BR112020001719A2 - reagentes para expansão de células que expressam receptores recombinantes - Google Patents

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Abstract

A presente invenção refere-se a composições e métodos para estimular, enriquecer, expandir e/ou ativar células manipuladas genticamente que expressam um receptor recombinante, por exemplo, um receptor de antígeno quimérico. Em algumas modalidades, os métodos fornecidos incluem estimulação ex vivo ou in vitro, enriquecimento, expansão e/ou ativação de células por incubação com uma partícula, por exemplo, uma partícula de esfera, ligada a uma molécula de ligação, como um antígeno de polipeptídeo ou anti anticorpo-idiotipo, que reconhece ou se liga ao receptor recombinante. Também são fornecidos neste documento métodos para transfectar ou transduzir células que não foram previamente incubadas com um agente ativador ou estimulador, como as que não foram incubadas com um anticorpos ti-CD3/anti-CD28 e/ou uma ou mais citocinas recombinantes, através da transdução ou transfecção das células na presença de partículas com moléculas de ligação unidas. Em algumas modalidades, as composições fornecidas podem ser usadas em métodos para preparar células, por exemplo, células T manipuladas geneticamente, para imunoterapia adotiva.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "REAGENTES PARA EXPANSÃO DE CÉLULAS QUE EXPRESSAM RECEPTORES RECOMBINANTES". Referência Cruzada a Pedidos Relacionados
[001] O pedido reivindica o benefício de prioridade ao pedido provisório de Patente U.S. 62/538.671, intitulado "REAGENTS FOR EXPANDING CELLS EXPRESSING RECOMBINANT RECEPTORS" depositado em 29 de julho de 2017; pedido provisório de Patente U.S. 62/596,742, intitulado "REAGENTS FOR EXPANDING CELLS EXPRESSING RECOMBINANT RECEPTORS" depositado em 8 de dezembro de 2017; pedido provisório de Patente U.S. 62/628,889, intitulado "REAGENTS FOR EXPANDING CELLS EXPRESSING RECOMBINANT RECEPTORS" depositado em 9 de fevereiro de 2018; e pedido provisório de Patente U.S. 62/665,468, intitulado "REAGENTS
FOR EXPANDING CELLS EXPRESSING RECOMBINANT RECEPTORS" depositado em 1 de maio de 2018; cujo conteúdo é incorporado por referência na íntegra para todos os fins. Incorporação por referência de listagem de Sequências
[002] O presente pedido está sendo depositado juntamente com uma Listagem de Sequências em formato eletrônico. A Listagem de sequência é fornecida como um arquivo intitulado 735042007340SeqList.TXT, criado em 27 de julho de 2018, com
123.336 bytes de tamanho. As informações no formato eletrônico da Listagem de sequências são incorporadas por referência em sua totalidade. Campo
[003] A presente divulgação fornece composições e métodos para estimular, enriquecer, expandir e/ou ativar células manipuladas geneticamente que expressam um receptor recombinante, por exemplo, um receptor de antígeno quimérico. Em algumas modalidades, os métodos fornecidos incluem a estimulação ex vivo ou in vitro, enriquecimento, expansão e/ou ativação de células por incubação com uma partícula, por exemplo, uma partícula de esfera, com uma molécula de ligação unida que reconhece ou se liga ao receptor recombinante. Em algumas modalidades, a molécula de ligação unida é um polipeptídeo, por exemplo, um antígeno de polipeptídeo ou um anticorpo anti-idiotipo que se liga ao receptor recombinante. Em algumas modalidades, as composições fornecidas podem ser usadas em métodos para preparar células, por exemplo, células T geneticamente manipuladas, para imunoterapia adotiva. Antecedentes
[004] Várias estratégias estão disponíveis para estimular ou expandir populações de células in vitro ou ex vivo, incluindo a expansão de células T específicas de antígeno in vitro para uso em imunoterapia celular adotiva ou terapia de câncer. Estratégias aprimoradas são necessárias para estimular ou expandir as populações celulares, inclusive para fins de pesquisa, diagnóstico e terapêutico. São fornecidos reagentes, métodos e artigos de fabricação e kits que atendem a essas necessidades. Sumário
[005] É aqui fornecido um método de expansão de células, incluindo a incubação de uma composição de entrada contendo células que expressam um receptor de antígeno recombinante contendo um domínio de ligação de antígeno extracelular que liga ou reconhece especificamente um antígeno com uma pluralidade de partículas, cada uma da pluralidade de partículas contendo uma molécula de ligação que se liga especificamente ao domínio de ligação de antígeno, em que a união da molécula de ligação ao domínio de ligação de antígeno induz a expansão das células contendo o receptor de antígeno recombinante, produzindo assim uma composição de saída contendo células expandidas. Em algumas modalidades, o receptor de antígeno recombinante é um receptor de antígeno quimérico (CAR). Em algumas modalidades, o domínio de ligação de antígeno contém um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo. Em alguns casos, o fragmento de ligação de antígeno é ou contém um fragmento de anticorpo de cadeia única. Em algumas modalidades, o fragmento de ligação de antígeno do mesmo contém regiões variáveis do anticorpo unidas por um ligante flexível. Em algumas tais modalidades, o fragmento de ligação de antígeno do mesmo é ou contém um scFv.
[006] Em algumas tais modalidades, o antígeno é selecionado a partir da integrina αvβ6 (integrina avb6), antígeno de maturação de células B (BCMA), B7-H3, B7-H6, anidrase carbônica 9 (CA9, também conhecida como CAIX ou G250), um antígeno para testagem de câncer, antígeno de câncer / teste 1B (CTAG, também conhecido como NY- ESO-1 e LAGE-2), antígeno carcinoembrionário (CEA), uma ciclina, ciclina A2, ligante 1 de Quimiocina de Motivo CC (CCL-1)), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD138, CD171, proteoglicano 4 de condroitina sulfato (CSPG4), proteína do fator de crescimento epidérmico (EGFR), mutação do receptor do fator de crescimento epidérmico do tipo III (EGFR vIII), glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), efrinaB2, receptor de efrina A2 (EPHa2), receptor de estrogênio, receptor Fc tipo 5 (FCRL5; também conhecido como homólogo 5 de receptor Fc ou FCRH5), receptor de acetilcolina fetal (AchR fetal), uma proteína de ligação de folato (FBP), receptor alfa de folato, gangliosídeo GD2, GD2 acetilado-O (OGD2), gangliosídeo GD3, glicoproteína 100 (gp100), Receptor 5D acoplado à proteína G (GPRC5D), Her2/neu (receptor de tirosina-quinase erb-B2), Her3 (erb- B3), Her4 (erb-B4), dímeros de erbB, antígeno associado a melanoma de alto peso molecular humano (HMW-MAA), antígeno de superfície da hepatite B, antígeno leucocitário humano A1 (HLA-A1), antígeno leucocitário humano A2 (HLA-A2), receptor alfa de IL-22 (IL-22Ra), Receptor alfa 2 IL-13 (IL-13Ra2), receptor de domínio de inserção de quinase (kdr), cadeia leve kappa, molécula de adesão de células L1 (L1- CAM), epítopo CE7 de L1-CAM, repetição rica em leucina que contém membro A da família 8 (LRRC8A), Lewis Y, antígeno associado ao melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, mesotelina, c-Met, citomegalovírus de murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, ligantes de membro D de grupo 2 de assassinas naturais (NKG2D), melan A (MART-1), molécula de adesão celular neural (NCAM), antígeno oncofetal, antígeno de melanoma preferivelmente expresso (PRAME), receptor de progesterona, antígeno prostático específico, antígeno prostático de células-tronco (PSCA), antígeno prostático específico de membrana (PSMA), receptor 1 de tirosina quinase tipo órfão (ROR1), survivina, glicoproteína trofoblástica (TPBG também conhecida como 5T4), glicoproteína 72 associada ao tumor (TAG72), receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), receptor 2 do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR2), Tumor 1 de Wilms (WT-1), um antígeno de patógeno específico ou expresso em patógeno ou um antígeno associado a um marcador universal e/ou moléculas biotiniladas e/ou moléculas expressas por HIV, HCV, HBV ou outros patógenos.
[007] Em algumas tais modalidades, o antígeno é selecionado a partir de ROR1, antígeno de maturação de células B (BCMA), anidrase carbônica 9 (CAIX), Her2/neu (receptor de tirosina quinase erbB2), Ll- CAM, CD19, CD20, CD22, mesotelina, CEA, e antígeno de superfície da hepatite B, receptor antifolato, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), EPHa2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, dímeros de erbB, EGFR vIII, proteína de ligação ao folato (FBP), FCRL5, FCRH5, receptor fetal de acetilcolina, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-alfa, IL-13R-alfa2, receptor de domínio de inserção de quinase (kdr), cadeia leve kappa, Lewis Y, molécula de adesão de células L1, (L1-CAM), antígeno associado ao melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, antígeno preferivelmente expresso do melanoma (PRAME), survivina, TAG72, B7-H6, receptor alfa 2 de IL-13 (IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY-ESO-1, PSCA, receptor-a de folato, CD44v6, CD44v7/8, avb6 integrina, 8H9, NCAM, receptores de VEGF, 5T4, AchR fetal, ligantes NKG2D, CD44v6, antígeno duplo, um antígeno de testículos de câncer, mesotelina, CMV de murino, mucina 1 (MUC1), MUC16, PSCA, NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, antígeno oncofetal, ROR1, TAG72, VEGF-R2, antígeno carcinoembrionário (CEA), antígeno prostático específico, PSMA, Her2/neu, receptor de estrogênio, receptor de progesterona, efrinaB2, CD123, c-Met, GD-2, GD2 O-acetilado (OGD2), CE7, tumor de Wilms 1 (WT-1), uma ciclina, ciclina A2, CCL-1, CD138, um antígeno de patógeno específico e um antígeno associado a um marcador universal.
[008] Em algumas tais modalidades, a molécula de ligação não liga ou reconhece um ligante ou região de ligação espaçadora do receptor de antígeno recombinante, o referido ligante ou região espaçadora que conecta o domínio de ligação de antígeno ao domínio transmembranar do receptor de antígeno. Em algumas tais modalidades, a molécula de ligação é um anticorpo anti-idiotípico ou um fragmento de ligação de antígeno que se liga especificamente ao domínio de ligação de antígeno.
[009] É aqui fornecido um método de expansão de células, incluindo a incubação de uma composição de entrada que contém células que expressam um receptor de antígeno quimérico (CAR) contendo um domínio de ligação de antígeno que se liga a ou reconhece especificamente um antígeno com uma pluralidade de partículas, cada uma da pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, contendo uma molécula de ligação que é um anticorpo anti-idiotípico ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que se liga especificamente ao domínio de ligação de antígeno, em que ligar o anticorpo anti-idiotípico ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo ao domínio de ligação de antígeno induz a expansão das células contendo o receptor de antígeno quimérico, produzindo assim uma composição de saída contendo células expandidas. Em algumas tais modalidades, a molécula de ligação contém um antígeno recombinante ou uma porção do mesmo reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno.
[010] É aqui fornecido um método de expansão de células, incluindo a incubação de uma composição de entrada contendo células que expressam um receptor de antígeno quimérico (CAR) contendo um domínio de ligação de antígeno que se liga a ou reconhece especificamente um antígeno com uma pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, cada uma da pluralidade de partículas contendo uma molécula de ligação contendo um antígeno recombinante ou uma porção do mesmo reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno, em que a ligação do antígeno recombinante ou uma porção do mesmo ao domínio de ligação de antígeno induz a expansão das células que contêm o receptor de antígeno quimérico, produzindo assim uma composição de saída contendo células expandidas.
[011] Em algumas tais modalidades, o antígeno é selecionado a partir da αvβ6 integrina (avb6 integrina), antígeno de maturação de células B (BCMA), B7-H3, B7-H6, anidrase carbônica 9 (CA9, também conhecida como CAIX ou G250), um antígeno para testagem de câncer, antígeno de câncer / teste 1B (CTAG, também conhecido como NY- ESO-1 e LAGE-2), antígeno carcinoembrionário (CEA), uma ciclina, ciclina A2, ligante 1 de quimiocina de motivo CC (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6,
CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, proteoglicano 4 de sulfato de condroitina (CSPG4), proteína do fator de crescimento epidérmico (EGFR), mutação do receptor do fator de crescimento epidérmico do tipo III (EGFR vIII), glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), efrina B2, receptor de efrina A2 (EPHa2), receptor de estrogênio, receptor Fc tipo 5 (FCRL5; também conhecido como homólogo 5 do receptor Fc ou FCRH5), receptor de acetilcolina fetal (AchR fetal), uma proteína de ligação ao folato (FBP), receptor alfa de folato, gangliosídeo GD2, GD2 O-acetilado (OGD2), gangliosídeo GD3, glicoproteína 100 (gp100), glipican-3 (GPC3), Receptor 5D Acoplado à Proteína G (GPRC5D), Her2/neu (receptor de tirosina quinase erb-B2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), dímeros de erbB, antígeno associado ao melanoma de alto peso molecular humano (HMW-MAA), antígeno de superfície da hepatite B, antígeno leucocitário humano A1 (HLA-A1), antígeno leucocitário humano A2 (HLA-A2), receptor alfa de IL-22 (IL- 22Rα), receptor alfa de IL-13 (IL-13Rα2), receptor de domínio de inserção de quinase (kdr), cadeia leve kappa, molécula de adesão celular L1 (L1-CAM), epítopo CE7 de L1-CAM, repetição rica em leucina contendo membro A da família 8 (LRRC8A), Lewis Y, antígeno associado ao melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE- A10, mesotelina (MSLN), c-Met, citomegalovírus de murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, ligantes de membro D de grupo 2 de assassinas naturais (NKG2D), melan A (MART-1), molécula de adesão a células neurais (NCAM), antígeno oncofetal, antígeno preferivelmente expresso de melanoma (PRAME), receptor de progesterona, antígeno prostático específico, antígeno prostático de células-tronco (PSCA), antígeno prostático específico de membrana (PSMA), receptor de tirosina quinase tipo receptor órfão 1 (ROR1), survivina, glicoproteína trofoblástica (TPBG também conhecida como 5T4), glicoproteína 72 associada ao tumor (TAG72), proteína 1 relacionada à tirosinase (TRP1,
também conhecida como TYRP1 ou gp75), proteína 2 relacionada à tirosinase (TRP2, também conhecida como dopacroma tautomerase, dopacroma delta-isomerase ou DCT), receptor de fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), receptor de fator de crescimento endotelial vascular 2 (VEGFR2), tumor 1 de Wilms (WT-1), antígeno de patógeno específico ou expresso em patógeno ou um antígeno associado a um marcador universal e/ou moléculas biotiniladas e/ou moléculas expressas por HIV, HCV, HBV ou outros patógenos.
[012] Em algumas modalidades, o antígeno recombinante é selecionado a partir de ROR1, antígeno de maturação de células B (BCMA), anidrase carbônica 9 (CAIX), Her2/neu (receptor de tirosina quinase erbB2), Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, mesotelina, CEA e antígeno de superfície da hepatite B, receptor antifolato, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), EPHa2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, dímeros de erbB, EGFR vIII, proteína de ligação ao folato (FBP), FCRL5, FCRH5, receptor de acetilcolina fetal, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-alfa, IL-13R-alfa2, receptor de domínio de inserção de quinase (kdr), cadeia leve kappa, Lewis Y, molécula de adesão de células L1, (L1-CAM), antígeno associado ao melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, antígeno preferivelmente expresso do melanoma (PRAME), survivina, TAG72, B7-H6, receptor alfa 2 de IL-13 (IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY- ESO-1, PSCA, receptor-a de folato, CD44v6, CD44v7/8, integrina avb6, 8H9, NCAM, receptores de VEGF, 5T4, AchR fetal, ligantes NKG2D, CD44v6, antígeno duplo, um antígeno de testículos de câncer, mesotelina, CMV de murino, mucina 1 (MUC1), MUC16, PSCA, NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, antígeno oncofetal, ROR1, TAG72, VEGF- R2, antígeno carcinoembrionário (CEA), antígeno prostático específico, PSMA, Her2/neu, receptor de estrogênio, receptor de progesterona,
efrinaB2, CD123, c-Met, GD-2, GD2 O-acetilado (OGD2), CE7, Tumor de Wilms 1 (WT-1), uma ciclina, ciclina A2, CCL-1, CD138 e um antígeno de patógeno específico ou uma porção de qualquer um dos anteriores descrita pelo domínio de ligação de antígeno. Em alguns casos, o antígeno recombinante é BCMA, CD22 ou ROR1, ou é uma porção do mesmo reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno.
[013] Em algumas tais modalidades, a porção do antígeno recombinante reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno contém o domínio extracelular ou uma porção do domínio extracelular do antígeno. Em algumas tais modalidades, a porção do antígeno recombinante reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno contém essencialmente o domínio extracelular ou uma porção do domínio extracelular do antígeno.
[014] Em algumas modalidades, é aqui fornecido um método de expandir células, compreendendo incubar uma composição de entrada, a referida composição de entrada compreendendo células que expressam um receptor de antígeno quimérico compreendendo um domínio de ligação de antígeno extracelular que se liga a ou reconhece especificamente um antígeno, com uma pluralidade de partículas que são ou compreendem esferas tendo se unido a uma molécula de ligação que se liga especificamente a ou reconhece o domínio de ligação de antígeno, em que (i) a pluralidade de partículas é a partir de composição tendo uma concentração da molécula de ligação entre 0,5 µg/mL e 500 µg/mL, inclusive, e, durante a incubação, a razão de células totais presentes na composição de entrada para a pluralidade de partículas é de ou de cerca de 5:1 a 1:5, inclusive; e (ii) a união da molécula de ligação ao domínio de ligação de antígeno induz a expansão das células compreendendo o receptor de antígeno quimérico, produzindo assim uma composição de saída compreendendo células expandidas.
[015] Também é aqui fornecido um método de expansão de células, incluindo a incubação de uma composição de entrada contendo células que expressam um receptor de antígeno quimérico (CAR) contendo um domínio de ligação de antígeno que se liga a ou reconhece especificamente o antígeno de maturação de células B (BCMA) com uma pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, cada uma da pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, contendo uma molécula de ligação contendo o domínio extracelular de BCMA ou uma porção do domínio extracelular reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno, em que a ligação do domínio extracelular de BCMA ou porção do mesmo ao domínio de ligação de antígeno induz a expansão das células contendo o receptor de antígeno quimérico, produzindo assim uma composição de saída contendo células expandidas. Em alguns exemplos, a porção de BCMA consiste essencialmente no domínio extracelular ou em uma porção do domínio extracelular.
[016] Em algumas tais modalidades, a molécula de ligação é um polipeptídeo de fusão que contém o antígeno recombinante ou a porção do mesmo ligada a uma porção, opcionalmente em que a porção facilita a ligação à partícula. Em alguns casos, a porção está ligada ao C- terminal do antígeno recombinante. Em alguns casos, a porção é hidrofóbica ou é enriquecida em aminoácidos hidrofóbicos. Em algumas modalidades, a porção é ou contém um domínio Fc. Em alguns exemplos, a região Fc é derivada de IgG humana. Em algumas tais modalidades, o antígeno é CD19.
[017] Também é aqui fornecido um método de expansão de células, incluindo a incubação de uma composição de entrada contendo células que expressam um receptor de antígeno quimérico (CAR) contendo um domínio de ligação de antígeno que se liga a ou reconhece especificamente CD19 com uma pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, cada uma da pluralidade de partículas contendo uma molécula de ligação que é um anticorpo anti-idiotípico ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que se liga especificamente ao domínio de ligação de antígeno, em que a ligação do anticorpo anti-idiotípico ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo ao domínio de ligação de antígeno induz a expansão das células contendo o receptor de antígeno quimérico, produzindo assim uma composição de saída contendo células expandidas. Em algumas tais modalidades, o domínio de ligação de antígeno do receptor de antígeno é ou contém o anticorpo SJ25C1 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo. Em algumas tais modalidades, o domínio de ligação de antígeno do receptor de antígeno é ou contém o anticorpo FMC63 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo.
[018] Em algumas tais modalidades, o fragmento de ligação de antígeno é ou contém um scFv. Em algumas tais modalidades, o antígeno ou antígeno recombinante é humano. Em algumas tais modalidades, o anticorpo anti-idiotípico ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo contém pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina. Em alguns exemplos, pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina contém uma região Fc ou uma porção de Fc contendo os domínios CH2 e CH3. Em algumas modalidades, a região constante ou região Fc é derivada de IgG humana.
[019] Em algumas tais modalidades, o anticorpo anti-idiotípico ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo é um anticorpo intacto ou anticorpo de comprimento completo. Em algumas tais modalidades, a molécula de ligação é covalente ou não covalentemente ligada às partículas, por exemplo, esferas. Em algumas tais modalidades, a molécula de ligação é unida a cada uma da pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, no ou perto do resíduo de aminoácido C-terminal da molécula de ligação e/ou união da molécula de ligação a cada uma das uma pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, é realizada tal que a região ou epítopo da molécula de ligação reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno do receptor de antígeno seja orientada tal que ela seja capaz de ser reconhecida pelo receptor de antígeno.
[020] Em algumas tais modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, são partículas sintéticas, partículas insolúveis, partículas sólidas ou são partículas não celulares. Em algumas das modalidades aqui divulgadas, as partículas são esferas. Em algumas tais modalidades, a pluralidade de partículas contém esferas. Em algumas tais modalidades, as partículas são ou compreendem um ou mais polímeros ou oligômeros e/ou são poliméricas e/ou oligoméricas. Em algumas tais modalidades, a pluralidade de partículas contém um diâmetro médio entre ou entre cerca de 1 µm e 10 µm ou entre ou entre cerca de 2 µm e 5 µm. Em algumas de qualquer uma tal modalidade, a pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, inclui um diâmetro médio de cerca de 2,8 µm. Em algumas tais modalidades, a pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, inclui um diâmetro médio de cerca de 4,5 µm. Em algumas tais modalidades, a pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, inclui uma densidade média entre cerca de 0,5 g/cm3 e 5,0 g/cm3 ou entre ou entre cerca de 1 g/cm3 e cerca de 2 g/cm3. Em algumas tais modalidades, a pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, inclui uma densidade média de cerca de 1,3 g/cm3. Em algumas tais modalidades, a pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, inclui uma densidade média de cerca de 1,5 g/cm3.
[021] Em algumas tais modalidades, a pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, é monodispersa. Em algumas tais modalidades, a molécula de ligação é covalentemente unida às partículas. Em algumas tais modalidades, a partícula contém um grupo funcional exposto à superfície para união da molécula de ligação e/ou em que a molécula de ligação é covalentemente unida à partícula por meio de um grupo funcional exposto à superfície.
[022] Em algumas tais modalidades, o grupo funcional exposto à superfície é um grupo amino, um grupo carboxila, um grupo tiol, um grupo aldeído, um grupo clorometila, um grupo epóxi, um grupo hidroxila, um grupo tosila ou um grupo hidrazina. Em algumas modalidades, o grupo funcional exposto à superfície é um grupo tosila.
[023] Em algumas tais modalidades, a pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, é biocompatível ou não tóxica para as células. Em algumas tais modalidades, a pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, contém partículas que incluem vidro, sílica, poliésteres de ácidos hidroxicarboxílicos, polianidretos de ácidos dicarboxílicos, copolímeros de ácidos hidroxicarboxílicos, copolímeros de ácidos dicarboxílicos ou metal. Em algumas tais modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, contêm uma superfície que inclui um polímero, um polissacarídeo, uma sílica, um ácido graxo, um carbono ou uma combinação dos mesmos. Em alguns exemplos, o polímero é polietileno glicol, poli (ácido lático-co-glicólico), poliglutaraldeído, poliuretano, poliestireno e álcool polivinílico ou combinações dos mesmos. Em algumas tais modalidades, a pluralidade de partículas contém partículas incluindo uma superfície hidrofóbica. Em algumas tais modalidades, a pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, contém partículas que incluem uma superfície de poliestireno.
[024] Em algumas tais modalidades, a pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, contém partículas que são magnéticas e/ou incluem um núcleo magnético, um núcleo paramagnético ou um núcleo superparamagnético.
[025] Em algumas tais modalidades, as partículas são de uma composição tendo uma concentração da molécula de ligação entre ou entre cerca de 0,5 µg/mL e 500 µg/mL, 1 µg/mL e 200 µg/mL ou 5 µg/mL e 100 µg/mL, inclusive. Em algumas tais modalidades, as partículas são de uma composição que tem uma concentração da molécula de ligação de pelo menos ou pelo menos cerca de 1 µg/mL, 5 µg/mL, 10 µg/mL, 25 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL ou 200 µg/mL. Em algumas tais modalidades, cada uma da pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, contém pelo menos ou cerca de 10 cópias, 102 cópias, 103 cópias, 104 cópias, 105 cópias ou 106 cópias da molécula de ligação.
[026] Em algumas tais modalidades, pelo menos uma porção da incubação é realizada na presença de um agente que se liga especificamente a uma molécula adicional na célula para fornecer um sinal acessório e/ou bloquear um sinal inibitório. Em algumas tais modalidades, o agente é fornecido junto com as partículas, por exemplo, esferas, opcionalmente, o agente é contido por cada uma da pluralidade de partículas ou um subconjunto delas. Em algumas tais modalidades, o agente é fornecido separadamente da pluralidade de partículas, por exemplo, esferas.
[027] Em algumas tais modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, incluem ainda um agente que se liga especificamente a uma molécula adicional na célula para fornecer um sinal acessório e/ou bloquear um sinal inibitório. Em algumas tais modalidades, o agente é um ligante ou é um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo. Em algumas tais modalidades, a molécula é uma molécula coestimulatória ou é um correceptor de ativação. Em algumas tais modalidades, a molécula coestimulatória ou correceptora de ativação é OX-40, ICOS, DAP10, CD28 ou 4-1BB. Em algumas modalidades, a molécula é um ligante de um receptor ou correceptora de ativação, tais como OX-40L, ICOSL, B7-1, B7-2 ou 4-1BBL. Em algumas tais modalidades, a molécula é um receptor inibitório. Em alguns exemplos, o receptor inibitório é CTLA-4, PD-1, LAG-3, Tim-3, BTLA ou TIGIT. Em algumas tais modalidades, o agente é covalentemente unido às partículas, por exemplo, esferas. Em algumas modalidades, a molécula é um ligante de um receptor inibitório, como PD-L1, PD-L2, CD155,
CD112 ou LIGHT.
[028] Em algumas tais modalidades, a razão, opcionalmente razão molar ou em peso, da molécula de ligação e o agente contido pelas partículas, por exemplo, esferas, é ou é de cerca de 1:1. Em algumas de quaisquer tais modalidades, a razão do total de células presentes na composição de entrada de partículas, por exemplo, esferas, é de ou cerca de 5:1 a 1:5, de 3:1 a 1:3, ou 2:1 a 1:2. Em algumas tais modalidades, a razão de células totais presentes na composição de entrada para partículas, por exemplo, esferas, é de ou de cerca de 1:0,1 a 1:5. Em algumas de quaisquer tais modalidades, a razão do total de células presentes na composição de entrada de partículas, por exemplo, esferas, é ou é de cerca de 1:1.
[029] Em algumas de quaisquer tais modalidades, a incubação é realizada durante, pelo menos, ou mais de que ou mais do que cerca de 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 24 horas, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias ou 14 dias. Em algumas de quaisquer tais modalidades, a incubação é realizada a uma temperatura entre ou entre cerca de 30 ºC e 39 ºC, inclusive. Em algumas tais modalidades, a incubação é realizada a uma temperatura de 37 ºC ± 2,0 ºC.
[030] Em algumas de quaisquer tais modalidades, as células incluem células imunes ou células estaminais pluripotentes induzidas (IPSC). Em algumas tais modalidades, a célula imune é uma célula T ou uma célula NK. Em algumas tais modalidades, as células contêm células T CD4+ e/ou CD8+. Em algumas de quaisquer tais modalidades, a razão das células CD4+ para as células CD8+ é ou é de cerca de 1:1, 1:2, 2:1, 1:3 ou 3:1. Em algumas de quaisquer tais modalidades, as células são células primárias obtidas a partir de um indivíduo, opcionalmente, um indivíduo humano. Em algumas de quaisquer tais modalidades, as células são humanos.
[031] Em algumas de quaisquer tais modalidades, a composição de entrada é produzida por um método que inclui contatar uma composição de células com uma molécula de ácido nucleico que codifica o receptor de antígeno recombinante sob condições de introduzir a molécula de ácido nucleico para dentro de uma ou mais células da composição.
[032] É também aqui fornecido um método de engenharia genética de uma célula, incluindo contatar uma composição de células com uma molécula de ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno recombinante sob condições para introduzir a molécula de ácido nucleico para dentro de uma ou mais células da composição, produzindo assim uma composição de entrada; e incubar células da composição de entrada de acordo com os métodos aqui descritos. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção do contato e incubação é realizada simultaneamente.
[033] Em algumas de quaisquer tais modalidades, a molécula de ácido nucleico está incluída em um vetor viral, um vetor epissomal ou um transposon. Em algumas tais modalidades, o contato é realizado por transferência gênica transposon/transposase. Em algumas tais modalidades, o contato é realizado por transdução com um vetor viral. Em algumas modalidades, o vetor viral é um retrovírus, que opcionalmente é um vetor gama-retroviral ou um vetor lentiviral.
[034] Em alguns casos, o contato inclui uma etapa de espinocular o vetor viral com a composição de células. Em alguns casos, espinocular inclui girar, em uma cavidade interna de uma câmara centrífuga, as partículas de vetor viral e composição de células, em que a rotação é a uma força centrífuga relativa a uma superfície interna da parede lateral da cavidade que está entre ou entre cerca de 500 g e 2500 g, 500 g e 2000 g, 500 g e 1600 g, 500 g e 1.000 g, 600 g e 1600 g, 600 g e 1000 g, 1000 g, e 2000 g ou 1000 g e 1600 g, cada, inclusive;
ou, pelo menos ou pelo menos cerca de 600 g, 800 g, 1000 g, 1200 g, 1600 g, ou 2000 g. Em algumas modalidades, espinocular é por um tempo que é maior do que ou cerca de 5 minutos, maior do que ou cerca de 10 minutos, maior do que ou cerca de 15 minutos, maior do que ou cerca de 20 minutos, maior do que ou cerca de 30 minutos, maior do que ou cerca de 45 minutos, maior do que ou cerca de 60 minutos, ou maior do que cerca de 90 minutos ou maior do que ou cerca de 120 minutos; ou entre ou entre cerca de 5 minutos e 60 minutos, 10 minutos e 60 minutos, 15 minutos e 60 minutos, 15 minutos e 45 minutos, 30 minutos e 60 minutos ou 45 minutos e 60 minutos, cada um, inclusive.
[035] Em algumas de quaisquer tais modalidades, o contato é realizado na presença de um adjuvante de transdução. Em algumas de quaisquer tais modalidades, a composição de células contém uma pluralidade de células T e, antes do contato, o método não inclui estimular ou ativar as células T.
[036] Em algumas de quaisquer tais modalidades, a composição de células contém uma pluralidade de células T e, antes do contato, o método não inclui a incubação da composição na presença de um agente ou agentes capazes de induzir um sinal através de complexo TCR e/ou incubação na presença de um agente ou agentes capazes de induzir proliferação de células T, células T CD4+ e/ou células T CD8+; e/ou moléculas de ligação de CD3, moléculas de ligação de CD28, IL-2 recombinante, IL-15 recombinante e IL-7 recombinante ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, antes do contato, o método não inclui estimular as células T na presença de um anticorpo anticorpo anti-CD3 e/ou anti-CD28.
[037] Em algumas tais modalidades, a composição de células contém uma pluralidade de células T, tendo a referida pluralidade de células sido obtida a partir de uma amostra de um indivíduo, em que o contato é iniciado não mais de 24 horas após a obtenção da amostra do indivíduo; e/ou antes do contato, as células T não foram submetidas a uma temperatura maior ou maior que cerca de 15 ºC, cerca de 18 ºC, cerca de 22 ºC ou cerca de 25 ºC por um período superior a 1 hora 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas ou 24 horas após a obtenção da amostra do indivíduo; e/ou antes do contato, as células T não foram submetidas a uma temperatura igual ou superior a 37 ° ± 2,0 ºC por um período superior a 15 minutos, 30 minutos, 1 hora ou 2 horas após a obtenção da amostra do indivíduo. Em algumas tais modalidades, antes do referido contato, não mais de 5%, 10%, 20%, 30% ou 40% das células T são células ativadas, expressam um marcador de superfície selecionado a partir do grupo que consiste em HLA-DR, CD25, CD69, CD71, CD40L e 4-1BB; incluem expressão intracelular de uma citocina selecionada a partir do grupo que consiste em IL-2, IFN-gama, TNF-alfa, estão na fase G1 ou posterior do ciclo celular e/ou são capazes de proliferar.
[038] Em algumas tais modalidades, o método inclui ainda, antes da incubação ou do contato, obter uma amostra biológica do indivíduo que contém as células e, opcionalmente, selecionar ou enriquecer as células, opcionalmente células T, da amostra. Em algumas tais modalidades, a porcentagem de células que expressam o receptor de antígeno recombinante na composição de entrada é menor ou menor do que cerca de 75%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% ou menos. Em algumas tais modalidades, a composição de células ou a composição de entrada contém pelo menos ou pelo menos cerca de 1 x 102 células, 1 x 103 células, 1 x 104 células, 1 x 105 células, 1 x 10 6 células ou 1 x 107 células.
[039] Em algumas tais modalidades, a expressão de superfície de um marcador de ativação ou marcador de exaustão das células presentes na composição de saída é menor que a expressão de superfície do marcador em uma composição de células produzidas após uma incubação semelhante, mas na presença de molécula estimulatória policlonal capaz de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo TCR. Em alguns casos, o marcador de exaustão é um receptor inibitório. Em alguns casos, o marcador de exaustão é PD-1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, BTLA ou TIGIT. Em alguns exemplos, o marcador de ativação é HLA- DR, CD25, CD69, CD71, CD40L ou 4-1BB. Em algumas tais modalidades, a expressão da superfície é pelo menos ou pelo menos cerca de 1,2 vez, 1,5 vez, 2,0 vezes, 3,0 vezes, 4,0 vezes, 4,0 vezes, 5,0 vezes, 10,0 vezes ou mais.
[040] Em algumas tais modalidades, o número de células na composição de saída é substancialmente o mesmo ou é maior que o número de células em uma composição de células produzidas por uma incubação semelhante, mas na presença de uma molécula estimulatória policlonal capaz de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo TCR. Em algumas tais modalidades, a molécula estimulatória policlonal contém um anticorpo ou fragmento anti-CD3 e/ou um anticorpo ou fragmento anti-CD28.
[041] Em algumas tais modalidades, o número de células na composição de saída é maior que o número de células na composição de entrada em maior ou maior que cerca de 1,2 vez, 1,5 vez, 2,0 vezes, 3,0 vezes, 4,0 vezes, 5,0 vezes, 10,0 vezes, 25 vezes, 50 vezes, 100 vezes ou mais. Em algumas tais modalidades, a porcentagem de células contendo o receptor de antígeno recombinante na composição de saída é maior ou maior que cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais. Em algumas tais modalidades, o número de células na composição de saída que contém o receptor de antígeno recombinante é aumentado ou enriquecido em 1,2 vez, 2,0 vezes, 3,0 vezes, 3,0 vezes, 4,0 vezes, 5,0 vezes, 6,0 vezes, 7,0 vezes, 8,0 vezes, 9,0 vezes,
10 vezes ou mais em comparação com o número de células que contêm o receptor de antígeno na composição de entrada.
[042] Em algumas tais modalidades, pelo menos uma porção da incubação é realizada na presença de um ou mais agentes adicionais que modulam a expansão ou atividade celular. Em alguns casos, os um ou mais agentes adicionais é lenalidomida.
[043] Em algumas tais modalidades, o método é realizado in vitro ou ex vivo. Em algumas tais modalidades, o receptor de antígeno é um CAR e o CAR adicionalmente é um domínio de sinalização intracelular contendo um ITAM. Em alguns casos, o domínio de sinalização intracelular contém um domínio intracelular de uma cadeia CD3-zeta (CD3ζ). Em algumas modalidades, o CAR adicionalmente contém uma região de sinalização coestimulatória. Em alguns aspectos, a região de sinalização coestimulatória contém um domínio de sinalização de CD28 ou 4-1BB. Em alguns exemplos, o domínio coestimulatório é CD28. Em algumas tais modalidades, o método inclui ainda a remoção da pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, da composição de saída.
[044] É aqui fornecida uma composição de células produzidas por qualquer um dos métodos aqui fornecidos. Também é aqui fornecida uma partícula modificada na superfície contendo uma partícula e uma molécula de ligação ligada à superfície da partícula, em que a molécula de ligação se liga especificamente a um domínio de ligação de antígeno extracelular de um receptor de antígeno. Em algumas modalidades, o receptor de antígeno é um receptor de antígeno quimérico (CAR). Em algumas modalidades, a molécula de ligação não liga ou reconhece um ligante ou região espaçadora do receptor de antígeno recombinante, o referido ligante ou região espaçadora conectando o domínio de ligação de antígeno ao domínio transmembranar do receptor de antígeno.
[045] Em algumas tais modalidades, o antígeno recombinante é selecionado a partir da integrina αvβ6 (integrina avb6), antígeno de maturação de células B (BCMA), B7-H3, B7-H6, anidrase carbônica 9 (CA9, também conhecida como CAIX ou G250), um antígeno para testagem de câncer, antígeno de câncer / teste 1B (CTAG, também conhecido como NY-ESO-1 e LAGE-2), antígeno carcinoembrionário (CEA), uma ciclina, ciclina A2, ligante 1 de quimiocina de motivo CC (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, proteoglicano de sulfato de condroitina 4 (CSPG4), proteína do fator de crescimento epidérmico (EGFR), mutação do receptor do fator de crescimento epidérmico do tipo III (EGFR vIII), glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), efrinaB2, receptor de efrina A2 (EPHa2), receptor de estrogênio, receptor Fc tipo 5 (FCRL5; também conhecido como homólogo 5 do receptor Fc ou FCRH5), receptor de acetilcolina fetal (AchR fetal), uma proteína de ligação ao folato (FBP), receptor alfa de folato, gangliosídeo GD2, GD2 O-acetilado (OGD2), gangliosídeo GD3, glicoproteína 100 (gp100), glipican-3 (GPC3), receptor 5D acoplado à proteína G (GPRC5D), Her2/neu (receptor de tirosina quinase erb-B2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), dímeros de erbB, antígeno associado ao melanoma de alto peso molecular humano (HMW-MAA), antígeno de superfície da hepatite B, antígeno leucocitário humano A1 (HLA-A1), antígeno leucocitário humano A2 (HLA-A2), receptor alfa de IL-22 (IL-22Rα), receptor alfa 2 de IL-13 (IL-13Rα2), receptor de domínio de inserção de quinase (kdr), cadeia leve kappa, molécula de adesão de células L1 (L1-CAM), epítopo CE7 de L1-CAM, repetição rica em leucina contendo Membro A da família 8 (LRRC8A), Lewis Y, antígeno associado ao melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, mesotelina (MSLN), c-Met, citomegalovírus murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, ligantes do membro D do grupo 2 de assassinas naturais (NKG2D), melan A (MART-1), molécula de adesão de células neurais (NCAM), antígeno oncofetal, antígeno preferivelmente expresso do melanoma (PRAME), receptor de progesterona, antígeno prostático específico, antígeno de célula tronco da próstata (PSCA), antígeno prostático específico de membrana (PSMA), receptor de tirosina quinase tipo receptor 1 órfão (ROR1), survivina, Glicoproteína trofoblástica (TPBG também conhecida como 5T4), glicoproteína 72 associada ao tumor (TAG72), proteína relacionada à tirosinase 1 (TRP1, também conhecida como TYRP1 ou gp75), proteína 2 relacionada à tirosinase (TRP2, também conhecida como dopacromo tautomerase, dopacromo delta-isomerase ou DCT), receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), receptor do fator de crescimento endotelial vascular 2 (VEGFR2), Tumor 1 de Wilms (WT-1), um antígeno de patógeno específico ou expresso por patógeno, ou um antígeno associado a um marcador universal e/ou moléculas biotiniladas e/ou moléculas expressas por HIV, HCV, HBV ou outros patógenos.
[046] Em algumas tais modalidades, a molécula de ligação contém um antígeno recombinante ou uma porção do mesmo reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno. Em alguns aspectos, o antígeno recombinante é selecionado a partir de ROR1, antígeno de maturação de células B (BCMA), anidrase carbônica 9 (CAIX), Her2/neu (receptor de tirosina quinase erbB2), Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, mesotelina, CEA e antígeno de superfície da hepatite B, receptor antifolato, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, glicoproteína epitelial 2 (EPG- 2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), EPHa2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, dímeros de erbB, EGFR vIII, proteína de ligação ao folato (FBP), FCRL5, FCRH5, receptor de acetilcolina fetal, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-alfa, IL-13R-alfa2, receptor de domínio de inserção de quinase (kdr), cadeia leve kappa, Lewis Y, molécula de adesão de células L1, (L1-CAM), antígeno associado ao melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3,
MAGE-A6, antígeno preferivelmente expresso do melanoma (PRAME), survivina, TAG72, B7-H6, receptor alfa-2 de IL-13 (IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY- ESO-1, PSCA, receptor-a de folato, CD44v6, CD44v7/8, avb6 integrina, 8H9, NCAM, receptores VEGF, 5T4, AchR fetal, ligantes NKG2D, CD44v6, antígeno duplo, antígeno para câncer de testículo, mesotelina, CMV de murino, mucina 1 (MUC1), MUC16, PSCA, NKG2D, NY-ESO- 1, MART-1, gp100, antígeno oncofetal, ROR1, TAG72, VEGF-R2, antígeno carcinoembrionário (CEA), antígeno prostático específico, PSMA, Her2/neu, receptor de estrogênio, receptor de progesterona, efrinaB2, CD123, c-Met, GD-2, GD2 O-acetilado (OGD2), CE7, tumor 1 de Wilms (WT-1), ciclina, ciclina A2, CCL-1, CD138 e um antígeno de patógeno específico ou uma porção de qualquer um dos precedentes reconhecidos pelo domínio de ligação de antígeno.
[047] Em algumas modalidades, o antígeno recombinante é CD19, BCMA, CD22 ou ROR1, ou é uma porção do mesmo reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno. Em algumas tais modalidades, a porção do antígeno recombinante reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno contém o domínio extracelular ou uma porção do domínio extracelular do antígeno. Em algumas tais modalidades, a porção do antígeno recombinante reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno consiste essencialmente no domínio extracelular ou em uma porção do domínio extracelular do antígeno.
[048] É aqui fornecida uma partícula modificada de superfície, contendo uma partícula e uma molécula de ligação ligada à superfície da partícula, em que a molécula de ligação contém um domínio extracelular ou uma porção do antígeno de maturação das células B (BCMA). Em algumas tais modalidades, a molécula de ligação é um polipeptídeo de fusão contendo o antígeno recombinante ou a porção do mesmo ligada a uma porção, opcionalmente em que a porção facilita a ligação à partícula. Em alguns casos, a porção está ligada ao C- terminal do antígeno recombinante. Em algumas modalidades, a porção é hidrofóbica ou é enriquecida em aminoácidos hidrofóbicos.
[049] Em algumas tais modalidades, a porção é ou contém um domínio Fc. Em alguns casos, a região Fc é derivada de IgG humana. Em algumas tais modalidades, o antígeno recombinante é humano.
[050] Em algumas tais modalidades, a molécula de ligação contém um anticorpo anti-idiotípico ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo. Em algumas tais modalidades, o antígeno reconhecido pelo domínio de ligação de antígeno é CD19. Em algumas tais modalidades, o domínio de ligação de antígeno do receptor de antígeno é ou contém o anticorpo SJ25C1 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o domínio de ligação de antígeno do receptor de antígeno é ou contém o anticorpo FMC63 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o fragmento de ligação de antígeno é ou contém um scFv.
[051] Em algumas tais modalidades, o anticorpo anti-idiotípico ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo contém pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina. Em alguns casos, pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina contém uma região Fc ou uma porção da Fc contendo os domínios CH2 e CH3. Em algumas modalidades, a região constante ou região Fc é derivada de IgG humana. Em algumas tais modalidades, o anticorpo anti-idiotípico ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo é um anticorpo intacto ou anticorpo completo.
[052] Em algumas tais modalidades, a molécula de ligação é covalente ou não covalentemente ligada às partículas, por exemplo, esferas. Em algumas tais modalidades, a molécula de ligação é unida a cada uma da pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, no ou perto do resíduo de aminoácido C-terminal da molécula de ligação e/ou união da molécula de ligação a cada uma das uma pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, é realizada tal que a região ou epítopo da molécula de ligação reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno do receptor de antígeno seja orientada tal que ela seja capaz de ser reconhecida pelo receptor de antígeno. Em algumas tais modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, são partículas sintéticas, partículas insolúveis, partículas sólidas ou são partículas não celulares.
[053] Em algumas tais modalidades, a pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, contém esferas. Em algumas tais modalidades, a partícula tem um diâmetro entre ou entre cerca de 1 µm e 10 µm ou entre ou entre cerca de 2 µm e 5 µm, cada, inclusive. Em algumas tais modalidades, a partícula tem um diâmetro de cerca de 2,8 µm. Em algumas tais modalidades, a partícula tem um diâmetro de cerca de 4,5 µm. Em algumas tais modalidades, a molécula de ligação é covalentemente unida às partículas, por exemplo, esferas.
[054] Em algumas tais modalidades, a partícula contém um grupo funcional exposto à superfície para união da molécula de ligação e/ou em que a molécula de ligação é covalentemente unida à partícula por meio de um grupo funcional exposto à superfície. Em algumas modalidades, o grupo funcional exposto à superfície é um grupo amino, um grupo carboxila, um grupo tiol, um grupo aldeído, um grupo clorometila, um grupo epóxi, um grupo hidroxila, um grupo tosila ou um grupo hidrazina. Em alguns casos, o grupo funcional exposto à superfície é um grupo tosila.
[055] Em algumas tais modalidades, a partícula é biocompatível ou não tóxica para as células. Em algumas tais modalidades, a pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, inclui partículas, por exemplo, esferas, contendo vidro, sílica, poliésteres de ácidos hidroxicarboxílicos, polianidretos de ácidos dicarboxílicos, copolímeros de ácidos hidroxicarboxílicos, ácidos copolímeros dicarboxílicos ou metal. Em algumas tais modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, contêm uma superfície que inclui um polímero, um polissacarídeo, uma sílica, um ácido graxo, um carbono ou uma combinação dos mesmos. Em alguns casos, o polímero é polietilenoglicol, poli (ácido lático-co-glicólico), poliglutaraldeído, poliuretano, poliestireno e álcool polivinílico ou combinações dos mesmos.
[056] Em algumas tais modalidades, a partícula contém uma superfície hidrofóbica. Em algumas tais modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, incluem uma superfície de poliestireno. Em algumas tais modalidades, a partícula é magnética e/ou contém um núcleo magnético, um núcleo paramagnético ou um núcleo superparamagnético. Em algumas tais modalidades, a partícula contém pelo menos ou cerca de 10 cópias, 102 cópias, 103 cópias, 104 cópias, 105 cópias ou 106 cópias da molécula de ligação.
[057] Em algumas tais modalidades, a partícula contém ainda um agente que se liga especificamente a uma molécula adicional na célula para fornecer um sinal acessório e/ou bloquear um sinal inibitório, modulando assim a expansão das células. Em algumas tais modalidades, o agente é um ligante ou é um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, a molécula é uma molécula coestimulatória ou é um correceptor de ativação. Em alguns exemplos, a molécula coestimulatória ou correceptor de ativação é OX-40, ICOS, DAP10, CD28 ou 4-1BB. Em algumas modalidades, a molécula é um ligante de um receptor ou correceptor de ativação, como OX-40L, ICOSL, B7-1, B7-2 ou 4-1BBL. Em alguns casos, a molécula é um receptor inibitório. Em alguns exemplos, o receptor inibitório é CTLA- 4, PD-1, LAG-3, Tim-3, BTLA ou TIGIT. Em algumas modalidades, a molécula é um ligante de um receptor inibitório, como PD-L1, PD-L2,
CD155, CD112 ou LIGHT.
[058] Em algumas tais modalidades, o agente é covalentemente unido às partículas, por exemplo, esferas. Em algumas tais modalidades, a razão, opcionalmente razão molar ou em peso, da molécula de ligação e do agente contido na partícula é ou é de cerca de 1:1.
[059] É aqui fornecida uma composição que contém uma pluralidade de partículas modificadas na superfície, por exemplo, esferas, aqui descritas. Em algumas modalidades, as partículas são de uma composição que tem uma concentração da molécula de ligação entre ou entre 0,5 µg/mL e 500 µg/mL, 1 µg/mL e 200 µg/mL ou 5 µg/mL e 100 µg/mL, cada, inclusive. Em algumas modalidades, as partículas são de uma composição tendo uma concentração da molécula de ligação que é pelo menos ou pelo menos cerca de 1 µg/mL, 5 µg/mL, 10 µg/mL, 25 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL ou 200 µg/mL. Em algumas tais modalidades, a composição é monodispersa.
[060] Também é aqui fornecido um kit contendo qualquer uma das partículas, por exemplo, esferas, aqui descritas ou qualquer uma das composições aqui descritas e instruções de uso. Em alguns casos, as instruções são para selecionar ou enriquecer, a partir de uma população de células, células que expressam um receptor de antígeno contendo um domínio de ligação de antígeno especificamente reconhecido pela molécula de ligação. Em alguns casos, as instruções são para expandir, a partir de uma população de células, células que expressam um receptor de antígeno contendo um domínio de ligação de antígeno especificamente reconhecido pela molécula de ligação. Em algumas modalidades, a porcentagem de células que expressam um receptor de antígeno recombinante na população de células em menos ou menos de cerca de 75%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10 % ou menos.
[061] É fornecido aqui um método para expandir células, incluindo a incubação de uma população de células com qualquer uma das partículas, por exemplo, esferas, aqui descritas ou qualquer uma das composições aqui descritas. Também é fornecido um método de seleção ou enriquecimento de células, incluindo o contato de uma população de células com qualquer uma das partículas, por exemplo, esferas, aqui descritas ou qualquer uma das composições aqui descritas.
[062] É aqui fornecido um método de estimulação de longo prazo para avaliar uma composição celular, incluindo a incubação, por um período de tempo de pelo menos 10 dias, uma composição de entrada sob condições para estimular uma atividade dependente de CAR nas células na composição de entrada, a referida composição de entrada contendo células T que expressam um receptor de antígeno quimérico (CAR) contendo um domínio de ligação de antígeno extracelular que se liga a ou reconhece especificamente um antígeno, produzindo assim uma composição de saída; e avaliar um ou mais fenótipo ou atividade de uma ou mais células da composição de saída.
[063] Em algumas das modalidades de um método de estimulação de longo prazo, as condições para estimular uma atividade dependente de CAR incluem a presença de uma molécula de ligação que liga-se especificamente ao domínio de ligação de antígeno do CAR. Em algumas modalidades, a molécula de ligação é unida a um suporte. Em algumas modalidades, o suporte é um suporte sólido. Em algumas modalidades, o suporte sólido é a superfície de um poço de uma microplaca ou uma esfera. Em algumas modalidades, o suporte sólido é uma microplaca com a molécula de ligação unida à microplaca e a incubação é realizada na microplaca. Em algumas modalidades, o suporte sólido é uma esfera que anexou a molécula de ligação e a incubação é realizada na presença de uma pluralidade de esferas.
[064] Em algumas das modalidades de um método de estimulação de longo prazo, a molécula de ligação é ou compreende um antígeno recombinante ou uma porção do mesmo reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno. Em algumas modalidades, o antígeno recombinante ou uma porção do mesmo é BCMA, ou é uma porção do mesmo reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno. Em algumas modalidades, a molécula de ligação é ou inclui um anticorpo anti- iditóptico ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que se liga especificamente ao domínio de ligação de antígeno. Em algumas modalidades, o domínio de ligação de antígeno do receptor de antígeno é ou compreende o anticorpo SJ25C1 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o domínio de ligação de antígeno do receptor de antígeno é ou inclui o anticorpo FMC63 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo.
[065] Em algumas das modalidades de um método de estimulação de longo prazo, o método é realizado in vitro ou ex vivo.
[066] Em algumas das modalidades de um método de estimulação de longo prazo, a composição de entrada é incubada na presença de um meio que não compreende citocinas recombinantes. Em algumas modalidades, a incubação é realizada continuamente ou não é interrompida durante o período de tempo. Em algumas modalidades, durante a incubação, as células não são substituídas, o meio não é alterado e a molécula de ligação não é adicionada.
[067] Em algumas das modalidades de um método de estimulação de longo prazo, o método inclui a avaliação de um ou mais fenótipos do estado de ativação, exaustão ou diferenciação de uma ou mais células da composição de saída. Em algumas modalidades, o fenótipo é exaustão e a avaliação inclui medir a expressão, opcionalmente expressão de superfície, de um ou mais marcadores selecionados a partir de CTLA-4, FOXP3, PD-1, TIGIT, LAB-3, 2B4, BTLA, TIM3, VISTA ou CD96. Em algumas modalidades, o fenótipo é ativação e a avaliação inclui medir a expressão, opcionalmente expressão de superfície, de um ou mais marcadores selecionados a partir de CD25, CD26, CD27, CD27, CD28, CD30, CD71, CD154, CD40L, CD127, LAG3 ou Ki67. Em algumas modalidades, o fenótipo é estado de diferenciação e a avaliação inclui medir um ou mais marcadores selecionados a partir de (i) um ou mais CD25, CD45RO, CD56, KLRG1, CD95 e/ou (ii) um ou CD45RA, CD27, CD28, CD62L e CCR7, opcionalmente em que os um ou mais marcadores são marcadores associados positiva ou inversamente a células T do tipo pura.
[068] Em algumas das modalidades de um método de estimulação de longo prazo, o método inclui avaliar uma ou mais atividades das uma ou mais células da composição de saída. Em algumas modalidades, as uma ou mais atividades compreendem uma atividade dependente de CAR, opcionalmente uma atividade estimulada por antígeno. Em algumas das modalidades de um método de estimulação de longo prazo, as uma ou mais atividades compreendem atividade citolítica ou produção de citocinas.
[069] Em algumas modalidades de qualquer método de estimulação de longo prazo, o período de tempo é de pelo menos ou pelo menos cerca de 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias ou 15 dias. Em algumas modalidades, o período de tempo é ou é de cerca de 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias ou 15 dias.
[070] Em algumas das modalidades de um método de estimulação de longo prazo, a composição de entrada contém células que foram expostas ou contatadas com um agente ou composto de teste antes da incubação, opcionalmente em que a exposição ou contato é realizada durante uma ou mais etapas de um processo para produzir a composição de entrada compreendendo as células T que expressam o CAR. Em algumas modalidades, o método é realizado em uma pluralidade de composições de entrada, cada uma das referidas composições de entrada da pluralidade sendo produzida por um processo diferente.
[071] Em algumas das modalidades de um método de estimulação de longo prazo, o método inclui ainda comparar o fenótipo ou atividade da composição de saída com o fenótipo ou atividade de uma composição de controle, opcionalmente em que a composição de controle é uma composição de células T que foram incubadas por pelo menos 10 dias sob as mesmas condições para estimular a atividade dependente de CAR, a referida composição de células T não foi produzida na presença do agente ou composto de teste ou foi produzida por um processo alternativo comparado com a composição de entrada. Em algumas modalidades, o método inclui ainda identificar uma composição de saída que exibe exaustão reduzida, ativação reduzida ou diferenciação reduzida, como em comparação com a composição de controle. Em algumas modalidades, a diferenciação reduzida compreende aumento da expressão de mais um marcador de células T do tipo puro. Breve Descrição dos Desenhos
[072] A FIGURA 1 mostra um histograma da coloração Cell Trace Violet (CTV) em células T CD3+ que expressam células CAR anti-BCMA (células T CAR) e células CD3+ que não expressam um CAR (Mock) após a incubação com esferas conjugadas com BCMA.
[073] A FIGURA 2A mostra gráficos de pontos para expressão da superfície de CD25 (eixo y) e intensidade de coloração CTV (eixo x) em células após a incubação com esferas conjugadas com anticorpo anti- CD3/anti-CD28 (esquerda) ou esferas conjugadas com BCMA (direita).
[074] A FIGURA 2B mostra um histograma de coloração CTV de células após tratamento com esferas conjugadas com anticorpo anti- CD3/anti-CD28 ou esferas conjugadas com BCMA.
[075] A FIGURA 2C mostra histogramas da expressão de PD-1 em células CD4+ (esquerda) ou células CD8+ (direita) após células de incubação com esferas conjugadas com anticorpo anti-CD3/anti-CD28 ou esferas conjugadas com BCMA.
[076] A FIGURA 3A mostra a porcentagem de células T anti- BCMA CAR+ após a incubação de cada uma das três composições diferentes de células T contendo as células T que expressam CAR (cada uma gerada a partir de um doador diferente) com esferas conjugadas com BCMA por até 14 dias. Os resultados de cada composição de célula são esquematizados separadamente com triângulos, quadrados e círculos.
[077] A FIGURA 3B mostra a expressão da superfície conforme determinada pela intensidade média de florescência (MFI) para detecção de CD25 (esquerda), CCR7 (centro) e CD27 (direita) em células CD8+ após quatro, sete ou catorze dias de incubação com esferas conjugadas com BCMA por até 14 dias. Os resultados são mostrados para cada uma das três diferentes composições de células contendo células que expressam anti-BCMA CAR descritas na FIGURA 3A e são esquematizados separadamente com triângulos, quadrados e círculos.
[078] A FIGURA 4A mostra gráficos para expressão da superfície de CD25 em células T CD4+ (painéis esquerdos) ou células T CD8+ (painéis direitos) presentes em uma composição de células T anti- BCMA CAR+ após incubação com diferentes quantidades de esferas conjugadas com BCMA. A FIGURA 4B mostra gráficos de histograma para expressão de superfície de PD-1 em células T CD4+ (painéis esquerdos) ou células T CD8+ (painéis direitos) apresentam uma composição de células T anti-BCMA CAR+ após incubação com diferentes quantidades de esferas conjugadas com BCMA. BCMA 50, BCMA 25, BCMA 10 e BCMA 5 indicam esferas conjugadas com BCMA geradas pela incubação de BCMA com as esferas em uma quantidade de 50, 25, 10 e 5 µg de BCMA por aproximadamente 4 x 108 esferas, respectivamente.
[079] A FIGURA 5A-B mostram gráficos exibindo o número total de células T CD3+ (FIGURA 5A) ou níveis de corante marcador de proliferação de CTV nas células T CD4+ (FIGURA 5B) apresentam uma composição de células T anti-BCMA CAR+ após a incubação com diferentes quantidades de esferas conjugadas com BCMA. BCMA 50, BCMA 25, BCMA 10 e BCMA 5 indicam esferas conjugadas com BCMA geradas pela incubação de BCMA com as esferas em uma quantidade de 50, 25, 10 e 5 µg de BCMA por aproximadamente 4 x 108 esferas, respectivamente.
[080] A FIGURA 6 mostra um gráfico exibindo a expressão da superfície CD25 em células T CD4+, apresentando uma composição de células T anti-BCMA CAR+ após incubação com diferentes quantidades de esferas conjugadas com BCMA. BCMA 50, BCMA 25, BCMA 10 e BCMA 5 indicam esferas conjugadas com BCMA geradas pela incubação de BCMA com as esferas em uma quantidade de 50, 25, 10 e 5 µg de BCMA por aproximadamente 4 x 108 esferas, respectivamente.
[081] As FIGURAS 7A-7H mostram coloração para vários marcadores ou nível de proliferação em composições de células T anti- BCMA CAR+ incubadas com esferas conjugadas com BCMA. A FIGURA 7A mostra histogramas de citometria de fluxo para expressão de superfície de CD25 em células T CD4+ (painéis esquerdos) ou células T CD8+ (painéis direitos) presentes em uma composição de células T anti-BCMA CAR+ após incubação com diferentes quantidades de esferas conjugadas com BCMA. A FIGURA 7B mostra histogramas de citometria de fluxo para expressão de superfície de CD25 em células T CD4+ (painéis esquerdos) ou células T CD8+ (painéis direitos)
presentes em uma composição de células T anti-BCMA CAR+ após incubação com diferentes razões de células T para esferas (200 µg/mL de composição de esfera conjugada com BCMA) ou anti-CD3 imobilizado.
A FIGURA 7C mostra histogramas de citometria de fluxo para expressão de superfície de CD69 em células T CD4+ (painéis esquerdos) ou células T CD8+ (painéis direitos) presentes em uma composição de células T anti-BCMA CAR+ após incubação com diferentes razões de células T para esferas (200 µg/mL de composição de esfera conjugada com BCMA) ou anti-CD3 imobilizado.
A FIGURA 7D mostra histogramas de citometria de fluxo para expressão de superfície de TIM3 em células T CD4+ (painéis esquerdos) ou células T CD8+ (painéis direitos) presentes em uma composição de células T anti- BCMA CAR+ após incubação com diferentes razões de células T para esferas (200 µg/mL de composição de esfera conjugada com BCMA) ou anti-CD3 imobilizado.
A FIGURA 7E mostra histogramas de citometria de fluxo para expressão de superfície de PD-1 em células T CD4+ (painéis esquerdos) ou células T CD8+ (painéis direitos) presentes em uma composição de células T anti-BCMA CAR+ após incubação com diferentes razões de células T para esferas (200 µg/mL de composição de esfera conjugada com BCMA) ou anti-CD3 imobilizado.
A FIGURA 7F mostra um gráfico de histograma da coloração CTV (medida de proliferação) do total de células em uma composição de células T anti- BCMA CAR+ após incubação com esferas (200 µg/mL de composição de esfera conjugadas com BCMA) na razão de células T 1:1 para esferas e na presença ou ausência de 5 µM de lenalidomida.
A FIGURA 7G e FIGURA 7H mostram histogramas de citometria de fluxo para CD25 em células T CD4+ (painéis esquerdos) ou células T CD8+ (painéis direitos) presentes em uma composição de células T anti- BCMA CAR+ após incubação com esferas (200 µg/mL de composição de esfera conjugadas com BCMA) a uma razão de células T 1:1 para esferas ou anti-CD3 imobilizado, respectivamente, na presença ou na ausência de lenalidomida. Nas figuras acima, "50", "100" e "200" indicam esferas conjugadas com BCMA geradas pela incubação de BCMA com as esferas em uma quantidade de 50, 100 e 200 µg de BCMA por aproximadamente 4 x 108 esferas, respectivamente.
[082] As FIGURAS 8A-8I mostram gráficos exibindo os níveis de fatores de transcrição e marcadores de ativação em ou nas células T CD4+ (painéis esquerdos) ou células T CD8+ (painéis direitos) presentes em uma composição de células T anti-BCMA CAR+ após incubação sem estimulação ou com diferentes quantidades de esferas conjugadas com BCMA ou esferas conjugadas com anti-CD3 e anti- CD28 e na presença de 0 µM, 0,5 µM ou 50 µM de lenalidomida. Níveis de Blimp1 (FIGURA 8A), CD25 (FIGURA 8B), CD31 (FIGURA 8C), PD- 1 (FIGURA 8D), Tbet (FIGURA 8E), EOMES (FIGURA 8F), GATA3 (FIGURA 8G), Helios (FIGURA 8H) e Ikaros (FIGURA 8I) são mostrados. 200 BCMA, 50 BCMA e 5 BCMA indicam esferas conjugadas com BCMA geradas pela incubação de BCMA com as esferas em uma quantidade de 200, 50, e 5 µg de BCMA por aproximadamente 4 x 108 esferas, respectivamente.
[083] As FIGURA 9A-9C mostram gráficos exibindo os níveis de IFN-gama extracelular (FIGURA 9A), IL-2 (FIGURA 9B) e TNF alfa (FIGURA 9C) de culturas após a incubação de uma composição de células T anti-BCMA CAR+ com duas quantidades diferentes de esferas conjugadas com BCMA na presença ou ausência de 5 µM de lenalidomida. 50 µg de BCMA e 5 µg de BCMA indicam esferas conjugadas com BCMA geradas pela incubação de BCMA com as esferas em uma quantidade de 50, e 5 µg de BCMA por aproximadamente 4 x 108 esferas, respectivamente.
[084] A FIGURA 9D mostra um gráfico exibindo os níveis de IL-2 extracelular de culturas após a incubação de uma composição de células T anti-BCMA CAR+ a partir de células de dois doadores diferentes (doador A e doador B) com diferentes quantidades de esferas conjugadas com BCMA na presença de 0 µM, 1 µM ou 5 µM de Lenalidomida. 200 BCMA e 5 BCMA indicam esferas conjugadas com BCMA geradas pela incubação de BCMA com as esferas em uma quantidade de 200, e 5 µg de BCMA por aproximadamente 4 x 10 8 esferas, respectivamente.
[085] A FIGURA 9E mostra a análise citométrica de fluxo de STAT5 fosforilada (pSTAT5) após 2 horas de estimulação do CAR (estimulação) com 50 µg de esferas de BCMA. Nenhum controle de estimulação mostrado com linha pontilhada. A FIGURA 9F mostra a análise citométrica de fluxo dos níveis intracelulares de citocinas em um doador CAR T normal representativo após 24 horas de estimulação com esferas de BCMA (fechado em CD3+ vivo, transduzido).
[086] A FIGURA 9G e FIGURA 9H mostram a contagem total de células após a cultura de uma composição de células T anti-BCMA CAR+ após incubação por 4 dias (FIGURA 9G) ou 7 dias (FIGURA 9H) com diferentes quantidades de esferas conjugadas com BCMA na presença de 5 µM de lenalidomida. 50 BCMA e 5 BCMA indicam esferas conjugadas com BCMA geradas pela incubação de BCMA com as esferas em uma quantidade de 50 e 5 µg de BCMA por aproximadamente 4 x 108 esferas, respectivamente.
[087] A FIGURA 9I mostra gráficos de histograma de coloração de CTV (medida de proliferação) de células T CD4+ ou células T CD8+ em uma composição de células T anti-BCMA CAR+ após incubação por 4 ou 7 dias com esferas conjugadas com BCMA na presença de 5 µM de lenalidomida (5uM Len) ou ausência de lenalidomida (veículo).
[088] A FIGURA 9J e 9K mostram gráficos exibindo a porcentagem de células positivas para o marcador substituto EGFRt conforme determinado com um anticorpo anti-EGFR após a incubação de uma composição de células T anti-BCMA CAR+ por 4 dias (FIGURA 9J) ou 7 dias (FIGURA 9K) com diferentes quantidades de esferas conjugadas com BCMA na presença de 5 µM de lenalidomida ou ausência de lenalidomida (veículo). "50" e "5" indicam esferas conjugadas com BCMA geradas pela incubação de BCMA com as esferas em uma quantidade de 50 e 5 µg de BCMA por aproximadamente 4 x 108 esferas, respectivamente.
[089] A FIGURA 9L mostra a porcentagem de morte celular de células alvo RPMI-8226 por células efetoras de células T anti-BCMA CAR+ que foram incubadas com diferentes quantidades de esferas conjugadas com BCMA na presença de 5 µM de lenalidomida ou ausência de lenalidomida (veículo). A atividade citolítica de composições contendo uma razão de células efetoras para células alvo de 3:1 ou 1:1 e na presença ou ausência adicional de lenalidomida é mostrada. "50" e "5" indicam esferas conjugadas com BCMA geradas pela incubação de BCMA com as esferas em uma quantidade de 50 e 5 µg de BCMA por aproximadamente 4 x 108 esferas, respectivamente.
[090] A FIGURA 9M mostra um gráfico exibindo os níveis de IFN- gama extracelular a produzido durante um ensaio de morte em uma cultura contendo células alvo RPMI-8226 e células efetoras de células T anti-BCMA CAR+ frescas ou células efetoras de células T anti-BCMA CAR+ que foram incubadas por 24 horas ou por sete dias com esferas conjugadas com BCMA (50 µg/mL de composição gerada pela incubação de BCMA com as esferas em uma quantidade de 50 µg de BCMA por aproximadamente 4 x 108 esferas). Os resultados são mostrados a partir de culturas contendo uma razão de célula efetora 0,3:1 ou 1:1 para célula alvo.
[091] A FIGURA 9N mostra a morte celular normalizada para contagem de células alvo em uma cultura contendo células alvo RPMI- 8226 e células efetoras frescas de células T anti-BCMA CAR+ ou células efetoras de células T anti-BCMA CAR+ que foram incubadas por 24 horas ou por sete dias com esferas conjugadas com BCMA (50 µg/mL de composição gerada pela incubação de BCMA com as esferas em uma quantidade de 50 µg de BCMA por aproximadamente 4 x 108 esferas). Os resultados são mostrados a partir de culturas contendo uma razão de célula efetora 0,3:1 ou 1:1 para célula alvo.
[092] As Figuras 10A-10B representam resultados de um ensaio de reestimulação serial de composições de células T anti-BCMA CAR que foram incubadas por sete dias com esferas conjugadas com BCMA (50 µg/mL geradas pela incubação de BCMA com as esferas em uma quantidade de 50 µg de BCMA por aproximadamente 4 x 108 esferas). Os resultados de três diferentes composições de doadores são mostrados. A FIGURA 10A e FIGURA 10B mostram a atividade citolítica das células T anti-BCMA CAR+ em cada um dos momentos para dois doadores diferentes.
[093] A FIGURA 11 mostra um gráfico exibindo a porcentagem de células T CAR+ ao longo do tempo em cinco composições diferentes de células anti-BCMA CAR+ que foram incubadas na presença de esferas conjugadas com BCMA (linhas sólidas) ou com esferas conjugadas com anticorpo anti-CD3/anti-CD28 (linhas pontilhadas) imediatamente após a transdução com um vetor lentiviral que codifica o CAR anti-BCMA.
[094] A FIGURA 12A e FIGURA 12B mostra expansão celular dobrada e número de células cumulativas de células T EGFRt+ / CD4+ ou células T EGFRt+ / CD4+, respectivamente, estimuladas com a razão indicada de esferas revestidas com anticorpo anti-idiotipo (anti-ID B-1) ou esferas revestidas com anticorpo anti-CD3/anti-CD28 de controle na presença (linhas sólidas) ou na ausência (linhas tracejadas) de citocinas. Resultados da estimulação com esferas 3:1 revestidas com anticorpo anti-CD3/anti-CD28 para células (círculos), esferas revestidas com anti-ID B-1 1:1 para células (quadrados) e 1:5 de esferas revestidas com anti-ID B-1 para células (triângulos) são mostradas.
[095] A FIGURA 13 mostra os níveis de expressão de PD-1 de células T CD4+ positivas para um anticorpo anti-EGFR após estimulação com a razão indicada de esferas revestidas com anticorpo anti-idiotipo (anti-ID B-1) ou esferas revestidas com anticorpo anti- CD3/anti-CD28 de controle na presença (linhas sólidas) ou ausência (linhas tracejadas) de citocinas, avaliadas por citometria de fluxo nos dias 3, 7, 10 e 14 de cultura. Resultados da estimulação com 3:1 de esferas revestidas com anticorpo anti-CD3/anti-CD28 para células (círculos), 1:1 de esferas revestidas com anti-ID B-1 para células (quadrados) e 1:5 de esferas revestidas com anti-ID B-1 para células (triângulos) são mostradas.
[096] A FIGURA 14 mostra a viabilidade de células T CD4+ ou CD8+ que expressam um CAR derivado de FMC63, avaliado por citometria de fluxo após estimulação com a razão indicada de esferas revestidas com anticorpo anti-idiotipo (anti-ID B-1) ou esferas revestidas com anticorpo anti-CD3/anti-CD28 de controle na presença (linhas sólidas) ou na ausência (linhas tracejadas) de citocinas, avaliadas por citometria de fluxo nos dias 3, 7, 10 e 14 de cultura. Resultados da estimulação com 1:3 de esferas revestidas de anticorpo anti-CD3/anti- CD28 para células (círculos), 1:1 de esferas revestidas com anti-ID B-1 para células (quadrados) e 1:5 de esferas revestidas com anti-ID B-1 para células (triângulos) são mostradas.
[097] A FIGURA 15A mostra coloração intracelular de citocina para IL-2, TNFα e IFNγ de células T que expressam um CAR derivado de FMC63 após estimulação com esferas revestidas de anticorpo anti- idiotipo específico para scFv derivado de FMC63 (anti-ID B-1). São mostrados resultados para células T CD8+ positivas ou negativas para o marcador substituto de EGFRt (EGFRt+ ou EGFRt-).
[098] A FIGURA 15B mostra coloração intracelular de citocinas para IL-2, TNFα e IFNγ de células T que expressam um CAR derivado de FMC63 após estimulação com células K562-CD19 que expressam antígeno. São mostrados resultados de células T CD8+ positivas para o marcador substituto de EGFRt.
[099] A FIGURA 16 mostra o número de duplicações populacionais em um ensaio de estimulação serial durante um período de cultura de 14 dias de células T expressando um CAR derivado de FMC63 após estimulação com a razão indicada de esferas revestidas com anticorpo anti-idiotipo (anti-ID B-1) ou esferas revestidas com anticorpo anti-CD3/anti-CD28 de controle na presença (linhas sólidas) ou na ausência (linhas tracejadas) de citocinas. São mostrados resultados para células T CD4+ positivas para o marcador substituto de EFGRt (EGFRt+) ou células T CD8+ positivas para o marcador substituto de EGFRt (EGFRt+). Resultados da estimulação com 1:3 de esferas revestidas de anticorpo anti-CD3/anti-CD28 para células (círculos), 1:1 de esferas revestidas com anti-ID B-1 para células (quadrados) e 1:5 de esferas revestidas com anti-ID B-1 para células (triângulos) são mostradas.
[100] A FIGURA 17A-17C mostram resultados após estimulação de células T CD4+ ou CD8+ que expressam um CAR derivado de FMC63, cultivado sozinho (linhas sólidas) ou como uma cocultura (linhas tracejadas), com esferas revestidas de anticorpo anti-idiotipo específico para scFv derivado de FMC63 (anti-ID B-1). Os resultados são mostrados para dois doadores diferentes (representados como círculos e quadrados). A FIGURA 17A representa a expansão dobrada de células T CD4+ ou células T CD8+ nas culturas que foram positivas para o marcador substituto de EGFRt (EGFRt+ / CD4+ ou EGFRt+ / CD8+). A FIGURA 17B mostra a frequência de células T CD4+ ou células T CD8+ nas culturas que foram positivas para o marcador substituto de EGFRt (EGFRt+ / CD4+ ou EGFRt+ / CD8+). A FIGURA
17C mostra a viabilidade de células T CD4+ ou células T CD8+ nas culturas.
[101] A FIGURA 18A e 18B mostram resultados de citometria de fluxo para marcadores de superfície de células T nos dias 5, 7 e 9 de cultura após a estimulação de células T CD4+ ou CD8+ que expressam um CAR derivado de FMC63, cultivado sozinho ou como uma cocultura, com esferas revestidas com anticorpo anti-idiotipo, derivado de FMC63, específico de scFv (anti-ID B-1). A FIGURA 18A mostra a expressão da superfície de PD-1 em células T CD4+ ou células T CD8+ nas culturas que foram positivas para o marcador substituto de EGFRt (EGFRt+ / CD4+ ou EGFRt+ / CD8+). A FIGURA 18B mostra a expressão da superfície de CD25 em células T CD4+ ou células T CD8+ nas culturas que foram positivas para o marcador substituto de EGFRt (EGFRt+ / CD4+ ou EGFRt+ / CD8+).
[102] A FIGURA 19A mostra os níveis intracelulares de citocinas de TNFα, IFNγ e IL-2, avaliados por citometria de fluxo de células T CD4+ ou CD8+ presentes em uma composição descongelada contendo células T que expressam um CAR derivado de FMC63 que foi expandido em cultura com CD19 que expressa células K562 ou com PMA / Ionomicina. É mostrado o nível das citocinas nas células T CD4+ e CD8+, sozinhas ou em cocultura, no descongelamento (d = 0) ou após outra cultura por mais 9 dias na presença de esferas conjugadas com B-1 anti-ID.
[103] A FIGURA 19B mostra a frequência de células positivas para CD25 ou Ki67, avaliadas por citometria de fluxo de células T CD4+ ou CD8+ presentes em uma composição descongelada contendo células T que expressam um CAR derivado de FMC63 que foram expandidas em cultura com células K56 que expressam CD19 ou com PMA / Ionomicina. É mostrado o nível dos marcadores nas células T CD4+ e CD8+, isoladamente ou em cocultura, no descongelamento (d = 0) ou após outra cultura por mais 9 dias na presença de esferas conjugadas com B-1 anti-ID.
[104] A FIGURA 20A mostra resultados para a atividade citolítica específica do antígeno CAR e a FIGURA 20B mostra resultados para a produção de citocinas para células CAR-T anti-BCMA que foram pré- estimuladas com esferas de BCMA (em comparação com células CAR- T anti-BCMA descongeladas recentemente (não pré-estimuladas)) nas coculturas, comparando células cultivadas em presença versus ausência de lenalidomida. A FIGURA 20C mostra a viabilidade geral e a contagem de células avaliadas para três doadores anti-BCMA CAR T. A FIGURA 20D mostra resultados da análise citométrica de fluxo da expressão de CD25 e PD-1 de superfície (intensidade fluorescente média (MFI)) para células T CD4+ e CD8+ anti-BCMA CAR após estimulação (pré-tratamento) com esferas de BCMA por 7 dias, na presença ou ausência de 1 µM de lenalidomida. A FIGURA 20E mostra a análise citométrica do fluxo entre os doadores CAR T para intensidade de fluorescência média (MFI; CD25 e Tim3) ou PD-1 e Lag3 positivos percentual na superfície de marcadores de células T em subconjuntos CD4+ CAR+ e CD8+ CAR+ (fechados em células CD3+ vivas) Os valores mostrados são IMF, viabilidade ou contagem de linha de base percentual (Veh).
[105] A FIGURA 21A mostra a análise da produção efetiva de citocinas após estimulação específica de CAR em 50 µg de esferas de BCMA por 24 horas na presença de 1 µM de lenalidomida em comparação com a resposta da linha de base (veículo) para cada um dos três doadores.
[106] A FIGURA 21B mostra os efeitos das células T anti-BCMA CAR ativadas em diferentes concentrações de esferas de BCMA (ou seja, 5 µg, 50 µg e 200 µg) na ausência (barras esquerdas) ou na presença de 0,1 µM (barra do meio) ou 1 µM (barras direitas) da lenalidomida na produção de citocinas efetoras CAR T.
[107] A FIGURA 21C mostra a produção de citocinas de células T anti-BCMA CAR derivadas de doadores saudáveis representativos e pacientes com mieloma múltiplo estimulado em esferas de BCMA com ou sem adição de PD-L1 nas esferas, na presença ou ausência de 1 µM de lenalidomida.
[108] As FIGURAS 22A e 22B apresentam gráficos mostrando a produção de citocinas em células T que expressam CAR anti-BCMA. A FIGURA 22A representa a concentração (pg/mL) de IFN-gama, IL-2, TNF-alfa, IL-6, GM-CSF e IL-4 em sobrenadante coletado de células T que expressam CAR anti-BCMA após uma incubação de 24 horas com esferas conjugadas com anticorpo anti-CD3/anti-CD28 (CD3 / CD28), esferas conjugadas com BCMA com uma concentração de BCMA conjugado com 200 µg/mL, 50 µg/mL ou 5 µg/mL por aproximadamente 4 x 108 esferas (200 µg, 50 µg ou 5 µg de BCMA, respectivamente) ou células incubadas sem esferas (sem estimulação). Linhas horizontais tracejadas indicam o limite superior de quantificação (ULOQ). A FIGURA 22B representa a porcentagem de células CD4+ CAR+ (linha superior) ou CD8+ CAR+ (linha inferior) positivas para coloração intracelular de IFN-gama, IL-2 ou TNF-alfa após incubação com esferas CD3 / CD28, 200 µg, 50 µg ou 5 µg de esferas conjugadas com BCMA ou sem estim.
[109] As FIGURAS 23A e 23B apresentam gráficos mostrando a atividade de composições de células T contendo células T anti-CD19 CAR+. As células foram incubadas com esferas conjugadas com anti- ID de anticorpo anti-CD19 por 14 dias (Dia 14; secundário) ou não foram incubadas antes da avaliação da atividade. Os resultados de um ensaio de citotoxicidade (FIGURA 23A) e um ensaio de coloração de citocina intracelular (ICS) após a exposição a células que expressam CD19 (FIGURA 23B) são mostrados.
[110] As FIGURAS 24A-24C apresentam gráficos mostrando características de composições de células T contendo células T anti- CD19 CAR+ durante ou após a incubação com esferas conjugadas com anti-ID de anticorpo anti-CD19 por 14 dias. Os resultados das composições de células T que foram geradas na presença de diferentes compostos de teste ou um veículo são mostrados. As Figuras 24A e 24B mostram atividade em resposta à exposição a células CD19 de composições de células T que não foram incubadas (primárias) ou incubadas por 14 dias (secundárias). São mostrados resultados de coloração polifuncional por ICS (FIGURA 24A) e uma atividade citolítica (FIGURA 24B) após a exposição a células que expressam CD19. A FIGURA 24C representa níveis de citocina secretada a partir de sobrenadante de composições de células contendo células que expressam CAR anti-CD19 que foram incubadas na razão de 1:1 com células que expressam CD19 por 20 horas. Quantidades de IL2, TNF e IFN-gama foram medidas e a média das pontuações em escala para todas as três citocinas é mostrada.
[111] As FIGURAS 25A-25D mostram gráficos exibindo atividade de células T a partir de composições de células anti-CD19 CAR-T geradas que foram expandidas na presença apenas de meio, controle com veículo DMSO, Composto 1 ou Composto 2 após estimulação com superfície de esferas conjugada com anticorpo anti-idiotipo específico para o CAR anti-CD19. A FIGURA 25A mostra a contagem total de células T vivas por poço de células T a partir de composições de células anti-CD19 CAR-T geradas cocultivadas com a superfície de esferas conjugadas com o anticorpo anti-idiotipo. A FIGURA 25B exibe a área sob a curva (AUC) calculada para as contagens de células T vivas em relação aos meios de controles somente. A FIGURA 25C mostra um gráfico exibindo a produção de TNF-alfa (TNF), IFN-gama (IFNg) e IL-2 por células T a partir de composições de células anti-CD19 CAR-T geradas após estimulação com uma cocultura de 16 horas com células alvo K562-CD19 irradiadas que se seguiu a uma incubação de 15 dias com a superfície das esferas conjugadas com o anticorpo anti-idiotipo. A alteração de dobra de TNF-alfa extracelular (TNF), IFN-gama (IFNg) e IL-2 em comparação com a condição apenas do meio é mostrada. A FIGURA 25D mostra gráficos que representam os perfis de citocinas polifuncionais de células T CD8+ a partir de composições de células anti-CD19 CAR-T geradas que se seguiram a uma incubação de 15 dias com esferas conjugadas com o anticorpo anti-idiotipo. Descrição Detalhada
[112] São fornecidas aqui composições e métodos para enriquecer, expandir e/ou ativar células geneticamente manipuladas que expressam um receptor recombinante, por exemplo, um receptor de antígeno quimérico (CAR). Em algumas modalidades, os métodos fornecidos incluem o enriquecimento ex vivo ou in vitro, expansão e/ou ativação de células por incubação com uma partícula, por exemplo, uma partícula de esfera, com uma molécula de ligação unida que reconhece ou se liga ao receptor recombinante. Em algumas modalidades, a molécula de ligação unida é um polipeptídeo, por exemplo, um antígeno de polipeptídeo ou um anticorpo anti-idiotipo que se liga ao receptor recombinante.
[113] Em algumas modalidades, as composições e métodos aqui fornecidos possuem uma ou mais vantagens sobre os meios existentes de expandir, enriquecer ou ativar células que expressam um receptor recombinante, por exemplo, um CAR. Muitos protocolos existentes para expansão ex vivo ou in vitro dependem da incubação das células, por exemplo, células T, com uma ou mais moléculas estimulatórias policlonais capazes de ativar componentes do complexo TCR. Por exemplo, um protocolo comum para expandir células é incubar as células com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28, como incubar as células com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 que estão unidos às esferas paramagnéticas. Uma desvantagem deste método é que todas ou a maioria das células de uma dada composição, por exemplo, células T cultivadas, serão contatadas e estimuladas pelos anticorpos. Assim, em algumas modalidades, para uma dada composição de células contatadas com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28, todas ou a maioria das células são ativadas, independentemente de expressarem ou não o receptor recombinante. Por outro lado, em modalidades particulares, quando as células são incubadas com as partículas, por exemplo, esferas, fornecidas aqui, as moléculas de ligação das partículas, por exemplo, esferas, se ligam diretamente ao receptor recombinante, resultando em maior estimulação, ativação, proliferação e/ou expansão nas células que expressam o receptor recombinante em comparação com as células que não possuem o receptor. Em algumas modalidades, incubar as células que incluem células que expressam um receptor recombinante com as partículas, por exemplo, esferas, aqui descritas aumenta a porção, parcela ou subconjunto das células que expressam o receptor recombinante.
[114] Em modalidades particulares, uma vantagem de expandir, enriquecer e/ou ativar as células com as partículas, por exemplo, esferas, aqui descritas em comparação com outros métodos, por exemplo, estimulação com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28, é que a incubação com as partículas aqui fornecidas resulta em menos ativação e/ou exaustão, em oposição às células que são expandidas, enriquecidas e/ou ativadas por outros métodos. Por exemplo, em algumas modalidades, as células incubadas com as partículas aqui fornecidas expressam níveis ou marcadores mais baixos associados à ativação, por exemplo, expressão de superfície de CD25 ou exaustão, por exemplo, expressão de PD1, em comparação com células incubadas com moléculas estimulatórias policlonais capaz de ativar componentes do complexo TCR, por exemplo, anticorpos anti-CD3 e anti-CD28.
[115] Em certas modalidades, são fornecidos métodos para a transdução ou transfecção de células com um vetor viral ou não viral para entregar um ácido nucleico que codifica um receptor recombinante ou CAR às células enquanto elas são contatadas, tratadas ou incubadas com as partículas, por exemplo, esferas, aqui descritas pelo menos para a porção do processo de transdução ou transfecção. Em algumas modalidades, uma vantagem de transduzir ou transfectar as células na presença de partículas, por exemplo, esferas, permite a transfecção ou transdução de células que não foram ativadas anteriormente com moléculas estimulatórias policlonais, por exemplo, anticorpos anti-CD3 e anti-CD28. Modalidades particulares contemplam que células que são transduzidas ou transfectadas sem ativação prévia com moléculas policlonais exibirão persistência aumentada e/ou exaustão reduzida em comparação com células que foram ativadas antes da transfecção ou transdução.
[116] Modalidades particulares contemplam que antígenos recombinantes específicos, ou seus fragmentos, unidos a partículas, por exemplo, esferas, como descrito podem ser particularmente adequados para usos para estimular especificamente um CAR contendo um domínio de ligação de antígeno que reconhece o antígeno. Em alguns casos, certos antígenos recombinantes, por exemplo, BCMA pode ter poucas ou nenhuma interação inespecífica, como interações proteína- proteína inespecíficas ou interações inespecíficas com células que previnem ou minimizam o antígeno que adere não especificamente às células ou se absorve pelas células. Em alguns casos, isso pode melhorar a qualidade da estimulação das células que expressam o CAR. Em algumas modalidades, a ligação a esferas ou partículas resulta em um estímulo, ativação ou expansão aumentada, aprimorada,
consistente e/ou mais confiável de células, em comparação com quando o antígeno recombinante está livre ou ligado a um suporte sólido diferente, como a superfície de uma placa ou prato. Em certas modalidades, a molécula de ligação é ou inclui BCMA recombinante ou um fragmento do mesmo.
[117] Em modalidades particulares, partículas ou esferas contendo BCMA recombinante unido (como uma fusão BCMA-FC recombinante) são usadas em conjunto com os métodos fornecidos para ativar, estimular ou expandir células de uma composição celular. Em algumas modalidades, as partículas ou esferas que contêm o BCMA recombinante ativam, estimulam ou expandem seletivamente as células que expressam um receptor recombinante contendo um domínio de ligação de antígeno que se liga a ou reconhece o BCMA, por exemplo, um CAR anti-BCMA. Em certas modalidades, a ativação, estimulação ou expansão das células, por exemplo, as células que expressam CAR anti-BCMA, é maior ou aumentada em comparação com a ativação, estimulação ou expansão por outros reagentes, como por exemplo, reagentes de esferas conjugadas com anticorpo anti-CD3/anti-CD28. Em certas modalidades, a ativação, estimulação ou expansão das células, por exemplo, as células que expressam CAR anti-BCMA, é mais indicativa de ativação, estimulação ou expansão das células in vivo e/ou em resposta ao antígeno endógeno em comparação à ativação, estimulação ou expansão por outros reagentes, como, por exemplo, reagentes de esferas conjugadas com anticorpo anti-CD3/anti-CD28. Em alguns aspectos, o grau em que as células são ativadas, estimuladas ou expandidas pelas partículas ou partículas de esferas ou esferas contendo BCMA recombinante unido pode ser ajustado, modificado ou controlado alterando a quantidade de BCMA recombinante unido às partículas ou esferas ou alterando a razão de partículas ou esferas para células. Em alguns aspectos, a ativação,
estimulação ou expansão de células, por exemplo, células que expressam CAR anti-BCMA, pelo BCMA recombinante é mais eficaz quando o BCMA recombinante é unido a partículas ou esferas do que quando o BCMA recombinante é flutuante ou desunido, ou do que quando o BCMA recombinante é unido a uma superfície diferente, por exemplo, um prato ou placa de cultura.
[118] Em algumas modalidades, a molécula de ligação é um anticorpo anti-idiotípico (anti-ID) que se liga a ou reconhece um receptor recombinante, por exemplo, um CAR. Em modalidades particulares, partículas ou esferas contendo anti-IDs recombinantes unidos são usadas em conjunto com os métodos fornecidos para ativar, estimular ou expandir células de uma composição celular. Em várias modalidades, as partículas ou esferas que contêm anti-IDs ativam, estimulam ou expandem seletivamente as células da composição, como células que expressam o receptor recombinante, por exemplo, um CAR. Em certas modalidades, a ativação, estimulação ou expansão das células, por exemplo, células que expressam CAR, é maior ou aumentada em comparação com a ativação, estimulação ou expansão por outros reagentes, como por exemplo, reagentes de esferas conjugadas com anticorpo anti-CD3/anti-CD28. Em certos aspectos, o grau em que as células são ativadas, estimuladas ou expandidas pelas partículas ou partículas de esferas ou esferas contendo anti-IDs pode ser ajustado, modificado ou controlado alterando a quantidade de anti- IDs unidos às partículas ou esferas ou alterando a razão de partículas ou esferas para células. Em modalidades particulares, o anti-ID é um anti-ID de anticorpo anti-CD19. Em modalidades particulares, a ativação, estimulação ou expansão de células que expressam CAR anti- CD19 por partículas ou esferas contendo anti-IDs de anticorpo anti- CD19 é maior ou aumentada em comparação com a ativação, estimulação ou expansão por outros reagentes, como para exemplo,
reagentes de esferas conjugadas com anticorpo anti-CD3/anti-CD28.
[119] Em algumas modalidades, as composições e métodos fornecidos expandem e ativam células T manipuladas geneticamente que expressam receptores recombinantes ou CARs que, quando administradas a um indivíduo, exibem persistência aumentada e/ou exaustão reduzida em comparação com células T manipuladas geneticamente que são expandidas por outras técnicas. Em algumas modalidades, as células T manipuladas geneticamente com persistência aumentada e/ou exaustão reduzida exibem melhor potência em um indivíduo ao qual são administradas.
[120] Todas as publicações, incluindo documentos de patentes, artigos científicos e banco de dados, mencionadas neste pedido são incorporadas por referência em sua totalidade para todos os fins, na mesma extensão que se cada publicação individual fosse incorporada individualmente por referência. Se uma definição estabelecida neste documento for contrária ou inconsistente com uma definição estabelecida nas patentes, aplicativos, aplicativos publicados e outras publicações que são aqui incorporadas por referência, a definição aqui estabelecida prevalece sobre a definição que é incorporada aqui por referência.
[121] Os cabeçalhos das seções aqui utilizados são apenas para fins organizacionais e não devem ser interpretados como limitando o assunto descrito. I. CONJUGADOS DE PARTÍCULAS
[122] São fornecidas aqui partículas, como esferas, que são conjugadas ou ligadas a uma molécula de ligação que se liga ou é reconhecida por um domínio de ligação de antígeno de um receptor recombinante, como um receptor de antígeno quimérico (CAR) e métodos para uso das mesmas. Em algumas modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, são partículas não celulares.
A. Partículas
[123] Em algumas modalidades, uma molécula de ligação que se liga a ou é reconhecida por um domínio de ligação de antígeno de um receptor recombinante, como um receptor de antígeno quimérico (CAR), é ligada a ou de outra forma unida a uma partícula (por exemplo, partículas de esfera), por exemplo, à superfície da partícula. Em certas modalidades, a partícula é uma partícula não celular. Em modalidades particulares, a partícula pode incluir uma partícula coloidal, uma microesfera, nanopartícula, uma esfera, tal como uma esfera magnética ou semelhante. Em algumas modalidades, as partículas ou esferas são biocompatíveis, isto é, não tóxicas. Em certas modalidades, as partículas ou esferas não são tóxicas para as células cultivadas, por exemplo, células T cultivadas. Em modalidades particulares, as partículas são monodispersas. Em certas modalidades, "monodisperso" abrange partículas (por exemplo, partículas de esferas) com dispersões de tamanho com um desvio padrão de menos de 5%, por exemplo, tendo menos de um desvio padrão de diâmetro de 5%.
[124] Em algumas modalidades, uma partícula descrita neste documento (por exemplo, partícula de esfera) fornece um suporte sólido ou matriz à qual uma molécula de ligação, como uma molécula de ligação descrita neste documento (por exemplo, um antígeno ou um anticorpo), pode ser ligada ou ligado de uma maneira que permite uma interação entre a molécula de ligação e uma célula, em particular a ligação entre a molécula de ligação e um receptor recombinante, por exemplo, um CAR, expresso na superfície da célula. Em modalidades particulares, a interação entre a molécula de ligação conjugada ou acoplada e a célula pode ser usada em métodos para facilitar o enriquecimento, ativação, estimulação e/ou expansão de um ou mais tipos de células em uma população de células com base na expressão ou nível de expressão de um ou mais receptores recombinantes na superfície de uma célula. Em certas modalidades, a partícula (por exemplo, uma partícula de esfera) compreende uma ou mais moléculas de ligação (por exemplo, um anticorpo ou um antígeno) que se liga a uma região de ligação de antígeno de um receptor recombinante, por exemplo, um CAR que é expresso na superfície da célula.
[125] Em algumas modalidades, a partícula ou esfera é biocompatível, isto é, composta de um material que é adequado para uso biológico. Em algumas modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, não são tóxicas para células cultivadas, por exemplo, células T cultivadas. Em algumas modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, podem ser quaisquer partículas capazes de unir moléculas de ligação de uma maneira que permita uma interação entre a molécula de ligação e uma célula. Em certas modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, podem ser quaisquer partículas que podem ser modificadas, por exemplo, funcionalizadas na superfície, para permitir a ligação de uma molécula de ligação na superfície da partícula. Em algumas modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, são compostas de vidro, sílica, poliésteres de ácidos hidroxicarboxílicos, polianidretos de ácidos dicarboxílicos ou copolímeros de ácidos hidroxicarboxílicos e ácidos dicarboxílicos. Em algumas modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, podem ser compostas ou pelo menos parcialmente compostas de poliésteres de cadeia linear ou ramificada, substituídos ou não substituídos, saturados ou insaturados, lineares ou reticulados, alcanila, haloalquila, tioalquila, aminoalquila, arila, aralquila, alcenila, aralquenila, heteroarila ou alcóxi-hidroxiácidos ou polianidretos de cadeia linear ou ramificada, substituídos ou não substituídos, saturados ou insaturados, linear ou reticulados, alcanila, haloalquila, tioalquila, aminoalquila, arila, aralquila, alcenila, aralquenila, heteroarila ou alcóxi-dicarboxílicos. Além disso, partículas, por exemplo, esferas, podem ser pontos quânticos ou compostas por pontos quânticos, como partículas de poliestireno com pontos quânticos, por exemplo, esferas. Partículas, por exemplo, esferas, incluindo misturas de ligações éster e anidrido (por exemplo, copolímeros de ácido glicólico e ácido sebático) também podem ser empregues. Por exemplo, partículas, por exemplo, esferas, podem compreender materiais que incluem polímeros de ácido poliglicólico (PGA), polímeros de ácido polilático (PLA), polímeros de ácido polissábico (PSA), copolímeros de ácido poli (láctico-co-glicólico) (PLGA), copolímeros de ácido [rho] poli (lático-co-sebácico) (PLSA), copolímeros de ácido poli (glicólico-co- sebático) (PGSA), etc. Outros polímeros, que partículas, por exemplo, esferas, podem ser compostos incluem polímeros ou copolímeros de caprolactonas, carbonatos, amidas, aminoácidos, ortoésteres, acetais, cianoacrilatos e uretanos degradáveis, bem como copolímeros destes com cadeia linear ou ramificada, substituídos ou não substituídos, alcanila, haloalquila, tioalquila, aminoalquila, alquenila ou ácidos aromáticos hidróxi- ou dicarboxílicos. Além disso, os aminoácidos biologicamente importantes com grupos de cadeia lateral reativos, como lisina, arginina, ácido aspártico, ácido glutâmico, serina, treonina, tirosina e cisteína ou seus enanciômeros, podem ser incluídos em copolímeros com qualquer um dos materiais mencionados acima para fornecer grupos reativos para a conjugação com moléculas de ligação, como antígeno de polipeptídeo ou anticorpos.
[126] Em algumas modalidades, as partículas ou esferas têm um diâmetro maior que 0,001 µm, maior que 0,01 µm, maior que 0,05 µm, maior que 0,1 µm, maior que 0,2 µm, maior que 0,3 µm, maior que 0,4 µm, maior que 0,5 µm, maior que 0,6 µm, maior que 0,7 µm, maior que 0,8 µm, maior que 0,9 µm, maior que 1 µm, maior que 2 µm, maior que 3 µm, maior que 4 µm, maior que 5 µm, superior a 6 µm, superior a 7 µm, superior a 8 µm, superior a 9 µm, superior a 10 µm, superior a 20 µm, superior a 30 µm, superior a 30 µm, superior a 40 µm, superior a 50 µm, superior a 100 µm, maior que 500 µm e/ou maior que
1.000 µm. Em algumas modalidades, as partículas ou esferas têm um diâmetro entre ou entre cerca de 0,001 µm e 1.000 µm, 0,01 µm e 100 µm, 0,1 µm e 10, µm, 0,1 µm e 100 µm, 0,1 µm e 10 µm, 0,001 µm e 0,01 µm, 0,01 µm e 0,1 µm, 0,1 µm e 1 µm, 1 µm e 10 µm, 1 µm e 2 µm, 2 µm e 3 µm, 3 µm e 4 µm, 4 µm e 5 µm, 1 µm e 5 µm e/ou 5 µm e 10 µm, cada, inclusive. Em certas modalidades, as partículas ou esferas têm um diâmetro médio de 1 µm e 10 µm, cada, inclusive. Em certas modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, têm um diâmetro de ou de cerca de 1 µm. Em modalidades particulares, as partículas, por exemplo, esferas, têm um diâmetro médio de ou de cerca de 2,8 µm. Em algumas modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, têm um diâmetro de ou de cerca de 4,8 µm.
[127] Em certas modalidades, uma pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, tem um tamanho de partícula uniforme. Em algumas modalidades, um tamanho de partícula uniforme compreende um desvio padrão de diâmetro inferior a 10%, inferior a 5% ou inferior a 1% do diâmetro médio da pluralidade. Em modalidades particulares, a pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, tem um desvio padrão de diâmetro inferior a 10%, inferior a 5% ou inferior a 1% do diâmetro médio da pluralidade.
[128] Em modalidades particulares, as partículas (por exemplo, partículas de esferas) são uniformes espaçadas. Em algumas modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, são esféricas. Em certas modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, são não esféricas.
[129] Em algumas modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, têm uma densidade maior que 0,001 g/cm3, maior que 0,01 g/cm3, maior que 0,05 g/cm3, maior que 0,05 g/cm3, maior que 0,1 g/cm3 e maior que 0,5 g/cm3, superior a 0,6 g/cm3, superior a
0,7 g/cm3, superior a 0,8 g/cm3, superior a 0,9 g/cm3, superior a 1 g/cm3, superior a 1 g/cm3, superior a 1,1 g/cm3, superior a 1,2 g/cm3, maior que 1,3 g/cm3, maior que 1,4 g/cm3, maior que 1,5 g/cm3, maior que 2 g/cm3, maior que 3 g/cm3, maior que 3 g/cm3, maior que 4 g/cm3 ou maior que 5g/cm3 . Em algumas modalidades, as partículas ou esferas têm uma densidade entre 0,001 g/cm3 e 100 g/cm3, 0,01 g/cm3 e 50 g/cm3, 0,1 g/cm3 e 10 g/cm3, 0,1 g/cm3. e 0,5 g/cm3, 0,5 g/cm3 e 1 g/cm3, 0,5 g/cm3 e 1,5 g/cm3, 1 g/cm3 e 1,5 g/cm3, 1 g/cm3 e 2 g/cm3 ou 1 g/cm 3 e 5 g/cm3. Em algumas modalidades, as partículas ou esferas têm uma densidade de, pelo menos, ou de cerca de 0,5 g/cm3, 0,5 g/cm3, t 0,6 g/cm3, 0,7 g/cm3, a0,8 g/cm3, 0,9 g/cm3, 1,0 g/cm3, 1,1 g/cm3, 1,2 g/cm3, 1,3 g/cm3, 1,4 g/cm3, 1,5 g/cm3, 1,6 g/cm3, 1,7 g/cm3, 1,8 g/cm3, 1,9 g/cm3 ou 2,0 g/cm3, cada, inclusive. Em certas modalidades, as esferas ou partículas têm uma densidade de cerca de 1,6 g/cm3. Em modalidades particulares, as esferas ou partículas têm uma densidade de cerca de 1,5 g/cm3. Em certas modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, têm uma densidade de ou de cerca de 1,3 g/cm3.
[130] Em certas modalidades, uma pluralidade de partículas ou esferas tem uma densidade uniforme. Em certas modalidades, uma densidade uniforme compreende um desvio padrão de densidade inferior a 10%, inferior a 5% ou inferior a 1% da densidade média das partículas.
[131] Em algumas modalidades, as partículas ou esferas têm uma área de superfície entre ou entre cerca de 0,001 m2 por cada grama de partículas, por exemplo, esferas (m2/g) e 1.000 m2/g, 0,010 m2g e 100 m2/g, 0,1 m2g e 10 m2/g, 0,1 m2g e 1 m2/g, 1 m2g e 10 m2/g, 10 m2g e 100 m2/g, 0,5 m2g e 20 m2/g, 0,5 m2g e 5 m2/g, ou 1 m2g e 4 m2/g, cada, inclusive. Em algumas modalidades, as partículas ou esferas têm uma área de superfície de ou de cerca de 1 m2/g a 4 m2/g.
[132] Em modalidades particulares, as partículas (por exemplo, partículas de esferas) têm uma gravidade específica, ou seja, a razão entre a densidade das partículas, por exemplo, esferas, e a densidade da água, entre 0,01 e 100, 0,1 ou 0,1 e 10, 0,5 e 5, 1 e 10, 1 e 2, 1,1 e 1,8, ou 1,2 e 1,5, cada, inclusive. Em certas modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, têm uma gravidade específica de 1,2 e 1,5. Em certas modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, são monodispersas e a gravidade específica é uniforme. Em modalidades particulares, partículas, por exemplo, esferas, com uma gravidade específica uniforme têm um desvio padrão específico da gravidade de menos de 10%, menos de 5% ou menos de 1%. Em várias modalidades, as partículas são monodispersas e têm uma gravidade específica com um desvio padrão inferior a 10%, inferior a 5% ou inferior a 1%.
[133] Em certas modalidades, a superfície da partícula compreende biomoléculas unidas que podem ligar ou unir moléculas de ligação. Em modalidades particulares, as biomoléculas são polipeptídeos. Em algumas modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, compreendem proteína A, proteína G ou biotina expostas à superfície.
[134] Em algumas das modalidades, a partícula contém uma ou mais coberturas ou revestimentos, como uma ou mais coberturas ou revestimentos na superfície da partícula (por exemplo, um revestimento de superfície). Em algumas modalidades, os uma ou mais coberturas ou revestimentos fornecem um material para conjugação ou acoplamento a uma molécula de ligação, por exemplo, um revestimento que é ou é capaz de ser funcionalizado na superfície. Em certas modalidades, a cobertura compreende, ou é capaz de fixar, grupos funcionais expostos à superfície. Em modalidades particulares, o revestimento compreende, ou é capaz de unir, grupos carboxila expostos à superfície, grupos amino, grupos hidroxila, grupos tosila,
grupos epóxi, grupos clorometila ou combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, a cobertura ou revestimento é hidrofóbico. Em modalidades particulares, a cobertura ou revestimento é não hidrofóbico. I. Partículas Magnéticas
[135] Em algumas modalidades, a partícula (por exemplo, partícula de esfera) reage em um campo magnético. Em algumas modalidades, a partícula é uma partícula magnética (por exemplo, partícula de esferas magnéticas). Em algumas modalidades, a partícula magnética é paramagnética. Em modalidades particulares, a partícula magnética é superparamagnética. Em certas modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, não exibem propriedades magnéticas, a menos que sejam expostas a um campo magnético.
[136] Em modalidades particulares, a partícula pode ser uma partícula composta contendo um núcleo interno. Em algumas modalidades, o núcleo interno é um núcleo magnético, um núcleo paramagnético ou um núcleo superparamagnético. Em algumas modalidades, o núcleo interno (por exemplo, núcleo magnético) é ou contém um metal. Em algumas modalidades, o metal pode ser, mas não está limitado a, ferro, níquel, cobre, cobalto, gadolínio, manganês, tântalo, zinco, zircônio ou qualquer combinação dos mesmos. Substâncias adequadas que podem ser incluídas em um núcleo interno aqui descrito (por exemplo, um núcleo magnético) incluem, mas não se limitam a, óxidos metálicos (por exemplo, óxidos de ferro), ferritas (por exemplo, ferritas de manganês, ferritas de cobalto, ferritas de níquel, etc.), hematita e ligas metálicas (por exemplo, CoTaZn). Em algumas modalidades, o núcleo interno compreende um ou mais dentre uma ferrita, um metal, uma liga de metal, um óxido de ferro ou dióxido de cromo. Em algumas modalidades, o núcleo interno compreende ferro elementar ou um composto do mesmo. Em algumas modalidades, o núcleo interno compreende uma ou mais magnetita (Fe3O4), maghemita (γFe2O3) ou greigita (Fe3S4). Em algumas modalidades, o núcleo interno compreende um óxido de ferro (por exemplo, Fe3O4).
[137] Em certas modalidades, a partícula contém um núcleo magnético, paramagnético e/ou superparamagnético coberto por uma cobertura ou revestimento funcionalizado na superfície. Em algumas modalidades, a partícula compreende grupos tosila expostos à superfície.
[138] Em algumas modalidades, o revestimento pode conter um material que pode incluir, mas não está limitado a, um polímero, um polissacarídeo, uma sílica, um ácido graxo, uma proteína, um carbono ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o polímero pode ser um polietileno glicol, poli (ácido lático-co-glicólico), poliglutaraldeído, poliuretano, poliestireno ou um álcool polivinílico. Em certas modalidades, a cobertura ou revestimento externo compreende poliestireno. Em algumas modalidades, a cobertura contém ou inclui um material que é ou inclui uma proteína que é uma albumina (por exemplo, albumina sérica humana), proteína A e proteína G. Em algumas modalidades, o carbono é uma acrilamida ou ácido maleico. Em algumas modalidades, o material é acoplado, ligado ou conjugado a uma molécula de ligação aqui descrita.
[139] Em algumas modalidades, uma partícula descrita neste documento (por exemplo, uma partícula de esfera) pode ter um núcleo interno e uma cobertura (por exemplo, cobertura protetora), em que a cobertura contém um ou mais material aqui descrito. Em algumas modalidades, a cobertura é hidrofóbica. Em certas modalidades, a cobertura é hidrofílica. Em algumas modalidades, uma partícula aqui descrita (por exemplo, uma partícula de esfera) tem um núcleo de óxido de metal (por exemplo, um núcleo interno de óxido de ferro) e uma cobertura (por exemplo, uma cobertura protetora), em que a cobertura compreende poliestireno.
[140] As partículas (por exemplo, partículas de esferas) utilizadas nos métodos aqui descritos podem ser produzidas ou obtidas comercialmente. Partículas, por exemplo, esferas, incluindo métodos de produção de partículas, por exemplo, esferas, são bem conhecidas na técnica. Vide, por exemplo, Pat. 6.074.884; 5.834.121; 5.395.688;
5.356.713; 5.318.797; 5.283.079; 5.232.782; 5.091.206; 4.774.265;
4.654.267; 4.554.088; 4.490.436; 4.452.773; Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 20100207051; e Sharpe, Pau T., Methods of Cell Separation, Elsevier, 1988. Partículas disponíveis comercialmente, por exemplo, esferas, (por exemplo, partículas de esferas) incluem, mas não estão limitadas a, ProMagTM (PolySciences, Inc.); COMPELTM (PolySciences, Inc.); BioMag® (PolySciences, Inc.), incluindo BioMag® Plus (PolySciences, Inc.) e BioMag® Maxi (Bang Laboratories, Inc.); M- PVA (Cehmagen Biopolymer Technologie AG); SiMAG (Chemicell GmbH); beadMAG (Chemicell GmbH); MagaPhase® (Cortex Biochem); Dynabeads® (Invitrogen), incluindo IgG anti-coelho de ovelhas Dynabeads® M-280 (Invitrogen), Dynabeads® FlowCompTM (por exemplo, Dynabeads® FlowCompTMHuman CD3, Invitrogen), Dynabeads® M-450 (por exemplo, Dynabeads® M-450 Ativado por tosila, Invitrogen), Dynabeads® UntouchedTM (por exemplo, células T CD8 humanas Dynabeads® UntouchedTM, Invitrogen) e Dynabeads® que ligam, expandem e/ou ativam células T (por exemplo, Dynabeads® Human T-Activator CD3/CD28 para Expansão e Ativação de Células T, Invitrogen); Estapor® M (Merk Chimie SAS); Estapor® EM (Merk Chimie SAS); Partículas MACSiBeadsTM (por exemplo, Partículas MACSiBead anti-biotina, Miltenyi Biotec, catálogo # 130-091-147); Esferas Magnéticas Streptamer® (IBA BioTAGnology); Esferas Magnéticas Strep-Tactin® (IBA BioTAGnology); Sicastar®-M (Micormod Partikeltechnologie GmbH) Micromer®-M (Micromod
Partikeltechnologie); MagneSilTM (Promega GmbH); MGP (Roche Applied Science Inc.); Esferas Magnéticas de proteína G Pierce ™ (Thermo Fisher Scientific Inc.); Esferas Magnéticas de Proteína A Pierce ™ (Thermo Fisher Scientific Inc.); Esferas Magnéticas de Proteína A/G Pierce ™ (Thermo Fisher Scientific Inc.); Esferas Magnéticas ativadas por NHS Pierce ™ (Thermo Fisher Scientific Inc.); Esferas Magnéticas de Proteína L Pierce ™ (Thermo Fisher Scientific Inc.); Esferas Magnéticas anti-HA Pierce ™ (Thermo Fisher Scientific Inc.); Esferas Magnéticas anti-c-Myc Pierce ™ (Thermo Fisher Scientific Inc.); Esferas Magnéticas de glutationa Pierce ™ (Thermo Fisher Scientific Inc.); Esferas Magnéticas de estreptavidina Pierce ™ (Thermo Fisher Scientific Inc.); Esferas Magnéticas MagnaBindTM (Thermo Fisher Scientific Inc.); Esferas Magnéticas Sera-MagTM (Thermo Fisher Scientific Inc.); Esferas Magnéticas Anti-FLAG® M2 (Sig ma-Aldrich); Partículas Magnéticas SPHEROTM (Spherotech Inc.); e Esferas Magnéticas Ni-NTA HisPurTM (Thermo Fisher Scientific Inc.).
[141] Em certas modalidades, a partícula é monodispersa, partículas de esferas superparamagnéticas compreendendo um núcleo de ferro superparamagnético, por exemplo, um núcleo de magnetita (Fe3O4) ou maghemita (γFe2O3), uma camada ou revestimento de poliestireno e uma superfície funcionalizada compreendendo grupos tosila expostos. Em certas modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, têm uma densidade de cerca de 1,5 g/cm3 e uma área de superfície de cerca de 1 m2/g a cerca de 4 m2/g. Em modalidades particulares, as partículas, por exemplo, esferas, são partículas superparamagnéticas monodispersas, por exemplo, esferas, que têm um diâmetro de cerca de 4,5 µm e uma densidade de cerca de 1,5 g/cm3. Em algumas modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, as partículas são partículas superparamagnéticas monodispersas que têm um diâmetro médio de cerca de 2,8 µm e uma densidade de cerca de 1,3 g/cm3.
2. Partículas de Oligômero
[142] Em algumas modalidades, a partícula é um oligômero ou polímero. Em algumas modalidades, a partícula é um oligômero ou um polímero composto de proteínas, por exemplo, estreptavidina. Em algumas modalidades, a partícula é um oligômero ou polímero que pode ser gerado pela ligação direta ou indireta de moléculas individuais de uma proteína, por exemplo, estreptavidina ou uma variante do mesmo, como existe naturalmente, seja pela ligação direta ou indireta de moléculas individuais de um monômero ou um complexo de subunidades que compõem uma molécula individual (por exemplo, ligante direta ou indiretamente dímeros, trímeros, tetrâmeros etc. de uma proteína, como ela existe naturalmente). Por exemplo, um homodímero ou heterodímero tetramérico de estreptavidina ou avidina pode ser referido como uma molécula individual ou o menor bloco de construção de um respectivo oligômero ou polímero. Em algumas modalidades, o oligômero ou polímero pode conter ligação de pelo menos 2 moléculas individuais da proteína (por exemplo, é um 2-mer), ou pode ser pelo menos um 3-mer, 4-mer, 5-mer, 6-mer, 7-mer, 8-mer, 9-mer, 10-mer, 11-mer, 12-mer, 13-mer, 14-mer, 15-mer, 16-mer, 17- mer, 18-mer, 19-mer, 20-mer, 25-mer, 30-mer, 35-mer, 40-mer, 45-mer ou 50-mer de moléculas individuais da proteína (por exemplo, monômeros, tetrâmeros). Em algumas modalidades, o reagente é um multímero, ou o reagente oligomérico é um reagente multimérico. Em modalidades particulares, a partícula é um oligômero ou polímero que compreende estreptavidina ou muteína de estreptavidina (por exemplo, STREP-TACTIN® ou STREP-TACTIN® ou STREP-TACTIN® XT estreptavidina muteínas).
[143] Os oligômeros podem ser gerados usando quaisquer métodos conhecidos na técnica, tal como os descritos no pedido de
Patente U.S. publicado US2004/0082012. Em algumas modalidades, o oligômero ou polímero compreende duas ou mais moléculas individuais que podem ser reticuladas, como por um polissacarídeo ou um ligante bifuncional.
[144] Em algumas modalidades, a partícula é um oligômero ou polímero que é obtido reticulando moléculas individuais ou um complexo de subunidades que compõem uma molécula individual na presença de um polissacarídeo. Em algumas modalidades, as partículas são oligômeros ou polímeros que podem ser preparados pela introdução de resíduos carboxila em um polissacarídeo, por exemplo, dextrano. Em alguns aspectos, moléculas individuais da partícula (por exemplo, monômeros, tetrâmeros) podem ser acopladas por meio de grupos amino primários de resíduos de lisina internos e/ou o N-terminal livre aos grupos carboxila no esqueleto de dextrano usando química convencional de carbodi-imida. Em algumas modalidades, a reação de acoplamento é realizada a uma razão molar de cerca de 60 moles de moléculas individuais do reagente (por exemplo, monômeros, tetrâmeros) por mole de dextrano.
[145] Em algumas modalidades, a partícula é um oligômero ou polímero de uma ou mais estreptavidina ou avidina ou de qualquer análogo ou muteína de estreptavidina (por exemplo, Strep-Tactin® ou Strep-Tactin® XT) ou analógico ou muteína de avidina (por exemplo, neutravidina). Em algumas modalidades, a avidina ou estreptavidina compreende um sítio de ligação Z que é um sítio de ligação de biotina natural à avidina ou estreptavidina, para o qual pode haver até quatro sítios de ligação em uma molécula individual (por exemplo, um tetrâmero contém quatro sítios de ligação Z), em que um homotetrâmero pode conter até 4 sítios de ligação iguais, ou seja, Z1, enquanto um heterotetrâmero pode conter até 4 sítios de ligação que podem ser diferentes, por exemplo, contendo Z1 e Z2. Em algumas modalidades,
o oligômero é gerado ou produzido a partir de uma pluralidade de moléculas individuais (por exemplo, uma pluralidade de homotetrâmeros) da mesma estreptavidina, estreptavidina muteína, avidina ou avidina muteína, caso em que cada sítio de ligação Z, por exemplo, Z1, do oligômero é o mesmo. Por exemplo, em alguns casos, um oligômero pode conter uma pluralidade de sítios de ligação Z1, como pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50 ou mais sítios de ligação Z1. Em algumas modalidades, o oligômero é gerado ou produzido a partir de uma pluralidade de moléculas individuais que podem ser heterotetrâmeros de uma estreptavidina, estreptavidina muteína, avidina ou avidina muteína e/ou de uma pluralidade de duas ou mais moléculas individuais diferentes (por exemplo, homotetrâmeros diferentes) de estreptavidina, estreptavidina muteína, avidina ou avidina muteína que diferem em seus sítios de ligação Z, por exemplo, Z1 e Z2, caso em que uma pluralidade de diferentes sítios de ligação Z, por exemplo, Z1 e Z2, pode estar presente no oligômero. Por exemplo, em alguns casos, um oligômero pode conter uma pluralidade de sítios de ligação Z1 e uma pluralidade de sítios de ligação Z, que, em combinação, podem incluir pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50 ou mais sítios de ligação combinados Z1 e Z2.
[146] Em algumas modalidades, a partícula é um oligômero ou polímero é obtido pela reticulação de moléculas individuais ou de um complexo de subunidades que compõem uma molécula individual utilizando um ligante bifuncional ou outro ligante químico, como avidina ou por outros métodos conhecidos na técnica. Em alguns aspectos, oligômeros ou polímeros reticulados de estreptavidina ou avidina ou de qualquer muteína ou análogo de estreptavidina ou avidina podem ser obtidos reticulando moléculas individuais de estreptavidina ou avidina por moléculas bifuncionais, servindo como ligante, como glutaraldeído ou por outros métodos descrito na técnica. É possível, por exemplo, gerar oligômeros de estreptavidina muteínas introduzindo grupos tiol na estreptavidina muteína (isso pode, por exemplo, ser feito reagindo a estreptavidina muteína com 2-iminotiolano (reagente de Traut) e ativando, por exemplo, uma reação separada, grupos amino disponíveis na estreptavidina muteína. Em algumas modalidades, essa ativação de grupos amino pode ser alcançada pela reação da estreptavidina muteína com um reticulador heterobifuncional disponível comercialmente, como sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclo- hexano-1-carboxilato (sulfo SMCC) ou succinimidil-6-[(β- maleimidopropionamido) hexanoato (SMPH) Em algumas tais modalidades, os dois produtos de reação assim obtidos são misturados, tipicamente levando à reação dos grupos tiol contidos no único lote de estreptavidina muteína modificada com os aminoácidos ativados (tal como pelas funções da maleimida) da outra batelada de estreptavidina muteína modificada. Como reação, são formados multímeros / oligômeros da estreptavidina muteína. Esses oligômeros podem ter qualquer número adequado de moléculas individuais, como pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50 ou mais, e o grau de oligomerização pode variar de acordo com a condição de reação.
[147] Em algumas modalidades, o reagente oligomérico ou polimérico pode ser isolado via cromatografia de exclusão de tamanho e qualquer porção desejada pode ser usada como partícula. Em algumas modalidades, após a reação da estreptavidina muteína modificada na presença de 2-iminotiolano e um reticulador heterobifuncional como o sulfo SMCC, o reagente oligomérico ou polimérico pode ser isolado via cromatografia de exclusão de tamanho e qualquer porção desejada pode ser usada como partícula. Em algumas modalidades, os oligômeros não têm (e não precisam ter) um único peso molecular, mas podem observar uma distribuição estatística de peso, como a distribuição Gaussiana. Em alguns casos, qualquer oligômero com mais de três tetrâmeros estreptavidina ou muteína, por exemplo, homotetrâmeros ou heterotetrâmeros, pode ser usado como partícula solúvel, como geralmente 3 a 50 tetrâmeros, por exemplo, homotetrâmeros ou heterotetrâmeros, 10 a 40 tetrâmeros, por exemplo, homotetrâmeros ou heterotetrâmeros ou 25 a 35 tetrâmeros, por exemplo, homotetrâmeros ou heterotetrâmeros. Os oligômeros podem ter, por exemplo, de 3 a 25 tetrâmeros de estreptavidina-muteína, por exemplo, homotetrâmeros ou heterotetrâmeros. Em alguns aspectos, com um peso molecular de cerca de 50 kDa para muteínas de estreptavidina, os oligômeros solúveis podem ter um peso molecular de cerca de 150 kDa a 2000 kDa, 150 kDa a 1500 kDa, 150 kDa a 1250 kDa, 150 kDa a 1000 kDa, 150 kDa a 500 kDa ou 150 kDa a 300 kDa, 300 kDa a 2000 kDa, 300 kDa a 1500 kDa, 300 kDa a 1250 kDa, 300 kDa a 1000 kDa, 300 kDa a 500 kDa, 500 kDa a 2000 kDa, 500 kDa a 1500 kDa, 500 kDa a 1250 kDa, 500 kDa a 1000 kDa, 1000 kDa a 2000 kDa, 1000 kDa a 2000 kDa, 1000 kDa a 1250 kDa, 1250 kDa a 2000 kDa ou 1500 kDa a 2000 kDa. Geralmente, porque cada molécula de estreptavidina / muteína tem quatro sítios de ligação de biotina, esse reagente pode fornecer 12 a 160 sítios de ligação Z, como 12 a 100 sítios de ligação Z. B. Moléculas de Ligação
[148] São fornecidas aqui moléculas de ligação, por exemplo, antígenos polipeptídicos ou anticorpos, que se ligam ou são reconhecidos por um domínio de ligação de antígeno de um receptor recombinante, como um CAR, que é conjugado ou unido a uma partícula, por exemplo, uma partícula de esfera. Em algumas modalidades, a molécula de ligação é um polipeptídeo. Em certas modalidades, a molécula de ligação inclui qualquer polipeptídeo para o qual um receptor recombinante, tal como receptor de antígeno, por exemplo, CAR, pode ser projetado para se ligar ou reconhecer. Em modalidades particulares, a molécula de ligação é um anticorpo anti- idiotipo que se liga a ou reconhece o domínio de ligação de antígeno de um receptor recombinante, tal como um receptor de antígeno, por exemplo, um CAR. Em modalidades particulares, a molécula de ligação é um polipeptídeo que é ligado ou é reconhecido pelo domínio de ligação de antígeno de um receptor recombinante, como um receptor de antígeno, por exemplo, um CAR. Em certas modalidades, a molécula de ligação é um polipeptídeo que é ligado ou é reconhecido pelo domínio de ligação de antígeno de um CAR.
[149] Em algumas modalidades, a molécula de ligação se liga a ou é reconhecida por um CAR que não compreende um domínio transmembranar ou um domínio de sinalização intracelular de um receptor do tipo imunoglobulina (KIR) de células assassinas. Em certas modalidades, a molécula de ligação se liga a ou é reconhecida por um CAR que não compreende um domínio transmembranar ou um domínio intracelular de qualquer um de KIR2DS2, KIR2DL3, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1, KIR2DS1, KIR2DS1, KIR2DS1, KIR2DS1, KIR2DS1, KIR2DS1, KIR2DS1, KIR2DS1, KIR3DL1, KIR3DS1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIR2DP1 e KIR3DP1. I. Antígenos
[150] Em algumas modalidades, a molécula de ligação é um antígeno, por exemplo, um antígeno recombinante ou seu fragmento. Em certas modalidades, o antígeno é um polipeptídeo, ou uma porção de um polipeptídeo, que está associado a uma doença, por exemplo, um câncer. Em algumas modalidades, o antígeno é um polipeptídeo, ou uma variante ou fragmento de um polipeptídeo que é expresso na superfície de uma célula que está associada a uma doença, por exemplo, uma célula cancerígena e/ou uma célula tumoral.
[151] Em algumas modalidades, o antígeno é ou inclui integrina αvβ6 (integrina avb6), antígeno de maturação de células B (BCMA), B7- H3, B7-H6, anidrase carbônica 9 (CA9, também conhecida como CAIX ou G250), um antígeno para testagem de câncer, antígeno câncer / teste 1B (CTAG, também conhecido como NY-ESO-1 e LAGE-2), antígeno carcinoembrionário (CEA), uma ciclina, ciclina A2, ligante 1 de quimiocina de motivo CC (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, proteoglicano sulfato de condroitina 4 (CSPG4), proteína do fator de crescimento epidérmico (EGFR), mutação do receptor do fator de crescimento epidérmico tipo III (EGFR vIII), glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), efrinaB2, receptor de efrina A2 (EPHa2), receptor de estrogênio, receptor Fc tipo 5 (FCRL5; também conhecido como Homólogo 5 do receptor Fc ou FCRH5), receptor da acetilcolina fetal (AchR fetal), uma proteína de ligação ao folato (FBP), receptor alfa de folato, gangliosídeo GD2, GD2 O-acetilado (OGD2), gangliosídeo GD3, glicoproteína 100 (gp100), glipican-3 (GPC3), Receptor 5D acoplado à proteína G (GPRC5D), Her2/neu (receptor de tirosina quinase erb-B2), Her3 (erb- B3), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), dímeros de erbB, Antígeno associado ao melanoma de alto peso molecular humano (HMW-MAA), antígeno de superfície da hepatite B, antígeno leucocitário humano A1 (HLA-A1), antígeno leucocitário humano A2 (HLA-A2), receptor alfa de IL-22 (IL- 22Rα), Receptor alfa-2 de IL-13 (IL-13Rα2), receptor do domínio de inserção de quinase (kdr), cadeia leve kappa, molécula de adesão de células L1 (L1-CAM), epítopo CE7 de L1-CAM, repetição rica em leucina que contém membro A da família 8 (LRRC8A), Lewis Y, antígeno associado ao melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE- A10, mesotelina (MSLN), c-Met, citomegalovírus murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, ligantes de membro D de grupo 2 de assassinas naturais (NKG2D), melan A (MART-1), molécula de adesão de células neurais (NCAM), antígeno oncofetal, antígeno preferivelmente expresso do melanoma (PRAME), receptor de progesterona, antígeno prostático específico, antígeno prostático de células-tronco (PSCA), antígeno prostático específico de membrana (PSMA), receptor de tirosina quinase tipo receptor órfão 1 (ROR1), survivina, glicoproteína trofoblástica (TPBG também conhecida como 5T4), glicoproteína 72 associada ao tumor (TAG72), proteína 1 relacionada à tirosinase (TRP1, também conhecida como TYRP1 ou gp75), proteína 2 relacionada à tirosinase (TRP2, também conhecida como dopacromo tautomerase, dopacromo delta-isomerase ou DCT), receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), receptor 2 do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR2), tumor de Wilms 1 (WT-1), um antígeno específico ao patógeno ou expresso ao patógeno, ou um antígeno associado a um marcador universal e/ou moléculas biotiniladas e/ou moléculas expressas pelo HIV, HCV, HBV ou outros patógenos. Os antígenos direcionados pelos receptores em algumas modalidades incluem antígenos associados a uma malignidade de células B, como qualquer um de vários marcadores conhecidos de células B. Em algumas modalidades, o antígeno é ou inclui CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igkappa, Iglambda, CD79a, CD79b ou CD30.
[152] Em algumas modalidades, a molécula de ligação compreende uma porção de um antígeno de polipeptídeo que é reconhecido por ou ligado por um receptor recombinante e/ou um CAR. Em modalidades particulares, a molécula de ligação compreende um epítopo que é reconhecido por ou ligado por um receptor recombinante e/ou um CAR. Em certas modalidades, a porção do antígeno de polipeptídeo contém, aproximadamente, ou contém pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 400 ou 500 aminoácidos, em alguns casos aminoácidos contíguos, do polipeptídeo reconhecido por ou ligado por um receptor recombinante e/ou um CAR. Em certas modalidades, a porção polipeptídica compreende uma sequência de aminoácidos do epítopo que é reconhecida pelo receptor recombinante e/ou CAR.
[153] Em certas modalidades, a molécula de ligação é uma variante de polipeptídeo que contém, contém aproximadamente ou contém pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade de sequência de aminoácidos com um polipeptídeo que é ligado por e/ou reconhecido pelo receptor recombinante e/ou CAR.
[154] Em certas modalidades, uma partícula é ligada a uma molécula de ligação compreendendo uma porção do antígeno de polipeptídeo, em que a porção é uma porção de um antígeno que é ligado por e/ou reconhecido por, ou pode potencialmente ser ligado por ou reconhecido por um receptor recombinante, isto é, um CAR. Em algumas modalidades, a molécula de ligação compreende uma porção do antígeno que contém o epítopo que é reconhecido pelo receptor recombinante. Em certas modalidades, a porção do antígeno é uma porção de (...). Em algumas modalidades, o antígeno é ou inclui αvβ6 integrina (avb6 integrina), antígeno de maturação de células B (BCMA), B7-H3, B7-H6, anidrase carbônica 9 (CA9, também conhecido como CAIX ou G250), antígeno para testagem de câncer, antígeno de câncer / teste 1B (CTAG, também conhecido como NY-ESO-1 e LAGE-2), antígeno carcinoembrionário (CEA), ciclina, ciclina A2, CC Motivo quimioquina ligante 1 (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30,
CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, proteoglicano 4 de sulfato de condroitina (CSPG4), proteína do fator de crescimento epidérmico (EGFR), mutação do receptor do fator de crescimento epidérmico tipo III (EGFR vIII), glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), efrinaB2, receptor de efrina A2 (EPHa2), receptor de estrogênio, receptor Fc tipo 5 (FCRL5; também conhecido como homólogo 5 do receptor Fc ou FCRH5), receptor fetal de acetilcolina (AchR fetal), uma proteína de ligação ao folato (FBP), receptor de folato alfa, gangliosídeo GD 2, GD2 O- acetilado (OGD2), gangliosídeo GD3, glicoproteína 100 (gp100), glipican-3 (GPC3), Receptor 5D Acoplado à Proteína G (GPRC5D), Her2/neu (receptor de tirosina quinase erb-B2), Her3 (erb -B3), Her4 (erb-B4), dímeros de erbB, antígeno associado ao melanoma de alto peso molecular humano (HMW-MAA), antígeno de superfície da hepatite B, antígeno leucocitário humano A1 (HLA-A1), antígeno leucocitário humano A2 (HLA -A2), receptor alfa de IL-22 (IL-22Rα), receptor alfa de IL-13 (IL-13Rα2), receptor de domínio de inserção de quinase (kdr), cadeia leve kappa, molécula de adesão celular L1 (L1- CAM), CE7 epítopo de L1-CAM, repetição rica em leucina contendo membro A da família 8 (LRRC8A), Lewis Y, antígeno associado ao melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, mesotelina (MSLN), c-Met, citomegalovírus murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, ligantes do membro natural 2 do grupo assassino D (NKG2D), melan A (MART-1), molécula de adesão a células neurais (NCAM), antígeno oncofetal, antígeno preferivelmente expresso do melanoma (PRAME), receptor de progesterona, um antígeno prostático específco, antígeno prostático de células-tronco (PSCA), antígeno prostático específico de membrana (PSMA), receptor de tirosina quinase tipo receptor órfão 1 (ROR1), survivina, glicoproteína trofoblástica (TPBG também conhecida como 5T4), glicoproteína 72 associada a tumor
(TAG72), Proteína 1 relacionada à tirosinase (TRP1, também conhecida como TYRP1 ou gp75), proteína 2 relacionada à tirosinase (TRP2, também conhecida como tautomerase dopacromada, delta-isomerase dopacromada ou DCT), receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), fator de crescimento endotelial vascular receptor 2 (VEGFR2), tumor de Wilms 1 (WT-1), um antígeno de patógeno específico ou expresso por patógeno ou um antígeno associado a um marcador universal e/ou moléculas biotiniladas e/ou moléculas expressas por HIV, HCV, HBV ou outros patógenos. Os antígenos direcionados pelos receptores em algumas modalidades incluem antígenos associados a uma malignidade de células B, como qualquer um de vários marcadores conhecidos de células B. Em algumas modalidades, o antígeno é ou inclui CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igkappa, Iglambda, CD79a, CD79b ou CD30.
[155] Em certas modalidades, a partícula é ligada a uma molécula de ligação compreendendo uma porção de um polipeptídeo BCMA. Em algumas modalidades, a partícula é ligada a uma molécula de ligação compreendendo uma porção de um polipeptídeo CD22. Em certas modalidades, a partícula é ligada a uma molécula de ligação compreendendo uma porção de um polipeptídeo ROR1.
[156] Em certas modalidades, a porção do antígeno de polipeptídeo é uma porção de um polipeptídeo BCMA. Em certas modalidades, o antígeno de polipeptídeo contém, contém aproximadamente ou contém pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade de sequência de aminoácidos com pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 35, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 55, pelo menos 60, pelo menos 65, pelo menos 70, pelo menos 70, pelo menos 75, pelo menos 80, pelo menos 85, pelo menos 90, pelo menos 95, pelo menos 100, pelo menos 110,
pelo menos 120, pelo menos 130, pelo menos 140, pelo menos 140, pelo menos 150, pelo menos 160, pelo menos pelo menos 170 ou pelo menos 180 aminoácidos contíguos de um polipeptídeo BCMA. Em modalidades particulares, a variante polipeptídica BCMA compreende uma sequência de aminoácidos que é, é aproximadamente ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 98% idêntica à sequência de aminoácidos de um epítopo de BCMA que é ligado e/ou reconhecido por um receptor recombinante e/ou um CAR.
[157] Em modalidades particulares, o antígeno é BCMA, ou uma porção ou variante do mesmo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo BCMA é um polipeptídeo BCMA de mamífero. Em modalidades particulares, o polipeptídeo BCMA é um polipeptídeo BCMA humano. Em algumas modalidades, o antígeno BCMA é ou compreende um domínio extracelular de BCMA ou uma porção do mesmo compreendendo um epítopo reconhecido por um receptor de antígeno, por exemplo, CAR. Em certas modalidades, o antígeno BCMA é ou compreende um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1 ou um fragmento do mesmo contendo pelo menos 50, pelo menos 55, pelo menos 60, pelo menos 65, pelo menos 70, pelo menos 75, pelo menos 80, pelo menos 85, pelo menos 90, pelo menos 95, pelo menos 100, pelo menos 110, pelo menos 120, pelo menos 120, pelo menos 130, pelo menos 140, pelo menos 150, pelo menos 160, pelo menos 170 ou pelo menos 180 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o antígeno BCMA é ou inclui a sequência apresentada em SEQ ID NO: 1 ou uma porção da mesma que é ou contém um epítopo reconhecido por um receptor de antígeno, por exemplo, CAR.
[158] Em algumas modalidades, o antígeno é ROR1, ou uma porção ou variante do mesmo. Em certas modalidades, o polipeptídeo ROR1 é mamífero. Em modalidades particulares, o polipeptídeo ROR1 é humano. Em algumas modalidades, o antígeno ROR1 é ou compreende um domínio extracelular de ROR1 ou uma porção do mesmo compreendendo um epítopo reconhecido por um receptor de antígeno, por exemplo, CAR. Em algumas modalidades, o antígeno ROR1 é um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 31 ou um fragmento do mesmo contendo pelo menos 50, pelo menos 55, pelo menos 60, pelo menos 65, pelo menos 70, pelo menos 75, pelo menos 80, pelo menos 85, pelo menos 90, pelo menos 95, pelo menos 100, pelo menos 110, pelo menos 120, pelo menos 130, pelo menos 130, pelo menos 140, pelo menos 150, pelo menos 160, pelo menos 170 ou pelo menos 180 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 31. Em algumas modalidades, o antígeno ROR compreende a sequência apresentada em SEQ ID NO: 31 ou uma porção da mesma compreendendo um epítopo reconhecido por um receptor de antígeno, por exemplo, CAR.
[159] Em algumas modalidades, o antígeno é CD22, ou uma porção ou variante do mesmo. Em certas modalidades, o polipeptídeo CD22 é mamífero. Em modalidades particulares, o polipeptídeo CD22 é humano. Em algumas modalidades, o antígeno é um domínio extracelular de CD22 ou uma porção do mesmo compreendendo um epítopo reconhecido por um receptor de antígeno, por exemplo, CAR. Em algumas modalidades, o antígeno é um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 29 ou um fragmento do mesmo contendo pelo menos 50, pelo menos 55, pelo menos 60, pelo menos 65, pelo menos 70, pelo menos 75, pelo menos 80, pelo menos 85, pelo menos 90, pelo menos 95, pelo menos 100, pelo menos 110, pelo menos 120, pelo menos 130, pelo menos 130, pelo menos 140, pelo menos 150, pelo menos pelo menos 160, pelo menos 170 ou pelo menos 180 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO:
29. Em algumas modalidades, o antígeno CD22 compreende a sequência apresentada em SEQ ID NO: 29 ou uma porção da mesma compreendendo um epítopo reconhecido por um receptor do antígeno, por exemplo, CAR.
[160] Em algumas modalidades, a porção do antígeno de polipeptídeo é uma porção de um polipeptídeo BCMA. Em certas modalidades, a porção do antígeno de polipeptídeo é uma porção de um polipeptídeo CD22. Em modalidades particulares, a porção do antígeno de polipeptídeo é uma porção de um polipeptídeo ROR1. Em certas modalidades, a porção do polipeptídeo contém pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 35, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 50, pelo menos 55, pelo menos 60, pelo menos 65, pelo menos 70, pelo menos 75, pelo menos 80, pelo menos 85, pelo menos 90, pelo menos 95, pelo menos 100, pelo menos 110, pelo menos 120, pelo menos 120, pelo menos 130, pelo menos 140, pelo menos 150, pelo menos 160, pelo menos 170 ou pelo menos 180 aminoácidos contíguos da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NOS: 1, 29 ou 31.
[161] Em algumas modalidades, a célula expressa um CAR que se liga a ou reconhece um marcador universal que pode ser fundido com um anticorpo ou um seu fragmento ou variante. Em modalidades particulares, as células que expressam esses CARs são capazes de reconhecer e matar especificamente células alvo, por exemplo, células tumorais, que foram ligadas por anticorpos que foram fundidos com o marcador universal. Um exemplo inclui, mas não está limitado a, células
T que expressam CAR anti-FITC podem se ligar e/ou reconhecer várias células cancerígenas humanas quando essas células são ligadas por anticorpos marcados com FITC reativos ao câncer. Assim, em algumas modalidades, o mesmo CAR que se liga ao marcador universal é útil para o tratamento de diferentes cânceres, desde que existam anticorpos disponíveis que reconheçam antígenos associados aos cânceres que contêm o marcador universal. Em modalidades particulares, uma partícula (por exemplo, uma partícula de esfera) compreende uma molécula de ligação exposta à superfície que compreende um antígeno, ou uma porção do mesmo, que se liga ou é reconhecido por um receptor de antígeno, por exemplo, CAR, que se liga a um marcador universal. Em certas modalidades, a molécula de ligação é um marcador universal ou uma porção do mesmo ligada ou reconhecida pelo receptor de antígeno, por exemplo, CAR.
[162] Modalidades particulares contemplam que qualquer domínio polipeptídico que possa ser fundido a um anticorpo, ou um fragmento de ligação de antígeno ou uma variante do mesmo, que não impeça a ligação do anticorpo ao seu respectivo alvo é adequado para uso como um marcador universal. Em algumas modalidades, uma partícula é ligada a uma molécula de ligação que compreende um marcador universal, ou uma sua porção, selecionada a partir do grupo que consiste em: FITC, estreptavidina, biotina, histidina, dinitrofenol, complexo proteico da clorofila peridinina, proteína fluorescente verde, PE, HRP, palmitoilação, nitrosilação, alcalanina fosfatase, glicose oxidase e proteína de ligação à maltose.
[163] Em algumas modalidades, a molécula de ligação é um multímero, por exemplo, um dímero, compreendendo dois ou mais antígenos polipeptídicos, ou porção ou variante dos mesmos, que é reconhecido e/ou ligado por um receptor recombinante, como um receptor de antígeno (por exemplo, um CAR). Em algumas modalidades, o antígeno de polipeptídeo, ou porção do mesmo, é idêntico. Em certas modalidades, o antígeno de polipeptídeo está ligado, direta ou indiretamente, a uma região ou domínio, por exemplo, um domínio de multimerização, que promove ou estabiliza a interação entre dois ou mais antígenos polipeptídicos por meio de interações complementares entre os domínios ou regiões. Em algumas modalidades, fornecer o antígeno de polipeptídeo como um multímero, por exemplo, dímero, fornece uma interação multivalente entre a molécula de ligação e o domínio de ligação de antígeno do receptor de antígeno, por exemplo, CAR, que, em alguns aspectos, pode aumentar a avidez da interação. Em algumas modalidades, uma avidez aumentada pode favorecer a atividade estimulatória ou agonista do receptor de antígeno, por exemplo, CAR, pela molécula de ligação conjugada à esfera.
[164] Em algumas modalidades, um polipeptídeo é unido direta ou indiretamente a um domínio de multimerização. Os domínios de multimerização exemplares incluem as sequências de imunoglobulinas ou porções das mesmas, zippers de leucina, regiões hidrofóbicas, regiões hidrofílicas e domínios de interação proteína-proteína compatíveis. O domínio de multimerização, por exemplo, pode ser uma região ou domínio constante de imunoglobulina, como, por exemplo, o domínio Fc ou porções do mesmo a partir de IgG, incluindo os subtipos IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4, IgA, IgE, IgD e IgM e suas formas modificadas. Em modalidades particulares, o antígeno de polipeptídeo é ligado, direta ou indiretamente, a um domínio Fc. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é um polipeptídeo de fusão compreendendo o antígeno do polipeptídeo ou uma porção do mesmo e o domínio Fc.
[165] Em modalidades particulares, uma molécula de ligação é um polipeptídeo de fusão que compreende um domínio Fc. Em algumas modalidades, o domínio Fc é composto pelo segundo e terceiro domínios constantes (isto é, domínios CH2 e CH3) da cadeia pesada de um isotipo IgG, IgA ou IgD, por exemplo, CH2 ou CH3 dos isotipos IgG, IgA e IgD. Em algumas modalidades, o domínio Fc é composto por três domínios constantes de cadeia pesada (isto é, domínios CH2, CH3 e CH4) de um isotipo IgM ou IgE. Em algumas modalidades, o domínio Fc pode ainda incluir uma sequência de dobradiça ou porção da mesma. Em certos aspectos, o domínio Fc contém parte ou todo o domínio de dobradiça de uma molécula de imunoglobulina mais um domínio CH2 e CH3. Em alguns casos, o domínio Fc pode formar um dímero de duas cadeias polipeptídicas unidas por uma ou mais ligações dissulfeto. Em algumas modalidades, o domínio Fc é derivado de uma imunoglobulina (por exemplo, IgG, IgA, IgM ou IgE) de um mamífero adequado (por exemplo, humano, camundongo, rato, cabra, ovelha ou macaco). Em algumas modalidades, o domínio Fc compreende domínios CH2 e CH3 de IgG. Em certas modalidades, o domínio Fc é fundido ao C-terminal do antígeno de polipeptídeo. Em modalidades particulares, o domínio Fc é fundido ao N-terminal do antígeno de polipeptídeo.
[166] Em algumas modalidades, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG, ou uma porção ou variante do mesmo. Em tão modalidades, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG humana, ou uma porção ou uma variante do mesmo, que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência para a sequência apresentada em SEQ ID NO: 2. Em modalidades particulares, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG humana do tipo selvagem, ou uma porção ou variante do mesmo. Em modalidades particulares, o domínio Fc é uma variante do domínio Fc de IgG1 humana do tipo selvagem.
[167] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de fusão compreende um domínio Fc variante. Em certas modalidades, o domínio Fc de IgG humana variante contém uma mutação, por exemplo, uma substituição, exclusão ou inserção, que reduz, diminui e/ou diminui o emparelhamento entre o domínio Fc e uma cadeia leve. Em algumas modalidades, o domínio Fc de IgG humana variante contém uma mutação que reduz a afinidade de ligação entre o domínio Fc e um Receptor Fc. Em modalidades particulares, o domínio Fc de IgG humana variante contém uma mutação que reduz, diminui e/ou diminui as interações, ou a probabilidade ou probabilidade de uma interação, entre o domínio Fc e um Receptor Fc. Em algumas modalidades, o domínio Fc de IgG humana variante contém uma mutação que reduz a afinidade de ligação entre o domínio Fc e uma proteína do sistema complemento. Em modalidades particulares, o domínio Fc de IgG humana variante contém uma mutação que reduz, diminui e/ou diminui as interações, ou a probabilidade ou probabilidade de uma interação, entre o domínio Fc e uma proteína do sistema complemento.
[168] Em algumas modalidades, a molécula de ligação compreende um domínio Fc de IgG1 humana variante. Em algumas modalidades, o domínio Fc de IgG humana variante contém uma substituição de cistina para serina na região de dobradiça do domínio Fc. Em algumas modalidades, o domínio Fc de IgG humana variante contém uma substituição de leucina para alanina na região de dobradiça do domínio Fc. Em modalidades particulares, o domínio Fc de IgG humana variante contém uma substituição de glicina por alanina na região de dobradiça. Em certas modalidades, o domínio Fc de IgG humana variante contém uma substituição de alanina para serina na região CH2 do domínio Fc. Em algumas modalidades, o domínio Fc de IgG humana variante compreende uma substituição de prolina para serina na região CH2 do domínio Fc. Em algumas modalidades, o domínio Fc de IgG humana variante compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido pela SEQ ID NO: 28.
[169] Em algumas modalidades, a molécula de ligação compreende um polipeptídeo de fusão compreendendo um domínio Fc, em que o domínio Fc está presente no C-terminal do polipeptídeo de fusão.
[170] Em algumas modalidades, a molécula de ligação é um polipeptídeo de fusão compreendendo um polipeptídeo BCMA, ou uma porção do mesmo, e um domínio Fc. Em algumas modalidades, o polipeptídeo BCMA ou uma porção do mesmo compreende uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% para SEQ ID NO: 1 e contém um epítopo reconhecido pelo receptor do antígeno, por exemplo, o CAR. Em algumas modalidades, o domínio Fc compreende uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o domínio Fc compreende uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 28 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% para SEQ ID NO: 28. Em algumas modalidades, o antígeno BCMA inclui BCMA, ou uma porção ou variante do mesmo, e um marcador ou um domínio de fusão, por exemplo, um domínio Fc. Em modalidades particulares, o antígeno BCMA contém toda ou uma porção da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 35 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,
96%, 97%, 98%, 99% para SEQ ID NO: 35, e que compreende um reconhecimento de epítopo por um receptor de antígeno, por exemplo, CAR.
[171] Em algumas modalidades, a molécula de ligação é um polipeptídeo de fusão compreendendo um polipeptídeo ROR1 ou uma porção do mesmo e um domínio Fc. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ROR1 ou uma porção do mesmo compreende uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 31 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% para SEQ ID NO: 31 e compreendendo um epítopo reconhecido pelo receptor do antígeno, por exemplo, CAR e um domínio Fc. Em algumas modalidades, o domínio Fc compreende uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o domínio Fc compreende uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 28 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% para SEQ ID NO: 28. Em certas modalidades, a molécula de ligação é um polipeptídeo de fusão compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 33 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87 %, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% para SEQ ID NO: 33 e que compreende um epítopo reconhecido por um receptor de antígeno, por exemplo, CAR.
[172] Em modalidades particulares, a molécula de ligação é um polipeptídeo de fusão compreendendo um polipeptídeo CD22 apresentado em SEQ ID NO: 29 ou parte dela ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% para SEQ ID NO: 29 e compreendendo um epítopo reconhecido pelo receptor de antígeno, por exemplo, CAR e um domínio Fc. Em algumas modalidades, o domínio Fc compreende uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o domínio Fc compreende uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 28 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% para SEQ ID NO: 28. Em certas modalidades, o polipeptídeo de fusão compreende uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 34 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% para SEQ ID NO: 34 e que compreende um epítopo reconhecido por um receptor de antígeno, por exemplo, CAR.
[173] Em algumas modalidades, o antígeno e o domínio de multimerização, como o domínio Fc, são unidos por um ligante, como um ligante de aminoácido. Em certas modalidades, o antígeno é fundido ao N-terminal de um ligante de aminoácido, e o domínio de multimerização, como o domínio Fc, é fundido ao C-terminal do ligante. Embora os ligantes de aminoácidos possam ter qualquer comprimento e conter qualquer combinação de aminoácidos, o comprimento do ligante pode ser relativamente curto (por exemplo, dez ou menos aminoácidos) para reduzir as interações entre os domínios ligados. A composição de aminoácidos do ligante também pode ser ajustada para reduzir o número de aminoácidos com cadeias laterais volumosas ou aminoácidos com probabilidade de introduzir estrutura secundária. Os ligantes de aminoácidos adequados incluem, mas não estão limitados a, aqueles com até 3, 4, 5, 6, 7, 10, 15, 20 ou 25 aminoácidos de comprimento. As sequências de ligantes de aminoácidos representativas incluem GGGGS (SEQ ID NO: 27) e ligantes compreendendo 2, 3, 4 ou 5 cópias de GGGGS (SEQ ID NO: 27).
[174] Em algumas modalidades, a molécula de ligação é um dímero formado por dois polipeptídeos de fusão Fc contendo um antígeno de polipeptídeo ou uma porção do mesmo, um domínio Fc, por exemplo, BCMA-Fc, ROR1-Fc ou CD22-Fc. Também são fornecidas moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer um dos polipeptídeos de fusão Fc. Também são fornecidos vetores, incluindo vetores de expressão, que codificam as moléculas de ácido nucleico. Em algumas modalidades, a molécula de ligação pode ser produzida nas células por expressão em uma célula hospedeira adequada. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma linhagem celular de mamífero. Exemplos de células de mamífero para expressão recombinante de proteínas incluem células HEK293 ou células CHO ou seus derivados. Em alguns aspectos, a molécula de ligação inclui ainda um peptídeo de sinal para secreção da célula. Em uma modalidade exemplar, o peptídeo de sinal é CD33 (por exemplo, apresentado em SEQ ID NO: 30). Em algumas modalidades, a proteína de fusão antígeno de polipeptídeo-Fc resultante, por exemplo, BCMA-Fc, ROR1- Fc ou CD22-Fc, podem ser expressos em células hospedeiras, por exemplo, transformado com os vetores de expressão, pelo qual a montagem entre os domínios Fc pode ocorrer por ligações dissulfeto intercadeia formadas entre as porções Fc para produzir uma proteína dimérica, como a proteína de fusão de antígeno de polipeptídeo divalente.
[175] Em modalidades particulares, a molécula de ligação é ou contém BCMA humano ou uma porção da mesma. Em algumas modalidades, a molécula de ligação compreende o domínio extracelular de BCMA humano. Em modalidades particulares, a molécula de ligação compreende uma porção de BCMA humano com uma sequência de polipeptídeo apresentado em SEQ ID NO: 1. Em modalidades particulares, a molécula de ligação é um polipeptídeo de fusão que compreende um domínio extracelular de BCMA humano e um domínio Fc. Em certas modalidades, o domínio Fc é uma variante de um domínio Fc de IgG1 humano. Em certas modalidades, o domínio Fc está posicionado no C-terminal do polipeptídeo de fusão. Em modalidades particulares, o polipeptídeo de fusão compreende uma porção de BCMA humano compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1 e um domínio variante de IgG1 Fc humano compreendendo um conjunto de aminoácidos apresentado em SEQ ID NO: 29. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de fusão compreende um ligante que une o polipeptídeo BCMA ao domínio Fc. Em modalidades particulares, o ligante tem uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 27. Em certas modalidades, a molécula de ligação é um polipeptídeo de fusão compreendendo um polipeptídeo BCMA humano (ou uma porção ou uma variante do mesmo) e um domínio Fc C-terminal e é conjugado à superfície ou de outra forma ligado a uma partícula ('por exemplo, partícula de esferas). Em modalidades particulares, o polipeptídeo de fusão é unido à partícula em um sítio dentro do domínio Fc. Em algumas modalidades, a partícula adicionalmente compreende um anticorpo conjugado à superfície ou um fragmento ou variante do mesmo, que se liga a ou reconhece CD28.
2. Anticorpos Anti-Idiotipo
[176] Em algumas modalidades, a molécula de ligação conjugada a uma partícula, por exemplo, esfera, como aqui fornecido é um anticorpo anti-idiotipo ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo ("anti-ID") que se liga a um receptor de antígeno alvo, por exemplo, CAR ou um fragmento ativo do mesmo. Em certas modalidades, a molécula de ligação é um anti-ID que se liga ao domínio de ligação de antígeno do CAR. Em modalidades particulares, o domínio de ligação de antígeno do CAR compreende um domínio scFv. Em algumas modalidades, a molécula de ligação é um anti-ID que se liga a um CAR no domínio de ligação de antígeno, e não se liga ao ligante ou região espaçadora do CAR que conecta o domínio de ligação de antígeno, por exemplo, um scFv, com um domínio transmembranar do CAR.
[177] Em algumas modalidades, o anti-ID é um anticorpo anti- idiotipo ou fragmentos de ligação de antígeno que reconhece especificamente um anticorpo que se liga a um antígeno alvo, como um antígeno alvo associado ou expresso em uma célula ou tecido de um doença ou condição, por exemplo, câncer. Em algumas modalidades, o anti-ID é um anticorpo anti-idiotipo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que reconhece especificamente um anticorpo alvo que se liga ao antígeno que é ou inclui (...). Em algumas modalidades, o antígeno é ou inclui αvβ6 integrina (avb6 integrina), antígeno de maturação de células B (BCMA), B7-H3, B7-H6, anidrase carbônica 9 (CA9, também conhecida como CAIX ou G250), um antígeno para testagem de câncer, antígeno de câncer / teste 1B (CTAG, também conhecido como NY-ESO-1 e LAGE-2), antígeno carcinoembrionário (CEA), uma ciclina, ciclina A2, ligante de quimiocina de motivo CC1 (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, proteoglicano 4 de sulfato de condroitina (CSPG4), proteína do fator de crescimento epidérmico (EGFR), mutação do receptor do fator de crescimento epidérmico tipo III (EGFR vIII), glicoproteína epitelial 2
(EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), efrinaB2, receptor de efrina A2 (EPHa2), receptor de estrogênio, receptor Fc tipo 5 (FCRL5; também conhecido como homólogo 5 do receptor Fc ou FCRH5), receptor de acetilcolina fetal (AchR fetal), uma proteína de ligação ao folato (FBP), receptor alfa de folato, gangliosídeo GD2, GD2 O-acetilado (OGD2), gangliosídeo GD3, glicoproteína 100 (gp100), glicanal 3 (GPC3), receptor 5D Acoplado à Proteína G (GPRC5D), Her2/neu (receptor de tirosina quinase erb-B2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), dímeros de erbB, antígeno associado ao melanoma de alto peso molecular humano (HMW-MAA), antígeno de superfície da hepatite B, antígeno leucocitário humano A1 (HLA-A1), antígeno leucocitário humano A2 (HLA-A2), receptor alfa de IL-22 (IL-22Rα), receptor alfa de IL-13 (IL-13Rα2), receptor de domínio de inserção de quinase (kdr), cadeia leve kappa, molécula de adesão de células L1 (L1-CAM), epítopo CE7 de L1-CAM, repetição rica em leucina contendo membro A da família 8 (LRRC8A), Lewis Y, antígeno associado a Melanoma (MAGE)- A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, mesotelina (MSLN), c-Met, citomegalovírus murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, ligantes de membro D de grup o2 de assassinas naturais (NKG2D), melan A (MART-1), molécula de adesão celular neural (NCAM), antígeno oncofetal, antígeno preferivelmente expresso do melanoma (PRAME), receptor de progesterona, antígeno prostático específico, antígeno prostático de células-tronco (PSCA), antígeno prostático específico de membrana (PSMA), receptor de tirosina quinase tipo receptor órfão 1 (ROR1), survivina, glicoproteína trofoblástica (TPBG também conhecida como 5T4), glicoproteína associada a tumores 72 (TAG72), proteína 1 relacionada à tirosinase (TRP1, também conhecida como TYRP1 ou gp75), proteína 2 relacionada à tirosinase (TRP2, também conhecida como tautomerase dopacromada), dopacromo delta-isomerase ou DCT), receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR),
receptor 2 do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR2), tumor 1 de Wilms (WT-1), um antígeno de patógeno específico ou expresso por patógeno ou um antígeno associado a um marcador universal e/ou moléculas biotiniladas e/ou moléculas expressas por HIV, HCV, HBV ou outros patógenos. Os antígenos direcionados pelos receptores em algumas modalidades incluem antígenos associados a uma malignidade de células B, como qualquer um de vários marcadores conhecidos de células B. Em algumas modalidades, o antígeno é ou inclui CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igkappa, Iglambda, CD79a, CD79b ou CD30.
[178] Em algumas modalidades, o anti-ID é um anticorpo anti- idiotipo ou fragmentos de ligação de antígeno que reconhece especificamente um anticorpo alvo que liga ROR1, antígeno de maturação das células B (BCMA), anidrase carbônica 9 (CAIX), Her2/neu (receptor de tirosina cinase erbB2), L1-CAM, CD19, CD20, CD22, mesotelina, CEA e antígeno de superfície da hepatite B, receptor antifolato, CD23, CD24, CD30, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), EPHa2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, dímerosd de erbB, EGFR vIII, proteína de ligação ao folato (FBP), FCRL5, FCRH5, receptor fetal de acetilcolina, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-alfa, IL-13R-alfa2, receptor de domínio de inserção de quinase (kdr), cadeia leve kappa, Lewis Y, molécula de adesão de células L1, (L1-CAM), antígeno associado ao melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, antígeno preferivelmente expresso do melanoma (PRAME), survivina, TAG72, B7-H6, receptor alfa-13 de IL-13 (IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY-ESO-1, PSCA, receptor-a de folato, CD44v6, CD44v7/8, avb6 integrina, 8H9, NCAM, receptores VEGF, 5T4, AchR fetal, ligantes NKG2D, CD44v6, antígeno duplo, antígeno para testagem de câncer, mesotelina, CMV de murino, mucina
1 (MUC1), MUC16, PSCA, NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, antígeno oncofetal, ROR1, TAG72, VEGF-R2, antígeno carcinoembrionário (CEA), antígeno prostático específico, PSMA, Her2/neu, receptor de estrogênio, receptor de progesterona, efrinaB2, CD123, c-Met, GD-2, GD2 O-acetilado (OGD2), CE7, Tumor 1 de Wilms (WT-1), uma ciclina, ciclina A2, CCL-1, CD138 ou um antígeno de patógeno específico.
[179] Em algumas modalidades, o anti-ID é um anticorpo anti- idiotipo ou fragmentos de ligação de antígeno ("anti-IDs") que reconhece especificamente uma porção de anticorpo anti-CD19 alvo. Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos reconhecem um anticorpo anti- CD19 alvo que é SJ25C1 ou um fragmento de ligação de antígeno ou é um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno derivado de SJ25C1. Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos reconhecem um anticorpo anti-CD19 alvo que é FMC63 ou um fragmento de ligação de antígeno é um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno derivado de FMC63.
[180] SJ25C1 é um anticorpo IgG1 monoclonal de camundongo criado contra células Nalm-1 e -16 que expressam CD19 de origem humana (Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302). O anticorpo SJ25C1 compreende CDRH1, H2 e H3 apresentado em SEQ ID NOS: 40-42, respectivamente, e sequências CDRL1, L2 e L3 apresentadas em SEQ ID NOS: 43-45, respectivamente. O anticorpo SJ25C1 compreende a região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 e a região variável de cadeia leve (VL) compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37.
[181] Em algumas modalidades, o anticorpo alvo é SJ25C1 ou um anticorpo derivado de SJ25C1. Em algumas modalidades, o anticorpo derivado de SJ25C1 "é um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno que compreende a VH e/ou VL de SJ25C1, o idiotipo de SJ25C1, o parátopo de SJ25C1 ou uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de SJ25C1. Em algumas modalidades, o anticorpo alvo que é SJ25C1 ou um anticorpo derivado de SJ25C1 é um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreende a VH de SJ25C1 apresentado em SEQ ID NO: 36 ou uma variante do mesmo com pelo menos 90% de identidade de sequência apresentada em SEQ ID NO: 36 e/ou a VL de SJ25C1 apresentado em SEQ ID NO: 37, ou uma variante do mesmo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 37. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreende a VH de SJ25C1 apresentado em SEQ ID NO: 36, ou uma variante do mesmo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36 e a VL de SJ25C1 apresentado em SEQ ID NO: 37, ou uma variante do mesmo com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:
37. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreende a VH e a VL de SJ25C1 estabelecidos nas SEQ ID NO: 36 e SEQ ID NO: 37, respectivamente. Em algumas modalidades, a variante tem pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36 e/ou SEQ ID NO: 37.
[182] Em algumas modalidades, o anticorpo alvo que é SJ25C1 ou um anticorpo derivado de SJ25C1 é um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreende uma ou mais CDRs de cadeia pesada (CDR-H) de SJ25C1 VH apresentado em SEQ ID NO: 36, como apresentado em SEQ ID NOS: 40-42 e/ou uma ou mais CDRs de cadeia leve (CDR-Ls) de SJ25C1 VL apresentado em SEQ ID NO: 37, como apresentado em SEQ ID NOS: 43 -45. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreende CDR-H3 de SJ25C1 (por exemplo, apresentado em SEQ ID NO: 42) e/ou CDR-L3 de SJ25C1 (por exemplo, apresentado em SEQ ID NO: 45). Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreende CDR-H3 e CDR-L3 de SJ25C1 (por exemplo, apresentado em SEQ ID NO: 42 e SEQ ID NO: 43, respectivamente). Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreende uma ou mais CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de SJ25C1 (por exemplo, apresentado em SEQ ID NOS: 40, 41, 42, respectivamente) e/ou uma ou mais CDR-L1, CDR-L2, uma CDR-L3 de SJ25C1 (por exemplo, apresentado em SEQ ID NOS: 43, 44, 45, respectivamente). Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de SJ25C1 (por exemplo, apresentado em SEQ ID NOS: 40, 41, 42, respectivamente) e/ou CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de SJ25C1 (por exemplo, apresentado em SEQ ID NOS: 43, 44, 45, respectivamente). Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de SJ25C1 (por exemplo, apresentado em SEQ ID NOS: 40, 41, 42, respectivamente) e CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de SJ25C1 (por exemplo, apresentado em SEQ ID NOS: 43, 44, 45, respectivamente). Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreende um fragmento de ligação de antígeno, como um fragmento de ligação de antígeno (Fab), um F(ab’)2, um Fab', uma variável de fragmento (Fv) ou um Fv de cadeia simples (scFv). Vide, por exemplo, Bejcek, B. E., et al. (1995). Cancer Research. 55 (11): 2346-2351.
[183] FMC63 é um anticorpo IgG1 monoclonal de camundongo criado contra células JVM3 que expressam CD19 de origem humana (Nicholson. et al. (1997). Molecular Immunology. 34 (16-17): 1157- 1165). O anticorpo FMC63 compreende CDRH1, H2 e H3 apresentado em SEQ ID NOS: 46-48, respectivamente, e as sequências CDRL1, L2 e L3 apresentadas em SEQ ID NOS: 49-51, respectivamente. O anticorpo FMC63 compreende a região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38 e a região variável de cadeia leve (VL) compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 39.
[184] Em algumas modalidades, o anticorpo alvo é FMC63 ou um anticorpo derivado de FMC63. Em algumas modalidades, o anticorpo derivado de FMC63 é um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno que compreende a VH e/ou VL de FMC63, o idiotipo de FMC63, o parátopo de FMC63 ou uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de FMC63. Em algumas modalidades, o anticorpo alvo que é FMC63 ou um anticorpo derivado de FMC63 é um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreende a VH de FMC63 apresentado em SEQ ID NO: 38, ou uma variante do mesmo com pelo menos 90% de identidade de sequência a SEQ ID NO: 38 e/ou a VL de FMC63 apresentado em SEQ ID NO: 39, ou uma variante do mesmo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 39. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreende a VH de FMC63 apresentado em SEQ ID NO: 38, ou uma variante do mesmo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 38 e a VL de FMC63 apresentado em SEQ ID NO: 39, ou uma variante do mesmo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 39. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreende a VH e a VL do FMC63 apresentado em SEQ ID NO: 38 e 39, respectivamente. Em algumas modalidades, a variante tem pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 38 e/ou SEQ ID NO: 39.
[185] Em algumas modalidades, o anticorpo alvo que é FMC63 ou um anticorpo derivado de FMC63 é um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreende uma ou mais CDRs de cadeia pesada
(CDR-H) de FMC63 VH apresentadas em SEQ ID NO: 38, como apresentado em SEQ ID NOS: 46-48 e/ou uma ou mais CDRs de cadeia leve (CDR-Ls) de FMC63VL apresentadas em SEQ ID NO: 39, como apresentado em SEQ ID NOS: 49-51 Em algumas modalidades, o anticorpo alvo que é FMC63 ou um anticorpo derivado de FMC63 é um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreende CDR-H3 de FMC63 (por exemplo, apresentado em SEQ ID NO: 48) e/ou CDR-L3 de FMC63 (por exemplo, apresentado em SEQ ID NO: 51). Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreende CDR-H3 (por exemplo, apresentado em SEQ ID NO: 48) e CDR-L3 de FMC63 (por exemplo, apresentado em SEQ ID NO: 51). Em algumas modalidades, o anticorpo alvo que é FMC63 ou um anticorpo derivado de FMC63 é um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreende uma ou mais CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de FMC63 (por exemplo, apresentado em SEQ ID NOS: 46, 47, 48, respectivamente) e/ou uma ou mais CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de FMC63 (por exemplo, apresentadas em SEQ ID NOS: 49, 50, 51, respectivamente). Em algumas modalidades, o anticorpo alvo que é FMC63 ou um anticorpo derivado de FMC63 é um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de FMC63 (por exemplo, apresentado em SEQ ID NOS: 46, 47, 48, respectivamente) e/ou CDR- L1, CDR-L2 e CDR-L3 de FMC63 (por exemplo, apresentado em SEQ ID NOS: 49, 50, 51, respectivamente). Em algumas modalidades, o anticorpo alvo que é FMC63 ou um anticorpo derivado de FMC63 é um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de FMC63 (por exemplo, apresentado em SEQ ID NOS: 46, 47, 48, respectivamente) e CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de FMC63 (por exemplo, apresentado em SEQ ID NOS: 49, 50, 51, respectivamente). Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreende um fragmento de ligação de antígeno, como um fragmento de ligação de antígeno (Fab), um F(ab’)2, um Fab', uma variável de fragmento (Fv) ou um Fv de cadeia simples (scFv).
[186] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-idiotipo fornecidos incluem anticorpos que se ligam especificamente a um domínio principal (Fv), tal como um Fv cadeia simples (scFv), derivado de SJ25C1 ou FMC63. Em algumas modalidades, os anticorpos anti- idiotipo se ligam especificamente a um epítopo ou região particular de um Fv, geralmente um epítopo ou região compreendendo uma ou mais regiões determinantes de complementaridade. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-idiotipo se ligam especificamente a um epítopo ou região que se sobrepõe a um parátopo Fv.
[187] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-idiotipo fornecidos incluem aqueles que se ligam especificamente a uma porção anti-CD19 derivada de SJ25C1 ou FMC63 que está contida como parte do domínio extracelular de um receptor de antígeno quimérico (CAR) alvo. Em algumas modalidades, o CAR alvo contém uma porção de ligação de antígeno que contém a molécula de anticorpo SJ25C1 ou FMC63 ou fragmento ou porção de ligação de antígeno do anticorpo SJ25C1 ou FMC63. Em algumas modalidades, o CAR alvo inclui um domínio de ligação de antígeno que é um scFv derivado das cadeias VH e VL do anticorpo SJ25C1 ou FMC63. Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo anti-idiotipo que se liga especificamente a um CAR anti-CD19 que contém um scFv derivado do anticorpo SJ25C1 ou FMC63. Recursos exemplares de CARs são descritos mais abaixo.
[188] O termo "anticorpo" aqui é usado no sentido mais amplo e inclui anticorpos policlonais e monoclonais, incluindo anticorpos intactos e fragmentos de anticorpos funcionais (ligação de antígeno), incluindo fragmentos de ligação de antígeno (Fab), fragmentos F(ab’)2, fragmentos Fab’, fragmentos Fv, fragmentos de IgG recombinante
(rIgG), fragmentos de anticorpo de cadeia única, incluindo fragmentos variáveis de cadeia única (scFv) e fragmentos de anticorpos de domínio único (por exemplo, sdAb, sdFv, nanocorpo). O termo abrange formas de imunoglobulinas modificadas por engenharia genética e/ou modificadas de outra forma, tais como intracorpos, pepticorpos, anticorpos quiméricos, anticorpos totalmente humanos, anticorpos humanizados e anticorpos heteroconjugados, anticorpos multiespecíficos, por exemplo, biespecíficos, diacorpos, triacorpos e tetrocorpos, di-scFv em tandem, tri-scFv em tandem. Salvo indicação em contrário, o termo "anticorpo" deve ser entendido como abrangendo fragmentos funcionais de anticorpos. O termo também abrange anticorpos intactos ou completos, incluindo anticorpos de qualquer classe ou subclasse, incluindo IgG e suas subclasses, IgM, IgE, IgA e IgD.
[189] O termo "anticorpo anti-idiotipo" refere-se a um anticorpo, incluindo seus fragmentos de ligação de antígeno, que reconhece especificamente, é especificamente direcionado e/ou se liga especificamente a um idiotipo de um anticorpo, como uma fragmento de ligação de antígeno. Os idiotipos de um anticorpo podem incluir, mas não estão limitados a, resíduos dentro de uma ou mais regiões (s) determinantes (s) de complementaridade (CDRs) do anticorpo, regiões variáveis do anticorpo e/ou porções parciais ou porções dessas regiões variáveis e/ou de tais CDRs e/ou qualquer combinação dos itens anteriores. A CDR pode ser uma ou mais selecionadas a partir do grupo que consiste em CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR- L3. As regiões variáveis do anticorpo podem ser regiões variáveis de cadeia pesada, regiões variáveis de cadeia leve ou uma combinação das regiões variáveis de cadeia pesada e regiões variáveis de cadeia leve. Os fragmentos ou porções parciais das regiões variáveis de cadeia pesada e/ou regiões variáveis de cadeia leve do anticorpo podem ser fragmentos incluindo 2 ou mais, 5 ou mais ou 10 ou mais aminoácidos contíguos, por exemplo, de ou de cerca de 2 a 100, 5 a 100, 10 a 100, 2 a 50, 5 a 50 ou 10 a 50 aminoácidos contíguos nas regiões variáveis de cadeia pesada ou nas regiões variáveis de cadeia leve do anticorpo; o idiotopo pode incluir vários trechos não contíguos de aminoácidos. Os fragmentos parciais das regiões variáveis de cadeia pesada e das regiões variáveis de cadeia leve do anticorpo podem ser fragmentos incluindo 2 ou mais, 5 ou mais ou 10 ou mais aminoácidos contíguos, por exemplo, de ou de 2 a 00, 5 a 100, 10 a 100, 2 a 50, 5 a 50 ou 10 a 50 aminoácidos contíguos dentro das regiões variáveis e, em algumas modalidades, contêm uma ou mais CDRs ou fragmentos de CDR. Os fragmentos de CDR podem ser consecutivos ou não consecutivos 2 ou mais, ou 5 ou mais aminoácidos dentro da CDR. Portanto, os idiotopos do anticorpo podem ser de ou entre 2 a 100, 5 a 100, 10 a 100, 2 a 50, 5 a 50 ou 10 a 50 aminoácidos contíguos contendo uma ou mais CDR ou um ou mais fragmentos de CDR dento das regiões variáveis de cadeia pesada ou das regiões variáveis de cadeia leve do anticorpo. Em outra modalidade, os idiotopos podem ser um único aminoácido que está localizado nas regiões variáveis do anticorpo, por exemplo, sítios CDR.
[190] Em algumas modalidades, o idiotopo é qualquer determinante antigênico único ou epítopo dentro da porção variável de um anticorpo. Em alguns casos, ele pode se sobrepor ao sítio de ligação de antígeno real do anticorpo e, em alguns casos, pode compreender sequências de regiões variáveis fora do sítio de ligação de antígeno do anticorpo. O conjunto de idiotopos individuais de um anticorpo é, em algumas modalidades, referido como o "idiotipo" desse anticorpo.
[191] Os termos "região determinante de complementaridade" e "CDR", sinônimo de "região hipervariável" ou "HVR", são conhecidos na técnica por se referirem a sequências não contíguas de aminoácidos nas regiões variáveis de anticorpos, que conferem especificidade de antígeno e/ou afinidade de ligação. Em geral, existem três CDRs em cada região variável de cadeia pesada (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3) e três CDRs em cada região variável de cadeia leve (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3). "Regiões estruturais" e "FR" são conhecidas na técnica por se referirem às porções não CDR das regiões variáveis de cadeias pesada e leve. Em geral, existem quatro FRs em cada região variável de cadeia pesada de comprimento completo (FR-H1, FR-H2, FR-H3 e FR-H4) e quatro FRs em cada região variável de cadeia leve de comprimento completo (FR- L1, FR-L2, FR-L3 e FR-L4).
[192] Os limites precisos da sequência de aminoácidos de uma determinada CDR ou FR podem ser facilmente determinados usando qualquer um de vários esquemas bem conhecidos, incluindo os descritos por by Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5º Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (esquema de numeração "Kabat"), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 (esquema de numeração "Chothia"), MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), "Antibody-antigen interactions: Contact analysis e binding site topography," J. Mol. Biol. 262, 732-745." (esquema de numeração "Contact"), Lefranc MP et al., "IMGT unique numbering for immunoglobulin e T cell receptor variable domains e Ig superfamily V-like domains," Dev Comp Immunol, Janeiro de 2003; 27(1): 55-77 (esquema de numeração "IMGT"), e Honegger A e Plückthun A, "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling e analysis tool," J Mol Biol, 8 de Junho de 2001;309(3): 657-70, (esquema de numeração "Aho").
[193] Os limites de uma determinada CDR ou FR podem variar dependendo do esquema usado para identificação. Por exemplo, o esquema Kabat é baseado em alinhamentos estruturais, enquanto o esquema Chothia é baseado em informações estruturais. A numeração para os esquemas de Kabat e Chothia baseia-se nos comprimentos de sequência da região de anticorpo mais comuns, com inserções acomodadas por letras de inserção, por exemplo, "30a" e exclusões que aparecem em alguns anticorpos. Os dois esquemas colocam determinadas inserções e exclusões ("indels") em posições diferentes, resultando em numeração diferencial. O esquema de contato é baseado na análise de estruturas cristalinas complexas e é semelhante em muitos aspectos ao esquema de numeração de Chothia.
[194] A Tabela 1, abaixo, lista limites de posição exemplares de CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 e CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, conforme identificados pelos esquemas Kabat, Chothia e Contat, respectivamente. Para CDR-H1, a numeração de resíduos é listada usando os esquemas de numeração Kabat e Chothia. As FRs estão localizadas entre CDRs, por exemplo, com FR-L1 localizada entre CDR- L1 e CDR-L2, e assim por diante. Note-se que, como o esquema de numeração Kabat mostrado coloca inserções em H35A e H35B, o final do loop Chothia CDR-H1 quando numerado usando a convenção de numeração Kabat mostrada varia entre H32 e H34, dependendo do comprimento do loop. Tabela 1 CDR Kabat Chothia Contact CDR-L1 L24--L34 L24--L34 L30--L36 CDR-L2 L50--L56 L50--L56 L46--L55 CDR-L3 L89--L97 L89--L97 L89--L96 CDR-H1 (Numeração1 Kabat) H31--H35B H26--H32..34 H30--H35B CDR-H1 (Numeração2 Chothia) H31--H35 H26--H32 H30--H35 CDR-H2 H50--H65 H52--H56 H47--H58 CDR-H3 H95--H102 H95--H102 H93--H101 1 - Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5ª ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD
2 - Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948
[195] Assim, a menos que seja especificado de outra forma, uma "CDR" ou "região determinante de complementaridade" ou CDRs especificadas individuais (por exemplo, "CDR-H1, CDR-H2) de um determinado anticorpo ou região do mesmo, como uma região variável deve ser entendido como abrangendo uma região determinante de complementaridade (ou específica), conforme definido por qualquer um dos esquemas mencionados acima. Por exemplo, onde se afirma que uma CDR específica (por exemplo, uma CDR-H3) contém a sequência de aminoácidos de uma CDR correspondente em uma determinada sequência de aminoácidos VH ou VL, entende-se que essa CDR tem uma sequência do CDR correspondente (por exemplo, CDR-H3) dentro da região variável, conforme definido por qualquer um dos esquemas mencionados acima. Em algumas modalidades, sequências CDR especificadas são especificadas.
[196] Da mesma forma, a menos que seja especificado de outra forma, uma FR ou FR (s) especificada (s) por exemplo (FR-H1, FR-H2), de um determinado anticorpo ou região do mesmo, como uma região variável do mesmo, deve compreender uma região de estrutura (ou a região específica) conforme definida por qualquer um dos esquemas conhecidos. Em alguns casos, o esquema para identificação de uma CDR, FR ou FR ou CDR específica é especificado, como a CDR, conforme definido pelo método Kabat, Chothia ou Contat. Em outros casos, é dada a sequência de aminoácidos específica de uma CDR ou FR.
[197] O termo "região variável" ou "domínio variável" refere-se ao domínio de um anticorpo de cadeia pesada ou leve que está envolvido na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo geralmente têm estruturas semelhantes, com cada domínio compreendendo quatro regiões estruturais conservadas (FRs) e três CDRs. (Vide, por exemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6ª ed., WH Freeman e Co., página 91 (2007). Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação de antígeno. Além disso, anticorpos que ligam um antígeno particular podem ser isolados usando um domínio VH ou VL de um anticorpo que liga o antígeno para rastrear uma biblioteca de domínios VL ou VH complementares, respectivamente. Vide, por exemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150: 880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352: 624-628 (1991).
[198] Entre os anticorpos fornecidos estão fragmentos de anticorpos. Um "fragmento de anticorpo" refere-se a uma molécula diferente de um anticorpo intacto que compreende uma porção de um anticorpo intacto que liga o antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a, Fv, Fab, Fab’, Fab'-SH, F(ab')2; diabetes; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única (por exemplo, scFv); e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo. Em modalidades particulares, os anticorpos são fragmentos de anticorpo de cadeia única compreendendo uma região variável de cadeia pesada e/ou uma região variável de cadeia leve, como scFvs.
[199] Anticorpos de domínio único são fragmentos de anticorpo compreendendo a totalidade ou uma parte do domínio variável de cadeia pesada ou toda ou uma porção do domínio variável de cadeia leve de um anticorpo. Em certas modalidades, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano.
[200] Os fragmentos de anticorpos podem ser produzidos por várias técnicas, incluindo, entre outros, a digestão proteolítica de um anticorpo intacto, bem como a produção por células hospedeiras recombinantes. Em algumas modalidades, os anticorpos são fragmentos produzidos de forma recombinante, como fragmentos que compreendem arranjos que não ocorrem naturalmente, como aqueles com duas ou mais regiões ou cadeias de anticorpos unidas por ligantes sintéticos, por exemplo, ligantes peptídicos e/ou que podem não ser ser produzido pela digestão enzimática de um anticorpo intacto de ocorrência natural. Em alguns aspectos, os fragmentos de anticorpo são scFvs.
[201] Um anticorpo "humanizado" é um anticorpo no qual todos ou substancialmente todos os resíduos de aminoácidos da CDR são derivados de CDRs não humanas e todos ou substancialmente todos os resíduos de aminoácidos da FR são derivados de FRs humanas. Um anticorpo humanizado pode opcionalmente incluir pelo menos uma porção de uma região constante de anticorpo derivada de um anticorpo humano. Uma "forma humanizada" de um anticorpo não humano, refere-se a uma variante do anticorpo não humano que foi submetido à humanização, tipicamente para reduzir a imunogenicidade para seres humanos, mantendo a especificidade e afinidade do anticorpo não humano parental. Em algumas modalidades, alguns resíduos FR em um anticorpo humanizado são substituídos por resíduos correspondentes de um anticorpo não humano (por exemplo, o anticorpo do qual os resíduos CDR são derivados), por exemplo, para restaurar ou melhorar a especificidade ou afinidade do anticorpo.
[202] Entre os anticorpos fornecidos estão os anticorpos humanos. Um "anticorpo humano" é um anticorpo com uma sequência de aminoácidos correspondente a de um anticorpo produzido por uma fonte humana, de célula humana, ou não humana que utiliza repertórios de anticorpos humanos ou outras sequências que codificam anticorpos, incluindo bibliotecas de anticorpos humanos. O termo exclui formas humanizadas de anticorpos não humanos compreendendo regiões de ligação a antígenos não humanos, tais como aquelas nas quais todas ou praticamente todas as CDRs não são humanas.
[203] Os anticorpos humanos podem ser preparados pela administração de um imunogênio a um animal transgênico que foi modificado para produzir anticorpos humanos intactos ou anticorpos intactos com regiões variáveis humanas em resposta ao desafio antigênico. Tais animais tipicamente contêm todos ou uma porção dos locais de imunoglobulina humana, que substituem os locais endógenos de imunoglobulina, ou que estão presentes de forma extracromossômica ou integrados aleatoriamente nos cromossomos do animal. Nesses animais transgênicos, os locais endógenos de imunoglobulina geralmente foram inativados. Os anticorpos humanos também podem ser derivados de bibliotecas de anticorpos humanos, incluindo bibliotecas de exibição de fagos e sem células, contendo sequências codificadoras de anticorpos derivadas de um repertório humano.
[204] Entre os anticorpos fornecidos estão os anticorpos monoclonais, incluindo fragmentos de anticorpos monoclonais. O termo "anticorpo monoclonal", conforme usado aqui, refere-se a um anticorpo obtido de ou dentro de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compõem a população são idênticos, exceto para possíveis variantes que contêm mutações de ocorrência natural ou resultantes durante a produção de uma preparação de anticorpo monoclonal, tais variantes geralmente presentes em pequenas quantidades. Em contraste com as preparações de anticorpos policlonais, que tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes epítopos, cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é direcionado contra um único epítopo em um antígeno. O termo não deve ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Um anticorpo monoclonal pode ser produzido por uma variedade de técnicas, incluindo, entre outras, a geração a partir de um hibridoma, métodos de DNA recombinante, exibição de fagos e outros métodos de exibição de anticorpos. a. Anticorpos derivados de SJ25C1
[205] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-idiotipo é específico para um anticorpo anti-CD19 alvo que é ou é derivado do anticorpo SJ25C1 ou de um fragmento de ligação de antígeno do mesmo.
[206] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-idiotipo ou seus fragmentos de ligação de antígeno incluem uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo pelo menos 90% de identidade de sequência tendo a sequência de aminoácidos da região VH apresentada em SEQ ID NO: 52, tais como pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência.
[207] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-idiotipo ou fragmentos de ligação de antígeno do mesmo inclui uma região variável de cadeia pesada (VH) contendo uma região determinante da complementaridade de cadeia pesada 3 (CDR-H3) tendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 53 ou 54 e/ou uma CDR- H3 contida na sequência variável de cadeia pesada (VH) apresentada em SEQ ID NO: 52.
[208] Em algumas tais modalidades, a região VH inclui uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (CDR-H1) compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 55, 56, 57 ou 58 e/ou uma CDR-H1 contida na sequência VH apresentada em SEQ ID NO: 52; e/ou uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 2 (CDR-H2) compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 59, 60, 61 ou 62 e/ou uma CDR-H2 contida na sequência VH apresentada em SEQ ID NO: 52.
[209] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-idiotipo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo inclui uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante da complementaridade de cadeia pesada 1 (CDR-H1), CDR-H2 e CDR-H3, em que a CDR-H1 compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 55, 56, 57 ou 58; a CDR-H2 compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 59, 60, 61 ou 62; e/ou a CDR-H3 compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 53 ou 54. Em algumas modalidades, são fornecidos anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos que incluem uma CDR-H1 tendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 55, 56, 57 ou 58; uma CDR-H2 tendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 59, 60, 61 ou 62; e uma CDR-H3 tendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 53 ou 54.
[210] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-idiotipo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que inclui uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (CDR-H1), uma CDR-H2 e uma CDR-H3, respectivamente, compreendendo o aminoácido sequências de uma CDR-H1, uma CDR-H2 e uma CDR-H3 contida na sequência de aminoácidos da região VH apresentada em SEQ ID NO: 52.
[211] Em algumas tais modalidades, a região VH contém uma região de estrutura 1 (FR1), uma FR2, uma FR3 e/ou uma sequência FR4 com pelo menos 90% de identidade de sequência, respectivamente, para uma FR1, FR2, FR3 e/ou FR4 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 52. Em algumas modalidades, a região VH contém uma região estrutural 1 (FR1), uma FR2, uma FR2, uma FR3 e/ou uma sequência FR4 tendo em pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 99% de identidade de sequência, respectivamente, para uma FR1, FR2, FR3 e/ou FR4 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:
52. Em algumas modalidades, a região VH contém uma região estrutural 1 (FR1), uma sequência FR2, uma FR3 e uma FR4 com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 99% de identidade de sequência, respectivamente, para uma FR1, FR2, FR3 e FR4 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 52.
[212] Em algumas tais modalidades, a região VH tem a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 52.
[213] Em algumas tais modalidades, o anticorpo anti-idiotipo ou fragmento de ligação de antígeno é apenas uma cadeia pesada, apenas uma VH e/ou não inclui uma VL ou uma porção de ligação de antígeno e/ou o sítio de ligação de antígeno do anticorpo ou fragmento anti- idiotipo inclui apenas resíduos da cadeia pesada e/ou não inclui resíduos de uma cadeia leve.
[214] Em algumas tais modalidades, o anticorpo ou fragmento anti- idiotipo não contém uma região variável de cadeia leve (VL), não contém uma CDR-L1, CDR-L2 e/ou CDR-L3 e/ou é um anticorpo de domínio único (sdAb) contendo apenas a região VH. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento é um sdAb que contém apenas uma região VH de qualquer uma como descrito.
[215] Em alguma modalidade s de qualquer um dos anticorpos ou fragmentos anti-idiotipo que contêm qualquer uma das sequências da região VH acima, o anticorpo ou fragmento anti-idiotipo adicionalmente compreende uma região variável de cadeia leve (VL). Em algumas tais modalidades, a região VL tem pelo menos 90% de identidade de sequência tendo a sequência de aminoácidos da região VL apresentada em SEQ ID NO: 63, como pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência tendo a sequência de aminoácidos da região VL apresentada em SEQ ID NO: 63.
[216] Em algumas tais modalidades, a região VL compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 3 (CDR-L3) compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 64 ou 65. Em algumas tais modalidades, o A região VL compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 3 (CDR- L3) tendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 64 ou 65.
[217] Em algumas tais modalidades, a região VL compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (CDR-L1) compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 66 ou 67 e/ou uma CDR-L1 contida dentro da sequência VL apresentada em SEQ ID NO: 63; e/ou uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 2 (CDR-L2) compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 68 ou 69 e/ou uma CDR-L2 contida na sequência VL apresentada em SEQ ID NO: 63. Em algumas tais modalidades, a região VL compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (CDR-L1) tendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 66 ou 67 e/ou uma CDR-L1 contida dentro a sequência VL apresentada em SEQ ID NO: 63; e/ou uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 2 (CDR-L2) tendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 68 ou 69, e/ou uma CDR-L2 contida na sequência VL apresentada em SEQ ID NO: 63.
[218] Em algumas tais modalidades, a região VL compreende uma CDR-L1 contendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 66 ou 67; uma CDR-L2 contendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 68 ou 69; e uma CDR-L3 contendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 64 ou 65.
[219] Em algumas tais modalidades, a região VL compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, respectivamente, compreendendo as sequências de aminoácidos de uma CDR-L1, uma CDR-L2 e uma CDR-
L3 contida na sequência de aminoácidos da região VL apresentada em SEQ ID NO: 63.
[220] Em algumas tais modalidades, a região VL compreende uma região estrutural 1 (FR1), uma FR2, uma FR3 e/ou uma FR4 com pelo menos 90% de identidade de sequência, respectivamente, para a FR1, FR2, FR3, e/ou FR4 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 63. Em algumas modalidades, a região VL compreende uma região estrutural 1 (FR1), uma sequência FR2, FR3 e/ou FR4 tendo pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 99% de identidade de sequência, respectivamente, para uma FR1, FR2, FR3 e/ou FR4 do aminoácido sequência apresentada em SEQ ID NO: 63. Em algumas modalidades, a região VL compreende uma região estrutural 1 (FR1), uma sequência FR2, uma FR3 e uma FR4 tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 99% de identidade de sequência, respectivamente, para uma FR1, FR2, FR3 e FR4 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 63.
[221] Em algumas tais modalidades, a região VL tem a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 63.
[222] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-idiotipo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende as sequências de aminoácidos das sequências CDR-H1, CDR-H2 e CDR- H3 contidas na sequência de aminoácidos da região VH apresentada em SEQ ID NO: 52; e/ou compreendem as sequências de aminoácidos das sequências CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 contidas na sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve (VL) apresentada em SEQ ID NO: 63.
[223] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-idiotipo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo inclui as regiões VH e VL tendo sequências de aminoácidos tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96 %, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID
NOS: 52 e 63, respectivamente.
[224] Em algumas modalidades, são fornecidos anticorpos anti- idiotipo ou seus fragmentos de ligação de antígeno que incluem as regiões VH e VL tendo sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NOS: 52 e 63, respectivamente.
[225] Em algumas tais modalidades, as regiões VH e VL incluem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 52 e 63, respectivamente.
[226] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-idiotipo específico para o anticorpo SJ25C1 ou um fragmento de ligação de antígeno é um fragmento de anticorpo de cadeia única, como um scFv ou um diacorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo de cadeia única inclui um ou mais ligantes que unem dois domínios ou regiões de anticorpo, como uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma cadeia leve variável (VL). O ligante é tipicamente um ligante de peptídeo, por exemplo, um ligante de peptídeo flexível e/ou solúvel. Entre os ligantes estão os ricos em glicina e serina e/ou em alguns casos treonina. Em algumas modalidades, os ligantes incluem ainda resíduos carregados como lisina e/ou glutamato, que podem melhorar a solubilidade. Em algumas modalidades, os ligantes incluem ainda um ou mais prolina.
[227] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-idiotipo é um anticorpo intacto ou anticorpo completo. Em algumas modalidades, o anti-ID pode conter pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina, como um ou mais domínios de região constante. Em algumas modalidades, as regiões constantes incluem uma região constante de cadeia leve (CL) e/ou uma região constante de cadeia pesada 1 (CH1). Em algumas modalidades, o anti-ID inclui um domínio CH2 e/ou CH3, como uma região Fc. Em algumas modalidades, a região Fc é uma região Fc de uma IgG humana, como IgG1 ou IgG4.
Em algumas modalidades, o anticorpo anti-idiotipo contém o domínio CH apresentado em SEQ ID NO: 115 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 115. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- idiotipo contém o domínio CL apresentado em SEQ ID NO: 118 ou uma porção do mesmo ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 118 ou uma porção da mesma.
[228] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-idiotipo específico para SJ25C1 compreende a sequência de cadeia pesada apresentada em SEQ ID NO: 116 ou uma sequência que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 116 e/ou compreende a sequência de cadeia leve definida em SEQ ID NO: 119 ou uma sequência que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 119. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-idiotipo específico para SJ25C1 compreende a sequência da cadeia pesada apresentada em SEQ ID NO: 116 e/ou a sequência da cadeia leve apresentada em SEQ ID NO:
119. Em algumas modalidades, a cadeia pesada e/ou cadeia leve do anticorpo anti-idiotipo adicionalmente compreende um peptídeo de sinal. Em alguns casos, o peptídeo de sinal tem a sequência apresentada em SEQ ID NO: 117 ou SEQ ID NO: 120.
[229] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-idiotipo é um fragmento de ligação de antígeno. Em algumas modalidades, o fragmento de ligação de antígeno é selecionado a partir do grupo que consiste em fragmentos de ligação de antígeno (Fab), fragmentos
F(ab’)2, fragmentos Fab', fragmentos Fv, um fragmento variável de cadeia única (scFv) ou um anticorpo de domínio único.
[230] Consequentemente, são fornecidos fragmentos de anticorpo de cadeia única, como scFvs e diacorpos, particularmente fragmentos de cadeia única humanos, tipicamente compreendendo ligantes que unem dois domínios ou regiões de anticorpo anti-idiotipo, como domínios VH e VL. O ligante é tipicamente um ligante de peptídeo, por exemplo, um ligante de peptídeo flexível e/ou solúvel, tal como um rico em glicina e serina.
[231] Em alguns aspectos, os ligantes ricos em glicina e serina (e/ou treonina) incluem pelo menos 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de tais aminoácidos (s). Em algumas modalidades, eles incluem pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 70% ou 75% de glicina, serina e/ou treonina. Em algumas modalidades, o ligante é composto substancialmente inteiramente de glicina, serina e/ou treonina. Os ligantes geralmente têm entre 5 e 50 aminoácidos de comprimento, tipicamente entre 10 e 10 ou cerca de 30, por exemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20., 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 e em alguns exemplos entre 10 e 25 aminoácidos de comprimento. Ligantes exemplares incluem ligantes com vários números de repetições da sequência GGGS (3GS; SEQ ID NO: 70) ou GGGGS (4GS; SEQ ID NO: 27), como entre 2, 3, 4 e 5 repetições dessa sequência . Ligantes exemplares incluem aqueles que possuem ou consistem em uma sequência apresentada em SEQ ID NO: 71 (GGGGSGGGGSGGGGS). Ligantes exemplares incluem ainda aqueles que possuem ou consistem na sequência apresentada em SEQ ID NO: 72 (GSTSGSGKPGSGEGSTKG).
[232] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-idiotipo incluem anticorpos isolados. Em algumas modalidades, o anti-ID é humanizado, recombinante e/ou monoclonal. Em algumas modalidades,
o anti-ID é humano. b. Anticorpos derivados de FMC63
[233] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-idiotipo é específico para um anticorpo anti-CD19 alvo que é ou é derivado do anticorpo FMC63 ou de um fragmento de ligação de antígeno do mesmo.
[234] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-idiotipo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo inclui uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo pelo menos 90% de identidade de sequência tendo a sequência de aminoácidos da região VH apresentada em SEQ ID NO: 73 ou 74, como pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência.
[235] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo inclui uma região VH com uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (CDR-H1) contendo a sequência de aminoácidos de GYX3FX5X6YX8MX10 (SEQ I D NO: 95), em que X3 é T ou S, X5 é T ou S, X6 é D ou R, X8 é Y ou W e X10 é K ou N; e/ou uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 2 (CDR-H2) contendo a sequência de aminoácidos de WIGX4IX6PX8X9X10X11TX13X14NQX17FKX20 (SEQ ID NO: 96), em que X4 é D ou M, X6 é N ou H, X6 é N ou S, X9 é N ou D, X10 é G ou S, X11 é G ou E, X13 é D ou R, X14 é Y ou L, X17 é N ou K e X20 é G ou D; e/ou uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 3 (CDR-H3) contendo a sequência de aminoácidos de AX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15 (SEQ ID NO: 97), em que X2 é R ou S, X3 é E ou I, X3 é E ou I, X4 é G ou Y, X5 é N ou Y, X6 é N ou E, X7 é Y ou nulo, X8 é G ou nulo, X9 é S ou nulo, X10 é R ou nulo, X10 é R ou nulo, X11 é D ou nulo, X12 é A ou nulo, X13 é M ou nulo, X14 é D ou E e X15 é Y ou A.
[236] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-idiotipo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo inclui uma região variável de cadeia pesada (VH) contendo uma região determinante da complementaridade de cadeia pesada 3 (CDR-H3) tendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 75, 76, 77 ou 78 e/ou uma CDR-H3 contida na sequência variável de cadeia pesada (VH) apresentada em SEQ ID NO: 73 ou 74.
[237] Em algumas tais modalidades, a região VH inclui uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (CDR-H1) compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 79, 80, 81, 82, 82, 83, 84, 85, ou 86, e/ou uma CDR-H1 contida na sequência VH apresentada em SEQ ID NO: 73 ou 74; e/ou uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 2 (CDR-H2) compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 ou 94 e/ou uma CDR-H2 contida na sequência VH apresentada em SEQ ID NO: 73 ou 74.
[238] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-idiotipo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo inclui uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma região determinante da complementaridade de cadeia pesada 1 (CDR-H1), CDR-H2 e CDR-H3, em que a CDR-H1 compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85 ou 86; a CDR- H2 compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 ou 94; e/ou a CDR-H3 compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 75, 76, 77 ou
78. Em algumas modalidades, são fornecidos anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos que incluem uma CDR-H1 tendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85 ou 86; uma CDR-H2 tendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 ou 94; e uma CDR-H3 tendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID
NO: 75, 76, 77 ou 78.
[239] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-idiotipo ou fragmentos de ligação de antígeno do mesmo inclui uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (CDR-H1), uma CDR-H2 e uma CDR-H3, respectivamente, compreendendo as sequências de aminoácidos de uma CDR-H1, uma CDR-H2 e uma CDR-H3 contida na sequência de aminoácidos da região VH apresentada em SEQ ID NO: 73 ou 74.
[240] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-idiotipo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo inclui uma CDR-H1 apresentada em SEQ ID NOS: 79, 81, 82, 83; uma CDR-H2 apresentada em SEQ ID NOS: 87, 89, 90, 91; e/ou uma CDR-H3 apresentada em SEQ ID NO: 71 ou 77. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-idiotipo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo inclui uma CDR-H1 apresentada em SEQ ID NO: 80, 84, 85 86; uma CDR-H2 apresentada em SEQ ID NO: 88, 92, 93, 94; e/ou uma CDR- H3 apresentada em SEQ ID NO: 76, 78, respectivamente.
[241] Em algumas tais modalidades, a região VH contém uma região de estrutura 1 (FR1), uma FR2, uma FR3 e/ou uma sequência FR4 com pelo menos 90% de identidade de sequência, respectivamente, para uma FR1, FR2, FR3 e/ou FR4 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 73 ou 74. Em algumas modalidades, a região VH contém uma região estrutural 1 (FR1), uma FR2, uma FR2, uma FR3 e/ou uma FR4 tendo pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 99% de identidade de sequência, respectivamente, para uma FR1, FR2, FR3 e/ou FR4 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 73 ou 74. Em algumas modalidades, a região VH contém uma região estrutural 1 (FR1), uma sequência FR2, uma FR3 e uma FR4 com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 99% de identidade de sequência, respectivamente, para uma FR1, FR2, FR3 e FR4 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 73 ou 74.
[242] Em algumas tais modalidades, a região VH tem a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 73 ou 74.
[243] Em algumas tais modalidades, o anticorpo anti-idiotipo ou fragmento de ligação de antígeno é apenas uma cadeia pesada, apenas uma VH e/ou não inclui uma VL ou uma porção de ligação de antígeno e/ou o sítio de ligação de antígeno do anticorpo ou fragmento anti- idiotipo inclui apenas resíduos da cadeia pesada e/ou não inclui resíduos de uma cadeia leve.
[244] Em algumas tais modalidades, o anticorpo ou fragmento anti- idiotipo não contém uma região variável de cadeia leve (VL), não contém uma CDR-L1, CDR-L2 e/ou CDR-L3 e/ou é um anticorpo de domínio único (sdAb) contendo apenas a região VH. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento é um sdAb que contém apenas uma região VH de qualquer uma como descrito.
[245] Em algumas modalidades de qualquer um dos anticorpos ou fragmentos anti-idiotipo que contêm qualquer uma das sequências da região VH acima, o anticorpo ou fragmento anti-idiotipo adicionalmente compreende uma região variável de cadeia leve (VL). Em algumas tais modalidades, a região VL tem pelo menos 90% de identidade de sequência tendo a sequência de aminoácidos da região VL apresentada em SEQ ID NO: 98 ou 99, como pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência de com a sequência de aminoácidos da região VL apresentada em SEQ ID NO: 98 ou 99.
[246] Em algumas modalidades, são fornecidos anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos que incluem uma região VH com uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (CDR-L1) contendo a sequência de aminoácidos de
X1AX3X4X5X6X7X8YX10X11WY (SEQ ID NO: 112), em que X1 é S ou R, X3 é S ou R, X4 é S ou G, X5 é G ou N, X6 é V ou I, X7 é I ou H, X7 é I ou H, X8 é N ou nulo, X10 é M ou L e X11 é Y ou A; e/ou uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 2 (CDR-L2) contendo a sequência de aminoácidos de X1X2X3YX5X6X7X8LAX11 (SEQ ID NO: 113), em que X1 é P ou L, X2 é W ou L, X3 é I ou V, X5 é L ou N, X6 é T ou A, X7 é S ou K, X8 é N ou T e X11 é S ou D; e/ou uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 3 (CDR-L3) contendo a sequência de aminoácidos de QX2X3X4X5X6PX8T (SEQ ID NO: 114), em que X2 é Q ou H, X3 é W ou F, X4 é S ou W, X5 é S ou W, X6 é N ou T e X8 é L ou Y.
[247] Em algumas quaisquer tais modalidades, a região VL compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 3 (CDR-L3) compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 100, 101, 102 ou 103. Em algumas quaisquer tais modalidades, a região VL compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 3 (CDR-L3) tendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 100, 101, 102 ou 103.
[248] Em algumas tais modalidades, a região VL compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (CDR-L1) compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 104, 105, 106 ou 107 e/ou uma CDR-L1 contida na sequência VL apresentada em SEQ ID NO: 98 ou 99; e/ou uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 2 (CDR-L2) compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 108, 109, 110 ou 111 e/ou uma CDR-L2 contida na sequência VL apresentada em SEQ ID NO: 98 ou 99. Em algumas tais modalidades, a região VL compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (CDR-L1) tendo a sequência de aminoácidos apresentada em
SEQ ID NO: 104, 105, 106, ou 107, e/ou uma CDR-L1 contida na sequência VL apresentada em SEQ ID NO: 98 ou 99; e/ou uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 2 (CDR-L2) tendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 108, 109, 110 ou 111 e/ou uma CDR-L2 contida na sequência VL apresentada em SEQ ID NO: 98 ou 99.
[249] Em algumas tais modalidades, a região VL compreende uma CDR-L1 contendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 104, 105, 106 ou 107; uma CDR-L2 contendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 108, 109, 110 ou 111; e uma CDR-L3 contendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 100, 101, 102 ou 103.
[250] Em algumas tais modalidades, a região VL compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, respectivamente, compreendendo as sequências de aminoácidos de uma CDR-L1, uma CDR-L2 e uma CDR- L3 contida na sequência de aminoácidos da região VL apresentada em SEQ ID NO: 98 ou 99.
[251] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-idiotipo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo inclui uma CDR-L1 apresentada em SEQ ID NOS: 104 ou 106; uma CDR-L2 apresentada em SEQ ID NOS: 108 ou 110; e/ou uma CDR-L3 apresentada em SEQ ID NO: 100 ou 101. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-idiotipo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo inclui uma CDR-L1 apresentada em SEQ ID NO: 105 ou 07; uma CDR-L2 apresentada em SEQ ID NO: 109 ou 111; e/ou uma CDR-L3 apresentada em SEQ ID NO: 102 ou 103, respectivamente.
[252] Em algumas tais modalidades, a região VL compreende uma região estrutural 1 (FR1), uma FR2, uma FR3 e/ou uma FR4 com pelo menos 90% de identidade de sequência, respectivamente, para a FR1, FR2, FR3, e/ou FR4 da sequência de aminoácidos apresentada em
SEQ ID NO: 98 ou 99. Em algumas modalidades, a região VL compreende uma região estrutural 1 (FR1), uma sequência FR2, uma FR2, uma FR3 e/ou FR4 tendo pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 99% de identidade de sequência, respectivamente, para uma FR1, FR2, FR3 e/ou FR4 do sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 98 ou 99. Em algumas modalidades, a região VL compreende uma região estrutural 1 (FR1), uma sequência FR2, uma FR3 e uma FR4 com pelo menos 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 99% de identidade de sequência, respectivamente, para uma FR1, FR2, FR3 e FR4 de a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 98 ou 99.
[253] Em algumas tais modalidades, a região VL tem a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 98 ou 99.
[254] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-idiotipo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende as sequências de aminoácidos das sequências de CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 contidas na sequência de aminoácidos da região VH apresentada em SEQ ID NO: 73 ou 74; e/ou compreendem as sequências de aminoácidos das sequências CDR-L1, CDR-L2 e CDR- L3 contidas na sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve (VL) apresentada em SEQ ID NO: 98 ou 99.
[255] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-idiotipo ou fragmentos de ligação de antígeno do mesmo inclui a região VH tendo sequências de aminoácidos tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NOS: 73 ou 74 e região VL tendo sequências de aminoácidos tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NOS: 98 ou 99.
[256] Em algumas modalidades, são fornecidos anticorpos anti- idiotipo ou seus fragmentos de ligação de antígeno que incluem a região
VH tendo sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NOS: 73 ou 74 e a região VL tendo sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NOS: 98 ou 99. Em algumas das modalidades, o anticorpo fornecido contém a região VH apresentada em SEQ ID NO: 73 e a região VL apresentada em SEQ ID NO: 98. Em algumas modalidades, o anticorpo fornecido contém a VH região apresentado em SEQ ID NO: 74 e a região VL apresentada em SEQ ID NOS: 99.
[257] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-idiotipo é um fragmento de anticorpo de cadeia única, como um scFv ou diacorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo de cadeia única inclui um ou mais ligantes que unem dois domínios ou regiões de anticorpo, como uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma cadeia leve variável (VL). O ligante é tipicamente um ligante de peptídeo, por exemplo, um ligante de peptídeo flexível e/ou solúvel. Entre os ligantes estão os ricos em glicina e serina e/ou em alguns casos treonina. Em algumas modalidades, os ligantes incluem ainda resíduos carregados, como lisina e/ou glutamato, que podem melhorar a solubilidade. Em algumas modalidades, os ligantes incluem ainda um ou mais prolina.
[258] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-idiotipo é um anticorpo intacto ou anticorpo completo. Em algumas modalidades, o anti-ID pode conter pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina, como um ou mais domínios de região constante. Em algumas modalidades, as regiões constantes incluem uma região constante de cadeia leve (CL) e/ou uma região constante de cadeia pesada 1 (CH1). Em algumas modalidades, o anti-ID inclui um domínio CH2 e/ou CH3, como uma região Fc. Em algumas modalidades, a região Fc é uma região Fc de uma IgG humana, como IgG1 ou IgG4. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-idiotipo contém o domínio CH apresentado em SEQ ID NO: 121 ou 127 ou uma porção do mesmo ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%,
87%, 88%, 89 %, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 121 ou 127 ou uma porção da mesma. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-idiotipo contém o domínio CL apresentado em SEQ ID NO: 124 ou 130 ou uma porção do mesmo ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89 %, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 124 ou 130 ou uma porção da mesma.
[259] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-idiotipo específico para SJ25C1 compreende a sequência de cadeia pesada apresentada em SEQ ID NO: 122 ou 128 ou uma sequência que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 122 ou 128 e/ou compreende a sequência de cadeia leve apresentada em SEQ ID NO: 125 ou 131 ou uma sequência que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 125 o 131. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-idiotipo específico para SJ25C1 compreende a sequência de cadeia pesada apresentada em SEQ ID NO: 122 e/ou a sequência da cadeia leve apresentada em SEQ ID NO: 131. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-idiotipo específico para SJ25C1 compreende a sequência de cadeia pesada apresentada em SEQ ID NO: 128 e/ou a sequência de cadeia leve apresentada em SEQ ID NO: 131. Em algumas modalidades, a cadeia pesada e/ou cadeia leve do anticorpo anti- idiotipo adicionalmente compreende um peptídeo de sinal. Em alguns casos, o peptídeo de sinal tem a sequência apresentada em SEQ ID NO: 123, 126, 129 ou 132.
[260] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-idiotipo é um fragmento de ligação de antígeno. Em algumas modalidades, o fragmento de ligação de antígeno é selecionado a partir do grupo que consiste em fragmentos de ligação de antígeno (Fab), fragmentos F(ab’)2, fragmentos Fab', fragmentos Fv, um fragmento variável de cadeia única (scFv) ou um anticorpo de domínio único.
[261] Consequentemente, são fornecidos fragmentos de anticorpos de cadeia única, como scFvs e diacorpos, particularmente fragmentos de cadeia única humana, compreendendo tipicamente ligante (s) que une dois domínios ou regiões de anticorpo anti-idiotipo, tais como domínios VH e VL. O ligante é tipicamente um ligante de peptídeo, por exemplo, um ligante de peptídeo flexível e/ou solúvel, tal como um rico em glicina e serina.
[262] Em alguns aspectos, os ligantes ricos em glicina e serina (e/ou treonina) incluem pelo menos 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de tais aminoácidos (s). Em algumas modalidades, eles incluem pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 70% ou 75% de glicina, serina e/ou treonina. Em algumas modalidades, o ligante é composto substancialmente inteiramente de glicina, serina e/ou treonina. Os ligantes geralmente têm entre 5 e 50 aminoácidos de comprimento, tipicamente entre 10 e 10 ou cerca de 30, por exemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 e, em alguns exemplos, entre 10 e 25 aminoácidos de comprimento. Ligantes exemplares incluem ligantes com vários números de repetições da sequência GGGS (3GS; SEQ ID NO: 70) ou GGGGS (4GS; SEQ ID NO: 27), como entre 2, 3, 4 e 5 repetições dessa sequência. Ligantes exemplares incluem aqueles que possuem ou consistem em uma sequência apresentada em SEQ ID NO: 71 (GGGGSGGGGSGGGGS). Ligantes exemplares incluem ainda aqueles que possuem ou consistem na sequência apresentada em SEQ ID NO: 72 (GSTSGSGKPGSGEGSTKG).
[263] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-idiotipo incluem anticorpos isolados. Em algumas modalidades, o anti-ID é humanizado, recombinante e/ou monoclonal. Em algumas modalidades, o anti-ID é humano.
3. Componentes Adicionais
[264] Em certas modalidades, partículas, por exemplo, partículas de esferas, compreendem uma molécula de ligação conjugada à superfície ou de outra forma ligada que se liga ou é reconhecida por um domínio de ligação de antígeno de um receptor recombinante, por exemplo, um CAR e um ou mais agentes adicionais que é capaz de se ligar e/ou reconhecer uma molécula adicional na célula. Em algumas modalidades, os um ou mais agentes adicionais é uma molécula de ligação adicional. Em algumas modalidades, as uma ou mais moléculas de ligação adicionais são anticorpos (ou fragmentos ou variantes dos mesmos) que se ligam a polipeptídeos (por exemplo, glicoproteínas) que se apresentam na superfície das células que expressam o receptor recombinante. Em modalidades particulares, a uma ou mais moléculas de ligação adicionais são polipeptídeos ou porções dos mesmos que se ligam a uma molécula da superfície celular, como um receptor, por exemplo, ativação, coestimulação ou correceptor, expresso na superfície de uma célula, como uma célula que expressa o receptor recombinante. Em modalidades particulares, as uma ou mais moléculas de ligação adicionais são ligantes ou porções dos mesmos que se ligam a polipeptídeos que estão presentes na superfície das células, como células que expressam o receptor recombinante. Em certas modalidades, os um ou mais agentes adicionais são expostos na superfície da partícula.
[265] Em modalidades particulares, os um ou mais agentes adicionais podem modular uma função das células, por exemplo, expansão, ligante-se à molécula adicional na superfície da célula. Em algumas modalidades, o agente se liga à molécula adicional na célula e ativa um sinal acessório na célula, ou seja, a ligação do agente adicional à molécula adicional na superfície da célula tem os mesmos efeitos ou similares em uma ou mais funções de células, por exemplo, expansão, como a ligação de uma molécula acessório à molécula adicional na superfície da célula. Em algumas modalidades, o agente adicional é um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a ou reconhece a molécula adicional na superfície celular. Em modalidades particulares, o agente é um ligante ou uma porção do mesmo que se liga a ou reconhece a molécula adicional na superfície da célula.
[266] Em algumas modalidades, a molécula reconhecida por ou ligada por um ou mais agentes adicionais é CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD25, CD27, CD28, CD29, CD31, CD44, CD45RA, CD45RO, CD54 (ICAM -1), CD127, MHCI, MHCII, CTLA-4, ICOS, ICOSL, PD-1 (CD279), PD-L1 (CD274, B7-H1), PDL2 (CD273, B7-DC), OX40 (CD134, TNFRSF4), OX-40L, DAP10, CD27L (CD70), 4-1BB (CD137), 4-1BBL, CD30L, LUZ, IL-2R, IL-12R, IL-1R, IL-15R; IFN-gama, TNF-alfaR, IL-4R, IL-10R, CD18/CDl 1a (LFA-1), CD62L (L-selectina), CD29/CD49d (VLA- 4), ligante Notch (por exemplo, tipo Delta) 1/4, Jagged 1/2, etc.), CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CXCR3, CTLA-4, LAG-3 (CD223), TIM-3, 4-1BB (CD137), GITR (TNFRSF18, AITR), CD40, CXCR2, antígenos associados a tumores (TAA), B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, GAL9, B7H3, B7H4, VISTA, KIR, 2B4 (pertence à família de moléculas CD2 e é expresso em todas as células T NK, γδ e CD8+ de memória (αβ)), CD160 (também conhecido como BY55), CGEN-15049, CEACAM (por exemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 e/ou CEACAM-5), TIGIT, CD155, CD155, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7- H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 ou CD270), LIGHT, KIR, A2aR, MHC classe I, MHC classe II, GAL9, adenosina ou um receptor de fator de crescimento transformante (TGFR; por exemplo, TGFR beta).
[267] Em algumas modalidades, as partículas, por exemplo,
esferas, compreendem uma superfície conjugada ou de outra forma ligada a uma molécula de ligação que se liga ou é reconhecida por um domínio de ligação de antígeno de um receptor recombinante, por exemplo, um CAR e um ou mais moléculas de ligação adicionais que se ligam a uma molécula de ponto de verificação, como um receptor inibidor ou receptor de ativação ou ligante do mesmo, em algumas modalidades, a molécula de ligação contém o domínio extracelular ou porção de ligação do mesmo de um receptor inibidor ou ligante do mesmo ou receptor ou ligante de ativação do mesmo. Em algumas modalidades, a molécula de ligação é fundida com um domínio de multimerização, como uma região ou domínio Fc. Em modalidades particulares, as partículas, por exemplo, esferas, compreendem uma molécula de ligação conjugada à superfície ou de outra forma unida que se liga ou é reconhecida por um domínio de ligação de antígeno de um receptor recombinante, por exemplo, um CAR e uma ou mais moléculas de ligação adicionais que se ligam a OX-40, ICOS, DAP10, CD28 ou 4- 1BB, CTLA-4, PD-1, LAG-3, Tim-3, BTLA ou TIGIT. Em algumas modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, compreendem uma molécula de ligação conjugada à superfície ou de outra forma ligada que se liga ou é reconhecida por um domínio de ligação de antígeno de um receptor recombinante, por exemplo, um CAR e uma ou mais moléculas de ligação adicionais que ligue a OX-40L, ICOSL, B7-1, B7-2 ou 4-1BBL, PD-L1, PD-L2, CD155, CD112 ou LIGHT.
[268] Em modalidades particulares, as partículas, por exemplo, esferas, compreendem uma molécula de ligação conjugada à superfície ou de outra forma unida que se liga ou é reconhecida por um domínio de ligação de antígeno de um receptor recombinante, por exemplo, um CAR e um ou mais adicionais moléculas de ligação, por exemplo, anticorpos ou fragmentos ou variantes dos mesmos, que se ligam a CD3 e/ou CD28. Em algumas modalidades, a uma ou mais moléculas adicionais se ligam a CD2 ou CD28. Em modalidades particulares, as partículas, por exemplo, esferas, compreendem uma molécula de ligação conjugada à superfície ou de outra forma ligada que se liga ou é reconhecida por um domínio de ligação de antígeno de um receptor recombinante, por exemplo, um CAR e uma ou mais moléculas de ligação adicionais que ligar ao CD28.
[269] Em algumas modalidades, a partícula contém uma molécula de ligação conjugada à superfície e um agente conjugado à superfície adicional que se liga ao CD2. Em certas modalidades, a partícula contém uma molécula de ligação conjugada à superfície e um anticorpo anti-CD2 conjugado à superfície. Em modalidades particulares, a partícula contém uma molécula de ligação conjugada à superfície e um agente conjugado à superfície adicional que se liga a CD28. Em várias modalidades, a partícula contém uma molécula de ligação à superfície conjugada e um anticorpo anti-CD28 conjugado à superfície. Em algumas modalidades, a partícula contém uma molécula de ligação conjugada à superfície e agentes conjugados à superfície adicionais que se ligam a CD2 e CD28. Em várias modalidades, a partícula contém uma molécula de ligação à superfície conjugada e anticorpos anti-CD2 e anti-CD28 conjugados à superfície. Em certas modalidades, a molécula de ligação é ou contém um fragmento contendo antígeno ou epítopo BCMA, ROR1 ou CD22. Em certas modalidades, a molécula de ligação é um anti-ID que se liga a ou reconhece um receptor recombinante, por exemplo, um CAR.
[270] Em modalidades particulares, a partícula contém um anti-ID conjugado à superfície, por exemplo, um anti-ID que se liga a ou reconhece um CAR, como um CAR anti_CD19, e um anticorpo anti-CD2 conjugado à superfície. Em certas modalidades, a partícula contém um anti-ID conjugado à superfície, por exemplo, um anti-ID que se liga a ou reconhece um CAR como um CAR anti_CD19 e um anticorpo anti-CD28 conjugado à superfície. Em várias modalidades, a partícula contém um anti-ID conjugado à superfície, por exemplo, um anti-ID que se liga a ou reconhece um CAR como um CAR anti_CD19 e anticorpos anti CD2 e anti-CD28 conjugados à superfície.
[271] Em algumas modalidades, a razão, como a razão molar ou em peso, da molécula de ligação e do agente ou molécula adicional é de cerca de 1:10 a 10:1, como 1:5 a 5:1 ou 1:2 ou 2:1 ou é cerca de 1:1. Em certas modalidades, a razão, como a razão molar ou em peso, da molécula de ligação para os dois agentes adicionais é ou é de cerca de 1:1: 1. C. Métodos de Conjugação
[272] São fornecidas aqui partículas (por exemplo, partículas de esferas) que são conjugadas e/ou ligadas a moléculas de ligação (por exemplo, antígeno de polipeptídeo ou anticorpo) que se ligam ou reconhecem um receptor recombinante (por exemplo, um CAR). Uma variedade de meios, bem conhecidos na técnica, pode ser usada para conjugar moléculas de ligação, por exemplo, antígenos polipeptídicos e anticorpos anti-idiotipo, a partículas (por exemplo, partículas de esferas). Esses métodos incluem qualquer química padrão que não destrua ou limite severamente a atividade biológica ou a estrutura da molécula de ligação e que permita que um número suficiente de moléculas de ligação seja conjugado à partícula de uma maneira que o que permite uma interação da molécula de ligação, por exemplo, peptídeo ou proteína do antígeno, com o receptor recombinante. Em algumas modalidades, um método de conjugação é selecionado que conjuga a região C-terminal da molécula de ligação, por exemplo, uma molécula de ligação ao polipeptídeo, à partícula. Um especialista na técnica entenderá que as químicas exatas para a conjugação podem depender da natureza do material da partícula, dos grupos funcionais expostos na superfície da partícula, da presença ou ausência de fusões do C-terminal à molécula de ligação e a presença ou ausência de porções conjugadoras. Qualquer que seja a química escolhida, é importante que o método de conjugação não altere a função e/ou confirmação estrutural da molécula de ligação. Por exemplo, se a molécula de ligação for um antígeno, o método selecionado para conjugar o antígeno com a partícula não deve impedir que o antígeno seja reconhecido pelo seu receptor conjugado. Em certas modalidades, se a molécula de ligação é um anticorpo, por exemplo, um anti-ID, o método de conjugação não deve impedir que o anticorpo se ligue ao antígeno alvo.
[273] Em algumas modalidades, a molécula de ligação (por exemplo, um antígeno de polipeptídeo ou anti-ID) é unida à partícula (por exemplo, uma partícula de esfera) por absorção passiva à superfície plana da partícula. O apego por esse método normalmente depende de interações hidrofóbicas que ligam a molécula de ligação de esfera. Embora este método seja relativamente simples, em algumas modalidades, o método fornece pouco controle sobre a orientação final da molécula unida em relação a outras técnicas de união da molécula de ligação, como qualquer uma das técnicas discutidas neste documento, como na Seção I-C.
1. Ligação à Superfície de Partículas
[274] Em certas modalidades, as moléculas de ligação são ligadas ao veículo por meio de uma ligação química covalente. Em modalidades particulares, a molécula de ligação é um polipeptídeo e um grupo ou porção reativa de um aminoácido é conjugado diretamente a um grupo ou porção reativa na superfície da partícula por uma reação química direta. Em certas modalidades, um grupo carboxila de aminoácido (por exemplo, um grupo carboxila C-terminal), um grupo hidroxila, tiol ou amina (como um grupo de cadeia lateral de aminoácidos) da molécula de ligação é conjugado diretamente a um grupo hidroxila ou carboxila de um polímero PLA ou PGA, um grupo amina terminal ou carboxil de um dendrímero ou um grupo hidroxila, carboxil ou fosfato de um fosfolípido na superfície da partícula por reação química direta. Em algumas modalidades, uma porção de conjugação se conjuga, por exemplo, se liga covalentemente, à molécula de ligação e à partícula, ligante-as, desse modo.
[275] Em certas modalidades, a superfície da partícula compreende porções químicas e/ou grupos funcionais que permitem a ligação (por exemplo, covalente, não covalente) da molécula de ligação (por exemplo, antígeno de polipeptídeo ou anticorpo). Em algumas modalidades, o número, orientação, espaçamento, etc. de porções químicas e/ou grupos funcionais na partícula variam de acordo com a química das partículas e as propriedades da molécula de ligação. Em modalidades particulares, as partículas, por exemplo, esferas, introduziram superfícies modificadas. Em modalidades particulares, as superfícies das partículas contêm grupos funcionais expostos. Grupos funcionais expostos à superfície adequados incluem, mas não estão limitados a, grupos carboxila, amino, hidroxila, sulfato, grupos tosila, epóxi e clorometila.
[276] Em algumas modalidades, a molécula de ligação é um polipeptídeo e é conjugada aos grupos funcionais expostos à superfície. Em algumas modalidades, o grupo funcional exposto à superfície deve ser ativado, isto é, deve sofrer uma reação química para produzir um produto intermediário capaz de se ligar diretamente a um polipeptídeo. Modalidades particulares contemplam que a ativação de grupos funcionais expostos à superfície em uma partícula para permitir a conjugação de uma molécula de ligação é uma questão de habilidade rotineira na técnica, e que um especialista identifica prontamente reagentes e protocolos adequados para executar quaisquer etapas de ativação necessárias para conjugar uma molécula de ligação a uma partícula.
[277] Em algumas modalidades, a fim de ligar uma molécula de ligação a polipeptídeo a uma partícula carboxilada, por exemplo, partícula de esfera, os grupos carboxila expostos à superfície da partícula requerem ativação entrando em contato com o grupo funcional com um agente que irá produzir um éster intermediário que é capaz de se ligar diretamente a um grupo amina. Grupos carboxila reativos (isto é, ativados) na superfície de uma partícula podem ser conjugados com aminas livres (por exemplo, a partir de resíduos de Lys) no polipeptídeo. Os agentes adequados incluem, por exemplo, mas não se limitando a, carbodiimida (EDC), etileno carbodiimida (ECDI), di-isocianato de hexametileno, di-glicidil éter de propilenoglicol que contém 2 resíduos de epóxi, epicloridrina, N-hidroxissuccinimida (NHS) ou sulfo-NHS ou etil (dimetilaminopropila). Em algumas modalidades, uma molécula de ligação a polipeptídeo é covalentemente ligado a uma partícula em um grupo carboxila exposto à superfície. Em modalidades particulares, a molécula de ligação ao polipeptídeo é covalentemente ligada ao grupo carboxila exposto à superfície, entrando primeiro em contato com o grupo carboxila com um agente para gerar um éster intermediário.
[278] Em algumas modalidades, um grupo funcional da molécula de ligação ao polipeptídeo é ativado antes da conjugação do polipeptídeo com um grupo funcional exposto à superfície. Por exemplo, um grupo carboxila da molécula polipeptídica pode ser ativado com os agentes descritos acima para gerar ésteres intermediários capazes de se ligar diretamente a grupos amino expostos à superfície da partícula. Em algumas modalidades, uma molécula de ligação ao polipeptídeo é conjugada à partícula em um grupo amina exposta à superfície. Em modalidades particulares, um grupo carboxila da molécula de ligação ao polipeptídeo é contatado com um agente para gerar um éster intermediário antes da ligação covalente da partícula ao grupo carboxila exposto à superfície da partícula. Alternativamente, grupos amina livres na superfície de um veículo podem ser ligados covalentemente a peptídeos e proteínas de antígeno, ou proteínas de fusão de peptídeo ou proteína de antígeno, usando a química de (4-iodoacetil) aminobenzoato de sulfosuccinimidila (sulfo-SIAB).
[279] Em modalidades particulares, uma molécula de ligação a polipeptídeo é covalentemente ligada à partícula, por exemplo, uma partícula de esfera, em um grupo funcional exposto à superfície que não requer ativação por um agente antes da formação de uma ligação covalente. Exemplos de tais grupos funcionais incluem, mas não estão limitados a, grupos tosila, epóxi e clorometila. Em modalidades particulares, a ligação covalente pode ser realizada na presença de tampões específicos, em intervalos de pH específicos, em intervalos de temperatura específicos e por quantidades específicas de tempo que podem ser facilmente identificadas e executadas para qualquer grupo funcional por um especialista na técnica. Por exemplo, em algumas modalidades, os grupos tosila na superfície da partícula se ligam aos grupos amino ou sulfidrila de uma molécula de ligação (por exemplo, um antígeno de polipeptídeo ou anticorpo) dependendo do pH. O pH neutro é usado para ligar grupos sulfidrila de um polipeptídeo ao grupo tosila, enquanto um pH mais básico é usado para ligar grupos amino de um polipeptídeo ao grupo tosila. Em modalidades particulares, uma molécula de ligação a polipeptídeo (por exemplo, um antígeno ou anticorpo) é covalentemente ligada a uma partícula (por exemplo, uma partícula de esfera) no grupo tosila exposto à superfície, grupo epóxi ou grupo clorometila da partícula. Em modalidades particulares, a molécula de ligação ao polipeptídeo está ligada a uma partícula tosilada (isto é, uma partícula compreendendo grupos tosila expostos à superfície).
[280] Em algumas modalidades, uma ligação não covalente entre um ligante ligado ao peptídeo ou proteína do antígeno e um antiligante unido ao veículo pode conjugar o antígeno ao veículo. Em algumas modalidades, um marcador de sequência de reconhecimento de biotina ligase pode ser unido ao C-terminal de um peptídeo ou proteína de antígeno e esse marcador pode ser biotinilado pela biotina ligase. A biotina pode então servir como um ligante para conjugar não covalentemente o peptídeo ou a proteína do antígeno à avidina ou estreptavidina que é adsorvida ou de outro modo ligada à superfície do veículo como um anti-ligante. Alternativamente, se os peptídeos e proteínas de antígeno forem fundidos a um domínio de imunoglobulina portador de uma região Fc, como descrito acima, o domínio Fc pode atuar como um ligante e a proteína A, ligada covalente ou não covalentemente à superfície do veículo, pode servir como anti-ligante para conjugar não covalentemente o peptídeo ou a proteína do antígeno ao veículo. Outros meios são bem conhecidos na técnica que podem ser empregados para conjugar peptídeos e proteínas de antígeno não covalentemente a veículos,, incluindo técnicas de quelação de íons metálicos (por exemplo, usando um marcador poli-His no C-terminal do peptídeo ou proteína de antígeno ou peptídeo de antígeno ou proteínas de fusão de proteínas e um veículo revestido com Ni), e esses métodos podem ser substituídos pelos aqui descritos.
[281] Em algumas modalidades, a molécula de ligação é conjugada à partícula por um ligante. Em certas modalidades, os ligantes podem incluir, mas não estão limitados a, uma variedade de agentes de acoplamento bifuncional de proteínas, como N-succinimidil- 3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), succinimidil-4-(N- maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (como dimetil adipimidato HCL), ésteres ativos (como suberato de disuccinimidila), aldeídos (como glutareldeído), compostos de bis-azido (como bis (p-azidobenzoil)) hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (como bis-(p-diazônio-
benzoil)-etilenodiamina), di-isocianatos (como 2,6-di-isocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-ativo (como 1,5-difluoro-2,4- dinitrobenzeno). Agentes de acoplamento particulares incluem N- succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) e N-succinimidil-4-(2- piridiltio) pentanoato (SPP) para fornecer uma ligação dissulfeto.
2. Ligação Reversível
[282] Em algumas modalidades, a molécula de ligação é unida reversivelmente ou associada a uma partícula, por exemplo, uma partícula de esfera. Em certa modalidade, a molécula de ligação é unida reversivelmente ou de outro modo associada a um reagente que é unido à partícula. Em modalidades particulares, o reagente é exposto na superfície da partícula. Em certas modalidades, o reagente contém uma pluralidade de sítios de ligação capazes de se ligar de forma reversível à molécula de ligação. Em algumas modalidades, o reagente é um reagente de multimerização. Em algumas modalidades, a interação de ligação entre a molécula de ligação e o reagente é uma interação não covalente. Em algumas modalidades, a interação de ligação entre a molécula de ligação e o reagente, por exemplo, uma interação de ligação não covalente é reversível. Em algumas modalidades, a molécula de ligação é unida reversivelmente a uma partícula que é um oligômero ou um polímero composto de proteínas, por exemplo, estreptavidina.
[283] Em algumas modalidades, a associação reversível entre a molécula de ligação e o reagente pode ser mediada na presença de uma substância, como um reagente de competição (também chamado de reagente eluente), que é ou contém um sítio de ligação que também é capaz de se ligar ao mesmo sítio (ou sítios) de ligação do reagente que está ligado pela molécula de ligação. Geralmente, a substância (por exemplo, reagente de competição) pode atuar como concorrente devido a uma maior afinidade de ligação ao sítio de ligação presente no reagente e/ou devido a estar presente em concentrações mais altas que a molécula de ligação, destacando e/ou dissociando a molécula de ligação do reagente. Em algumas modalidades, a afinidade da substância (por exemplo, reagente de competição) a pelo menos um sítio de ligação no reagente é maior que a afinidade da molécula de ligação a pelo menos um sítio de ligação no reagente. Assim, em algumas modalidades, a ligação entre a ligação do reagente e a molécula de ligação pode ser interrompida pela adição da substância (por exemplo, reagente de competição), tornando assim a associação do agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) e reagente reversível.
[284] Os reagentes que podem ser utilizados em tais sistemas reversíveis são descritos e conhecidos na técnica, vide, por exemplo, as patentes US Nos. 5.168.049; 5,506,121; 6.103.493; 7.776.562;
7.981.632; 8.298.782; 8.735.540; 9.023.604; e Pedido de PCT publicado internacional Nos. WO2013/124474 e WO2014/076277. Exemplos não limitativos de reagentes e parceiros de ligação capazes de formar uma interação reversível, bem como substâncias (por exemplo, reagentes de competição) capazes de reverter essa ligação, são descritos abaixo.
[285] Em algumas modalidades, o reagente é unido e exposto na superfície de uma partícula, por exemplo, uma partícula de esfera, e contém uma pluralidade de sítios de ligação que são capazes de se ligar especificamente à molécula de ligação, tal que o reagente seja capaz de se ligar reversivelmente a uma pluralidade de moléculas de ligação, por exemplo, é um reagente de multimerização. Em algumas modalidades, o reagente é um oligômero ou polímero de moléculas individuais (por exemplo, monômeros) ou complexos que compõem uma molécula individual (por exemplo, tetrâmero) que é unida à superfície de uma partícula, cada uma contendo pelo menos um sítio de ligação capaz de ligação à molécula de ligação. Em algumas modalidades, a partícula é composta do reagente, isto é, a partícula é um oligômero ou um polímero do reagente.
[286] Em algumas modalidades, o reagente é uma estreptavidina, uma estreptavidina muteína ou análogo, avidina, uma avidina muteína ou análogo (como neutravidina) ou uma mistura dos mesmos, na qual esse reagente contém um ou mais sítios de ligação capazes de uma reversibilidade associação com uma molécula de ligação. Em algumas modalidades, a molécula de ligação compreende uma biotina, um derivado ou análogo de biotina ou um peptídeo de ligação a estreptavidina ou outra molécula que é capaz de se ligar especificamente ao reagente. Em algumas modalidades, a molécula de ligação compreende uma biotina, um derivado ou análogo de biotina ou um peptídeo de ligação a estreptavidina ou outra molécula que é capaz de se ligar especificamente a estreptavidina, uma estreptavidina muteína ou análogo, avidina ou avidina muteína ou análogo. Em certas modalidades, a molécula de ligação é um polipeptídeo, por exemplo, um antígeno de polipeptídeo ou anticorpo, que compreende um domínio de fusão que é uma biotina, um derivado ou análogo de biotina ou um peptídeo de ligação à estreptavidina ou outra molécula que é capaz de se ligar especificamente a estreptavidina, uma estreptavidina muteína ou análogo, avidina ou uma avidina muteína ou análogo. Em algumas modalidades, a molécula de ligação é um polipeptídeo que compreende um domínio de fusão que é uma biotina, um derivado ou análogo de biotina ou um peptídeo de ligação a estreptavidina ou outra molécula que é capaz de se ligar especificamente a estreptavidina, uma estreptavidina muteína ou análogo, avidina ou uma avidina muteína ou análogo, e o reagente é ou compreende estreptavidina, avidina, um análogo ou muteína de estreptavidina, ou um análogo ou muteína ou avidina que reverte y se liga a biotina, um análogo de biotina ou um fragmento biologicamente ativo do mesmo. Em certas modalidades, o domínio de fusão está localizado no C-terminal da molécula de ligação. Em algumas modalidades, o reagente é ou compreende um análogo ou muteína de estreptavidina ou um análogo ou muteína de avidina que se liga reversivelmente a um peptídeo de ligação a estreptavidina. Em algumas modalidades, a substância (por exemplo, reagente competitivo) pode ser uma biotina, um derivado de biotina ou análogo ou um peptídeo de ligação a estreptavidina capaz de competir pela ligação com a molécula de ligação para um ou mais sítios de ligação do reagente. Em algumas modalidades, o domínio de fusão da molécula de ligação e a substância (por exemplo, reagente competitivo) são diferentes, e a substância (por exemplo, reagente competitivo) exibe uma afinidade de ligação mais alta para o reagente em comparação com a afinidade da molécula de ligação ao reagente. Em certas modalidades, o domínio de fusão e a substância, por exemplo, reagente competitivo, são os mesmos.
[287] Em algumas modalidades, a estreptavidina pode ser estreptavidina do tipo selvagem, estreptavidina muteína ou análogos, como polipeptídeos semelhantes ao estreptavidina. Da mesma forma, a avidina, em alguns aspectos, inclui avidina ou muteína de tipo selvagem ou análogos da avidina, como neutravidina, uma avidina desglicosilada com argininas modificadas que normalmente exibe um ponto isoelétrico mais neutro e está disponível como uma alternativa à avidina nativa. Geralmente, as formas neutras desglicosiladas de avidina incluem as formas comercialmente disponíveis, como "Extravidina", disponível através da Sigma Aldrich, ou "NeutrAvidin" disponível na Thermo Scientific ou Invitrogen, por exemplo.
[288] Em algumas modalidades, o reagente é uma estreptavidina ou uma estreptavidina muteína ou análogo. Em algumas modalidades, a estreptavidina do tipo selvagem (wt-estreptavidina) possui a sequência de aminoácidos divulgada por Argarana et al., Nucleic Acids Res. 14 (1986) 1871-1882 (SEQ ID NO: 21). Em geral, a estreptavidina ocorre naturalmente como um tetrâmero de quatro subunidades idênticas, isto é, é um homotetrâmero, onde cada subunidade contém um único sítio de ligação para biotina, um derivado ou análogo de biotina ou um mimético de biotina. Uma sequência exemplar de uma subunidade de estreptavidina é a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 21, mas essa sequência também pode incluir uma sequência presente em seus homólogos de outras espécies de Streptomyces. Em particular, cada subunidade da estreptavidina pode exibir uma forte afinidade de ligação à biotina com uma constante de dissociação de equilíbrio (KD) da ordem de 10 a 14 M. Em alguns casos, a estreptavidina pode existir como um tetrâmero monovalente, no qual apenas uma das quatro sítios de ligação é funcional (Howarth et al. (2006) Nat. Methods, 3: 267-73; Zhang et al. (2015) Biochem. Biophys. Res. Commun., 463:1059-63)), um tetrâmero divalente em que dois dos quatro sítios de ligação são funcionais (Fairhead et al. (2013) J. Mol. Biol., 426: 199-214), ou podem estar presentes na forma monomérica ou dimérica (Wu et al. (2005) J Biol. Chem., 280: 23225- 31; Lim et al. (2010) Biochemistry, 50: 8682-91).
[289] Em algumas modalidades, a molécula de ligação compreende um domínio de fusão que é um marcador Strep, por exemplo, tal como divulgado na Patente U.S. No. 5.506.121, que é uma sequência de peptídeo que atua como imitação de biotina e demonstra uma afinidade de ligação à estreptavidina. Em alguns casos, a afinidade de ligação pode ser melhorada fazendo uma mutação dentro da molécula de estreptavidina, vide, por exemplo, Pat. No. 6.103.493 ou Pedido de PCT publicado Internacional. WO2014/076277. Em algumas modalidades, a afinidade de ligação pode ser determinada por métodos conhecidos na técnica.
[290] Em algumas modalidades, o reagente, como uma estreptavidina ou estreptavidina muteína, exibe afinidade de ligação para um domínio de fusão da molécula de ligação. Em algumas modalidades, o domínio de fusão compreende uma sequência de peptídeo contém uma sequência com a fórmula geral apresentada em SEQ ID NO: 11, tal como contém a sequência apresentada em SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades, a sequência de peptídeo tem a fórmula geral apresentada em SEQ ID NO: 13, como a apresentada em SEQ ID NO: 43. Em um exemplo, a sequência de peptídeo é apresentada em SEQ ID NO: 9. Em um exemplo, a sequência de peptídeo é apresentada em SEQ ID NO: 10, também conhecida como polipeptídeo de estreptavidina STREP-TAG® II. Em algumas modalidades, o ligante de peptídeo contém um arranjo sequencial de pelo menos dois módulos de ligação a estreptavidina, em que a distância entre os dois módulos é de pelo menos 0 e não maior que 50 aminoácidos, em que um módulo de ligação tem de 3 a 8 aminoácidos e contém pelo menos a sequência His-Pro-Xaa (SEQ ID NO: 11), em que Xaa é glutamina, asparagina ou metionina, e em que o outro módulo de ligação possui o mesmo ou diferente ligante de peptídeo de estreptavidina, como apresentado em SEQ ID NO: 13 (vide, por exemplo, Pedido PCT Publicado Internacional. No. WO02/077018; Patente U.S. No. 7.981.632). Em algumas modalidades, o ligante de peptídeo contém uma sequência com a fórmula apresentada em qualquer uma das SEQ ID NO: 15 ou 16. Em algumas modalidades, o ligante de peptídeo ide tem a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 15-22.
[291] Em algumas modalidades, o reagente é uma estreptavidina ou estreptavidina muteína (ou uma porção da mesma) que se liga a ou reconhece a outros ligantes de estreptavidina, como mas não se limitando a biotina, iminobiotina, ácido lipóico, destiobiotina,
diaminobiotina, HABA (ácido hidroxazobenzeno-benzóico) e/ou dimetil- HABA. Em algumas modalidades, a estreptavidina muteína exibe uma afinidade de ligação por outro ligante de estreptavidina, como biotina ou destiobiotina, que é maior que a afinidade de ligação da estreptavidina muteína por um ligante de peptídeo imitador de biotina, como estabelecido em qualquer um dos SEQ ID NOS: 7-19. Assim, em algumas modalidades, a biotina ou um análogo ou derivado de biotina (por exemplo, destiobiotina) pode ser empregada como reagente de competição nos métodos fornecidos. Por exemplo, como um exemplo, a interação de uma muteína estreptavidina designada Strep-tactin® (por exemplo, contendo a sequência apresentada em SEQ ID NO: 23).
[292] Em algumas modalidades, o reagente compreende pelo menos dois grupos quelantes K que podem ser capazes de se ligar a um íon de metal de transição. Em algumas modalidades, o reagente pode ser capaz de se ligar a um marcador de afinidade de oligo- histidina, uma glutationa-S-transferase, calmodulina ou um análogo do mesmo, peptídeo de ligação à calmodulina (CBP), um peptídeo de FLAG, um peptídeo FLAG, uma proteína de ligação à maltose e um marcador HA (MBP), um epítopo HSV, um epítopo myc e/ou uma proteína de veículo biotinilada.
3. Orientação da Molécula de Ligação
[293] Em algumas modalidades, a molécula de ligação está ligada ou unida à partícula, por exemplo, uma partícula de esfera, em uma orientação que é otimizada para permitir uma interação entre a molécula de ligação e uma célula que expressa um receptor recombinante, por exemplo, um CAR, que é ligado ou reconhecido pela molécula de ligação. Em algumas modalidades, a orientação otimizada permite a ligação entre a molécula de ligação e o receptor recombinante com mínima ou nenhuma interferência da partícula à qual a molécula de ligação está ligada. Em algumas modalidades, a posição relativa da partícula em relação à região da molécula de ligação que se liga a ou reconhece o CAR, por exemplo, o antígeno ou o anti-ID, não impede o acesso a essa região para contatar células que expressam o recombinante receptor, por exemplo, o CAR. Em algumas modalidades, a molécula de ligação é unida à partícula em uma região diferente, por exemplo, um domínio de fusão, do que a região que se liga a ou reconhece o receptor recombinante da célula alvo, por exemplo, o antígeno ou anti-ID. Em certas modalidades, a molécula de ligação não está ligada à partícula na região que se liga a ou reconhece o receptor recombinante. Em certas modalidades, é menos provável que a molécula de ligação esteja ligada à partícula na região que se liga a ou reconhece o receptor recombinante em comparação com outra região da molécula de ligação.
[294] Modalidades particulares contemplam que quando uma molécula de ligação é ligada a uma partícula, por exemplo, uma partícula de esfera, em uma extremidade da molécula de ligação, por exemplo, no C-terminal, isso fornece uma orientação ideal para a molécula de ligação se ligar ao receptor recombinante. Em algumas modalidades, a molécula de ligação está ligada à partícula na extremidade oposta da região que se liga a ou reconhece o receptor recombinante. Em certas modalidades, a molécula de ligação é unida à partícula, tal que a região que se liga ao receptor recombinante, por exemplo, o antígeno ou anti-ID, seja posicionada longe da partícula. Em modalidades particulares, a molécula de ligação está ligada à partícula em uma extremidade, por exemplo, no seu C-terminal, e a região que se liga ao receptor recombinante está na extremidade oposta, por exemplo, o N-terminal da molécula de ligação . Em modalidades particulares, a molécula de ligação é unida à partícula, tal que o antígeno ou anti-ID da molécula de ligação seja posicionado em uma orientação externa em relação à partícula. Algumas modalidades contemplam que a orientação externa para a região que liga o receptor recombinante da partícula fornece a maior probabilidade de interações entre as moléculas de ligação e as células que expressam um receptor recombinante.
[295] ] Em algumas modalidades, a molécula de ligação, por exemplo, um polipeptídeo, compreende uma região que se liga a ou reconhece o receptor recombinante da célula alvo, por exemplo, antígeno ou anti-ID, e está ligado ou ligado à partícula em uma região separada, por exemplo, um domínio de fusão. Em certas modalidades, a região que se liga a ou reconhece o receptor recombinante e a região separada, por exemplo, o domínio de fusão, estão em extremidades opostas da molécula de ligação. Em certas modalidades, a molécula de ligação compreende uma região que se liga a ou reconhece o receptor recombinante da célula alvo que está no ou perto do N-terminal da molécula de ligação e uma região separada, por exemplo, um domínio de fusão que está em ou próximo ao domínio C-terminal. Em algumas modalidades, a molécula de ligação compreende uma região que se liga a ou reconhece o receptor recombinante da célula alvo que está no ou perto do C-terminal da molécula de ligação e na região separada, por exemplo, um domínio de fusão que está em ou próximo ao domínio N- terminal. Em algumas modalidades, uma região de uma molécula de ligação, por exemplo, um antígeno de polipeptídeo ou anticorpo, está próximo ao N-terminal ou ao C-terminal se a região estiver localizada dentro de um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, quinze, vinte, vinte e cinco, trinta, trinta e cinco, quarenta, quarenta e cinco, cinquenta, sessenta, setenta, oitenta, noventa ou cem aminoácidos do N-terminal ou do C-terminal.
[296] Em algumas modalidades, a molécula de ligação é um polipeptídeo, por exemplo, um antígeno de polipeptídeo ou anticorpo, que compreende um domínio de fusão que se liga à partícula. Em algumas modalidades, a molécula de ligação se liga à partícula em um ou mais sítios dentro do domínio de fusão. Em certas modalidades, é mais provável que a molécula de ligação se ligue à partícula em um ou mais sítios dentro do domínio de fusão do que em um ou mais sítios da molécula de ligação que caem fora do domínio de fusão. Em algumas modalidades, a molécula de ligação é pelo menos 1%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99%, pelo menos 99,9% ou pelo menos 100% mais provável de se ligar à partícula em um ou mais sítios dentro do domínio de fusão do que em um ou mais sítios da molécula de ligação que caem fora do domínio de fusão. Em certas modalidades, a molécula de ligação é pelo menos 1 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 9 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 40 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 500 vezes ou pelo menos 1000 vezes mais provável de se ligar à partícula em um ou mais sítios dentro do domínio de fusão do que em um ou mais sítios da molécula de ligação que ficam fora do domínio de fusão.
[297] Em certas modalidades, a molécula de ligação está ligada a um domínio de fusão ou marcador. Em algumas modalidades, a molécula de ligação, é ou contém um antígeno ou um anti-ID que é reconhecido e/ou ligado por um receptor recombinante, como um receptor de antígeno ou um CAR, é ligada, direta ou indiretamente, a um domínio de fusão ou marcador. Em algumas modalidades, a molécula de ligação é um polipeptídeo de fusão que contém o antígeno ou porção do mesmo e domínio de fusão ou marcador. Em algumas modalidades, a molécula de ligação é conjugada com a partícula em um sítio (por exemplo, uma cadeia lateral de um aminoácido) no ou dentro do domínio de fusão ou marcador. Em certas modalidades, a união da molécula de ligação à partícula no domínio de fusão ou marcador resulta em uma orientação ideal para a molécula de ligação que é conjugada à partícula a ser ligada ou reconhecida pelo receptor recombinante ou CAR. Em algumas modalidades, uma molécula de ligação compreendendo um antígeno ou anti-ID que é reconhecido por um receptor de antígeno, por exemplo, CAR, está ligado a um domínio de fusão ou marcador no C-terminal; nesse caso, a conjugação com a partícula via domínio de fusão ou marcador orienta preferivelmente ou expõe a região N-terminal da molécula de ligação ligada para interações com o receptor de antígeno, por exemplo, CAR.
[298] Os domínios de fusão ou marcadores são bem conhecidos na técnica e podem ser ligados a um antígeno nas moléculas de ligação fornecidas para conferir uma propriedade desejada, por exemplo, isolamento do polipeptídeo de fusão por cromatografia de afinidade ou ligação covalente a um grupo funcional em uma superfície de partícula. Exemplos bem conhecidos de tais domínios de fusão incluem, mas não estão limitados a, poli-histidina, Glu-Glu, avidina, glutationa S transferase (GST), tioredoxina, proteína A, proteína G, uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina (Fc), proteína de ligação de maltose (MBP) ou albumina sérica humana. Em algumas modalidades, o domínio de fusão é um marcador polipeptídico. Exemplos bem conhecidos de marcadores polipeptídicos incluem, mas não estão limitados a, AviTag (SEQ ID NO: 3), um marcador Calmodulina (SEQ ID NO: 4), um marcador poliglutamato (SEQ ID NO: 5), um marcador FLAG (SEQ ID NO: 6), um marcador HA (SEQ ID NO: 7), um marcador His (5-10 histidinas), um marcador Myc (SEQ ID NO:
8) e marcadores proteicos fluorescentes (por exemplo, EGFP).
[299] Em algumas modalidades, o domínio de fusão ou marcador compreende uma sequência de peptídeo de ligação a estreptavidina. Em algumas modalidades, a sequência é uma sequência de peptídeo de ligação a estreptavidina STREP-TAG®, como exemplificado por SEQ ID NOS: 9 e 10. Em algumas modalidades, o domínio de fusão compreende uma sequência de peptídeo de ligação a estreptavidina, como exemplificado pelas sequências de aminoácidos definidas adiante em SEQ ID NOS: 11-19.
[300] Em algumas modalidades, a molécula de ligação compreende um domínio de fusão GST que se liga a uma superfície exposta de glutationa da partícula. Em modalidades particulares, o domínio de fusão GST está localizado no C-terminal ou próximo à molécula de ligação. Em algumas modalidades, a molécula de ligação compreende um domínio de fusão com marcador strep, que se liga a um ligante de biotina ou estreptavidina exposto à superfície da partícula. Em algumas modalidades, o domínio de fusão com marcador strep está no ou perto do C-terminal da molécula de ligação. Em modalidades particulares, a molécula de ligação compreende um domínio de fusão da Proteína A que se liga a um polipeptídeo Fc ligado à superfície da partícula. Em algumas modalidades, o domínio de fusão da proteína A está no C-terminal da molécula de ligação ou próximo a ela. Em certas modalidades, a molécula de ligação compreende um domínio de fusão da Proteína G que se liga a uma albumina ou a um polipeptídeo Fc ligado à superfície da partícula. Em algumas modalidades, o domínio de fusão da proteína A está no C-terminal da molécula de ligação ou próximo a ela.
[301] Em modalidades particulares, a molécula de ligação contém uma região hidrofóbica ou uma região que é mais hidrofóbica do que o restante da molécula de ligação. Em algumas modalidades, a molécula de ligação compreende uma região que é mais hidrofóbica do que os sítios da molécula de ligação que ficam fora da região hidrofóbica. Em algumas modalidades, a região hidrofóbica é um domínio de fusão. Em modalidades particulares, a região hidrofóbica é um domínio Fc. Em certas modalidades, é mais provável que a molécula de ligação se ligue ou se ligue à partícula, em mais um sítio em uma região hidrofóbica do que em uma região diferente da molécula de ligação se a superfície da partícula for hidrofóbica. Em várias modalidades, a região hidrofóbica da molécula de ligação liga um grupo funcional exposto à superfície da partícula. Em algumas modalidades, o grupo de função é ou contém um grupo tosila.
[302] Em algumas modalidades, a molécula de ligação compreende um domínio Fc, em que o domínio Fc está presente no C- terminal do polipeptídeo de fusão. Em algumas modalidades, a molécula de ligação é um anticorpo, por exemplo, e anticorpo anti- idiotipo, compreendendo um domínio Fc. Em modalidades particulares, o domínio Fc se liga ou se liga a uma proteína G ou proteína A exposta à superfície da partícula. Em algumas modalidades, um ou mais grupos funcionais de um ou mais aminoácidos presentes no domínio Fc se ligam a um grupo funcional da partícula. Em modalidades particulares, o domínio Fc do polipeptídeo de fusão ou anticorpo é mais hidrofóbico que a região do antígeno ou anticorpo da molécula de ligação, e os sítios dentro do domínio Fc têm maior probabilidade de se ligar a uma partícula, por exemplo, em grupos de funções expostas à superfície, quando a superfície da partícula é hidrofóbica do que os sítios da molécula de ligação que estão fora do domínio Fc.
[303] Em modalidades particulares, uma molécula de ligação compreendendo um domínio Fc é ligada a uma partícula em um ou mais sítios dentro da região Fc. A ligação de uma molécula de ligação em um sítio localizado na região Fc a uma partícula, por exemplo, uma partícula de esfera, pode ser facilmente realizada através de técnicas padrão na técnica. Por exemplo, os domínios Fc tendem a ser hidrofóbicos e, onde o domínio Fc é mais hidrofóbico do que os outros domínios da molécula de ligação (por exemplo, o antígeno de polipeptídeo), a ligação entre as cadeias laterais de aminoácidos localizadas no domínio Fc e a grupos funcionais expostos de superfície localizados na partícula (por exemplo, grupos tosila) podem ocorrer se a superfície da partícula for hidrofóbica. Em algumas modalidades, a superfície da partícula é hidrofóbica. Em algumas modalidades, a superfície da partícula é não hidrofílica. Em modalidades particulares, a superfície da partícula é hidrofóbica e compreende grupos tosila expostos à superfície.
[304] Em algumas modalidades, a partícula é não hidrofóbica. Em certas modalidades, a partícula é hidrofílica. Em algumas modalidades, a superfície da partícula é não hidrofóbica. Em algumas modalidades, a superfície da partícula é hidrofílica.
4. Partículas Conjugadas
[305] Em algumas modalidades, uma molécula de ligação (por exemplo, um antígeno de polipeptídeo ou anticorpo) é unida a uma partícula, por exemplo, uma partícula de esfera. Em certas modalidades, o polipeptídeo é covalentemente ligado à partícula. Em algumas modalidades, o polipeptídeo não está ligado covalentemente à partícula. Em algumas modalidades, pelo menos 1 molécula de ligação, pelo menos 10 moléculas de ligação, pelo menos 102 moléculas de ligação, pelo menos 103 moléculas de ligação, pelo menos 104 moléculas de ligação, pelo menos 105 moléculas de ligação, pelo menos 10 6 moléculas de ligação, pelo menos 107 moléculas de ligação, pelo menos 108 moléculas de ligação ou pelo menos 109 moléculas de ligação estão ligadas a cada partícula. Em modalidades particulares, entre ou entre cerca de 102 moléculas de ligação e 109 moléculas de ligação, t 102 moléculas de ligação e 107 moléculas de ligação, 103 moléculas de ligação e 109 moléculas de ligação, 103 moléculas de ligação e 108 moléculas de ligação, ou 103 moléculas de ligação e 106 moléculas de ligação são covalentemente ligadas para cada partícula, cada inclusive. Em modalidades particulares, entre ou entre cerca de 103 moléculas de ligação e 106 moléculas de ligação, inclusive, são covalentemente ligadas a cada partícula. Em modalidades particulares, entre ou entre cerca de 104 moléculas de ligação e 106 moléculas de ligação, inclusive, são covalentemente ligadas a cada partícula. Em certas modalidades, entre ou entre cerca de 104 moléculas de ligação e 105 moléculas de ligação são covalentemente ligadas a cada partícula. Em algumas modalidades, entre cerca de 105 moléculas de ligação e 106 de ligação, moléculas inclusivas são covalentemente ligadas a cada partícula.
[306] Em certas modalidades, a molécula de ligação é covalentemente unida à partícula, por exemplo, partícula de esferas. Em modalidades particulares, uma quantidade de pelo menos 0,001 µg, pelo menos 0,01 µg, pelo menos 0,1 µg, pelo menos 0,5 µg, pelo menos 1 µg, pelo menos 1,5 µg, pelo menos 2 µg, pelo menos 2,5 µg, em pelo menos 3 µg, pelo menos 3,5 µg, pelo menos 4 µg, pelo menos 4,5 µg, pelo menos 5 µg, pelo menos 6 µg, pelo menos 7 µg, pelo menos 8 µg, pelo menos 9 µg, pelo menos 10 µg ou pelo menos 50 µg das moléculas de ligação ao polipeptídeo são covalentemente ligados às partículas, por exemplo, esferas, para cada 107 partículas. Em algumas modalidades, entre ou entre 0,001 µg e 100 µg, 0,01 µg e 50 µg, 0,1 µg e 10 µg, 0,5 µg e 10 µg, 0,1 µg e 1 µg, 1 µg e 10 µg, 0,5 µg e 5 µg, ou 1 µg e 5 µg, cada, inclusive, uma das moléculas de ligação ao polipeptídeo, são covalentemente ligadas às partículas, por exemplo, esferas, para cada 107 partículas. Em modalidades particulares, entre ou entre cerca de 1 µg e cerca de 10 µg, inclusive, das moléculas de ligação ao polipeptídeo são covalentemente ligadas às partículas, por exemplo, esferas, para cada 107 partículas.
[307] Em certas modalidades, a molécula de ligação é ligada ou unida à partícula, por exemplo, partícula de esferas. Em modalidades particulares, uma quantidade média de, de cerca de ou de pelo menos 0,0001 pg, 0,001 pg, 0,005 pg, 0,01 pg, 0,02 pg, 0,03 pg, 0,04 pg, 0,05 pg, 0,06 pg, 0,07 pg, 0,08 pg, 0,09 pg, 0,1 pg, 0,2 pg, 0,3 pg, 0,4 pg, 0,5 pg, 0,6 pg, 0,7 pg, 0,8 pg, 0,9 pg, 1,0 pg ou 5,0 pg das moléculas de ligação ao polipeptídeo estão ligadas ou unidas a cada partícula. Em algumas modalidades, entre ou entre cerca de 0,0001 pg e cerca de 10 pg, 0,001 pg e 1 pg, 0,001 pg e 1 pg, 0,001 µg e 0,1 pg, 0,01 pg e 0,1 pg, 1 pg e 10 pg, 0,5 pg e 5 pg, ou b 1 pg e 5 pg, cada, inclusive, uma das moléculas de ligação estão ligadas ou unidas à partícula. Em modalidades particulares, uma quantidade média igual ou inferior a 0,0001 pg, 0,001 pg, 0,005 pg, 0,01 pg, 0,02 pg, 0,03 pg, 0,04 pg, 0,05 pg, 0,06 pg, 0,07 pg, 0,08 pg, 0,09 pg, 0,1 pg, 0,2 pg, 0,3 pg, 0,4 pg, 0,5 pg, 0,6 pg, 0,7 pg, 0,8 pg, 0,9 pg, 1,0 pg ou 5,0 pg das moléculas de ligação ao polipeptídeo estão ligadas ou unidas a cada partícula. Em modalidades particulares, a partícula tem um diâmetro de cerca de 2,8 µm e entre ou entre cerca de 0,001 e 0,1 pg, inclusive, das moléculas de ligação são ligadas ou unidas à partícula. Em modalidades particulares, a partícula tem um diâmetro de cerca de 4,5 µm e entre ou entre cerca de 0,01 e cerca de 1 pg, inclusive, das moléculas de ligação são ligadas ou unidas à partícula.
[308] Em modalidades particulares, a molécula de ligação é ligada ou unida à partícula, por exemplo, partícula de esfera, em uma quantidade de pelo menos 10-16 mol, pelo menos 10-15 mol, pelo menos 10-14 mol, pelo menos 10-13 mol, pelo menos 10-12 mol, pelo menos 10-11 mol, pelo menos 10-10 mol, pelo menos 10-9 mol, pelo menos 10-8 mol, pelo menos 10-7 mol, pelo menos 10-6 mol, pelo menos 10-5 mol, pelo menos 10-4 mol, pelo menos 10-3 mol, pelo menos 10-2 mol, pelo menos 10-1 mol, ou pelo menos 1 mol for every 107 partículas. Em algumas modalidades, entre ou entre cerca de 1 x 10-13 mol e 1 x 10-9 mol, 1 x 10-12 mol e 1 x 10-9 mol, 1 x 10-13 mol e 1 x 10-10 mol, ou 1 x 10-12 mol e 1 x 10-9 mol, cada, inclusive, são ligados ou ligados às partículas para cada 107 partículas.
[309] Em algumas modalidades, a molécula de ligação é ligada ou unida à partícula, por exemplo, partícula de esfera, em uma quantidade de pelo menos 10-20 mol, pelo menos 10-19 mol, pelo menos 10-18 mol, pelo menos 10-17 mol, pelo menos 10-16 mol, pelo menos 10-15 mol, pelo menos 10-14 mol, pelo menos 10-13 mol, pelo menos 10-12 mol, pelo menos 10-11 mol, ou pelo menos 10-10 mol à cada partícula. Em algumas modalidades, entre ou entre cerca de 10-21 mol e 10-10 mol, 10-20 mol e 10-18 mol, 10-19 mol e 10-17 mol, ou 10-21 mol e 10-19 mol, cada, inclusive, são covalentemente ligados às partículas, por exemplo, esferas, para cada partícula. Em algumas modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, têm um diâmetro de cerca de 2,8 µm e a molécula de ligação é ligada ou unida à partícula em uma quantidade entre ou entre cerca de 10-20 mol e 10-18 mol, inclusive. Em certas modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, têm um diâmetro de cerca de 4,5 µm e a molécula de ligação é ligada ou unida à partícula em uma quantidade entre ou entre cerca de 10-19 mol e 10-17 mol, inclusive.
[310] Em certas modalidades, a molécula de ligação é incubada com partículas, por exemplo, esferas, por exemplo, esferas tosiladas, para unir e/ou conjugar as moléculas de ligação às partículas, por exemplo, esferas. Em modalidades particulares, as moléculas de ligação e as partículas, por exemplo, esferas, são incubadas a uma concentração de ou de cerca de 1 µg, 2 µg, 2,5 µg, 5 µg, 10 µg, 20 µg, 25 µg, 30 µg, 40 µg, 50 µg, 60 µg, 70 µg, 75 µg, 100 µg, 125 µg, 150 µg, 175 µg ou 200 µg de moléculas de ligação por entre 1 x 108 e 1 x 1010 partículas, inclusive, e as moléculas de ligação são unidas e/ou conjugadas às partículas, por exemplo, esferas, com uma eficiência igual ou superior a 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,9% ou de ou de cerca de 100%. Em algumas modalidades, as moléculas de ligação e as partículas, por exemplo, esferas, são incubadas em uma concentração de ou de cerca de 1 µg, 2 µg, 2,5 µg, 5 µg, 10 µg, 20 µg, 25 µg, 30 µg, 40 µg, 50 µg, 60 µg, 70 µg, 75 µg, 100 µg, 125 µg, 150 µg, 175 µg ou 200 µg de moléculas de ligação por entre 4 x 108 e 5 x 108 partículas, inclusive, e as moléculas de ligação são unidas e/ou conjugadas às partículas, por exemplo, esferas, com uma eficiência igual ou superior a 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,9% ou de ou de cerca de 100%. Em modalidades particulares, as moléculas de ligação e as partículas, por exemplo, esferas, são incubadas em uma concentração de ou de cerca de 1 µg, 2 µg, 2,5 µg, 5 µg, 10 µg, 20 µg, 25 µg, 30 µg, 40 µg, 50 µg, 60 µg, 70 µg, 75 µg, 100 µg, 125 µg, 150 µg, 175 µg ou 200 µg de moléculas de ligação por entre 3,5 x 109 e 4,5 x 109 partículas, inclusive, e as moléculas de ligação são unidas e/ou conjugado às partículas com uma eficiência igual ou superior a 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,9% ou igual ou igual a cerca de 100 % Em modalidades particulares, entre 1 µg e 5 µg, entre 5 µg e 25 µg, entre 1 µg e 50 µg, entre 10 µg e 50 µg, 0,1 µg e 10 µg ou 50 µg e 200 µg, cada, inclusive, da molécula de ligação é incubada entre ou entre cerca de 4 x 108 e 5 x 108 partículas ou entre 3,5 x 109 e 4,5 x 109 partículas, cada uma inclusive, e as moléculas de ligação são ligadas e/ou conjugadas às partículas, por exemplo, esferas, com uma eficiência de ou de cerca de ou superior a 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,9% ou de ou cerca de 100%.
[311] Em algumas modalidades, a quantidade média de molécula de ligação conjugada ou ligada à partícula é, é de cerca de, ou é, pelo menos, 2x10-16 g/partícula, 1 x 10-15 g/partícula, 2 x 10-15 g/partícula, 5x10-15 g/partícula, 1 x 10-14 g/partícula, 2x10-14 g/partícula,
5x10-14 g/partícula, 1x10-13 g/partícula, 2x10-13 g/partícula, 5x10-13 g/partícula, 1x10-13 g/partícula, e 2x10-13 g/partícula ±50%, ±40%, ±30%, ±25%, ±20%, ±10%, ±5%, ou ±1%. Em certas modalidades, a quantidade média de molécula de ligação conjugada ou unida à partícula é ou é de cerca de 2 x 10-16 g/partícula ± 50%, ± 40%, ± 30%, ± 25%, ± 20%, ± 10%, ± 5% ou ± 1%. Em modalidades particulares, a quantidade média de molécula de ligação conjugada ou ligada à partícula é ou é de cerca de 1 x 10-15 g/partícula ± 50%, ± 40%, ± 30%, ± 25%, ± 20%, ± 10%, ± 5% ou ± 1%. Em certas modalidades, a quantidade média de molécula de ligação conjugada ou ligada à partícula é ou é de cerca de 2 x 10-15 g/partícula ± 50%, ± 40%, ± 30%, ± 30%, ± 25%, ± 20%, ± 10%, ± 5% ou ± 1%. Em modalidades particulares, a quantidade média de molécula de ligação conjugada ou unida à partícula é ou é de cerca de 1 x 10-14 g/partícula ± 50%, ± 40%, ± 30%, ± 30%, ± 25%, ± 20%, ± 10%, ± 5% ou ± 1%. Em certas modalidades, a quantidade média de molécula de ligação conjugada ou unida à partícula é igual ou menor que 5x10-13 g/partícula, 2x10-13 g/partícula, 1x10-13 g/partícula, 5x10-14 g/partícula, 2x10-14 g/partícula, 1x10-14 g/partícula, 5x10-15 g/partícula, 2x10-15 g/partícula, 1x10-15 g/partícula, ou 2x10-16 g/partícula.
[312] Em algumas modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, compreendem moléculas de ligação que são anticorpos anti- idiotípicos, ou fragmentos ativos dos mesmos, que se ligam ao domínio de ligação de antígeno de um CAR. Em certas modalidades, o anticorpo anti-idiotipo anti-CAR, ou fragmento ativo do mesmo, está ligado a um grupo tosila exposto à superfície da partícula em um local (por exemplo, um grupo amino de cadeia lateral ou um grupo sulfidril de um aminoácido) localizado dentro do domínio Fc do anticorpo. Em modalidades particulares, as partículas, por exemplo, esferas, são monodispersas e superparamagnéticas. Em modalidades particulares,
as partículas, por exemplo, esferas, e têm um diâmetro de cerca de 2,8 µm, entre cerca de 104 e cerca de 106 cópias, inclusive, da molécula de ligação, isto é, um anticorpo anti-CAR anti-idiotípico, por partícula. Em algumas modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, têm um diâmetro de cerca de 4,5 µm e compreendem entre cerca de 5 x 105 e cerca de 5 x 106 cópias, inclusive, do anticorpo anti-CAR anti-idiotípico por partícula.
[313] Em certas modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, compreendem uma molécula de ligação que é ou contém antígeno de polipeptídeo BCMA. Em modalidades particulares, a molécula de ligação compreende um domínio extracelular de BCMA humano e um domínio Fc, que, em alguns casos, é um domínio Fc C-terminal. Em modalidades particulares, as partículas, por exemplo, esferas, têm um diâmetro de cerca de 280 µm e compreendem cerca de 105 cópias da molécula de ligação, por exemplo, o polipeptídeo de fusão BCMA, por partícula. Em certas modalidades, o polipeptídeo de fusão BCMA é ligado a um grupo tosila exposto à superfície da partícula em um sítio (por exemplo, um grupo amino de cadeia lateral ou um grupo sulfidrila de um aminoácido) localizado no domínio Fc do polipeptídeo de fusão. Em modalidades particulares, as partículas, por exemplo, esferas, são monodispersas e superparamagnéticas. Em modalidades particulares, as partículas, por exemplo, esferas, e têm um diâmetro de cerca de 2,8 µm, entre cerca de 104 e cerca de 106 cópias, inclusive, da molécula de ligação, isto é, um polipeptídeo de fusão BCMA, por partícula. Em algumas modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, têm um diâmetro de cerca de 4,5 µm e compreendem entre ou entre cerca de 5 x 105 e 5 x 106 cópias, inclusive, do polipeptídeo de fusão BCMA por partícula. II ESTIMULAÇÃO ex vivo OU EXPANSÃO DE CÉLULAS
[314] É aqui fornecido um método para estimular ou expandir células que expressam um receptor recombinante, por exemplo, um CAR, compreendendo a incubação de uma composição de entrada compreendendo células que expressam um CAR com partículas, por exemplo, esferas, que compreendem uma molécula de ligação que se liga especificamente ou reconhece o receptor recombinante, por exemplo, reagentes conjugados com esferas tal como fornecidos, tais como esferas conjugadas anti-ID ou esferas conjugadas com BCMA. Em algumas modalidades, a ligação entre a molécula de ligação e o receptor recombinante, por exemplo, um CAR, induz a expansão das células que expressam o CAR, produzindo assim uma composição de saída compreendendo células expandidas. Em modalidades particulares, o receptor recombinante é um CAR. Em certas modalidades, a molécula de ligação é um anticorpo anti-idiotipo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que se liga ao fragmento de ligação de antígeno do receptor recombinante. Em certas modalidades, a molécula de ligação é um antígeno que se liga ou é reconhecido pelo CAR.
[315] Em algumas modalidades, partículas, por exemplo, esferas, compreendendo uma molécula de ligação são contatadas ou incubadas com uma composição de entrada compreendendo uma ou mais células para gerar uma composição de saída. Em certas modalidades, a composição de entrada ou células de entrada se refere a uma composição e/ou uma pluralidade de células que se deseja tratar, incubar ou contatar sob condições que estimulem, ativem, causem, gerem e/ou produzam uma ou mais alterações à pelo menos uma porção das células da composição de entrada, convertendo assim a composição de entrada em uma composição de saída. Em algumas modalidades, as células de entrada são uma composição de células imunes, por exemplo, uma composição de células T que contêm células que expressam um receptor recombinante, por exemplo, um CAR. Em modalidades particulares, pelo menos uma porção das células na composição de entrada é ativada, expandida e/ou enriquecida na composição de saída gerada pela prática dos métodos fornecidos.
[316] Em certas modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo uma molécula de ligação são contatadas ou incubadas com células de uma composição de entrada para gerar uma composição de saída expandindo, enriquecendo e/ou ativando pelo menos uma porção, por exemplo, um subgrupo ou uma porção das células de entrada. Em modalidades particulares, as células da composição de entrada compreendem pelo menos uma porção de células que expressam um receptor recombinante, por exemplo, um CAR e/ou pelo menos uma porção de células que contêm uma molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica um receptor recombinante. Em algumas modalidades, a composição de entrada compreende células que devem ser tratadas, contatadas ou incubadas com uma partícula compreendendo uma molécula de ligação, em que o tratamento, contato ou incubação com o agente alterará pelo menos uma porção das células da entrada composição, gerando assim uma composição de saída. Tais alterações podem incluir, mas não estão limitadas a, expandir e/ou enriquecer uma porção de células, ativação de pelo menos uma porção das células e/ou aumentar ou diminuir a expressão de pelo menos um gene de pelo menos uma porção de células. Em certas modalidades, a composição de saída compreende pelo menos uma porção de células da composição de entrada que sofreu uma alteração após a alteração pelo tratamento, contato ou incubação com o agente.
[317] Em algumas modalidades, a expansão, enriquecimento, estimulação e/ou ativação alcançada pela incubação de células com partículas, por exemplo, esferas, compreendendo uma molécula de ligação, podem ser tituladas, ajustadas e/ou controladas pela seleção de partículas, por exemplo, esferas, com um número, nível ou quantidade específica de moléculas de ligação que são conjugadas ou de alguma forma ligadas a cada partícula. Em modalidades particulares, aumentar o número de ligações moléculas de ingestão conjugadas ou de outro modo ligadas a cada partícula aumenta a expansão, enriquecimento, estimulação e/ou ativação alcançada pela incubação das células com as partículas, por exemplo, esferas. Em certas modalidades, a diminuição do número de moléculas de ligação conjugadas ou ligadas a cada partícula diminui a expansão, enriquecimento, estimulação e/ou ativação alcançada pela incubação das células com as partículas, por exemplo, esferas. Em modalidades particulares, a expansão, enriquecimento, estimulação e/ou ativação é medida por qualquer meio conhecido adequado. Em modalidades particulares, um aumento na expansão, enriquecimento, estimulação e/ou ativação é um aumento estatisticamente significativo e/ou pelo menos ou pelo menos cerca de 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, 10 vezes, aumento de 100 vezes, por exemplo, em comparação com um controle e/ou incubação sob diferentes condições, de uma medição associada à expansão, enriquecimento, estimulação e/ou ativação das células durante ou após a incubação com as partículas, por exemplo, esferas. Em certas modalidades, uma diminuição na expansão, enriquecimento, estimulação e/ou ativação é uma diminuição estatisticamente significativa e/ou pelo menos ou pelo menos cerca de 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, Redução de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 99,9% de uma medição associada à expansão, enriquecimento, estimulação e/ou ativação das células durante ou após a incubação com as partículas, por exemplo, esferas.
[318] Em algumas modalidades, a composição de entrada compreende células eucarióticas, como células de mamífero. Em certas modalidades, a composição de entrada compreende células humanas.
Em algumas modalidades, a composição de entrada compreende células que são derivadas do sangue, medula óssea, linfa ou órgãos linfoides. Em modalidades particulares, a composição de entrada compreende células do sistema imunológico, isto é, células de imunidade inata ou adaptativa, por exemplo, células mieloides ou linfoides, incluindo linfócitos, tipicamente células T e/ou células NK. Em algumas modalidades, a composição de entrada compreende células- tronco, como células-tronco multipotentes e pluripotentes, incluindo células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Em modalidades particulares, a composição de entrada compreende células CD3+. Em certas modalidades, a composição de saída compreende células CD4+. Em algumas modalidades, a composição de entrada compreende células CD8+. Em algumas modalidades, a composição de entrada compreende células CD3+ que também expressam níveis baixos ou nenhum CD28.
[319] Em algumas modalidades, a molécula de ligação estimula a ativação e/ou expansão de células que expressam baixos níveis de CD28 ou células que são negativas para CD28. Em certas modalidades, as células não são contatadas com reagentes conjugados anti- CD3/anti-CD28 antes de contatar as células com a molécula de ligação.
[320] Em algumas modalidades, os métodos e partículas, por exemplo, esferas, compreendendo uma molécula de ligação (por exemplo, reagentes conjugados com esferas tal como fornecido, como esferas conjugadas anti-ID ou esferas conjugadas com BCMA) são capazes de estimular células T deficientes em ou que tenham regulado de maneira negativa uma ou mais moléculas de sinalização naturais, como um ou mais receptores coestimulatórios ou receptores de antígeno ou receptores de citocinas, mas que expressem o receptor quimérico, por exemplo, o CAR, reconhecido pela molécula de ligação dos reagentes conjugados à esfera fornecida. Em algumas modalidades, as células da composição de entrada são baixas ou negativas para a expressão de superfície de CD28 ou outra molécula coestimulatória ou outra molécula de sinalização.
Assim, em algumas modalidades, os reagentes e métodos fornecidos têm certas vantagens em comparação com outros agentes ou métodos de ativação ou estimulação que podem exigir ou depender da expressão de superfície de CD28 ou outra molécula de sinalização endógena, para fornecer o sinal desejado e/ou extensão completa de tal sinal, por exemplo, para fornecer sinal coestimulatório e/ou para obter ativação completa.
Em algumas modalidades, os agentes e métodos fornecidos são vantajosos em relação a isso em comparação com reagentes anti-CD3/anti-CD28 (por exemplo, esferas); em alguns aspectos, as partículas fornecidas, por exemplo, esferas, compreendendo uma molécula de ligação (por exemplo, reagentes conjugados com esferas tal como fornecidas, como esferas conjugadas anti-ID ou esferas conjugadas com BCMA) são vantajosas por serem capazes de estimular ou alcançar o efeito desejado como ativação ou proliferação de células baixas ou negativas para CD28 ou outra molécula de sinalização natural.
Em alguns aspectos, a sinalização através do CAR por estimulação com um anticorpo anti-ID resulta em um sinal primário e secundário (coestimulatório) através do CAR usando apenas o único reagente.
Em algumas modalidades, a composição de entrada compreende células CD3+ que expressam baixos níveis de CD28 ou outra molécula de sinalização endógena.
Em algumas modalidades, a composição de entrada compreende células CD3+ que são CD28 negativas ou são negativas para outra molécula de sinalização endógena.
Em algumas modalidades, partículas, por exemplo, esferas, compreendem A ingestão de uma molécula de ligação (por exemplo, reagentes conjugados com esferas tal como fornecido, como esferas conjugadas com anti-ID ou esferas conjugadas com BCMA) estimula a ativação e/ou expansão de células que expressam baixos níveis de CD28 ou células que são negativas para CD28.
[321] Em modalidades particulares, a composição de entrada é ou inclui células T humanas primárias. Em algumas modalidades, a composição de entrada é ou inclui células T CD4+ enriquecidas. Em algumas modalidades, a composição de entrada é ou inclui células T CD8+ enriquecidas. Em certas modalidades, a composição de entrada compreende células CD4+ e células CD8+. Em modalidades particulares, a razão das células CD4+ para as células CD8+ na composição de entrada é maior que cerca de 50:1, ou entre ou entre cerca de 25:1 e 50:1, 10: e 25:1, 5:1 e 10:1, 3:1 e 5:1, 2:1 e 3:1, 1:1 e 2:1, 1:1 e 1:2, 2:1 e 1:2, 1:2 e 1:3, 1:3 e 1:5, 1:5 e 1:10, 1:10 e 1:25, ou 1:25 e 1:50, cada, inclusive.
[322] Em algumas modalidades, uma composição de entrada compreende uma população de células que foram transduzidas ou transfectadas ou células que são derivadas de células que foram transduzidas ou transfectadas, com um ou mais ácidos nucleicos que codificam um receptor recombinante, por exemplo, CAR, que é ligado ou reconhecido pela molécula de ligação das partículas, por exemplo, esferas. Em algumas modalidades, a composição de entrada compreende uma população de células que foram transduzidas ou transfectadas ou células que são derivadas de células que foram transduzidas ou transfectadas com um ou mais ácidos nucleicos que codificam um receptor recombinante, que é ligado ou reconhecido por a molécula de ligação. Em modalidades particulares, as células da composição de entrada foram transfectadas ou transduzidas por qualquer método como aqui descrito, por exemplo, na Seção III. Em certas modalidades, os um ou mais ácidos nucleicos foram transfectados para a célula com um vírus, conforme descrito aqui, por exemplo, na Seção III. Em algumas modalidades, os um ou mais ácidos nucleicos foram transfectados para a célula com um plasmídeo não viral, por exemplo, um epissoma ou um transposon, como aqui descrito, por exemplo, na Seção III. Em modalidades particulares, uma composição de entrada compreendendo células que expressam um receptor recombinante, por exemplo, um CAR, na superfície celular que é ligada ou reconhecida pela molécula de ligação das partículas, por exemplo, esferas.
[323] Em modalidades particulares, a composição de entrada compreende uma célula que expressa um receptor recombinante, por exemplo, um CAR, como um que é derivado de qualquer um dos métodos descritos neste documento, por exemplo, na Seção III.
[324] Em modalidades particulares, uma composição de entrada não compreende inicialmente células que expressam um receptor recombinante, por exemplo, um CAR. Em algumas modalidades, as células de uma composição de entrada que não compreendem inicialmente células que expressam um receptor recombinante são contatadas, incubadas ou tratadas com partículas, por exemplo, esferas, compreendendo uma molécula de ligação pelo menos durante uma porção de uma transfecção ou transdução do células com um ou mais ácidos nucleicos que compreendem um gene que expressa um receptor recombinante que é ligado ou reconhecido pela molécula de ligação. Em algumas modalidades, a transfecção ou transdução é realizada como descrito aqui, por exemplo, na Seção III. Em algumas modalidades, durante pelo menos uma porção da incubação com a molécula de ligação, após a introdução do ácido nucleico nas células, o receptor recombinante se expressa na superfície das células onde é capaz de interagir com a molécula de ligação. Em modalidades particulares, a transfecção ou transdução é realizada sem nenhuma etapa prévia de expansão, ativação e/ou isolamento. Em certas modalidades, as células não são incubadas, tratadas ou contatadas com uma ou mais moléculas estimulatórias policlonais capazes de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo de TCR antes da transfecção ou transdução. Em modalidades particulares, as células não são contatadas com uma ou mais moléculas estimulatórias policlonais que são anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 antes da transdução ou transfecção.
[325] Em certas modalidades, a composição de entrada compreende células que o fazem e células que não expressam o receptor recombinante, por exemplo, um CAR, que é ligado ou reconhecido pela molécula de ligação. Em algumas modalidades, o tratamento, o contato ou a incubação das células da composição de entrada com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação estimulará a ativação e/ou expansão de células que expressam o receptor recombinante, por exemplo, um CAR, mas não estimula a ativação e/ou expansão de células que não expressam o receptor recombinante. Em certas modalidades, o tratamento, o contato ou a incubação das células da composição de entrada com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação que se liga a ou reconhece o receptor recombinante, irá estimular a ativação e/ou a expansão de células que não expressam o receptor recombinante em menor grau do que as células que expressam o receptor recombinante.
[326] Em modalidades particulares, uma porção das células da composição de entrada expressa ou contém DNA heterólogo que codifica um receptor recombinante, por exemplo, um CAR. Em certas modalidades, menor que 0,01%, menor que 0,1%, menor que 1%, menor que 5%, menor que 10%, menor que 20%, menor que 25%, menor que 30%, menor que 35%, menor inferior a 40%, inferior a 45%, inferior a 50%, inferior a 55%, inferior a 60%, inferior a 65%, inferior a
70%, inferior a 80% ou inferior a 90% das células expressas, ou contêm um ou mais ácidos nucleicos que contêm um gene que codifica, um receptor recombinante. As células que expressam o receptor recombinante ou compreendem DNA heterólogo que codifica um receptor recombinante podem ser identificadas por qualquer meio conhecido na técnica, por exemplo, mas não limitado à detecção de um mRNA que codifica o receptor recombinante na célula, detectando diretamente o receptor heterólogo, por exemplo, detectando a ligação de uma sonda ou anticorpo marcado que se liga ao receptor recombinante, ou detectando um marcador substituto que é codificado pelo DNA heterólogo. Em algumas modalidades, células que expressam o receptor recombinante identificado pela detecção de um marcador substituto. Em certas modalidades, o marcador substituto é um polipeptídeo EGFR truncado.
[327] Em modalidades particulares, as células de entrada são ou incluem células que foram transfectadas e/ou transduzidas com uma baixa quantidade de partículas virais, por exemplo, esferas, razão de cópias das partículas do vetor viral, por exemplo, esferas, para células e/ou unidades infecciosas (UI), antes do contato com as partículas, por exemplo, esferas. Em modalidades particulares, as células de entrada, por exemplo, células que são contatadas, incubadas e/ou tratadas com partículas, por exemplo, esferas que contêm uma molécula de ligação, são células que foram transduzidas com uma quantidade menor de partículas virais, razão de cópias das partículas do vetor viral, por exemplo, esferas, para células e/ou UI, do que células de entrada que são expandidas e/ou enriquecidas por estimulação policlonal, por exemplo, partículas revestidas com anticorpo anti-CD3 e/ou anti-CD28. Por exemplo, em algumas modalidades, a composição de entrada que é incubada com as partículas, por exemplo, esferas, contendo moléculas de ligação é gerada a partir de células que foram transduzidas com ou com pelo menos 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 ou 60 menos UI por célula do que uma composição de entrada que é expandida e/ou enriquecida por estimulação policlonal. Em algumas modalidades, a composição de entrada que é incubada com as partículas, por exemplo, esferas, contendo uma molécula de ligação é gerada a partir de células que foram transduzidas com um título de partículas de vetores virais, por exemplo, esferas, com ou com pelo menos 1 x 105 IU/mL, 5 x 105 IU/mL, 1 x 106 IU/mL, 5 x 10 6 IU/mL, 6 x 106 IU/mL, 7 x 106 IU/mL, 8 x 106 IU/mL, 9 x 106 IU/mL, ou 1 x 107 IU/mL a menos que a composição de entrada que é expandida e/ou enriquecida por estimulação policlonal.
[328] Em modalidades particulares, a transdução de células com uma IU/célula alta levará a alta eficiência de transdução, mas, em algumas modalidades, também pode levar a células transfectadas com um número de cópia vetorial alto (VCN), o que pode apresentar riscos à segurança e pode não atender aos padrões regulamentares. Em modalidades particulares, a redução da IU/célula com a qual as células são transduzidas reduzirá a eficiência da transdução, mas diminuirá o VCN. Em modalidades particulares, o aumento da IU/célula com a qual as células são transduzidas aumentará a eficiência da transdução, mas também aumentará o VCN.
[329] Em modalidades particulares, a incubação, o contato ou o tratamento de células da composição de entrada com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo uma molécula de ligação é realizada sob condições de estimulação, expansão e/ou ativação de células que condições podem incluem um ou mais meios específicos, temperatura, conteúdo de oxigênio, conteúdo de dióxido de carbono, tempo, agentes, por exemplo, nutrientes, aminoácidos, antibióticos, íons e/ou fatores estimuladores, como citocinas, quimiocinas, antígenos, parceiros de ligação, fusão proteínas, receptores solúveis recombinantes e quaisquer outros agentes projetados para ativar as células.
[330] Em algumas modalidades, as células da composição de entrada não expressam um receptor recombinante, por exemplo, um CAR, e são incubadas, contatadas ou tratadas com partículas, por exemplo, esferas, compreendendo uma molécula de ligação enquanto estão em contato com os um ou mais ácidos nucleicos que compreendem um gene que codifica um receptor recombinante. Em certas modalidades, a molécula de ligação das partículas, por exemplo, esferas, liga-se ou reconhece o receptor recombinante que é codificado pelo gene. Em algumas modalidades, o um ou mais ácidos nucleicos são entregues em uma partícula de vírus. Em modalidades particulares, o um ou mais ácidos nucleicos são um vetor epissomal. Em algumas modalidades, o um ou mais ácidos nucleicos são um transposon. Em certas modalidades, as células da composição de entrada são tratadas, incubadas ou contatadas com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo uma molécula de ligação ecule pelo menos uma parte do tempo em que um ou mais ácidos nucleicos contatam as células da composição de entrada. Em modalidades particulares, as células são contatadas com o um ou mais ácidos nucleicos, conforme descrito aqui, por exemplo, na Seção III.
[331] Em algumas modalidades, as células da composição de entrada foram transfectadas ou transduzidas com um ácido nucleico compreendendo um gene que codifica um receptor recombinante, por exemplo, um CAR; a composição de entrada compreende células que expressam um receptor recombinante, por exemplo, um CAR; e as células são contatadas, incubadas ou tratadas com partículas, por exemplo, esferas, compreendendo moléculas de ligação que se ligam ou reconhecem o receptor recombinante. Em algumas modalidades, as células da composição de entrada são tratadas, incubadas ou colocadas em contato com as partículas, por exemplo, esferas,
compreendendo uma molécula de ligação após as células serem transduzidas ou transfectadas. Em algumas modalidades, as células da composição de entrada são tratadas, incubadas ou contatadas com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo uma molécula de ligação após as células terem sido transduzidas ou transfectadas com um ou mais ácidos nucleicos, como descrito aqui, por exemplo, na Seção III. Em modalidades particulares, as células da composição de entrada são tratadas, incubadas ou contatadas com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo uma molécula de ligação imediatamente, dentro de cerca de 1 minuto, dentro de cerca de 5 minutos, dentro de cerca de 30 minutos, dentro de cerca de 1 hora, em aproximadamente 2 horas, em aproximadamente 4 horas, em aproximadamente 6 horas, em aproximadamente 8 horas, em aproximadamente 12 horas, em aproximadamente 12 horas, em aproximadamente 24 horas, em aproximadamente 2 dias, em aproximadamente 3 dias, em aproximadamente 4 dias, em aproximadamente 5 dias, dentro de cerca de 6 dias, dentro de cerca de 1 semana, dentro de cerca de 2 semanas, dentro de cerca de 3 semanas, dentro de cerca de 4 semanas, dentro de cerca de 5 semanas ou dentro de cerca de 6 semanas após o contato das células com um ou mais ácidos nucleicos.
[332] Em algumas modalidades, as células da composição de entrada são transduzidas ou transfectadas com o um ou mais ácidos nucleicos que compreendem um gene que codifica um receptor recombinante, por exemplo, conforme descrito na Seção III, e as células são subsequentemente congeladas e armazenadas para um tempo antes de descongelar e expandir as células. Em algumas modalidades, as células da composição de entrada foram congeladas e as células são contatadas, incubadas ou tratadas com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo uma molécula de ligação dentro ou dentro de cerca de 1 minuto, 5 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas, 24 horas, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas ou t 6 semanas após o descongelamento das células.
[333] Em algumas modalidades, o contato, incubação ou tratamento de células da composição de entrada com as partículas (por exemplo, esferas) compreendendo uma molécula de ligação é realizado em um recipiente, por exemplo, um prato de cultura de células, um poço de cultura de células ou uma saqueta.
[334] Em algumas modalidades, as células da composição de entrada são contatadas, incubadas ou tratadas com as partículas, por exemplo, esferas, numa razão do total de células da composição de entrada para partículas, por exemplo, esferas, entre ou cerca de 100:1 a 1:100, 50:1 a 1:50, 25:1 a 1:25, 10:1 a 1:10, 5:1 a 1:5, 3:1 a 1:3 ou 2:1 a 1:2. Em modalidades particulares, a razão é de ou de cerca de 1:0,1 a cerca de 1:5. Em algumas modalidades, a razão do total de células da composição de entrada para partículas, por exemplo, esferas, é de cerca de 1:1.
[335] Em algumas modalidades, entre ou entre cerca de 102 e 1012, 103 e 1010, 104 e 109, 103 e 106, 104 e 108, 102 e 104, 103 e 105, 104 e 106, 105 e 107, ou 106 e 108 células, cada uma inclusive, da composição de entrada são contatadas, incubadas ou tratadas com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo uma molécula de ligação. Em certas modalidades, menos de cerca de 102, ou entre ou entre 102 e 103, 103 e 104, 104 e 105, 105 e 106, 106 e 107, 107 e 108, 108 e 109,109 e 1010, 1010 e 1011, ou 1011 e 1012 células da composição de entrada, cada uma inclusive, são contatadas, incubadas ou tratadas com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo uma molécula de ligação.
[336] Em algumas modalidades, a incubação ou contato com células de uma composição de entrada é realizada com uma quantidade suficiente de partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação para permitir a união da molécula de ligação a uma ou mais células na entrada composição e/ou para induzir a estimulação, ativação e/ou proliferação de uma ou mais células na composição de entrada. O número ou razão específica de partículas, por exemplo, esferas, para células da composição de entrada podem ser determinados empiricamente, dependendo da quantidade específica de molécula de ligação por esfera, o antígeno específico, a fonte de células da composição de entrada e outros fatores dentro do nível de um versado na técnica.
[337] Em algumas modalidades, a quantidade de partículas, por exemplo, esferas, adicionadas às células de uma composição de entrada é uma quantidade a ser fornecida entre ou entre cerca de 1 molécula de ligação e 1012 moléculas de ligação por célula da composição de entrada durante a incubação ou o contato, como entre ou entre cerca de 102 moléculas de ligação e 1010 moléculas de ligação, 103 moléculas de ligação e 108 moléculas de ligação, 104 moléculas de ligação e 106 moléculas de ligação, 1 molécula de ligação e 102 moléculas de ligação, 102 moléculas de ligação e 103 moléculas de ligação, 103 moléculas de ligação e 104 moléculas de ligação, 104 moléculas de ligação e 105 moléculas de ligação, 105 moléculas de ligação e 106 moléculas de ligação, 105 moléculas de ligação e 106 moléculas de ligação, 106 moléculas de ligação e 107 moléculas de ligação, 107 moléculas de ligação e 108 moléculas de ligação, 109 moléculas de ligação e 1010 moléculas de ligação, 1010 moléculas de ligação e 1011 moléculas de ligação ou 1011 moléculas de ligação e 1012 moléculas de ligação por célula, cada uma inclusive na composição de entrada durante a incubação ou o contato. Em algumas modalidades, a quantidade de partículas, por exemplo, esferas, adicionadas à composição de entrada é uma quantidade para fornecer entre cerca de
104 moléculas de ligação e cerca de 106 moléculas de ligação para cada célula na composição de entrada durante a incubação ou o contato. Em algumas modalidades, a quantidade de partículas, por exemplo, esferas, contém cerca de 105 moléculas de ligação para cada célula na composição de entrada durante a incubação ou o contato.
[338] Em algumas modalidades, a quantidade de partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação adicionada à composição de entrada durante a incubação ou o contato é uma quantidade de partículas, por exemplo, esferas, que contém entre ou entre cerca de 0,0001 pg e cerca de 10 pg, 0,001 pg e 1 pg, 0,001 pg e 1 pg, 0,001 pg e 0,1 pg, 0,005 pg e 0,05 pg, 0,005 pg e 0,02 pg ou 0,01 pg e 0,05 pg de moléculas de ligação, cada uma inclusive para cada célula na composição de entrada durante a incubação ou o contato. Em algumas modalidades, a quantidade total de partículas, por exemplo, esferas, adicionadas às células da composição de entrada é uma quantidade para fornecer entre ou entre cerca de 0,0001 µg e 10 µg, 0,001 µg e 1 µg, 0,001 µg e 1 µg, 0,001 µg e 0,1 µg, 0,005 µg e 0,05 µg, 0,005 µg e 0,02 µg ou 0,01 µg e 0,05 µg de moléculas de ligação, cada uma inclusive.
[339] Em algumas modalidades, a quantidade de partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação adicionada à composição de entrada durante a incubação ou o contato é uma quantidade de partículas, por exemplo, esferas, que contém pelo menos 10-20 mol, pelo menos 10-19 mol, pelo menos 10-18 mol, pelo menos 10-17 mol, pelo menos 10-16 mol, pelo menos 10-15 mol, pelo menos 10-14 mol, pelo menos 10-13 mol, pelo menos 10-12 mol, pelo menos 10-11 mol, ou pelo menos 10-10 mol de moléculas de ligação para cada célula na composição de entrada durante a incubação ou o contato. Em algumas modalidades, a quantidade contém entre 10-21 mol e 10-10 mol, 10-20 mol e 10-18 mol, 10-19 mol e 10-17 mol, ou 10-21 mol e 10-19 mol de moléculas de ligação, cada uma inclusive, para cada célula na composição de entrada durante a incubação ou o contato. Em algumas modalidades, a quantidade total de partículas, por exemplo, esferas, adicionadas às células da composição de entrada é uma quantidade que fornece pelo menos 10-16 mol, pelo menos 10-15 mol, pelo menos 10-14 mol, pelo menos 10-13 mol, pelo menos 10-12 mol, pelo menos 10-11 mol, pelo menos 10-10 mol, pelo menos 10-9 mol, pelo menos 10-8 mol, pelo menos 10-7 mol, pelo menos 10-6 mol, pelo menos 10-5 mol, pelo menos 10-4 mol, pelo menos 10-3 mol, pelo menos 10-2 mol, pelo menos 10-1 mol ou pelo menos 1 mol de moléculas de ligação.
[340] Em algumas modalidades, o contato ou incubação das partículas, por exemplo, esferas, compreendendo uma molécula de ligação com a composição de entrada é realizado em um volume que está entre ou entre cerca de 0,01 mL e 100 mL, como 0,01 mL e 50 mL, 0,01 mL e 25 mL, 0,01 mL e 10 mL, 0,01 mL e 5 mL, 0,01 mL e 1 mL, 0,01 mL e 0,5 mL, 0,01 mL e 0,1 mL, 0,01 mL e 0,05 mL, 0,05 mL e 100 mL, 0,05 mL e 50 mL, 0,05 mL e 25 mL, 0,05 mL e 10 mL, 0,05 mL e 5 mL, 0,05 mL e 1 mL, 0,05 mL e 0,5 mL, 0,05 mL e 0,1 mL, 0,1 mL e 100 mL, 0,1 mL e 50 mL, 0,1 mL e 25 mL, 0,1 mL e 10 mL, 0,1 mL e 5 mL, 0,1 mL e 1 mL, 0,1 mL e 0,5 mL, 0,5 mL e 100 mL, 0,5 mL e 50 mL, 0,5 mL e 25 mL, 0,5 mL e 10 mL, 0,5 mL e 5 mL, 0,5 mL e 1 mL, 1 mL e 100 mL, 1 mL e 50 mL, 1 mL e 25 mL, 1 mL e 10 mL, 1 mL e 5 mL, 5 mL e 100 mL, 5 mL e 50 mL, 5 mL e 25 mL, 5 mL e 10 mL, 10 mL e 100 mL, 10 mL e 50 mL, 10 mL e 25 mL, 25 mL e 100 mL, 25 mL e 5 0 mL ou 50 mL e 100 mL, cada, inclusive. Em algumas modalidades, o volume é fornecido por uma solução, tal como meios ou um tampão farmaceuticamente aceitável.
[341] Em algumas modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação são de uma composição de partículas, por exemplo, esferas, que têm uma concentração de moléculas de ligação de pelo menos 0,001 µg/mL, pelo menos 0,01 µg/mL, pelo menos 0,1 µg/mL, pelo menos 0,5 µg/mL, pelo menos 1 µg/mL, pelo menos 1,5 µg/mL, pelo menos t 2 µg/mL, pelo menos 3 µg/mL, pelo menos 4 µg/mL, pelo menos 5 µg/mL, pelo menos 6 µg/mL, pelo menos 7 µg/mL, pelo menos 7 µg/mL, pelo menos 8 µg/mL, pelo menos 9 µg/mL, pelo menos 10 µg/mL, pelo menos 50 µg/mL, pelo menos 100 µg/mL, pelo menos 500 µg/mL, pelo menos 1 mg/ml ou pelo menos 10 mg/ml. Em algumas modalidades, a composição de partículas contém entre ou entre cerca de 5x107 e 1 x 1010 partículas ou esferas por ml, inclusive. Em modalidades particulares, as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação são de uma composição de partículas, por exemplo, esferas, que têm uma concentração de moléculas de ligação entre ou entre cerca de 0,001 µg/mL a 10 mg/ml, 0,001 µg/mL e 1 µg/mL, 0,001 µg/mL e 1 µg/mL, 0,001 µg/mL e 0,1 µg/mL, 0,01 µg/mL e 1 µg/mL, 1 µg/mL e 10 µg/mL, 0,5 µg/mL e 5 µg/mL, ou 1 µg/mL e 5 µg/mL. Em algumas modalidades, a composição de partículas contém entre ou entre cerca de 5 x 107 e 1 x 1010, 1 x 108 e 5 X 109, ou partículas ou esferas de 4 x 108 e 4 x 109 por ml, cada uma inclusive.
[342] Em certas modalidades, a quantidade de partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação adicionada à composição de entrada durante a incubação ou o contato é uma quantidade de partículas, por exemplo, esferas, que fornece uma concentração de 10-13 M, pelo menos 10-12 M, pelo menos 10-11 M, pelo menos 10-10 M, pelo menos 10-9 M, pelo menos 10-8 M, pelo menos 10-7 M, pelo menos 10-6 M, pelo menos 10-5 M, pelo menos 10-4 M, pelo menos 10-3 M, pelo menos 10-2 M, pelo menos 0.1 M, pelo menos 1 M, ou pelo menos 10 M da molécula de ligação. Em algumas modalidades, a quantidade de partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação adicionada à composição de entrada durante a incubação ou o contato, é uma quantidade de partículas, por exemplo, esferas, que fornece uma concentração entre ou entre 10-10 M e 10-3 M, 10-9 M e 10-6 M, 10-10 M e 10-7 M, ou 10-9 M e cerca de 10-6 M, inclusive.
[343] Em modalidades particulares, as células da composição de entrada são contatadas, incubadas ou tratadas com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação por pelo menos ou pelo menos cerca de 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 3 semanas ou 4 semanas. Em modalidades particulares, as células da composição de entrada são contatadas, incubadas ou tratadas com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação por menos ou menos de cerca de 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 6 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias ou menos que ou cerca de 12 dias. Em algumas modalidades, as células da composição de entrada são contatadas, incubadas ou tratadas com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação entre ou entre cerca de 1 dia e cerca de 14 dias, 3 dias e 7 dias ou 4 dias e 6 dias, inclusive. Em algumas modalidades, as células da composição de entrada são contatadas, incubadas ou tratadas com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação por cerca de 5 dias. Em certas modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo uma molécula de ligação são contatadas ou incubadas com células da composição de entrada, por exemplo, compreendendo células que expressam um receptor recombinante, por exemplo, um CAR, por um período de tempo para expandir uma ou mais células da composição de entrada, tal como expandir células da composição de entrada que expressam o receptor recombinante. Em modalidades particulares, as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo uma molécula de ligação são contatadas ou incubadas com células da composição de entrada, por exemplo, compreendendo células que expressam um receptor recombinante, por exemplo, um CAR, por um período de tempo para inserir composição cronicamente
[344] Em modalidades particulares, células de uma composição de entrada, por exemplo compreendendo células que expressam um receptor recombinante, por exemplo, um CAR, são incubadas, contatadas ou tratadas com partículas, por exemplo, esferas, compreendendo uma molécula de ligação a temperaturas maiores que a temperatura ambiente para expandir as células da composição de entrada que expressam o receptor recombinante. Em algumas modalidades, o tratamento, incubação ou contato é realizado a uma temperatura maior que cerca de 25 ºC, como geralmente maior ou maior que cerca de 32 ºC, 35 ºC ou 37 ºC. Em algumas modalidades, o tratamento, contato ou incubação é realizado a uma temperatura de cerca de 37 ºC ± 2 ºC, como a uma temperatura de cerca de 37 ºC.
[345] Em algumas modalidades, as células da composição de entrada, por exemplo compreendendo células que expressam um receptor recombinante, por exemplo, um CAR, são incubadas, tratadas ou contatadas com as partículas, por exemplo, esferas, contendo a molécula de ligação e um ou mais agentes adicionais (por exemplo, agentes estimuladores e/ou acessórios), por exemplo, ligante, capaz de ativar um domínio de sinalização intracelular de um complexo TCR.
[346] Em algumas modalidades, o agente adicional é unido à superfície da partícula.
[347] Em certas modalidades, os um ou mais agentes adicionais são separados das partículas, por exemplo, esferas. Em algumas modalidades, os um ou mais agentes adicionais são uma ou mais citocinas. Em modalidades particulares, os um ou mais agentes adicionais são ou incluem uma ou mais citocinas recombinantes. Em algumas modalidades, as uma ou mais citocinas são citocinas recombinantes humanas. Em certas modalidades, as uma ou mais citocinas se ligam e/ou são capazes de se ligar a receptores que são expressos por e/ou são endógenos às células T. Em modalidades particulares, as uma ou mais citocinas são ou incluem um ou mais membros da família de citocinas 4-alfa-hélix bundle. Em algumas modalidades, as uma ou mais citocinas podem incluir, mas não estão limitadas a, interleucina-2 (IL-2), interleucina-4 (IL-4), interleucina-7 (IL- 7), interleucina-9 (IL-9), interleucina 12 (IL-12), interleucina 15 (IL-15), fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF) e fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF). Em algumas modalidades, a uma ou mais citocinas é ou inclui uma ou mais de IL-2, IL-7 e IL-15.
[348] Em algumas modalidades, pelo menos uma porção das células da composição de entrada expressa um CAR, e as células são incubadas, tratadas ou contatadas com partículas, por exemplo, esferas, com moléculas de ligação acopladas, em que as moléculas de ligação são anticorpos anti-idiotípicos, ou fragmentos ativos dos mesmos, que se ligam ao domínio de ligação de antígeno do CAR. Em algumas modalidades, as células são incubadas por cerca de 3-7 dias, inclusive. Em modalidades particulares, as partículas, por exemplo, esferas, têm um diâmetro de cerca de 280 µm, as partículas, por exemplo, esferas, compreendem cerca de 105 cópias das moléculas de ligação, isto é, um anticorpo anti-CAR anti-idiotípico, por partícula, e as células são incubadas, contatadas e/ou tratadas com as células em uma razão de cerca de 1:1 partículas, por exemplo, esferas, para células. Em algumas modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, têm um diâmetro de cerca de 450 µm, as partículas, por exemplo, esferas, compreendem entre cerca de 1 x 106 e cerca de 2 x 106 cópias do anticorpo anti-CAR anti-idiotípico, por partícula, e células são incubadas, contatadas e/ou tratadas com as células em uma razão de cerca de 1:1 partículas, por exemplo, esferas, para células.
[349] Modalidades particulares são projetadas para um método de expansão de células, compreendendo a incubação de uma composição de entrada que compreende células que expressam um CAR com um domínio de ligação de antígeno que se liga a ou reconhece especificamente o BCMA com partículas, por exemplo, esferas, que compreendem uma molécula de ligação que se liga a ou reconhece o CAR. Em algumas modalidades, a molécula de ligação é um polipeptídeo de fusão compreendendo um domínio extracelular de BCMA humano e um domínio Fc C-terminal. Em algumas modalidades, as células são incubadas por cerca de 3-7 dias. Em modalidades particulares, as partículas, por exemplo, esferas, têm um diâmetro de cerca de 280 µm, as partículas, por exemplo, esferas, compreendem cerca de 105 cópias das moléculas de ligação, ou seja, os polipeptídeos de fusão BCMA, por partícula, e as células são incubadas, contatadas e/ou tratadas com as células em uma razão de cerca de 1:1 partículas, por exemplo, esferas, para células. Em algumas modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, têm um diâmetro de cerca de 450 µm, as partículas, por exemplo, esferas, compreendem entre cerca de 1 x 106 e cerca de 2 x 106 cópias das moléculas de ligação, isto é, polipeptídeos de fusão BCMA, por partícula, e as células são incubadas, contatadas e/ou tratadas com as células em uma razão de cerca de 1:1 partículas, por exemplo, esferas, para células.
[350] Em modalidades particulares, as células da composição de entrada são contatadas, incubadas ou tratadas com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação por um longo período de tempo para realizar uma estimulação de longo prazo, por exemplo, mais de 10 dias. Em algumas modalidades, as células que expressam um receptor recombinante são incubadas, como são incubadas continuamente ou sem interrupção, com as partículas ou esferas contendo a molécula de ligação por pelo menos 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias ou 16 dias. Em alguns aspectos, o período de tempo escolhido para a incubação é um tempo em que uma ou mais funções ou atividades das células da composição exibem características de células ou células estimuladas cronicamente que têm exposição prolongada ao antígeno na terminação ou no final da incubação. Em algumas modalidades, as células que expressam um receptor recombinante são incubadas com as partículas ou esferas para executar um método de estimulação de longo prazo, como modelar características de células estimuladas cronicamente ou células com exposição prolongada ao antígeno. Recursos Exemplares de Composições de Saída
[351] Em modalidades particulares, o contato de células da composição de entrada com partículas, por exemplo, esferas, compreendendo uma molécula de ligação (por exemplo, reagentes conjugados com esferas, conforme fornecido, como esferas conjugadas com anti-ID ou esferas conjugadas com BCMA) resulta em uma composição de saída compreendendo pelo menos uma propriedade, por exemplo, número total de células, a porção ou subconjunto de células que expressam um receptor recombinante, taxa de proliferação celular e/ou expressão de um gene como como marcador de ativação ou marcador de exaustão, que é diferente de uma célula correspondente de uma composição de entrada. Em algumas modalidades, os métodos resultam em proliferação, ativação, estimulação, liberação de citocinas ou outro resultado funcional, como a regulação positiva de um marcador de ativação ou liberação ou produção de citocinas, de células que expressam o receptor quimérico, como o CAR, reconhecido pela molécula de ligação. Em alguns aspectos, essa proliferação ou outra resposta ou leitura funcional é induzida nessas células em um grau semelhante ou superior ao induzido pela incubação das células com um agente e/ou condições que estimulam a proliferação de células T, como esferas anti-CD3/CD28 e/ou anti-CD3 reticulado.
[352] Em algumas modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo uma molécula de ligação são removidas da composição de saída. Em algumas modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, são magnetizáveis ou responsivas magneticamente, por exemplo, partículas paramagnéticas ou superparamagnéticas, por exemplo, esferas. Em algumas modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, são oligômeros de estreptavidina. São conhecidos métodos para remover partículas, por exemplo, esferas, (por exemplo, partículas de esferas, por exemplo, esferas ou partículas magnetizáveis) das células. Em algumas modalidades, pode ser usado o uso de anticorpos não marcados concorrentes, que, por exemplo, se ligam à molécula de ligação e alteram sua afinidade por seu receptor recombinante na célula, permitindo, assim, um destacamento suave da molécula de ligação e, portanto, a partícula. Em alguns casos, após o destacamento, os anticorpos concorrentes podem permanecer associados à molécula de ligação da partícula enquanto o anticorpo não marcado não reagido é ou pode ser lavado e a célula está livre de anticorpo e da molécula de ligação. Exemplo de tal reagente é DETACaBEAD (Friedl et al. 1995; Entschladen et al. 1997). Em algumas modalidades, partículas (por exemplo, partículas de esferas) podem ser removidas na presença de um ligante clivável (por exemplo, ligador de DNA), pelo que os anticorpos ligados a partículas são conjugados com o ligante (por exemplo, CELLection, Dynal). Em alguns casos, a região ligante fornece um local clivável para remover as partículas (por exemplo, partículas de esferas) das células após o isolamento, por exemplo, pela adição de DNase ou outro tampão de liberação. Em algumas modalidades, outros métodos enzimáticos também podem ser empregados para a liberação de uma partícula (por exemplo, partícula de esferas) das células. Em algumas modalidades, as partículas (por exemplo, partículas de esferas ou partículas magnetizáveis) são biodegradáveis.
[353] Em algumas modalidades, as células da composição de saída que foram incubadas, contatadas ou tratadas com as partículas, por exemplo, esferas que compreendem a molécula de ligação, são comparadas a uma composição de saída que foi derivada de uma composição de entrada idêntica, ou seja, uma composição de entrada com a mesma composição celular, que foi incubada, tratada ou contatada com uma ou mais moléculas estimulatórias policlonais capazes de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo de TCR. Em certas modalidades, a composição de entrada idêntica não foi tratada com partículas, por exemplo, esferas, compreendendo moléculas de ligação. Em algumas modalidades, as células da composição de entrada idêntica foram contatadas, incubadas ou tratadas com uma ou mais moléculas estimulatórias policlonais nas mesmas condições (por exemplo, o mesmo meio, a mesma temperatura, a mesma duração e a mesma quantidade e/ou concentração das uma ou mais moléculas estimulatórias policlonais como a quantidade e/ou concentração das moléculas de ligação) como as células da composição de entrada que foram tratadas com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação. Em algumas modalidades, as células da composição de entrada idêntica foram contatadas com uma ou mais moléculas estimulatórias policlonais que estão ligadas a uma superfície. Em certas modalidades, as células da composição de entrada idêntica foram contatadas com uma ou mais moléculas estimulatórias policlonais que estão ligadas a uma superfície de uma partícula (por exemplo, uma partícula de esferas). Em modalidades particulares, as células da composição de entrada idênticas foram contatadas com uma ou mais moléculas estimulatórias policlonais que são anticorpos anti-CD3 e anti-CD28.
[354] Em modalidades particulares, o número de células na composição de saída é de pelo menos cerca de 1%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25 %, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 100%, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 6 vezes, pelo menos cerca de 7 vezes, pelo menos cerca de 8 vezes, pelo menos cerca de 9 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, em pelo menos cerca de 15 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 25- dobra, pelo menos cerca de 50 vezes ou pelo menos cerca de 100 vezes maior que o número de células na composição de entrada.
[355] Em certas modalidades, a composição de saída compreende um número maior de células após a incubação, o contato ou o tratamento com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação do que uma composição de saída que foi derivada de uma composição de entrada idêntica, isto é, uma composição de entrada com a mesma composição celular que foi incubada, tratada ou contatada com uma ou mais moléculas estimulatórias policlonais capazes de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo TCR, por exemplo, anti-CD3 e anticorpos anti-CD28. Em algumas modalidades, o número de células da composição de saída que foram tratadas com partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação é de pelo menos ou pelo menos cerca de 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 100%, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes ou 100 vezes maior que o número de células da saída composição da composição de entrada idêntica que foi incubada, tratada ou contatada com a uma ou mais moléculas estimulatórias policlonais.
[356] Em modalidades particulares, as células de uma composição de entrada são tratadas, contatadas ou incubadas com partículas, por exemplo, esferas, compreendendo uma molécula de ligação que se liga ou é reconhecida pelo receptor recombinante expresso por um subconjunto das células de um composição de entrada, resultando assim em uma composição de saída compreendendo um subconjunto maior de células que expressam o receptor recombinante do que na composição de entrada. Em certas modalidades, o subconjunto de células que expressam o receptor recombinante é pelo menos ou pelo menos cerca de 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50 %, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 100%, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes ou 100 vezes maior na composição de saída do que na composição de entrada.
[357] Em algumas modalidades, a composição de saída compreende um subconjunto maior de células que expressam o receptor recombinante após a incubação, o contato ou o tratamento com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação do que a composição de entrada antes da composição de entrada antes da incubação, entrando em contato, ou tratamento com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação. Em algumas modalidades, pelo menos ou pelo menos cerca de 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65 %, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 98%, 99% ou 99,9% das células da composição de saída expressam o receptor recombinante.
[358] Em certas modalidades, a composição de saída compreende um subconjunto maior de células que expressam o receptor recombinante que é ligado ou reconhecido pela molécula de ligação, após a incubação, o contato ou o tratamento com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação do que o subconjunto de células que expressam o receptor recombinante em uma composição de saída derivada de uma composição de entrada idêntica, que foi incubada, tratada ou contatada com uma ou mais moléculas estimulatórias policlonais capazes de ativar um ou mais componentes de um complexo TCR, por exemplo, anticorpos anti-CD3 e anti-CD28. Em algumas modalidades, o subconjunto de células que expressam o receptor recombinante em uma composição de saída de células que foram tratadas com partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação é pelo menos ou pelo menos cerca de 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 100%, 2 dobrado, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes ou 100 vezes maior que o subconjunto de células que expressam o receptor recombinante da composição de saída que foi derivada da composição de entrada idêntica que foi incubada, tratada ou contatada com uma ou mais moléculas estimulatórias policlonais.
[359] Em algumas modalidades, as células que expressam o receptor recombinante, por exemplo, o CAR, na composição de saída que foi incubada, tratada e/ou em contato com as partículas, por exemplo, esferas, contendo uma molécula de ligação contêm pelo menos ou pelo menos cerca de 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%,
35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 98%, 99% ou 99,9% de VCN mais baixo do que as células de uma composição de saída que receberam estimulação policlonal, por exemplo, incubação com anticorpos anti-CD3 e/ou anti-CD28. Em algumas modalidades, o VCN médio das células que expressam CAR da saída não mais do que 10, 5, 4, 2,5, 1,5 ou 1.
[360] Em algumas modalidades, a composição de saída compreende um subconjunto maior de células ativadas após a incubação, o contato ou o tratamento com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação do que a composição de entrada antes da incubação, o contato ou o tratamento com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação. Em algumas modalidades, as células ativadas são células que expressam pelo menos um marcador de ativação, isto é, um polinucleotídeo ou um polipeptídeo associado à ativação. Em algumas modalidades, as células ativadas expressam pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez ou mais de dez marcadores de ativação diferentes. Em algumas modalidades, o marcador de ativação é o antígeno leucocitário humano - relacionado ao antígeno D (HLA-DR), CD25, CD69, CD71, CD40L ou 4-1BB (CD137). Em modalidades particulares, o marcador de ativação é IL-2, IFN gama ou TNF-alfa. Em algumas modalidades, o marcador de ativação é a expressão intracelular de IL-2, IFN gama ou TNF-alfa. Em certas modalidades, o marcador de ativação é secretado por IL-2, IFN gama ou TNF-alfa. Em certas modalidades, o subconjunto de células de expressão do marcador de ativação é pelo menos ou pelo menos cerca de 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 100%, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes,
20 vezes, 50 vezes ou 100 vezes maior na composição de saída do que na composição de entrada.
[361] Em algumas modalidades, a composição de saída compreende um número maior de células ativadas por células após a incubação, o contato ou o tratamento com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação do que a composição de entrada antes da incubação, o contato ou o tratamento com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação. Em algumas modalidades, pelo menos ou pelo menos cerca de 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65 %, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 98%, 99% ou 99,9% das células da composição de saída são ativadas. Em algumas modalidades, menor ou menor do que cerca de 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65 % ou 70% das células estão ativadas.
[362] Em algumas modalidades, a composição de saída compreende um subconjunto menor de células ativadas após a incubação, o contato ou o tratamento com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação do que uma composição de saída que foi derivada de uma composição de entrada idêntica, isto é, uma composição de entrada com a mesma composição celular que foi incubada, tratada ou contatada com uma ou mais moléculas estimulatórias policlonais capazes de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo TCR. Em algumas modalidades, o subconjunto de células ativadas da composição de saída que foi tratada com partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação é menor ou menor do que cerca de 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 99% ou 99,9% dos subconjunto de células ativadas da composição de saída derivada da composição de entrada idêntica que foi incubada, tratada ou contatada com uma ou mais moléculas estimulatórias policlonais.
[363] Em modalidades particulares, as células da composição de saída são mais ativadas após a incubação, o contato ou o tratamento com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação do que a composição de entrada antes da incubação, o contato ou o tratamento com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação. Em algumas modalidades, as células são mais ativadas quando elas expressam um nível maior de pelo menos um marcador de ativação do que células menos ativadas ou células que não são ativadas. Em algumas modalidades, as células mais ativadas expressam pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, ou mais do que dez marcadores de ativação diferentes em níveis maiores do que células menos ativadas ou não ativadas. Em algumas modalidades, as células ativadas expressam uma quantidade maior de pelo menos um de (HLA-DR), CD25, CD69, CD71, CD40L ou 4-1BB (CD137) relacionados ao antígeno D - antígeno leucocitário humano do que as células da composição de entrada. Em modalidades particulares, as células ativadas expressam um nível maior de IL-2, IFN gama ou TNF- alfa, por exemplo, mRNA ou polipeptídeos. Em algumas modalidades, as células ativadas expressam uma quantidade maior de intracelular de IL-2, IFN gama ou TNF-alfa. Em certas modalidades, as células ativadas secretam uma quantidade maior de IL-2, IFN gama ou TNF-alfa. Em certas modalidades, as células ativadas expressam uma quantidade de um marcador de ativação que é pelo menos ou pelo menos cerca de 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45 %, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 100%, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes ou 100 vezes maior que a quantidade do marcador de ativação expressa pelas células da composição de entrada.
[364] Em algumas modalidades, a composição de saída compreende células que são menos ativadas após a incubação, o contato ou o tratamento com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação que uma composição de saída que foi derivada de uma composição de entrada idêntica, isto é, uma composição de entrada com a mesma composição celular, que foi incubada, tratada ou contatada, com uma ou mais moléculas estimulatórias policlonais capazes de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo TCR. Em algumas modalidades, a expressão de pelo menos um marcador de ativação nas células da composição de saída que foi tratada com partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação é menor ou menor do que cerca de 1%, 5%, 10%, 15 %, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 99% ou 99,9% da expressão de pelo menos um marcador de ativação em células da composição de saída da composição de entrada idêntica que foi incubada, tratada ou contatada com a uma ou mais moléculas estimulatórias policlonais.
[365] Em algumas modalidades, um subconjunto maior de células que expressam o receptor recombinante (que é reconhecido pela molécula de ligação) da composição de saída é ativado após a incubação, o contato ou o tratamento com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação do que as células que expressam o receptor recombinante da composição de entrada antes da incubação, o contato ou o tratamento com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação. Em certas modalidades, o subconjunto de células de expressão do receptor recombinante que é ativado é pelo menos ou pelo menos cerca de 1%,
5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 100%, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes mais, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes ou 100 vezes maior na composição de saída do que o subconjunto de células ativadas que expressam o receptor recombinante da composição de entrada.
[366] Em algumas modalidades, as células que expressam o receptor recombinante (que é ligado ou reconhecido pela molécula de ligação) da composição de saída compreendem um subconjunto maior de células ativadas após a incubação, o contato ou o tratamento com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação do que a composição de entrada antes da incubação, o contato ou o tratamento com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação. Em algumas modalidades, pelo menos ou pelo menos cerca de 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65 %, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 98%, 99% ou 99,9% das células que expressam o receptor recombinante da composição de saída são ativadas. Em algumas modalidades, menos de ou menos do que cerca de 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% das células que expressam o receptor recombinante são ativadas.
[367] Em algumas modalidades, um subconjunto menor das células que expressam o receptor recombinante (que se liga ou é reconhecido pela molécula de ligação) a partir da composição de saída é ativado após a incubação, o contato ou o tratamento com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação em comparação com as células que expressam o receptor recombinante de uma composição de saída derivada de uma composição de entrada idêntica, isto é, uma composição de entrada com a mesma composição celular, que foi incubada, tratada ou contatada, com uma ou mais moléculas estimulatórias policlonais capazes de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo de TCR. Em algumas modalidades, o subconjunto de células que expressam o receptor recombinante da composição de saída ativada é menor ou menor do que cerca de 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 99% ou 99,9% do que o subconjunto de células que expressam o receptor recombinante da composição de saída derivada da composição de entrada idêntica que foi incubada, tratada ou contatada com uma ou mais moléculas estimulatórias policlonais.
[368] Em modalidades particulares, as células que expressam o receptor recombinante (que se liga ou é ou é reconhecido pela molécula de ligação) da composição de saída são mais ativadas após a incubação, o contato ou o tratamento com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação do que as células que expressam o receptor recombinante da composição de entrada antes da incubação, o contato ou o tratamento com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação. Em algumas modalidades, as células que expressam o receptor recombinante da composição de saída expressam uma quantidade maior de pelo menos um marcador de ativação em comparação com as células que expressam o receptor recombinante da composição de entrada. Em modalidades particulares, as células que expressam o receptor recombinante da composição de saída expressam uma quantidade maior de pelo menos um de (HLA-DR), CD25, CD69, CD71, CD40L ou 4-1BB (CD137) relacionados ao antígeno D do antígeno leucocitário humano do que células que expressam o receptor recombinante da composição de entrada.
[369] Em modalidades particulares, as células que expressam o receptor recombinante expressam um nível maior de IL-2, IFN gama ou TNF-alfa. Em algumas modalidades, as células que expressam o receptor recombinante expressam uma quantidade maior de intracelular de IL-2, IFN gama ou TNF-alfa. Em certas modalidades, as células que expressam o receptor recombinante secretam uma quantidade maior de IL-2, IFN gama ou TNF-alfa. Em certas modalidades, as células que expressam o receptor recombinante da composição de saída expressam uma quantidade de um marcador de ativação que é pelo menos ou pelo menos cerca de 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 100%, 2 vezes, 3 vezes, 4-vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes ou 100 vezes maior que a quantidade do marcador de ativação expressa por células que expressam o receptor recombinante da composição de entrada.
[370] Em algumas modalidades, a composição de saída compreende células que expressam o receptor recombinante (que é ligado ou reconhecido pela molécula de ligação) que são menos ativadas após a incubação, o contato ou o tratamento com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação do que as células que expressam o receptor recombinante de uma composição de saída derivada de uma composição de entrada idêntica, isto é, uma composição de entrada com a mesma composição celular que foi incubada, tratada ou contatada, com uma ou mais moléculas estimulatórias policlonais capazes de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo TCR. Em algumas modalidades, a expressão de pelo menos um marcador de ativação nas células que expressam o receptor recombinante da composição de saída que foi tratada com partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação é menor ou menor do que cerca de 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%,
40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 75%, 80%, 85%, 95%, 99% ou 99,9% da expressão do pelo menos um marcador de ativação em células que expressam o receptor recombinante da composição de saída derivada da composição de entrada idêntica que foi incubada, tratada ou contatada com as uma ou mais moléculas estimulatórias policlonais.
[371] Em algumas modalidades, as células da composição de saída que foram incubadas, contatadas ou tratadas com partículas, por exemplo, esferas, compreendendo uma molécula de ligação, exibem um nível de exaustão reduzido ou mais baixo em comparação com as células que expressam o receptor recombinante de um composição de saída que foi derivada de uma composição de entrada idêntica, ou seja, uma composição de entrada com a mesma composição celular que foi incubada, tratada ou contatada, nas mesmas condições, com uma ou mais moléculas estimulatórias policlonais capazes de ativar uma ou mais intracelulares domínios de sinalização de um ou mais componentes de um complexo TCR. Em modalidades particulares, as células da composição de saída que foram incubadas, contatadas ou tratadas com partículas, por exemplo, esferas, compreendendo uma molécula de ligação, exibem uma expressão reduzida ou mais baixa de um marcador de exaustão em comparação com as células de uma composição de saída que foi derivado de uma composição de entrada idêntica que foi incubada, tratada ou contatada com uma ou mais moléculas estimulatórias policlonais. Em algumas modalidades, o marcador de exaustão é um polipeptídeo que está associado à exaustão ou é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que está associado à exaustão. Em algumas modalidades, a expressão de um marcador de exaustão compreende a expressão de superfície de um polipeptídeo marcador de exaustão. Em algumas modalidades, o marcador de exaustão é um receptor inibidor, isto é, um receptor que,
quando ligado ao seu ligante correspondente, reduz pelo menos uma atividade imune ou celular da célula. Em certas modalidades, o marcador de exaustão é PD-1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, BTLA ou TIGIT. Em modalidades particulares, as células da composição de saída foram contatadas, tratadas ou incubadas com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação que é menor ou menor do que cerca de 1%, 5%, 10%, 15%, 20 %, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 99% ou 99,9% da expressão de pelo menos um marcador de exaustão do que células de uma composição de saída que foi contatada, tratada ou incubada com uma ou mais moléculas estimulatórias policlonais.
[372] Em modalidades particulares, as células que expressam o receptor recombinante da composição de saída que foram incubadas, contatadas ou tratadas com partículas, por exemplo, esferas, compreendendo uma molécula de ligação, exibem um nível de exaustão reduzido ou inferior em comparação com as células que expressam o receptor recombinante de uma composição de saída que foi derivada de uma composição de entrada idêntica que foi incubada, tratada ou contatada com uma ou mais moléculas estimulatórias policlonais capazes de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo TCR. Em modalidades particulares, as células que expressam o receptor recombinante da composição de saída que foram incubadas, contatadas ou tratadas com partículas, por exemplo, esferas, compreendendo uma molécula de ligação, exibem uma expressão reduzida ou mais baixa de um marcador de exaustão em comparação com as células que expressam o receptor recombinante de uma composição de saída que foi derivada de uma composição de entrada idêntica que foi incubada, tratada ou contatada, nas mesmas condições, com uma ou mais moléculas estimulatórias policlonais capazes de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo de TCR. Em modalidades particulares, as células que expressam um receptor recombinante da composição de saída que foi contatada, tratada ou incubada com as partículas, por exemplo, esferas, compreendendo a molécula de ligação, têm menos ou menos que cerca de 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 80%, 85%, 95%, 99 % ou 99,9% da expressão do pelo menos um marcador de exaustão do que células que expressam um receptor recombinante de uma composição de saída que foi contatada, tratada ou incubada com uma ou mais moléculas estimulatórias policlonais.
III MÉTODOS PARA AVALIAR A ESTIMULAÇÃO DE LONGO PRAZO
[373] É aqui fornecido um método de estimulação de longo prazo (também aqui referido como um método para estimulação de longo prazo) que é útil, inter alia, para avaliar fenótipos, características ou atividades de uma composição celular, por exemplo, uma composição celular. Em algumas modalidades, o método de estimulação de longo prazo é ou inclui a incubação de uma composição celular, por exemplo, uma composição de entrada contendo células que expressam um receptor recombinante, como um CAR, sob condições para estimular uma atividade dependente do receptor recombinante (por exemplo, atividade dependente do CAR) nas células. Em alguns aspectos, a composição celular, por exemplo, a composição de entrada, contém células T que expressam um receptor recombinante (por exemplo, um CAR) compreendendo um domínio de ligação de antígeno extracelular que se liga a ou reconhece especificamente um antígeno. Em alguns aspectos, a incubação resulta em uma composição de células T, por exemplo, composições de saída, contendo células que exibem características de células estimuladas cronicamente ou de células tendo exposição prolongada ao antígeno.
[374] Em algumas modalidades, o método de estimulação de longo prazo é ou inclui a incubação de uma composição celular, por exemplo, uma composição de entrada contendo células que expressam um receptor recombinante, como um CAR, sob condições para estimular uma atividade dependente do receptor recombinante (por exemplo, atividade dependente de CAR) nas células. Em tais modalidades, uma atividade dependente do receptor recombinante é uma atividade que é específica para a estimulação do receptor recombinante, por exemplo, CAR, tal como através da presença de um antígeno ou outro agente reconhecido pelo domínio de ligação de antígeno do receptor recombinante, por exemplo, CAR, ou que estimula especificamente o receptor recombinante. Em alguns aspectos, a composição celular, por exemplo, a composição de entrada, contém células T que expressam um receptor recombinante (por exemplo, um CAR) compreendendo um domínio de ligação de antígeno extracelular que se liga a ou reconhece especificamente um antígeno. Em alguns aspectos, a incubação resulta em uma composição de células T, por exemplo, composições de saída, contendo células que exibem características de células estimuladas cronicamente ou de células com exposição prolongada ao antígeno. Em certas modalidades, a incubação é realizada continuamente sem interrupção.
[375] Em certas modalidades, os métodos para estimulação de longo prazo aqui fornecidos são úteis, entre outros, para identificar composições celulares que podem ter características desejáveis quando administradas in vivo, como uma persistência, viabilidade ou atividade mantida ou prolongada. Em algumas modalidades, os métodos são realizados em duas ou mais composições celulares diferentes para identificar diferenças que podem aumentar ou prolongar a persistência, atividade ou viabilidade, ou diminuir a exaustão ou diferenciação, como quando as células são administradas in vivo. Em algumas modalidades, essas diferenças podem incluir, mas não estão limitadas a, aspectos do processo de fabricação, como tempo, condições ou reagentes usados em diferentes etapas do processo de engenharia genética, diferenças no receptor recombinante (por exemplo, diferenças no diferenças na sequência de aminoácidos nos construtos ou vetores usados para entregar o receptor recombinante, ou diferentes métodos de entrega de genes), diferenças nas células (por exemplo, diferenças no tipo de célula ou subtipo ou fonte de célula, como diferenças nas amostras ou indivíduos em que as células são obtidas), diferentes condições de armazenamento (por exemplo, número de ciclos de congelamento e descongelamento anteriores, temperatura de armazenamento, formulação de meios de armazenamento, recipiente de armazenamento, ciropreservativo ou densidade celular) ou condições de ensaio (como presença ou ausência de um controle ou composto de teste durante a incubação).
[376] Em algumas modalidades, a molécula de ligação é um antígeno (como um antígeno recombinante ou seu fragmento) que está ligado ou é reconhecido pelo receptor recombinante. Em certas modalidades, a molécula de ligação é um anti-ID que se liga a ou reconhece o receptor recombinante. Em algumas modalidades, essas características podem incluir evidências de diminuição da viabilidade, atividade ou persistência ou aumento da exaustão ou diferenciação. Em várias modalidades, as células são incubadas com as moléculas de ligação na presença de um meio sem agentes adicionais que promovem divisão celular, crescimento, expansão ou ativação. Em algumas modalidades, as células são incubadas com as partículas por um período prolongado de tempo. por exemplo, 14 dias, sem nenhuma manipulação adicional, por exemplo, alterações de mídia, substituição de esferas, ou divisão ou substituição das células.
[377] Modalidades particulares contemplam que os métodos de estimulação de longo prazo aqui fornecidos são úteis para modelar ex vivo as condições pelas quais as células de uma terapia celular sofrem quando administradas a um indivíduo, por exemplo, um indivíduo humano, in vivo. Assim, em alguns aspectos, o ensaio fornecido é útil para identificar composições de células que podem ter características desejáveis quando administradas in vivo, tais como, sem limitação, persistência, viabilidade ou atividade mantida ou prolongada.
[378] Em modalidades particulares, o método de estimulação de longo prazo é realizado em duas ou mais composições de células, por exemplo, composições de entrada, para identificar composições de células que aumentam ou mantêm viabilidade, atividade ou persistência, ou aumentam ou mantêm a expressão de marcadores, por exemplo, biomarcadores, indicativos de maior viabilidade, atividade ou persistência. Em certas modalidades, o método de estimulação de longo prazo é realizado em duas ou mais composições celulares para identificar diferenças nas composições celulares que diminuem ou impedem a exaustão ou diferenciação (por exemplo, como diferenciação para um estado senescente) ou diminuem a expressão de marcadores indicativos de aumento exaustão ou diferenciação. Em algumas modalidades, a molécula de ligação é unida ou conjugada a uma superfície sólida, como uma superfície de uma placa ou prato de cultura de células. Em modalidades particulares, as moléculas de ligação são conjugadas ou ligadas a partículas, por exemplo, esferas.
[379] Em certas modalidades, os métodos incluem etapas para incubar as células na presença de partículas, por exemplo, esferas, contendo uma molécula de ligação, por exemplo, uma molécula de ligação que se liga a ou reconhece o receptor recombinante. Em algumas modalidades, as partículas, por exemplo, esferas, contendo a molécula de ligação são ou incluem reagentes conjugados com esferas, conforme fornecido, tais como esferas conjugadas com anti-ID ou esferas conjugadas com BCMA. Em modalidades particulares, as células ou composições de células são incubadas com uma partícula com uma molécula de ligação unida descrita aqui, por exemplo, na Seção I. Em certas modalidades, a partícula é uma partícula descrita aqui, por exemplo, na Seção I-A. Em certas modalidades, a molécula de ligação é uma molécula de ligação aqui descrita, por exemplo, na Seção I-B. Em modalidades particulares, a molécula de ligação se liga a ou reconhece o receptor recombinante.
[380] Em modalidades particulares, a composição de entrada é incubada com a molécula de ligação, como com partículas ou esferas que contêm a molécula de ligação, por, por em cerca de, ou em pelo menos 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias ou 21 dias. Em várias modalidades, a composição de entrada é incubada com a molécula de ligação, por exemplo, partículas ou esferas que contêm a molécula de ligação, entre ou entre cerca de 10 dias e 21 dias, 12 dias e 18 dias ou 14 dias e 16 dias, inclusive. Em certas modalidades, as células são incubadas com a molécula de ligação, por exemplo, partículas ou esferas que contêm a molécula de ligação, por, por cerca de ou por pelo menos 14 dias. Em modalidades particulares, as células da composição celular são incubadas com a molécula de ligação a temperaturas maiores que a temperatura ambiente. Em algumas modalidades, a incubação é realizada a uma temperatura maior que cerca de 25 ºC, como geralmente maior ou maior que cerca de 32 ºC, 35 ºC ou 37 ºC. Em algumas modalidades, a incubação é realizada a uma temperatura igual ou superior a 37 ºC ± 2 ºC, tal como a uma temperatura igual ou superior a 37 ºC.
[381] Em algumas modalidades, as células são incubadas com as moléculas de ligação, como partículas ou esferas contendo moléculas de ligação, na presença de um meio sem agentes adicionais que promovem a célula, por exemplo, célula T, divisão, crescimento, expansão, ou ativação. Em algumas modalidades, as células são incubadas com as moléculas de ligação na ausência de quaisquer citocinas recombinantes. Em modalidades particulares, a incubação ocorre sem interrupção, por exemplo, sem substituição, substituição do meio ou adição de molécula de ligação fresca, etc. Em certas modalidades, a incubação ocorre em condições estáticas. Em modalidades particulares, a incubação ocorre sem perfusão, mistura, balanço ou agitação. Em alguns aspectos, as partículas, por exemplo, esferas, contendo uma molécula de ligação, estão presentes durante toda a duração da incubação. Em certas modalidades, as moléculas de ligação não são alteradas ou substituídas durante a incubação. Modalidades particulares contemplam que, já que, em alguns aspectos, o meio não contém citocinas recombinantes, e citocinas presentes no meio durante a incubação teriam sido produzidas pelas células, por exemplo, em resposta a uma interação entre o receptor recombinante da célula e a molécula de ligação da partícula.
[382] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos para estimulação de longo prazo podem ser utilizados para comparar diferentes células ou composições de células. Por exemplo, em algumas modalidades, duas ou mais composições de células que contêm células que expressam o mesmo receptor recombinante, por exemplo, um mesmo CAR, podem ser comparadas incubando as células com a mesma molécula de ligação, por exemplo, partículas ou esferas contendo a mesma molécula de ligação, que se liga a ou reconhece o receptor recombinante. Em certas modalidades, as duas ou mais composições de células são geradas por diferentes processos de engenharia, como processos envolvendo diferentes condições, diferentes tempos e durações, ou diferentes equipamentos ou reagentes. Em modalidades particulares, as composições celulares são incubadas com partículas, por exemplo, esferas, contendo uma molécula de ligação na presença de um ou mais agentes ou compostos de teste, como agentes suspeitos de reduzir a exaustão ou promover persistência. Em modalidades particulares, as composições celulares podem ser comparadas a uma composição celular de controle ou de referência. Em alguns aspectos, as composições celulares de controle ou de referência podem incluir, mas não estão limitadas a, composições celulares que não passam por nenhuma incubação, composições celulares que não são incubadas na presença de partículas, por exemplo, esferas, contendo uma molécula de ligação, composições celulares que não contêm células que expressam o receptor recombinante, composições de células que são geradas a partir de um processo de engenharia diferente e/ou composições de células que são incubadas na presença de um veículo ou composto de controle.
[383] Em algumas modalidades, o método de estimulação de longo prazo é realizado na presença de um ou mais agentes ou compostos de teste. Em modalidades particulares, o agente ou composto de teste é um agente suspeito ou é candidato a alterar ou influenciar uma ou mais características, fenótipos ou atividades de células da composição celular, por exemplo, células que expressam o receptor recombinante durante ou após a incubação . Em alguns aspectos, o agente ou composto de teste aumenta ou diminui, ou é suspeito de aumentar ou diminuir, um ou mais fenótipos, características ou atividades das células T, como crescimento, divisão, expansão, divisão, persistência, diferenciação, ativação, ou exaustão, ou atividades, como atividades estimuladas por antígeno, incluindo, mas não se limitando a, atividade citolítica ou produção de citocinas. Em certas modalidades, um agente ou composto de teste é um polipeptídeo natural ou quimicamente modificado, um anticorpo, um pequeno oligopeptídeo natural ou quimicamente modificado, um aminoácido natural, não natural ou quimicamente modificado, um polinucleotídeo, um oligonucleotídeo natural ou quimicamente modificado, RNAi, shRNA, siRNA, um pequeno nucleotídeo, um mononucleotídeo natural ou quimicamente modificado, um lipopeptídeo, um antimicrobiano, uma molécula pequena ou uma molécula farmacêutica.
[384] Em modalidades particulares, duas ou mais composições celulares que contêm células que expressam os diferentes receptores recombinantes, por exemplo, CARs diferentes, podem ser comparadas incubando as células com moléculas de ligação, como com partículas ou esferas contendo moléculas de ligação diferentes que se ligam ou reconhece os diferentes receptores recombinantes.
[385] Em algumas modalidades, a composição de saída é composta por células que foram submetidas a todo ou a uma parte de um método de estimulação de longo prazo, por exemplo, um método de estimulação de longo prazo aqui descrito. Em certas modalidades, as células submetidas ao método de estimulação de longo prazo são avaliadas em diferentes momentos durante a incubação. Por exemplo, em alguns aspectos, um fenótipo, característica ou atividade das células de uma ou mais composições celulares são avaliadas em um ponto intermediário no tempo, como um ponto no tempo que ocorre em, aproximadamente ou pelo menos 5%, 10 %, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, conclusão da incubação. Em certas modalidades, as células são avaliadas uma vez, duas vezes, três vezes, quatro vezes, cinco vezes, seis vezes, sete vezes, oito vezes, nove vezes, dez vezes ou mais do que dez vezes durante a incubação. Em certas modalidades, as células são avaliadas após diferentes intervalos durante a incubação, como intervalo de, aproximadamente ou pelo menos 6 horas, 12 horas, 18 horas, 18 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias ou 8 dias. Em alguns órgãos, as células são avaliadas todos os dias. Em algumas modalidades, as células são avaliadas a cada três dias. Em certas modalidades, as células são avaliadas a cada 7 dias.
[386] Em certas modalidades, as células da composição de saída, por exemplo, células que foram submetidas ao método de estimulação de longo prazo, são avaliadas quanto a uma atividade, por exemplo, uma atividade simulada por antígeno, um fenótipo ou uma característica. Em algumas modalidades, e a atividade estimulada pelo antígeno é avaliada nas células durante ou após a conclusão do método, por exemplo, durante ou após a incubação com as moléculas de ligação. Em modalidades particulares, os resultados da avaliação são comparados a uma avaliação da mesma atividade ou de uma atividade similar medida em células de uma composição celular diferente, por exemplo, uma composição celular de controle ou de referência.
[387] Em algumas modalidades, a atividade é uma atividade estimulada por antígeno. Modalidades particulares contemplam que a atividade de células estimuladas por antígeno, como células T que expressam um receptor recombinante, pode ser avaliada por qualquer uma de várias técnicas adequadas conhecidas. Em algumas modalidades, a produção de uma ou mais citocinas é medida, detectada e/ou quantificada por coloração intracelular de citocinas. Em alguns aspectos, a coloração intracelular de citocinas (ICS) por citometria de fluxo é uma técnica adequada para o estudo da produção de citocinas no nível de célula única. Em certos aspectos, o ICS é útil para detectar a produção e o acúmulo de citocinas no retículo endoplasmático após a estimulação celular, como uma célula que expressa o antígeno ou uma partícula, por exemplo, uma partícula de esfera, com um antígeno conjugado, permitindo a identificação de populações de células positivas ou negativas para a produção de uma citocina específica ou para a separação de células de alta e baixa produção com base em um limiar. O ICS também pode ser usado em combinação com outros protocolos de citometria de fluxo para imunofenotipagem usando marcadores de superfície celular, por exemplo, CD4 ou CD8, para acessar a produção de citocinas em um subgrupo particular de células. Outras técnicas de célula única para medir ou detectar a produção de citocinas incluem, mas não estão limitadas a ELISPOT, diluição limitante e clonagem de células T.
[388] Em algumas modalidades, a atividade estimulada por antígeno é a produção de uma ou mais citocinas. As citocinas que podem ser produzidas em resposta à estimulação do antígeno podem incluir, mas não estão limitadas a, IL-1, IL-1β, IL-2, sIL-2Ra, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL 27, IL-33, IL-35, TNF, TNF alfa, CXCL2, CCL2, CCL3, CCL5, CCL17, CCL24, PGD2, LTB4, interferon gama (IFN-γ), fator estimulador de colônias de macrófagos de granulócitos (GM-CSF), proteína inflamatória de macrófagos (MIP)-1a, MIP-1b, Flt-3L, fractalkina e/ou IL-5. Em algumas modalidades, as uma ou mais citocinas são ou incluem uma ou mais dentre IL-2, IFN-gama ou TNF-alfa. Em algumas modalidades, a secreção de citocinas é avaliada medindo, detectando ou quantificando a quantidade ou concentração de citocinas extracelulares após uma cocultura com células que expressam antígenos ou após uma incubação de partículas, por exemplo, esferas, contendo fragmentos de antígeno ou antígeno unidos.
[389] Em modalidades particulares, a atividade estimulada por antígeno é atividade citolítica (citotóxica). Em algumas modalidades, a atividade citolítica é avaliada pela exposição, incubação e/ou contato com as células da composição, por exemplo, células que expressam o receptor recombinante, com uma célula alvo que expressa o antígeno ou um epítopo que é reconhecido pelo receptor recombinante. A atividade citolítica pode ser medida medindo direta ou indiretamente o número de células alvo ao longo do tempo. Por exemplo, as células alvo podem ser incubadas com um marcador detectável antes de serem incubadas com células que expressam receptores recombinantes, tal marcador que é detectável quando a célula alvo é lisada ou um marcador detectável que é detectável apenas em células alvo viáveis. Essas leituras fornecem direta ou indiretamente o número de células alvo e/ou a morte celular alvo e podem ser medidas em diferentes momentos no decorrer do ensaio. Uma redução do número de células alvo e/ou um aumento da morte celular alvo indicam a atividade citolítica das células. Os métodos adequados para a realização de ensaios citolíticos são conhecidos na técnica e incluem, entre outros, ensaios de liberação de cromo-51, ensaios de radioatividade de cromo não radioativos, ensaios de citometria de fluxo que utilizam corantes fluorescentes, como éster de carboxifluoresceína succinimidil (CFSE), PKH-2 e PKH-26.
[390] Em certas modalidades, as células, por exemplo, células que expressam o receptor recombinante, da composição são avaliadas quanto a uma ou mais características ou fenótipos durante ou após o ensaio, por exemplo, durante ou após uma incubação com partículas, por exemplo, esferas, contendo um receptor de ligação. Em algumas modalidades, as uma ou mais características ou fenótipos são ou se relacionam com um ou mais de ativação, exaustão ou diferenciação. Em certas modalidades, os um ou mais fenótipos ou características são avaliados medindo, detectando ou quantificando a presença, ausência, quantidade ou nível de um ou mais marcadores.
[391] Em algumas modalidades, a expressão de um marcador, por exemplo, um biomarcador associado positiva ou negativamente à ativação, exaustão ou diferenciação, é ou inclui avaliar, medir, determinar e/ou quantificar um nível, quantidade, ou concentração de um marcador na amostra. Em certas modalidades, o marcador é um produto genético, por exemplo, qualquer biomolécula que é montada, gerada e/ou sintetizada com informações codificadas por um gene e pode incluir polinucleotídeos e/ou polipeptídeos. Em certas modalidades, o nível, quantidade ou concentração do marcador pode ser transformado (por exemplo, normalizado) ou analisado diretamente (por exemplo, bruto). Em algumas modalidades, o marcador é uma proteína. Em certas modalidades, o marcador é um polinucleotídeo, por exemplo, um mRNA ou uma proteína, que é codificado pelo gene.
[392] Em modalidades particulares, a quantidade ou o nível de um marcador que é um polinucleotídeo pode ser avaliado, medido, determinado e/ou quantificado por qualquer meio conhecido adequado. Por exemplo, em algumas modalidades, a quantidade ou o nível de um marcador de polinucleotídeo pode ser avaliado, medido, determinado e/ou quantificado por reação em cadeia da polimerase (PCR), incluindo PCR de transcriptase reversa (rt), PCR digital de gotículas, tempo real e métodos quantitativos de PCR (incluindo, por exemplo, TAQMAN®, sinalizador molecular, LIGHTUP™, SCORPION™, SIMPLEPROBES®; vide, por exemplo, as patentes U.S. 5.538.848; 5.925.517; 6.174.670;
6.329.144; 6.326.145 e 6.635.427); Northern Blotting; Southern blotting, por exemplo, de produtos e derivados de transcrição reversa; métodos baseados em matriz, incluindo matrizes blotted, microarranjos ou matrizes sintetizadas in situ; e sequenciamento, por exemplo, sequenciamento por síntese, pirossequenciamento, sequenciamento dideóxi ou sequenciamento por ligação, ou qualquer outro método conhecido na técnica, tal como discutido em Shendure et al., Nat. Rev. Genet. 5: 335-44 (2004) ou Nowrousian, Euk. Cell 9 (9): 1300-1310 (2010), incluindo plataformas específicas como sequenciamento HELICOS®, ROCHE® 454, ILLUMINA®/SOLEXA®, ABI SOLiD® e POLONATOR®. Em modalidades particulares, os níveis de produtos de genes de ácidos nucleicos são medidos por qRT-PCR. Em algumas modalidades, o qRT-PCR usa três conjuntos de ácidos nucleicos para cada gene, em que os três ácidos nucleicos compreendem um par de iniciadores juntamente com uma sonda que se liga entre as regiões de um ácido nucleico alvo em que os iniciadores se ligam - conhecido comercialmente como um ensaio TAQMAN®.
[393] Em modalidades particulares, a expressão de dois ou mais marcadores polinucleotídicos é medida ou avaliada simultaneamente. Em certas modalidades, uma PCR multiplex, por exemplo, uma avaliação rt-PCR multiplex que avalia, mede, determina e/ou quantifica o nível, quantidade ou concentração de dois ou mais produtos gênicos. Em algumas modalidades, microarranjos (por exemplo, arranjos no estilo AFFYMETRIX®, AGILENT® e ILLUMINA®) são usados para avaliar, medir, determinar e/ou quantificar o nível, quantidade ou concentração de dois ou mais produtos genéticos. Em algumas modalidades, os microarranjos são utilizados para avaliar, medir, determinar e/ou quantificar o nível, quantidade ou concentração de um polinucleotídeo de cDNA que é derivado de um produto de gene de RNA.
[394] Em algumas modalidades, a expressão de um ou mais marcadores polinucleotídicos é determinada sequenciando um mRNA marcador ou um polinucleotídeo cDNA que é derivado do mRNA marcador. Em algumas modalidades, o sequenciamento é realizado por um método de sequenciamento não Sanger e/ou uma técnica de sequenciamento de próxima geração (NGS). Exemplos de técnicas de sequenciamento de próxima geração incluem, entre outros, MPSS (Sequenciamento de Sinalização Massivamente Paralelo), sequenciamento Polony, pirossequenciamento, sequenciamento reversível de corante-terminador, SOLiD, sequenciamento SOLiD, sequenciamento de semicondutores de íons, sequenciamento de nanobolas de DNA, sequenciamento de moléculas únicas por helioscópio, sequenciamento de molécula única em tempo real (SMRT), sequenciamento de molécula única em tempo real (RNAP) e sequenciamento de DNA Nanopore.
[395] Em algumas modalidades, a técnica NGS é o sequenciamento de RNA (RNA-Seq). Em modalidades particulares, a expressão de um ou mais produtos gênicos polinucleotídicos é medida, determinada e/ou quantificada por RNA-Seq. O RNA-Seq, também chamado de sequenciamento shotgun de transcriptoma inteiro, determina a presença e a quantidade de RNA em uma amostra. Os métodos de sequenciamento de RNA foram adaptados para as plataformas mais comuns de sequenciamento de DNA [sistemas HiSeq (Illumina), 454 Genome Sequencer FLX System (Roche), Applied Biosystems SOLiD (Life Technologies), IonTorrent (Life Technologies)]. Essas plataformas requerem transcrição reversa inicial de RNA para cDNA. Por outro lado, o sequenciador de molécula única HeliScope (Helicos BioSciences) é capaz de usar o RNA como modelo para o sequenciamento. Também foi demonstrada uma prova de princípio para sequenciamento direto de RNA na plataforma PacBio RS (Pacific Bioscience). Em algumas modalidades, os um ou mais produtos dos genes de RNA são avaliados, medidos, determinados e/ou quantificados por RNA-seq. Em algumas modalidades, o RNA-seq é um RNA-seq baseado em marcador ou um RNA-seq shotgun.
[396] Em modalidades particulares, o marcador é uma proteína ou um fragmento do mesmo. Em certas modalidades, um ou mais marcadores de proteína são medidos por qualquer meio adequado conhecido na técnica. Os métodos adequados para avaliar, medir, determinar e/ou quantificar o nível, quantidade ou concentração ou mais, ou marcadores adicionais de proteínas incluem, mas não estão limitados a, detecção com imunoensaios, técnicas de aptâmero à base de ácido nucleico ou à base de proteínas, HPLC (cromatografia líquida de alta precisão), sequenciamento de peptídeos (como o sequenciamento de degradação de Edman ou espectrometria de massa (como MS/MS), opcionalmente acoplado ao HPLC) e adaptações de microarranjos de qualquer um dos anteriores (incluindo ácido nucleico, anticorpo ou proteína-proteína (ou seja, sem anticorpo)). Em algumas modalidades, o imunoensaio é ou inclui métodos ou ensaios que detectam proteínas com base em uma reação imunológica, por exemplo, detectando a ligação de um anticorpo ou fragmento de anticorpo de ligação a antígeno a um produto genético. Os imunoensaios incluem, mas não estão limitados a, imunocitoquímica quantitativa ou imunoistoquímica, ELISA (incluindo ELISA diretos, indiretos, sanduíche, competitivos, múltiplos e portáteis (vide, por exemplo, Patente U.S. No. 7.510.687), western blotting (incluindo um, dois ou mais) blots dimensionais ou outros meios cromatográficos, opcionalmente incluindo sequenciamento de peptídeos), imunoensaio enzimático (EIA), RIA (radioimunoensaio) e SPR (ressonância plasmônica de superfície).
[397] Em algumas modalidades, o marcador de proteína é medido, detectado ou quantificado por citometria de fluxo. Em alguns aspectos, a citometria de fluxo é uma tecnologia biofísica baseada em laser ou em impedância empregada na detecção de marcadores ao suspender células em uma corrente de fluido e passando-as por um aparelho de detecção eletrônica. Os marcadores presentes nas células podem ser marcados, como com um anticorpo marcado com fluorescência para detecção por citometria de fluxo. Em alguns aspectos, a citometria de fluxo é empregada para medir, detectar ou quantificar a presença, ausência, quantidade ou nível de um marcador presente em uma população de células. Em alguns aspectos, a população de células pode ser o total ou total de células viáveis da composição celular ou de um subconjunto de células da composição celular, por exemplo, células positivas para o receptor recombinante, células T CD4+ ou células T CD8+.
[398] Em modalidades particulares, o marcador está positivamente associado ou correlacionado com a ativação ou um estado do tipo ativação. Em algumas modalidades, o marcador é ou inclui CD25, CD26, CD27, CD28, CD30, CD71, CD154, CD40L, CD127, LAG3 ou Ki67. Em algumas modalidades, o marcador está associado ou correlacionado positivamente à exaustão ou a uma condição relacionada à exaustão. Em modalidades particulares, o marcador é ou inclui um ou mais dentre CTLA-4, FOXP3, PD-1, TIGIT, LAB-3, 2B4, BTLA, TIM3, VISTA ou CD96. Em algumas modalidades, o marcador está associado à diferenciação de uma célula T. Em modalidades particulares, o marcador é ou inclui um ou mais CD25, CD45RO, CD56, KLRG1, CD95 e/ou um ou mais de CD45RA, CD27, CD28, CD62L e CCR7. Em algumas modalidades, células, por exemplo, células da composição de saída são avaliadas para células que são positivas para a superfície para um marcador de ativação de células T selecionado a partir do grupo que consiste em CD45RA, CD27, CD28, CD62L e CCR7; e/ou que são de superfície negativa para um marcador selecionado a partir do grupo que consiste em CD25, CD45RO, CD56, KLRG1; e/ou tem baixa expressão de CD95; e/ou são negativos para a expressão intracelular de uma citocina selecionada a partir do grupo que consiste em IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10. Em algumas, a composição de saída é avaliada para células CD45RA+, CD27+, CCR7+ e/ou CD45RO-.
[399] Em algumas modalidades, as células de uma composição celular, por exemplo, composição celular de saída, exibem características de células que foram submetidas a estímulos prolongados ou crônicos após o método de estímulo de longo prazo, por exemplo, após uma incubação com as partículas, por exemplo, esferas, contendo uma molécula de ligação. Em algumas modalidades, as células que expressam o receptor recombinante de uma composição celular, por exemplo, uma composição celular de referência ou controle, exibem características de células que sofreram estimulação prolongada ou crônica após o ensaio, por exemplo, após uma incubação com as partículas, por exemplo, esferas, contendo uma molécula de ligação.
[400] Em algumas modalidades, as células das composições de saída que foram submetidas ao método de estimulação de longo prazo, por exemplo, uma incubação com as partículas, por exemplo, esferas, contendo uma molécula de ligação, exibem atividade estimulada por antígeno reduzida em comparação com as células da composição que não foram submetidos ao método de estimulação de longo prazo. Em certas modalidades, a atividade estimulada por antígeno é reduzida em, aproximadamente, ou em pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 99,9% ou cerca de 100% ou em comparação com as células da composição que não sofreram estímulos de longo prazo n método. Em certas modalidades, a atividade estimulada por antígeno é reduzida por uma quantidade detectável e estatisticamente significativa em comparação com as células da composição que não foram submetidas ao método de estimulação de longo prazo. Em algumas modalidades, a produção de citocinas estimuladas por antígeno é reduzida em comparação com células da composição que não foram submetidas ao método de estimulação de longo prazo. Em modalidades particulares, a secreção de citocinas estimulada por antígeno é reduzida em comparação com células da composição que não foram submetidas ao método de estimulação de longo prazo. Em modalidades particulares, a atividade citolítica estimulada pelo antígeno é reduzida em comparação com as células da composição que não foram submetidas ao método de estimulação de longo prazo.
[401] Em modalidades particulares, as células de composições de saída, como células de ou composições de controle ou de referência, exibem um nível, expressão ou quantidade reduzida de células positivas para um marcador associado a células T do tipo puro, em comparação com células da composição que não foi submetida ao método de estimulação de longo prazo. Em certas modalidades, a quantidade de células positivas para o marcador, como um marcador, por exemplo, tendo uma quantidade detectável do marcador ou uma quantidade ou expressão acima de um nível limite ou quantidade de coloração, é reduzida em, aproximadamente, ou em pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 99,9% ou em ou em cerca de 100% em comparação com células da composição que não foram submetidas ao método de estimulação de longo prazo. Em certas modalidades, a quantidade de células positivas para o marcador é reduzida em uma quantidade estatisticamente significativa detectável em comparação com as células da composição que não foram submetidas ao método de estimulação de longo prazo.
[402] Em algumas modalidades, a expressão, quantidade ou nível médio ou mediano de um marcador, como um marcador associado à ativação ou um marcador positivamente associado ao estado puro das células ou um subconjunto das células da composição da produção é reduzida em, em cerca de, ou em pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90 %, 95%, 99%, 99,9% ou cerca de 100% ou em comparação com células da composição que não foram submetidas ao método de estimulação de longo prazo. Em certas modalidades, a quantidade de células positivas para o marcador associado à ativação é reduzida por uma quantidade estatisticamente significativa detectável em comparação com as células da composição que não foram submetidas ao método de estimulação de longo prazo.
[403] Em certas modalidades, as células das composições de saída, por exemplo, composições de saída ou composições de controle ou referência, que foram submetidas ao método de estimulação de longo prazo, por exemplo, uma incubação com as partículas, por exemplo, esferas, contendo uma molécula de ligação, exibem um nível aumentado, expressão ou quantidade de células positivas para um marcador, como um marcador associado positivamente à exaustão ou um marcador associado positivamente a células T diferenciadas, em comparação com células da composição que não foram submetidas ao método de estimulação de longo prazo. Em certas modalidades, a quantidade de células positivas para o marcador, por exemplo, tendo uma quantidade detectável do marcador ou uma quantidade ou expressão acima de um nível limite ou quantidade de coloração, é aumentada em cerca de ou pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes ou 100 vezes em comparação com as células da composição que não foram submetidas ao método de estimulação de longo prazo. Em certas modalidades, a quantidade de células positivas para o marcador é aumentada em uma quantidade detectável e estatisticamente significativa em comparação com as células da composição que não foram submetidas ao método de estimulação de longo prazo.
[404] Em várias modalidades, a expressão, quantidade ou nível médio ou mediano de um marcador, como um marcador associado positivamente à exaustão ou um marcador associado positivamente a células T diferenciadas, das células ou um subconjunto das células submetidas ao método de estimulação de longo prazo aumentam em, em cerca de, ou em pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70 %, 80%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes ou 100 vezes em comparação com células da composição que não foram submetidas ao método de estimulação de longo prazo. Em certas modalidades, a quantidade de células positivas para o marcador associado positivamente à exaustão é aumentada em uma quantidade detectável e estatisticamente significativa em comparação com as células da composição que não foram submetidas ao método de estimulação de longo prazo.
[405] Em certas modalidades, uma composição celular contendo células que expressam um receptor recombinante é incubada na presença de uma partícula contendo uma molécula de ligação por entre 7 dias e 21 dias. Em modalidades particulares, as células de uma composição celular contendo células que expressam CAR são incubadas com partículas, por exemplo, esferas, contendo uma molécula de ligação por pelo menos 14 dias na ausência de citocinas recombinantes. Em certas modalidades, seguindo o método de estimulação de longo prazo, as células ou um subconjunto das células, por exemplo, células CAR+, são avaliadas quanto a uma atividade estimulada por antígeno, como produção de citocinas ou atividade citolítica. Em modalidades particulares, após o ensaio ex vivo, as células ou um subconjunto das células da composição são avaliadas quanto à expressão de um ou mais marcadores. Em modalidades particulares, duas ou mais composições de células que sofrem o método de estimulação de longo prazo são comparadas para identificar variações ou reagentes que melhoram a persistência, viabilidade ou atividade das composições de células quando são administradas a um indivíduo in vivo.
IV CÉLULAS GENETICAMENTE MANIPULADAS E RECEPTORES RECOMBINANTES
[406] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos, por exemplo para estimular ou expandir células que expressam receptores recombinantes, são realizados em uma composição de entrada compreendendo células que expressam um receptor recombinante e/ou em conexão com métodos para engenharia genética de células com um receptor recombinante. Em alguns aspectos, a engenharia genética de uma célula com um receptor recombinante envolve contatar uma composição de células com uma molécula de ácido nucleico, por exemplo, um vírus ou um plasmídeo não viral, que contém um gene que codifica um receptor recombinante, por exemplo, um CAR, sob condições para entregar a molécula de ácido nucleico em uma ou mais células da composição.
[407] Em algumas modalidades, as células incluem um ou mais ácidos nucleicos introduzidos por engenharia genética de acordo com os métodos fornecidos e, assim, expressam produtos recombinantes ou geneticamente modificados desses ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos são heterólogos, ou seja, normalmente não estão presentes em uma célula ou amostra obtida da célula, como uma obtida de outro organismo ou célula, que, por exemplo, não é normalmente encontrada na célula que está sendo projetada e/ou um organismo do qual essa célula é derivada. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos não ocorrem naturalmente, como um ácido nucleico não encontrado na natureza, incluindo um que compreende combinações quiméricas de ácidos nucleicos que codificam vários domínios de vários tipos celulares diferentes. Em modalidades particulares, os ácidos nucleicos contêm um gene que codifica um receptor recombinante, por exemplo, um CAR.
[408] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos podem ser realizados simultânea, sequencial ou simultaneamente com uma ou mais etapas de processamento para fabricar ou preparar células manipuladas geneticamente. As etapas de processamento dos métodos podem incluir uma ou mais dentre várias etapas de processamento celular, sozinhas ou em combinação. Em modalidades particulares, as etapas de processamento incluem transdução ou transfecção das células com um ou mais ácidos nucleicos, por exemplo, um polinucleotídeo heterólogo compreendendo um gene que codifica um receptor recombinante. Em certas modalidades, as células são transduzidas com partículas de vetores virais contendo um vetor retroviral, como um que codifica um produto recombinante para expressão nas células. Em certas modalidades, as células são transfectadas com um ou mais ácidos nucleicos não virais, por exemplo, um plasmídeo epissomal ou um transposon. Os métodos podem ainda e/ou alternativamente incluir outras etapas de processamento, como etapas para o isolamento, separação, seleção, lavagem, suspensão, diluição, concentração e/ou formulação das células. Em alguns casos, os métodos também podem incluir uma etapa ex vivo para cultivo, estimulação ou expansão de células (por exemplo, estimulação das células, por exemplo, para induzir sua proliferação e/ou ativação), que, em alguns casos, pode ser realizada de acordo com os métodos fornecidos. Em algumas modalidades, os métodos incluem isolar células do indivíduo, prepará-las, processá-las, cultivá-las e/ou projetá- las e reintroduzi-las no mesmo indivíduo, antes ou depois da criopreservação.
[409] Em algumas modalidades, o método inclui etapas de processamento realizadas em uma ordem na qual: células, por exemplo, células primárias, são primeiro isoladas, como selecionadas ou separadas, de uma amostra biológica; as células selecionadas são incubadas com partículas de vetores virais para transdução; e células transduzidas são formuladas em uma composição. Em alguns casos, as células transduzidas são ativadas, expandidas ou propagadas ex vivo, como por estimulação na presença de um reagente de estimulação, como de acordo com os métodos fornecidos. Em algumas modalidades, o método pode incluir uma ou mais etapas de processamento entre as células de lavagem, suspensão, diluição e/ou concentração, que podem ocorrer antes, durante ou simultaneamente com ou após um ou mais isolamentos, como separação ou etapas de seleção, transdução, estimulação e/ou formulação.
[410] Em modalidades particulares, as células a serem transfectadas ou transduzidas não são isoladas, selecionadas ou enriquecidas antes do contato com um ou mais ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, as células não são selecionadas antes de entrar em contato com os um ou mais ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, as células a serem transfectadas ou transduzidas não são enriquecidas antes de entrar em contato com as células com um ou mais ácidos nucleicos.
[411] Em algumas modalidades, uma ou mais ou todas as etapas de processamento, por exemplo, isolamento, seleção e/ou enriquecimento, processamento, incubação em conexão com etapas de transdução e manipulação, estimulação e/ou ativação e formulação são realizadas usando um sistema, dispositivo ou aparelho em um sistema integrado ou independente e/ou de maneira automatizada ou programável. Em alguns aspectos, o sistema ou aparelho inclui um computador e/ou programa de computador em comunicação com o sistema ou aparelho, que permite ao usuário programar, controlar, avaliar o resultado e/ou ajustar vários aspectos etapas de processamento, isolamento, engenharia e formulação. Em um exemplo, o sistema é um sistema conforme descrito no Pedido de Patente Internacional, Número da Publicação WO2009/072003 ou US 20110003380 A1. Em um exemplo, o sistema é um sistema conforme descrito no Número da Publicação Internacional WO2016/073602.
[412] Em algumas modalidades, uma ou mais das etapas de processamento de células em conexão com a preparação, processamento e/ou incubação de células em conexão com o método fornecido, incluindo em conexão com a preparação de uma composição contendo células manipuladas geneticamente, podem ser realizadas na cavidade interna de uma câmara centrífuga, como uma câmara substancialmente rígida que geralmente tem formato cilíndrico e é rotativa em torno de um eixo de rotação, o que pode fornecer certas vantagens em comparação com outros métodos disponíveis. Em algumas modalidades, todas as etapas de processamento são realizadas na mesma câmara centrífuga. Em algumas modalidades, uma ou mais etapas de processamento são realizadas em diferentes câmaras centrífugas, como múltiplas câmaras centrífugas do mesmo tipo. Tais métodos incluem qualquer um dos descritos no Número de Publicação Internacional WO2016/073602.
[413] Câmaras centrífugas exemplares incluem aquelas produzidas e vendidas pela Biosafe SA, incluindo aquelas para uso com o sistema Sepax® e Sepax® 2, incluindo câmaras centrífugas A-200/F e A-200 e vários kits para uso com esses sistemas. De 6.123.655, Patente U.S. No. 6.733.433 e Pedido de Patente U.S. publicado, Publicação No.: US 2008/0171951 e pedido de patente internacional publicado, publicação No. WO 00/38762, cujo conteúdo de cada um deles é incorporado aqui por referência na sua totalidade. Dependendo do processo específico (por exemplo, diluição, lavagem, transdução, formulação), está dentro do nível de um especialista na técnica escolher um kit específico que seja apropriado para o processo. Kits exemplares para uso com esses sistemas incluem, entre outros, kits de uso único vendidos pela BioSafe SA sob os nomes de produtos CS-430.1, CS-
490.1, CS-600.1 ou CS-900.2.
[414] Em algumas modalidades, o sistema é incluído e/ou colocado em associação com outra instrumentação, incluindo instrumentação para operar, automatizar, controlar e/ou monitorar aspectos das várias etapas de processamento realizadas no sistema. Esta instrumentação em algumas modalidades está contida dentro de um gabinete. Em algumas modalidades, a instrumentação inclui um gabinete, que inclui um alojamento que contém circuitos de controle, uma centrífuga, uma tampa, motores, bombas, sensores, displays e uma interface de usuário. Um dispositivo exemplar é descrito na Patente U.S. No. 6.123.655, Patente U.S. No. 6.733.433 e US 2008/0171951.
[415] Em algumas modalidades, o sistema compreende uma série de recipientes, por exemplo, sacos, tubos, torneiras, braçadeiras, conectores e uma câmara de centrifugação. Em algumas modalidades, os recipientes, como sacos, incluem um ou mais recipientes, como sacos, contendo as células a serem transduzidas ou transfectadas e as partículas de vetor, por exemplo, partículas de vetor viral ou plasmídeos não virais, no mesmo recipiente ou recipientes separados, como o mesmo saco ou sacos separados. Em algumas modalidades, o sistema inclui ainda um ou mais recipientes, como sacos, contendo meio, como diluente e/ou solução de lavagem, que é puxado para dentro da câmara e/ou outros componentes para diluir, ressuspender e/ou lavar componentes e/ou composições durante os métodos. Os recipientes podem ser unidos em uma ou mais posições no sistema, como em uma posição correspondente a uma linha de entrada, linha de diluente, linha de lavagem, linha de resíduos e/ou linha de saída.
[416] Em algumas modalidades, o sistema, como um sistema fechado, é estéril. Em algumas modalidades, todas as conexões de componentes do sistema, como entre a linha de tubulação e um recipiente por meio de um conector, são feitas sob condições estéreis. Em algumas modalidades, as conexões são feitas sob fluxo laminar. Em algumas modalidades, as conexões são feitas usando um dispositivo de conexão estéril que produz conexões estéreis, como soldas estéreis, entre uma tubulação e um recipiente. Em algumas modalidades, um dispositivo de conexão estéril efetua a conexão sob condição térmica alta o suficiente para manter a esterilidade, como temperaturas de pelo menos 200 ºC, como pelo menos 260 ºC ou 300 ºC.
[417] Em algumas modalidades, o sistema pode ser descartável, como um kit de uso único. Em algumas modalidades, um kit de uso único pode ser utilizado em uma pluralidade de ciclos de um processo ou processos, como pelo menos 2, 3, 4, 5 ou mais vezes, por exemplo, em processos que ocorrem de forma contínua ou maneira semicontínua. Em algumas modalidades, o sistema, como um kit de uso único, é empregado para o processamento de células a partir de um único paciente. Em aspectos dos métodos, os processos não precisam ser executados no mesmo sistema fechado, como na mesma câmara centrífuga, mas podem ser executados sob um sistema fechado diferente, como em uma câmara centrífuga diferente; em algumas modalidades, essas diferentes câmaras centrífugas estão nos respectivos pontos nos métodos colocados em associação com o mesmo sistema, como colocados em associação com a mesma centrífuga. Em algumas modalidades, todas as etapas de processamento são realizadas em um sistema fechado, no qual todo ou um subconjunto de cada uma ou mais etapas de processamento é realizado na mesma ou em uma câmara centrífuga diferente. A. Amostras e Preparações Celulares
[418] São fornecidas aqui células, incluindo células manipuladas geneticamente que contêm um receptor recombinante. Também são fornecidas populações dessas células e composições que contêm essas células. Entre as composições são composições de entrada contendo células nas quais uma ou mais células são conhecidas ou prováveis de ou irão expressar um receptor recombinante capaz de ser reconhecido ou ligado por uma molécula de ligação presente em uma ou mais partículas nas quais as células são incubadas ou contatadas. Também entre as composições são composições produzidas pelos métodos fornecidos, incluindo composições de saída nas quais estão contidas células estimuladas ou expandidas, incluindo composições enriquecidas para células contendo um receptor recombinante ligado ou reconhecido pela molécula de ligação da partícula, como nas quais as células que expressam o receptor recombinante, por exemplo receptor quimérico, compõem pelo menos 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou mais percentual do total de células na composição ou células de um determinado tipo como células T ou CD8+ ou CD4+. Assim, são fornecidas células manipuladas geneticamente que expressam os receptores a recombinantes, por exemplo, CARs.
[419] Entre as composições são composições farmacêuticas e formulações para administração, tal como para terapia celular adotiva. Também são fornecidos métodos para engenharia, produção ou geração de tais células, métodos terapêuticos para administrar as células e composições a indivíduos, por exemplo, pacientes e métodos para detectar, selecionar, isolar ou separar essas células.
[420] As células geralmente são células eucarióticas, como células de mamíferos, e tipicamente são células humanas. Em algumas modalidades, as células são derivadas do sangue, medula óssea, linfa ou órgãos linfoides, são células do sistema imunológico, como células da imunidade inata ou adaptativa, por exemplo, células mieloides ou linfoides, incluindo linfócitos, tipicamente células T e/ou células NK. Outras células exemplares incluem células-tronco, como células-tronco multipotentes e pluripotentes, incluindo células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs).
[421] As células são tipicamente células primárias, como aquelas isoladas diretamente de um indivíduo e/ou isoladas de um indivíduo e congeladas. Em algumas modalidades, as células incluem um ou mais subconjuntos de células T ou outros tipos de células, como populações inteiras de células T, células CD4+, células CD8+ e subpopulações das mesmas, como as definidas por função, estado de ativação, maturidade,
potencial para capacidades de diferenciação, expansão, recirculação, localização e/ou persistência, especificidade de antígeno, tipo de receptor de antígeno, presença em um órgão ou compartimento específico, perfil de secreção de marcador ou citocina e/ou grau de diferenciação. Com referência ao indivíduo a ser tratado, as células podem ser alogênicas e/ou autólogas. Entre os métodos incluem métodos prontos para uso. Em alguns aspectos, como para tecnologias prontas para uso, as células são pluripotentes e/ou multipotentes, como células-tronco, como células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs).
[422] Entre os subtipos e subpopulações de células T e/ou CD4+ e/ou CD8+, estão as células T (TN) puras, as células T efetoras (TEFF), as células T de memória e seus subtipos, como como memória de células-tronco T (TSCM), T de memória central (TCM), T de memória efetiva (TEM) ou células efetoras de memória terminalmente diferenciadas, linfócitos infiltrantes de tumor (TIL), células T imaturas, células T maduras, células T auxiliares, células T citotóxicas, células T invariantes associadas à mucosa (MAIT), células T reguladoras adaptativas de ocorrência natural e adaptativas (Treg), células T auxiliares, como células TH1, células TH2, células TH3, células TH17, Células TH9, células TH22, células T foliculares auxiliares, células T alfa / beta e células T delta / gama.
[423] Em algumas modalidades, as células são células naturais assassinas (NK). Em algumas modalidades, as células são monócitos ou granulócitos, por exemplo, células mieloides, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, mastócitos, eosinófilos e/ou basófilos.
[424] Em algumas modalidades, as células são derivadas de linhagens celulares, por exemplo, linhagens celulares T. As células em algumas modalidades são obtidas a partir de uma fonte xenogênica, por exemplo, de camundongo, rato, primata não humano e porco.
[425] Em algumas modalidades, as células podem ser isoladas de uma amostra, como uma amostra biológica, por exemplo, uma obtida ou derivada de um indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo do qual a célula é isolada é aquele que tem a doença ou condição ou precisa de uma terapia celular ou ao qual a terapia celular será administrada. O indivíduo em algumas modalidades é um ser humano que precisa de uma intervenção terapêutica específica, como a terapia celular adotiva para a qual as células estão sendo isoladas, processadas e/ou manipuladas geneticamente.
[426] Por conseguinte, as células em algumas modalidades são células primárias, por exemplo, células humanas primárias. As amostras incluem tecido, fluido e outras amostras colhidas diretamente do indivíduo, bem como amostras resultantes de uma ou mais etapas de processamento, como separação, centrifugação, engenharia genética (por exemplo, transdução com vetor viral), lavagem e/ou incubação. A amostra biológica pode ser uma amostra obtida diretamente de uma fonte biológica ou de uma amostra que é processada. As amostras biológicas incluem, entre outros, fluidos corporais, como sangue, plasma, soro, líquido cefalorraquidiano, líquido sinovial, urina e suor, amostras de tecidos e órgãos, incluindo amostras processadas delas derivadas.
[427] Em alguns exemplos, as células do sangue circulante de um indivíduo são obtidas, por exemplo, por aférese ou leucaférese. Em certas modalidades, as células sanguíneas contêm linfócitos, incluindo células T, monócitos, granulócitos, células B, outros glóbulos brancos nucleados, glóbulos vermelhos e/ou plaquetas, e em alguns aspectos contêm células que não são glóbulos vermelhos e plaquetas. Em algumas modalidades, antes da seleção e/ou enriquecimento de células, a amostra ou as células da amostra podem ser descansadas ou mantidas antes de outras etapas de processamento. Em algumas modalidades, a amostra é mantida a ou mantida a uma temperatura de cerca de 2ºC a 8ºC por até 48 horas, como por até 12 horas, 24 horas ou 36 horas. Em certas modalidades, as células não são selecionadas e/ou enriquecidas antes de entrar em contato com as células com um ou mais ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, a amostra ou as células podem ser descansadas ou mantidas antes de entrar em contato ou incubar as células com um ou mais ácidos nucleicos. Em certas modalidades, a amostra é mantida a ou mantida a uma temperatura entre 2 ºC e 8 ºC por até 48 horas, como por até 12 horas, 24 horas ou 36 horas antes do contato ou incubação das células com um ou mais ácidos nucleicos.
[428] Em algumas modalidades, os métodos de preparação incluem etapas para congelamento, por exemplo, criopreservação, das células, antes ou depois do isolamento, seleção e/ou enriquecimento, incubação para transdução e engenharia genética e/ou estimulação, ativação e/ou expansão de células. Em algumas modalidades, as células são suspensas em uma solução de congelamento, por exemplo, após uma etapa de lavagem para remover o plasma e as plaquetas. Qualquer uma de uma variedade de soluções e parâmetros de congelamento conhecidos em alguns aspectos pode ser usada. Um exemplo envolve o uso de PBS contendo 20% de DMSO e 8% de albumina sérica humana (HSA) ou outro meio de congelamento celular adequado. Este é então diluído 1:1 com meio, tal que a concentração final de DMSO e HSA seja 10% e 4%, respectivamente. As células são geralmente congeladas a -80 ºC a uma taxa de 1 ° po r minuto e armazenadas na fase de vapor de um tanque de armazenamento de nitrogênio líquido.
[429] Em algumas modalidades, o isolamento das células inclui uma ou mais etapas de preparação e/ou separação de células sem afinidade. Em alguns exemplos, as células são lavadas, centrifugadas e/ou incubadas na presença de um ou mais reagentes, por exemplo,
para remover componentes indesejados, enriquecer para componentes desejados, lisar ou remover células sensíveis a reagentes específicos. Em alguns exemplos, as células são separadas com base em uma ou mais propriedades, como densidade, propriedades aderentes, tamanho, sensibilidade e/ou resistência a componentes específicos.
[430] Em algumas modalidades, os métodos incluem métodos de separação de células com base na densidade, como a preparação de glóbulos brancos a partir de sangue periférico através da lise dos glóbulos vermelhos e centrifugação através de um gradiente de Percoll ou Ficoll.
[431] Em algumas modalidades, os métodos de isolamento incluem a separação de diferentes tipos de células com base na expressão ou presença na célula de uma ou mais moléculas específicas, como marcadores de superfície, por exemplo, proteínas de superfície, marcadores intracelulares ou ácido nucleico. Em alguma modalidade, qualquer método conhecido para separação com base nesses marcadores pode ser usado. Em algumas modalidades, a separação é uma separação baseada em afinidade ou imunoafinidade. Por exemplo, o isolamento em alguns aspectos inclui a separação de células e populações de células com base na expressão ou nível de expressão das células de um ou mais marcadores, tipicamente marcadores de superfície celular, por exemplo, por incubação com um anticorpo ou parceiro de ligação que se liga especificamente a tais marcadores, seguidos geralmente por etapas de lavagem e separação de células que se ligaram ao anticorpo ou parceiro de ligação, daquelas células que não se ligaram ao anticorpo ou parceiro de ligação.
[432] Tais etapas de separação podem ser baseadas na seleção positiva, na qual as células que ligaram os reagentes são retidas para uso posterior e/ou na seleção negativa, na qual as células que não se ligam ao anticorpo ou parceiro de ligação são retidas. Em alguns exemplos, ambas as frações são retidas para uso posterior. Em alguns aspectos, a seleção negativa pode ser particularmente útil quando não há anticorpo disponível que identifique especificamente um tipo de célula em uma população heterogênea, tal que a separação seja melhor realizada com base em marcadores expressos por células que não a população desejada.
[433] A separação não precisa resultar em 100% de enriquecimento ou remoção de uma determinada população de células ou células que expressam um determinado marcador. Por exemplo, seleção positiva ou enriquecimento para células de um tipo particular, como aquelas que expressam um marcador, refere-se ao aumento do número ou porcentagem dessas células, mas não precisa resultar em uma ausência completa de células que não expressam o marcador. Da mesma forma, seleção negativa, remoção ou depleção de células de um tipo específico, como aquelas que expressam um marcador, refere-se à diminuição do número ou porcentagem dessas células, mas não precisa resultar na remoção completa de todas essas células.
[434] Em alguns exemplos, múltiplas rodadas de etapas de separação são realizadas, onde a porção selecionada positiva ou negativamente de uma etapa é submetida a outra etapa de separação, tal como uma seleção positiva ou negativa subsequente. Em alguns exemplos, uma única etapa de separação pode esgotar as células que expressam vários marcadores simultaneamente, tal como incubando células com uma pluralidade de anticorpos ou parceiros de ligação, cada um específico para um marcador direcionado para seleção negativa. Da mesma forma, vários tipos de células podem ser simultaneamente selecionados positivamente através da incubação de células com uma pluralidade de anticorpos ou parceiros de ligação expressos nos vários tipos de células.
[435] Por exemplo, em alguns aspectos, subpopulações específicas de células T, como células positivas ou expressando altos níveis de um ou mais marcadores de superfície, por exemplo, CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ e/ou células T CD45RO+, são isoladas por técnicas de seleção positiva ou negativa.
[436] Por exemplo, as células T CD3+, CD28 + podem ser selecionadas positivamente usando esferas magnéticas conjugadas anti-CD3/anti-CD28 (por exemplo, Expansor de Células T M-450 CD3/CD28 DYNABEADS®). Em modalidades particulares, as células são contatadas com esferas magnéticas conjugadas com anti-CD3/anti- CD28 (por exemplo, Expansor de Células T M-450 CD3/CD28 DYNABEADS®) para expandir as células T CD3+, CD28 + antes de contatar as células com um ou mais ácidos nucleicos. Em certas modalidades, as células não são contatadas com esferas magnéticas conjugadas com anti-CD3/anti-CD28 antes de contatar as células com um ou mais ácidos nucleicos.
[437] Em algumas modalidades, o isolamento é realizado por enriquecimento para uma população celular específica por seleção positiva, ou depleção de uma população celular específica, por seleção negativa. Em algumas modalidades, a seleção positiva ou negativa é realizada incubando células com um ou mais anticorpos ou outro agente de ligação que se ligam especificamente a um ou mais marcadores de superfície expressos ou expressos (marcador +) em um nível relativamente mais alto (marcadoralto) nas células positiva ou negativamente selecionadas, respectivamente.
[438] Em algumas modalidades, as células T são separadas de uma amostra de PBMC por seleção negativa de marcadores expressos em células não T, como células B, monócitos ou outros glóbulos brancos, como CD14. Em alguns aspectos, uma etapa de seleção CD4+ ou CD8+ é usada para separar as células T citotóxicas auxiliares CD4+ e CD8+. Tais populações CD4+ e CD8+ podem ser ainda classificadas em subpopulações por seleção positiva ou negativa para marcadores expressos ou expressos em um grau relativamente mais alto em uma ou mais subpopulações de células T puras, de memória e/ou efetoras.
[439] Em algumas modalidades, as células CD8+ são ainda enriquecidas ou esgotadas de células-tronco puras, de memória central, de memória efetiva e/ou de células-tronco da memória central, como por seleção positiva ou negativa com base em antígenos de superfície associados à respectiva subpopulação. Em algumas modalidades, o enriquecimento das células T da memória central (TCM) é realizado para aumentar a eficácia, como melhorar a sobrevivência de longo prazo, expansão e/ou enxerto após a administração, o que em alguns aspectos é particularmente robusta em tais subpopulações. Vide Terakura et al. (2012) Blood.1: 72–82; Wang et al. (2012) J. Immunother. 35 (9): 689-701. Em algumas modalidades, a combinação de células T CD8+ enriquecidas com TCM e células T CD4+ aprimora ainda mais a eficácia.
[440] Nas modalidades, as células T de memória estão presentes nos subconjuntos CD62L+ e CD62L- dos linfócitos do sangue periférico CD8+. O PBMC pode ser enriquecido ou esgotado das frações CD62L- CD8+ e/ou CD62L+ CD8+, como o uso de anticorpos anti-CD8 e anti- CD62L.
[441] Em algumas modalidades, o enriquecimento para células T de memória central (TCM) é baseado na expressão de superfície positiva ou alta de CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 e/ou CD 127; em alguns aspectos, é baseado na seleção negativa para células que expressam ou expressam CD45RA e/ou granzima B. Em alguns aspectos, o isolamento de uma população de CD8+ enriquecida para células TCM é realizado pela depleção de células que expressam CD4, CD14, CD45RA, e seleção ou enriquecimento positivo para células que expressam CD62L. Em um aspecto, o enriquecimento das células T da memória central (TCM) é realizado começando com uma porção negativa de células selecionadas com base na expressão de CD4, que é submetida a uma seleção negativa com base na expressão de CD14 e CD45RA e uma seleção positiva com base em CD62L. Tais seleções em alguns aspectos são realizadas simultaneamente e em outros aspectos são realizadas sequencialmente, em qualquer ordem. Em alguns aspectos, a mesma etapa de seleção baseada em expressão de CD4 usada na preparação da população ou subpopulação de células CD8+, também é usada para gerar a população ou subpopulação de células CD4+, tal que as parcelas positiva e negativa da separação baseada em CD4 são retidas e usadas nas etapas subsequentes dos métodos, seguindo opcionalmente uma ou mais etapas de seleção positivas ou negativas.
[442] Em um exemplo particular, uma amostra de PBMCs ou outra amostra de glóbulos brancos é submetida à seleção de células CD4+, onde são mantidas as parcelas negativa e positiva. A porção negativa é então submetida a seleção negativa com base na expressão de CD14 e CD45RA ou CD19 e seleção positiva com base em um marcador característico das células T da memória central, como CD62L ou CCR7, onde as seleções positiva e negativa são realizadas em ordem.
[443] As células auxiliares CD4+ T são classificadas em células puras, de memória central e efetoras, identificando populações de células que possuem antígenos de superfície celular. Os linfócitos CD4+ podem ser obtidos por métodos padrão. Em algumas modalidades, os linfócitos T CD4+ puros são células CD45RO-, CD45RA+, CD62L+ e CD4+. Em algumas modalidades, as células CD4+ da memória central são CD62L+ e CD45RO+. Em algumas modalidades, as células CD4+ efetoras são CD62L- e CD45RO-.
[444] Em um exemplo, para enriquecer as células CD4+ por seleção negativa, um coquetel de anticorpos monoclonais normalmente inclui anticorpos para CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR e CD8. Em algumas modalidades, o anticorpo ou parceiro de ligação está ligado a um suporte ou matriz sólida, como uma esfera magnética ou esfera paramagnética, para permitir a separação de células para seleção positiva e/ou negativa. Por exemplo, em algumas modalidades, as células e as populações de células são separadas ou isoladas usando técnicas de separação imunomagnética (ou afinidade magnética) (revisadas em Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Comportamento Celular in vitro e in vivo, por exemplo, 17-25 Editado por: SA Brooks e U. Schumacher © Humana Press Inc., Totowa, NJ).
[445] Em alguns aspectos, a amostra ou composição de células a serem separadas é incubada com material pequeno, magnetizável ou responsivo magneticamente, como partículas ou micropartículas responsivas magneticamente, como esferas paramagnéticas (por exemplo, esferas Dynalbeads ou MACS). O material responsivo magneticamente, por exemplo, partícula, geralmente é direta ou indiretamente ligado a um parceiro de ligação, por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula, por exemplo, marcador de superfície, presente na célula, células ou população de células que ele se desejar separar, por exemplo, que se deseja selecionar negativa ou positivamente.
[446] Em algumas modalidades, a partícula ou esfera magnética compreende um material responsivo magneticamente ligado a um membro de ligação específico, como um anticorpo ou outro parceiro de ligação. Existem muitos materiais responsivos magneticamente conhecidos usados nos métodos de separação magnética. Partículas magnéticas adequadas incluem as descritas em Molday, Pat. U.S.
4.452.773, e na Especificação de Patente Europeia EP 452342 B, que são aqui incorporadas por referência. Partículas de tamanho coloidal, como as descritas em Owen, Pat. U.S. 4.795.698, e Liberti et al., Pat. U.S. 5.200.084 são outros exemplos.
[447] A incubação geralmente é realizada sob condições pelas quais os anticorpos ou parceiros de ligação, ou moléculas, como anticorpos secundários ou outros reagentes, que se ligam especificamente a esses anticorpos ou parceiros de ligação, que estão ligados à partícula magnética ou esferas, liguem-se especificamente às moléculas da superfície celular, se presentes nas células da amostra.
[448] Em alguns aspectos, a amostra é colocada em um campo magnético e as células que possuem partículas magneticamente responsivas ou magnetizáveis ligadas a elas serão atraídas ao ímã e separadas das células não identificadas. Para seleção positiva, as células atraídas pelo ímã são retidas; para seleção negativa, as células que não são atraídas (células não marcadas) são retidas. Em alguns aspectos, uma combinação de seleção positiva e negativa é realizada durante a mesma etapa de seleção, em que as parcelas positiva e negativa são retidas e posteriormente processadas ou submetidas a etapas de separação adicionais.
[449] Em certas modalidades, as partículas responsivas magneticamente são revestidas em anticorpos primários ou outros parceiros de ligação, anticorpos secundários, lectinas, enzimas ou estreptavidina. Em certas modalidades, as partículas magnéticas são unidas às células através de um revestimento de anticorpos primários específicos para um ou mais marcadores. Em certas modalidades, as células, em vez das esferas, são marcadas com um anticorpo primário ou parceiro de ligação e, em seguida, são adicionadas partículas magnéticas revestidas com anticorpo secundário específico do tipo de célula ou outro parceiro de ligação (por exemplo, estreptavidina). Em certas modalidades, partículas magnéticas revestidas com estreptavidina são usadas em conjunto com anticorpos primários ou secundários biotinilados.
[450] Em algumas modalidades, as partículas responsivas magneticamente são deixadas unidas às células que devem ser subsequentemente incubadas, cultivadas e/ou manipuladas geneticamente; em alguns aspectos, as partículas são deixadas unidas às células para administração a um paciente. Em algumas modalidades, as partículas magnetizáveis ou magneticamente responsivas são removidas das células. Os métodos para remover partículas magnetizáveis das células são conhecidos e incluem, por exemplo, o uso de anticorpos não marcados concorrentes e partículas ou anticorpos magnetizáveis conjugados com ligantes cliváveis. Em algumas modalidades, as partículas magnetizáveis são biodegradáveis.
[451] Em algumas modalidades, a seleção baseada em afinidade é via classificação celular ativada magneticamente (MACS) (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Os sistemas de Classificação Magnética de Células Ativadas (MACS) são capazes de seleção de alta pureza de células tendo partículas magnetizadas ligadas a elas. Em certas modalidades, o MACS opera em um modo em que as espécies não alvo e alvo são sequencialmente eluídas após a aplicação do campo magnético externo. Ou seja, as células ligadas às partículas magnetizadas são mantidas no lugar enquanto as espécies não acopladas são eluídas. Então, após a conclusão desta primeira etapa de eluição, as espécies que foram capturadas no campo magnético e impedidas de serem eluídas são liberadas de alguma maneira, de forma que possam ser eluídas e recuperadas. Em certas modalidades, as células não alvo são marcadas e esgotadas da população heterogênea de células.
[452] Em certas modalidades, o isolamento ou separação é realizado usando um sistema, dispositivo ou aparelho que realiza uma ou mais das etapas de isolamento, preparação celular, separação, processamento, incubação, cultura e/ou formulação das métodos. Em alguns aspectos, o sistema é usado para executar cada uma dessas etapas em um ambiente fechado ou estéril, por exemplo, para minimizar erros, manipulação do usuário e/ou contaminação. Em um exemplo, o sistema é um sistema conforme descrito no Pedido de Patente Internacional, Número da Publicação WO2009/072003 ou US 20110003380 A1. Em um exemplo, o sistema é um sistema conforme descrito no Número da Publicação Internacional WO2016/073602.
[453] Em alguns aspectos, a separação e/ou outras etapas são realizadas usando o sistema CliniMACS (Miltenyi Biotec), por exemplo, para separação automatizada de células em nível de escala clínica em um sistema fechado e estéril. Os componentes podem incluir um microcomputador integrado, unidade de separação magnética, bomba peristáltica e várias válvulas pinch. O computador integrado em alguns aspectos controla todos os componentes do instrumento e direciona o sistema para executar procedimentos repetidos em uma sequência padronizada. A unidade de separação magnética em alguns aspectos inclui um ímã permanente móvel e um mantenedor para a coluna de seleção. A bomba peristáltica controla a vazão em todo o conjunto de tubulação e, juntamente com as válvulas pinch, garante o fluxo controlado de tampão através do sistema e a suspensão contínua das células.
[454] O sistema CliniMACS em alguns aspectos usa partículas magnetizáveis acopladas a anticorpos que são fornecidas em uma solução estéril e não pirogênica. Em algumas modalidades, após a marcação das células com partículas magnéticas, as células são lavadas para remover o excesso de partículas. Um saco de preparação de células é então unida ao conjunto de tubos, que por sua vez é unido a um saco contendo tampão e um saco de coleta de células. O conjunto de tubos consiste em tubos estéreis pré-montados, incluindo uma pré- coluna e uma coluna de separação, e são apenas para uso único. Após o início do programa de separação, o sistema aplica automaticamente a amostra de células na coluna de separação. As células marcadas são retidas na coluna, enquanto as células não marcadas são removidas por uma série de etapas de lavagem. Em algumas modalidades, as populações de células para uso com os métodos aqui descritos não são marcadas e não são retidas na coluna. Em algumas modalidades, as populações de células para uso com os métodos aqui descritos são marcadas e retidas na coluna. Em algumas modalidades, as populações de células para uso com os métodos aqui descritos são eluídas da coluna após a remoção do campo magnético e são coletadas dentro do saco de coleta de células.
[455] Em certas modalidades, a separação e/ou outras etapas são realizadas usando o sistema CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec). O sistema CliniMACS Prodigy, em alguns aspectos, é equipado com uma unidade de processamento celular que permite a lavagem e o fracionamento automatizados de células por centrifugação. O sistema CliniMACS Prodigy também pode incluir uma câmera integrada e um software de reconhecimento de imagem que determina o ponto final ideal de fracionamento da célula, discernindo as camadas macroscópicas do produto da célula de origem. Por exemplo, o sangue periférico é automaticamente separado em eritrócitos, glóbulos brancos e camadas plasmáticas. O sistema CliniMACS Prodigy também pode incluir uma câmara de cultivo celular integrada que realiza protocolos de cultura de células como, por exemplo, diferenciação e expansão celular, carregamento de antígeno e cultura celular de longo prazo. As portas de entrada podem permitir a remoção estéril e a reposição de mídia e as células podem ser monitoradas usando um microscópio integrado. Vide, por exemplo, Klebanoff et al. (2012) J. Immunother. 35 (9): 651–
660, Terakura et al. (2012) Blood.1: 72–82, e Wang et al. (2012) J. Immunother. 35 (9): 689-701.
[456] Em algumas modalidades, uma população de células aqui descrita é coletada e enriquecida (ou esgotada) por citometria de fluxo, na qual as células coradas para vários marcadores de superfície celular são transportadas em uma corrente fluídica. Em algumas modalidades, uma população de células aqui descrita é coletada e enriquecida (ou esgotada) por meio de classificação em escala preparativa (FACS). Em certas modalidades, uma população de células aqui descrita é coletada e enriquecida (ou esgotada) pelo uso de chips de sistemas microeletromecânicos (MEMS) em combinação com um sistema de detecção baseado em FACS (vide, por exemplo, WO 2010/033140, Cho et al. (2010) Lab Chip 10, 1567-1573; e Godin et al. (2008) J. Biophoton. 1 (5): 355–376. Nos dois casos, as células podem ser marcadas com vários marcadores, permitindo o isolamento de elementos bem definidos. Subconjuntos de células T com alta pureza.
[457] Em algumas modalidades, os anticorpos ou parceiros de ligação são marcados com um ou mais marcadores detectáveis, para facilitar a separação para seleção positiva e/ou negativa. Por exemplo, a separação pode ser baseada na ligação a anticorpos marcados com fluorescência. Em alguns exemplos, a separação de células com base na ligação de anticorpos ou outros parceiros de ligação específicos para um ou mais marcadores de superfície celular é realizada em uma corrente fluídica, como por classificação celular ativada por fluorescência (FACS), incluindo escala preparativa (FACS) e/ou chips de sistemas microeletromecânicos (MEMS), por exemplo, em combinação com um sistema de detecção citométrica de fluxo. Tais métodos permitem a seleção positiva e negativa com base em vários marcadores simultaneamente.
[458] Em algumas modalidades, as células são ativadas ou estimuladas antes de uma ou mais etapas para engenharia genética das células, por exemplo, pela transdução ou transfecção das células. Em modalidades particulares, as células são cultivadas ou incubadas sob condição estimulatória antes de uma ou mais etapas para engenharia genética das células. Em algumas modalidades, as condições ou agentes estimulantes incluem um ou mais agentes, por exemplo, ligantes, capazes de ativar um domínio de sinalização intracelular de um complexo TCR. Em alguns aspectos, o agente liga ou inicia a cascata de sinalização intracelular TCR/CD3 em uma célula T. Tais agentes podem incluir anticorpos, tais como os específicos para um TCR, por exemplo, anti-CD3. Em algumas modalidades, as condições estimulantes incluem um ou mais agentes, por exemplo, ligante, que é capaz de estimular um receptor coestimulatório, por exemplo, anti- CD28. Em algumas modalidades, esses agentes e/ou ligantes podem estar ligados a um suporte sólido, como uma esfera, e/ou uma ou mais citocinas. Opcionalmente, a ativação ou estimulação pode ainda compreender a etapa de adição de anticorpo anti-CD3 e/ou anti-CD28 ao meio de cultura (por exemplo, a uma concentração de pelo menos cerca de 0,5 ng/ml). Em algumas modalidades, os agentes estimulantes incluem IL-2, IL-15 e/ou IL-7. Em alguns aspectos, a concentração de IL-2 é de pelo menos cerca de 10 unidades / mL. B. Ácido nucleico que Codifica uma Proteína Heteróloga
[459] Também são fornecidos um ou mais polinucleotídeos (por exemplo, moléculas de ácido nucleico) que codificam receptores recombinantes, vetores para células de engenharia genética para expressar tais receptores e métodos para produzir as células manipuladas geneticamente. Em algumas modalidades, o vetor contém o ácido nucleico que codifica o receptor recombinante. Em modalidades particulares, o vetor é um vetor viral, um vetor não viral. Em alguns casos, o vetor é um vetor viral, como um vetor retroviral, por exemplo,
um vetor lentiviral ou um vetor gammaretroviral.
[460] Em algumas modalidades, as células são contatadas com o vetor sem ativação prévia das células e/ou dentro de um período de tempo iniciado não mais de 24 horas após a obtenção das células de um indivíduo e/ou no qual as células não foram submetidas a uma temperatura superior a 15 ºC a 25 ºC, superior ou superior a cerca de 37 ° ± 2,0 ºC, durante um período não superior a 24 horas após a obtenção das células de um indivíduo. Em certas modalidades, o vetor é contatado com as células sem primeiro, isto é, antes da engenharia genética (por exemplo, transdução ou transfecção), ativando e/ou estimulando as células T com um reagente de estimulação ex vivo (por exemplo, anti-reagente anti-CD3 / CD28) antes e/ou em conjunto com o contato ou a incubação das células com as partículas virais. Em algumas modalidades, os vetores incluem vetores virais, por exemplo, retrovirais ou lentivirais, vetores ou transposons não virais, por exemplo, sistema de transposons Sleeping Beauty, vetores derivados do vírus símio 40 (SV40), adenovírus, vírus adenoassociado (AAV), vetores lentivirais ou vetores retrovirais, como vetores gama-retrovirais, vetor retroviral derivado do vírus da leucemia de murino Moloney (MoMLV), vírus do sarcoma mieloproliferativo (MPSV), vírus das células-tronco embrionárias de murino (MESV), vírus das células-tronco de murino (MSCV), vírus formador de foco do baço (SFFV) ou vírus adenoassociado (AAV).
[461] Em algumas modalidades, o vetor viral ou o DNA não viral contém um ácido nucleico que codifica uma proteína recombinante heteróloga. Em algumas modalidades, a molécula recombinante heteróloga é ou inclui um receptor recombinante, por exemplo, um receptor de antígeno, transposons SB, por exemplo, para silenciamento de genes, transposons fechados por capsídeo, ácido nucleico de cadeia dupla homóloga, por exemplo, para recombinação genômica ou genes repórter (por exemplo, proteínas fluorescentes, (tal como GFP) ou luciferase).
[462] Em algumas modalidades, o vetor viral ou o DNA não viral contém um ácido nucleico que codifica um receptor recombinante e/ou receptor quimérico, como uma proteína receptora heteróloga. O receptor recombinante, como receptor heterólogo, pode incluir receptores de antígeno, como receptores funcionais de antígeno não TCR, incluindo receptores de antígeno quiméricos (CARs) e outros receptores de ligação a antígeno, como receptores de células T transgênicos (TCRs). Os receptores também podem incluir outros receptores, como outros receptores quiméricos, tais como receptores que se ligam a ligantes específicos e que possuem domínios de sinalização transmembranar e/ou intracelular semelhantes aos presentes em um CAR.
[463] Em algumas modalidades, o ácido nucleico é inserido ou localizado em uma região de um vetor viral, como geralmente em uma região não essencial do genoma viral. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é inserido no genoma viral no lugar de certas sequências virais para produzir um vírus com defeito de replicação. Em certas modalidades, o ácido nucleico está localizado dentro de um DNA não viral, por exemplo, dentro de um transposon.
[464] Receptores de antígeno, incluindo CARs e TCRs recombinantes, e produção e introdução dos mesmos, em algumas modalidades incluem aqueles descritos, por exemplo, nos números de publicação de pedido de patente internacional WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061 números de publicação de pedido de Patente U.S. US2002131960, US2013287748, US20130149337, Patente U.S. Nos.: 6,451,995, 7,446,190, 8,252,592, 8,339,645, 8,398,282, 7,446,179, 6,410,319, 7,070,995, 7,265,209, 7,354,762,
7,446,191, 8,324,353, e 8,479,118, e número de pedido de Patente Europeia EP2537416, e/ou aqueles descritos por Sadelain et al., Cancer Discov. Abril de 2013; 3(4): 388–398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., Outubro de 2012; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, Março de 2012 18(2): 160-75.
1. Receptor Quimérico de Antígeno
[465] Em algumas modalidades, são fornecidas células manipuladas geneticamente, como células T, que expressam um CAR com especificidade para um antígeno específico (ou marcador ou ligante), como um antígeno expresso na superfície de um tipo de célula específico. Em algumas modalidades, o antígeno é um polipeptídeo. Em algumas modalidades, é um carboidrato ou outra molécula. Em algumas modalidades, o antígeno é seletivamente expresso ou superexpressado nas células da doença ou condição, por exemplo, o tumor ou células patogênicas, em comparação com células ou tecidos normais ou não direcionados. Em outras modalidades, o antígeno é expresso nas células normais e/ou é expresso nas células manipuladas geneticamente.
[466] Em modalidades particulares, o receptor recombinante, tal como o receptor quimérico, contém uma região de sinalização intracelular, que inclui um domínio de sinalização citoplasmático (também chamado de domínio de sinalização intracelular), tal como uma região citoplasmática (intracelular) capaz de induzir um sinal de ativação primário em uma célula T, por exemplo, um domínio de sinalização citoplasmático de um componente do receptor de célula T (TCR) (por exemplo, um domínio de sinalização citoplasmático de uma cadeia zeta de uma cadeia CD3-zeta (CD3ζ) ou uma variante funcional ou porção de sinalização da mesma) e/ou que compreende um motivo de ativação baseado em tirosina imunoreceptora (ITAM).
[467] Em algumas modalidades, o receptor quimérico contém ainda um domínio de ligação de ligante extracelular que se liga especificamente a um antígeno de ligante (por exemplo, antígeno). Em algumas modalidades, o receptor quimérico é um CAR que contém um domínio de reconhecimento de antígeno extracelular que se liga especificamente a um antígeno. Em algumas modalidades, o ligante, tal como um antígeno, é uma proteína expressa na superfície das células. Em algumas modalidades, o CAR é um CAR tipo TCR e o antígeno é um antígeno de peptídeo processado, tal como um antígeno de antígeno de uma proteína intracelular, que, tipo um TCR, é reconhecido na superfície celular no contexto de uma grande molécula do complexo de histocompatibilidade (MHC).
[468] Receptores de antígeno exemplares, incluindo CARs, e métodos para engenharia e introdução de tais receptores nas células, incluem aqueles descritos, por exemplo, nos números de publicação de pedido de patente internacional WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061 números publicação de pedido de patente U.S. US2002131960, US2013287748, US20130149337, Patente U.S. Nos.: 6,451,995, 7,446,190, 8,252,592, 8,339,645, 8,398,282, 7,446,179, 6,410,319, 7,070,995, 7,265,209, 7,354,762, 7,446,191, 8,324,353, e 8,479,118, e número de pedido de patente Europeia EP2537416, e/ou aqueles descritos por Sadelain et al., Cancer Discov. Abril de 2013; 3(4): 388–398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., Outubro de 2012; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, Março de 2012 18(2): 160-75. Em alguns aspectos, os receptores de antígeno incluem um CAR, como descrito na Patente U.S.: 7.446.190, e aqueles descritos na Publicação de Pedido de Patente Internacional: WO/2014055668 A1. Exemplos de CARs incluem CARs, conforme divulgado em qualquer uma das publicações mencionadas, como WO2014031687, US 8.339.645, US
7.446.179, US 2013/0149337, Patente U.S.: 7.446.190, Patente U.S.:
8.389.282, Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang et al. (2012) J. Immunother. 35 (9): 689-701; e Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5 (177). Vide também WO2014031687, US 8.339.645, US 7.446.179, US 2013/0149337, Patente U.S. No. 7.446.190 e Patente U.S. No. 8.389.282.
[469] Em algumas modalidades, o CAR é construído com uma especificidade para um antígeno específico (ou marcador ou ligante), como um antígeno expresso em um tipo de célula específico a ser alvo de terapia adotiva, por exemplo, um marcador de câncer e/ou um antígeno destinado a induzir uma resposta dampening, tal como um antígeno expresso em um tipo de célula normal ou não doente. Assim, o CAR inclui tipicamente em sua porção extracelular uma ou mais moléculas de ligação de antígeno, como um ou mais fragmento, domínio ou porção de ligação de antígeno, ou um ou mais domínios variáveis de anticorpo e/ou moléculas de anticorpo. Em algumas modalidades, o CAR inclui uma porção ou porções de ligação de antígeno de uma molécula de anticorpo, tal como um fragmento de anticorpo de cadeia única (scFv) derivado das cadeias variável pesada (VH) e variável leve (VL) de um anticorpo monoclonal (mAb).
[470] Em algumas modalidades, o anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo é expresso nas células como parte de um receptor recombinante, tal como um receptor de antígeno. Entre os receptores de antígeno estão receptores funcionais de antígeno não TCR, como receptores quiméricos de antígeno (CARs). Geralmente, um CAR contendo um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno que exibe especificidade do tipo TCR direcionada contra complexos peptídeo-MHC também pode ser referido como um CAR do tipo TCR. Em algumas modalidades, o domínio de ligação de antígeno extracelular específico para um complexo de peptídeo MHC de um CAR do tipo TCR está ligado a um ou mais componentes de sinalização intracelular, em alguns aspectos via ligantes e/ou domínio (s) transmembranar (s). Em algumas modalidades, essas moléculas podem tipicamente imitar ou aproximar um sinal através de um receptor de antígeno natural, tal como um TCR, e, opcionalmente, um sinal através desse receptor em combinação com um receptor coestimulatório.
[471] Em algumas modalidades, o receptor recombinante, tal como um receptor quimérico (por exemplo, CAR), inclui um domínio de ligação de ligante que se liga, tal como especificamente se liga, a um antígeno (ou um ligante). Entre os antígenos direcionados pelos receptores quiméricos estão os expressos no contexto de uma doença, condição ou tipo de célula a ser direcionada através da terapia celular adotiva. Entre as doenças e condições estão doenças e distúrbios proliferativos, neoplásicos e malignos, em incluindo cânceres e tumores, incluindo cânceres hematológicos, cânceres do sistema imunológico, como linfomas, leucemias e/ou mielomas, como B, T e leucemias mieloides, linfomas e múltiplos mielomas.
[472] Em algumas modalidades, o antígeno (ou um ligante) é um polipeptídeo. Em algumas modalidades, é um carboidrato ou outra molécula. Em algumas modalidades, o antígeno (ou um ligante) é seletivamente expresso ou superexpresso nas células da doença ou condição, por exemplo, o tumor ou células patogênicas, em comparação com células ou tecidos normais ou não direcionados. Em outras modalidades, o antígeno é expresso nas células normais e/ou é expresso nas células manipuladas geneticamente.
[473] Em algumas modalidades, o CAR contém um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno (por exemplo, scFv) que reconhece especificamente um antígeno, tal como um antígeno intacto, expresso na superfície de uma célula.
[474] Em algumas modalidades, o antígeno é ou inclui integrina αvβ6 (integrina avb6), antígeno de maturação de células B (BCMA), B7- H3, B7-H6, anidrase carbônica 9 (CA9, também conhecida como CAIX ou G250), um antígeno para testagem de câncer, antígeno câncer / teste 1B (CTAG, também conhecido como NY-ESO-1 e LAGE-2), antígeno carcinoembrionário (CEA), uma ciclina, ciclina A2, ligante 1 de quimiocina de motivo CC (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, proteoglicano sulfato de condroitina 4 (CSPG4), proteína do fator de crescimento epidérmico (EGFR), mutação do receptor do fator de crescimento epidérmico tipo III (EGFR vIII), glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), efrinaB2, receptor de efrina A2 (EPHa2), receptor de estrogênio, receptor Fc tipo 5 (FCRL5; também conhecido como Homólogo 5 do receptor Fc ou FCRH5), receptor fetal de acetilcolina (AchR fetal), uma proteína de ligação ao folato (FBP), receptor alfa de folato, gangliosídeo GD2, GD2 O-acetilado (OGD2), gangliosídeo GD3, glicoproteína 100 (gp100), glipican-3 (GPC3), Receptor 5D acoplado à proteína G (GPRC5D), Her2/neu (receptor de tirosina quinase erb-B2), Her3 (erb- B3), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), dímeros de erbB, antígeno associado ao melanoma de alto peso molecular humano (HMW-MAA), antígeno de superfície da hepatite B, antígeno leucocitário humano A1 (HLA-A1), antígeno leucocitário humano A2 (HLA-A2), receptor alfa de IL-22 (IL- 22Rα), receptor alfa-2 de IL-13 (IL-13Rα2), receptor do domínio de inserção de quinase (kdr), cadeia leve kappa, molécula de adesão de células L1 (L1-CAM), epítopo CE7 de L1-CAM, repetição rica em leucina que contém membro A da família 8 (LRRC8A), Lewis Y, antígeno associado ao melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE- A10, mesotelina (MSLN), c-Met, citomegalovírus murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, ligantes de membro D de grupo 2 de assassinas naturais (NKG2D), melan A (MART-1), molécula de adesão de células neurais (NCAM), antígeno oncofetal, antígeno preferivelmente expresso do melanoma (PRAME), receptor de progesterona, antígeno prostático específico, antígeno prostático de células-tronco (PSCA), antígeno prostático específico de membrana (PSMA), receptor de tirosina quinase tipo receptor órfão 1 (ROR1), survivina, glicoproteína trofoblástica (TPBG também conhecida como 5T4), glicoproteína 72 associada ao tumor (TAG72), proteína 1 relacionada à tirosinase (TRP1, também conhecida como TYRP1 ou gp75), proteína 2 relacionada à tirosinase (TRP2, também conhecida como dopacromo tautomerase, dopacromo delta-isomerase ou DCT), receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), receptor 2 do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR2), tumor de Wilms 1 (WT-1), um antígeno específico ao patógeno ou expresso ao patógeno, ou um antígeno associado a um marcador universal e/ou moléculas biotiniladas e/ou moléculas expressas pelo HIV, HCV, HBV ou outros patógenos. Os antígenos direcionados pelos receptores em algumas modalidades incluem antígenos associados a uma malignidade de células B, como qualquer um de vários marcadores conhecidos de células B. Em algumas modalidades, o antígeno é ou inclui CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igkappa, Iglambda, CD79a, CD79b ou CD30.
[475] Em algumas modalidades, o antígeno é um antígeno de patógeno específico. Em algumas modalidades, o antígeno é um antígeno viral (como um antígeno viral do HIV, HCV, HBV, etc.), antígenos bacterianos e/ou antígenos parasitários.
[476] Em algumas modalidades, o CAR contém um anticorpo semelhante ao TCR, como um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno (por exemplo, scFv) que reconhece especificamente um antígeno intracelular, como um antígeno associado a um tumor,
apresentado na superfície celular como um complexo MHC-peptídeo. Em algumas modalidades, um anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo que reconhece um complexo de peptídeo MHC pode ser expresso nas células como porção de um receptor recombinante, como um receptor de antígeno. Entre os receptores de antígeno estão receptores funcionais de antígeno não TCR, como receptores quiméricos de antígeno (CARs). Geralmente, um CAR contendo um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno que exibe especificidade do tipo TCR direcionada contra complexos peptídeo- MHC também pode ser referido como um CAR do tipo TCR.
[477] A referência a "Complexo principal de histocompatibilidade" (MHC) refere-se a uma proteína, geralmente uma glicoproteína, que contém um sítio de ligação de peptídeo polimórfico ou sulco de ligação que pode, em alguns casos, complexar-se com antígenos peptídicos de polipeptídeos, incluindo antígenos peptídicos processados pela maquinaria celular. Em alguns casos, as moléculas de MHC podem ser exibidas ou expressas na superfície celular, inclusive como um complexo com peptídeo, isto é, complexo de peptídeo MHC, para apresentação de um antígeno em uma conformação reconhecível por um receptor de antígeno nas células T, como TCRs ou anticorpo semelhante ao TCR. Geralmente, as moléculas de MHC classe I são heterodímeros tendo uma membrana que abrange a cadeia α, em alguns casos com três domínios α e uma microglobulina β2 não covalentemente associada. Geralmente, as moléculas de MHC de classe II são compostas por duas glicoproteínas transmembranares, α e β, ambas tipicamente abrangendo a membrana. Uma molécula de MHC pode incluir uma porção eficaz de um MHC que contém um sítio ou sítios de ligação de antígeno para a ligação de um peptídeo e as sequências necessárias para o reconhecimento pelo receptor de antígeno apropriado. Em algumas modalidades, as moléculas de MHC de classe I entregam peptídeos originários do citosol à superfície celular, onde um complexo de MHC-peptídeo é reconhecido pelas células T, tais como geralmente células T CD8+, mas em alguns casos células T CD4+. Em algumas modalidades, as moléculas do MHC de classe II entregam peptídeos originários do sistema vesicular à superfície celular, onde são tipicamente reconhecidos pelas células T CD4+. Geralmente, as moléculas de MHC são codificadas por um grupo de locais ligados, que são coletivamente denominados H-2 no camundongo e antígeno leucocitário humano (HLA) em humanos. Portanto, o MHC tipicamente humano também pode ser referido como antígeno leucocitário humano (HLA).
[478] O termo "complexo MHC-peptídeo" ou "complexo peptídeo- MHC" ou variações do mesmo, refere-se a um complexo ou associação de um antígeno de antígeno e uma molécula MHC, tal como, geralmente, por interações não covalentes do peptídeo no sulco de ligação ou fenda da molécula de MHC. Em algumas modalidades, o complexo MHC-peptídeo está presente ou exibido na superfície das células. Em algumas modalidades, o complexo MHC-peptídeo pode ser especificamente reconhecido por um receptor de antígeno, tal como um TCR, um CAR tipo TCR ou porções de ligação a antígeno do mesmo.
[479] Em algumas modalidades, um peptídeo, como um antígeno ou epítopo peptídico, de um polipeptídeo pode se associar a uma molécula de MHC, como para o reconhecimento por um receptor de antígeno. Geralmente, o peptídeo é derivado de ou com base em um fragmento de uma molécula biológica mais longa, como um polipeptídeo ou proteína. Em algumas modalidades, o peptídeo normalmente tem cerca de 8 a cerca de 24 aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, um peptídeo tem um comprimento de ou de cerca de 9 a 22 aminoácidos para reconhecimento no complexo MHC Classe II. Em algumas modalidades, um peptídeo tem um comprimento de ou de cerca de 8 a 13 aminoácidos para reconhecimento no complexo MHC Classe I. Em algumas modalidades, após o reconhecimento do peptídeo no contexto de uma molécula de MHC, como o complexo MHC- peptídeo, o receptor de antígeno, como TCR ou CAR tipo TCR, produz ou dispara um sinal de ativação para a célula T que induz uma Resposta de células T, como proliferação de células T, produção de citocinas, resposta de células T citotóxicas ou outra resposta.
[480] Em algumas modalidades, um anticorpo do tipo TCR ou porção de ligação de antígeno é conhecido ou pode ser produzido por métodos conhecidos na técnica (vide, por exemplo, pedidos de publicação nos. Nos. US 2002/0150914; US 2003/0223994; US 2004/0191260; US 2006/0034850; US 2007/00992530; US20090226474; US20090304679; e Publicação Internacional PCT No. WO 03/068201).
[481] Em algumas modalidades, um anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo que se liga especificamente a um complexo peptídeo-MHC, pode ser produzido imunizando um hospedeiro com uma quantidade eficaz de um imunogênio contendo um complexo peptídeo-MHC específico. Em alguns casos, o peptídeo do complexo MHC-peptídeo é um epítopo do antígeno capaz de se ligar ao MHC, como um antígeno tumoral, por exemplo, um antígeno universal do tumor, antígeno de mieloma ou outro antígeno, conforme descrito abaixo. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz do imunogênio é então administrada a um hospedeiro para provocar uma resposta imune, em que o imunogênio retém uma forma tridimensional do mesmo por um período de tempo suficiente para provocar uma resposta imune contra a apresentação tridimensional do peptídeo no sulco de ligação da molécula de MHC. O soro coletado do hospedeiro é então analisado para determinar se anticorpos desejados que reconhecem uma apresentação tridimensional do peptídeo no sulco de ligação da molécula de MHC estão sendo produzidos. Em algumas modalidades, os anticorpos produzidos podem ser avaliados para confirmar que o anticorpo pode diferenciar o complexo MHC-peptídeo da molécula MHC sozinha, apenas o peptídeo de interesse e um complexo de MHC e peptídeo irrelevante. Os anticorpos desejados podem então ser isolados.
[482] Em algumas modalidades, um anticorpo ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a um complexo de peptídeo MHC pode ser produzido empregando métodos de exibição de biblioteca de anticorpos, como fagos bibliotecas de anticorpos. Em algumas modalidades, as bibliotecas de exibição de fagos de Fab mutante, scFv ou outras formas de anticorpo podem ser geradas, por exemplo, nas quais os membros da biblioteca são mutados em um ou mais resíduos de uma CDR ou CDRs. Vide por exemplo, Pedido publicado U.S. No. US20020150914, US2014/0294841; e Cohen CJ. et al. (2003) J. Mol. Recogn. 16: 324-332.
[483] O termo "anticorpo" aqui é usado no sentido mais amplo e inclui anticorpos policlonais e monoclonais, incluindo anticorpos intactos e fragmentos de anticorpos funcionais (ligação de antígeno), incluindo fragmentos de ligação de antígeno (Fab), fragmentos F(ab’)2, fragmentos Fab’, fragmentos Fv, fragmentos de IgG recombinante (rIgG), regiões variáveis de cadeia pesada (VH) capazes de se ligar especificamente ao antígeno, fragmentos de anticorpos de cadeia única, incluindo fragmentos variáveis de cadeia única (scFv) e anticorpos de domínio único (por exemplo, sdAb, sdFv, nanocorpo). O termo abrange formas de imunoglobulinas modificadas por engenharia genética e/ou modificadas de outra forma, tais como anticorpos, anticorpos, quiméricos, anticorpos totalmente humanos, anticorpos humanizados e anticorpos heteroconjugados, multiespecíficos, por exemplo, biespecíficos, anticorpos, diabéticos, triaborpos e tetracorpos,
di-scFv em tandem, tri-scFv em tandem. Salvo indicação em contrário, o termo "anticorpo" deve ser entendido como abrangendo fragmentos funcionais de anticorpos. O termo também abrange anticorpos intactos ou completos, incluindo anticorpos de qualquer classe ou subclasse, incluindo IgG e suas subclasses, IgM, IgE, IgA e IgD.
[484] Em algumas modalidades, as proteínas de ligação de antígeno, anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos reconhecem especificamente um antígeno de um anticorpo completo. Em algumas modalidades, as cadeias pesada e leve de um anticorpo podem ser de tamanho completo ou podem ser uma porção de ligação de antígeno (um Fab, F(ab’)2, Fv ou um fragmento Fv de cadeia única (scFv)). Em outras modalidades, a região constante de cadeia pesada do anticorpo é escolhida dentre, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD e IgE, particularmente escolhida dentre, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, mais particularmente, IgG1 (por exemplo, IgG1 humana). Em outra modalidade, a região constante de cadeia leve do anticorpo é escolhida entre, por exemplo, kappa ou lambda, particularmente kappa.
[485] Entre os anticorpos fornecidos estão fragmentos de anticorpos. Um "fragmento de anticorpo" refere-se a uma molécula diferente de um anticorpo intacto que compreende uma porção de um anticorpo intacto que liga o antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a, Fv, Fab, Fab’, Fab'-SH, F(ab’)2; diabetes; anticorpos lineares; regiões variáveis de cadeia pesada (VH), moléculas de anticorpo de cadeia única, como scFvs e anticorpos únicos de VH de domínio único; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo. Em modalidades particulares, os anticorpos são fragmentos de anticorpo de cadeia única compreendendo uma região variável de cadeia pesada e/ou uma região variável de cadeia leve, como scFvs.
[486] O termo "região variável" ou "domínio variável" refere-se ao domínio de um anticorpo de cadeia pesada ou leve que está envolvido na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo geralmente têm estruturas semelhantes, com cada domínio compreendendo quatro regiões estruturais conservadas (FRs) e três CDRs. (Vide, por exemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6ª ed., W.H. Freeman e Co., página 91 (2007). Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação de antígeno. Além disso, anticorpos que ligam um antígeno específico pode ser isolado usando um domínio VH ou VL de um anticorpo que liga o antígeno para rastrear uma biblioteca de domínios complementares VL ou VH, respectivamente. Vide, por exemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150: 880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352: 624-628 (1991).
[487] Anticorpos de domínio único são fragmentos de anticorpo que compreendem todo ou uma porção do domínio variável de cadeia pesada ou todo ou uma porção do domínio variável de cadeia leve de um anticorpo. Em certas modalidades, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano. Em algumas modalidades, o CAR compreende um domínio de cadeia pesada de anticorpo que liga especificamente o antígeno, como um marcador de câncer ou antígeno da superfície celular de uma célula ou doença a ser direcionada, como uma célula tumoral ou uma célula cancerígena, como qualquer um dos os antígenos alvo aqui descritos ou conhecidos na técnica.
[488] Os fragmentos de anticorpos podem ser produzidos por várias técnicas, incluindo, entre outros, a digestão proteolítica de um anticorpo intacto, bem como a produção por células hospedeiras recombinantes. Em algumas modalidades, os anticorpos são fragmentos produzidos de forma recombinante, como fragmentos que compreendem arranjos que não ocorrem naturalmente, como aqueles com duas ou mais regiões ou cadeias de anticorpos unidas por ligantes sintéticos, por exemplo, ligantes peptídicos e/ou que podem não ser produzidos pela digestão enzimática de um anticorpo intacto de ocorrência natural. Em algumas modalidades, o fragmento de anticorpo nts são scFvs.
[489] Um anticorpo "humanizado" é um anticorpo no qual todos ou substancialmente todos os resíduos de aminoácidos CDR são derivados de CDR não humanas e todos ou substancialmente todos os resíduos de aminoácidos FR são derivados de FRs humanos. Um anticorpo humanizado pode opcionalmente incluir pelo menos uma porção de uma região constante de anticorpo derivada de um anticorpo humano. Uma "forma humanizada" de um anticorpo não humano refere- se a uma variante do anticorpo não humano que foi submetido à humanização, tipicamente para reduzir a imunogenicidade para seres humanos, mantendo a especificidade e afinidade do anticorpo não humano parental. Em algumas modalidades, alguns resíduos FR em um anticorpo humanizado são substituídos por resíduos correspondentes de um anticorpo não humano (por exemplo, o anticorpo do qual os resíduos CDR são derivados), por exemplo, para restaurar ou melhorar a especificidade ou afinidade do anticorpo.
[490] Assim, em algumas modalidades, o receptor de antígeno quimérico, incluindo CARs semelhantes a TCR, inclui uma porção extracelular contendo um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento inclui um scFv. Em alguns aspectos, o receptor de antígeno quimérico inclui uma porção extracelular contendo o anticorpo ou fragmento e uma região de sinalização intracelular. Em algumas modalidades, a região de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização intracelular. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular é ou compreende um domínio de sinalização primário, um domínio de sinalização que é capaz de induzir um sinal de ativação primária em uma célula T, um domínio de sinalização de um componente do receptor de célula T (TCR) e/ou um domínio de sinalização compreendendo um motivo de ativação à base de tirosina imunorreceptora (ITAM).
[491] Em algumas modalidades, o receptor recombinante, como o CAR, como a porção de anticorpo do mesmo, inclui ainda um espaçador, que pode ser ou incluir pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina ou uma variante ou versão modificada do mesmo, como uma região de dobradiça, por exemplo, uma região de dobradiça de IgG4 e/ou uma região de CH1/CL e/ou Fc. Em algumas modalidades, o receptor recombinante adicionalmente compreende um espaçador e/ou uma região de dobradiça. Em algumas modalidades, a região ou porção constante é de uma IgG humana, como IgG4 ou IgG1. Em alguns aspectos, a porção da região constante serve como uma região espaçadora entre o componente de reconhecimento de antígeno, por exemplo, scFv e domínio transmembranar. O espaçador pode ter um comprimento que proporcione maior capacidade de resposta da célula após a ligação de antígeno, em comparação com a ausência do espaçador. Em alguns exemplos, o espaçador tem aproximadamente 12 aminoácidos de comprimento ou não tem mais que 12 aminoácidos de comprimento. Espaçadores exemplares incluem aqueles com pelo menos cerca de 10 a 229 aminoácidos, cerca de 10 a 200 aminoácidos, cerca de 10 a 175 aminoácidos, cerca de 10 a 150 aminoácidos, cerca de 10 a 125 aminoácidos, cerca de 10 a 125 aminoácidos, cerca de 10 a 100 aminoácidos, cerca de 10 a 75 aminoácidos, cerca de 10 a 50 aminoácidos, cerca de 10 a 40 aminoácidos, cerca de 10 a 30 aminoácidos, cerca de 10 a 20 aminoácidos ou cerca de 10 a 15 aminoácidos, e incluindo qualquer número inteiro entre os pontos finais de qualquer um dos intervalos listados. Em algumas modalidades, uma região espaçadora tem cerca de 12 aminoácidos ou menos, cerca de 119 aminoácidos ou menos, ou cerca de 229 aminoácidos ou menos. Espaçadores exemplares incluem dobradiça de IgG4 sozinha, dobradiça de IgG4 ligada aos domínios CH2 e CH3 ou dobradiça de IgG4 ligada ao domínio CH3. Espaçadores exemplares incluem, mas não estão limitados aos descritos em Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19: 3153 ou número da publicação do pedido de patente internacional WO2014031687. Em algumas modalidades, o espaçador tem a sequência definida em SEQ ID NO: 133 e é codificado pela sequência apresentada em SEQ ID NO: 134. Em algumas modalidades, o espaçador tem a sequência apresentada em SEQ ID NO: 135 Em algumas modalidades, o espaçador tem a sequência apresentada em SEQ ID NO: 136.
[492] Em algumas modalidades, a região ou porção constante é de IgD. Em algumas modalidades, o espaçador tem a sequência apresentada em SEQ ID NO: 137. Em algumas modalidades, o espaçador tem uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência para qualquer uma das SEQ ID NOS: 133, 135, 136 e 137.
[493] O domínio de reconhecimento de antígeno geralmente está ligado a um ou mais componentes de sinalização intracelular, como componentes de sinalização que imitam a ativação por meio de um complexo receptor de antígeno, como um complexo TCR, no caso de um CAR, e/ou sinal por outro receptor de superfície celular. Assim, em algumas modalidades, o componente de ligação de antígeno (por exemplo, anticorpo) está ligado a uma ou mais regiões de sinalização transmembranar e intracelular. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar é fundido ao domínio extracelular. Em uma modalidade, é utilizado um domínio transmembranar que naturalmente está associado a um dos domínios no receptor, por exemplo, CAR. Em alguns casos, o domínio transmembranar é selecionado ou modificado por uma substituição aminoácido para evitar a ligação de tais domínios aos domínios transmembranares da mesma ou de diferentes proteínas da membrana superficial para minimizar as interações com outros membros do complexo receptor.
[494] O domínio transmembranar em algumas modalidades é derivado de uma fonte natural ou de uma fonte sintética. Onde a fonte é natural, em alguns aspectos, o domínio é derivado de qualquer proteína ligada à membrana ou transmembrana. As regiões transmembranares incluem aquelas derivadas (ou seja, compreendem pelo menos as regiões transmembranares) da cadeia alfa, beta ou zeta do receptor de células T, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD 154. Alternativamente, o domínio transmembranar em algumas modalidades é sintético. Em alguns aspectos, o domínio transmembranar sintético compreende resíduos predominantemente hidrofóbicos, como leucina e valina. Em alguns aspectos, um tripleto de fenilalanina, triptofano e valina será encontrado em cada extremidade de um domínio transmembranar sintético. Em algumas modalidades, a ligação é feita por ligantes, espaçadores e/ou domínios transmembranares.
[495] Entre a região de sinalização intracelular estão aquelas que imitam ou aproximam um sinal através de um receptor de antígeno natural, um sinal através desse receptor em combinação com um receptor coestimulatório e/ou um sinal através de um receptor coestimulatório sozinho. Em algumas modalidades, um ligante oligo- ou polipeptídico curto, por exemplo, um ligante de 2 a 10 aminoácidos de comprimento, como um contendo glicina e serinas, por exemplo, dupleto de glicina-serina, está presente e forma uma ligação entre o domínio transmembranar e de domínio citoplasmático de sinalização do CAR.
[496] O receptor, por exemplo, o CAR, geralmente inclui pelo menos um componente ou componentes de sinalização intracelular. Em algumas modalidades, o receptor inclui um componente intracelular de um complexo TCR, como uma cadeia CD3 CDR que medeia a ativação de células T e citotoxicidade, por exemplo, cadeia zeta CD3. Assim, em alguns aspectos, o domínio de ligação de antígeno do CAR está ligado a um ou mais módulos de sinalização celular. Em algumas modalidades, os módulos de sinalização celular incluem o domínio transmembranar CD3, domínios de sinalização intracelular CD3 e/ou outros domínios transmembranares de CD. Em algumas modalidades, o receptor, por exemplo, CAR, inclui ainda uma porção de uma ou mais moléculas adicionais, tais como o receptor Fc γ, CD8, CD4, CD25 ou CD16. Por exemplo, em alguns aspectos, o CAR inclui uma molécula quimérica entre CD3-zeta (CD3-ζ) ou receptor Fc γ e CD8, CD4, CD25 ou CD16.
[497] Em algumas modalidades, após a ligação do CAR, o domínio citoplasmático ou a região de sinalização intracelular do CAR ativa pelo menos uma das funções efetoras normais ou respostas da célula imune, por exemplo, célula T projetada para expressar o CAR. Por exemplo, em alguns contextos, o CAR induz uma função de uma célula T, como atividade citolítica ou atividade auxiliar de T, como secreção de citocinas ou outros fatores. Em algumas modalidades, uma porção truncada de uma região de sinalização intracelular de um componente receptor de antígeno ou molécula coestimulatória é usada no lugar de uma cadeia imunoestimulatória intacta, por exemplo, se ela transduz o sinal da função efetora. Em algumas modalidades, as regiões de sinalização intracelular, por exemplo, compreendendo domínio ou domínios intracelulares, incluem as sequências citoplasmáticas do receptor de células T (TCR) e, em alguns aspectos, também os de correceptores que no contexto natural agem em conjunto com tais receptor para iniciar a transdução de sinal após o engate do receptor de antígeno e/ou qualquer derivado ou variante de tais moléculas e/ou qualquer sequência sintética que tenha a mesma capacidade funcional.
[498] No contexto de um TCR natural, a ativação completa geralmente requer não apenas sinalização através do TCR, mas também um sinal coestimulatório. Assim, em algumas modalidades, para promover a ativação completa, um componente para gerar sinal secundário ou coestimulatório também é incluído no CAR. Em outras modalidades, o CAR não inclui um componente para gerar um sinal coestimulatório. Em alguns aspectos, um CAR adicional é expresso na mesma célula e fornece o componente para gerar o sinal secundário ou coestimulatório.
[499] A ativação de células T é, em alguns aspectos, descrita como sendo mediada por duas classes de sequências de sinalização citoplasmáticas: aquelas que iniciam a ativação primária dependente de antígeno através do TCR (sequências de sinalização citoplasmática primária) e aquelas que agem de maneira independente de antígeno fornecer um sinal secundário ou coestimulatório (sequências de sinalização citoplasmáticas secundárias). Em alguns aspectos, o CAR inclui um ou ambos os componentes de sinalização.
[500] Em alguns aspectos, o CAR inclui uma sequência de sinalização citoplasmática primária que regula a ativação primária do complexo TCR. As sequências citoplasmáticas primárias de sinalização que agem de maneira estimulatória podem conter motivos de sinalização conhecidos como motivos de ativação baseados em tirosina imunorreceptora ou ITAMs. Exemplos de ITAM contendo sequências de sinalização citoplasmáticas primárias incluem aquelas derivadas de TCR ou CD3 zeta, FcR gama ou FcR beta. Em algumas modalidades, a (s) molécula (s) de sinalização citoplasmática no CAR contém um domínio de sinalização citoplasmático, uma porção do mesmo ou uma sequência derivada do CD3 zeta.
[501] Em algumas modalidades, o CAR inclui uma região de sinalização e/ou porção transmembranar de um receptor coestimulatório, como CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 e ICOS. Em alguns aspectos, o mesmo CAR inclui a região de sinalização e os componentes coestimulatórioes.
[502] Em algumas modalidades, a região de sinalização é incluída dentro de um CAR, enquanto o componente coestimulatório é fornecido por outro CAR reconhecendo outro antígeno. Em algumas modalidades, os CARs incluem CARs ativadores ou estimuladores e CARs coestimulatórios, ambos expressos na mesma célula (vide WO2014 / 055668).
[503] Em certas modalidades, a região de sinalização intracelular compreende um domínio transmembranar e de sinalização CD28 ligado a um domínio intracelular CD3 (por exemplo, CD3-zeta). Em algumas modalidades, a região de sinalização intracelular compreende um domínio coestimulatório quimérico CD28 e CD137 (4-1BB, TNFRSF9), ligado a um domínio intracelular zeta CD3.
[504] Em algumas modalidades, o CAR abrange um ou mais, por exemplo, dois ou mais domínios coestimulatórios e um domínio de ativação, por exemplo, domínio de ativação primário, na porção citoplasmática. Exemplos de CARs incluem componentes intracelulares de CD3-zeta, CD28 e 4-1BB.
[505] Em alguns casos, os CARs são referidos como CARs de primeira, segunda e/ou terceira geração. Em alguns aspectos, um CAR de primeira geração é aquele que apenas fornece um sinal induzido pela cadeia CD3 após a ligação de antígeno; em alguns aspectos, um CAR de segunda geração é aquele que fornece tal um sinal e sinal coestimulatório, como um que inclui um domínio de sinalização intracelular de um receptor coestimulatório como CD28 ou CD137; em alguns aspectos, um CAR de terceira geração em alguns aspectos é aquele que inclui múltiplos domínios coestimulatórios de diferentes receptores coestimulatórioes.
[506] Em algumas modalidades, o receptor de antígeno quimérico inclui uma porção extracelular contendo o anticorpo ou fragmento aqui descrito. Em alguns aspectos, o receptor de antígeno quimérico inclui uma porção extracelular contendo o anticorpo ou fragmento aqui descrito e um domínio de sinalização intracelular. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento inclui um scFv ou um anticorpo VH de domínio único e o domínio intracelular contém um ITAM. Em alguns aspectos, o domínio de sinalização intracelular inclui um domínio de sinalização de uma cadeia zeta de uma cadeia CD3-zeta (CD3ζ). Em algumas modalidades, o receptor de antígeno quimérico inclui um domínio transmembranar disposto entre o domínio extracelular e a região de sinalização intracelular.
[507] Em alguns aspectos, o domínio transmembranar contém uma porção transmembranar de CD28. O domínio extracelular e a transmembrana podem ser ligados direta ou indiretamente. Em algumas modalidades, o domínio extracelular e a transmembrana estão ligados por um espaçador, como qualquer um aqui descrito. Em algumas modalidades, o receptor de antígeno quimérico contém um domínio intracelular de uma molécula coestimulatória de células T, como entre o domínio transmembranar e o domínio de sinalização intracelular. Em alguns aspectos, a molécula coestimulatória de células T é CD28 ou 4- 1BB.
[508] Em algumas modalidades, o CAR contém um anticorpo, por exemplo, um fragmento de anticorpo, um domínio transmembranar que é ou contém uma porção transmembranar de CD28 ou uma variante funcional do mesmo e um domínio de sinalização intracelular contendo uma porção de sinalização de CD28 ou funcional sua variante e uma porção de sinalização de CD3 zeta ou sua variante funcional. Em algumas modalidades, o CAR contém um anticorpo, por exemplo, fragmento de anticorpo, um domínio transmembranar que é ou contém uma porção transmembranar de CD28 ou uma variante funcional do mesmo e um domínio de sinalização intracelular contendo uma porção de sinalização de um 4-1BB ou variante funcional e uma porção de sinalização de CD3 zeta ou sua variante funcional. Em algumas tais modalidades, o receptor inclui ainda um espaçador contendo uma porção de uma molécula de Ig, tal como uma molécula de Ig humana, tal como uma dobradiça de Ig, por exemplo, uma dobradiça IgG4, como um espaçador apenas de dobradiça.
[509] Em algumas modalidades, o domínio transmembranar do receptor, por exemplo, o CAR é um domínio transmembranar do CD28 humano ou uma variante do mesmo, por exemplo, um domínio transmembranar de 27 aminoácidos de um CD28 humano (No. de acesso: P10747.1), ou é um domínio transmembranar que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 138 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência de SEQ ID NO: 138; em algumas modalidades, a porção contendo o domínio transmembranar do receptor recombinante compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 139 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 93%, 94%, 95%, 96 %, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência.
[510] Em algumas modalidades, o receptor de antígeno quimérico contém um domínio intracelular de uma molécula coestimulatória de células T. Em alguns aspectos, a molécula coestimulatória de células T é CD28 ou 4-1BB.
[511] Em algumas modalidades, a região de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização coestimulatório intracelular de CD28 humano ou uma variante ou porção funcional do mesmo, como um domínio de 41 aminoácidos e/ou um domínio com uma substituição de LL a GG nas posições 186 -187 de uma proteína CD28 nativa. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular pode compreender a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 140 ou 141 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 140 ou 141. Em algumas modalidades, a região intracelular compreende um domínio de sinalização coestimulatório intracelular de 4-1BB ou variante funcional ou porção do mesmo, como um domínio citoplasmático de 42 aminoácidos de um 4-1BB humano (No. de acesso Q07011.1) ou variante funcional ou porção do mesmo, como a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 142 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais da identidade de sequência com SEQ ID NO: 142.
[512] Em algumas modalidades, a região de sinalização intracelular compreende uma cadeia CD3 humana, opcionalmente um domínio de sinalização estimulatória de CD3 zeta ou uma variante funcional do mesmo, como um domínio citoplasmático 112 AA da isoforma 3 de CD3ζ humano (No. de acesso: P20963.2) ou um domínio de sinalização CD3 zeta como descrito na Patente U.S. No .: 7.446.190 ou Patente U.S. No 8.911.993. Em algumas modalidades, a região de sinalização intracelular compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 143, 144 ou 145 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%,
91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 143, 144 ou 145.
[513] Em alguns aspectos, o espaçador contém apenas uma região de dobradiça de uma IgG, como apenas uma dobradiça de IgG4 ou IgG1, como o espaçador de dobradiça apresentado em SEQ ID NO:
133. Em outras modalidades, o espaçador é uma dobradiça de Ig, por exemplo, e dobradiça de IgG4, ligada a um domínio CH2 e/ou CH3. Em algumas modalidades, o espaçador é uma dobradiça de Ig, por exemplo, uma dobradiça de IgG4, ligada aos domínios CH2 e CH3, como apresentado em SEQ ID NO: 135. Em algumas modalidades, o espaçador é uma dobradiça de Ig, por exemplo, uma dobradiça de IgG4, ligada apenas a um domínio CH3, como apresentado em SEQ ID NO:
136. Em algumas modalidades, o espaçador é ou compreende uma sequência rica em glicina-serina ou outro ligante flexível, como ligantes flexíveis conhecidos.
[514] Em algumas modalidades, o receptor recombinante, por exemplo, CAR ou outro receptor de antígeno inclui ainda um marcador, como um marcador de superfície celular, que pode ser usado para confirmar a transdução ou engenharia da célula para expressar o receptor, como uma versão truncada de um receptor de superfície celular, como EGFR truncado (tEGFR). Em alguns aspectos, o marcador inclui todo ou parte (por exemplo, forma truncada) de CD34, um NGFR ou receptor de fator de crescimento epidérmico (por exemplo, tEGFR). Em certas modalidades, o tEGFR contém uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 147 ou 148. Em modalidades particulares, o tEGFR contém uma sequência de aminoácidos com ou com aproximadamente ou pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99% de identidade tendo a sequência apresentada em SEQ ID NO: 147 ou 148. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o marcador está operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica para uma sequência ligante, como uma sequência ligante clivável, por exemplo, T2A. Por exemplo, um marcador e, opcionalmente, uma sequência de ligação, pode ser qualquer como divulgado no pedido de patente publicado No. WO2014031687. Por exemplo, o marcador pode ser um EGFR truncado (tEGFR) que é, opcionalmente, vinculado a uma sequência de ligante, como uma sequência de ligante clivável em T2A.
[515] Em certos casos em que moléculas de ácido nucleico codificam duas ou mais cadeias polipeptídicas diferentes, cada uma das cadeias polipeptídicas pode ser codificada por uma molécula de ácido nucleico separada. Por exemplo, são fornecidos dois ácidos nucleicos separados e cada um pode ser transferido ou introduzido individualmente na célula para expressão na célula.
[516] Em algumas modalidades, como aquelas em que o polinucleotídeo contém uma primeira e segunda sequência de ácido nucleico, as sequências de codificação que codificam cada uma das diferentes cadeias polipeptídicas podem ser operacionalmente ligadas a um promotor, que pode ser o mesmo ou diferente. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico pode conter um promotor que aciona a expressão de duas ou mais cadeias polipeptídicas diferentes. Em algumas modalidades, essas moléculas de ácido nucleico podem ser multicistrônicas (bicistrônicas ou tricistrônicas, vide, por exemplo, Patente U.S. No. 6.060.273). Em algumas modalidades, as unidades de transcrição podem ser projetadas como uma unidade bicistrônica contendo um IRES (sítio interno de entrada do ribossomo), que permite a coexpressão de produtos gênicos ((por exemplo, codificando o PSMA ou sua forma modificada e codificando o receptor recombinante) por uma mensagem de um promotor único. Alternativamente, em alguns casos, um promotor único pode direcionar a expressão de um RNA que contém, em um único quadro de leitura aberto (ORF), dois ou três genes (por exemplo, codificando o PSMA ou sua forma modificada e codificando o receptor recombinante) separados por sequências que codificam um peptídeo de autoclivagem (por exemplo, sequências 2A) ou um sítio de reconhecimento de protease (por exemplo, furina). O ORF codifica um único polipeptídeo que, durante (no caso de 2A) ou após tradução, é processado nas proteínas individuais. Em alguns casos, o peptídeo, como um T2A, pode fazer com que o ribossomo pule (pule o ribossomo) a síntese de uma ligação peptídica no C-terminal de um elemento 2A, levando a separação entre o final da sequência 2A e o próximo peptídeo a jusante (vide, por exemplo, deFelipe. Genetic Vaccines e Ther. 2:13 (2004) e deFelipe et al. Traffic 5: 616-626 (2004)). Vários elementos 2A são conhecidos. Exemplos de sequências 2A que podem ser usadas nos métodos e sistemas aqui divulgados, sem limitação, sequências 2A do vírus da febre aftosa (F2A, por exemplo, SEQ ID NO: 32), vírus da rinite equina A (E2A, por exemplo, SEQ ID NO: 153), vírus Thosea asigna (T2A, por exemplo, SEQ ID NO: 146 ou 149) e teschovirus-1 porcino (P2A, por exemplo, SEQ ID NO: 151 ou 152), conforme descrito na Publicação de Patente U.S. 20070116690.
2. Receptores de células T (TCRs)
[517] Em algumas modalidades, são fornecidas células manipuladas, como células T, que expressam um receptor de células T (TCR) ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo que reconhece um epítopo peptídico ou epítopo da célula T de um polipeptídeo alvo, como um antígeno de um tumor, proteína viral ou autoimune.
[518] Em algumas modalidades, um "receptor de célula T" ou "TCR" é uma molécula que contém cadeias α e β variáveis (também conhecidas como TCRα e TCRβ, respectivamente) ou cadeias γ e δ variáveis (também conhecidas como TCRα e TCRβ, respectivamente), ou suas porções de ligação de antígeno, e que é capaz de se ligar especificamente a um peptídeo ligado a uma molécula de MHC. Em algumas modalidades, o TCR está na forma αβ. Tipicamente, TCRs que existem nas formas αβ e γδ são geralmente estruturalmente semelhantes, mas as células T que os expressam podem ter sítios ou funções anatômicas distintas. Um TCR pode ser encontrado na superfície de uma célula ou na forma solúvel. Geralmente, um TCR é encontrado na superfície das células T (ou linfócitos T), onde geralmente é responsável pelo reconhecimento de antígenos ligados às moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC).
[519] A menos que seja indicado de outra forma, o termo "TCR" deve ser entendido como abrangendo TCRs completos, bem como porções de ligação de antígeno ou seus fragmentos. Em algumas modalidades, o TCR é um TCR intacto ou completo, incluindo TCRs na forma αβ ou γδ. Em algumas modalidades, o TCR é uma porção de ligação a antígeno que é menor que um TCR de comprimento completo, mas que se liga a um peptídeo específico ligado a uma molécula de MHC, como se liga a um complexo de peptídeo de MHC. Em alguns casos, uma porção ou fragmento de ligação de antígeno de um TCR pode conter apenas uma porção dos domínios estruturais de um TCR inteiro ou intacto, mas ainda é capaz de ligar o epítopo peptídico, como o complexo MHC-peptídeo, a ao qual o TCR completo se liga. Em alguns casos, uma porção de ligação de antígeno contém os domínios variáveis de um TCR, como a cadeia α variável e a cadeia β variável de um TCR, suficientes para formar um sítio de ligação para a ligação a um complexo específico de peptídeo MHC. Geralmente, as cadeias variáveis de um TCR contêm regiões determinantes de complementaridade envolvidas no reconhecimento do complexo peptídeo, MHC e/ou MHC-peptídeo.
[520] Em algumas modalidades, os domínios variáveis do TCR contêm loops hipervariáveis, ou regiões determinantes de complementaridade (CDRs), que geralmente são os principais contribuintes para o reconhecimento de antígenos e capacidades e especificidade de ligação. Em algumas modalidades, uma CDR de um TCR ou uma combinação dos mesmos, forma todo ou substancialmente todo o sítio de ligação de antígeno de uma dada molécula de TCR. As várias CDRs dentro de uma região variável de uma cadeia de TCR geralmente são separadas por regiões estruturais (FRs), que geralmente exibem menos variabilidade entre as moléculas de TCR em comparação com as CDRs (vide, por exemplo, Jores et al., Proc. Nat'l Acad Sci. USA 87: 9138, 1990; Chothia et al., EMBO J. 7: 3745, 1988; vide também Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003). Em algumas modalidades, a CDR3 é o principal CDR responsável pela ligação ou especificidade do antígeno ou é o mais importante entre as três CDRs em uma determinada região variável do TCR para reconhecimento do antígeno e/ou para interação com a porção peptídica processada do peptídeo-MHC complexo. Em alguns contextos, a CDR1 da cadeia alfa pode interagir com a parte N-terminal de certos peptídeos antigênicos. Em alguns contextos, CDR1 da cadeia beta pode interagir com a parte C-terminal do peptídeo. Em alguns contextos, a CDR2 contribui mais fortemente para ou é o principal CDR responsável pela interação ou reconhecimento da porção MHC do complexo MHC-peptídeo. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia β pode conter uma região hipervariável adicional (CDR4 ou HVR4), que geralmente está envolvida na ligação de superantígenos e não no reconhecimento de antígenos (Kotb (1995) Clinical Microbiology Reviews, 8: 411-426).
[521] Em algumas modalidades, um TCR também pode conter um domínio constante, um domínio transmembranar e/ou uma cauda citoplasmática curta (vide, por exemplo, Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health e Disease, 3rd Ed., Current Biology
Publications, por exemplo, 4:33, 1997). Em alguns aspectos, cada cadeia do TCR pode possuir um domínio variável da imunoglobulina N- terminal, um domínio constante da imunoglobulina, uma região transmembranar e uma cauda citoplasmática curta na extremidade C- terminal. Em algumas modalidades, um TCR está associado a proteínas invariantes do complexo CD3 envolvidas na mediação da transdução de sinal.
[522] Em algumas modalidades, uma cadeia de TCR contém um ou mais domínio constante. Por exemplo, a porção extracelular de uma determinada cadeia de TCR (por exemplo, cadeia α ou cadeia)) pode conter dois domínios do tipo imunoglobulina, como um domínio variável (por exemplo, Vα ou Vβ; tipicamente os aminoácidos 1 a 116 sobre a numeração de Kabat Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5º ed.) e um domínio constante (por exemplo, domínio constante de cadeia α ou Cα, tipicamente posiciona 117 a 259 da cadeia com base na numeração de Kabat ou domínio constante de cadeia ou ou Cβ, tipicamente posiciona 117 a 295 da cadeia com base em Kabat) adjacente à membrana celular. Por exemplo, em alguns casos, a porção extracelular do TCR formada pelas duas cadeias contém dois domínios constantes proximais à membrana e dois domínios variáveis de membrana distal, cujos domínios variáveis contêm CDRs. O domínio constante do TCR pode conter sequências de conexão curtas nas quais um resíduo de cisteína forma uma ligação dissulfeto, ligante assim as duas cadeias do TCR. Em algumas modalidades, um TCR pode ter um resíduo de cisteína adicional em cada uma das cadeias α e β, tal que o TCR contenha duas ligações dissulfeto nos domínios constantes.
[523] Em algumas modalidades, as cadeias de TCR contêm um domínio transmembranar. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar é carregado positivamente. Em alguns casos, a cadeia TCR contém uma cauda citoplasmática. Em alguns casos, a estrutura permite que o TCR se associe a outras moléculas como CD3 e suas subunidades. Por exemplo, um TCR contendo domínios constantes com uma região transmembranar pode ancorar a proteína na membrana celular e associar-se a subunidades invariantes do aparelho ou complexo de sinalização CD3. As caudas intracelulares das subunidades de sinalização de CD3 (por exemplo, cadeias CD3γ, CD3δ, CD3ε e CD3) contêm um ou mais motivos de ativação à base de tirosina imunorreceptores ou ITAM que estão envolvidos na capacidade de sinalização do complexo TCR.
[524] Em algumas modalidades, o TCR pode ser um heterodímero de duas cadeias α e β (ou opcionalmente γ e δ) ou pode ser um construto de TCR de cadeia única. Em algumas modalidades, o TCR é um heterodímero contendo duas cadeias separadas (cadeias α e β ou cadeias γ e δ) que estão ligadas, como por uma ligação dissulfeto ou ligações dissulfeto.
[525] Em algumas modalidades, o TCR pode ser gerado a partir de uma sequência conhecida de TCR, como sequências de cadeias Vα, β, para as quais uma sequência de codificação substancialmente completa está prontamente disponível. Os métodos para obter sequências de TCR de tamanho completo, incluindo sequências da cadeia V, de fontes celulares são bem conhecidos. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos que codificam o TCR podem ser obtidos a partir de uma variedade de fontes, como por amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR) dos ácidos nucleicos que codificam o TCR dentro ou isolados de uma determinada célula ou células ou síntese de sequências de DNA TCR disponíveis publicamente.
[526] Em algumas modalidades, o TCR é obtido a partir de uma fonte biológica, como células de uma célula T (por exemplo, célula T citotóxica), hibridomas de células T ou outra fonte disponível publicamente. Em algumas modalidades, as células T podem ser obtidas a partir de células isoladas in vivo. Em algumas modalidades, o TCR é um TCR timidamente selecionado. Em algumas modalidades, o TCR é um TCR restrito a neoepítopos. Em algumas modalidades, as células T podem ser um hibridoma ou clone de célula T cultivado. Em algumas modalidades, o TCR ou porção de ligação de antígeno do mesmo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo pode ser gerado sinteticamente a partir do conhecimento da sequência do TCR.
[527] Em algumas modalidades, o TCR é gerado a partir de um TCR identificado ou selecionado a partir do rastreamento de uma biblioteca de TCRs candidatos contra um antígeno de polipeptídeo alvo ou seu epítopo de célula T alvo. Bibliotecas TCR podem ser geradas por amplificação do repertório de Vα e Vβ a partir de células T isoladas de um indivíduo, incluindo células presentes em PBMCs, baço ou outro órgão linfoide. Em alguns casos, as células T podem ser amplificadas a partir de linfócitos infiltrantes de tumores (TILs). Em algumas modalidades, as bibliotecas de TCR podem ser geradas a partir de células CD4+ ou CD8+. Em algumas modalidades, os TCRs podem ser amplificados a partir de uma fonte de células T de um indivíduo saudável normal, isto é, bibliotecas normais de TCR. Em algumas modalidades, os TCRs podem ser amplificados a partir de uma fonte de células T de um indivíduo doente, isto é, bibliotecas de TCR doentes. Em algumas modalidades, iniciadores degenerados são usados para amplificar o repertório genético de Vα e Vβ, como por RT-PCR em amostras, como células T, obtidas de seres humanos. Em algumas modalidades, as bibliotecas scTv podem ser montadas a partir de bibliotecas Vα e Vβ puras nas quais os produtos amplificados são clonados ou montados para serem separados por um ligante. Dependendo da fonte do indivíduo e das células, as bibliotecas podem ser específicas do alelo HLA. Alternativamente, em algumas modalidades, as bibliotecas de TCR podem ser geradas por mutagênese ou diversificação de uma molécula de TCR parental ou de scaffold. Em alguns aspectos, os TCRs são indivíduos a evolução direcionada, como por mutagênese, por exemplo, da cadeia α ou β. Em alguns aspectos, resíduos particulares nas CDRs do TCR são alterados. Em algumas modalidades, os TCRs selecionados podem ser modificados por maturação por afinidade. Em algumas modalidades, as células T específicas do antígeno podem ser selecionadas, como por meio de triagem para avaliar a atividade de CTL contra o peptídeo. Em alguns aspectos, TCRs, por exemplo, presente nas células T específicas do antígeno, pode ser selecionado, como por atividade de ligação, por exemplo, afinidade ou avidez particular para o antígeno.
[528] Em algumas modalidades, o TCR ou porção de ligação de antígeno do mesmo é aquele que foi modificado ou manipulado geneticamente. Em algumas modalidades, métodos de evolução direcionada são usados para gerar TCRs com propriedades alteradas, como com maior afinidade para um complexo específico de MHC- peptídeo. Em algumas modalidades, a evolução direcionada é alcançada por métodos de exibição, incluindo, mas não limitado a, exibição de leveduras (Holler et al. (2003) Nat Immunol, 4, 55-62; Holler et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA, 97, 5387-92), exibição de fagos (Li et al. (2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54), ou exibição de células T (Chervin et al. (2008) J Immunol Methods, 339, 175-84). Em algumas modalidades, as abordagens de exibição envolvem engenharia genética, ou modificação, de um TCR conhecido, parental ou referência. Por exemplo, em alguns casos, um TCR do tipo selvagem pode ser usado como modelo para produzir TCRs mutagenizados nos quais um ou mais resíduos das CDRs são mutados, e mutantes com uma propriedade alterada desejada, como maior afinidade por um antígeno alvo desejado, são selecionados.
[529] Em algumas modalidades, os peptídeos de um polipeptídeo alvo para uso na produção ou geração de um TCR de interesse são conhecidos ou podem ser facilmente identificados por um especialista na técnica. Em algumas modalidades, os peptídeos adequados para uso na geração de TCRs ou porções de ligação de antígeno podem ser determinados com base na presença de um motivo restrito a HLA em um polipeptídeo alvo de interesse, como um polipeptídeo alvo descrito abaixo. Em algumas modalidades, os peptídeos são identificados usando modelos de previsão de computador disponíveis. Em algumas modalidades, para a previsão de sítios de ligação de MHC classe I, esses modelos incluem, mas não estão limitados a, ProPred1 (Singh e Raghava (2001) Bioinformatics 17 (12): 1236-1237 e SYFPEITHI (vide Schuler et al. (2007)) Immunoinformtics Methods in Molecular Biology, 409 (1): 75-93, 2007. Em algumas modalidades, o epítopo restrito de MHC é HLA-A0201, que é expresso em aproximadamente 39-46% de todos os Caucasianos e, portanto, representa uma escolha adequada de antígeno MHC para uso na preparação de um TCR ou outra molécula de ligação ao peptídeo MHC.
[530] Os motivos de ligação ao HLA-A0201 e os sítios de clivagem para proteassomas e imunoproteassomas usando modelos de previsão por computador são conhecidos dos especialistas na técnica. Para prever sítios de ligação de MHC classe I, esses modelos incluem, mas não estão limitados a, ProPred1 (descrito em mais detalhes em Singh and Raghava, ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. BIOINFORMATICS 17(12):1236-1237 2001), e SYFPEITHI (vide Schuler et al. SYFPEITHI, Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction in Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, vol. 409(1): 75-93 2007).
[531] Em algumas modalidades, o TCR ou porção de ligação de antígeno do mesmo pode ser uma proteína natural produzida de forma recombinante ou uma forma mutada na qual uma ou mais propriedades, como característica de ligação, foram alteradas. Em algumas modalidades, um TCR pode ser derivado de uma de várias espécies animais, como humano, camundongo, rato ou outro mamífero. Um TCR pode estar ligado à célula ou na forma solúvel. Em algumas modalidades, para fins dos métodos fornecidos, o TCR está na forma ligada à célula, expressa na superfície de uma célula.
[532] Em algumas modalidades, o TCR é um TCR de tamanho completo. Em algumas modalidades, o TCR é uma porção de ligação de antígeno. Em algumas modalidades o TCR é um TCR dimérico (dTCR). Em algumas modalidades, o TCR é um TCR de cadeia única (sc-TCR). Em algumas modalidades, um dTCR ou scTCR tem as estruturas descritas nos documentos WO 03/020763, WO 04/033685, WO2011 / 044186.
[533] Em algumas modalidades, o TCR contém uma sequência correspondente à sequência transmembranar. Em algumas modalidades, o TCR contém uma sequência correspondente às sequências citoplasmáticas. Em algumas modalidades, o TCR é capaz de formar um complexo de TCR com CD3. Em algumas modalidades, qualquer um dos TCRs, incluindo um dTCR ou scTCR, pode ser ligado a domínios de sinalização que produzem um TCR ativo na superfície de uma célula T. Em algumas modalidades, o TCR é expresso na superfície das células.
[534] Em algumas modalidades, um dTCR contém um primeiro polipeptídeo em que uma sequência correspondente a uma sequência de região variável de cadeia α de TCR é fundida ao N-terminal de uma sequência correspondente a uma sequência extracelular da região constante de cadeia α de TCR e um segundo polipeptídeo em que uma sequência correspondente a uma sequência da região variável de cadeia TCR β é fundida ao N-terminal; uma sequência correspondente a uma sequência extracelular da região constante de cadeia TCR β, sendo o primeiro e o segundo polipeptídeos ligados por uma ligação dissulfeto. Em algumas modalidades, a ligação pode corresponder à ligação dissulfeto intercadeia nativa presente nos αβ TCRs diméricos nativos. Em algumas modalidades, as ligações dissulfeto intercadeia não estão presentes em um TCR nativo. Por exemplo, em algumas modalidades, uma ou mais cisteínas podem ser incorporadas nas sequências extracelulares da região constante do par de polipeptídeo dTCR. Em alguns casos, uma ligação dissulfeto nativa e uma não nativa pode ser desejável. Em algumas modalidades, o TCR contém uma sequência transmembranar para ancorar na membrana.
[535] Em algumas modalidades, um dTCR contém uma cadeia α de TCR contendo um domínio α variável, um domínio α constante e um primeiro motivo de dimerização unido ao C-terminal do domínio α constante e uma cadeia β de TCR compreendendo um domínio β variável, um domínio β constante e um primeiro motivo de dimerização unido ao C-terminal do domínio β constante, em que o primeiro e o segundo motivos de dimerização interagem facilmente para formar uma ligação covalente entre um aminoácido no primeiro motivo de dimerização e um aminoácido no segundo motivo de dimerização que liga a cadeia TCR α e a cadeia TCR β juntas.
[536] Em algumas modalidades, o TCR é um scTCR. Tipicamente, um scTCR pode ser gerado usando métodos conhecidos dos versados na técnica, Vide, por exemplo, Soo Hoo, W. F. et al. PNAS (USA) 89, 4759 (1992); Wülfing, C. and Plückthun, A., J. Mol. Biol. 242, 655 (1994); Kurucz, I. et al. PNAS (USA) 90 3830 (1993); PCT Publicado Internacional Nos. WO 96/13593, WO 96/18105, WO99/60120, WO99/18129, WO 03/020763, WO2011/044186; e Schlueter, C. J. et al.
J. Mol. Biol. 256, 859 (1996). Em algumas modalidades, um scTCR contém uma ligação intercadeia dissulfeto não nativa introduzida para facilitar a associação das cadeias de TCR (vide, por exemplo, PCT publicado internacional No. WO 03/020763). Em algumas modalidades, um scTCR é um TCR truncado não ligado a dissulfeto no qual zíperes de leucina heterólogos fundidos com seus C-terminais facilitam a associação de cadeias (vide, por exemplo, o PCT internacional publicado No. WO99/60120). Em algumas modalidades, um scTCR contém um domínio variável de TCRα covalentemente ligado a um domínio variável de TCRβ por meio de um ligante de peptídeo (vide, por exemplo, PCT publicado internacional No. WO99/18129).
[537] Em algumas modalidades, um scTCR contém um primeiro segmento constituído por uma sequência de aminoácidos correspondente a uma região variável de cadeia α do TCR, um segundo segmento constituído por uma sequência de aminoácidos correspondente a uma sequência de região variável de cadeia β de TCR fundida ao N-terminal de uma sequência de aminoácidos correspondente a uma sequência extracelular de domínio constante de cadeia TCR β e uma sequência ligante que liga o C-terminal do primeiro segmento ao N-terminal do segundo segmento.
[538] Em algumas modalidades, um scTCR contém um primeiro segmento constituído por uma sequência de região variável de cadeia α fundida ao N-terminal de uma sequência de domínio constante extracelular da cadeia α, e um segundo segmento constituído por uma sequência de região variável de cadeia β fundida ao N-terminal de uma sequência constante extracelular de cadeia β e sequência transmembranar e, opcionalmente, uma sequência ligante que liga o C- terminal do primeiro segmento ao N-terminal do segundo segmento.
[539] Em algumas modalidades, um scTCR contém um primeiro segmento constituído por uma sequência de região variável de cadeia
TCR β fundida ao N-terminal de uma sequência de domínio constante extracelular de cadeia β e um segundo segmento constituído por uma sequência de região variável de cadeia α fundida com o N-terminal de uma sequência extracelular constante de cadeia α e sequência transmembranar e, opcionalmente, uma sequência ligante que liga o C- terminal do primeiro segmento ao N-terminal do segundo segmento.
[540] Em algumas modalidades, o ligante de um scTCRs que vincula o primeiro e o segundo segmentos de TCR pode ser qualquer ligante capaz formar uma única cadeia polipeptídica, mantendo a especificidade de ligação ao TCR. Em algumas modalidades, a sequência do ligante pode, por exemplo, ter a fórmula -P-AA-P- em que P é prolina e AA representa uma sequência de aminoácidos em que os aminoácidos são glicina e serina. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo segmentos são emparelhados tal que as sequências da região variável dos mesmos sejam orientadas para essa ligação. Portanto, em alguns casos, o ligante tem um comprimento suficiente para abranger a distância entre o C-terminal do primeiro segmento e o N-terminal do segundo segmento, ou vice-versa, mas não é muito longo para bloquear ou reduzir a ligação do scTCR para o ligante alvo. Em algumas modalidades, o ligante pode conter de ou de cerca de 10 a 45 aminoácidos, como 10 a 30 aminoácidos ou 26 a 41 resíduos de aminoácidos, por exemplo, 29, 30, 31 ou 32 aminoácidos. Em algumas modalidades, o ligante tem a fórmula -PGGG-(SGGGG)5-P- em que P é prolina, G é glicina e S é serina (SEQ ID NO: 28). Em algumas modalidades, o ligante tem a sequência GSADDAKKDAAKKDGKS (SEQ ID NO: 29)
[541] Em algumas modalidades, o scTCR contém uma ligação dissulfeto covalente que liga um resíduo da região de imunoglobulina do domínio constante de cadeia α a um resíduo da região de imunoglobulina do domínio constante de cadeia β. Em algumas modalidades, a ligação dissulfeto intercadeia em um TCR nativo não está presente. Por exemplo, em algumas modalidades, uma ou mais cisteínas podem ser incorporadas nas sequências extracelulares da região constante dos primeiro e segundo segmentos do polipeptídeo scTCR. Em alguns casos, uma ligação dissulfeto nativa e uma não nativa pode ser desejável.
[542] Em algumas modalidades de um dTCR ou scTCR contendo ligações dissulfeto intercadeias introduzidas, as ligações dissulfeto nativas não estão presentes. Em algumas modalidades, as uma ou mais das cisteínas nativas que formam uma ligação dissulfeto intercadeia nativa são substituídas por outro resíduo, como uma serina ou alanina. Em algumas modalidades, uma ligação dissulfeto introduzida pode ser formada pela mutação de resíduos não cisteína no primeiro e segundo segmentos em cisteína. Exemplos de ligações dissulfeto não nativas de um TCR são descritas no International PCT No. WO2006/000830 publicado.
[543] Em algumas modalidades, o TCR ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo exibe uma afinidade com uma constante de ligação de equilíbrio para um antígeno alvo entre ou entre cerca de 10- 5 e 10-12 M e todos os valores e faixas individuais nele. Em algumas modalidades, o antígeno alvo é um complexo ou ligante do MHC- peptídeo.
[544] Em algumas modalidades, o ácido nucleico ou ácidos nucleicos que codificam um TCR, como as cadeias α e β, podem ser amplificados por PCR, clonagem ou outros meios adequados e clonados em um vetor ou vetores de expressão adequados. O vetor de expressão pode ser qualquer vetor de expressão recombinante adequado e pode ser usado para transformar ou transfectar qualquer hospedeiro adequado. Os vetores adequados incluem aqueles projetados para propagação e expansão ou expressão ou ambos, como plasmídeos e vírus.
[545] Em algumas modalidades, o vetor pode um vetor da série pUC (Fermentas Life Sciences), da série pBluescript (Stratagene, LaJolla, Califórnia), da série pET (Novagen, Madison, Wis.), da série pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia) ou da série pEX (Clontech, Palo Alto, Califórnia). Em alguns casos, vetores de bacteriófagos, como λG10, λGT11, λZapII (Stratagene), λEMBL4 e λNM1149, também podem ser utilizados. Em algumas modalidades, os vetores de expressão de plantas podem ser usados e incluem pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 e pBIN19 (Clontech). Em algumas modalidades, os vetores de expressão animal incluem pEUK-Cl, pMAM e pMAMneo (Clontech). Em algumas modalidades, um vetor viral é usado, como um vetor retroviral.
[546] Em algumas modalidades, os vetores de expressão recombinantes podem ser preparados usando técnicas padrão de DNA recombinante. Em algumas modalidades, os vetores podem conter sequências reguladoras, como códons de iniciação e terminação da transcrição e tradução, que são específicos para o tipo de hospedeiro (por exemplo, bactéria, fungo, planta ou animal) no qual o vetor deve ser introduzido, como apropriado e levando em consideração se o vetor é baseado em DNA ou RNA. Em algumas modalidades, o vetor pode conter um promotor não nativo operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica o TCR ou a porção de ligação de antígeno (ou outra molécula de ligação ao peptídeo MHC). Em algumas modalidades, o promotor pode ser um promotor não viral ou um promotor viral, como um promotor de citomegalovírus (CMV), um promotor SV40, um promotor de RSV e um promotor encontrado na repetição terminal longa do vírus da célula-tronco de murino. Outros promotores conhecidos também são contemplados.
[547] Em algumas modalidades, para gerar um vetor que codifica um TCR, as cadeias α e β são amplificadas por PCR a partir do cDNA total isolado de um clone de células T que expressa o TCR de interesse e clonadas em um vetor de expressão. Em algumas modalidades, as cadeias α e β são clonadas no mesmo vetor. Em algumas modalidades, as cadeias α e β são clonadas em diferentes vetores. Em algumas modalidades, as cadeias α e β geradas são incorporadas a um vetor retroviral, por exemplo, lentiviral. C. Introdução de Ácidos Nucléicos e Vetores nas Células
[548] Vários métodos para a introdução de componentes geneticamente modificados, por exemplo, receptores recombinantes, por exemplo, CARs ou TCRs, são bem conhecidos e podem ser utilizados com os métodos e composições fornecidos. Métodos exemplares incluem aqueles para transferência de ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos ou receptores, incluindo via vetores virais, por exemplo, retrovirais ou lentivirais, vetores ou transposons não virais, por exemplo, Sistema de transposon Sleeping Beauty. Os métodos de transferência de genes podem incluir transdução, eletroporação ou outro método que resulta na transferência de genes para a célula.
[549] Em algumas modalidades, a transferência de genes é realizada primeiro estimulando a célula, como combinando-a com um estímulo que induz uma resposta como proliferação, sobrevivência e/ou ativação, por exemplo, conforme medido pela expressão de uma citocina ou marcador de ativação, seguido de transdução das células ativadas e expansão em cultura para números suficientes para aplicações clínicas.
[550] Em alguns contextos, pode ser desejável salvaguardar contra o potencial de que a superexpressão de um fator estimulador (por exemplo, uma linfocina ou uma citocina) possa resultar potencialmente em um resultado indesejado ou em menor eficácia em um indivíduo, como um fator associado à toxicidade em um indivíduo. Assim, em alguns contextos, as células manipuladas geneticamente incluem segmentos de genes que fazem com que as células sejam suscetíveis à seleção negativa in vivo, tal como na administração em imunoterapia adotiva. Por exemplo, em alguns aspectos, as células são manipuladas para que possam ser eliminadas como resultado de uma alteração na condição in vivo do paciente ao qual são administradas. O fenótipo selecionável negativo pode resultar da inserção de um gene que confere sensibilidade a um agente administrado, por exemplo, um composto. Genes selecionáveis negativos incluem o gene da timidina quinase do vírus Herpes simplex tipo I (HSV-I TK) (Wigler et al., Cell 2: 223, I977) que confere sensibilidade ao ganciclovir; o gene da hipoxantina fosfribosiltransferase celular (HPRT), o gene da adenina fosforibosiltransferase (APRT) celular, citosina desaminase bacteriana (Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 89:33 (1992)).
[551] Em algumas modalidades, as células, por exemplo, células T, podem ser transfectadas durante ou após a expansão, por exemplo com ácidos nucleicos que codificam para o receptor recombinante, por exemplo, um receptor de células T (TCR) ou um receptor de antígeno quimérico (CAR). Esta transfecção para a introdução do gene do polipeptídeo ou receptor desejado pode ser realizada com qualquer sistema de transferência baseado em gene adequado, inclusive via vetor retroviral. Em algumas modalidades, a população de células manipuladas geneticamente pode, concorrente, simultânea ou subsequentemente, ser estimulada com um estímulo antigênico, por exemplo, através do receptor introduzido de novo, tal como de acordo com os métodos fornecidos. Em algumas modalidades, a molécula de ligação presente nas partículas fornecidas, por exemplo, esferas, fornece um estímulo antigênico, tal como fornecido na forma de um antígeno ou ligante cognato (reticulação cruzada) do receptor geneticamente introduzido (por exemplo, ligante natural de um CAR) ou um anticorpo anti-idiotíptico que se liga a ou reconhece diretamente o receptor recombinante.
[552] Entre os ácidos nucléicos adicionais, por exemplo, os genes para introdução são aqueles que melhoram a eficácia da terapia, como a promoção da viabilidade e/ou função das células transferidas; genes para fornecer um marcador genético para seleção e/ou avaliação das células, como para avaliar a sobrevivência ou localização in vivo; genes para melhorar a segurança, por exemplo, tornando a célula suscetível à seleção negativa in vivo, como descrito por Lupton S. D. et al., Mol. e Cell Biol., 11: 6 (1991); e Riddell et al., Human Gene Therapy 3: 319- 338 (1992); vide também as publicações PCT/US91/08442 e PCT/US94/05601 de Lupton et al. descrever o uso de genes de fusão selecionáveis bifuncionais derivados da fusão de um marcador selecionável positivo dominante com um marcador selecionável negativo. Vide, por exemplo, Riddell et al., Patente U.S. No. 6.040.177, nas colunas 14-17.
[553] Como descrito acima, em algumas modalidades, as células são incubadas e/ou cultivadas antes ou em conexão com a engenharia genética. As etapas de incubação podem incluir cultura, cultivo, estimulação, ativação, propagação e/ou congelamento para preservação, por exemplo, criopreservação.
1. Partículas de Vetor Viral
[554] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes são transferidos para as células usando partículas de vírus infecciosos recombinantes, tal como, por exemplo, vetores derivados do vírus símio 40 (SV40), adenovírus, vírus adenoassociado (AAV). Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes são transferidos para células T usando vetores lentivirais recombinantes ou vetores retrovirais, tal como vetores gamma-retrovirais (vide, por exemplo, Koste et al. (2014) Gene Therapy, 3 de abril de 2014. doi:
10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28 (10): 1137- 46; Alonso-Camino et (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 29 de novembro (11): 550-557.
[555] Em algumas modalidades, o vetor retroviral tem uma sequência de repetição terminal longa (LTR), por exemplo, um vetor retroviral derivado do vírus da leucemia de murino de Moloney (MoMLV), vírus do sarcoma mieloproliferativo (MPSV), vírus da célula- tronco embrionária de murino (MESV), vírus da célula-tronco de murino (MSCV), vírus formador do foco do baço (SFFV) ou vírus adenoassociado (AAV). A maioria dos vetores retrovirais é derivada de retrovírus murinos. Em algumas modalidades, os retrovírus incluem aqueles derivados de qualquer fonte de células aviária ou de mamífero. Os retrovírus são tipicamente anfotrópicos, o que significa que são capazes de infectar células hospedeiras de várias espécies, incluindo seres humanos. Em uma modalidade, o gene a ser expresso substitui as sequências retrovirais de gag, pol e/ou env. Um número de sistemas retrovirais ilustrativos foi descrito (por exemplo, patentes US 5.219.740;
6.207.453; 5.219.740; Miller e Rosman (1989) BioTechniques 7: 980- 990; Miller, AD (1990) Human Gene Therapy 1:5-14 Scarpa et al. (1991) Virology 180: 849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8033-8037; e Boris-Lawrie e Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop.3:102-109.
[556] São conhecidos métodos de transdução lentiviral. Métodos exemplares são descritos em, por exemplo, Wang et al. (2012) J. Immunother. 35 (9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637- 1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; e Cavalieri et al. (2003) Blood. 102 (2): 497-505.
[557] Em algumas modalidades, as partículas de vetor viral contêm um genoma derivado de um vetor baseado em genoma retroviral, tal como derivado de um vetor baseado em genoma lentiviral.
Em alguns aspectos dos vetores virais fornecidos, o ácido nucleico heterólogo que codifica um receptor recombinante, como um receptor de antígeno, como um CAR, está contido e/ou localizado entre as sequências 5’ LTR e 3' LTR do genoma do vetor.
[558] Em algumas modalidades, o genoma do vetor viral é um genoma do lentivírus, como um genoma do HIV-1 ou um genoma do SIV. Por exemplo, os vetores lentivirais foram gerados pela multiplicação de genes de virulência atenuantes, por exemplo, os genes env, vif, vpu e nef podem ser excluídos, tornando o vetor mais seguro para fins terapêuticos. Os vetores lentivirais são conhecidos. Vide Naldini et al., (1996 e 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., 1998, Pat.
6.013.516; e 5.994.136). Em algumas modalidades, esses vetores virais são baseados em plasmídeo ou em vírus e são configurados para transportar as sequências essenciais para incorporar ácido nucleico estranho, para seleção, e para transferência do ácido nucleico para uma célula hospedeira. Os lentivírus conhecidos podem ser facilmente obtidos em depósitos ou coleções, como a American Type Culture Collection ("ATCC"; 10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110- 2209), ou isolados de fontes conhecidas, usando técnicas geralmente disponíveis.
[559] Exemplos não limitativos de vetores lentivirais incluem aqueles derivados de um lentivírus, como o vírus da imunodeficiência humana 1 (HIV-1), HIV-2, um vírus da imunodeficiência símia (SIV), o vírus linfotrópico T humano 1 (HTLV-1), HTLV-2 ou vírus da anemia por infecção equina (E1AV). Por exemplo, os vetores lentivirais foram gerados pela atenuação múltipla dos genes de virulência do HIV, por exemplo, os genes env, vif, vpr, vpu e nef são excluídos, tornando o vetor mais seguro para fins terapêuticos. Os vetores lentivirais são conhecidos na técnica, vide Naldini et al., (1996 e 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., 1998, Pat. 6.013.516; e 5.994.136). Em algumas modalidades, esses vetores virais são baseados em plasmídeo ou em vírus e são configurados para transportar as sequências essenciais para incorporar ácido nucleico estranho, para seleção e para transferência do ácido nucleico para uma célula hospedeira. Os lentivírus conhecidos podem ser facilmente obtidos em depósitos ou coleções, como a American Type Culture Collection ("ATCC"; 10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209), ou isolados de fontes conhecidas, usando técnicas geralmente disponíveis.
[560] Em algumas modalidades, o vetor do genoma viral pode conter sequências das LTRs 5' e 3' de um retrovírus, como um lentivírus. Em alguns aspectos, o construto do genoma viral pode conter sequências dos 5’ e 3' LTRs de um lentivírus e, em particular, pode conter as sequências R e U5 do 5’ LTR de um lentivírus e um 3' LTR inativado ou autoinativado de um lentivírus. As sequências LTR podem ser sequências LTR de qualquer lentivírus de qualquer espécie. Por exemplo, elas podem ser sequências LTR do HIV, SIV, FIV ou BIV. Tipicamente, as sequências LTR são sequências LTR de HIV.
[561] Em algumas modalidades, o ácido nucleico de um vetor viral, como um vetor viral de HIV, carece de unidades transcricionais adicionais. O genoma do vetor pode conter um 3 'LTR inativado ou autoinativado (Zufferey et al. J Virol 72: 9873, 1998; Miyoshi et al., J Virol 72: 8150, 1998). Por exemplo, a exclusão na região U3 do 3 'LTR do ácido nucleico usado para produzir o vetor viral RNA pode ser usada para gerar vetores autoinativadores (SIN). Esta deleção pode então ser transferida para o 5’ LTR do DNA proviral durante a transcrição reversa. Um vetor de autoinativação geralmente tem uma exclusão das sequências potenciadoras e promotoras da repetição terminal longa de 3' (LTR), que é copiada para o 5' LTR durante a integração do vetor. Em algumas modalidades, é possível eliminar uma sequência suficiente, incluindo a remoção de uma box TATA, para abolir a atividade transcricional do LTR. Isso pode impedir a produção de RNA de vetor completo em células transduzidas. Em alguns aspectos, o elemento U3 do 3' LTR contém uma exclusão de sua sequência intensificadora, os sítios TATA box, Sp1 e NF-kappa B. Como resultado da 3' LTR autoativado, o provírus que é gerado após a entrada e a transcrição reversa contém um 5' LTR inativado. Isso pode melhorar a segurança reduzindo o risco de mobilização do genoma de vetor e a influência do LTR nos promotores celulares próximos. O 3' LTR autoativado pode ser construído por qualquer método conhecido na técnica. Em algumas modalidades, isso não afeta os títulos do vetor ou as propriedades in vitro ou in vivo do vetor.
[562] Opcionalmente, a sequência U3 do Lentiviral 5’ LTR pode ser substituída por uma sequência promotora no construto viral, como uma sequência promotora heteróloga. Isso pode aumentar o título do vírus recuperado da linhagem celular de empacotamento. Uma sequência intensificadora também pode ser incluída. Qualquer combinação potenciadora / promotors que aumente a expressão do genoma do RNA viral na linhagem celular de empacotamento pode ser usada. Em um exemplo, é utilizada a sequência potenciadora / promotora de CMV (Patente U.S. No. 5.385.839 e Patente U.S. No. 5.168.062).
[563] Em certas modalidades, o risco de mutagênese de inserção pode ser minimizado através da construção do genoma do vetor retroviral, como o genoma do vetor lentiviral, como defectivo na integração. Uma variedade de abordagens pode ser seguida para produzir um genoma vetorial não integrador. Em algumas modalidades, uma ou mais mutações podem ser modificadas por engenharia genética no componente da enzima integrase do gene pol, tal que ele codifica uma proteína com uma integrase inativa. Em algumas modalidades, o próprio genoma do vetor pode ser modificado para impedir a integração, por exemplo, mutando ou excluindo um ou ambos os sítios de união, ou tornando o trato de polipurina proximal (PPT) 3' LTR não funcional através de exclusão ou modificação. Em algumas modalidades, abordagens não genéticas estão disponíveis; estes incluem agentes farmacológicos que inibem uma ou mais funções da integrase. As abordagens não são mutuamente exclusivas; isto é, mais de um deles pode ser usado por vez. Por exemplo, os sítios integrase e união podem não funcionar, ou o sítio integrase e PPT podem ser não funcionais, ou os sítios de união e sítio PPT podem ser não funcionais, ou todos eles podem se não funcionais. Tais métodos e genomas de vetores virais são conhecidos e disponíveis (vide Philpott and Thrasher, Human Gene Therapy 18:483, 2007; Engelman et al. J Virol 69:2729, 1995; Brown et al J Virol 73:9011 (1999); WO 2009/076524; McWilliams et al., J Virol 77:11150, 2003; Powell and Levin J Virol 70:5288, 1996).
[564] Em algumas modalidades, o vetor contém sequências para propagação em uma célula hospedeira, como uma célula hospedeira procariótica. Em algumas modalidades, o ácido nucleico do vetor viral contém uma ou mais origens de replicação para propagação em uma célula procariótica, como uma célula bacteriana. Em algumas modalidades, os vetores que incluem uma origem de replicação procariótica também podem conter um gene cuja expressão confere um marcador detectável ou selecionável, como resistência a drogas.
[565] O genoma do vetor viral é tipicamente construído em uma forma de plasmídeo que pode ser transfectado para uma linhagem celular de empacotamento ou produtor. Qualquer um de uma variedade de métodos conhecidos pode ser usado para produzir partículas retrovirais cujo genoma contém uma cópia de RNA do genoma do vetor viral. Em algumas modalidades, pelo menos dois componentes estão envolvidos na fabricação de um sistema de entrega de genes baseado em vírus: primeiro, empacotando plasmídeos, englobando as proteínas estruturais, bem como as enzimas necessárias para gerar uma partícula de vetor viral, e segundo, o próprio vetor viral, ou seja, o material genético a ser transferido. As salvaguardas de biossegurança podem ser introduzidas no design de um ou de ambos os componentes.
[566] Em algumas modalidades, o plasmídeo de embalagem pode conter todas as proteínas retrovirais, como o HIV-1, que não sejam proteínas do envelope (Naldini et al., 1998). Em outras modalidades, os vetores virais podem não ter genes virais adicionais, como aqueles que estão associados à virulência, por exemplo, vpr, vif, vpu e nef, e/ou Tat, um transativador primário do HIV. Em algumas modalidades, vetores lentivirais, tais como os vetores virais, compreendem apenas três genes do vírus parental: gag, pol e rev, o que reduz ou elimina a possibilidade de reconstituição de um vírus do tipo selvagem por meio de recombinação.
[567] Em algumas modalidades, o genoma do vetor viral é introduzido em uma linhagem celular de empacotamento que contém todos os componentes necessários para embalar o RNA genômico viral, transcrito do genoma do vetor viral, em partículas virais. Alternativamente, o genoma do vetor viral pode compreender um ou mais genes que codificam componentes virais, além de uma ou mais sequências, por exemplo, ácidos nucleicos recombinantes de interesse. Em alguns aspectos, para impedir a replicação do genoma na célula alvo, no entanto, os genes virais endógenos necessários para a replicação são removidos e fornecidos separadamente na linhagem celular de empacotamento.
[568] Em algumas modalidades, uma linhagem celular de empacotamento é transfectada com um ou mais vetores de plasmídeo contendo os componentes necessários para gerar as partículas. Em algumas modalidades, uma linhagem celular de empacotamento é transfectada com um plasmídeo contendo o genoma do vetor viral, incluindo as LTRs, a sequência de empacotamento de ação cis e a sequência de interesse, isto é, um ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno, como um CAR; e um ou mais plasmídeos auxiliares que codificam os componentes enzimáticos e/ou estruturais do vírus, tais como Gag, pol e/ou rev. Em algumas modalidades, vários vetores são utilizados para separar os vários componentes genéticos que geram as partículas do vetor retroviral. Em algumas tais modalidades, o fornecimento de vetores separados para a célula de empacotamento reduz a chance de eventos de recombinação que poderiam gerar vírus competentes para replicação. Em algumas modalidades, um único vetor de plasmídeo com todos os componentes retrovirais pode ser usado.
[569] Em algumas modalidades, a partícula de vetor retroviral, como partícula de vetor lentiviral, é pseudotipada para aumentar a eficiência de transdução das células hospedeiras. Por exemplo, uma partícula de vetor retroviral, como uma partícula de vetor lentiviral, em algumas modalidades é pseudotipada com uma glicoproteína VSV-G, que fornece uma ampla gama de hospedeiros celulares que estende os tipos de células que podem ser transduzidos. Em algumas modalidades, uma linhagem celular de empacotamento é transfectada com um plasmídeo ou polinucleotídeo que codifica uma glicoproteína do envelope não nativa, tal como incluir envelopes xenotrópicos, politrópicos ou anfotrópicos, como envelope do vírus Sindbis, GALV ou VSV-G.
[570] Em algumas modalidades, a linhagem celular de empacotamento fornece os componentes, incluindo proteínas reguladoras e estruturais virais, necessárias em trans para o empacotamento do RNA genômico viral em partículas de vetor lentiviral. Em algumas modalidades, a linhagem celular de empacotamento pode ser qualquer linhagem celular que seja capaz de expressar proteínas lentivirais e produzir partículas funcionais do vetor lentiviral. Em alguns aspectos, as linhagens celulares de embalagem adequadas incluem 293 (ATCC CCL X), 293T, HeLA (ATCC CCL 2), D17 (ATCC CCL 183), MDCK (ATCC CCL 34), BHK (ATCC CCL-10) e Cf2Th (ATCC CRL 1430).
[571] Em algumas modalidades, a linhagem celular de empacotamento expressa de forma estável a (s) proteína (s) viral (s). Por exemplo, em alguns aspectos, pode ser construída uma linhagem celular de empacotamento contendo os genes gag, pol, rev e/ou outros genes estruturais, mas sem o LTR e os componentes de empacotamento. Em algumas modalidades, uma linhagem celular de empacotamento pode ser transientemente transfectada com moléculas de ácido nucleico que codificam uma ou mais proteínas virais junto com o genoma do vetor viral contendo uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína heteróloga e/ou um ácido nucleico que codifica uma glicoproteína de envelope.
[572] Em algumas modalidades, os vetores virais e os plasmídeos de embalagem e/ou auxiliar são introduzidos via transfecção ou infecção na linhagem celular de embalagem. A linhagem celular de empacotamento produz partículas de vetor viral que contêm o genoma do vetor viral. Os métodos para transfecção ou infecção são bem conhecidos. Exemplos não limitativos incluem métodos de fosfato de cálcio, DEAE-dextrano e lipofecção, eletroporação e microinjeção.
[573] Quando um plasmídeo recombinante e a LTR retroviral e sequências de empacotamento são introduzidos em uma linhagem celular especial (por exemplo, por precipitação com fosfato de cálcio, por exemplo), as sequências de empacotamento podem permitir que o transcrito de RNA do plasmídeo recombinante seja empacotado em partículas virais, que podem ser secretados nos meios de cultura. O meio contendo os retrovírus recombinantes em algumas modalidades é então coletado, opcionalmente concentrado e utilizado para transferência de genes. Por exemplo, em alguns aspectos, após cotransfecção dos plasmídeos de empacotamento e do vetor de transferência para a linhagem celular de empacotamento, as partículas do vetor viral são recuperadas do meio de cultura e tituladas por métodos padrão usados pelos especialistas na técnica.
[574] Em algumas modalidades, um vetor retroviral, como um vetor lentiviral, pode ser produzido em uma linhagem celular de empacotamento, como uma linhagem celular HEK 293T exemplar, através da introdução de plasmídeos para permitir a geração de partículas lentivirais. Em algumas modalidades, uma célula de empacotamento é transfectada e/ou contém um polinucleotídeo que codifica gag e pol, e um polinucleotídeo que codifica um receptor recombinante, como um receptor de antígeno, por exemplo, um CAR. Em algumas modalidades, a linhagem celular de empacotamento é opcional e/ou adicionalmente transfectada com e/ou contém um polinucleotídeo que codifica uma proteína rev. Em algumas modalidades, a linhagem celular de empacotamento é opcional e/ou adicionalmente transfectada com e/ou contém um polinucleotídeo que codifica uma glicoproteína do envelope não nativa, como VSV-G. Em algumas tais modalidades, aproximadamente dois dias após a transfecção de células, por exemplo, células HEK 293T, o sobrenadante celular contém vetores lentivirais recombinantes, que podem ser recuperados e titulados.
[575] Partículas de vetores retrovirais recuperadas e/ou produzidas podem ser usadas para transduzir células alvo usando os métodos como descritos. Uma vez nas células alvo, o RNA viral é transcrito reversamente, importado para o núcleo e integrado de maneira estável no genoma do hospedeiro. Um ou dois dias após a integração do RNA viral, a expressão da proteína recombinante, por exemplo, receptor de antígeno, como CAR, pode ser detectada.
[576] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos envolvem métodos de transdução de células ao contatar, por exemplo, incubar, uma composição celular que compreende uma pluralidade de células com uma partícula viral. Em algumas modalidades, as células a serem transfectadas ou transduzidas são ou compreendem células primárias obtidas de um indivíduo, como células enriquecidas e/ou selecionadas de um indivíduo.
[577] Em algumas modalidades, a concentração de células a serem transduzidas da composição é de cerca de 1,0 x 105 células/mL a 1,0 x 108 células/mL, tal como pelo menos ou cerca de pelo menos ou cerca de 1,0 x 105 células/mL, 5 x 105 células/mL, 1 x 106 células/mL, 5 x 106 células/mL, 1 x 107 células/mL, 5 x 107 células/mL ou 1 x 108 células/mL.
[578] Em algumas modalidades, as partículas virais são fornecidas em uma certa razão de cópias das partículas de vetores virais ou unidades infecciosas (IU) das mesmas, por número total de células a serem transduzidas (IU/célula). Por exemplo, em algumas modalidades, as partículas virais estão presentes durante o contato em ou cerca ou pelo menos em ou cerca de 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 ou 60 IU das partículas do vetor viral por uma das células.
[579] Em algumas modalidades, a titulação de partículas de vetores virais está entre ou entre cerca de 1 x 106 IU/mL e 1 x 108 IU/mL, como entre ou entre cerca de 5 x 10 6 IU/mL and 5 x 107 IU/mL, tal como pelo menos 6 x 106 IU/mL, 7 x 106 IU/mL, 8 x 106 IU/mL, 9 x 106 IU/mL, 1 x 107 IU/mL, 2 x 107 IU/mL, 3 x 107 IU/mL, 4 x 107 IU/mL, ou 5 x10 7 IU/mL.
[580] Em algumas modalidades, a transdução pode ser alcançada em uma multiplicidade de infecção (MOI) inferior a 100, como geralmente inferior a 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 ou menos.
[581] Em algumas modalidades, o método envolve o contato ou a incubação das células com as partículas virais. Em algumas modalidades, o contato é de 30 minutos a 72 horas, como 30 minutos a 48 horas, 30 minutos a 24 horas ou 1 hora a 24 horas, como pelo menos ou cerca de pelo menos 30 minutos, 1 hora e 2 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas ou mais.
[582] Em algumas modalidades, o contato é realizado em solução. Em algumas modalidades, as células e as partículas virais são contatadas em um volume de ou de cerca de 0,5 mL a 500 mL, como de ou de cerca de 0,5 mL a 200 mL, 0,5 mL a 100 mL, 0,5 mL a 50 mL, 0,5 mL a 10 mL, 0,5 mL a 5 mL, 5 mL a 500 mL, 5 mL a 200 mL, 5 mL a 100 mL, 5 mL a 50 mL, 5 mL a 10 mL, 10 mL a 500 mL, 10 mL a 200 mL, 10 mL a 100 mL, 10 mL a 50 mL, 50 mL a 500 mL, 50 mL a 200 mL, 50 mL a 100 mL, 100 mL a 500 mL, 100 mL a 200 mL ou 200 mL a 500 mL.
[583] Em algumas modalidades, quando o contato pode ser efetuado com centrifugação, como espinoculação (por exemplo, inoculação centrífuga). Em algumas modalidades, a composição contendo células, partículas virais e reagente pode ser girada, geralmente em força ou velocidade relativamente baixa, como velocidade menor que a usada para granular as células, como de ou de cerca de 600 rpm a 1700 rpm (por exemplo,, a aproximadamente ou pelo menos 600 rpm, 1000 rpm ou 1500 rpm ou 1700 rpm). Em algumas modalidades, a rotação é realizada com uma força, por exemplo, uma força centrífuga relativa, de ou de cerca de 100 g a 3200 g (por exemplo, a ou cerca de ou pelo menos, ou cerca de, 100 g, 200 g, 300 g, 400 g, 500 g, 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2500 g, 3000 g ou 3200 g), medida por exemplo em uma parede interna ou externa da câmara ou cavidade. O termo "força centrífuga relativa" ou RCF é geralmente entendido como a força efetiva transmitida a um indivíduo ou substância (como uma célula, amostra ou pélete e/ou um ponto na câmara ou outro recipiente sendo girado), em relação à força gravitacional da Terra, em um ponto específico do espaço em comparação com o eixo de rotação. O valor pode ser determinado usando fórmulas conhecidas, levando em consideração a força gravitacional, velocidade de rotação e raio de rotação (distância do eixo de rotação e do indivíduo, substância ou partícula na qual a RCF está sendo medida).
[584] Em certas modalidades, as células de entrada são tratadas, incubadas ou contatadas com partículas, por exemplo, esferas, que compreendem moléculas de ligação que se ligam ou reconhecem o receptor recombinante que é codificado pelo DNA viral.
[585] Em algumas modalidades, a incubação das células com as partículas do vetor viral resulta ou produz uma composição de saída compreendendo células transduzidas com as partículas do vetor viral.
2. Vetores Não Virais
[586] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes são transferidos para as células T por eletroporação (vide, por exemplo, Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8 (3): e60298 e Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7 (16): 1431-1437). Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes são transferidos para as células T por transposição (vide, por exemplo, Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 and Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437). Em algumas modalidades, ácidos nucleicos recombinantes são transformados em células T via transposição (vide, pode exemplo, Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; e Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126), fusão de protoplastos, transfecção mediada por lipossomas catiônicos; bombardeamento de micropartículas facilitado por partículas de tungstênio (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); e coprecipitação de DNA de fosfato de estrôncio (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034
(1987)).
[587] Outras abordagens e vetores para a transferência dos ácidos nucleicos que codificam os produtos recombinantes são os descritos, por exemplo, no pedido de patente internacional, Publicação No.: WO2014055668 e Patente U.S. No. 7.446.190.
[588] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes são transferidos para as células T através de transposons. Transposons (elementos transponíveis) são segmentos móveis de DNA que podem se mover de um locus para outro dentro dos genomas. Esses elementos se movem através de um mecanismo conservador de "recortar e colar": a transposase catalisa a excisão do transposon de sua localização original e promove sua reintegração em outras partes do genoma. Elementos deficientes em transposase podem ser mobilizados se a transposase for fornecida por outro gene da transposase. Assim, os transposons podem ser utilizados para incorporar um DNA estranho no genoma do hospedeiro sem o uso de um sistema de transdução viral. Exemplos de transposons adequados para uso com células de mamífero, por exemplo, leucócitos primários humanos, incluem, mas não estão limitados a, Sleeping Beauty e Piggybac.
[589] A transfecção baseada em transposon é um sistema de dois componentes que consiste em uma transposase e um transposon. Em algumas modalidades, o sistema compreende um transposon que é projetado para compreender um DNA estranho (também aqui referido como DNA cargo), por exemplo, um gene que codifica um receptor recombinante, que é flanqueado por sequências de repetição invertida / repetição direta (IR / DR) que são reconhecidos por um tranposase acompanhante. Em algumas modalidades, um plasmídeo não viral codifica uma transposase sob o controle de um promotor. A transfecção do plasmídeo para uma célula hospedeira resulta em uma expressão transitória da transposase, assim, por um período inicial após a transfecção, a transposase é expressa em níveis suficientes para integrar o transposon no DNA genômico. Em algumas modalidades, a própria transposase não está integrada no DNA genômico e, portanto, a expressão da transposase diminui com o tempo. Em algumas modalidades, a expressão da transposase é expressa pela célula hospedeira em níveis suficientes para integrar um transposon correspondente por menos de cerca de 4 horas, menos de cerca de 8 horas, menos de cerca de 12 horas, menos de cerca de 12 horas, menos de cerca de 24 horas, menos de cerca de 2 dias, menos de 3 dias, menos de 4 dias, menos de 5 dias, menos de 6 dias, menos de 7 dias, menos de 2 semanas, menos de 3 semanas, menos de 4 semanas, menos de cerca de semanas ou menos de cerca de 8 semanas. Em algumas modalidades, o DNA cargo que é introduzido no genoma do hospedeiro não é subsequentemente removido do genoma do hospedeiro, pelo menos porque a dose do hospedeiro não expressa uma transposase endógena capaz de extrair o DNA cargo.
[590] Sleeping Beauty (SB) é um membro sintético da superfamília de transposons Tc/1-mariner, reconstruída a partir de elementos inativos armazenados no genoma de peixes salmonídeos. A transfecção baseada em transposon SB é um sistema de dois componentes que consiste em uma transposase e um transposon contendo sequências de repetição invertida / repetição direta (IR/DR) que resultam em integração precisa em um dinucleotídeo TA. O transposon é projetado com uma cassete de expressão de interesse, ladeada por IR/DRs. A transposase SB liga locais específicos de ligação que estão localizados no IR do transposon Sleeping Beauty. A transposase SB medeia a integração do transposon, um elemento móvel que codifica uma sequência de carga flanqueada de ambos os lados pelo terminal invertido repete que abriga sítios de ligação para a enzima catalítica (SB). A expressão estável resulta quando o SB insere sequências de genes nos cromossomos de vertebrados em um dinucleotídeo alvo de AT através de um mecanismo de cortar e colar. Este sistema foi usado para projetar uma variedade de tipos de células de vertebrados, incluindo leucócitos primários do sangue periférico humano. Em algumas modalidades, as células são contatadas, incubadas e/ou tratadas com um transposon SB compreendendo um gene cargo, por exemplo, um gene que codifica um receptor recombinante ou um CAR, flanqueado por sequências IR SB. Em modalidades particulares, as células a serem transfectadas são contatadas, incubadas e/ou tratadas com um plasmídeo compreendendo um transposon SB compreendendo um gene cargo, por exemplo, um gene que codifica um CAR, flanqueado por sequências IR SB. Em certas modalidades, o plasmídeo adicionalmente compreende um gene que codifica uma transposase SB que não é flanqueada por sequências IR SB.
[591] Uma sequência exemplar de SB IR é fornecida pela SEQ ID NO: 26. Uma sequência de polinucleotídeo exemplar que codifica uma transposase de SB e uma sequência de aminoácidos de uma transposase de SB exemplar são fornecidas pela SEQ ID NOS: 24 e 25, respectivamente.
[592] PiggyBac (PB) é outro sistema de transposon que pode ser usado para integrar o DNA cargo no DNA genômico de um hospedeiro, por exemplo, um humano. A transposase PB reconhece sequências de repetição terminal invertidas (ITRs) específicas do transposon PB localizadas em ambas as extremidades do transposon e move eficientemente o conteúdo dos sítios originais e os integra de maneira eficiente nos sítios cromossômicos TTAA. O sistema de transposon PB permite que genes de interesse entre as duas ITRs no vetor PB sejam mobilizados nos genomas alvo. O sistema PB foi usado para projetar uma variedade de tipos de células de vertebrados, incluindo células humanas primárias. Em algumas modalidades, as células a serem transfectadas são contatadas, incubadas e/ou tratadas com um transposon PB compreendendo um gene cargo, por exemplo, um gene que codifica um CAR, flanqueado por sequências de PB IR. Em modalidades particulares, as células a serem transfectadas são contatadas, incubadas e/ou tratadas com um plasmídeo compreendendo um transposon PB compreendendo um gene cargo, por exemplo, um gene que codifica um CAR, flanqueado por sequências de PB IR. Em certas modalidades, o plasmídeo adicionalmente compreende um gene que codifica uma transposase SB que não é flanqueada por sequências de PB IR.
[593] Uma sequência exemplar de PB IR é ilustrada pela SEQ ID NO: 27. Uma sequência de polinucleotídeo exemplar que codifica uma transposase PB é ilustrada pela SEQ ID NO: 28. Uma sequência de aminoácidos de uma transposase PB exemplar é ilustrada pela SEQ ID NO: 29
[594] Em algumas modalidades, os vários elementos do transposon / transposase utilizados nos métodos em questão, por exemplo, vetor (s) SB ou PB, podem ser produzidos por métodos padrão de clivagem enzimática de restrição, ligação e clonagem molecular. Um protocolo para construir os vetores indivíduos inclui as seguintes etapas. Primeiro, os fragmentos de ácido nucleico purificados contendo sequências nucleotídicas de componentes desejados, bem como sequências estranhas, são clivados com endonucleases de restrição de fontes iniciais, por exemplo, um vetor compreendendo o gene da transposase. Os fragmentos contendo as sequências nucleotídicas desejadas são então separados dos fragmentos indesejados de tamanho diferente usando métodos de separação convencionais, por exemplo, por eletroforese em gel de agarose. Os fragmentos desejados são excisados do gel e interligados na configuração apropriada, de modo a produzir um ácido nucleico circular ou plasmídeo contendo as sequências desejadas, por exemplo, sequências correspondentes aos vários elementos dos vetores indivíduos, como descrito acima. Onde desejado, as moléculas circulares assim construídas são então amplificadas em um hospedeiro procariótico, por exemplo, por exemplo, E. coli. Os procedimentos de clivagem, construção de plasmídeo, transformação celular e produção de plasmídeo envolvidos nessas etapas são bem conhecidos dos especialistas na técnica e as enzimas necessárias para restrição e ligação estão disponíveis comercialmente. (vide, por exemplo, R. Wu, Ed., Methods in Enzymology, Vol. 68, Academic Press, N.Y. (1979); T. Maniatis, E. F. Fritsch e J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982); Catálogo 1982-83, New England Biolabs, Inc.; Catálogo 1982-83, Bethesda Research Laboratories, Inc. Um exemplo de como construir os vetores empregados nos métodos em questão é fornecido na seção Experimental, infra. A preparação de um sistema de transposon da Sleeping Beauty representativo também é divulgada nos documentos WO 98/40510 e WO 99/25817).
[595] Em algumas modalidades, a transdução com transposons é realizada com um plasmídeo que compreende um gene da transposase e um plasmídeo que compreende um transposon que contém uma sequência de DNA cargo que é flanqueada por sequências de repetição invertida / repetição direta (IR/DR) que são reconhecidos pela transposase. Em certas modalidades, a sequência de DNA cargo codifica uma proteína heteróloga, por exemplo, um receptor de célula T recombinante ou um CAR. Em algumas modalidades, o plasmídeo compreende transposase e o transposon. Em algumas modalidades, a transposase está sob controle de um promotor onipresente, ou qualquer promotor adequado para dirigir a expressão da transposase na célula alvo. Os promotores ubíquos incluem, mas não estão limitados a, EF1a, CMB, SV40, PGK1, Ubc, β-actina humana, CAG, TRE, UAS, Ac5, CaMKIIa e U6. Em algumas modalidades, o DNA cargo compreende um cassete de seleção que permite a seleção de células com integração estável do DNA cargo no DNA genômico. Cassetes de seleção adequados incluem, mas não estão limitados a, cassetes de seleção que codificam um gene de resistência à canamicina, gene de resistência à espectinomicina, gene de resistência à estreptomicina, gene de resistência à ampicilina, gene de resistência à carbenicilina, gene de resistência à higromicina, gene de resistência à bleomicina, gene de resistência à eritromicina e polimixina B gene de resistência.
[596] Em algumas modalidades, os componentes para a transdução com um transposon, por exemplo, plasmídeos compreendendo um transposase SB e um transposon SB, são introduzidos na célula alvo. Qualquer protocolo conveniente pode ser empregado, em que o protocolo pode fornecer a introdução in vitro ou in vivo dos componentes do sistema na célula alvo, dependendo da localização da célula alvo. Por exemplo, onde a célula alvo é uma célula isolada, o sistema pode ser introduzido diretamente na célula sob condições de cultura celular permissivas de viabilidade da célula alvo, por exemplo, usando técnicas de transformação padrão. Tais técnicas incluem, mas não estão necessariamente limitadas a: infecção viral, transformação, conjugação, fusão de protoplastos, eletroporação, tecnologia de pistola de partículas, precipitação de fosfato de cálcio, microinjeção direta, entrega de vetor viral e similares. A escolha do método é geralmente dependente do tipo de célula que está sendo transformada e das circunstâncias nas quais a transformação está ocorrendo (isto é, in vitro, ex vivo ou in vivo). Uma discussão geral desses métodos pode ser encontrada em Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3ª ed., Wiley & Sons, 1995.
[597] Em algumas modalidades, o transposon SB e a fonte de transposase SB são introduzidos em uma célula alvo de um organismo multicelular, por exemplo, um mamífero ou um humano, sob condições suficientes para excisão do ácido nucleico flanqueado por repetição invertida do vetor o transposon e subsequente integração do ácido nucleico excisado no genoma da célula alvo. Algumas modalidades compreendem ainda uma etapa de garantir que a atividade necessária da transposase esteja presente na célula alvo juntamente com o transposon introduzido. Dependendo da estrutura do próprio vetor de transposon, isto é, se o vetor inclui ou não uma região que codifica um produto com atividade de transposase, o método pode ainda incluir a introdução de um segundo vetor na célula alvo que codifica a atividade de transposase necessária.
[598] Em algumas modalidades, a quantidade de ácido nucleico do vetor compreendendo o transposon e a quantidade de ácido nucleico do vetor que codifica a transposase que é introduzida na célula é suficiente para fornecer a excisão e inserção desejadas do ácido nucleico do transposon no alvo genoma celular. Como tal, a quantidade de ácido nucleico do vetor introduzida deve fornecer uma quantidade suficiente de atividade da transposase e um número suficiente de cópias do ácido nucleico que se deseja que seja inserido na célula alvo. A quantidade de ácido nucleico do vetor que é introduzida na célula alvo varia dependendo da eficiência do protocolo de introdução específico que é empregado, por exemplo, o protocolo de administração ex vivo específico que é empregado.
[599] Depois que o DNA do vetor entra na célula alvo em combinação com a transposase necessária, a região de ácido nucleico do vetor que é flanqueada por repetições invertidas, ou seja, o ácido nucleico do vetor posicionado entre a transposase da Sleeping Beauty reconhece repetições invertidas, é excisada a partir do vetor via transposase fornecida e inserida no genoma da célula alvo. Como tal, a introdução do DNA do vetor na célula alvo é seguida por excisão subsequente mediada pela transposase e inserção do ácido nucleico exógeno transportado pelo vetor no genoma da célula alvo. Em modalidades particulares, o vetor é integrado aos genomas de pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 6% pelo menos 7% pelo menos 8%, pelo menos 9%, pelo menos 10%, pelo menos 15% ou pelo menos 20% das células que são transfectadas com o transposon SB e/ou transposase SB. Em algumas modalidades, a integração do ácido nucleico no genoma da célula alvo é estável, ou seja, o ácido nucleico do vetor permanece presente no genoma da célula alvo por mais de um período transitório e é passado a uma parte do material genético cromossômico para a progênie da célula alvo.
[600] Em certas modalidades, os transposons são usados para integrar ácidos nucleicos, isto é, polinucleotídeos, de vários tamanhos no genoma da célula alvo. Em algumas modalidades, o tamanho do DNA que é inserido no genoma da célula alvo usando os métodos em questão varia de cerca de 0,1 kb a 200 kb, de cerca de 0,5 kb a 100 kb, de cerca de 1,0 kb a cerca de 8,0 kb, de cerca de 1,0 a cerca de 200 kb, de cerca de 1,0 a cerca de 10 kb, de cerca de 10 kb a cerca de 50 kb, de cerca de 50 kb a cerca de 100 kb ou de cerca de 100 kb a cerca de 200 kb. Em algumas modalidades, o tamanho do DNA que é inserido no genoma da célula alvo usando os métodos em questão varia de cerca de 1,0 kb a cerca de 8,0 kb. Em algumas modalidades, o tamanho do DNA que é inserido em um genoma da célula alvo usando os métodos em questão varia de cerca de 1,0 a cerca de 200 kb. Em modalidades particulares, o tamanho do DNA que é inserido em um genoma da célula alvo usando os métodos em questão varia de cerca de 1,0 kb a cerca de 8,0 kb. V. MÉTODOS DE DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO
[601] São aqui fornecidos métodos para detectar um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo um domínio de ligação de antígeno extracelular que é um anticorpo anti-BCMA entrando em contato com uma composição ou amostra biológica contendo células que expressam o CAR (células que expressam o CAR) com uma proteína de fusão BCMA-Fc. Em algumas modalidades, o método inclui ainda detectar se um complexo é formado entre a proteína de fusão BCMA-Fc e o CAR expresso por ou nas células da composição ou amostra biológica, como detectar a presença ou ausência ou nível dessa ligação. Em algumas modalidades, a detecção compreende a detecção de células ligadas à fusão BCMA-Fc. Em algumas modalidades, a fusão BCMA-Fc é marcada direta ou indiretamente para detecção.
[602] Em algumas modalidades, o antígeno BCMA da proteína de fusão BCMA-Fc é ou compreende um domínio extracelular de BCMA ou uma porção do mesmo compreendendo um epítopo reconhecido por um receptor de antígeno, por exemplo, CAR. Em certas modalidades, a proteína de fusão BCMA-Fc recombinante contém um antígeno BCMA que contém o domínio extracelular de um BCMA humano ou uma porção do mesmo que é ou contém um epítopo reconhecido pelo CAR. Em algumas modalidades, o antígeno BCMA da fusão BCMA-Fc não contém um domínio transmembranar e um domínio citoplasmático do BCMA humano nativo. Assim, em algumas modalidades, o antígeno BCMA da fusão BCMA-Fc é, consiste ou consiste essencialmente no domínio extracelular ou em uma porção do mesmo de um BCMA humano nativo. Em algumas modalidades, o antígeno BCMA da proteína de fusão BCMA-Fc é ou compreende, em alguns casos consiste ou consiste essencialmente em um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 86 %, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1 ou é um fragmento do mesmo contendo pelo menos 50, pelo menos 55, pelo menos 60, pelo menos 65, pelo menos 70, pelo menos 75, pelo menos 80, pelo menos 85, pelo menos 90, pelo menos 90, pelo menos 95, pelo menos 100, pelo menos 110, pelo menos 120, pelo menos 130, pelo menos 140, pelo menos 150, pelo menos 160, pelo menos 170 ou pelo menos 180 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 1 que são reconhecidos ou especificamente ligados pelo antígeno domínio de ligação do CAR. Em algumas modalidades, o antígeno BCMA é ou compreende, em alguns casos consiste ou consiste essencialmente em, a sequência apresentada em SEQ ID NO: 1 ou uma porção da mesma que é ou contém um epítopo reconhecido por um receptor de antígeno, por exemplo, CAR.
[603] Em algumas modalidades, o antígeno BCMA recombinante ou uma porção do mesmo é fundido direta ou indiretamente a uma região ou domínio constante de imunoglobulina, como, por exemplo, o domínio Fc ou porções do mesmo de IgG, incluindo subtipos IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4, IgA, IgE, IgD e IgM e formas modificadas dos mesmos. Em modalidades particulares, o antígeno BCMA está ligado, direta ou indiretamente, a um domínio Fc. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é um polipeptídeo de fusão compreendendo o antígeno BCMA ou uma porção do mesmo e o domínio Fc.
[604] Em algumas modalidades, o domínio Fc é composto pelo segundo e terceiro domínios constantes (isto é, domínios CH2 e CH3) da cadeia pesada de um isotipo IgG, IgA ou IgD, por exemplo CH2 ou CH3 dos isotipos IgG, IgA e IgD. Em algumas modalidades, o domínio Fc é composto por três domínios constantes de cadeia pesada (isto é, domínios CH2, CH3 e CH4) de um isotipo IgM ou IgE. Em algumas modalidades, o domínio Fc pode ainda incluir uma sequência de dobradiça ou porção da mesma. Em certos aspectos, o domínio Fc contém parte ou todo o domínio de dobradiça de uma molécula de imunoglobulina mais um domínio CH2 e CH3. Em alguns casos, o domínio Fc pode formar um dímero de duas cadeias polipeptídicas unidas por uma ou mais ligações dissulfeto. Em algumas modalidades, o domínio Fc é derivado de uma imunoglobulina (por exemplo, IgG, IgA, IgM ou IgE) de um mamífero adequado (por exemplo, humano, camundongo, rato, cabra, ovelha ou macaco). Em algumas modalidades, o domínio Fc compreende domínios CH2 e CH3 de IgG. Em certas modalidades, o domínio Fc é fundido ao C-terminal do antígeno BCMA. Em modalidades particulares, o domínio Fc é fundido ao N-terminal do antígeno BCMA.
[605] Em algumas modalidades, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG, ou uma porção ou variante do mesmo. Em algumas modalidades, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG humana, ou uma porção ou uma variante do mesmo, que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência para a sequência apresentada em SEQ ID NO: 2. Em modalidades particulares, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG humana do tipo selvagem, ou uma porção ou variante do mesmo. Em modalidades particulares, o domínio Fc é uma variante do domínio Fc de IgG1 humana do tipo selvagem.
[606] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de fusão compreende um domínio Fc variante. Em certas modalidades, o domínio Fc de IgG humana variante contém uma mutação, por exemplo, uma substituição, exclusão ou inserção, que reduz, diminui e/ou diminui o emparelhamento entre o domínio Fc e uma cadeia leve. Em algumas modalidades, o domínio Fc de IgG humana variante contém uma mutação que reduz a afinidade de ligação entre o domínio Fc e um Receptor Fc. Em modalidades particulares, o domínio Fc de IgG humana variante contém uma mutação que reduz, diminui e/ou diminui as interações, ou a probabilidade ou probabilidade de uma interação, entre o domínio Fc e um Receptor Fc. Em algumas modalidades, o domínio Fc de IgG humana variante contém uma mutação que reduz a afinidade de ligação entre o domínio Fc e uma proteína do sistema complemento. Em modalidades particulares, o domínio Fc de IgG humana variante contém uma mutação que reduz, diminui e/ou diminui as interações, ou a probabilidade ou probabilidade de uma interação, entre o domínio Fc e uma proteína do sistema complemento.
[607] Em algumas modalidades, o BCMA-Fc compreende um domínio variantes de IgG1 Fc humano. Em algumas modalidades, o domínio Fc de IgG humana variante contém uma substituição de cistina para serina na região de dobradiça do domínio Fc. Em algumas modalidades, o domínio Fc de IgG humana variante contém uma substituição de leucina a alanina na região de dobradiça do domínio Fc. Em modalidades particulares, o domínio Fc de IgG humana variante contém uma substituição de glicina para alanina na região de dobradiça. Em certas modalidades, o domínio Fc de IgG humana variante contém uma substituição de alanina para serina na região CH2 do domínio Fc. Em algumas modalidades, o domínio Fc de IgG humana variante compreende uma substituição de prolina para serina na região CH2 do domínio Fc. Em algumas modalidades, o domínio Fc de IgG humana variante compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido pela SEQ ID NO: 28.
[608] Em algumas modalidades, o BCMA-Fc compreende um polipeptídeo de fusão compreendendo um domínio Fc, em que o domínio Fc está presente no C-terminal do polipeptídeo de fusão.
[609] Em algumas modalidades, o BCMA-Fc é um polipeptídeo de fusão compreendendo um polipeptídeo BCMA, ou uma porção do mesmo, e um domínio Fc. Em algumas modalidades, o polipeptídeo BCMA ou uma porção do mesmo compreende uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% para SEQ ID NO: 1 e contém um epítopo reconhecido pelo receptor do antígeno, por exemplo o CAR. Em algumas modalidades, o domínio Fc compreende uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o domínio Fc compreende uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 28 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% para SEQ ID NO: 28. Em algumas modalidades, o antígeno BCMA inclui BCMA, ou uma porção ou variante do mesmo, e um marcador ou um domínio de fusão, por exemplo, um domínio Fc. Em modalidades particulares, o antígeno BCMA contém toda ou uma porção da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 35 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% para SEQ ID NO: 35, e que compreende um epítopo reconhecer por um receptor de antígeno, por exemplo, CAR.
[610] Em algumas modalidades, o BCMA-F é um dímero compreendendo dois ou mais antígenos BCMA, conforme descrito, que cada um é reconhecido e/ou ligado por um CAR. Em algumas modalidades, os antígenos BCMA são idênticos.
[611] Em certas modalidades, os métodos para detectar células que expressam CAR com uma fusão BCMA-Fc aqui descrita são usados para avaliar as células que expressam CAR em um indivíduo. Em algumas modalidades, são aqui fornecidos métodos de uso para a fusão BCMA-Fc para avaliar, medir e/ou quantificar a farmacocinética in vivo, expansão e/ou persistência de células que expressam CAR de uma composição celular terapêutica. Em algumas modalidades, a farmacocinética in vivo, expansão e/ou persistência das células e/ou alterações nos fenótipos celulares ou atividade funcional das células, tais como células que expressam CAR administradas para imunoterapia, por exemplo, terapia celular CAR-T, nos métodos aqui fornecidos, pode ser medida com a proteína de fusão BCMA-Fc. Em algumas modalidades, a farmacocinética, expansão e/ou persistência das células que expressam CAR são medidas ou avaliadas pela detecção da presença e/ou quantidade de células que expressam o CAR no indivíduo e/ou em uma amostra biológica obtida do indivíduo após a administração da composição celular terapêutica durante e/ou após a administração da terapia.
[612] Em alguns aspectos, a fusão BCMA-Fc é usada com citometria de fluxo para avaliar a quantidade de células que expressam CAR no sangue ou soro ou amostra de órgão ou tecido (por exemplo, sítio da doença, por exemplo, amostra de tumor) do indivíduo. Em alguns aspectos, a persistência é quantificada como o número de células que expressam CAR por microlitro da amostra, por exemplo, de sangue ou soro ou por número total de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) ou glóbulos brancos ou células T por microlitro da amostra. Em certos aspectos, a expansão é quantificada como o aumento no número de células que expressam CAR por microlitro entre amostras, por exemplo, de sangue ou soro, ou por número total de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs)
ou glóbulos brancos ou células T por microlitro das amostras ao longo do tempo. Em algumas modalidades, a farmacocinética, expansão e/ou persistência são medidas ou avaliadas pela detecção da quantidade de células que expressam CAR no indivíduo e/ou em amostras coletadas do indivíduo em vários momentos. Em certas modalidades, as uma ou mais amostras são coletadas, obtidas e/ou coletadas do indivíduo dentro de 24 horas, 48 horas, 72 horas, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 10 dias, 14 dias, 21 dias, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas, 3 meses, 4 meses, 6 meses, um ano ou mais de um ano após o a composição celular terapêutica é administrada.
[613] Em algumas modalidades, é fornecido um método para avaliar uma terapia com células T anti-BCMA CAR em um indivíduo, em que o CAR compreende um anticorpo anti-BCMA ou um fragmento de ligação de antígeno, e o método compreende incubar uma amostra do indivíduo com uma proteína de fusão BCMA-Fc e determinação da quantidade de células T ligadas à proteína de fusão BCMA-Fc. Em algumas modalidades, a fusão BCMA-Fc é marcada e as células T ligadas à fusão BCMA-Fc são testadas por citometria de fluxo. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra derivada de sangue ou é ou é derivada de um produto de aférese ou leucaférese. Em alguns aspectos, a administração é realizada após o início de uma primeira dose da terapia.
[614] Em uma modalidade, um BCMA-Fc é usado para determinar se o ajuste a uma terapia de células T CAR em um indivíduo é necessário, por exemplo onde baixos níveis de células T CAR no indivíduo indicam a necessidade de ajustar a terapia. Em alguns aspectos, a terapia é ajustada (i) se o número de células da terapia com células T detectáveis no sangue ou em outra amostra biológica, após terem sido detectáveis, não for detectável ou for reduzido,
opcionalmente reduzido em comparação com um momento anterior após administração da terapia com células T; (ii) o número de células da terapia de células T detectáveis no sangue ou em outra amostra biológica diminui em mais de 1,5 vez, 2,0 vezes, 3,0 vezes, 3,0 vezes, 4,0 vezes, 5,0 vezes, 10 vezes ou mais o número máximo ou máximo de células da terapia de células T detectáveis no sangue ou a amostra biológica do indivíduo após o início da administração da terapia de células T, opcionalmente a primeira dose, segunda ou subsequente; (iii) em um momento após um pico ou nível máximo das células da terapia de células T serem detectáveis no sangue do indivíduo, o número de células ou derivado das células T detectáveis no sangue do indivíduo é menor que inferior a 10%, inferior a 5%, inferior a 1% ou inferior a 0,1% do total de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) no sangue do indivíduo; e/ou (iv) se o número de células CD3+ ou CD8+ da terapia celular detectável no sangue for inferior a 20 células por µL, 15 células por µL, 10 células por µL, inferior a 5 células por µL ou inferior a 1 célula por µL. Em algumas modalidades, a terapia é ajustada administrando uma ou mais doses adicionais da terapia celular CAR-T, administrando uma dose aumentada da terapia celular CAR-T, administrando uma terapia celular alternativa CAR-T específica para o mesmo ou diferente antígeno, administrando um ou mais agente imunomodulador ou outro agente para promover ou aumentar a expansão ou persistência das células CAR-T.
[615] Vários métodos conhecidos na técnica para detectar a ligação de uma fusão BCMA-Fc a células que expressam CAR podem ser utilizados. Em algumas modalidades, o método inclui citometria de fluxo ou imunoensaio. Uma porção de indicador, ou grupo de marcador, pode ser unida à fusão BCMA-Fc e é selecionada de modo a atender às necessidades de vários usos do método que são frequentemente ditados pela disponibilidade de equipamento de ensaio e procedimentos de imunoensaio compatíveis. Em algumas modalidades, o rótulo é escolhido dentre porções ou proteínas fluorescentes (por exemplo, fluoresceína, rodamina, fitoeritrina, GFP ou BFP) ou porções luminescentes (por exemplo, nanopartículas QdotTM fornecidas pela Quantum Dot Corporation, Palo Alto, Califórnia). Várias técnicas gerais a serem usadas na realização dos vários imunoensaios mencionados acima são conhecidas.
[616] Em algumas modalidades, as fusões BCMA-Fc não precisam ser marcadas e a presença delas pode ser detectada usando um anticorpo marcado que se liga à fusão BCMA-Fc. Em algumas modalidades, o anticorpo marcado é específico para a porção Fc da molécula.
[617] Em algumas modalidades, a fusão BCMA-Fc é imobilizada ou ligada a um suporte sólido, em que uma composição ou amostra biológica contendo uma ou mais células alvo compreendendo células CAR-T é contatada com o suporte sólido. Em algumas modalidades, o suporte sólido é uma esfera. Em algumas modalidades, o suporte sólido é a superfície de um poço ou placa, por exemplo, uma placa de cultura de células. Em algumas modalidades, o suporte sólido é uma resina ou matriz presente ou contida dentro de uma coluna de cromatografia, por exemplo, para permitir o isolamento cromatográfico ou a seleção de células T CAR+. Em algumas modalidades, a proteína de fusão BCMA- Fc é ou é capaz de ser reversivelmente ligada a um suporte sólido. Em algumas modalidades, o suporte sólido é uma matriz de cromatografia de afinidade que compreende um ou mais sítios de ligação capazes de se ligar, por exemplo, ligação reversível a um parceiro de ligação presente na proteína de fusão BCMA-Fc. Em uma modalidade exemplar, a proteína de fusão BCMA-Fc compreende um peptídeo de ligação à estreptavidina ou outra porção de ligação à estreptavidina capaz de se ligar a uma molécula de estreptavidina ou estreptavidina muteína presente ou imobilizada no suporte sólido, que, em alguns casos, pode ser dissociada na presença de uma substância de competição, como a biotina. Exemplos de tais sistemas incluem aqueles descritos no pedido de patente publicado U.S. No. US20150024411. VI. ARTIGOS DE FABRICAÇÃO E KITS
[618] Em algumas modalidades, também são fornecidos sistemas, aparelhos e kits úteis na execução dos métodos fornecidos. Em algumas modalidades, são fornecidos artigos de fabricação, como kits ou dispositivos, contendo as partículas, por exemplo, esferas, aqui descritas, isto é, partículas, por exemplo, esferas, com moléculas de ligação ligadas. Em algumas modalidades, as moléculas de ligação compreendem um antígeno ou um anticorpo que se liga a ou reconhece um receptor recombinante ou um CAR. Em algumas modalidades, os kits podem ser usados em métodos para expandir, selecionar e/ou enriquecer células, como de acordo com a preparação de células manipuladas geneticamente para terapia celular adotiva. Em modalidades particulares, as células manipuladas geneticamente expressam um receptor recombinante, por exemplo, um CAR, que é ligado ou reconhecido pela ligação das moléculas de ligação.
[619] Em algumas modalidades, os artigos de fabricação incluem um ou mais recipientes, tipicamente uma pluralidade de recipientes, material de embalagem e um rótulo ou bula ou associados ao recipiente ou recipientes e/ou embalagem, geralmente incluindo instruções para expansão de células, como células de um indivíduo que são transduzidas ou transfectadas com um ou mais ácidos nucleicos, por exemplo, um ou mais ácidos nucleicos compreendendo um gene que codifica um receptor recombinante ou CAR.
[620] Em certas modalidades, o kit adicionalmente compreende instruções para o uso das partículas, por exemplo, esferas, descritas aqui para selecionar ou enriquecer células que expressam um receptor recombinante de uma população de células. Em algumas modalidades, o kit compreende instruções para usar as partículas, por exemplo, esferas, descritas aqui para enriquecer células que expressam um CAR. Em modalidades particulares, o kit compreende instruções para incubar, contatar ou tratar uma composição compreendendo células com as partículas, por exemplo, esferas, aqui descritas, em que menos que todas as células expressam o CAR. Em algumas modalidades, o kit compreende instruções para ativar, expandir e/ou enriquecer células que expressam um CAR. Em certas modalidades, o kit compreende instruções para ativar, expandir e/ou enriquecer células que expressam um CAR de uma população de células em que menos de 0,01%, menos de 0,1%, menos de 1%, menos de 5%, menos de 10 %, menos de 15%, menos de 20%, menos de 25%, menos de 30%, menos de 35%, menos de 40%, menos de 45%, menos de 50%, menos de 55%, menos de 60 %, menos de 65%, menos de 70%, menos de 80% ou menos de 90% das células expressam o CAR.
[621] Em algumas modalidades, o kit contém ainda ± instruções para transfectar ou transduzir células com um ou mais ácidos nucleicos que codificam um receptor recombinante, por exemplo, um CAR, que não foi expandido, ativado e/ou enriquecido antes da transfecção ou transdução, contato, incubação ou tratamento das células com as partículas, por exemplo, esferas, descritas aqui.
VII DEFINIÇÕES
[622] A menos que definido de outra forma, todos os termos da técnica, notações e outros termos ou terminologia técnica e científica usados neste documento têm o mesmo significado que é comumente entendido por um versado na técnica a que o assunto reivindicado pertence. Em alguns casos, termos com significados comumente entendidos são aqui definidos para maior clareza e/ou referência imediata, e a inclusão de tais definições aqui não deve necessariamente ser interpretada como representando uma diferença substancial em relação ao que é geralmente entendido na técnica.
[623] Como aqui utilizado, a referência a uma "forma correspondente" de um anticorpo significa que, ao comparar uma propriedade ou atividade de dois anticorpos, a propriedade é comparada usando a mesma forma do anticorpo. Por exemplo, se for declarado que um anticorpo possui uma atividade maior em comparação com a atividade da forma correspondente de um primeiro anticorpo, isso significa que uma forma específica, como um scFv desse anticorpo, possui uma atividade maior em comparação com a forma scFv do primeiro anticorpo.
[624] Como aqui utilizado, a recitação de que as posições de nucleotídeos ou aminoácidos "correspondem a" posições de nucleotídeos ou aminoácidos em uma sequência divulgada, tal como estabelecido na listagem de Sequências, refere-se a posições de nucleotídeos ou aminoácidos identificadas após o alinhamento com as divulgadas sequência para maximizar a identidade usando um algoritmo de alinhamento padrão, como o algoritmo GAP. Alinhando as sequências, um especialista na técnica pode identificar resíduos correspondentes, por exemplo, usando resíduos de aminoácidos conservados e idênticos como guias. Em geral, para identificar posições correspondentes, as sequências de aminoácidos são alinhadas para que seja obtida a correspondência de mais alta ordem (vide, por exemplo: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M
Stockton Press, New York, 1991; Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073).
[625] "Funções efetoras" se referem às atividades biológicas atribuíveis à região Fc de um anticorpo, que variam com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem: ligação a C1q e citotoxicidade dependente do complemento (CDC); Ligação ao receptor Fc; citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC); fagocitose; regulação negativa de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de células B); e ativação de células B.
[626] O termo "região Fc" aqui é usado para definir uma região C- terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina que contém pelo menos uma porção da região constante. O termo inclui regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Em uma modalidade, uma região Fc da cadeia pesada de IgG humana se estende de Cys226, ou de Pro230, até o terminal carboxila da cadeia pesada. No entanto, a lisina C-terminal (Lys447) da região Fc pode ou não estar presente. A menos que especificado de outra forma aqui, a numeração de resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante está de acordo com o sistema de numeração EU, também chamado de índice EU, como descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
[627] Os termos "anticorpo de comprimento completo", "anticorpo intacto" e "anticorpo inteiro" são usados aqui de forma intercambiável para se referir a um anticorpo com uma estrutura substancialmente semelhante a uma estrutura de anticorpo nativa ou com cadeias pesadas que contêm uma região Fc como aqui definida.
[628] Um anticorpo "isolado" é aquele que foi separado de um componente de seu ambiente natural. Em algumas modalidades, um anticorpo é purificado com pureza superior a 95% ou 99%, conforme determinado por, por exemplo, eletroforético (por exemplo, SDS-PAGE, foco isoelétrico (IEF), eletroforese capilar) ou cromatográfico (por exemplo, troca iônica ou HPLC de fase reversa). Para revisão dos métodos para avaliação da pureza do anticorpo, vide, por exemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848: 79-87 (2007).
[629] Um ácido nucleico "isolado" refere-se a uma molécula de ácido nucleico que foi separada de um componente do seu ambiente natural. Um ácido nucleico isolado inclui uma molécula de ácido nucleico contida em células que normalmente contêm a molécula de ácido nucleico, mas a molécula de ácido nucleico está presente de forma extracromossômica ou em um local cromossômico diferente da sua localização cromossômica natural.
[630] "Ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo anti- idiotipo" refere-se a uma ou mais moléculas de ácido nucleico ácidos que codificam cadeias pesadas e leves de anticorpo (ou seus fragmentos), incluindo a (s) molécula (s) de ácido nucleico em um único vetor ou vetores separados, e tal (s) molécula (s) de ácido nucleico presente em um ou mais sítios em uma célula hospedeira.
[631] Os termos "célula hospedeira", "linhagem celular hospedeira" e "cultura de células hospedeiras" são usados de forma intercambiável e se referem a células nas quais o ácido nucleico exógeno foi introduzido, incluindo a progênie de tais células. As células hospedeiras incluem "transformantes" e "células transformadas", que incluem a célula primária transformada e a progênie delas derivadas, sem levar em consideração o número de passagens. A progênie pode não ser completamente idêntica no conteúdo de ácido nucleico a uma célula-mãe, mas pode conter mutações. A progênie mutante que tem a mesma função ou atividade biológica como rastreada ou selecionada na célula originalmente transformada está incluída aqui.
[632] Como aqui utilizado, "porcentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos" e "porcentagem de identidade" quando usado em relação a uma sequência de aminoácidos (sequência polipeptídica de referência) é definido como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata (por exemplo, o anticorpo ou fragmento em questão) que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência polipeptídica de referência, depois de alinhar as sequências e introduzir lacunas, se necessário, para atingir a identidade percentual máxima da sequência e sem considerar substituições conservadoras como parte da identidade de sequência. O alinhamento para fins de determinação da porcentagem de identidade de sequência de aminoácidos pode ser alcançado de várias maneiras dentro da especialidade na técnica, por exemplo, usando software de computador disponível publicamente, como o software BLAST, BLAST- 2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os especialistas na técnica podem determinar parâmetros apropriados para o alinhamento de sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo ao longo de todo o comprimento das sequências sendo comparadas.
[633] Uma substituição de aminoácido pode incluir a substituição de um aminoácido em um polipeptídeo por outro aminoácido. A substituição pode ser uma substituição conservadora de aminoácidos ou uma substituição não conservadora de aminoácidos As substituições de aminoácidos podem ser introduzidas em uma molécula de ligação, por exemplo, anticorpo, de interesse e os produtos selecionados para uma atividade desejada, por exemplo, ligação retida / aprimorada ao antígeno, imunogenicidade reduzida ou ADCC ou CDC aprimorado.
[634] Os aminoácidos geralmente podem ser agrupados de acordo com as seguintes propriedades comuns da cadeia lateral: (1) hidrofóbico: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácido: Asp, Glu; (4) básico: His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; (6) aromático: Trp, Tyr, Phe
[635] Em algumas modalidades, as substituições conservadoras podem envolver a troca de um membro de uma dessas classes por outro membro da mesma classe. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácidos não conservadoras podem envolver a troca de um membro de uma dessas classes por outra classe. As substituições de aminoácidos não conservadoras envolverão a troca de um membro de uma dessas classes por outra classe.
[636] O termo "vetor", como aqui utilizado, refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de propagar outro ácido nucleico ao qual está ligado. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico autorreplicante, bem como o vetor incorporado no genoma de uma célula hospedeira na qual foi introduzido. Certos vetores são capazes de direcionar a expressão de ácidos nucleicos aos quais eles estão operacionalmente ligados. Tais vetores são referidos aqui como "vetores de expressão".
[637] Como usadas neste documento, as formas singulares "a", "o", "uma" e "um" incluem referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Por exemplo, "o" ou "um" significa "pelo menos um" ou "um ou mais". Entende-se que aspectos e variações aqui descritos incluem "consistindo" e/ou "consistindo essencialmente em" aspectos e variações.
[638] Ao longo desta divulgação, vários aspectos da matéria reivindicada são apresentados em um formato de intervalo. Deve-se entender que a descrição no formato de intervalo é meramente por conveniência e brevidade e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível no escopo do indivíduo reivindicado. Por conseguinte, a descrição de um intervalo deve ser considerado como tendo divulgado especificamente todos os subintervalos possíveis, bem como valores numéricos individuais dentro desse intervalo. Por exemplo, quando é fornecido um intervalo de valores, entende-se que cada valor intermediário, entre o limite superior e inferior desse intervalo e qualquer outro valor declarado ou interveniente nesse intervalo declarado, é abrangido pelo indivíduo reivindicado. Os limites superior e inferior desses intervalos menores podem ser incluídos independentemente nos intervalos menores e também estão incluídos na matéria reivindicada, submetida a qualquer limite excluído especificamente no intervalo indicado. Onde o intervalo indicado inclui um ou ambos os limites, intervalos excluindo um ou ambos os limites incluídos também são incluídos na matéria reivindicada. Isso se aplica independentemente da amplitude do intervalo.
[639] O termo "sobre", conforme usado aqui, refere-se ao intervalo de erro usual para o respectivo valor prontamente conhecido pelo especialista neste campo técnico. A referência a "cerca de" um valor ou parâmetro neste documento inclui (e descreve) modalidades que são direcionadas a esse valor ou parâmetro per se. Por exemplo, a descrição referente a "cerca de X" inclui a descrição de "X". Em algumas modalidades, "cerca de" refere-se a ± 20%, ± 15%, ± 10%, ± 5% ou ± 1% do valor ou parâmetro.
[640] Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são usados de forma intercambiável para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos, e não estão limitados a um comprimento mínimo. Os polipeptídeos, incluindo os anticorpos e cadeias de anticorpos fornecidos e outros peptídeos, por exemplo, ligantes, podem incluir resíduos de aminoácidos, incluindo resíduos de aminoácidos naturais e/ou não naturais. Os termos também incluem modificações pós- expressão do polipeptídeo, por exemplo, glicosilação, sialilação, acetilação, fosforilação e semelhantes. Em alguns aspectos, os polipeptídeos podem conter modificações em relação a uma sequência nativa ou natural, desde que a proteína mantenha a atividade desejada. Essas modificações podem ser deliberadas, como por meio de mutagênese direcionada a sítio, ou podem ser acidentais, como por meio de mutações de hospedeiros que produzem as proteínas ou erros devido à amplificação por PCR.
[641] Como aqui utilizado, uma composição refere-se a qualquer mistura de dois ou mais produtos, substâncias ou compostos, incluindo células. Pode ser uma solução, uma suspensão, líquido, pó, uma pasta, aquosa, não aquosa ou qualquer combinação dos mesmos.
[642] Como aqui utilizado, uma declaração de que uma célula ou população de células é "positiva" para um marcador específico refere- se à presença detectável na célula ou dentro de um marcador específico, normalmente um marcador de superfície. Quando se refere a um marcador de superfície, o termo refere-se à presença de expressão de superfície como detectada por citometria de fluxo, por exemplo, pela coloração com um anticorpo que se liga especificamente ao marcador e pela detecção do referido anticorpo, em que a coloração é detectável por citometria de fluxo em um nível substancialmente acima da coloração detectada executando o mesmo procedimento com um controle compatível com isotipo sob condições idênticas e/ou em um nível substancialmente semelhante ao da célula que se sabe ser positiva para o marcador e/ou em um nível substancialmente mais alto do que para uma célula que se sabe ser negativa para o marcador.
[643] Como aqui utilizado, uma declaração de que uma célula ou população de células é "negativa" para um marcador específico refere- se à ausência de presença detectável substancial na ou na célula de um marcador específico, tipicamente um marcador de superfície. Quando se refere a um marcador de superfície, o termo refere-se à ausência de expressão da superfície como detectada por citometria de fluxo, por exemplo, pela coloração com um anticorpo que se liga especificamente ao marcador e pela detecção do referido anticorpo, em que a coloração não é detectada pela citometria de fluxo em um nível substancialmente acima da coloração detectada executando o mesmo procedimento com um controle compatível com isotipo em condições idênticas, e/ou em um nível substancialmente mais baixo do que o da célula conhecida como positiva para o marcador e/ou em um nível substancialmente semelhante ao de uma célula conhecida como negativa para o marcador. VIII. MODALIDADES EXEMPLARES
[644] Entre as modalidades fornecidas, estão:
[645] 1. Método de expansão de células, compreendendo incubar uma composição de entrada que compreende células que expressam um receptor de antígeno recombinante compreendendo um domínio de ligação de antígeno extracelular que se liga a ou reconhece especificamente um antígeno com uma pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, cada uma da pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, compreendendo uma molécula de ligação que se liga especificamente ao domínio de ligação de antígeno, em que a união da molécula de ligação ao domínio de ligação de antígeno induz a expansão das células compreendendo o receptor de antígeno recombinante, produzindo assim uma composição de saída compreendendo células expandidas.
[646] 2. O método da modalidade 1, em que o receptor de antígeno recombinante é um receptor de antígeno quimérico (CAR).
[647] 3. O método da modalidade 1 ou modalidade 2, em que o domínio de ligação de antígeno compreende um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo.
[648] 4. O método da modalidade 3, em que o fragmento de ligação de antígeno é ou compreende um fragmento de anticorpo de cadeia única.
[649] 5. O método da modalidade 3 ou modalidade 4, em que o fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende regiões variáveis do anticorpo unidas por um ligante flexível.
[650] 6. O método de qualquer uma das modalidades 3-5, em que o fragmento de ligação de antígeno do mesmo é ou compreende um scFv.
[651] 7. O método de qualquer uma das modalidades 1-6, em que o antígeno é selecionado a partir de ROR1, antígeno de maturação de células B (BCMA), anidrase carbônica 9 (CAIX), Her2/neu (receptor de tirosina quinase erbB2), Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, mesotelina, CEA e antígeno de superfície da hepatite B, receptor antifolato, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), EPHa2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, dímeros de erbB, EGFR vIII, proteína de ligação ao folato (FBP), FCRL5, FCRH5, receptor fetal de acetilcolina, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-alfa, IL-13R-alfa2, receptor de domínio de inserção de quinase (kdr), cadeia leve kappa, Lewis Y, molécula de adesão às células L1, (L1-CAM), antígeno associado ao melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, antígeno do melanoma expresso preferivelmente (PRAME), survivina, TAG72, B7-H6, receptor alfa-2 de IL-13 (IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY- ESO-1, PSCA, receptor-a de folato, CD44v6, CD44v7/8, avb6 integrina, 8H9, NCAM, receptores VEGF, 5T4, AchR fetal, ligantes NKG2D, CD44v6, antígeno duplo, antígeno testicular para câncer, mesotelina, CMV de murino, mucina 1 (MUC1), MUC16, PSCA, NKG2D, NY-ESO- 1, MART-1, gp100, antígeno oncofetal, ROR1, TAG72, VEGF-R2,
antígeno carcinoembrionário (CEA), antígeno prostático específico, PSMA, Her2/neu, receptor de estrogênio, receptor de estrogênio, receptor de progesterona, efrinaB2, CD123, c-Met, GD- 2, GD2 O- acetilado (OGD2), CE7, Tumor de Wilms 1 (WT-1), uma ciclina, ciclina A2, CCL-1, CD138, um antígeno de patógeno específico e um antígeno associado a um marcador universal e/ou o antígeno é selecionado a partir da integrina αvβ6 (integrina avb6), antígeno de maturação de células B (BCMA), B7-H3, B7-H6, anidrase carbônica 9 (CA9, também conhecida como CAIX ou G250), um antígeno para testagem de câncer, antígeno de câncer / teste 1B (CTAG, também conhecido como NY- ESO-1 e LAGE-2), antígeno carcinoembrionário (CEA), uma ciclina, ciclina A2, ligante 1 da quimiocina de motivo CC (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD138, CD171, proteoglicano sulfato de condroitina 4 (CSPG4), proteína do fator de crescimento epidérmico (EGFR), mutação no receptor do fator de crescimento epidérmico do tipo III (EGFR vIII), glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), efrina B2, receptor de efrina A2 (EPHa2), receptor de estrogênio, receptor Fc semelhante a 5 (FCRL5; também conhecido como homólogo 5 do receptor Fc ou FCRH5), receptor fetal de acetilcolina (AchR fetal), uma proteína de ligação ao folato (FBP), receptor alfa de folato, gangliosídeo GD2, GD2 O-acetilado (OGD2), gangliosídeo GD3, glicoproteína 100 (gp100), Receptor 5D Acoplado à Proteína G (GPRC5D), Her2/neu (receptor de tirosina quinase erb-B2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), dímeros de erbB, antígeno associado ao melanoma de alto peso molecular humano (HMW -MAA), antígeno de superfície da hepatite B, antígeno leucocitário humano A1 (HLA-A1), antígeno leucocitário humano A2 (HLA-A2), receptor alfa de IL-22 (IL- 22Ra), receptor alfa de IL-13 (IL-13Ra2), receptor de domínio de inserção de quinase (kdr), cadeia leve kappa, molécula de adesão de células L1 (L1-CAM), epítopo CE7 de L1-CAM, repetição rica em leucina contendo membro A da família 8 (LRRC8A), Lewis Y, antígeno associado ao melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, mesotelina, c-Met, citomegalovírus de murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, ligantes de membro D de grupo 2 de assassinas naturais D (NKG2D), melan A (MART-1), molécula de adesão celular neural (NCAM), antígeno oncofetal, antígeno preferivelmente expresso do melanoma (PRAME), receptor de progesterona, antígeno prostático específico, antígeno prostático de células-tronco (PSCA), antígeno prostático específico de membrana (PSMA), receptor de tirosina quinase tipo receptor órfão 1 (ROR1), survivina, glicoproteína trofoblástica (TPBG também conhecida como 5T4), glicoproteína 72 associada ao tumor (TAG72), receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), receptor 2 do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR2), tumor 1 de Wilms (WT-1), um antígeno específico ao patógeno ou expresso ao patógeno, ou um antígeno associado a um marcador universal e/ou moléculas biotiniladas e/ou moléculas expressas pelo HIV, HCV, HBV ou outro patógeno.
[652] 8. O método de qualquer uma das modalidades 1-7, em que a molécula de ligação não liga ou reconhece um ligante ou região espaçadora do receptor de antígeno recombinante, o referido ligante ou região espaçadora conectando o domínio de ligação de antígeno ao domínio transmembranar do receptor do antígeno.
[653] 9. O método de qualquer uma das modalidades 1-8, em que a molécula de ligação é um anticorpo anti-idiotípico ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que se liga especificamente ao domínio de ligação de antígeno.
[654] 10. O método de expansão de células, caracterizado pelo fato de que compreende a incubação de uma composição de entrada que compreende células que expressam um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo um domínio de ligação de antígeno que especificamente liga ou reconhece um antígeno com uma pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, cada uma da pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, compreendendo uma molécula de ligação que é um anticorpo anti-idiotípico ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que se liga especificamente ao domínio de ligação de antígeno, em que a ligação do anticorpo anti-idiotípico ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo ao domínio de ligação de antígeno induz a expansão das células compreendendo o receptor de antígeno quimérico, produzindo assim uma composição de saída compreendendo células expandidas.
[655] 11. O método de qualquer uma das modalidades 1-8, em que a molécula de ligação compreende um antígeno recombinante ou uma porção do mesmo reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno.
[656] 12. O método de expansão de células, em que compreende a incubação de uma composição de entrada que compreende células que expressam um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo um domínio de ligação de antígeno que especificamente liga ou reconhece um antígeno com uma pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, cada uma da pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, compreendendo uma molécula de ligação compreendendo um antígeno recombinante ou uma porção do mesmo reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno, em que a ligação do antígeno recombinante ou uma porção do mesmo ao domínio de ligação de antígeno induz a expansão das células compreendendo o quimérico receptor de antígeno, produzindo assim uma composição de saída compreendendo células expandidas.
[657] 13. O método da modalidade 11 ou modalidade 12, em que o antígeno recombinante é selecionado a partir de ROR1, antígeno de maturação de células B (BCMA), anidrase carbônica 9 (CAIX), Her2/neu
(receptor de tirosina quinase erbB2), Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, mesotelina, CEA e antígeno de superfície da hepatite B, receptor antifolato, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG- 40), dímeros de EPHa2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, erbB, EGFR vIII, proteína de ligação ao folato (FBP), FCRL5, FCRH5, receptor fetal de acetilcolina, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-alfa, IL-13R-alfa2, receptor de domínio de inserção de quinase (kdr), cadeia leve kappa, Lewis Y, molécula de adesão de células L1, (L1-CAM), antígeno associado ao melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, antígeno preferivelmente expresso do melanoma (PRAME), survivina, TAG72, B7-H6, receptor alfa-13 de IL-13 (IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY-ESO-1, PSCA, receptor-a de folato, CD44v6, CD44v7/8, avb6 em tegrina, 8H9, NCAM, receptores VEGF, 5T4, AchR fetal, ligantes NKG2D, CD44v6, antígeno duplo, antígeno para testagem de câncer, mesotelina, CMV de murino, mucina 1 (MUC1), MUC16, PSCA, NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, antígeno oncofetal, ROR1, TAG72, VEGF-R2, antígeno carcinoembrionário (CEA), antígeno prostático específico, PSMA, Her2/neu, receptor de estrogênio, receptor de estrogênio, receptor de progesterona, efrinaB2, CD123, c-Met, GD-2, GD2 O-acetilado (OGD2), CE7, Tumor de Wilms 1 (WT-1), uma ciclina, ciclina A2, CCL-1, CD138 e um antígeno de patógeno específico ou uma porção de qualquer um dos itens anteriores reconhecidos pelo antígeno domínio de ligação e/ou o antígeno é selecionado a partir da integrina αvβ6 (integrina avb6), antígeno de maturação de células B (BCMA), B7-H3, B7-H6, anidrase carbônica 9 (CA9, também conhecida como CAIX ou G250), um antígeno para testagem de câncer, antígeno câncer / teste 1B (CTAG, também conhecido como NY-ESO-1 e LAGE-2), antígeno carcinoembrionário (CEA), uma ciclina, ciclina A2, ligante 1 de quimiocina de motivo CC (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD138, CD171, proteína do fator de crescimento epidérmico (EGFR), mutação do receptor do fator de crescimento epidérmico tipo III (EGFR vIII), glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), efrinaB2, receptor de efrina A2 (EPHa2), receptor de estrogênio, receptor Fc tipo 5 (FCRL5; também conhecido como homólogo 5 do receptor Fc ou FCRH5), receptor fetal de acetilcolina (AchR fetal), uma proteína de ligação ao folato (FBP), receptor alfa de folato, gangliosídeo GD2, GD2 O-acetilado (OGD2), gangliosídeo GD3, glicoproteína 100 (gp100), Receptor 5D Acoplado à Proteína G (GPRC5D), Her2/neu (receptor de tirosina quinase erb-B2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), dímeros de erbB, antígeno associado ao melanoma de alto peso molecular humano (HMW -MAA), antígeno de superfície da hepatite B, antígeno leucocitário humano A1 (HLA-A1), antígeno leucocitário humano A2 (HLA-A2), receptor alfa de IL-22 (IL-22Ra), receptor alfa de IL-13 (IL-13Ra2), receptor de domínio de inserção de quinase (kdr), cadeia leve kappa, molécula de adesão de células L1 (L1-CAM), epítopo CE7 de L1-CAM, repetição rica em leucina contendo membro A da família 8 (LRRC8A), Lewis Y, antígeno associado ao melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, mesotelina, c-Met, citomegalovírus de murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, ligantes de membro D de grupo 2 de assassinas naturais D (NKG2D), melan A (MART-1), molécula de adesão celular neural (NCAM), antígeno oncofetal, antígeno preferivelmente expresso do melanoma (PRAME), receptor de progesterona, antígeno prostático específico, antígeno prostático de células-tronco (PSCA), antígeno prostático específico de membrana (PSMA), receptor de tirosina quinase tipo receptor órfão 1 (ROR1), survivina, glicoproteína trofoblástica (TPBG também conhecida como 5T4), glicoproteína 72 associada ao tumor (TAG72), receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), receptor 2 do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR2), tumor 1 de Wilms (WT-1), um antígeno específico ao patógeno ou expresso ao patógeno, ou um antígeno associado a um marcador universal e/ou moléculas biotiniladas e/ou moléculas expressas pelo HIV, HCV, HBV ou outro patógeno.
[658] 14. O método de qualquer uma das modalidades 11-13, em que o antígeno recombinante é BCMA, CD22 ou ROR1, ou é uma pelo domínio de ligação de antígeno.
[659] 15. O método de qualquer uma das modalidades 11-14, em que a porção do antígeno recombinante reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno compreende o domínio extracelular ou uma porção do domínio extracelular do antígeno.
[660] 16. O método de qualquer uma das modalidades 11-14, em que a porção do antígeno recombinante reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno consiste essencialmente no domínio extracelular ou em uma porção do domínio extracelular do antígeno.
[661] 17. Um método de expansão de células, compreendendo a incubação de uma composição de entrada que compreende células que expressam um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo um domínio de ligação de antígeno que especificamente liga ou reconhece o antígeno de maturação de células B (BCMA) com uma pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, cada uma da pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, compreendendo uma molécula de ligação compreendendo o domínio extracelular de BCMA ou uma porção do domínio extracelular reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno, em que a ligação do domínio extracelular de BCMA ou uma porção do mesmo ao o domínio de ligação de antígeno induz a expansão das células compreendendo o receptor de antígeno quimérico, produzindo assim uma composição de saída compreendendo células expandidas.
[662] 18. O método da modalidade 17, em que a porção de BCMA consiste essencialmente no domínio extracelular ou em uma porção do domínio extracelular.
[663] 19. O método de qualquer uma das modalidades 11-18, em que a molécula de ligação é um polipeptídeo de fusão compreendendo o antígeno recombinante ou a porção do mesmo ligada a uma porção, opcionalmente em que a porção facilita a ligação à partícula.
[664] 20. O método da modalidade 19, em que a porção está ligada ao C-terminal do antígeno recombinante.
[665] 21. O método da modalidade 19 ou modalidade 20, em que a porção é hidrofóbica ou é enriquecida em aminoácidos hidrofóbicos.
[666] 22. O método de qualquer uma das modalidades 19-21, em que a porção é ou compreende um domínio Fc.
[667] 23. O método da modalidade 22, em que a região Fc é derivada de IgG humana.
[668] 24. O método de qualquer uma das modalidades 1-12, em que o antígeno é CD19.
[669] 25. Um método de expansão de células, compreendendo a incubação de uma composição de entrada que compreende células que expressam um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo um domínio de ligação de antígeno que se liga a ou reconhece especificamente CD19 com uma pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, cada uma da pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, compreendendo uma molécula de ligação que é um anticorpo anti- idiotípico ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que se liga especificamente ao domínio de ligação de antígeno, em que a ligação do anticorpo anti-idiotípico ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo ao domínio de ligação de antígeno induz a expansão das células compreendendo o receptor de antígeno quimérico, produzindo assim uma composição de saída compreendendo células expandidas.
[670] 26. O método da modalidade 9, modalidade 24 ou modalidade 25, em que o domínio de ligação de antígeno do receptor de antígeno é ou compreende o anticorpo SJ25C1 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo.
[671] 27. O método da modalidade 9, modalidade 24 ou modalidade 25, em que o domínio de ligação de antígeno do receptor de antígeno é ou compreende o anticorpo FMC63 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo.
[672] 28. O método da modalidade 26 ou modalidade 27, em que o fragmento de ligação de antígeno é ou compreende um scFv.
[673] 29. O método de qualquer uma das modalidades 1-28, em que o antígeno ou antígeno recombinante é humano.
[674] 30. O método de qualquer uma das modalidades 9, 10 e 25- 29, em que o anticorpo anti-idiotípico ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina.
[675] 31. O método da modalidade 30, em que pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina compreende uma região Fc ou uma porção da Fc compreendendo os domínios CH2 e CH3.
[676] 32. O método da modalidade 30 ou modalidade 31, em que a região constante ou a região Fc é derivada da IgG humana.
[677] 33. O método de qualquer uma das modalidades 9, 10 e 25- 32, em que o anticorpo anti-idiotípico ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo é um anticorpo intacto ou anticorpo completo.
[678] 34. O método de qualquer uma das modalidades 1-33, em que a molécula de ligação é covalente ou não covalentemente ligada às partículas, por exemplo, esferas.
[679] 35. O método de qualquer uma das modalidades 1-34, em que a molécula de ligação é unida a cada uma da pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, no ou perto do resíduo de aminoácido C-terminal da molécula de ligação e/ou união do molécula de ligação a cada uma da pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, é realizada tal que a região ou epítopo da molécula de ligação reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno do receptor de antígeno seja orientada tal que ela seja capaz de ser reconhecida pelo receptor de antígeno.
[680] 36. O método de qualquer uma das modalidades 1-35, em que as partículas, por exemplo, esferas, são partículas sintéticas, partículas insolúveis, partículas sólidas ou são partículas não celulares.
[681] 37. O método de qualquer uma das modalidades 1-35, em que o a pluralidade de partículas compreende esferas.
[682] 38. O método de qualquer uma das modalidades 1-37, em que a pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, compreende um diâmetro médio entre ou entre cerca de 1 µm e 10 µm ou entre ou entre cerca de 2 µm e 5 µm.
[683] 39. O método de qualquer uma das modalidades 1-38, em que a pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, compreende um diâmetro médio de cerca de 2,8 µm.
[684] 40. O método de qualquer uma das modalidades 1-38, em que a pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, compreende um diâmetro médio de cerca de 4,5 µm.
[685] 41. O método de qualquer uma das modalidades 1-40, em que a pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, compreende uma densidade média entre cerca de 0,5 g/cm3 e 5,0 g/cm3 ou entre ou entre cerca de 1 g/cm3 e cerca de 2 g/cm3.
[686] 42. O método de qualquer uma das modalidades 1-41, em que a pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, compreende uma densidade média de cerca de 1,3 g/cm3.
[687] 43. O método das modalidades 1-42, em que a pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, compreende uma densidade média de cerca de 1,5 g/cm3.
[688] 44. O método de qualquer uma das modalidades 1-43, em que a pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, é monodispersa.
[689] 45. O método de qualquer uma das modalidades 1-44, em que a molécula de ligação é covalentemente unida às partículas, por exemplo, esferas.
[690] 46. O método de qualquer uma das modalidades 1-45, em que a partícula compreende um grupo funcional exposto à superfície para união da molécula de ligação e/ou em que a molécula de ligação é covalentemente unida à partícula por meio de um grupo funcional exposto à superfície.
[691] 47. O método da modalidade 46, em que o grupo funcional exposto à superfície é um grupo amino, um grupo carboxila, um grupo tiol, um grupo aldeído, um grupo clorometila, um grupo epóxi, um grupo hidroxila, um grupo tosila ou um grupo hidrazina .
[692] 48. O método da modalidade 46 ou modalidade 47, em que o grupo funcional exposto à superfície é um grupo tosila.
[693] 49. O método de qualquer uma das modalidades 1-48, em que a pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, é biocompatível ou não tóxica para as células.
[694] 50. O método de qualquer uma das modalidades 1-49, em que a pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, compreende partículas compreendendo vidro, sílica, poliésteres de ácidos hidroxicarboxílicos, polianidretos de ácidos dicarboxílicos, copolímeros de ácidos hidroxicarboxílicos, ácidos copolímeros dicarboxílicos, ou metal.
[695] 51. O método de qualquer uma das modalidades 1-50, em que as partículas, por exemplo, esferas, compreendem uma superfície compreendendo um polímero, um polissacarídeo, uma sílica, um ácido graxo, um carbono ou uma combinação dos mesmos.
[696] 52. O método da modalidade 51, em que o polímero é polietilenoglicol, poli (ácido lático-co-glicólico), poliglutaraldeído, poliuretano, poliestireno e álcool polivinílico ou combinações dos mesmos.
[697] 53. O método de qualquer uma das modalidades 1-52, em que a pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, compreende partículas compreendendo uma superfície hidrofóbica.
[698] 54. O método de qualquer uma das modalidades 1-53, em que a pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, compreende partículas compreendendo uma superfície de poliestireno.
[699] 55. O método de qualquer uma das modalidades 1-54, a pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, compreende partículas que são magnéticas e/ou compreendem um núcleo magnético, um núcleo paramagnético ou um núcleo superparamagnético.
[700] 56. O método de qualquer uma das modalidades 1-55, em que a concentração da molécula de ligação está entre ou entre cerca de 0,5 µg/mL e 500 µg/mL, 1 µg/mL e 200 µg/mL ou 5 µg/mL e 100 µg/mL.
[701] 57. O método de qualquer uma das modalidades 1-56, em que a concentração da molécula de ligação é pelo menos ou pelo menos cerca de 1 µg/mL, 5 µg/mL, 10 µg/mL, 25 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL ou 200 µg/mL.
[702] 58. O método de qualquer uma das modalidades 1-57, em que cada uma da pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, compreende pelo menos ou cerca de pelo menos 10 cópias, 102 cópias, 103 cópias, 104 cópias, 105 cópias ou 106 cópias do molécula de ligação.
[703] 59. O método de qualquer uma das modalidades 1-58, em que pelo menos uma porção da incubação é realizada na presença de um agente que se liga especificamente a uma molécula adicional na célula para fornecer um sinal acessório e/ou bloquear um inibidor sinal.
[704] 60. O método de qualquer uma das modalidades 1-59, em que o agente é fornecido junto com as partículas, por exemplo, esferas, opcionalmente, o agente é composto por cada uma da pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, ou um subconjunto delas.
[705] 61. O método de qualquer uma das modalidades 1-59, em que o agente é fornecido separadamente da pluralidade de partículas, por exemplo, esferas.
[706] 62. O método de qualquer uma das modalidades 1-60, em que as partículas, por exemplo, esferas, compreendem ainda um agente que se liga especificamente a uma molécula adicional na célula para fornecer um sinal acessório e/ou bloquear um sinal inibitório.
[707] 63. O método de qualquer uma das modalidades 59-62, em que o agente é um ligante ou é um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo.
[708] 64. O método de qualquer uma das modalidades 58-63, em que a molécula é uma molécula coestimulatória ou é um correceptor de ativação ou um ligante do mesmo.
[709] 65. O método da modalidade 64, em que a molécula coestimulatória ou correceptor de ativação é OX-40, ICOS, DAP10, CD28 ou 4-1BB ou é um ligante do mesmo, opcionalmente OX-40L, ICOSL, B7-1, B7-2 ou 4-1BBL.
[710] 66. O método de qualquer uma das modalidades 58-63, em que a molécula é um receptor inibidor ou um ligante do mesmo.
[711] 67. O método da modalidade 66, em que o receptor inibitório é CTLA-4, PD-1, LAG-3, Tim-3, BTLA ou TIGIT ou é um ligante do mesmo, opcionalmente PD-L1, PD-L2, CD155, CD112 ou LUZ.
[712] 68. O método de qualquer uma das modalidades 62-67, em que o agente é covalentemente unido às partículas, por exemplo, esferas.
[713] 69. O método de qualquer uma das modalidades 62-68, em que a razão, opcionalmente razão molar ou em peso, da molécula de ligação e do agente compreendido pelas partículas, por exemplo, esferas, é ou é de cerca de 1:1.
[714] 70. O método de qualquer uma das modalidades 1-69, em que a razão de células totais presentes na composição de entrada para partículas, por exemplo, esferas, é de ou de cerca de 5:1 a 1:5, 3:1 a 1:3 ou 2:1 a 1:2.
[715] 71. O método de qualquer uma das modalidades 1-70, em que a razão de células totais presentes na composição de entrada para partículas, por exemplo, esferas, é de ou de cerca de 1:0,1 a 1:5.
[716] 72. O método de qualquer uma das modalidades 1-71, em que a razão de células totais presentes na composição de entrada para partículas, por exemplo, esferas, é ou é de cerca de 1:1.
[717] 73. O método de qualquer uma das modalidades 1-72, em que a incubação é realizada por mais de ou mais do que cerca de 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 24 horas, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias ou 12 dias.
[718] 74. O método de qualquer uma das modalidades 1-73, em que a incubação é realizada a uma temperatura entre ou entre cerca de 30 ºC e 39 ºC.
[719] 75. O método de qualquer uma das modalidades 1-74, em que a incubação é realizada a uma temperatura de 37 ° ± 2,0 ºC.
[720] 76. O método de qualquer uma das modalidades 1-75, em que as células compreendem células imunes ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC).
[721] 77. O método de qualquer uma das modalidades 1-76, em que a célula imune é uma célula T ou uma célula NK.
[722] 78. O método de qualquer uma das modalidades 1-77, em que as células compreendem células T CD4+ e/ou CD8+.
[723] 79. O método de qualquer uma das modalidades 1-78, em que a razão das células CD4+ para as células CD8+ é ou é de cerca de 1:1, 1:2, 2:1, 1:3 ou 3:1.
[724] 80. O método de qualquer uma das modalidades 1-79, em que as células são células primárias obtidas de um indivíduo, opcionalmente um indivíduo humano.
[725] 81. O método de qualquer uma das modalidades 1-80, em que as células são humanas.
[726] 82. O método de qualquer uma das modalidades 1-81, em que a composição de entrada é produzida por um método que compreende contatar uma composição de células com uma molécula de ácido nucleico que codifica o receptor de antígeno recombinante sob condições para introduzir a molécula de ácido nucleico em uma ou mais células na composição.
[727] 83. Método de engenharia genética de uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende:
[728] (a) entrar em contato com uma composição de células com uma molécula de ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno recombinante sob condições para introduzir a molécula de ácido nucleico em uma ou mais células da composição, produzindo assim uma composição de entrada; e
[729] (b) incubar células da composição de entrada de acordo com o método de qualquer uma das modalidades 1-74.
[730] 84. O método da modalidade 82 ou modalidade 83, em que pelo menos uma porção do contato e incubação é realizada simultaneamente.
[731] 85. O método de qualquer uma das modalidades 82-84, em que a molécula de ácido nucleico está compreendida em um vetor viral, um vetor epissomal ou um transposon.
[732] 86. O método de qualquer uma das modalidades 82-85, em que o contato é realizado por transposon / transferência de gene transposase.
[733] 87. O método de qualquer uma das modalidades 82-85, em que o contato é realizado por transdução com um vetor viral.
[734] 88. O método da modalidade 85 ou modalidade 87, em que o vetor viral é um retrovírus, que opcionalmente é um vetor gama- retroviral ou um vetor lentiviral.
[735] 89. O método da modalidade 87 ou modalidade 88, em que o contato compreende uma etapa de espinocular o vetor viral com a composição das células.
[736] 90. O método da modalidade 89, em que a espinoculação compreende girar, em uma cavidade interna de uma câmara centrífuga, as partículas de vetor viral e a composição das células, em que a rotação está em uma força centrífuga relativa em uma superfície interna da parede lateral da parede lateral da cavidade que é:
[737] entre ou entre cerca de 500 g e 2500 g, 500 g e 2000 g 500 g e 1600 g, 500 g e 1000 g, 600 g e 1600 g, 600 g e 1000 g, 1000 g e 2000 g ou 1000 g e 1600 g, cada, inclusive; ou
[738] pelo menos ou pelo menos cerca de 600 g, 800 g, 1000 g, 1200 g, 1600 g ou 2000 g.
[739] 91. O método da modalidade 89 ou modalidade 90, em que a spinoculação é por um tempo que é:
[740] maior que ou cerca de 5 minutos, maior que ou cerca de 10 minutos, maior que ou cerca de 15 minutos, maior que ou cerca de 20 minutos, maior que ou cerca de 30 minutos, maior que ou cerca de 30 minutos, maior que ou cerca de 45 minutos, maior que ou cerca de 60 minutos, maior ou mais ou menos 90 minutos ou mais que ou cerca de 120 minutos; ou
[741] entre ou entre cerca de 5 minutos e 60 minutos, 10 minutos e 60 minutos, 15 minutos e 60 minutos, 15 minutos e 45 minutos, 30 minutos e 60 minutos ou 45 minutos e 60 minutos, cada, inclusive.
[742] 92. O método de qualquer uma das modalidades 87-91, em que o contato é realizado na presença de um adjuvante de transdução.
[743] 93. O método de qualquer uma das modalidades 82-92, em que a composição das células compreende uma pluralidade de células T e, antes do contato, o método não compreende estimular ou ativar as células T.
[744] 94. O método de qualquer uma das modalidades 82-93, em que a composição de células compreende uma pluralidade de células T e, antes do contato, o método não compreende incubar a composição na presença de um agente ou agentes capazes de induzir uma sinalizar através de um complexo TCR e/ou incubação na presença de um agente ou agentes capazes de induzir a proliferação de células T, células T CD4+ e/ou células T CD8+; e/ou moléculas de ligação a CD3, moléculas de ligação a CD28, IL-2 recombinante, IL-15 recombinante e IL-7 recombinante ou uma combinação dos mesmos.
[745] 95. O método do molusco 93 ou modalidade 94, em que, antes do contato, o método não compreende estimular as células T na presença de um anticorpo anticorpo anti-CD3 e/ou anti-CD28.
[746] 96. O método de qualquer uma das modalidades 82-95, em que a composição de células compreende uma pluralidade de células T, tendo a referida pluralidade de células sido obtida a partir de uma amostra de um indivíduo, em que:
[747] o contato é iniciado não mais de 24 horas após a obtenção da amostra do indivíduo; e/ou
[748] antes do contato, as células T não foram submetidas a uma temperatura maior ou maior que cerca de 15 ºC, cerca de 18 ºC, cerca de 22 ºC ou cerca de 25 ºC por um período superior a 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas ou 24 horas após a obtenção da amostra do indivíduo; e/ou
[749] antes do contato, as células T não foram submetidas a uma temperatura igual ou superior a 37 ° ± 2,0 ºC por u m período superior a 15 minutos, 30 minutos, 1 hora ou 2 horas depois de obter a amostra do indivíduo.
[750] 97. O método de qualquer uma das modalidades 82-96, em que, antes do referido contato, não mais de 5%, 10%, 20%, 30% ou 40% das células T são células ativadas, expressam um marcador de superfície selecionado a partir do grupo que consiste em HLA-DR, CD25, CD69, CD71, CD40L e 4-1BB; compreendem a expressão intracelular de uma citocina selecionada a partir do grupo que consiste em IL-2, IFN-gama, TNF-alfa, estão na fase G1 ou posterior do ciclo celular e/ou são capazes de proliferar.
[751] 98. O método de qualquer uma das modalidades 1-97, que adicionalmente compreende, antes da incubação ou do contato, obter uma amostra biológica do indivíduo compreendendo as células e, opcionalmente, selecionar ou enriquecer as células, opcionalmente células T, da amostra .
[752] 99. O método de qualquer uma das modalidades 1-98, em que a porcentagem de células que expressam o receptor de antígeno recombinante na composição de entrada é menor ou menor do que cerca de 75%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% ou menos.
[753] 100. O método de qualquer uma das modalidades 1-99, em que a composição de células ou a composição de entrada compreende pelo menos ou pelo menos cerca de 1 x 102 células, 1 x 103 células, 1 x 104 células, 1 x 105 células, 1 x 106 células ou 1 x 107 células.
[754] 101. O método de qualquer uma das modalidades 1-100, em que a expressão da superfície de um marcador de ativação ou marcador de exaustão das células presentes na composição de saída é menor que a expressão da superfície do marcador em uma composição de células produzidas após uma incubação semelhante, mas na presença de molécula estimulatória policlonal capaz de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo de TCR.
[755] 102. O método da modalidade 101, em que o marcador de exaustão é um receptor inibidor.
[756] 103. O método da modalidade 101 ou modalidade 102, em que o marcador de exaustão é PD-1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, BTLA ou TIGIT.
[757] 104. O método da modalidade 103, em que o marcador de ativação é HLA-DR, CD25, CD69, CD71, CD40L ou 4-1BB.
[758] 105. O método de qualquer uma das modalidades 93-96, em que a expressão da superfície é pelo menos ou pelo menos cerca de 1,2 vez, 1,5 vez, 2,0 vezes, 3,0 vezes, 4,0 vezes, 4,0 vezes, 5,0 vezes, 10,0 vezes ou mais menos.
[759] 106. O método de qualquer uma das modalidades 1-105, em que o número de células na composição de saída é substancialmente igual ou é maior que o número de células em uma composição de células produzidas por uma incubação semelhante, mas na presença de um policlonal molécula estimulatória capaz de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo de TCR.
[760] 107. O método de qualquer uma das modalidades 101-106, em que a molécula estimulatória policlonal compreende um anticorpo ou fragmento anti-CD3 e/ou um anticorpo ou fragmento anti-CD28.
[761] 108. O método de qualquer uma das modalidades 1-107, em que o número de células na composição de entrada é maior que o número de células na composição de entrada em maior ou maior que 1,2 vez, 1,5 vez, 2,0 vezes, 3,0 vezes, 4,0 vezes, 4,0 vezes, 5,0 vezes, 10,0 vezes, 25 vezes, 50 vezes, 100 vezes ou mais.
[762] 109. O método de qualquer uma das modalidades 1-108, em que a porcentagem de células compreendendo o receptor de antígeno recombinante na composição de saída é maior ou maior que cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais.
[763] 110. O método de qualquer uma das modalidades 1-109, em que o número de células na composição de saída que compreende o receptor de antígeno recombinante é aumentado ou enriquecido em 1,2 vez, 2,0 vezes, 3,0 vezes, 4,0 vezes, 4,0 vezes, 5,0 vezes, 6,0 vezes, 7,0 vezes, 8,0 vezes, 9,0 vezes, 10 vezes ou mais em comparação com o número de células compreendendo o receptor de antígeno na composição de entrada.
[764] 111. O método de qualquer uma das modalidades 1-110, em que pelo menos uma porção da incubação é realizada na presença de um ou mais agentes adicionais que modulam a expansão ou atividade celular.
[765] 112 .O método da modalidade 111, em que os um ou mais agentes adicionais são uma ou mais citocinas.
[766] 113. O método de qualquer uma das modalidades 1-112, que é realizado in vitro ou ex vivo.
[767] 114. O método de qualquer uma das modalidades 1-113, em que o receptor de antígeno é um CAR, e o CAR adicionalmente um domínio de sinalização intracelular compreendendo um ITAM.
[768] 115. O método da modalidade 114, em que o domínio de sinalização intracelular compreende um domínio intracelular de uma cadeia CD3-zeta (CD3ζ).
[769] 116. O método da modalidade 114 ou modalidade 115, em que o CAR adicionalmente compreende uma região de sinalização coestimulatória.
[770] 117. O método da modalidade 116, em que a região de sinalização coestimulatória compreende um domínio de sinalização de CD28 ou 4-1BB.
[771] 118. O método da modalidade 117, em que o domínio coestimulatório é CD28.
[772] 119. O método de qualquer uma das modalidades 1-118, que adicionalmente compreende remover a pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, da composição de saída.
[773] 120. Uma composição de células produzidas pelo método de qualquer uma das modalidades 1-119.
[774] 121. Partícula modificada na superfície, compreendendo uma partícula e uma molécula de ligação ligada à superfície da partícula, em que a molécula de ligação se liga especificamente a um domínio de ligação de antígeno extracelular de um receptor de antígeno.
[775] 122. A partícula modificada na superfície da modalidade 121, em que o receptor de antígeno é um receptor de antígeno quimérico (CAR).
[776] 123. A partícula modificada na superfície da modalidade 121 ou modalidade 122, em que a molécula de ligação não liga ou reconhece um ligante ou região espaçadora do receptor de antígeno recombinante, o referido ligante ou região espaçadora conectando o domínio de ligação de antígeno ao domínio transmembranar do receptor de antígeno.
[777] 124. A partícula modificada na superfície de qualquer uma das modalidades 121-123, em que a molécula de ligação compreende um antígeno recombinante ou uma porção do mesmo reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno.
[778] 125. A partícula modificada na superfície da modalidade 124, em que o antígeno recombinante é selecionado a partir de ROR1, antígeno de maturação de células B (BCMA), anidrase carbônica 9 (CAIX), Her2/neu (receptor de tirosina quinase erbB2), Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, mesotelina, CEA e antígeno de superfície da hepatite B, receptor antifolato, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR,
glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), EPHa2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, erbB dímeros, EGFR vIII, proteína de ligação ao folato (FBP), FCRL5, FCRH5, receptor fetal de acetilcolina, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-alfa, IL-13R-alfa2, receptor de domínio de inserção de quinase (kdr), cadeia leve kappa, Lewis Y, molécula de adesão de células L1, (L1-CAM), antígeno associado ao melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, antígeno preferivelmente expresso do melanoma (PRAME), survivina, TAG72, B7-H6, receptor alfa-13 de IL-13 (IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY-ESO-1, PSCA, receptor-a de folato, CD44v6, CD44v7/8, avb 6 integrina, 8H9, NCAM, receptores VEGF, 5T4, AchR fetal, ligantes NKG2D, CD44v6, antígeno duplo, antígeno para testagem de câncer, mesotelina, CMV de murino, mucina 1 (MUC1), MUC16, PSCA, NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, antígeno oncofetal, ROR1, TAG72, VEGF-R2, antígeno carcinoembrionário (CEA), antígeno prostático específico, PSMA, Her2/neu, receptor de estrogênio, receptor de progesterona, efrinaB2, CD123, c-Met, GD-2, GD2 O-acetilado (OGD2), CE7, Tumor de Wilms 1 (WT-1), uma ciclina, ciclina A2, CCL- 1, CD138 e um antígeno de patógeno específico ou uma porção de qualquer dos itens acima reconhecidos pelo domínio de ligação de antígeno e/ou o antígeno é selecionado a partir da integrina αvβ6 (integrina avb6), antígeno de maturação de células B (BCMA), B7-H3, B7-H6, anidrase carbônica 9 (CA9, também conhecida como CAIX ou G250), um antígeno para testagem de câncer, antígeno câncer / teste 1B (CTAG, também conhecido como NY-ESO-1 e LAGE-2), antígeno carcinoembrionário (CEA), uma ciclina, ciclina A2, ligante 1 de quimiocina de motivo CC (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, C D44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD138, CD171, proteína do fator de crescimento epidérmico (EGFR), mutação do receptor do fator de crescimento epidérmico tipo III (EGFR vIII),
glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), efrinaB2, receptor de efrina A2 (EPHa2), receptor de estrogênio, receptor Fc tipo 5 (FCRL5; também conhecido como Homólogo 5 do receptor Fc ou FCRH5), receptor de acetilcolina fetal (AchR fetal), uma proteína de ligação ao folato (FBP), receptor alfa de folato, gangliosídeo GD2, GD2 O-acetilado (OGD2), gangliosídeo GD3, glicoproteína 100 (gp100), Receptor 5D acoplado à proteína G (GPRC5D), Her2/neu (receptor de tirosina quinase erb-B2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), dímeros de erbB, antígeno associado ao melanoma de alto peso molecular humano (HMW-MAA), antígeno de superfície da hepatite B, antígeno leucocitário humano A1 (HLA-A1), antígeno leucocitário humano A2 (HLA-A2), receptor alfa de IL-22 (IL-22Ra), receptor alfa 2 de IL-13 (IL-13Ra2), receptor de domínio de inserção de quinase (kdr), cadeia leve kappa, molécula de adesão celular L1 (L1-CAM), epítopo CE7 de L1-CAM, repetição rica em leucina contendo membro A da família 8 (LRRC8A), Lewis Y, antígeno associado a melanoma (MAGE)- A1, MAGE-A3, MAGE-A6, mesotelina, c-Met, citomegalovírus de murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, ligantes de membro D de grupo 2 de assassinas naturais (NKG2D), melan A (MART-1), molécula de adesão celular neural (NCAM), antígeno oncofetal, antígeno preferivelmente expresso do melanoma (PRAME), receptor de progesterona, um antígeno prostático específico, antígeno prostático de células-tronco (PSCA), antígeno prostático específico de membrana (PSMA), receptor de tirosina quinase tipo receptor órfão 1 (ROR1), survivina, glicoproteína trofoblástica (TPBG também conhecida como 5T4), glicoproteína 72 associada ao tumor (TAG72), receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), receptor do fator de crescimento endotelial vascular 2 (VEGFR2), Tumor de Wilms 1 (WT-1), um antígeno de patógeno específico ou expresso por patógeno, ou um antígeno associado a um marcador universal e/ou moléculas biotiniladas e/ou moléculas expressas por HIV, HCV, HBV ou outro patógeno.
[779] 126. A partícula modificada na superfície da modalidade 124 ou modalidade 125, em que o antígeno recombinante é BCMA, CD22 ou ROR1, ou é uma porção do mesmo reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno.
[780] 127. O método de qualquer uma das modalidades 124-126, em que a porção do antígeno recombinante reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno compreende o domínio extracelular ou uma porção do domínio extracelular do antígeno.
[781] 128. O método de qualquer uma das modalidades 124-126, em que a porção do antígeno recombinante reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno consiste essencialmente no domínio extracelular ou em uma porção do domínio extracelular do antígeno.
[782] 129. Partícula modificada na superfície, compreendendo uma partícula e uma molécula de ligação ligada à superfície da partícula, em que a molécula de ligação compreende um domínio extracelular ou uma porção do antígeno de maturação das células B (BCMA).
[783] 130. A partícula modificada na superfície de qualquer uma das modalidades 124-129, em que a molécula de ligação é um polipeptídeo de fusão compreendendo o antígeno recombinante ou a porção do mesmo ligada a uma porção, opcionalmente em que a porção facilita a ligação à partícula.
[784] 131. A partícula modificada na superfície da modalidade 130, em que a porção está ligada ao C-terminal do antígeno recombinante.
[785] 132. A partícula modificada na superfície da modalidade 130 ou modalidade 131, em que a porção é hidrofóbica ou é enriquecida em aminoácidos hidrofóbicos.
[786] 133. A partícula modificada na superfície de qualquer uma das modalidades 130-132, em que a porção é ou compreende um domínio Fc.
[787] 134. A partícula modificada na superfície da modalidade 133, em que a região Fc é derivada de IgG humana.
[788] 135. A partícula modificada na superfície de qualquer uma das modalidades 130-134, em que o antígeno recombinante é humano.
[789] 136. A partícula modificada na superfície de qualquer uma das modalidades 121-123, em que a molécula de ligação compreende um anticorpo anti-idiotípico ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo.
[790] 137. A partícula modificada na superfície de qualquer uma das modalidades 121-123 e 136, em que o antígeno reconhecido pelo domínio de ligação de antígeno é CD19.
[791] 138. A partícula modificada na superfície da modalidade 136 ou modalidade 137, em que o domínio de ligação de antígeno do receptor de antígeno é ou compreende o anticorpo SJ25C1 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo.
[792] 139. A partícula modificada na superfície da modalidade 136 ou modalidade 137, em que o domínio de ligação de antígeno do receptor de antígeno é ou compreende o anticorpo FMC63 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo.
[793] 140. A partícula modificada na superfície da modalidade 138 ou modalidade 139, em que o fragmento de ligação de antígeno é ou compreende um scFv.
[794] 141. A partícula modificada na superfície de qualquer uma das modalidades 136-140, em que o anticorpo anti-idiotípico ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina.
[795] 142. A partícula modificada na superfície da modalidade 141, em que pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina compreende uma região Fc ou uma porção da Fc compreendendo os domínios CH2 e CH3.
[796] 143. A partícula modificada na superfície da modalidade 141 ou modalidade 142, em que a região constante ou região Fc é derivada de IgG humana.
[797] 144. A partícula modificada na superfície de qualquer uma das modalidades 136-143, em que o anticorpo anti-idiotípico ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo é um anticorpo intacto ou anticorpo de tamanho completo.
[798] 145. A partícula modificada na superfície de qualquer uma das modalidades 121-144, em que a molécula de ligação é covalentemente ou não covalentemente ligada às partículas, por exemplo, esferas.
[799] 146. A partícula modificada na superfície de qualquer uma das modalidades 121-145, em que a molécula de ligação é unida a cada uma da pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, no ou perto do resíduo de aminoácido C-terminal da molécula de ligação e/ou união da molécula de ligação a cada uma da pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, é realizada tal que a região ou epítopo da molécula de ligação reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno do receptor de antígeno seja orientada tal que ela seja capaz de ser reconhecida pelo receptor de antígeno.
[800] 147. A partícula modificada na superfície de qualquer uma das modalidades 121-146, em que as partículas, por exemplo, esferas, são partículas sintéticas, partículas insolúveis, partículas sólidas ou partículas não celulares.
[801] 148. A partícula modificada na superfície de qualquer uma das modalidades 121-147, em que a pluralidade de partículas compreende esferas.
[802] 149. Partícula modificada na superfície de qualquer uma das modalidades 121-148, em que a partícula tem um diâmetro entre ou entre cerca de 1 µm e 10 µm ou entre ou entre cerca de 2 µm e 5 µm.
[803] 150. Partícula modificada na superfície de qualquer uma das modalidades 121-149, em que a partícula tem um diâmetro de cerca de 2,8 µm.
[804] 151. A partícula modificada na superfície de qualquer uma das modalidades 121-149, em que a partícula tem um diâmetro de cerca de 4,5 µm.
[805] 152. A partícula modificada na superfície de qualquer uma das modalidades 121-151, em que a molécula de ligação é covalentemente unida às partículas, por exemplo, esferas.
[806] 153. A partícula modificada na superfície de qualquer uma das modalidades 121-152, em que a partícula compreende um grupo funcional exposto à superfície para união da molécula de ligação e/ou em que a molécula de ligação é covalentemente unida à partícula por meio de um grupo funcional exposto à superfície.
[807] 154. A partícula modificada na superfície da modalidade 153, em que o grupo funcional exposto à superfície é um grupo amino, um grupo carboxila, um grupo tiol, um grupo aldeído, um grupo clorometila, um grupo epóxi, um grupo hidroxila, um grupo tosila ou uma grupo hidrazina.
[808] 155. A partícula modificada na superfície da modalidade 154, em que o grupo funcional exposto à superfície é um grupo tosila.
[809] 156. A partícula modificada na superfície de qualquer uma das modalidades 121-155, em que a partícula é biocompatível ou não tóxica para as células.
[810] 157. A partícula modificada na superfície de qualquer uma das modalidades 121-156, em que a pluralidade de partículas, por exemplo, esferas, compreende partículas compreendendo vidro, sílica, poliésteres de ácidos hidroxicarboxílicos, polianidretos de ácidos dicarboxílicos, copolímeros de ácidos hidroxicarboxílicos, copolímeros dicarboxílicos ácidos ou metal.
[811] 158. A partícula modificada na superfície de qualquer uma das modalidades 121-157, em que as partículas, por exemplo, esferas, compreendem uma superfície compreendendo um polímero, um polissacarídeo, uma sílica, um ácido graxo, um carbono ou uma combinação dos mesmos.
[812] 159. A partícula modificada na superfície da modalidade 158, em que o polímero é polietileno glicol, poli (ácido lático-co-glicólico), poliglutaraldeído, poliuretano, poliestireno e álcool polivinílico ou combinações dos mesmos.
[813] 160. A partícula modificada na superfície de qualquer uma das modalidades 121-149, em que a partícula compreende uma superfície hidrofóbica.
[814] 161. A partícula modificada na superfície de qualquer uma das modalidades 121-160, em que as partículas, por exemplo, esferas, compreendem uma superfície de poliestireno.
[815] 162. A partícula modificada na superfície de qualquer uma das modalidades 121-161, a partícula é magnética e/ou compreende um núcleo magnético, um núcleo paramagnético ou um núcleo superparamagnético.
[816] 163. A partícula modificada na superfície de qualquer uma das modalidades 121-162, em que a partícula compreende pelo menos ou cerca de 10 cópias, 102 cópias, 103 cópias, 103 cópias, 104 cópias, 105 cópias ou 106 cópias da molécula de ligação.
[817] 164. A partícula modificada na superfície de qualquer uma das modalidades 121-163, em que a partícula adicionalmente compreende um agente que se liga especificamente a uma molécula adicional na célula para fornecer um sinal acessório e/ou bloquear um sinal inibitório, modulando assim a expansão das células.
[818] 165. A partícula modificada na superfície da modalidade 165,
em que o agente é um ligante ou é um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo.
[819] 166. A partícula modificada na superfície da modalidade 164 ou modalidade 165, em que a molécula é uma molécula coestimulatória ou é um correceptor de ativação ou um ligante do mesmo.
[820] 167. A partícula modificada na superfície da modalidade 166, em que a molécula coestimulatória ou correceptor de ativação é OX-40, ICOS, DAP10, CD28 ou 4-1BB, ou é um ligante do mesmo, opcionalmente OX-40L, ICOSL, B7-1, B7-2 ou 4-1BBL.
[821] 168. A partícula modificada na superfície da modalidade 164 ou embo dispositivo 165, em que a molécula é um receptor inibidor ou um ligante do mesmo.
[822] 169. A partícula modificada na superfície da modalidade 168, em que o receptor inibitório é CTLA-4, PD-1, LAG-3, Tim-3, BTLA ou TIGIT, ou é um ligante do mesmo, opcionalmente PD-L1, PD-L2, CD155, CD112 ou LIGHT.
[823] 170. A partícula modificada na superfície de qualquer uma das modalidades 164-169, em que o agente está covalentemente ligado às partículas, por exemplo, esferas.
[824] 171. A partícula modificada na superfície de qualquer uma das modalidades 164-170, em que a razão, opcionalmente razão molar ou em peso, da molécula de ligação e do agente compreendido pela partícula é ou é de cerca de 1:1.
[825] 172. Uma composição, compreendendo uma pluralidade de partículas modificadas na superfície, por exemplo, esferas, de qualquer uma das modalidades 113-153.
[826] 173. A composição da modalidade 172, em que a concentração da molécula de ligação está entre ou entre cerca de 0,5 µg/mL e 500 µg/mL, 1 µg/mL e 200 µg/mL ou 5 µg/mL e 5 µg/mL e 100 µg/mL.
[827] 174. A composição da modalidade 172 ou modalidade 173, em que a concentração da molécula de ligação é pelo menos ou pelo menos cerca de 1 µg/mL, 5 µg/mL, 10 µg/mL, 25 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL ou 200 µg/mL.
[828] 175. A composição de qualquer uma das modalidades 172- 174 que é monodispersa.
[829] 176. Um kit, compreendendo a partícula de qualquer uma das modalidades 121-171 ou a composição de qualquer uma das modalidades 154-158 e instruções de uso.
[830] 177. O kit da modalidade 176, em que as instruções são para selecionar ou enriquecer, a partir de uma população de células, células que expressam um receptor de antígeno compreendendo um domínio de ligação de antígeno especificamente reconhecido pela molécula de ligação.
[831] 178. O kit da modalidade 176, em que as instruções são para expandir, a partir de uma população de células, células que expressam um receptor de antígeno compreendendo um domínio de ligação de antígeno especificamente reconhecido pela molécula de ligação.
[832] 179. O kit da modalidade 177 ou modalidade 178, em que a porcentagem de células que expressam um receptor de antígeno recombinante na população de células é menor ou menor do que cerca de 75%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% ou menos.
[833] 180. Um método para expandir células, compreendendo incubar uma população de células com a partícula de qualquer uma das modalidades 121-171 ou a composição de qualquer uma das modalidades 172-175.
[834] 181. Um método de seleção ou enriquecimento de células, compreendendo o contato de uma população de células com a partícula de qualquer uma das modalidades 121-171 ou a composição de qualquer uma das modalidades 172-175.
[835] 182. Método de estimulação de longo prazo para avaliar uma composição celular, o método compreendendo:
[836] incubar, por um período de tempo de pelo menos 10 dias, uma composição de entrada sob condições para estimular uma atividade dependente de CAR nas células na composição de entrada, a referida composição de entrada compreendendo células T expressando um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo um antígeno extracelular domínio de ligação que se liga a ou reconhece especificamente um antígeno, produzindo assim uma composição de saída; e
[837] avaliar um ou mais fenótipo ou atividade de uma ou mais células da composição de saída.
[838] 183. O método da modalidade 182, em que as condições para estimular uma atividade dependente do CAR compreendem a presença de uma molécula de ligação que se liga especificamente ao domínio de ligação de antígeno do CAR.
[839] 184. O método da modalidade 183, em que a molécula de ligação está ligada a um suporte.
[840] 185. O método da modalidade 184, em que o suporte é um suporte sólido.
[841] 186. O método da modalidade 185, em que o suporte sólido é a superfície de um poço de uma microplaca ou uma esfera.
[842] 187. O método de qualquer uma das modalidades 183-186, em que o suporte sólido é uma microplaca com a molécula de ligação ligada à microplaca, e a incubação é realizada na microplaca.
[843] 188. O método de qualquer uma das modalidades 183-187, em que o suporte sólido é uma esfera que uniu a molécula de ligação e a incubação é realizada na presença de uma pluralidade de esferas.
[844] 189. O método de qualquer uma das modalidades 183-187, em que a molécula de ligação é ou compreende um antígeno recombinante ou uma porção do mesmo reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno.
[845] 190. O método da modalidade 189, em que o antígeno recombinante ou uma porção do mesmo é BCMA, ou é uma porção do mesmo reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno.
[846] 191. O método de qualquer uma das modalidades 183-190, em que a molécula de ligação é ou compreende um anticorpo anti- iditóptico ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que se liga especificamente ao domínio de ligação de antígeno.
[847] 192. O método da modalidade191, em que o domínio de ligação de antígeno do receptor de antígeno é ou compreende o anticorpo SJ25C1 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo.
[848] 193. O método da modalidade 192, em que o domínio de ligação de antígeno do receptor de antígeno é ou compreende o anticorpo FMC63 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo.
[849] 194. O método de qualquer uma das modalidades 183-193, em que o método é realizado in vitro ou ex vivo.
[850] 195. O método de qualquer uma das modalidades 182-194, em que a composição de entrada é incubada na presença de um meio que não compreende citocinas recombinantes.
[851] 196. O método de qualquer uma das modalidades 182-195, em que a incubação é realizada continuamente ou não é interrompida pelo período de tempo.
[852] 197. O método de qualquer uma das modalidades 182-196, em que durante a incubação as células não são substituídas, o meio não é alterado e a molécula de ligação não é adicionada.
[853] 198. O método de qualquer uma das modalidades 182-197, compreendendo avaliar um ou mais fenótipos do estado de ativação, exaustão ou diferenciação das uma ou mais células da composição de saída.
[854] 199. O método da modalidade 198, em que o fenótipo é exaustão e a avaliação compreende medir a expressão, opcionalmente expressão de superfície, de um ou mais marcadores selecionados a partir de CTLA-4, FOXP3, PD-1, TIGIT, LAB-3, 2B4, BTLA, TIM3, VISTA ou CD96.
[855] 200. O método da modalidade 198, em que com o fenótipo é a ativação e a avaliação compreendendo medir a expressão, opcionalmente expressão de superfície, de um ou mais marcadores selecionados a partir dentre CD25, CD26, CD27, CD28, CD30, CD71, CD154, CD40L, CD127, LAG3 ou Ki67.
[856] 201. O método da modalidade 198, em que o fenótipo é um estado de diferenciação e a avaliação compreende medir um ou mais marcadores selecionados a partir de (i) um ou mais de CD25, CD45RO, CD56, KLRG1, CD95 e/ou (ii) um ou de CD45RA, CD27, CD28, CD62L e CCR7, opcionalmente em que os um ou mais marcadores são marcadores estão associados positiva ou inversamente a células T do tipo pura.
[857] 202. O método de qualquer uma das modalidades 182-201, compreendendo avaliar uma ou mais atividades das uma ou mais células da composição de saída.
[858] 203. O método de qualquer uma das modalidades 182-202, em que as uma ou mais atividades compreendem uma atividade dependente de CAR, opcionalmente uma atividade estimulada por antígeno.
[859] 204. O método da modalidade 202 ou 203, em que uma ou mais atividades compreendem atividade citolítica ou produção de citocinas.
[860] 205. O método de qualquer uma das modalidades 182-204, em que o período de tempo é pelo menos ou pelo menos cerca de 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias ou 15 dias.
[861] 206. O método de qualquer uma das modalidades 182-205, em que o período de tempo é ou é de cerca de 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias ou 15 dias.
[862] 207. O método de qualquer uma das modalidades 182-206, em que a composição de entrada compreende células que foram expostas ou contatadas com um agente ou composto de teste antes da incubação, opcionalmente em que a exposição ou contato é realizada durante uma ou mais etapas da um processo para produzir a composição de entrada compreendendo as células T que expressam o CAR.
[863] 208. O método de qualquer uma das modalidades 182-207, em que o método é realizado em uma pluralidade de composições de entrada, cada uma das referidas composições de entrada da pluralidade sendo produzida por um processo diferente.
[864] 209. O método de qualquer uma das modalidades 182-208, que adicionalmente compreende comparar o fenótipo ou atividade da composição de saída com o fenótipo ou atividade de uma composição de controle, opcionalmente em que a composição de controle é uma composição de células T que foram incubadas por pelo menos 10 dias sob as mesmas condições para estimular a atividade dependente de CAR, a referida composição de células T não foi produzida na presença do agente ou composto de teste ou foi produzida por um processo alternativo em comparação com a composição de entrada.
[865] 210. O método de qualquer uma das modalidades 182-209, que adicionalmente compreende identificar uma composição de saída que exibe exaustão reduzida, ativação reduzida ou diferenciação reduzida, opcionalmente em que a diferenciação reduzida compreende expressão aumentada de mais um marcador de célula T do tipo puro.
IX EXEMPLOS
[866] Os exemplos a seguir são incluídos apenas para fins ilustrativos e não pretendem limitar o escopo da invenção. Exemplo 1: Geração de esferas conjugadas com BCMA
[867] O antígeno de maturação das células B (BCMA) foi conjugado com esferas por acoplamento covalente de um polipeptídeo de fusão BCMA-Fc, contendo BCMA humano solúvel fundido em seu C- terminal a uma região Fc de IgG, à superfície de esferas magnéticas ativadas por tosila disponível comercialmente (ThermoFisher, Waltham MA). As esferas são esferas superparamagnéticas, não porosas, monodispersas e ativadas com tosila que ligam covalentemente grupos amino e sulfidrila primários. A conjugação foi realizada utilizando esferas com um diâmetro de aproximadamente 2,8 µm (designado M-280) ou 4,5 µm (designado M-450).
[868] O BCMA-Fc (SEQ ID NO: 35) continha o domínio extracelular de BCMA humano (GenBank NP_001183.2) e um IgG1 Fc humano unido a um ligante da seguinte forma:
MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCNASVT NSVKGTNA (domínio extracelular de BCMA; SEQ ID NO: 1) GGGGS (ligante; SEQ ID NO: 27)
PKSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRD ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (Hum IgG1 Fc; SEQ ID NO: 28).
[869] O clone que codifica o construto de fusão BCMA-Fc humana recombinante tendo a sequência líder CD33 do N-terminal (SEQ ID NO: 30) foi inserido em um vetor de expressão e expresso em células HEK
293. O sobrenadante das células HEK transientemente transfectadas foi colhido após 5 dias e a proteína de fusão BCMA-FC foi purificada por cromatografia de afinidade com proteína A e cromatografia de exclusão por tamanho (SEC). A proteína de fusão BCMA-Fc resultante foi determinada como tendo uma pureza superior a 95%, conforme avaliado por cromatografia de permeação em gel. Para testar a ligação, a proteína de fusão BCMA-Fc foi incubada com células T que expressam CARs anti-BCMA e células T que expressam CARs que não se ligam ao BCMA. Os resultados da citometria de fluxo indicaram que a proteína de fusão BCMA-Fc se ligava especificamente às células T que expressam CAR anti-BCMA.
[870] Várias concentrações da proteína de fusão BCMA-Fc variando de 5 µg a 200 µg foram adicionadas a aproximadamente 1 mL de esferas ativadas com tosila (por exemplo, contendo cerca de 4 x 109 esferas ativadas com tosila com um diâmetro de 2,8 µm ou cerca de 4 x 108 esferas ativadas com tosila com um diâmetro de 4,5 µm). O acoplamento covalente foi realizado por incubação durante a noite a 37ºC em solução tamponada com fosfato (PBS) contendo albumina sérica humana a 0,1% (HSA). As esferas foram lavadas e ressuspensas em 1 mL de PBS com HSA a 0,1%. Antes e depois da conjugação, a concentração de esferas foi determinada usando um Cellometer. A porcentagem de antígeno BCMA-Fc que foi acoplada às esferas foi determinada análise da SDS page. Nos exemplos abaixo, as esferas conjugadas com BCMA usadas em vários estudos são referidas com referência à quantidade de antígeno BCMA-Fc adicionado por mL ou a concentração de antígeno (µg/mL) durante a conjugação, por exemplo 5 µg ou 5 µg/mL; 50 µg ou 50 µg/mL; 200 µg ou 200 µg/mL e assim por diante.
[871] Para alguns dos estudos descritos abaixo, as esferas foram conjugadas duplamente com BCMA-Fc e um anticorpo anti-CD28 na razão de 1:1 usando os procedimentos substancialmente como descrito acima. Exemplo 2: Estimulação de esfera conjugada com anticorpo anti-
BCMA de células T CAR
[872] As esferas conjugadas com BCMA (diâmetro de 4,5 µm), geradas como descrito no Exemplo 1, foram incubadas com células T que expressam CAR anti-BCMA. As células T foram isoladas por enriquecimento à base de imunoafinidade a partir de amostras de leucaférese de doadores saudáveis. As células T isoladas foram transduzidas com um vetor viral que codifica um dos dois CARs anti- BCMA, cada um contendo um domínio de ligação de antígeno scFv específico para BCMA, um espaçador, uma região transmembranar CD28, uma região de sinalização estimulatória de 4-1BB e um domínio de sinalização intracelular derivado de CD3-zeta (designado como CAR anti-BCMA # 1 e anti-BCMA CAR # 2, diferindo apenas na porção scFv). O construto do vetor viral codificou ainda um EGFR truncado (EGFRt), que serviu como um marcador substituto para a expressão de CAR; a região codificadora de EGFRt foi separada da sequência CAR por uma sequência de salto T2A. Após a transdução, as células foram expandidas, formuladas na razão de célula T CAR+ CD4+ para célula T CAR+ CD8+ de aproximadamente 1:1 e as composições resultantes foram congeladas por criopreservação. Para os estudos descritos, a eficiência de transdução das composições de células T que expressam anti-BCMA CAR # 1 e anti-BCMA CAR # 2 foi de 45% ou 56%, respectivamente, conforme determinado usando um anticorpo anti- EGFR para detecção do marcador substituto de EGFRt.
[873] A composição de células T contendo células T anti-BCMA- CAR+ foi descongelada e as esferas de uma composição de esfera conjugadas com BCMA 100 µg/mL foram adicionadas às células na razão de 1:1 esfera:célula e incubadas por cinco dias. Como controle positivo, as células foram cultivadas com esferas anti-CD3/anti-CD28 na razão 1:1 esfera:célula por cinco dias. As células T que não expressaram um CAR (grupo de estudo simulado) também foram avaliadas após a incubação com as esferas conjugadas com BCMA.
[874] Para avaliar a proliferação, a composição celular contendo células T que expressam CAR anti-BCMA foi marcada com o corante marcador de proliferação CELLTRACE VIOLET (CTV; ThermoFisher Scientific, Waltham MA) de acordo com o protocolo do fabricante antes da incubação com as esferas conjugadas por BCMA. Resultados exemplares mostrados na FIGURA 1 demonstraram que a incubação com esferas conjugadas com BCMA resultou em diminuição da intensidade fluorescente da mancha CTV nas células T CD3+, indicando uma diluição do corante de proliferação representativo do grau de proliferação de acordo com o número de divisões celulares. Para células simuladas, pouquíssimas células T CD3+ sobreviveram após a incubação e não foi observada diminuição na intensidade da CTV para células simuladas que não expressaram um CAR anti-BCMA. Estes dados indicaram que a incubação com esferas conjugadas com BCMA aumentou especificamente a proliferação celular em células T que expressam CAR anti-BCMA.
[875] Para avaliar se a expansão de células T CAR+ foi especificamente enriquecida após a incubação com esferas conjugadas com BCMA, as células da composição de células T foram coradas para expressão na superfície de CD4 ou CD8 e para expressão do marcador de transdução de EGFRt usando um anticorpo anti-EGFR e analisado por citometria de fluxo. A extensão do enriquecimento de células T CAR+ (como detectado pela expressão do marcador substituto de EGFRt) após a incubação com esferas conjugadas com BCMA foi comparada com o enriquecimento após estimulação policlonal usando as esferas anti-CD3/anti-CD28. O grau de proliferação celular (determinado por diluição na intensidade de coloração do corante de proliferação de CTV) e o grau de ativação (determinado pela expressão da superfície de CD25 ou PD-1) também foram comparados nas composições de células T incubadas com esferas conjugadas com BCMA ou esferas anti-CD3/anti-CD28 de controle.
[876] Como mostrado na Tabela E1, incubação de composições de células T contendo células T anti-BCMA CAR+ com esferas conjugadas com BCMA por cinco dias resultou em uma porcentagem maior de células CD4+ e células CD8+ que expressam EGFRt em comparação com a incubação das mesmas composições de células T com esferas conjugadas com anticorpo anti-CD3/anti-CD28, indicando esferas conjugadas com BCMA enriquecem para células T anti-BCMA CAR+. Tabela E1: Porcentagem de células EGFRt+ após a incubação com esferas conjugadas com BCMA Células T CAR Tipo de célula Esferas Percentual conjugadas com EGFRt+ anticorpo cálulas Composição de CD4+ BCMA 76,6 célula T anti- Anti-CD3/CD28 63,5 BCMA CAR #1 CD8+ BCMA 55,3 Anti-CD3/CD28 34,7 Composição de CD4+ BCMA 86,3 célula T anti- Anti-CD3/CD28 68,2 BCMA CAR #2 CD8+ BCMA 58,3 Anti-CD3/CD28 39,9
[877] Como mostrado na FIGURA 2A, em comparação com a incubação com esferas conjugadas com anticorpo anti-CD3/anti-CD28, a incubação da composição de células T contendo células T que expressam anti-BCMA-CAR com esferas conjugadas com BCMA por cinco dias resultou em expressão reduzida de CD25, mas uma capacidade proliferativa um pouco maior, como evidenciado por uma diminuição maior na intensidade do corante de proliferação de CTV. A
FIGURA 2B fornece um gráfico de histograma no qual o eixo x mostra a intensidade da mancha CTV e o eixo y mostra o número de células normalizadas para representar os dados em termos de "% de máximo", de acordo com o software FlowJo (designado "normalizado para modo"). A % de max indica o número de células em cada compartimento (os intervalos numéricos do parâmetro no eixo x) dividido pelo número de células no compartimento que contém o maior número de células. FlowJo usa 256 posições, e cada gráfico foi dimensionado para a porcentagem de seu compartimento máximo. Como mostrado, foi observada uma intensidade ligeiramente menor da coloração de CTV (maior diluição evidenciando proliferação celular) em pelo menos um subconjunto das células em comparação com células T incubadas com esferas conjugadas com anti-CD3/anti-CD28. Além disso, como mostrado na FIGURA 2C, a expressão de PD-1 aumentou em células T CD4+ e CD8+ incubadas com esferas conjugadas com anticorpo anti- CD3/anti-CD28, enquanto a incubação de células T CD4+ e CD8+ com esferas conjugadas com BCMA não resultou em aumento da expressão de PD-1, particularmente nas células T CD8+.
[878] Para avaliar ainda mais a extensão do enriquecimento das células T CAR+, três composições de células T separadas compreendendo células T derivadas de três doadores diferentes manipulados geneticamente para expressar um CAR anti-BCMA foram incubadas com esferas conjugadas com BCMA. As células foram analisadas por citometria de fluxo após quatro, sete ou catorze dias de incubação (as células foram substituídas aos 7 dias). Como mostrado na FIGURA 3A, a porcentagem de células T que expressam CAR anti- BCMA aumentou ao longo do tempo em todas as três composições de células T. As células CD8+ CAR+ de cada composição foram analisadas por citometria de fluxo quanto à expressão de superfície de CD25, CD27 ou CCR7 após quatro, sete ou catorze dias de incubação. Como mostrado na FIGURA 3B, os níveis de expressão de superfície de CD25 e CCR7 diminuíram durante a incubação em comparação com as medições no dia 4. Por outro lado, a expressão de superfície de CD27 nas células CD8+ CAR+ permaneceu relativamente consistente. Exemplo 3: Efeitos das titulações de esferas conjugadas com BCMA nas células T CAR
[879] A composição de células AT contendo células T anti-BCMA CAR+ CD4/CD8 foi gerada substancialmente como descrito no Exemplo 2, exceto que a composição formulada resultante continha aproximadamente 74% de células CD8+ e 21% de células CD4+, nas quais 82% do total as células foram positivas para o CAR anti-BCMA (como detectado usando o BCMA-FC solúvel) e 68% foram positivas para EGFRt conforme determinado usando um anticorpo anti-EGFR. A composição contendo células T anti-BCMA CAR+ foi congelada por criopreservação e descongelada antes do uso nos seguintes estudos.
[880] Várias preparações de esferas conjugadas com BCMA (diâmetro de 4,5 µm; incluindo esferas de uma composição de esfera conjugadas com BCMA de 50 µg/mL, 25 µg/mL, 10 µg/mL ou 5 µg/mL), preparadas conforme descrito no Exemplo 1, foram adicionados na razão de 1:1 esfera:célula para a composição de células contendo células T que expressam CAR anti-BCMA e depois incubadas por 4 dias. As células T, que foram marcadas com o corante marcador de proliferação de CTV, foram monitoradas por citometria de fluxo quanto à intensidade do sinal de CTV como um indicador da proliferação celular. As células também foram avaliadas quanto à expressão de superfície de CD3, CD4, CD8, CD25, PD1 e o marcador substituto de EGFRt por citometria de fluxo.
[881] A FIGURA 4A representa gráficos de barras dos níveis de coloração de CD25 de superfície em células CD4+ e CD8+, e a FIGURA 4B representa gráficos de histograma, normalizados para o modo como descrito acima, para expressão da superfície de PD-1 em células T CD4+ ou CD8+ após incubação com as concentrações indicadas de esferas conjugadas com BCMA. Como mostrado nas FIGURAS 4A e 4B, a incubação com esferas conjugadas com BCMA resultou em aumento dependente da dose na expressão da superfície de CD25 (painéis superiores) e PD-1 (painéis inferiores) nas células CD4+ e CD8+.
[882] Como mostrado na FIGURA 5A e FIGURA 5B, não houve diferença dependente da dose na contagem total de células T avaliada pelo número de células CD3+ (FIGURA 5A); no entanto, houve uma ligeira diminuição dependente da dose na intensidade fluorescente média da CTV (MFI) nas células CD4+ (FIGURA 5B) após incubação com esferas conjugadas com BCMA. Como mostrado na FIGURA 6, a incubação com esferas conjugadas com BCMA resultou em um aumento dependente da dose na expressão da superfície de CD25 em células CD4+.
[883] Juntos, esses dados mostraram que as esferas conjugadas com BCMA com uma menor concentração de BCMA demonstraram menor expressão do marcador de ativação e maior proliferação. Estes dados indicam que certos atributos de uma composição de células T contendo células T anti-BCMA CAR+ podem ser manipulados por titulação da quantidade de antígeno BCMA conjugado com as esferas. Exemplo 4: Avaliação de marcadores de células T em células T anti- BCMA CAR+ estimuladas com esferas conjugadas com BCMA
[884] As esferas conjugadas com BCMA (diâmetro de 4,5 µm) conjugadas com várias quantidades de antígeno BCMA, como descrito no Exemplo 1, foram incubadas com células T anti-BCMA CAR+, e a expressão de marcadores de células T foi avaliada.
[885] Em um experimento, as células T anti-BCMA CAR criocongeladas, produzidas substancialmente como descrito no
Exemplo 2 e formuladas na razão de 1:1 de células T CD4+ e CD8+, foram descongeladas e semeadas a 1,5 x 106 células por poço de um placa de 12 poços. As células foram incubadas durante três dias na presença de esferas de uma composição de esfera conjugada com BCMA de 50 µg/mL, 100 µg/mL ou 200 µg/mL. A incubação foi realizada na razão de 1:1 células T para esferas. A análise da expressão da superfície CD25 em células CD4+ e CD8+ por citometria de fluxo mostrou uma indução semelhante de CD25 para todas as concentrações de esferas conjugadas com BCMA (FIGURA 7A).
[886] Em outro experimento, aproximadamente 1,5 x 106 células T CAR+, preparadas conforme descrito acima, foram adicionadas aos poços de uma placa de 12 poços e foram incubadas com esferas de uma composição de esfera conjugadas com BCMA de 200 µg na razão célula T CAR+ para esfera conjugada com BCMA de 1:0,3, 1:1 ou 1:3 (aproximadamente 0,5 x 106, 1,5 x 106 e 4,5 x 106 esferas por poço, respectivamente). Como controles, 5 µg/mL de anticorpo anti-CD3 foi revestido nos poços (concentração abaixo do ideal para estimulação) ou as células foram semeadas na ausência de qualquer agente (sem controle de estimulação). Cada condição foi incubada na presença ou ausência de 5 µM de lenalidomida. As células foram incubadas por quatro dias e depois analisadas por citometria de fluxo para expressão da superfície de CD4, CD8, Tim3, PD-1, CD25 e CD69. A incubação de células T anti-BCMA CAR+ com esferas conjugadas com BCMA aumentou a expressão da superfície de CD25 (FIGURA 7B), CD69 (FIGURA 7C) e Tim3 (FIGURA 7D) em células T CD4+ e CD8+. As células que foram estimuladas na presença da maior quantidade de esferas fornecidas na razão de células T CAR+ para esferas de 1:3 exibiram o maior aumento na expressão desses marcadores. Como mostrado na FIGURA 7E, a expressão de superfície de PD-1 em células T anti-BCMA CAR+ também foi maior quando as células CD4+ foram incubadas na razão de 1:3 células T CAR+ para esferas. Também houve um ligeiro aumento na expressão da superfície de PD-1 nas células CD8+ quando estimuladas com esferas conjugadas com BCMA na maior concentração de esferas BCMA fornecida na razão de 1:3 células T CAR+ para esferas. Os resultados são consistentes com a descoberta de que a concentração de BCMA presente durante a incubação pode modular diferencialmente a expressão do marcador de superfície nas células T CAR+.
[887] Como mostrado na FIGURA 7F, a presença de 5 µM de lenalidomida aumentou a capacidade proliferativa de células T (observada pela diminuição na intensidade do corante CTV) após a incubação por três dias com esferas conjugadas com 200 µg de antígeno BCMA na razão de 1:1 células T para esferas comparadas incubar com as esferas na ausência de lenalidomida (controle com veículo). Como mostrado nas FIGURAS 7G e 7H, a presença de lenalidomida durante a incubação aumentou ainda mais a extensão da expressão de superfície de CD25 em células T CD4+ e CD8+ induzidas após a incubação de células T anti-BCMA CAR+ com esferas conjugadas com BCMA (FIGURA 7G) ou estimulação anti-CD3 (FIGURA 7H).
[888] Em uma experiência posterior, as composições de células anti-BCMA CAR-T produzidas substancialmente como descrito no Exemplo 1 foram colocadas em placas de 96 poços a uma densidade de 5 x 105 células por poço. As composições de células CAR-T testadas continham, em média, aproximadamente 45% de células anti-BCMA CAR+ no plaqueamento. As células de cada composição foram incubadas por 18 horas na presença de esferas de uma composição de esfera conjugada com BCMA de 5 µg/mL, 50 µg/mL ou 200 µg/mL em uma razão de células T 1:1 para esferas. Como controle, as células foram incubadas com esferas conjugadas com anticorpo anti-CD3/anti-
CD28 (controle positivo) ou sem agente adicionado (controle negativo). As incubações foram realizadas na ausência de lenalidomida ou na presença de 0,5 µM ou 5 µM de lenalidomida. Após a incubação, as células foram tratadas com reagentes que permitiram a coloração extracelular e intracelular de anticorpos por citometria de fluxo para os fatores de transcrição Blimp1, EOMES, GATA-3, ikaros, helios e Tbet e marcadores CD25, CD31 e PD-1.
[889] Níveis de marcadores após a incubação de uma composição de células T CAR+ de um doador exemplar são mostrados para BLIMP- 1 (FIGURA 8A), CD25 (FIGURA 8B), CD31 (FIGURA 8C), PD-1 (FIG 8D), Tbet (FIGURA 8E) e EOMES (FIGURA 8F), GATA-3 (FIGURA 8G) Helios (FIGURA 8H) e Ikaros (FIGURA 8I). Como mostrado, a expressão de um número de fatores de transcrição e marcadores de ativação associados a células efetoras T avaliadas aumentou após estimulação com as esferas conjugadas com BCMA. Para muitos dos marcadores avaliados, a extensão do aumento da expressão foi semelhante à expressão induzida por estimulação com esferas anti- CD3/anti-CD28. Em alguns casos, o grau de estimulação com esferas conjugadas com BCMA foi maior na presença de 5 µg de esferas. Como mostrado na FIGURA 8I, o nível de expressão de Ikaros diminuiu na presença de lenalidomida em todas as condições. Resultados semelhantes foram observados a partir de uma composição de células T CAR+ gerada a partir de um segundo doador, exceto que nenhuma alteração na expressão de Helios foi observada nas células desse doador quando estimulada nas condições testadas. Exemplo 5: Avaliação da atividade de células T anti-BCMA CAR estimuladas com esferas conjugadas com BCMA
[890] A atividade de células T anti-BCMA CAR que foram geradas a partir de um processo que incluiu expansão na presença de esferas conjugadas com BCMA foi avaliada.
A. Respostas Efetivas
[891] As células T anti-BCMA CAR criocongeladas, produzidas substancialmente como descrito no Exemplo 2 e formuladas na razão de 1:1 de células T CD4+ e CD8+, foram descongeladas. A menos que indicado de outra forma, as esferas (diâmetro de cerca de 4,5 µm) de uma composição de esfera conjugada com BCMA de 5 µg/mL ou 50 µg/mL, geradas conforme descrito no Exemplo 1, foram adicionadas aos poços na razão de células T para esferas de 1:2 na presença ou ausência de 5 µM de lenalidomida. As células foram incubadas por até 14 dias e analisadas em vários momentos para secreção de citocinas, expansão celular por citometria de fluxo para o marcador substituto de EGFRt e atividade citolítica. a. Expressão de citocinas (i) Presença de citocinas no sobrenadante
[892] Vinte e quatro horas após a adição de esferas conjugadas com BCMA, a presença de TNF-α, IFNγ e IL-2 em sobrenadantes da cultura foi avaliada. Como mostrado nas FIGURAS 9A-9C, a incubação com esferas conjugadas com BCMA induziu a secreção de IFNγ (FIGURA 9A), IL-2 (FIGURA 9B) e TNF-α (FIGURA 9C) em sobrenadantes da cultura. O grau de produção de citocina foi maior quando as células foram incubadas com esferas da composição de esfera conjugadas com BCMA de 50 µg/mL em comparação com a composição de esfera conjugadas com BCMA de 5 µg/mL, demonstrando que a estimulação do CAR através das esferas de BCMA era dependente da dose. Como mostrado, a lenalidomida aumentou a produção de citocinas de células T CAR+ induzidas por BCMA após estimulação com as esferas conjugadas com BCMA.
[893] Em um outro estudo exemplar, duas composições de células T anti-BCMA CAR foram geradas a partir de diferentes doadores, cada uma contendo células T expressando o mesmo CAR anti-BCMA. As células foram descongeladas e incubadas com esferas (diâmetro de cerca de 4,5 µm) a partir de uma composição de esfera conjugada com BCMA de 5 µg/mL ou 200 µg/mL gerada como descrito no Exemplo 1. A incubação foi realizada na razão de células T para esferas de 1:1 na presença ou ausência de 1 µM ou 5 µM de lenalidomida. Vinte e quatro horas após a adição de esferas conjugadas com BCMA, a produção de IL-2 pelas células T anti-BCMA CAR+ foi avaliada em sobrenadantes da cultura. Como mostrado na FIGURA 9D, foi observada uma produção mais alta de IL-2 na presença de alta estimulação de antígeno (200 µg/mL de esferas conjugadas com BCMA) em comparação com menor estimulação de antígeno (5 µg/mL de esferas conjugadas com BCMA). A lenalidomida, em 1 µM ou 5 µM, aumentou a produção de citocinas na presença da estimulação de antígeno alto e baixo. (ii) Níveis intracelulares de citocinas
[894] As células T anti-BCMA CAR+ foram incubadas na presença de 1 µM de lenalidomida ou um veículo e esferas conjugadas 50 µg/mL de BCMA-Fc por 2 horas, e as células foram avaliadas por citometria de fluxo para STAT5 fosforilado. Para avaliar IFNγ e os níveis de citocinas TNFα, células T anti-BCMA CAR+ foram incubadas na presença de 0,1 µM ou 1 µM de lenalidomida ou um veículo e esferas conjugadas com 5 µg/mL, 50 µg/mL ou 200 µg/mL de 200 µg/mL de BCMA-Fc por 24 horas. As células foram fechadas em células CD3+ vivas e transduzidas e avaliadas por citometria de fluxo quanto à acumulação intracelular de citocinas de IFNγ e TNFα em células CD4+ e CD8+.
[895] Como mostrado na FIGURA 9E, uma estimulação de 2 horas com antígeno aumentou a porcentagem de células positivas para fósforo-STAT5 em comparação com o controle sem estimulação (mostrado com a linha pontilhada). Os resultados para os níveis intracelulares de citocinas de IFNy e TNFα de células T CAR anti-BCMA geradas a partir de um doador de células CAR-T normal representativo são mostrados na FIGURA 9F. Neste estudo, a produção de citocinas de células anti-BCMA CAR-T foi aumentada pela lenalidomida em uma ampla gama de níveis e concentrações de antígenos. b. Proliferação Celular
[896] A contagem total de células, monitorada no dia 4 (FIGURA 9G) e no dia 7 (FIGURA 9H), foi aumentada após a estimulação de células T anti-BCMA CAR+ com esferas de uma composição de esfera conjugadas com BCMA a 50 µg/mL, mas não 5 µg/mL de composição de esfera conjugadas com BCMA, em comparação com as células presentes no momento do início da incubação (linha tracejada). Um pequeno aumento na proliferação foi observado em células incubadas com esferas de 50 ug na presença de lenalidomida no dia 7.
[897] Para avaliar ainda mais a proliferação, as células que contêm células T que expressam CAR anti-BCMA foram marcadas com o corante marcador de proliferação CELLTRACE VIOLET (CTV; ThermoFisher Scientific, Waltham MA) de acordo com o protocolo do fabricante antes da incubação com esferas conjugadas com BCMA. A proliferação foi avaliada por diluição de corante usando citometria de fluxo em células que foram estimuladas com esferas a partir da composição de esfera conjugada com BCMA a 50 µg/mL. Comparado com a proliferação na ausência de lenalidomida, houve um ligeiro atraso na proliferação, avaliado por diluição de CTV na presença de lenalidomida no dia 4, mas não no dia 7 (FIGURA 9I). c. Expansão
[898] Quatro dias e sete dias após a adição de esferas conjugadas com BCMA, as células incubadas foram coradas com CD4 ou CD8 e com um anticorpo anti-EGFR para determinar a porcentagem de células positivas para EGFRt como substituto para células T CAR+. No momento do revestimento, 26% das células CD4+ expressaram CAR anti-BCMA e 39% das células CD8+ expressaram CAR anti-BCMA,
conforme determinado pela coloração com BCMA-Fc. A porcentagem de células T EGFRt+ CD4+ aumentou de cerca de 26% no início da incubação para mais de 40% no dia 4 (FIGURA 9J) e maior que 60% no dia 7 (FIGURA 9K) quando as células foram incubadas na presença de esferas de uma composição de esfera conjugada com BCMA a 50 µg/mL. Como mostrado na FIGURA 9K, a porcentagem de células T EGFRt+ CD8+ aumentou no dia 7 de cerca de 38% no início da incubação para mais de 60% quando as células foram incubadas na presença de esferas da composição de esfera conjugadas com BCMA a 50 µg/mL. A extensão da expansão celular foi maior quando as células foram incubadas na presença de esferas a partir de uma composição de esfera conjugada com BCMA a 50 µg/mL em comparação com esferas da composição de esfera conjugada a BCMA a 5 µg/mL. A presença de lenalidomida não afetou substancialmente a extensão da expansão das células T CAR+ neste estudo. d. Atividade Citolítica
[899] A atividade citolítica das células T CAR+ após a incubação com esferas conjugadas com BCMA foi avaliada por incubação com a linhagem celular alvo que expressa BCMA RPMI-8226, que é uma linhagem celular de mieloma múltiplo BCMA+. Após sete dias de incubação de células T anti-BCMA CAR+ com esferas conjugadas com BCMA (5 µg/mL ou 50 µg/mL) na presença ou ausência de lenalidomida, as esferas foram removidas das culturas e as células foram revestidas com células alvo RPMI-8226 na razão de células efetoras para células alvo de 3:1 ou 1:1 na presença ou ausência adicional de 5 µM de lenalidomida. Para realizar o ensaio citolítico, as células alvo RPMI-8226 foram marcadas com NucLight Red (NLR) para permitir o rastreamento das células alvo por microscopia. A atividade citolítica foi avaliada medindo a perda de células alvo viáveis durante um período de quatro dias, conforme determinado pelo sinal fluorescente vermelho (usando o
Sistema de Análise de Células Vivas INCUCYTE®, Essen Bioscience). O número de células viáveis foi normalizado para células no dia 0 antes da incubação com as células alvo RPMI-8226.
[900] Resultados exemplares na relação 1:1 de efetora para célula alvo são mostrados na FIGURA 9L. Como mostrado, as células T anti- BCMA CAR+ demonstraram morte eficaz no ensaio. As células T anti- BCMA CAR+ que foram estimuladas com esferas da composição de esfera conjugadas com BCMA a 5 µg/mL foram levemente menos eficientes na morte celular do que as células T CAR anti-BCMA que foram estimuladas com esferas da composição de esfera conjugadas com BCMA a 5 µg/mL. Para todas as condições, a pré-incubação com lenalidomida durante os sete dias de incubação antes do ensaio de morte aumentou a atividade citolítica das células T CAR+. A presença de lenalidomida durante o ensaio de morte celular não afetou substancialmente a atividade de morte. Não foi observada morte celular quando as células RPMI 8226 foram cultivadas sozinhas ou na presença de lenalidomida, demonstrando que a lenalidomida não influenciou diretamente a viabilidade celular alvo neste ensaio.
[901] Em outro estudo exemplar, as células T anti-BCMA CAR+ não foram tratadas ou foram incubadas por 24 horas ou por sete dias com esferas (diâmetro de cerca de 4,5 µm) a partir de uma composição de esfera conjugada com BCMA a 50 µg/mL gerada como descrito no Exemplo 1 na razão de esferas para células de 1:1. As células T anti- BCMA CAR+ foram removidas das culturas e incubadas com células alvo RPMI-8226 na razão de célula efetora 0,3:1 ou 1:1 para célula alvo. Para avaliar a resposta de citocinas às células alvo após incubação com esferas conjugadas com BCMA, os níveis de IFN gama foram medidos no sobrenadante. Como mostrado na FIG 9M. As células T anti-BCMA CAR+ que foram incubadas por 24 horas com as esferas conjugadas com BCMA produziram maior IFN-gama em comparação com as outras células testadas quando cultivadas com células alvo RPMI-8226 em qualquer razão. Como mostrado na FIGURA 9N para a razão de 1:1 célula efetora para alvo, as células T CAR anti-BCMA demonstraram morte eficaz após a incubação com esferas conjugadas com BCMA por 24 horas ou 7 dias, demonstrando que as células mantinham a função após a estimulação com as esferas. B. Restimulação Serial
[902] As composições de células T anti-BCMA CAR foram geradas a partir de três doadores diferentes, cada uma contendo células T expressando o mesmo CAR anti-BCMA, descongeladas e foram incubadas por sete dias com esferas (diâmetro de cerca de 4,5 µm) a partir de composição de esfera conjugada com BCMA a 50 µg/mL gerada como descrito no Exemplo 1 a uma razão de 1:1 de esferas para células. A incubação foi realizada na presença de 5 µM de lenalidomida ou na ausência de lenalidomida (controle com veículo). As células foram colhidas após 7 dias e substituídas por mais três rodadas até 28 dias, cada rodada envolvendo a reposição da densidade inicial de semeadura e a incubação por mais 7 dias na presença da mesma concentração de lenalidomida.
[903] Em cada redefinição após o pré-tratamento, a atividade citolítica foi avaliada por incubação com a linhagem celular alvo que expressa BCMA RPMI-8226 (rotulada com NucLight Red (NLR)) em uma razão de célula efetora para alvo (E:T) de 1:1 na presença adicional ou na ausência de lenalidomida. A atividade citolítica foi avaliada medindo a perda de células alvo viáveis por um período de até 80-150 horas, conforme determinado pelo sinal fluorescente vermelho (usando o Sistema de Análise de Células Vivas IncuCyte®, Essen Bioscience). As células de cada condição foram plaqueadas em triplicado. A % de morte celular em comparação com o controle apenas de veículo (definido em 100%) foi determinada.
[904] A FIGURA 10A mostra resultados para a atividade citolítica de células T anti-BCMA CAR+ de um doador exemplar após pré- tratamento por 7 dias, 14 dias ou 21 dias. Como mostrado, as células T anti-BCMA CAR+ que foram pré-incubadas com lenalidomida por 7 dias ou 14 dias exibiram maior atividade citolítica em comparação com células que não foram pré-incubadas na presença de lenalidomida. Neste doador, foi observada uma diminuição geral na eficácia de morte pelas células T anti-BCMA CAR+ que foram pré-incubadas com lenalidomida por 14 ou 21 dias em comparação com o dia 7. Efeitos semelhantes na atividade citolítica das células T anti-BCMA CAR+ após o pré-tratamento com lenalidomida por 7 ou 14 dias foram observados no doador; atividade citolítica após 21 dias pré-tratamento com lenalidomida não foi avaliada neste doador. Como mostrado na FIGURA 10B, foi observada maior eficácia de morte das células T anti-BCMA CAR+ neste doador em células que foram pré-incubadas com lenalidomida em todos os momentos. Exemplo 6: Transdução e expansão de células T anti-BCMA CAR+ na presença de esferas conjugadas com BCMA
[905] Amostras de leucaférese humana enriquecidas em células mononucleares foram obtidas de uma amostra de sangue total de um indivíduo usando um sistema de coleta de leucaférese. No mesmo dia da leucaférese, as células da amostra de leucaférese foram lavadas e ressuspensas em um tampão para uso em seleção baseada em afinidade, o tampão contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS), EDTA e albumina sérica humana. Para seleção baseada em imunoafinidade de células T, as células lavadas no tampão de seleção foram incubadas por 30 minutos em temperatura ambiente com esferas magnéticas acopladas a anticorpos monoclonais específicos para CD4 e CD8 e enriquecidas por seleção positiva usando uma coluna de separação magnética. As células CD4+ e CD8+ enriquecidas, na razão de 1:1, foram ressuspensas no meio de criopreservação e as células foram criopreservadas em um freezer de taxa controlada e armazenadas em nitrogênio líquido até uso posterior. Foram utilizadas células criopreservadas de 4 doadores diferentes.
[906] As células T CD4+ e CD8+ criopreservadas foram descongeladas, lavadas e depois contatadas com partículas de vetores lentivirais sem ativação prévia das células com um agente de ativação de células T, por exemplo, sem incubar as células com anti-CD3/anti- CD28. Para a transdução, foram adicionadas aproximadamente 1 x 10 6 das células T descongeladas aos poços individuais de uma placa de 96 poços. Partículas de vetor lentiviral, que foram pré-misturadas com um adjuvante de transdução de policatião (neste caso, 100 µg/mL de sulfato de protamina) foram adicionadas aos poços. As partículas do vetor lentiviral continham um ácido nucleico que codifica um transgene que codifica um CAR anti-BCMA e uma Sequência EGFR truncada (EGFRt) para uso como marcador de transdução, separada da sequência CAR por uma sequência T2A autoclivável. O volume final por poço foi ajustado para 100 µl. Cinco composições diferentes contendo células manipuladas para expressar CARs anti-BCMA foram preparadas usando os procedimentos descritos acima.
[907] As esferas conjugadas com BMCA-Fc e anti-CD28 (esferas designadas BCMA/anti-CD28) foram preparadas substancialmente como descritas no Exemplo 1. Imediatamente após a transdução, foram adicionados aproximadamente 50 µL das células geradas a partir de cada doador foram adicionados a 500 µL de meio contendo esferas conjugadas com BCMA / anti-CD28 ou esferas conjugadas com anti- CD3/anti-CD28 a uma razão de esferas de 1:1 por célula e incubadas por 12 dias.
[908] As células foram contadas a cada dois dias e coradas para expressão de EGFRt (um marcador substituto para expressão de CAR)
usando um anticorpo anti-EGFR nos dias 3, 7, 10 e 12 após a transfecção. Os dados mostraram que as composições de células T foram incubadas por até 12 dias na presença das esferas conjugadas anti-CD3/anti-CD28 expandidas na cultura, ocorrendo uma expansão de aproximadamente 95 a 140 vezes até o dia 12 da cultura. A expansão das células T simuladas de controle que não foram transduzidas, mas incubadas com as esferas conjugadas anti-CD3/anti-CD28, também exibiram uma expansão de cerca de 65 vezes no dia 12 em comparação com o início da incubação. A expansão de dobras das composições de células T que foram incubadas com esferas de BCMA / anti-CD28 imediatamente após a transdução foi de cerca de 1,0 a 7,0 vezes no dia
12.
[909] Como mostrado na FIGURA 11, as composições de células T que foram incubadas na presença de anti-CD3/anti-CD28 exibiram alta expressão do marcador de transdução de EGFRt, mesmo sem ativação das células antes da transdução com as partículas virais. Este resultado é consistente com a estimulação imediata sendo associada à expressão da superfície CAR. As células T estimuladas com esferas BCMA / anti-CD28 exibiram uma cinética mais longa para atingir a mesma porcentagem de células positivas para EGFRt, embora no dia 12 entre cerca de 60% e 90% das células fossem positivas para EGFRt. Os resultados indicam que, apesar do crescimento mais lento das células após a incubação com esferas BCMA / anti-CD28, em comparação com as esferas anti-CD3/anti-CD28, as células T CAR+ poderiam ser enriquecidas ao longo dos 12 dias de cultura, indicando que as esferas BCMA / anti-CD28 expandiram as células T CAR+.
[910] As células T incubadas nas condições descritas acima, sem ativação das células antes da transdução com partículas do vetor lentiviral, também foram coradas no dia 12 para expressão da superfície de CD4 e CD8 e analisadas por citometria de fluxo. Como controle, uma composição de células T gerada a partir de células doadoras, também na razão de 1:1 de células CD4+ e CD8+, foi ativada antes da transdução por estimulação com esferas anti-CD3/anti-CD28 por 24 horas antes de entrar em contato com as células ativadas com partículas de vetor lentiviral que expressam um CAR anti-BCMA como descrito acima; nesta condição, as células foram incubadas por mais 12 dias, mas na ausência de quaisquer esferas conjugadas.
[911] A tabela E2 resume os resultados das mesmas células doadoras incubadas nas condições acima. Como mostrado, a incubação de células com esferas conjugadas anti-CD3/anti-CD28 ou esferas BCMA / anti-CD28, sem ativação de células antes da transdução, alterou a razão de células T CD4/CD8 em comparação com as células que foram ativadas pela primeira vez 24 horas na presença de esferas conjugadas anti-CD3/anti-CD28 antes da transdução. Além disso, esses resultados mostraram que a incubação com as esferas conjugadas com anticorpo BCMA / anti-CD28 ou com as esferas conjugadas com anticorpo anti-CD3/anti-CD28, sem ativação prévia das células T, resultou em níveis de expressão de CAR similares e fenótipo de célula CD4/CD8 . Como mostrado na Tabela E3, foi observada uma reversão semelhante da razão de células T CD4/CD8 em células T derivadas de 4 doadores diferentes quando incubadas com esferas anti- CD3/anti-CD28, sem ativação das células antes da transdução, em comparação com células que foram ativadas pela primeira vez por 24 horas na presença de esferas conjugadas com anti-CD3/anti-CD28 antes da transdução.
Tabela E2: Porcentagem de células CD4+ e CD8+ em culturas de células T que foram tratadas com esferas conjugadas com antígeno e/ou anticorpo. Tratamento com esfera % de células % de células CD8+ CD4+ BCMA/anti-CD28 92,2 7,57 Anti-CD3/Anti-CD28 76,7 23,0 Anti-CD3/Anti-CD28 (24 h) 19,9 78,5 Tabela E3: Porcentagem de células CD4+ e CD8+ em culturas de células T que foram tratadas com esferas conjugadas com anticorpos. Doador Tratamento com % de células % de células esfera CD4+ CD8+ 1 Anti-CD3/Anti-CD28 65,6 29,7 2 Anti-CD3/Anti-CD28 68,0 27,8 3 Anti-CD3/Anti-CD28 61,8 32,6 4 Anti-CD3/Anti-CD28 76,8 21,9 4 Anti-CD3/Anti-CD28 19,9 76,8 (24 h) Exemplo 7: Geração de esferas conjugadas ROR1
[912] O receptor de tirosina-quinase tipo receptor órfão 1 (ROR1) foi conjugado a esferas por acoplamento covalente de um polipeptídeo de fusão ROR1-Fc, contendo o domínio extracelular do ROR1 humano fundido em seu C-terminal a uma região Fc de IgG, à superfície de esferas magnéticas ativadas por tosila disponíveis comercialmente (ThermoFisher, Waltham MA). As esferas eram esferas superparamagnéticas, não porosas, monodispersas e ativadas com tosila que se ligam covalentemente aos grupos amino primário e sulfidrila. A conjugação foi realizada utilizando esferas com um diâmetro de aproximadamente 2,8 µm (designado M-280) ou 4,5 µm (designado
M-450).
[913] O ROR1-Fc continha um fragmento de ROR1 humano e um IgG1 Fc humano unido a um ligante como segue:
QETELSVSAELVPTSSWNISSELNKDSYLTLDEPMNNITTSLGQTAEL HCKVSGNPPPTIRWFKNDAPVVQEPRRLSFRSTIYGSRLRIRNLDTT DTGYFQCVATNGKEVVSSTGVLFVKFGPPPTASPGYSDEYEEDGFC QPYRGIACARFIGNRTVYMESLHMQGEIENQITAAFTMIGTSSHLSDK CSQFAIPSLCHYAFPYCDETSSVPKPRDLCRDECEILENVLCQTEYIF ARSNPMILMRLKLPNCEDLPQPESPEAANCIRIGIPMADPINKNHKCY NSTGVDYRGTVSVTKSGRQCQPWNSQYPHTHTFTALRFPELNGGH SYCRNPGNQKEAPWCFTLDENFKSDLCDIPACDSKDSKEKNKMEILY GGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL
DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PGK (SEQ ID NO: 33).
[914] Várias concentrações da proteína de fusão ROR1-Fc foram adicionadas a aproximadamente 1 mL de esferas ativadas com tosila (por exemplo, 4 x 109 esferas ativadas com tosila com diâmetro de 2,8 µm) O acoplamento covalente foi realizado por incubação durante a noite a 37 ºC em solução tamponada com fosfato (PBS) contendo 0,1% de albumina sérica humana (HSA). As esferas foram lavadas e ressuspensas em 1 mL de PBS com HSA a 0,1%. Após a conjugação, a concentração de esferas foi determinada usando um Cellometer.
[915] As células T que expressam CAR anti-ROR1 são estimuladas por incubação com esferas conjugadas com ROR1 Fc. Exemplo 8: Geração de esferas conjugadas com CD22
[916] CD22 foi conjugado com esferas por acoplamento covalente de um polipeptídeo de fusão CD22-Fc, contendo o domínio extracelular de CD22 humano fundido em seu C-terminal a uma região Fc de IgG, para superfície de esferas magnéticas ativadas por tosila disponíveis comercialmente (ThermoFisher, Waltham MA). As esferas eram esferas superparamagnéticas, não porosas, monodispersas e ativadas com tosila que se ligam covalentemente aos grupos amino primário e sulfidrila. A conjugação foi realizada utilizando esferas com um diâmetro de aproximadamente 2,8 µm (designado M-280) ou 4,5 µm (designado M-450).
[917] O CD22-Fc continha o domínio extracelular de CD22 humano e um ser humano de Fc de IgG1 ligado com um ligante como segue:
DSSKWVFEHPETLYAWEGACVWIPCTYRALDGDLESFILFHNPEYNK NTSKFDGTRLYESTKDGKVPSEQKRVQFLGDKNKNCTLSIHPVHLND SGQLGLRMESKTEKWMERIHLNVSERPFPPHIQLPPEIQESQEVTLT CLLNFSCYGYPIQLQWLLEGVPMRQAAVTSTSLTIKSVFTRSELKFSP QWSHHGKIVTCQLQDADGKFLSNDTVQLNVKHTPKLEIKVTPSDAIV REGDSVTMTCEVSSSNPEYTTVSWLKDGTSLKKQNTFTLNLREVTK DQSGKYCCQVSNDVGPGRSEEVFLQVQYAPEPSTVQILHSPAVEGS QVEFLCMSLANPLPTNYTWYHNGKEMQGRTEEKVHIPKILPWHAGT YSCVAENILGTGQRGPGAELDVQYPPKKVTTVIQNPMPIREGDTVTL SCNYNSSNPSVTRYEWKPHGAWEEPSLGVLKIQNVGWDNTTIACAA CNSWCSWASPVALNVQYAPRDVRVRKIKPLSEIHSGNSVSLQCDFS SSHPKEVQFFWEKNGRLLGKESQLNFDSISPEDAGSYSCWVNNSIG QTASKAWTLEVLYAPRRLRVSMSPGDQVMEGKSATLTCESDANPPV SHYTWFDWNNQSLPYHSQKLRLEPVKVQHSGAYWCQGTNSVGKG RSPLSTLTVYYSPETIGRRGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 34).
[918] Várias concentrações da proteína de fusão CD22-Fc foram adicionadas a aproximadamente 1 mL de esferas ativadas com tosila (por exemplo, 4 X 109 esferas ativadas com tosila com diâmetro de 2,8 µm). Acoplamento covalente foi realizado por incubação durante a noite a 37 ºC em solução tamponada com fosfato (PBS). Esferas foram lavadas e ressuspensas em 1 mL de PBS com 0,1% de HSA. Após a conjugação, a concentração de esferas foi determinada usando um Cellometer.
[919] Células T que expressam CAR anti-CD22 são estimuladas por incubação com esferas conjugadas com CD22-Fc. Exemplo 9: Conjugação de anticorpo anti-idiotipo a esferas
[920] Um de dois diferentes anticorpo anti-CD19, anticorpo anti- idiotipo (ID), anticorpo anti-ID específico de scFv derivado de FMC63, (sequências estabelecidas na Tabela E4) foi covalentemente acoplado à superfície de esferas magnéticas ativadas por tosila comercialmente disponíveis (ThermoFisher, Waltham MA) que são esferas superparamagnéticas, não porosas, monodispersas e tosiladas. As esferas ligam-se covalentemente aos grupos amino e sulfidrila primários. A conjugação foi realizada utilizando esferas com um diâmetro de aproximadamente 2,8 µm (designado M-280) ou 4,5 µm (designado M-450). Tabela E4. Sequências anti-ID B-1 e B-2 Cadeia leve Cadeia Pesada Completa Variável Constante Completa Variável Constante (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO) NO) NO) NO) NO) NO) Anti-ID B-1 125 98 124 122 73 121 Aminoácido Anti-ID B-2 131 99 124 128 74 127 Aminoácido
[921] 200 µg de anticorpo anti-ID foram adicionados a aproximadamente 1 mL das esferas ativadas por tocila (por exemplo, aproximadamente 4 X 109 esferas ativadas por tocila com diâmetro de 2,8 µm ou cerca de 4 x 108 esferas ativadas por tosila com diâmetro de 4,5 µm) e acoplamento covalente foi realizado por incubação durante a noite a 37 ºC em solução tamponada com fosfato (PBS) contendo albumina de soro humano a 0,1% (HSA). As esferas foram lavadas e ressuspensas em 1 mL de PBS com HSA a 0,1%. Após a conjugação, a concentração de esferas foi determinada usando um Cellometer.
[922] Para avaliar a estabilidade das esferas conjugadas anti-ID, as esferas foram sedimentadas, o sobrenadante foi removido e carregado em um gel 4-12% de Bis-Tris SDS-PAGE e o gel foi corado com azul de Coomassie. Como um controle da proteína total conjugada nas esferas, as esferas peletizadas foram fervidas em tampão de amostra LSD 4X (dodecil sulfato de lítio) a cerca de 70 ºC por 20 minutos e aproximadamente 12,5 µL ou 25 µL de sobrenadante fervido em aproximadamente também foi executado em gel SDS-PAGE e avaliado pelo azul de Coomassie. Aproximadamente 2,5 µg ou 5,0 µg de anticorpo anti-ID que não foram conjugados com as esferas (controle positivo) ou 5 µL de HSA a 0,1% (controle negativo) também foram avaliados por coloração com SDS-PAGE e azul de Coomassie. Não foi detectado anticorpo anti-ID no sobrenadante de amostras conjugadas que não haviam sido fervidas, indicando que a conjugação era estável, enquanto anticorpo anti-ID foi detectado no sobrenadante de amostras conjugadas que foram fervidas. Exemplo 10: Avaliação da estimulação de células T cultivadas com esferas conjugadas com anticorpo anti-idiotipo
[923] As esferas conjugadas com B-1 anti-ID específicas de scFv derivadas de FMC63 foram incubadas com células T. As células T purificadas por CD3 foram isoladas por enriquecimento à base de imunoafinidade a partir de amostras de leucaférese de doadores saudáveis. As células isoladas foram transduzidas com um vetor viral que codifica um CAR anti-CD19 com um scFv derivado de FMC63. O construto do vetor viral codificou ainda um EGFR truncado (EGFRt), que serviu como um marcador substituto para a expressão de CAR; a região codificadora de EGFRt foi separada da sequência CAR por uma sequência de salto T2A. Após transduções, as células foram expandidas em cultura e congeladas por criopreservação.
[924] Para estudos de estimulação de células T, as células que expressam CD4+ ou CD8+ descongeladas foram semeadas separadamente em aproximadamente 50.000 células totais por poço. Em alguns casos, o meio de cultura foi suplementado adicionalmente com citocinas da seguinte forma: para células CD4+, aproximadamente 1200 UI/mL de IL-7 recombinante, 20 UI/mL de IL-15 recombinante e 100 UI/mL de IL-2 recombinante; para células CD8+, aproximadamente 200 UI/mL de IL-2 recombinante e 20 UI/mL de IL-15 recombinante. As esferas conjugadas com B-1 anti-ID foram adicionadas às células na razão de célula:esfera 1:1 ou 1:5 e incubadas até 14 dias com uma troca de meio de 50% a cada 2-3 dias. Como controle positivo, as células foram cultivadas com esferas magnéticas anti-CD3/anti-CD28 na razão 3:1 célula:esfera na presença ou ausência das citocinas indicadas.
[925] Em vários momentos da cultura, as células transduzidas CD4+ ou CD8+ (como detectadas pelo anti-EGFR para expressão do marcador substituto) foram avaliadas quanto à expansão, expressão de PD-1 e viabilidade.
[926] Como mostrado nas FIGURA12A e 12B, a expansão das células T CD4+ e CD8+, respectivamente, foi observada quando as células foram cultivadas com esferas conjugadas anti-ID na razão 1:1 ou 1:5 célula:esfera, particularmente na presença de citocinas. A extensão da expansão foi maior do que quando as células foram cultivadas com as esferas magnéticas de controle anti-CD3/anti-CD28.
[927] A expressão da superfície de PD-1 no subconjunto de células CD4+ foi avaliada por citometria de fluxo nos dias 3, 7, 10 e 14 de cultura. Como mostrado na FIGURA 13, a expressão de PD-1 era alta em células cultivadas com esferas magnéticas anti-CD3/anti-CD28, no entanto, os níveis de PD-1 eram substancialmente mais baixos ou indetectáveis em células que foram cultivadas com esferas conjugadas com anti-ID.
[928] Como mostrado na FIGURA 14, a porcentagem de viabilidade das células T CD4+ e CD8+ cultivadas com a razão 1:1 ou 1:5 de esferas conjugadas anti-ID ou as esferas conjugadas anti- CD3/anti-CD28 de controle permaneceu consistentemente alta durante o período de cultura quando as células foram adicionalmente cultivadas na presença de citocinas. Sob todas as condições, no entanto, a viabilidade das células diminuiu na ausência de citocinas adicionadas, com a maior perda na viabilidade celular ocorrendo nos dias posteriores da cultura celular. Exemplo 11: Avaliação da produção de citocinas de células T cultivadas com esferas conjugadas com anticorpo anti-idiotipo
[929] As células T manipuladas com um CAR anti-CD19 com um scFv derivado de FMC63 foram geradas substancialmente como descrito no Exemplo 10. As células T CD8+ descongeladas foram cultivadas com esferas conjugadas B-1 anti-ID por 4 horas na presença de inibidor de Golgi. Os níveis intracelulares de citocinas de TNFα, IFNγ e IL-2 foram determinados por citometria de fluxo no subconjunto de células T CAR+ (conforme determinado pela coloração positiva da superfície com anti-EGFR para o marcador substituto) ou no subconjunto de células CAR-T (conforme determinado por coloração negativa da superfície com anti-EGFR). Como comparação, as células T CAR+ (EGFRt+) também foram cultivadas com células alvo que expressam CD19 (células K562 transduzidas para expressar CD19,
K562-CD19) na razão célula efetora:T de 1:2.
[930] Como mostrado na FIGURA 15A, níveis de citocina intracelular TNFα, IFNγ e IL2 foram induzidos em células T CAR+ (EGFRt+), mas não em células CAR-T (EGFRt-), quando as células foram cultivadas na presença das esferas conjugadas anti-ID B-1. Neste estudo, a extensão da estimulação observada na presença de esferas conjugadas anti-ID foi semelhante à estimulação de células T CAR+ usando células K562-CD19 que expressam antígeno, que é um reagente de estimulação alternativo específico para CAR (FIGURA 15B). Estes resultados demonstraram que o anti-ID conjugado com as esferas é agonístico e estimula especificamente células T que expressam um CAR com um domínio de ligação de antígeno reconhecido pelo anticorpo anti-ID. Além disso, o reagente de esferas fornece um melhor reagente de estimulação específico para CAR comparado às linhagens celulares, que requerem cultura de células e são propensas a variabilidade de lotes a lotes. Exemplo 12: Avaliação da Expansão Após Reestimulação Serial
[931] A capacidade das células de se expandir ex vivo após estímulos repetidos pode ser um substituto potencial para a capacidade das células T CAR+ de persistência (por exemplo, após a ativação inicial) e/ou é indicativa da função in vivo (Zhao et al. (2015) Cancer Cell, 28: 415-28). As células T CAR+ foram geradas como descrito acima e as células T que expressam CAR CD4+ ou CD8+ descongeladas foram plaqueadas separadamente a 50.000 células CAR+ / poço. As esferas conjugadas com B-1 anti-ID foram adicionadas às células na razão de célula:esfera 1:1 ou 1:5 na presença ou ausência de citocinas, conforme descrito no Exemplo 10. Como controle, esferas magnéticas anti- CD3/anti-CD28 foram adicionadas às células na razão de 3:1 célula:esfera na presença ou ausência das citocinas. As células foram colhidas a cada 3-4 dias e contadas e reestimuladas com novas células alvo usando as mesmas condições de cultura após a redefinição do número de células para a densidade inicial de semeadura para cada rodada. Um total de 4 ciclos de estimulação durante um período de cultura de 14 dias foi realizado. Para cada rodada de estimulação, foi determinado o número de duplicações.
[932] Como mostrado na FIGURA 16, foi observada expansão celular contínua de células CD4+ (EGFRt+) que expressam CAR após a reestimulação com esferas conjugadas com anti-ID, embora o grau de expansão fosse maior quando as células eram cultivadas na presença de citocinas. Além disso, a extensão da expansão foi maior do que quando as células foram cultivadas com esferas anti-CD3/anti-CD28. Para células T CD8+, cinéticas de expansão semelhantes foram observadas quando as células foram cultivadas na presença de esferas conjugadas anti-ID ou esferas anti-CD3/anti-CD28, embora a expansão tenha sido um pouco maior quando as células foram cultivadas com esferas conjugadas anti-ID, particularmente na ausência de citocinas recombinantes adicionadas. Exemplo 13: Análise Adicional de Expansão Celular Específica de CAR usando Esferas Conjugadas com Anticorpo Anti-idiotipo
[933] Estudos semelhantes aos descritos nos Exemplos 11 e 12 foram realizados, exceto usando células T expressando CAR geradas a partir de dois doadores de pacientes diferentes. As células T purificadas de CD3 foram isoladas de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de dois pacientes doadores, transduzidas com um vetor viral que codifica um CAR anti-CD19 com um scFv derivado de FMC63, expandido em cultura, congelado e descongelado.
[934] CD4+, CD8+ descongeladas ou coculturas de CD4/CD8 (razão 1:1) foram semeadas em poços de uma placa de 6 poços a aproximadamente 5 x 106 células totais / poço em meio de cultura que foi suplementado adicionalmente com citocinas como segue: para células CD4+ ou coculturas CD4+/CD8+, o meio foi suplementado com aproximadamente 1200 UI/mL de IL-7 recombinante, 20 UI/mL de IL-15 recombinante e 100 UI/mL de IL-2 recombinante; para células CD8+, o meio foi suplementado com 200 UI/mL de IL-2 recombinante e 20 UI/mL de IL-15 recombinante. As esferas conjugadas com B-1 anti-ID foram adicionadas às células na razão 1:1 célula:esfera e incubadas por até 9 dias com uma troca de meio de 50% a cada 2-3 dias.
[935] Em vários momentos da cultura, o número de células transduzidas CD4+ ou CD8+ (como detectadas pelo anti-EGFR para expressão do marcador substituto do EGFRt) presentes na cultura para cada condição foi avaliado e a expansão de desdobramento ou a frequência das células que expressam CAR como uma porcentagem do total de células foi determinada. A expressão de PD-1 e CD25 e a viabilidade celular também foram determinadas.
[936] Como mostrado na FIGURA 17A, foi observada uma expansão de mais de 60 vezes as células T CD4+ que expressam CAR (EGFRt+) quando as células CD4+ foram cultivadas sozinhas com esferas conjugadas anti-ID. Para células T CD8+, ocorreu uma expansão substancialmente mais alta de células T CD8+ (EGFRt+) que expressam CAR na presença de esferas conjugadas anti-ID quando as células T CD8+ foram cocultivadas com células CD4+. Como mostrado na FIGURA 17B, a frequência de CD4+ ou CD8+ que expressam CAR (EGFRt+) aumentou durante os 9 dias de cultura na presença das esferas conjugadas anti-ID com >90% das células transduzidas (EGFRt+) presentes na cultura no dia 9. Viabilidade de células CD4+ e CD8+ também permaneceu próxima a 100% durante a cultura, com viabilidade um pouco maior de células T CD8+ observada quando cocultivadas com células T CD4+ (FIGURA 17C). Resultados semelhantes foram observados para ambos os doadores. Os resultados são consistentes com um enriquecimento de células T CAR+, sem seleção prévia de CAR através do uso de esferas conjugadas com anticorpo anti-idiotipo específico de CAR.
[937] A expressão da superfície de PD-1 e CD25 em células CD4+ ou CD8+ transduzidas (EGFR +) foi avaliada por citometria de fluxo nos dias 5, 7 e 9 de cultura com as esferas conjugadas anti-ID. Como mostrado na FIGURA 18A, a expressão de PD-1 nas células T CD4+ e CD8+ diminuiu substancialmente ao longo do tempo da cultura com esferas conjugadas anti-ID. Como mostrado na FIGURA 18B, a expressão de CD25 também diminuiu após 9 dias de cultura na presença de esferas conjugadas com anti-ID. Resultados semelhantes foram observados para ambos os doadores. Exemplo 14: Comparação de Níveis de Citocina e Fenótipo Após Cultura com Esferas Conjugadas de Anticorpos Anti-idiotipo
[938] As células T purificadas de CD3 foram isoladas de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de dois pacientes doadores, transduzidas com um vetor viral que codifica um CAR anti- CD19 tendo um scFv derivado de FMC63 e expandido em cultura com esferas revestidas com anticorpo anti-CD3 e anti-CD28. Após a expansão, as células T expandidas foram congeladas por criopreservação. Para os estudos, as células T congeladas foram descongeladas e as células T CD4+ e CD8+ avaliadas quanto aos níveis de citocinas intracelulares ou fenótipo de superfície (d = 0) ou células T de cocultura de CD4+, CD8+ ou CD4+/CD8+ descongeladas foram cultivadas por mais 9 dias na presença de esferas conjugadas com B-1 anti-ID antes de avaliar os níveis intracelulares de citocinas e o fenótipo do marcador de superfície após estimulação por células K562 transduzidas por PMA / ionomicina ou CD19 (d = 9).
[939] Para avaliação dos níveis intracelulares de citocinas, o inibidor de Golgi foi adicionado por 4 horas e, em seguida, TNFα, IFNγ e IL-2 foram avaliados por citometria de fluxo. Para todas as condições,
a extensão da expressão intracelular de citocinas foi substancialmente maior quando as células foram estimuladas com PMA / ionomicina em comparação com a estimulação específica de CAR com células K562 transduzidas por CD19. Como mostrado na FIGURA 19A, os níveis de citocinas TNFα e IL-2 foram semelhantes nas células CD4+ ou CD8+ imediatamente após o descongelamento em comparação com as células CD4+ ou CD8+ correspondentes, ou coculturas de células T CD4/CD8, adicionalmente cultivadas na presença de esferas conjugadas anti-ID por 9 dias. Níveis elevados de IFNγ foram observados nas células T descongeladas CD4+, CD8+ ou CD4/CD8 que foram cultivadas na presença de esferas conjugadas anti-ID por 9 dias em comparação com o nível de IFNγ nas células T CD4+ ou CD8+ imediatamente após descongelamento. Estes resultados demonstraram que a função das células T foi mantida em comparação com células T CAR+ descongeladas recentemente, após uma expansão de 9 dias com esferas conjugadas anti-ID. Resultados semelhantes foram obtidos nas células dos dois doadores.
[940] A expressão da superfície do marcador de ativação CD25, a expressão da superfície dos receptores inibitórios PD-1 e LAG-3 e a expressão nuclear do marcador de proliferação Ki-67 também foram avaliadas em células CD4+ ou CD8+ imediatamente após o descongelamento (d = 0) ou em células T CD4+ ou CD8+ expandidas sozinhas ou como uma cocultura CD4/CD8 por mais 9 dias na presença das esferas conjugadas anti-ID (d = 9). Como mostrado na FIGURA 19B, expressão reduzida de CD25, mas não de Ki-67, foi observada em células que foram posteriormente cultivadas na presença de esferas conjugadas com anti-ID por 9 dias em comparação com células T imediatamente após o descongelamento. A expressão reduzida de CD25 foi substancialmente maior nas células CD8+ do que nas células CD4+. Além disso, a expressão reduzida de PD-1 e LAG-3 também foi observada em células CD4+ e CD8+ cultivadas sozinhas ou como uma cocultura CD4/CD8 após incubação por 9 dias com esferas conjugadas anti-ID em comparação com a expressão nas células imediatamente depois de descongelar. Este resultado demonstrou que, após a incubação com as esferas conjugadas com anti-ID, as células transduzidas anteriormente congeladas mantinham a capacidade funcional, como é evidente pela alta porcentagem de células positivas para o marcador Ki-67, indicativo de proliferação celular, mas também exibiram um diferente estado de ativação caracterizado pela baixa expressão de superfície do marcador de ativação CD25 e dos marcadores de receptor inibitório PD-1 e LAG-3. Exemplo 15: Efeito de Estimulação de Esferas Conjugadas Anti- BCMA ou Esferas Conjugadas Anti-BCMA/PD-L1 na Expressão e/ou Sinalização de PD-1
[941] Células CAR-T anti-BCMA, geradas a partir de amostras de doadores saudáveis representativos ou material derivado de paciente com mieloma múltiplo, e cultivadas com esferas conjugadas com BCMA-Fc a 50 µg/mL (geradas como descrito no Exemplo 1) na razão de 1:1 esfera:célula T CAR+ por 7 dias, na presença de 1 de 1 µM de lenalidomida ou um controle com veículo. A expressão de CD25, PD-1, Tim3 e Lag3 em células T CAR (utilizando um anticorpo para marcador CAR substituto) cultivadas sob as diferentes condições foi então avaliada por citometria de fluxo.
[942] Essas células anti-BCMA CAR-T pré-estimuladas com esferas na presença ou ausência de lenalidomida ou células anti-BCMA CAR-T descongeladas, geradas a partir de amostras de doadores comparáveis, foram então desfeitas das esferas, lavadas e cultivadas com RPMI-8226 células alvo (rotuladas com NucLight Red (NLR) para permitir seu rastreamento por microscopia), na presença de 1 µM de lenalidomida ou de um controle com veículo. Especificamente, para células pré-tratadas nas quais o pré-tratamento foi realizado na presença de lenalidomida, as células foram cultivadas com as células alvo na presença de lenalidomida; do mesmo modo, para células pré- tratadas nas quais o pré-tratamento foi realizado na presença de veículo, as células foram cultivadas com as células alvo na presença de veículo. Após a cocultura, a atividade citolítica foi avaliada medindo a perda de células alvo viáveis durante um período de sete dias, conforme determinado pelo sinal fluorescente vermelho. A percentagem de morte foi normalizada para células T anti-BCMA CAR pré-estimuladas em esferas na presença de veículo. A produção de citocinas foi avaliada por ELISA a partir do sobrenadante após a cultura com células alvo por 24 horas. Os experimentos foram realizados duas vezes em três doadores. Modelos lineares de efeito fixo ou efeito misto foram utilizados para avaliar a significância dos tratamentos com lenalidomida na atividade citolítica e na produção de citocinas, com tratamento, doador e tempo tratados como efeitos fixos e animais tratados como efeito aleatório, aninhados com o tempo quando medidas repetidas foram derivadas do mesmo animal. Os valores P foram obtidos por testes de razão de verossimilhança comparando o modelo completo com o efeito do interesse em relação ao modelo sem o efeito do interesse.
[943] A FIGURA 20A mostra resultados para a atividade citolítica específica do antígeno CAR e a FIGURA 20B mostra resultados para a produção de citocinas para células CAR-T anti-BCMA que foram pré- estimuladas com esferas de BCMA (em comparação com células CAR- T anti-BCMA descongeladas recentemente (não pré-estimuladas)) nas coculturas, comparando células cultivadas em presença versus ausência de lenalidomida. As células T CAR estimuladas apresentaram diminuição da atividade citolítica (P = 2,1 x 10-4) e produção de citocinas (P = 0,03 para IFN-γ) em comparação com as células T anti-BCMA CAR descongeladas recentemente.
[944] Na ausência de lenalidomida no pré-tratamento e subsequente cocultura, os resultados das células CAR-T pré- estimuladas exibiram redução na morte celular e produção de citocinas em comparação com as células CAR-T frescas, indicando que a pré- estimulação crônica leva ao comprometimento funcional. Estes resultados são consistentes com um fenótipo do tipo exaustão que foi induzido por pré-estimulação nas esferas conjugadas com BCMA. A presença de lenalidomida durante o período de pré-estimulação preservou a função citolítica (P = 0,04) e houve uma tendência ao aumento da produção de citocinas em comparação com as células expostas ao veículo durante o período de pré-estimulação (FIGURA 24B). A presença de lenalidomida neste ensaio foi consistente com uma observação de que a lenalidomida pode reduzir os fenótipos funcionais do tipo exaustão nas células CAR-T pré-estimuladas.
[945] Como mostrado na FIGURA 20C, foi avaliado o fenótipo de células T anti-BCMA CAR estimuladas por 7 dias nas esferas de BCMA, e a adição de lenalidomida aumentou significativamente a viabilidade CAR+ do material T anti-BCMA CAR em três doadores saudáveis (P = 0,04). A adição de lenalidomida não alterou a contagem total de células em todos os doadores neste período de 7 dias, e não foram observadas diferenças significativas na porcentagem de CAR+ entre as células T CAR tratadas com veículo e lenalidomida. A FIGURA 20D mostra resultados representativos da análise citométrica de fluxo da expressão CD25 e PD-1 de superfície (intensidade fluorescente média (MFI)) para células T CD4+ ou CD8+ anti-BCMA CAR após estimulação (pré- tratamento) com esferas de BCMA por 7 dias, na presença ou ausência de lenalidomida a 1 µM. Como mostrado, os resultados indicaram que a lenalidomida reduziu a expressão de PD-1 das células BCMA-CAR-T, enquanto aumentava a expressão de CD25 após estimulação prolongada. Como mostrado na FIGURA 20E, a análise citométrica de fluxo entre os três doadores T CAR indicou que a adição de lenalidomida aumentou a expressão de superfície de Tim3 na população CD8+ (P = 4,0 x 10-4), com efeitos mistos na população CD4+ CAR+. Em todos os doadores e nas populações CD4+ e CD8+ CAR+, lenalidomida aumentou CD25 (CD4+ e CD8+; P = 2,2 x 10-16) e a porcentagem positiva para a expressão de Lag3 (CD8+ P < 0,03; CD4+ P = 0,002). Notavelmente, também houve uma diminuição na porcentagem de células PD-1+ observado na população CD4+ (P = 0,04), com 2 de 3 doadores mostrando uma diminuição na população de CD8+ também.
[946] Em outro estudo, esferas conjugadas com BCMA humano recombinante foram usadas para estimular células T CAR em várias concentrações para titular a magnitude da estimulação, estimulação quer baixa (5 µg/mL), média (50 µg/mL) e alta (200 µg/mL). Em uma condição de estimulação média, a produção de citocinas secretadas 24 horas após a estimulação foi medida e um aumento de 200% nas concentrações de IL-2 e TNF-α foram observados em comparação com o controle com veículo, com aumentos dependentes de doadores em IFN-γ (FIGURA 21A). As células foram estimuladas com esferas conjugadas com BCMA por 24 horas na presença de 0,1 µM ou 1,0 µM de lenalidomida ou controle com veículo. Um inibidor transporte de proteínas foi adicionado nas horas finais de incubação, e as células foram coradas para IL-2 intracelular, IFN-γ e TNF-α.
[947] As células T anti-BCMA CAR ativadas nas esferas de BCMA mostraram efeitos dependentes do nível de estimulação na produção de citocinas, com 5 µg de esferas de BCMA causando produção limitada de citocinas efetoras de T CAR em comparação com as esferas de 50 µg e 200 µg de BCMA (FIGURA 21B). A lenalidomida aumentou a porcentagem de coloração intracelular por IFN-γ+ e TNF-α+ em todos os níveis de estimulação para as células T CD4+ e CD8+ CAR. A magnitude da estimulação aumentou ou diminuiu IL-2 em resposta à lenalidomida, com a lenalidomida diminuindo a porcentagem de células T-IL-2+ CAR+ a 50 µg e 200 µg de estimulação, mas aumentando a porcentagem de células T IL-2+ CAR+ na condição de estimulação de 5 µg. Na ausência de estimulação, a lenalidomida não teve efeito na produção de citocinas T CAR, indicando que o aprimoramento de citocinas fornecido pela lenalidomida requer estimulação.
[948] Em outro estudo, as células foram cultivadas na presença de esferas de BCMA geradas como descrito no Exemplo 1, com ou sem conjugação adicional de PD-L1-Fc recombinante humana. Células T CAR derivadas de doador ou paciente saudáveis foram estimuladas na presença de esferas conjugadas com BCMA ou esferas conjugadas com BCMA / PD-L1 por 24 horas na presença de lenalidomida a 1 µM. A produção de citocinas foi medida no sobrenadante. Os resultados são mostrados na FIGURA 21C. Como mostrado na FIGURA 25C, a avaliação das células T CAR do doador saudáveis e dos pacientes demonstrou que a adição de PD-L1 recombinante às esferas de BCMA recombinante reduziu IFN-γ, IL-2 e TNF-α. Foi demonstrado que o tratamento com lenalidomida potencializou os níveis de citocinas segregadas além daqueles das células T CAR tratadas com veículo na presença de PD-L1. Os resultados foram consistentes com a conclusão de que a produção de citocinas anti-BCMA CAR-T após a incubação com esferas conjugadas com BCMA foi aumentada pela lenalidomida na presença de inibição mediada por PD-L1. Exemplo 16: Avaliação de Produção de Citocinas por Células T Anti-BCMA CAR Estimuladas com Esferas Conjugadas com BCMA
[949] As células T anti-BCMA CAR foram geradas geralmente como descritas no Exemplo 2. As células T anti-BCMA CAR foram formuladas na razão de 1:1 de células T CD4+ e CD8+ e foram descongeladas e cultivadas a 5,0 x 105 células por poço em uma placa de 96 poços. Esferas conjugadas com anticorpo anti-CD3 / anti CD28 ou esferas conjugadas com BCMA com 4,5 ou 2,8 µm de diâmetro (a partir de uma composição de esfera conjugadas com BCMA de 5 µg/mL, 50 µg/mL ou 200 µg/mL, adicionadas conforme descrito no Exemplo 1) foram adicionadas às culturas na razão de células CAR-T anti-BCMA para esferas de 1:1. As células CAR-T anti-BCMA cultivadas na ausência de anticorpo anti-CD3/anti-CD28 ou esferas conjugadas com BCMA serviram como controle.
[950] Após uma incubação de vinte e quatro horas, a presença de IFN-gama, IL-2, TNF-alfa, IL-6, GM-CSF e IL-4 em sobrenadantes da cultura foi avaliada usando um imunoensaio de citocinas multiplex (Luminex ®). Como mostrado na FIGURA 22A, a incubação com esferas conjugadas com anticorpo anti-CD3/anti-CD28 resultou em concentrações mais altas de citocinas presentes no sobrenadante em comparação com a incubação com esferas conjugadas com BCMA. Neste ensaio, a magnitude da produção de citocinas a partir de células incubadas com esferas conjugadas com BCMA era dependente da dose, correlacionando-se com concentrações crescentes de BCMA (ou seja, 5 µg/mL, 50 µg/mL ou 200 µg/mL) usadas para a conjugação de esferas. Este resultado é consistente com a descoberta de que a ativação do CAR direcionada ao BCMA pode ser controlada e titulada pela variação da quantidade de BCMA conjugado às esferas. Comparações da liberação de citocinas após a incubação com esferas conjugadas com anticorpo anti-CD3/anti-CD28 ou esferas conjugadas com BCMA revelaram diferenças em magnitude e qualidade da produção de citocinas, com um perfil de liberação de citocinas mais semelhante ao Th1 observado após a estimulação com esferas conjugadas com BCMA.
[951] As células CAR-T anti-BCMA foram cultivadas como descritas acima e avaliadas quanto aos níveis de citocinas intracelulares por citometria de fluxo. As células T anti-BCMA CAR foram incubadas com esferas conjugadas com anticorpo anti-CD3/anti-CD28 ou esferas conjugadas com BCMA na razão de células CAR-T anti-BCMA para esferas de 1:1 por vinte horas, seguidas de quatro horas de incubação com um inibidor de transporte de proteínas. As células foram coradas quanto à viabilidade, expressão de CAR, CD4 e CD8, depois fixadas, permeabilizadas e coradas para níveis intracelulares de IFN-gama, IL-2 e TNF-alfa. Como mostrado na FIGURA 22B, a estimulação com esferas conjugadas com BCMA resultou na produção de citocinas nas células que expressam CD4+ e CD8+ anti-BCMA CAR. Semelhante ao anterior, a magnitude dos níveis de citocinas intracelulares parecia correlacionar-se com a quantidade de BCMA conjugado às esferas. Exemplo 17: Geração de esferas conjugadas com anticorpo anti- CD19 anti-ID e anticorpo anti-CD2
[952] Esferas revestidas de anticorpo anti-CD2 e anticorpo anti- CD19 foram geradas. O anticorpo anti-CD2 de camundongo (clone RPA-2.10, ED biosciences) e o anticorpo anti-ID B-2 anti-idiotípico descrito no Exemplo 9 foram acoplados covalentemente à superfície do superparamagnético ativado por tosila comercialmente disponível, com um diâmetro de aproximadamente 4,5 µm (designado M-450; ThermoFisher, Waltham MA).
[953] Aproximadamente 6,67 x 10-10 mol de cada anticorpo foi adicionado por 1 mL das esferas ativadas por tocila (por exemplo, aproximadamente 4 x 108 esferas/mL) e o acoplamento covalente foi realizado por incubação durante a noite a 37 ºC em solução tamponada com fosfato (PBS) contendo albumina sérica humana a 0,1% (HSA). As esferas foram lavadas e ressuspensas em 1 mL de PBS com HSA a 0,1%. Após a conjugação, a concentração de esferas foi determinada usando um Cellometer. Com base na concentração de acoplamento e na contagem de esferas, o número aproximado de moléculas nas esferas foi de 1,58 x 106 moléculas de anticorpo por esfera. As esferas revestidas com anticorpo foram suspensas em solução a uma concentração de 4,1 x 108 esferas/mL.
[954] A estabilidade das esferas conjugadas com anticorpo foi avaliada granulando as esferas conjugadas com anticorpo, executando o sobrenadante resultante em um gel Bis-Tris 4-12% e corando o gel para proteína com azul de Coomassie. Como controle da proteína total conjugada nas esferas, também foi avaliada uma amostra de 10 µL de sobrenadante de esferas granuladas que foram fervidas em tampão de amostra de LDS. Os controles também incluíram a avaliação de 1 µg de anticorpo anti-CD2, 1 µg de anticorpo anti-ID B-2 que não haviam sido conjugados com as esferas (controles positivos) e 5 µL de HSA a 0,1% (controle negativo). As bandas correspondentes aos anticorpos foram detectadas na amostra com o sobrenadante da amostra fervida. Não foi detectado anticorpo anti-ID no sobrenadante de amostras conjugadas que não haviam sido fervidas, consistente com uma conjugação estável. Exemplo 18: Geração de Esferas Conjugadas de Anticorpo Anti- CD19, anti-ID e anticorpo anti-CD28
[955] Esferas revestidas com anticorpo anti-CD28 e anticorpo anti- CD19 foram geradas. O anticorpo anti-CD28 de camundongo (clone CD28.2 purificado de baixa endotoxina, livre de azida (LEAF) (Biolegend) e o anticorpo idiotípico anti-ID B-2 descrito no Exemplo 9 foram acoplados covalentemente à superfície do superparamagnético ativado por tosila comercialmente disponível com um diâmetro de aproximadamente 4,5 µm (designado M-450; ThermoFisher, Waltham MA). Aproximadamente 6,67 x 10-10 mol de cada anticorpo foram adicionados por 1 mL das esferas ativadas por tocila (por exemplo, aproximadamente 4 x 108 esferas/mL) e acopladas covalentemente substancialmente como descrito no Exemplo 17. Com base na concentração de acoplamento e na contagem de esferas, o número aproximado de moléculas nas esferas foi de 1,79 x 106 moléculas de anticorpo por esfera. As esferas revestidas de anticorpos foram suspensas em solução a uma concentração de 3,2 x 108 esferas/mL, conforme determinado com um Cellometer. Exemplo 19: Geração de esferas contendo anticorpo Anti-CD19 conjugado com superfície Anti-ID, Anti-CD2 e Anti-CD28
[956] Esferas paramagnéticas revestidas com esferas revestidas de anticorpos anti-CD2, anti-CD28 e anticorpo anti-CD19. Anticorpo anti-CD2 de camundongo (clone RPA-2.10, biociências ED), anti-CD28 de camundongo (clone CD28.2 purificado por LEAF, Biolegend) e o anticorpo idiotípico anti-ID B-2 descrito no Exemplo 9 foram acoplados covalentemente à superfície do superparamagnético ativado por tosila comercialmente disponível com um diâmetro de aproximadamente 4,5 µm (designado M-450; ThermoFisher, Waltham MA).
[957] Aproximadamente 4,44 x 10-10 mol de cada anticorpo foram adicionados por 1 mL das esferas ativadas por tocila (por exemplo, aproximadamente 4 x 108 esferas/mL) e foram acopladas covalentemente substancialmente como descrito no Exemplo 17. Com base na concentração de acoplamento e na contagem de esferas, o número aproximado de moléculas nas esferas foi de 1,56 x 106 moléculas de anticorpo por esfera. As esferas revestidas com anticorpo foram suspensas em solução a uma concentração de 3,91 x 108 esferas/mL.
[958] A estabilidade das esferas conjugadas com anticorpo foi avaliada granulando as esferas conjugadas com anticorpo, executando o sobrenadante resultante em um gel Bis-Tris 4-12% e corando o gel para a proteína com azul de Coomassie. Como controle da proteína total conjugada nas esferas, foram avaliados 10 µL de sobrenadante de esferas granuladas que foram fervidas em tampão de amostra de LDS. Controles adicionais que foram avaliados também 1 µg de anticorpo anti CD2, 1 µg de anticorpo anti-ID B-2 que não foram conjugados às esferas
(controles positivos) e 5 µL de HSA a 0,1% (controle negativo). Não foi detectado anticorpo anti-ID no sobrenadante a partir de amostras conjugadas que não haviam sido fervidas, indicando que a conjugação era estável, enquanto bandas correspondentes aos anticorpos foram detectadas no sobrenadante carregado da amostra fervida. Exemplo 20: Ensaio in vitro para Estimulação Crônica de Células T CAR+ Utilizando Esferas Conjugadas Anti-ID
[959] Composições separadas de células CD4+ e CD8+ foram isoladas de doadores humanos, ativadas e transduzidas com um vetor viral que codifica um CAR anti-CD19 com um scFv derivado de FMC63. As células T CD4+ e CD8+ de cada doador foram então colhidas, formuladas e congeladas separadamente. As células T CD4+ e CD8+ criocongeladas foram descongeladas e formuladas na razão de 1:1 de células T CD4+ e CD8+ do mesmo doador para gerar uma composição de células T contendo células T CAR+. As esferas conjugadas anti-ID contra o CAR anti-CD19 foram incubadas com células na razão de 1:1 esfera:célula por 14 dias.
[960] A resposta secundária de células CAR-T colhidas no dia 14 após estimulação específica de CAR com esferas conjugadas anti-ID (dia 14; secundário) foi avaliada após estimulação com células alvo que expressam antígeno K562-CD19 em uma razão efetor alvo de 1:1 (para avaliar os níveis de citocinas) ou 3:1 para avaliar a atividade citolítica). A resposta primária das células T da composição das células T que não foram incubadas com as esferas conjugadas com anti-ID também foi determinada por estimulação semelhante com células que expressam antígenos (Dia 0; "primário"). Para avaliar a atividade citolítica, as células alvo foram marcadas com NucLight Red (NLR) para permitir o rastreamento por microscopia fluorescente. A atividade de matar foi avaliada medindo a perda de células alvo viáveis por 72 horas, conforme determinado pela perda de sinal fluorescente ao longo do tempo por microscopia de fluorescência cinética (usando o Sistema de Análise de Células Vivas INCUCYTE®, Essen Bioscience). O índice de morte foi determinado como o inverso da área sob a curva (AUC) para a fluorescência alvo ao longo do tempo. Os níveis intracelulares de citocinas de IL-2 e TNF-alfa também foram avaliados por citometria de fluxo em células T cocultivadas após incubação na presença de inibidor de Golgi.
[961] Como mostrado na FIGURA 23A, a morte celular alvo por uma composição de células T contendo células T CAR+ coletadas após estimulação específica por CAR por 14 dias com esferas conjugadas com anti-ID foi reduzida em comparação com a atividade citolítica de células T CAR+ que não foram submetidas à estimulação específica por CAR prévia. Os níveis intracelulares de citocinas de IL-2 e TNF-alfa também foram reduzidos em células T CAR+ que receberam estimulação específica de CAR de longo prazo com as esferas conjugadas anti-ID (FIGURA 23B). Esses resultados são consistentes com uma observação de que a estimulação específica de longo prazo do CAR, como por incubação com esferas conjugadas anti-ID por 14 dias, leva ao estímulo crônico do CAR e à perda da função sustentada.
[962] O ensaio de estimulação crônica descrito acima foi usado para avaliar os efeitos de vários compostos na melhoria da função das células T CAR+ após estimulação de longo prazo. As composições de células T anti-CD19 CAR+ foram geradas como descrito acima, exceto na presença de um composto diferente ou de um controle com veículo. As células de cada composição celular CAR-T gerada foram incubadas com esferas paramagnéticas conjugadas com anti-ID na razão de 1:1 esfera para célula por 14 dias.
[963] A resposta primária das composições de células CAR-T no descongelamento (sem estimulação com esferas conjugadas anti-ID) ou a resposta secundária de composições CAR-T estimuladas por CAR
(após 14 dias de estimulação específica de CAR com esferas conjugadas anti-ID) foi avaliado após estimulação com células que expressam antígenos. As composições de células CAR-T foram cultivadas 1:1 com células que expressam antígenos K562-CD19 na presença de inibidor de Golgi, e a produção de citocinas polifuncionais foi avaliada por citometria de fluxo após coloração intracelular de citocinas para IL-2, IFN-gama e TNF-alfa. Uma pontuação polifuncional foi determinada a partir dos níveis cumulativos de citocinas, conforme determinado nas células CD8+, após a normalização dos dados por escalonamento nas coortes de doadores (FIGURA 24A). Citocinas TNF e IFN-gama, IL-2 secretadas de sobrenadante de culturas de células após 20 horas de incubação com células alvo foram determinadas, e a média das pontuações em escala das três citocinas foi calculada, conforme mostrado na FIGURA 24B. Como mostrado nas FIGURAS 24A e 24B, certos compostos resultaram em respostas primárias ou secundárias melhoradas com base na capacidade das composições de células CAR-T de produzir citocinas. Também foram observadas melhorias na resposta citolítica primária ou secundária, após cocultura com células alvo na razão efetor:célula alvo de 3:1, como descrito acima, entre as composições de células T produzidas na presença de certos compostos (FIGURA 24C).
[964] Estes resultados demonstram a utilidade do ensaio de estimulação crônica para avaliar composições de células CAR-T, incluindo diferentes composições de células CAR-T produzidas em diferentes condições ou na presença de compostos ou outros agentes, por sua capacidade de exibir de longo prazo sobrevivência e/ou função de sustentação após estimulação crônica de células CAR-T, como pode ocorrer após exposição prolongada ao antígeno in vivo. Exemplo 21: Avaliação Funcional de Células T Transduzidas por Receptor de Antígeno Quimérico (CAR) (Células T CAR)
Expandidas na Presença de Compostos de Moléculas Pequenas
[965] As composições de células T manipuladas geneticamente contendo células T que expressam um CAR anti-CD19 foram geradas a partir de três doadores separados na presença de diferentes compostos ou um controle com veículo.
[966] A capacidade das células das diferentes composições de células T se expandirem após a estimulação do CAR foi avaliada através da incubação de células das composições de células CAR-T anti-CD19 geradas com superfície de esferas conjugadas com um anticorpo anti-idiotipo específico para o CAR anti-CD19. As esferas conjugadas anti-ID foram incubadas com células na razão de 1:1 esfera:célula em poços de frascos de expansão G-rex de 24 poços (Argos Technologies) por 15 dias. O total de células T vivas por poço foi determinado pela contagem de células nas culturas a cada 5 dias (FIGURA 25A). A área média sob a curva (AUC) da função do número de células T ao longo do tempo foi calculada em relação à AUC de células expandidas apenas com meio (FIGURA 25B).
[967] Como mostrado na FIGURA 25A, a estimulação de células com esferas conjugadas com anticorpo anti-idiotípico resultou em uma expansão inicial que foi seguida por um declínio no número de células. As células T das composições de células T anti-CD19 CAR geradas que foram previamente expandidas por incubação com os compostos tinham uma AUC média maior em comparação com as células T previamente expandidas com o controle com veículo (FIGURA 25B). Os resultados indicam que a presença de um ensaio de estimulação de longo prazo pode ser usada para identificar compostos que, em alguns casos, melhoram a capacidade das composições de células T geradas para expandir e sobreviver após uma única estimulação específica de CAR.
[968] A resposta secundária de citocinas após estimulação com células que expressam antígenos foi avaliada em células CAR-T a partir das composições de células T colhidas no dia 11 após a expansão com esferas conjugadas anti-ID. As células estimuladas com anti-ID foram incubadas com células alvo K562-CD19 irradiadas a uma razão efetora: alvo de 1:1 por aproximadamente 16 horas. O sobrenadante foi coletado e a produção de citocina TNF-alfa, IFN-gama e IL-2 foi medida usando um ensaio Luminex Multiplex. A alteração dobrada da produção de citocinas observada nos sobrenadantes de cocultura foi determinada a partir de composições de células anti-CD19 CAR-T geradas expandidas na presença de compostos ou controle com veículo em comparação com células expandidas apenas em meio. Como mostrado na FIGURA 25C, este ensaio identificou composições de células T, geradas a partir de composições de células T anti-CD19 CAR que haviam sido previamente expandidas na presença de certos compostos, que exibiam melhor produção secundária de citocinas após estimulação subsequente com antígeno. Além disso, o ensaio identificou uma composição de células T de algumas células derivadas de doadores que, quando manipuladas geneticamente e expandidas na presença de um composto, exibiram uma frequência aumentada de células T CD8+ que eram células CD107a + IFNγ + no dia 11, conforme determinado por coloração intracelular de citocinas após incubação com inibidor de Golgi por 4 horas substancialmente como descrito acima (FIGURA 25D). Estes resultados são consistentes com o uso de um ensaio de estimulação de longo prazo para identificar os efeitos dos compostos utilizados no processo para projetar células T para melhorar a função da composição de células T manipuladas geneticamente.
[969] A presente invenção não se destina a ser limitada em escopo às modalidades particulares divulgadas, as quais são fornecidas, por exemplo, para ilustrar vários aspectos da invenção. Várias modificações nas composições e métodos descritos se tornarão aparentes a partir da descrição e dos ensinamentos aqui contidos. Tais variações podem ser praticadas sem se afastar do verdadeiro escopo e espírito da divulgação e pretendem se enquadrar no escopo da presente divulgação.
SEQUÊNCIAS # SEQUÊNCIA COMENTÁRIO 1 MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRY Domínio CNASVTNSVKGTNA extracelular de BCMA humano (GenBank No. NP_001183.2) 2 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP IgG1 Fc humano
EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG
NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 3 GLNDIFEAQKIEWHE AviTag 4 KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL Marcadro Calmodulina 5 EEEEEE Marcador Poliglutamina 6 DYKDDDDK Flag-marcador 7 YPYDVPDYA HA- marcador 8 EQKLISEEDL Myc- marcador 9 Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (WRHPQFGG) Sequência de peptídeo de ligação de estreptavidina STREP-TAG® I 10 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (WSHPQFEK) Sequência de peptídeo de ligação de estreptavidina STREP-TAG® II 11 His-Pro-Baa (HPX) - Peptídeo de ligação de estreptavidina - X é selcionado de
# SEQUÊNCIA COMENTÁRIO glutamina, asparagina e metionina 12 His-Pro-Gln-Phe (HPQF) Peptídeo de ligação de estreptavidina 13 Oaa-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa (XX HPQFXX) Peptídeo de ligação de estreptavidina Oaa é Trp, Lys ou Arg Xaa é qualquer aminoácido; Yaa é Gly ou Glu Zaa é Gly, Lys ou Arg 14 Trp-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa (WXHPQFXX) Peptídeo de ligação de estreptavidina
Xaa é qualquer aminoácido; Yaa é Gly ou Glu, Zaa é Gly, Lys ou Arg 15 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Xaa)n-Trp-Ser-His-Pro- Peptídeo de Gln-Phe-Glu-Lys- (Xaa é qualquer aminoácido; n é quer 8 ou ligação de 12) estreptavidina (WSHPQFEKXnWSHPQFEK) (Xaa é qualquer aminoácido; n é quer 8 ou 12) 16 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)n-Trp-Ser- Peptídeo de His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (n é 2 ou 3) ligação de (WSHPQFEK(GGGS)nWSHPQFEK estreptavidina
(n é 2 ou 3) 17 SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEK Peptídeo de ligação de
# SEQUÊNCIA COMENTÁRIO estreptavidina 18 SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK Peptídeo de ligação de estreptavidina 19 WSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEK Peptídeo de ligação de estreptavidina 20 WSHPQFEKGGGSGGGSWSHPQFEK Peptídeo de ligação de estreptavidina 21 WSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK Peptídeo de ligação de estreptavidina 22 DPSKDSKAQVSAAEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTG Sequência de TYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKN estreptavidina de NYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWK tipo selvagem STLVGHDTFTKVKPSAASIDAAKKAGVNNGNPLDAVQQ (Estreptavidina - Espécies: Streptomyces avidinii - UniProt No. P22629 23 EAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYVTARGNAESRY muteína VLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWS estreptavidina GQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKV designada Strep- KPSAAS tactin® 24 MGKSKEISQDLRKKIVDLHKSGSSLGAISKRLKVPRSSVQTIV Sleeping Beauty RKYKHHGTTQPSYRSGRRRVLSPRDERTLVRKVQINPRTTA Transposase
KDLVKMLEETGTKVSISTVKRVLYRHNLKGRSARKKPLLQN RHKKARLRFATAHGDKDRTFWRNVLWSDETKIELFGHNDH RYVWRKKGEACKPKNTIPTVKHGGGSIMLWCGFAAGGTGA LHKIDGIMRKENYVDILKQHLKTSVRKLKLGRKWVFQMDND PKHTSKVVAKWLKDNKVKVLEWPSQSPDLNPIENLWAELKK RVRARRPTNLTQLHQLCQEEWAKIHPTYCGKLVEGYPKRLT # SEQUÊNCIA COMENTÁRIO
QVKQFKGNATKY 25 ATGGGAAAATCAAAAGAAATCAGCCAAGACCTCAGAAAAA Gene de AAATTGTAGACCTCCACAAGTCTGGTTCATCCTTGGGAGC codificação de AATTTCCAAACGCCTGAAAGTACCACGTTCATCTGTACAA Sleeping Beauty TCTGGTTCATCCTTGGGAGCAATTTCCAAACGCCTGAAAG Transpose
TACCACGTTCATCTGTACAAACAATAGTACGCAAGTATAA ACACCATGGGACCACGCAGCCGTCATACCGCTCAGGAAG G AGACGCGTTCTGTCTCCTAGAGATGAACGTACTTTGGTG CGAAAAGTGCAAATCAATCCCAGAACAACAGCAAAGGAC CTTGTGAAGATGCTGGAGGAAACAGGTACAAAAGTATCTA TA TCCACAGTAAAACGAGTCCTATATCGACATAACCTGAAAG GCCGCTCAGCAAGGAAGAAGCCACTGCTCCAAAACCGAC ATAAGAAAGCCAGACTACGGTTTGCAACTGCACATGGGG ACAAAGATCGTACTTTTTGGAGAAATGTCCTCTGGTCTGA TGAAACAAAAATAGAACTGTTT GGCCATAATGACCATCGTTATGTTTGGAGGAAGAAGGGG GAGGCTTGCAAGCCGAAGAACACCATCCCAACCGTGAAG CACGGGGGTGGCAGCATCATGTTGTGGGGGTGCTTTGCT GCAGGAGGGACTGGTGCACTTCACAAAATAGATGGCATC ATGAGGAAGGAAAATTATGTGGAT ATATTGAAGCAACATCTCAAGACATGAGTCAGGAAGTTAA AGCTTGGTCGCAAATGGGTCTTCCAAATGGACAATGACC CCAAGCATACTTCCAAAGTTGTGGCAAAATGGCTTAAGGA CAACAAAGTCAAGGTATTGGAGTGGCCATCACAAAGCCC TGACCTCAATCCTATAGAAAAT TTGTGGGCAGAACTGAAAAAGCGTGTGCGAGCAAGGAG GCCTACAAACCTGACTCAGTTACACCAGCTCTGTCAGGA GGAATGGGCCAAAATTCACCCAACTTATTGTGGGAAGCTT GTGGAAGGCTACCCGAAACGTTTGACCCAAGTTAAACAA
TTTAAAGGCAATGCTACCAAATAC TAG 26 cagttgaagtcggaagtttacatacacttaagttggagtcattaaaactcgtttttcaact Sequência de acTccacaaatttcttgttaacaaacaatagttttggcaagtcagttaggacatctactt repetição invertida tgtgcatgacacaagtcatttttccaacaattgtttacagacagattatttcacttataattc Sleeping Beauty actgtatcacaattccagtgggtcagaagtttacatacactaagttgactgtgcctttaa acagcttggaaaattccagaaaatgatgtcatggctttagaagcttctgatagactaat tgacatcatttgagtcaattggaggtgtacctgtggatgtatttcaagg
# SEQUÊNCIA COMENTÁRIO 27 GGGGS Seqência ligante 28 PKSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE IgG1 Fc humano VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS modificado
TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 29 DSSKWVFEHPETLYAWEGACVWIPCTYRALDGDLESFILFH domínio NPEYNKNTSKFDGTRLYESTKDGKVPSEQKRVQFLGDKNK extracelular de NCTLSIHPVHLNDSGQLGLRMESKTEKWMERIHLNVSERPF CD22 Humano
PPHIQLPPEIQESQEVTLTCLLNFSCYGYPIQLQWLLEGVPM RQAAVTSTSLTIKSVFTRSELKFSPQWSHHGKIVTCQLQDA DGKFLSNDTVQLNVKHTPKLEIKVTPSDAIVREGDSVTMTCE VSSSNPEYTTVSWLKDGTSLKKQNTFTLNLREVTKDQSGKY CCQVSNDVGPGRSEEVFLQVQYAPEPSTVQILHSPAVEGS QVEFLCMSLANPLPTNYTWYHNGKEMQGRTEEKVHIPKILP WHAGTYSCVAENILGTGQRGPGAELDVQYPPKKVTTVIQNP MPIREGDTVTLSCNYNSSNPSVTRYEWKPHGAWEEPSLGV LKIQNVGWDNTTIACAACNSWCSWASPVALNVQYAPRDVR VRKIKPLSEIHSGNSVSLQCDFSSSHPKEVQFFWEKNGRLL GKESQLNFDSISPEDAGSYSCWVNNSIGQTASKAWTLEVLY APRRLRVSMSPGDQVMEGKSATLTCESDANPPVSHYTWFD WNNQSLPYHSQKLRLEPVKVQHSGAYWCQGTNSVGKGRS
PLSTLTVYYSPETIGRR 30 MPLLLLLPLLWAGALA Peptídeo de Sinal de CD33 31 QETELSVSAELVPTSSWNISSELNKDSYLTLDEPMNNITTSL Fragmento de GQTAELHCKVSGNPPPTIRWFKNDAPVVQEPRRLSFRSTIY ROR1 Humano
GSRLRIRNLDTTDTGYFQCVATNGKEVVSSTGVLFVKFGPP PTASPGYSDEYEEDGFCQPYRGIACARFIGNRTVYMESLHM QGEIENQITAAFTMIGTSSHLSDKCSQFAIPSLCHYAFPYCD ETSSVPKPRDLCRDECEILENVLCQTEYIFARSNPMILMRLK LPNCEDLPQPESPEAANCIRIGIPMADPINKNHKCYNSTGVD YRGTVSVTKSGRQCQPWNSQYPHTHTFTALRFPELNGGHS YCRNPGNQKEAPWCFTLDENFKSDLCDIPACDSKDSKEKN
KMEILY 32 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP F2A 33 QETELSVSAELVPTSSWNISSELNKDSYLTLDEPMNNITTSL Polipeptídeo de
# SEQUÊNCIA COMENTÁRIO GQTAELHCKVSGNPPPTIRWFKNDAPVVQEPRRLSFRSTIY fusão ROR1-Fc
GSRLRIRNLDTTDTGYFQCVATNGKEVVSSTGVLFVKFGPP PTASPGYSDEYEEDGFCQPYRGIACARFIGNRTVYMESLHM QGEIENQITAAFTMIGTSSHLSDKCSQFAIPSLCHYAFPYCD ETSSVPKPRDLCRDECEILENVLCQTEYIFARSNPMILMRLK LPNCEDLPQPESPEAANCIRIGIPMADPINKNHKCYNSTGVD YRGTVSVTKSGRQCQPWNSQYPHTHTFTALRFPELNGGHS YCRNPGNQKEAPWCFTLDENFKSDLCDIPACDSKDSKEKN KMEILYGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 34 DSSKWVFEHPETLYAWEGACVWIPCTYRALDGDLESFILFH Polipeptídeo de NPEYNKNTSKFDGTRLYESTKDGKVPSEQKRVQFLGDKNK fusão CD22-Fc
NCTLSIHPVHLNDSGQLGLRMESKTEKWMERIHLNVSERPF PPHIQLPPEIQESQEVTLTCLLNFSCYGYPIQLQWLLEGVPM RQAAVTSTSLTIKSVFTRSELKFSPQWSHHGKIVTCQLQDA DGKFLSNDTVQLNVKHTPKLEIKVTPSDAIVREGDSVTMTCE VSSSNPEYTTVSWLKDGTSLKKQNTFTLNLREVTKDQSGKY CCQVSNDVGPGRSEEVFLQVQYAPEPSTVQILHSPAVEGS QVEFLCMSLANPLPTNYTWYHNGKEMQGRTEEKVHIPKILP WHAGTYSCVAENILGTGQRGPGAELDVQYPPKKVTTVIQNP MPIREGDTVTLSCNYNSSNPSVTRYEWKPHGAWEEPSLGV LKIQNVGWDNTTIACAACNSWCSWASPVALNVQYAPRDVR VRKIKPLSEIHSGNSVSLQCDFSSSHPKEVQFFWEKNGRLL GKESQLNFDSISPEDAGSYSCWVNNSIGQTASKAWTLEVLY APRRLRVSMSPGDQVMEGKSATLTCESDANPPVSHYTWFD WNNQSLPYHSQKLRLEPVKVQHSGAYWCQGTNSVGKGRS PLSTLTVYYSPETIGRRGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAE GAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEL TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPGK 35 MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRY Polipeptídeo de
# SEQUÊNCIA COMENTÁRIO CNASVTNSVKGTNAGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA fusão BCMA-Fc
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL
SLSPGK 36 EVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQR SJ25C1 VH
PGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAY MQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVS
S 37 DIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKP SJ25C1 VL
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DLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKR 38 EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPP FMC63 VH
RKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMN
SLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS 39 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPD FMC63 VL
GTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDI
ATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT 40 SYWMN SJ25C1 HC-CDR1 41 QIYPGDGDTNYNGKFKG SJ25C1 HC-CDR2 42 KTISSVVDFYFDY SJ25C1 HC-CDR3 43 KASQNVGTNVA SJ25C1 LC-CDR1 44 SATYRNS SJ25C1 LC-CDR2 45 QQYNRYPYT SJ25C1 LC-CDR3 46 DYGVS FMC63 HC-CDR1 47 VIWGSETTYYNSALKS FMC63 HC-CDR2 48 HYYYGGSYAMDY FMC63 HC-CDR3 49 RASQDISKYLN FMC63 LC-CDR1 50 HTSRLHS FMC63 LC-CDR2 51 QQGNTLPYT FMC63 LC-CDR3 52 QVQLQQPGSELVRPGGSVKLSCKASDYTFTSYWMHWVRQ anti-ID VH
RPGQGLEWIGNIYPGSGGTNYDEKFKRKATLTVDTSSSTAY MQLRSLTSEDSAVYYCTREVTTVAYYYSMDYWGQGTSVTV
SS 53 EVTTVAYYYSMDY anti-ID HC-CDR3 54 TREVTTVAYYYSMD anti-ID HC-CDR3
# SEQUÊNCIA COMENTÁRIO 55 SYWMH anti-ID HC-CDR1 56 DYTFTSY anti-ID HC-CDR1 57 DYTFTSYWMH anti-ID HC-CDR1 58 TSYWMH anti-ID HC-CDR1 59 NIYPGSGGTNYDEKFKR anti-ID HC-CDR2 60 YPGSGG anti-ID HC-CDR2 61 NIYPGSGGTN anti-ID HC-CDR2 62 WIGNIYPGSGGTN anti-ID HC-CDR2 63 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPD anti-ID VL
GTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIA
TYFCQQGKTVPFTFGSGTKLEIK 64 QQGKTVPFT anti-ID LC-CDR3 65 QQGKTVPF anti-ID LC-CDR3 66 RASQDISNYLN anti-ID LC-CDR1 67 SNYLNWY anti-ID LC-CDR1 68 YTSRLHS anti-ID LC-CDR2 69 LLIYYTSRLH anti-ID LC-CDR2 70 GGGS Ligante 3GS 71 GGGGSGGGGSGGGGS Ligante 72 GSTSGSGKPGSGEGSTKG Ligante 73 EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQ anti-ID B-1 VH
CHGKSLEWIGDINPNNGGTDYNQNFKGKATLTVDKSSSTAY MQLNSLTSEDSAVYYCAREGNNYGSRDAMDYWGQGTSVT
VSS 74 QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKTSGYSFTRYWMNWVKQ anti-ID B-2 VH
RPGQGLEWIGMIHPSDSETRLNQKFKDKATLTVDNSSSTAY
MQLSSPTSEDSAVYYCASIYYEEAWGQGTLVTVSA 75 EGNNYGSRDAMDY anti-ID B-1 HC- CDR3 76 IYYEEA anti-ID B-2 HC- CDR3 77 AREGNNYGSRDAMD anti-ID B-1 HC- CDR3 78 ASIYYEE anti-ID B-2 HC- CDR3 79 DYYMK anti-ID B-1 HC- CDR1
# SEQUÊNCIA COMENTÁRIO 80 RYWMN anti-ID B-2 HC- CDR1 81 GYTFTDY anti-ID B-1 HC- CDR1 82 GYTFTDYYMK anti-ID B-1 HC- CDR1 83 TDYYMK anti-ID B-1 HC- CDR1 84 GYSFTRY anti-ID B-2 HC- CDR1 85 GYSFTRYWMN anti-ID B-2 HC- CDR1 86 TRYWMN anti-ID B-2 HC- CDR1 87 DINPNNGGTDYNQNFKG anti-ID B-1 HC- CDR2 88 MIHPSDSETRLNQKFKD anti-ID B-2 HC- CDR2 89 NPNNGG anti-ID B-1 HC- CDR2 90 DINPNNGGTD anti-ID B-1 HC- CDR2 91 WIGDINPNNGGTD anti-ID B-1 HC- CDR2 92 HPSDSE anti-ID B-2 HC- CDR2 93 MIHPSDSETR anti-ID B-2 HC- CDR2 94 WIGMIHPSDSETR anti-ID B-2 HC- CDR2 95 GYX3FX5X6YX8MX10 HC-CDR1 X3 = T ou S; Consenso X5 = T ou S; X6 = D ou R; X8 = Y ou W; X10 = K ou N 96 WIGX4IX6PX8X9X10X11TX13X14NQX17FKX20 HC-CDR2 X4 = D ou M; Consenso
# SEQUÊNCIA COMENTÁRIO X6 = N ou H; X8 = N ou S; X9 = N ou D; X10 = G ou S; X11 = G ou E; X13 = D ou R; X14 = Y ou L; X17 = N ou K; X20 = G ou D 97 AX2X3X4X5X6 X7X8 X9 X10X11 X12 X13 X14 X15 HC-CDR3 X2 = R ou S; Consenso X3 = E ou I; X4 = G ou Y; X5 = N ou Y; X6 = N ou E; X7 = Y ou nulo; X8 = G ou nulo; X9 = S ou nulo; X10 = R ou nulo; X11 = D ou nulo; X12 = A ou nulo; X13 = M ou nulo; X14 = D ou E; X15 = Y ou A; 98 QIVLTQSPALMSASPGEKVTMTCSASSGVIYMYWYQQKPR anti-ID B-1 VL
SSPKPWIYLTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAED
AATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK 99 DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQG anti-ID B-2 VL
KSPQLLVYNAKTLADSVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPED
FGSYYCQHFWSTPYTFGGGTKLEIK 100 QQWSSNPLT anti-ID B-1 LC- CDR3 101 QQWSSNPL anti-ID B-1 LC- CDR3 102 QHFWSTPYT anti-ID B-2 LC- CDR3 103 QHFWSTPY anti-ID B-2 LC- CDR3
# SEQUÊNCIA COMENTÁRIO 104 SASSGVIYMY anti-ID B-1 LC- CDR1 105 RASGNIHNYLA anti-ID B-2 LC- CDR1 106 IYMYWY anti-ID B-1 LC- CDR1 107 HNYLAWY anti-ID B-2 LC- CDR1 108 LTSNLAS anti-ID B-1 LC- CDR2 109 NAKTLAD anti-ID B-2 LC- CDR2 110 PWIYLTSNLA anti-ID B-1 LC- CDR2 111 LLVYNAKTLA anti-ID B-2 LC- CDR2 112 X1AX3X4X5X6 X7X8 YX10X11WY LC-CDR1 X1 = S ou R; Consenso X3 = S ou R; X4 = S ou G; X5 = G ou N; X6 = V ou I; X7 = I ou H; X8 = N ou nulo; X10 = M ou L; X11 = Y ou A 113 X1X2X3YX5X6 X7X8 LAX11 LC-CDR2 X1 = P ou L; Consenso X2 = W ou L; X3 = I ou V; X5 = L ou N; X6 = T ou A; X7 = S ou K; X8 = N ou T; X11 = S ou D 114 QX2X3X4X5X6PX8T LC-CDR3 X2 = Q ou H; Consenso X3 =W ou F;
# SEQUÊNCIA COMENTÁRIO X4 = S ou W; X5 = S ou W; X6 = N ou T; X8 = L ou Y 115 AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTW anti-ID CH
NSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTC NVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKP KDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQT QPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFP APIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDF FPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNV
QKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK 116 QVQLQQPGSELVRPGGSVKLSCKASDYTFTSYWMHWVRQ Cadeia pesada RPGQGLEWIGNIYPGSGGTNYDEKFKRKATLTVDTSSSTAY anti-ID
MQLRSLTSEDSAVYYCTREVTTVAYYYSMDYWGQGTSVTV SSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTV TWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETV TCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPP KPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTA QTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAA FPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMIT DFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKL
NVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK 117 MGWSSIILFLVATASGVHS Sequência de sinal anti-ID HC 118 RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKW anti-ID CL
KIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYER
HNNYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC 119 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPD Cadeia leve anti-
GTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIA ID TYFCQQGKTVPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLT SGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQ DSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNNYTCEATHKTSTSPIVKS
FNRNEC 120 MMSSAQFLGLLLLCFQGTRC Sequência de sinal anti-ID LC 121 AKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTW anti-ID B-1 CH
NSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITC # SEQUÊNCIA COMENTÁRIO NVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVF IFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEV HTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVN NKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLT CMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFM YSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPG
K 122 EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQ Cadeia pesada CHGKSLEWIGDINPNNGGTDYNQNFKGKATLTVDKSSSTAY anti-ID B-1
MQLNSLTSEDSAVYYCAREGNNYGSRDAMDYWGQGTSVT VSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVT LTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQS ITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGP SVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNN VEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKC KVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQV TLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSY FMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRT
PGK 123 MGWSWIFLFLLSGTAGVLS Sequência de sinal anti-ID B-1
HC 124 RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKW anti-ID B-1 CL
KIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYER
HNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC 125 QIVLTQSPALMSASPGEKVTMTCSASSGVIYMYWYQQKPR Cadeia leve anti- SSPKPWIYLTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAED ID B-1
AATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSE QLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSW TDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPI
VKSFNRNEC 126 MDFQVQIFSFLLMSASVIMSRG Sequência de sinal anti-ID B-1
LC 127 AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTW anti-ID B-2 CH
NSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTC NVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKP KDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQT # SEQUÊNCIA COMENTÁRIO QPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFP APIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDF FPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNV
QKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK 128 QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKTSGYSFTRYWMNWVKQ Cadeia pesada RPGQGLEWIGMIHPSDSETRLNQKFKDKATLTVDNSSSTAY anti-ID B-2
MQLSSPTSEDSAVYYCASIYYEEAWGQGTLVTVSAAKTTPP SVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSL SSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHP ASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTI TLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREE QFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTI SKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDIT VEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNW
EAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK 129 MGWSSIILFLVATATGVHS Sequência de sinal anti-ID B-2
HC 130 DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQG anti-ID B-2 VL
KSPQLLVYNAKTLADSVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPED
FGSYYCQHFWSTPYTFGGGTKLEIK 131 DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQG Cadeia leve anti- KSPQLLVYNAKTLADSVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPED ID B-2
FGSYYCQHFWSTPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSE QLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSW TDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPI
VKSFNRNEC 132 MSVLTQVLALLLLWLTGARC Sequência de sinal anti-ID B-2
LC 133 ESKYGPPCPPCP Espaçador (IgG4 dobradiça) (aa) Homo sapiens 134 GAATCTAAGTACGGACCGCCCTGCCCCCCTTGCCCT Espaçador (IgG4 dobradiça) (nt) Homo sapiens 135 ESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCL Espaçador VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSR Dobradiça-CH3
# SEQUÊNCIA COMENTÁRIO LTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK Homo sapiens 136 ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT Espaçador CVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTY Dobradiça-CH2- RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKG CH3 Homo QPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE sapiens
SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNV
FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 137 RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRG IgD-dobradiça-Fc GEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQD Homo sapiens
LWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGL LERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQ RLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFS PPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVL
RVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH 138 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV CD28 (aminoácidos 153- 179 de No. de Registro P10747) Homo sapiens 139 IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP CD28 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (aminoácidos 114- 179 de No. de Registro P10747) Homo sapiens 140 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYR CD28 S (aminoácidos 180- 220 de P10747) Homo sapiens 141 RSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAY CD28 (LL a GG) RS Homo sapiens 142 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGC 4-1BB EL (aminoácidos 214- 255 de Q07011.1) Homo sapiens 143 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRG CD3 zeta Homo RDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGE sapiens
RRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 144 RVKFSRSAEPPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRG CD3 zeta Homo
# SEQUÊNCIA COMENTÁRIO RDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGE sapiens
RRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 145 RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRG CD3 zeta Homo RDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGE sapiens
RRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 146 LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR T2A artificial 147 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNI tEGFR artificial
KHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVK EITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVS LNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSG QKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVS CRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQ AMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTL VWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSI
ATGMVGALLLLLVVALGIGLFM 148 RKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFR tEGFR artificial
GDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAF ENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIIS GNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQV CHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEG EPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYI DGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCT YGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLF
M 149 EGRGSLLTCGDVEENPGP T2A artificial 150 PLGLWA Ligante clivável
MMP 151 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP P2A 152 ATNFSLLKQAGDVEENPGP P2A 153 QCTNYALLKLAGDVESNPGP E2A 154 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP F2A

Claims (155)

REIVINDICAÇÕES
1. Método de expansão de células, caracterizado pelo fato de que compreende a incubação de uma composição de entrada, a referida composição de entrada compreendendo células que expressam um receptor de antígeno quimérico compreendendo um domínio de ligação de antígeno extracelular que se liga a ou reconhece especificamente um antígeno, com uma pluralidade de partículas que são ou compreendem esferas, em que a pluralidade de partículas compreende um diâmetro médio entre ou entre cerca de 2 µm e 5 µm e tem unida uma molécula de ligação que se liga especificamente a ou reconhece o domínio de ligação de antígeno, em que a união da molécula de ligação ao domínio de ligação de antígeno induz expansão das células compreendendo o receptor de antígeno quimérico, produzindo assim uma composição de saída compreendendo células expandidas.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a molécula de ligação não liga ou reconhece um ligante ou região espaçadora do receptor de antígeno quimérico, o referido ligante ou região espaçadora conectando o domínio de ligação de antígeno ao domínio transmembranar do receptor de antígeno.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a molécula de ligação é um anticorpo anti-idotípico ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que se liga especificamente ao domínio de ligação de antígeno.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o antígeno é CD19.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a molécula de ligação compreende um antígeno recombinante ou uma porção do mesmo reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o antígeno recombinante é BCMA ou é uma porção do mesmo reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno.
7. Método de expansão de células, caracterizado pelo fato de que compreende incubar uma composição de entrada, a referida composição de entrada compreendendo células que expressam um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo um domínio de ligação de antígeno que se liga a ou reconhece especificamente o antígeno de maturação das células B (BCMA), com uma pluralidade de partículas tendo unido uma molécula de ligação compreendendo o domínio extracelular de BCMA ou uma porção do domínio extracelular reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno, em que a ligação do domínio extracelular de BCMA ou uma porção do mesmo ao domínio de ligação de antígeno induz a expansão das células compreendendo o receptor de antígeno quimérico, produzindo assim uma composição de saída compreendendo células expandidas.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo fato de que a molécula de ligação é um polipeptídeo de fusão compreendendo o antígeno recombinante ou a porção do mesmo ligada a uma porção, opcionalmente em que a porção facilita a ligação à partícula.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a porção está ligada ao C-terminal do antígeno recombinante.
10. Método, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que a porção é ou compreende um domínio Fc.
11. Método de expansão de células, caracterizado pelo fato de que compreende incubar uma composição de entrada, a referida composição de entrada compreendendo células que expressam um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo um domínio de ligação de antígeno que se liga a ou reconhece especificamente CD19, com uma pluralidade de partículas, tendo ligado uma molécula de ligação que é um anticorpo anti-idiotípico ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que se liga especificamente ao antígeno-bi domínio de busca, em que a ligação do anticorpo anti-idiotípico ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo ao domínio de ligação de antígeno induz a expansão das células compreendendo o receptor de antígeno quimérico, produzindo assim uma composição de saída compreendendo células expandidas.
12. Método, de acordo com a reivindicação 3, 4 ou 11, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação de antígeno do receptor de antígeno é ou compreende o anticorpo SJ25C1 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo.
13. Método, de acordo com a reivindicação 3, 4 ou 11, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação de antígeno do receptor de antígeno é ou compreende o anticorpo FMC63 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 13, caracterizado pelo fato de que as partículas são partículas sintéticas, partículas insolúveis, partículas sólidas ou são partículas não celulares.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 14, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de partículas compreende esferas.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de partículas é de uma composição tendo uma concentração da molécula de ligação entre ou entre cerca de 0,5 µg/mL e 500 µg/mL, inclusive.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações
1 a 16, caracterizado pelo fato de que, durante a incubação, a razão de células totais presentes na composição de entrada para a pluralidade de partículas é de ou de cerca de 5:1 a 1:5, inclusive.
18. Método de expansão de células, caracterizado pelo fato de que compreende incubar uma composição de entrada, a referida composição de entrada compreendendo células que expressam um receptor de antígeno quimérico compreendendo um domínio de ligação de antígeno extracelular que se liga a ou reconhece especificamente um antígeno, com uma pluralidade de partículas que são ou compreendem esferas que possuem anexou uma molécula de ligação que se liga especificamente a ou reconhece o domínio de ligação de antígeno, em que: a pluralidade de partículas é de uma composição tendo uma concentração da molécula de ligação entre 0,5 µg/mL e 500 µg/mL, inclusive, e, durante a incubação, a razão de células totais presentes na composição de entrada para a a pluralidade de partículas é de ou de cerca de 5:1 a 1:5, inclusive; e a união da molécula de ligação ao domínio de ligação de antígeno induz a expansão das células compreendendo o receptor de antígeno quimérico, produzindo assim uma composição de saída compreendendo células expandidas.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a molécula de ligação não liga ou reconhece um ligante ou região espaçadora do receptor de antígeno quimérico, o referido ligante ou região espaçadora conectando o domínio de ligação de antígeno ao domínio transmembranar do receptor de antígeno.
20. Método, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que a molécula de ligação é um anticorpo anti-idiotípico ou um fragmento de ligação de antígeno que se liga especificamente ao domínio de ligação de antígeno.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o antígeno é CD19.
22. Método, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que a molécula de ligação compreende um antígeno recombinante ou uma porção do mesmo reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o antígeno recombinante é BCMA ou é uma porção do mesmo reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno.
24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que: a pluralidade de partículas é de uma composição tendo uma concentração da molécula de ligação entre ou entre cerca de 1 µg/mL e 200 µg/mL ou 5 µg/mL e 100 µg/mL, cada, inclusive; ou a pluralidade de partículas é de uma composição compreendendo uma concentração da molécula de ligação de pelo menos ou pelo menos cerca de 1 µg/mL, 5 µg/mL, 10 µg/mL, 25 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL ou 200 µg/mL.
25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de partículas é de uma composição tendo uma concentração da molécula de ligação de ou cerca de 5 µg/mL, 10 µg/mL, 25 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL ou 200 µg/mL.
26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que, durante a incubação, a razão de células totais presentes na composição de entrada para a pluralidade de partículas é de ou de cerca de 3:1 a 1:3 ou 2:1 a 1:2, cada, inclusive.
27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que, durante a incubação, a razão de células totais presentes na composição de entrada para a pluralidade de partículas é ou é de cerca de 1:1.
28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 27, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de esferas compreende um diâmetro médio entre ou entre cerca de 2 µm e 5 µm ou uma densidade média entre ou entre cerca de 1 g/cm3 e cerca de 2 g/cm3.
29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e 28, caracterizado pelo fato de que o diâmetro médio é de ou de cerca de 2,8 µm ou 4,5 µm.
30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3, 4, 11 a 17, 20, 21 e 24 a 29, caracterizado pelo fato de que o fragmento de ligação de antígeno é ou compreende um scFv.
31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3, 4 e 11 a 30, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-idiotípico ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina, opcionalmente uma região Fc ou uma porção da Fc compreendendo os domínios CH2 e CH3.
32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3, 4, 11 a 17, 20, 21 e 24 a 31, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-idiotípico ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo é um intacto anticorpo ou anticorpo completo.
33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que a molécula de ligação está ligada a cada uma da pluralidade de partículas no ou próximo ao resíduo de aminoácido C-terminal da molécula de ligação.
34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de partículas é monodispersa.
35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 34, caracterizado pelo fato de que a molécula de ligação é ligada covalentemente à partícula por meio de um grupo funcional exposto à superfície.
36. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o grupo funcional exposto à superfície é um grupo amino, um grupo carboxila, um grupo tiol, um grupo aldeído, um grupo clorometila, um grupo epóxi, um grupo hidroxila, um grupo tosila ou um grupo hidrazina.
37. Método, de acordo com a reivindicação 35 ou 36, caracterizado pelo fato de que o grupo funcional exposto à superfície é um grupo tosila.
38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de partículas compreende partículas compreendendo vidro, sílica, poliésteres de ácidos hidroxicarboxílicos, polianidretos de ácidos dicarboxílicos, copolímeros de ácidos hidroxicarboxílicos, copolímeros ácidos dicarboxílicos ou metal.
39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 38, caracterizado pelo fato de que as partículas compreendem uma superfície compreendendo um polímero, um polissacarídeo, uma sílica, um ácido graxo, um carbono ou uma combinação dos mesmos.
40. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o polímero é polietilenoglicol, poli (ácido lático-co- glicólico), poliglutaraldeído, poliuretano, poliestireno e álcool polivinílico ou combinações dos mesmos.
41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de partículas compreende partículas compreendendo uma superfície hidrofóbica.
42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 41, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de partículas compreende partículas compreendendo uma superfície de poliestireno.
43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 42, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de partículas compreende partículas que são magnéticas e/ou compreendem um núcleo magnético, um núcleo paramagnético ou um núcleo superparamagnético.
44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 43, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma porção da incubação é realizada na presença de um agente que se liga especificamente a uma molécula adicional na célula para fornecer um sinal acessório e/ou bloquear um sinal inibitório.
45. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o agente é fornecido junto com as partículas, opcionalmente, o agente é unido a cada uma da pluralidade de partículas ou um subconjunto delas.
46. Método, de acordo com a reivindicação 44 ou 45, caracterizado pelo fato de que o agente está ligado às partículas e o agente se liga especificamente a uma molécula adicional na célula para fornecer um sinal acessório e/ou bloquear um sinal inibitório.
47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 46, caracterizado pelo fato de que o agente é um ligante ou é um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo.
48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 47, caracterizado pelo fato de que a molécula adicional: é uma molécula coestimulatória ou é um correceptor ativador, opcionalmente OX-40, ICOS, DAP10, B7-1, B7-2, CD28 ou 4- 1BB; ou é um receptor inibitório, opcionalmente CTLA-4, PD-1, LAG- 3, Tim-3, BTLA ou TIGIT; ou é uma proteína de superfície de célula T, opcionalmente CD2 ou CD3.
49. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações
44 a 48, caracterizado pelo fato de que a molécula adicional é CD2 ou CD28.
50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 49, caracterizado pelo fato de que as partículas compreendem um ou ambos os anticorpos ananti-CD2 e um anticorpo anti-CD28.
51. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a molécula de ligação é um anticorpo anti-idiotipo anti- CD19.
52. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a molécula de ligação é um antígeno recombinante que é reconhecido pelo receptor de antígeno quimérico, opcionalmente em que o antígeno recombinante é BCMA ou é uma porção do mesmo reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno.
53. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 52, caracterizado pelo fato de que o agente está covalentemente ligado às partículas.
54. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 53, caracterizado pelo fato de que a razão, opcionalmente razão molar ou em peso, da molécula de ligação e do agente ligado às partículas é ou é de cerca de 1:1.
55. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 54, caracterizado pelo fato de que a incubação é realizada por mais de ou mais de 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 24 horas, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias ou 12 dias.
56. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 55, caracterizado pelo fato de que a incubação é realizada por mais de ou mais de 24 horas, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9. dias, 10 dias, 11 dias ou 12 dias.
57. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações
1 a 56, caracterizado pelo fato de que a incubação é realizada por mais de ou mais de 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias ou 16 dias.
58. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 57, caracterizado pelo fato de que as células compreendem células imunes ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC).
59. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 58, caracterizado pelo fato de que a célula imune é uma célula T ou uma célula NK.
60. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 59, caracterizado pelo fato de que as células compreendem uma ou ambas as células T CD4+ e células T CD8+.
61. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 60, caracterizado pelo fato de que a razão de células CD4+ para células CD8+ está entre ou entre ab 1:2 e 2:1 ou 1:3 e 3:1 ou é ou é aproximadamente 1:1.
62. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 61, caracterizado pelo fato de que as células são células primárias obtidas de um indivíduo, opcionalmente um indivíduo humano.
63. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 62, caracterizado pelo fato de que a composição de entrada é produzida por um método que compreende contatar uma composição de células com uma molécula de ácido nucleico que codifica o receptor de antígeno quimérico sob condições para introduzir a molécula de ácido nucleico em uma ou mais células na composição.
64. Método de engenharia genética de uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) contatar uma composição de células com uma molécula de ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico sob condições para introduzir a molécula de ácido nucleico em uma ou mais células da composição, produzindo assim uma composição de entrada; e (b) incubar células da composição de entrada como definida no método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 63.
65. Método, de acordo com a reivindicação 63 ou 64, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma porção do contato e incubação é realizada simultaneamente.
66. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63 a 65, caracterizado pelo fato de que o contato é realizado por transdução com um vetor viral, opcionalmente em que o vetor viral é um vetor retroviral, um vetor gama-retroviral ou um vetor lentiviral.
67. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 66, caracterizado pelo fato de que a composição de células compreende uma pluralidade de células T e, antes do contato, o método não compreende estimular ou ativar as células T.
68. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63 a 67, caracterizado pelo fato de que a composição de células compreende uma pluralidade de células T e, antes do contato, o método não compreende incubar a composição na presença de um agente ou agentes capazes de induzir uma sinalizar através de um complexo TCR e/ou incubação na presença de um agente ou agentes capazes de induzir a proliferação de células T, células T CD4+ e/ou células T CD8+; e/ou moléculas de ligação a CD3, moléculas de ligação a CD28, IL-2 recombinante, IL-15 recombinante e IL-7 recombinante ou uma combinação destes, opcionalmente, em que o método não compreende estimular as células T na presença de um anticorpo anti-CD3 e/ou anti- CD28.
69. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 68, caracterizado pelo fato de que a expressão de superfície de um marcador de ativação ou marcador de exaustão das células presentes na composição de saída é menor que a expressão de superfície do marcador em uma composição de células produzidas após uma incubação semelhante, mas na presença de uma molécula estimulatória policlonal capaz de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo TCR, opcionalmente em que a molécula estimulatória policlonal compreende um anticorpo ou fragmento anti-CD3 e/ou um anticorpo ou fragmento anti-CD28.
70. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que o marcador de exaustão é um receptor inibidor, opcionalmente PD-1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, BTLA ou TIGIT.
71. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que o marcador de ativação é HLA-DR, CD25, CD69, CD71, CD40L ou 4-1BB.
72. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 71, caracterizado pelo fato de que o número de células na composição de saída que compreende o receptor de antígeno quimérico é aumentado ou enriquecido em 1,2 vez, 2,0 vezes, 3,0 vezes, 3,0 vezes, 4,0 vezes, 5,0 vezes, 6,0 vezes, 7,0 vezes, 8,0 vezes, 9,0 vezes, 10 vezes ou mais em comparação com o número de células compreendendo o receptor de antígeno na composição de entrada.
73. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 72, caracterizado pelo fato de que é realizado in vitro ou ex vivo.
74. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 73, caracterizado pelo fato de que o CAR compreende um domínio de ligação de antígeno extracelular que se liga especificamente ao antígeno, uma região transmembranar e uma região de sinalização intracelular compreendendo um ITAM.
75. Método, de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que o domínio de sinalização intracelular compreende um domínio intracelular de uma cadeia CD3-zeta (CD3ζ).
76. Método, de acordo com a reivindicação 74 ou 75, caracterizado pelo fato de que o CAR adicionalmente compreende uma região de sinalização coestimulatória compreendendo um domínio de sinalização de CD28 ou 4-1BB.
77. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 76, caracterizado pelo fato de compreender ainda a remoção da pluralidade de esferas da composição de saída.
78. Composição de células, caracterizada pelo fato de que são produzidas pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 77.
79. Partícula modificada na superfície, caracterizada pelo fato de que compreende (i) uma partícula que é uma esfera compreendendo um diâmetro entre ou entre cerca de 2 µm e 5 µm e (ii) e uma molécula de ligação unida à superfície da esfera, em que a molécula de ligação liga-se especificamente a um domínio de ligação de antígeno extracelular de um receptor de antígeno quimérico.
80. Partícula modificada na superfície, de acordo com a reivindicação 79, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação não liga ou reconhece um ligante ou região espaçadora do receptor de antígeno recombinante, o referido ligante ou região espaçadora conectando o domínio de ligação de antígeno ao domínio transmembranar do receptor de antígeno.
81. Partícula modificada na superfície, de acordo com a reivindicação 79 ou 80, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação compreende um antígeno recombinante ou uma porção do mesmo reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno.
82. Partícula modificada na superfície, de acordo com a reivindicação 81, caracterizada pelo fato de que o antígeno recombinante é BCMA ou é uma porção do mesmo reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno.
83. Partícula modificada na superfície, caracterizada pelo fato de que compreende uma partícula e uma molécula de ligação acoplada à superfície da partícula, em que a molécula de ligação compreende um domínio extracelular ou uma porção do mesmo de um antígeno recombinante que é o antígeno de maturação das células B (BCMA).
84. Partícula modificada na superfície, de acordo com qualquer uma das reivindicações 81 a 83, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação é um polipeptídeo de fusão compreendendo o antígeno recombinante ou a porção do mesmo ligada a uma porção, opcionalmente em que a porção facilita a ligação à partícula.
85. Partícula modificada na superfície, de acordo com a reivindicação 84, caracterizada pelo fato de que a porção está ligada ao C-terminal do antígeno recombinante.
86. Partícula modificada na superfície, de acordo com a reivindicação 84 ou 85, caracterizada pelo fato de que a porção é ou compreende um domínio Fc.
87. Partícula modificada na superfície, de acordo com a reivindicação 79 ou 80, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação compreende um anticorpo anti-idiotípico ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo.
88. Partícula modificada na superfície, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79, 80 e 87, caracterizada pelo fato de que o antígeno reconhecido pelo domínio de ligação de antígeno é CD19.
89. Partícula modificada na superfície, de acordo com a reivindicação 87 ou 88, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação de antígeno do receptor de antígeno quimérico é ou compreende o anticorpo SJ25C1 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo.
90. Partícula modificada na superfície, de acordo com a reivindicação 87 ou 88, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação de antígeno do receptor de antígeno quimérico é ou compreende o anticorpo FMC63 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo.
91. Partícula modificada na superfície, de acordo com a reivindicação 89 ou 90, caracterizada pelo fato de que o fragmento de ligação de antígeno é ou compreende um scFv.
92. Partícula modificada na superfície, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 91, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-idiotípico ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina, opcionalmente uma região Fc ou uma porção da Fc compreendendo o CH2 e domínios CH3.
93. Partícula modificada na superfície, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 92, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-idiotípico ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo é um anticorpo intacto ou anticorpo completo.
94. Partícula modificada na superfície, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79 a 93, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação está ligada à partícula no ou perto do resíduo de aminoácido C-terminal da molécula de ligação.
95. Partícula modificada na superfície, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 94, caracterizada pelo fato de que a partícula é uma partícula sintética, partícula insolúvel, partícula sólida ou partícula não celular.
96. Partícula modificada na superfície, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 95, caracterizada pelo fato de que a partícula é uma esfera.
97. Partícula modificada na superfície, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79 a 96, caracterizada pelo fato de que a partícula tem um diâmetro entre ou entre cerca de 2 µm e 5 µm.
98. Partícula modificada na superfície, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79 a 97, caracterizada pelo fato de que a partícula tem um diâmetro de cerca de 2,8 µm ou 4,5 µm.
99. Partícula modificada na superfície, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79 a 98, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação é covalentemente unida às partículas.
100. Partícula modificada na superfície, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79 a 99, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação é covalentemente unida à partícula por meio de um grupo funcional exposto à superfície.
101. Partícula modificada na superfície, de acordo com a reivindicação 100, caracterizada pelo fato de que o grupo funcional exposto à superfície é um grupo amino, um grupo carboxila, um grupo tiol, um grupo aldeído, um grupo clorometila, um grupo epóxi, um grupo hidroxila, um grupo tosila ou uma grupo hidrazina.
102. Partícula modificada na superfície, de acordo com a reivindicação 101, caracterizada pelo fato de que o grupo funcional exposto à superfície é um grupo tosila.
103. Partícula modificada na superfície, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79 a 102, caracterizada pelo fato de que a partícula é ou compreende vidro, sílica, poliésteres de ácidos hidroxicarboxílicos, polianidretos de ácidos dicarboxílicos, copolímeros de ácidos hidroxicarboxílicos, copolímeros ácidos dicarboxílicos ou um metal.
104. Partícula modificada na superfície, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79 a 103, caracterizada pelo fato de que a partícula compreende uma superfície compreendendo um polímero, um polissacarídeo, uma sílica, um ácido graxo, um carbono ou uma combinação dos mesmos.
105. Partícula modificada na superfície, de acordo com a reivindicação 104, caracterizada pelo fato de que o polímero é polietilenoglicol, poli (ácido lático-co-glicólico), poliglutaraldeído, poliuretano, poliestireno e álcool polivinílico ou combinações dos mesmos.
106. Partícula modificada na superfície, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79 a 105, caracterizada pelo fato de que a partícula compreende uma superfície hidrofóbica.
107. Partícula modificada na superfície, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79 a 106, caracterizada pelo fato de que a partícula compreende uma superfície de poliestireno.
108. Partícula modificada na superfície, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79 a 107, caracterizada pelo fato de que a partícula é magnética e/ou compreende um núcleo magnético, um núcleo paramagnético ou um núcleo superparamagnético.
109. Partícula modificada na superfície, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79 a 108, caracterizada pelo fato de que a partícula compreende pelo menos ou cerca de 10 cópias, 102 cópias, 103 cópias, 104 cópias, 105 cópias ou 106 cópias da molécula de ligação.
110. Partícula modificada na superfície, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79 a 109, caracterizada pelo fato de que a partícula adicionalmente compreende pelo menos um agente ligado à superfície da partícula, em que o pelo menos um agente se liga especificamente a uma molécula adicional em uma célula para fornecer um sinal acessório e/ou bloquear um sinal inibitório.
111. Partícula modificada na superfície, de acordo com a reivindicação 110, caracterizada pelo fato de que pelo menos um agente é um ligante ou é um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo.
112. Partícula modificada na superfície, de acordo com a reivindicação 110 ou 111, caracterizada pelo fato de que a molécula adicional é uma molécula coestimulatória ou um correceptor ativador, opcionalmente OX-40, ICOS, DAP10, B7-1, B7-2, CD28 ou 4-1BB.
113. Partícula modificada na superfície, de acordo com a reivindicação 110 ou 111, caracterizada pelo fato de que a molécula adicional é um receptor inibidor, opcionalmente CTLA-4, PD-1, LAG-3, Tim-3, BTLA ou TIGIT.
114. Partícula modificada na superfície, de acordo com a reivindicação 110 ou 111, caracterizada pelo fato de que a molécula adicional é uma proteína de superfície de célula T, opcionalmente CD2 ou CD3.
115. Partícula modificada na superfície, de acordo com a reivindicação 110 ou 111, caracterizada pelo fato de que a molécula adicional é CD2 ou CD28.
116. Partícula modificada na superfície, de acordo com a reivindicação 115, caracterizada pelo fato de que a partícula compreende um ou ambos de um anticorpo anti-CD2 e um anticorpo anti-CD28.
117. Partícula modificada na superfície, de acordo com qualquer uma das reivindicações 110 a 116, caracterizada pelo fato de que pelo menos um agente é covalentemente unido à partícula.
118. Partícula modificada na superfície, de acordo com qualquer uma das reivindicações 110 a 117, caracterizada pelo fato de que a razão, opcionalmente razão molar ou de peso, da molécula de ligação e pelo menos um agente compreendido pela partícula é ou é de cerca de 1:1.
119. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma pluralidade de partículas modificadas na superfície como definida em qualquer uma das reivindicações 79 a 118.
120. Composição, de acordo com a reivindicação 119, caracterizada pelo fato de que: a concentração da molécula de ligação na composição está entre ou entre cerca de 0,5 µg/mL e 500 µg/mL, 1 µg/mL e 200 µg/mL ou 5 µg/mL e 100 µg/mL L; ou a concentração da molécula de ligação na composição é de pelo menos ou pelo menos cerca de 1 µg/mL, 5 µg/mL, 10 µg/mL, 25 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL ou 200 µg/mL.
121. Composição, de acordo com a reivindicação 119 ou 120, caracterizada pelo fato de que a pluralidade de partículas modificadas na superfície é monodispersa.
122. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende a partícula modificada na superfície como definida em qualquer uma das reivindicações 79 a 118 ou a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 119 a 121 e instruções de uso.
123. Kit, de acordo com a reivindicação 122, caracterizado pelo fato de que as instruções são para selecionar ou enriquecer, a partir de uma população de células, células que expressam um receptor de antígeno quimérico compreendendo um domínio de ligação de antígeno especificamente reconhecido pela molécula de ligação.
124. Kit, de acordo com a reivindicação 122, caracterizado pelo fato de que as instruções são para estimular ou expandir, a partir de uma população de células, células que expressam um receptor de antígeno quimérico compreendendo um domínio de ligação de antígeno especificamente reconhecido pela molécula de ligação.
125. Método para expandir células, caracterizado pelo fato de que compreende incubar uma população de células com a partícula modificada na superfície de qualquer uma das reivindicações 79 a 118 ou a composição de qualquer uma das reivindicações 119 a 121.
126. Método para selecionar ou enriquecer células,
caracterizado pelo fato de que compreende contatar uma população de células com a partícula modificada na superfície como definida em qualquer uma das reivindicações 79 a 118 ou a composição de qualquer uma das reivindicações 119 a 121.
127. Método de estimulação de longo prazo para avaliar uma composição celular, caracterizado pelo fato de que compreende: incubar, por um período de tempo de pelo menos 10 dias, uma composição de entrada sob condições para estimular uma atividade dependente de CAR nas células na composição de entrada, a referida composição de entrada compreendendo células T expressando um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo um antígeno extracelular domínio de ligação que se liga a ou reconhece especificamente um antígeno, produzindo assim uma composição de saída; e avaliar um ou mais fenótipos ou atividades de uma ou mais células da composição de saída.
128. Método, de acordo com a reivindicação 127, caracterizado pelo fato de que as condições para estimular uma atividade dependente do CAR compreendem a presença de uma molécula de ligação que se liga especificamente ao domínio de ligação de antígeno do CAR.
129. Método, de acordo com a reivindicação 128, caracterizado pelo fato de que a molécula de ligação está ligada a um suporte.
130. Método, de acordo com a reivindicação 129, caracterizado pelo fato de que o suporte é um suporte sólido.
131. Método, de acordo com a reivindicação 130, caracterizado pelo fato de que o suporte sólido é a superfície de um poço de uma microplaca ou uma esfera.
132. Método, de acordo com a reivindicação 130 ou 131,
caracterizado pelo fato de que o suporte sólido é uma microplaca com a molécula de ligação ligada à microplaca e a incubação é realizada na microplaca.
133. Método, de acordo com a reivindicação 130 ou 131, caracterizado pelo fato de que o suporte sólido é uma esfera que uniu a molécula de ligação e a incubação é realizada na presença de uma pluralidade de esferas.
134. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 128 a 133, caracterizado pelo fato de que a molécula de ligação é ou compreende um antígeno recombinante ou uma porção do mesmo reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno.
135. Método, de acordo com a reivindicação 134, caracterizado pelo fato de que o antígeno recombinante ou uma porção do mesmo é BCMA, ou é uma porção do mesmo reconhecida pelo domínio de ligação de antígeno.
136. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 128 a 133, caracterizado pelo fato de que a molécula de ligação é ou compreende um anticorpo anti-iditóptico ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que se liga especificamente ao domínio de ligação de antígeno.
137. Método, de acordo com a reivindicação 136, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação de antígeno do receptor de antígeno é ou compreende o anticorpo SJ25C1 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo.
138. Método, de acordo com a reivindicação 136, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação de antígeno do receptor de antígeno é ou compreende o anticorpo FMC63 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo.
139. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127 a 138, caracterizado pelo fato de que o método é realizado in vitro ou ex vivo.
140. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127 a 139, caracterizado pelo fato de que a composição de entrada é incubada na presença de um meio que não compreende citocinas recombinantes.
141. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127 a 140, caracterizado pelo fato de que a incubação é realizada continuamente ou não é interrompida por um período de tempo.
142. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127 a 140, caracterizado pelo fato de que durante a incubação as células não são substituídas, o meio não é alterado e a molécula de ligação não é adicionada.
143. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127 a 142, caracterizado pelo fato de compreender a avaliação de um ou mais fenótipos do estado de ativação, exaustão ou diferenciação das uma ou mais células da composição de saída.
144. Método, de acordo com a reivindicação 143, caracterizado pelo fato de que o fenótipo é exaustão e a avaliação compreende medir a expressão, opcionalmente expressão de superfície, de um ou mais marcadores selecionados a partir de CTLA- 4, FOXP3, PD-1, TIGIT, LAB-3, 2B4, BTLA, TIM3, VISTA ou CD96.
145. Método, de acordo com a reivindicação 143, caracterizado pelo fato de que com o fenótipo é a ativação e a avaliação compreendendo medir a expressão, opcionalmente expressão de superfície, de um ou mais marcadores selecionados a partir de CD25, CD26, CD27, CD28, CD30, CD71, CD154, CD40L, CD127, LAG3 ou Ki67.
146. Método, de acordo com a reivindicação 143, caracterizado pelo fato de que o fenótipo é um estado de diferenciação e a avaliação compreende medir um ou mais marcadores selecionados a partir de (i) um ou mais de CD25, CD45RO, CD56, KLRG1, CD95 e/ou (ii) um ou de CD45RA, CD27, CD28, CD62L e CCR7, opcionalmente em que os um ou mais marcadores são marcadores estão associados positiva ou inversamente a células T do tipo pura.
147. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127 a 146, caracterizado pelo fato de que compreende avaliar uma ou mais atividades das uma ou mais células da composição de saída.
148. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127 a 147, caracterizado pelo fato de que uma ou mais atividades compreendem uma atividade dependente de CAR, opcionalmente uma atividade estimulada por antígeno.
149. Método, de acordo com a reivindicação 147 ou 148, caracterizado pelo fato de que uma ou mais atividades compreendem atividade citolítica ou produção de citocinas.
150. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127 a 149, caracterizado pelo fato de que o período de tempo é pelo menos ou pelo menos cerca de 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias ou 15 dias.
151. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127 a 149, caracterizado pelo fato de que o período de tempo é ou é de cerca de 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias ou 15 dias.
152. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127 a 151, caracterizado pelo fato de que a composição de entrada compreende células que foram expostas ou contatadas com um agente ou composto de teste antes da incubação, opcionalmente, em que a exposição ou contato é realizada durante uma ou mais etapas da um processo para produzir a composição de entrada compreendendo as células T que expressam o CAR.
153. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127 a 152, caracterizado pelo fato de que o método é realizado em uma pluralidade de composições de entrada, cada uma das referidas composições de entrada da pluralidade sendo produzida por um processo diferente.
154. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127 a 153, caracterizado pelo fato de compreender ainda a comparação do fenótipo ou atividade da composição de saída com o fenótipo ou atividade de uma composição de controle, opcionalmente em que a composição de controle é uma composição de células T que foram incubadas por pelo menos 10 dias sob as mesmas condições para estimular a atividade dependente de CAR, a referida composição de células T não foi produzida na presença do agente ou composto de teste ou foi produzida por um processo alternativo em comparação com a composição de entrada.
155. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127 a 154, caracterizado pelo fato de compreender ainda uma composição de saída que exibe exaustão reduzida, ativação reduzida ou diferenciação reduzida, opcionalmente em que a diferenciação reduzida compreende expressão aumentada de mais um marcador de célula T do tipo puro.
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