ser purificado usando uma co- luna antianticorpo padrão (por exemplo, uma coluna de proteína A ou proteína G). Técnicas de ultrafiltração e diafiltração, em conjunto com a concentração de proteínas, também são úteis. Ver, por exemplo, Scopes (1994) “Protein Purification, 3" edition,” Springer-Verlag, New York City, New York. O grau de purificação necessário variará depen- dendo do uso desejado. Em alguns casos, não será necessária a purifi- cação do anticorpo expresso ou fragmentos dos mesmos.
[00289] Os métodos para determinar o rendimento ou pureza de um anticorpo purificado ou fragmento do mesmo são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, ensaio de Bradford, espectroscopia UV, ensaio de proteína Biuret, ensaio de proteína Lowry, ensaio de proteína amido preto, cromatografia líquida de alta pressão (HPLC), espectrometria de massa (MS) e métodos eletroforéticos em gel (por exemplo, usando uma mancha de proteína como Coomassie Blue ou mancha de prata coloidal).
Modificação dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno
[00290] Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos podem ser modificados após sua expressão e purificação. As modificações podem ser modificações covalentes ou não covalentes. Tais modificações podem ser introduzidas nos anticorpos ou fragmen- tos, por exemplo, reagindo resíduos de aminoácidos direcionados do polipeptídeo com um agente de derivação orgânico que é capaz de re- agir com cadeias laterais selecionadas ou resíduos terminais. Sítios adequados para modificação podem ser escolhidos usando qualquer um de uma variedade de critérios, incluindo, por exemplo, análise estru- tural ou análise de sequência de aminoácidos dos anticorpos ou frag- mentos.
[00291] Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos podem ser conjugados com uma fra- ção heteróloga. A fração heteróloga pode ser, por exemplo, um polipep- tídeo heterólogo, um agente terapêutico (por exemplo, uma toxina ou um fármaco) ou uma etiqueta detectável, como, mas não limitado a, uma etiqueta radioativa, uma etiqueta enzimática, uma etiqueta fluorescente, uma etiqueta de metal pesado, uma etiqueta luminescente ou uma eti- queta de afinidade, como biotina ou estreptavidina. Os polipeptídeos he- terólogos adequados incluem, por exemplo, um marcador antigênico (FLAG (DYKDDDDK (SEQ ID NO: 405)), poli-histidina (6-His; HHHHHH (SEQ ID NO: 406), hemaglutinina (HA; YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 407)), glutationa-S-transferase (GST) ou proteína de ligação à maltose (MBP)) para uso na purificação de anticorpos ou fragmentos. Os poli- peptídeos heterólogos também incluem polipeptídeos (por exemplo, en- zimas) que são úteis como marcadores de diagnóstico ou detectáveis, por exemplo, luciferase, uma proteína fluorescente (por exemplo, prote- ína fluorescente verde (GFP)) ou cloranfenicol acetil transferase (CAT). Marcadores radioativos adequados incluem, por exemplo, 3?P, 33P, VC, 125), 131), 358, e 3H, Etiquetas fluorescentes adequadas incluem, sem |i- mitação, fluorescência, isotiocianato de fluoresceína (FITC), proteína verde fluorescente (GFP), DyLight'"y 488, ficoceritrina (PE), iodeto de propídio (PI), PerCP, PE-Alexa Fluor& 700, Cy5, aloficocianina e Cy7. As etiquetas luminescentes incluem, por exemplo, qualquer uma de uma variedade de quantatos de lantanídeos luminescentes (por exemplo, európio ou térbio). Por exemplo, os quelatos de európio adequados in- cluem o quelato de európio de ácido dietileno triamina penta-acético (DTPA) ou ácido tetra-azaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA). Os marcadores enzimáticos incluem, por exemplo, fosfatase alcalina, CAT, luciferase e peroxidase de rábano silvestre.
[00292] Duas proteínas (por exemplo, um anticorpo e uma fração he- teróloga) podem ser reticuladas usando qualquer um de vários reticu- lantes químicos conhecidos. E xemplos de tais reticulantes são aqueles que ligam dois resíduos de aminoácidos através de uma ligação que inclui uma ligação dissulfeto "impedida". Nestas ligações, uma ligação dissulfeto dentro da unidade de reticulação é protegida (impedindo gru- pos de ambos os lados da ligação dissulfeto) da redução pela ação, por exemplo, de glutationa reduzida ou da enzima dissulfeto redutase. Um reagente adequado, 4-succinimidiloxicarbonil-S-metil-S(2-piridilditio )to- lueno (SMPT), forma essa ligação entre duas proteínas utilizando uma lisina terminal em uma das proteínas e uma cisteína terminal na outra. Também podem ser utilizados reagentes hetero-bifuncionais que reticu- lam por uma porção de acoplamento diferente em cada proteína. Outros reticulantes úteis incluem, sem limitação, reagentes que ligam dois gru- pos amino (por exemplo, N-5-azido-2-nitrobenzoiloxissuccinimida), dois grupos sulfidril (por exemplo, 1,4-bis-maleimidobutano), um grupo amino e um grupo sulfidril (por exemplo, éster m-maleimidobenzoil-N- hidroxissuccinimida), um grupo amino e um grupo carboxila (por exem- plo, 4-[p-azidosalicilamido]butilamina) e um grupo amino e um grupo guanidínio que está presente na cadeia lateral de arginina (por exemplo, p-azidofenil-glioxal mono-hidratado).
[00293] Em algumas modalidades, um marcador radioativo pode ser diretamente conjugado à espinha dorsal de aminoácidos do anticorpo. Alternativamente, o marcador radioativo pode ser incluído como parte de uma molécula maior (por exemplo, "1 in meta-[*I liodofenil-N-hidro- xissuccinimida ([*SIJMIPNHS) que se liga a grupos amino livres para formar derivados de meta-iodofenil (mIP) de proteínas relevantes (ver, por exemplo, Rogers et al. (1997) / Nucl Med 38:1221-1229) ou quelato (por exemplo, para DOTA ou DTPA) que por sua vez está ligado à es- pinha dorsal da proteína. Os métodos para conjugar os marcadores ra- dioativos ou moléculas/quelatos maiores que os contêm aos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno aqui descritos são conhecidos na técnica. Tais métodos envolvem incubar as proteínas com o marcador radioativo sob condições (por exemplo, pH, concentração de sal e/ou temperatura) que facilitam a ligação do marcador radioativo ou quelato à proteína (ver, por exemplo, Patente US 6.001.329).
[00294] Os métodos para conjugar um marcador fluorescente (às ve- zes chamado de "fluoróforo") a uma proteína (por exemplo, um anti- corpo) são conhecidos na técnica da química de proteínas. Por exem- plo, os fluoróforos podem ser conjugados com grupos amino livres (por exemplo, de lisinas) ou grupos sulfidril (por exemplo, cisteínas) de pro- teínas utilizando frações éster succinimidil (NHS) ou éster tetrafluorofe- nil (TFP) ligadas aos fluoróforos. Em algumas modalidades, os fluorófo- ros podem ser conjugados com uma fração de reticulante heterobifunci- onal, como sulfo-SMCC. Os métodos de conjugação adequados envol- vem incubar uma proteína de anticorpo, ou fragmento do mesmo, com o fluoróforo sob condições que facilitam a ligação do fluoróforo à prote- Ína. Ver, por exemplo, Welch and Redvanly (2003) “Handbook of Radi- opharmaceuticals: Radiochemistry and Applications,” John Wiley and Sons (ISBN 0471495603).
[00295] Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos po- dem ser modificados, por exemplo, com uma fração que melhora a es- tabilização e/ou retenção dos anticorpos em circulação, por exemplo, no sangue, soro ou outros tecidos. Por exemplo, o anticorpo ou fragmento pode ser PEGuilado como descrito em, por exemplo, Lee et al. (1999) Bioconjug Chem 10(6): 973-8; Kinstler et al. (2002) Advanced Drug De- liveries Reviews 54:477-485; and Roberts et al. (2002) Advanced Drug Delivery Reviews 54:459-476 or HES ylated (Fresenius Kabi, Germany; ver, por exemplo, Pavisié et al. (2010) /Int/ Pharm 387(1-2):110-119). A fração de estabilização pode melhorar a estabilidade ou retenção do an- ticorpo (ou fragmento) em pelo menos 1,5 (por exemplo, pelo menos 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 ou 50 ou mais) vezes.
[00296] Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui descritos podem ser glicosilados.
Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao an- tígeno do mesmo aqui descrito pode ser submetido a tratamento enzi- mático ou químico, ou produzido a partir de uma célula, de modo que o anticorpo ou fragmento possua glicosilação reduzida ou ausente. Os métodos para a produção de anticorpos com glicosilação reduzida são conhecidos na técnica e descritos em, por exemplo, patente US
6.933.368; Wright et al. (1991) EMBO J 10(10):2717-2723; e Co et al. (1993) Mol Immunol 30:1361. Composições e Formulações farmacêuticas
[00297] Em certas modalidades, a invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-IL-27 com um diluente, transportador, solubilizador, emulsificante, conservante e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitável.
[00298] Em certas modalidades, materiais de formulação aceitáveis são preferencialmente não tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas. Em certas modalidades, os materiais de formulação são para administração s.c. e/ou |V. Em certas modalidades, a composição farmacêutica pode conter materiais de formulação para modificar, manter ou preservar, por exemplo, o pH, osmolaridade, viscosidade, claridade, cor, isotonicidade, odor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução ou liberação, adsorção ou penetração da composição. Em certas modalidades, os materiais de formulação adequados incluem, mas não estão limitados a, aminoácidos (como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina); antimicrobianos; antioxidantes (como ácido ascórbico, sulfito de sódio ou hidrogenossulfito de sódio); tampões (como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos ou outros ácidos orgânicos); agentes de volume (como manitol ou glicina); agentes quelantes (tais como ácido etilenodiamina tetra-acético (EDTA)); agentes complexantes (como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina ou hidroxipropil-beta-
ciclodextrina); enchimentos; monossacarídeos; dissacarídeos; e outros carboidratos (como glicose, manose ou dextrina); proteínas (como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas); agentes corantes, aromatizantes e diluentes; agentes emulsificantes; polímeros hidrofíli- cos (como polivinilpirrolidona); polipeptídeos de baixo peso molecular; contraíons formadores de sal (como sódio); conservantes (como cloreto de benzalcônio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, álcool fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorexidina, ácido sórbico ou peróxido de hidrogênio); solventes (como glicerina, propileno glicol ou polietileno glicol); álcoois de açúcar (como manitol ou sorbitol); agentes de suspensão; tensoativos ou agentes umectantes (tais como plurônicos, PEG, ésteres de sorbitano, polissorbatos, tais como polissorbato 20, polissorbato 80, triton, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes que intensificam a estabilidade (como sacarose ou sorbitol); agentes intensificadores de tonicidade (tais como haletos de metais alcalinos, preferencialmente cloreto de sódio ou potássio, manitol sorbitol); veículos de distribuição; diluentes; excipientes e/ou adjuvantes farmacêuticos. (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company (1995). Em certas modalidades, a formulação compreende PBS; NaãaOAC 20 mM, pH 5,2, NaCl 50 mM; e/ou NAOAC 10 mM, pH 5,2, sacarose à 9%. Em certas modalidades, a composição farmacêutica ideal será determinada por um versado na técnica dependendo, por exemplo, da via de administração prevista, formato de distribuição e dosagem desejada. Ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. Em certas modalidades, essas composições podem influenciar o estado físico, estabilidade, taxa de liberação in vivo e/ou taxa de depuração in vivo do anticorpo anti-IL-27.
[00299] Em certas modalidades, o veículo ou transportador primário numa composição farmacêutica pode ser aquoso ou não aquoso na natureza. Por exemplo, em certas modalidades, um veículo ou transportador adequado pode ser água para injeção, solução salina fisiológica ou líquido cefalorraquidiano artificiall possivelmente suplementado com outros materiais comuns em composições para administração parenteral. Em certas modalidades, a solução salina compreende solução salina tamponada com fosfato isotônico. Em certas modalidades, a solução salina tamponada neutra ou solução salina misturada com albumina sérica são veículos adicionalmente exemplificativos. Em certas modalidades, as composições farmacêuti- cas compreendem tampão Tris de cerca de pH 7,0-8,5 ou tampão de acetato de cerca de pH 4,0-5,5, que pode incluir ainda sorbitol ou um substituto adequado. Em certas modalidades, uma composição compreendendo um anticorpo anti-IL-27 pode ser preparada para armazenamento misturando a composição selecionada com o grau de pureza desejado com agentes de formulação opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra) na forma de uma torta liofilizada ou uma solução aquosa. Além disso, em certas modalidades, uma compo- sição compreendendo um anticorpo anti-IL-27 pode ser formulada como um liofilizado usando excipientes apropriados, como sacarose.
[00300] Em certas modalidades, a composição farmacêutica pode ser selecionada para distribuição parenteral. Em certas modalidades, as composições podem ser selecionadas para inalação ou distribuição através do trato digestivo, como por via oral. A preparação de tais composições farmaceuticamente aceitáveis está dentro da capacidade de um versado na técnica.
[00301] Em certas modalidades, os componentes da formulação estão presentes em concentrações aceitáveis para o sítio da administração. Em certas modalidades, os tampões são usados para manter a composição em pH fisiológico ou em um pH ligeiramente mais baixo, tipicamente dentro de uma faixa de pH de cerca de 5 a cerca de
8.
[00302] Em certas modalidades, quando a administração parenteral é contemplada, uma composição terapêutica pode estar na forma de uma solução aquosa parenteralmente aceitável, livre de pirogênio, compreendendo um anticorpo anti-IL-27, em um veículo farmaceuti- camente aceitável. Em certas modalidades, um veículo para injeção parenteral é água destilada estéril, na qual um anticorpo anti-IL-27 é formulado como uma solução isotônica estéril e adequadamente preservada. Em certas modalidades, a preparação pode envolver a formulação da molécula desejada com um agente, como microesferas injetáveis, partículas bioerodíveis, compostos poliméricos (como ácido polilático ou ácido poliglicólico), esferas ou lipossomas, que podem fornecer liberação controlada ou prolongada do produto que pode então ser distribuído através de injeção de depósito. Em certas modalidades, ácido hialurônico também pode ser usado e pode ter o efeito de promo- ção de duração prolongada na circulação. Em certas modalidades, os dispositivos implantáveis de administração de fármacos podem ser usados para introduzir a molécula desejada.
[00303] Emcertas modalidades, uma composição farmacêutica pode ser formulada para inalação. Em certas modalidades, um anticorpo anti- IL-27 pode ser formulado como um pó seco para inalação. Em certas modalidades, uma solução de inalação compreendendo um anticorpo anti-IL-27 pode ser formulada com um propulsor para distribuição de aerossol. Em certas modalidades, as soluções podem ser nebulizadas. A administração pulmonar é descrita adicionalmente no pedido PCT PCT/US94/001875, que descreve a distribuição pulmonar de proteínas quimicamente modificadas.
[00304] Em certas modalidades, é contemplado que as formulações possam ser administradas por via oral. Em certas modalidades, um anticorpo anti-lIL-27 que é administrado dessa maneira pode ser formulado com ou sem os veículos usados habitualmente na compo- sição de formas de dosagem sólidas, como comprimidos e cápsulas. Em certas modalidades, uma cápsula pode ser projetada para liberar a porção ativa da formulação no ponto do trato gastrointestinal quando a biodisponibilidade é maximizada e a degradação pré-sistêmica é minimizada. Em certas modalidades, pelo menos um agente adicional pode ser incluído para facilitar a absorção de um anticorpo anti-IL-27. Em certas modalidades, diluentes, aromas, ceras de baixo ponto de fusão, óleos vegetais, lubrificantes, agentes de suspensão, agentes de desintegração de comprimidos e aglutinantes também podem ser empregados.
[00305] Em certas modalidades, uma composição farmacêutica pode envolver uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-IL-27 em uma mistura com excipientes não tóxicos que são adequados para a fabricação de comprimidos. Em certas modalidades, dissolvendo os comprimidos em água estéril, ou outro veículo apropriado, as soluções podem ser preparadas na forma de dose unitária. Em certas modali- dades, excipientes adequados incluem, mas não estão limitados a, diluentes inertes, como carbonato de cálcio, carbonato ou bicarbonato de sódio, lactose ou fosfato de cálcio; ou agentes aglutinantes, tais como amido, gelatina ou acácia; ou agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco.
[00306] Composições farmacêuticas adicionais serão evidentes para os versados na técnica, incluindo formulações envolvendo um anticorpo anti-IL-27 em formulações de distribuição prolongada ou controlada. Em certas modalidades, técnicas de formulação de uma variedade de outros meios de distribuição prolongada ou prolongada, como transportadores de lipossoma, micropartículas bioerodíveis ou microesferas porosas e injeções de depósito, também são conhecidas pelos versados na técnica. Ver, por exemplo, Pedido PCT PCT/US93/00829, que descreve a liberação controlada de micropartículas poliméricas porosas para distribuição de composições farmacêuticas. Em certas modalidades, preparações de liberação prolongada podem incluir matrizes poliméricas semipermeáveis sob a forma de artigos conformados, por exemplo, filmes, ou microcápsulas. As matrizes de liberação prolongada podem incluir poliésteres, hidrogéis, polilactídeos (Pat. US 3.773.919 e EP 058.481), copolímeros de ácido L-glutâmico e gama-etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 (1983)), poli (2-hidroxietil- metacrilato) (Langer et al., |. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981) and Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)), acetato de vinil etileno (Langer et al., Supra) ou ácido poli-D(-)- 3-hidroxibutírico (EP 133.988). Em certas modalidades, as composições de liberação prolongada também podem incluir lipossomos, que podem ser preparados por qualquer um dos vários métodos conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985); EP 036.676; EP 088.046 e EP 143.949.
[00307] A composição farmacêutica a ser utilizada para adminis- tração in vivo é tipicamente estéril. Em certas modalidades, isso pode ser obtido por filtração através de membranas de filtração estéreis. Em certas modalidades, onde a composição é liofilizada, a esterilização usando este método pode ser realizada antes ou após a liofilização e reconstituição. Em certas modalidades, a composição para adminis- tração parenteral pode ser armazenada na forma liofilizada ou em uma solução. Em certas modalidades, composições parenterais geralmente são colocadas num recipiente tendo uma porta de acesso estéril, por exemplo, um frasco ou bolsa de solução intravenosa que tem um batente perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica.
[00308] Em certas modalidades, uma vez que a composição farma- cêutica foi formulada, a mesma pode ser armazenada em frascos estéreis como uma solução, suspensão, gel, emulsão, sólido, ou como um pó desidratado ou liofiizado. Em certas modalidades, tais formulações podem ser armazenadas ou numa forma pronta para uso ou numa forma (por exemplo, liofilizada) que é reconstituída antes da administração.
[00309] Em certas modalidades, são fornecidos kits para a produção de uma unidade de administração de dose única. Em certas modali- dades, o kit pode conter um primeiro recipiente com uma proteína seca e um segundo recipiente com uma formulação aquosa. Em certas modalidades, são incluídos kits contendo seringas pré-preenchidas de uma e múltiplas câmaras (por exemplo, seringas líquidas e lio-seringas).
[00310] Em certas modalidades, a quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-IL-27 a ser empregado terapeuticamente dependerá, por exemplo, do contexto e objetivos terapêuticos. Um versado na técnica compreenderá que os níveis de dosagem apropriados para o tratamento, de acordo com certas modalidades, variarão, portanto, dependendo, em parte, da molécula distribuída, a indicação para a qual um anticorpo anti-CD-lL-27 está sendo usado, a via de administração e o tamanho (peso corporal, superfície corporal ou tamanho do órgão) e/ou condição (idade e estado geral de saúde) do paciente. Em certas modalidades, o clínico pode titular a dosagem e modificar a via de administração para obter o efeito terapêutico ideal.
[00311] Em certas modalidades, a frequência da dosagem levará em consideração os parâmetros farmacocinéticos de um anticorpo anti-IL- 27 na formulação utilizada. Em certas modalidades, um clínico administrará a composição até que seja alcançada uma dosagem que atinja o efeito desejado. Em certas modalidades, a composição pode, portanto, ser administrada como uma dose única ou como duas ou mais doses (que podem ou não conter a mesma quantidade da molécula desejada) ao longo do tempo, ou como uma infusão contínua via dispositivo ou cateter de implantação. Um refinamento adicional da dosagem apropriada é feito rotineiramente por aqueles versados na técnica e está no âmbito das tarefas rotineiramente executadas por eles. Em certas modalidades, as dosagens apropriadas podem ser determinadas através do uso de dados de resposta à dose apropriados.
[00312] Em certas modalidades, a via de administração da composi- ção farmacêutica está de acordo com métodos conhecidos, por exemplo, por via oral, por injeção por via intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intra-parenquimatosa), intracerebroventricular, intramuscular, subcutânea, intra-ocular, intra-arterial, intraportal, rotas intralesionais; por sistemas de liberação prolongada ou por dispositivos de implantação. Em certas modalidades, as composições podem ser administradas por injeção em bolus ou continuamente por infusão ou por dispositivo de implantação. Em certas modalidades, elementos individuais da terapia de combinação podem ser administrados por diferentes vias.
[00313] Em certas modalidades, a composição pode ser adminis- trada localmente via implantação de uma membrana, esponja ou outro material apropriado no qual a molécula desejada tenha sido absorvida ou encapsulada. Em certas modalidades, onde um dispositivo de implantação é usado, o dispositivo pode ser implantado em qualquer tecido ou órgão adequado, e a distribuição da molécula desejada pode ser via difusão, bolo de liberação programada ou administração contínua. Em certas modalidades, pode ser desejável usar uma compo- sição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-IL-27 de maneira ex vivo. Em tais casos, células, tecidos e/ou órgãos que foram removi- dos do paciente são expostos a uma composição farmacêutica compre- endendo um anticorpo anti-IL-27, após o qual as células, tecidos e/ou órgãos são subsequentemente implantados de volta ao paciente.
[00314] Em certas modalidades, um anticorpo anti-IL-27 pode ser distribuído implantando certas células que foram geneticamente modifi- cadas, usando métodos como os aqui descritos, para expressar e se- cretar os polipeptídeos. Em certas modalidades, essas células podem ser células animais ou humanas e podem ser autólogas, heterólogas ou xenogênicas. Em certas modalidades, as células podem ser imortaliza- das. Em certas modalidades, a fim de diminuir a chance de uma res- posta imunológica, as células podem ser encapsuladas para evitar a in- filtração dos tecidos circundantes. Em certas modalidades, os materiais de encapsulamento são tipicamente invólucros ou membranas polimé- ricas semipermeáveis biocompatíveis que permitem a liberação do(s) produto(s) de proteínas, mas impedem a destruição das células pelo sistema imunológico do paciente ou por outros fatores prejudiciais dos tecidos circundantes.
Aplicações
[00315] As composições aqui descritas podem ser usadas em várias aplicações terapêuticas e de diagnóstico. Por exemplo, moléculas de ligação a antígeno marcadas de forma detectável podem ser usadas em ensaios para detectar a presença ou quantidade dos antígenos alvo em uma amostra (por exemplo, uma amostra biológica). As composições podem ser utilizadas em ensaios in vitro para estudar a inibição da fun- ção do antígeno-alvo. Em algumas modalidades, por exemplo, nas quais as composições se ligam e inibem uma proteína do complemento, as composições podem ser usadas como controles positivos em en- saios projetados para identificar novos compostos adicionais que inibem a atividade do complemento ou são úteis para o tratamento de um dis- túrbio associado ao complemento. Por exemplo, uma composição inibi- dora de IL-27 pode ser usada como controle positivo em um ensaio para identificar compostos adicionais (por exemplo, pequenas moléculas, ap- tâmeros ou anticorpos) que reduzem ou revogam a produção de IL-27. As composições também podem ser usadas em métodos terapêuticos,
conforme elaborado abaixo.
[00316] Em algumas modalidades, a descrição fornece um método para detectar I1L-27 em uma amostra biológica ou em um sujeito, com- preendendo (i) contatar a amostra ou o sujeito (e, opcionalmente, uma amostra ou sujeito de referência) com qualquer anticorpo descrito aqui sob condições que permitem que ocorra a interação da molécula de an- ticorpo e 11-27 e (ii) detectar a formação de um complexo entre a molé- cula de anticorpo e a amostra ou o sujeito (e, opcionalmente, a amostra ou sujeito de referência). Kits
[00317] Um kit pode incluir um anticorpo anti-IL-27, conforme divul- gado neste documento, e instruções de uso. Os kits podem compreen- der, em um recipiente adequado, um anticorpo anti-IL-27, um ou mais controles e vários tampões, reagentes, enzimas e outros ingredientes padrão bem conhecidos na técnica. Em alguns aspectos, a descrição fornece um kit que compreende um anticorpo anti-IL-27 ou uma porção de ligação ao antígeno, conforme divulgado aqui, e instruções para uso no estímulo de uma resposta imune em um sujeito ou no tratamento de câncer em um sujeito, opcionalmente com instruções para uso em com- binação com um ou mais agentes ou procedimentos terapêuticos adici- onais, conforme divulgado neste documento.
[00318] O recipiente pode incluir pelo menos um frasco, poço, tubo de ensaio, frasco, garrafa, seringa ou outro meio de recipiente, no qual um anticorpo anti-IL-27 pode ser colocado e, em alguns casos, adequa- damente aliquotado. Onde um componente adicional é fornecido, o kit pode conter recipientes adicionais nos quais esse componente pode ser colocado. Os kits também podem incluir um meio para conter um anti- corpo anti-IL-27 e qualquer outro recipiente de reagente em confina- mento próximo para venda comercial. Esses recipientes podem incluir recipientes de plástico injetado ou moldado por sopro nos quais os fras- cos desejados são retidos. Recipientes e/ou kits podem incluir etiquetas com instruções de uso e/ou avisos. Métodos de uso
[00319] As composições da presente invenção têm inúmeras utilida- des in vitro e in vivo envolvendo a detecção e/ou quantificação de IL-27 e/ou o antagonismo da função de IL-27.
[00320] Em algumas modalidades, a descrição fornece um método para inibir ou reduzir a fosforilação de STAT1 e/ou STAT3 em uma cé- lula, o método compreendendo contatar a célula com um anticorpo mo- noclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, fornecido pela descrição, em que o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, inibe ou reduz a fosforilação de STAT1 e/ou STAT3 em uma célula.
[00321] Em algumas modalidades, a descrição fornece um método para inibir ou reduzir a inibição da expressão de CD161 em uma célula, o método compreendendo contatar a célula com um anticorpo monoclo- nal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, fornecido pela descri- ção, em que o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno, inibe ou reduz a inibição da expressão de CD161 em uma célula.
[00322] Em algumas modalidades, a descrição fornece um método para inibir ou reduzir a expressão de expressão de PD-L1 e/ou TIM-3 em uma célula, o método compreendendo contatar a célula com um an- ticorpo monoclonal isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, fornecido pela descrição, em que o anticorpo, ou porção de |i- gação ao antígeno do mesmo, inibe a expressão de PD-L1 e/ou TIM-3 em uma célula.
[00323] Em algumas modalidades, a descrição fornece um método para induzir ou intensificar a secreção de uma ou mais citocinas de uma célula, o método compreendendo contatar a célula com o anticorpo mo- noclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, fornecido pela descrição, em que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, induz ou intensifica a secreção mediada por PD-1 de uma ou mais citocinas de uma célula.
[00324] Em algumas modalidades, a descrição fornece um método para estimular uma resposta imune em um sujeito, o método compreen- dendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente à e antagoniza 1127 humana, fornecido pelo descrição ou uma composição farmacêutica compreendendo o anti- corpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo e um transportador farmaceuticamente aceitável.
[00325] Em algumas modalidades, a descrição fornece um método de tratamento de um câncer em um sujeito, o método compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclo- nal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente à e antagoniza IL27, fornecido pela descrição, ou uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou porção de |li- gação ao antígeno do mesmo e um transportador farmaceuticamente aceitável.
[00326] Em algumas modalidades, a descrição fornece um método para estimular uma resposta imune, ou tratamento de um câncer em um sujeito, o método compreendendo administrar ao sujeito uma quanti- dade eficaz de um anticorpo monoclonal isolado, ou fragmento de liga- ção ao antígeno, fornecido pela descrição, ou uma composição farma- cêutica compreendendo o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo e um transportador farmaceuticamente aceitável, em que o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, ou a composi- ção farmacêutica, inibe ou reduz a fosforilação de STAT1 e/ou STAT3 em uma célula, estimulando assim a resposta imune, ou o tratamento do câncer.
[00327] Em algumas modalidades, a descrição fornece um método para estimular uma resposta imune, ou tratamento de um câncer em um sujeito, o método compreendendo administrar ao sujeito uma quanti- dade eficaz de um anticorpo monoclonal isolado, ou fragmento de liga- ção ao antígeno, fornecido pela descrição, ou uma composição farma- cêutica que compreende o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo e um transportador farmaceuticamente aceitável, em que o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, ou a composi- ção farmacêutica, inibe ou reduz a inibição da expressão de CD161 em uma célula, estimulando assim a resposta imune ou o tratamento do câncer.
[00328] Em algumas modalidades, a descrição fornece um método para estimular uma resposta imune, ou tratamento de um câncer em um sujeito, o método compreendendo administrar ao sujeito uma quanti- dade eficaz de um anticorpo monoclonal isolado, ou fragmento de liga- ção ao antígeno, fornecido pela descrição, ou uma composição farma- cêutica compreendendo o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo e um transportador farmaceuticamente aceitável, em que o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, ou a composi- ção farmacêutica, inibe ou reduz a expressão da expressão de PD-L1 e/ou TIM-3 em uma célula, estimulando assim a resposta imune ou o tratamento do câncer.
[00329] Em algumas modalidades, a descrição fornece um método para estimular uma resposta imune, ou tratamento de um câncer em um sujeito, o método compreendendo administrar ao sujeito uma quanti- dade eficaz de um anticorpo monoclonal isolado, ou fragmento de liga- ção ao antígeno, fornecido pela descrição, ou uma composição farma- cêutica que compreende o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo e um transportador farmaceuticamente aceitável, em que o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, ou a composi- ção farmacêutica, induz ou intensifica a secreção mediada por PD-1 de uma ou mais citocinas de uma célula, estimulando assim a resposta imune ou o tratamento do câncer.
[00330] Emalgumas modalidades, o câncer é escolhido entre câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de células não pequenas), sarcoma, câncer de testículo, câncer de ovário, câncer de pâncreas, câncer de mama (por exemplo, câncer de mama triplo negativo), mela- noma, câncer de cabeça e pescoço (por exemplo, câncer de cabeça e pescoço), câncer colorretal, câncer de bexiga, câncer de endométrio, câncer de próstata, câncer de tireoide, carcinoma hepatocelular, câncer de estômago, câncer de cérebro, linfoma (por exemplo, DL- BCL), leu- cemia (por exemplo, AML) ou câncer renal (por exemplo, carcinoma de células renais, por exemplo, carcinoma de células claras renais).
[00331] As composições descritas acima são úteis, inter alia em mé- todos para o tratamento ou prevenção de uma variedade de cânceres em um sujeito. As composições podem ser administradas a um sujeito, por exemplo, um sujeito humano, usando uma variedade de métodos que dependem, em parte, da via de administração. A via pode ser, por exemplo, injeção intravenosa ou infusão (IV), injeção subcutânea (SC), injeção intraperitoneal (IP), injeção intramuscular (IM) ou injeção intra- tecal (IT). A injeção pode ser em bolo ou em infusão contínua.
[00332] A administração pode ser realizada por, por exemplo, infusão local, injeção ou por meio de um implante. O implante pode ser de um material poroso, não poroso ou gelatinoso, incluindo membranas, como membranas sialásticas ou fibras. O implante pode ser configurado para liberação prolongada ou periódica da composição para o sujeito. Ver, por exemplo, a Publicação do Pedido de Patente US 20080241223; Pa- tentes US 5.501.856; 4.863.457; e 3.710.795; EP488401; e EP 430539,
cujas descrições são incorporadas aqui por referência na sua totalidade. A composição pode ser distribuída ao sujeito por meio de um dispositivo implantável baseado em, por exemplo, sistemas difusivos, erodíveis ou convectivos, por exemplo, bombas osmóticas, implantes biodegradá- veis, sistemas de eletrodifusão, sistemas de eletro osmose, bombas de pressão de vapor, bombas eletrolíticas, bombas efervescentes, bombas piezelétricas, sistemas baseados em erosão ou sistemas eletromecâni- cos.
[00333] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL-27 ou frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo é terapeuticamente distribuído a um sujeito por meio de administração local.
[00334] Uma dose adequada de um anticorpo ou fragmento do mesmo descrito aqui, cuja dose é capaz de tratar ou prevenir o câncer em um sujeito, pode depender de uma variedade de fatores, incluindo, por exemplo, idade, sexo e peso de um sujeito a ser tratado e o com- posto inibidor particular utilizado. Por exemplo, uma dose diferente de um anticorpo anti-IL-27 completo pode ser necessária para tratar um sujeito com câncer em comparação com a dose de um fragmento de anticorpo F ab' de ligação a IL-27 necessário para tratar o mesmo sujeito. Outros fatores que afetam a dose administrada ao sujeito incluem, por exemplo, o tipo ou gravidade do câncer. Por exemplo, um sujeito com melanoma metastático pode exigir a administração de uma dosagem diferente de um anticorpo anti-IL-27 do que um sujeito com glioblas- toma. Outros fatores podem incluir, por exemplo, outros distúrbios mé- dicos que afetam o sujeito de forma simultânea ou prévia, a saúde geral do sujeito, a disposição genética do sujeito, dieta, tempo de administra- ção, taxa de excreção, combinação de fármaco e quaisquer outros tera- pêuticos adicionais que são administrados ao sujeito. Também deve ser entendido que uma dosagem e regime de tratamento específicos para qualquer sujeito em particular também dependerão do julgamento do médico assistente (por exemplo, médico ou enfermeiro). Dosagens ade- quadas são descritas aqui.
[00335] Uma composição farmacêutica pode incluir uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-IL-27 ou fragmento de |li- gação ao antígeno do mesmo aqui descrito. Tais quantidades eficazes podem ser prontamente determinadas por um versado na técnica, com base, em parte, no efeito do anticorpo administrado ou no efeito combi- natório do anticorpo e um ou mais agentes ativos adicionais, se mais de um agente for usado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou fragmento descrito aqui também pode variar de acordo com fatores como estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo, e a capacidade do anticorpo (e um ou mais agentes ativos adicionais) de provocar uma resposta desejada no indivíduo, por exemplo, redução no crescimento do tumor. Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-IL-27 pode inibir (diminuir a gravidade ou eliminar a ocorrência de) e/ou prevenir um distúrbio específico e/ou qualquer um dos sintomas do distúrbio específico conhecido na técnica ou aqui descrito. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também a em que quaisquer efeitos prejudiciais ou tóxicos de uma composição são compensados pelos efeitos terapeuticamente benéficos.
[00336] Doses humanas adequadas de qualquer um dos anticorpos ou fragmentos descritos aqui podem ser ainda avaliadas em, por exem- plo, estudos de escalonamento da dose da Fase |. Ver, por exemplo, van Gurp et al. (2008) Am / Transplantation 8(8):1711-1718; Hanouska etal. (2007) Clin CancerRes 13(2, part 1):523-531; and Hetherington et al. (2006) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 50(10): 3499-3500.
[00337] Em algumas modalidades, a composição contém qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui descritos e um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, 10 ou 11 ou mais) agentes terapêuticos adicionais de modo que a composição como um todo seja terapeuticamente eficaz. Por exemplo, uma composição pode conter um anticorpo anti-IL-27 aqui descrito e um agente alquilante, em que o anticorpo e o agente estão cada um em uma concentração que, quando combinados, são terapeu- ticamente eficazes para o tratamento ou prevenção de um câncer (por exemplo, melanoma) em um sujeito.
[00338] A toxicidade e eficácia terapêutica de tais composições po- dem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos conhecidos em culturas de células ou animais experimentais (por exemplo, modelos animais de qualquer um dos cânceres aqui descritos). Esses procedi- mentos podem ser utilizados, por exemplo, para determinar o LDs5o (a dose letal para 50% da população) e o ED5o (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A razão de dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expressa como a razão LD5so/ED5o. É preferido um anticorpo ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo que exibe um alto índice terapêutico. Enquanto as com- posições que apresentam efeitos colaterais tóxicos podem ser usadas, deve-se tomar cuidado para projetar um sistema de distribuição que di- recione tais compostos ao sítio do tecido afetado a fim de minimizar possíveis danos às células normais e, assim, reduzir os efeitos colate- rais.
[00339] Os dados obtidos de ensaios da cultura de células e estudos em animais podem ser utilizados na formulação de uma faixa de dosa- gem para uso em seres humanos. A dosagem de tais anticorpos ou fra- gmentos de ligação ao antígeno está geralmente dentro de uma faixa de concentrações circulantes dos anticorpos ou fragmentos que incluem o EDso com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar den- tro desta faixa dependendo da forma de dosagem empregada e a via de administração utilizada. Para um anticorpo anti-IL-27 aqui descrito, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura de células. Uma dose pode ser formulada em mode- los animais para atingir uma faixa de concentração no plasma circulante que inclua à ICso (isto é, a concentração do anticorpo que atinge uma inibição meio-máxima) conforme determinado em cultura de células. Tal informação pode ser usada para determinar com maior precisão as do- ses úteis em seres humanos. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alto desempenho. Em algu- mas modalidades, por exemplo, onde a administração local (por exem- plo, no olho ou em uma articulação) é desejada, a cultura de células ou a modelagem animal podem ser usadas para determinar uma dose ne- cessária para alcançar uma concentração terapeuticamente eficaz no sítio local.
[00340] Em algumas modalidades, os métodos podem ser realizados em conjunto com outras terapias para o câncer. Por exemplo, a compo- sição pode ser administrada a um sujeito ao mesmo tempo, antes ou depois da radiação, cirurgia, quimioterapia direcionada ou citotóxica, quimiorradioterapia, terapia hormonal, imunoterapia, terapia genética, terapia de transplante celular, medicina de precisão, terapia de edição de genoma ou outra farmacoterapia.
[00341] “Conforme descrito acima, as composições aqui descritas (por exemplo, composições anti-IL-27) podem ser usadas para tratar uma variedade de cânceres, tais como, mas não se limitando a: sar- coma de Kaposi, leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielo- cítica aguda, mieloblastos promielócitos, mielomonocítica, eritroleuce- mia monocítica, leucemia crônica, leucemia mielocítica crônica (granu- locítica), leucemia linfocítica crônica, linfoma de células do manto, lin- foma primário do sistema nervoso central, linfoma de Burkitt e linfoma de células B da zona marginal, Linfoma Policitemia vera, doença de Ho- dgkin, doença não Hodgkin, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, doença da cadeia pesada, tumores sólidos, sarcomas e carcinomas, fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, crondrossar- coma, sarcoma osteogênico, osteoarcoma, cordoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, linfangiossarcoma, linfangioendoteliossarcoma, si- novioma, mesotelioma, tumor de E wing, leiomiossarcoma, rabdomios- sarcoma, sarcoma de cólon, carcinoma colorretal, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basais, adenocarcinoma, car- cinoma das glândulas sudoríparas, carcinoma das glândulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma de células re- nais, carcinoma hepatocelular (HCC), hepatoma, carcinoma do ducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor de Wilm, câncer cervical, câncer uterino, tumor testicular, carcinoma pul- monar, carcinoma pulmonar de células pequenas, carcinoma pulmonar de células não pequenas, carcinoma de bexiga, carcinoma epitelial, gli- oma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pi- nealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma esofágico, carcinoma basocelular, câncer do trato biliar, câncer de bexiga, câncer ósseo, câncer de cérebro e do sis- tema nervoso central (CNS), câncer cervical, coriocarcinoma, cânceres colorretais, câncer de tecido conjuntivo, câncer do sistema digestivo, câncer endometrial, câncer de esôfago, câncer de olho, câncer de ca- beça e pescoço, câncer gástrico, neoplasia intraepitelial, câncer de rim, câncer de laringe, câncer de fígado, câncer de pulmão (células peque- nas, células grandes), melanoma, neuroblastoma; câncer da cavidade oral (por exemplo, lábio, língua, boca e faringe), câncer de ovário, cân- cer pancreático, retinoblastoma, rabdomiossarcoma, câncer retal; cân- cer do sistema respiratório, sarcoma, câncer de pele, câncer de estô- mago, câncer testicular, câncer de tireoide, câncer uterino e câncer do sistema urinário. Terapia de Combinação
[00342] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL-27, ou por- ção de ligação ao antígeno do mesmo, fornecido pela descrição, pode ser combinado com um ou mais terapêuticos ou tratamentos adicionais, por exemplo, outro terapêutico ou tratamento para um câncer. Por exemplo, o anticorpo anti-IL-27, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, pode ser administrado a um sujeito (por exemplo, um paciente humano) em combinação com um ou mais terapêuticos adicionais, em que a combinação fornece um benefício terapêutico a um sujeito que possui, ou corre o risco de desenvolver câncer.
[00343] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL-27, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, e o um ou mais terapêuticos adicionais são administrados ao mesmo tempo (por exemplo, simulta- neamente). Em outras modalidades, o anticorpo anti-IL-27, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, é administrado em primeiro lugar e o um ou mais terapêuticos adicionais são administrados em segundo lu- gar (por exemplo, sequencialmente). Em algumas modalidades, o um ou mais terapêuticos adicionais são administrados em primeiro lugar e o anticorpo anti-IL-27 é administrado em segundo lugar.
[00344] Um anticorpo anti-IL-27 ou um fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo aqui descrito pode substituir ou aumentar uma terapia administrada anteriormente ou atualmente. Por exemplo, ao tratar com um anticorpo anti-IL-27 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, a administração de um ou mais terapêuticos adicionais pode cessar ou diminuir, por exemplo, ser administrada em níveis mais bai- xos. Em algumas modalidades, a administração da terapia anterior pode ser mantida. Em algumas modalidades, uma terapia anterior será man- tida até que o nível do anticorpo anti-IL-27 atinja um nível suficiente para fornecer um efeito terapêutico.
[00345] Em algumas modalidades, a descrição fornece um método de tratamento de câncer em um sujeito, o método compreendendo ad- ministrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga espe- cificamente à e antagoniza a IL-27, fornecida pela descrição, em com- binação com um ou mais procedimentos ou agentes terapêutico adicio- nais, em que o segundo procedimento ou agente terapêutico é selecio- nado do grupo que consiste em: uma quimioterapia, uma terapia anti- câncer direcionada, um fármaco oncolítica, um agente citotóxico, uma terapia imunobaseada, uma citocina, procedimento cirúrgico, um proce- dimento de radiação, um ativador de uma molécula coestimulatória, um inibidor de uma molécula inibitória, uma vacina ou uma imunoterapia celular, ou uma combinação dos mesmos.
[00346] Em algumas modalidades, o um ou mais agentes terapêuti- cos adicionais é um antagonista de PD-1, um inibidor de TIM-3, um ini- bidor de LAG-3, um inibidor de TIGIT, um inibidor de CD112R, um inibi- dor de TAM, um agonista de STING, um agonista de 4-1BB ou uma combinação dos mesmos.
[00347] Em algumas modalidades, o um ou mais agentes terapêuti- cos adicionais é um antagonista de PD-1. Em algumas modalidades, o antagonista de P D-1 é selecionado do grupo que consiste em: PDRO001, nivolumabe, pembrolizumabe, pidilizumabe, MEDIO680, REGN2810, TSR-042, PF-O06801591 e AMP-224. Em certas modalidades, o um ou mais agentes terapêuticos adicionais é um inibidor de PD-L1. Em algu- mas modalidades, o inibidor de PD-L1 é selecionado do grupo que con- siste em: FAZO53, Atezolizumabe, Avelumabe, Durvalumabe e BMS-
936559. Em algumas modalidades, a descrição fornece um método para intensificar uma ou mais atividades de um anticorpo anti-PD-1 (por exemplo, intensifica a secreção de citocinas mediada por PD-1; intensi- fica a secreção de TNFa mediada por anti-P D-1; intensifica a secreção de IL-6 mediada por anti-PD-1 a partir de uma célula exposta a anticor- pos anti-PD-1), o método compreendendo expor uma célula a um anti- corpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, fornecido pela des- crição, simultaneamente ou sequencialmente a um anti-PD-1 para me- lhorar uma ou mais atividades do anticorpo anti-PD1.
[00348] Em algumas modalidades, o ou mais agentes terapêuticos adicionais são sunitinibe (Sutentº), Cabozantinibe (Cabometyxº), Axiti- nibe (Inlytaº), Lenvatinibe (Lenvimaº), E verolimus (Afinitorº), Bevacizu- mabe (Avastinº), epacadostat, NKTR-214 (agonista com tendência CD- 122), tivozanibe (Fotivdaº), abexinostat, Ipilimumabe (Yervoyº), tre- melimumabe, P azopanibe (Votrientº), Sorafenibe (Nexavarº), Temsiro- limus (Toriselº), Ramucirumabe (Cyramza*º), niraparibe, savolitinibe, vo- rolanibe (X-82), Regorafenibe (Stivargoº), Donafenibe (iniilbdor de mul- tiquinase), Camrelizumabe (SHR-1210), pexastimogene devacirepvec (| X-594), Ramucirumabe (Cyramzaº), apatinibe (YN968D1), encapsu- lated doxorubicina (Thermodoxº), Tivantinibe (ARQ197), ADI-PEG 20, binimetinibe, mesilato de apatinibe, nintedanibe, lirlumabe, Nivolumabe (O pdivoº), Pembrolizumabe (Keytrudaº), Atezolizumabe (Tecentrigº), Avelumabe (Bavencioº), Durvalumabe (Imfimziº), cemiplimabe-rwIlc (Li- btayoº), tislelizumabe, e espartalizumabe.
[00349] Em algumas modalidades, um ou mais agentes terapêuticos adicionais é um inibidor TIM-3, opcionalmente em que o inibidor TIM-3 é MGB453 ou TSR-022.
[00350] Em algumas modalidades, o um ou mais agentes terapêuti- cos adicionais é um inibidor de LAG-3, opcionalmente em que o inibidor de LAG-3 é selecionado do grupo que consiste em LAG525, BMS- 986016 e TSR-033.
[00351] Em algumas modalidades, o um ou mais agentes terapêuti- cos adicionais é um inibidor de TIGIT. Em algumas modalidades, o um ou mais agentes terapêuticos adicionais é um inibidor de CD112R. Em algumas modalidades, o um ou mais agentes terapêuticos adicionais é um inibidor de TAM (Axl, Mer, Tyro). Em algumas modalidades, o um ou mais agentes terapêuticos adicionais é um agonista de STING. Em al- gumas modalidades, o um ou mais agentes terapêuticos adicionais é um agonista 4-1BB. Combinação com agentes quimioterápicos
[00352] Outros agentes quimioterápicos adequados para combina- ção e/ou coadministração com composições da presente invenção in- cluem, por exemplo: taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vin- blastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, di-hidroxiantrancin- diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestoste- rona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolo! e pu- romicina e análogos ou homólogos dos mesmos. Outros agentes in- cluem, por exemplo, antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6-mer- captopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agen- tes alquilantes (por exemplo, mecloretamina, tio TEPA, clorambucil, mel- falano, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), lomustina ciclofosfa- mida, bussulfano, dibromomannitol, estreptozotocina, mitomicina C, cis- diclordiamina platina (11) (DDP), procarbazina, altretamina, cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, nedaplatina, satraplatina ou tetranitrato de tri- platina), antraciclina (por exemplo, daunorrubicina (anteriormente dau- nomicina) e doxorrubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC)) e agentes antimitóticos (por exemplo, vinolastina) e te- mozolomida. Combinação com antagonistas PD-1/PD-L1
[00353] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-IL-27, ou por- ções de ligação ao antígeno dos mesmos, fornecidos pela descrição são combinados (por exemplo, administrados em combinação) com um ou mais antagonistas de PD-1 que se ligam especificamente à PD-1 ou PD- L1 humano e inibem a atividade biológica de PD-1/PD-L1 e/ou via(s) a jusante e/ou celular processado mediado por sinalização humana de PD-1/PD-L1 ou outras funções humanas mediadas por PD-1/PD-L1.
[00354] Por conseguinte, são aqui fornecidos antagonistas de PD-1 que bloqueiam, antagonizam, suprimem, inibem ou reduzem direta ou alostericamente a atividade biológica de PD-1/PD-L1, incluindo vias a jusante e/ou processos celulares mediados pela sinalização de PD- 1/PD-L1, como ligação ao receptor e/ou obtenção de uma resposta ce- lular à PD-1/PD-L1. Também são aqui fornecidos antagonistas de PD-1 que reduzem a quantia ou quantidade de PD-1 ou PD-L1 humana pro- duzida por uma célula ou sujeito.
[00355] Em algumas modalidades, a descrição fornece um antago- nista de PD-1 que liga PD-1 humana e impede, inibe ou reduz a ligação de PD-L1 à PD-1. Em alguns aspectos, o antagonista de PD-1 se liga ao MRNA que codifica PD-1 ou PD-L1 e impede a tradução. Em algu- mas modalidades, o antagonista de PD-1 se liga ao MRNA que codifica PD-1 ou PD-L1 e causa degradação e/ou rotatividade.
[00356] Em algumas modalidades, o antagonista de PD-1 inibe a si- nalização ou função de PD-1. Em algumas modalidades, o antagonista de PD-1 bloqueia a ligação de PD-1 ao PD-L1, PD-L2 ou ao PD-L1 e PD-L2. Em algumas modalidades, o antagonista de PD-1 bloqueia a |i- gação de PD-1 ao PD-L1. Em algumas modalidades, o antagonista de PD-1 bloqueia a ligação de PD-1 ao PD-L2. Em algumas modalidades, o antagonista de PD-1 bloqueia a ligação de PD-1 ao PD-L1 e PD-L2. Em algumas modalidades, o antagonista de PD-1 se liga especifica- mente à PD-1. Em algumas modalidades, o antagonista de PD-1 se liga especificamente à PD-L1. Em algumas modalidades, o antagonista de PD-1 se liga especificamente ao PD-L?2.
[00357] Em algumas modalidades, o antagonista de PD-1 inibe a |i- gação de PD-1 ao seu ligando cognato. Em algumas modalidades, o antagonista de PD-1 inibe a ligação de PD-1 ao PD-L1, PD-1 ao PD-L2 ou PD-1 ao PD-L1 e PD-L2. Em algumas modalidades, o antagonista de PD-1 não inibe a ligação de PD-1 ao seu ligando cognato.
[00358] Em algumas modalidades, o antagonista de PD-1 é um anti- corpo monoclonal isolado (mAb), ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente à PD-1 ou PD-L1. Em algumas modalidades, o antagonista de PD-1 é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente à PD-1 hu- mana. Em algumas modalidades, o antagonista de PD-1 é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especifica- mente à PD-L1 humana. Em algumas modalidades, o antagonista de PD-1 é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga ao PD-L1 humano e inibe a ligação de PD-L1 à PD-1. Em algumas mo- dalidades, o antagonista de PD-1 é um anticorpo ou fragmento de liga- ção ao antígeno que se liga à PD-1 humana e inibe a ligação de PD-L1 à PD-1.
[00359] Vários antagonistas do ponto de verificação imune que ini- bem ou interrompem a interação entre PD-1 e um ou ambos de seus ligantes PD-L1 e PD-L2 estão em desenvolvimento clínico ou estão atu- almente disponíveis para os médicos no tratamento de câncer.
[00360] “Exemplos de anticorpos monoclonais anti-P D-1 humanos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, que podem compreen- der o antagonista de PD-1 em qualquer uma das composições, métodos e usos fornecidos pela descrição incluem, mas não estão limitados a: KEYTRUDAG (pembrolizumabe, MK-3475, h409A11; ver US8952136, US8354509, US8900587 e EP2170959, todos aqui incluídos por refe- rência na sua totalidade; Merck), OPDIVO & (nivolumabe, BMS-936558, MDX-1106, ONO-4538; ver US7595048, US8728474, US9073994,
US9067999, EP1537878, US8008449, US8779105 e EP2161336, to- dos aqui incluídos por referência na íntegra; Bristol Myers Squibb), MEDIO680 (AMP-514), BGB-A317 e BGB-108 (BeiGene), 244C8 e 388D4 (ver WO2016106159, que é incorporado aqui por referência na sua totalidade; E numeral Biomedical), PDR 001 (Novartis) e REGN2810 (Regeneron). Por conseguinte, em algumas modalidades o antagonista de PD-1 é pembrolizumabe. Em algumas modalidades, o antagonista da PD-1 é nivolumabe.
[00361] Exemplos de anticorpos monoclonais anti-PD-L1 humanos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, que podem com- preender o antagonista de PD-1 em qualquer uma das composições, métodos e usos fornecidos pela descrição incluem, mas não estão limi- tados a: BAVENCIOGO (avelumabe, MSBOO10718C, consulte WO2013/79174, que é incorporado aqui por referência em sua totali- dade; Merck/Pfizer), IMFINZIO (durvalumabe, MEDI4736), TECEN- TRIQO (atezolizumab, MPDL3280A, RG 7446; consulte WO2010/077634, que é incorporado aqui por referência em sua totali- dade; Roche), MDX-1105 (BMS-936559, 12A4; ver US7943743 e WO2013/173223, os quais são aqui incorporados por referência em sua totalidade; Medarex/BMS) e FAZO53 (Novartis). Por conseguinte, em al- gumas modalidades o antagonista de PD-1 é avelumabe. Em algumas modalidades, o antagonista de PD-1 é durvalumabe. Em algumas mo- dalidades, o antagonista de PD-1 é atezolizumabe.
[00362] Emalgumas modalidades, o antagonista de PD-1 é uma imu- noadesina que se liga especificamente à PD-1 humana ou PD-L1 hu- mana, por exemplo, uma proteína de fusão contendo a porção de liga- ção extracelular ou PD-1 de PD-L1 ou PD-L2 fundida a uma região cons- tante, como uma região Fc de uma molécula de imunoglobulina. Exem- plos de moléculas de imunoadesão que se ligam especificamente à PD- 1 são descritos em WO02010/027827 e WO2011/066342, os quais são aqui incorporados por referência na sua totalidade. Em algumas moda- lidades, o antagonista de PD-1 é AMP-224 (também conhecido como B7-DCIg), que é uma proteína de fusão PD-L2-FC que se liga especifi- camente à PD-1 humana.
[00363] Será entendido por um versado na técnica que qualquer an- tagonista de PD-1 que se liga à PD-1 ou PD-L1 e interrompe a via de sinalização PD-1/PD-L1, é adequado para composições, métodos e usos aqui divulgados.
[00364] Em algumas modalidades, o antagonista de PD-1/PD-L1 é uma molécula pequena, um ácido nucleico, um peptídeo, um peptídeo mimético, uma proteína, um carboidrato, um derivado de carboidrato ou um glicopolímero. Inibidores de PD-1 de molécula pequena exemplifica- tivos são descritos em Zhan et al.,, (2016) Drug Discov Today 21(6):1027-1036. Combinações com inibidores TIM-3
[00365] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL-27, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, fornecida pela descrição é combinada (por exemplo, administrada em combinação) com um inibi- dor de TIM-3. O inibidor de TIM-3 pode ser um anticorpo, um fragmento de ligação de antígeno, uma imunoadesina, uma proteína de fusão, ou um oligopeptídeo. Em algumas modalidades, o inibidor de TIM-3 é es- colhido entre MGB453 (Novartis), TSR-022 (Tesaro) ou LY 3321367 (Eli Lilly). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IL-27, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, é administrado em combinação com MGB453. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IL-27, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, é administrado em combinação com TSR-022. Combinações com inibidores LAG-3
[00366] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL-27, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, fornecida pela descrição é combinada (por exemplo, administrada em combinação) com um inibi- dor de LAG-3. O inibidor de LAG-3 pode ser um anticorpo, um fragmento de ligação de antígeno, uma imunoadesina, uma proteína de fusão, ou oligopeptídeo. Em algumas modalidades, o inibidor de LAG-3 é esco- lhido de LAG525 (Novartis), BMS-986016 (Bristol-Myers S quibb), TSR- 033 (Tesaro), MK-4280 (Merck & Co) ou REGN3767 (Regeneron). Outras combinações
[00367] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL-27, ou por- ção de ligação ao antígeno do mesmo, fornecido pela descrição é com- binado (por exemplo, administrado em combinação) com um inibidor de TIGIT, um inibidor de quinase (por exemplo, um inibidor de tirosina qui- nase (TKI)), um inibidor de CD112R, um inibidor de receptor de TAM, um agonista de STING e/ou um agonista de 4-1BB ou uma combinação dos mesmos. Métodos de detecção
[00368] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-IL-27 ou um fra- gmento de ligação ao antígeno do mesmo aqui descrito pode ser em- pregado em métodos de detecção e/ou quantificação de IL-27 humano em uma amostra biológica. P or conseguinte, um anticorpo anti-IL-27, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como descrito aqui é útil para diagnosticar, prognosticar e/ou determinar a progressão da do- ença (por exemplo, câncer) em um paciente.
[00369] Monitorar um sujeito (por exemplo, um paciente humano) em busca de uma melhora em um câncer, como aqui definido, significa ava- liar o sujeito em busca de uma alteração no parâmetro da doença, por exemplo, uma redução no crescimento do tumor. Em algumas modali- dades, a avaliação é realizada pelo menos uma (1) hora, por exemplo, pelo menos 2, 4, 6, 8, 12, 24 ou 48 horas, ou pelo menos 1 dia, 2 dias, 4 dias, 10 dias, 13 dias, 20 dias ou mais, ou pelo menos 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 10 semanas, 13 semanas, 20 semanas ou mais,
após uma administração. O sujeito pode ser avaliado em um ou mais dos seguintes períodos: antes do início do tratamento; durante o trata- mento; ou após a administração de um ou mais elementos do trata- mento. A avaliação pode incluir avaliar a necessidade de tratamento adicional, por exemplo, avaliar se uma dosagem, frequência de admi- nistração ou duração do tratamento deve ser alterada. Também pode incluir a avaliação da necessidade de adicionar ou eliminar uma moda- lidade terapêutica selecionada, por exemplo, adicionar ou eliminar qual- quer um dos tratamentos para um câncer aqui descrito.
[00370] Em algumas modalidades, a descrição fornece um método de detecção de IL-27 em uma amostra de um sujeito, o método compre- endendo (a) contatar uma amostra do sujeito com um anticorpo de de- tecção sob condições para permitir que o anticorpo de detecção forme um complexo anticorpo de detecção-lL-27, se IL-27 estiver presente na amostra, em que o anticorpo de detecção é um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, fornecido pela descrição; e (b) de- tectar a presença do complexo, se houver, produzido na etapa (a).
[00371] Em algumas modalidades, a descrição fornece um método para detectar um câncer associado à IL-27 em um sujeito, o método compreendendo as etapas de: (a) contatar uma amostra de um sujeito suspeito de ter um câncer associado à IL-27 com um anticorpo de de- tecção sob condições para permitir que o anticorpo de detecção forme um complexo anticorpo de detecção-lL-27, se IL-27 estiver presente na amostra, em que o anticorpo de detecção é um anticorpo ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, fornecido pela descrição; e (b) de- tectar a presença do complexo, se houver, produzido na etapa (a). Em algumas modalidades, o anticorpo de detecção é acoplado a um mar- cador detectável. Em algumas modalidades, o método compreende ainda contatar a amostra com um anticorpo de captura para produzir um complexo compreendendo IL-27 e o anticorpo de captura, se IL-27 esti- ver presente na amostra, em que o anticorpo de captura é um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, fornecido pela descrição.
[00372] Em algumas modalidades, o anticorpo de captura é imobili- zado em um suporte sólido. Em algumas modalidades, a amostra é con- tatada com o anticorpo de captura antes do anticorpo de detecção. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de fluido corporal. Em algumas modalidades, a amostra de fluido é sangue, soro, plasma, lisa- dos celulares ou lisados de tecido.
[00373] Em algumas modalidades, o câncer é selecionado de carci- noma de células renais (RCC), carcinoma hepatocelular, câncer de pul- mão, câncer gastroesofágico, câncer de ovário, câncer de endométrio, melanoma, leucemia e linfoma. Em algumas modalidades, o câncer é carcinoma de células renais (RCC). Em outras modalidades, o câncer é carcinoma hepatocelular (HCC). Em algumas modalidades, o câncer é selecionado de leucemia e linfoma. Em algumas modalidades, o câncer é leucemia mieloide aguda (AML). EXEMPLOS:
[00374] Embora a presente descrição tenha sido descrita com refe- rência às modalidades específicas da mesma, deve ser compreendido por aqueles versados na técnica que várias mudanças podem ser feitas e equivalentes podem ser substituídos sem afastamento do verdadeiro espírito e escopo da descrição. Além disso, podem ser feitas muitas mo- dificações para adaptar uma situação particular, material, composição de matéria, processo, etapas ou etapas de processo, ao objetivo, espí- rito e âmbito da presente descrição. Todas essas modificações devem estar dentro do escopo da descrição. Exemplo 1: Geração e caracterização de anticorpos anti-IL-27 que se ligam especificamente ao monômero IL-27 EBI3
[00375] Este exemplo descreve a produção de anticorpos anti-IL-27 que se ligam especificamente à subunidade EBI3 da IL-27 humana. Re- sumidamente, camundongos BALB/c foram imunizados com um vetor de imunização EBI3 humano (Aldevron) e usados na geração e isola- mento de hibridomas que expressam anticorpos monoclonais anti-EBI3. Os hibridomas isolados incluíram hibridomas que expressam moléculas de anticorpo anti-IL-27 aqui referidas como Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, AbS5, Ab6, Ab7 e Ab8. Os sobrenadantes do hibridoma foram analisados por citometria de fluxo em células de mamíferos que expressam um EBI3 humano direcionado à superfície. Todos os sobrenadantes do clone de hibridoma testados se ligaram a células que expressam EBI3 (dados não mostrados).
[00376] Um anticorpo anti-EBI3 isolado Ab7 exemplificativo (dora- vante referido como "Ab7", compreendendo uma região variável de ca- deia pesada de imunoglobulina doravante referida como "Ab7-Vno" e uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina doravante refe- rida como "Ab7-V.o") foi sequenciado e adicionalmente caracterizado abaixo (sequências peptídicas de sinal do terminal amino não são mos- tradas).
[00377] A região variável da cadeia pesada do anticorpo Ab7 isolado (Ab7-Vno) tem a seguinte sequência (FRI-CDR1-FR2-CDR2-FR3- CDR3-FRA4-Região constante): EVKLVESGGGLVQPGGSLKLFCAASGFTFTSYSMSWVRQTPEKR- LEWVAYISYDGGSAYYP-
DTVKGRFSISRDNAKKTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHGDYDDDD AMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 1).
[00378] Uma sequência de ácido nucleico que codifica a região vari- ável da cadeia pesada Ab7-Vno tem a seguinte sequência (FRI-CDR1- FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4): GAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAG-
CCTGGGGGGTCCCTGAAACTCTT- CTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTACCAGCTATTCCATGAGCTG GGTCCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATA- CATTAGTTATGATGGTGG- TAGCGCCTACTACCCTGACACTGTGAAGGGCCGGTTCTCCATCTC CAGAGACAATGCCAAGAAAACCCTGTATCTGCAAATGAGCAG- CCTGAAGTCTGAGGACACGG-
CCATGTATTACTGTGCAAGACATGGAGACTATGACGACGACGAC GCGATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCTCAGTCACCG- TCTCCTCA (SEQ ID NO: 2).
[00379] A região variável da cadeia leve do anticorpo Ab7 isolado (Ab7-V1o) tem a seguinte sequência (FRI-CDR1-FR2-CDR2-FR3- CDR3-FRA4-Região constante): DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASE- NIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAETLTEGVPS-
RFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGNYYCQHHYGTPLTFGAGTKLDL K (SEQ ID NO: 3).
[00380] A cadeia pesada do anticorpo Ab7 isolado (Ab7-VromlgG2a) tem a seguinte sequência (FRI-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-Re- gião constante): EVKLVESGGGLVQPGGSLKLFCAASGFTFTSYSMSWVRQTPEKR- LEWVAYISYDGGSAYYP-
DTVKGRFSISRDNAKKTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHGDYDDDD AMDYWGQGTSVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLG- CLVKGYFPEPVTLTWNSGS- LSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKV DKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPI- VTCVVVDVSEDDP- DVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGK EFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTK- KQVTLTCMVTDFMPEDIY-
VEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYS CSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK (SEQ ID NO: 183).
[00381] Uma sequência de ácido nucleico que codifica a região vari- ável da cadeia leve Ab7-V.otem a seguinte sequência (FRI-CDR1-FR2- CDR2-FR3-CDR3-FR4): GACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGCCTCCCTGTCTGCATCTG- TAGGAGAAACTGTCACCAT-
CACTTGCCGGGCAAGTGAGAACATTTACAGCTATTTAGCATGGTA TCAGCAGAAACAGGGGAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATAATG- CAGAAACCTTGACA- GAAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAC AATTCTCTCTCAAGATCAACAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGG- GAATTACTACTGTCAACAT-
CATTACGGTACCCCGCTCACATTCGGCGCTGGGACCAAGCTGGA TCTGAAA (SEQ ID NO: 4).
[00382] A cadeia leve do anticorpo Ab7 isolado (Ab7-Vio-mKappa) tem a seguinte sequência (FRI-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-Re- gião constante): DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASE- NIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAETLTEGVPS-
RFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGNYYCQHHYGTPLTFGAGTKLDL KADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKID- GSERQNGVLNSWTDQDSK-
DSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO: 184).
[00383] Os anticorposAb7 humanizados foram concebidos utilizando métodos conhecidos na técnica. Resumidamente, as sequências do gene da região V que codificam o anticorpo monoclonal Ab7 de camun- dongo foram usadas para construir uma série de anticorpos totalmente humanizados. Os genes da região variável foram clonados em vetores que codificam um domínio constante da cadeia pesada de IgG1 humana e um domínio constante da cadeia leve Capa humana. Os anticorpos quiméricos e humanizados foram expressos transitoriamente em células de mamíferos. A humanização da região variável da cadeia pesada Ab7 isolada resultou em 5 variantes da região variável da cadeia pesada hu- manizada (doravante referidas como “Ab7-Vhu1,” “Ab7-Vhn2,” “Ab7-Vu3/” “Ab7-Vra,” e “Ab7-Vn5”). A humanização da região variável da cadeia leve Ab7 isolada resultou em 4 variantes da região variável da cadeia leve humanizada (doravante referidas como “Ab7-Vu1,” “Ab7-V12,” “Ab7- V13,” e “Ab7-Vid”).
[00384] As sequências de proteína que definem as regiões variáveis de variantes Ab7 humanizadas e as sequências nucleotídicas que codi- ficam as regiões variáveis de variantes Ab7 humanizadas estão resumi- das abaixo (as sequências peptídicas de sinal do terminal amino não são mostradas).
[00385] A região variável da cadeia pesada Ab7-Vu1 tem a seguinte sequência (FRI-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FRA4): EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYSMSWNVR- QAPGKGLEWVAYISYDGGSAYYP-
DTVKGRFTISRDNSKKTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHGDYDDDDA MDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 5).
[00386] Uma sequência de ácido nucleico que codifica a região vari- ável da cadeia pesada Ab7-Vx1 em à seguinte sequência (FRI-CDR1- FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4): GAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAG- CCTGGGGGGTCCCTGAGAC-
TCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTACCAGCTATTCCATGA GCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCG- CATACATTAGTTATGATGG- TGGTAGCGCCTACTACCCTGACACTGTGAAGGGCCGGTTCACCA TCTCCAGAGACAATTCCAAGAAAACCCTGTATCTGCAAATGAG- CAGCCTGAAGTCTGAGGA-
CACGGCCATGTATTACTGTGCAAGACATGGAGACTATGACGACG ACGACGCGATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCTCAGTCACCG- TCTCCTCA (SEQ ID NO: 6).
[00387] A região variável da cadeia pesada Ab7-Vh2 tem a seguinte sequência (FRI-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FRA4): EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYSMSWVR- QAPGKGLEWVAYISYDGGSAYYP-
DTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHGDYDDDD AMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 7).
[00388] “Uma sequência de ácido nucleico que codifica a região vari- ável da cadeia pesada Ab7-Vx2 em à seguinte sequência (FRI-CDR1- FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4): GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAG- CCTGGGGGGTCCCTGAGAC-
TCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTACCAGCTATTCCATGA GCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCG- CATACATTAGTTATGATGG- TGGTAGCGCCTACTACCCTGACACTGTGAAGGGCCGGTTCACCA TCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTGCAAATGAG- CAGCCTGAAGTCTGAGGA-
CACGGCCATGTATTACTGTGCAAGACATGGAGACTATGACGACG ACGACGCGATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCG- TCTCCTCA (SEQ ID NO: 8).
[00389] A região variável da cadeia pesada Ab7-Vu3 tem a seguinte sequência (FRI-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FRA4):
EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYSMSWNVR- QAPGKGLEWVAYISYDGGSAYYP-
DTVKGRFTISRDNSKKTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGDY DDDDA MDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 9).
[00390] Uma sequência de ácido nucleico que codifica a região vari- ável da cadeia pesada Ab7-Vx3 em a seguinte sequência (FRI-CDR1- FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4): GAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAG- CCTGGGGGGTCCCTGAGAC-
TCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTACCAGCTATTCCATGA GCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCG- CATACATTAGTTATGATGG- TGGTAGCGCCTACTATCCTGACACTGTGAAGGGCCGGTTCACCAT CTCCAGAGACAATTCCAAGAAAACCCTGTATCTGCAAATGAACA- GCCTGAGAGCCGAGGACA-
CGGCCGTATATTACTGTGCAAGACATGGAGACTATGACGACGAC GACGCGATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCG- TCTCCTCA (SEQ ID NO: 10).
[00391] A região variável da cadeia pesada Ab7-Vua tem a seguinte sequência (FRI-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FRA4): EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYSMSWVR- QAPGKGLEWVAYISYDGGSAYYP-
DTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGDYDDDDA MDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 11).
[00392] Uma sequência de ácido nucleico que codifica a região vari- ável da cadeia pesada Ab7-Vna em à seguinte sequência (FRI-CDR1- FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4): GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAG- CCTGGGGGGTCCCTGAGAC-
TCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTACCAGCTATTCCATGA GCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCG- CATACATTAGTTATGATGG- TGGTAGCGCCTACTATCCTGACACTGTGAAGGGCCGGTTCACCAT CTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTGCAAATGAACA- GCCTGAGAGCCGAGGACA-
CGGCCGTATATTACTGTGCAAGACATGGAGACTATGACGACGAC GACGCGATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCG- TCTCCTCA (SEQ ID NO: 12).
[00393] A região variável da cadeia pesada Ab7-Vus tem a seguinte sequência (FRI-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FRA4): EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYSMSWNVR- QAPGKGLEWVSYISYDGGSAYYP-
DTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGDY DDDDA MDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 13).
[00394] “Uma sequência de ácido nucleico que codifica a região vari- ável da cadeia pesada Ab7-Vns em à seguinte sequência (FRI-CDR1- FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4): GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAG- CCTGGGGGGTCCCTGAGAC-
TCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTACCAGCTATTCCATGA GCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTG- TCTTACATTAGTTATGATGG- TGGTAGCGCCTACTATCCTGACACTGTGAAGGGCCGGTTCACCAT CTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTGCAAATGAACA- GCCTGAGAGCCGAGGACA-
CGGCCGTATATTACTGTGCAAGACATGGAGACTATGACGACGAC GACGCGATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCG- TCTCCTCA (SEQ ID NO: 14).
[00395] A região variável da cadeia leve Ab7-Vu1 tem a seguinte se- quência (FRI-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASE- NIYSYLAWYQQKQGKAPKLLVYNAETLTEGVPS-
RFSGSGSGTDFTLTISSLQOPEDFANYYCQHHYGTPLTFGQGTKLDIK (SEQ ID NO: 15).
[00396] Uma sequência de ácido nucleico que codifica a região vari- ável da cadeia leve Ab7-Vu1 tem a seguinte sequência (FRI-CDR1-FR2- CDR2-FR3-CDR3-FR4): GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTG- TAGGAGACAGAGTCACCAT-
CACTTGCCGGGCAAGTGAGAACATTTACAGCTATTTAGCATGGTA TCAGCAGAAACAGGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGGTCTATAA- TGCAGAAACCTTGACA- GAAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAG ATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTG- CAAATTACTACTGTCAACAT-
CATTACGGTACCCCGCTCACATTCGGCCAAGGGACCAAGCTGGA TATCAAA (SEQ ID NO: 16).
[00397] A região variável da cadeia leve Ab7-V12 tem a seguinte se- quência (FRI-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4): DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQK- PGKAPKLLVYNAETLTEGVPS-
RFSGSGSGTDFTLTISSLQOPEDFANYYCQHHYGTPLTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 17).
[00398] Uma sequência de ácido nucleico que codifica a região vari- ável da cadeia leve Ab7-V.2 tem a seguinte sequência (FRI-CDR1-FR2- CDR2-FR3-CDR3-FR4): GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTG- TAGGAGACAGAGTCACCAT-
CACTTGCCGGGCAAGTGAGAACATTTACAGCTATTTAGCATGGTA TCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGGTCTATAA- TGCAGAAACCTTGACA- GAAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAG ATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTG- CAAATTACTACTGTCAACAT-
CATTACGGTACCCCGCTCACATTCGGCCAAGGGACCAAGCTGGA AATCAAA (SEQ ID NO: 18).
[00399] A região variável da cadeia leve Ab7-V13 tem a seguinte se- quência (FRI-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4): DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQK- PGKAPKLLVYNAETLTEGVPS-
RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPLTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 19).
[00400] “Uma sequência de ácido nucleico que codifica a região vari- ável da cadeia leve Ab7-V.3 tem a seguinte sequência (FRI-CDR1-FR2- CDR2-FR3-CDR3-FR4): GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTG- TAGGAGACAGAGTCACCAT-
CACTTGCCGGGCAAGTGAGAACATTTACAGCTATTTAGCATGGTA TCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGGTCTATAA- TGCAGAAACCTTGACA- GAAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAG ATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTG- CAACTTACTACTGTCAACAT-
CATTACGGTACCCCGCTCACATTCGGCCAAGGGACCAAGCTGGA AATCAAA (SEQ ID NO: 20).
[00401] A região variável da cadeia leve Ab7-V1a tem a seguinte se- quência (FRI-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4): DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLNWYQQK-
PGKAPKLLVYNAETLTEGVPS-
RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPLTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 21).
[00402] “Uma sequência de ácido nucleico que codifica a região vari- ável da cadeia leve Ab7-V.a tem a seguinte sequência (FRI-CDR1-FR2- CDR2-FR3-CDR3-FR4): GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTG- TAGGAGACAGAGTCACCAT-
CACTTGCCGGGCAAGTGAGAACATTTACAGCTATTTAAATTGGTAT CAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGGTCTATAATG- CAGAAACCTTGACA- GAAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAG ATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTG- CAACTTACTACTGTCAACAT-
CATTACGGTACCCCGCTCACATTCGGCCAAGGGACCAAGCTGGA AATCAAA (SEQ ID NO: 22).
[00403] As sequências de aminoácidos de CDR de cadeia pesada e de cadeia leve do anticorpo Ab7 parental isolado (definição de Kabat) são mostradas na Tabela 1. TABELA1 qua TOTIT fe e free HCDR1 HCDR2 HCDR3 sada: SYSMS YISYDGGSAYYP- Ab7-Vhuo HGDYDDDDAMDY (SEQIDNO (SEQ ID NO: | DTVKG (SEQ ID NO: 16) 25) Momo gene deçõã Emma RASE- Ab7T-V1o NIYSYLA NAETLTE QHHYGTPLT (SEQ ID NO: 29) (SEQ ID NO: | (SEQID NO: 27) (SEQ ID NO: 28) 26)
[00404] Paracriaras sequências completas de anticorpos da cadeia pesada ou leve quiméricas e humanizadas, cada região variável da ca- deia pesada descrita acima foi combinada com uma região constante de IgG1 humana, e cada região variável da cadeia leve descrita acima foi combinada com uma região constante Capa humana.
[00405] As sequências de proteínas que definem a cadeia pesada e a cadeia leve completas das variantes Ab7 quiméricas e humanizadas estão resumidas abaixo (as sequências peptídicas de sinal do terminal amino não são mostradas).
[00406] A cadeia pesada Ab7-Vno-I9G1 tem a seguinte sequência (FRI-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-Região Constante): EVKLVESGGGLVQPGGSLKLFCAASGFTFTSYSMSWVRQTPEKR- LEWVAYISYDGGSAYYP-
DTVKGRFSISRDNAKKTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHGDYDDDD AMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK- DYFPEPVTVSWNSGAL- TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHED- PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN- QVSLTCLVKGFYPSDI-
AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 29).
[00407] Uma sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia pe- sada Ab7-Vuo-I9G1 tem a seguinte sequência (FRI-CDR1-FR2-CDR2- FR3-CDR3-FR4-R egião constante): GAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAG- CCTGGGGGGTCCCTGAAACTCTT-
CTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTACCAGCTATTCCATGAGCTG GGTCCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATA- CATTAGTTATGATGGTGG- TAGCGCCTACTACCCTGACACTGTGAAGGGCCGGTTCTCCATCTC CAGAGACAATGCCAAGAAAACCCTGTATCTGCAAATGAGCAG- CCTGAAGTCTGAGGACACGG- CCATGTATTACTGTGCAAGACATGGAGACTATGACGACGACGAC GCGATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCT- CAGCCTCCACCAAAGG- CCCCAGCGTCTTCCCCCTCGCGCCGTCCTCCAAGTCCACCTCGG GTGGCACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTT- CCCGGAGCCTGTGACCGTG- TCCTGGAACTCGGGCGCGCTCACGAGCGGCGTACACACCTTCCC GGCGGTGCTCCAGTCCTCCGGGCTGTACTCGCTCTCGTCGGTCG- TCACGGTGCCG- TCCTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCAC AAGCCGTCCAACACCAAGGTGGATAAGAAGGTCGAGCCCAAG- TCGTGCGACAAGACGCACA- CGTGCCCGCCGTGCCCGGCCCCEGGAGCECTGCECTGGGCGGCCCCETCE GGTCTTCCTGTTCCCCCCGAAGCCCAAGGATACG- CTGATGATCTCCCGCACCCCGGAGGT- CACCTGCGTGGTGGTGGACGTCTCCCACGAGGACCCGGAGGTGA AATTCAACTGGTACGTCGACGGAGTGGAGGTCCACAACGCCAA- GACCAAGCCCCGGGAGGAG- CAGTACAACTCCACGTACCGCGTCGTCTCCGTCCTGACCGTCCTC CACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGG- TCTCCAACAAGGCGCTGCCCG- CCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCAAAGGGTCAGCCGCGG GAGCCGCAGGTCTATACCCTCCCCCCGTCCCGCGACGAGCTGA- CGAAAAACCAGG- TCTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGTTTCTACCCCTCCGACATCG CGGTCGAGTGGGAGTCGAACGGCCAGCCGGAGAACAACTACAA- GACCACCCCCCCCGTG- CTCGACAGTGACGGCTCGTTCTTCCTGTACTCGAAGCTGACCGTC GACAAGTCGCGCTGGCAGCAGGGCAACGTCTTCTCGTGCTCCGT- TATGCACGAGGCCCTGCA-
CAACCACTACACGCAGAAGAGTCTTTCGCTGTCCCCGGGGAAGT GA (SEQ ID NO: 30).
[00408] A cadeia pesada Ab7-Vn1-I9G1 tem à seguinte sequência (FRI-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-Região constante): EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYSMSWNVR- QAPGKGLEWVAYISYDGGSAYYP-
DTVKGRFTISRDNSKKTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHGDYDDDDA MDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK- DYFPEPVTVSWNSGAL- TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHED- PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN- QVSLTCLVKGFYPSDI-
AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 31).
[00409] “Uma sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia pe- sada Ab7-Vu1-I9G1 tem a seguinte sequência (FRI-CDR1-FR2-CDR2- FR3-CDR3-FR4-R egião constante): GAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAG- CCTGGGGGGTCCCTGAGAC-
TCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTACCAGCTATTCCATGA GCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCG- CATACATTAGTTATGATGG- TGGTAGCGCCTACTACCCTGACACTGTGAAGGGCCGGTTCACCA TCTCCAGAGACAATTCCAAGAAAACCCTGTATCTGCAAATGAG- CAGCCTGAAGTCTGAGGA- CACGGCCATGTATTACTGTGCAAGACATGGAGACTATGACGACG ACGACGCGATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCTCAGTCACCG- TCTCCTCAGCCTCCAC- CAAAGGCCCCAGCGTCTTCCCCCTCGCGCCGTCCTCCAAGTCCA CCTCGGGTGGCACCGCCGCCCECTGGGCTGCCTGGTCAAGGAC- TACTTCCCGGAGCCTGTGAC- CGTGTCCTGGAACTCGGGCGCGCTCACGAGCGGCGTACACACCT TCCCGGCGGTGCTCCAGTCCTCCGGGCTGTACTCGCTCTCG- TCGGTCGTCACGGTGCCG- TCCTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCAC AAGCCGTCCAACACCAAGGTGGATAAGAAGGTCGAGCCCAAG- TCGTGCGACAAGACGCACA- CGTGCCCGCCGTGCCCGGCCCCEGGAGCECTGCECTGGGCGGCCCCETCE GGTCTTCCTGTTCCCCCCGAAGCCCAAGGATACG- CTGATGATCTCCCGCACCCCGGAGGT- CACCTGCGTGGTGGTGGACGTCTCCCACGAGGACCCGGAGGTGA AATTCAACTGGTACGTCGACGGAGTGGAGGTCCACAACGCCAA- GACCAAGCCCCGGGAGGAG- CAGTACAACTCCACGTACCGCGTCGTCTCCGTCCTGACCGTCCTC CACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGG- TCTCCAACAAGGCGCTGCCCG- CCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCAAAGGGTCAGCCGCGG GAGCCGCAGGTCTATACCCTCCCCCCGTCCCGCGACGAGCTGA- CGAAAAACCAGG- TCTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGTTTCTACCCCTCCGACATCG CGGTCGAGTGGGAGTCGAACGGCCAGCCGGAGAACAACTACAA- GACCACCCCCCCCGTG- CTCGACAGTGACGGCTCGTTCTTCCTGTACTCGAAGCTGACCGTC GACAAGTCGCGCTGGCAGCAGGGCAACGTCTTCTCGTGCTCCGT- TATGCACGAGGCCCTGCA-
CAACCACTACACGCAGAAGAGTCTTTCGCTGTCCCCGGGGAAGT GA (SEQ ID NO: 32).
[00410] A cadeia pesada Ab7-Vn2-I9G1 tem a seguinte sequência (FRI-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-Região constante): EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYSMSWVR- QAPGKGLEWVAYISYDGGSAYYP-
DTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHGDYDDDD AMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK- DYFPEPVTVSWNSGAL- TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHED- PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN- QVSLTCLVKGFYPSDI-
AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 33).
[00411] Uma sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia pe- sada Ab7-Vu2-I9G1 tem a seguinte sequência (FRI-CDR1-FR2-CDR2- FR3-CDR3-FR4-R egião constante): GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAG- CCTGGGGGGTCCCTGAGAC-
TCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTACCAGCTATTCCATGA GCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCG- CATACATTAGTTATGATGG- TGGTAGCGCCTACTACCCTGACACTGTGAAGGGCCGGTTCACCA TCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTGCAAATGAG- CAGCCTGAAGTCTGAGGA- CACGGCCATGTATTACTGTGCAAGACATGGAGACTATGACGACG ACGACGCGATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCG- TCTCCTCAGCCTCCAC- CAAAGGCCCCAGCGTCTTCCCCCTCGCGCCGTCCTCCAAGTCCA CCTCGGGTGGCACCGCCGCCCECTGGGCTGCCTGGTCAAGGAC- TACTTCCCGGAGCCTGTGAC- CGTGTCCTGGAACTCGGGCGCGCTCACGAGCGGCGTACACACCT TCCCGGCGGTGCTCCAGTCCTCCGGGCTGTACTCGCTCTCG- TCGGTCGTCACGGTGCCG- TCCTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCAC AAGCCGTCCAACACCAAGGTGGATAAGAAGGTCGAGCCCAAG- TCGTGCGACAAGACGCACA- CGTGCCCGCCGTGCCCGGCCCCEGGAGCECTGCECTGGGCGGCCCCETCE GGTCTTCCTGTTCCCCCCGAAGCCCAAGGATACG- CTGATGATCTCCCGCACCCCGGAGGT- CACCTGCGTGGTGGTGGACGTCTCCCACGAGGACCCGGAGGTGA AATTCAACTGGTACGTCGACGGAGTGGAGGTCCACAACGCCAA- GACCAAGCCCCGGGAGGAG- CAGTACAACTCCACGTACCGCGTCGTCTCCGTCCTGACCGTCCTC CACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGG- TCTCCAACAAGGCGCTGCCCG- CCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCAAAGGGTCAGCCGCGG GAGCCGCAGGTCTATACCCTCCCCCCGTCCCGCGACGAGCTGA- CGAAAAACCAGG- TCTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGTTTCTACCCCTCCGACATCG CGGTCGAGTGGGAGTCGAACGGCCAGCCGGAGAACAACTACAA- GACCACCCCCCCCGTG- CTCGACAGTGACGGCTCGTTCTTCCTGTACTCGAAGCTGACCGTC GACAAGTCGCGCTGGCAGCAGGGCAACGTCTTCTCGTGCTCCGT- TATGCACGAGGCCCTGCA-
CAACCACTACACGCAGAAGAGTCTTTCGCTGTCCCCGGGGAAGT GA (SEQ ID NO: 34).
[00412] A cadeia pesada Ab7-Vu3-I9G1 tem a seguinte sequência (FRI-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-Região constante): EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYSMSWNVR- QAPGKGLEWVAYISYDGGSAYYP-
DTVKGRFTISRDNSKKTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGDY DDDDA MDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK- DYFPEPVTVSWNSGAL- TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHED- PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN- QVSLTCLVKGFYPSDI-
AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 35).
[00413] Uma sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia pe- sada Ab7-Vu3-I9G1 tem a seguinte sequência (FRI-CDR1-FR2-CDR2- FR3-CDR3-FR4-R egião constante): GAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAG- CCTGGGGGGTCCCTGAGAC-
TCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTACCAGCTATTCCATGA GCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCG- CATACATTAGTTATGATGG- TGGTAGCGCCTACTATCCTGACACTGTGAAGGGCCGGTTCACCAT CTCCAGAGACAATTCCAAGAAAACCCTGTATCTGCAAATGAACA- GCCTGAGAGCCGAGGACA- CGGCCGTATATTACTGTGCAAGACATGGAGACTATGACGACGAC GACGCGATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCG- TCTCCTCAGCCTCCACCAAAGG- CCCCAGCGTCTTCCCCCTCGCGCCGTCCTCCAAGTCCACCTCGG GTGGCACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTT- CCCGGAGCCTGTGACCGTG- TCCTGGAACTCGGGCGCGCTCACGAGCGGCGTACACACCTTCCC GGCGGTGCTCCAGTCCTCCGGGCTGTACTCGCTCTCGTCGGTCG- TCACGGTGCCG- TCCTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCAC AAGCCGTCCAACACCAAGGTGGATAAGAAGGTCGAGCCCAAG- TCGTGCGACAAGACGCACA- CGTGCCCGCCGTGCCCGGCCCCEGGAGCTGCECTGGGCGGCCCCETCE GGTCTTCCTGTTCCCCCCGAAGCCCAAGGATACG- CTGATGATCTCCCGCACCCCGGAGGT- CACCTGCGTGGTGGTGGACGTCTCCCACGAGGACCCGGAGGTGA AATTCAACTGGTACGTCGACGGAGTGGAGGTCCACAACGCCAA- GACCAAGCCCCGGGAGGAG- CAGTACAACTCCACGTACCGCGTCGTCTCCGTCCTGACCGTCCTC CACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGG- TCTCCAACAAGGCGCTGCCCG- CCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCAAAGGGTCAGCCGCGG GAGCCGCAGGTCTATACCCTCCCCCCGTCCCGCGACGAGCTGA- CGAAAAACCAGG- TCTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGTTTCTACCCCTCCGACATCG CGGTCGAGTGGGAGTCGAACGGCCAGCCGGAGAACAACTACAA- GACCACCCCCCCCGTG- CTCGACAGTGACGGCTCGTTCTTCCTGTACTCGAAGCTGACCGTC GACAAGTCGCGCTGGCAGCAGGGCAACGTCTTCTCGTGCTCCGT- TATGCACGAGGCCCTGCA-
CAACCACTACACGCAGAAGAGTCTTTCGCTGTCCCCGGGGAAGT GA (SEQ ID NO: 36).
[00414] A cadeia pesada Ab7-Vuna-I9G1 tem a seguinte sequência (FRI-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-Região constante): EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYSMSWVR- QAPGKGLEWVAYISYDGGSAYYP-
DTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGDYDDDDA MDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK- DYFPEPVTVSWNSGAL- TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHED- PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN- QVSLTCLVKGFYPSDI-
AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 37).
[00415] Uma sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia pe- sada Ab7-Vu4-Ig9G1 tem a seguinte sequência (FRI-CDR1-FR2-CDR2- FR3-CDR3-FR4-R egião constante): GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAG- CCTGGGGGGTCCCTGAGAC-
TCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTACCAGCTATTCCATGA GCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCG- CATACATTAGTTATGATGG- TGGTAGCGCCTACTATCCTGACACTGTGAAGGGCCGGTTCACCAT CTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTGCAAATGAACA- GCCTGAGAGCCGAGGACA- CGGCCGTATATTACTGTGCAAGACATGGAGACTATGACGACGAC GACGCGATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCG- TCTCCTCAGCCTCCACCAAAGG- CCCCAGCGTCTTCCCCCTCGCEGCCGTCCTCCAAGTCCACCTCGG GTGGCACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTT- CCCGGAGCCTGTGACCGTG- TCCTGGAACTCGGGCGCGCTCACGAGCGGCGTACACACCTTCCC GGCGGTGCTCCAGTCCTCCGGGCTGTACTCGCTCTCGTCGGTCG- TCACGGTGCCG- TCCTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCAC AAGCCGTCCAACACCAAGGTGGATAAGAAGGTCGAGCCCAAG- TCGTGCGACAAGACGCACA- CGTGCCCGCCGTGCCCGGCCCCEGGAGCECTGCECTGGGCGGCCCCETCE GGTCTTCCTGTTCCCCCCGAAGCCCAAGGATACG- CTGATGATCTCCCGCACCCCGGAGGT- CACCTGCGTGGTGGTGGACGTCTCCCACGAGGACCCGGAGGTGA AATTCAACTGGTACGTCGACGGAGTGGAGGTCCACAACGCCAA- GACCAAGCCCCGGGAGGAG- CAGTACAACTCCACGTACCGCGTCGTCTCCGTCCTGACCGTCCTC CACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGG- TCTCCAACAAGGCGCTGCCCG- CCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCAAAGGGTCAGCCGCGG GAGCCGCAGGTCTATACCCTCCCCCCGTCCCGCGACGAGCTGA- CGAAAAACCAGG- TCTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGTTTCTACCCCTCCGACATCG CGGTCGAGTGGGAGTCGAACGGCCAGCCGGAGAACAACTACAA- GACCACCCCCCCCGTG- CTCGACAGTGACGGCTCGTTCTTCCTGTACTCGAAGCTGACCGTC GACAAGTCGCGCTGGCAGCAGGGCAACGTCTTCTCGTGCTCCGT- TATGCACGAGGCCCTGCA-
CAACCACTACACGCAGAAGAGTCTTTCGCTGTCCCCGGGGAAGT GA (SEQ ID NO: 38).
[00416] A cadeia pesada Ab7-Vus-lgG1 tem a seguinte sequência (FRI-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-Região constante): EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYSMSWNVR- QAPGKGLEWVSYISYDGGSAYYP-
DTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGDY DDDDA MDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK- DYFPEPVTVSWNSGAL- TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHED- PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN- QVSLTCLVKGFYPSDI-
AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 39).
[00417] Uma sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia pe- sada Ab7-Vu5-I9G1 tem a seguinte sequência (FRI-CDR1-FR2-CDR2- FR3-CDR3-FR4-R egião constante): GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAG- CCTGGGGGGTCCCTGAGAC-
TCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTACCAGCTATTCCATGA GCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTG- TCTTACATTAGTTATGATGG- TGGTAGCGCCTACTATCCTGACACTGTGAAGGGCCGGTTCACCAT CTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTGCAAATGAACA- GCCTGAGAGCCGAGGACA- CGGCCGTATATTACTGTGCAAGACATGGAGACTATGACGACGAC GACGCGATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCG- TCTCCTCAGCCTCCACCAAAGG- CCCCAGCGTCTTCCCCCTCGCGCCGTCCTCCAAGTCCACCTCGG GTGGCACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTT- CCCGGAGCCTGTGACCGTG- TCCTGGAACTCGGGCGCGCTCACGAGCGGCGTACACACCTTCCC GGCGGTGCTCCAGTCCTCCGGGCTGTACTCGCTCTCGTCGGTCG- TCACGGTGCCG- TCCTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCAC AAGCCGTCCAACACCAAGGTGGATAAGAAGGTCGAGCCCAAG- TCGTGCGACAAGACGCACA- CGTGCCCGCCGTGCCCGGCCCCEGGAGCECTGCECTGGGCGGCCCCETCE GGTCTTCCTGTTCCCCCCGAAGCCCAAGGATACG- CTGATGATCTCCCGCACCCCGGAGGT- CACCTGCGTGGTGGTGGACGTCTCCCACGAGGACCCGGAGGTGA AATTCAACTGGTACGTCGACGGAGTGGAGGTCCACAACGCCAA- GACCAAGCCCCGGGAGGAG- CAGTACAACTCCACGTACCGCGTCGTCTCCGTCCTGACCGTCCTC CACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGG- TCTCCAACAAGGCGCTGCCCG- CCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCAAAGGGTCAGCCGCGG GAGCCGCAGGTCTATACCCTCCCCCCGTCCCGCGACGAGCTGA- CGAAAAACCAGG- TCTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGTTTCTACCCCTCCGACATCG CGGTCGAGTGGGAGTCGAACGGCCAGCCGGAGAACAACTACAA- GACCACCCCCCCCGTG- CTCGACAGTGACGGCTCGTTCTTCCTGTACTCGAAGCTGACCGTC GACAAGTCGCGCTGGCAGCAGGGCAACGTCTTCTCGTGCTCCGT- TATGCACGAGGCCCTGCA-
CAACCACTACACGCAGAAGAGTCTTTCGCTGTCCCCGGGGAAGT GA (SEQ ID NO: 40).
[00418] A cadeialeve Ab7-Vio-Capa tem a seguinte sequência (FR1- CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-Região constante): DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASE- NIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAETLTEGVPS-
RFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGNYYCQHHYGTPLTFGAGTKLDL KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD- NALQSGNSQESVTE-
QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG EC (SEQ ID NO: 41).
[00419] “Uma sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia leve Ab7-Vio-Capa tem a seguinte sequência (FRI-CDR1-FR2-CDR2-FR3- CDR3-FRA4-Região constante): GACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGCCTCCCTGTCTGCATCTG- TAGGAGAAACTGTCACCAT-
CACTTGCCGGGCAAGTGAGAACATTTACAGCTATTTAGCATGGTA TCAGCAGAAACAGGGGAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATAATG- CAGAAACCTTGACA- GAAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAC AATTCTCTCTCAAGATCAACAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGG- GAATTACTACTGTCAACAT- CATTACGGTACCCCGCTCACATTCGGCGCTGGGACCAAGCTGGA TCTGAAACGAACGGTGGCCGCGCCGAGCGTCTTCATCTTCCCG- CCTTCCGACGAGCAGCT- CAAGTCCGGGACCGCCTCCGTAGTATGCCTCCTCAATAACTTCTA CCCCCGGGAGGCGAAGGTCCAGTGGAAGGTCGACAACG- CCCTCCAATCGGGCAACTCCCAG- GAGTCGGTGACCGAGCAGGATTCCAAGGACTCGACCTACAGTCT AAGCTCCACCCTCACACTGTCGAAGGCGGACTACGAGAAGCA- CAAGGTGTACGCCTGCGAGG-
TCACCCACCAGGGCCTGAGCAGCCCGGTCACCAAGTCCTTCAAC CGGGGCGAGTGCTGA (SEQ ID NO: 42).
[00420] A cadeialeve Ab7-Vi1-Capa tem a seguinte sequência (FR1- CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-Região constante): DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASE- NIYSYLAWYQQKQGKAPKLLVYNAETLTEGVPS-
RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFANYYCQHHYGTPLTFGQGTKLDIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL- QSGNSQESVTEQDSK-
DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 43).
[00421] Uma sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia leve Ab7-Vu1-Capa tem a seguinte sequência (FRI-CDR1-FR2-CDR2-FR3- CDR3-FRA4-Região constante): GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTG- TAGGAGACAGAGTCACCAT-
CACTTGCCGGGCAAGTGAGAACATTTACAGCTATTTAGCATGGTA TCAGCAGAAACAGGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGGTCTATAA- TGCAGAAACCTTGACA- GAAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAG ATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTG- CAAATTACTACTGTCAACAT- CATTACGGTACCCCGCTCACATTCGGCCAAGGGACCAAGCTGGA TATCAAACGAACGGTGGCCGCGCCGAGCGTCTTCATCTTCCCG- CCTTCCGACGAGCAGCT- CAAGTCCGGGACCGCCTCCGTAGTATGCCTCCTCAATAACTTCTA CCCCCGGGAGGCGAAGGTCCAGTGGAAGGTCGACAACG- CCCTCCAATCGGGCAACTCCCAG- GAGTCGGTGACCGAGCAGGATTCCAAGGACTCGACCTACAGTCT AAGCTCCACCCTCACACTGTCGAAGGCGGACTACGAGAAGCA- CAAGGTGTACGCCTGCGAGG-
TCACCCACCAGGGCCTGAGCAGCCCGGTCACCAAGTCCTTCAAC CGGGGCGAGTGCTGA (SEQ ID NO: 44).
[00422] A cadeialeve Ab7-Vi2-Capa tem a seguinte sequência (FR1- CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-Região constante): DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQK- PGKAPKLLVYNAETLTEGVPS-
RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFANYYCQHHYGTPLTFGQGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL- QSGNSQESVTEQDSK-
DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 45).
[00423] Uma sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia leve Ab7-Vi2-Capa tem a seguinte sequência (FRI-CDR1-FR2-CDR2-FR3- CDR3-FRA4-Região constante): GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTG- TAGGAGACAGAGTCACCAT-
CACTTGCCGGGCAAGTGAGAACATTTACAGCTATTTAGCATGGTA TCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGGTCTATAA- TGCAGAAACCTTGACA- GAAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAG ATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTG- CAAATTACTACTGTCAACAT- CATTACGGTACCCCGCTCACATTCGGCCAAGGGACCAAGCTGGA AATCAAACGAACGGTGGCCGCGCCGAGCGTCTTCATCTTCCCG- CCTTCCGACGAGCAGCT- CAAGTCCGGGACCGCCTCCGTAGTATGCCTCCTCAATAACTTCTA CCCCCGGGAGGCGAAGGTCCAGTGGAAGGTCGACAACG- CCCTCCAATCGGGCAACTCCCAG- GAGTCGGTGACCGAGCAGGATTCCAAGGACTCGACCTACAGTCT AAGCTCCACCCTCACACTGTCGAAGGCGGACTACGAGAAGCA- CAAGGTGTACGCCTGCGAGG-
TCACCCACCAGGGCCTGAGCAGCCCGGTCACCAAGTCCTTCAAC CGGGGCGAGTGCTGA (SEQ ID NO: 46).
[00424] A cadeialeve Ab7-V13-Capa tem a seguinte sequência (FR1- CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-Região constante): DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQK- PGKAPKLLVYNAETLTEGVPS-
RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPLTFGQGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL- QSGNSQESVTEQDSK-
DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 47).
[00425] Uma sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia leve Ab7-Vi13-Capa tem a seguinte sequência (FRI-CDR1-FR2-CDR2-FR3- CDR3-FRA4-Região constante): GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTG- TAGGAGACAGAGTCACCAT-
CACTTGCCGGGCAAGTGAGAACATTTACAGCTATTTAGCATGGTA TCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGGTCTATAA- TGCAGAAACCTTGACA- GAAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAG ATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTG- CAACTTACTACTGTCAACAT- CATTACGGTACCCCGCTCACATTCGGCCAAGGGACCAAGCTGGA AATCAAACGAACGGTGGCCGCGCCGAGCGTCTTCATCTTCCCG- CCTTCCGACGAGCAGCT- CAAGTCCGGGACCGCCTCCGTAGTATGCCTCCTCAATAACTTCTA CCCCCGGGAGGCGAAGGTCCAGTGGAAGGTCGACAACG- CCCTCCAATCGGGCAACTCCCAG- GAGTCGGTGACCGAGCAGGATTCCAAGGACTCGACCTACAGTCT AAGCTCCACCCTCACACTGTCGAAGGCGGACTACGAGAAGCA- CAAGGTGTACGCCTGCGAGG-
TCACCCACCAGGGCCTGAGCAGCCCGGTCACCAAGTCCTTCAAC CGGGGCGAGTGCTGA (SEQ ID NO: 48).
[00426] A cadeialeve Ab7-Vi4-Capa tem a seguinte sequência (FR1- CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-Região constante): DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLNWYQQK- PGKAPKLLVYNAETLTEGVPS-
RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPLTFGQGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL- QSGNSQESVTEQDSK-
DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 49).
[00427] Uma sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia leve Ab7-Vi4-Capa tem a seguinte sequência (FRI-CDR1-FR2-CDR2-FR3- CDR3-FRA4-Região constante): GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTG- TAGGAGACAGAGTCACCAT-
CACTTGCCGGGCAAGTGAGAACATTTACAGCTATTTAAATTGGTAT CAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGGTCTATAATG- CAGAAACCTTGACA- GAAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAG ATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTG- CAACTTACTACTGTCAACAT- CATTACGGTACCCCGCTCACATTCGGCCAAGGGACCAAGCTGGA AATCAAACGAACGGTGGCCGCGCCGAGCGTCTTCATCTTCCCG- CCTTCCGACGAGCAGCT- CAAGTCCGGGACCGCCTCCGTAGTATGCCTCCTCAATAACTTCTA CCCCCGGGAGGCGAAGGTCCAGTGGAAGGTCGACAACG- CCCTCCAATCGGGCAACTCCCAG- GAGTCGGTGACCGAGCAGGATTCCAAGGACTCGACCTACAGTCT AAGCTCCACCCTCACACTGTCGAAGGCGGACTACGAGAAGCA- CAAGGTGTACGCCTGCGAGG-
TCACCCACCAGGGCCTGAGCAGCCCGGTCACCAAGTCCTTCAAC CGGGGCGAGTGCTGA (SEQ ID NO: 50).
[00428] É também contemplado que as sequências da região variá- vel podem ser fundidas com outras sequências da região constante do anticorpo para produzir cadeias pesadas e leves de imunoglobulina de comprimento total. Por exemplo, as regiões variáveis da cadeia pesada Ab7-Vno, Ab7-Vn1, Ab7-Vn2, Ab7-Vn3, Ab7-Vh4, ou Ab7-Vx5 podem ser combinadas com uma IgG2, IgG3, IgG4 humana ou uma IgG4 compre- endendo um ou mais substituições de aminoácidos na região constante (por exemplo, IgG4mt ou IgG4mt2). Da mesma forma as regiões variá- veis da cadeia leve Ab7-V.LO, Ab7-VL1, Ab7-V12, Ab7-V13 ou Ab7-V4 podem ser combinadas com uma região constante lambda humana.
[00429] Os fragmentos de DNA que codificam as regiões variáveis da cadeia pesada e leve de Ab7 e as variantes de Ab7 humanizadas descritas acima foram sintetizados com sítios de enzima de restrição de flanqueamento para clonagem em um sistema de vetor de expressão pANT (Antítopo) para cadeias pesadas e Capa leves de I9G1. Todos os construtos foram confirmados por sequenciamento. As combinações de cadeia pesada e leve mostradas na Tabela 2 foram transitoriamente transfectadas em células HEK293 EBNA aderentes (LGC Standards,
Teddington, UK) usando um método de transfecção PEI e incubadas durante sete dias após a transfecção.
Tabela 2
[00430] Os anticorpos foram purificados a partir de sobrenadantes de cultura de células em colunas de Sepharose conjugada com Proteína À (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido), o tampão foi trocado em 1x DPBS pH 7,2 e quantificado por OD>28o0nm usando um coeficiente de extinção (E C(0,1%)) com base na sequência de aminoácidos prevista. 1 ug de cada anticorpo foi analisado por SDS-PAGE e bandas correspon- dentes ao perfil de um anticorpo típico foram observadas (dados não mostrados).
Caracterização In Vitro de anticorpos Anti-EBI3
[00431] O anticorpo Ab7 e as variantes do anticorpo Ab7 produzidas conforme descrito na Tabela 2 foram testados em uma série de ensaios in vitro para determinar suas características e atividades biológicas.
[00432] Para avaliara ligação das variantes do anticorpo Ab7 huma- nizado em relação ao anticorpo quimérico Ab7.1, foi estabelecido um ELISA de competição de ligação. As placas de ensaio foram revestidas com 1 ug/mL de IL-27 humana (hlL-27) (R&D Systems, Abingdon, UK) diluídas em 1x DPBS pH 7,2 e incubadas durante a noite a 4ºC. Todos os anticorpos foram diluídos em 2% de BSA/DPBS para 25 ug/mL e diluídos em série três vezes na placa para gerar uma curva de ligação de oito pontos. As diluições dos anticorpos foram pré-misturadas com o anticorpo Ab7.1 biotinilado a uma concentração final constante de 0,08 Vg/mL. As misturas de anticorpos foram então transferidas para as pla- cas de ensaio revestidas e incubadas durante 1 hora à temperatura am- biente. A ligação do anticorpo Ab7.1 biotinilado foi detectada com con- jugado de estreptavidina-peroxidase (Sigma-Aldrich, Gillingham, UK) e substrato TMB (ThermoFisher, Loughborough, UK). A reação foi inter- rompida com HCI 1M e a absorbância lida a 450 nm em um leitor de placas Dynex Technologies MRX TC Il.
[00433] Os valores absolutos de IC5o dos anticorpos testados foram determinados usando uma curva logística de quatro parâmetros. IC5o normalizado em relação ao ICso do anticorpo quimérico em cada placa está resumido na Tabela 3. Os resultados mostram que todas as vari- antes de Ab7 humanizadas geradas, com exceção de variantes con- tendo a cadeia leve Ab7-Vua, têm perfis de ligação semelhantes ao an- ticorpo Ab7.1 quimérico, com a maioria das variantes competindo em duas vezes do anticorpo Ab7.1 quimérico. Tabela 3
E E
PE pm e WO RD Ae EA
E PD AEE RP E E RE E RP AEE [BD A E BR
[00434] Os anticorpos foram ainda caracterizados por ressonância de plasmon de superfície (SPR). Experimentos cinéticos foram realiza- dos em um Biacore T200 (GE Healthcare, Uppsala, Suécia). Todas as experiências foram realizadas a 25ºC com tampão de execução HBS- P+(pH 7,4) (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido) usando hlL- 27 (R&D Systems, Abingdon, Reino Unido). O antígeno IL-27 humano (hIL-27) foi capturado em um chip CM5 para - 16 RU. A imobilização foi realizada a uma concentração de proteína de 1 ug/mL em tampão de acetato 10 mM pH 5,0. Foi utilizada uma faixa de diluição tripla de três pontos de 3,3 nM a 30 nM de anticorpo diluído em tampão HBS-P+sem regeneração entre cada concentração. A fase de associação para as três injeções de concentrações crescentes de anticorpo foi monitorada por 75 segundos de cada vez e uma única fase de dissociação foi me- dida por 250 segundos após a última injeção de anticorpo. A regenera- ção da superfície de hlL-27 foi conduzida usando uma única injeção de MgCl2 2M por 120s. Múltiplas repetições (n =4) do anticorpo quimérico foram realizadas ao longo do ensaio para verificar a estabilidade da su- perfície e analito ao longo dos ciclos cinéticos.
[00435] Ambos os modelos de analito de ligação 1:1 e bivalente fo- ram usados para analisar os dados devido à natureza bivalente do anti- corpo. Os resultados da análise do modelo de ligação 1:1 estão resumi- dos na Tabela 4 e os resultados do modelo de analito bivalente estão resumidos na Tabela 5.
Tabela 4
ESSO SEO E ESET FONE ATAS [A fra [sx ea o a a a a
A o A | Tabela 5
ESEC ESET E JA
IP |
A a o
[00426] A cinética de ciclo único usando o modelo 1:1 (Tabela 4) de- monstrou que as variantes humanizadas Ab7-Via não se ligaram a hiL- 27 e as variantes restantes se ligaram em duas vezes do anticorpo qui- mérico, consistente com os resultados do modelo de analito bivalente (Tabela 5)e o ELISA de competição.
[00427] Em resumo, a afinidade de ligação do anticorpo quimérico Ab7.1 conforme determinado pela cinética de ciclo único e usando um modelo de ligação 1:1 foi de 1 nM. Todas as variantes humanizadas tinham um KD de 1,5 nM ou inferior, com exceção das variantes con- tendo Ab7-Vu nas quais a ligação foi abolida. Estes resultados demons- tram que o anticorpo Ab7 e as variantes do anticorpo Ab7 se ligam com alta afinidade à subunidade EBI3 de IL-27. Exemplo 2: Geração de anticorpos anti-IL-27 em leveduras que li- gam especificamente subunidades EBI3 e/ou P28 da IL-27 humana
[00428] Anticorpos monoclonais anti-IL-27 adicionais representando múltiplos bins de epítopos foram selecionados de oito bibliotecas de le- vedura sintética humana ingênua usando métodos descritos abaixo. Materiais e Métodos
[00429] Oito bibliotecas de levedura sintética humana ingênua, cada uma com diversidade de —10º foram propagadas como descrito anteri- ormente (ver, por exemplo, Xu et al., (2013) Protein Eng Des Sel
26(10):663-670; WO 2009036379; WO 2010105256; e WO 2012009568, todos os quais são incorporados neste documento por referência em sua totalidade). Para as duas primeiras rodadas de seleção, foi reali- zada uma técnica de triagem magnética utilizando o sistema Miltenyi MACS, conforme descrito anteriormente (ver por exemplo, Siegel et al. (2004) J] Immunol Methods 286(1-2):141-153, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade).
[00430] Resumidamente, células de levedura (-10*º células/bibliote- ca) foram incubadas com 3 ml de 100 nM de antígeno biotinilado (IL-27 humana recombinante; R&D Systems) por 30 min a 30ºC em tampão de lavagem (solução salina tamponada com fosfato (PBS)/albumina de soro bovino a 0,1% (BSA)). Após lavagem uma vez com 40 ml de tam- pão de lavagem gelada, o pelete celular foi ressuspenso em 20 ml de tampão de lavagem e Streptavidin MicroBeads (500 ul) foi adicionada à levedura e incubada por 15 min a 4ºC. Em seguida, as células de leve- duras foram peletizadas, ressuspensas em 20 mL de tampão de lava- gem e carregadas em uma coluna Miltenyi LS. Após os 20 mL terem sido carregados, a coluna foi lavada 3 vezes com 3 mL de tampão de lavagem. A coluna foi então removida do campo magnético e as células de levedura foi eluídas com 5 ml de meio de crescimento e depois culti- vada durante a noite. As seguintes rodadas de seleção foram realizadas usando citometria de fluxo. Aproximadamente 2 x107 células de levedu- ras peletizadas, lavadas três vezes com tampão de lavagem e incuba- das a 30ºC com concentrações decrescentes de antígeno biotinilado (100 a 1 nM) em condições de equilíbrio, 30 nM de antígenos biotinila- dos de espécies diferentes para obter reatividade cruzada de espécies ou com um reagente de depleção de poliespecificidade (PSR) para re- mover anticorpos não específicos da seleção. Para a depleção de PSR, as bibliotecas foram incubadas com uma diluição 1:10 de reagente PSR biotinilado.
[00431] As células de levedura foram então lavadas duas vezes com tampão de lavagem e coradas com LC-FITC (diluídas 1:100) e com os reagentes secundários S A-633 (diluídos 1:500) ou EAPE (diluídos 1:50) por 15 min a 4ºC. Após lavagem duas vezes com tampão de lavagem, os peletes celulares foram ressuspensos em 0,3 mL de tampão de lava- gem e transferidos para tubos do tipo com tampa filtrante. A classifica- ção foi realizada usando um classificador FACS ARIA (BD Biosciences) e as portas de classificação foram determinadas para selecionar anti- corpos com as características desejadas. As rodadas de seleção foram repetidas até que uma população com todas as características deseja- das fosse obtida. Após a rodada final de classificação, as células de leveduras foram semeadas e colônias individuais foram colhidas para caracterização. Diversificação da Cadeia Leve
[00432] O protocolo de diversificação da cadeia leve foi utilizado du- rante a fase primária de descoberta para posterior descoberta e aprimo- ramento de anticorpos.
[00433] Protocolo de diversificação de lote de cadeia leve: plasmí- deos de cadeia pesada de uma saída de seleção ingênua foram extraí- dos da levedura por meio de esmagamento e captura, propagados e subsequentemente purificados de E. coli e transformados em uma bibli- oteca de cadeia leve com uma diversidade de 5 x 1056. As seleções foram realizadas com uma rodada de MACS e quatro rodadas de FACS em- pregando as mesmas condições da descoberta ingênua. Otimização de anticorpos
[00434] A otimização de anticorpos foi realizada através da introdu- ção de diversidades nas regiões variáveis da cadeia pesada, conforme descrito abaixo.
[00435] SeleçãodeCDRHI1eCDRH2:O0 CDRH3 de um único anti- corpo foi recombinado em uma biblioteca pré-fabricada com variantes de CDRH1e CDRH2 de uma diversidade de 1 x 10º e as seleções foram realizadas com uma rodada de MACS e quatro rodadas de FACS con- forme descrito na descoberta ingênua. Nas diferentes rodadas FACS, as bibliotecas foram analisadas quanto à ligação de PSR, reatividade cruzada de espécies e pressão de afinidade por titulação ou pré-com- plexação de Fab parental, e a classificação foi realizada para obter uma população com as características desejadas. Produção e Purificação de Anticorpos
[00436] Os clones de levedura foram cultivados até à saturação e depois induzidos durante 48 h a 30ºC com agitação. Após indução, as células de levedura foram peletizadas e os sobrenadantes foram reco- lhidos para purificação. As IgGs foram purificadas utilizando uma coluna de Proteína A e eluídas com ácido acético, pH 2,0. Os fragmentos Fab foram gerados por digestão com papaína e purificados sobre KappaSe- lect (GE Healthcare LifeSciences). Medições de ForteBio Kp:
[00437] As medições de afinidade ForteBio foram realizadas em um Octet RED384 geralmente conforme descrito anteriormente (ver, por exemplo, Estep et al, High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning. Mabs 5(2), 270-278 (2013), aqui incorporado por referência em sua totalidade). Brevemente, as medições de afinidade por ForteBio foram realizadas carregando IgGs on-line nos sensores AHQ. Os sensores foram equilibrados off-line em tampão de ensaio durante 30 min e depois monitorizados on-line durante 60 segundos para o estabelecimento da linha de base. Os sen- sores com IgGs carregadas foram expostos ao antígeno 100 nM por 3 minutos e depois foram transferidos para o tampão de teste por 3 min para medição da taxa off. Todas as cinéticas foram analisadas usando o modelo de ligação 1:1. A proteína I1L-27 humana recombinante (R&D Systems Cat: 2526-IL) foi usada como um antígeno. As medições de afinidade para anticorpos anti-IL-27 são mostradas na FIG. 1. ForteBio Armazenamento de epítopo/Bloqueio de Ligando
[00438] O Armazenamento de epítopo/Bloqueio de Ligando foi reali- zado usando um ensaio de bloqueio cruzado em formato sanduíche pa- drão. A IgG antialvo de controle foi carregada nos sensores AHQ e os sítios de ligação a Fc desocupados no sensor foram bloqueados com um anticorpo IgG 1 humano irrelevante. Os sensores foram então expos- tos ao antígeno-alvo 100 nM, seguido por um segundo anticorpo ou li- gante antialvo. A ligação adicional pelo segundo anticorpo ou ligante após a associação do antígeno indica um epítopo desocupado (não con- corrente), enquanto nenhuma ligação indica bloqueio do epítopo (blo- queio do competidor ou ligando). Ensaio cinético MSD-SET
[00439] Medições de afinidade de equilíbrio realizadas conforme descrito anteriormente (Estep etal., 2013). As titulações de equilíbrio da solução (SET) foram realizadas em PBS + 0,1% de BSA livre de IgG (PBSF) com o antígeno mantido constante a 10-100 pM e incubado com diluições em série de 3 a 5 vezes de anticorpo começando em 5 - 100 nM (a condição experimental depende da amostra). Anticorpos (20 nM em PBS) foram revestidos sobre placas de MSD-ECL de ligação padrão durante a noite a 4ºC ou temperatura ambiente durante 30 min. As pla- cas foram então bloqueadas durante 30 min com agitação a 700 rpm, seguido por três lavagens com tampão de lavagem (PBSF +0,05% de Tween 20). Amostras SET foram aplicadas e incubadas nas placas por 150s com agitação a 700 rpm seguido de uma lavagem. O antígeno capturado numa placa foi detectado com 250 ng/mL de estreptavidina marcada com sulfotag em PBSF por incubação na placa durante 3 min. As placas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem e depois lidas no instrumento MSD Sector Imager 2400 utilizando 1x de Tampão de Leitura T com tensoativo. O percentual de antígeno livre foi repre- sentado graficamente em função do anticorpo titulado em Prism e ajus- tado a uma equação quadrática para extrair a Kp. Para melhorar o ren- dimento, robôs de manuseio de líquidos foram utilizados em experimen- tos MSD-SET, incluindo preparação de amostras SET.
Exemplo 3: Ligação de anticorpos anti-IL-27 a IL-27 humana recom- binante
[00440] A capacidade dos anticorpos anti-IL-27 descritos no Exemplo 2 de se ligarem à IL-27 humana recombinante foi avaliada por ELISA. Resumidamente, as placas Nunc MaxiSorp ELISA (Affymetrix 44- 2404-21) foram revestidas com 100 uL/poço de IL-27 humana recombi- nante (R&D Systems %2526-IL / CF) (0,5 ug/mL diluído em PBS), veda- das e incubadas durante a noite a 4ºC. As placas foram lavadas 3 vezes com 100 uL/poço de tampão de lavagem (PBS + Tween 0,01%). As pla- cas foram então bloqueadas com 200 uL/poço de tampão de bloqueio (PBS +0,1% BSA +0,01% Tween) por 1 hora em temperatura ambiente (RT) com agitação. O tampão de bloqueio foi decantado e 100 ul por poço de controle diluído e anticorpos anti-IL-27 foram adicionados, con- forme indicado. Uma diluição em série de 10 pontos foi criada para cada anticorpo diluindo os anticorpos 1:10 a partir de uma concentração má- xima de 1ug/mL. As placas foram incubadas por 1-2 horas em tempera- tura ambiente com agitação. As placas foram lavadas 3 vezes com 100 ul/poço de tampão de lavagem. 100 uL/poço de anticorpo secundário IgG anti-humano (SouthernBiotech; Cat. 4 2014-05) foi adicionado (1:5000 diluído em tampão de bloqueio). As placas foram então incuba- das durante 1 hora à temperatura ambiente com agitação. Após a incu- bação de 1 hora, as placas foram lavadas 3 vezes com 100 uL/poço de tampão de lavagem. Para desenvolver as placas, foi adicionado 100 uL/poço de Tampão TMB (Life Technologies %00-2023). O desenvolvi- mento de cor azul nos poços da curva padrão foi observado e assim que a maior concentração de anticorpos de controle diluídos atingiu um azul profundo (5-10 minutos), 50 uL/poço de solução STOP (Thermo Fisher fSS04) foi adicionado (a cor mudará para amarelo). As placas desen- volvidas foram lidas a 450 nm (menos 570 nm para correção de compri- mento de onda) dentro de 30 minutos após a interrupção da reação.
[00441] “Como mostrado na FIG. 2, os anticorpos anti-IL-27 ligam-se à IL-27 humana recombinante. Um anticorpo de controle de isótipo IgG (Controle IgG) foi usado como um comparador.
[00442] Por exemplo, estudos de afinidade e especificidade bioquí- mica mostraram que o anticorpo anti-IL-27 SRF388 se liga à subunidade p28 (mas não à subunidade EBI3) da citocina heterodimérica IL-27. SRF388 ligou-se à 11-27 recombinante humano, primata não humano e roedor, e a extensão da ligação diferiu entre as espécies. A especifici- dade de ligação de SRF388 à IL-27 foi confirmada por teste contra um painel de — 4500 superfície celular e moléculas solúveis, e nenhuma ligação fora do alvo foi observada. A especificidade de ligação de IL-27 para seu receptor IL-27RA (WSX-1) também foi confirmada; nenhum outro receptor da superfície celular se ligou à IL-27 humana. A capaci- dade do SRF388 de bloquear a interação entre IL-27 e IL-27RA humana (WS X-1) foi confirmada por ressonância de plásmon de superfície.
[00443] A ligação dos anticorpos aqui divulgados foi avaliada em vá- rios sistemas modelo. Como a IL-27 humana é biologicamente ativa nas células de camundongos, a superexpressão sistêmica da IL-27 humana em camundongos usando distribuição de minicírculo de DNA foi utili- zada para analisar os efeitos mediados por IL-27 in vivo por análise de microarranjos de genoma completo, citometria de fluxo e análise de ci- tocina sérica. Muitos dos marcadores que foram modulados pela IL-27 in vivo foram consistentes com os achados em ensaios baseados em células humanas. SRF381 também foi avaliado em um modelo de tumor B16 disseminado. Nesse cenário, o tratamento com SRF381 mostrou resultados consistentes com fenótipos observados em camundongos deficientes para vários componentes do ligando IL-27 (IL-27 p28, EBI3) ou receptor (IL-27RA).
[00444] —Coletivamente, esses estudos demonstram que SRF388 (e seu irmão SRF381) pode fenocopiar a deficiência de IL 27 em camun- dongos, liga-se especificamente e com alta afinidade à IL-27 e pode ini- bir seus efeitos imunossupressores, isoladamente ou em combinação com agentes bloqueadores de PD-L1. Exemplo 4: Anticorpos anti-IL-27 inibem a fosforilação de STAT1 in vitro
[00445] A sinalização de IL-27 através do receptor de IL-27 (IL-27R) resulta na fosforilação do polipeptídeo Transdutor e Ativador de Sinal da Transcrição 1 (STAT1) (pSTAT1). Os anticorpos anti-IL-27 descritos no Exemplo 2 foram testados quanto à sua capacidade de inibir a fosforila- ção mediada por IL-27 de STAT1 em sangue total humano, PBMCs hu- manas, células mieloides U937 (linhagem celular de linfoma histiocítico) e células de linfoma de células T HUT-78 por citometria de fluxo.
[00446] Os anticorpos anti-IL-27 foram testados quanto à sua capa- cidade de inibir a fosforilação mediada por IL-27 de STAT1 em sangue total humano. Resumidamente, o sangue humano anticoagulado com EDTA, armazenado à temperatura ambiente, foi usado neste ensaio. 45uL de sangue foi distribuído em cada poço de um poço profundo, placa de fundo redondo (P henix 4850356) e aquecido por 30 minutos a 37ºC em um aquecedor de placas (EchoTherm IC20) ou em uma incu- badora a 37ºC. Os anticorpos anti-IL-27 foram diluídos para uma con- centração máxima de 10x em PBS sem endotoxina (Teknova *P 0300) em uma placa de polipropileno com fundo em V (Corning 43363). Os anticorpos anti-IL-27 foram diluídos em série como desejado em PBS sem endotoxina. PBS sozinho foi adicionado aos poços para controles não estimulados e estimulados. 5uL de cada diluição foram adicionados a um poço de 454uL de sangue e misturados por agitação em agitador de placa 15 segundos 1000 RPM (E ppendorf Mix Mate). A placa foi in- cubada por 60 minutos a 37ºC em um aquecedor de placas ou em uma incubadora a 37ºC.
[00447] Um frasco de 10 ug de IL-27 humana recombinante (R&D Systems %* 2526-IL) foi reconstituído para 100 ug/mL adicionando 100 uL de PBS + 0,1% de BSA (feito de 10% BSA Sigma $A1595). Um es- toque de trabalho de hlL-27 recombinante (rhlL-27) foi preparado por diluição para 200 ng/mL em PBS livre de endotoxina. Após a incubação de 60 minutos, 5 ul de 200 ng/mL de rhIL-27 foram adicionados a cada poço de sangue estimulado. 5 uL de PBS foram adicionados a poços de controle não estimulados. A placa foi agitada em um agitador de placa por 15 segundos a 1000 RPM. A placa foi incubada durante 30 minutos a 37ºC.
[00448] Após a incubação de 30 minutos, as células foram fixadas. O reagente Lyse/Fix (BD *558049) foi diluído 1:5 em água estéril (Hyclone 45 H3052902) e aquecido a 37ºC em banho-maria. 500 ul de reagente Lyse/Fix foram adicionados à cada poço da placa de poço pro- fundo e a placa foi misturada em um agitador de placa por 15 segundos a 1000 RPM. A placa foi incubada durante 15 min a 37ºC.
[00449] Após a incubação de 15 minutos, a placa foi centrifugada por minutos a 1500 RPM à temperatura ambiente (centrífuga E ppendorf 5810R) e o sobrenadante foi descartado por agitação. Foi adicionado 1 mL de PBS livre de endotoxina por poço e a placa foi agitada em um agitador de placa por 15 segundos a 1000 RPM. A placa foi centrifugada durante 5 minutos a 1500 RPM à temperatura ambiente (centrífuga E p- pendorf 5810R) e o sobrenadante foi eliminado por agitação. Os péletes de células permaneceram na placa.
[00450] Os péletes celulares foram ressuspensos em 50 ul 1:200 CD14-Pacific Blue (Biolegend 4325616) em tampão FACS (PBS, Gibco
* 14190-144/2% FBS, Sigma F8317/ILMM EDTA, Fisher *BP 2482) e transferidos para uma placa de 96 poços de fundo em U (Costar 43799). A placa foi vedada com vedante de placa (VWR %89134-432) e incubada por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro.
[00451] Após a incubação de 30 minutos, 150 uL de tampão FACS foram adicionados a cada poço e a placa foi centrifugada a 1.500 RPM por 5 minutos em temperatura ambiente. Os péletes de células foram então ressuspensos em 100 uL de Perm Ill (armazenados a -20ºC) (BD 558050) com pipetagem e a placa foi vedada com vedante de placa e tampa. A placa foi incubada durante a noite a -20ºC ou 15 minutos a 4ºC.
[00452] Após a incubação, 150 ul de PBS foram adicionados e a placa foi centrifugada a 1.500 RPM por 5 minutos em temperatura am- biente. O sobrenadante foi descartado da placa por um movimento rá- pido e a placa foi ressuspensa em um coquetel de coloração de 50 ul preparado conforme descrito na Tabela 6 abaixo: Tabela 6 Csseo DF Taco — Teor Tião sm E mm
[00453] A placa foi incubada durante 1 hora à temperatura ambiente no escuro. Após a incubação de 1 hora, 100 uL de tampão FACS foram adicionados e a placa foi centrifugada a 1500 RPM por 5 minutos em temperatura ambiente. O sobrenadante foi descartado da placa por mo- vimento rápido e a placa foi ressuspensa em 100 uL de tampão FACS para análise por citometria de fluxo.
[00454] “Como mostrado na FIG. 3A, os anticorpos anti-IL-27 inibem a fosforilação de STAT1 em sangue total humano. O anticorpo anti-IL- 27 Ab14 inibiu a fosforilação de STAT1 a um ICsode 24,7 ng/mL - em sangue total humano.
[00455] Os anticorpos anti-IL-27 descritos no Exemplo 2 foram ainda testados quanto à sua capacidade para inibir a fosforilação de STAT1 mediada por IL-27 em PBMCs humanas agrupadas por citometria de fluxo. Resumidamente, criotubos congelados de PBMC humanas (célu- las mononucleares do sangue periférico), obtidas a partir de leucócitos, foram removidos do armazenamento de nitrogênio líquido e rapida- mente descongelados em banho-maria a 37ºC. O conteúdo de cada cri- otubo foi removido com uma pipeta P 1000 e transferido para um tubo cônico falcon de 15 mL. 2-3 mL de RP MI-1640 completo (Gibco, 61870- 036) foram lentamente adicionados às células descongeladas e as cé- lulas foram suavemente agitadas ou sacudidas para suspender. Tubos cônicos foram completados até 10mlL com RPMI-1640 completo e os tubos foram invertidos para misturar. Tubos cônicos foram centrifugados em tubo a 1400 RPM em temperatura ambiente por 8 minutos.
[00456] As células PBMC foram ressuspensas a uma densidade de 4 milhões de células por mL em RPMI-1640 livre de soro quente e pla- queadas a uma densidade de 200.000 células por poço (50 uy) em uma placa de 96 poços de fundo redondo (Costar, 3799). Os anticorpos anti- IL-27 foram diluídos em RP MI-1640 sem soro na primeira linha de uma placa de polipropileno de 96 poços para uma concentração máxima de 40 pg/ml (será 10upg/ml final). Diluições em série conforme desejado (1:2, 1:3, etc...) foram feitas no restante das primeiras 10 linhas da placa. Cinquenta microlitros (uL) do estoque de anticorpos (4x) foram adicio- nados às primeiras 10 linhas da placa de células PBMC na placa de fundo redondo. Nas linhas 11 e 12, foram adicionados 50 ul de meio celular RP MI-1640 sem soro. A placa foi então incubada a 37ºC durante 2 horas.
[00457] Após a incubação de 2 horas, 100 pu de 50 ng/ml de IL-27 humana recombinante (R&D Systems, 2526-IL) diluída em meio celular
RPMI-1640 sem soro foram adicionados a cada poço (exceto, os poços de controle que incluíam meio sem soro sozinho ou anticorpo sozinho) para uma concentração final de 25 ng/ml. 100 uL de meio celular RPMI- 1640 livre de soro foram adicionados aos poços de controle ou poços com anticorpo sozinho. A placa foi incubada durante 20 minutos a 37ºC.
[00458] Após a incubação de 20 minutos, 50 ul de PFA 4% (Pierce, 28906) em água DI foram adicionados diretamente a cada poço e a placa foi incubada a 37ºC por 5 minutos para fixar as células. A placa foi centrifugada a 2.000 RPM durante 5 minutos. O meio foi descartado rapidamente e a placa foi lavada com 150 ul de DPBS. As etapas de lavagem foram repetidas mais 2 vezes. 50 yu de metanol gelado a 90% (MeOH) (Sigma, 439193) diluído em H2O foi adicionado rapidamente a cada poço usando uma pipeta de 12 canais. Ao adicionar o MeOH, um cuidado especial foi tomado para misturar cada poço. A placa foi incu- bada a 20ºC durante pelo menos 15 minutos. 100 ul de DPBS foram adicionados a cada poço no topo do metanol a 90% e a placa foi centri- fugada a 2.000 RPM por 5 minutos. O conteúdo da placa foi descartado por agitação e a placa foi lavada 3 vezes como descrito anteriormente. Após a última lavagem, os péletes de células permaneceram nos poços da placa.
[00459] As PBMCs peletizadas foram coradas com pSTAT1 PE (BD Phosflow, 526069) 1:100 em tampão FACS (2% FBS, 2 mM EDTA em DPBS) durante 45 minutos à temperatura ambiente no escuro. Foi to- mado um cuidado especial para misturar cada poço com uma pipeta de 12 canais ao adicionar a mancha. Após a incubação de 45 minutos, 100 ul de tampão FACS foram adicionados a cada poço e a placa foi cen- trifugada a 2.000 RPM por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado por agitação e a placa foi lavada 2 vezes como descrito anteriormente. As células foram ressuspensas em 100 uL de tampão FACS e analisa- das por citometria de fluxo.
[00460] “Como mostrado na FIG. 3B, os anticorpos anti-IL-27 inibiram a fosforilação de STAT1 em PBMCs humanas agrupadas. O anticorpo anti-IL-27 SRF381 inibiu a fosforilação de STAT1 a um IC5so médio de 140,5 ng/ml (n =2) em PBMCs humanas agrupadas. O anticorpo anti- IL-27 SRF388 inibiu a fosforilação de STAT1 a um IC5o médio de 58,3 ng/ml (n =3) em PBMCs humanas agrupadas.
[00461] Os anticorpos anti-IL-27 foram ainda testados quanto à sua capacidade de inibir a fosforilação de STAT1 mediada por IL-27 em cé- lulas U937, uma linhagem celular conhecida por expressar receptores Fc, por citometria de fluxo essencialmente como descrito para a FIG. 3B. Como mostrado na FIG. 3C, os anticorpos anti-IL-27 inibem a fos- forilação de STAT1 em células U-937, conforme indicado. O anticorpo SRF381 inibiu a fosforilação de STAT1 a um IC5o médio de 81 ng/ml (n = 2) em células U937. O anticorpo SRF388 inibiu a fosforilação de STAT1 a um IC5o médio de 96 ng/ml (n =2) em células U937.
[00462] Os anticorpos anti-IL-27 foram testados quanto à sua capa- cidade de inibir a fosforilação mediada por IL-27 de STAT1 na linhagem de linfoma de células T cutânea HUT-78, que não expressa receptores Fc de superfície celular, por citometria de fluxo essencialmente como descrito para a FIG. 3B. Como mostrado na FIG. 3D, os anticorpos anti- IL-27 inibiram a fosforilação de STAT1 em células HUT-78. O anticorpo SRF381 inibiu a fosforilação de STAT1 a um IC50 de 80 ng/ml (n =1) em células HUT-78. O anticorpo SRF388 inibiu a fosforilação de STAT1 a um ICso de 95 ng/ml (n =1) em células HUT-78.
[00463] A presente descrição também avaliou a inibição de IL-27 por SRF388 entre as espécies em um ensaio de sangue total. Para carac- terizar a atividade de SRF388 entre as espécies, a I1L-27 recombinante de humano, macaco cynomolgus, rato e camundongo foi testada para estimular a sinalização de pSTAT1 em linfócitos T de amostras de san- gue total obtidas dessas espécies (dados não mostrados).
[00464] “Resumidamente, o sangue total foi aquecido a 37ºC seguido por uma pré-incubação de 60 minutos com SRF388, e 20 ng/mL de IL- 27 humana foram adicionados. As amostras foram incubadas por mais minutos. Os glóbulos brancos foram fixados e os glóbulos vermelhos foram lisados. Após a lavagem, as células fixas foram permeabilizadas e coradas com anti-CD3 e anti-fosfo-STAT1 (Y701). Após incubação de 1 hora, as amostras foram lavadas e ressuspensas para citometria de fluxo. A inibição percentual foi calculada usando poços de controle esti- mulados e não estimulados, e os valores de IC50 foram calculados usando GraphP ad Prism.
[00465] Os dados representativos para a inibição da sinalização SRF388 em células T humanas são mostrados na FIG. 3E. Consistente com as observações feitas sobre a afinidade de SRF388 para espécies diferentes, a potência da inibição da sinalização de I1L-27 por SRF388 foi mais forte em humanos, seguido por macaco cynomolgus, rato e ca- mundongo (ver, por exemplo, Tabela 7). Tabela 7: Valores de IC5oº de SRF388 em células T do sangue peri- férico de diferentes espécies | Macaco Cynomelaus RR a FE gs | Abreviaturas: ICso = metade da concentração inibitória máxima, N/A = não aplicável Exemplo 5: Redução da inibição de CD161 mediada por IL-27 por anticorpos anti-IL-27
[00466] A lectinatipo C CD161 é um marcador de células T cuja ex- pressão é suprimida por IL-27. Os anticorpos anti-IL-27 descritos no Exemplo 2 foram testados quanto à sua capacidade de reverter a inibi- ção de CD161 mediada por IL-27 em células PBMC humanas agrupa- das por citometria de fluxo. Resumidamente, criotubos congelados de
PBMC humanas agrupadas (células mononucleares do sangue perifé- rico), obtidas a partir de leucócitos, foram removidos do armazenamento de nitrogênio líquido e rapidamente descongelados em banho-maria a 37ºC. Os conteúdos de cada criotubo foram removidos com uma pipeta P1000 e transferido para um tubo cônico falcon de 15 mL. 2-3 mL de RPMI-1640 completo (Gibco, 61870-036) foram lentamente adicionados às células descongeladas e as células foram suavemente agitadas ou sacudidas para suspender. Tubos cônicos foram completados até 10mL com RP MI-1640 completo e os tubos foram invertidos para misturar. Tu- bos cônicos foram centrifugados em tubo a 1400 RPM em temperatura ambiente por 8 minutos.
[00467] O uso de paredes externas foi evitado para minimizar os efei- tos da evaporação durante o ensaio de 5 dias. Os poços externos de- vem ser preenchidos com 200 uL por poço de DPBS (Gibco, 14190- 144). As células PBMC foram ressuspensas a uma densidade de 2 mi- lhões de células por mL em RPMI-1640 completo e quente. Anticorpo humano anti-CD3 purificado (Biolegend, UCTH1, £ 300402) foi adicio- nado a uma concentração de 0,5 ug/mL (isso é 2X a concentração final). Placa de 100 mL por poço desta mistura de células (200.000 células por poço) em uma placa de 96 poços de fundo redondo (Costar, 3799).
[00468] Os anticorpos anti-IL-27 foram diluídos em RP MI-1640 com- pleto na primeira linha de uma placa de polipropileno de 96 poços para uma concentração máxima de 40 pg/ml (será 10ug/ml final). Diluições em série conforme desejado (1:2, 1:3, etc...) foram feitas no restante das primeiras 10 linhas da placa. 50 ul do estoque de anticorpos (4x) foram adicionados às primeiras 10 linhas da placa de células PBMC na placa de fundo redondo. Nas linhas 11 e 12, 50 ul de RPMI-1640 com- pleto foram adicionados.
[00469] Após a adição dos anticorpos anti-IL-27, 50 ul de 100 ng/ml de IL-27 humana recombinante (R&D Systems, *%2526-IL) diluída em
RPMI-1640 completo foram adicionados a cada poço (exceto poços de controle que incluíam meio sem soro ou anticorpo sozinho) para uma concentração final de 25 ng/ml. Cinquenta ul de RPMI-1640 completo foram adicionados aos poços de controle. A placa foi incubada por 5 dias a 37ºC em uma incubadora de cultura de tecidos com interferência mínima.
[00470] Após a incubação de 5 dias, a placa foi removida da incuba- dora e agitada em um agitador de placas por 30 segundos a 600 RPM. A placa foi centrifugada a 1.800 RPM durante 5 minutos. O meio foi re- movido e retirado para ensaios adicionais e a placa foi lavada com 150 mL de DPBS (Gibco, %14190-144). As etapas de lavagem foram repeti- das mais 2 vezes. Os peletes celulares foram corados com 50 uL por poço de coquetel de coloração, conforme descrito na Tabela 8 abaixo: Tabela 8 [Estloga Biolegend 7 [Alvo de Aniícarpe [Tor — TDiição Boer a
[00471] A placa foi agitada em um agitador de placas por 30 segun- dos a 600 RPM e a placa foi incubada por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro.
[00472] Após a incubação de 30 minutos, a placa foi centrifugada e o sobrenadante foi descartado por agitação. A placa foi lavada 2 vezes conforme descrito anteriormente. Após a última lavagem, os péletes de células foram fixados pela adição de 50 ul de PFA a 4% (Pierce, 28906) em água DI em temperatura ambiente por 10 minutos. 100 ul de tampão FASC foram adicionados a cada poço e a placa foi centrifugada a 1800 RPM por 5 minutos. As células foram ressuspensas em 100 uL de tam- pão FACS e lidas por citometria de fluxo.
[00473] Como mostrado na FIG. 4, os anticorpos anti-IL-27, con- forme indicado, reduzem a inibição mediada por IL-27 de CD161. Exemplo 6: Aumento da secreção mediada por PD-1 de TNFa, IL-6 e outras citocinas por anticorpos anti-IL-27, incluindo caracteriza- ção in vitro adicional de anticorpos anti-IL-27
[00474] Os anticorpos anti-IL-27 foram testados quanto à sua capa- cidade de aumentar a secreção mediada por PD-1 de TNFa e IL-6 em células PBMC humanas de pacientes com câncer. As células PBMC hu- manas de pacientes com câncer foram cultivadas essencialmente como descrito no Exemplo 5 com a adição de poços que também receberam anticorpo anti-PD-1, como indicado, a 1 ug/mL. Os sobrenadantes do ensaio foram analisados para TNFa e IL-6 usando o kit Human CBA Th1/Th2/Th17 (BD, 560484). Como mostrado nas FIGS. 5A e 5B, os anticorpos anti-IL-27 aumentam a secreção mediada por PD-1 de TNFa e IL-6 em células PBMC humanas agrupadas.
[00475] As técnicas aqui também mostram atividade indutora de ci- tocinas de monoterapia com SRF388 e em combinação com anti-PD-1 em PBMCs humanas. A IL-27 é conhecida por regular negativamente a expressão de várias citocinas inflamatórias. Para determinar os efeitos do bloqueio de IL-27 na produção de citocinas, PBMCs humanos de do- adores saudáveis, pacientes com RCC e pacientes com câncer de ová- rio foram ativados com anti-CD3 na presença ou ausência de SRF388 por vários dias e testados para níveis de citocinas secretadas incluindo IL-17, IFNy, TNFa e IL-6. Resumidamente, PBMCs isolados de sangue total fresco de 4 doadores saudáveis, 5 pacientes com RCC e 2 pacien- tes com câncer de ovário foram ativados por 0,25 ug/mL de anticorpo anti-CD3 na ausência ou presença de SRF388 (1 ug/mL), anti PD 1 (pembrolizumabe, 1 ug/mL) ou ambos os anticorpos. Após 5 dias, os sobrenadantes foram coletados e testados quanto aos níveis de TNFa (A) ou IFNy (B) por MSD ou CBA. Os dados mostrados representam a alteração na produção de citocinas em comparação com a estimulação anti-CD3 sozinha. As estatísticas foram calculadas por teste t pareado (*p <0,005).
[00476] O anticorpo anti-PD-1 foi usado como um controle nestes en- saios e a combinação de bloqueio de P D-1 e IL-27 também foi explorada como mostrado na FIG. 5C. O tratamento com SRF388 levou ao au- mento da produção de TNFa em 6 das 11 amostras de PBMC testadas (determinado por aumento > 2 vezes), incluindo 2 de 4 doadores sau- dáveis, 3 de 5 pacientes com RCC e 1 de 2 pacientes com câncer de ovário. Quando testado em um subconjunto de doadores, essa atividade foi SRF388 dependente da dose (dados não mostrados). O tratamento anti-PD-1 (pembrolizumabe) mostrou um aumento no TNFa em 2 dos 11 doadores testados (1 de 5 RCC e 1 de 2 câncer de ovário) enquanto a combinação de SRF388 e anti-P D-1 levou a um aumento em 10 de 11 doadores. O aumento do TNFa observado nas condições de tratamento combinado pareceu ser aditivo em 8 de 10 respondedores. Um efeito aditivo para a produção de IFNy foi observado nessas culturas após SRF388 e tratamento anti-PD-1 (10 de 11 doadores); no entanto, as respostas ao tratamento anti-PD-1 sozinho foram vistas com mais fre- quência (10 de 11 doadores) em comparação com SRF388 (2 de 11 doadores). J untos, esses dados sugerem que o SRF388 aumenta os níveis de TNFa nas culturas ativas de PBMC de doadores saudáveis e pacientes com câncer e a combinação de SRF388 e tratamento anti- PD-1 leva a níveis mais altos de TNFa e IFNy em comparação com o tratamento isolado.
[00477] Para explorar ainda mais o papel do bloqueio de IL-27 e PD- 1, o mesmo sistema de cultura de PBMC ativado foi usado para deter- minar se a IL-27 poderia neutralizar diretamente o efeito do aumento da produção de citocinas causado pelo bloqueio de PD-1. Resumidamente, PBMCs isoladas de sangue total humano foram ativadas por 0,25 ug/mL de anticorpo anti-CD3. As células foram tratadas com IgG1 controle (1 Vpg/mL), anticorpo aPD-1 (pembrolizumabe, 1 ug/mL) sozinho, rhlL-27 (25 ng/mL) mais aPD-1 ou rhlL-27 mais aPD-1 com SRF388 (1 ug/mL) a 37ºC por 5 dias. Os sobrenadantes foram coletados para detecção de CBA. As citocinas de exemplo (IL-17A e IFNy) de 4 doadores saudáveis foram mostradas como mudança de vezes para o controle. Média e des- vio padrão foram representados. As estatísticas foram calculadas por teste t pareado (*p <0,05, **p0,01). Resultados semelhantes também foram observados em PBMCs de pacientes com RCC.PD-1 o bloqueio aumentou IL-17 e IFNy nessas culturas e IL-27 pode inibir completa- mente esta atividade, uma resposta que foi revertida na presença de SRF388 como mostrado na FIG. 5D. Esses dados mostram que a IL-27 pode atenuar os efeitos do tratamento anti-PD-1 na produção de citoci- nas.
[00478] Portanto, IL-27 demonstrou inibir a produção de citocinas pró-inflamatórias mediada por anti-PD-1 em PBMCs humanas ativadas, uma propriedade que foi bloqueada por SRF388. Além disso, SRF388 em combinação com o bloqueio de P D-1 levou ao aumento da produção de citocinas em PBMCs ativadas de doadores saudáveis e pacientes com RCC. Assim, ao bloquear a IL-27, o SRF388 aumenta a ativação das células imunes alterando a expressão do receptor imunorregulatório e aumentando a produção de citocinas inflamatórias.
[00479] Em caracterização adicional de anticorpos anti-IL-27 indivi- duais na presença de anticorpo anti-IL-27 (aqui, SRF388), aanticorpo PD-1 ou anticorpos anti-IL-27 e aPD-1 combinados, a caracterização adicional da indução de citocinas/secreção foi realizada (FIG. 5E, espe- cificamente para TNF a., IFNy, IL-6 e IL-17A). As curvas dose-respostain vitro também foram obtidas através de uma série de efeitos de sinaliza- ção mediados por IL-27 para anticorpos SRF405, SRF410, SRF411, SRF414, SRF416, SRF536, SRF543, SRF529, SRF381, SRF388 e Ab7
(FIGS. 5F-5K, onde: FIG. 5F mostra a inibição de sinal pPSTAT1 em cé- lulas U937 (linfoma) em concentrações crescentes de anticorpos anti- IL-27; FIG. 5G mostra a inibição do sinal pSTAT1 em PBMCs (células mononucleares do sangue periférico) em concentrações crescentes de anticorpos anti-IL-27; FIG. 5H mostra efeitos variáveis sobre o sinal de CD161 em PBMCs (células mononucleares do sangue periférico) em concentrações crescentes de anticorpos anti-IL-27; FIG. 51 mostra efei- tos variáveis sobre o sinal de PD-L1 em linfócitos T CDA4 (células CD4) em concentrações crescentes de anticorpos anti-IL-27; FIG. 5) mostra efeitos variáveis sobre o sinal de PD-L1 em monócitos em concentra- ções crescentes de anticorpos anti-IL-27; e FIG. 5K mostra efeitos de inibição de vários graus sobre o sinal TIM-3 em monócitos em concen- trações crescentes de anticorpos anti-IL-27). Exemplo 7: Inibição da expressão mediada por IL-27 de PD-L1 e TIM3 por anticorpos anti-IL-27
[00480] Os anticorpos anti-IL-27 descritos nos Exemplos 1 e 2 foram testados quanto à sua capacidade de inibir a expressão de PD-L1 e TIM- 3 mediada por IL-27 em monócitos humanos agrupados por citometria de fluxo.
[00481] “Monócitos frescos foram isolados a partir de leucócitos hu- manos usando RosetteSep""y Human Monocyte Enrichment Cocktail (Stemcell 415068).
[00482] O uso de paredes externas foi evitado para minimizar os efei- tos da evaporação durante o ensaio de 5 dias. Os poços externos de- vem ser preenchidos com 200 uL por poço de DPBS (Gibco, 14190- 144).
[00483] Os monócitos foram ressuspensos a uma densidade de 2 milhões de células por mL em RPMI-1640 completo e quente. 100 ul por poço desta mistura de células foram plaqueados (200.000 células por poço) em uma placa de 96 poços de fundo redondo (Costar, 3799).
[00484] Os anticorpos anti-IL-27 foram diluídos em RP MI-1640 com- pleto na primeira linha de uma placa de polipropileno de 96 poços para uma concentração máxima de 40 pg/ml (concentração final de 10upg/ml). Diluições em série conforme desejado (1:2, 1:3, etc...) foram feitas no restante das primeiras 10 linhas da placa. 50 ul do estoque de anticor- pos (4x) foram adicionados às primeiras 10 linhas da placa de células PBMC na placa de fundo redondo. Nas linhas 11 e 12, 1250 ul de RPMI-1640 completo foram adicionados.
[00485] Após a adição dos anticorpos anti-IL-27, 50 ul de 80 ng/ml de I1L-27 humana recombinante (R&D Systems, 2526-IL) diluída em RPMI-1640 completo foram adicionados a cada poço (exceto, poços de controle que incluíam meio sem soro ou anticorpo sozinho) para uma concentração final de 20 ng/ml. 100 ul de RPMI-1640 sem soro foram adicionados aos poços de controle. A placa foi incubada durante 3 dias a 37ºC com interferência mínima.
[00486] Após a incubação de 3 dias, a placa foi removida da incuba- dora e agitada em um agitador de placas por 30 segundos a 600 RPM. A placa foi centrifugada a 1.800 RPM durante 5 minutos. O meio foi des- cartado rapidamente e a placa foi lavada com 150 ul de DPBS (Gibco, 14190-144). As etapas de lavagem foram repetidas duas vezes. Os pé- letes celulares foram corados com 50 uL por poço de coquetel de colo- ração, conforme descrito na Tabela 9 abaixo: Tabela 9
[00487] A placa foi agitada em um agitador de placas por 30 segun- dos a 600 RPM e a placa foi incubada por 30 minutos a 4ºC no escuro.
[00488] Após a incubação de 30 minutos, a placa foi centrifugada e o sobrenadante foi descartado por agitação. A placa foi lavada 2 vezes conforme descrito anteriormente. Após a última lavagem, os péletes de células foram fixados pela adição de 50 ul de PFA a 4% (Pierce, 28906) água desionizada (DI) em temperatura ambiente por 10 minutos. 100 ul de tampão FACS foram adicionados a cada poço e a placa foi centrifu- gada a 1800 RPM por 5 minutos. As células foram ressuspensas em 100 uL de tampão FACS e analisadas por citometria de fluxo.
[00489] “Como mostrado nas FIGURAS 6A, 6B e 6C, os anticorpos anti-IL-27 inibem potentemente a expressão mediada por IL-27 de PD- L1 e TIM3 em monócitos humanos agrupados.
[00490] Os anticorpos anti-IL-27 foram ainda testados quanto à sua capacidade de inibir a expressão mediada por IL-27 de PD-L1 em célu- las T em repouso (inativadas) essencialmente como descrito para as FIGURAS 6A, 6B e 6C. As células T em repouso foram isoladas a partir de buffy coats humanos usando RosetteSep'!" Human Cell Enrichment Cocktail (Stemcell % 15061).
[00491] “Na conclusão do ensaio, os peletes celulares foram corados com 50 ul por poço de coquetel de coloração, conforme descrito na Tabela 10 abaixo: Tabela 10 [Catélogo Blotegendf ==> AModeAntcomo ———jcor = jemção == |
[00492] A placa foi agitada em um agitador de placas por 30 segun- dos a 600 RPM e à placa foi incubada por 30 minutos a 4ºC no escuro.
[00493] Após a incubação de 30 minutos, a placa foi centrifugada e o sobrenadante foi descartado por agitação. A placa foi lavada 2 vezes conforme descrito anteriormente. Após a última lavagem, os péletes de células foram fixados pela adição de 50 ul de PFA a 4% (Pierce, 28906) em água DI em temperatura ambiente por 10 minutos. 100 ul de tampão FACS foram adicionados a cada poço e a placa foi centrifugada a 1800
RPM por 5 minutos. As células foram ressuspensas em 100 uL de tam- pão FACS e lidas por citometria de fluxo. Como mostrado na FIG. 6D, os anticorpos anti-IL-27 inibem potentemente a expressão mediada por IL-27 de PD-L1 em células T humanas em repouso reunidas. Exemplo 8: Eficácia in vivo de um anticorpo anti-IL-27 em um mo- delo disseminado de melanoma B16F10
[00494] Um modelo de metástase pulmonar de melanoma foi usado para avaliar a atividade antitumoral do bloqueio de IL-27 usando o can- didato clínico SRF388. O crescimento de metástases pulmonares de B16F10 disseminadas é conhecido por ser significativamente reduzido em camundongos deficientes em EBI3 e 1127ra (Wsx-1) (Sauer et al. /. Immunology 181: 6148-6157). Uma vez que o tamanho do nódulo pul- monar e a cinética de crescimento são dependentes do número de cé- lulas B16F10 transferidas e podem prosseguir de forma variável e rá- pida, a combinação de anti-PD-1 e anti-CTLA-4 foi estudada como refe- rência para a atividade terapêutica. O pré-tratamento com SRF388 re- sultou em uma redução significativa na carga geral do tumor. Para ava- liar a eficácia antitumoral de um anticorpo anti-IL-27 in vivo, foi avaliado o efeito de Ab14 no crescimento do tumor em um modelo de tumor de melanoma B16F10.
[00495] “Resumidamente, camundongos C57BL/6 fêmeas de seis a oito semanas de idade (n = 10/grupo) foram inoculados por via intrave- nosa (i.v.) com 2,5 x 10º células B16F 10 ou 1 x10º células B16-Luc atra- vés da veia da cauda em 200 uL de solução salina tamponada com fos- fato (PBS). Os animais foram injetados intraperitonealmente (i.p.) com SRF388 (dose de 1 mg) (Wuxi; lote 21088 D170316K01X01101) ou con- trole de isótipo IgG humano policlonal (dose de 1 mg) (Bioxcell; BE 0092; lote 658417D1). Os anticorpos foram administrados uma vez por se- mana começando 7 dias antes da injeção do tumor para um total de quatro doses (dias -7, 0, 7 e 14). Para enumeração visual de metástases pulmonares, camundongos com tumor B16F10 foram sacrificados por asfixia com CO218 dias após a injeção de células tumorais e os pulmões foram perfundidos com PBS por punção cardíaca, removidos e fixados em formalina tamponada neutra a 10% por 24 horas. Os pulmões fixa- dos foram então transferidos para etanol a 70% e as metástases pulmo- nares de superfície foram contadas visualmente. Para a análise imuno- histoquímica, os pulmões fixados em formalina (n = 5/grupo) foram in- cluídos em parafina, seccionados e corados com hematoxilina e eosina para quantificação da área total do tumor como uma porcentagem da área total do tecido em cada seção. Para o imageamento de tumor in vivo de metástases pulmonares, animais com tumor B16-Luc foram in- jetados i.v. através da veia da cauda com 3 mg de VivoGlo D-luciferina em 200 ul de PBS (Promega) duas vezes por semana. Cinco minutos após a injeção de luciferina, os animais foram anestesiados e o image- amento bioluminescente foi realizado usando um aparelho de imagea- dor IVIS Lumina LT Series Ill. As imagens foram analisadas usando o software Living Image (versão 4.5.5) e representadas como medições de fluxo total em fótons/segundo.
[00496] Como mostrado nas FIGURAS 7A-7D, o tratamento de ca- mundongos com tumor B16F10 com o anticorpo anti-IL-27 SRF388 re- sultou em uma redução significativa na carga global do tumor, medida por ambas as contagens totais de metástases pulmonares de superfície (% nódulos pulmonares, FIG. 7A), e por uma redução da área do tumor em seções de tecido pulmonar por análise de imuno-histoquímica (IHC) (FIG. 7C e FIG. 7D). O bloqueio de p28 com SR F388 resultou em uma redução de 42% no número de nódulos B16 pulmonares em compara- ção com o tratamento de controle de isótipo. O tratamento com SRF388 inibiu significativamente (p = 0,0079) o crescimento de metástases pul- monares B16F10 em comparação com o controle de isótipo (21,6 +8,4 versus 37,6 +10,9 nódulos pulmonares, respectivamente). O tratamento com SRF388 resultou em uma redução de 83% na área total de metás- tases do tumor pulmonar, conforme medido por IHC (16,43 + 1,39% no grupo de controle de isótipo versus 2,83 +1,45% no grupo de tratamento com SRF388). Da mesma forma, o imageamento bioluminescente reve- lou que o tratamento com SRF388 atrasou significativamente (p = 0,0062) o crescimento de metástases pulmonares Bl6-Luc (FIG. 7B). Uma redução semelhante no número de metástases pulmonares de su- perfície e área total do tumor foi observada com bloqueio de anticorpos mediado por IL-27RA (WSX-1) e com terapia de combinação anti-PD- 1+ anti-CTLA-4, como mostrado na FIG. 7D. Estes dados são de 2 ex- periências independentes nas quais a combinação de benchmark anti- PD-1 e anti-CTLA-4 demonstrou atividade antitumoral. Células B16F10 (2,5 x 105) foram injetadas por via intravenosa em camundongos C57BL 16 (n = 10/grupo). Os camundongos foram tratados IP com 1 mg de SRF388, anti-IL-27RA (WSX-1) ou anticorpo de controle de isótipo IgG humano (Dias -7, 0, 7, 14). Alguns animais foram tratados IP com anti- PD-1 e anti-CTLA-4 (Dias 0, 4,7 e 11). Os pulmões foram coletados de animais (n =5/grupo) portadores de metástases pulmonares de B16F10 tratadas como descrito acima foram seccionados e corados com H&E. O tecido tumoral B16F 10 foi delineado a partir do tecido pulmonar nor- mal em seções de pulmão coradas com H&E de animais tratados (FIG. 7A). A área do tumor foi calculada como uma porcentagem da área total do pulmão (FIG. 7D). As estatísticas foram calculadas pelo teste t. Co- letivamente, esses dados indicam que SRF388 pode fenocopiar 1127ra (WSX-1) e a deficiência de EBI3 em um modelo de tumor e mostra ati- vidade semelhante ao bloqueio combinado de PD-1 e CTLA-4.
[00497] Esses dados demonstram que o tratamento com um anti- corpo anti-IL-27 (SRF388) resulta em efeitos antitumorais, reduzindo tanto o crescimento do tumor quanto as metástases em maior medida que o tratamento com um anticorpo de controle de isótipo que não se liga à IL-27. Exemplo 9: Perfil de expressão genética de esplenócitos murinos de camundongos transfectados hidrodinamicamente com minicír- culos de IL-27 humana
[00498] Para examinar o efeito da IL-27 no fenótipo de células T in vivo, foram usados minicírculos de DNA que codificam IL-27 para supe- rexpressar IL-27 em camundongos e as respostas das células T foram avaliadas por RNA-Seg e citometria de fluxo. A IL-27 humana é conhe- cida por apresentar reatividade cruzada entre as espécies e pode indu- zir a sinalização de pSTAT1 e PD L1 em esplenócitos murinos in vitro. Essa reatividade cruzada de espécies foi usada para estudar os efeitos da superexpressão de IL-27 humana em camundongos e sua inibição por SRF388. Para fazer isso, minicírculos de plasmídeo de DNA que codificam IL-27 humana (p28 amarrado a EBI3 por um ligante de glicina serina) foram administrados a camundongos por transfecção hidrodinâ- mica, conforme descrito abaixo, o que resultou em altos níveis sistêmi- cos de IL-27. Transfecção hidrodinâmica de minicírculos de IL-27 humana
[00499] “Camundongos BALB/c fêmeas de seis semanas de idade fo- ram injetados com 20 ug de vetor vazio ou DNA de minicírculo de IL-27 humana ligada (System Biosciences, Palo Alto, CA) em 2 mL de solução salina normal a 0,9% através da veia da cauda ao longo do curso de 5 segundos. Os animais injetados foram transferidos para uma gaiola va- zia com uma almofada de aquecimento para se recuperar por 5 minutos. O sangue total foi coletado em tubos K2-EDTA para separação do plasma 24 horas após a injeção do minicírculo e os níveis plasmáticos de IL-27 foram confirmados por ELISA. PBMCs e esplenócitos totais fo- ram coletados 5 dias após a transfecção e as células foram coradas e analisadas por citometria de fluxo. A expressão dos marcadores indica- dos foi analisada em células T CD4+ e células T CD8+. A análise foi realizada usando o software Flow) o. Perfil de expressão genética
[00500] “Esplenócitos de camundongo foram preparados por dissoci- ação mecânica de baços inteiros, seguido por lise ACK de glóbulos ver- melhos. O RNA total foi extraído dos esplenócitos com o RNeasyº Mini Kit (Qiagen, Cat. No: 74104) e ajustado para 20 ng/ul em água sem nu- clease (Qiagen, Cat. No: 19101). O perfil de expressão genética foi re- alizado em Affymetrix GeneChip"" Mouse Gene 2.0 ST Arrays (Applied Biosystems, Cat. No: 902118). O processamento de amostras de RNA, a hibridação e a varredura de arranjo foram realizados usando protoco- los Affymetrix GeneChip!" padrão no Boston University Microarray and Sequencing Resource (BUMSR). Todos os arquivos CEL foram norma- lizados por Robust Multi-array Average (RMA) (Irizarry et al., 2003) e os dados de expressão genética foram pré-processados removendo son- das não expressas e descartando transcrições com alto coeficiente de variância inter-replicado. As análises subsequentes (expressão média, alteração de dobra, teste t) foram realizadas em R. Análise de citometria de fluxo
[00501] “Sangue total e baço foram coletados de camundongos cinco dias após a injeção do minicírculo. Os esplenócitos foram coletados de camundongos que expressam IL 27 5 dias após a transfecção e anali- sados por Arranjo Affymetrix GeneChip Mouse Gene 2.0 ST. As sus- pensões de esplenócitos de célula única foram preparadas por dissoci- ação mecânica através de um filtro de células de nylon de 40 um se- guido por lise de glóbulos vermelhos em tampão ACK. As células san- guíneas totais foram coradas diretamente, seguidas de lise de glóbulos vermelhos e fixação em Tampão BD Phosflow Lyse/Fix de acordo com as instruções do fabricante (BD Biosciences, San J ose, CA). FeyRilWII foi bloqueado por pré-incubação de células com mAb CD16/CD32 de rato anticcamundongo (1 ug por milhão de células; Biolegend, San Di- ego, CA) em PBS com 2% de FBS e 2 mM de EDTA. As células foram coradas com mAbs conjugados com APC, PE, Brilliant Violet 510 e Bril- liant Violet 711 contra CD4 murino (clone GK1.5), CD8 (53-6.7), PD-L1 (10F).9G2), TIM3 (RMT3-23), LAG3 (C9B7W) e TIGIT (169) (Biole- gend). A fluorescência associada à célula foi medida usando um citô- metro de fluxo LSRFortessa X-20 (BD Biosciences), e a análise foi rea- lizada usando o software Flow) o (Tree Star, Ashland, OR). Análise Estatística
[00502] A significância estatística foi determinada usando o software GraphPad Prism, usando um teste t de Student pareado, não pareado ou de razão, conforme indicado. Quando o teste t de razão foi usado, 0,1 foi adicionado aos valores zero para torná-los diferentes de zero. Valores p menores que 0,05 foram considerados significativos. 1L-27 promove a expressão de receptores inibitórios por células T in vivo
[00503] “Maisde 400 genes foram alterados em 2 1,0 vez em resposta à administração de I1L-27, como mostrado na FIG. 8A. Um subconjunto desses genes é mostrado na Tabela 11. Entre esses genes estavam aqueles que codificam receptores inibidores da imunidade que desem- penham papéis-chave na resposta imune. Como mostrado na FIG. 8B, Ly6a (codifica Sca-1), Lag3, Tigit e 1110 foram suprarregulados em es- plenócitos em resposta à IL-27. Houve também uma tendência para a suprarregulação mediada por IL-27 de Ctla4 e Cd274 (codifica PD-L1) que era menos que 1 vez de indução (dados não mostrados). Para va- lidar os dados de expressão, a citometria de fluxo foi utilizada para ava- liar a expressão da proteína de PD-L1, LAG-3, TIGIT e TIM-3 nas célu- las T desses camundongos. A administração de minicírculos de IL-27 levou à suprarregulação de PD-L1, LAG-3 e TIGIT em células T CD4*+ esplênicas (baço) e de sangue periférico (PBMC). Em células T CD8*, os minicírculos IL-27 suprarregularam PD-L1, LAG-3, TIGIT e TIM-3.
Como mostrado na FIG. 8C, a administração de minicírculos de IL-27 levou à suprarregulação de PD-L1, Lag-3 e Tigit em células T CD4* de sangue periférico e esplênico. Em células T CD8*, os minicírculos IL-27 suprarregularam PD-L1,Lag-3, Tigite Tim-3. Esses dados sugerem que a 1L-27 pode desempenhar um papel fundamental na condução da ex- pressão do receptor imunorregulatório in vivo.
[00504] Para investigar a capacidade do SRF388 de bloquear a IL- 27 humana derivada de minicírculo in vivo, foram estudados tanto o en- gajamento do alvo por ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA) quanto a expressão do receptor imunorregulatório em esplenócitos. Cinco dias após a transfecção de IL-27 e tratamento com SRF388 (50 mg/kg), o plasma foi coletado de camundongos para analisar o hetero- dímero de IL-27 e os níveis de EBI3 por Meso Scale Discovery (MSD). O ensaio do heterodímero de IL-27 utiliza um anticorpo de captura de p28 que bloqueia SR F388 e um anticorpo de detecção de EBI3 especí- fico humano; portanto, se SRF388 estiver ligado à IL-27, sua detecção será mascarada. O ensaio E BI3 utiliza anticorpos de captura e detecção específicos para 2 epítopos distintos de EBI3 humano e, uma vez que o minicírculo derivado de IL-27 é um heterodímero amarrado, este ensaio permite a detecção de IL 27 total independentemente da ligação de SRF388.
[00505] Resumidamente, camundongos Balb/c fêmeas de seis se- manas de idade foram injetados com vetor vazio (controle) ou I1L-27 hu- mana. Os camundongos foram tratados com 1 mg de SRF388 ou anti- corpo de controle do isótipo anti-DNP IgG1 7 dias antes e no dia da transfecção do minicírculo (Dia -7 e 0). O sangue total foi coletado e o plasma foi analisado para IL-27 (FIG. 8D) por Meso Scale Discovery. A FIG. 8D mostra que o tratamento com SRF388 inibe completamente a detecção de IL-27 no plasma por MSD. Dados semelhantes foram ob- servados quando uma dose de 25 mg/kg de SRF388 foi testada. Estes dados sugerem que SRF388 a uma dose de 25 mg/kg ou superior pode saturar completamente a IL-27 derivada de minicírculo in vivo. Este en- gajamento do alvo completo também foi confirmado em um ensaio fun- cional pPSTAT1.
[00506] Para avaliar a capacidade do SRF388 de bloquear a ativi- dade da IL-27 in vivo, a expressão de PD L1, Tim-3, Lag-3 e Tigit foram analisadas em PBMCs murinas e esplenócitos por citometria de fluxo. SRF388 bloqueou significativamente a expressão de PD-L1 e Lag 3 in- duzida por IL 27 em PBMCs CD4+ e expressão de PD-L1, Tim-3, Lag- 3 e Tigitem PBMCs CD8+. O tratamento com SRF388 também blo- queou a expressão de PD-L1,Lag-3 e Tigitinduzida por IL 27 em esple- nócitos CD4+e a expressão de PD-L1 e Lag 3 em esplenócitos CD8+. Estes dados sugerem que SRF 388 pode envolver e bloquear a atividade da I1L-27 humana in vivo.
[00507] Estes resultados demonstram que a expressão ectópica de IL-27 in vivo leva à suprarregulação de múltiplos receptores inibitórios por células T e várias outras moléculas com atividade imunomodulatória em esplenócitos. Esses dados sugerem que o antagonismo de IL-27 (por exemplo, por tratamento com um anticorpo anti-IL-27) diminuiria a expressão de receptores inibidores nas células T, aumentando assim as respostas imunes. Tabela 11: Genes suprarregulados em resposta à administração de I1L-27 [Smoolo do gene — Mudança em veres Tuelrp
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GM22973 1,663495667 0,004472758 CASC5 1,659578 0,044333895 ADD? 1,659553667 0,053938067 CAMP 1,659111667 0,066745225 CLEC5A 1,654882667 0,00665055 Tabela 12: LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS o o E ooo o o ooo o o o o ooo e
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AGGCAACGTETICTCCTGCTCCGTGATGEACGAGGECCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTECCTGTCCETGTCTCTGGGE E TRE RREO O »OO»,;»>tI IC IIODDIIDODâDTIDDO ——— Tabela 13: Sequências Fc (=CH2+CH3)
Pseudô- Sequência de aminoácidos
FE EEE EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLEPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK- 1061 ho ENWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP mana 1 SRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS- RWQQGNVFSCSVYMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 702) ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVYVDVSQEDPEVQFNWYVD- 1964 hu GVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMT mana KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLOSDGSFFLYSALTVDKSAWQEGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 703) ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVYVDVSQEDPEVOFNWYVD. 1964 hu GVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMT mara ” KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN- (6228) VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 704) 1964 hu ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVD- mana GVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMT (5228PL ” KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN- 235E) VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 705) Exemplo 10: Propriedades de ligação de SRF388 e bloqueio do re- ceptor IL-27
[00508] A associação e dissociação de IL-27 humana recombinante em concentrações que variam de O a 5,0 ug/mL com uma concentração de SRF388 de 1 ug/mL foram determinadas. Os parâmetros cinéticos de ligação finais são mostrados na Tabela 14, juntamente com os parâ- metros de ajuste do modelo de ligação (R2 e x2) que demonstram a qualidade do ajuste do modelo aos dados.
[00509] —AIL-27 humana exibiu a afinidade de ligação mais forte para SRF388 de todas as espécies testadas neste estudo (3,86 pM). A IL-27 recombinante de rato e macaco cynomolgus também mostrou fortes afi- nidades para SRF388 com valores de 80,9 e 37,4 pM, respectivamente, embora um pouco mais fraca do que a proteína humana. A IL-27 de camundongo recombinante teve a menor afinidade por SRF388 em comparação com a proteína humana, com um valor na faixa de nM (4,43 nM), conforme indicado por sua associação mais lenta e taxas de dis- sociação mais rápidas. Tabela 14: Resumo de dados para ligação de IL-27 a SRF388 e rea- tividade cruzada de espécies [amarem em REG [compen [coment |
Abreviaturas: IL-27 = interleucina 27, ka = constante de associação, ka = constante de dissociação, Kp = afinidade de ligação Observação: Os valores de R? > 0,95 e os valores de x2 < 3,0 são de- monstrativos de um bom ajuste do modelo aos dados. Exemplo 11: Alinhamentos de sequência CDR
[00510] Uma série de subseleções de anticorpos anti-IL-27 da pre- sente descrição compartilham homologia de sequência em suas regiões CDR, fornecendo uma diversidade de sequências CDR variantes que foram validadas como funcionalidade de retenção. É expressamente contemplado neste documento que as seguintes sequências de con- senso de CDR são totalmente suportadas - e estão, portanto, dentro do escopo - da presente descrição.
[00511] Para os anticorpos SRF388, SRF381, SRF382, SRF384, SRF386 e SRF529, os alinhamentos das sequências CDR de cada um destes anticorpos anti-IL-27 revelaram homologia extensa, pontuada por resíduos variáveis. Em particular, os alinhamentos de CDR1 de ca- deia pesada revelaram os seguintes resíduos variáveis: HCDR1 (IMGT) Alinhamento de múltiplas sequências CLUSTAL O (1.2.4) 1 GFTFRSYG8 (SEQ ID NO: 161) GFTFRSYG8 (SEQ ID NO: 73) 4 GFTFASYG8 (SEQ ID NO: 139) 2 GFTFSRTG8 (SEQ ID NO: 95) 3 GFTFSRYG8 (SEQ ID NO: 117) 6 GFTFSSYS 8 (SEQ ID NO: 51) Acfolok
[00512] Uma sequência consenso de CDR1 (IMGT) da cadeia pe- sada para estes anticorpos homólogos é, portanto, N- GFTFIS/A/RIIS/RIT/YUG/S]-C (SEQ ID NO: 412) e, consequentemente,
mais geralmente contemplado aqui como uma sequência consenso de CDR1 da cadeia pesada (IMGT) é N-GFTFXXXX-C (SEQ ID NO: 408), onde X é qualquer resíduo de aminoácido.
[00513] O alinhamento das sequências de CDR2 (IMGT) da cadeia pesada do anticorpo SRF388, SRF381, SRF382, SRF384, SRF386 e SRF529 revelou o seguinte: HCDR2 (IMGT) Alinhamento de múltiplas sequências CLUSTAL O (1.2.4) ISSSGSYI8 (SEQ ID NO: 162) 11 ISSSSSYI 8 (SEQ ID NO: 140) 7 ISSSSSYI 8 (SEQ ID NO: 74) 9 ISSSSSYI 8 (SEQ ID NO: 96) 8 ISSSSAYI 8 (SEQ ID NO: 118) 12 ISSSSSYI 8 (SEQ ID NO: 52) Folk ek
[00514] Uma sequência consenso de CDR2 da cadeia pesada (IMGT) para estes anticorpos homólogos é, portanto, N- ISSSIS/GNIS/ANI-C (SEQ ID NO: 413) e, consequentemente, mais ge- ralmente contemplado aqui como um consenso pesado a sequência de CDR2 de cadeia (IMGT) é N-ISSSXXYI-C (SEQ ID NO: 409), onde X é qualquer resíduo de aminoácido.
[00515] Os alinhamentos das sequências CDR1 (NT) humana e CDR2 (NT) humana também revelaram o seguinte: HCDR1 (NT) Alinhamento de múltiplas sequências CLUSTAL O (1.2.4) 13 FTFRSYGMN 9 (SEQ ID NO: 76) 16 FTFRSYGMN 9 (SEQ ID NO: 164) 17 FTFASYGMN 9 (SEQ ID NO: 142) 14 FTFSRTGMN 9 (SEQ ID NO: 98) FTFSRYGMN 9 (SEQ ID NO: 120)
18 FTFSSYSMN 9 (SEQ ID NO: 54) AAA olok HCDR2 (NT) Alinhamento de múltiplas sequências CLUSTAL O (1.2.4) 23 GISSSGSYIYYADSVKG 17 (SEQ ID NO: 165) 19 SISSSSSYIYYADSVKG 17 (SEQ ID NO: 77) SISSSSSYIYYADSVKG 17 (SEQ ID NO: 99) 22 SISSSSSYIYYADSVKG 17 (SEQ ID NO: 143) 21 SISSSSAYILYADSVKG 17 (SEQ ID NO: 121) 24 SISSSSSYIYYADSVKG 17 (SEQ ID NO: 55) ARARRE Rk Acfoletetetok
[00516] As sequências de consenso de CDR1 (NT) e CDR2 (NT) da cadeia pesada para esses anticorpos homólogos são, portanto, N- FTFIS/A/RIS/RIT/NYING/SIMN-C (SEQ ID NO: 414) e N- [G/S]ISSS[S/G]S/ANYIIL/Y NADSVKG-C (SEQ ID NO: 415), respectiva- mente. Em vista dessas sequências de consenso, mais geralmente con- templadas aqui são as sequências CDR1 (NT) e CDR2 (NT) da cadeia pesada de consenso N-FTFXXXXMN-C (SEQ ID NO: 410) and N-XIS- SSXXYIXYADSVKG-C (SEQ ID NO: 411), respectivamente, onde X é qualquer resíduo de aminoácido.
[00517] ACDR3da cadeia pesada (IMGT ou NT) e as CDRs da ca- deia leve CDR1 (IMGT ou NT), CDR2 (IMGT ou NT) e CDR3 (IMGT ou NT) foram totalmente conservadas entre SRF388, SRF381, SRF382, SRF384, SRF386 e SRF529.
[00518] —Alinhamentos de sequência de CDR semelhantes realizados em anticorpos monoclonais SRF535 e SRF538 revelaram as seguintes sequências de CDR de consenso para estes dois anticorpos relaciona- dos: Variação observada (IMGT): HCDR1 (IMGT) - N-GFTFSSYG-C (SEQ ID NO: 361)
HCDR2 (IMGT) — N-IIK/W IIQ/Y IDGS[E/NIK-C (SEQ ID NO: 445) HCDR3 (IMGT) — N-ARID/G]JAP[WDIY DY Y M/EYVIDV-C (SEQ ID NO: 446) LCDR1 (IMGT) — N-QS[IWVISSY-C (SEQ ID NO: 447) LCDR2 (IMGT) — N-[A/D][A/S]S-C (SEQ ID NO: 448) LCDR3 (IMGT) — N-QQIS/Y IIY/SIIV/LIIP /Y IP [W/-IT-C (SEQ ID NO: 449) Consenso (IMGT): HCDR1 (IMGT) - N-GFTFSSYG-C (SEQ ID NO: 361) HCDR2 (IMGT) — N-IXXDGSXK-C (SEQ ID NO: 436) HCDR3 (IMGT) — N-ARXAP [Xh=3.-86DV-C (SEQ ID NO: 437) LCDR1 (IMGT) — N-QSXSSY-C (SEQ ID NO: 438) LCDR2 (IMGT) — N-XXS-C (SEQ ID NO: 439) LCDR3 (IMGT) — N-QQXXXXP[X]h=0-1T-C (SEQ ID NO: 440) Variação observada (NT): HCDR1 (NT) — N-FTFSSYGMIS/H]-C (SEQ ID NO: 450) HCDR2 (NT) — N-IN/VIIK/W IQ/YIDGS[E/NIKYY[V/AIDSVKG-C (SEQ ID NO: 451) HCDR3 (NT) -N-ARID/G]JAP[W DIY DY Y M/EYV]DV-C (SEQ ID NO: 446) LCDR1 (NT) — N-RASQSI[IVISSYLIN/AI-C (SEQ ID NO: 452) LCDR2 (NT) — N-[AA/DISSI[LQS/NRAT]-C (SEQ ID NO: 453) LCDR3 (NT) — N-QQIS/YIY/SIV/LIP/Y]IP[W/-IT-C (SEQ ID NO: 449) Consenso (NT): HCDR1 (NT) — N-FTFSSYGMX-C (SEQ ID NO: 441) HCDR2 (NT) — N-KIXXDGSXKYYXDSVKG-C (SEQ ID NO: 442) HCDR3 (NT) — N-ARXAP [X]hn=3.86DV-C (SEQ ID NO: 437) LCDR1 (NT) - N-RASQSXSSYLX-C (SEQ ID NO: 443) LCDR2 (NT) — N-[Xlh=1-2S S[X ln=3:-4-C (SEQ ID NO: 444) LCDR3 (NT) — N-QQXXXXP[Xh=0-1T-C (SEQ ID NO: 440)
[00519] —Alinhamentos de sequências de CDR também foram realiza- dos entre a totalidade dos anticorpos SRF388, SRF381, SRF382,
SRF384, SRF386, SRF529, SRF535 e SRF538, que resultaram nas se- guintes variações observadas e sequências de consenso: Variação observada (IMGT): HCDR1 (IMGT) — N-GFTFIS/A/RIS/RIT/YING/S]-C (SEQ ID NO: 454) HCDR2 (IMGT) — N-IIS/K/W IIS/Q/Y US/DIS/GUS/ANY/E/NII/KI-C (SEQ ID NO: 455) HCDR3 (IMGT) — N-ARIDGGRTSYTATAHNWF/DAPWDIYDYYM/GA- PEYVIDIP/VI-C (SEQ ID NO: 457) LCDR1 (IMGT) — N-QSIVLF/IWVISSINNKN/-]Y-C (SEQ ID NO: 459) LCDR2 (IMGT) — N-[W/A/D]IA/S]S-C (SEQ ID NO: 461) LCDR3 (IMGT) — N-QQIH/S/Y IIA/Y/SUS/V/LUA/P/YIP[PW/-IT-C (SEQ ID NO: 463) Consenso (IMGT): HCDR1 (IMGT) — N-GFTFXXXX-C (SEQ ID NO: 408) HCDR2 (IMGT) — N-IXXXXXXX-C (SEQ ID NO: 456) HCDR3 (IMGT) — N-ARI[Xh=6-15DX-C (SEQ ID NO: 458) LCDR1 (IMGT) — N-QS[Xh=1-35 S[X ln=0-4Y -C (SEQ ID NO: 460) LCDR2 (IMGT) — N-XXS-C (SEQ ID NO: 462) LCDR3 (IMGT) — N-QQXXXXP[X]h=0-1T-C (SEQ ID NO: 464) Variação observada (NT): HCDR1 (NT) — N-FTFIS/A/RYIS/RUT/YIG/SIMIN/S/HI-C (SEQ ID NO: 465) HCDR2 (NT) - N- [G/S/N/VIIS/K/WIS/Q/Y US/DIS/GUS/ANY/E/NUVKUL/NY IN IV/AIDSVKG- C (SEQ ID NO: 467) HCDR3 (NT) - N-ARID/GIGGRTSYTATA- HNWF/APWDIYDYYM/APEYVIDIP/V]-C (SEQ ID NO: 469) LCDR1 (NT) — N-RASQSI[IVISSYLIN/AI-C (SEQ ID NO: 471) LCDR2 (NT) — N-[IWA/AA/DISITRES/SLQS/SNRAT]-C (SEQ ID NO: 473)
LCDR3 (NT) — N-QQIH/S/YIA/Y/SUS/V/LUA/P/YIP[P/W/-IT-C (SEQ ID NO: 475) Consenso (NT): HCDR1 (NT) — N-FTFXXXXMX-C (SEQ ID NO: 466) HCDR2 (NT) — N-KIXXXXXXXXYXDSVKG-C (SEQ ID NO: 468) HCDR3 (NT) — N-ARIX hh=6-15DX-C (SEQ ID NO: 470) LCDR1 (NT) - N-RASQSXSSYLX-C (SEQ ID NO: 472) LCDR2 (NT) — N-[Xh=1-2S [X ln=4-5-C (SEQ ID NO: 474) LCDR3 (NT) — N-QQXXXXP[Xh=0-1T-C (SEQ ID NO: 476)
[00520] Os alinhamentos de SRF543 e SRF414 também foram reali- zados, e produziram as seguintes variações observadas e sequências de consenso: Variação observada (IMGT): HCDR1 (IMGT) — N-GGSFS[R/DIY[E/Y]-C (SEQ ID NO: 426) HCDR2 (IMGT) — N-IDIW/Y ISG[I/STT-C (SEQ ID NO: 427) HCDR3 (IMGT) — N-ARID/LIP/GIM/V NY YL- NIDSSIVSTGSV/DLGFIDIV/I--C (SEQ ID NO: 428) LCDR1 (IMGT) — N-QIS/DIIV/IISIS/NJY-C (SEQ ID NO: 429) LCDR2 (IMGT) — N-DIS/AJS-C (SEQ ID NO: 430) LCDR3 (IMGT) — N-QQID/YIS/DIDIH/LIPIT-C (SEQ ID NO: 431) Consenso (IMGT): HCDR1 (IMGT) -— N-GGSFSXYX-C (SEQ ID NO: 416) HCDR2 (IMGT) — N-IDXSGXT-C (SEQ ID NO: 417) HCDR3 (IMGT) — N-ARXXXY Y[Xh=0-1DSS[X] n=a-6DX-C (SEQ ID NO: 418) LCDR1 (IMGT) — N-QXXSXY-C (SEQ ID NO: 419) LCDR2 (IMGT) — N-DXS-C (SEQ ID NO: 420) LCDR3 (IMGT) — N-QQXXDXPIT-C (SEQ ID NO: 421) Variação observada (NT): HCDR1 (NT) — N-GSFS[R/DIY[E/Y WS-C (SEQ ID NO: 432)
HCDR2 (NT) - N-SID[W/Y ISG[I/SITTIN/E NY NPSLKS-C (SEQ ID NO : 433) HCDR3 (NT) — N-AR[D/LI[P/G]M/V NY YI-NIDSSIVSTGSV/DLGF]DIV/I]- C (SEQ ID NO: 428) LCDR1 (NT) — N-[Q/RJASQIS/DIIV/IISIS/NIY LIN/AI-C (SEQ ID NO: 434) LCDR2 (NT) — N-DIS/AJISNIR/LIA/EIT-C (SEQ ID NO: 435) LCDR3 (NT) — N-QQ[D/YIIS/DIDIH/LIPIT-C (SEQ ID NO: 431) Consenso (NT): HCDR1 (NT) - N-GSFSXYXWS-C (SEQ ID NO: 422) HCDR2 (NT) — N-SIDKSGXTXYNPSLKS-C (SEQ ID NO: 423) HCDR3 (NT) — N-ARXXXY Y[Xh=01DSS[X]n=4-6DX-C (SEQ ID NO: 418) LCDR1 (NT) — N-KASQXXSXYLX-C (SEQ ID NO: 424) LCDR2 (NT) — N-DXSNXXT-C (SEQ ID NO: 425) LCDR3 (NT) — N-QQXXDXPIT-C (SEQ ID NO: 421) Exemplo 12: Propriedades dos anticorpos monoclonais seleciona- dos
[00521] Os anticorpos monoclonais selecionados da presente descri- ção foram avaliados quanto a várias propriedades funcionais. O resul- tado de certas avaliações está tabulado na FIG. 9. Notavelmente, um amplo arranjo de anticorpos monoclonais foi identificado que exibiu liga- ção à IL-27 humana (conforme determinado pela tecnologia de resso- nância de plásmon de superfície (SPR) em um instrumento BIACORE 2000, conforme descrito acima) ("Propriedade (i)") com uma constante de dissociação de equilíbrio (KD) de 15 nM ou menos, incluindo Ab7, SRF557, SRF536, SRF416, SRF543, SRF414, SRF529, SRF381, SRF388, SRF382, SRF384, SRF386, SRF410, SRF411, SRF405, SRF535 e SRF538.
[00522] “Inesperadamente, uma seleção de anticorpos monoclonais foi identificada como sendo WS X-1 competitiva ("Propriedade (ii)"), in- cluindo Ab7, SRF536, SRF416, SRF543, SRF414, SRF529, SRF381, SRF388, SRF382, SRF384, SRF386, SRF535 e SRF538.
[00523] Surpreendentemente, foi identificada uma seleção de anti- corpos monoclonais que inibiu PS TAT1 U937 ("Propriedade (ili)"), inclu- indo Ab7, SRF536, SRF416, SRF543, SRF414, SRF529, SRF381, SRF388, SRF382, SRF384, SRF386, SRF410, SRF411, SRF535 e SRF538.
[00524] —Notavelmente, uma seleção de anticorpos monoclonais tam- bém foi identificada que inibiu a expressão de CD161 ("Propriedade (iv)"), incluindo Ab7, SRF536, SRF416, SRF543, SRF529, SRF381, SRF388, SRF382, SRF384 e SRF386.
[00525] Uma seleção de anticorpos monoclonais que, notavelmente, inibiu a expressão de PD-L1 em células T CD4* ("Propriedade (v)") tam- bém foi identificada, incluindo Ab7, SRF536, SRF416, SRF543, SRF414, SRF529, SRF381, SRF388, SRF382, SRF384, SRF386 e SRF535.
[00526] Embora testado apenas para um número limitado de anticor- pos monoclonais, a variabilidade na capacidade desses anticorpos tes- tados de aumentar a secreção de citocinas mediada por PD-1 ("Propri- edade (vi)") também foi observada. Especificamente, os anticorpos SRF381 e SRF388 foram notavelmente identificados como intensifi- cando a secreção de citocinas mediada por PD-1, ao passo que SRF536 não.
[00527] — Anticorpos monoclonais possuindo cada uma das proprieda- des (i)-(vi), como recitado acima, foram portanto identificados aqui. Nem todos os anticorpos examinados foram identificados como possuindo cada uma das propriedades (i)-(vi), e é, portanto, expressamente con- templado que as seleções de anticorpos podem ser montadas com uma subseleção dessas propriedades. Por exemplo, os anticorpos Ab7, SRF536, SRF416, SRF543, SRF529, SRF381, SRF388, SRF382, SRF384 e SRF386 foram identificados como possuindo cada uma das propriedades (i)-(v). Enquanto isso, os anticorpos Ab7, SRF536,
SRF416, SRF543, SRF529, SRF381, SRF388, SRF382, SRF384 e SRF386 foram identificados como possuindo cada uma das proprieda- des (iii) e (iv). Como será aparente para o versado na técnica, subsele- ções semelhantes de anticorpos e propriedades associadas são pron- tamente montadas a partir da informação apresentada na FIG. 9.

Claims (118)

REIVINDICAÇÕES
1. Anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente a e antagoniza a IL-27 humana, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou a porção de ligação ao antígeno do mesmo exibe pelo menos uma ou mais das se- guintes propriedades: (i) se liga à IL-27 humana com uma constante de dissociação de equilíbrio (Kp) igual ou inferior a 15 nM; (ii) bloqueia a ligação de IL-27 ao receptor de IL-27; (iii) inibe ou reduz a fosforilação de STAT1 e/ou STAT3 em uma célula; (iv) inibe ou reduz a inibição mediada por IL-27 da expressão de CD161 em uma célula; (v) inibe ou reduz a expressão de PD-L1 e/ou TIM-3 mediada por IL-27 em uma célula; e (vi) induz ou intensifica a secreção mediada por PD-1 de uma ou mais citocinas de uma célula.
2. Anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao an- tígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo se liga à 11-27 humana com uma constante de dissociação de equilíbrio (Kp) de 15 nM ou menos.
3. Anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao an- tígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo se liga à IL-27 murina.
4. Anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à I1L-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende CDRs das cadeias pesada e leve selecionadas do grupo que consiste em: (i) sequência CDR1 de cadeia pesada consistindo em N- GFTFXXXX-C (SEQ ID NO: 408), CDR2 de cadeia pesada consistindo em N-ISSSXXYI-C (SEQ ID NO: 409) e /CDR3 de cadeia pesada esta- belecida na SEQ ID NO : 163; e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 169, 170 e 171, respectiva- mente; ou (ii) sequência CDR1 de cadeia pesada consistindo em N- FTFXXXXMN-C (SEQ ID NO: 410), CDR2 de cadeia pesada consistindo em N-XISSSXXYIXYADSVKG-C (SEQ ID NO: 411) e CDR3 de cadeia pesada estabelecida na SEQ ID NO: 166; e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 172, 173 e 174, respectivamente.
5. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com a reivindica- ção 4, caracterizado pelo fato de que a CDR1 de cadeia pesada consiste em N-GFTF[S/A/RIIS/RI[T/Y][G/S]-C (SEQ ID NO: 412) e a CDR2 de cadeia pesada consiste em N-ISSS[S/G][S/A]YI-C (SEQ ID NO: 413); ou a CDRI de cadeia pesada consiste em N- FTFIS/A/RIIS/RI[T/YI[G/S]JMN-C (SEQ ID NO: 414) e a CDR2 de cadeia pesada consiste em N-[G/S]ISSS[S/G][S/A]YI[L/Y]YADSVKG-C (SEQ ID NO: 415).
6. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com a reivindica- ção 4, caracterizado pelo fato de que: (i) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada são es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 161, 162 e 163, respectivamente, e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 169, 170 e 171, respectivamente; (ii) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada são es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 164, 165 e 166, respectivamente, e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve são estabelecidas nas
SEQ ID NOs: 172, 173 e 174, respectivamente;
(iii) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada são es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 73, 74 e 75, respectivamente, e as se- quências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 81, 82 e 83, respectivamente;
(iv) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada são es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 76, 77 e 78, respectivamente, e as se- quências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 84, 85 e 86, respectivamente;
(v) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada são es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 95, 96 e 97, respectivamente, e as se- quências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 103, 104 e 105, respectivamente;
(vi) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada são es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 98, 99 e 100, respectivamente, e as se- quências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 106, 107 e 108, respectivamente;
(vii) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada são es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 117, 118 e 119, respectivamente, e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 125, 126 e 127, respectivamente;
(viii) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada são es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 120, 121 e 122, respectivamente, e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 128, 129 e 130, respectivamente;
(ix) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada são es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 139, 140 e 141, respectivamente, e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 147, 148 e 149, respectivamente;
(x) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada são es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 142, 143 e 144, respectivamente, e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 150, 151 e 152, respectivamente; (xi) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada são es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 51, 52 e 53, respectivamente, e as se- quências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 59, 60 e 61, respectivamente; ou (xii) as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 54, 55 e 56, respectivamente, e as se- quências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 62, 63 e 64, respectivamente.
7. Anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente à 11-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende CDRs de cadeias pesada e leve selecionadas do grupo que consiste em: (i) sequência CDR1 de cadeia pesada consistindo em N- GGSFSXYX-C (SEQ ID NO: 416), CDR2 de cadeia pesada consistindo em N-IDXSGXT-C (SEQ ID NO: 417), e CDR3 de cadeia pesada con- sistindo em N-ARXXXYY[X]Jn=0-1:DSS[X] n=4-6DX-C (SEQ ID NO: 418); e CDR1 de cadeia leve consistindo em N-QXXSXY-C (SEQ ID NO: 419), CDR?2 de cadeia leve consistindo em N-DXS-C (SEQ ID NO: 420), e sequência de CDR3 de cadeia leve consistindo em N-QQXXDXPIT-C (SEQ ID NO: 421), respectivamente; ou (ii) sequência de CDR1 de cadeia pesada consistindo em N- GSFSXYXWS-C (SEQ ID NO: 422), CDR2 de cadeia pesada consis- tindo em N-SIDKSGXTXYNPSLKS-C (SEQ ID NO: 423) e CDR3 de ca- deia pesada consistindo em N-ARXXXYY[X]n=0-:DSS[X] n=4-6DX-C (SEQ ID NO: 418); e CDR1 de cadeia leve consistindo em N-KASQXXSXYLX-
C (SEQ ID NO: 424), CDR2 de cadeia leve consistindo em N-DXSN- XXT-C (SEQ ID NO: 425) e sequência CDR3 de cadeia leve consistindo em N-QQXXDXPIT-C (SEQ ID NO: 421), respectivamente.
8. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com a reivindica- ção 7, caracterizado pelo fato de que: (i) a CDR1 de cadeia pesada consiste em N-GGSFS[R/D]Y[E/Y]- C (SEQ ID NO: 426), a CDR2 de cadeia pesada consiste em N- IDIW/Y]ISG[I/S]T-C (SEQ ID NO: 427), a CDR3 de cadeia pesada con- siste em N-ARID/L][P/G]I[IM/VIYY[-YIDSS[VSTGSV/DLGF]D[V/I])-C (SEQ ID NO: 428); e a CDR1I de cadeia leve consiste em N- OQ[IS/DIIV/IIS[S/N]JY-C (SEQ ID NO: 429), a CDR2 de cadeia leve con- siste em N-D[S/AJS-C (SEQ ID NO: 430), e a CDR3 de cadeia leve con- siste em N-QQ[D/Y][S/D]D[H/L]IPIT-C (SEQ ID NO: 431), respectiva- mente; ou (ii) a CDRI de cadeia pesada consiste em N- GSFSI[R/DJY[E/Y]WS-C (SEQ ID NO: 432), a CDR2 de cadeia pesada consiste em N-SID[W/Y]SG[I/S]ITIN/EIYNPSLKS-C (SEQ ID NO: 433), a CDR3 de cadeia pesada consiste em N-AR[D/L][P/G][M/VIYY|[- N]IDSS[VSTGSV/DLGF]D[V/I]-C (SEQ ID NO: 428); e a CDR1 de ca- deia leve consiste em N-[O/RJASQ[S/D][V/IIS[S/N]IYL[IN/AJ]-C (SEQ ID NO: 434), a CDR2 de cadeia leve consiste em N-D[S/AJSN[R/L][A/E]T- C (SEQ ID NO: 435), e a CDR3 de cadeia leve consiste em N- QQ[D/YIIS/DIDIH/LIPIT-C (SEQ ID NO: 431), respectivamente.
9. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com a reivindica- ção 7, caracterizado pelo fato de que: (i) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada são es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 229, 230 e 231, respectivamente, e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 237, 238 e 239, respectivamente; ou (ii) as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 232, 233 e 234, respectivamente, e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 240, 241 e 242, respectivamente.
10. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com a reivindi- cação 7, caracterizado pelo fato de que: (i) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada são es- tabelecidas nas SEQ ID NOs: 251, 252 e 253, respectivamente, e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 259, 260 e 261, respectivamente; ou (ii) as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 254, 255 e 256, respectivamente, e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 262, 263 e 264, respectivamente.
11. Anticorpo monoclional isolado que se liga especifica- mente à I|L-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou a porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende CDRs das cadeias pesada e leve se- lecionadas do grupo que consiste nas sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 23, 24 e 25, respec- tivamente, e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 26, 27 e 28, respectivamente.
12. Anticorpo monoclional isolado que se liga especifica- mente à IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de ligação ao an- tígeno do mesmo compreende CDRs de cadeias pesada e leve seleci- onadas do grupo que consiste em: (i) as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 339, 340 e 341, respectivamente, e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 347, 348 e 349, respectivamente; ou
(ii) as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 342, 343 e 344, respectivamente, e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 350, 351 e 352, respectivamente.
13. Anticorpo monoclional isolado que se liga especifica- mente à IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de ligação ao an- tígeno do mesmo compreende CDRs das cadeias pesada e leve seleci- onadas do grupo que consiste em: (i) as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 185, 186 e 187, respectivamente, e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 193, 194 e 195, respectivamente; ou (ii) as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 188, 189 e 190, respectivamente, e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 196, 197 e 198, respectivamente.
14. Anticorpo monoclional isolado que se liga especifica- mente à I|L-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de ligação ao an- tígeno do mesmo compreende CDRs das cadeias pesada e leve seleci- onadas do grupo que consiste em: (i) as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 207, 208 e 209, respectivamente, e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 215, 216 e 217, respectivamente; ou (ii) as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 210, 211 e 212, respectivamente, e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 218, 219 e 220, respectivamente.
15. Anticorpo monoclional isolado que se liga especifica- mente à IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de ligação ao an- tígeno do mesmo compreende CDRs das cadeias pesada e leve seleci- onadas do grupo que consiste em: (i) as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 273, 274 e 275, respectivamente, e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 281, 282 e 283, respectivamente; ou (ii) as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 276, 277 e 278, respectivamente, e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 284, 285 e 286, respectivamente.
16. Anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamen- te à IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, carac- terizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende CDRs das cadeias pesada e leve selecionadas do grupo que consiste em: (i) sequência CDR1 de cadeia pesada consistindo em N- GFTFSSYG-C (SEQ ID NO: 361), CDR2 de cadeia pesada consistindo em N-IXXDGSXK-C (SEQ ID NO: 436) e CDR3 de cadeia pesada con- sistindo em N-ARXAP [ XJn=3-6DV-C (SEQ ID NO: 437); e CDR1 de ca- deia leve consistindo em N-QSXSSY-C (SEQ ID NO: 438), CDR2 de cadeia leve consistindo em N-XXS-C (SEQ ID NO: 439) e sequência CDR3 de cadeia leve consistindo em N-QQXXXXP [X]n=0-1T-C (SEQ ID NO: 440), respectivamente; ou (ii) sequência CDR1 de cadeia pesada consistindo em N- FTFSSYGMX-C (SEQ ID NO: 441), CDR2 de cadeia pesada consistindo em N-XKIXXDGSXKYYXDSVKG-C (SEQ ID NO: 442) e CDR3 de cadeia pesada consistindo em N-ARXAP[X]n = 3-56DV-C (SEQ ID NO: 437); e
CDR1 de cadeia leve consistindo em N-RASQSXSSYLX-C (SEQ ID NO: 443), CDR2 de cadeia leve consistindo em N-[X]n=1-2SS[X]n=34-C (SEQ ID NO: 444), e sequência CDR3 de cadeia leve consistindo em N- QQXXXXP[X]n=0-1T-C (SEQ ID NO: 440), respectivamente.
17. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com a reivindi- cação 16, caracterizado pelo fato de que: (i) a CDR1 de cadeia pesada consiste em N-GFTFSSYG-C (SEQ ID NO: 361) a CDR2 de cadeia pesada consiste em N- IIKWI[Q/YIDGS[E/N]JK-C (SEQ ID NO: 445), e a CDR3 de cadeia pe- sada consiste em N-AR[D/GJAP[WDIYDYYM/EYV]DV-C (SEQ ID NO: 446); e a CDR1 de cadeia leve consiste em N-OS[I/V]ISSY-C (SEQ ID NO: 447), a CDR2 de cadeia leve consiste em N-[A/D][A/S]S-C (SEQ ID NO: 448), e a CDR3 de cadeia leve consiste em N- QA[SNTIIYISIIVILIIP/YIP[WY-]T-C (SEQ ID NO: 449), respectivamente; ou (ii) a CDR1 de cadeia pesada consiste em N-FTFSSYGM|[S/H]-C (SEQ ID NO: 450), a CDR2 de cadeia pesada consiste em N- [N/VII[K/W][Q/YIDGS[E/NJKYY[V/AIDSVKG-C (SEQ ID NO: 451) ea CDR3 de cadeia pesada consiste em N- ARID/GJAP[WDIYDYYMEYV]DV-C (SEQ ID NO: 446); e a CDR1 de cadeia leve consiste em N-RASQS[IVISSYL[N/AJ-C (SEQ ID NO: 452), a CDR?2 de cadeia leve consiste em f N-[AW/DJSS[LQS/NRAT]-C (SEQ ID NO: 453) e a CDR3 de cadeia leve consiste em N- QAISNYSIIVILIIP/YIP[WY/-]T-C (SEQ ID NO: 449), respectivamente.
18. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com a reivindi- cação 16, caracterizado pelo fato de que: (i) as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada são SEQ ID NOs: 361, 362 e 363, respectivamente, e as sequências CDR1, CDR?2 e CDR3 de cadeia leve são SEQ ID NOs: 369, 370 e 371, res- pectivamente; ou (ii) as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada são
SEQ ID NOs: 364, 365 e 366, respectivamente, e as sequências CDR1, CDR?2 e CDR3 de cadeia leve são SEQ ID NOs: 372, 373 e 374, res- pectivamente.
19. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com a reivindi- cação 16, caracterizado pelo fato de que: (i) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada são SEQ ID NOs: 383, 384 e 385, respectivamente, e as sequências CDR1, CDR?2 e CDR3 de cadeia leve são SEQ ID NOs: 391, 392 e 393, res- pectivamente; ou (ii) as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada são SEQ ID NOs: 386, 387 e 388, respectivamente, e as sequências CDR1, CDR?2 e CDR3 de cadeia leve são SEQ ID NOs: 394, 395 e 396, res- pectivamente.
20. Anticorpo monoclional isolado que se liga especifica- mente à I|L-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de ligação ao an- tígeno do mesmo compreende CDRs das cadeias pesada e leve seleci- onadas do grupo que consiste em: (i) sequência CDR1 de cadeia pesada consistindo em N- GFTFXXXX-C (SEQ ID NO: 408), CDR2 de cadeia pesada consistindo em N-IXXXXXXX-C (SEQ ID NO: 456) e CDR3 de cadeia pesada con- sistindo em N-AR[X]n=6-15DX-C (SEQ ID NO: 458); e sequência CDR1 de cadeia leve consistindo em N-QS[X]n=1-38S[X]n=0-4Y-C (SEQ ID NO: 460), CDR2 de cadeia leve consistindo em N-XXS-C (SEQ ID NO: 462), e CDR3 de cadeia leve consistindo em N-QQXXXXP[X]n=0-1T-C (SEQ ID NO: 464), respectivamente; ou (ii) sequência CDR1 de cadeia pesada consistindo em N- FTFXXXXMX-C (SEQ ID NO: 466), CDR2 de cadeia pesada consistindo em N-XKIXXXXXXXXYXDSVKG-C (SEQ ID NO: 468), e CDR3 de cadeia pesada consistindo em N-AR[X]n=6-15DX-C (SEQ ID NO: 470); e sequên- cia CDR1 de cadeia leve consistindo em N-RASQSXSSYLX-C (SEQ ID NO: 472), CDR2 de cadeia leve consistindo em N-[X]n=1-2S[X]n=4-5-C (SEQ ID NO: 474), e CDR3 de cadeia leve consistindo em N- QQXXXXP[X]n=0-1T-C (SEQ ID NO: 476), respectivamente.
21. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com a reivindi- cação 20, caracterizado pelo fato de que: (i) a sequência CDR1 de cadeia pesada consiste em N- GFTFI[S/A/RI[IS/RI[T/YI[G/S]-C (SEQ ID NO: 454), CDR2 de cadeia pe- sada consiste em N-I[S/K/WI[S/Q/Y][S/D][S/G][S/A][Y/E/N][I/K]-C (SEQ ID NO: 455) e CDR3 de cadeia pesada consiste em N- AR[IDGGRTSYTATAHNWF/DAPWDIYDYYM/GAPEYVI]D[P/V]-C (SEQ ID NO: 457); e a sequência CDR1 de cadeia leve consiste em N- QS[VLF/WISSINNKN/-]Y-C (SEQ ID NO: 459), CDR2 de cadeia leve consiste em N-[W/A/D][A/S]S-C (SEQ ID NO: 461), e CDR3 de cadeia leve consiste em N-QQ[H/S/Y][A/Y/S][S/V/L][A/P/Y]P[P/WY/-]T-C (SEQ ID NO: 463), respectivamente; ou (ii) a sequência CDR1 de cadeia pesada consiste em N- FTFIS/A/RIIS/RI[T/YI[G/S]M[N/S/H]-C (SEQ ID NO: 465), CDR2 de ca- deia pesada consiste em N- [G/S/N/V]I[S/K/WI[S/Q/Y]IIS/D]I[S/G][S/A][Y/E/N][VK][L/Y]IY[V/AIDSVKG- C (SEQ ID NO: 467), e CDR3 de cadeia pesada consiste em N- ARID/GI|/GGRTSYTATAHNWF/APWDIYDYYM/APEYVID[P/V]-C (SEQ ID NO: 469); e a sequência CDR1 de cadeia leve consiste em N- RASQSIIVISSYL[N/AJ-C (SEQ ID NO: 471), CDR2 de cadeia leve con- siste em N-[WA/AA/DIS[TRES/SLQS/SNRAT]-C (SEQ ID NO: 473), e CDR3 de cadeia leve consiste em N- QQA[H/S/YIIA/Y/SIIS/VILI[IA/P/YIP[P/WY/-]T-C (SEQ ID NO: 475), respec- tivamente.
22. Anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo antagoniza IL-27.
23. Anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo inibe ou reduz a fosforilação de STAT1 e/ou STAT3 em uma célula.
24. Anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula imune.
25. Anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula cancerígena.
26. Anticorpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno inibe ou reduz a inibição da expressão de CD161 em uma cé- lula.
27. Anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula imune.
28. Anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo inibe ou reduz a expressão de PD-L1 e/ou TIM- 3 em uma célula.
29. Anticorpo monocional isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula imune.
30. Anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula cancerígena.
31. Anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula cancerígena, em que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo inibe ou reduz a expressão de PD-L1 em uma célula cancerígena.
32. Anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo induz ou melhora a secreção mediada por PD-1 de uma ou mais citocinas de uma célula.
33. Anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que uma ou mais citocinas são IFNg, TNFa ou IL-6.
34. Anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que uma ou mais citocinas são IFNg, IL-17, TNFa ou IL-6.
35. Anticorpo monocional isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais citocinas é TNFa.
36. Anticorpo monocional isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 35, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula imune.
37. Anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é selecionado do grupo que consiste em uma IgG1, uma IgG2, uma IgG3, uma IgG4, uma IgM, uma IgA1 uma IgA2, uma IgD e um anticorpo IgE.
38. Anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo I9gG1 ou um anticorpo IgG4.
39. Anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região constante de ca- deia pesada de IgG1 do tipo selvagem.
40. Anticorpo monoclional isolado, ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada de IgG4 do tipo selvagem.
41. Anticorpo monoclional isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domí- nio Fc compreendendo pelo menos uma mutação.
42. Anticorpo monoclional isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região constante de ca- deia pesada de IgG1 mutante.
43. Anticorpo monoclional isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região constante de ca- deia pesada de IgG4 mutante.
44. Anticorpo monoclional isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada de IgG4 mutante compreende qualquer uma das substituições S228P, L235E, L235A ou uma combinação dos mesmos, de acordo com a numeração da UE.
45. Anticorpo monoclional isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que se liga substancial- mente ao mesmo epitopo que o anticorpo, ou porção de ligação ao an- tígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 44.
46. Anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que se liga a pelo menos um dos resíduos de aminoácidos ligados ao anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 44.
47. Anticorpo monoclional isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que uma mutação do epitopo ligado pelo anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo inibe, reduz ou bloqueia a ligação ao anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo e ao anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1a44.
48. Anticorpo monoclional isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que se liga a um epitopo na IL-27, em que o epitopo é o mesmo ou é semelhante ao epitopo |i- gado por uma molécula de anticorpo descrita na Tabela 12.
49. Anticorpo monoclional isolado que se liga especifica- mente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de li- gação ao antígeno do mesmo compreende CDRs das cadeias pesada e leve selecionadas do grupo que consiste em: (i) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabe- lecidas nas SEQ ID NOs: 51, 52 e 53, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 59, 60 e 61, respectivamente;
(ii) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabe- lecidas nas SEQ ID NOs: 73, 74 e 75, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 81, 82 e 83, respectivamente;
(iii) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabe- lecidas nas SEQ ID NOs: 95, 96 e 97, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 103, 104 e 105, respectivamente;
(iv) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabe- lecidas nas SEQ ID NOs: 117, 118 e 119, respectivamente, e sequên- cias CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 125, 126 e 127, respectivamente;
(v) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabe- lecidas nas SEQ ID NOs: 139, 140 e 141, respectivamente, e sequên- cias CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 147, 148 e 149, respectivamente;
(vi) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabe- lecidas nas SEQ ID NOs: 161, 162 e 163, respectivamente, e sequên- cias CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 169, 170 e 171, respectivamente;
(vii) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabe- lecidas nas SEQ ID NOs: 185, 186 e 187, respectivamente, e sequên- cias CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 193, 194 e 195, respectivamente;
(viii) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabe- lecidas nas SEQ ID NOs: 207, 208 e 209, respectivamente, e sequên- cias CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 215, 216 e 217, respectivamente;
(ix) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabe-
lecidas nas SEQ ID NOs: 229, 230 e 231, respectivamente, e sequên- cias CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 237, 238 e 239, respectivamente;
(x) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabe- lecidas nas SEQ ID NOs: 251, 252 e 253, respectivamente, e sequên- cias CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 259, 260 e 261, respectivamente;
(xi) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabe- lecidas nas SEQ ID NOs: 273, 274 e 275, respectivamente, e sequên- cias CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 281, 282 e 283, respectivamente;
(xii) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabe- lecidas nas SEQ ID NOs: 295, 296 e 297, respectivamente, e sequên- cias CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 303, 304 e 305, respectivamente;
(xiii) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabe- lecidas nas SEQ ID NOs: 317, 318 e 319, respectivamente, e sequên- cias CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 325, 326 e 327, respectivamente;
(xiv) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabe- lecidas nas SEQ ID NOs: 339, 340 e 341, respectivamente, e sequên- cias CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 347, 348 e 349, respectivamente;
(xv) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabe- lecidas nas SEQ ID NOs: 361, 362 e 363, respectivamente, e sequên- cias CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 369, 370 e 371, respectivamente; e
(xvi) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabe- lecidas nas SEQ ID NOs: 383, 384 e 385, respectivamente, e sequên- cias CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID
NOs: 391, 392 e 393, respectivamente.
50. Anticorpo monoclional isolado que se liga especifica- mente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de li- gação ao antígeno do mesmo compreende CDRs das cadeias pesada e leve selecionadas do grupo que consiste em: (i) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabele- cidas nas SEQ ID NOs: 54, 55 e 56, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 62, 63 e 64, respectivamente; (ii) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabele- cidas nas SEQ ID NOs: 76, 77 e 78, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 84, 85 e 86, respectivamente; (iii) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabe- lecidas nas SEQ ID NOs: 98, 99 e 100, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 106, 107 e 108, respectivamente; (iv) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabe- lecidas nas SEQ ID NOs: 120, 121 e 122, respectivamente, e sequên- cias CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 128, 129 e 130, respectivamente; (v) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabe- lecidas nas SEQ ID NOs: 142, 143 e 144, respectivamente, e sequên- cias CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 150, 151 e 152, respectivamente; (vi) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabe- lecidas nas SEQ ID NOs: 164, 165 e 166, respectivamente, e sequên- cias CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 172, 173 e 174, respectivamente;
(vii) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabe- lecidas nas SEQ ID NOs: 188, 189 e 190, respectivamente, e sequên- cias CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 196, 197 e 198, respectivamente;
(viii) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabe- lecidas nas SEQ ID NOs: 210, 211 e 212, respectivamente, e sequên- cias CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 218, 219 e 220, respectivamente;
(ix) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabe- lecidas nas SEQ ID NOs: 232, 233 e 234, respectivamente, e sequên- cias CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 240, 241 e 242, respectivamente;
(x) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabe- lecidas nas SEQ ID NOs: 254, 255 e 256, respectivamente, e sequên- cias CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 262, 263 e 264, respectivamente;
(xi) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabe- lecidas nas SEQ ID NOs: 276, 277 e 278, respectivamente, e sequên- cias CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 284, 285 e 286, respectivamente;
(xii) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabe- lecidas nas SEQ ID NOs: 298, 299 e 300, respectivamente, e sequên- cias CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 306, 307 e 308, respectivamente;
(xiii) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabe- lecidas nas SEQ ID NOs: 320, 321 e 322, respectivamente, e sequên- cias CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 328, 329 e 330, respectivamente;
(xiv) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabe-
lecidas nas SEQ ID NOs: 342, 343 e 344, respectivamente, e sequên- cias CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 350, 351 e 352, respectivamente; (xv) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabe- lecidas nas SEQ ID NOs: 364, 365 e 366, respectivamente, e sequên- cias CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 372, 373 e 374, respectivamente; e (xvi) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabe- lecidas nas SEQ ID NOs: 386, 387 e 388, respectivamente, e sequên- cias CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 394, 395 e 396, respectivamente.
51. Anticorpo monoclional isolado que se liga especifica- mente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou a porção de ligação ao antígeno do mesmo compreende CDRs das cadeias pesada e leve, em que as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 164, 165 e 166, respectivamente, e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 172, 173 e 174, respectivamente.
52. Anticorpo monoclional isolado que se liga especifica- mente à e antagoniza a IL-27 humana, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de li- gação ao antígeno do mesmo compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 57, 79, 101, 123, 145, 167, 191, 213, 235, 257, 279, 301, 323, 345, 367 e 389; e em que a região variável de cadeia leve compre- ende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que con- siste nas SEQ ID NOs: 65, 87, 109, 131, 153, 175, 199, 221, 243, 265, 287, 309, 331, 353, 375 e 397.
53. Anticorpo monoclional isolado que se liga especifica- mente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de li- gação ao antígeno do mesmo compreende regiões variáveis das ca- deias leve e pesada compreendendo sequências de aminoácidos sele- cionadas do grupo que consiste em: ()) SEQID NO: 57 e 65, respectivamente; (ii)) SEQID NO: 79 e 87, respectivamente; (iii) SEQ ID NO: 101 e 109, respectivamente; (iv) SEQ ID NO: 123 e 131, respectivamente; (v) SEQID NO: 145 e 153, respectivamente; (vi) SEQ ID NO: 167 e 175, respectivamente; (vii) SEQ ID NO: 191 e 199, respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 213 e 221, respectivamente; (ix) SEQ ID NO: 235 e 243, respectivamente; (x) SEQID NO: 257 e 265, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 279 e 287, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 301 e 309, respectivamente; (xiii) SEQ ID NO: 323 e 331, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 345 e 353, respectivamente; (xv) SEQ ID NO: 367 e 375, respectivamente; e (xvi) SEQ ID NO: 389 e 397, respectivamente.
54. Anticorpo monoclional isolado que se liga especifica- mente à e antagoniza a IL-27 humana, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de li- gação ao antígeno do mesmo compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos, que é pelo menos 90% idêntica à se- quência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 57, 79, 101, 123, 145, 167, 191, 213, 235, 257, 279, 301, 323,
345, 367 e 389; e em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à se- quência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 65, 87, 109, 131, 153, 175, 199, 221, 243, 265, 287, 309, 331, 353, 375 e 397.
55. Anticorpo monoclonal isolado que se liga especifica- mente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de li- gação ao antígeno do mesmo compreende regiões variáveis das ca- deias leve e pesada compreendendo sequências de aminoácidos pelo menos 90% idênticas às sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em: (),) SEQID NO: 57 e 65, respectivamente; (i)) SEQID NO: 79 e 87, respectivamente; (iii) SEQ ID NO: 101 e 109, respectivamente; (iv) SEQ ID NO: 123 e 131, respectivamente; (v) SEQID NO: 145 e 153, respectivamente; (vi) SEQ ID NO: 167 e 175, respectivamente; (vil) SEQ ID NO: 191 e 199, respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 213 e 221, respectivamente; (ix) SEQ ID NO: 235 e 243, respectivamente; (x) SEQID NO: 257 e 265, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 279 e 287, respectivamente; (xii) SEQ ID NO: 301 e 309, respectivamente; (xiii) SEQ ID NO: 323 e 331, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 345 e 353, respectivamente; (xv) SEQ ID NO: 367 e 375, respectivamente; e (xvi) SEQ ID NO: 389 e 397, respectivamente.
56. Anticorpo monocional isolado que se liga especifica- mente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de li- gação ao antígeno do mesmo compreende regiões variáveis das ca- deias leve e pesada compreendendo sequências de aminoácidos esta- belecidas na SEQ ID NO: 167 e 175, respectivamente.
57. Anticorpo monoclional isolado que se liga especifica- mente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de li- gação ao antígeno do mesmo compreende regiões variáveis das ca- deias leve e pesada compreendendo sequências de aminoácidos pelo menos 90% idênticas às sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NO: 167 e 175, respectivamente.
58. Anticorpo monoclional isolado que se liga especifica- mente à e antagoniza a IL-27 humana, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de li- gação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 67, 89, 111, 133, 155, 177, 201, 243, 245, 267, 289, 311, 333, 355, 377 e 399; e em que a cadeia leve compreende uma sequência de aminoáci- dos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 69, 91, 113, 135, 157, 179, 203, 225, 247, 269, 291, 313, 335, 357, 379 e 401.
59. Anticorpo monocional isolado que se liga especifica- mente à e antagoniza a IL-27 humana, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de li- gação ao antígeno ao mesmo compreende uma cadeia pesada e uma leve, em que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoá- cidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos se- lecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 67, 89, 111, 133, 155, 177, 201, 243, 245, 267, 289, 311, 333, 355, 377 e 399; e em que a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 69, 91, 113, 135, 157, 179, 203, 225, 247, 269, 291, 313, 335, 357, 379 e 401.
60. Anticorpo monoclional isolado que se liga especifica- mente à e antagoniza a IL-27 humana, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de li- gação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 71, 93, 115, 137, 159, 181, 205, 227, 249, 271, 293, 315, 337, 359, 381 e 403; e em que a cadeia leve compreende uma sequência de aminoáci- dos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 69, 91, 113, 135, 157, 179, 203, 225, 247, 269, 291, 313, 335, 357, 379 e 401.
61. Anticorpo monoclional isolado que se liga especifica- mente à e antagoniza a IL-27 humana, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de li- gação ao antígeno ao mesmo compreende uma cadeia pesada e uma leve, em que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoá- cidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos se- lecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 71, 93, 115, 137, 159, 181, 205, 227, 249, 271, 293, 315, 337, 359, 381 e 403; e em que a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 69, 91, 113, 135, 157, 179, 203, 225, 247, 269, 291, 313, 335, 357, 379 e 401.
62. Anticorpo monocional isolado que se liga especifica- mente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de li- gação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve compreendendo sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em: () SEQID NO: 67 e 69, respectivamente; (ii); SEQID NO: 89 e 91, respectivamente; (iii) SEQ ID NO: 111 e 113, respectivamente; (iv) SEQ ID NO: 133 e 135, respectivamente; (v) SEQID NO: 155 e 157, respectivamente; (vi) SEQ ID NO: 177 e 179, respectivamente; (vii) SEQ ID NO: 201 e 203, respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 243 e 225, respectivamente; (ix) SEQ ID NO: 245 e 247, respectivamente; (x) SEQID NO: 267 e 269, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 289 e 291, respectivamente; (xii) SEQ ID NO: 311 e 313, respectivamente; (xiii) SEQ ID NO: 333 e 335, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 355 e 357, respectivamente; (xv) SEQ ID NO: 377 e 379, respectivamente; e (xvi) SEQ ID NO: 399 e 401, respectivamente.
63. Anticorpo monocional isolado que se liga especifica- mente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de li- gação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve compreendendo sequências de aminoácidos pelo menos 90% idênticas às sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em: (), SEQID NO: 67 e 69, respectivamente; (ii), SEQID NO: 89 e 91, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 111 e 113, respectivamente; (iv) SEQ ID NO: 133 e 135, respectivamente; (v) SEQID NO: 155 e 157, respectivamente; (vi) SEQ ID NO: 177 e 179, respectivamente;
(vii) SEQ ID NO: 201 e 203, respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 243 e 225, respectivamente; (ix) SEQ ID NO: 245 e 247, respectivamente; (x) SEQID NO: 267 e 269, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 289 e 291, respectivamente; (xii) SEQ ID NO: 311 e 313, respectivamente; (xiii) SEQ ID NO: 333 e 335, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 355 e 357, respectivamente; (xv) SEQ ID NO: 377 e 379, respectivamente; e (xvi) SEQ ID NO: 399 e 401, respectivamente.
64. Anticorpo monoclional isolado que se liga especifica- mente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de li- gação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada e uma leve compreendendo sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em: () SEQID NO: 71 e 69, respectivamente; (ii), SEQID NO: 93 e 91, respectivamente; (iii) SEQ ID NO: 115 e 113, respectivamente; (iv) SEQ ID NO: 137 e 135, respectivamente; (v) SEQID NO: 159 e 157, respectivamente; (vi) SEQ ID NO: 181 e 179, respectivamente; (vii) SEQ ID NO: 205 e 203, respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 227 e 225, respectivamente; (ix) SEQ ID NO: 249 e 247, respectivamente; (x) SEQID NO: 271 e 269, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 293 e 291, respectivamente; (xii) SEQ ID NO: 315 e 313, respectivamente; (xii) SEQ ID NO: 337 e 335, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 359 e 357, respectivamente;
(xv) SEQ ID NO: 381 e 379, respectivamente; e (xvi) SEQ ID NO: 403 e 401, respectivamente.
65. Anticorpo monoclional isolado que se liga especifica- mente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de li- gação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada e uma leve compreendendo sequências de aminoácidos pelo menos 90% idênticas às sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em: () SEQID NO: 71 e 69, respectivamente; (ii), SEQID NO: 93 e 91, respectivamente; (iii) SEQ ID NO: 115 e 113, respectivamente; (iv) SEQ ID NO: 137 e 135, respectivamente; (v) SEQID NO: 159 e 157, respectivamente; (vi) SEQ ID NO: 181 e 179, respectivamente; (vii) SEQ ID NO: 205 e 203, respectivamente; (viii) SEQ ID NO: 227 e 225, respectivamente; (ix) SEQ ID NO: 249 e 247, respectivamente; (x) SEQID NO: 271 e 269, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 293 e 291, respectivamente; (xi) SEQ ID NO: 315 e 313, respectivamente; (xiii) SEQ ID NO: 337 e 335, respectivamente; (xiv) SEQ ID NO: 359 e 357, respectivamente; (xv) SEQ ID NO: 381 e 379, respectivamente; e (xvi) SEQ ID NO: 403 e 401, respectivamente.
66. Anticorpo monocional isolado que se liga especifica- mente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de li- gação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve compreendendo sequências de aminoácidos estabelecidas na SEQ ID NO: 177 e 179, respectivamente.
67. Anticorpo monoclional isolado que se liga especifica- mente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de li- gação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve compreendendo sequências de aminoácidos pelo menos 90% idênticas às sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NO: 177 e 179, respectivamente.
68. Anticorpo monoclional isolado que se liga especifica- mente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de li- gação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada e uma leve compreendendo sequências de aminoácidos estabelecidas na SEQ ID NO: 181 e 179, respectivamente.
69. Anticorpo monoclional isolado que se liga especifica- mente à e antagoniza a IL-27 humana ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de li- gação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve compreendendo sequências de aminoácidos pelo menos 90% idênticas às sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NO: 181 e 179, respectivamente.
70. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo monoclional isolado ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindica- ções anteriores, e um transportador farmaceuticamente aceitável.
71. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que compre- ende uma sequência nucleotídica que codifica a cadeia leve, a cadeia pesada ou as cadeias leve e pesada do anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qual- quer uma das reivindicações 1 a 69.
72. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que com- preende o ácido nucleico como definido na reivindicação 71.
73. Célula, caracterizada pelo fato de que é transformada com um vetor de expressão como definido na reivindicação 72.
74. Método para produzir um anticorpo monocilonal que se liga especificamente à IL-27 humana, ou a uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende manter uma célula como definida na reivindicação 73, sob condições que per- mitem a expressão do anticorpo monoclonal ou porção de ligação ao antígeno do mesmo.
75. Método, de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que compreende ainda obter o anticorpo monoclonal ou porção de ligação ao antígeno do mesmo.
76. Método para inibir ou reduzir a fosforilação de STAT1 e/ou STAT3 em uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende contatar a célula com o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 69, em que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo inibe ou reduz a fosforilação de STAT1 e/ou STAT3 em uma célula.
77. Método para inibir ou reduzir a inibição da expressão de CD161 em uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende con- tatar a célula com o anticorpo monoclonal isolado, ou fragmento de liga- ção ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 69, em que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, inibe ou reduz a inibição da expressão de CD161 em uma célula.
78. Método para inibir ou reduzir a expressão de PD-L1 e/ou TIM-3 em uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende con- tatar a célula com o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de liga- ção ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 69, em que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo inibe a expressão de PD-L1 e/ou TIM-3 em uma célula.
79. Método para induzir ou intensificar a secreção de uma ou mais citocinas de uma célula, caracterizado pelo fato de que compre- ende contatar a célula com o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 69, em que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, induz ou intensifica a secreção mediada por PD-1 de uma ou mais citocinas de uma célula.
80. Método para estimular uma resposta imune em um indi- víduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indiví- duo uma quantidade eficaz do anticorpo monoclional isolado, ou frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido qualquer uma das reivindicações 1 a 69 ou a composição farmacêutica como definida na reivindicação 70.
81. Método de tratamento de um câncer em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo monoclonal isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 69 ou a composição farmacêutica como definida na reivindicação 70.
82. Método para estimular uma resposta imune ou tratar um câncer em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo monocional isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 69 ou a composição farmacêu- tica, como definida na reivindicação 70, em que o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, ou a composição farmacêutica inibe ou reduz a fosforilação de STAT1 e/ou STAT3 em uma célula, estimu- lando assim a resposta imune ou tratando o câncer.
83. Método para estimular uma resposta imune ou tratar um câncer em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qual- quer uma das reivindicações 1 a 69 ou a composição farmacêutica como definida na reivindicação 70, em que o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, ou a composição farmacêutica inibe ou reduz a inibição da expressão de CD161 em uma célula, estimulando assim a resposta imune ou tratando o câncer.
84. Método para estimular uma resposta imune ou tratar um câncer em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo monoclonal isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 69 ou a composição farmacêu- tica, como definida na reivindicação 70, em que o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, ou a composição farmacêutica inibe ou reduz a expressão de PD-L1 e/ou TIM-3 em uma célula, estimulando assim a resposta imune ou tratando o câncer.
85. Método para estimular uma resposta imune ou tratar um câncer em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo monocional isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qual- quer uma das reivindicações 1 a 69 ou a composição farmacêutica como definida na reivindicação 70, em que o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, ou a composição farmacêutica induz ou inten- sifica a secreção mediada por PD-1 de uma ou mais citocinas de uma célula, estimulando assim a resposta imune ou tratando o câncer.
86. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 81 a 85, caracterizado pelo fato de que o câncer é escolhido entre cân- cer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de células não peque-
nas), sarcoma, câncer de testículo, câncer de ovário, câncer de pân- creas, câncer de mama (por exemplo, câncer de mama triplo negativo), melanoma, câncer de cabeça e pescoço (por exemplo, câncer de ca- beça e pescoço escamoso), câncer colorretal, câncer de bexiga, câncer de endométrio, câncer de próstata, câncer de tireoide, carcinoma hepa- tocelular, câncer de estômago, câncer de cérebro, linfoma (por exemplo, DL- BCL), leucemia (por exemplo, AML) ou câncer renal (por exemplo, carcinoma de células renais, por exemplo, carcinoma de células claras renais).
87. Método para intensificar uma ou mais atividades de um anticorpo anti-PD-1 (por exemplo, intensifica a secreção de citocinas mediada por PD-1; intensifica a secreção de TNFa mediada por anti- PD-1; intensifica a secreção de IL-6 mediada por anti-PD-1 a partir de uma célula exposta a anticorpos anti-PD-1), caracterizado pelo fato de que compreende expor uma célula a um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 69, simultaneamente ou sequencialmente a um anti-PD-1 para melhorar uma ou mais atividades de anticorpos anti-PD1.
88. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo anti-PD-1 e um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 69, e um transportador farmaceuticamente aceitável.
89. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende um anti- corpo anti-PD-1 e um anticorpo, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 69, para administração simultânea ou sequencial, e instruções para o seu uso.
90. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 80 a 86, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclional isolado,
ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, é administrado em combi- nação com um ou mais agentes ou procedimentos terapêuticos adicio- nais, em que o segundo agente ou procedimento terapêutico é selecio- nado do grupo que consiste em: quimioterapia, terapia anticâncer dire- cionada, droga oncolítica, agente citotóxico, terapia imunológica, cito- cina, procedimento cirúrgico, procedimento de radiação, ativador de uma molécula coestimulatória, inibidor de molécula inibitória, vacina ou imunoterapia celular ou uma combinação dos mesmos.
91. Método, de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes terapêuticos adicionais é um antagonista de PD-1, um inibidor de PD-L1, um inibidor de TIM-3, um inibidor de LAG-3, um inibidor de TIGIT, um inibidor de CD112R, um inibidor de TAM, um agonista de STING, um agonista de 4-1BB ou uma combinação dos mesmos.
92. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes terapêuticos adicionais é um antagonista de PD-1.
93. Método, de acordo com a reivindicação 92, caracterizado pelo fato de que o antagonista de PD-1 é selecionado do grupo que consiste em: PDROO01, nivolumabe, pembrolizumabe, pidilizumabe, MEDIO680, REGN2810, TSR-042, PF-O6801591 e AMP-224.
94. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que o inibidor de PD-L1 é selecionado do grupo que con- siste em: FAZO53, Atezolizumabe, Avelumabe, Durvalumabe e BMS-
936559.
95. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que um ou mais agentes terapêuticos adicionais são sele- cionados do grupo que consiste em sunitinibe (Sutentº), Cabozantinibe (Cabometyxº), Axitinibe (Inlytaº), Lenvatinibe (Lenvimaº), Everolimus (Afinitorº), Bevacizumabe (Avastinº), epacadostat, NKTR-214 (agonista com tendência CD-122), tivozanibe (Fotivdaº), abexinostat, Ipilimumabe (Yervoyº), tremelimumabe, Pazopanibe (Votrientº), Sorafenibe (Nexa- varº), Temsirolimus (Toriselº), Ramucirumabe (Cyramzaº), niraparibe, savolitinibe, vorolanibe (X-82), Regorafenibe (Stivargo?), Donafenibe (iniilbdor de multicinase), Canrelizumabe (SHR-1210), pexastimogene devacirepvec (JX-594) —Ramucirumabe (Cyramzaº), apatinibe (YN968D1), doxorubicina encapsulada (Thermodoxº), Tivantinibe (ARQ197), ADI-PEG 20, binimetinibe, mesilato de apatinibe, ninteda- nibe, lirlumabe, Nivolumabe (Opdivoº), Pembrolizumabe (Keytrudaº), Atezolizumabe (Tecentrigº), Avelumabe (Bavencioº), Durvalumabe (Im- fimziº), cemiplimab-rwlc (Libtayoº), tislelizumabe, e espartalizumabe.
96. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes terapêuticos adicionais é um inibidor de TIM-3, opcionalmente em que o inibidor de TIM-3 é MGB453 ou TSR-022.
97. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes terapêuticos adicionais é um inibidor de LAG-3, opcionalmente em que o inibidor de LAG-3 é seleci- onado do grupo que consiste em LAG525, BMS-986016 e TSR-033.
98. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes terapêuticos adicionais é um inibidor de TIGIT.
99. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes terapêuticos adicionais é um inibidor de CD112R.
100. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracteri- zado pelo fato de que o um ou mais agentes terapêuticos adicionais é um inibidor de TAM (Axl, Mer, Tyro).
101. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracteri- zado pelo fato de que o um ou mais agentes terapêuticos adicionais é um agonista de 4-1BB.
102. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracteri- zado pelo fato de que o um ou mais agentes terapêuticos adicionais é um Inibidor de Tirosina Cinase (TKI).
103. Método para detectar 11-27 ou EBI3 em uma amostra de um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende (a) conta- tar uma amostra do indivíduo com um anticorpo de detecção sob condi- ções para permitir que o anticorpo de detecção forme um complexo an- ticorpo de detecção-EBI3, se 11-27 ou EBI3 estiver presente na amostra, em que o anticorpo de detecção é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 69; e (b) detectar a presença do complexo, se houver, produ- zido na etapa (a).
104. Método para detectar um câncer associado à I|L-27 em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) contatar uma amostra de um indivíduo suspeito de ter um câncer associado à IL-27 com um anticorpo de detecção sob condições para permitir que o anticorpo de detecção forme um complexo anticorpo de detecção-EBlI3, se IL-27 ou EBI3 estiver presente na amostra, em que o anticorpo de detecção é um anticorpo ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 69; e (b) detectar a presença do complexo, se houver, produzido na etapa (a).
105. Método, de acordo com a reivindicação 103 ou 104, ca- racterizado pelo fato de que o anticorpo de detecção é acoplado a um marcador detectável.
106. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 103 a 105, caracterizado pelo fato de que compreende ainda con- tatar amostra com um anticorpo de captura para produzir um complexo compreendendo IL-27 ou EBI3 e o anticorpo de captura, se I1L-27 ou
EBI3 estiver presente na amostra, em que o anticorpo de captura é um anticorpo, ou a porção de ligação ao antígeno, como definido em qual- quer uma das reivindicações 1 a 69.
107. Método, de acordo com a reivindicação 106, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo de captura é imobilizado em um su- porte sólido.
108. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 103 a 107, caracterizado pelo fato de que a amostra é contatada com o anticorpo de captura antes do anticorpo de detecção.
109. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 103 a 108, caracterizado pelo fato de que a amostra é uma amos- tra de fluido corporal.
110. Método, de acordo com a reivindicação 109, caracteri- zado pelo fato de que a amostra de fluido é sangue, soro, plasma, lisa- dos celulares ou lisados de tecidos.
111. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 104 a 110, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado de carcinoma de células renais (RCC), carcinoma hepatocelular (HCC), câncer de pulmão, câncer gastroesofágico, câncer de ovário, câncer de endométrio, melanoma, leucemia e linfoma.
112. Método, de acordo com a reivindicação 111, caracteri- zado pelo fato de que o câncer é carcinoma de células renais (RCC).
113. Método, de acordo com a reivindicação 111, caracteri- zado pelo fato de que o câncer é carcinoma hepatocelular (HCC).
114. Método, de acordo com a reivindicação 111, caracteri- zado pelo fato de que o câncer é selecionado de leucemia e linfoma.
115. Método, de acordo com a reivindicação 111, caracteri- zado pelo fato de que o câncer é câncer de ovário.
116. Uso do anticorpo monoclonal isolado, ou porção de |i-
gação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 69 ou a composição farmacêutica como definida na rei- vindicação 70, caracterizado pelo fato de que é para estimular uma res- posta imune em um indivíduo, ou para tratar o câncer em um indivíduo, opcionalmente para uso em combinação com um ou mais agentes ou procedimentos terapêuticos adicionais.
117. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende um an- ticorpo monoclional isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 69 ou a composição farmacêutica como definida na reivindicação 70 e instru- ções para uso no estímulo de uma resposta imune em um indivíduo ou no tratamento de câncer em um indivíduo, opcionalmente, com instru- ções para uso em combinação com um ou mais agentes ou procedi- mentos terapêuticos adicionais.
118. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende o anti- corpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 69, e instruções para uso na detecção de I|L-27 em uma amostra de um indivíduo, opci- onalmente com instruções de uso para detectar um câncer associado a I1L-27 em um indivíduo.
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