EA045436B1 - Аденовирусные векторы и пути их применения - Google Patents
Аденовирусные векторы и пути их применения Download PDFInfo
- Publication number
- EA045436B1 EA045436B1 EA202091039 EA045436B1 EA 045436 B1 EA045436 B1 EA 045436B1 EA 202091039 EA202091039 EA 202091039 EA 045436 B1 EA045436 B1 EA 045436B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- vectors
- adenoviral vector
- vector
- adenoviral
- seq
- Prior art date
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 282
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 80
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 38
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 37
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 29
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 28
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 28
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 claims description 27
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 22
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 21
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 13
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 9
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 claims description 8
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 8
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 101100165660 Alternaria brassicicola bsc6 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101100499295 Bacillus subtilis (strain 168) disA gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150007210 ORF6 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101100226894 Phomopsis amygdali PaGT gene Proteins 0.000 claims description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 53
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 51
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 50
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 44
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 35
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 32
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 29
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 28
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 27
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 24
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 22
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 22
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 22
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 20
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 20
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 20
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 18
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 18
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 17
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 17
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 16
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 12
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 11
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 11
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 11
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 11
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 10
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 10
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 10
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 10
- 101710094396 Hexon protein Proteins 0.000 description 9
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 9
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 9
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 9
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 8
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 7
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 6
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 6
- 238000011510 Elispot assay Methods 0.000 description 5
- 101710145505 Fiber protein Chemical group 0.000 description 5
- 241000205701 Human adenovirus 26 Species 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 5
- 101100379247 Salmo trutta apoa1 gene Proteins 0.000 description 5
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 5
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 241001217856 Chimpanzee adenovirus Species 0.000 description 4
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 4
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 4
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 4
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 241000990167 unclassified Simian adenoviruses Species 0.000 description 3
- CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 3,3-bis(chloromethyl)oxetane Chemical compound ClCC1(CCl)COC1 CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010059886 Apolipoprotein A-I Proteins 0.000 description 2
- 102000005666 Apolipoprotein A-I Human genes 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 2
- 241000963438 Gaussia <copepod> Species 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 2
- 241000701124 Human adenovirus 35 Species 0.000 description 2
- 241001135572 Human adenovirus E4 Species 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000002298 density-gradient ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- -1 devices Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000000799 fusogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 2
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 2
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 2
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 241000701242 Adenoviridae Species 0.000 description 1
- 108700026758 Adenovirus hexon capsid Proteins 0.000 description 1
- 101100113692 Caenorhabditis elegans clk-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 229940046168 CpG oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101150029662 E1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150005585 E3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000282575 Gorilla Species 0.000 description 1
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 1
- 101000733802 Homo sapiens Apolipoprotein A-I Proteins 0.000 description 1
- 208000009602 Human Adenovirus Infections Diseases 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 101710155913 Major envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004264 Petrolatum Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100038611 Vitamin D-binding protein Human genes 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 108700010877 adenoviridae proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 210000001776 amniocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000010775 animal oil Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I calcium;potassium;disodium;(2s)-2-hydroxypropanoate;dichloride;dihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[Na+].[Na+].[Cl-].[Cl-].[K+].[Ca+2].C[C@H](O)C([O-])=O BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 229940066842 petrolatum Drugs 0.000 description 1
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920006254 polymer film Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000002064 post-exposure prophylaxis Effects 0.000 description 1
- 230000002516 postimmunization Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 239000013639 protein trimer Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000013643 reference control Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000010845 search algorithm Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 238000011524 similarity measure Methods 0.000 description 1
- 239000008354 sodium chloride injection Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 108010063191 vitamin D-binding protein-macrophage activating factor Proteins 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, более конкретно, к области и применению, связанным с аденовирусными векторами, такими как дефектные по репликации аденовирусные векторы для доставки антигенов и индуцирования иммунного ответа у хозяев.
Предпосылки изобретения
Векторы на основе рекомбинантных аденовирусов широко используются в связанных с генной терапией областях применения и для вакцин. Было показано, что вакцины на основе вектора AdV-5 вызывают эффективные и защитные иммунные ответы в ряде различных животных моделей (см., например, WO 2001/02607; WO 2002/22080; Shiver et al., Nature, 415:331 (2002); Letvin et al., Ann. Rev. Immunol. 20:73 (2002); Shiver and Emini, Ann. Rev. Med. 55:355 (2004)). Тем не менее применимость вакцин на основе рекомбинантного вектора AdV-5, вероятно, будет ограничена высокой серопревалентностью AdV-5-специфических нейтрализующих антител (NAb) в популяциях людей. В исследованиях на мышах, макаках-резусах и людях было показано, что существование иммунитета против AdV-5 существенно подавляет иммуногенность вакцин на основе AdV-5.
Одна перспективная стратегия, позволяющая обойти наличие предсуществующего иммунитета у индивидуумов, ранее инфицированных или получавших лечение наиболее распространенным аденовирусом человека, например AdV-5, предусматривает разработку рекомбинантных векторов на основе серотипов аденовирусов, которые не подвергаются воздействию таких предсуществующих механизмов иммунной защиты. Одна из таких стратегий основана на применении химерных аденовирусов, предусматривающих замену нативных последовательностей капсидных белков (например, последовательностей белков гексона и/или фибры) на последовательности капсидных белков (например, последовательности белков гексона и/или фибры) от аденовирусов с низкой (или отсутствующей) серопревалентностью.
Таким образом, в данной области техники существует потребность в альтернативных аденовирусных векторах, которые можно получать в больших количествах, которые не сталкиваются с предсуществующими механизмами иммунной защиты у хозяина, но которые тем не менее характеризуются иммуногенностью и способностью индуцировать сильный иммунный ответ на антигены, кодируемые гетерологичными нуклеиновыми кислотами, вставленными в вектор.
Краткое описание изобретения
Настоящим изобретением предусмотрены аденовирусные векторы. Аденовирусный вектор может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид гексона, предусматривающий полипептид, охватывающий гипервариабельные области гексона, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В определенных вариантах осуществления аденовирусный вектор может содержать полипептидную последовательность гексона, предусматривающую SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4.
В определенных вариантах осуществления аденовирусный вектор дополнительно предусматривает делецию Е1. В определенных вариантах осуществления аденовирусный вектор дополнительно предусматривает делецию E3. Аденовирусный вектор может дополнительно содержать orf6 E4 аденовируса-5 человека (HAdV-5). Аденовирусный вектор может, например, содержать последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6.
В определенных вариантах осуществления аденовирусный вектор дополнительно содержит по меньшей мере один трансген. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один трансген расположен в области делеции Е1, в области делеции E3 и/или в участке, прилегающем к правому инвертированному концевому повтору (rITR).
В определенных вариантах осуществления аденовирусный вектор содержит одну или несколько последовательностей нуклеиновой кислоты из аденовируса-26 человека (Ad26).
Настоящим изобретением также предусмотрены рекомбинантные клетки, содержащие описанные в данном документе аденовирусные векторы. Настоящим изобретением также предусмотрены способы получения аденовирусных векторов. Способы включают (а) выращивание раскрытых в данном документе рекомбинантных клеток в условиях, обеспечивающих продуцирование аденовирусного вектора; и (b) выделение аденовирусного вектора из рекомбинантной клетки.
Настоящим изобретением также предусмотрены иммуногенные композиции, содержащие описанные в данном документе аденовирусные векторы и фармацевтически приемлемый носитель. Также настоящим изобретением предусмотрены способы индуцирования иммунного ответа у нуждающегося в этом субъекта. Способы предусматривают введение субъекту описанных в данном документе иммуногенных композиций. Настоящим изобретением также предусмотрены способы получения иммуногенных композиций, при этом способы предусматривают объединение описанных в данном документе аденовирусных векторов с фармацевтически приемлемым носителем.
Краткое описание графических материалов
Вышеизложенное краткое описание, а также нижеследующее подробное описание предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения будут более понятны при их рассмотрении в сочетании с прилагаемыми графическими материалами. Следует понимать, однако, что настоящее изобре- 1 045436 тение не ограничивается конкретными вариантами осуществления, показанными на графических материалах.
На фиг. 1 показана схема замен в последовательности гексона для описанных в данном документе содержащих химерный гексон векторов.
На фиг. 1А показана схема, демонстрирующая местоположения в гене, кодирующем полноразмерный гексон HAdV-26 (незаштрихованная полоска), пяти сегментов гена гексона (серые полоски) и семи коротких гипервариабельных областей (HVR) (черные полоски), которые предварительно были заменены с гексонов HAdV-5 на гексоны HAdV-48 с получением содержащего химерный гексон HAdV-5 вектора Ad5HVR48(1-7) (Roberts et al., Nature, 441:239-43 (2006)).
На фиг. 1B показаны результаты частичного выравнивания полипептидных последовательностей гексонов HAdV-26, PtroAdV-1, PtroAdV-12 и PtroAdV-13. Серые полоски соответствуют пяти сегментам гена гексона, которые согласно настоящему документу были заменены с HAdV-26 на PtroAdV-1, PtroAdV-12 или PtroAdV-13. Черными полосками указаны последовательности, соответствующие вышеупомянутым ранее обозначенным HVR, которые были заменены с HAdV-5 на HAdV-48.
На фиг. 2 показана схема химерных векторов pAd26.
На фиг. 2А показана схема общих элементов pAd26.HVRPtr12.luc (SEQ ID NO: 21).
На фиг. 2В показана схема общих элементов pAd26.HVRPtr13.luc (SEQ ID NO: 22).
На фиг. 3 показана схема общих элементов pAd26.ApoA1.RSVF-2A-GLuc (SEQ ID NO: 29).
На фиг. 4 показана схема стратегии гомологичной рекомбинации, которая была использована для создания аденовирусных векторов Ad26HVRPtr12.RSVF-2A-GLuc и Ad26HVRPtr13.RSVF-2A-GLuc (в Е1-дополняющих клетках).
На фиг. 5 показаны клеточные и гуморальные иммунные ответы, индуцированные Ad26HVRPtr12.FLuc и Ad26HVRPtr13.FLuc.
На фиг. 5А показана схема эксперимента.
На фиг. 5В показан график иммунного ответа, индуцированного Ad26.FLuc, Ad26HVRPtr12.FLuc и Ad26HVRPtr13.FLuc против кодируемого вектором антигена (т.е. Fluc, люциферазы светлячка), как определено с помощью анализа ELISPOT с применением интерферона гамма (IFN-γ). По оси у показано количество пятнообразующих единиц (SFU) на 10 спленоцитов, а пунктирной линией обозначено значение 95% процентиля для средовых стимуляторов.
На фиг. 6 показаны клеточные и гуморальные иммунные ответы, индуцированные Ad26HVRPtr12.RSVF-2A-GLuc и Ad26HVRPtr13.RSVF-2A-GLuc.
На фиг. 6А показана схема эксперимента.
На фиг. 6В показаны результаты анализа нейтрализации вируса RSV A2 (VNA), проведенного через восемь недель после иммунизации посредством Ad26.RSVF-2A-GLuc, Ad26HVRPtr12.RSVF-2A-GLuc и Ad26HVRPtr13.RSVF-2A-GLuc.
На фиг. 6С показан клеточный иммунный ответ, индуцированный посредством Ad26.RSVF-2A-GLuc, Ad26HVRPtr12.RSVF-2A-GLuc и Ad26HVRPtr13.RSVF-2A-GLuc, против кодируемого вектором антигена RSV F, как определено с помощью анализа ELISPOT с применением IFN-γ. По оси у показано количество пятнообразующих единиц (SFU) на 10 спленоцитов, а пунктирной линией обозначено значение 95% процентиля для средовых стимуляторов.
На фиг. 6D показан график RSVF-специфических связывающих антител IgG, индуцированных Ad26.RSVF-2A-GLuc, Ad26HVRPtr12.RSVF-2A-GLuc и Ad26HVRPtr13.RSVF-2A-GLuc в сыворотке крови иммунизированных мышей через 8 недель после иммунизации. На графике изображены титры по результатам ELISA с IgG, рассчитанные как конечные показатели титра (log10).
На фиг. 7 показаны титры нейтрализации гомологичных и гетерологичных аденовирусов, индуцированные у мышей, иммунизированных аденовирусными векторами Ad35, Ad26, Ad5, Ad4, Ad26HVRPtr12 и Ad26HVRPtr13.
На фиг. 8 показана серопревалентность для Ad26, Ad5, Ad26HVRPtr12 и Ad26HVRPtr13 в образцах сыворотки крови, полученных от группы из 200 взрослых человек в возрасте от 18 до 55 лет, проживающих в Соединенных Штатах (США) и Европейском союзе (ЕС). Титры нейтрализации, измеренные в данных образцах сыворотки крови для каждого вектора, были разделены на четыре категории (<16 (нейтрализация отсутствовала), от 16 до 300, от 300 до 1000, от 1000 до 4000 и >4000), представленные в указанных диаграммах.
На фиг. 9 показана продуктивность в отношении новых содержащих химерный капсид векторов AdHVRPtr12.FLuc и Ad26HVRPtr13.FLuc в линии клеток-продуцентов sPER.C6.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение основано, по меньшей мере отчасти, на создании химерных аденовирусных векторов, содержащих остов аденовируса человека и по меньшей мере одну из полипептидных последовательностей химерных гексона или фибры. Аденовирусные векторы способны вызывать иммунный ответ, при этом сохраняя низкую серопревалентность. Аденовирусные векторы можно составлять для получения вакцин и применять для индуцирования защитного иммунитета против конкретных представ- 2 045436 ляющих интерес антигенов.
Различные публикации, статьи и патенты цитируются или описываются в разделе Предпосылки изобретения и на протяжении всего описания; при этом каждый из этих литературных источников включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Обсуждение документов, актов, материалов, устройств, изделий и т. п., которое было включено в настоящее описание, предназначено для обеспечения контекста настоящего изобретения. Такое обсуждение не является признанием того, что любые или все из этих материалов являются частью предшествующего уровня техники относительно любых раскрытых или заявленных изобретений.
Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимает средний специалист в области техники, к которой относится настоящее изобретение. В иных случаях определенные термины, используемые в данном документе, имеют значения, изложенные в описании.
Следует отметить, что используемые в данном документе и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают ссылку на множественное число, если из контекста явно не следует иное.
Если не указано иное, любые числовые значения, такие как концентрация или диапазон концентраций, описанные в данном документе, во всех случаях следует понимать как модифицированные термином приблизительно. Таким образом, числовое значение обычно включает ±10% от указанного значения. Например, концентрация 1 мг/мл включает в себя все значения в диапазоне от 0,9 до 1,1 мг/мл. Таким же образом диапазон концентраций от 1 до 10% (вес./об.) включает в себя диапазон от 0,9 до 11% (вес./об.). В данном контексте использование числового диапазона однозначно включает в себя все возможные поддиапазоны, все отдельные численные значения в этом диапазоне, включая целые числа в таких диапазонах и дробные значения, если контекст явно не указано иное.
Если не указано иное, термин по меньшей мере, предшествующий серии элементов, следует понимать как относящийся к каждому элементу в серии. Специалистам в данной области будет известно, или же они смогут установить с помощью постановки стандартного эксперимента многие эквиваленты конкретных вариантов осуществления описанного в данном документе настоящего изобретения. Такие эквиваленты подразумеваются как охватываемые настоящим изобретением.
В данном контексте подразумевается, что термины предусматривает, предусматривающий, включает, включающий, имеет, имеющий, содержит, содержащий или любые другие их вариации означают, что они охватывают указанное целое число или группу целых чисел, но не исключают любые другие целые числа или группу целых чисел, и подразумевается, что они являются неисключающими или неограничивающими. Например, композиция, смесь, процесс, способ, изделие или устройство, содержащие перечень элементов необязательно ограничиваются только этими элементами, но могут включать другие элементы, явно не указанные или являющиеся неотъемлемой частью такой композиции, смеси, процесса, способа, изделия или устройства. Кроме того, если явно не указано иное, или относится к включающему или, а не исключающему или. Например, условию А или В отвечает любое из следующего: А истинно (или в наличии) и В ложно (или отсутствует), А ложно (или отсутствует) и В истинно (или в наличии) и оба А и В истинны (или в наличии).
Используемый в данном документе связующий термин и/или между несколькими перечисленными элементами понимают как охватывающий как индивидуальные, так и объединенные варианты. Например, когда два элемента соединены и/или, первый вариант относится к применимости первого элемента без второго. Второй вариант относится к применимости второго элемента без первого. Третий вариант относится к применимости первого и второго элементов совместно. Любой из этих вариантов понимают как подпадающий под данное значение и, следовательно, удовлетворяющий требованию применяемого в данном документе термина и/или. Понятно, что одновременную применимость более чем одного из вариантов понимают как подпадающую под данное значение и, следовательно, удовлетворяющий требованию термина и/или.
Применяемый в данном контексте термин состоит из или варианты, такие как состоят из или состоящий(е) из, используемые во всем описании или формуле изобретения, указывают на включение любого из приведенных целых чисел или группы целых чисел, но при этом дополнительное целое число или группа целых чисел не могут быть добавлены к указанному способу, структуре или композиции.
Применяемый в данном контексте термин по сути состоит из или варианты, такие как по сути состоят из или по сути состоящий(е) из, используемые во всем описании или формуле изобретения, указывают на включение любого из приведенных целых чисел или группы целых чисел и необязательное включение любых приведенных целого числа или группы целых чисел, которые существенным образом не меняют основные или новые признаки указанного способа, структуры или композиции. См. М.Р.Е.Р. § 2111.03.
В данном контексте субъект означает любое животное, предпочтительно млекопитающее, наиболее предпочтительно человека, которого будут вакцинировать или которое было вакцинировано согласно способу в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. В данном контексте термин млекопитающее охватывает любое млекопитающее. Примеры млекопитающих включают без ограни- 3 045436 чения коров, лошадей, овец, свиней, кошек, собак, мышей, крыс, кроликов, морских свинок, обезьян, людей и т. д., более предпочтительно человека.
Слова правый, левый, нижний и верхний обозначают направления на графических материалах, на которые делается ссылка.
Термины приблизительно, примерно, как правило, по сути и подобные им, используемые в данном контексте в отношении размера или свойства компонента предпочтительного изобретения, следует рассматривать как указывающие на то, что описываемый размер/свойство не представляет собой строго установленное ограничение или параметр и не исключает небольшие отклонения от него, которые функционально являются идентичными или сходными, как это будет понятно специалисту в данной области техники. Как минимум, ссылки на такие числовые параметры будут включать вариации, которые при использовании математических и промышленных принципов, принятых в области техники (например, округление, ошибки измерения или другие систематические ошибки, допуски при производстве и т. п.), не будут изменять последнюю значащую цифру.
Термины идентичный или процент идентичности в контексте двух или более последовательностей нуклеиновой кислоты или полипептида (например, полипептидов гексона и фибры и полинуклеотидов, которые их кодируют) относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые являются одинаковыми, при сравнении и выравнивании для максимального соответствия, что измеряют с использованием одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или путем визуального изучения.
При сравнении последовательностей обычно одна последовательность выступает в роли эталонной последовательности, с которой сравнивают тестируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестируемые и эталонные последовательности вводят в компьютер, при необходимости обозначают координаты подпоследовательностей, и задают программные параметры алгоритма сравнения последовательностей. Затем алгоритм сравнения последовательностей вычисляет процент идентичности последовательностей для тестируемой(ых) последовательности(ей) относительно эталонной последовательности на основе заданных параметров программы.
Оптимальное выравнивание последовательностей для их сравнения можно проводить, например, с помощью алгоритма поиска локальной гомологии Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), с помощью алгоритма гомологичного выравнивания Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), с помощью способа поиска сходства по Пирсону-Липману, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 85:2444 (1988), с помощью компьютеризированных реализаций этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в программном комплексе Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Сайенс-Драйв 575, Мэдисон, Висконсин) или с помощью визуального изучения (см., в целом, Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1995 Supplement) (Ausubel)).
Примерами алгоритмов, которые подходят для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей, являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, которые описаны в Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403-410 и Altschuel et al. (1977), Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 соответственно. Программное обеспечение для проведения анализов BLAST является общедоступным посредством Национального центра биотехнологической информации. Данный алгоритм предусматривает первоначальную идентификацию пар последовательностей с высоким показателем сходства (HSP) путем идентификации коротких слов с длиной W в запрашиваемой последовательности, которые либо совпадают, либо удовлетворяют некоторой положительной пороговой оценке Т при выравнивании со словом той же длины в последовательности из базы данных. Т называют порогом показателя сходства соседних слов (Altschul et al. выше). Данные начальные совпадения соседних слов выполняют роль затравок для начала поисков с целью выявления более длинных HSP, которые их содержат. Совпадения слов затем продлевают в обоих направлениях вдоль каждой последовательности настолько, насколько можно увеличить совокупный показатель выравнивания.
В случае нуклеотидных последовательностей совокупные оценки рассчитывают с помощью параметров М (вознаграждение за пару совпадающих остатков; всегда >0) и N (штраф за несовпадающие остатки; всегда <0). В случае аминокислотных последовательностей для расчета совокупной оценки применяют матрицу замен. Продление совпадений слов в каждом направлении останавливают, когда совокупная оценка выравнивания уменьшается на величину X от ее максимального достигнутого значения; совокупная оценка падает до нуля или ниже из-за накопления одного или нескольких выравниваний остатков с отрицательной оценкой; или достигнут конец любой из последовательностей. Параметры алгоритма BLAST W, Т и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. В программе BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) по умолчанию используют длину слова (W), равную 11, ожидаемое значение (Е), равное 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих цепей. Для аминокислотных последовательностей в программе BLASTP применяют в качестве значений по умолчанию длину слова (W), равную 3, ожидаемое значение (Е), равное 10, и матрицу сравнения BLOSUM62 (см. Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915 (1989)).
- 4 045436
Помимо расчета процента идентичности последовательностей, алгоритм BLAST также выполняет статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 90:5873-5787 (1993)). Одним из показателей сходства, который выдается алгоритмом BLAST, является наименьшая суммарная вероятность (P(N)), которая указывает на вероятность, с которой совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями может произойти случайно. Например, нуклеиновая кислота считается схожей с эталонной последовательностью, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении тестируемой нуклеиновой кислоты с эталонной нуклеиновой кислотой составляет менее приблизительно 0,1, более предпочтительно менее приблизительно 0,01 и наиболее предпочтительно менее приблизительно 0,001.
Дополнительным признаком того, что две последовательности нуклеиновой кислоты или полипептидные последовательности являются по сути идентичными, является то, что полипептид, кодируемый первой нуклеиновой кислотой, является иммунологически перекрестно реактивным с полипептидом, кодируемым второй нуклеиновой кислотой, как описано ниже. Таким образом, полипептид обычно по сути идентичен второму полипептиду, например, если два пептида отличаются только консервативными заменами. Другим признаком того, что две последовательности нуклеиновой кислоты являются практически идентичными, является то, что две молекулы гибридизируются друг с другом в жестких условиях, как описано ниже.
В данном контексте термин защитный иммунитет или защитный иммунный ответ означает, что вакцинированный субъект в состоянии контролировать инфекцию, вызываемую патогенным возбудителем, в отношении которого была проведена вакцинация. Патогенный агент может, например, представлять собой антигенный продукт гена или антигенный белок или их фрагмент. Обычно у субъекта, у которого выработался защитный иммунный ответ, развиваются клинические симптомы только от легкой до умеренной степени тяжести или симптомы вовсе не развиваются. Обычно субъект, имеющий защитный иммунный ответ на определенного возбудителя или защитный иммунитет к нему, не погибает в результате инфицирования указанным возбудителем.
Термин адъювант определяется как одно или несколько веществ, которые обуславливают стимуляцию иммунной системы. В данном контексте адъювант используют для усиления иммунного ответа на аденовирусные векторы по настоящему изобретению.
В данном контексте термин антигенный продукт гена или его фрагмент или антигенный белок может включать бактериальный, вирусный, паразитарный или грибковый белок или его фрагмент. Антигенный белок или антигенный продукт гена предпочтительно способен обусловливать в организме хозяина защитный иммунный ответ, например, индуцировать иммунный ответ на заболевание или инфекцию (например, бактериальное, вирусное, паразитическое или грибковое заболевание или инфекцию) и/или обеспечивать выработку у субъекта иммунитета к заболеванию или инфекции (т.е. вакцинации), который защищает субъекта от заболевания или инфекции.
Используемый в данном документе термин химерный означает ген, нуклеиновую кислоту, белок, пептид или полипептид, который содержит два или более генов, нуклеиновых кислот, белков, пептидов или полипептидов, которые в обычных условиях не связаны друг с другом. Химерный ген, нуклеиновая кислота или белок могут представлять собой слитую молекулу из двух или более неродственных последовательностей (например, двух или более различных нуклеиновых кислот, которые кодируют два или более различных белков). Химерные ген, нуклеиновая кислота или белок могут представлять собой слитую молекулу из двух или более родственных последовательностей (например, нуклеиновых кислот, которые кодируют один и тот же белок, однако при этом нуклеиновые кислоты получены из различного исходного материала, т.е. одна нуклеиновая кислота происходит от человека, а другая нуклеиновая кислота происходит от представителя обезьянообразных).
Аденовирусные векторы.
Воздействие определенных аденовирусов приводит к выработке иммунных ответов на определенные аденовирусные серотипы, что может влиять на эффективность аденовирусных векторов. Поскольку инфекции, вызванные аденовирусами человека, распространены у людей, распространенность нейтрализующих антител к аденовирусам человека в популяциях людей является высокой. Можно ожидать, что наличие таких нейтрализующих антител у индивидуумов снизит эффективность переносящего ген вектора, в основе которого лежит остов аденовируса человека. Одним из способов преодоления снижения эффективности является замена эпитопов на аденовирусных капсидных белках, которые являются мишенями для нейтрализующих антител. Целевые последовательности на капсидных белках можно заменить белковыми последовательностями из других аденовирусов (например, аденовирусов обезьян), которые имеют низкую распространенность и, следовательно, против которых нейтрализующие антитела редко встречаются в популяциях людей.
Капсидный белок относится к белку на капсиде аденовируса или его функциональному фрагменту или производному, который задействуют при определении серотипа и/или тропизма конкретного аденовируса. К капсидным белкам, как правило, относятся белки фибры, пентона и/или гексона. В определенных вариантах осуществления капсидный белок представляет собой весь или полноразмерный капсидный белок аденовируса. В других вариантах осуществления капсидный белок представляет собой
- 5 045436 фрагмент или производное полноразмерного капсидного белка аденовируса. В определенных вариантах осуществления гексон, пентон и фибра, кодируемые аденовирусным вектором по настоящему изобретению, происходят от одного и того же или различных аденовирусов.
Полипептид гексона относится к гексоновым белкам оболочки аденовируса, их функциональным фрагментам и производным.
Полипептид фибры относится к белкам фибры аденовируса, их функциональным фрагментам и производным.
Одной из мишеней нейтрализующих антител к аденовирусам является основной белок оболочки, белок гексона. Замена белка гексона или вариабельных последовательностей в белке гексона, которые определяют серотип и связываются с нейтрализующими антителами, белком гексона или вариабельными последовательностями в белке гексона из аденовирусов, которые являются редкими в популяции людей, может позволить сконструировать аденовирусные векторы, которые были бы менее восприимчивы к нейтрализации антителами, обычно встречающимися у людей.
Гипервариабельные области (HVR) гексона представляют собой области полипептида гексона, характеризующиеся наибольшей вариабельностью среди различных аденовирусных серотипов. Как правило, считается, что эти HVR соответствуют контактирующим с растворителем поверхностям тримера белка гексона (в контексте интактной вирусной частицы), и, соответственно, ожидается, что они будут выступать в роли важных детерминант антитело-опосредованной нейтрализации аденовируса (Roberts et al., Nature, 441:239-43 (2006)). Поэтому замена HVR гексона данного аденовирусного вектора на HVR гексона аденовируса с низкой (или отсутствующей) серопревалентностью у людей представляет собой возможное средство для преодоления предсуществующего противовекторного гуморального иммунитета в целевых популяциях людей. Соответственно, было проведено множество исследований, посвященных изучению идеи химерных гексонов, в основном затрагивающих замену последовательностей гексона в векторах на основе HAdV-5 (Roy et al., J. Virol. 72:6875-9 (1998); Gall et al., J. Virol. 72:10260-4 (1998); Youil et al., Hum. Gene Ther. 13:311-20 (2002); Wu et al. J. Virol. 76:12775-82 (2002); Roy et al., Virology. 333:207-14 (2005); Roberts et al., Nature, 441:239-43 (2006); Bradley et al., J. Virol. 86:1267-72 (2012); Yu et al., Biochem Biophys Res Commun. 421:170-6 (2012); Bruder et al., PLoS One, 7(4):e33920 (2012)).
Второй мишенью нейтрализующих антител к аденовирусам является белок фибры. Замена белка фибры на последовательности фибры от редких аденовирусов, которые имеют происхождение от отличного от человека животного, более предпочтительно замена вариабельных последовательностей в белке фибры, также может позволять конструировать аденовирусные векторы, которые будут менее восприимчивы к нейтрализации антителами, обычно встречающимися у людей. Сочетание описанных выше замен фибр с заменами гексонов может придать дополнительную устойчивость к нейтрализации антителами, обычно присутствующими в популяциях людей.
Настоящим изобретением предусмотрены химерные аденовирусные векторы, содержащие трансгены и последовательности нуклеиновых кислот химерных гексонов. Аденовирусные векторы могут, например, содержать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид гексона, предусматривающий полипептид, охватывающий гипервариабельные области гексона, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В определенных вариантах осуществления полипептидная последовательность гексона предусматривает SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4. Аденовирусный вектор может, например, содержать одну или несколько последовательностей нуклеиновой кислоты из аденовируса-4 человека, аденовируса-5 человека, аденовируса-26 человека или аденовируса-35 человека. В определенных вариантах осуществления аденовирусный вектор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6.
Аденовирусный вектор относится к рекомбинантному вектору, полученному по меньшей мере из части аденовирусного генома или содержащему такую часть аденовирусного генома.
Как правило, аденовирусный вектор по настоящему изобретению содержит весь геном рекомбинантного аденовируса, например, в плазмидном, космидном или бакуловирусном векторе. Молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению могут быть представлены в виде РНК или в виде ДНК, полученных путем клонирования или изготовленных синтетическим путем. ДНК может быть двунитевой или однонитевой.
Специалист в данной области техники поймет, что элементы, полученные из нескольких серотипов, можно объединить в одном аденовирусном векторе, например, на основе аденовируса человека или обезьян. Таким образом, можно получить химерный аденовирусный вектор, в котором сочетаются требуемые свойства от различных серотипов. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления химерный аденовирусный вектор по настоящему изобретению может сочетать отсутствие предсуществующего иммунитета к последовательностям полипептидов химерных гексона и/или фибры с высоким уровнем доставки антигена и презентирующей способности существующих аденовирусных векторов, таких как rAd4, rAd5, rAd26 или rAd35.
Преимущества аденовирусных векторов при применении в качестве вакцин включают легкость использования, хорошую технологичность производства в широком масштабе и превосходные показатели безопасности, основанные на многолетнем опыте исследований, разработки, производства и клиниче- 6 045436 ских испытаний с многочисленными аденовирусными векторами, о которых сообщалось. Аденовирусные векторы, которые применяют в качестве вакцин, как правило, обеспечивают хороший иммунный ответ на кодируемый трансгеном белок или кодируемый трансгеном антигенный продукт гена, в том числе клеточный иммунный ответ. Аденовирусный вектор в соответствии с настоящим изобретением может быть основан на любом типе аденовируса и в некоторых вариантах осуществления основан на аденовирусе человека, который может принадлежать к любой группе или любому серотипу. В предпочтительных вариантах осуществления рекомбинантный аденовирус основан на аденовирусе человека из группы А, В, С, D, E, F или G. В других предпочтительных вариантах осуществления рекомбинантный аденовирус основан на аденовирусе человека серотипа 5, 11, 26, 34, 35, 48, 49 или 50. В других вариантах осуществления он представляет собой аденовирус обезьян, такой как аденовирус шимпанзе или гориллы, который может принадлежать любому серотипу. В определенных вариантах осуществления данный рекомбинантный аденовирус основан на аденовирусе шимпанзе типа 1, 3, 7, 8, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.1, 28.1, 29, 30, 31.1, 32, 33, 34, 35.1, 36, 37.2, 39, 40.1, 41.1, 42.1, 43, 44, 45, 46, 48, 49, 50, 67 или SA7P.
В более предпочтительном варианте осуществления вектор на основе аденовируса шимпанзе из второй композиции представляет собой ChAdV3. Рекомбинантный аденовирус шимпанзе серотипа 3 (ChAd3 или cAd3) представляет собой аденовирус подгруппы С со свойствами, сходными со свойствами аденовируса человека серотипа 5 (Ad5). В исследованиях на людях, в которых оценивали кандидатные вакцины к вирусу гепатита С (HCV), было показано, что ChAd3 является безопасным и иммуногенным (Barnes E, et al., 2012, Science translational medicine, 4:115ra1). Сообщалось, что вакцины на основе ChAd3 были способны индуцировать иммунный ответ, сравнимый с вакциной, предусматривающей вектор на основе Ad5 человека. См., например, Peruzzi D., et al., 2009, Vaccine, 27:1293-300 и Quinn K.M., et al., 2013, J. Immunol. 190: 2720-35; WO 2005/071093; WO 2011/0130627 и т.д.
Аденовирусные векторы, способы их конструирования и способы их размножения хорошо известны из уровня техники и описаны, например, в патентах США № 5559099, 5837511, 5846782, 5851806, 5994106, 5994128, 5965541, 5981225, 6040174, 6020191 и 6113913 и Thomas Shenk, Adenoviridae and their Replication, M.S. Horwitz, Adenoviruses, главы 67 и 68 соответственно в Virology, В.К. Fields et al., eds., 3rd ed., Raven Press, Ltd., New York (1996), а также других источниках, упомянутых в данном документе. Как правило, конструирование аденовирусных векторов предусматривает использование стандартных молекулярно-биологических методик, таких как описанные, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Watson et al., Recombinant DNA, 2nd ed., Scientific American Books (1992) и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, NY (1995), а также других источниках, упомянутых в данном документе.
В определенных вариантах осуществления аденовирусный вектор предусматривает делецию Е1 и/или делецию E3. Делеция Е1 или E3 может, например, предусматривать полную делецию гена или частичную делецию, что делает продукт гена Е1 или E3 функционально дефектным. Таким образом, в определенных вариантах осуществления аденовирус является дефектным по репликации, например, потому что он предусматривает делецию в участке Е1 генома. Как известно специалисту, в случае делеций существенно важных участков в геноме аденовируса функциональные элементы, кодируемые этими участками, должны быть обеспечены в транс-положении, предпочтительно клеткой-продуцентом, т.е. если части или целые участки E1, E2 и/или Е4 удалены из аденовируса, то они должны присутствовать в клетке-продуценте, например, быть встроенными в ее геном или находиться в виде так называемого вспомогательного аденовируса или вспомогательных плазмид. Аденовирус также может предусматривать делецию в участке E3, который не является существенным для репликации, и, следовательно, такую делецию не следует компенсировать. Одну или несколько областей Е1, Е2, E3 и Е4 также можно инактивировать другими способами, такими как вставка представляющего интерес трансгена (обычно связанного с промотором) в подлежащие инактивации области.
Клетка-продуцент (также иногда называемая в уровне техники и в данном документе как 'пакующая клетка' или 'дополняющая клетка'), которую можно использовать, может представлять собой любую клетку-продуцент, в которой требуемый аденовирус может быть размножен. Например, размножение векторов на основе рекомбинантного аденовируса проводят в клетках-продуцентах, которые компенсируют дефекты в аденовирусе. Предпочтительно такие клетки-продуценты содержат в своем геноме по меньшей мере последовательность Е1 аденовируса, и таким образом они способны к компенсированию дефектов рекомбинантных аденовирусов с делецией в участке Е1. Можно использовать любую Е1-дополняющую клетку-продуцент, такую как клетки сетчатки глаза человека, иммортализированные с использованием Е1, например клетки 911 или PER.C6 (см. патент США № 5994128), Е1-трансформированные амниоциты (см. патент ЕР № 1230354), Е1-трансформированные клетки А549 (см., например, WO 98/39411, патент США № 5891690), GH329:HeLa (Gao et al., 2000, Hum Gene Ther. 11:213-19), 293 и т.п. В определенных вариантах осуществления клетками-продуцентами являются, например, клетки HEK293, или клетки PER.C6, или клетки 911, или клетки IT293SF и т.п. Продуцирование аденовирусных векторов в клетках-продуцентах описано в Kovesdi et al., 2010, Viruses, 2:1681-703.
В определенных вариантах осуществления аденовирусный вектор представляет собой химерный
- 7 045436 аденовирусный вектор, содержащий одну или несколько последовательностей нуклеиновой кислоты аденовируса человека. Нуклеиновые кислоты аденовируса человека могут, например, быть выбраны из аденовируса-4 человека (Ad-4), аденовируса-5 человека (Ad-5), аденовируса-26 человека (Ad-26) или аденовируса-35 человека (Ad-35). В определенных вариантах осуществления дефектный по Е1 аденовирусный вектор содержит кодирующую последовательность E4-orf6 из аденовируса Ad5 человека. Это обеспечивает возможность размножения таких аденовирусов в хорошо известных дополняющих линиях клеток, которые экспрессируют гены Е1 из Ad5, таких как, например, клетки 293 или клетки PER.C6 (см., например, Fallaux et al., 1998, Hum Gene Ther. 9:1909-17, Havenga et al., 2006, J. Gen. Virol. 87:213543; WO 03/104467, включенные в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).
В определенных вариантах осуществления аденовирусный вектор содержит трансген. Трансген относится к гетерологичной нуклеиновой кислоте, которая представляет собой нуклеиновую кислоту, которая в норме отсутствует в векторе, и согласно настоящему изобретению трансген может кодировать антигенный продукт гена или антигенный белок, который вызывает иммунный ответ у субъекта. Например, трансген можно вводить в вектор посредством стандартных методик молекулярной биологии. Трансген можно, например, клонировать в делетированные области Е1 или E3 аденовирусного вектора или в область между областью Е4 и rITR. Трансген обычно функционально связан с последовательностями, контролирующими экспрессию. В предпочтительных вариантах осуществления трансген вставлен в сайт вставки трансгена.
При необходимости последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая гексон или фибру в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, и/или трансген, можно подвергать оптимизации в отношении кодонов для обеспечения надлежащей экспрессии у подвергаемого обработке хозяина (например, у человека). Оптимизация кодонов представляет собой технологию, широко применяемую в данной области техники.
Трансген может находиться под контролем происходящего из аденовируса промотора (т.е. быть функционально связан с ним) (например, главного позднего промотора) или может находиться под контролем гетерологичного промотора. Примеры подходящих гетерологичных промоторов включают промотор CMV и промотор RSV. Промотор предпочтительно расположен выше представляющего интерес гена в кассете экспрессии.
В предпочтительных вариантах осуществления аденовирусный вектор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6.
Иммуногенные композиции.
Иммуногенные композиции представляют собой композиции, содержащие иммунологически эффективное количество очищенных или частично очищенных векторов на основе аденовируса человека для применения в настоящем изобретении. Указанные композиции можно составлять в виде вакцины (также называемой в данном документе иммуногенной композицией) согласно способам, хорошо известным из уровня техники. Такие композиции могут включать адъюванты для усиления иммунных реакций. Оптимальные доли каждого компонента в составе можно определить с помощью методик, хорошо известных специалистам в данной области в свете настоящего раскрытия.
Иммуногенные композиции в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения можно получать с помощью известных специалистам в данной области техники способов, принимая во внимание настоящее раскрытие. Жидкие фармацевтические композиции обычно содержат жидкий носитель, такой как вода, вазелин, масла животного или растительного происхождения, минеральное масло или синтетическое масло. Могут быть включены физиологический солевой раствор, раствор декстрозы или другого сахарида или гликоли, такие как этиленгликоль, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль.
Иммуногенные композиции, применяемые в настоящем изобретении, могут содержать адъюванты. Адъюванты, подходящие для совместного введения в соответствии с настоящим изобретением, должны быть потенциально безопасными, хорошо переносимыми и эффективными для людей, включая QS-21, Detox-PC, MPL-SE, MoGM-CSF, TiterMax-G, CRL-1005, GERBU, TERamide, PSC97B, Adjumer, PG-026, GSK-I, AS01, AS03, AS04, AS15, GcMAF, В-алетин, МРС-026, Adjuvax, CpG ODN, бетафектин, квасцы и MF59.
К другим адъювантам, которые можно вводить, относятся лектины, факторы роста, цитокины и лимфокины, такие как альфа-интерферон, гамма-интерферон, тромбоцитарный фактор роста (PDGF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (gCSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (gMCSF), фактор некроза опухоли (TNF), эпидермальный фактор роста (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 и IL-12 или кодирующие их нуклеиновые кислоты.
Композиции по настоящему изобретению могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательное вещество, носитель, буфер, стабилизатор или другие материалы, хорошо известные специалистам в данной области техники. Такие материалы должны быть нетоксичными и не должны препятствовать эффективности активного ингредиента. Конкретная природа носителя или другого материала может зависеть от пути введения, например, внутримышечного, подкожного, перорального, внутривенного, кожного, внутрислизистого (например, в кишечнике), интраназального или внутрибрюшинного путей.
Способ индуцирования защитного иммунитета.
- 8 045436
Другой общий аспект настоящего изобретения относится к способу индуцирования иммунного ответа у нуждающегося в этом субъекта. Способы могут, например, предусматривать введение субъекту вакцины, содержащей описанный в данном документе аденовирусный вектор и фармацевтически приемлемый носитель. Настоящим изобретением также предусмотрены способы получения вакцины. Способы предусматривают объединение описанного в данном документе аденовирусного вектора с фармацевтически приемлемым носителем.
В способах по настоящему изобретению в качестве вакцины можно применять любую из иммуногенных композиций в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, включая без ограничения описанные в данном документе.
Введение иммуногенных композиций/вакцин, содержащих векторы, обычно осуществляют внутримышечно или подкожно. Тем не менее, также могут быть предусмотрены другие способы введения, такие как внутривенный, кожный, внутрикожный или назальный и т.д. Внутримышечное введение иммуногенных композиций можно осуществлять с помощью иглы для инъекции суспензии аденовирусного вектора. Альтернативой является применение безыгольного инъекционного устройства для введения композиции (с использованием, например, Biojector™) или лиофилизированного порошка, содержащего вакцину.
В случае внутривенной, кожной или подкожной инъекции или инъекции в участок поражения вектор будет представлен в форме парентерально приемлемого водного раствора, который является апирогенным и характеризуется подходящим значением pH, изотоничностью и стабильностью. Специалисты в данной области техники вполне способны получить подходящие растворы с применением, например, изотонических сред-носителей, таких как раствор хлорида натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, раствор Рингера с лактатом для инъекций. При необходимости можно включать консерванты, стабилизаторы, буферы, антиоксиданты и/или другие добавки. Также можно использовать состав с замедленным высвобождением.
Как правило, введение будет предназначено для профилактики с целью выработки иммунного ответа к представляющему интерес антигену (например, бактериального, вирусного, паразитарного и/или грибкового патогена) до инфицирования или развития симптомов. К заболеваниям и нарушениям, которые можно лечить или предупреждать в соответствии с настоящим изобретением, относятся таковые, при которых иммунный ответ может играть защитную или терапевтическую роль. В других вариантах осуществления аденовирусные векторы можно вводить для постконтактной профилактики.
Иммуногенные композиции, содержащие химерные векторы на основе аденовируса человека, вводят субъекту, вызывая иммунный ответ на представляющий интерес антиген у субъекта. Количество композиции, достаточное для индуцирования выявляемого иммунного ответа, определяют как иммунологически эффективную дозу или эффективное количество композиции. Иммуногенные композиции по настоящему изобретению могут индуцировать как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ. В типичном варианте осуществления иммунный ответ представляет собой защитный иммунный ответ.
Фактическое вводимое количество, а также частота и продолжительность введения будут зависеть от природы и тяжести подлежащего лечению явления. Назначение лечения, например, принятие решений относительно дозировки и т.д., находится в пределах сферы ответственности врачей общей практики и других врачей или ветеринара в случае ветеринарной практики, и при этом, как правило, учитываются подлежащее лечению нарушение, состояние отдельного пациента, участок доставки, способ введения и другие факторы, известные практикующим врачам. Примеры методик и протоколов, упоминаемых выше, можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed., 1980.
После получения аденовирусных векторов и необязательного составления таких частиц в виде композиций векторы можно вводить индивидууму, в частности человеку или другому примату. Введение можно осуществлять людям или другому млекопитающему, например мыши, крысе, хомяку, морской свинке, кролику, овце, козе, свинье, лошади, корове, ослу, мартышке, собаке или кошке. Доставка отличному от человека млекопитающему необязательно может предназначаться для терапевтической цели, а может предназначаться для применения в рамках эксперимента, например, при изучении механизмов иммунных ответов на аденовирусные векторы.
В одном иллюстративном режиме аденовирусный вектор вводят (например, внутримышечно) в объеме от приблизительно 100 мкл до приблизительно 10 мл, содержащем концентрации приблизительно от 104 до 1012 вирусных частиц/мл. Предпочтительно аденовирусный вектор вводят в объеме от 0,1 до 2,0 мл. Например, аденовирусный вектор можно вводить в объеме 100 мкл, 500 мкл, 1 мл, 2 мл. Более предпочтительно аденовирусный вектор вводят в объеме 0,5 мл. Необязательно, аденовирусный вектор можно вводить в концентрации приблизительно 107, 108, 109, 1010, 5χ1010, 1011 или 1012 в.ч./мл. Как правило, аденовирусный вектор вводят в количестве от приблизительно 109 до приблизительно 1012 вирусных частиц (в.ч.) субъекту-человеку за одно введение, более типично в количестве от приблизительно 1010 до приблизительно 1012 в.ч. После начальной вакцинации идет бустерная инъекция, как описано выше.
После начальной вакцинации может идти бустерная или вторичная инъекция вакцины/композиции,
- 9 045436 содержащей тот же аденовирусный вектор, кодирующий представляющий интерес антиген, или вакцины/композиции, содержащей другой аденовирусный вектор, кодирующий тот же представляющий интерес антиген.
Композиция может, при необходимости, быть представлена в наборе, упаковке или дозаторе, который может содержать одну или несколько стандартных лекарственных форм, содержащих активный ингредиент. Набор, например, может предусматривать металлическую фольгу или полимерную пленку, как например блистерная упаковка. Набор, упаковка или дозатор могут сопровождаться инструкциями по введению.
Композиции по настоящему изобретению можно вводить отдельно или в комбинации с другими средствами лечения либо одновременно, либо последовательно в зависимости от подлежащего лечению состояния.
Варианты осуществления
Вариант осуществления 1 представляет собой аденовирусный вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид гексона, предусматривающий полипептид, охватывающий гипервариабельные области гексона, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.
Вариант осуществления 2 представляет собой аденовирусный вектор по варианту осуществления 1, где полипептидная последовательность гексона предусматривает SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4.
Вариант осуществления 3 представляет собой аденовирусный вектор по варианту осуществления 1 или 2, где аденовирусный вектор дополнительно предусматривает делецию Е1.
Вариант осуществления 4 представляет собой аденовирусный вектор по любому из вариантов осуществления 1-3, где аденовирусный вектор дополнительно предусматривает делецию E3.
Вариант осуществления 5 представляет собой аденовирусный вектор по любому из вариантов осуществления 1-4, где аденовирусный вектор дополнительно содержит orf6 E4 аденовируса-5 человека (HAdV-5).
Вариант осуществления 6 представляет собой аденовирусный вектор по любому из вариантов осуществления 1-5, где аденовирусный вектор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6.
Вариант осуществления 7 представляет собой аденовирусный вектор по любому из вариантов осуществления 1-6, где аденовирусный вектор дополнительно содержит по меньшей мере один трансген.
Вариант осуществления 8 представляет собой аденовирусный вектор по любому из вариантов осуществления 1-7, где трансген расположен в области делеции Е1, в области делеции E3 и/или в участке, прилегающем к правому инвертированному концевому повтору (rITR).
Вариант осуществления 9 представляет собой аденовирусный вектор по любому из вариантов осуществления 1-8, где аденовирусный вектор содержит одну или несколько последовательностей нуклеиновой кислоты из аденовируса-26 (Ad26) человека.
Вариант осуществления 10 представляет собой рекомбинантную клетку, содержащую вектор по любому из вариантов осуществления 1-9.
Вариант 11 осуществления представляет собой способ получения аденовирусного вектора, включающий: (а) выращивание рекомбинантной клетки по варианту осуществления 10 в условиях, обеспечивающих продуцирование аденовирусного вектора; и (b) выделение аденовирусного вектора из рекомбинантной клетки.
Вариант осуществления 12 представляет собой иммуногенную композицию, содержащую аденовирусный вектор по любому из вариантов осуществления 1-9 и фармацевтически приемлемый носитель.
Вариант осуществления 13 представляет собой способ индуцирования иммунного ответа у нуждающегося в этом субъекта, при этом способ включает введение субъекту иммуногенной композиции по варианту осуществления 12.
Вариант осуществления 14 представляет собой способ получения иммуногенной композиции, при этом способ включает объединение аденовирусного вектора по любому из вариантов осуществления 1-9 с фармацевтически приемлемым носителем.
Примеры
Пример 1. Разработка содержащих химерный гексон аденовирусных векторов Ad26HVRPtr1, Ad26HVRPtr12 и Ad26HVRPtr13.
В данном примере описаны схемы Ad26HVRPtr1, Ad26HVRPtr12 и Ad26HVRPtr13, которые являются новыми векторами на основе HAdV-26, несущими определенные замены в последовательности гексона, на последовательности, полученные из аденовирусов шимпанзе. Данные содержащие химерный гексон аденовирусные вектора разрабатывали с целью создания возможных новых основанных на аденовирусах (вакцинных) векторов, которые являются технологичными, серологически отличными от HAdV-26 и против которых имеет место низкий (или вовсе отсутствует) предсуществующий иммунитет в популяциях людей.
Ad26HVRPtr1, Ad26HVRPtr12 и Ad26HVRPtr13, содержащие последовательности генома аденовирусного вектора под SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6 соответственно, разрабатывали в виде
- 10 045436 содержащих химерный гексон версий описанного ранее рекомбинантного вектора HAdV-26 (WO 2007/104792 А2; Abbink et al., 2007). Таким образом, данные векторы разрабатывали таким образом, чтобы они несли одну и ту же делецию Е1, делецию E3 и замену orf6 E4 (на таковую от HAdV-5), как указано ранее (WO 2007/104792 А2; Abbink et al., 2007).
Конкретными вариантами созданных и исследованных в данном примере содержащих химерный гексон векторов, которые описаны в последующих примерах, являются Ad26HVRPtr1.Fluc, Ad26HVRPtr12.Fluc, Ad26HVRPtr13.Fluc, Ad26HVRPtr12.RSVF-2A-GLuc и Ad26HVRPtr13.RSVF-2AGLuc, которые содержат вирусные геномные последовательности SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11 соответственно. Как указано в названиях их векторов, данные векторы были получены таким образом, чтобы они несли в местоположении своей делеции Е1 управляемую промотором CMV кассету экспрессии, кодирующую либо люциферазу светлячка (FLuc), либо химерный белок RSV-Fa2-2A-GLuc (RSVF-2A-GLuc), который представляет собой слитую молекулу на основе фузогенного гликопротеина респираторно-синцитиального вируса штамма А2 (RSV-F2A), пептида 2А вируса ящура и люциферазы Gaussia (GLuc). Обе кассеты экспрессии FLuc и RSVF-2A-GLuc находятся под управлением промотора CMV и несут сигнал полиаденилирования SV40. Кассета для RSVF-2A-GLuc дополнительно содержит в своей 5'-нетранслируемой области последовательность, предусматривающую интрон 2 гена аполипопротеина А1 (ApoA1) человека.
Аденовирусные векторы Ad26HVRPtr1, Ad26HVRPtr12 и Ad26HVRPtr13 (содержащие SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6 соответственно) разрабатывали как содержащие химерный гексон в том смысле, что определенные сегменты гена гексона в их геномах на основе HAdV-26 заменяли соответствующими сегментами гена гексона других аденовирусов. Вирусами, которые служили донорами последовательности гексона для Ad26HVRPtr1, Ad26HVRPtr12 и Ad26HVRPtr13 являлись PtroAdV-1, PtroAdV-12 и PtroAdV-13 соответственно. Данные вирусы были выявлены в образцах фекалий диких шимпанзе и были отнесены к аденовирусам человека вида Е (HAdV-E) (Wevers et al., J. Virol. 85(20):10774-84 (2011)). Частичные последовательности кодирующих гексон генов из этих вирусов были предоставлены в открытый доступ под номерами доступа GenBank JN163971, JN163982 и JN163983 соответственно. Учитывая, что акцепторный вектор для последовательностей гексона основан на HAdV-26, т.е. представителе аденовирусов человека вида D (HAdV-D), тогда как три донорных по последовательностям гексона вируса принадлежат к HAdV-E, полученные согласно данному документу векторы представляют собой межвидовые аденовирусные содержащие химерный гексон векторы.
Сегменты гена гексона HAdV-26, которые согласно данному документу были заменены для получения содержащих химерный гексон векторов Ad26HVRPtr1, Ad26HVRPtr12 и Ad26HVRPtr13 (и их сконструированные согласно данному документу производные, содержащие трансгенные кассеты экспрессии), соответствовали нуклеотидам 18178-18357, 18379-18438, 18556-18633, 18685-18723 и 19027-19158 полного генома HAdV-26 дикого типа, депонированного под регистрационным номером Genbank EF153474 (версия 1). Эти пять сегментов гена гексона HAdV-26 и их соответствующие заменяющие сегменты, полученные из PtroAdV-1, PtroAdV-12 или PtroAdV-13, в значительной степени, но не полностью, соответствовали последовательностям, кодирующим гипервариабельные области (HVR). Это показано на фиг. 1А, где местоположения пяти сегментов, а также местоположения ранее обозначенных HVR указаны на схематическом представлении гена гексона HAdV-26. Более того, более подробно это проиллюстрировано с помощью результатов выравнивания аминокислот, произведенном с использованием (частичных) полипептидных последовательностей гексона HAdV-26, PtroAdV-1, PtroAdV-12 и PtroAdV-13, где конкретные сегменты, которые в соответствии с данным документом были заменены, специально выделены параллельно с ранее обозначенными HVR (фиг. 1В).
Следует отметить, что пять сегментов гена гексона HAdV-26, которые были в соответствии с данным документом заменены для создания Ad26HVRPtr1, Ad26HVRPtr12 и Ad26HVRPtr13, не полностью соответствовали последовательностям, предусматривающим HVR гексона, которые были заменены в предыдущих публикациях, в которых описаны содержащие химерный гексон векторы на основе HAdV-5 (Roberts et al., Nature, 441:239-43 (2006); Bradley et al., J. Virol. 86:1267-72 (2012); Yu et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 421:170-6 (2012); Bruder et al., PLoS One. 7(4):e33920 (2012)).
Например, как проиллюстрировано на фиг. 1А и 1В, пять сегментов гена гексона не полностью соответствовали семи аминокислотным участкам, которые ранее заменяли для создания Ad5HVR48(1-7), содержащего химерный гексон вектора на основе HAdV-5 и содержащего HVR гексона из HAdV-48 (Roberts et al., Nature, 441:239-43 (2006)).
Полные нуклеотидные последовательности кодирующих химерные гексоны генов аденовирусных векторов Ad26HVRPtr1 Ad26HVRPtr12 и Ad26HVRPtr13 приведены под SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15 соответственно. Полные полипептидные последовательности химерных гексонов для этих векторов приведены под SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 соответственно.
Пример 2. Молекулярное конструирование плазмид, несущих полные геномы аденовирусных векторов Ad26HVRPtr1.Fluc, Ad26HVRPtr12.Fluc и Ad26HVRPtr13.Fluc.
Содержащие геном вектора Ad26HVRPtr1, Ad26HVRPtr12 и Ad26HVRPtr13 плазмиды, несущие управляемую промотором кассету экспрессии FLuc в аденовирусной области Е1, конструировали с по
- 11 045436 мощью тех же способов и той же стратегии, которые описаны ранее для создания содержащего химерный гексон кодирующего Fluc вектора Ad26.HVR5C (Ma et al., J. Cane. Res. Clin. Oncol. 141(3):419-29 (2015), добавочная фиг. 4). Вкратце, требуемые изменения в кодирующем гексон гене сначала вводили в контексте промежуточной переносящей ген гексона челночной плазмиды pHex26-Shuttle.BamHI. Это выполняли с помощью стандартных процедур синтеза и субклонирования генов (проводимых посредством GeneArt (LifeTechnologies, Карлсбад, Калифорния)) и в результате получали модифицированные, переносящие ген гексона челночные плазмиды, несущие вышеупомянутые последовательности кодирующих химерные гексоны генов, указанные под SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15. Затем путем гомологичной рекомбинации в E.coli BJ5183 (Stratagene/Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния) кодирующие химерные гексоны гены переносили из переносящих ген гексона челночных плазмид в pAd26.luc.dH, плазмиду, которая несет между двумя сайтами рестрикции PacI геном рекомбинантного вектора на основе HAdV-26 с делецией гена гексона, снабженный в местоположении выполненной в нем делеции Е1 управляемой промотором CMV кассетой экспрессии, кодирующей Fluc. Вышеупомянутые процедуры молекулярного клонирования приводили к созданию плазмид pAd26.HVRPtr1.luc (SEQ ID NO: 20), pAd26.HVRPtr12.luc (SEQ ID NO: 21; фиг. 2А) и pAd26.HVRPtr13.luc (SEQ ID NO: 22; фиг. 2В).
Также три плазмиды, кодирующие совпадающие аденовирусные векторы, содержащие химерный гексон, конструировали точно так же, как описано выше. В данных трех плазмидах, имевших названия pAd26.HVR5.luc (SEQ ID NO: 17), pAd26.HVR35.luc (SEQ ID NO: 18) и pAd26.HVR52.luc (SEQ ID NO: 19), вышеупомянутый набор из пяти сегментов гена гексона HAdV-26 заменяли на соответствующие наборы сегментов от HAdV-5, HAdV-35 и HAdV-52 соответственно. Эти плазмиды содержали нуклеотидные последовательности генов химерного гексона, изложенные под SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 25 соответственно. Эти гены гексонов кодируют полипептидные последовательности химерных гексонов, изложенные под SEQ ID NO: 26, SEQID NO: 27 и SEQ ID NO: 28 соответственно.
Пример 3. Первоначальная оценка жизнеспособности, эффективности роста и продуктивности аденовирусных векторов Ad26HVRPtr1.Fluc, Ad26HVRPtr12.Fluc и Ad26HVRPtr13.Fluc.
В предшествующих исследованиях было показано, что химерные аденовирусные векторы, предусматривающие межвидовые аденовирусные замены в последовательности гексонов, зачастую являются нежизнеспособными или могут проявлять замедленную кинетику роста и обеспечивать более низкие выходы (Youil et al., Hum. Gene Ther. 13:311-20 (2002); Wu et al., J. Virol. 76:12775-82 (2002); Bradley et al., J. Virol. 86:1267-72 (2012); Bruder et al., PLoS One. 7(4):e33920 (2012)). Поэтому новые содержащие химерный гексон химерные аденовирусные (вакцинные) векторы необходимо подвергать тестированию на основные свойства роста, выход при продуцировании и качество частиц.
Разработанные и сконструированные в соответствии с данным документом содержащие химерный гексон аденовирусные векторы оценивали в отношении их жизнеспособности, эффективности роста, продуктивности и инфекционности частиц, проводя их сравнение с их родительским вектором на основе HAdV-26. С этой целью создавали аденовирусные векторы Ad26HVRPtr1.Fluc, Ad26HVRPtr12.Fluc и Ad26HVRPtr13.Fluc, а также векторы сравнения Ad26HVR5.Fluc, Ad26HVR35.Fluc и Ad26HVR52.Fluc путем трансфекции в соответствии со стандартными процедурами с применением облегчающего трансфекцию реагента липофектамина (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), соответствующими несущими геном вектора Ad плазмидами, которые описаны в примере 2 (т.е. pAd26.HVRPtr1.luc, pAd26.HVRPtr12.luc, pAd26.HVRPtr13.luc, pAd26.HVR5, pAd26.HVR35 и pAd26.HVR52 соответственно), Е1-дополняющих клеток PER.55K (Vogels et al., J. Virol. 77:8263-71 (2003)), которые культивировали в колбах Т25. Перед трансфекциями плазмиды, несущие геном вектора Ad, расщепляли с помощью PacI, высвобождая из плазмиды соответствующие геномы аденовирусных векторов. Культуры трансфицированных клеток ежедневно отслеживали для регистрации дня начала формирования первой вирусной бляшки, а также дня, на который достигался общий цитопатический эффект (СРЕ) (см. таблицу). При полном СРЕ собирали инфицированные клетки и среду и высвобождали вирус с помощью трех циклов замораживанияоттаивания. После сбора спасенных путем трансфекции вирусов их дополнительно размножали с помощью нескольких последовательных раундов инфицирования в культурах Е1-дополняющих клеток. Затем из неочищенной вирусной биомассы выделяли вирусы (с помощью двухстадийной процедуры ультрацентрифугирования в градиенте плотности хлорида цезия (CsCl)), а затем определяли титры вирусных частиц (в.ч.) и инфекционных единиц (ИЕ/мл), все проводили с помощью стандартных способов, которые были описаны ранее (Alba R., Baker А.Н., Nicklin S.A. Vector systems for prenatal gene therapy: principles of adenovirus design and production. Methods Mol. Biol. 2012; 891:55-84).
- 12 045436
Показатели эффективности спасения, конечных выходов при продуцировании и отношения в.ч./ИЕ, наблюдаемые для содержащих химерный гексон аденовирусных векторов
| Вектор | Виды HAdV, ЯВЛЯЮЩ иеся донором HVR | Эффективность спасения вируса | Характеристика очищенной партии | |||
| Образо вавши хся вирусн ых бляше к | 1-я вирусная бляшка (дней и. т.) | Общее количеств о СРЕ (дней и. т.) | Общий выход для 25 колб Т150 (в. ч.) | Отнош ение в. ч. к НЕ | ||
| Ad26.FLuc | n.a. | Да | 3-5 | 7-8 | Ι,ΙΟχΙΟ10 | 337 |
| Ad26HVR5.FLuc | C | Да | 5 | 11 | 1,05x10 | 4000 |
| Ad26HVR35.FLuc | В | Да | 5 | 12 | 1,75χ101ζ | 829 |
| Ad26HVR52.FLuc | G | Нет | - | - | - | - |
| Ad26HVRPtrl.FLuc | E | Да | 3 | 9 | 3,78x10 | 1029 |
| Ad26HVRPtrl2.FLuc | E | Да | 4 | 8 | 2,16χ101ζ | 272 |
| Ad26HVRPtrl3.FLuc | E | Да | 3 | 7 | 1,07χ1010 | 150 |
n.а. - не применимо;
п.т. - после трансфекции.
Из шести протестированных химерных векторов только Ad26HVRPtr12.Fluc и Ad26HVRPtr13.Fluc давали результаты, свидетельствующие о том, что модификации их капсида не оказывали отрицательного влияния на продуктивность и инфекционность вектора (см. таблицу). Показатели эффективности вирусного спасения и роста для этих двух векторов, выраженные посредством времени начала образования бляшек и времени, необходимого для достижения полного СРЕ (после трансфекции вирусной ДНК Е1-дополняющих клеток), находились в диапазоне значений, который наблюдали для родительского вектора Ad26.Fluc. Этого не наблюдали в случае остальных протестированных химерных векторов, за исключением Ad26HVRPtr1.Fluc. Более того, из всех протестированных векторов Ad26HVRPtr12.Fluc и Ad26HVRPtr13.Fluc обеспечивали наиболее высокие выходы вирусных частиц (в. ч.) при крупномасштабном продуцировании и очистке. Наконец, хотя все остальные химерные векторы проявляли более высокие показатели отношения в.ч.:ИЕ, чем у родительских Ad26.Fluc, было обнаружено, что для Ad26HVRPtr12.Fluc и Ad26HVRPtr13.Fluc отношение в.ч.:ИЕ изменению не подвергалось.
Четыре остальных химерных вектора, т.е. Ad26HVR5.Fluc, Ad26HVR35.Fluc, Ad26HVR52.Fluc и Ad26HVRPtr1.Fluc, демонстрировали различные степени сниженной производительности и/или инфекционности. Ad26HVR52.Fluc вовсе не был жизнеспособным (т.е. вирусные бляшки нельзя было обнаружить после трансфекции вирусной ДНК), тогда как остальные три вектора успешно подвергались спасению. Из этих трех Ad26HVR5.Fluc и Ad26HVR35.Fluc явно демонстрировали замедленную кинетику спасения и роста, тогда как Ad26HVRPtr1.Fluc, судя по всему, характеризовался приблизительно такой же эффективностью в отношении спасения и роста, как родительский вектор. Характеристика очищенных партий векторов позволяла выявить, что физические выходы вирусных частиц были особенно затронуты в случае Ad26HVR5.Fluc и Ad26HVRPtr1.Fluc, тогда как инфекционность частиц оказалась сильно сниженной у всех трех из них (на что указывало более высокое отношение в. ч.:ИЕ, наблюдаемое для этих векторов).
В заключение необходимо отметить, что Ad26HVRPtr12 и Ad26HVRPtr13, которые являются содержащими химерный гексон векторами, предусматривающими межвидовые аденовирусные замены в последовательности гексонов, демонстрировали хорошие свойства роста и продуцирования, и поэтому их рассматривают в качестве перспективных кандидатов на роль новых вакцинных векторов (с точки зрения технологичности). Четыре остальных содержащих химерный гексон вектора, которые были созданы с применением той же схемы химерного гексона, но с применением других аденовирусов в качестве донора последовательности гексона, демонстрировали менее благоприятные свойства.
Пример 4. Создание аденовирусных векторов Ad26HVRPtr12.Fluc и Ad26HVRPtr13.Fluc.
В этом примере описано создание содержащих химерный гексон кодирующих Fluc аденовирусных векторов, применяемых в экспериментах по иммуногенности, серопревалентности, перекрестной нейтрализации и технологичности, описанных в примерах 6, 8 и 9.
Аденовирусные векторы Ad26HVRPtr12.Fluc (также обозначаемый Ad26C4NVT005) и Ad26HVRPtr13.Fluc (также обозначаемый Ad26C3NVT005), которые содержали последовательности генома аденовирусного вектора SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9 соответственно, получали путем трансфекции соответствующими плазмидами с геномом Ad-вектора (т.е. pAd26.HVRPtr12.luc и pAd26.HVRPtr13.luc соответственно) Е1-дополняющих клеток PER.C6. Перед трансфекцией клеток PER.C6, которые выращивали в качестве адгезивных культур клеток на модифицированной по Дульбекко среде Игла (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 10 мМ MgCl2, плазмиды с геномом Ad-вектора расщепляли с помощью PacI для высвобождения соответствующих геномов аденовирусных векторов из плазмиды. Трансфекции выполняли в соответствии со стандартными процедурами с применением реагента для трансфекции липофектамина (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния). После сбора вирусов, спасенных путем трансфекции, вирусы дополнительно размножали с помощью
- 13 045436 нескольких последовательных циклов инфицирования на культурах клеток PER.C6. Вирусы очищали из собранной неочищенной вирусной биомассы с помощью двухстадийной процедуры ультрацентрифугирования в градиенте плотности хлорида цезия (CsCl), как описано ранее (Havenga et al., Novel replication-incompetent adenoviral B-group vectors: high vector stability and yield in PER.C6 cells, J. Gen. Virol. 87(8):2135-43 (2006)). Титры вирусных частиц (в.ч.) измеряли с помощью ранее описанной спектрофотометрической процедуры (Maizel et al., The polypeptides of adenovirus: I. Evidence for multiple protein components in the virion and a comparison of types 2, 7A, and 12, Virology, 36(1): 115-25 (1968)).
Пример 5. Создание аденовирусных векторов Ad26HVRPtr12.RSVF-2A-GLuc и Ad26HVRPtr13.RSVF-2A-GLuc.
В этом примере описано создание содержащих химерный гексон кодирующих RSVF-2A-GLuc аденовирусных векторов, применяемых в экспериментах по иммуногенности, описанных в примере 7.
Создание аденовирусных векторов Ad26HVRPtr12.RSVF-2A-GLuc (также обозначаемого Ad26C4NVT001) и Ad26HVRPtr13.RSVF-2A-Gluc (также обозначаемого Ad26C3NVT001), которые содержали последовательности генома аденовирусного вектора SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11 соответственно, предусматривало применение вышеупомянутых плазмид pAd26.HVRPtr12.luc (SEQ ID NO: 21; фиг. 2А) и pAd26.HVRPtr13.luc (SEQ ID NO: 22; фиг. 2B) соответственно, а также плазмиды pAdApt26.ApoAI.RSVF-2A-GLuc (SEQ ID NO: 29; фиг. 3).
pAdApt26.ApoAI.RSVF-2A-GLuc представляет собой плазмиду, несущую фрагмент левого края генома из несущего делецию Е1 вектора на основе HAdV-26, который был описан ранее (WO 2007/104792 А2; Abbink et al., 2007), которая в местоположении аденовирусной делеции Е1 дополнительно содержит вышеупомянутую трансгенную кассету экспрессии, кодирующую RSV-Fa2-2A-GLuc (RSVF-2A-GLuc). pAdApt26.ApoAI.RSVF-2A-GLuc конструировали за несколько стадий стандартного генного синтеза и молекулярного клонирования, которые совместно приводили к созданию указанной кассеты RSVF-2A-GLuc и ее вставки в pAdApt26, ранее описанной плазмиды, несущей указанный фрагмент левого края генома Ad-вектора (WO 2007/104792 А2; Abbink et al., 2007).
Аденовирусные векторы Ad26HVRPtr12.RSVF-2A-GLuc и Ad26HVRPtr13.RSVF-2A-GLuc создавали так, как описано далее. Плазмиды pAd26.HVRPtr12.luc и pAd26.HVRPtr13.luc расщепляли рестрикционными ферментами PacI и PsiI с целью высвобождения из этих плазмид определенного делетированного по левому краю фрагмента генома аденовирусного вектора размером 28 т. п. о., содержащего последовательность химерного гексона. Каждым из полученных соответствующих продуктов расщепления по отдельности совместно с расщепленной посредством PacI pAdApt26.ApoAI.RSVF-2A-GLuc трансфицировали E1-дополняющие клетки PER.C6 для обеспечения возможности спасения соответствующих содержащих химерный гексон вирусов, кодирующих RSVF-2A-Gluc, посредством гомологичной рекомбинации между перекрывающимися рестрикционными фрагментами генома вектора, как показано на фиг. 4. Согласно данной стратегии гомологичная рекомбинация происходит в области размером 2,7 т. п. о., представляющей собой перекрытие между фрагментом рестрикции Pad-Pad размером 6,7 т. п. о. в pAdApt26.ApoAI.RSVF-2A-GLuc (фиг. 4, верхняя часть) и фрагментом рестрикции PsiI-PacI размером 28 т. п. о. в pAd26.HVRPtr12.luc или pAd26.HVRPtr13.luc (фиг. 4, нижняя часть). Трансфекции выполняли в соответствии со стандартными процедурами с применением реагента для трансфекции липофектамина (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния). Отдельные выделенные бляшки, обусловленные двумя спасенными вирусами Ad26HVRPtr12.RSVF-2A-GLuc и Ad26HVRPtr13.RSVF-2A-Gluc, дополнительно размножали на клетках PER.C6, а затем очищали и титровали так, как описано в данном документе для векторов Ad26HVRPtr12.FLuc и Ad26HVRPtr13.Fluc в примере 4.
Клеточные и гуморальные иммунные ответы, индуцированные новым аденовирусным вектором.
В примерах 6 и 7 описаны эксперименты, проведенные для оценки иммуногенности новых аденовирусных векторов Ad26HVRPtr12 и Ad26HVRPtr13, полученных в соответствии с данным документом. В этих экспериментах новые векторы оценивали в отношении их способности индуцировать гуморальный и клеточный иммунные ответы к кодируемым вектором (модельным) антигенам у мышей после внутримышечной иммунизации. Векторы тестировали с помощью двух разных антигенов: люциферазы светлячка (FLuc) и RSV-FA2-2A-GLuc (RSVF-2A-GLuc). RSVF-2A-GLuc представляет собой химерный белок, состоящий из фузогенного гликопротеина респираторно-синцитиального вируса штамма А2, пептида 2А вируса ящура и люциферазы Gaussia (GLuc). Каждый вектор сравнивали параллельно с эталонным вектором на основе аденовируса человека типа 26 (HAdV-26, также называемого в данном документе Ad26), несущем ту же самую кодирующую антиген трансгенную кассету. Иммунные ответы на соответствующие антигены измеряли с помощью хорошо известных иммунологических анализов, таких как иммуноферментный спот-анализ (ELISPOT), иммуноферментный анализ (ELISA) и, в случае антигена RSVF-2A-GLuc, анализ нейтрализации респираторного-синцитиального вируса (VNA).
Пример 6. Клеточные иммунные ответы, индуцированные Ad26HVRPtr12.FLuc и Ad26HVRPtr13.FLuc.
Для оценки клеточной иммуногенности новых аденовирусных векторов Ad26HVRPtr12 и Ad26HVRPtr13 мышей Balb/C иммунизировали внутримышечно посредством векторов Ad26.FLuc (положительный контроль), Ad26HVRPtr12 и Ad26HVRPtr13, экспрессирующих FLuc
- 14 045436 (т.е. Ad26HVRPtr12.FLuc и Ad26HVRPtr13.FLuc) или посредством аденовектора, который не кодировал FLuc, т.е. пустого Ad26. Экспрессирующие FLuc векторы тестировали в количестве 109 и 1010 вирусных частиц (в.ч.) на мышь, а пустой вектор Ad26 вводили в количестве 1010 в.ч. Через две недели после иммунизации мышей умерщвляли и выделяли спленоциты (фиг. 5А). Клеточные иммунные ответы определяли анализом ELISPOT ex-vivo, измеряя относительное количество секретирующих IFN-γ клеток после стимуляции спленоцитов в течение ночи с помощью пула 15-мерных перекрывающихся пептидов FLuc (фиг. 5В). Из результатов было видно, что при иммунизации в более высоких дозах (1010) клеточные иммунные ответы, индуцированные векторами Ad26HVRPtr12 и Ad26HVRPtr13, находились в том же диапазоне значений или превышали уровень ответа, наблюдаемый в случае Ad26.Fluc.
В целом, клеточные иммунные ответы, индуцированные экспрессирующим FLuc рекомбинантными аденовирусными векторами Ad26HVRPtr12 и Ad26HVRPtr13 по настоящему изобретению, четко указывали на сильную иммуногенность этих векторов у мышей.
Пример 7. Клеточные и гуморальные иммунные ответы, индуцированные Ad26HVRPtr12.RSVF-2AGLuc и Ad26HVRPtr13.RSVF-2A-GLuc.
Иммуногенность новых аденовирусных векторов Ad26HVRPtr12 и Ad26HVRPtr13 дополнительно оценивали с использованием RSV-Fa2-2A-GLuc (RSVF-2A-GLuc) в качестве кодируемого вектором (модельного) вакцинного антигена. Мышей Balb/C иммунизировали внутримышечно посредством Ad26.RSVF-2A-GLuc (положительный контроль), Ad26HVRPtr12.RSVF-2A-GLuc или Ad26HVRPtr13.RSVF-2A-GLuc в трех различных концентрациях (в количестве каждого из них, составляющем 108, 109 или 1010 в.ч. на мышь) или посредством Ad26.FLuc, Ad26HVRPtr12.FLuc или Ad26HVRPtr13.FLuc в количестве 1010 в.ч. на мышь). Через восемь недель после иммунизации мышей умерщвляли и собирали образцы крови и спленоциты (фиг. 6А). Оценивали различные иммунные параметры так, как описано ниже.
Проводили анализ нейтрализации вируса (VNA) для оценки способности Ad26HVRPtr12.RSVF-2AGLuc и Ad26HVRPtr13.RSVF-2A-GLuc индуцировать выработку нейтрализирующих респираторносинцитиальный вирус антител. На фиг. 6В показаны титры VNA для респираторно-синцитиального вируса штамма А2 (RSV A2), измеренные для образцов сыворотки крови, собранных через восемь недель после иммунизации. Каждая точка обозначает одну мышь; столбцы обозначают среднее по группе, а пунктирная линия соответствует нижнему пределу количественного определения (LLOQ=6,88; средний конечный титр линейных образцов). Из результатов видно, что иммунизации дозой 1010 в.ч. Ad26HVRPtr12.RSVF-2A-GLuc и Ad26HVRPtr13.RSVF-2A-GLuc приводили к титрам нейтрализации RSV A2, схожим с титрами, которые определяли для эталонного вектора Ad26, кодирующего тот же антиген. Титры, индуцированные всеми тремя векторами, Ad26, Ad26HVRPtr12 и Ad26HVRPtr13, кодирующими RSVF-2A-GLuc, обнаруживали преимущественно при наиболее высокой дозе, использованной для иммунизации, составляющей 1010 в.ч. Как и ожидалось, не было обнаружено специфических к RSV A2 ответов на соответствующие аденовекторы, кодирующие люциферазу светлячка.
Индукцию клеточного иммунитета к кодируемому вектором антигену оценивали с помощью анализа ELISPOT, специфичного в отношении RSV-FA2. С этой целью через восемь недель после иммунизации выделяли спленоциты от иммунизированных мышей и стимулировали их в течение ночи 15-мерными перекрывающимися пептидами, охватывающими белок RSV-FA2, и клеточные иммунные ответы определяли с помощью анализа ELISPOT ex vivo, измеряя относительное количество секретирующих IFN-γ клеток. Из данных видно, что антигенспецифические клеточные иммунные ответы, вызванные новыми векторами Ad26HVRPtr12 и Ad26HVRPtr13, кодирующим RSVF-2A-GLuc, имели дозозависимый характер и для каждой дозы соответственно были выше и схожи по величине с ответами, индуцированными эталонным вектором Ad26.RSVF-2A-GLuc (фиг. 6С). Как и ожидалось, в результате измерений не было обнаружено специфических к RSVF-FA2 ответов среди спленоцитов мышей, иммунизированных аденовекторами, кодирующими люциферазу светлячка.
Способность экспрессирующих RSVF-2A-GLuc векторов вызывать выработку специфических к RSV-FA2 антител IgG оценивали с помощью ELISA. Сыворотку крови, собранную спустя 8 недель после иммунизации у мышей, иммунизированных Ad26 (положительный контроль), Ad26HVRPtr12, Ad26HVRPtr13, экспрессирующими трансген RSVF-2A-GLuc или люциферазу светлячка (контроль), тестировали посредством ELISA в отношении IgG к RSV-FA2. В частности, с помощью данного анализа ELISA обнаруживали антитела IgG, способные связываться с рекомбинантным стабильным белком RSV-F RSV-FA2 в конформации до слияния (pre-RSV-F). Из результатов видно, что Ad26HVRPtr12.RSVF-2A-GLuc и Ad26HVRPtr13.RSVF-2A-GLuc дозозависимым образом вызывали выработку титров специфических к pre-RSV-F антител IgG, схожих с титрами, выработка которых была индуцирована посредством Ad26.RSVF-2A-GLuc (фиг. 6D). Как и ожидалось, титры антител, специфичных к RSV-FA2, в сыворотке крови мышей, иммунизированных векторами, кодирующими только люциферазу светлячка, обнаружены не были. На графике изображены титры по результатам ELISA с IgG, рассчитанные как конечные показатели титра (log10). Каждая точка обозначает одну мышь; столбцы обозначают среднее по группе, а пунктирная линия означает нижний предел количественного определения
- 15 045436 (LLOQ), рассчитанный как log10 1,36.
В целом, из данных видно, что новые аденовирусные векторы Ad26HVRPtr12 и Ad26HVRPtr13 индуцировали сильные клеточный и гуморальный иммунные ответы на кодируемые антигены, которые были схожи по величине или характеризовались более высоким уровнем, чем ответы, которые индуцировались эталонным вектором на основе HAdV-26. Эти иммунные ответы четко указывали на сильную иммуногенность аденовирусных векторов Ad26HVRPtr12 и Ad26HVRPtr13 у мышей.
Пример 8. Оценка серологической перекрестной нейтрализации среди новых и существующих аденовирусных векторов.
Для обеспечения своей потенциальной применимости в качестве новых аденовирусных вакцинных векторов новые аденовирусные векторы Ad26HVRPtr12 и Ad26HVRPtr13, созданные в соответствии с настоящим документом, предпочтительно будут серологически отличаться от существующих аденовирусных векторов, которые в настоящее время уже находятся в разработке в качестве вакцинных векторов, таких как векторы на основе аденовируса человека серотипов HAdV-5 и HAdV-35. Поэтому проводили тесты перекрестной нейтрализации среди новых аденовирусных векторов Ad26HVRPtr12 и Ad26HVRPtr13 и нескольких существующих векторов на основе HAdV-4, HAdV-5, HAdV-26 и HAdV-35. С этой целью антисыворотку мышей, каждая из которых была индуцирована в ответ на один из этих аденовирусных векторов, тестировали в отношении каждого из данных различных векторов в анализе нейтрализации аденовируса. Антисыворотку мышей, применяемую для этого анализа, собирали у мышей Balb/C через две или восемь недель после их иммунизации посредством 1010 векторных частиц на мышь. Анализ нейтрализации аденовируса проводили так, как описано ранее (Spangers et al., 2003. J. Clin. Microbiol. 41:5046-5052). Вкратце, начиная с разведения 1:16, сыворотку крови серийно разводили в 2 раза, затем предварительно смешивали с аденовирусными векторами, экспрессирующими люциферазу светлячка (FLuc), а затем инкубировали в течение ночи с клетками А549 (при множественности инфицирования, составляющей 500 вирусных частиц на клетку). Уровни активности люциферазы в лизатах инфицированных клеток, измеренные через 24 ч после инфицирования, представляли собой эффективность инфицирования вектором. Титры нейтрализации к данному вектору определяли как наибольшее разведение сыворотки, способное понижать эффективность инфицирования вектором на 90%. Титры нейтрализации условно разделяли на следующие категории: <16 (нейтрализация отсутствовала), 16-200, 200-2000 и >2000.
Результаты демонстрировали отсутствие или наличие очень низкого уровня перекрестной нейтрализации среди протестированных векторов (фиг. 7). Незначительную перекрестную нейтрализацию наблюдали у Ad26HVRPtr12 с векторами Ad26 и Ad26HVRPtr13 и у Ad26HVRPtr13 с векторами Ad26 и Ad26HVRPtr12. Титры реципрокной перекрестной нейтрализации, наблюдаемые для этих векторов, были значительно ниже, чем соответствующие титры гомологичной нейтрализации, полученные для этих же векторов. Важно отметить, что новые векторы Ad26HVRPtr12 и Ad26HVRPtr13 не демонстрировали перекрестной нейтрализации с векторами на основе аденовируса человека, включенными в тестируемую панель, т.е. Ad35, Ad5 и Ad4, за исключением Ad26, у которого перекрестную нейтрализацию наблюдали на очень низком уровне. Следовательно, каждый из новых аденовирусных векторов Ad26HVRPtr12 и Ad26HVRPtr13 потенциально можно применять в сочетании с одним или несколькими из этих или других отдельных аденовирусных векторов при последовательных иммунизациях, например, в контексте режима гетерологичной прайм-буст вакцинации или, альтернативно или дополнительно, в контексте серии двух или более последовательных режимов вакцинации против различных заболеваний или антигенов.
Пример 9. Серопревалентность новых аденовирусных векторов в популяциях людей.
Важным для их потенциального применения в качестве эффективных вакцинных векторов является то, что описанные в данном документе новые аденовирусные векторы не сдерживаются высокими уровнями предсуществующего противовекторного гуморального иммунитета в целевых для вакцины популяциях. По этой причине каждый из векторов Ad26HVRPtr12 и Ad26HVRPtr13 оценивали на его серопревалентность в образцах сыворотки крови, полученных от группы из 200 взрослых человек в возрасте от 18 до 55 лет, проживающих в Соединенных Штатах (США) и Европейском союзе (ЕС). Векторы тестировали в отношении нейтрализации образцами сыворотки крови человека, проводя стандартный анализ нейтрализации аденовируса, который проводили в примере 7 и который был описан ранее (Spangers et al., 2003. J. Clin. Microbiol. 41:5046-5052). Вкратце, начиная с разведения 1:16, сыворотку крови серийно разводили в 2 раза, затем предварительно смешивали с аденовирусными векторами, экспрессирующими люциферазу светлячка (FLuc), а затем инкубировали в течение ночи с клетками А549 (при множественности инфицирования, составляющей 500 вирусных частиц на клетку). Уровни активности люциферазы в лизатах инфицированных клеток, измеренные через 24 ч после инфицирования, представляли собой эффективность инфицирования вектором. Титры нейтрализации к данному вектору определяли как наибольшее разведение сыворотки, способное понижать эффективность инфицирования вектором на 90%. Титры нейтрализации условно разделяли на следующие категории: <16 (нейтрализация отсутствовала), 16-300, 300-1000, 1000-4000 и >4000.
Из результатов видно, что аденовирусные векторы Ad26HVRPtr12 и Ad26HVRPtr13 характеризо
- 16 045436 вался значительно меньшей серопревалентностью у исследованных субъектов-людей, чем контрольный вектор Ad5, и схожей с эталонным вектором Ad26 серопревалентностью у этих субъектов (фиг. 8). Более того, положительные титры нейтрализации, которые наблюдали в отношении новых векторов Ad26HVRPtr12 и Ad26HVRPtr13, были, в целом, довольно низкими, в основном не выше 300. Напротив, большинство обнаруженных положительных титров нейтрализации как в отношении Ad26, так и в отношении Ad5 превышали 300.
В целом, приведенные выше данные указывали на то, что предсуществующий гуморальный противовекторный иммунитет к векторам Ad26HVRPtr12 и Ad26HVRPtr13 можно считать низким в оцененных целевых для вакцины популяциях, что позволяло предположить, что эти векторы потенциально могут являться эффективными вакцинными векторами в этих популяциях.
Пример 10. Продуктивность аденовирусного вектора в суспензии клеток PER.C6.
Аденовирусные векторы, подлежащие применению в клинических испытаниях и за их пределами, должны предусматривать легкое получение высоких титров в масштабируемой бессывороточной платформе для получения аденовирусов. Такой платформой являются адаптированные к суспензии клетки PER.C6®, также называемые данном документе суспендированными клетками PER.C6 или SPER.C6, поскольку было показано, что они поддерживают крупномасштабное производство аденовирусных векторов в биореакторах, обеспечивая большие количества препаратов клинического класса на основе векторов с высоким титром, например предусматривающих делецию Е1 векторов на основе HAdV-26 или HAdV-35 (ЕР 2536829 В1, ЕР 2350268 В1).
В качестве первоначальной оценки того, будут ли описанные в данном документе новые векторы подходить для способов производства на основе клеток SPER.C6, проводили мелкомасштабные эксперименты по изучению продуктивности вектора на клетках SPER.C6, культивируемых в шейкерных колбах. Такие эксперименты по изучению продуктивности проводили с помощью кодирующих Fluc версий новых химерных векторов Ad26HVRPtr12 и Ad26HVRPtr13 (описанных в примере 4). В качестве эталонного контроля использовали вектор Ad26.Fluc на основе HAdV-26. Суспензию культур клеток PER.C6, высеянных в шейкерные колбы с плотностью 1x106 клеток/мл в общем объеме 10 мл среды PERMEXCIS® (доступной от Lonza) с добавлением 4 мМ L-глутамина (Lonza), инфицировали различными векторами с различными отношениями вирусных частиц (в.ч.) на клетку, а затем инкубировали в течение 4 дней. Различные отношения в.ч. на клетку, применяемые для инфицирования, составляли 70, 150 и 900. Каждый день собирали образцы инфицированных культур клеток и определяли титры в.ч. в этих образцах с помощью протокола на основе количественной ПЦР (qPCR), который предусматривал использование праймеров и зонда, специфичных к промотору CMV (который присутствовал во всех протестированных векторах). Этот протокол предусматривал обработку ДНКазой тестируемых образцов перед проведением qPCR для удаления любой свободной векторной ДНК (т.е. векторных геномов, которые не были упакованы в вирусные частицы).
Результаты в отношении продуктивности, полученные для химерных векторов Ad26HVRPtr12.FLuc и Ad26HVRPtr13.Fluc, показаны на фиг. 9. Два химерных вектора обеспечивали титры в.ч., которые являлись эквивалентными титрам, полученным для родительского эталонного вектора Ad26.Fluc. Эти результаты демонстрировали хорошую продуктивность для каждого из новых химерных векторов в модели бессывороточной суспензионной культуры на основе SPER.C6.
В совокупности, результаты исследований гуморального и клеточного иммунных ответов на новые рекомбинантные аденовирусные векторы по настоящему изобретению, которые представлены выше, ясно указывали на сильную иммуногенность этих векторов у мышей. Кроме того, было продемонстрировано, что векторы не индуцировали или индуцировали лишь в крайне незначительной степени перекрестные ответы нейтрализующих антител в отношении определенных существующих векторов-кандидатов аденовирусных вакцин (например, Ad26 и Ad35) или наоборот, а также индуцировали лишь очень низкий перекрестный нейтрализующий ответ антител друг к другу. Более того, для новых векторов наблюдали низкую серопревалентность у людей. Наконец, новые векторы можно легко получать с высокими показателями выхода. Сочетание низкой серопревалентности, высокой иммуногенности и продуктивности позволяет предположить, что новые аденовирусные векторы по настоящему изобретению могут быть пригодны в качестве новых кандидатов на вакцинный вектор к различным патогенам и дополнительно могут быть применимы в генной терапии и/или диагностике.
Специалистам в данной области техники будет понятно, что в описанные выше варианты осуществления могут быть внесены изменения без отступления от их общего изобретательского замысла. Таким образом, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретными раскрытыми вариантами осуществления, но предусматривает охват модификаций в рамках сущности и объема настоящего изобретения, определенных настоящим раскрытием.
Claims (9)
1. Аденовирусный вектор HAdV-26, включающий:
а) делецию Е1 и E3;
б) замену на Е4 orf6 аденовируса-5 человека (HAdV-5);
в) последовательность, кодирующую гипервариабельную область гексона, содержащую SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, или гексон, состоящий из SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4.
2. Аденовирусный вектор по п.1, где аденовирусный вектор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6.
3. Аденовирусный вектор по любому из пп.1, 2, где аденовирусный вектор дополнительно содержит по меньшей мере один трансген.
4. Аденовирусный вектор по любому из пп.1-3, где трансген расположен в области делеции Е1, в области делеции E3 и/или на участке, прилегающем к правому инвертированному концевому повтору (rITR).
5. Рекомбинантная клетка, содержащая аденовирусный вектор по любому из пп.1-4.
6. Способ получения аденовирусного вектора, включающий:
(a) выращивание рекомбинантной клетки по п.5 в условиях, обеспечивающих продуцирование аденовирусного вектора; и (b) выделение аденовирусного вектора из рекомбинантной клетки.
7. Иммуногенная композиция, содержащая аденовирусный вектор по любому из пп.1-4 и фармацевтически приемлемый носитель.
8. Способ индукции иммунного ответа у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту иммуногенной композиции по п.7.
9. Способ получения иммуногенной композиции, включающий комбинирование аденовирусного вектора по любому из пп.1-4 с фармацевтически приемлемым носителем.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP17199350.4 | 2017-10-31 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045436B1 true EA045436B1 (ru) | 2023-11-24 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11459583B2 (en) | Adenovirus vectors and uses thereof | |
| JP7366014B2 (ja) | アデノウイルス及びその用途 | |
| JP7285833B2 (ja) | アデノウイルス及びその用途 | |
| EP3703722B1 (en) | Adenovirus and uses thereof | |
| EA045436B1 (ru) | Аденовирусные векторы и пути их применения | |
| EA044526B1 (ru) | Аденовирус и пути его применения | |
| EA044813B1 (ru) | Аденовирус и его применения | |
| EA042952B1 (ru) | Аденовирус и пути его применения | |
| US20220372515A1 (en) | Adenovirus vectors and uses thereof | |
| BR112020008198A2 (pt) | adenovírus e seus usos |