BR112020006661A2 - terapias de genes para distúrbios lipossomais - Google Patents

terapias de genes para distúrbios lipossomais Download PDF

Info

Publication number
BR112020006661A2
BR112020006661A2 BR112020006661-3A BR112020006661A BR112020006661A2 BR 112020006661 A2 BR112020006661 A2 BR 112020006661A2 BR 112020006661 A BR112020006661 A BR 112020006661A BR 112020006661 A2 BR112020006661 A2 BR 112020006661A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
nucleic acid
isolated nucleic
sequence
protein
seq
Prior art date
Application number
BR112020006661-3A
Other languages
English (en)
Inventor
Asa Abeliovich
Laura Heckman
Herve RHINN
Original Assignee
Prevail Therapeutics, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Prevail Therapeutics, Inc. filed Critical Prevail Therapeutics, Inc.
Publication of BR112020006661A2 publication Critical patent/BR112020006661A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/761—Adenovirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/23—Parvoviridae, e.g. feline panleukopenia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0085—Brain, e.g. brain implants; Spinal cord
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/864—Parvoviral vectors, e.g. parvovirus, densovirus
    • C12N15/8645—Adeno-associated virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/20—Animals treated with compounds which are neither proteins nor nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vectore
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/48—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating transport or export of RNA, e.g. RRE, PRE, WPRE, CTE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/50—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating RNA stability, not being an intron, e.g. poly A signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01045—Glucosylceramidase (3.2.1.45), i.e. beta-glucocerebrosidase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)

Abstract

A presente invenção refere-se, em alguns aspectos, a composições e métodos para o tratamento de doenças associadas com a função lisossomal aberrante, por exemplo, o mal de Parkinson (PD) e a doença de Gaucher. Em algumas modalidades, a invenção provê construtos de expressão que compreendem um transgene que codifica a beta-Glucocerebrosidase (GBA) ou uma porção da mesma sozinho ou em combinação com um ou mais genes associados ao PD. Em algumas modalidades, a invenção provê métodos de mal de Parkinson mediante a administração de tais construtos de expressão a um indivíduo com necessidade dos mesmos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “TERA- PIAS DE GENES PARA DISTÚRBIOS LIPOSSOMAIS”.
PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS
[0001] O presente pedido de patente reivindica o benefício sob 35 U.S.C.119(e) da data de depósito dos Pedidos de Patente Provisórios U.S. números de série 62/567.296, depositado em 03 de outubro de 2017, intitulado "TERAPIAS DE GENES PARA DISTÚRBIOS LISOS- SOMAIS", 62/567.311, depositado em 03 de outubro de 2017, intitulado "TERAPIAS DE GENES PARA DISTÚRBIOS LISOSSOMAIS", 62/567.319, depositado em 03 de outubro de 2017, intitulado "TERA- PIAS DE GENES PARA DISTÚRBIOS LISOSSOMAIS", 62/567.301, depositado em 03 de outubro de 2018, intitulado "TERAPIAS DE GE- NES PARA DISTÚRBIOS LISOSSOMAIS", e 62/567.310, depositado em 03 de outubro de 2017, intitulado "TERAPIAS DE GENES PARA DISTÚRBIOS LISOSSOMAIS", em que os teores integrais de cada pe- dido de patente são incorporados ao presente documento a título de referência.
ANTECEDENTES
[0002] A doença de Gaucher é um erro de nascença raro do meta- bolismo de glicosesfingolipídio devido à deficiência de ácido de B- glu- cocerebrosidase lisossomal (Gcase, "GBA"). Os pacientes sofrem dos sintomas que não de CNS e averiguações que incluem a hepatospleno- medglia, a insuficiência de medula óssea que conduz à pancitopenia, dis- túrbios do pulmão e fibrose, e defeitos nos ossos. Além disso, um nú- mero significativo de pacientes sofre de manifestações neurológicas, in- cluindo movimentos e esgazear dos olhos sacádicos defeituosos, con- vulsões, déficits cognitivos, desenvolvimento tardio, e distúrbios do mo- vimento incluindo o mal de Parkinson.
[0003] Existem várias terapêuticas destinadas a combater a doença peri- férica e as principais manifestações clínicas da medula óssea hematopoiética e das vísceras, incluindo as terapias de substituição de enzima tal como des- crito a seguir, fármacos de moléculas pequenas do tipo chaperone que se ligam a Gcase defeituoso e melhoram a estabilidade, e a terapia de redução de substrato que bloqueia a produção de substrato que se acu- mula na doença de Gaucher que conduz aos sintomas e às averigua- ções. No entanto, outros aspectos da doença de Gaucher (em particular aqueles que afetam o esqueleto e o cérebro) parecem refratários ao tra- tamento.
SUMÁRIO
[0004] Além dos pacientes da doença de Gaucher (que possuem mutações em ambos os alelos cromossomais de gene GBA1), os paci- entes com mutações em somente um alelo de GBA1 correm um risco altamente aumentado de mal de Parkinson (PD). A gravidade dos sin- tomas de PD - que incluem a dificuldade em caminhar, um tremor em repouso, a rigidez, e frequentemente a depressão, dificuldades de sono e declínio cognitivo - é correlacionada com o grau de redução da ativi- dade da enzima. Desse modo, os pacientes da doença de Gaucher têm O Curso mais grave, ao passo que o paciente com uma única mutação suave em GBA1 tem tipicamente um curso mais benigno. Os portadores de mutação também correm um risco elevado de outros distúrbios rela- cionados ao PD, incluindo a demência de corpo de Lewy, caracterizada pela disfunção executiva, psicose e um distúrbio do movimento tal como o PD, e a atrofia de múltiplos sistemas, com diminuição motora e cogni- tiva características. Não existe nenhuma terapia que altera o curso ine- xorável desses distúrbios.
[0005] Os déficits em enzimas tais como Gcase (por exemplo, o pro- duto de gene do gene de GBA1), assim como as variantes comuns em muitos genes implicados na função de lisossoma ou no tráfico de macromoléculas ao lisossoma (por exemplo, a Proteína de Membrana Lisossomal 1 (LIMP), tam- bém indicada como SCARB2), foram associados com o risco aumentado de
PD. A invenção é baseada, em parte, nos construtos de expressão (por exemplo, vetores) que codificam um ou mais genes associados ao PD, por exemplo, Gcase, GBA2, prosaposina, progranulina, LIMP2, GALC, CTSB, SMPD1, GCH1, RAB7, VPS35, IL-34, TREM2, TMEM106B, ou uma combinação de qualquer um dos citados acima (ou porções dos mesmos). Em algumas modalidades, as combinações dos produtos de genes descritos no presente documento agem em conjunto (por exem- plo, sinergicamente) para reduzir um ou mais sinais e sintomas do PD quando expressas em um indivíduo.
[0006] Por conseguinte, em alguns aspectos, a invenção provê um ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica um Gcase (por exemplo, o produto de gene do gene de GBA1). Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado compreende uma sequência de codificação de Gcase que é otimizada com códons (por exemplo, otimizada com códons para a expressão em células de mamí- feros, por exemplo, células humanas). Em algumas modalidades, a se- quência de ácidos nucleicos que codifica Gcase codifica uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos tal como indicado na SEQ ID NO: 14 (por exemplo, tal como indicado na Sequência de Refe- rência de NCBI NP 000148.2). Em algumas modalidades, o ácido nu- cleico isolado compreende a sequência indicada na SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades o construto de expressão compreende repetições de terminais invertidos (ITRs) de vírus adenoassociados (AAV), por exemplo, AAV ITRs que flanqueiam a sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína Gcase.
[0007] Em alguns aspectos, a invenção provê um ácido nucleico iso- lado que compreende um construto de expressão que codifica Prosaposina (por exemplo, o produto de gene do gene de PSAP). Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado compreende uma sequência de codificação de prosapo- sina que é otimizada com códons (por exemplo, otimizada com códons para a expressão em células de mamíferos, por exemplo, células humanas). Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos que codifica prosaposina codifica uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos tal como indicado na SEQ ID NO: 16 (por exemplo, tal como indicado na sequência de referência de NCBI NP. 002769.1). Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado compreende a sequên- cia indicada na SEQ ID NO: 17. Em algumas modalidades o construto de expressão compreende repetições terminais invertidas (ITRs) de ví- rus adenoassociados (AAV), por exemplo AAV ITRs que flanqueiam a sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína prosaposina.
[0008] Em alguns aspectos, a invenção provê um ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica LIMP2/SCARB?2 (por exemplo, o produto de gene do gene de SCARB2). Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado compreende uma sequência de codificação de SCARB?2 que é otimizada com códons (por exemplo, otimizada com códons para a expressão em células de mamí- feros, por exemplo, células humanas). Em algumas modalidades, a se- quência de ácidos nucleicos que codifica LIMP2/SCARB?2 codifica uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos tal como in- dicado na SEQ ID NO: 18 (por exemplo, tal como indicado na sequência de referência de NCBI NP 005497.1). Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado compreende a sequência indicada na SEQ ID NO: 29. Em algumas modalidades o construto de expressão compre- ende repetições de terminais invertidos (ITRs) de vírus adenoassocia- dos (AAV), por exemplo, AAV ITRs que flanqueiam a sequência de áci- dos nucleicos que codifica a proteína SCARB?2.
[0009] Em alguns aspectos, a invenção provê um ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica a proteína GBA2 (por exemplo, o produto de gene do gene de GBA2). Em algumas modalida- des, o ácido nucleico isolado compreende uma sequência de codificação de
GBA? que é otimizada com códons (por exemplo, otimizada com códons para a expressão em célula de mamíferos, por exemplo, células huma- nas). Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos que codifica o GBA?2 codifica uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos tal como indicado na SEQ ID NO: 30 (por exemplo, tal como indicado na sequência de referência de NCBI NP. 065995.1). Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado compreende a sequên- cia indicada na SEQ ID NO: 31. Em algumas modalidades o construto de expressão compreende repetições terminais invertidas (ITRs) de ví- rus adenoassociados (AAV), por exemplo, AAV ITRs que flanqueiam a sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína GBA2.
[0010] Em alguns aspectos, a invenção provê um ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica a pro- teína GALC (por exemplo, o produto de gene do gene de GALC). Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado compreende uma se- quência de codificação de GALC que é otimizada com códons (por exemplo, otimizada com códons para a expressão em células de mamí- feros, por exemplo, células humanas). Em algumas modalidades, a se- quência de ácidos nucleicos que codifica o GALC codifica uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos tal como indicado na SEQ ID NO: 33 (por exemplo, tal como indicado na sequência de refe- rência de NCBI NP 000144.2). Em algumas modalidades, o ácido nu- cleico isolado compreende a sequência indicada na SEQ ID NO: 34. Em algumas modalidades o construto de expressão compreende repetições terminais invertidas (ITRs) de vírus adenoassociados (AAV), por exem- plo, AAV ITRs que flanqueiam a sequência de ácidos nucleicos que co- difica a proteína GALC.
[0011] Em alguns aspectos, a invenção provê um ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica a pro- teína CTSB (por exemplo, o produto de gene do gene de CTSB). Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado compreende uma se- quência de codificação de CTSB que é otimizada com códons (por exemplo, otimizada com códons para a expressão em células de mamí- feros, por exemplo, células humanas). Em algumas modalidades, a se- quência de ácidos nucleicos que codifica o CTSB codifica uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos tal como indicado na SEQ ID NO: 35 (por exemplo, tal como indicado na sequência de refe- rência de NCBI NP 001899.1). Em algumas modalidades, o ácido nu- cleico isolado compreende a sequência indicada na SEQ ID NO: 36. Em algumas modalidades, o construto de expressão compreende repeti- ções terminais invertidas (ITRs) de vírus adenoassociados (AAV), por exemplo, AAV ITRs que flanqueiam a sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína CTSB.
[0012] Em alguns aspectos, a invenção provê um ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica a pro- teína SMPD1 (por exemplo, o produto de gene do gene de SMPD1). Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado compreende uma se- quência de codificação de SMPD1 que é otimizada com códons (por exemplo, otimizada com códons para a expressão em células de mamí- feros, por exemplo, células humanas). Em algumas modalidades, a se- quência de ácidos nucleicos que codifica o SMPD1 codifica uma prote- Ína que compreende uma sequência de aminoácidos tal como indicado na SEQ ID NO: 37 (por exemplo, tal como indicado na sequência de referência de NCBI NP 000534.3). Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado compreende a sequência indicada na SEQ ID NO: 38. Em algumas modalidades o construto de expressão compreende repe- tições terminais invertidas (ITRs) de vírus adenoassociados (AAV), por exemplo, AAV ITRs que flanqueiam a sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína SMPD1.
[0013] Em alguns aspectos, a invenção provê um ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica a pro- teina GCH1 (por exemplo, o produto de gene do gene de GCH1). Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado compreende uma se- quência de codificação de GCH1 que é otimizada com códons (por exemplo, otimizada com códons para a expressão em células de mamí- feros, por exemplo, células humanas). Em algumas modalidades, a se- quência de ácidos nucleicos que codifica o GCH1 codifica uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos tal como indicado na SEQ ID NO: 45 (por exemplo, tal como indicado na sequência de refe- rência de NCBI NP 000534.3). Em algumas modalidades, o ácido nu- cleico isolado compreende a sequência indicada na SEQ ID NO: 46. Em algumas modalidades o construto de expressão compreende repetições terminais invertidas (ITRs) de vírus adenoassociados (AAV), por exem- plo, AAV ITRs que flanqueiam a sequência de ácidos nucleicos que co- difica a proteína GCH1.
[0014] Em alguns aspectos, a invenção provê um ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica a pro- teína RAB7L (por exemplo, o produto de gene do gene de RAB7L). Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado compreende uma sequên- cia de codificação de RAB7L que é otimizada com códons (por exemplo, otimizada com códons para a expressão em células de mamíferos, por exemplo, células humanas). Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos que codifica o RAB7L codifica uma proteína que compre- ende uma sequência de aminoácidos tal como indicado na SEQ ID NO: 47 (por exemplo, tal como indicado na sequência de referência de NCBI NP 003920.1). Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado com- preende a sequência indicada na SEQ ID NO: 48. Em algumas modalida- des o construto de expressão compreende repetições terminais invertidas (ITRs) de vírus adenoassociados (AAV), por exemplo AAV ITRs que flan- queiam a sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína RAB7L.
[0015] Em alguns aspectos, a invenção provê um ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica a pro- teína VPS35 (por exemplo, o produto de gene do gene de VPS35). Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado compreende uma se- quência de codificação de VPS35 que é otimizada com códons (por exemplo, otimizada com códons para a expressão em células de mamí- feros, por exemplo, células humanas). Em algumas modalidades, a se- quência de ácidos nucleicos que codifica o VPS35 codifica uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos tal como indicado na SEQ ID NO: 49 (por exemplo, tal como indicado na sequência de refe- rência de NCBI NP 060676.2). Em algumas modalidades, o ácido nu- cleico isolado compreende a sequência indicada na SEQ ID NO: 50. Em algumas modalidades o construto de expressão compreende repetições terminais invertidas (ITRs) de vírus adenoassociados (AAV), por exem- plo AAV ITRs que flanqueiam a sequência de ácidos nucleicos que co- difica a proteína VPS35.
[0016] Em alguns aspectos, a invenção provê um ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica a pro- teína IL-34 (por exemplo, o produto de gene do gene de IL34). Em algu- mas modalidades, o ácido nucleico isolado compreende uma sequência de codificação de IL-34 que é otimizada com códons (por exemplo, oti- mizada com códons para a expressão em células de mamíferos, por exemplo, células humanas). Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos que codifica o IL-34 codifica uma proteína que compre- ende uma sequência de aminoácidos tal como indicado na SEQ ID NO: 55 (por exemplo, tal como indicado na sequência de referência de NCBI NP 689669.2). Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado compreende a sequência indicada na SEQ ID NO: 56. Em algumas mo- dalidades o construto de expressão compreende repetições terminais invertidas (ITRs) de vírus adenoassociados (AAV), por exemplo AAV
ITRs que flanqueiam a sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína IL. 34.
[0017] Em alguns aspectos, a invenção provê um ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica a pro- teina TREM2 (por exemplo, o produto de gene do gene de TREM). Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado compreende uma se- quência de codificação de TREM2 que é otimizada com códons (por exemplo, otimizada com códons para a expressão em células de mamí- feros, por exemplo, células humanas). Em algumas modalidades, a se- quência de ácidos nucleicos que codifica o TREM2 codifica uma prote- íÍna que compreende uma sequência de aminoácidos tal como indicado na SEQ ID NO: 57 (por exemplo, tal como indicado na sequência de referência de NCBI NP 061838.1). Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado compreende a sequência indicada na SEQ ID NO: 58. Em algumas modalidades o construto de expressão compreende repe- tições terminais invertidas (ITRs) de vírus adenoassociados (AAV), por exemplo AAV ITRs que flanqueiam a sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína TREM?2.
[0018] Em alguns aspectos, a invenção provê um ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica a pro- teina TMEM106B (por exemplo, o produto de gene do gene de TMEM106B). Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado com- preende uma sequência de codificação de TMEM106B que é otimizada com códons (por exemplo, otimizada com códons para a expressão em células de mamíferos, por exemplo, células humanas). Em algumas mo- dalidades, a sequência de ácidos nucleicos que codifica o TMEM106B codifica uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos tal como indicado na SEQ ID NO: 63 (por exemplo, tal como indicado na sequência de referência de NCBI NP 060844.2). Em algumas mo- dalidades, o ácido nucleico isolado compreende a sequência indicada na SEQ ID NO:64. Em algumas modalidades o construto de expressão compreende repetições terminais invertidas (ITRs) de vírus adenoasso- ciados (AAV), por exemplo AAV ITRs que flanqueiam a sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína TMEM106B.
[0019] Em alguns aspectos, a invenção provê um ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica a pro- granulina (por exemplo, o produto de gene do gene de PGRN). Em al- gumas modalidades, o ácido nucleico isolado compreende uma sequên- cia de codificação de prosaposina que é otimizada com códons (por exemplo, otimizada com códons para a expressão em células de mamí- feros, por exemplo, células humanas). Em algumas modalidades, a se- quência de ácidos nucleicos que codifica a progranulina (PRGN) codi- fica uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos tal como indicado na SEQ ID NO: 67 (por exemplo, tal como indicado na sequência de referência de NCBI NP 002078.1). Em algumas modali- dades, o ácido nucleico isolado compreende a sequência indicada na SEQ ID NO:68. Em algumas modalidades o construto de expressão compreende repetições terminais invertidas (ITRs) de vírus adenoasso- ciados (AAV), por exemplo AAV ITRs que flanqueiam a sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína prosaposina.
[0020] Em alguns aspectos, a invenção provê um ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica um primeiro produto de gene e um segundo produto de gene, em que cada produto de gene é selecionado independentemente de produtos de ge- nes, ou porções dos mesmos, indicados na Tabela 1.
[0021] Em algumas modalidades, um primeiro produto de gene ou um segundo produto de gene são uma proteína Gcase, ou uma porção da mesma. Em algumas modalidades, um primeiro produto de gene é uma proteína Gcase e um segundo produto de gene é selecionado de GBA?2, prosaposina, progranulina, LIMP2, GALC, CTSB, SMPD1,
GCH1, RAB7, VPS35, IL-34, TREM2 e TMEM106B.
[0022] Em algumas modalidades, um construto de expressão tam- bém codifica um ácido nucleico intermediário (por exemplo, shRNA, MIRNA, dsRNA, etc.). Em algumas modalidades, um ácido nucleico in- termediário inibe a expressão de a-Sinucleina (a-Syn). Em algumas mo- dalidades, um ácido nucleico intermediário que visa a a-Sinucleina com- preende uma sequência indicada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 20-25. Em algumas modalidades, um ácido nucleico intermediário que visa a a-Sinucleina se liga (por exemplo, hibridiza com) uma sequência indicada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 20-25.
[0023] Em algumas modalidades, um ácido nucleico intermediário inibe a expressão de TMEM106B. Em algumas modalidades, um ácido nucleico intermediário que visa TMEM106B compreende uma sequên- cia indicada na SEQ ID NO: 64 ou 65. Em algumas modalidades, um ácido nucleico intermediário que visa TMEM106B se liga a (por exem- plo, hibridiza com) uma sequência indicada nas SEQ ID NOs: 64 ou 65.
[0024] Em algumas modalidades, um construto de expressão com- preende ainda um ou mais promotores. Em algumas modalidades, um promotor é um promotor de beta actina de galinha (CBA), um promotor de CAG, um promotor de CD68, ou um promotor de JeT. Em algumas modalidades, um promotor é um promotor de pol Il de RNA (por exem- plo, ou um promotor de pol Ill de RNA (por exemplo, U6, etc.).
[0025] Em algumas modalidades, um construto de expressão com- preende ainda um sítio de entrada ribossomal interno (IRES). Em algu- mas modalidades, um IRES fica localizado entre um primeiro produto de gene e um segundo produto de gene.
[0026] Em algumas modalidades, um construto de expressão com- preende ainda uma sequência de codificação de peptídeo autoclivável. Em algumas modalidades, um peptídeo autoclivável é um peptídeo de T2A.
[0027] Em algumas modalidades, um construto de expressão com- preende duas sequências de repetições terminais invertidas (ITRs) de vírus adenoassociado (AAV). Em algumas modalidades, as sequências de ITR flanqueiam um primeiro produto de gene e um segundo produto de gene (por exemplo, são arranjados tal como segue das extremidade 5' à extremidade 3": ITR-primeiro produto de gene-segundo produto de gene-ITR). Em algumas modalidades, uma das sequências de ITR de um ácido nucleico isolado não possui um sítio de resolução terminal fun- cional (trs). Por exemplo, em algumas modalidades, uma das ITRs é uma AITR.
[0028] A invenção refere-se, em alguns aspectos, aos vetores do rAAV que compreendem um ITR que tem uma região “D” modificada (por exemplo, uma sequência que seja modificada relativo ao selvagem- tipo AAV2 ITR, NO. SEQ de D do ID: 29). Em algumas modalidades, a ITR que tem a região modificada de D é o 5' ITR do vetor do rAAV. Em algumas modalidades, uma região “D” modificada compreende uma se- quência de "S", por exemplo tal como indicado na SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a ITR que tem a região “D” modificada é o 3' ITR do vetor do rAAV. Em algumas modalidades, uma região “D” modificada compreende um 3'ITR em que a região de "D" é posicionada no fim 3' da ITR (por exemplo, no fim exterior ou terminal da ITR relativo à inser- ção do transgene do vetor). Em algumas modalidades, uma região “D” modificada compreende uma sequência tal como indicado na SEQ ID NO: 26 ou 27.
[0029] Em algumas modalidades, um ácido nucleico isolado (por exemplo, um vetor de rAAV) compreende uma região TRY. Em algumas modalidades, uma região TRY compreende a sequência indicada na SEQ ID NO: 28.
[0030] Em algumas modalidades, um ácido nucleico isolado descrito pela invenção compreende ou consiste em, ou codifica em um peptídeo que tem a sequência indicada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-78.
[0031] Em alguns aspectos, a invenção provê um vetor que com- preende um ácido nucleico isolado tal como descrito pela invenção. Em algumas modalidades, um vetor é um plasmídeo, ou um vetor viral. Em algumas modalidades, um vetor viral é um vetor de AAV recombinante (rAAV) ou um vetor de Baculovirus. Em algumas modalidades, um vetor de rAAV é de um só cordão (por exemplo, DNA de um cordão).
[0032] Em alguns aspectos, a invenção provê uma célula hospe- deira que compreende um ácido nucleico isolado tal como descrito pela invenção ou um vetor tal como descrito pela invenção.
[0033] Em alguns aspectos, a invenção provê um vírus adenoasso- ciado recombinante (rAAV) que compreende uma proteína de capsídeo e um ácido nucleico isolado ou um vetor tal como descrito pela invenção.
[0034] Em algumas modalidades, uma proteína de capsídeo é ca- paz de cruzar a barreira sangue-cérebro, por exemplo, uma proteína de capsídeo AAV9 ou uma proteína de capsídeo AAVrh.10. Em algumas modalidades, um rAAV transduz células neuronais e células não neuro- nais do sistema nervoso central (CNS).
[0035] Em alguns aspectos, a invenção provê um método de trata- mento de um indivíduo que tem ou é suspeito de ter mal de Parkinson, em que o método compreende a administração ao indivíduo de uma composição (por exemplo, uma composição que compreende um ácido nucleico isolado ou um vetor ou um rAAV) tal como descrito pela inven- ção.
[0036] Em algumas modalidades, a administração compreende a in- jeção direta ao CNS de um indivíduo. Em algumas modalidades, a inje- ção direta é uma injeção intracerebral, injeção intraparenquimal, injeção intratecal, injeção intra-cisterna manga, ou qualquer combinação das mesmas. Em algumas modalidades, a injeção direta ao CNS de um in- divíduo compreende a aplicação realçada por convecção (CED).
[0037] Em algumas modalidades, a administração compreende a in- jeção periférica. Em algumas modalidades, a injeção periférica é uma injeção intravenosa.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0038] A FIGURA 1 é um diagrama esquemático que ilustra uma modalidade de um vetor que compreende um construto de expressão que codifica Gcase (por exemplo, GBA1 ou uma porção da mesma).
[0039] A FIGURA 2 é um diagrama esquemático que ilustra uma modalidade de um vetor que compreende um construto de expressão que codifica Gcase (por exemplo, GBA1 ou uma porção da mesma) e LIMP2 (SCARB2) ou uma porção da mesma. As sequências de codifi- cação de Gcase e LIMP2 são separadas por um sítio de entrada ribos- somal interno (IRES).
[0040] A FIGURA 3 é um diagrama esquemático que ilustra uma modalidade de um vetor que compreende um construto de expressão que codifica Gcase (por exemplo, GBA1 ou uma porção da mesma) e LIMP2 (SCARB2) ou uma porção da mesma. A expressão de cada uma das sequências de codificação de Gcase e LIMP? é dirigida por um pro- motor separado.
[0041] A FIGURA 4 é um diagrama esquemático que ilustra uma modalidade de um vetor que compreende um construto de expressão que codifica Gcase (por exemplo, GBA1 ou uma porção da mesma), LIMP2 (SCARB2) ou uma porção da mesma, e um RNA intermediário para a-Syn.
[0042] A FIGURA 5 é um diagrama esquemático que ilustra uma modalidade de um vetor que compreende um construto de expressão que codifica Gcase (por exemplo, GBA1 ou uma porção da mesma), Prosaposina (por exemplo, PSAP ou uma porção da mesma), e um RNA intermediário para a-Syn.
[0043] A FIGURA 6 é um diagrama esquemático que ilustra uma modalidade de um vetor que compreende um construto de expressão que codifica Gcase (por exemplo, GBA1 ou uma porção da mesma) e Prosaposina (por exemplo, PSAP ou uma porção da mesma). As se- quências de codificação de Gcase e Prosaposina são separadas por um sítio de entrada ribossomal interno (IRES).
[0044] A FIGURA 7 é um diagrama esquemático que ilustra uma modalidade de um vetor que compreende um construto de expressão que codifica uma Gcase (por exemplo, GBA1 ou uma porção da mesma). Nesta modalidade, o vetor compreende um elemento do pro- motor de CBA (CBA), que consiste em quatro porções: o intensificador CMV (CMVe), o promotor de CBA (CBAp), Exon 1 e o íntron (int) para expressar constitutivamente a sequência de codificação otimizada com códon de GBA1 humano. A região 3' também contém um elemento re- gulador de WPRE seguido por uma cauda de polyA bGH. Três sítios de ativação reguladores transcricionais são incluídos na extremidade 5' da região do promotor: TATA, RBS e YY1. As ITRs flanqueadoras permi- tem a compactação correto das sequências intermediárias. Duas vari- antes da sequência de 5' ITR (caixa inserida) foram avaliadas; estas têm várias diferenças de nucleotídeo dentro da região "D" de 20 nucleotí- deos de AAV2 ITR do tipo selvagem. Em algumas modalidades, um ve- tor de rAAV contém a sequência de nucleotídeos do domínio "D" mos- trada na linha superior. Em algumas modalidades, um vetor de rAAV compreende um domínio "D" mutante (por exemplo, um domínio "S", com as mudanças de nucleotídeos mostradas na linha inferior).
[0045] A FIGURA 8 é um diagrama esquemático que ilustra uma modalidade do vetor descrito na FIGURA 6
[0046] A FIGURA 9 mostra dados representativos para a aplicação de um rAAV que compreende um transgene que codifica uma Gcase (por exemplo, GBA1 ou uma porção da mesma) em um modelo de ca- mundongo de CBE de mal de Parkinson. Aplicação diária IP do veículo de PBS, 25 mg/kg de CBE, 37,5 mg/kg de CBE, ou 50 mg/kg de CBE (da esquerda para a direita) iniciado em P8. A sobrevivência (lado es- querdo superior) foi verificada duas vezes ao um dia e o peso (lado di- reito superior) foi verificada diariamente. Todos os grupos começaram com n = 8. O comportamento foi avaliado pela distância total percorrida no Campo Aberto (lado esquerdo inferior) em P23 e a latência na queda em Rotarod (metade inferior) em P24. Os níveis dos substratos de GCase foram analisados no córtex de camundongos em PBS e grupos de tratamento de 25 mg/kg de CBE, ambos com (dia 3) e sem (dia 1) retirada de CBE. Os níveis agregados de GluSph e de GalSph (lado direito inferior) são mostrados como pmol por mg do peso úmido do te- cido. A média é apresentada. As barras de erro são SEM. * p < 0,05; ** Pp < 0,01; p < 0,001, valores p nominais para grupos de tratamento por meio de regressão linear.
[0047] A FIGURA 10 é um diagrama esquemático que ilustra uma modalidade de um projeto de estudo para a dose máxima de rAAV em um modelo de camundongo de CBE. Resumidamente, o rAAV foi apli- cado através de injeção ICV em P3, e o tratamento diário de CBE foi iniciado em P8. O comportamento foi avaliado nos ensaios de Campo Aberto e Rotarod em P24-25 e os níveis de substrato foram medidos em P36 e P38.
[0048] A FIGURA 11 mostra os dados representativos para a avali- ação em vida da dose máxima de rAAV em um modelo de camundongo de CBE. Em P3, os camundongos foram tratados com o excipiente ou
8.869 vg rAAV-GBA1 através de aplicação via ICV. A aplicação diária IP de PBS ou de 25 mg/kg de CBE foi iniciada em P8. No final do estudo, a metade dos camundongos foi sacrificada um dia após a sua último dose de CBE em P36 (dia 1) ao passo que a metade restante foi através de 3 dias da retirada de CBE antes do sacrifício em P38 (Dia 3). Todos os grupos de tratamento (excipiente + PBS n = 8, rAAV-GBA1+ PBS n
= 7, excipiente + CBE n = 8, e variante + CBE n = 9) foram pesados diariamente (lado esquerdo superior), e o peso em P36 foi analisado (lado direito superior). O comportamento foi avaliado pela distância total percorrida no Campo Aberto em P23 (lado esquerdo inferior) e a latência na queda em Rotarod em P24 (lado direito inferior), avaliado para cada animal como o número médio através de 3 experimentos. Devido à le- talidade, n = 7 para o excipiente + grupo de CBE para os ensaios com- portamentais, ao passo que n = 8 para todos os grupos restantes. À média através dos animais é apresentada. As barras de erro são SEM. * p < 0,05; *** p < 0,001, valores p nominais para grupos de tratamento por meio de regressão linear nos animais tratados com CBE.
[0049] A FIGURA 12 mostra dados representativos para a avaliação bioquímica da dose máximo de rAAV em um modelo de camundongo de CBE. Os córtex de todos os grupos de tratamento (excipiente + PBS n = 8, variante + PBS n = 7, excipiente + CBE n = 7, e variante + CBE n = 9) foram usados para medir a atividade de GCase (lado esquerdo su- perior), os níveis de GluSph (lado direito superior), os níveis de GluCer (lado esquerdo inferior), e os genomas do vetor (lado direito inferior) nos grupos antes (dia 1) ou após (dia 3) a retirada de CBE. A biodistribuição é mostrada como genomas do vetor por 1 ug de DNA genômico. A mé- dia é apresentada. As barras de erro são SEM. (*)p < 0,1; ** p < 0,01; *** p < 0,001, valores p nominais para grupos de tratamento por meio de regressão linear nos animais tratados com CBE, com os dias da co- leta e o gênero corrigidos como covariadas.
[0050] A FIGURA 13 mostra os dados representativos para as cor- relações comportamentais e bioquímicas em um modelo de camundongo de CBE após a administração do excipiente + PBS, excipiente + CBE, e variante + grupos de tratamento de CBE. Através dos grupos de tratamento, o desempe- nho em Rotarod foi correlacionado negativamente com a acumulação de Glu- Cer (A, p = 0,0012 por meio de regressão linear), e a acumulação de GluSph foi correlacionada negativamente com a atividade aumentada de GCase (B, p = 0,0086 por meio de regressão linear).
[0051] A FIGURA 14 mostra os dados representativos para a bio- distribuição da variante em um modelo de camundongo de CBE. A pre- sença de genomas do vetor foi avaliada no fígado, no baço, no rim e nas gônadas para todos os grupos de tratamento (excipiente + PBS n = 8, variante + PBS n = 7, excipiente + CBE n = 7, e variante + CBE n = 9). A biodistribuição é mostrada como genomas do vetor por 1 ug do DNA genômico. A presença do genoma do vetor foi quantificada por PCR quantitativa ao usar uma curva padrão de referência do vetor; a concentração do DNA genômico foi avaliada por meio da medição da densidade óptica de A260. A média é apresentada. As barras de erro são SEM. * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001, valores p nominais para grupos do tratamento por meio de regressão linear nos animais tratados com CBE, com os dias de coleta e o gênero corrigidos como covariadas.
[0052] A FIGURA 15 mostra os dados representativos para a avali- ação em vida da dose de rAAV que varia em um modelo de camundongo de CBE. Os camundongos receberam o excipiente ou uma de três do- ses diferentes de rAAV-GBA1 ICV por meio da aplicação em P3: 3.2e9 vg, 1.0610vg, ou 3.2810 vg. Em P8, o tratamento diário IP de 25 mg/kg CBE foi iniciado. Os camundongos que receberam o excipiente e CBE ou o excipiente e PBS serviram como controles. Todos os grupos de tratamento começaram com n = 10 (S5M/5F) por grupo. Todos os camun- dongos foram sacrificados um dia após a sua dose final de CBE (P38- P40). Todos os grupos de tratamento foram pesados diariamente, e o seu peso foi analisado em P36. O desempenho motor foi avaliado pela latência na queda em Rotarod em P24 e a latência para atravessar o Travessa afunilada em P30. Devido à letalidade precoce, o número de camundongos que participam nos ensaios comportamentais era: excipi- ente + PBS n = 10, excipiente + CBE n = 9, e 3.269 vg rAAV-GBA1+
CBE n = 6, 1.0010 vg rAAV-GBA1+ CBE n = 10, 3.2810 vg rAAV-GBA1+ CBE n = 7. A média é apresentada. As barras de erro são SEM; * p < 0,05; ** p < 0,01 para valores p nominais por meio de regressão linear nos grupos tratados com CBE, com o gênero corrigido como uma cova- riada.
[0053] A FIGURA 16 mostra os dados representativos para a avali- ação bioquímica da dose de rAAV que varia em um modelo de camun- dongo de CBE. Os córtex de todos os grupos de tratamento (excipiente + PBS n = 10, excipiente + CBE n = 9, e 3.209 vg rAAV-GBA1+ CBE n = 6, 1.0010 vg rAAV-GBA1+ CBE n = 10, 3.2810 vg rAAV-GBA1+ CBE n =7) foram usados para medir a atividade de GCase, os níveis de Glu- Sph, os níveis de GluCer, e os genomas do vetor. A atividade de GCase é mostrada como ng de GCase por mg da proteína total. Os níveis de GluSph e de GluCer são mostrados como pmol por mg de peso úmido do tecido. A biodistribuição é mostrada como genomas do vetor por 1 pg do DNA genômico. A presença do genoma do vetor é quantificada por PCR quantitativa ao usar uma curva padrão de referência do vetor; a concentração do DNA genômico foi avaliada por meio da medição da densidade óptica de A260. A presença do genoma do vetor também foi medida no fígado (E). A média é apresentada. As barras de erro são SEM. ** p < 0,01; *** p < 0,001 para valores p nominais por meio de regressão linear nos grupos tratados com CBE, com o gênero corrigido como uma covariada.
[0054] A FIGURA 17 mostra os dados representativos para a aná- lise de travessa afunilada na dose máximo de rAAV-GBA1 em um mo- delo de camundongo genético. O desempenho motor dos grupos de tra- tamento (WT + excipiente, n = 5), 4l/ps-na + excipiente (n = 6), e 41/ps- na + rAAV-GBA1 (n = 5)) foi analisado por Caminhar na Travessa 4 se- manas após a administração de rAAV-GBA1. O total de escorregadelas e o tempo ativo é mostrado como total para 5 experimentos em feixes diferentes. A velocidade e as escorregadelas por velocidade são mos- tradas como a média de 5 experimentos em feixes diferentes. A média é apresentada. As barras de erro são SEM.
[0055] A FIGURA 18 mostra os dados representativos para a ex- pressão in vitro de construtos de rAAV que codificam a proteína progra- nulina (PGRN). O painel esquerdo mostra uma curva padrão de ensaio ELISA da progranulina (PGRN). O painel inferior mostra uma resposta à dose da expressão de PGRN medida pelo ensaio ELISA em lisatos de célula de células HEK293T transduzidas com rAAV. MOI = multiplici- dade da infecção (genomas do vetor por célula).
[0056] A FIGURA 19 mostra os dados representativos para a ex- pressão in vitro de construtos de rAAV que codificam GBA1 em combi- nação com Prosaposina (PSAP), SCARB2, e/ou um ou mais ácidos nu- cleicos inibidores. Os dados indicam que a transfecção das células HEK293 com cada construto resultou na superexpressão dos transge- nes de interesse em relação às células transfectadas simuladas.
[0057] A FIGURA 20 é um diagrama esquemático que ilustra os ve- tores de um rAAV que compreendem uma região "D" localizada na "parte externa" da ITR (por exemplo, proximal ao terminal da ITR em relação à inserção de transgene ou ao construto de expressão) (topo) e um vetor de rAAV do tipo selvagem que tem ITRs no "interior" do vetor (por exemplo, proximal à inserção de transgene do vetor).
[0058] A FIGURA 21 um diagrama esquemático que ilustra uma mo- dalidade de um vetor que compreende um construto de expressão que codifica GBA2 ou uma porção da mesma, e um RNA intermediário para a-Syn.
[0059] A FIGURA 22 é um diagrama esquemático que ilustra uma modalidade de um vetor que compreende um construto de expressão que codifica Gcase (por exemplo, GBA1 ou uma porção da mesma) e Galactosilceramidase (por exemplo, GALC ou uma porção da mesma).
A expressão das sequências de codificação de Gcase e Galactosilcera- midase é separada por uma sequência de peptídeo autoclivável de T2A.
[0060] A FIGURA 23 é um diagrama esquemático que ilustra uma modalidade de um vetor que compreende um construto de expressão que codifica Gcase (por exemplo, GBA1 ou uma porção da mesma) e Galactosilceramidase (por exemplo, GALC ou uma porção da mesma). A expressão das sequências de codificação de Gcase e Galactosilcera- midase é separada por uma sequência de peptídeo autoclivável de T2A.
[0061] A FIGURA 24 é um diagrama esquemático que ilustra uma modalidade de um vetor que compreende um construto de expressão que codifica Gcase (por exemplo, GBA1 ou uma porção da mesma), catepsina B (por exemplo, CTSB ou uma porção da mesma), e um RNA intermediário para a-Syn. A expressão das sequências de codificação de Gcase e catepsina B é separada por uma sequência de peptídeo autoclivável de T2A.
[0062] A FIGURA 25 é um diagrama esquemático que ilustra uma modalidade de um vetor que compreende um construto de expressão que codifica Gcase (por exemplo, GBA1 ou uma porção da mesma), Esfingomielina fosfodiesterase 1 (por exemplo, SMPD1, uma porção da mesma, e um RNA intermediário para a-Syn.
[0063] A FIGURA 26 é um diagrama esquemático que ilustra uma modalidade de um vetor que compreende um construto de expressão que codifica Gcase (por exemplo, GBA1 ou uma porção da mesma) e Galactosilceramidase (por exemplo, GALC ou uma porção da mesma). As sequências de codificação de Gcase e Galactosilceramidase são se- paradas por um sítio de entrada ribossomal interno (IRES).
[0064] A FIGURA 27 é um diagrama esquemático que ilustra uma moda- lidade de um vetor que compreende um construto de expressão que codifica Gcase (por exemplo, GBA1 ou uma porção da mesma) e catepsina B (por exemplo, CTSB ou uma porção da mesma). A expressão de cada uma das sequências de codificação de Gcase e catepsina B é dirigida por um promo- tor separado.
[0065] A FIGURA 28 é um diagrama esquemático que ilustra uma modalidade de um vetor que compreende um construto de expressão que codifica Gcase (por exemplo, GBA1 ou uma porção da mesma), GCH1 (por exemplo, GCH1 ou uma porção da mesma), e um RNA in- termediário para a-Syn. As sequências de codificação de Gcase e GCH1 são separadas por uma sequência de peptídeo autoclivável de T2A
[0066] A FIGURA 29 é um diagrama esquemático que ilustra uma modalidade de um vetor que compreende um construto de expressão que codifica Gcase (por exemplo, GBA1 ou uma porção da mesma), RAB7L1 (por exemplo, RAB7L1 ou uma porção da mesma), e um RNA intermediário para a-Syn. As sequências de codificação de Gcase e RAB7L1 são separadas por uma sequência de peptídeo autoclivável de T2A.
[0067] A FIGURA 30 é um diagrama esquemático que ilustra uma modalidade de um vetor que compreende um construto de expressão que codifica Gcase (por exemplo, GBA1 ou uma porção da mesma), GCH1 (por exemplo, GCH1 ou uma porção da mesma), e um RNA in- termediário para a-Syn. A expressão das sequências de codificação de Gcase e GCH1 é um sítio de entrada ribossomal interno (IRES).
[0068] A FIGURA 31 é um diagrama esquemático que ilustra uma modalidade de um vetor que compreende um construto de expressão que codifica VPS35 (por exemplo, VPS35 ou uma porção da mesma) e RNAs intermediários para a-Syn e TMEM106B.
[0069] A FIGURA 32 é um diagrama esquemático que ilustra uma modalidade de um vetor que compreende um construto de expressão que codifica Gcase (por exemplo, GBA1 ou uma porção da mesma), IL-34 (por exemplo, IL34 ou uma porção da mesma), e um RNA intermediário para a-
Syn. As sequências de codificação de Gcase e |L-34 são separadas pela sequência de peptídeo autoclivável de T2A.
[0070] A FIGURA 33 é um diagrama esquemático que ilustra uma modalidade de um vetor que compreende um construto de expressão que codifica Gcase (por exemplo, GBA1 ou uma porção da mesma) e IL-34 (por exemplo, IL34 ou uma porção da mesma). As sequências de codificação de Gcase e IL-34 são separadas por um sítio de entrada ribossomal interno (IRES).
[0071] A FIGURA 34 é um diagrama esquemático que ilustra uma modalidade de um vetor que compreende um construto de expressão que codifica Gcase (por exemplo, GBA1 ou uma porção da mesma) e TREM? (por exemplo, TREM2 ou uma porção da mesma). A expressão de cada uma das sequências de codificação de Gcase e TREM2m é dirigida por um promotor separado.
[0072] A FIGURA 35 é um diagrama esquemático que ilustra uma modalidade de um vetor que compreende um construto de expressão que codifica Gcase (por exemplo, GBA1 ou uma porção da mesma) e IL-34 (por exemplo, IL34 ou uma porção da mesma). A expressão de cada uma das sequências de codificação de Gcase e IL-34 é dirigida por um promotor separado.
[0073] As FIGURAS 36A e 36B mostram os dados representativos para a superexpressão de TREM2 e GBA1 nas células HEK293 em re- lação às células transduzidas, tal como medido por meio de qPCR e ELISA. A FIGURA 36A mostra os dados para a superexpressão de TREM?2. A FIGURA 36B mostra os dados para a superexpressão de GBA1 do mesmo construto.
[0074] A FIGURA 37 mostra os dados representativos que indicam o silenciamento bem sucedido de SCNA in vitro pelo ensaio de repórter de GFP (topo) e pelo ensaio de a-Syn (base).
[0075] A FIGURA 38 mostra os dados representativos que indicam o silenciamento bem sucedido de TMEM106B in vitro pelo ensaio de repórter de GFP (topo) e pelo ensaio de a-Syn (base).
[0076] A FIGURA 39 é um diagrama esquemático que ilustra uma modalidade de um vetor que compreende um construto de expressão que codifica PGRN.
[0077] A FIGURA 40 mostra os dados para a transdução das célu- las HEK293 ao usar os rAAVs que têm ITRs com a colocação da se- quência "D" do tipo selvagem (círculos) ou alternativa (por exemplo, "parte externa"; quadrados). Os rAAVs que têm ITRs colocadas na "parte externa" podem transduzir células tão eficientemente quanto os rAAVs que têm ITRs do tipo selvagem.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0078] A invenção é baseada, em parte, em composições e méto- dos para a expressão de combinações de produtos de genes associa- dos ao PD em um indivíduo. Um produto de gene pode ser uma prote- ína, um fragmento (por exemplo, uma porção) de uma proteína, um ácido nucleico intermediário que inibe um gene associado ao PD, etc. Em algumas modalidades, um produto de gene é uma proteína ou um fragmento de proteína codificado por um gene associado ao PD. Em algumas modalidades, um produto de gene é um ácido nucleico inter- mediário (por exemplo, shRNA, siRNA, miRNA, amiRNA, etc.) que inibe um gene associado ao PD.
[0079] Um gene associado ao PD refere-se a um gene que codifica um produto de gene que é associado genética, bioquímica ou funcional- mente com o PD. Por exemplo, foi observado que os indivíduos que têm mutações no gene GBA1 (que codifica a proteína Gcase) têm um risco maior de desenvolver o PD em comparação aos indivíduos que não têm uma mutação em GBA1. Em um outro exemplo, o PD é associado com a acumulação dos agregados de proteína que compreendem a proteína a-Sinucleina (a-Syn); por conseguinte, o SCNA (que codifica a-Syn) é um gene associado ao PD.
Em algumas modalidades, um cassete de expressão descrito no presente documento codifica uma forma do tipo selvagem ou não mutante de um gene associado ao PD (ou sua se- quência de codificação). Os exemplos de genes associados ao PD são listados na Tabela 1. Tabela 1: Exemplos de genes associados ao PD Proteína de membrana de li: | SCARB2/LIMP2 | Receptor lisossomal para a gluco- | NP 005497.1 (Isofoma 1), sossoma 2 silceramidase (foco em GBA) NP 001191184.1 (Isoforma 2) Prosaposina PSAP Precursor para as saposinas A, B, | ARHO1503.1, —AAHO7612.1, C e D, que ficam localizadas no | AAHO4275.1, AAA6O303.1 compartimento lisossomal e facili- tam o catabolismo da glicoesfingo- lipídios com grupos de oligossaca- rídeos curtos beta-glucocerebrosidase GBA1 Cliva a ligação beta-glucosídio de — NP 001005742.1 (Isoforma 1), Qglucocerebroside NP 001165282.1 (Isoforma 2), NP 001165283.1 (Isoforma 3) Glucosilceramidase não |li-)| GBA2 Catalisa a conversão de glucosilce- | NP 065995.1 (Isoforma 1), sossomal ramida em glicose e ceramida li- | NP 001317589.1 (Isoforma 2) vres Galactosilceramidase GALC Remove a galactose dos derivados | EAWS8S1359.1 (Isoforma de ceramida CRA a), EAW81360.1 (Iso- forma CRA b), EAW81362.1 (Isoforma CRA c) Esfingomielina — fosfodieste- | SMPD1 Converte a esfingomielina em ce- | EAW68726.1 (Isoforma rase 1 ramida CRA a), EAWB68727.1 (Iso- forma CRA b), EAW68728.1 (Isoforma CRA c), EAW68729.1 (Isoforma CRA d) Catepsina B CTSB Tiol protease que deve participar | AAC37547.1, — AAH95408.1, da degradação celular e rotação de | AAH10240.1 proteinas; também implicada na in- vasão de tumor e na metástase RAB7, oncogene RAS de | RAB7L1 Regula o transporte vesicular AAHO2585.1 membro da família do tipo 1 Proteína associada com a | VPS35 Componente de complexo seletivo | NP 060676.2 classificação de proteína va- de carga de retrômero cuolar 35
GTP ciclohidrolase 1 GCH1 Responsável pela hidrólise de tri- | AAH25415.1 fosfato de guanosina para formar trifosfato de 7,8-diidroneopterina Interleucina 34 1L34 Aumenta o crescimento ou a so- AAH29804.1 brevivência de monócitos; induz a atividade mediante a ligação do re- ceptor 1 do fator estimulador de co- lônia receptor Receptor ativador expresso | TREM2 Forma um complexo de sinalização | AAF69824.1 em células mieloides 2 de receptor com a proteína de liga- ção TYRO da proteína tirosina ci- nase; funciona na imuno resposta e pode estar envolvida na inflama- ção crônica Progranulina PGRN Desempenha um papel no desen- | NP 002087.1 volvimento, inflamação, prolifera- ção de células e homeostase de proteina Ácidos nucleicos e vetores isolados
[0080] Um ácido nucleico isolado pode ser o DNA ou o RNA. A in- venção provê, em alguns aspectos, ácidos nucleicos isolados (por exemplo, vetores de rAAV) que compreendem um construto de expres- são que codifica um ou mais genes associados a PD, por exemplo, uma Gcase (por exemplo, o produto de gene do gene de GBA1) ou uma por- ção da mesma. A Gcase, também indicada como B-glucocerebrosidase ou GBA, refere-se a uma proteína lisossomal que cliva a ligação beta- glucosídica do glucocerebrosídeo químico, um intermediário no meta- bolismo de glicolipídios. Nos seres humanos, a Gcase é codificada pelo gene GBA1, localizado no cromossoma 1. Em algumas modalidades, GBA1 codifica um peptídeo que é representado pela Sequência de Re- ferência de NCBI NP. 000148.2 (SEQ ID NO: 14). Em algumas modali- dades, um ácido nucleico isolado compreende uma sequência de codi- ficação de Gcase que é otimizada com códons (por exemplo, otimizada com códons para a expressão em células de mamíferos, por exemplo, células humanas), tal como a sequência indicada na SEQ ID NO: 15.
[0081] Em alguns aspectos, a invenção provê um ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica a Pro- saposina (por exemplo, o produto de gene do gene de PSAP). A Prosa- posina é uma glicoproteína precursoras para proteínas ativadoras de esfingolipídios (saposinas) A, B, C e D, que facilitam o catabolismo dos glioesfingolipídios com grupos de oligossacarídeos curtos. Nos seres humanos, o gene de PSAP fica localizado no cromossoma 10. Em algu- mas modalidades, PSAP codifica um peptídeo que é representado pela sequência de referência de NCBI NP 002769.1 (por exemplo, a SEQ ID NO: 16). Em algumas modalidades, um ácido nucleico isolado compre- ende uma sequência de codificação de prosaposina que é otimizada com códons (por exemplo, otimizada com códons para a expressão em células de mamíferos, por exemplo, células humanas), tal como a se- quência indicada na SEQ ID NO: 17.
[0082] Os aspectos da invenção referem-se a um ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica LIMP2/SCARB?2 (por exemplo, o produto de gene do gene de SCARB2). SCARB?2 refere-se a uma proteína de membrana que regula o trans- porte lisossomal e endossomal dentro de uma célula. Nos seres huma- nos, o gene SCARB?2 fica localizado no cromossoma 4. Em algumas modalidades, o gene SCARB2 codifica um peptídeo que é representado pela sequência de referência de NCBI NP 005497.1 (SEQ ID NO: 18). Em algumas modalidades, um ácido nucleico isolado compreende a se- quência indicada na SEQ ID NO: 19. Em algumas modalidades o ácido nucleico isolado compreende uma sequência de codificação de SCARB?2 que é otimizada com códons.
[0083] Os aspectos da invenção referem-se a um ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica a pro- teína GBA2 (por exemplo, o produto de gene do gene de GBA2). A pro- teína GBA2 refere-se à glucosilceramidase não lisossomal. Nos seres humanos, o gene GBA2 fica localizado no cromossoma 9. Em algumas modalidades, o gene GBA2 codifica um peptídeo que é representado pela sequência de referência de NCBI NP 065995.1 (SEQ ID NO: 30). Em algumas modalidades, um ácido nucleico isolado compreende a se- quência indicada na SEQ ID NO: 31. Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado compreende uma sequência de codificação de GBA2 que é otimizada com códons.
[0084] Os aspectos da invenção referem-se a um ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica a pro- teína GALC (por exemplo, o produto de gene do gene de GALC). A pro- teína GALC refere-se à Galactosilceramidase (ou à galactocerebrosi- dase), que é uma enzima que hidrolisa as ligações de éster de galactose de galactocerebrosídeo, galactosilesfingosina, lactosilceramida e mono- galactosildiglicerídeo. Nos seres humanos, o gene de GALC fica locali- zado no cromossoma 14. Em algumas modalidades, o gene de GALC codifica um peptídeo que é representado pela sequência de referência de NCBI NP 000144.2 (SEQ ID NO: 33). Em algumas modalidades, um ácido nucleico isolado compreende a sequência indicada na SEQ ID NO: 34. Em algumas modalidades o ácido nucleico isolado compreende uma sequência de codificação de GALC que é otimizada com códons.
[0085] Os aspectos da invenção referem-se a um ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica a pro- teína CTSB (por exemplo, o produto de gene do gene de CTSB). A pro- teína CTSB refere-se à catepsina B, que é uma cisteína protease lisos- somal que desempenha um papel importante na proteólise intracelular. Nos seres humanos, o gene de CTSB fica localizado no cromossoma 8. Em algumas modalidades, o gene de CTSB codifica um peptídeo que é representado pela sequência de referência de NCBI NP 001899.1 (SEQ ID NO: 35). Em algumas modalidades, um ácido nucleico isolado compreende a sequência indicada na SEQ ID NO: 36. Em algumas mo-
dalidades o ácido nucleico isolado compreende uma sequência de co- dificação de CTSB que é otimizada com códons.
[0086] Os aspectos da invenção referem-se a um ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica a pro- teina SMPD1 (por exemplo, o produto de gene do gene de SMPD1). A proteína SMPD1 refere-se à esfingomielina fosfodiesterase 1, que é uma enzima de hidrolase que está envolvida no metabolismo de esfin- golipídios. Nos seres humanos, o gene SMPD1 fica localizado no cro- mossoma 11. Em algumas modalidades, o gene SMPD1 codifica um peptídeo que é representado pela sequência de referência de NCBI NP 000534.3 (SEQ ID NO: 37). Em algumas modalidades, um ácido nucleico isolado compreende a sequência indicada na SEQ ID NO: 38. Em algumas modalidades o ácido nucleico isolado compreende uma se- quência de codificação de SMPD1 que é otimizada com códons.
[0087] Os aspectos da invenção referem-se a um ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica a pro- teína GCH1 (por exemplo, o produto de gene do gene de GCH1). A pro- teina GCH1 refere-se à GTP ciclohidrolase |, que é uma enzima de hi- drolase que faz parte das vias de biossíntese de folato e biopterina. Nos seres humanos, o gene GCH1 fica localizado no cromossoma 14. Em algumas modalidades, o gene GCH1 codifica um peptídeo que é repre- sentado pela sequência de referência de NCBI NP 000152.1 (SEQ ID NO: 45). Em algumas modalidades, um ácido nucleico isolado compre- ende a sequência indicada na SEQ ID NO: 46. Em algumas modalida- des o ácido nucleico isolado compreende uma sequência de codificação de GCH1 que é otimizada com códons.
[0088] Os aspectos da invenção referem-se a um ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica a pro- teína RAB7L (por exemplo, o produto de gene do gene de RAB7L). À proteína RAB7L refere-se a RAB7, oncogene RAS membro da família do tipo 1, que é uma proteína de ligação de GTP. Nos seres humanos, o gene de RAB7L fica localizado no cromossoma 1. Em algumas moda- lidades, o gene de RAB7L codifica um peptídeo que é representado pela sequência de referência de NCBI NP 003920.1 (SEQ ID NO: 47). Em algumas modalidades, um ácido nucleico isolado compreende a se- quência indicada na SEQ ID NO: 48. Em algumas modalidades o ácido nucleico isolado compreende uma sequência de codificação de RAB7L que é otimizada com códons.
[0089] Os aspectos da invenção referem-se a um ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica a pro- teina VPS35 (por exemplo, o produto de gene do gene de VPS35). A proteína VPS35 refere-se à proteína associada à classificação de pro- teína vacuolar 35, que faz parte de um complexo de proteína envolvido no transporte retrógrado de proteínas dos endossomas à rede trans- Golgi. Nos seres humanos, o gene VPS35 fica localizado no cromos- soma 16. Em algumas modalidades, o gene VPS35 codifica um peptí- deo que é representado pela sequência de referência de NCBI NP 060676.2 (SEQ ID NO: 49). Em algumas modalidades, um ácido nucleico isolado compreende a sequência indicada na SEQ ID NO:50. Em algumas modalidades o ácido nucleico isolado compreende uma se- quência de codificação de VPS35 que é otimizada com códons.
[0090] Os aspectos da invenção referem-se a um ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica a pro- teína IL-34 (por exemplo, o produto de gene do gene de IL34). A prote- ína IL-34 refere-se à interleucina 34, que é uma citocina que aumenta o crescimento e a sobrevivência dos monócitos. Nos seres humanos, o gene IL34 fica localizado no cromossoma 16. Em algumas modalidades, o gene IL34 codifica um peptídeo que é representado pela sequência de referência de NCBI NP. 689669.2 (SEQ ID NO: 55). Em algumas mo- dalidades, um ácido nucleico isolado compreende a sequência indicada na SEQ ID NO: 56. Em algumas modalidades o ácido nucleico isolado compreende uma sequência de codificação de IL-34 que é otimizada com códons.
[0091] Os aspectos da invenção referem-se a um ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica a pro- teina TREM?2 (por exemplo, o produto de gene do gene de TREM2). À proteína TREM? refere-se ao receptor de ativação expresso nas células mieloides 2, que é um receptor da superfamília de imunoglobulina en- contrado em células mieloides. Nos seres humanos, o gene TREM? fica localizado no cromossoma 6. Em algumas modalidades, o gene TREM2 codifica um peptídeo que é representado pela sequência de referência de NCBI NP 061838.1 (SEQ ID NO: 57). Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado compreende a sequência indicada na SEQ ID NO: 58. Em algumas modalidades um ácido nucleico isolado compre- ende uma sequência de codificação de TREM2 que é otimizada com códons.
[0092] Os aspectos da invenção referem-se a um ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica a pro- teina TMEM1O6B (por exemplo, o produto de gene do gene de TMEM106B). A proteína TMEM106B refere-se à proteína de transmem- brana 106B, que é uma proteína envolvida na morfogênese de dendrito e na regulação do tráfico lisossomal. Nos seres humanos, o gene de TMEMA106B fica localizado no cromossoma 7. Em algumas modalida- des, o gene de TMEM106B codifica um peptídeo que é representado pela sequência de referência de NCBI NP 060844.2 (SEQ ID NO: 62). Em algumas modalidades, um ácido nucleico isolado compreende a se- quência indicada na SEQ ID NO: 63. Em algumas modalidades o ácido nucleico isolado compreende uma sequência de codificação de TMEMA106B que é otimizada com códons.
[0093] Os aspectos da invenção referem-se a um ácido nucleico isolado que compreende um construto d expressão que codifica a pro- teína progranulina (por exemplo, o produto de gene do gene de PRGN). A proteína PGRN refere-se à progranulina, que é uma proteína envol- vida no desenvolvimento, na inflamação, na proliferação de célula e na homeostase de proteína. Nos seres humanos, o gene de PGRN fica lo- calizado no cromossoma 17. Em algumas modalidades, o gene de PGRN codifica um peptídeo que é representado pela sequência de re- ferência de NCBI NP 002078.1 (SEQ ID NO: 66). Em algumas modali- dades, um ácido nucleico isolado compreende a sequência indicada na SEQ ID NO: 67. Em algumas modalidades o ácido nucleico isolado com- preende uma sequência de codificação de PGRN que é otimizada com códons.
[0094] Em alguns aspectos, a invenção provê um ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica um primeiro produto de gene e um segundo produto de gene, em que cada produto de gene é selecionado independentemente dos produtos de ge- nes, ou das porções dos mesmos, indicados na Tabela 1.
[0095] Em algumas modalidades, um produto de gene é codificado por uma porção de codificação (por exemplo, um cDNA) de um gene natural. Em algumas modalidades, um primeiro produto de gene é uma proteína (ou um fragmento da mesma) codificada pelo gene GBA1. Em algumas modalidades, um produto de gene é uma proteína (ou um fra- gmento da mesma) codificada por um outro gene listado na Tabela 1, por exemplo, o gene de SCARB2/LIMP2 ou o gene de PSAP. No en- tanto, o elemento versado no estado da técnica reconhece que a ordem de expressão de um primeiro produto de gene (por exemplo, Gcase) e de um segundo produto de gene (por exemplo, LIMP2, etc.) pode ser geralmente invertida (por exemplo, LIMP2 é o primeiro produto de gene e Gcase é o segundo produto de gene). Em algumas modalidades, um produto de gene é um fragmento (por exemplo, uma porção) de um gene listado na Tabela 1. Um fragmento da proteína pode compreender cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80% cerca de 90% ou cerca de 99% de uma proteína codificada pelos genes listados na Ta- bela 1. Em algumas modalidades, um fragmento de proteína compre- ende entre 50% e 99,9% (por exemplo, qualquer valor entre 50% e 99,9%) de uma proteína codificada por um gene listado na Tabela 1.
[0096] Em algumas modalidades, um construto de expressão é mo- nocistrônico (por exemplo, o construto de expressão codifica uma única proteína de fusão que compreende um primeiro produto de gene e um segundo produto de gene). Em algumas modalidades, um construto de expressão é policistrônico (por exemplo, o construto de expressão codi- fica dois produtos de genes distintos, por exemplo, duas proteínas ou fragmentos de proteína diferentes).
[0097] Um vetor de expressão policistrônico pode compreender um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou mais) promotores. Qualquer pro- motor apropriado pode ser usado, por exemplo, um promotor constitu- tivo, um promotor induzível, um promotor endógeno, um promotor espe- cífico de tecido (por exemplo, um promotor específico de CNS), etc. Em algumas modalidades, um promotor é um promotor de beta-actina de galinha (promotor de CBA), um promotor de CAG (por exemplo, tal como descrito por Alexopoulou et al. (2008) BMC Cell Biol. 9:2; doi:
10.1186/1471-2121-9-2), um promotor de CD68, ou um promotor de JeT (por exemplo, tal como descrito por Tornge et al. (2002) Gene 297(1- 2):21-32). Em algumas modalidades, um promotor é operavelmente |i- gado a uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um primeiro produto de gene, um segundo produto de gene, ou um primeiro produto de gene e um segundo produto de gene. Em algumas modalidades, um cassete de expressão compreende uma ou mais sequências regulado- ras adicionais incluindo, mas sem nenhuma limitação, as sequências de ligação do fator de transcrição, os sítios de emenda de íntron, os sítios de adição de poli(A), as sequências de intensificadores, os sítios de li- gação de repressores, ou qualquer combinação dos elementos acima.
[0098] Em algumas modalidades, uma sequência de ácidos nuclei- cos que codificam um primeiro produto de gene e uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um segundo produto de gene são separa- das por uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um sítio de entrada ribossomal interno (IRES). Os exemplos de sítios de IRES são descritos, por exemplo, por Mokrejs et al. (2006) Nucleic Acids Res. 34 (Database issue):D125-30. Em algumas modalidades, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um primeiro produto de gene e uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um segundo produto de gene são separadas por uma sequência de ácidos nucleicos que codi- fica um peptídeo autoclivável. Os exemplos de peptídeos autocliváveis incluem, mas sem ficar a eles limitados, T2A, P2A, E2A, F2A, BMCPV 2A e BmMIFV 2A, e aqueles descritos por Liu et al. (2017) Sci Rep. 7:
2193. Em algumas modalidades, o peptídeo autoclivável é um peptídeo T2A.
[0099] Patologicamente, distúrbios tais como o PD e a doença de Gaucher são associados com a acumulação de agregados de proteínas compostos em sua maior parte pela proteína a-Sinucleina (a-Syn). Por conseguinte, em algumas modalidades, os ácidos nucleicos isolados descritos no presente documento compreendem um ácido nucleico ini- bidor que reduz ou impede a expressão da proteína a-Syn. Uma se- quência que codifica um ácido nucleico inibidor pode ser colocada em uma região não traduzida (por exemplo, íntron, S"UTR, 3'UTR, etc.) do vetor de expressão.
[0100] Em algumas modalidades, um ácido nucleico inibidor é posi- cionado em um íntron de um construto de expressão, por exemplo, em um íntron a montante da sequência que codifica um primeiro produto de gene. Um ácido nucleico inibidor pode ser um RNA de cordão duplo
(AsSRNA), siRNA, micro RNA (miRNA), miRNA artificial (amiRNA), ou um aptâmero de RNA. D maneira geral, um ácido nucleico inibidor liga (por exemplo, hibridiza com) entre cerca de 6 e cerca de 30 (por exemplo, qualquer número inteiro entre 6 e 30, inclusive) nucleotídeos contíguos de um RNA alvo (por exemplo, mRNA). Em algumas modalidades, a molécula do ácido nucleico inibidor é um mIiRNA ou um amiRNA, por exemplo, um miRNA que visa SNCA (o gene que codifica a proteína a- Syn) ou TMEM106B (por exemplo, o gene que codifica a proteína TMEM106B). Em algumas modalidades, o miRNA não compreende ne- nhuma má combinação com a região de SNCA mRNA com a qual hibri- diza (por exemplo, o miRNA é "aperfeiçoado"). Em algumas modalida- des, o ácido nucleico inibidor é um sShRNA (por exemplo, um shRNA que visa SNCA ou TMEM106B). Em algumas modalidades, um ácido nu- cleico inibidor é um miRNA artificial (amiRNA) que inclui uma estrutura de suporte de miR-155 e uma sequência de focar em SCNA ou TMEM106B.
[0101] Um ácido nucleico isolado tal como descrito no presente do- cumento pode existir por si próprio, ou como parte de um vetor. De modo geral, um vetor pode ser um plasmídeo, um cosmídeo, um fagemídeo, um cromossoma artificial bacteriano (BAC), ou um vetor viral (por exem- plo, vetor adenoviral, vetor de vírus adenoassociado (AAV), vetor retro- viral, vetor baculoviral, etc.). Em algumas modalidades, o vetor é um plasmídeo (por exemplo, um plasmídeo que compreende um ácido nu- cleico isolado tal como descrito no presente documento). Em algumas modalidades, um vetor de rAAV de um só cordão (por exemplo, DNA de um só cordão). Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de AAV recombinante (rAAV). Em algumas modalidades, um vetor é um vetor de Baculovirus (por exemplo, um vetor de poliedrose nuclear de Auto- grapha californica (ACNPV)).
[0102] Tipicamente, um vetor de rAAV (por exemplo, genoma de rAAV) compreende um transgene (por exemplo, um construto de ex- pressão que compreende um ou mais de cada um dos seguintes: pro- motor, íntron, sequência de intensificadores, sequência de codificação de proteína, sequência de codificação inibidora de RNA, sequência de cauda de poliA, etc.) flanqueados por duas sequências de repetição ter- minal invertida (ITR) de AAV. Em algumas modalidades, o transgene de um vetor de rAAV compreende um ácido nucleico isolado tal como des- crito pela invenção. Em algumas modalidades, cada uma das duas se- quências de ITR de um vetor de rAAV é uma ITR de comprimento total (por exemplo, cerca de 145 bp de comprimento, e contendo o sítio de ligação de Rep funcional (RBS) e o sítio de resolução terminal (trs)). Em algumas modalidades, uma das ITRs de um vetor de rAAV é truncado (por exemplo, encurtado ou que não de comprimento total). Em algumas modalidades, uma ITR truncada não possui um sítio de resolução termi- nal funcional (trs) e é usado para a produção de vetores de AAV auto complementares (vetores de scAAV). Em algumas modalidades, uma ITR truncada é uma AITR, por exemplo, tal como descrito por McCarty et al. (2003) Gene Ther. 10(26):2112-8.
[0103] Os aspectos da invenção referem-se a ácidos nucleicos iso- lados (por exemplo, vetores de rAAV) que compreendem uma ITR que tem uma ou mais modificações (por exemplo, adições de ácidos nuclei- cos, deleções, substituições, etc.) em relação a uma AAV ITR do tipo selvagem, por exemplo, em relação à AAV2 ITR do tipo selvagem (por exem- plo, a SEQ ID NO: 29). A estrutura da AAV2 ITR do tipo selvagem é mostrada na FIGURA 20. De maneira geral, uma ITR do tipo selvagem compreende uma região de 125 nucleotídeo que se auto emparelha para formar uma es- trutura de hairpin em forma de T de cordão duplo palindrômica, em que a estrutura de hairpin consiste em dois braços transversais (formados pelas se- quências indicadas como B/B' e C/C', respectivamente), uma região de haste mais longa (formada pelas sequências A/A'), e uma região terminal de um só cordão indicada como região "D" (FIGURA 20). De maneira geral, a região "D" de uma ITR é posicionada entre a região da haste formada pelas sequências A/A' e a inserção que contém o transgene do vetor de rAAV (por exemplo, posicionado no "interior" da ITR em relação ao ter- minal da ITR ou proximal à inserção de transgene ou ao construto de expressão do vetor de rAAV). Em algumas modalidades, uma região "D" compreende a sequência indicada na SEQ ID NO: 27. Foi observado que a região "D" desempenha um papel importante na encapsidação de vetores de rAAV por proteínas de capsídeo, por exemplo, tal como di- vulgado por Ling et al. (2015) J Mol Genet Med 9(3).
[0104] A invenção é baseada, em parte, na descoberta surpreen- dente que os vetores de rAAV que compreendem uma região "D" loca- lizada na "parte externa" da ITR (por exemplo, proximal ao terminal da ITR em relação à inserção de transgene ou ao construto de expressão) são encapsidados eficientemente por proteínas de capsídeo de AAV do que os vetores de rAAV que têm ITRs com ITRs não modificadas (por exemplo, do tipo selvagem) em algumas modalidades, vetores de rAAV que têm uma sequência de "D" modificada (por exemplo, uma sequên- cia de "D" na posição da "parte externa") têm uma toxicidade reduzida em relação aos vetores de rAAV que têm sequências de ITR do tipo selvagem.
[0105] Em algumas modalidades, uma sequência de "D" modificada compreende pelo menos uma substituição de nucleotídeo em relação a uma sequência de "D" do tipo selvagem (por exemplo, a SEQ ID NO: 27). Uma sequência de "D" modificada pode ter pelo menos 1, 2,3,4, 5,6,7,8,9,10, ou mais de 10 substituições de nucleotídeos em relação a uma sequência de "D" do tipo selvagem (por exemplo, a SEQ ID NO: 27). Em algumas modalidades, uma sequência de "D" modificada com- preende pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, ou 19 substitui- ções de ácidos nucleicos em relação a uma sequência de "D" do tipo selvagem (por exemplo, a SEQ ID NO: 27). Em algumas modalidades, uma sequência de "D" modificada fica entre cerca de 10% e cerca de 99% (por exemplo, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 99%) idêntica a uma sequência de "D" do tipo selvagem (por exemplo, a SEQ ID NO: 27). Em algumas modalidades, uma sequência de "D" modificada compreende a sequência indicada na SEQ ID NO: 26, também indicada como uma sequência de "S" tal como descrito por Wang et al. (1995) J Mol Biol 250(5):573-80.
[0106] Um ácido nucleico isolado ou um vetor de rAAV tal como descrito pela invenção também pode compreender uma sequência de "TRY", por exemplo, tal como indicado na SEQ ID NO: 28, ou tal como descrito por Francois, et al. 2005. The Cellular TATA Binding Protein Is Required for Rep-Dependent Replication of a Minimal Adeno-Associ- ated Virus Type 2 p5 Element J Virol. Em algumas modalidades, uma sequência de TRY é posicionada entre uma ITR (por exemplo, uma 8'ITR) e um construto de expressão (por exemplo, uma inserção de co- dificação de transgene) de um ácido nucleico ou vetor de rAAV isolado.
[0107] Em alguns aspectos, a invenção refere-se a vetores de Ba- culovirus que compreendem um ácido nucleico ou vetor de rAAV isolado tal como descrito pela invenção. Em algumas modalidades, o vetor de Baculovirus é um vetor de poliedrose nuclear de Autographa californica (ACNPV), por exemplo, tal como descrito por Urabe et al. 2002) Hum Gene Ther 13(16):1935-43e Smith et al. (2009) Mol Ther 17(11):1888-
1896.
[0108] Em alguns aspectos, a invenção provê uma célula hospe- deira que compreende um ácido nucleico ou um vetor isolado tal como descrito no presente documento. Uma célula hospedeira pode ser uma célula procariótica ou uma célula eucariótica. Por exemplo, uma célula hospedeira pode ser uma célula de mamífero, uma célula bacteriana,
uma célula de levedura, uma célula de inseto, etc. Em algumas modali- dades, uma célula hospedeira é uma célula de mamífero, por exemplo, uma célula de HEK293T. Em algumas modalidades, uma célula hospe- deira é uma célula bacteriana, por exemplo, uma célula de E. coli. rAAVs
[0109] Em alguns aspectos, a invenção refere-se a AAVs recombi- nantes (rAAVs) que compreendem um transgene que codifica um ácido nucleico tal como descrito no presente documento (por exemplo, um ve- tor de rAAV tal como descrito no presente documento). O termo "rAAVs" refere-se de maneira geral às partículas virais que compreendem um vetor de rAAV encapsidado por uma ou mais proteínas de capsídeo de AAV. Um rAAV descrito pela invenção pode compreender uma proteína de capsídeo que tem um sorotipo selecionado de AAV1, AAV2, AAV3, AAVA, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 e AAV10. Em algumas moda- lidades, um rAAV compreende uma proteína de capsídeo de um hospe- deiro não humano, por exemplo uma proteína de capsídeo de AAV de rhesus, tal como AAVrh.10, AAVrh.39, etc. Em algumas modalidades, um rAAV descrito pela invenção compreende uma proteína de capsídeo que é uma variante de uma proteína de capsídeo do tipo selvagem, tal como uma variante da proteína de capsídeo que inclui pelo menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais de 10 (por exemplo, 15, 20 25, 50, 100, etc.) substituições de aminoácido (por exemplo, mutações) em relação à proteína de capsídeo de AAV do tipo selvagem da qual é derivada.
[0110] Em algumas modalidades, as rAAVs descritos pela invenção se disseminam de imediato através do CNS, em particular quando intro- duzidos no espaço do CSF ou diretamente no parênquima do cérebro. Por conseguinte, em algumas modalidades, os rAAVs descritos pela in- venção compreendem uma proteína de capsídeo que é capaz de cruzar a barreira de sangue-cérebro (BBB). Por exemplo, em algumas modali- dades, um rAAV compreende uma proteína de capsídeo que tem um sorotipo AAV9 ou AAVrh.10. A produção de rAAVs é descrita, por exem- plo, por Samulski et al. (1989) J Virol. 63(9):3822-8 e Wright (2009) Hum gene Ther. 20(7): 698-706.
[0111] Em algumas modalidades, um rAAV tal como descrito pela invenção (por exemplo, que compreende um genoma de rAAV recom- binante encapsidado por proteínas de capsídeo de AAV para formar uma partícula de capsídeo de rAAV) é produzido em um sistema de ex- pressão de vetor de Baculovirus (BEVS). A produção de rAAVs com o uso de BEVS é descrita, por exemplo, por Urabe et al. (2002) Hum Gene Ther 13(16):1935-43, Smith et al. (2009) Mol Ther 17(11): 1888-1896, na Patente U.S. nº. 8.945.918, na Patente U.S. nº 9.879.282, e na Publica- ção de Patente PCT Internacional WO 2017/184879. No entanto, um rAAV pode ser produzido ao usar qualquer método apropriado (por exemplo, ao usar genes rep e cap recombinantes). Composições Farmacêuticas
[0112] Em alguns aspectos, a invenção provê composições farma- cêuticas que compreendem um ácido nucleico isolado ou um rAAV tal como descrito no presente documento, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Tal como usado no presente documento, o termo "farmaceu- ticamente aceitável" refere-se a um material, tal como um veículo ou um diluente, que não anulam a atividade ou as propriedades biológicas do composto, e é relativamente atóxico, por exemplo, o material pode ser administrado a um indivíduo sem causar efeitos biológicos indesejáveis ou interagir de uma maneira deletéria com qualquer um dos componen- tes da composição na qual é contido.
[0113] Tal como usado no presente documento, o termo "veículo farmaceuticamente aceitável" refere-se a um material, uma composição ou um veículo farmaceuticamente aceitável, tal como uma carga líquida ou só- lida, um estabilizante, um agente de dispersão, um agente de suspensão, um diluente, um excipiente, um agente espessante, um solvente ou material encapsulante, envolvido na condução ou no transporte de um composto útil dentro da invenção dentro ou para o paciente de maneira tal que pode executar a sua função pretendida. Os ingredientes adicionais que podem ser incluídos nas composições farmacêuticas usadas na prática da invenção são conhecidos no estado da técnica e descritos, por exem- plo, em Remington's Pharmaceutical Sciences (Genaro, Ed., Mack Pu- blishing Co., 1985, Easton, PA), que é incorporado no presente docu- mento a título de referência.
[0114] As composições (por exemplo, composições farmacêuticas) providas no presente documento podem ser administradas por qualquer via, inclusive enteral (por exemplo, oral), parenteral, intravenosa, intra- muscular, intra-arterial, intramedular, intratecal, subcutânea, intraventri- cular, transdermal, interdermal, retal, intravaginal, intraperitoneal, tópica (tal como por meio de pós, pomadas, cremes e/ou gotas), mucosal, na- sal, bucal, sublingual; por meio de instilação intratraqueal, instilação bronquial e/ou inalação; e/ou como um spray oral, spray nasal e/ou ae- rossol. As vias especificamente contempladas são a administração oral, a administração intravenosa (por exemplo, injeção intravenosa sistê- mica), a administração regional através do suprimento de sangue e/ou linfa, e/ou a administração direta a um sítio afetado. De modo geral, a via de administração mais apropriada ira depender de uma variedade de fatores incluindo a natureza do agente (por exemplo, a sua estabili- dade no ambiente do trato gastrointestinal), e/ou da condição do indiví- duo (por exemplo, se o indivíduo pode tolerar a administração oral). Em determinadas modalidades, o composto ou a composição farmacêutica descritos no presente documento são apropriados para a administração tópica ao olho de um indivíduo. Métodos
[0115] A invenção é baseada, na parte, em composições para a ex- pressão de combinações dos produtos de genes associados ao PD em um indivíduo que agem em conjunto (por exemplo, sinergicamente) para tratar o mal de Parkinson. Tal como usado no presente documento, "tra- tar" ou "tratamento" refere-se (a) à prevenção ou surgimento retardado do mal de Parkinson; (b) redução da gravidade do mal de Parkinson; (c) redução ou prevenção do desenvolvimento dos sintomas característicos do mal de Parkinson; (d) e/ou prevenção da piora dos sintomas carac- terísticos do mal de Parkinson. Os sintomas do mal de Parkinson in- cluem, por exemplo, a disfunção motora (por exemplo, agitação, rigidez, lentidão nos movimentos, dificuldade no caminhar), a disfunção cogni- tiva (por exemplo, demência, depressão, ansiedade) e a disfunção emo- cional e comportamental.
[0116] Por conseguinte, em alguns aspectos, a invenção provê um método de tratamento de um indivíduo que tem ou é suspeito de ter o mal de Parkinson, em que o método compreende a administração ao indivíduo de uma composição (por exemplo, uma composição que com- preende um ácido nucleico isolado ou um vetor ou um rAAV) tal como descrito pela invenção.
[0117] Em algumas modalidades, uma composição é administrada diretamente ao CNS do indivíduo, por exemplo, por meio de injeção di- reta no cérebro e/ou no cordão espinal do indivíduo. Os exemplos de modalidades de administração direta no CNS incluem, mas sem ficar a eles limitados, a injeção intracerebral, a injeção intraventricular, a inje- ção intracisternal, a injeção intraparenquimal, injeção intratecal e qual- quer combinação das opções acima. Em algumas modalidades, a inje- ção direta no CNS de um indivíduo resulta na expressão do transgene (por exemplo, expressão do primeiro produto de gene, segundo produto de gene e, se for aplicável, do terceiro produto de gene) no mesencé- falo, no striatum e/ou no córtex cerebral do indivíduo. Em algumas mo- dalidades, a injeção direta no CNS resulta na expressão do transgene (por exemplo, expressão do primeiro produto de gene, segundo produto de gene e, se for aplicável, do terceiro produto de gene) no cordão es- pinal e/ou no CSF do indivíduo.
[0118] Em algumas modalidades, a injeção direta ao CNS de um indivíduo compreende a aplicação realçada por convecção (CED). À aplicação realçada por convecção é uma estratégia terapêutica que en- volve a exposição cirúrgica do cérebro e a colocação de um cateter de pequeno diâmetro diretamente em uma área alvo do cérebro, seguida pela infusão de um agente terapêutico (por exemplo, uma composição ou um rAAV tal como descrito no presente documento) diretamente ao cérebro do indivíduo. A CED é descrita, por exemplo, por Debinski et al. (2009) Expert Rev Neurother. 9(10):1519-27.
[0119] Em algumas modalidades, uma composição é administrada perifericamente a um indivíduo, por exemplo, por meio de injeção peri- férica. Os exemplos de injeção periférica incluem a injeção subcutânea, a injeção intravenosa, a injeção intra-arterial, a injeção intraperitoneal, ou qualquer combinação das opções acima. Em algumas modalidades, a injeção periférica é a injeção intra-arterial, por exemplo, a injeção na artéria carótida de um indivíduo.
[0120] Em algumas modalidades, uma composição (por exemplo, uma composição que compreende um ácido nucleico isolado ou um ve- tor ou um rAAV) tal como descrito pela invenção é administrada perifé- rica e diretamente ao CNS de um indivíduo. Por exemplo, em algumas modalidades, a um indivíduo é administrada uma composição por meio de injeção intra-arterial (por exemplo, injeção na artéria carótida) e de injeção intraparenquimal (por exemplo, injeção intraparenquimal por CED). Em algumas modalidades, a injeção direta ao CNS e a injeção periférica são simultâneas (por exemplo, acontecem ao mesmo tempo). Em algumas modalidades, a injeção direta ocorre anteriormente (por exemplo, entre 1 minuto e 1 semana, ou mais antes) à injeção periférica. Em algumas modalidades, a injeção direta ocorre posteriormente (por exemplo, entre 1 minuto e 1 semana, ou mais depois) à injeção perifé- rica.
[0121] A quantidade de composição (por exemplo, uma composição que compreende um ácido nucleico isolado ou um vetor ou um rAAV) tal como descrito pela invenção administrada a um indivíduo irá variar dependendo do método de administração. Por exemplo, em algumas modalidades, um rAAV tal como descrito no presente documento é ad- ministrado a um indivíduo a um título entre cerca de 10º cópias do ge- noma (GC)/kg e cerca de 10** GC/kg (por exemplo, cerca de 10º GC/kg, cerca de 10*º GC/kg, cerca de 10** GC/kg, cerca de 10º? GC/Kkg, cerca de 10º? GC/kg, ou cerca de 10º** GC/kg). Em algumas modalidades, a um indivíduo é administrado um título elevado (por exemplo, > 10"? có- pia de genoma GC/kg de um rAAV) por meio de injeção ao espaço do CSF, ou através de injeção intraparenquimal.
[0122] Uma composição (por exemplo, uma composição que com- preende um ácido nucleico isolado ou um vetor ou um rAAV) tal como descrito pela invenção pode ser administrada a um indivíduo uma vez ou múltiplas vezes (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20 vezes ou mais). Em algumas modalidades, uma composição é administrada a um indivíduo continuamente (por exemplo, cronicamente), por exemplo através de uma bomba de infusão.
EXEMPLOS Exemplo 1: vetores de rAAV
[0123] Os vetores de AAV são gerados ao usar células, tais como células HEK293, para a transfecção de plasmídeo triplo. As sequências de ITRs flanqueiam um construto de expressão que compreende um promotor/elemento intensificador para cada transgene de interesse, um sinal de 3' polyA, e sinais pós-translacionais tais como o elemento de WPRE. Múltiplos produtos de genes podem ser expressos simultanea- mente, tais como GBA1 e LIMP2 e/ou Prosaposina, através da fusão das sequências de proteínas; ou ao usar um ligante de peptídeo 2A, tal como T2A ou P2A, que conduz 2 fragmentos de peptídeo com aminoá- cidos adicionados devido à prevenção da criação de uma ligação peptí- dica; ou ao usar um elemento de IRES; ou pela expressão com 2 cas- setes de expressão separados. A presença de uma sequência intrônica curta que é emendada eficientemente, a montante do gene expresso, pode melhorar os níveis de expressão. Os sShRNAs e outros RNAs re- guladores podem ser potencialmente incluídos dentro dessas sequên- cias. Os exemplos dos construtos de expressão descritos pela invenção são mostrados nas FIGURAS 1 a 8 e 21 a 35, e na Tabela 2 a seguir. Tabela 2 Tome Promotor T | SPRNA | COST | PoyÃT Elemento —T Promo: “| CDSZ T Polà | Extensão em Cr A nan e e [E E [ear | | ENVe- CBAp GBA INPREPGH [EB esa | Wereseh a Tris Jeiong mRNAISSYn SCARBZ | Jeiong — | asm — | SCAR | boR TA TEN as passa O a O TM Jetrong SCARBZTRES- Tetrong SCAR | bom TRES TEM 75 FPI Jeitona GBAT ba Jeitona. | Jeitong TBAT | DOR Jeitong | SCAR | Svão | s46a sc RR PrevailVec- JetLong asyn PSAP | bGH T2A GBA 4353 tor LT2s JetLong mRNAiaSYn PSA P-T2A-GBA1 bGH 4353nt ProvalVoo: Tetrong PSAP | Syíetepà | RES E 57 tor LI2 JetLong PSAP IRES GBA1 —SymtheticpolvA 43s7nt Prevalvoo- Jetong | asm | &BAZ | WPREBOR 505 tor 105 JeiLong mRNAiaSy GBA2.
WPRE bGH 4308nt Prevalveo Tetong TEM | Syhelepà | TA TA 57 tor FT4 JetLong GBA1 T2A GALC.
SyntheticpolyA 4373nt PrevalVec Teto | TAC | SynelepA | TA 7 TEM | - 7 tor LT4 JetLong GALC T2A GBA1 SyntheticpolyA 4373nt Prevalveo Jetong —[asm — | TSE | WPREBGA | TM TER TZ tor LTSs JetLong mRNAiaSyn CTS B-T2A-GBA1 WPRE, bGH 4392nt Prevalveo Jetong [asma | GBA | Symíelepã | TA SWFD 7 tor FTI1LJetLona mRNAIaSyn GB 1 A1.T28 SMPD1. Syr- theticpolyA 4477mt Prevalvec- Tetrong TAC | SyhelepA | RES TER Fm tor Ll4 JetLong GALC IRES GBA1I SymiheticpolyA 4820nt PrevalVec- Teto | TEM | OA 7 Tetong | cTse | sv | 108 tor FP5 JetLong GBA1 bGH JetLon L 9 CTSB SV40| 4108nt Prevalveo Jetong —[asm — | GBA | WPREGBOR | TA GOA Ts tor FT6s JetLong mRNAIaSyn GBA 1-T2A-GCH1 WPRE bGH 4125nt
Provaívoo Jetong Tam | RAS7 | WPREBOR | TX 7 Em T- 7068 tor LT7s JetLong mRNAIaSyn RAB uú TLI-T2A-GBA1 WPRE bGH 3984nt Provalivoo: Tetong —[asm | BAT | vom TES Teo 7575 tor Fl6s JetLong mRNAiaSYn GBA 1-IRES-GCH1 bGH 3678nt Prevalveo Jetong — [asma | VPSS | WPRE-BOR 8 tor 9st JetLong mRNAiaSyn mRNAi TMENTO | 5 TMEMIOSB VPS35 WPRE bGH 41 6 sont Provaívoo Jetong [am — | GBA | WPAREBOR | TM TS o tor FT12s JetLong mRNAIaSyn GB A1-T2A-1L34 WPRE bGH 4104nt Provalvor- Jetong —fasm — | sa | vom TES TE F067 tor FI12s JetLong mRNAiaSYn GB ATIRES-L34 GH 3967nt Provalveo: Tetrong TEM | vom TD | TREM | Seo | 4255 tor FP9 JetLong GBA1 bGH CD68 2 L TREM? SV40 4263nt Prevalvec CER TEM | OA Teto [ic | sv | 1505 tor FP12 CMVe CBA GBA1 bGH J L etLong 134 SV4ol asoant Exemplo 2: Ensaios à base de células de transdução viral em células com déficit de GBA
[0124] As células com déficit de GBA1 são obtidas, por exemplo, como fibroblastos dos pacientes de GD, monócitos, ous célula hES, ou células tronco pluripotentes induzidas derivadas de pacientes (iPSCs). Essas células acumulam substratos tais como a glucosilceramida e a glucosilesfingosina (GlcCer e GlcSph). O tratamento de linhagens de células cultivada mutantes ou do tipo selvagem com inibidores de Gcase, tal como CBE, também é usado para obter células com déficit de GBA.
[0125] Ao usar tais modelos de células, os defeitos lisossomais são quantificados em termos da acumulação de agregados de proteína, tal como a a-Sinucleína, com um anticorpo para essa proteína ou fosfo-a- Syn, seguida pela obtenção de imagem ao usar microscopia fluores- cente. A obtenção de imagem para anomalias lisossomais por ICC para marcadores de proteínas tais como LAMP1, LAMP2, LIMP1, LIMP2, ou o uso de corantes tais como Lysotracker, ou a absorção através do com- partimento endocítico de dextrana fluorescente ou outros marcadores, também é executada. A obtenção de imagem para a acumulação de marcador de autofagia devido à fusão defeituosa com o lisossoma, tal como para LC3, também pode ser executada. A transferência Western e/ou o ensaio ELISA são usados para quantificar a acumulação anormal desses marcadores. Além disso, a acumulação de substratos de glicoli- pídios e produtos de GBA1 é medida ao usar abordagens padrão.
[0126] Os pontos extremos terapêuticos (por exemplo, a redução da patologia associado ao PD) são medidos no contexto da expressão da transdução dos vetores de AAV, para confirmar e quantificar a atividade e a função. Gcase também pode ser quantificada ao usar medições ELISA de proteína, ou por ensaios da atividade de Gcase padrão. Exemplo 3: Ensaios in vivo ao usar camundongos mutantes
[0127] Este exemplo descreve os ensaios in vivo de vetores de AAV ao usar camundongos mutantes. Os estudos in vivo de vetores de AAV tal como acima em camundongos mutantes são realizados ao usar os ensaios descritos, por exemplo, por Liou et al. (2006) J. Biol. Chem. 281(7): 4242-4253, Sun et al. (2005) J. Lipid Res. 46:2102-2113, e Farfel-Becker et al. (2011) Dis. Modelo Mech. 4(6):746-752.
[0128] A aplicação intratecal ou intraventricular de vetores de con- trole de veículo e de AAV (por exemplo, a uma dose de 2 x 10! vg/ca- mundongo) é executada ao usar materiais de partida de AAV concen- trados, por exemplo, a um volume de injeção entre 5 e 10 ul. A aplicação intraparenquimal pela aplicação realçada por convecção é executada.
[0129] O tratamento é iniciado tanto antes do surgimento dos sinto- mas, quanto subsequente ao surgimento. Os pontos extremos medidos são a acumulação do substrato no CNS e CSF, a acumulação da en- zima Gcase por ELISA e os pontos extremos da atividade da enzima, motora e cognitiva, disfunção lisossomal e a acumulação de monôme- ros, protofibrilas e fibrilas de a-Sinucleína. Exemplo 4: Modelos químicos da doença
[0130] Este exemplo descreve os ensaios in vivo de vetores de AAV ao usar um modelo de camundongo quimicamente induzido da doença de Gaucher (por exemplo, o modelo de camundongo de CBE). Os estu- dos in vivo desses vetores de AAV são realizados em um modelo de camundongo quimicamente induzido da doença de Gaucher, por exem- plo, tal como descrito por Vardi et al. (2016) J Pathol. 239(4):496-509.
[0131] A aplicação intratecal ou intraventricular dos vetores de con- trole de veículo e de AAV (por exemplo, a uma dose de 2 x 10! vgíca- mundongo) é executada ao usar materiais de partida de AAV concen- trado, por exemplo, com um volume da injeção entre 5 e 10 ul. A aplica- ção intraparenquimal pela aplicação realçada por convecção é execu- tada. A aplicação periférica é obtida por meio de injeção na veia da cauda.
[0132] O tratamento é iniciado tanto antes do surgimento dos sinto- mas, quanto depois do surgimento. Os pontos extremos medidos são a acumulação do substrato no CNS e CSF, a acumulação da enzima Gcase por ELISA e da atividade da enzima, e os pontos extremos cog- nitivos, disfunção lisossomal e acumulação de monômeros, protofibrilas e fibrilas de a-Sinucleína. Exemplo 5: Experimentos clínicos em pacientes de PD, LBD e doença de Gaucher
[0133] Em algumas modalidades, os pacientes que têm determina- das formas da doença de Gaucher (por exemplo, GD1) têm um risco maior de desenvolver o mal de Parkinson (PD) ou a demência de corpos de Lewy (LBD). Este exemplo descreve experimentos clínicos para ava- liar a segurança e a eficácia dos rAAVs tal como descrito pela invenção, nos pacientes que têm a doença de Gaucher, PD e/ou LBD.
[0134] Os experimentos clínicos de tais vetores para o tratamento da doença de Gaucher, PD e/ou LBD são realizados ao usar um projeto de estudo similar àquele descrito por Grabowski et al. (1995) Ann. Inter- nar. Med. 122(1):33-39. Exemplo 6: Tratamento de doença periférica
[0135] Em algumas modalidades, os pacientes que têm determina- das formas da doença de Gaucher exibem sintomas de neuropatia pe- riférica, por exemplo, tal como descrito por Biegstraaten et al. (2010) Brain 133(10):2909-2919.
[0136] Este exemplo descreve ensaios in vivo de vetores de AAV tal como descrito no presente documento para o tratamento da neuropatia periférica associada com a doença de Gaucher (por exemplo, doença de Gaucher do tipo 1). Resumidamente, aos pacientes da doença de Gaucher do tipo 1 identificados como tendo sinais ou sintomas de neu- ropatia periférica é administrado um rAAV tal como descrito pela inven- ção. Em algumas modalidades, os sinais e os sintomas de neuropatia periférica do indivíduo são monitorados, por exemplo, ao usar os méto- dos descritos por Biegstraaten et al., após a administração de rAAV.
[0137] Os níveis de produtos de genes transduzidos tal como des- crito pela presente invenção nos pacientes (por exemplo, no soro de um paciente, no tecido periférico (por exemplo, tecido do fígado, tecido do baço, etc.)) de um paciente submetido ao ensaio, por exemplo, pela análise de transferência Western, ensaios funcionais enzimáticos, ou estudos com obtenção de imagem. Exemplo 7: Tratamento de formas do CNS
[0138] Este exemplo descreve os ensaios in vivo de rAAVs tal como descrito no presente documento para o tratamento de formas do CNS da doença de Gaucher. Resumidamente, aos pacientes da doença de Gaucher identificados como tendo uma forma de CNS da doença de Gaucher (por exem- plo, doença de Gaucher do tipo 2 ou do tipo 3) é administrada um rAAV tal como descrito pela invenção. Os níveis de produtos de gene transduzidos tal como descrito pela presente invenção no CNS dos pacientes (por exemplo, no soro do CNS de um paciente, no fluido cerebrospinal (CSF) de um paciente, ou no tecido do CNS de um paciente) submetidos ao ensaio, por exemplo, pela aná- lise de transferência Westem, ensaios funcionais enzimáticos, ou estudos com obtenção de imagem. Exemplo 8: Terapia de genes do mal de Parkinson em indivíduos que têm mutações em GBA1
[0139] Este exemplo descreve a administração de um vírus adeno- associado recombinante (rAAV) GBA1 codificando a um indivíduo que tem mal de Parkinson caracterizado por uma mutação no gene de GBA1.
[0140] A inserção do vetor rAAV-GBA1 contém o elemento promo- tor de CBA (CBA), que consiste em quatro partes: o intensificador de CMV (CMVe), o promotor de CBA (CBAp), o Éxon 1, e o íntron (int) para expressar constitutivamente a sequência de codificação (CD) otimizada com códons de GBA1 humano (marrom). A região 3' também contém um elemento regulador pós-transcricional Elemento Regulador Pós- transcricional (WVPRE) do vírus da hepatite de Woodchuck seguido por uma cauda de sinal poliA do Hormônio do Crescimento de bovino (bGH polyA). As ITRs de flanqueio permitem a compactação correta das se- quências intermediárias. Duas variantes da sequência de 5' ITR (FI- GURA 7, caixa inserida, sequência de baixo) foram avaliadas; essas variantes têm várias diferenças de nucleotídeos dentro da região "D" de nucleotídeos da ITR, que se acredita causa impactos na eficiência de compactação e de expressão. O produto do vetor rAAV-GBA1 con- tém a sequência de nucleotídeos de domínio "D" mostrada na FIGURA 7 (caixa inserida, sequência de cima). Um vetor da variante abriga um domínio "D" mutante (denominado como domínio "S" no presente docu- mento, com as mudanças de nucleotídeos mostradas por sombrea- mento), teve um desempenho similar em estudos pré-clínicos. A cadeia principal contém o gene para conferir resistência à Canamicina, bem como uma sequência de recheador para impedir a compactação re- versa. Um diagrama esquemático que ilustra um vetor rAAV-GBA1 é mostrado na FIGURA 8. O vetor rAAV-GBA1 é compactado em um rAAV ao usar proteínas de capsídeo de sorotipo AAV9.
[0141] rAAV-GBA1 é administrado a um indivíduo como uma única dose através de uma injeção suboccipital guiada por fluoroscopia na cisterna magna (magna intracisternal; ICM). Uma modalidade de um es- tudo de regime de dosagem de rAAV-GBA1 é tal como segue.
[0142] Uma única dose de rAAV-GBA1 é administrada aos pacien- tes (N = 12) a um de dois níveis de dose (3e13 vg (dose baixa); 1614 vg (dose elevada), etc.) que são determinados com base nos resultados de estudos de farmacologia e toxicologia não clínicos.
[0143] Os estudos iniciais foram realizados em um modelo de ca- mundongo químico envolvendo a aplicação diária de conduritol-b-epó- xido (CBE), um inibidor de GCase para avaliar a eficácia e a segurança do vetor rAAV-GBA1 e um construto da variante S de rAAV-GBA1 (tal como descrito mais adiante). Além disso, os estudos iniciais foram rea- lizados em um modelo de camundongo genético, que carrega uma mu- tação GBA1 homozigótica e é parcialmente deficiente em saposinas (4L/PS-NA). Os estudos de variação de doses adicionais nos camun- dongos e em primatas não humanos (NHPs) são realizados para avaliar ainda mais a segurança e a eficácia do vetor.
[0144] Duas versões ligeiramente diferentes da repetição de termi- nal invertido 5' (ITR) na cadeia principal de AAV foram testadas para avaliar a manufaturabilidade e a expressão de transgene (FIGURA 7). Acre- dita-se que o domínio "D" de 20 bp dentro da 5' ITR de 145 bp seja necessário para a produção viral ideal do vetor, mas também foram relatadas mutações dentro do domínio "D" para aumentar a expressão do transgene em alguns casos. Desse modo, além do vetor rAAV-GBA1 viral, que abriga um domínio "D" intacto, uma segunda forma de vetor com um domínio D mutante (deno- minado como domínio "S" no presente documento) também foi avaliada. Am- bos rAAV-GBA1 e a variante expressam o mesmo transgene. Embora ambos os vetores tenham produzido o vírus que era eficaz in vivo tal como detalhado a seguir, rAAV-GBA1, que contém um domínio "D" do tipo selvagem, foi selecionado para mais desenvolvimento.
[0145] Para estabelecer o modelo de CBE da deficiência de GCase, camundongos juvenis foram dosados com CBE, um inibidor específico de GCase. Aos camundongos foi administrado CBE através de injeção IP diária, começando no 8º dia após o nascimento (P8). Três doses di- ferentes de CBE (25 mg/kg, 37,5 mg/kg, 50 mg/kg) e PBS foram testa- das para estabelecer um modelo que exibisse um fenótipo comporta- mental (FIGURA 9). Doses mais elevadas de CBE conduziram à letali- dade de uma maneira dependente da dose. Todos os camundongos tratados com 50 mg/kg de CBE morreram em P23, e 5 dos 8 camun- dongos tratados com 37,5 mg/kg de CBE morreram em P27. Não havia nenhuma letalidade nos camundongos tratados com 25 mg/kg de CBE. Ao passo que os camundongos nos quais foi injetado CBE não mostra- ram nenhum déficit motor geral no ensaio de campo aberto (percorrendo a mesma distância e à mesma velocidade que os camundongos que receberam PBS), os camundongos tratados com CBE exibiram um dé- ficit de coordenação motora e equilíbrio tal como medido pelo ensaio rotarod.
[0146] Os camundongos que sobreviveram ao final do estudo foram sacrificados no dia após a sua última dose de CBE (P27, "dia 1") ou três dias depois da retirada de CBE (P29, "dia 3"). A análise de lipídio foi executada no córtex dos camundongos que receberam 25 mg/kg de CBE para avaliar a acumulação de substratos de GCase nas coortes do dia 1 e do dia 3. Os níveis de GluSph e de GalSph (medidos no agre- gado neste exemplo) foram acumulados de maneira significativa nos ca- mundongos tratados com CBE em comparação aos controles tratados com PBS, consistentes com a insuficiência de GCase.
[0147] Com base no estudo descrito acima, a dose de 25 mg/kg de CBE foi selecionada, uma vez que produziu déficits comportamentais sem causar impactos na sobrevivência. Para obter a distribuição de GBA1 amplamente difundida por todo o cérebro e a expressão do trans- gene durante o tratamento de CBE, rAAV-GBA1 ou o excipiente foi apli- cado através de injeção intracerebroventricular (ICV no dia 3 após o nascimento (P3) seguido pelo tratamento diário de IP CBE ou PBS ini- ciado em P8 (FIGURA 10).
[0148] Os camundongos tratados com CBE que receberam rAAV- GBA1 tiveram um desempenho estatisticamente significativamente me- lhor no rotarod do que aqueles que receberam o excipiente (FIGURA 11). Os camundongos no grupo de tratamento variante não diferiram dos camundongos tratados com excipiente em termos de outras medi- das comportamentais, tal como a distância total percorrida durante os testes (FIGURA 11).
[0149] Na conclusão do estudo em vida, a metade dos camundon- gos foi sacrificada no dia após a última dose de CBE (P36, "dia 1") ou três dias depois da retirada de CBE (P38, "dia 3") para a análise bioquíi- mica (FIGURA 12). Ao usar um ensaio de enzima fluorométrico reali- zado em triplicata biológica, a atividade de GCase foi avaliada no córtex. A atividade de GCase foi aumentada nos camundongos que foram tra- tados com rAAV-GBA1, ao passo que o tratamento de CBE reduziu a atividade de GCase. Além disso, os camundongos que receberam CBE e rAAV-GBA1 tiveram níveis de atividade de GCase que eram similares ao grupo tratado com pBS, indicando que a aplicação de rAAV-GBA1 pode superar a inibição da atividade de GCase induzida pelo tratamento de CBE. A análise de lipídio foi executada no córtex motor dos camun- dongos para examinar níveis dos substratos GluCer e GluSph. Ambos os lipídios acumularam nos cérebros dos camundongos que receberam CBE, e o tratamento de rAAV-GBA1 reduziu de maneira significativa a acumulação do substrato.
[0150] Os níveis de lipídios foram correlacionados negativamente com a atividade e o desempenho de GCase no ensaio Rotarod através dos grupos de tratamento. A atividade aumentada de GCase depois da administração de rAAV-GBA1 foi associada com a redução do substrato e realçou a função motora (FIGURA 13). Tal como mostrado na FIGURA 14, a biodistribuição preliminar foi avaliada pela presença do genoma do vetor, tal como medido por qPCR (com > 100 genomas de vetor por 1 ug de DNA genômico definido como positivo). Os camundongos que receberam rAAV-GBA1, com e sem CBE, eram positivos para genomas do vetor rAAV-GBA1 no córtex, indicando que a aplicação ICV resulta na aplicação de rAAV-GBA1 ao córtex. Além disso, os genomas de vetor foram detectados no fígado, poucos no baço, e nenhum no coração, no rim ou nas gônadas. Para todas as medidas, não havia nenhuma dife- rença estatisticamente significativa entre os grupos no dia 1 e no dia 3.
[0151] Um estudo mais amplo no modelo de CBE também explorou doses eficazes de rAAV-GBA1 no modelo de CBE. Ao usar o modelo de dose de 25 mg/kg de CBE, o excipiente ou o rAAV-GBA1 foi aplicado através de ICV em P3, e o tratamento diário de IP PBS ou CBE foi inici- ado em P8. Devido à similaridade entre os grupos com e sem a retirada de CBE observada nos estudos precedentes, todos os camundongos foram sacrificados um dia após a dose final de CBE (P38-40). O efeito de três doses de rAAV-GBA1 diferentes foi avaliado, resultando nos cinco grupos a seguir, com 10 camundongos (S5M/5F) por grupo: Excipiente ICV + PBS IP Excipiente ICV + 25 mg/kg de CBE |P
3.209 vg (2.13e10 vg/g do cérebro) rAAV-GBA1 ICV + 25 mg/kg de CBE IP
1.0810 vg (6.67e10 vg/g do cérebro) rAAV-GBA1 ICV + 25 mg/kg de
CBE IP
3.2610 vg do cérebro) rAAV-GBA1 ICV + 25 mg/kg de CBE |P.
[0152] A dose mais elevada de rAAV-GBA1 resgatou a falha relaci- onada ao tratamento de CBE para ganho de peso em P37. Além disso,
essa dose resultou em um aumento estatisticamente significativo no de- sempenho no ensaio rotarod e na travessa afunilada em comparação ao grupo tratado com excipiente + CBE (FIGURA 15). A letalidade foi observado em vários grupos, incluindo os grupos tratados com excipi- ente e tratados com rAAV-GBA1 (excipiente + PBS: O; Excipiente + 25 mg/kg de CBE: 1; 3.269 vg rAAV-GBA1 + 25 mg/kg de CBE: 4; 1.0810 vg rAAV-GBA1 + 25 mg/kg de CBE: 0; 3.2e010 vg rAAV-GBA1 + 25 mg/kg de CBE: 3).
[0153] Na conclusão do estudo em vida, os camundongos foram sa- crificados para a análise bioquímica (FIGURA 16). A atividade de GCase no córtex foi avaliada em triplicatas biológicas por um ensaio fluoromé- trico. Os camundongos tratados com CBE exibiram uma atividade redu- zida de GCase, ao passo que os camundongos que receberam uma dose elevada de rAAV-GBA1 exibiram um aumento estatisticamente significativo na atividade de GCase em comparação ao tratamento de CBE. Os camundongos tratados com CBE também tiveram uma acu- mulação de GluCer e de GluSph, ambos os quais foram resgatados me- diante a administração de uma dose elevada de rAAV-GBA1.
[0154] Além do modelo de CBE químico estabelecido, rAAV-GBA1 também é avaliado no modelo genético de 4L/PS-NA, que é homozigó- tico para a mutação de V394L GD em Gba1 e também é parcialmente deficiente em saposinas, o que afeta a localização e a atividade de GCase. Esses camundongos exibem déficits na resistência motora, na coordenação e no equilíbrio, tal como evidenciado por seu desempenho nos ensaios de caminhar na travessa, rotarod e pendurar no fio. Tipica- mente, o período de vida desses camundongos é de menos de 22 se- manas. Em um estudo inicial, 3 ul do vírus ao título máximo foram apli- cados por ICV em P23, com uma dose final de 2.4010 vg (6.0810 vg/g do cérebro). Com 6 camundongos por grupo, os grupos do tratamento eram:
WT + Excipiente ICV 4L/PS-NA + Excipiente ICV 4L/PS-NA + 2.4e€10 vg (6.0810 vg/g do cérebro) rAAV-GBA1 ICV
[0155] O desempenho motor pelo teste de caminhar na travessa foi avaliado 4 semanas após a aplicação de rAAV-GBA1. O grupo dos ca- mundongos mutantes que receberam rAAV-GBA1 mostrou uma tendên- cia para menos escorregadelas no total e menos escorregadelas por velocidade quando comparado aos camundongos mutantes tratados com o excipiente, restaurando a função motora até quase níveis de WT (FIGURA 17). Uma vez que os fenótipos da função motora se tornam mais graves à medida que esses camundongos envelhecem, o seu de- sempenho neste e em outros testes comportamentais é avaliado em pontos no tempo mais adiante. Na conclusão do estudo em vida, os ní- veis de lipídios, a atividade de GCase e a biodistribuição são avaliados nesses camundongos.
[0156] Doses menores adicionais de rAAV-GBA1 estão sendo tes- tadas atualmente ao usar o modelo de CBE, que corresponde a 0,03x, 0,1xe 1x a dose clínica elevada de fase 1 proposta. Cada grupo inclui camundongos (SM/5F) por grupo: Excipiente ICV Excipiente ICV + 25 mg/kg de CBE IP
3.268 vg (2.13e9 vg/g do cérebro) rAAV-GBA1 ICV + 25 mg/kg de CBE
IP
1.069 vg (6.67e9 vg/g do cérebro) rAAV-GBA1 ICV + 25 mg/kg de CBE
IP
1.0810 vg (6.67e10 vg/g do cérebro) rAAV-GBA1 ICV + 25 mg/kg de CBE IP.
[0157] Além dos fenótipos da função motora, os níveis de lipídios e a atividade de GCase são avaliados no córtex. O curso do tempo dos tratamentos e das análises também é executado.
[0158] Um estudo de maior variação da dose foi iniciado para ava- liar os dados da eficácia e da segurança. 10 camundongos 4L/PS-NA (SM/5F por grupo) foram injetados com 10 ul de rAAV-GBA1. Ao usar um cálculo do peso alométrico do cérebro, as doses foram correlacio- nadas a 0,15x, 1,5x, 4,4x e 14,5x a dose elevada clínica da fase 1 pro- posta. Os grupos de injeção consistem em: WT + Excipiente ICV 4L/PS-NA + Excipiente ICV 4L/PS-NA + 4.3e9 vg (1.1610 vg/g do cérebro) rAAV-GBA1 ICV 4L/PS-NA + 4.3e10 vg (1.1611 vg/g do cérebro) rAAV-GBA1 ICV 4L/PS-NA + 1.3e11 vg (3.2611 vg/g do cérebro) rAAV-GBA1 ICV 4L/PS-NA + 4.3e11 vg (1.1612 vg/g do cérebro) rAAV-GBA1 ICV.
[0159] Um sumário de estudos não clínicos no modelo de CBE é mostrado na Tabela 3 a seguir. Tabela 3: Sumário dos Resultados no Modelo de Camundongo CBE | ee tt mA e DS Erre me E TITO MAAVGBAI no [TT06TOva TT WE 75 ns 7 7 F30T0va ET ns s s o 7 Ns EXSPPIMMMAMMBR Variante PRVZOTEDOS — | 8860 vg NÃ [NS s s 7 7 Faixa de dose de | (6.9010 vglg cérebro) delo CBE Deve ser observado que a biodistribuição positiva é definida como > 100 vg/l ug de DNA genômico. Abreviaturas: BD = biodistribuição; NS = não significativo; T = tendência; S = significativo; N/A = não aplicável; + = positivo; - = negativo. Exemplo 9: Análise in vitro de vetores de rAAV
[0160] Construtos de rAAV foram testados in vitro e in vivo. A FI- GURA 18 mostra os dados representativos para a expressão in vitro dos construtos de rAAV que codificam a proteína progranulina (PGRN). O painel à esquerda mostra uma curva padrão do ensaio de ELISA da progranulina (PGRN). O painel inferior mostra uma resposta à dose da expressão de PGRN medida pelo ensaio ELISA em lisatos de célula de células HEK293T transduzidas com rAAV. MOI = multiplicidade da in- fecção (genomas de vetor por célula).
[0161] Um estudo piloto foi realizado para avaliar a atividade in vitro dos vetores do rAAV que codificam a Prosaposina (PSAP) e SCARB?2, sozinhas ou em combinação com GBA1 e/ou um ou mais RNAs inibido- res. Um construto que codifica PSAP e a progranulina (PGRN) também foi testado. Os vetores testados incluem aqueles mostrados na Tabela
4. "Opt" refere-se a uma sequência de ácidos nucleicos otimizada com códons para a expressão em células de mamíferos (por exemplo, célu- las humanas). A FIGURA 19 mostra os dados representativos que indi- cam que a transfecção das células HEK293 com cada um dos constru- tos resultou na superexpressão do produto de gene correspondente em comparação às células transfectadas de simulacro.
[0162] Um estudo piloto foi realizado para avaliar a atividade in vitro dos vetores de rAAV que codificam TREM?2, sozinhos ou em combina- ção com um ou mais RNAs inibidores. Os vetores testados incluem aqueles mostrados na Tabela 4. "Opt" refere-se a uma sequência de ácidos nucleicos optimizada com códons para a expressão em células de mamíferos (por exemplo, células humanas). As FIGURAS 36A e 36B mostram os dados representativos que indicam que a transfecção de célula HEK293 com cada um dos construtos resultou na superexpres- são do produto de gene correspondente em comparação às células transfectadas de simulacro. Tabela 4 1D Promotor RNA inibidor Promotor Transgene 100038 7 7 JetLong OprPSAP-GRN
Exemplo 10: Teste de construtos de SARNA de SCNA e TMEM106B Células HEK293
[0163] A linhagem de células do rim embrionárias 293 (HEK293) foi usada neste estudo (ft 85120602, Sigma-Aldrich). As células HEK293 foram mantidas no meio de cultura (D-MEM [ %& 11995065, Thermo Fis- her Scientific] suplementado com soro fetal de bovino a 10% [FBS] [t 10082147, Thermo Fisher Scientific]) contendo 100 unidades/ml! de pe- nicilina e 100 pg/ml de estreptomicina (* 15140122, Thermo Fisher Sci- entific). Transfecção de plasmídeo
[0164] A transfecção de plasmídeo foi executada ao usar o reagente de transfecção Lipofectamine 2000 (*% 11668019, Thermo Fisher Scien- tific) de acordo com a instrução do fabricante. Resumidamente, as célu- las HEK293 (tt 12022001, Sigma-Aldrich) foram chapeadas à densidade de 3 x 105 células/ml em um meio de cultura sem antibióticos. No dia seguinte, o plasmídeo e o reagente Lipofectamine 2000 foram combina- dos em uma solução de Opti-MEM (t 31985062, Thermo Fisher Scien- tific). Depois de 5 minutos, as misturas foram adicionadas à cultura de HEK293. Depois de 72 horas, as células foram colhidas para a extração do RNA ou de proteína, ou sujeitadas a análises de imagens. Para as análises de imagens, as placas foram pré-revestidas com 0,01% de uma solução de poli-L-Lisina (P8920, Sigma-Aldrich) antes do chapeamento das células. Análise da expressão do gene por análise PCR em tempo real quantita- tiva (4RT-PCR)
[0165] Os níveis relativos da expressão do gene foram determina- dos por meio de análise PCR em tempo real quantitativa (GRT-PCR) ao usar o Kit Power SYBR Green Cells to CT (4% 4402955, Thermo Fisher Scientific) de acordo com a instrução do fabricante. Os plasmídeos can- didatos foram transfectados de modo transiente nas células HEK293 chapeadas em placas de 48 poços (7,5 x 10º células) ao usar o reagente de transfecção Lipofectamine 2000 (0,5 ug de plasmídeo e 1,5 ul de reagente em 50 ul da solução de Opti-MEM). Depois de 72 horas, o RNA foi extraído das células e usado para a transcrição reversa para sinteti- zar O DNA de acordo com a instrução do fabricante. Para a análise PCR quantitativa, 2 a 5 ul de produtos de cDNA foram amplificados em dupli- catas ao usar pares de iniciadores específicos de genes (concentração final de 250 nM) com a mistura Power SYBR Green PCR Master (ft 4367659, Thermo Fisher Scientific). As sequências de iniciadores para os genes de SNCA, TMEM106B e GAPDH eram: 5- AAG AGG GTG TTC TCT ATG TAG GC -3' (SEQ ID NO: 71), 5- GOT CCT CCA ACA TTT GTC ACT T -3' (SEQ ID NO: 72) para SNCA, 5-ACA CAG TAC CTA CCG TTA TAG CA-3' (SEQ ID NO: 73), 5-TGT TGT CAC AGT AAC TTG CAT CA-3' (SEQ ID NO: 74) para TMEM106B, e 5- CTG GGC TAC ACT GAG CAC C -3' (SEQ ID NO: 75), 5- AAG TGG TCG TTG AGG GCA ATG -3' (SEQ ID NO: 76) para GAPDH. A análise PCR quan- titativa foi executada em um sistema QuantStudio 3 Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific). Os níveis da expressão foram normalizados pelo gene GAPDH doméstico e calculados ao usar o método de CT comparativa.
Análise de Imagem de Fluorescência
[0166] Os plasmídeos repórteres de EGFP, que contêm 3'-TUR do gene de SNCA humano a jusante da região de codificação de EGFP, foram usados para a validação de plasmídeos de kKnockdown de SNCA e TMEM106B. Os plasmídeo repórteres de EGFP os plasmídeos de knockdown candidatos foram transfectados simultaneamente nas célu- las HEK293 chapeadas nas placas de 96 poços revestidas com poli-L- Lisina (3,0 x 10º células) ao usar o reagente de transfecção Lipofecta- mine 2000 (0,04 ug de plasmídeo repórter, 0,06 ug de plasmídeo de knockdown e 0,3 ul de reagente em 10 ul da solução de Opti-MEM).
Depois de 72 horas, as intensidades fluorescentes do sinal de EGFP foram medidas à excitação de 488 nm/emissão de 512 nm ao usar o leitor multimodal Varioskan LUX (Thermo Fisher Scientific). As células foram fixadas com 4% de PFA à temperatura ambiente por 10 minutos, e incubadas com D-PBS contendo 40 pg/ml de 7-aminoactinomicina D (7-AAD) por 30 minutos à temperatura ambiente. Após a lavagem com D-PBS, as intensidades fluorescentes do sinal de 7-AAD foram medidas à excitação de 546 nm/emissão de 647 nm ao usar o leitor Varioskan para quantificar o número das células. O sinal de EGFP normalizado por níveis de sinal de 7-AAD foi comparado com as amostras de knockdown de controle.
Ensaio de Imunoabsorção Enzimática (ELISA)
[0167] Plasmídeos repórteres de a-Sinucleína, que contêm 3-UTR de gene de SNCA humano ou de gene de TMEM106B a jusante da re- gião de codificação de SNCA, foram usados para a validação de plas- mídeos de knockdown ao nível da proteína. Os níveis da proteína a- Sinucleína foram determinados por meio de ELISA (% KHBOO061, Thermo Fisher Scientific) ao usar os lisatos extraídos de células HEK293. Os plasmídeos candidatos foram transfectados de modo transiente nas cé- lulas HEK293 chapeadas em placas de 48 poços (7,5 x 10º células) ao usar o reagente de transfecção Lipofectamine 2000 (0,1 ug de plasmí- deo repórter, 0,15 ug de plasmídeo de knockdown e 0,75 ul de reagente em 25 ul da solução de Opti-MEM). Depois de 72 horas, as células fo- ram lisadas em tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) (tt 89900, Thermo Fisher Scientific) suptementado com o coquetel de inibi- dor de protease (% P8340, Sigma-Aldrich), e submetido à sonicação por alguns segundos. Após a incubação em gelo por 30 minutos, os lisatos foram centrifugados a 20.000 x g a 4ºC por 15 minutos, e o sobrena- dante foi coletado. Os níveis de proteína foram quantificados. As placas foram lidas em um leitor de placa Varioskan a 450 nm, e as concentra- ções foram calculadas ao usar o software SoftMax Pro 5. As concentra- ções de proteína medidas foram normalizadas à concentração de pro- teína total determinada com um ensaio de ácido bicinconínico (tt 23225, Thermo Fisher Scientific).
[0168] A FIGURA 37 e a Tabela 5 mostram os dados representati- vos que indicam o silenciamento bem sucedido de SCNA em ensaio de repórter de GFP in vitro (topo) e ensaio de a-Syn (base). A FIGURA 38 e a Tabela 6 mostram dados representativos que indicam o silencia- mento bem sucedido de TMEM106B in vitro pelo ensaio de repórter de GFP (topo) e ensaio de a-Syn (base). Tabela 5 Tabela 6
Exemplo 11: Colocação da sequência "D" de ITR e transdução de célu- las
[0169] O efeito da colocação da sequência "D" de ITR na transdu- ção de células de vetores de rAAV foi investigado. As células HEK293 foram transduzidas com os rAAVs de codificação de Gcase que têm 1) ITRs do tipo selvagem (por exemplo, sequências de "D" proximais à in- serção do transgene e distais ao terminal da ITR) ou 2) ITRs com a se- quência "D" localizada na "parte externa" do vetor (por exemplo, a se- quência "D" proximal ao terminal da ITR e distal da inserção do trans- gene), tal como mostrado na FIGURA 20. Surpreendentemente, os da- dos indicam que os rAAVs que têm a sequência de "D" localizada na posição da "parte externa" retêm a capacidade de serem compactados de transduzir as células eficientemente (FIGURA 40). Exemplo 12: Teste in vitro de rAAVs de Progranulina
[0170] A FIGURA 39 é um diagrama esquemático que ilustra uma modalidade de um vetor que compreende um construto de expressão que codifica PGRN. A Progranulina é superexpressa no CNS de roedo- res com déficit de GRN, tanto heterozigóticos quanto homozigóticos para a deleção de GRN, por meio da injeção de um vetor de rAAV que codifica PGRN (por exemplo, PGRN otimizada com códons), pela inje- ção tanto intraparenquimal quanto intratecal tal como na cisterna magna.
[0171] Os camundongos são injetados a 2 meses ou 6 meses de idade, e envelhecidos até 6 meses ou 12 meses, e analisados quanto a um ou mais do que segue: nível de expressão de GRN aos níveis de RNA e de proteína, ensaios comportamentais (por exemplo, movimento melhorado), ensaios de sobrevivência (por exemplo, sobrevivência me- lhorada), marcadores de microglia e inflamatórios, gliose, perda neuro- nal, Lipofuscinose e/ou resgate de acumulação de marcador Lisosso- mal, tal como LAMP1. Os ensaios em camundongos com déficit de
PGRN são descritos, por exemplo, por Arrant et al. (2017) Brain 140: 1477-1465; Arrant et al. (2018) J. Neuroscience 38(9):2341 —2358; e Amado et al. (2018) doi:https://doi.org/10.1101/30869; cujos teores inte- grais são incorporados no presente documento a título de referência.
EQUIVALENTES
[0172] Este pedido de patente incorpora a título de referência os conteúdos dos documentos a seguir em sua totalidade: Pedido de Pa- tente PCT Internacional referente ao Documento de Advogado número P1094.70002WO00, depositado em 03 de outubro de 2018; Pedido de Patente PCT Internacional referente ao Documento de Advogado nú- mero P1094.70004WO0O00, depositado em 03 de outubro de 2018; Pedi- dos de Patente Provisórios Números de Série 62/567.296, depositado em 03 de outubro de 2017, intitulado "TERAPIAS DE GENES PARA DISTÚRBIOS LISOSSOMAIS"; 62/567.311, depositado em 03 de outu- bro de 2017, intitulado "TERAPIAS DE GENES PARA DISTÚRBIOS LI- SOSSOMAIS"; 62/567.319, depositado em 03 de outubro de 2017, inti- tulado "TERAPIAS DE GENES PARA DISTÚRBIOS LISOSSOMAIS"; 62/567.301, depositado em 03 de outubro de 2018, intitulado "TERA- PIAS DE GENES PARA DISTÚRBIOS LISOSSOMAIS"; 62/567.310, depositado em 03 de outubro de 2017, intitulado "TERAPIAS DE GE- NES PARA DISTÚRBIOS LISOSSOMAIS"; 62/567.303, depositado em 03 de outubro de 2017, intitulado "TERAPIAS DE GENES PARA DIS- TÚRBIOS LISOSSOMAIS"; e 62/567.305, depositado em 03 de outubro de 2017, intitulado "TERAPIAS DE GENES PARA DISTÚRBIOS LISOS- SOMAIS".
[0173] Tendo desse modo sido descritos vários aspectos de pelo menos uma modalidade da presente invenção, deve ser apreciado que várias alterações, modificações e melhorias irão ocorrer de imediato aos elementos versados na técnica. Tais alterações, modificações e melho- rias devem ser consideradas como parte desta invenção, e devem estar dentro do caráter e do âmbito da invenção. Por conseguinte, a descrição e os desenhos acima são apenas a título de exemplo.
[0174] Embora várias modalidades da presente invenção tenham sido descritas e ilustradas no presente documento, os elementos nor- malmente versados no estado da técnica irão vislumbrar de imediato uma variedade de outros meios e/ou estruturas para executar as fun- ções e/ou obter os resultados e/ou uma ou mais das vantagens descri- tas no presente documento, e cada uma de tais variações e/ou modifi- cações é considerada para estando dentro do âmbito da presente in- venção. De modo mais geral, os elementos versados na técnica irão apreciar de imediato que todos os parâmetros, dimensões, materiais e configurações descritos no presente documento devem ser considera- dos como exembplificadores, e que os parâmetros, as dimensões, os ma- teriais e/ou as configurações reais irão depender da aplicação ou das aplicações específicas para as quais os ensinamentos da presente in- venção são usados. Os elementos versados na técnica irão reconhecer, ou poderão verificar ao usar uma experimentação não mais do que roti- neira, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção des- critas no presente documento. Portanto, deve ser compreendido que as modalidades acima são apresentadas apenas a título de exemplo e que, dentro do âmbito das reivindicações e dos equivalentes adicionados à mesma, a invenção pode ser praticada de uma outra maneira que não aquela especificamente descrita e reivindicada. A presente invenção é dirigida a cada característica, sistema, artigo, material e/ou método in- dividuais descritos no presente documento. Além disso, qualquer com- binação de dois ou mais de tais características, sistemas, artigos, ma- teriais e/ou métodos, se tais características, sistemas, artigos, materiais e/ou métodos não forem mutuamente inconsistentes, é incluída dentro do âmbito da presente invenção.
[0175] Os artigos indefinidos "um" e "uma", tal como usado no pre- sente documento no relatório descritivo e nas reivindicações, a menos que esteja indicado claramente de alguma outra maneira, devem ser compreendidos como se referindo a "pelo menos um".
[0176] A expressão "e/ou", tal como usada no presente documento no relatório descritivo e nas reivindicações, deve ser compreendida como se referindo a "qualquer um ou ambos" elementos assim unidos, isto é, os elementos que estão presentes em conjunto em alguns casos e presentes não conjuntamente em outros casos. Outros elementos po- dem estar opcionalmente presentes além dos elementos identificados especificamente pela cláusula "e/ou", quer estejam relacionados ou não relacionados aos elementos identificou especificamente a menos que esteja indicado claramente de alguma outra maneira. Desse modo, como um exemplo não limitador, uma referência a "A e/ou B," quando usada em conjunto com a linguagem de sentido aberto tal como "com- preende" pode se referir, em uma modalidade, a A sem B (opcional- mente incluindo elementos que não B); em uma outra modalidade, a B sem A (opcionalmente incluindo elementos que não A); em ainda uma outra modalidade, a A e a B (opcionalmente incluindo outros elementos); etc.
[0177] Tal como usado no presente documento no relatório descri- tivo e nas reivindicações, "ou" deve ser compreendido como tendo o mesmo significado que "e/ou" tal como definido acima. Por exemplo, quando itens são separados em uma lista, "ou" ou "e/ou" será interpre- tado como sendo inclusivo, isto é, a inclusão de pelo menos um, mas também incluindo mais de um, de um número ou de uma lista de ele- mentos e, opcionalmente, itens não listados adicionais. Somente os ter- mos indicados claramente de alguma outra maneira, tais como "so- mente um de" ou "exatamente um de" ou, quando usados nas reivindi-
cações, "consiste", irão de referir à inclusão de exatamente um ele- mento de um número ou uma lista de elementos. De modo geral, o termo "ou", tal como usado no presente documento, será interpretado somente como indicando alternativas exclusivas (isto é "uma ou a outra, mas não ambas") quando precedido por termos de exclusividade tais como "qual- quer um de", "um de", "somente um de" ou "exatamente um de". "Con- siste essencialmente em", quando usado nas reivindicações, terá o seu significado comum tal como usado no campo da lei de patentes.
[0178] Tal como usado no presente documento no relatório descri- tivo e nas reivindicações, a expressão "pelo menos um", em referência a uma lista de um ou mais elementos, deve ser compreendido como se referindo a pelo menos um elemento selecionado de qualquer um ou mais dos elementos na lista de elementos, mas não incluindo necessa- riamente pelo menos um de cada elemento listado especificamente den- tro da lista de elementos e não excluindo quaisquer combinações dos elementos na lista de elementos. Esta definição também permite que elementos possam estar opcionalmente presentes além dos elementos identificados especificamente dentro da lista de elementos aos quais a expressão "pelo menos um" de refere, quer esteja relacionado ou não aos elementos identificados especificamente. Desse modo, como um exemplo não limitador, "pelo menos um de A e B" (ou, de modo equiva- lente, "pelo menos um de A ou B," ou, de modo equivalente "pelo menos um de A e/ou B") pode se referir, em uma modalidade, a pelo menos um, opcionalmente incluindo mais de um, A, sem nenhum B presente (e incluindo opcionalmente elementos que não B); em uma outra modali- dade, a pelo menos um, opcionalmente incluindo mais de um, B, sem nenhum A presente (e incluindo opcionalmente elementos que não A); em ainda uma outra modalidade, a pelo menos um, opcionalmente in- cluindo mais de um, A, e pelo menos um, opcionalmente incluindo mais de um, B (e opcionalmente incluindo outros elementos); etc.
[0179] Nas reivindicações, assim como no relatório descritivo acima, todas as expressões de transição tais como "compreende", "in- clui", "porta", "tem", "contém", "envolve", "mantém", e outras ainda de- vem ser compreendidas como de sentido aberto, isto é, significando que incluem mas sem ficar limitados a. Somente as expressões de transição "que consiste em" e "que consiste essencialmente em" serão expres- sões de transição de sentido fechado ou semifechado, respectivamente, tal como determinado United States Patent Office Manual of Patent Exa- mining Procedures, seção 2111.03.
[0180] O uso de expressões ordinais tais como "primeiro", "se- gundo". "terceiro", etc., nas reivindicações para modificar um elemento da reivindicação não conota em si nenhuma prioridade, precedência ou ordem de um elemento da reivindicação em relação a um outro ou a ordem temporal em que os atos de um método são executados, mas são usadas meramente como etiquetas para distinguir um elemento da reivindicação que tem um determinado nome de um outro elemento que tem um mesmo nome (mas para o uso do termo ordinal) para distinguir os elementos da reivindicação.
[0181] Também deve ser compreendido que, a menos que esteja indicado claramente de alguma outra maneira, em todos os métodos reivindicados no presente documento que incluem mais de uma etapa ou ato, a ordem das etapas ou dos atos do método não são limitados necessariamente à ordem em que as etapas ou os atos do método são recitados.
SEQUÊNCIAS
[0182] Em algumas modalidades, um cassete de expressão que co- difica um ou mais produtos de genes (por exemplo, um primeiro, se- gundo e/ou terceiro produtos de genes) compreende ou consiste em (ou codifica um peptídeo que tem) em uma sequência indicada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-78. Em algumas modalidades, um produto de gene é codificado por uma porção (por exemplo, fragmento) de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-78.

Claims (109)

REIVINDICAÇÕES
1. Ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica uma proteína Gcase flanqueada por duas repe- tições de terminal invertidas (ITRs) de vírus adeno-associado (AAV) (ITRs), caracterizado pelo fato de que (i) pelo menos uma das ITRs compreende uma região "D" modificada em relação a uma AAV2 ITR do tipo selvagem (SEQ ID NO: 29); e/ou (ii) a proteína Gcase é codificada por uma sequência de áci- dos nucleicos otimizada com códon.
2. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína Gcase compreende a sequên- cia de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 14 ou uma porção da mesma.
3. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a proteína Gcase é codificada por uma sequência de ácidos nucleicos otimizada com códon, opcionalmente a sequência de ácidos nucleicos indicada na SEQ ID NO: 15.
4. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a região “D” modifi- cada é uma sequência de "D" situada na parte externa da ITR em rela- ção ao construto de expressão.
5. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a ITR que compre- ende a sequência modificada de "D" é uma 3' ITR.
6. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência TRY, em que a sequência TRY é opcionalmente indi- cada na SEQ ID NO: 28.
7. Ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica uma proteína prosaposina flanqueada por duas repetições terminais invertidas (ITRs) de vírus adeno-associado (AAV), caracterizado pelo fato de que (i) pelo menos uma das ITRs compreende uma região “D” modificada em relação a uma AAV2 ITR do tipo selvagem (SEQ ID NO: 29); e/ou (ii) a proteína prosaposina é codificada por uma sequência de ácidos nucleicos otimizada com códon.
8. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a proteína prosaposina compreende a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 16 ou uma porção da mesma.
9. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a proteína prosaposina é codificada por uma sequência de ácidos nucleicos otimizada com códon, opcional- mente a sequência de ácidos nucleicos indicada na SEQ ID NO: 17.
10. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que a região “D” modifi- cada é uma sequência "D" situada na parte externa da ITR em relação ao construto de expressão.
11. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizado pelo fato de que a ITR que compre- ende a sequência modificada de "D" é uma 3' ITR.
12. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência TRY, em que a sequência TRY é opcionalmente indi- cada na SEQ ID NO: 28.
13. Ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica uma proteína SCARB?2 flanqueada por duas re- petições terminais invertidas (ITRs) de vírus adeno-associado (AAV),
caracterizado pelo fato de que (i) pelo menos uma das ITRs compreende uma região “D” modificada em relação a uma AAV2 ITR do tipo selvagem (SEQ ID NO: 29); e/ou (ii) a proteína SCARB?2 é codificada por uma sequência de ácidos nucleicos otimizada com códon.
14. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a proteína SCARB2 compreende a se- quência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 18 ou uma porção da mesma.
15. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que a proteína SCARB?2 é codificada por uma sequência de ácidos nucleicos otimizada com códon ou pela sequência de ácidos nucleicos indicada na SEQ ID NO: 19.
16. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado pelo fato de que a região “D” mo- dificada é uma sequência de "D" situada na parte externa da ITR em relação ao construto de expressão.
17. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizado pelo fato de que a ITR que com- preende a sequência modificada de "D" é uma 3' ITR.
18. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 17, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência TRY, em que a sequência TRY é opcionalmente indicada na SEQ ID NO: 28.
19. Ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica uma proteína GBA?2 flanqueada por duas repe- tições terminais invertidas (ITRs) de vírus adeno-associado (AAV), ca- racterizado pelo fato de que (i) pelo menos uma das ITRs compreende uma região “D”
modificada em relação a uma AAV2 ITR do tipo selvagem (SEQ ID NO: 29); e/ou (ii) a proteína GBA?2 é codificada por uma sequência de áci- dos nucleicos otimizada com códon.
20. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a proteína GBA2 compreende a sequên- cia de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 30 ou uma porção da mesma.
21. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que a proteína GBA2 é codificada por uma sequência de ácidos nucleicos otimizada com códon ou pela se- quência de ácidos nucleicos indicada na SEQ ID NO: 31.
22. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21, caracterizado pelo fato de que a região “D” mo- dificada é uma sequência de "D" situada na parte externa da ITR em relação ao construto de expressão.
23. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 22, caracterizado pelo fato de que a ITR que com- preende a sequência modificada de "D" é uma 3' ITR.
24. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 23, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência TRY, em que a sequência TRY é opcionalmente indicada na SEQ ID NO: 28.
25. Ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica uma proteína GALC flanqueada por duas repe- tições terminais invertidas (ITRs) de vírus adeno-associado (AAV), ca- racterizado pelo fato de que (i) pelo menos uma das ITRs compreende uma região “D” modificada em relação a uma AAV2 ITR do tipo selvagem (SEQ ID NO: 29); e/ou
(ii) a proteína GALC é codificada por uma sequência de áci- dos nucleicos otimizada com códon.
26. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a proteína GALC compreende a sequên- cia de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 33 ou uma porção da mesma.
27. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracterizado pelo fato de que a proteína GALC é codificada por uma sequência de ácidos nucleicos otimizada com códon ou pela se- quência de ácidos nucleicos indicada na SEQ ID NO: 34.
28. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 27, caracterizado pelo fato de que a região “D” mo- dificada é uma sequência de "D" situada na parte externa da ITR em relação ao construto de expressão.
29. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 28, caracterizado pelo fato de que a ITR que com- preende a sequência modificada de "D" é uma 3' ITR.
30. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 29, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência TRY, em que a sequência TRY é opcionalmente indicada na SEQ ID NO: 28.
31. Ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica uma proteína CTSB flanqueada por duas repe- tições terminais invertidas (ITRs) de vírus adeno-associado (AAV), ca- racterizado pelo fato de que (i) pelo menos uma das ITRs compreende uma região “D” modificada em relação a uma AAV2 ITR do tipo selvagem (SEQ ID NO: 29); e/ou (ii) a proteína CTSB é codificada por uma sequência de áci- dos nucleicos otimizada com códon.
32. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a proteína CTSB compreende a sequên- cia de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 30 ou uma porção da mesma.
33. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizado pelo fato de que a proteína CTSB é codificada por uma sequência de ácidos nucleicos otimizada com códon ou pela se- quência de ácidos nucleicos indicada na SEQ ID NO: 36.
34. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 33, caracterizado pelo fato de que a região “D” mo- dificada é uma sequência de "D" situada na parte externa da ITR em relação ao construto de expressão.
35. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 34, caracterizado pelo fato de que a ITR que com- preende a sequência modificada de "D" é uma 3' ITR.
36. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 35, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência TRY, em que a sequência TRY é opcionalmente indicada na SEQ ID NO: 28.
37. Ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica uma proteína SMPD1 flanqueada por duas re- petições terminais invertidas (ITRs) de vírus adeno-associado (AAV), caracterizado pelo fato de que (i) pelo menos uma das ITRs compreende uma região “D” modificada em relação a uma AAV2 ITR do tipo selvagem (SEQ ID NO: 29); e/ou (ii) a proteína SMPD1 é codificada por uma sequência de áci- dos nucleicos otimizada com códon.
38. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a proteína SMPD1 compreende a sequência
7IN7 de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 37 ou uma porção da mesma.
39. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 37 ou 38, caracterizado pelo fato de que a proteína SMPD1 é codificada por uma sequência de ácidos nucleicos otimizada com códon ou pela sequência de ácidos nucleicos indicada na SEQ ID NO: 38.
40. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 39, caracterizado pelo fato de que a região “D” mo- dificada é uma sequência de "D" situada na parte externa da ITR em relação ao construto de expressão.
41. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 40, caracterizado pelo fato de que a ITR que com- preende a sequência modificada de "D" é uma 3' ITR.
42. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 41, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência TRY, em que a sequência TRY é opcionalmente indicada na SEQ ID NO: 28.
43. Ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica uma proteína GCH1 flanqueada por duas repe- tições terminais invertidas (ITRs) de vírus adeno-associado (AAV), ca- racterizado pelo fato de que (i) pelo menos uma das ITRs compreende uma região “D” modificada em relação a uma AAV2 ITR do tipo selvagem (SEQ ID NO: 29); e/ou (ii) a proteína GCH1 é codificada por uma sequência de áci- dos nucleicos otimizada com códon.
44. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que a proteína GCH1 compreende a sequên- cia de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 45 ou uma porção da mesma.
45. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 43
Ou 44, caracterizado pelo fato de que a proteína GCH1 é codificada por uma sequência de ácidos nucleicos otimizada com códon ou pela se- quência de ácidos nucleicos indicada na SEQ ID NO: 46.
46. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 45, caracterizado pelo fato de que a região “D” mo- dificada é uma sequência de "D" situada na parte externa da ITR em relação ao construto de expressão.
47. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 46, caracterizado pelo fato de que a ITR que com- preende a sequência modificada de "D" é uma 3' ITR.
48. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 47, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência TRY, em que a sequência TRY é opcionalmente indicada na SEQ ID NO: 28.
49. Ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica uma proteína RAB7L flanqueada por duas repe- tições terminais invertidas (ITRs) de vírus adeno-associado (AAV), ca- racterizado pelo fato de que (i) pelo menos uma das ITRs compreende uma região “D” modificada em relação a uma AAV2 ITR do tipo selvagem (SEQ ID NO: 29); e/ou (ii) a proteína RAB7L é codificada por uma sequência de áci- dos nucleicos otimizada com códon.
50. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que a proteína RAB7L compreende a sequên- cia de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 47 ou uma porção da mesma.
51. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 49 ou 50, caracterizado pelo fato de que a proteína RAB7L é codificada por uma sequência de ácidos nucleicos otimizada com códon ou pela sequência de ácidos nucleicos indicada na SEQ ID NO: 48.
52. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 51, caracterizado pelo fato de que a região “D” mo- dificada é uma sequência de "D" situada na parte externa da ITR em relação ao construto de expressão.
53. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 52, caracterizado pelo fato de que a ITR que com- preende a sequência modificada de "D" é uma 3' ITR.
54. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 53, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência TRY, em que a sequência TRY é opcionalmente indicada na SEQ ID NO: 28.
55. Ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica uma proteína VPS35 flanqueada por duas repe- tições terminais invertidas (ITRs) de vírus adeno-associado (AAV), ca- racterizado pelo fato de que (i) pelo menos uma das ITRs compreende uma região “D” modificada em relação a uma AAV2 ITR do tipo selvagem (SEQ ID NO: 29); e/ou (ii) a proteína VPS35 é codificada por uma sequência de áci- dos nucleicos otimizada com códon.
56. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que a proteína VPS35 compreende a sequên- cia de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 49 ou uma porção da mesma.
57. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 55 ou 56, caracterizado pelo fato de que a proteína VPS35 é codificada por uma sequência de ácidos nucleicos otimizada com códon ou pela se- quência de ácidos nucleicos indicada na SEQ ID NO: 50.
58. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 57, caracterizado pelo fato de que a região “D” mo- dificada é uma sequência de "D" situada na parte externa da ITR em relação ao construto de expressão.
59. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 58, caracterizado pelo fato de que a ITR que com- preende a sequência modificada de "D" é uma 3' ITR.
60. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 59, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência TRY, em que a sequência TRY é opcionalmente indicada na SEQ ID NO: 28.
61. Ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica uma proteína 11-34 flanqueada por duas repeti- ções terminais invertidas (ITRs) de vírus adeno-associado (AAV), carac- terizado pelo fato de que (i) pelo menos uma das ITRs compreende uma região “D” modificada em relação a uma AAV2 ITR do tipo selvagem (SEQ ID NO: 29); e/ou (ii) a proteína 11-34 é codificada por uma sequência de ácidos nucleicos otimizada com códon.
62. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que a proteína 11-34 compreende a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 55 ou uma porção da mesma.
63. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 61 ou 62, caracterizado pelo fato de que a proteína 11-34 é codificada por uma sequência de ácidos nucleicos otimizada com códon ou pela se- quência de ácidos nucleicos indicada na SEQ ID NO: 56.
64. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 63, caracterizado pelo fato de que a região “D” mo- dificada é uma sequência de "D" situada na parte externa da ITR em relação ao construto de expressão.
65. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 64, caracterizado pelo fato de que a ITR que com- preende a sequência modificada de "D" é uma 3' ITR.
66. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 65, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência TRY, em que a sequência TRY é opcionalmente indicada na SEQ ID NO: 28.
67. Ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica uma proteína TREM2 flanqueada por duas re- petições terminais invertidas (ITRs) de vírus adeno-associado (AAV), caracterizado pelo fato de que (i) pelo menos uma das ITRs compreende uma região “D” modificada em relação a uma AAV2 ITR do tipo selvagem (SEQ ID NO: 29); e/ou (ii) a proteína TREM? é codificada por uma sequência de áci- dos nucleicos otimizada com códon.
68. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de que a proteína TREM2 compreende a se- quência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 57 ou uma porção da mesma.
69. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 67 ou 68, caracterizado pelo fato de que a proteína TREM? é codificada por uma sequência de ácidos nucleicos otimizada com códon ou pela sequência de ácidos nucleicos indicada na SEQ ID NO: 58.
70. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 67 a 69, caracterizado pelo fato de que a região “D” mo- dificada é uma sequência de "D" situada na parte externa da ITR em relação ao construto de expressão.
71. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 67 a 70, caracterizado pelo fato de que a ITR que compreende a sequência modificada de "D" é uma 3' ITR.
72. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 67 a 71, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência TRY, em que a sequência TRY é opcionalmente indicada na SEQ ID NO: 28.
73. Ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica uma proteína TMEM106B flanqueada por duas repetições terminais invertidas (ITRs) de vírus adeno-associado (AAV), caracterizado pelo fato de que (i) pelo menos uma das ITRs compreende uma região “D” modificada em relação a uma AAV2 ITR do tipo selvagem (SEQ ID NO: 29); e/ou (ii) a proteína TMEM106B é codificada por uma sequência de ácidos nucleicos otimizada com códon.
74. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que a proteína TMEM106B compreende a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 63 ou uma porção da mesma.
75. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 73 ou 74, caracterizado pelo fato de que a proteína TMEM106B é codifi- cada por uma sequência de ácidos nucleicos otimizada com códon ou pela sequência de ácidos nucleicos indicada na SEQ ID NO: 64.
76. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 73 a 75, caracterizado pelo fato de que a região “D” mo- dificada é uma sequência de "D" situada na parte externa da ITR em relação ao construto de expressão.
77. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 73 a 76, caracterizado pelo fato de que a ITR que com- preende a sequência modificada de "D" é uma 3' ITR.
78. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 73 a 77, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência TRY, em que a sequência TRY é opcionalmente indicada na SEQ ID NO: 28.
79. Ácido nucleico isolado que compreende um construto de expressão que codifica uma proteína Progranulin (PGRN) flanqueada por duas repetições terminais invertidas (ITRs) de vírus adeno-associ- ado (AAV), caracterizado pelo fato de que (i) pelo menos uma das ITRs compreende uma região “D” modificada em relação a uma AAV2 ITR do tipo selvagem (SEQ ID NO: 29); e/ou (ii) a proteína PGRN é codificada por uma sequência de áci- dos nucleicos otimizada com códon.
80. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que a proteína PGRN compreende a sequên- cia de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 67 ou uma porção da mesma.
81. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 79 ou 80, caracterizado pelo fato de que a proteína PGRN é codificada por uma sequência de ácidos nucleicos otimizada com códon ou pela se- quência de ácidos nucleicos indicada na SEQ ID NO: 68.
82. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 79 a 81, caracterizado pelo fato de que a região “D” mo- dificada é uma sequência de "D" situada na parte externa da ITR em relação ao construto de expressão.
83. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 79 a 82, caracterizado pelo fato de que a ITR que com- preende a sequência modificada de "D" é uma 3' ITR.
84. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 79 a 83, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência TRY, em que a sequência TRY é opcionalmente indicada na SEQ ID NO: 28.
85. Ácido nucleico isolado, o qual compreende um construto de expressão que codifica um primeiro produto de gene e um segundo produto de gene, caracterizado pelo fato de que cada produto de gene é selecionado independentemente dos produtos de gene, ou de porções dos mesmos, indicados na Tabela 1.
86. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 85, caracterizado pelo fato de que o primeiro produto de gene é uma prote- Ína Gcase, ou uma porção da mesma.
87. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 85 ou 86, caracterizado pelo fato de que o segundo produto de gene é LIMP2 ou uma porção da mesma, ou Prosaposina ou uma porção da mesma.
88. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 85 a 87, caracterizado pelo fato de que também codifica um ácido nucleico intermediário (por exemplo, SshRNA, miRNA, dsRNA, etc.), opcionalmente em que o ácido nucleico intermediário inibe a ex- pressão de a-Syn ou TMEM106B.
89. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 85 a 88, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um ou mais promotores, opcionalmente em que cada um de um ou mais promotores é independentemente um promotor de beta actina de galinha (CBA), um promotor de CAG, um promotor de CD68, ou um promoter de JeT.
90. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 85 a 89, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um sítio de entrada ribossomal interno (IRES), em que o IRES fica localizado opcionalmente entre o primeiro produto de gene e o segundo produto de gene.
91. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 85 a 90, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência de codificação de peptídeo de autoclivagem, op- cionalmente em que o peptídeo de autoclivagem é T2A.
92. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 85 a 91, caracterizado pelo fato de que o construto de expressão compreende duas sequências de repetições terminais inver- tidas (ITRs) de vírus adeno-associado (AAV) que flanqueiam o primeiro produto de gene e o segundo produto de gene, opcionalmente em que uma das sequências de ITR não contém um sítio de resolução terminal funcional.
93. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 92, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das ITRs compreende uma região “D” modificada em relação a uma AAV?2 ITR do tipo selva- gem (SEQ ID NO:29).
94. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 93, caracterizado pelo fato de que a região “D” modificada é uma sequência de "D" situada na parte externa da ITR em relação ao construto de ex- pressão.
95. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 93 ou 94, caracterizado pelo fato de que a ITR que compreende a sequên- cia modificada de "D" é uma 3' ITR.
96. Ácido nucleico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 85 a 95, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência TRY, em que a sequência TRY é opcionalmente indicada na SEQ ID NO: 28.
97. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que tem a sequência determinada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a
78.
98. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico isolado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 97.
99. Vetor de acordo com a reivindicação 98, caracterizado pelo fato de que o vetor é um plasmídeo.
100. Vetor de acordo com a reivindicação 98, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor viral, opcionalmente em que o vetor viral é um vetor de AAV recombinante (rAAV) ou um vetor de Baculovi- rus.
101. Composição, caracterizada pelo fato de que compre- ende o ácido nucleico isolado como definido em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 97 ou o vetor como definido em qualquer uma das rei- vindicações 98 a 100.
102. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que com- preende o ácido nucleico isolado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 97 ou o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 98 a 100.
103. Vírus adeno-associado recombinante (rAAV), caracteri- zado pelo fato de que compreende: (i) uma proteína de capsídeo; e (ii) o ácido nucleico isolado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 97, ou o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 98 a 100.
104. rAAV de acordo com a reivindicação 103, caracterizado pelo fato de que a proteína de capsídeo é capaz de cruzar a barreira de sangue-cérebro, opcionalmente em que a proteína de capsídeo é uma proteína de capsídeo AAV9 ou uma proteína de capsídeo AAVrh.10.
105. rAAV de acordo com a reivindicação 103 ou a 104, ca- racterizado pelo fato de que o rAAV transduz as células neuronais e as células não neuronais do sistema nervoso central (CNS).
106. Método para tratamento de um indivíduo que tem ou é suspeito que tem mal de Parkinson, caracterizado pelo fato de que o método compreende a administração ao indivíduo de um ácido nucleico isolado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 97, o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 98 a 100, a composição como definida na reivindicação 101, ou o rAAV como defi- nido em qualquer uma das reivindicações 103 a 105.
107. Método de acordo com a reivindicação 106, caracteri- zado pelo fato de que a administração compreende a injeção direta ao CNS do indivíduo, opcionalmente em que a injeção direta é a injeção intracerebral, a injeção intraparenquimal, a injeção intratecal, a injeção intra-cisterna magna, ou qualquer combinação destas.
108. Método de acordo com a reivindicação 107, caracteri- zado pelo fato de que a injeção direta ao CNS do indivíduo compreende a aplicação realçada por convecção (CED).
109. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 106 a 108, caracterizado pelo fato de que a administração com- preende a injeção periférica, opcionalmente em que a injeção periférica é a injeção intravenosa.
BR112020006661-3A 2017-10-03 2018-10-03 terapias de genes para distúrbios lipossomais BR112020006661A2 (pt)

Applications Claiming Priority (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762567311P 2017-10-03 2017-10-03
US201762567301P 2017-10-03 2017-10-03
US201762567319P 2017-10-03 2017-10-03
US201762567296P 2017-10-03 2017-10-03
US201762567310P 2017-10-03 2017-10-03
US62/567,301 2017-10-03
US62/567,296 2017-10-03
US62/567,319 2017-10-03
US62/567,311 2017-10-03
US62/567,310 2017-10-03
PCT/US2018/054227 WO2019070894A1 (en) 2017-10-03 2018-10-03 GENE THERAPIES FOR LYSOSOMIAL DISORDERS

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112020006661A2 true BR112020006661A2 (pt) 2020-10-13

Family

ID=65994362

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112020006661-3A BR112020006661A2 (pt) 2017-10-03 2018-10-03 terapias de genes para distúrbios lipossomais

Country Status (11)

Country Link
US (5) US11993790B2 (pt)
EP (1) EP3692158A4 (pt)
JP (3) JP7361037B2 (pt)
KR (3) KR20200074132A (pt)
CN (3) CN112553210A (pt)
AU (3) AU2018346105C1 (pt)
BR (1) BR112020006661A2 (pt)
CA (1) CA3078464A1 (pt)
IL (3) IL273771A (pt)
MX (3) MX2020003965A (pt)
WO (1) WO2019070894A1 (pt)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JOP20190248A1 (ar) 2017-04-21 2019-10-20 Amgen Inc بروتينات ربط مولد ضد trem2 واستخداماته
HUE062436T2 (hu) 2017-08-03 2023-11-28 Alector Llc Anti-trem2 antitestek és alkalmazási módszereik
KR20200074132A (ko) 2017-10-03 2020-06-24 프리베일 테라퓨틱스, 인크. 리소좀 장애를 위한 유전자 요법
WO2019070893A1 (en) 2017-10-03 2019-04-11 Prevail Therapeutics, Inc. GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS
MX2020004005A (es) 2017-10-03 2020-10-05 Prevail Therapeutics Inc Terapias genicas para los trastornos lisosomales.
SG11202108480UA (en) * 2019-02-26 2021-09-29 Univ Pennsylvania Compositions useful in treatment of krabbe disease
MX2021011958A (es) 2019-04-10 2021-12-15 Prevail Therapeutics Inc Terapias genicas para trastornos lisosomales.
WO2020210713A1 (en) 2019-04-10 2020-10-15 Prevail Therapeutics, Inc. Gene therapies for lysosomal disorders
GB201913974D0 (en) * 2019-09-27 2019-11-13 King S College London Vector
CA3158516A1 (en) * 2019-10-22 2021-04-29 Applied Genetic Technologies Corporation Adeno-associated virus (aav) systems for treatment of progranulin associated neurodegeneative diseases or disorders
MX2022006895A (es) * 2019-12-05 2022-11-09 Univ Columbia Estabilizacion de retromero para el tratamiento de la enfermedad de alzheimer y otros trastornos neurodegenerativos.
WO2021163681A2 (en) * 2020-02-14 2021-08-19 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Combination of retromer pharmacological chaperones and exogenous retromer for the treatment of alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases and disorders
BR112023001456A2 (pt) 2020-07-27 2023-04-11 Voyager Therapeutics Inc Composições e métodos para o tratamento de distúrbios neurológicos relacionados à deficiência de beta glicosilceramidase
IL299811A (en) 2020-07-29 2023-03-01 Freeline Therapeutics Ltd polypeptide
CA3190866A1 (en) 2020-08-10 2022-02-17 Prevail Therapeutics, Inc. Gene therapies for lysosomal disorders
MX2023001564A (es) * 2020-08-10 2023-05-03 Prevail Therapeutics Inc Terapias genicas para trastornos neurodegenerativos.
WO2022082178A2 (en) 2020-10-14 2022-04-21 Denali Therapeutics Inc. Methods for treating and monitoring frontotemporal dementia
MX2023004420A (es) 2020-10-15 2023-07-05 Prevail Therapeutics Inc Composiciones de virus adenoasociados recombinantes y métodos para su producción.
WO2022081985A1 (en) 2020-10-15 2022-04-21 Prevail Therapeutics, Inc. Assay for measuring potency of gene therapy drug product
WO2022271944A2 (en) * 2021-06-23 2022-12-29 Avrobio, Inc. Compositions and methods for treatment of gaucher disease
WO2023091949A2 (en) 2021-11-17 2023-05-25 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of neurological disorders related to glucosylceramidase beta deficiency
WO2023202637A1 (en) * 2022-04-19 2023-10-26 Shanghai Vitalgen Biopharma Co., Ltd. Recombinant aav vectors for treating neurodegenerative disorders
WO2024076940A1 (en) 2022-10-04 2024-04-11 Eli Lilly And Company Gene therapy for trem2-associated diseases and disorders
WO2024074142A1 (en) * 2022-10-08 2024-04-11 Lingyi Biotech Co., Ltd. Polynucleotides for the treatment of disease associated with gcase deficiency
GB202216168D0 (en) 2022-10-31 2022-12-14 UCB Biopharma SRL Route of administration

Family Cites Families (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5879680A (en) 1987-12-23 1999-03-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Cloned DNA for synthesizing unique glucocerebrosidase
US20020068285A1 (en) * 1996-01-11 2002-06-06 Frudakis Tony N. Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer
WO1998009524A1 (en) 1996-09-06 1998-03-12 Chiron Corporation Methods and compositions for liver specific delivery of therapeutic molecules using recombinant aav vectors
EP1112090A2 (en) 1998-09-09 2001-07-04 Myelos Corporation Method of stimulating prosaposin receptor activity
WO2000023587A2 (en) 1998-10-16 2000-04-27 Introgene B.V. Gene therapy of alzheimer's disease by delivery of an encoded apolipoprotein e
ATE454445T1 (de) 1998-11-10 2010-01-15 Univ North Carolina Virusvektoren und verfahren für ihre herstellung und verabreichung.
US6696272B1 (en) 1999-06-02 2004-02-24 Hsc Research & Development Limited Partnership Products and methods for gaucher disease therapy
AU2001253233B2 (en) 2000-04-06 2006-12-07 Kos Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for lowering cholesterol levels without inducing hypertriglyceridemia
GB0009887D0 (en) 2000-04-20 2000-06-07 Btg Int Ltd Cytotoxic agents
JP2004514407A (ja) 2000-04-28 2004-05-20 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 異種キャプシド中にシュードタイピングされたａａｖ５キャプシドおよびａａｖ５ベクターを含む組換えａａｖベクター
ES2252293T3 (es) 2000-09-18 2006-05-16 Genzyme Corporation Vectores de expresion que contienene promotores hibridos de ubiquitina.
US7232670B2 (en) 2001-09-28 2007-06-19 St. Jude Children's Research Hospital Targeting proteins to cells expressing mannose receptors via expression in insect cells
US20030133924A1 (en) 2001-12-21 2003-07-17 Novazyme Pharmaceuticals, Inc. Highly phosphorylated acid beta-glucocerebrosidase and methods of treating gaucher's disease
AU2003221733A1 (en) 2002-04-17 2003-11-03 University Of Florida Research Foundation, Inc. Improved raav vectors
WO2004098648A1 (en) 2003-05-01 2004-11-18 Genzyme Corporation Gene therapy for neurometabolic disorders
CN101443046A (zh) * 2004-06-23 2009-05-27 建新公司 治疗多囊病的方法和组合物
WO2006036465A2 (en) 2004-09-03 2006-04-06 University Of Florida Compositions and methods for treating cystic fibrosis
WO2006039253A2 (en) 2004-09-29 2006-04-13 Children's Memorial Hospital Sirna-mediated gene silencing of alpha synuclein
JP2009509913A (ja) 2005-06-08 2009-03-12 アミカス セラピューティックス インコーポレイテッド リソソーム酵素をコードする遺伝子の変異に関連するｃｎｓ障害の治療
GB0605337D0 (en) 2006-03-17 2006-04-26 Genomica Sau Treatment of CNS conditions
DK2037948T3 (en) 2006-05-30 2016-08-01 Mayo Foundation Detection and treatment of dementia
DK2687223T3 (en) 2006-05-30 2017-10-23 Mayo Foundation Detection and treatment of dementia
SI2029742T1 (sl) 2006-06-07 2016-11-30 Genzyme Corporation Genska terapija amiotrofične lateralne skleroze in drugih motenj hrbtenjače
WO2008124066A1 (en) 2007-04-05 2008-10-16 The J. David Gladstone Institutes Agents that reduce neuronal overexcitation
WO2008143797A1 (en) 2007-05-11 2008-11-27 Genzyme Corporation Methods of producing a secreted protein
EP3000320B1 (en) 2007-05-16 2019-01-16 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Treatment of synucleinopathies
EP3666284A1 (en) * 2007-06-22 2020-06-17 Children's Medical Center, Corp. Methods and uses thereof of a fragment of saposin a
WO2009079399A2 (en) 2007-12-14 2009-06-25 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method of treating neurodegenerative disease
EP2249861B1 (en) 2008-01-16 2016-07-06 Neurodyn Life Sciences Inc. Progranulin for use in treating parkinson's disease or alzheimer's disease
WO2009120978A2 (en) * 2008-03-27 2009-10-01 The Ohio State University Treatment of metabolic-related disorders using hypothalamic gene transfer of bdnf and compositions therfor
MX356669B (es) 2009-05-02 2018-06-08 Genzyme Corp Terapia genica para trastornos neurodegenerativos.
WO2010129791A1 (en) 2009-05-06 2010-11-11 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Rna targeting in alpha-synucleinopathies
CN102858985A (zh) * 2009-07-24 2013-01-02 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 基因组编辑方法
EP3366695B1 (en) * 2009-12-17 2021-07-07 Children's Medical Center Corporation Saposin-a derived peptides and uses thereof
CA3049237C (en) 2010-04-23 2024-06-11 University Of Massachusetts Cns targeting aav vectors and methods of use thereof
WO2012027558A2 (en) 2010-08-25 2012-03-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York OPTIMIZED miRNA CONSTRUCTS
WO2012027713A2 (en) 2010-08-26 2012-03-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibition of snca
CN103189507A (zh) 2010-10-27 2013-07-03 学校法人自治医科大学 用于向神经***细胞导入基因的腺相关病毒粒子
WO2012065248A1 (en) 2010-11-16 2012-05-24 Kay Denis G Method for increasing neprilysin expression and activity
EP2707369B1 (en) 2011-05-09 2016-07-27 Eip Pharma, LLC Compositions and methods for treating alzheimer's disease
EP3501550A1 (en) 2012-04-02 2019-06-26 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease
AU2013263346B2 (en) 2012-05-18 2018-08-23 The General Hospital Corporation Methods and compositions for treating amyloid deposits
US10648001B2 (en) 2012-07-11 2020-05-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Method of treating mucopolysaccharidosis type I or II
JP2016503405A (ja) 2012-11-05 2016-02-04 ジェンザイム・コーポレーション タンパク質症を処置するための組成物および方法
CA3174963A1 (en) 2013-04-08 2014-10-16 University Of Iowa Research Foundation Chimeric adeno-associated virus/ bocavirus parvovirus vector
KR20240093939A (ko) 2013-05-15 2024-06-24 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 미네소타 중추 신경계로의 아데노-연관 바이러스 매개 유전자 전달
US9347107B2 (en) 2013-05-23 2016-05-24 Norman Z Lai Vector containing multiple nucleotide sequences for the expression of enzymes
JP2016523980A (ja) 2013-07-11 2016-08-12 ザ トラスティーズ オブ コロンビア ユニバーシティ イン ザ シティ オブ ニューヨーク タウ発現を抑制するマイクロｒｎａ
US9574184B2 (en) 2013-09-25 2017-02-21 Children's Hospital Medical Center Lysosomal protein targeting sequence and therapeutic applications of same
EA201790342A1 (ru) * 2014-08-08 2017-07-31 ЭЛЕКТОР ЭлЭлСи Антитела к trem2 и способы их применения
US10603364B2 (en) * 2014-08-11 2020-03-31 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Lysosomal targeting and uses thereof
CA2996445A1 (en) * 2014-09-05 2016-03-10 Eli Hatchwell Methods and compositions for inhibiting and treating neurological conditions
EP3221456B1 (en) * 2014-11-21 2021-09-22 University of Florida Research Foundation, Inc. Genome-modified recombinant adeno-associated virus vectors
WO2016151523A1 (en) 2015-03-25 2016-09-29 Università Degli Studi Di Trento Rna interference mediated therapy for neurodegenerative diseases
US20170035860A1 (en) 2015-04-02 2017-02-09 Alexander C. Flynn Compositions and methods for treatment of neurogenerative diseases
EP3285788A4 (en) * 2015-04-23 2018-12-05 University of Massachusetts Modulation of aav vector transgene expression
EP3292206B8 (en) 2015-05-07 2022-02-09 Takeda Pharmaceutical Company Limited Glucocerebrosidase gene therapy for parkinson's disease
EP3091087A1 (en) 2015-05-08 2016-11-09 Fundació Institut d'Investigació en Ciències de la Salut Germans Trias i Pujol Method for in vitro diagnosis of synucleinopathies using alpha-synuclein gene transcripts
CN108367055A (zh) 2015-05-15 2018-08-03 明尼苏达大学董事会 用于治疗性递送到中枢神经***的腺相关物
CA3002406A1 (en) 2015-10-29 2017-05-04 Voyager Therapeutics, Inc. Delivery of central nervous system targeting polynucleotides
EP3370778A1 (en) 2015-11-05 2018-09-12 Bamboo Therapeutics, Inc. Modified friedreich ataxia genes and vectors for gene therapy
US11826433B2 (en) 2016-02-02 2023-11-28 University Of Massachusetts Method to enhance the efficiency of systemic AAV gene delivery to the central nervous system
PL3411484T3 (pl) 2016-02-05 2024-02-19 Emory University Wstrzykiwanie jednoniciowego lub samokomplementarnego wirusa adenosatelitarnego 9 do płynu mózgowego
WO2017147509A1 (en) 2016-02-25 2017-08-31 Marco Colonna Compositions comprising trem2 and methods of use thereof
EP3423109A4 (en) 2016-03-02 2019-08-14 The Children's Hospital of Philadelphia THERAPY FOR FRONTOTEMPORAL DEMENTIA
EP3662060A2 (en) 2017-08-03 2020-06-10 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of aav
KR20200074132A (ko) 2017-10-03 2020-06-24 프리베일 테라퓨틱스, 인크. 리소좀 장애를 위한 유전자 요법
WO2019070893A1 (en) 2017-10-03 2019-04-11 Prevail Therapeutics, Inc. GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS
MX2020004005A (es) 2017-10-03 2020-10-05 Prevail Therapeutics Inc Terapias genicas para los trastornos lisosomales.
US20200283800A1 (en) 2017-10-23 2020-09-10 Prevail Therapeutics, Inc. Gene therapies for neurodegenerative diseases
WO2019084068A1 (en) 2017-10-23 2019-05-02 Prevail Therapeutics, Inc. GENE THERAPIES FOR NEURODEGENERATIVE DISEASE
WO2020112802A1 (en) 2018-11-28 2020-06-04 Prevail Therapeutics, Inc. Gene therapies for neurodegenerative disease
MX2021011958A (es) 2019-04-10 2021-12-15 Prevail Therapeutics Inc Terapias genicas para trastornos lisosomales.
US20220211871A1 (en) 2019-04-10 2022-07-07 Prevail Therapeutics, Inc. Gene therapies for lysosomal disorders
AU2020272974A1 (en) 2019-04-10 2021-11-11 Prevail Therapeutics, Inc. Gene therapies for lysosomal disorders
WO2020210713A1 (en) 2019-04-10 2020-10-15 Prevail Therapeutics, Inc. Gene therapies for lysosomal disorders

Also Published As

Publication number Publication date
AU2020260485B2 (en) 2023-07-06
JP7389828B2 (ja) 2023-11-30
WO2019070894A1 (en) 2019-04-11
AU2020260491A1 (en) 2020-11-26
IL279931A (en) 2021-03-01
US20230287358A1 (en) 2023-09-14
IL279930A (en) 2021-03-01
US20200308554A1 (en) 2020-10-01
KR20220015500A (ko) 2022-02-08
CN111492061A (zh) 2020-08-04
MX2020011747A (es) 2021-01-08
US20200071680A1 (en) 2020-03-05
MX2020003965A (es) 2020-10-05
US11661585B2 (en) 2023-05-30
EP3692158A4 (en) 2021-08-04
CN112553210A (zh) 2021-03-26
US11993790B2 (en) 2024-05-28
JP2022068158A (ja) 2022-05-09
KR20220015499A (ko) 2022-02-08
AU2018346105A1 (en) 2020-04-30
EP3692158A1 (en) 2020-08-12
JP7336730B2 (ja) 2023-09-01
AU2020260485A1 (en) 2020-11-26
JP2020537544A (ja) 2020-12-24
KR20200074132A (ko) 2020-06-24
US11655460B2 (en) 2023-05-23
US10689625B2 (en) 2020-06-23
MX2020011746A (es) 2021-01-08
AU2018346105B2 (en) 2023-06-15
US20200282080A1 (en) 2020-09-10
IL273771A (en) 2020-05-31
JP2022068157A (ja) 2022-05-09
AU2018346105C1 (en) 2023-10-12
AU2020260491B2 (en) 2023-06-29
CA3078464A1 (en) 2019-04-11
CN112481269A (zh) 2021-03-12
US20200276335A1 (en) 2020-09-03
JP7361037B2 (ja) 2023-10-13
AU2018346105A2 (en) 2020-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7336730B2 (ja) ライソゾーム病の遺伝子治療
US11060113B2 (en) Gene therapies for lysosomal disorders
US11807849B2 (en) Gene therapies for lysosomal disorders
CA3134841A1 (en) Gene therapies for lysosomal disorders
US20220211871A1 (en) Gene therapies for lysosomal disorders
JP2022526823A (ja) リソソーム障害のための遺伝子療法
JP2022527015A (ja) リソソーム障害のための遺伝子治療

Legal Events

Date Code Title Description
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]