KR20140081855A - 알파-아밀라아제 변이체 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 - Google Patents

알파-아밀라아제 변이체 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알파-아밀라아제 변이체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 작제물, 벡터 및 숙주 세포; 및 변이체의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

알파-아밀라아제 변이체 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드{ALPHA-AMYLASE VARIANTS AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING SAME}
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 본 명세서에 참조로 포함되는 컴퓨터로 판독가능한 형태의 서열 목록을 포함한다.
기술 분야
본 발명은 알파-아밀라아제 변이체, 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 변이체의 생성 방법 및 변이체의 이용 방법에 관한 것이다.
알파-아밀라아제(E.C. 3.2.1.1)는 전분, 글리코겐, 및 관련 다당류 및 올리고당류의 가수분해를 촉매작용시키는 효소의 군을 이룬다.
알파-아밀라아제는 전분 가공의 초기 단계(예를 들어, 액화); 습식 제분 공정; 및 탄수화물원으로부터의 알콜 제조에서와 같이 다양한 목적을 위해 상업적으로 이용된다. 이들은 또한 세제 매트릭스에서의 세정제 또는 보조제(adjunct)로서; 전분 호발(desizing)을 위해 직물 산업에서; 베이킹 응용에서; 음료 산업에서; 드릴링 공정(drilling process)에서의 유전에서; 예를 들어 종이 탈묵을 위한 재활용 공정에서; 그리고 동물 사료에서 이용된다.
예를 들어, 전분 액화를 위한 몇몇 상업적 알파-아밀라아제는 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) 또는 바실러스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus)에서 비롯된다. 야생형 효소의 단백질 조작 변이체가 공정 문제를 극복하기 위하여 개발되었다. 그렇지만, 개선된 특성, 예를 들어, 낮은 pH, 저 칼슘 및 고온에서 보다 높은 안정성을 지니는 신규한 알파-아밀라아제가 여전히 필요하다. 이러한 효소는 전분 액화 공정이 감소된 pH에서 시행되게 할 것이며, 이는 화학물질 절약에 대해 긍정적인 영향을 갖는다.
낮은 pH 및/또는 고온에서, 특히 저 칼슘 농도에서 증가된 안정성을 갖는 신규한 알파-아밀라아제 변이체를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
발명의 요약
본 발명자들은 SEQ ID NO: 1의 위치 15, 48, 49, 50, 107, 116, 133, 138, 156, 176, 181, 187, 188, 190, 197, 201, 205, 209, 213, 239, 241, 255, 264, 299, 360, 375, 416, 437, 474 및 475에 상응하는 1개 이상의 위치에서의 치환과 조합된 위치 185에 상응하는 위치에서의 프롤린으로의 치환을 포함하는 알파-아밀라아제 변이체가 낮은 pH 및/또는 고온, 특히 저 칼슘 농도에서 증가된 안정성을 갖는 것을 관찰하였다.
이에 따라, 본 발명은 SEQ ID NO: 1의 위치 185에 상응하는 위치에서의 프롤린으로의 치환을 포함하고, SEQ ID NO: 1의 위치 15, 48, 49, 50, 107, 116, 133, 138, 156, 176, 181, 187, 188, 190, 197, 201, 205, 209, 213, 239, 241, 255, 264, 299, 360, 375, 416, 437, 474 및 475에 상응하는 1개 이상의 위치에서의 치환을 더 포함하는 알파-아밀라아제 변이체에 관한 것이며, 여기서, 변이체는 (i) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 중 임의의 것의 성숙 폴리펩티드, 또는 (ii) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 3의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 4의 아미노산 1 내지 482, SEQ ID NO: 5의 아미노산 1 내지 484, SEQ ID NO: 6의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 7의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 8의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 9의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 11의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 12의 아미노산 1 내지 480, SEQ ID NO: 13의 아미노산 1 내지 483 또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 1 내지 481에 대하여 적어도 60% 및 100% 미만의 서열 동일성을 가지며, 상기 변이체는 알파-아밀라아제 활성을 갖는다.
본 발명은 또한 변이체를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드; 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 작제물(construct), 벡터 및 숙주 세포; 및 변이체의 생성 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 변이체의 용도, 및 액화 전분의 생성 방법 및 발효 산물의 생성 방법에 관한 것이다.
도 1은 하기의 아미노산 서열을 지니는 알파-아밀라아제의 정렬을 보여준다:
SEQ ID NO: 1은 바실러스 리케니포르미스 알파-아밀라아제이다.
SEQ ID NO: 2는 바실러스 스테아로써모필루스 알파-아밀라아제이다.
SEQ ID NO: 3은 문헌[J. Appl. Microbiology, 1997, 82: 325-334 (SWALL:q59222)]에 기술된 바실러스 알파-아밀라아제 TS-23이다.
SEQ ID NO: 4는 WO 2005/001064호에 기술된 바실러스 플라보써무스(Bacillus flavothermus) 알파-아밀라아제 AMY1048이다.
SEQ ID NO: 5는 WO 04/113511호에 SEQ ID NO: 21로 기술된 바실러스 알파-아밀라아제 TS-22이다.
SEQ ID NO: 6은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 알파-아밀라아제이다.
SEQ ID NO: 7은 WO 95/26397호에 SEQ ID NO: 1로 기술된 바실러스 알칼리성 종 SP690 아밀라아제이다.
SEQ ID NO: 8은 WO 95/26397호에 SEQ ID NO: 2로 기술된 바실러스 할마팔루스(Bacillus halmapalus) 알파-아밀라아제이다.
SEQ ID NO: 9는 WO 00/60060호에 SEQ ID NO: 4로 기술된 바실러스 알칼리성 종 AA560 아밀라아제이다.
SEQ ID NO: 10은 WO200210356호에 SEQ ID NO: 2로 기술된 바실러스 알칼리성 종 A 7-7 아밀라아제이다.
SEQ ID NO: 11은 문헌[Tsukamoto et al., 1988, Biochem. Biophys. Res. Commun. 151: 25-33]에 기술된 바실러스 알칼리성 종 SP707 아밀라아제이다.
SEQ ID NO: 12는 EP 1022334호에 SEQ ID NO: 2로 기술된 바실러스 알칼리성 종 K-38 아밀라아제이다.
SEQ ID NO: 13은 문헌[Lee et al, 2006, J. Biochem, 139: 997-1005]에 기술된 바실러스 리케니포르미스 알파-아밀라아제이다.
SEQ ID NO: 14는 예를 들어, WO 2002/010355호에 이전에 개시된 알파-아밀라아제 변이체 LE399이다.
정의
대립형질 변이체: 용어 "대립형질 변이체"는 동일한 염색체 로커스(locus)를 차지하는 유전자의 둘 이상의 대안적 형태 중 임의의 형태를 의미한다. 대립형질 변이는 돌연변이를 통해 자연적으로 발생하며, 모집단 내 다형성을 초래할 수 있다. 유전자 돌연변이는 침묵(암호화된 폴리펩티드에서 변화 없음)일 수 있거나 변경된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 폴리펩티드의 대립형질 변이체는 유전자의 대립형질 변이체에 의해 암호화되는 폴리펩티드이다.
알파-아밀라아제: 알파-아밀라아제(E.C. 3.2.1.1)는 전분 및 그 밖의 선형 및 분지형 1,4 글루코시드 올리고당류 및 다당류의 가수분해를 촉매작용시키는 효소의 군이다. 통상의 기술자는 알파-아밀라아제 활성을 결정하는 방법을 알 것이다. 이는 실시예에 기재된 절차에 따라, 예를 들어, PNP-G7 검정에 의해 결정될 수 있다. 일 양태에서, 본 발명의 변이체는 SEQ ID NO: 1의 성숙 폴리펩티드의 알파-아밀라아제 활성의 적어도 20%, 예를 들어, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 100%를 갖는다. 다른 양태에서, 본 출원의 변이체는 그의 모체(parent)의 알파-아밀라아제 활성의 적어도 20%, 예를 들어, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 100%를 갖는다.
cDNA: 용어 "cDNA"는 진핵 또는 원핵 세포로부터 획득한 스플라이스된 성숙 mRNA 분자로부터 역전사에 의해 제조될 수 있는 DNA 분자를 의미한다. cDNA는 대응하는 게놈 DNA에 존재할 수 있는 인트론 서열이 없다. 초기의 일차 RNA 전사체는 스플라이스된 성숙 mRNA로 나타나기 전에 스플라이싱을 포함하는 일련의 단계들을 통해 처리되는 mRNA에 대한 전구체이다.
암호화 서열: 용어 "암호화 서열"은 폴리뉴클레오티드를 의미하며, 이는 변이체의 아미노산 서열을 직접 명시한다. 암호화 서열의 경계는 일반적으로 오픈 리딩 프레임(open reading frame)에 의해 결정되며, 이는 ATG, GTG 또는 TTG와 같은 출발 코돈으로 시작되어 TAA, TAG 또는 TGA와 같은 종결 코돈으로 종결된다. 암호화 서열은 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 또는 그들의 조합일 수 있다.
제어 서열: 용어 "제어 서열"은 본 발명의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 필요한 핵산 서열을 의미한다. 각 제어 서열은 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대해 고유(native)(즉, 동일한 유전자 유래) 또는 외래(즉, 상이한 유전자 유래)이거나, 서로 고유 또는 외래일 수 있다. 이러한 제어 서열은, 제한되는 것은 아니지만, 리더(leader), 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 프로모터, 신호 펩티드 서열 및 전사 종결자를 포함한다. 최소한으로, 제어 서열은 프로모터, 및 전사 및 번역 종결 신호를 포함한다. 제어 서열은 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 암호화 영역과 제어 서열의 라이게이션(ligation)을 가능하게 하는 특이적 제한 부위를 도입하는 목적을 위한 링커와 함께 제공될 수 있다.
발현: 용어 "발현"은 제한되는 것은 아니지만, 전사, 전사-후 변형, 번역, 번역-후 변형 및 분비를 포함하는 변이체의 생성에 수반되는 임의의 단계를 포함한다.
발현 벡터: 용어 "발현 벡터"는 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 그것의 발현을 가능하게 하는 제어 서열에 작동가능하게 연결되는 선형 또는 원형 DNA 분자를 의미한다.
단편: 용어 "단편"은 성숙 폴리펩티드의 아미노 및/또는 카르복실 말단이 없는 1개 이상의(예를 들어, 몇몇의) 아미노산을 갖는 폴리펩티드를 의미하며; 여기서, 단편은 알파-아밀라아제 활성을 갖는다. 일 양태에서, 단편은 300개 이상의 아미노산 잔기, 350개 이상의 아미노산 잔기, 400개 이상의 아미노산 잔기, 450개 이상의 아미노산 잔기, 470개 이상의 아미노산 잔기 또는 480개 이상의 아미노산 잔기를 함유한다.
숙주 세포: 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 작제물 또는 발현 벡터가 형질전환, 트랜스펙션, 형질도입되기 쉬운 등등의 임의의 세포 유형을 의미한다. 용어 "숙주 세포"는 복제 동안 일어나는 돌연변이에 기인하여 모 세포와 동일하지 않은 모 세포의 임의의 자손을 포함한다.
단리된: 용어 "단리된"은 자연에서 발생하지 않는 형태 또는 환경에서의 물질을 의미한다. 단리된 물질의 비제한적인 예는 (1) 임의의 비자연 발생 물질; (2) 자연에서 회합되어 있는 자연 발생 성분 중 1개 이상 또는 모두로부터 적어도 부분적으로 떨어져 있는, 비제한적으로 임의의 효소, 변이체, 핵산, 단백질, 펩티드 또는 보조인자를 포함하는 임의의 물질; (3) 자연에서 관찰되는 물질에 비해 사람이 손을 대어 변형된 임의의 물질; 또는 (4) 자연에서 회합되어 있는 다른 성분에 비해 물질의 양을 증가시킴으로써 변형된 임의의 물질(예를 들어, 물질을 암호화하는 다수의 카피(copy)의 유전자; 물질을 암호화하는 유전자와 자연에서 회합되어 있는 프로모터보다 더 강력한 프로모터의 이용)을 포함한다. 단리된 물질이 발효 브로쓰 시료에 존재할 수 있다.
성숙 폴리펩티드: 용어 "성숙 폴리펩티드"는 번역 및 임의의 번역-후 변형, 예를 들어, N-말단 프로세싱, C-말단 절단, 글리코실화, 인산화 등 이후의 그의 최종 형태의 폴리펩티드를 의미한다. 숙주 세포가 동일한 폴리뉴클레오티드에 의해 발현되는 둘 이상의 상이한 성숙 폴리펩티드(즉, 상이한 C-말단 및/또는 N-말단 아미노산을 지님)의 혼합물을 생성할 수 있는 것이 본 발명이 속하는 분야에 알려져 있다. 몇몇 알파-아밀라아제, 예를 들어, 몇몇 박테리아 알파-아밀라아제의 성숙 형태는 기질 가수분해를 위한 활성 부위를 포함하는 촉매 도메인 및 탄수화물 기질(전분)로의 결합을 위한 1개 이상의 탄수화물-결합 모듈(CBM), 및 임의로 CBM(들)을 촉매 도메인에 연결하는 폴리펩티드를 포함하며, 후자 유형의 영역은 보통 "링커"로 표기된다.
핵산 작제물: 용어 "핵산 작제물"은 자연 발생 유전자로부터 단리되거나 또는 그 밖에 자연에서 존재 하지 않는 방식으로 핵산의 세그먼트를 함유하도록 변형된, 또는 1개 이상의 제어 서열을 포함하는 합성인 단일- 또는 이중-가닥의 핵산 분자를 의미한다.
작동가능하게 연결된: 용어 "작동가능하게 연결된"은 제어 서열이 폴리뉴클레오티드의 암호화 서열에 대한 적절한 위치에 배치되어 제어 서열이 암호화 서열의 발현을 지시하게 하는 구성을 의미한다.
모체 또는 모 알파-아밀라아제: 용어 "모체" 또는 "모 알파-아밀라아제"는 본 발명의 효소 변이체를 생성하도록 변경이 이루어지는 알파-아밀라아제를 의미한다. 모체는 자연 발생(야생형) 폴리펩티드 또는 그의 변이체 또는 단편일 수 있다.
서열 동일성: 2개의 아미노산 서열 간의 또는 2개의 뉴클레오티드 서열 간의 관계는 파라미터 "서열 동일성"에 의해 기술된다.
본 발명의 목적을 위해, 2개의 아미노산 서열 간의 서열 동일성은 EMBOSS 패키지의 Needle 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 문헌[Rice et al., 2000, Trends Genet. 16:276-277])에서 구현되는 바와 같이 Needleman-Wunsch 알고리즘(문헌[Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453]), 바람직하게는 버전 5.0.0 또는 그 이후를 사용하여 결정된다. 사용되는 파라미터는 10의 갭 오픈 페널티, 0.5의 갭 연장 페널티 및 EBLOSUM62(BLOSUM62의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. "가장 긴 동일성"(nobrief 옵션을 사용하여 획득) 표시된 Needle의 출력은 동일성 백분율로 사용되고 하기와 같이 계산된다:
(동일한 잔기 × 100)/(정렬 길이 - 정렬 내의 갭의 총 수).
변이체: 용어 "변이체"는 1개 이상의(예를 들어, 몇몇의) 위치에서의 변경, 즉, 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함하는 알파-아밀라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 치환은 소정의 위치를 차지하는 아미노산의 상이한 아미노산으로의 대체를 의미하며; 결실은 소정의 위치를 차지하는 아미노산의 제거를 의미하고; 삽입은 소정의 위치를 차지하는 아미노산에 인접한 1개 이상의(예를 들어, 몇몇의) 아미노산, 예를 들어, 1 내지 5개의 아미노산의 부가를 의미한다. 일 양태에서, 본 발명의 변이체는 SEQ ID NO: 1의 성숙 폴리펩티드의 알파-아밀라아제 활성의 적어도 20%, 예를 들어, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 100%를 갖는다. 다른 양태에서, 본 출원의 변이체는 그의 모체의 알파-아밀라아제 활성의 적어도 20%, 예를 들어, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 100%를 갖는다. 알파-아밀라아제 활성은 실시예에 기재된 PNP-G7 검정에 의해 결정될 수 있다.
야생형 알파-아밀라아제: 용어 "야생형" 알파-아밀라아제는 자연 발생 미생물, 예를 들어, 자연에서 관찰되는 박테리아, 효모 또는 사상 진균에 의해 발현되는 알파-아밀라아제를 의미한다.
변이체의 표기를 위한 관례
본 발명의 목적을 위해, SEQ ID NO: 1에 개시된 성숙 폴리펩티드를 사용하여 다른 알파-아밀라아제에서의 상응하는 아미노산 잔기를 결정한다. 다른 알파-아밀라아제의 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 1에 개시된 성숙 폴리펩티드와 정렬하고, 정렬에 기초하여, SEQ ID NO: 1에 개시된 성숙 폴리펩티드에서의 임의의 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 위치 개수는 EMBOSS 패키지의 Needle 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 문헌[Rice et al., 2000, Trends Genet. 16:276-277])에서 구현되는 바와 같이 Needleman-Wunsch 알고리즘(문헌[Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453]), 바람직하게는 버전 5.0.0 또는 그 이후를 사용하여 결정된다. 사용되는 파라미터는 10의 갭 오픈 페널티, 0.5의 갭 연장 페널티 및 EBLOSUM62(BLOSUM62의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다.
다른 알파-아밀라아제에서의 상응하는 아미노산 잔기의 확인은 비제한적으로 그들 각각의 디폴트 파라미터를 사용하는 MUSCLE(multiple sequence comparison by log-expectation; 버전 3.5 또는 그 이후; 문헌[Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797]), MAFFT(버전 6.857 또는 그 이후; 문헌[Katoh and Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066]; 문헌[Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518]; 문헌[Katoh and Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374]; 문헌[Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64]; 문헌[Katoh and Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900]) 및 ClustalW를 사용하는 EMBOSS EMMA(1.83 또는 그 이후; 문헌[Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680])를 포함하는 몇몇 컴퓨터 프로그램을 사용한 다중 폴리펩티드 서열의 정렬에 의해 결정될 수 있다.
그 밖의 효소가 SEQ ID NO: 1의 성숙 폴리펩티드로부터 벗어나서, 종래의 서열 기반의 비교로 그들의 관계를 검출하지 못하게 되는 경우(문헌[Lindahl and Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615]), 그 밖의 쌍별 서열 비교 알고리즘이 사용될 수 있다. 서열 기반의 검색에서 보다 큰 감수성은 데이터베이스를 검색하기 위한 폴리펩티드 패밀리(프로파일)의 확률론적 표시를 이용하는 검색 프로그램을 사용하여 얻어질 수 있다. 예를 들어, PSI-BLAST 프로그램은 반복적인 데이터베이스 검색 과정을 통하여 프로파일을 산출하고 원거리 상동체를 검출할 수 있다(문헌[Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402]). 폴리펩티드에 대한 패밀리 또는 슈퍼패밀리가 단백질 구조 데이터베이스에서 1개 이상의 표시를 가진다면 훨씬 더 큰 민감성이 달성될 수 있다. GenTHREADER(문헌[Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815]; 문헌[McGuffin and Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881])와 같은 프로그램은 질의 서열(query sequence)에 대한 구조적 폴딩을 예측하는 신경망에 대한 입력으로서 다양한 공급원(PSI-BLAST, 2차 구조 예측, 구조정렬 프로파일 및 용매화 포텐셜)으로부터의 정보를 이용한다. 유사하게는 문헌[Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919]의 방법은 알려지지 않은 구조의 서열과 SCOP 데이터베이스에 존재 하는 슈퍼패밀리 모델을 정렬하기 위해 사용될 수 있다. 이들 정렬은 폴리펩티드에 대한 상동성 모델을 생성하기 위해 차례로 사용될 수 있고, 이러한 모델은 그 목적을 위해 개발된 다양한 툴을 사용하여 정확성에 대해 평가될 수 있다.
공지된 구조의 단백질에 대해, 몇몇의 툴 및 리소스가 구조적 정렬을 검색하고 만들어내는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 단백질의 SCOP 슈퍼패밀리는 구조적으로 정렬되었고, 이 정렬은 접근가능하며 다운로드가능하다. 둘 이상의 단백질 구조는 거리 정렬 매트릭스(문헌[Holm and Sander, 1998, Proteins 33: 88-96]) 또는 조합 확장(문헌[Shindyalov and Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747])과 같은 다양한 알고리즘을 사용하여 정렬될 수 있고, 이들 알고리즘의 구현은 가능한 구조적 상동체을 발견하기 위해 대상 구조를 가지는 구조 데이터베이스를 질의하기 위해 추가적으로 이용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Holm and Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567]).
본 발명의 변이체의 기재에 있어서, 하기에 기재된 명명법이 참조의 용이성을 위해 채용된다. 용인된 IUPAC 1-문자 또는 3-문자 아미노산 약어가 사용된다.
치환. 아미노산 치환을 위해, 하기 명명법이 사용된다: 원래 아미노산, 위치, 치환된 아미노산. 따라서 위치 226의 트레오닌의 알라닌으로의 치환은 "Thr226Ala" 또는 "T226A"로서 표기된다. 다수의 돌연변이가 부가 표시("+")에 의해 분리되며, 예를 들어, "Gly205Arg+Ser411Phe" 또는 "G205R+S411F"는 각각 위치 205 및 411에서 글리신(G)의 아르기닌(R)으로의, 그리고 세린(S)의 페닐알라닌(F)으로의 치환을 나타낸다. 본 출원의 실시예에서, 다수의 돌연변이가 간격에 의해 분리되며, 예를 들어, G205R S411F는 G205R+S411F를 나타낸다.
결실. 아미노산 결실을 위해 하기의 명명법이 사용된다: 원래 아미노산, 위치, *. 따라서, 위치 195에서 글리신의 결실은 "Gly195*" 또는 "G195*"로 표기된다. 다수의 결실은 부가 표시("+")에 의해 분리되며, 예를 들어, "Gly195*+Ser411*" 또는 "G195*+S411*"이다.
삽입. 아미노산 삽입을 위하여, 하기의 명명법이 사용된다: 원래 아미노산, 위치, 원래 아미노산, 삽입 아미노산. 따라서, 위치 195에서 글리신 뒤의 라이신의 삽입은 "Gly195GlyLys" 또는 "G195GK"로 표기된다. 다수 아미노산의 삽입은 [원래 아미노산, 위치, 원래 아미노산, 삽입 아미노산 #1, 삽입 아미노산 #2 등]으로 표기된다. 예를 들어, 위치 195에서 글리신 뒤의 라이신 및 알라닌의 삽입은 "Gly195GlyLysAla" 또는 "G195GKA"로 표기된다.
이러한 경우, 삽입 아미노산 잔기(들)는 삽입 아미노산 잔기(들) 앞의 아미노산 잔기의 위치 번호에 대한 소문자의 부가에 의해 넘버링된다. 이에 따라, 상기 예에서, 서열은 하기와 같을 것이다:
Figure pct00001
다수의 변경. 다수의 변경을 포함하는 변이체는 부가 표시("+")에 의해 분리되며, 예를 들어, "Arg170Tyr+Gly195Glu" 또는 "R170Y+G195E"는 각각 위치 170 및 195에서 아르기닌 및 글리신의 티로신 및 글루탐산으로의 치환을 나타낸다.
상이한 변경. 상이한 변경이 소정의 위치에 도입될 수 있는 경우, 상이한 변경은 컴마에 의해 분리되며, 예를 들어, "Arg170Tyr,Glu"는 위치 170에서 아르기닌의 티로신 또는 글루탐산으로의 치환을 나타낸다. 따라서, "Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala"는 하기의 변이체를 지정한다:
"Tyr167Gly+Arg170Gly", "Tyr167Gly+Arg170Ala", "Tyr167Ala+Arg170Gly" 및 "Tyr167Ala+Arg170Ala".
발명의 상세한 설명
본 발명은 SEQ ID NO: 1의 위치 185에 상응하는 위치에서의 프롤린으로의 치환을 포함하고, SEQ ID NO: 1의 위치 15, 48, 49, 50, 107, 116, 133, 138, 156, 176, 181, 187, 188, 190, 197, 201, 205, 209, 213, 239, 241, 255, 264, 299, 360, 375, 416, 437, 474 및 475에 상응하는 1개 이상의 위치에서의 치환을 더 포함하는 알파-아밀라아제 변이체에 관한 것이며, 여기서, 변이체는 (i) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 중 임의의 것의 성숙 폴리펩티드, 또는 (ii) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 3의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 4의 아미노산 1 내지 482, SEQ ID NO: 5의 아미노산 1 내지 484, SEQ ID NO: 6의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 7의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 8의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 9의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 11의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 12의 아미노산 1 내지 480, SEQ ID NO: 13의 아미노산 1 내지 483 또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 1 내지 481에 대하여 적어도 60% 및 100% 미만의 서열 동일성을 가지며, 변이체는 알파-아밀라아제 활성을 갖는다.
바람직하게는, 변이체는 단리된다.
변이체
본 발명은 SEQ ID NO: 1의 위치 185에 상응하는 위치에서의 프롤린으로의 치환을 포함하는 알파-아밀라아제 변이체를 제공한다.
변이체는 SEQ ID NO: 1의 위치 15, 48, 49, 50, 107, 116, 133, 138, 156, 176, 181, 187, 188, 190, 197, 201, 205, 209, 213, 239, 241, 255, 264, 299, 360, 375, 416, 437, 474 및 475에 상응하는 1개 이상의(예를 들어, 몇몇의) 위치에서의 치환을 더 포함한다.
변이체는 위치 185에 상응하는 위치에서의 Pro으로의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 15에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Leu, Ser 또는 Thr으로의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 48에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Ala으로의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 49에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Gly, His, Ile 또는 Leu으로의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 50에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Thr으로의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 107에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Ala으로의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 116에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Gly으로의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 133에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Tyr으로의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 138에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Tyr 또는 Val, 특히 Phe 또는 Tyr으로의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 156에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Tyr으로의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 176에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Leu으로의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 181에 상응하는 위치에서의 Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Asp, Glu 또는 Thr으로의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 187에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Asp으로의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 188에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Ser 또는 Thr으로의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 190에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Phe으로의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 197에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Ile, Leu, Ser, Thr 또는 Val으로의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 201에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Phe 또는 Tyr으로의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 205에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Tyr으로의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 209에 상응하는 위치에서의 Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Val으로의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 213에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Thr으로의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 239에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Ala, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu 또는 Met으로의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 241에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Asp으로의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 255에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Gly 또는 Pro으로의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 264에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Ser으로의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 299에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Arg으로의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 360에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Ser으로의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 375에 상응하는 위치에서의 Ala, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Gly 또는 Val으로의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 416에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Val으로의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 437에 상응하는 위치에서의 Ala, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Trp으로의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 474에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Arg, Gln, Glu 또는 Lys으로의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 475에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Arg, Gln, Glu 또는 Lys으로의 치환을 포함한다.
변이체는 (i) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 중 임의의 것의 성숙 폴리펩티드, 또는 (ii) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 3의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 4의 아미노산 1 내지 482, SEQ ID NO: 5의 아미노산 1 내지 484, SEQ ID NO: 6의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 7의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 8의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 9의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 11의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 12의 아미노산 1 내지 480, SEQ ID NO: 13의 아미노산 1 내지 483 또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 1 내지 481에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는다.
바람직한 구현예에서, 변이체는 (i) SEQ ID NO: 1의 성숙 폴리펩티드, 또는 (ii) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 483에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는다.
일 구현예에서, 변이체는 (i) SEQ ID NO: 2의 성숙 폴리펩티드, (ii) I181*+G182* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 2의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 483, 또는 (iv) I181*+G182* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 483에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는다.
다른 구현예에서, 변이체는 (i) SEQ ID NO: 3의 성숙 폴리펩티드, (ii) T183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 3의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1 내지 485, 또는 (iv) T183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 1 내지 485에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는다.
다른 구현예에서, 변이체는 (i) SEQ ID NO: 4의 성숙 폴리펩티드, (ii) T180*+G181* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 4의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 4의 아미노산 1 내지 482, 또는 (iv) T180*+G181* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 1 내지 482에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는다.
다른 구현예에서, 변이체는 (i) SEQ ID NO: 5의 성숙 폴리펩티드, (ii) T182*+G183* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 5의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 5의 아미노산 1 내지 484, 또는 (iv) T182*+G183* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 1 내지 484에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는다.
다른 구현예에서, 변이체는 (i) SEQ ID NO: 6의 성숙 폴리펩티드, (ii) E178*+G179* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 6의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 6의 아미노산 1 내지 483, 또는 (iv) E178*+G179* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 1 내지 483에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는다.
다른 구현예에서, 변이체는 (i) SEQ ID NO: 7의 성숙 폴리펩티드, (ii) T183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 7의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 7의 아미노산 1 내지 485, 또는 (iv) T183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 7의 아미노산 1 내지 485에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는다.
다른 구현예에서, 변이체는 (i) SEQ ID NO: 8의 성숙 폴리펩티드, (ii) D183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 8의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 8의 아미노산 1 내지 485, 또는 (iv) D183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 1 내지 485에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는다.
다른 구현예에서, 변이체는 (i) SEQ ID NO: 9의 성숙 폴리펩티드, (ii) D183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 9의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 9의 아미노산 1 내지 485, 또는 (iv) D183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 9의 아미노산 1 내지 485에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는다.
다른 구현예에서, 변이체는 (i) SEQ ID NO: 10의 성숙 폴리펩티드, (ii) D183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 10의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 485, 또는 (iv) D183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 485에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는다.
다른 구현예에서, 변이체는 (i) SEQ ID NO: 11의 성숙 폴리펩티드, (ii) H183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 11의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 11의 아미노산 1 내지 485, 또는 (iv) H183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 1 내지 485에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는다.
다른 구현예에서, 변이체는 (i) SEQ ID NO: 12의 성숙 폴리펩티드, 또는 (ii) SEQ ID NO: 12의 아미노산 1 내지 480에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는다.
다른 구현예에서, 변이체는 (i) SEQ ID NO: 13의 성숙 폴리펩티드, 또는 (ii) SEQ ID NO: 13의 아미노산 1 내지 483에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는다.
다른 바람직한 구현예에서, 변이체는 (i) SEQ ID NO: 14의 성숙 폴리펩티드, 또는 (ii) SEQ ID NO: 14의 아미노산 1 내지 481에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는다.
본 발명의 변이체는 위치 185에서의 프롤린으로의 치환을 포함한다. 추가로, 변이체는 SEQ ID NO: 1의 위치 15, 48, 49, 50, 107, 116, 133, 138, 156, 176, 181, 187, 188, 190, 197, 201, 205, 209, 213, 239, 241, 255, 264, 299, 360, 375, 416, 437, 474 및 475에 상응하는 하나 이상의(예를 들어, 몇몇의) 위치에서의 치환을 포함한다. 일 구현예에서, 변이체는 위치 15, 48, 49, 50, 107, 116, 133, 138, 156, 176, 181, 187, 188, 190, 197, 201, 205, 209, 213, 239, 241, 255, 264, 299, 360, 375, 416, 437, 474 및 475 중 임의의 위치에 상응하는 1개의 위치에서의 치환을 포함한다. 다른 구현예에서, 변이체는 위치 15, 48, 49, 50, 107, 116, 133, 138, 156, 176, 181, 187, 188, 190, 197, 201, 205, 209, 213, 239, 241, 255, 264, 299, 360, 375, 416, 437, 474 및 475 중 임의의 위치에 상응하는 2개의 위치에서의 치환을 포함한다. 다른 구현예에서, 변이체는 위치 15, 48, 49, 50, 107, 116, 133, 138, 156, 176, 181, 187, 188, 190, 197, 201, 205, 209, 213, 239, 241, 255, 264, 299, 360, 375, 416, 437, 474 및 475 중 임의의 위치에 상응하는 3개의 위치에서의 치환을 포함한다. 다른 구현예에서, 변이체는 위치 15, 48, 49, 50, 107, 116, 133, 138, 156, 176, 181, 187, 188, 190, 197, 201, 205, 209, 213, 239, 241, 255, 264, 299, 360, 375, 416, 437, 474 및 475에 상응하는 4개의 위치에서의 치환을 포함한다. 다른 구현예에서, 변이체는 위치 15, 48, 49, 50, 107, 116, 133, 138, 156, 176, 181, 187, 188, 190, 197, 201, 205, 209, 213, 239, 241, 255, 264, 299, 360, 375, 416, 437, 474 및 475에 상응하는 4개 초과, 예를 들어, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 위치에서의 치환을 포함한다. 다른 구현예에서, 변이체는 위치 15, 48, 49, 50, 107, 116, 133, 138, 156, 176, 181, 187, 188, 190, 197, 201, 205, 209, 213, 239, 241, 255, 264, 299, 360, 375, 416, 437, 474 및 475에 상응하는 10개 초과의 위치, 예를 들어, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개의 위치에서의 치환을 포함한다.
본 발명의 변이체는 E185P 치환을 포함한다. 일 구현예에서, 변이체는 M15T, M15S, M15L, G48A, T49H, T49G, T49L, T49I, S50T, G107A, T116G, H133Y, W138Y, W138F, H156Y, K176L, A181T, A181E, A181D, S187D, N188S, N188T, N190F, M197S, M197T, M197V, M197L, M197I, I201Y, I201F, H205Y, A209V, K213T, S239Q, S239E, S239N, S239D, S239A, S239M, S239C, L241D, E255P, E255G, Q264S, G299R, Q360S, R375V, R375G, D416V, R437W, G474K, G474R, G474E, G474Q, G475K, G475R, G475E 및 G475Q로 구성된 군으로부터 선택되는 1개 이상의 치환을 더 포함한다.
바람직한 구현예에서, 변이체는 위치 49, 50, 116, 176, 201, 205, 213, 241, 360, 375, 416 및 437에 상응하는 1개 이상의 위치에서의 치환을 포함한다. 변이체는 바람직하게는 T49H, T49G, T49L, S50T, T116G, K176L, I201Y, H205Y, K213T, L241D, Q360S, R375V, R375G, D416V 및 R437W 중에서 선택되는 1개 이상의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 49, 50, 116, 176, 201, 205, 213, 241, 360, 375, 416 및 437에 상응하는 1개 이상의 위치에서의 치환을 포함하고, 위치 15, 48, 107, 133, 138, 156, 181, 187, 188, 190, 197, 209, 239, 255, 264, 299, 474 및 475에 상응하는 1개 이상의 위치에서의 치환을 더 포함한다. 변이체는 바람직하게는 T49H, T49G, T49L, S50T, T116G, K176L, I201Y, H205Y, K213T, L241D, Q360S, R375V, R375G, D416V 및 R437W 중에서 선택되는 1개 이상의 치환을 포함하고, M15T, M15S, M15L, G48A, G107A, H133Y, W138Y, W138F, H156Y, A181T, A181E, A181D, S187D, N188S, N188T, N190F, M197S, M197T, M197V, M197L, M197I, A209V, S239Q, S239E, S239N, S239D, S239A, S239M, S239C, E255P, E255G, Q264S, G299R, G474K, G474R, G474E, G474Q, G475K, G475R, G475E 및 G475Q 중에서 선택되는 1개 이상의 치환을 더 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 15에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P 치환을 포함한다. 바람직하게는, 변이체는 M15T+E185P; M15S+E185P 또는 M15L+E185P 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 48에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P 치환을 포함한다. 바람직하게는, 변이체는 G48A+E185P 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 49에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P 치환을 포함한다. 바람직하게는, 변이체는 T49H+E185P; T49G+E185P; T49L+E185P 또는 T49I+E185P 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 50에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P 치환을 포함한다. 바람직하게는, 변이체는 S50T+E185P 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 107에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P 치환을 포함한다. 바람직하게는 변이체는 G107A+E185P 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 116에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P 치환을 포함한다. 바람직하게는 변이체는 T116G+E185P 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 133에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P 치환을 포함한다. 바람직하게는 변이체는 H133Y+E185P 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 138에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P 치환을 포함한다. 바람직하게는 변이체는 W138Y+E185P 또는 W138F+E185P 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 156에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P 치환을 포함한다. 바람직하게는 변이체는 H156Y+E185P 치환을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 변이체는 위치 176에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P 치환을 포함하며, 변이체는 K176L+E185P 치환을 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서, 변이체는 위치 176에 상응하는 위치에서의 치환과 조합되고, 추가로 위치 15, 48, 49, 50, 107, 116, 133, 138, 156, 181, 187, 188, 190, 197, 201, 205, 209, 213, 239, 241, 255, 264, 299, 360, 375, 416, 437, 474 및 475에 상응하는 1개 이상의 위치에서의 치환과 조합된 E185P 치환을 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서, 변이체는 K176L+E185P 치환을 포함하며, M15T, M15S, M15L, G48A, T49H, T49G, T49L, T49I, S50T, G107A, T116G, H133Y, W138Y, W138F, H156Y, A181T, A181E, A181D, S187D, N188S, N188T, N190F, M197S, M197T, M197V, M197L, M197I, I201Y, I201F, H205Y, A209V, K213T, S239Q, S239E, S239N, S239D, S239A, S239M, S239C, L241D, E255P, E255G, Q264S, G299R, Q360S, R375V, R375G, D416V, R437W, G474K, G474R, G474E, G474Q, G475K, G475R, G475E 및 G475Q로 구성된 군으로부터 선택되는 1개 이상의 치환을 더 포함한다.
더욱 바람직한 구현예에서, 변이체는 K176L+E185P 치환을 포함하며, T49H, T49G, T49L, S50T, T116G, I201Y, H205Y, K213T, L241D, Q360S, R375V, R375G, D416V 및 R437W로 구성된 군으로부터 선택되는 1개 이상의 치환을 더 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서, 변이체는 위치 176에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P 치환을 포함하며, 변이체는 SEQ ID NO: 1에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는다. 바람직하게는 변이체는 K176L+E185P 치환을 포함하며, 변이체는 SEQ ID NO: 1에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는다.
다른 바람직한 구현예에서, 변이체는 위치 176에 상응하는 위치에서의 치환과 조합되고, 추가로 위치 15, 48, 49, 50, 107, 116, 133, 138, 156, 181, 187, 188, 190, 197, 201, 205, 209, 213, 239, 241, 255, 264, 299, 360, 375, 416, 437, 474 및 475에 상응하는 1개 이상의 위치에서의 치환과 조합된 E185P 치환을 포함하며, 변이체는 SEQ ID NO: 1에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는다.
다른 바람직한 구현예에서, 변이체는 K176L+E185P 치환을 포함하며, M15T, M15S, M15L, G48A, T49H, T49G, T49L, T49I, S50T, G107A, T116G, H133Y, W138Y, W138F, H156Y, A181T, A181E, A181D, S187D, N188S, N188T, N190F, M197S, M197T, M197V, M197L, M197I, I201Y, I201F, H205Y, A209V, K213T, S239Q, S239E, S239N, S239D, S239A, S239M, S239C, L241D, E255P, E255G, Q264S, G299R, Q360S, R375V, R375G, D416V, R437W, G474K, G474R, G474E, G474Q, G475K, G475R, G475E 및 G475Q로 구성된 군으로부터 선택되는 1개 이상의 치환을 더 포함하며, 변이체는 SEQ ID NO: 1에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는다.
더욱 바람직한 구현예에서, 변이체는 K176L+E185P 치환을 포함하며, T49H, T49G, T49L, S50T, T116G, I201Y, H205Y, K213T, L241D, Q360S, R375V, R375G, D416V 및 R437W로 구성된 군으로부터 선택되는 1개 이상의 치환을 더 포함하며, 변이체는 SEQ ID NO: 1에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는다.
다른 바람직한 구현예에서, 변이체는 위치 176에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P 치환을 포함하며, 변이체는 SEQ ID NO: 14에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는다. 바람직하게는, 변이체는 K176L+E185P 치환을 포함하며, 변이체는 SEQ ID NO: 14에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는다.
다른 바람직한 구현예에서, 변이체는 위치 176에 상응하는 위치에서의 치환과 조합되고, 추가로 위치 15, 48, 49, 50, 107, 116, 133, 138, 156, 181, 187, 188, 190, 197, 201, 205, 209, 213, 239, 241, 255, 264, 299, 360, 375, 416, 437, 474 및 475에 상응하는 1개 이상의 위치에서의 치환과 조합된 E185P 치환을 포함하며, 변이체는 SEQ ID NO: 14에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는다.
다른 바람직한 구현예에서, 변이체는 K176L+E185P 치환을 포함하며, M15T, M15S, M15L, G48A, T49H, T49G, T49L, T49I, S50T, G107A, T116G, H133Y, W138Y, W138F, H156Y, A181T, A181E, A181D, S187D, N188S, N188T, N190F, M197S, M197T, M197V, M197L, M197I, I201Y, I201F, H205Y, A209V, K213T, S239Q, S239E, S239N, S239D, S239A, S239M, S239C, L241D, E255P, E255G, Q264S, G299R, Q360S, R375V, R375G, D416V, R437W, G474K, G474R, G474E, G474Q, G475K, G475R, G475E 및 G475Q로 구성된 군으로부터 선택되는 1개 이상의 치환을 더 포함하며, 변이체는 SEQ ID NO: 14에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는다.
더욱 바람직한 구현예에서, 변이체는 K176L+E185P 치환을 포함하며, T49H, T49G, T49L, S50T, T116G, I201Y, H205Y, K213T, L241D, Q360S, R375V, R375G, D416V 및 R437W로 구성된 군으로부터 선택되는 1개 이상의 치환을 더 포함하고, 변이체는 SEQ ID NO: 14에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 181에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 A181T+E185P; A181E+E185P 또는 A181D+E185P 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 187에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 E185P+S187D 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 188에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 E185P+N188S 또는 E185P+N188T 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 190에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 E185P+N190F 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 197에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 E185P+M197S, E185P+M197T, E185P+M197V, E185P+M197L 또는 E185P+M197I 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 201에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 E185P+I201Y 또는 E185P+I201F 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 205에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 E185P+H205Y 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 209에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 E185P+A209V 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 213에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 E185P+K213T 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 239에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 E185P+S239Q, E185P+S239E, E185P+S239N, E185P+S239D, E185P+S239A, E185P+S239M 또는 E185P+S239C 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 241에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 E185P+L241D 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 255에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 E185P+E255P 또는 E185P+E255G 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 264에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 E185P+Q264S 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 299에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 E185P+G299R 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 360에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 E185P+Q360S 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 375에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 E185P+R375V 또는 E185P+R375G 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 416에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 E185P+D416V 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 437에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 E185P+R437W 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 474에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 E185P+474K, E185P+474R, E185P+474E 또는 E185P+474Q 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 475에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 E185P+475K, E185P+475R, E185P+475E 또는 E185P+475Q 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 15에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P+K176L 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 M15T+K176L+E185P; M15S+K176L+E185P 또는 M15L+K176L+E185P 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 48에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P+K176L 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 G48A+K176L+E185P 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 49에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P+K176L 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 T49H+K176L+E185P; T49G+K176L+E185P; T49L+K176L+E185P 또는 T49I+K176L+E185P 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 50에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P+K176L 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 S50T+K176L+E185P 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 107에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P+K176L 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 G107A+K176L+E185P 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 116에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P+K176L 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 T116G+K176L+E185P 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 133에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P+K176L 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 H133Y+K176L+E185P 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 138에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P+K176L 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 W138Y+K176L+E185P 또는 W138F+K176L+E185P 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 156에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P+K176L 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 H156Y+K176L+E185P 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 181에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P+K176L 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 K176L+A181T+E185P; K176L+A181E+E185P 또는 K176L+A181D+E185P 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 187에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P+K176L 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 K176L+E185P+S187D 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 188에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P+K176L 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 K176L+E185P+N188S 또는 K176L+E185P+N188T 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 190에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P+K176L 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 K176L+E185P+N190F 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 197에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P+K176L 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 K176L+E185P+M197S, K176L+E185P+M197T, K176L+E185P+M197V, K176L+E185P+M197L 또는 K176L+E185P+M197I 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 201에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P+K176L 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 K176L+E185P+I201Y 또는 K176L+E185P+I201F 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 205에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P+K176L 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 K176L+E185P+H205Y 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 209에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P+K176L 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 K176L+E185P+A209V 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 213에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P+K176L 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 K176L+E185P+K213T 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 239에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P+K176L 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 K176L+E185P+S239Q, K176L+E185P+S239E, K176L+E185P+S239N, K176L+E185P+S239D, K176L+E185P+S239A, K176L+E185P+S239M 또는 K176L+E185P+S239C 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 241에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P+K176L 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 K176L+E185P+L241D 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 255에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P+K176L 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 K176L+E185P+E255P 또는 K176L+E185P+E255G 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 264에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P+K176L 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 K176L+E185P+Q264S 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 299에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P+K176L 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 K176L+E185P+G299R 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 360에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P+K176L 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 K176L+E185P+Q360S 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 375에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P+K176L 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 K176L+E185P+R375V 또는 K176L+E185P+R375G 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 416에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P+K176L 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 K176L+E185P+D416V 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 437에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P+K176L 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 K176L+E185P+R437W 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 474에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P+K176L 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 K176L+E185P+G474K, K176L+E185P+G474R, K176L+E185P+G474E 또는 K176L+E185P+G474Q 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 변이체는 위치 475에 상응하는 위치에서의 치환과 조합된 E185P+K176L 치환을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 K176L+E185P+G475K, K176L+E185P+G475R, K176L+E185P+G475E 또는 K176L+E185P+G475Q 치환을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 변이체는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 일련의 치환을 포함한다:
T49H+K176L+E185P,
T49G+K176L+E185P,
T49L+S50T+K176L+E185P,
T116G+K176L+E185P,
K176L+E185P,
K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W,
K176L+E185P+L241D,
K176L+E185P+R375V, 및
K176L+E185P+R375G.
다른 바람직한 구현예에서, 변이체는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 일련의 치환을 포함한다:
G48A+T49H+G107A+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201F+A209V+Q264S;
G48A+T49G+G107A+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201F+A209V+Q264S;
G48A+T49L+S50T+G107A+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201F+A209V+Q264S;
G48A+T49I+G107A+T116G+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201F+A209V+Q264S;
G48A+T49I+G107A+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201F+A209V+Q264S;
G48A+T49I+G107A+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201Y+H205Y+A209V+K213T+Q264S+Q360S+D416V+R437W;
G48A+T49I+G107A+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201F+L241D+A209V+Q264S;
G48A+T49I+G107A+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201F+A209V+Q264S+R375V;
G48A+T49I+G107A+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201F+A209V+Q264S+R375G; 및
G48A+G107A+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201F+A209V+Q264S.
일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO: 1의 위치 180에 상응하는 위치 바로 앞의 2개의 위치 둘 모두에서의 결실, 즉, SEQ ID NO: 2의 위치 181 및 182에 상응하는 2개의 아미노산의 결실을 더 포함한다.
다른 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO: 1의 위치 177에 상응하는 위치 뒤의, 그리고 SEQ ID NO: 1의 위치 180에 상응하는 위치 앞의 2개의 아미노산의 결실, 즉, SEQ ID NO: 2의 R179-G180-I181-G182 펩티드에서의 2개의 아미노산 또는 SEQ ID NO: 3 내지 11 중 임의의 것에서의 상동성 아미노산의 결실을 더 포함한다.
변이체는 1개 이상의(예를 들어, 몇몇의) 추가의 변경, 예를 들어, 1개 이상의(예를 들어, 몇몇의) 추가의 치환을 더 포함할 수 있다.
추가의 아미노산 변화는 부수적 특성, 즉, 단백질의 폴딩 및/또는 활성에 유의미하게 영향을 미치지 않는 보존적 아미노산 치환 또는 삽입; 전형적으로 1 내지 30개의 아미노산의 작은 결실; 작은 아미노- 또는 카르복실-말단 연장, 예를 들어 아미노-말단 메티오닌 잔기; 20 내지 25개 이하의 잔기의 작은 링커 펩티드; 또는 폴리-히스티딘 트랙(tract), 항원 에피토프 또는 결합 도메인과 같은 순전하 또는 다른 기능을 변경시키는 것에 의해 정제를 촉진하는 작은 연장일 수 있다.
보존적 치환의 예는 염기성 아미노산(아르기닌, 라이신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산(글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산(류신, 아이소류신 및 발린), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판 및 티로신), 및 작은 아미노산(글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌 및 메티오닌)의 그룹 내에서 이루어진다. 일반적으로 고유 활성을 변경시키지 않는 아미노산 치환이 본 발명이 속하는 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[H. Neurath and R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York]에 기재되어 있다. 흔한 치환에는 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 및 Asp/Gly이 있다.
다르게는, 아미노산 변화는 폴리펩티드의 물리화학적 특성이 변경되는 특성의 것이다. 예를 들어, 아미노산 변화는 폴리펩티드의 열적 안정성을 향상시키고, 기질 특이성을 변경시키고, pH 최적을 변하게 하는 등등일 수 있다.
소정의 폴리펩티드에서 필수 아미노산은 위치-지정 돌연변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발과 같은 본 발명이 속하는 분야에 공지된 절차에 따라 확인될 수 있다(문헌[Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085]). 후자의 기술에서, 단일 알라닌 돌연변이는 분자 내 모든 잔기에 도입되고, 얻어진 돌연변이 분자는 분자의 활성에 중요한 아미노산 잔기를 확인하기 위해 알파-아밀라아제 활성에 대해 시험된다. 또한 문헌[Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708]을 참조한다. 효소의 활성 부위 또는 다른 생물학적 상호작용은 또한 추정의 접촉 위치 아미노산의 돌연변이와 함께 핵자기공명, 결정학, 전자 회절, 또는 광친화성 표지와 같은 기술에 의해 결정되는 바와 같은 구조의 물리적 분석에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 문헌[de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312]; 문헌[Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904]; 문헌[Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64]을 참조한다. 또한, 필수 아미노산의 동일성은 관련 폴리펩티드와의 정렬로부터 추론될 수 있다.
변이체는 300 내지 700개, 예를 들어, 350 내지 650개, 400 내지 600개, 450 내지 500개 또는 470 내지 490개의 아미노산으로 구성될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 변이체는 고온, 저 칼슘 및 낮은 pH에서 SEQ ID NO: 1의 성숙 폴리펩티드에 비하여 증가된 열안정성을 갖는다.
다른 바람직한 구현예에서, 변이체는 고온, 저 칼슘 및 낮은 pH에서 SEQ ID NO: 14의 성숙 폴리펩티드에 비하여 증가된 열안정성을 갖는다.
다른 바람직한 구현예에서, 변이체는 고온, 저 칼슘 및 낮은 pH에서 그의 모체에 비하여 증가된 열안정성을 갖는다.
본 발명의 문맥에서, "고온"은 70 내지 120℃, 바람직하게는 80 내지 100℃, 더욱 바람직하게는 85 내지 95℃의 온도를 의미한다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "낮은 pH"는 4 내지 6, 바람직하게는 4.2 내지 5.5, 더욱 바람직하게는 4.5 내지 5 범위의 pH를 의미한다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "저 칼슘"은 60 ppm, 바람직하게는 40 ppm, 더욱 바람직하게는 25 ppm, 더더욱 바람직하게는 5 ppm 미만의 칼슘의 유리 칼슘 수준을 의미한다. 0.125 mM CaCl2는 5 ppm의 칼슘을 제공한다.
일 구현예에서, 변이체는 90℃ 및 pH 4.8에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, SEQ ID NO: 1의 성숙 폴리펩티드에 비하여 증가된 열안정성을 갖는다. 다른 구현예에서, 변이체는 95℃ 및 pH 4.8에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, SEQ ID NO: 1의 성숙 폴리펩티드에 비하여 증가된 열안정성을 갖는다. 다른 구현예에서, 변이체는 90℃ 및 pH 4.5에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, SEQ ID NO: 1의 성숙 폴리펩티드에 비하여 증가된 열안정성을 갖는다. 다른 구현예에서, 변이체는 95℃ 및 pH 4.5에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, SEQ ID NO: 1의 성숙 폴리펩티드에 비하여 증가된 열안정성을 갖는다.
일 구현예에서, 변이체는 90℃ 및 pH 4.8에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, SEQ ID NO: 14의 성숙 폴리펩티드에 비하여 증가된 열안정성을 갖는다. 다른 구현예에서, 변이체는 95℃ 및 pH 4.8에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, SEQ ID NO: 14의 성숙 폴리펩티드에 비하여 증가된 열안정성을 갖는다. 다른 구현예에서, 변이체는 90℃ 및 pH 4.5에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, SEQ ID NO: 14의 성숙 폴리펩티드에 비하여 증가된 열안정성을 갖는다. 다른 구현예에서, 변이체는 95℃ 및 pH 4.5에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, SEQ ID NO: 14의 성숙 폴리펩티드에 비하여 증가된 열안정성을 갖는다.
일 구현예에서, 변이체는 90℃ 및 pH 4.8에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, 그의 모체에 비하여 증가된 열안정성을 갖는다. 다른 구현예에서, 변이체는 95℃ 및 pH 4.8에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, 그의 모체에 비하여 증가된 열안정성을 갖는다. 다른 구현예에서, 변이체는 90℃ 및 pH 4.5에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, 그의 모체에 비하여 증가된 열안정성을 갖는다. 다른 구현예에서, 변이체는 95℃ 및 pH 4.5에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, 그의 모체에 비하여 증가된 열안정성을 갖는다.
통상의 기술자는 효소의 열안정성을 결정하는 방법을 알 것이다. 이는 본 출원의 실시예에 나타낸 바와 같이 잔류 활성 반감기를 결정함으로써 행해질 수 있다. 통상의 기술자는 검정에 대한 관련 조건, 예를 들어, 인큐베이션 시간을 선택하는 방법을 알 것이다.
바람직한 구현예에서, 변이체는 고온, 저 칼슘 및 낮은 pH에서 SEQ ID NO: 1의 성숙 폴리펩티드에 비해 증가된 잔류 활성 반감기를 갖는다. 일 구현예에서, 변이체는 90℃ 및 pH 4.8에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, SEQ ID NO: 1의 성숙 폴리펩티드에 비하여 증가된 잔류 활성 반감기를 갖는다. 다른 구현예에서, 변이체는 95℃ 및 pH 4.8에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, SEQ ID NO: 1의 성숙 폴리펩티드에 비하여 증가된 잔류 활성 반감기를 갖는다. 다른 구현예에서, 변이체는 90℃ 및 pH 4.5에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, SEQ ID NO: 1의 성숙 폴리펩티드에 비하여 증가된 잔류 활성 반감기를 갖는다. 다른 구현예에서, 변이체는 95℃ 및 pH 4.5에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, SEQ ID NO: 1의 성숙 폴리펩티드에 비하여 증가된 잔류 활성 반감기를 갖는다.
바람직한 구현예에서, 변이체는 고온, 저 칼슘 및 낮은 pH에서 SEQ ID NO: 14의 성숙 폴리펩티드에 비해 증가된 잔류 활성 반감기를 갖는다. 일 구현예에서, 변이체는 90℃ 및 pH 4.8에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, SEQ ID NO: 14의 성숙 폴리펩티드에 비하여 증가된 잔류 활성 반감기를 갖는다. 다른 구현예에서, 변이체는 95℃ 및 pH 4.8에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, SEQ ID NO: 14의 성숙 폴리펩티드에 비하여 증가된 잔류 활성 반감기를 갖는다. 다른 구현예에서, 변이체는 90℃ 및 pH 4.5에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, SEQ ID NO: 14의 성숙 폴리펩티드에 비하여 증가된 잔류 활성 반감기를 갖는다. 다른 구현예에서, 변이체는 95℃ 및 pH 4.5에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, SEQ ID NO: 14의 성숙 폴리펩티드에 비하여 증가된 잔류 활성 반감기를 갖는다.
바람직한 구현예에서, 변이체는 90℃ 및 pH 4.8에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, 적어도 5분, 예를 들어, 적어도 10분 또는 적어도 20분인 잔류 활성 반감기를 갖는다. 더욱 바람직한 구현예에서, 변이체는 90℃ 및 pH 4.8에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, 적어도 50분, 예를 들어, 적어도 60분 또는 적어도 70분인 잔류 활성 반감기를 갖는다. 일 구현예에서, 변이체는 90℃ 및 pH 4.8에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, 적어도 100분인 잔류 활성 반감기를 갖는다.
바람직한 구현예에서, 변이체는 90℃ 및 pH 4.5에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, 적어도 2분, 예를 들어, 적어도 3분 또는 적어도 5분인 잔류 활성 반감기를 갖는다. 더욱 바람직한 구현예에서, 변이체는 90℃ 및 pH 4.5에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, 적어도 10분, 예를 들어, 적어도 15분 또는 적어도 20분인 잔류 활성 반감기를 갖는다. 일 구현예에서, 변이체는 90℃ 및 pH 4.5에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, 적어도 30분인 잔류 활성 반감기를 갖는다.
바람직한 구현예에서, 변이체는 95℃ 및 pH 4.8에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, 적어도 1분, 예를 들어, 적어도 2분 또는 적어도 5분인 잔류 활성 반감기를 갖는다. 더욱 바람직한 구현예에서, 변이체는 95℃ 및 pH 4.8에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, 적어도 10분, 예를 들어, 적어도 15분 또는 적어도 20분인 잔류 활성 반감기를 갖는다. 일 구현예에서, 변이체는 95℃ 및 pH 4.8에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, 적어도 30분인 잔류 활성 반감기를 갖는다.
바람직한 구현예에서, 변이체는 95℃ 및 pH 4.5에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, 적어도 1분, 예를 들어, 적어도 2분 또는 적어도 3분인 잔류 활성 반감기를 갖는다. 더욱 바람직한 구현예에서, 변이체는 95℃ 및 pH 4.5에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, 적어도 5분, 예를 들어, 적어도 7분 또는 적어도 10분인 잔류 활성 반감기를 갖는다. 일 구현예에서, 변이체는 95℃ 및 pH 4.8에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, 적어도 15분인 잔류 활성 반감기를 갖는다.
일 구현예에서, 변이체는 90℃ 및 pH 4.8에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, 모 효소에 비하여 증가된 열안정성, 예를 들어, 증가된 잔류 활성 반감기를 갖는다. 다른 구현예에서, 변이체는 95℃ 및 pH 4.8에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, 모 효소에 비하여 증가된 열안정성, 예를 들어, 증가된 잔류 활성 반감기를 갖는다. 다른 구현예에서, 변이체는 90℃ 및 pH 4.5에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, 모 효소에 비하여 증가된 열안정성, 예를 들어, 증가된 잔류 활성 반감기를 갖는다. 다른 구현예에서, 변이체는 95℃ 및 pH 4.5에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, 모 효소에 비하여 증가된 열안정성, 예를 들어, 증가된 잔류 활성 반감기를 갖는다.
다른 구현예에서, 변이체는 모 효소에 비하여 향상된 촉매 효능, 향상된 촉매 속도, 향상된 화학적 안정성, 향상된 산화 안정성, 향상된 고유 활성, 저장 조건 하에서의 향상된 안정성, 향상된 기질 결합, 향상된 기질 절단, 향상된 기질 특이성, 향상된 기질 안정성, 향상된 표면 특성, 향상된 열 활성 또는 향상된 열안정성을 갖는다.
모 알파-아밀라아제
변이체는 바람직하게는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 모 알파-아밀라아제의 변이체이다:
(a) (i) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 중 임의의 것의 성숙 폴리펩티드, 또는 (ii) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 3의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 4의 아미노산 1 내지 482, SEQ ID NO: 5의 아미노산 1 내지 484, SEQ ID NO: 6의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 7의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 8의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 9의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 11의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 12의 아미노산 1 내지 480, SEQ ID NO: 13의 아미노산 1 내지 483 또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 1 내지 481에 대하여 적어도 60%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드; 또는
(b) 알파-아밀라아제 활성을 갖는, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 중 임의의 것의 성숙 폴리펩티드의 단편.
일 구현예에서, 모 알파-아밀라아제는 (i) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 중 임의의 것의 성숙 폴리펩티드, 또는 (ii) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 3의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 4의 아미노산 1 내지 482, SEQ ID NO: 5의 아미노산 1 내지 484, SEQ ID NO: 6의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 7의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 8의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 9의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 11의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 12의 아미노산 1 내지 480, SEQ ID NO: 13의 아미노산 1 내지 483, 또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 1 내지 481에 대하여 적어도 65%, 예를 들어, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
일 구현예에서, 모 알파-아밀라아제는 (i) SEQ ID NO: 1의 성숙 폴리펩티드, 또는 (ii) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 483에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
다른 구현예에서, 모 알파-아밀라아제는 (i) SEQ ID NO: 2의 성숙 폴리펩티드, (ii) I181*+G182* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 2의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 483, 또는 (iv) I181*+G182* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 483에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
다른 구현예에서, 모 알파-아밀라아제는 (i) SEQ ID NO: 3의 성숙 폴리펩티드, (ii) T183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 3의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1 내지 485, 또는 (iv) T183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 1 내지 485에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
다른 구현예에서, 모 알파-아밀라아제는 (i) SEQ ID NO: 4의 성숙 폴리펩티드, (ii) T180*+G181* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 4의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 4의 아미노산 1 내지 482, 또는 (iv) T180*+G181* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 1 내지 482에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
다른 구현예에서, 모 알파-아밀라아제는 (i) SEQ ID NO: 5의 성숙 폴리펩티드, (ii) T182*+G183* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 5의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 5의 아미노산 1 내지 484, 또는 (iv) T182*+G183* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 1 내지 484에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
다른 구현예에서, 모 알파-아밀라아제는 (i) SEQ ID NO: 6의 성숙 폴리펩티드, (ii) E178*+G179* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 6의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 6의 아미노산 1 내지 483, 또는 (iv) E178*+G179* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 1 내지 483에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
다른 구현예에서, 모 알파-아밀라아제는 (i) SEQ ID NO: 7의 성숙 폴리펩티드, (ii) T183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 7의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 7의 아미노산 1 내지 485, 또는 (iv) T183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 7의 아미노산 1 내지 485에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
다른 구현예에서, 모 알파-아밀라아제는 (i) SEQ ID NO: 8의 성숙 폴리펩티드, (ii) D183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 8의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 8의 아미노산 1 내지 486, 또는 (iv) D183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 1 내지 486에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
다른 구현예에서, 모 알파-아밀라아제는 (i) SEQ ID NO: 9의 성숙 폴리펩티드, (ii) D183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 9의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 9의 아미노산 1 내지 485, 또는 (iv) D183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 9의 아미노산 1 내지 485에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
다른 구현예에서, 모 알파-아밀라아제는 (i) SEQ ID NO: 10의 성숙 폴리펩티드, (ii) D183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 10의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 485, 또는 (iv) D183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 485에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
다른 구현예에서, 모 알파-아밀라아제는 (i) SEQ ID NO: 11의 성숙 폴리펩티드, (ii) H183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 11의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 11의 아미노산 1 내지 485, 또는 (iv) H183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 1 내지 485에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
다른 구현예에서, 모 알파-아밀라아제는 (i) SEQ ID NO: 12의 성숙 폴리펩티드, 또는 (ii) SEQ ID NO: 12의 아미노산 1 내지 480에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
다른 구현예에서, 모 알파-아밀라아제는 (i) SEQ ID NO: 13의 성숙 폴리펩티드, 또는 (ii) SEQ ID NO: 13의 아미노산 1 내지 483에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
다른 구현예에서, 모 알파-아밀라아제는 (i) SEQ ID NO: 14의 성숙 폴리펩티드, 또는 (ii) SEQ ID NO: 14의 아미노산 1 내지 481에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
일 구현예에서, 모 알파-아밀라아제는 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 중 임의의 것의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나 이로 구성된다.
일 구현예에서, 모 알파-아밀라아제는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 3의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 4의 아미노산 1 내지 482, SEQ ID NO: 5의 아미노산 1 내지 484, SEQ ID NO: 6의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 7의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 8의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 9의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 11의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 12의 아미노산 1 내지 480, SEQ ID NO: 13의 아미노산 1 내지 483, 또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 1 내지 481을 포함하거나 이로 구성된다.
다른 구현예에서, 모 알파-아밀라아제는 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 중 임의의 것의 성숙 폴리펩티드의 단편이며, 여기서, 단편은 알파-아밀라아제 활성을 갖는다.
일 구현예에서, 변이체는 모 알파-아밀라아제에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 예를 들어, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는다.
일 구현예에서, 본 발명의 변이체 내의 총 변경 개수는 2 내지 20개, 예를 들어, 2 내지 10개 및 2 내지 5개, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 변경이다.
모체는 한 폴리펩티드의 영역이 다른 폴리펩티드의 영역의 N-말단 또는 C-말단에서 융합된 하이브리드 폴리펩티드일 수 있다.
모체는 다른 폴리펩티드가 본 발명의 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에서 융합된 융합 폴리펩티드 또는 절단가능한 융합 폴리펩티드일 수 있다. 융합 폴리펩티드는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 다른 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 융합함으로써 생성된다. 융합 폴리펩티드를 생성하기 위한 기술은 본 발명이 속한 분야에 공지되어 있고, 폴리펩티드를 암호화하는 암호화 서열을 그것들이 인 프레임(in frame)으로 존재 하고, 융합 폴리펩티드의 발현이 동일한 프로모터(들) 및 종결자의 제어 하에 존재 하도록 라이게이션시키는 것을 포함한다. 융합 폴리펩티드는 또한 융합 폴리펩티드가 번역 후에 생성되는 인테인 기술을 사용하여 구축될 수도 있다(문헌[Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583]; 문헌[Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779]).
융합 폴리펩티드는 2개의 폴리펩티드 사이의 절단 부위를 더 포함할 수 있다. 융합 단백질의 분비시, 부위가 절단되어 2개의 폴리펩티드를 방출한다. 절단 부위의 예는 문헌[Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576]; 문헌[Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251]; 문헌[Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493]; 문헌[Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503]; 및 문헌[Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381]; 문헌[Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512]; 문헌[Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987]; 문헌[Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248]; 및 문헌[Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48]에 개시된 부위를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
모체는 임의의 속의 미생물로부터 획득될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 주어진 공급원과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 용어 "로부터 획득된"은 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 모체가 공급원에 의해 또는 공급원 유래의 폴리뉴클레오티드가 삽입된 균주에 의해 생성되는 것을 의미한다. 일 양태에서, 모체는 세포 외로 분비된다.
모체는 박테리아 알파-아밀라아제일 수 있다. 예를 들어, 모체는 그램-양성 박테리아 폴리펩티드, 예를 들어, 바실러스(Bacillus), 클로스트리듐(Clostridium), 엔테로코커스(Enterococcus), 게오바실러스(Geobacillus), 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 오세아노바실러스(Oceanobacillus), 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus) 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces) 알파-아밀라아제, 또는 그램-음성 박테리아 폴리펩티드, 예를 들어, 캄필로박터(Campylobacter), 에스케리키아 콜라이(E. coli), 플라보박테리움(Flavobacterium), 푸소박테리움(Fusobacterium), 헬리코박터(Helicobacter), 일리오박터(Ilyobacter), 네이세리아(Neisseria), 슈도모나스(Pseudomonas), 살모넬라(Salmonella) 또는 유레아플라스마(Ureaplasma) 알파-아밀라아제일 수 있다.
일 양태에서, 모체는 바실러스 알칼로필러스(Bacillus alkalophilus), 바실러스 아밀로리쿼파시엔스, 바실러스 브레비스(Bacillus brevis), 바실러스 서큘란스(Bacillus circulans), 바실러스 클라우시이(Bacillus clausii), 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans), 바실러스 퍼무스(Bacillus firmus), 바실러스 라우투스(Bacillus lautus), 바실러스 렌투스(Bacillus lentus), 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus), 바실러스 스테아로써모필루스, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 알파-아밀라아제이다.
앞서 언급한 종에 대해, 본 발명은 완전하고 불완전한 상태, 및 다른 분류학적 동등물, 예를 들어, 그것들이 알려진 종 명칭과 상관 없이, 무성세대를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 숙련된 기술자는 적절한 동등물의 동일성을 용이하게 인식할 것이다.
이들 종의 균주는 다양한 균주 보관기관, 예컨대, ATCC(American Type Culture Collection), DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), CBS(Centraalbureau Voor Schimmelcultures) 및 NRRL(Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center)에서 공중에게 용이하게 접근될 수 있다.
모체는 자연(예를 들어, 토양, 퇴비, 물 등)으로부터 단리된 미생물 또는 상기 언급된 프로브를 사용하여 자연 물질(예를 들어, 토양, 퇴비, 물 등)로부터 직접 획득된 DNA 시료를 포함하는 다른 공급원으로부터 확인되고 획득될 수 있다. 자연 서식지로부터 미생물 및 DNA를 직접 단리하는 기술은 본 발명이 속하는 분야에 널리 공지되어 있다. 이어서, 모체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 다른 미생물 또는 혼합된 DNA 시료의 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리를 유사하게 스크리닝함으로써 획득될 수 있다. 모체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로브(들)로 검출되면, 폴리뉴클레오티드는 본 발명이 속하는 분야의 숙련자에게 공지되어 있는 기술을 이용함으로써 단리 또는 클로닝될 수 있다(예를 들어, 상기 문헌[Sambrook et al., 1989] 참조).
변이체의 제조
본 발명은 또한 (a) SEQ ID NO: 1의 위치 185에 상응하는 위치에서의 프롤린으로의 치환 및 추가로 SEQ ID NO: 1의 위치 15, 48, 49, 50, 107, 116, 133, 138, 156, 176, 181, 187, 188, 190, 197, 201, 205, 209, 213, 239, 241, 255, 264, 299, 360, 375, 416, 437, 474 및 475에 상응하는 1개 이상의 위치에서의 치환을 모 알파-아밀라아제에 도입하는 단계; 및 (b) 변이체를 회수하는 단계를 포함하는 알파-아밀라아제 활성을 갖는 변이체의 획득 방법에 관한 것이다.
변이체는 본 발명이 속하는 분야에 알려져 있는 임의의 돌연변이유발 절차, 예를 들어, 부위-지정 돌연변이유발, 합성 유전자 구축, 반합성 유전자 구축, 무작위 돌연변이유발, 셔플링(shuffling) 등을 사용하여 제조될 수 있다.
부위-지정 돌연변이유발은 1개 이상의(예를 들어, 몇몇의) 돌연변이를, 모체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 내의 1개 이상의 정의된 부위에 도입하는 기술이다.
부위-지정 돌연변이유발은 요망되는 돌연변이를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 사용을 포함하는 PCR에 의해 시험관 내에서 달성될 수 있다. 부위-지정 돌연변이유발은 또한 모체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 내의 소정의 부위에서의 제한 효소에 의한 절단과, 폴리뉴클레오티드 내의 돌연변이를 함유하는 올리고뉴클레오티드의 이후의 라이게이션을 수반하는 카세트 돌연변이유발에 의해 시험관 내에서 수행될 수 있다. 통상적으로, 플라스미드 및 올리고뉴클레오티드를 분해하는 제한 효소는 동일하여, 플라스미드와 삽입물의 부착성 말단이 서로 라이게이션되게 한다. 예를 들어, 문헌[Scherer and Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955]; 및 문헌[Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966]을 참조한다.
부위-지정 돌연변이유발은 또한 본 발명이 속하는 분야에 알려져 있는 방법에 의해 생체 내에서 달성될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2004/0171154호; 문헌[Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773-776]; 문헌[Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290]; 및 문헌[Calissano and Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16]을 참조한다.
임의의 부위-지정 돌연변이유발 절차가 본 발명에 사용될 수 있다. 변이체를 제조하기 위해 사용될 수 있는 많은 상용의 키트가 입수가능하다.
합성 유전자 구축은 대상 폴리펩티드를 암호화하기 위해 설계된 폴리뉴클레오티드 분자의 시험관 내 합성을 수반한다. 유전자 합성은 문헌[Tian et al. (2004, Nature 432: 1050-1054)]에 의해 설명되는 멀티플렉스 마이크로칩-기반 기술 및 올리고뉴클레오티드가 합성되고 광-프로그램화가능한 미소유체 칩에서 조립되는 유사한 기술과 같은 다수의 기술을 이용하여 수행될 수 있다.
돌연변이유발, 재조합, 및/또는 셔플링의 공지된 방법에 이어서, 문헌[Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57]; 문헌[Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156]; WO 95/17413호; 또는 WO 95/22625호에 의해 개시되는 것과 같은 관련있는 스크리닝 절차를 사용하여 단일 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입이 만들어지고 시험될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 방법은 오류 유발 PCR, 파지 디스플레이(예를 들어, 문헌[Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837]; 미국 특허 제5,223,409호; WO 92/06204호) 및 영역-지정 돌연변이유발(문헌[Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145]; 문헌[Ner et al., 1988, DNA 7: 127])을 포함한다.
돌연변이유발/셔플링 방법은 숙주 세포에 의해 발현된 클로닝되고, 돌연변이유발된 폴리펩티드의 활성을 검출하는 고효율의 자동화된 스크리닝 방법과 조합될 수 있다(문헌[Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896]). 활성 폴리펩티드를 암호화하는 돌연변이유발된 DNA 분자는 숙주 세포로부터 회수될 수 있고 본 발명이 속하는 분야의 표준 방법을 사용하여 신속하게 시퀀싱될 수 있다. 이들 방법은 폴리펩티드에서 개개의 아미노산 잔기의 중요성의 신속한 결정을 가능하게 한다.
반-합성 유전자 구축은 합성 유전자 구축, 및/또는 부위-지정 돌연변이유발, 및/또는 무작위 돌연변이유발, 및/또는 셔플링의 양태를 조합함으로써 달성된다. 반-합성 구축은 PCR 기술과 조합하여 합성되는 폴리뉴클레오티드 단편을 이용하는 과정이 전형적이다. 따라서 유전자의 정의된 영역은 새로 합성될 수 있는 한편, 다른 영역은 부위-특이적 돌연변이유발 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있고, 또 다른 영역은 오류-유발 PCR 또는 비-오류 유발 PCR 증폭으로 처리될 수 있다. 그 후 폴리뉴클레오티드 하위서열이 셔플링될 수 있다.
폴리뉴클레오티드
본 발명은 또한 본 발명의 변이체를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
핵산 작제물
본 발명은 또한, 제어 서열에 적합한 조건 하에서 적절한 숙주 세포에서 암호화 서열의 발현을 지시하는 1개 이상의 제어 서열에 작동가능하게 연결된 본 발명의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 작제물에 관한 것이다.
폴리뉴클레오티드는 변이체의 발현을 가능하게 하는 다양한 방식으로 조작될 수 있다. 벡터로의 폴리뉴클레오티드의 삽입 전의 폴리뉴클레오티드의 조작이 발현 벡터에 따라 바람직하거나 필요할 수 있다. 재조합 DNA 방법을 사용하는 폴리뉴클레오티드의 변경 기술은 본 발명이 속하는 분야에 널리 알려져 있다.
제어 서열은 프로모터, 폴리뉴클레오티드의 발현을 위해 숙주 세포에 의해 인지되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 프로모터는 변이체의 발현을 매개하는 전사 제어 서열을 함유한다. 돌연변이형, 절단형 및 하이브리드 프로모터를 포함하는 프로모터는 숙주 세포에서 전사 활성을 보이는 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 숙주 세포에 대하여 동종 또는 이종인 세포외 또는 세포내 폴리펩티드를 암호화하는 유전자로부터 획득될 수 있다.
박테리아 숙주 세포에서 본 발명의 핵산 작제물의 전사를 지시하기 위한 적합한 프로모터의 예에는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 알파-아밀라아제 유전자(amyQ), 바실러스 리케니포르미스 알파-아밀라아제 유전자(amyL), 바실러스 리케니포르미스 페니실리나아제 유전자(penP), 바실러스 스테아로써모필루스 말토제닉 아밀라아제 유전자(amyM), 바실러스 서브틸리스 레반수크라아제(levansucrase) 유전자(sacB), 바실러스 서브틸리스 xylA 및 xylB 유전자, 바실러스 투린지엔시스 cryIIIA 유전자(문헌[Agaisse and Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107])로부터 획득되는 프로모터, 에스케리키아 콜라이 lac 오페론, 에스케리키아 콜라이 trc 프로모터(문헌[Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315]), 스트렙토마이세스 코엘리콜라 아가라아제(agarase) 유전자(dagA) 및 원핵 베타-락타마아제(beta-lactamase) 유전자(문헌[Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731]) 및 tac 프로모터(문헌[DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25])가 있다. 추가의 프로모터는 문헌["Useful proteins from recombinant bacteria" in Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94]; 및 상기 문헌[Sambrook et al., 1989]에 설명되어 있다. 탠덤 프로모터의 예는 WO 99/43835호에 개시되어 있다.
사상 진균 숙주 세포에서 본 발명의 핵산 작제물의 전사를 지시하는 적합한 프로모터의 예는 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 아세트아미다아제, 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 중성 알파-아밀라아제, 아스페르길루스 니게르 산 안정성 알파-아밀라아제, 아스페르길루스 니게르 또는 아스페르길루스 아와모리(Aspergillus awamori) 글루코아밀라아제(glaA), 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae) TAKA 아밀라아제, 아스페르길루스 오리자에 알칼리성 프로테아제, 아스페르길루스 오리자에 트리오스 포스페이트 아이소머라아제, 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 트립신-유사 프로테아제(WO 96/00787호), 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum) 아밀로글루코시다아제(WO 00/56900호), 푸사리움 베네나툼 다리아(Daria)(WO 00/56900호), 푸사리움 베네나툼 퀸(Quinn)(WO 00/56900호), 리조무코르 미에헤이(Rhizomucor miehei) 리파아제, 리조무코르 미에헤이 아스파르트산 프로테이나아제, 트리코데르마 리세이(Trichoderma reesei) 베타-글루코시다아제, 트리코데르마 리세이 셀로비오히드롤라아제 I, 트리코데르마 리세이 셀로비오히드롤라아제 II, 트리코데르마 리세이 엔도글루카나아제 I, 트리코데르마 리세이 엔도글루카나아제 II, 트리코데르마 리세이 엔도글루카나아제 III, 트리코데르마 리세이 엔도글루카나아제 IV, 트리코데르마 리세이 엔도글루카나아제 V, 트리코데르마 리세이 자일라나아제 I, 트리코데르마 리세이 자일라아나제 II, 트리코데르마 리세이 베타-자일로시다아제 및 NA2-tpi 프로모터(비번역 리더(leader)가 아스페르길루스 트리오스(Aspergillus triose) 포스페이트 아이소머라아제 유전자 유래의 비번역 리더에 의해 대체되는 아스페르겔루스 중성 알파-아밀라아제 유전자 유래의 변형된 프로모터)이며; 비제한적인 예에는 비번역 리더가 아스페르길루스 니둘란스 또는 아스페르길루스 오리자에 트리오스 포스페이트 아이소머라아제 유전자 유래의 비번역 리더에 의해 대체되는 아스페르길루스 니게르 중성 알파-아밀라아제 유전자 유래의 변형된 프로모터; 및 그의 돌연변이형, 절단형 및 하이브리드 프로모터가 포함된다.
효모 숙주에서, 유용한 프로모터는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 엔올라아제(ENO-1), 사카로마이세스 세레비지애 갈락토키나아제(GAL1), 사카로마이세스 세레비지애 알콜 탈수소효소/글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(ADH1, ADH2/GAP), 사카로마이세스 세레비지애 트리오스 포스페이트 아이소머라아제(TPI), 사카로마이세스 세레비지애 메탈로티오네인(CUP1), 및 사카로마이세스 세레비지애 3-포르포글리세레이트 키아나제에 대한 유전자로부터 획득된다. 효모 숙주 세포에 대한 다른 유용한 프로모터는 문헌[Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488]에 의해 기술된다.
제어 서열은 또한 전사를 종결시키는, 숙주 세포에 의해 인식되는 전사 종결자일 수 있다. 종결자 서열은 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에 작동가능하게 연결된다. 숙주 세포에서 기능성인 임의의 종결자가 사용될 수 있다.
박테리아 숙주 세포에 바람직한 종결자는 바실러스 클라우시이 알칼리성 프로테아제(aprH), 바실러스 리케니포르미스 알파-아밀라아제(amyL) 및 에스케리키아 콜라이 리보솜 RNA(rmB)에 대한 유전자로부터 획득된다.
사상 진균 숙주 세포에 바람직한 종결자는 아스페르길루스 니둘란스 안트라닐레이트 신타아제, 아스페르길루스 니게르 글루코아밀라아제, 아스페르길루스 니게르 알파-글루코시다아제, 아스페르길루스 오리자에 TAKA 아밀라아제 및 푸사리움 옥시스포룸 트립신-유사 프로테아제에 대한 유전자로부터 획득된다.
효모 숙주 세포에 바람직한 종결자는 사카로마이세스 세레비지애 에놀라아제, 사카로마이세스 세레비지애 사이토크롬 C(CYC1) 및 사카로마이세스 세레비지애 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소에 대한 유전자로부터 획득된다. 효모 숙주 세포에 대한 다른 유용한 종결자는 상기 문헌[Romanos et al., 1992]에 의해 기술된다.
제어 서열은 또한 프로모터의 다운스트림 및 유전자의 암호화 서열의 업스트림 mRNA 안정화 영역일 수 있으며, 이는 유전자의 발현을 증가시킨다.
적합한 mRNA 안정화 영역의 예는 바실러스 투린지엔시스 cryIIIA 유전자(WO 94/25612호) 및 바실러스 서브틸리스 SP82 유전자(문헌[Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471])로부터 획득된다.
제어 서열은 또한 리더, 숙주 세포에 의한 번역에 중요한 mRNA의 비번역 영역일 수 있다. 리더 서열은 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드의 5' 말단에 작동가능하게 연결된다. 숙주 세포에서 기능성인 임의의 리더가 사용될 수 있다.
사상 진균 숙주 세포에 바람직한 리더는 아스페르길루스 오리자에 TAKA 아밀라아제 및 아스페르길루스 니둘란스 트리오스 포스페이트 아이소머라아제에 대한 유전자로부터 획득된다.
효모 숙주 세포에 적합한 리더는 사카로마이세스 세레비지애 에놀라아제(ENO-1), 사카로마이세스 세레비지애 3-포스포글리세레이트 키나아제, 사카로마이세스 세레비지애 알파-인자, 및 사카로마이세스 세레비지애 알콜 탈수소효소/글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(ADH2/GAP)에 대한 유전자로부터 획득된다.
제어 서열은 또한 폴리아데닐화 서열, 변이체-암호화 서열의 3' 말단에 작동가능하게 연결되고, 전사되는 경우, 전사 mRNA에 폴리아데노신 잔기를 부가하기 위한 신호로서 숙주 세포에 의해 인지되는 서열일 수 있다. 숙주 세포에서 기능성인 임의의 폴리아데닐화 서열이 사용될 수 있다.
사상 진균 숙주 세포에 바람직한 폴리아데닐화 서열은 아스페르길루스 니둘란스 안트라닐레이트 신타아제, 아스페르길루스 니게르 글루코아밀라아제, 아스페르길루스 니게르 알파-글루코시다아제, 아스페르길루스 오리자에 TAKA 아밀라아제, 및 푸사리움 옥시스포룸 트립신-유사 프로테아제에 대한 유전자로부터 획득된다.
효모 숙주 세포에 유용한 폴리아데닐화 서열은 문헌[Guo and Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990]에 의해 기술된다.
제어 서열은 또한 변이체의 N 말단에 연결되는 신호 펩티드를 암호화하고, 변이체를 세포의 분비 경로로 지시하는 신호 펩티드 암호화 영역일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열의 암호화 서열의 5' 말단은 변이체를 암호화하는 암호화 서열의 세그먼트와, 번역 리딩 프레임으로 자연적으로 연결되어 있는 신호 펩티드 암호화 서열을 본래부터 함유할 수 있다. 다르게는, 암호화 서열의 5' 말단은 암호화 서열에 외래인 신호 펩티드 암호화 서열을 함유할 수 있다. 외래 신호 펩티드 암호화 서열은 암호화 서열이 신호 펩티드 암호화 서열을 자연적으로 함유하지 않는 경우에 필요할 수 있다. 다르게는, 외래 신호 펩티드 암호화 서열은 변이체의 분비를 향상시키기 위해서 자연 신호 펩티드 암호화 서열을 단순히 대체할 수 있다. 그러나, 발현된 변이체를 숙주 세포의 분비 경로로 지시하는, 임의의 신호 펩티드 암호화 서열이 사용될 수 있다.
박테리아 숙주 세포에 효과적인 신호 펩티드 암호화 서열은 바실러스 NCIB 11837 말토제닉 아밀라아제, 바실러스 리케니포르미스 서브틸리신, 바실러스 리케니포르미스 베타-락타마아제, 바실러스 스테아로써모필루스 알파-아밀라아제, 바실러스 스테아로써모필루스 중성 프로테아제(nprT, nprS, nprM) 및 바실러스 서브틸리스 prsA이다. 추가의 신호 펩티드는 문헌[Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137]에 의해 기술되어 있다.
사상 진균 숙주 세포에 효과적인 신호 펩티드 암호화 서열은 아스페르길루스 니게르 중성 아밀라아제, 아스페르길루스 니게르 글루코아밀라아제, 아스페르길루스 오리자에 TAKA 아밀라아제, 휴미콜라 인솔렌스(Humicola insolens) 셀룰라아제, 휴미콜라 인솔렌스 엔도글루카나아제 V, 휴미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa) 리파아제 및 리조무코르 미에헤이 아스파르트산 프로테이나아제에 대한 유전자로부터 획득되는 신호 펩티드 암호화 서열이다.
효모 숙주 세포에 유용한 신호 펩티드는 사카로마이세스 세레비지애 알파-인자 및 사카로마이세스 세레비지애 인버타아제(invertase)에 대한 유전자로부터 획득된다. 다른 유용한 신호 펩티드 암호화 서열은 상기 문헌[Romanos et al., 1992]에 기술되어 있다.
제어 서열은 또한 변이체의 N 말단에 위치된 프로펩티드를 암호화하는 프로펩티드 암호화 서열일 수 있다. 생성된 폴리펩티드는 전구효소(proenzyme) 또는 프로폴리펩티드(또는 일부 경우에 치모겐)로서 알려져 있다. 프로폴리펩티드는 일반적으로 불활성이고 프로폴리펩티드로부터 프로펩티드의 촉매적 또는 자가촉매적 절단에 의해 활성 폴리펩티드로 전환될 수 있다. 프로펩티드 암호화 서열은 바실러스 서브틸리스 알칼리성 프로테아제(aprE), 바실러스 서브틸리스 중성 프로테아제(nprT), 마이셀리옵토라 써모필라(Myceliophthora thermophila) 락카아제(laccase)(WO 95/33836호), 리조무코르 미에헤이 아스파르트산 프로테이나아제 및 사카로마이세스 세레비지애 알파-인자에 대한 유전자로부터 획득될 수 있다.
신호 펩티드 및 프로펩티드 서열 둘 모두가 존재 하는 경우, 프로펩티드 서열은 변이체의 N-말단 다음에 위치되며, 신호 펩티드 서열은 프로펩티드 서열의 N-말단 다음에 위치된다.
또한 숙주 세포의 성장에 대하여 변이체의 발현을 조절하는 조절 서열을 부가하는 것이 바람직할 수 있다. 조절 시스템의 예는 조절 화합물의 존재를 포함하는 화학적 또는 물리적 자극에 반응하여 유전자의 발현이 턴 온(turn on)되거나 턴 오프(turn off)되게 하는 것이다. 원핵 시스템 내 조절 시스템은 lac, tac, 및 trp 오퍼레이터 시스템을 포함한다. 효모에서, ADH2 시스템 또는 GAL1 시스템이 사용될 수 있다. 사상 진균에서, 아스페르길루스 니게르 글루코아밀라아제 프로모터, 아스페르길루스 오리자에 TAKA 알파-아밀라아제 프로모터 및 아스페르길루스 오리자에 글루코아밀라아제 프로모터가 사용될 수 있다. 조절 서열의 다른 예는 유전자 증폭을 가능하게 하는 것이다. 진핵 시스템에서, 이들 조절 서열은 메토트렉세이트의 존재 하에서 증폭되는 디히드로폴레이트 환원효소 유전자, 및 중금속과 함께 증폭되는 메탈로티오네인 유전자를 포함한다. 이들 경우에, 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 조절 서열과 작동가능하게 연결될 것이다.
발현 벡터
본 발명은 또한 본 발명의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 프로모터, 및 전사 및 번역 종결 신호를 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다. 다양한 뉴클레오티드 및 제어 서열은 함께 결합되어 1개 이상의 편리한 제한 부위를 포함할 수 있는 재조합 발현 벡터를 생성하여, 이러한 부위에서 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 삽입 또는 치환을 가능하게 할 수 있다. 다르게는, 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 작제물을 발현에 적절한 벡터에 삽입함으로써 발현될 수 있다. 발현 벡터의 생성에 있어서, 암호화 서열은 벡터에 위치되어 암호화 서열이 발현을 위한 적절한 제어 서열과 작동가능하게 연결되게 한다.
재조합 발현 벡터는 편리하게 재조합 DNA 과정으로 처리될 수 있고 폴리뉴클레오티드의 발현을 초래할 수 있는 임의의 벡터(예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스)일 수 있다. 벡터의 선택은 전형적으로 벡터와 벡터가 도입되어야 하는 숙주 세포의 양립가능성에 좌우될 것이다. 벡터는 선형 또는 폐환 플라스미드일 수 있다.
벡터는 자가 복제 벡터, 즉 그 복제가 염색체 복제에 독립적인 염색체외 엔티티(entity), 예컨대 플라스미드, 염색체외 요소, 미니염색체, 또는 인공 염색체로서 존재하는 벡터일 수 있다. 이 벡터는 자가-복제를 보장하기 위한 임의의 수단을 함유할 수 있다. 다르게는, 벡터는 숙주 세포에 도입되었을 때 게놈에 통합되어 통합된 염색체(들)와 함께 복제되는 것일 수 있다. 또한, 단일 벡터 또는 플라스미드, 또는 숙주 세포의 게놈에 도입될 전체 DNA를 함께 함유하는 둘 이상의 벡터 또는 플라스미드, 또는 트랜스포존이 사용될 수 있다.
벡터는 바람직하게는 형질전환되거나, 트랜스펙션되거나, 형질도입된 등등의 세포의 용이한 선택을 가능하게 하는 1개 이상의 선택가능한 마커를 함유한다. 선택가능한 마커는 그 산물이 살균 또는 바이러스 내성, 중금속 내성, 영양 요구 균주에 대한 독립영양성 등을 제공하는 유전자이다.
박테리아의 선택가능한 마커의 예는 바실러스 리케니포르미스 또는 바실러스 서브틸리스 dal 유전자, 또는 항생제 내성, 예를 들어 앰피실린, 클로람페니콜, 카나마이신, 네오마이신, 스펙티노마이신 또는 테트라사이클린 내성을 부여하는 마커이다. 효모 숙주 세포에 적합한 마커는 ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, 및 URA3을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 사상 진균 숙주 세포에서의 사용을 위한 선택가능한 마커는, 제한되는 것은 아니지만, amdS(아세트아미다아제), argB(오르니틴 카르바모일트랜스퍼라아제), bar(포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라아제), hph(하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제) niaD(질산염 환원효소), pyrG(오로티딘-5'-포스페이트 데카르복실라아제), sC(술페이트 아데닐트랜스퍼라아제), 및 trpC(안트라닐레이트 신타아제) 및 그들의 동등물을 포함한다. 아스페르길루스 니둘란스 또는 아스페르길루스 오리자에 amdS 및 pyrG 유전자, 및 스트렙토마이세스 하이그로스코피커스(Streptomyces hygroscopicus) bar 유전자는 아스페르길루스 세포에서 사용하기에 바람직하다.
벡터는 바람직하게는 숙주 세포의 게놈으로의 벡터의 통합 또는 세포에서의 게놈과 독립적인 벡터의 자가 복제를 가능하게 하는 요소(들)를 함유한다.
숙주 세포 게놈으로의 통합을 위해, 벡터는 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 서열 또는 상동성 또는 비상동성 재조합에 의한 게놈으로의 통합을 위한 벡터의 임의의 다른 요소에 의존할 수 있다. 다르게는, 벡터는 염색체(들)의 정확한 위치(들)에서 숙주 세포의 게놈으로의 상동성 재조합에 의한 통합을 지시하기 위한 추가의 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 정확한 위치에서의 통합 가능성을 증가시키기 위해서, 통합 요소는 상응하는 표적 서열과 높은 정도의 동일성을 가지는 충분한 개수의 핵산, 예를 들어 100 내지 10,000개 염기쌍, 바람직하게는 400 내지 10,000개 염기쌍, 800 내지 10,000개 염기쌍을 함유해야 하며, 이로써 상동성 재조합의 가능성이 증진된다. 통합 요소는 숙주 세포의 게놈에서 표적 서열과 상동성인 임의의 서열일 수 있다. 추가로, 통합 요소는 비-암호화 또는 암호화 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 반면에, 벡터는 비-상동성 재조합에 의해 숙주 세포의 게놈으로 통합될 수 있다.
자가 복제를 위해, 벡터는 대상 숙주 세포에서 벡터가 자가 복제할 수 있도록 하는 복제 원점을 더 포함할 수 있다. 복제 원점은 세포에서 기능하는 자가 복제를 매개하는 임의의 플라스미드 레플리케이터(replicator)일 수 있다. 용어 "복제 원점" 또는 "플라스미드 레플리케이터"는 플라스미드 또는 벡터가 생체 내에서 복제되게 하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
박테리아 복제 원점의 예에는 에스케리키아 콜라이에서 복제를 가능하게 하는 플라스미드 pBR322, pUC19, pACYC177 및 pACYC184의 복제 원점, 및 바실러스에서 복제를 가능하게 하는 pUB110, pE194, pTA1060 및 pAMβ1의 복제 원점이 있다.
효모 숙주 세포에서 사용하기 위한 복제 원점의 예에는 2 미크론 복제 원점, ARS1, ARS4, ARS1 및 CEN3의 조합, 및 ARS4 및 CEN6의 조합이 있다.
사상 진균 세포에서 유용한 복제 원점의 예에는 AMA1 및 ANS1(문헌[Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67]; 문헌[Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175]; WO 00/24883호)이 있다. AMA1 유전자의 단리 및 유전자를 포함하는 플라스미드 또는 벡터의 구축은 WO 00/24883호에 개시된 방법에 따라 달성될 수 있다.
1 카피 초과의 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 변이체의 생성을 증가시키기 위해 숙주 세포에 삽입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 카피수의 증가는 1개 이상의 추가의 카피의 서열을 숙주 세포 게놈 내로 통합시킴으로써 또는 증폭가능한 선택가능 마커 유전자를 폴리뉴클레오티드에 포함시킴으로써 획득될 수 있으며, 여기서, 증폭된 카피의 선택가능한 마커 유전자를 함유하는 세포 및 이에 따라 추가의 카피의 폴리뉴클레오티드는 적절한 선택가능한 작용제의 존재 하에 세포를 배양함으로써 선택될 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터를 구축하기 위한 상기 기술된 요소를 라이게이션시키기 위해 사용되는 절차는 본 발명이 속하는 분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있다(예를 들어, 상기 문헌[Sambrook et al., 1989] 참조).
숙주 세포
본 발명은 또한 본 발명의 변이체의 생성을 지시하는 1개 이상의 제어 서열에 작동가능하게 연결된 본 발명의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드를 포함하는 작제물 또는 벡터는 숙주 세포에 도입되어 작제물 또는 벡터가 앞서 설명된 바와 같은 염색체 통합물로서 또는 자가-복제 염색체외 벡터로서 유지되게 한다. 용어 "숙주 세포"는 복제 동안 일어나는 돌연변이에 기인하여 모 세포와 동일하지 않은 모 세포의 임의의 자손을 포함한다. 숙주 세포의 선택은 변이체 및 그의 공급원을 암호화하는 유전자에 크게 좌우될 것이다.
숙주 세포는 변이체의 재조합 생성에 유용한 임의의 세포, 예를 들어, 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다.
원핵 숙주 세포는 임의의 그램-양성 또는 그램-음성 박테리아일 수 있다. 그램-양성 박테리아에는 바실러스, 클로스트리듐, 엔테로코커스, 게오바실러스, 락토바실러스, 락토코커스, 오세아노바실러스, 스타필로코커스, 스트렙토코커스 및 스트렙토마이세스가 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 그램-음성 박테리아에는 캄필로박터, 에스케리키아 콜라이, 플라보박테리움, 푸소박테리움, 헬리코박터, 일리오박터, 네이세리아, 슈도모나스, 살모넬라 및 유레아플라스마가 포함되나 이들에 한정되지 않는다.
박테리아 숙주 세포는 바실러스 알칼로필러스, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스, 바실러스 브레비스, 바실러스 서큘란스, 바실러스 클라우시이, 바실러스 코아굴란스, 바실러스 퍼무스, 바실러스 라우투스, 바실러스 렌투스, 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 메가테리움, 바실러스 푸밀러스, 바실러스 스테아로써모필루스, 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 투린지엔시스 세포를 포함하나 이들에 한정되지 않는 임의의 바실러스 세포일 수 있다.
또한, 박테리아 숙주 세포는 스트렙토코커스 에퀴시밀리스(Streptococcus equisimilis), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 유베리스(Streptococcus uberis) 및 스트렙토코커스 에퀴(Streptococcus equi) 하위종 주에피데미쿠스(Zooepidemicus) 세포를 포함하나 이들에 한정되지 않는 임의의 스트렙토코커스 세포일 수 있다.
박테리아 숙주 세포는 또한 스트렙토마이세스 아크로모게네스(Streptomyces achromogenes), 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis), 스트렙토마이세스 코엘리콜라, 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 및 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 세포를 포함하나 이들에 한정되지 않는 스트렙토마이세스 세포일 수 있다.
바실러스 세포로의 DNA의 도입은, 원형질체 형질전환(예를 들어, 문헌[Chang and Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115] 참조), 컴피턴트(competent) 세포 형질전환(예를 들어, 문헌[Young and Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829], 또는 문헌[Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221] 참조), 전기천공법(예를 들어, 문헌[Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751] 참조), 또는 컨쥬게이션(예를 들어, 문헌[Koehler and Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278] 참조)에 의해 달성될 수 있다. 에스케리키아 콜라이 세포로의 DNA의 도입은 원형질체 형질전환(예를 들어, 문헌[Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580] 참조) 또는 전기천공법(예를 들어, 문헌[Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145] 참조)에 의해 달성될 수 있다. 스트렙토마이세스 세포로의 DNA의 도입은 원형질체 형질전환, 전기천공법(예를 들어, 문헌[Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405] 참조), 컨쥬게이션(예를 들어, 문헌[Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585] 참조) 또는 형질도입(예를 들어, 문헌[Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294] 참조)에 의해 달성될 수 있다. 슈도모나스 세포로의 DNA의 도입은 전기천공법(예를 들어, 문헌[Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397] 참조) 또는 컨쥬게이션(예를 들어, 문헌[Pinedo and Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57] 참조)에 의해 달성될 수 있다. 스트렙토코커스 세포로의 DNA의 도입은 자연 수용능(예를 들어, 문헌[Perry and Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297] 참조), 원형질체 형질전환(예를 들어, 문헌[Catt and Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207] 참조), 전기천공법(예를 들어, 문헌[Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804] 참조) 또는 컨쥬게이션(예를 들어, 문헌[Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436] 참조)에 의해 달성될 수 있다. 그러나, 숙주 세포로 DNA를 도입하기 위한 본 발명이 속하는 분야에 알려져 있는 임의의 방법이 사용될 수 있다.
숙주 세포는 또한 포유동물, 곤충, 식물 또는 진균 세포와 같은 진핵생물일 수 있다.
숙주 세포는 진균 세포일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "진균"은 자낭균문, 담자균문, 통곰팡이문 및 접합균문뿐 아니라 난균문 및 모든 불완전 진균류를 포함한다(문헌[Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK]에 정의됨).
진균 숙주 세포는 효모 세포일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "효모"는 자낭포자형성(ascosporogenous) 효모(엔도마이세탈레스(Endomycetales)), 담자포자(basidiosporogenous) 효모 및 불완전 진균류(Fungi imperfecti)(블라스토마이세테스(Blastomycetes))에 속하는 효모를 포함한다. 효모의 분류는 장래에 변화할 수도 있기 때문에, 본 발명의 목적을 위해, 효모는 문헌[Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, and Davenport, editors, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980)]에 설명된 바와 같이 정의될 것이다.
효모 숙주 세포는 칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 사카로마이세스(Saccharomyces), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 또는 야로위아(Yarrowia) 세포, 예를 들어, 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 사카로마이세스 칼스베르겐시스(Saccharomyces carlsbergensis), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 디아스타티쿠스(Saccharomyces diastaticus), 사카로마이세스 도우글라시이(Saccharomyces douglasii), 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 사카로마이세스 노르벤시스(Saccharomyces norbensis), 사카로마이세스 오비포르미스(Saccharomyces oviformis) 또는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 세포일 수 있다.
진균 숙주 세포는 사상 진균 세포일 수 있다. "사상 진균"은 진균문 및 난균문 아문의 모든 사상 형태를 포함한다(상기 문헌[Hawksworth et al., 1995]에 정의된 바와 같음). 사상 진균은 일반적으로, 키틴, 셀룰로스, 글루칸, 키토산, 만난 및 그 밖의 복합 다당류로 이루어진 균사 벽을 특징으로 한다. 영양 성장은 균사 신장에 의한 것이며, 탄소이화는 절대적으로 호기성이다. 대조적으로, 효모, 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애에 의한 영양 성장은 단세포 엽상체(thallus)의 발아에 의한 것이며, 탄소이화는 발효성일 수 있다.
사상 진균 숙주 세포는 아크레모늄(Acremonium), 아스페르길루스, 아우레오바시듐(Aureobasidium), 비어칸데라(Bjerkandera), 세리포리옵시스(Ceriporiopsis), 크리소스포리움(Chrysosporium), 코프리누스(Coprinus), 코리올루스(Coriolus), 크립코코커스(Cryptococcus), 필리바시듐(Filibasidium), 푸사리움, 휴미콜라, 마그나포르테(Magnaporthe), 무코르(Mucor), 마이셀리옵토라, 네오칼리마스틱스(Neocallimastix), 뉴로스포라(Neurospora), 파에실로마이세스(Paecilomyces), 페니실리움, 파네로차에테(Phanerochaete), 플레비아(Phlebia), 피로마이세스(Piromyces), 플레우로투스(Pleurotus), 스키조필룸(Schizophyllum), 탈라로마이세스(Talaromyces), 써모아스쿠스(Thermoascus), 티엘라비아(Thielavia), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 트라메테스(Trametes) 또는 트리코데르마 세포일 수 있다.
예를 들어, 사상 진균 숙주 세포는 아스페르길루스 아와모리, 아스페르길루스 포에티두스(Aspergillus foetidus), 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스페르길루스 야포니쿠스(Aspergillus japonicus), 아스페르길루스 니둘란스, 아스페르길루스 니게르, 아스페르길루스 오리자에, 비어칸데라 아두스타(Bjerkandera adusta), 세리포리옵시스 아네이리나(Ceriporiopsis aneirina), 세리포리옵시스 카레기에나(Ceriporiopsis caregiea), 세리포리옵시스 길베센스(Ceriporiopsis gilvescens), 세리포리옵시스 판노신타(Ceriporiopsis pannocinta), 세리포리옵시스 리불로사(Ceriporiopsis rivulosa), 세리포리옵시스 서브루파(Ceriporiopsis subrufa), 세리포리옵시스 서브베르미스포라(Ceriporiopsis subvermispora), 크리소스포리움 이놉스(Chrysosporium inops), 크리소스포리움 케라티노필룸(Chrysosporium keratinophilum), 크리소스포리움 루크노웬스(Chrysosporium lucknowense), 크리소스포리움 메르다리움(Chrysosporium merdarium), 크리소스포리움 판니콜라(Chrysosporium pannicola), 크리소스포리움 퀸스란디쿰(Chrysosporium queenslandicum), 크리소스포리움 트로피쿰(Chrysosporium tropicum), 크리소스포리움 조나툼(Chrysosporium zonatum), 코프리누스 시네레우스(Coprinus cinereus), 코리올루스 히르수투스(Coriolus hirsutus), 푸사리움 박트리디오이데스(Fusarium bactridioides), 푸사리움 세레알리스(Fusarium cerealis), 푸사리움 크루크웰렌스(Fusarium crookwellense), 푸사리움 쿨모룸(Fusarium culmorum), 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸사리움 그라미눔(Fusarium graminum), 푸사리움 헤테로스포룸(Fusarium heterosporum), 푸사리움 네군디(Fusarium negundi), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 푸사리움 레티쿨라툼(Fusarium reticulatum), 푸사리움 로세움(Fusarium roseum), 푸사리움 삼부시눔(Fusarium sambucinum), 푸사리움 사로크로움(Fusarium sarcochroum), 푸사리움 스포로트리키오이데스(Fusarium sporotrichioides), 푸사리움 설푸레움(Fusarium sulphureum), 푸사리움 토룰로숨(Fusarium torulosum), 푸사리움 트리코테시오이데스(Fusarium trichothecioides), 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum), 휴미콜라 인솔렌스(Humicola insolens), 휴미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa), 무코르 미에헤이, 마이셀리옵토라 써모필라, 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 페니실리움 푸르푸로게눔(Penicillium purpurogenum), 파네로차에테 크리소스포리움(Phanerochaete chrysosporium), 플레비아 라디아타(Phlebia radiata), 플레우로투스 에린지이(Pleurotus eryngii), 티엘라비아 테레스트리스(Thielavia terrestris), 트라메테스 빌로사(Trametes villosa), 트라메테스 베르시콜라(Trametes versicolor), 트리코데르마 하지아눔(Trichoderma harzianum), 트리코데르마 코닌지이(Trichoderma koningii), 트리코데르마 론지브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum), 트리코데르마 리세이 또는 트리코데르마 비리데(Trichoderma viride) 세포일 수 있다.
진균 세포는 공지된 방식 그대로 원형질체 형성, 원형질체의 형질전환, 및 세포벽의 재생을 수반하는 과정에 의해 형질전환될 수 있다. 아스페르길루스 및 트리코데르마 숙주 세포의 형질전환에 적합한 방법은 EP 238023호, 문헌[Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474] 및 문헌[Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422]에 기술되어 있다. 푸사리움 종의 형질전환을 위한 적합한 방법은 문헌[Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156] 및 WO 96/00787호에 기술되어 있다. 효모는 문헌[Becker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163]; 및 문헌[Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920]에 의해 기술된 절차를 사용하여 형질전환될 수 있다.
생성 방법
본 발명은 또한 (a) 본 발명의 숙주 세포를 변이체의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계; 및 (b) 변이체를 회수하는 단계를 포함하는 변이체의 생성 방법에 관한 것이다.
숙주 세포는 본 발명이 속하는 분야에 공지되어 있는 방법을 사용한 변이체의 생성에 적합한 영양 배지에서 배양된다. 예를 들어, 세포는 적합한 배지 중에서 수행된 실험실 또는 산업적 발효조에서 그리고 변이체가 발현 및/또는 단리되게 하는 조건 하에서 진탕 플라스크 배양, 또는 소-규모 또는 대-규모 발효(연속, 회분식, 유가식, 또는 고체상 발효)에 의해 배양될 수 있다. 배양은 본 발명이 속하는 분야에 공지된 절차를 사용하여, 탄소 및 질소원 및 무기염을 포함하는 적합한 영양 배지에서 일어난다. 적합한 배지는 상업적 공급처로부터 입수가능하거나 또는 공개된 조성(예를 들어, ATCC(Amencan Type Culture Collection)의 카탈로그)에 따라 제조될 수 있다. 변이체가 영양 배지 내로 분비된다면, 변이체는 배지로부터 직접 회수될 수 있다. 변이체가 분비되지 않는다면, 이는 세포 용해물로부터 회수될 수 있다.
변이체는 변이체에 대해 특이적인 본 발명이 속하는 분야에 공지되어 있는 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 효소 검정을 사용하여 변이체의 활성을 결정할 수 있다.
변이체는 본 발명이 속하는 분야에 알려져 있는 방법을 사용하여 회수될 수 있다. 예를 들어, 변이체는 수집, 원심분리, 여과, 추출, 분무-건조, 증발 또는 침전을 포함하나 이들에 한정되지 않는 통상적인 절차에 의해 영양 배지로부터 회수될 수 있다.
변이체는, 제한되는 것은 아니지만, 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화성, 소수성, 크로마토포커싱(chromatofocusing), 및 크기 배제), 전기영동 절차(예를 들어, 예비 등전점 전기영동), 분별 용해성(예를 들어, 황산암모늄 침전), SDS-PAGE 또는 추출(예를 들어, 문헌[Protein Purification, Janson and Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989] 참조)을 포함하는 본 발명이 속하는 분야에 공지된 다양한 절차에 의해 정제되어 실질적으로 순수한 변이체를 획득할 수 있다.
대안적인 양태에서, 변이체는 회수되지 않고, 오히려 변이체를 발현하는 본 발명의 숙주 세포는 변이체의 공급원으로 사용된다.
조성물
본 발명은 또한 알파-아밀라아제 변이체 및 1개 이상의 추가의 효소를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 추가의 효소(들)는 베타-아밀라아제, 셀룰라아제(베타글루코시다아제, 셀로비오히드롤라아제 및 엔도글루카나아제), 글루코아밀라아제, 헤미셀룰라아제(예를 들어, 자일라아나제), 아이소아밀라아제, 아이소머라아제, 리파아제, 피타아제, 프로테아제, 풀룰라나아제 및/또는 알파-아밀라아제와 함께 상업적 과정에서 유용한 그 밖의 효소로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 추가의 효소는 제2 알파-아밀라아제일 수도 있다. 이러한 효소는 전분 가공, 당 전환, 알콜 및 그 밖의 유용한 최종-산물을 위한 발효, 상용의 세제 및 세정 보조제, 얼룩 제거, 패브릭 처리 또는 호발 등의 분야에 알려져 있다.
용도
본 발명의 변이체는 가치있는 특성을 가져, 다양한 산업적 응용을 가능하게 한다. 특히, 변이체는 세제, 특히 세탁 세제 조성물 및 식기세척 세제 조성물, 경질 표면 세정 조성물, 그리고 직물, 패브릭 또는 의류의 호발을 위하여, 펄프 및 종이의 생성, 비어(beer) 제조, 에탄올 생성 및 전분 전환 공정에 사용될 수 있다.
알파-아밀라아제 변이체는 전분 공정, 특히 전분 전환, 특별히는 전분의 액화에 사용될 수 있다(예를 들어, 본 명세서에 모두 참조로 포함되는 미국 특허 제3,912,590호, EP 252730호 및 EP 063909호, WO 99/19467호 및 WO 96/28567호 참조). 또한 본 발명의 변이체 이외에, AMG, 풀룰라나아제 및 그 밖의 알파-아밀라아제도 또한 포함할 수 있는 전분 전환 목적을 위한 조성물이 고려된다.
추가로, 변이체는 전분 또는 전곡으로부터의 감미료 및 에탄올(예를 들어, 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 제5,231,017호 참조), 예를 들어, 연료, 에탄올 음료 및 산업용 에탄올의 생성에 특히 유용하다.
변이체는 직물, 패브릭 및 의류의 호발(예를 들어, 본 명세서에 참조로 포함되는 WO 95/21247호, 미국 특허 제4,643,736호 및 EP 119920호 참조), 비어 제조 또는 브루잉을 위해, 그리고 펄프 및 종이 제조 또는 관련 공정에 사용될 수 있다.
전분 처리
천연의 전분은 실온에서 수불용성인 미세 과립으로 구성된다. 수성 전분 슬러리를 가열할 경우, 과립이 팽창하여 결국에는 파열하여, 전분 분자들이 용액 중에 분산된다. 이러한 "젤라틴화" 공정 동안 점도가 급격히 증가한다. 전형적인 산업 공정에서 고체 수준이 30-40% 이므로, 전분이 적절하게 처리될 수 있게 하기 위해서 묽게 하거나 또는 "액화"해야 한다. 오늘날 이러한 점도의 감소는 현재의 상용의 실시에서 주로 효소적 분해로 달성한다.
통상적인 전분-전환 공정, 예를 들어, 액화 및 당화 공정은 예를 들어, 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 제3,912,590호 및 EP 252730호 및 EP 063909호에 기술되어 있다.
일 구현예에서, 전분을 보다 저 분자량의 탄수화물 성분, 예를 들어, 당 또는 지방 대체물(replacer)로 분해하는 전환 공정은 탈분지 단계를 포함한다.
전분을 당으로 전환하는 경우에, 전분은 탈중합화된다. 이러한 탈중합 공정은 예를 들어, 사전-처리 단계 및 2개 또는 3개의 연속 공정 단계, 즉, 액화 공정, 당화 공정 및 요망되는 최종 산물에 따라, 선택적인 이성체화 공정으로 구성된다.
요망되는 최종 당 산물이 예를 들어, 고 프룩토스 시럽인 경우, 덱스트로스 시럽이 프룩토스로 전환될 수 있다. 당화 공정 후에, pH는 6 내지 8 범위의 값, 예를 들어, pH 7.5로 증가되고, 칼슘은 이온 교환에 의해 제거된다. 덱스트로스 시럽은 이어서 고정화 글루코스 아이소머라제를 사용하여 고 프룩토스 시럽으로 전환된다.
발효 산물의 생성
일반적으로, 전곡으로부터의 알콜 생성(에탄올)은 4가지 주요 단계로 분리될 수 있다: 제분, 액화, 당화 및 발효.
곡물은 구조를 개방하여 추가 가공을 가능하게 하기 위해 제분된다. 이용되는 2가지 공정은 습식 또는 건식 제분이다. 건식 제분에서는, 전립(whole kernel)을 제분하여 이를 나머지 공정의 부분에서 사용한다. 습식 제분은 배아 및 거친가루(meal)(전분 과립 및 단백질)를 매우 양호하게 단리하는데, 일부 예외가 있으나, 시럽이 병행 제조되는 위치에 적용된다.
액화 공정에서, 전분 과립은 가수분해에 의해 대부분 DP가 4를 초과하는 말토덱스트린으로 가용화된다. 가수분해는 산 처리에 의해 또는 알파-아밀라아제에 의해 효소적으로 수행될 수 있다. 제한적으로는 산 가수분해가 사용된다. 원료는 제분된 전곡 또는 전분 가공에서의 측류(side stream)일 수 있다.
전형적인 효소에 의한 액화 동안, 장쇄 전분은 알파-아밀라아제에 의해 분지형 및 선형의 보다 짧은 단위(말토덱스트린)로 분해된다. 효소에 의한 액화는 일반적으로 3 단계 고온 슬러리 공정으로 수행된다. 슬러리는 60 내지 95℃(예를 들어, 77 내지 86℃, 80 내지 85℃ 또는 83 내지 85℃)로 가열되며, 효소(들)가 첨가된다. 액화 공정은 1 내지 2시간 동안 85℃에서 수행된다. pH는 일반적으로 5.5 내지 6.2이다. 이들 조건 하에서 최적의 효소 안정성을 보장하기 위하여, 1 mM의 칼슘이 첨가된다(약 40 ppm의 유리 칼슘 이온을 제공하기 위해). 이러한 처리 후에, 액화된 전분은 10 내지 15의 "덱스트로오스 당량"(DE)을 가질 것이다.
슬러리는 이후에 95 내지 140℃, 예를 들어, 105 내지 125℃에서 제트 쿠킹(jet cooking)하고, 60 내지 95℃로 냉각시킨 후, 효소(들)를 더 첨가하여 최종 가수분해를 달성한다. 액화 공정은 pH 4.5 내지 6.5, 전형적으로 5 내지 6의 pH에서 실시한다. 제분 및 액화된 곡물은 또한 매시(mash)로도 알려져 있다.
액화된 전분-함유 물질은 당화 효소, 예를 들어, 글루코아밀라아제의 존재 하에 당화된다. 당화 공정은 12시간 내지 120시간(예를 들어, 12시간 내지 90시간, 12 내지 60시간 및 12 내지 48시간) 동안 지속될 수 있다.
그러나, 30 내지 65℃, 전형적으로 약 60℃의 온도에서 약 30분 내지 2시간(예를 들어, 30 내지 90분) 동안 전-당화(pre-saccharification) 단계에 이어서, 동시당화발효(SSF)로 지칭되는 발효 동안 완전한 당화를 수행하는 것이 통상적이다. pH는 통상 4.2 내지 4.8, 예를 들어, pH 4.5이다. 동시발효당화(SSF) 공정에서, 당화를 위한 유지 단계가 존재 하지 않고, 오히려 효모와 효소를 함께 첨가한다.
전형적인 당화 공정에서, 액화 동안 생성되는 말토덱스트린은 글루코아밀라아제 및 탈분지화 효소, 예를 들어, 아이소아밀라아제(미국 특허 제4,335,208호) 또는 풀룰라나아제를 첨가함으로써 덱스트로스로 전환된다. 온도는 글루코아밀라아제 및 탈분지화 효소의 첨가 전에, 60℃로 낮춘다. 당화 공정은 24 내지 72시간 동안 진행한다.
당화 효소의 첨가 전에, pH를 4.5 미만으로 감소시키면서, 고온(95℃ 초과)을 유지하여, 액화 알파-아밀라아제를 불활성화시킨다. 이러한 공정은 탈분지화 효소에 의해 적절히 가수분해될 수 없는 "파노스(panose) 전구체"로 불리는 짧은 올리고당의 형성을 감소시킨다. 보통, 당화 산물의 약 0.2 내지 0.5%는 풀룰라나아제에 의해 분해될 수 없는 분지형 삼당류인 파노스(Glc pαl-6Glc pαl-4Glc)이다. 액화 유래의 활성 아밀라아제가 당화 동안 존재한다면(즉, 변성이 일어나지 않는다면), 파노오스의 양은 1 내지 2%만큼 높을 수 있으며, 이는 당화 수율을 상당히 저하시키기 때문에, 매우 바람직하지 않다.
발효가능한 당(예를 들어, 덱스트린, 단당류, 특히 글루코오스)은 효소에 의한 당화로부터 생성된다. 이들 발효가능한 당은 추가로 정제되고/거나 유용한 당 산물로 전환될 수 있다. 또한, 당은 최종 산물, 예를 들어, 알콜(예를 들어, 에탄올 및 부탄올), 유기산(예를 들어, 석신산 및 락트산), 당 알콜(예를 들어, 글리세롤), 아스코르브산 중간체(예를 들어, 글루코네이트, 2-케토-D-글루코네이트, 2,5-디케토-D-글루코네이트 및 2-케토-L-굴론산), 아미노산(예를 들어, 라이신), 단백질(예를 들어, 항체 및 그의 단편)을 생성하기 위한 미생물 발효 공정에서의 발효 공급원료로 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 액화 공정 단계 동안 수득되는 발효가능한 당을 사용하여, 알콜 및 특히 에탄올을 생성한다. 에탄올 생성에서, SSF 공정이 흔히 사용되며, 여기서, 당화 효소 및 발효 유기체(예를 들어, 효모)는 함께 첨가된 다음, 30 내지 40℃의 온도에서 수행된다.
발효에 사용되는 유기체는 요망되는 최종 산물에 따라 달라질 것이다. 전형적으로, 에탄올이 요망되는 최종 산물이면, 효모는 발효 유기체로 사용될 것이다. 일부 바람직한 구현예에서, 에탄올-생성 미생물은 효모이며, 구체적으로는 사카로마이세스, 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애의 균주이다(미국 특허 제4,316,956호). 다양한 사카로마이세스 세레비지애는 상업적으로 입수할 수 있으며, 이들은 FALI(Fleischmann's Yeast), SUPERSTART(Alltech), FERMIOL(DSM Specialties), RED STAR(Lesaffre) 및 Angel 알콜 효모(Angel Yeast Company, China)를 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 상기 방법에 사용되는 출발 효모의 양은 적합한 시간에 상업적으로 유의미한 양의 에탄올을 생성하기 위한(예를 들어, 72시간 미만의 시간에 25 내지 40% DS를 갖는 기질로부터 적어도 10%의 에탄올을 생성하기 위한) 유효량이다. 효모 세포는 일반적으로 발효 브로쓰 ㎖당 약 104 내지 약 1012, 바람직하게는 약 107 내지 약 1010개의 생존가능 효모의 양으로 공급된다. 효모를 매시에 첨가한 후에, 이를 전형적으로 약 24 내지 96시간, 예를 들어, 35 내지 60시간 동안 발효로 처리한다. 온도는 약 26 내지 34℃, 전형적으로 약 32℃이고, pH는 pH 3 내지 6, 예를 들어, 약 pH 4 내지 5이다.
발효물은 발효 미생물(예를 들어, 효모)에 더하여, 영양소 및 피타아제를 비롯한 추가의 효소를 포함할 수 있다. 발효에서의 효모의 용도는 본 발명이 속하는 분야에 널리 공지되어 있다.
추가의 구현예에서, 본 발명이 속하는 분야에 공지되어 있는 바와 같이, 적절한 발효 미생물의 이용은 예를 들어, 글리세롤, 1,3-프로판디올, 글루코네이트, 2-케토-D-글루코네이트, 2,5-디케토-D-글루코네이트, 2-케토-L-굴론산, 석신산, 락트산, 아미노산 및 그들의 유도체를 포함하는 발효 최종 산물을 야기할 수 있다. 더욱 구체적으로, 락트산이 요망되는 최종 산물인 경우, 락토바실러스 종(락토바실러스 카세이(L. casei))이 사용될 수 있으며; 글리세롤 또는 1,3-프로판디올이 요망되는 최종 산물인 경우, 에스케리키아 콜라이가 사용될 수 있고; 2-케토-D-글루코네이트, 2,5-디케토-D-글루코네이트 및 2-케토-L-굴론산이 요망되는 최종 산물인 경우, 판토에아 시트레아(Pantoea citrea)가 발효 미생물로 사용될 수 있다. 상기 열거된 목록은 오직 예일 뿐이며, 본 발명이 속한 분야의 기술자는 요망되는 최종 산물을 획득하기 위해 사용될 수 있는 다수의 발효 미생물을 알고 있을 것이다.
비겔라틴화 전분-함유 물질로부터의 발효 산물의 생성 방법
본 발명은 전분-함유 물질의 겔라틴화 없이(즉, 조리 없이) 전분-함유 물질로부터의 발효 산물의 생성 방법에 관한 것이다. 발효 산물, 예를 들어, 에탄올은 전분-함유 물질 및 물을 함유하는 수성 슬러리의 액화 없이 생성될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 방법은 (예를 들어, 제분된) 전분-함유 물질, 예를 들어, 과립형 전분을 초기 겔라틴화 온도 미만의 온도에서, 바람직하게는 알파-아밀라아제 및/또는 탄수화물원 생성 효소(들)의 존재 하에 당화시켜, 적합한 발효 유기체에 의해 발효 산물로 발효될 수 있는 당을 생성하는 것을 포함한다. 이러한 구현예에서, 요망되는 발효 산물, 예를 들어, 에탄올은 비겔라틴화된(즉, 비조리된), 바람직하게는 제분된 곡물, 예를 들어, 옥수수로부터 생성된다. 따라서, 제1 양태에서, 본 발명은 전분-함유 물질의 초기 겔라틴화 온도 미만의 온도에서, 탄수화물원 생성 효소 및 발효 유기체를 사용하여, 전분-함유 물질을 동시당화발효시키는 것을 포함하는 전분-함유 물질로부터의 발효 산물의 생성 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 프로테아제도 또한 존재한다. 프로테아제는 임의의 산 진균 프로테아제 또는 메탈로프로테아제일 수 있다. 발효 산물, 예를 들어, 에탄올은 선택적으로, 예를 들어, 증류에 의해 발효 후에 회수될 수 있다. 전형적으로, 아밀라아제(들), 예를 들어, 글루코아밀라아제(들) 및/또는 다른 탄수화물원 생성 효소 및/또는 알파-아밀라아제(들)는 발효 동안 존재한다. 글루코아밀라아제 및 다른 탄수화물원 생성 효소의 예에는 생녹말 가수분해 글루코아밀라아제가 포함된다. 알파-아밀라아제(들)의 예에는 산 알파-아밀라아제, 예를 들어, 산 진균 알파-아밀라아제가 포함된다. 발효 유기체의 예에는 효모, 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애의 균주가 포함된다. 용어 "초기 겔라틴화 온도"는 전분 겔라틴화가 시작되는 가장 낮은 온도를 의미한다. 일반적으로, 수 중에서 가열된 전분은 약 50℃ 내지 75℃에서 겔라틴화되기 시작하며; 겔라틴화의 정확한 온도는 특정 전분에 좌우되며, 숙련된 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 따라서, 초기 겔라틴화 온도는 식물 종, 특정 식물 종의 변종 및 성장 조건에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 주어진 전분-함유 물질의 초기 겔라틴화 온도는 문헌[Gorinstein and Lii, 1992, Starch/St44(12): 461-466]에 기재된 방법을 사용하여 5%의 전분 과립에서 복굴절이 소실되는 온도로 결정될 수 있다. 공정을 개시하기 전에, 전분-함유 물질의 슬러리, 예를 들어, 10 내지 55 w/w% 건조 고체(DS), 바람직하게는 25 내지 45 w/w% 건조 고체, 더욱 바람직하게는 30 내지 40 w/w% 건조 고체의 전분-함유 물질을 갖는 과립 전분이 제조될 수 있다. 슬러리는 물 및/또는 공정수, 예를 들어, 증류폐액(백세트(backset)), 집진수, 증발기 응축수 또는 증류수, 증류로부터의 사이드-스트리퍼 워터 또는 다른 발효 산물 공장으로부터의 공정수를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 초기 겔라틴화 온도 미만의 온도에서 수행되며, 이에 따라, 상당한 점도 증가가 발생하지 않으며, 필요에 따라 높은 수준의 증류폐액이 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 수성 슬러리는 약 1 내지 약 70 vol%, 바람직하게는 15 내지 60 vol%, 특히 약 30 내지 50 vol%의 물 및/또는 공정수, 예를 들어, 증류폐액(백세트), 집진수, 증발기 응축수 또는 증류수, 증류로부터의 사이드-스트리퍼 워터 또는 다른 발효 산물 공장으로부터의 공정수 또는 그들의 조합 등을 함유한다. 전분-함유 물질은 바람직하게는 건식 또는 습식 제분에 의해 입자 크기를 0.05 내지 3.0 ㎜, 바람직하게는 0.1 내지 0.5 ㎜로 감소시킴으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 방법으로 처리한 후에, 전분-함유 물질 중의 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 바람직하게는 적어도 99%의 건조 고체는 용해성 전분 가수분해물로 전환된다. 본 발명의 이러한 양태에서 방법은 초기 겔라틴화 온도 미만의 온도에서 행해지며, 이는 온도가 전형적으로 30 내지 75℃, 바람직하게는 45 내지 60℃ 범위에 있는 것을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 25℃ 내지 40℃, 예를 들어, 28℃ 내지 35℃, 예를 들어, 30℃ 내지 34℃, 바람직하게는 약 32℃의 온도에서 수행된다. 일 구현예에서, 상기 방법은 당 수준, 예를 들어, 글루코오스 수준이 낮은 수준, 예를 들어, 6 w/w% 미만, 예를 들어, 약 3 w/w% 미만, 예를 들어, 약 2 w/w% 미만, 예를 들어, 약 0.1 w/w% 미만, 예를 들어, 약 0.5 w/w% 미만 또는 약 0.25 w/w% 미만, 예를 들어 약 0.1 w/w% 미만으로 유지되도록 수행된다. 이러한 낮은 수준의 당은 단순히 조정된 양의 효소 및 발효 유기체를 사용함으로써 달성될 수 있다. 숙련된 기술자는 사용할 효소 및 발효 유기체의 용량/양을 용이하게 결정할 수 있다. 사용되는 효소 및 발효 유기체의 양은 또한 발효 브로쓰 중의 낮은 농도의 말토스를 유지하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 말토스 수준은 약 0.5 w/w% 미만, 예를 들어, 약 0.2 w/w% 미만으로 유지될 수 있다. 본 발명의 방법은 pH 약 3 내지 7, 바람직하게는 pH 3.5 내지 6, 또는 더욱 바람직하게는 pH 4 내지 5에서 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 발효는 6 내지 120시간, 특히 24 내지 96시간 동안 계속된다.
겔라틴화 전분-함유 물질로부터의 발효 산물의 생성 방법
이러한 양태에서, 본 발명은 전분-함유 물질로부터 발효 산물, 특히 에탄올을 생성하기 위한 방법에 관한 것이며, 이 방법은 액화 단계 및 순차적으로 또는 동시에 수행되는 당화 및 발효 단계를 포함한다. 결과적으로, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 전분-함유 물질로부터의 발효 산물의 생성 방법에 관한 것이다:
(a) 전분-함유 물질을 알파-아밀라아제 변이체의 존재 하에 액화시키는 단계; 또는
(b) 탄수화물원 생성 효소를 사용하여, 단계 (a)에서 획득되는 액화된 물질을 당화시키는 단계;
(c) 발효 유기체를 사용하여 발효시키는 단계.
일 양태에서, 풀룰라나아제, 예를 들어, GH57과 풀룰라나아제도 또한 액화 단계에서 사용된다. 일 구현예에서, 프로테아제, 예를 들어, 산 진균 프로테아제 또는 메탈로프로테아제가 액화 전, 그 동안 및/또는 그 후에 첨가된다. 일 구현예에서, 메탈로프로테아제는 써모아스쿠스, 예를 들어, 써모아스쿠스 아우란티아쿠스(Thermoascus aurantiacus)의 균주, 특히 써모아스쿠스 아우란티아쿠스 CGMCC 번호 0670으로부터 유래된다. 일 구현예에서, 탄수화물원 생성 효소는 아스페르길루스의 균주, 예를 들어, 아스페르길루스 니게르 또는 아스페르길루스 아와모리, 탈라로마이세스의 균주, 특히 탈라로마이세스 에메르소니이(Talaromyces emersonii); 또는 아텔리아(Athelia)의 균주, 특히 아텔리아 롤프시이(Athelia rolfsii); 트라메테스의 균주, 예를 들어, 트라메테스 신굴라타(Trametes cingulata); 파치키토스포라(Pachykytospora) 속의 균주, 예를 들어, 파치키토스포라 파피라세아(Pachykytospora papyracea)의 균주; 또는 류코팍실루스(Leucopaxillus) 속의 균주, 예를 들어, 류코팍실루스 지잔테우스(Leucopaxillus giganteus); 또는 페니오포라(Peniophora) 속의 균주, 예를 들어, 페니오포라 루포마르지나타(Peniophora rufomarginata) 종의 균주; 또는 그들의 혼합물로부터 유래된 글루코아밀라아제이다. 당화 단계 (b) 및 발효 단계 (c)는 순차적으로 또는 동시에 수행될 수 있다. 상기 방법이 순차적 당화 및 발효 공정으로 수행되는 경우, 그리고 발효 전 또는 그 동안에 단계 (b) 및 (c)가 동시에 수행되는 경우(SSF 공정), 풀룰라나아제 및/또는 메탈로프로테아제는 당화 및/또는 발효 동안 첨가될 수 있다. 또한, 풀룰라나아제 및/또는 메탈로프로테아제는 유리하게는 액화 전에(사전-액화 처리), 다시 말하면, 단계 (a) 전에 또는 그 동안 및/또는 액화 후에(액화 처리 후), 즉, 단계 (a) 후에 첨가될 수 있다. 풀룰라나아제는 가장 유리하게는 액화 전에 또는 그 동안, 즉, 단계 (a) 전에 또는 그 동안 첨가된다. 발효 산물, 예를 들어, 특히 에탄올은 선택적으로, 예를 들어, 증류에 의해 발효 후에 회수될 수 있다. 발효 유기체는 바람직하게는 효모, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애의 균주이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 단계 (a) 전에, 하기의 단계를 더 포함한다:
x) 전분-함유 물질의 입자 크기를 바람직하게는 제분(예를 들어, 해머 밀(hammer mill) 사용)에 의해 감소시키는 단계;
y) 전분-함유 물질 및 물을 포함하는 슬러리를 형성하는 단계.
일 구현예에서, 입자 크기는 #7 스크린, 예를 들어, #6 스크린보다 더 작다. #7 스크린이 보통 통상적인 종래 기술 방법에 사용된다. 수성 슬러리는 10 내지 55, 예를 들어, 25 내지 45 및 30 내지 40 w/w%의 건조 고체(DS)의 전분-함유 물질을 함유할 수 있다. 겔라틴화 온도 초과의 온도로 슬러리를 가열하고, 알파-아밀라아제 변이체를 첨가하여 액화를 개시할 수 있다(시닝(thinning)). 일 구현예에서, 슬러리를 제트-쿠킹하여, 단계 (a)에서 알파-아밀라아제로 처리하기 전에 슬러리를 더 겔라틴화시킬 수 있다. 일 구현예에서, 액화는 3차 고온 슬러리 공정으로 수행될 수 있다. 슬러리는 pH 4 내지 6, 바람직하게는 4.5 내지 5.5에서 60 내지 95℃, 바람직하게는 70 내지 90℃, 예를 들어, 바람직하게는 80 내지 85℃로 가열되며, 선택적으로, 풀룰라나아제 및/또는 프로테아제, 바람직하게는 메탈로프로테아제와 함께, 알파-아밀라아제 변이체가 첨가되어 액화가 개시된다(시닝). 일 구현예에서, 슬러리는 이어서 95 내지 140℃, 바람직하게는 100 내지 135℃, 예를 들어, 105 내지 125℃의 온도에서 약 1 내지 15분 동안 바람직하게는 약 3 내지 10분 동안, 특히 약 5분 동안 제트-쿠킹할 수 있다. 슬러리는 60 내지 95℃로 냉각되며, 알파-아밀라아제 변이체 및 선택적으로 풀룰라나아제 변이체 및/또는 프로테아제, 바람직하게는 메탈로프로테아제가 더 첨가되어, 가수분해가 완결된다(2차 액화). 액화 공정은 보통 pH 4.0 내지 6, 특히 4.5 내지 5.5의 pH에서 수행된다. 당화 단계 (b)는 본 발명이 속하는 분야에 널리 알려져 있는 조건을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 전체 당화 공정은 최대 약 24 내지 약 72시간 지속될 수 있으나, 30 내지 65℃, 전형적으로 약 60℃의 온도에서 전형적으로 40 내지 90분의 사전-당화를 수행하고, 동시당화발효 공정(SSF 공정)에서 발효 동안 완전한 당화로 이어지는 것이 통상적이다. 당화는 전형적으로 20 내지 75℃, 바람직하게는 40 내지 70℃, 전형적으로 약 60℃의 온도 및 4 내지 5의 pH, 보통 약 pH 4.5에서 수행된다. 발효 산물, 특히 에탄올을 생성하기 위한 가장 널리 사용되는 공정은 동시당화발효(SSF) 공정이며, 여기서, 당화를 위한 유지 단계가 존재 하지 않으며, 이는 발효 유기체, 예를 들어, 효모 및 효소(들)가 함께 첨가될 수 있음을 의미한다. SSF는 전형적으로 25℃ 내지 40℃, 예를 들어, 28℃ 내지 35℃, 예를 들어, 30℃ 내지 34℃, 바람직하게는 약 32℃의 온도에서 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 발효는 6 내지 120시간, 특히 24 내지 96시간 동안 계속된다.
비어 제조
알파-아밀라아제 변이체는 또한 비어-제조 공정 및 유사 발효에서 사용될 수 있으며; 알파-아밀라아제는 전형적으로 매시 공정 동안 첨가될 것이다. 상기 공정은 상기 기술된 제분, 액화, 당화 및 발효 공정과 실질적으로 유사하다.
증류폐액으로의 전분 슬러리 처리
제분된 전분-함유 물질을 물 및 재활용된 묽은 증류폐액과 합하여, 수성 슬러리를 초래한다. 슬러리는 15 내지 55 w/w% ds(예를 들어, 20 내지 50%, 25 내지 50%, 25 내지 45%, 25 내지 40%, 20 내지 35% 및 30 내지 36% ds)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 재활용된 묽은 증류폐액(백세트)은 약 10 내지 70 v/v%(예를 들어, 10 내지 60%, 10 내지 50%, 10 내지 40%, 10 내지 30%, 10 내지 20%, 20 내지 60%, 20 내지 50%, 20 내지 40% 및 또한 20 내지 30%)의 범위로 존재한다.
일단 제분된 전분-함유 물질이 물과 백세트와 합해지면, 슬러리에서 pH는 조정되지 않는다. 추가로, 피타아제 및 선택적으로 알파-아밀라아제의 슬러리로의 첨가 후에 pH는 조정되지 않는다. 일 구현예에서, 슬러리의 pH는 약 pH 4.5 내지 약 6.0 미만(예를 들어, pH 4.5 내지 5.8, pH 4.5 내지 5.6, pH 4.8 내지 5.8, pH 5.0 내지 5.8, pH 5.0 내지 5.4, pH 5.2 내지 5.5 및 pH 5.2 내지 5.9)의 범위로 존재할 것이다. 슬러리의 pH는 슬러리에 첨가되는 묽은 증류폐액의 양 및 묽은 증류폐액을 포함하는 물질의 유형에 따라 약 pH 4.5 내지 5.2일 수 있다. 예를 들어, 묽은 증류폐액의 pH는 pH 3.8 내지 pH 4.5일 수 있다.
에탄올 생성 동안, 산을 첨가하여, 비어 웰 내의 pH를 더 낮추어, 증류 전에 미생물 오염의 위험을 낮출 수 있다.
일부 구현예에서, 피타아제가 슬러리에 첨가된다. 다른 구현예에서, 피타아제에 더하여, 알파-아밀라아제가 슬러리에 첨가된다. 일부 구현예에서, 피타아제 및 알파-아밀라아제가 슬러리에 순차적으로 첨가된다. 다른 구현예에서, 피타아제 및 알파-아밀라아제는 동시에 첨가된다. 일부 구현예에서, 피타아제 및 선택적으로 알파-아밀라아제를 포함하는 슬러리가 약 5분 내지 약 8시간(예를 들어, 5분 내지 6시간, 5분 내지 4시간, 5분 내지 2시간 및 15분 내지 4시간)의 기간 동안 인큐베이션(사전처리)된다. 다른 구현예에서, 슬러리는 약 40 내지 115℃(예를 들어, 45 내지 80℃, 50 내지 70℃, 50 내지 75℃, 60 내지 110℃, 60 내지 95℃, 70 내지 110℃, 70 내지 85℃ 및 77 내지 86℃)의 범위의 온도에서 인큐베이션된다.
다른 구현예에서, 슬러리는 전분-함유 물질의 전분 겔라틴화 온도보다 약 0 내지 약 30℃(예를 들어, 0 내지 25℃, 0 내지 20℃, 0 내지 15℃, 0 내지 10℃ 및 0 내지 5℃) 더 낮은 온도에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 온도는 약 68℃ 미만, 약 65℃ 미만, 약 62℃ 미만, 약 60℃ 미만 및 약 55℃ 미만이다. 일부 구현예에서, 온도는 약 45℃ 초과, 약 50℃ 초과, 약 55℃ 초과 및 약 60℃ 초과이다. 일부 구현예에서, 피타아제 및 알파-아밀라아제를 포함하는 슬러리의 전분 겔라틴화 온도 미만의 온도에서의 인큐베이션은 일차(1°) 액화로 지칭된다.
일 구현예에서, 제분된 전분-함유 물질은 옥수수 또는 마일로(milo)이다. 슬러리는 25 내지 40% DS를 포함하며, pH는 4.8 내지 5.2의 범위이며, 슬러리는 60 내지 75℃의 온도 범위에서 5분 내지 2시간 동안 피타아제 및 선택적으로 알파-아밀라아제와 인큐베이션된다.
현재, 액화 공정에 사용되는 상업적으로 입수할 수 있는 미생물 알파-아밀라아제가 일반적으로 pH 5.6 미만의 pH 수준에서, 약 80℃ 초과의 온도에서 분쇄된 전립을 사용하여 건식 제분 공정으로부터 액화된 전분 기질을 생성하기에 충분히 안정적이지 않는 것으로 여겨진다. 많은 상업적으로 입수할 수 있는 알파-아밀라아제의 안정성은 낮은 pH에서 감소된다.
추가의 액화 단계에서, 인큐베이션되거나 사전처리된 전분-함유 물질은 약 4.0 내지 5.5의 pH, 더욱 바람직하게는 1시간 내지 2시간에, 약 2분 내지 약 6시간의 기간(예를 들어, 2분 내지 4시간, 90분, 140분 및 90 내지 140분) 동안 전분-함유 물질의 전분 겔라틴화 온도(예를 들어, 70℃ 내지 120℃, 70℃ 내지 110℃ 및 70℃ 내지 90℃)보다 약 0 내지 약 45℃ 더 높은 온도의 증가에 노출된다. 온도는 단기간, 예를 들어, 1 내지 15분 동안 통상적인 고온 제트 쿠킹 시스템에 의해 증가될 수 있다. 이어서, 전분은 약 75℃ 내지 95℃(예를 들어, 80℃ 내지 90℃ 및 80℃ 내지 85℃) 범위의 온도에서 약 15 내지 150분(예를 들어, 30 내지 120분)의 기간 동안 더 가수분해될 수 있다. 바람직한 구현예에서, pH는 이들 공정 단계 동안 조정되지 않으며, 액화된 매시의 pH는 약 pH 4.0 내지 pH 5.8의 범위(예를 들어, pH 4.5 내지 5.8, pH 4.8 내지 5.4 및 pH 5.0 내지 5.2)이다. 일부 구현예에서, 제2 용량의 열안정성 알파-아밀라아제가 제2 액화 단계에 첨가되나. 다른 구현예에서, 추가의 알파-아밀라아제의 투여가 존재 하지 않는다.
인큐베이션 및 액화 단계는 본 발명이 속하는 분야에 널리 공지되어 있는 당화 및 발효 단계로 이어질 수 있다.
증류
선택적으로, 발효 후에, 예를 들어, 증류에 의해 알콜(예를 들어, 에탄올)이 추출되고, 선택적으로 1개 이상의 공정 단계로 이어질 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공되는 방법에 의해 생성되는 에탄올의 수율은 적어도 8%, 적어도 10%, 적어도 12%, 적어도 14%, 적어도 15%, 적어도 16%, 적어도 17% 및 적어도 18%(v/v) 및 적어도 23 v/v%이다. 본 명세서에 제공되는 공정에 따라 획득되는 에탄올은 예를 들어, 연료 에탄올, 음용 에탄올, 즉, 음용의 중성 에탄올 또는 공업용 에탄올로 사용될 수 있다.
부산물
상기 발효의 잔존물은 곡물로서, 이는 전형적으로 액체 형태 또는 건조 형태로 동물 사료에 사용된다. 추가의 구현예에서, 최종 산물은 발효 공동-산물, 예를 들어, 주정박(DDG) 및 주정혼합박(DDGS)을 포함할 수 있으며, 이는 예를 들어, 동물 사료로 사용될 수 있다.
액화, 당화, 발효, 증류 및 에탄올의 회수를 수행하는 방법에 대한 추가의 상세사항은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
본 명세서에 제공된 공정에 따르면, 당화 및 발효는 동시에 또는 따로 수행될 수 있다.
펄프 및 종이 제조
알파-아밀라아제 변이체는, 전분 강화 폐지 및 카드보드로부터, 펄프, 종이 및 카드보드와 같은 리그노셀룰로오스계 물질 제조에 사용될 수도 있는데, 특히 여기서는 7 초과의 pH에서 재펄프화(repulping)가 발생하며, 아밀라아제는 강화 전분의 분해를 통해 폐 물질의 분해를 촉진한다. 알파-아밀라아제 변이체는 특히 전분-코팅된 인쇄지로부터 제지 펄프를 제조하는 공정에서 유용하다. 상기 공정은 WO 95/14807호에 기술된 바와 같이 하기 단계를 포함해 수행할 수 있다:
a) 종이를 분해하여 펄프를 제조하는 단계,
b) 단계 a) 전, 그 동안 또는 그 후에, 전분-분해 효소로 처리하는 단계, 및
c) 단계 a) 및 b) 후에 펄프로부터 잉크 입자를 분리하는 단계.
알파-아밀라아제는 또한 전분 변성에 유용할 수 있으며, 효소에 의해 변성된 전분이 탄산칼슘, 카올린 및 점토와 같은 알칼리 충전제와 함께 제지에서 사용된다. 알파-아밀라아제 변이체를 사용하여, 충전제의 존재 하에서 전분을 변성시켜, 보다 단순한 통합 공정을 가능하게 할 수 있다.
직물, 패브릭 및 의류의 호발
알파-아밀라아제 변이체는 또한 직물, 패브릭 또는 의류 호발에 매유 유용할 수도 있다. 직물 처리 산업에 있어서, 전통적으로 알파-아밀라아제는 직조(weaving) 동안, 경사(warp yarn) 상에 보호 코팅으로서 역할하는 전분 함유 아교풀의 제거를 촉진시키는 호발 공정에서 보조제로서 사용된다. 직조 후 아교풀 코팅의 완벽한 제거는, 패브릭을 스코어링(scouring), 표백 및 염색하는 후속 공정에서 최적의 결과를 보장하는 데 중요하다. 효소에 의한 전분 분해가 섬유 물질에 어떠한 해로운 효과도 포함하지 않기 때문에 바람직하다. 공정 비용을 줄이고 제분 처리량을 늘리기 위해서, 호발 공정은 종종 세정 및 표백 단계와 조합된다. 그러한 경우에, 알칼리 또는 산화제와 같은 비-효소 보조제가 전형적으로 사용되어 전분을 분해하는데, 그 이유는 통상의 알파-아밀라아제는 고 pH 수준 및 표백제와 매우 상용가능하지는 않기 때문이다. 효소에 의하지 않은 전분 아교풀의 분해는 사용되는 다소 공격적인 화학물질로 인한 섬유 손상을 일부 발생시킨다. 따라서, 알파-아밀라아제 변이체를 사용하는 것이 바람직할 수 있는데, 이는 이들이 알칼리 용액 내에서 개선된 성능을 갖기 때문이다. 알파-아밀라아제 변이체는 단독으로 또는 셀룰로오스-함유 패브릭 또는 직물의 호발시에 셀룰라아제와 조합하여 사용될 수 있다.
호발 및 표백 공정은 본 발명이 속하는 분야에 익히 공지되어 있다. 예를 들어, 이러한 공정은 본 명세서에 그 전문이 참조로 인용되는 WO 95/21247호, 미국 특허 제4,643,736호, EP 119920호에 기술되어 있다.
세정 공정 및 세제 조성물
알파-아밀라아제 변이체는 세탁 및 식기세척을 포함하는 각종 세정 또는 세척 공정을 위한 세제 조성물의 성분으로 첨가될 수 있다. 예를 들어, 변이체는 WO 96/23874호 및 WO 97/07202호에 기재된 세제 조성물에서 사용될 수 있다.
알파-아밀라아제 변이체는 통상적으로 사용되는 농도에서 세제에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 변이체는 통상적인 세제의 투여 수준을 사용하여 세척/식기세척액 리터당 0.00001 내지 10mg(고순도 활성 효소 단백질로 계산)의 알파-아밀라아제에 상응하는 양으로 혼입될 수 있다.
세제 조성물은 예를 들어 오염된 패브릭의 예비처리에 적합한 세탁 첨가제 조성물 및 린스가 첨가된 섬유 유연제 조성물을 포함하는 손 또는 기계 세탁 세제 조성물로서 제형화될 수 있거나, 또는 일반 가정 경질 표면 세정 작업에서 사용하기 위한 세제 조성물로서 제형화될 수 있거나, 또는 손 또는 기계 식기세척 작업을 위해 제형화될 수 있다.
세제 조성물은 1개 이상의 다른 효소, 예를 들어, 리파아제, 퍼옥시다아제, 프로테아제, 다른 전분분해 효소, 예를 들어 다른 알파-아밀라아제, 글루코아밀라아제, 말토제닉 아밀라아제, CGTase, 셀룰라아제, 만난아제(예컨대, MANNASTAR™, Novozymes, Denmark), 펙티나아제, 펙틴 리아제, 큐티나아제, 및/또는 락카아제를 더 포함할 수 있다.
일반적으로 선택된 효소(들)의 특성은 선택된 세제와 상용성이어야 하고(즉, 최적의 pH, 기타 효소 및 비효소 성분과의 상용성, 등), 효소(들)는 유효량으로 존재해야 한다.
세제 효소(들)는 1개 이상의 효소를 함유하는 별도의 첨가제를 첨가하거나, 또는 이들 효소 모두를 포함하는 조합된 첨가제를 첨가함으로써 세제 조성물에 포함시킬 수 있다. 세제 첨가제, 예를 들어, 별도의 첨가제 또는 조합된 첨가제는 예를 들어, 과립, 액체, 슬러리 등으로 제형화될 수 있다. 바람직한 세제 첨가제 제형은 과립, 특히 무분진 과립, 액체, 특히 안정화된 액체, 또는 슬러리이다.
무-분진 과립은 예컨대, 미국 특허 제4,106,991호 및 제4,661,452호에 개시된 바와 같이 제조할 수 있고, 선택적으로는 본 발명이 속하는 분야에 공지되어 있는 방법에 의해 코팅할 수도 있다. 왁스성 코팅 물질의 예로서는 평균 몰중량이 1,000 내지 20000인 폴리(에틸렌 옥시드) 제품(폴리에틸렌글리콜, PEG); 16 내지 50개의 에틸렌 옥시드 단위를 갖는 에톡시화 노닐-페놀; 에톡시화 지방 알콜(이 때, 알콜의 탄소수는 12 내지 20개이고, 15 내지 80개의 에틸렌 옥시드 단위가 존재함); 지방 알콜, 지방산; 및 지방산의 모노- 및 디- 및 트리글리세리드가 있다. 유동층 기술에 의한 응용에 적합한 막-형성 코팅 물질의 예는 GB 1483591호에 제시되어 있다. 액체 효소 제제는 예를 들어, 확립된 방법에 따라 프로필렌 글리콜 등의 폴리올, 당 또는 당 알콜, 락트산 또는 붕산을 첨가하여 안정화될 수 있다. 보호된 효소는 EP 238216호에 개시된 방법에 따라 제조할 수 있다.
세제 조성물은 임의의 편리한 형태, 예를 들어, 바(bar), 정제, 분말, 과립, 페이스트 또는 액체로 존재할 수 있다. 액체 세제는 수성일 수 있는데, 전형적으로 약 70% 이하의 물 및 0% 내지 약 30%의 유기 용매 또는 비수성 용매를 함유한다.
세제 조성물은 1개 이상의 계면활성제를 포함하는데, 이들은 반-극성(semi-polar)을 포함하여 비-이온성, 및/또는 음이온성, 양이온성 및/또는 쯔비터이온성일 수 있다. 계면활성제는 전형적으로 0.1 중량% 내지 60 중량%의 수준으로 존재한다.
음이온성 계면활성제가 포함되는 경우, 상기 세제는 보통 약 1% 내지 약 40%의 음이온성 계면활성제, 예를 들어, 선형 알킬벤젠술포네이트, α-올레핀술포네이트, 알킬 술페이트(지방 알콜 술페이트), 알콜 에톡시술페이트, 2차 알칸술포네이트, α-술포 지방산 메틸 에스테르, 알킬- 또는 알케닐숙신산, 또는 비누를 함유할 것이다.
비-이온성 계면활성제가 포함된 경우, 상기 세제는 약 0.2% 내지 약 40%의 비-이온성 계면활성제, 예를 들어, 알콜 에톡실레이트, 노닐페놀 에톡실레이트, 알킬폴리글리코시드, 알킬디메틸아민-옥시드, 에톡시화 지방산 모노에탄올아미드, 지방산 모노에탄올-아미드, 폴리히드록시 알킬 지방산 아미드, 또는 글루코사민의 N-아실-N-알킬 유도체("글루카미드")를 함유할 것이다.
상기 세제는 0% 내지 약 65%의 세제 강화제 또는 착화제, 예컨대 제올라이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 포스포네이트, 카르보네이트, 시트레이트, 니트릴로트리아세트산, 에틸렌디아민테트라아세트산, 디에틸렌트리아민펜타아세트산, 알킬- 또는 알케닐숙신산, 가용성 실리케이트 또는 층상 실리케이트(예컨대, Hoechst 사의 SKS-6)를 함유할 수 있다.
상기 세제는 1개 이상의 폴리머를 포함할 수 있다. 예로서는 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리(비닐-피롤리돈), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(비닐 알콜), 폴리(비닐피리딘-N-옥시드), 폴리(비닐이미다졸), 폴리카르복실레이트, 예컨대, 폴리아크릴레이트, 말레산/아크릴산 코폴리머), 및 라우릴 메타크릴레이트/아크릴산 코폴리머가 있다.
상기 세제는, 과산-형성 표백 활성화제, 예컨대 테트라아세틸에틸렌디아민 또는 노나노일옥시벤젠술포네이트와 조합될 수 있는, 과붕산염 또는 과탄산염과 같은 H2O2 공급원을 포함할 수도 있는 표백 시스템을 함유할 수 있다. 다르게는, 상기 표백 시스템은 퍼옥시산, 예를 들어 아미드, 이미드, 또는 술폰 유형의 퍼옥시산을 포함할 수 있다.
세제 조성물의 효소(들)는, 통상적인 안정화제, 예컨대, 폴리올, 예컨대, 프로필렌 글리콜 또는 글리세롤, 당 또는 당 알콜, 락트산, 붕산, 또는 붕산 유도체, 예컨대, 방향족 붕산염 에스테르, 또는 페닐 보론산 유도체, 예컨대, 4-포르밀페닐 보론산을 사용하여 안정화할 수 있고, 상기 조성물은 예를 들어, WO 92/19709호 및 WO 92/19708호에 기재된 바와 같이 제형화될 수 있다.
상기 세제는 또한 예컨대 점토를 비롯한 패브릭 유연제, 거품 촉진제, 비누거품 억제제, 항부식제, 오염 현탁화제, 오염 재침착방지제, 염료, 살균제, 형광 증백제, 가용화제, 변색 억제제, 또는 향료의 기타 통상의 세제 성분을 함유할 수 있다.
세제 조성물은 세척액 리터당 0.01 내지 100 mg의 효소 단백질, 바람직하게는 세척액 리터당 0.055 mg의 효소 단백질, 특히 세척액 리터당 0.1 내지 1 mg의 효소 단백질에 상응하는 양의 임의의 효소를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 1개 이상의 변이체 효소는 추가로 본 명세서에 참조로 포함되는 WO 97/07202호에 개시된 세제 제형에 혼입될 수 있다.
본 발명은 하기의 구현예에 의해 더 정의된다:
구현예 1. SEQ ID NO: 1의 위치 185에 상응하는 위치에서의 프롤린으로의 치환 및 SEQ ID NO: 1의 위치 15, 48, 49, 50, 107, 116, 133, 138, 156, 176, 181, 187, 188, 190, 197, 201, 205, 209, 213, 239, 241, 255, 264, 299, 360, 375, 416, 437, 474 및 475에 상응하는 1개 이상의 위치에서의 치환을 더 포함하는 알파-아밀라아제 변이체로서, 상기 변이체가 (i) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 중 임의의 것의 성숙 폴리펩티드, 또는 (ii) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 3의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 4의 아미노산 1 내지 482, SEQ ID NO: 5의 아미노산 1 내지 484, SEQ ID NO: 6의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 7의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 8의 1 내지 485, SEQ ID NO: 9의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 11의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 12의 아미노산 1 내지 480, SEQ ID NO: 13의 아미노산 1 내지 483 또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 1 내지 481에 대하여 적어도 60% 및 100% 미만의 서열 동일성을 갖고, 상기 변이체가 알파-아밀라아제 활성을 갖는 변이체.
구현예 2. 구현예 1에 있어서, 위치 15에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Leu, Ser 또는 Thr로의 치환;
위치 48에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Ala으로의 치환;
위치 49에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Gly, His, Ile 또는 Leu으로의 치환;
위치 50에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Thr으로의 치환;
위치 107에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Ala으로의 치환;
위치 116에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Gly으로의 치환;
위치 133에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Tyr으로의 치환;
위치 138에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Tyr 또는 Val, 특히 Phe 또는 Tyr으로의 치환;
위치 156에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Tyr으로의 치환;
위치 176에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Leu으로의 치환;
위치 181에 상응하는 위치에서의 Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Asp, Glu 또는 Thr으로의 치환;
위치 187에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Asp으로의 치환;
위치 188에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Ser 또는 Thr으로의 치환;
위치 190에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Phe으로의 치환;
위치 197에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Ile, Leu, Ser, Thr 또는 Val으로의 치환;
위치 201에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Phe 또는 Tyr으로의 치환;
위치 205에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Tyr으로의 치환;
위치 209에 상응하는 위치에서의 Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Val으로의 치환;
위치 213에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Thr으로의 치환;
위치 239에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Ala, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu 또는 Met으로의 치환;
위치 241에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Asp으로의 치환;
위치 255에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Gly 또는 Pro으로의 치환;
위치 264에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Ser으로의 치환;
위치 299에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Arg으로의 치환;
위치 360에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Ser으로의 치환;
위치 375에 상응하는 위치에서의 Ala, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Gly 또는 Val으로의 치환;
위치 416에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Val으로의 치환;
위치 437에 상응하는 위치에서의 Ala, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Trp으로의 치환;
위치 474에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Arg, Gln, Glu 또는 Lys으로의 치환; 또는
위치 475에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Arg, Gln, Glu 또는 Lys으로의 치환을 포함하는 변이체.
구현예 3. 구현예 1 또는 2에 있어서, 상기 변이체가 (i) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 중 임의의 것의 성숙 폴리펩티드, 또는 (ii) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 3의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 4의 아미노산 1 내지 482, SEQ ID NO: 5의 아미노산 1 내지 484, SEQ ID NO: 6의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 7의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 8의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 9의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 11의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 12의 아미노산 1 내지 480, SEQ ID NO: 13의 아미노산 1 내지 483, 또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 1 내지 481에 대하여 적어도 65%, 예를 들어, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는 변이체.
구현예 4. 구현예 1 또는 2에 있어서, 상기 변이체가 (i) SEQ ID NO: 1의 성숙 폴리펩티드, 또는 (ii) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 483에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는 변이체.
구현예 5. 구현예 1 또는 2에 있어서, 상기 변이체가 (i) SEQ ID NO: 2의 성숙 폴리펩티드, (ii) I181*+G182* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 2의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 483, 또는 (iv) I181*+G182* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 483에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는 변이체.
구현예 6. 구현예 1 또는 2에 있어서, 상기 변이체가 (i) SEQ ID NO: 3의 성숙 폴리펩티드, (ii) T183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 3의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1 내지 485, 또는 (iv) T183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 1 내지 485에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는 변이체.
구현예 7. 구현예 1 또는 2에 있어서, 상기 변이체가 (i) SEQ ID NO: 4의 성숙 폴리펩티드, (ii) T180*+G181* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 4의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 4의 아미노산 1 내지 482, 또는 (iv) T180*+G181* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 1 내지 482에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는 변이체.
구현예 8. 구현예 1 또는 2에 있어서, 상기 변이체가 (i) SEQ ID NO: 5의 성숙 폴리펩티드, (ii) T182*+G183* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 5의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 5의 아미노산 1 내지 484, 또는 (iv) T182*+G183* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 1 내지 484에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는 변이체.
구현예 9. 구현예 1 또는 2에 있어서, 상기 변이체가 (i) SEQ ID NO: 6의 성숙 폴리펩티드, (ii) E178*+G179* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 6의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 6의 아미노산 1 내지 483, 또는 (iv) E178*+G180* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 1 내지 483에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는 변이체.
구현예 10. 구현예 1 또는 2에 있어서, 상기 변이체가 (i) SEQ ID NO: 7의 성숙 폴리펩티드, (ii) T183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 7의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 7의 아미노산 1 내지 485, 또는 (iv) T183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 7의 아미노산 1 내지 485에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는 변이체.
구현예 11. 구현예 1 또는 2에 있어서, 상기 변이체가 (i) SEQ ID NO: 8의 성숙 폴리펩티드, (ii) D183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 8의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 8의 아미노산 1 내지 485, 또는 (iv) D183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 1 내지 485에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는 변이체.
구현예 12. 구현예 1 또는 2에 있어서, 상기 변이체가 (i) SEQ ID NO: 9의 성숙 폴리펩티드, (ii) D183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 9의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 9의 아미노산 1 내지 485, 또는 (iv) D183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 9의 아미노산 1 내지 485에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는 변이체.
구현예 13. 구현예 1 또는 2에 있어서, 상기 변이체가 (i) SEQ ID NO: 10의 성숙 폴리펩티드, (ii) D183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 10의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 485, 또는 (iv) D183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 485에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는 변이체.
구현예 14. 구현예 1 또는 2에 있어서, 상기 변이체가 (i) SEQ ID NO: 11의 성숙 폴리펩티드, (ii) H183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 11의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 11의 아미노산 1 내지 485, 또는 (iv) H183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 1 내지 485에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는 변이체.
구현예 15. 구현예 1 또는 2에 있어서, 상기 변이체가 (i) SEQ ID NO: 12의 성숙 폴리펩티드, 또는 (ii) SEQ ID NO: 12의 아미노산 1 내지 480에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는 변이체.
구현예 16. 구현예 1 또는 2에 있어서, 상기 변이체가 (i) SEQ ID NO: 13의 성숙 폴리펩티드, 또는 (ii) SEQ ID NO: 13의 아미노산 1 내지 483에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는 변이체.
구현예 17. 구현예 1 또는 2에 있어서, 상기 변이체가 (i) SEQ ID NO: 14의 성숙 폴리펩티드, 또는 (ii) SEQ ID NO: 14의 아미노산 1 내지 481에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는 변이체.
구현예 18. 구현예 1 또는 17에 있어서,
(a) (i) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 중 임의의 것의 성숙 폴리펩티드, 또는 (ii) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 3의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 4의 아미노산 1 내지 482, SEQ ID NO: 5의 아미노산 1 내지 484, SEQ ID NO: 6의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 7의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 8의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 9의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 11의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 12의 아미노산 1 내지 480, SEQ ID NO: 13의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 14의 아미노산 1 내지 481에 대하여 적어도 60%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드; 또는
(b) 알파-아밀라아제 활성을 갖는, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 중 임의의 것의 성숙 폴리펩티드의 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 모 알파-아밀라아제의 변이체인 변이체.
구현예 19. 구현예 18에 있어서, 상기 모 알파-아밀라아제가 (i) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 중 임의의 것의 성숙 폴리펩티드, 또는 (ii) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 3의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 4의 아미노산 1 내지 482, SEQ ID NO: 5의 아미노산 1 내지 484, SEQ ID NO: 6의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 7의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 8의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 9의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 11의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 12의 아미노산 1 내지 480, SEQ ID NO: 13의 아미노산 1 내지 483, 또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 1 내지 481에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 변이체.
구현예 20. 구현예 18에 있어서, 상기 모 알파-아밀라아제가 (i) SEQ ID NO: 1의 성숙 폴리펩티드, 또는 (ii) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 483에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 변이체.
구현예 21. 구현예 18에 있어서, 상기 모 알파-아밀라아제가 (i) SEQ ID NO: 2의 성숙 폴리펩티드, (ii) I181*+G182* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 2의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 483, 또는 (iv) I181*+G182* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 483에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 변이체.
구현예 22. 구현예 18에 있어서, 상기 모 알파-아밀라아제가 (i) SEQ ID NO: 3의 성숙 폴리펩티드, (ii) T183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 3의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1 내지 485, 또는 (iv) T183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 1 내지 485에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 변이체.
구현예 23. 구현예 18에 있어서, 상기 모 알파-아밀라아제가 (i) SEQ ID NO: 4의 성숙 폴리펩티드, (ii) T180*+G181* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 4의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 4의 아미노산 1 내지 482, 또는 (iv) T180*+G181* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 1 내지 482에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 변이체.
구현예 24. 구현예 18에 있어서, 상기 모 알파-아밀라아제가 (i) SEQ ID NO: 5의 성숙 폴리펩티드, (ii) T182*+G183* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 5의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 5의 아미노산 1 내지 484, 또는 (iv) T182*+G183* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 1 내지 484에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 변이체.
구현예 25. 구현예 18에 있어서, 상기 모 알파-아밀라아제가 (i) SEQ ID NO: 6의 성숙 폴리펩티드, (ii) E178*+G179* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 6의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 6의 아미노산 1 내지 483, 또는 (iv) E178*+G179* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 1 내지 483에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 변이체.
구현예 26. 구현예 18에 있어서, 상기 모 알파-아밀라아제가 (i) SEQ ID NO: 7의 성숙 폴리펩티드, (ii) T183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 7의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 7의 아미노산 1 내지 485, 또는 (iv) T183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 7의 아미노산 1 내지 485에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 변이체.
구현예 27. 구현예 18에 있어서, 상기 모 알파-아밀라아제가 (i) SEQ ID NO: 8의 성숙 폴리펩티드, (ii) D183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 8의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 8의 아미노산 1 내지 485, 또는 (iv) D183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 1 내지 485에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 변이체.
구현예 28. 구현예 18에 있어서, 상기 모 알파-아밀라아제가 (i) SEQ ID NO: 9의 성숙 폴리펩티드, (ii) D183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 9의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 9의 아미노산 1 내지 485, 또는 (iv) D183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 9의 아미노산 1 내지 485에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 변이체.
구현예 29. 구현예 18에 있어서, 상기 모 알파-아밀라아제가 (i) SEQ ID NO: 10의 성숙 폴리펩티드, (ii) D183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 10의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 485, 또는 (iv) D183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 485에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 변이체.
구현예 30. 구현예 18에 있어서, 상기 모 알파-아밀라아제가 (i) SEQ ID NO: 11의 성숙 폴리펩티드, (ii) H183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 11의 성숙 폴리펩티드, (iii) SEQ ID NO: 11의 아미노산 1 내지 485, 또는 (iv) H183*+G184* 결실을 포함하는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 1 내지 485에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 변이체.
구현예 31. 구현예 18에 있어서, 상기 모 알파-아밀라아제가 (i) SEQ ID NO: 12의 성숙 폴리펩티드, 또는 (ii) SEQ ID NO: 12의 아미노산 1 내지 480에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 변이체.
구현예 32. 구현예 18에 있어서, 상기 모 알파-아밀라아제가 (i) SEQ ID NO: 13의 성숙 폴리펩티드, 또는 (ii) SEQ ID NO: 13의 아미노산 1 내지 483에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 변이체.
구현예 33. 구현예 18에 있어서, 상기 모 알파-아밀라아제가 (i) SEQ ID NO: 14의 성숙 폴리펩티드, 또는 (ii) SEQ ID NO: 14의 아미노산 1 내지 481에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 변이체.
구현예 34. 구현예 18에 있어서, 상기 모 알파-아밀라아제가 (i) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 중 임의의 것의 성숙 폴리펩티드, 또는 (ii) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 3의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 4의 아미노산 1 내지 482, SEQ ID NO: 5의 아미노산 1 내지 484, SEQ ID NO: 6의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 7의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 8의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 9의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 11의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 12의 아미노산 1 내지 480, SEQ ID NO: 13의 아미노산 1 내지 483, 또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 1 내지 481을 포함하거나 이로 구성되는 변이체.
구현예 35. 구현예 18에 있어서, 상기 모 알파-아밀라아제가 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 중 임의의 것의 성숙 폴리펩티드의 단편이며, 상기 단편이 알파-아밀라아제 활성을 갖는 변이체.
구현예 36. 구현예 1 내지 구현예 35 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 변이체가 300 내지 700개, 예를 들어, 350 내지 650개, 400 내지 600개, 450 내지 500개 또는 470 내지 490개의 아미노산으로 구성되는 변이체.
구현예 37. 구현예 1 내지 구현예 36 중 어느 한 구현예에 있어서, 단리된 알파-아밀라아제 변이체인 변이체.
구현예 38. 구현예 1 내지 구현예 37 중 어느 한 구현예에 있어서, M15T, M15S, M15L, G48A, T49H, T49G, T49L, T49I, S50T, G107A, T116G, H133Y, W138Y, W138F, H156Y, K176L, A181T, A181E, A181D, S187D, N188S, N188T, N190F, M197S, M197T, M197V, M197L, M197I, I201Y, I201F, H205Y, A209V, K213T, S239Q, S239E, S239N, S239D, S239A, S239M, S239C, L241D, E255P, E255G, Q264S, G299R, Q360S, R375V, R375G, D416V, R437W, G474K, G474R, G474E, G474Q, G475K, G475R, G475E 및 G475Q로 구성된 군으로부터 선택되는 1개 이상의 치환을 포함하는 변이체.
구현예 39. 구현예 1 내지 구현예 38 중 어느 한 구현예에 있어서, 위치 176에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하는 변이체.
구현예 40. K176L 치환을 포함하는 구현예 1 내지 39 중 어느 한 구현예의 변이체.
구현예 41. 구현예 39 또는 구현예 40에 있어서, 위치 15, 48, 49, 50, 107, 116, 133, 138, 156, 181, 187, 188, 190, 197, 201, 205, 209, 213, 239, 241, 255, 264, 299, 360, 375, 416, 437, 474 및 475에 상응하는 1개 이상의 위치에서의 치환을 더 포함하는 변이체.
구현예 42. 구현예 40에 있어서, M15T, M15S, M15L, G48A, T49H, T49G, T49L, T49I, S50T, G107A, T116G, H133Y, W138Y, W138F, H156Y, A181T, A181E, A181D, S187D, N188S, N188T, N190F, M197S, M197T, M197V, M197L, M197I, I201Y, I201F, H205Y, A209V, K213T, S239Q, S239E, S239N, S239D, S239A, S239M, S239C, L241D, E255P, E255G, Q264S, G299R, Q360S, R375V, R375G, D416V, R437W, G474K, G474R, G474E, G474Q, G475K, G475R, G475E 및 G475Q로 구성된 군으로부터 선택되는 1개 이상의 치환을 더 포함하는 변이체.
구현예 43. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 위치 15에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하는 변이체.
구현예 44. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, M15T 치환을 포함하는 변이체.
구현예 45. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, M15S 치환을 포함하는 변이체.
구현예 46. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, M15L 치환을 포함하는 변이체.
구현예 47. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 위치 48에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하는 변이체.
구현예 48. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, G48A 치환을 포함하는 변이체.
구현예 49. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 위치 49에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하는 변이체.
구현예 50. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, T49H 치환을 포함하는 변이체.
구현예 51. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, T49G 치환을 포함하는 변이체.
구현예 52. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, T49L 치환을 포함하는 변이체.
구현예 53. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, T49I 치환을 포함하는 변이체.
구현예 54. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 위치 50에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하는 변이체.
구현예 55. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, S50T 치환을 포함하는 변이체.
구현예 56. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 위치 107에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하는 변이체.
구현예 57. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, G107A 치환을 포함하는 변이체.
구현예 58. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 위치 T116에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하는 변이체.
구현예 59. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, T116G 치환을 포함하는 변이체.
구현예 60. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 위치 133에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하는 변이체.
구현예 61. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, H133Y 치환을 포함하는 변이체.
구현예 62. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 위치 138에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하는 변이체.
구현예 63. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, W138Y 치환을 포함하는 변이체.
구현예 64. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, W138F 치환을 포함하는 변이체.
구현예 65. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 위치 156에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하는 변이체.
구현예 66. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, H156Y 치환을 포함하는 변이체.
구현예 67. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 위치 181에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하는 변이체.
구현예 68. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, A181T 치환을 포함하는 변이체.
구현예 69. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, A181E 치환을 포함하는 변이체.
구현예 70. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, A181D 치환을 포함하는 변이체.
구현예 71. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 위치 187에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하는 변이체.
구현예 72. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, S187D 치환을 포함하는 변이체.
구현예 73. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 위치 188에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하는 변이체.
구현예 74. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, N188S 치환을 포함하는 변이체.
구현예 75. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, N188T 치환을 포함하는 변이체.
구현예 76. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 위치 190에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하는 변이체.
구현예 77. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, N190F 치환을 포함하는 변이체.
구현예 78. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 위치 197에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하는 변이체.
구현예 79. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, M197S 치환을 포함하는 변이체.
구현예 80. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, M197T 치환을 포함하는 변이체.
구현예 81. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, M197V 치환을 포함하는 변이체.
구현예 82. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, M197L 치환을 포함하는 변이체.
구현예 83. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, M197I 치환을 포함하는 변이체.
구현예 84. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 위치 201에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하는 변이체.
구현예 85. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, I201Y 치환을 포함하는 변이체.
구현예 86. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, I201F 치환을 포함하는 변이체.
구현예 87. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 위치 205에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하는 변이체.
구현예 88. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, H205Y 치환을 포함하는 변이체.
구현예 89. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 위치 209에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하는 변이체.
구현예 90. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, A209V 치환을 포함하는 변이체.
구현예 91. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 위치 213에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하는 변이체.
구현예 92. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, K213T 치환을 포함하는 변이체.
구현예 93. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 위치 239에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하는 변이체.
구현예 94. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, S239Q 치환을 포함하는 변이체.
구현예 95. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, S239E 치환을 포함하는 변이체.
구현예 96. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, S239N 치환을 포함하는 변이체.
구현예 97. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, S239D 치환을 포함하는 변이체.
구현예 98. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, S239A 치환을 포함하는 변이체.
구현예 99. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, S239M 치환을 포함하는 변이체.
구현예 100. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, S239C 치환을 포함하는 변이체.
구현예 101. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 위치 241에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하는 변이체.
구현예 102. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, L241D 치환을 포함하는 변이체.
구현예 103. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 위치 255에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하는 변이체.
구현예 104. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, E255P 치환을 포함하는 변이체.
구현예 105. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, E255G 치환을 포함하는 변이체.
구현예 106. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 위치 264에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하는 변이체.
구현예 107. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, Q264S 치환을 포함하는 변이체.
구현예 108. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 위치 299에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하는 변이체.
구현예 109. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, G299R 치환을 포함하는 변이체.
구현예 110. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 위치 360에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하는 변이체.
구현예 111. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, Q360S 치환을 포함하는 변이체.
구현예 112. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 위치 375에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하는 변이체.
구현예 113. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, R375V 치환을 포함하는 변이체.
구현예 114. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, R375G 치환을 포함하는 변이체.
구현예 115. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 위치 416에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하는 변이체.
구현예 116. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, D416V 치환을 포함하는 변이체.
구현예 117. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 위치 437에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하는 변이체.
구현예 118. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, R437W 치환을 포함하는 변이체.
구현예 119. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 위치 474에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하는 변이체.
구현예 120. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, G474K 치환을 포함하는 변이체.
구현예 121. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, G474R 치환을 포함하는 변이체.
구현예 122. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, G474E 치환을 포함하는 변이체.
구현예 123. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, G474Q 치환을 포함하는 변이체.
구현예 124. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 위치 475에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하는 변이체.
구현예 125. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, G475K 치환을 포함하는 변이체.
구현예 126. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, G475R 치환을 포함하는 변이체.
구현예 127. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, G475E 치환을 포함하는 변이체.
구현예 128. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, G475Q 치환을 포함하는 변이체.
구현예 129. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 일련의 치환을 포함하는 변이체:
T49H+K176L+E185P,
T49G+K176L+E185P,
T49L+S50T+K176L+E185P,
T116G+K176L+E185P,
K176L+E185P,
K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W,
K176L+E185P+L241D,
K176L+E185P+R375V, 및
K176L+E185P+R375G.
구현예 130. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 일련의 치환을 포함하는 변이체:
G48A+T49H+G107A+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201F+A209V+Q264S;
G48A+T49G+G107A+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201F+A209V+Q264S;
G48A+T49L+S50T+G107A+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201F+A209V+Q264S;
G48A+T49I+G107A+T116G+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201F+A209V+Q264S;
G48A+T49I+G107A+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201F+A209V+Q264S;
G48A+T49I+G107A+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201Y+H205Y+A209V+K213T
+Q264S+Q360S+D416V+R437W;
G48A+T49I+G107A+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201F+L241D+A209V+Q264S;
G48A+T49I+G107A+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201F+A209V+Q264S+R375V;
G48A+T49I+G107A+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201F+A209V+Q264S+R375G; 및
G48A+G107A+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201F+A209V+Q264S.
구현예 131. 구현예 1 내지 구현예 42에 있어서, 위치 49, 50, 116, 176, 201, 205, 213, 241, 360, 375, 416 및 437에 상응하는 1개 이상의 위치에서의 치환을 포함하는 변이체.
구현예 132. 구현예 131에 있어서, T49H, T49G, T49L, S50T, T116G, K176L, I201Y, H205Y, K213T, L241D, Q360S, R375V, R375G, D416V 및 R437W 중에서 선택되는 1개 이상의 치환을 포함하는 변이체.
구현예 133. 구현예 131 또는 구현예 132에 있어서, 위치 15, 48, 107, 133, 138, 156, 181, 187, 188, 190, 197, 209, 239, 255, 264, 299, 474 및 475에 상응하는 1개 이상의 위치에서의 치환을 더 포함하는 변이체.
구현예 134. 구현예 133에 있어서, M15T, M15S, M15L, G48A, G107A, H133Y, W138Y, W138F, H156Y, A181T, A181E, A181D, S187D, N188S, N188T, N190F, M197S, M197T, M197V, M197L, M197I, A209V, S239Q, S239E, S239N, S239D, S239A, S239M, S239C, E255P, E255G, Q264S, G299R, G474K, G474R, G474E, G474Q, G475K, G475R, G475E 및 G475Q 중에서 선택되는 1개 이상의 치환을 포함하는 변이체.
구현예 135. 구현예 1 내지 구현예 134 중 어느 한 구현예에 있어서, SEQ ID NO: 1의 위치 180 바로 앞의 2개의 위치 둘 모두에서의 결실을 더 포함하는 변이체.
구현예 136. 구현예 1 내지 구현예 135 중 어느 한 구현예에 있어서, 총 치환 개수가 2 내지 20개, 예를 들어, 2 내지 10개 또는 2 내지 5개, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 치환인 변이체.
구현예 137. 구현예 1 내지 구현예 136 중 어느 한 구현예에 있어서, 고온, 저 칼슘 및 낮은 pH에서 인큐베이션되는 경우, SEQ ID NO: 1의 성숙 폴리펩티드에 비해 증가된 열안정성을 갖는 변이체.
구현예 138. 구현예 1 내지 구현예 136 중 어느 한 구현예에 있어서, 고온, 저 칼슘 및 낮은 pH에서 인큐베이션되는 경우, SEQ ID NO: 14의 성숙 폴리펩티드에 비해 증가된 열안정성을 갖는 변이체.
구현예 139. 구현예 1 내지 구현예 136 중 어느 한 구현예에 있어서, 고온, 저 칼슘 및 낮은 pH에서 인큐베이션되는 경우, 그의 모체에 비해 증가된 열안정성을 갖는 변이체.
구현예 140. 구현예 1 내지 구현예 136 중 어느 한 구현예에 있어서, 90℃ 및 pH 4.5에서 0.125 mM CaCl2와 함께 인큐베이션되는 경우, SEQ ID NO: 1의 성숙 폴리펩티드에 비하여 증가된 잔류 활성 반감기를 갖는 변이체.
구현예 141. 구현예 1 내지 구현예 136 중 어느 한 구현예에 있어서, 90℃ 및 pH 4.5에서 0.125 mM CaCl2와 함께 인큐베이션되는 경우, SEQ ID NO: 14의 성숙 폴리펩티드에 비하여 증가된 잔류 활성 반감기를 갖는 변이체.
구현예 142. 구현예 1 내지 구현예 136 중 어느 한 구현예에 있어서, 90℃ 및 pH 4.5에서 0.125 mM CaCl2와 함께 인큐베이션되는 경우, 그의 모체에 비하여 증가된 잔류 활성 반감기를 갖는 변이체.
구현예 143. 구현예 1 내지 구현예 142 중 어느 한 구현예의 변이체 및 계면활성제를 포함하는 세제 조성물.
구현예 144. 구현예 1 내지 구현예 142 중 어느 한 구현예의 변이체 및 베타-아밀라아제, 셀룰라아제(베타-글루코시다아제, 셀로비오히드롤라아제 및 엔도글루카나아제), 글루코아밀라아제, 헤미셀룰라아제(예를 들어, 자일라나아제), 아이소아밀라아제, 아이소머라아제, 리파아제, 피타아제, 프로테아제 및 풀룰라나아제로 구성된 군으로부터 선택되는 1개 이상의 효소를 포함하는 조성물.
구현예 145. 세척 및/또는 식기세척을 위한 구현예 1 내지 구현예 142 중 어느 한 구현예의 변이체의 용도.
구현예 146. 직물을 호발하기 위한 구현예 1 내지 구현예 142 중 어느 한 구현예의 변이체의 용도.
구현예 147. 베이킹 제품을 제조하기 위한 구현예 1 내지 구현예 142 중 어느 한 구현예의 변이체의 용도.
구현예 148. 전분-함유 물질을 액화시키기 위한 구현예 1 내지 구현예 142 중 어느 한 구현예의 변이체의 용도.
구현예 149. 전분-함유 물질을 구현예 1 내지 구현예 142 중 어느 한 구현예의 변이체로 액화시키는 단계를 포함하는 액화된 전분의 생성 방법.
구현예 150. (a) 전분-함유 물질을 구현예 1 내지 구현예 142 중 어느 한 구현예의 변이체로 액화시켜, 액화된 매시를 생성하는 단계;
(b) 액화된 매시를 당화시켜, 발효가능한 당을 생성하는 단계; 및
(c) 발효가능한 당을 발효 유기체의 존재 하에서 발효시키는 단계를 포함하는 발효 생성물의 생성 방법.
구현예 151. 구현예 150에 있어서, 단계 (a)가 pH 4 내지 5에서 수행되는 방법.
구현예 152. 전분 기질을 구현예 1 내지 구현예 142 중 어느 한 구현예의 변이체, 글루코아밀라아제 및 발효 유기체와 접촉시키는 단계를 포함하는 발효 생성물의 생성 방법.
구현예 153. 구현예 1 내지 구현예 142 중 어느 한 구현예의 변이체를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
구현예 154. 구현예 153의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 작제물.
구현예 155. 구현예 153의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
구현예 156. 구현예 153의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
구현예 157. a. 구현예 156의 숙주 세포를 변이체의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계; 및
b. 변이체를 회수하는 단계를 포함하는 알파-아밀라아제 변이체의 생성 방법.
구현예 158. (a) SEQ ID NO: 1의 위치 185에 상응하는 위치에서의 프롤린으로의 치환 및 SEQ ID NO: 1의 위치 15, 48, 49, 50, 107, 116, 133, 138, 156, 176, 181, 187, 188, 190, 197, 201, 205, 209, 213, 239, 241, 255, 264, 299, 360, 375, 416, 437, 474 및 475에 상응하는 1개 이상의 위치에서의 치환을 모 알파-아밀라아제로 도입하는 단계; 및 (b) 변이체를 회수하는 단계를 포함하는 알파-아밀라아제 변이체의 획득 방법.
본 발명은 하기의 실시예에 의해 추가로 기재되며, 이는 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.
실시예
전분분해 활성(알파-아밀라아제 활성)의 측정을 위한 검정
PNP-G7 검정:
알파-아밀라아제 활성은 PNP-G7 기질을 사용하는 방법에 의해 결정된다. PNP-G7은 엔도-아밀라아제, 예를 들어, 알파-아밀라아제에 의해 절단될 수 있는 블로킹된 올리고당류, 4,6-에틸리덴(G7)-p-니트로페닐(G1)-α,D-말토헵타오시드에 대한 약어이다. 절단 후에, 키트에 포함되는 알파-글루코시다아제는 가수분해된 기질을 분해하여, 황색을 가지며, 이에 따라 λ=405nm(400 내지 420nm)에서 가시광 분광광도법에 의해 측정될 수 있는 유리 PNP 분자를 더 유리시킨다. PNP-G7 기질 및 알파-글루코시다아제를 함유하는 키트는 Roche/Hitachi(카탈로그 번호 11876473)에 의해 제조된다.
시약:
이러한 키트로부터의 G7-PNP 기질은 22 mM 4,6-에틸리덴-G7-PNP 및 52.4 mM HEPES(2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]-에탄설폰산), pH 7.0을 함유한다.
알파-글루코시다아제 시약은 52.4 mM HEPES, 87 mM NaCl, 12.6 mM MgCl2, 0.075 mM CaCl2, 4 kU/ℓ 초과의 알파-글루코시다아제를 함유한다.
기질 작동 용액은 1 ㎖의 알파-글루코시다아제 시약을 0.2 ㎖의 G7-PNP 기질과 혼합함으로써 제조된다. 이러한 기질 작동 용액은 사용 직전에 제조된다.
희석 완충제: 50 mM EPPS, 0.01%(w/v) Triton X100(폴리에틸렌 글리콜 p-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)-페닐 에테르(C14H22O(C2H4O)n (n = 9-10))), 1 mM CaCl2, pH 7.0.
절차:
분석할 아밀라아제 시료를 희석 완충제 중에 희석하여, 희석된 시료에서의 pH가 7이 되게 보장한다. 검정은 20 ㎕의 희석된 효소 시료를 96 웰 마이크로타이터 플레이트에 전달하고, 80 ㎕의 기질 작동 용액을 첨가함으로써 수행된다. 용액을 혼합하고, 실온에서 1분 사전-인큐베이션시키고, 흡광도를 OD 405 nm에서 5분에 걸쳐 20초마다 측정한다.
시간 의존적 흡광도-곡선의 기울기(분당 흡광도)는 주어진 조건의 세트 하에서의 대상 알파-아밀라아제의 고유 활성(효소 ㎎당 활성)에 정비례한다. 아밀라아제 시료는 기울기가 분당 0.4 미만의 흡광 단위인 수준으로 희석되어야 한다.
Phadebas 활성 검정:
알파-아밀라아제 활성은 또한 Phadebas 기질을 사용하는 방법에 의해 결정될 수 있다(예를 들어, Magle Life Sciences(Lund, Sweden)사 제품). Phadebas 정제는 수 중에서 불용성인 구형 마이크로스피어의 형태인 가교결합된 전분 폴리머를 포함한다. 청색 염료는 이들 마이크로스피어에 공유 결합된다. 마이크로스피어 내의 내부연결된(interlinked) 전분 폴리머는 알파-아밀라아제 활성에 비례하는 속도로 분해된다. 알파-아밀라아제가 전분 폴리머를 분해하는 경우, 방출된 청색 염료는 수용성이며, 염료의 농도는 620 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 결정될 수 있다. 청색의 농도는 시료 중의 알파-아밀라아제 활성에 비례한다.
분석할 아밀라아제 시료는 요망되는 pH를 갖는 활성 완충제 중에 희석된다. 1개의 기질 정제를 5 ㎖ 활성 완충제 중에 현탁화시키고, 자성 교반기에서 혼합한다. 기질의 혼합 동안, 150 ㎕를 마이크로타이터 플레이트(MTP) 또는 PCR-MTP로 옮긴다. 30 ㎕의 희석된 아밀라아제 시료를 150 ㎕ 기질에 첨가하고, 혼합한다. 37℃에서 15분 동안 인큐베이션시킨다. 30 ㎕의 1M NaOH를 첨가함으로써 반응을 중단시키고 혼합한다. MTP를 4000xg에서 5분 동안 원심분리한다. 100 ㎕를 새로운 MTP로 옮기고, 620nm에서 흡광도를 측정한다.
620nm에서의 흡광도가 0 내지 2.2이고 활성 검정의 선형 범위 내에 있도록 아밀라아제 시료를 희석해야 한다.
환원당 활성 검정:
알파-아밀라아제 활성은 또한, 예를 들어, 옥수수 전분 기질을 사용하는 환원당 검정에 의해 결정될 수 있다. 전분 중의 알파-1,4-글리코시드 결합을 가수분해시키는 알파-아밀라아제에 의해 형성되는 환원 말단의 개수는 p-하이드록시벤조산 하이드라지드(PHBAH)와의 반응에 의해 결정된다. PHBAH와의 반응 후에, 환원 말단의 개수는 405nm에서의 흡광도에 의해 측정될 수 있으며, 환원 말단의 농도는 시료 중의 알파-아밀라아제 활성에 비례한다.
옥수수 전분 기질(3 ㎎/㎖)을 밀리큐 물 중에 5분 동안 조리함으로써 가용화시키고, 검정 전에 냉각시킨다. 정지 용액을 위하여, Ka-Na-타르트레이트/NaOH 용액(K-Na-타르트레이트(Merck 8087) 50g/ℓ, NaOH 20g/ℓ)을 제조하고, p-하이드록시벤조산 하이드라지드(PHBAH, Sigma H9882)를 Ka-Na-타르트레이트/NaOH 용액에 15 ㎎/㎖로 첨가함으로써 정지 용액을 신선하게 제조한다.
PCR-MTP에서, 50 ㎕의 활성 완충제를 50 ㎕의 기질과 혼합한다. 50 ㎕의 희석 효소를 첨가하고 혼합한다. PCR 장치에서 5분 동안 요망되는 온도로 인큐베이션시킨다. 75㎕ 정지 용액(Ka-Na-타르트레이트/NaOH/PHBAH)을 첨가함으로써 반응을 정지시킨다. 95℃에서 10분 동안 PCR 장치에서 인큐베이션시킨다. 150 ㎕를 신규한 MTP로 전달하고, 405nm에서 흡광도를 측정한다.
405nm에서의 흡광도가 0 내지 2.2이고 활성 검정의 선형 범위 내에 있도록 아밀라아제 시료를 희석해야 한다.
EnzChek® 검정:
잔류 아밀라아제 활성의 결정을 위하여, EnzChek® Ultra 아밀라아제 검정 키트(E33651, Invitrogen, La Jolla, CA, USA)를 사용하였다.
기질은 옥수수 전분 유도체, DQ™ 전분이며, 이는 형광이 켄칭되는 그러한 정도로 BODIPY® FL 염료로 표지된 옥수수 전분이다. 대략 1㎎의 동결건조 기질을 함유하는 1개의 바이얼을 100 마이크로리터의 50 mM 아세트산나트륨(pH 4.0) 중에 용해시킨다. 바이얼은 20초 동안 와류시키고, 실온에서 암 중에 놔두고, 용해될 때까지 가끔 혼합한다. 이어서, 900 마이크로리터의 100 mM 아세테이트, 0.01%(w/v) TRITON® X100, 0.125 mM CaCl2, pH 5.5를 첨가하고, 완전히 와류시키고, 사용할 준비가 될 때까지 실온에서 암 중에 저장한다. 잔류 활성 완충제(100 mM 아세테이트, 0.01%(w/v) TRITON® X100, 0.125 mM CaCl2, pH 5.5) 중에 10배 희석함으로써 스톡 기질 작동 용액을 제조한다. 인큐베이션 직후에, 효소를 100 mM 아세테이트, 0.01%(w/v) TRITON® X100, 0.125 mM CaCl2, pH 5.5 중에 10 내지 20ng의 효소 단백질/㎖의 농도로 희석한다.
검정을 위하여, 10초 동안, 25 마이크로리터의 기질 작동 용액을 블랙(black) 384 웰 마이크로타이터 플레이트에서 25 마이크로리터의 희석 효소와 혼합한다. 형광 세기는 각 웰에서 25℃에서 15분 동안 매분 측정하고(여기: 485nm, 방출: 555nm), Vmax를 시간에 대한 형광 세기의 플롯의 기울기로 계산한다. 플롯은 선형이어야 하며, 희석된 참조 시료 용액이 활성 검정의 선형 범위 내에 있도록 잔류 활성 검정은 조정된다.
참조 알파-아밀라아제 및 그의 변이체
참조 알파-아밀라아제는 LE399(예를 들어, 이전에 WO 2002/010355호에 개시)이다. LE399는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 유래의 알파-아밀라아제(SEQ ID NO: 6)의 아미노산 1 내지 37 및 하기의 치환 G48A T49I G107A H156Y A181T N190F I201F A209V Q264S을 지니는 바실러스 리케니포르미스 유래의 알파-아밀라아제(SEQ ID NO: 1)의 아미노산 40 내지 483을 포함한다.
시험된 변이체는 LE399의 변이체여서, 하기 표에 열거된 바와 같은 각 변이체 내의 치환은 LE399에 비한 치환이다. 위치 넘버링은 SEQ ID NO: 1에 따라 이루어진다.
실시예 1
pH 4.5에서 알파-아밀라아제 변이체의 열안정성
참조 알파-아밀라아제 및 그의 알파-아밀라아제 변이체의 열안정성은, 참조 알파-아밀라아제 및 변이체를 pH 4.5 및 90 또는 95℃의 온도에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션시키고, 이어서 EnzChek® 기질(EnzChek® Ultra 아밀라아제 검정 키트, E33651, Molecular Probes)을 사용한 잔류 활성 결정에 의해 결정하였다.
정제된 효소 시료를 효소 희석 완충제(10 mM 아세테이트, 0.01% Triton X100, 0.125 mM CaCl2, pH 5.0) 중에 5 및 10ppm(마이크로그램/㎖)의 작동 농도로 희석하였다. 20 마이크로리터의 효소 시료를 96-웰 PCR MTP로 옮기고, 180 마이크로리터의 안정성 완충제(150 mM 아세테이트, 0.01% Triton X100, 0.125 mM CaCl2, pH 4.5 또는 4.8)를 각 웰에 첨가하고 혼합하였다. 2가지 농도의 효소를 사용하여 검정을 2벌로 수행하였다. 90℃ 또는 95℃에서의 인큐베이션 전에, 20 마이크로리터를 빼내고, 비스트레스(unstressed) 대조군 시료로서 얼음에 보관하였다. 인큐베이션을 2 또는 8분(pH 4.5 및 90℃) 및 30분(pH 4.5 및 95℃) 동안 PCR 장치에서 수행하였다. 잔류 활성이 10 내지 90%이도록 인큐베이션 시간(분)을 선택한다.
인큐베이션 시료를 잔류 활성 완충제(100 mM 아세테이트, 0.01% Triton X100, 0.125 mM CaCl2, pH 5.5) 중에 15 ng/㎖로 희석한 후에, 25 마이크로리터의 희석된 효소를 블랙 384-웰 MTP에 전달하였다. 25 마이크로리터의 기질 용액(100 마이크로그램/㎖)을 각 웰에 첨가함으로써 잔류 활성을 EnzChek® 기질을 사용하여 결정하였다. 형광을 485-P nm에서 여기 필터 및 555 nm에서 방출 필터를 사용하여 25℃에서 15분 동안 매분 결정하였다(형광 판독기는 Polarstar, BMG임). 잔류 활성을 각 설정을 위해 비스트레스 대조군 시료에 대하여 정규화시켰다.
지수함수형 붕괴라면, 반감기 시간(T½(분))을 식 T½(분) = T(분)*LN(0.5)/LN(RA%/100)을 사용하여 계산하고, 여기서, T는 분 단위의 검정 인큐베이션 시간이며, RA%는 검정에서 결정되는 잔류 활성%이다.
이러한 검정 설정을 사용하여, 반감기 시간은 표 1 및 2에 나타낸 바와 같이 참조 알파-아밀라아제 및 그의 변이체에 대한 열안정성의 척도로서 결정되었다.
참조 아밀라아제를 95℃에서 30분 동안 pH 4.5, 0.125 mM CaCl2에서 시험하지 않았는데, 이는 잔류 활성이 존재하지 않기 때문이다(반감기는 90℃에서 1.2분이다).
Figure pct00002
Figure pct00003
실시예 2
pH 4.8에서의 알파-아밀라아제 변이체의 열안정성
참조 알파-아밀라아제 및 그의 알파-아밀라아제 변이체의 열안정성은, 참조 알파-아밀라아제 및 변이체를 pH 4.8 및 90 또는 95℃의 온도에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션시키고, 이어서 EnzChek® 기질(EnzChek® Ultra 아밀라아제 검정 키트, E33651, Molecular Probes)을 사용한 잔류 활성 결정에 의해 결정하였다.
정제된 효소 시료를 효소 희석 완충제(10 mM 아세테이트, 0.01% Triton X100, 0.125 mM CaCl2, pH 5.0) 중에 5 및 10ppm(마이크로그램/㎖)의 작동 농도로 희석하였다. 20 마이크로리터의 효소 시료를 96-웰 PCR MTP로 옮기고, 180 마이크로리터의 안정성 완충제(150 mM 아세테이트, 0.01% Triton X100, 0.125 mM CaCl2, pH 4.5 또는 4.8)를 각 웰에 첨가하고 혼합하였다. 2가지 농도의 효소를 사용하여 검정을 2벌로 수행하였다. 90 또는 95℃에서의 인큐베이션 전에, 20 마이크로리터를 빼내고, 비스트레스 대조군 시료로서 얼음에 보관하였다. 인큐베이션을 PCR 장치에서 12, 20 또는 25분(pH 4.8 및 90℃), 또는 50분(pH 4.8 및 95℃)에 수행하였다. 잔류 활성이 10 내지 90%이도록 인큐베이션 시간(분)을 선택하였다.
인큐베이션 시료를 잔류 활성 완충제(100 mM 아세테이트, 0.01% Triton X100, 0.125 mM CaCl2, pH 5.5) 중에 10 내지 20 ng/㎖로 희석한 후에, 25 마이크로리터의 희석된 효소를 블랙 384-웰 MTP에 전달하였다. 25 마이크로리터의 기질 용액(100 마이크로그램/㎖)을 각 웰에 첨가함으로써 잔류 활성을 EnzChek® 기질을 사용하여 결정하였다. 형광을 485-P nm에서 여기 필터 및 555 nm에서 방출 필터를 사용하여 25℃에서 15분 동안 매분 결정하였다(형광 판독기는 Polarstar, BMG임). 잔류 활성을 각 설정을 위해 대조군 시료에 대하여 정규화시켰다.
지수함수형 붕괴라면, 반감기 시간(T½(분))을 식 T½(분) = T(분)*LN(0.5)/LN(RA%/100)을 사용하여 계산하였고, 여기서, T는 분 단위의 검정 인큐베이션 시간이며, RA%는 검정에서 결정되는 잔류 활성%이다.
이러한 검정 설정을 사용하여, 반감기 시간은 표 3 및 4에 나타낸 바와 같이 참조 알파-아밀라아제 및 그의 변이체에 대한 열안정성의 척도로서 결정하였다.
참조 아밀라아제를 95℃에서 50분 동안 pH 4.8, 0.125 mM CaCl2에서는 시험하지 않았는데, 이는 잔류 활성이 존재하지 않기 때문이다(반감기는 90℃에서 4.6분이다).
Figure pct00004
Figure pct00005
본 명세서에서 설명되고 청구되는 본 발명은 본 명세서에 개시되는 특정 양태에 의해 범주가 제한되지 않는데, 이는 이들 양태가 본 발명의 몇몇 양태의 예시로서 의도되기 때문이다. 어떤 동등한 양태는 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 의도된다. 게다가, 본 명세서에 나타내고 설명한 것에 더하여 본 발명의 다양한 변형은 앞서 언급한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 또한 첨부되는 특허청구범위의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다. 상충되는 경우에, 정의를 포함하는 본 명세서가 좌우할 것이다.

Claims (15)

  1. SEQ ID NO: 1의 위치 185에 상응하는 위치에서의 프롤린으로의 치환을 포함하고, SEQ ID NO: 1의 위치 15, 48, 49, 50, 107, 116, 133, 138, 156, 176, 181, 187, 188, 190, 197, 201, 205, 209, 213, 239, 241, 255, 264, 299, 360, 375, 416, 437, 474 및 475에 상응하는 1개 이상의 위치에서의 치환을 더 포함하는 알파-아밀라아제 변이체로서, 상기 변이체가 (i) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 중 임의의 것의 성숙 폴리펩티드, 또는 (ii) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 3의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 4의 아미노산 1 내지 482, SEQ ID NO: 5의 아미노산 1 내지 484, SEQ ID NO: 6의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 7의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 8의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 9의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 11의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 12의 아미노산 1 내지 480, SEQ ID NO: 13의 아미노산 1 내지 483 또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 1 내지 481에 대하여 적어도 60% 및 100% 미만의 서열 동일성을 가지며, 상기 변이체가 알파-아밀라아제 활성을 가지는 변이체.
  2. 제1항에 있어서,
    위치 15에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Leu, Ser 또는 Thr으로의 치환;
    위치 48에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Ala으로의 치환;
    위치 49에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Gly, His, Ile 또는 Leu으로의 치환;
    위치 50에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Thr으로의 치환;
    위치 107에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Ala으로의 치환;
    위치 116에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Gly으로의 치환;
    위치 133에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Tyr으로의 치환;
    위치 138에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Tyr 또는 Val, 특히 Phe 또는 Tyr으로의 치환;
    위치 156에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Tyr으로의 치환;
    위치 176에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Leu으로의 치환;
    위치 181에 상응하는 위치에서의 Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Asp, Glu 또는 Thr으로의 치환;
    위치 187에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Asp으로의 치환;
    위치 188에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Ser 또는 Thr으로의 치환;
    위치 190에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Phe으로의 치환;
    위치 197에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Ile, Leu, Ser, Thr 또는 Val으로의 치환;
    위치 201에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Phe 또는 Tyr으로의 치환;
    위치 205에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Tyr으로의 치환;
    위치 209에 상응하는 위치에서의 Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Val으로의 치환;
    위치 213에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Thr으로의 치환;
    위치 239에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Ala, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu 또는 Met으로의 치환;
    위치 241에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Asp으로의 치환;
    위치 255에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Gly 또는 Pro으로의 치환;
    위치 264에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Ser으로의 치환;
    위치 299에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Arg으로의 치환;
    위치 360에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Ser으로의 치환;
    위치 375에 상응하는 위치에서의 Ala, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Gly 또는 Val으로의 치환;
    위치 416에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Val으로의 치환;
    위치 437에 상응하는 위치에서의 Ala, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Trp으로의 치환;
    위치 474에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Arg, Gln, Glu 또는 Lys으로의 치환; 또는
    위치 475에 상응하는 위치에서의 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val, 특히 Arg, Gln, Glu 또는 Lys으로의 치환을 포함하는 변이체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 변이체가 (i) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 중 임의의 것의 성숙 폴리펩티드, 또는 (ii) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 3의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 4의 아미노산 1 내지 482, SEQ ID NO: 5의 아미노산 1 내지 484, SEQ ID NO: 6의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 7의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 8의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 9의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 11의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 12의 아미노산 1 내지 480, SEQ ID NO: 13의 아미노산 1 내지 483 또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 1 내지 481에 대하여 적어도 65%, 예를 들어, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이지만 100% 미만인 서열 동일성을 갖는 변이체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, (a) (i) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 중 임의의 것의 성숙 폴리펩티드, 또는 (ii) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 3의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 4의 아미노산 1 내지 482, SEQ ID NO: 5의 아미노산 1 내지 484, SEQ ID NO: 6의 아미노산 1 내지 483, SEQ ID NO: 7의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 8의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 9의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 11의 아미노산 1 내지 485, SEQ ID NO: 12의 아미노산 1 내지 480, SEQ ID NO: 13의 아미노산 1 내지 483 또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 1 내지 481에 대하여 적어도 60%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드, 또는
    (b) 알파-아밀라아제 활성을 갖는, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 중 임의의 것의 성숙 폴리펩티드의 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 모(parent) 알파-아밀라아제의 변이체인 변이체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 알파-아밀라아제 변이체인 변이체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, M15T, M15S, M15L, G48A, T49H, T49G, T49L, T49I, S50T, G107A, T116G, H133Y, W138Y, W138F, H156Y, K176L, A181T, A181E, A181D, S187D, N188S, N188T, N190F, M197S, M197T, M197V, M197L, M197I, I201Y, I201F, H205Y, A209V, K213T, S239Q, S239E, S239N, S239D, S239A, S239M, S239C, L241D, E255P, E255G, Q264S, G299R, Q360S, R375V, R375G, D416V, R437W, G474K, G474R, G474E, G474Q, G475K, G475R, G475E 및 G475Q로 구성된 군으로부터 선택되는 1개 이상의 치환을 포함하는 변이체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    T49H+K176L+E185P,
    T49G+K176L+E185P,
    T49L+S50T+K176L+E185P,
    T116G+K176L+E185P,
    K176L+E185P,
    K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W,
    K176L+E185P+L241D,
    K176L+E185P+R375V, 및
    K176L+E185P+R375G로 구성된 군으로부터 선택되는 일련의 치환을 포함하는 변이체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 90℃ 및 pH 4.5에서 0.125 mM CaCl2와 인큐베이션되는 경우, SEQ ID NO: 1의 성숙 폴리펩티드에 비하여 증가된 잔류 활성 반감기를 갖는 변이체.
  9. 전분-함유 물질을 액화시키기 위한 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 변이체의 용도.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 변이체를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  11. 제10항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 작제물(construct).
  12. 제10항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  13. 제10항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
  14. 알파-아밀라아제 변이체의 생성 방법으로서,
    a. 제13항의 숙주 세포를 변이체의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계; 및
    b. 상기 변이체를 회수하는 단계를 포함하는 알파-아밀라아제 변이체의 생성 방법.
  15. 알파-아밀라아제 변이체의 획득 방법으로서,
    (a) SEQ ID NO: 1의 위치 185에 상응하는 위치에서의 프롤린으로의 치환 및 추가로 SEQ ID NO: 1의 위치 15, 48, 49, 50, 107, 116, 133, 138, 156, 176, 181, 187, 188, 190, 197, 201, 205, 209, 213, 239, 241, 255, 264, 299, 360, 375, 416, 437, 474 및 475에 상응하는 1개 이상의 위치에서의 치환을 모 알파-아밀라아제에 도입하는 단계; 및 (b) 상기 변이체를 회수하는 단계를 포함하는 알파-아밀라아제 변이체의 획득 방법.
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