BR112019023133B1 - DRY COMPOSITION COMPRISING B. LICHENIFORMIS, B. PUMILUS AND B. AMILOLIQUEFACIENS, LIQUID MIXTURE FOR PEST CONTROL, THEIR METHOD OF PREPARATION AND METHODS OF CONTROLLING NEMATODES AND/OR FUNGAL INFECTIONS AROUND PLANTS - Google Patents

Abstract

Métodos de controle de pragas agrícolas são descritos. Uma mistura líquida aerada é formada a partir de uma composição contendo uma fonte de nutriente bacteriano, um composto contendo nitrogênio, um composto contendo fosfato, um composto contendo magnésio, um tampão, um indutor de quitinase, e pelo menos uma cepa de bactérias que produz quitinase. A mistura líquida é administrada ao solo e às plantas, e atua como um pesticida biológico orgânico.Agricultural pest control methods are described. An aerated liquid mixture is formed from a composition containing a bacterial nutrient source, a nitrogen-containing compound, a phosphate-containing compound, a magnesium-containing compound, a buffer, a chitinase inducer, and at least one strain of bacteria that produces chitinase. The liquid mixture is administered to the soil and plants, and acts as an organic biological pesticide.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOSCROSS REFERENCE TO RELATED ORDERS

[0001] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente Provisório US número de série 62/501.500, depositado em 4 de maio de 2017. A totalidade deste pedido é incorporada aqui completamente por referência.[0001] This application claims priority to US Provisional Patent Application serial number 62/501,500, filed May 4, 2017. The entirety of this application is incorporated herein in its entirety by reference.

FUNDAMENTOSFUNDAMENTALS

[0002] A presente invenção refere-se a métodos para controle de pragas, particularmente pragas agrícolas que infestam e reduzem o rendimento na agricultura comercial, isto é, através da otimização de produção de enzimas de degradação de quitina e outras enzimas extracelulares. Composições para uso em tais métodos também são descritas.[0002] The present invention relates to methods for controlling pests, particularly agricultural pests that infest and reduce yields in commercial agriculture, that is, through optimizing the production of chitin degradation enzymes and other extracellular enzymes. Compositions for use in such methods are also described.

[0003] Várias pragas atacam culturas e são prejudiciais para a saúde da planta. Exemplos de tais pragas incluem nematóides ou nematelmintos, tais como nematóides de nós da raiz. Outras infestações de cultura podem incluir sigatoka negra, uma doença de mancha foliar de bananeiras causada pelo fungo Mycosphaerella fijiensis, que é a principal doença fúngica que afeta as culturas de banana; e besouros tais como Monochamus alternatus. Muitas outras doenças de plantas são causadas por organismos fúngicos, tais como botritis e míldio pulverulento. De um modo geral, paredes de células de plantas contêm celulose, enquanto paredes de células de fungos contêm quitina.[0003] Various pests attack crops and are harmful to the health of the plant. Examples of such pests include nematodes or roundworms, such as root knot nematodes. Other crop infestations may include black Sigatoka, a banana leaf spot disease caused by the fungus Mycosphaerella fijiensis, which is the main fungal disease affecting banana crops; and beetles such as Monochamus alternatus. Many other plant diseases are caused by fungal organisms, such as botrytis and powdery mildew. Generally speaking, plant cell walls contain cellulose, while fungal cell walls contain chitin.

[0004] A fim de controlar tais infestações, plantas podem ser alternadas ou tratadas com antagonistas naturais, incluindo biopesticidas. Biopesticidas, uma abreviatura comum de “pesticidas biológicos”, incluem vários tipos de manejo de pragas. Comumente associados com controles biológicos, os biopesticidas são obtidos a partir de organismos incluindo plantas, bactérias e outros micróbios, fungos, nematóides, etc. Tais componentes têm servido como substitutos para produtos químicos sintéticos de proteção de plantas.[0004] In order to control such infestations, plants can be alternated or treated with natural antagonists, including biopesticides. Biopesticides, a common abbreviation for “biological pesticides,” include several types of pest management. Commonly associated with biological controls, biopesticides are obtained from organisms including plants, bacteria and other microbes, fungi, nematodes, etc. Such components have served as substitutes for synthetic plant protection chemicals.

BREVE DESCRIÇÃOBRIEF DESCRIPTION

[0005] São descritos aqui, em várias modalidades, métodos para controlar pragas. Isto é realizado, em parte, por administração de uma mistura líquida aerada que atua como um biopesticida. A mistura líquida aerada pode ser feita misturando água com uma composição seca que compreende pelo menos uma cepa de bactérias que produz quitinase; uma fonte de nutriente bacteriano; um composto contendo nitrogênio; um composto contendo fosfato; um composto contendo magnésio; um tampão; e um indutor de quitinase. A mistura líquida aerada é um biopesticida mais potente do que a mistura líquida não aerada. A mistura líquida não aerada, aplicada diretamente ao solo ou como uma pulverização foliar mostra alguma eficácia, enquanto a mistura aerada mostra eficácia extremamente intensificada.[0005] Methods for controlling pests are described herein, in various embodiments. This is accomplished, in part, by administering an aerated liquid mixture that acts as a biopesticide. The aerated liquid mixture can be made by mixing water with a dry composition comprising at least one strain of bacteria that produces chitinase; a bacterial nutrient source; a nitrogen-containing compound; a phosphate-containing compound; a magnesium-containing compound; a tampon; and a chitinase inducer. The aerated liquid mixture is a more potent biopesticide than the non-aerated liquid mixture. The non-aerated liquid mixture, applied directly to the soil or as a foliar spray shows some effectiveness, while the aerated mixture shows extremely enhanced effectiveness.

[0006] O processo de aeração para esta mistura líquida resulta na produção intensificada de várias enzimas extracelulares que promovem o crescimento da planta atacando as pragas da planta. Tais enzimas incluem quitinase, protease, amilase, e lipase, são esperadas como operando na interface raiz/solo (isto é, a rizosfera) quando aplicadas diretamente no solo. A mesma mistura aplicada como uma pulverização foliar irá operar contra infecções fúngicas da planta. A mistura líquida também não é tóxica para animais e humanos.[0006] The aeration process for this liquid mixture results in the enhanced production of several extracellular enzymes that promote plant growth by attacking plant pests. Such enzymes, including chitinase, protease, amylase, and lipase, are expected to operate at the root/soil interface (i.e., the rhizosphere) when applied directly to soil. The same mixture applied as a foliar spray will work against fungal infections of the plant. The liquid mixture is also non-toxic to animals and humans.

[0007] Em alguns aspectos, a presente invenção é dirigida a composições secas, e método de utilização da mesma, para reduzir as populações de nematóides. As composições secas contêm uma fonte de nutriente bacteriano, um indutor de quitinase, e pelo menos uma cepa de bactérias que produz quitinase. Outros ingredientes incluem um composto contendo nitrogênio; um composto contendo fosfato; um composto contendo magnésio; e um tampão.[0007] In some aspects, the present invention is directed to dry compositions, and method of using the same, to reduce nematode populations. The dry compositions contain a bacterial nutrient source, a chitinase inducer, and at least one strain of bacteria that produces chitinase. Other ingredients include a nitrogen-containing compound; a phosphate-containing compound; a magnesium-containing compound; and a tampon.

[0008] A pelo menos uma cepa de bactérias que produz quitinase pode ser selecionada dentre Bacillus, Aeromonas, Serratia, Vibrio, Streptomyces, Pseudomonas, ou Klebsiella. Em modalidades particulares, as bactérias compreendem Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, Bacillus amiloliquefaciens, e/ou Bacillus subtilis.[0008] At least one strain of bacteria that produces chitinase can be selected from Bacillus, Aeromonas, Serratia, Vibrio, Streptomyces, Pseudomonas, or Klebsiella. In particular embodiments, the bacteria comprise Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, Bacillus amiloliquefaciens, and/or Bacillus subtilis.

[0009] O composto contendo nitrogênio pode ser selecionado dentre um grupo compreendendo cloreto de amônio, nitrato de amônio, sulfato de amônio, e fosfato de amônio. Em modalidades particulares, o composto contendo nitrogênio é cloreto de amônio.[0009] The nitrogen-containing compound can be selected from a group comprising ammonium chloride, ammonium nitrate, ammonium sulfate, and ammonium phosphate. In particular embodiments, the nitrogen-containing compound is ammonium chloride.

[0010] O composto contendo fosfato pode ser selecionado dentre um grupo compreendendo fosfato dipotássico, ácido fosfórico, fosfato de diamônio, fosfato dissódico, fosfato monossódico, e tripolifosfato de sódio. Em modalidades particulares, o composto contendo fosfato é fosfato dipotássico.[0010] The phosphate-containing compound can be selected from a group comprising dipotassium phosphate, phosphoric acid, diammonium phosphate, disodium phosphate, monosodium phosphate, and sodium tripolyphosphate. In particular embodiments, the phosphate-containing compound is dipotassium phosphate.

[0011] O composto contendo magnésio pode ser selecionado dentre um grupo compreendendo sulfato de magnésio e cloreto de magnésio. Em modalidades particulares, o composto contendo magnésio é sulfato de magnésio.[0011] The magnesium-containing compound can be selected from a group comprising magnesium sulfate and magnesium chloride. In particular embodiments, the magnesium-containing compound is magnesium sulfate.

[0012] O tampão pode ser selecionado dentre um grupo compreendendo bicarbonato de sódio ou carbonato de sódio (isto é, carbonato de sódio). Em modalidades particulares, o tampão é bicarbonato de sódio.[0012] The buffer may be selected from a group comprising sodium bicarbonate or sodium carbonate (i.e., sodium carbonate). In particular embodiments, the buffer is sodium bicarbonate.

[0013] O indutor de quitinase é uma substância que promove a produção de quitinase a partir das bactéria. O indutor de quitinase pode ser quitina (por exemplo, coloidal ou finamente moída/ triturada), celulose, queratina, quitosano, ou um derivado de quitina tal como oligômeros de N-acetilglucosamina (GlcNAc).[0013] The chitinase inducer is a substance that promotes the production of chitinase from bacteria. The chitinase inducer can be chitin (e.g., colloidal or finely ground/crushed), cellulose, keratin, chitosan, or a chitin derivative such as N-acetylglucosamine (GlcNAc) oligomers.

[0014] Ainda em outro aspecto adicional, a presente invenção refere-se a métodos para preparar uma mistura líquida aerada para controle de pragas. Água é combinada com uma composição seca como descrito acima para obter uma mistura líquida. A mistura líquida é então aerada durante um primeiro período de tempo em uma primeira temperatura para produzir uma mistura líquida aerada contendo pelo menos quitinase, e potencialmente outras enzimas extracelulares também.[0014] In yet another additional aspect, the present invention relates to methods for preparing an aerated liquid mixture for pest control. Water is combined with a dry composition as described above to obtain a liquid mixture. The liquid mixture is then aerated for a first period of time at a first temperature to produce an aerated liquid mixture containing at least chitinase, and potentially other extracellular enzymes as well.

[0015] Cerca de 1 a 2 libras (0,45 a 0,9 kg) da composição seca é combinado com de 100 litros a 400 litros de água. O primeiro período de tempo pode ser de cerca de 8 horas a cerca de 168 horas, ou de cerca de 24 horas a cerca de 120 horas, ou de cerca de 48 horas a cerca de 72 horas. A primeira temperatura pode ser de cerca de 15°C a cerca de 40°C, ou de cerca de 23°C a cerca de 40°C, ou de cerca de 23°C a cerca de 30°C. A mistura líquida pode permanecer dentro de uma faixa de pH de cerca de 6,5 a cerca de 9,5 durante a aeração.[0015] About 1 to 2 pounds (0.45 to 0.9 kg) of the dry composition is combined with 100 liters to 400 liters of water. The first period of time may be from about 8 hours to about 168 hours, or from about 24 hours to about 120 hours, or from about 48 hours to about 72 hours. The first temperature may be from about 15°C to about 40°C, or from about 23°C to about 40°C, or from about 23°C to about 30°C. The liquid mixture can remain within a pH range of about 6.5 to about 9.5 during aeration.

[0016] Em um terceiro aspecto, a presente invenção refere-se a misturas líquidas aeradas feitas usando as composições secas e métodos descritos aqui. Tais misturas líquidas aeradas podem conter pelo menos 25 U/mL de quitinase, e também podem conter outras enzimas tais como celulase, amilase, protease ou lipase.[0016] In a third aspect, the present invention relates to aerated liquid mixtures made using the dry compositions and methods described here. Such aerated liquid mixtures may contain at least 25 U/mL of chitinase, and may also contain other enzymes such as cellulase, amylase, protease or lipase.

[0017] Em um quarto aspecto, a presente invenção refere-se a métodos de controle de nematóides e/ou infecções fúngicas em torno de plantas, pulverizando uma mistura líquida aerada sobre ou em torno de plantas, em que a mistura líquida aerada é produzida como descrito acima. Cem litros da mistura líquida aerada são geralmente aplicados sobre cerca de 2000 metros quadrados (m2) a cerca de 4000 m2 de terra contendo as plantas.[0017] In a fourth aspect, the present invention relates to methods of controlling nematodes and/or fungal infections around plants by spraying an aerated liquid mixture on or around plants, wherein the aerated liquid mixture is produced as described above. One hundred liters of the aerated liquid mixture is generally applied over about 2000 square meters (m2) to about 4000 m2 of land containing the plants.

[0018] As plantas tratadas por estas misturas líquidas e métodos podem ser flores, plantas verdes, plantas lenhosas ou culturas tais como vegetais, frutas, milho, trigo, soja, etc. As pragas que são controladas por estes métodos podem incluir nematóides e fungos contendo quitina em suas paredes das células. Desejavelmente, a administração das misturas líquidas aeradas é tóxica para pragas, incluindo nematóides e fungos patogênicos das plantas.[0018] The plants treated by these liquid mixtures and methods can be flowers, green plants, woody plants or crops such as vegetables, fruits, corn, wheat, soybeans, etc. Pests that are controlled by these methods can include nematodes and fungi containing chitin in their cell walls. Desirably, administration of the aerated liquid mixtures is toxic to pests, including nematodes and plant pathogenic fungi.

[0019] Estas e outras características não limitantes da invenção são descritas mais particularmente baixo.[0019] These and other non-limiting features of the invention are described more particularly below.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOSBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0020] A patente ou depósito do pedido contém, pelo menos, um desenho colorido. Cópias desta publicação da patente ou do pedido de patente com desenho(s) colorido(s) serão fornecidas pelo Escritório mediante solicitação e pagamento da taxa necessária.[0020] The patent or application filing contains at least one color drawing. Copies of this patent publication or patent application with color drawing(s) will be provided by the Office upon request and payment of the required fee.

[0021] A seguir, é apresentada uma breve descrição dos desenhos, que são apresentados para fins de ilustração das modalidades exemplares descritas aqui e não para fins de limitação das mesmas.[0021] The following is a brief description of the drawings, which are presented for the purpose of illustrating the exemplary embodiments described here and not for the purpose of limiting them.

[0022] Figura 1 é uma representação gráfica de atividade de quitinase ao longo de 180 horas após a cominação de duas libras (0,9 kg) da mistura de pó seco com 200 litros de água e aerando a mistura. O pH também é mostrado, e está na mesma escala que a atividade de quitinase.[0022] Figure 1 is a graphical representation of chitinase activity over 180 hours after combining two pounds (0.9 kg) of the dry powder mixture with 200 liters of water and aerating the mixture. pH is also shown, and is on the same scale as chitinase activity.

[0023] Figura 2 é uma representação gráfica de nematóides J2 imóveis/paralisados de populações de Meloidogyne spp. mistas.[0023] Figure 2 is a graphical representation of immobile/paralyzed J2 nematodes from populations of Meloidogyne spp. mixed.

[0024] Figura 3 é uma imagem tomada com uma ampliação de 100x de nematóides J2 imobilizados de Meloidogyne spp. mistos colocados em suspensão no Produto 1.[0024] Figure 3 is an image taken at 100x magnification of immobilized J2 nematodes of Meloidogyne spp. mixed materials placed in suspension in Product 1.

[0025] Figura 4 é uma imagem tomada com uma ampliação de 100x de nematóides J2 imobilizados de Meloidogyne spp. mistos colocados em suspensão no Produto 2.[0025] Figure 4 is an image taken at 100x magnification of immobilized J2 nematodes of Meloidogyne spp. mixed materials placed in suspension in Product 2.

[0026] Figura 5 é uma imagem tomada com uma ampliação de 100x de nematóides J2 imobilizados de Meloidogyne spp. mistos colocados em suspensão no Produto 3.[0026] Figure 5 is an image taken at 100x magnification of immobilized J2 nematodes of Meloidogyne spp. mixed materials placed in suspension in Product 3.

[0027] Figura 6 é uma imagem tomada com uma ampliação de 100x tanto de J2 imobilizados como em movimento de Meloidogyne spp. mistos colocados em suspensão no Produto 5.[0027] Figure 6 is an image taken at 100x magnification of both immobilized and moving J2 of Meloidogyne spp. mixed materials placed in suspension in Product 5.

[0028] Figura 7 é uma imagem tomada com uma ampliação de 100x de nematóides J2 em movimento de Meloidogyne spp. mistos colocados em suspensão no Produto 6 (controle de água da bica estéril).[0028] Figure 7 is an image taken at 100x magnification of moving J2 nematodes of Meloidogyne spp. mixtures placed in suspension in Product 6 (sterile spout water control).

[0029] Figura 8 é uma imagem tomada com uma ampliação de 100x de nematóides J2 imobilizados de Meloidogyne spp. mistos colocados em suspensão no Produto 7 (controle negative com etanol a 70%).[0029] Figure 8 is an image taken at 100x magnification of immobilized J2 nematodes of Meloidogyne spp. mixed mixtures placed in suspension in Product 7 (negative control with 70% ethanol).

[0030] Figuras 9A-9F são um conjunto de seis gráficos mostrando os resultados de testes que usaram três quantidades diferentes e dois tipos diferentes de biopesticida (em pó e líquido). Em cada gráfico, o eixo y é a classificação ED, e se estende de 0 a 450 em incrementos de 50. O eixo x é dias, e se estende de 0 a 98 em incrementos de 14. As variantes em pó (que continham quitina) funcionaram melhor do que as variantes líquidas (que não continham quitina ou quitinase).[0030] Figures 9A-9F are a set of six graphs showing the results of tests that used three different amounts and two different types of biopesticide (powder and liquid). In each graph, the y-axis is ED rating, and spans from 0 to 450 in increments of 50. The x-axis is days, and spans from 0 to 98 in increments of 14. The powder variants (which contained chitin ) worked better than the liquid variants (which did not contain chitin or chitinase).

[0031] Figura 10 é um diagrama ilustrando o arranjo dos blocos de tratamento e células de tratamento usados em um experimento comparando um fungicida convencional, uma versão em pó não ativada de uma composição da presente invenção, e uma versão líquida ativada da composição.[0031] Figure 10 is a diagram illustrating the arrangement of treatment blocks and treatment cells used in an experiment comparing a conventional fungicide, an unactivated powder version of a composition of the present invention, and an activated liquid version of the composition.

[0032] Figura 11 é um gráficos comparando as classificações ED para os três tratamentos diferentes ao longo do tempo. O eixo y é a classificação ED, e se estende de 0 a 350 em incrementos de 50. O eixo x é dias, e se estende de 0 a 35 em incrementos de 7. T1 (Phyton-27) está em quadrados, T2 (PV) está em círculos, e T3 (LAV) está em triângulos.[0032] Figure 11 is a graph comparing the ED ratings for the three different treatments over time. The y-axis is ED rating, and spans from 0 to 350 in increments of 50. The x-axis is days, and spans from 0 to 35 in increments of 7. T1 (Phyton-27) is in squares, T2 ( PV) is in circles, and T3 (LAV) is in triangles.

DESCRIÇÃO DETALHADADETAILED DESCRIPTION

[0033] A presente invenção pode ser entendida mais rapidamente por referência à descrição detalhada seguinte de modalidades desejadas e aos exemplos incluídos aqui. No relatório seguinte e nas reivindicações que seguem, será feita referência a diversos termos que devem ser definidos como tendo os seguintes significados.[0033] The present invention can be more readily understood by reference to the following detailed description of desired embodiments and the examples included herein. In the following report and the claims that follow, reference will be made to several terms which are to be defined as having the following meanings.

[0034] Embora termos específicos sejam usados na descrição seguinte com o objetivo de clareza, estes termos são planejados apenas para se referirem à estrutura particular das modalidades selecionadas para ilustração nos desenhos, e não são planejados para definir ou limitar o escopo da invenção. Nos desenhos e na descrição seguinte abaixo, deve ser entendido que designações numéricas iguais se referem a componentes de função igual. Além disso, deve ser entendido que os desenhos não estão em escala.[0034] Although specific terms are used in the following description for the purpose of clarity, these terms are intended only to refer to the particular structure of the embodiments selected for illustration in the drawings, and are not intended to define or limit the scope of the invention. In the drawings and the following description below, it is to be understood that like numerical designations refer to components of equal function. Furthermore, it must be understood that the drawings are not to scale.

[0035] As formas no singular de "um”, "uma”, e "o", "a" incluem referências no plural, salvo se o contexto ditar claramente o contrário.[0035] The singular forms of "a", "a", and "the", "a" include plural references, unless the context clearly dictates otherwise.

[0036] Como usado no relatório e nas reivindicações, o termo "compreendendo" pode incluir as modalidades "consistindo em" e "consistindo essencialmente de”. Os termos “compreende(s)”, “inclui(s)”, “tendo”, “tem”, “pode”, “contém(s)”, e variantes dos mesmos, como usados aqui, são planejados para serem frases de transição abertas, termos, ou palavras que exigem a presença dos ingredientes/etapas designados e permitem a presença de outros ingredientes/ etapas. No entanto, tal descrição deve ser interpretada como descrevendo também composições ou processos como "consistindo em" e "consistindo essencialmente em" ingredientes/etapas enumeradas, que permitem apenas a presença de ingredientes/etapas designadas, junto com quaisquer impurezas que possam resultar dos mesmos, e excluem outros ingredientes/etapas.[0036] As used in the report and claims, the term “comprising” may include the embodiments “consisting of” and “consisting essentially of”. The terms “comprise(s)”, “include(s)”, “having” , “has”, “may”, “contain(s)”, and variants thereof, as used herein, are intended to be open transitional phrases, terms, or words that require the presence of the designated ingredients/steps and allow for presence of other ingredients/steps. However, such description should be interpreted as also describing compositions or processes as "consisting of" and "consisting essentially of" enumerated ingredients/steps, which permit only the presence of designated ingredients/steps, together with any impurities that may result from them, and exclude other ingredients/steps.

[0037] Valores numéricos no relatório e reivindicações deste pedido devem ser entendidos como incluindo valores numéricos que são os mesmos quando reduzidos ao mesmo número de algarismos significativos e valores numéricos que diferem do valor especificado por menos do que o erro experimental da técnica de medição convencional do tipo descrito no presente pedido para determinar o valor.[0037] Numerical values in the report and claims of this application are to be understood as including numerical values that are the same when reduced to the same number of significant figures and numerical values that differ from the specified value by less than the experimental error of conventional measurement technique of the type described in this application to determine value.

[0038] Todas as faixas descritas aqui são inclusivas dos pontos finais citados e independentemente combináveis (por exemplo, a faixa de “de 2 gramas a 10 gramas” é inclusiva dos pontos finais, 2 gramas e 10 gramas, e todos os valores intermediários).[0038] All ranges described here are inclusive of the aforementioned endpoints and independently combinable (for example, the range “from 2 grams to 10 grams” is inclusive of the endpoints, 2 grams and 10 grams, and all values in between) .

[0039] O termo “cerca de” pode ser usado para incluir qualquer valor numérico que pode variar sem mudar a função básica daquele valor. Quando usado com uma faixa, “cerca de” também descreve a faixa definida pelos valores absolutos dos dois pontos finais, por exemplo, “cerca de 2 a cerca de 4” descreve também a faixa “de 2 a 4”. O termo “cerca de” pode se referir a mais ou menos 10% do número indicado.[0039] The term “about” can be used to include any numerical value that can vary without changing the basic function of that value. When used with a range, “about” also describes the range defined by the absolute values of the two endpoints, for example, “about 2 to about 4” also describes the range “from 2 to 4”. The term “about” can refer to plus or minus 10% of the indicated number.

[0040] O termo “rizosfera” refere-se à região estreita de solo que é influenciada diretamente pelas secreções de raízes e microrganismos associados do solo.[0040] The term “rhizosphere” refers to the narrow region of soil that is directly influenced by root secretions and associated soil microorganisms.

[0041] O presente pedido refere-se a métodos para controle de pragas usando misturas líquidas que contêm quantidades elevadas de enzimas de degradação de quitina (isto é, quitinase) e outras enzimas extracelulares, tais como protease, amilase e lipase. As misturas líquidas são feitas combinando água com uma composição seca. As misturas líquidas podem ser usadas nesta forma, ou podem ser tornadas ainda mais eficazes através de aeração. As composições secas contêm bactérias que produzem as enzimas, e podem incluir também uma mistura de nutrientes para auxiliar o crescimento das bactérias. Quando estas composições são aplicadas na rizosfera, elas diminuem a mobilidade de pragas indesejáveis tais como nematóides. Quando estas composições são aplicadas nas superfícies da planta (acima do solo), elas diminuem o crescimento e reduzem a patogenicidade de infecções fúngicas. Estas mesmas bactérias também podem proporcionar benefícios de promoção de crescimento da planta, se aplicadas à rizosfera ou às superfícies da planta acima do solo.[0041] The present application relates to methods for controlling pests using liquid mixtures that contain high amounts of chitin-degrading enzymes (i.e., chitinase) and other extracellular enzymes, such as protease, amylase and lipase. Liquid mixtures are made by combining water with a dry composition. Liquid mixtures can be used in this form, or can be made even more effective through aeration. The dry compositions contain bacteria that produce the enzymes, and may also include a mixture of nutrients to aid the growth of the bacteria. When these compositions are applied to the rhizosphere, they decrease the mobility of undesirable pests such as nematodes. When these compositions are applied to plant surfaces (above ground), they slow growth and reduce the pathogenicity of fungal infections. These same bacteria can also provide plant growth-promoting benefits if applied to the rhizosphere or above-ground plant surfaces.

[0042] Plantas que podem ser tratadas incluem vegetais, frutas, flores, plantas folhosas verdes básicas, e culturas, incluindo milho. Pragas indesejáveis incluem especificamente nematóides, mas também podem incluir outras infestações de cultura, tais como sigatoka negra, uma doença de mancha foliar de plantas de banana causada pelo fungo ascomiceto Mycosphaerella fijiensis, e fungos contendo quitina em suas paredes celulares. Outras pragas indesejadas tais como besouros, e outras pragas que incluem quitina em sua estrutura em um estágio ou outro de seu ciclo de vida, serão controladas pela mistura líquida.[0042] Plants that can be treated include vegetables, fruits, flowers, basic green leafy plants, and crops, including corn. Undesirable pests specifically include nematodes, but may also include other crop infestations such as black Sigatoka, a leaf spot disease of banana plants caused by the ascomycete fungus Mycosphaerella fijiensis, and fungi containing chitin in their cell walls. Other unwanted pests such as beetles, and other pests that include chitin in their structure at one stage or another in their life cycle, will be controlled by the liquid mixture.

[0043] Inicialmente, a composição bacteriana seca compreende pelo menos uma cepa de bactérias que produz quitinase; uma fonte de nutriente bacteriano; um composto contendo nitrogênio; um composto contendo fosfato; um composto contendo magnésio; um tampão; e um indutor de quitinase.[0043] Initially, the dry bacterial composition comprises at least one strain of bacteria that produces chitinase; a bacterial nutrient source; a nitrogen-containing compound; a phosphate-containing compound; a magnesium-containing compound; a tampon; and a chitinase inducer.

[0044] As bactérias que produzem quitinase podem se originar de qualquer um dos gêneros Bacillus, Aeromonas, Serratia, Vibrio, Streptomyces, Pseudomonas e Klebsiella. É observado que uma ou mais cepas / espécies diferentes de bactérias podem estar presentes na composição seca. Em relação a Bacillus, B. licheniformis, B. pumilus, B. amiloliquefaciens, e B. subtilis são especialmente contemplados para uso. B. licheniformus pode ser usado para produzir quitinase ou celulase em uma taxa elevada. Tais cepas de B. licheniformus podem ser produzidas através de cultivo em placas da cepa usando meios que elucidam a produção de quitinase, então repetidamente cultivando e cultivando em placas e de modo cíclico a fim de expressar capacidade intensificada de produção de celulose e quitinase. Desejavelmente, as bactérias (singular ou plural) que é/são usada(s) devem ser selecionadas para produzir quitinase, assim como enzimas adicionais tais como protease, amilase, lipase e/ou celulase.[0044] Bacteria that produce chitinase can originate from any of the genera Bacillus, Aeromonas, Serratia, Vibrio, Streptomyces, Pseudomonas and Klebsiella. It is noted that one or more different strains/species of bacteria may be present in the dry composition. In relation to Bacillus, B. licheniformis, B. pumilus, B. amiloliquefaciens, and B. subtilis are especially contemplated for use. B. licheniformus can be used to produce chitinase or cellulase at a high rate. Such strains of B. licheniformus can be produced by plating the strain using media that elucidate chitinase production, then repeatedly plating and culturing in a cyclic manner in order to express enhanced cellulose and chitinase production capacity. Desirably, the bacteria (singular or plural) that is/are used should be selected to produce chitinase, as well as additional enzymes such as protease, amylase, lipase and/or cellulase.

[0045] Bactérias das mesmas espécies ou diferentes espécies podem ser usadas em qualquer razão uma com a outra.Em modalidades particulares, é contemplado que B. licheniformis, B. pumilus e B. amiloliquefaciens são usadas. 8. licheniformis pode ter uma alta taxa de produção de celulose e/ou uma alta taxa de produção de quitinase. B. pumilus é conhecida por promover o crescimento da planta. B. amiloliquefaciens produz protease, amilase, e lipase em taxas elevadas. Em modalidades particulares, a razão em peso de B. licheniformis para (B. pumilus + B. amiloliquefaciens) é de cerca de 2:1 a cerca de 3:1. B. subtilis também é contemplada como um organismo útil, uma vez que é fácil de fabricar e sendo bem conhecida pela capacidade de produção de enzima extracelular. Bactérias Bacillus tem vários traços desejáveis. Elas sobrevivem à liofilização e/ou secagem por pulverização, e têm uma vida útil longa uma vez secas e, assim, são úteis em uma mistura em pó seca.[0045] Bacteria of the same species or different species may be used in any ratio with each other. In particular embodiments, it is contemplated that B. licheniformis, B. pumilus and B. amiloliquefaciens are used. 8. licheniformis may have a high rate of cellulose production and/or a high rate of chitinase production. B. pumilus is known to promote plant growth. B. amyloliquefaciens produces protease, amylase, and lipase at high rates. In particular embodiments, the weight ratio of B. licheniformis to (B. pumilus + B. amiloliquefaciens) is from about 2:1 to about 3:1. B. subtilis is also contemplated as a useful organism since it is easy to manufacture and is well known for its extracellular enzyme production capacity. Bacillus bacteria have several desirable traits. They survive freeze-drying and/or spray drying, and have a long shelf life once dried and thus are useful in a dry powder mix.

[0046] É contemplado que a pelo menos uma cepa de bactérias está presente em uma composição seca em uma quantidade de pelo menos 1x106 UFC (isto é, 1E6 UFC) por grama de pó seco (na composição seca). Em modalidades adicionais, a pelo menos uma cepa de bactérias está presente na quantidade de cerca de 1x1010 UFC a cerca de 5x1012 UFC por quilograma (Kg) de pó seco, incluindo de cerca de 1x1011 UFC a cerca de 1x1012 UFC por Kg de pó seco. Uma concentração mais alta de bactérias em UFC por Kg de pó seco pode ser usada, mas quantidades além destas faixas indicadas aqui não parecem ser mais eficazes. Estes números de UFC podem ser considerados a quantidade “total” de bactérias também quando é usada mais do que uma espécie de bactérias. O termo “UFC” refere-se a unidades formadoras de colônia.[0046] It is contemplated that at least one strain of bacteria is present in a dry composition in an amount of at least 1x106 CFU (i.e., 1E6 CFU) per gram of dry powder (in the dry composition). In additional embodiments, the at least one strain of bacteria is present in an amount of from about 1x1010 CFU to about 5x1012 CFU per kilogram (Kg) of dry powder, including from about 1x1011 CFU to about 1x1012 CFU per Kg of dry powder. . A higher concentration of bacteria in CFU per kg of dry powder can be used, but amounts beyond these ranges indicated here do not appear to be more effective. These CFU numbers can be considered the “total” amount of bacteria also when more than one species of bacteria is used. The term “UFC” refers to colony-forming units.

[0047] A pelo menos uma cepa de bactérias está/estão presentes para produzir enzimas que atacaram as pragas. Estas enzimas incluem quitinase, protease, amilase, lipase e/ou celulase. Quitinase rompe ligações glicosídicas na quitina. Proteases geralmente rompem proteínas por hidrólise de ligações de peptídeos. Amilases rompem carboidratos de cadeia longa (isto é, amido) por hidrólise. Lipases hidrolisam gorduras/lipídeos. Celulases rompem celulose em açúcares simples.[0047] At least one strain of bacteria is/are present to produce enzymes that attack the pests. These enzymes include chitinase, protease, amylase, lipase and/or cellulase. Chitinase breaks glycosidic bonds in chitin. Proteases generally break down proteins by hydrolyzing peptide bonds. Amylases break down long-chain carbohydrates (i.e., starch) by hydrolysis. Lipases hydrolyze fats/lipids. Cellulases break down cellulose into simple sugars.

[0048] A fonte de nutriente bacteriano atua como uma fonte de carbono orgânico e fatores de crescimento bacteriano tais como aminoácidos e vitaminas. Muitos compostos diferentes podem ser usados, ou individualmente ou em uma mistura. Alguns exemplos de materiais que poderiam ser usados como uma fonte de nutriente bacteriano incluem peptona, triptona, caseína, aminoácidos, vitaminas, extrato de carne bovina, e extrato de levedura. Peptona refere-se a um derivado de proteína obtido por hidrólise parcial de proteínas, e é comumente usada no meio de cultura de célula.Triptona é comumente obtida por digestão de caseína com tripsina, sendo comumente usada para produzir caldo de cultura de células. Em modalidades particulares, extrato de levedura é usado como a fonte de nutrientes bacterianos. Extrato de levedura é produzido geralmente pela extração de conteúdos de células de levedura, tal como por autólise. A levedura a partir da qual o extrato de levedura é derivado é geralmente da classe Saccharomyces. É contemplado particularmente que a levedura é Saccharomyces cerevisiae (comumente conhecida como fermento de padaria). A fonte de nutriente bacteriano (e, particularmente o extrato de levedura) pode compreender de cerca de 3% em peso a cerca de 95% em peso, ou de cerca de 33% em peso a cerca de 93% em peso, ou mais do que 50% em peso, ou de cerca de 70% em peso a cerca de 80% em peso da composição seca. A fonte de nutriente bacteriano é geralmente a maior parte da composição seca.[0048] The bacterial nutrient source acts as a source of organic carbon and bacterial growth factors such as amino acids and vitamins. Many different compounds can be used, either individually or in a mixture. Some examples of materials that could be used as a bacterial nutrient source include peptone, tryptone, casein, amino acids, vitamins, beef extract, and yeast extract. Peptone refers to a protein derivative obtained by partial hydrolysis of proteins, and is commonly used in cell culture medium. Tryptone is commonly obtained by digestion of casein with trypsin, and is commonly used to produce cell culture broth. In particular embodiments, yeast extract is used as the source of bacterial nutrients. Yeast extract is generally produced by extracting the contents of yeast cells, such as by autolysis. The yeast from which yeast extract is derived is generally of the Saccharomyces class. It is particularly contemplated that the yeast is Saccharomyces cerevisiae (commonly known as baker's yeast). The bacterial nutrient source (and particularly the yeast extract) may comprise from about 3% by weight to about 95% by weight, or from about 33% by weight to about 93% by weight, or more than than 50% by weight, or from about 70% by weight to about 80% by weight of the dry composition. The bacterial nutrient source is generally the majority of the dry composition.

[0049] O composto contendo nitrogênio pode ser qualquer fonte que possa fornecer amônia, de modo direto ou indireto, para auxiliar as bactérias no crescimento e reprodução. Compostos que poderiam adicionar amônia indiretamente incluem compostos tais como ureia ou proteínas. No entanto, fontes diretas de amônia são preferidas de modo que nenhuma etapa intermediária é exigida para liberar a amônia e tornar a mesma disponível como uma fonte de alimento. Em modalidades particulares, o composto contendo nitrogênio pode ser pelo menos um de cloreto de amônio, nitrato de amônio, sulfato de amônio, ou um fosfato de amônio. Em modalidades específicas, o composto contendo nitrogênio é cloreto de amônio. É contemplado que o composto contendo nitrogênio pode compreender de cerca de 0,1% em peso a cerca de 5% em peso, ou de cerca de 0,25% em peso a cerca de 3% em peso, ou de cerca de 1% em peso a cerca de 2% em peso, ou de cerca de 1% em peso a cerca de 1,5% em peso da composição seca.[0049] The nitrogen-containing compound can be any source that can provide ammonia, directly or indirectly, to assist bacteria in growth and reproduction. Compounds that could add ammonia indirectly include compounds such as urea or proteins. However, direct sources of ammonia are preferred so that no intermediate steps are required to release the ammonia and make it available as a food source. In particular embodiments, the nitrogen-containing compound may be at least one of ammonium chloride, ammonium nitrate, ammonium sulfate, or ammonium phosphate. In specific embodiments, the nitrogen-containing compound is ammonium chloride. It is contemplated that the nitrogen-containing compound may comprise from about 0.1% by weight to about 5% by weight, or from about 0.25% by weight to about 3% by weight, or from about 1% by weight. by weight to about 2% by weight, or from about 1% by weight to about 1.5% by weight of the dry composition.

[0050] O composto contendo fosfato deve ser adicionado na forma mais biodisponível, isto é, ortofosfato solúvel. Em modalidades particulares, o composto contendo fosfato pode ser pelo menos um de fosfato dipotássico, ácido fosfórico, fosfato de diamônio, fosfato dissódico, fosfato monossódico, e tripolifosfato de sódio. Em modalidades específicas, o composto contendo fosfato é fosfato dipotássico. É contemplado que o composto contendo fosfato pode compreender de cerca de 0,1% em peso a cerca de 5% em peso, ou de cerca de 0,1% em peso a cerca de 1% em peso, ou de cerca de 0,5% em peso a cerca de 0,75% em peso da composição seca.[0050] The phosphate-containing compound must be added in the most bioavailable form, that is, soluble orthophosphate. In particular embodiments, the phosphate-containing compound may be at least one of dipotassium phosphate, phosphoric acid, diammonium phosphate, disodium phosphate, monosodium phosphate, and sodium tripolyphosphate. In specific embodiments, the phosphate-containing compound is dipotassium phosphate. It is contemplated that the phosphate-containing compound may comprise from about 0.1% by weight to about 5% by weight, or from about 0.1% by weight to about 1% by weight, or from about 0. 5% by weight to about 0.75% by weight of the dry composition.

[0051] O composto contendo magnésio pode ser qualquer fonte não tóxica de magnésio divalente. Compostos possíveis incluem sulfato de magnésio e cloreto de magnésio. Em modalidades específicas, o composto contendo magnésio é sulfato de magnésio. É contemplado que o composto contendo magnésio pode compreender de cerca de 0,1% em peso a cerca de 5% em peso, ou de cerca de 0,1% em peso a cerca de 1% em peso, ou de cerca de 0,5% em peso a cerca de 0,75% em peso da composição seca.[0051] The magnesium-containing compound can be any non-toxic source of divalent magnesium. Possible compounds include magnesium sulfate and magnesium chloride. In specific embodiments, the magnesium-containing compound is magnesium sulfate. It is contemplated that the magnesium-containing compound may comprise from about 0.1% by weight to about 5% by weight, or from about 0.1% by weight to about 1% by weight, or from about 0. 5% by weight to about 0.75% by weight of the dry composition.

[0052] O tampão é destinado a manter o nível de pH da mistura líquida uma vez que a composição seca é combinada com água e aerada. O tampão deve manter o nível de pH da composição entre 6,5 e 9,5 do início ao fim da duração do período de aeração. Em modalidades particulares, o tampão pode ser bicarbonato de sódio ou carbonato de sódio (isto é, carbonato de sódio). Em modalidades específicas, o tampão é bicarbonato de sódio. É contemplado que o tampão pode compreender de cerca de 5% em peso a cerca de 20% em peso, ou de cerca de 7% em peso a cerca de 16% em peso, ou de cerca de 12% em peso a cerca de 15% em peso da composição seca.[0052] The buffer is intended to maintain the pH level of the liquid mixture once the dry composition is combined with water and aerated. The buffer must maintain the pH level of the composition between 6.5 and 9.5 from the beginning to the end of the aeration period. In particular embodiments, the buffer may be sodium bicarbonate or sodium carbonate (i.e., sodium carbonate). In specific embodiments, the buffer is sodium bicarbonate. It is contemplated that the buffer may comprise from about 5% by weight to about 20% by weight, or from about 7% by weight to about 16% by weight, or from about 12% by weight to about 15% by weight. % by weight of the dry composition.

[0053] O indutor de quitinase é uma substância que promove a produção de quitinase a partir das bactérias. O indutor de quitinase pode ser quitina (por exemplo, coloidal ou finamente moída / triturada), celulose, queratina, quitosano, ou um derivado de quitina.[0053] The chitinase inducer is a substance that promotes the production of chitinase from bacteria. The chitinase inducer can be chitin (e.g., colloidal or finely ground/crushed), cellulose, keratin, chitosan, or a chitin derivative.

[0054] Preferivelmente, quitina é usada como o indutor de quitinase. A quitina pode ser uma fonte de diversas substâncias, incluindo paredes de células de fungos, exoesqueletos de artrópodes, como crustáceos (por exemplo, camarão e caranguejos) e insetos, rádulas de moluscos, bicos e conchas internas e cefalópodes, e escamas e tecidos moles de peixes e anfíbios. Em modalidades particulares, a quitina é originária de cascas de caranguejo e cascas de camarão. A quitina pode ser moída a fim de passar través de uma malha 325 padrão (isto é, aberturas de 0,0017 polegadas ou 44 micrômetros). A quitina pode ser adicionada em uma quantidade de cerca de 0,1% em peso a cerca de 15% em peso, ou de cerca de 0,1% em peso a cerca de 5% em peso, ou de cerca de 1% em peso a cerca de 2% em peso da composição seca.[0054] Preferably, chitin is used as the chitinase inducer. Chitin can be a source of diverse substances, including fungal cell walls, exoskeletons of arthropods such as crustaceans (e.g., shrimp and crabs) and insects, radulae of molluscs, beaks and inner shells and cephalopods, and scales and soft tissues of fish and amphibians. In particular embodiments, the chitin originates from crab shells and shrimp shells. Chitin can be ground to pass through a standard 325 mesh (i.e., 0.0017 inch or 44 micrometer openings). Chitin can be added in an amount of from about 0.1% by weight to about 15% by weight, or from about 0.1% by weight to about 5% by weight, or from about 1% by weight. weight to about 2% by weight of the dry composition.

[0055] Desejavelmente, a composição seca não inclui a presença de quaisquer amidos ou açúcares. A inclusão de baixos níveis de açúcares solúveis ou amidos exerce um forte efeito repressivo na produção de quitinase.[0055] Desirably, the dry composition does not include the presence of any starches or sugars. The inclusion of low levels of soluble sugars or starches exerts a strong repressive effect on chitinase production.

[0056] A composição bacteriana é seca, isto é, ela não contém água adicionada. A composição bacteriana seca pode ser fornecida na forma de um pó, grânulos ou pastilhas. Hidratação normal da umidade atmosférica não prejudica severamente a eficácia da composição, mas pode encurtar sua vida útil. É observado que extrato de levedura (que pode ser usado como a fonte de nutriente bacteriano) é higroscópico, e irá captar umidade do ar quando a composição não está completamente vedada.[0056] The bacterial composition is dry, that is, it does not contain added water. The dry bacterial composition may be provided in the form of a powder, granules or tablets. Normal hydration from atmospheric moisture does not severely impair the effectiveness of the composition, but may shorten its useful life. It is noted that yeast extract (which can be used as the bacterial nutrient source) is hygroscopic, and will capture moisture from the air when the composition is not completely sealed.

[0057] A composição bacteriana seca é usada para preparar uma mistura líquida que é subsequentemente aplicada no solo / plantas para controle de pragas. Água é combinada com a composição bacteriana seca para formar uma mistura líquida inicial ou de partida. Esta mistura líquida sozinha, quando aplicada no solo ou como uma pulverização foliar, terá alguma eficácia contra as pragas agrícolas descritas aqui. No entanto, para aumentar extremamente a eficácia, a mistura de partida é então aerada por um primeiro período de tempo em uma primeira temperatura para produzir a mistura líquida aerada. A mistura líquida aerada contém enzimas que incluem quitinase e outras, como protease, amilase, lipase e celulase. A mistura líquida aerada é cerca de 5 a 10 vezes mais efetiva do que a mistura líquida não aerada.[0057] The dry bacterial composition is used to prepare a liquid mixture which is subsequently applied to soil/plants for pest control. Water is combined with the dry bacterial composition to form an initial or starting liquid mixture. This liquid mixture alone, when applied to the soil or as a foliar spray, will have some effectiveness against the agricultural pests described here. However, to greatly increase effectiveness, the starting mixture is then aerated for a first period of time at a first temperature to produce the aerated liquid mixture. The aerated liquid mixture contains enzymes that include chitinase and others such as protease, amylase, lipase and cellulase. The aerated liquid mixture is about 5 to 10 times more effective than the non-aerated liquid mixture.

[0058] Para produzir a mistura, entre 1 libra e 2 libras (0,45 kg e 0,9 kg) da composição bacteriana em pó são combinadas com 100 litros a 400 litros de água. Em outras palavras, a razão peso/volume da composição seca para a água é de cerca de 0,0025 lb/litros (0,00113 kg/litro) a cerca de 0,02 lb/litros (0,00907/litro). Em modalidades específicas, duas libras (0,9 kg) da composição bacteriana em pó são adicionados a 200 litros de água. Quando o teor de orgânicos solúveis na mistura líquida é muito alto, a síntese de enzima extracelular útil é reprimida até muito tarde no crescimento aeróbico da mistura líquida para uso prático em aplicações de controle de pragas no mundo real.[0058] To produce the mixture, between 1 pound and 2 pounds (0.45 kg and 0.9 kg) of the powdered bacterial composition are combined with 100 liters to 400 liters of water. In other words, the weight/volume ratio of the dry composition to water is about 0.0025 lb/liter (0.00113 kg/liter) to about 0.02 lb/liter (0.00907/liter). In specific embodiments, two pounds (0.9 kg) of the powdered bacterial composition are added to 200 liters of water. When the soluble organic content in the liquid mixture is too high, useful extracellular enzyme synthesis is suppressed until too late in the aerobic growth of the liquid mixture for practical use in real-world pest control applications.

[0059] A composição bacteriana e mistura de água são então aeradas usando aeração de borbulhamento médio, suficientemente vigoroso para prover oxigenação e boa mistura. A aeração dura um primeiro período de tempo de cerca de 8 horas a cerca de 168 horas, ou de cerca de 24 horas a cerca de 120 horas, ou de cerca de 48 horas a cerca de 72 horas, ou em modalidades específicas, cerca de 72 horas. A este respeito, a produção de enzima geralmente começa em 12 a 24 horas e continua através de uma taxa de produção máxima de 24 horas a 72 horas, com uma diminuição gradual da taxa de produção após 72 horas.[0059] The bacterial composition and water mixture are then aerated using medium bubbling aeration, vigorous enough to provide oxygenation and good mixing. Aeration lasts for a first period of time from about 8 hours to about 168 hours, or from about 24 hours to about 120 hours, or from about 48 hours to about 72 hours, or in specific embodiments, about 72 hours. In this regard, enzyme production generally begins within 12 to 24 hours and continues through a maximum production rate from 24 hours to 72 hours, with a gradual decrease in production rate after 72 hours.

[0060] A mistura pode ser aerada em uma primeira temperatura de cerca de 15°C a cerca de 40°C, ou de cerca de 23°C a cerca de 40°C, ou de cerca de 23°C a cerca de 30°C. Em modalidades específicas, a mistura é aerada de 48 horas a 72 horas a 27°C. Como mencionado previamente, a mistura líquida desejavelmente permanece dentro de uma faixa de pH de cerca de 6,5 a cerca de 9,5 durante a aeração.[0060] The mixture can be aerated at a first temperature of about 15°C to about 40°C, or from about 23°C to about 40°C, or from about 23°C to about 30°C. °C. In specific embodiments, the mixture is aerated for 48 hours to 72 hours at 27°C. As previously mentioned, the liquid mixture desirably remains within a pH range of about 6.5 to about 9.5 during aeration.

[0061] A mistura líquida aerada resultante contém desejavelmente pelo menos 25 unidades/mL (U/mL) de quitinase. A mistura líquida aerada também pode conter outras enzimas tais como celulase, amilase, protease ou lipase. Uma unidade de atividade de quitinase é definida como a quantidade de enzima que produz 1 μmol de açúcar redutor como equivalente de N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc) por minuto.[0061] The resulting aerated liquid mixture desirably contains at least 25 units/mL (U/mL) of chitinase. The aerated liquid mixture may also contain other enzymes such as cellulase, amylase, protease or lipase. One unit of chitinase activity is defined as the amount of enzyme that produces 1 μmol of reducing sugar as N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) equivalent per minute.

[0062] A presente invenção também contempla métodos de controle de pragas, tais como nematóides e infecções fúngicas, em plantas, compreendendo pulverizar a mistura líquida aerada diretamente no solo, ou como uma pulverização foliar. Esta mistura aerada pode ser aplicada em culturas e plantas que necessitam de controle de pragas. Para problemas leves (isto é, até 25% de perda de cultura esperada ou típica), 100 litros de mistura aerada aplicada por 4000 m2 a cada 2-4 semanas deve controlar de modo adequado as pragas. Para problemas moderados (isto é, 25-50% de perda de cultura esperada ou típica), 100 litros de mistura aerada aplicada por 4000 m2 a cada 1-2 semanas deve controlar adequadamente as pragas. Para problemas severos (isto é, mais do que 50% de perda de cultura esperada ou típica), 100 litros de mistura aerada aplicados por 2000 m2 a cada sete dias devem controlar adequadamente as pragas.[0062] The present invention also contemplates methods of controlling pests, such as nematodes and fungal infections, on plants, comprising spraying the aerated liquid mixture directly onto the soil, or as a foliar spray. This aerated mixture can be applied to crops and plants that require pest control. For mild problems (i.e. up to 25% expected or typical crop loss), 100 liters of aerated mixture applied per 4000 m2 every 2-4 weeks should adequately control pests. For moderate problems (i.e. 25-50% expected or typical crop loss), 100 liters of aerated mix applied per 4000 m2 every 1-2 weeks should adequately control pests. For severe problems (i.e., more than 50% expected or typical crop loss), 100 liters of aerated mixture applied per 2000 m2 every seven days should adequately control pests.

[0063] A presente invenção é ilustrada adicionalmente nos exemplos de trabalho não limitativos seguintes, sendo entendido que estes exemplos são destinados apenas para serem ilustrativos e a invenção não é destinada a ser limitada aos materiais, condições, parâmetros de processo e similares citados aqui.[0063] The present invention is further illustrated in the following non-limiting working examples, it being understood that these examples are intended to be illustrative only and the invention is not intended to be limited to the materials, conditions, process parameters and the like cited herein.

EXEMPLOS PRIMEIRO CONJUNTO DE EXPERIMENTOSEXAMPLES FIRST SET OF EXPERIMENTS

[0064] O efeito de uma composição bacteriana na mobilidade de nematóides juvenis de segundo estágio (J2) de nós da raiz (Meloidogyne spp.) foi determinado.[0064] The effect of a bacterial composition on the mobility of juvenile second-stage (J2) root knot nematodes (Meloidogyne spp.) was determined.

Materiais e MétodosMaterials and methods

[0065] Uma mistura de pó seco de 75 libras (34 kg) da composição bacteriana foi preparada de acordo com a Tabela 1 abaixo.Tabela 1 [0065] A 75 pound (34 kg) dry powder mixture of the bacterial composition was prepared according to Table 1 below. Table 1

[0066] Duas cepas diferentes de B. licheniformis foram usadas. A primeira cepa tinha uma alta taxa de produção de celulase, enquanto a segunda cepa tinha uma alta taxa de produção de quitinase. B. pumilus é conhecida como uma excelente bactéria promotora de crescimento de plantas. B. amiloliquefaciens é conhecida como uma forte produtora de protease, amilase e lipase.[0066] Two different strains of B. licheniformis were used. The first strain had a high rate of cellulase production, while the second strain had a high rate of chitinase production. B. pumilus is known as an excellent plant growth-promoting bacterium. B. amyloliquefaciens is known as a strong producer of protease, amylase and lipase.

[0067] As cascas de caranguejo e cascas de camarão foram moídas a fim de passar através de uma peneira padrão malha 325.[0067] The crab shells and shrimp shells were ground in order to pass through a standard 325 mesh sieve.

[0068] Quatro lotes de 600 m2 de cobertura morta de plantas de mostarda em um campo de crisântemos foram tratados com vapor quente a fim de criar uma linha de base zero de infestação.[0068] Four 600 m2 batches of mustard plant mulch in a chrysanthemum field were treated with hot steam in order to create a zero infestation baseline.

[0069] Uma primeira preparação e aplicação da mistura de pó seco foi iniciada diluindo 200 gramas de composição bacteriana em pó com 50 litros de água. A mistura foi então aerada vigorosamente com ar difuso a 27°C por 48 horas. Após 48 horas, a mistura aerada foi aplicada em um primeiro lote de 600 m2 de cobertura morta de planta de mostarda. O primeiro lote de 600 m2 de cobertura morta de planta de mostarda foi tratado a cada dois dias com a mistura aerada.[0069] A first preparation and application of the dry powder mixture was started by diluting 200 grams of powdered bacterial composition with 50 liters of water. The mixture was then vigorously aerated with diffused air at 27°C for 48 hours. After 48 hours, the aerated mixture was applied to a first batch of 600 m2 of mustard plant mulch. The first batch of 600 m2 of mustard plant mulch was treated every two days with the aerated mixture.

[0070] Para comparação, uma segunda preparação da mistura de pó seco também foi feita diluindo 200 gramas de composição bacteriana em pó com 50 litros de água. Nenhuma aeração foi realizada com esta segunda preparação. A segunda preparação foi aplicada em um segundo lote de 600m2 de cobertura morta de planta de mostarda. O segundo lote de 600 m2 de cobertura morta de planta de mostarda foi tratado a cada duas semanas com a mistura.[0070] For comparison, a second preparation of the dry powder mixture was also made by diluting 200 grams of powdered bacterial composition with 50 liters of water. No aeration was performed with this second preparation. The second preparation was applied to a second 600m2 batch of mustard plant mulch. The second batch of 600 m2 of mustard plant mulch was treated every two weeks with the mixture.

[0071] Água foi usada como um controle, e etanol a 70% foi usado como um controle negativo, já que etanol mata nematóides, em dois outros lotes de 600 m2 de cobertura morta de planta de mostarda em um campo de crisântemos.[0071] Water was used as a control, and 70% ethanol was used as a negative control, as ethanol kills nematodes, in two other 600 m2 batches of mustard plant mulch in a chrysanthemum field.

ResultadosResults

[0072] A primeira preparação (mistura líquida aerada) mostrou matar nematóides J2, que foram observados como imóveis ou paralisados.[0072] The first preparation (aerated liquid mixture) was shown to kill J2 nematodes, which were observed to be immobile or paralyzed.

[0073] No entanto, a segunda preparação (não aerada) não afetou nematóides J2, visto que a inspeção da cobertura morta revelou atividade móvel de nematóide J2. Neste exemplo, a preparação misturada com água, mas sem aeração não reduziu visivelmente a atividade de nematóide J2.[0073] However, the second (non-aerated) preparation did not affect J2 nematodes, as inspection of the mulch revealed mobile J2 nematode activity. In this example, the preparation mixed with water but without aeration did not visibly reduce J2 nematode activity.

SEGUNDO CONJUNTO DE EXPERIMENTOSSECOND SET OF EXPERIMENTS

[0074] O efeito de quitina na mobilidade de nematóides juvenis de segundo estágio (J2) dos nós da raiz (Meloidogyne spp.) foi determinado.[0074] The effect of chitin on the mobility of juvenile second stage (J2) root knot nematodes (Meloidogyne spp.) was determined.

Materiais e MétodosMaterials and methods

[0075] A composição bacteriana foi preparada de acordo com a Tabela 2 abaixo. Esta difere da composição de Tabela 1 por não incluir quitina.Tabela 2. [0075] The bacterial composition was prepared according to Table 2 below. This differs from the composition of Table 1 in that it does not include chitin.Table 2.

[0076] Aproximadamente 200 gramas da composição bacteriana foram misturados com 50 litros de água. A mistura foi então aplicada em um lote de 600 m2 de cobertura morta de planta de mostarda em um campo de crisântemos tratado com vapor aquecido.[0076] Approximately 200 grams of the bacterial composition were mixed with 50 liters of water. The mixture was then applied to a 600 m2 plot of mustard plant mulch in a chrysanthemum field treated with heated steam.

[0077] Nenhum efeito na mobilidade de nematóide J2 foi observado. A inspeção da cobertura morta revelou atividade de nematóide. Em outras palavras, quitina foi necessária para ter um efeito na atividade de nematóide J2.[0077] No effect on J2 nematode mobility was observed. Inspection of the mulch revealed nematode activity. In other words, chitin was necessary to have an effect on J2 nematode activity.

TERCEIRO CONJUNTO DE EXPERIMENTOSTHIRD SET OF EXPERIMENTS

[0078] A atividade de quitinase foi testada medindo o açúcar redutor liberado da quitina coloidal.[0078] Chitinase activity was tested by measuring the reducing sugar released from colloidal chitin.

Materiais e MétodosMaterials and methods

[0079] 150 microlitros (μL) de enzima bruta foram adicionados a uma mistura consistindo em 300 μL de quitina coloidal a 0,1% e 150 μL de tampão fosfato 0,1 M (pH 7,0). Após incubação a 55°C por 10 minutos, a mistura de reação foi submetida a uma centrifugação refrigerada a 10,000 rpm por 5 minutos. O sobrenadante resultante (200 μL) foi adicionado com 500 ml de água deionizada e 1000 ml de reagente de Schales e então fervido por 10 minutos. Após resfriamento, a absorvência da mistura foi medida a 420 nm. Uma unidade da atividade de quitinase foi definida como a quantidade de enzima que produz 1 μmol de açúcar redutor como equivalente de N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc) por minuto.[0079] 150 microliters (μL) of crude enzyme was added to a mixture consisting of 300 μL of 0.1% colloidal chitin and 150 μL of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0). After incubation at 55°C for 10 minutes, the reaction mixture was subjected to refrigerated centrifugation at 10,000 rpm for 5 minutes. The resulting supernatant (200 μL) was added with 500 ml of deionized water and 1000 ml of Schales reagent and then boiled for 10 minutes. After cooling, the absorbance of the mixture was measured at 420 nm. One unit of chitinase activity was defined as the amount of enzyme that produces 1 μmol of reducing sugar as N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) equivalent per minute.

[0080] Duas libras(0,90 kg) de composição bacteriana preparada de acordo com a Tabela 3 abaixo foi adicionado a 200 litros de água da bica, pré-aquecida e, então mantida a 27°C. A mistura foi então aerada vigorosamente e testes foram realizados com intervalos de 6 horas.Tabela 3. [0080] Two pounds (0.90 kg) of bacterial composition prepared according to Table 3 below was added to 200 liters of tap water, preheated and then maintained at 27°C. The mixture was then vigorously aerated and tests were carried out at 6 hour intervals. Table 3.

ResultadosResults

[0081] Figura 1 ilustra graficamente a atividade de quitinase ao longo de 180 horas de reação aeróbica a 27°C. Como pode ser visto, a atividade de quitinase aumentou logaritmicamente entre 0 e 60 horas, atingindo o pico em 60 horas, e então diminuiu uniformemente até quase 130 horas antes de declinar acentuadamente. A atividade de quitinase alcançou 25 U/mL em cerca de 18 horas, atingindo o pico a cerca de 41 U/mL em cerca de 60 horas, e diminuindo novamente para 25 U/mL em cerca de 115 horas.[0081] Figure 1 graphically illustrates chitinase activity over 180 hours of aerobic reaction at 27°C. As can be seen, chitinase activity increased logarithmically between 0 and 60 hours, peaking at 60 hours, and then decreased uniformly until almost 130 hours before declining sharply. Chitinase activity reached 25 U/mL at about 18 hours, peaking at about 41 U/mL at about 60 hours, and decreasing again to 25 U/mL at about 115 hours.

QUARTO CONJUNTO DE EXPERIMENTOS Materiais e MétodosFOURTH SET OF EXPERIMENTS Materials and Methods

[0082] Para obter nematóides J2 recentemente eclodidos de Meloidogyne spp.: M. incognita e M. javanica mistos (razão 80:20), raízes de tomates infectados de plântulas de 30 dias de idade foram removidas dos vasos nos quais elas estavam crescendo e lavadas com água corrente da bica. Ovos foram extraídos separadamente usando um método NaOCl adaptado (Riekert, 1995). Juvenis de segundo estágio (J2) foram obtidos subsequentemente pela eclosão dos ovos extraídos de acordo com o método de Moura et al. (1993) a 25 ± 1°C. Juvenis de segundo estágio que foram recuperados após as primeiras 24 horas foram descartados e apenas os coletados após as próximas 24 horas foram usados para todos os experimentos.[0082] To obtain newly hatched J2 nematodes of Meloidogyne spp.: M. incognita and M. javanica mixed (80:20 ratio), infected tomato roots from 30-day-old seedlings were removed from the pots in which they were growing and washed with running water from the spout. Eggs were extracted separately using an adapted NaOCl method (Riekert, 1995). Second stage juveniles (J2) were subsequently obtained by hatching eggs extracted according to the method of Moura et al. (1993) at 25 ± 1°C. Second stage juveniles that were recovered after the first 24 hours were discarded and only those collected after the next 24 hours were used for all experiments.

[0083] Sete tratamentos foram preparados de acordo com as diluições seguintes listadas abaixo na Tabela 4.Tabela 4. [0083] Seven treatments were prepared according to the following dilutions listed below in Table 4.Table 4.

[0084] Um mL do tratamento foi transferido para placas com cavidades de plástico, e aproximadamente 100 nematóides J2 se movendo ativamente do Meloidogyne spp. misto contidos em 90 μL de água da bica estéril foram adicionados a cada dos diferentes tratamentos em cada cavidade. As placas com cavidades foram subsequentemente incubadas em um gabinete escuro, com temperatura regulada (25°C ± 1°C). Mobilidade dos nematóides J2 foi registrada após 24 horas, 48 horas e 72 horas após exposição aos tratamentos pela contagem do número de nematóides J2 móveis e não móveis. Juvenis de segundo estágio foram considerados não móveis quando nenhum movimento ocorreu após serem observados por 30 segundos a 1 minuto usando um microscópio estéreo com ampliação de 100x.[0084] One mL of the treatment was transferred to plates with plastic wells, and approximately 100 actively moving J2 nematodes from Meloidogyne spp. mixture contained in 90 μL of sterile tap water were added to each of the different treatments in each well. The well plates were subsequently incubated in a dark, temperature-regulated cabinet (25°C ± 1°C). Mobility of J2 nematodes was recorded after 24 hours, 48 hours and 72 hours after exposure to treatments by counting the number of motile and non-motile J2 nematodes. Second-stage juveniles were considered nonmobile when no movement occurred after being observed for 30 seconds to 1 minute using a stereo microscope at 100x magnification.

[0085] Os dados foram submetidos a Anova (Estatística 13), com os meios sendo separados pelo teste de Tukey (P<0,05).[0085] The data was subjected to Anova (Statistics 13), with the means being separated by the Tukey test (P<0.05).

ResultadosResults

[0086] Como mostrado nas Figuras 4-10, foram notadas diferenças significativas nos tratamentos com relação aos seus efeitos na mobilidade de nematóide J2, entre os três intervalos de tempo, e interação entre intervalos de tempo e tratamentos.[0086] As shown in Figures 4-10, significant differences in treatments were noted with respect to their effects on J2 nematode mobility, between the three time intervals, and interaction between time intervals and treatments.

[0087] Figura 2 é uma representação gráfica de nematóides J2 imóveis/paralisados de populações de Meloidogyne spp. mistas. O efeito corrente foi observado a F(12,70)=25,1888, p=0,000. As barras verticais denotam intervalos de confiança de 0,95. Produtos 1-5 e Produto 7 (controle com etanol a 70%) mostraram numerous significativamente maiores de nematóides J2 imóveis em todos os intervalos de amostragem em comparação com o Produto 6 (controle com água da bica estéril), que mostrou significativamente menos nematóides J2 imóveis. Produto 5 mostrou eficácia levemente menor do que os Produtos 1-4 e Produto 7, mas mesmo assim mostrou efeito significativo na paralisação de nematóides J2. Produto 5 é a mistura líquida sem aeração.[0087] Figure 2 is a graphical representation of immobile/paralyzed J2 nematodes from populations of Meloidogyne spp. mixed. The current effect was observed at F(12,70)=25.1888, p=0.000. Vertical bars denote 0.95 confidence intervals. Products 1-5 and Product 7 (70% ethanol control) showed significantly greater numbers of immobile J2 nematodes at all sampling intervals compared to Product 6 (sterile spout water control), which showed significantly fewer J2 nematodes. properties. Product 5 showed slightly lower efficacy than Products 1-4 and Product 7, but still showed a significant effect in stopping J2 nematodes. Product 5 is the liquid mixture without aeration.

[0088] Figura 3 é uma imagem tomada a uma ampliação de 100x de nematóides J2 imobilizados colocados em suspensão no Produto 1.[0088] Figure 3 is an image taken at 100x magnification of immobilized J2 nematodes placed in suspension in Product 1.

[0089] Figura 4 é uma imagem tomada a uma ampliação de 100x de nematóides J2 imobilizados colocados em suspensão no Produto 2.[0089] Figure 4 is an image taken at 100x magnification of immobilized J2 nematodes placed in suspension in Product 2.

[0090] Figura 5 é uma imagem tomada a uma ampliação de 100x de nematóides J2 imobilizados colocados em suspensão no Produto 3.[0090] Figure 5 is an image taken at 100x magnification of immobilized J2 nematodes placed in suspension in Product 3.

[0091] Figura 6 é uma imagem tomada a uma ampliação de 100x tanto de nematóides J2 imobilizados como em movimento colocados em suspensão no Produto 5.[0091] Figure 6 is an image taken at 100x magnification of both immobilized and moving J2 nematodes placed in suspension in Product 5.

[0092] Figura 7 é uma imagem tomada a uma ampliação de 100x de nematóides J2 em movimento colocados em suspensão no Produto 6 (controle com água da bica estéril).[0092] Figure 7 is an image taken at 100x magnification of moving J2 nematodes placed in suspension in Product 6 (sterile spout water control).

[0100] Figura 8 é uma imagem tomada a uma ampliação de 100x de nematóides J2 imobilizados colocados em suspensão no Produto 7 (controle negativo com etanol a 70%).[0100] Figure 8 is an image taken at 100x magnification of immobilized J2 nematodes suspended in Product 7 (negative control with 70% ethanol).

DISCUSSÃODISCUSSION

[0101] Durante aeração inicial, as principais enzimas extracelulares (por exemplo, quitinase, protease, etc.) não foram produzidas em quantidades significativas pelas bactérias na composição. Durante as primeiras 12 a 24 horas de crescimento aeróbico (dependendo da razão específica da composição para água), permaneceram suficientes nutrientes biodisponíveis e solúveis, que suportaram o crescimento logarítmico das bactérias na composição. Após cerca de 18 horas de aeração, as bactérias na composição consumiram os nutrientes solúveis disponíveis. A cultura entrou, então, em um padrão de crescimento em fase estacionária/morte. Neste momento, as enzimas extracelulares foram produzidas em uma taxa acelerada, à medida que a cultura mudava de crescimento e reprodução em síntese de enzimas extracelulares que ajudaram a produzir novos substratos solúveis a partir de macromoléculas que podem estar presentes no meio.[0101] During initial aeration, the main extracellular enzymes (e.g., chitinase, protease, etc.) were not produced in significant quantities by the bacteria in the composition. During the first 12 to 24 hours of aerobic growth (depending on the specific ratio of the composition to water), sufficient bioavailable and soluble nutrients remained that supported the logarithmic growth of the bacteria in the composition. After approximately 18 hours of aeration, the bacteria in the composition consumed the available soluble nutrients. The culture then entered a stationary/death phase growth pattern. At this time, extracellular enzymes were produced at an accelerated rate as the culture shifted from growth and reproduction to synthesis of extracellular enzymes that helped produce new soluble substrates from macromolecules that may be present in the medium.

[0102] A extensão de aeração passou de crescimento logarítmico para crescimento da fase de morte, o que é útil na produção de grandes quantidades das enzimas desejadas, embora estas enzimas não sejam produzidas em concentrações úteis ou significativas durante crescimento logarítmico.[0102] The extent of aeration has gone from logarithmic growth to death phase growth, which is useful in producing large quantities of the desired enzymes, although these enzymes are not produced in useful or significant concentrations during logarithmic growth.

[0103] A inclusão de quitina finamente moída fornece, induz síntese de quitinase aumentada. A inclusão de quitina na presente invenção induz síntese máxima de quitinase nos Bacillus da fase estacionária/morte capazes de produzir quitinase.[0103] The inclusion of finely ground chitin provides, induces increased chitinase synthesis. The inclusion of chitin in the present invention induces maximum chitinase synthesis in stationary/death phase Bacillus capable of producing chitinase.

[0104] Como visto no primeiro e segundo conjunto de experimentos, a mistura da composição bacteriana seca apenas com água não mostrou eficácia no controle de pragas ou mostrou eficácia reduzida em relação as amostras aeradas. Além disso, deixar de incluir quitina na composição resultou em perda de eficácia.[0104] As seen in the first and second set of experiments, mixing the dry bacterial composition with water alone did not show effectiveness in controlling pests or showed reduced effectiveness compared to aerated samples. Furthermore, failing to include chitin in the composition resulted in a loss of effectiveness.

[0105] Pode ser possível escolher seletivamente enzimas de degradação com base no tempo de aeração. Por exemplo, como mostrado na Figura 1, quitinase é produzida preferencialmente entre 10 e 60 horas de aeração. Amilase e protease são produzidas preferencialmente em 18 a 48 horas de aeração, e celulase e lipase são produzidas preferencialmente em 48 a 96 horas de aeração.[0105] It may be possible to selectively choose degradation enzymes based on aeration time. For example, as shown in Figure 1, chitinase is preferentially produced between 10 and 60 hours of aeration. Amylase and protease are preferentially produced in 18 to 48 hours of aeration, and cellulase and lipase are preferentially produced in 48 to 96 hours of aeration.

QUINTO CONJUNTO DE EXPERIMENTOSFIFTH SET OF EXPERIMENTS

[0106] A eficácia de quitinase foi avaliada em uma população de plantas de milho inoculadas com uma mistura de nematóides Meloidogyne incognita e Meloidogyne javanica. A dose por tratamento e a frequência de tratamento foram as variáveis que foram mudadas.[0106] The effectiveness of chitinase was evaluated in a population of corn plants inoculated with a mixture of Meloidogyne incognita and Meloidogyne javanica nematodes. The dose per treatment and the frequency of treatment were the variables that were changed.

Materiais e MétodosMaterials and methods

[0107] Ovos e nematóides juvenis de segundo estágio (J2) de M. incognita e M. javanica (razão 70:30) foram extraídos das raízes de plantas de tomate infectadas usando o método NaOCl. J2 foram eclodidos colocando os ovos extraídos em uma peneira de malha 25 μm, submersos em um recipiente de 5 cm de profundidade cheio com água da bica, e incubados a 26°C por 48 horas.[0107] Eggs and juvenile second-stage nematodes (J2) of M. incognita and M. javanica (ratio 70:30) were extracted from the roots of infected tomato plants using the NaOCl method. J2 were hatched by placing the extracted eggs in a 25 μm mesh sieve, submerged in a 5 cm deep container filled with tap water, and incubated at 26°C for 48 hours.

[0108] Sete grupos (seis grupos de tratamento, um grupo de controle) de seis vasos de plástico, cada tendo uma capacidade de 10 L, foram cheios com solo arenoso-lodoso (5,3% argila, 93,6% areia, 1,1% lodo, e 0,47% matéria orgânica) tendo um pH de 6,8. O solo foi fumigado com Telone® II (Dow AgroSciences, substância ativa 1,3-dicloropropeno) a uma taxa de dosagem de 150 L/hectare (~ 15 gal/acre (56,7 litros/acre)). Os vasos foram mantidos a uma temperatura de 21,6°C a 29,4°C.[0108] Seven groups (six treatment groups, one control group) of six plastic pots, each having a capacity of 10 L, were filled with sandy-silty soil (5.3% clay, 93.6% sand, 1.1% silt, and 0.47% organic matter) having a pH of 6.8. The soil was fumigated with Telone® II (Dow AgroSciences, active substance 1,3-dichloropropene) at a dose rate of 150 L/hectare (~15 gal/acre (56.7 liters/acre)). The vessels were maintained at a temperature of 21.6°C to 29.4°C.

[0109] Um kg da mistura de pó seco de Tabela 1 foram adicionados em 200 L de água, e aerados vigorosamente a 27°C por 72 horas. Tratamento foi aplicado a 1 mL, 5 mL, ou 10 mL por vaso (ver Tabela 5).[0109] One kg of the dry powder mixture from Table 1 was added to 200 L of water, and aerated vigorously at 27°C for 72 hours. Treatment was applied at 1 mL, 5 mL, or 10 mL per vessel (see Table 5).

[0110] Vinte quatro horas antes do plantio, aproximadamente 10.000 ovos e J2 (razão 50:50) foram inoculados e adicionados a 5-10 cm do topo do solo em cada vaso. Uma semente de cultivar de milho DKC 78-79 BR foi então plantada (aproximadamente 4 cm de profundidade) por vaso, e o primeiro tratamento foi aplicado em cada vaso. As plantas foram aguadas três vezes por semana com 0,5 L de água da bica e após cada tratamento. Nutrifeed (Startke Ayres) foi aplicado como fertilizante líquido (1 grama/litro de água) após emergências das plantas terem sido observadas e novamente 35 dias mais tarde (0,5 litros aplicados de cada vez, para um total de 1 grama Nutrifeed por vaso). O tratamento foi aplicado ou em 3 aplicações mensais ou 9 aplicações semanais (ver Tabela 5).[0110] Twenty four hours before planting, approximately 10,000 eggs and J2 (50:50 ratio) were inoculated and added 5-10 cm from the top of the soil in each pot. One seed of corn cultivar DKC 78-79 BR was then planted (approximately 4 cm deep) per pot, and the first treatment was applied to each pot. The plants were watered three times a week with 0.5 L of tap water after each treatment. Nutrifeed (Startke Ayres) was applied as a liquid fertilizer (1 gram/liter of water) after plant emergences were observed and again 35 days later (0.5 liters applied each time, for a total of 1 gram Nutrifeed per pot ). The treatment was applied in either 3 monthly applications or 9 weekly applications (see Table 5).

[0111] 60 dias após o plantio e inoculação, o sistema radicular de cada planta foi excisado das partes aéreas, e a massa aérea pesada. O sistema radicular de cada planta foi removido subsequentemente de cada vaso, junto com cerca de 200 gramas de solo da rizosfera, e cada sistema radicular pesado. Ovos de Meloidogyne spp. e J2 foram extraídos do solo obtido de cada vaso por um método NaOCl adaptado, 1995). J2 foram extraídos do solo extraído usando um método de decantação, peneiramento, e flotação de açúcar. Ovos e J2 foram contados em um prato de contagem usando um microscópio estéreo (ampliação de 60x).[0111] 60 days after planting and inoculation, the root system of each plant was excised from the aerial parts, and the aerial mass was weighed. The root system of each plant was subsequently removed from each pot, along with approximately 200 grams of rhizosphere soil, and each root system weighed. Eggs of Meloidogyne spp. and J2 were extracted from soil obtained from each pot by an adapted NaOCl method, 1995). J2 were extracted from the mined soil using a decantation, sieving, and sugar flotation method. Eggs and J2 were counted in a counting dish using a stereo microscope (60x magnification).

[0112] Os dados de nematoides e massa de plantas aéreas foram submetidos a análise ANOVA de uma via com médias separadas pelo teste de Tukey HSD (* p < 0,05, ** p < 0,01).[0112] Nematode and aerial plant mass data were subjected to one-way ANOVA analysis with means separated by the Tukey HSD test (* p < 0.05, ** p < 0.01).

ResultadosResults

[0113] Todos os grupos de tratamento tenderam para uma redução de taxa de sobrevivência de ovos + nematóide J2 quando comparados ao grupo de controle, que mostrou um aumento na população de ovos + nematóide J2. Os grupos de tratamento 4 (5 mL por cada tratamento semanal) e 5 (10 mL por cada tratamento mensal) tiveram um efeito estatisticamente significativo nas taxas de sobrevivência de ovo + nematóide J2, como ilustrado na Tabela 5.Tabela 5. [0113] All treatment groups tended towards a reduced survival rate of eggs + nematode J2 when compared to the control group, which showed an increase in the population of eggs + nematode J2. Treatment groups 4 (5 mL per weekly treatment) and 5 (10 mL per monthly treatment) had a statistically significant effect on egg + J2 nematode survival rates, as illustrated in Table 5.Table 5.

SEXTO CONJUTO DE EXPERIMENTOSSIXTH SET OF EXPERIMENTS

[0114] As composições da presente invenção foram avaliadas quanto a seu efeito na propagação da doença fúngica sigatoka negra (Mycosphaerella fijiensis) em plantas de banana Cavendish (Musa paradisiaca).[0114] The compositions of the present invention were evaluated for their effect on the spread of the fungal disease black Sigatoka (Mycosphaerella fijiensis) in Cavendish banana plants (Musa paradisiaca).

Materiais e MétodosMaterials and methods

[0115] As composições foram testadas em campos de banana contendo 2.226 plantas/hectare localizados na República Dominicana ao longo de um período de 97 dias. Seis parcelas de terra, cada 0,14 hectares (ha), foram usadas.[0115] The compositions were tested in banana fields containing 2,226 plants/hectare located in the Dominican Republic over a period of 97 days. Six parcels of land, each 0.14 hectares (ha), were used.

[0116] As plantas de banana tinham cerca de 3 meses de idade no início do experimento, e tinham cerca de 6 meses de idade na conclusão do experimento. Este período é considerado o tempo mais crítico para o desenvolvimento de sigatoka negra. O tempo de teste também foi um período de muita chuva, o que aumenta a progressão da doença.[0116] The banana plants were about 3 months old at the beginning of the experiment, and they were about 6 months old at the conclusion of the experiment. This period is considered the most critical time for the development of black Sigatoka. The testing time was also a period of heavy rain, which increases the progression of the disease.

[0117] Uma variante em pó (PV) foi testada, que tinha a composição de Tabela 6.Tabela 6. [0117] A powder variant (PV) was tested, which had the composition of Table 6.Table 6.

[0118] Uma variante líquida (LV) foi preparada a partir de PV de acordo com Tabela 6, mas não continha quitina. Dois quilogramas do pó de LV foram colocados em suspensão em 1000 litros de água, aerados a 27°C por 72 horas, e armazenados por 28 dias a temperatura ambiente antes do uso no experimento. Após 28 dias, uma amostra bem misturada da suspensão aquosa foi então filtrada para remover as bactérias, e o teor residual de carbono orgânico total restante era menor do que 25 ppm. A suspensão de LV foi testada para atividade de quitinase, e nenhuma foi detectada. A solução de LV foi então colocada em placas usando técnicas de colocação diferenciais e verificada por 16S PCR para conter as seguintes quantidades de bactérias: [0118] A liquid variant (LV) was prepared from PV according to Table 6, but did not contain chitin. Two kilograms of LV powder were suspended in 1000 liters of water, aerated at 27°C for 72 hours, and stored for 28 days at room temperature before use in the experiment. After 28 days, a well-mixed sample of the aqueous suspension was then filtered to remove bacteria, and the remaining residual total organic carbon content was less than 25 ppm. The LV suspension was tested for chitinase activity, and none was detected. The LV solution was then plated using differential plating techniques and checked by 16S PCR to contain the following amounts of bacteria:

[0119] Os lotes de teste de campos de banana foram tratados nos dias 7, 21, 42, e 82 de acordo com o protocolo de dosagem de Tabela 7. Tanto a variante em pó (PV, contend quitina) como a suspensão líquida (LV, sem quitina) foram testadas com baixas, médias, e altas dosagens. Para o LV, a quantidade indicada da suspensão líquida foi misturada em 20 litros de água, então aplicada no lote de teste. Para o PV,a quantidade indicada do pó foi misturada em 20 litros de água, então aplicada no lote de teste. Tabela 7. [0119] Banana field test batches were treated on days 7, 21, 42, and 82 according to the dosing protocol of Table 7. Both the powder variant (PV, containing chitin) and the liquid suspension ( LV, without chitin) were tested at low, medium, and high doses. For LV, the indicated amount of liquid suspension was mixed in 20 liters of water, then applied to the test batch. For PV, the indicated amount of powder was mixed in 20 liters of water, then applied to the test batch. Table 7.

ResultadosResults

[0120] O sistema de medição e previsão padrão da indústria para sigatoka negra é descrito em Ganry et al., Fruits, 2008, vol. 63, pp 381-387. Geralmente, novos ataques de fungos são detectados apenas em folhas jovens. A progressão de sigatoka negra é, assim da parte superior para a parte inferior da planta (pior na parte superior). A esporulação começa nos estágios necróticos da doença, que é quando a taxa de infecção está no seu máximo. Assim, detecção precoce e ação preventiva / curativa é muito importante. A folha mais jovem manchada (em dias) é combinada com a taxa de emissão foliar para expressar o desenvolvimento evolucionário (ED) da doença como um valor de velocidade. Quanto maior este valor ED, maior o risco de o estágio necrótico. Um valor menor de folhas mais jovens manchadas sugere geralmente uma virulência aumentada. A taxa de emissão foliar é a taxa de geração ajustada de novas folhas por dia. O valor ED é usado como uma ferramenta de previsão para identificar quando aplicar o fungicida. Um valor ED de 200 ou superior é geralmente usado como um limiar para a iniciação de aplicação de controle de fungos na República Dominicana.[0120] The industry standard measurement and prediction system for black Sigatoka is described in Ganry et al., Fruits, 2008, vol. 63, pp 381-387. Generally, new fungal attacks are only detected on young leaves. The progression of black Sigatoka is thus from the top to the bottom of the plant (worse in the top). Sporulation begins in the necrotic stages of the disease, which is when the infection rate is at its highest. Thus, early detection and preventive/curative action is very important. The youngest leaf spotted (in days) is combined with the leaf emission rate to express the evolutionary development (ED) of the disease as a velocity value. The higher this ED value, the greater the risk of the necrotic stage. A lower value of younger mottled leaves generally suggests increased virulence. Leaf emission rate is the adjusted generation rate of new leaves per day. The ED value is used as a predictive tool to identify when to apply the fungicide. An ED value of 200 or greater is generally used as a threshold for initiating mold control application in the Dominican Republic.

[0121] Os valores ED para cada dos seis lotes são indicados na Tabela 8 abaixo, e são traçados como gráficos de linhas nas Figuras 9A-9F. A linha tracejada horizontal indica o valor ED limiar de 200. Os gráficos mostram uma magnitude extremamente menor e taxa reduzida de doença sigatoka negra entre lotes de teste tratados com PV, em relação aos lotes de teste tratados com LV. Os tratamentos com LV (sem quitina) falharam em manter valores ED aceitáveis. Uma correlação inversamente proporcional entre dosagem de PV e ED pode ser observada adicionalmente (isto é, quanto maior a dosagem, menor a evolução da doença).Tabela 8. [0121] The ED values for each of the six batches are indicated in Table 8 below, and are plotted as line graphs in Figures 9A-9F. The horizontal dashed line indicates the threshold ED value of 200. The graphs show an extremely lower magnitude and reduced rate of black Sigatoka disease among PV-treated test batches, relative to LV-treated test batches. LV treatments (without chitin) failed to maintain acceptable ED values. An inversely proportional correlation between PV dosage and ED can additionally be observed (i.e., the higher the dosage, the shorter the disease progression).Table 8.

[0122] Contanto que o tratamento fosse aplicado a cada duas a quatro semanas, as composições bacterianas eram eficazes. Em comparação, tratamentos químicos foram similarmente eficazes quando aplicados a cada quatro semanas.[0122] As long as the treatment was applied every two to four weeks, the bacterial compositions were effective. In comparison, chemical treatments were similarly effective when applied every four weeks.

[0123] É observado que a variante PV aplicada não foi aerada ao longo do tempo como nos experimentos anteriores. Acredita-se que isso aumentaria a potência da mistura líquida, porque a síntese de quitinase seria muito maior (em cerca de 5 a 10 vezes). Isso permitiria o controle de valores ED com uma dose mais baixa, aplicação menos frequente, ou uma combinação de ambos.[0123] It is observed that the applied PV variant was not aerated over time as in previous experiments. It is believed that this would increase the potency of the liquid mixture, because chitinase synthesis would be much greater (by about 5 to 10 times). This would allow control of ED values with a lower dose, less frequent application, or a combination of both.

SÉTIMO CONJUNTO DE EXPERIMENTOSSEVENTH SET OF EXPERIMENTS

[0124] No sexto conjunto de experimentos, a variante líquida (LV) não incluiu pó de quitina, e continha apenas bactérias. Como a dose do LV foi aumentada de 500 mL para 750 mL para 1000 mL por Ha, a supressão melhorada de Sigatoka negra não foi evidente. Em contraste, a variante em pó (PV) incluiu quitina, e como a dose do PV aumentou de 226 gramas para 454 gramas para 904 gramas por hectare, a eficácia melhorou.[0124] In the sixth set of experiments, the liquid variant (LV) did not include chitin powder, and contained only bacteria. As the LV dose was increased from 500 mL to 750 mL to 1000 mL per Ha, improved suppression of black Sigatoka was not evident. In contrast, the powdered variant (PV) included chitin, and as the PV dose increased from 226 grams to 454 grams to 904 grams per hectare, efficacy improved.

[0125] Assim, no sétimo conjunto de experimentos, uma variante líquida ativada (LAV) foi preparada usando o PV de Tabela 6. O PV e o LAV foram então testados em campos de banana contendo 2.222 plantas/hectare (2 plantas por 9 m2) localizados na República Dominicana ao longo do período de 35 dias. A dosagem começou 90 dias após o plantio.[0125] Thus, in the seventh set of experiments, a liquid activated variant (LAV) was prepared using the PV of Table 6. The PV and LAV were then tested in banana fields containing 2,222 plants/hectare (2 plants per 9 m2 ) located in the Dominican Republic over the 35-day period. Dosing began 90 days after planting.

MateriaisMaterials

[0126] O LAV foi preparado como a seguir. Duzentos litros de água foram adicionados em um tambor de 55 galões (208 litros) aberto no topo. O tambor foi equipado com 25 litros por minuto de ar difuso, e um pequeno aquecedor de aquário submersível de 100 watts, para manter a temperatura a 27°C. Antes do início da aeração, os 200 litros de água foram clorados para esterilizar, então desclorados, e colocados a 27°C. 908 gramas (2 lb) do PV de Tabela 6 foram adicionados ao tambor de aeração. Aeração foi mantida por 72 horas, tempo em que a batelada foi considerada completa. O líquido do tambor de aeração foi usado 24 horas após o término.[0126] The LAV was prepared as follows. Two hundred liters of water were added into a 55-gallon (208-liter) drum open at the top. The drum was equipped with 25 liters per minute of diffused air, and a small 100-watt submersible aquarium heater, to maintain the temperature at 27°C. Before aeration began, the 200 liters of water were chlorinated to sterilize, then dechlorinated, and placed at 27°C. 908 grams (2 lb) of the PV from Table 6 was added to the aeration drum. Aeration was maintained for 72 hours, during which time the batch was considered complete. The liquid from the aeration drum was used 24 hours after completion.

[0127] Tanto para o PV como para o LAV, 1500 gramas por Ha foram usados como a taxa de dosagem escolhida. Esta foi superior a dose mais forte de 908 gramas por hectare usada no sexto conjunto de experimentos.[0127] For both PV and LAV, 1500 grams per Ha was used as the chosen dosage rate. This was higher than the strongest dose of 908 grams per hectare used in the sixth set of experiments.

[0128] Para comparação, fungicida Phyton-27 (Phyton Corporation, Bloomington, MN) também foi aplicado em lotes separados. Phyton-27 é um bactericida e fungicida sistêmico de amplo espectro. Phyton-27 contém sulfato de cobre pentaidratado (21,4%), equivalente a 5,43% de metal de cobre. Um litro de Phyton-27 é usado para tratar 1 hectare. Um litro de Phyton-27 é diluído em 100 galões (378 litros) de água e, então, aplicado.[0128] For comparison, fungicide Phyton-27 (Phyton Corporation, Bloomington, MN) was also applied in separate batches. Phyton-27 is a broad-spectrum systemic bactericide and fungicide. Phyton-27 contains copper sulfate pentahydrate (21.4%), equivalent to 5.43% copper metal. One liter of Phyton-27 is used to treat 1 hectare. One liter of Phyton-27 is diluted in 100 gallons (378 liters) of water and then applied.

[0129] Três blocos de tratamento amplamente espaçados foram usados para os experimentos. Cada bloco foi então dividido em três células de tratamento distintas T1, T2 e T3. Cada célula de tratamento tinha uma área de 10 metros x 10 metros (100 m2). Em cada bloco de tratamento, célula T1 foi tratada com Phyton-27, célula T2 foi tratada com a variante em pó (PV), e célula T3 foi tratada com a variante líquida ativada (LAV). Figura 10 mostra o layout das células de tratamento e blocos de tratamento.[0129] Three widely spaced treatment blocks were used for the experiments. Each block was then divided into three distinct treatment cells T1, T2 and T3. Each treatment cell had an area of 10 meters x 10 meters (100 m2). In each treatment block, T1 cell was treated with Phyton-27, T2 cell was treated with the powder variant (PV), and T3 cell was treated with the liquid activated variant (LAV). Figure 10 shows the layout of the treatment cells and treatment blocks.

MétodosMethods

[0130] Cada célula de tratamento recebeu três aplicações de produto, especificamente em 90, 104 e 118 dias após o plantio (isto é, dias 0, 14, e 28 após a primeira dosagem).[0130] Each treatment cell received three product applications, specifically on 90, 104 and 118 days after planting (i.e., days 0, 14, and 28 after the first dosage).

[0131] Cada célula de tratamento T1 recebeu uma dose de 10 mL de Phyton-27. Um único pulverizador de mochila de 20 litros foi carregado com 54,6 mL de Phyton-27 e cheio com água, e usado para dosar cada célula de tratamento T1. Cada célula T1 foi dosada com 3,67 litros de solução do pulverizador de mochila.[0131] Each T1 treatment cell received a dose of 10 mL of Phyton-27. A single 20-liter backpack sprayer was loaded with 54.6 mL of Phyton-27 and filled with water, and used to dose each T1 treatment cell. Each T1 cell was dosed with 3.67 liters of solution from the backpack sprayer.

[0132] Para dosar cada célula de tratamento T2, 81,7 gramas de PV foram adicionados em 20 litros de água no pulverizador de mochila. Cada célula T2 foi dosada com 3,67 litros de solução do pulverizador de mochila, que correspondiam a 1500 gramas de PV por hectare. (Observe que o PV não está ativado em comparação com o LAV.)[0132] To dose each T2 treatment cell, 81.7 grams of PV were added to 20 liters of water in the backpack sprayer. Each T2 cell was dosed with 3.67 liters of backpack sprayer solution, which corresponded to 1500 grams of PV per hectare. (Note that PV is not activated compared to LAV.)

[0133] Para dosar cada célula de tratamento T3, 18 litros de LAV bem misturados foram adicionados ao pulverizador de mochila de 20 litros, e outros 2 litros de água foram adicionados para encher o pulverizador de mochila para o nível de 20 litros. Uma vez que diluídos desse modo, o pulverizador de mochila continha o equivalente a 81,7 gramas de PV (antes da ativação) nos 20 litros. Cada célula T3 foi dosada com 3,67 litros de solução do pulverizador de mochila, que correspondia a 1500 gramas de PV por hectare. Como observado, para tratamentos T3, o PV foi submetido a um procedimento de “ativação” para obter o LAV.[0133] To dose each T3 treatment cell, 18 liters of well-mixed LAV was added to the 20-liter backpack sprayer, and another 2 liters of water was added to fill the backpack sprayer to the 20-liter level. Once diluted in this way, the backpack sprayer contained the equivalent of 81.7 grams of PV (before activation) in the 20 liters. Each T3 cell was dosed with 3.67 liters of backpack sprayer solution, which corresponded to 1500 grams of PV per hectare. As noted, for T3 treatments, the PV underwent an “activation” procedure to obtain the LAV.

ResultadosResults

[0134] Os valores médios ED para cada das três células de tratamento são indicados na Tabela 9 abaixo, e são traçados em gráfico na Figura 11 em relação ao tempo. Tabela 9. [0134] The average ED values for each of the three treatment cells are indicated in Table 9 below, and are plotted in Figure 11 against time. Table 9.

[0135] Phyton-27 retardou a progressão de Sigatoka negra, mas o escore médio ED foi 206. O controle foi alcançado, mas a doença permaneceu no ou acima do nível de perigo (ED=200). Após a dose inicial, o escore médio ED foi 152 para a variante em pó (PV), enquanto o valor médio para a variante ativada (LAV) foi 63.[0135] Phyton-27 slowed the progression of black Sigatoka, but the average ED score was 206. Control was achieved, but the disease remained at or above the danger level (ED=200). After the initial dose, the mean ED score was 152 for the powder variant (PV), while the mean value for the activated variant (LAV) was 63.

[0136] Estes dados mostraram que a inclusão de quitina moída na formulação de LAV aumentou sua eficácia em relação ao LV de Tabela 8. O aumento das doses do PV resultou em supressão aumentada de Sigatoka negra (Comparar Tabela 8 com Tabela 9). A variante ativada (LAV) superou tanto o PV como Phyton-27.[0136] These data showed that the inclusion of ground chitin in the LAV formulation increased its effectiveness compared to the LV of Table 8. Increasing doses of the PV resulted in increased suppression of black Sigatoka (Compare Table 8 with Table 9). The activated variant (LAV) outperformed both PV and Phyton-27.

OITAVO CONJUNTO DE EXPERIMENTOSEIGHTH SET OF EXPERIMENTS

[0137] Das várias pragas que afetam a grama do campo de golfe da Florida, nematóides estão entre as mais difíceis de manejar. Infestações de nematóides são comuns e severas na Florida já que o clima e solos arenosos fornecem um habitat perfeito para muitas das espécies mais destrutivas de nematóides. Um teste foi conduzido em um campo de golfe usando a variante em pó (PV) de Tabela 6.[0137] Of the various pests that affect Florida golf course grass, nematodes are among the most difficult to manage. Nematode infestations are common and severe in Florida as the climate and sandy soils provide a perfect habitat for many of the most destructive nematode species. A test was conducted on a golf course using the powder variant (PV) of Table 6.

[0138] O PV foi ativado para otimizar sua atividade. Uma variante líquida ativada (LAV) foi preparada a partir de PV como a seguir. Cem litros de água da bica foram adicionados em um tanque, clorados para esterilizar, e então desclorados. O tanque foi levado a 27°C usando um aquecedor do estilo aquário de 40 watts. Aeração foi fornecida a uma taxa de 20 litros por minuto através de uma pedra porosa de alumina submersa, de bolhas médias. Uma libra (0,45 kg) do PV foi adicionado ao tanque de aeração, e deixada aerar por 72 horas.[0138] PV has been activated to optimize its activity. A liquid activated variant (LAV) was prepared from PV as follows. One hundred liters of tap water was added to a tank, chlorinated to sterilize, and then dechlorinated. The tank was brought to 27°C using a 40-watt aquarium-style heater. Aeration was provided at a rate of 20 liters per minute through a submerged, medium-bubble alumina airstone. One pound (0.45 kg) of PV was added to the aeration tank, and allowed to aerate for 72 hours.

[0139] A taxa de dose foi uma libra (0,45 kg) (454 gramas) do PV por acre. A área de avaliação verde do campo de golfe tinha um tamanho de cerca de 0,057 acres, assim, 5,7 litros do LAV foram usados.[0139] The dose rate was one pound (0.45 kg) (454 grams) of PV per acre. The golf course green assessment area was about 0.057 acres in size, so 5.7 liters of the LAV were used.

[0140] Uma primeira amostragem do núcleo do campo de golfe foi feita no dia 0. O LAV foi aplicado nos dias 25 e 39. Uma segunda amostragem do núcleo foi realizada no dia 52. As amostragens do núcleo foram analisadas para a presença de nematóides lança (Hoplolaimus) e nematóides do nó da raiz (Meloidogyne). Os resultados são mostrados na Tabela 10 abaixo.Tabela 10. [0140] A first golf course core sampling was done on day 0. LAV was applied on days 25 and 39. A second core sampling was done on day 52. The core samplings were analyzed for the presence of nematodes spear (Hoplolaimus) and root knot nematodes (Meloidogyne). The results are shown in Table 10 below.Table 10.

[0141] O uso do LAV produziu uma redução de 45% a 75% na população problemática de nematóides lança e do nó da raiz.[0141] The use of LAV produced a 45% to 75% reduction in the problematic population of spear and root knot nematodes.

[0142] Embora modalidades particulares tenham sido descritas, alternativas, modificações, variações, aperfeiçoamentos e equivalentes substanciais, que são ou podem ser inesperados atualmente, podem surgir para requerentes ou outros versados na técnica. Consequentemente, as reivindicações em anexo, como depositadas e como podem ser modificadas, são destinadas a abranger todas estas alternativas, modificações, variações, aperfeiçoamentos e equivalentes substanciais.[0142] Although particular embodiments have been described, alternatives, modifications, variations, improvements and substantial equivalents, which are or may be unexpected today, may arise to applicants or others skilled in the art. Accordingly, the appended claims, as filed and as may be modified, are intended to encompass all such substantial alternatives, modifications, variations, improvements and equivalents.

Claims (15)

1. Composição seca, caracterizada pelo fato de compreender pelo menos uma cepa de bactérias que produz quitinase; uma fonte de nutriente bacteriano; um composto contendo nitrogênio; um composto contendo fosfato; um composto contendo magnésio; um tampão; e um indutor de quitinase; em que a pelo menos uma cepa de bactérias compreende B. licheniformis, B. pumilus e B. amiloliquefaciens; em que a fonte de nutriente bacteriano compreende peptona, triptona, caseína, um aminoácido, uma vitamina, extrato de carne bovina, ou extrato de levedura; em que o composto contendo nitrogênio compreende cloreto de amônio, nitrato de amônio, sulfato de amônio ou fosfato de amônio; em que o composto contendo fosfato compreende fosfato dipotássico, ácido fosfórico, fosfato de diamônio, fosfato dissódico, fosfato monossódico, ou tripolifosfato de sódio; em que o composto contendo magnésio compreende sulfato de magnésio ou cloreto de magnésio; e em que o indutor de quitinase compreende quitina, celulose, queratina, quitosano, ou um derivado de quitina, cascas de caranguejo moídas ou cascas de camarão moídas que passam através de malha 325.1. Dry composition, characterized by the fact that it comprises at least one strain of bacteria that produces chitinase; a bacterial nutrient source; a nitrogen-containing compound; a phosphate-containing compound; a magnesium-containing compound; a tampon; and a chitinase inducer; wherein the at least one strain of bacteria comprises B. licheniformis, B. pumilus and B. amiloliquefaciens; wherein the bacterial nutrient source comprises peptone, tryptone, casein, an amino acid, a vitamin, beef extract, or yeast extract; wherein the nitrogen-containing compound comprises ammonium chloride, ammonium nitrate, ammonium sulfate or ammonium phosphate; wherein the phosphate-containing compound comprises dipotassium phosphate, phosphoric acid, diammonium phosphate, disodium phosphate, monosodium phosphate, or sodium tripolyphosphate; wherein the magnesium-containing compound comprises magnesium sulfate or magnesium chloride; and wherein the chitinase inducer comprises chitin, cellulose, keratin, chitosan, or a chitin derivative, ground crab shells or ground shrimp shells passing through 325 mesh. 2. Composição seca, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a razão em peso de B. licheniformis para (B. pumilus + B. amiloliquefaciens) é de cerca de 2:1 a cerca de 3:1, em que o termo cerca de se refere a ± 10% do número indicado.2. Dry composition according to claim 1, characterized by the fact that the weight ratio of B. licheniformis to (B. pumilus + B. amiloliquefaciens) is from about 2:1 to about 3:1, in that the term about refers to ± 10% of the indicated number. 3. Composição seca, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a pelo menos uma cepa de bactérias está presente na quantidade de pelo menos 1x106 UFC por grama de pó seco, ou de cerca de 1x1010 UFC a cerca de 5x1012 UFC, de cerca de 1x1011 UFC a cerca de 1x1012 UFC, em que o termo cerca de se refere a ± 10% do número indicado.3. Dry composition according to claim 1 or 2, characterized by the fact that the at least one strain of bacteria is present in an amount of at least 1x106 CFU per gram of dry powder, or from about 1x1010 CFU to about 5x1012 UFC, from about 1x1011 UFC to about 1x1012 UFC, where the term about refers to ± 10% of the indicated number. 4. Composição seca, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a fonte de nutriente bacteriano compreende de cerca de 3% em peso a cerca de 95% em peso, ou de cerca de 33% em peso a cerca de 93% em peso, ou de cerca de 70% em peso a cerca de 80% em peso da composição seca, em que o termo cerca de se refere a ± 10% do número indicado.4. Dry composition according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the bacterial nutrient source comprises from about 3% by weight to about 95% by weight, or from about 33% by weight to about 93% by weight, or from about 70% by weight to about 80% by weight of the dry composition, wherein the term about refers to ± 10% of the indicated number. 5. Composição seca, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o composto contendo nitrogênio compreende de cerca de 0,1% em peso a cerca de 5% em peso, ou de cerca de 0,25% em peso a cerca de 3% em peso, ou de cerca de 1% em peso a cerca de 2% em peso, ou de cerca de 1% em peso a cerca de 1,5% em peso da composição seca, em que o termo cerca de se refere a ± 10% do número indicado.5. Dry composition according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the nitrogen-containing compound comprises from about 0.1% by weight to about 5% by weight, or from about 0.25 % by weight to about 3% by weight, or from about 1% by weight to about 2% by weight, or from about 1% by weight to about 1.5% by weight of the dry composition, wherein the term about refers to ± 10% of the indicated number. 6. Composição seca, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o composto contendo fosfato compreende de cerca de 0,1% em peso a cerca de 5% em peso, ou de cerca de 0,1% em peso a cerca de 1% em peso, ou de cerca de 0,5% em peso a cerca de 0,75% em peso da composição seca, em que o termo cerca de se refere a ± 10% do número indicado.6. Dry composition according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the phosphate-containing compound comprises from about 0.1% by weight to about 5% by weight, or from about 0.1 % by weight to about 1% by weight, or from about 0.5% by weight to about 0.75% by weight of the dry composition, wherein the term about refers to ± 10% of the indicated number. 7. Composição seca, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o tampão compreende bicarbonato de sódio ou carbonato de sódio; ou em que o tampão compreende de cerca de 5% em peso a cerca de 20% em peso, ou de cerca de 7% em peso a cerca de 16% em peso, ou de cerca de 12% em peso a cerca de 15% em peso da composição seca, em que o termo cerca de se refere a ± 10% do número indicado.7. Dry composition according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the buffer comprises sodium bicarbonate or sodium carbonate; or wherein the buffer comprises from about 5% by weight to about 20% by weight, or from about 7% by weight to about 16% by weight, or from about 12% by weight to about 15% by weight of the dry composition, wherein the term about refers to ± 10% of the indicated number. 8. Composição seca, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o indutor de quitinase compreende de cerca de 0,1% em peso a cerca de 15% em peso, ou de cerca de 0,1% em peso a cerca de 5% em peso da composição seca, em que o termo cerca de se refere a ± 10% do número indicado.8. Dry composition according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the chitinase inducer comprises from about 0.1% by weight to about 15% by weight, or from about 0.1 % by weight to about 5% by weight of the dry composition, wherein the term about refers to ± 10% of the indicated number. 9. Composição seca, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a fonte de nutriente bacteriano é extrato de levedura e está presente em uma quantidade de cerca de 33% em peso a 93% em peso da composição seca; o composto contendo nitrogênio é cloreto de amônio e está presente em uma quantidade de cerca de 0,1% em peso a cerca de 5% em peso da composição seca; o composto contendo fosfato está presente em uma quantidade de cerca de 0,1% em peso a cerca de 5% em peso da composição seca; o composto contendo magnésio é sulfato de magnésio e está presente em uma quantidade de cerca de 0,1% em peso a cerca de 5% em peso da composição seca; o tampão está presente em uma quantidade de cerca de 5% em peso a 20% em peso da composição seca; o indutor de quitinase é quitina e está presente em uma quantidade de cerca de 0,1% em preso a 15% em peso da composição seca; e o termo cerca de se refere a ± 10% do número indicado.9. Dry composition according to any one of claims 1 to 8, characterized by the fact that the bacterial nutrient source is yeast extract and is present in an amount of about 33% by weight to 93% by weight of the composition dry; the nitrogen-containing compound is ammonium chloride and is present in an amount of about 0.1% by weight to about 5% by weight of the dry composition; the phosphate-containing compound is present in an amount of about 0.1% by weight to about 5% by weight of the dry composition; the magnesium-containing compound is magnesium sulfate and is present in an amount of about 0.1% by weight to about 5% by weight of the dry composition; the buffer is present in an amount of about 5% by weight to 20% by weight of the dry composition; the chitinase inducer is chitin and is present in an amount of about 0.1% in 15% by weight of the dry composition; and the term about refers to ± 10% of the indicated number. 10. Método de preparar uma mistura líquida para controle de pragas, caracterizado pelo fato de que compreende combinar (A) uma composição seca compreendendo pelo menos uma cepa de bactérias que produz quitinase, em que a pelo menos uma cepa de bactérias compreende B. licheniformis, B. pumilus e B. amiloliquefaciens; uma fonte de nutriente bacteriano; um composto contendo nitrogênio; um composto contendo fosfato; um composto contendo magnésio; um tampão; e um indutor de quitinase com (B) água, para obter uma mistura líquida, em que a fonte de nutriente bacteriano compreende peptona, triptona, caseína, um aminoácido, uma vitamina, extrato de carne bovina, ou extrato de levedura; em que o composto contendo nitrogênio compreende cloreto de amônio, nitrato de amônio, sulfato de amônio ou fosfato de amônio; em que o composto contendo fosfato compreende fosfato dipotássico, ácido fosfórico, fosfato de diamônio, fosfato dissódico, fosfato monossódico, ou tripolifosfato de sódio; em que o composto contendo magnésio compreende sulfato de magnésio ou cloreto de magnésio; e em que o indutor de quitinase compreende quitina, celulose, queratina, quitosano, ou um derivado de quitina, cascas de caranguejo moídas ou cascas de camarão moídas que passam através de malha 325.10. Method of preparing a liquid mixture for pest control, characterized by the fact that it comprises combining (A) a dry composition comprising at least one strain of bacteria that produces chitinase, wherein the at least one strain of bacteria comprises B. licheniformis , B. pumilus and B. amiloliquefaciens; a bacterial nutrient source; a nitrogen-containing compound; a phosphate-containing compound; a magnesium-containing compound; a tampon; and a chitinase inducer with (B) water, to obtain a liquid mixture, in which the bacterial nutrient source comprises peptone, tryptone, casein, an amino acid, a vitamin, beef extract, or yeast extract; wherein the nitrogen-containing compound comprises ammonium chloride, ammonium nitrate, ammonium sulfate or ammonium phosphate; wherein the phosphate-containing compound comprises dipotassium phosphate, phosphoric acid, diammonium phosphate, disodium phosphate, monosodium phosphate, or sodium tripolyphosphate; wherein the magnesium-containing compound comprises magnesium sulfate or magnesium chloride; and wherein the chitinase inducer comprises chitin, cellulose, keratin, chitosan, or a chitin derivative, ground crab shells or ground shrimp shells passing through 325 mesh. 11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente aerar a mistura líquida durante um primeiro período de tempo em uma primeira temperatura para produzir uma mistura líquida aerada contendo quitinase.11. The method of claim 10, further comprising aerating the liquid mixture for a first period of time at a first temperature to produce an aerated liquid mixture containing chitinase. 12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o primeiro período de tempo é de cerca de 8 horas a cerca de 168 horas, ou de cerca de 24 horas a cerca de 120 horas, ou de cerca de 48 horas a cerca de 72 horas, ou de cerca de 72 horas a cerca de 150 horas; ou em que a primeira temperatura é de cerca de 15°C a cerca de 40°C, ou de cerca de 23°C a cerca de 40°C, ou de cerca de 23°C a cerca de 30°C; ou em que a mistura líquida permanece dentro de uma faixa de pH de cerca de 6,5 a cerca de 9,5 durante a aeração, em que o termo cerca de se refere a ± 10% do número indicado.12. The method of claim 11, wherein the first period of time is from about 8 hours to about 168 hours, or from about 24 hours to about 120 hours, or from about 48 hours to about 72 hours, or from about 72 hours to about 150 hours; or wherein the first temperature is from about 15°C to about 40°C, or from about 23°C to about 40°C, or from about 23°C to about 30°C; or wherein the liquid mixture remains within a pH range of about 6.5 to about 9.5 during aeration, wherein the term about refers to ± 10% of the indicated number. 13. Mistura líquida, caracterizada pelo fato de que é produzida pelo método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 12, em que a mistura líquida compreende pelo menos uma cepa de bactérias que produz quitinase, em que a pelo menos uma cepa de bactérias compreende B. licheniformis, B. pumilus e B. amiloliquefaciens; uma fonte de nutriente bacteriano; um composto contendo nitrogênio; um composto contendo fosfato; um composto contendo magnésio; um tampão; um indutor de quitinase; e água, em que a fonte de nutriente bacteriano compreende peptona, triptona, caseína, um aminoácido, uma vitamina, extrato de carne bovina, ou extrato de levedura; em que o composto contendo nitrogênio compreende cloreto de amônio, nitrato de amônio, sulfato de amônio ou fosfato de amônio; em que o composto contendo fosfato compreende fosfato dipotássico, ácido fosfórico, fosfato de diamônio, fosfato dissódico, fosfato monossódico, ou tripolifosfato de sódio; em que o composto contendo magnésio compreende sulfato de magnésio ou cloreto de magnésio; e em que o indutor de quitinase compreende quitina, celulose, queratina, quitosano, ou um derivado de quitina, cascas de caranguejo moídas ou cascas de camarão moídas que passam através de malha 325.13. Liquid mixture, characterized by the fact that it is produced by the method as defined in any one of claims 10 to 12, wherein the liquid mixture comprises at least one strain of bacteria that produces chitinase, wherein the at least one strain of bacteria comprises B. licheniformis, B. pumilus and B. amiloliquefaciens; a bacterial nutrient source; a nitrogen-containing compound; a phosphate-containing compound; a magnesium-containing compound; a tampon; a chitinase inducer; and water, wherein the bacterial nutrient source comprises peptone, tryptone, casein, an amino acid, a vitamin, beef extract, or yeast extract; wherein the nitrogen-containing compound comprises ammonium chloride, ammonium nitrate, ammonium sulfate or ammonium phosphate; wherein the phosphate-containing compound comprises dipotassium phosphate, phosphoric acid, diammonium phosphate, disodium phosphate, monosodium phosphate, or sodium tripolyphosphate; wherein the magnesium-containing compound comprises magnesium sulfate or magnesium chloride; and wherein the chitinase inducer comprises chitin, cellulose, keratin, chitosan, or a chitin derivative, ground crab shells or ground shrimp shells passing through 325 mesh. 14. Método de controlar nematódeos e/ou infecções fúngicas ao redor de plantas, caracterizado pelo fato de que compreende pulverizar uma mistura líquida sobre ou ao redor de plantas, em que a mistura líquida é produzida pelo método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 12.14. Method of controlling nematodes and/or fungal infections around plants, characterized in that it comprises spraying a liquid mixture on or around plants, wherein the liquid mixture is produced by the method as defined in any one of the claims 10 to 12. 15. Método de controlar nematódeos e/ou infecções fúngicas ao redor de plantas, caracterizado pelo fato de que compreende pulverizar uma mistura líquida sobre as plantas ou sobre o solo em torno das plantas, em que a mistura líquida compreende pelo menos uma cepa de bactérias que produz quitinase, em que a pelo menos uma cepa de bactérias compreende B. licheniformis, B. pumilus e B. amiloliquefaciens; uma fonte de nutriente bacteriano; um composto contendo nitrogênio; um composto contendo fosfato; um composto contendo magnésio; um tampão; um indutor de quitinase; e água, em que a fonte de nutriente bacteriano compreende peptona, triptona, caseína, um aminoácido, uma vitamina, extrato de carne bovina, ou extrato de levedura; em que o composto contendo nitrogênio compreende cloreto de amônio, nitrato de amônio, sulfato de amônio ou fosfato de amônio; em que o composto contendo fosfato compreende fosfato dipotássico, ácido fosfórico, fosfato de diamônio, fosfato dissódico, fosfato monossódico, ou tripolifosfato de sódio; em que o composto contendo magnésio compreende sulfato de magnésio ou cloreto de magnésio; e em que o indutor de quitinase compreende quitina, celulose, queratina, quitosano, ou um derivado de quitina, cascas de caranguejo moídas ou cascas de camarão moídas que passam através de malha 325.15. Method of controlling nematodes and/or fungal infections around plants, characterized by the fact that it comprises spraying a liquid mixture onto the plants or onto the soil around the plants, wherein the liquid mixture comprises at least one strain of bacteria which produces chitinase, wherein the at least one strain of bacteria comprises B. licheniformis, B. pumilus and B. amiloliquefaciens; a bacterial nutrient source; a nitrogen-containing compound; a phosphate-containing compound; a magnesium-containing compound; a tampon; a chitinase inducer; and water, wherein the bacterial nutrient source comprises peptone, tryptone, casein, an amino acid, a vitamin, beef extract, or yeast extract; wherein the nitrogen-containing compound comprises ammonium chloride, ammonium nitrate, ammonium sulfate or ammonium phosphate; wherein the phosphate-containing compound comprises dipotassium phosphate, phosphoric acid, diammonium phosphate, disodium phosphate, monosodium phosphate, or sodium tripolyphosphate; wherein the magnesium-containing compound comprises magnesium sulfate or magnesium chloride; and wherein the chitinase inducer comprises chitin, cellulose, keratin, chitosan, or a chitin derivative, ground crab shells or ground shrimp shells passing through 325 mesh.