BR112020017451A2 - Composição farmacêutica para tratamento ou prevenção de ossificação heterotópica - Google Patents

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Sho TSUKAMOTO
Keigo Kumagai
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Abstract

a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica para uso em um método para tratar e/ou prevenir um paciente com ossificação ectópica e/ou tumor cerebral, em que o paciente tem uma mutação ativa na proteína alk2 que é responsável pela ossificação ectópica ou tumor cerebral; um resíduo de aminoácido na posição 330 de alk2 é prolina; e um ingrediente ativo desta composição é um anticorpo anti-alk2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo uma propriedade de ligação a alk2, uma propriedade de reticulação de alk2 e uma propriedade de inibição da transdução de sinal de bmp.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA TRATAMENTO OU PREVENÇÃO DE OSSIFICAÇÃO HETEROTÓPICA”.
CAMPO TÉCNICO
[001] A presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica para uso em um método para tratar e/ou prevenir ossificação ectópica (ou heterotópica) (ou formação óssea) e/ou tumor cerebral, caracterizada pela administração de um anticorpo anti-ALK2 tendo ligação de ALK2 e capacidades de reticulação em um paciente tendo uma mutação ativa em ALK2 e sem mutação do resíduo de aminoácido na posição 330 de ALK2.
TÉCNICA ANTECEDENTE
[002] Fibrodisplasia ossificante progressiva (FOP) é uma doença genética em que um tecido de cartilagem ou tecido ósseo é formado ectopicamente em tecidos moles, como músculo esquelético, tendão e ligamento, onde os tecidos ósseos não são normalmente formados (Literatura Não Patenteada 1 a 3). Nessa doença, a ossificação ectópica ocorre em todo o corpo, incluindo o rosto, de modo que um tecido ósseo ectópico e um tecido ósseo existente são fundidos para reduzir notavelmente a amplitude de movimento articular ou deformar o corpo (Literatura Não Patenteada 1 a 3).
[003] É conhecido que a ossificação ectópica em FOP inclui não apenas ossificação ectópica prosseguindo cronicamente com o crescimento, porém da mesma forma a ossificação ectópica aguda que precedendo acompanhada por um sintoma, chamado surto, causado por lesão muscular, infecção viral ou similar (Literatura Não Patente 1). O surto é acompanhado pelo inchaço com resposta inflamatória ou dor prolongada como principais sintomas e é conhecido por ser induzido por hematoma, queda, injeção intramuscular ou similar, que causa lesão muscular. Além disso, surtos repentinos sem causa clara são da mesma forma conhecidos. Para FOP, procedimentos médicos invasivos, tal como biópsia e operação, são contraindicados porque ossos ectópicos podem ser formados após o surto. Como tal, os tecidos ósseos ectópicos não podem ser removidos cirurgicamente. Os tecidos ósseos ectópicos na FOP são formados com células de cartilagem normais ou osteoblastos e são metabolizados da mesma maneira que os tecidos ósseos normais. Por causa disso, é impossível remover apenas tecidos ósseos ectópicos usando fármacos ou similares.
[004] Qualquer terapia fundamental para suprimir a ossificação ectópica na FOP ainda não foi estabelecida, e apenas o tratamento sintomático para a dor ou similar foi feito. Desse modo, os tecidos ósseos ectópicos formados na FOP são muito difíceis de remover, e o desenvolvimento de um fármaco promissor que pode exercer efeitos profiláticos antes do início da ossificação ectópica é esperado.
[005] O gene de ativina similar a cinase 2 (ALK2), que codifica um receptor de proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs) que induz a formação óssea ectópica em tecidos moles, incluindo tecidos do músculo esquelético, foi identificado como um gene causador da FOP (literatura não patenteada 4). O gene ALK2 é idêntico ao gene do receptor 1 de ativina A tipo I (ACVR1). ALK2 tendo uma substituição de aminoácido foi encontrado em casos familiares e esporádicos de FOP (Literatura Não Patenteada 4).
[006] ALK2 humano ou de camundongo é uma única proteína transmembrana consistindo em 509 aminoácidos e tendo um peptídeo de sinal e funciona como um tipo de transmembrana de ligação de receptor de serina/treonina cinase a BMPs (Literatura Não Patenteada 1 a 3). ALK2 liga BMPs em sua região extracelular N-terminal para ativar a trilha de sinalização intracelular a jusante através de sua serina/treonina cinase intracelular.
[007] Os receptores BMP são classificados com base em suas estruturas e funções em 2 tipos: receptores tipo I, incluindo ALK2; e receptores tipo II (Literatura Não Patenteada 1 a 3). Os receptores tipo II são enzimas constitutivamente ativas que exibem atividade cinase, mesmo se não ligadas com BMP. Por outro lado, receptores tipo I, incluindo ALK2, são enzimas inativas em um estado não ligado com BMP e exibem atividade de cinase de uma maneira dependente da ligação a BMP. Isto provavelmente se deve ao fato de que, após a ligação a BMP, o receptor cinase tipo II fosforila o domínio intracelular do receptor tipo I como o substrato, que pode alterar sua conformação, e ativa o receptor tipo I (Literatura Não Patenteada 1 a 3).
[008] Os receptores tipo I são conhecidos por serem constitutivamente ativados independentemente de um receptor tipo II, por substituição de um aminoácido particular na região intracelular (Literatura Não Patenteada 1 a 3). A superexpressão dos mutantes constitutivamente ativados dos receptores do tipo I ativa a trilha de sinalização intracelular, mesmo quando o sinal não é estimulado com BMP. Desse modo, os receptores tipo I são considerados moléculas responsáveis por transduzir sinais de BMP de fora para dentro das células.
[009] A mutação em ALK2 identificada em casos familiares e esporádicos típicos de FOP foi a mutação de R206H na qual Arg206 é substituído por His (Literatura Não Patenteada 4). Todas as mutações genéticas previamente identificadas em casos de FOP foram relatadas causar substituições de aminoácidos na região intracelular de ALK2. A maioria dessas mutações em casos de FOP se concentra na vizinhança da região de ligação de ATP no domínio intracelular de ALK2 (Literatura Não Patenteada 5).
[0010] Superexpressão dos mutantes de ALK2 identificados na FOP em células cultivadas ativa a trilha de sinalização intracelular de
BMP, mesmo quando o sinal não é estimulado com BMP (Literatura Não Patenteada 6). Desta maneira, os anticorpos anti-ALK2 que podem ser esperados ter efeito inibitório sobre o ALK2 tipo silvestre e vários mutantes de ALK2 intracelulares, incluindo novos mutantes não identificados, agindo na região extracelular de ALK2 e inibindo sua transdução de sinal, estão sendo desenvolvidos como terapêuticos para FOP (Literatura de Patente 1).
[0011] O glioma pontino intrínseco difuso (DIPG) é o astrocitoma difuso (infiltrativo) encontrado principalmente na ponte do cérebro e supostamente responsável por aproximadamente 75 a 80% dos tumores pediátricos do tronco cerebral. DIPG é uma doença rara com uma taxa de sobrevivência a longo prazo inferior a 10%, porque o tronco cerebral regula funções essenciais, tal como a respiração. As mesmas mutações em ALK2 em casos de FOP também foram identificadas em casos de DIPG (Literatura Não Patenteada 7). Desse modo, os anticorpos anti-ALK2 podem ser capazes de tratar tumores cerebrais, tal como DIPG.
LITERATURA DA TÉCNICA ANTECEDENTE Literatura de Patente
[0012] Literatura de Patente 1: Publicação Internacional No. WO 2016/121908 Literatura Não Patenteada
[0013] Literatura Não Patenteada 1: T. Katagiri, J. Oral Biosci., 52, 33-41 (2010)
[0014] Literatura Não Patenteada 2: T. Katagiri, J. Oral Biosci., 54, 119-123 (2012)
[0015] Literatura Não Patenteada 3: T. Katagiri e S. Tsukamoto, Biol. Chem., 394, 703-714 (2013)
[0016] Literatura Não Patenteada 4: E.M. Shore e outro, Nat. Genet., 38, 525-527 (2006)
[0017] Literatura Não Patenteada 5: A. Chaikuad e outro, J. Biol. Chem., 287, 36990-36998 (2012)
[0018] Literatura Não Patenteada 6: T. Fukuda e outro, J. Biol. Chem., 284, 7149-7156 (2009)
[0019] Literatura Não Patenteada 7: K.R. Taylor e outro, Nat Genet., 46, 457-461 (2014)
SUMÁRIO DA INVENÇÃO Problema a ser resolvido pela invenção
[0020] Um objetivo da presente invenção é fornecer um método eficaz para tratar e/ou prevenir ossificação ectópica (ou heterotópica) (ou formação óssea) e/ou tumor cerebral, e uma composição farmacêutica para uso no método. Meios de solução do problema
[0021] Os presentes inventores avaliaram os anticorpos anti-ALK2 como terapêuticos para FOP e, consequentemente, constataram que a administração do anticorpo anti-ALK2 a modelos de camundongos FOP promove ossificação ectópica. Os presentes inventores conduziram estudos diligentes para atingir o objetivo e, consequentemente, constataram agora que o anticorpo anti-ALK2 promove a transdução de sinal intracelular de ALK2 de camundongo com mutação de R206H, mas ao invés disso, inibe a transdução de sinal intracelular quando ALK2 humano com mutação de R206H é usado. Desta maneira, como um resultado da realização de substituições intracelulares e extracelulares em ALK2 humano e ALK2 de camundongo, o anticorpo anti-ALK2 foi descoberto agora promover a transdução de sinal intracelular de ALK2 quando uma região intracelular é derivada de ALK2 de camundongo com mutação de R206H. A comparação das sequências de aminoácidos das regiões intracelulares entre ALK2 humano e ALK2 de camundongo revelou que suas sequências de aminoácidos diferem apenas nos resíduos de aminoácido na posição 182 (isto é, ácido aspártico (D) para ácido glutâmico (E) humano para camundongo) e na posição 330 (isto é, prolina (P) para humanos e serina (S) para camundongos). Desta maneira, os presentes inventores prepararam mutantes substituindo- se ácido aspártico (D) na posição 182 e prolina (P) na posição 330 de ALK2 humano com mutação de R206H pelos resíduos de aminoácido de camundongo, ou seja, ácido glutâmico (E) e serina (S), respectivamente, e em seguida estudaram o efeito dos anticorpos anti- ALK2 nos mutantes. Como um resultado, foi agora revelado que os anticorpos anti-ALK2 promovem a transdução de sinal intracelular quando prolina (P) na posição 330 de ALK2 humano com mutação de R206H é substituída por serina (S). A substituição de prolina (P) na posição 330 por ácido aspártico (D), ácido glutâmico (E) ou alanina (A) foi agora constatada dar resultados similares. Os anticorpos anti-ALK2 foram também constatados realçar a transdução de sinal de BMP mediada por ALK2 quando a glicina (G) na posição 328 de ALK2 humano sem mutação de R206H é substituída por valina (V). Como um resultado, os presentes inventores completaram a presente invenção através da constatação que a ossificação ectópica e/ou tumor cerebral podem ser efetivamente tratados e/ou evitados pela administração de anticorpos anti-ALK2 apenas a pacientes sem mutação de um resíduo de aminoácido na posição 330 de ALK2 e/ou pacientes sem mutação de G328V de ALK2 entre pacientes tendo uma mutação ativa em ALK2.
[0022] Especificamente, a presente invenção abrange as seguintes características:
[0023] (1) Uma composição farmacêutica para uso em um método para tratar e/ou prevenir um paciente com ossificação ectópica, em que:
[0024] o paciente tem uma mutação ativa em uma proteína cinase
2 similar a Activina (ALK2) que é responsável por ossificação ectópica;
[0025] um resíduo de aminoácido na posição 330 do ALK2 é prolina; e
[0026] um ingrediente ativo da composição é um anticorpo anti- ALK2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo uma propriedade de ligação ao ALK2, uma propriedade de reticulação do ALK2 e uma propriedade de inibição de transdução de sinal de BMP.
[0027] (2) A composição farmacêutica de acordo com (1), em que o ALK2 não tem mutação de G328V.
[0028] (3) A composição farmacêutica de acordo com (1), em que o método compreende as etapas de:
[0029] (a) detectar a presença ou ausência de uma mutação ativa em ALK2 em pacientes;
[0030] (b) selecionar um paciente com a mutação ativa em ALK2;
[0031] (c) confirmar que o paciente não tem mutação de um resíduo de aminoácido na posição 330 de ALK2; e
[0032] (d) administrar o anticorpo anti-ALK2 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ao paciente selecionado.
[0033] (4) A composição farmacêutica de acordo com (3), em que a etapa (c) também compreende a etapa de confirmação de que o ALK2 do paciente não possui mutação de G328V.
[0034] (5) A composição farmacêutica de acordo com (3), em que a seleção do paciente ao qual o anticorpo anti-ALK2 ou o fragmento de ligação ao antígeno deve ser administrado compreende as etapas de:
[0035] (a) detectar a presença ou ausência de uma mutação ativa em ALK2 em pacientes com ossificação ectópica;
[0036] (b) selecionar um paciente com a mutação ativa em ALK2; e
[0037] (c) excluir um paciente tendo uma mutação de um resíduo de aminoácido na posição 330 de ALK2.
[0038] (6) A composição farmacêutica de acordo com (5), em que a etapa (c) também compreende a etapa de exclusão de um paciente com mutação de G328V em ALK2.
[0039] (7) A composição farmacêutica, de acordo com qualquer um de (1) a (6), em que o anticorpo anti-ALK2 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga especificamente a um polipeptídeo que consiste em resíduos de aminoácido da posição 21 à posição 123 na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1.
[0040] (8) A composição farmacêutica de acordo com qualquer um de (1) a (7), em que o anticorpo anti-ALK2 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga a:
[0041] (i) um epítopo compreendendo cada resíduo de ácido glutâmico na posição 38, glicina na posição 39, isoleucina na posição 59, asparagina na posição 60, ácido aspártico na posição 61, glicina na posição 62, fenilalanina na posição 63, histidina na posição 64, valina na posição 65, tirosina na posição 66, asparagina na posição 102, treonina na posição 104, glutamina na posição 106 e leucina na posição 107 na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; ou
[0042] (ii) um epítopo compreendendo cada resíduo de ácido glutâmico na posição 38, glicina na posição 39, leucina na posição 40, isoleucina na posição 59, asparagina na posição 60, ácido aspártico na posição 61, glicina na posição 62, fenilalanina na posição 63, histidina na posição 64, valina na posição 65, tirosina na posição 66 e treonina na posição 104 na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
[0043] (9) A composição farmacêutica, de acordo com qualquer um de (1) a (7), em que o anticorpo anti-ALK2 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compete, pela ligação a ALK2, com o anticorpo anti-ALK2 ou fragmento de ligação ao antígeno dos mesmos de acordo com (8).
[0044] (10) A composição farmacêutica de acordo com qualquer um de (1) a (9), em que o anticorpo anti-ALK2 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, um humano anticorpo, um diacorpo, um anticorpo multiespecífico ou F(ab')2.
[0045] (11) A composição farmacêutica de acordo com qualquer um de (1) a (10), em que
[0046] uma sequência de cadeia pesada do anticorpo anti-ALK2 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável com CDRH1, CDRH2 e CDRH3, em que CDRH1, CDRH2 e CDRH3 consistem nas sequências de aminoácidos de:
[0047] SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7, respectivamente;
[0048] SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13, respectivamente;
[0049] SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 20, respectivamente; ou
[0050] SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26, respectivamente, e
[0051] uma sequência de cadeia leve deste compreende uma região variável com CDRL1, CDRL2 e CDRL3, em que CDRL1, CDRL2 e CDRL3 consistem nas sequências de aminoácidos de
[0052] SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10, respectivamente;
[0053] SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 10, respectivamente;
[0054] SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16, respectivamente;
[0055] SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 23, respectivamente; ou
[0056] SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO: 29, respectivamente.
[0057] (12) A composição farmacêutica de acordo com qualquer um de (1) a (11), em que
[0058] a sequência da região variável da cadeia pesada do anticorpo anti-ALK2 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é:
[0059] a1) uma sequência de aminoácidos consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 à posição 142 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31;
[0060] a2) uma sequência de aminoácidos consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 à posição 142 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33;
[0061] a3) uma sequência de aminoácidos consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 à posição 140 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34;
[0062] a4) uma sequência de aminoácidos consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 à posição 140 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36;
[0063] a5) uma sequência de aminoácidos consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 à posição 140 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38;
[0064] a6) uma sequência de aminoácidos consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 à posição 140 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39;
[0065] a7) uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade com qualquer sequência de aminoácidos selecionada a partir das sequências de aminoácidos a1) a a6);
[0066] a8) uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade com qualquer sequência de aminoácidos selecionada a partir das sequências de aminoácidos a1) a a6); ou
[0067] a9) uma sequência de aminoácidos compreendendo uma substituição(ões), uma deleção(ões) ou uma adição(ões) de um ou vários resíduos de aminoácido em qualquer sequência de aminoácido selecionada a partir das sequências de aminoácido a1) a a6), e
[0068] a sequência da região variável da cadeia leve é:
[0069] b1) uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido da posição 21 à posição 133 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 32;
[0070] b2) uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido da posição 21 à posição 129 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 35;
[0071] b3) uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido da posição 21 à posição 129 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 37;
[0072] b4) uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 95% de identidade com qualquer sequência de aminoácido selecionada a partir das sequências de aminoácido b1) a b3);
[0073] b5) uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 99% de identidade com qualquer sequência de aminoácido selecionada das sequências de aminoácido b1) a b3); ou
[0074] b6) uma sequência de aminoácido compreendendo uma substituição(ões), uma deleção(ões) ou uma adição(ões) de um ou vários resíduos de aminoácido em qualquer sequência de aminoácido selecionada a partir das sequências de aminoácido b1) a b3).
[0075] (13) A composição farmacêutica, de acordo com (12), em que o anticorpo anti-ALK2 é:
[0076] um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma região variável da cadeia pesada consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 à posição 142 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável da cadeia leve consistindo de resíduos de aminoácido da posição 21 para a posição 133 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 32;
[0077] um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma região variável da cadeia pesada consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 à posição 142 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 33 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável da cadeia leve consistindo em resíduos de aminoácido da posição 21 para a posição 133 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 32;
[0078] um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma região variável da cadeia pesada consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 à posição 140 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 34 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável da cadeia leve consistindo em resíduos de aminoácido da posição 21 à posição 129 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 35;
[0079] um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma região variável da cadeia pesada consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 à posição 140 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 36 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável da cadeia leve consistindo em resíduos de aminoácido da posição 21 para a posição 129 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 37;
[0080] um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma região variável da cadeia pesada consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 à posição 140 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 38 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável da cadeia leve consistindo em resíduos de aminoácido da posição 21 à posição 129 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 35; ou
[0081] um anticorpo que consiste em uma cadeia pesada compreendendo uma região variável da cadeia pesada consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 à posição 140 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 39 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável da cadeia leve consistindo de resíduos de aminoácido da posição 21 para a posição 129 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 37.
[0082] (14) A composição farmacêutica, de acordo com qualquer um de (1) a (13), em que a mutação ativa em ALK2 é pelo menos uma selecionada de L196P, delP197_F198insL, R202I, R206H, Q207E, R258S, R258G, G325A, G328E, G328R, G328W, G356D e R375P.
[0083] (15) A composição farmacêutica de acordo com qualquer um de (1) a (13), em que a mutação ativa em ALK2 é a mutação de R206H.
[0084] (16) A composição farmacêutica de acordo com qualquer um de (1) a (15), em que a ossificação ectópica é fibrodisplasia ossificante progressiva (FOP).
[0085] (17) Uma composição farmacêutica para uso em um método para tratar e/ou prevenir um paciente com tumor cerebral, em que o paciente tem uma mutação ativa na proteína cinase 2 similar a Activina (ALK2) que é responsável pelo tumor cerebral; e um ingrediente ativo da composição é um anticorpo anti-ALK2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo uma propriedade de ligação ao ALK2, uma propriedade de reticulação do ALK2 e uma propriedade de inibição da transdução de sinal BMP.
[0086] (18) A composição farmacêutica de acordo com (17), em que um resíduo de aminoácido na posição 330 de ALK2 no paciente é prolina.
[0087] (19) A composição farmacêutica de acordo com (17) ou
(18), em que a mutação ativa em ALK2 é pelo menos uma selecionada de R206H, R258G, G328E, G328W e G356D.
[0088] (20) A composição farmacêutica de acordo com qualquer um de (17) a (19), em que o anticorpo anti-ALK2 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo anti-ALK2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo definido em qualquer um de (7 ) a (13).
[0089] (21) A composição farmacêutica de acordo com qualquer um de (17) a (20), em que o tumor cerebral é glioma pontino intrínseco difuso (DIPG).
[0090] (22) Um método para prever um risco de desenvolver uma reação adversa atribuível à administração de um anticorpo anti-ALK2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo as seguintes etapas de:
[0091] (a) detectar a presença ou ausência de uma mutação ativa em ALK2 e uma mutação de um resíduo de aminoácido na posição 330 de ALK2 de um paciente; e
[0092] (b) determinar que quando o paciente tem a mutação ativa em ALK2 e não tem mutação de um resíduo de aminoácido na posição 330 de ALK2, o paciente tem um baixo risco de desenvolver uma reação adversa atribuível à administração de um anticorpo anti-ALK2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[0093] (23) Um método para prever a responsividade ao tratamento e/ou prevenção por administração de um anticorpo anti- ALK2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo as seguintes etapas de:
[0094] (a) detectar a presença ou ausência de uma mutação ativa em ALK2 e uma mutação de um resíduo de aminoácido na posição 330 de ALK2 de um paciente; e
[0095] (b) determinar que quando o paciente tem a mutação ativa em ALK2 e não tem mutação de um resíduo de aminoácido na posição 330 de ALK2, o paciente tem capacidade de resposta ao tratamento e/ou prevenção pela administração de um anticorpo anti-ALK2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[0096] (24) Um método para selecionar um paciente a ser tratado e/ou prevenido pela administração de um anticorpo anti-ALK2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo as seguintes etapas:
[0097] (a) detectar a presença ou ausência de uma mutação ativa em ALK2 e uma mutação de um resíduo de aminoácido na posição 330 de ALK2 de um paciente; e
[0098] (b) selecionar o paciente como um paciente a ser tratado e/ou prevenido pela administração de um anticorpo anti-ALK2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo quando o paciente tem a mutação ativa em ALK2 e não tem mutação de um resíduo de aminoácido na posição 330 de ALK2.
[0099] (25) Método para tratar e/ou prevenir uma doença pela administração de um anticorpo anti-ALK2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo as seguintes etapas de:
[00100] (a) detectar a presença ou ausência de uma mutação ativa em ALK2 e uma mutação de um resíduo de aminoácido na posição 330 de ALK2 de um paciente; e
[00101] (b) administrar ao paciente o anticorpo anti-ALK2 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo quando o paciente tem a mutação ativa em ALK2 e não tem mutação de um resíduo de aminoácido na posição 330 de ALk2.
[00102] (26) O método de acordo com (25), também compreendendo a execução da etapa (b) do método de acordo com qualquer um de (22) a (24).
[00103] (27) O método de acordo com qualquer um de (22) a (26),
em que a administração do anticorpo anti-ALK2 ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é a administração de uma composição farmacêutica de acordo com qualquer um de (1) a (21) .
[00104] (28) O método de acordo com qualquer um de (22) a (27), em que a etapa (b) também compreende a confirmação de que a mutação ativa em ALK2 não é a mutação de G328V.
[00105] (29) O método de acordo com qualquer um de (22) a (28), em que a mutação ativa em ALK2 é pelo menos uma selecionada de L196P, delP197_F198insL, R202I, R206H, Q207E, R258S, R258G, G325A, G328E, G328R, G328W, G356D e R375P.
[00106] (30) O método de acordo com qualquer um de (22) a (28), em que a mutação ativa em ALK2 é pelo menos uma selecionada de R206H, R258G, G328E, G328W e G356D.
[00107] (31) O método de acordo com qualquer um de (25) a (30), em que a doença que afeta o paciente é ossificação ectópica ou tumor cerebral.
[00108] (32) O método de acordo com (31), em que a doença que afeta o paciente é ossificação ectópica.
[00109] (33) O método de acordo com qualquer um de (25) a (31), em que a doença que afeta o paciente é fibrodisplasia ossificante progressiva (FOP) ou glioma pontino intrínseco difuso (DIPG).
[00110] (34) O método de acordo com (33), em que a doença que afeta o paciente é a fibrodisplasia ossificante progressiva (FOP).
[00111] A presente especificação descritiva inclui o conteúdo descrito em Pedido de Patente Japonesa No. 2018-039066, do qual o presente pedido reivindica a prioridade.
[00112] A presente invenção fornece um método eficiente para tratar e/ou prevenir ossificação ectópica e/ou tumor cerebral em um paciente particular, e uma composição farmacêutica para uso no método. A presente invenção também fornece um método para prever um risco de desenvolver uma reação adversa atribuível à administração de um anticorpo anti-ALK2, um método para prever a capacidade de resposta ao tratamento e/ou prevenção por administração de um anticorpo anti-ALK2 e um método para selecionar um indivíduo a ser tratado e/ou prevenido pela administração de um anticorpo anti-ALK2. A presente invenção fornece ainda um método para tratar e/ou prevenir uma doença causada por uma mutação ativa em ALK2 (por exemplo, ossificação ectópica e/ou tumor cerebral) por administração de um anticorpo anti-ALK2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00113] [FIG. 1] Esta figura é um gráfico que mostra, usando um repórter de luciferase específico de BMP, que um anticorpo anti-ALK2 (27D-H2L2_LALA) ativa a transdução de sinal BMP em células HEK293 que expressam R206H ALK2 de camundongo (Fig. 1A), enquanto o anticorpo faz não ativar a transdução de sinal BMP em células HEK293 que expressam R206H ALK2 humano (Fig. 1B). A ordenada representa a atividade relativa da luciferase ("Atividade relativa da luc") para um controle não tratado (ou seja, um controle livre do anticorpo anti-ALK2). A abcissa representa uma concentração de anticorpo. As proteínas ALK2 de controle são ALK2 tipo silvestre de camundongo (‘Mouse WT ALK2’) e ALK2 tipo silvestre humano (‘Human WT ALK2’), e um anticorpo de controle (Ctrl) é IgG1.
[00114] [FIG. 2] Esta figura é um gráfico que mostra, usando um repórter de luciferase específico de BMP, que F(ab')2 ('27D- H2L2_F(ab')2') ativa a transdução de sinal BMP apenas em células HEK293 que expressam R206H ALK2 de camundongo (Fig. 2A), como no anticorpo anti-ALK2 ('27D-H2L2_LALA'), enquanto Fab ('27D- H2L2_Fab') não ativa a transdução de sinal de BMP mesmo em células HEK293 que expressam R206H ALK2 de rato ou humano
(Figs. 2A e 2B, respectivamente). A ordenada representa a atividade relativa de luciferase (atividade relativa luc) para um controle não tratado (isto é, um controle livre de F(ab')2). A abcissa representa uma concentração de anticorpo e um anticorpo de controle (Ctrl) é IgG1.
[00115] [FIG. 3] Esta figura é um gráfico que mostra, usando a tecnologia binária Nanoluc, que A2-27D, 27D-H2L2_LALA e 27D- H2L2_F(ab')2 induzem a formação de reticulação (isto é, formação de complexo) de ALK2. Em contraste, 27D-H2L2_Fab não induziu a formação de reticulação (isto é, formação de complexo) de ALK2. A ordenada representa a “atividade de luciferase (atividade de luc) determinada usando Nanoluc Binary Technology”. A abcissa representa uma concentração de anticorpo.
[00116] [FIG. 4] Esta figura é um alinhamento de sequência que mostra que na comparação de sequência entre as proteínas ALK2 humanas, de macaco, cachorro, rato e camundongo, nem o resíduo de aminoácido na posição 182 (ou seja, humano "D" e camundongo "E") nem o resíduo de aminoácido na posição 330 (isto é, humano "P" e camundongo "S") é conservado entre humano e camundongo.
[00117] [FIG. 5] Esta figura é um gráfico que mostra, usando um repórter de luciferase específico de BMP, que o anticorpo anti-ALK2 (A2-27D) ativa a transdução de sinal de BMP em células HEK293 que expressam R206H ALK2 humano com prolina na posição 330 substituída por serina. A inibição da ativação da transdução de sinal de BMP foi encontrada em células HEK293 que expressam R206H ALK2 de camundongo com serina na posição 330 substituída por prolina (dados não mostrados). Esta figura também mostra, usando o repórter de luciferase específico de BMP, que o anticorpo anti-ALK2 ativa a transdução de sinal de BMP em células HEK293 que expressam R206H ALK2 de camundongo, porém não ativa ou suprime ou inibe a transdução de sinal de BMP em células HEK293 que expressam WT humano ALK2 e os outros mutantes de ALK2 humanos indicados, tais como ALK2 humano com ácido aspártico na posição 182 substituído por ácido glutâmico.
[00118] [FIG. 6] Esta figura é um gráfico que mostra, usando um repórter de luciferase específico de BMP, que o anticorpo anti-ALK2 (A2-27D) ativa a transdução de sinal de BMP em células HEK293 que expressam R206H ALK2 humano com prolina (P) na posição 330 substituída por serina (S), ácido aspártico (D), ácido glutâmico (E) ou alanina (A), porém não ativa a transdução de sinal de BMP para R206H ALK2 humano com prolina (P) na posição 330 substituída por valina (V). Esta figura da mesma forma mostra que o anticorpo anti- ALK2 não ativa a transdução de sinal de BMP para WT ALK2 humano tendo a substituição descrita acima, porém não contendo nenhuma mutação de R206H. A presença ou ausência da ativação da transdução de sinal de BMP também é indicada para ALK2 de camundongo com a mutação mostrada nesta figura. Um controle ('Controle') é IgG2 de rato.
[00119] [FIG. 7] Esta figura é um gráfico que mostra, usando um repórter de luciferase específico de BMP, que quatro tipos de anticorpos anti-ALK2 (27D-H2L2_LALA, 15A-H4L6_IgG2, A2-11E e A2-25C) ativam a transdução de sinal de BMP em células HEK293 que expressam R206H ALK2 de camundongo (Fig. 7A), enquanto nenhum destes anticorpos ativam a transdução de sinal de BMP em células HEK293 que expressam um mutante de R206H ALK2 humano (Fig. 7B). A ordenada representa a atividade de luciferase relativa (atividade de luc relativa) para um controle não tratado (isto é, um controle livre de anticorpos anti-ALK2). A abcissa representa uma concentração de anticorpo.
[00120] [FIG. 8] Esta figura é um gráfico que mostra, usando um repórter de luciferase específico de BMP, que o anticorpo anti-ALK2
(A2-27D) ativa a transdução de sinal de BMP em células HEK293 que expressam G328V humano ou Q207D ALK2, porém não ativa o sinal BMP transdução em células HEK293 que expressam outros mutantes de ALK2 humanos (R206H, L196P, PF197-8L (da mesma forma referida como "delP197_F198insL"), R202I, Q207E, R258G, R258S, G325A, G328E, G328R, G328W, e G328R, G328W, G328R, G328W). A atividade foi medida da mesma forma que no Exemplo 5. Na figura, a ordenada representa a atividade de luciferase contra um controle não tratado. A abcissa representa uma concentração A2-27D. Quanto G328V (1/3) e Q207D (1/20), mutante de G328V e mutante de Q207D foram usados no ensaio de modo que suas quantidades fossem 1/3 da quantidade dos outros mutantes (por exemplo, 12,5 ng/cavidade quando cada um dos outros mutantes era 37,5 ng/cavidade) e 1/20 (por exemplo, 1,875 ng/cavidade quando cada um dos outros mutantes era 37,5 ng/cavidade).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[00121] A presente invenção será descrita em mais detalhes.
1. Definição
[00122] Quando aqui usado, o termo "gene" inclui não apenas DNA, mas mRNA, cDNA e cRNA.
[00123] Quando aqui usado, o termo "polinucleotídeo" é usado com o mesmo significado que um ácido nucleico e da mesma forma inclui, por exemplo, DNA, RNA, sondas, oligonucleotídeos e iniciadores.
[00124] Quando aqui usado, o "polipeptídeo" e a "proteína" são usados alternadamente um com o outro.
[00125] Quando aqui utilizado, a "fração de RNA" refere-se a uma fração contendo RNA.
[00126] Quando aqui utilizado, a "célula" da mesma forma inclui células em indivíduos animais e células em cultura.
[00127] Quando aqui utilizado, "ALK2" é utilizado com o mesmo significado que proteína ALK2 e inclui ALK2 tipo silvestre e seus mutantes (da mesma forma referido como "mutante").
[00128] Quando aqui utilizado, o "fragmento de ligação ao antígeno de um (o) anticorpo", da mesma forma denominado "fragmento funcional de um (o) anticorpo", significa um fragmento parcial do anticorpo com uma atividade de ligação de antígeno e inclui, por exemplo, F(ab')2, diacorpos, anticorpos lineares, Fvs de cadeia única e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos. No entanto, o fragmento de ligação ao antígeno não está limitado a essas moléculas, visto que o fragmento de ligação ao antígeno tenha uma capacidade de se ligar a ALK2 (ou uma propriedade de ligação a ALK2) e tenha uma capacidade de reticular ALK2 (ou um propriedade de reticulação de ALK2), como no anticorpo anti-ALK2. De preferência, o fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo tem ainda uma capacidade de inibir a transdução de sinal de BMP (ou uma propriedade de inibir a transdução de sinal de BMP), como no anticorpo anti-ALK2. Esse fragmento de ligação ao antígeno inclui não apenas um fragmento obtido pelo tratamento de uma molécula de tamanho natural da proteína do anticorpo com uma enzima apropriada, porém uma proteína produzida em células hospedeiras apropriadas usando um gene de anticorpo geneticamente modificado.
[00129] Quando aqui utilizado, o "epítopo", da mesma forma denominado "determinante antigênico", geralmente se refere a um sítio antigênico de ligação de anticorpo que consiste em pelo menos 7 aminoácidos, pelo menos 8 aminoácidos, pelo menos 9 aminoácidos ou pelo menos 10 aminoácidos ácidos, de um antígeno. Quando aqui usado, o "epítopo" significa um peptídeo parcial ou uma conformação parcial de ALK2 ao qual um anticorpo anti-ALK2 particular se liga. O epítopo como um peptídeo parcial de ALK2 pode ser determinado por um método bem conhecido por aqueles versados na técnica, tal como um imunoensaio e pode ser determinado, por exemplo, pelo seguinte método em que várias estruturas parciais de ALK2 são preparadas.
Para a preparação das estruturas parciais, pode ser usada uma técnica de síntese de oligopeptídeos conhecida na técnica.
Por exemplo, uma série de fragmentos polipeptídicos com um comprimento apropriado são preparados na ordem do terminal C ou N de ALK2 usando técnicas de recombinação de genes bem conhecidas por aqueles versados na técnica.
Em seguida, a reatividade do anticorpo com os fragmentos de polipeptídeo é estudada para determinar aproximadamente os locais de reconhecimento.
Em seguida, peptídeos mais curtos são sintetizados e a reatividade do anticorpo com esses peptídeos pode ser estudada para determinar o epítopo.
Alternativamente, o epítopo como uma conformação parcial de ALK2 ao qual um anticorpo ALK2 particular se liga pode ser determinado identificando resíduos de aminoácido de ALK2 adjacentes ao anticorpo por análise de estrutura de cristal de raios X.
Se um segundo anticorpo anti-ALK2 se liga a um peptídeo parcial ou uma conformação parcial que está ligada por um primeiro anticorpo anti- ALK2, em seguida o primeiro anticorpo e o segundo anticorpo pode ser determinado para compartilhar um epítopo.
Além disso, mesmo se uma sequência ou estrutura específica de um epítopo não for determinada, o primeiro anticorpo e o segundo anticorpo podem ser determinados para compartilhar o epítopo, confirmando que o segundo anticorpo anti-ALK2 (cruzado) compete com o primeiro Anticorpo anti- ALK2 para ligação a ALK2 (ou seja, que o segundo anticorpo interfere na ligação do primeiro anticorpo a ALK2). Além disso, quando o primeiro anticorpo e o segundo anticorpo se ligam a um epítopo comum e o primeiro anticorpo tem uma atividade, tal como atividade inibitória contra a transdução de sinal de BMP mediada por ALK2, o segundo anticorpo pode da mesma forma ter atividade similar.
[00130] As cadeias pesadas e leves de uma molécula de anticorpo são conhecidas por cada uma ter três regiões de determinação de complementaridade (CDRs). As regiões de determinação de complementaridade, da mesma forma chamadas de domínios hipervariáveis, estão localizadas nas regiões variáveis das cadeias pesadas e leves do anticorpo. Estes locais têm uma estrutura primária particularmente variável e são separados em três locais nas respectivas estruturas primárias das cadeias polipeptídicas de cadeia pesada e leve. Quando aqui utilizado, as regiões de determinação de complementaridade de um anticorpo são referidas como CDRH1, CDRH2 e CDRH3 a partir do terminal amino da sequência de aminoácido da cadeia pesada para as regiões de determinação de complementaridade da cadeia pesada e como CDRL1, CDRL2 e CDRL3 do terminal amino da sequência de aminoácido da cadeia leve para as regiões de determinação de complementaridade da cadeia leve. Esses locais são próximos uns dos outros na conformação e determinam a especificidade do antígeno a ser ligado.
[00131] Na presente invenção, o termo "hibridização sob condições rigorosas" significa hibridização sob condições envolvendo hibridização a aproximadamente 50 a 70 °C (por exemplo, 68 °C) em uma solução de hibridização comercialmente disponível ExpressHyb Hybridization Solution (fabricado por Clontech Laboratories, Inc.), ou hibridização a aproximadamente 50 a 70°C (por exemplo, 68°C) na presença de NaCl aproximadamente 0,7 a 1,0 M usando um filtro imobilizado de DNA, seguido por lavagem a aproximadamente 50 a 70°C (por exemplo, 68°C) usando uma solução de SSC com uma concentração de aproximadamente 0,1 a 2 x (SSC com uma concentração de 1 x consiste em NaCl 150 mM e citrato de sódio 15 mM; se necessário, a solução pode conter aproximadamente 0,1 a
0,5% de SDS), o que permite a identificação, ou hibridização em condições equivalentes às mesmas.
[00132] Quando aqui utilizado, o termo "vários" na frase "um ou vários" refere-se a 2 a 10. O termo "vários" é preferencialmente 10 ou menos, mais preferencialmente 5 ou 6 ou menos, muito mais preferencialmente 2 ou 3.
[00133] Na presente invenção, a "capacidade de reticulação" ou a "capacidade de reticulação" refere-se à capacidade de um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno se ligar às respectivas regiões extracelulares em duas moléculas da proteína ALK2, desse modo reticulação dessas moléculas. Normalmente, ALK2 forma um complexo na presença de um ligante de BMP para ativar SMAD1 / 5/8 a jusante. O anticorpo anti-ALK2 induz a reticulação entre duas moléculas de ALK2, provavelmente levando à formação do tipo complexo, mesmo na ausência do ligante. Os presentes inventores constataram agora que um anticorpo anti-ALK2 que se liga a ALK2 inibe a transdução de sinal de BMP quando o resíduo de aminoácido na posição 330 em um mutante da proteína ALK2 humana é prolina e, em alguns casos, quando um mutante de ALK2 humano a proteína não tem mutação de G328V, porém o anticorpo anti-ALK2 promove (ou ativa) a transdução de sinal de BMP quando a prolina na posição 330 é um resíduo de aminoácido diferente, tal como serina, ácido aspártico, ácido glutâmico ou alanina. Com base nesta descoberta, quando um paciente tem prolina na posição 330 em um mutante da proteína ALK2 humana e, em alguns casos, não tem mutação de G328V no mutante da proteína ALK2 humana, o paciente assim identificado pode ser efetivamente tratado com o anticorpo anti-ALK2.
[00134] Quando aqui utilizado, a promoção de transdução de sinal de BMP refere-se à ativação da trilha de sinalização intracelular a jusante através da molécula do receptor ALK2.
[00135] Na presente invenção, o "paciente" não é apenas um ser humano afetado por (ou sofrendo de) uma doença, porém da mesma forma pode ser um ser humano suspeito de ser afetado por uma doença.
[00136] A "amostra biológica", quando aqui utilizada, não é particularmente limitada, visto que a presença ou ausência de uma mutação em ALK2 seja detectável em uma amostra biológica. A amostra biológica é, por exemplo, uma amostra de sangue ou uma amostra de tumor. A amostra biológica pode ser extratos de proteínas ou extratos de ácido nucleico (por exemplo, extratos de mRNA e uma preparação de cDNA e uma preparação de cRNA preparada a partir dos extratos de mRNA) obtidos a partir dessas amostras.
[00137] 2. ALK2
[00138] O gene ALK2 é um gene causador de FOP que codifica um receptor de BMP que induz a formação óssea ectópica em tecidos moles, incluindo tecidos do músculo esquelético. ALK2 mutante tendo substituições de aminoácido foram encontradas em casos familiares e esporádicos de FOP. Por exemplo, L196P (ou seja, a mutação que substitui a leucina na posição 196 pela prolina), delP197_F198insL (da mesma forma referido como "PF197-8L") (ou seja, a mutação que deleta prolina na posição 197 e fenilalanina na posição 198 e, em vez disso, insere leucina entre eles), R202I (ou seja, a mutação que substitui a arginina na posição 202 por isoleucina), R206H (ou seja, a mutação que substitui arginina na posição 206 pela histidina), Q207E (ou seja, a mutação que substitui a glutamina na posição 207 por ácido glutâmico), R258S (ou seja, a mutação que substitui a arginina na posição 258 por serina), R258G (ou seja, a mutação que substitui arginina na posição 258 pela glicina), G325A (ou seja, a mutação que substitui a glicina na posição 325 por alanina), G328E (ou seja, a mutação que substitui a glicina na posição 328 pelo ácido glutâmico),
G328R (ou seja, a mutação que substitui a glicina na posição 328 pela arginina), G328W (ou seja, a mutação que substitui a glicina na posição 328 por triptofano), G356D (ou seja, a mutação que substitui glicina na posição 356 por ácido aspártico) e R375P (ou seja, a mutação que substitui arginina na posição 375 por prolina) na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 são conhecidas como mutações ativas no ALK2 humano.
[00139] O ALK2 mutante com substituição(ões) de aminoácido foi da mesma forma encontrado em casos de DIPG. R206H, R258G, G328E, G328V (que é a mutação que substitui a glicina na posição 328 por valina), G328W, G356D e similares na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 são conhecidas como mutações ativas em ALK2 humano.
[00140] O ALK2 aqui utilizado pode ser obtido por síntese in vitro ou por produção a partir de células hospedeiras por meio da manipulação de genes. Especificamente, cDNA de ALK2 é inserido em um vetor que permite sua expressão. Em seguida, a proteína ALK2 pode ser obtida por síntese em soluções contendo enzimas, substratos e substâncias energéticas necessárias para a transcrição e tradução, ou por expressão em outras células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas transformadas com o vetor.
[00141] ALK2 usado aqui é de um mamífero incluindo humano ou camundongo. Por exemplo, as sequências de aminoácido e nucleotídeos de ALK2 humano estão disponíveis com referência ao GenBank No. de Acesso NM_001105. Aqui, da mesma forma, a sequência de aminoácido é descrita como SEQ ID NO: 1 e a sequência de nucleotídeo é descrita como SEQ ID NO: 2. As sequências de aminoácido e nucleotídeos de ALK2 de camundongo estão disponíveis com referência ao GenBank No. de Acesso NP_001103674. Aqui, da mesma forma, a sequência de aminoácido é descrita como SEQ ID NO: 3, e a sequência de nucleotídeo é descrita como SEQ ID NO: 4. Além disso, as sequências de aminoácido de macaco, rato e cachorro ALK2s estão disponíveis com referência aos números de acesso do GenBank. NM-001260761 (SEQ ID NO: 40), NP_077812 (SEQ ID NO: 42) e XM_549615.5 (SEQ ID NO: 41), respectivamente. ALK2 é da mesma forma chamado de ACVR1 (receptor 1 de ativina A tipo I) ou ACTR1 (receptor de ativina tipo 1), e todos esses termos representam as mesmas moléculas.
[00142] O cDNA de ALK2 pode ser obtido por um denominado método de PCR que envolve a realização da reação em cadeia da polimerase (doravante, referida como "PCR") (Saiki, RK, e outro, Science, (1988) 239, 487-49), por exemplo, usando uma biblioteca de cDNA que expressa o cDNA de ALK2 como um molde e iniciadores que amplificam especificamente o cDNA de ALK2.
[00143] 3. Detecção de mutação em ALK2
[00144] Aqui, o termo "detectar uma mutação" significa detectar uma mutação no DNA genômico como regra. Alternativamente, quando a mutação no DNA genômico é refletida na mudança de uma base(s) em um produto transcrito ou na mudança de um aminoácido(s) em um produto traduzido, este termo da mesma forma significa incluir a detecção dessa mudança no produto transcrito ou o produto traduzido (ou seja, detecção indireta).
[00145] Em uma modalidade preferida, o método da presente invenção é um método para determinar diretamente uma sequência de nucleotídeo de uma região do gene ALK2 de um paciente, desse modo detectando uma mutação. Quando aqui utilizado, a "região do gene ALK2" significa uma determinada região no DNA genômico contendo o gene ALK2. A região da mesma forma contém as regiões de controle de expressão (por exemplo, uma região promotora e uma região intensificadora) do gene ALK2, uma região não traduzida do terminal 3'
do gene ALK2 e similar. Uma mutação nessas regiões pode influenciar, por exemplo, a atividade de transcrição do gene ALK2.
[00146] Neste método, primeiro, uma amostra de DNA é preparada a partir de uma amostra biológica derivada de um paciente. Exemplos da amostra de DNA incluem amostras de DNA genômico e amostras de cDNA preparadas a partir de RNA por transcrição reversa.
[00147] Um método para extrair DNA ou RNA genômico da amostra biológica não é particularmente limitado, e as abordagens conhecidas na técnica podem ser apropriadamente selecionadas para uso na extração. Exemplos do método para extrair DNA genômico incluem um método de SDS fenol (ou seja, um método que envolve: proteína desnaturante em tecidos preservados em uma solução contendo ureia ou em etanol, usando uma enzima proteolítica (proteinase K), um tensoativo (SDS) e fenol; e extração de DNA por precipitação dos tecidos usando etanol), e métodos de extração de DNA usando Clean Columns® (fabricado por NextTec Biotechnolgie GmbH), AquaPure®) (fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.), ZR Plant / Seed DNA Kit ( fabricado por Zymo Research Corp.), Aqua Genomic Solution® (fabricado por MoBiTec GmbH), prepGEM® (fabricado por ZyGEM NZ Ltd.) ou BuccalQuick® (fabricado por TrimGen Corp.). Exemplos do método para extrair RNA incluem métodos de extração usando fenol e um sal caotrópico (mais especificamente, métodos de extração usando um kit comercialmente disponível, tal como TRIzol (fabricado por Invitrogen Corp.) ou ISOGEN (fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ), e métodos usando outros kits comercialmente disponíveis (RNAPrep Total RNA Extraction Kit (fabricado por Beckman Coulter, Inc.), RNeasy Mini (fabricado por Qiagen NV), RNA Extraction Kit (fabricado por Pharmacia Biotech Inc.), etc.). Exemplos de transcriptase reversa para uso na preparação de cDNA a partir do RNA extraído incluem, porém não estão particularmente limitados a transcriptase reversa derivada de retrovírus, tal como RAV (vírus associado de Rous) ou AMV (vírus de mieloblastose aviária), e transcriptase reversa derivada de retrovírus de camundongo, tal como MMLV (vírus da leucemia murina Moloney).
[00148] Neste aspecto, o DNA contendo um local de mutação na região do gene ALK2 é subsequentemente isolado e a sequência de nucleotídeo do DNA isolado é determinada. O isolamento do DNA pode ser realizado, por exemplo, por PCR usando um par de iniciadores oligonucleotídicos concebidos de modo a flanquear em ambos os lados da mutação na região do gene ALK2 e usando o DNA genômico ou o RNA como modelo. A determinação da sequência de nucleotídeo do DNA isolado pode ser realizada, por exemplo, por um método conhecido por aqueles versados na técnica, tal como o método de Maxam-Gilbert ou o método de Sanger, ou um método usando um sequenciador de próxima geração.
[00149] A sequência de nucleotídeo determinada do DNA ou do cDNA pode ser comparada com um controle (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo do DNA ou cDNA correspondente derivada de amostras biológicas de pessoas saudáveis), desse modo determinando a presença ou ausência da mutação no gene ALK2 região do paciente.
[00150] O método para detectar uma mutação na região do gene ALK2 pode ser realizado por vários métodos capazes de detectar uma mutação, além do método de determinar diretamente a sequência de nucleotídeo de DNA ou cDNA.
[00151] A detecção de uma mutação de acordo com a presente invenção pode da mesma forma ser realizada, por exemplo, pelo seguinte método. Especificamente, uma amostra de DNA ou cDNA é primeiro preparada a partir de uma amostra biológica. Subsequentemente, é preparada uma sonda oligonucleotídica rotulada por tintura fluorescente e tintura fluorescente supressora tendo uma sequência de nucleotídeo complementar a uma sequência de nucleotídeo contendo a mutação na região do gene ALK2. Em seguida, a sonda de oligonucleotídeo é hibridizada com a amostra de DNA em condições rigorosas. A sequência de nucleotídeo contendo a mutação na região do gene ALK2 é ainda amplificada usando a amostra de DNA hibridizada com a sonda de oligonucleotídeo como molde. Em seguida, é detectada a fluorescência (sinais) emitida pela tintura fluorescente repórter através da decomposição da sonda de oligonucleotídeo associada à amplificação. Posteriormente, a fluorescência detectada é comparada com um controle. Exemplos de tal método incluem método de sonda de matriz dupla e método de sonda TaqMan®.
[00152] Em um método alternativo, uma amostra de DNA ou cDNA é preparada a partir de uma amostra biológica. Posteriormente, a sequência de nucleotídeo contendo a mutação na região do gene ALK2 é amplificada usando a amostra de DNA como um modelo em um sistema de reação contendo um intercalador que emite fluorescência após a inserção entre dois filamentos de DNA. Em seguida, a temperatura do sistema de reação é alterada, e a variação na intensidade da fluorescência emitida pelo intercalador é detectada. A variação detectada na intensidade da fluorescência causada pela mudança na temperatura é comparada com um controle. Exemplos de tal método incluem método de HRM (fusão de alta resolução).
[00153] Em um outro método alternativo, uma amostra de DNA ou cDNA é primeiro preparada a partir da amostra biológica. Posteriormente, o DNA contendo um sítio de mutação na região do gene ALK2 é amplificado. O DNA amplificado é posteriormente clivado com enzimas de restrição e os fragmentos de DNA clivados são separados de acordo com seus tamanhos. Em seguida, os tamanhos detectados dos fragmentos de DNA são comparados com um controle. Exemplos de tal método incluem um método usando polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP) e PCR-RFLP.
[00154] Em um outro método alternativo, uma amostra de DNA ou cDNA é primeiro preparada a partir de uma amostra biológica. Subsequentemente, o DNA contendo um sítio de mutação na região do gene ALK2 é amplificado. O DNA amplificado é posteriormente dissociado em DNAs de filamento único, que são em seguida separados em um gel não desnaturante. Subsequentemente, a mobilidade dos DNAs de filamento único separados no gel é comparada com um controle. Exemplos de tal método incluem PCR- SSCP (polimorfismo de conformação de filamento único).
[00155] Em um outro método alternativo, uma amostra de DNA ou cDNA é primeiro preparada a partir de uma amostra biológica. Subsequentemente, o DNA contendo um sítio de mutação na região do gene ALK2 é amplificado. Em seguida, o DNA amplificado é separado em um gel em que a concentração de um desnaturante de DNA é gradualmente elevada. Subsequentemente, a mobilidade do DNA separado no gel é comparada com um controle. Exemplos de um tal método incluem eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE).
[00156] Um outro método alternativo é um método que usa DNA contendo um sítio de mutação na região do gene ALK2 preparado a partir da amostra biológica e um substrato com sondas oligonucleotídicas imobilizadas que hibridizam com o DNA sob condições estringentes. Exemplos de tal método incluem um método de matriz de DNA.
[00157] Em um outro método alternativo, uma amostra de DNA ou cDNA é primeiro preparada a partir da amostra biológica. Além disso, um "iniciador de oligonucleotídeo tendo uma sequência de nucleotídeo complementar a um nucleotídeo do lado 3' a jusante por um nucleotídeo da base no sítio de mutação na região do gene ALK2 e a uma sequência de nucleotídeo do lado 3' a jusante do lado 3' nucleotídeo" é preparado. Subsequentemente, a reação de extensão do iniciador de ddNTP é realizada usando o DNA como um modelo e o iniciador. Subsequentemente, o produto de reação de extensão do iniciador é aplicado a um espectrômetro de massa para conduzir a espectrometria de massa. Subsequentemente, o genótipo é determinado a partir dos resultados da espectrometria de massa. O genótipo determinado é em seguida comparado com um controle. Exemplos de tal método incluem MALDI-TOF / MS.
[00158] Em um outro método alternativo, uma amostra de DNA ou cDNA é primeiro preparada a partir de uma amostra biológica. Subsequentemente, uma sonda de oligonucleotídeo consistindo em 5'- (uma sequência de nucleotídeo complementar ao nucleotídeo no sítio de mutação na região do gene ALK2 e a uma sequência de nucleotídeo do lado 5' a montante do nucleotídeo) - (uma sequência de nucleotídeo que não hibridiza para o nucleotídeo do lado 3' a jusante por um nucleotídeo do sítio de mutação na região do gene ALK2 e para uma sequência de nucleotídeo do lado 3' a jusante do nucleotídeo do lado 3') - 3' (isto é, retalho) é preparado. Além disso, uma "sonda de oligonucleotídeo tendo uma sequência de nucleotídeo complementar ao nucleotídeo no sítio de mutação na região do gene ALK2 e a uma sequência de nucleotídeo do lado 3' a jusante do nucleotídeo" é preparada. Subsequentemente, o DNA preparado é hibridizado com os dois tipos de sondas oligonucleotídicas e o DNA hibridado é clivado com uma enzima de clivagem de DNA de filamento único para liberar o retalho. Exemplos da enzima de clivagem de DNA de filamento único incluem, porém não estão particularmente limitados a clivase. Neste método, uma sonda oligonucleotídica marcada com repórter fluorescente e supressor fluorescente tendo uma sequência complementar ao retalho é em seguida hibridizada com o retalho. Subsequentemente, a intensidade da fluorescência gerada é medida. Subsequentemente, a intensidade medida da fluorescência é comparada com um controle. Exemplos de tal método incluem o método Invader.
[00159] Em um outro método alternativo, uma amostra de DNA ou cDNA é primeiro preparada a partir de uma amostra biológica. Subsequentemente, o DNA contendo um sítio de mutação na região do gene ALK2 é amplificado. Em seguida, o DNA amplificado é dissociado em filamentos únicos e apenas um dos filamentos únicos do DNA dissociado é separado. A reação de extensão é em seguida realizada a partir de um nucleotídeo na vizinhança do nucleotídeo no sítio de mutação na região do gene ALK2. O ácido pirofosfórico gerado durante esta reação é enzimaticamente permitido desenvolver luz. A intensidade da luz é medida. A intensidade medida da fluorescência é comparada com um controle. Exemplos de tal método incluem o método de pirossequenciamento.
[00160] Em um outro método alternativo, uma amostra de DNA ou cDNA é primeiro preparada a partir de uma amostra biológica. Subsequentemente, o DNA contendo um sítio de mutação na região do gene ALK2 é amplificado. Em seguida, um "iniciador de oligonucleotídeo tendo uma sequência de nucleotídeo complementar a um nucleotídeo do lado 3' a jusante por um nucleotídeo do nucleotídeo no sítio de mutação na região do gene ALK2 e a uma sequência de nucleotídeo do lado 3' a jusante do lado 3' nucleotídeo" é preparado. Subsequentemente, a reação de extensão de base única é realizada usando o DNA amplificado como um molde e o iniciador preparado na presença de nucleotídeos marcados com fluorescência. Em seguida, o grau de polarização da fluorescência é medido. O grau de polarização medido de fluorescência é comparado com um controle. Exemplos de um tal método inclui o método de AcycloPrime.
[00161] Em um outro método alternativo, uma amostra de DNA ou cDNA é primeiro preparada a partir de uma amostra biológica. Subsequentemente, o DNA contendo um sítio de mutação na região do gene ALK2 é amplificado. Em seguida, um "iniciador de oligonucleotídeo tendo uma sequência de nucleotídeo complementar a um nucleotídeo do lado 3' a jusante por um nucleotídeo do nucleotídeo no sítio de mutação na região do gene ALK2 e a uma sequência de nucleotídeo do lado 3' a jusante do lado 3' nucleotídeo" é preparado. Subsequentemente, a reação de extensão de nucleotídeo único é realizada usando o DNA amplificado como um molde e o iniciador preparado na presença de nucleotídeos fluorescentemente rotulados. Subsequentemente, as espécies de nucleotídeos usadas na reação de extensão de nucleotídeo único são determinadas. Em seguida, as espécies de nucleotídeos determinadas são comparadas com um controle. Exemplos de tal método incluem o método de SNuPE.
[00162] A amostra preparada a partir da amostra biológica acima mencionada pode ser uma proteína. Nesse caso, um método usando uma molécula (por exemplo, um anticorpo) que se liga especificamente a um local com uma alteração de aminoácido causada pela mutação pode ser usado para detectar a mutação.
[00163] 4. Detecção de ossificação ectópica e/ou tumor cerebral
[00164] A ossificação ectópica e/ou tumor cerebral é induzida por transdução de sinal de BMP mediada por ALK2.
[00165] A "ossificação ectópica" significa formação óssea em um sítio onde o osso está originalmente ausente. Exemplos da "ossificação ectópica" podem incluir fibrodisplasia ossificante progressiva (FOP) e heteroplasia óssea progressiva (POH), embora a ossificação ectópica não seja limitada a ela, desde que a ossificação ectópica seja induzida por transdução de sinal de BMP mediada por ALK2 tendo uma mutação ativa.
[00166] O "tumor cerebral" significa um tumor que se desenvolve em um tecido do crânio. Exemplos do "tumor cerebral" podem incluir glioma pontino intrínseco difuso (DIPG), glioma do tronco cerebral, glioblastoma, glioblastoma multiforme (GBM), tumor cerebral não glioblastoma, meningioma, linfoma do sistema nervoso central, glioma, astroglioma, astrocitoma anaplásico, oligoastrocitoma, meduloblastoma e ependimoma, embora o tumor cerebral não seja limitado a eles, desde que o tumor cerebral seja induzido por transdução de sinal de BMP mediada por ALK2 tendo uma mutação ativa.
[00167] ALK2 é um receptor transmembrana de serina/treonina cinase que se liga a BMP. ALK2 se liga a BMP na região extracelular N-terminal e ativa uma trilha de sinalização intracelular a jusante através de serina/treonina cinase intracelular. A proteína morfogenética óssea (BMP) é um fator de crescimento multifuncional pertencente à superfamília do fator de crescimento transformador  (TGF-), e aproximadamente 20 membros da família BMP foram identificados. Foi confirmado que o BMP induz a formação óssea ectópica em tecidos moles, incluindo tecidos do músculo esquelético, e é, portanto, considerado participante em doenças que promovem a formação óssea anormal. BMP-2 e BMP-4 são considerados como tendo maior afinidade para ALK3 do que para ALK2. Uma vez que ALK3 é expresso de forma ubíqua em comparação com ALK2, BMP-2 ou BMP-4 parece ser frequentemente usado em experimentos de indução de ossificação ectópica em vários sítios. Por outro lado, BMP- 7 tem afinidade relativamente alta para ALK2. BMP-9 é geralmente considerado como tendo alta afinidade para ALK1 e também foi constatado ter uma afinidade relativamente alta para ALK2. Em FOP, a ossificação ectópica ocorre por meio de ALK2. Portanto, a presença ou ausência de efeitos terapêuticos e/ou profiláticos em FOP pode provavelmente ser confirmada pelo teste de eficácia para osteoindução ectópica causada pela ativação de sinais mediados por ALK2 por BMP-7 e BMP-9.
[00168] A cultura de mioblastos (células C2C12) na presença de BMP suprime sua diferenciação em células musculares maduras por meio de um mecanismo de transdução de sinal intracelular específico para BMP e, em vez disso, induz a diferenciação em osteoblastos. Desse modo, a transdução de sinal de BMP mediada por ALK2 pode ser analisada com modelos de indução de diferenciação de células C2C12 em osteoblastos por BMP.
[00169] 5. Produção de anticorpo anti-ALK2
[00170] O anticorpo utilizado na presente invenção contra ALK2 pode ser obtido de acordo com um método conhecido na técnica (por exemplo, Kohler e Milstein, Nature (1975) 256, p. 495-497; e Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, p. 365-367, Plenum Press, NY (1980)). Especificamente, o anticorpo monoclonal pode ser obtido fundindo células produtoras de anticorpos que produzem o anticorpo contra ALK2 com células de mieloma para estabelecer hibridomas. O anticorpo obtido pode ser testado quanto à sua atividade de ligação e capacidade de reticulação com ALK2 para selecionar um anticorpo aplicável a doenças humanas.
[00171] Aqui, as posições de aminoácidos atribuídas a características de CDR/FR de um anticorpo são apresentadas de acordo com a numeração de KABAT (KABAT e outro, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)).
[00172] O anticorpo utilizado na presente invenção inclui anticorpos monoclonais contra ALK2 descritos acima, bem como, por exemplo, anticorpos policlonais similarmente tendo efeitos terapêuticos e/ou profiláticos, anticorpos recombinantes artificialmente criados para o propósito de, por exemplo, reduzir a antigenicidade heterogênea contra humanos, por exemplo, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos e similar. Estes anticorpos podem ser produzidos pelo uso de métodos conhecidos.
[00173] Exemplos do anticorpo quimérico podem incluir anticorpos quiméricos compreendendo regiões variáveis e regiões constantes (Fc) de anticorpos derivados de diferentes espécies, por exemplo, as regiões variáveis de um anticorpo derivado de camundongo ou rato ligado a regiões constantes derivadas de humanos (ver Proc .Natl. Acad. Sei. USA, 81, 6851-6855, (1984)).
[00174] Exemplos do anticorpo humanizado podem incluir um anticorpo compreendendo CDRs apenas integrados em um anticorpo derivado de humanos (veja Nature (1986) 321, p. 522-525), e um anticorpo compreendendo as sequências de CDR, bem como resíduos de aminoácido de uma porção de estruturas enxertadas em um anticorpo humano por um método de enxerto de CDR (Publicação Internacional No. WO 90/07861).
[00175] Exemplos do anticorpo anti-ALK2 que podem ser usados na presente invenção podem incluir, porém não são limitados aos seguintes anticorpos anti-ALK2 compreendendo a sequência da região variável da cadeia pesada e uma sequência da região variável da cadeia leve.
[00176] Um anticorpo anti-ALK2 em que
[00177] uma sequência de cadeia pesada do anticorpo anti-ALK2 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável com CDRH1, CDRH2 e CDRH3, em que CDRH1, CDRH2 e CDRH3 consistem nas sequências de aminoácido de
[00178] SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7, respectivamente;
[00179] SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13, respectivamente;
[00180] SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 20, respectivamente; ou
[00181] SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26, respectivamente, e
[00182] uma sequência de cadeia leve deste compreende uma região variável com CDRL1, CDRL2 e CDRL3, em que CDRL1, CDRL2 e CDRL3 consistem nas sequências de aminoácido de
[00183] SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10, respectivamente;
[00184] SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 10, respectivamente;
[00185] SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16, respectivamente;
[00186] SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 23, respectivamente; ou
[00187] SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO: 29, respectivamente, e
[00188] um anticorpo que compete, pela ligação ao ALK2, com o anticorpo anti-ALK2, e tem uma propriedade de reticulação de ALK2 e uma propriedade de inibir a transdução de sinal de BMP.
[00189] Alternativamente, um anticorpo anti-ALK2 em que
[00190] a sequência da região variável da cadeia pesada do anticorpo anti-ALK2 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é:
[00191] a1) uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 à posição 142 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 31;
[00192] a2) uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 à posição 142 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 33;
[00193] a3) uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 à posição 140 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 34;
[00194] a4) uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 à posição 140 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 36;
[00195] a5) uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 à posição 140 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 38;
[00196] a6) uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 à posição 140 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 39;
[00197] a7) uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 95% de identidade com qualquer sequência de aminoácido selecionada a partir das sequências de aminoácido a1) a a6);
[00198] a8) uma sequência de aminoácido com pelo menos 99% de identidade com qualquer sequência de aminoácido selecionada a partir das sequências de aminoácido a1) a a6); ou
[00199] a9) uma sequência de aminoácido compreendendo uma (s) substituição(ões), uma deleção(ões) ou uma adição(ões) de um ou vários resíduos de aminoácido em qualquer sequência de aminoácido selecionada a partir das sequências de aminoácido a1) a a6), e
[00200] a sequência da região variável da cadeia leve é
[00201] b1) uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido da posição 21 à posição 133 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 32;
[00202] b2) uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido da posição 21 à posição 129 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 35;
[00203] b3) uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido da posição 21 à posição 129 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 37;
[00204] b4) uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 95% de identidade com qualquer sequência de aminoácido selecionada a partir das sequências de aminoácido b1) a b3);
[00205] b5) uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 99% de identidade com qualquer sequência de aminoácido selecionada das sequências de aminoácido b1) a b3); ou
[00206] b6) uma sequência de aminoácido compreendendo uma (s) substituição(ões), uma deleção(ões) ou uma adição(ões) de um ou vários resíduos de aminoácido em qualquer sequência de aminoácido selecionada a partir das sequências de aminoácido b1) a b3), e
[00207] um anticorpo que compete, pela ligação ao ALK2, com o anticorpo anti-ALK2, e tem uma propriedade de reticulação do ALK2 e uma propriedade de inibir a transdução de sinal de BMP.
[00208] Mais especificamente, os exemplos do anticorpo anti-ALK2 que podem ser usados na presente invenção podem incluir anticorpos anti-ALK2 descritos em WO 2016/121908 pelos presentes inventores.
[00209] Exemplos do anticorpo anti-ALK2 de rato podem incluir A2- 11E, A2-15A, A2-25C e A2-27D descritos no Exemplo 1 de WO 2016/121908.
[00210] Exemplos do anticorpo anti-ALK2 quimérico humano podem incluir cA2-15A e cA2-27D descritos no Exemplo 5 de WO 2016/121908.
[00211] O anticorpo humanizado derivado do anticorpo A2-15A está incluído no anticorpo usado na presente invenção, desde que o anticorpo humanizado contenha todas as 6 sequências CDR de A2- 15A e tenha atividade de ligação e capacidade de reticulação para ALK2. A região variável da cadeia pesada do anticorpo A2-15A compreende CDRH1 consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5 (GFTFSHYYMA), CDRH2 consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 6 (SITNSGGSINYRDSVKG), e CDRH3 consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7 (EGGENYGGYPPFAY). A região variável da cadeia leve do anticorpo A2-15A compreende CDRL1 consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 (RANQGVSLSRYNLMH), CDRL2 consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 (RSSNLAS), e CDRL3 consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 (QQSRESPFT). Além disso, um anticorpo que compete, pela ligação ao ALK2, com o anticorpo A2-15A, e tem uma propriedade de reticulação do ALK2 e uma propriedade de inibir a transdução do sinal de BMP está da mesma forma incluída na presente invenção.
[00212] O anticorpo humanizado derivado do anticorpo A2-27D está incluído no anticorpo usado na presente invenção, desde que o anticorpo humanizado contenha todas as 6 sequências CDR de A2- 27D e tenha atividade de ligação e capacidade de reticulação para ALK2. A região variável da cadeia pesada do anticorpo A2-27D compreende CDRH1 consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11 (GSTFSNYGMK), CDRH2 consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 12 (SISRSSTYIYYADTVKG), e CDRH3 consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13 (AISTPFYWYFDF). A região variável da cadeia leve do anticorpo A2- 27D compreende CDRL1 consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 (LASSSVSYMT), CDRL2 consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15 (GTSNLAS), e CDRL3 consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 16 (LHLTSYPPYT). Além disso, um anticorpo que compete, para se ligar ao ALK2, com o anticorpo A2-27D, e tem uma propriedade de reticulação do ALK2 e uma propriedade de inibir a transdução do sinal de BMP está da mesma forma incluído na presente invenção.
[00213] O anticorpo humanizado derivado do anticorpo A2-11E é incluído no anticorpo usado na presente invenção, desde que o anticorpo humanizado contenha todas as 6 sequências CDR de A2- 11E e tenha atividade de ligação e capacidade de reticulação para ALK2. A região variável da cadeia pesada do anticorpo A2-11E compreende CDRH1 consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18 (GFTFSNYYMY), CDRH2 consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 19 (SINTDGGSTYYPDSVKG), e CDRH3 consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 20 (STPNIPLAY). A região variável da cadeia leve do anticorpo A2-11E compreende CDRL1 consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 21 (KASQNIYKYLN), CDRL2 consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 22 (YSNSLQT), e CDRL3 consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 23 (FQYSSGPT). Além disso, um anticorpo que compete, pela ligação ao ALK2, com o anticorpo A2-11E, e tem uma propriedade de reticulação do ALK2 e uma propriedade de inibir a transdução do sinal de BMP também está incluído nele.
[00214] O anticorpo humanizado derivado do anticorpo A2-25C é incluído no anticorpo usado na presente invenção, desde que o anticorpo humanizado contenha todas as 6 sequências CDR de A2- 25C e tenha atividade de ligação e capacidade de reticulação para ALK2. A região variável da cadeia pesada do anticorpo A2-25C compreende CDRH1 consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 24 (GFTFSYYAMS), CDRH2 consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 25 (SISRGGDNTYYRDTVKG), e CDRH3 consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 26 (LNYNNYFDY). A região variável da cadeia leve do anticorpo A2-25C compreende CDRL1 consistindo na sequência de aminoácido de SEQ
ID NO: 27 (QASQDIGNWLS), CDRL2 consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 28 (GATSLAD), e CDRL3 consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 29 (LQAYSAPFT). Além disso, um anticorpo que compete, pela ligação ao ALK2, com o anticorpo A2-25C, e tem uma propriedade de reticulação do ALK2 e uma propriedade de inibir a transdução de sinal de BMP estão da mesma forma incluídos na presente invenção.
[00215] Um anticorpo humanizado modificado por CDR preparado por substituição de 1 a 3 resíduos de aminoácido em cada CDR por outros resíduos de aminoácido está da mesma forma incluído no anticorpo usado na presente invenção, desde que o anticorpo humanizado tenha atividade de ligação e capacidade de reticulação para ALK2. Exemplos da substituição de aminoácidos em CDRL2 podem incluir a substituição de um aminoácido de CDRL2 na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30 (hA2-15A-L4 humanizado). CDRL2 consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 17 (RSSNLAQ) é preferido.
[00216] Os exemplos reais do anticorpo humanizado derivado do anticorpo A2-15A podem incluir:
[00217] um anticorpo que consiste em uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de região variável de cadeia pesada consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 à posição 142 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 31 (hA2-15A-H4 humanizado) e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de região variável de cadeia leve consistindo em resíduos de aminoácido da posição 21 a posição 133 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 32 (hA2-15A-L6 humanizado), e
[00218] um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de região variável de cadeia pesada consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 a posição 142 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 33 (hA2-15A-H4 IgG2 humanizado) e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de região variável de cadeia leve consistindo em resíduos de aminoácido da posição 21 a posição 133 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 32, e
[00219] um anticorpo que compete, para se ligar ao ALK2, com qualquer um dos anticorpos A2-15A, e tem uma propriedade de reticulação do ALK2 e uma propriedade de inibir a transdução de sinal de BMP está da mesma forma incluído na presente invenção.
[00220] Os exemplos preferidos da combinação podem incluir:
[00221] um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 a 472 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido da posição 21 para a posição 238 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 32, e
[00222] um anticorpo que consiste em uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que consiste em resíduos de aminoácido da posição 20 a posição 468 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 33 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que consiste em resíduos de aminoácido da posição 21 para a posição 238 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 32, e
[00223] um anticorpo que compete, para se ligar ao ALK2, com qualquer um dos anticorpos, e tem uma propriedade de reticulação do ALK2 e uma propriedade de inibir a transdução do sinal de BMP está da mesma forma incluída nele.
[00224] Os exemplos atuais do anticorpo humanizado derivado do anticorpo A2-27D podem incluir:
[00225] um anticorpo que consiste em uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de região variável de cadeia pesada consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 a posição 140 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 34 (hA2-27D-H2 humanizado) e uma cadeia leve compreendendo uma sequência da região variável da cadeia leve consistindo em resíduos de aminoácido da posição 21 a posição 129 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 35 (hA2-27D-L2 humanizado);
[00226] um anticorpo que consiste em uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de região variável de cadeia pesada consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 a posição 140 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 36 (hA2-27D-H3 humanizado) e uma cadeia leve compreendendo uma sequência da região variável da cadeia leve consistindo em resíduos de aminoácido da posição 21 a posição 129 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 37 (hA2-27D-L4 humanizado);
[00227] um anticorpo que consiste em uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de região variável de cadeia pesada que consiste em resíduos de aminoácido da posição 20 a posição 140 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 38 (hA2-27D-H2-LALA humanizado) e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de região variável de cadeia leve consistindo em resíduos de aminoácido da posição 21 a posição 129 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 35; e
[00228] um anticorpo que consiste em uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de região variável de cadeia pesada consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 a posição 140 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 39 (hA2-27D-H3-LALA humanizado) e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de região variável de cadeia leve consistindo em resíduos de aminoácido da posição 21 a posição 129 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 37; e
[00229] um anticorpo que compete, para se ligar ao ALK2, com qualquer um dos anticorpos, e tem uma propriedade de reticulação do ALK2 e uma propriedade de inibir a transdução do sinal de BMP está da mesma forma incluído na presente invenção.
[00230] Os exemplos preferidos da combinação podem incluir:
[00231] um anticorpo que consiste em uma cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácido que consiste em resíduos de aminoácido da posição 20 a posição 470 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 34 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido da posição 21 a posição 234 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 35;
[00232] um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 a posição 470 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 36 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido da posição 21 para a posição 234 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 37;
[00233] um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 a posição 470 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 38 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido consistindo de resíduos de aminoácido da posição 21 para a posição 234 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 35; e
[00234] um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 a posição 470 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 39 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido da posição 21 para a posição 234 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 37; e
[00235] um anticorpo que compete, para se ligar ao ALK2, com qualquer um dos anticorpos, e tem uma propriedade de reticulação do ALK2 e uma propriedade de inibir a transdução do sinal de BMP está da mesma forma incluído na presente invenção.
[00236] Outros exemplos do anticorpo usado na presente invenção podem incluir um anticorpo humano. O anticorpo humano anti-ALK2 significa um anticorpo humano produzido apenas a partir de sequências de genes de anticorpos derivados de cromossomos humanos. O anticorpo humano anti-ALK2 pode ser obtido por um método usando camundongos de produção de anticorpos humanos transportando fragmentos de cromossomos humanos que compreendem genes de cadeia pesada e leve de anticorpos humanos (veja, por exemplo, Tomizuka, K. e outro, Nature Genetics (1997), 16 , pág. 133-143; Kuroiwa, Y. e outro, Nuc. Acids Res. (1998), 26, pág. 3447-3448; Yoshida, H. e outro, Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, p. 69-73 (Kitagawa, Y., Matsuda, T. e Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; e Tomizuka, K. e outro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000), 97, p. 722-727).
[00237] Especificamente, tal camundongo de produção de anticorpos humanos pode ser criado como um animal recombinante em que locais do gene da cadeia pesada e leve da imunoglobulina endógena foram interrompidos e, em vez disso, os locais do gene da cadeia pesada e leve da imunoglobulina humana são integrados por meio de um vetor, por exemplo, um vetor de cromossomo artificial humano (HAC) ou vetor de cromossomo artificial de camundongo
(MAC), pela preparação de um animal knockout ou transgênico ou pelo cruzamento desses animais.
[00238] Alternativamente, as células eucarióticas podem ser transformadas com cDNAs que codificam as cadeias pesadas e leves, respectivamente, de tal anticorpo humano, de preferência com vetores compreendendo cDNAs, por técnicas de recombinação de genes. As células transformadas que produzem um anticorpo monoclonal humano recombinante podem ser cultivadas para obter este anticorpo a partir do sobrenadante da cultura. Neste contexto, por exemplo, células eucarióticas, de preferência células de mamíferos, tais como células CHO, linfócitos ou células de mieloma, podem ser utilizadas como hospedeiros.
[00239] Além disso, um método para obter um anticorpo humano derivado de exibição de fago selecionado a partir de uma biblioteca de anticorpos humanos (veja, por exemplo, Wormstone, IM e outro, Investigative Ophthalmology & Visual Science (2002), 43 (7), p. 2301- 2308; Carmen, S. e outro, Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), pág. 189-203; e Siriwardena, D. e outro, Ophthalmology (2002), 109 (3), pág. 427-431) é conhecido.
[00240] Por exemplo, um método de exibição de fago (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), p. 1105-1116) pode ser usado, o que envolve permitir que as regiões variáveis de um anticorpo humano sejam expressas como cadeia única Fv (scFv) na superfície do fago e seleção de um fago que se liga ao antígeno. O fago selecionado com base na sua capacidade de se ligar ao antígeno pode ser submetido à análise de genes para determinar as sequências de DNA que codificam as regiões variáveis da ligação do anticorpo humano ao antígeno. Se a sequência de DNA de ligação de scFv ao antígeno for determinada, um vetor de expressão com esta sequência pode ser preparado e transferido para hospedeiros apropriados, seguido por expressão para obter o anticorpo humano (WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93 / 06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388, Annu. Rev. Immunol (1994), 12, p. 433-455; e Nature Biotechnology (2005), 23 (9), p. 1105-1116).
[00241] Os anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que aquele para um anticorpo anti-ALK2 descrito em WO 2016/121908 estão da mesma forma incluídos no anticorpo anti-ALK2 que pode ser usado na presente invenção. Exemplos destes incluem anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que aquele para o anticorpo A2-11E, o anticorpo A2-15A, o anticorpo A2-25C, e/ou o anticorpo A2-27D.
[00242] Quando um anticorpo se liga ou reconhece uma conformidade parcial de um antígeno, o epítopo para este anticorpo pode ser determinado identificando resíduos de aminoácido no antígeno adjacente ao anticorpo por meio de análise de estrutura de raios-X. Por exemplo, o anticorpo ou um fragmento do mesmo e o antígeno ou um fragmento do mesmo podem ser ligados um ao outro, cristalizados e estruturalmente analisados para identificar resíduos de aminoácido no antígeno com uma distância de interação entre o resíduo de aminoácido e o anticorpo. A distância de interação é de 8 angstroms ou menor, de preferência 6 angstroms ou menor, mais preferencialmente 4 angstroms ou menor. Um ou mais resíduos de aminoácido com tal distância de interação com o anticorpo podem constituir um epítopo (ou um determinante antigênico) para o anticorpo. Quando o número de tais resíduos de aminoácido é dois ou mais, esses aminoácidos podem não estar adjacentes uns aos outros na sequência primária.
[00243] Exemplos do anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao epítopo da proteína ALK2 são descritos abaixo.
[00244] O anticorpo anti-ALK2 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode se ligar especificamente a um polipeptídeo que consiste em resíduos de aminoácido da posição 21 a posição 123 na sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 1) de ALK2 humano.
[00245] O anticorpo A2-27D reconhece uma conformação parcial em ALK2 humano. Na sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 1) de ALK2 humano, os resíduos de aminoácido tendo uma distância de interação com o anticorpo A2-27D, ou seja, o epítopo, é constituído por cada um dos resíduos de ácido glutâmico (Glu) na posição 38, glicina (Gly) na posição 39, isoleucina (Ile) na posição 59, asparagina (Asn) na posição 60, ácido aspártico (Asp) na posição 61, glicina (Gly) na posição 62, fenilalanina (Phe) na posição 63, histidina (His) na posição 64, valina (Val) na posição 65, tirosina (Tyr) na posição 66, asparagina (Asn) na posição 102, treonina (Thr) na posição 104, glutamina (Gln) na posição 106, e leucina (Leu) na posição 107. O anticorpo, um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou uma forma modificada do anticorpo ou fragmento que se liga a este epítopo ou tem uma distância de interação entre o anticorpo ou o fragmento e cada um dos resíduos de aminoácidos estão da mesma forma incluídos no anticorpo usado na presente invenção.
[00246] O anticorpo A2-25C reconhece uma conformação parcial em ALK2 humano. Na sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 1) de ALK2 humano, os resíduos de aminoácido tendo uma distância de interação com o anticorpo A2-25C, ou seja, o epítopo, é constituído por cada um dos resíduos de ácido glutâmico (Glu) na posição 38, glicina (Gly) na posição 39, leucina (Leu) na posição 40, isoleucina (Ile) na posição 59, asparagina (Asn) na posição 60, ácido aspártico (Asp) na posição 61, glicina (Gly) na posição 62, fenilalanina (Phe) na posição 63, histidina (His) na posição 64, valina (Val) na posição 65, tirosina (Tyr) na posição 66 e treonina (Thr) na posição 104. O anticorpo, uma ligação de antígeno fragmento do mesmo, ou uma forma modificada do anticorpo ou o fragmento que se liga a este epítopo ou tem uma distância de interação com esses resíduos de aminoácido estão da mesma forma incluídos no anticorpo usado na presente invenção.
[00247] Alternativamente, o anticorpo anti-ALK2 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compete, pela ligação ao ALK2, com o anticorpo anti-ALK2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo descrito acima (por exemplo, o anticorpo A2-27D e o anticorpo A2-25C).
[00248] O anticorpo descrito acima pode ser avaliado quanto à sua atividade de ligação de antígeno, por exemplo, por um método descrito no Exemplo 2, 6, 9 ou 10 de WO 2016/121908 para selecionar anticorpos adequados. A constante de dissociação (KD) do anticorpo é, por exemplo, 1 x 10-6 a 1 x 10-12 M ou menos, porém não está limitada a esta faixa, visto que os efeitos terapêuticos ou profiláticos de interesse sejam obtidos. A constante de dissociação do anticorpo para o antígeno (ALK2) pode ser medida usando Biacore T200 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) com base na ressonância de plásmon superficial (SPR) como princípios de detecção. Por exemplo, o anticorpo ajustado para uma concentração apropriada reage como um analito com o antígeno imobilizado como um ligante em uma fase sólida. A associação e dissociação entre o anticorpo e o antígeno podem ser medidas para obter uma constante de taxa de associação ka1, uma constante de taxa de dissociação kd1 e uma constante de dissociação (KD; KD = kd1 / ka1). A avaliação da atividade de ligação a ALK2 não está limitada ao uso de Biacore T200 e pode ser conduzida usando, por exemplo, um instrumento com base em ressonância de plásmon superficial (SPR) como princípios de detecção, KinExA (Sapidyne Instruments Inc.) com base em ensaio de exclusão cinética como princípios de detecção, sistema de BLItz (Pall Corp.) com base em interferometria de bio-camada como princípios de detecção, ou ELISA (ensaio de imunoabsorção enzimática).
[00249] O anticorpo descrito acima pode ser avaliado quanto à sua capacidade de reticulação com o antígeno, por exemplo, por um método descrito no Exemplo 4 mencionado posteriormente para selecionar anticorpos adequados. Especificamente, um corpo de fusão de ALK2 e LgBiT ou SmBiT é expresso em células in vitro usando NanoLuc® Binary Technology: NanoBiT® (Promega Corp.), e a interação da proteína ALK2 com o anticorpo pode ser detectada a partir de luminescência provocada por complementaridade de LgBiT e SmBiT.
[00250] Um exemplo de outro indicador para comparar as propriedades dos anticorpos pode incluir a estabilidade dos anticorpos. A calorimetria de varredura diferencial (DSC) é um método que pode medir de forma rápida e precisa um ponto médio de transição (Tm), que serve como um bom indicador para a estabilidade estrutural relativa das proteínas. Os valores de Tm podem ser medidos usando DSC e comparados para determinar a diferença na estabilidade térmica. A estabilidade de preservação de um anticorpo é conhecida por se correlacionar com a estabilidade térmica do anticorpo em certa medida (Lori Burton, e outro, Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, p. 265-273). Um anticorpo adequado pode ser selecionado usando sua estabilidade térmica como um indicador. Exemplos de outros indicadores para selecionar o anticorpo podem incluir altos rendimentos em células hospedeiras apropriadas e baixa agregação em uma solução aquosa. Por exemplo, um anticorpo com o rendimento mais alto nem sempre exibe a estabilidade térmica mais alta. Portanto, é necessário selecionar um anticorpo mais adequado para administração a humanos por meio de julgamento abrangente com base nos indicadores mencionados acima.
[00251] Um método para obter uma imunoglobulina de cadeia única ligando as sequências de tamanho natural das cadeias pesadas e leves do anticorpo através de um ligante apropriado é da mesma forma conhecida (Lee, HS, e outro, Molecular Immunology (1999) 36, p. 61-71; e Shirrmann, T. e outro, mAbs (2010), 2, (1) p. 1-4). Essas imunoglobulinas de cadeia simples podem ser dimerizadas para reter uma estrutura e atividade similares às dos anticorpos que são originalmente tetrâmeros. Alternativamente, o anticorpo usado na presente invenção pode ser um anticorpo que possui uma única região variável de cadeia pesada e não possui uma sequência de cadeia leve. Tal anticorpo, que é chamado de anticorpo de domínio único (sdAb), um nanocorpo ou um anticorpo da família Camelidae (anticorpo de cadeia pesada), foi realmente observado em camelos ou lhamas e relatados ter a capacidade de se ligar a um antígeno (Muyldemans S. e outro, Protein Eng. (1994) 7 (9), 1129-35; e Hamers-Casterman C. e outro, Nature (1993) 363 (6428) 446-8). Estes anticorpos podem da mesma forma ser interpretados como um fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo de acordo com a presente invenção.
[00252] A atividade citotóxica celular dependente de anticorpo do anticorpo usado na presente invenção pode ser aumentada controlando a modificação da cadeia de açúcar ligada ao anticorpo. Por exemplo, os métodos descritos em WO 99/54342, WO 2000/61739 e WO 2002/31140 são conhecidos como uma técnica de controle da modificação da cadeia de açúcar do anticorpo, embora esta técnica não se limite a eles.
[00253] No caso da preparação de um anticorpo isolando os genes do anticorpo e depois transferindo os genes para um hospedeiro apropriado, o hospedeiro apropriado pode ser usado em combinação com um vetor de expressão.
[00254] Exemplos específicos dos genes de anticorpos podem incluir um gene (ou um polinucleotídeo) que codifica uma sequência de cadeia pesada e um gene (ou um polinucleotídeo) que codifica uma sequência de cadeia leve do anticorpo, como descrito em WO 2016/121908, e uma combinação desses genes (ou polinucleotídeos).
[00255] Para a transformação de células hospedeiras, um gene de sequência de cadeia pesada (ou polinucleotídeo) e um gene de sequência de cadeia leve (ou polinucleotídeo) podem ser inseridos em um mesmo vetor de expressão ou podem ser inseridos em vetores de expressão distintos. Quando as células eucarióticas são utilizadas como hospedeiros, células animais, células vegetais ou microrganismos eucarióticos podem ser utilizados. Exemplos de células animais podem incluir células de mamífero, por exemplo, células COS de símio (Gluzman, Y., Cell (1981) 23, p. 175-182, ATCC CRL-1650), fibroblastos de camundongo NIH3T3 (ATCC No. CRL- 1658 ), e linhagens celulares deficientes em diidrofolato redutase (Urlaub, G. e Chasin, LA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, p. 4126-4220) de células de ovário de hamster chinês (células CHO, ATCC CCL -61). No caso de usar células procarióticas, exemplos das mesmas podem incluir E. coli e Bacillus subtilis. O gene do anticorpo de interesse é transferido para essas células por transformação, e as células transformadas são cultivadas in vitro para obter anticorpos. Tais métodos de cultura podem diferir em rendimento dependendo das sequências dos anticorpos. Um anticorpo que é fácil de produzir como um fármaco pode ser selecionado usando seu rendimento como um indicador dentre anticorpos com atividade de ligação equivalente.
[00256] O isotipo do anticorpo utilizado na presente invenção pode ser qualquer isotipo com a capacidade de reticular ALK2. Exemplos dos mesmos podem incluir, porém não estão limitados a IgGs (IgG1,
IgG2, IgG3 e IgG4), IgM, IgAs (IgA1 e IgA2), IgD e IgE. Os exemplos preferidos dos isotipos podem incluir IgG e IgM, mais preferencialmente IgG1, IgG2 e IgG4.
[00257] Quando IgG1 é usado como um isótipo do anticorpo usado na presente invenção, as funções efetoras podem ser controladas substituindo uma parte dos resíduos de aminoácido em regiões constantes (ver WO 88/07089, WO 94/28027 e WO9 4/29351) Exemplos de tais variantes de IgG1 incluem IgG1 LALA (IgG1-L234A, L235A) e IgG1 LAGA (IgG1-L235A, G237A). IgG1 LALA é o preferido.
[00258] Quando IgG4 é usado como um isótipo do anticorpo usado na presente invenção, a divisão única de IgG4 pode ser suprimida para estender a meia-vida substituindo uma parte dos resíduos de aminoácido em regiões constantes (veja Molecular Immunology, 30, 1105-108 (1993)). Um exemplo de tal mutante de IgG4 inclui IgG4 pro (IgG4-S241P).
[00259] O anticorpo utilizado na presente invenção pode ser um fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo possuindo locais de ligação de antígeno, ou uma forma modificada do anticorpo. O fragmento do anticorpo pode ser obtido tratando o anticorpo com uma enzima proteolítica tal como papaína ou pepsina ou expressando um gene de anticorpo geneticamente modificado em células cultivadas apropriadas. Entre esses fragmentos de anticorpo, um fragmento que mantém a totalidade ou uma parte das funções possuídas pela molécula de tamanho natural do anticorpo pode ser referido como um fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo. Exemplos das funções do anticorpo podem geralmente incluir uma atividade de ligação de antígeno, uma atividade de inibição da atividade do antígeno, uma atividade de aumento da atividade do antígeno, uma atividade citotóxica celular dependente de anticorpo, uma atividade citotóxica dependente de complemento, e uma atividade citotóxica celular dependente do complemento. A função possuída pelo fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo de acordo com a presente invenção é uma atividade para ligar ALK2 e uma capacidade de reticular ALK2. A atividade de ligação a ALK2 é a propriedade do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (de preferência, especificamente) de ligação à molécula de ALK2, e é preferencialmente uma atividade de inibição da atividade de ALK2, mais preferencialmente uma atividade de inibição da transdução de sinal de BMP mediada por ALK2, mais preferencialmente uma atividade de suprimir, mitigar ou causar a regressão de ossificação ectópica e/ou tumor cerebral.
[00260] Exemplos do fragmento do anticorpo podem incluir F(ab’)2 e similar.
[00261] O anticorpo utilizado na presente invenção pode ter afinidade aumentada para um antígeno por multimerização. Um único anticorpo pode ser multimerizado, ou uma pluralidade de anticorpos que reconhecem uma pluralidade de epítopos, respectivamente, do mesmo antígeno pode ser multimerizada. Exemplos de um método para multimerizar estes anticorpos podem incluir a ligação de dois scFvs a um domínio de IgG CH3, a ligação a estreptavidina e a introdução de um motif de hélice-volta-hélice.
[00262] O anticorpo utilizado na presente invenção pode ser um anticorpo policlonal que é uma mistura de vários tipos de anticorpos anti-ALK2, cujas sequências de aminoácido são diferentes umas das outras. Um exemplo do anticorpo policlonal pode incluir uma mistura de vários tipos de anticorpos que são diferentes em CDRs. Um anticorpo obtido pela cultura de uma mistura de células que produzem diferentes anticorpos, seguido pela purificação das culturas, pode ser usado como tal anticorpo policlonal (veja WO 2004/061104).
[00263] O anticorpo usado na presente invenção pode ser um anticorpo tendo 80% a 99% de identidade quando comparado com as cadeias pesadas e/ou leves do anticorpo. Nesse contexto, o termo “identidade” tem definição geral utilizada na técnica. O % de identidade refere-se à porcentagem do número de aminoácidos idênticos em relação ao número total de aminoácidos (incluindo lacunas) quando duas sequências de aminoácido estão alinhadas para produzir maior consistência de aminoácidos. Os anticorpos que têm uma capacidade de se ligar ao antígeno, um efeito inibitório na transdução de sinal de BMP e a capacidade de reticulação em níveis análogos aos anticorpos descritos acima podem ser selecionados combinando sequências que exibem alta identidade com as sequências de aminoácido de cadeias leves. Tal identidade é geralmente 80% ou 85% ou identidade superior, de preferência 90% ou superior, 91% ou superior, 92% ou superior, 93% ou superior ou 94% ou identidade superior, mais preferencialmente 95% ou superior, 96% ou superior, 97% ou superior ou 98% ou identidade superior, mais preferencialmente 99% ou identidade superior. Alternativamente, os anticorpos que têm vários efeitos equivalentes aos anticorpos descritos acima podem ser selecionados combinando sequências de aminoácido que compreendem uma substituição(ões), uma deleção(ões) e/ou uma adição(ões) de um ou vários resíduos de aminoácido nas sequências de aminoácido das cadeias pesadas e/ou leves. O número de resíduos de aminoácido a serem substituídos, deletados e/ou adicionados é geralmente de 10 ou menos resíduos de aminoácido, de preferência 5 ou 6 ou menos resíduos de aminoácido, mais preferencialmente dois ou três ou menos resíduos de aminoácido, mais preferencialmente um resíduo de aminoácido.
[00264] A cadeia pesada de um anticorpo produzido por células de mamífero cultivadas é conhecida por não possuir um resíduo de lisina de terminal carboxila (Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)). Além disso, a cadeia pesada de tal anticorpo é conhecida por não ter dois resíduos de aminoácido do terminal carboxila (glicina e lisina) e, em vez disso, ter um resíduo de prolina amidado no terminal carboxi (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)).
[00265] Um resíduo de glutamina N-terminal ou ácido glutâmico na cadeia pesada ou leve de um anticorpo é conhecido por ser modificado por piroglutamilação durante a preparação do anticorpo, e o anticorpo usado na presente invenção pode ter essa modificação (WO 2013/147153).
[00266] Tal deleção na sequência da cadeia pesada ou modificação na sequência da cadeia pesada ou leve não influencia a capacidade do anticorpo de se ligar ao antígeno e suas funções efetoras (ativação do complemento, efeitos citotóxicos dependentes de anticorpos, etc.).
[00267] Desse modo, o anticorpo usado na presente invenção da mesma forma abrange um anticorpo que recebeu a deleção ou modificação. Exemplos dos mesmos podem incluir uma variante de deleção derivada de uma cadeia pesada pela deleção de um ou dois aminoácidos em seu terminal carboxila, uma forma amidada da variante de deleção (por exemplo, uma cadeia pesada tendo um resíduo de prolina amidado no sítio do terminal carboxila), e um anticorpo tendo um resíduo de aminoácido N-terminal piroglutamilado em uma cadeia pesada ou leve do mesmo. Entretanto, a variante de deleção no terminal carboxila da cadeia pesada do anticorpo usada na presente invenção não é limitada aos tipos descritos acima, visto que a variante de deleção mantenha a capacidade de se ligar ao antígeno e às funções efetoras. Duas cadeias pesadas que constituem o anticorpo usado na presente invenção podem ser cadeias pesadas de qualquer tipo selecionado a partir do grupo que consiste na cadeia pesada de tamanho natural e as variantes de deleção descritas acima, ou podem ser uma combinação de cadeias pesadas de quaisquer dois tipos selecionados a partir daí. A proporção quantitativa de cada variante de deleção pode ser influenciada pelo tipo de células de mamífero em cultura que produzem o anticorpo de acordo com a presente invenção e pelas condições de cultura. Exemplos de tal caso podem incluir a deleção de um resíduo de aminoácido do terminal carboxila em ambas as duas cadeias pesadas como componentes principais do anticorpo.
[00268] A identidade entre dois tipos de sequências de aminoácido pode ser determinada usando os parâmetros padrão do algoritmo Blast versão 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller e David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389- 3402). O algoritmo Blast está da mesma forma disponível em www.ncbi.nlm.nih.gov/blast na Internet. Dois tipos de valores percentuais, Identidade (ou Identidades) e Positividade (ou Positividades), são calculados de acordo com o algoritmo Blast. O primeiro é um valor que indica resíduos de aminoácido idênticos entre dois tipos de sequências de aminoácido cuja identidade deve ser determinada. Este último é um valor numérico determinado da mesma forma levando em consideração resíduos de aminoácido similares em termos de suas estruturas químicas. Aqui, o valor de identidade é definido como o valor de "Identidade" quando os resíduos de aminoácido são idênticos entre as sequências de aminoácido.
[00269] Um anticorpo conjugado com qualquer uma das várias moléculas, tal como polietilenoglicol (PEG), pode da mesma forma ser usado como uma forma modificada do anticorpo.
[00270] O anticorpo utilizado na presente invenção pode também ser qualquer um dos conjugados formados por esses anticorpos com outros fármacos (imunoconjugados). Exemplos de tal anticorpo podem incluir o anticorpo conjugado com um material radioativo ou um composto tendo um efeito farmacológico (Nature Biotechnology (2005) 23, p. 1137-1146).
[00271] Os anticorpos obtidos podem ser purificados até se tornarem homogêneos. Os métodos de separação e purificação de proteínas convencionalmente usados podem ser usados para a separação e purificação dos anticorpos. Os anticorpos podem ser separados e purificados por abordagens apropriadamente selecionadas ou combinadas, por exemplo, cromatografia em coluna, filtração através de um filtro, ultrafiltração, relardagem, diálise, eletroforese em gel de poliacrilamida preparativa e/ou focagem isoelétrica (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak e outro Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); e Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow e David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), embora a separação e o método de purificação não esteja limitado aos mesmos.
[00272] Exemplos da cromatografia podem incluir cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iônica, cromatografia hidrofóbica, cromatografia de filtração em gel, cromatografia de fase reversa e cromatografia de adsorção.
[00273] Estas abordagens de cromatografia podem ser realizadas usando cromatografia líquida, como HPLC ou FPLC.
[00274] Exemplos da coluna para uso na cromatografia de afinidade podem incluir colunas de proteína A e colunas de proteína G.
[00275] Exemplos de colunas de proteína A podem incluir Hyper D, POROS e Sepharose F.F. (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.).
[00276] Além disso, o anticorpo pode ser purificado explorando sua atividade de ligação de antígeno usando um transportador imobilizado por antígeno.
[00277] O valor KD que indica a afinidade de ligação do anticorpo anti-ALK2 de acordo com a presente invenção para ALK2 é de preferência 10-6 M ou menos, por exemplo, 10-7 M ou menos, 10-8 M ou menos, 10-9 M ou menos, 10-10 M ou menos, 10-11 M ou menos, ou 10-12 M ou menos.
[00278] 6. Método para tratar ossificação ectópica e/ou tumor cerebral e composição farmacêutica para uso no método
[00279] A presente invenção fornece um método para tratar e/ou prevenir uma doença causada por uma mutação ativa em ALK2, compreendendo o uso de uma amostra biológica de um paciente, detectar a presença ou ausência da mutação ativa em ALK2 na amostra biológica e administrar um anticorpo anti-ALK2 para um paciente tendo a mutação ativa em ALK2 e sem mutação de um resíduo de aminoácido na posição 330 (resíduo de prolina na sequência ALK2 humana). Exemplos da doença causada por uma mutação ativa em ALK2 podem incluir fibrodisplasia ossificante progressiva (FOP), heteroplasia óssea progressiva (POH), ossificação ectópica traumática, ossificação ectópica após artroplastia de implante, glioma pontino difuso intrínseco (DIPG), espondiloartrite (SpA), espondilite anquilosante (EA), anemia e queda de cabelo. A doença é preferencialmente fibrodisplasia ossificante progressiva (FOP), heteroplasia óssea progressiva (POH), ossificação ectópica traumática ou ossificação ectópica após artroplastia de implante, mais preferencialmente fibrodisplasia ossificante progressiva (FOP), embora a doença não se limite a isso enquanto a doença é causada por uma mutação ativa no ALK2. Em pacientes com FOP, fusão ou deformidade nos dedos das mãos ou dos pés, fusão ou deformidade cervical ou similar é da mesma forma constatada, e perda auditiva é da mesma forma manifestada. Essas condições estão da mesma forma incluídas na doença causada por uma mutação ativa no ALK2.
[00280] A presente invenção da mesma forma fornece uma composição farmacêutica para uso em um método para tratar e/ou prevenir um paciente com ossificação ectópica, em que o paciente tem uma mutação ativa na proteína ALK2 que é responsável pela ossificação ectópica; um resíduo de aminoácido na posição 330 do ALK2 é prolina; e um ingrediente ativo da composição é um anticorpo anti-ALK2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo uma propriedade de ligação ao ALK2, uma propriedade de reticulação do ALK2 e uma propriedade de inibição da transdução de sinal de BMP.
[00281] Em uma modalidade, o método compreende as etapas de: (a) detectar a presença ou ausência de uma mutação ativa em ALK2 em pacientes; (b) selecionar um paciente com a mutação ativa em ALK2; (c) confirmar que o paciente não tem mutação de um resíduo de aminoácido na posição 330 de ALK2; e (d) administrar o anticorpo anti- ALK2 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ao paciente selecionado.
[00282] Em outra modalidade, a etapa (c) também compreende a etapa de confirmação de que o ALK2 do paciente não tem mutação de G328V.
[00283] Em outra modalidade alternativa, a seleção do paciente ao qual o anticorpo anti-ALK2 ou o fragmento de ligação ao antígeno deve ser administrado compreende as etapas de: (a) detectar a presença ou ausência de uma mutação ativa em ALK2 em pacientes com ossificação ectópica; (b) selecionar um paciente com a mutação ativa em ALK2; e (c) excluir um paciente tendo uma mutação de um resíduo de aminoácido na posição 330 de ALK2.
[00284] Em outra modalidade, a etapa (c) também compreende a etapa de exclusão de um paciente com mutação de G328V em ALK2.
[00285] Exemplos da "ossificação ectópica" de acordo com a presente invenção podem incluir fibrodisplasia ossificante progressiva
(FOP). A fibrodisplasia ossificante progressiva (FOP) é preferida.
[00286] Mutações ativas em ALK2 foram confirmadas em todos os pacientes com FOP, e 10 ou mais tipos de mutações foram relatados até agora. Todas essas mutações foram encontradas para serem mutações de aminoácidos (mutações missense) presentes na região intracelular da proteína ALK2 e não causam qualquer alteração na sequência de aminoácido da região extracelular. Desse modo, o uso da ligação do anticorpo anti-ALK2 à região extracelular de ALK2 produz efeitos terapêuticos e/ou profiláticos na FOP, independentemente dos tipos de mutações.
[00287] O tratamento de FOP significa cura dos sintomas de FOP, melhora dos sintomas, mitigação dos sintomas ou supressão de progressão dos sintomas.
[00288] A prevenção de FOP significa contornar ou supressão do início do surto ou ossificação ectópica.
[00289] Alternativamente, a presente invenção fornece um método para tratar e/ou prevenir tumor cerebral, compreendendo o uso de uma amostra biológica derivada de um paciente, a detecção da presença ou ausência de uma mutação ativa em ALK2 na amostra biológica e a administração de um anticorpo anti-ALK2 em um paciente com a mutação ativa diferente da mutação de G328V em ALK2.
[00290] A presente invenção também fornece uma composição farmacêutica para uso em um método para tratar e/ou prevenir um paciente com tumor cerebral, em que o paciente tem uma mutação ativa na proteína ALK2 que é responsável pelo tumor cerebral; e um ingrediente ativo da composição é um anticorpo anti-ALK2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo uma propriedade de ligação ao ALK2, uma propriedade de reticulação do ALK2 e uma propriedade de inibição da transdução de sinal de BMP.
[00291] Exemplos do "tumor cerebral" de acordo com a presente invenção podem incluir glioma pontino intrínseco difuso (DIPG), glioma do tronco cerebral, glioblastoma, glioblastoma multiforme (GBM), tumor cerebral não glioblastoma, meningioma, linfoma do sistema nervoso central, glioma, astroglioma, astrocitoma anaplásico, oligodendroglioma, oligoastrocitoma, meduloblastoma e ependimoma. O glioma pontino intrínseco difuso (DIPG) é o preferido.
[00292] Mutações ativas em ALK2 foram da mesma forma confirmadas em pacientes com DIPG. Os mutantes R206H, R258G, G328E, G328V, G328W e G356D são conhecidos como mutantes de ALK2 humano. Essas mutações, exceto a mutação de G328V, são da mesma forma comuns em pacientes com FOP. O anticorpo anti-ALK2 exibe atividade inibidora de ALK2, exceto que a mutação de G328V esteja presente. Portanto, o anticorpo anti-ALK2 usado na presente invenção tem efeitos terapêuticos e/ou profiláticos em DIPG em um paciente tendo uma mutação ativa diferente da mutação de G328V em ALK2.
[00293] A inibição da atividade biológica de ALK2 (atividade inibidora de sinal de BMP) com anticorpo anti-ALK2 pode ser confirmada in vitro, por exemplo, por ensaio de luciferase usando plasmídeos repórter com uma inserção de uma sequência responsiva a BMP, fosforilação SMAD1/5/8, análise de expressão de genes alvo de BMP ou medição da atividade de fosfatase alcalina em mioblastos C2C12 de camundongo induzidos para se diferenciar em osteoblastos por estimulação com um ligante de BMP.
[00294] Os efeitos terapêuticos ou profiláticos do anticorpo anti- ALK2 na ossificação ectópica podem ser confirmados in vivo usando animais de laboratório, por exemplo, por administração subcutânea ou intravenosa do anticorpo anti-ALK2 em modelos induzidos por ossificação ectópica com pelotas contendo ligante de BMP transplantadas para músculo de camundongo, ou modelos de camundongo FOP que abrigam ALK2 mutado e analisam a formação óssea ectópica. Alternativamente, os efeitos terapêuticos ou profiláticos no tumor cerebral podem ser confirmados, por exemplo, por administração subcutânea ou intravenosa do anticorpo anti-ALK2 a modelos preparados pela administração de células tumorais derivadas de paciente ao cérebro ou sob a pele de camundongos imunodeficientes, e analisar o crescimento do tumor ou o número de dias de sobrevivência dos ratos.
[00295] No método da presente invenção, o paciente a ser tratado ou prevenido é um paciente tendo uma mutação ativa em ALK2, o paciente não tendo nenhuma mutação de um resíduo de aminoácido na posição 330 de ALK2 (o paciente tendo prolina na posição 330) ou o paciente sem mutação de G328V (o paciente não tendo substituição de um resíduo de aminoácido na posição 328 por valina), de preferência um paciente sem mutação de um resíduo de aminoácido na posição 330 de ALK2 e tendo uma mutação ativa diferente da mutação de G328V em ALK2. Exemplos da mutação ativa em ALK2 incluem L196P, delP197_F198insL (também referido como "PF-197- 8L"), R202I, R206H, Q207E, R258S, R258G, G325A, G328E, G328R, G328W, G356D, e R375P, embora o a mutação não esteja limitada a isso, desde que a mutação ative ALK2.
[00296] O anticorpo anti-ALK2 utilizado na presente invenção pode ser administrado sozinho ou em combinação com pelo menos um medicamento terapêutico adicional para ossificação ectópica no tratamento ou prevenção de ossificação ectópica e pode ser administrado sozinho ou em combinação com pelo menos um fármaco terapêutico adicional para tumor cerebral, radioterapia, imunoterapia ou quimioterapia, etc. no tratamento ou prevenção de tumor cerebral.
[00297] Exemplos de fármacos terapêuticas adicionais para ossificação ectópica que podem ser administrados em combinação com o anticorpo anti-ALK2 podem incluir, porém não são limitados a fármacos anti-inflamatórias, esteroides, bifosfonatos, relaxantes musculares e  agonistas de receptor de ácido retinoico (RAR).
[00298] Exemplos do medicamento anti-inflamatório podem incluir aspirina, diclofenaco, indometacina, ibuprofeno, cetoprofeno, naproxeno, piroxicam, rofecoxibe, celecoxibe, azatioprina, penicilamina, metotrexato, sulfasalazina, leflunomida, infliximabe e etanercept. Indometacina, ibuprofeno, piroxicam ou celecoxibe é preferido.
[00299] Exemplos do esteroide podem incluir prednisolona, beclometasona, betametasona, fluticasona, dexametasona e hidrocortisona. A prednisolona é preferida.
[00300] Exemplos do bisfosfonato podem incluir alendronato, cimadronato, clodronato, etidronato, ibandronato, incadronato, minodronato, neridronato, olpadronato, pamidronato, piridronato, risedronato, tiludronato e zoledronato. Pamidronato ou zoledronato é preferido.
[00301] Exemplos de relaxante muscular podem incluir ciclobenzaprina, metaxalona e baclofeno. O baclofeno é o preferido.
[00302] Exemplos do agonista do receptor de ácido retinoico  podem incluir palovaroteno.
[00303] Exemplos de fármacos terapêuticas adicionais para tumor cerebral que podem ser administradas em combinação com o anticorpo anti-ALK2 podem incluir temozolomida, bevacizumabe, carmustina, lomustina, cloridrato de procarbazina e vincristina.
[00304] Dependendo da condição de ossificação ectópica ou tumor cerebral ou do grau pretendido de tratamento e/ou prevenção, dois ou três ou mais medicamentos terapêuticos adicionais podem ser administrados, e esses medicamentos terapêuticos adicionais podem ser incluídos na mesma preparação e, portanto, administrados no mesmo tempo. O fármaco terapêutico adicional e o anticorpo anti-
ALK2 podem da mesma forma ser incluídos na mesma preparação e, portanto, administrados ao mesmo tempo. Além disso, o anticorpo anti-ALK2 e o fármaco terapêutico adicional podem ser incluídos em preparações distintas e administrados ao mesmo tempo. Alternativamente, o agente adicional e o anticorpo anti-ALK2 podem ser administrados separadamente um após o outro. Especificamente, um medicamento terapêutico compreendendo o anticorpo anti-ALK2 ou o fragmento de ligação ao antígeno deste como um ingrediente ativo pode ser administrado após a administração do medicamento terapêutico adicional, ou o medicamento terapêutico adicional pode ser administrado após a administração do medicamento terapêutico contendo o anticorpo anti-ALK2 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como um ingrediente ativo. Para administração em terapia de gene, um gene para uma proteína que serve como um fármaco terapêutico para ossificação ectópica ou tumor cerebral e o gene para o anticorpo anti-ALK2 pode ser inserido em um sítio a jusante de regiões promotoras distintas ou na mesma região promotora e pode ser introduzido em vetores distintos ou no mesmo vetor.
[00305] O anticorpo anti-ALK2 ou o fragmento do mesmo pode ser conjugado com um fármaco terapêutico para ossificação ectópica ou tumor cerebral para produzir um conjugado de fármaco direcionado descrito em M.C. Garnet "Targeted drug conjugates: sources and progress", Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53, 171-216. Para este propósito, uma molécula de anticorpo, bem como qualquer fragmento de anticorpo, é aplicável, a menos que sua capacidade de se ligar a ALK 2 (propriedades de reconhecimento de ALK2) e a capacidade de reticular ALK2 sejam completamente deletadas. Exemplos do fragmento de anticorpo podem incluir fragmentos tais como F(ab’)2. O modo de conjugação do anticorpo anti-ALK2 ou do fragmento do anticorpo com o fármaco terapêutico para FOP pode assumir várias formas descritas em, por exemplo, M.C. Garnet "Targeted drug conjugates: owners and progress", Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53, 171-216, G.T. Hermanson "Bioconjugate Techniques" Academic Press, Califórnia (1996), Putnam e J. Kopecek "Polymer Conjugates with Anticancer Activity" Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123. Exemplos específicos dos mesmos podem incluir uma maneira pela qual o anticorpo anti-ALK2 é quimicamente conjugado com o fármaco terapêutico para ossificação ectópica ou tumor cerebral, diretamente ou por meio de um espaçador, tal como um oligopeptídeo, e uma maneira pela qual o anticorpo anti- ALK2 é conjugado com o medicamento terapêutico para ossificação ectópica ou tumor cerebral por meio de um transportador de fármaco apropriado. Exemplos de transportadores de fármacos podem incluir sistemas de distribuição de fármacos (por exemplo, X. Yu e outro, J Nanomater. 2016; 2016:doi: 10.1155 / 2016/1087250; e J. Wang e outro, Drug Delivery, 25: 1, 1319-1327, DOI: 10.1080 /
10717544.2018.1477857), tais como lipossomas, nanopartículas, nanomicelas e polímeros solúveis em água. Exemplos de tal maneira por meio do transportador de fármaco podem incluir mais especificamente uma maneira em que o fármaco terapêutico para ossificação ectópica ou tumor cerebral é encapsulada em um lipossoma e o lipossoma é conjugado com o anticorpo, e uma maneira na qual o fármaco terapêutico para ossificação ectópica ou tumor cerebral é quimicamente conjugado com um polímero solúvel em água (composto com um peso molecular da ordem de 1000 a 100.000), diretamente ou por meio de um espaçador, como um oligopeptídeo, e o polímero solúvel em água é conjugado com o anticorpo. A conjugação do anticorpo (ou fragmento) com o fármaco terapêutico para ossificação ectópica ou tumor cerebral ou o transportador de fármaco (por exemplo, um lipossoma ou um polímero solúvel em água)
pode ser realizada por um método bem conhecido por aqueles versado na técnica, tal como um método descrito em G.T. Hermanson "Bioconjugate Techniques" Academic Press, Califórnia (1996), e Putnam e J. Kopecek "Polymer Conjugates with Anticancer Activity" Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123. A encapsulação do fármaco terapêutico para ossificação ectópica ou tumor cerebral no lipossoma pode ser realizada por um método bem conhecido dos especialistas na técnica, tal como um método descrito em, por exemplo, D.D. Lasic "Liposomes: From Physics to Applications", Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam (1993). A conjugação do fármaco terapêutico para ossificação ectópica ou tumor cerebral com o polímero solúvel em água pode ser realizada por um método bem conhecido por aqueles versados na técnica, tal como um método descrito em D. Putnam e J Kopecek "Polymer Conjugates with Anticancer Activity "Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123. O conjugado do anticorpo (ou o fragmento) com a proteína como um fármaco terapêutico para ossificação ectópica ou tumor cerebral (por exemplo, um anticorpo ou um fragmento do mesmo) pode ser preparado por qualquer um dos métodos descritos acima ou um método de engenharia genética bem conhecido para os versados na técnica.
[00306] Para a administração do anticorpo anti-ALK2 tipo humano a um paciente, a dose do anticorpo anti-ALK2 usado na presente invenção é, por exemplo, aproximadamente 0,1 a 100 mg/kg de peso corporal, que pode ser administrado uma ou duas vezes ou mais por 1 a 180 dias. Entretanto, a dose e o número de doses devem geralmente ser determinados levando em consideração o sexo, peso corporal e idade de um paciente, sintomas, gravidade, reações adversas, etc. e, portanto, não são limitados à dose ou uso descrito acima.
[00307] Exemplos não limitantes de formulações compreendendo o anticorpo anti-ALK2 usado na presente invenção podem incluir injeções incluindo gotejamentos intravenosos, supositórios, formulações transnasais, formulações sublinguais e formulações de absorção transdérmica. A rotina de administração é uma rotina de administração oral ou uma rotina de administração parentérica. Exemplos não limitantes da rotina de administração parenteral incluem as rotinas intravenosas, intra-arteriais, intramusculares, intrarretais, transmucosas, intradérmicas, intraperitoneais e intraventriculares.
[00308] 7. Determinação da elegibilidade do paciente para tratamento e/ou prevenção
[00309] Na presente invenção, os seguintes métodos podem ser realizados a fim de tratar eficazmente e/ou prevenir um paciente tendo uma mutação na proteína ALK2 (por exemplo, uma mutação ativa em ALK2) pela administração do anticorpo anti-ALK2 ou do produto farmacêutico composição que compreende o anticorpo.
[00310] Um primeiro método é um método para prever um risco de desenvolver uma reação adversa atribuível à administração de um anticorpo anti-ALK2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo as etapas de:
[00311] (a) detectar a presença ou ausência de uma mutação ativa em ALK2 e uma mutação de um resíduo de aminoácido na posição 330 de ALK2 de um paciente; e
[00312] (b) determinar que quando o paciente tem a mutação ativa em ALK2 e não tem mutação de um resíduo de aminoácido na posição 330 de ALK2, o paciente tem um baixo risco de desenvolver uma reação adversa atribuível à administração de um anticorpo anti-ALK2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

Claims (34)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição farmacêutica para uso em um método para tratar e/ou prevenir um paciente com ossificação ectópica, caracterizada pelo fato de que: o paciente tem uma mutação ativa na proteína cinase 2 similar a Ativina (ALK2), que é responsável pela ossificação ectópica; um resíduo de aminoácido na posição 330 do ALK2 é prolina; e um ingrediente ativo da composição é um anticorpo anti- ALK2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo uma propriedade de ligação ao ALK2, uma propriedade de reticulação do ALK2 e uma propriedade de inibição da transdução de sinal de BMP.
2. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o ALK2 não tem mutação de G328V.
3. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o método compreende as etapas de: (a) detectar a presença ou ausência de uma mutação ativa em ALK2 em pacientes; (b) selecionar um paciente com a mutação ativa em ALK2; (c) confirmar que o paciente não tem mutação de um resíduo de aminoácido na posição 330 de ALK2; e (d) administrar o anticorpo anti-ALK2 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ao paciente selecionado.
4. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a etapa (c) ainda compreende a etapa de confirmação de que o ALK2 do paciente não tem mutação de G328V.
5. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a seleção do paciente ao qual o anticorpo anti-ALK2 ou o fragmento de ligação ao antígeno deve ser administrado compreende as etapas de: (a) detectar a presença ou ausência de uma mutação ativa em ALK2 em pacientes com ossificação ectópica; (b) selecionar um paciente com a mutação ativa em ALK2; e (c) excluir um paciente tendo uma mutação de um resíduo de aminoácido na posição 330 de ALK2.
6. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a etapa (c) ainda compreende a etapa de exclusão de um paciente com mutação de G328V em ALK2.
7. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-ALK2 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga especificamente a um polipeptídeo que consiste em resíduos de aminoácido da posição 21 a posição 123 na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1.
8. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-ALK2 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga a: (i) um epítopo compreendendo cada resíduo de ácido glutâmico na posição 38, glicina na posição 39, isoleucina na posição 59, asparagina na posição 60, ácido aspártico na posição 61, glicina na posição 62, fenilalanina na posição 63, histidina na posição 64, valina na posição 65, tirosina na posição 66, asparagina na posição 102, treonina na posição 104, glutamina na posição 106 e leucina na posição 107 na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1; ou
(ii) um epítopo compreendendo cada resíduo de ácido glutâmico na posição 38, glicina na posição 39, leucina na posição 40, isoleucina na posição 59, asparagina na posição 60, ácido aspártico na posição 61, glicina na posição 62, fenilalanina na posição 63, histidina na posição 64, valina na posição 65, tirosina na posição 66 e treonina na posição 104 na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1.
9. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-ALK2 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compete, para a ligação a ALK2, com o anticorpo anti-ALK2 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 8.
10. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-ALK2 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano, um diacorpo, um anticorpo multiespecífico ou F(ab’)2.
11. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que uma sequência de cadeia pesada do anticorpo anti-ALK2 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável com CDRH1, CDRH2 e CDRH3, em que CDRH1, CDRH2 e CDRH3 consistem nas sequências de aminoácido de: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7, respectivamente; SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13, respectivamente; SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 20, respectivamente; ou SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26,
respectivamente, e uma sequência de cadeia leve do mesmo compreende uma região variável tendo CDRL1, CDRL2 e CDRL3, em que CDRL1, CDRL2 e CDRL3 consistem nas sequências de aminoácido de: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10, respectivamente; SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 10, respectivamente; SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 23, respectivamente; ou SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO: 29, respectivamente.
12. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que a sequência da região variável da cadeia pesada do anticorpo anti-ALK2 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é: a1) uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 a posição 142 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 31; a2) uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 a posição 142 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 33; a3) uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 a posição 140 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 34; a4) uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 a posição 140 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 36;
a5) uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 a posição 140 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 38; a6) uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 a posição 140 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 39; a7) uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 95% de identidade com qualquer sequência de aminoácido selecionada a partir das sequências de aminoácido a1) a a6); a8) uma sequência de aminoácido com pelo menos 99% de identidade com qualquer sequência de aminoácido selecionada a partir das sequências de aminoácido a1) a a6); ou a9) uma sequência de aminoácido compreendendo uma (s) substituição (ões), uma deleção (ões) ou uma adição (ões) de um ou vários resíduos de aminoácido em qualquer sequência de aminoácido selecionada a partir das sequências de aminoácido a1) a a6), e a sequência da região variável da cadeia leve é b1) uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido da posição 21 a posição 133 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 32; b2) uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido da posição 21 a posição 129 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 35; b3) uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido da posição 21 a posição 129 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 37; b4) uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 95% de identidade com qualquer sequência de aminoácido selecionada a partir das sequências de aminoácido b1) a b3); b5) uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 99%
de identidade com qualquer sequência de aminoácido selecionada das sequências de aminoácido b1) a b3); ou b6) uma sequência de aminoácido compreendendo uma substituição (ões), uma deleção (ões) ou uma adição (ões) de um ou vários resíduos de aminoácido em qualquer sequência de aminoácido selecionada a partir das sequências de aminoácido b1) a b3).
13. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-ALK2 é: um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma região variável da cadeia pesada consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 a posição 142 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável da cadeia leve consistindo em resíduos de aminoácido da posição 21 para a posição 133 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 32; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma região variável da cadeia pesada consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 a posição 142 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 33 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável da cadeia leve consistindo em resíduos de aminoácido da posição 21 para a posição 133 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 32; um anticorpo que consiste em uma cadeia pesada compreendendo uma região variável da cadeia pesada consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 a posição 140 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 34 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável da cadeia leve consistindo em resíduos de aminoácido da posição 21 a posição 129 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 35;
um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma região variável da cadeia pesada consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 a posição 140 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 36 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável da cadeia leve consistindo em resíduos de aminoácido da posição 21 para a posição 129 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 37; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma região variável da cadeia pesada consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 a posição 140 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 38 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável da cadeia leve consistindo em resíduos de aminoácido da posição 21 a posição 129 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 35; ou um anticorpo que consiste em uma cadeia pesada compreendendo uma região variável da cadeia pesada consistindo em resíduos de aminoácido da posição 20 a posição 140 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 39 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável da cadeia leve consistindo em resíduos de aminoácido da posição 21 para a posição 129 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 37.
14. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que a mutação ativa em ALK2 é pelo menos uma selecionada de L196P, delP197_F198insL, R202I, R206H, Q207E, R258S, R258G, G325A, G328E, G328R, G328W, G356D e R375P.
15. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que a mutação ativa em ALK2 é a mutação de R206H.
16. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que a ossificação ectópica é a fibrodisplasia ossificante progressiva (FOP).
17. Composição farmacêutica para uso em um método para tratar e/ou prevenir um paciente com tumor cerebral, caracterizada pelo fato de que o paciente tem uma mutação ativa na proteína cinase 2 similar a Activina (ALK2) que é responsável pelo tumor cerebral; e um ingrediente ativo da composição é um anticorpo anti-ALK2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo uma propriedade de ligação ao ALK2, uma propriedade de reticulação do ALK2 e uma propriedade de inibição da transdução de sinal de BMP.
18. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que um resíduo de aminoácido na posição 330 de ALK2 no paciente é prolina.
19. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizada pelo fato de que a mutação ativa em ALK2 é pelo menos uma selecionada de R206H, R258G, G328E, G328W e G356D.
20. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-ALK2 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo anti-ALK2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 13.
21. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20, caracterizada pelo fato de que o tumor cerebral é glioma pontino intrínseco difuso (DIPG).
22. Método para prever um risco de desenvolver uma reação adversa atribuível à administração de um anticorpo anti-ALK2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: (a) detectar a presença ou ausência de uma mutação ativa em ALK2 e uma mutação de um resíduo de aminoácido na posição 330 de ALK2 de um paciente; e (b) determinar que quando o paciente tem a mutação ativa em ALK2 e não tem mutação de um resíduo de aminoácido na posição 330 de ALK2, o paciente tem um baixo risco de desenvolver uma reação adversa atribuível à administração de um anticorpo anti-ALK2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
23. Método para prever a responsividade ao tratamento e/ou prevenção por administração de um anticorpo anti-ALK2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas de: (a) detectar a presença ou ausência de uma mutação ativa em ALK2 e uma mutação de um resíduo de aminoácido na posição 330 de ALK2 de um paciente; e (b) determinar que quando o paciente tem a mutação ativa em ALK2 e não tem mutação de um resíduo de aminoácido na posição 330 de ALK2, o paciente tem capacidade de resposta ao tratamento e/ou prevenção pela administração de um anticorpo anti-ALK2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
24. Método para selecionar um paciente a ser tratado e/ou prevenido pela administração de um anticorpo anti-ALK2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: (a) detectar a presença ou ausência de uma mutação ativa em ALK2 e uma mutação de um resíduo de aminoácido na posição 330 de ALK2 de um paciente; e (b) selecionar o paciente como o paciente a ser tratado e/ou prevenido pela administração de um anticorpo anti-ALK2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo quando o paciente tem a mutação ativa em ALK2 e não tem mutação de um resíduo de aminoácido na posição 330 de ALK2.
25. Método para tratar e/ou prevenir uma doença por administração de um anticorpo anti-ALK2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas de: (a) detectar a presença ou ausência de uma mutação ativa em ALK2 e uma mutação de um resíduo de aminoácido na posição 330 de ALK2 de um paciente; e (b) administrar ao paciente o anticorpo anti-ALK2 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo quando o paciente tem a mutação ativa em ALK2 e não tem mutação de um resíduo de aminoácido na posição 330 de ALK2.
26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a realização da etapa (b) do método de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24.
27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 26, caracterizado pelo fato de que a administração do anticorpo anti-ALK2 ou do fragmento de ligação ao antígeno é a administração de uma composição farmacêutica, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 21.
28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 27, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) ainda compreende a confirmação de que a mutação ativa em ALK2 não é a mutação de G328V.
29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 28, caracterizado pelo fato de que a mutação ativa em ALK2 é pelo menos uma selecionada de L196P, delP197_F198insL, R202I, R206H, Q207E, R258S, R258G, G325A, G328E, G328R, G328W, G356D e R375P.
30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 28, caracterizado pelo fato de que a mutação ativa em ALK2 é pelo menos uma selecionada de R206H, R258G, G328E, G328W e G356D.
31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 30, caracterizado pelo fato de que a doença que afeta o paciente é ossificação ectópica ou tumor cerebral.
32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a doença que afeta o paciente é ossificação ectópica.
33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 31, caracterizado pelo fato de que a doença que afeta o paciente é fibrodisplasia ossificante progressiva (FOP) ou glioma pontino intrínseco difuso (DIPG).
34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a doença que afeta o paciente é fibrodisplasia ossificante progressiva (FOP).
Petição 870200107647, de 26/08/2020, pág. 179/243 Atividade de Luciferase Relativa Atividade de Luciferase Relativa Camundongo WT
Camundongo R206H
Atividade de Luciferase Relativa Atividade de Luciferase Relativa Camundongo WT
Camundongo R206H 1/8
Petição 870200107647, de 26/08/2020, pág. 180/243 Atividade de Luciferase Relativa Camundongo R206H
Atividade de Luciferase Relativa Camundongo R206H 2/8
Atividade de Luciferase 3/8
Peptídeo de sinal Humano Macaco Cachorro Rato Camundongo Transmembrana Humano Macaco Cachorro Rato Camundongo Domínio GS Humano Macaco Cachorro Rato Camundongo Domínio quinase Humano Macaco Cachorro Rato Camundongo
Humano Macaco Cachorro Rato Camundongo
Humano Macaco Cachorro Rato Camundongo
Humano Macaco Cachorro Rato Camundongo
Humano Macaco Cachorro Rato Camundongo
(vaga-lume/Renila) Atividade de luciferase relativa
Controle Atividade de luciferase (vaga-lume/Renila)
Simulado
Camundongo ALK2 Humano ALK2
Petição 870200107647, de 26/08/2020, pág. 185/243 Atividade de luciferase relativa Camundongo R206H
Atividade de luciferase relativa Humano R206H 7/8
Atividade de Luciferase (% de controle) 8/8
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170105558A (ko) 2015-01-30 2017-09-19 각코우호우징 사이타마이카다이가쿠 항 alk2 항체
US11945872B2 (en) 2020-02-11 2024-04-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-ACVR1 antibodies and uses thereof
WO2023212560A1 (en) * 2022-04-26 2023-11-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. A rodent model of fibrodysplasia ossificans progressiva

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
CA2109602C (en) 1990-07-10 2002-10-01 Gregory P. Winter Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
WO1993006213A1 (en) 1991-09-23 1993-04-01 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
ATE275198T1 (de) 1991-12-02 2004-09-15 Medical Res Council Herstellung von antikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken.
JP3507073B2 (ja) 1992-03-24 2004-03-15 ケンブリッジ アンティボディー テクノロジー リミティド 特異的結合対の成員の製造方法
US5885573A (en) 1993-06-01 1999-03-23 Arch Development Corporation Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
GB9313509D0 (en) 1993-06-30 1993-08-11 Medical Res Council Chemisynthetic libraries
AU690171B2 (en) 1993-12-03 1998-04-23 Medical Research Council Recombinant binding proteins and peptides
DK1071700T3 (da) 1998-04-20 2010-06-07 Glycart Biotechnology Ag Glykosylerings-modifikation af antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellulær cytotoksicitet
ES2420835T3 (es) 1999-04-09 2013-08-27 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Procedimiento para controlar la actividad de las moléculas inmunofuncionales
BR0114475A (pt) 2000-10-06 2003-12-23 Kyowa Hakko Kogyo Kk Célula para a produção de composição de anticorpo
DE602004002275T2 (de) 2003-01-07 2007-09-06 Symphogen A/S Verfahren zur herstellung rekombinanterpolyklonaler proteine
JP6280031B2 (ja) 2012-03-29 2018-02-14 中外製薬株式会社 抗ｌａｍｐ５抗体およびその利用
KR102334260B1 (ko) 2013-03-14 2021-12-02 스미토모 다이니폰 파마 온콜로지, 인크. Ｊａｋ2 및 ａｌｋ2 억제제 및 이들의 사용 방법
US20160075772A1 (en) * 2014-09-12 2016-03-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treatment of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva
KR20170105558A (ko) 2015-01-30 2017-09-19 각코우호우징 사이타마이카다이가쿠 항 alk2 항체
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