BR112020003459A2

BR112020003459A2 - bibliotecas, animal não humano, fago, cadeia leve de anticorpo, anticorpos, métodos para preparar uma biblioteca, para produzir uma biblioteca de anticorpos e para gerar um anticorpo biespecífico e kit

Info

Publication number: BR112020003459A2
Application number: BR112020003459-2A
Authority: BR
Inventors: Peter Peizhi Luo; Yan Li; Fangyong Du
Original assignee: Adagene Inc.
Priority date: 2017-08-21
Filing date: 2017-08-21
Publication date: 2020-08-25
Also published as: AU2017428934A1; EP3673100A4; CN111566262A; KR20230119260A; JP7324744B2; US20200362019A1; US20230287597A1; AU2017428934B2; US11585014B2; JP2020537633A; AU2017428934A8; WO2019036856A1; SG11202001549UA; CA3072111A1; IL272699A; EP3673100A1; JP2022033762A; KR20200054209A

Abstract

Trata-se de bibliotecas que contêm polinucleotídeos, em que um dos polinucleotídeos codifica uma cadeia leve de anticorpo com regiões hipervariáveis específicas HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3. São fornecidas adicionalmente bibliotecas que contêm polinucleotídeos que codificam uma pluralidade de anticorpos exclusivos, em que cada anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve. Além disto, são fornecidos anticorpos, bibliotecas de polipeptídeos, bibliotecas de vetores, células, animais não humanos, cadeias leves de anticorpo, métodos de produção de uma biblioteca de anticorpo, kits e métodos para gerar um anticorpo biespecífico relacionado aos mesmos.

Description

“CADEIA LEVE DE ANTICORPO, BIBLIOTECAS, FAGO, ANTICORPOS, MÉTODOS PARA PREPARAR UMA BIBLIOTECA, PARA PRODUZIR UMA BIBLIOTECA DE ANTICORPOS E PARA GERAR UM ANTICORPO BIESPECÍFICO E KIT” CAMPO DA INVENÇÃO:

[001] A presente divulgação se refere a bibliotecas contendo polinucleotídeos que codificam cadeias leves de anticorpo (por exemplo, cadeias leves de um anticorpo humano dinâmico), assim como cadeias leves de anticorpo, anticorpos, células, animais, métodos e kits relacionados aos mesmos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Anticorpos monoclonais se tornam extremamente úteis numa ampla variedade de campos, incluindo pesquisa biológica, diagnósticos médicos e produtos farmacêuticos. A variabilidade de especificidades de ligação potenciais permite anticorpos com especificidade e potência valiosas. No entanto, esta variabilidade torna difícil e trabalhosa a triagem através de um grande número de anticorpos para identificar um ou mais as propriedades desejadas.

[003] Um método de identificação de um anticorpo de interesse consiste na triagem através de uma biblioteca de anticorpos, tal como uma biblioteca de sequências de células B clonadas, uma biblioteca de exibição de fagos, uma biblioteca de exibição de levedura e assim por diante. Estas bibliotecas permitem que alguém realize a triagem através de um grande número de anticorpos, representando uma multiplicidade de sequências de anticorpos exclusivos, para identificar anticorpos com propriedades específicas de interesse, por exemplo, ligação a um alvo particular, afinidade de ligação, seletividade e similares. No entanto, as bibliotecas atuais têm limitações particulares. As bibliotecas derivadas de uma fonte biológica, tal como um repertório de células B humanas, são limitadas àquelas sequências de anticorpos que podem ser clonadas a partir da fonte. As bibliotecas sintéticas podem incluir sequências de ocorrência não natural em comparação com as bibliotecas biologicamente derivadas, porém elas são muito limitadas pela quantidade de anticorpos que podem ser sintetizados num período de tempo particular. Ademais, bibliotecas extremamente grandes exigem abordagens de triagem mais demoradas e exaustivas; de outro modo, apenas uma fração da biblioteca pode ser analisada de modo prático para um anticorpo de interesse.

[004] Portanto, existe uma necessidade de desenvolvimento de bibliotecas de anticorpo dinâmico contendo um conjunto robusto de unidades dinâmicas com perfis de sequência desenvolvíveis bem definidos para projetar e construir anticorpos dinâmicos que são potencialmente mais relevantes funcionalmente. Tais bibliotecas podem aprimorar muito não apenas a diversidade dos sítios de ligação ao anticorpo em anticorpos dentro da biblioteca, mas, também a eficiência de triagem para anticorpos que abrigam epítopos inovadores e/ou conformacionais num determinado antígeno. Além disto, tais bibliotecas podem aumentar a probabilidade com que um anticorpo particular de interesse pode ser identificado com um alto perfil de afinidade e capacidade de desenvolvimento.

[005] Todas as referências citadas no presente documento, incluindo pedidos de patente, publicações de patente e números de acesso ao UniProtKB/Swiss-Prot, são incorporadas ao presente documento a título de referência em sua totalidade, como se cada referência individual fosse específica e individualmente indicada para ser incorporada a título de referência.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] Para atender as necessidades acima e outras necessidades, são divulgadas no presente documento sequências de anticorpos, tais como regiões hipervariáveis de cadeia leves (HVRs) e regiões variáveis de cadeia leves (por exemplo, regiões VL), que permitem anticorpos humanos dinâmicos.

Estas sequências foram projetadas para permitir anticorpos com alças de sequências HVR altamente flexíveis que são capazes de ligar seus alvos com alta potência e/ou reconhecer múltiplos epítopos úteis e/ou reagir de modo cruzado com epítopos compartilhados entre diferentes espécies com baixa identidade de sequência (aproximadamente 60% de identidade de sequência ou menos). Vantajosamente, estas sequências de anticorpos permitem a criação de bibliotecas muito menores que, no entanto, contêm uma multiplicidade de anticorpos úteis e/ou uma diversidade muito maior num determinado tamanho de biblioteca. Tais bibliotecas podem ser usadas para identificar novos anticorpos de interesse que são específicos para uma ampla faixa de alvos ou, em alguns casos, reativos de modo cruzado contra múltiplos alvos de interesse.

[007] Consequentemente, num aspecto, são fornecidas no presente documento bibliotecas que compreendem polinucleotídeos (por exemplo, polinucleotídeos sintéticos), em que um dos polinucleotídeos codifica uma região variável de cadeia leve de anticorpo que compreende uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3, e em que pelo menos duas das HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 da região variável de cadeia leve de anticorpo compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de uma sequência HVR-L1 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, uma sequência HVR-L2 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma sequência HVR- L3 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23. Em algumas modalidades, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos dez, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 250 ou pelo menos 280 dos polinucleotídeos codificam uma região variável de cadeia leve que compreende uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR- L3, e em que pelo menos duas das HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 da região variável de cadeia leve de anticorpo compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de uma sequência HVR-L1 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, uma sequência HVR-L2 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma sequência HVR-L3 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23. Em algumas modalidades, cada um dos polinucleotídeos codifica uma região variável de cadeia leve que compreende uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3, e em que pelo menos duas das HVR- L1, HVR-L2 e HVR-L3 compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de uma sequência HVR-L1 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, uma sequência HVR-L2 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma sequência HVR-L3 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23.

[008] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos contêm menos que cerca de 1000 combinações exclusivas de sequências HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos contêm cerca de 280 ou menos combinações exclusivas de sequências HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma HVR-L3 do anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, e uma HVR-L2 do anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, e uma HVR-L3 do anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs:10-23. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 do anticorpo da região variável de cadeia leve de anticorpo adota múltiplas conformações, conforme analisado pela determinação estrutural e/ou modelagem computacional. Em algumas modalidades, pelo menos um dos polinucleotídeos que codificam a região variável de cadeia leve de anticorpo se situa num vetor. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de expressão. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de exibição. Em algumas modalidades, pelo menos um dos polinucleotídeos que codificam a região variável de cadeia leve de anticorpo se situa numa célula. Em algumas modalidades, a célula é uma célula bacteriana, de levedura ou de mamífero (por exemplo, células animais não humanas ou células humanas isoladas).

[009] Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende três dentre uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3 selecionadas do grupo que consiste em: (1) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23; (2) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23; (3) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID

NOS:10-23; (4) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da

SEQ ID NO:2, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18; (5) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23; (6) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, uma sequência HVR-L2 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20; (7) uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID

NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:18; (8) uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23; (9) uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20; (10) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23; (11)

uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4,

uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23; (12) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID

NOS:5-9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:23; (13) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da

SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14; (14) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18; (15) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma

HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20; (16)

uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14; (17) uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23; e (18) uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID

NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:7, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:23. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende três dentre uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3 selecionadas do grupo que consiste em: (1) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18; (2) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23; (3) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20; (4) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14; (5) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20; (6) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18; (7) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:7, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23; (8) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23; (9) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:17; (10) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:5, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20; e (11) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:8, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:11. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3 de um anticorpo listado na Tabela 2.

[010] Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende um FW-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:24, um FW-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25, um FW-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:26, e um FW-L4 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 28-50. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos codificam cadeias leves de anticorpo de comprimento total. Em algumas modalidades, as bibliotecas compreendem polinucleotídeos que codificam regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo.

Em algumas modalidades, os polinucleotídeos que codificam regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo incluem pelo menos uma sequência exclusiva, pelo menos 100 sequências exclusivas, pelo menos 1000 sequências exclusivas ou pelo menos cerca de 109 sequências exclusivas.

[011] Em outro aspecto, são fornecidas no presente documento bibliotecas que compreendem polinucleotídeos (por exemplo, polinucleotídeos sintéticos) que codificam uma pluralidade de anticorpos exclusivos, em que cada anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia leve de cada anticorpo dentre a pluralidade compreende uma sequência idêntica e compreende uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3, e em que pelo menos duas das HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre uma sequência HVR-L1 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, uma sequência HVR-L2 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma sequência HVR-L3 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID

NOS:5-9, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, e uma HVR-L2 do anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma HVR-

L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, e uma HVR-L3 do anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID

NOS:10-23. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs:10-23. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende três dentre uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3 selecionadas do grupo que consiste em: (1) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID

NO:1, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID

NO:9, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23; (2) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23; (3) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23; (4)

uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2,

uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18; (5) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID

NOS:5-9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:23; (6) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da

SEQ ID NO:1, uma sequência HVR-L2 selecionada do grupo que consiste nas

SEQ ID NOS:5-9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20; (7) uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, uma

HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma

HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18; (8)

uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23; (9) uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID

NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:20; (10) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da

SEQ ID NO:3, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da

SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23; (11) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23; (12) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID

NOS:5-9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:23; (13) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da

HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20; (16)

NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:7, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende três dentre uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3 selecionadas do grupo que consiste em: (1) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18; (2) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23; (3) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20; (4) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14; (5) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20; (6) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18; (7) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:7, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23; (8) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23; (9) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:17; (10) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:5, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20; e (11) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:8, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:11. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3 de um anticorpo listado na Tabela 2.

[012] Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende um FW-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:24, um FW-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25, um FW-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:26, e um FW-L4 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:28-50.Em algumas modalidades, as regiões variáveis de cadeia pesada dos anticorpos na biblioteca têm pelo menos uma sequência exclusiva, pelo menos 100 sequências exclusivas, pelo menos 1000 sequências exclusivas ou pelo menos cerca de 109 sequências exclusivas. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos da biblioteca são polinucleotídeos sintéticos.

[013] Em outro aspecto, são fornecidos no presente documento anticorpos que compreendem um polipeptídeo expresso por um polinucleotídeo (por exemplo, um polinucleotídeo sintético) a partir da biblioteca de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga pelo menos a 1 alvo com uma constante de dissociação de equilíbrio (Kd) entre cerca de 10-7 e cerca de 10-11 M.

[014] Em outro aspecto, são fornecidas no presente documento bibliotecas que compreendem polipeptídeos em que pelo menos um (por exemplo, pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos cinco, pelo menos 10, pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 125, pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 225, pelo menos 250, pelo menos 275, etc.) dos polipeptídeos é codificado por um polinucleotídeo da biblioteca de polinucleotídeos (por exemplo, polinucleotídeo sintético), de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores. Em algumas modalidades, pelo menos dois dos polipeptídeos são codificados por um polinucleotídeo da biblioteca de polinucleotídeos. Em algumas modalidades, pelo menos 100 dos polipeptídeos são codificados por um polinucleotídeo da biblioteca de polinucleotídeos. Em algumas modalidades, cada um dos polipeptídeos é codificado por um polinucleotídeo da biblioteca de polinucleotídeos. Em algumas modalidades, o pelo menos um polipeptídeo é um domínio variável de cadeia leve. Em algumas modalidades, o pelo menos um polipeptídeo é exibido na superfície de um fago. Em algumas modalidades, a biblioteca que compreende polipeptídeos compreende ainda pelo menos um polipeptídeo de domínio variável de cadeia pesada.

[015] Em outro aspecto, são fornecidas no presente documento bibliotecas que compreendem vetores em que pelo menos um (por exemplo, pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos cinco, pelo menos 10, pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 125, pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 225, pelo menos 250, pelo menos 275, etc.) dos vetores compreende um polinucleotídeo da biblioteca de polinucleotídeos, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores. Em algumas modalidades, pelo menos dois dos vetores compreendem um polinucleotídeo da biblioteca de polinucleotídeos. Em algumas modalidades, pelo menos 100 dos vetores compreendem um polinucleotídeo da biblioteca de polinucleotídeos. Em algumas modalidades, cada um dos vetores compreende um polinucleotídeo da biblioteca de polinucleotídeos. Em algumas modalidades, o pelo menos um vector codifica um polipeptídeo de domínio variável de cadeia leve. Em algumas modalidades, a biblioteca que compreende vetores compreende ainda um vetor que codifica um polipeptídeo de domínio variável de cadeia pesada. Também são fornecidas no presente documento bibliotecas que compreendem populações de células em que pelo menos uma (por exemplo, pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos cinco, pelo menos 10, pelo menos 100, pelo menos 103, pelo menos 104, pelo menos 105, pelo menos 106, pelo menos 107, pelo menos 108, pelo menos 109, etc.) célula compreende um vetor da biblioteca, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores.

Em algumas modalidades, pelo menos duas das células compreendem um vetor da biblioteca. Em algumas modalidades, pelo menos 100 das células compreendem um vetor da biblioteca. Em algumas modalidades, cada uma das células compreende um vetor da biblioteca. Em algumas modalidades, a pelo menos uma célula é uma célula bacteriana, de levedura ou de mamífero (por exemplo, células animais não humanas ou células humanas isoladas).

[016] Em outro aspecto, são fornecidos no presente documento fagos que compreendem pelo menos um polipeptídeo exibido em sua superfície,

em que o pelo menos um polipeptídeo compreende um domínio de ligação ao antígeno que compreende uma região variável de cadeia leve de anticorpo que compreende uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3, e em que pelo menos duas das HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 da região variável de cadeia leve de anticorpo compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de uma sequência HVR-L1 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, uma sequência HVR-L2 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5- 9, e uma sequência HVR-L3 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno compreende ainda uma região variável de cadeia pesada de anticorpo.

[017] Em outro aspecto, são fornecidos no presente documento animais não humanos que compreendem a biblioteca de polinucleotídeos, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores. Em algumas modalidades, os animais não humanos são mamíferos (por exemplo, um camundongo, rato, coelho, camelo ou primata não humano). Em algumas modalidades, o animal não humano compreende polinucleotídeos, em que um dos polinucleotídeos codifica uma região variável de cadeia leve de anticorpo que compreende uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3, e em que pelo menos duas das HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 da região variável de cadeia leve de anticorpo compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de uma sequência HVR-L1 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, uma sequência HVR-L2 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5- 9, e uma sequência HVR-L3 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23.

[018] Em outro aspecto, são fornecias cadeias leves de anticorpo que compreendem uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3, e em que pelo menos duas das HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 da região variável de cadeia leve de anticorpo compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de uma sequência HVR-L1 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4,

uma sequência HVR-L2 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-

9, e uma sequência HVR-L3 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID

NOS:10-23. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma HVR-L3 do anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID

NOS:1-4, e uma HVR-L2 do anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma HVR-

NO:1, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID

NO:9, e uma HVR-L3 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-

23; (2) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID

NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID

NO:9, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23; (3) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23; (4) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18; (5)

uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1,

uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23; (6) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, uma sequência HVR-L2 selecionada de um grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20; (7) uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18; (8) uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID

NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:23; (9) uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20; (10) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23; (11) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID

NOS:10-23; (12) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da

SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23; (13) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14; (14) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma

HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18; (15)

uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3,

uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20; (16) uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14; (17) uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID

NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:6, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:23; e (18) uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:7, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende três dentre uma HVR-

L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3 selecionadas do grupo que consiste em: (1)

uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2,

uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18;

(2) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1,

uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23;

(3) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1,

uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20;

(4) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4,

uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14;

(5) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3,

(6) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1,

(7) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4,

uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:7, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23;

(8) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23; (9) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:17; (10) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:5, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20; e (11) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:8, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:11. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3 de um anticorpo listado na Tabela 2. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende um FW-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:24, um FW-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25, um FW-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:26, e um FW-L4 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 28-50. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 da região variável de cadeia leve de anticorpo adota múltiplas conformações, conforme analisado pela determinação estrutural e/ou modelagem computacional.

[019] Em outro aspecto, são fornecidos no presente documento anticorpos que compreendem uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve descrita no presente documento.

Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3, e em que pelo menos duas das HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de uma sequência HVR-L1 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, uma sequência HVR-L2 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma sequência HVR-L3 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma HVR-L3 do anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma HVR-

L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, e uma HVR-L2 do anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID

NOS:5-9. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, e uma HVR-L3 do anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID

NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs:10-23. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende três dentre uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3 selecionadas do grupo que consiste em: (1) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23; (2) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID

NOS:10-23; (3) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da

SEQ ID NO:2, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da

SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23; (4) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18; (5) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma

HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23; (6)

uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1,

uma sequência HVR-L2 selecionada de um grupo que consiste nas SEQ ID

NOS:5-9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:20; (7) uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18; (8) uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23; (9) uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID

NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:20; (10) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da

SEQ ID NO:3, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da

NOS:5-9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:23; (13) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da

HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20; (16)

NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:7, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:23. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende três dentre uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3 selecionadas do grupo que consiste em: (1) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18; (2) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23; (3) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20; (4) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14; (5) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20; (6) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18; (7) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:7, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23; (8) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23; (9) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:17; (10) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:5, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20; e (11) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:8, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:11. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3 de um anticorpo listado na Tabela 2. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende um FW-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:24, um FW-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25, um FW-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:26, e um FW-L4 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 28-50. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga pelo menos a 1 alvo com uma constante de dissociação de equilíbrio (Kd) entre cerca de 10-7 e cerca de 10-11 M.

[020] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um polinucleotídeo (por exemplo, um polinucleotídeo sintético) que codifica qualquer uma das regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo descritas no presente documento. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codifica uma cadeia leve de anticorpo de comprimento total que compreende qualquer uma das regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo descritas no presente documento.

Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codifica um anticorpo que compreende qualquer uma das regiões variáveis de cadeia leve anticorpo descritas no presente documento.

[021] Em outro aspecto, é fornecida no presente documento uma que compreende regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo, em que pelo menos uma (por exemplo, pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos dez, pelo menos 50, pelo menos 100, etc.) das regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo descritas no presente documento. Em algumas modalidades, cada uma das regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo na biblioteca compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo descritas no presente documento. Em algumas modalidades, a biblioteca compreende ainda uma ou mais regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo. Em algumas modalidades, é fornecida no presente documento uma biblioteca que compreende cadeias leves de anticorpo de comprimento total, em que pelo menos uma (por exemplo, pelo menos uma, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos dez, pelo menos 50, pelo menos 100, etc.) das cadeias leves de anticorpo compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo descritas no presente documento. Em algumas modalidades, cada uma das cadeias leves de anticorpo na biblioteca compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo descritas no presente documento. Em algumas modalidades, a biblioteca compreende ainda uma ou mais cadeias pesadas de anticorpo de comprimento total. Em algumas modalidades, é fornecida no presente documento uma biblioteca que compreende anticorpos, em que pelo menos um (por exemplo, pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos dez, pelo menos 50, pelo menos 100, etc.) dos anticorpos compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo descritas no presente documento. Em algumas modalidades, cada um dos anticorpos na biblioteca compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo descritas no presente documento.

[022] Em outro aspecto, são fornecidos no presente documento métodos de preparo de uma biblioteca que compreende fornecer e montar as sequências de polinucleotídeos da biblioteca, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores.

[023] Em outro aspecto, são fornecidos no presente documento métodos de fabricação de uma biblioteca de anticorpos que compreende as etapas de: (a) selecionar uma, duas ou três HVRs de cadeia leve que compreendem uma sequência que tem múltiplas conformações; e (b) montar sequências de polinucleotídeos para produzir uma biblioteca de polinucleotídeos (por exemplo, polinucleotídeos sintéticos) que codificam uma pluralidade de sequências de regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo. Em algumas modalidades, as sequências de regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo são sequências de anticorpos humanos. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3, e em que pelo menos duas das HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 compreendem uma região variável de cadeia leve compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de uma sequência HVR-L1 selecionada do grupo que consiste nas

SEQ ID NOS:1-4, uma sequência HVR-L2 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma sequência HVR-L3 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, e uma

HVR-L2 do anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, e uma HVR-L3 do anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma HVR-

L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma

HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs:10-23. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende três dentre uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3 selecionadas do grupo que consiste em: (1) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23; (2) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23; (3)

uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2,

uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23; (4) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID

NOS:5-9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:18; (5) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da

SEQ ID NO:1, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23; (6) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, uma sequência

HVR-L2 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma HVR-

L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20; (7) uma

HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18; (8) uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID

NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

NOS:10-23; (12) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da

HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18; (15)

uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3,

NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:6, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3 selecionadas do grupo que consiste em: (1)

uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2,

(2) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1,

(3) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20;

(4) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4,

(5) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3,

(6) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1,

(7) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4,

(8) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4,

uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23;

(9) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4,

uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:17;

(10) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID

NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID

NO:5, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID

NO:20; e (11) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da

SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da

SEQ ID NO:8, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da

SEQ ID NO:11. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3 de um anticorpo listado na Tabela 2. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende um FW-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:24, um FW-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID

NO:25, um FW-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID

NO:26, e um FW-L4 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID

NO:27. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 28-50. Em outro aspecto, são fornecidas no presente documento bibliotecas que compreendem domínios de ligação ao antígeno, em que um dos domínios de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia leve de anticorpo que compreende uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3, e em que pelo menos duas das HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 da região variável de cadeia leve de anticorpo compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de uma sequência HVR-L1 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4,

uma sequência HVR-L2 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-

9, e uma sequência HVR-L3 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID

NOS:10-23. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno compreende ainda uma região variável de cadeia pesada de anticorpo.

Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve de anticorpo compreende uma ou mais sequências de aminoácidos, de acordo com qualquer uma das modalidades acima. Em algumas modalidades, a biblioteca compreende fagos.

Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno é exibido na superfície de pelo menos um fago da biblioteca. Em algumas modalidades, a biblioteca compreende uma pluralidade de fagos que expressam um domínio de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades acima exibidas na superfície de fago.

[024] Em outro aspecto, são fornecidos no presente documento métodos de geração de um anticorpo biespecífico que compreende duas regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo e duas regiões variáveis de cadeia leve idênticas, que compreendem: (a) realizar a triagem de um primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno compreende uma primeira região variável de cadeia pesada de anticorpo e uma primeira região variável de cadeia leve de anticorpo, e em que a primeira região variável de cadeia leve de anticorpo é codificada por um polinucleotídeo da biblioteca, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores (por exemplo, o primeiro domínio de ligação ao antígeno compreende uma primeira região variável de cadeia pesada de anticorpo e uma primeira região variável de cadeia leve de anticorpo, em que a primeira região variável de cadeia leve de anticorpo compreende uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3, e em que pelo menos duas das HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 da região variável de cadeia leve de anticorpo compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de uma sequência HVR-L1 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, uma sequência HVR-L2 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma sequência HVR- L3 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23); (b) realizar a triagem de um segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo domínio de ligação ao antígeno compreende uma segunda região variável de cadeia pesada de anticorpo e uma segunda região variável de cadeia leve de anticorpo, em que a segunda região variável de cadeia leve de anticorpo tem a mesma sequência que a primeira região variável de cadeia leve de anticorpo (por exemplo, o segundo domínio de ligação ao antígeno compreende uma segunda região variável de cadeia pesada de anticorpo e uma segunda região variável de cadeia leve de anticorpo, em que a segunda região variável de cadeia leve de anticorpo compreende uma HVR- L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3, e em que pelo menos duas das HVR-L1, HVR- L2 e HVR-L3 da região variável de cadeia leve de anticorpo compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de uma sequência HVR-L1 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, uma sequência HVR-L2 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma sequência HVR- L3 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23); e (c) produzir um anticorpo biespecífico que compreende o primeiro domínio de ligação ao antígeno e o segundo domínio de ligação ao antígeno.

[025] Em outro aspecto, são fornecidos no presente documento anticorpos biespecíficos que compreendem: (a) um primeiro domínio de ligação que compreende uma primeira região variável de cadeia pesada e uma primeira região variável de cadeia leve, em que o primeiro domínio de ligação se liga a um primeiro alvo; (b) um segundo domínio de ligação que compreende uma segunda região variável de cadeia pesada e uma segunda região variável de cadeia leve, em que o segundo domínio de ligação se liga a um segundo alvo, em que a segunda região variável de cadeia leve tem uma sequência idêntica à primeira sequência de regiões variáveis de cadeia leve; em que cada uma dentre a primeira e a segunda regiões variáveis de cadeia leve compreende uma HVR- L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3, e em que pelo menos duas das HVR-L1, HVR- L2 e HVR-L3 compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de uma sequência HVR-L1 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4,

uma sequência HVR-L2 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-

9, e uma sequência HVR-L3 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID

NOS:10-23. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma HVR-L3 do anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, e uma HVR-L2 do anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma HVR-

NO:1, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID

uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2,

NOS:5-9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:23; (6) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da

SEQ ID NO:1, uma sequência HVR-L2 selecionada do grupo que consiste nas

HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma

HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18; (8)

NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:20; (10) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da

SEQ ID NO:3, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da

SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23; (11) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23; (12) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:23; (13) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da

HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20; (16)

NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:7, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:23. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende três dentre uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3 selecionadas do grupo que consiste em: (1) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18; (2) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23; (3) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20; (4) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14; (5) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20; (6) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18; (7) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:7, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23; (8) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23; (9) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:17; (10) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:5, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20; e (11) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:8, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:11. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma

HVR-L3 de um anticorpo listado na Tabela 2. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende um FW-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:24, um FW-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25, um FW-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:26, e um FW-L4 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas

SEQ ID Nos: 28-50. Em algumas modalidades, a primeira região variável de cadeia pesada é ligada a uma primeira região constante de cadeia pesada, em que a segunda região variável de cadeia pesada é ligada a uma segunda região constante de cadeia pesada, em que a primeira região variável de cadeia leve de anticorpo é ligada a uma primeira região constante de cadeia leve, em que a segunda região variável de cadeia leve de anticorpo é ligada a uma segunda região constante de cadeia leve, e em que a primeira e a segunda cadeias leves de anticorpo têm sequências idênticas.

[026] Em outro aspecto, são fornecidos no presente documento kits que compreendem a biblioteca de polinucleotídeos ou a população de células que compreendem os polinucleotídeos, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores.

[027] Deve-se compreender que uma, algumas ou todas as propriedades das várias modalidades descritas acima e no presente documento podem ser combinadas para formar outras modalidades da presente invenção.

Estes e outros aspectos da invenção se tornarão evidentes para uma pessoa versada na técnica. Estas e outras modalidades da invenção são adicionalmente descritas pela descrição detalhada a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[028] A Figura 1A mostra uma plotagem de entropia por número de resíduos para os aminoácidos de um domínio VL. 81 estruturas VL de anticorpos humanos foram usadas para calcular a entropia.

[029] A Figura 1B mostra a definição das regiões hipervariáveis (HVRs) usadas no presente documento para uma sequência de domínio variável de cadeia leve (VL) de anticorpo exemplificativo (SEQ ID NO:60) em comparação com a definição de Kabat das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) para a mesma sequência VL.

[030] A Figura 2A mostra uso de segmento HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 para anticorpos com ligação ao antígeno confirmada a partir das bibliotecas de anticorpos DPL5 e SEL021. As sequências de aminoácidos que correspondem às SEQ ID NOs indicadas podem ser encontradas na Tabela 1.

[031] A Figura 2B mostra uso de segmento HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 para anticorpos com ligação ao antígeno confirmada a alvos de antígeno únicos e múltiplos a partir das bibliotecas de anticorpos DPL5, SEL021 e DPL16~34. As sequências de aminoácidos que correspondem às SEQ ID NOs indicadas podem ser encontradas na Tabela 1.

[032] A Figura 3 mostra as medições de afinidade para fabs com ligação confirmada aos antígenos TAGT-1, TAGT-2 e TAGT-3.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[033] A presente divulgação fornece bibliotecas contendo polinucleotídeos (por exemplo, de ocorrência não natural ou sintéticos) que codificam cadeias leves de anticorpo (por exemplo, cadeias leves de um anticorpo humano dinâmico). Vantajosamente, as cadeias leves de anticorpo divulgadas no presente documento incluem sequências HVR projetadas para gerar alças altamente flexíveis para ligação de substrato mais eficaz e/ou especificidade contra múltiplos substratos de interesse. Acredita-se que estas sequências HVR permitem a criação de bibliotecas de anticorpos menores que as técnicas existentes.

I. TÉCNICAS GERAIS

[034] As técnicas e procedimentos descritos ou referidos no presente documento são, de modo geral, bem entendidos e comumente empregados com o uso de metodologia convencional por aqueles versados na técnica, tal como, por exemplo, as metodologias amplamente utilizadas descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3ª edição (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames e G.R. Taylor eds. (1995)); Harlow e Lane, eds.

(1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, edição (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, edição, 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E.

Cellis, edição, 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), edição, 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather e P.E.

Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures

(A. Doyle, J.B. Griffiths, e D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley e Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir e C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller e M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley e Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway e P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., edição, IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P.

Shepherd e C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow e D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti e J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); e Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).

II. DEFINIÇÕES

[035] Antes de descrever a invenção em detalhes, deve-se compreender que esta invenção não se limita a composições ou sistemas biológicos particulares, que podem, certamente, variar. Deve-se entender também que a terminologia usada no presente documento tem o propósito de descrever apenas modalidades particulares e não se destina a ser limitante.

[036] Conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “uma”, “o” e “a” incluem referentes plurais a menos que o conteúdo indique claramente o contrário. Deste modo, por exemplo, a referência a “uma molécula” inclui opcionalmente uma combinação de duas mais tais moléculas e similares.

[037] O termo “cerca de”, conforme usado no presente documento, se refere à faixa de erro usual para o respectivo valor prontamente conhecido pelo versado na técnica neste campo técnico. A referência a “cerca de” um valor ou parâmetro no presente documento inclui (e descreve)

modalidades que são direcionadas a este valor ou parâmetro por si.

[038] Deve ser entendido que os aspectos e as modalidades da invenção descrita no presente documento incluem "compreender", "consistir" e "consistir essencialmente" nos aspectos e nas modalidades.

[039] O termo “anticorpo” é usado no presente documento no sentido mais amplo e cobre especificamente anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpos (por exemplo, um fragmento variável de cadeia única ou scFv) desde que eles exibam a atividade biológica desejada.

[040] A unidade básica de anticorpos de 4 cadeias é uma glicoproteína heterotetramérica composta por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. O emparelhamento de VH e VL em conjunto forma um único sítio de ligação ao antígeno. Para a estrutura e propriedades das diferentes classes de anticorpos, consultar, por exemplo, Basic and Clinical Immunology, 8ª Edição, Daniel P. Stites, Abba I. Terr e Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, página 71 e Capítulo 6.

[041] A cadeia L de quaisquer espécies de vertebrados pode ser atribuída a um dos dois tipos claramente distintos, chamados de kappa (κ) e lambda (λ), com base nas sequências de aminoácidos de seus domínios constantes. Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas (CH), imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes ou isotipos. Há cinco classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, tendo cadeias pesadas designadas alfa (“α”), delta (“δ”), épsilon (“ε”), gama (“γ”) e mu (“μ”), respectivamente. As classes γ e α são adicionalmente divididas em subclasses (isotipos) com base nas diferenças relativamente pequenas na sequência e função CH, por exemplo, seres humanos expressam as seguintes subclasses: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. As estruturas de subunidade e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas e geralmente descritas, por exemplo, em Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 4ª edição (W.B. Saunders Co., 2000).

[042] A “região variável” ou “domínio variável” de um anticorpo se refere aos domínios aminoterminais da cadeia pesada ou leve do anticorpo. O domínio variável da cadeia pesada pode ser chamado de “VH”. O domínio variável da cadeia leve pode ser chamado de “VL”. Estes domínios são geralmente as partes mais variáveis de um anticorpo e contêm os sítios de ligação ao antígeno.

[043] O termo “numeração de domínio variável como em Kabat” ou “numeração de posição de aminoácido como em Kabat”, e variações dos mesmos, se refere ao sistema de numeração usado para domínios variáveis de cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve da compilação de anticorpos em Kabat et al., supra. Com o uso deste sistema de numeração, a sequência de aminoácidos linear real pode conter menos ou mais aminoácidos que correspondem a um encurtamento ou inserção numa FR ou HVR do domínio variável. Por exemplo, uma cadeia pesada domínio variável pode incluir uma única inserção de aminoácido (resíduo 52a de acordo com Kabat) após o resíduo 52 de H2 e resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b e 82c, etc., de acordo com Kabat) após o resíduo 82 de FR de cadeia pesada. A numeração de Kabat de resíduos pode ser determinada para um determinado anticorpo por alinhamento nas regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência numerada Kabat “padrão”.

[044] O sistema de numeração de Kabat é geralmente usado ao se referir a um resíduo no domínio variável (aproximadamente os resíduos 1 a 107 da cadeia leve e os resíduos 1 a 113 da cadeia pesada) (por exemplo, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5ª Edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). O “sistema de numeração

EU” ou “índice EU” é geralmente usado ao se referir a um resíduo numa região constante de cadeia pesada de imunoglobulina (por exemplo, o índice EU relatado em Kabat et al., supra). O “índice EU como em Kabat” refere-se à numeração de resíduo do anticorpo IgG1 EU humano.

[045] O termo “domínio constante ” se refere à porção de uma molécula de imunoglobulina que tem uma sequência de aminoácidos mais conservada em relação à outra porção da imunoglobulina, o domínio variável, que contém o sítio de ligação ao antígeno. O domínio constante contém os domínios CH1, CH2 e CH3 (coletivamente, CH) da cadeia pesada e o domínio CHL (ou CL) da cadeia leve.

[046] O termo “anticorpo de comprimento total” (os termos anticorpo “intacto” ou anticorpo “inteiro” pode ser usado de modo intercambiável no presente documento) pode se referir a um anticorpo em sua forma substancialmente intacta, em oposição a um fragmento de anticorpo. De modo similar, o termo “cadeia leve de anticorpo de comprimento total” (os termos cadeia leve de anticorpo “intacto” ou cadeia leve de anticorpo “inteiro” pode ser usado de modo intercambiável no presente documento) pode se referir a uma cadeia leve de anticorpo em sua forma substancialmente intacta, em oposição a um fragmento de cadeia leve de anticorpo. Especificamente, os anticorpos inteiros incluem aqueles com cadeias pesada e leve incluindo uma região Fc. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência nativa (por exemplo, domínios constantes de sequência nativa humanos) ou variantes de sequência de aminoácidos dos mesmos. Em alguns casos, o anticorpo intacto pode ter uma ou mais funções efetoras.

[047] O termo “anticorpo monoclonal”, conforme usado no presente documento se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos, exceto pelas possíveis mutações de ocorrência natural e/ou modificações pós-traducionais (por exemplo, isomerizações, amidações) que podem estar presentes em menores quantidades. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo diretamente contra a um sítio antigênico único. Ao contrário de preparações de anticorpo policlonal que incluem tipicamente diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante no antígeno. O modificador “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como exigindo a produção do anticorpo por nenhum método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo, por exemplo, o método de hibridoma (por exemplo, Kohler e Milstein., Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3):253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª edição 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), métodos de ADN recombinante (consultar, por exemplo, a patente nº U.S. 4.816.567), tecnologias de exibição de fago (consultar, por exemplo, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol.

222:581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 101(34):12467-472 (2004); e Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004), e tecnologias para produzir anticorpos humanos ou anticorpos semelhantes a humanos em animais que têm partes ou todos os loci ou genes de imunoglobulina humana que codificam sequências de imunoglobulina humana (consultar, por exemplo, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); U.S. Patent Nos. 5.545.807; 5.545.806;

5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; e 5.661.016; Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14:845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14:826 (1996); e Lonberg e Huszar, Intern. Rev.

Immunol. 13:65-93 (1995).

[048] Conforme usado no presente documento, “região hipervariável (HVR)” se refere às regiões de um domínio de anticorpo que são hipervariáveis em sequência e/ou formam alças estruturalmente definidas. De modo geral, os anticorpos compreendem seis HVRs; três no VH (H1, H2, H3) e três no VL (L1, L2, L3). Consultar, por exemplo, Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson e Wu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, edição, Human Press, Totowa, N.J., 2003). Cada VH e VL é composta por três HVRs e quatro regiões de framework (FW) dispostas a partir do terminal amino ao terminal carbóxi na seguinte ordem: FW1-HVR1-FW2-HVR2-FW3-HVR3-FW4.

Ao longo da presente divulgação, as três HVRs da cadeia leve são chamadas de HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3. Para comparação, a definição das HVRs (conforme usado no presente documento) é contrastada com a definição de Kabat das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) (Yvonne Chen et al. (1999) “Selection and Analysis of an Optimized Anti-VEGF Antibody: Crystal Structure of an Affinity-matured Fab in Complex with Antigen”, J. Mol. Biol. 293, 865-881) para o domínio variável de cadeia leve de anticorpo exemplificativo mostrado na Figura 1B.

[049] Conforme usado no presente documento, “biblioteca” se refere a um conjunto de duas ou mais entidades que têm uma classe compartilhada. Por exemplo, uma biblioteca contendo polinucleotídeos pode se referir a um conjunto de dois ou mais polinucleotídeos. O termo “biblioteca” é usado no presente documento no sentido mais amplo e cobre especificamente sub-bibliotecas que podem ser combinadas ou não.

[050] Conforme usado no presente documento, “exclusivo” se refere a um membro de um conjunto que é diferente de outros membros do conjunto. Por exemplo, um anticorpo exclusivo de uma biblioteca que codifica uma pluralidade de polinucleotídeos que codificam anticorpos pode se referir a um anticorpo que tem uma sequência particular não compartilhada por outros anticorpos codificados pela biblioteca. Por uma questão prática, deve-se compreender que um membro “exclusivo” de uma realização física de uma biblioteca pode estar presente em mais de uma cópia. Por exemplo, uma biblioteca pode conter uma pluralidade de anticorpos “exclusivos”, com uma ou mais das moléculas de anticorpo “exclusivas” ocorrendo em mais de uma cópia.

[051] Conforme usado no presente documento, “diversidade” se refere a uma variedade e/ou heterogeneidade. Por exemplo, uma diversidade de anticorpos numa biblioteca pode se referir a uma variedade de anticorpos com sequências exclusivas presentes na biblioteca.

[052] Os termos “polipeptídeo”, “proteína” e “peptídeo” são usados de modo intercambiável no presente documento e podem se referir a polímeros de dois ou mais aminoácidos.

[053] “Polinucleotídeo” ou “ácido nucleico”, conforme usado de modo intercambiável no presente documento, se refere a polímeros de nucleotídeos de qualquer comprimento, e incluem ADN e ARN. Os nucleotídeos podem ser desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos ou bases modificados e/ou seus análogos, ou qualquer substrato que possa ser incorporado num polímero por ADN ou ARN polimerase ou por uma reação sintética. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e seus análogos. Se presente, a modificação para a estrutura de nucleotídeo pode ser conferida antes ou após a montagem do polímero. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídeos. Um polinucleotídeo pode compreender modificação (ou modificações) feitas após a síntese, tal como conjugação a uma identificação.

Outros tipos de modificações incluem, por exemplo, “caps”, substituição de um mais dos nucleotídeos de ocorrência natural por modificações de internucleotídeos análogas, tais como, por exemplo, aquelas com ligações não carregadas (por exemplo, fosfonatos de metila, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) e com ligações carregadas (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquelas contendo porções químicas pendentes, tais como, por exemplo, proteínas (por exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeos de sinalização, poli-L-lisina, etc.), aquelas com intercaladores (por exemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquelas contendo quelantes (por exemplo, metais, metais radioativos, boro, metais oxidantes, etc.), aquelas contendo aquilantes, aquelas com ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), assim como formas não modificadas dos polinucleotídeos.

Ademais, qualquer um dos grupos hidroxila comumente presente nos açúcares pode ser substituído, por exemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegido por grupos protetores padrão ou ativados para preparar ligações adicionais a nucleotídeos adicionais, ou pode ser conjugado com suportes sólidos ou semissólidos. O OH terminal 5’ e 3’ pode ser fosforilado ou substituído por aminas ou porções químicas de grupo de capping orgânico de 1 a 20 átomos de carbono. Outras hidroxilas também podem ser derivatizadas para grupos protetores padrão. Polinucleotídeos também podem conter formas análogas de açúcares de ribose ou desoxirribose que são geralmente conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, 2’-O-metil-, 2’-O-alil-, 2’-fluoro- ou 2’-azido-ribose, análogos de açúcar carboxílico, açucares α-anoméricos, açúcares epiméricos, tais como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares de piranose, açúcares de furanose, sedo-heptuloses, análogos acíclicos e análogos de nucleosídeo básicos, tal como metil ribosídeo. Uma ou mais ligações de fosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligação alternativos. Estes grupos de ligação alternativos incluem, porém sem limitação, modalidades em que o fosfato é substituído por P(O)S (“tioato”), P(S)S (“ditioato”), (O)NR2 (“amidato”), P(O)R, P(O)OR’, CO, ou CH2 (“formacetal”), em que cada R ou R’ é independentemente H ou alquila substituída ou não substituída (1-20 C) contendo opcionalmente uma ligação de éter (-O-), arila, alquenila, cicloalquila, cicloalquenila ou araldila. Nem todas as ligações num polinucleotídeo precisam ser idênticas. A descrição anterior se aplica a todos os polinucleotídeos mencionados no presente documento, incluindo ARN e ADN.

[054] “Isolado” (tal como um polipeptídeo, ácido nucleico ou célula isolada) se refere a uma molécula que foi separada de um componente de seu ambiente natural.

[055] Uma célula (por exemplo, uma célula ou população de células que compreende um polinucleotídeo sintético ou biblioteca de polinucleotídeos sintéticos) ou uma célula isolada inclui uma célula individual ou a cultura celular pode ser ou ter sido um receptor para o vetor (ou vetores) para incorporação em insertos de polinucleotídeo. As células hospedeiras incluem a progênie de uma célula hospedeira única, e a progênie pode não ser necessariamente idêntica por completo (em morfologia ou em complemento de DNA genômico) à célula progenitora original devido a mutação natural, acidental ou deliberada. Uma célula hospedeira inclui células transfectadas in vivo com um polinucleotídeo (ou polinucleotídeos) (por exemplo, um polinucleotídeo sintético que codifica uma região variável de cadeia leve de anticorpo da presente divulgação).

[056] Um “animal não humano” se refere a qualquer animal não classificado como um ser humano, tais como animais domésticos, de fazenda ou de zoológico, esportes, animais de estimação (tais como como cães, cavalos, gatos, vacas etc.), assim como animais usados em pesquisas. Animais de pesquisa podem se referir sem limitação a nematódeos, artrópodes, vertebrados, mamíferos, sapos, roedores (por exemplo, camundongos ou ratos), peixe (por exemplo, peixe-zebra ou baiacu), pássaros (por exemplo, galinhas), cães, gatos e primatas não humanos (por exemplo, macacos rhesus, macacos cinomolgos, chimpanzés, etc.). Em modalidades preferidas, o animal é aquele que produz anticorpos.

III. BIBLIOTECAS DE ANTICORPOS E GERAÇÃO DE BIBLIOTECAS

[057] Determinados aspectos da presente divulgação se referem a bibliotecas de polinucleotídeos, por exemplo, que codificam uma região variável de cadeia pesada (VH) ou região variável de cadeia leve (VL) de anticorpo. Uma biblioteca da presente divulgação pode conter um ou mais polinucleotídeos que codificam uma região variável de cadeia leve que compreende uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3, sendo que cada um compreende independentemente uma sequência HVR descritas no presente documento (por exemplo, uma sequência HVR mostrada na Tabela 1).

[058] Em algumas modalidades, uma biblioteca da presente divulgação contém um número menor de sequências HVR de cadeia leve exclusivas e/ou sequências VL exclusivas que as bibliotecas de anticorpo típicas.

Vantajosamente, tais bibliotecas podem fornecer diversidade suficiente para a identificação de anticorpos que se ligam a um ou mais dentre vários antígenos de interesse enquanto também permitem a triagem mais eficiente devido ao tamanho de biblioteca reduzido. Em algumas modalidades, uma biblioteca da presente divulgação inclui ou consiste em polinucleotídeos que contêm menos que cerca de 1000, menos que cerca de 900, menos que cerca de 800, menos que cerca de 700, menos que cerca de 600, menos que cerca de 500, menos que cerca de 400 ou menos que cerca de 300 combinações exclusivas de sequências HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3. Em determinadas modalidades, uma biblioteca da presente divulgação inclui ou consiste em polinucleotídeos contendo cerca de 280 ou menos combinações exclusivas de sequências HVR- L1, HVR-L2 e HVR-L3.

[059] Em algumas modalidades, uma biblioteca contém uma pluralidade de polinucleotídeos, com pelo menos um dos polinucleotídeos codificando uma região variável de cadeia leve de anticorpo da presente divulgação (por exemplo, que compreende uma HVL-L1, uma HVR-L2 e HVR- L3 da presente divulgação). Em algumas modalidades, um ou mais dos polinucleotídeos codificado, codificam uma região variável de cadeia leve de anticorpo que compreende uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3, em que pelo menos uma ou pelo menos duas das HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de uma sequência HVR-L1 da presente divulgação (por exemplo, SEQ ID NOS:1-4), uma sequência HVR-L2 da presente divulgação (por exemplo, SEQ ID NOS:5-9), e uma sequência HVR-L3 da presente divulgação (por exemplo, SEQ ID NOS:10-23).

Em algumas modalidades, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 35, pelo menos 40, pelo menos 45, pelo menos 50, pelo menos 55, pelo menos 60, pelo menos 65, pelo menos 70, pelo menos 75, pelo menos 80, pelo menos 85, pelo menos 90, pelo menos 95, pelo menos 100, pelo menos 110, pelo menos 120, pelo menos 130, pelo menos 140, pelo menos 150, pelo menos 160, pelo menos 170, pelo menos 180, pelo menos 190, pelo menos 200, pelo menos 225 ou pelo menos 250 dos polinucleotídeos codificam uma região variável de cadeia leve de anticorpo que compreende uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3, em que pelo menos uma ou pelo menos duas das HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de uma sequência HVR-L1 da presente divulgação (por exemplo, SEQ ID NOS:1-4), uma sequência HVR-L2 da presente divulgação (por exemplo, SEQ ID NOS:5-9), e uma sequência HVR-L3 da presente divulgação (por exemplo, SEQ ID NOS:10- 23); e/ou menos que cerca de 300, ou menos que ou igual a 280 dos polinucleotídeos codificam uma região variável de cadeia leve de anticorpo que compreende uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3, em que pelo menos uma ou pelo menos duas das HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de uma sequência HVR-L1 da presente divulgação (por exemplo, SEQ ID NOS:1-4), uma sequência HVR-L2 da presente divulgação (por exemplo, SEQ ID NOS:5-9), e uma sequência HVR-L3 da presente divulgação (por exemplo, SEQ ID NOS:10-23). Em certas modalidades, cada um dos polinucleotídeos da biblioteca codifica uma região variável de cadeia leve de anticorpo que compreende uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3, em que pelo menos uma ou pelo menos duas das HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de uma sequência HVR-L1 da presente divulgação (por exemplo, SEQ ID NOS:1-4), uma sequência HVR-L2 da presente divulgação (por exemplo, SEQ ID NOS:5-9), e uma sequência HVR-L3 da presente divulgação (por exemplo, SEQ ID NOS:10- 23). Em algumas modalidades, um ou mais polinucleotídeos da biblioteca se situam num vetor (por exemplo, um vetor de expressão ou vetor de exibição).

[060] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos na biblioteca codificam uma região variável de cadeia leve de anticorpo que compreende uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3, em que a HVR-L1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 1-4). Em algumas modalidades, os polinucleotídeos na biblioteca codificam uma região variável de cadeia leve de anticorpo que compreende uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3, em que a HVR-L2 compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9). Em algumas modalidades, os polinucleotídeos na biblioteca codificam uma região variável de cadeia leve de anticorpo que compreende uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma

HVR-L3, em que a HVR-L1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 10-23).

[061] As sequências HVR de cadeia leve descritas no presente documento podem ser incluídas em qualquer combinação numa biblioteca da presente divulgação. Em algumas modalidades, uma região variável de cadeia leve compreende uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma HVR-L3 do anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23. Em algumas modalidades, uma região variável de cadeia leve compreende uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, e uma HVR-L2 do anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9. Em algumas modalidades, uma região variável de cadeia leve compreende uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, e uma HVR-L3 do anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23. Em algumas modalidades, uma região variável de cadeia leve compreende uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs:10-23.

[062] Em certas modalidades, uma região variável de cadeia leve compreende três dentre uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3 selecionadas do grupo que consiste em: uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23; uma

HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, uma

HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18; uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma

HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23; uma

HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma sequência HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOS:20; uma HVR-L1 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18; uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID

NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:23; uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20; uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23; uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23; uma

HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma

HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23; uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma

HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14; uma

HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18; uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma

HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20; uma

HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14; uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID

NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:6, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:23; e uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:7, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23. Em certas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende três dentre uma HVR-

L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3 selecionadas do grupo que consiste em: uma

HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, uma

HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma

HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18; uma

HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, uma

HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma

HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23; uma

HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, uma

HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma

HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20; uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma

HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma

HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14; uma

HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3, uma

HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma

HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20; uma

HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, uma

HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma

HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18; uma

HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma

HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:7, e uma

HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23; uma

HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma

HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, e uma

HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23; e uma

HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma

HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, e uma

HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:17; uma

HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma

HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17; uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:5, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20 e uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4; uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8 e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, uma região variável de cadeia leve compreende três dentre uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3 de um anticorpo listado na Tabela 2. Em algumas modalidades, uma região variável de cadeia leve compreende três dentre uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3 listadas na Tabela 1. Em algumas modalidades, uma região variável de cadeia leve compreende uma sequência selecionada das SEQ ID NOS:28-50 ou uma sequência que tem pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com uma sequência selecionada das SEQ ID NOS:28-

50.

[063] Em algumas modalidades, uma região variável de cadeia leve compreende ainda sequências de framework de cadeia leve de região variável justapostas entre as HVRs de acordo com a fórmula: (FW-L1)-(HVR-L1)- (FW-L2)-(HVR-L2)-(FW-L3)-(HVR-L3)-(FW-L4). Em algumas modalidades, uma, duas, três ou quatro das sequências de framework são as seguintes:

[064] FW-L1 é DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO:24)

[065] FW-L2 é WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO:25)

[066] FW-L3 é PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY (SEQ ID NO:26)

[067] FW-L4 é FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:27).

[068] Em algumas modalidades, uma biblioteca contém uma pluralidade de polinucleotídeos, com pelo menos um dos polinucleotídeos codificando uma região variável de cadeia pesada de anticorpo (por exemplo, que compreende uma HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3). Em algumas modalidades, uma biblioteca contém uma pluralidade de polinucleotídeos que codificam pelo menos 103, pelo menos 104, pelo menos 105, pelo menos 106, pelo menos 107, pelo menos 108, pelo menos 109, pelo menos 1010, pelo menos 1011, ou pelo menos 1012 sequências exclusivas de regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo. Em algumas modalidades, uma biblioteca contém uma pluralidade de polinucleotídeos que codificam pelo menos 103 sequências exclusivas de regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo. Em algumas modalidades, uma biblioteca contém uma pluralidade de polinucleotídeos que codificam pelo menos 109 sequências exclusivas de regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo.

Em outras modalidades, uma biblioteca contém um polinucleotídeo que codifica uma região variável de cadeia pesada de anticorpo. Em algumas modalidades, uma biblioteca contém uma pluralidade de polinucleotídeos que codifica de 1 a cerca de 103 sequências exclusivas de regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo.

[069] Em algumas modalidades, um ou mais dos polinucleotídeos de uma biblioteca codificam cadeia (ou cadeias) leve de anticorpo de comprimento total. Em outras modalidades, um ou mais dos polinucleotídeos de uma biblioteca codificam fragmento (ou fragmentos) Fab de cadeia leve. Em algumas modalidades, um ou mais dos polinucleotídeos de uma biblioteca codificam fragmento (ou fragmentos) variável de cadeia única.

[070] Em algumas modalidades, uma biblioteca contém uma pluralidade de polinucleotídeos que codificam uma pluralidade de anticorpos exclusivos. Em algumas modalidades, cada anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve de cada anticorpo dentre a pluralidade compreende uma sequência idêntica e compreende uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3. Em algumas modalidades, pelo menos uma ou pelo menos duas das HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de uma sequência HVR-L1 da presente divulgação (por exemplo, SEQ ID NOS:1-4), uma sequência HVR-L2 da presente divulgação (por exemplo, SEQ ID NOS:5-9), e uma sequência HVR-L3 da presente divulgação (por exemplo, SEQ ID NOS:10-23). As sequências HVR de cadeia leve descritas no presente documento podem ser incluídas em qualquer combinação numa biblioteca da presente divulgação que também inclui polinucleotídeos que codificam uma ou mais regiões variáveis de cadeia pesada.

[071] Em algumas modalidades, uma biblioteca da presente divulgação inclui um ou mais vetores que codificam um ou mais polinucleotídeos (por exemplo, polinucleotídeos sintéticos) da presente divulgação. Por exemplo, em algumas modalidades, a biblioteca inclui um ou mais vetores que codificam um ou mais polinucleotídeos (por exemplo, polinucleotídeos sintéticos) que codificam uma região variável de cadeia leve de anticorpo, em que a região variável de cadeia leve de anticorpo compreende uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3, e em que pelo menos duas das HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 da região variável de cadeia leve de anticorpo compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de uma sequência HVR-L1 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, uma sequência HVR-L2 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma sequência HVR-L3 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23).

[072] Ademais, é fornecido no presente documento um método de preparo de uma biblioteca, por exemplo, ao fornecer e montar as sequências de polinucleotídeos (por exemplo, polinucleotídeo (ou polinucleotídeos) sintético) de uma biblioteca da presente divulgação. Ademais, é fornecido no presente documento um método de produção de uma biblioteca, por exemplo, ao selecionar uma, duas ou três HVRs de cadeia leve (por exemplo, uma, duas ou três HVRs de cadeia leve da presente divulgação) que compreendem uma sequência que tem múltiplas conformações e montar sequências de polinucleotídeo para produzir uma biblioteca de polinucleotídeos (por exemplo, polinucleotídeos sintéticos) que codificam uma pluralidade de sequências de regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo. Em algumas modalidades, as sequências de regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo são sequências de anticorpos humanos. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve de anticorpo compreende uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3, e pelo menos duas das HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de uma sequência HVR-L1 da presente divulgação (por exemplo, SEQ ID NOS:1-4), uma sequência HVR-L2 da presente divulgação (por exemplo, SEQ ID NOS:5-9), e uma sequência HVR-L3 da presente divulgação (por exemplo, SEQ ID NOS:10-23).

[073] Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a HVR- L1, HVR-L2 e HVR-L3 da região variável de cadeia leve de anticorpo adota múltiplas conformações. Em algumas modalidades, as múltiplas conformações podem ser analisadas ou detectadas com o uso de técnicas conhecidas na técnica, incluindo, sem limitação, determinação estrutural (por exemplo, cristalografia de raios X ou RMN) e/ou modelagem computacional.

[074] Os polinucleotídeos que codificam um conjunto de regiões variáveis de cadeia leve e/ou pesada de anticorpo podem ser clonados em qualquer vetor adequado para expressão de uma porção ou todas as sequências de cadeia leve ou pesada. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo clonado num vetor permite a produção de uma porção ou toda a sequência de cadeia leve ou pesada fundida em toda ou uma porção de uma proteína de revestimento viral (isto é, criando uma proteína de fusão) e exibida na superfície de uma partícula ou célula. Diversos tipos de vetores estão disponíveis e podem ser usados para praticar esta invenção, por exemplo, vetores de fagomídeo.

Os vetores de fagomídeo contêm geralmente uma variedade de componentes incluindo promotores, sequências de sinal, genes de seleção fenotípicos, origem de sítios de replicação e outros componentes necessários que são conhecidos por aqueles de habilidade comum na técnica.

Em algumas modalidades, os polinucleotídeos que codificam um conjunto de regiões variáveis de cadeia leve e/ou pesada de anticorpo podem ser clonados em vetores para expressão em células bacterianas para exibição bacteriana ou em células de levedura para exibição de levedura.

Os vetores exemplificativos são descritos na Publicação PG US nº US20160145604. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de exibição que compreende, de 5’ a 3’, um polinucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos a ser exibida numa superfície (por exemplo, uma superfície do fago, bactérias, leveduras ou células de mamíferos), um sítio de restrição, um segundo polinucleotídeo que codifica um peptídeo de superfície capaz de ser exibido na superfície, e um segundo sítio de restrição.

Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo codifica uma proteína de revestimento de fago, uma proteína de parede externa de levedura, uma proteína de membrana externa bacteriana, um domínio de ancoragem de superfície celular,

ou um adaptador, ou um truncamento ou derivado do mesmo.

Em certas modalidades, o segundo polinucleotídeo é o gene III do fago filamentoso M13,

ou um truncamento ou derivado do mesmo.

Em algumas modalidades, o peptídeo de superfície serve para exibição de fago, exibição de levedura,

exibição bacteriana ou exibição de mamífero, ou exibição de vaivém entre as mesmas.

Em algumas modalidades, quando expressa, a sequência de aminoácidos e o peptídeo de superfície são exibidos como uma proteína de fusão na superfície.

Em algumas modalidades, o vetor compreende ainda uma etiqueta de fusão 5’ para o primeiro sítio de restrição ou 3’ para o segundo sítio de restrição.

[075] Certos aspectos da presente divulgação se referem a uma população de células contendo o vetor (ou vetores) descrito no presente documento. As cadeias leve e/ou pesada de anticorpo codificadas por polinucleotídeos gerados por qualquer uma das técnicas descritas no presente documento, ou outras técnicas adequadas, podem ser expressas e analisadas para identificar tendo estrutura e/ou atividade desejadas. A expressão dos anticorpos pode ser realizada, por exemplo, com o uso de extratos livres de célula (por exemplo, exibição de ribossoma), exibição de fago, células procarióticas (por exemplo, exibição bacteriana) ou células eucarióticas (por exemplo, exibição de levedura). Em algumas modalidades, as células são células bacterianas, células de levedura ou células de mamífero. Métodos para transfectar células bacterianas, células de levedura ou células de mamífero são conhecidos na técnica e descritos nas referências citadas no presente documento. A expressão (por exemplo, a partir de uma biblioteca da presente divulgação) de polipeptídeos (por exemplo, cadeias de anticorpos) nestes tipos de célula, assim como a triagem de anticorpos de interesse, são descritas em mais detalhes abaixo.

[076] Alternativamente, os polinucleotídeos podem ser expressos num sistema de expressão de E. coli, tal como aquele descrito por Pluckthun e Skerra. (Meth. Enzymol., 1989, 178: 476; Biotechnology, 1991, 9: 273). As proteínas mutantes podem ser expressas para secreção no meio e/ou no citoplasma da bactéria, conforme descrito por Better e Horwitz, Meth. Enzymol., 1989, 178: 476. Em algumas modalidades, os domínios únicos que codificam VH e VL são, cada um, ligados à extremidade 3′ de uma sequência que codifica uma sequência de sinalização, tal como a sequência de sinalização ompA, phoA ou pelB (Lei et al., J. Bacteriol., 1987, 169: 4379). Estas fusões de genes são montadas num construto dicistrônico, de modo que elas possam ser expressas a partir de um único vetor e selecionadas no espaço periplásmico de E. coli em que elas irão se reenovelar e podem ser recuperadas na forma ativa. (Skerra et al., Biotechnology, 1991, 9: 273). Por exemplo, os genes de cadeia pesada de anticorpo podem ser simultaneamente expressos com genes de cadeia leve de anticorpo para produzir anticorpos ou fragmentos de anticorpos.

[077] Em outras modalidades, as sequências de anticorpos são expressas na superfície de membrana de um procariota, por exemplo, E. coli, com o uso de um sinal de secreção e porção química de lipidação, conforme descrito, por exemplo, nos documentos US20040072740; US20030100023; e US20030036092.

[078] Alternativamente, os anticorpos podem ser expressos e analisados por expressão periplásmica ancorada (exibição de superfície híbrida APEx 2), conforme descrito, por exemplo, em Jeong et al., PNAS, 2007, 104: 8247 ou por outros métodos de ancoragem, conforme descrito, por exemplo, em Mazor et al., Nature Biotechnology, 2007, 25: 563.

[079] Células eucarióticas mais altas, tais como células de mamíferos, por exemplo, células de mieloma (por exemplo, células NS/0), células de hibridoma, células de ovário de hamster chinês (CHO), e células de rim embrionárias humanas (HEK), também podem ser usadas para expressão dos anticorpos da presente divulgação. Tipicamente, os anticorpos expressos em células de mamíferos são projetados para serem secretados no meio de cultura, ou expressos na superfície da célula. O anticorpo ou fragmentos de anticorpo podem ser produzidos, por exemplo, como moléculas de anticorpo intactas ou como fragmentos VH e VL individuais, fragmentos Fab, domínios únicos, ou como cadeias únicas (scFv).

[080] Em outras modalidades, os anticorpos podem ser selecionados com o uso de exibição de células de mamíferos (Ho et al., PNAS, 2006, 103: 9637). Em algumas modalidades, conforme descrito acima e exemplificado abaixo, anticorpos podem ser selecionados após a produção de uma porção ou toda a sequência de cadeia leve ou pesada fundida a toda uma porção de uma proteína de revestimento viral (isto é, criando uma proteína de fusão) e exibida na superfície de uma partícula ou célula, por exemplo, com o uso de exibição de fago.

[081] Certos aspectos da presente divulgação se referem a um animal não humano que compreende uma biblioteca de polinucleotídeos da presente divulgação. Por exemplo, um animal não humano da presente divulgação pode ser modificado de modo que seu genoma inclua um polinucleotídeo que codifica uma região variável de cadeia leve da presente divulgação. Num exemplo não limitante, é gerado um camundongo transgênico que inclui um locus de imunoglobulina de cadeia leve (por exemplo, um locus VL) modificado para expressar uma ou mais das regiões variáveis de cadeia leve da presente divulgação. Em algumas modalidades, o animal transgênico (por exemplo, camundongo) expressa anticorpos ou cadeias leves codificadas pelos polinucleotídeos. As técnicas para modificar um ou mais loci de imunoglobulina de um animal não humano são conhecidas na técnica (por exemplo, métodos usados para gerar Xenomouse™).

[082] A triagem dos anticorpos derivados das bibliotecas da presente divulgação pode ser realizada por quaisquer meios adequados conhecidos na técnica. Por exemplo, a atividade de ligação pode ser avaliada por imunoensaio padrão e/ou cromatografia de afinidade. A triagem dos anticorpos da invenção para função catalítica, por exemplo, função proteolítica pode ser realizada com o uso de um ensaio padrão, por exemplo, um ensaio de placa de hemoglobina. A determinação de afinidade de ligação de um anticorpo a um alvo pode ser analisada in vitro com o uso de uma variedade de técnicas bem conhecidas, por exemplo, um instrumento BIACORE™, que mede as taxas de ligação de um anticorpo a um determinado alvo ou antígeno com base na ressonância plasmônica de superfície, ou Interferometria de Biocamada (BLI),

conforme exemplificado abaixo com o uso da plataforma ForteBio Octet® RED96 (Pall Life Sciences). Ensaios in vivo podem ser conduzidos com o uso de qualquer um dentre inúmeros modelos animais e, então, subsequentemente testados, conforme adequados, em seres humanos. Ensaios biológicos baseados em célula também são contemplados. Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno podem ser adicionalmente selecionados para atividade funcional, por exemplo, atividade antagonista ou agonista. Os métodos de triagem exemplificativos são descritos no presente documento. Por exemplo, em algumas modalidades, a afinidade de ligação entre fragmentos fab e um ou mais alvos é medida com o uso de BLI marcando-se antígenos com etiqueta IgG1-Fc humana e captura por Biossensor de Captura Anti-hIgG-Fc (AHC). Fabs podem ser marcados em seu C-terminal do domínio CH1 com uma etiqueta His6, superexpressos numa célula hospedeira, tal como E. coli, e purificados, por exemplo, com o uso de uma resina de Ni-NTA. A afinidade pode, então, ser medida com o uso de sensores AHC (biossensores de imersão e leitura por captura de IgG-Fc anti-humano) imersos em poços contendo os fabs purificados diluídos, por exemplo, a 5 a 10 µg/ml com tampão cinético.

[083] Após os ligantes serem identificados por ligação ao alvo ou antígeno e/ou ensaios funcionais, o ácido nucleico pode ser extraído. O ADN extraído pode, então, ser usado diretamente para transformar células hospedeiras de E. coli ou alternativamente, as sequências de codificação podem ser amplificadas, por exemplo, com o uso de PCR com iniciadores adequados, e sequenciadas por qualquer método de sequenciamento típico. O ADN de domínio variável dos ligantes pode ser digerido por enzima de restrição e, então, inserido num vetor para expressão de proteína.

IV. ANTICORPOS E PRODUÇÃO DE ANTICORPOS

[084] São fornecidos no presente documento anticorpos identificados e selecionados a partir das bibliotecas descritas no presente documento. Certos aspectos da presente divulgação se referem às HVRs de ou cadeia pesada e cadeia leve de anticorpo, regiões variáveis que compreendem as HVRs e/ou polinucleotídeo (ou polinucleotídeos) que codifica as mesmas. Em algumas modalidades, as HVRs e/ou regiões variáveis fazem parte de um fragmento de anticorpo, anticorpo de comprimento total ou fragmento variável de cadeia única (scFv).

[085] Em algumas modalidades, uma região variável de cadeia leve compreende uma, duas ou três das sequências HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 listadas na Tabela 1 abaixo. TABELA 1: SEQUÊNCIAS HVR DE CADEIA LEVE SEQ ID NO. Sequência projetada HVR-L1 1 RASQGISSYLA 2 RASQSVSSYLA 3 RASQGVSSYLA 4 RASQSISSYLN HVR-L2 5 AASSLQSGV 6 DASSLESGV 7 AASTLQSGV 8 DASNRATGI 9 DASNLETGV HVR-L3 10 HCQHYAGYSAT

SEQ ID NO. Sequência projetada 11 YCQQSYSTPPT 12 YCQQSYSTPRT 13 YCQQWSSHPQT 14 YCQHHYGTPLT 15 YCQQSYSTSHT 16 YCQQSYSTPNT 17 YCQQWSSSPLT 18 YCQQSYSTPLT 19 YCQQYGSSPLT 20 YCQQYYTTPLT 21 YCKQAYIPPLT 22 YCFQGSHVPRT 23 YCQQYYSTPLT

[086] Em algumas modalidades, uma região variável de cadeia leve compreende três dentre uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3 de um anticorpo listado na Tabela 2 abaixo.

TABELA 2: COMBINAÇÕES DE SEQUÊNCIAS HVR DE CADEIA LEVE Número Região Variável Região Variável Região Variável VR3 de VR1 VR2 Anticorpo Sequência SEQ Sequência SE Sequência SE

ID Q Q NO ID ID

NO NO 1 RASQGISSYL 1 AASSLQSG 5 HCQHYAGYSAT 10

Número Região Variável Região Variável Região Variável VR3 de VR1 VR2 Anticorpo Sequência SEQ Sequência SE Sequência SE

ID Q Q NO ID ID NO NO A V

RASQGISSYL AASSLQSG 2 A 1 V 5 YCQQSYSTPPT 11

RASQGISSYL AASSLQSG 3 A 1 V 5 YCQQSYSTPRT 12

RASQGISSYL AASSLQSG 4 A 1 V 5 YCQQWSSHPQT 13

RASQGISSYL AASSLQSG 5 A 1 V 5 YCQHHYGTPLT 14

RASQGISSYL AASSLQSG 6 A 1 V 5 YCQQSYSTSHT 15

RASQGISSYL AASSLQSG 7 A 1 V 5 YCQQSYSTPNT 16

RASQGISSYL AASSLQSG 8 A 1 V 5 YCQQWSSSPLT 17

RASQGISSYL AASSLQSG 9 A 1 V 5 YCQQSYSTPLT 18

RASQGISSYL AASSLQSG 10 A 1 V 5 YCQQYGSSPLT 19

RASQGISSYL AASSLQSG 11 A 1 V 5 YCQQYYTTPLT 20

RASQGISSYL AASSLQSG 12 A 1 V 5 YCKQAYIPPLT 21

RASQGISSYL AASSLQSG 13 A 1 V 5 YCFQGSHVPRT 22

RASQGISSYL AASSLQSG 14 A 1 V 5 YCQQYYSTPLT 23

RASQGISSYL DASSLESG 15 A 1 V 6 HCQHYAGYSAT 10

RASQGISSYL DASSLESG 16 A 1 V 6 YCQQSYSTPPT 11

ID Q Q NO ID ID NO NO

RASQGISSYL DASSLESG 17 A 1 V 6 YCQQSYSTPRT 12

RASQGISSYL DASSLESG 18 A 1 V 6 YCQQWSSHPQT 13

RASQGISSYL DASSLESG 19 A 1 V 6 YCQHHYGTPLT 14

RASQGISSYL DASSLESG 20 A 1 V 6 YCQQSYSTSHT 15

RASQGISSYL DASSLESG 21 A 1 V 6 YCQQSYSTPNT 16

RASQGISSYL DASSLESG 22 A 1 V 6 YCQQWSSSPLT 17

RASQGISSYL DASSLESG 23 A 1 V 6 YCQQSYSTPLT 18

RASQGISSYL DASSLESG 24 A 1 V 6 YCQQYGSSPLT 19

RASQGISSYL DASSLESG 25 A 1 V 6 YCQQYYTTPLT 20

RASQGISSYL DASSLESG 26 A 1 V 6 YCKQAYIPPLT 21

RASQGISSYL DASSLESG 27 A 1 V 6 YCFQGSHVPRT 22

RASQGISSYL DASSLESG 28 A 1 V 6 YCQQYYSTPLT 23

RASQGISSYL AASTLQSG 29 A 1 V 7 HCQHYAGYSAT 10

RASQGISSYL AASTLQSG 30 A 1 V 7 YCQQSYSTPPT 11

RASQGISSYL AASTLQSG 31 A 1 V 7 YCQQSYSTPRT 12 32 RASQGISSYL 1 AASTLQSG 7 YCQQWSSHPQT 13

ID Q Q NO ID ID NO NO A V

RASQGISSYL AASTLQSG 33 A 1 V 7 YCQHHYGTPLT 14

RASQGISSYL AASTLQSG 34 A 1 V 7 YCQQSYSTSHT 15

RASQGISSYL AASTLQSG 35 A 1 V 7 YCQQSYSTPNT 16

RASQGISSYL AASTLQSG 36 A 1 V 7 YCQQWSSSPLT 17

RASQGISSYL AASTLQSG 37 A 1 V 7 YCQQSYSTPLT 18

RASQGISSYL AASTLQSG 38 A 1 V 7 YCQQYGSSPLT 19

RASQGISSYL AASTLQSG 39 A 1 V 7 YCQQYYTTPLT 20

RASQGISSYL AASTLQSG 40 A 1 V 7 YCKQAYIPPLT 21

RASQGISSYL AASTLQSG 41 A 1 V 7 YCFQGSHVPRT 22

RASQGISSYL AASTLQSG 42 A 1 V 7 YCQQYYSTPLT 23

RASQGISSYL 43 A 1 DASNRATGI 8 HCQHYAGYSAT 10

RASQGISSYL 44 A 1 DASNRATGI 8 YCQQSYSTPPT 11

RASQGISSYL 45 A 1 DASNRATGI 8 YCQQSYSTPRT 12

RASQGISSYL 46 A 1 DASNRATGI 8 YCQQWSSHPQT 13

RASQGISSYL 47 A 1 DASNRATGI 8 YCQHHYGTPLT 14

ID Q Q NO ID ID NO NO

RASQGISSYL 48 A 1 DASNRATGI 8 YCQQSYSTSHT 15

RASQGISSYL 49 A 1 DASNRATGI 8 YCQQSYSTPNT 16

RASQGISSYL 50 A 1 DASNRATGI 8 YCQQWSSSPLT 17

RASQGISSYL 51 A 1 DASNRATGI 8 YCQQSYSTPLT 18

RASQGISSYL 52 A 1 DASNRATGI 8 YCQQYGSSPLT 19

RASQGISSYL 53 A 1 DASNRATGI 8 YCQQYYTTPLT 20

RASQGISSYL 54 A 1 DASNRATGI 8 YCKQAYIPPLT 21

RASQGISSYL 55 A 1 DASNRATGI 8 YCFQGSHVPRT 22

RASQGISSYL 56 A 1 DASNRATGI 8 YCQQYYSTPLT 23

RASQGISSYL DASNLETG 57 A 1 V 9 HCQHYAGYSAT 10

RASQGISSYL DASNLETG 58 A 1 V 9 YCQQSYSTPPT 11

RASQGISSYL DASNLETG 59 A 1 V 9 YCQQSYSTPRT 12

RASQGISSYL DASNLETG 60 A 1 V 9 YCQQWSSHPQT 13

RASQGISSYL DASNLETG 61 A 1 V 9 YCQHHYGTPLT 14

RASQGISSYL DASNLETG 62 A 1 V 9 YCQQSYSTSHT 15 63 RASQGISSYL 1 DASNLETG 9 YCQQSYSTPNT 16

ID Q Q NO ID ID NO NO A V

RASQGISSYL DASNLETG 64 A 1 V 9 YCQQWSSSPLT 17

RASQGISSYL DASNLETG 65 A 1 V 9 YCQQSYSTPLT 18

RASQGISSYL DASNLETG 66 A 1 V 9 YCQQYGSSPLT 19

RASQGISSYL DASNLETG 67 A 1 V 9 YCQQYYTTPLT 20

RASQGISSYL DASNLETG 68 A 1 V 9 YCKQAYIPPLT 21

RASQGISSYL DASNLETG 69 A 1 V 9 YCFQGSHVPRT 22

RASQGISSYL DASNLETG 70 A 1 V 9 YCQQYYSTPLT 23

RASQSVSSYL AASSLQSG 71 A 2 V 5 HCQHYAGYSAT 10

RASQSVSSYL AASSLQSG 72 A 2 V 5 YCQQSYSTPPT 11

RASQSVSSYL AASSLQSG 73 A 2 V 5 YCQQSYSTPRT 12

RASQSVSSYL AASSLQSG 74 A 2 V 5 YCQQWSSHPQT 13

RASQSVSSYL AASSLQSG 75 A 2 V 5 YCQHHYGTPLT 14

RASQSVSSYL AASSLQSG 76 A 2 V 5 YCQQSYSTSHT 15

RASQSVSSYL AASSLQSG 77 A 2 V 5 YCQQSYSTPNT 16

RASQSVSSYL AASSLQSG 78 A 2 V 5 YCQQWSSSPLT 17

ID Q Q NO ID ID NO NO

RASQSVSSYL AASSLQSG 79 A 2 V 5 YCQQSYSTPLT 18

RASQSVSSYL AASSLQSG 80 A 2 V 5 YCQQYGSSPLT 19

RASQSVSSYL AASSLQSG 81 A 2 V 5 YCQQYYTTPLT 20

RASQSVSSYL AASSLQSG 82 A 2 V 5 YCKQAYIPPLT 21

RASQSVSSYL AASSLQSG 83 A 2 V 5 YCFQGSHVPRT 22

RASQSVSSYL AASSLQSG 84 A 2 V 5 YCQQYYSTPLT 23

RASQSVSSYL DASSLESG 85 A 2 V 6 HCQHYAGYSAT 10

RASQSVSSYL DASSLESG 86 A 2 V 6 YCQQSYSTPPT 11

RASQSVSSYL DASSLESG 87 A 2 V 6 YCQQSYSTPRT 12

RASQSVSSYL DASSLESG 88 A 2 V 6 YCQQWSSHPQT 13

RASQSVSSYL DASSLESG 89 A 2 V 6 YCQHHYGTPLT 14

RASQSVSSYL DASSLESG 90 A 2 V 6 YCQQSYSTSHT 15

RASQSVSSYL DASSLESG 91 A 2 V 6 YCQQSYSTPNT 16

RASQSVSSYL DASSLESG 92 A 2 V 6 YCQQWSSSPLT 17

RASQSVSSYL DASSLESG 93 A 2 V 6 YCQQSYSTPLT 18 94 RASQSVSSYL 2 DASSLESG 6 YCQQYGSSPLT 19

ID Q Q NO ID ID NO NO A V

RASQSVSSYL DASSLESG 95 A 2 V 6 YCQQYYTTPLT 20

RASQSVSSYL DASSLESG 96 A 2 V 6 YCKQAYIPPLT 21

RASQSVSSYL DASSLESG 97 A 2 V 6 YCFQGSHVPRT 22

RASQSVSSYL DASSLESG 98 A 2 V 6 YCQQYYSTPLT 23

RASQSVSSYL AASTLQSG 99 A 2 V 7 HCQHYAGYSAT 10

RASQSVSSYL AASTLQSG 100 A 2 V 7 YCQQSYSTPPT 11

RASQSVSSYL AASTLQSG 101 A 2 V 7 YCQQSYSTPRT 12

RASQSVSSYL AASTLQSG 102 A 2 V 7 YCQQWSSHPQT 13

RASQSVSSYL AASTLQSG 103 A 2 V 7 YCQHHYGTPLT 14

RASQSVSSYL AASTLQSG 104 A 2 V 7 YCQQSYSTSHT 15

RASQSVSSYL AASTLQSG 105 A 2 V 7 YCQQSYSTPNT 16

RASQSVSSYL AASTLQSG 106 A 2 V 7 YCQQWSSSPLT 17

RASQSVSSYL AASTLQSG 107 A 2 V 7 YCQQSYSTPLT 18

RASQSVSSYL AASTLQSG 108 A 2 V 7 YCQQYGSSPLT 19

RASQSVSSYL AASTLQSG 109 A 2 V 7 YCQQYYTTPLT 20

ID Q Q NO ID ID NO NO

RASQSVSSYL AASTLQSG 110 A 2 V 7 YCKQAYIPPLT 21

RASQSVSSYL AASTLQSG 111 A 2 V 7 YCFQGSHVPRT 22

RASQSVSSYL AASTLQSG 112 A 2 V 7 YCQQYYSTPLT 23

RASQSVSSYL 113 A 2 DASNRATGI 8 HCQHYAGYSAT 10

RASQSVSSYL 114 A 2 DASNRATGI 8 YCQQSYSTPPT 11

RASQSVSSYL 115 A 2 DASNRATGI 8 YCQQSYSTPRT 12

RASQSVSSYL 116 A 2 DASNRATGI 8 YCQQWSSHPQT 13

RASQSVSSYL 117 A 2 DASNRATGI 8 YCQHHYGTPLT 14

RASQSVSSYL 118 A 2 DASNRATGI 8 YCQQSYSTSHT 15

RASQSVSSYL 119 A 2 DASNRATGI 8 YCQQSYSTPNT 16

RASQSVSSYL 120 A 2 DASNRATGI 8 YCQQWSSSPLT 17

RASQSVSSYL 121 A 2 DASNRATGI 8 YCQQSYSTPLT 18

RASQSVSSYL 122 A 2 DASNRATGI 8 YCQQYGSSPLT 19

RASQSVSSYL 123 A 2 DASNRATGI 8 YCQQYYTTPLT 20

RASQSVSSYL 124 A 2 DASNRATGI 8 YCKQAYIPPLT 21 125 RASQSVSSYL 2 DASNRATGI 8 YCFQGSHVPRT 22

ID Q Q NO ID ID NO NO A

RASQSVSSYL 126 A 2 DASNRATGI 8 YCQQYYSTPLT 23

RASQSVSSYL DASNLETG 127 A 2 V 9 HCQHYAGYSAT 10

RASQSVSSYL DASNLETG 128 A 2 V 9 YCQQSYSTPPT 11

RASQSVSSYL DASNLETG 129 A 2 V 9 YCQQSYSTPRT 12

RASQSVSSYL DASNLETG 130 A 2 V 9 YCQQWSSHPQT 13

RASQSVSSYL DASNLETG 131 A 2 V 9 YCQHHYGTPLT 14

RASQSVSSYL DASNLETG 132 A 2 V 9 YCQQSYSTSHT 15

RASQSVSSYL DASNLETG 133 A 2 V 9 YCQQSYSTPNT 16

RASQSVSSYL DASNLETG 134 A 2 V 9 YCQQWSSSPLT 17

RASQSVSSYL DASNLETG 135 A 2 V 9 YCQQSYSTPLT 18

RASQSVSSYL DASNLETG 136 A 2 V 9 YCQQYGSSPLT 19

RASQSVSSYL DASNLETG 137 A 2 V 9 YCQQYYTTPLT 20

RASQSVSSYL DASNLETG 138 A 2 V 9 YCKQAYIPPLT 21

RASQSVSSYL DASNLETG 139 A 2 V 9 YCFQGSHVPRT 22

RASQSVSSYL DASNLETG 140 A 2 V 9 YCQQYYSTPLT 23

ID Q Q NO ID ID NO NO

RASQGVSSYL AASSLQSG 141 A 3 V 5 HCQHYAGYSAT 10

RASQGVSSYL AASSLQSG 142 A 3 V 5 YCQQSYSTPPT 11

RASQGVSSYL AASSLQSG 143 A 3 V 5 YCQQSYSTPRT 12

RASQGVSSYL AASSLQSG 144 A 3 V 5 YCQQWSSHPQT 13

RASQGVSSYL AASSLQSG 145 A 3 V 5 YCQHHYGTPLT 14

RASQGVSSYL AASSLQSG 146 A 3 V 5 YCQQSYSTSHT 15

RASQGVSSYL AASSLQSG 147 A 3 V 5 YCQQSYSTPNT 16

RASQGVSSYL AASSLQSG 148 A 3 V 5 YCQQWSSSPLT 17

RASQGVSSYL AASSLQSG 149 A 3 V 5 YCQQSYSTPLT 18

RASQGVSSYL AASSLQSG 150 A 3 V 5 YCQQYGSSPLT 19

RASQGVSSYL AASSLQSG 151 A 3 V 5 YCQQYYTTPLT 20

RASQGVSSYL AASSLQSG 152 A 3 V 5 YCKQAYIPPLT 21

RASQGVSSYL AASSLQSG 153 A 3 V 5 YCFQGSHVPRT 22

RASQGVSSYL AASSLQSG 154 A 3 V 5 YCQQYYSTPLT 23

RASQGVSSYL DASSLESG 155 A 3 V 6 HCQHYAGYSAT 10 156 RASQGVSSYL 3 DASSLESG 6 YCQQSYSTPPT 11

ID Q Q NO ID ID NO NO A V

RASQGVSSYL DASSLESG 157 A 3 V 6 YCQQSYSTPRT 12

RASQGVSSYL DASSLESG 158 A 3 V 6 YCQQWSSHPQT 13

RASQGVSSYL DASSLESG 159 A 3 V 6 YCQHHYGTPLT 14

RASQGVSSYL DASSLESG 160 A 3 V 6 YCQQSYSTSHT 15

RASQGVSSYL DASSLESG 161 A 3 V 6 YCQQSYSTPNT 16

RASQGVSSYL DASSLESG 162 A 3 V 6 YCQQWSSSPLT 17

RASQGVSSYL DASSLESG 163 A 3 V 6 YCQQSYSTPLT 18

RASQGVSSYL DASSLESG 164 A 3 V 6 YCQQYGSSPLT 19

RASQGVSSYL DASSLESG 165 A 3 V 6 YCQQYYTTPLT 20

RASQGVSSYL DASSLESG 166 A 3 V 6 YCKQAYIPPLT 21

RASQGVSSYL DASSLESG 167 A 3 V 6 YCFQGSHVPRT 22

RASQGVSSYL DASSLESG 168 A 3 V 6 YCQQYYSTPLT 23

RASQGVSSYL AASTLQSG 169 A 3 V 7 HCQHYAGYSAT 10

RASQGVSSYL AASTLQSG 170 A 3 V 7 YCQQSYSTPPT 11

RASQGVSSYL AASTLQSG 171 A 3 V 7 YCQQSYSTPRT 12

ID Q Q NO ID ID NO NO

RASQGVSSYL AASTLQSG 172 A 3 V 7 YCQQWSSHPQT 13

RASQGVSSYL AASTLQSG 173 A 3 V 7 YCQHHYGTPLT 14

RASQGVSSYL AASTLQSG 174 A 3 V 7 YCQQSYSTSHT 15

RASQGVSSYL AASTLQSG 175 A 3 V 7 YCQQSYSTPNT 16

RASQGVSSYL AASTLQSG 176 A 3 V 7 YCQQWSSSPLT 17

RASQGVSSYL AASTLQSG 177 A 3 V 7 YCQQSYSTPLT 18

RASQGVSSYL AASTLQSG 178 A 3 V 7 YCQQYGSSPLT 19

RASQGVSSYL AASTLQSG 179 A 3 V 7 YCQQYYTTPLT 20

RASQGVSSYL AASTLQSG 180 A 3 V 7 YCKQAYIPPLT 21

RASQGVSSYL AASTLQSG 181 A 3 V 7 YCFQGSHVPRT 22

RASQGVSSYL AASTLQSG 182 A 3 V 7 YCQQYYSTPLT 23

RASQGVSSYL 183 A 3 DASNRATGI 8 HCQHYAGYSAT 10

RASQGVSSYL 184 A 3 DASNRATGI 8 YCQQSYSTPPT 11

RASQGVSSYL 185 A 3 DASNRATGI 8 YCQQSYSTPRT 12

RASQGVSSYL 186 A 3 DASNRATGI 8 YCQQWSSHPQT 13 187 RASQGVSSYL 3 DASNRATGI 8 YCQHHYGTPLT 14

ID Q Q NO ID ID NO NO A

RASQGVSSYL 188 A 3 DASNRATGI 8 YCQQSYSTSHT 15

RASQGVSSYL 189 A 3 DASNRATGI 8 YCQQSYSTPNT 16

RASQGVSSYL 190 A 3 DASNRATGI 8 YCQQWSSSPLT 17

RASQGVSSYL 191 A 3 DASNRATGI 8 YCQQSYSTPLT 18

RASQGVSSYL 192 A 3 DASNRATGI 8 YCQQYGSSPLT 19

RASQGVSSYL 193 A 3 DASNRATGI 8 YCQQYYTTPLT 20

RASQGVSSYL 194 A 3 DASNRATGI 8 YCKQAYIPPLT 21

RASQGVSSYL 195 A 3 DASNRATGI 8 YCFQGSHVPRT 22

RASQGVSSYL 196 A 3 DASNRATGI 8 YCQQYYSTPLT 23

RASQGVSSYL DASNLETG 197 A 3 V 9 HCQHYAGYSAT 10

RASQGVSSYL DASNLETG 198 A 3 V 9 YCQQSYSTPPT 11

RASQGVSSYL DASNLETG 199 A 3 V 9 YCQQSYSTPRT 12

RASQGVSSYL DASNLETG 200 A 3 V 9 YCQQWSSHPQT 13

RASQGVSSYL DASNLETG 201 A 3 V 9 YCQHHYGTPLT 14

RASQGVSSYL DASNLETG 202 A 3 V 9 YCQQSYSTSHT 15

ID Q Q NO ID ID NO NO

RASQGVSSYL DASNLETG 203 A 3 V 9 YCQQSYSTPNT 16

RASQGVSSYL DASNLETG 204 A 3 V 9 YCQQWSSSPLT 17

RASQGVSSYL DASNLETG 205 A 3 V 9 YCQQSYSTPLT 18

RASQGVSSYL DASNLETG 206 A 3 V 9 YCQQYGSSPLT 19

RASQGVSSYL DASNLETG 207 A 3 V 9 YCQQYYTTPLT 20

RASQGVSSYL DASNLETG 208 A 3 V 9 YCKQAYIPPLT 21

RASQGVSSYL DASNLETG 209 A 3 V 9 YCFQGSHVPRT 22

RASQGVSSYL DASNLETG 210 A 3 V 9 YCQQYYSTPLT 23

RASQSISSYL AASSLQSG 211 N 4 V 5 HCQHYAGYSAT 10

RASQSISSYL AASSLQSG 212 N 4 V 5 YCQQSYSTPPT 11

RASQSISSYL AASSLQSG 213 N 4 V 5 YCQQSYSTPRT 12

RASQSISSYL AASSLQSG 214 N 4 V 5 YCQQWSSHPQT 13

RASQSISSYL AASSLQSG 215 N 4 V 5 YCQHHYGTPLT 14

RASQSISSYL AASSLQSG 216 N 4 V 5 YCQQSYSTSHT 15

RASQSISSYL AASSLQSG 217 N 4 V 5 YCQQSYSTPNT 16 218 RASQSISSYL 4 AASSLQSG 5 YCQQWSSSPLT 17

ID Q Q NO ID ID NO NO N V

RASQSISSYL AASSLQSG 219 N 4 V 5 YCQQSYSTPLT 18

RASQSISSYL AASSLQSG 220 N 4 V 5 YCQQYGSSPLT 19

RASQSISSYL AASSLQSG 221 N 4 V 5 YCQQYYTTPLT 20

RASQSISSYL AASSLQSG 222 N 4 V 5 YCKQAYIPPLT 21

RASQSISSYL AASSLQSG 223 N 4 V 5 YCFQGSHVPRT 22

RASQSISSYL AASSLQSG 224 N 4 V 5 YCQQYYSTPLT 23

RASQSISSYL DASSLESG 225 N 4 V 6 HCQHYAGYSAT 10

RASQSISSYL DASSLESG 226 N 4 V 6 YCQQSYSTPPT 11

RASQSISSYL DASSLESG 227 N 4 V 6 YCQQSYSTPRT 12

RASQSISSYL DASSLESG 228 N 4 V 6 YCQQWSSHPQT 13

RASQSISSYL DASSLESG 229 N 4 V 6 YCQHHYGTPLT 14

RASQSISSYL DASSLESG 230 N 4 V 6 YCQQSYSTSHT 15

RASQSISSYL DASSLESG 231 N 4 V 6 YCQQSYSTPNT 16

RASQSISSYL DASSLESG 232 N 4 V 6 YCQQWSSSPLT 17

RASQSISSYL DASSLESG 233 N 4 V 6 YCQQSYSTPLT 18

ID Q Q NO ID ID NO NO

RASQSISSYL DASSLESG 234 N 4 V 6 YCQQYGSSPLT 19

RASQSISSYL DASSLESG 235 N 4 V 6 YCQQYYTTPLT 20

RASQSISSYL DASSLESG 236 N 4 V 6 YCKQAYIPPLT 21

RASQSISSYL DASSLESG 237 N 4 V 6 YCFQGSHVPRT 22

RASQSISSYL DASSLESG 238 N 4 V 6 YCQQYYSTPLT 23

RASQSISSYL AASTLQSG 239 N 4 V 7 HCQHYAGYSAT 10

RASQSISSYL AASTLQSG 240 N 4 V 7 YCQQSYSTPPT 11

RASQSISSYL AASTLQSG 241 N 4 V 7 YCQQSYSTPRT 12

RASQSISSYL AASTLQSG 242 N 4 V 7 YCQQWSSHPQT 13

RASQSISSYL AASTLQSG 243 N 4 V 7 YCQHHYGTPLT 14

RASQSISSYL AASTLQSG 244 N 4 V 7 YCQQSYSTSHT 15

RASQSISSYL AASTLQSG 245 N 4 V 7 YCQQSYSTPNT 16

RASQSISSYL AASTLQSG 246 N 4 V 7 YCQQWSSSPLT 17

RASQSISSYL AASTLQSG 247 N 4 V 7 YCQQSYSTPLT 18

RASQSISSYL AASTLQSG 248 N 4 V 7 YCQQYGSSPLT 19 249 RASQSISSYL 4 AASTLQSG 7 YCQQYYTTPLT 20

ID Q Q NO ID ID NO NO N V

RASQSISSYL AASTLQSG 250 N 4 V 7 YCKQAYIPPLT 21

RASQSISSYL AASTLQSG 251 N 4 V 7 YCFQGSHVPRT 22

RASQSISSYL AASTLQSG 252 N 4 V 7 YCQQYYSTPLT 23

RASQSISSYL 253 N 4 DASNRATGI 8 HCQHYAGYSAT 10

RASQSISSYL 254 N 4 DASNRATGI 8 YCQQSYSTPPT 11

RASQSISSYL 255 N 4 DASNRATGI 8 YCQQSYSTPRT 12

RASQSISSYL 256 N 4 DASNRATGI 8 YCQQWSSHPQT 13

RASQSISSYL 257 N 4 DASNRATGI 8 YCQHHYGTPLT 14

RASQSISSYL 258 N 4 DASNRATGI 8 YCQQSYSTSHT 15

RASQSISSYL 259 N 4 DASNRATGI 8 YCQQSYSTPNT 16

RASQSISSYL 260 N 4 DASNRATGI 8 YCQQWSSSPLT 17

RASQSISSYL 261 N 4 DASNRATGI 8 YCQQSYSTPLT 18

RASQSISSYL 262 N 4 DASNRATGI 8 YCQQYGSSPLT 19

RASQSISSYL 263 N 4 DASNRATGI 8 YCQQYYTTPLT 20

RASQSISSYL 264 N 4 DASNRATGI 8 YCKQAYIPPLT 21

ID Q Q NO ID ID NO NO

RASQSISSYL 265 N 4 DASNRATGI 8 YCFQGSHVPRT 22

RASQSISSYL 266 N 4 DASNRATGI 8 YCQQYYSTPLT 23

RASQSISSYL DASNLETG 267 N 4 V 9 HCQHYAGYSAT 10

RASQSISSYL DASNLETG 268 N 4 V 9 YCQQSYSTPPT 11

RASQSISSYL DASNLETG 269 N 4 V 9 YCQQSYSTPRT 12

RASQSISSYL DASNLETG 270 N 4 V 9 YCQQWSSHPQT 13

RASQSISSYL DASNLETG 271 N 4 V 9 YCQHHYGTPLT 14

RASQSISSYL DASNLETG 272 N 4 V 9 YCQQSYSTSHT 15

RASQSISSYL DASNLETG 273 N 4 V 9 YCQQSYSTPNT 16

RASQSISSYL DASNLETG 274 N 4 V 9 YCQQWSSSPLT 17

RASQSISSYL DASNLETG 275 N 4 V 9 YCQQSYSTPLT 18

RASQSISSYL DASNLETG 276 N 4 V 9 YCQQYGSSPLT 19

RASQSISSYL DASNLETG 277 N 4 V 9 YCQQYYTTPLT 20

RASQSISSYL DASNLETG 278 N 4 V 9 YCKQAYIPPLT 21

RASQSISSYL DASNLETG 279 N 4 V 9 YCFQGSHVPRT 22 280 RASQSISSYL 4 DASNLETG 9 YCQQYYSTPLT 23

ID Q Q NO ID ID NO NO N V

[087] Em algumas modalidades, é fornecida no presente documento uma cadeia leve de anticorpo com uma região variável de cadeia leve que compreende uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3 da presente divulgação. Em algumas modalidades, pelo menos duas das HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de uma sequência HVR-L1 da presente divulgação (por exemplo, SEQ ID NOS:1-4), uma sequência HVR-L2 da presente divulgação (por exemplo, SEQ ID NOS:5-9), e uma sequência HVR-L3 da presente divulgação (por exemplo, SEQ ID NOS:10- 23).

[088] As sequências HVR de cadeia leve descritas no presente documento podem ser incluídas em qualquer combinação numa cadeia leve de anticorpo ou região variável de cadeia leve da presente divulgação. Em algumas modalidades, uma região variável de cadeia leve compreende uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma HVR-L3 do anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23. Em algumas modalidades, uma região variável de cadeia leve compreende uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, e uma HVR-L2 do anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9. Em algumas modalidades, uma região variável de cadeia leve compreende uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID

NOS:1-4, e uma HVR-L3 do anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23. Em algumas modalidades, uma região variável de cadeia leve compreende uma

HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID

NOS:5-9, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs:10-23. Em certas modalidades, uma região variável de cadeia leve compreende três dentre uma

HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3 selecionadas do grupo que consiste em:

uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1,

uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:10-23; uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID

NOS:5-9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:18; uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:1, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOS: 23; uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma sequência HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOS:20; uma HVR-L1 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18; uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID

NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma

HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14; uma

HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, uma

HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18; uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:5-9, e uma

HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20; uma

NOS:1-4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO:6, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3 selecionadas do grupo que consiste em: uma

HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, uma

HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma

HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18; uma

HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, uma

HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma

HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23; uma

HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, uma

HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma

HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20; uma

HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma

HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma

HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14; uma

HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3, uma

HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma

HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20; uma

HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, uma

HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, e uma

HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18; uma

HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma

HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:7, e uma

HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23; uma

HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma

HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23; e uma

HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma

HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, e uma

HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:17; uma

HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma

HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, e uma

HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17; uma

HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, uma

HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:5, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:

20 e uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID

NO: 4; uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID

NO: 8 e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO: 11. Em algumas modalidades, uma região variável de cadeia leve compreende três dentre uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3 de um anticorpo listado na Tabela 2. Em algumas modalidades, uma região variável de cadeia leve compreende três dentre uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3 listadas na Tabela 1. Em algumas modalidades, uma região variável de cadeia leve compreende uma sequência selecionada dentre as SEQ ID NOS: 28-50.

[089] Em algumas modalidades, uma região variável de cadeia leve compreende ainda sequências de framework de cadeia leve de região variável justapostas entre as HVRs de acordo com a fórmula: (FW-L1)-(HVR-L1)- (FW-L2)-(HVR-L2)-(FW-L3)-(HVR-L3)-(FW-L4). Em algumas modalidades, uma, duas, três ou quatro das sequências de framework são as seguintes:

[090] FW-L1 é DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO:24)

[091] FW-L2 é WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO:25)

[092] FW-L3 é PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY (SEQ ID NO:26)

[093] FW-L4 é FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:27).

[094] Em algumas modalidades, é fornecido ainda no presente documento um anticorpo que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia leve inclui uma região variável de cadeia leve da presente divulgação. Em algumas modalidades, é fornecido adicionalmente no presente documento um fragmento de anticorpo ou scFv que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve da presente divulgação.

[095] Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de anticorpo da presente divulgação se liga a pelo menos 1 alvo (por exemplo, uma proteína alvo ou um epítopo) ou pelo menos dois alvos com afinidades de ligação particular. Por exemplo, em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de anticorpo da presente divulgação se liga a pelo menos 1 alvo ou pelo menos dois alvos com uma constante de dissociação de equilíbrio (Kd) de cerca de 10- 7M ou menos, 10-8 M ou menos, 10-9 M ou menos, 10-10 M ou menos ou 10-11 M ou menos. Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de anticorpo da presente divulgação se liga a pelo menos 1 alvo ou pelo menos dois alvos com uma constante de dissociação de equilíbrio (Kd) entre cerca de 10-7 e cerca de 10-11 M. Ensaios exemplificativos para determinar a afinidade de ligação são descritos e exemplificados infra.

[096] Os anticorpos da presente divulgação podem ser produzidos com o uso de métodos e composições recombinantes, por exemplo, conforme descrito na patente nº U.S. 4.816.567. Em algumas modalidades, são fornecidos ácidos nucleicos isolados que codificam qualquer anticorpo descrito no presente documento Tais ácidos nucleicos podem codificar uma sequência de aminoácidos que compreende a VL e/ou uma sequência de aminoácidos que compreende a VH dos anticorpos (por exemplo, as cadeias leves e/ou pesadas dos anticorpos). Em algumas modalidades, um ou mais vetores (por exemplo, vetores de expressão ou vetores de exibição) que compreendem tais ácidos nucleicos são fornecidos no presente documento. Em algumas modalidades, é fornecida uma célula hospedeira que compreende tais ácidos nucleicos. Numa tal modalidade, uma célula hospedeira compreende (por exemplo, foi transformada com): (1) um vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a VL do anticorpo e uma sequência de aminoácidos que compreende a VH do anticorpo ou (2) um primeiro vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a VL do anticorpo e um segundo vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a VH do anticorpo. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é eucariótica, por exemplo, uma célula de ovário de hamster chinês (CHO) ou célula linfoide (por exemplo, célula Y0, NS0, Sp20). Em algumas modalidades, é fornecido um método para produzir um anticorpo, em que o método compreende cultivar uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico que codifica o anticorpo, conforme fornecido acima, sob condições adequadas para expressão do anticorpo e recuperando opcionalmente o anticorpo da célula hospedeira (ou meio de cultura de célula hospedeira).

[097] Para produção recombinante de anticorpos da presente divulgação, o ácido nucleico que codifica um anticorpo, por exemplo, conforme descrito acima, é isolado e inserido num ou mais vetores para clonagem e/ou expressão adicional numa célula hospedeira. Tal ácido nucleico pode ser prontamente isolado e sequenciado com o uso de procedimentos convencionais (por exemplo, com o uso de sondas de oligonucleotídeo que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesadas e leves do anticorpo).

[098] As células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão dos vetores que codificam o anticorpo incluem células procarióticas ou eucarióticas. Por exemplo, os anticorpos podem ser produzidos em bactérias, em particular quando a glicosilação e a função efetora Fc não são necessárias.

Para expressão de fragmentos de anticorpo e polipeptídeos em bactérias, consultar, por exemplo, as patentes nos U.S. 5.648.237, 5.789.199 e 5.840.523.

(Consultar, também Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, edição, Humana Press, Totowa, NJ, 2003), páginas 245-254, que descreve a expressão de fragmentos de anticorpo em E. coli. Após a expressão, o anticorpo pode ser isolado da pasta de células bacterianas numa fração solúvel e pode ser adicionalmente purificado.

[099] Além de procariontes, micróbios eucarióticos, tais como fungos filamentosos ou levedura são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vetores de codificação de anticorpo, incluindo cepas de fungos e leveduras cujas vias de glicosilação foram “humanizadas”, resultando na produção de um anticorpo com um padrão de glicosilação parcial ou totalmente humano. Consultar Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004) e Li et al., Nat.

Biotech. 24:210-215 (2006).

[0100] As células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpo glicosilado também são derivadas de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados). Exemplos de células de invertebrados incluem células vegetais e de insetos. Foram identificadas inúmeras cepas baculovirais que podem ser usadas em conjunto com células de insetos, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda.

[0101] Culturas de células vegetais também podem ser utilizadas como hospedeiros. Consultar, por exemplo, as patentes nos U.S. 5.959.177,

6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 e 6.417.429 (que descrevem a tecnologia PLANTIBODIES™ para produzir anticorpos em plantas transgênicas).

[0102] As células de vertebrados também podem ser usadas como hospedeiros. Por exemplo, as linhagens celulares de mamífero que são adaptadas para crescer em suspensão podem ser úteis. Outros exemplos de linhagens de célula hospedeira de mamífero são linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7); linhagem de rim embrionário humano (293 ou 293 células, conforme descrito, por exemplo, em Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de rim de hamster bebê (BHK); células de sertoli de camundongo (células TM4 conforme descrito, por exemplo, em Mather, Biol.

Reprod. 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1); células de rim de macaco verde africano (VERO-76); células de carcinoma cervical humano (HELA); células de rim canino (MDCK; células de fígado de rato búfalo (BRL 3A); células de pulmão humano (W138); células de fígado humano (Hep G2); tumor mamário de camundongo (MMT 060562); células TRI, conforme descrito, por exemplo, em Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); células MRC 5 e células FS4. Outras linhagens de célula hospedeira de mamífero úteis incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células DHFR- CHO (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)) e linhagens celulares de mieloma, tais como Y0, NS0 e Sp2/0. Para análise de determinadas linhagens de célula hospedeira de mamífero para produção de anticorpos, consultar, por exemplo, Yazaki e Wu, Methods in Molecular Biology, Volume 248 (B.K.C. Lo, edição, Humana Press, Totowa, NJ), páginas 255-268 (2003).

ANTICORPOS BIESPECÍFICOS COM CADEIA LEVE IDÊNTICA/COMUM/ÚNICA

[0103] Ademais, é fornecido no presente documento um anticorpo biespecífico que tem uma região variável de cadeia leve idêntica da presente divulgação (por exemplo, que tem duas regiões variáveis de cadeia pesada com diferentes especificidades de ligação e duas regiões variáveis de cadeia leve idênticas). Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende duas regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo e duas regiões variáveis de cadeia leve idênticas, em que o anticorpo biespecífico inclui: um primeiro domínio de ligação que se liga a um primeiro alvo ou antígeno e compreende uma primeira região variável de cadeia leve de anticorpo e uma primeira região variável de cadeia pesada; e um segundo domínio de ligação que se liga a um segundo alvo ou antígeno e compreende uma segunda região variável de cadeia pesada de anticorpo e uma segunda região variável de cadeia leve de anticorpo; em que a segunda região variável de cadeia leve de anticorpo tem uma sequência idêntica à primeira sequência de regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo domínios de ligação se ligam a diferentes biomoléculas alvo. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo domínios de ligação se ligam a epítopos diferentes numa mesma molécula. Em algumas modalidades, a primeira região variável de cadeia pesada de anticorpo faz parte de uma primeira cadeia pesada de anticorpo que compreende a primeira região variável de cadeia pesada e uma primeira região constante de cadeia pesada (por exemplo, que compreende CH1, dobradiça, CH2 e CH3). Em algumas modalidades, a segunda região variável de cadeia pesada de anticorpo faz parte de uma segunda cadeia pesada de anticorpo que compreende a segunda região variável de cadeia pesada e uma segunda região constante de cadeia pesada (por exemplo, que compreende CH1, dobradiça, CH2 e CH3). Em algumas modalidades, a primeira região variável de cadeia leve de anticorpo faz parte de uma primeira cadeia leve de anticorpo que compreende a primeira região variável de cadeia leve e uma primeira região constante de cadeia leve. Em algumas modalidades, a segunda região variável de cadeia leve de anticorpo faz parte de uma segunda cadeia leve de anticorpo que compreende a segunda região variável de cadeia leve e uma segunda região constante de cadeia leve. Em algumas modalidades, a primeira e a segunda cadeias leves de anticorpo têm sequências idênticas a uma cadeia leve da presente divulgação.

[0104] Ademais, é fornecido no presente documento um método de geração de um anticorpo biespecífico que tem uma região variável de cadeia leve idêntica da presente divulgação (por exemplo, que tem duas regiões variáveis de cadeia pesada com diferentes especificidades de ligação e duas regiões variáveis de cadeia leve idênticas). Em algumas modalidades, o método inclui selecionar um primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno e compreende uma primeira região variável de cadeia pesada de anticorpo e uma primeira região variável de cadeia leve da presente divulgação; (b) selecionar um segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno e compreende uma segunda região variável de cadeia pesada de anticorpo e uma segunda região variável de cadeia pesada da presente divulgação, em que a segunda região variável de cadeia leve de anticorpo tem uma sequência idêntica à primeira sequência de regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo; e (c) produzir o anticorpo biespecífico que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da primeira região variável de cadeia pesada de anticorpo, uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da segunda região variável de cadeia pesada de anticorpo, uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da primeira sequência de regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo, e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da segunda sequência de regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo. Em algumas modalidades, a primeira região variável de cadeia leve é codificada por um polinucleotídeo a partir de uma biblioteca da presente divulgação.

[0105] Em algumas modalidades, os anticorpos biespecíficos descritos no presente documento podem ter especificidades adicionais. Por exemplo, um dos sítios de ligação ao antígeno ou alvo do anticorpo biespecífico pode se ligar a mais de um alvo especificamente.

[0106] Métodos para produzir/gerar anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. A produção de anticorpos biespecíficos de comprimento total pode se basear na coexpressão de dois pares de cadeia pesada-leve de imunoglobulina, em que as duas cadeias têm especificidades diferentes (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Devido à classificação aleatória de cadeias pesada e leve de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas de anticorpos diferentes, das quais apenas uma tem estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, que é geralmente feita por etapas de cromatografia de afinidade, é bastante complicada, e os rendimentos de produto são baixos. Procedimentos similares são divulgados no documento WO 93/08829, e em Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

[0107] Uma abordagem conhecida na técnica para produzir anticorpos biespecíficos é a abordagem “knobs-into-holes” ou “protuberance- into-cavity” (consultar, por exemplo, a patente nº US 5.731.168). Nesta abordagem, dois polipeptídeos de imunoglobulina (por exemplo, polipeptídeos de cadeia pesada) compreendem, cada um, uma interface. Uma interface de um polipeptídeo de imunoglobulina interage com uma interface correspondente no outro polipeptídeo de imunoglobulina permitindo, deste modo, que os dois polipeptídeos de imunoglobulina se associem. Estas interfaces podem ser geneticamente modificadas de modo que um “knob” ou “protuberance” (estes termos podem ser usados de modo intercambiável no presente documento) situado na interface de um polipeptídeo de imunoglobulina corresponda a um “hole” ou “cavity” (estes termos podem ser usados de modo intercambiável no presente documento) situado na interface do outro polipeptídeo de imunoglobulina. Em algumas modalidades, o orifício é de tamanho idêntico ou similar ao botão e adequadamente posicionado, de modo que quando as duas interfaces interagirem, o botão de uma interface seja posicionável no orifício correspondente da outra interface. Se se ater à teoria, imagina-se que isto estabilize o heteromultímero e favoreça a formação do heteromultímero em relação a outras espécies, por exemplo, homomultímeros. Em algumas modalidades, esta abordagem pode ser usada para promover a heteromultimerização de dois polipeptídeos de imunoglobulina diferentes, criando um anticorpo biespecífico que compreende dois polipeptídeos de imunoglobulina com especificidades de ligação para diferentes epítopos.

[0108] Em algumas modalidades, um knob pode ser construído substituindo-se uma cadeia lateral de aminoácido pequena por uma cadeia lateral maior. Em algumas modalidades, um hole pode ser construído substituindo-se uma cadeia lateral de aminoácido grande por uma cadeia lateral menor. Knobs ou holes podem existir na interface original, ou eles podem ser introduzidos sinteticamente. Por exemplo, knobs ou holes podem ser introduzidos sinteticamente alterando-se a sequência de ácidos nucleicos que codificam a interface para substituir pelo menos um resíduo de aminoácido “original” por pelo menos um resíduo de aminoácido “importado”. Métodos para alterar as sequências de ácidos nucleicos podem incluir técnicas de biologia molecular padrão bem conhecidas na técnica. Em algumas modalidades, os resíduos originais têm um pequeno volume de cadeia lateral (por exemplo, alanina, asparagina, ácido aspártico, glicina, serina, treonina ou valina), e resíduos importados para formar um knob são aminoácido de ocorrência natural e podem incluir arginina, fenilalanina, tirosina e triptofano. Em algumas modalidades, os resíduos originais têm um grande volume de cadeia lateral (por exemplo, arginina, fenilalanina, tirosina e triptofano), e resíduos importados para formar um hole são aminoácidos de ocorrência natural e podem incluir alanina, serina, treonina e valina.

[0109] Em algumas modalidades, resíduos originais para formar um knob ou hole são identificados com base na estrutura tridimensional do heteromultímero ou homomultímero (por exemplo, homodímero). As técnicas conhecidas na técnica para obter uma estrutura tridimensional podem incluir uma cristalografia de raios X ou RMN. Em algumas modalidades, a interface é o domínio CH3 de um domínio constante de imunoglobulina (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4). Nestas modalidades, a interface CH3/CH3 de IgG1 humana envolve dezesseis resíduos em cada domínio situado em quatro β-fitas antiparalelas. Sem desejar se ater à teoria, os resíduos que sofreram mutação estão situados, de preferência, nas duas β-fitas antiparalelas centrais para minimizar o risco que os knobs podem ser acomodados pelo solvente circundante, em vez dos holes compensatórios no domínio CH3 parceiro. Em algumas modalidades, as mutações que formam knobs e holes correspondentes em dois polipeptídeos de imunoglobulina correspondem a um ou mais pares fornecidos na tabela a seguir.

TABELA 3: CONJUNTOS EXEMPLIFICATIVOS DE MUTAÇÕES DE FORMAÇÃO DE KNOB E

HOLE CH3 da primeira imunoglobulina CH3 da segunda imunoglobulina T366Y Y407T T366W Y407A F405A T394W

CH3 da primeira imunoglobulina CH3 da segunda imunoglobulina Y407T T366Y T366Y:F405A T394W:Y407T T366W:F405W T394S:Y407A F405W:Y407A T366W:T394S F405W T394S As mutações são indicadas pelo resíduo original, seguido pela posição que usa o sistema de numeração de Kabat e, então, o resíduo importado (todos os resíduos são fornecidos em código de aminoácido de única letra). Múltiplas mutações são separadas por dois pontos.

[0110] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de imunoglobulina compreende um domínio CH3 que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos listadas na Tabela 3 acima. Em algumas modalidades, um anticorpo biespecífico compreende um primeiro polipeptídeo de imunoglobulina que compreende um domínio CH3 que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos na coluna esquerda da Tabela 3, e um segundo polipeptídeo de imunoglobulina que compreende um domínio CH3 que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos listadas na coluna direita da Tabela 3.

[0111] Após a mutação do ADN, conforme discutido acima, os polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de imunoglobulina modificados com uma ou mais mutações de formação de knob ou hole correspondentes podem ser expressos e purificados com o uso de técnicas recombinantes padrão e sistemas de célula conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, as patentes US nos 5.731.168; 5.807.706; 5.821.333; 7.642.228; 7.695.936; 8.216.805; publicação U.S. nº 2013/0089553; e Spiess et al., Nature Biotechnology 31: 753-

758, 2013. Os polipeptídeos de imunoglobulina modificados podem ser produzidos com o uso de células hospedeiras procarióticas, tal como E. coli, ou células hospedeiras eucarióticas, tais como células CHO.

Os polipeptídeos de imunoglobulina contendo knob e hole podem ser expressos em células hospedeiras em cocultura e purificados em conjunto como um heteromultímero,

ou eles podem ser expressos em culturas únicas, separadamente purificados e montados in vitro.

Em algumas modalidades, duas cepas de células hospedeiras bacterianas (uma expressando um polipeptídeo de imunoglobulina com um knob, e a outra expressando um polipeptídeo de imunoglobulina com um hole) são cocultivadas com o uso de técnicas de cultura bacteriana padrão conhecidas na técnica.

Em algumas modalidades, as duas cepas podem ser misturadas numa razão específica, por exemplo, a fim de obter níveis de expressão iguais em cultura.

Em algumas modalidades, as duas cepas podem ser misturadas numa razão de 50:50, 60:40 ou 70:30. Após a expressão de polipeptídeos, as células podem ser lisadas em conjunto, e a proteína pode ser extraída.

As técnicas padrão conhecidas na técnica que permitem a medição da abundância de espécies homomultiméricas versus heteromultiméricas podem incluir cromatografia de exclusão de tamanho.

Em algumas modalidades, cada polipeptídeo de imunoglobulina modificado é expresso com o uso de técnicas recombinantes padrão, e eles podem ser montados em conjunto in vitro.

A montagem pode ser obtida, por exemplo, ao purificar cada polipeptídeo de imunoglobulina modificado, misturar e incubar os mesmos em conjunto em massa igual, reduzir dissulfetos (por exemplo, ao tratar com ditiotreitol),

concentrar e reoxidar os polipeptídeos.

Os anticorpos biespecíficos formados podem ser purificados com o uso de técnicas padrão incluindo cromatografia de troca de cátions e medidos com o uso de técnicas padrão incluindo cromatografia de exclusão de tamanho.

Para uma descrição mais detalhada destes métodos,

consultar Speiss et al., Nat Biotechnol 31:753-8, 2013. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de imunoglobulina modificados podem ser expressos separadamente em células CHO e montados in vitro com o uso dos métodos descritos acima.

V. KITS

[0112] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um kit que compreende uma biblioteca de polinucleotídeos da presente divulgação.

Em algumas modalidades, o kit compreende ainda uma bula que compreende instruções para expressar, modificar, realizar triagem ou, de outro modo, usar a biblioteca, por exemplo, para identificar uma HVR de anticorpo ou região variável de interesse. Em algumas modalidades, o kit compreende ainda um ou mais tampões, por exemplo, para armazenar, transferir, transfectar ou, de outro modo, usar um ou mais dos polinucleotídeos (por exemplo, polinucleotídeos sintéticos).

Em algumas modalidades, i kit compreende ainda um ou mais recipientes para armazenar um ou mais dos polinucleotídeos. Em algumas modalidades, o kit compreende ainda um ou mais vetores, por exemplo, para transfecção de uma célula hospedeira com um ou mais dos polinucleotídeos.

EXEMPLOS

[0113] A invenção será mais totalmente compreendida por meio de referência aos exemplos a seguir. Os exemplos não devem, no entanto, ser interpretados como limitantes do escopo da divulgação. É entendido que os exemplos e as modalidades descritos no presente documento têm apenas propósitos ilustrativos e que várias modificações ou mudanças à luz dos mesmos serão sugeridas a pessoas versadas na técnica e podem ser incluídos no espírito e alcance deste pedido e escopo das reivindicações anexas.

EXEMPLO 1: IDENTIFICAÇÃO DO CONJUNTO MÍNIMO DE MOTIVOS DINÂMICOS EM

REGIÕES HIPERVARIÁVEIS

[0114] Para entender a variabilidade de domínios variáveis de anticorpo num nível estrutural, um algoritmo foi desenvolvido para mapear o alinhamento geométrico para domínios variáveis de anticorpo, e ainda, para calcular a entropia estrutural e de sequência com base no alinhamento geométrico. Tal abordagem combina a teoria clássica da diversidade de anticorpo que é determinada pelo processo bem estabelecido de recombinação V(D)J acoplada à diversidade conformacional de unidades dinâmicas (seleção conformacional direcionada por modelo de Linus Pauling; Consultar, por exemplo, James, L. e Tawfik, D. “Conformational diversity and protein evolution - a 60-year-old hypothesis revisited”, Trends Biochem Sci. julho de 2003;28(7):361-8) para permitir a amostragem de um espaço de epítopos quase infinito por seleção e adaptação de sítios de ligação ao anticorpo. Como um exemplo, este algoritmo foi usado para analisar a variabilidade estrutural e de sequência de 81 estruturas de cristal de alta resolução de domínios de cadeia leve variáveis de anticorpo humano. A entropia foi calculada e plotada para cada posição do domínio de cadeia leve variável (Figura 1A; entropia estrutural em linha em negrito, entropia de sequência em linha pontilhada). Os resultados obtidos calculando-se a entropia estrutural e de sequência com base no alinhamento geométrico foram usados para localizar as regiões hipervariáveis (HVR), e para identificar as posições críticas nestas regiões variáveis. Para comparação, as HVRs (conforme definido pela metodologia descrita acima) e CDRs (conforme definido por Kabat) foram identificadas para uma sequência de domínio variável de leve pesada de anticorpo (Figura 1B).

[0115] De modo interessante, a variabilidade conforme analisada por alinhamentos estruturais foi geralmente menor que a variabilidade observada com alinhamentos de sequência. Embora a variabilidade fosse geralmente inferior conforme analisada por alinhamentos estruturais, houve vários sítios/regões com variação estrutural drástica, sugerindo que estes sítios variáveis podem desempenhar funções críticas na função de anticorpo.

Adicionalmente, algumas regiões hipervariáveis mostram alta flexibilidade com múltiplas conformações. A identificação de regiões de resíduos altamente variáveis proporcionou uma imagem mais abrangente da conservação e variabilidade de domínios variáveis de anticorpos que poderiam ser explorados em novos projetos de anticorpos. A identificação do motivo dinâmico tornou possível cobrir uma ampla faixa de diversidades estruturais com um número reduzido de sequências de aminoácidos. A vantagem surpreendente desta abordagem do projeto de anticorpo foi que um número mais limitado de motivos dinâmicos poderia ser empregado nas regiões variáveis para cobrir uma ampla faixa de diversidades estruturais de anticorpo e fornecer ampla flexibilidade a estes anticorpos, o que pode permitir a ligação a múltiplos antígenos de interesse. Deste modo, uma biblioteca de cadeia leve comum (chamada DL280) foi construída com o uso de sequências de linhagem germinativa humana única ou sequências derivadas de linhagem germinativa para os resíduos invariantes, enquanto um número limitado de motivos dinâmicos foi usado para as regiões hipervariáveis para capturar a ampla faixa de variabilidade estrutural identificada nas regiões variáveis HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3.

EXEMPLO 2: CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECAS DE CADEIA LEVE COMUNS CONSTRUÇÃO DA BIBLIOTECA DE CADEIA LEVE DL280

[0116] Para começar a construção da biblioteca de cadeia leve DL280, foram sintetizados 20 minigenes que codificaram 20 combinações de sequências HVR-L1 e HVR-L2 (Tabela 1). Os minigenes sintetizados foram, então, digeridos com PvuI e BamHI, e ligados ao vetor alvo Fad22 que foi digerido com as mesmas duas enzimas de restrição. As misturas de ligação foram transformadas em células DH10B, os 20 construtos foram purificados, e as sequências foram verificadas para o próximo estágio de construção.

[0117] Um total de 14 pares de oligo que codificaram 14 sequências HVR-L3 (Tabela 1) foi projetado e sintetizado. O anelamento de oligo foi realizado numa máquina PCR com as seguintes configurações: 95°C por 3 minutos e, então, 35 ciclos (15 segundos para cada ciclo) iniciando em 95°C, diminuindo a temperatura em 1°C a cada ciclo. Após o anelamento, cada par foi digerido individualmente com PstI e Acc65I, e ligado individualmente aos 20 construtos mencionados acima digeridos com as mesmas duas enzimas de restrição. As misturas de ligação foram transformadas em células DH10B individualmente, os 280 construtos resultantes foram purificados, quantificados e as sequências foram verificadas. As sequências das regiões HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 que correspondem a estes 280 construtos são listadas na Tabela 2.

Além disto, estes construtos compartilharam, cada um, as mesmas regiões de framework, a saber FW-L1 (SEQ ID NO:24), FW-L2 (SEQ ID NO:25), FW-L3 (SEQ ID NO:26) e FW-L4 (SEQ ID NO:27). Quantidades iguais de cada um dos 280 construtos foram misturadas para construção de biblioteca.

[0118] A mistura mencionada acima de 280 plasmídeos foi digerida com PvuI e Acc65I, e ligada ao vetor de fagomídeo Fad40 que também foi digerido com as mesmas enzimas de restrição. As misturas de ligação foram transformadas em células DH10B, a biblioteca resultante (DL280) foi purificada, quantificada e armazenada para a montagem da biblioteca de fagomídeos completa.

CONSTRUÇÃO DA BIBLIOTECA VH

[0119] Múltiplos oligos degenerados que codificam VHs_vr1 e VHs_vr2 foram projetados, sintetizados e convertidos em ADN de fita dupla através do seguinte protocolo: 0,75 µl de oligos modelo 0,2 µM foram misturados com 10 µl 5x de tampão PrimeSTAR, 4 µl de mistura dNTP, 1 µl de 100 µM de iniciador direto, 1 µl de 100 µM de iniciador reverso, 0,5 µl de ADN polimerase PrimeSTAR HS (2,5 U/ µl) e 33 µl de água. As soluções PCR foram preaquecidas a 96°C por 5 minutos, então 14 ciclos (96°C por 15 segundos, 60°C por 15 segundos, 72°C por seis segundos) foram realizados, seguido de extensão a 72°C por três minutos. As VHs_vr1 foram amplificadas com o uso do par de iniciadores F_1999 (CGTTTGTCCTGTGCAGCTTCCGG) (SEQ ID NO:61) e R_1999 (CGAGGCCCTTACCCGGGGCCTGACG) (SEQ ID NO:62), enquanto as VHs_vr2 foram amplificadas com o uso do par de iniciadores F_2003 (CCGGGTAAGGGCCTCGAGTGG) (SEQ ID NO:63) e R_2003 (GAGCACGTCCGTTCGAATTGTCGCGACTTATAG) (SEQ ID NO:64) (Tabela 4).

[0120] As VHs_vr1 e VHs_vr2 de fita dupla foram reunidas através de sequências sobrepostas em suas extremidades 5' ou 3'. O protocolo usado foi da seguinte forma: 20 ng de modelos de VH_vr1 e 20 ng de VH_vr2 foram misturados com 10 µl 5x de tampão PrimeSTAR, 4 µl de mistura de dNTP, 1 µl de 100 µM de iniciador F_1999, 1 µl de 100 µM de iniciador R_2003, 0,5 µl de ADN Polimerase PrimeSTAR HS (2,5 U/ µl) e água (até 50 µl). As misturas foram preaquecidas a 96°C por 5 minutos, então 14 ciclos (96°C por 15 segundos, 60°C por 15 segundos, 72°C por 10 segundos) foram realizados, seguido de extensão a 72°C por três minutos. Estes fragmentos PCR foram, então purificados através de eletroforese em gel (GENEray Gel Extraction kit), digeridos com BspEI e BstBI (Thermo Scientific) e, subsequentemente clonados num FTV014 digerido com as mesmas duas enzimas. A mistura de ligação foi transformada em células DH10B por eletroporação, e o número de colônias que excede 10 vezes a diversidade calculada foi coletado para preparação de plasmídeos. Os plasmídeos purificados constituíram a biblioteca VH-vr12

[0121] Várias centenas de oligos degenerados que codificam VH_vr3 foram projetados, sintetizados e convertidos no ADN de fita dupla através do seguinte protocolo: 0,75 µl de oligos modelo 0,2 µM foram misturados com 10 µl 5x de tampão PrimeSTAR, 4 µl de mistura dNTP, 1 µl de 100 µM de iniciador direto, 1 µl de 100 µM de iniciador reverso, 0,5 µl de ADN polimerase PrimeSTAR HS (2,5 U/ µl) e 33 µl de água. As soluções PCR foram preaquecidas a 96°C por 5 minutos, então 14 ciclos (96°C por 15 segundos, 60°C por 15 segundos, 72°C por seis segundos) foram realizados, seguido de extensão a 72°C por três minutos. O iniciador direto foi S1089 (ACAACTGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTG) (SEQ ID NO:65) e o iniciador reverso foi S1090 (GAGGAGACGGTGACTAGTGTTCCTTGACCCCA) (SEQ ID NO:66) (Tabela 4). Os ADNs de fita dupla que codificam a VH_vr3 foram, então, purificados através de eletroforese em gel (GENEray Gel Extraction kit), digeridos com AflII e SpeI (Thermo Scientific) e, subsequentemente clonados no FTV012 digerido com as mesmas duas enzimas de restrição. A mistura de ligação foi transformada em células DH10B por eletroporação, e o número de colônias que excede 10 vezes a diversidade calculada foi coletado para preparação de plasmídeos. Os plasmídeos purificados constituíram a biblioteca VH-VR3

[0122] Para montar a biblioteca VH de comprimento total, a mistura de plasmídeos de biblioteca VH-VR3 foi digerida AflII e SpeI (NEB), e os fragmentos que codificam VR3 foram purificados através de eletroforese em gel (GENEray Gel Extraction kit), e subsequentemente clonados na mistura de plasmídeos de biblioteca VH-VR12 que foi digerida com as mesmas duas enzimas de restrição. Os produtos de ligação foram dessalinizados (QIAquick® PCR Purification Kit (QIAGEN)) antes da amplificação por círculo rolante (RCA).

A RCA foi realizada da seguinte forma: 40 ng de produtos de ligação foram misturados com 10 μl de 10x NEBuffer 4, 50 μl de 100 μM de pd(N)8, e água (até 88,5 μl), aquecidos a 95°C por três minutos, e anelados por 65 ciclos (30 segundo cada ciclo) com cada ciclo diminuindo em 1°C. As reações aneladas foram incubadas de um dia para o outro a 30 °C após a adição de 10 μl de 10 mM de mistura de dNTP, 1 μl de 100 x BSA e 0,5 μl de ADN polimerase Phi29.

Os produtos de RCA foram primeiro digeridos com NotI, fragmentos de ADN foram purificados (QIAquick® PCR Purification Kit), e adicionalmente digeridos com XhoI. Os produtos digeridos foram então ligados com AND ligase T4 DNA

(Thermo Scientific). Após a purificação através de precipitação de etanol, os produtos de ligação foram transformados em células DH10B por eletroporação, e o número de colônias que excede 10 vezes a diversidade calculada foi coletado para preparação de plasmídeos. Os plasmídeos purificados constituíram a biblioteca VH-VR123 TABELA 4: INICIADORES USADOS PARA AMPLIFICAÇÃO PCR Iniciador Sequência F_1999 CGTTTGTCCTGTGCAGCTTCCGG (SEQ ID NO:61) R_1999 CGAGGCCCTTACCCGGGGCCTGACG (SEQ ID NO:62) F_2003 CCGGGTAAGGGCCTCGAGTGG (SEQ ID NO:63) R_2003 GAGCACGTCCGTTCGAATTGTCGCGACTTATAG (SEQ ID NO:64) S1089 ACAACTGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTA TTG (SEQ ID NO:65) S1090 GAGGAGACGGTGACTAGTGTTCCTTGACCCCA (SEQ ID NO:66)

CONSTRUÇÃO DA BIBLIOTECA DE CADEIA LEVE COMUM

[0123] A biblioteca leve comum era composta da biblioteca de cadeia pesada derivada da biblioteca VH-VR123 e da biblioteca de cadeia leve derivada da biblioteca DL280. Tanto os plasmídeos de biblioteca VH-VR123 como os plasmídeos de biblioteca DL280 foram digeridos com BspEI e SpeI (Thermo Scientific). Os fragmentos de ADN que codificam a cadeia pesada derivada da biblioteca VH-VR123 foram clonados nas cadeias principais de vetor derivadas da biblioteca DL280. Os produtos de ligação foram dessalinizados (QIAquick® PCR Purification Kit (QIAGEN)) antes da amplificação por círculo rolante (RCA). A RCA foi realizada da seguinte forma: 40 ng de produtos de ligação foram misturados com 10 μl de 10x NEBuffer 4, 50 μl de 100 μM de pd(N)8, e água (até 88,5 μl), aquecidos a 95°C por três minutos, e anelados por 65 ciclos (30 segundo cada ciclo) com cada ciclo diminuindo em 1°C. As reações aneladas foram incubadas de um dia para o outro a 30°C após a adição de 10 μl de 10 mM de mistura de dNTP, 1 μl de 100 x BSA e 0,5 μl de ADN polimerase Phi29. Os produtos de RCA foram primeiro digeridos com NotI, fragmentos de ADN foram purificados (QIAquick® PCR Purification Kit), e adicionalmente digeridos com Acc65I. Os produtos digeridos foram então ligados com AND ligase T4 DNA (Thermo Scientific). Após a purificação através de precipitação de etanol, os produtos de ligação foram transformados em células ER2738 por eletroporação. Um número total de 3,5*109 colônias foi coletado de placas (2xYT,1% de glicose, 100 μg/ml de ampicilina).

EXEMPLO 3: TRIAGEM DA BIBLIOTECA DE CADEIA LEVE COMUM PARA ISOLAR

ANTICORPOS DE INTERESSE PREPARAÇÃO DE PARTÍCULAS DE FAGOMÍDEOS DE BIBLIOTECA DE CADEIA LEVE COMUM

[0124] Para preparar as partículas de fagomídeos de biblioteca de cadeia leve comum para panning de antígeno, 1,6 litros de células ER2738 que abrigam a biblioteca de cadeia leve comum (descrita no Exemplo 2 acima) foram inoculadas em meio contendo 2xYT, 2% de glicose, 100 μg/ml de ampicilina e 12,5 μg/ml de tetraciclina numa OD600 inicial de 0,1. A cultura foi desenvolvida a 37°C, agitada a 250 rpm, até a mesma alcançar a OD600 de 0,6 a 0,8. As células foram, então infectadas com fagos auxiliares M13KO7 numa multiplicidade de infecções (MOI) de 10 por 30 minutos a 37°C. As células ER2738 infectadas foram desenvolvidas de um dia para o outro a 22°C em 3,2 litros de meio contendo 2xYT, 100 μg/ml de ampicilina e 50 μg/ml de canamicina. Os sobrenadantes de cultura foram, então colhidos por centrifugação a 10000 rpm por 15 minutos, e filtrados através de um filtro de baixa ligação de 0,45 µm

(Corning). As partículas de fagomídeo foram, então precipitadas a partir do sobrenadante filtrado com o uso de PEG/NaCl e ressuspensas em PBS. Uma rodada adicional de precipitação de PEG/NaCl, seguida de ressuspensão em PBS, foi conduzida O título de fago foi determinado por medição de OD268 (supondo que 1 unidade em OD268 seja aproximadamente 1*1013 partículas de fagos/ml) e confirmado por ensaio de placa. As partículas de fagomídeos de biblioteca foram armazenadas em glicerol a 20% a -80°C.

PANNING DE BIBLIOTECA DE FAGOS

[0125] As proteínas de antígeno a uma concentração de 1 a 30 μg/ml foram revestidas em tiras Maxisorp (Thermo Scientific, nº Cat. 446469) de um dia para o outro a 4°C. Múltiplos poços de antígenos foram preparados para cada biblioteca. Os poços revestidos foram bloqueados primeiro com 5% de leite em PBS por 1 a 2 horas à temperatura ambiente e lavados com PBS. Então1,100 μl/poço de solução de partículas de fagomídeos (tipicamente 1 a 5*1012 fagos em 2% de leite-PBS) foram adicionados em 4 poços paralelos e incubados por 1 a 2 horas. Os poços foram, então, lavados diversas vezes com PBS com concentrações crescentes de Tween 20 (de 0,1% a 0,3%) e, finalmente com PBS sozinho. As partículas de fagomídeos ligadas foram eluídas a partir de poços com 100 µl de glicina-HCl 0,2 M por 10 minutos à temperatura ambiente. Os fagos eluídos foram imediatamente neutralizados com 18 µl de Tris-HCl 1M (pH 9,1)

[0126] Alternativamente, o panning de biblioteca de fagomídeos foi realizado com o uso de Dynabeads (M280, Streptavidin, Invitrogen, nº Cat.

60210) através de KingFisher (Thermo Scientific) de acordo com as instruções do fabricante. 300 µl de Dynabeads foram lavados com PBS e incubados com Fc anti-humano biotinilado por 20 minutos à temperatura ambiente. As microesferas foram, então, bloqueadas com BSA a 5% em PBS por uma hora à temperatura ambiente. Os antígenos de fusão Fc (70-100 pmols) foram capturados por uma incubação de uma hora à temperatura ambiente. As microesferas foram, então, lavadas uma vez com PBS, e incubadas com 1 ml de solução de biblioteca de fagos (tipicamente 5*1012 a 1*1013 partículas de fagos em BSA-PBS a 5%) por 1 a 2 horas. As microesferas foram, então, lavadas diversas vezes com PBS/Tween (0,1% a 0,3%) e PBS, e os fagos ligados foram eluídos a partir das microesferas com 100 µl de glicina-HCl 0,2 M por 10 minutos à temperatura ambiente. Os fagos eluídos foram imediatamente neutralizados com 18 µl de Tris-HCl 1M (pH 9,1). Um total de três ou quatro rodadas de panning foram conduzidas contra cada um dos antígenos, e um excesso de 10 a 100 vezes de Fc humano purificado foi incluído para reduzir a ligação de fundo.

[0127] Para alguns dos antígenos testados, 2 ml de antígenos (10 a 30 μg/ml) foram usados para revestir tubos imunes de um dia para o outro a 4°C. O volume de soluções de bloqueio, lavagem e eluição foi consequentemente aumentado.

AMPLIFICAÇÃO DE FAGO ENRIQUECIDO

[0128] O grupamento de fagos enriquecidos eluídos foi adicionalmente amplificado da seguinte forma: Células ER2738 foram infectadas com as partículas de fagomídeos eluídas a 37°C por 30 minutos. As células infectadas foram, então plaqueadas em placas de ágar 2xYT com glicose a 2%, 100 μg/ml de ampicilina e 12,5 μg/ml de tetraciclina. As colônias foram, então, colhidas a partir de placas, cultivadas em 100 ml de glicose a 2%, 100 μg/ml de ampicilina e 12,5 μg/ml de tetraciclina, e infectadas com fago auxiliar M13KO7.

Os fagos amplificados foram purificados e quantificados pelos processos descritos acima. Geralmente, os fagos eluídos após a rodada final de panning foram usados para infectar células ER2738, e as colônias ER2738 resultantes foram selecionadas para ensaios de triagem ELISA de sobrenadante.

ENSAIO ELISA EM SANDUÍCHE DE SOBRENADANTE

[0129] Um ensaio Elisa em sanduíche sensível foi desenvolvido para medir os Fabs presentes em sobrenadante bacteriano. Microplacas foram revestidas com IgG policlonal anti-humana (específica de Fab) (Sigma I5260) para capturar Fabs presentes no sobrenadante bacteriano e, então, Fc anti- humano de cabra marcado com HRP foi usado para detectar a quantidade de Fabs capturados. A A450 de cada poço foi medida para determinar a atividade de ligação Fab. Os hits primários foram definidos como aqueles cujos sinais ELISA foram pelo menos duas vezes aqueles do fundo, e foram adicionalmente caracterizados no exemplo a seguir (Exemplo 4).

EXEMPLO 4: CARACTERIZAÇÃO DE ANTICORPOS IN VITRO

[0130] Os Fabs que correspondem aos hits primários identificados no Exemplo 3 acima, que foram marcados em seu C-terminal do domínio CH1 com uma etiqueta His6, foram superexpressos em E. coli, e foram purificados através de resina Ni-NTA (Thermo Fisher Scientific) de acordo com as instruções do fabricante. Suas afinidades foram medidas pelo Sistema ForteBio Octet RED96. Resumidamente, os sensores AHC (biossensores de imersão e leitura por captura de IgG-Fc anti-humano) foram usados para capturar o antígeno e imersos em poços contendo Fabs purificados que foram diluídos a 5 a 10 µg/ml com tampão cinético (consultar, por exemplo, ForteBio, Anti-human IgG Capture (AHC) Biosensors, Product Insert 41-0072-PD (2008)). Os dados ForteBio adquiridos foram processados com software de Aquisição de Dados 7.1, e dados cinéticos foram adaptados a um modelo de ligação Langmuir 1:1. As afinidades Fab medidas a 25°C para alvos TAGT-1, TAGT-2 e TAGT-3 são mostradas na Tabela 5 e na Figura 3. Estes três antígenos alvo (TAGT-1, TAGT-2 e TAGT-3) eram proteínas não relacionadas que compartilham menos de 17% de identidade de sequência.

TABELA 5: MEDIÇÕES DE AFINIDADE PARA FABS COM LIGAÇÃO CONFIRMADA A TAGT - 1, TAGT-2 E TAGT-3 A 25°C

ID de Hit ID Alvo Kd (M) 3763 TAGT-1 9,30E-09 7190 TAGT-1 1,03E-08 7166 TAGT-1 1,24E-08 3760 TAGT-1 1,26E-08 7163 TAGT-1 1,26E-08 7183 TAGT-1 1,48E-08 3757 TAGT-1 1,84E-08 7077 TAGT-1 1,88E-08 7129 TAGT-1 1,90E-08 7097 TAGT-1 2,43E-08 7080 TAGT-1 2,44E-08 7199 TAGT-1 2,46E-08 7078 TAGT-1 2,52E-08 4216 TAGT-1 2,59E-08 4218 TAGT-1 2,85E-08 7079 TAGT-1 2,99E-08 7131 TAGT-1 3,04E-08 3762 TAGT-1 3,04E-08 7135 TAGT-1 3,17E-08 7109 TAGT-1 3,20E-08 7201 TAGT-1 3,26E-08 7105 TAGT-1 3,33E-08 7120 TAGT-1 3,45E-08 7100 TAGT-1 3,50E-08 7159 TAGT-1 3,79E-08 7128 TAGT-1 3,97E-08 7133 TAGT-1 4,03E-08 7081 TAGT-1 4,31E-08 7088 TAGT-1 4,36E-08 7092 TAGT-1 4,57E-08

ID de Hit ID Alvo Kd (M) 4222 TAGT-1 5,55E-08 7090 TAGT-1 5,55E-08 4220 TAGT-1 5,72E-08 7087 TAGT-1 6,96E-08 3761 TAGT-1 9,65E-08 4217 TAGT-1 9,67E-08 7107 TAGT-1 1,22E-07

7055 TAGT-2 7,57E-10 5129 TAGT-2 1,12E-09 7044 TAGT-2 1,12E-09 3780 TAGT-2 1,47E-09 7035 TAGT-2 3,04E-09 5132 TAGT-2 3,06E-09 7073 TAGT-2 3,19E-09 7039 TAGT-2 5,21E-09 5144 TAGT-2 6,79E-09 5145 TAGT-2 7,00E-09 5126 TAGT-2 9,54E-09 7068 TAGT-2 1,11E-08 7043 TAGT-2 1,34E-08 7036 TAGT-2 1,59E-08 7066 TAGT-2 1,80E-08 7032 TAGT-2 2,08E-08 7037 TAGT-2 2,10E-08 7047 TAGT-2 2,15E-08 5131 TAGT-2 2,17E-08 7038 TAGT-2 2,33E-08 7040 TAGT-2 2,72E-08 7067 TAGT-2 3,41E-08

ID de Hit ID Alvo Kd (M) 7030 TAGT-2 3,47E-08 7025 TAGT-2 4,87E-08

7222 TAGT-3 1,26E-09 5989 TAGT-3 1,74E-09 7238 TAGT-3 2,14E-09 7231 TAGT-3 3,38E-09 7243 TAGT-3 4,95E-09 7249 TAGT-3 5,36E-09 7221 TAGT-3 5,58E-09 5930 TAGT-3 5,66E-09 5123 TAGT-3 5,67E-09 7246 TAGT-3 6,22E-09 7241 TAGT-3 6,43E-09 5113 TAGT-3 6,80E-09 7256 TAGT-3 7,08E-09 5128 TAGT-3 7,12E-09 5119 TAGT-3 7,54E-09 7226 TAGT-3 7,57E-09 7228 TAGT-3 7,62E-09 5921 TAGT-3 8,01E-09 7232 TAGT-3 8,06E-09 5997 TAGT-3 8,51E-09 5138 TAGT-3 8,55E-09 5935 TAGT-3 8,78E-09 7213 TAGT-3 8,87E-09 7229 TAGT-3 8,91E-09 7247 TAGT-3 8,93E-09 7220 TAGT-3 9,12E-09 5121 TAGT-3 9,29E-09

ID de Hit ID Alvo Kd (M) 7209 TAGT-3 9,36E-09 7225 TAGT-3 9,53E-09 7230 TAGT-3 9,53E-09 7252 TAGT-3 9,56E-09 7258 TAGT-3 9,72E-09 7210 TAGT-3 9,85E-09 7244 TAGT-3 1,05E-08 7254 TAGT-3 1,07E-08 5967 TAGT-3 1,10E-08 7257 TAGT-3 1,11E-08 5932 TAGT-3 1,12E-08 5993 TAGT-3 1,13E-08 5980 TAGT-3 1,14E-08 5990 TAGT-3 1,15E-08 5115 TAGT-3 1,16E-08 7240 TAGT-3 1,17E-08 7255 TAGT-3 1,20E-08 5913 TAGT-3 1,23E-08 7211 TAGT-3 1,26E-08 5968 TAGT-3 1,27E-08 7248 TAGT-3 1,28E-08 5970 TAGT-3 1,35E-08 7245 TAGT-3 1,38E-08 5964 TAGT-3 1,40E-08 5995 TAGT-3 1,42E-08 7219 TAGT-3 1,44E-08 5116 TAGT-3 1,46E-08 7218 TAGT-3 1,49E-08 5906 TAGT-3 1,50E-08 5994 TAGT-3 1,58E-08

ID de Hit ID Alvo Kd (M) 5923 TAGT-3 1,60E-08 7215 TAGT-3 1,61E-08 5934 TAGT-3 1,66E-08 5912 TAGT-3 1,68E-08 5992 TAGT-3 1,70E-08 7212 TAGT-3 1,70E-08 7242 TAGT-3 1,71E-08 5915 TAGT-3 1,82E-08 5920 TAGT-3 1,88E-08 7216 TAGT-3 1,88E-08 5922 TAGT-3 1,95E-08 5928 TAGT-3 1,97E-08 5963 TAGT-3 2,07E-08 5983 TAGT-3 2,09E-08 7237 TAGT-3 2,13E-08 7235 TAGT-3 2,18E-08 5996 TAGT-3 2,21E-08 5979 TAGT-3 2,31E-08 5919 TAGT-3 2,38E-08 7239 TAGT-3 2,40E-08 5961 TAGT-3 2,41E-08 5125 TAGT-3 2,42E-08 7251 TAGT-3 2,69E-08 5977 TAGT-3 2,70E-08 6010 TAGT-3 2,83E-08 5976 TAGT-3 2,88E-08 5933 TAGT-3 3,13E-08 5929 TAGT-3 3,20E-08 5926 TAGT-3 3,23E-08 5978 TAGT-3 3,25E-08

ID de Hit ID Alvo Kd (M) 5910 TAGT-3 3,30E-08 5914 TAGT-3 3,30E-08 5911 TAGT-3 3,35E-08 5114 TAGT-3 3,42E-08 5918 TAGT-3 3,46E-08 5905 TAGT-3 3,83E-08 5985 TAGT-3 3,92E-08 5927 TAGT-3 4,35E-08 5986 TAGT-3 4,65E-08 5974 TAGT-3 5,02E-08 6008 TAGT-3 5,10E-08 6004 TAGT-3 5,50E-08 5916 TAGT-3 5,83E-08 5924 TAGT-3 5,95E-08 5999 TAGT-3 6,29E-08 6000 TAGT-3 7,86E-08 5962 TAGT-3 8,06E-08

[0131] Conforme indicado pela Tabela 5 acima, múltiplos anticorpos que direcionam três antígenos diferentes com alta afinidade podem ser identificados de maneira bem-sucedida e selecionados a partir da biblioteca preparada.

EXEMPLO 5: APLICAÇÃO DA BIBLIOTECA DL280

[0132] Para demonstrar a aplicação da biblioteca de cadeia leve DL280 montada no Exemplo 2 sob cenários diferentes, três bibliotecas de anticorpo foram construídas com o uso da biblioteca de cadeia leve DL280:

[0133] DPL5: o conjunto inteiro de cadeias leves DL280 emparelhadas com uma biblioteca VH grande

[0134] VH: diversidade é > 109 VHs

[0135] VL: o conjunto inteiro de DL280

[0136] SEL021: o conjunto inteiro de cadeias leves DL280 com uma biblioteca VH pequena

[0137] VH: 20 VHs

[0138] VL: o conjunto inteiro de DL280

[0139] DPL16~DPL34: um subconjunto das cadeias leves DL280 emparelhadas com uma biblioteca VH grande

[0140] VH: diversidade é > 1010 VHs

[0141] VL: uma única espécie de DL280

[0142] Para examinar a robustez e flexibilidade da biblioteca de cadeia leve DL280, foram realizadas triagens nas bibliotecas DPL5, SEL021 e DPL16~DPL34 contra três alvos: TAGT-1, TAGT-2 e TAGT-3 (conforme descrito no Exemplo 3). Hits positivos foram identificados a partir de cada uma das três bibliotecas testadas, e um total de 165 hits positivos contendo 24 VLs exclusivas foi medido e confirmado com dados de afinidade (Tabela 6).

TABELA 6: DADOS DE AFINIDADE PARA HITS CONFIRMADOS ID de Hit Biblioteca Antígeno Kd (M) DL280-135 (SEQ ID NO:28) 3757 DPL5 TAGT-1 1,84E-08 4220 DPL5 TAGT-1 5,72E-08 5905 DPL16 TAGT-3 3,83E-08 5906 DPL16 TAGT-3 1,50E-08 5910 DPL16 TAGT-3 3,30E-08 5911 DPL16 TAGT-3 3,35E-08 5912 DPL16 TAGT-3 1,68E-08 5913 DPL16 TAGT-3 1,23E-08 5914 DPL16 TAGT-3 3,30E-08 5915 DPL16 TAGT-3 1,82E-08 5916 DPL16 TAGT-3 5,83E-08 5918 DPL16 TAGT-3 3,46E-08

ID de Hit Biblioteca Antígeno Kd (M) 5919 DPL16 TAGT-3 2,38E-08 5920 DPL16 TAGT-3 1,88E-08 5921 DPL16 TAGT-3 8,01E-09 5922 DPL16 TAGT-3 1,95E-08 5923 DPL16 TAGT-3 1,60E-08 5924 DPL16 TAGT-3 5,95E-08 5926 DPL16 TAGT-3 3,23E-08 5927 DPL16 TAGT-3 4,35E-08 5928 DPL16 TAGT-3 1,97E-08 5929 DPL16 TAGT-3 3,20E-08 5961 DPL16 TAGT-3 2,41E-08 5962 DPL16 TAGT-3 8,06E-08 5963 DPL16 TAGT-3 2,07E-08 5964 DPL16 TAGT-3 1,40E-08 5967 DPL16 TAGT-3 1,10E-08 5968 DPL16 TAGT-3 1,27E-08 5970 DPL16 TAGT-3 1,35E-08 5974 DPL16 TAGT-3 5,02E-08 5976 DPL16 TAGT-3 2,88E-08 5977 DPL16 TAGT-3 2,70E-08 5978 DPL16 TAGT-3 3,25E-08 5979 DPL16 TAGT-3 2,31E-08 5980 DPL16 TAGT-3 1,14E-08 5983 DPL16 TAGT-3 2,09E-08 5985 DPL16 TAGT-3 3,92E-08 5986 DPL16 TAGT-3 4,65E-08 5989 DPL16 TAGT-3 1,74E-09 5990 DPL16 TAGT-3 1,15E-08 5992 DPL16 TAGT-3 1,70E-08 5993 DPL16 TAGT-3 1,13E-08 5994 DPL16 TAGT-3 1,58E-08

ID de Hit Biblioteca Antígeno Kd (M) 5995 DPL16 TAGT-3 1,42E-08 5996 DPL16 TAGT-3 2,21E-08 5997 DPL16 TAGT-3 8,51E-09 5999 DPL16 TAGT-3 6,29E-08 6000 DPL16 TAGT-3 7,86E-08 6004 DPL16 TAGT-3 5,50E-08

DL280-70 (SEQ ID NO:32) 4218 DPL5 TAGT-1 2,85E-08 4222 DPL5 TAGT-1 5,55E-08 5114 SEL021 TAGT-3 3,42E-08 7035 DPL19 TAGT-2 3,04E-09 7036 DPL19 TAGT-2 1,59E-08 7037 DPL19 TAGT-2 2,10E-08 7038 DPL19 TAGT-2 2,33E-08 7039 DPL19 TAGT-2 5,21E-09 7040 DPL19 TAGT-2 2,72E-08 7090 DPL19 TAGT-1 5,55E-08 7092 DPL19 TAGT-1 4,57E-08 7097 DPL19 TAGT-1 2,43E-08 7100 DPL19 TAGT-1 3,50E-08 7105 DPL19 TAGT-1 3,33E-08 7107 DPL19 TAGT-1 1,22E-07 7109 DPL19 TAGT-1 3,20E-08 7120 DPL19 TAGT-1 3,45E-08 7221 DPL19 TAGT-3 5,58E-09 7222 DPL19 TAGT-3 1,26E-09 7225 DPL19 TAGT-3 9,53E-09 7226 DPL19 TAGT-3 7,57E-09 7228 DPL19 TAGT-3 7,62E-09 7229 DPL19 TAGT-3 8,91E-09

ID de Hit Biblioteca Antígeno Kd (M) 7230 DPL19 TAGT-3 9,53E-09 7231 DPL19 TAGT-3 3,38E-09 7232 DPL19 TAGT-3 8,06E-09 7235 DPL19 TAGT-3 2,18E-08 7237 DPL19 TAGT-3 2,13E-08 7238 DPL19 TAGT-3 2,14E-09 7239 DPL19 TAGT-3 2,40E-08 7240 DPL19 TAGT-3 1,17E-08 7241 DPL19 TAGT-3 6,43E-09 7242 DPL19 TAGT-3 1,71E-08 7243 DPL19 TAGT-3 4,95E-09 7244 DPL19 TAGT-3 1,05E-08 7245 DPL19 TAGT-3 1,38E-08 7246 DPL19 TAGT-3 6,22E-09 7247 DPL19 TAGT-3 8,93E-09 7248 DPL19 TAGT-3 1,28E-08 7249 DPL19 TAGT-3 5,36E-09 7251 DPL19 TAGT-3 2,69E-08 7252 DPL19 TAGT-3 9,56E-09 7254 DPL19 TAGT-3 1,07E-08 7255 DPL19 TAGT-3 1,20E-08 7256 DPL19 TAGT-3 7,08E-09 7257 DPL19 TAGT-3 1,11E-08 7258 DPL19 TAGT-3 9,72E-09

DL280-67 (SEQ ID NO:34) 5145 SEL021 TAGT-2 7,00E-09 7025 DPL18 TAGT-2 4,87E-08 7030 DPL18 TAGT-2 3,47E-08 7032 DPL18 TAGT-2 2,08E-08 7077 DPL18 TAGT-1 1,88E-08

ID de Hit Biblioteca Antígeno Kd (M) 7078 DPL18 TAGT-1 2,52E-08 7079 DPL18 TAGT-1 2,99E-08 7080 DPL18 TAGT-1 2,44E-08 7081 DPL18 TAGT-1 4,31E-08 7087 DPL18 TAGT-1 6,96E-08 7088 DPL18 TAGT-1 4,36E-08 7209 DPL18 TAGT-3 9,36E-09 7210 DPL18 TAGT-3 9,85E-09 7211 DPL18 TAGT-3 1,26E-08 7212 DPL18 TAGT-3 1,70E-08 7213 DPL18 TAGT-3 8,87E-09 7215 DPL18 TAGT-3 1,61E-08 7216 DPL18 TAGT-3 1,88E-08 7218 DPL18 TAGT-3 1,49E-08 7219 DPL18 TAGT-3 1,44E-08 7220 DPL18 TAGT-3 9,12E-09

DL280-271 (SEQ ID NO:36) 5930 DPL17 TAGT-3 5,66E-09 5932 DPL17 TAGT-3 1,12E-08 5933 DPL17 TAGT-3 3,13E-08 5934 DPL17 TAGT-3 1,66E-08 5935 DPL17 TAGT-3 8,78E-09 6008 DPL17 TAGT-3 5,10E-08 6010 DPL17 TAGT-3 2,83E-08

DL280-207 (SEQ ID NO:35) 3762 DPL5 TAGT-1 3,04E-08 7047 DPL23 TAGT-2 2,15E-08 7131 DPL23 TAGT-1 3,04E-08

ID de Hit Biblioteca Antígeno Kd (M) 7133 DPL23 TAGT-1 4,03E-08 7135 DPL23 TAGT-1 3,17E-08 7190 DPL31 TAGT-1 1,03E-08

DL280-65 (SEQ ID NO:29) 5119 SEL021 TAGT-3 7,54E-09 5132 SEL021 TAGT-2 3,06E-09 7043 DPL21 TAGT-2 1,34E-08 7044 DPL21 TAGT-2 1,12E-09 7128 DPL21 TAGT-1 3,97E-08 7129 DPL21 TAGT-1 1,90E-08

DL280-252 (SEQ ID NO:38) 5129 SEL021 TAGT-2 1,12E-09 7055 DPL26 TAGT-2 7,57E-10 7159 DPL26 TAGT-1 3,79E-08 7163 DPL26 TAGT-1 1,26E-08 7166 DPL26 TAGT-1 1,24E-08

DL280-238 (SEQ ID NO:39) 3780 DPL5 TAGT-2 1,47E-09 7066 DPL31 TAGT-2 1,80E-08 7067 DPL31 TAGT-2 3,41E-08 7068 DPL31 TAGT-2 1,11E-08

DL280-232 (SEQ ID NO:49) 7073 DPL34 TAGT-2 3,19E-09 7199 DPL34 TAGT-1 2,46E-08 7201 DPL34 TAGT-1 3,26E-08

ID de Hit Biblioteca Antígeno Kd (M)

DL280-221 4216 DPL5 TAGT-1 2,59E-08 5144 SEL021 TAGT-2 6,79E-09

DL280-254 5116 SEL021 TAGT-3 1,46E-08 7183 DPL31 TAGT-1 1,48E-08

DL280-109 5115 SEL021 TAGT-3 1,16E-08

DL280-114 5125 SEL021 TAGT-3 2,42E-08

DL280-121 5128 SEL021 TAGT-3 7,12E-09

DL280-132 3760 DPL5 TAGT-1 1,26E-08

DL280-165 3763 DPL5 TAGT-1 9,30E-09

DL280-205 5113 SEL021 TAGT-3 6,80E-09

DL280-257 5138 SEL021 TAGT-3 8,55E-09

DL280-261

ID de Hit Biblioteca Antígeno Kd (M) 5121 SEL021 TAGT-3 9,29E-09 DL280-28 4217 DPL5 TAGT-1 9,67E-08 DL280-53 3761 DPL5 TAGT-1 9,65E-08 DL280-79 5123 SEL021 TAGT-3 5,67E-09 DL280-80 5131 SEL021 TAGT-2 2,17E-08 DL280-9 5126 SEL021 TAGT-2 9,54E-09

[0143] Das 24 VLs exclusivas, nove das mesmas se ligaram a múltiplos alvos quando emparelhadas com VHs diferentes. Por exemplo, ID de Hit 3757 continha DL280-135 (SEQ ID NO:28) e uma VH (SEQ ID NO:51) e ligada a TAGT-1, enquanto o ID de Hit 5905 também continha DL280-135, porém com uma VH diferente (SEQ ID NO:52), e ligada a um alvo diferente, TAGT-3. De modo similar, quando a DL280-67 (SEQ ID NO:34) é emparelhada com uma VH (SEQ ID NO:56) como ID de Hit 5145, a mesma se liga a TAGT-2, e quando emparelhada com uma VH diferente (SEQ ID NO:57) como ID de Hit 7077, se liga a TAGT-1.

[0144] Foi também descoberto que as VLs de DL280 poderiam se ligar a todos os três antígenos alvos quando emparelhadas com sequências VH diferentes. Por exemplo, quando a DL280-70 (SEQ ID NO:32) foi emparelhada com uma VH (SEQ ID NO:53) como ID de Hit 7035, a mesma se liga a TAGT-2,

quando emparelhada com a segunda VH (SEQ ID NO:54) como ID de Hit 4218, a mesma se liga a TAGT-1, e quando emparelhada com uma terceira VH (SEQ ID NO:55) como ID de Hit 5114, a mesma se liga a TAGT-3. Duas DL280s adicionais ligadas ao mesmo alvo com o uso de múltiplas VHs diferentes.

Por exemplo, a DL280-271 (SEQ ID NO:36) se liga a TAGT-3 quando emparelhada com duas VHs diferentes (SEQ ID NOs: 58 e 59) como IDs de Hit 5930 e 6008, respectivamente.

A Tabela 7 abaixo mostra o uso de sequência e o número de alvos ligados para as 24 VLs exclusivas identificadas durante a análise de biblioteca.

TABELA 7: CAPACIDADE LIGAÇÃO ALVO DE VLS Porcentagem Número de de Uso de alvos atingidos ID de DL280 Sequência dentre 3 DL280-135 30% 2 DL280-70 28% 3 DL280-67 13% 3 DL280-271 4% 1 DL280-207 4% 2 DL280-65 4% 3 DL280-252 3% 2 DL280-238 2% 1 DL280-232 2% 2 DL280-221 1% 2 DL280-254 1% 2 DL280-109 1% 1 DL280-114 1% 1 DL280-121 1% 1 DL280-132 1% 1 DL280-165 1% 1 DL280-205 1% 1 DL280-257 1% 1

DL280-261 1% 1 DL280-28 1% 1 DL280-53 1% 1 DL280-79 1% 1 DL280-80 1% 1 DL280-9 1% 1

[0145] O uso de segmento DL280 foi analisado para os hits de anticorpo a partir de bibliotecas DPL5 e SEL021 (Figura 2A).

[0146] 19 das VLs superiores (conforme mostrado na Tabela 7) foram construídas como bibliotecas VL únicas (DPL16~34) emparelhando-se as VLs com uma biblioteca VH que abriga mais 1010 sequências VH, e estes anticorpos foram triados novamente analisando-se a ligação a TAGT-3, TAGT-2 e TAGT-1. Após confirmar os hits de todas as três bibliotecas (DPL5, SEL021 e DPL16~34), o uso de segmento DL280 (Figura 2B) foi triado novamente (Tabela 8). Sem desejar se ater à teoria, imagina-se que um alto número de antígenos ligados por um anticorpo que compreende uma região hipervariável pode ser indicativo de um alto grau de flexibilidade daquela região hipervariável particular, enquanto um uso de segmento alto de uma determinada região hipervariável pode ser indicativo de enovelamento robusto da região hipervariável (e sequência de polipeptídeos circundante).

TABELA 8: USO DE SEGMENTO DL280 EM HITS CONFIRMADOS A PARTIR DE DPL5, SEL021 E DPL16~34 Frequência em Frequência em Uso de hits que se hits que se SEQ ID NO segmento ligam a >1 alvo ligam a >0 alvo 1 47% 3 6 HVR-L1 2 33% 1 7

Frequência em Frequência em Uso de hits que se hits que se SEQ ID NO segmento ligam a >1 alvo ligam a >0 alvo 3 5% 1 3 4 15% 4 8 5 3% 1 4 6 5% 1 4 HVR-L2 7 4% 1 2 8 4% 1 6 9 84% 5 8 11 2% 1 2 14 5% 0 2 15 1% 0 1 17 2% 1 1 HVR-L3 18 36% 2 7 19 1% 0 1 20 19% 3 6 23 35% 2 4

[0147] A distribuição de combinação de segmentos também foi calculada para todas as combinações de HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 (Tabelas 9 e 10).

TABELA 9: USO DE COMBINAÇÃO DE 2 SEGMENTOS HVR-L1, HVR-L2 E HVR-L3

Porcenta SEQ ID NO.

SEQ ID NO. gem

1 5 0,61%

1 6 0,61%

1 8 0,61%

1 9 44,85%

1 18 4,24%

1 20 13,33%

1 23 29,09%

2 5 1,21%

2 7 0,61%

2 8 1,21%

2 9 30,30%

2 11 0,61%

2 15 0,61%

2 18 30,91%

2 19 0,61%

2 20 0,61%

3 6 0,61%

3 9 4,24%

3 18 0,61%

3 20 4,24%

4 5 1,21%

4 6 4,24%

4 7 3,03%

Porcenta SEQ ID NO.

SEQ ID NO. gem

4 8 2,42%

4 9 4,24%

4 11 1,21%

4 14 4,85%

4 17 1,82%

4 18 0,61%

4 20 1,21%

4 23 5,45%

5 18 1,21%

5 19 0,61%

5 20 1,21%

6 17 1,82%

6 20 0,61%

6 23 3,03%

7 20 0,61%

7 23 3,03%

8 11 1,82%

8 14 0,61%

8 18 1,21%

8 20 0,61%

9 14 4,24%

9 15 0,61%

9 18 33,94%

9 20 16,36%

Porcenta SEQ ID NO.

SEQ ID NO. gem

9 23 28,48%

TABELA 10: USO DE COMBINAÇÃO DE 3 SEGMENTOS HVR-L1, HVR-L2 E HVR-L3

SEQ ID NO. SEQ ID NO. SEQ ID NO.

Porcentagem

1 5 18 0,61%

1 6 23 0,61%

1 8 20 0,61%

1 9 18 3,64%

1 9 20 12,73%

1 9 23 28,48%

2 5 18 0,61%

2 5 19 0,61%

2 7 20 0,61%

2 8 11 0,61%

2 8 18 0,61%

2 9 15 0,61%

2 9 18 29,70%

3 6 20 0,61%

3 9 18 0,61%

3 9 20 3,64%

4 5 20 1,21%

4 6 17 1,82%

4 6 23 2,42%

4 7 23 3,03%

4 8 11 1,21%

SEQ ID NO. SEQ ID NO. SEQ ID NO. Porcentagem 4 8 14 0,61% 4 8 18 0,61% 4 9 14 4,24%

[0148] A metodologia inovadora empregada para identificar o motivo dinâmico das regiões hipervariáveis redefinidas de anticorpos com base na variabilidade estrutural e de sequência levou ao projeto de um número limitado de componentes VL que podem se ligar ao mesmo ou a múltiplos alvos diferentes dependendo do segmento VH com o qual o componente VL está emparelhado Os dados e anticorpos descritos no presente documento revelam que a biblioteca de cadeia leve DL280, usada como um conjunto inteiro ou um subconjunto, é robusta o suficiente para servir como o componente VL para a descoberta de anticorpos.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. CADEIA LEVE DE ANTICORPO, caracterizada por compreender uma região variável de cadeia leve que compreende uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3, e em que pelo menos duas das HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de uma sequência HVR-L1 selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 1 a 4, uma sequência HVR-L2 selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 5 a 9, e uma sequência HVR-L3 selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 10 a 23.

2. CADEIA LEVE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por: a. uma região variável de cadeia leve compreender uma HVR- L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 5 a 9 e uma HVR-L3 do anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 10 a 23.

b. a região variável de cadeia leve compreender uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 1 a 4 e uma HVR-L2 do anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 5 a 9.

c. a região variável de cadeia leve compreender uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 1 a 4 e uma HVR-L3 do anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 10 a 23.

d. a região variável de cadeia leve compreender uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 1 a 4, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 5 a 9 e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 10 a 23.

e. a região variável de cadeia leve compreender três dentre uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3 selecionadas a partir do grupo que consiste em: (1) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9, e uma HVR-L3 selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 10 a 23; (2) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 10 a 23; (3) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 10 a 23; (4) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 5 a 9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18; (5) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 5 a 9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23; (6) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, uma sequência HVR-L2 selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 5 a 9, e uma HVR- L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20; (7) uma

HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 1 a 4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18; (8) uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas

SEQ ID NOS: 1 a 4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23; (9) uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 1 a 4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20;

(10) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:

3, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:

9, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 10 a 23; (11) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 10 a 23; (11b) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas

SEQ ID NOS: 10 a 23; (12) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 5 a 9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID

NO: 23; (13) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ

ID NO: 4, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 5 a 9, e uma HVR- L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14; (14) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 5 a 9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18; (15) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 5 a 9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20; (16) uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 1 a 4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14; (17) uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 1 a 4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23; e (18) uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 1 a 4, uma HVR- L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7, e uma HVR- L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23.

f. a região variável de cadeia leve compreender três dentre uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3 selecionadas a partir do grupo que consiste em: (1) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18; (2) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23; (3) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20; (4) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14; (5) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20; (6) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18; (7) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23; (8) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23; (9) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17; (10) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20; e (11) uma HVR-

L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, uma HVR-

L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, e uma HVR-

L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11.

3. CADEIA LEVE, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada por: a. a região variável de cadeia leve compreender um FW-L1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24, um FW-L2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25, um FW-L3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26, e um FW-L4 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27; b. a região variável de cadeia leve compreender uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 28 a 50; e/ou c. pelo menos uma dentre a HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 da região variável de cadeia leve adotar múltiplas conformações, conforme analisadas por determinação estrutural e/ou modelagem computacional.

4. BIBLIOTECA, caracterizada por compreender polinucleotídeos, em que um dos polinucleotídeos codifica uma região variável de cadeia leve de anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

5. BIBLIOTECA, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por: a. pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou pelo menos dez dos polinucleotídeos codificarem uma região variável de cadeia leve que compreende uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR- L3, e em que pelo menos duas das HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 da região variável de cadeia leve de anticorpo compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de uma sequência HVR-L1 selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 1 a 4, uma sequência HVR-L2 selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 5 a 9, e uma sequência HVR-L3 selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 10 a 23; ou b. cada um dos polinucleotídeos codificar uma cadeia leve que compreende uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3, e em que pelo menos duas das HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 da região variável de cadeia leve de anticorpo compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de uma sequência HVR-L1 selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 1 a 4, uma sequência HVR-L2 selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 5 a 9, e uma sequência HVR-L3 selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 10 a 23.

6. BIBLIOTECA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 5, caracterizada por: a. os polinucleotídeos conterem menos cerca de 1000 combinações exclusivas de sequências HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3; e/ou b. os polinucleotídeos conterem cerca de 280 ou menos combinações exclusivas de sequências HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3.

7. BIBLIOTECA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizada pelos polinucleotídeos codificarem cadeias leves de anticorpos de comprimento total.

8. BIBLIOTECA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, caracterizada por compreender adicionalmente polinucleotídeos que codificam regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo, opcionalmente em que os polinucleotídeos que codificam as regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo incluem pelo menos uma sequência exclusiva, pelo menos 100 sequências exclusivas, pelo menos 1000 sequências exclusivas, ou pelo menos cerca de 109 sequências exclusivas.

9. BIBLIOTECA, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelos polinucleotídeos codificarem uma pluralidade de anticorpos exclusivos, em que a região variável de cadeia leve de cada anticorpo da pluralidade compreende uma sequencia idêntica, opcionalmente em que as regiões variáveis de cadeia pesada dos anticorpos na biblioteca possui pelo menos uma sequência exclusiva, pelo menos 100 sequências exclusivas, pelo menos 1000 sequências exclusivas, ou pelo menos cerca de 109 sequências exclusivas.

10. BIBLIOTECA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 9, caracterizada por: a. os polinucleotídeos da biblioteca serem polinucleotídeos sintéticos; b. pelo menos uma dentre a HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 da região variável de cadeia leve de anticorpo adotar múltiplas conformações, conforme analisadas por determinação estrutural e/ou modelagem computacional; c. pelo menos um dos polinucleotídeos que codificam a região variável de cadeia leve de anticorpo se situar em um vetor, opcionalmente em que o vetor é um vetor de expressão ou um vetor de exibição; e/ou d. pelo menos um dos polinucleotídeos que codificam a região variável de cadeia leve de anticorpo se situar em uma célula, opcionalmente em que a célula é uma célula bacteriana, de levedura ou de mamífero.

11. FAGO, caracterizado por compreender a biblioteca, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 10.

12. ANTICORPO, caracterizado por compreender uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia leve é a cadeia leve de anticorpo, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3; opcionalmente em que o anticorpo se liga a pelo menos 1 alvo com uma constante de dissociação de equilíbrio (Kd) entre cerca de 10-7 e cerca de 10-11 M.

13. BIBLIOTECA, caracterizada por compreender domínios de ligação ao antígeno, em que um dos domínios de ligação ao antígeno compreende a região variável de cadeia leve de anticorpo, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3; opcionalmente em que: a. o domínio de ligação ao antígeno compreende adicionalmente uma região variável de cadeia pesada de anticorpo, e/ou b. a biblioteca compreende fagos, e em que o domínio de ligação ao antígeno é exibido na superfície de pelo menos um fago da biblioteca.

14. MÉTODO PARA PREPARAR UMA BIBLIOTECA, caracterizado por compreender fornecer e montar as sequências de polinucleotídeos da biblioteca, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 10.

15. MÉTODO PARA PRODUZIR UMA BIBLIOTECA DE ANTICORPOS, caracterizado por compreender as etapas de: a. selecionar uma, duas ou três HVRs de cadeia leve que compreendem uma sequência que tem que múltiplas conformações; e b. montar sequências de polinucleotídeos para produzir uma biblioteca de polinucleotídeos que codificam uma pluralidade de sequências de regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo; em que cada um dos polinucleotídeos codifica a região variável de cadeia leve de anticorpo, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3; opcionalmente em que as sequências da região variável de cadeia leve de anticorpo são sequências do anticorpo humano.

16. MÉTODO PARA GERAR UM ANTICORPO BIESPECÍFICO, caracterizado por compreender duas regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo e duas regiões variáveis de cadeia leve idênticas que compreende: a. realizar a triagem de um primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno, em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno compreende uma primeira região variável de cadeia pesada de anticorpo e uma primeira região variável de cadeia leve de anticorpo, em que a primeira região variável de cadeia leve de anticorpo é a região variável de cadeia leve de anticorpo, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3; b. realizar a triagem de um segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga a um segundo antígeno, em que o segundo domínio de ligação ao antígeno compreende uma segunda região variável de cadeia pesada de anticorpo e uma segunda região variável de cadeia leve de anticorpo, em que a segunda região variável de cadeia leve de anticorpo tem a mesma sequência que a primeira região variável de cadeia leve de anticorpo; e c. produzir um anticorpo biespecífico que compreende o primeiro domínio de ligação ao antígeno e o segundo domínio de ligação ao antígeno.

17. ANTICORPO biespecífico, caracterizado por compreender: a. um primeiro domínio de ligação que compreende uma primeira região variável de cadeia pesada e uma primeira região variável de cadeia leve, em que o primeiro domínio de ligação se liga a um primeiro alvo; b. um segundo domínio de ligação que compreende uma segunda região variável de cadeia pesada e uma segunda região variável de cadeia leve, em que o segundo domínio de ligação se liga a um segundo alvo, em que a segunda região variável de cadeia leve tem uma sequência idêntica à primeira sequência da região variável de cadeia leve; em que cada uma das primeira e segunda regiões variáveis de cadeia leve são as regiões variáveis de cadeia leve, conforme definida em qualquer uma das regiões 1 a 3;.

opcionalmente em que a primeira região variável de cadeia pesada é ligada a uma primeira região constante de cadeia pesada, em que a segunda região variável de cadeia pesada é ligada a uma segunda região constante de cadeia pesada, em que a primeira região variável de cadeia leve de anticorpo é ligada a uma primeira região constante de cadeia leve, em que a segunda região variável de cadeia leve de anticorpo é ligada a uma segunda região constante de cadeia leve, e em que a primeira e a segunda cadeias leves de anticorpo têm sequências idênticas.

18. KIT, caracterizado por compreender a biblioteca, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 10.

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