BR112020004617A2

BR112020004617A2 - processo de produção de xilitol a partir de resíduos lignocelulósicos utilizando candida guilliermondii

Info

Publication number: BR112020004617A2
Application number: BR112020004617-5A
Authority: BR
Inventors: Javier Arragoiti Kuri; Lorena Leticia Pedraza Segura
Original assignee: Universidad Iberoamericana, A.C.
Priority date: 2017-09-08
Filing date: 2018-09-06
Publication date: 2020-09-24
Also published as: WO2019049064A1; MX2017011538A; CL2020000548A1; CO2020001985A2

Abstract

A presente invenção consiste em um processo de produção de xilitol a partir de resíduos lignocelulósicos utilizando Candida guilliermondii que procura eliminar os inconvenientes apresentados pelos processos biotecnológicos de produção de xilitol atualmente utilizados em termos de rendimento e em um tempo convenientemente mais curto, sem a necessidade de um processo de desintoxicação antes da fermentação; sendo assim de descreve um processo que compreende fermentar uma solução de xilose obtida a partir da hidrólise do milho com uma levedura Candida guilliermondii e branquear o meio resultante da fermentação com carvão ativado para obter xilitol.

Description

“PROCESSO DE PRODUÇÃO DE XILITOL A PARTIR DE RESÍDUOS LIGNOCELULÓSICOS UTILIZANDO CANDIDA GUILLIERMONDII” CAMPO DA INVENÇÃO

[001]A presente invenção está relacionada a métodos biotecnológicos que usam resíduos lignocelulósicos para produzir biomoléculas de interesse e, mais particularmente, está relacionada a um processo de produção de xilitol a partir de resíduos lignocelulósicos usando levedura Candida guilliermondii.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002]O xilitol é um poliálcool que possui um amplo mercado em todo o mundo devido às suas vantagens na área de alimentos e saúde. Do ponto de vista de seu uso como adoçante, o xilitol possui uma doçura e um sabor semelhantes à sacarose, mas é absorvido muito mais lentamente e não promove hiperglicemia; além disso, seu metabolismo é independente da insulina de modo que resulta em um adoçante adequado para diabéticos. Na área médica, o xilitol demonstrou ter efeitos anticáries e de inibição na na formação de placa e de tártaro. Também existem publicações como por exemplo, a de Uhari, Matti et al., “A Novel Use of Xylitol Sugar in Preventing Acute Otitis Media”, Pediatrics, 102 (4 Pt 1): 879–884 (Octubre 1998) y la de Jones AH., “Intranasal xylitol, recurrent otitis media and asthma: Three case studies.”, Clinical Practice of Alternative Medicine, 2 (2): 112–17 (2001) que mencionam o uso de xilitol na prevenção de otite aguda pediátrica.

[003]A produção industrial de xilitol é realizada principalmente através da hidrogenação da xilose, um processo químico que requer várias etapas de purificação e onde é obtido um rendimento de xilitol de aproximadamente 50-60% da xilose presente nos resíduos hemicelulósicos. É um processo trabalhoso que torna este produto relativamente caro.

[004]Uma alternativa importante do método químico é realizada através de processos biotecnológicos, utilizando leveduras de diferentes gêneros e tendo como matéria-prima resíduos lignocelulósicos. Existem vários documentos de patentes que descrevem processos para obter etanol e/ou xilitol a partir de resíduos lignocelulósicos, como madeira, casca de arroz e sabugo de milho, com o uso de cepas do gênero Pichia e Candida, por exemplo, documentos US2011/0097780, EP1306442 e WO2014/045297. Também os documentos Jeevan, P et. al., “Optimization Studies on acid hydrolysis of corn cob hemicellulosic hydrolysate for microbial production of xylitol”, J Microbiol. Biotech. Res., 2011, 1(4):114-123 y Villalba, M et. al., “Producción de xilitol a partir de cascarilla de arroz utilizando Candida guilliermondii”, Rev. Fac. Nal. Agr. Medellín, 62 (1): 4897-4905 (2009) descrevem processos microbianos para obtenção de xilitol, no entanto, todos esses processos têm a grande desvantagem de obter rendimentos muito baixos (entre 0,19 e 0,65 g de xilitol/g de substrato) e de se tratar de processos com um tempo de fermentação muito alto (entre 72 a 216 horas) que aumentam o custo total da produção de xilitol.

[005]Além disso, antes do processo de fermentação, é necessário desintoxicar o licor proveniente de um tratamento físico-químico de material lignocelulósico, para eliminar subprodutos tóxicos para os microrganismos utilizados na fermentação, os quais são gerados durante o mesmo tratamento.

[006]Como resultado do exposto, procurou-se eliminar os inconvenientes apresentados pelos processos biotecnológicos da produção de xilitol atualmente utilizados, desenvolvendo um processo de produção de xilitol a partir de resíduos lignocelulósicos utilizando Candida guilliermondii que, além de fornecer uma alternativa para a síntese química do xilitol, permite que seja feito com um rendimento aumentado e em um menor tempo de fermentação.

OBJETIVOS DA INVENÇÃO

[007]Tendo em conta os defeitos da técnica anterior, é um objetivo da presente invenção fornecer um método de produção de xilitol alternativo à síntese química por hidrogenação da xilose.

[008]Um outro objetivo da presente invenção é fornecer um processo que tenha um rendimento superior ao método químico e aos processos de fermentação descritos no estado da técnica em um tempo convenientemente mais curto, sem a necessidade de um processo de desintoxicação antes da fermentação.

[009]Outro objetivo da presente invenção é usar resíduos lignocelulósicos como matéria-prima para obter xilitol, especificamente sabugo de milho que é uma fonte barata e com boa disponibilidade de matéria-prima para obter xilitol pela via fermentativa que também possui facilidade de ser purificada.

[010] Estes e outros objetivos são alcançados por um processo de produção de xilitol a partir de resíduos lignocelulósicos usando Candida guilliermondii de acordo com a presente invenção. BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO.

[011]A presente invenção descreve um processo de produção de xilitol compreendendo as etapas de: i) fermentação com levedura Candida guilliermondii de uma solução de xilose obtida a partir da hidrólise do sabugo de milho (ii) descoloração do meio resultante da fermentação com carvão ativado para obter xilitol, em que a etapa de fermentação ocorre em menos de 65 horas.

[012]Outro aspecto da presente invenção compreende uma levedura Candida guilliermondii com o número de acesso CM-CNRG-0032, que possui um comportamento vantajoso contra fatores de estresse, como a presença de ácido acético e hidroximetilfurfural (HMF).

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[013]Os novos aspectos que são considerados característicos da presente invenção serão estabelecidos com particularidade nas reivindicações anexas. No entanto, algumas modalidades, características e alguns objetivos e vantagens das mesmas serão melhor compreendidos na descrição detalhada, quando lidos em relação aos desenhos anexos, nos quais:

[014]A Figura 1 mostra a curva de crescimento de C. guilliermondii N°. de acesso CM-CNRG-0032 em diferentes concentrações de ácido acético adicionado ao meio de cultura.

[015]A Figura 2 é um gráfico que mostra os resultados da produção de xilitol, consumo de xilose e crescimento microbiano (D.O.) para o experimento 1 do projeto de Plackett-Burman.

[016]A Figura 3 mostra os valores de rendimento de conversão de substrato em produto (YP/S) para os experimentos 1 a 7.

[017]A Figura 4 é um gráfico que mostra os resultados da produção de xilitol, consumo de xilose e crescimento microbiano (D.O.) para o experimento 3c do projeto de quadrados latinos.

[018]A Figura 5 mostra os valores de rendimento de conversão de substrato para produto (YP/S) para os experimentos 1a-c, 2a-c e 3a-c.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[019]Verificou-se que é necessário um método de produção de xilitol alternativo à síntese química que tenha um rendimento superior e que seja realizado em um tempo convenientemente mais curto do que os métodos fermentativos descritos na técnica anterior, além de poupar o processo de desintoxicação antes da fermentação

[020]Assim, em um aspecto da invenção, é descrito um processo de produção de xilitol que compreende as etapas de: (i) fermentação com uma levedura Candida guilliermondii de uma solução de xilose obtida a partir da hidrólise do sabugo de milho e que não precisa ser previamente desintoxicada.

(ii) descoloração do meio resultante da fermentação com carvão ativado para obter xilitol, em que a etapa de fermentação ocorre em menos de 65 horas.

[021]A cepa de Candida guilliermondii depositada em 9 de maio de 2017 no Centro Nacional de Recursos Genéticos, localizado em Jalisco, México, com o número de acesso CM-CNRG-0032 utilizada no processo de produção de xilitol de acordo com a presente invenção apresenta um comportamento vantajoso diante de fatores de estresse, como a presença de ácido acético e hidroximetilfurfural (HMF), o que é importante já que o pré-tratamento que é dado ao sabugo de milho para obter a solução de xilose gera ácido acético como subproduto. Além disso, a cepa de Candida guilliermondii com o número de acesso CM-CNRG-0032 pode crescer a uma temperatura de até 40 °C sem inibição.

[022]Em uma modalidade preferida da presente invenção, a etapa de fermentação é realizada em um lote ou lote alimentado, em que a velocidade de agitação é menor que 300 rpm. De preferência, a velocidade de agitação está entre 125 e 150 rpm.

[023]A solução de xilose é o meio de cultura de fermentação. De preferência, a solução de xilose obtida a partir da hidrólise do sabugo de milho contém entre 20 e 100 g/L de xilose.

[024]De preferência, o valor de pH da solução de xilose está entre 6 e 8. Com mais preferência, o pH do meio de fermentação é 7.

[025]Em uma modalidade preferida da presente invenção, a solução de xilose obtida a partir da hidrólise do sabugo de milho compreende adicionalmente o extrato de levedura (YE), uma solução de elementos traços, sais e nutrientes para levedura.

[026]De preferência, a solução de xilose contém entre 2,5 e 3,5 g de extrato de levedura por litro. Com mais preferência, a solução de xilose contém 3 g de extrato de levedura por litro.

[027]A composição da solução de elementos traços é de preferência a seguinte: 15 g/L de EDTA, 5,75 g/L de ZnSO4·7H2O, 0,32 g/L de MnCl2 ·4H2O, 0,5 g/L de CuSO4·5H2O, 0,47g/L de CoCl2·6H2O, 0,48 g/L de Na2MoO4·2H2O, 2,9 g/L de CaCl2·2H2O e 2,8 g/L de FeSO4·7 H2O. No meio de cultura, isso é equivalente a 17,25 ppm de ZnSO4 • 7H2O, 0,96 ppm de MnCl2 4H2O, 1,5 ppm de CuSO4 5H2O, 1,41 ppm de CoCl2 · 6H2O, 1,44 ppm de Na2MoO4 2H2O, 8,7 ppm de CaCl2 2H2O e 8,4 ppm de FeSO4 7 H2O.

[028]De preferência, os sais são selecionados do grupo que compreende KH2PO4, MgSO4, (NH4)2SO4 ou CaCl2.

[029]De acordo com a presente invenção, o nutriente de levedura deve ser entendido como a mistura de nitrogênio inorgânico, vitaminas e minerais, que pode variar de acordo com a empresa que o fornece.

[030]De acordo com a presente invenção, o meio de cultura após a conclusão da fermentação é centrifugado a 2000 rpm por 20 minutos para a separação da biomassa. Posteriormente, o líquido separado é filtrado e realiza-se uma descoloração do líquido passando-o através de uma coluna de carvão ativado em que a razão entre o carvão ativado e o líquido na coluna é de 70 a 100 g/L.

[031]Os parâmetros mais importantes da descoloração com carvão ativado são: o tempo de contato e a velocidade linear do fluido. Para a descoloração total do líquido de acordo com a presente invenção, o tempo de contato é mantido entre 6 e 30 minutos, enquanto a velocidade linear é mantida entre 5 e 20 m/h.

[032]A presente invenção será mais bem compreendida a partir dos exemplos a seguir, que são apresentados para fins ilustrativos apenas para permitir o entendimento completo das modalidades preferidas. Exemplo 1: Resistência de Candida guilliermondii nº. de acesso CM-CNRG- 0032 a fatores de estresse relevantes na produção de xilitol.

[033]Foi testada a resistência da cepa com nº. de acesso CM-CNRG-0032 ao ácido acético, um inibidor presente no licor de xilose proveniente de resíduos lignocelulósicos, medindo sua velocidade de crescimento e analisando sua morfologia em meios de cultura com e sem ácido acético.

[034]Na Figura 1 observa-se que a levedura cresce mais rapidamente com a adição de ácido acético, uma vez que surpreendentemente consegue assimilar o dito composto, apesar do fato de que na técnica anterior há evidências de que o dito microrganismo é sensível à presença de ácido acético, como demonstrado por Silva et al (2004), Sene et al (2001), e Pereira (2011). TABELA 1 Concentração Inibidor Φ às 24 h Φ às 96 h (g/L) 0 1,1 cm 1,5 cm 0,45 1 cm 1,4 cm 0,95 1 cm 1,4 cm

HMF 1,9 0,9 cm 1,2 cm 2,85 0,6 cm 1,1 cm 3,8 0,6 cm 1,2 cm 0 1,1 cm 1,5 cm 25 1 cm 1,3 cm NaCl 37,5 1 cm 1 cm 50 1 cm 1 cm 75 0,9 cm 0,9 cm 0 0,7 cm 1 cm 20 1,1 cm 1,5 cm 40 1 cm 1 cm Glc 50 0,5 cm 1,1 cm 60 1 cm 1,2 cm 70 0,9 cm 1,1 cm

[035]No entanto, foi analisada sua resistência a vários compostos, tanto inibidores provenientes do tratamento termoquímico como altas concentrações de açúcares e sais, que são condições que podem ser encontradas nos meios de cultura. As placas de Petri foram preparadas com meio YPD padrão (10 g/L de extrato de levedura, 20 g/L de peptona, 20 g/L de dextrose e 15 g/L de ágar) e adição de hidroximetilfurfural (HMF), cloreto de sódio (NaCl) ou glicose (Glc) em diferentes concentrações, as placas foram inoculadas e o diâmetro de crescimento da colônia de Candida guilliermondii foi medido às 24 e 96 horas de incubação a 27 °C. A tabela 1 mostra os resultados, expressos como a medida em cm do diâmetro (Φ) da colônia de leveduras.

[036]Os resultados anteriores mostram que a levedura Candida guilliermondii nº. de acesso CM-CNRG-0032 apresenta osmotolerância e resistência à presença de ácido acético, o que permite evitar um processo de desintoxicação do licor de xilose a partir de um tratamento físico-químico do material lignocelulósico, reduzindo os custos do processo. Exemplo 2: Identificação de parâmetros com maior influência na produção de xilitol

[037]A metodologia de Plackett-Burman é utilizada estabelecendo sete variáveis ou parâmetros e seus limites de variação conforme mostrado na Tabela 2. TABELA 2 Parâmetro Símbolo - + 7 (6,5 de pH (licor) A 6,5 (6,0 de meio) meio) Velocidade de agitação B 125 rpm 175 rpm Razão de carbono/nitrogênio (C/N) C 15 20 Extrato de levedura (YE) D 1,5 g/L 3 g/L Solução de elementos traços E 2 mL/L 3 mL/L KH2PO4 F 1 g/L 2 g/L MgSO4 G 0,1 g/L 0,3 g/L

[038]Deve-se entender que a razão de carbono/nitrogênio (C/N) se refere à razão em peso entre carbono orgânico e nitrogênio em um meio de cultura.

[039]Oito experimentos foram realizados de acordo com a matriz de variação estabelecida para este projeto experimental que é mostrado na Tabela 3. TABELA 3

Parâmetro

A B C D E F G Experimento 1 + - - + - + + 2 + + - - + - + 3 + + + - - + - 4 - + + + - - + 5 + - + + + - - 6 - + - + + + - 7 - - + - + + + 8 - - - - - - -

[040]Independentemente dos sete parâmetros descritos acima, o meio de cultura manteve valores fixos para os parâmetros mostrados na Tabela 4. TABLA 4 Parâmetro Concentração (g/L) (NH4)2SO4 1,2 CaCl2 0,1 Nutriente para levedura 0,5

[041]Cada experimento foi realizado em triplicata com o uso de frascos Erlenmeyer de 500 mL. Para cada frasco foram adicionados 100 mL de meio de cultura e 5 mL de inóculo.

[042]As amostras foram coletadas a 0, 6, 12, 22, 28, 36, 46, 54 e 60 horas de fermentação para a medição da densidade óptica, concentração de açúcar e xilitol. As leituras de densidade óptica foram realizadas por espectrofotometria no comprimento de onda de 660 nm, enquanto a quantificação da concentração de açúcares e xilitol foi realizada por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC).

[043]O gráfico da cinética obtida no experimento 1, que registrou o melhor rendimento de conversão de xilose em xilitol com um valor de YP/S = 0,55, é mostrado na Figura 2. Os resultados dos rendimentos de conversão de substrato em produto de todos os experimentos são mostrados na Figura 3.

[044]Foi realizada análise estatística, que consiste em realizar a soma algébrica das respostas, de acordo com os experimentos delineados de acordo com a tabela 3. A partir dessa soma, um modelo linear é gerado de acordo com a influência de cada fator, resultando em uma equação geral: Y = b0 + A + B + C + D + E + F + G Onde: Y = resposta esperada b0 = resposta média ou grande média A… G = influência de cada parâmetro

[045]Os resultados da referida análise estatística produziram uma equação específica para a matriz gerada na Tabela 2, como mostrado a seguir: Y = 0,3324 + 0,09631A -0,05459B -0,00367C + 0,05244D + 0,03146E + 0,01495F + 0,03171G

[046]Para interpretar dita equação, considera-se que o valor absoluto do coeficiente de cada parâmetro avaliado é o critério para determinar quais são os parâmetros com maior influência no rendimento da produção. Em outras palavras, o coeficiente com o valor mais alto é o parâmetro mais influente.

[047]De acordo com a presente invenção, o parâmetro mais influente é o pH (A), seguido da velocidade de agitação (B) e da concentração de extrato de levedura (D), enquanto a razão entre carbono e nitrogênio (C) acabou sendo a menos influente. Exemplo 3: Otimização dos parâmetros com maior influência na produção de xilitol

[048]Uma vez identificados os parâmetros mais influentes para a produção de xilitol, foi realizada uma otimização desses parâmetros. Nesse caso, o método escolhido para atingir esse objetivo foi o uso de um projeto experimental de quadrados latinos.

[049]Neste projeto experimental, três valores são atribuídos a cada parâmetro, com nove experimentos diferentes. A tabela 5 abaixo mostra o projeto experimental utilizado: TABELA 5 Velocidade de agitação pH 125 rpm 135 rpm 150 rpm 7,5 de meio (licor 8) 2,5 g YE/L 3 g YE/L 3.5 g YE/L 7 de meio (licor 7,5) 3 g YE/L 3,5 g YE/L 2,5 g YE/L 6,5 de meio (licor 7) 3,5 g YE/L 2,5 g YE/L 3 g YE/L Codificação alfanumérica gerada para cada experimento

[050]Experimento 1a: meio de pH 7,5 (licor 8), concentração de extrato de levedura 2,5 g/L e velocidade de agitação de 125 rpm.

[051]Experimento 1b: meio de pH 7,5 (licor 8), concentração de extrato de levedura 3 g/L e velocidade de agitação de 135 rpm.

[052]Experimento 1c: meio de pH 7,5 (licor 8), concentração de extrato de levedura 3.5 g/L e velocidade de agitação de 150 rpm.

[053]Experimento 2a: meio de pH 7 (licor 7,5), concentração de extrato de levedura 3 g/L e velocidade de agitação de 125 rpm.

[054]Experimento 2b: meio de pH 7 (licor 7,5), concentração de extrato de levedura 3,5 g/L e velocidade de agitação de 135 rpm.

[055]Experimento 2c: meio de pH 7 (licor 7,5), concentração de extrato de levedura 2,5 g/L e velocidade de agitação de 150 rpm.

[056]Experimento 3a: meio de pH 6,5 (licor 7), concentração de extrato de levedura 3,5 g/L e velocidade de agitação de 125 rpm.

[057]Experimento 3b: meio de pH 6,5 (licor 7), concentração de extrato de levedura 2,5 g/L e velocidade de agitação de 135 rpm.

[058]Experimento 3c: meio de pH 6,5 (licor 7), concentração de extrato de levedura 3 g/L e velocidade de agitação de 150 rpm.

[059]A Tabela 6 mostra o restante dos componentes do meio, que foram fixados de acordo com os melhores resultados dos Experimentos realizados no projeto experimental de Plackett-Burman. TABLA 6 Componente Concentração Xilose 21 g/L KH2PO4 2 g/L (NH4)2SO4 1,2 g/L MgSO4 0,3 g/L CaCl2 0,1 g/L Nutriente de levedura 0,5 g/L Solução de elementos traços 2 mL/L

[060]Cada experimento foi realizado em frascos Erlenmeyer de 500 mL, em duplicata. Para cada frasco foram adicionados 100 mL de meio de cultura e 5 mL de inóculo.

[061]As amostras foram coletadas a horas 0, 6, 12, 22, 28, 36, 46, 54 e 60 para a medição da densidade óptica, concentração de açúcar e xilitol. As leituras de densidade óptica foram realizadas com o uso de espectrofotômetros a um comprimento de onda de 660 nm, enquanto a quantificação da concentração de açúcares e xilitol foi realizada por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC).

[062]A Figura 4 mostra a cinética obtida no experimento 3c, que registrou o melhor rendimento de conversão de xilose em xilitol com um valor de YP/S = 0,77. Os resultados dos rendimentos de conversão de substrato em produto do restante dos Experimentos são mostrados na Figura 5.

[063]Como pode ser visto na Figura 5, o experimento 3b/3c registrou um rendimento surpreendentemente superior ao restante dos experimentos que oscilam entre valores de produtividade de 0,4 e 0,54, que são ainda menores que o rendimento inicial obtido no experimento 1 do exemplo 1

[064]De acordo com o acima exposto, será evidente para um versado na técnica que a modalidade preferida do processo de produção de xilitol ilustrada acima é apresentada apenas para fins ilustrativos, mas não limita-se à presente invenção, uma vez que um versado na técnica pode executar numerosas variações, desde que sejam projetadas de acordo com os princípios da presente invenção.

[065]Como consequência do precedente, a presente invenção inclui todas as modalidades que um versado na técnica pode deduzir dos conceitos contidos na presente descrição, de acordo com as reivindicações a seguir.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo de produção de xilitol, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: i) fermentar uma solução de xilose obtida a partir da hidrólise do sabugo de milho com uma levedura Candida guilliermondii com número de acesso CM-CNRG-0032 (ii) descolorir o meio resultante da fermentação com carvão ativado para obter xilitol, onde a etapa de fermentação ocorre em menos de 65 horas.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO adicionalmente pelo fato de que a etapa de fermentação é realizada em um lote ou lote alimentado.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO adicionalmente pelo fato de que a etapa de fermentação é realizada a uma velocidade de agitação menor que 300 rpm.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO adicionalmente pelo fato de que a etapa de fermentação é realizada a uma velocidade de agitação entre 125 e 150 rpm.

5. Processo de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO adicionalmente pelo fato de que a solução de xilose obtida a partir da hidrólise do sabugo de milho contém entre 20 e 100 g/L de xilose.

6. Processo de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO adicionalmente pelo fato de que o valor de pH da solução de xilose está entre 6 e 8.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO adicionalmente pelo fato de que o valor de pH da solução de xilose é 7.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO adicionalmente pelo fato de que a solução de xilose obtida a partir da hidrólise do sabugo de milho compreende adicionalmente extrato de levedura (YE), uma solução de elementos traços, sais e/ou nutrientes para levedura.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO adicionalmente pelo fato de que a solução de xilose compreende entre 2,5 e 3,5 g de extrato de levedura por litro.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO adicionalmente pelo fato de que a solução de xilose compreende 3 g de extrato de levedura por litro.

11. Processo de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO adicionalmente pelo fato de que a solução de elementos traços compreende 15 g/L de EDTA, 5,75 g/L de ZnSO4·7H2O, 0,32 g/L de MnCl2 ·4H2O, 0,5 g/L de CuSO4·5H2O, 0,47g/L de CoCl2·6H2O, 0,48 g/L de Na2MoO4·2H2O, 2,9 g/L de CaCl2·2H2O e 2,8 g/L de FeSO4·7 H2O.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO adicionalmente pelo fato de que os sais são selecionados do grupo que compreende KH2PO4, MgSO4, (NH4)2SO4 ou CaCl2.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO adicionalmente pelo fato de que o nutriente de levedura é uma mistura de nitrogênio inorgânico, vitaminas e minerais.

14. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO adicionalmente pelo fato de que após a etapa (i) o meio de cultura é centrifugado a 2000 rpm por 20 minutos.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO adicionalmente pelo fato de que o líquido separado que foi centrifugado é filtrado.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO adicionalmente pelo fato de que a etapa (ii) é realizada em uma coluna de carvão ativado.

17. Processo, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO adicionalmente pelo fato de que a razão entre o carvão ativado e o líquido na coluna é de 70 a 100 g/L.

18. Processo, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO adicionalmente pelo fato de que o tempo de contato entre o líquido e o carvão ativado na etapa (ii) é mantido entre 6 e 30 minutos.

19. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO adicionalmente pelo fato de que a etapa (ii) é realizada a uma velocidade linear entre 5 e 20 m/h.

20. Levedura Candida guilliermondii, CARACTERIZADA pelo fato de que tem o número de acesso CM-CNRG-0032.