BR112020006356A2 - polipeptídeo com atividade de protease, polinucleotídeo, construto de ácido nucleico, ou vetor de expressão recombinante, célula hospedeira recombinante, método para a produção de um polipeptídeo com atividade de protease, processos para liquefazer material contendo amido, para produzir produtos de fermentação a partir de material contendo amido e para recuperação de óleo de uma produção de produto de fermentação, composição enzimática, e, uso de uma protease s8a de palaeococcus ferrophilus. - Google Patents

Abstract

A presente invenção se refere a polipeptídeos com atividade de protease obtida de Palaeococcus ferrophilus, em particular proteases selecionadas do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo com pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de estringência muito elevada com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, (ii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii); (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1; (d) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b) ou (c), que tem atividade de protease e polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos. A invenção também se refere a construtos de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos, bem como métodos de produção e uso dos polipeptídeos.

Description

POLIPEPTÍDEO COM ATIVIDADE DE PROTEASE, POLINUCLEOTÍDEO, CONSTRUTO DE ÁCIDO NUCLEICO, OU VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE, CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO COM ATIVIDADE DE PROTEASE, PROCESSOS PARA LIQUEFAZER MATERIAL CONTENDO AMIDO, PARA PRODUZIR PRODUTOS DE FERMENTAÇÃO A PARTIR DE MATERIAL

CONTENDO AMIDO E PARA RECUPERAÇÃO DE ÓLEO DE UMA PRODUÇÃO DE PRODUTO DE FERMENTAÇÃO, COMPOSIÇÃO ENZIMÁTICA, E, USO DE UMA PROTEASE S8A DE PALAEOCOCCUS

FERROPHILUS Referência a uma Listagem de Sequências

[001] Este pedido contém uma listagem de sequências, em formato legível por computador, que é aqui incorporado por referência. Campo da Invenção

[002] A presente invenção se refere a polipeptídeos com atividade de protease e polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos. A invenção também se refere a construtos de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos, bem como métodos de produção e uso dos polipeptídeos. Antecedentes da Invenção

[003] Os produtos de fermentação, como o etanol, são normalmente produzidos pela moagem do material contendo amido, em um processo de moagem a seco ou de moagem úmida, degradando depois o material em açúcares fermentáveis usando enzimas e, finalmente, convertendo os açúcares direta ou indiretamente no produto de fermentação desejado usando um organismo de fermentação. Os produtos de fermentação líquidos são recuperados do mosto fermentado (frequentemente referido como “mosto de cerveja”), por exemplo, por destilação, que separa o produto de fermentação desejado de outros líquidos e/ou sólidos. A fração restante é chamada de “resíduo de destilaria inteiro”. O resíduo de destilaria inteiro é desidratado e separado em uma fase sólida e líquida, por exemplo, por centrifugação. A fase sólida é denominada “bolo úmido” (ou "grãos úmidos") e a fase líquida (sobrenadante) é denominada "resíduo de destilaria fino". O bolo úmido e o resíduo de destilaria fino contêm cerca de 35 e 7% de sólidos, respectivamente. O bolo úmido desidratado é seco para fornecer “Grãos Secos de Destilaria” (GSD) usados como nutriente na alimentação animal. O resíduo de destilaria fino é normalmente evaporado para fornecer condensado e xarope ou, alternativamente, pode ser reciclado diretamente para oO reservatório de pasta como reserva (backset). O condensado pode ser encaminhado para um metanador antes de ser dispensado ou pode ser reciclado para o reservatório de pasta. O xarope pode ser misturado com GSD, ou adicionado ao bolo úmido antes da secagem, para produzir GSDS (Grãos Secos de Destilaria com Solúveis).

[004] O documento WO 2012/088303 (Novozymes) divulga processos para a produção de produtos de fermentação pela liquefação de material contendo amido, a um pH na gama de 4,5-5,0, a uma temperatura na gama de 80-90 ºC, usando uma combinação de alfa-amilase com um TY2 (min) a pH 4,5, 85 ºC, CaCl2 0,12 mM) de, pelo menos, 10 e uma protease com um valor de termoestabilidade superior a 20%, determinado como Atividade Relativa a 80 ºC/70 ºC; seguido de sacarificação e fermentação.

[005] O documento WO 2013/082486 (Novozymes) divulga processos para produzir produtos de fermentação pela liquefação de material contendo amido, a um pH na gama entre cerca de 5,0-7,0, a uma temperatura superior à temperatura inicial de gelatinização, usando uma alfa-amilase; uma protease com um valor de termoestabilidade superior a 20%, determinado como atividade relativa a 80 ºC/70 ºC; e opcionalmente uma enzima geradora de fonte de carboidrato seguida por sacarificação e fermentação. O processo é exemplificado usando uma protease de Pyrococcus furiosus, PfuS

[006] O documento WO2014/209800 (Novozymes) divulga um processo para produzir produtos de fermentação pela liquefação de material contendo amido, a uma temperatura superior à temperatura inicial de gelatinização, usando uma alfa-amilase e dose elevada de protease PfuS.

[007] Um número crescente de usinas de etanol extrai óleo do resíduo de destilaria fino e/ou xarope como um subproduto para uso na produção de biodiesel ou outros produtos biorrenováveis. Grande parte do trabalho de recuperação/extração de óleo dos processos de produção de produtos de fermentação concentrou-se em melhorar a capacidade de extração do óleo do resíduo de destilaria fino. A remoção eficaz do óleo é geralmente realizada por extração com hexano. No entanto, o uso da extração com hexano não tem aplicação generalizada devido ao investimento de capital elevado necessário. Portanto, outros processos que melhoram a extração de óleo dos processos de produção de produtos de fermentação foram explorados.

[008] O documento WO 2011/126897 (Novozymes) divulga processos de recuperação de óleo pela conversão de materiais contendo amido em dextrinas com alfa-amilase; sacarificação com uma enzima geradora de fonte de carboidratos para formar açúcares; fermentação dos açúcares usando organismo fermentador; em que o meio de fermentação compreende uma hemicelulase; destilação do produto de fermentação para formar um resíduo de destilaria inteiro; separação do resíduo de destilaria inteiro em resíduo de destilaria fino e bolo úmido; e recuperação do resíduo de destilaria fino. O meio de fermentação pode ainda compreender uma protease.

[009] O documento WO 2016/196202 divulga uma protease S8 de Thermococcus para uso em um processo de etanol.

[0010] É um objetivo da presente invenção fornecer processos melhorados para aumentar a quantidade de óleo recuperável dos processos de produção de produtos de fermentação e fornecer processos para a produção de produtos de fermentação, como etanol, a partir de material contendo amido que possa fornecer um maior rendimento do produto de fermentação, ou outras vantagens, em comparação com um processo convencional.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0011] A presente invenção se refere a um polipeptídeo com atividade de protease selecionado do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo com pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de estringência muito elevada com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, (11) o complemento de comprimento total de (1) ou (11); (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1; e (d) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b) ou (c) que tem atividade de protease.

[0012] A presente invenção se refere também a polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos da presente invenção; construtos de ácidos nucleicos; vetores de expressão recombinantes; células hospedeiras recombinantes compreendendo os polinucleotídeos; e métodos de produção dos polipeptídeos.

[0013] A presente invenção se refere ainda a um processo para liquefazer material contendo amido compreendendo a liquefação do material contendo amido a uma temperatura superior à temperatura inicial de gelatinização na presença de, pelo menos, uma alfa-amilase e uma protease S8A de Palaeococcus ferrophilus. Em um aspecto adicional, a invenção se refere a um processo para a produção de produtos de fermentação a partir de material contendo amido, compreendendo as etapas de: a) liquefação do material contendo amido a uma temperatura superior à temperatura inicial de gelatinização na presença de, pelo menos: uma alfa- amilase; e uma protease S8A de Palaeococcus ferrophilus; b) sacarificação usando uma glucoamilase; c) fermentação usando um organismo de fermentação.

[0014] A presente invenção se refere ainda a um processo para recuperação de óleo de uma produção de produtos de fermentação compreendendo as etapas de: a) liquefação do material contendo amido, a uma temperatura superior à temperatura inicial de gelatinização na presença de, pelo menos: uma alfa-amilase; e uma protease S8A de Palaeococcus ferrophilus da invenção; b) sacarificação usando uma glucoamilase; c) fermentação usando um organismo de fermentação; d) recuperação do produto de fermentação para formar um resíduo de destilaria inteiro; e) separação do resíduo de destilaria inteiro em resíduo de destilaria fino e bolo úmido; f) concentração opcional do resíduo de destilaria fino em xarope; em que o óleo é recuperado do: material liquefeito contendo amido após a etapa a) do processo; e / ou a jusante da etapa de fermentação c) do processo.

[0015] A presente invenção refere-se ainda a uma composição enzimática compreendendo uma protease S8A de Palaeococcus ferrophilus da invenção.

[0016] Ainda em um aspecto adicional, a invenção se refere ao uso de uma protease S8A de Palaeococcus ferrophilus na liquefação de material contendo amido.

DEFINIÇÕES

[0017] Protease S8A: O termo “protease S8A” designa uma protease S8 pertencente à subfamília A. Subtilisinas, EC 3.4.21.62, são um subgrupo da subfamília S8A; no entanto, a presente protease S8A de Palaeococcus FJerrophilus é uma protease semelhante a subtilisina, que ainda não foi incluída no sistema de classificação IUBMB. A protease S8A, de acordo com a invenção, hidrolisa o substrato Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA. A liberação de p- nitroanilina (DNA) resulta em um aumento da absorvância a 405 nm e é proporcional à atividade da enzima.

[0018] Em um aspecto, os polipeptídeos da presente invenção têm pelo menos 20%, por exemplo, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100% da atividade de protease do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, a atividade da protease pode ser determinada pelo ensaio cinético Suc-AAPF-pNA, como divulgado no exemplo 2.

[0019] Variante alélica: O termo “variante alélica” designa qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupam o mesmo locus cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutações e pode resultar em polimorfismo nas populações. As mutações genéticas podem ser silenciosas (sem alteração no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos com sequências de aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.

[0020] Domínio catalítico: O termo “domínio catalítico” designa a região de uma enzima contendo a maquinaria catalítica da enzima.

[0021] cDNA: O termo “cDNA” designa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa a partir de uma molécula de mMRNA madura, emendada, obtida a partir de uma célula eucariótica ou procariótica. O cDNA não possui sequências de íntrons que podem estar presentes no DNA genômico correspondente. O transcrito de RNA primário inicial é um precursor de mMRNA que é processado através de uma série de etapas, incluindo processamento, antes de aparecer como MRNA maduro processado.

[0022] Sequência codificante: O termo “sequência codificante” designa um polinucleotídeo que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo. Os limites da sequência codificante são, geralmente, determinados por uma fase de leitura aberta que começa com um códon de iniciação, como ATG, GTG ou TTG, e termina com um códon de terminação, como TAA, TAG ou TGA. A sequência codificante pode ser um DNA genômico, cDNA, DNA sintético ou uma combinação destes.

[0023] Sequências de controle: O termo “sequências de controle” designa sequências de ácidos nucleicos necessárias para a expressão de um polinucleótido que codifica um polipeptídeo maduro da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa (isto é, do mesmo gene) ou estranha/heteróloga (isto é, de um gene diferente) ao polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou nativa ou estranha uma à outra. Tais sequências de controle incluem, mas não estão limitadas a, um líder, sequência de poliadenilação, sequência pró-peptídica, promotor, sequência peptídica sinal e terminador de transcrição. No mínimo, as sequências de controle incluem um promotor e sinais de terminação de transcrição e tradução. As sequências de controle podem ser fornecidas com ligadores com a finalidade de introduzir locais de restrição específicos, facilitando a ligação das sequências de controle com a região de codificação do polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo.

[0024] Expressão: O termo “expressão” inclui qualquer etapa envolvida na produção de um polipeptídeo incluindo, mas não se limitando a, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós- traducional e secreção.

[0025] Vetor de expressão: O termo “vetor de expressão” designa uma molécula de DNA, linear ou circular, que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo e está operacionalmente ligado a sequências de controle que proporcionam a sua expressão.

[0026] Fragmento: O termo “fragmento” designa um polipeptídeo que tem um ou mais (por exemplo, diversos) aminoácidos ausentes no terminal amino e/ou carboxila de um polipeptídeo ou domínio maduro; em que o fragmento tem atividade de protease. Em um aspecto, um fragmento contém pelo menos 325 resíduos de aminoácidos (por exemplo, aminoácidos 101 a 425 da SEQID NO: 2).

[0027] Célula hospedeira: O termo “célula hospedeira” designa qualquer tipo de célula que seja suscetível a transformação, transfecção, transdução ou semelhante com um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção. O termo “célula hospedeira” abrange qualquer progênie de uma célula progenitora que não é idêntica à célula progenitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação.

[0028] Isolado: O termo “isolado” designa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitativos de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância que não ocorre naturalmente, (2) qualquer substância incluindo, mas não se limitando a, qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removido de um ou mais ou todos os constituintes que ocorrem naturalmente aos quais está associado na natureza; (3) qualquer substância modificada pela mão do homem em relação à substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada aumentando a quantidade da substância em relação a outros componentes com os quais está naturalmente associada (por exemplo, produção recombinante em uma célula hospedeira; várias cópias de um gene que codifica a substância; e uso de um promotor mais forte do que o promotor naturalmente associado ao gene que codifica a substância). Uma substância isolada pode estar presente em uma amostra de caldo de fermentação; por exemplo, uma célula hospedeira pode ser geneticamente modificada para expressar o polipeptídeo da invenção. O caldo de fermentação da célula hospedeira compreenderá o polipeptídeo isolado.

[0029] Polipeptídeo maduro: O termo “polipeptídeo maduro” designa um polipeptídeo em sua forma final após a tradução e quaisquer modificações —pós-traducionais, como processamento no N-terminal, truncamento no C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro consiste nos aminoácidos 101 a 425 da SEQ ID NO: 2. Os aminoácidos 1 a 24 da SEQ ID NO: 2 são um peptídeo-sinal. Os aminoácidos 25 a 100 são um pró-peptídeo.

[0030] É conhecido na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeos maduros diferentes (isto é, com um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) expresso pelo mesmo polinucleotídeo. É também conhecido na técnica que diferentes células hospedeiras processam polipeptídeos diferentemente e, assim, uma célula hospedeira expressando um polinucleotídeo pode produzir um polipeptídeo maduro diferente (por exemplo, com um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) em comparação com outra célula hospedeira expressando o mesmo polinucleotídeo. O N-terminal foi confirmado por dados MS-EDMAN na protease purificada, conforme apresentado na seção de exemplos.

[0031] Sequência codificante do polipeptídeo maduro: O termo “polipeptídeo maduro” designa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro com atividade de protease. Em um aspecto, a sequência codificante do polipeptídeo maduro são os nucleotídeos 1 a 1275 da SEQ ID NO: |.

[0032] Construto de ácido nucleico: O termo “construto de ácido nucleico” designa uma molécula de ácido nucleico, de cadeia simples ou dupla, que é isolada de um gene que ocorre naturalmente ou é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de uma maneira que não existiria na natureza ou que é sintético, que compreende uma ou mais sequências de controle.

[0033] Operacionalmente ligado: O termo “operacionalmente ligado” designa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação à sequência codificante de um polinucleotídeo, de modo que a sequência de controle direcione a expressão da sequência codificante.

[0034] Identidade de sequência: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro “identidade de sequência”.

[0035] Para os fins da presente invenção, a identidade da sequência entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), de preferência a versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de lacunas de 10, penalidade de extensão de lacunas de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUMO6?2 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle identificado como “identidade mais longa” (obtido usando a opção —nobrief) é usado como a identidade percentual e é calculado da seguinte forma:

[0036] (Resíduos idênticos x 100)/(Comprimento do alinhamento - Número total de lacunas no alinhamento)

[0037] Para os fins da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências desoxirribonucleotídicas é determinada usando o algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra), como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The

European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), de preferência a versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de lacuna de 10, penalidade de extensão de lacuna de 0,5 e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUCA4.4). O resultado de Needle identificado como “identidade mais longa” (obtido usando a opção —nobrief) é usado como a identidade percentual e é calculado da seguinte forma: (Desoxirribonucleotídeos idênticos x 100)/(Comprimento do alinhamento - Número total de lacunas no alinhamento)

[0038] Condições de estringência: O termo “condições de estringência muito baixa” designa sondas de pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 ºC em SSPE 5X, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cortado e desnaturado e formamida a 25%, seguindo os procedimentos padrão de Southern blotting durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada vez durante 15 minutos, usando SSC 2X, SDS a 0,2% a 45 ºC.

[0039] O termo “condições de estringência baixa ” designa sondas com pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 ºC em SSPE 5X, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cortado e desnaturado e formamida a 25%, seguindo os procedimentos padrão de Southern blotting durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada vez durante 15 minutos, usando SSC 2X, SDS a 0,2% a 50 ºC.

[0040] O termo “condições de estringência média” designa sondas com pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 ºC em SSPE 5X, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cortado e desnaturado e formamida a 35%, seguindo os procedimentos padrão de Southern blotting durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada vez durante 15 minutos,

usando SSC 2X, SDS a 0,2% a 55ºC.

[0041] O termo “condições de estringência média-elevada” designa sondas com pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 ºC em SSPE 5X, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cortado e desnaturado e formamida a 35%, seguindo os procedimentos padrão de Southern blotting durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada vez durante 15 minutos, usando SSC 2X, SDS a 0,2% a 60ºC.

[0042] O termo “condições de estringência elevada” designa sondas com pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 ºC em SSPE 5X, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cortado e desnaturado e formamida a 50%, seguindo os procedimentos padrão de Southern blotting durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada vez durante 15 minutos, usando SSC 2X, SDS a 0,2% a 65ºC.

[0043] O termo “condições de estringência muito elevada” designa sondas com pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42 ºC em SSPE 5X, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cortado e desnaturado e formamida a 50%, seguindo os procedimentos padrão de Southern blotting durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada vez durante 15 minutos, usando SSC 2X, SDS a 0,2% a 70 “ºC.

[0044] Sub-sequência: O termo “sub-sequência” designa um polinucleotídeo com um ou mais (por exemplo, vários) nucleotídeos ausentes da extremidade 5' e/ou 3' de uma sequência codificante de polipeptídeo maduro, em que a sub-sequência codifica um fragmento com atividade de protease.

[0045] Variante: O termo “variante” designa um polipeptídeo com atividade de protease, compreendendo uma alteração, isto é, uma substituição,

inserção e/ou deleção, em uma ou mais (por exemplo, várias) posições. Uma substituição designa o reposicionamento do aminoácido ocupando uma posição com um aminoácido diferente; uma deleção designa a remoção do aminoácido ocupando uma posição; e uma inserção designa a adição de um aminoácido adjacente ao e imediatamente após o aminoácido ocupando uma posição. Na descrição de variantes, a nomenclatura descrita a seguir é adaptada para facilidade de referência. É empregue a abreviatura de aminoácidos de letra única ou três letras aceite pela IUPAC.

[0046] Substituições. Para uma substituição de aminoácido é usada a seguinte — nomenclatura: > Aminoácido —original, posição, aminoácido substituído. De acordo, a substituição de treonina na posição 226 por alanina é designada como “Thr226Ala” ou “T226A”. Mutações múltiplas são separadas por sinais de adição (“+”), por exemplo, “Gly205Arg + Ser411Phe” ou “G205R + S411F”, representando substituições nas posições 205 e 411 de glicina (G) por arginina (R) e serina (S) por fenilalanina (F), respectivamente.

[0047] Deleções. Para uma deleção de aminoácido é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição, *. De acordo, a deleção de glicina na posição 195 é designada como “Gly195*” ou “G195*”. Deleções múltiplas são separadas por sinais de adição (“+”), por exemplo, “Gly195* + Ser411*” ou “G195* + S411*”.

[0048] Inserções. Para uma inserção de aminoácido é usada a seguinte nomenclatura: — Aminoácido original, posição, aminoácido original, aminoácido inserido. De acordo, a inserção de lisina após a glicina na posição 195 é designada como “Gly195GIyLys” ou “GI95GK”. Uma inserção de múltiplos aminoácidos é designada [Aminoácido original, posição, aminoácido original, aminoácido inserido 1, aminoácido inserido t2; etc.]. Por exemplo, a inserção de lisina e alanina após a glicina na posição 195 é indicada como “Gly195GIyLysAla” ou “GI95GKA”.

[0049] Alterações múltiplas. As variantes que compreendem múltiplas alterações são separadas por sinais de adição (“+”), por exemplo, “Arg170Tyr + GIy195Glu” ou “RI70Y + G1I95E” representando uma substituição de arginina e glicina nas posições 170 e 195 por tirosina e ácido glutâmico, respectivamente.

[0050] Alterações diferentes. Quando alterações diferentes podem ser introduzidas em uma posição, as alterações diferentes são separadas por uma vírgula, por exemplo, “Argl70Tyr,Glu” representa uma substituição de arginina na posição 170 por tirosina ou ácido glutâmico. Assim, “Tyrl167GIly,Ala + Arg170Gly,Ala” designa as seguintes variantes: "Tyrl167GIy+Arg170G]y", "Tyr167GIy+Arg170Ala", "Tyrl167Ala+Arg170GIy” e "Tyr167Ala+Arg170Ala".

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Polipeptídeos Com Atividade de Protease

[0051] Em uma modalidade, a presente invenção se refere a polipeptídeos com uma identidade de sequências com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 de pelo menos 85%, pelo menos 90%, 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, que têm atividade de protease. Em um aspecto, os polipeptídeos diferem em até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

[0052] Em uma modalidade particular, a invenção se refere a polipeptídeos que têm uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 de pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 75% da atividade de protease do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

[0053] Em uma modalidade particular, a invenção se refere a polipeptídeos que têm uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 de pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos

95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 80% da atividade de protease do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

[0054] Em uma modalidade particular, a invenção se refere a polipeptídeos que têm uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 de pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 85% da atividade de protease do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

[0055] Em uma modalidade particular, a invenção se refere a polipeptídeos que têm uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 de pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 90% da atividade de protease do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

[0056] Em uma modalidade particular, a invenção se refere a polipeptídeos que têm uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 de pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 95% da atividade de protease do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

[0057] Em uma modalidade particular, a invenção se refere a polipeptídeos que têm uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 de pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 96% da atividade de protease do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

[0058] Em uma modalidade particular, a invenção se refere a polipeptídeos que têm uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 de pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 97% da atividade de protease do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

[0059] Em uma modalidade particular, a invenção se refere a polipeptídeos que têm uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 de pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 98% da atividade de protease do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

[0060] Em uma modalidade particular, a invenção se refere a polipeptídeos que têm uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 de pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, e em que o polipeptídeo tem pelo menos 99% da atividade de protease do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

[0061] Os polinucleótidos da SEQ ID NO: 1, ou sub-sequências destes, assim como os polipeptídeos da SEQ ID NO: 2, ou seus fragmentos, podem ser usados para conceber sondas de ácido nucleico para identificar e clonar polipeptídeos que codificam DNA com atividade de protease de estirpes de diferentes gêneros ou espécies, de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, tais sondas podem ser usadas para hibridação com o DNA genômico ou cDNA de uma célula de interesse, seguindo procedimentos padrão de Southern blotting, a fim de identificar e isolar o gene correspondente. Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a sequência inteira, mas devem ter pelo menos 15, por exemplo, pelo menos 25, pelo menos 35, ou pelo menos 70 nucleotídeos de comprimento. De preferência, a sonda de ácido nucleico tem pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, pelo menos 200 nucleotídeos,

pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, ou pelo menos 900 nucleotídeos de comprimento. Podem ser usadas sondas tanto de DNA como de RNA. As sondas são normalmente marcadas para detectar o gene correspondente (por exemplo, com *?P, ?H, **S, biotina ou avidina). Tais sondas são englobadas pela presente invenção.

[0062] Uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA preparada a partir de tais outras estirpes pode ser rastreada quanto a DNA que hibridiza com as sondas descritas acima e codifica um polipeptídeo que tem atividade de protease. O DNA genômico ou outro de tais outras estirpes pode ser separado por eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida ou outras técnicas de separação. O DNA das bibliotecas ou o DNA separado pode ser transferido para, e imobilizado em, nitrocelulose ou outro material transportador adequado. Para identificar um clone ou DNA que hibrida com a SEQ ID NO: 1 ou sub-sequências da mesma, o material transportador é usado em um Southern blot.

[0063] Para os fins da presente invenção, a hibridação indica que o polinucleotídeo hibrida com uma sonda de ácido nucleico marcada correspondente a (1) SEQ ID NO: 1; (11) à sequência codificante do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1; (iii) ao seu complemento de comprimento total; ou (iv) a uma sua sub-sequência; sob condições de estringência muito baixa a muito elevada. As moléculas com as quais a sonda de ácido nucleico hibrida sob estas condições podem ser detectadas usando, por exemplo, filme de raios X ou qualquer outro meio de detecção conhecido na técnica.

[0064] Em um aspecto, a sonda de ácido nucleico é os nucleotídeos 1 a 1275 da SEQ ID NO: 1. Em outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 2; o seu polipeptídeo maduro; ou um seu fragmento. Em outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é SEQ ID NO: 1.

[0065] Em outra modalidade, a presente invenção se refere a um polipeptídeo com atividade de protease codificado por um polinucleotídeo com uma identidade de sequência com a sequência codificante de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 de pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%. Em uma modalidade adicional, o polipeptídeo foi isolado.

[0066] Em outra modalidade, a presente invenção se refere a variantes do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 compreendendo uma substituição, deleção e/ou inserção em uma ou mais (por exemplo, várias) posições. Em uma modalidade, o número de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos introduzidas no polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 é até 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. As alterações de aminoácidos podem ser de natureza menor, ou seja, substituições ou inserções conservativas de aminoácidos que não afetam significativamente oO enovelamento e/ou atividade da proteína; pequenas deleções, normalmente de 1 a 30 aminoácidos; pequenas extensões do terminal amino ou carboxila, como um resíduo de metionina do terminal amino; um pequeno peptídeo ligador de até 20-25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação alterando a carga geral ou outra função, como um trecho de poli- histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

[0067] Exemplos de substituições conservativas estão dentro dos grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina) e pequenos aminoácidos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições de aminoácidos que geralmente não alteram a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e RL. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. Substituições comuns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly.

[0068] Os aminoácidos essenciais em um polipeptídeo podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese de varredura por alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na técnica mais recente, mutações únicas de alanina são introduzidas em cada resíduo da molécula e as moléculas resultantes são testadas quanto à atividade de protease para identificar resíduos de aminoácidos que são críticos para a atividade da molécula. Ver também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O local ativo da enzima ou outra interação biológica pode também ser determinado por análise física da estrutura, como determinado por técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons ou marcação por fotoafinidade, em conjunto com a mutação de aminoácidos putativos do local de contato. Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wilodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. A identidade de aminoácidos essenciais pode ser também inferida a partir de um alinhamento com um polipeptídeo relacionado.

[0069] Podem ser feitas e testadas substituições, deleções e/ou inserções únicas ou múltiplas de aminoácidos usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação e/ou embaralhamento, seguidos por um procedimento de rastreamento relevante, tais como aqueles divulgados por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625.

Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propenso a erros, exibição de fagos (por exemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; Patente U.S. No. 5,223,409; WO 92/06204), e mutagênese região-dirigida (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

[0070] Os métodos de mutagênese/embaralhamento podem ser combinados com métodos de rastreamento automatizados de alto rendimento para detectar a atividade de polipeptídeos clonados, mutagenizados, expressos pelas células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893- 896). As moléculas de DNA mutagenizadas que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas das células hospedeiras e sequenciadas rapidamente usando métodos padrão na técnica. Estes métodos permitem a determinação rápida da importância de resíduos de aminoácidos individuais em um polipeptídeo.

[0071] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo híbrido no qual uma região de um polipeptídeo está fundida ao N-terminal ou C-terminal de uma região de outro polipeptídeo.

[0072] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de fusão ou um polipeptídeo de fusão clivável no qual outro polipeptídeo está fundido no N- terminal ou C-terminal do polipeptídeo da presente invenção. Um polipeptídeo de fusão é produzido pela fusão de um polinucleotídeo que codifica outro polipeptídeo a um polinucleotídeo da presente invenção. Técnicas para produção de polipeptídeos de fusão são conhecidas na técnica e incluem a ligação das sequências codificantes que codificam os polipeptídeos, de tal forma que fiquem em fase de leitura e que a expressão do polipeptídeo de fusão esteja sob o controle do(s) mesmo(s) promotor(es) e terminador. Polipeptídeos de fusão podem ser também construídos usando tecnologia de inteína na qual os polipeptídeos de fusão são criados pós-translacionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science

266: 776-779).

[0073] Um polipeptídeo de fusão pode ainda compreender um local de clivagem entre os dois polipeptídeos. Após a secreção da proteína de fusão, o local é clivado liberando os dois polipeptídeos. Exemplos de locais de clivagem incluem, mas não estão limitados a, os locais divulgados em Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498 a 503; e Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378 a 381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505 a 512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982 a 987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240- 248; e Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48. Fontes de Polipeptídeos Tendo Atividade de Protease

[0074] Um polipeptídeo com atividade de protease da presente invenção pode ser obtido a partir de microorganismos do gênero Palaeococcus.

[0075] Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Palaeococcus ferrophilus.

[0076] Estirpes destas espécies são facilmente acessíveis ao público em várias coleções de culturas, como as da American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[0077] O polipeptídeo pode ser identificado e obtido a partir de outras fontes, incluindo microrganismos isolados da natureza (por exemplo, solo, composto, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente de materiais naturais (por exemplo, solo, composto, água, etc.) usando as sondas acima mencionadas. Técnicas para isolamento de microrganismos e DNA diretamente a partir de habitats naturais são bem conhecidas na técnica. Um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo pode então ser obtido por rastreamento semelhante de uma biblioteca genômica de DNA ou cDNA de outro microorganismo ou amostra mista de DNA. Uma vez que um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tiver sido detectado com a sonda (ou sondas), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado utilizando- se técnicas que são conhecidas dos peritos na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra). Polinucleotídeos

[0078] A presente invenção se refere também a polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo da presente invenção, como aqui descrito. Em uma modalidade, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo da presente invenção foi isolado.

[0079] As técnicas usadas para isolar ou clonar um polinucleotídeo são conhecidas na técnica e incluem isolamento do DNA genômico ou cDNA, ou uma combinação destes. A clonagem dos polinucleotídeos do DNA genômico pode ser realizada, por exemplo, usando a bem conhecida reação em cadeia da polimerase (PCR) ou rastreamento de anticorpos de bibliotecas de expressão para detectar fragmentos de DNA clonados com características estruturais compartilhadas. Ver, por exemplo, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nova Iorque. Podem ser usados outros procedimentos de amplificação de ácidos nucleicos tais como reação em cadeia da ligase (LCR), transcrição ativada por ligação (LAT) e amplificação baseada em polinucleotídeos (NASBA). Os polinucleotídeos podem ser clonados a partir de uma cepa de Palaeococcus, particularmente Palaeococcus ferrophilus, ou um organismo relacionado e, portanto, por exemplo, pode ser uma variante alélica ou de espécie da região codificante do polipeptídeo do polinucleotídeo. Construtos de Ácido Nucleico

[0080] A presente invenção também se refere a construtos de ácido nucleico, compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle, que direcionam a expressão da sequência codificante em uma célula hospedeira adequada, sob condições compatíveis com as sequências de controle. Em uma modalidade particular, pelo menos uma sequência de controle é heteróloga em relação ao polinucleotídeo que codifica uma variante da presente invenção. Assim, o construto de ácido nucleico não seria encontrado na natureza.

[0081] O polinucleotídeo pode ser manipulado de variadas maneiras para providenciar a expressão do polipeptídeo. A manipulação do polinucleotídeo antes da sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificar os polinucleotídeos utilizando métodos de DNA recombinante são bem conhecidos na técnica.

[0082] A sequência de controle pode ser um promotor, um polinucleotídeo que é reconhecido por uma célula hospedeira para expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção. O promotor contém sequências de controle transcricional que medeiam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer polinucleotídeo que apresente atividade transcricional na célula hospedeira incluindo promotores variantes, truncados e híbridos, e pode ser obtido a partir de genes que codificam polipeptídeos extracelulares ou intracelulares homólogos ou heterólogos à célula hospedeira.

[0083] Exemplos de promotores adequados para o direcionamento da transcrição dos construtos de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira bacteriana são os promotores obtidos a partir do gene da alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), gene da alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyL), gene da penicilinase de Bacillus licheniformis (penP), gene da amilase maltogênica de Bacillus stearothermophilus (amyM),

gene da levansucrase de Bacillus subtilis (sacB), genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis (Agaisse e Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), operon lac de E. coli, promotor trc de E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), gene da agarase de Streptomyces coelicolor (dagA), e gene da beta-lactamase procariótica (Villa- Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), assim como o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21- 25). Promotores adicionais são descritos em Useful proteins from recombinant bacteria em Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; e em Sambrook er al., 1989, supra. Exemplos de promotores tandem são divulgados em WO 99/43835.

[0084] A sequência de controle pode ser também um terminador da transcrição, que é reconhecido por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. O terminador está operacionalmente ligado ao terminal 3' do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Qualquer terminador que seja funcional na célula hospedeira pode ser usado na presente invenção.

[0085] Os terminadores preferidos para células hospedeiras bacterianas são obtidos a partir dos genes da protease alcalina de Bacillus clausii (aprH), alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyL) e RNA ribossômico de Escherichia coli (rrnB).

[0086] A sequência de controle pode também ser uma região estabilizadora de mRNA a jusante de um promotor e a montante da sequência codificante de um gene que aumenta a expressão do gene.

[0087] Exemplos de regiões estabilizantes de MRNA adequadas são obtidas a partir de um gene crylIIIA de Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) e um gene SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3.465-3.471).

[0088] A sequência de controle pode também ser um líder, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para a tradução pela célula hospedeira. O líder está operacionalmente ligado ao terminal 5' do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Qualquer líder que seja funcional na célula hospedeira pode ser usado.

[0089] A sequência de controle pode também ser uma região codificante de peptídeo-sinal que codifica um peptídeo-sinal ligado ao N- terminal de um polipeptídeo e direciona o polipeptídeo para a via secretora da célula. A extremidade 5º da sequência codificante do polinucleotídeo pode inerentemente conter uma sequência codificante de peptídeo-sinal naturalmente ligada na fase de leitura de tradução com o segmento da sequência codificante que codifica o polipeptídeo. Alternativamente, a extremidade 5' da sequência codificante pode conter uma sequência codificante de peptídeo-sinal que é estranha à sequência de codificação. Pode ser necessária uma sequência codificante de peptídeo-sinal estranha onde a sequência codificante não contém naturalmente uma sequência codificante de peptídeo de sinal. Alternativamente, uma sequência codificante do peptídeo- sinal estranha pode simplesmente substituir a sequência codificante do peptídeo-sinal natural para intensificar a secreção do polipeptídeo. No entanto, qualquer sequência codificante de peptídeo-sinal que direciona o polipeptídeo expresso para a via secretora de uma célula hospedeira pode ser usada.

[0090] Sequências codificantes do peptídeo-sinal eficazes para células hospedeiras bacterianas são as sequências codificantes do peptídeo-sinal obtidas a partir dos genes da amilase maltogênica de Bacillus NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, proteases neutras (nprT, nprS, nprM) de Bacillus stearothermophilus e prsA de Bacillus subtilis. Peptídeos- sinal adicionais são descritos por Simonen e Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

[0091] A sequência de controle pode também ser uma sequência codificante de pró-peptídeo que codifica um pró-peptídeo posicionado no N- terminal de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma pró-enzima ou pró-polipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um pró-polipeptídeo é geralmente inativo e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo por clivagem catalítica ou autocatalítica do pró-peptídeo do pró-polipeptídeo. A sequência codificante do pró-peptídeo pode ser obtida a partir dos genes da protease alcalina de Bacillus subtilis (aprE), protease neutra de Bacillus subtilis (nprT), lacase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), proteinase aspártica de Rhizomucor miehei e fator alfa de Saccharomyces cerevisiae.

[0092] Quando estão presentes as sequências peptídicas e pró- peptídicas sinal, a sequência pró-peptídica é posicionada próxima ao N- terminal de um polipeptídeo e a sequência peptídica sinal é posicionada próxima ao N-terminal da sequência pró-peptídica. Vetores de Expressão

[0093] A presente invenção também se refere a vetores de expressão recombinantes compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção, um promotor e sinais de terminação de transcrição e tradução. As sequências polinucleotídicas e de controle podem ser unidas para produzir um vetor de expressão recombinante, que pode incluir um ou mais locais de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo em tais locais. Em uma modalidade particular, pelo menos uma sequência de controle é heteróloga ao polinucleotídeo da presente invenção. Alternativamente, o polinucleotídeo pode ser expresso inserindo o polinucleotídeo, ou um construto de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo, em um vetor apropriado para expressão. Na criação do vetor de expressão, a sequência codificante está localizada no vetor de forma a que a sequência codificante esteja operacionalmente ligada às sequências de controle adequadas para a expressão.

[0094] O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que pode ser convenientemente submetido a procedimentos de DNA recombinante e podem dar origem à expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor é para ser introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado.

[0095] O vetor pode ser um vetor de replicação autônoma, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um mini-cromossomo ou um cromossomo artificia. O vetor pode conter quaisquer meios para assegurar a autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, seja integrado no genoma e replicado junto com o cromossomo (ou cromossomos) no qual foi integrado. Adicionalmente, pode ser usado um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que contenham, em conjunto, o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transpóson.

[0096] O vetor contém, de preferência, um ou mais marcadores selecionáveis que permitem a seleção fácil de células transformadas, transfetadas, transduzidas ou semelhantes. Um marcador selecionável é um gene cujo produto fornece resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxotróficos, e semelhantes.

[0097] Exemplos de marcadores bacterianos selecionáveis são os genes dal de Bacillus licheniformis ou Bacillus subtilis, ou marcadores que conferem resistência a antibióticos, como ampicilina, cloranfenicol, canamicina, neomicina, espectinomicina ou resistência à tetraciclina.

[0098] O marcador selecionável pode ser um sistema marcador selecionável duplo, como descrito em WO 2010/039889. Em um aspecto, o marcador selecionável duplo é um sistema marcador selecionável duplo hph-tk.

[0099] O vetor contém, de preferência, um elemento (ou elementos) que permite a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independentemente do genoma.

[00100] Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode se basear na sequência de polinucleotídeos que codifica o polipeptídeo ou qualquer outro elemento do vetor para integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter polinucleotídeos adicionais para direcionar a integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em um ou mais locais precisos no(s) cromossomo(s). Para aumentar a probabilidade de integração em uma localização precisa, os elementos de integração devem conter uma quantidade suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10.000 pares de bases, 400 a 10.000 pares de bases e 800 a 10.000 pares de bases, que têm um elevado grau de identidade de sequência com a sequência-alvo correspondente para potenciar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos de integração podem ser qualquer sequência que seja homóloga à sequência-alvo no genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos de integração podem ser polinucleotídeos não-codificantes ou codificantes. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.

[00101] Para replicação autônoma, o vetor pode compreender, adicionalmente, uma origem de replicação que permite que o vetor se replique autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem da replicação pode ser qualquer replicador de plasmídeo que medeie a replicação autônoma que funciona em uma célula. O termo “origem de replicação” ou “replicador de plasmídeo” designa um polinucleotídeo que permite que um plasmídeo ou vetor se replique in vivo.

[00102] Exemplos de origens bacterianas de replicação são as origens de replicação dos plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177 e pACYCI8A, que permitem replicação em E. coli, e pUB110, pE194, prA1060 e pAMBI, que permitem replicação em Bacillus.

[00103] Pode ser inserida mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção em uma célula hospedeira para aumentar a produção de um polipeptídeo. Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido integrando pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira, ou incluindo um gene marcador selecionável amplificável com o polinucleotídeo, onde as células que contêm cópias amplificadas do gene marcador selecionável, e assim cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas cultivando as células na presença do agente selecionável apropriado.

[00104] Os procedimentos utilizados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos dos peritos na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra). Células Hospedeiras

[00105] A presente invenção também se refere a células hospedeiras recombinantes, compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que direcionam a produção de um polipeptídeo da presente invenção. Em uma modalidade, uma ou mais sequências de controle são heterólogas ao polinucleotídeo da presente invenção. Um construto ou vetor compreendendo um polinucleotídeo é introduzido em uma célula hospedeira de modo a que o construto ou vetor seja mantido como um integrador cromossômico ou como um vetor extra-cromossômico auto-replicante, como descrito anteriormente. O termo "célula hospedeira" engloba qualquer progênie de uma célula progenitora que não é idêntica à célula progenitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá,

em grande medida, do gene que codifica o polipeptídeo e sua fonte.

[00106] A célula hospedeira pode ser qualquer célula útil na produção recombinante de um polipeptídeo da presente invenção, por exemplo, uma procariótica ou uma eucariótica.

[00107] A célula hospedeira procariótica pode ser qualquer Gram- positiva. As bactérias Gram-positivas incluem, mas não estão limitadas a, Bacillus, Clostridium, — Enterococcus, Geobacillus, — Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, e Streptomyces. Bactérias Gram-negativas incluem, mas não se limitam a, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, e Ureaplasma.

[00108] A célula hospedeira bacteriana pode ser qualquer célula de Bacillus incluindo, mas não se limitando a, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuringiensis.

[00109] A introdução de DNA em uma célula de Bacillus pode ser efetuada por transformação de protoplastos (ver, por exemplo, Chang e Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), transformação de células competentes (ver, por exemplo, Young and Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829 ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), eletroporação (ver, por exemplo, Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) ou conjugação (ver, por exemplo, Koehler e Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). A introdução de DNA em uma célula de E. coli pode ser efetuada por transformação de protoplastos (ver, por exemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) ou eletroporação (ver, por exemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). À introdução de DNA em uma célula de Streptomyces pode ser efetuada por transformação de protoplastos, eletroporação (ver, por exemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praga) 49: 399-405), conjugação (ver, por exemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585), ou transdução (ver, por exemplo, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). À introdução de DNA em uma célula de Pseudomonas pode ser efetuada por eletroporação (ver, por exemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) ou conjugação (ver, por exemplo, Pinedo e Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). A introdução de DNA em uma célula de Streptococcus pode ser efetuada por competência natural (ver, por exemplo, Perry e Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), transformação de protoplastos (ver, por exemplo, Catt e Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), eletroporação (ver, por exemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804), ou conjugação (ver, por exemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). Contudo, qualquer método conhecido na técnica para introduzir DNA em uma célula hospedeira pode ser usado. Métodos de Produção

[00110] A presente invenção também se refere a métodos de produção de um polipeptídeo da presente invenção, compreendendo (a) cultivar uma célula, que em sua forma wild-type produz o polipeptídeo, sob condições favoráveis à produção do polipeptídeo; e, opcionalmente, (b) recuperar o polipeptídeo. Num aspecto, a célula é uma célula de Palaeococcus ferrophilus, em particular DSM13482.

[00111] A presente invenção também se refere a métodos para produzir um polipeptídeo da presente invenção, compreendendo (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante da presente invenção em condições favoráveis à produção do polipeptídeo; e, opcionalmente, (b) recuperar o polipeptídeo.

[00112] As células hospedeiras são cultivadas em um meio nutritivo adequado para a produção do polipeptídeo usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, as células podem ser cultivadas por cultura em frasco de agitação ou fermentação em pequena ou larga escala (incluindo fermentações contínuas, descontínuas, descontínuas alimentadas ou em estado sólido), em fermentadores laboratoriais ou industriais, em um meio adequado e sob condições que permitam o polipeptídeo de ser expresso e/ou isolado. À cultura ocorre em um meio nutritivo adequado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Meios adequados estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (por exemplo, em catálogos da American Type Culture Collection). Se o polipeptídeo for secretado para o meio nutritivo, o polipeptídeo pode ser recuperado diretamente a partir do meio. Se o polipeptídeo não for secretado pode ser recuperado a partir de lisados celulares.

[00113] O polipeptídeo pode ser recuperado usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado do meio nutritivo por procedimentos convencionais, incluindo, mas não se limitando a, recolha, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação ou precipitação. Em um aspecto é recuperado um caldo de fermentação compreendendo o polipeptídeo.

[00114] O polipeptídeo pode ser purificado por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando a, cromatografia (por exemplo, troca iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofoco e exclusão de tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, foco isoelétrico preparativo), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGE ou extração (ver, por exemplo, Protein Purification, Janson e Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para obter polipeptídeos substancialmente puros.

[00115] Num aspecto alternativo, o polipeptídeo não é recuperado, mas uma célula hospedeira da presente invenção que expressa o polipeptídeo é usada como fonte do polipeptídeo.

Formulações de Caldo de Fermentação ou Composições de Células

[00116] A presente invenção também se refere a uma formulação de caldo de fermentação ou composições de células compreendendo um polipeptídeo da presente invenção O produto de caldo de fermentação compreende adicionalmente ingredientes adicionais usados no processo de fermentação, tais como, por exemplo, células (incluindo as células hospedeiras contendo o gene codificando o polipeptídeo da presente invenção que são usadas para produzir o polipeptídeo de interesse), detritos celulares, biomassa, meios de fermentação e/ou produtos de fermentação. Em algumas modalidades, a composição é um caldo inteiro de células mortas contendo ácido(s) orgânico(s), células mortas e/ou detritos celulares e meio de cultura.

[00117] O termo “caldo de fermentação” como usado aqui se refere a uma preparação produzida por fermentação celular que sofre recuperação e/ou purificação nulas ou mínimas. Por exemplo, os caldos de fermentação são produzidos quando as culturas microbianas são crescidas até a saturação, incubadas sob condições de limitação de carbono para permitir a síntese de proteínas (por exemplo, expressão de enzimas pelas células hospedeiras) e secreção para o meio de cultura celular. O caldo de fermentação pode conter conteúdos não fracionados assim como fracionados dos materiais de fermentação derivados no final da fermentação. Normalmente, o caldo de fermentação não é fracionado e compreende o meio de cultura gasto e os detritos celulares presentes após a remoção das células microbianas (por exemplo, células fúngicas filamentosas), por exemplo, por centrifugação. Em algumas modalidades, o caldo de fermentação contém meio de cultura de células gasto, enzimas extracelulares e células microbianas viáveis e/ou não viáveis.

[00118] Em uma modalidade, a formulação de caldo de fermentação e composições de células compreendem um primeiro componente de ácido orgânico, compreendendo pelo menos um ácido orgânico com 1-5 carbonos e/ou um seu sal e um segundo componente de ácido orgânico compreendendo pelo menos um ácido orgânico com 6 ou mais carbonos e/ou um seu sal. Em uma modalidade específica, o primeiro componente de ácido orgânico é ácido acético, ácido fórmico, ácido propiônico, um sal destes ou uma mistura de dois ou mais dos itens anteriores, e o segundo componente de ácido orgânico é ácido benzoico, ácido ciclo-hexanocarboxílico, ácido 4-metilvalérico, ácido fenilacético, um sal destes ou uma mistura de dois ou mais dos anteriores.

[00119] Em um aspecto, a composição contém um ou mais ácidos orgânicos e, opcionalmente, contém adicionalmente células mortas e/ou detritos celulares. Em uma modalidade, as células mortas e/ou detritos celulares são removidos de um caldo inteiro de células mortas para fornecer uma composição que está livre desses componentes.

[00120] As formulações de caldo de fermentação ou composições de células podem ainda compreender um agente conservante e/ou antimicrobiano (por exemplo, bacteriostático), incluindo, mas não se limitando a, sorbitol, cloreto de sódio, sorbato de potássio e outros conhecidos na técnica.

[00121] O caldo inteiro de células mortas ou composição pode conter os conteúdos não fracionados dos materiais de fermentação derivados no final da fermentação. Normalmente, o caldo inteiro de células mortas ou composição contém o meio de cultura gasto e os resíduos celulares presentes após o crescimento das células microbianas (por exemplo, células fúngicas filamentosas) até a saturação, incubadas em condições de limitação de carbono para permitir a síntese de proteínas. Em algumas modalidades, o caldo inteiro de células mortas ou composição contém o meio de cultura de células gasto, enzimas extracelulares e células fúngicas filamentosas mortas. Em algumas modalidades, as células microbianas presentes no caldo inteiro de células mortas ou composição podem ser permeabilizadas e/ou lisadas usando métodos conhecidos na técnica.

[00122] Um caldo inteiro ou composição de células como descrito aqui é tipicamente um líquido, mas pode conter componentes insolúveis, tais como células mortas, detritos celulares, componentes de meios de cultura e/ou enzima(s) insolúvel(eis). Em algumas modalidades, os componentes insolúveis podem ser removidos para fornecer uma composição líquida clarificada.

[00123] As formulações de caldo inteiro e composições de células da presente invenção podem ser produzidas por um método descrito em WO 90/15861 ou WO 2010/096673. Composições Enzimáticas:

[00124] A presente invenção também se relaciona com composições compreendendo um polipeptídeo da presente invenção.

[00125] As composições podem compreender uma protease da presente invenção como a componente enzimática principal, por exemplo, uma composição monocomponente. Alternativamente, as composições podem compreender múltiplas atividades enzimáticas, como uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em alfa-amilase, glucoamilase, beta-amilase, pululanase.

[00126] As composições podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca. As composições podem ser estabilizadas de acordo com métodos conhecidos na técnica.

[00127] São dados em baixo exemplos de uso preferenciais das composições da presente invenção. Uma composição enzimática da invenção compreende uma alfa-amilase e uma protease S8A de Palaeococcus ferrophilus adequada para uso em uma etapa de liquefação em um processo da invenção.

[00128] Em uma modalidade particular, a invenção se refere a uma composição enzimática compreendendo: uma alfa-amilase e uma protease S8A de Palaeococcus ferrophilus, em particular uma protease com pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

[00129] Em uma modalidade preferida, a proporção entre alfa-amilase e protease está na gama de 1:1 e 1:50 (microgramas de alfa- amilase:microgramas de protease), mais particularmente na gama entre 1:3 e 1:40, tal como cerca de 1:4 (microgramas de alfa-amilase:microgramas de protease).

[00130] Em uma modalidade preferida, a composição enzimática da invenção compreende uma glucoamilase e a proporção entre alfa-amilase e glucoamilase na liquefação está entre 1:1 e 1:10, tal como cerca de 1:2 (microgramas de alfa-amilase:microgramas de glucoamilase).

[00131] A alfa-amilase é, de preferência, uma alfa-amilase estável ao ácido bacteriano. Particularmente, a alfa-amilase é de um Exiguobacterium sp. ou de um Bacillus sp. tal como, por exemplo, Bacillus stearothermophilus ou Bacillus licheniformis.

[00132] Em uma modalidade, a alfa-amilase é do gênero Bacillus, tal como uma estipe de Bacillus stearothermophilus, em particular uma variante de uma alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, tal como aquela apresentada na SEQ ID NO: 3 em WO 99/019467 ou SEQ ID NO: 4 aqui.

[00133] Em uma modalidade, a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, ou sua variante, é truncada para ter, de preferência, cerca de 491 aminoácidos, como de 480 a 495 aminoácidos.

[00134] Em uma modalidade a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilu tem uma deleção em duas posições dentro da gama de posições de 179 a 182, tal como as posições 1181 + G182, R179 + G180, G180 + 1181, R179 + 1181, ou GI80 + G182,de preferência 1181 + G182, e opcionalmente uma substituição N193F, (usando a SEQ ID NO: 4 para numeração).

[00135] Em uma modalidade, a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus tem uma substituição na posição S242, de preferência, uma substituição S242Q.

[00136] Em uma modalidade, a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus tem uma substituição na posição E188, de preferência, uma substituição E188P.

[00137] Em uma modalidade, a alfa-amilase é selecionada do grupo de variantes de alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus com as seguintes mutações, além de uma dupla deleção na região da posição 179 a 182, particularmente I181*+G182* e opcionalmente N193F: V59A+Q89R+G112D+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N2241+Q254S+D269E+D281N; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+1270L; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+H274K; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+Y276F; V59A+E129V+R157Y+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y +K220P+N2241+S242Q+Q254S; S9A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N2241+S242Q+Q254S+H274K; V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F; V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+D281N; - VS9A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T; V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N2241L+S242Q+Q254S+G416V; V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S; V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T; A9ILHM96IHE129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S8; E129V+K177L+R179E; E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F+LA27M; E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T; E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+N376*+1377*; E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S; E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T; E129V+K177L+R179E+S242Q; E129V+K177L+R179V+K220P+N224L+S242Q+Q254S; K220P+N224L+S242Q+Q254S; M2BAV; V59A Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V.

[00138] Em uma modalidade, a alfa-amilase é selecionada do grupo de variantes de alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus com as seguintes mutações:

- 1181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E; - 1181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y +K220P+N224L +Q254S; - I181*+G182*+N193F +V59A Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; e - I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+ S242Q+Q254S (usando SEQ ID NO: 4 para numeração).

[00139] Em uma modalidade, a variante de alfa-amilase tem pelo menos 75% de identidade, de preferência pelo menos 80%, mais preferencialmente, pelo menos, 85%, mais preferencialmente, pelo menos, 90%, mais preferencialmente, pelo menos, 91%, mais preferencialmente, pelo menos, 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, mais preferencialmente pelo menos 94% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos de 100% de identidade com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 4.

[00140] Em uma modalidade preferida, a composição enzimática da invenção compreende uma protease S8A de Palaeococcus ferrophilus com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade com os aminoácidos 101 a 425 da SEQ ID NO: 2.

[00141] Em uma modalidade, a composição enzimática compreende ainda uma glucoamilase.

[00142] Em uma modalidade, a glucoamilase deriva de uma estirpe do gênero Penicillium, especialmente uma estirpe de Penicillium oxalicum divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802.

[00143] Em uma modalidade, a glucoamilase tem pelo menos 80%,

mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, mais preferencialmente pelo menos 94% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 ou SEQ ID NO: 11 aqui.

[00144] Em uma modalidade, a glucoamilase é uma variante da glucoamilase de Penicillium oxalicum divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 aqui com uma substituição K79V, tal como uma variante divulgada em WO 2013/053801.

[00145] Em uma modalidade, a glucoamilase é a glucoamilase de Penicillium oxalicum com uma substituição K79V e ainda uma das seguintes substituições: - PI1F + T65A + Q327F - P2N + PAS + PI1F + T65A + Q327F.

[00146] Em uma modalidade, a composição compreende ainda uma pululanase.

[00147] Em uma modalidade, a composição da invenção compreende uma alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus e uma protease S8A de Palaeococcus ferrophilus; em uma modalidade, a proporção entre alfa- amilase e protease está na gama de 1:1 e 1:50 (microgramas de alfa- amilase:microgramas de protease).

[00148] Em uma modalidade, a proporção entre alfa-amilase e protease está na gama de 1:3 e 1:40, tal como cerca de 1:4 (microgramas de alfa- amilase:microgramas de protease).

[00149] Em uma modalidade, a proporção entre alfa-amilase e glucoamilase está entre 1:1 e 1:10, tal como cerca de 1:2 (microgramas de alfa-amilase:micrograma de glucoamilase).

40 / 88 Processos da invenção

[00150] A presente invenção se refere a processos de recuperação de óleo de um processo de produção de produtos de fermentação e também a processos para a produção de produtos de fermentação a partir de material contendo amido.

[00151] Os inventores descobriram que pode ser obtido um aumento no rendimento de etanol em processos para a produção de produtos de fermentação a partir de material contendo amido ao combinar uma alfa- amilase e uma protease de Palaeococcus ferrophilus em liquefação. Assim, em um aspecto, a invenção se refere a um processo para liquefazer material contendo amido, compreendendo a liquefação do material contendo amido a uma temperatura superior à temperatura inicial de gelatinização, na presença de pelo menos uma alfa-amilase e uma protease S8A de Palaeococcus FJerrophilus da invenção, particularmente uma protease com pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

[00152] Também se verificou que um processo de etanol da invenção pode ser executado eficientemente com redução, ou sem adição, de uma fonte de nitrogênio, como a ureia, na SFS. Processo de Produção de um Produto de Fermentação da Invenção

[00153] Em um aspecto particular, a invenção se refere a processos para a produção de produtos de fermentação a partir de material contendo amido, compreendendo as etapas de: a) liquefação do material contendo amido a uma temperatura superior à temperatura inicial de gelatinização na presença de pelo menos: - uma alfa-amilase; e - uma protease S8A de Palaeococcus ferrophilus; b) sacarificação usando uma glucoamilase;

c) fermentação usando um organismo de fermentação.

[00154] Em uma modalidade, o produto de fermentação é recuperado após a fermentação. Em uma modalidade preferida, o produto de fermentação é recuperado após a fermentação, tal como por destilação. Em uma modalidade, o produto de fermentação é um álcool, de preferência etanol, especialmente etanol combustível, etanol potável e/ou etanol industrial. Processos de Recuperação/Extração de Óleo da Invenção

[00155] Em outro aspecto particular, a invenção se refere a processos de recuperação de óleo de um processo de produção de produtos de fermentação, compreendendo as etapas de: a) liquefação do material contendo amido a uma temperatura superior à temperatura inicial de gelatinização na presença de pelo menos: - uma alfa-amilase; e - uma protease S8A de Palaeococcus ferrophilus; b) sacarificação usando uma glucoamilase; c) fermentação usando um organismo de fermentação.

d) recuperação do produto de fermentação para formar um resíduo de destilaria inteiro; e) separação do resíduo de destilaria inteiro em resíduo de destilaria fino e bolo úmido; f) concentração opcional do resíduo de destilaria fino em xarope; em que o óleo é recuperado a partir: - do material contendo amido liquefeito após o passo a); e/ou - a jusante da etapa de fermentação c).

[00156] Em uma modalidade, o óleo é recuperado/extraído durante e/ou após a liquefação do material contendo amido. Em uma modalidade, o óleo é recuperado do resíduo de destilaria inteiro. Em uma modalidade, o óleo é recuperado do resíduo de destilaria fino. Em uma modalidade, o óleo é recuperado do xarope.

[00157] Em uma modalidade preferida dos processos da invenção, a sacarificação e a fermentação são realizadas simultaneamente.

[00158] Em uma modalidade preferida, nenhum composto de nitrogênio, tal como ureia, está presente e/ou é adicionado nas etapas a) -c), tal como durante a etapa de sacarificação b) ou na etapa de fermentação c) ou na sacarificação e fermentação simultâneas (SFS).

[00159] Em uma modalidade, 10-1.000 ppm, tal como 50-800 ppm, tal como 100-600 ppm, tal como 200-500 ppm de composto de nitrogênio, de preferência ureia, estão presentes e/ou são adicionados nas etapas a) -c), tal como durante a etapa de sacarificação b) ou etapa de fermentação c) ou sacarificação e fermentação simultânea (SFS).

[00160] Em uma modalidade, entre 0,5-100 microgramas de protease S8A de Palaeococcus ferrophilus por grama de SS (sólidos secos), SS estão presentes e/ou são adicionados na etapa de liquefação a). Em uma modalidade, entre 1-50 microgramas de protease S8A de Palaeococcus ferrophilus por grama de SS (sólidos secos), SS estão presentes e/ou são adicionados na etapa de liquefação a). Em uma modalidade, entre 2-40 microgramas de protease S8A de Palaeococcus ferrophilus por grama de SS estão presentes e/ou são adicionados na etapa de liquefação a). Em uma modalidade, entre 4-25 microgramas de protease S8A de Palaeococcus ferrophilus por grama de SS estão presentes e/ou são adicionados na etapa de liquefação a). Em uma modalidade, entre 5-20 microgramas de protease S8A de Palaeococcus ferrophilus por grama de SS estão presentes e/ou são adicionados na etapa de liquefação a). Em uma modalidade, cerca de, ou mais de, 1 micrograma de protease S8A de Palaeococcus ferrophilus por grama de SS está presente e/ou é adicionada na etapa de liquefação a). Em uma modalidade, cerca de, ou mais de, 2 microgramas de protease S8A de Palaeococcus ferrophilus por grama de SS estão presentes e/ou são adicionadas na etapa de liquefação a). Em uma modalidade, cerca de, ou mais de, 5 micrograma de protease S8A de Palaeococcus ferrophilus por grama de SS está presente e/ou é adicionada na etapa de liquefação a). Alfa-Amilases Presentes e/ou Adicionadas à Liquefação

[00161] A alfa-amilase adicionada durante a etapa de liquefação a) em um processo da invenção (isto é, processo para recuperação de óleo e processo de produção de produtos de fermentação) pode ser qualquer alfa- amilase.

[00162] São preferidas as alfa-amilases bacterianas, que são normalmente estáveis a uma temperatura usada na liquefação.

[00163] Em uma modalidade, a alfa-amilase é de uma estirpe do gênero Exiguobacterium ou Bacillus.

[00164] Em uma modalidade preferida, a alfa-amilase é de uma estirpe de Bacillus stearothermophilus, como a sequência apresentada na SEQ ID NO: 3 em WO99 / 019467 ou na SEQ ID NO: 4 aqui. Em uma modalidade, a alfa-amilase é a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus apresentada na SEQ ID NO: 4 aqui, tal como uma que tenha pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 4 aqui.

[00165] Em uma modalidade, a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, ou sua variante, é truncada, de preferência no C-terminal, de preferência truncada para ter cerca de 491 aminoácidos, tal como de 480 a 495 aminoácidos.

[00166] Em uma modalidade, a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus tem uma deleção em duas posições dentro da gama de posições de 179 a 182, tal como as posições 1181 + G182, R179 + G180, G180 + 1181, R179 + I181, ou G180 + G182,, de preferência 1181 + G182, e opcionalmente uma substituição NI93F (usando a SEQ ID NO: 4 para

44 / 88 numeração).

[00167] Em uma modalidade, a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus tem uma substituição na posição S242, de preferência uma substituição S242Q.

[00168] Em uma modalidade, a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus tem uma substituição na posição E1I88, de preferência uma substituição E188P.

[00169] Em uma modalidade, a alfa-amilase é selecionada do grupo de variantes de alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus com as seguintes mutações, além de uma dupla deleção na região da posição 179 a 182, particularmente I181*+G182*, e opcionalmente N193F: V59A+Q89R+G112D+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N2241+Q254S+D269E+D281N; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N2241+Q254S+1270L; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+H274K; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+Y276F; V59A+E129V+R157Y+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S; S9A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+H274K; V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F; V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+D281N; - VS9A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T; VS59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+G416V; V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S; V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T; A9ILHM96IH+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; E129V+K177L+R179E; E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F+1L427M; E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T; E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+N376*+1377*; E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S; E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T; E129V+K177L+R179E+S242Q; E129V+K177L+R179V+K220P+N224L+S242Q+Q254S; K220P+N224L+S242Q+Q254S; M284V; V59A Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V.

[00170] Em uma modalidade preferida, a alfa-amilase é selecionada do grupo de variantes de alfa-amilases de Bacillus stearothermophilus: - T181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E;

- 1181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+ H208Y+ K220P+N224L+ Q254S; - 1181*+G182*+N193F +V59A Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; e - I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+ S242Q+ Q254S (usando SEQ ID NO: 4 para numeração).

[00171] De acordo com a invenção, a variante alfa-amilase tem pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, mais preferencialmente pelo menos 94% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos de 100% de identidade com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 4 aqui.

[00172] A alfa-amilase pode, de acordo com a invenção, estar presente e/ou ser adicionada em uma concentração de 0,1-100 microgramas por grama de SS, como 0,5-50 microgramas por grama de SS, como 1-25 microgramas por grama de SS, como 1 a 10 microgramas por grama de SS, como 2 a 5 microgramas por grama de SS.

[00173] Em uma modalidade, de 1-50 microgramas, particularmente de 2-40 microgramas, particularmente 4-25 microgramas, particularmente 5-20 microgramas de protease S8A de Palaeococcus ferrophilus por grama de SS estão presentes e/ou são adicionados na liquefação e 1-10 microgramas de alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus estão presentes e/ou são adicionados na liquefação.

[00174] Em uma modalidade, a protease de Palaeococcus ferrophilus é selecionada entre: a) um polipeptídeo compreendendo ou consistindo nos

46 / 88 aminoácidos 101 a 425 da SEQ ID NO: 2; b) um polipeptídeo com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com os aminoácidos 101 a 425 da SEQ ID NO: 2.

Glucoamilase Presente e/ou Adicionada na Liquefação

[00175] Em uma modalidade, uma glucoamilase está presente e/ou é adicionada na etapa de liquefação a) em um processo da invenção (isto é, processo para recuperação de óleo e processo de produção de produtos de fermentação).

[00176] Em uma modalidade preferida, a glucoamilase presente e/ou adicionada na etapa de liquefação a) deriva de uma estirpe do gênero Penicillium, especialmente uma estirpe de Penicillium oxalicum divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 ou SEQ ID NO: 11 aqui.

[00177] Em uma modalidade, a glucoamilase tem pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, mais preferencialmente pelo menos 94% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com o polipeptídeo maduro apresentado na SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 ou SEQ ID NO: 11 aqui.

[00178] Em uma modalidade preferida, a glucoamilase é uma variante da glucoamilase de Penicillium oxalicum apresentada na SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 com uma substituição K79V, tal como uma variante divulgada em WO 2013/053801.

[00179] Em uma modalidade preferida, a glucoamilase presente e/ou adicionada na liquefação é a glucoamilase de Penicillium oxalicum com uma substituição K79V e, de preferência, ainda uma das seguintes substituições: - PI1F + T65A + Q327F; - P2N + PAS + PI1F + T65A + Q327F.

[00180] Em uma modalidade, a variante da glucoamilase tem pelo menos 75% de identidade, de preferência pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, mais preferencialmente pelo menos 94% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100% de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 ou SEQ ID NO: 11 aqui.

[00181] A glucoamilase pode ser adicionada em quantidades de 0,1- 100 microgramas EP/g, como 0,5-50 microgramas EP/g, tal como 1-25 microgramas EP/g, tal como 2-12 microgramas EP/g de SS. Glucoamilase Presente e/ou Adicionada na Sacarificação e/ou Fermentação

[00182] Uma glucoamilase está presente e/ou é adicionada na sacarificação e/ou fermentação, de preferência sacarificação e fermentação simultâneas (SFS), em um processo da invenção (isto é, processo para recuperação de óleo e processo de produção de produtos de fermentação).

[00183] Em uma modalidade, a glucoamilase presente e/ou adicionada na sacarificação e/ou fermentação é de origem fúngica, de preferência de uma estirpe de Aspergillus, de preferência A. niger, A. awamori ou A. oryzae; ou uma estirpe de Trichoderma, de preferência T. reesei, ou uma estirpe de Talaromyces, de preferência T. emersonii ou uma estirpe de Trametes, de preferência T. cingulata ou uma estirpe de Pycnoporus ou uma estirpe de Gloeophyllum, como G. sepiarium ou G. trabeum, ou uma estirpe de Nigrofomes.

[00184] Em uma modalidade, a glucoamilase deriva de Talaromyces,

48 / 88 tal como uma estirpe de Talaromyces emersonii, tal como aquela apresentada na SEQ ID NO: 5 aqui.

[00185] Em uma modalidade, a glucoamilase é selecionada do grupo que consiste em: (1) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo da SEQ ID NO: 5 aqui; (1) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60%, pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 5 aqui.

[00186] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada de uma estirpe do gênero Pycnoporus, em particular uma estirpe de Pycnoporus sanguineus descrita em WO 2011/066576 (SEQ ID NOs 2, 4 ou 6), tal como aquela apresentada como SEQ ID NO: 4 em WO 2011/066576.

[00187] Em uma modalidade a glucoamilase deriva de uma estirpe do gênero Gloeophyllum, tal como uma estirpe de Gloeophyllum sepiarium ouGloeophyllum trabeum, em particular uma estirpe de Gloeophyllum como descrita em WO 2011/068803 (SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ou 16). Em uma modalidade preferida, a glucoamilase é o Gloeophyllum sepiarium apresentado na SEQ ID NO: 2 em WO 2011/068803 ou SEQ ID NO: 6 aqui.

[00188] Em uma modalidade preferida, a glucoamilase deriva de Gloeophyllum sepiarium, tal como a apresentada na SEQ ID NO: 6 aqui. Em uma modalidade a glucoamilase é selecionada do grupo que consiste em: (1) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo da SEQ ID NO: 6 aqui; (11) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60%, pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 6 aqui.

[00189] Em outra modalidade, a glucoamilase é derivada de Gloeophyllum trabeum tal como a apresentada na SEQ ID NO: 7 aqui. Em uma modalidade a glucoamilase é selecionada do grupo que consiste em: (1) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo da SEQ ID NO: 7 aqui; (1) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60%, pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 7 aqui.

[00190] Em uma modalidade, a glucoamilase deriva de uma estirpe do gênero Nigrofomes, em particular uma estirpe de Nigrofomes sp. divulgada em WO 2012/064351.

[00191] As glucoamilases podem, em uma modalidade, ser adicionadas à sacarificação e/ou fermentação em uma quantidade de 0,0001-20 AGU/g de SS, preferencialmente 0,001-10 AGU/g de SS, especialmente entre 0,01-5 AGU/g de SS, tal como 0,1-2 AGU/g de SS.

[00192] Composições compreendendo glucoamilase comercialmente disponíveis incluem AMG 200L; AMG 300 L; SANT'Y SUPER, SANTYX EXTRA L, SPIRIZYME'!Y PLUS, SPIRIZYME'!Y FUEL, SPIRIZYME'"Y B4U, SPIRIZYME"Y ULTRA, SPIRIZYME'"Y EXCEL e AMG'Y E (da Novozymes A/S); OPTIDEX'!M 300, GC480, GC417 (da DuPont.);, AMIGASE'"Y e AMIGASE"Y PLUS (da DSM); G-ZYME'M G900, G- ZYMETY e G990 ZR (da DuPont).

[00193] De acordo com uma modalidade preferida da invenção, a glucoamilase está presente e/ou é adicionada na sacarificação e/ou fermentação em combinação com uma alfa-amilase. Exemplos de alfa- amilase adequadas são descritos em baixo. Alfa-Amilase Presente e/ou Adicionada na Sacarificação e/ou Fermentação

[00194] Em uma modalidade, uma alfa-amilase está presente e/ou é adicionada na sacarificação e/ou fermentação em um processo da invenção. Em uma modalidade preferida, a alfa-amilase é de origem fúngica ou bacteriana. Em uma modalidade preferida, a alfa-amilase é uma alfa-amilase fúngica estável em ácido. Uma alfa-amilase fúngica estável em ácido é uma alfa-amilase que tem atividade na gama de pH de 3,0 a 7,0 e, de preferência, na gama de pH de 3,5 a 6,5, incluindo atividade a um pH de cerca de 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 e 6,0.

[00195] Em uma modalidade preferida, a alfa-amilase presente e/ou adicionada na sacarificação e/ou fermentação deriva de uma estirpe do gênero Rhizomucor, de preferência uma estirpe Rhizomucor pusillus, tal como a apresentada na SEQ ID NO: 3 em WO 2013/006756, tal como um hibrido de alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com um ligador de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido, tal como o apresentado na SEQ ID NO: 8 aqui, ou uma sua variante.

[00196] Em uma modalidade, a alfa-amilase presente e/ou adicionada na sacarificação e/ou fermentação é selecionada do grupo que consiste em: (1) uma alfa-amilase compreendendo o polipeptídeo da SEQ ID NO: 8 aqui; (11) uma alfa-amilase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60%, pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 8 aqui.

[00197] Em uma modalidade preferida, a alfa-amilase é uma variante da alfa-amilase apresentada na SEQ ID NO: 8 com pelo menos uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: DI6SSM; YI41W; YI141R; K136F; K192R; P224A; P224R; S123H + Y141W; G20S + YI41W,; AT6G + YI41W; G128D + YI41W; G128D + DI43N; P219€C + YUIW,; N1I42D + DI43N; YI41W + KI92R; YI41W + DI43N; YI41W + N383R; YI41W + P219C + A265C; YI41W + NI42D + DI43N; YI41W + KI92R V410A; G128D + YI41W + DI43N; YI41W + DI43N + P219C; YI41W + DI143N + K192R; G128D + DI43N + K192R; YI41W + DI43N + KI92R + P219C; G128D + Y141W + DI43N + K192R; ou G128D + Y141W + DI43N + KI192R + P219C (usando a SEQ ID NO: 8 para numeração).

[00198] Em uma modalidade, a alfa-amilase deriva de um Rhizomucor pusillus com um ligador de glucoamilase e domínio de ligação ao amido (DLA) de Aspergillus niger, preferencialmente divulgada como SEQ ID NO: 8 aqui, de preferência com uma ou mais das seguintes substituições: G128D, DI1I43N, de preferência G128D + DI43N (usando a SEQ ID NO: 8 para numeração).

[00199] Em uma modalidade, a variante de alfa-amilase presente e/ou adicionada na sacarificação e/ou fermentação tem pelo menos 75% de identidade, de preferência pelo menos 80%, mais preferencialmente, pelo menos, 85%, mais preferencialmente, pelo menos, 90%, mais preferencialmente, pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, mais preferencialmente pelo menos 94% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos de 100% de identidade com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 8 aqui.

[00200] Em uma modalidade preferida, a razão entre glucoamilase e alfa-amilase presentes e/ou adicionadas durante a sacarificação e/ou fermentação pode estar, de preferência, na gama de 500:1 a 1:1, tal como de 250:1 a 1:1, tal como de 100:1 a 1: 1, tal como de 100: 2 a 100:50, tal como de 100:3 a 100:70. Pululanase Presente e/ou Adicionada na Liquefação e/ou Sacarificação e/ou Fermentação

[00201] A pululanase pode estar presente e/ou ser adicionada durante a etapa de liquefação a) e/ou etapa de sacarificação b) ou etapa de fermentação c) ou sacarificação e fermentação simultâneas.

[00202] As pululanases (E.C. 3.2.1.41, pululana 6-glucanoidrolases), são enzimas desramificadoras caracterizadas pela sua capacidade de hidrolisarem as ligações alfa-1,6-glicosídicas, por exemplo, na amilopectina e pululana.

[00203] As pululanases contempladas, de acordo com a presente invenção, incluem as pululanases de Bacillus amyloderamificans divulgadas na Patente U.S. No. 4,560,651 (aqui incorporada por referência), a pululanase divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 01/51620 (aqui incorporado por referência), o Bacillus deramificans divulgado como SEQ ID NO: 4 em WO 01/151620 (aqui incorporado por referência) e a pululanase deBacillus acidopullulyticus divulgada como SEQ ID NO: 6 em WO 01/51620 e também descrita em FEMS Mic. Ler. (1994) 115, 97-106.

[00204] A pululanase pode, de acordo com a invenção, ser adicionada em uma quantidade eficaz que inclui a quantidade preferida de cerca de 0,0001-10 mg de proteína enzimática por grama de SS, de preferência 0,0001- 0,10 mg de proteína enzimática por grama de SS, mais preferencialmente 0,0001-0,010 mg de proteína enzimática por grama de SS. A atividade de pululanase pode ser determinada como NPUN. Um Ensaio para a determinação de NPUN é descrito na seção “Materiais & Métodos” em baixo.

[00205] Os produtos pululanase comercialmente disponíveis adequados incluem PROMOZYME D, PROMOZYME 'M D2 (Novozymes A/S,

Dinamarca), OPTIMAX L-300 (Genencor Int., EUA) e AMANO 8 (Amano, Japão). Aspectos Adicionais dos Processos da Invenção

[00206] Antes da etapa de liquefação a), os processos da invenção, incluindo processos de extração/recuperação de óleo e processos para a produção de produtos de fermentação, podem compreender as etapas de: i) redução do tamanho de partícula do material contendo amido, de preferência, por moagem a seco; ii) formação de uma pasta fluida que compreende o material contendo amido e água.

[00207] Em uma modalidade, pelo menos 50%, de preferência pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, especialmente pelo menos 90% do material contendo amido se encaixam através de uma peneira com tela t6.

[00208] Em uma modalidade, o pH durante a liquefação está entre acima de 4,5-6,5, tal como 4,5-5,0, tal como cerca de 4,8, ou um pH entre 5,0- 6,2, tal como 5,0-6,0, tal como entre 5,0-5,5, tal como cerca de 5,2, tal como cerca de 5,4, tal como cerca de 5,6, como cerca de 5,8.

[00209] Em uma modalidade, a temperatura durante a liquefação é superior à temperatura inicial de gelatinização, de preferência na gama de 70- 100 ºC, tal como entre 75-95 ºC, de preferência entre 80-90”ºC, especialmente cerca de 85 ºC.

[00210] Em uma modalidade, uma etapa de cozimento a jato é realizada antes da liquefação na etapa a). Em uma modalidade, o cozimento a jato é realizado a uma temperatura entre 110-145 ºC, de preferência 120-140 ºC, tal como 125-135 ºC, de preferência cerca de 130 ºC durante cerca de 1- minutos, de preferência durante cerca de 3-10 minutos, especialmente cerca de 5 minutos.

[00211] Em uma modalidade preferida, a sacarificação e a fermentação são realizadas sequencialmente ou simultaneamente.

[00212] Em uma modalidade, a sacarificação é realizada a uma temperatura de 20-75 ºC, de preferência de 40-70 ºC, tal como cerca de 60 º*C,eaumpHentre4e5.

[00213] Em uma modalidade, a fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas (SFS) são realizadas a uma temperatura de 25 ºC a 40 ºC, tal como de 28 ºC a 35 ºC, tal como de 30 ºC a 34 ºC, de preferência cerca de 32 ºC. Em uma modalidade, a fermentação decorre durante 6 a 120 horas, em particular 24 a 96 horas.

[00214] Em uma modalidade preferida, o produto de fermentação é recuperado após a fermentação, tal como por destilação.

[00215] Em uma modalidade, o produto de fermentação é um álcool, de preferência etanol, especialmente etanol combustível, etanol potável e/ou etanol industrial.

[00216] Em uma modalidade, o material de partida contendo amido são grãos inteiros. Em uma modalidade, o material contendo amido é selecionado do grupo de milho, trigo, cevada, centeio, sorgo, sagu, mandioca, tapioca, milho-zaburro, arroz e batata.

[00217] Em uma modalidade, o organismo de fermentação é a levedura, de preferência uma estirpe de Saccharomyces, especialmente uma estirpe de Saccharomyces cerevisiae.

[00218] Em uma modalidade, a temperatura na etapa (a) é superior à temperatura inicial de gelatinização, tal como a uma temperatura entre 80-90 ºC, tal como cerca de 85 ºC.

[00219] E uma modalidade, um processo da invenção compreende ainda uma etapa de pré-sacarificação, antes da etapa de sacarificação b), realizada durante 40-90 minutos a uma temperatura entre 30-65 ºC. Em uma modalidade, a sacarificação é realizada a uma temperatura de 20-75 ºC, de preferência de 40-70 ºC, tal como cerca de 60 ºC e a um pH entre 4 e 5. Em uma modalidade, a etapa de fermentação c) ou a sacarificação e fermentação simultâneas (SFS) (isto é, as etapas b) e c)) são realizadas a uma temperatura de 25 ºC a 40 ºC, tal como de 28 ºC a 35 ºC, tal como de 30 ºC a 34 ºC, de preferência cerca de 32 ºC. Em uma modalidade, a etapa de fermentação c) ou a sacarificação e fermentação simultâneas (SFS) (isto é, as etapas b) e c)) decorrem durante 6 a 120 horas, em particular 24 a 96 horas.

[00220] Em uma modalidade, a separação na etapa e) é realizada por centrifugação, de preferência uma centrífuga decantadora, filtração, de preferência usando uma prensa de filtragem, uma prensa de parafuso, uma prensa de placa e armação, um espessador ou decker de gravidade.

[00221] Em uma modalidade, o produto de fermentação é recuperado por destilação. Meio de Fermentação

[00222] O ambiente em que a fermentação é realizada geralmente é chamado de “meios de fermentação” ou “meio de fermentação". O meio de fermentação inclui o substrato para a fermentação, isto é, a fonte de carboidratos que é metabolizada pelo organismo fermentador. De acordo com a invenção, o meio de fermentação pode compreender nutrientes e estimulante(s) do crescimento para o(s) organismo(s) fermentador(es). Nutrientes e estimulantes do crescimento são amplamente usados na técnica de fermentação e incluem fontes de nitrogênio, tais como amônia; ureia, vitaminas e minerais ou suas combinações. Organismos Fermentadores

[00223] O termo “organismo fermentador” se refere a qualquer organismo, incluindo organismos bacterianos e fúngicos, especialmente levedura, adequado para uso em um processo de fermentação e capaz de produzir o produto de fermentação desejado. Organismos de fermentação especialmente adequados são capazes de fermentar, isto é, converter açúcares, como glicose ou maltose, direta ou indiretamente, no produto de fermentação desejado, tal como o etanol. Exemplos de organismos fermentadores incluem organismos fúngicos, tais como levedura. Leveduras preferenciais incluem estirpes de Saccharomyces spp., em particular, Saccharomyces cerevisiae.

[00224] Concentrações adequadas do organismo fermentador viável durante a fermentação, tal como SFS, são bem conhecidas na técnica ou podem ser facilmente determinadas pelo perito na técnica. Em uma modalidade, o organismo fermentador, tal como a levedura fermentadora de etanol (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae), é adicionado ao meio de fermentação de tal forma que a contagem do organismo fermentador viável, tal como a levedura, por mL de meio de fermentação esteja na gama de 10º a 10"?, de preferência de 107 a 10"º, especialmente cerca de 5 x 107.

[00225] Exemplos de leveduras comercialmente disponíveis incluem, por exemplo, levedura RED STAR'YX e ETHANOL RED“ (disponível a partir da Fermentis/Lesaffre, EUA), FALI (disponível a partir da Fleischmann's Yeast, EUA), leveduras frescas SUPERSTART e THERMOSACC'Y (disponíveis a partir da Ethanol Technology, WI, EUA), BIOFERM AFT e XR (disponíveis a partir da NABC - North American Bioproducts Corporation, GA, EUA), GERT STRAND (disponível a partir da Gert Strand AB, Suécia) e FERMIOL (disponível a partir da DSM Specialties). Materiais Contendo Amido

[00226] Qualquer material contendo amido pode ser usado de acordo com a presente invenção O material de partida é geralmente selecionado com base no produto de fermentação desejado. Exemplos de materiais contendo amido, adequados para uso em um processo da invenção, incluem grãos inteiros, milho, trigo, cevada, centeio, sorgo, sagu, mandioca, tapioca, milho- zaburro, arroz, ervilhas, feijão ou batata doce, ou suas misturas ou amidos à base destes, ou cereais. São também contemplados tipos cerosos e não cerosos de milho e cevada. Em uma modalidade preferida, o material contendo amido,

utilizado para a produção de etanol de acordo com a invenção, é milho ou trigo. Produtos de Fermentação

[00227] O termo “produto de fermentação” designa um produto produzido por um processo que inclui uma etapa de fermentação usando um organismo de fermentação. Os produtos de fermentação contemplados de acordo com a invenção incluem álcoois (por exemplo, etanol, metanol, butanol; poliois como glicerol, sorbitol e inositol); ácidos orgânicos (por exemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido itacônico, ácido lático, ácido suceínico, ácido glucônico); cetonas (por exemplo, acetona); aminoácidos (por exemplo, ácido glutâmico); gases (por exemplo, H; e CO»); antibióticos (por exemplo, penicilina e tetraciclina); enzimas; vitaminas (por exemplo, riboflavina, B12, beta-caroteno); e hormônios. Em uma modalidade preferida, o produto da fermentação é etanol, por exemplo, etanol combustível; etanol bebível, isto é, bebidas alcoólicas neutras potáveis; ou etanol industrial ou produtos usados na indústria do álcool consumível (por exemplo, cerveja e vinho), indústria dos lacticínios (por exemplo, produtos lácteos fermentados), indústria das peles e indústria do tabaco. Tipos de cerveja preferidos compreendem ales, stouts, porters, lagers, bitters, licores de malte, happoushu, cerveja com muito álcool, cerveja com pouco álcool, cerveja baixa em calorias ou cerveja sem álcool. De preferência, os processos da invenção são utilizados para a produção de um álcool, tal como etanol. O produto de fermentação, tal como etanol, obtido de acordo com a invenção, pode ser usado como combustível, o qual é tipicamente misturado com gasolina. No entanto, no caso do etanol, esse também pode ser usado como etanol potável. Recuperação de Produtos de Fermentação

[00228] Após a fermentação, ou SFS,, o produto de fermentação pode ser separado do meio de fermentação. A pasta semifluida pode ser destilada para se extrair o produto de fermentação desejado (por exemplo, etanol). Alternativamente, o produto de fermentação desejado pode ser extraído do meio de fermentação por técnicas de microfiltração ou filtração com membranas. O produto de fermentação pode ser também recuperado por separação ou outro método bem conhecido na técnica. Recuperação de Óleo

[00229] De acordo com a invenção, o óleo é recuperado, durante e/ou após a liquefação, do resíduo de destilaria inteiro, do resíduo de destilaria fino ou do xarope. O petróleo pode ser recuperado por extração. Em uma modalidade, o óleo é recuperado por extração com hexano. Outras tecnologias de recuperação de óleo bem conhecidas na técnica também podem ser usadas.

[00230] A invenção é ainda definida nas seguintes modalidades numeradas:

1. Um polipeptídeo com atividade de protease selecionado do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo com pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de estringência muito elevada com (1) a sequência codificante do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, (ii) o complemento de comprimento total de (i) ou (11); (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1; e (d) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b) ou (c) que tem atividade de protease.

[00231] 2. O polipeptídeo da modalidade 1, que tem pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

[00232] 3. O polipeptídeo da modalidade 1 ou 2, que é codificado por um polinucleotídeo que hibrida em condições de estringência muito elevada com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, ou (11) o complemento de comprimento total de (i).

[00233] 4. O polipeptídeo de qualquer uma das modalidades 1-3, que é codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98 %, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1.

[00234] 5. O polipeptídeo de qualquer uma das modalidades 1-4, compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO: 2 ou no polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

[00235] 6. O polipeptídeo da modalidade 5, em que o polipeptídeo maduro consiste nos aminoácidos 101 a 425 da SEQ ID NO: 2.

[00236] 7. O polipeptídeo de qualquer uma das modalidades 1-6, que é uma variante do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 compreendendo uma substituição, deleção e/ou inserção em uma ou mais (várias) posições.

[00237] 8. O polipeptídeo da modalidade 1, que é um fragmento da SEQ ID NO: 2, em que o fragmento tem atividade de protease

[00238] 9. Um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de qualquer uma das modalidades 1 a 8.

[00239] 10. Um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão recombinante — compreendendo o polinucleotídico da modalidade 9 operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle heterólogas que direcionam a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.

[00240] 11. Uma célula hospedeira recombinante, compreendendo o polinucleotídeo da modalidade 9 operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle heterólogas que direcionam a produção do polipeptídeo.

[00241] 12. Uma composição compreendendo o polipeptídeo de qualquer uma das modalidades 1-8.

[00242] 13. Um método de produção do polipeptídeo de qualquer uma das formas de realização 1-8, compreendendo: (a) cultivar uma célula que, na sua forma wild-type, produz o polipeptídeo, sob condições propícias à produção do polipeptídeo e (b) recuperar opcionalmente o polipeptídeo.

[00243] 14. Método de produção de um polipeptídeo que tem atividade de protease compreendendo: (a) cultivar a célula hospedeira da modalidade 11 sob condições favoráveis à produção do polipeptídeo; e (b) recuperar opcionalmente o polipeptídeo.

[00244] 15. Processo para liquefazer material contendo amido compreendendo a liquefação do material contendo amido a uma temperatura superior à temperatura inicial de gelatinização, na presença de pelo menos uma alfa-amilase e uma protease S8A de Palaeococcus ferrophilus, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-8.

[00245] 16. Processo para produzir produtos de fermentação a partir de material contendo amido, compreendendo as etapas de: a) liquefação do material contendo amido a uma temperatura superior à temperatura inicial de gelatinização na presença de pelo menos: - uma alfa-amilase; e - uma protease S8A de Palaeococcus ferrophilus; b) sacarificação usando uma glucoamilase;

c) fermentação usando um organismo de fermentação.

[00246] 17. Um processo para recuperação de óleo de um processo como divulgado na modalidade 16, compreendendo ainda as etapas de: d) recuperação do produto de fermentação para formar um resíduo de destilaria inteiro; e) separação do resíduo de destilaria inteiro em resíduo de destilaria fino e bolo úmido; f) concentração opcional do resíduo de destilaria fino em xarope; em que o óleo é recuperado a partir: - material contendo amido liquefeito após a etapa a) do processo, como divulgado na modalidade 16; e/ou - a jusante da etapa de fermentação c) do processo, como divulgado na modalidade 16.

[00247] 18. O processo das modalidades 16-17, em que o óleo é recuperado durante e/ou após a liquefação do material contendo amido.

[00248] 19. O processo de qualquer uma das modalidades 16-18, em que o óleo é recuperado do resíduo de destilaria inteiro.

[00249] 20. O processo de qualquer uma das modalidades 16-18, em que o óleo é recuperado do resíduo de destilaria fino.

[00250] 21. O processo de qualquer modalidade 16-18, em que o óleo é recuperado do xarope.

[00251] 22. O processo de qualquer uma das modalidades 16-21, em que a sacarificação e a fermentação são realizadas simultaneamente.

[00252] 23. O processo de qualquer uma das modalidades 16-22, em que nenhum composto de nitrogênio está presente e/ou é adicionado nas etapas a) -c), tal como durante a etapa de sacarificação b), etapa de fermentação c) ou sacarificação e fermentação simultâneas (SFS).

24. O processo de qualquer uma das modalidades 16-22, em que 10-1.000 ppm, tal como 50-800 ppm, tal como 100-600 ppm, tal como 200-500 ppm de composto de nitrogênio, preferencialmente ureia, está presente e/ou é adicionado nas etapas a) -c), tal como na etapa de sacarificação b) ou na etapa de fermentação c) ou na sacarificação e fermentação simultânea (SFS).

[00253] 25. O processo de qualquer uma das modalidades 16-24, em que a alfa-amilase na etapa a) é do gênero Bacillus, tal como uma estirpe de Bacillus stearothermophilus, em particular uma variante de alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, tal como a apresentada na SEQ ID NO: 4.

[00254] 26. O processo da modalidade 25, em que a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, ou sua variante, é truncada, de preferência para ter cerca de 491 aminoácidos, tal como de 480 a 495 aminoácidos.

[00255] 27. O processo de qualquer uma das modalidades 25 ou 26, em que a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus tem uma deleção em duas posições dentro da gama de posições de 179 a 182, como as posições I181 + G182, R179 + G180, G180 + I181, R179 + I181, ou GI80 + G182, de preferência 1181 + G182, e opcionalmente uma substituição N193F (usando a SEQ ID NO: 4 para numeração).

[00256] 28. O processo de qualquer uma das modalidades 25-27, em que a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus tem uma substituição na posição S242, de preferência uma substituição S242Q.

[00257] 29. O processo de qualquer uma das modalidades 25-28, em que a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus tem uma substituição na posição E188, de preferência uma substituição E188P.

[00258] 30. O processo de qualquer uma das modalidades 25-29, em que a alfa-amilase é selecionada do grupo de variantes de alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus com as seguintes mutações, para além de 1181*+G182 * e, opcionalmente, N193F: Ev59A+Q89R+G112D+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q2548; À

E VS9A+QBIR+E129V+K177L+R179E+K220P+N2241+Q254S+D269E+D28]IN; | V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N2241+Q254S+1270L; |- VS9A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+H274K; |- VS9A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+Y276F; | VS9A+E129V+R157Y+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; | VS9A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S; | S9A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; | VS9A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+H274K; E VS9A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F; | VS9A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+D281N; - VS9A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T; | VS9A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+G416V; | VS9A+E129V+K177L+R179E+K220P+N2241+Q254S; | VS9A+E129V+K177L+R179E+K220P+N2241+Q254S+M284T; | A9IL+M96I+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; | EI29V+K177L+R179E; FEI29V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; FEI29V+K177LHR179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F+1A27M; FEI29V+K177LHR179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T; FEI29V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+N376*+1377"; FEI29V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S; FEI29V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T; FEI29V+K177L+R179E+S242Q; FEI29V+K177L+R179V+K220P+N224L+S242Q+Q254S; | K220P+N224L+S242Q+Q254S; | M284V; | V59A Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V.

[00259] 31. O processo de qualquer uma das modalidades 25-30, em que a alfa-amilase é selecionada a partir do grupo de variantes de alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus: - 1181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E; - I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+ H208Y+K220P+N224L+Q254S; - I181*+G182*+N193F +V59A Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; e - I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+ S242Q+Q254S8 (usando SEQ ID NO: 4 para numeração).

[00260] 32. O processo de qualquer uma das modalidades 25-31, em que a variante de alfa-amilase tem pelo menos 75% de identidade, de preferência pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, mais preferencialmente pelo menos 94% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos de 100% de identidade com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 4.

[00261] 33. O processo de qualquer uma das modalidades 25-32, em que a alfa-amilase está presente e/ou é adicionada em uma concentração de 0,1-100 microgramas por grama de SS, como 0,5-50 microgramas por grama de SS, como 1-25 microgramas por grama SS, como 1-10 microgramas por grama SS, como 2-5 microgramas por grama de SS.

[00262] 34. O processo de qualquer uma das modalidades 16-33, em que estão presentes e/ou são adicionadas 1-50 microgramas, particularmente 2-40 microgramas, particularmente 4-25 microgramas, particularmente 5-20 microgramas de protease S8A de Palaeococcus ferrophilus por grama de SS na liquefação.

[00263] 35. O processo de qualquer uma das modalidades 16-34, em que a protease de Palaeococcus ferrophilus é selecionada entre: a) um polipeptídeo compreendendo ou consistindo nos aminoácidos 101 a 425 da SEQ ID NO: 2; b) um polipeptídeo com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com os aminoácidos 101 a 425 da SEQ ID NO: 2.

[00264] 36. O processo de qualquer uma das modalidades 16-35, em que a glucoamilase presente e/ou adicionada na etapa de sacarificação b) e/ou etapa de fermentação c) é de origem fúngica, de preferência de uma estirpe de Aspergillus, de preferência A. niger, A. awamori, ou A. oryzae; ou de uma estirpe de Trichoderma, de preferência 7. reesei,; ou uma de uma estirpe de Talaromyces, de preferência T. emersonii, ou de uma estirpe de Trametes, de preferência 7. cingulata, ou de uma estirpe de Pycnoporus, ou de uma estirpe de Gloeophyllum, como G. sepiarium ou G. trabeum, ou de uma estirpe de Nigrofomes.

[00265] 37. O processo da modalidade 36, em que a glucoamilase deriva de Talaromyces emersonii, tal como a apresentada na SEQ ID NO: 5 aqui.

[00266] 38. O processo da modalidade 37, em que a glucoamilase é selecionada do grupo que consiste em: (1) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo da SEQ ID NO: 5; (1) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60%, pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 5.

[00267] 39. O processo da modalidade 36, em que a glucoamilase deriva de Gloeophyllum sepiarium, tal como a apresentada na SEQ ID NO: 6.

[00268] 40. O processo da modalidade 39, em que a glucoamilase é selecionada do grupo que consiste em: (1) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo da SEQ ID NO: 6; (11) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60%, pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 6.

[00269] 41. O processo da modalidade 36, em que a glucoamilase deriva de Gloeophyllum trabeum, tal como a apresentada na SEQ ID NO: 7.

[00270] 42. O processo da modalidade 41, em que a glucoamilase é selecionada do grupo que consiste em: (1) uma glucoamilase compreendendo o polipeptídeo da SEQ ID NO: 7; (11) uma glucoamilase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60%, pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 7.

[00271] 43. O processo de qualquer uma das modalidades 16-42, em que a glucoamilase está presente na sacarificação e/ou fermentação em combinação com uma alfa-amilase.

[00272] 44. O processo da modalidade 43, em que a alfa-amilase que está presente na sacarificação e/ou fermentação é de origem fúngica ou bacteriana.

[00273] 45. O processo da modalidade 43 ou 44, em que a alfa-amilase presente e/ou adicionada na sacarificação e/ou fermentação deriva de uma estirpe do gênero Rhizomucor, de preferência uma estirpe de Rhizomucor pusillus, tal como um híbrido de alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com um ligador de Aspergillus niger e um domínio de ligação ao amido, como o apresentado na SEQ ID NO: 8.

[00274] 46. O processo da modalidades 45, em que a alfa-amilase presente na sacarificação e/ou fermentação é selecionada do grupo que consiste em: (1) uma alfa-amilase compreendendo o polipeptídeo da SEQ ID NO: 8; (11) uma alfa-amilase compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60%, pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 8.

[00275] 47. O processo de qualquer uma das modalidade 44-46, em que a alfa-amilase deriva de um Rhizomucor pusillus com um ligador de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (DLA), de preferência divulgado como SEQ ID NO: 8, com, de preferência, uma ou mais das seguintes substituições: G128D, DI43N, de preferência G128D + D143N (usando a SEQ ID NO: 8 para numeração).

[00276] 48. O processo de qualquer uma das reivindicações 16-47, compreendendo ainda, antes da etapa de liquefação a), as etapas de: i) redução do tamanho de partícula do material contendo amido, de preferência, por moagem a seco; ii) formação de uma pasta fluida que compreende o material contendo amido e água.

[00277] 49. O processo de qualquer uma das modalidades 16-48, em que pelo menos 50%, de preferência pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, especialmente pelo menos 90% do material contendo amido se encaixa através de uma peneira com tela t6.

[00278] 50. O processo de qualquer uma das modalidades 16-49, em que o pH na liquefação está entre acima de 4,5-6,5, tal como cerca de 4,8, ou um pH entre 5,0-6,2, tal como 5,0-6,0, tal como entre 5,0-5,5, tal como cerca de 5,2, tal como cerca de 5,4, tal como cerca de 5,6, tal como cerca de 5,8.

[00279] 51. O processo de qualquer uma das modalidades 16-50, em que a temperatura na liquefação é superior à temperatura inicial de gelatinização, tal como na gama de 70-100 ºC, tal como entre 75-95 ºC, tal como entre 75-90 ºC, de preferência entre 80-90 ºC, especialmente cerca de 85ºC.

[00280] 52. O processo de qualquer uma das modalidades 16-51, em que uma etapa de cozimento a jato é realizada antes da liquefação na etapa a).

[00281] 53. O processo da modalidade 52, em que o cozimento a jato é realizado a uma temperatura entre 110-145 ºC, de preferência 120-140 ºC, tal como 125-135 ºC, de preferência cerca de 130 ºC durante cerca de 1-15 minutos, de preferência durante cerca de 3-10 minutos, especialmente cerca de 5 minutos.

[00282] 54. O processo de qualquer uma das modalidades 16-53, em que a sacarificação é realizada a uma temperatura de 20-75ºC, de preferência de 40-70 ºC, tal como cerca de 60 ºC, ea um pH entre 4 e 5.

[00283] 55. O processo de qualquer uma das modalidades 16-54, em que a fermentação ou sacarificação e fermentação simultânea (SFS) é realizada a uma temperatura de 25 ºC a 40 ºC, tal como de 28 ºC a 35 ºC, tal como de 30 ºC a 34 ºC, de preferência cerca de 32 ºC.

[00284] 56. O processo de qualquer uma das modalidades 16-55, em que o produto de fermentação é recuperado após a fermentação, tal como por destilação.

[00285] 57. O processo de qualquer uma das modalidades 16-56, em que o produto de fermentação é um álcool, de preferência etanol, especialmente etanol combustível, etanol potável e/ou etanol industrial.

[00286] 58. O processo de qualquer uma das modalidades 16-57, em que o material de partida contendo amido é grãos inteiros.

[00287] 59. O processo de qualquer uma das modalidades 16-58, em que o material contendo amido deriva de milho, trigo, cevada, centeio, sorgo, sagu, mandioca, tapioca, milho-zaburro, arroz ou batata.

[00288] 60. O processo de qualquer uma das modalidades 16-59, em que o organismo fermentador é levedura, de preferência uma estirpe de Saccharomyces, especialmente uma estirpe de Saccharomyces cerevisiae.

[00289] 61. Um processo de acordo com qualquer uma das modalidades 16-60, em que a proporção entre alfa-amilase e protease na liquefação está na gama entre 1:1 e 1:50 (microgramas de alfa- amilase:micrograma de protease), tal como entre 1:3 e 1:40, tal como cerca de 1:4 (microgramas de alfa-amilase:microgramas de protease).

[00290] 62. Composição enzimática compreendendo:

[00291] uma alfa-amilase e uma protease S8A de Palaeococcus Ferrophilus, de preferência um polipeptídeo de acordo com as modalidades 1-

8.

[00292] 63. A modalidade 62 da composição enzimática, em que a proporção entre alfa-amilase e protease está na gama de 1:1 e 1:50 (microgramas de alfa-amilase:microgramas de protease), tal como entre 1:3 e 1:40, tal como cerca de 1:4 (microgramas de alfa-amilase:microgramas de protease).

[00293] 64. A composição enzimática de qualquer uma das modalidades 62-64, em que a composição enzimática compreende uma glucoamilase e a proporção entre alfa-amilase e glucoamilase na liquefação está entre 1:1 e 1:10, tal como cerca de 1:2 (microgramas de alfa- amilase:microgramas de glucoamilase).

[00294] 65. A composição enzimática de qualquer uma das modalidades 62-64, em que a alfa-amilase é uma alfa-amilase bacteriana, particularmente derivada das espécies de Bacillus ou Exiguobacterium, como por exemplo, Bacillus licheniformis ou Bacillus stearothermophilus.

[00295] 66. A composição enzimática de qualquer uma das modalidades 62-65, em que a alfa-amilase é de uma estirpe de Bacillus stearothermophilus, em particular uma variante de uma alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, tal como a apresentada na SEQ ID NO: 4.

[00296] 67. A composição enzimática de qualquer uma das modalidades 62-66, em que a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, ou sua variante, é truncada, de preferência para ter cerca de 491 aminoácidos, tal como 480-495 aminoácidos.

[00297] 68. A composição enzimática de qualquer uma das modalidades 62-67, em que a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus tem uma deleção em duas posições dentro da gama de posições 179 a 182, como as posições I181 + G182, R179 + G180, G180 + I181, R179 + I181, ou G180 + G182, de preferência 1181 + G182, e opcionalmente uma substituição N193F (usando a SEQ ID NO: 4 para numeração).

[00298] 69. A composição enzimática de qualquer uma das modalidades 62-68, em que a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus tem uma substituição na posição S242, de preferência uma substituição S242Q.

[00299] 70. A composição enzimática de qualquer uma das modalidades 62-69, em que a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus tem uma substituição na posição E188, de preferência uma substituição E188P.

[00300] 71. A composição enzimática de qualquer uma das modalidades 62-70, em que a alfa-amilase é selecionada do grupo de variantes de alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus com as seguintes mutações, além das deleções I181*+G182* e, opcionalmente, N193F: EV59A+Q89R+G112D+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S; | VS9A+QBIR+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N2241+Q254S; | VS9A+QBIR+E129V+K177L+R179E+K220P+N2241+Q254S+D269E+D281N; | VS9A+QBIR+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+1270L; | V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N2241+Q254S+H274K; | V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N2241+Q254S+Y276F; | V59A+E129V+R157Y+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; | V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S; | S9A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; | V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N2241+S242Q+Q254S+H274K; | V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F; | VS9A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+D281N; - VS9A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T; | VS9A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+G416V; | VS9A+E129V+K177L+R179E+K220P+N2241+Q254S; | VS9A+E129V+K177L+R179E+K220P+N2241+Q254S+M284T; | A9IL+M96I+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; E EI29V+K177L+R179E; E EI29V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; | EI29V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F+LA27M; | EI29V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T; | EI29V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+N376*+1377*; | E129V+K177L+R179E+K220P+N2241+Q254S; FEI29V+K177LHR179E+K220P+N224L+Q254S+M284T;

[00301] 72. A composição enzimática de qualquer uma das modalidades 62-71, em que a alfa-amilase é selecionada do grupo de variantes de alfa-amilase de Bacillus stearomthermphilus com as seguintes mutações: - 1181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E; - I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y +K220P+N224L+Q254S; - 1181*+G182*+N193F +V59A Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V; e - I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N2241L + S242Q+Q254S (usando SEQ ID NO: 4 para numeração).

[00302] 73. A composição enzimática de qualquer uma das modalidades 62-72, em que a variante de alfa-amilase tem pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93 %, de preferência pelo menos 94% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos de 100% de identidade com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 4.

[00303] 74. A composição enzimática de qualquer uma das modalidades 62-73, em que a protease S8A de Palaeococcus ferrophilus tem pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99% de identidade com os aminoácidos 101 a 425 da SEQ ID NO: 2.

[00304] 75. A composição de qualquer uma das modalidades 62-74, compreendendo uma glucoamilase de SEQ ID NO: 11 ou uma glucoamilase com pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%,

tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99 % de identidade com a SEQ ID NO: 11.

[00305] 76. O processo de qualquer uma das modalidades 15-61, em que uma glucoamilase da SEQ ID NO: 11 ou uma glucoamilase com pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99 % de identidade com a SEQ ID NO: 11 está/é presente/adicionada durante a liquefação.

[00306] 77. O processo de acordo com a modalidade 60, em que a célula de levedura expressa uma glucoamilase, por exemplo, a glucoamilase das modalidades 36-42.

[00307] 78. O uso de uma protease S8A de Palaeococcus ferrophilus na liquefação de material contendo amido.

[00308] 79. O uso, de acordo com a modalidade 75, em que a protease S8A tem pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99% de identidade com os aminoácidos 101 a 425 da SEQ ID NO: 2.

[00309] A presente invenção é ainda descrita pelos seguintes exemplos que não devem ser interpretados como limitativos do escopo da invenção.

EXEMPLOS Enzimas e leveduras usadas nos exemplos:

[00310] Alfa-Amilase Liquozima SC: Alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus divulgada no presente documento como SEQ ID NO: 4 e adicionalmente com as mutações: I1181* + G182* + N193F.

[00311] Alfa-Amilase BE369 (AA369): Alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus divulgada no presente documento como SEQ ID NO: 4 e adicionalmente com as mutações: I181* + G182* + NI93F + V59A + Q89R + EI29V + KI77L + R1I79E + Q254S + M284V truncada até 491 aminoácidos (usando a SEQ ID NO: 4 para numeração).

[00312] Glucoamilase Po: Parte madura da glucoamilase de Penicillium oxalicum divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 e apresentada na SEQ ID NO: 11 aqui.

[00313] Glucoamilase POAMGA498 (GA498): Variante de glucoamilase de Penicillium oxalicum com as seguintes mutações: K79V+ P2N+ P4S+ P11F+ T65A+ Q327F (usando a SEQ ID NO: 11 para numeração).

[00314] Glucoamilase X: Mistura compreendendo glucoamilase de Talaromyces emersonii divulgada como SEQ ID NO: 34 em WO99/28448, glucoamilase de Trametes cingulata divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 06/69289 e alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com ligador de glucoamilase e domínio de ligação ao amido (DLA) de Aspergillus niger, divulgada na SEQ ID NO: 8 aqui, com as seguintes substituições G128D + DI43N usando a SEQ ID NO: 8 para numeração (a proporção de atividade em AGU:AGU:FAU-F é cerca de 29:8:1).

[00315] Levedura: ETHANOL RED'Y disponível junto à Fermentis,

EUA Ensaios Ensaios de protease 1) Ensaio cinético de Suc-AAPF-pNA: Substrato pNA: Suc-AAPF-pNA (L-1400 da Bachem).

Temperatura: Temperatura ambiente (25 ºC) Tampões do ensaio: ácido succínico a 100 mM, HEPES a 100 mM, CHES a 100 mM, CABS a 100 mM, CaCl; a 1 MM, KCI a 150 mM, Triton X-100 a 0,01% ajustado até valores de pH 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 e 11,0 com HCI ou NaOH.

uL de protease (diluída em Triton X-100 a 0,01%) foram misturados com 100 uL de tampão do ensaio. O ensaio foi iniciado pela adição de 100 uL de substrato pNA (50 mg dissolvidas em 1,0 mL de DMSO e diluído 45x com Triton X-100 a 0,01%). O aumento na DOa"s foi monitorado como uma medida da atividade de protease. 2) Ensaio de Parâmetro Suc-AAPF-pNA AK: Substrato pNA: Suc-AAPF-pNA (L-1400 da Bachem).

Temperatura: controlada (temperatura do ensaio).

Tampão do ensaio: ácido succínico a 100 mM, HEPES a 100 mM, CHES a 100 mM, CABS a 100 mM, CaCl; a 1 mM, KCl a 150 Mm, Triton X-100 a 0,01%, pH 7,0.

200 uL de substrato pNA (50 mg dissolvidas em 1,0 mL de DMSO e diluído 45x com tampão de Ensaio) foram pipetados para um tubo Eppendorf e colocados em gelo. Foram adicionados 20 uL de amostra (diluída em Triton X-100 a = 0,01%) O ensaio foi iniciado por transferência do tubo Eppendorf para um termomisturador Eppendorf, que estava definido para a temperatura do ensaio. O tubo foi incubado durante 15 minutos no termomisturador Eppendorf à sua velocidade de agitação mais elevada (1400 rpm). A incubação foi terminada transferindo o tubo novamente para o banho de gelo e adicionando 600 uL ácido Succínico/NaOH a 500 mM, pH 3,5. Após misturar o tubo Eppendorf no vórtex, 200 uL de mistura foram transferidos para uma placa de microtitulação. A DOaos foi lida como uma medida da atividade de protease. Um tampão cego foi incluído no ensaio (em vez da enzima). Exemplo 1: Clonagem e expressão da Protease S8A de Palaeococcus Jerrophilus

[00316] Palaeococcus ferrophilus foi isolado da costa do Japão e depositado na DSMZ como DMS No.: 13482 (Takai et al, 2000. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 50, 489- 500). Um gene que codifica uma protease S8 foi identificado no genoma. O gene que codifica a protease S8 de Palaeococcus ferrophilus (SEQ ID NO: 1)

foi otimizado por códon e sintetizado por Gene Art (GENEART AG BioPark, Josef-Engert-Str. 11, 93053, Regensburg, Alemanha) (gene sintético: SEQ ID NO: 3). O construto feito a partir do gene sintético expressava o gene como uma enzima intracelular sem o sinal de secreção nativo . O construto que expressa o gene como uma enzima intracelular foi feito como um construto de integração linear, onde o gene sintético (sem sinal) foi fundido por PCR entre duas regiões cromossômicas homólogas de Bacillus subtilis, Juntamente com um promotor forte e um marcador de resistência ao cloranfenicol. A fusão foi feita por SOE PCR (Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K. e Pease, L. R. (1989) Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes, gene splicing by overlap extension Gene 77: 61-68). O método de SOE PCR é também descrito no pedido de patente WO 2003095658. No construto o gene foi expresso sob o controle de um sistema promotor triplo (como descrito em WO 99/43835) consistindo nos promotores do gene da alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyL), do gene da alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ) e do promotor cryIlIA de Bacillus thuringiensis, incluindo sequência estabilizadora. O construto plasmídico e o construto de PCR linear foram transformados em Bacillus subtilis. Os transformantes foram selecionados em placas LB suplementadas com 6 ug de cloranfenicol por mL. Para o construto expressando a enzima intracelular, um clone recombinante de Bacillus subrtilis foi cultivado em cultura líquida. À enzima recombinante foi acumulada no sobrenadante após lise natural das células. O sobrenadante contendo enzima foi recolhido e as enzimas purificadas como descrito no Exemplo 2. Exemplo 2: Purificação e Caracterização da Protease S8 de Purificação da Protease S8 de Palaeococcus ferrophilus

[00317] O caldo de cultura foi centrifugado (20000 x g, 20 min) e o sobrenadante foi cuidadosamente decantado a partir do precipitado. O sobrenadante foi filtrado através de uma unidade de filtração de 0,2 um da

Nalgene, de modo a se remover o resto das células hospedeiras de Bacillus. Foi adicionado (NH,) 2SO, sólido ao filtrado de 0,2 um para uma concentração final de 1,8 M de (NH) 2SO, e a solução enzimática foi aplicada a uma coluna Butil Toyopearl (da Tosoh Haas) equilibrada com H;BO;3 a 100 mM, MES a 10 mM, CaCl; a 2mM, (NH) 2SO,s a 1,8 M, pH 6,0. Após lavagem extensiva da coluna com o tampão de equilíbrio, a protease foi eluída com um gradiente linear entre o tampão de equilíbrio e H;3;BO; a 100 mM, MES a 10 mM, CaCl; a 2 mM, pH 6,0, em quatro volumes de coluna. As frações da coluna foram analisadas quanto à atividade da protease (usando o ensaio cinético Suc-AAPF-pNA a pH 9) e o pico da atividade da protease foi reunido. A amostra da coluna Butil Toyopearl foi transferida para H;BO; a 100mM, MES a 10 mM, CaCl2 a 2 mM, pH 6,0 em uma coluna G25 Sephadex (da GE Healthcare) e o pH da enzima G25 transferida foi ajustado para pH 9,0 com Tris-base a 3 M. A solução ajustada ao pH foi aplicada a uma coluna SOURCE 30Q (da GE Healthcare) equilibrada com Tris/HCI a 10 mM, CaCl; a 1 mM, pH 9,0. Após lavagem extensiva da coluna com o tampão de equilíbrio, a protease foi eluída com um gradiente linear ao longo de dez volumes da coluna entre o tampão de equilíbrio e Tris/HClI a 10 mM, CaCl; a 1 MM, NaCl a 500 mM, pH 9,0. As frações da coluna foram analisadas quanto à atividade da protease (usando o ensaio cinético Suc-AAPF-pNA a pH 9) e as frações ativas foram analisadas posteriormente por SDS-PAGE. Frações com uma banda dominante a aproximadamente 37 kDa no gel de SDS-PAGE corado com coomassie foram reunidos. A amostra era a preparação purificada e foi usada para caracterização adicional.

Caracterização da Protease S8 de Palaeococcus ferrophilus

[00318] O ensaio cinético Suc-AAPF-pNA foi usado para obter o perfil de atividade de pH e o perfil de estabilidade de pH para a Protease S8 de Palaeococcus ferrophilus. Para o perfil de estabilidade de pH, a protease foi diluída 10 x nos diferentes tampões de ensaio para alcançar os valores de pH desses tampões e, então, incubada durante 2 horas a 37 ºC. Após a incubação, o pH das incubações de protease foi transferido para pH 9,0, antes do ensaio para atividade residual, por meio de diluição no tampão de ensaio em pH 9,0. O ensaio de parâmetro Suc-AAPF-pNA foi usado para obtenção do perfil de atividade de temperatura a pH 7,0.

[00319] Os resultados são apresentados nas Tabelas 1-3 em baixo. Para a Tabela 1, as atividades são em relação ao pH ótimo para a enzima. Para a Tabela 2, as atividades são atividades residuais em relação a uma amostra, que foi mantida em condições estáveis (5 ºC, pH 9,0). Para a Tabela 3, as atividades são em relação à temperatura ideal para a enzima em pH 7,0. Tabela 1: perfil de atividade de pH Palaeococcus ferrophilus | 2 | oo | LL 3 | oo | LL 8 | oo | a osg Tabela 2: perfil de estabilidade de pH (atividade residual após 2 horas a 37

O [5 utsstEo Palaeococcus ferrophilus LL 1 | oo | Lo n | oog |

Tabela 3: Perfil de atividade de temperatura a pH 9,0 Palaeococcus ferrophilus EL so JJ og |

[00320] Outras características para a Protease S8 1 de P. ferrophilus

[00321] Inibidor: PMSF.

[00322] Determinou-se que a sequência N-terminal se inicia na posição 101 da SEQ ID NO: 2.

[00323] A massa molecular relativa, como determinada por SDS- PAGE, foi aproximadamente M, = 37 kDa.

[00324] A massa molecular observada, determinada por análise de massa molecular intacta, foi 33544,3 Da

[00325] A massa molecular calculada a partir desta sequência madura foi 33541,8 Da. Exemplo 3. Uso da Protease S8 de Palaeococcus ferrophilus em um processo de etanol

[00326] A protease madura da invenção, aminoácidos 101-425 da SEQ ID NO: 2, foi testada para uso em um processo convencional de etanol em pasta de amido, incluindo uma etapa de liquefação seguida por sacarificação e fermentação simultâneas.

[00327] Liquefação: Foram preparadas dez pastas de milho inteiro moído, resíduo de destilaria fino e água corrente, para uma massa total de 120 g, visando 32,50% de sólidos secos (SS); o resíduo de destilaria fino foi misturado a 30% em massa de backset por massa de pasta. O pH da pasta inicial foi de aproximadamente 5,2 e foi ajustado para 5,0 com hidróxido de potássio a 45% m/v ou ácido sulfúrico a 40% v/v. Uma dose fixa de alfa- amilase BE369 (2,1 ug EP/gSS) e glucoamilase Po AMGA498 (4,5 ug EP/gSS)

foi aplicada a todas as pastas e foi combinada com a protease S8 de Thermococcus litoralis (TI) (SEQ ID NO: 9), divulgada em WO 2016/196202, ou protease S8 de Thermococcus thioreducens (Tt), divulgada aqui como SEQ ID NO: 10 e no pedido provisório US 62/425.655 ou protease S8 dos aminoácidos de P. ferrophilus (PL) 101-425 da SEQ ID NO: 2, a seguir, para avaliar o efeito do tratamento com protease durante a liquefação: Controle: Alfa-amilase + glucoamilase Alfa-amilase BE369 + glucoamilase PDoAMGA498 + 0,5 ug/gSS de Protease TI Alfa-amilase BE369 + glucoamilase PDAMGA498 + 1 ug/gSS de Protease TI Alfa-amilase BE369 + glucoamilase POAMGA498 + 3 ug/gSS de Protease TI Alfa-amilase BE369 + glucoamilase POAMGA498 + 0,5 ug/gSS de Protease Tt Alfa-amilase BE369 + glucoamilase POAMGA498 + 1 ug/gSS de Protease Tt Alfa-amilase BE369 + glucoamilase POAMGA498 + 3 ug/gSS de Protease Tt Alfa-amilase BE369 + glucoamilase PDPAMGA498 + 0,5 ug/gSS de Protease Pf Alfa-amilase BE369 + glucoamilase PPAMGA498 + 1 ug/gSS de Protease Pf Alfa-amilase BE369 + glucoamilase PPAMGA498 + 3 ug/gSS de Protease Pf

[00328] Água e enzimas foram adicionadas a cada recipiente e, em seguida, cada recipiente foi selado e bem misturado antes do carregamento no Labomat. Todas as amostras foram incubadas no Labomat programado para as seguintes condições: 5 ºC/min rampa de 15 minutos a 80 ºC, manter durante 1 minuto, rampa para 85 ºC a 1 ºC/min e manter durante 103 minutos, 40 rpm durante 30 segundos para a esquerda e 30 segundos para a direita. Uma vez concluída a liquefação, todos os recipientes foram resfriados em um banho de gelo durante, aproximadamente, 20 minutos antes de prosseguir com a fermentação.

[00329] Sacarificação e Fermentação Simultâneas (SFS): Foi adicionada penicilina a cada mosto para uma concentração final de 3 ppm e o pH foi ajustado para 5,0. Em seguida, partes deste mosto foram transferidas para tubos de ensaio. Todos os tubos de ensaio foram perfurados com um ponta de 1/64” para permitir a liberação de CO;. Foi adicionada ureia a metade dos tubos para uma concentração de 500 ppm. Além disso, sólidos equivalentes foram mantidos em todos os tratamentos através da adição de água, conforme necessário, para garantir que a ureia versus os mostos livres de ureia continham sólidos iguais. A fermentação foi iniciada através da adição de Glucoamilase X (0,60 AGU/gSS), água e levedura reidratada. À reidratação da levedura ocorreu misturando 5,5 g de ETHANOL RED'TY em 100 mL de água corrente a 32 ºC durante, pelo menos, 15 minutos e dosando 100 uL por tubo de ensaio.

[00330] Análise de HPLC: A análise por HPLC usou um Agilent 1100/1200 combinado com uma coluna de exclusão iônica Bio-Rad HPX- 87H (300 mm x 7,8 mm) e um cartucho protetor Bio-Rad Cation H. A fase móvel foi de ácido sulfúrico a 0,005 M e amostras processadas a uma taxa de fluxo de 0,6 mL/min, com temperaturas de coluna e detector de RI de 65 e 55 ºC, respectivamente. A amostragem da fermentação ocorreu após 54 horas, sacrificando 3 tubos por tratamento. Cada tubo foi processado por desativação com 50 uL de H3;SO, a 40% v/v, agitando em vórtex, centrifugando a 1460xg durante 10 minutos e filtrando através de um filtro Whatman PP de 0,45 pm. As amostras foram armazenadas a 4ºC antes e durante a análise por HPLC. O método quantificou os analitos usando padrões de calibração para DP4+, DP3, DP2, glicose, frutose, ácido acético, ácido lático, glicerol e etanol (% m/v). Uma calibração de quatro pontos, incluindo a origem, é usada para quantificação.

[00331] Os rendimentos de etanol obtidos são apresentados nas tabelas 4 e5 abaixo. Tabela 4. Etanol Final para fermentações com nitrogênio limitado (sem ureia) Controle + Ta | 168 | [Controle + Ta] 18 |

[Controle + Tt 3 Controle + PE [| 133518 | Tabela 5. Etanol Final para fermentações baseadas em ureia (500 ppm) Controle + TI 1 Controle + TI 3 Controle + Tt 0,5 Controle + Tt 1 Controle + Tt 3 (Controle + Pf 0,5 |iControle + Pf 1 Exemplo 4: Uso de protease S8 de Palaeococcus ferrophilus (PL) para produção de etanol

[00332] A protease madura da invenção, aminoácidos 101-425 da SEQ ID NO: 2 foi testado para uso em um processo convencional de etanol em pasta de amido, incluindo uma etapa de liquefação seguida de sacarificação e fermentação simultâneas.

[00333] Liquefação: Pastas de milho inteiro moído, resíduo de destilaria fino e água corrente foram preparadas para uma massa total de 120 g visando 32,50% de sólidos secos (SS); o resíduo de destilaria fino foi misturado a 30% em massa de backset por massa de pasta. O pH da pasta inicial foi de aproximadamente 5,2 e foi ajustado para 5,0 com hidróxido de potássio a 45% m/v ou ácido sulfúrico a 40% v/v. Uma dose fixa de alfa- amilase BE369 (2,1 ug EP/gSS) foi aplicada a todas as pastas e foi combinada com a protease S8 de Thermococcus litoralis (TI) (SEQ ID NO: 9), divulgada em WO 2016/196202, ou protease S8 de Thermococcus thioreducens (Tt), divulgada aqui como SEQ ID NO: 10 e pedido provisório US 62/425,655, ou protease S8 dos aminoácidos dePalaeococcus ferrophilus (PL) 101-425 da SEQ ID NO: 2, a seguir, para avaliar o efeito do tratamento com protease durante a liquefação: Controle: Alfa-amilase Alfa-amilase BE369 + 0,5 ug/gSS de Protease TI

Alfa-amilase BE369 + 1 ug/gSS de Protease TI Alfa-amilase BE369 + 3 ug/gSS de Protease TI Alfa-amilase BE369 + 15 ug/g SS de Protease TI Alfa-amilase BE369 + 0,5 ug/gSS de Protease Tt Alfa-amilase BE369 + 1 ug/gSS de Protease Tt Alfa-amilase BE369 + 3 ug/gSS de Protease Tt Alfa-amilase BE369 + 15 ug/gSS de Protease Tt Alfa-amilase BE369 + 0,5 ug/gSS de Protease Pf Alfa-amilase BE369 + 1 ug/gSS de Protease Pf Alfa-amilase BE369 + 3 ug/gSS de Protease Pf Alfa-amilase BE369 + 15 ug/gSS de Protease Pf

[00334] Água e enzimas foram adicionadas a cada recipiente e, em seguida, cada recipiente foi selado e bem misturado antes do carregamento no Labomat. Todas as amostras foram incubadas no Labomat programado para as seguintes condições: 5 ºC/min rampa de 15 minutos a 80 ºC, manter durante 1 minuto, rampa para 85 ºC a 1 ºC/min e manter durante 103 minutos, 40 rpm durante 30 segundos para a esquerda e 30 segundos para a direita. Uma vez concluída a liquefação, todos os recipientes foram resfriados em um banho de gelo durante, aproximadamente, 20 minutos antes de prosseguir com a fermentação.

[00335] Sacarificação e Fermentação Simultâneas (SFS): Foi adicionada penicilina a cada mosto para uma concentração final de 3 ppm e o pH foi ajustado para 5,0. Em seguida, partes deste mosto foram transferidas para tubos de ensaio. Todos os tubos de ensaio foram perfurados com um ponta de 1/64” para permitir a liberação de CO». Foi adicionada ureia a metade dos tubos para uma concentração de 500 ppm. Além disso, sólidos equivalentes foram mantidos em todos os tratamentos através da adição de água, conforme necessário, para garantir que a ureia versus os mostos livres de ureia continham sólidos iguais. A fermentação foi iniciada através da adição de Glucoamilase X (0,60 AGU/gSS), água e levedura reidratada. À reidratação da levedura ocorreu misturando 5,5 g de ETHANOL RED'Y em 100 mL de água corrente a 32 ºC durante, pelo menos, 15 minutos e dosando 100 uL por tubo de ensaio.

[00336] Análise de HPLC: A análise por HPLC usou um Agilent 1100/1200 combinado com uma coluna de exclusão iônica Bio-Rad HPX- 87H (300 mm x 7,8 mm) e um cartucho protetor Bio-Rad Cation H. A fase móvel foi de ácido sulfúrico a 0,005 M e amostras processadas a uma taxa de fluxo de 0,6 mL/min, com temperaturas de coluna e detector de RI de 65 e 55 ºC, respectivamente. A amostragem da fermentação ocorreu após 54 horas, sacrificando 3 tubos por tratamento. Cada tubo foi processado por desativação com 50 uL de H3SO, a 40% v/v, agitando em vórtex, centrifugando a 1460xg durante 10 minutos e filtrando através de um filtro Whatman PP de 0,45 pm. As amostras foram armazenadas a 4ºC antes e durante a análise por HPLC. O método quantificou os analitos usando padrões de calibração para DP4+, DP3, DP2, glicose, frutose, ácido acético, ácido lático, glicerol e etanol (% m/v). Uma calibração de quatro pontos, incluindo a origem, é usada para quantificação.

[00337] Os rendimentos de etanol obtidos são apresentados nas tabelas 6 e 7 abaixo. Tabela 6. Etanol Final para fermentações com nitrogênio limitado (sem ureia)

Tabela 7. Etanol Final para fermentações baseadas em ureia (500 ppm) BE369 + 1 Tt 1 BAT BE369 + 3 Tt 3 13,59 Exemplo 5: Uso de protease S8 protease de Palaeococcus ferrophilus (PL) para produção de etanol

[00338] A protease madura da invenção, aminoácidos 101-425 da SEQ ID NO: 2, foi testada para uso em um processo convencional de etanol em pasta de amido, incluindo uma etapa de liquefação seguida por sacarificação e fermentação simultâneas.

[00339] Liquefação: Pastas de milho inteiro moído, resíduo de destilaria fino e água corrente foram preparadas para uma massa total de 120 g visando 32,50% de sólidos secos (SS); o resíduo de destilaria fino foi misturado a 30% em massa de backset por massa de pasta. O pH da pasta inicial foi de aproximadamente 5,2 e foi ajustado para 5,0 com hidróxido de potássio a 45% m/v ou ácido sulfúrico a 40% v/v. Uma dose fixa de alfa- amilase BE369 (2,1 ug EP/gSS) foi aplicada a todas as pastas e foi combinada com protease S8 de Thermococcus litoralis (TI) (SEQ ID NO: 9), divulgada em WO 2016/196202, ou protease S8 de Thermococcus thioreducens (Tt), divulgada aqui como SEQ ID NO: 10 e em pedido provisório US 62/425,655, ou protease S8 dos aminoácidos dePalaeococcus ferrophilus 101-425 da SEQ ID NO: 2, a seguir, para avaliar o efeito do tratamento com protease durante a liquefação: Controle: Alfa-amilase Alfa-amilase BE369 + 0,5 ug/gSS de Protease TI

Alfa-amilase BE369 + 5,0 ug/gSS de Protease TI Alfa-amilase BE369 + 0,5 ug/gSS de Protease Tf Alfa-amilase BE369 + 5,0 ug/gSS de Protease Tf Alfa-amilase BE369 + 0,5 ug/gSS de Protease Pf Alfa-amilase BE369 + 5,0 ug/gSS de Protease Pf

[00340] Água e enzimas foram adicionadas a cada recipiente e, em seguida, cada recipiente foi selado e bem misturado antes do carregamento no Labomat. Todas as amostras foram incubadas no Labomat programado para as seguintes condições: 5 ºC/min rampa de 15 minutos a 80 ºC, manter durante 1 minuto, rampa para 85 ºC a 1 ºC/min e manter durante 103 minutos, 40 rpm durante 30 segundos para a esquerda e 30 segundos para a direita. Uma vez concluída a liquefação, todos os recipientes foram resfriados em um banho de gelo durante, aproximadamente, 20 minutos antes de prosseguir com a fermentação.

[00341] Sacarificação e Fermentação Simultâneas (SFS): Foi adicionada penicilina a cada mosto para uma concentração final de 3 ppm e o pH foi ajustado para 5,0. Em seguida, partes deste mosto foram transferidas para tubos de ensaio. Todos os tubos de ensaio foram perfurados com um ponta de 1/64” para permitir a liberação de CO;. Foi adicionada ureia a metade dos tubos para uma concentração de 500 ppm. Além disso, sólidos equivalentes foram mantidos em todos os tratamentos através da adição de água, conforme necessário, para garantir que a ureia versus os mostos livres de ureia continham sólidos iguais. A fermentação foi iniciada através da adição de Glucoamilase X (0,60 AGU/gSS), água e levedura reidratada. À reidratação da levedura ocorreu misturando 5,5 g de ETHANOL RED'Y em 100 mL de água corrente a 32 ºC durante, pelo menos, 15 minutos e dosando 100 uL por tubo de ensaio.

[00342] Análise de HPLC: A análise por HPLC usou um Agilent 1100/1200 combinado com uma coluna de exclusão iônica Bio-Rad HPX-

87H (300 mm x 7,8 mm) e um cartucho protetor Bio-Rad Cation H. A fase móvel foi de ácido sulfúrico a 0,005 M e amostras processadas a uma taxa de fluxo de 0,6 mL/min, com temperaturas de coluna e detector de RI de 65 e 55 ºC, respectivamente. A amostragem da fermentação ocorreu após 54 horas, sacrificando 3 tubos por tratamento. Cada tubo foi processado por desativação com 50 uL de H35SO, a 40% v/v, agitando em vórtex, centrifugando a 1460xg durante 10 minutos e filtrando através de um filtro Whatman PP de 0,45 pm. As amostras foram armazenadas a 4 ºC antes e durante a análise por HPLC. O método quantificou os analitos usando padrões de calibração para DP4+, DP3, DP2, glicose, frutose, ácido acético, ácido lático, glicerol e etanol (% m/v). Uma calibração de quatro pontos, incluindo a origem, é usada para quantificação.

[00343] Os rendimentos de etanol obtidos são apresentados nas tabelas abaixo. Tabela 8. Etanol Final para fermentações com nitrogênio limitado (sem ureia) BE nB | Tabela 9. Etanol Final para fermentações baseadas em ureia (500 ppm) BE BA | BE369 +5TI 5 BE369 + 0,5 Tt os BE369+5Tt 5 BE369 + 0,5 Pf 05 Exemplo 6: Uso de protease S8 protease de Palaeococcus ferrophilus (PL) para produção de etanol

[00344] A protease madura da invenção, aminoácidos 101-425 da SEQ ID NO: 2, foi testada para uso em um processo convencional de etanol em pasta de amido, incluindo uma etapa de liquefação seguida por sacarificação e fermentação simultâneas.

[00345] Liquefação: Pastas de milho inteiro moído, resíduo de destilaria fino e água corrente foram preparadas para uma massa total de 120 g visando 32,50% de sólidos secos (SS); O pH da pasta inicial foi de, aproximadamente, 5,8 e foi ajustado para 5,0 com ácido sulfúrico a 40% v/v. Uma dose fixa de Liquozima SC (0,02% m/m de milho) foi aplicada a todas as pastas e foi combinada com protease S8 de Thermococcus thioreducens (Tt), aqui divulgada como SEQ ID NO: 10 e em pedido provisório US 62/425,655 ou protease S8 dos aminoácidos de Palaeococcus ferrophilus (Pf) 101-425 da SEQ ID NO: 2, a seguir, para avaliar o efeito do tratamento com protease durante a liquefação: Controle: SS de Alfa-amilase Liquozima SC Alfa-amilase Liquozima SC + 5 ug/gSS de Protease Tt Alfa-amilase Liquozima SC + 5 ug/gSS de Protease Pf

[00346] Água e enzimas foram adicionadas a cada recipiente e, em seguida, cada recipiente foi selado e bem misturado antes do carregamento no Labomat. Todas as amostras foram incubadas no Labomat programado para as seguintes condições: 5º C/min Rampa, 15 minutos de Rampa para 80ºC, manter durante 1 min, Rampa para 85ºC a 1º C/min e manter durante 103 min, 40 rpm durante 30 segundos para a esquerda e 30 segundos para a direita. Uma vez concluída a liquefação, todos os recipientes foram resfriados em um banho de gelo durante, aproximadamente, 20 minutos antes de prosseguir com a fermentação.

[00347] Sacarificação e Fermentação Simultâneas (SFS): Foi adicionada penicilina a cada mosto para uma concentração final de 3 ppm e o pH foi ajustado para 5,0. Em seguida, partes deste mosto foram transferidas para tubos de ensaio. Todos os tubos de teste foram perfurados com uma ponta de 1/64” para permitir a liberação de CO;. Além disso, sólidos equivalentes foram mantidos em todos os tratamentos através da adição de água, conforme necessário, para garantir que os mostos continham sólidos iguais. A fermentação foi iniciada através da adição de Glucoamilase X (0,60 AGU/gSS), água e levedura reidratada. A reidratação da levedura ocorreu misturando 5,5 g de ETHANOL RED'Y em 100 mL de água corrente a 32 ºC durante, pelo menos, 15 minutos e dosando 100 uL por tubo de ensaio.

[00348] Análise de HPLC: A análise por HPLC usou um Agilent 1100/1200 combinado com uma coluna de exclusão iônica Bio-Rad HPX- 87H (300 mm x 7,8 mm) e um cartucho protetor Bio-Rad Cation H. A fase móvel foi de ácido sulfúrico a 0,005 M e amostras processadas a uma taxa de fluxo de 0,8 mL/min, com temperaturas de coluna e detector de RI de 65 e 55 ºC, respectivamente. À amostragem da fermentação ocorreu após 54 horas, sacrificando 5 tubos por tratamento. Cada tubo foi processado por desativação com 50 uL de H3;SO, a 40% v/v, agitando em vórtex, centrifugando a 1460xg durante 10 minutos e filtrando através de um filtro de nylon Whatman PP de 0,2 pm. As amostras foram armazenadas a 4ºC antes e durante a análise por HPLC. O método quantificou os analitos usando padrões de calibração para DP3, DP2, glicose, frutose, ácido acético, ácido lático, glicerol e etanol (% m/v). Uma calibração de quatro pontos, incluindo a origem, é usada para quantificação.

[00349] Os rendimentos de etanol obtidos são apresentados nas tabelas abaixo. Tabela 10. Etanol Final para fermentações com nitrogênio limitado (sem ureia)

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo com atividade de protease, caracterizado pelo fato de ser selecionado do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo com pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de estringência muito elevada com (1) a sequência codificante do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, (11) o complemento de comprimento total de (i) ou (il); (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo com pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1; (d) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b) ou (c), que tem atividade de protease

2. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo maduro consiste nos aminoácidos 101 a 425 da SEQ ID NO: 2.

3. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de que codifica o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2.

4. Construto de ácido nucleico, ou vetor de expressão recombinante, caracterizado pelo fato de compreender o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 3, operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle heterólogas, que direcionam a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.

5. Célula hospedeira recombinante caracterizada pelo fato de compreender o polinucleotídeo, como definido na reivindicação 3, operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle heterólogas, que direcionam a produção do polipeptídeo.

6. Método para a produção de um polipeptídeo com atividade de protease, caracterizado pelo fato de compreender (a) cultivar a célula hospedeira, como definida na reivindicação 5, sob condições favoráveis à produção do polipeptídeo e (b) recuperar, opcionalmente, o polipeptídeo.

7. Processo para liquefazer material contendo amido caracterizado pelo fato de compreender a liquefação do material contendo amido a uma temperatura superior à temperatura inicial de gelatinização na presença de, pelo menos, uma alfa-amilase e uma protease S8A de Palaeococcus ferrophilus.

8. Processo para produzir produtos de fermentação a partir de material contendo amido, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) liquefação do material contendo amido a uma temperatura superior à temperatura inicial de gelatinização na presença de pelo menos: - uma alfa-amilase; e - uma protease S8A de Palaeococcus ferrophilus; b) sacarificação usando uma glucoamilase; c) fermentação usando um organismo de fermentação.

9. Processo para recuperação de óleo de uma produção de produto de fermentação por um processo, como definido na reivindicação 8, caracterizado pelo fato de compreender ainda as etapas de: d) recuperação do produto de fermentação para formar um resíduo de destilaria inteiro; e) separação do resíduo de destilaria inteiro em resíduo de destilaria fino e bolo úmido; f) concentração opcional do resíduo de destilaria fino em xarope; em que o óleo é recuperado a partir de: - material liquefeito contendo amido após a etapa a) do processo, como definido na reivindicação 8; e/ou - jusante da etapa de fermentação c) do processo, como definido na reivindicação 8.

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que estão presentes e/ou são adicionadas, na liquefação, 1-50 microgramas, particularmente 2-40 microgramas, particularmente 4-25 microgramas, particularmente 5-20 microgramas de protease S8A de Palaeococcus ferrophilus por grama de SS.

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 8, 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que a protease de Palaeococcus FJerrophilus é selecionada entre: a) um polipeptídeo compreendendo ou consistindo nos aminoácidos 101 a 425 da SEQ ID NO: 2; ou b) um polipeptídeo com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com os aminoácidos 101 a 425 da SEQ ID NO: 2.

12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 8, 9, 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o produto de fermentação é um álcool, de preferência etanol, especialmente etanol combustível, etanol potável e/ou etanol industrial.

13. Composição enzimática caracterizada pelo fato de compreender uma protease S8A de Palaeococcus ferrophilus, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2.

14. Composição enzimática, de acordo com a reivindicação 13,

caracterizada pelo fato de compreender ainda uma alfa-amilase.

15. Uso de uma protease S8A de Palaeococcus ferrophilus, caracterizado pelo fato de ser na liquefação de material contendo amido.