BR112019024972A2 - Variantes de mananase - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se às variantes de mananase, composições compreendendo as ditas variantes, a métodos de sua produção para métodos para usar as ditas variantes para degradar e modificar a manana contendo material.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VARIANTES DE MANANASE".

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a variantes da enzima mananase. As variantes são úteis em aplicações industriais onde a degradação ou a modificação de manana é desejada, como aplicações de lavandaria e limpeza, na indústria de alimentos para animais, alimentos, papel, celulose e petróleo. A invenção também fornece enzimas mananases úteis, polinucleotídeos que codificam estas enzimas, composições de enzima e métodos para a sua produção e uso.

ANTECEDENTES

[002] Mananas são manoses contendo polissacarídeos encontrados em várias plantas. Mananas são pouco solúveis em meio aquoso e suas propriedades físico-químicas dão origem a dispersões viscosas. Além disso, mananas têm alta capacidade de ligação de água. Todas essas características causam problemas em várias indústrias, incluindo o preparo, cozimento, a nutrição animal, e aplicações de lavandaria e de limpeza.

[003] Em dietas à base de plantas diferentes, ß-mananas estão presentes e, dependendo de suas quantidades e propriedades, podem comprometer a digestão de nutrientes, a colonização microbiana e o desempenho de crescimento. A degradação enzimática de mananas reduz a viscosidade da digestão de mananas altamente solúveis em água e leva à produção de mano-oligossacarídeos que podem formar mananas lineares insolúveis em água presentes em leguminosas. Mananase aumenta o ganho médio diário, a eficiência alimentar, habitabilidade e uniformidade de peso em todos os animais monogástricos.

[004] Para aplicações de alimentação animal, como alimento para os animais monogástricos com dietas de cereais, a manana é um fator que contribui para a viscosidade do conteúdo intestinal e, assim, afeta negativamente a digestibilidade do alimento e a taxa de crescimento do animal. Para ruminantes, a manana representa um componente substancial de consumo de fibra e uma digestão mais completa de manana facilitaria a maior eficiência de conversão alimentar.

[005] Para aplicações de lavandaria e de limpeza as composições enzimáticas compreendendo a mananase podem ser usadas para degradar a manana. No entanto, fornecendo as mananases que são estáveis em diferentes armazenamentos e condições de uso enquanto ainda mostrando boa atividade degradante de manana é difícil.

[006] A glicosilação N-ligada de proteínas é um tipo de modificação pós-traducional, onde uma molécula de açúcar oligossacarídeo conhecida como glicano está ligada a um grupo de nitrogênio amida de um resíduo de asparagina (Asn, N) de uma proteína. Este tipo de acoplamento é importante tanto para a estrutura como função de enzimas e de outras proteínas.

[007] É um objetivo da presente invenção fornecer as variantes de mananase tendo melhor estabilidade e exibindo atividade de mananase quando aplicada em diferentes processos industriais, bem como composições de enzima para a degradação ou modificação da manana.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] De acordo com o primeiro aspecto é fornecido uma variante de mananase tendo atividade de mananase e um aminoácido não glicosilado na posição 283, em que a variante é selecionada do grupo que consiste em 1) um polipeptídeo tendo, pelo menos, 85% de identidade de sequência para os resíduos 27-331 da SEQ ID NO: 2; 2) um polipeptídio codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza sob condições de alta estringência com a) nucleotídeos 79-993 da SEQ ID NO: 1 (man7) b) o complemento de comprimento total de a); e 3) uma variante codificada por um polinucleotídeo tendo pelo menos 95% de identidade de sequência para a SEQ ID NO: 1 ou a sequência de DNA genômico da mesma; e em que a numeração dos aminoácidos corresponde à numeração dos aminoácidos da SEQ ID NO: 2 (Man7), sequência de aminoácidos de comprimento total contendo uma sequência sinal.

[009] A presente variante de mananase é vantajosa, pois tem boa estabilidade e atividade da mananase. A variante tem diferente padrão de glicosilação em comparação com uma mananase do tipo selvagem, que pode fornecer maior atividade específica, estabilidade e rendimento quando produzida em uma célula hospedeira. Assim, a presente variante de mananase pode proporcionar maior rendimento na produção e melhor desempenho no uso. A estabilidade da variante é particularmente boa em detergentes e a temperaturas normalmente usadas em aplicações onde a degradação de manana é usada, como em detergentes para lavagem de roupas.

[0010] De acordo com o segundo aspecto da invenção, é fornecida uma composição da enzima compreendendo a variante de mananase do primeiro aspecto e a. pelo menos um conservante, por exemplo, selecionado do grupo consistindo em ácido orgânico, ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido benzoico e seus sais e seus derivados, benzoato de sódio, benzoato, hidroxibenzoato e derivados, ácido sórbico, sorbato de sódio, sorbato, sais, como o cloreto de sódio ou cloreto de potássio, 1,2- benzisotiazolin-3-ona (BIT), ou uma combinação dos mesmos; b. opcionalmente, pelo menos um estabilizador selecionado de poliol, propilenoglicol, polietilenoglicol, hexileno glicol, glicerol, um açúcar, álcool de açúcar, polissacarídeo, ácido láctico, ácido bórico, derivado de ácido bórico, éster de borato aromático, ácido 4- formilfenil borônico, derivado do ácido fenil-borônico, peptídeo, tensoativo, ou uma combinação dos mesmos; c. opcionalmente pelo menos uma enzima selecionada de proteases, amilases, celulases, lipases, xilanases, mananases, cutinases, esterases, fitases, DNAses, pectinases, enzimas pectinolítica, pectato liase, carboidrases, arabinases, galactanases, xantanases, xiloglucanases, lacases, peroxidases e oxidases, com ou sem um mediador, ou uma combinação dos mesmos; e d. opcionalmente, pelo menos, uma carga selecionada de maltodextrina, farinha, cloreto de sódio, sulfato, sulfato de sódio, ou uma combinação destes.

[0011] Como evidenciado pelos Exemplos, as variantes compreendidas na composição de enzima, de acordo com a invenção, têm uma estrutura e propriedades que permitem a produção em células hospedeiras recombinantes e as tornam úteis em composições de enzimas para aplicações industriais. A composição de enzima é particularmente boa para formulações de detergente porque a variante de mananase tem boa estabilidade, bom desempenho de lavagem e boa atividade específica quando usada para degradar a manana no uso de lavandaria e máquina de lavar.

[0012] De acordo com o terceiro aspecto neste documento, é fornecida uma composição detergente compreendendo a variante de mananase do primeiro aspecto ou a composição de enzima do segundo aspecto.

[0013] A presente composição detergente é vantajosa na medida em que é eficiente e econômica na remoção de manchas contendo manana.

[0014] De acordo com outro aspecto, é fornecido o uso de, e um método para usar, a presente composição de enzima ou a presente variante de mananase em um detergente.

[0015] De acordo com o quarto aspecto, é fornecida uma célula hospedeira recombinante contendo elementos genéticos que permitem produzir pelo menos um polipeptídeo recombinante compreendendo a variante de mananase do primeiro aspecto.

[0016] De acordo com o quinto aspecto, é fornecido um método para produzir um polipeptídeo recombinante tendo atividade de mananase e compreendendo: a. cultivo de uma célula hospedeira recombinante do quarto aspecto, onde os elementos genéticos compreendem, pelo menos, uma sequência de controle que controla a produção do polipeptídeo recombinante na célula hospedeira recombinante; os elementos genéticos opcionalmente compreendem, pelo menos, uma sequência codificando uma sequência sinal para transportar o polipeptídeo recombinante fora da célula hospedeira; e o cultivo é realizado em condições que permitam a produção do polipeptídeo recombinante; e b. recuperação do polipeptídeo recombinante.

[0017] O método fornece uma maneira eficiente para produzir um polipeptídeo recombinante compreendendo uma variante de mananase. Em virtude da variante de mananase ser produzida em uma célula hospedeira recombinante, é fornecido um sistema de produção que pode ser otimizado, adaptado e controlado da maneira desejada. A variante de mananase produzida pelo método pode diferir de mananases naturais a um nível estrutural e funcional. A variante de mananase produzida pelo método tem um padrão de glicosilação, ou outras modificações pós-traducionais, o que causa diferenças na estrutura e/ou função quando comparada a uma mananase natural, como uma mananase tendo sequência de aminoácidos semelhante, ou em comparação a uma mananase com a mesma sequência de aminoácidos, mas produzida em outra célula hospedeira. Em particular, quando a variante é produzida em uma célula hospedeira capaz de glicosilação N-ligada, a variante tem vantajosamente um resíduo não glicosilado Asn283 resultando em propriedades melhoradas. A variante de mananase produzida pelo presente método pode ser usada como tal, ou formulada em uma formulação selecionada.

[0018] De acordo com outro aspecto, é fornecida uma preparação enzimática compreendendo um polipeptídeo recombinante tendo atividade de mananase e alcançável através da presente célula hospedeira.

[0019] A preparação enzimática ou a composição de enzimas podem ainda incluir outra(s) enzima(s) selecionada(s) do grupo consistindo em proteases, amilases, celulases, lipases, xilanases, mananases, cutinases, esterases, fitases, DNAses, pectinases, pectato liase, enzimas pectinolíticas, carbohidrases, arabinases, galactanases, xantanases, xiloglucanases, lacases, peroxidases e oxidases, com ou sem um mediador, bem como aditivos adequados selecionados a partir do grupo consistindo em estabilizadores, tampões, tensoativos, agentes alvejantes, mediadores, agentes anticorrosão, builders, agentes antirredeposição, abrilhantadores ópticos, corantes, pigmentos, perfumes, produtos cáusticos, abrasivos e conservantes.

[0020] De acordo com um sexto aspecto, é fornecido um método para degradar ou modificar a manana contendo material compreendendo tratar a dita manana contendo material com uma quantidade eficaz da composição de enzima presente ou a variante presente de mananase.

[0021] De acordo com o sétimo aspecto, é fornecida uma alimentação animal, compreendendo a composição de enzima presente ou a variante presente de mananase, e pelo menos uma fonte de proteína de origem vegetal ou uma manana contendo produto ou subproduto, e a. opcionalmente, pelo menos, uma enzima selecionada de protease, amilase, fitase, xilanase, endoglucanase, beta-glucanase, ou uma combinação dos mesmos; e b. opcionalmente, pelo menos, uma carga selecionada de maltodextrina, farinha, sal, cloreto de sódio, sulfato, sulfato de sódio, ou uma combinação destes.

[0022] De acordo com o oitavo aspecto, é fornecido um suplemento alimentar contendo a presente composição de enzima ou variante de mananase; e a. opcionalmente, pelo menos, uma enzima selecionada de protease, amilase, fitase, xilanase, endoglucanase, beta-glucanase, ou uma combinação dos mesmos; e b. opcionalmente, pelo menos, uma carga selecionada de maltodextrina, farinha, sal, cloreto de sódio, sulfato, sulfato de sódio, ou uma combinação destes.

[0023] A alimentação e a alimentação complementar melhoram o valor nutricional dos alimentos em comparação com uma alimentação sem a variante. A presente composição da enzima compreende a variante de mananase, que melhorou a estabilidade. A presente composição da enzima e a presente variante degradam a manana presente no alimento e, assim, tornam-o mais facilmente digerível para o animal. Em particular, para a farinha de soja contendo ração de manana-oligossacarídeos que resultam da digestão enzimática têm efeitos benéficos sobre a microbiota intestinal e, consequentemente, sobre o desempenho dos animais. O efeito das variantes de mananase pode ser reforçado através da inclusão de xilanase para digerir arabinoxilanos presentes em dietas à base de soja de milho. As presentes variantes também podem ser usadas para modificar propriedades reológicas de alimentos úmidos.

[0024] Em uma modalidade, o alimento pode conter proteína de origem animal, como, por exemplo, farinha de carne e ossos.

[0025] De acordo com outro aspecto, é fornecido o uso de, e um método para usar, a presente alimentação animal ou a presente alimentação suplementada em: a. alimentação dos animais; b. melhoria do ganho de peso dos animais.

[0026] Em uma modalidade, o animal é um animal monogástrico ou um ruminante. Em outra modalidade, o animal é um frango de corte, galinha de postura, suínos, peru, ou um organismo de aquicultura como o peixe. Em outra modalidade, o animal é um ruminante.

[0027] De acordo com um nono aspecto, é fornecido o uso de, e um método para usar, a presente variante ou a presente composição da enzima na perfuração de poços de petróleo ou hidrofraturamento.

[0028] A presente composição da enzima e a presente variante são vantajosas na modificação de propriedades reológicas dos fluidos de perfuração de poços de petróleo e fluidos de hidrofraturamento, e para melhorar a recuperação de óleo.

[0029] De acordo com um décimo aspecto, é fornecido o uso de, e um método para usar, a presente variante ou a presente composição da enzima presente no processamento de extrato de café, suco de frutas, suco de abacaxi, ou leite de soja.

[0030] Usando a presente variante e a presente composição da enzima é vantajoso no processamento de extrato de café porque reduz a viscosidade do extrato de café.

[0031] Usando a presente variante e a presente composição da enzima é vantajoso no processamento e na fabricação de suco de fruta porque reduz a viscosidade e melhora a taxa de filtração, estabilidade e ajuda na extração de componentes da fruta.

[0032] Usando a presente variante e a presente composição da enzima é vantajoso no processamento e na fabricação de leite de soja porque melhora o rendimento, a cor, o teor de proteína e o sabor do leite de soja.

[0033] Em outro aspecto, é fornecida uma molécula de ácido nucleico codificando a presente variante de mananase.

[0034] Em outro aspecto é fornecido um vetor compreendendo a presente molécula de ácido nucleico.

[0035] Em outro aspecto, é fornecido um fragmento funcional da presente variante de mananase, e um polinucleotídeo codificando-a.

[0036] Em outro aspecto, a informação da sequência revelada neste documento refere-se a uma sequência de polinucleotídeo codificando uma mananase da invenção que pode ser usada como uma ferramenta para identificar outras mananases homólogas. Por exemplo, a reação em cadeia da polimerase (PCR) pode ser usada para amplificar as sequências codificando outras mananases homólogas de uma variedade de fontes biológicas. Além disso, as abordagens de mineração genômica podem ser usadas para identificar as sequências que codificam outras mananases homólogas a partir de bases de dados do genoma.

[0037] Em uma modalidade, os presentes produtos, métodos e usos são implementados em escala industrial.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0038] A Fig. 1 mostra a representação esquemática do cassete de expressão.

[0039] A Fig. 2 mostra a atividade específica relativa das variantes (TBH5, TBH6, TBH9, TBH10, TBH11 e TBH17) em relação à mananase Man7 do tipo selvagem (produzida em Trichoderma).

[0040] As Figs. 3A-B descrevem o desempenho de remoção de manchas de Man7 variantes e de tipo selvagem (wt) (produzido em

Trichoderma) como um aumento de leveza (soma de ∆L*de 3 manchas) na presença de 4,4 g/l de detergente líquido para serviços pesados comercial A a 40°C, 16 °dH, 60 min, pH aproximado de 8,3 e enzimas dosadas como unidades de atividade (MNU) por licor de lavagem.

[0041] A Fig 3A mostra as variantes TBH1, TBH2, TBH3, TBH4, TBH5, TBH6, TBH7, TBH8, TBH9 e do tipo selvagem.

[0042] A Fig 3B mostra variantes TBH6, TBH10, TBH11 e do tipo selvagem.

[0043] As Figs. 4A-B descrevem o desempenho de remoção de manchas de Man7 variantes e de tipo selvagem (produzido em Trichoderma) como um aumento de leveza (soma de ∆L*de 3 manchas) na presença de 3,8 g/l de detergente de cor em pó comercial A a 40 °C, 16 °dH, 60 min, pH aproximado de 10 e enzimas dosadas como unidades de atividade (MNU) por licor de lavagem.

[0044] A Fig 4A mostra as variantes de Man7 TBH1, TBH2, TBH3, TBH4, TBH5, TBH6, TBH7, TBH8, TBH9 e do tipo selvagem.

[0045] A Fig 4B mostra variantes de Man7 TBH6, TBH10, TBH11 e do tipo selvagem.

[0046] A Fig. 5 descreve o desempenho de remoção de manchas de variantes de Man7 TBH1, TBH2, TBH3, TBH4, TBH5, TBH6, TBH7, TBH8, TBH9 e de tipo selvagem (produzido em Trichoderma) como um aumento de leveza (soma de ∆L*de 3 manchas) na presença de 4,2 g/l de detergente alvejante em pó comercial A a 40 °C, 16 °dH, 60 min, pH aproximado de 9,5 e enzimas dosadas como unidades de atividade (MNU) por licor de lavagem.

[0047] A Fig. 6 mostra um fluxograma de produção de café instantâneo, envolvendo o uso de variantes de mananase da invenção.

DEPÓSITOS

[0048] Os seguintes depósitos da cepa foram feitos de acordo com o Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de microrganismos para efeitos de procedimento de patentes:

[0049] A cepa RF12379 da E.coli, incluindo o plasmídeo pALK4434, foi depositada no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, Alemanha, em 2 de março de 2017, e atribuído o número de adesão DSM 32425.

[0050] A cepa RF12380 da E.coli, incluindo o plasmídeo pALK4435, foi depositada no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, Alemanha, em 2 de março de 2017, e atribuído o número de adesão DSM 32426.

[0051] A cepa RF12381 da E.coli, incluindo o plasmídeo pALK4436, foi depositada no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, Alemanha, em 2 de março de 2017, e atribuído o número de adesão DSM 32427.

[0052] A cepa RF12382 da E.coli, incluindo o plasmídeo pALK4437, foi depositada no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, Alemanha, em 2 de março de 2017, e atribuído o número de adesão DSM 32428.

[0053] A cepa RF12383 da E.coli, incluindo o plasmídeo pALK4438, foi depositada no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, Alemanha, em 2 de março de 2017, e atribuído o número de adesão DSM 32429.

[0054] A cepa RF12384 da E.coli, incluindo o plasmídeo pALK4439, foi depositada no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, Alemanha, em 2 de março de 2017, e atribuído o número de adesão DSM 32430.

[0055] A cepa RF12385 da E.coli, incluindo o plasmídeo pALK4440, foi depositada no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, Alemanha, em 2 de março de 2017, e atribuído o número de adesão DSM 32431.

[0056] A cepa RF12386 da E.coli, incluindo o plasmídeo pALK4441, foi depositada no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, Alemanha, em 2 de março de 2017, e atribuído o número de adesão DSM 32432.

[0057] A cepa RF12387 da E.coli, incluindo o plasmídeo pALK4442, foi depositada no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, Alemanha, em 2 de março de 2017, e atribuído o número de adesão DSM 32433.

[0058] A cepa RF12456 da E.coli, incluindo o plasmídeo pALK4432, foi depositada no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, Alemanha, em quinta-feira, 18 de maio de 2017, e atribuído o número de adesão DSM 32518.

[0059] A cepa RF12457 da E.coli, incluindo o plasmídeo pALK4433, foi depositada no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, Alemanha, em quinta-feira, 18 de maio de 2017, e atribuído o número de adesão DSM 32519.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0060] SEQ ID NO: 1 Sequência de DNA de Man7

[0061] SEQ ID NO: 2 Sequência de aminoácidos de comprimento total de Man7

[0062] SEQ ID NO: 3 Sequência de aminoácidos deduzidos (maduros) de Man7

[0063] SEQ ID NO: 4 Sequência de aminoácidos do núcleo de Man7, sem CBM

[0064] SEQ ID NO: 5 Sequência de genes sintéticos da variante tbh1

[0065] SEQ ID NO: 6 Sequência de aminoácidos deduzidos (maduros) de TBH1 variante

[0066] SEQ ID NO: 7 Sequência de genes sintéticos da variante tbh2

[0067] SEQ ID NO: 8 Sequência de aminoácidos deduzidos (maduros) de TBH2 variante

[0068] SEQ ID NO: 9 Sequência de genes sintéticos da variante tbh3

[0069] SEQ ID NO: 10 Sequência de aminoácidos deduzidos (maduros) de TBH3 variante

[0070] SEQ ID NO: 11 Sequência de genes sintéticos da variante tbh4

[0071] SEQ ID NO: 12 Sequência de aminoácidos deduzidos (maduros) de TBH4 variante

[0072] SEQ ID NO: 13 Sequência de genes sintéticos da variante tbh5

[0073] SEQ ID NO: 14 Sequência de aminoácidos deduzidos (maduros) de TBH5 variante

[0074] SEQ ID NO: 15 Sequência de genes sintéticos da variante tbh6

[0075] SEQ ID NO: 16 Sequência de aminoácidos deduzidos (maduros) de TBH6 variante

[0076] SEQ ID NO: 17 Sequência de genes sintéticos da variante tbh7

[0077] SEQ ID NO: 18 Sequência de aminoácidos deduzidos (maduros) de TBH7 variante

[0078] SEQ ID NO: 19 Sequência de genes sintéticos da variante tbh8

[0079] SEQ ID NO: 20 Sequência de aminoácidos deduzidos (maduros) de TBH8 variante

[0080] SEQ ID NO: 21 Sequência de genes sintéticos da variante tbh9

[0081] SEQ ID NO: 22 Sequência de aminoácidos deduzidos (maduros) de TBH9 variante

[0082] SEQ ID NO: 23 Sequência de genes sintéticos da variante tbh10

[0083] SEQ ID NO: 24 Sequência de aminoácidos deduzidos (maduros) de TBH10 variante

[0084] SEQ ID NO: 25 Sequência de genes sintéticos da variante tbh11

[0085] SEQ ID NO: 26 Sequência de aminoácidos deduzidos (maduros) da variante TBH11

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0086] Manana refere-se aos polissacarídeos compostos por uma cadeia principal de manose ligada por ligações β-1,4 com cadeias laterais de galactose acopladas à cadeia principal por ligações α-1,6. As mananas compreendem material à base de planta como goma guar e goma de alfarrobeira. Glucomananas são polissacarídeos tendo uma cadeia principal de mais ou menos regularmente alternando manose e glicose β-1,4 ligada, galactomananas e galactoglucomananas são mananas e glucomananas com ramificações laterais de galactose alfa- 1,6 ligadas.

[0087] O termo "fragmento funcional" ou "fragmento eficaz" significa um fragmento ou uma porção da SEQ ID NO: (2) Man7 variante que mantém cerca da mesma função enzimática ou efeito.

[0088] O termo "mananase variante" e "variante de mananase" significa qualquer molécula de mananase obtida por mutagênese sítio- dirigida ou aleatória, inserção, substituição, deleção, recombinação e/ou qualquer outro método de engenharia de proteínas, o que leva a mananases que diferem em sua sequência de aminoácidos a partir da mananase original, isto é, uma mananase do tipo selvagem. Os termos "mananase do tipo selvagem", "enzima do tipo selvagem", "tipo selvagem", ou "wt" de acordo com a revelação descreve uma enzima mananase com uma sequência de aminoácidos encontrados na natureza ou um fragmento do mesmo.

[0089] O termo "atividade catalítica" ou "atividade" descreve quantitativamente a conversão de um dado substrato sob determinadas condições de reação. O termo "atividade residual" é definido como a razão entre a atividade catalítica da enzima sob um determinado conjunto de condições para a atividade catalítica sob um conjunto diferente de condições. Portanto, a atividade residual ai é dada por ai = vi/v0 onde v denota qualquer medida de atividade catalítica e ai *100 é a atividade relativa em porcentagem. O termo "atividade específica" descreve quantitativamente a atividade catalítica por quantidade de enzima sob determinadas condições de reação.

[0090] O termo "estabilidade proteolítica" descreve a propriedade de uma proteína para resistir a uma exposição limitada de proteases sob condições em que as proteases são ativas, sem perder a atividade sob condições em que a sua atividade pode ser medida.

[0091] Como usado neste documento, o termo "mananase" ou "galactomananase" denota uma enzima mananase definida de acordo com o conhecido na técnica como manana endo-1,4-beta-manosidase e tendo os nomes alternativos beta-mananase e endo-1,4-mananase e catalisando a hidrólise de ligações 1,4-beta-D-manosídicas em mananas, galactomananas, glucomananas e galactoglucomananas. Mananases são classificadas de acordo com a nomenclatura de enzimas como a EC 3.2.1.78.

[0092] Como usado neste documento, "isolado" significa uma substância, em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância que não ocorre naturalmente, (2) qualquer substância, incluindo qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removida de uma ou mais ou todos os constituintes que ocorrem naturalmente com o qual ele está associado na natureza; (3) qualquer substância modificada pela mão do homem em relação à substância encontrada na natureza, como uma variante; ou (4) qualquer substância modificada pelo aumento ou diminuição da quantidade da substância em relação a outros componentes com o qual está naturalmente associado (por exemplo, produção recombinante em uma célula hospedeira; uma ou várias cópias de um gene que codifica a substância; e o uso de um promotor alternativo do promotor naturalmente associado com o gene que codifica a substância). Em uma modalidade, um polipeptídeo, uma enzima, uma variante, um polinucleotídeo, uma célula hospedeira ou uma composição da invenção é isolado.

[0093] Como usado neste documento, o termo "compreendendo" inclui os significados mais amplos de "incluindo", "contendo" e "compreendendo", bem como as expressões mais restritas "consistindo em" e "consistindo apenas em".

[0094] Como usado neste documento, "variante” significa uma sequência ou um fragmento de uma sequência (de nucleotídeos ou aminoácido) inserida, substituída ou deletada por um ou mais nucleotídeos e aminoácidos, ou que é quimicamente modificada. Em uma modalidade, o termo variante inclui também uma enzima mananase recombinante.

[0095] Como usado neste documento, "substituição de aminoácidos conservativa" é uma em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral semelhante. Famílias de resíduos de aminoácidos com cadeias laterais semelhantes foram definidas na técnica. Em uma modalidade, os aminoácidos conservativos na presente descrição referem-se a aminoácidos dentro dos seguintes agrupamentos: hidrófobos (F W Y H K M I L V A G C); aromáticos (F W Y H); alifáticos (I L V); polar (W Y H K R E D C S T N Q); carregado (H K R E D); positivamente carregado (H K R); negativamente carregado (E D); pequeno (V C A G S P T N D); pequeno (A G S). Assim, uma substituição conservadora ocorre quando um aminoácido é substituído por um aminoácido no mesmo grupo.

[0096] Em uma modalidade, a substituição é uma substituição com, pelo menos, um resíduo de aminoácido. Em outras modalidades, o ao menos aminoácido é Ala.

[0097] Como usado neste documento, uma "substituição de aminoácidos não conservativa" é uma em que um aminoácido é substituído por um aminoácido em um grupo diferente como definido acima. A substituição não conservativa pode resultar em uma mudança de um aminoácido para outro aminoácido com diferentes propriedades bioquímicas, como carga, hidrofobicidade e/ou tamanho. Em uma modalidade, a substituição não conservativa muda pelo menos uma propriedade da variante, como estabilidade, padrão de glicosilação, dobragem, estrutura, atividade ou afinidade.

[0098] Processo de glicosilação N-ligada ocorre em eucariotas, mas muito raramente em bactérias. A fixação de um resíduo glicano a uma proteína requer o reconhecimento de uma sequência consenso. Glicanos N-ligados são quase sempre fixados a uma cadeia lateral de asparagina (Asn) que está presente como parte da sequência consenso

Asn-X-Ser/Thr, onde X é qualquer aminoácido, exceto prolina (Pro). Os inventores descobriram que uma cadeia lateral de Asn não glicosilada estruturalmente perto do sítio ativo da mananase é importante para a obtenção de uma variante com bom desempenho de degradação da manana. Sem estar ligado a qualquer teoria, os açúcares glicano são moléculas polares e quando conectados a um Asn, eles se localizam na superfície da proteína causando alterações estruturais no Asn glicosilado e em suas proximidades. A mutagênese sítio-dirigida dos resíduos Asn ou Ser/Thr na sequência consenso Asn-Xaa-Thr(Ser) pode ser usada para evitar a glicosilação dos sítios de glicosilação N- ligados desejados na variante do primeiro aspecto da invenção.

[0099] Em uma modalidade a variante tem uma substituição de um aminoácido por um resíduo que previne a glicosilação N-ligada do resíduo 283 quando expressado em uma célula hospedeira capaz de glicosilação N-ligada.

[00100] Em uma modalidade, a presente variante compreende pelo menos uma sequência consenso Asn-X-Ser/Thr.

[00101] Em uma modalidade, a presente variante compreende resíduo Pro no local X da pelo menos uma sequência consenso Asn-X- Ser/Thr.

[00102] Em uma modalidade, a substituição é uma substituição conservativa ou não conservativa.

[00103] Como usado neste documento, um "peptídeo" e um "polipeptídeo" são sequências de aminoácidos incluindo uma pluralidade de resíduos de aminoácidos polimerizados consecutivos. Para efeitos da presente invenção, peptídeos são moléculas incluindo até 20 resíduos de aminoácidos, e polipeptídeos incluem mais de 20 resíduos de aminoácidos. O peptídeo ou polipeptídeo pode incluir resíduos de aminoácidos modificados, resíduos de aminoácidos que ocorrem naturalmente não codificados por um códon e resíduos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente. Como usado neste documento, uma "proteína" pode se referir a um peptídeo ou um polipeptídeo de qualquer tamanho. Uma proteína pode ser uma enzima, uma proteína, um anticorpo, uma proteína de membrana, um hormônio peptídeo, regulador ou qualquer outra proteína.

[00104] O termo "polinucleotídeo" se refere a um polímero de fita simples ou dupla de bases de desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo lidos da extremidade 5’para a 3’. Polinucleotídeos incluem RNA e DNA, e podem ser isolados a partir de fontes naturais, sintetizados in vitro, ou preparados a partir de uma combinação de moléculas naturais e sintéticas.

[00105] Como usado neste documento, "modificação", "modificado", e termos similares no contexto de polinucleotídeos se referem a modificação de uma região de codificação ou não codificação do polinucleotídeo, como uma sequência reguladora, região 5' não traduzida, região 3' não traduzida, elemento genético de regulação positiva, elemento genético de regulação negativa, potencializador, supressor, promotor, éxon, ou região íntron. A modificação pode, em algumas modalidades, ser apenas estrutural, não tendo nenhum efeito sobre o efeito biológico, ação ou função do polinucleotídeo. Em outras modalidades, a modificação é uma modificação estrutural, que proporciona uma mudança no efeito biológico, ação ou função do polinucleotídeo. Tal modificação pode melhorar, suprimir ou alterar a função biológica do polinucleotídeo.

[00106] Como usado neste documento, "identidade” significa a percentagem de correspondências exatas de resíduos de aminoácidos entre duas sequências alinhadas com o número de posições onde existem resíduos presentes em ambas as sequências. Quando uma sequência tem um resíduo sem resíduo correspondente na outra sequência, o programa de alinhamento permite uma lacuna no alinhamento, e essa posição não é contabilizada no denominador do cálculo de identidade. Identidade é um valor determinado com a ferramenta de alinhamento de pares de sequência EMBOSS Needle no website EMBL-EBI (www.ebi.ac.uk/Ferramentas/PSA/emboss_/ agulha).

[00107] Como usado neste documento, as condições de baixa estrigência significa para sondas de pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento correspondente a hibridização na pré-hibridização e hibridização a 55°C em 5× SSC, 0,1 % N-lauroilsarcosina, 0,02% SDS, 1% reagente de bloqueio (Roche 11 096 176 001), seguindo os procedimentos padrão de Southern blotting por 12 a 24 horas. O material veículo é finalmente lavado duas a três vezes cada por 15 minutos usando 2X SSC, 0,1% SDS a 55°C.

[00108] Como usado neste documento, condições de alta estringência significa para sondas de pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento correspondente a hibridização na pré-hibridização e hibridização a 65°C em 5× SSC, 0,1% N-lauroilsarcosina, 0,02% SDS, 1% reagente de bloqueio (Roche 11 096 176 001), seguindo os procedimentos padrão de Southern blotting por 12 a 24 horas. O material veículo é finalmente lavado duas a três vezes cada por 15 minutos usando 0,1X SSC, 0,1% SDS a 65°C.

[00109] Como usado neste documento, "célula hospedeira" significa qualquer tipo de célula, que é suscetível a transformação, transfecção, transdução, correspondência, cruzamento ou similares com uma construção de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo. O termo "célula hospedeira" engloba qualquer descendência que não é idêntica, devido a mutações que ocorrem durante a replicação. Exemplos não limitantes de uma célula hospedeira são células fúngicas, células fúngicas filamentosas da Divisão Ascomycota, Subdivisão Pezizomycotina; de preferência do grupo consistindo em membros da classe Sordariomycetes, subclasse Hypocreomycetidae, ordens Hypocreales e Microascales e Aspergillus, Chrysosporium, Myceliophthora e Humicola; mais de preferência do grupo consistindo em famílias Hypocreacea, Nectriaceae, Clavicipitaceae, Microascaceae, e gêneros Trichoderma (anamorfo de Hypocrea), Fusarium, Gibberella, Nectria, Stachybotrys, Claviceps, Metarhizium, Villosiclava, Ophiocordyceps, Cephalosporium e Scedosporium; mais de preferência do grupo consistindo em Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina), T.citrinoviridae, T. longibrachiatum, T. virens, T. harzianum, T. asperellum, T. atroviridae, T.parareesei, Fusarium oxysporum, F.gramineanum, F.pseudograminearum, F.venenatum, Gibberella fujikuroi, G. moniliformis, G. zeaea, Nectria (Haematonectria) haematococca, Stachybotrys chartarum, S. chlorohalonata, Claviceps purpurea, Metarhizium acridum, M. anisopliae, Villosiclava virens, Ophiocordyceps sinensis, Acremonium (Cephalosporium) chrysogenum, e Scedosporium apiospermum, e Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Chrysosporium lucknowense, Myceliophthora thermophila, Humicola insolens, e Humicola grisea, com mais preferência Trichoderma reesei. Exemplos não limitantes de uma célula hospedeira são células bacterianas, de preferência bacilos gram- positivos (por exemplo Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. megaterium, B. amyloliquefaciens, B. pumilus), bactérias gram-negativas (por exemplo Escherichia coli), actinomycetales (por exemplo Streptomyces sp.) e leveduras (por exemplo Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica).

[00110] Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula fúngica, de preferência uma célula fúngica filamentosa, como Trichoderma ou Trichoderma reesei. Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula bacteriana, de preferência uma célula de bacilo gram-positivo, como B. subtilis, B. licheniformis, B. megaterium, B. amyloliquefaciens, B. pumilus.

[00111] Em uma modalidade, a célula hospedeira é capaz de glicosilação N-ligada.

[00112] Uma "célula recombinante" ou "célula hospedeira recombinante" refere-se a uma célula ou célula hospedeira que tenha sido geneticamente modificada ou alterada para incluir uma sequência de ácido nucleico, que não é nativo na dita célula ou célula hospedeira. A modificação genética pode incluir a integração do polinucleotídeo no genoma da célula hospedeira. O polinucleotídeo também pode ser exógeno na célula hospedeira. Em uma modalidade, a presente célula hospedeira é uma célula hospedeira recombinante.

[00113] Como usado neste documento, "expressão" inclui qualquer etapa envolvida na produção de um polipeptídeo em uma célula hospedeira, incluindo, mas não limitado a, transcrição, tradução, modificação pós-traducional e secreção. A expressão pode ser seguida do cultivo, ou seja, recuperação de células hospedeiras ou produto expressado.

[00114] O termo "vetor de expressão" denota uma molécula de DNA, linear ou circular, que compreende um segmento codificando um polipeptídeo de interesse ligado de maneira funcional a segmentos adicionais que proporcionam sua transcrição. Tais segmentos adicionais podem incluir o promotor e sequências terminadoras, e pode opcionalmente incluir uma ou mais origens de replicação, um ou mais marcadores selecionáveis, um potencializador, um sinal de poliadenilação, veículos de similares. Vetores de expressão são geralmente derivados de plasmídeo ou DNA viral, ou podem conter elementos de ambos. O vetor de expressão pode ser qualquer vetor de expressão que está convenientemente submetido a procedimentos de DNA recombinantes, e a escolha do vetor, muitas vezes, depende da célula hospedeira em que o vetor está sendo introduzido. Assim, o vetor pode ser um vetor de replicação de forma autônoma, ou seja, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, uma replicação que é independente da replicação cromossômica, como, por exemplo, um plasmídeo. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido em uma célula hospedeira, é integrado ao genoma da célula hospedeira e replicado em conjunto com o(s) cromossomo(s) em que foi integrado. Em uma modalidade, o presente vetor é um vetor de expressão.

[00115] O termo "produzido de forma recombinante" ou "produzido recombinantemente" usado neste documento em conexão com a produção de um polipeptídeo ou proteína é definido de acordo com a definição padrão na técnica.

[00116] O termo "obtido a partir de" e "obtenível" como usado neste documento em conexão com uma fonte microbiana específica significa que o polinucleotídeo é expressado pela fonte específica (expressão homóloga), ou por uma célula em que um gene da fonte foi inserido (expressão heteróloga).

[00117] O termo "composição enzimática” significa um produto de fermentação enzimática convencional, possivelmente isolado e purificado, de uma única espécie de um microrganismo, tal preparação, geralmente compreendendo um número de diferentes atividades enzimáticas; ou uma mistura de enzimas de monocomponente, de preferência as enzimas provenientes de espécies de bactérias ou fúngicas, usando técnicas recombinantes convencionais, cujas enzimas foram fermentadas e, possivelmente, isoladas e purificadas separadamente e que podem ser originárias de diferentes espécies, preferencialmente espécies fúngicas ou bacterianas ou o produto de fermentação de um microrganismo que age como uma célula hospedeira para a produção de uma mananase recombinante, mas cujo microrganismo produz simultaneamente outras enzimas.

[00118] O termo "ligado de maneira funcional", quando se refere a segmentos de DNA, significa que os segmentos são organizados de forma que eles funcionam em conjunto para os seus fins, como, por exemplo, a transcrição inicia o promotor e prossegue com o segmento de codificação para o terminador.

[00119] O termo "promotor" significa uma parte de um gene contendo sequências de DNA que proporcionam a ligação do RNA polimerase e o início da transcrição. As sequências promotoras são normalmente, mas nem sempre, encontradas nas regiões não codificadoras 5' dos genes.

[00120] O termo "sequência sinal secretora" ou "sequência sinal" significa uma sequência de DNA que codifica um polipeptídeo (um "peptídeo secretor") que, como um componente de um polipeptídeo maior, direciona o maior polipeptídeo através de uma via secretora de uma célula hospedeira em que é produzido. A sequência sinal secretora pode ser nativa ou pode ser substituída por sequência sinal secretora ou sequência carreadora a partir de outra fonte. Dependendo da célula hospedeira, o peptídeo maior pode ser clivado para remover o peptídeo secretor durante o trânsito através da via secretora.

[00121] O termo "região de núcleo" ou "domínio catalítico" denota um domínio de uma enzima, que pode ou não ter sido modificada ou alterada, mas que manteve pelo menos parte de sua atividade original. A região do núcleo de uma mananase de acordo com a invenção corresponde aos aminoácidos alinhados com os aminoácidos 27-331 de Man7, SEQ ID NO: 2.

[00122] Pelo termo "ligante" ou "espaçador" é um polipeptídio compreendendo, pelo menos, dois aminoácidos que podem estar presentes entre os domínios de uma proteína com vários domínios, como, por exemplo, uma enzima compreendendo um enzima de núcleo e um domínio de ligação como uma molécula de ligação de carboidrato (CBM) ou qualquer outra enzima híbrida, ou entre duas proteínas ou polipeptídeos produzidos como um polipeptídeo de fusão, por exemplo, uma proteína de fusão compreendendo duas enzimas de núcleo. Por exemplo, a proteína de fusão de uma enzima de núcleo com uma CBM é fornecida pela fusão de uma sequência de DNA codificando a enzima de núcleo, uma sequência de DNA codificando o ligante e uma sequência de DNA codificando a CBM sequencialmente em um quadro de leitura aberto e expressando esta construção.

[00123] Quantidade eficiente significa uma quantidade que é suficiente para degradar manose na aplicação selecionada.

[00124] As abreviaturas a seguir são usadas para aminoácidos: A Ala Alanina C Cys Cisteína D Asp Ácido aspártico E Glu Ácido glutâmico F Phe Fenilalanina G Gly Glicina H His Histidina I Ile Isoleucina K Lys Lisina L Leu Leucina M Met Metionina N Asn Asparagina P Pro Prolina Q Gln Glutamina R Arg Arginina S Ser Serina T Thr Treonina V Val Valina

W Trp Triptofano Y Tyr Tirosina

[00125] As substituições são descritas usando a seguinte nomenclatura: resíduo de aminoácido no arcabouço da proteína; posição; resíduo(s) de aminoácido substituído(s). De acordo com esta nomenclatura, a substituição de, por exemplo, um resíduo de serina para um resíduo de glicina na posição 20 é indicada como Ser20Gly ou S20G.

[00126] Os termos "composição detergente " e "detergente” incluem, salvo indicação em contrário, agentes de lavagem para múltiplas finalidades ou para tarefas pesadas sob forma de sólido, granular ou em pó, especialmente detergentes para limpeza; agentes de lavagem para todas as finalidades sob forma de líquido, gel ou pasta, especialmente os tipos sob a forma de líquido para tarefas pesadas (HDL); detergentes líquidos para tecidos finos; agentes para lavagem manual de louças ou agentes para lavagem manual pesada, especialmente aqueles do tipo alto espumante; agentes de lavagem de louças à máquina, incluindo os vários tipos em tablete, granulares, líquidos e de auxílio ao enxágue para uso doméstico e institucional; agentes líquidos de limpeza e desinfecção, xampus para carros ou tapetes, limpadores para metal; produtos de limpeza para banheiro; bem como auxiliares de limpeza, como aditivo alvejante e "bastão removedor de manchas" ou tipos de pré-tratamento. Os termos "detergente", "composição detergente" e "formulação do detergente" são usados em referência às misturas, que são destinadas para uso em um meio de lavagem para a limpeza de objetos sujos. Em algumas modalidades, o termo é usado em referência à lavagem de tecidos e/ou peças de vestuário (por exemplo, "detergentes para lavagem de roupas"). Em modalidades alternativas, o termo refere-se a outros detergentes, como os usados para limpar pratos, talheres, etc. (por exemplo, "detergentes para lavagem de louças"). Não se pretende que a presente invenção seja limitada a uma determinada formulação ou composição de detergente. Pretende-se que além das mananases de acordo com a invenção, o termo abranja detergentes que podem conter, por exemplo, tensoativos, builders, quelantes ou agentes quelantes, sistema alvejante ou componentes alvejantes, polímeros, condicionadores de tecido, reforçador de espuma, supressores de espuma, corantes, perfumes, inibidores de bronzeamento, branqueadores ópticos, bactericidas, fungicidas, agentes de suspensão de sujeira, agentes anticorrosão, hidrótropos, tecidos tonalizantes de tecido, dispersantes, agentes inibidores de transferência de corante, agentes branqueadores fluorescentes, polímero para liberação de sujeiras, agentes de antirredeposição, agentes antiencolhimento, agentes antipregas, bactericidas, aglutinantes, veículos, corantes, enzimas estabilizantes, amaciantes de tecido, cargas, reguladores de espuma, perfumes, pigmentos, supressores de grama, solventes, e estruturantes para detergentes líquidos, agentes elásticos de estrutura, inibidores de enzima ou estabilizadores, ativadores de enzimas, transferase(s), enzimas hidrolíticas, óxido reductases, agentes de azulamento e corantes fluorescentes, antioxidantes e solubilizadores.

[00127] O termo "têxtil" significa qualquer material têxtil, incluindo fios, intermediários de fios, fibras, materiais não tecidos, materiais naturais, materiais sintéticos, e qualquer outro material têxtil, tecidos feitos desses materiais e produtos feitos a partir de tecidos (por exemplo, peças de vestuário, roupa de cama e outros artigos). Os têxteis ou tecidos podem ser em forma de malhas, tecidos, denims, não tecidos, feltros, fios e toalhas. O têxtil pode ser à base de celulose, como celulósicos naturais incluindo algodão, linho, juta, rami, sisal ou fibra de coco celuloses ou celulósicos artificiais (por exemplo, provenientes da polpa de madeira), incluindo viscose/raiom, rami, fibras de acetato de celulose (tricel), liocel ou misturas destes. O têxtil ou tecido também pode não ser à base de celulose como poliamidas naturais incluindo lã, camelo, cashmere, mohair, coelho e seda ou polímero sintético, como náilon, aramida, poliéster, acrílico, polipropileno e spandex/elastano, ou misturas dos mesmos, bem como a mistura de fibras à base de celulose e de não celulose. Exemplos de misturas são misturas de algodão e/ou raiom/viscose com um ou mais material complementar como lã, fibras sintéticas (por exemplo, fibras de poliamida, fibras acrílicas, fibras de poliéster, fibras de poli (álcool vinílico), fibras de policloreto de vinila, fibras de poliuretano, fibras de poliureia, fibras de aramida) e fibras contendo celulose (por exemplo, raiom/viscose, rami, linho, juta, fibras de acetato de celulose, liocel). Tecido pode ser de tecido lavável convencional, por exemplo, tecido doméstico manchado. Quando o termo tecido ou vestuário é usado ele destina-se a incluir o termo mais amplo têxteis, também.

[00128] O termo "estabilidade" inclui a estabilidade de armazenamento e a estabilidade durante o uso, por exemplo, durante o processo de lavagem (na estabilidade de lavagem) e reflete a estabilidade da mananase de acordo com a invenção como uma função do tempo, como, por exemplo, o quanto a atividade é mantida quando a mananase é mantida em solução, em especial em uma solução de detergente. A estabilidade é influenciada por muitos fatores, como, por exemplo, pH, temperatura, composição do detergente, por exemplo, proteases, estabilizadores, construtores, tensoativos etc. A estabilidade da mananase pode ser medida usando o "ensaio de atividade", como descrito nos exemplos.

[00129] A “atividade da mananase" como usado neste documento refere-se à atividade degradante da manana de um polipeptídeo. Degradando ou modificando conforme usado neste documento, significa que as unidades de manose são hidrolisadas a partir do polissacarídeo manana pela mananase. A atividade degradante da manana dos polipeptídeos de acordo com a presente invenção pode ser testada de acordo com os procedimentos de teste padrão conhecido na técnica. O Exemplo 4 fornece um exemplo de um método padrão para a determinação da atividade da mananase.

[00130] Em uma modalidade, a presente variante tem pelo menos uma posição N283, T285 ou S285; de preferência T285 ou S285; com a máxima preferência T285; substituída por um resíduo que previne a glicosilação N-ligada do resíduo 283 quando expressado em uma célula hospedeira capaz de glicosilação N-ligada.

[00131] Em uma modalidade, a presente variante tem pelo menos mais uma substituição na posição correspondente à posição abaixo: 229, 283, 285, 300, 340, 400, 419, 433 ou 446; ou S229, N283, T285, S285, N300, N340, S400, N419, S433 ou N446.

[00132] Em uma modalidade, a substituição compreende uma substituição na dita posição para um aminoácido selecionado de Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr e Val. De preferência, a substituição é uma substituição para um aminoácido diferente de Ser ou Thr.

[00133] Em uma modalidade, a variante compreende um resíduo P na posição 284 e/ou 286. Uma substituição para um resíduo P em qualquer ou ambas as posições acima pode provocar uma mudança estrutural na variante, que impede a glicosilação N-ligada.

[00134] Em uma modalidade, na presente variante, a posição T285 ou S285 é substituída por um resíduo diferente de T ou S.

[00135] Em uma modalidade, na presente variante, a posição T285 ou S285 é substituída por uma alanina.

[00136] Em uma modalidade, a substituição é um substituição conservativa ou não conservativa, resultando em uma glicosilação alterada da variante quando produzida em uma célula hospedeira capaz de glicosilação, preferencialmente glicosilação N-ligada.

[00137] Em uma modalidade é fornecida uma variante de mananase compreendendo um polipeptídeo tendo, pelo menos, 85% de identidade de sequência para os resíduos 27-331 da SEQ ID NO: 2, e um resíduo Asn não glicosilado na posição 283, quando produzido em uma célula hospedeira capaz de glicosilação N-ligada.

[00138] Em uma modalidade, a presente variante compreende pelo menos um sítio N glicosilado adicional, em que a posição correspondente ao N283 não é glicosilada. Tal variante é obtida por produzir a variante em uma célula hospedeira, que é capaz de N- glicosilação, resultando, pelo menos, na glicosilação parcial dos outros sítios de N-glicosilação, mas onde a N-glicosilação do N283 é inibida.

[00139] Em outra modalidade, a presente variante não inclui quaisquer sítios N-glicosilados. Tal variante é obtida por produzir a variante em uma célula hospedeira, que não é capaz de N-glicosilação, ou produzindo a variante em uma célula hospedeira capaz de glicosilação, mas onde a variante foi modificada de tal forma que os outros sítios de N-glicosilação não são inibidos, resultando na glicosilação inibida da variante.

[00140] Em uma modalidade, a variante tem um peso molecular previsto entre 50000 e 51000, de preferência entre 50750 e 50970, sem incluir a sequência sinal.

[00141] Em uma modalidade, a variante tem um pl previsto entre 4,5 e 4,8, de preferência entre 4,6 e 4,75.

[00142] A previsão de pI ou peso molecular da variante pode ser realizada conforme descrito na Tabela 3.

[00143] Em uma outra modalidade da invenção a variante tem atividade de mananase. Em uma modalidade, a variante tem maior atividade específica em relação à mananase de tipo selvagem quando produzida em uma célula hospedeira eucariótica. As mananases compreendidas na presente composição enzimática da invenção são adequadas para degradar e modificar a manana contendo material em diferentes ambientes químicos, de preferência em composições de detergentes.

[00144] Em uma modalidade do primeiro aspecto a presente composição de enzima está sob a forma de uma composição líquida ou uma composição sólida como solução, dispersão, pasta, pó, grânulo, granulado, granulado revestido, comprimido, bolo, cristal, pasta de cristal, gel ou pélete.

[00145] A presente invenção refere-se a usos diferentes da presente composição de enzima, como, por exemplo, para degradar a manana e para uso em um processo de lavagem.

[00146] A presente composição de enzima também pode ser usada em agentes de limpeza ou reforçadores que são adicionados no topo do detergente durante ou antes da lavagem e que estão, por exemplo, sob a forma de líquido, gel, pó, grânulos ou tabletes. A composição de enzima e os componentes detergentes também pode ser embebidos em um veículo do tipo têxteis.

[00147] Em uma modalidade da presente invenção, a composição de enzima inclui ainda uma ou mais enzimas adicionais selecionadas do grupo consistindo em protease, lipase, cutinase, amilase, carboidrase, celulase, pectinase, pectateliase, enzima pectinolítica, esterase, fitase, mananase, arabinase, galactanase, xilanase, oxidase, xantanase, xiloglucanase, DNAse, lacase e/ou peroxidase selecionada de preferência do grupo consistindo em proteases, amilases, celulases e lipases.

[00148] A presente composição de enzima compreendendo mananase e uma enzima adicional é vantajosa no fornecimento de efeito sinérgico. Essas enzimas adicionais são desejadas quando a presente composição de enzima compreendendo mananase é usada em detergentes, por exemplo, ao lavar as manchas. Enzimas sinérgicas particularmente vantajosas que funcionam com a mananase em detergentes são amilases, proteases e celulases, ou uma combinação das mesmas, como uma composição compreendendo mananase, amilase e protease.

[00149] Em uma modalidade a presente composição detergente está na forma de uma barra, um tablete de homogeneização, um tablete com duas ou mais camadas, uma bolsa com um ou mais compartimentos, um pó, uma barra, um tablete regular ou compacto, um grânulo, granulado, líquido, granulado, uma pasta, um gel ou um líquido concentrado, regular ou compacto. Em uma modalidade, a composição detergente pode ser uma composição detergente para lavagem de roupas, de preferência uma composição detergente para lavagem de roupas líquida ou sólida.

[00150] Em uma modalidade da presente invenção, a presente composição detergente inclui ainda uma ou mais enzimas adicionais selecionadas do grupo consistindo em protease, lipase, cutinase, amilase, carboidrase, celulase, pectinase, pectateliase, enzima pectinolítica, esterase, mananase, arabinase, galactanase, xilanase, oxidase, xantanase, xiloglucanase, lacase, DNAse e/ou peroxidase, selecionada de preferência do grupo consistindo em proteases, amilases, celulases e lipases.

[00151] A presente invenção refere-se ainda ao uso da, e um método de uso da, composição de enzima ou composição detergente como revelado neste documento para degradar a manana.

[00152] Em mais uma modalidade, a presente invenção refere-se ao uso de, e um método de uso da, composição de enzima ou composição detergente como revelado neste documento no processo de lavagem.

[00153] A presente invenção refere-se ainda a um método para remover uma mancha de uma superfície, compreendendo colocar a superfície em contato com a composição de enzima ou composição detergente como revelado neste documento.

[00154] A presente invenção também se refere a um método para degradar a manana compreendendo aplicar a composição de enzima ou a composição detergente, como revelado neste documento, à manana, de preferência onde a manana está sobre uma superfície de um têxtil, ou pelo menos parcialmente incorporado em um têxtil.

[00155] Em geral, as propriedades da(s) enzima(s) seleciona(s) deve ser compatível com o detergente selecionado (ou seja, pH ideal, compatibilidade com outros ingredientes enzimáticos e não enzimáticos, etc.) e a(s) enzima(s) deve(m) estar presente(s) em quantidades eficazes.

[00156] Uma composição para uso em detergentes sólidos para lavagem de roupas, por exemplo, pode incluir 0,000001% a 5%, como 0,000005 a 2%, como, por exemplo, 0,00001% a 1%, como 0,00001% a 0,1% de proteína de enzima em peso da composição.

[00157] Uma composição para uso em detergentes líquidos, por exemplo, pode incluir 0,000001% a 3%, como 0,000005% a 1%, como 0,00001% a 0,1% de proteína de enzima em peso da composição.

[00158] Uma composição para uso em máquina lavadora automática de louças, por exemplo, pode incluir 0,000001% a 5%, como 0,000005% a 2%, como 0,00001% a 1%, como 0,00001% a 0,1% de proteína de enzima em peso da composição.

[00159] Os componentes adicionais a-d do segundo aspecto da invenção proporcionam propriedades melhoradas para a presente composição de enzima. A composição de enzima é compatível com os componentes adicionais e melhora a aplicabilidade da composição de enzima em diferentes usos.

[00160] Sais, como o cloreto de sódio e sulfato de sódio funcionam como auxiliares de secagem.

[00161] Em uma modalidade, a variante de mananase compreende a região do núcleo.

[00162] Em uma modalidade, a variante de mananase compreende um CBM.

[00163] Fornecendo mananases que mantenham a atividade em temperaturas acima da temperatura ambiente é vantajoso para aplicações onde é necessária a degradação da manana em tais condições. Além disso, as mannanases de acordo com a invenção podem ter boa estabilidade e atividade em condições alcalinas, que é vantajoso no uso de detergentes e no processamento de biomassa.

[00164] Em uma modalidade, a variante de mananase tem uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2.

[00165] Em uma modalidade, a variante de mananase tem uma sequência de aminoácidos com, pelo menos, 90% de identidade de sequência para SEQ ID NO:2.

[00166] Em uma modalidade, a enzima mananase tem uma sequência de aminoácidos que não é 100% idêntica à SEQ ID NO: 2.

[00167] Em uma modalidade, os elementos genéticos compreendem, pelo menos, uma sequência de controle que controla a produção do polipeptídeo recombinante na célula hospedeira recombinante.

[00168] Em uma modalidade do terceiro aspecto, a célula hospedeira é selecionada do grupo que consiste em: células fúngicas, células fúngicas filamentosas da Divisão Ascomycota, Subdivisão Pezizomycotina; de preferência do grupo consistindo em membros da classe Sordariomycetes, subclasse Hypocreomycetidaede,

ordens Hypocreales e Microascales e Aspergillus, Chrysosporium, Myceliophthora e Humicola; mais de preferência do grupo consistindo em famílias Hypocreacea, Nectriaceae, Clavicipitaceae, Microascaceae, e gêneros Trichoderma (anamorfo de Hypocrea), Fusarium, Gibberella, Nectria, Stachybotrys, Claviceps, Metarhizium, Villosiclava, Ophiocordyceps, Cephalosporium e Scedosporium; com mais preferência do grupo consistindo em Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina), T. citrinoviridae, T. longibrachiatum, T. virens, T. harzianum, T. asperellum, T. atroviridae, T. parareesei, Fusarium oxysporum, F. gramineanum, F. pseudograminearum, F. venenatum, Gibberella fujikuroi, G. moniliformis, G. zeaea, Nectria (Haematonectria) haematococca, Stachybotrys chartarum, S. chlorohalonata, Claviceps purpurea, Metarhizium acridum, M. anisopliae, Villosiclava virens, Ophiocordyceps sinensis, Acremonium (Cephalosporium) chrysogenum, e Scedosporium apiospermum, e Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Chrysosporium lucknowense, Myceliophthora thermophila, Humicola insolens, e Humicola grisea, células bacterianas, de preferência bacilos gram-positivos, como Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. megaterium, B. amyloliquefaciens, B. pumilus, bactérias gram-negativas, como Escherichia coli, actinomycetales, como Streptomyces sp., e leveduras como Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, com a máxima preferência Trichoderma reesei.

[00169] Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula hospedeira eucariótica capaz de glicosilação N-ligada. Em uma modalidade preferencial a célula hospedeira é Trichoderma reesei.

[00170] A célula hospedeira recombinante pode ser usada para produzir a variante de mananase e transportar um polinucleotídeo que a codifica. A célula hospedeira recombinante é útil também na preparação de variantes de mananase com propriedades diferentes. Por exemplo, uma célula hospedeira pode ser selecionada, que prevê modificações pós-traducionais benéficas para a estabilidade ou atividade, ou que facilita o pós-processamento e a formulação da variante de mananase produzida na célula hospedeira.

[00171] Em uma modalidade, a presente composição da enzima compreende a célula hospedeira recombinante do segundo aspecto.

[00172] Em uma modalidade, a presente variante de mananase é um polipeptídeo recombinante, que é uma proteína de fusão.

[00173] Em uma modalidade, o presente polipeptídeo recombinante é uma proteína de fusão, que compreende ainda pelo menos um dos seguintes: uma sequência de aminoácidos proporcionando uma sequência sinal secretora; uma sequência de aminoácidos que facilita a purificação, como um marcador de afinidade, marcador His; uma sequência de aminoácidos que aumenta a produção, como uma sequência de aminoácidos, que é um veículo, como CBM; uma sequência de aminoácidos tendo uma atividade enzimática; e uma sequência de aminoácidos proporcionando a proteína de fusão com afinidade de ligação, como uma porção de ligação do carboidrato.

[00174] A CBM, porção de ligação do carboidrato, como um veículo é vantajosa, por exemplo, em produção de Trichoderma.

[00175] Em uma modalidade, a célula hospedeira é não patogênica. Isto é particularmente vantajoso para uso da célula hospedeira na alimentação, e em aplicações de detergentes como em detergentes para lavagem de roupas em casa.

[00176] Em uma modalidade do quinto aspecto, a manana contendo o material é selecionada a partir do material vegetal, têxtil, água residual, esgoto, óleo ou uma combinação destes.

[00177] Em uma modalidade, a manana contendo material é material têxtil ou tecido.

[00178] Em outra modalidade, a manana contendo material é papel reciclado, polpa mecânica, pasta de celulose, polpa de semicelulose, processo Kraft ou outras polpas para fabricação de papel; fibras submetidas a um processo de retting; ou material contendo goma guar ou goma de alfarroba.

[00179] Em outra modalidade, a degradação ou a modificação é realizada em um ambiente aquoso, onde mananase mostra a atividade.

[00180] Em uma modalidade preferida, a manana contendo material, que é degradada ou modificada no método, é sobre um têxtil ou um tecido opcionalmente com manchas de manana. Degradando a manana fixada ao têxtil ou tecido, sujeira ou terra ligado à manana é liberado e não é capaz de se ligar novamente à manana ou manchas de manana. O têxtil ou tecido pode ser de qualquer material, por exemplo, algodão, linho, juta, rami, sisal ou fibra de coco celuloses ou celulósicos artificiais (por exemplo, provenientes da polpa de madeira), incluindo viscose/raiom, modal, fibras de acetato de celulose (tricel), liocel, cupro ou misturas destes.

[00181] Em uma modalidade, a presente alimentação compreende ou consiste em milho e farelo de soja.

[00182] Em uma modalidade, a fonte de proteína de origem vegetal compreende ou consiste em soja, cereais, como cevada, trigo, centeio, aveia ou milho.

[00183] Em uma modalidade, a manana contendo produto ou subproduto compreende ou consiste em óleo de palma, refeição de guar ou refeição de copra.

[00184] Em uma modalidade, a presente alimentação animal ou o presente suplemento alimentar é formulado sob a forma de uma composição úmida ou composição seca.

[00185] Em uma modalidade, a composição compreendendo pelo menos uma variante da enzima mananase é usada na indústria de papel e celulose, biobranqueamento, modificação da fibra, melhoria de drenagem e na indústria de petróleo, ou seja, perfuração de poços de petróleo ou indústria de serviços de petróleo para hidrofraturamento ou controlar a viscosidade dos fluidos de perfuração.

[00186] Em uma modalidade, a composição compreendendo pelo menos uma variante de mananase é usada na indústria têxtil e de detergentes, processamento de biomassa e hidrólise de biomassa, de preferência nas indústrias de biocombustível, amido, celulose e papel, alimentos, panificação, fluxo de alimentação ou bebidas.

[00187] Em uma modalidade, a variante da hidrólise de mananase endo-beta-1,4-manosídica faz ligação aleatoriamente.

[00188] Em uma modalidade, a variante de mananase, ou a sequência de nucleotídeos codificando a mananase correspondente do tipo selvagem, é obtida ou derivada de uma fonte bacteriana.

[00189] Em uma modalidade, a variante de mananase é fundida com pelo menos mais um polipeptídeo, formando assim um polipeptídeo de fusão. O polipeptídeo de fusão ou polipeptídeo adicional pode ter outras atividades catalíticas e de ligação, além daquelas da mananase. Em uma modalidade, o polipeptídeo adicional compreende ou consiste em módulo de ligação de carboidratos, que é opcionalmente um fragmento de outra proteína ou enzima derivada do mesmo ou diferente organismo como a mananase.

[00190] Em uma modalidade, a variante de mananase é conectada ao polipeptídio adicional com um ligante.

[00191] Em uma modalidade, é fornecido um processo para tratamento da máquina de tecidos cujo processo compreende o tratamento do tecido durante um ciclo de lavagem de um processo de lavagem na máquina com uma solução de lavagem contendo a variante de mananase do primeiro aspecto ou a composição de enzima do segundo aspecto.

[00192] Em uma modalidade, é fornecido um uso da composição de enzima do segundo aspecto ou a variante de mananase do primeiro aspecto, junto com uma enzima selecionada de protease, amilase, celulase, lipase, xilanase, mananase, cutinase, esterase, fitase, DNAse, pectinase, enzima pectinolítica, pectato liase, carboidrase, arabinase, galactanase, xantanase, xiloglucanase, lacase, peroxidase e oxidase, com ou sem um mediador em uma composição de limpeza para limpeza de tecido e/ou remoção de manchas de tecido.

[00193] Em uma modalidade, é fornecido um uso da variante de mananase do primeiro aspecto, ou a composição de enzima do segundo aspecto, junto com uma enzima selecionada de protease, amilase, celulase, lipase, xilanase, mananase, cutinase, esterase, fitase, DNAse, pectinase, enzima pectinolítica, pectato liase, carboidrase, arabinase, galactanase, xantanase, xiloglucanase, lacase, peroxidase e oxidase, com ou sem um mediador em uma composição de limpeza para a limpeza de superfícies duras, como pisos, paredes, azulejos e similares.

[00194] Em uma modalidade, é fornecido um uso da variante de mananase do primeiro aspecto, ou a composição de enzima do segundo aspecto, junto com uma enzima selecionada de protease, amilase, celulase, lipase, xilanase, mananase, cutinase, esterase, fitase, DNAse, pectinase, enzima pectinolítica, pectato liase, carboidrase, arabinase, galactanase, xantanase, xiloglucanase, lacase, peroxidase e oxidase, com ou sem um mediador em uma composição de limpeza para lavagem de louças à máquina e à mão.

EXEMPLOS

[00195] Os exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar vários aspectos da presente invenção. Eles não são destinados a limitar a invenção, que é definida pelas reivindicações em anexo. Exemplo 1. Design da variante

[00196] Para melhorar a estabilidade e a atividade específica da mananase Man7 do tipo selvagem, conjuntos de variantes foram projetados com base em análise estrutural da enzima do tipo selvagem. O modelo estrutural da Mn7 foi criado usando o software Bioluminate (Schrödinger LCC) com coordenadas de Bacillus sp. Endo-Beta-D-1,4- mananase (1WKY). O design incluiu duas ou mais mutações específicas por variante. A Tabela 1 mostra a lista de variantes. A numeração dos aminoácidos corresponde à numeração dos aminoácidos da SEQ ID NO: 2 (Man7), sequência de aminoácidos de comprimento total contendo uma sequência sinal. Tabela 1. Lista de variantes Man7 Variante: Mutações TBH1: M123I, S229A, G272Q, T285A TBH2: A158S, S229A, T285A, T307R TBH3: S229A, T285A, L316K TBH4: M123I, A158S, S229A, G272Q, T285A, T307R TBH5: M123I, S229A, G272Q, T285A, L316K TBH6: A158S, S229A, T285A, T307R, L316K TBH7: F180L, S229A, T285A, L316K TBH8: S229A, T285A TBH9: S229A, T285A, N300Q, N340Q, S400A, N419A, S433A, N446Q TBH10: A158S, S229A, T307R, L316K TBH11: A158S, T285A, T307R, L316K TBH17: A158S, N283S, T307R, L316K

Exemplo 2. Clonagem de Genes Sintéticos da Variante de Mananase

[00197] Métodos de biologia molecular padrão foram usados nos tratamentos de isolamento e de enzimas de DNA (por exemplo, isolamento de DNA plasmidial, digestão de DNA para produzir fragmentos de DNA), transformações em E. coli, sequenciamento etc. Os métodos básicos usados foram descritos pela enzima, pelo reagente ou kit do fabricante.

[00198] As Variantes tbh1 - tbh11 foram encomendadas junto à GenScript como construções sintéticas sem suas próprias sequências de codificação do peptídeo sinal e com otimização do códon para Trichoderma reesei. Plasmídios de DNAs obtidos a partir de GenScript, incluindo os genes tbh1 - tbh11, foram ressuspensos em água estéril, digeridos com enzimas de restrição NruI e BamHI (Thermo Fisher Scientific) de acordo com as instruções do fabricante e clonados em um vetor de expressão clivado com NruI e BamHI. Misturas de ligação foram transformadas em células de Escherichia coli XL1-azul ou XL10- dourada (AH Diagnostics) e plaqueadas em placas LB (Luria-Bertani) contendo 50-100 µg/ml de ampicilina. Várias colônias de E. coli foram coletadas das placas e o DNA foi isolado com GenJet plasmídeo Miniprep Kit (Thermo Fisher Scientific). Os clones positivos foram triados usando digestões de restrição e foram mostrados para conter inserções do tamanho esperado. Os sítios de fusão para o plasmídeo de expressão dos genes de mananase tbh1- tbh11 foram sequenciados e os plasmídeos foram nomeados pALK4415 pALK4423, pALK4430 e pALK4431, respectivamente (para detalhes vide Exemplo 4). Os DNAs plasmidiais incluindo os genes tbh entregues por GenScript também foram transformados em células de E. coli XL10-dourada (Agilent) e depositados na coleção de cepa DSMZ. As informações pertinentes sobre os genes e as sequências de aminoácidos deduzidas (SEQ ID

NOs: 5 a 26) são resumidas na Tabela 2 e na Tabela 3, respectivamente.

As cepas de E. coli RF12379 - RF12387, RF12456 e RF12457 incluindo os plasmídeos pALK4434 - pALK4442, pALK4432 e pALK4433, respectivamente, foram depositadas para a coleção DSMZ sob os números de adesão DSM 32425, DSM 32426, DSM 32427, DSM 32428, DSM 32429, DSM 32430, DSM 32431, DSM 32432, DSM32433, DSM 32518 e DSM 32519, respectivamente.

Tabela 2. Sumário sobre a Variante Mananase que codifica Genes Sintéticos tbh1 - tbh11 Gene Comprimento (bp)(a) SEQ ID NO tbh1 1395 5 tbh2 1395 7 tbh3 1395 9 tbh4 1395 11 tbh5 1395 13 tbh6 1395 15 tbh7 1395 17 tbh8 1395 19 tbh9 1395 21 tbh10 1395 23 tbh11 1395 25 (a o códon de parada está incluído Tabela 3. O Sumário das Sequências de Aminoácidos Deduzidos da Variante Mananase que codifica as Sequências de Genes.

Proteí- Nº de Compri CBM Núcleo Previsto pI SEQ na Man aas (b mento (aa-aa) (Da), ss previsto, ID NO de ss (a não ss não incluído (b incluído (b TBH1 464 26 Sim 27-331 50886 4,62 6 TBH2 464 26 Sim 27-331 50904 4,67 8 TBH3 464 26 Sim 27-331 50848 4,67 10 TBH4 464 26 Sim 27-331 50957 4,67 12 TBH5 464 26 Sim 27-331 50901 4,67 14 TBH6 464 26 Sim 27-331 50919 4,72 16 TBH7 464 26 Sim 27-331 50814 4,67 18

TBH8 464 26 Sim 27-331 50833 4,62 20 TBH9 464 26 Sim 27-331 50800 4,62 22 TBH10 464 26 Sim 27-331 50949 4,72 24 TBH11 464 26 Sim 27-331 50935 4,72 26 (a A previsão sobre a sequência sinal foi feita usando o programa SignalP v3.0, NN/HMM (Nielsen et al., 1997; Nielsen & Krogh, 1998; Bendtsen et al., 2004). (b A sequência sinal prevista não foi incluída. A previsão foi feita usando Clone Manager Professional versão 9 para Windows, Sci-Ed Software. Exemplo 3. Produção de Proteínas Recombinantes de Variante de Mananase em Trichoderma reesei

[00199] Os plasmídeos de expressão foram construídos para produção de proteínas recombinantes de mananase TBH1 - TBH11 (SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 e 26) em Trichoderma reesei. Os plasmídeos de expressão construídos são listados na Tabela

4. Os genes recombinantes da mananase sem suas próprias sequências sinais foram fundidos para o promotor de T. reesei cel7A/cbh1 com o veículo CBM de T. reesei cel6A/cbh2 e ligante seguido pelo sítio de reconhecimento da protease Kex2. A terminação da transcrição foi assegurada pelo terminador T. reesei cel7A/cbh1 e o gene marcador A. nidulans amdS foi usado para a seleção dos transformantes como descrito em Paloheimo et al. (2003). Os cassetes de expressão linear (Fig. 1) foram isolados de cadeias principais de vetor após digestões de NotI e foram transformadas em protoplastos de T. reesei. As cepas hospedeiras usadas não produzem qualquer das quatro celulases principais de T. reesei (CBHI, CBHII, EGI, EGII). As transformações foram realizadas como em Penttilä et al. (1987) com as modificações descritas em Karhunen et al. (1993), selecionando acetamidase como única fonte de nitrogênio (gene marcador amdS). Os transformantes foram purificados em placas de seleção através de conídios únicos antes de esporulá-los no PD. Tabela 4. Cassetes de Expressão construídos para produzir TBH1 - TBH11 (SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 e 26),

Proteínas Recombinantes em Trichoderma reesei. A estrutura geral dos cassetes de expressão foi como descrita na Fig. 1. Proteína mananase Plasmídeo de Cassete de Expressão Expressão (a TBH1 pALK4415 7,5 kb NotI TBH2 pALK4416 7,5 kb NotI TBH3 pALK4417 7,5 kb NotI TBH4 pALK4418 7,5 kb NotI TBH5 pALK4419 7,5 kb NotI TBH6 pALK4420 7,5 kb NotI TBH7 pALK4421 7,5 kb NotI TBH8 pALK4422 7,5 kb NotI TBH9 pALK4423 7,5 kb NotI TBH10 pALK4430 7,5 kb NotI TBH11 pALK4431 7,5 kb NotI (a O cassete de expressão para transformação de T. reesei foi isolado da cadeia principal de vetor usando as digestões NotI.

[00200] A produção de mananase dos transformantes foi analisada a partir dos sobrenadantes de cultura dos cultivos do frasco de agitação. Os transformantes foram inoculados a partir das inclinações PD para os frascos de agitação contendo 50 ml de complexo de celulase baseado em lactose induzindo o meio (Joutsjoki et al. 1993) tamponado com 5% KH2PO4. A produção da proteína mananase dos transformantes foi analisada a partir de sobrenadantes de cultura depois de crescê-los por 7 dias a 30°C, 250 rpm. Produção heteróloga de proteínas recombinantes foi analisada por SDS-PAGE, com subsequente coloração de Coomassie. Os sobrenadantes foram recuperados também para testes de aplicação por centrifugação. Exemplo 4. Ensaio de Atividade de galactomannanase pelo Método

DNS

[00201] A atividade da mananase (MNU) foi medida como a liberação de açúcares redutores a partir de galactomanano (0,3% p/p) a 50°C e pH 7,0 em 5 min. A quantidade de carboidratos de redução liberados foi determinada espectrofotometricamente usando ácido dinitrosalicílico.

[00202] O substrato (0,3% p/p-%) usado no ensaio foi preparado como se segue: 0,6 g de goma de alfarrobeira (Sigma G-0753) estava em 50 mM de tampão de citrato de sódio pH 7 (ou tampão de citrato de fosfato pH 7) a cerca de 80 °C por meio de um agitador magnético aquecedor e aquecido até o ponto de fervura. A solução foi resfriada e deixada dissolver durante a noite em uma sala fria (2 - 8 °C) com agitação contínua e os resíduos insolúveis foram removidos por centrifugação. Depois disso a solução foi preenchida com até 200 ml de tampão. O substrato foi armazenado como congelado e derretido por aquecimento em banho de água fervente por cerca de 80 °C, arrefecido à temperatura ambiente e misturado cuidadosamente antes de usar.

[00203] O reagente DNS usado no ensaio foi preparado pela dissolução de 50 g de ácido 3,5-dinitrosalisílico (Sigma D-550) em cerca de 4 litro de água. Com agitação magnética contínua 80,0 g de NaOH foram gradualmente adicionados e deixados para dissolver. Uma quantidade de 1500 g de sal Rochelle (K-Na-tartrato, Merck 8087) foi adicionada em pequenas porções com agitação contínua. A solução que foi cautelosamente aquecida a uma temperatura máxima de 45 °C, foi resfriada à temperatura ambiente e enchida até 5000 ml. Depois disso, ela foi filtrada através de papel de filtro Whatman 1 e armazenada em um frasco escuro à temperatura ambiente.

[00204] A reação foi primeiro iniciada pela adição de 1,8 ml de solução de substrato para cada um dos dois tubos de ensaio e deixada para equilibrar a 50°C durante 5 minutos, após os quais 200 μl da solução enzimática devidamente diluída foram adicionados a um dos tubos, bem misturados com misturador de vórtex e incubados exatamente por 5 min a 50°C. Brancos de enzima não precisaram ser equilibrados ou incubados. A reação foi interrompida pela adição de 3,0 ml de reagente DNS em ambos os tubos e misturada. 200 μl de solução de amostra foram adicionados aos tubos de branco de enzima. Ambos os tubos foram colocados em um banho de água em ebulição. Após a ebulição durante exatamente 5 minutos, os tubos foram colocados em um banho de água de refrigeração e deixados arrefecer à temperatura ambiente. A absorvância da amostra foi medida contra o branco da enzima a 540 nm e a atividade foi lida a partir da curva de calibração e multiplicada pelo fator de diluição. Uma amostra diluída adequada rendeu uma diferença de absorvância de 0,15 a 0,4.

[00205] A curva padrão foi preparada 20 mM de solução de estoque de manose por dissolução de 360 mg de manose (SigmaM-6020, armazenada em um dessecador) em tampão de ensaio e diluída para soluções contendo 3, 6, 10 e 14 μmol/ml de manose. Padrões foram tratados como as amostras, exceto para incubação a 50°C. As absorvâncias foram medidas contra o branco do reagente (contendo tampão em vez de diluição padrão de manose) a 540 nm. A curva de calibração foi construída para cada série de ensaios.

[00206] Uma unidade de mananase (MNU) foi definida como a quantidade de enzima que produz carboidratos redutores tendo um poder redutor correspondente a 1 nmol de manose a partir de galactomanano em um segundo sob as condições do ensaio (1 MNU = 1nkat). Exemplo 5. Atividades Específicas das Variantes de mananase Purificadas

[00207] Células e sólidos foram removidos do meio de cultura de fermentação por centrifugação por 10 min, a 4000 g a 4°C. O sobrenadante de 10 ml foi usado para a purificação de proteínas. A amostra foi filtrada através de membrana de PVDF de 0,44 µm (Millex- HV, Merck Millipore Ltd, Carrigtwohill, IRL). O filtrado foi carregado em uma coluna de dessalinização HiPrep 26/10 (GE Healthcare, Uppsala, Suécia) equilibrada em 20 mM HEPES, pH 7. A amostra dessalinizada foi, em seguida, carregada em uma coluna de 5 ml HiTrap Q HP (GE Healthcare, Uppsala, Suécia) pré-equilibrada com 20 mM HEPES pH 7. Após o carregamento da amostra, a coluna foi lavada com o mesmo tampão para 20 ml. As proteínas foram eluídas com gradiente linear de sal 20 mM HEPES, 500 mM de NaCl pH 7 em 15 CVs. Frações de 5 ml foram coletadas e analisadas em SDS-PAGE. As frações contendo proteína-alvo foram combinadas e concentradas a 2 ml usando dispositivos de ultrafiltração Vivaspin 20, 10 kDa MWCO (GE Healthcare). A amostra concentrada foi ainda fracionada usando coluna de filtração de gel Superdex 75 26/60 equilibrada com 20 mM MES, 200 mM NaCl pH 6,5. Frações de 2 ml foram coletadas e analisadas em SDS-PAGE. Frações contendo mananase puras foram combinadas.

[00208] As amostras purificadas foram acima de 95% de pureza.

[00209] O teor de enzima da amostra purificada foi determinado usando as medições de absorvância UV 280 nm. Coeficientes de excitação para cada mananase foram calculados nas bases da sequência de aminoácidos da enzima usando ExPASy (servidor http://web.expasy.org/protparam/). (Gasteiger et al. 2005).

[00210] A atividade enzimática (MNU) de amostras purificadas foi medida como liberação de açúcares redutores como descrito no Exemplo 4.

[00211] A atividade específica (MNU/mg) de mananases foi calculada pela divisão da atividade MNU da amostra purificada com a quantidade de enzima purificada. Atividade específica relativa (%) foi calculada pela divisão da atividade específica da variante mananase por atividade específica da mananase do tipo selvagem Man7.

[00212] De acordo com o modelo 3D do sítio de glicosilação potencial de Man7 do tipo selvagem, a asparagina 283 localiza-se perto do centro catalítico da enzima. Glicosilação da asparagina 283 pode levar à diminuição da atividade catalítica da enzima. Para melhorar a atividade específica de mananase, a treonina 285 foi mutada para alanina. Esta mutação evita a N-glicosilação da asparagina 283.

[00213] Os resultados indicaram que a atividade específica da enzima do tipo selvagem produzida em Trichoderma foi aumentada mais de 10 vezes quando T285 foi mutado para alanina (TBH5, TBH6, TBH9 e TBH11) (Fig. 2). Os mesmos resultados foram recebidos pela mudança N283S (TBH17) (Fig.2). Por outro lado, a atividade específica da variante TBH10, na qual sítios de glicosilação diferente de N283 foram eliminados, não foi melhorada (Fig. 2).

[00214] Os resultados indicaram claramente que a mutação que impede a glicosilação de N283 melhora a atividade específica da variante mananase, enquanto eliminando outros sítios de glicosilação não apresenta efeitos significativos na atividade específica. Produção de rendimento (medido como atividade de mananase) foi maior com TBH5, TBH6, TBH9 e TBH11 (dados não mostrados) em relação à Man7 do tipo selvagem.

[00215] Variantes mananase com maior atividade específica resultam para a diminuição de custos de produção e, portanto, são comercialmente mais viáveis. Exemplo 6. Desempenho da remoção de manchas de Variantes de mananase produzidas em Trichoderma com Detergentes Comerciais

[00216] Sobrenadantes de cultura de variantes TBH1 -TBH11 produzidas em Trichoderma (como descrito no Exemplo 3) foram testados para a sua capacidade de remover manchas padrão sensíveis à mananase a 40°C e dureza da água de 16°dH com detergentes comerciais e comparado à enzima Man7 do tipo selvagem. Os seguintes panos de testes artificialmente sujos do Centro para materiais de teste B.V. (Países Baixos) foram usados: pudim de chocolate mananase sensível em algodão (E-165), goma de alfarroba com pigmento em algodão (C-S-73) e goma guar com carbono preto em algodão (C-S-43). O tecido foi cortado em amostras 6 cm x 6 cm e 2 peças de cada foram usadas no teste.

[00217] Detergente líquido para tarefas pesadas comerciais A contendo todas as outras enzimas exceto mananase foi usado na concentração de 4,4 g por litro de licor de lavagem, detergente em pó de cor comercial sem enzimas foi usado em 3,8 g/l e detergente alvejante em pó comercial sem enzimas foi usado em 4,2 g/l. Detergente contendo licores de lavagem foi preparado em água sintética com dureza de 16°dH. Protease Savinase® 16 L (0,5% p/p) e amilase Stainzyme® 12 L (0,4% p/p) foram adicionadas em água dura usada com detergentes de cor e alvejantes comerciais em pó, o detergente líquido já continha amilase e protease. pH do licor de lavagem de detergente líquido foi de aproximadamente 8,3, com detergente em pó de cor de aproximadamente 10 e com o detergente alvejante aproximadamente 9,5.

[00218] As mananases foram dosadas como 0,025 e/ou 0,05 atividade MNU por ml de licor de lavagem. A atividade foi medida como descrito no Exemplo 4. Amostra controle continha a solução de detergente, mas não mananase.

[00219] Para água de torneira sintética com dureza de 16 °dH as seguintes soluções de estoque foram preparadas em água desionizada (Milli-Q ou equivalente):

[00220] Solução de estoque com 1000 °d dureza de cálcio: CaCl2 x 2 H2O (1.02382.1000, Merck KGaA, Alemanha) 26,22 g/l

[00221] Solução de estoque com 200 °d dureza de magnésio: MgSO4 x 7 H2O (1.05886.1000, Merck KGaA, Alemanha) 8,79 g/l H2O

[00222] Solução de estoque de NaHCO3: NaHCO3 (1.06329.1000, Merck KGaA, Alemanha) 29,6 g/l

[00223] 13,3 ml de solução de CaCl2, 13,3 ml de solução de MgSO4 e 10,0 ml de solução de NaHCO3 fresco foram adicionadas no balão volumétrico em determinada ordem, até 1 litro com água desionizada e misturada. A dureza da água foi determinada por titulação complexométrica e encontrada correta.

[00224] Foram realizados tratamentos de remoção de manchas em Atlas LP-2 Launder-Ometer como se segue. Launder-Ometer foi primeiro aquecido a 40°C. Então detergente, 250 ml de água de torneira sintética com dureza de 16 °dH e enzima diluída (<1,0 ml) foram adicionados em recipientes de 1,2 litros. As manchas foram adicionadas e o Launder-Ometer foi executado a 40°C por 60 min, com uma velocidade de rotação de 42 rpm. Depois disso, as amostras foram cuidadosamente lavadas em água corrente e secadas em ar interior durante a noite, em uma grade protegida da luz solar.

[00225] O efeito de remoção de manchas foi avaliado pela medição da cor como valores de reflectância com espectrofotômetro Konica Minolta CM-3610A usando coordenadas de espaço de cor L*a*b* (iluminante D65/10°, corte de 420 nm). Desbotamento das manchas, indicou que o desempenho de mananase (eficiência de remoção de manchas) foi calculado como o ΔL* (delta L*), o que significa valor de luminosidade L* da enzima tratou o tecido menos o valor de luminosidade L* do tecido tratado com licor de lavagem sem mananase (controle). Resultados finais (efeito de remoção de manchas total) foram mostrados como soma de ΔL* de cada mancha. Os valores de cor de cada mancha foram à média de 2 amostras.

[00226] Os resultados obtidos com detergente líquido comercial são mostrados nas Figs 3 A e B, os resultados com detergente em pó de cor comercial nas Figs 4 A e B, e os resultados com detergente alvejante comercial na Fig 5. Todas as variantes (TBH1-TBH11) apresentaram excelente desempenho de remoção de manchas com detergentes comerciais de diferentes tipos. Desempenho das variantes foi semelhante ao tipo selvagem. Exemplo 7. Estudo de eficiência com mananase sozinha ou em combinação com uma enzima degradante de polissacarídeo não amido (NSP) em frangos de corte

[00227] Os efeitos das variantes de mananase recombinante da invenção são estudados no crescimento em frangos de corte. A ultrafiltração de caldo de fermentação, incluindo uma variante de mananase recombinante, é secada e os níveis-alvo aplicados a uma dieta de frangos peletizados sozinha ou em combinação com um produto à base de xilanase comercial disponível.

[00228] Uma dieta controle à base de milho e farelo de soja extraído com solventes descascado é alimentada sem enzima ou adicionada por diferentes níveis de variantes de mananase recombinantes da invenção sozinha ou em combinação com uma dose padrão de uma xilanase comercial.

[00229] Peso inicial dos frangos é entre 30 g e 50 g. O ensaio dura entre três e cinco semanas. Cada tratamento consiste em um mínimo de seis repetições com 10 frangos cada. Em cada caso, a dieta é analisada para umidade, proteína bruta, fibra bruta, gordura, cinzas e proteína de enzima.

[00230] Cinco dietas são preparadas: 1) controle não suplementado (BD) 2) BD + mananase 1 - 500 mg/kg. 3) BD + mananase 1 - 1000 mg/kg. 4) BD + mananase 1 - 500 mg/kg + xilanase 1 - 10 mg/kg. 5) BD + xilanase 1 - 10 mg/kg.

[00231] O estado de saúde e a mortalidade dos animais são verificados diariamente por inspeção visual. Nos dias 0, 14 e 35, o ganho de peso corporal (BW), o consumo de alimento (FI), e a razão de conversão alimentar (FCR) são medidos. A FCR é calculada como o alimento total consumido dividido pelo ganho de peso durante o mesmo período. Determinação do efeito das variantes de mananase recombinantes é baseada na comparação com os animais alimentados com a mesma dieta ou a mesma dieta, mas adicionada por xilanase. Exemplo 8. Produção de Café Instantâneo

[00232] Manana pura é o principal componente do polissacarídeo de armazenamento dos endospermas de café e é responsável por sua alta viscosidade, o que afeta negativamente o processamento tecnológico de café instantâneo e aumenta o consumo de energia durante a secagem. Esses efeitos são atribuídos à manana, formando estruturas cristalinas insolúveis duras. Β-mananase, muitas vezes junto com outras enzimas, como pectinase e celulase, é adicionada durante a etapa de concentração da produção do café instantâneo para reduzir a viscosidade em extratos de café. Mananase é também empregada para hidrolisar galactomananas presentes em um extrato de café líquido para inibir a formação de gel durante a liofilização de café instantâneo. Além disso, devido ao uso de tratamento enzimático, os extratos de grãos de café podem ser concentrados por um procedimento de baixo custo, como evaporação.

[00233] O teste é realizado de acordo com a seguinte tabela de fluxo da Fig. 6 nas temperaturas de 10°C e uma dosagem de enzima de 0,15% d.s.

[00234] As variantes da mananase da invenção são testadas na mistura composta de diferentes enzimas, como as pectinases e celulases.

[00235] A viscosidade do extrato de café aumenta significativamente ao longo do tempo sob condições de processo padrão. No entanto, a viscosidade é significativamente reduzida usando a mistura de enzima contendo as variantes da mananase da invenção, resultando em um melhor processamento a jusante, como secagem por congelamento ou pulverização. Exemplo 9. Processamento de Abacaxi

[00236] Em especial, a mananase é útil para extração e clarificação de suco espremido de abacaxi, pois o abacaxi contém uma grande fração do mananas, incluindo glucomananas e galactomananas.

[00237] Mananase ajuda a melhorar a extração de componentes valiosos de frutas, diminuir a viscosidade de suco de frutas antes de concentração, e aumentar a taxa de filtração e a estabilidade do produto final.

[00238] Os abacaxis são triturados em um moedor de carne e preenchem 500 g de purê em um béquer de 1000 ml. A enzima é aplicada a 21°C, com um tempo de reação de 60 minutos. O purê é então espremido com uma pequena prensa Hafico de acordo com o protocolo da prensa: 0 bar (0 kPa) 2 min - 50 bar (5.000 kPa) 2 min - 100 bar (10.000 kPa) 2 min - 150 bar (15.000 kPa) 2 min - 200 bar (20.000 kPa) 1 min - 300 bar (30.000 kPa) 1 min - 400 bar (40.000 kPa) 1min. O suco obtido é então centrifugado a 4500 rpm por 5 minutos e analisado para turbidez e viscosidade.

[00239] As variantes de mananase da invenção são testadas em misturas de enzimas A, B e C (Tabela 5).

[00240] As enzimas são primeiro diluídas com água da torneira antes de serem adicionadas ao purê de abacaxi. Tabela 5. Misturas de Enzimas 5 ml de Posologia Atividade [% Solução [ppm] Enzimática Enzimática] Branco 5 ml H2O Mistura A Pectinase 50 0,50% Pectinase + Mistura B 50 0,50% Arabanase Pectinase + Mistura C 50 0,50% Mananase

[00241] Aplicação de variantes mananase da invenção leva ao aumento de produtividade e menor turbidez do suco no processamento de abacaxi. Exemplo 10. Tratamento de Mananase de Grãos de Soja para a Produção de Leite de Soja

[00242] Para o tratamento enzimático de grãos de soja para obter leite de soja, o "processo quente" é geralmente usado. Para o processo de leite de soja quente os grãos de soja secos foram misturados e esmagados em um misturador com água de torneira fervente em uma razão de 1:7 (grãos embebidos: água). Toda a pasta aquosa de soja é arrefecida a 50-55°C antes da adição da enzima. O valor do pH para a pasta aquosa de soja deve ser em torno de pH 6,5 e pode ser ajustada com o NaHCO3. A enzima mananase é dosada em 1 kg/t de grãos de soja secos para a pasta aquosa e agitada por 30 min. Após a conclusão do tempo de reação, a pasta aquosa é prensada usando uma prensa de laboratório para obter o produto final: leite de soja. A fim de assegurar o mesmo perfil de prensa, a pressão, bem como o correspondente tempo de pressão, é especificada, conforme mostrado na Tabela 6. Além da amostra para a reação enzimática, uma amostra de controle, sem qualquer enzima, é preparada, na qual a solução enzimática foi substituída por água. Tabela 6. Esquema de Prensa Pressão [bar] (kPa) 0 (0) 50 (5.000) 100 (10.000) 300 (30.000) Tempo (min) 2 2 2 1

[00243] Depois da prensa, o leite de soja é aquecido no micro-ondas até ferver para parar a reação enzimática. Análise do leite de soja: ₒ Rendimento em grama/hora. ₒ Brix, que dá uma correlação direta da quantidade de açúcar no leite de soja, é determinado com um refratômetro. ₒ A turbidez do suco é medida com um fotômetro de NTU, que mede a turbidez nefelométrica.

ₒ O brilho será medido com uma medição LAB. ₒ O teor de proteínas é determinado com um CN-Analyzer (método de combustão). ₒ Flavorizante.

[00244] Leite de soja tratado com variantes de mananase da invenção mostra um aumento de produtividade, cor mais brilhante, maior °Brix, uma menor turbidez, um maior teor de proteína e um melhor sabor (remoção de gostos estranhos).

[00245] Sem limitar o escopo e a interpretação das reivindicações de patente, certos efeitos técnicos de um ou mais dos aspectos ou modalidades reveladas neste documento são listados a seguir: um efeito técnico é a degradação ou a modificação da manana. Outro efeito técnico é o fornecimento de mananase que tem boa estabilidade de armazenamento.

[00246] A descrição acima tem fornecido por meio de exemplos não limitantes de implementações particulares e modalidades da invenção uma completa e informativa descrição do melhor modo atualmente contemplado por inventores para realizar a invenção. No entanto, está claro para um versado na técnica que a invenção não é restrita aos detalhes das modalidades apresentadas acima, mas que pode ser implementada em outras modalidades usando meios equivalentes sem desviar das características da invenção.

[00247] Além disso, alguns dos recursos dos aspectos revelados acima e das modalidades da presente invenção podem ser usados como vantagem sem o uso correspondente de outros recursos. Como tal, a descrição precedente deve ser considerada como meramente ilustrativa dos princípios da presente invenção, e não de limitação desta. Por isso, o escopo da invenção é apenas restrito pelas reivindicações em anexo.

[00248] Em uma modalidade, pelo menos um componente das composições da invenção tem uma característica diferente química, estrutural ou física em comparação com o correspondente componente natural a partir do qual pelo menos um componente é derivado. Em uma modalidade, a dita característica é, pelo menos, uma de tamanho uniforme, dispersão homogênea, isoforma diferente, diferente degenerescência de códon, diferentes modificações pós-traducionais, diferente metilação, diferentes estruturas terciárias ou quaternárias, diferente atividade da enzima, diferente afinidade, diferente atividade de ligação e diferente imunogenicidade. Referências

[00249] Bendtsen JD, Nielsen H, von Heijne G e Brunak S. (2004) Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. J. Mol.Biol. 340:783-

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[00250] Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.; Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server; (In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). pp. 571-607.

[00251] Joutsjoki VV, Torkkeli TK, and Nevalainen KMH. (1993) Transformation of Trichoderma reesei with the Hormoconis resinae glucoamylase P (gamP) gene: production of a heterologous glucoamylase by Trichoderma reesei. Curr. Genet. 24: 223-228.

[00252] Karhunen T, Mäntylä M, Nevalainen KMH e Suominen PL. (1993) High frequency one-step gene replacement in Trichoderma reesei. I. Endoglucanase I overproduction. Mol. Gen. Genet. 241: 515-

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Claims (18)

REIVINDICAÇÕES

1. Variante de mananase tendo atividade de mananase e um aminoácido não glicosilado na posição 283, caracterizada pelo fato de que a variante é selecionada do grupo que consiste em 1) um polipeptídeo tendo, pelo menos, 85% de identidade de sequência para os resíduos 27-331 da SEQ ID NO: 2; 2) um polipeptídio codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza sob condições de alta estringência com a) nucleotídeos 79-993 da SEQ ID NO: 1 (man7) b) o complemento de comprimento total de a); e 3) uma variante codificada por um polinucleotídeo tendo pelo menos 95% de identidade de sequência para a SEQ ID NO: 1 ou a sequência de DNA genômico da mesma; e em que a numeração dos aminoácidos corresponde à numeração dos aminoácidos da SEQ ID NO: 2 (Man7), sequência de aminoácidos de comprimento total contendo uma sequência sinal.

2. Variante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que pelo menos posição N283, T285 ou S285; de preferência T285 ou S285; com a máxima preferência T285; é substituída por um resíduo que previne a glicosilação N-ligada do resíduo 283 quando expressado em uma célula hospedeira capaz de glicosilação N-ligada.

3. Variante, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a posição T285 ou S285 é substituída por um resíduo diferente de T ou S.

4. Composição de enzima, caracterizada pelo fato de que compreende a variante da mananase, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e a. pelo menos um conservante, por exemplo, selecionado do grupo consistindo em ácido orgânico, ácido cítrico, ácido ascórbico,

ácido benzoico e seus sais e seus derivados, benzoato de sódio, benzoato, hidroxibenzoato e derivados, ácido sórbico, sorbato de sódio, sorbato, sais, como o cloreto de sódio ou cloreto de potássio, 1,2- benzisotiazolin-3-ona (BIT), ou uma combinação dos mesmos; b. opcionalmente, pelo menos um estabilizador selecionado de poliol, propilenoglicol, polietilenoglicol, hexileno glicol, glicerol, um açúcar, álcool de açúcar, polissacarídeo, ácido láctico, ácido bórico, derivado de ácido bórico, éster de borato aromático, ácido 4-formilfenil borônico, derivado do ácido fenil-borônico, peptídeo, tensoativo, ou uma combinação dos mesmos; c. opcionalmente pelo menos uma enzima selecionada de proteases, amilases, celulases, lipases, xilanases, mananases, cutinases, esterases, fitases, DNAses, pectinases, enzimas pectinolítica, pectato liase, carboidrases, arabinases, galactanases, xantanases, xiloglucanases, lacases, peroxidases e oxidases, com ou sem um mediador, ou uma combinação dos mesmos; e d. opcionalmente, pelo menos, uma carga selecionada de maltodextrina, farinha, cloreto de sódio, sulfato, sulfato de sódio, ou uma combinação destes.

5. Composição de enzima, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de estar sob a forma de uma composição líquida ou uma composição sólida como solução, dispersão, pasta, pó, grânulo, granulado, granulado revestido, comprimido, bolo, cristal, pasta de cristal, gel ou pélete.

6. Composição detergente caracterizada pelo fato de compreender a variante da mananase, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou a composição de enzima, como definida na reivindicação 4 ou 5.

7. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que está sob a forma de um detergente líquido ou detergente sólido, de preferência, sob a forma de uma barra, um tablete de homogeneização, um tablete com duas ou mais camadas, uma bolsa com um ou mais compartimentos, um pó compacto ou regular, um grânulo, um granulado, uma pasta, um gel ou um líquido concentrado, regular ou compacto.

8. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma ou mais enzimas adicionais selecionadas do grupo consistindo em protease, lipase, cutinase, amilase, carboidrase, celulase, pectinase, pectateliase, enzima pectinolítica, esterase, mananase, arabinase, galactanase, xilanase, oxidase, xantanase, xiloglucanase, lacase, DNAse e/ou peroxidase, selecionada de preferência do grupo consistindo em proteases, amilases, celulases e lipases.

9. Célula hospedeira recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende elementos genéticos que permitem produzir pelo menos um polipeptídeo recombinante compreendendo a variante de mananase como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

10. Célula hospedeira recombinante, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é selecionada do grupo que consiste em: células fúngicas, células fúngicas filamentosas da divisão Ascomycota, Subdivisão Pezizomycotina; de preferência do grupo consistindo em membros da classe Sordariomycetes, subclasse Hypocreomycetidaede, ordens Hypocreales e Microascales e Aspergillus, Chrysosporium, Myceliophthora e Humicola; mais de preferência do grupo consistindo em famílias Hypocreacea, Nectriaceae, Clavicipitaceae, Microascaceae, e gêneros Trichoderma (anamorfo de Hypocrea), Fusarium, Gibberella, Nectria, Stachybotrys, Claviceps, Metarhizium, Villosiclava, Ophiocordyceps,

Cephalosporium e Scedosporium; com mais preferência do grupo consistindo em Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina), T. citrinoviridae, T. longibrachiatum, T. virens, T. harzianum, T. asperellum, T. atroviridae, T. parareesei, Fusarium oxysporum, F. gramineanum, F. pseudograminearum, F. venenatum, Gibberella fujikuroi, G. moniliformis, G. zeaea, Nectria (Haematonectria) haematococca, Stachybotrys chartarum, S. chlorohalonata, Claviceps purpurea, Metarhizium acridum, M. anisopliae, Villosiclava virens, Ophiocordyceps sinensis, Acremonium (Cephalosporium) chrysogenum, e Scedosporium apiospermum, e Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Chrysosporium lucknowense, Myceliophthora thermophila, Humicola insolens, e Humicola grisea, células bacterianas, de preferência bacilos gram-positivos, como Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. megaterium, B. amyloliquefaciens, B. pumilus, bactérias gram-negativas, como Escherichia coli, actinomycetales, como Streptomyces sp., e leveduras como Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, com a máxima preferência Trichoderma reesei.

11. Célula hospedeira recombinante, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo recombinante é uma proteína de fusão, que compreende pelo menos um dos seguintes: uma sequência de aminoácidos proporcionando uma sequência sinal secretora; uma sequência de aminoácidos que facilita a purificação, como um marcador de afinidade ou marcador His; uma sequência de aminoácidos que aumenta a produção, como uma sequência de aminoácidos, que é um veículo, como CBM;

uma sequência de aminoácidos tendo uma atividade enzimática; e uma sequência de aminoácidos proporcionando a proteína de fusão com afinidade de ligação, como uma porção de ligação do carboidrato.

12. Método para a produção de um polipeptídeo recombinante tendo atividade de mananase, caracterizado pelo fato de que compreende: a. cultivar uma célula hospedeira recombinante como definida em qualquer uma das reivindicações 9 a 11, em que os elementos genéticos compreendem, pelo menos, uma sequência de controle que controla a produção do polipeptídeo recombinante na célula hospedeira recombinante; os elementos genéticos opcionalmente compreendem, pelo menos, uma sequência codificando uma sequência sinal para transportar o polipeptídeo recombinante fora da célula hospedeira; e o cultivo é realizado em condições que permitam a produção do polipeptídeo recombinante; e b. recuperação do polipeptídeo recombinante.

13. Método para degradar ou modificar a manana contendo material, caracterizado pelo fato de que compreende tratar a dita manana contendo material com uma quantidade eficaz da composição de enzima, como definida na reivindicação 4 ou 5, ou a variante, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a manana contendo o material é selecionada a partir do material vegetal, têxtil, água residual, esgoto, óleo ou uma combinação destes.

15. Alimentação animal, caracterizada pelo fato de que compreende a composição de enzima, como definida em na reivindicação 4 ou 5, ou a variante de mananase, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, e pelo menos uma fonte de proteína de origem vegetal ou uma manana contendo um produto ou subproduto, e a. opcionalmente, pelo menos, uma enzima selecionada de protease, amilase, fitase, xilanase, endoglucanase, beta-glucanase, ou uma combinação dos mesmos; e b. opcionalmente, pelo menos, uma carga selecionada de maltodextrina, farinha, sal, cloreto de sódio, sulfato, sulfato de sódio, ou uma combinação destes.

16.Suplemento alimentar contendo a composição de enzima, como definida em na reivindicação 4 ou 5, ou a variante de mananase como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3; e a. opcionalmente, pelo menos, uma enzima selecionada de protease, amilase, fitase, xilanase, endoglucanase, beta-glucanase, ou uma combinação dos mesmos; e b. opcionalmente, pelo menos, uma carga selecionada de maltodextrina, farinha, sal, cloreto de sódio, sulfato, sulfato de sódio ou uma combinação destes.

17. Uso da variante, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou a composição de enzima, como definida na reivindicação 4 ou 5, na perfuração de poços de petróleo ou hidrofraturamento.

18. Uso da variante como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou a composição de enzima, como definida na reivindicação 4 ou 5, no processamento de extrato de café, suco de frutas, suco de abacaxi ou leite de soja.