KR20230115115A - 만난아제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드 - Google Patents

만난아제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드 Download PDF

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Abstract

본 출원은 만난아제(mannanase)의 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

만난아제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드 {Modified polypeptide having mannanase activity}
본 출원은 만난아제(mannanase)의 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드 및 이의 용도에 관한 것이다.
만난(mannan) 폴리머는 헤미셀룰로오스(hemicellullose)를 이루는 주요 구성물질이며, 구성하는 당 사이에 β-1,4 결합이 직쇄골격을 이루는데, 당 성분에 따라 β-만난(β-mannan), 글루코만난(glucomannan), 갈락토만난(galactomannan)과 갈락토글루코만난(galactoglucomannan)으로 구분된다. β-만난은 상아야자(ivory nut)를 포함한 비-콩과 식물에 존재하는 것으로, β-1,4-연쇄 만노스(beta-1,4-linked mannose)로 이뤄진 골격을 갖는 비치환 선형 폴리머다. 글루코만난은 곤약(konjac)에 존재하는 것으로, β-1,4-연쇄 만노스 및 글루코스가 규칙적으로 교대하는 구조의 골격을 갖는 폴리머다. 갈락토만난과 갈락토글루코만난은 각각 만노스 잔기의　O-6에 결합된 α-갈락토스를 갖는 β-만난 및 글루코만난이다. 갈락토만난은 콩과 식물의 씨앗 내에 대량으로 존재하고, 아세틸화된 갈락토글루코만난은 연질목의 주요 구성성분이다.
β-D-만난아제(Mannan endo-1,4-beta-mannosidase; EC 3.2.1.78)는 갈락토만난(galactomannan), 글루코만난(glucomannan), 갈락토글루코만난(galactoglucomannan), 그리고 만난(mannan)으로 구성된 1,4-β-D-만난을 무작위로 분해하는 특성을 가지는 엔도(endo) 타입의 가수분해 효소이다. 만난은 항영양인자로 알려진 콩, 구아, 알팔파, 파암 핵박, 코프라 등 다양한 식물성 재료의 구성성분이며 이들의 소화 흡수를 활성화 하기 위해 만난의 분해는 필수적이다. 따라서, 다양한 만난아제들이 사료용 효소로써 사용되었다.
동물이 사료 섭취 후 영양분을 흡수하기 위해 중성 pH인 장내에서 다양한 효소들로 이를 분해한다. 하지만 만난아제는 중성 pH에서 상대적으로 낮은 활성으로 인해 사료용 효소 적용에 있어 한계가 있다. 따라서, 장내 pH 조건에서의 활성이 개선된 만난아제에 대한 연구의 필요성이 대두되고 있다.
KR 10-2016-0045465 A
본 출원의 하나의 목적은 만난아제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드를 제공하는 것이다.
하나의 구체예로서, 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 3 내지 6 중 어느 하나의 서열번호로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 변이형 폴리펩티드이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 본 출원의 변이형 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 본 출원의 변이형 폴리펩티드를 포함하는 만난-함유 물질과의 반응용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 만난-함유 물질과의 반응을 위한, 상기 변이형 폴리펩티드 및/또는 상기 변이형 폴리펩티드를 포함하는 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 상기 변이형 폴리펩티드, 상기 변이형 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포, 및/또는 상기 변이형 폴리펩티드를 포함하는 조성물과 만난을 접촉시키는 것을 포함하는, 만노스, 만노비오스, 만노트리오스 또는 긴 사슬의 만노올리고당을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 상기 변이형 폴리펩티드, 상기 변이형 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포, 및/또는 상기 변이형 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 만난-함유 물질에 처리시키는 것을 포함하는, 만난-함유 물질을 분해하는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조체를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 핵산 구조체를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 상기 변이형 폴리펩티드, 상기 폴리뉴클레오티드, 상기 핵산 구조체, 및/또는 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 양태는 상기 숙주세포를 배양하는 단계; 및 상기 배양단계에서 발현되는 상기 변이형 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 변이형 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.
본 출원의 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형 관사("a", "an", 및 "the")에는 문맥상 명백하게 다르게 언급되지 않는 한 복수의 참조대상이 포함된다. 문맥상 달리 언급되지 않는 한, 단수형 용어는 복수형을 포함하고 복수형 용어는 단수형을 포함한다. 본 출원의 명세서 및 첨부된 청구범위에서, 달리 언급되지 않는 한, "또는"의 사용은 "및/또는"을 포함하는 의미로 사용될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "약(about)"은 특정 숫자 값 앞에 제시될 수 있다. 본 출원에서 사용되는 용어 "약"은 용어 뒤에 기재되는 정확한 숫자뿐만 아니라, 거의 그 숫자이거나 그 숫자에 가까운 범위까지 포함한다. 그 숫자가 제시된 문맥을 고려하여, 언급된 구체적인 숫자와 가깝거나 거의 그 숫자인지 여부를 결정할 수 있다. 일 예로, 용어 "약"은 숫자 값의 -10% 내지 +10% 범위를 지칭할 수 있다. 다른 예로, 용어 "약"은 주어진 숫자 값의 -5% 내지 +5% 범위를 지칭할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서, 용어 "제1, 제2, 제3,," "i), ii), iii),," 또는 "(a), (b), (c), (d),,"와 같은 기재는 유사한 구성을 구별하기 위해 사용되었으며, 이들 용어는 연속적이거나 순서대로 수행되는 것을 의미하는 것이 아니다. 예를 들어, 상기 용어가 방법, 용도 또는 분석의 단계(step)와 관련하여 사용되었을 경우, 이들 단계 사이에는 시간적인 간격이 없거나, 동시에 수행되거나, 수 초, 수 분, 수 시간, 수 일, 또는 수 개월 간격을 두고 수행될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "본질적으로 이루어지는(consisting essentially of)"은 본 출원에서 청구하는 대상의 특징이 불특정 성분의 존재에 실질적으로 영향을 받지 않는 경우, 상기 불특정 성분이 존재할 수 있음을 의미한다.
본 출원에서, 용어 "이루어지는(consisting of)"은 특정 성분(들)의 비율이 총 100%인 것을 의미한다. 용어 "이루어지는" 이하에 오는 성분 또는 특징은 필수적이거나 의무적인 것일 수 있다. 일부 구체예에서, "이루어지는" 이하에 오는 성분 또는 특징 외에, 다른 임의의 성분 또는 필수적이지 않은 성분은 배제될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "포함하는(comprising)"은 상기 용어 이하에 기재되는 특징, 단계 또는 구성 요소의 존재를 의미하며, 하나 이상의 특징, 단계 또는 구성 요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. 본 출원에서 "포함하는" 이하에 기재되는 성분 또는 특징은 필수적이거나 의무적인 것일 수 있으나, 일부 구체예에서는 다른 임의의 혹은 필수적이지 않은 성분 또는 특징을 더 포함할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "포함하는" 은, 일부 구체예에서, "본질적으로 이루어지는" 또는 "이루어지는"을 지칭하는 것으로 수정될 수 있다.
본 출원에서 아미노산 서열과 관련하여, 특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 "포함하는" 폴리펩티드, 특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열로 "이루어진" 폴리펩티드, 또는 특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 "갖는" 폴리펩티드 또는 단백질이라고 기재되어 있더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단 그리고/또는 C-말단에 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 출원에서, 용어 "단백질" 또는 "폴리펩티드"는 연속적인 아미노산 잔기의 폴리머 또는 올리고머를 의미한다. 본 출원에서, "폴리펩티드", "단백질", 및 "펩티드"는 "아미노산 서열"과 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
경우에 따라, 활성을 나타내는 아미노산 서열은 "효소"로 지칭할 수 있다. 본 출원에서, 아미노산 서열은 달리 표시되지 않는 한, N-말단 → C-말단 배향으로 기재된다.
세포, 핵산, 폴리펩티드, 또는 벡터와 관련하여, 본 출원에서 용어 "재조합"은 세포, 핵산, 폴리펩티드 또는 벡터가 이종(heterologous) 핵산 또는 폴리펩티드의 도입 또는 천연 핵산 또는 폴리펩티드의 변경에 의해 변형된 것, 또는 세포가 그렇게 변형된 세포로부터 유도되는 것을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 세포의 천연(비-재조합) 형태 내에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 또는 발현되거나 전혀 발현되지 않는, 다르게는 비정상적으로 발현되는 천연 유전자를 발현할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "분리된(isolated)"은 자연적으로 발생하지 않는 환경에 존재하거나 혹은 자연적으로 존재하지 않는 형태의 물질을 지칭한다. 이는 자연에서 자연적으로 회합되어 있고 자연에서 발견되는 것과 같은 물질, 예를 들어 서열, 효소 또는 핵산을 갖는 적어도 하나의 다른 성분으로부터 상기 물질(서열, 효소 또는 핵산)이 적어도 실질적으로 유리되는 것을 포함한다.
예를 들어, 본 출원에서 제공하는 분리된 서열, 효소 또는 핵산은 하나 이상의 오염물질이 실질적으로 없는 형태로 제공될 수 있다.
분리된 물질의 예시는 i) 자연적으로 발생하지 않는(non-naturally occurring) 임의의 물질, ii) 자연 상태에서 결합되어(associated) 있는 하나, 그 이상, 또는 모든 자연적으로 발생하는 구성이 제거된 임의의 물질(예를 들어, 효소, 변이체, 핵산, 단백질, 펩타이드 또는 보조인자(cofactor)), iii) 자연에서 발견되는 물질이 인위적으로 변형된 임의의 물질, 또는 iv) 자연적으로 결합된 다른 구성성분에 비해 그 물질의 양을 변경하도록 변형된 물질(예를 들어, 특정 물질을 코딩하는 유전자 카피수 증가; 특정 물질을 코딩하는 유전자와 자연적으로 연결된 프로모터를 활성이 강한 프로모터로 변형 등)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 출원에서, 용어 "야생형"은 인위적인 변형을 가지지 않는 천연형(naturally-occurring)인 것을 의미한다. 상기 용어 "야생형"이 폴리펩티드와 관련하여 사용되는 경우, 천연형(naturally occurring) 폴리펩티드로, 하나 이상의 아미노산 위치에서 인위적인 변이(치환, 삽입, 결실 등)를 갖지 않는 것을 의미한다. 이와 유사하게, 용어 "야생형"이 폴리뉴클레오티드와 관련하여 사용되는 경우, 하나 이상의 뉴클레오티드의 인위적인 변형(치환, 삽입, 결실)을 갖지 않는 것을 의미한다. 그러나 야생형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 천연형 폴리뉴클레오티드에 제한되지 않으며, 임의의 야생형 폴리펩티드를 코딩하는 서열도 포함한다.
본 출원에서, 모서열(parent sequence) 또는 골격(backbone)이란 변형(modification)을 도입하여 변이형 폴리펩티드가 되는 기준 서열을 의미한다. 즉, 모서열은 시작 서열(starting sequence)로서 치환, 삽입 및/또는 결실 등의 변이를 도입하는 대상일 수 있다. 상기 모서열은 천연형(naturally occurring) 혹은 야생형(wild type)일 수 있고, 또는 상기 천연형 또는 야생형에 하나 이상의 치환, 삽입 또는 결실이 발생한 변이체(variant)이거나, 또는 인위적으로 합성된 서열일 수 있다. 상기 모서열이 활성을 나타내는 아미노산 서열, 즉 효소의 아미노산 서열인 경우 모효소(parent enzyme)로 칭할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "참조 서열(reference sequence)"은 임의의 아미노산 서열 내 아미노산의 위치(position)를 결정하는 데 사용되는 서열을 의미한다. 임의의 아미노산 서열과 참조 서열을 정렬(align)하여, 임의의 아미노산 서열 내에서 참조 서열의 특정 위치에 대응하는 아미노산의 위치를 결정할 수 있다.
본 출원에서 아미노산 또는 핵산 서열과 관련하여, 용어 "단편"은 모서열(parent sequence)의 일부를 의미한다. 예를 들어, 모서열에서 하나 이상의 아미노산이 C 또는 N 말단에서 제거된 형태의 폴리펩티드일 수 있다.
본 출원에서, 효소의 "단편"은 "기능적 단편(functional fragment)"을 지칭하는 것일 수 있다. "기능적 단편"은 활성 단편(active fragment)으로도 지칭될 수 있으며, 모효소의 일부이면서 모효소의 효소활성을 가지는 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들어, 효소의 기능적 단편은 효소의 활성 부위(catalytic site)를 포함하는 것일 수 있다.
효소의 단편은 모효소의 전장(full length)의 일부를 포함할 수 있다. 예를 들어, 모효소의 전장의 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 이상, 100% 미만의 아미노산을 포함할 수 있다.
본 출원에서, "변이/변형시키는(modifying)"은 변화(changing) 또는 변경(altering)시키는 것을 의미한다. 이는 자연적으로 발생하는 것으로부터의 변경일 수 있다. 일 예로, 효소가 모서열 또는 참조 서열로부터 변경되게 하는 방식으로 효소를 변화시킬 수 있다.
본 출원에서, 변형된 효소는 그 자체로 자연에 존재하지 않는, 즉 자연적으로 발생하지 않는(non-naturally occurring) 효소일 수 있다.
본 출원에서 용어, "변형된(modified)"은, 예를 들어 그의 자연적으로 발생하는 형태로부터 변경된 것을 의미한다. 본 출원의 변형된 효소는 자연적으로 발생하지 않는 효소 또는 자연적으로 발생하는 변이체를 포함한다. 일 예로, 본 출원의 변형된 효소는 자연에서 발견되지 않은 변형된 효소이다. 일 예로, 본 출원의 변형된 효소는 자발적으로(spontaneously) 발생되지 않은 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어 "변형(modification)"이 아미노산/핵산 서열과 관련하여 사용되는 경우, 아미노산 서열에서 하나 이상의 부위에서 상이한 아미노산/핵산 잔기에 대한 모서열의 아미노산/핵산 잔기의 치환(substitution), 하나 이상의 부위에서 모서열의 아미노산/핵산 잔기(또는 일련의 아미노산/핵산 잔기)의 결실(deletion), 하나 이상의 부위에서 모서열의 아미노산/핵산 잔기(또는 일련의 아미노산/핵산 잔기)의 삽입(insertion), N-말단 및/또는 C-말단의 아미노산 서열 또는 5' 및/또는 3' 핵산 서열의 절단(truncation), 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 효소의 "변이체(variant)" 또는 "변이형 폴리펩티드(modified polypeptide)"는 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)에 있어서 모효소와 상이한 단백질을 지칭한다. "변이체" 또는 "변이형 폴리펩티드"는 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 상기 변이체 또는 변이형 폴리펩티드는 자연적으로 발생하지 않는(non-naturally occurring)것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 변이체는 하나 이상의 변형, 예를 들어 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입에 의해 모효소의 서열과 상이하다.
이러한 변이체는 일반적으로 상기 모효소에서 하나 이상의 아미노산을 변형하고, 상기 변형된 단백질의 특성을 평가하여 식별될 수 있다. 즉, 변이체의 능력은 모효소에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다.
또한, 일부 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변이형 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
다른 변이체는 성숙 단백질(mature protein)의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다.
용어 "변이체" 또는 "변이형 폴리펩티드"는 변이형, 변형, 변이된 단백질, 변이 등의 용어(영문 표현으로는 modification, modified protein, mutant, mutein, divergent, variant 등)가 혼용되어 사용될 수 있으며, 변이된 의미로 사용되는 용어라면 이에 제한되지 않는다.
변이체는 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 폴리펩티드는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이전(transfer)에 관여하는 단백질 N-말단의 시그널(또는 리더) 서열과 컨쥬게이트 할 수 있다. 또한 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드를 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.
예를 들어, 상기 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이전(transfer)에 관여하는 단백질 N-말단의 시그널(또는 리더) 서열과 컨쥬게이트 된 변이체는, 이에 제한되지는 않으나, 서열번호 7의 폴리펩티드인 것일 수 있다. 또한, 만난아제 활성을 갖는 한, 서열번호 7의 폴리펩티드와 약 60%, 70%, 75%. 80%. 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드일 수 있으며, 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 단백질 N-말단의 시그널(또는 리더) 서열과 컨쥬게이트 된 변이체의 범위에 제한 없이 포함될 수 있다.
또한, 예를 들어, 상기 단백질 N-말단의 시그널(또는 리더) 서열과 컨쥬게이트 된 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 7로 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다. 본 출원의 일 예로, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8의 서열을 가지거나 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8의 서열로 이루어지거나, 필수적으로 구성될 수 있다. 구체적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 8의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있다.
본 출원에서, 용어 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다.
본 출원 명세서 전반에서, 천연적으로 존재하는 아미노산에 대한 통상의 1문자 및 3문자 코드가 사용된다. 또한 본 출원에서 약어로 언급된 아미노산은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 기재되었다.
알라닌 Ala, A 아르기닌 Arg, R
아스파라긴 Asn, N 아스파르트산 Asp, D
시스테인 Cys, C 글루탐산 Glu, E
글루타민 Gln, Q 글리신 Gly, G
히스티딘 His, H 이소류신 Ile, I
류신 Leu, L 라이신 Lys, K
메티오닌 Met, M 페닐알라닌 Phe, F
프롤린 Pro, P 세린 Ser, S
트레오닌 Thr, T 트립토판 Trp, W
티로신 Tyr, Y 발린 Val, V
한편, 임의의 아미노산은 Xaa, X로 기재할 수 있다.
또한, 천연적으로 존재하는 아미노산뿐만 아니라 Aib(2-Aminoisobutyric acid), Sar(N-methylglycine), α-메틸-글루탐산(α-methyl-glutamic acid) 등과 같은 다른 아미노산에 대해 일반적으로 허용되는 3문자 코드가 사용될 수 있다.
아미노산은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 분류할 수 있다. 이에, 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다.
예를 들면, 전하를 띠는 곁사슬(electrically charged amino acid)을 갖는 아미노산 중 양으로 하전된(염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신, 및 히스티딘을, 음으로 하전된(산성) 아미노산은 글루탐산 및 아스파르트산을 포함하고; 전하를 띠지 않는 곁사슬(uncharged amino acid)을 갖는 아미노산 중 비극성 아미노산(nonpolar amino acid)은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 프롤린을 포함하고, 극성(polar) 또는 친수성(hydrophilic) 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하고, 상기 비극성 아미노산 중 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신을 포함한다.
본 출원에서 용어, "유전자(gene)"는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 상기 코딩 영역의 앞뒤의 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 일부 구체예에서, 유전자는 각각의 코딩 영역(엑손; exon) 사이에 삽입되는 서열(인트론; intron)을 가질 수 있다.
본 출원에서 용어, "상동성(homology)" 또는 "동일성(identity)"은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 역시 포함됨이 자명하다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO et al.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.
또한, 임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 츨원에서, 용어 "성숙 폴리펩티드(mature polypeptide)"는 신호 서열(signal sequence) 또는 프로펩타이드 서열(propeptide sequence)이 없는 형태의 폴리펩티드를 의미한다. 성숙 단백질/폴리펩티드/펩티드는, 단백질/폴리펩티드/펩티드의 기능적 형태일 수 있다. 성숙 폴리펩티드는 번역 이후, 또는 번역 후 변형을 거친 최종(final form) 형태일 수 있다. 번역 후 변형의 예시로는 N-또는 C-말단 변형, 글리코실화, 인산화, 리더 서열(leader sequence) 제거 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 출원에서 용어, "핵산 구조체(nucleic acid construct)"는, 하나 이상의 조절 서열(regulatory sequence)을 포함하고, 인위적으로 합성되거나, 자연계에 존재하지 않는 방법으로 특정 서열을 포함하도록 조작되거나, 자연으로부터 분리된 단일 혹은 이중가닥 핵산 분자를 의미한다.
본 출원에서 용어, "발현"은 폴리펩티드의 생성에 관여하는 임의의 단계, 예를 들어 전사, 전사 후 변형, 번역, 번역후 변형, 및 분비 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "발현 벡터"는 코딩 서열 및 이의 발현을 위해 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함하는 선형 혹은 환형 핵산 분자를 의미한다.
본 출원에서 용어, "작동가능하게 연결된"은 조절 서열이 코딩 서열의 발현을 지시하도록 조절 서열이 적절한 위치에 배치되는 구성을 의미한다. 따라서 "작동가능하게 연결된"은, 프로모터, 종결자, 신호 서열 또는 인핸서 영역과 같이 알려진 혹은 원하는 활성을 가진 기능적 도메인의 조절 영역이 타겟(유전자 또는 폴리펩티드)의 발현, 분비 또는 기능을 상기의 알려진 혹은 원하는 활성에 따라 조절할 수 있도록 그 타겟에 부착되거나 연결된 것을 포함한다.
본 출원에서 용어, "cDNA"는 진핵 또는 원핵 세포로부터 얻을 수 있는 성숙된, 스플라이싱된 mRNA 분자로부터 역전사를 통해 제조될 수 있는 DNA 서열을 의미한다. cDNA 서열은 상응하는 게놈 DNA에 존재할 수 있는 인트론 서열을 포함하지 않는다. 초기 1차 RNA 전사체는 스플라이싱을 포함한 일련의 단계를 통해 처리되어 성숙된 스플라이싱된 mRNA로 나타나기 전 mRNA의 전구체이다.
본 출원에서 용어, "조절 서열(regulatory sequence)"은 코딩 서열의 발현에 필요한 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 각각의 조절 서열은 코딩 서열에 대해 천연형이거나(기원이 동일함) 또는 외래(foreign; 다른 유전자에서 유래함) 서열일 수 있다. 상기 조절 서열의 예시는 리더 서열(leader sequence), 폴리아데닐레이션 서열(polyadenylation sequence), 프로펩타이드 서열, 프로모터, 신호 펩타이드 서열, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 번역 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 상기 조절 서열의 최소 단위는 프로모터, 전사 및 번역 종결 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "상응하는(corresponding to)"은, 단백질 또는 폴리펩티드에서 열거되는 위치의 아미노산 잔기이거나, 또는 단백질 또는 폴리펩티드에서 열거되는 잔기와 유사하거나 동일하거나 상동한 아미노산 잔기를 지칭한다. 상응하는 위치의 아미노산을 확인하는 것은 특정 서열을 참조하는 서열의 특정 아미노산을 결정하는 것일 수 있다. 본 출원에 사용된 "상응 영역"은 일반적으로 관련 단백질 또는 참조 (reference) 단백질에서의 유사하거나 대응되는 위치를 지칭한다.
예를 들어, 임의의 아미노산 서열을 서열번호 1과 정렬(align)하고, 이를 토대로 상기 아미노산 서열의 각 아미노산 잔기는 서열번호 1의 아미노산 잔기와 상응하는 아미노산 잔기의 숫자 위치를 참조하여 넘버링 할 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 기재된 것과 같은 서열 정렬 알고리즘은, 쿼리 시퀀스("참조 서열"이라고도 함)와 비교하여 아미노산의 위치, 또는 치환, 삽입 또는 결실 등의 변형이 발생하는 위치를 확인할 수 있다.
이러한 정렬에는 Needleman-Wunsch 알고리즘 (Needleman 및 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), EMBOSS 패키지의 Needle 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000), Trends Genet. 16: 276-277) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한 다중 서열 정렬(Multiple sequence alignment)을 통해 다른 만난아제에서 상응하는 아미노산 잔기를 식별할 수 있다. 당업계에 알려진 다중 서열 정렬 프로그램의 예시로 MUSCLE (multiple sequence comparison by log-expectation; 3.5 버전 이상; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFFT (6.857 버전 이상; Katoh and Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh and Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh and Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900) 등의 프로그램 및 ClustalW를 사용하는 EMBOSS EMMA (1.83 이상; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22 : 4673-4680) 등이 있으며, 상기 프로그램 각각의 기본 매개 변수를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.
그 외에, 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드로부터 갈라져 나온 효소가 종래의 서열 기반 비교로 그들의 관계를 검출하지 못하게 되는 경우, 그 밖의 쌍 서열(pairwise sequence) 비교 알고리즘이 사용될 수 있다(Lindahl and Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615). 데이터베이스를 검색하기 위한 폴리펩티드 패밀리(프로파일)의 확률론적 표시를 이용하는 검색 프로그램을 사용하여, 서열 기반 검색에서 보다 높은 민감도(sensitivity)를 얻을 수 있다. 예를 들어, PSI-BLAST 프로그램은 반복적인 데이터베이스 검색 과정을 통하여 프로파일을 산출하고, 관계도가 낮은 상동체(remote homolog)를 검출할 수 있다(Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). 폴리펩티드에 대한 패밀리 또는 슈퍼패밀리가 단백질 구조 데이터베이스에서 1개 이상의 표시를 가지는 경우, 훨씬 더 큰 민감성이 달성될 수 있다. GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin and Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881)와 같은 프로그램은 쿼리 시퀀스(query sequence)에 대한 구조적 폴딩을 예측하는 신경망에 대한 입력으로 PSI-BLAST, 2차 구조 예측, 구조 정렬 프로파일 및 용매화 포텐셜과 같은 다양한 소스로부터의 정보를 이용한다. 유사하게는, 구조를 알 수 없는 서열과 SCOP 데이터베이스에 존재하는 슈퍼패밀리 모델을 정렬하기 위해 Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919의 방법이 사용될 수 있다. 이들 정렬은 폴리펩티드에 대한 상동성 모델을 만들기 위해 차례로 사용될 수 있고, 이러한 모델은 그 목적을 위해 개발된 다양한 툴을 사용하여 정확성에 대해 평가될 수 있다.
공지된 구조의 단백질에 대해, 구조적 정렬을 검색하고 만들어내는 데 몇몇의 툴 및 리소스가 이용될 수 있다. 예를 들어, 단백질의 SCOP 슈퍼패밀리는 구조적으로 정렬되었고, 이 정렬은 접근 및 다운로드 가능하다. 둘 이상의 단백질 구조는 거리행렬 정렬(distance alignment matrix) (Holm and Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) 또는 CE(Combinatiorial extension) Shindyalov and Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747)와 같은 다양한 알고리즘을 사용하여 정렬될 수 있다. 이들 알고리즘의 구현은 가능한 구조적 상동체를 발견하기 위해, 대상 구조를 가지는 구조 데이터베이스를 질의하기 위해 추가적으로 이용될 수 있다(Holm and Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).
상기의 방법들은 하나의 예시로, 이에 제한되지는 않는다.
이하, 본 출원의 구체예를 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 출원에서, 만난아제는 만난에서 1,4-β-D-만난을 무작위로 분해하는 특성을 가지는 엔도(endo) 타입의 가수분해 효소를 의미한다. 일 예로, β-D-만난아제(Mannan endo-1,4-beta-mannosidase)일 수 있다. 일 예로, EC 번호가 3.2.1.78인 효소 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 출원에서 상기 만난아제는 "β-D-만난아제" 및 "엔도-1,4-β-만난아제"와 혼용될 수 있다.
본 출원에서 만난아제 활성은 본 출원에 기재된 실시 양태를 포함하여, 당업계에 공지된 방법을 사용함으로써 측정 및 평가할 수 있다.
본 출원에서 "모 만난아제(Parent mannanase)"는 본 출원의 변이체 또는 변이형 폴리펩티드를 생산하기 위하여 변형이 가해지는 만난아제를 의미한다. 구체적으로는, 모 만난아제, 모 효소 또는 모서열은 자연적으로 발생하는 폴리펩티드 또는 야생형 폴리펩티드일 수 있고, 이의 성숙 폴리펩티드일 수 있으며, 이의 변이체 또는 기능적 단편을 포함할 수 있으나, 만난아제 활성을 갖고 변이체의 모체가 될 수 있는 폴리펩티드라면 이에 제한되지는 않는다.
본 출원에서 제공하는 모 만난아제(Parent mannanase)는, 이에 제한되지는 않으나 서열번호 1의 폴리펩티드인 것일 수 있다. 또한, 만난아제 활성을 갖는 한, 서열번호 1의 폴리펩티드와 약 60%, 70%, 75%. 80%. 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드일 수 있으며, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 모 만난아제(Parent mannanase)의 범위에 제한 없이 포함될 수 있다.
본 출원의 모 만난아제(Parent mannanase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다. 본 출원의 일 예로, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 서열을 가지거나 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 서열로 이루어지거나, 필수적으로 구성될 수 있다.
본 출원의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy) 또는 본 출원의 모 만난아제(Parent mannanase)를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 본 출원의 모 만난아제(Parent mannanase)의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 2의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있다.
본 출원에서 제공하는 변이체의 모 만난아제(Parent mannanase)는, 아스퍼질러스(Aspergillus) 속 유래일 수 있다. 구체적으로 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 유래일 수 있다.
한편 전술한 미생물은 본 출원에서 제공하는 모 만난아제(Parent mannanase)가 유래될 수 있는 미생물의 일 예시로, 미생물의 명칭과 관계없이 그와 분류학적으로 상동인 미생물로부터 유래하는 것도 포함한다.
전술한 미생물은 ATCC, DSMZ, CBS, NRRL, KCTC, KCCM과 같은 공지된 미생물 기탁기관에서 분양받을 수 있다.
본 출원에서, 특정 미생물에서 "유래하는(derived from)" 서열은 그 미생물에서 자연적으로 제조되거나 제조 가능한 것에 제한되지 않고, 그 유전자를 포함하는 미생물에서 제조되고 분리되는 유전자에 의해 코딩되는 서열도 포함한다.
예를 들어, 아스퍼질러스(Aspergillus) 속 유래 만난아제는 아스퍼질러스(Aspergillus)에서 자연적으로 생산되는 만난아제 활성을 갖는 효소뿐만 아니라 아스퍼질러스(Aspergillus) source에서 생산되는 것, 그리고 당업계에 공지된 유전적 변형(예를 들면, 상기 효소를 코딩하는 서열로 형질전환)을 통해 다른 숙주세포에서 생산되는 것 또한 포함한다.
본 출원에서 "만난아제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드"는 모 만난아제의 변이체일 수 있다.
본 출원에서 용어, "모 만난아제의 변이체" 또는 "만난아제 변이체"는 하나 이상의 아미노산이 모 만난아제(Parent mannanase)의 아미노산 서열과 상이하고, 만난아제의 활성을 갖는 단백질을 지칭한다.
상기 "만난아제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드", "모 만난아제의 변이체"와 "만난아제 변이체"는 혼용 가능하다.
본 출원에서 제공하는 변이체는 만난아제 활성을 가지면서, 모 만난아제 (Parent mannanase) 서열에서 하나 이상의 아미노산의 변형(modification)을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 변이체는 i) 서열번호 1과 70% 이상 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드이고; 및/또는 ii) 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 서열과 70% 이상 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드이고; 및/또는 iii) 상기 변이형 폴리펩티드는 (a) 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드 코딩 서열, (b) 이의 cDNA, 또는 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 전장 상보 서열(full-length complement)과 낮은 엄격도 조건, 중간 엄격도 조건, 중상 엄격도 조건, 높은 엄격도 조건, 또는 매우 높은 엄격도 조건에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드이고; 및/또는 iv) 상기 변이형 폴리펩티드는 만난아제 활성을 갖는 i), ii) 또는 iii) 폴리펩티드의 기능적 단편일 수 있다.
구체적으로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 만난아제 활성을 가지면서, 모 만난아제 서열에서 하나 이상의 아미노산의 변형(modification)을 포함하여 모 만난아제 대비 하나 이상의 변경된 기능 또는 특성을 가지는 것일 수 있다.
일 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 만난아제 활성을 가지면서, 모 만난아제 서열에서 하나 이상의 아미노산의 변형(modification)을 포함하여 모 만난아제 대비 하나 이상의 변경된 기능 또는 특성을 가지고, 하나 이상의 보존적 치환을 가질 수 있다.
본 출원에서 제공하는 변이체는 모 만난아제의 변이체로서, 만난아제 활성을 갖는 폴리펩티드일 수 있다.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 3 내지 6 중 어느 하나의 서열번호로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것 일 수 있다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 출원의 변이체는 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열, 서열번호 4로 기재된 아미노산 서열, 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 6으로 기재된 아미노산 서열을 가지거나 및/또는 포함하거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어지거나(essentially consisting of), 구성될 수 있다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 출원의 변이체는 상기 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열, 서열번호 4로 기재된 아미노산 서열, 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 6으로 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 본 출원의 변이체에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는, 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이전(transfer)에 관여하는 단백질 N-말단의 시그널(또는 리더) 서열과 컨쥬게이트 된 변이체 일 수 있다. "단백질 N-말단의 시그널(또는 리더) 서열과 컨쥬게이트 된 변이체" 는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 단백질 N-말단의 시그널(또는 리더) 서열과 컨쥬게이트 된 변이체의 아미노산 서열 내 아미노산의 위치(position)를 결정하는 데 서열번호 7이 참조 서열(reference sequence)로 사용될 수 있다.
본 출원에서 제공하는 변이체는 다른 만난아제, 예를 들어 야생형 만난아제, 모 만난아제, 다른 만난아제 변이체 등과 비교하여, 선택되거나 검출될 수 있는 폴리펩티드의 임의의 특성 또는 속성이 1 이상 변경된 것일 수 있다.
상기의 특성 또는 속성에는, 산화 안정성, 기질 특이성, 촉매 활성, 열 안정성, 알칼리 안정성, pH 활성 프로파일, 단백질분해에 대한 내성, Km, kcat, kcat/Km 비율, 단백질 접힘, 면역 반응 유도, 리간드에 결합하는 능력, 수용체에 결합하는 능력, 분비되는 능력, 세포의 표면에 전시되는 능력, 올리고머를 형성하는 능력, 신호를 보내는 능력, 세포 증식을 촉진하는 능력, 세포 증식을 억제하는 능력, 세포자멸사를 유도하는 능력, 인산화 또는 글리코실화에 의해 개질되는 능력, 및/또는 질환을 치료하는 능력이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 모서열에 비해 내열성 및/또는 열안정성이 증가한 것일 수 있다.
구체적으로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 모서열에 비해 pH 5.0 내지 pH 9.0, pH 5.0 내지 pH 8.0, pH 5.0 내지 pH 7.5, 또는 pH 5.5 내지 pH 7.0에서의 효소활성이 증가한 것일 수 있다. 즉, 본 출원에서 제공하는 변이체는 동물의 장내 pH 범위에서 높은 효소활성을 보여 효율적으로 가수분해물을 수득할 수 있다.
본 출원에서, "효소활성(enzymatic activity)"은 적어도 하나의 촉매 활성(catalytic activity)을 나타낸다. 구체적으로는 kcat/Km으로 주로 표현되는 효소의 전환 효율일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
kcat는 효소가 기질로 완전히 포화되었을 때, 한 개의 효소에 의한 단위시간에 생성물로 전환하는 속도상수(catalytic constant)를 의미하며, 전환수(turnover number)라고도 칭해진다. Km은 반응속도가 최고값(Vmax)의 절반일 때의 기질 농도(substrate concenstration)이다.
효소활성을 표현하는 방법의 예시로, 특이적 활성(specific activity; umol of converted substrate x mg -1 x min -1) 또는 volumetric activity (umol of converted substrate x mL -1 x min -1)등이 있다.
다만 효소활성을 정의하는 것은 전술한 내용에 제한되지 않고, Irwin H. Segel, Enzyme kinetics, John Wiley & Sons, 1979; A. G. Marangoni, Enzyme kinetics, Wiley-Interscience, 2003; A. Fersht, Enzyme structure and mechanisms, John Wiley & Sons, 1981; Structure and Mechanism in Protein Science: A guide to enzyme catalysis and protein folding, Alan Fersht, W.H. Freeman, 1999; Fundamentals of Enzyme Kinetics, Athel Cornish-Bowden, Wiley-Blackwell 2012 and Voet ef al., "Biochemie" [Biochemistry], 1992, VCH-Verlag, Chapter 13, pages 331-332 with respect to enzymatic activity 등에 알려진 내용을 토대로 정의하고 평가할 수 있다.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 모효소 대비 약 100%, 약 110%, 약 120%, 약 130%, 약 140%, 약 150%, 약 160%, 약 170%, 약 171%, 약 172%, 약 173%, 약 174%, 약 175%, 약 176%, 약 177% 또는 약 180% 이상의 증가된 효소활성을 가질 수 있다. 전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 모효소는 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드일 수 있다.
본 출원에서 용어 "특이적 활성(specific activity)"은 단백질 단위 중량 당 나타나는 효소의 활성으로, unit/mg으로 표현할 수 있다. 단백질의 정량은, 예를 들면 SDS-PAGE 혹은 Bradford assay 등을 이용하여 할 수 있다.
효소 안정성(enzyme stability)이란, 효소활성이 저장 또는 반응 시간 동안 보존되는 것을 의미한다. 이러한 안정성의 변화를 측정하기 위해, 최초 효소활성을 정해진 조건 하에 0시간(time zero) (100%) 및 일정 시간 경과 후 (x%) 측정하여 비교함으로써, 효소활성이 상실되는 수준 내지는 효소 안정성을 표현할 수 있다.
효소활성에 영향을 미치는 요소는, 예를 들어 pH, 열, 다른 물질(예를 들어, 산화제, 킬레이트제)의 존재 등이 있다.
본 출원에서 용어, "pH 안정성"이란 특정 pH 범위에서 단백질이 기능할 수 있는 능력(ability)을 의미한다. 특정 pH 범위에서 단백질이 기능을 유지하는 경우 "pH 안정성"을 가지는 것으로 정의할 수 있으며, 하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 pH 5.0 내지 pH 9.0, pH 5.5 내지 pH 8.0, pH 5.0 내지 pH 7.5, 또는 pH 5.5 내지 pH 7.0에서 높은 효소활성을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "열안정성(thermal stability)"이란 특정 온도 범위에서 단백질이 기능할 수 있는 능력을 의미한다. 하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 약 25℃ 내지 약 100℃ 범위에서 활성을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "내열성(thermal tolerance)"이란 단백질이 특정 온도, 예를 들어 고열 또는 극저온에 노출된 후 기능할 수 있는 능력을 의미한다. 예를 들어, 내열성을 갖는 단백질은 노출된 온도에서는 기능하지 않을 수 있으나, 최적 온도 환경으로 돌아오면 다시 기능을 가질 수 있다.
안정성의 증가는 다른 효소, 예를 들어 야생형 효소, 모 효소 및/또는 다른 변이체와 비교하여, 높은 효소활성 유지; 단백질이 기능을 유지하는 pH, 온도 및/또는 시간 등의 범위 증가를 포함한다.
안정성의 감소는 다른 효소, 예를 들어 야생형 효소, 모 효소 및/또는 다른 변이체와 비교하여, 낮은 효소활성 유지; 단백질이 기능을 유지하는 pH, 온도 및/또는 시간 등의 범위 감소를 포함한다.
본 출원에서 용어, "기질특이성(substrate speicifity)"이란 기질 및 기질과 경쟁하는 분자들을 식별할 수 있는 효소의 능력을 의미한다. 기질특이성은 상이한 기질에 대한 효소의 활성을 측정하여 결정할 수 있다. 하나의 구체예로, 상기 기질특이성의 변화는 목적하는 산물을 생성할 수 있는 기질에 대한 특이성이 증가하는 방향으로 변화하는 것일 수 있다. 다른 하나의 구체예로, 상기 기질특이성의 변화는 목적하는 산물을 생성할 수 있는 기질에 대한 특이성이 감소하는 방향으로 변화하는 것일 수 있다.
본 출원에서 제공하는 변이체의 변경된 특성은 사료, 제빵, 펄프 표백(Pulp bleaching) 등을 포함한 다양한 산업 분야에 적용하기 적합한 활성, 개선된 활성일 수 있다.
본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 전술한 변이체의 코딩 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 폴리펩티드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다.
또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화하여, 본 출원의 변이체를 코딩하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다.
상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)에 구체적으로 기재되어 있다.
예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 폴리뉴클레오티드끼리, 40% 이상, 구체적으로 90% 이상, 보다 구체적으로 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 더욱 구체적으로 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1XSSC, 0.1% SDS, 구체적으로 60℃, 0.1XSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로 68℃, 0.1XSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).
예를 들어 "높은 엄격도"는 프로브의 Tm의 약 5 내지 10℃아래에서 발생하고; "중간 엄격도"는 프로브의 Tm의 약 10 내지 20℃아래에서 발생하며; "낮은 엄격도"는 Tm의 약 20 내지 25℃아래에서 발생할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일 예로, "낮은 엄격도 조건(low stringency condition)" 은 써던 블롯팅 표준 절차에 따라 12-24시간 동안, 적어도 100개의 뉴클레오티드 길이의 프로브에 대해, 5X SSPE, 0.3% SDS, 전단 및 변성된 연어 정자 DNA 200 micrograms/ml 및 25% 포름아미드에서, 42℃에서의 사전 혼성화(prehybridization) 및 혼성화 일 수 있다. 상기 운반체 물질은 최종적으로 50℃에서 2 X SSC, 0.1 내지 0.2% SDS를 사용하여 15분 동안 각각 2회 내지 3회 세척될 수 있다.
일 예로, "중간 엄격도 조건(medium stringency condition)"은 써던 블롯팅 표준 절차에 따라 12-24시간 동안, 적어도 100개의 뉴클레오티드 길이의 프로브에 대해, 5X SSPE, 0.3% SDS, 전단 및 변성된 연어 정자 DNA 200 micrograms/ml 및 35% 포름아미드에서, 42℃에서의 사전 혼성화(prehybridization) 및 혼성화 일 수 있다. 상기 운반체 물질은 최종적으로 55℃에서 2 X SSC, 0.1 내지 0.2% SDS를 사용하여 15분 동안 각각 2회 내지 3회 세척될 수 있다.일 예로, "중상 엄격도 조건(medium-high stringency condition)"은 써던 블롯팅 표준 절차에 따라 12-24시간 동안, 적어도 100개의 뉴클레오티드 길이의 프로브에 대해, 5X SSPE, 0.3% SDS, 전단 및 변성된 연어 정자 DNA 200 micrograms/ml 및 35% 포름아미드에서, 42℃에서의 사전 혼성화(prehybridization) 및 혼성화 일 수 있다. 상기 운반체 물질은 최종적으로 60℃에서 1 내지 2 X SSC, 0.1 내지 0.2% SDS를 사용하여 15분 동안 각각 2회 내지 3회 세척될 수 있다.
일 예로, "높은 엄격도 조건(high stringency condition)"은 써던 블롯팅 표준 절차에 따라 12-24시간 동안, 적어도 100개의 뉴클레오티드 길이의 프로브에 대해, 5 X SSPE, 0.3% SDS, 전단 및 변성된 연어 정자 DNA 200 micrograms/ml 및 35% 포름아미드에서, 42℃에서의 사전 혼성화(prehybridization) 및 혼성화 일 수 있다. 상기 운반체 물질은 최종적으로 65℃에서 2 X SSC, 0.1 내지 0.2% SDS를 사용하여 15분 동안 각각 2회 내지 3회 세척될 수 있다.
본 출원에서 제공하는 핵산 구조체는, 조절 서열에 적합한 조건 하에서 적절한 숙주 세포에서 코딩서열의 발현을 지시하는 1개 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된, 본 출원에서 제공하는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
폴리뉴클레오티드는 변이체의 발현을 가능하게 하는 다양한 방식으로 조작될 수 있다. 발현 벡터에 따라, 벡터로 폴리뉴클레오티드를 삽입하기 전 폴리뉴클레오티드를 조작하는 것이 바람직하거나 필요할 수 있다. 그와 같은 조작은 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다.
본 출원에서 제공하는 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 본 출원의 변이체를 발현시킬 수 있도록 적합한 발현조절영역(또는 발현조절서열)에 작동 가능하게 연결된 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 발현조절영역은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용될 수 있는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 본 출원에서 제공하는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원의 숙주 세포는, 본 출원의 변이체를 발현할 수 있는 것이면 제한 없이 포함될 수 있다.
본 출원의 숙주 세포는 전술한 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 핵산 구조체 및/또는 벡터를 포함할 수 있다.
상기 핵산 구조체 또는 벡터는 앞서 설명된 바와 같이 염색체에 통합되거나, 또는 자가 복제되는 염색체외 벡터로 유지될 수 있다.
본 출원의 숙주 세포는 복제 동안 일어나는 돌연변이에 기인하여 모 세포와 동일하지 않은 모 세포의 임의의 자손을 포함한다.
숙주 세포는 변이체의 재조합 생성에 유용한 임의의 세포, 예를 들어, 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다.
원핵 숙주 세포는 임의의 그람-양성 또는 그람-음성 박테리아일 수 있다.
그람-양성 박테리아에는 바실러스, 클로스트리듐, 엔테로코커스, 게오바실러스, 락토바실러스, 락토코커스, 오세아노바실러스, 스타필로코커스, 스트렙토코커스 및 스트렙토마이세스가 포함되나 이들에 제한되지 않는다.
그람-음성 박테리아에는 캄필로박터, 에스케리키아 콜라이, 플라보박테리움, 푸소박테리움, 헬리코박터, 일리오박터, 네이세리아, 슈도모나스, 살모넬라, 비브리오(예컨대, 비브리오 나트리에겐스(Vibrio natriegens)) 및 유레아플라스마가 포함되나 이들에 제한되지 않는다.
하나의 구체예로, 상기 박테리아 숙주 세포는 에스케리키아 속 숙주 세포일 수 있고, 구체적으로 에스케리키아 콜라이 세포를 포함하나 이들에 제한되지 않는다.
하나의 구체예로, 상기 박테리아 숙주 세포는 바실러스 속 숙주 세포일 수 있고, 구체적으로 바실러스 알칼로필러스, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스, 바실러스 브레비스, 바실러스 서큘란스, 바실러스 클라우시이, 바실러스 코아굴란스, 바실러스 퍼무스, 바실러스 라우투스, 바실러스 렌투스, 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 메가테리움, 바실러스 푸밀러스, 바실러스 스테아로써모필루스, 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 투린지엔시스 세포를 포함하나 이들에 제한되지 않는다.
하나의 구체예로, 상기 박테리아 숙주 세포는 스트렙토코커스 속 숙주 세포일 수 있고 구체적으로 스트렙토코커스 에퀴시밀리스(Streptococcus equisimilis), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 유베리스(Streptococcus uberis) 및 스트렙토코커스 에퀴(Streptococcus equi) 하위종 주에피데미쿠스(Zooepidemicus) 세포를 포함하나 이들에 제한되지 않는다.
하나의 구체예로, 상기 박테리아 숙주 세포는 스트렙토마이세스 속 숙주 세포일 수 있고, 구체적으로 스트렙토마이세스 아크로모게네스(Streptomyces achromogenes), 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis), 스트렙토마이세스 코엘리콜라, 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 및 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 세포를 포함하나 이들에 제한되지 않는다.
하나의 구체예로, 상기 박테리아 숙주 세포는 코리네박테리움 속 숙주 세포일 수 있고, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스(Corynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris) 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
숙주 세포는 포유동물, 곤충, 식물 또는 진균 세포와 같은 진핵생물일 수 있다.
숙주 세포는 진균 세포일 수 있다. 본 출원에서 "진균"은 자낭균문, 담자균문, 통곰팡이문 및 접합균문뿐 아니라 난균문 및 모든 불완전 진균류를 포함한다.
진균 숙주 세포는 효모 세포일 수 있다. 본 출원의 "효모"는 자낭포자형성(ascosporogenous) 효모(엔도마이세탈레스(Endomycetales)), 담자포자(basidiosporogenous) 효모 및 불완전 진균류(Fungi imperfecti)(블라스토마이세테스(Blastomycetes))에 속하는 효모를 포함한다. 다만, 이러한 분류는 변화할 수 있으며, Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, and Davenport, editors, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980)에 설명된 바에 따라 분류를 정의할 수 있다.
효모 숙주 세포는 칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 코마가텔라(Komagataella), 사카로마이세스(Saccharomyces), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 또는 야로위아(Yarrowia) 세포, 예를 들어, 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 사카로마이세스 칼스베르겐시스(Saccharomyces carlsbergensis), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 디아스타티쿠스(Saccharomyces diastaticus), 사카로마이세스 도우글라시이(Saccharomyces douglasii), 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 사카로마이세스 노르벤시스(Saccharomyces norbensis), 사카로마이세스 오비포르미스(Saccharomyces oviformis), 코마가텔라 파피(Komagataella phaffii) 또는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 세포일 수 있다.
진균 숙주 세포는 사상 진균 세포일 수 있다. "사상 진균"은 진균문 및 난균문 아문의 모든 사상 형태를 포함한다(상기 문헌(Hawksworth et al., 1995)에 정의된 바와 같음). 사상 진균은 일반적으로, 키틴, 셀룰로스, 글루칸, 키토산, 만난 및 그 밖의 복합 다당류로 이루어진 균사 벽을 특징으로 한다. 영양 성장은 균사 신장에 의한 것이며, 탄소이화는 절대적으로 호기성이다. 대조적으로, 효모, 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애에 의한 영양 성장은 단세포 엽상체(thallus)의 발아에 의한 것이며, 탄소이화는 발효성일 수 있다.
사상 진균 숙주 세포는 아크레모늄(Acremonium), 아스페르길루스, 아우레오바시듐(Aureobasidium), 비어칸데라(Bjerkandera), 세리포리옵시스(Ceriporiopsis), 크리소스포리움(Chrysosporium), 코프리누스(Coprinus), 코리올루스(Coriolus), 크립코코커스(Cryptococcus), 필리바시듐(Filibasidium), 푸사리움, 휴미콜라, 마그나포르테(Magnaporthe), 무코르(Mucor), 마이셀리옵토라, 네오칼리마스틱스(Neocallimastix), 뉴로스포라(Neurospora), 파에실로마이세스(Paecilomyces), 페니실리움, 파네로차에테(Phanerochaete), 플레비아(Phlebia), 피로마이세스(Piromyces), 플레우로투스(Pleurotus), 스키조필룸(Schizophyllum), 탈라로마이세스(Talaromyces), 써모아스쿠스(Thermoascus), 티엘라비아(Thielavia), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 트라메테스(Trametes) 또는 트리코데르마 세포일 수 있다.
예를 들어, 사상 진균 숙주 세포는 아스페르길루스 아와모리, 아스페르길루스 포에티두스(Aspergillus foetidus), 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스페르길루스 야포니쿠스(Aspergillus japonicus), 아스페르길루스 니둘란스, 아스페르길루스 니게르, 아스페르길루스 오리자에, 비어칸데라 아두스타(Bjerkandera adusta), 세리포리옵시스 아네이리나(Ceriporiopsis aneirina), 세리포리옵시스 카레기에나(Ceriporiopsis caregiea), 세리포리옵시스 길베센스(Ceriporiopsis gilvescens), 세리포리옵시스 판노신타(Ceriporiopsis pannocinta), 세리포리옵시스 리불로사(Ceriporiopsis rivulosa), 세리포리옵시스 서브루파(Ceriporiopsis subrufa), 세리포리옵시스 서브베르미스포라(Ceriporiopsis subvermispora), 크리소스포리움 이놉스(Chrysosporium inops), 크리소스포리움 케라티노필룸(Chrysosporium keratinophilum), 크리소스포리움 루크노웬스(Chrysosporium lucknowense), 크리소스포리움 메르다리움(Chrysosporium merdarium), 크리소스포리움 판니콜라(Chrysosporium pannicola), 크리소스포리움 퀸스란디쿰(Chrysosporium queenslandicum), 크리소스포리움 트로피쿰(Chrysosporium tropicum), 크리소스포리움 조나툼(Chrysosporium zonatum), 코프리누스 시네레우스(Coprinus cinereus), 코리올루스 히르수투스(Coriolus hirsutus), 푸사리움 박트리디오이데스(Fusarium bactridioides), 푸사리움 세레알리스(Fusarium cerealis), 푸사리움 크루크웰렌스(Fusarium crookwellense), 푸사리움 쿨모룸(Fusarium culmorum), 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸사리움 그라미눔(Fusarium graminum), 푸사리움 헤테로스포룸(Fusarium heterosporum), 푸사리움 네군디(Fusarium negundi), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 푸사리움 레티쿨라툼(Fusarium reticulatum), 푸사리움 로세움(Fusarium roseum), 푸사리움 삼부시눔(Fusarium sambucinum), 푸사리움 사로크로움(Fusarium sarcochroum), 푸사리움 스포로트리키오이데스(Fusarium sporotrichioides), 푸사리움 설푸레움(Fusarium sulphureum), 푸사리움 토룰로숨(Fusarium torulosum), 푸사리움 트리코테시오이데스(Fusarium trichothecioides), 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum), 휴미콜라 인솔렌스(Humicola insolens), 휴미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa), 무코르 미에헤이, 마이셀리옵토라 써모필라, 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 페니실리움 푸르푸로게눔(Penicillium purpurogenum), 파네로차에테 크리소스포리움(Phanerochaete chrysosporium), 플레비아 라디아타(Phlebia radiata), 플레우로투스 에린지이(Pleurotus eryngii), 티엘라비아 테레스트리스(Thielavia terrestris), 트라메테스 빌로사(Trametes villosa), 트라메테스 베르시콜라(Trametes versicolor), 트리코데르마 하지아눔(Trichoderma harzianum), 트리코데르마 코닌지이(Trichoderma koningii), 트리코데르마 론지브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum), 트리코데르마 리세이(Trichoderma reesei) 또는 트리코데르마 비리데(Trichoderma viride) 세포일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 변이체를 제조하는 방법은 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
본 출원에서, 용어 "배양"은 상기 숙주 세포를 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "배지"는 상기 숙주 세포를 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 숙주 세포의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 숙주 세포의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 숙주 세포를 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 라이신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 숙주 세포의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
배지의 온도는 20℃ 내지 55℃, 구체적으로는 25℃내지 40℃일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 유용 물질의 원하는 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 24 시간 내지 196 시간일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
하나의 구체예로, 본 출원의 만난아제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드를 제조하는 방법은 상기 배양단계에서 발현되는 본 출원의 만난아제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드를 회수하는 단계를 더 포함할 수 있다.
다른 하나의 구체예로, 상기 배양단계에서 발현된 변이체는 본 출원이 속하는 분야에 알려져 있는 방법을 사용하여 회수될 수 있다. 예를 들어, 변이체는 수집, 원심분리, 여과, 추출, 분무-건조, 증발 또는 침전을 포함하나 이들에 한정되지 않는 통상적인 절차에 의해 영양 배지로부터 회수될 수 있다.
상기 회수 방법은 본 출원의 숙주 세포의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 변이체를 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 및 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 숙주 세포로부터 변이체를 회수할 수 있다.
다른 하나의 구체예로, 배양단계에서 숙주 세포에 의해 발현되는 변이체는 회수되지 않을 수 있다. 상기 구체예에서, 변이체를 발현하는 숙주 세포 자체를 변이체의 공급원으로 사용할 수 있다.
본 출원의 조성물은 만난(mannan)-함유 물질을 분해하는 데에 사용될 수 있다.
본 출원의 조성물은 만난-함유 물질을 만노스, 만노비오스, 만노트리오스 또는 긴 사슬의 만노올리고당으로 전환하는 데에 사용될 수 있다.
본 출원의 조성물은 본 출원에서 제공하는 변이체 외에 다른 구성요소를 추가로 더 포함할 수 있다. 당업자는 본 출원의 조성물에 추가되는 구성요소를 적절히 선택할 수 있다.
일 구체예로, 본 출원의 조성물은 만난-함유 물질을 만노스, 만노비오스, 만노트리오스 또는 긴 사슬의 만노올리고당으로 전환하는 데 적용하기 적합한 임의의 구성요소를 더 포함할 수 있다.
일 구체예로, 본 출원의 조성물은 동물 사료, 제빵, 바이오매스 당화, 펄프 표백 등 다양한 산업 분야에 적용하기 적합한 임의의 구성요소를 더 포함할 수 있다.
추가될 수 있는 물질의 예시는, 안정화제, 계면활성제, 빌더, 킬레이트제, 분산제, 효소, 효소 안정제, 촉매제, 활성화제, 담체, 합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 현탁화제, 색소, 향료, 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제, 희석제, 윤활제, 보존제 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일 구체예로, 본 출원에서 제공하는 조성물은 본 출원에서 제공하는 변이체 외에, 자연적으로 발생한 물질 또는 자연적으로 비발생한(Non-naturally occurring) 물질을 더 포함할 수 있다.
일 구체예로, 본 출원에서 제공하는 조성물은 본 출원에서 제공하는 변이체 외에 동물 사료, 제빵, 바이오매스 당화, 펄프 표백(Pulp bleaching) 등을 포함한 다양한 산업 분야에 통상 사용 되는 추가적인 효소를 더 포함할 수 있다.
예를 들어 상기 추가적인 효소는, β-아밀라아제, 셀룰라아제(β글루코시다아제, 셀로비오히드롤라아제 및 엔도글루카나아제), 글루코아밀라아제, 헤미셀룰라아제(엔도-만난아제, β-자일로시다제, α-L-아라비노푸라노시다제, α-D-글루쿠로니다제. 페룰로일 에스터라제, 쿠마로일 에스터라제(coumaroyl esterase), α-갈락토시다제, β-갈락토시다제, β-만나나제(mannanase) 또는 β-만노시다제), 아이소아밀라아제, 아이소머라아제, 리파아제, 피타아제, 프로테아제, 풀룰라나아제 및/또는 α-아밀라아제와 함께 상업적 과정에서 유용한 그 밖의 효소로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 효소를 더 포함할 수 있다.
본 출원의 만난아제 변이체 또는 본 출원의 만난아제 변이체를 포함하는 조성물은 임의의 만난-함유 물질을 분해시키는 데 사용될 수 있다.
본 출원에서, 만난-함유 물질은 만난아제에 의해 분해될 수 있는 임의의 물질이다. 일 예로 상기 만난-함유 물질은 갈락토만난(galactomannan), 글루코만난(glucomannan), 갈락토글루코만난(galactoglucomannan), 로커스트콩검(locust bean gum) 및 만난(mannan) 중 선택되는 물질일 수 있다. 일 예로 상기 만난-함유 물질은 만난 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
하나의 구체예로, 본 출원은 만난-함유 물질을 분해 (또는 붕괴)시키는 방법을 제공한다. 이것은 또한 만난의 가용화로 언급될 수 있다.
본 출원의 추가 실시 형태에서, 방법은 만난 분해로부터 유래되는 폴리머의 분해 (예를 들어, 분해)에 관한 것이다.
분해 생성물 (만노오스, 만노바이오스, 만노트라이오스 그리고 긴 사슬의 만노올리고당)은 동물의 에너지원이나 발효 공정의 공급 원료로서, 예컨대 바이오 연료 (예를 들어, 바이오에탄올) 사용될 수 있으며 프리바이오틱스로서 사용될 수 있다.
본 출원의 변이체, 이를 발현하는 숙주 세포, 상기 변이체 및/또는 숙주 세포를 포함하는 조성물을 이용하여 만난을 분해할 수 있다. 만난의 가수 분해 단계에서 본 출원의 변이체 외에 보조인자(cofactor), 조효소(coenzyme) 등이 함께 첨가될 수 있다. 기질의 가수 분해 단계는 최적 pH, 온도 조건 등에서 수행될 수 있으며 당업자가 적절한 조건을 선택할 수 있다.
본 출원의 만난아제 변이체는 하기 응용들 중 어느 하나로 사용될 수 있다:
a) 동물 사료원료에서의 첨가제; 및/또는
b) 동물용 사료 보충제; 및/또는
c) 곡물 기반 물질 (예를 들어, 이는 통곡물 또는 곡물의 일부일 수 있음)의 분해.
일 구체예로, 본 출원의 만난아제 변이체는 사료원료에 사용될 수 있다.
일 구체예로, 만난-함유 물질은 사료원료 또는 사료 성분일 수 있다.
본 출원의 사료 조성물은 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미할 수 있으며, 당업계의 공지된 다양한 형태로 제조 가능하다.
일 구체예로 본 출원의 만난아제 변이체는 식품 조성물 또는 그 제조에 사용 될 수 있다.
일 구체예로, 만난-함유 물질은 곡물 기반 물질 (통곡물 또는 부분적인 곡물 또는 맥아 곡물, 예를 들어 맥아 보리를 포함함)일 수 있다.
일 구체예로, 만난-함유 물질은 곡분 (예를 들어, 밀, 귀리, 호밀 또는 보리 가루)일 수 있다.
일 구체예로, 만난-함유 물질은 보리 맥아 또는 당화액, 또는 맥아 보리 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 예로 상기 식품 조성물은 맥주 및 와인을 포함하는 발효 음료일 수 있다. 다른 예로 상기 식품 조성물은 로브, 롤, 번, 피자, 프렛첼, 또띠야, 케익, 쿠키, 비스킷, 크랙커를 포함하는 베이커리 제품일 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 만난아제 변이체는 밀 글루텐-전분 분리에 사용될 수 있다.
일 예로, 배유로부터 밀겨 및 밀 배아의 초기 분리 후에, 밀 배유 가루의 전분 및 글루텐 분획으로의 분획화는 고품질 α-전분 및 부산물 β-전분 및 활성 글루텐을 얻기 위해 이용 될 수 있다.
곡분 (예를 들어, 밀가루)을 전분 및 글루텐 분획으로 분리하기 위한 방법에서, 그 방법은 곡분 (예를 들어, 밀가루), 물 및 만난아제 변이체를 혼합하는 단계를 포함한다. 곡분, 물 및 만난아제 변이체는 동시에 또는 순차적으로 혼합될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 만난아제 변이체와 혼합하기 전에 곡분 (예를 들어, 밀가루)과 물을 혼합할 수 있다.
본 출원의 만난아제 변이체를 밀 글루텐-전분 분리에 적용함으로써 더 높은 α-전분 수율 및/또는 더 우수한 품질의 글루텐 (예를 들어, 더 우수한 품질의 활성 글루텐)을 생성할 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, 본 출원의 만난아제 변이체는 곡물 기반 물질의 분해에 사용되고, 바이오 연료 (예를 들어, 바이오에탄올) 생산 공정의 일부에 사용될 수 있다.
일 예로, 본 출원의 만난아제 변이체는 바이오 연료 (예를 들어, 바이오에탄올)의 생산 및 바이오 연료 산업에서의 곡물 기반 물질의 이용을 향상시킬 수 있다.
일 예로, 바이오 연료와 만난아제 변이체를 액화, 당화, 발효, 동시 당화 및 발효 전에 또는 그 동안에, 그리고 발효 후에, 또는 이들의 조합에서 혼합하는 단계를 포함하여 사용할 수 있다.
본 출원의 만난아제 변이체를 바이오 연료 생산 공정에 적용할 경우, 더 많은 건조 물질 당화액이 공정에 사용될 수 있거나; 최종 시럽에서 더 높은 고형물 함량을 얻거나; 열 전달이 더욱 우수하거나; 에너지 요구량이 더욱 낮아지거나; 증발기 부착오염이 감소되거나; 세정 비용이 감소되거나; 최종 연료 수율이 증가하거나; 부산물 품질이 개선되거나; 증류 후 찌꺼기의 고체 및 액체 부분 분리가 보다 용이하거나; 또는 전술한 이점의 조합을 얻을 수 있다.
본 출원의 만난아제 변이체는 펄프 표백에 사용 될 수 있다.
예를 들어 펄프에서 착색된 리그닌이 자일란을 통해 결정 셀룰로스에 연결되어 있는 상태에서 만난아제 변이체를 처리함으로써 자일란을 분해하고 착색된 리그닌을 방출함으로써 펄프 표백을 촉진할 수 있다.
본 출원의 만난아제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드는 다양한 산업 분야에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 출원의 변이형 폴리펩티드의 pH 5.0 내지 pH 7.5 에서의 활성을 확인한 결과이다.
도 2는 본 출원의 변이형 폴리펩티드의 내열성을 확인한 결과이다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 출원을 예시하기 위한 바람직한 실시양태에 불과한 것이며 따라서, 본 출원의 권리범위를 이에 한정하는 것으로 의도되지는 않는다. 한편, 본 명세서에 기재되지 않은 기술적인 사항들은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 기술 분야에서 숙련된 통상의 기술자이면 충분히 이해하고 용이하게 실시할 수 있다.
실시예 1. 단일 변이체 제작
실시예 1-1. 무작위 변이체 제작
AnMAN에 무작위 변이를 주고자 망간과 함께 Taq polymerase로 유전자 증폭 기술을 이용해 다양한 아미노산으로 치환된 AnMAN 변이체를 제작하였다.
구체적으로, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 만난아제(mannanase) (AnMAN)를 코딩하는 유전자(서열번호 2)를 Template으로, Primer, PCR premix(Taq 2X premix, Bioneer)를 사용하여 PCR을 통해 변이유전자 라이브러리를 제작하였다. PCR은 Eppendorf Mastercycler Nexus GX2를 이용하였고, 반응 조건은 다음과 같다.
서열번호 명칭 서열(5'→ 3')
9 ORF(AnMAN)-F TTCGTGATATACTGATAATAAATTGAATTTTCACACT
10 ORF(AnMAN)-R AAACAGCCAAGCTTGCATGCCT
11 Vector-F ATGCAAGCTTGGCTGTTTTGG
12 Vector-R ATTATCAGTATATCACGAACAAAAAAGAG
최초 변성(Initial denaturation): - 95℃, 2min
변성(Denaturation): - 95℃, 20sec
어닐링(Annealing): - 50℃, 10sec
신장(Extension): - 72℃, 1min(Denaturation에서 Extension까지 30cycle)
최종 신장(Final Extension): - 72℃, 5min
증폭된 변이유전자를 In-Fusion HD cloning kit(Takara, Cat. No. 639650)를 이용하여 HCE 프로모터를 가진 pHCE 벡터에 클로닝하였다. 그리고 E.coli BL21 균주에 형질전환 후 특성평가를 위해 콜로니를 96 deep well plate(bioneer)의 LB배지에 접종하여 배양하였으며 BugBuster(Merck)를 배양액과 1:1로 섞어 세포 파쇄 하였다. 원심분리를 통해 조효소액(lysate)을 분리하였고 이를 새로운 96 well plate(SPL)에 적당량 분주 후 0.3% 만난액과 1:1로 섞어 phosphate 버퍼 pH 7.0에서 효소반응 하였다. 그리고 10분 뒤 적당량의 DNS solution을 첨가하여 반응정지 하였고 20분 85℃ 오븐에 방치하여 발색 후 540nm 흡광도에서 활성을 측정 하였다. 활성이 증가한 변이체를 선별하고 시퀀싱을 통해 변이 위치를 확인하였다.
본 출원의 DNS solution 제조법은 다음과 같다. 증류수 500ml이 포함된 비이커에 6.3g의 3,5-dinitrosalicylic acid(samchus, D1267)의 무게를 정확하게 측정하고 50 °C에 21g의 Sodium Hydroxide(Daejung, 7571-4400)을 첨가하고 300ml의 물에 Potassium sodium tartrate tetrahydrate(Daejung, 6618-4400)182g을 가열하여 용해 예비 용액에 Phenol(Sigma-Aldrich, P1037) 5g을 첨가하고, Sodium sulfite anhydrous(Daejung, 7634-4405) 5g을 첨가하여 용해 될 때까지 교반 한 후, 냉각 후 증류수로 1000ml로하여 여과하여 제조하였다.
그 결과, 서열번호 3 내지 5의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 확인하였다.
실시예 1-2. 단일 변이체 정제
상기 실시예 1-1에서 제조한 우수한 활성을 보였던 단일 변이체들(각각, 서열번호 3 내지 5) 및 AnMAN을 코딩하는 유전자로 각각 형질전환된 E.coli BL21 균주를 멸균된 LB kanamycin배지(BD Difco) 5ml에 접종하고, 37℃, 200rpm으로 12시간동안 배양하였다. 배양된 균체는 다시 400ml LB kanamycin배지로 옮겨져 37℃, 200rpm으로 24시간동안 본배양을 진행하였고 원심분리를 통해 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 다시 회수된 균체에 20ml lysis buffer(50mM Tris-HCl pH 8.0, 100mM NaCl, 10mM imidazole)를 가하여 재분산시킨 다음sonication과 원심분리를 통해 조효소액을 확보하였다. 조효소액을 Ni-NTA resin(Qiagen, Cat no. 30230)에 흘려주어 흡착시킨 다음, washing buffer(lysis buffer 조성중 imidazole 농도만 20mM), Elution buffer(lysis buffer 조성에서 imidazole만 250mM)를 차례로 흘려주어 정제된 단일 변이체들과 정제된 AnMAN를 획득하였다.
실시예 2. 조합 변이체 제작
실시예 2-1. 조합 변이체 제작
상기 실시예 1-1에서 제조한 우수한 활성을 보였던 단일 변이체들 중 서열번호 3 및 서열번호 4의 변이 위치를 조합한 변이체(서열번호 6)를 제작하였다. 구체적으로, Template(서열번호 2)와 Primer, PCR premix(Taq 2X premix, Bioneer)를 사용하여 PCR을 통해 제작하였다. PCR은 Eppendorf Mastercycler Nexus GX2를 이용하였고, 반응 조건은 다음과 같다.
서열번호 명칭 서열(5'→ 3')
13 SEQ ID NO: 3-N GCGGGTACAAATACCTACTGGATCGGA
14 SEQ ID NO: 3-R TCCGATCCAGTAGGTATTTGTACCCGC
15 SEQ ID NO: 4-N GGTGGATCTGGTGTGACAGACTTTTAC
16 SEQ ID NO: 4-R GTAAAAGTCTGTCACACCAGATCCACC
최초 변성(Initial denaturation): - 95℃, 2min
변성(Denaturation): - 95℃, 20sec
어닐링(Annealing): - 50℃, 10sec
신장(Extension): - 72℃, 1min(Denaturation에서 Extension까지 30cycle)
최종 신장(Final Extension): - 72℃, 5min
증폭된 유전자는 In-Fusion HD cloning kit(Takara, Cat. No. 639650)를 이용하여 constitutive 발현 시스템을 가진 pHCE 벡터에 클로닝되었다. 그리고 E.coli Dh5α 균주에 형질전환 후 시퀀싱(sequencing)을 통해 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 확인하였다.
실시예 2-2. 조합 변이체 정제
상기 실시예 2-1에서 제조한 조합 변이체(서열번호 6)를 코딩하는 유전자로 형질전환된 E.coli BL21 균주를 멸균된 5ml의 LB kanamycin배지(BD Difco)에 접종하고, 37℃, 200rpm으로 12시간동안 배양하였다. 배양된 균체는 다시 400ml LB kanamycin배지로 옮겨져 37℃, 200rpm으로 24시간동안 본배양 진행하였고 원심분리를 통해 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 다시 회수된 균체에 20ml lysis buffer(50mM Tris-HCl pH 8.0, 100mM NaCl, 10mM imidazole)를 가하여 재분산시킨 다음 sonication과 원심분리를 통해 조효소액을 확보하였다. 조효소액을 Ni-NTA resin(Qiagen, Cat no. 30230)에 흘려주어 흡착시킨 다음, washing buffer(lysis buffer 조성중 imidazole 농도만 20mM), Elution buffer(lysis buffer 조성에서 imidazole만 250mM)를 차례로 흘려주어 정제된 조합 변이체를 획득하였다.
실험예 1. 만난아제 변이체의 pH별 활성 확인
만난아제 변이체의 pH별 활성측정을 위하여, 상기 실시예 1-2 및 실시예 2-2에서 각각 정제된 변이체 및 정제 AnMAN 적당량을 0.3%의 만난액과 섞어 pH5.5 아세트산 완충액 또는 pH 7.0 인산 완충액에서 효소반응 하였다. 이어서, 37℃에서 10분 반응 후 적당량의 DNS solution을 첨가하여 반응을 정지하였다. 이어서, 100℃에서 10분간 방치하여 발색 후, 540nm 흡광도에서 활성을 측정하여 평가하였다.
효소활성은 상대활성(%)으로 계산하여 도 1 및 하기 표 3에 나타내었다.
구체적으로, 야생주는 AnMAN을 코딩하는 유전자(서열번호 2)로 형질전환된 E.coli BL21 균주, SEQ ID NO: 3 내지 SEQ ID NO: 6은 각각 서열번호 3 내지 6의 변이체를 코딩하는 유전자로 각각 형질전환된 E.coli BL21 균주를 이용하여 생산한 효소의 활성을 나타낸 것이다.
그 결과, 도 1 및 상기 표 3에 나타난 바와 같이, pH 5.5 및 pH 7.0 조건에서 상대적으로 낮은 활성을 보이는 AnMAN(야생주)에 비해, 단일 변이체 3종(SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5)의 경우 각각 50%, 60%, 49% 더 높은 활성을 보였으며, 조합 변이체 1종(SEQ ID NO: 6)의 경우에도 77% 더 높은 활성을 나타냄을 확인하였다.
실험예 2. 만난아제 조합 변이체의 내열성 확인
만난아제 변이체의 내열성을 확인하기 위하여, AnMAN을 코딩하는 유전자(서열번호 2) 및 조합 변이체(서열번호 6)를 코딩하는 유전자로 각각 형질전환된 E.coli BL21 균주를 이용하여, 상기 실시예 1-2 및 실시예 2-2에서 각각 정제된 변이체 및 정제 AnMAN를 이용하여 내열성 평가를 진행하였다.
구체적으로, 40℃, 50℃, 60℃, 70℃ 및 80℃에 상기 정제된 변이체 및 정제 AnMAN를 각각 5분씩 방치하였으며, 이를 0.3%의 만난액 및 pH 5.5 아세트산 완충액과 혼합 후 37℃ 10분간 반응하였다. 반응 후 적당량의 DNS solution으로 반응을 정지하였다. 이어서, 혼합액을 100℃에서 10분간 방치하여 발색하였고 540nm에서 측정하여 내열성을 평가하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 조합 변이체(SEQ ID NO: 6)는 AnMAN(wild type)와 유사한 내열성을 나타냄을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Modified polypeptide having mannanase activity <130> KPA211565-KR <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 345 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mannanase <400> 1 Ser Phe Ala Ser Thr Ser Gly Leu Gln Phe Thr Ile Asp Gly Glu Thr 1 5 10 15 Gly Tyr Phe Ala Gly Thr Asn Ser Tyr Trp Ile Gly Phe Leu Thr Asp 20 25 30 Asn Ala Asp Val Asp Leu Val Met Gly His Leu Lys Ser Ser Gly Leu 35 40 45 Lys Ile Leu Arg Val Trp Gly Phe Asn Asp Val Thr Ser Gln Pro Ser 50 55 60 Ser Gly Thr Val Trp Tyr Gln Leu His Gln Asp Gly Lys Ser Thr Ile 65 70 75 80 Asn Thr Gly Ala Asp Gly Leu Gln Arg Leu Asp Tyr Val Val Ser Ser 85 90 95 Ala Glu Gln His Asp Ile Lys Leu Ile Ile Asn Phe Val Asn Tyr Trp 100 105 110 Thr Asp Tyr Gly Gly Met Ser Ala Tyr Val Ser Ala Tyr Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Glu Thr Asp Phe Tyr Thr Ser Asp Thr Met Gln Ser Ala Tyr Gln 130 135 140 Thr Tyr Ile Lys Thr Val Val Glu Arg Tyr Ser Asn Ser Ser Ala Val 145 150 155 160 Phe Ala Trp Glu Leu Ala Asn Glu 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ttatttcgcc 60 ggtacaaata gttactggat cggttttctg accgacaacg cagatgtgga tcttgttatg 120 ggtcatctga aaagcagcgg cttgaagatc ctgcgtgtat ggggtttcaa cgacgttacc 180 tctcagccga gcagcgggac ggtctggtat caactgcacc aagatggaaa aagcaccatt 240 aacaccggtg cggatggcct ccagcgtctg gattacgtcg tgagcagcgc tgaacagcac 300 gatatcaaac tgattattaa cttcgtgaac tattggaccg actacggcgg tatgagcgcg 360 tacgtgagcg cgtacggcgg ctctggcgaa accgatttct acacctcgga taccatgcag 420 agcgcgtacc aaacctatat caaaaccgtg gtggagcgct atagcaacag cagcgctgtg 480 tttgcttggg aactggcaaa tgaaccgcgt tgcccgtctt gtgatacctc cgtgctgtac 540 aactggatcg agaaaacctc caaattcatc aagggtttag acgccgaccg catggtttgc 600 attggcgatg agggtttcgg cctgaacatc gacagcgatg gcagctaccc gtatcagttt 660 agcgaaggcc tgaattttac catgaatctg ggtattgaca ccatcgattt tggtacgttg 720 catctgtacc cagattcctg gggtacgtcc gacgactggg gcaacggttg gattaccgca 780 catggtgctg cgtgtaaagc agccggtaag ccgtgcctgc tggaagagta tggtgttacc 840 agcaatcatt gcagcgttga gggcagttgg caaaaaactg cgctgagcac gaccggtgtt 900 ggtgcggatc tgttttggca gtatggcgat gacctctcaa cgggcaaatc cccggatgat 960 ggcaacacta tttattacgg cacctctgac taccaatgtc tggttactga ccacgtcgcg 1020 gcgattggtt ctgcg 1035 <210> 3 <211> 345 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mannanase variant <400> 3 Ser Phe Ala Ser Thr Ser Gly Leu Gln Phe Thr Ile Asp Gly Glu Thr 1 5 10 15 Gly Tyr Phe Ala Gly Thr Asn Thr Tyr Trp Ile Gly Phe Leu Thr Asp 20 25 30 Asn Ala Asp Val Asp Leu Val Met Gly His Leu Lys Ser Ser Gly Leu 35 40 45 Lys Ile Leu Arg Val Trp Gly Phe Asn Asp Val Thr Ser Gln Pro Ser 50 55 60 Ser Gly Thr Val Trp Tyr Gln Leu His Gln Asp Gly Lys Ser Thr Ile 65 70 75 80 Asn Thr Gly Ala Asp Gly Leu Gln Arg Leu Asp Tyr Val Val Ser Ser 85 90 95 Ala Glu Gln His Asp Ile Lys Leu Ile Ile Asn Phe Val Asn Tyr Trp 100 105 110 Thr Asp Tyr Gly Gly Met Ser Ala Tyr Val Ser Ala Tyr Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Glu Thr Asp Phe Tyr Thr Ser Asp Thr Met Gln Ser Ala Tyr Gln 130 135 140 Thr Tyr Ile Lys Thr Val Val Glu Arg Tyr Ser Asn Ser Ser Ala Val 145 150 155 160 Phe Ala Trp Glu Leu Ala Asn Glu Pro Arg Cys Pro Ser Cys Asp Thr 165 170 175 Ser Val Leu Tyr Asn Trp Ile Glu Lys Thr Ser Lys Phe Ile Lys Gly 180 185 190 Leu Asp Ala Asp Arg Met Val Cys Ile Gly Asp Glu Gly Phe Gly Leu 195 200 205 Asn Ile Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Tyr Gln Phe Ser Glu Gly Leu 210 215 220 Asn Phe Thr Met Asn Leu Gly Ile Asp Thr Ile Asp Phe Gly Thr Leu 225 230 235 240 His Leu Tyr Pro Asp Ser Trp Gly Thr Ser Asp Asp Trp Gly Asn Gly 245 250 255 Trp Ile Thr Ala His Gly Ala Ala Cys Lys Ala Ala Gly Lys Pro Cys 260 265 270 Leu Leu Glu Glu Tyr Gly Val Thr Ser Asn His Cys Ser Val Glu Gly 275 280 285 Ser Trp Gln Lys Thr Ala Leu Ser Thr Thr Gly Val Gly Ala Asp Leu 290 295 300 Phe Trp Gln Tyr Gly Asp Asp Leu Ser Thr Gly Lys Ser Pro Asp Asp 305 310 315 320 Gly Asn Thr Ile Tyr Tyr Gly Thr Ser Asp Tyr Gln Cys Leu Val Thr 325 330 335 Asp His Val Ala Ala Ile Gly Ser Ala 340 345 <210> 4 <211> 345 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mannanase variant <400> 4 Ser Phe Ala Ser Thr Ser Gly Leu Gln Phe Thr Ile Asp Gly Glu Thr 1 5 10 15 Gly Tyr Phe Ala Gly Thr Asn Ser Tyr Trp Ile Gly Phe Leu Thr Asp 20 25 30 Asn Ala Asp Val Asp Leu Val Met Gly His Leu Lys Ser Ser Gly Leu 35 40 45 Lys Ile Leu Arg Val Trp Gly Phe Asn Asp Val Thr Ser Gln Pro Ser 50 55 60 Ser Gly Thr Val Trp Tyr Gln Leu His Gln Asp Gly Lys Ser Thr Ile 65 70 75 80 Asn Thr Gly Ala Asp Gly Leu Gln Arg Leu Asp Tyr Val Val Ser Ser 85 90 95 Ala Glu Gln His Asp Ile Lys Leu Ile Ile Asn Phe Val Asn Tyr Trp 100 105 110 Thr Asp Tyr Gly Gly Met Ser Ala Tyr Val Ser Ala Tyr Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Val Thr Asp Phe Tyr Thr Ser Asp Thr Met Gln Ser Ala Tyr Gln 130 135 140 Thr Tyr Ile Lys Thr Val Val Glu Arg Tyr Ser Asn Ser Ser Ala Val 145 150 155 160 Phe Ala Trp Glu Leu Ala Asn Glu Pro Arg Cys Pro Ser Cys Asp Thr 165 170 175 Ser Val Leu Tyr Asn Trp Ile Glu Lys Thr Ser Lys Phe Ile Lys Gly 180 185 190 Leu Asp Ala Asp Arg Met Val Cys Ile Gly Asp Glu Gly Phe Gly Leu 195 200 205 Asn Ile Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Tyr Gln Phe Ser Glu Gly Leu 210 215 220 Asn Phe Thr Met Asn Leu Gly Ile Asp Thr Ile Asp Phe Gly Thr Leu 225 230 235 240 His Leu Tyr Pro Asp Ser Trp Gly Thr Ser Asp Asp Trp Gly Asn Gly 245 250 255 Trp Ile Thr Ala His Gly Ala Ala Cys Lys Ala Ala Gly Lys Pro Cys 260 265 270 Leu Leu Glu Glu Tyr Gly Val Thr Ser Asn His Cys Ser Val Glu Gly 275 280 285 Ser Trp Gln Lys Thr Ala Leu Ser Thr Thr Gly Val Gly Ala Asp Leu 290 295 300 Phe Trp Gln Tyr Gly Asp Asp Leu Ser Thr Gly Lys Ser Pro Asp Asp 305 310 315 320 Gly Asn Thr Ile Tyr Tyr Gly Thr Ser Asp Tyr Gln Cys Leu Val Thr 325 330 335 Asp His Val Ala Ala Ile Gly Ser Ala 340 345 <210> 5 <211> 345 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mannanase variant <400> 5 Ser Phe Ala Ser Thr Ser Gly Leu Gln Phe Thr Ile Asp Gly Glu Thr 1 5 10 15 Gly Tyr Phe Ala Gly Thr Asn Ser Tyr Trp Ile Gly Phe Leu Thr Asp 20 25 30 Asn Ala Asp Val Asp Leu Val Met Gly His Leu Lys Ser Ser Gly Leu 35 40 45 Lys Ile Leu Arg Val Trp Gly Phe Asn Asp Val Thr Ser Gln Pro Ser 50 55 60 Ser Gly Thr Val Trp Tyr Gln Leu His Gln Asp Gly Lys Ser Thr Ile 65 70 75 80 Asn Thr Gly Ala Asp Gly Leu Gln Arg Leu Asp Tyr Val Val Ser Ser 85 90 95 Ala Glu Gln His Asp Ile Lys Leu Ile Ile Asn Phe Val Asn Tyr Trp 100 105 110 Thr Asp Tyr Gly Gly Met Ser Ala Tyr Val Ser Ala Tyr Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Glu Thr Asp Phe Tyr Thr Ser Asp Thr Met Gln Ser Ala Tyr Gln 130 135 140 Thr Tyr Ile Lys Thr Val Val Glu Arg Tyr Ser Asn Ser Ser Ala Val 145 150 155 160 Phe Ala Trp Glu Leu Ala Asn Glu Pro Arg Cys Pro Ser Cys Asp Thr 165 170 175 Ser Val Leu Tyr Asn Trp Ile Glu Lys Thr Ser Lys Phe Ile Lys Gly 180 185 190 Leu Asp Ala Asp Arg Met Val Cys Ile Gly Asp Glu Gly Phe Gly Leu 195 200 205 Asn Ile Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Tyr Gln Phe Ser Glu Gly Leu 210 215 220 Asn Phe Thr Met Asn Leu Gly Ile Asp Thr Ile Asp Phe Gly Thr Leu 225 230 235 240 His Leu Tyr Pro Asp Ser Trp Gly Thr Ser Asp Asp Trp Gly Asn Gly 245 250 255 Trp Ile Thr Ala His Cys Ala Ala Cys Lys Ala Ala Gly Lys Pro Cys 260 265 270 Leu Leu Glu Glu Tyr Gly Val Thr Ser Asn His Cys Ser Val Glu Gly 275 280 285 Ser Trp Gln Lys Thr Ala Leu Ser Thr Thr Gly Val Gly Ala Asp Leu 290 295 300 Phe Trp Gln Tyr Gly Asp Asp Leu Ser Thr Gly Lys Ser Pro Asp Asp 305 310 315 320 Gly Asn Thr Ile Tyr Tyr Gly Thr Ser Asp Tyr Gln Cys Leu Val Thr 325 330 335 Asp His Val Ala Ala Ile Gly Ser Ala 340 345 <210> 6 <211> 345 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mannanase variant <400> 6 Ser Phe Ala Ser Thr Ser Gly Leu Gln Phe Thr Ile Asp Gly Glu Thr 1 5 10 15 Gly Tyr Phe Ala Gly Thr Asn Thr Tyr Trp Ile Gly Phe Leu Thr Asp 20 25 30 Asn Ala Asp Val Asp Leu Val Met Gly His Leu Lys Ser Ser Gly Leu 35 40 45 Lys Ile Leu Arg Val Trp Gly Phe Asn Asp Val Thr Ser Gln Pro Ser 50 55 60 Ser Gly Thr Val Trp Tyr Gln Leu His Gln Asp Gly Lys Ser Thr Ile 65 70 75 80 Asn Thr Gly Ala Asp Gly Leu Gln Arg Leu Asp Tyr Val Val Ser Ser 85 90 95 Ala Glu Gln His Asp Ile Lys Leu Ile Ile Asn Phe Val Asn Tyr Trp 100 105 110 Thr Asp Tyr Gly Gly Met Ser Ala Tyr Val Ser Ala Tyr Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Val Thr Asp Phe Tyr Thr Ser Asp Thr Met Gln Ser Ala Tyr Gln 130 135 140 Thr Tyr Ile Lys Thr Val Val Glu Arg Tyr Ser Asn Ser Ser Ala Val 145 150 155 160 Phe Ala Trp Glu Leu Ala Asn Glu Pro Arg Cys Pro Ser Cys Asp Thr 165 170 175 Ser Val Leu Tyr Asn Trp Ile Glu Lys Thr Ser Lys Phe Ile Lys Gly 180 185 190 Leu Asp Ala Asp Arg Met Val Cys Ile Gly Asp Glu Gly Phe Gly Leu 195 200 205 Asn Ile Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Tyr Gln Phe Ser Glu Gly Leu 210 215 220 Asn Phe Thr Met Asn Leu Gly Ile Asp Thr Ile Asp Phe Gly Thr Leu 225 230 235 240 His Leu Tyr Pro Asp Ser Trp Gly Thr Ser Asp Asp Trp Gly Asn Gly 245 250 255 Trp Ile Thr Ala His Gly Ala Ala Cys Lys Ala Ala Gly Lys Pro Cys 260 265 270 Leu Leu Glu Glu Tyr Gly Val Thr Ser Asn His Cys Ser Val Glu Gly 275 280 285 Ser Trp Gln Lys Thr Ala Leu Ser Thr Thr Gly Val Gly Ala Asp Leu 290 295 300 Phe Trp Gln Tyr Gly Asp Asp Leu Ser Thr Gly Lys Ser Pro Asp Asp 305 310 315 320 Gly Asn Thr Ile Tyr Tyr Gly Thr Ser Asp Tyr Gln Cys Leu Val Thr 325 330 335 Asp His Val Ala Ala Ile Gly Ser Ala 340 345 <210> 7 <211> 383 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mannanase <400> 7 Met Lys Leu Ser Asn Ala Leu Leu Thr Leu Ala Ser Leu Ala Leu Ala 1 5 10 15 Asn Val Ser Thr Ala Leu Pro Lys Ala Ser Pro Ala Pro Ser Thr Ser 20 25 30 Ser Ser Ala Ala Ser Thr Ser Phe Ala Ser Thr Ser Gly Leu Gln Phe 35 40 45 Thr Ile Asp Gly Glu Thr Gly Tyr Phe Ala Gly Thr Asn Ser Tyr Trp 50 55 60 Ile Gly Phe Leu Thr Asp Asn Ala Asp Val Asp Leu Val Met Gly His 65 70 75 80 Leu Lys Ser Ser Gly Leu Lys Ile Leu Arg Val Trp Gly Phe Asn Asp 85 90 95 Val Thr Ser Gln Pro Ser Ser Gly Thr Val Trp Tyr Gln Leu His Gln 100 105 110 Asp Gly Lys Ser Thr Ile Asn Thr Gly Ala Asp Gly Leu Gln Arg Leu 115 120 125 Asp Tyr Val Val Ser Ser Ala Glu Gln His Asp Ile Lys Leu Ile Ile 130 135 140 Asn Phe Val Asn Tyr Trp Thr Asp Tyr Gly Gly Met Ser Ala Tyr Val 145 150 155 160 Ser Ala Tyr Gly Gly Ser Gly Glu Thr Asp Phe Tyr Thr Ser Asp Thr 165 170 175 Met Gln Ser Ala Tyr Gln Thr Tyr Ile Lys Thr Val Val Glu Arg Tyr 180 185 190 Ser Asn Ser Ser Ala Val Phe Ala Trp Glu Leu Ala Asn Glu Pro Arg 195 200 205 Cys Pro Ser Cys Asp Thr Ser Val Leu Tyr Asn Trp Ile Glu Lys Thr 210 215 220 Ser Lys Phe Ile Lys Gly Leu Asp Ala Asp Arg Met Val Cys Ile Gly 225 230 235 240 Asp Glu Gly Phe Gly Leu Asn Ile Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Tyr 245 250 255 Gln Phe Ser Glu Gly Leu Asn Phe Thr Met Asn Leu Gly Ile Asp Thr 260 265 270 Ile Asp Phe Gly Thr Leu His Leu Tyr Pro Asp Ser Trp Gly Thr Ser 275 280 285 Asp Asp Trp Gly Asn Gly Trp Ile Thr Ala His Gly Ala Ala Cys Lys 290 295 300 Ala Ala Gly Lys Pro Cys Leu Leu Glu Glu Tyr Gly Val Thr Ser Asn 305 310 315 320 His Cys Ser Val Glu Gly Ser Trp Gln Lys Thr Ala Leu Ser Thr Thr 325 330 335 Gly Val Gly Ala Asp Leu Phe Trp Gln Tyr Gly Asp Asp Leu Ser Thr 340 345 350 Gly Lys Ser Pro Asp Asp Gly Asn Thr Ile Tyr Tyr Gly Thr Ser Asp 355 360 365 Tyr Gln Cys Leu Val Thr Asp His Val Ala Ala Ile Gly Ser Ala 370 375 380 <210> 8 <211> 1149 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mannanase <400> 8 atgaagcttt ccaacgccct cctcaccctg gctagcctgg cgctggccaa cgtctccacg 60 gctctgccga aagcctcccc tgcaccgagc accagcagca gtgctgcctc caccagcttc 120 gccagcactt ctgggcttca atttaccatc gacggtgaga caggctactt cgcgggtaca 180 aattcttact ggatcggatt cttgaccgat aatgccgacg ttgaccttgt gatgggtcat 240 cttaagagta gtgggttaaa aattcttaga gtctgggggt tcaatgatgt gacttcgcag 300 ccctccagcg gaaccgtgtg gtaccaactt catcaggatg gaaagtccac tattaacacg 360 ggcgcggatg gcttgcagcg cctggactac gttgtatcga gcgccgagca acacgatatc 420 aaacttatca taaacttcgt aaattattgg acagattacg gtggaatgtc agcgtacgtt 480 agcgcttacg gtggatctgg tgaaacagac ttttacactt cagacacgat gcagtcagcc 540 tatcagacct atattaagac cgtagtggaa cgctactcga attcatcagc ggtgtttgcg 600 tgggaattgg caaatgagcc acgttgcccc tcttgcgata ctagtgttct ttacaactgg 660 attgaaaaga catcaaaatt catcaaaggt ctggacgcag acagaatggt ttgtatcgga 720 gatgagggct tcggattaaa catcgactct gacgggtcat atccatatca attctccgaa 780 gggttaaatt ttactatgaa cttagggata gacactattg atttcggtac gctgcacttg 840 taccctgact cctggggcac ctcggatgat tggggaaatg gctggataac ggctcatggt 900 gcggcatgca aggccgctgg aaaaccatgt ttattagagg agtacggcgt cacaagcaat 960 cattgcagcg tggaaggtag ttggcaaaag acagcactgt caaccacagg ggtcggcgcg 1020 gacctgtttt ggcagtacgg ggatgactta agcacaggaa agtcccccga tgatggaaat 1080 acaatatact acggtacatc tgattaccag tgcctggtta ctgaccatgt cgccgccatc 1140 ggctctgca 1149 <210> 9 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ORF(AnMAN)-F <400> 9 ttcgtgatat actgataata aattgaattt tcacact 37 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ORF(AnMAN)-R <400> 10 aaacagccaa gcttgcatgc ct 22 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vector-F <400> 11 atgcaagctt ggctgttttg g 21 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vector-R <400> 12 attatcagta tatcacgaac aaaaaagag 29 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID NO: 3-N <400> 13 gcgggtacaa atacctactg gatcgga 27 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID NO: 3-R <400> 14 tccgatccag taggtatttg tacccgc 27 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID NO: 4-N <400> 15 ggtggatctg gtgtgacaga cttttac 27 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID NO: 4-R <400> 16 gtaaaagtct gtcacaccag atccacc 27

Claims (13)

  1. 만난아제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드로서,
    상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 3 내지 6 중 어느 하나의 서열번호로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 변이형 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드에 비하여 pH 5.0 내지 pH 9.0에서의 효소활성이 증가한 것인, 변이형 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드에 비하여 내열성 및/또는 열안정성이 증가한 것인, 변이형 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 변이형 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 변이형 폴리펩티드 또는 상기 변이형 폴리펩티드를 포함하는 만난-함유 물질과의 반응용 조성물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 변이형 폴리펩티드, 상기 변이형 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포, 및/또는 상기 변이형 폴리펩티드를 포함하는 조성물과 만난-함유 물질을 접촉시키는 것을 포함하는, 만노스, 만노비오스, 만노트리오스 또는 긴 사슬의 만노올리고당을 제조하는 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 변이형 폴리펩티드, 상기 변이형 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포, 및/또는 상기 변이형 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 기질에 처리시키는 것을 포함하는, 만난-함유 물질을 분해하는 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 변이형 폴리펩티드를 코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
  9. 제8항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조체.
  10. 제8항의 폴리뉴클레오티드 또는 제9항의 핵산 구조체를 포함하는 벡터.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 변이형 폴리펩티드, 제8항의 폴리뉴클레오티드, 제9항의 핵산 구조체, 및/또는 제10항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
  12. 제11항의 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는,
    만난아제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드를 제조하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 배양단계에서 발현되는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 만난아제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드를 회수하는 단계를 더 포함하는,
    만난아제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드를 제조하는 방법.
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