BR112019027614A2 - ligantes de braços pendentes curtos para nucleotídeos em aplicações de sequenciamento - Google Patents

ligantes de braços pendentes curtos para nucleotídeos em aplicações de sequenciamento Download PDF

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Abstract

A presente divulgação se refere a novos compostos nucleotídicos e oligonucleotídicos e suas utilizações em aplicações de sequenciamento de ácidos nucleicos.

Description

“LIGANTES DE BRAÇOS PENDENTES CURTOS PARA NUCLEOTÍDEOS EM APLICAÇÕES DE SEQUENCIAMENTO” INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA A QUALQUER PEDIDO PRIORITÁRIO
[0001] O presente pedido reivindica benefício de prioridade ao Pedido do Reino Unido (GB) No. 1711219.4, depositado em 12 de Julho de 2017, o qual é incorporado por referência na sua totalidade.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0002] A presente divulgação refere-se a novos compostos nucleotídicos e oligonucleotídicos e suas utilizações em aplicações de sequenciamento de ácidos nucleicos.
DESCRIÇÃO DA ARTE RELACIONADA
[0003] À medida que a tecnologia de sequenciamento avança, desenvolveu-se uma necessidade de reagentes de sequenciamento aprimorados que são particularmente favoráveis a métodos moleculares de alto rendimento, tal como sequenciamento de fase sólida e similar.
[0004] Em certos tipos de sequenciamento de alto rendimento, os nucleotídeos utilizados contêm fluoróforos que identificam especificamente a base incorporada. O fluoróforo pode ser ligado à base nucleotídica através de um ligante clivável. Portanto, depois que a base incorporada é identificada, o ligante pode ser clivado, permitindo que o fluoróforo seja removido, pronto para a próxima base a ser ligada e identificada. Tal clivagem deixa uma porção de "cicatriz" ou "braço pendente" localizada em cada uma das nucleobases detectadas. Embora seja possível projetar reagentes que não deixam qualquer traço após a clivagem, estes tendem a ser lentos para clivar e, portanto, não são particularmente eficazes. É necessário encontrar um equilíbrio entre a incorporação eficiente dos nucleotídeos marcados, a clivagem eficiente para remover todos os marcadores incorporados e a incorporação eficiente do nucleotídeo seguinte. Aqui são descritas estruturas otimizadas de nucleotídeos que melhoram o desempenho de nucleotídeos da técnica anterior em ciclos de Sequenciamento por Síntese (SBS).
[0005] Ligantes de nucleotídeos adequados estão descritos, por exemplo, no documento WO2004/018493. Os compostos aqui divulgados são mostrados como exemplo de fórmula (e): (e) em que B é uma base nucleosídica; e Fl é um fluoróforo conectado através de um ligante opcional. Este é clivado para deixar uma porção de braço pendente de fórmula (ei): (ei)
[0006] A Requerente percebeu que alterações no braço pendente podem fornecer melhorias para os dados de sequenciamento obtidos.
[0007] Aqui são descritas estruturas nucleotídicas aprimoradas e suas utilizações no sequenciamento. As moléculas descritas podem ser incorporadas em fitas de ácidos nucleicos. Também são descritas cadeias de ácidos nucleicos com certas modificações que permitem uma incorporação mais eficiente de nucleotídeos. Também são descritos arranjos de ácidos nucleicos e sua utilização no sequenciamento. Melhorias particulares podem ser observadas no que tange a eficiência da incorporação de nucleotídeos marcados, no comprimento e na precisão de leitura do sequenciamento obtido através dos novos construtos. As moléculas descritas abaixo são particularmente vantajosas em situações em que comprimentos de leitura longos são necessários ou em que tempos mais curtos de incorporação de nucleotídeos são vantajosos, fontes de excitação de alta potência são usadas.
SUMÁRIO
[0008] A presente divulgação refere-se a reagentes aprimorados para sequenciamento de ácidos nucleicos. Durante ciclos repetidos de sequenciamento por síntese (SBS), em que os nucleotídeos marcados com fluorescência são incorporados em uma fita estendida de ácido nucleico, é produzido um iniciador: molde de DNA "cicatrizado". A "cicatriz" ou "braço pendente" é uma fração localizada em cada uma das nucleobases detectadas, resultante da clivagem química do fluoróforo da nucleobase à qual está ligada. Esses braços pendentes se acumulam no iniciador:molde de DNA ao longo dos ciclos repetidos de SBS, produzindo uma molécula de iniciador:molde de DNA com estrutura molecular que difere em relação ao iniciador:molde de DNA natural. Esses braços pendentes residuais retardam a incorporação do novo nucleotídeo recebido e, portanto, aumentam a taxa de erro e diminuem a qualidade dos dados, especialmente nos estágios posteriores de uma execução de sequenciamento e em longas execuções de sequenciamento. A presente divulgação visa minimizar o tamanho do braço pendente deixado no iniciador: molde de DNA durante o sequenciamento.
[0009] De acordo com um primeiro aspecto, a presente divulgação fornece compostos de fórmula (I): (I) em que B é uma base nucleosídica; e Fl é um fluoróforo conectado através de um ligante opcional.
[00010] Os nucleosídeos são compostos que possuem uma ribose de carboidrato ligada a uma nucleobase. A nucleobase pode ser uma purina ou uma pirimidina. As purinas comuns de ocorrência natural são adenina (A) e guanina (G). As pirimidinas comuns de ocorrência natural são citidina (C) e timina (T) nas cadeias de DNA ou uracila (U) nas cadeias de RNA. A ribose pode ser uma 2'- desoxirribose (no DNA). Um nucleosídeo com uma porção fosfato ligado ao mesmo é um nucleotídeo e, portanto, os compostos aqui descritos podem estar na forma de um nucleotídeo. Em qualquer formulação como aqui descrita, B representa uma base nucleotídica.
[00011] Em quaisquer fórmulas aqui descritas, B pode representar uma base de pirimidina.
A base B pode assumir a forma de qualquer uma das quatro bases naturais comuns, A, G, C ou T/U.
A porção fosfato pode ser uma porção trifosfato, que pode ser ligada à posição 5'- da ribose.
Os compostos da presente divulgação podem incluir compostos de fórmula (c), fórmula (t) ou fórmula (a):
(c)
(t)
(a) em que P é um grupo trifosfato; e Fl é um fluoróforo conectado através de um ligante opcional.
[00012] A porção trifosfato permite a incorporação do composto nucleotídico em um ácido nucleico. A extensão que utiliza uma polimerase de ácido nucleico permite a ligação do composto ao 3'-OH de um iniciador de ácido nucleico. Assim, os compostos da presente divulgação podem ser ligados a um ácido oligonucleico. O oligonucleotídeo pode assumir a forma de um iniciador de ácido nucleico que foi submetido à extensão de polimerase para incorporar um composto da presente divulgação. Assim, é divulgado um oligonucleotídeo que compreende um composto conforme aqui divulgado.
[00013] É divulgado um composto nucleotídico ligado a um oligonucleotídeo. Quando o composto é marcado com fluorescência, geralmente apenas um único composto modificado seria ligado a cada oligonucleotídeo. Assim, é divulgado um oligonucleotídeo em que o 3'-nucleotídeo é um composto de fórmula (I):
(I) em que B é uma base nucleosídica; e Fl é um fluoróforo conectado através de um ligante opcional.
[00014] Para evitar dúvidas, é apreciado que, após incorporação, o grupo trifosfato é convertido em um diéster de monofosfato. Assim, é divulgado um oligonucleotídeo em que o 3'-nucleotídeo é um composto de fórmula (c), fórmula (t) ou fórmula (a): (c) (t)
(a) em que P é um grupo monofosfato; e Fl é um fluoróforo conectado através de um ligante opcional.
[00015] Os compostos acima podem alternativamente ser representados como um oligonucleotídeo, em que o 3'- nucleotídeo é um composto de fórmula (c), fórmula (t) ou fórmula (a): (c)
(t) (a) em que Oln é um oligonucleotídeo; e Fl é um fluoróforo conectado através de um ligante opcional.
[00016] Após a detecção da nucleobase incorporada, o marcador fluorescente e o ligante opcional podem ser removidos. A remoção é realizada pela redução do grupo azido, levando à fragmentação da porção O-CHNH2-. Após clivagem, um grupo hidroxil é deixado ligado à nucleobase e a fração fluorescente é destacada.
[00017] Assim, é divulgado um composto de fórmula (II):
(II) em que B é uma base nucleotídica.
[00018] A nucleobase pode ser uma purina ou uma pirimidina. As purinas comuns de ocorrência natural são adenina (A) e guanina (G). As pirimidinas comuns de ocorrência natural são citidina (C) e timina (T) nas cadeias de DNA ou uracila (U) nas cadeias de RNA. A ribose pode ser uma 2'-desoxirribose (no DNA).
[00019] O composto de fórmula II pode ser ligado a um oligonucleotídeo. Assim, a porção B pode ser uma base ligada a outras bases. Assim, é divulgado um oligonucleotídeo em que o 3'-nucleotídeo é um composto de fórmula (ci), fórmula (ti) ou fórmula (ai): (ci)
(ti) (ai) em que Oln é um oligonucleotídeo.
[00020] O oligonucleotídeo que possui o braço pendente hidroxil pode possuir vários braços pendentes no mesmo oligonucleotídeo. As bases modificadas com os braços pendentes normalmente seriam contíguas em uma sequência. É divulgado um oligonucleotídeo que compreende duas ou mais cópias de um composto de acordo com a fórmula (II). É divulgado um oligonucleotídeo que compreende dez ou mais cópias de uma composição de acordo com a fórmula (II). É divulgado um oligonucleotídeo que compreende cem ou mais cópias de um composto de acordo com a fórmula (II).
[00021] A incorporação de nucleotídeos pode ser realizada usando soluções com mais de um tipo de nucleotídeo. É divulgado um kit que compreende dois ou mais nucleotídeos, em que pelo menos um nucleotídeo é um nucleotídeo marcado conforme aqui descrito. O kit pode compreender dois ou mais nucleotídeos, em que pelo menos dois nucleotídeos são nucleotídeos marcados, conforme descrito aqui. O kit pode compreender quatro nucleotídeos em que pelo menos dois nucleotídeos são nucleotídeos marcados, conforme descrito aqui.
[00022] Os nucleosídeos, nucleotídeos, oligonucleotídeos e kits, tal como aqui descritos, podem ser utilizados no sequenciamento, análise de expressão, análise de hibridação, análise genética, análise de RNA, ou ensaios de ligação proteica, ou combinações dos mesmos.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[00023] A Figura 1 ilustra a formação do iniciador:molde de DNA cicatrizado ou pendente durante o sequenciamento.
[00024] A Figura 2 ilustra um exemplo da estrutura do nucleotídeo totalmente funcionalizado (ffN) do braço pendente curto usado durante o sequenciamento.
[00025] A Figura 3 ilustra exemplos de quatro nucleotídeos de braço pendente curto para sequenciamento de SBS de 2 canais.
[00026] As Figuras de 4A a 4C ilustram um exemplo das métricas de sequenciamento observados com o padrão e os nucleotídeos de braço pendente curto em um Hiseq® modificado de 2 canais com duas polimerases diferentes
(PolA e PolB) e duas bibliotecas de moldes diferentes (PhiX e humano).
[00027] As Figuras 5A e 5B demonstram um exemplo das métricas de sequenciamento observadas com o nucleotídeo padrão ou com o nucleotídeo de braço pendente curto em um Miseq® modificado de 2 canais.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[00028] A presente divulgação fornece novos compostos particularmente adequados para métodos de detecção de fluorescência e sequenciamento por síntese. Os compostos que possuem um braço pendente residual reduzido melhoram certas aplicações de sequenciamento de ácidos nucleicos.
[00029] De acordo com um primeiro aspecto, a presente divulgação fornece compostos de fórmula (I): (I) em que B é uma base nucleosídica; e Fl é um fluoróforo conectado através de um ligante opcional.
[00030] Os nucleosídeos são compostos que possuem uma ribose de carboidrato ligada a uma nucleobase. A nucleobase pode ser uma purina ou uma pirimidina. As purinas comuns de ocorrência natural são adenina (A) e guanina (G). As pirimidinas comuns de ocorrência natural são citidina (C) e timina (T) nas cadeias de DNA ou uracila (U) nas cadeias de RNA. A ribose pode ser uma 2'- desoxirribose (no DNA). Um nucleosídeo com uma porção fosfato ligada a mesma é um nucleotídeo e, portanto, os compostos aqui descritos podem estar na forma de um nucleotídeo. Em qualquer formulação como aqui descrita, B representa uma base nucleotídica.
[00031] Fl é um fluoróforo. Assim, os compostos da presente divulgação são marcados com fluorescência. A natureza do fluoróforo não é importante e pode incluir compostos selecionados a partir de qualquer espécie fluorescente conhecida, por exemplo, rodaminas ou cianinas. O fluoróforo pode ser ligado à nucleobase através de um ligante opcional. A função do ligante é geralmente auxiliar a ligação química do fluoróforo ao nucleotídeo. O ligante pode ser, por exemplo, uma cadeia alquil opcionalmente possuindo uma ou mais substituições de heteroátomo. O ligante pode conter grupos amida ou éster para facilitar as reações de acoplamento químico. O ligante pode ser sintetizado usando química de cliques. O ligante pode conter grupos triazol. O ligante pode conter outros grupos aril.
[00032] Exemplos de ligantes podem incluir espécies como as seguintes: ( )n onde n é um número inteiro de 2 a 6 e Fl é um fluoróforo.
[00033] A porção ribose do nucleosídeo ou nucleotídeo pode ser uma ribose ou desoxirribose. A ribose pode ter um ou mais grupos de bloqueio 2' ou 3' com o intuito de limitar a incorporação a um único nucleotídeo. O grupo de bloqueio pode ser um grupo azidometil. A ribose pode ser uma 2'-desoxirribose que possui um grupo de bloqueio 3'-azidometil. O grupo de bloqueio pode ser um grupo alil. A ribose pode ser uma 2'-desoxirribose com um grupo de bloqueio 3'-alil.
[00034] Em quaisquer fórmulas aqui descritas, B pode representar uma base de pirimidina. A base B pode assumir a forma de qualquer uma das quatro bases naturais comuns, A, G, C ou T/U. A porção fosfato pode ser uma porção trifosfato, que pode ser ligada à posição 5'- da ribose. Os compostos da presente divulgação podem incluir compostos de fórmula (cl), fórmula (tl) ou fórmula (al): ( )n (cl) ( )n (tl)
( )n (al) em que P é um grupo trifosfato; n é um número inteiro de 2 a 6; e Fl é um fluoróforo.
[00035] A fração trifosfato permite a incorporação do composto nucleotídico em um ácido nucleico. A extensão utilizando uma polimerase de ácido nucleico permite a ligação do composto ao 3'-OH de um iniciador de ácido nucleico. Assim, os compostos da presente divulgação podem ser ligados a um ácido oligonucleico. O oligonucleotídeo pode assumir a forma de um iniciador de ácido nucleico que foi submetido à extensão de polimerase para incorporar um composto da presente divulgação. Assim, é divulgado aqui é um oligonucleotídeo que compreende um composto, conforme divulgado aqui.
[00036] É divulgado um composto nucleotídico ligado a um oligonucleotídeo. Quando o composto é marcado com fluorescência, geralmente apenas um único composto modificado seria ligado a cada oligonucleotídeo. Assim, é divulgado um oligonucleotídeo em que o 3'-nucleotídeo é um composto de fórmula (III):
( )n (III) em que B é uma base nucleosídica; n é um número inteiro de 2 a 6; e Fl é um fluoróforo.
[00037] Para evitar dúvidas, é apreciado que, após incorporação, o grupo trifosfato é convertido em um diéster de monofosfato. Assim, é divulgado um oligonucleotídeo em que o 3'-nucleotídeo é um composto de fórmula (cl), fórmula (tl) ou fórmula (al): ( )n (cl) ( )n (tl)
( )n (al) em que P é um grupo monofosfato; n é um número inteiro de 2 a 6; e Fl é um fluoróforo.
[00038] Os compostos acima podem alternativamente ser representados como um oligonucleotídeo em que o 3'- nucleotídeo é um composto de fórmula (cl), fórmula (tl) ou fórmula (al): ( )n (cl) ( )n (tl)
( )n (al) em que Oln é um oligonucleotídeo; n é um número inteiro de 2 a 6; e Fl é um fluoróforo.
[00039] Em qualquer um dos exemplos disponibilizados n pode ser de 2 a 6. Em qualquer um dos exemplos disponibilizados n pode ser igual a 2. Em qualquer um dos exemplos disponibilizados n pode ser igual a 3. Em qualquer um dos exemplos disponibilizados n pode ser igual a 4. Em qualquer um dos exemplos disponibilizados n pode ser igual a 5. Em qualquer um dos exemplos disponibilizados n pode ser igual a 6.
[00040] Após a detecção da nucleobase incorporada, o marcador fluorescente e o ligante opcional podem ser removidos. A remoção é realizada pela redução do grupo azido, levando à fragmentação da porção O-CHNH2-. Após clivagem, um grupo hidroxil é deixado ligado à nucleobase e a fração fluorescente é destacada.
[00041] Assim, é divulgado um composto de fórmula (II): (II)
em que B é uma base nucleotídica.
[00042] A nucleobase pode ser uma purina ou uma pirimidina. As purinas comuns de ocorrência natural são adenina (A) e guanina (G). As pirimidinas comuns de ocorrência natural são citidina (C) e timina (T) nas cadeias de DNA ou uracila (U) nas cadeias de RNA. A ribose pode ser uma 2'-desoxirribose (no DNA).
[00043] O composto de fórmula II pode ser ligado a um oligonucleotídeo. Assim, a porção B pode ser uma base ligada a outras bases. Assim, é divulgado um oligonucleotídeo em que o 3'-nucleotídeo é um composto de fórmula (ci), fórmula (ti) ou fórmula (ai) (ci) (ti)
(ai) em que Oln é um oligonucleotídeo.
[00044] O oligonucleotídeo que possui o braço pendente hidroxil pode possuir vários braços pendentes no mesmo oligonucleotídeo. As bases modificadas com os braços pendentes normalmente seriam contíguas em uma sequência. É divulgado um oligonucleotídeo que compreende duas ou mais cópias de um composto de acordo com a fórmula (II). É divulgado um oligonucleotídeo que compreende dez ou mais cópias de uma composição de acordo com a fórmula (II). É divulgado um oligonucleotídeo que compreende cem ou mais cópias de um composto de acordo com a fórmula (II).
[00045] A incorporação de nucleotídeos pode ser realizada usando soluções com mais de um tipo de nucleotídeo. Assim, é divulgado um kit que compreende dois ou mais nucleotídeos, em que pelo menos um nucleotídeo é um nucleotídeo marcado conforme aqui descrito. O kit pode compreender dois ou mais nucleotídeos, em que pelo menos dois nucleotídeos são nucleotídeos marcados conforme descrito aqui. O kit pode compreender quatro nucleotídeos em que pelo menos dois nucleotídeos são nucleotídeos marcados conforme descrito aqui.
[00046] Os nucleosídeos, nucleotídeos, oligonucleotídeos e kits, tal como aqui descritos, podem ser utilizados no sequenciamento, análise de expressão, análise de hibridação, análise genética, análise de RNA, ou ensaios de ligação proteica, ou combinações dos mesmos.
[00047] São aqui fornecidos kits incluindo dois ou mais nucleotídeos, em que pelo menos um nucleotídeo é um nucleotídeo da presente divulgação. O kit pode incluir dois ou mais nucleotídeos marcados. Os nucleotídeos podem ser marcados com dois ou mais marcadores fluorescentes. Duas ou mais marcações podem ser excitadas usando uma única fonte de excitação, que pode ser um laser. Por exemplo, as bandas de excitação para os dois ou mais marcadores podem estar pelo menos parcialmente sobrepostas, de modo que a excitação na região de sobreposição do espectro faça com que ambos os marcadores emitam fluorescência. Em concretizações particulares, a emissão dos dois ou mais marcadores ocorrerá em diferentes regiões do espectro, de modo que a presença de pelo menos um dos marcadores possa ser determinada pela distinção óptica da emissão.
[00048] O kit pode conter quatro nucleotídeos marcados, em que o primeiro dos quatro nucleotídeos é conforme aqui divulgado. Nesse kit, o segundo, terceiro e quarto nucleotídeos podem ser marcados com um composto que é opcionalmente espectralmente diferente do marcador no primeiro nucleotídeo e opcionalmente espectralmente diferente dos marcadores entre si. Assim, um ou mais dos compostos podem ter um máximo de absorbância e/ou máximo de emissão distinto(s), de modo que o(s) composto(s) é(são)
distinguível(s) em relação aos outros compostos. Por exemplo, cada composto pode ter um máximo de absorbância e/ou máximo de emissão distinta, de modo que cada um dos compostos seja distinguível em relação aos outros três compostos. Será entendido que parte do espectro de absorbância e/ou espectro de emissão diferentes dos máximos podem diferir e essas diferenças podem ser exploradas para distinguir os compostos. O kit pode ser tal que dois ou mais dos compostos tenham uma absorbância distinta máxima acima de 600 nm. Os compostos da invenção absorvem tipicamente luz na região acima de 640 nm.
[00049] Os compostos, nucleotídeos ou kits aqui apresentados podem ser utilizados para detectar, medir ou identificar um sistema biológico (incluindo, por exemplo, processos ou componentes dos mesmos). Técnicas exemplificativas que podem empregar os compostos, nucleotídeos ou kits incluem sequenciamento, análise de expressão, análise de hibridação, análise genética, análise de RNA, ensaio celular (por exemplo, ligação celular ou análise da função celular), ou ensaio de proteínas (por exemplo, ensaio de ligação proteica ou ensaio de atividade proteica). O uso pode estar em um instrumento automatizado para concretizar uma técnica específica, tal como um instrumento de sequenciamento automatizado. O instrumento de sequenciamento pode conter dois lasers operando em diferentes comprimentos de onda.
[00050] A presente divulgação fornece conjugados de nucleosídeos e nucleotídeos (nucleotídeos modificados) marcados com fluorescência. Os nucleosídeos e nucleotídeos marcados são úteis para a marcação de polinucleotídeos formados por síntese enzimática, tal como, a título de exemplo não limitativo, na amplificação por PCR, amplificação isotérmica, amplificação de fase sólida, sequenciamento de polinucleotídeos (por exemplo, sequenciamento de fase sólida), reações de conversão de níquel e similares.
[00051] Os nucleosídeos e nucleotídeos podem ser marcados em sítios no açúcar ou nas nucleobases. Tal como conhecido na arte, um "nucleotídeo" consiste em uma base nitrogenada, um açúcar e um ou mais grupos fosfato. No RNA, o açúcar é uma ribose e, no DNA, é uma desoxirribose, ou seja, um açúcar sem um grupo hidroxila que está presente na ribose. A base nitrogenada é um derivado da purina ou pirimidina. As purinas podem ser adenina (A) ou guanina (G), e as pirimidinas podem ser citosina (C), timina (T) ou, no contexto do RNA, uracila (U). O átomo C-1 da desoxirribose está ligado a N-1 de uma pirimidina ou N-9 de uma purina. Um nucleotídeo também é um éster fosfato de um nucleosídeo, com esterificação ocorrendo no grupo hidroxila ligado ao C-3 ou C-5 do açúcar. Os nucleotídeos são geralmente mono, di ou trifosfatos.
[00052] Um "nucleosídeo" é estruturalmente semelhante a um nucleotídeo, mas sem a presença das porções fosfato. Um exemplo de um análogo de nucleosídeo seria aquele em que o marcador está ligado à base e não há grupo fosfato ligado à molécula de açúcar.
[00053] Embora a base seja geralmente referida como purina ou pirimidina, o técnico na arte apreciará que existem derivados e análogos que não alteram a capacidade do nucleotídeo ou nucleosídeo de sofrer o pareamento de bases de Watson-Crick. "Derivado" ou "análogo" significa um composto ou molécula cuja estrutura principal é a mesma ou que se assemelha à de um composto equivalente, mas que possui uma modificação química ou física, tal como, por exemplo, um grupo lateral diferente ou adicional, que permite que o nucleotídeo ou nucleosídeo derivado seja ligado à outra molécula. Por exemplo, a base pode ser uma deazapurina. Em concretizações particulares, os derivados são capazes de sofrer o pareamento de Watson-Crick. "Derivado" e "análogo" também incluem, por exemplo, um nucleotídeo sintético ou nucleosídeo derivado com porções de base modificadas e/ou porções de açúcar modificadas. Tais derivados e análogos são discutidos, por exemplo, em Scheit, Nucleotide analogs (John Wiley & Son, 1980) e Uhlman et al., Chemical Reviews 90:543-584, 1990. Os análogos de nucleotídeos também podem ter ligações fosfodiéster modificadas, incluindo ligações fosforotioato, fosforoditioato, alquilfosfonato, fosforanilidato, fosforamidato e similares.
[00054] O fluoróforo pode estar ligado a qualquer posição em uma base nucleotídica, por exemplo, através de um ligante. Em concretizações particulares, a base de Watson-Crick ainda pode ser realizada para o análogo resultante. Os sítios de marcação de nucleobases específicos incluem a posição C5 de uma base de pirimidina ou a posição C7 de uma base de 7-deszapurina. Tal como descrito acima, um grupo ligante pode ser usado para ligar covalentemente um corante ao nucleosídeo ou nucleotídeo. Em concretizações particulares, o nucleosídeo ou nucleotídeo marcado pode ser enzimaticamente incorporável e enzimaticamente extensível. Consequentemente, uma porção ligante pode possuir comprimento suficiente para conectar o nucleotídeo ao composto, de modo que o composto não interfira significativamente com a ligação geral e o reconhecimento do nucleotídeo por uma enzima de replicação de ácido nucleico. Assim, o ligante também pode compreender uma unidade de espaçamento. A unidade de espaçamento distancia, por exemplo, a base do nucleotídeo em relação a um sítio ou marcação de clivagem.
[00055] Os nucleosídeos ou nucleotídeos marcados de acordo com a divulgação podem possuir a fórmula: B-L-Dye em que Dye (corante) é um composto fluorescente, B é uma nucleobase, tal como, por exemplo, uracila, timina, citosina, adenina, guanina e semelhantes e L é um grupo de ligação opcional que pode ou não estar presente. R' pode ser H, monofosfato, difosfato, trifosfato, tiofosfato, um análogo de éster de fosfato, -O- ligado a um grupo contendo fósforo reativo ou -O- protegido por um grupo de bloqueio. R'' pode ser H, OH, um fosforamidita ou um grupo de bloqueio 3'OH e R''' é H ou OH. R'' é fosforamidita, R' é um grupo protetor de hidroxila clivável por ácido que permite subsequente acoplamento de monômero sob condições de síntese automatizada.
[00056] Em outra concretização alternativa, não há grupo de bloqueio no carbono 3' do açúcar pentose e o corante (ou construto de corante e ligante) fixado à base, por exemplo, pode ser de tamanho ou estrutura suficiente para agir como um bloco para a incorporação de outro nucleotídeo. Assim, o bloco pode ser devido ao obstáculo estérico ou devido a uma combinação de tamanho, carga e estrutura, independentemente de o corante estar ou não ligado à posição 3' do açúcar.
[00057] Em outra concretização alternativa, o grupo de bloqueio está presente no carbono 2' ou 4' do açúcar pentose e pode ser de tamanho ou estrutura suficiente para atuar como um bloco para a incorporação de um nucleotídeo adicional.
[00058] O uso de um grupo de bloqueio permite que a polimerização seja controlada, tal como interromper a extensão quando um nucleotídeo modificado é incorporado. Se o efeito de bloqueio for reversível, por exemplo, a título de exemplo não limitativo, pela alteração das condições químicas ou pela remoção de um bloco químico, a extensão poderá ser interrompida em determinados pontos e, em seguida, autorizada a continuar.
[00059] Em outra concretização particular, um grupo de bloqueio 3'OH compreenderá porções divulgadas no documento WO2004/018497. Por exemplo, o grupo de bloqueio pode ser azidometil (CH2N3) ou alil.
[00060] Em uma concretização específica, um ligante (entre o corante e o nucleotídeo) e um grupo de bloqueio estão presentes e são porções separadas. Em concretizações particulares, o ligante e o grupo de bloqueio são cliváveis sob condições substancialmente semelhantes. Assim, os processos de desproteção e desbloqueio podem ser mais eficientes, uma vez que apenas um único tratamento será necessário para remover o composto corante e o bloco. No entanto, em algumas modalidades, um ligante e um grupo de bloqueio não precisam ser cliváveis sob condições semelhantes, estes podem ser individualmente cliváveis sob condições distintas.
[00061] A presente divulgação também abrange polinucleotídeos que incorporam compostos fluorescentes. Tais polinucleotídeos podem ser DNA ou RNA compreendidos respectivamente de desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos unidos na ligação fosfodiéster. Os polinucleotídeos de acordo com a divulgação podem compreender nucleotídeos de ocorrência natural, nucleotídeos de ocorrência não natural (ou modificados) que não sejam os nucleotídeos modificados da presente divulgação ou qualquer combinação dos mesmos, em combinação com pelo menos um nucleotídeo modificado (por exemplo, marcado com um composto corante) definido aqui adiante. Os polinucleotídeos de acordo com a divulgação também podem incluir ligações de cadeia principal não naturais e/ou modificações químicas não nucleotídicas. Estruturas quiméricas constituídas por misturas de ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos compreendendo pelo menos um nucleotídeo modificado de acordo com a invenção são também contempladas.
[00062] Os nucleotídeos (ou nucleosídeos) modificados compreendendo um composto fluorescente de acordo com a presente divulgação podem ser utilizados em qualquer método de análise, tais como métodos que incluem a detecção de uma marcação fluorescente ligada a um nucleotídeo ou nucleosídeo, por si só, incorporado, ou associado a uma estrutura molecular maior ou conjugada. Neste contexto, o termo "incorporado a um polinucleotídeo" pode significar que o fosfato 5' está unido na ligação fosfodiéster ao grupo hidroxila 3' de um segundo nucleotídeo (modificado ou não modificado), que pode ele próprio fazer parte de uma cadeia polinucleotídica mais longa. A extremidade 3' de um nucleotídeo modificado apresentado aqui pode ou não ser unida na ligação fosfodiéster ao fosfato 5' de outro nucleotídeo (modificado ou não modificado). Assim, em uma concretização não limitativa, a divulgação fornece um método para detectar um nucleotídeo modificado incorporado em um polinucleotídeo que compreende: (a) incorporar pelo menos um nucleotídeo modificado da presente divulgação em um polinucleotídeo e (b) detectar o(s) nucleotídeo(s) modificado(s) incorporado(s) no polinucleotídeo através da detecção do sinal fluorescente do composto corante ligado ao(s) referido(s) nucleotídeo(s) modificado(s).
[00063] Este método pode incluir: uma etapa sintética (a) na qual um ou mais nucleotídeos modificados de acordo com a divulgação são incorporados em um polinucleotídeo e uma etapa de detecção (b) na qual um ou mais nucleotídeos modificados incorporados ao polinucleotídeo são detectados, através da detecção ou medição quantitativa de sua(s) fluorescência(s).
[00064] Em uma concretização da presente divulgação, pelo menos um nucleotídeo modificado é incorporado em um polinucleotídeo em uma etapa sintética pela ação de uma enzima polimerase. No entanto, podem ser utilizados outros métodos para ligar nucleotídeos modificados a polinucleotídeos, como por exemplo, síntese química de oligonucleotídeos ou ligação de oligonucleotídeos marcados a oligonucleotídeos não marcados. Portanto, o termo "incorporando", quando usado em referência a um nucleotídeo e polinucleotídeo, pode abranger a síntese de polinucleotídeos por métodos químicos, bem como por métodos enzimáticos.
[00065] Em uma concretização específica, uma etapa sintética é realizada e pode opcionalmente compreender a incubação de um molde de fita polinucleotídica com uma mistura de reação compreendendo nucleotídeos modificados marcados com fluorescência da presente divulgação. Uma polimerase também pode ser fornecida sob condições que permitem a formação de uma ligação fosfodiéster entre um grupo hidroxila 3' livre em uma fita polinucleotídica anelada no molde de fita polinucleotídica e um grupo fosfato 5' no nucleotídeo modificado. Assim, uma etapa sintética pode incluir a formação de uma fita polinucleotídica, conforme direcionado pelo pareamento complementar de bases de nucleotídeos com um molde de fita.
[00066] Em todas as concretizações do método, a etapa de detecção pode ser realizada enquanto a fita polinucleotídica, na qual os nucleotídeos modificados são incorporados, é anelada a uma molde de fita, ou após uma etapa de desnaturação na qual as duas fitas são separadas. Etapas adicionais, por exemplo, etapas de reação química ou enzimática ou etapas de purificação, podem ser incluídas entre uma etapa sintética e uma etapa de detecção. Em particular, a fita alvo que incorpora o(s) nucleotídeo(s) modificado(s) pode ser isolada ou purificada e depois adicionalmente processada, ou usada em uma análise subsequente. A título de exemplo, os polinucleotídeos alvo marcados com nucleotídeo(s) modificado(s) em uma etapa sintética podem ser subsequentemente utilizados como sondas ou iniciadores marcados. Em outras modalidades, o produto de uma etapa sintética aqui apresentada pode estar sujeito a outras etapas da reação e, se desejado, o produto dessas etapas subsequentes pode ser purificado ou isolado.
[00067] As condições adequadas para uma etapa sintética serão bem conhecidas dos familiarizados com as técnicas padrão de biologia molecular. Em uma modalidade, uma etapa sintética pode ser análoga a uma reação padrão de extensão do iniciador usando precursores de nucleotídeos, incluindo nucleotídeos modificados aqui apresentados, para formar uma fita alvo estendida complementar ao molde de fita na presença de uma enzima polimerase adequada. Em outras modalidades, uma etapa sintética pode ela própria fazer parte de uma reação de amplificação produzindo um produto de amplificação de fita dupla marcado, composto por fitas complementares pareadas derivadas da cópia de molde de fitas polinucleotídicas e alvo. Outras etapas sintéticas exemplares incluem tradução de Nick, polimerização por deslocamento de cadeia, marcação aleatória de DNA primed, etc. Uma enzima polimerase particularmente útil para uma etapa sintética é aquela que é capaz de catalisar a incorporação de um ou mais dos nucleotídeos modificados estabelecidos aqui. Pode ser utilizada uma variedade de polimerases de ocorrência natural ou modificadas. A título de exemplo, uma polimerase termoestável pode ser utilizada para uma reação sintética realizada através da utilização de condições de termociclagem, enquanto que uma polimerase termoestável também pode não ser desejada para reações de extensão isotérmica do iniciador. Polimerases termoestáveis adequadas que são capazes de incorporar os nucleotídeos modificados de acordo com a divulgação incluem aquelas descritas nos documentos WO 2005/024010 ou WO06120433. Em reações sintéticas realizadas com temperaturas mais baixas, tal 37°C, as enzimas polimerase não precisam necessariamente ser polimerases termoestáveis, portanto, a escolha da polimerase dependerá de vários fatores, tais como temperatura da reação, pH, atividade de desalinhamento da cadeia e similares.
[00068] Em concretizações específicas não limitativas, a divulgação abrange métodos de sequenciamento de ácidos nucleicos, resequenciamento, sequenciamento de genoma inteiro, pontuação de polimorfismo de nucleotídeo único ou qualquer outra aplicação que envolva a detecção do nucleotídeo modificado ou nucleosídeo marcado com corantes estabelecidos aqui quando incorporado em um polinucleotídeo. Qualquer uma de várias outras aplicações que se beneficiam do uso de polinucleotídeos marcados com os nucleotídeos modificados compreendendo fluoróforos podem utilizar nucleotídeos modificados ou nucleosídeos marcados com corantes aqui estabelecidos.
[00069] Em uma concretização específica, a divulgação fornece o uso de nucleotídeos modificados de acordo com a divulgação em uma reação de sequenciamento por síntese de polinucleotídeo. O sequenciamento por síntese geralmente envolve a adição sequencial de um ou mais nucleotídeos ou oligonucleotídeos a uma cadeia polinucleotídica crescente na direção 5' a 3' usando uma polimerase ou ligase, com o intuito de formar uma cadeia polinucleotídica estendida complementar ao molde de ácido nucleico a ser sequenciado. A identidade da base presente em um ou mais nucleotídeo(s) adicionado(s) pode ser determinada em uma etapa de detecção ou "de imagem". A identidade da base adicionada pode ser determinada após cada etapa de incorporação do nucleotídeo. A sequência do molde pode então ser inferida usando regras convencionais de pareamento de bases de Watson-Crick. O uso dos nucleotídeos modificados marcados com corantes aqui apresentados para determinação da identidade de uma única base pode ser útil, por exemplo, na classificação de polimorfismos de nucleotídeo único, e essas reações de extensão de base única estão dentro do escopo da presente divulgação.
[00070] Em uma concretização da presente divulgação, a sequência de um molde de polinucleotídeo é determinada pela detecção da incorporação de um ou mais nucleotídeos em uma fita nascente complementar ao molde de polinucleotídeo a ser sequenciado através da detecção de marcador(es) fluorescente(s) ligado(s) ao(s) nucleotídeo(s) incorporado(s). O sequenciamento do molde de polinucleotídeo pode ser iniciado com um iniciador adequado (ou preparado como uma construção tipo harpin que conterá o iniciador como parte do harpin), e a fita nascente é estendida de maneira gradual através da adição de nucleotídeos a extremidade 3' do iniciador em uma reação catalisada por polimerase.
[00071] Em concretizações particulares, cada um dos diferentes trifosfatos de nucleotídeos (A, T, G e C) pode ser marcado com um fluoróforo exclusivo e também compreende um grupo de bloqueio na posição 3' para prevenir a polimerização descontrolada. Alternativamente, um dos quatro nucleotídeos pode não estar marcado (escuro). A enzima polimerase incorpora um nucleotídeo na fita nascente complementar ao molde de polinucleotídeo, e o grupo de bloqueio impede a incorporação adicional de nucleotídeos. Quaisquer nucleotídeos não incorporados podem ser lavados e o sinal fluorescente de cada nucleotídeo incorporado pode ser "lido" opticamente por meios adequados, tal como um dispositivo acoplado de carga usando excitação a laser e filtros de emissão adequados. O grupo de bloqueio 3' e os compostos fluoróforo podem então ser removidos (desprotegidos), (simultaneamente ou sequencialmente) para expor a fita nascente para posterior incorporação de nucleotídeos. Tipicamente, a identidade do nucleotídeo incorporado será determinada após cada etapa de incorporação, mas isso não é estritamente essencial. Da mesma forma, a Patente Norte Americana No. 5.302.509 descreve um método para sequenciar polinucleotídeos imobilizados em um suporte sólido.
[00072] O método, tal como exemplificado acima, utiliza a incorporação de nucleotídeos A, G, C e T bloqueados em 3’, marcados com fluorescência em uma fita crescente complementar ao polinucleotídeo imobilizado, na presença de DNA polimerase. A polimerase incorpora uma base complementar ao polinucleotídeo alvo, mas é impedida de exercer adição adicional pelo grupo de bloqueio 3'. O marcador do nucleotídeo incorporado pode então ser determinado e o grupo de bloqueio removido por clivagem química para permitir que ocorra polimerização adicional. O molde de ácido nucleico a ser sequenciado em uma reação de sequenciamento por síntese pode ser qualquer polinucleotídeo que se deseja sequenciar. O molde de ácido nucleico para uma reação de sequenciamento compreenderá tipicamente uma região de fita dupla com um grupo hidroxila 3' livre que serve como um iniciador ou ponto de iniciação para a adição de nucleotídeos adicionais na reação de sequenciamento. A região do molde a ser sequenciado ultrapassará esse grupo hidroxila 3' livre na cadeia complementar. A região pendente do molde a ser sequenciado pode ser de cadeia simples, mas pode ser de cadeia dupla, desde que um "nick esteja presente" na cadeia complementar à cadeia do molde a ser sequenciado para fornecer um grupo 3' OH livre para iniciação da reação de sequenciamento. Em tais modalidades, o sequenciamento pode ser processado pelo deslocamento da fita. Em certas modalidades, um iniciador contendo o grupo hidroxila 3' livre pode ser adicionado como um componente separado (por exemplo, um oligonucleotídeo curto) que hibridiza com uma região de fita simples do molde a ser sequenciado. Alternativamente, o iniciador e o molde de fita a ser sequenciada podem formar parte de uma cadeia de ácido nucleico parcialmente auto-complementar capaz de formar um duplex intra- molecular, tal como, por exemplo, uma estrutura de laço de harpin. Os polinucleotídeos e os métodos harpin pelos quais eles podem ser ligados a suportes sólidos são divulgados nas publicações de patentes internacionais Nos. WO0157248 e WO2005/047301. Os nucleotídeos podem ser adicionados sucessivamente a um iniciador em crescimento, resultando na síntese de uma cadeia polinucleotídica na direção 5' para 3'. A natureza da base que foi adicionada pode ser determinada, particularmente, mas não necessariamente, após cada adição de nucleotídeo, fornecendo assim informações de sequência para o molde de ácido nucleico. Assim, um nucleotídeo é incorporado em uma fita de ácido nucleico (ou polinucleotídeo) pela união do nucleotídeo ao grupo hidroxila 3' livre da fita de ácido nucleico através da formação de uma ligação fosfodiéster com o grupo fosfato 5' do nucleotídeo.
[00073] O molde de ácido nucleico a ser sequenciado pode ser DNA ou RNA, ou mesmo uma molécula híbrida composta por desoxinucleotídeos e ribonucleotídeos. O molde de ácido nucleico pode compreender nucleotídeos de ocorrência natural e/ou não natural e ligações de cadeia principal naturais ou não naturais, desde que eles não impeçam a cópia do molde na reação de sequenciamento.
[00074] Em certas modalidades, o molde de ácido nucleico a ser sequenciado pode ser ligado a um suporte sólido por meio de qualquer método de ligação adequado conhecido na arte, por exemplo, através da ligação covalente. Em certas modalidades, os moldes de polinucleotídeos podem ser ligados diretamente a um suporte sólido (por exemplo, um suporte à base de sílica). No entanto, em outras concretizações da presente divulgação, a superfície do suporte sólido pode ser modificada de alguma maneira para permitir a ligação covalente direta do molde de polinucleotídeos ou para imobilizar os moldes de polinucleotídeos através de uma multicamada de hidrogel ou polieletrólito, que por si só pode ser não covalentemente ligado ao suporte sólido.
[00075] Os arranjos em que os polinucleotídeos foram diretamente ligados aos suportes à base de sílica são aqueles, por exemplo, descritos em WO00006770, em que os polinucleotídeos são imobilizados sobre um suporte de vidro, através de reação entre um grupo epóxido pendente no vidro com um grupo amino interno sobre o polinucleotídeo. Além disso, os polinucleotídeos podem ser ligados a um suporte sólido por reação de um nucleófilo à base de enxofre com o suporte sólido, por exemplo, tal como descrito no documento WO2005/047301. Outro exemplo de molde de polinucleotídeos com suporte sólido é aquele em que os moldes de polinucleotídeos são conectados ao hidrogel suportado em suportes à base de sílica ou outros suportes sólidos, por exemplo, conforme descrito nos documentos W000/31148, W001/01143, W002/12566, W003/014392, Patente Norte Americana No. 6.465.178 e W000/53812.
[00076] Uma superfície particular, na qual os moldes de polinucleotídeos podem ser imobilizados, é um hidrogel de poliacrilamida. Os hidrogéis de poliacrilamida são descritos nas referências citadas acima e no documento WO2005/065814.
[00077] Moldes de moléculas de DNA podem ser ligadas a esferas ou micropartículas. A ligação a esferas ou micropartículas pode ser útil para aplicações de sequenciamento. As bibliotecas de esferas podem ser preparadas onde cada esfera contém diferentes sequências de DNA. Bibliotecas e métodos exemplificativos para suas criações são descritos em Nature. 437, 376-380 (2005); Science. 309, 5741, 1728-1732 (2005). O sequenciamento de arranjos de tais esferas utilizando nucleotídeos aqui apresentados está dentro do escopo da presente divulgação.
[00078] O(s) molde(s) a ser(serem) sequenciado(s) pode(m) fazer parte de um "arranjo" em um suporte sólido; nesse caso, o arranjo pode assumir qualquer forma conveniente. Assim, o método da presente divulgação é aplicável a todos os tipos de arranjos de alta densidade, incluindo arranjos de molécula única, arranjos agrupados e arranjos de esferas. Os nucleotídeos modificados marcados com compostos corantes da presente divulgação podem ser utilizados para sequenciar moldes em essencialmente qualquer tipo de arranjos, incluindo, mas não se limitando a, aqueles formados pela imobilização de moléculas de ácido nucleico em um suporte sólido.
[00079] No entanto, os nucleotídeos modificados da presente divulgação são particularmente vantajosos no contexto de sequenciamento de arranjos agrupados. Em arranjos agrupados, regiões distintas no arranjo (muitas vezes referidas como sítios ou características) compreendem vários moldes de moléculas polinucleotídicas. Geralmente, as múltiplas moléculas de polinucleotídeo não são individualmente resolvíveis por meios ópticos e, em vez disso, são detectadas como um conjunto. Dependendo de como o arranjo é formado, cada sítio do arranjo pode compreender várias cópias de uma molécula de polinucleotídeo individual (por exemplo, o sítio é homogêneo para uma determinada espécie de ácido nucleico de fita simples ou dupla) ou até várias cópias de um pequeno número de moléculas polinucleotídicas diferentes (por exemplo, cópias múltiplas de duas espécies diferentes de ácidos nucleicos). Arranjos agrupados de moléculas de ácido nucleico podem ser produzidos usando técnicas geralmente conhecidas na arte. A título de exemplo, os documentos WO 98/44151 e WO00/18957, cada um dos quais incorporados aqui, descrevem métodos de amplificação de ácidos nucleicos nos quais os moldes e os produtos de amplificação permanecem imobilizados em um suporte sólido, com o intuito de formar arranjos compostos de agrupamentos ou "colônias" de moléculas imobilizadas de ácido nucleico. As moléculas de ácido nucleico presentes nos arranjos agrupados preparados de acordo com esses métodos são moldes adequados para sequenciamento usando os nucleotídeos modificados marcados com compostos corantes da presente divulgação.
[00080] Os nucleotídeos modificados da presente divulgação também são úteis no sequenciamento de moldes em arranjos de moléculas únicas. O termo "arranjo de molécula única" ou "SMA", conforme usado aqui, refere-se a uma população de moléculas de polinucleotídeos, distribuída (ou arranjada) sobre um suporte sólido, em que o espaçamento de qualquer polinucleotídeo individual em relação aos outros da população é tal que é possível resolver individualmente as moléculas polinucleotídicas individuais. As moléculas de ácido nucleico alvo imobilizadas na superfície do suporte sólido podem assim ser capazes de serem resolvidas por meios ópticos em algumas modalidades. Isto significa que um ou mais sinais distintos, cada um representando um polinucleotídeo, ocorrerão dentro da área resolvível do dispositivo de imagem usado.
[00081] A detecção de molécula única pode ser alcançada onde o espaçamento entre as moléculas de polinucleotídeo adjacentes em um arranjo é de pelo menos 100 nm, mais particularmente pelo menos 250 nm, ainda mais particularmente pelo menos 300 nm, ainda mais particularmente pelo menos 350 nm. Assim, cada molécula é individualmente resolvível e detectável como um ponto fluorescente de molécula única, e a fluorescência a partir do referido ponto fluorescente de molécula única também exibe fotodegradação em uma única etapa.
[00082] Os termos "resolvido individualmente" e "resolução individual" são aqui usados para especificar que, quando visualizada, é possível distinguir uma molécula no arranjo a partir de suas moléculas vizinhas. A separação entre moléculas individuais no arranjo será determinada, em parte, pela técnica específica usada para resolver as moléculas individuais. As características gerais dos arranjos de moléculas únicas serão entendidas por referência aos pedidos WO00/06770 e WO 01/57248. Embora o uso dos nucleotídeos modificados da presente divulgação seja aplicado em reações de sequenciamento por síntese, a utilidade dos nucleotídeos modificados não está limitada a esses métodos. De fato, os nucleotídeos podem ser utilizados vantajosamente em qualquer metodologia de sequenciamento que exija a detecção de marcadores fluorescentes ligados a nucleotídeos incorporados em um polinucleotídeo.
[00083] Em particular, os nucleotídeos modificados da presente divulgação podem ser utilizados em protocolos automatizados de sequenciamento de fluorescência, particularmente sequenciamento de ciclo de fluoróforo- terminador com base no método de sequenciamento de terminação em cadeia de Sanger. Tais métodos geralmente usam enzimas e sequenciamento de ciclo para incorporar didesoxi-nucleotídeos marcados com fluorescência em uma reação de sequenciamento de extensão do iniciador. Os chamados métodos de sequenciamento de Sanger e protocolos relacionados (tipo Sanger) utilizam terminação de cadeia aleatória com didesoxi-nucleotídeos marcados.
[00084] A presente divulgação também fornece kits que incluem nucleosídeos e/ou nucleotídeos modificados marcados com fluoróforos. Tais kits geralmente incluem pelo menos um nucleotídeo modificado ou nucleosídeo marcado, tal como estabelecido aqui juntamente com pelo menos um componente adicional. O(s) componente(s) adicional(ais) pode(m) ser um ou mais dos componentes identificados em um método estabelecido acima ou na seção de Exemplos abaixo. Alguns exemplos não limitativos de componentes que podem ser combinados em um kit da presente divulgação são apresentados abaixo.
[00085] Em uma concretização particular, um kit pode incluir pelo menos um nucleotídeo ou nucleosídeo modificado marcado como estabelecido aqui juntamente com nucleotídeos ou nucleosídeos modificados ou não modificados. Por exemplo, nucleotídeos modificados marcados de acordo com a presente divulgação podem ser fornecidos em conjunto com nucleotídeos não marcados ou nativos e/ou com nucleotídeos marcados com fluorescência ou qualquer combinação dos mesmos. Consequentemente, os kits podem compreender nucleotídeos modificados marcados com corantes de acordo com a presente divulgação e nucleotídeos modificados marcados com outros, por exemplo, compostos corantes presentes na técnica anterior. As combinações de nucleotídeos podem ser fornecidas como componentes individuais separados (por exemplo, um tipo de nucleotídeo por recipiente ou tubo) ou como misturas de nucleotídeos (por exemplo, dois ou mais nucleotídeos misturados no mesmo recipiente ou tubo).
[00086] Onde os kits compreendem uma pluralidade, particularmente dois, mais particularmente quatro, nucleotídeos modificados marcados com um composto corante, os diferentes nucleotídeos podem ser marcados com diferentes compostos corantes, ou um pode ser escuro, sem compostos de corante.
Quando os diferentes nucleotídeos são marcados com diferentes compostos corantes, é uma característica dos kits que os referidos compostos corantes sejam fluoróforos espectralmente distinguíveis.
Tal como usado aqui, o termo "fluoróforos espectralmente distinguíveis" refere-se à fluoróforos que emitem energia fluorescente em comprimentos de onda que podem ser distinguidos por equipamento de detecção de fluorescência (por exemplo, uma plataforma comercial de sequenciamento de DNA baseada em capilares) quando dois ou mais desses corantes estão presentes em uma amostra.
Quando dois nucleotídeos modificados marcados com compostos fluoróforos são fornecidos em forma de kit, é uma característica de algumas concretizações que os fluoróforos espectralmente distinguíveis possam ser excitados no mesmo comprimento de onda, tal como, por exemplo, pelo mesmo laser.
Quando quatro nucleotídeos modificados marcados com compostos fluoróforos são fornecidos em forma de kit, é uma característica de algumas concretizações que dois dos fluoróforos espectralmente distinguíveis possam ser excitados em um comprimento de onda e os outros dois corantes espectralmente distinguíveis possam ser excitados em outro comprimento de onda.
Comprimentos específicos de onda de excitação são 532 nm, 630 nm a 700 nm, particularmente 660 nm.
[00087] Em uma modalidade, um kit inclui um nucleotídeo modificado marcado com um composto da presente divulgação e um segundo nucleotídeo modificado marcado com um segundo corante, em que os corantes têm uma diferença na absorbância máxima de pelo menos 10 nm, particularmente de 20 nm a 50 nm. Mais particularmente, os dois compostos corantes têm desvios de Stokes entre 15 nm e 40 nm, onde o "desvio de Stokes" é a distância entre o pico de absorção e o comprimento de onda do pico emissão.
[00088] Em uma concretização adicional, um kit pode incluir ainda dois outros nucleotídeos modificados marcados com fluoróforos, em que os corantes são excitados pelo mesmo laser de 488 nm a 550 nm, particularmente 532 nm. Os corantes podem ter uma diferença na absorbância máxima de pelo menos 10 nm, particularmente 20 nm a 50 nm. Mais particularmente, os dois compostos corantes podem ter desvios de Stokes entre 20 nm e 40 nm. Ainda mais particularmente, os dois compostos corantes podem ter uma absorbância máxima diferente abaixo de 640 nm, particularmente abaixo de 600 nm. Corantes particulares que são espectralmente distinguíveis dos corantes de polimetina da presente divulgação e que atendem aos critérios acima são os análogos de polimetina, tais como descrito na Patente Norte Americana No. 5.268.486 (por exemplo Cy3) ou WO 0226891 (Alexa 532; Molecular Probes A20106) ou polimetinas assimétricas, tal como divulgadas na Patente Norte Americana No. 6.924.372. Corantes alternativos incluem análogos de rodamina, por exemplo, tetrametil rodamina e análogos dos mesmos.
[00089] Em uma concretização alternativa, os kits da presente divulgação podem conter nucleotídeos onde a mesma base é marcada com dois compostos diferentes. Um primeiro nucleotídeo pode ser marcado com um primeiro composto fluorescente, por exemplo, um fluoróforo 'vermelho' absorvendo a mais de 650 nm. Um segundo nucleotídeo pode ser marcado com um composto espectralmente distinto, por exemplo, um fluoróforo 'verde' absorvendo a menos de 600 nm. Um terceiro nucleotídeo pode ser marcado como uma mistura do primeiro fluoróforo e o composto espectralmente distinto, e o quarto nucleotídeo pode ser 'escuro' e não conter marcador. Em termos simples, os nucleotídeos de 1 a 4 podem ser marcados como 'verde', 'vermelho', 'vermelho/verde' e escuro. Para simplificar ainda mais a instrumentação, quatro nucleotídeos podem ser marcados com dois corantes excitados com um único laser e, portanto, a marcação dos nucleotídeos de 1 a 4 pode ser 'vermelho 1', 'vermelho 2,' 'vermelho 1/vermelho 2' e escuro ou 'verde 1', 'verde 2' 'verde 1/verde 2' e escuro.
[00090] Embora os kits sejam exemplificados acima em relação às configurações com nucleotídeos diferentes que são marcados com diferentes compostos corantes, deverá ser entendido que os kits podem incluir 2, 3, 4 ou mais nucleotídeos diferentes que possuem o mesmo composto corante.
[00091] Em concretizações particulares, um kit pode incluir uma enzima polimerase capaz de catalisar a incorporação dos nucleotídeos modificados em um polinucleotídeo. Outros componentes a serem incluídos em tais kits podem incluir tampões e similares. Os nucleotídeos modificados marcados com corantes de acordo com a divulgação e outros componentes de nucleotídeos, incluindo misturas de diferentes nucleotídeos, podem ser fornecidos no kit em uma forma concentrada a ser diluída antes do uso. Em tais modalidades, um tampão de diluição adequado também pode ser incluído. Novamente, um ou mais dos componentes identificados em um método estabelecido neste relatório descritivo podem ser incluídos em um kit da presente divulgação.
[00092] Observa-se que, conforme usado nesta especificação e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um/uma", e "o/a" incluem referentes plurais, a menos que expressa e inequivocamente limitada a um referente. Será evidente para os técnicos na arte que várias modificações e variações podem ser feitas em várias concretizações descritas neste documento sem se afastar do espírito ou escopo dos presentes ensinamentos. Assim, pretende-se que as várias concretizações descritas aqui abranjam outras modificações e variações dentro do escopo das reivindicações anexas e seus equivalentes.
EXEMPLOS
[00093] Concretizações adicionais são divulgadas em mais detalhes nos exemplos a seguir, que não têm a intenção de limitar o escopo das reivindicações. Exemplo 1. Síntese de trifosfato de nucleotídeo de braço pendente curto
Esquema 1: Exemplo de síntese de dois trifosfatos de braço pendente curto (pppT-sPA-Fl e pppT-sPA2-Fl, em que Fl é um fluoróforo) Síntese do L2 intermediário
[00094] O material de partida L1 (1,07 g, 4 mmol) foi dissolvido em DMF anidro (15 mL), depois colocado em nitrogênio a 0°C em um banho de gelo. Adicionou-se N,N- diisopropiletilamina (884 µL, 4,8 mmol), seguido de PyBOP (2,29 g, 4,4 mmol). A reação foi agitada em nitrogênio a 0°C por 20 minutos. Em seguida, foi adicionado sal de N-(5- aminopentil)-2,2,2-trifluoroacetamida, trifluoroacetato (1,5 g, 4,8 mmol), seguido por N,N-diisopropiletilamina (1 mL, 5,4 mmol). A reação foi removida do banho de gelo e agitada à temperatura ambiente por 3 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida e o resíduo dissolvido em acetato de etila (100 mL). A solução foi extraída com 3x 100 mL de KHSO4 aquoso diluído (pH = 1), 1x 50 mL de água, 2x 100 mL de NaHCO3 saturado aquoso. A fase orgânica foi seca em Na2SO4 anidro e o solvente foi removido sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia flash em gel de sílica (gradiente linear de acetato de etila em DCM, de 50% a 100%). L2 foi isolado como um óleo viscoso claro (1,60 g, 3,59 mmol, 90%). 1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ (ppm) 7,45 (m, 1H, Ar CH), 7,33 (m, 2H, Ar CH), 7,07 (m, 2H, Ar CH, NH), 6,57 (t, J = 5,6 Hz, 1H, NH), 4,85 (t, J = 4,9 Hz, 1H, CH-N3), 4,22 (dd, J = 10,4, 5,1 Hz, 1H, CH2-OAr), 4,16 (dd, J = 10,5, 4,7 Hz, 1H, CH2-OAr), 4,00 (ddd, J = 10,1, 4,9, 2,9 Hz, 1H, CH2-O), 3,83 (m, 2H, CH2- OH), 3,75 (ddd, J = 9,8, 6,6, 3,0 Hz, 1H, CH2-O), 3,45 (q,
J = 6,7 Hz, 2H, CH2-NH), 3,36 (q, J = 6,6 Hz, 2H, CH2-NH), 2,78 (t, J = 6,2 Hz, 1H, OH), 1,65 (m, 4H, CH2-CH2-NH), 1,41 (p, J = 7,4, 6,9 Hz, 2H, CH2-CH2-CH2-NH). 19F RMN (376,5 MHz, CDCl3): δ (ppm) -75,7. 13C RMN (100 MHz, CDCl3): δ (ppm) 167,5 (s), 158,2 (s), 137,5 (s), 135,9 (s), 129,7 (d), 128,2 (d), 119,6 (d), 118,5 (d), 113,2 (d), 89,9 (d), 71,4 (t), 69,4 (t), 61,6 (t), 39,7 (t), 39,4 (t), 29,0 (t), 28,1 (t), 23,6 (t). LC-MS (ES e CI): (-ve) m/z 446 (M-H+); (+ve) m/z 448 (M+H+), 470 (M+Na+). Síntese do ligante sPA LN3 TFA
[00095] O álcool L2 (500 mg, 1,12 mmol) foi dissolvido em acetonitrila (15 mL), depois TEMPO (70 mg, 0,448 mmol) foi adicionado. NaH2PO4·2H2O (1,1 g, 7,2 mmol) e NaClO2 (405 mg, 4,48 mmol) foram dissolvidos em 10 mL de água e adicionados à reação. Então NaClO aquoso (14,5% de cloro disponível, 1,32 mL, 2,24 mmol) foi adicionado e a solução ficou imediatamente marrom escura. A reação foi agitada à temperatura ambiente por 6 horas. Durante esse período, a cor marrom desbotou para laranja. A reação foi extinta com concentrado aquoso de Na2S2O3 até a reação ficar incolor. A acetonitrila foi evaporada sob pressão reduzida e a solução foi diluída com 20 mL de água, e misturada com trietilamina (aprox. 1 mL). A solução foi extraída com 10 mL de acetato de etila e a fase aquosa foi concentrada sob pressão reduzida. O sPA LN3 TFA bruto foi purificado por cromatografia de fase reversa em C18 (gradiente linear de acetonitrila em água de 0% a 30%) e isolado como um óleo transparente (438 mg, 0,95 mmol, 85%). RP-HPLC: tR = 17,9 min (gradiente TEAB 0,1 M/acetonitrila de 5% a 50%, em coluna analítica YMC-C18). 1H RMN (400 MHz, CD3CN): δ (ppm) 8,03 (br s, 1H, NH), 7,63 (s, 1H, NH), 7,54 (s, 1H, Ar), 7,42 (d, J = 7,7 Hz, 1H, Ar), 7,34 (t, J = 7,9 Hz, 1H, Ar), 7,08 (d, J = 8,1 Hz, 1H, Ar), 5,10 (m, 1H, CH-N3), 4,35 (dd, J = 10,9, 3,7 Hz, 1H, CH2O), 4,18 (dd, J = 10,8, 6,1 Hz, 1H, CH2O), 4,09 (m, 2H, CH2O), 3,32 (m, 2H, CH2-NH), 3,27 (m, 2H, CH2-NH), 3,02 (q, J = 7,3 Hz, 2H, Et3N), 1,60 (m, 4H, CH2-CH2-NH), 1,39 (m, 2H, CH2-CH2-CH2-NH), 1,21 (t, J = 7,3 Hz, 2H, Et3N). 19F RMN (376,5 MHz, CD3CN): δ (ppm) - 76,5. 13C RMN (100 MHz, CD3OD): δ (ppm) 173,1 (s), 170,0 (s), 159,9 (s), 137,5 (s), 131,0 (d), 125,7 (d), 121,4 (d), 119,2 (d), 114,5 (d), 90,8 (d), 70,5 (t), 66,7 (t), 41,0 (t), 40µ.8 (t), 30,2 (t), 29,7 (t), 25,4 (t). LC-MS (ES e CI): (-ve) m/z 460 (M-H+). (+ve) m/z 484 (M+Na+), 561 (M+Et3NH+). Síntese do L3 intermediário
[00096] O material de partida L1 (658 mg, 2,46 mmol) foi dissolvido em DMF anidro (10 mL), depois colocado sob nitrogênio a 0°C em um banho de gelo. Adicionou-se N,N-di- isopropiletilamina (544 µL, 2,95 mmol), seguido de PyBOP (1,41 g, 2,71 mmol). A reação foi agitada sob nitrogênio a 0°C por 20 minutos, depois foi adicionou-se N-(2- aminoetil)-2,2,2-trifluoroacetamida, sal de trifluoroacetato (796 mg, 2,95 mmol), seguido por N,N- diisopropiletilamina (589 µL, 3,2 mmol). A reação foi removida do banho de gelo e agitada à temperatura ambiente por 3 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida e o resíduo dissolvido em acetato de etila (100 mL). A solução foi extraída com 3x 100 mL de KHSO4 aquoso diluído
(pH = 1), 1x 50 mL de água, 2x 100 mL de solução NaHCO3 saturado aquoso. A fase orgânica foi seca sobre Na2SO4 anidro e o solvente foi removido sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia "flash" em gel de sílica (gradiente linear de acetato de etila em DCM, de 50% a 100%) e isolado como um óleo viscoso (0,91 g, 2,24 mmol, 91%). 1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ (ppm) 8,19 (br s, 1H, NH), 7,39 (d, J = 1,7 Hz, 1H, Ar CH), 7,38 – 7,30 (m, 2H, Ar), 7,24 (t, J = 5,5 Hz, 1H, Ar CH), 7,07 (dt, J = 7,2, 2,1 Hz, 1H, Ar CH), 4,84 (t, J = 4,9 Hz, 1H, CH-N3), 4,20 (dd, J = 10,5, 5,1 Hz, 1H, CH2-OAr), 4,15 (dd, J = 6,0, 4,5 Hz, 1H, CH2-OAr), 4,00 (ddd, J = 10,2, 4,8, 3,0 Hz, 1H, CH2-O), 3,88 – 3,79 (m, 2H, CH2-OH), 3,74 (ddd, J = 9,8, 6,4, 3,2 Hz, 1H, CH2-O), 3,65 (m, 2H, CH2-NH), 3,58 (m, 2H, CH2-NH), 2,82 (t, J = 5,6 Hz 1H, OH). 19F RMN (376,5 MHz, CDCl3): δ (ppm) -75,9. LC-MS (ES e CI): (-ve) m/z 404 (M-H+); (+ve) m/z 406 (M+H+), 428 (M+Na+). Síntese de sPA2 LN3 TFA
[00097] O álcool L3 (230 mg, 0,567 mmol) foi dissolvido em acetonitrila (10 mL), depois, TEMPO (35 mg, 0,27 mmol) foi adicionado. NaH2PO4·2H2O (575 mg, 3,68 mmol) e NaClO2 (205 mg, 2,26 mmol) foram dissolvidos em 10 mL de água e adicionados à reação. Então NaClO aquoso (14,5% de teor de cloro, 0,671 mL, 1,13 mmol) foi adicionado e a solução ficou imediatamente marrom escura. A reação foi mantida à temperatura ambiente por 18 horas. Durante esse período, a cor marrom desbotou para laranja. A reação foi extinta com Na2S2O3 concentrado aquoso até ficar incolor. Acetonitrila foi evaporada sob pressão reduzida e a solução foi diluída com 10 mL de água, basificada com trietilamina (aprox. 0,6 mL) e extraída com 10 mL de acetato de etila. A fase aquosa foi concentrada sob pressão reduzida. sPA2 LN3 TFA bruto foi purificado por cromatografia de fase reversa em C18 (gradiente linear de acetonitrila em água de 0% a 20%) e isolado como óleo transparente (224 mg como sal de trietilamônio, 0,43 mmol, 77%). RP-HPLC: tR = 17,9 min (gradiente TEAB 0,1 M/acetonitrila de 5% a 40%, em coluna analítica YMC-C18). 1H RMN (400 MHz, CD3CN): δ (ppm) 8,52 (br s, 1H, NH), 8,34 (br s, 1H, NH), 7,77 (s, 1H, Ar), 7,49 (dt, J = 7,7, 1,1 Hz, 1H, Ar), 7,38 (t, J = 7,9 Hz, 1H, Ar), 7,10 (ddd, J = 8,2, 2,6, 1,0 Hz, 1H, Ar), 5,14 (dd, J = 6,7, 3,4 Hz, 1H, CH-N3), 4,48 (dd, J = 11,5, 3,4 Hz, 1H, CH2O), 4,20 (dd, J = 11,5, 6,7 Hz, 1H, CH2O), 4,11 (d, J = 1,4 Hz, 2H, CH2O), 3,66 – 3,42 (m, 4H, CH2-NH), 3,05 (q, J = 7,3 Hz, 5H, Et3N), 1,22 (t, J = 7,3 Hz, 8H, Et3N). 19F RMN (376,5 MHz, CD3CN): δ (ppm) -76,3. 13C RMN (101 MHz, CD3CN): δ (ppm) 173,1 (s), 166,9 (s), 157,6 (s), 135,7 (s), 129,3 (d), 120,0 (d), 118,0 (d), 117,0 (s), 112,1 (d), 88,4 (d), 68,8 (t), 67,6 (t), 45,1 (t), 39,2 (t), 38,4 (t), 7,5 (q). LC-MS (ES e CI): (-ve) m/z 418 (M-H+). Síntese geral de pppT-sPA e pppT-sPA2
[00098] O ligante (sPA-LN3-TFA ou sPA2-LN3-TFA, 0,089 mmol) foi coevaporado com 2x 2 mL de N, N'- dimetilformamida (DMF) anidro, e depois dissolvido em 2 mL em DMF anidro. Adicionou-se N,N-diisopropiletilamina (33 µL, 0,178 mmol), seguido por tetrafluoroborato de O-(N- succinimidil)-N,N,N',N'-tetrametilurônio (TSTU, 32 mg, 0,106 mmol). A reação foi agitada com nitrogênio à temperatura ambiente durante 1 hora. Enquanto isso, uma solução aquosa de trifosfato PA-TTP (0,1 mmol) foi evaporada até a secura sob pressão reduzida e ressuspensa em 300 µL de solução de bicarbonato de trietilamônio (TEAB) 0,1 M em água. A solução ligante foi adicionada ao trifosfato e a reação foi agitada à temperatura ambiente durante 18 horas. Em seguida, o solvente foi evaporado sob pressão reduzida e o resíduo dissolvido em 1 mL de metanol e 3 mL de hidróxido de amônio aquoso a 33%. A solução foi agitada à temperatura ambiente durante 7 horas, depois foi evaporada até à secura. O produto bruto foi purificado por RP-HPLC em escala preparativa usando uma coluna YMC-Pack- Pro C18 eluindo com TEAB 0,1 M e acetonitrila. pppT-sPA: Rendimento: 67%. RP-HPLC: tR = 16,9 min (gradiente TEAB 0,1 M/acetonitrila de 5% a 35%, em coluna analítica YMC-C18). LC-MS (ES e CI): (-ve) m/z 922 (M-H+), 461 (M-2H+). pppT- sPA2: Rendimento: 65%. RP-HPLC: tR = 17,5 min (gradiente TEAB 0,1 M/acetonitrila de 5% a 30%, em coluna analítica YMC-C18). LC-MS (ES e CI): (-ve) m/z 880 (M-H+), 440 (M- 2H+). Síntese geral de pppT-sPA-Fl e pppT-sPA2-Fl
[00099] Carboxilato de fluoróforo (Fl, 0,0105 mmol) foi coevaporado com 2x 2 mL de N,N’-dimetilformamida (DMF) anidro, em seguida, dissolvido em 2 mL de N,N'- dimetilacetamida (DMA) anidro. Adicionou-se N,N-di- isopropiletilamina (15 µL, 0,084 mmol), seguido por tetrafluoroborato de O-(N-succinimidil)-N,N,N',N'- tetrametilurônio (TSTU, 0,012 mmol). A reação foi agitada com nitrogênio à temperatura ambiente por 45 minutos.
Enquanto isso, uma solução aquosa de trifosfato pppT-sPA ou pppT-sPA2 (0,084 mmol) foi evaporada até a secura sob pressão reduzida e ressuspensa em 300 µL de solução de bicarbonato de trietilamônio (TEAB) 0,1 M em água. A solução de éster NHS-fluoróforo foi adicionada ao trifosfato e a reação foi agitada à temperatura ambiente durante 18 horas. O produto bruto foi purificado por cromatografia de troca iônica em DEAE-Sephadex (gradiente TEAB 0,1 M a TEAB 1 M, com 20% de acetonitrila) e por escala preparativa RP-HPLC (coluna YMC-Pack-Pro C18, eluindo com TEAB 0,1 M e acetonitrila). Síntese geral de N-(aminoalquil)-2,2,2- trifluoroacetamida Esquema 2: Síntese geral de N -trifluoroacetamido-diamina.
[000100] terc-butil (aminoalquil)carbamato (48 mmol) foi dissolvido em DCM anidro (60 mL) e colocado em banho de gelo com nitrogênio. Adicionou-se trietilamina (103 mmol), seguido por anidrido trifluoroacético (53 mmol) gota a gota. A reação foi removida do banho de gelo e agitada à temperatura ambiente durante 1 hora. A reação foi diluída com 200 mL de DCM e extraída com 2x 200 mL de solução saturada aquosa de NaHCO3. A fase orgânica foi seca sobre MgSO4 anidro e concentrada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia "flash" em sílica gel (éter de petróleo / acetato de etila 3:7).
[000101] terc-butil (5-(2,2,2- trifluoroacetamido)pentil) carbamato (n = 5): 1H RMN (400
MHz, CDCl3): δ (ppm) 6,40 (br s, 1H, NH), 4,49 (br s, 1H, NH), 3,30 (q, J = 6,8 Hz, 2H, CH2-NH), 3,06 (q, J = 6,6 Hz, 2H, CH2-NH), 1,56 (p, J = 7,2 Hz, 2H, CH2-CH2-NH), 1,45 (p, J = 7,0 Hz, 2H, CH2-CH2-NH), 1,37 (m, 9H, CH3), 1,31 (m, 2H, CH2-CH2- CH2-NH).19F RMN (376,5 MHz, CDCl3): δ (ppm) -75,8.
[000102] terc-butil (2-(2,2,2- trifluoroacetamido)etil) carbamato (n = 2): 1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ (ppm) 7,72 (br s, 1H, NH), 4,86 (br s, 1H, NH), 3,39 (m, 2H, CH2-NH), 3,31 (m, 2H, CH2-NH), 1,38 (s, 9H, CH3). 19F RMN (376,5 MHz, CDCl3): δ (ppm) -76,1.
[000103] terc-butil(2-(2,2,2- trifluoroacetamido)alquil) carbamato (44 mmol) foi dissolvido em DCM anidro (40 mL) e ácido trifluoroacético (40 mL). A reação foi agitada à temperatura ambiente, aberta ao ar por 1 hora. Os voláteis foram removidos sob pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em água e extraído com 50 mL de DCM, depois a fase aquosa foi evaporada até à secura. O resíduo foi co-evaporado com 100 mL de etanol e 4x 100 mL de acetonitrila.
[000104] N-(5-aminopentil)-2,2,2-trifluoroacetamida (n = 5): 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO): δ (ppm) 9,44 (br s, 1H, NH), 7,75 (br s, 3H, NH), 3,17 (q, J = 6,7 Hz, 2H, CH2-NH), 2,77 (m, 2H, CH2-NH), 1,57-1,45 (m, 4H, CH2-CH2-NH), 1,29 (m, 2H, CH2-CH2- CH2-NH).19F RMN (376,5 MHz, d6-DMSO): δ (ppm) -74,4, -74,7.
[000105] N-(2-aminoetil)-2,2,2-trifluoroacetamida (n = 2): 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO): δ (ppm) 9,58 (br t, 1H, NHCO), 8,04 (br s, 3H, NH), 3,45 (m, 2H, CH2NHCO), 2,98 (m,
2H, CH2NH). 19F RMN (376,5 MHz, d6-DMSO): δ (ppm) -74,0, - 74,4. Exemplo 2. Uso de trifosfatos de nucleotídeos de braços pendentes curtos no sequenciamento de SBS
[000106] O desempenho de sequenciamento dos nucleotídeos de braços pendentes curto foi comparado contra o desempenho de nucleotídeos padrão em SBS, os nucleotídeos continham os mesmos grupos fluorescentes sobre um agente de ligação clivável padrão. Quatro nucleotídeos de braços pendentes curtos (dois As, C, T) marcados com fluoróforos adequados para o sequenciamento de SBS em 2 canais (Figura 3) e G escuro foram incluídos em uma solução compreendendo uma DNA polimerase e um tampão de incorporação, ambos usados em Hiseq® modificado de 2 canais ou Miseq® modificado de 2 canais para sequenciar em duas leituras de 150 ciclos cada. As métricas de sequenciamento (por exemplo, faseamento, pré-faseamento, taxa de erro % e Q30 %) foram comparadas entre experimentos realizados usando todos os quatro nucleotídeos de braços pendentes curtos ou todos os nucleotídeos padrão, nas mesmas condições (por exemplo, temperatura de incorporação, tempo de incorporação, polimerase, biblioteca de molde). Os resultados são mostrados nas Figuras de 4A a 4C e Figuras 5A e 5B.
[000107] As Figuras de 4A a 4C demonstram um exemplo das métricas de sequenciamento (faseamento, pré-faseamento, taxa de erro %, Q30 %) observadas com o nucleotídeo padrão e o nucleotídeo de braço pendente curto em um Hiseq® modificado de 2 canais, usando temperatura de incorporação igual a 50°C e tempo de incorporação igual a 10 segundos, com duas polimerases diferentes (PolA e PolB) e duas bibliotecas de moldes diferentes (PhiX e humano). Quando os nucleotídeos de braços pendentes curtos foram utilizados, observou-se uma redução no feaseamento e na taxa de erro %, e um aumento de Q30 %, independentemente da polimerase ou molde utilizado.
[000108] As Figuras 5A e 5B demonstram um exemplo de métricas de sequenciamento (faseamento e taxa de erro %) observadas com nucleotídeo padrão ou nucleotídeo de braço pendente curto em um Miseq® modificado de 2 canais com temperatura de incorporação igual a 60°C, em um molde PhiX, permitindo tempos de incorporação diferentes.
[000109] Os nucleotídeos de braços pendentes curtos permitiram uma redução aproximada de 50% no que tange o tempo de incorporação sem um impacto significativo sobre a taxa de erro percentual. No menor tempo de incorporação testado (10 + 5s), a taxa de erro percentual ainda era <1%, em comparação a taxa de erro de 2,5% com os nucleotídeos padrão.
FIGURAS Figura 1 DNA molde:iniciador Iniciador:molde de DNA standard ffN ffN padrão SBS cycle Ciclo de SBS (incorporação / (incorporation/cleavage/ clivagem / geração de imagens) imaging) Pendant arm Braço pendente Scarred DNA Iniciador:molde de DNA molde:iniciador cicatrizado
Figura 2 DNA molde:iniciador Iniciador:molde de DNA SBS cycle Ciclo de SBS (incorporação / (incorporation/cleavage/ clivagem / geração de imagens) imaging) Pendant arm Braço pendente Scarred DNA Iniciador:molde de DNA molde:iniciador cicatrizado Short pendant arm LN3 Braço pendente curto LN3 Dye Corante
Figura 3 Short pendant arm A1 Braço pendente curto A1 Short pendant arm A2 Braço pendente curto A2 Short pendant arm T Braço pendente curto T Short pendant arm C Braço pendente curto C
Figuras 4A - 4C Read1 Leitura1 Read2 Leitura2 Phasing Faseamento Prephasing Pré-faseamento % Error rate % de Taxa de erro sPA (Human) sPA (Humano) Standard (PhiX) Padrão (PhiX) Standard (Human) Padrão (Humano)
Figura 5A
% Error rate % de Taxa de erro incorporation time(s) Tempo(s) de incorporação Short pendant arm read1 Leitura 1 - braço pendente curto Short pendant arm read2 Leitura 2 - braço pendente curto standard read1 Leitura 1 - padrão standard read2 Leitura 2 - padrão
Figura 5B empirical phasing Faseamento empírico incorporation time(s) Tempo(s) de incorporação Short pendant arm read1 Leitura 1 - braço pendente curto Short pendant arm read2 Leitura 2 - braço pendente curto standard read1 Leitura 1 - padrão standard read2 Leitura 2 - padrão

Claims (23)

REIVINDICAÇÕES
1. Composto caracterizado pelo fato de que possui a fórmula (I): (I) em que B é uma base nucleosídica; e Fl é um fluoróforo conectado através de um ligante opcional.
2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que B é uma base nucleotídica.
3. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que B é uma base de pirimidina.
4. Composto, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o composto possui a fórmula (c) ou a fórmula (t): (c)
(t) em que P é um grupo trifosfato; e Fl é um fluoróforo conectado através de um ligante opcional.
5. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo de que B é uma base de 7-deszapurina.
6. Composto, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que possui a fórmula (a): (a) em que P é um grupo trifosfato; e Fl é um fluoróforo conectado através de um ligante opcional.
7. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o composto está ligado a um oligonucleotídeo.
8. Oligonucleotídeo caracterizado pelo fato de ser marcado com um composto conforme definido na reivindicação
2.
9. Composto caracterizado pelo fato de que possui a fórmula (II): (II) em que B é uma base nucleotídica.
10. Composto, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que B é uma base de pirimidina.
11. Composto, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que possui a fórmula (ci) ou a fórmula (ti): (ci)
(ti) onde em Oln é um oligonucleotídeo.
12. Composto, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que B é uma base de 7- desazapurina.
13. Composto, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que possui a fórmula (ai): (ai) em que Oln é um oligonucleotídeo.
14. Oligonucleotídeo caracterizado pelo fato de que compreende um composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 13.
15. Oligonucleotídeo caracterizado pelo fato de que compreende duas ou mais cópias de um composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 13.
16. Oligonucleotídeo caracterizado pelo fato de que compreende dez ou mais cópias de um composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 13.
17. Oligonucleotídeo caracterizado pelo fato de que compreende cem ou mais cópias de um composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 13.
18. Kit caracterizado pelo fato de que compreende dois ou mais nucleotídeos, em que pelo menos um nucleotídeo é um nucleotídeo marcado que é um composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 2 a 6.
19. Kit, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que compreende dois ou mais nucleotídeo, em que pelo menos dois nucleotídeos são nucleotídeos marcados que são compostos conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 2 a 6.
20. Kit, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que compreende quatro nucleotídeos, em que pelo menos dois nucleotídeos são nucleotídeos marcados que são compostos conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 2 a 6.
21. Uso de um composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 2 a 6 caracterizado pelo fato de ser para sequenciamento, análise de expressão, análise de hibridação, análise genética, análise de RNA, ou ensaios de ligação proteica, ou combinações dos mesmos.
22. Uso de um oligonucleotídeo conforme definido na reivindicação 8 caracterizado pelo fato de ser para sequenciamento, análise de expressão, análise de hibridação, análise genética, análise de RNA, ou ensaios de ligação proteica, ou combinações dos mesmos.
23. Uso de um oligonucleotídeo conforme definido na reivindicação 14 caracterizado pelo fato de ser para sequenciamento, análise de expressão, análise de hibridação, análise genética, análise de RNA, ou ensaios de ligação proteica, ou combinações dos mesmos.
Petição 870190137956, de 20/12/2019, pág. 99/103 Braço pendente 1 ciclo SBS X ciclos SBS (incorporação (incorporação /clivagem/ /clivagem/ imagem) imagem)
Padrão ffN Padrão ffN 1/5
DNA DNA marcado Molde: iniciador Molde: iniciador
Petição 870190137956, de 20/12/2019, pág. 100/103 Braço pendente 1 ciclo SBS x ciclos SBS (incorporação (incorporação /clivagem/ /clivagem/ imagem) imagem) 2/5
DNA DNA marcado Molde: iniciador Molde: iniciador corante
Pequeno braço pendente LN3 sPALN3
Pequeno Braço pendente A1
Pequeno Braço pendente A2
Pequeno Braço pendente T
Pequeno Braço pendente C
Leitura1 Leitura2 Leitura1 Leitura 2 Leitura1 Leitura2 Leitura1 Leitura2 Leitura1 Leitura 2 Leitura1 Leitura2
Faseamento Pré-Faseamento % Taxa erro Faseamento Pré-Faseamento % Taxa erro
Padrão (PhiX) Padrão (PhiX)
Padrão (Humano) Padrão (Humano)
Leitura1 Leitura2 Leitura1 Leitura 2
Padrão Padrão
A Pequeno braço pendente leitura 1 Pequeno braço pendente leitura 2 Padrão leitura 1 % Taxa de erro Padrão Leitura 2 Tempo de incorporação (s)
B Pequeno braço pendente leitura 1 Pequeno braço pendente leitura 2 Padrão leitura 1 Padrão Leitura 2 Fase empírica Tempo de incorporação (s)
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B06W Patent application suspended after preliminary examination (for patents with searches from other patent authorities) chapter 6.23 patent gazette]