BR112020011037A2

BR112020011037A2 - processo de fluxo pistonado vertical para bioconversão de biomassa envolvendo enzimas

Info

Publication number: BR112020011037A2
Application number: BR112020011037-0A
Authority: BR
Inventors: Jonatan Ahrens DICKOW; Laila Thirup; Katrine Hvid Ellegård; Stig Victor PETERSEN; Svend Andreas Geleff
Original assignee: Hamlet Protein A/S
Priority date: 2017-12-22
Filing date: 2018-12-20
Publication date: 2020-11-17
Also published as: CA3083424A1; KR20200101382A; US20230145337A1; AR113383A1; WO2019122192A1; RU2020123072A; EP3727030A1; CN111479472A

Abstract

A presente invenção refere-se a um método para produzir um produto sólido de transformação de um substrato compreendendo as seguintes etapas: ? preparar um substrato de biomassa compreendendo carboidratos e matéria proteinácea originários de grão de soja, semente de colza ou suas misturas, opcionalmente em mistura adicional com carboidratos e matéria proteinácea originários de feijões-fava, ervilhas, sementes de girassol, tremoço, cereais e/ou gramíneas, ? misturar o dito substrato com uma preparação enzimática ou uma combinação de preparações enzimáticas e adicionar água em uma quantidade que forneça uma mistura de incubação inicial com um teor de água de 30 a 70% em peso e uma razão de densidade aparente úmida a densidade aparente seca de 0,60 a 1,45 na mistura resultante; ? incubar a dita mistura de incubação inicial por 0,15-72 horas a uma temperatura de 20-70°C; e, em seguida, recuperar o produto sólido de transformação úmido da mistura incubada; compreendendo adicionalmente que a etapa de incubação seja realizada como um processo de fluxo pistonado contínuo em um tanque de incubação vertical não agitado com meios de entrada para a dita mistura e aditivos e meios de saída para o dito produto sólido de transformação.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO DE FLUXO PISTONADO VERTICAL PARA BIOCONVERSÃO DE BIOMASSA ENVOLVENDO ENZIMAS". Campo da invenção

[0001] A presente invenção refere-se a um substrato sólido, método de bioconversão para a produção de um valioso produto sólido de transformação do substrato, em que a bioconversão é realizada pelo uso de uma ou mais preparações enzimáticas adequadas por um processo contínuo de fluxo pistonado em um tanque vertical não agitado, em que o transporte é mediado pela força gravitacional. Fundamentos da invenção

[0002] Há uma necessidade de produtos biológicos que possam ser usados principalmente como alimento ou ração ou como ingredientes em alimentos ou rações. Os constituintes básicos desses produtos são proteínas, gorduras e carboidratos. As biomassas adequadas para esses produtos são culturas contendo óleo, como sementes oleaginosas, cereais e leguminosas. Os cereais têm um teor de proteínas de até 15%, por exemplo, no trigo, e as leguminosas têm um teor de proteínas de até 40%, por exemplo em grãos de soja, com base na matéria seca. Os grãos de soja são principalmente uma cultura industrial, cultivada para óleo e proteína. Tem um teor de óleo relativamente baixo da semente, mas os grãos de soja ainda são uma grande fonte única de óleo comestível.

[0003] A qualidade nutricional da proteína, medida por seu escore químico como composição essencial de aminoácidos, e a palatabilidade dos produtos proteicos são parâmetros importantes e essenciais para fins nutricionais em produtos alimentícios e de ração e suplementos nutricionais. As aplicações dos produtos proteicos em produtos farmacêuticos e cosméticos, às vezes, também podem exigir alta palatabilidade e/ou propriedades funcionais específicas.

[0004] Um problema geral especialmente relacionado a leguminosas secas e frutas e sementes de leguminosas que compreendem carboidratos e matéria proteinácea como fontes de produtos biológicos (em particular, produtos proteicos) é o teor de oligossacarídeos indigestíveis, como estaquiose e rafinose, causando flatulência e diarreia quando fermentados no cólon.

[0005] A composição química média aproximada do grão de soja, tomada como exemplo, medida sem umidade, é de 40% de proteína; 20% de gordura, principalmente triglicerídeos e alguns fosfolipídios; 35% de carboidratos na forma de oligossacarídeos solúveis (sacarose, rafinose, estaquiose, verbascose) e fibras insolúveis; e 5% de cinzas compreendendo os minerais, em particular potássio, cálcio e magnésio.

[0006] Proteínas de leguminosas secas, sementes, cereais e gramíneas, incluindo proteínas de soja, como inibidores de tripsina, alérgenos e lectinas, são conhecidas como fatores antinutricionais. Elas exercem efeitos fisiológicos específicos. Os inibidores de tripsina prejudicam a digestão de proteínas ao inativar a tripsina e são considerados prejudiciais para o valor nutricional da soja e sugere-se que sejam responsáveis pelo comprometimento do crescimento em galinhas. A β-conglicinina é um alérgeno à soja que induz inflamação e disfunção intestinal.

[0007] O objetivo da presente invenção é fornecer um método para a produção de um produto de transformação de um substrato de biomassa em um processo de bioconversão de fluxo pistonado vertical realizado na presença de uma ou mais enzimas adequadas.

[0008] Outro objetivo é fornecer um método, que possa ser realizado em um projeto de reator grande e simples e, portanto, de baixo custo.

[0009] Ainda assim, um objetivo é fornecer um método eficiente para a bioconversão de biomassas, em particular grãos de soja ou semente de colza ou suas misturas, de modo a produzir produtos biológicos com propriedades desejáveis, como alto teor de proteínas e/ou um perfil de açúcar modificado e/ou valor nutricional aprimorado e/ou fatores antinutricionais reduzidos e/ou palatabilidade aprimorada e/ou propriedades organolépticas aprimoradas e/ou propriedades funcionais aprimoradas.

[00010] Um objetivo final da invenção é fornecer um método aprimorado para a produção de produtos biológicos compreendendo uma quantidade reduzida considerável de carboidratos indigestíveis e/ou fatores antinutricionais.

[00011] Estes objetos são cumpridos com o método da presente invenção. Sumário da invenção

[00012] Por conseguinte, em um aspecto da presente invenção, refere-se a um método para produzir um produto sólido de transformação de um substrato compreendendo as seguintes etapas:  preparar um substrato de biomassa compreendendo carboidratos e matéria proteinácea originários de grão de soja, semente de colza ou suas misturas, opcionalmente em mistura adicional com carboidratos e matéria proteinácea originários de feijões-fava, ervilhas, sementes de girassol, tremoço, cereais e/ou gramíneas,  misturar o dito substrato com uma preparação enzimática ou uma combinação de preparações enzimáticas e adicionar água em uma quantidade que forneça uma mistura de incubação inicial com um teor de água de 30% a 70% em peso e uma razão de densidade aparente úmida para densidade aparente seca de 0,60 a 1,45 na mistura resultante;  incubar a dita mistura de incubação inicial por 0,15-240 horas a uma temperatura de 20-70°C e recuperar o produto sólido de transformação úmido da mistura incubada;

compreendendo adicionalmente que a etapa de incubação seja realizada como um processo de fluxo pistonado contínuo em um tanque de incubação vertical não agitado com meios de entrada para a dita mistura e aditivos e meios de saída para o dito produto sólido de transformação.

[00013] O presente método para tratamento de biomassa utiliza força gravitacional para transportar/mover a biomassa durante a bioconversão. Embora o uso da gravidade para o transporte em geral seja direto, ele requer seleção cuidadosa das condições de reação para a finalidade específica, como no caso do presente processo de fluxo pistonado.

[00014] Normalmente, quando o teor de água é aumentado, uma mistura de incubação tende a se compactar, pela redução do volume vazio, de modo que o comportamento do transporte é afetado negativamente. Quando um certo teor de água é alcançado, a mistura é compactada até um certo ponto para que o transporte por força gravitacional seja interrompido. O material grudará nas paredes do reator e o fluxo pistonado uniforme é interrompido, resultando em um tempo de retenção desigual da biomassa.

[00015] A solução, de acordo com a presente invenção, para o problema conectado ao transporte por força gravitacional da mistura de incubação é fazer uso de um tanque, conforme definido nas reivindicações de incubação, em que o fluxo de material pode ser mantido tão alto e uniforme que as condições de fluxo pistonado são alcançadas e mantidas. A vazão é regulada pelos meios de entrada e saída e pelas dimensões (razão largura/altura) do tanque.

[00016] Além disso, a solução de acordo com a invenção deve garantir o equilíbrio do teor de água na mistura de incubação, de modo que a atividade da água na superfície da partícula seja suficiente para o processo de reação. Isso é alcançado mantendo a razão de densidade aparente úmida para densidade aparente seca do substrato baixa e dentro de certos limites, conforme definido na reivindicação 1.

[00017] Mais especificamente, os presentes inventores descobriram que o processo uniforme necessário pode ser alcançado usando uma mistura de incubação inicial com um teor de água de 30% a 70% em peso, e uma razão de densidade aparente úmida para densidade aparente seca de 0,60 a 1,45. Em combinação com o presente projeto vertical para o processo de fluxo pistonado, é possível garantir um fluxo pistonado uniforme e garantir o mesmo tempo de processamento para a mistura de incubação. Além disso, o método da presente invenção é realizado sem agitação. Se o teor de água exceder aproximadamente 70% em peso, a biomassa não poderá reter a água e a mistura de incubação se tornará uma pasta com uma fase aquosa e uma fase sólida. Essas duas fases não fluirão com as mesmas vazões, o fluxo pistonado uniforme não será obtido e a mistura de incubação poderá grudar nas paredes da incubadora. Um teor de água de mais de aproximadamente 70% resultará em uma razão de densidade aparente úmida para densidade aparente seca, superior a 1,45, que é o limite superior de acordo com a invenção.

[00018] O projeto vertical é mais barato de se investir do que o projeto horizontal devido à sua maior capacidade em uma única linha de produção. Também é mais barato manter devido a movimentos menos mecânicos. O uso de um tanque não agitado contribui ainda mais para reduzir os custos operacionais.

[00019] O presente método é, em particular, eficiente se o substrato da biomassa tiver sido pré-tratado antes de ser misturado com a preparação enzimática ou com uma combinação de preparações enzimáticas, porque o pré-tratamento melhora o acesso das enzimas aos componentes na biomassa que precisam ser transformadas. O pré- tratamento é tipicamente realizado por pré-tratamento químico ou físico,

por exemplo, por meio de desintegração, moagem, descamaçãotratamento térmico, tratamento sob pressão, tratamento ultrassônico, tratamento hidrotérmico ou tratamento ácido ou alcalino.

[00020] O método da invenção fornece um produto sólido de transformação do substrato que é um produto da transformação de matéria proteinácea e/ou carboidratos originários da dita biomassa.

[00021] Tais produtos sólidos de transformação podem ser utilizados, por exemplo, em um produto alimentício processado ou como um ingrediente em um produto alimentícios ou de ração ou como um ingrediente de um produto cosmético ou farmacêutico ou de um suplemento nutricional. A transformação sólida do substrato pode, por exemplo, ser incluída em um alimento, ração, produto cosmético ou farmacêutico ou em um suplemento nutricional contendo de 1% a 99% em peso de um produto sólido de transformação. Definições

[00022] No contexto da presente invenção, os termos a seguir compreendem o seguinte, a menos que definido em outra parte da descrição.

[00023] Os termos "cerca de", "ao redor", "aproximadamente" ou "~" devem indicar, por exemplo, a incerteza de medição comumente experimentada na técnica, que pode estar na ordem de grandeza de, por exemplo, +/- 1, 2, 5, 10, 20 ou até 50%.

[00024] O termo "compreendendo" deve ser interpretado como especificando a presença da(s) parte(s) declarada(s), etapa(s), característica(s), composição(ões), produto(s) químico(s) ou componente(s), mas não indica excluir a presença de uma ou mais partes, etapas, recursos, composições, produtos químicos ou componentes. Por exemplo, uma composição compreendendo um composto químico pode assim compreender compostos químicos adicionais, etc.

Processo de fluxo pistonado:

[00025] Neste tipo de processo contínuo, a mistura de reação flui através de, por exemplo, um reator tubular ou poliédrico com mistura por refluxo limitada. O fluxo é um fluxo laminar em que a composição da mistura de reação muda ao longo da direção axial do reator, ou um fluxo de massa uniforme. Biomassa:

[00026] Compreende material biológico, produzido pela fotossíntese e que pode ser usado como matéria-prima na produção industrial. Neste contexto, biomassa refere-se à matéria vegetal na forma de sementes, cereais, leguminosas, gramíneas, por exemplo, feijões e ervilhas etc., e suas misturas, em especial frutos e sementes de leguminosas. Além disso, uma biomassa compreendendo leguminosas secas é especificamente aplicável devido ao teor e composição de proteínas.

[00027] O substrato da biomassa pode ser desintegrado por pré- tratamento, como pré-tratamento químico ou físico, por exemplo, por meio de desintegração, moagem, laminação, tratamento térmico, tratamento sob pressão, tratamento ultrassônico, tratamento hidrotérmico ou tratamento ácido ou alcalino. Bioconversão

[00028] É o processo para incubar enzimas em um substrato para uma finalidade específica, por exemplo, incubar uma protease em uma proteína para produzir peptídeos ou aminoácidos únicos. Produto sólido de transformação do substrato:

[00029] No presente contexto, o produto sólido de transformação do substrato refere-se a um produto resultante da incubação da biomassa selecionada com uma preparação enzimática ou combinação de preparações enzimáticas, que podem converter a matéria do substrato em um produto desejável e, opcionalmente, auxiliares de processamento.

Densidade aparente:

[00030] A densidade aparente é um parâmetro importante para o comportamento físico de uma biomassa que tem a forma de pó, grânulos e similares. O parâmetro é definido como peso por volume e pode ser medido em, por exemplo, g/ml. Não é uma propriedade intrínseca, mas pode mudar dependendo do manuseio e pode ser usado como um índice de alterações estruturais. A densidade de um material é determinada colocando um volume fixo do material em um copo de medição e determinando o peso ou determinando o peso de um volume medido de um material. Por esse teste, os seguintes recursos podem ser determinados: Densidade aparente (também conhecida como densidade volumétrica) = massa/volume seco não compactado em g/mL ou kg/m3; Densidade aparente úmida (também conhecida como densidade total) = a razão da massa total (Ms + Ml) para seu volume total; Ms = massa de sólidos e Ml = massa de líquidos.

[00031] Assim, no contexto da presente invenção, "densidade aparente seca" é a densidade aparente medida da biomassa sem adição de água, ou seja, a densidade aparente/densidade volumétrica. "Densidade aparente úmida" é a densidade aparente medida após a adição de uma certa quantidade de água.

[00032] Normalmente, a densidade aparente é determinada de acordo com as normas internacionais ISO 697 e ISO 60, mas devido à natureza das substâncias, isso não era aplicável no presente contexto. O método individual usado é descrito nos exemplos. Oligossacarídeos e polissacarídeos:

[00033] Um oligossacarídeo é um polímero de sacarídeo contendo pelo menos dois açúcares de monômero de componentes. Polissacarídeos são polímeros de sacarídeos que contêm muitos açúcares de monômeros de componentes, também conhecidos como carboidratos complexos. Exemplos incluem polissacarídeos de armazenamento, como amido e polissacarídeos estruturais, como celulose. Carboidratos:

[00034] Compreendem mono-, di-, oligo- e polissacarídeos. Materiais proteináceos:

[00035] Compreendem compostos orgânicos com um teor substancial de proteínas feitas de aminoácidos dispostos em uma ou mais cadeias. Com um comprimento de cadeia de até aproximadamente 50 aminoácidos, o composto é chamado de peptídeo; com peso molecular mais alto, o composto orgânico é chamado de polipeptídeo ou proteína. Gorduras:

[00036] Compreendem ésteres entre ácidos graxos e glicerol. Uma molécula de glicerol pode ser esterificada a uma, duas e três moléculas de ácidos graxos, resultando em um monoglicerídeo, um diglicerídeo ou um triglicerídeo, respectivamente. Normalmente, as gorduras consistem principalmente em triglicerídeos e pequenas quantidades de lecitinas, esteróis etc. Se a gordura for líquida à temperatura ambiente, normalmente ela é chamada de óleo. No que diz respeito a óleos, gorduras e produtos relacionados, neste contexto, é feita referência a "Physical and Chemical Characteristics of Oils, Fats and Waxes", AOCS, 1996, bem como "Lipid Glossary 2", F.D. Gunstone, The Oily Press, 2004. Glicerídeos:

[00037] Compreendem mono-, di- e triglicerídeos. Enzimas:

[00038] A enzima é uma classe muito grande de substâncias proteicas com capacidade de atuar como catalisadores. Geralmente, e de acordo com as recomendações do Comitê de Nomenclatura de

Enzimas, elas são divididas em seis classes.

[00039] Exemplos típicos no contexto da invenção podem compreender, mas não estão limitados a, protease(s), peptidase(s), fitase(s), carboidrase(s), lipase(s), amilase(s), glucosidase(s), amiloglucosidase(s), galactosidase(s), descarboxidase(s), glucanase(s), pectinase(s), celulase(s), hemicelulase(s), fosfolipase(s), transferase(s) e oxidoredutase(s). Auxiliares de processamento:

1. Componentes de plantas e agentes de processamento orgânico

[00040] Algumas das propriedades funcionais importantes neste contexto são: Ação antioxidante, antibacteriana, propriedades de umedecimento e estimulação da atividade enzimática.

[00041] A lista de componentes à base de plantas é enorme, mas os mais importantes são os seguintes: Alecrim, tomilho, orégano, flavonoides, ácidos fenólicos, saponinas e ácidos α - e β - do lúpulo, por exemplo, ácido α-lupúlico para a modulação de carboidratos solúveis.

[00042] Além disso, ácidos orgânicos, por exemplo, o ácido sórbico, propiônico, láctico, cítrico e ascórbico e seus sais para o ajuste do valor do pH, das propriedades quelantes e de conservação fazem parte desse grupo de auxiliares de processamento.

2. Agentes de processamento inorgânico

[00043] Compreendem composições inorgânicas que podem preservar contra-ataque bacteriano durante o processamento, por exemplo bissulfito de sódio, etc.; agentes antiaglomerantes e agentes de melhora de fluxo no produto final, por exemplo, silicato de alumínio e potássio, etc.

[00044] Compreendem ácidos inorgânicos, por exemplo, ácido clorídrico ou ácido sulfúrico. Produtos alimentícios processados:

[00045] Compreendem produtos lácteos, carnes processadas,

doces, sobremesas, sobremesas de sorvetes, conservas, refeições liofilizadas, molhos, sopas, alimentos congelados, pão, bolos, etc. Produtos de ração processados:

[00046] Compreendem rações prontas para o uso para animais, como leitões, bezerros, aves, animais peludos, ovelhas, gatos, cães, peixes e crustáceos, etc. Produtos farmacêuticos:

[00047] Compreendem produtos, tipicamente na forma de um comprimido ou na forma granulada, contendo um ou mais ingredientes biologicamente ativos destinados a curar e/ou aliviar os sintomas de uma doença ou condição. Além disso, os produtos farmacêuticos compreendem excipientes e/ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. Os produtos biológicos sólidos aqui descritos são muito bem adequados para uso como ingrediente farmaceuticamente aceitável em um comprimido ou granulado. Produtos cosméticos:

[00048] Compreendem produtos destinados à higiene pessoal bem como à melhora da aparência, como condicionadores e preparações para o banho. Breve descrição dos desenhos

[00049] A Figura 1 mostra: na faixa 1: Marcador; Faixa 2: Amostra tratada com protease do exemplo 2; Faixa 3: Amostra de referência para os exemplos 2 e 3; Faixa 4: Amostra tratada com protease do exemplo

3.

[00050] A Figura 2 mostra a composição de açúcares e oligossacarídeos solúveis. Faixa 1: Amostra tratada com carboidrase; Faixa 2: Referência (farelo de grãos de soja).

[00051] A Figura 3 mostra a cromatografia em camada fina mostrando açúcares e oligossacarídeos solúveis. Faixa 1: produto tratado com carboidrase; Faixa 2: referência.

Descrição detalhada da invenção

[00052] Em uma primeira modalidade do método da invenção, pelo menos 20% em peso da biomassa, como pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80 %, ou pelo menos 90% em peso, compreendem matéria proteinácea originária da soja opcionalmente desengordurada. A soja também pode estar descascada.

[00053] Em uma segunda modalidade do método da invenção, pelo menos 20% em peso da biomassa, como pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80 %, ou pelo menos 90% em peso, compreendem matéria proteinácea originária das sementes de colza opcionalmente desengorduradas.

[00054] Em uma terceira modalidade do método da invenção, a biomassa compreende matéria proteinácea originária de flocos de soja desengordurados em uma quantidade de 5% a 95% em peso em mistura com matéria proteinácea originária de semente de colza opcionalmente desengordurada em uma quantidade de 95% a 5% em peso opcionalmente em mistura adicional com matéria proteinácea originária de feijões-fava, ervilhas, sementes de girassol e/ou cereais em quantidades para formar uma quantidade total de matéria proteinácea de 100% em peso.

[00055] Em qualquer uma das modalidades da invenção, a biomassa compreendendo matéria proteinácea pode compreender adicionalmente oligossacarídeos e/ou polissacarídeos e/ou compreende adicionalmente óleos e gorduras, por exemplo a partir de sementes de plantas contendo óleo.

[00056] Em qualquer uma das modalidades da invenção, o produto sólido de transformação do substrato pode ser um produto da transformação de matéria proteinácea e/ou carboidratos originários da dita biomassa, como um produto de transformação de leguminosas secas, como soja, ervilha, tremoço, girassol e/ou cereais, como trigo ou milho, ou de sementes de plantas contendo óleo, por exemplo, semente de colza.

[00057] Em qualquer uma das modalidades da invenção, o substrato, ou o substrato após a mistura com uma preparação enzimática ou uma combinação de preparações enzimáticas e água, pode não compreender qualquer fermento biológico vivo e/ou pode não compreender qualquer levedura viva selecionada entre cepas de Saccharomyces cerevisiae, incluindo leveduras de cerveja usadas e leveduras de destilaria usadas e fermento biológico e leveduras usadas da produção de vinho, ou não incluem leveduras vivas; e/ou em particular, pode não compreender fermento biológico quando a enzima é α-galactosidase.

[00058] Em qualquer uma das modalidades da invenção, o produto sólido de transformação do substrato pode ser um produto da transformação de matéria proteinácea e/ou carboidratos originários da dita biomassa.

[00059] Em qualquer uma das modalidades da invenção, a preparação enzimática ou mistura de preparações enzimáticas compreende uma ou mais enzimas selecionadas dentre proteases, peptidases, fitases, carboidrases, como α-galactosidase, amilase, amiloglucosidase, celulase, pectinase e hemicelulases, por exemplo xilanase, mananase ou glucanase; e lipase e oxidorredutase.

[00060] Em qualquer uma das modalidades da invenção, a razão de matéria seca do dito substrato de biomassa para a dita preparação enzimática, ou a dita combinação de preparações enzimáticas, pode ser de 2:1 a 100.000.000:1, como 1.000:1, 10.000:1, 50.000:1, 100.000:1.

500.000:1, 1.000.000:1, 5.000.000:1, 10.000.000:1, 50.000.000:1, ou

100.000.000:1. A pessoa habilitada apreciará que a razão pode ser selecionada dependendo de parâmetros, tais como condições do processo, a atividade da enzima e o produto desejado, e a pessoa habilitada poderá otimizar a razão de acordo com esses parâmetros.

[00061] Em qualquer uma das modalidades da invenção, a água pode ser adicionada ao substrato em uma quantidade para fornecer uma razão de densidade aparente úmida para densidade aparente seca de cerca de 0,60 a 1,45 no substrato, tal como de cerca de 0,65 a cerca de 1,40, por exemplo, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,95, 1,00, 1,10, 1,15, 1,20, 1,25, 1,30 ou 1,35.

[00062] Em qualquer uma das modalidades da invenção, pelo menos 40% em peso da biomassa, como pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% em peso, podem compreender matéria proteinácea originária de sementes de colza opcionalmente desengorduradas, enquanto água pode ser adicionada ao substrato em uma quantidade para fornecer uma razão de densidade aparente úmida para densidade aparente seca de cerca de 0,65 a cerca de 1,10, como 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,95, 1,00 ou 1,05.

[00063] Em qualquer uma das modalidades da invenção, um ou mais auxiliares de processamento selecionados a partir de enzimas, componentes de plantas e agentes de processamento orgânicos e inorgânicos podem ser adicionados ao substrato antes ou durante a incubação.

[00064] Em qualquer uma das modalidades da invenção, uma preparação de α-galactosidase pode ser adicionada ao substrato de biomassa e/ou à mistura de incubação inicial em uma quantidade de 0,05 a 50 unidades de α-galactosidase por g. de matéria seca do substrato da biomassa, como 0,5 a 25 unidades de α-galactosidase por g. de matéria seca do substrato da biomassa, por exemplo, de 1 a 10, de 2 a 8, de 3 a 6 ou de 4 a 5 unidades de α-galactosidase por g. de matéria seca do substrato da biomassa.

[00065] Em qualquer uma das modalidades da invenção, o grau de enchimento do dito tanque de incubação pode ser mantido constante. Isso resultará em um fluxo uniforme.

[00066] Em qualquer uma das modalidades da invenção, a incubação pode ser realizada sob condições anaeróbicas.

[00067] Em qualquer uma das modalidades da invenção, o teor de água na mistura de incubação pode ser de 35% a 70% em peso, como 40%, 45%, 50%, 55%, 60% ou 65% em peso. Assim, o teor de água na mistura inicial não excede 70% em peso e pode variar de, por exemplo, de 40% a 65%, de 45% a 60%, de 48% a 52% ou 50% a 55%, como 49, 50, 51, 52, 53 ou 54%.

[00068] Em qualquer uma das modalidades da invenção, a mistura pode ser incubada por 1-240 horas a 20-70oC. A pessoa habilitada saberá como otimizar o tempo de reação e a temperatura da reação, tendo em vista as outras condições da reação, como a seleção da(s) enzima(s). Assim, a temperatura pode variar como por exemplo 20- 65oC, 25-60oC, 30-55oC, 35-50oC, ou 40-45oC; e o tempo de reação pode ser selecionado como, por exemplo, 1 a 180 horas, como 2 a 150 horas, 3 a 120 horas, 5 a 90 horas, 8 a 72 horas ou 12 a 48 horas, em cada um dos intervalos de temperatura mencionados aqui.

[00069] Em qualquer uma das modalidades da invenção, o produto sólido de transformação do substrato pode ser seco, opcionalmente seguido de moagem.

[00070] Em qualquer uma das modalidades da invenção, a mistura de substrato pode ser incubada por um tempo e a uma temperatura suficiente para inativar a(s) enzima(s), quaisquer fatores antinutricionais e quaisquer auxiliares de processamento, e se usada parcial ou totalmente, e se desejado.

[00071] Em qualquer uma das modalidades da invenção, o tanque de incubação vertical não agitado pode ser fechado.

[00072] Em qualquer uma das modalidades da invenção, o tanque de incubação não agitado pode ser do tipo cilíndrico ou poliédrico vertical, oblongo. A vantagem de usar esse tipo é a economia de espaço e, como não é agitado, os custos operacionais e de manutenção dos equipamentos de mistura são evitados.

[00073] Em qualquer uma das modalidades da invenção, a área na parte superior do dito tanque de incubação não agitado pode ser menor que a área na parte inferior, isto é, o tanque é de formato cônico. A vantagem disso é que o efeito de deslizamento é aumentado para que a biomassa com fluidez reduzida possa ser usada.

[00074] Em qualquer uma das modalidades da invenção, o tanque de incubação não agitado pode ter uma manta isolante ou uma camisa de controle térmico (thermal dimple jacket) e meios para controlar a temperatura no interior do tanque de incubação.

[00075] O produto sólido de transformação do substrato da invenção pode ser seco até um teor de água não superior a 15%, 13%, 10%, 6%, 4% ou 2% em peso e, opcionalmente, estar na forma moída.

[00076] O produto sólido da invenção pode ser um produto da transformação de matéria proteinácea, oligossacarídeos e/ou polissacarídeos originários da dita biomassa. O produto sólido de transformação pode ter conteúdo reduzido de fatores antinutricionais, tais como inibidores de tripsina, antígenos, oligossacarídeos produtores de flatulência, por exemplo, estaquiose e rafinose; ácido fítico e lectina.

[00077] O produto sólido da invenção pode compreender pelo menos 40% de matéria proteinácea em peso de matéria seca originária da soja.

[00078] O produto sólido da invenção pode compreender pelo menos 40% de matéria proteinácea em peso de matéria seca originária da semente de colza.

[00079] O produto sólido da invenção pode compreender proteínas em uma quantidade de 30 a 65% em peso, com base na matéria seca, originária de partes de plantas de soja, semente colza ou girassol, ou misturas dos mesmos.

[00080] O produto sólido da invenção pode compreender uma quantidade total de rafinose, estaquiose e verbascose de 3% em peso ou menos, como 2% ou menos, 1% ou menos, 0,5% ou menos ou 0,4% ou menos.

[00081] Finalmente, a invenção fornece um produto alimentício, de ração, cosmético ou farmacêutico ou um suplemento nutricional contendo de 1% a 99% em peso de um produto sólido de transformação fornecido de acordo com a invenção.

EXEMPLOS

RAZÃO DE DENSIDADE Exemplo 1: Razão de densidade aparente úmida/densidade aparente seca para substratos preferenciais com base em várias biomassas

1.1.Biomassas usadas no procedimento: Soja

[00082] A soja utilizada foi a farinha de grãos de soja (SBM) desengordurada. Milho

[00083] O milho usado foi milho integral, moído em um moinho de martelos através de uma peneira de 3,5 mm. Trigo

[00084] O trigo utilizado foi trigo integral, moído em um moinho de martelos por uma peneira de 3,5 mm. Girassol

[00085] O girassol utilizado foi a farinha de sementes de girassol (SSM) desengordurada. Semente de colza

[00086] A semente de colza utilizada foi a farinha de colza (RSM) desengordurada.

Feijões-fava

[00087] Os grãos utilizados eram feijões-fava integrais. Proteína de ervilha

[00088] A proteína de ervilha utilizada foi um concentrado de proteína de ervilha.

1.2 Descrição do procedimento:

[00089] A(s) quantidade(s) de biomassa e água na tabela a seguir foi(ram) misturada(s) por dez minutos seguidos por cinquenta minutos de equilíbrio em um recipiente fechado.

[00090] Depois disso, o material foi vertido em um copo medidor de 500 mL e sua massa determinada pela pesagem do copo e subtração da tara do copo.

[00091] A densidade aparente foi calculada como massa/volume não compactado em kg/m3.

[00092] A densidade aparente seca utilizada foi a densidade aparente medida da biomassa sem adição de água.

[00093] A densidade aparente úmida foi a densidade aparente da biomassa com adição de água.

[00094] A razão foi calculada como densidade aparente úmida dividida pela densidade aparente seca.

[00095] O teor de umidade das biomassas foi determinado por secagem até peso constante.

[00096] Após adição de água, a umidade na mistura foi determinada por cálculo.

1.3 Resultados:

[00097] Os resultados para 100% de soja e 80% de misturas com soja estão na tabela a seguir:

Soja Milho Trigo Gi- Colza grão Ervi Águ Umi- Densi- Ra- ras- de lha a em dade dade zão sol fava g em % apa- rente kg/m3 1000 g 0 10,9 665 - 1000 g 100 19,0 638 0,96 1000 g 250 28,7 500 0,75 1000 g 450 38,6 476 0,72 1000 g 750 49,1 470 0,71 1000 g 900 53,1 572 0,86 1000 g 1100 57,6 655 0,98 1000 g 1400 62,9 715 1,07 1000 g 1900 69,3 889 1,34

800 g 200 g 0g 11,4 703 - 800 g 200 g 450 38,9 617 0,88 800 g 200 g 900 53,4 634 0,90 800 g 200 g 1900 69,4 1008 1,43

800 g 200 g 0 11,7 694 - 800 g 200 g 450 39,1 580 0,84 800 g 200 g 900 53,5 623 0,90 800 g 200 g 1900 69,5 960 1,38

800 g 200 0 10,4 683 - g 800 g 200 450 38,2 554 0,81 g 800 g 200 900 52,9 598 0,88 g 800 g 200 1900 69,1 926 1,36 g

800 g 200 g 0 11,3 711 - 800 g 200 g 100 19,4 576 0,81 800 g 200 g 250 29,0 514 0,72 800 g 200 g 450 38,8 483 0,68 800 g 200 g 750 49,3 490 0,69 800 g 200 g 900 53,3 597 0,84 800 g 200 g 1100 57,8 528 0,74 800 g 200 g 1900 69,4 908 1,28

800 g 200 0 11,1 691 - g 800 g 200 450 38,7 569 0,82 g 800 g 200 900 53,2 605 0,88 g 800 g 200 1900 69,3 941 1,36 g 800 g 200 0 11,2 703 - g 800 g 200 450 38,7 488 0,69 g 800 g 200 900 53,2 728 1,04 g 800 g 200 1900 69,4 964 1,37 g

[00098] Os resultados para 60% e 40% das misturas de soja com milho, girassol e colza e 100% colza estão na tabela a seguir: Soja Milho Girassol Colza Água Umidade Densidade Razão em % aparente kg/m3 600 g 400 g 0g 11,8 703 - 600 g 400 g 250 g 29,5 651 0,93 600 g 400 g 450 g 39,2 626 0,89 600 g 400 g 750 g 49,6 631 0,90 600 g 400 g 900 g 53,6 666 0,95 600 g 400 g 1100 g 58,0 723 1,03 600 g 400 g 1400 g 63,3 796 1,13 600 g 400 g 0g 10,0 644 - 600 g 400 g 100 g 18,2 530 0,82 600 g 400 g 250 g 28,0 435 0,68 600 g 400 g 450 g 37,9 433 0,67 600 g 400 g 750 g 48,6 436 0,68 600 g 400 g 900 g 52,6 480 0,75 600 g 400 g 1100 g 57,1 449 0,70 600 g 400 g 1400 g 62,5 616 0,96

600 g 400 g 0g 11,7 643 - 600 g 400 g 100 g 19,7 560 0,82 600 g 400 g 250 g 29,4 502 0,78 600 g 400 g 450 g 39,1 503 0,78 600 g 400 g 750 g 49,5 492 0,77 600 g 400 g 900 g 53,5 516 0,80 600 g 400 g 1100 g 57,9 545 0,85 600 g 400 g 1400 g 63,2 655 1,02

400 g 600 g 0g 12,3 718 - 400 g 600 g 250 g 29,9 636 0,89 400 g 600 g 450 g 39,5 638 0,89 400 g 600 g 750 g 49,9 666 0,93 400 g 600 g 900 g 53,8 721 1,00 400 g 600 g 1100 g 58,2 802 1,12 400 g 600 g 1400 g 63,5 988 1,38

400 g 600 g 0g 9,5 654 - 400 g 600 g 100 g 17,7 535 0,82 400 g 600 g 250 g 27,6 422 0,65 400 g 600 g 450 g 37,6 487 0,74 400 g 600 g 750 g 48,3 491 0,75 400 g 600 g 900 g 52,4 512 0,78 400 g 600 g 1100 g 56,9 585 0,89 400 g 600 g 1400 g 62,3 612 0,94

400 g 600 g 0g 12,1 658 - 400 g 600 g 100 g 20,1 556 0,84 400 g 600 g 250 g 29,7 471 0,72 400 g 600 g 450 g 39,4 458 0,70 400 g 600 g 750 g 49,8 486 0,74 400 g 600 g 900 g 53,7 486 0,74 400 g 600 g 1100 g 58,1 531 0,81 400 g 600 g 1400 g 63,4 605 0,92

0g 1000 g 0g 12,9 616 - 0g 1000 g 100 g 20,8 484 0,79 0g 1000 g 250 g 30,3 438 0,71 0g 1000 g 450 g 39,9 457 0,74 0g 1000 g 750 g 50,2 507 0,82 0g 1000 g 900 g 54,1 535 0,87 0g 1000 g 1100 g 58,5 585 0,95 0g 1000 g 1400 g 63,7 688 1,12

BIOCONVERSÃO EM ESCALA PILOTO Materiais e métodos: Materiais

[00099] Biomassas: Farelo de grãos de soja (SBM), flocos de soja, farinha de semente de colza (RSM) e farinha de semente de girassol (SSM).

[000100] Água: Água da torneira normal Enzimas:

[000101] Protease: papaína de Enzybel; Ronozyme Pro Act da DSM; Protease ácida da Suntaq International Ltd;

[000102] α-galactosidase: da Bio-Cat (12.500 U/g);

[000103] Fitase: Natuphos da BASF

[000104] Outras carboidrases: Viscozyme L da Novozymes, Ronozyme VP da Novozymes Exemplo 2: Bioconversão com protease em SBM e em RSM (razão 50:50)

2.1 Incubadora:

[000105] A incubadora piloto utilizada foi um tubo de aço inoxidável oblongo, cilíndrico e isolado, com um volume operacional efetivo de 2 m3 e entradas e saídas. Além disso, a incubadora foi equipada com uma sonda de temperatura na entrada e na saída.

2.2 Método:

[000106] Em um reator vertical em escala piloto com um volume total de 2,0 m2, aplicou-se uma quantidade de entrada contínua de 250 kg/h de farelo de grãos de soja (SBM), 250 kg/h de farelo de semente de colza (RSM), 967 kg/h água a 25°C, 0,5 kg/h de protease (papaína da Enzybel) e 0,5 kg/h de protease (Ronozyme ProAct da DSM). A razão densidade aparente úmida/densidade aparente seca da mistura de incubação foi de 1,10.

[000107] A quantidade de saída foi ajustada para manter um nível constante de enchimento dentro do reator e o nível de enchimento foi ajustado para produzir um tempo total de processamento de 1,0 hora. Imediatamente após deixar o reator vertical, o produto foi tratado termicamente a 99°C por 15 min, seguido de secagem ao ar.

2.3 Procedimento de teste para o produto:

[000108] O produto tratado com enzima e sua referência não tratada, uma mistura 50:50 de SBM e RSM, foram analisados quanto a peptídeos solúveis por SDS-PAGE usando o seguinte método:

[000109] 5,0 g de produto foi suspenso em água, pH ajustado para 8,5 e ajustado com água para um peso total de 50,0 g. A suspensão foi aquecida a 90°C por 15 min seguida por centrifugação a 3000 RCF por 15 min. O sobrenadante foi misturado 1+5 com tampão de amostra de Laemmli + DTT 50 mM (Laemmli, 1970) e aquecido a 90°C por 15 min. 15 µL de cada amostra foram carregados em um gel TGX Any kD e analisados seguindo as instruções do fabricante. O gel foi corado com coomassie coloidal (Kang et al., 2002). Referências:

[000110] Kang D, Gho YS, Suh M, and Kang C, Bull. Korean Chem. Soc., 2002, Vol. 23, No. 11, pp. 1511-1512.

[000111] Laemmli UK, Nature, 1970, Vol. 227, pp. 680-685.

2.4 Resultados:

[000112] Os resultados do SDS-PAGE são mostrados na figura 1, faixas 2 e 3.

[000113] Fica claro a partir do SDS-PAGE que a maioria das bandas de proteínas distintas na mistura SBM/RSM não tratada (faixa 3) foi hidrolisada em peptídeos pelo tratamento com protease no reator vertical usado de acordo com a invenção (faixa 2). Exemplo 3: Bioconversão com protease em SBM e em RSM (razão 50:50)

3.1 Incubadora:

[000114] A incubadora piloto utilizada foi um tubo de aço inoxidável oblongo, cilíndrico e isolado, com um volume operacional efetivo de 2 m3 e entradas e saídas. Além disso, a incubadora foi equipada com uma sonda de temperatura na entrada e na saída.

3.2 Método:

[000115] Em um reator vertical em escala piloto com um volume total de 2,0 m2, aplicou-se uma quantidade de entrada contínua de 15,6 kg/h de farelo de grãos de soja (SBM), 15,6 kg/h de farelo de semente de colza (RSM), 24 kg/h água a 40°C, 0,03 kg/h de protease (Protease ácida da Suntaq International Ltd.) e 0,88 kg/h de H 2SO4. A razão densidade aparente úmida/densidade aparente seca da mistura de incubação foi de 0,75.

[000116] A quantidade de saída foi ajustada para manter um nível constante de enchimento dentro do reator e o nível de enchimento foi ajustado para produzir um tempo total de processamento de 16 hora. Imediatamente após deixar o reator vertical, o produto foi tratado termicamente a 99°C por 15 min, seguido de secagem ao ar.

3.3 Procedimento de teste para o produto:

[000117] O produto tratado com enzima e sua referência não tratada, uma mistura 50:50 de SBM e RSM, foram analisados quanto a peptídeos solúveis por SDS-PAGE usando o seguinte método:

[000118] 5,0 g de produto foi suspenso em água, pH ajustado para 8,5 e ajustado com água para um peso total de 50,0 g. A suspensão foi aquecida a 90°C por 15 min seguida por centrifugação a 3000 RCF por 15 min. O sobrenadante foi misturado 1+5 com tampão de amostra de Laemmli + DTT 50 mM (Laemmli, 1970) e aquecido a 90°C por 15 min. 15 µL de cada amostra foram carregados em um gel TGX Any kD e analisados seguindo as instruções do fabricante. O gel foi corado com coomassie coloidal (Kang et al., 2002). Referências:

[000119] Kang D, Gho YS, Suh M, and Kang C, Bull. Korean Chem. Soc., 2002, Vol. 23, No. 11, pp. 1511-1512.

[000120] Laemmli UK, Nature, 1970, Vol. 227, pp. 680-685.

3.4 Resultados:

[000121] Os resultados do SDS-PAGE são mostrados na figura 1, faixas 3 e 4.

[000122] Fica claro a partir do SDS-PAGE que quase todas as bandas de proteínas distintas na mistura SBM/RSM não tratada (faixa 3) foi hidrolisada em peptídeos pelo tratamento com protease de 16 horas no reator vertical (faixa 4). Exemplo 4: Bioconversão com α-galactosidase em flocos de soja

[000123] Essa biomassa compreende polissacarídeos e proteínas de leguminosas secas.

4.1 Incubadora

[000124] A incubadora utilizada foi um tubo de aço inoxidável oblongo, cilíndrico e isolado, com diâmetro interno de 1,55 m e altura total de 4,75 m. Na parte superior, havia uma série de três monitores de nível do tipo pás rotativas para regular o sistema de entrada e distribuição a um nível de 4,25 m. Isso fornece à incubadora um volume operacional efetivo de 8 m3. Além disso, a incubadora foi equipada com uma sonda de temperatura na entrada e na saída.

4.2 Método

[000125] Uma mistura de flocos de soja descascada, desengordurada e dessolventizada, ácido sulfúrico, α-galactosidase e água a 60°C foi preparada continuamente em quantidades para atingir um teor de matéria seca de 50% em peso na mistura, um pH de 4,7 e uma concentração de alfa-galactosidase de 1,1 kg/ton de soja. A razão densidade aparente úmida/densidade aparente seca da mistura de incubação foi de 0,73.

[000126] A incubadora foi preenchida com mistura de incubação a uma taxa adequada por hora. Após 16 horas, a incubadora foi preenchida até o nível operacional e os meios de saída foram ajustados a uma taxa para manter o nível de enchimento constante.

[000127] Um volume de alíquota de aprox. 30 litros foi retirado após 18 horas da execução teste e incubado a 100°C com vapor vivo por 25 min.

[000128] Posteriormente, o produto sólido de transformação úmido da biomassa foi submetido à secagem em flash e moído.

[000129] Os parâmetros gerais de incubação foram os seguintes:

[000130] Tempo de incubação - 16 horas

[000131] Temperatura de entrada - 45°C

[000132] Temperatura de saída - 45°C

4.3 Resultados:

[000133] O produto sólido de transformação da biomassa tinha um teor total de proteína bruta (N x 6,25) de 52,6% e um teor de água de 5,6% em peso, o que corresponde a uma proteína de matéria seca de 55,5%. Além disso, estaquiose e rafinose no produto sólido de transformação seco foram significativamente reduzidas, como mostrado na tabela 1: Tabela 1

Flocos de soja Produto Proteína da matéria seca 56 % +/- 1 % 55,5 % Estaquiose + rafinose 5-6 % Ausente

[000134] O produto sólido de transformação é altamente nutritivo e palatável e, portanto, adequado como ingrediente em vários produtos alimentícios e rações ou suplementos nutricionais. Além disso, ele pode ser utilizado como excipiente em produtos farmacêuticos e em cosméticos, por exemplo, formulações para banho. Exemplo 5: Bioconversão com fitase em flocos de soja

[000135] Essa biomassa compreende polissacarídeos e proteínas de leguminosas secas.

5.1 Incubadora

[000136] A incubadora utilizada foi um tubo de aço inoxidável oblongo, cilíndrico e isolado, com diâmetro interno de 1,55 m e altura total de 4,75 m. Na parte superior, havia uma série de três monitores de nível do tipo pás rotativas para regular o sistema de entrada e distribuição a um nível de 4,25 m. Isso fornece à incubadora um volume operacional efetivo de 8 m3. Além disso, a incubadora foi equipada com uma sonda de temperatura na entrada e na saída.

5.2 Método

[000137] Uma mistura de flocos de soja descascada, desengordurada e dessolventizada, fitase termoestável e água a 95°C foi preparada continuamente em quantidades para atingir um teor de matéria seca de 46% em peso na mistura e uma concentração de fitase de 250 g/ton de soja.

[000138] A razão densidade aparente úmida/densidade aparente seca da mistura de incubação foi de 0,87.

[000139] A incubadora foi preenchida com mistura de incubação na taxa de 750 litros por hora. Após 12 horas, a incubadora foi preenchida até o nível operacional e os meios de saída foram ajustados a uma taxa para manter o nível de enchimento constante.

[000140] Um volume de alíquota de aprox. 30 litros foi retirado após 14 horas da execução teste e incubado a 100°C com vapor vivo por 25 min.

[000141] Posteriormente, o produto sólido de transformação úmido da biomassa foi submetido à secagem em flash e moído.

[000142] Os parâmetros gerais de incubação foram os seguintes:

[000143] Tempo de incubação - 12 horas

[000144] Temperatura de entrada - 67 °C

[000145] Temperatura de saída - 66 °C

5.3: Resultados

[000146] O produto sólido de transformação da biomassa tinha um teor total de proteína bruta (N x 6,25) de 51,0 % e um teor de água de 8,0 % em peso, o que corresponde a uma proteína de matéria seca de 55,4 %. Além disso, o fósforo ligado ao ácido fítico (um antinutriente) no produto sólido de transformação seco foram significativamente reduzidas, como mostrado na tabela 2: Tabela 2 Flocos de soja Produto Proteína da matéria seca 55 % +/- 1 % 55,4 % Fósforo ligado ao ácido fítico 0,42 % 0,08 %

[000147] O produto sólido de transformação é altamente nutritivo e palatável e, portanto, adequado como ingrediente em vários produtos alimentícios e rações ou suplementos nutricionais. Além disso, ele pode ser utilizado como excipiente em produtos farmacêuticos e em cosméticos, por exemplo, formulações para banho. Exemplo 6: Bioconversão com carboidrase em farelo de grãos de soja (SBM)

[000148] Essa biomassa compreende polissacarídeos e proteínas de leguminosas secas.

6.1 Incubadora

[000149] A incubadora era um reator vertical em escala de produção com um volume total de 96 m2.

6.2 Método

[000150] Foi aplicada uma quantidade de entrada contínua de 1800 kg/h de farelo de grãos de soja, 2800 kg/h de água a 60°C, 6,5 kg/h de Viscozyme L da Novozymes e 2,8 kg/h de Depol 679 de Biocatalysts. A razão densidade aparente úmida/densidade aparente seca da mistura de incubação foi de 1,1.

[000151] A quantidade de saída foi ajustada para manter um nível constante de enchimento dentro do reator e o nível de enchimento foi ajustado para produzir um tempo total de processamento de 16 horas. Imediatamente após deixar o reator vertical, o produto foi tratado termicamente a 99°C por 15 min, seguido de secagem ao ar.

6.3 Procedimento de teste para o produto

[000152] A composição de açúcares e oligossacarídeos solúveis foi analisada por cromatografia em camada fina, extraindo uma pasta aquosa de suspensão de 10% de DM por 30 min, seguida por centrifugação por 10 min a 3.000 x g e aplicando o sobrenadante em placas TLC silica gel 60 (Merck). Os diferentes componentes foram quantificados por comparação com padrões de concentração conhecidos (Chaplan e Kennedy, 1986). Referências

[000153] Chaplan MF and Kennedy JF. Carbohydrate analysis - practical approach; I RL Press, Oxford, 1986

6.4 Resultados

[000154] Os resultados da cromatografia em camada fina são mostrados na figura 2 É evidente que o tratamento com carboidrase (faixa 1) libera alguns carboidratos solúveis, visualizados pelo ponto adicional entre sacarose e rafinose na cromatografia em camada fina, bem como um esfregaço geral em toda a faixa em comparação com a referência (faixa 2). Exemplo 7: Bioconversão com carboidrase em farelo de grãos de soja (SBM), farelo de sementes de colza (RSM) e trigo

[000155] Essa biomassa compreende polissacarídeos e proteínas de leguminosas secas.

7.1 Incubadora

[000156] A incubadora era um recipiente de plástico em escala de laboratório.

7.2 Método

[000157] Uma quantidade de 60 g de farelo de grãos de soja, 45 g de farelo de sementes de colza, 45 g de trigo moído, 180 g de água, 3,0 g de H2SO4, 0,525 g de Viscozyme L da Novozymes, 0,225 g de Depol 679 de Biocatalysts, 0,30 g de BAN 480 L da Novozymes e 0,30 g de AMG 300 L da Novozymes foram misturados e deixados incubados a 37°C por 16 horas. A razão densidade aparente úmida/densidade aparente seca da mistura de incubação foi de 0,90.

[000158] Após a incubação, o produto foi tratado termicamente a 100°C por 15 min, seguido de secagem ao ar e moagem.

7.3 Procedimento de teste para o produto

[000159] O produto tratado com enzima e sua referência não tratada, 60 g de farinha de soja + 45 g de farinha de colza + 45 g de trigo moído, foram analisados quanto a polissacarídeos não amiláceos (NSP) solúveis/insolúveis usando o método de Englyst et al. 1994. O teor de carboidratos no extrato aquoso foi analisado pelo método do ácido fenol e sulfúrico e a composição de açúcares e oligossacarídeos solúveis foi analisada por cromatografia em camada fina, extraindo uma pasta aquosa de suspensão de 10% de DM por 30 min, seguida por centrifugação por 10 min a 3.000 x g e aplicando o sobrenadante em placas TLC silica gel 60 (Merck). Os diferentes componentes foram quantificados por comparação com padrões de concentração conhecidos (Chaplan e Kennedy, 1986). Referências

[000160] Chaplan MF and Kennedy JF. Carbohydrate analysis - practical approach; I RL Press, Oxford, 1986

[000161] Englyst HN, Quigley ME, e Hudson GJ; Analyst, 1994, Vol 119, pp. 1497-1509.

7.4 Resultados

[000162] Os resultados do NSP solúvel e insolúvel, bem como o teor de carboidratos solúveis, são mostrados na tabela 3. Os resultados da cromatografia em camada fina são mostrados na figura 3.

[000163] É evidente que o tratamento com carboidrase libera alguns carboidratos solúveis, visualizados por um esfregaço na cromatografia em camada fina, e que o tratamento com carboidrase altera as quantidades de carboidratos e NSP solúveis presentes no produto em comparação com a referência.

[000164] Tabela 3: Teor do NSP solúvel/insolúvel, bem como o teor de carboidratos solúveis do produto tratado com enzima e sua referência não tratada, respectivamente. Nome do produto Fração Total g/100g SD NSP solúvel 4,0 0,1 NSP insolúvel 8,5 0,1 Exemplo 7, produto NSP total 12,5 0,3 Carboidratos solúveis 28,7 4,8 NSP solúvel 2,8 0,2 NSP insolúvel 12,0 0,2 Exemplo 7, referência NSP total 14,8 0,5 Carboidratos solúveis 15,0 4,2

Exemplo 8: Bioconversão com carboidrase em farelo de grãos de soja (SBM) e girassol

[000165] Essa biomassa compreende polissacarídeos e proteínas de leguminosas secas.

8.1 Incubadora

[000166] A incubadora era um reator vertical em escala piloto com um volume total de 2,0 m2.

8.2 Método

[000167] Foi aplicada uma quantidade de entrada contínua de 18,8 kg/h de farelo de grãos de soja, 12,5 kg/h de girassol, 30 kg/h de água a 40°C, 0,03 kg/h de carboidrase (Ronozyme VP da Novozymes) e 0,88 kg/h de H2SO4. A razão densidade aparente úmida/densidade aparente seca da mistura de incubação foi de 0,80.

[000168] A quantidade de saída foi ajustada para manter um nível constante de enchimento dentro do reator e o nível de enchimento foi ajustado para produzir um tempo total de processamento de 16 horas. Imediatamente após deixar o reator vertical, o produto foi tratado termicamente a 99°C por 15 min, seguido de secagem ao ar.

8.3 Procedimento de teste para o produto

[000169] O produto tratado com enzima e sua referência não tratada, 90 g de farinha de soja + 60 g de farinha de girassol, foram analisados quanto a polissacarídeos não amiláceos (NSP) solúveis/insolúveis usando o método de Englyst et al. 1994.

[000170] Referências: Englyst HN, Quigley ME, e Hudson GJ; Analyst, 1994, Vol 119, pp. 1497-1509.

8.4 Resultados

[000171] Os resultados da análise de NSP são mostrados na tabela 4. É evidente que o processamento altera as quantidades das frações de NSP.

Tabela 4: Teor do NSP solúvel/insolúvel, bem como o teor de carboidratos solúveis do produto tratado com enzima e sua referência não tratada, respectivamente. Nome do produto Fração Total g/100g SD NSP solúvel 3,8 1,4 Exemplo 8, NSP insolúvel 12,6 1,4 produto NSP total 16,3 0,2 NSP solúvel 3,4 1,0 Exemplo 8, NSP insolúvel 14,8 1,0 referência NSP total 18,2 0,1 Exemplo 9: Bioconversão em larga escala Incubadora:

[000172] O reator utilizado foi um cilindro vertical com uma altura efetiva de 7,3 m e um diâmetro de 4,3 m.

[000173] No topo do reator vertical, a mistura de alimentação cai na posição próxima ao centro do reator. Para distribuição uniforme, uma lâmina raspadora ou braço nivelado distribui a mistura de alimentação de entrada pelo perímetro do reator.

[000174] No fundo do reator, o produto foi extraído por meios para obter um tempo de residência uniforme para qualquer propagação de partículas no topo do reator. Teste do fluxo pistonado uniforme

[000175] Os meios de entrada e saída do reator foram ajustados para atingir um tempo de permanência esperado de 12 horas. Para prover o tempo de distribuição uniforme, uma substância marcadora inerte foi adicionada à mistura de alimentação. A mistura de alimetação utilizada no experimento tinha um teor natural de ferro de cerca de 143 mg/kg de matéria seca (= concentração compensada); portanto, sulfato de ferro

(FeSO4) foi usado como marcador em uma concentração de 1167 mg FeSO4/kg de matéria seca da mistura de alimentação, igual a um teor total de ferro de 572 mg Fe/kg de matéria seca total.

Às 0 hora, foi adicionado FeSO4 à mistura de alimentação dosada ao reator por um período de 60 minutos.

As amostras foram coletadas a cada 20 minutos, secas e analisadas quanto ao teor de ferro, e verificou-se que o produto enriquecido com FeSO4 sai do reator 12-13 horas após a dosagem de FeSO4 à mistura de alimentação de entrada e uma concentração máxima de 355 mg/kg de Fe foi encontrada 12,5 horas após o início.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para produzir um produto sólido de transformação de um substrato, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:  preparar um substrato de biomassa compreendendo carboidratos e matéria proteinácea originários de grão de soja, semente de colza ou suas misturas, opcionalmente em mistura adicional com carboidratos e matéria proteinácea originários de feijões-fava, ervilhas, sementes de girassol, tremoço, cereais e/ou gramíneas,  misturar o dito substrato com uma preparação enzimática ou uma combinação de preparações enzimáticas e adicionar água em uma quantidade que forneça uma mistura de incubação inicial com um teor de água de 30% a 70% em peso e uma razão de densidade aparente úmida a densidade aparente seca de 0,60 a 1,45;  incubar a dita mistura de incubação inicial por 0,15-240 horas a uma temperatura de 20-70°C e recuperar o produto sólido de transformação da mistura incubada; compreendendo adicionalmente que a etapa de incubação seja realizada como um processo de fluxo pistonado contínuo em um tanque de incubação vertical não agitado com meios de entrada para a dita mistura e aditivos e meios de saída para o dito produto sólido de transformação.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente o pré-tratamento do dito substrato de biomassa antes de ser misturado com a dita preparação enzimática ou com a dita combinação de preparações enzimáticas, como pré-tratamento químico ou físico, por exemplo, por meio de desintegração, moagem, laminação, tratamento térmico, tratamento sob pressão, tratamento ultrassônico, tratamento hidrotérmico ou tratamento ácido ou alcalino.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 e 2, caracterizado pelo fato de que a dita mistura de incubação inicial é incubada por 1 a 180 horas, como 2 a 150 horas, 3 a 120 horas, 5 a 90 horas, 8 a 72 horas ou 12 a 48 horas.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que pelo menos 20% em peso da dita biomassa, como pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% em peso da dita biomassa, compreendem carboidratos e matéria proteinácea originários da soja opcionalmente desengordurada, sementes de colza opcionalmente desengorduradas ou suas misturas.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a dita biomassa compreende oligossacarídeos e/ou polissacarídeos e, opcionalmente, compreende adicionalmente óleos e gorduras, por exemplo, de sementes de plantas contendo óleo.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o dito substrato de biomassa, ou a dita mistura de incubação inicial, não compreende leveduras vivas.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o dito substrato de biomassa, ou a dita mistura de incubação inicial, não compreende qualquer levedura viva selecionada entre as cepas de Saccharomyces cerevisiae, incluindo leveduras de cerveja usadas e leveduras de destilaria usadas e fermento biológico e leveduras usadas da produção de vinho.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o dito produto sólido de transformação do substrato é um produto da transformação de matéria proteinácea, ou da transformação de carboidratos, ou da transformação de matéria proteinácea e carboidratos originários da dita biomassa.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o dito produto sólido de transformação do substrato de biomassa é um produto da transformação de matéria proteinácea, ou da transformação de carboidratos, ou da transformação de matéria proteinácea e carboidratos originários de leguminosas secas, e/ou cereais, e/ou sementes de plantas contendo óleo.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o dito produto sólido de transformação do substrato de biomassa é um produto da transformação de matéria proteinácea, ou da transformação de carboidratos, ou da transformação de matéria proteinácea e carboidratos originários de soja, ervilha, tremoço, girassol, trigo, milho ou colza.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a dita preparação enzimática, ou combinação de preparações enzimáticas, compreende uma ou mais enzimas selecionadas dentre proteases, peptidases, fitases, carboidrases, lipase e oxidorredutase.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a dita preparação enzimática, ou combinação de preparações enzimáticas, compreende uma ou mais carboidrases selecionadas de α-galactosidase, amilase, amiloglucosidase, pectinase, celulase e hemicelulases, por exemplo xilanase, mananase ou glucanase.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a matéria seca do dito substrato de biomassa para a dita preparação enzimática, ou a dita combinação de preparações enzimáticas, é de 2:1 a 100.000.000:1,

como 1.000:1, 10.000:1, 50.000:1, 100.000:1. 500.000:1, 1.000.000:1,

5.000.000:1, 10.000.000:1, 50.000.000:1, ou 100.000.000:1.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a água é adicionada ao dito substrato de biomassa em uma quantidade que fornece uma mistura de incubação inicial com uma razão de densidade aparente úmida para densidade aparente seca de 0,65 a 1,40, como 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,95, 1,00, 1,10, 1,15, 1,20, 1,25, 1,30 ou 1,35.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o teor de água na dita mistura de incubação inicial é de 35% a 70% em peso, como 40%, 45%, 50%, 55%, 60% ou 65%.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que um ou mais auxiliares de processamento selecionados a partir de componentes de plantas e agentes de processamento orgânicos e inorgânicos são adicionados ao dito substrato de biomassa e/ou à dita mistura de incubação inicial.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a α-galactosidase é adicionada ao dito substrato de biomassa e/ou à dita mistura de incubação inicial.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a preparação de α- galactosidase é adicionada ao substrato de biomassa e/ou à mistura de incubação inicial em uma quantidade de 0,05 a 50 unidades de α- galactosidase por g. de matéria seca do substrato da biomassa, como 0,5 a 25 unidades de α-galactosidase por g. de matéria seca do substrato da biomassa, por exemplo, de 1 a 10, de 2 a 8, de 3 a 6 ou de 4 a 5 unidades de α-galactosidase por g. de matéria seca do substrato da biomassa.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente que o tanque de incubação vertical não agitado esteja fechado.

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o dito tanque de incubação não agitado é do tipo cilíndrico ou poliédrico vertical, oblongo.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a área na parte superior do dito tanque de incubação não agitado é menor que a área na parte inferior, isto é, o tanque é de forma cônica.

24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o dito tanque de incubação não agitado possui manta isolante ou uma camisa de controle térmico (dimple jacket) e meios para controlar a temperatura no tanque.

25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o grau de enchimento do dito tanque de incubação é mantido constante.