BR112019018863A2

BR112019018863A2 - tcrs de alta afinidade específicos para mage-a1 e usos dos mesmos

Info

Publication number: BR112019018863A2
Application number: BR112019018863A
Authority: BR
Inventors: Chapuis Aude; McAfee Megan; Schmitt Thomas
Original assignee: Hutchinson Fred Cancer Res
Priority date: 2017-03-15
Filing date: 2018-03-15
Publication date: 2020-04-14
Also published as: SG11201908527SA; WO2018170338A2; WO2018170338A3; JP2021090462A; US20210355189A1; MX2019010972A; EP3595708A4; JP7037577B2; CN110582299A; US11034748B2; CA3055983A1; AU2018234830A1; KR102375033B1; KR20190129082A; BR112019018863A8; JP2020509767A; US20200017568A1; IL269250A; AU2018234830B2; EA201992131A1

Abstract

a presente divulgação fornece tcrs com alta afinidade ou com afinidade aprimorada contra vários antígenos associados a tumores (incluindo epítopos de mage-a1 humano), células t que expressam esses tcrs de alta afinidade antígenos-específicos, ácidos nucleicos que codificam os mesmos e composições para uso no tratamento de doenças ou distúrbios em que as células superexpressam um ou mais desses antígenos, como no câncer.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: TCRS DE

ALTA AFINIDADE ESPECÍFICOS PARA MAGE-A1 E USOS DOS MESMOS

DECLARAÇÃO QUANTO À LISTAGEM DE SEQUÊNCIA [0001] A Listagem de Sequência associada a este pedido é provida em formato de texto ao invés de uma cópia em papel e é incorporada por meio do presente instrumento por referência no relatório descritivo. O nome do arquivo de texto que contém a Listagem de Sequência é 360056_446WO_SEQUENCE_LISTING.txt. O arquivo de texto tem 86,3 KB, foi criado em 14 de março de 2018 e está sendo enviado eletronicamente via EFS-Web.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [0002] A transferência adotiva de células T específicas de tumores é uma estratégia atraente para eliminar tumores existentes e requer o estabelecimento de uma população robusta de células T específicas de antígenos ín vivo para eliminar tumores existentes e prevenir recorrências (Stromnes et al. , Immunol. Rev. 257:145, 2014) . Embora a transferência de linfócitos T citotóxicos (CTLs) CD8⁺específicos de tumor seja segura e possa mediar a atividade antitumoral direta em pacientes selecionados (Chapuis et al., Cancer Res. 72:LB-136, 2012; Chapuis et al., Sei.

Transi. Med. 5:174ral27, 2013; Chapuis et al. , Proc. Nat ' 1.

Acad. Sei. USA. 109:4592, 2012),^2-4 a variabilidade na avidez dos CTLs isolados de cada paciente ou doador limita a

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2/115 eficácia antitumoral em ensaios clínicos (Chapuis et al., 2013) . Uma vez que a afinidade do TCR é um determinante importante da avidez do CTL (Zoete et al. , Frontiers Immunol. 4:268, 2013), estratégias foram desenvolvidas para redirecionar a especificidade de antígeno de células T de doador ou paciente usando genes TCRa/β de alta afinidade isolados de um clone de célula T bem caracterizado, específico para um antígeno específico de tumor (Stromnes et al. , Immunol. Rev. 257:145, 2014; Robbins et al., J. Clin. Oncol. 29:911, 2011). Tais células T autorreativas/reativas tumorais de alta afinidade são raras, visto que as células T que expressam TCRs autorreativas/reativas tumorais estão sujeitas a tolerância central e periférica (Stone and Kranz, Frontiers Immunol. 4:244, 2013), com afinidades relativas de TCR variando amplamente entre doadores. Portanto, muitos doadores compatíveis devem ser examinados para identificar um clone de célula T específico de tumor de afinidade suficientemente alta a partir do qual um construto de terapia genética de TCRa/β pode ser gerado. Por exemplo, o isolamento de um TCR específico de antígeno 1 do tumor de Wilms (WT1) provocado naturalmente, com alta avidez funcional para um único alelo HLA, exigiu o exame de centenas de linhas de células T específicas de WT, representando milhares de clones de células T individuais dos repertórios periféricos de mais de 75 doadores normais, um processo que demanda muito tempo

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3/115 e trabalho (Chapuis et al., 2013; Schmitt et al., Hum. Gene Then. 20:1240, 2009; Ho et al., J. Immunol. Methods 310:40, 2006).

[0003] Há uma necessidade de imunoterapias alternativas ao TCR especificas de antigeno, direcionadas contra vários tipos de câncer, tais como leucemia e tumores. As modalidades atualmente divulgadas atendem a essas necessidades e fornecem outras vantagens relacionadas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0004] As Figuras IA e 1B mostram dados representativos que ilustram que células T de alta afinidade para antigenos virais são encontradas em frequências mais altas (A) do que células T de alta afinidade para autoantigenos, que são encontradas em frequências muito baixas (B).

[0005] As Figuras 2A e 2B mostram, respectivamente, (A) um esquema de um ensaio de enriquecimento de células T realizado pelos inventores da presente divulgação, (B) dados de citometria de fluxo de uma série de experiências de classificação usadas para enriquecer células T CD8⁺especificas de antígeno.

[0006] A Figura 3 mostra dados exemplificativos de um esquema de enriquecimento de TCRp CDR3 da presente divulgação usando tetrâmeros MAGE-A1:HLA.

[0007] As Figuras 4A e 4B mostram, respectivamente, (A) ligação específica de tetrâmeros MAGE-A1:HLA por TCRs

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4/115 identificados usando métodos da presente divulgação e (B) enriquecimento de TCRs específicos de MAGE-Al.

[0008] As Figuras 5A-5C fornecem, respectivamente, (A) dados de citometria de fluxo mostrando células T CD8⁺específicas de MAGE-Al da presente divulgação que ligam tetrâmeros MAGE-Al:HLA, (B) produção de citocinas por células T CD8⁺ específicas de MAGE-Al na ausência (esquerda) ou presença (direita) de células de mieloma U266 que expressam antígenos e (C) dados de lise específicos que mostram que as células T CD8⁺ transduzidas por TCR MAGE-Al de alta afinidade desta divulgação ligam o antígeno:tetrâmeros MHC e matam as células apresentando MAGE-Al :MHC (A*0201) . Os dados em (C) foram de um ensaio padrão de liberação de Cr⁵¹, no qual as células T CD8⁺ foram cocultivadas apenas com células U266, com interferon gama exógeno (ΙΕΝγ) ou com peptídeo MAGE-Al exógeno.

[0009] A Figura 6A ilustra uma abordagem de imunoterapia de acordo com a presente divulgação, na qual células T CD4⁺são transduzidas para expressar um correceptor de TCR e CD8, ambos a partir de uma célula T CD8⁺ que é específica para um antígeno peptídico. A ativação da célula T CD4⁺ transduzida pode aumentar ou melhorar a resposta antigênica das células T CD8⁺, tais como CTLs infundidos em um cenário de imunoterapia. A Figura 6B mostra o projeto de uma experiência realizada pelos inventores da presente divulgação na qual

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5/115 uma célula T CD4⁺ foi transduzida para expressar um TCR restrito ao MHC de Classe I independente de CD8, mas não um correceptor de CD8.

[0010] A Figura 7A mostra os dados da citometria de fluxo de uma experiência em que as células T (CD8⁺ e CD4⁺) que expressam o TCR anti-MAGE-Al de CD8 de alta afinidade foram testadas quanto à ligação a tetrâmeros MAGE-A1:MHC. A Figura 7B mostra a ligação específica pelas células T específicas de MAGE-A1 aos tetrâmeros MAGE-A1:MHC. A Figura 7C mostra a lise de células alvo (liberação de Cr⁵¹) por células T CD8⁺ que expressam TCR específico de MAGE-A1 desta divulgação e a falta de morte por células T CD4 ⁺ comparáveis.

[0011] A Figura 8A mostra um esguema que ilustra uma experiência conduzida pelos inventores da presente divulgação na qual células T CD4⁺ foram transduzidas para expressar o TCR MAGE Al de Classe I de alta afinidade mais um correceptor CD8a[3 e examinadas quanto à funcionalidade na presença de células que expressam peptídeo:MHC. A Figura 8B mostra que uma proporção mais alta de células T CD4⁺transduzidas com o correceptor TCR MAGE-Al e correceptor CD8 produziu citocinas em comparação com células T CD4⁺ que expressam apenas o TCR MAGE-Al. A Figura 8C mostra a lise específica de células alvo de melanoma MEL526 que apresentam antígeno pelas células T indicadas. A Figura 8D mostra a

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6/115 expansão dos dois grupos de células T CD4⁺ transduzidas após estimulação com antigeno.

DESCRIÇÃO DETALHADA [0012] Em certos aspectos, a presente divulgação fornece composições que compreendem proteínas de ligação específicas para antígenos peptídicos MAGE-Al associados a um complexo principal de histocompatibilidade (MHC) (por exemplo, antigeno leucocitário humano, HLA), que pode ser usado, por exemplo, no tratamento de doenças ou distúrbios associados à expressão de MAGE-Al (por exemplo, câncer) ou imunoterapia adotiva para tratar o câncer. Em certas modalidades, a presente divulgação fornece polinucleotídeos que codificam tais proteínas de ligação específicas de MAGE-Al, bem como células hospedeiras modificadas para expressar proteínas de ligação específicas de MAGE-Al (por exemplo, TCRs).

[0013] Em outros aspectos, a presente divulgação fornece células T CD4⁺ modificadas compreendendo um polinucleotídeo heterólogo que codifica um TCR a partir de uma célula T CD8⁺que é capaz de se ligar especificamente a um antigeno peptídico (por exemplo, MAGE-Al) e opcionalmente compreendendo um polinucleotídeo heterólogo que codifica pelo menos uma porção extracelular de uma molécula de correceptor de CD8 .

[0014] A título de fundamentos, a maioria dos alvos tumorais para imunoterapias baseadas em células T são

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7/115 autoantígenos, visto que os tumores surgem de tecido previamente normal. Por exemplo, esses antigenos associados a tumores (TAAs) podem ser expressos em altos níveis em uma célula cancerígena, mas podem não ser expressos ou podem ser minimamente expressos em outras células. Durante o desenvolvimento das células T no timo, as células T que se ligam fracamente aos autoantígenos podem sobreviver no timo e podem sofrer desenvolvimento e maturação adicionais, enquanto as células T que se ligam fortemente aos autoantígenos são eliminadas pelo sistema imunológico, visto que tais células montariam uma resposta autoimune indesejável. Portanto, as células T são classificadas por sua capacidade relativa de se ligar aos antigenos para preparar o sistema imunológico para responder contra um invasor estranho (ou seja, reconhecimento de não autoantígeno) e, ao mesmo tempo, impedir uma resposta autoimune (ou seja, reconhecimento de autoantígeno). Esse mecanismo de tolerância limita as células T de ocorrência natural que podem reconhecer (auto) antigenos tumorais com alta afinidade e, portanto, elimina as células T que eliminariam efetivamente as células tumorais. Consequentemente, o isolamento de células T com TCRs de alta afinidade específicos de antigenos tumorais é difícil porque a maioria dessas células é essencialmente eliminada pelo sistema imunológico.

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8/115 [0015] A presente divulgação fornece TCRs específicos de peptídeos MAGE-A1 (também chamados de MAGE-1, membro da família MAGE Al, CT 1.1 e Gene de Antígeno de Melanoma 1), tais como TCRs de alta afinidade específicos de peptídeos MAGE-Al, em que uma célula que expressa tal TCR é capaz de se ligar a um complexo de MAGE-A1:HLA independente de CD8. Além disso, tais TCRs podem opcionalmente ser capazes de se associar mais eficientemente a uma proteína CD3 em comparação com TCRs endógenos.

[0016] Um método foi desenvolvido para examinar e classificar rápida e simultaneamente os clonotipos de células T (com base na afinidade) de uma grande coorte de doadores compatíveis com HLA em um curto período de tempo (cerca de 6-8 semanas). Em certas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para enriquecer células com TCRs de alta afinidade usando concentrações limitantes de multímeros pMHC específicos de antígenos na presença de células imunes de um sujeito (por exemplo, PBMCs). O repertório de TCR[3 e a análise de frequência, juntamente com a bioinformática, foram usados para identificar com precisão os pares de cadeia α e cadeia β do TCR. Uma vantagem desses métodos é que eles permitem uma rápida comparação da afinidade de TCR de milhares de clones de múltiplos doadores, em oposição à clonagem de TCRs individuais.

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9/115 [0017] As composições e métodos descritos neste documento terão, em certas modalidades, utilidade terapêutica para o tratamento de doenças e condições associadas à expressão de MAGE-A1. Tais doenças incluem várias formas de distúrbios hiperproliferativos, tais como malignidades hematológicas e cânceres sólidos. Exemplos não limitantes destes e usos relacionados são descritos neste documento e incluem a estimulação in vitro, ex vivo e in vivo de respostas de células T específicas de antígeno MAGEAl, tal como pelo uso de células T recombinantes que expressam um TCR de alta afinidade ou aprimorado específico para um peptídeo MAGE-A1.

[0018] Antes de estabelecer esta divulgação em mais detalhes, pode ser útil para um entendimento desta prover definições de certos termos a serem usados neste documento. Definições adicionais são estabelecidas ao longo desta divulgação.

[0019] Na presente descrição, qualquer intervalo de concentração, intervalo de porcentagem, intervalo de razão, ou intervalo de número inteiro deve ser entendido como incluindo o valor de qualquer número inteiro dentro do intervalo recitado e, quando apropriado, frações deste (como um décimo e um centésimo de um número inteiro), a menos que indicado de outra forma. Além disso, deve-se entender que qualquer intervalo numérico citado neste documento em

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10/115 relação a qualquer característica física, tal como subunidades poliméricas, tamanho ou espessura, inclui qualquer número inteiro dentro do intervalo citado, a menos que indicado de outra forma. Como usado neste documento, o termo cerca de significa ±20% da faixa, valor ou estrutura indicada, a menos que indicado de outra forma. Deve-se entender que os termos um e uma como usados neste documento se referem a um ou mais dos componentes enumerados. O uso da alternativa (por exemplo, ou) deve ser entendido como significando qualquer um, ambos, ou qualquer combinação das alternativas. Como usados neste documento, os termos incluir, ter e compreender são usados como sinônimos, cujos termos e variantes destes se destinam a serem interpretados como não limitantes.

[0020] Ademais, deve ser entendido que os compostos individuais ou grupos de compostos derivados de várias combinações das estruturas e substituintes descritos neste documento são divulgados pelo presente pedido na mesma medida, como se cada composto ou grupo de compostos fosse definido adiante individualmente. Assim, a seleção de estruturas particulares ou substituintes particulares está dentro do escopo da presente divulgação.

[0021] O termo consistir essencialmente em não é equivalente a compreender e se refere aos materiais ou etapas especificadas de uma reivindicação, ou àqueles que

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11/115 não afetam materialmente as características básicas de um assunto reivindicado. Por exemplo, um domínio, região ou módulo de proteína (por exemplo, um domínio de ligação, região de dobradiça, módulo de ligante) ou uma proteína (que pode ter um ou mais domínios, regiões ou módulos) consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos particular quando a sequência de aminoácidos de um domínio, região, módulo ou proteína inclui extensões, deleções, mutações ou uma combinação destes (por exemplo, aminoácidos no amino- ou carboxi-terminal ou entre domínios) que, em combinação, contribuem até no máximo 20% (por exemplo, no máximo 15%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1%) do comprimento de um domínio, região, módulo ou proteína e não afetam substancialmente (ou seja, não reduzem a atividade em mais de 50%, tal como não mais de 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% ou 1%) a atividade do(s) domínio(s), região(ões), módulo(s) ou proteína (por exemplo, a afinidade de ligação alvo de uma proteína de ligação).

[0022] Conforme usado neste documento, célula do sistema imunológico significa qualquer célula do sistema imunológico que se origina de uma célula-tronco hematopoiética na medula óssea, que dá origem a duas linhagens principais, uma célula progenitora mieloide (que dá origem a células mieloides, tais como monócitos, macrófagos, células dendríticas, megacariócitos e

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12/115 granulócitos) e uma célula progenitora linfoide (que dá origem a células linfoides, tais como células T, células B e células natural killer (NK)). As células do sistema imunológico exemplificativas incluem uma célula T CD4+, uma célula T CD8+, uma célula T dupla negativa CD4- CD8-, uma célula T γδ, uma célula T reguladora, uma célula natural killer e uma célula dendritica. Os macrófagos e células dendriticas podem ser referidos como células que apresentam antigeno ou ABCs, que são células especializadas que podem ativar células T quando um receptor do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) na superfície do ABC complexado com um peptídeo interage com um TCR na superfície de uma célula T.

[0023] Complexo principal de histocompatibilidade (MHC) se refere a glicoproteínas que liberam antígenos peptídicos para uma superfície celular. As moléculas de MHC de classe I são heterodímeros com uma membrana que abrange a cadeia α (com três domínios a) e uma microglobulina β2 associada de maneira não covalente. As moléculas de MHC de classe II são compostas por duas glicoproteínas transmembranares, α e β, ambas abrangendo a membrana. Cada cadeia tem dois domínios. As moléculas de MHC de classe I liberam peptídeos originários do citosol à superfície celular, onde um complexo de peptídeo:MHC é reconhecido pelas células T CD8⁺. As moléculas de MHC de classe II liberam

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13/115 peptideos originários do sistema vesicular à superfície celular, onde são reconhecidos pelas células T CD4⁺. 0 MHC humano é referido como antígeno leucocitário humano (HLA).

[0024] Uma célula T é uma célula do sistema imunológico que amadurece no timo e produz receptores de células T (TCRs) . As células T podem ser virgens (não expostas ao antígeno; aumento da expressão de CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD127 e CD45RA e diminuição da expressão de CD45RO em comparação com o Tcm) , células T de memória (T_M) (com experiência em antígenos e longa duração) e células efetoras (com experiência em antígenos, citotóxicas) . A Tm pode ser dividida adicionalmente em subconjuntos de células T de memória central (Tcm, aumento da expressão de CD62L, CCR7, CD28, CD127, CD45RO e CD95 e diminuição da expressão de CD54RA em comparação com células T virgens) e células T efetoras de memória (Tem, diminuição da expressão de CD62L, CCR7, CD28, CD45RA e aumento da expressão de CD127 em comparação com células T virgens ou Tcm) . As células T efetoras (Te) se referem aos linfócitos T citotóxicos CD8+ com experiência em antígeno que têm diminuição da expressão de CD62L, CCR7, CD28 e são positivos para granzima e perforina em comparação com Tcm. Outras células T exemplificativas incluem células T reguladoras, tais como células T reguladoras CD4+ CD25+ (Foxp3+) e células Tregl7, bem como células T restritas a Tri, Th3, CD8+CD28- e Qa-1.

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14/115 [0025] Receptor de células T (TCR) se refere a um membro da superfamilia da imunoglobulina (com um domínio de ligação variável, um domínio constante, uma região transmembranar e uma cauda citoplasmática curta; ver, por exemplo, Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3^a Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997) capaz de se ligar especificamente a um peptideo de antigeno ligado a um receptor MHC. Um TCR pode ser encontrado na superfície de uma célula ou na forma solúvel e geralmente é compreendido por um heterodimero com cadeias a e β (também conhecidas como TCRoc e TCR3, respectivamente) ou cadeias γ e δ (também conhecidas como TCRy e TCRô, respectivamente) . Como imunoglobulinas, a porção extracelular das cadeias de TCR (por exemplo, cadeia a, cadeia β) contém dois domínios de imunoglobulina, um domínio variável (por exemplo, domínio variável da cadeia α ou να, domínio variável da cadeia β ou Vp; tipicamente os aminoácidos 1 a 116 com base na numeração Rabat, Rabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5^a ed.) no terminal N, e um domínio constante (por exemplo, domínio constante da cadeia α ou Ca, tipicamente aminoácidos 117 a 259 com base em Rabat, domínio constante da cadeia β ou Cp, tipicamente

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15/115 aminoácidos 117 a 295 com base em Rabat) adjacentes à membrana celular. Também como imunoglobulinas, os domínios variáveis contêm regiões determinantes complementares (CDRs) separadas por regiões estruturais (FRs) (ver, por exemplo, Jores et al. , Proc. Nat ' 1 Acad. Sei. USA. 87:9138, 1990; Chothia et al. , EMBO J. 7:3745, 1988; ver também Lefranc et al. , Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003) . Os ν_α e Vp de um TCR nativo geralmente têm estruturas semelhantes, com cada domínio variável compreendendo quatro FRs conservados e três CDRs. O domínio ν_α é codificado por dois segmentos de DNA separados, o segmento genético variável e o segmento genético de união (V-J); o domínio Vp é codificado por três segmentos de DNA separados, o segmento genético variável, o segmento genético de diversidade e o segmento genético de união (VD-J) . Um único domínio ν_α ou Vp pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação ao antígeno. Além disso, os TCRs que se ligam a um antígeno específico podem ser isolados usando um domínio ν_α ou Vp de um TCR que se liga ao antígeno, a fim de fazer a triagem de uma biblioteca de domínios ν_α ou Vp complementares, respectivamente. Em certas modalidades, um TCR é encontrado na superfície das células T (ou linfócitos T) e associado ao complexo de CD3. A fonte de um TCR conforme usado na presente divulgação pode ser de

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16/115 várias espécies de animais, incluindo humanos, camundongo, rato, coelho ou outros mamíferos.

[0026] Conforme usado neste documento, o termo correceptor CD8 ou CD8 significa a glicoproteína CD8 da superfície celular, como um homodímero alfa-alfa ou um heterodímero alfa-beta. O correceptor CD8 auxilia na função das células T citotóxicas (CD8⁺) e funciona através da sinalização por meio de sua via de fosforilação da tirosina citoplasmática (Gao and Jakobsen, Immunol. Today 21:630-636, 2000; Cole and Gao, Cell. Mol. Immunol. 1:81-88, 2004) . Existem 5 (cinco) cadeias beta CD8 diferentes (consulte ο identificador UniProtKB P10966) e uma única cadeia alfa CD8 (consulte o identificador UniProtKB P01732). O CD8 geralmente liga complexos de pMHC de Classe I.

[0027] Correceptor CD4 ou CD4 se refere a uma glicoproteína de correceptor de imunoglobulina que auxilia o TCR na comunicação com células que apresentam antígeno (ver, Campbell & Reece, Biology 909 (Benjamin Cummings, Sexta Ed., 2002)) . O CD4 é encontrado na superfície de células imunes, tais como células T helper, monócitos, macrófagos e células dendríticas, e inclui guatro domínios de imunoglobulina (Dl a D4) que são expressos na superfície celular. Durante a apresentação do antígeno, o CD4 é recrutado, juntamente com o complexo de TCR, para se ligar a diferentes regiões da molécula MHCII (CD4 se liga a MHCII

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17/115 β2, enquanto ο complexo de TCR se liga a MHCII αΐ/βΐ). Sem querer se limitar à teoria, acredita-se que a proximidade do complexo de TCR permite que as moléculas de quinase associadas a CD4 fosforilem os motivos de ativação de tirosina imunorreceptora (ITAMs) presentes nos domínios citoplasmáticos de CD3. Pensa-se que essa atividade amplifica o sinal gerado pelo TCR ativado, a fim de produzir vários tipos de células T helper. 0 CD4 geralmente liga complexos de pMHC de Classe II.

[0028] O CD3 é um complexo multiproteico de seis cadeias (ver, Abbas and Lichtman, 2003; Janeway et al. , pl72 e 178, 1999). Nos mamíferos, o complexo compreende uma cadeia de CD3y, uma cadeia de CD3õ, duas cadeias de CD3s e um homodímero de cadeias de CD3/. As cadeias de CD3y, CD3õ e CD3s são proteínas de superfície de célula altamente relacionados da superfamília de imunoglobulina contendo um domínio único de imunoglobulina. As regiões transmembranares das cadeias de CD3y, CD3õ e CD3s são negativamente carregadas, que é uma característica que permite que estas cadeias se associem com a célula T carregada positivamente das cadeias do receptor. As caudas intracelulares das cadeias CD3y, CD3õ, e CD3s contêm um único motivo conservado, conhecido como um motivo de ativação baseada em tirosina imunorreceptora ou ITAM, considerando que cada cadeia de CD3/ tem três. Sem querer se limitar à teoria, acredita-se

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18/115 que os ITAM são importantes para a capacidade de sinalização de um complexo de TCR. 0 CD3, conforme usado na presente divulgação, pode ser de várias espécies de animais, incluindo humanos, camundongo, rato ou outros mamíferos.

[0029] Conforme usado neste documento, complexo de TCR se refere a um complexo formado pela associação de CD3 com TCR. Por exemplo, um complexo TCR pode ser composto por uma cadeia de CD3y, uma cadeia de CD3õ, duas cadeias de CD3s, um homodímero de cadeias de CD3ζ, uma cadeia de TCRa e uma cadeia de TCRp . Alternativamente, um complexo TCR pode ser composto de uma cadeia de CD3y, uma cadeia de CD3õ, duas cadeias de CD3s, um homodímero de cadeias de CD3ζ, uma cadeia de TCRy e uma cadeia de TCRõ.

[0030] Um componente de um complexo de TCR, conforme usado neste documento, se refere a uma cadeia de TCR (ou seja, TCRa, TCRp, TCRy ou TCRõ), uma cadeia de CD3 (ou seja, CD3y, CD3õ, CD3s ou CD3ζ) ou um complexo formado por duas ou mais cadeias de TCR ou cadeias de CD3 (por exemplo, um complexo de TCRa e TCRp, um complexo de TCRy e TCRõ, um complexo de CD3s e CD3õ, um complexo de CD3y e CD3s ou um complexo sub-TCR de cadeias de TCRa, TCRp, CD3y, CD3õ e duas cadeias de CD3s).

[0031] Um domínio de ligação (também referido como região de ligação ou fração de ligação), conforme usado neste documento, se refere a uma molécula ou porção desta

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19/115 (por exemplo, peptideo, oligopeptideo, polipeptídeo, proteína) que possui a capacidade de associar, unir ou combinar especificamente e de maneira não covalente com um alvo (por exemplo, complexo de peptideo MAGE-Al, MAGEAl :MHC) . Um domínio de ligação inclui qualquer parceiro de ligação de ocorrência natural, sintético, semissintético ou produzido de forma recombinante para uma molécula biológica, um complexo molecular (ou seja, um complexo compreendendo duas ou mais moléculas biológicas) ou outro alvo de interesse. Os domínios de ligação exemplificativos incluem regiões variáveis de imunoglobulina de cadeia única (por exemplo, scTCR, scFv) , ectodominios de receptor, ligantes (por exemplo, citocinas, quimiocinas) ou polipeptídeos sintéticos selecionados por sua capacidade específica de se ligar a uma molécula biológica, um complexo molecular ou outro alvo de interesse.

[0032] Conforme usado neste documento, se liga especificamente ou específico para se refere a uma associação ou união de uma proteína de ligação (por exemplo, receptor de TCR) ou um domínio de ligação (ou proteína de fusão deste) a uma molécula alvo com uma afinidade ou K_a (ou seja, uma constante de associação de equilíbrio de uma interação de ligação específica com unidades de 1/M) igual ou superior a 10⁵ M^_1 (que é igual à razão entre a taxa de associação [k_on] e a taxa de dissociação [k_Off] para essa

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20/115 reação de associação) , embora não se associe ou se junte significativamente a outras moléculas ou componentes em uma amostra. As proteínas de ligação ou domínios de ligação (ou proteínas de fusão destes) podem ser classificados como proteínas de ligação de alta afinidade ou domínios de ligação (ou proteínas de fusão destes) ou como proteínas de ligação de baixa afinidade ou domínios de ligação (ou proteínas de fusão destes) . As proteínas de ligação ou domínios de ligação de alta afinidade se referem a essas proteínas de ligação ou domínios de ligação com uma K_a de pelo menos 10⁷ M^_1, pelo menos 10⁸ M^_1, pelo menos 10⁹ M^_1, pelo menos IO¹⁰ M^_1, pelo menos 10¹¹ M^_1, pelo menos 10¹² M^_1, ou pelo menos 10¹³ As proteínas de ligação ou domínios de ligação de baixa afinidade se referem a essas proteínas de ligação ou domínios de ligação com uma K_a de até 10⁷ M^_1, até 10⁶ M^_1, até 10⁵ Alternativamente, a afinidade pode ser definida como uma constante de dissociação de equilíbrio (Kd) de uma interação de ligação específica com unidades de M (por exemplo, ICT⁵ M a ICT¹³ M) .

[0033] Em certas modalidades, um receptor ou domínio de ligação pode ter afinidade aprimorada, que se refere a receptores selecionados ou manipulados por engenharia ou domínios de ligação com ligação mais forte a um antígeno alvo do que um domínio de ligação de tipo selvagem (ou precursor). Por exemplo, a afinidade aprimorada pode ser

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21/115 devido a uma K_a (constante de associação de equilíbrio) para o antígeno alvo que é maior que o domínio de ligação do tipo selvagem, devido a uma Kd (constante de dissociação) para o antígeno alvo que é menor que o domínio de ligação do tipo selvagem, devido a uma taxa de dissociação (k_Off) para o antígeno alvo que é menor que o domínio de ligação do tipo selvagem ou uma combinação destes. Em certas modalidades, os TCRs de afinidade aprimorada podem ser otimizados por códon para aprimorar a expressão em uma célula hospedeira específica, tais como células T (Scholten et al., Clln. Immunol. 119:135, 2006).

[0034] Uma variedade de ensaios são conhecidos para identificar domínios de ligação da presente divulgação que ligam especificamente um alvo específico, bem como determinar as afinidades do domínio de ligação ou das proteínas de fusão, tais como o teste Western blot, ELISA, ultracentrifugação analítica, espectroscopia e análise de ressonância plasmônica de superfície (Biacore®) (ver, por exemplo, Scatchard et al. , Ann. N.Y. Acad. Scl. 51:660, 1949; Wilson, Science 295:2103, 2002; Wolff et al. , Cancer Res. 53:2560, 1993; e Patentes US n° 5.283.173, 5.468.614 ou equivalente).

[0035] O termo proteína de ligação específica de MAGEAl se refere a uma proteína ou polipeptídeo que se liga especificamente à MAGE-A1 ou a um peptídeo ou fragmento

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22/115 desta. Em algumas modalidades, uma proteína ou polipeptídeo de ligação específica de MAGE-Al se liga à MAGE-A1 ou a um peptídeo desta, como um peptídeo MAGE-Al complexado com uma molécula de MHC ou HLA, por exemplo, em uma superfície celular, com pelo menos, ou pelo menos cerca de uma afinidade específica. Em certas modalidades, uma proteína de ligação específica de MAGE-Al se liga a um complexo de peptídeo derivado de MAGE-Al:HLA (ou complexo de peptídeo derivado de MAGE-Al:MHC) com um Kd menor que cerca de ICT⁸ M, menor que cerca de ICT⁹ M, menor que cerca de ICT¹⁰ M, menor que cerca de ICG¹¹ M, menor que cerca de ICT¹² M ou menor que cerca de ICr¹³ M, ou com uma afinidade aproximadamente igual a, pelo menos aproximadamente igual a, ou que é maior do que ou aproximadamente a afinidade exibida por uma proteína de ligação específica de MAGE-Al exemplificativa fornecida neste documento, tal como qualquer um dos TCRs específicos de MAGE-Al fornecidos neste documento, por exemplo, conforme medido pelo mesmo ensaio. Em certas modalidades, uma proteína de ligação específica de MAGE-Al compreende uma proteína de ligação à superfamília de imunoglobulina específica de MAGEAl ou uma porção de ligação desta.

[0036] Os ensaios para avaliar afinidade ou afinidade aparente ou afinidade relativa incluem, por exemplo, medir a afinidade aparente para um TCR (ou para uma proteína de ligação compreendendo um domínio de ligação derivado de um

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TCR) avaliando a ligação a várias concentrações de tetrâmeros, por exemplo, por citometria de fluxo usando tetrâmeros rotulados. Em alguns exemplos, a Kd aparente de um TCR é medida usando diluições de 2 vezes de tetrâmeros rotulados em uma faixa de concentrações, seguidas pela determinação de curvas de ligação por regressão não linear, sendo a Kd aparente determinada como a concentração do ligante que rendeu metade da ligação máxima.

[0037] O termo domínio de ligação de MAGE-Al ou fragmento de ligação de MAGE-Al se refere a um domínio ou porção de uma proteína de ligação específica de MAGE-A1, responsável pela ligação específica de MAGE-Al. Um domínio de ligação específico de MAGE-A1 sozinho (ou seja, sem qualquer outra porção de uma proteína de ligação específica de MAGE-Al) pode ser solúvel e pode se ligar a MAGE-Al com uma Kd menor que cerca de 10^-8 M, menor que cerca de 10^-9 M, menor que cerca de IO^-10 M, menor que cerca de 10^-11 M, menor que cerca de 10^-12 M ou menor que cerca de 10^-13 M. Os domínios de ligação específicos de MAGE-A1 exemplificativos incluem scTCR específico de MAGE-A1 (por exemplo, proteínas αβΤΟΚ de cadeia única, tais como Va-L-νβ, νβ-L-Va, Va-Ca-L-Va ou VaΕ-νβ-Οβ, em que Va e νβ são domínios variáveis de TCRa e β respectivamente, Ca e Cβ são domínios constantes de TCRa e β respectivamente, e L é um ligante) e fragmentos de scFv,

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24/115 conforme descrito neste documento, que podem ser derivados de um TCR ou anticorpo anti-MAGE-Al.

[0038] Os princípios de processamento de antígeno por células que apresentam antígeno (ARC) (tais como células dendríticas, macrófagos, linfócitos ou outros tipos de células) e de apresentação de antígeno por ARC a células T, incluindo apresentação restrita ao complexo principal de histocompatibilidade (MHC) entre células T e ARC imunocompatíveis (por exemplo, compartilhando pelo menos uma forma alélica de um gene MHC que seja relevante para a apresentação de antígenos), estão bem estabelecidos (ver, por exemplo, Murphy, Janeway's Immunobiology (8^a Ed.) 2011 Garland Science, NY; capítulos 6, 9 and 16). Por exemplo, os peptídeos de antígeno processados originários do citosol (por exemplo, antígeno tumoral, patógeno intracelular) têm geralmente de cerca de 7 aminoácidos a cerca de 11 aminoácidos de comprimento e se associarão às moléculas de MHC de classe I, enquanto os peptídeos processados no sistema vesicular (por exemplo, bacteriana, viral) variarão em comprimento de cerca de 10 aminoácidos a cerca de 25 aminoácidos e se associarão às moléculas de MHC de classe

II.

[0039] O antígeno MAGE-Al ou antígeno peptídico MAGEAl se referem a uma porção produzida natural ou sinteticamente de uma proteína MAGE-Al que varia em

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25/115 comprimento de cerca de 7 aminoácidos a cerca de 15 aminoácidos, que pode formar um complexo com uma molécula de MHC (por exemplo, HLA) e, um tal complexo pode se ligar a um TCR específico para um complexo de peptídeo MAGE-A1:MHC (por exemplo, HLA).

[0040] Um ligante se refere a uma sequência de aminoácidos que conecta duas proteínas, polipeptídeos, peptídeos, domínios, regiões ou motivos e pode fornecer uma função espaçadora compatível com a interação dos dois domínios de subligação, de modo que o polipeptídeo resultante retenha uma afinidade de ligação específica (por exemplo, scTCR) a uma molécula alvo ou retenha a atividade de sinalização (por exemplo, complexo de TCR). Em certas modalidades, um ligante é compreendido por cerca de dois a cerca de 35 aminoácidos, por exemplo, ou cerca de quatro a cerca de 20 aminoácidos ou cerca de oito a cerca de 15

aminoácidos	ou	cerca de 15 a	cerca de 25	aminoácidos.
[0041]	Os	aminoácidos	de junção	ou	resíduos de
aminoácidos	de	junção se referem a um ou	mais	(por exemplo,
cerca de 2-	10)	resíduos de	aminoácidos	entre	dois motivos

adjacentes, regiões ou domínios de um polipeptídeo, tal como entre um domínio de ligação e um domínio de constante adjacente ou entre uma cadeia de TCR e um peptídeo de autoclivagem adjacente. OS aminoácidos de junção podem resultar desde o projeto do construto de uma proteína de

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26/115 fusão (por exemplo, resíduos de aminoácidos resultantes do uso de sítio de enzima de restrição durante a construção de uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína de fusão) .

[0042] Um domínio alterado ou proteína alterada se refere a um motivo, região, domínio, peptídeo, polipeptídeo ou proteína com uma identidade de sequência não idêntica a um motivo, região, domínio, peptídeo, polipeptídeo ou proteína do tipo selvagem (por exemplo, uma cadeia TCRa do tipo selvagem, cadeia TCR3, domínio constante de TCRa, domínio constante de TCR3) de pelo menos 85% (por exemplo, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9%) .

[0043] Conforme usado neste documento, o ácido nucleico ou molécula de ácido nucleico ou polinucleotídeos se referem a qualquer ácido desoxirribonucleico (DNA), ácido ribonucleico (RNA), oligonucleotídeos, fragmentos gerados, por exemplo, pela reação em cadeia da polimerase (PCR) ou por tradução in vitro e fragmentos gerados por qualquer ligação, cisão, ação endonuclease ou ação exonuclease. Em certas modalidades, os ácidos nucleicos da presente divulgação são produzidos por PCR. Os ácidos nucleicos podem ser compostos por monômeros

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27/115 que são nucleotídeos de ocorrência natural (tais como desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos), análogos de nucleotídeos de ocorrência natural (por exemplo, formas enantioméricas α de nucleotídeos de ocorrência natural) ou uma combinação de ambos. Os nucleotídeos modificados podem ter modificações ou substituição de frações de açúcar ou frações de pirimidina ou base de purina. Os monômeros de ácido nucleico podem ser ligados por ligações fosfodiéster ou análogos de tais ligações. Análogos de ligações fosfodiéster incluem fosforotioato, fosforoditioato, fosforosselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato e semelhantes. As moléculas de ácido nucleico podem ser de fita simples ou de fita dupla.

[0044] O termo isolado significa que o material é removido de seu ambiente original (por exemplo, o ambiente natural se ele é natural). Por exemplo, um polipeptídeo ou ácido nucleico ocorrendo naturalmente presente em um animal vivo não é isolado, mas o mesmo polipeptídeo ou ácido nucleico, separado de algum ou de todos os materiais no sistema natural, são isolados. Tal ácido nucleico pode fazer parte de um vetor e/ou tal ácido nucleico ou polipeptídeo pode fazer parte de uma composição (por exemplo, um lisado celular) e ainda ser isolado pelo fato desse tal vetor ou composição não fazer parte do ambiente natural para o ácido nucleico ou polipeptídeo. O termo gene significa o segmento

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28/115 de DNA envolvido na produção de uma cadeia polipeptídica; este inclui regiões que precedem e seguem a região de codificação de iniciação e terminação, bem como sequências intermediárias (introns) entre segmentos de codificação individuais (éxons).

[0045] Conforme usado neste documento, os termos modificado, manipulado ou recombinante se referem a uma célula, microrganismo, molécula de ácido nucleico ou vetor que tenha sido geneticamente manipulado por intervenção humana - ou seja, modificado pela introdução de uma molécula de ácido nucleico exógena ou heteróloga ou se refere a uma célula ou microrganismo que tenha sido alterado de modo que a expressão de uma molécula ou gene de ácido nucleico endógeno seja controlada, desregulada ou constitutiva. Alterações genéticas geradas por humanos podem incluir, por exemplo, modificações que introduzem moléculas de ácidos nucleicos (as quais podem incluir um elemento de controle de expressão, tal como um promotor) que codificam uma ou mais proteínas ou enzimas ou outras adições, deleções, substituições ou outras interrupções funcionais de moléculas de ácidos nucleicos ou adição ao material genético de uma célula. Modificações exemplificativas incluem aquelas nas regiões codificadoras ou fragmentos funcionais destes de polipeptídeos heterólogos ou homólogos de uma molécula de referência ou precursora.

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29/115 [0046] Conforme usado neste documento, mutação se refere a uma alteração na sequência de uma molécula de ácido nucleico ou molécula de polipeptideo em comparação com uma molécula de referência ou molécula de ácido nucleico ou molécula de polipeptideo do tipo selvagem, respectivamente. Uma mutação pode resultar em vários tipos diferentes de alterações na sequência, incluindo substituição, inserção ou deleção de nucleotídeo(s) ou aminoácido(s). Em certas modalidades, uma mutação é uma substituição de um ou três códons ou aminoácidos, uma exclusão de um a cerca de 5 códons ou aminoácidos, ou uma combinação destes.

[0047] Uma substituição conservativa é reconhecida na técnica como uma substituição de um aminoácido por outro aminoácido que tem propriedades semelhantes. Substituições conservativas exemplificativas são descritas em, por exemplo: WO 97/09433 na página 10; Lehninger, Biochemistry, 2^a Edição; Worth Publishers, Inc. NY, NY, pp.71-77, 1975; e Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY e Cell Press, Cambridge, MA, p. 8, 1990. As substituições conservativas de aminoácidos podem ocorrer naturalmente ou podem ser introduzidas quando uma proteína de ligação ou TCR é produzida de forma recombinante. As substituições, deleções e adições de aminoácidos podem ser introduzidas em uma proteína usando métodos de mutagênese conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al. , Molecular Cloning: A

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Laboratory Manual, 3^a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 2001) . Procedimentos de mutagênese específica do local direcionada por oligonucleotídeos (ou segmento específico) pode ser empregado para fornecer um polinucleotídeo alterado que tem determinados códons alterados de acordo com a substituição, deleção ou inserção desejada. Alternativamente, técnicas de mutagênese aleatória ou de saturação, tal como mutagênese de varredura de alanina, mutagênese de reação em cadeia da polimerase propensa a erros, e mutagênese direcionada por oligonucleotídeo podem ser usadas para preparar variantes de polipeptídeo imunogênico (ver, por exemplo, Sambrook et al., supra) .

[0048] O termo construto se refere a qualquer polinucleotídeo que contém uma molécula de ácido nucleico recombinante. Um construto pode estar presente em um vetor (por exemplo, um vetor bacteriano, um vetor viral) ou pode ser integrada a um genoma.

[0049] Um vetor é uma molécula de ácido nucleico que é capaz de transportar outra molécula de ácido nucleico. Os vetores podem ser, por exemplo, plasmídeos, cosmídeos, vírus, um vetor de RNA ou uma molécula de DNA ou RNA linear ou circular que pode incluir moléculas de ácido nucleico cromossômicas, não cromossômicas, semissintéticas ou sintéticas. Os vetores exemplificativos são aqueles capazes de replicação autônoma (vector epissomal) ou expressão de

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31/115 moléculas de ácido nucleico às quais estão ligados (vetores de expressão).

[0050] O termo operacionalmente ligado ou operacionalmente ligado se refere a associação de moléculas de ácidos nucleicos em um único fragmento ou molécula de ácido nucleico de modo que a função de um seja afetada pelo outro. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação quando é capaz de afetar a expressão daquela sequência de codificação (ou seja, a sequência de codificação está sob o controle transcricional do promotor). Não ligado significa que os elementos genéticos associados não estão intimamente associados um ao outro e a função de um não afeta o outro.

[0051] Conforme usado neste documento, vetor de expressão se refere a um construto de DNA contendo uma molécula de ácido nucleico que esteja operacionalmente vinculada a uma sequência de controle apropriada capaz de efetuar a expressão da molécula de ácido nucleico em um hospedeiro adequado. Tais sequências de controle incluem um promotor para efetuar transcrição, uma sequência de operador opcional para controlar tal transcrição, uma sequência que codifica sítios de ligação de ribossomo adequados de mRNA e sequências que controlam a terminação de transcrição e tradução. O vetor pode ser um plasmideo, uma partícula de fago, um vírus ou simplesmente uma inserção genômica em

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32/115 potencial. Uma vez transformado em um hospedeiro adequado, o vetor pode se replicar e funcionar independentemente do genoma do hospedeiro, ou pode, em alguns casos, integrar-se ao próprio genoma. Na presente especificação, plasmídeo, plasmídeo de expressão, vírus e vetor são frequentemente usados de forma intercambiável.

[0052] O termo expressão, conforme usado neste documento, se refere ao processo pelo qual um polipeptídeo é produzido com base na sequência de codificação de uma molécula de ácido nucleico, tal como um gene. O processo pode incluir transcrição, controle pós-transcricional, modificação pós-transcricional, tradução, controle póstradução, modificação pós-tradução ou qualquer combinação destes.

[0053] O termo introduzido no contexto da inserção de uma molécula de ácido nucleico em uma célula, significa transfecção ou transformação ou transdução e inclui referência à incorporação de uma molécula de ácido nucleico em uma célula eucariótica ou procariótica em que a molécula de ácido nucleico pode ser incorporada ao genoma de uma célula (por exemplo, cromossomo, plasmídeo, plastídeo ou DNA mitocondrial), convertida em um replicon autônomo ou expresso transitoriamente (por exemplo, mRNA transfectado).

[0054] Conforme usado neste documento, molécula, construto ou sequência heteróloga ou exógena de ácido

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33/115 nucleico se refere a polinucleotídeo ou porção de um polinucleotídeo que não é nativo de uma célula hospedeira, mas pode ser homólogo a um polinucleotídeo ou porção de um polinucleotídeo da célula hospedeira. A fonte da sequência ou construto de polinucleotídeo heteróloga ou exógena pode ser de um gênero ou espécie diferente. Em certas modalidades, um polinucleotídeo heterólogo ou exógeno é adicionado (ou seja, não endógeno ou nativo) a uma célula hospedeira ou genoma hospedeiro por, por exemplo, conjugação, transformação, transfecção, eletroporação ou semelhantes, em que a molécula adicionada pode se integrar ao genoma hospedeiro ou existir como material genético extracromossômico (por exemplo, como um plasmídeo ou outra forma de vetor autorreplicante) e pode estar presente em múltiplas cópias. Além disso, heterólogo se refere a uma enzima, proteína ou outra atividade não nativa codificada por um polinucleotídeo exógeno introduzido na célula hospedeira, até mesmo se a célula hospedeira codificar uma proteína ou atividade homóloga.

[0055] Conforme descrito neste documento, mais de uma molécula de ácido nucleico heteróloga ou exógena pode ser introduzida em uma célula hospedeira como polinucleotídeos separados, como uma pluralidade de genes controlados individualmente, como um polinucleotídeo policistrônico, como uma única molécula de ácido nucleico que codifica uma

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34/115 proteína de fusão, ou qualquer combinação destas. Por exemplo, conforme divulgado neste documento, uma célula hospedeira pode ser modificada para expressar dois ou mais polinucleotídeos heterólogos ou exógenos que codificam o TCR desejado específico para um peptídeo antígeno MAGE-A1 (por exemplo, TCRa e TCR3) . Quando duas ou mais moléculas de ácidos nucleicos exógenas são introduzidas em uma célula hospedeira, entende-se que as duas ou mais moléculas de ácidos nucleicos exógenas podem ser introduzidas como um único polinucleotídeo (por exemplo, em um único vetor), em vetores separados, integrados no cromossomo hospedeiro em um único sítio ou em múltiplos sítios, ou qualquer combinação destes. 0 número de moléculas de ácidos nucleicos heterólogas ou atividades proteicas mencionadas se refere ao número de moléculas de ácidos nucleicos codificantes ou ao número de atividades proteicas, não ao número de polinucleotídeos separados introduzidos em uma célula hospedeira.

[0056] Conforme usado neste documento, o termo endógeno ou nativo se refere a um gene, proteína ou atividade que normalmente está presente em uma célula hospedeira. Além disso, um gene, proteína ou atividade que seja mutada, superexpressa, embaralhada, duplicada ou alterada de outra forma em comparação com um gene, proteína ou atividade precursora ainda é considerada como endógena ou nativa a essa célula hospedeira em particular. Por exemplo,

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35/115 uma sequência de controle endógena de um primeiro gene (por exemplo, promotor, sequências de atenuação de tradução) pode ser usada para alterar ou regular a expressão de um segundo gene nativo ou molécula de ácido nucleico, em que a expressão ou regulação do segundo gene nativo ou molécula de ácido nucleico difere da expressão ou regulação normal em uma célula precursora.

[0057] O termo homóloga ou homólogo se refere a uma molécula ou atividade encontrada em ou derivada de uma célula hospedeira, espécie ou cepa. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico heteróloga ou exógena pode ser homóloga a um gene nativo de uma célula hospedeira e opcionalmente pode ter um nível de expressão alterado, uma sequência diferente, uma atividade alterada ou qualquer combinação destes.

[0058] A identidade de sequência, conforme usado neste documento, se refere à percentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência que são idênticos aos resíduos de aminoácidos em outra sequência polipeptídica de referência, após o alinhamento das sequências e a introdução de intervalos, se necessário, para atingir a percentagem máxima identidade de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência. Os valores percentuais de identidade de sequência podem ser gerados usando o software NCBI BLAST2.0, conforme definido por Altschul et al. (1997) Gapped BLAST and PSIPetição 870190114027, de 07/11/2019, pág. 41/139

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BLAST: a new generation of protein database search programs, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, com os parâmetros configurados para os valores padrão.

[0059] Conforme usado neste documento, uma célula progenitora hematopoiética é uma célula que pode ser derivada de células-tronco hematopoiéticas ou tecido fetal e é capaz de diferenciação adicional em tipos de células maduras (por exemplo, células do sistema imunológico). As células progenitoras hematopoiéticas exemplificativas incluem aquelas com um fenótipo CD24^Lo Lin~ CD117⁺ ou aquelas encontradas no timo (denominadas timócitos progenitores).

[0060] Conforme usado neste documento, o termo hospedeiro se refere a uma célula (por exemplo, célula T) ou microrganismo direcionado para modificação genética com uma molécula de ácido nucleico heteróloga ou exógena para produzir um polipeptídeo de interesse (por exemplo, TCR antiMAGE-A1). Em certas modalidades, uma célula hospedeira pode opcionalmente já possuir ou ser modificada para incluir outras modificações genéticas que conferem propriedades desejadas relacionadas ou não à biossíntese da proteína heteróloga ou exógena (por exemplo, inclusão de um marcador detectável; TCR endógeno excluído, alterado ou truncado; expressão do fator coestimulatório aumentada). Em certas modalidades, uma célula hospedeira é uma célula progenitora hematopoiética humana transduzida com uma molécula de ácido

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37/115 nucleico heteróloga ou exógena que codifica uma cadeia TCRa específica para um peptídeo de antígeno MAGE-Al.

[0061] Conforme usado neste documento, distúrbio hiperproliferativo se refere ao crescimento ou proliferação excessiva em comparação com uma célula normal ou não induzida. Os distúrbios hiperproliferativos exemplificativos incluem tumores, cânceres, tecido neoplásico, carcinoma, sarcoma, células malignas, células pré-malignas, bem como distúrbios hiperproliferativos não neoplásicos ou não malignos (por exemplo, adenoma, fibroma, lipoma, leiomioma, hemangioma, fibrose, reestenose, bem como doenças autoimunes, como artrite reumatoide, osteoartrite, psoríase, doença inflamatória intestinal ou semelhante).

Proteínas de Ligação Específicas para Peptídeos do Antígeno MAGE-Al [0062] Em certos aspectos, a presente divulgação fornece uma célula modificada compreendendo um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma proteína de ligação (por exemplo, um TCR, um TCR de cadeia única (scTCR) ou um CAR) que se liga especificamente a MAGE-Al ou a um antígeno peptídico MAGE-Al, tal como um peptídeo MAGE-Al complexado com uma molécula HLA.

[0063] A título de fundamentos, os alvos ideais para imunoterapia são proteínas imunogênicas com alta expressão em tecidos malignos e expressão limitada a ausente em tecidos

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38/115 normais. Um grupo único de proteínas, conhecido como antígenos câncer/testículo (CTAs), foi identificado como alvos imunoterapêuticos promissores devido à sua expressão em vários tecidos malignos, mas expressão de baixo nível no tecido adulto saudável, exceto nas células germinativas do testículo (Ademuyiwa et al. PLoS One, 7(6):e38783 (2012) ; Badovinac Crnjevic et al. , Med Oncol., 29(3):158 6-91 (2012); Curigliano, G. et al. , Ann. Oncol., 22(1) :98-103 (2011) . Além disso, os CTAs são especialmente expressos em lesões de alto grau e malignidades agressivas e associados a piores resultados clínicos (Barrow et al. , Clin Cancer Res., 12 (3 Pt 1) :764-71 (2006) ; Gure, et al. Clin Cancer Res., 11(22):8055-62 (2005); Velazquez et al., Cancer Immun., 7: 11 (2007)). As proteínas da família MAGE são CTAs amplamente expressas em muitos tipos de tumores, tais como melanoma, pulmão, ovário, mieloma múltiplo e TNBC. Simpson, A.J., et al., Cancer/testis antigens, gametogenesis and cancer, Nat. Rev. Cancer, 2005. 5(8) :615-25; Weon, J.L. and P.R. Potts, Curr Opin Cell Biol, 2015. 37: 1-8; Park, T.S., et al., J Immunother, 2016. 39(1) : 1-7; Li, X., S.C. Hughes, and R. Wevrick, Cancer Genet, 2015. 208(1-2):25-34; Kerkar, S.P., et al., J Immunother, 2016. 39(4) :181-7. Em particular, o MAGE-Al é expresso em 69,1% dos casos de TNBC no geral (n=81) e em 85,7% dos casos de Grau TIT. Mrklic, I., et al., Acta Histochem, 2014. 116(5): 740-6. Além disso, evidências de

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39/115 linhas celulares de melanoma sugerem que o MAGE-Al aciona diretamente a tumorogênese. Wang, D., et ah, Bíochem Bíophys Res Commun, 2016. 473(4): 959-65.

[0064] Em certas modalidades, uma proteína de ligação da presente divulgação compreende (a) um domínio variável de cadeia α (V_a) do receptor de célula T (TCR) com uma sequência de aminoácidos CDR3 de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS. :26, 32, 38, 44, 50, ou 51, e um domínio variável de cadeia β (Vp) do TCR; (b) um domínio Vp, com uma sequência de aminoácidos CDR3 de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS.:23, 29, 35, 41 ou 47, e um domínio V«; ou (c) um domínio ν_α com uma sequência de aminoácidos CDR3 de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS :26, 32, 38, 44, 50, ou 51 e um domínio Vp com uma sequência de aminoácidos CDR3 de acordo

com qualquer uma das SEQ	ID NOs:23, 29,	35,	41, ou 47.
[0065] Os complexos	de peptídeo	MHC,	tais como os
complexos de peptídeo	MAGE-Al:MHC,	são	reconhecidos e
ligados através dos domínios Va de TCR	e νβ	de TCR. Durante

o desenvolvimento de linfócitos, os éxons de Va são montados a partir de diferentes variáveis e segmentos de genes de junção (V-J) , e os éxons de νβ são montados a partir de diferentes variáveis, diversidade e segmentos de genes de junção (V-D-J) . O locus cromossômico do TCRa tem 70-80 segmentos de genes variáveis e 61 segmentos de genes de junção. O locus cromossômico do ΤΕΕβ tem 52 segmentos de

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40/115 genes variáveis e dois aglomerados separados de cada contendo um único segmento de gene de diversidade, juntamente com seis ou sete segmentos de genes de junção. Os éxons funcionais dos genes Va e νβ são gerados pela recombinação de um segmento de gene variável com um segmento de gene de junção para Va e um segmento de gene variável com um segmento de gene de diversidade e um segmento de gene de união para νβ.

[0066] Os domínios Va e νβ de TCR compreendem, cada um, três alças hipervariáveis, também denominadas regiões determinantes complementares (CDRs) gue entram em contato com o complexo de peptídeo MHC. CDR1 e CDR2 são codificados dentro do segmento de gene variável, enquanto CDR3 é codificado pela região que abrange os segmentos variáveis ou de junção para Va, ou a região que abrange segmentos variáveis, de diversidade e de junção para νβ. Assim, se a identidade do segmento de gene variável de um Va ou νβ for conhecida (por exemplo, por alelos TRAV ou TRVB conhecidos), as sequências de seus CDR1 e CDR2 correspondentes podem ser deduzidas. Além disso, algumas das regiões variáveis de TCR de alta afinidade divulgadas atualmente, específicas para MAGE-A1 (por exemplo, aquelas identificadas por ter sequências CDR3 de alta afinidade) são codificadas por um alelo TCRa selecionado ou um alelo ΤΟΕβ. Em certas modalidades, um domínio de ligação codificado compreende um

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41/115 domínio Vp que é derivado de um alelo TRBV30, um alelo TRBV29 ou um alelo TRBV9. Em algumas modalidades, um domínio de ligação codificado compreende um domínio V_a que é derivado de um alelo TRAV38-1, um alelo TRAV34, um alelo TRAV16 ou um alelo TRAV5.

[0067] As sequências de domínio variável do TCR podem ser alinhadas a um esquema de numeração (Sistema Internacional de Informações sobre Imunogenética (IMGT) e Aho), permitindo que posições equivalentes de resíduos sejam anotadas e que diferentes moléculas sejam comparadas usando a ferramenta de software de Classificação de Receptor e Numeração de receptor de Antígeno (ANARCI) (2016, Bioinformatics 15:298-300). Um esquema de numeração fornece uma delimitação padronizada de regiões de estrutura e CDRs nos domínios variáveis do TCR.

[0068] Em certas modalidades, uma proteína de ligação compreende uma sequência de aminoácidos variantes funcionais em comparação com uma sequência de aminoácidos de referência divulgada neste documento, em que a proteína de ligação codificada retém características de ligação em comparação com uma proteína de ligação que compreende uma sequência de aminoácidos de referência. Por exemplo, em algumas modalidades, um domínio V_a codificado compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 90% idêntica (por exemplo, é pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%,

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93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% ou 100% idêntica) a uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS.:3, 7, 11, 15 e 19, e um domínio Vp codificado compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 90% idêntica à sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS.: 1, 5, 9, 13, 17, desde que (a) pelo menos três ou quatro das CDRs não tenham alteração na sequência, em que as CDRs que têm mudanças na sequência tenham apenas até duas substituições de aminoácidos, até uma deleção de cinco aminoácidos contíguos ou uma combinação destas, e (b) a proteína de ligação codificada permaneça capaz de se ligar especificamente a um complexo de superfície celular do peptídeo MAGE-A1:HLA independente, ou na ausência, de CD8.

[0069] Em modalidades particulares, (a) um domínio ν_αcompreende (i) uma sequência de aminoácidos de CDR1 de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS :24, 30, 36, 42 e 48 e/ou (ii) uma sequência de aminoácidos de CDR2 de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS:25, 31, 37, 43 e 49; e/ou (b) o domínio Vp codificado compreende (iii) uma sequência de aminoácidos de CDR1 de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 21, 27, 33, 39 e 45 e/ou (iv) uma sequência de aminoácidos de CDR2 de acordo com qualquer uma das SEQ ID

NOS: 22, 28, 34, 40 e 46. Em outras modalidades, uma proteína

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43/115 de ligação codificada compreende: (a) sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 de Va de acordo com a SEQ ID NOS :24-26, respectivamente, e sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 de νβ de acordo com a SEQ ID NOS :21-23, respectivamente; (b) sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 de Va de acordo com a SEQ ID NOS :30-32, respectivamente, e sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 de νβ de acordo com a SEQ ID NOS :27-29, respectivamente; (c) sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 de Va de acordo com a SEQ ID NOS :36-38, respectivamente, e sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 de νβ de acordo com a SEQ ID NOS :33-35, respectivamente; (d) sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 de Va de acordo com a SEQ ID NOS :42-44, respectivamente, e sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 de νβ de acordo com a SEQ ID NOS :39-41, respectivamente; ou (e) sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 de Va de acordo com a SEQ ID NOS :48-50, respectivamente, e sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 de νβ de acordo com a SEQ ID NOS :45-47, respectivamente.

[0070] Em certas modalidades, um domínio Va compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos de acordo com a

SEQ ID NO.:3, 7, 11, 15 ou 19. Em outras modalidades, um

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44/115 domínio νβ codificado compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO.:1, 5, 9, 13 ou 17.

[0071] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação compreende um domínio constante da cadeia a do TCR, um domínio constante da cadeia β do TCR ou ambos. Em certas modalidades, um domínio de constante da cadeia α do TCR (Ca) tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO.:4, 8, 12, 16 ou 20. Em outras modalidades, um domínio de constante da cadeia β do TCR (Cβ) tem pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências de aminoácidos da SEQ ID NO.:2, 6, 10, 14 ou 18.

[0072] Consequentemente, em algumas modalidades, uma ligação da presente divulgação compreende um domínio ν_α, um domínio Vp, um domínio C_a e um domínio Cp. Em outras modalidades, uma proteína de ligação compreende o domínio Va compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO.:3, um domínio νβ compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO.:1, um domínio Ca compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO.:4, e um domínio Οβ compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO.:2. Em outras modalidades, uma proteína de ligação compreende um domínio Va compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO.:7, um domínio νβ compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO.:5, um domínio Ca compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO.: 8, e um Οβ compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO.: 6. Em ainda

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45/115 outras modalidades, uma proteína de ligação compreende um domínio Va compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO.:11, um domínio νβ compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO.:9, um domínio Ca compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO.:12 e um domínio Οβ compreendendo ou consistindo na SEQ ID NQ.:10. Em outras modalidades, uma proteína de ligação compreende um domínio Va compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO.:15, um domínio νβ compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO.:13, um Ca compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO.:16, e um domínio Οβ compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO.:14. Em ainda outras modalidades, uma proteína de ligação compreende

um	domínio	Va	compreendendo	ou	consistindo	na	SEQ	ID	NO.	:19,
um	domínio	νβ	compreendendo	ou	consistindo	na	SEQ	ID	NO.	: 17,
um	domínio	Ca	compreendendo	ou	consistindo	na	SEQ	ID	NO.	:20,

e um domínio Οβ compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO.:

.

[0073] Em qualquer uma das modalidades divulgadas neste documento, uma proteína de ligação (por exemplo, na forma solúvel ou expressa na superfície celular de uma célula modificada da presente divulgação) é capaz de se ligar a um complexo de MAGE-Al:HLA-A*201 (por exemplo, um complexo de KVLEYVIKV (SEQ ID NO.:123):HLA-A*201) em uma superfície celular independente ou na ausência de CD8.

[0074] Em certas modalidades, qualquer uma das proteínas de ligação específicas de MAGE-Al mencionadas acima são,

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46/115 cada uma, um receptor de células T (TCR) , um receptor de antígeno quimérico ou um fragmento de ligação ao antígeno de um TCR, qualquer um dos quais pode ser quimérico, humanizado ou humano. Em outras modalidades, um fragmento de ligação ao antígeno do TCR compreende um TCR de cadeia única (scTCR) ou um receptor de antígeno quimérico (CAR). Em certas modalidades, uma proteína de ligação específica de MAGE-Al é um TCR, opcionalmente um scTCR. Os métodos para a produção de TCR manipulados são descritos em, por exemplo, Bowerman et al. , Mol. Immunol., 46(15):3000 (2009), cujas técnicas são incorporadas neste documento por referência. Em certas modalidades, um domínio de ligação específico de MAGE-Al é um CAR compreendendo um domínio de ligação ao TCR específico de MAGE-Al (ver, por exemplo, Walseng et al. , Scientific Reports 7:10713 (2017), cujos construtos de TCR CAR são incorporados por referência na sua totalidade). Os métodos para fabricar CARs também são descritos, por exemplo, na Patente US n° 6.410.319; Patente US n° 7.446.191; Publicação de Patente US n° 2010/065818; Patente US n° 8.822.647; Publicação PCT No. WO 2014/031687; Patente US n° 7.514.537; e Brentjens et al. , 2007, Clin. Cancer Res. 13:5426, cujas técnicas são incorporadas neste documento por referência.

[0075] Os métodos úteis para isolar e purificar o TCR solúvel produzido por recombinação, a título de exemplo, podem incluir obter sobrenadantes de células

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47/115 hospedeiras/sistemas vetoriais adequados que secretam o TCR solúvel recombinante no meio de cultura e, em seguida, concentrar o meio usando um filtro disponível comercialmente. Após a concentração, o concentrado pode ser aplicado a uma única matriz de purificação adequada ou a uma série de matrizes adequadas, tal como uma matriz de afinidade ou uma resina de troca iônica. Uma ou mais etapas de HPLC de fase reversa podem ser empregadas para purificar adicionalmente um polipeptídeo recombinante. Esses métodos de purificação também podem ser empregados ao isolar um imunógeno de seu ambiente natural. Os métodos para a produção em grande escala de um ou mais dos TCR solúveis isolados/recombinantes descritos neste documento incluem cultura de células em lotes, que é monitorada e controlada para manter condições de cultura apropriadas. A purificação do TCR solúvel pode ser realizada de acordo com os métodos descritos neste documento e conhecidos na técnica e que estão de acordo com as leis e diretrizes das agências reguladoras nacionais e estrangeiras.

[0076] Em certas modalidades, as moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína de ligação ou TCR de alta afinidade específica para MAGE-A1 são usadas para transfectar/transduzir uma célula hospedeira (por exemplo, células T) para uso em terapia de transferência adotiva. Os avanços no sequenciamento de TCR foram descritos (por

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48/115 exemplo, Robins et al. , Blood 114:4099, 2009; Robins et al. , Sei. Translat. Med. 2:47ra64, 2010; Robins et al., (Set. 10) J. Imm. Meth. Epub ahead of print, 2011; Warren et al., Genome Res. 21:790, 2011) e podem ser empregados no curso da prática das modalidades de acordo com a presente divulgação. Do mesmo modo, os métodos para transfectar/transduzir células T com ácidos nucleicos desejados foram descritos (por exemplo, o Pedido de Patente US Pub. No. US 2004/0087025) como possuem procedimentos de transferência adotivos usando células T com especificidade de antigeno desejada (por exemplo, Schmitt et al. , Hum. Gen. 20:1240, 2009; Dossett et al., Mol. Ther. 1 7:742, 2009; Till et al. , Blood 112:2261, 2008; Wang et al. , Hum. Gene Ther. 18:112, 2007; Kuball et al., Blood 109:2331, 2007; US 2011/0243972; US 2011/0189141; Leen et al., Ann. Rev. Immunol. 25:243, 2007), de modo a adaptação dessas metodologias às modalidades divulgadas atualmente seja contemplada, com base nos ensinamentos neste documento, incluindo aqueles direcionados a TCRs de alta afinidade específicos para antígenos peptídicos MAGE-Al complexados com um receptor HLA.

[0077] As proteínas ou domínios de ligação específicos de MAGE-Al, conforme descrito neste documento, podem ser funcionalmente caracterizados de acordo com qualquer um de um grande número de metodologias aceitas na técnica para avaliar a atividade das células T, incluindo a determinação

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49/115 da ligação, ativação ou indução de células T e também incluindo a determinação das respostas de célula T que são especificas do antigeno. Os exemplos incluem determinação da proliferação de células T, liberação de citocinas de células T, estimulação de células T específicas de antígenos, estimulação de células T restrita ao MHC, atividade de CTL (por exemplo, detectando a liberação de ⁵¹Cr a partir de células-alvo pré-carregadas), mudanças na expressão do marcador fenotipico de células T e outras medidas das funções das células T. Os procedimentos para realizar estes ensaios e semelhantes podem ser incluídos, por exemplo, em Lefkovits (Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, 1998) . Veja, também, Current Protocols in Immunology: Weir, Handbook of Experimental Immunology, Blackwell Scientific, Boston, MA (1986); Mishell and Shigii (eds.) Selected Methods in Cellular Immunology, Freeman Publishing, San Francisco, CA (1979); Green and Reed, Science 281:1309 (1998) e referências citadas nestes.

[0078] Coloração com tetrâmero de peptídeo MHC se refere a um ensaio usado para detectar células T específicas de antigeno, que apresenta um tetrâmero de moléculas de MHC, cada uma compreendendo um peptídeo idêntico com uma sequência de aminoácidos cognata (por exemplo, idêntica ou relacionada a) em pelo menos um antigeno (por exemplo, MAGE-A1), em que o complexo é capaz de se ligar aos receptores de células T

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50/115 específicos para o antígeno cognato. Cada uma das moléculas de MHC pode ser marcada com uma molécula de biotina. MHC/peptídeos biotinilados são tetramerizados pela adição de estreptavidina, que pode ser marcada com fluorescência. O tetrâmero pode ser detectado por citometria de fluxo através do rótulo fluorescente. Em certas modalidades, um ensaio de tetrâmero de peptídeo MHC é usado para detectar ou selecionar TCRs de afinidade aprimorada da presente divulgação.

[0079] Os níveis de citocinas podem ser determinados de acordo com métodos descritos neste documento e praticados na técnica, incluindo, por exemplo, ELISA, ELISPOT, coloração intracelular de citocinas, e a citometria de fluxo e suas combinações (por exemplo, coloração de citocina intracelular e citometria de fluxo). A proliferação de células imunológicas e a expansão clonal, resultante de uma indução específica para o antígeno ou a estimulação de uma resposta imunológica pode ser determinada através do isolamento de linfócitos, tais como linfócitos circulantes em amostras de células de sangue periférico ou células de nódulos linfáticos, estimulando as células com antígeno, e medição produção de citocina, proliferação celular e/ou a viabilidade das células, tal como por incorporação de timidina tritiada ou ensaios não radioativos, tais como ensaios de MTT e semelhantes. O efeito de um imunógeno descrito neste documento no equilíbrio entre a resposta imune

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Thl e uma resposta imune de Th2 pode ser examinado, por exemplo, por determinação dos níveis de citocinas Thl tais como IFN-γ, IL-12, IL-2, e TNF- β, e citocinas tipo 2, tais como IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 e IL-13.

Polínucleotldeos e Vetores [0080] Em outro aspecto, polínucleotldeos isolados ou recombinantes são fornecidos neste documento, em que um polinucleotídeo codifica uma proteína de ligação da presente divulgação (por exemplo, proteína de ligação à superfamília de imunoglobulina, como um TCR, scTCR ou CAR) específico para 5T4, e em que o polinucleotídeo é otimizado por códon para expressão em uma célula hospedeira (por exemplo, uma célula imune da presente divulgação). Também são fornecidos vetores (por exemplo, vetores de expressão) que compreendem um polinucleotídeo desta divulgação, em que o polinucleotídeo está operativamente associado ou operacionalmente ligado a uma sequência de controle de expressão (por exemplo, um promotor). A construção de um vetor de expressão para produzir uma proteína de ligação específica para um peptídeo MAGE-A1 desta divulgação pode ser feita usando digestão com endonuclease de restrição, ligação, transformação, purificação de plasmídeo, sequenciamento de DNA ou uma combinação destes, conforme descrito em, por exemplo, Sambrook et al. (Edições de 1989 e 2001; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring

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Harbor Laboratory Press, NY) e Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, 2003) . Para uma transcrição e tradução eficiente, um polinucleotídeo contido em um construto de expressão inclui pelo menos uma sequência de controle de expressão apropriada (também chamada de sequência reguladora), tal como uma sequência de iniciação e particularmente um promotor operacionalmente (ou seja, operativamente) ligado à sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de ligação desta divulgação.

[0081] Um ácido nucleico pode ser um DNA, cDNA ou RNA de fita simples ou dupla, sob qualquer forma, e pode incluir uma fita positiva e uma negativa do ácido nucleico que se complementam, incluindo DNA, cDNA e RNA antisense. Também estão incluídos o siRNA, microRNA, híbridos de RNA—DNA, ribozimas e outras várias formas de ocorrências naturais ou sintéticas de DNA ou RNA.

[0082] As moléculas de ácido nucleico isoladas ou recombinantes que codificam uma proteína de ligação (por exemplo, proteína de ligação à superfamília de imunoglobulinas) ou receptor de células T recombinantes de alta afinidade (TCR) específico para MAGE-A1, conforme descrito neste documento, podem ser produzidas e preparadas de acordo com vários métodos e técnicas da biologia molecular ou técnicas de purificação de polipeptídeos.

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53/115 [0083] Em certas modalidades, é fornecido um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína de ligação com um domínio TCR Va e um domínio TCR νβ, em que a proteína de ligação codificada é capaz de se ligar especificamente a um complexo de peptídeo MAGE-A1:HLA em uma superfície celular independente de CD8 ou na ausência de CD8, em que o polinucleotídeo isolado compreende: (a) um polinucleotídeo codificador de Va CDR3 de acordo com a SEQ ID NO: 97, 103, 109, 115 ou 121 e um polinucleotídeo codificador de νβ; (b) um polinucleotídeo codificador de νβ CDR3 de acordo com a SEQ ID NO: 94, 100, 106, 112 ou 118 e um polinucleotídeo codificador de Va; ou (c) um polinucleotídeo codificador de Va CDR3 de acordo com a SEQ ID NO:97, 103, 109, 115 ou 121 e um polinucleotídeo codificador de νβ CDR3 de acordo com a SEQ ID NO:94, 100, 106, 112 ou 118. Em outras modalidades, um polinucleotídeo codificador de νβ é derivado de um alelo TRBV30, um alelo TRBV29 ou um alelo TRBV9. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo codificador de Va é derivado de um alelo TRAV38-1, um alelo TRAV34, um alelo TRAV16 ou um alelo TRAV5.

[0084] Os polinucleotídeos atualmente divulgados que codificam proteínas de ligação podem, em algumas modalidades, compreender: (a) um polinucleotídeo codificador de ν_α CDR3 de acordo com a SEQ ID NO:97 e um polinucleotídeo codificador de Vp CDR3 de acordo com a SEQ ID NO:94; (b) um

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54/115 polinucleotídeo codificador de ν_α CDR3 de acordo com a SEQ ID NO: 103 e um polinucleotídeo codificador de Vp CDR3 de acordo com a SEQ ID NO: 100; (c) um polinucleotídeo codificador de V_a CDR3 de acordo com a SEQ ID NO: 109 e um polinucleotídeo codificador de Vp CDR3 de acordo com a SEQ ID NO:106; (d) um polinucleotídeo codificador de V_a CDR3 de acordo com a SEQ ID NO:115 e um polinucleotídeo codificador de Vp CDR3 de acordo com a SEQ ID NO: 112; ou (e) um polinucleotídeo codificador de V_a CDR3 de acordo com a SEQ ID NO: 121 e um polinucleotídeo codificador de Vp CDR3 de acordo com a SEQ ID NO: 118. Em certas modalidades, um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína de ligação compreende adicionalmente (a) um polinucleotídeo codificador de Va CDR1 de acordo com a SEQ ID NO: 95, 101, 107, 113 ou 119; (b) um polinucleotídeo codificador de Va CDR2 de acordo com a SEQ ID NO:96, 102, 108, 114 ou 120; (c) um polinucleotídeo codificador de νβ CDR1 de acordo com a SEQ ID NO:92, 98, 104, 110 ou 116; e/ou (d) um polinucleotídeo codificador de νβ CDR2 de acordo com a SEQ ID NO: 93, 99, 105, 111 ou 117.

[0085] Em modalidades particulares, um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína de ligação da presente divulgação compreende (a) um polinucleotídeo codificador de Va CDR1 de acordo com a SEQ ID NO: 95, um polinucleotídeo codificador de Va CDR2 de acordo com a SEQ ID NO: 96, um

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55/115 polinucleotídeo codificador de Va CDR3 de acordo com a SEQ ID NO:97, um polinucleotídeo codificador de νβ CDR1 de acordo com a SEQ ID NO: 92, um polinucleotídeo codificador de νβ CDR2 de acordo com a SEQ ID NO: 93 e um polinucleotídeo codificador de νβ CDR3 de acordo com a SEQ ID NO:94; (b) um polinucleotídeo codificador de Va CDR1 de acordo com a SEQ ID NO:101, um polinucleotídeo codificador de Va CDR2 de acordo com a SEQ ID NO:102, um polinucleotídeo codificador de Va CDR3 de acordo com a SEQ ID NO:103, um codificador de νβ CDR1 polinucleotídeo de acordo com a SEQ ID NO: 98, um polinucleotídeo codificador de νβ CDR2 de acordo com a SEQ ID NO:99 e polinucleotídeo codificador de νβ CDR3 de acordo com a SEQ ID NO:100; (c) um polinucleotídeo codificador de Va CDR1 de acordo com a SEQ ID NO: 107, um polinucleotídeo codificador de Va CDR2 de acordo com a SEQ ID NO: 108, um polinucleotídeo codificador de Va CDR3 de acordo com a SEQ ID NO:109, um polinucleotídeo codificador de νβ CDR1 de acordo com a SEQ ID NO:104, um polinucleotídeo codificador de νβ CDR2 de acordo com a SEQ ID NO: 105 e um polinucleotídeo codificador de νβ CDR3 de acordo com a SEQ ID NO:106; (d) um polinucleotídeo codificador de Va CDR1 de acordo com a SEQ ID NO:113, um polinucleotídeo codificador de Va CDR2 de acordo com a SEQ ID NO:114, um polinucleotídeo codificador de Va CDR3 de acordo com a SEQ ID NO:115, um codificador de νβ CDR1 polinucleotídeo de acordo com a SEQ ID NO: 110, um

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56/115 polinucleotídeo codificador de νβ CDR2 de acordo com a SEQ ID NO: 111 e um polinucleotídeo codificador de νβ CDR3 de acordo com a SEQ ID NO: 112; ou (e) um polinucleotídeo codificador de Va CDR1 de acordo com a SEQ ID NO: 119, um polinucleotídeo codificador de Va CDR2 de acordo com a SEQ ID NO:120, um polinucleotídeo codificador de Va CDR3 de acordo com a SEQ ID NO:121, um polinucleotídeo codificador de νβ CDR1 de acordo com a SEQ ID NO:116, um polinucleotídeo de codificação de νβ CDR2 de acordo com a SEQ ID NO:117 e um polinucleotídeo de codificação de νβ CDR3 de acordo com a SEQ ID NO:118.

[0086] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um polinucleotídeo que codifica uma proteína de ligação, em que um polinucleotídeo codificador de V_a

compreende uma	sequência	de nucleotídeos	com	pelo	menos	80%
de identidade	(por	exemplo, pelo menos	cerca de	80%,	81%,
82%, 83%, 84%,	85%,	86%,	87%, 88%, 89%,	90%,	91%,	92%,	93%,
94%, 95%, 96%,	97%,	98%,	99%, 99,1%, 9Í	3, 2%,	99, 3	%, 99	, 4%,

99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% ou 100% de identidade) para a SEQ ID NO:58, 66, 74, 82 ou 90 e um polinucleotídeo codificador de Vp compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:56, 64, 72, 80 ou 88. Em outras modalidades: (a) um polinucleotídeo codificador de Va compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 58 e um

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57/115 polinucleotídeo codificador de νβ com uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:56; (b) um polinucleotídeo codificador de Va compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:66 e um polinucleotídeo codificador de νβ compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:64; (c) um polinucleotídeo codificador de Va compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:74 e um polinucleotídeo codificador de νβ compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 72; (d) um polinucleotídeo codificador de Va compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 82 e um polinucleotídeo codificador de νβ compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:80; ou (e) um polinucleotídeo codificador de Va compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 90 e um polinucleotídeo codificador de νβ compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:88.

[0087] Em modalidades particulares, (a) um polinucleotídeo codificador de Va compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO:58 e um polinucleotídeo codificador de νβ compreende ou consiste

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58/115 em uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO:56; (b) um polinucleotídeo codificador de Va compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO:66 e um polinucleotídeo codificador de νβ compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO:64; (c) um polinucleotídeo codificador de Va compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO:74 e um polinucleotídeo codificador de νβ compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 72; (d) um polinucleotídeo codificador de Va compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 82 e um polinucleotídeo codificador de νβ compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO:80; ou (e) um polinucleotídeo codificador de Va compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO:90 e um polinucleotídeo codificador de νβ compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO:88.

[0088] Os polinucleotídeos que codificam a proteína de ligação da presente divulgação podem, em certas modalidades, compreender adicionalmente um polinucleotídeo que codifica um domínio constante da cadeia α de TCR, um polinucleotídeo que codifica um domínio constante da cadeia β de TCR ou ambos. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo isolado

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59/115 que codifica uma proteína de ligação da presente divulgação compreende adicionalmente: (a) um polinucleotídeo codificador do domínio C_a com pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:59, 67, 75, 83 ou 91; e/ou (b) um polinucleotídeo codificador do domínio Cp com pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 57, 65, 73, 81 ou 89. Em modalidades adicionais, um polinucleotídeo codificador do domínio C_a compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO:59, 67, 75, 83 ou 91 e o polinucleotídeo codificador do domínio Cp compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO:57, 65, 73, 81 ou 89.

[0089] Em modalidades particulares, um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína de ligação da presente divulgação compreende: (a) um polinucleotídeo codificador de ν_α de acordo com a SEQ ID NO:58, um polinucleotídeo codificador de Vp de acordo com a SEQ ID NO: 56, um polinucleotídeo codificador de domínio C_a de acordo com a SEQ ID NO:59 e um polinucleotídeo codificador de domínio Cp de acordo com a SEQ ID NO: 57; (b) um polinucleotídeo codificador de V« de acordo com a SEQ ID NO:66, um polinucleotídeo codificador de Vp de acordo com a SEQ ID NO:64, um polinucleotídeo codificador de domínio C_a de acordo com a SEQ ID NO: 67 e um polinucleotídeo codificador de domínio Cp de acordo com a SEQ ID NO: 65; (c) um

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60/115 polinucleotídeo codificador de ν_α de acordo com a SEQ ID NO:74, um polinucleotídeo codificador de Vp de acordo com a SEQ ID NO:72, um polinucleotídeo codificador de domínio C_ade acordo com a SEQ ID NO:75 e um polinucleotídeo codificador de domínio Cp de acordo com a SEQ ID NO: 73; (d) um polinucleotídeo codificador de V_a de acordo com a SEQ ID NO:82, um polinucleotídeo codificador de Vp de acordo com a SEQ ID NO: 80, um polinucleotídeo codificador de domínio C_ade acordo com a SEQ ID NO: 83 e um polinucleotídeo codificador de domínio Cp de acordo com a SEQ ID NO:81; ou (e) um polinucleotídeo codificador de V_a de acordo com a SEQ ID NO:90, um polinucleotídeo codificador de Vp de acordo com a SEQ ID NO:88, um polinucleotídeo codificador de domínio C_ade acordo com a SEQ ID NO:91 e um polinucleotídeo codificador de domínio Cp de acordo com a SEQ ID NO:89.

[0090] Em modalidades adicionais, dois ou mais produtos gênicos substituintes de uma proteína de ligação desta divulgação são expressos como um único peptídeo com as partes separadas por um segmento clivável ou removível. Por exemplo, peptídeos de autoclivagem úteis para expressão de polipeptídeos separáveis codificados por um único polinucleotídeo ou vetor são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, um peptídeo 2A de teschovirus-1 Porcino (P2A), tal como um peptídeo codificado por um polinucleotídeo com a sequência de nucleotídeos mostrada em qualquer uma das SEQ

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ID NOS :128 ou 129, um peptídeo 2A de Thoseaasigna virus (T2A), tal como um peptídeo codificado por um polinucleotídeo com a sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO:132, um peptídeo do vírus A (ERAV) e 2A (E2A) da rinite equina, tal como um peptídeo codificado por um polinucleotídeo com a sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO:131, e um peptídeo 2A do vírus da febre aftosa (F2A), tal como um peptídeo codificado por um polinucleotídeo com a sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO:130.

[0091] Consequentemente, em certas modalidades, um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína de ligação da presente divulgação compreende adicionalmente um polinucleotídeo que codifica um peptídeo de autoclivagem disposto entre um polinucleotídeo codificador da cadeia α do TCR e um polinucleotídeo codificador da cadeia β do TCR, ou disposto entre um polinucleotídeo codificador do domínio TCR νβ e um polinucleotídeo codificador de TCR Va, ou disposto entre um polinucleotídeo codificador de domínio variável do TCR e um polinucleotídeo codificador de domínio constante do TCR, ou qualquer combinação destes. Em modalidades particulares, um polinucleotídeo que codifica um peptídeo de autoclivagem compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS.:128132. Em modalidades adicionais, um polinucleotídeo codifica um peptídeo de autoclivagem que compreende ou consiste em

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62/115 uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS. : 124-127 .

[0092] Também são fornecidos neste documento vetores contendo polinucleotídeos da presente divulgação. A construção de um vetor de expressão que é usado para produzir de forma recombinante uma proteína de ligação ou um TCR manipulado de alta afinidade específico para um peptídeo MAGE-A1 de interesse pode ser realizado usando qualquer técnica de engenharia de biologia molecular adequada, incluindo o uso de digestão com endonucleases de restrição, ligação, transformação, purificação de plasmídeo e sequenciação de DNA conforme descrito, por exemplo, em Sambrook et al. (Edições de 1989 e 2001; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) e Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, 2003) . Para obter uma transcrição e tradução eficiente, um polinucleotídeo em cada construto de expressão recombinante inclui pelo menos uma sequência de controle de expressão apropriada, tal como um promotor operacionalmente (ou seja, operativamente) ligado a uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de ligação. Além disso, um polinucleotídeo que codifica uma proteína de ligação desta divulgação também pode incluir uma sequência que codifica uma sequência de iniciação no amino-terminal da proteína de ligação (também referida como uma proteína de pré-ligação),

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63/115 cuja sequência de iniciação pode ser removida pela célula para produzir uma proteína de ligação madura.

[0093] Um vetor exemplar pode compreender uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outra molécula de ácido nucleico à qual foi ligada ou que é capaz de replicação em um organismo hospedeiro. Alguns exemplos de vetores incluem plasmídeos, vetores virais, cosmídeos e outros. Alguns vetores podem ser capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos com uma origem bacteriana de replicação e vetores de mamíferos epissomais), enquanto outros vetores podem ser integrados ao genoma de uma célula hospedeira ou promover a integração do inserto de polinucleotídeo após a introdução na célula hospedeira e, assim, se replica junto com o genoma do hospedeiro (por exemplo, vetor lentiviral)). Além disso, alguns vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais estão operativamente ligados (esses vetores podem ser chamados de vetores de expressão). De acordo com modalidades relacionadas, entende-se adicionalmente que, se um ou mais agentes (por exemplo, polinucleotídeos que codificam proteínas de ligação ou TCRs recombinantes de alta afinidade específicos para MAGE-A1, ou variantes destes, conforme descrito neste documento) são coadministrados a um sujeito, que cada agente pode residir em vetores separados ou nos mesmos vetores, e múltiplos

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64/115 vetores (cada um contendo um agente diferente, o mesmo agente) podem ser introduzidos em uma célula ou população de células ou administrados a um sujeito.

[0094] Em certas modalidades, um polinucleotídeo que codifica proteínas de ligação ou TCRs recombinantes de alta afinidade específicos para MAGE-A1, pode ser operativamente ligado a certos elementos de um vetor. Por exemplo, as sequências de polinucleotídeos necessárias para efetuar a expressão e o processamento das sequências de codificação às quais estão ligadas podem estar operativamente ligadas. As sequências de controle de expressão podem incluir sequências apropriadas de iniciação, terminação, promotoras e potencializadoras da transcrição; sinais eficientes de processamento de RNA, como sinais de splicing e poliadenilação; sequências que estabilizam o mRNA citoplasmático; sequências que melhoram a eficiência da tradução (ou seja, sequências de consenso de Kozak); sequências que aprimoram a estabilidade das proteínas; e possivelmente sequências que aprimoram a secreção de proteínas. As sequências de controle de expressão podem ser operativamente ligadas se forem contíguas ao gene de interesse e as sequências de controle de expressão que atuam em trans ou a uma distância para controlar o gene de interesse. Em certas modalidades, os polinucleotídeos que codificam proteínas de ligação da presente divulgação estão

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65/115 contidos em um vetor de expressão que é um vetor viral, tal como um vetor lentiviral ou um vetor retroviral γ.

[0095] Os vetores virais incluem retrovirus, adenovirus, parvovirus (por exemplo, vírus adenoassociados) , coronavirus, vírus de RNA de cadeia negativa, tal como ortomixovírus (por exemplo, vírus da gripe), rabdovírus (por exemplo, vírus da raiva e estomatite vesicular), paramixovirus (por exemplo, sarampo e Sendai), vírus de RNA de cadeia positiva, tal como picornavírus e alfavírus, e vírus de DNA de cadeia dupla, incluindo adenovirus, herpesvirus (por exemplo, vírus Herpes Simplex tipos 1 e 2, vírus Epstein-Barr, citomegalovírus) e poxvirus (por exemplo, vaccinia, bouba aviária e vírus da varíola dos canários). Outros vírus incluem o vírus Norwalk, togavirus, flavivírus, reovírus, papovavírus, hepadnavírus e vírus da hepatite, por exemplo. Os exemplos de retrovirus incluem: sarcoma de leucose aviária, vírus em mamíferos tipo C e tipo B, vírus tipo D, grupo HTLV-BLV, lentivírus, spumavírus (Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Terceira Edição, Β. N. Fields et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Filadélfia, 1996).

[0096] O vetor lentiviral, conforme usado neste documento, significa que os vetores lentivirais baseados no

HIV para transmissão de genes, que podem ser integrativos ou

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66/115 não integrativos, têm capacidade de empacotamento relativamente grande e podem transduzir uma variedade de diferentes tipos de células. Os vetores lentivirais são geralmente gerados após a transfecção transitória de três (empacotamento, envelope e transferência) ou mais plasmídeos nas células produtoras. Como o HIV, os vetores lentivirais entram na célula alvo através da interação das glicoproteínas da superfície viral com os receptores na superfície celular. Na entrada, o RNA viral sofre transcrição reversa, que é mediada pelo complexo da transcriptase reversa viral. 0 produto da transcrição reversa é um DNA viral linear de fita dupla, que é o substrato para a integração viral no DNA das células infectadas.

[0097] Em modalidades particulares, um vetor de expressão recombinante ou manipulado é entregue a uma célula apropriada (ou seja, é capaz de transmitir um polinucleotídeo codificador de proteína de ligação da presente divulgação a uma célula hospedeira), por exemplo, uma célula T ou uma célula que apresenta antígeno, ou seja, uma célula que exibe um complexo de peptídeo/MHC em sua superfície celular (por exemplo, uma célula dendrítica) e não tem CD8. Em certas modalidades, uma célula hospedeira é uma célula progenitora hematopoiética ou uma célula do sistema imunológico humano. Por exemplo, uma célula do sistema imunológico humano pode ser uma célula T CD4+, uma célula T CD8+, uma célula T dupla

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67/115 negativa CD4- CD8-, uma célula T γδ, uma célula natural killer, uma célula dendrítica ou qualquer combinação destas. Em certas modalidades, em que uma célula T é o hospedeiro, a célula T pode ser virgem, uma célula T de memória central, uma célula T de memória efetora ou qualquer combinação destas. Os vetores de expressão recombinantes da presente divulgação podem, por conseguinte, incluir ainda, por exemplo, elementos regulatórios de transcrição (TREs) específicos do tecido linfoide, como linfócito B, linfócito T ou TREs específicos de células dendríticas. Os TREs específicos do tecido linfoide são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Thompson et al., Mol. Cell. Biol. 12:1043, 1992); Todd et al., J. Exp. Med. 177:1663, 1993); Penix et al., J. Exp. Med. 178:1483, 1993).

[0098] Ademais aos vetores, certas modalidades se referem a células hospedeiras que compreendem os vetores que são divulgados atualmente. Um especialista na técnica entende prontamente que muitas células hospedeiras adequadas estão disponíveis na técnica. Uma célula hospedeira pode incluir qualquer célula individual ou cultura celular que possa receber um vetor ou a incorporação de ácidos nucleicos e/ou proteínas, bem como quaisquer células descendentes. O termo também abrange a descendência da célula hospedeira, seja genética ou fenotipicamente igual ou diferente. As células hospedeiras adequadas podem depender do vetor e podem

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68/115 incluir células de mamíferos, células animais, células humanas, células símias, células de insetos, células de leveduras e células bacterianas. Essas células podem ser induzidas para incorporar o vetor ou outro material pelo uso de um vetor viral, transformação por precipitação com fosfato de cálcio, DEAE-dextrano, eletroporação, microinjeção ou outros métodos. Ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2^a ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) .

Células Hospedeiras [0099] Também são fornecidas células hospedeiras (Ou seja, células modificadas) que incluem um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma proteína de ligação desta divulgação. Em certas modalidades, uma célula hospedeira compreende uma célula imune humana, tal como, por exemplo, uma célula T, uma célula NK ou uma célula NK-T. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira compreende uma célula T CD4⁺, uma célula T CD8⁺ ou ambas. Os métodos para transfectar/transduzir células T com ácidos nucleicos desejados foram descritos (por exemplo, o Pedido de Patente US Pub. No. US 2004/0087025) como possuem procedimentos de transferência adotivos usando células T com especificidade alvo desejada (por exemplo, Schmitt et al. , Hum. Gen. 20:1240, 2009; Dossett et al., Mol. Ther. 17:742, 2009; Till et al., Blood 112:2261, 2008; Wang et al., Hum. Gene Ther.

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18:712, 2007; Kuball et al., Blood 109:2331, 2007; US 2011/0243972; US 2011/0189141; Leen et al., Ann. Rev. Immunol. 25:243, 2007), de modo que a adaptação dessas metodologias às modalidades atualmente divulgadas seja contemplada, com base nos ensinamentos neste documento.

[0100] Em certas modalidades, uma célula modificada compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma proteína de ligação, em que a proteína de ligação codificada compreende: (a) um domínio variável de cadeia α (ν_α) do receptor de célula T (TCR) com uma seguência de aminoácidos CDR3 de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS.:26, 32, 38, 44, 50, ou 51, e um domínio variável de cadeia β (Vp) do TCR; (b) um domínio Vp com uma sequência de aminoácidos CDR3 de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS. :23, 29, 35, 41 ou 47, e um domínio ν_α; ou (c) um domínio ν_α com uma sequência de aminoácidos CDR3 de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS :26, 32, 38, 44, 50, ou 51 e um domínio Vp com uma sequência de aminoácidos CDR3 de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs:23, 29, 35, 41, ou 47; e em que a proteína de ligação é capaz de se ligar especificamente a um complexo de peptídeo MAGE-Al:HLA em uma superfície celular independente de CD8 ou na ausência de CD8. Em algumas modalidades, a proteína de ligação codificada é capaz de se ligar especificamente a um complexo de KVLEYVIKV (SEQ ID

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NO.:123):antígeno leucocitário humano (HLA) com um Kd menor ou igual a cerca de 10^-8 M.

[0101] Qualquer método apropriado pode ser usado para transfectar ou transduzir as células, por exemplo, as células T, ou para administrar os polínucleotldeos ou composições dos presentes métodos. Os métodos conhecidos para transmitir polínucleotldeos às células hospedeiras incluem, por exemplo, o uso de polímeros catiônicos, moléculas semelhantes a lipídios e certos produtos comerciais, tal como, por exemplo, IN-VIVO-JET PEI. Outros métodos incluem transdução ex vivo , injeção, eletroporação, DEAE-dextrano, carga de sonicação, transfecção mediada por lipossomas, transdução mediada por receptor, bombardeamento de microprojéteis, transferência mediada por transposon e similares. Ainda outros métodos adicionais de transfecção ou transdução de células hospedeiras empregam vetores, descritos em mais detalhes neste documento.

[0102] Em qualquer uma das modalidades anteriores, uma célula hospedeira (por exemplo, uma célula imune) pode ser uma célula doadora universal que é modificada para reduzir ou eliminar a expressão de um ou mais genes endógenos que codificam um polipeptídeo envolvido na sinalização imune ou outras atividades relacionadas. Exemplos de nocautes de gene incluem aqueles que codificam PD-1, LAG-3, CTLA4, TIM3, uma molécula de HLA, uma molécula de TCR ou similares. Sem se

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71/115 limitar à teoria, certas proteínas de células imunes expressas endogenamente podem ser reconhecidas como estranhas por um hospedeiro alogênico que recebe as células imunes do hospedeiro, o que pode resultar na eliminação das células imunes do hospedeiro (por exemplo, um alelo HLA) ou pode diminuir a regulação da atividade imune de uma célula modificada (por exemplo, PD-1, LAG-3, CTLA4), ou pode interferir com a atividade de ligação de uma proteína de ligação expressa heterologicamente da presente divulgação (por exemplo, um TCR endógeno que se liga a um antigeno nãoMAGE-A1 e, assim, interfere com a célula modificada que liga uma célula que expressa o antigeno MAGE-Al). Consequentemente, diminuir ou eliminar a expressão ou atividade de tais genes ou proteínas endógenas pode melhorar a atividade, tolerância e persistência de células modificadas dentro de um hospedeiro alogênico e permite a administração de células universais prontas para uso (por exemplo, para qualquer destinatário, independentemente do tipo de HLA).

[0103] Em certas modalidades, uma célula hospedeira (por exemplo, uma célula imune modificada) desta divulgação compreende um nocaute de gene cromossômico de um ou mais de um gene que codifica PD-1, LAG-3, CTLA4, TIM3, um componente de HLA (por exemplo, um gene que codifica uma macroglobulina al, uma macroglobulina a2, uma macroglobulina a3, uma

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72/115 microglobulina βΐ ou uma microglobulina β2) ou um componente de TCR (por exemplo, um gene que codifica uma região variável ou uma região constante de TCR) (ver, por exemplo, Torikai et al. , Nature Sei. Rep. 6:21151 (2016); Torikai et al. , Blood 119 (24) : 5697 (2012); e Torikai et al. , Blood 122(8):1341 (2013), cujas técnicas e composições de edição de genes são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade). Conforme usado neste documento, o termo nocaute de gene cromossômico se refere a uma alteração genética em uma célula modificada que impede a produção, pela célula modificada, de um produto polipeptídico endógeno funcionalmente ativo. Alterações que resultam em nocaute de gene cromossômico podem incluir, por exemplo, mutações sem sentido introduzidas (incluindo a formação de códons terminais prematuros), mutações missense, deleção de genes e rupturas de fita, bem como a expressão heteróloga de moléculas inibidoras de ácido nucleico que inibem expressão de gene endógeno na célula modificada.

[0104] Um nocaute de gene cromossômico pode ser introduzido pela edição cromossômica da célula imune. Em certas modalidades, o nocaute de gene cromossômico é feito pela edição cromossômica da célula imune. A edição cromossômica pode ser realizada usando, por exemplo, endonucleases. Conforme usado neste documento, endonuclease se refere a uma enzima capaz de catalisar a

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73/115 divagem de uma ligação fosfodiéster dentro de uma cadeia polinucleotídica. Em certas modalidades, uma endonuclease é capaz de clivar um gene alvo, inativando ou nocauteando o gene alvo. Uma endonuclease pode ser uma endonuclease de ocorrência natural, recombinante, geneticamente modificada ou de fusão. As rupturas de fita de ácido nucleico causadas pela endonuclease são comumente reparadas através de mecanismos distintos de recombinação homóloga ou junção de extremidade não homóloga (NHEJ). Durante a recombinação homóloga, uma molécula de ácido nucleico de doador pode ser usada para o knock-in do gene para inativar um gene alvo. 0 NHEJ é um processo de reparo propenso a erros que geralmente resulta em mudanças na sequência de DNA no sítio da divagem, por exemplo, uma substituição, deleção ou adição de pelo menos um nucleotídeo. 0 NHEJ pode ser usado para nocautear um gene alvo. Os métodos para romper ou nocautear genes ou expressão de gene em células imunes usando endonucleases são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, nas Publicações PCT Nos. WO 2015/066262; WO 2013/074916; e WO 2014/059173; cujos métodos de cada um é incorporado por referência. Exemplos de endonucleases incluem nucleases de dedo de zinco, nucleases TALE, nucleases CRISPR-Cas e meganucleases.

[0105] Conforme usado neste documento, uma nuclease de dedo de zinco (ZFN) se refere a uma proteína de fusão

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74/115 compreendendo um domínio de ligação a DNA de dedo de zinco fundido com um domínio de divagem de DNA não específico, tal como uma endonuclease de Fokl. Cada motivo de dedo de zinco de cerca de 30 aminoácidos se liga a cerca de 3 pares de base de DNA, e os aminoácidos em certos resíduos podem ser mudados para alterar a especificidade da sequência tripla (ver, por exemplo, Desjarlais et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 90:2256-2260, 1993; Wolfe et al. , J. Mol. Biol. 285:19171934, 1999) . Múltiplos motivos de dedo de zinco podem ser ligados em tandem para criar especificidade de ligação às sequências de DNA desejadas, tais como regiões com um comprimento variando de cerca de 9 a cerca de 18 pares de base. A título de fundamentos, os ZFNs mediam a edição do genoma catalisando a formação de uma ruptura de DNA de fita dupla específico de sítio (DSB) no genoma, e a integração direcionada de um transgene compreendendo sequências de flanqueamento homólogas ao genoma no sítio do DSB é facilitada por reparo direcionado à homologia. Alternativamente, um DSB gerado por um ZFN pode resultar em nocaute do gene alvo por meio de reparo por junção de extremidade não homóloga (NHEJ) , que é uma via de reparo celular propensa a erros que resulta na inserção ou deleção de nucleotídeos no sítio de divagem. Em certas modalidades, um nocaute de gene compreende uma inserção, uma deleção, uma

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75/115 mutação ou uma combinação destes, feitas usando uma molécula de ZFN.

[0106] Conforme usado neste documento, uma nuclease efetora do tipo ativadora de transcrição (TALEN) se refere a uma proteína de fusão compreendendo um domínio de ligação ao DNA TALE e um domínio de divagem de DNA, tal como uma endonuclease de Fokl. Um domínio de ligação ao DNA TALE ou TALE é composto por um ou mais domínios/unidades de repetição TALE, cada um com geralmente uma sequência de aminoácidos 33-35 altamente conservada com 12° e 13° aminoácidos divergentes. Os domínios de repetição TALE estão envolvidos na ligação da TALE a uma sequência de DNA alvo. Os resíduos de aminoácidos divergentes, referidos como Dirresíduo Variável de Repetição (RVD), se correlacionam com o reconhecimento específico de nucleotideos. O código (canônico) natural para o reconhecimento de DNA desses TALEs foi determinado de tal forma que uma sequência HD nas posições 12 e 13 leva a uma ligação à citosina (C) , NG se liga a T, NI a A, NN se liga a G ou A, e NG se liga a T e RVDs não-canônicos (atípicos) também são conhecidos (ver, por exemplo, a Publicação de Patente US n° US 2011/0301073, cujos RVDs atípicos são incorporados por referência neste documento na sua totalidade). Os TALENs podem ser usados para direcionar rupturas de fita dupla específicas de sítio (DSB) no genoma das células T. A junção de extremidade não

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76/115 homóloga (NHEJ) liga o DNA de ambos os lados de uma ruptura de fita dupla, na qual há pouca ou nenhuma sobreposição de sequência para o anelamento, introduzindo erros que nocauteiam a expressão de gene. Alternativamente, o reparo direcionado à homologia pode introduzir um transgene no sítio do DSB, desde que sequências de flanqueamento homólogas estejam presentes no transgene. Em certas modalidades, um nocaute de gene compreende uma inserção, uma deleção, uma mutação ou uma combinação destes, e feitas usando uma molécula de TALEN.

[0107] Conforme usado neste documento, um sistema de nuclease de repetições palindrômicas curtas interespaçadas regularmente em aglomerado/Cas (CRISPR/Cas) se refere a um sistema que emprega uma nuclease Cas guiada por CRISPR RNA (crRNA) para reconhecer sítios alvo em um genoma (conhecidos como protoespaçadores) por meio da complementaridade de emparelhamento de base e, em seguida, para clivar o DNA se um motivo associado ao protoespaçador (PAM) curto e conservado seguir imediatamente 3' da sequência alvo complementar. Os sistemas de CRISPR/Cas são classificados em três tipos (ou seja, tipo I, tipo II e tipo III) com base na sequência e estrutura das nucleases de Cas. Os complexos de vigilância guiados por crRNA nos tipos I e III precisam de múltiplas subunidades de Cas. O sistema tipo II, o mais estudado, compreende pelo menos três componentes: uma

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77/115 nuclease Cas9 guiada por RNA, um crRNA e um crRNA de ação trans (tracrRNA). 0 tracrRNA compreende uma região de formação duplex. Um crRNA e um tracrRNA formam um duplex capaz de interagir com uma nuclease Cas9 e guiar o complexo de Cas9/crRNA:tracrRNA para um sítio específico no DNA alvo por meio do emparelhamento de base Watson-Crick entre o espaçador no crRNA e o protoespaçador no DNA alvo a montante de um PAM. A nuclease Cas9 cliva uma ruptura de fita dupla dentro de uma região definida pelo espaçador de crRNA. 0 reparo pelo NHEJ resulta em inserções e/ou deleções que interrompem a expressão do locus alvo. Alternativamente, um transgene com sequências de flanqueamento homólogas pode ser introduzido no sítio do DSB por meio do reparo direcionado à homologia. 0 crRNA e o tracrRNA podem ser manipulados em um único RNA guia (sgRNA ou gRNA) (ver, por exemplo, Jinek et al. , Science 337:816-21, 2012) . Adicionalmente, a região do RNA guia complementar ao sítio alvo pode ser alterada ou programada para atingir uma sequência desejada (Xie et al., PLOS One 9:el00448, 2014; Pub. do Ped. de Pat. dos EUA US 2014/0068797, Pub. do Ped. de Pat. Dos EUA US 2014/0186843; Pat. US n° 8.697.359, e Publicação PCT n° WO 2015/071474; cujas técnicas e composições de cada uma é incorporada por referência). Em certas modalidades, um nocaute de gene compreende uma inserção, uma deleção, uma mutação ou uma

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78/115 combinação destes, e feitas usando um sistema de nuclease CRISPR/Cas.

[0108] Conforme usado neste documento, uma meganuclease, também referida como endonuclease de retorno, se refere a uma endodeoxirribonuclease caracterizada por um grande sítio de reconhecimento (sequências de DNA de fita dupla de cerca de 12 a cerca de 40 pares de base). As meganucleases podem ser divididas em cinco famílias com base nos motivos estrutura e sequência: LAGLIDADG, GIY-YIG, HNH, caixa His-Cys e PD-(D/E)XK. Os exemplos de meganucleases incluem I-Scel, I-Ceul, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-Csml, I-PanI, I-SceII, I-Ppol, I-SceIII, I-Crel, I-TevI, I-TevII e I-TevIII, cujas sequências de reconhecimento são conhecidas (ver, por exemplo, Patentes US n° 5.420.032 e 6.833.252; Belfort et al. , Nucleic Acids Res. 25:3379-3388, 1997; Dujon et al., Gene 82:115-118, 1989; Perler et al., Nucleic Acids Res. 22:1125-1127, 1994; Jasin, Trends Genet. 12:224-228, 1996; Gimble et al., J. Mol. Biol. 253:163-180, 1996; Argast et al., J. Mol. Biol. 280:345-353, 1998).

[0109] Em certas modalidades, as meganucleases de ocorrência natural podem ser usadas para promover a modificação do genoma específico de sítio de um alvo selecionado de PD-1, LAG3, TIM3, CTLA4, um gene codificador de HLA ou um gene codificador de componente TCR. Em outras

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79/115 modalidades, uma meganuclease manipulada com uma nova especificidade de ligação para um gene alvo é usada para modificação do genoma específico de sítio (ver, por exemplo, Porteus et al., Nat. Biotechnol. 23:961-73, 2005; Sussman et al. , J. Mol. Biol. 342:31-41, 2004; Epinat et al. , Nucleic Acids Res. 31:2952-62, 2003; Chevalier et al., Molec. Cell 10:895-905, 2002; Ashworth et al., Nature 441:656-659, 2006; Paques et al., Curr. Gene Ther. 7:49-66, 2007; Publicações de Patentes dos EUA US n° 2007/0117128; US 2006/0206949; US 2006/0153826; US 2006/0078552; e US 2004/0002092).

[0110] Em certas modalidades, um nocaute de gene cromossômico compreende uma molécula de ácido nucleico inibidora que é introduzida em uma célula modificada que compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica um receptor específico de antígeno que se liga especificamente a um antígeno associado a um tumor, em que a molécula de ácido nucleico inibidora codifica um inibidor específico de alvo e em que o inibidor específico de alvo codificado inibe a expressão de gene endógena (ou seja, de PD-1, TIM3, LAG3, CTLA4, um componente HLA, um componente TCR ou qualquer combinação destes) na célula modificada.

[0111] Um nocaute de gene cromossômico pode ser confirmado diretamente pelo sequenciamento de DNA da célula modificada após o uso do procedimento ou do agente de nocaute. Os nocautes de gene cromossômicos também podem ser

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80/115 inferidos a partir da ausência de expressão de gene (por exemplo, a ausência de um mRNA ou produto polipeptídico codificado pelo gene) após o nocaute.

[0112] Em algumas modalidades, uma célula modificada é uma célula T CD4⁺ que compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma proteína de ligação da presente divulgação (por exemplo, um TCR específico de MAGE-A1 a partir de uma célula T CD8⁺ que é capaz de se ligar especificamente a um antígeno peptídico). Em algumas modalidades, um TCR codificado heterologicamente de uma célula T CD4⁺ modificada é um TCR de alta afinidade. Em modalidades particulares, um TCR codificado heterologicamente de uma célula T CD4⁺ modificada é capaz de se ligar especificamente a um complexo de peptídeo: antígeno HLA em uma superfície celular independente de CD8 ou na ausência de CD8.

[0113] Em outras modalidades, uma célula T CD4⁺modificada compreende adicionalmente um polinucleotídeo heterólogo que codifica pelo menos uma porção extracelular de um correceptor de CD8. Conforme mostrado nos Exemplos, a coexpressão de uma proteína de ligação específica de MAGEA1 da presente divulgação e pelo menos uma porção extracelular de um correceptor CD8 por uma célula T CD4⁺ pode conferir uma funcionalidade nova ou melhorada (por exemplo, liberação de citocinas melhorada, resposta de CTL melhorada

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81/115 quando ligada a uma célula alvo que expressa MAGE-A1:HLA) na célula T CD4⁺. Uma sequência de aminoácidos de uma cadeia α de correceptor CD8 é fornecida na SEQ ID NO:143. As sequências de aminoácidos de cinco isoformas diferentes da cadeia β de correceptor CD8 são fornecidas nas SEQ ID NOS :144-148, respectivamente. Em algumas modalidades, uma célula T CD4⁺ modificada desta divulgação compreende adicionalmente um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma cadeia β de receptor de correceptor de CD8 de comprimento completo, um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma cadeia α de correceptor de CD8 de comprimento completo ou ambos. Um polinucleotídeo codificador de CD8 pode, em algumas modalidades, ser [0114] Também são fornecidos neste documento métodos para produzir uma célula T CD4⁺ modificada, em que os métodos compreendem a transdução de uma célula T CD4+ com um polinucleotídeo heterólogo que codifica um TCR a partir de uma célula T CD8⁺ que seja capaz de se ligar especificamente a um antígeno peptídico. Em certas modalidades, um polinucleotídeo codificador de TCR usado para modificar uma célula T CD4⁺ é de uma célula T CD8⁺ de ocorrência natural (ou seja, o TCR é um TCR de ocorrência natural) . As modalidades adicionais dos métodos podem incluir a transdução da célula T CD4⁺ com um polinucleotídeo heterólogo que codifica pelo menos uma porção extracelular de um

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82/115 correceptor de CD8, que pode, em algumas modalidades, compreender um CD8a e um CD8p da célula T CD8⁺.

Composições [0115] Também são fornecidas neste documento composições (por exemplo, composições farmacêuticas) que compreendem uma célula modificada, conforme divulgado neste documento, e um carreador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Os excipientes adequados são água, solução salina, dextrose, glicerol ou afins e combinações destes. Nas modalidades, as composições compreendendo proteínas de fusão ou células hospedeiras, como divulgadas neste documento, compreendem ainda um meio de infusão adequado. Os meios de infusão podem ser qualquer formulação de meio isotônico, geralmente uma solução salina normal, Normosol R (Abbott) ou Plasma-Lyte A (Baxter), 5% de dextrose em água ou lactato de Ringer podem ser utilizados. Um meio de infusão pode ser suplementado com albumina sérica humana ou outros componentes séricos humanos. As composições descritas neste documento podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou multidose, como ampolas ou frascos selados. Tais recipientes podem ser congelados para preservar a estabilidade da formulação até a infusão no paciente.

[0116] Uma quantidade eficaz de uma composição referese a uma quantidade suficiente, em dosagens e por períodos

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83/115 de tempo necessários, para alcançar os resultados clínicos desejados ou tratamento benéfico, como descrito neste documento. Uma quantidade eficaz pode ser distribuída em uma ou mais administrações. Se a administração é para um sujeito já conhecido ou confirmado como tendo uma doença ou estado de doença, o termo quantidade terapêutica pode ser usado em referência ao tratamento, enquanto quantidade profilaticamente eficaz pode ser usada para descrever a administração de uma quantidade eficaz a um sujeito

suscetível	ou em risco de	desenvolver	uma doença ou	estado
de doença	(por exemplo	, recorrência) como um	curso
preventivo.
[0117]	As composições	podem ser	administradas	de uma

maneira apropriada à doença ou condição a ser tratada (ou evitada), conforme determinado por pessoas versadas na técnica médica. Uma dose apropriada e uma duração e frequência adequadas de administração das composições serão determinadas por fatores como a condição de saúde do paciente, tamanho do paciente (ou seja, peso, massa ou área corporal), o tipo e a gravidade da condição do paciente, forma particular do ingrediente ativo e método de administração. Em geral, uma dose e regime apropriado fornece a(s) composição(ões) numa quantidade suficiente para fornecer benefícios terapêuticos e/ou profiláticos (tal como descrito neste documento, incluindo um resultado clínico

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84/115 melhorado, tal como remissões completas ou parciais mais frequentes, ou mais tempo livre de doença e/ou maior sobrevida global, ou uma diminuição da gravidade dos sintomas) . Para uso profilático, uma dose deve ser suficiente para prevenir, retardar o aparecimento de ou diminuir a gravidade de uma doença associada com a doença ou distúrbio. 0 benefício profilático das composições administradas de acordo com os métodos descritos neste documento pode ser determinado executando estudos pré-clínicos (incluindo estudos in vitro e in vivo ) e clínicos e analisando dados obtidos a partir deles por métodos e técnicas estatísticas, biológicas e clínicas apropriadas.

[0118] Uma dose terapeuticamente eficaz é uma quantidade de células hospedeiras (expressando uma proteína de ligação ou TCR recombinante de alta afinidade específica para MAGEA1 humana) usada na transferência adotiva que é capaz de produzir um resultado clinicamente desejável (ou seja, uma quantidade suficiente para induzir ou melhorar uma resposta imune específica de células T contra células que superexpressam MAGE-A1 (por exemplo, uma resposta de células T citotóxicas) de uma maneira estatisticamente significativa) em um mamífero humano ou não humano tratado. A dosagem para qualquer paciente depende de muitos fatores, incluindo o tamanho do paciente, peso, área de superfície corporal, idade, a terapia específica a ser administrada,

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85/115 sexo, tempo e via de administração, saúde geral, e outras drogas que estão sendo administradas concomitantemente. As doses variarão, mas uma dose preferida para administração de uma célula hospedeira compreendendo um vetor de expressão

recombinante	como	descrito	neste	documento é	de cerca de	10⁷
células/m²,	cerca	de	5	x 10⁷	células/m²,	cerca	de	10⁸
células/m²,	cerca	de	5	x 10⁸	células/m²,	cerca	de	10⁹
células/m²,	cerca	de	5	x 10⁹	células/m²,	cerca	de	10¹⁰
células/m²,	cerca	de 5	X	10¹⁰ células/m², ou cerca	de	10¹¹

células/m².	Em	certas	modalidades,	uma	dose	unitária
compreende	uma	célula	modificada	como	descrito neste
documento a	uma	dose de	cerca de 10⁷	células/m² a	cerca de
10¹¹ células	/m².
[0119]	Em	certas	modalidades,	uma	dose	unitária

compreende (i) uma composição compreendendo pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% de células T CD4⁺ manipuladas, combinadas com (ii) uma composição compreendendo pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, em pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% de células T CD8 ⁺manipuladas, em uma proporção de cerca de 1:1. Em outras

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86/115 modalidades, uma dose unitária contém uma quantidade reduzida ou praticamente nenhuma célula T não exposta (ou seja, tem menos de cerca de 50%, menos de cerca de 40%, menos de cerca de 30%, menos de cerca de 20%, menos de cerca de 10%, menos de cerca de 5% ou menos de cerca de 1% da população de células T não expostas presentes em uma dose unitária em comparação com uma amostra de paciente com um número comparável de PBMCs).

[0120] Em algumas modalidades, uma dose unitária compreende (i) uma composição compreendendo pelo menos cerca de 50% de células T CD4⁺ manipuladas, combinada com (ii) uma composição compreendendo pelo menos cerca de 50% de células T CD8⁺ manipuladas, em uma proporção de cerca de 1:1, em que a dose unitária contém uma quantidade reduzida ou praticamente nenhuma célula T não exposta. Em outras modalidades, uma dose unitária compreende (i) uma composição compreendendo pelo menos cerca de 60% de células T CD4 ⁺modificadas, combinada com (ii) uma composição compreendendo pelo menos cerca de 60% de células T CD8⁺ modificadas, em uma proporção de cerca de 1:1, em que a dose unitária contém uma quantidade reduzida ou praticamente nenhuma célula T não exposta. Em ainda outras modalidades, uma dose unitária compreende (i) uma composição compreendendo pelo menos cerca de 70% de células T CD4⁺ modificadas, combinada com (ii) uma composição compreendendo pelo menos cerca de 70% de células

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T CD8⁺ modificadas, em uma proporção de cerca de 1:1, em que a dose unitária contém uma quantidade reduzida ou praticamente nenhuma célula T não exposta. Em algumas modalidades, uma dose unitária compreende (1) uma composição compreendendo pelo menos cerca de 80% de células T CD4 ⁺modificadas, combinada com (11) uma composição compreendendo pelo menos cerca de 80% de células T CD8⁺ modificadas, em uma proporção de cerca de 1:1, em que a dose unitária contém uma quantidade reduzida ou praticamente nenhuma célula T não exposta. Em outras modalidades, uma dose unitária compreende (1) uma composição compreendendo pelo menos cerca de 85% de células T CD4⁺ modificadas, combinada com (11) uma composição compreendendo pelo menos cerca de 85% de células T CD8 ⁺modificadas, em uma proporção de cerca de 1:1, em que a dose unitária contém uma quantidade reduzida ou praticamente nenhuma célula T não exposta. Em outras modalidades, uma dose unitária compreende (1) uma composição compreendendo pelo menos cerca de 90% de células T CD4⁺ modificadas, combinada com (11) uma composição compreendendo pelo menos cerca de 90% de células T CD8⁺ modificadas, em uma proporção de cerca de 1:1, em que a dose unitária contém uma quantidade reduzida ou praticamente nenhuma célula T não exposta.

[0121] Em qualquer uma das modalidades descritas neste documento, uma dose unitária compreende números iguais ou

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88/115 aproximadamente iguais de células CD45RA CD3⁺ CD8⁺ e células CD45RA^- CD3⁺ CD4⁺ T_M modificadas.

[0122] O desenvolvimento de regimes de dosagem e tratamento adequados para usar as composições particulares descritas neste documento em uma variedade de regimes de tratamento, incluindo, por exemplo, administração ou formulação parentérica ou intravenosa. Se a composição em questão for administrada parentericamente, a composição também pode incluir solução ou suspensão aquosa ou oleaginosa estéril. Os diluentes ou solventes parentericamente aceitáveis não tóxicos adequados incluem água, solução de Ringer, solução salina isotônica, 1,3-butanodiol, etanol, propileno glicol ou polietileno glicóis em misturas com água. As soluções ou suspensões aquosas podem ainda compreender um ou mais agentes tamponantes, como acetato de sódio, citrato de sódio, borato de sódio ou tartarato de sódio. É óbvio que qualquer material usado na preparação de qualquer formulação de unidade de dosagem deve ser farmaceuticamente puro e substancialmente não-tóxico nas quantidades utilizadas. Além disso, os compostos ativos podem ser incorporados em preparações e formulações de liberação sustentada. A forma da unidade de dosagem, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias aos sujeitos a serem tratados; cada unidade pode conter uma quantidade predeterminada de células modificadas ou composto ativo

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89/115 calculado para produzir o efeito terapêutico desejado em associação ao carreador farmacêutico apropriado.

[0123] Como utilizado neste documento, a administração de uma composição refere-se à distribuição desta a um sujeito, independentemente da via ou modo de distribuição. A administração pode ser efetuada de forma continua ou intermitente e parenteral. A administração pode ser para tratar um sujeito já confirmado como tendo uma condição reconhecida, doença ou estado de doença, ou para tratar um sujeito suscetível ou em risco de desenvolver tal condição, doença ou estado de doença. A coadministração com uma terapia adjuvante pode incluir distribuição simultânea e/ou sequencial de múltiplos agentes em qualquer ordem e em qualquer esquema de dosagem (por exemplo, células modificadas com uma ou mais citocinas; terapia imunossupressora, como inibidores de calcineurina, corticosteroides, inibidores de microtúbulos, baixa dose de um pró-droga do ácido micofenólico, inibidores de HDAC, agentes de hipometilação do DNA ou qualquer combinação destes).

[0124] Em certas modalidades, uma pluralidade de doses de uma célula modificada descrita neste documento é administrada ao sujeito, que pode ser administrada em intervalos entre administrações de cerca de duas a cerca de quatro semanas.

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Métodos de Tratamento [0125] Em certos aspectos, a presente divulgação é direcionada a métodos para o tratamento de um distúrbio hiperproliferativo ou uma condição caracterizada pela expressão de MAGE-Al (por exemplo, expressão aberrante de MAGE-A1), administrando ao sujeito humano em necessidade de uma célula, composição ou unidade modificada dose como divulgado neste documento (ou qualquer combinação destes).

[0126] Uma condição associada à expressão de MAGE-Al inclui qualquer distúrbio ou condição em que a subatividade, atividade excessiva ou atividade imprópria de um evento celular ou molecular de MAGE-Al esteja presente, e pode ser o resultado de níveis incomumente altos (com significância estatística) de expressão MAGE-Al ou expressão inadequada (ou seja, não ocorre em células saudáveis do tipo de célula especificado) em células afetadas (por exemplo, células de mieloma), em relação às células normais. Um sujeito com tal distúrbio ou condição se beneficiaria do tratamento com uma composição ou método das modalidades atualmente descritas. Algumas condições associadas à expressão aberrante de MAGEAl podem, assim, incluir distúrbios e doenças agudas, bem como crônicas, como as condições patológicas que predispõem o sujeito a um distúrbio específico.

[0127] Alguns exemplos de condições associadas à expressão de MAGE-Al incluem distúrbios proliferativos ou

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91/115 hiperproliferativos, que se referem a estados de células ativadas e/ou proliferativas (que também podem ser transcricionalmente hiperativas) em um sujeito, incluindo tumores, neoplasias, câncer, malignidade etc. Além de células ativadas ou em proliferação, o distúrbio hiperproliferativo também pode incluir uma aberração ou desregulação dos processos de morte celular, seja por necrose ou apoptose. Essa aberração dos processos de morte celular pode estar associada a uma variedade de condições, incluindo câncer (incluindo neoplasias primárias, secundárias e metástases) ou outras condições.

[0128] A presença de um distúrbio hiperproliferativo ou condição maligna em um sujeito refere-se à presença de células displásicas, cancerígenas e/ou transformadas no sujeito, incluindo, por exemplo, células neoplásicas, tumorais, inibidas por não contato ou transformadas oncogenicamente ou semelhantes (por exemplo, câncer sólido; câncer hematológico, incluindo linfomas e leucemias, como leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica, etc.), que são conhecidos na técnica e para os quais são estabelecidos critérios para diagnóstico e classificação (por exemplo, Hanahan e Weinberg, Cell 144: 646, 2011; Hanahan e Weinberg, Cell 100: 57, 2000; Cavallo et al., Cane. Immunol. Immunother. 60:319, 2011; Kyrigideis et al., J. Carcinog. 9:3, 2010) . Em certas modalidades, essas células

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92/115 cancerígenas podem ser células de leucemia mieloide aguda, leucemia linfoblástica de células B, leucemia linfoblástica de células T ou mieloma, incluindo células-tronco cancerígenas capazes de iniciar e transplantar em série qualquer um desses tipos de câncer (ver, por exemplo, Park et al., Molec. Therap. 17:219, 2009).

[0129] Em certas modalidades, são fornecidos métodos para o tratamento de um distúrbio hiperproliferativo, tal como uma neoplasia hematológica ou um câncer sólido, em que o método compreende a administração a um sujeito humano em necessidade destes de uma célula, composição ou dose unitária modificada da presente divulgação. Exemplos de malignidades hematológicas incluem leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mieloide crônica (CML), leucemia eosinofílica crônica (CEL), síndrome mielodisplásica (MDS), linfoma não-Hodgkin (NHL) ou mieloma múltiplo (MM).

[0130] Em modalidades adicionais, são fornecidos métodos para tratar um distúrbio hiperproliferativo, tal como um câncer sólido é selecionado dentre câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) , câncer de mama triplo negativo (TNBC), câncer de ovário, melanoma maligno, câncer de cólon, adenocarcinoma colorretal, câncer colorretal, câncer biliar, câncer de bexiga, carcinoma de ossos e tecidos moles, tumor cerebral, câncer de mama, câncer de colo de

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93/115 útero, tumor desmoide, câncer embrionário, câncer endometrial, câncer de esôfago, câncer gástrico, adenocarcinoma gástrico, glioblastoma multiforme, tumor ginecológico, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, câncer hepático, câncer de pulmão, mesotelioma, osteossarcoma, câncer de pâncreas, adenocarcinoma ductal pancreático, tumor astrocítico primário, câncer de tireoide primário, câncer de próstata, câncer de rim, carcinoma de células renais, rabdomiossarcoma, câncer de pele, sarcoma de tecidos moles, tumor de células germinativas testicular, sarcoma uterino ou câncer uterino.

[0131] Como entendido por alguém versado na técnica médica, os termos tratar e tratamento referem-se ao tratamento médico de uma doença, distúrbio ou condição de um sujeito (ou seja, paciente, hospedeiro, que pode ser humano ou animal não humano) (ver, por exemplo, Stedman's Medical Dictionary) . Em geral, uma dose apropriada e um regime de tratamento fornecem um ou mais de uma proteína de ligação ou TCR recombinante de alta afinidade específica para MAGE-Al humana ou uma célula hospedeira que expressa o mesmo e, opcionalmente, uma terapia adjuvante (por exemplo, uma citocina como IL- 2, IL-15, IL-21 ou qualquer combinação destes), em uma quantidade suficiente para fornecer benefício terapêutico ou profilático. Os benefícios terapêuticos ou profiláticos resultantes do tratamento

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94/115 terapêutico ou dos métodos profiláticos ou preventivos incluem, por exemplo, um resultado clínico aprimorado, em que o objetivo é prevenir ou retardar ou reduzir (por exemplo, diminuir de maneira estatisticamente significativa em relação a um controle não tratado) uma indesejável alteração ou distúrbio fisiológico, ou para impedir, retardar ou reduzir a expansão ou gravidade de tal doença ou distúrbio. Resultados clínicos benéficos ou desejados incluem a, redução, diminuição ou alívio de sintomas que resultam de ou estão associados a doença ou distúrbio a ser tratado; diminuição da ocorrência de sintomas; melhoria da qualidade de vida; mais tempo livre do estado de doença (ou seja, diminuir a probabilidade ou a propensão que um sujeito apresente sintomas os quais são a base em que um diagnóstico de uma doença é feito); diminuição da extensão da doença; estabilização (ou seja, sem piora) do estado da doença; retardamento ou abrandamento da progressão da doença; melhoria ou paliação do estado de doença; e remissão (quer parcial, quer total), seja detectável ou não detectável; ou sobrevida global.

[0132] Tratamento pode significar também prolongar a sobrevida em comparação com a sobrevida esperada se o sujeito não receber tratamento. Os sujeitos em necessidade dos métodos e composições descritos neste documento incluem aqueles que já têm a doença ou distúrbio, bem como sujeitos

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95/115 propensos a ter ou em risco de desenvolver a doença ou distúrbio. Os sujeitos em necessidade de tratamento profilático incluem sujeitos nos quais a doença, condição ou distúrbio pretende-se prevenir (ou seja, diminuir a probabilidade de ocorrência ou de recorrência da doença ou distúrbio). 0 benefício clínico fornecido pelas composições (e preparações compreendendo as composições) e métodos descritos neste documento podem ser avaliados pelo design e execução de ensaios in vitro , estudos pré-clínicos e estudos clínicos em sujeitos para os quais a administração das composições se destina a se beneficiar, como descrito nos exemplos.

[0133] Em certas modalidades dos métodos atualmente divulgados, uma célula modificada é capaz de promover uma resposta de célula T específica de antígeno contra uma MAGEA1 de uma maneira restrita a HLA classe I. Em algumas modalidades, uma resposta restrita a HLA de classe I é associada ao transportador com processamento de antígeno (TAP) independente. Em algumas modalidades, uma resposta de célula T específica de antígeno promovida por uma célula modificada administrada de acordo com os métodos atualmente

divulgados	compreende pelo menos	uma	de	uma	resposta	de
linfócito	T auxiliar de CD4 +	(Th)	e	uma	resposta	de
linfócito	T citotóxico (CTL) de	CD8	+.	Em	modalidades

particulares, uma resposta de CTL desencadeada de acordo com

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96/115 os métodos divulgados instantaneamente é direcionada contra uma célula com expressão aberrante de MAGE-Al (por exemplo, uma célula de tumor MAGE-Al +). 0 nível de uma resposta imune de CTL pode ser determinado por qualguer um dos numerosos métodos imunológicos descritos neste documento e praticados rotineiramente na técnica. 0 nível de uma resposta imune de CTL pode ser determinado antes e após a administração de qualquer uma das proteínas de ligação específicas para MAGEAl descritas neste documento, expressas por, por exemplo, uma célula T. Os ensaios de citotoxicidade para determinar a atividade de CTL pode ser realizada utilizando qualquer uma de várias técnicas e métodos rotineiramente praticados na técnica (ver, por exemplo, Henkart et al., Cytotoxic TLymphocytes ín Fundamental Immunology, Paul (ed.) (2003 Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA) , páginas 1127-50, e referências citadas em tal documento).

[0134] As respostas das células T específicas ao antígeno são tipicamente determinadas por comparações das respostas das células T observadas de acordo com qualquer um dos parâmetros funcionais das células T descritas neste documento (por exemplo, proliferação, liberação de citocinas, atividade CTL, fenótipo de marcador de superfície celular alterado, etc.) que podem ser feita entre células T que são expostas a um antígeno cognato em um contexto apropriado (por exemplo, o antígeno usado para ativar as

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97/115 células T, quando apresentadas por células apresentadoras de antígenos imunocompatíveis) e células T desta população de origem que são expostas a um antígeno de controle estruturalmente distinto ou irrelevante. Uma resposta ao antígeno cognato que é maior, com significância estatística, do que a resposta ao antígeno de controle significa especificidade do antígeno.

[0135] Uma amostra biológica pode ser obtida de um sujeito para determinar a presença e o nível de uma resposta imune a um peptídeo de antígeno derivado de MAGE-A1, como descrito neste documento. Uma amostra biológica, tal como utilizada neste documento pode ser uma amostra de sangue (a partir da qual o soro ou plasma pode ser preparado) , espécime de biópsia, fluidos corporais (por exemplo, a lavagem pulmonar, ascite, as lavagens das mucosas, fluido sinovial), medula óssea, nódulos linfáticos, explante de tecido, cultura de órgãos, ou qualquer outra preparação de tecido ou célula a partir do sujeito ou uma fonte biológica. As amostras biológicas também podem ser obtidas do sujeito antes de receber qualquer composição imunogênica, amostra biológica útil como controle para estabelecer dados de linha de base (ou seja, pré-imunização).

[0136] As células modificadas desta divulgação são úteis, em certas modalidades, em terapias celulares adotivas. Por exemplo, em algumas modalidades, uma célula

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98/115 modificada é modificada (por exemplo, transduzida com um vetor de expressão recombinante ou polinucleotídeo da presente divulgação) ex vivo, e em seguida, administrada a um sujeito em necessidade deste. Em certas modalidades, célula modificada é uma célula alogênica, uma célula singeneica ou uma célula autóloga (ou seja, em relação ao sujeito administrado à célula modificada). Em qualquer um dos métodos atualmente divulgados, uma célula modificada compreende uma célula imune humana modificada selecionada de uma célula T CD4 +, uma célula T CD8 +, uma célula T dupla CD4- CD8- negativa, uma célula T γδ, uma célula assassina natural, uma célula dendrítica ou qualquer combinação destas. Em certas modalidades, uma célula modificada é uma célula T, por exemplo, é uma célula T não exposta, uma célula T de memória central, uma célula T de memória efetiva ou qualquer combinação destas.

[0137] Em modalidades particulares, uma célula modificada usada nos métodos atualmente divulgados é uma célula T CD4 +. Em algumas dessas modalidades, uma célula T CD4 + modificada compreende ainda um polinucleotídeo heterólogo que codifica pelo menos uma porção extracelular de um correceptor de CD8 e opcionalmente codifica uma cadeia a CD8 completa, uma cadeia β CD8 completa ou ambas. Tais métodos podem, em certas modalidades, compreender ainda a administração ao sujeito de uma célula T CD8 + que é capaz

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99/115 de se ligar especificamente a um complexo de peptídeo MAGEA1:HLA em uma superfície celular, como uma célula T modificada por CD8 + de acordo com a presente divulgação.

[0138] Os métodos de tratamento ou prevenção atualmente divulgados podem incluir qualquer método apropriado de administração ou dosagem de uma célula modificada ou uma terapia combinada. Por exemplo, em certas modalidades, uma pluralidade de doses de uma célula modificada descrita neste documento é administrada ao sujeito, que pode ser administrada em intervalos entre administrações de cerca de duas a cerca de quatro semanas. Além disso, os métodos de tratamento ou prevenção desta divulgação podem ser administrados a um sujeito como parte de um curso ou regime de tratamento, que pode compreender tratamentos adicionais antes ou depois da administração das doses, células ou composições unitárias divulgadas instantaneamente. Em outras modalidades, uma citocina é administrada sequencialmente, desde que o sujeito tenha sido administrado à célula hospedeira recombinante pelo menos três ou quatro vezes antes da administração de citocinas. Em certas modalidades, a citocina é administrada por via subcutânea (por exemplo, IL2, IL-15, IL-21). Em ainda outras modalidades, o sujeito a ser tratado recebe ainda terapia imunossupressora, como inibidores de calcineurina, corticosteroides, inibidores de microtúbulos, baixa dose de uma pró-droga de ácido

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100/115 micofenólico ou qualquer combinação destes. Em ainda outras modalidades, o sujeito a ser tratado recebeu um transplante de células hematopoiéticas não mieloablativas ou mieloablativas, em que o tratamento pode ser administrado pelo menos dois a pelo menos três meses após o transplante de células hematopoiéticas não mieloablativas. Em algumas modalidades, o sujeito foi administrado um ou mais de um agente de hipometilação do DNA e um inibidor de HDAC, um ou ambos os quais podem melhorar a expressão de MAGE-A1 (ver Weon, JL e PR Potts, Curr Opin Cell Biol, 2015. 37:p. 1-8) e assim melhorar uma terapia celular adotiva direcionando MAGE-A1.

[0139] Os métodos de acordo com a presente divulgação podem, em certas modalidades, incluir ainda a administração de um ou mais agentes adicionais para tratar a doença ou distúrbio em uma terapia combinada. Por exemplo, em certas modalidades, uma terapia de combinação compreende administrar uma célula modificada com (simultaneamente ou sequencialmente) um inibidor de checkpoint imune. Em algumas modalidades, uma terapia de combinação compreende administrar uma célula modificada com um agonista de um agente de checkpoint imune estimulador. Em outras modalidades, uma terapia de combinação compreende administrar uma célula modificada com uma terapia secundária, como agente quimioterapêutico, uma terapia de

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101/115 radiação, uma cirurgia, um anticorpo ou qualquer combinação destes.

[0140] Como utilizado neste documento, o termo agente de supressão imune ou agente de imunossupressão referese a uma ou mais células, proteínas, moléculas, compostos ou complexos que fornecem sinais inibitórios para auxiliar no controle ou suprimir uma resposta imune. Por exemplo, agentes de supressão imune incluem aquelas moléculas que bloqueiam parcial ou totalmente a estimulação imune; diminuir, prevenir ou atrasar a ativação imune; ou aumentar, ativar ou regular a supressão imunológica. Agentes de imunossupressão exemplificativos a serem direcionados (por exemplo, com um inibidor de checkpoint imune) incluem PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG3, CTLA4, B7-H3, B7-H4, CD244/2B4, HVEM, BTLA, CD160, TIM3, GAL9, KIR, PVR1G (CD112R), PVRL2, adenosina, A2aR, citocinas imunossupressoras (por exemplo, IL-10, IL-4, IL1RA, IL-35), IDO, arginase, VISTA, TIGIT, LAIR1, CEACAM- 1, células CEACAM-3, CEACAM-5, Treg ou qualquer combinação destas.

[0141] Um inibidor do agente de supressão imune (também conhecido como inibidor do checkpoint imune) pode ser um composto, um anticorpo, um fragmento de anticorpo ou polipeptídeo de fusão (por exemplo, fusão Fc, como CTLA4-Fc ou LAG3-Fc), uma molécula antisense, uma molécula de ribozima ou RNAi, ou uma molécula orgânica de baixo peso molecular.

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102/115

Em qualquer uma das modalidades divulgadas neste documento, um método pode compreender uma célula modificada com um ou mais inibidores de qualquer um dos seguintes componentes de supressão imune, isoladamente ou em qualquer combinação.

[0142] Em certas modalidades, uma célula modificada é usada em combinação com um inibidor de PD-1, por exemplo, um anticorpo específico para PD-1 ou fragmento de ligação deste, como pidilizumabe, nivolumabe, pembrolizumabe, MEDI0680 (anteriormente AMP-514), AMP -224, BMS-936558 ou qualquer combinação destes. Em outras modalidades, uma célula modificada da presente divulgação é usada em combinação com um anticorpo específico para PD-L1 ou fragmento de ligação deste, como BMS-936559, durvalumabe (MEDI4736), atezolizumabe (RG7446), avelumabe (MSB0010718C), MPDL3280A, ou qualquer combinação destes.

[0143] Em certas modalidades, uma célula modificada da presente divulgação é usada em combinação com um inibidor de LAG3, como LAG525, IMP321, IMP701, 9H12, BMS-986016 ou qualquer combinação destes.

[0144] Em certas modalidades, uma célula modificada é usada em combinação com um inibidor de CTLA4. Em modalidades particulares, uma célula modificada é usada em combinação com um anticorpo específico para CTLA4 ou fragmento de ligação deste, como ipilimumabe, tremelimumabe, proteínas de

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103/115 fusão CTLA4-Ig (por exemplo, abatacept, belatacept) ou qualquer combinação destes.

[0145] Em certas modalidades, uma célula modificada é usada em combinação com um anticorpo especifico de B7-H3 ou fragmento de ligação deste, como o enoblituzumabe (MGA271),

376,96 ou ambos. Um fragmento de ligação ao anticorpo B7-H4 pode ser um scFv ou uma proteína de fusão deste, como descrito em, por exemplo, Dangaj et al. , Cancer Res. 73:4820, 2013, bem como os descritos na Patente US n° 9.574.000 e nas Publicações de Patentes PCT n° WO /201640724A1 e WO 2013/025779A1.

[0146] Em certas modalidades, uma célula modificada é usada em combinação com um inibidor de CD244.

[0147] Em certas modalidades, uma célula modificada é usada em combinação com um inibidor de BLTA, HVEM, CD160 ou qualquer combinação destes. Os anticorpos anti-CD-160 são descritos, por exemplo, na Publicação PCT n° WO 2010/084158.

	[0148] Em certas	modalidades, uma	célula	modificada	é
usada	em combinação com um inibidor de	TIM3 .
	[0149] Em certas	modalidades, uma	célula	modificada	é
usada	em combinação com um inibidor de	Gal9.
	[0150] Em certas	modalidades, uma	célula	modificada	é
usada	em combinação	com um inibidor	da sinalização	de

adenosina, como um receptor de adenosina isca.

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104/115 [0151] Em certas modalidades, uma célula modificada é usada em combinação com um inibidor de A2aR.

[0152] Em certas modalidades, uma célula modificada é usada em combinação com um inibidor de KIR, como o lirilumabe (BMS-986015) .

[0153] Em certas modalidades, uma célula modificada é usada em combinação com um inibidor de uma citocina inibidora (tipicamente, uma citocina diferente de TGFp) ou desenvolvimento ou atividade de Treg.

[0154] Em certas modalidades, uma célula modificada é usada em combinação com um inibidor de IDO, como levo-1metil triptofano, epacadostat (INCB024360; Liu et al., Blood 115:3520-30, 2010), ebselen (Terentis et al., Blochem. 49:591-600, 2010), indoximod, NLG919 (Mautino et al. , American Association for Cancer Research 104^a Reunião Anual 2013; 6-10 de abril de 2013), 1-metil-triptofano (1-MT)tira-pazamina ou qualquer combinação destes.

[0155] Em certas modalidades, uma célula modificada é usada em combinação com um inibidor de arginase, como éster metilico da N(ômega)-Nitro-L-arginina (L-NAME), N-ômegahidroxi-nor-l-arginina (nor-NOHA), L-NOHA, ácido 2(S)-amino-

6-borono-hexanoico (ABH), S-(2-boronoetil)-L-cisteína (BEC) ou qualquer combinação destes.

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105/115 [0156] Em certas modalidades, uma célula modificada é usada em combinação com um inibidor de VISTA, como CA-17 0 (Curls, Lexington, Mass.).

[0157] Em certas modalidades, uma célula modificada é usada em combinação com um inibidor de TIGIT, como, por exemplo, COM902 (Compugen, Toronto, Ontário Canadá), um inibidor de CD155, como, por exemplo, COM701 (Compugen) ou ambos.

[0158] Em certas modalidades, uma célula modificada é usada em combinação com um inibidor de PVRIG, PVRL2 ou ambos. Os anticorpos anti-PVRIG são descritos, por exemplo, na Publicação PCT n° WO 2016/134333. Os anticorpos anti-PVRL2 são descritos, por exemplo, na Publicação PCT n° WO 2017/021526.

[0159] Em certas modalidades, uma célula modificada é usada em combinação com um inibidor de LAIR1.

[0160] Em certas modalidades, uma célula modificada é usada em combinação com um inibidor de CEACAM-1, CEACAM-3, CEACAM-5 ou qualquer combinação destes.

[0161] Em certas modalidades, uma célula modificada é usada em combinação com um agente que aumenta a atividade (ou seja, um agonista) de uma molécula de checkpoint imune estimulante. Por exemplo, uma célula modificada pode ser usada em combinação com um agonista de CD137 (4-1BB) (como, por exemplo, urelumabe), um agonista de CD134 (OX-40) (como,

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106/115 por exemplo, MEDI6469, MEDI6383 ou MEDI0562), lenalidomida, pomalidomida, um agonista de CD27 (como, por exemplo, CDX1127), um agonista de CD28 (como, por exemplo, TGN1412, CD80 ou CD86), um agonista de CD40 (como, por exemplo, CP-870.893, rhuCD40L ou SGN-40), um agonista de CD122 (como, por exemplo, IL-2) um agonista de GITR (como, por exemplo, anticorpos monoclonais humanizados descritos na Publicação de Patente PCT n° WO 2 016/054 638), um agonista de IGOS (CD278) (como, por exemplo, GSK3359609, mAb 88.2, JTX-2011, Icos 145-1, Icos 314-8 ou qualquer combinação destes). Em qualquer uma das modalidades divulgadas neste documento, um método pode compreender a administração de uma célula modificada com um ou mais agonistas de uma molécula de checkpoint imune estimulante, incluindo qualquer um dos anteriores, isoladamente ou em qualquer combinação.

[0162] Em certas modalidades, uma terapia de combinação compreende uma célula modificada e uma terapia secundária que compreende um ou mais dentre: um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste que é específico para um antígeno do câncer expresso pelo tumor sólido não inflamado, um tratamento de radiação, um cirurgia, um agente quimioterapêutico, uma citocina, RNAi ou qualquer combinação destes.

[0163] Em certas modalidades, um método de terapia de combinação compreende administrar uma célula modificada e

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107/115 administrar ainda um tratamento de radiação ou uma cirurgia. A terapia de radiação é bem conhecida na técnica e inclui terapias de raios X, como irradiação gama e terapias radiofarmacêuticas. As cirurgias e técnicas cirúrgicas apropriadas para o tratamento de um determinado câncer em um sujeito são bem conhecidas dos versados na técnica.

[0164] Em certas modalidades, um método de terapia de combinação compreende a administração de uma célula modificada e a administração adicional de um agente quimioterapêutico. Um agente quimioterapêutico inclui, mas não está limitado a, um inibidor da função da cromatina, um inibidor da topoisomerase, uma droga inibidor de microtúbulos, um agente prejudicial ao DNA, um antimetabólito (como antagonistas do folato, análogos da pirimidina, análogos da purina e análogos modificados pelo açúcar), um inibidor de síntese de DNA, um agente interativo de DNA (como um agente intercalante) e um inibidor de reparo de DNA. Os agentes quimioterapêuticos ilustrativos incluem, sem limitação, os seguintes grupos: agentes antimetabólitos/anticâncer, como análogos de pirimidina (5fluorouracil, floxuridina, capecitabina, gemcitabina e citarabina) e análogos de purina, antagonistas de folato e inibidores relacionados (mercaptopurina, tioguanina, pentostatina e 2-clorodesoxiadenosina (cladribina)); agentes antiproliferativos/antimitóticos, incluindo produtos

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108/115 naturais, como alcalóides da vinca (vinblastina, vincristina e vinorelbina), disruptores de microtúbulos, como taxano (paclitaxel, docetaxel), vincristina, vinblastina, nocodazol, epotilonas e navelbina, epidipodofilotoxinas (etoposideo, teniposideo), agentes prejudiciais ao DNA (actinomicina, amsacrina, antraciclina, bleomicina, bussulfano, camptotecina, carboplatina, clorambucil, cisplatina, ciclofosfamida, Citoxan, dactinomicina, daunorrubicina, epirrubicina, hexametilmelamineoxaliplatina, ifosfamida, melfalan, mercloretamina, mitomicina, mitoxantrona, nitrosoureia, plicamcina, procarbazina, taxol, taxotere, temozolamida, teniposideo, trietilenotiofosfaramida e etoposideo (VP 16)); antibióticos como dactinomicina (actinomicina D) , daunorrubicina, doxorrubicina (adriamicina), idarubicina, antraciclinas, mitoxantrona, bleomicinas, plicamicina (mitramicina) e mitomicina; enzimas (L-asparaginase que metaboliza sistematicamente L-asparagina e priva células que não têm capacidade para sintetizar sua própria asparagina); agentes antiplaquetários; agentes alquilantes antiproliferativos/antimitóticos, como mostardas de nitrogênio (mecloretamina, ciclofosfamida e análogos, melfalano, clorambucil), etileniminas e metilmelaminas (hexametilmelamina e tiotepa), sulfonatos de alquilbussulfano, nitrosoureias (carmustina (BCNU) e análogos,

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109/115 estreptozocina), trazenos-dacarbazinina (DTIC); antimetabólitos antiproliferativos/antimitóticos, tais como análogos do ácido fólico (metotrexato); complexos de coordenação de platina (cisplatina, carboplatina), procarbazina, hidroxiureia, mitotano, aminoglutotimida; hormônios, análogos da hormônio (estrogênio, tamoxifeno, goserelina, bicalutamida, nilutamida) e inibidores da aromatase (letrozol, anastrozol); anticoagulantes (heparina, sais sintéticos de heparina e outros inibidores de trombina); agentes fibrinolíticos (como ativador do plasminogênio tecidual, estreptoquinase e uroquinase), aspirina, dipiridamol, ticlopidina, clopidogrel, abciximabe; agentes antimigratórios; agentes antissecretores (breveldina); imunossupressores (ciclosporina, tacrolimus (FK-506), sirolimus (rapamicina), azatioprina, micofenolato de mofetil); compostos antiangiogênicos (TNP470, genisteína) e inibidores do fator de crescimento (inibidores do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), inibidores do fator de crescimento de fibroblastos (FGF)); bloqueador do receptor da angiotensina; doadores de óxido nítrico; oligonucleotideos antisense; anticorpos (trastuzumabe, rituximabe); receptores quiméricos de antígeno; inibidores do ciclo celular e indutores de diferenciação (tretinoína); inibidores da mTOR, inibidores da topoisomerase (doxorrubicina (adriamicina), amsacrina, camptotecina,

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110/115 daunorrubicina, dactinomicina, eniposideo, epirrubicina, etoposideo, idarrubicina, irinotecano (CPT-11) e mitoxantrona, topotecano, irinotecano); corticosteroides (cortisona, dexamtasona, hidrocortisona, metilpednisolona, prednisona e prenisolona); inibidores da transdução de sinal de quinase do fator de crescimento; indutores de disfunção mitocondrial, toxinas como toxina de cólera, ricina, exotoxina de Pseudomonas, toxina de adenilato ciclase de Bordetella pertussis ou toxina de difteria e ativadores de caspase; e desreguladores de cromatina.

[0165] As citocinas são cada vez mais usadas para manipular a resposta imune do hospedeiro à atividade anticâncer. Ver, por exemplo, Floros & Tarhini, Semin. Oncol. 42(4) :539-548, 2015. As citocinas úteis para promover a resposta imune ao câncer ou antitumoral incluem, por exemplo, IFN-α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-21, IL-24 e GM-CSF, isoladamente ou em qualquer combinação com uma célula modificada desta divulgação.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1

GERAÇÃO DE TCRS DE ALTA AFINIDADE ESPECÍFICOS PARA EPÍTOPOS DE CÂNCER [0166] A geração de TCRs de alta afinidade para uso em terapias celulares adotivas é difícil devido à seleção

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111/115 tímica, em que os TCRs com alta afinidade por autoantígenos (por exemplo, MARTI e MAGE-Al) são removidos e, portanto, relativamente raros em comparação aos TCRs especifico para antígenos estranhos (ver, por exemplo, Figuras IA e 1B) . Como mostrado nas Figuras 2A e 2B, um novo processo de triagem e enriquecimento foi desenvolvido para identificar TCRs de alta afinidade específicos para MAGE-Al. Resumidamente, as células T CD8 + de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de 12 doadores saudáveis foram estimuladas uma vez com DCs autólogas pulsadas por peptídeo e duas vezes com PBMCs autólogas pulsadas por peptídeo, na presença de IL-2, IL-7, IL-15 e IL-21, para obter linhas de células T CD8 + policlonais específicas de MAGE-Al. As linhas celulares estimuladas de todos os doadores foram reunidas e classificadas várias vezes usando concentrações limitadas do peptídeo MAGE-Al:muitímeros MHC, que produziram populações enriquecidas de clones de células T de alta afinidade. Os genes de TCRp das populações foram sequenciados com a frequência de TCRs em tipos de pMHC combinados e individuais.

[0167] A Figura 3 mostra dados exemplificativos de uma série de tipos de pMHC que enriqueceram para células T que expressam TCRp CDR3 específico para o antígeno MAGE-Al. Os clones de alta afinidade identificados a partir do pool ligaram-se fortemente a MAGE-Al:MHC, correlacionando-se com ECso inferior (Figuras 4A, 4B).

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EXEMPLO 2

FUNCIONALIDADE IN VITRO DE TCR ESPECÍFICO DE MAGE-Al [0168] Um clone de células T CD8⁺ específico para MAGEAl de alta afinidade MA2 gerado usando o método do Exemplo 1 (Figura 5A) foi selecionado para testes adicionais. Como mostrado na Figura 5B, as células MA2⁺ CD8⁺ T produziram citocinas seletivamente quando co-cultivadas com múltiplas células de mieloma HAL-A*0201⁺ U266 que expressam MAGE-Al (proporção de efetor para alvo (E:T) de 10:1, 4 horas) . Em um padrão de 4 horas ensaio de liberação de Cr⁵¹, células T MA2⁺ foram capazes de matar células alvo na presença ou ausência de peptídeo exógeno de ΙΕΝ-γ e MAGE-Al (Figura 5C).

EXEMPLO 3

TCR CD8 ESPECÍFICO PARA MAGE-Al LIGA O TETRÂMERO INDEPENDENTE DO CD8 [0169] TCRs CD8⁺ reconhecem antígenos apresentados pelas moléculas de HLA da classe I, enquanto os TCRs CD4⁺reconhecem os antígenos apresentados no contexto do HLA de classe II. Para testar se o TCR MA2 de alta afinidade podería se ligar a MAGE-Al:HLA I independente de CD8, as células T CD4⁺ foram transduzidas com o TCR MA2 (ver, por exemplo, diagramas esquemáticos das Figuras 6A e 6B) . Como mostrado nas Figuras 7A e 7B, as células T CD4⁺ transduzidas com tetrâmeros MAGE-Al:HLA ligados a TCR MA2 com uma afinidade comparável (diferença de aproximadamente 5 vezes em B_max) às

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113/115 células T CD8 + MA2 . No entanto, como mostrado na Figura 7C, as células T CD4⁺ transformadas não mataram as células alvo in vitro.

EXEMPLO 4

TESTE FUNCIONAL DE UMA CÉLULA T CD4⁺ MANIPULADA QUE EXPRESSA UM CORRECEPTOR CD8 E TCR CD8 ESPECÍFICO DE MAGE-Al [0170] Em seguida, foi investigada a capacidade de um correceptor CD8⁺ de melhorar a funcionalidade de células T CD4⁺ que expressam CD8-TCR de alta afinidade (ver, por exemplo, Figura 6A) . Como ilustrado no diagrama da Figura 8A, as células T CD4⁺ foram transduzidas com um TCR especifico de MAGE-Al de alta afinidade e restrito à Classe I e com um correceptor de CD8. A Figura 8B mostra que uma proporção maior de células T CD4⁺ transduzidas com o TCR CD8 exógeno e o CD8 correceptor produziram citocinas em resposta ao antígeno, em comparação com as células T CD4⁺ transduzidas apenas com o TCR CD8 exógeno. A Figura 8C mostra que as células T CD4⁺ duplamente transduzidas exibiram surpreendentemente atividade citolítica contra células alvo MEL526, a taxas comparáveis às células T CD8⁺ que expressam o mesmo TCR de alta afinidade. Como mostrado na Figura 8D, as células T CD4⁺ transduzidas duplamente também proliferaram de maneira mais robusta após a estimulação com antígeno do que as células MA2⁺ CD4⁺ sem CD8.

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114/115 [0171] Estes dados mostram que os TCRs específicos de MAGE-Al de alta afinidade da presente divulgação e as células T CD8⁺ e CD4⁺ que expressam este são úteis para direcionar e matar células cancerígenas que expressam MAGE-Al e têm uso em imunoterapias celulares contra doenças que expressam MAGE-Al.

[0172] As várias modalidades descritas acima podem ser combinadas para fornecer modalidades adicionais. Todas as Patentes US, Publicações de Pedido de Patente US, Pedidos de Patente US, patentes estrangeiras, pedidos de patente estrangeiros e publicações não-patentes referidas neste relatório descritivo e/ou listados na Folha de Dados do Pedido, incluindo Pedido de Patente Provisória US n° 62/471.956, depositado em 15 de março de 2017, são incorporados neste documento por referência em sua totalidade. Os aspectos das modalidades podem ser modificados, se necessário, para empregar conceitos das várias patentes, pedidos e publicações para fornecer modalidades adicionais.

[0173] Essas e outras alterações podem ser feitas nas modalidades à luz da descrição detalhada acima. Em geral, nas seguintes reivindicações, os termos usados não devem ser interpretados como limitantes das reivindicações às modalidades específicas divulgadas no relatório descritivo e nas reivindicações, mas devem ser interpretados como

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115/115 incluindo todas as modalidades possíveis juntamente com o escopo completo dos equivalentes para os quais tais reivindicações são direcionadas. Nesse sentido, as reivindicações não são limitadas pela divulgação.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Célula modificada caracterizada pelo fato de que compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma proteína de ligação, em que a proteína de ligação codificada compreende:

(a) um domínio variável de cadeia α (ν_α) do receptor de células T (TCR) com uma sequência de aminoácidos de CDR3 de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS.:26, 32, 38, 44, 50 ou 51 e um domínio variável de cadeia β (Vp) de TCR;

(b) um domínio Vp tendo uma sequência de aminoácidos de CDR3 de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS.: 23, 29, 35, 41 ou 47 e um domínio ν_α; ou (c) um domínio V_a tendo uma sequência de aminoácidos de CDR3 de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 26, 32,

38, 44, 50 ou 51 e um domínio Vp tendo uma sequência de aminoácidos de CDR3 de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS.: 23, 29 , 35, 41 ou 47; e

em que a proteína de ligação é capaz de se ligar especificamente a um complexo de peptídeo MAGE-A1:HLA em uma superfície celular independente de CD8 ou na ausência de CD8.
2. Célula modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação codificada é capaz de se ligar especificamente a um complexo de KVLEYVIKV (SEQ ID NO.123):antígeno leucocitário

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2/28 humano (HLA) com um Kd menor ou igual a cerca de 10^-8 Μ.
3. Célula modificada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o domínio Vp de (a) é derivado de um alelo TRBV30, um alelo TRBV29 ou um alelo TRBV9.
4. Célula modificada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o domínio V_a de (b) é derivado de um alelo TRAV38-1, um alelo TRAV34, um alelo TRAV16 ou um alelo TRAV5.
5. Célula modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o domínio V_a codificado compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 90% idêntica a uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS.:3, 7, 11, 15 e 19, e o domínio Vp codificado compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 90% idêntica à sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS.: 1, 5, 9, 13, 17, desde que (a) pelo menos três ou quatro das CDRs não tenham alteração na sequência, em que as CDRs que têm mudanças na sequência tenham apenas até duas substituições de aminoácidos, até uma deleção de cinco aminoácidos contíguos ou uma combinação destas, e (b) a proteína de ligação codificada permaneça capaz de se ligar especificamente a um complexo de superfície celular do peptídeo MAGE-A1:HLA

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3/28 independente, ou na ausência, de CD8.
6. Célula modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que:

(a) o domínio V_a codificado compreende (i) uma sequência de aminoácidos de CDR1 de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 24, 30, 36, 42 e 48 e/ou (ii) uma sequência de aminoácidos de CDR2 de acordo com qualquer uma das SEQ

ID NOS: 25, 31, 37, 43 e 49; e/ou (b) o domínio Vp codificado compreende (iii) uma sequência de aminoácidos de CDR1 de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 21, : 27, 33, 39 e 45, e/ou (iv) uma sequência de aminoácidos de CDR2 de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 22, 28, 34, 40 e 46.
7. Célula modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação codificada compreende:

(a) sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2, CDR3 de ν_α de acordo com as SEQ ID NOS: 24-26, respectivamente, e sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 de Vp de acordo com a SEQ ID NOS: 21-23, respectivamente;

(b) sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 de Va de acordo com as SEQ ID NOS: 30-32, respectivamente, e sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 de Vp de acordo com as SEQ ID NOS: 27-29, respectivamente;

(c) sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2, CDR3 de

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4/28 ν_α de acordo com as SEQ ID NOS: 36-38, respectivamente, e sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 de Vp de acordo com a SEQ ID NOS: 33-35, respectivamente;

(d) sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 de ν_α de acordo com as SEQ ID NOS: 42-44, respectivamente, e sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 de Vp de acordo com as SEQ ID NOS: 39-41, respectivamente; ou (e) sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2, CDR3 de ν_α de acordo com as SEQ ID NOS: 48-50, respectivamente, e sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 de Vp de acordo com a SEQ ID NOS: 45-47, respectivamente.
8. Célula modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação codificada se liga especificamente a um complexo de KVLEYVIKV (SEQ ID NO: 123):HLA-A*201.
9. Célula modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o domínio V_a codificado compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO.: 3, 7, 11, 15 ou 19.
10. Célula modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que o domínio Vp codificado compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO.: 1, 5, 9, 13 ou 17.

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5/28
11. Célula modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um polinucleotideo heterólogo que codifica um domínio constante de cadeia α (Ca) de TCR com pelo menos 90% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO.: 4, 8, 12, 16 ou 20 .
12. Célula modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um polinucleotideo heterólogo que codifica um domínio constante de cadeia β (Cp) de TCR compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO.: 2, 6, 10, 14 ou 18.
13. Célula modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação codificada compreende um domínio V« compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO.: 3, um domínio Vp compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO.: 1, um domínio C_a compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO.: 4 e um domínio Cp compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO.: 2 .
14. Célula modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação codificada compreende um domínio V«

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6/28 compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO.: 7, um domínio Vp compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO.: 5, um domínio C_a compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO.: 8 e um Cp compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO.: 6.
15. Célula modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação codificada compreende um domínio V_acompreendendo ou consistindo na SEQ ID NO.: 11, um domínio Vp compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO.: 9, um domínio C_a compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO.: 12 e um domínio Cp compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO.: 10 .
16. Célula modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação codificada compreende um domínio V_acompreendendo ou consistindo na SEQ ID NO.: 15, um domínio Vp compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO.: 13, um C_acompreendendo ou consistindo na SEQ ID NO.: 16 e um domínio Cp compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO.: 14.
17. Célula modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação codificada compreende um domínio V_acompreendendo ou consistindo na SEQ ID NO.: 19, um domínio Vp compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO.: 17, um domínio C_a compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO.: 20 e

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7/28 um domínio Cp compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO.: 18 .
18. Célula modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação é um receptor de células T (TCR), um fragmento de ligação ao antígeno de um TCR ou um receptor de antígeno quimérico.
19. Célula modificada, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o TCR, o receptor de antígeno quimérico ou o fragmento de ligação ao antígeno do TCR é quimérico, humanizado ou humano.
20. Célula modificada, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizada pelo fato de que o fragmento de ligação ao antígeno do TCR compreende um TCR de cadeia simples (scTCR).
21. Célula modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação é um receptor de antígeno quimérico, opcionalmente, um TCR-CAR.
22. Célula modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação é um TCR.
23. Célula modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizada pelo fato de que a célula modificada é uma célula imunológica humana.

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8/28
24. Célula modificada, de acordo com a reivindicação

23, caracterizada pelo fato de que a célula imunológica é uma célula T, uma célula NK ou uma célula NK-T.
25. Célula modificada, de acordo com a reivindicação

24, caracterizada pelo fato de que a célula imunológica é uma célula T CD4+, uma célula T CD8+, ou ambas.
26. Célula modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 25, caracterizada pelo fato de que a célula modificada compreende um nocaute gênico cromossômico de um gene PD-1; um gene LAG3; um gene TIM3; um gene CTLA4; um gene do componente de HLA; um gene do componente do TCR, ou qualquer combinação destes.
27. Célula modificada, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que o nocaute gênico cromossômico compreende um nocaute de um gene do componente de HLA selecionado dentre um gene da macroglobulina al, um gene da macroglobulina a2, um gene da macroglobulina a3, um gene da microglobulina βΐ ou um gene da microglobulina β2.
28. Célula modificada, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que o nocaute gênico cromossômico compreende um nocaute de um gene do componente do TCR selecionado dentre um gene de região variável α de TCR, um gene de região variável β de TCR, um gene de região constante de TCR ou uma combinação destes.
29. Célula modificada, de acordo com qualquer uma das

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9/28 reivindicações 25 a 28, caracterizada pelo fato de que a célula modificada é uma célula T CD4+ e compreende adicionalmente um polinucleotídeo heterólogo que codifica pelo menos uma porção extracelular de um correceptor de CD8 .
30. Célula modificada, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo que codifica a proteína de ligação e/ou o polinucleotídeo que codifica pelo menos uma porção extracelular de um correceptor de CD8 têm códons otimizados para expressão pela célula modificada.
31. Composição caracterizada pelo fato de que compreende uma célula modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, e um carreador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
32. Dose unitária caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz de (i) célula modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, ou (ii) uma composição de acordo com a reivindicação 31.
33. Dose unitária, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos cerca de 30% de células T CD4+ modificadas, combinada com (ii) uma composição compreendendo pelo menos cerca de 30% de células T CD8+ modificadas, em uma razão de cerca de 1:1.
34. Dose unitária, de acordo com a reivindicação 33,

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10/28 caracterizada pelo fato de que a dose unitária não contém substancialmente células T não expostas.
35. Polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína de ligação tendo um domínio V_a de TCR e um domínio Vp de TCR, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação codificada é capaz de se ligar especificamente a um complexo de peptídeo MAGE-Al:HLA em uma superfície celular independente de CD8 ou na ausência de CD8, o polinucleotídeo isolado compreendendo:

(a) um polinucleotídeo que codifica ν_α CDR3 de acordo com a SEQ ID NO: 97,103, polinucleotídeo que codifica Vp;

(b) um polinucleotídeo que com a SEQ ID NO: 94,100, polinucleotídeo que codifica V«;

(c) um polinucleotídeo que com a SEQ ID NO: 97,103, polinucleotídeo NO:94, 100, 106,

109, 115 ou 121 e um codifica Vp CDR3 de acordo

106, 112, ou 118 e um ou codifica Va CDR3 de acordo

109, 115 ou 121 e um com a SEQ ID que codifica Vp CDR3 de acordo

112 ou 118.
36. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo que codifica Vp de (a) é derivado de um alelo TRBV30, um alelo TRBV29 ou um alelo TRBV9.
37. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o

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11/28 polinucleotídeo que codifica ν_α de (b) é derivado de um alelo TRAV38-1, um alelo TRAV34, um alelo TRAV16 ou um alelo TRAV5.
38. Polinucleotídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 37, caracterizado pelo fato de que compreende:

(a) um polinucleotídeo que codifica de V_a CDR3 de acordo com a SEQ ID NO: 97 e um polinucleotídeo que codifica de Vp CDR3 de acordo com a SEQ ID NO: 94;

(b) um polinucleotídeo que codifica de V_a CDR3 de acordo com a SEQ ID NO: 103 e um polinucleotídeo que codifica de Vp CDR3 de acordo com a SEQ ID NO: 100;

(c) um polinucleotídeo que codifica V_a CDR3 de acordo com a SEQ ID NO: 109 e um polinucleotídeo que codifica Vp CDR3 de acordo com a SEQ ID NO: 106;

(d) um polinucleotídeo codificador de V_a CDR3 de acordo com a SEQ ID NO: 115 e um polinucleotídeo codificador de Vp CDR3 de acordo com a SEQ ID NO: 112; ou (e) um polinucleotídeo que codifica de V_a CDR3 de acordo com a SEQ ID NO: 121 e um polinucleotídeo que codifica de Vp CDR3 de acordo com a SEQ ID NO: 118.
39. Polinucleotídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 38, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente:

(a) um polinucleotídeo que codifica V_a CDR1 de acordo

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12/28 com a SEQ ID NO: 95, 101, 107, 113 ou 119;

(b) um polinucleotídeo que codifica V« CDR2 de acordo com a SEQ ID NO: 96, 102, 108, 114 ou 120;

(c) um polinucleotídeo que codifica Vp CDR1 de acordo com a SEQ ID NO: 92, 98, 104, 110 ou 116; e/ou (d) um polinucleotídeo que codifica Vp CDR2 de acordo com a SEQ ID NO: 93, 99, 105, 111 ou 117.
40. Polinucleotídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 39, caracterizado pelo fato de que compreende:

(a) um polinucleotídeo que codifica V_a CDR1 de acordo com a SEQ ID NO: 95, um polinucleotídeo que codifica V_aCDR2 de acordo com a SEQ ID NO: 96, um polinucleotídeo que codifica ν_α CDR3 de acordo com a SEQ ID NO: 97, um polinucleotídeo que codifica Vp CDR1 de acordo com a SEQ ID NO:92, um polinucleotídeo que codifica Vp CDR2 de acordo com a SEQ ID NO: 93 e um polinucleotídeo que codifica Vp CDR3 de acordo com a SEQ ID NO: 94;

(b) um polinucleotídeo que codifica V« CDR1 de acordo com a SEQ ID NO: 101, um polinucleotídeo que codifica V« CDR2 de acordo com a SEQ ID NO: 102, um polinucleotídeo que codifica V« CDR3 de acordo com a SEQ ID NO: 103, um polinucleotídeo que codifica Vp CDR1 de acordo com a SEQ ID NO: 98, um polinucleotídeo que codifica Vp CDR2 de acordo com a SEQ ID NO: 99 e um polinucleotídeo que codifica Vp

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13/28

CDR3 de acordo com a SEQ ID NO: 100;

(c) um polinucleotídeo que codifica ν_α CDR1 de acordo com a SEQ ID NO: 107, um polinucleotídeo que codifica ν_αCDR2 de acordo com a SEQ ID NO: 108, um polinucleotídeo que codifica ν_α CDR3 de acordo com a SEQ ID NO: 109, um polinucleotídeo que codifica Vp CDR1 de acordo com a SEQ ID NO: 104, um polinucleotídeo que codifica Vp CDR2 de acordo com a SEQ ID NO: 105 e um polinucleotídeo que codifica Vp CDR3 de acordo com a SEQ ID NO: 106;

(d) um polinucleotídeo que codifica ν_α CDR1 de acordo com a SEQ ID NO: 113, um polinucleotídeo que codifica ν_αCDR2 de acordo com a SEQ ID NO: 114, um polinucleotídeo que codifica ν_α CDR3 de acordo com a SEQ ID NO: 115, um polinucleotídeo que codifica Vp CDR1 de acordo com a SEQ ID NO:110, um polinucleotídeo que codifica Vp CDR2 de acordo com a SEQ ID NO: 111 e um polinucleotídeo que codifica Vp CDR3 de acordo com a SEQ ID NO: 112; ou (e) um polinucleotídeo que codifica ν_α CDR1 de acordo com a SEQ ID NO: 119, um polinucleotídeo que codifica ν_αCDR2 de acordo com a SEQ ID NO: 120, um polinucleotídeo que codifica ν_α CDR3 de acordo com a SEQ ID NO: 121, um polinucleotídeo que codifica Vp CDR1 de acordo com a SEQ ID NO: 116, um polinucleotídeo que codifica Vp CDR2 de acordo com a SEQ ID NO: 117 e um polinucleotídeo que codifica Vp CDR3 de acordo com a SEQ ID NO: 118.

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14/28
41. Polinucleotídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 40, caracterizado pelo fato de

que o polinucleotídeo que codifica v_a compreende uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO : 58, 66, 74, 82 ou 90, e o

polinucleotídeo que codifica Vp compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 56, 64, 72, 80 ou 88.
42. Polinucleotídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 41, caracterizado pelo fato de que:

(a) o polinucleotídeo que codifica ν_α compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 58 e o polinucleotídeo que codifica Vp compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 56;

(b) o polinucleotídeo que codifica V_a compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 66 e o polinucleotídeo que codifica Vp compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 64;

(c) o polinucleotídeo que codifica ν_α compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 74 e o polinucleotídeo que codifica Vp compreende uma sequência de nucleotídeos tendo

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15/28 pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 72;

(d) o polinucleotídeo que codifica V_a compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 82 e o polinucleotídeo que codifica Vp compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 80; ou (e) o polinucleotídeo que codifica ν_α compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 90 e o polinucleotídeo que codifica Vp compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 88.
43. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que:

(a) o polinucleotídeo que codifica ν_α compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 58 e um polinucleotídeo que codifica Vp compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 56;

(b) o polinucleotídeo que codifica ν_α compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 66 e o polinucleotídeo que codifica Vp compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 64;

(c) o polinucleotídeo que codifica ν_α compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos de acordo com a

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16/28

SEQ ID NO: 74 e o polinucleotídeo que codifica Vp compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 72;

(d) o polinucleotídeo que codifica ν_α compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 82 e um polinucleotídeo que codifica Vp compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 80; ou (e) o polinucleotídeo que codifica ν_α compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 90 e o polinucleotídeo que codifica Vp compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 88.
44. Polinucleotídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 43, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente:

(a) um polinucleotídeo que codifica o domínio C_a tendo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 59, 67, 75, 83 ou 91; e/ou (b) um polinucleotídeo que codifica o domínio Cp tendo

pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 57, 65, 73, 81 ou 89. 45. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica o domínio C_a compreende ou

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17/28 consiste em uma sequência de nucleotídeos de acordo com a

SEQ ID NO: 59, 67, 75, 83 ou 91 e o polinucleotídeo que codifica o domínio Cp compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeo s de acordo com a SEQ ID NO: 57, 65, 73, 81 ou 89. 46. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que

compreende:

(a) um polinucleotídeo que codifica um ν_α de acordo com a SEQ ID NO: 58, um polinucleotídeo que codifica um Vp de acordo com a SEQ ID NO: 56, um polinucleotídeo que codifica o domínio C_a de acordo com a SEQ ID NO: 59 e um polinucleotídeo que codifica o domínio Cp de acordo com a SEQ ID NO: 57;

(b) um polinucleotídeo que codifica um ν_α de acordo com a SEQ ID NO: 66, um polinucleotídeo que codifica um Vp de acordo com a SEQ ID NO: 64, um polinucleotídeo que codifica o domínio C_a de acordo com a SEQ ID NO: 67 e um polinucleotídeo que codifica o domínio Cp de acordo com a SEQ ID NO: 65;

(c) um polinucleotídeo que codifica ν_α de acordo com a SEQ ID NO: 74, um polinucleotídeo que codifica Vp de acordo com a SEQ ID NO: 72, um polinucleotídeo que codifica o domínio C_a de acordo com a SEQ ID NO: 7 5 e um polinucleotídeo que codifica o domínio Cp de acordo com a

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18/28

SEQ ID NO: 73;

(d) um polinucleotídeo que codifica um ν_α de acordo com a SEQ ID NO: 82, um polinucleotídeo que codifica um Vp de acordo com a SEQ ID NO: 80, um polinucleotídeo que codifica o domínio C_a de acordo com a SEQ ID NO: 83 e um polinucleotídeo que codifica o domínio Cp de acordo com a SEQ ID NO: 81; ou (e) um polinucleotídeo que codifica um ν_α de acordo com a SEQ ID NO: 90, um polinucleotídeo que codifica um Vp de acordo com a SEQ ID NO: 88, um polinucleotídeo que codifica o domínio C_a de acordo com a SEQ ID NO: 91 e um polinucleotídeo que codifica o domínio Cp de acordo com a SEQ ID NO: 89.
47. Polinucleotídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 46, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um polinucleotídeo que codifica um peptídeo de autoclivagem disposto entre um

polinucleotídeo que codifica a cadeia α de TCR e um polinucleotídeo que codifica a cadeia β de TCR. 48. Polinucleotídeo isolado , de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo que codifica um peptídeo de autoclivagem

compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS.: 128-132.
49. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a

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19/28 reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o polinucleotideo codifica um peptídeo de autoclivagem que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS.: 124-127.
50. Vetor de expressão caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotideo de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 49, operacionalmente ligado a uma sequência de controle de expressão.
51. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação

50, caracterizado pelo fato de que o vetor é capaz de distribuir o polinucleotideo a uma célula hospedeira.
52. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação

51, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula progenitora hematopoiética ou uma célula do sistema imunológico humano.
53. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação

52, caracterizado pelo fato de que a célula do sistema imunológico humano é uma célula T CD4+, uma célula T CD8+, uma célula T dupla negativa CD4- CD8-, uma célula T γδ, uma célula natural killer, uma célula dendrítica ou qualquer combinação destas.
54. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação

53, caracterizado pelo fato de que a célula T é uma célula T não exposta, uma célula T de memória central, uma célula T de memória efetora ou qualquer combinação destas.

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20/28
55. Vetor de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 54, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor viral.
56. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que o vetor viral é um vetor lentiviral ou um vetor γ-retroviral.
57. Método para tratamento de um distúrbio hiperproliferativo associado à expressão de MAGE-A1, caracterizado pelo fato de que compreende administrar, ao sujeito humano em necessidade, uma célula modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, uma composição de acordo com a reivindicação 31, ou uma dose unitária de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 34 .

58 . Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que o distúrbio hiperproliferativo é uma malignidade hematológica ou um câncer sólido. 59. Método, de acordo com a reivindicação 60,

caracterizado pelo fato de que a malignidade hematológica é selecionada dentre leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mieloide crônica (CML), leucemia eosinofílica crônica (GEL) , síndrome mielodisplásica (MDS), linfoma não Hodgkin (NHL) ou mieloma múltiplo (MM).

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21/28
60. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que o câncer sólido é selecionado dentre câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), câncer de mama triplo negativo (TNBC), câncer de ovário, melanoma maligno, câncer de cólon, adenocarcinoma colorretal, câncer colorretal, câncer biliar, câncer de bexiga, carcinoma de ossos e tecidos moles, tumor cerebral, câncer de mama, câncer de colo de útero, tumor desmoide, câncer embrionário, câncer endometrial, câncer de esôfago, câncer gástrico, adenocarcinoma gástrico, glioblastoma multiforme, tumor ginecológico, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, câncer hepático, câncer de pulmão, mesotelioma, osteossarcoma, câncer de pâncreas, adenocarcinoma ductal pancreático, tumor astrocítico primário, câncer de tireoide primário, câncer de próstata, câncer de rim, carcinoma de células renais, rabdomiossarcoma, câncer de pele, sarcoma de tecidos moles, tumor de células germinativas testiculares, câncer urotelial, sarcoma uterino ou câncer uterino.
61. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 60, caracterizado pelo fato de que a célula modificada é capaz de promover uma resposta de células T específica ao antígeno contra um MAGE-A1 de uma maneira restrita ao HLA de classe I.
62. Método, de acordo com a reivindicação 61,

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22/28 caracterizado pelo fato de que a resposta restrita ao HLA de classe I está associada ao transportador com processamento de antígeno independente (TAP).
63. Método, de acordo com a reivindicação 61 ou 62, caracterizado pelo fato de que a resposta de células T específica ao antígeno compreende pelo menos uma das respostas de linfócitos T helper (Th) CD4+ e uma resposta de linfócitos T citotóxicos (CTL) CD8+.
64. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que a resposta CTL é direcionada contra uma célula com expressão de MAGE-A1 aberrante.
65. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 64, caracterizado pelo fato de que a célula modificada é modificada ex vivo.
66. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que a célula modificada é uma célula alogênica, uma célula singênica ou uma célula autóloga.
67. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 66, caracterizado pelo fato de que a célula modificada é uma célula imunológica humana modificada, em que a célula imunológica é selecionada dentre uma célula T CD4+, uma célula T CD8+, uma célula T dupla negativa CD4- CD8-, uma célula T γδ, uma célula natural killer, uma célula dendritica ou qualquer

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23/28 combinação destas.
68. Método, de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de que a célula T é uma célula T não exposta, uma célula T de memória central, uma célula T de memória efetora ou qualquer combinação destas.
69. Método, de acordo com a reivindicação 67 ou 68, caracterizado pelo fato de que a célula T é uma célula T CD4+ .
70. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que a célula T CD4+ compreende adicionalmente um polinucleotídeo heterólogo que codifica pelo menos uma porção extracelular de um correceptor de CD8 .
71. Método, de acordo com a reivindicação 69 ou 70, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a administração, ao sujeito, de uma célula T CD8+ que é capaz de se ligar especificamente a um complexo de peptídeo MAGEA1:HLA em uma superfície celular.
72. Método, de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que a célula T CD8+ compreende uma célula modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30.
73. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 72, caracterizado pelo fato de que a célula modificada é administrada parenteralmente.

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24/28
74. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 73, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar uma pluralidade de doses da célula modificada ao sujeito.
75. Método, de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de doses é administrada em intervalos entre administrações de cerca de duas a cerca de quatro semanas.
76. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 75, caracterizado pelo fato de que a célula modificada é administrada ao sujeito em uma dose de cerca de 10⁷ células/m² a cerca de 10¹¹ células/m².
77. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 76, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente a administração de uma citocina.
78. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracterizado pelo fato de que a citocina é IL-2, IL-15, IL-21 ou qualquer combinação destas.
79. Método, de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo fato de que a citocina é IL-2 e é administrada simultânea ou sequencialmente com a célula modificada.
80. Método, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que a citocina é administrada

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25/28 sequencialmente, desde que a célula modificada tenha sido administrada ao sujeito pelo menos três ou quatro vezes antes da administração da citocina.
81. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 78 a 80, caracterizado pelo fato de que a citocina é IL-2 e é administrada subcutaneamente.
82. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 81, caracterizado pelo fato de que o sujeito está adicionalmente recebendo terapia imunossupressora.
83. Método, de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pelo fato de que a terapia imunossupressora é selecionada dentre inibidores de calcineurina, corticosteroides, inibidores de microtúbulos, baixa dose de uma pró-droga de ácido micofenólico, um inibidor de checkpoint imunológico ou qualquer combinação destes.
84. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 83, caracterizado pelo fato de que uma quantidade eficaz de uma molécula de checkpoint imunológico estimuladora é adicionalmente administrada ao sujeito.
85. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 84, caracterizado pelo fato de que o sujeito recebeu um transplante de células hematopoiéticas não mieloablativo ou mieloablativo.
86. Método, de acordo com a reivindicação 85,

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26/28 caracterizado pelo fato de que a célula modificada é administrada ao sujeito pelo menos três meses após o transplante de células hematopoiéticas não mieloablativo.
87. Método, de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que a célula modificada é administrada ao sujeito pelo menos dois meses após o transplante de células hematopoiéticas mieloablativo.
88. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 87, caracterizado pelo fato de que o um ou mais de um agente de hipometilação do DNA e um inibidor de HDAC foram administrados ao sujeito.
89. Célula T CD4+ modificada caracterizada pelo fato de que compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica um TCR a partir de uma célula T CD8+ que é capaz de se ligar especificamente a um antigeno peptidico.
90. Célula T CD4+ modificada, de acordo com a reivindicação 89, caracterizada pelo fato de que o TCR é um TCR de alta afinidade.
91. Célula T CD4+ modificada, de acordo com a reivindicação 89 ou 90, caracterizada pelo fato de que o TCR é capaz de se ligar especificamente a um complexo de peptideo:antigeno HLA em uma superfície celular independente de CD8 ou na ausência de CD8.
92. Célula T CD4+ modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 89 a 91, caracterizada pelo fato de

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27/28 que compreende adicionalmente um polinucleotídeo heterólogo que codifica pelo menos uma porção extracelular de uma molécula de correceptor de CD8.
93. Célula T CD4+ modificada, de acordo com a reivindicação 92, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo heterólogo codifica um CD8a e um CD8p a partir da célula T CD8+.
94. Célula T CD4+ modificada, de acordo com a reivindicação 92 ou 93, caracterizada pelo fato de que a célula T CD4+ modificada é capaz de provocar uma resposta CTL quando ligada ao complexo de peptídeo: antigeno HLA.
95. Célula T CD4+ modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 89 a 94, caracterizada pelo fato de que o antígeno peptídico vem de MAGE-A1.
96. Método para produzir uma célula T CD4+ modificada, caracterizado pelo fato de que compreende a transdução de uma célula T CD4+ com um polinucleotídeo heterólogo que codifica um TCR a partir de uma célula T CD8+ que seja capaz de se ligar especificamente a um antígeno peptídico.
97. Método, de acordo com a reivindicação 96, caracterizado pelo fato de que o TCR é um TCR de ocorrência natural.
98. Método, de acordo com a reivindicação 96 ou reivindicação 97, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a transdução da célula T CD4+ com um

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28/28 polinucleotídeo heterólogo que codifica pelo menos uma porção extracelular de um correceptor de CD8.
99. Método, de acordo com a reivindicação 98, caracterizado pelo fato de que o correceptor de CD8 compreende um CD8a e um CD8p da célula T CD8+.