BR112019011303B1 - Derivados de ácido hidroxibenzoico, métodos e usos dos mesmos - Google Patents

Abstract

DERIVADOS DE ÁCIDO HIDROXIBENZOICO, MÉTODOS E USOS DOS MESMOS. A presente revelação se refere ao projeto e à síntese de novos compostos antioxidantes mitocondriotrópicos baseados em ácidos hidroxibenzoicos e análogos. Além disso, essa revelação está também relacionada com os métodos e utilizações dos derivados e análogos baseados em hidroxibenzoicos, por exemplo, no campo das doenças humanas e animais, por exemplo, para tratar disfunções mitocondriais ou deficiências mitocondriais, e cosméticos, por exemplo, para prevenir ou retardar o envelhecimento da pele.

Description

CAMPO DA TÉCNICA

[0001] A presente revelação se refere ao projeto e à síntese de novos compostos antioxidantes mitocondriotrópicos baseados em ácidos hidroxibenzoicos e análogos.

[0002] Além disso, essa revelação está também relacionada com os métodos e utilizações dos derivados e análogos baseados em hidroxibenzoicos, por exemplo, no campo das doenças humanas e animais, por exemplo, para tratar disfunções mitocondriais ou deficiências mitocondriais, e cosméticos, por exemplo, para prevenir ou retardar o envelhecimento da pele.

TÉCNICA ANTERIOR

[0003] As mitocôndrias desempenham um papel vital na regulação do metabolismo energético, concentração de cálcio citosólico, produção de ERO e vias de morte celular.

[0004] A produção excessiva de ERO, se não for contrariada por mecanismos de defesa intrínsecos, pode causar dano oxidativo em componentes celulares, como lipídeos, proteínas e ácidos nucleicos, que levam à morte celular subsequente por necrose ou apoptose.

[0005] Alterações mitocondriais decorrentes do aumento do estresse oxidativo desempenham papel crucial nas doenças relacionadas ao estresse oxidativo, como câncer, acidente vascular cerebral, insuficiência cardíaca, obesidade e doenças neurodegenerativas1. Acredita-se que a segmentação de mitocôndrias com farmacêuticos específicos para organelas seja uma estratégia terapêutica eficaz. Mais especificamente, o controle do equilíbrio das EROs celulares por meio da entrega seletiva de um antioxidante às mitocôndrias tem sido descrito como uma estratégia terapêutica eficaz e promissora para a prevenção e/ou tratamento de doenças relacionadas ao estresse oxidativo2.

[0006] Embora a produção de ERO seja rigidamente regulada por uma rede endógena de antioxidantes, sua superprodução pode levar a danos e disfunção oxidativa mitocondrial. A disfunção oxidativa mitocondrial prejudica múltiplas vias metabólicas e de sinalização e pode desencadear morte celular por apoptose ou necrose.

[0007] O estresse oxidativo e a disfunção mitocondrial têm sido associados ao envelhecimento e várias patologias associadas ao estresse oxidativo, por exemplo, diabetes, doença hepática gordurosa não alcoólica, doenças cardiovasculares, pancreatite aguda e doenças neurodegenerativas, incluindo doença de Alzheimer ou Parkinson e esclerose lateral amiotrófica. Assim, a prevenção do dano oxidativo mitocondrial é hoje uma estratégia farmacológica reconhecida para retardar a progressão da doença.

[0008] Em um evento patológico, o conjunto de defesas antioxidantes endógenas pode não ser suficiente para lidar com o aumento da produção de oxidantes, por isso tem sido sugerido que a administração de antioxidantes exógenos pode ser benéfica para diminuir a lesão celular, já que eles não apenas compensam a insuficiência de sistemas de defesa endógenos, mas também melhoram a resposta antioxidante geral. Antioxidantes exógenos podem, em teoria, bloquear as complexas redes de vias de danos oxidativos em diferentes níveis, produzindo um efeito terapêutico. Consequentemente, os antioxidantes que são adquiridos exogenamente da dieta podem ter funções importantes na homeostase das células redox e podem ser importantes para a função celular e prevenção de doenças.

[0009] Embora o papel da mitocôndria na patogênese da doença seja bastante consensual, mirar essa organela para evitar a interrupção nem sempre é fácil. A melhoria da função mitocondrial através da prevenção/minimização do dano oxidativo é uma estratégia terapêutica eficaz e promissora. Uma vez que a manutenção da razão ERO/antioxidante e a manutenção de redox são críticas para a sinalização celular que tem como alvo antioxidantes para mitocôndrias disfuncionais de interesse farmacológico.

[0010] Um número de antioxidantes direcionados para mitocôndrias estão sendo desenvolvidos, em particular aqueles que usam trifenilfosfônio (TPP) como veículo. Esse tipo de cátion lipofílico pode atravessar a membrana mitocondrial e se acumular dentro da matriz mitocondrial, aproveitando o gradiente do potencial elétrico da membrana interna3-5.

[0011] Um dos antioxidantes mais estudados em mitocôndrias é a Mitoquinona (metanossulfonato de MitoQ, MitoQ10, [10- (4,5- dimetoxi-2-metil-3,6-dioxo-1,4-ciclo- hexadien-1-il) decil] trifenilfosfônio). MitoQ é constituída por uma porção antioxidante endógena (coenzima Q) ligada covalentemente a um espaçador de cadeia alquílica de 10 carbonos (dTPP) e a um cátion trifenilfosfônio (TPP). A MitoQ está em fase de testes clínicos para diferentes eventos patológicos, nomeadamente para a hepatite C. No entanto, os ensaios clínicos que utilizaram o MitoQ como solução terapêutica para doenças neurodegenerativas produziram resultados decepcionantes4,5.

[0012] Outro antioxidante relevante direcionado para mitocôndria é o SKQ1 [brometo de 10- (4,5-dimetil-3,6-dioxociclohexa-1,4-dien-1-il) decil] trifenilfosfônio]], que é baseado em plastoquinona, uma quinona envolvida na cadeia de transferência de elétrons de cloroplastos. O SkQ1 mostrou diminuir o estresse oxidativo dentro das mitocôndrias e proporcionar benefícios protetores significativos para a condição de olho seco.

[0013] No entanto, existe ainda a necessidade de moduladores mitocondriais mais eficazes e seguros para serem utilizados na terapia e noutras aplicações, tais como suplementos ou nutracêuticos e no campo cosmético.

[0014] Os polifenóis são metabólitos secundários de plantas geralmente envolvidos na defesa contra estressores oxidativos que são encontrados principalmente em frutas, vegetais, cereais e bebidas que compõem a dieta humana. A sua ingestão diária na dieta ocidental convencional foi estimada em cerca de 1 g. Estudos epidemiológicos e metanálises associadas sugeriram fortemente uma associação entre o consumo de dietas ricas em polifenóis e a prevenção de doenças relacionadas ao estresse oxidativo, como câncer, diabetes, doenças cardiovasculares e neurodegenerativas.

[0015] Os ácidos hidroxibenzoicos (HBAs), uma subclasse de ácido fenólico, compreendem sete átomos de carbono (C6-C1) ligados a pelo menos um grupo hidroxila.

[0016] Alguns derivados de HBA são atualmente usados como aditivos antioxidantes em alimentos para prevenir ou minimizar a oxidação de nutrientes e para manter ou melhorar o valor nutricional dos alimentos. Ácidos hidroxibenzoicos e derivados são também utilizados como excipientes nas indústrias cosmética e farmacêutica devido às suas propriedades antioxidantes. Entretanto, várias desvantagens têm sido apontadas principalmente relacionadas à sua eficácia.

[0017] A atividade antioxidante dos HBAs tem sido associada às suas propriedades quelantes e sequestradoras de radicais livres, nomeadamente através da inibição dos processos de peroxidação lipídica. Também é atualmente reconhecido que os derivados de HBAs podem desempenhar um papel na inibição de várias enzimas pró-oxidantes que estão envolvidas na produção de espécies reativas de oxigênio (ERO). Evidências científicas apontam que a eficácia antioxidante dos HBAs está relacionada ao número e à posição dos grupos hidroxila localizados no anel aromático. Esses diferentes mecanismos de ação podem resultar em uma inibição ou redução da formação de ERO, interrompendo a propagação de reações em cadeia de radicais livres ou retardando suas taxas de início ou reação.

[0018] A utilidade dos HBAs e seus derivados na terapia, isoladamente ou como adjuvantes, é limitada principalmente devido às limitações de biodisponibilidade e capacidade de drogabilidade. Apesar de suas propriedades promotoras de saúde putativas, a biodisponibilidade de polifenóis administrados por via oral parece insuficiente para permitir concentrações suficientes para terapia sistêmica, um problema que está principalmente relacionado com suas propriedades físico-químicas (por exemplo, lipofilicidade) e metabolismo rápido e extenso. Diferentes estratégias têm sido desenvolvidas até o momento para aumentar a lipofilicidade e a estabilidade dos HBAs, permitindo uma melhor biodisponibilidade e melhorando sua liberação para um alvo intracelular, como as mitocôndrias.

[0019] Esses fatos são divulgados para ilustrar o problema técnico abordado pela presente revelação.

DESCRIÇÃO GERAL

[0020] As mitocôndrias são alvos atraentes para várias moléculas, o que pode minimizar danos causados por organelas no contexto de diferentes patologias.

[0021] Evidências crescentes sugerem que a disfunção mitocondrial amplifica os eventos de estresse oxidativo, desempenhando um papel crucial em diferentes patologias e processos de envelhecimento. Centros de enxofre de ferro mitocondrial, ácidos graxos poli-insaturados de membrana, proteínas e DNA mitocondrial são suscetíveis a danos oxidativos, muitas vezes levando a rompimento de organelas e células.

[0022] A presente revelação relata a concepção e síntese de novos antioxidantes mitocondriotrópicos baseados em ácidos hidroxibenzoicos e análogos (AntiOxBENs).

[0023] Como parte da presente revelação, que está relacionada com o desenvolvimento de antioxidantes eficazes baseados em modelos naturais, é relatado o desenvolvimento de um novo antioxidante dirigido por mitocôndrias baseado em HBAs naturais de dieta, com propriedades antioxidantes robustas e quelantes de ferro, mantendo ao mesmo tempo baixo perfil de citotoxicidade.

[0024] A presente revelação refere-se a um composto de fórmula I

ou um sal, solvato, hidrato, tautômero, estereoisômero; preferencialmente um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, hidrato, tautômero, estereoisômero; para uso em medicina, em que R1, R2, R3, R4, R5, R6 e R7 são independentemente selecionados entre si; R1, R2, R3, R4 e R5 são selecionados de H, halogênio, hidroxila, metila, metoxila, amino, ácido carboxílico ou grupo nitro; R6 é uma amida secundária ou amida terciária; R7 é uma cadeia de alquila, uma cadeia de alquenila, uma cadeia de alquinila, uma arila substituída ou uma amida secundária e Z- é um ânion aceitável, preferencialmente um ânion farmacêutico aceitável, em particular, um halogênio, mais em particular um Cl.

[0025] A presente revelação também se refere a um composto de fórmula I

ou um sal, solvato, hidrato, tautômero, estereoisômero; preferencialmente um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, hidrato, tautômero, estereoisômero; em que R1, R2, R3, R4, R5, R6 e R7 são independentemente selecionados entre si; R1, R2, R3, R4 e R5 são selecionados de H, halogênio, hidroxila, metila, metoxila, amino, ácido carboxílico ou grupo nitro; R6 é uma amida secundária ou amida terciária; R7 é uma cadeia de alquila, uma cadeia de alquenila, uma cadeia de alquinila, uma arila substituída ou uma amida secundária e Z- é um ânion aceitável, preferencialmente um ânion farmacêutico aceitável, em particular, um halogênio, mais em particular um Cl; com a condição de que

seja excluído.

[0026] Com base nas definições da União Internacional de Química Pura e Aplicada (IUPAC), um grupo alquila é definido como um grupo univalente derivado de alcanos pela remoção de um átomo de hidrogênio de qualquer átomo de carbono -CnH2n+1. Os grupos derivados por remoção de um átomo de hidrogênio de um átomo de carbono terminal de alcanos não ramificados formam uma subclasse de grupos alquila (n-alquila) normais H (CH2)n. Os grupos RCH2, R2CH (R + H) e R3C (R + H) são grupos alquila primários, secundários e terciários, respectivamente. Um grupo arila é derivado de arenos (hidrocarbonetos aromáticos monocíclicos e policíclicos) por remoção de um átomo de hidrogênio de um átomo de carbono do anel.

[0027] “Alquila” inclui “alquila inferior” e3 se estende para cobrir fragmentos de carbono que têm até 30 átomos de carbono. Exemplos de grupos alquila incluem octila, nonila, norbornila, undecila, dodecila, tridecila, tetradecila, pentadecila, eicosila, 3,7-dietil-2,2- dimetil-4 -propilnonila, 2-(ciclododecil)etila, adamantila e semelhantes.

[0028] “Alquila inferior” significa grupos alquila de 1 a 7 átomos de carbono. Exemplos de grupos alquila inferior incluem metila, etila, propila, isopropila, butila, sec e terc-butila, pentila, hexila, heptila, ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclohexila, cicloheptila, 2- metilciclopropila, ciclopropilmetila e semelhantes.

[0029] Em uma modalidade, o composto de fórmula I é

[0030] Em uma modalidade, o composto de fórmula I

[0031] Em uma modalidade, R7 é uma amida secundária de R8-(C=O)NH-R9 amida; R8 e R9 são independentemente selecionados entre si e R8 e R9 são a cadeia de alquila, uma cadeia de alquenila, uma cadeia de alquinila ou uma arila substituída.

[0032] Em uma modalidade, a arila substituída é uma alcano-arila substituída, alceno- arila substituída ou alcino-arila substituída.

[0033] Em uma modalidade, a alcano-arila substituída, alceno-arila substituída ou alcino- arila substituída é: C1-C6-alquila, C3-C8-cicloalquila, C6-C10-arila, C6-C10-aril-C1-C8-alquila, C1- C6-alcóxi, C6-C10-arilóxi, C6-C10-aril-C1-C8-alcóxi, hidroxila, CO2H, C1-C6-alcoxicarbonila, C6-C10-ariloxicarbonila, C6-C10-aril-C1-C8-alcoxicarbonila, C1-C6-alquilcarbonila, C6-C10- arilcarbonila, C6-C10-aril-C1-C8-alquilcarbonila, C1-C6-alquilcarbóxi, C6-C10-arilcarbóxi, C1-C6-alquilmercaptila, C6-C10-arilmercaptila, C1-C6-alquilmercaptocarbonila, C3-C8- cicloalquilmercaptocarbonila, C6-C10-arilmercaptocarbonila, C1-C6- alquilmercaptocarboxi, C6-C10- arilmercaptocarboxi, C1-C6-alquilsulfonila, C6-C10- arilsulfonila, C1-C6-alquilsulfóxi, C6-C10- arilsulfóxi; cada uma dessas é substituída uma ou diversas vezes por C1-C6-alquila, C1- C6-alcóxi, COOH; CONH2, substituída uma ou duas vezes por C1-C6-alquila; SO3H, amino, tiol, hidroxila, nitro, ciano, flúor, cloro, bromo, iodo, CF3 ou OCF3; em que inúmeros desses substituintes opcionais são combinados para formar sistemas de homo ou hetero anéis saturados, insaturados ou aromáticos anelados; ou um heterociclo saturado, insaturado ou aromático substituído uma ou diversas vezes por C1-C6-alquila, C1-C6-alcóxi, COOH; CONH2, substituído uma ou duas vezes.

[0034] Em uma modalidade, a cadeia de alquila, a cadeia alquenila ou a cadeia alquinila é uma cadeia C1-C30, de preferência cadeia C1-C18.

[0035] Em uma modalidade, a cadeia de alquila, a cadeia de alquenila ou a cadeia de alquinila é uma cadeia C2-C16, de preferência uma cadeia C3-C16, mais preferencialmente uma cadeia C5-C14, ainda mais preferencialmente C6-C14.

[0036] Em uma modalidade, a cadeia de alquila é uma cadeia C5 alquila, cadeia C6 alquila, uma cadeia C7 alquila, uma cadeia C8 alquila, uma cadeia C9 alquila, uma cadeia C10 alquila, uma cadeia C11 alquila, uma cadeia C12 alquila, uma cadeia C13 alquila ou uma cadeia C14 alquila.

[0037] Em uma modalidade, R1 e R5 são H.

[0038] Em uma modalidade, R2 e R3 são OH.

[0039] Em uma modalidade, R4 é H ou OH.

[0040] Em uma modalidade, R7 é a cadeia C6 alquila.

[0041] Em uma modalidade, R8 e R9 são independentemente um do outro a cadeia C5 alquila ou a cadeia C6 alquila.

[0042] Em uma modalidade, o halogênio é F, Cl, Br, I ou At.

[0043] Em uma modalidade, o composto é brometo de 6-(3,4-di- hidroxibenzamido)hexiltrifenilfosfônio.

[0044] Em uma modalidade, o composto é brometo de 6-(3,4,5-tri- hidroxibenzamido)hexiltrifenilfosfônio.

[0045] Em uma modalidade, o composto é brometo de 5-(6-(3,4,5-tri- hidroxibenzamido)hexilamino) carbonilpentil]trifenilfosfônio.

[0046] A presente revelação também se refere a qualquer composto, ou a compostos relacionados, agora revelados para uso em medicina, veterinária ou cosmética.

[0047] Em uma modalidade, os compostos revelados, ou relacionados, podem ser utilizados para modular pelo menos uma das morfologias mitocondriais e/ou expressão de enzimas OXPHOS.

[0048] Em uma modalidade, os compostos divulgados, ou relacionados, podem ser utilizados para o tratamento ou prevenção ou supressão de sintomas associados a um distúrbio mitocondrial ou com uma condição associada à disfunção mitocondrial em geral, incluindo doenças originadas de defeitos da cadeia respiratória mitocondrial.

[0049] Em uma modalidade, o distúrbio mitocondrial é um distúrbio selecionado do grupo consistindo em: epilepsia mioclônica; epilepsia mioclônica com fibras vermelhas rasgadas; neuropatia óptica hereditária de Leber; neuropatia ataxia e retinite pigmentosa; miopatia mitocondrial, encefalopatia, lactacidose, acidente vascular cerebral; síndrome de Leigh; síndrome tipo Leigh; atrofia óptica dominante; síndrome de Kearns-Sayre; diabetes e surdez maternalmente herdados; síndrome de Alpers-Huttenlocher; espectro de neuropatia de ataxia; oftalmoplegia externa progressiva crônica; síndrome de Pearson; encefalopatia neuro-gastro-intestinal mitocondrial; síndrome de Sengers; 3- acidúria metilglutacônica, surdez sensorioneural, encefalopatia e achados neurorradiológicos da síndrome tipo Leigh; miopatia; miopatia mitocondrial; cardiomiopatia; e encefalomiopatia, síndrome de Leigh deficiente devido à deficiência de proteínas com excesso de complexo IV; deficiências isoladas ou combinadas de OXPHOS com defeitos genéticos até agora não resolvidos, incluindo oxidação de piruvato perturbada e taxas de produção de ATP mais PCR.

[0050] Em uma modalidade, a condição associada à disfunção mitocondrial é uma condição selecionada do grupo consistindo em: Ataxia de Friedreich; acidose tubular renal; mal de Parkinson; doença de Alzheimer; esclerose lateral amiotrica; doença de Huntington; distúrbios invasivos do desenvolvimento; perda de audição; surdez; diabetes; envelhecimento; e efeitos adversos de drogas que dificultam a função mitocondrial.

[0051] Em uma modalidade, os compostos agora revelados, ou relacionados, podem ser para uso no tratamento ou prevenção ou supressão de uma doença neurodegenerativa, doença hepática gordurosa não alcoólica, neoplasia, câncer, doença renal, escleroderma, doença hepática de sobrecarga de ferro, doença hepática de sobrecarga de cobre, alopecia, infertilidade humana, pancreatite aguda, fibromialgia, distúrbio mitocondrial ou uma condição associada à disfunção mitocondrial ou doenças mitocondriais.

[0052] Em uma modalidade, os compostos agora revelados, ou relacionados, podem ser utilizados no tratamento ou prevenção de doença neurodegenerativa, em particular, para esclerose lateral amiotrófica.

[0053] Em uma modalidade, os compostos agora revelados, ou relacionados, podem ser utilizados para o tratamento ou prevenção de câncer em que o câncer é câncer do fígado, do pâncreas ou biliar.

[0054] Em uma modalidade, os compostos agora revelados, ou relacionados, podem ser para uso no tratamento ou prevenção de doença hepática gordurosa não alcoólica, em que a doença hepática gordurosa não alcoólica é doença hepática gordurosa não alcoólica, esteato-hepatite não alcoólica ou cirrose hepática.

[0055] Em uma modalidade, os compostos agora revelados, ou relacionados, podem ser para uso no tratamento ou prevenção de doença renal em que a doença renal é câncer renal ou insuficiência renal.

[0056] Em uma modalidade, a doença neoplásica pode ser câncer, em particular carcinoma das células basais, câncer dos ossos, câncer do intestino, câncer do cérebro, câncer da mama, câncer do colo do útero, leucemia, câncer do fígado, câncer do pulmão, linfoma, melanoma, câncer do ovário, câncer pancreático, câncer da próstata, câncer de tireoide ou câncer biliar.

[0057] Em uma modalidade, os compostos agora revelados, ou relacionados, podem ser utilizados como agente antimicrobiano, em particular como um desinfetante.

[0058] Em uma modalidade, os compostos agora divulgados, ou relacionados, podem ser para utilização na manutenção de uma cultura celular pluripotente, como um suplemento para cultura de células em particular como composto de meio de crescimento.

[0059] Essa revelação também se refere a um meio de cultura de células para manter as células estaminais pluripotentes em um estado indiferenciado compreendendo qualquer dos compostos, ou relacionados, agora revelados.

[0060] Em uma modalidade, os compostos agora revelados, ou relacionados, podem ser utilizados como um protetor muscular ou recuperação muscular após o exercício físico.

[0061] Em uma modalidade, os compostos agora revelados, ou relacionados, podem ser para uso como um cosmético, ou um suplemento, ou um nutracêutico, nomeadamente um produto antienvelhecimento ou antirrugas.

[0062] Em uma modalidade, os compostos agora divulgados, ou relacionados, podem ser utilizados como sonda em estudos de imagiologia, em particular para monitorizar estudos de imagiologia mitocondrial.

[0063] Essa revelação também se refere a uma composição, de um modo preferencial, uma composição farmacêutica ou cosmética, compreendendo qualquer um dos compostos, ou relacionados, revelados agora e um ou mais transportadores, adjuvantes, excipientes, diluentes ou suas misturas farmaceuticamente aceitáveis.

[0064] Em uma modalidade, o transportador aceitável pode ser selecionado da seguinte lista: solução salina, goma arábica, gelatina, pasta de amido, talco, queratina, sílica coloidal, ureia, entre outros, ou suas misturas.

[0065] Em uma modalidade, o adjuvante pode ser selecionado da seguinte lista: adjuvante de emulsão óleo-em-água, adjuvante de alumínio, um ligante de TLR-4, uma saponina, entre outros, e suas misturas.

[0066] Em uma modalidade, o excipiente pode ser selecionado da seguinte lista: glicose, lactose, sacarose, monoestearato de glicerol, cloreto de sódio, glicerol, propileno, glicol, água, etanol, entre outros, ou misturas dos mesmos.

[0067] Em uma modalidade, a composição farmacêutica pode ser administrada, por exemplo, via oral, parenteral, inalatória ou tópica. No caso de composição não farmacêutica, nomeadamente composições cosméticas, a via preferencial é tópica.

[0068] Em uma modalidade, as vias farmacêuticas preferenciais de administração incluem, mas não se limitam a, via oral, parenteral, intramuscular, intravenosa, in situ, intranasal, sublingual, intratraqueal e inalatória ou tópica.

[0069] Em uma modalidade, a composição farmacêutica pode ser para uso, por exemplo, em um método para o tratamento ou prevenção de uma doença neurodegenerativa, doença hepática gordurosa não alcoólica, neoplasia, doença renal, esclerodermia, doença hepática por sobrecarga de ferro, doença por sobrecarga hepática de cobre, alopecia, infertilidade humana, pancreatite aguda ou fibromialgia, em que a composição farmacêutica é administrada em uma dose diária.

[0070] Em uma modalidade, a dose diária da composição farmacêutica pode ser 20 mg/dia ou 10 mg/dia, entre outras.

[0071] Em algumas modalidades, a forma de dose ou dosagem pode ser administrada ao indivíduo, por exemplo, uma vez ao dia, duas vezes ao dia ou três vezes ao dia. Em outras modalidades, a dose é administrada ao indivíduo uma vez por semana, uma vez por mês, uma vez de dois em dois meses, quatro vezes por ano, três vezes por ano, duas vezes por ano ou uma vez por ano.

[0072] Em uma modalidade, a composição pode compreender um ou mais dos compostos revelados, ou relacionados, no presente objeto, em uma quantidade eficaz para melhorar a eficácia de outras terapias, incluindo imunoterapia ou qualquer abordagem farmacológica, por pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 95,7%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% no sujeito.

[0073] Em algumas modalidades, a composição compreende uma dose de 0,1 a 1.000 mg. Por exemplo, em algumas modalidades, a preparação compreende uma dose de 0,1 mg / kg, 0,2 mg / kg, 0,3 mg / kg, 0,4 mg / kg, 0,5 mg / kg, 0,7 mg / kg, 0,8 mg / kg, 0,9 mg / kg, 1 mg / kg, 2 mg / kg, 3 mg / kg, 4 mg / kg, 5 mg / kg, 6 mg / kg, 7 mg / kg, 8 mg / kg, 9 mg / kg, 10 mg / kg, 11 mg / kg, 12 mg / kg, 13 mg / kg, 14 mg / kg, 15 mg / kg, 16 mg / kg, 17 mg / kg, 18 mg / kg, 19 mg / kg, 20 mg / kg, 25 mg / kg, 30 mg / kg, 40 mg / kg, 50 mg / kg, 60 mg / kg, 70 mg / kg, 80 mg / kg, 90 mg / kg, 100 mg / kg, 200 mg / kg, 250 mg / kg, 300 mg / kg, 400 mg / kg, 500 mg / kg, 600 mg / kg, 700 mg / kg, 750 mg / kg, 800 mg / kg, 900 mg / kg ou 1.000 mg / kg. Em algumas modalidades, a composição compreende uma dose de 0,1 a 10 mg/kg, 0,1 a 100 mg/kg, 1 a 10 mg/kg, 1 a 100 mg/kg, 1 a 1.000 mg/kg, 10 a 100 mg/kg, 10 a 1.000 mg/kg, 100 a 1.000 mg/kg, 10 a 50 mg/kg, 10 a 25 mg/kg, 10 a 20 mg/kg, 50 a 100 mg/kg ou 100 a 250 mg/kg.

[0074] Essa revelação também fornece um nanocarreador, por exemplo, lipossomas, em que o nanocarreador compreende os compostos, ou relacionados, ou a composição, agora revelados.

[0075] Ao longo da descrição e das reivindicações, a palavra “compreende” e variações da palavra não se destina a excluir outros recursos técnicos, aditivos, componentes ou etapas.

[0076] Objetivos adicionais, vantagens e características da solução agora divulgada tornar-se-ão evidentes para os versados na técnica após análise da descrição ou podem ser aprendidos pela prática da solução.

[0077] Ao longo da descrição e das reivindicações, a palavra “compreende” e variações da palavra não se destina a excluir outros recursos técnicos, aditivos, componentes ou etapas. Objetivos adicionais, vantagens e características da divulgação tornar-se-ão evidentes para os versados na técnica após análise da descrição ou podem ser aprendidos pela prática da divulgação.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0078] As figuras seguintes proporcionam modalidades preferenciais para ilustrar a descrição e não devem ser vistas como limitativas do âmbito da presente revelação.

[0079] Figura 1: Estratégias sintéticas buscadas para o desenvolvimento de vários antioxidantes mitocondriotrópicos A- AntiOxBEN1 e AntiOxBEN2; B- AntiOxBEN3.

[0080] Figura 2: Avaliação de propriedades quelantes de ferro de ácidos benzoicos e derivados (AntiOxBEN1, AntiOxBEN2 e AntiOxBEN3) e MitoQ. EDTA (agente quelante) foi usado como referência. Estatisticamente significativo em comparação com o grupo de controle utilizando ANOVA a um fator (P <0,0001, n.s., não significativo).

[0081] Figura 3: (A) Absorção de AntiOxBENs pela mitocôndria de fígado de rato energizada, medida por eletrodo seletivo de TPP. (B) Razão de acumulação de AntiOxBENs por mitocôndrias de fígado de rato. MIT, mitocôndrias; SUC, succinato; VAL, valinomicina.

[0082] Figura 4: Efeito dos ácidos benzoicos, AntiOxBENs e MitoQ na peroxidação lipídica mitocondrial sob diferentes condições oxidativas: (A) níveis de TBARS e (B) alterações no consumo de oxigênio. As comparações entre controle e AntiOxCINs (5 μM) pré-incubações foram realizadas usando One-way ANOVA.

[0083] Figura 5: Registro típico do efeito do ácido benzoico e derivados AntiOxBEN, contendo um núcleo (A) catecol (ácido protocatecuico e AntiOxBEN1) ou (B) pirogalol (ácido gálico, AntiOxBEN2 e AntiOxBEN3) e (C) dTPP e MitoQ na peroxidação lipídica de membranas RLM induzidas por ADP e Fe2+ seguido de consumo de oxigênio.

[0084] Figura 6: Efeito de AntiOxBENs e MitoQ no edema mitocondrial na indução do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP). AntiOxBENs e MitoQ a (A) 2,5 μM, (B) 5 μM e (C) 10 μM foram pré-incubados com RLM por 5 min antes da adição de cálcio. As comparações foram realizadas utilizando One-way ANOVA entre controles (apenas Ca2+) versus ensaios em que os derivados de AntiOxBEN foram pré-incubados antes de Ca2+. Ciclosporina A (CsA).

[0085] Figura 7: Efeito de AntiOxBENs e MitoQ na respiração RLM suportada por (A) glutamato 10 mM + malato 5 mM ou (B) succinato 5 mM. Barras brancas, controle; Barras com padrão horizontal, 2,5 μM, Barras com padrão vertical, 5 μM, Barras com padrão quadriculado, 10 μM). A significância estatística em relação às diferentes taxas/estados respiratórios foi determinada usando o teste t de duas caudas de Student.

[0086] Figura 8: Perfil de citotoxicidade de AntiOxBEN1 (AntiOxBEN2 (•) e AntiOxBEN3 (O) na proliferação de células de carcinoma hepatocelular humano (HepG2).

[0087] Estatisticamente significativo em comparação com o grupo controle usando Oneway ANOVA.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0088] Em uma modalidade, e como um exemplo, as estratégias sintéticas adquiridas para o desenvolvimento de vários derivados de ácido hidroxibenzoico (AntiOxBENs) são descritas na Figura 1.

[0089] Em uma modalidade, e como um exemplo, os antioxidantes mitocondriotrópicos AntiOxBEN1 e AntiOxBEN2 foram obtidos seguindo uma estratégia sintética de quatro etapas descrita na Figura 1A. Nesse exemplo, os materiais de partida di (1) ou trimetoxibenzoico (2) ácidos foram ligados a um espaçador de alquila bifuncionalizado (6-aminohexan-1-ol) por uma reação de amidação, usando etilcloroformato como reagente de acoplamento. A segunda etapa da reação foi destinada a converter a função do álcool (compostos 3 ou 4) em um haleto que é um bom grupo de saída. Os compostos desejados (5 ou 6) foram obtidos com elevados rendimentos, em particular 70 a 90%, por reação modificada por Appel utilizando 1,2-bis (difenilfosfino) etano (difos). Em uma terceira etapa, os sais de trifenilfosfônio (compostos 7 ou 8) foram obtidos por meio de uma reação SN2 deslocada pela trifenilfosfina (PPh3). A síntese dos análogos hidroxilados (AntiOxBEN1 e AntiOxBEN2) foi realizada por um processo de desmetilação utilizando tribrometo de boro (BBr3).

[0090] Em uma modalidade, e como um exemplo, o antioxidante mitocondriotrópico AntiOxBEN3 foi obtido seguindo uma estratégia sintética de quatro etapas apresentada na Figura 1B, na qual o ácido trimetoxibenzoico (2) foi ligado a um espaçador diamina monoprotegido para obter o derivado 9 que foi subsequentemente desprotegido em meio ácido para obter o composto 10. A amina 10 foi então acoplada ao composto catiônico trifenilfosfônio 11 por uma reação de amidação na qual o agente de acilação foi gerado in situ. Em seguida, o composto 12 foi desmetilado usando solução de tribrometo (BBr3) para obter AntiOxBEN3. Globalmente, bons a moderados rendimentos foram obtidos.

[0091] Em uma modalidade, e como um exemplo, as propriedades antioxidantes e redox do AntiOxBEN foram relatadas. Ácidos protocatecuicos e gálicos também foram incluídos no estudo. Vitamina E e trolox foram usados como padrões.

[0092] Em uma modalidade, a hierarquia de atividade de ranking antioxidante AntiOxBENs foi estabelecida por métodos não celulares in vitro. Os ensaios de capacidade antioxidante total (TAC) selecionados (DPPH, ABTS e GO) envolveram a medida espectrofotométrica da redução da absorbância radical como resultado de uma desativação radical in situ por um antioxidante. Compostos com maior atividade antioxidante apresentam menores valores de IC50. Os resultados são descritos na Tabela 1.

[0093] Os dados antioxidantes permitem concluir que os AntiOxBENs são antioxidantes eficazes e que os valores de IC50 atingiram a mesma tendência nos três ensaios diferentes. A partir dos dados obtidos é possível concluir que os compostos com a fração pirogalol, em especial o AntiOxBEN2 e o AntiOxBEN3, apresentaram uma atividade antioxidante superior aos sistemas de catecol, em particular AntiOxBEN1. Em geral, a introdução da cadeia lateral alifática do trifenilfosfônio (TPP) levou a uma ligeira diminuição da atividade antioxidante, quando comparada aos ácidos protocatecuico e gálico.

[0094] TABELA 1. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE E POTENCIAIS REDOX (Ep) DE ANTIOXIDANTES BENZOICOS DIRIGIDOS ÀS MITOCÔNDRIAS.

[0095] Em uma modalidade, e como um exemplo, propriedades redox de AntiOxBENs foram avaliadas (Tabela 1). Os potenciais redox estão correlacionados com a capacidade de um antioxidante em doar um átomo de hidrogênio e/ou um elétron para um radical livre. Geralmente, baixos potenciais de oxidação (Ep) estão associados a um desempenho antioxidante superior.

[0096] Em uma modalidade, o comportamento oxidativo dos antioxidantes parentais (ácidos protocatecuicos e gálicos) e AntiOxBENs foi avaliado em pH fisiológico de 7,4, por pulso diferencial e voltametria cíclica, utilizando um eletrodo de carbono vítreo. Os dados redox permitem concluir que o ácido protocatecuico e o AntiOxBEN1 apresentaram potenciais redox (Ep) característicos da presença de um grupo catecol (Ep = 0,257 e 0,224 V, respectivamente) (Tabela 1). Para derivados de pirogalol (ácido gálico, AntiOxBEN2, AntiOxBEN3), foi observada uma diminuição significativa nos potenciais redox (Ep = 0,163 a 0,168 V) (Tabela 1).

[0097] Em uma modalidade, apenas uma onda anódica foi observada no estudo voltamétrico de pulso diferencial do antioxidante mitocondriotrópico AntiOxBEN1. A ocorrência de uma única onda voltamétrica parece indicar menor propensão do AntiOxBEN1 a adsorver na superfície do eletrodo, quando comparado ao ácido original.

[0098] O estudo voltamétrico de pulso diferencial do ácido gálico e seus derivados (AntiOxBEN2 e AntiOxBEN3) revelou a presença de duas ondas anódicas bem definidas em pH fisiológico. Os picos de oxidação estão relacionados com a oxidação da unidade de pirogalol presente na sua estrutura.

[0099] Em uma modalidade, os voltamogramas cíclicos obtidos tanto para o ácido protocatecuico como para o AntiOxBEN1 apresentam um pico anódico e o pico catódico correspondente. A diferença entre o valor potencial de pico anódico e catódico indica um processo irreversível de transferência de elétrons. Experimentos de voltametria cíclica apresentaram um único pico de oxidação sem onda de redução distinta na varredura reversa, mostrando que o ácido gálico e o AntiOxBEN2 e o AntiOxBEN3 também foram irreversivelmente oxidados.

[0100] Em uma modalidade, os resultados obtidos permitem concluir que o ácido gálico e AntiOxBEN2 e AntiOxBEN3 exibiram menores potenciais redox do que os observados para o ácido protocatecuico e AntiOxBEN1. A diminuição do potencial de oxidação parece ser devida à existência de um grupo fenólico adicional no ácido gálico e seus derivados (unidade de pirogalol). O grupo hidroxila extra promove a estabilização do intermediário radical produzido pela oxidação, o que foi traduzido em uma diminuição substancial do potencial redox obtido.

[0101] Em uma modalidade, a introdução de uma cadeia lateral de cátions trifenilfosfônio não tem uma influência digna de nota nos potenciais redox obtidos para AntiOxBENs.

[0102] Os dados obtidos sugerem que as modificações estruturais realizadas resultam em modesto ou mesmo nenhum efeito na densidade eletrônica do catecol ou anel de pirogalol.

[0103] Em uma modalidade, os dados obtidos com ensaios TAC são consistentes com o esquema redox do AntiOxBENs. Em geral, os resultados reforçam a suposição de que o número de substituintes hidroxila presentes no anel aromático benzoico está diretamente relacionado com as propriedades antioxidantes e eletroquímicas.

[0104] Em uma modalidade, e como um exemplo, as propriedades lipofílicas AntiOxBEN1 e AntiOxBEN2 foram avaliadas por meio de voltametria de pulso diferencial (VPD) em pH fisiológico. A técnica usada é frequentemente usada para imitar a transferência de drogas iônicas através de membranas biológicas, pois o processo ocorre na interface entre duas soluções eletrolíticas imiscíveis (ITIES). O potencial de transferência (Etr) no qual o fármaco iônico, inicialmente presente na fase aquosa (C = 0,32 mM), é transferido para a fase de 1,6-diclorohexano (DCH) é medido por voltametria de pulso diferencial (VPD).

[0105] No modelo ITIES, o potencial de transferência (Etr) torna-se menos positivo com o aumento do caráter lipofílico do fármaco.

[0106] Em uma modalidade, e como um exemplo, os potenciais de transferência AntiOxBEN1 e AntiOxBEN2 (Etr) foram de 0,405 V e 0,495 V, respectivamente. A partir dos dados concluiu-se que a presença de uma função OH extra em AntiOxBEN2 (antioxidante direcionado para mitocôndrias com base em ácido gálico) aumentou a hidrofilicidade em comparação com AntiOxBEN1 (antioxidante direcionado para mitocôndrias baseado em ácido protocatecuico), que foi traduzido em um aumento de o potencial de transferência. Como esperado, devido à sua hidrofilicidade, os ácidos hidroxibenzoicos não permeiam.

[0107] Em uma modalidade, e como um exemplo, propriedades quelantes AntiOxBENs, nomeadamente a sua capacidade de quelar o ferro, foram determinadas. O ferro é um metal redox ativo que pode catalisar as reações de Fenton e Haber-Weiss gerando radicais hidroxila (•OH), que é uma forte espécie oxidante que está ligada a eventos de dano oxidativo com graves implicações para a saúde e doença humana. Observa-se que a perda da homeostase do ferro mitocondrial e a consequente sobrecarga de ferro podem contribuir para a disfunção mitocondrial e, por sua vez, para diferentes patologias.

[0108] Assim, o uso de agentes quelantes de metais, ou antioxidantes que operam por este ou mais de um mecanismo, pode funcionar como uma abordagem terapêutica para prevenir a toxicidade induzida por metais. Os antioxidantes fenólicos que podem atuar através de uma combinação de diferentes mecanismos de ação, nomeadamente capturando espécies reativas deletérias, por doação de hidrogênio e/ou transferência eletrônica e/ou por quelação de metais de transição pró-oxidantes (nomeadamente Cu e Fe) podem ser o maior significado.

[0109] Em uma modalidade, a capacidade de quelação de ferro (II) do novo AntiOxBENs foi avaliada pelo ensaio de ferrozina usando EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) como referência. As propriedades quelantes de ferro dos ácidos protocatecuico e gálico e MitoQ, um antioxidante mitocondriotrópico, também foram avaliadas (Figura 2). O EDTA foi capaz de quelar todo o ferro disponível em solução, pois pode inibir completamente a formação do complexo colorido de ferrozina-fe (II).

[0110] Em uma modalidade, o AntiOxBENs (série catecol ou pirogalol) e os ácidos hidroxibenzoicos, em oposição ao MitoQ, foram capazes de quelar ferro ferroso (Figura 2). Os ácidos hidroxibenzoicos (ácidos protocatecoicos e gálicos) foram capazes de quelar o ferro eficientemente; no entanto, aqueles que apresentam uma porção pirogalol foram mais eficazes. Os AntiOxBENs (série catecol ou pirogalol) também foram capazes de quelar ferro ferroso, sendo os que apresentam uma porção pirogalol mais eficaz. As propriedades quelantes dos AntiOxBENs parecem ser, até certo ponto, afetadas pela introdução do espaçador de cátions TPP, quando comparados com os respectivos precursores. No entanto, o AntiOxBEN2 e o AntiOxBEN3 foram capazes de quelar mais de 80% do ferro total presente na solução.

[0111] Em uma modalidade, e diante da potente capacidade antioxidante e da propriedade quelante de ferro de AntiOxBENs, prevê-se que esses antioxidantes inovadores possam levar, após um programa de otimização de descoberta de fármacos, a um candidato a fármaco que possa ser aplicado para mitigar os efeitos da sobrecarga de ferro mitocondrial e/ou reduzir os estoques de ferro mitocondrial em doenças e condições relacionadas ao estresse oxidativo.

[0112] Em uma modalidade, e como um exemplo, a absorção mitocondrial de alguns AntiOxBENs foi avaliada em mitocôndrias isoladas de fígado de rato (RLM) em resposta ao potencial de membrana. AntiOxBENs podem se acumular dentro das mitocôndrias dirigidas pelo Δ^ (Figura 3A). Diferentes contornos de acumulação de AntiOxBENs dentro da matriz mitocondrial foram medidos. Verificou-se que o processo está relacionado com o incremento do comprimento do espaçador e do padrão de substituição aromática (Figura 3B). A pequena razão de acumulação observada para o derivado de pirogalol AntiOxBEN2 foi significativamente melhorada pelo incremento do comprimento do espaçador. A seguinte ordem de classificação foi obtida: AntiOxBEN2 < AntiOxBEN1 < AntiOxBEN3. Todos os AntiOxBENs apresentam uma taxa de acumulação comparável à da MitoQ (Figura 3B).

[0113] As membranas mitocondriais possuem uma alta concentração de ácidos graxos poli-insaturados que são particularmente propensos à oxidação, pois estão localizados próximos aos locais produtores de ERO.

[0114] Em uma modalidade, e como um exemplo, o desempenho antioxidante de AntiOxBENs, na proteção da peroxidação lipídica de membranas de RLM foi determinado. Dois agentes estressores oxidativos diferentes, FeSO4/ H2O2/ascorbato e ADP/FeSO4, e dois pontos de extremidade, produção de TBARS e consumo de oxigênio, respectivamente, foram usados. MitoQ foi usado como referência (Figuras 4 e 5).

[0115] Em uma modalidade, ácido gálico, AntiOxBEN2 e AntiOxBEN3, no ensaio FeSO4/H2O2/ascorbato, foram os mais eficazes derivados benzoicos mitocondriotrópicos na prevenção da peroxidação lipídica das mitocôndrias (Figura 4A). AntiOxBEN1 e ácido protocatecuico não foram eficazes na prevenção da formação de TBARS em RLM (Figura 4A). No ensaio de ADP/FeSO4, nenhum dos AntiOxBENs preveniu de maneira eficaz a peroxidação lipídica (Figuras 4B e 5). A capacidade de AntiOxBENs vs MitoQ inibir a peroxidação lipídica em RLM diminuiu na ordem MitoQ >> AntiOxBEN3 ~ ácido gálico ~ AntiOxBEN2 > AntiOxBENi ~ ácido protocatecuico. Em geral, AntiOxBENs à base de pirogalol (Figuras 4 e 5) foram mais eficazes em retardar o processo de membrana de peroxidação lipídica.

[0116] Em uma modalidade, e como um exemplo, foram avaliados os efeitos de alguns AntiOxBENs na abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP).

[0117] Em geral, os AntiOxBENs testados não tiveram nenhum efeito per se sobre a abertura do mPTP para todas as concentrações testadas.

[0118] Em uma modalidade, verificou-se que o AntiOxBEN3, mas não o AntiOxBEN1 e o AntiOxBEN2 e a MitoQ, causaram uma inibição dependente da concentração da abertura do mPTP dependente de cálcio (Figuras 6A a C). Esse efeito foi comparável ao da ciclosporina A (1 μM), um dessensibilizante clássico de PTP, e pode estar relacionado à sua atividade antioxidante ou a uma possível quelação de íons cálcio. Essa propriedade pode ser de interesse terapêutico, por exemplo, para prevenir e tratar a rejeição enxerto versus hospedeiro em transplantes, que normalmente envolvem a ruptura mitocondrial no enxerto.

[0119] Como o metabolismo celular depende da função mitocondrial ideal, os efeitos dos compostos nos parâmetros funcionais das mitocôndrias podem fornecer informações sobre seu perfil de toxicidade. Assim, sua capacidade de induzir disfunção mitocondrial por danificar a membrana mitocondrial interna ou por inibir a cadeia respiratória, a síntese de ATP, o processo de poro de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP) ou a maquinaria de exportação foi avaliada.

[0120] Em uma modalidade, e como um exemplo, os efeitos de toxicidade de alguns AntiOxBENs e MitoQ na bioenergética mitocondrial, ou seja, nos parâmetros Δ^ de RLM e respiração, foram medidos. O ΔΦ representa o principal componente do gradiente eletroquímico gerado pela respiração mitocondrial e é responsável por mais de 90% da energia total disponível. Para ensaios de respiração mitocondrial, glutamato/malato (para complexo I) e succinato (para complexo II) foram usados como substratos. Além disso, o índice de acoplamento da fosforilação oxidativa mitocondrial, conhecido como relação de controle respiratório (RCR, respiração estado 3/estado 4) e índice ADP/O (o acoplamento entre a síntese de ATP e consumo de oxigênio) também foram calculados.

[0121] AntiOxBENs e MitoQ foram testados em concentrações relevantes para o antioxidante, sendo 10 μM a concentração mais alta.

[0122] Em uma modalidade, os dados bioenergéticos mitocondriais obtidos para MitoQ foram mostrados na Tabela 2. Os resultados obtidos foram usados para análise comparativa. TABELA 2. Efeito de MitoQ em bioenergética mitocondrial: razão de controle respiratório mitocondrial (RCR), eficiência do sistema fosforilativo (ADP/O) e potencial transmembrana mitocondrial (ΔΦ). *, **, ***, **** ESTATISTICAMENTE SIGNIFICATIVO EM COMPARAÇÃO COM O CONTROLE USANDO O TESTE T DE DUAS CAUDAS DE STUDENT.

[0123] Em uma modalidade, observou-se que MitoQ, para todas as concentrações testadas, causou uma diminuição significativa dos parâmetros de RCR e ADP/O (Tabela 2). Além disso, quando o RLM foi incubado com concentrações de MitoQ até 2,5 μM um aumento no estado 2, estado 4 e respiração inibida por oligomicina e uma diminuição no estado 3 e respiração desacoplada por FCCP, usando glutamato/malato como substrato foi observado (Figura 7A). Ao utilizar succinato, os RLM foram completamente desacoplados na presença de MitoQ na maior concentração testada (Figura 7B). A incubação com concentrações crescentes de MitoQ resultou em uma diminuição progressiva do máximo ΔΦ obtido na energização (Tabela 2). Δ^ colapso após a adição de ADP foi observada com 10 μM MitoQ, uma vez que não ocorreu repolarização após despolarização induzida por ADP (Tabela 2).

[0124] Em uma modalidade, e como um exemplo, a maior concentração utilizada nos estudos de toxicidade de AntiOxBENs foi aquela em que MitoQ interrompeu completamente a bioenergética mitocondrial. Os dados dos estudos de toxicidade de AntiOxBENs são mostrados nas Tabelas 3 a 5.

[0125] Em uma modalidade, e como um exemplo, o AntiOxBENs, após energização com glutamato/malato, causou uma leve despolarização dependente de dose ΔD (10 a 20 mV), enquanto promoveu uma leve hiperpolarização de 5 a 20 mV sob energização com succinato. Ainda assim, é importante observar que os AntiOxBENs não afetam significativamente o ΔD de RLM. TABELA 3. Efeito do AntiOxBEN1 na bioenergética mitocondrial: relação de controle respiratório mitocondrial (RCR), eficiência do sistema fosforilativo (ADP/O) e potencial transmembrana mitocondrial (ΔΦ). *, **, **** ESTATISTICAMENTE SIGNIFICATIVO EM COMPARAÇÃO COM O CONTROLE USANDO O TESTE T DE DUAS CAUDAS DE STUDENT.

TABELA 4. Efeito do AntiOxBEN2 na bioenergética mitocondrial: razão de controle respiratório mitocondrial (RCR), eficiência do sistema fosforilativo (ADP/O) e potencial transmembrana mitocondrial (ΔΦ). *, **, **** ESTATISTICAMENTE SIGNIFICATIVO EM COMPARAÇÃO COM O CONTROLE USANDO O TESTE T DE DUAS CAUDAS DE STUDENT.

TABELA 5. Efeito do AntiOxBEN3 na bioenergética mitocondrial: relação de controle respiratório mitocondrial (RCR), eficiência do sistema fosforilativo (ADP/O) e potencial transmembrana mitocondrial (ΔΦ). *, **, **** ESTATISTICAMENTE SIGNIFICATIVO EM COMPARAÇÃO COM O CONTROLE USANDO O TESTE T DE DUAS CAUDAS DE STUDENT.

[0126] Em uma modalidade, e como exemplo, as taxas de AntiOxBENs e MitoQ para estado 2, estado 3, estado 4, ensaios de respiração mitocondrial e respiração inibida por oligomicina e succinato (foi usado como respiração estimulada por substrato FCCP) são mostrados nas Figuras 7A e B.

[0127] Em uma modalidade, verificou-se que os AntiOxBENs induziram alterações na cadeia respiratória de maneira dose-dependente. Em geral, os AntiOxBENs aumentaram o estado 2, estado 4 e a respiração inibida pela oligomicina em concentrações superiores a 2,5 μM em um processo que é principalmente dependente de sua lipofilicidade e não depende de seu padrão aromático (catecol vs pirogalol). No entanto, deve-se ressaltar que os efeitos observados foram mais aparentes usando substratos de complexo I. (Figuras 7A e B).

[0128] Em uma modalidade, e como um exemplo, foi demonstrado que AntiOxBENs induziram alterações dose-dependentes no perfil respiratório do RLM isolado. Alguns dos efeitos observados podem provavelmente resultar de um efeito de permeabilização da membrana ou de uma atividade de transporte de prótons. Esse efeito pode levar à estimulação da respiração de não fosforilação e a uma pequena despolarização ΔΦ. Consequentemente, o AntiOxBENs, para todas as concentrações testadas, causou uma diminuição significativa do RCR. Além disso, o AntiOxBENs (10 μM) também afetou o sistema fosforilativo mitocondrial, avaliado por alterações na razão ADP/O.

[0129] Em uma modalidade, a toxicidade mitocondrial de AntiOxBENs observada em concentrações mais elevadas pode estar associada à lipofilicidade do espaçador e/ou à presença de uma porção de TPP e tem pouca, se alguma, relação com o seu (catecol vs pirogalol). Ainda assim, a presença do cátion TPP e de um espaçador lipofílico é essencial para um acúmulo mitocondrial eficiente e algumas vezes extensivo.

[0130] Em uma modalidade, e como um exemplo, verificou-se que em altas concentrações, os antioxidantes direcionados às mitocôndrias, AntiOxBENs e MitoQ, podem romper a respiração mitocondrial causando danos na membrana mitocondrial interna ou inibindo a cadeia respiratória, síntese de ATP ou maquinaria de exportação.

[0131] Em uma modalidade, deve-se ressaltar que MitoQ inibiu efetivamente a peroxidação lipídica em RLM a 5 μM (Figuras 4 e 5), mas causou toxicidade no aparato bioenergético mitocondrial de RLM a 2,5 μM (Figuras 7A e B e Tabela 2).

[0132] Em uma modalidade, concluiu-se que, para os AntiOxBENs em estudo, a toxicidade de RLM foi detectada em concentrações maiores que as necessárias para exercer efeito antioxidante, independentemente de seu mecanismo.

[0133] Em uma modalidade, e como um exemplo, concluiu-se que, em geral, os AntiOxBENs apresentaram um perfil de segurança melhor que o MitoQ.

[0134] Em uma modalidade, e como um exemplo, a citotoxicidade do AntiOxBENs foi avaliada usando culturas em monocamada de hepatócitos humanos de carcinoma hepatocelular (HepG2) e método SRB (Figura 8). A partir dos dados, concluiu-se que os AntiOxBENs exibiram baixa toxicidade para as células HepG2 (Figura 8). Embora o AntiOxBEN1 promova uma pequena inibição da proliferação celular para concentrações mais baixas, em concentrações superiores a 100 μM estimulou a proliferação celular.

[0135] Notavelmente, em concentrações inferiores a 250 μM, o AntiOxBEN2 estimulou significativamente a proliferação celular, enquanto em concentrações superiores a 250 μM, inibiu significativamente a proliferação celular. AntiOxBEN3, em concentrações superiores a 250 μM, inibiu significativamente a proliferação celular.

[0136] Em uma modalidade, e como um exemplo, concluiu-se que a toxicidade de AntiOxBENs, com base em suas propriedades (Tabela 1) e taxas de acumulação de RLM (Figura 3), pode ser mediada pela lipofilia dos compostos. Em geral, os AntiOxBENs têm uma margem de segurança para as células HepG2.

[0137] Em uma modalidade, e como um exemplo, concluiu-se que as modificações estruturais dos ácidos benzoicos (ácidos protocatecuicos e gálicos) levaram a uma melhora significativa de suas propriedades mitocondriotrópicas. AntiOxBENs têm atividade antioxidante aumentada, maior acúmulo mitocondrial e menor toxicidade.

[0138] Em uma modalidade, os resultados globais mostraram que os AntiOxBENs se acumulam dentro das mitocôndrias impulsionadas pelo potencial elétrico transmembrana da organela e evitam a peroxidação lipídica, exibindo baixa toxicidade intrínseca. AntiOxBENs apresentam uma maior lipofilicidade que seus compostos originais, por exemplo, ácido protocatecuico e ácido gálico, e propriedades antioxidantes e quelantes de ferro semelhantes.

[0139] Em uma modalidade, AntiOxBENs são antioxidantes mitocondriotrópicos que têm como objetivo prevenir ou retardar o estresse oxidativo mitocondrial associado ao envelhecimento e várias patologias, como diabetes, doença hepática gordurosa não alcoólica, doenças cardiovasculares, pancreatite aguda e doenças neurodegenerativas, incluindo doença de Alzheimer ou Parkinson, e esclerose lateral amiotrófica.

[0140] Em uma modalidade, e da série AntiOxBENs usada como exemplo, os análogos baseados em pirogalol são considerados candidatos potenciais para o desenvolvimento de fármacos de primeira classe com aplicação terapêutica em distúrbios relacionados à oxidação mitocondrial.

[0141] Exemplos de procedimentos sintéticos seguidos para obter e um número de intermediários e AntiOxBENs são fornecidos.

[0142] Em uma modalidade, a caracterização estrutural dos compostos foi alcançada por métodos espectrométricos de análise. Os espectros de RMN de 1H e 13C foram adquiridos à temperatura ambiente e registrados em um Bruker Avance III operando a 400 e 100 MHz, respectivamente. Os desvios químicos são expressos em valores de δ (ppm) em relação ao tetrametilsilano (TMS) como referência interna e as constantes de acoplamento (J) são dadas em Hz. As atribuições também foram feitas a partir de DEPT (realce sem distorção por transferência de polarização) (valores sublinhados). Os espectros de massa (MS) foram registrados em um aparelho Bruker Microtof (ESI) ou Varian 320-MS (EI) e referidos em m/z (% relativa) de fragmentos importantes.

[0143] Em uma modalidade, o progresso da reação foi avaliado por cromatografia em camada delgada (TLC) em placas de sílica gel de alumínio 60 F254 (Merck, Darmstadt, Alemanha) em diclorometano, acetato de etila e diclorometano/metanol, em várias proporções. Os pontos foram detectados usando detecção UV (254 e 366 nm). A cromatografia flash em coluna foi realizada utilizando sílica gel 60 (0,040 a 0,063 mm) (Carlo Erba Reactifs - SDS, França).

[0144] Em uma modalidade, a obtenção de AntiOxBEN1 e AntiOxBEN2 foi realizada seguindo uma estratégia sintética de quatro etapas descrita na Figura 1A. Em primeiro lugar, os compostos intermediários 3 e 4 foram sintetizados como se segue: ácido 3,4- dimetoxibenzoico (1), ou ácido 3,4,5-trimetoxibenzoico (2), em particular 1 mmol, foi dissolvido em diclorometano, em particular em 40 ml de diclorometano e foi adicionada trietilamina, em particular em 2 mmol de trietilamina. Etilcloroformato, em particular 2 mmol de etilcloroformato foi adicionado gota a gota à solução agitada, mantida em um banho de gelo. Após agitação, em particular durante 2 h à temperatura ambiente, a mistura foi novamente arrefecida e adicionou-se 6-amino-hexan-1-ol, em particular 2 mmol de 6-amino-hexan-1-ol. A reação foi agitada, em particular durante 10 h à temperatura ambiente. A mistura foi extraída com diclorometano, em particular 3 x 20 ml.

[0145] As fases orgânicas foram combinadas, lavadas com água, NaHCO3 a 5%, em particular 20 ml de NaHCO3 a 5% e HCl 1M, em particular 20 ml de HCl 1M. As fases orgânicas foram combinadas, secas e, após filtração, o solvente foi evaporado para obter um resíduo branco. A reação foi seguida por TLC, em particular gel de sílica, acetato de etila.

[0146] Em uma modalidade, a caracterização de N-(6-hidroxihexil)-3,4- dimetoxibenzamida (3) é conforme a seguir: rendimento de 74%; 1H RMN (400 MHz, CDCls): δ = 1,39 - 1,41 (4H, m, (CH2)2(CH2)2OH), 1,55 - 1,63 (4H, m, NCH2CH2(CH2)2CH2), 1,99 (1H, s, OH), 3,40 - 3,45 (2H, m, NCH2), 3,63 (2H, t, J = 6,5 Hz, CH2OH), 3,91 (6H, s, 2 □ OCH3), 6,38 (1H, t, J = 5,2 Hz, CONH), 6,85 (1H, d, J = 8,4 Hz, H(5)), 7,29 (1H, dd, J = 8,4 Hz, J = 2,0 Hz, H(6)), 7,43 (1H, d, J = 2,0 Hz, H(2)). 13C RMN (100 MHz, CDCI3): δ = 25,4 (CH2(CH2)2OH), 26,7 (N(CH2)2CH2), 29,8 (NCH2CH2), 32,6 (CH2CH2OH), 40,0 (NCH2), 56,1 (2 x OCH3), 62,7 (CH2OH), 110,4 (C(5)), 110,7 (C(2)), 119,4 (C(6)), 127,5 (C(1)), 149,0 (C(3)), 151,7 (C(4)), 167,3 (CONH). EI-MS m/z (%): 281 (M«+), 208 (16), 195 (21), 194 (100), 180 (16), 165 (75), 164 (55), 121 (15).

[0147] Em uma modalidade, a caracterização de N-(6-hidroxihexil)-3,4,5- trimetoxibenzamida (4) é conforme a seguir: rendimento de 82%; 1H RMN (400 MHz, CDCls): δ = 1,40 - 1,43 (4H, m, (CH2)2(CH2)2OH), 1,54 - 1,66 (4H, m, NCH2CH2(CH2)2CH2), 1,81 (1H, s, OH), 3,41 - 3,46 (2H, m, NCH2), 3,64 (2H, t, J = 6,4 Hz, CH2OH), 3,87 (3H, s, OCH3), 3,89 (6H, s, 2x OCH3), 6,28 (1H, t, J = 5,1 Hz, CONH), 7,00 (2H, s, H(2) e H(6)); 13C RMN (100 MHz, CDCh): δ = 25,4 (CH2(CH2)2OH), 26,7 (NCH2CH2CH2), 29,8 (NCH2CH2), 32,6 (CH2CH2OH), 40,1 (NCHz), 56,4 (2x OCH3), 61,0 (OCH3), 62,8 (CH2OH), 104,5 (C(2) e C(6)), 130,4 (C(1)), 140,9 (C(4)), 153,3 (C(3) e C(5)), 167,5 (CONH) e EI-MS m/z (%): 312 (M«+), 225 (38), 224 (34), 211 (59), 196 (49), 195 (100).

[0148] Em uma modalidade, o procedimento sintético geral para obtenção dos compostos bromohexilbenzamidas 5 e 6 é o seguinte: N-(6-hidroxihexil)-3,4- dimetoxibenzamida (3), ou N-(6-hidroxi- hexil)-3,4,5-trimetoxibenzamida (4), em particular 1 mmol de hidroxi-hexilbenzamida 3, ou hidroxi-hexilbenzamida 4, e 1, 2- dibromotetracloroetano, em particular 1 mmol de 1, 2-dibromotetracloroetano foi dissolvido em THF, em particular em 20 ml de THF. Após adicionar 1,2-bis(difenilfosfina) etano (difos), em particular 0,5 mmol, a reação foi agitada, em particular à temperatura ambiente durante 20 horas. Em seguida, a mistura reacional foi filtrada, em particular através de uma almofada de Celite. Após evaporação do filtrado, obteve-se um resíduo oleoso. O óleo foi purificado, em particular por cromatografia flash em sílica gel usando acetato de etila como sistema de eluição. As frações contendo o composto pretendido foram recolhidas, o solvente foi evaporado e os produtos foram recristalizados em n- hexano. A reação foi seguida por TLC, em particular gel de sílica, acetato de etila.

[0149] Em uma modalidade, a N-(6-bromohexil)-3,4-dimetoxibenzamida (5) é caracterizada conforme a seguir: rendimento de 66%; 1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ = 1,38 - 1,53 (4H, m, (CH2)2(CH2)2Br), 1,59 - 1,67 (2H, m, NCH2CH2), 1,83 - 1,90 (2H, m, CH2CH2Br), 3,39 - 3,46 (4H, m, NCH2(CH2)4CH2Br), 3,92 (6H, s, 2 □ OCH3), 6,25 (1H, t, J = 5,4 Hz, CONH), 6,85 (1H, d, J = 8,4 Hz, H(5)), 7,27 (1H, dd, J = 8,4 Hz , J = 2,0 Hz, , H(6)), 7,43 (1H, d, J = 2,0 Hz, H(2)); 13C RMN (100 MHz, CDCh): δ = 26,2 (NCH2CH2CH2), 28,0 (CH2(CH2)2Br), 29,7 (NCH2CH2), 32,7 (CH2CH2Br), 33,9 (CHzBr), 40,0 (NCH2), 561 (OCH3 □ 2), 110,3 (C(5)), 110,7 (C(2)), 119,2 (C(6)), 127,5 (C(1)), 149,1 (C(3)), 151,7 (C(4)), 167,2 (CONH) e EI-MS m/z (%): 345 (M«+), 343 (24), 264 (36), 195 (34), 194 (19), 181 (40), 166 (24), 165 (100).

[0150] Em uma modalidade, a N-(6-bromohexil)-3,4,5-trimetoxibenzamida (6) é caracterizada conforme a seguir: rendimento de 75%; 1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ = 1,37 - 1,52 (4H, m, (CH2)2(CH2)2Br), 1,59 - 1,66 (2H, m, NCH2CH2), 1,83 - 1,90 (2H, m, CH2CH2Br), 3,39 - 3,45 (4H, m, NCH2(CH2)4CH2Br), 3,87 (3H, s, OCH3), 3,88 (6H, s, 2 x OCH3), 6,40 (1H, t, J = 5,3 Hz, CONH), 7,01 (2H, s, H(2) e H(6)); 13C RMN (100 MHz, CDCls): δ = 26,2 (NCH2CH2CH2), 27,9 (CH2(CH2)2Br), 29,6 (NCH2CH2), 32,6 (CH2CH2Br), 33,9 (CH2Br), 40,1 (NCH2), 56,4 (2x OCH3), 61,0 (OCH3), 104,4 (C(2) e C(6)), 130,3 (C(1)), 140,8 (C(4)), 153,2 (C(3) e C(5)), 167,3 (CONH) e EM/EI m/z (%): 374 (M«+), 372 (15), 225 (18), 224 (100), 210 (18), 195 (32), 194 (48).

[0151] Em uma modalidade, a bromohexilbenzamida 5 ou 6 (1 mmol) foi misturada com trifenilfosfina (PPh3) (1 mmol) em um balão de fundo redondo e aquecida a uma temperatura de aproximadamente 120 ° C por 48 horas. O resíduo foi purificado por cromatografia flash em sílica gel usando eluição gradiente (acetato de etila: metanol). As frações contendo o composto desejado foram recolhidas e o solvente foi evaporado até à secura. A reação foi seguida por TLC (sílica gel, acetato de etila: metanol (9: 1) e diclorometano: metanol (9:1)).

[0152] Em uma modalidade, o brometo de 6-(3,4-dimetoxibenzamido)hexiltrifenilfosfônio (7) é caracterizado conforme a seguir: rendimento de 65%; 1H RMN (400 MHz, CD3OD): δ = 1,40 - 1,72 (8H, m, NCH2(CH2)4), 3,33 - 3,37 (2H, m, CH2P+Ph3), 3,42 - 3,49 (2H, m, NCH2), 3,83 (6H, s, 2 □ OCH3), 6,98 (1H, d, J = 8,5 Hz, H(5)), 7,46 (1H, d, J = 2,1 Hz, H(2)), 7,49 (1H, dd, J = 8,5, J = 2,1 Hz, Hz, H(6)), 7,73 - 7,89 (15H, m, PPh3); 13C RMN (100 MHz, CD3OD): δ = 22,7 (d, JCP = 51,0 Hz, CH2P+Ph3), 23,5 (d, JCP = 4,3 Hz, CH2(CH2)2P+Ph3), 27,2 (CH2(CH2)3P+Ph3), 30,3 (NCH2CH2), 31,2 (d, JCP = 16,3 Hz, CH2CH2P+Ph3), 40,8 (NCH2), 56,7 (2 □ OCH3), 112,0 (C(5)), 112,2 (C(2)), 120,0 (d, JCP = 86,2 Hz, C(1’)), 122,0 (C(6)), 128,1 (C(1)), 131,6 (d, JCP = 12,6 Hz, C(3’) e C(5’)), 134,9 (d, JCP = 10,0 Hz, C(2’) e C(6’)), 136,3 (d, JCP = 3,0 Hz, C(4’)), 150,2 (C(3)), 153,4 (C(4)), 169,5 (CONH) e EI-MS m/z (%): 511 (M«+), 277 (37), 263 (40), 262 (100), 183 (87), 165 (47), 151 (35), 108 (44), 107 (29), 77 (26), 52 (26).

[0153] Em uma modalidade, o brometo de 6-(3,4,5- trimetoxibenzamido)hexiltrifenilfosfônio (8) é caracterizado conforme a seguir: rendimento de 79%; 1H RMN (400 MHz, CD3OD): δ = 1,41 - 1,73 (8H, m, NCH2(CH2)4), 3,37 - 3,40 (2H, m, CH2P+Ph3), 3,50 - 3,56 (2H, m, NCH2), 3,94 (3H, s, OCH3), 3,95 (9H, s, 2 □ OCH3), 7,28 (2H, s, H(2) e H(6)), 7,75 - 7,90 (15H, m, PPhβ); 13C RMN (100 MHz, CD3OD): δ = 22,5 (d, JCP = 50,8 Hz, CH2P+Ph3), 23,3 (d, JCP = 4,0 Hz, CH2(CH2)2P+Ph3), 27,1 (CH2(CH2)3P+Ph3), 30,0 (NCH2CH2), 30,9 (d, JCP = 16,2 Hz, CH2CH2P+Ph3), 40,6 (NCH2), 57,0 (2x OCH3), 61,1 (OCH3), 106,0 (C(2) e C(6)), 119,7 (d, JCP = 86,1 Hz, C(1’)), 130,8 (C(1)), 131,4 (d, JCP = 12,5 Hz, C(3’) e C(5’)), 134,7 (d, JCP = 10,0 Hz, C(2’) e C(6’)), 136,1 (d, JCP = 2,8 Hz, C(4’)), 141,6 (C(4)), 154,1 (C(3) e C(5)), 168,7 (CONH) e EI-MS m/z (%): 448 (M«+), 446 (41), 278 (35), 277 (81), 276 (27), 275 (58), 263 (29), 262 (100), 185 (31), 184 (25), 183 (94), 152 (21), 108 (36), 96 (53), 94 (54), 77 (24), 58 (41).

[0154] Em uma modalidade, o sal trifenilfosfônio 7, ou 8, em particular 1 mmol de sal trifenilfosfônio 7, ou 1 mmol de sal trifenilfosfônio 8, foi dissolvido em diclorometano anidro, em particular em 15 ml de diclorometano anidro. A mistura reacional foi agitada sob argônio e arrefecida a uma temperatura abaixo de -70 °C. Tribrometo de boro, em particular 5 a 7 mmol de tribrometo de boro, solução 1 M em diclorometano, foi adicionado à solução e a reação foi mantida, em particular a -70 °C durante 10 minutos.

[0155] Depois de atingir a temperatura ambiente, a reação foi continuada durante 12 horas. Depois disso, a reação foi terminada por adição cuidadosa de água, em particular 40 ml de água. Após a remoção da água, o produto resultante foi dissolvido em metanol e seco, filtrado e o solvente foi evaporado. O resíduo foi purificado, em particular por cromatografia flash em sílica gel utilizando eluição gradiente, em particular diclorometano: metanol. As frações contendo o composto desejado foram recolhidas e o solvente foi evaporado até à secura. A reação foi seguida por TLC, em particular gel de sílica, diclorometano: metanol (9:1). O resíduo resultante foi cristalizado a partir de éter etílico/metanol para render o sal de brometo de trifenilfosfônio correspondente.

[0156] Em uma modalidade, a caracterização estrutural do brometo de 6-(3,4-di- hidroxibenzamido)hexiltrifenilfosfônio (AntiOxBEN1) foi a seguinte: rendimento de 60%; 1H RMN (400 MHz, CD3OD): δ = 1,35 - 1,47 (2H, m, N(CH2)4CH2), 1,50 - 1,75 (6H, m, NCH2(CH2)3), 3,33 - 3,47 (4H, m, NCH2(CH2)4CH2P+Ph3), 6,79 (1H, d, J = 8,3 Hz, H(5)), 7,18 (1H, dd, J = 8,3 Hz, J = 2,2 Hz, H(6)), 7,26 (1H, d, J = 2,2 Hz, H(2)), 7,69 - 7,92 (15H, m, PPh3); 13C RMN (100 MHz, CD3OD): δ = 22,7 (d, JCP = 51,2 Hz, CH2P+Ph3), 23,4 (d, JCP = 4,5 Hz, CH2(CH2)2P+Ph3), 27,0 (CH2(CH2)3P+Ph3), 30,1 (NCH2CH2), 31,0 (d, JCP = 16,2 Hz, CH2CH2P+Ph3), 40,0 (NCH2), 115,7 (C(5)), 115,8 (C(2)), 120,0 (d, JCP = 86,4 Hz, C(1’)), 120,5 (C(6)), 126,9 (C(1)), 131,5 (d, JCP = 12,5 Hz, C(3’) e C(5’)), 134,8 (d, JCP = 9,9 Hz, C(2’) e C(6’)), 136,3 (d, JCP = 3,0 Hz, C(4’)), 146,3 (C(3)), 150,1 (C(4)), 170,3 (cONH) e ME/ESI m/z (%): 499 (M++H- Br, 51), 498 (M+-Br, 98), 399 (31), 397 (31), 291 (100), 277 (67).

[0157] Em uma modalidade, a caracterização estrutural do brometo de 6-(3,4,5-tri- hidroxibenzamido)hexiltrifenilfosfônio (AntiOxBEN2) é conforme a seguir: rendimento de 50 %; 1H RMN (400 MHz, DMSO): δ = 1,23 - 1,50 (8H, m, NCH2(CH2)4), 3,11 - 3,16 (2H, m, CH2P+Ph3), 3,54 - 3,59 (2H, m, NCH2), 6,81 (2H, s, H(2) e H(6)), 7,74 - 7,91 (15H, m, PPh3), 8,00 (1H, t, J = 5,1 Hz, CONH); 13C RMN (100 MHz, DMSO): δ = 20,2 (d, JCP = 49,8 Hz, CH2P+Ph3), 21,8 (d, JCP = 4,1 Hz, CH2(CH2)2P+Ph3), 25,6 (CH2(CH2)3P+Ph3), 28,9 (NCH2CH2), 29,6 (d, JCP = 16,6 Hz, CH2CH2P+Ph3), 38,9 (NCH2), 106,7 (C(2) e C(6)), 118,6 (d, JCP = 85,6 Hz, C(1’)), 125,1 (C(1)), 130,3 (d, JCP = 12,4 Hz, C(3’) e C(5’)), 133,6 (d, JCP = 10,1 Hz, C(2’) e C(6’)), 134,9 (d, JCP = 2,7 Hz, C(4’)), 136,1 (C(4)), 145,4 (C(3) e C(5)), 166,3 (CONH) e ME/ESI m/z (%): 526 (M++Na- Br, 62), 515 (M++H- Br, 30), 514 (M+-Br, 100), 277 (24).

[0158] Em uma modalidade, o AntiOxBEN3 foi realizado seguindo uma estratégia sintética de quatro etapas descrita na Figura 1B. Em primeiro lugar, o ácido 3,4,5- trimetoxibenzoico (2), (500 mg, 2,3 mmol) foi dissolvido em DMF (3,9 ml) a 4 °C e depois N, N-dietilpropan-2-amina (0,421 ml, 2,3 mmol) e pyBOp (1.668 mg, 2,3 mmol) em CH2Cl2 (3,9 ml) foram adicionados. A mistura foi mantida em banho de gelo e agitada durante meia hora. Após este período, foi adicionado carbamato de terc-butil (6-amino- hexil) (0,529 ml, 2,3 mmol) e a mistura foi deixada aquecer até à temperatura ambiente.

[0159] A reação foi mantida com agitação durante 18 horas. Depois a mistura foi diluída com diclorometano (20 ml) e lavada com solução saturada de NaHCO3 (2x10 ml). A fase orgânica foi seca sobre Na2SO4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia flash (50% de AcOEt/ éter de petróleo) e obteve-se um rendimento de 73%.

[0160] Em uma modalidade, a caracterização estrutural do composto terc-butil (6-(3,4,5- trimetoxibenzamido)hexil)carbamato) (9) foi conforme a seguir: 1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ = 7,07 (2H, s, H5, H6), 6,55 (1H, s, H1’), 4,59 (1H, s, H8’), 3,91 (6H, s, 2XOCH3), 3,88 (3H, s, OCH3), 3,43 (2H, dd, J = 13,0, 6,9 Hz, H2’), 3,13 (1H, dd, J = 12,6, 6,2 Hz, H7’), 1,67 - 1,58 (2H, m, H3’), 1,53 - 1,32 (15H, m, H4’, H5’, H6’, NHCOOC(CH3)); e 13C RMN (100 MHz, CDCI3): δ = 167,3 (CONH), 156,3 (NHCOOC(CH3)), 153,3 (C3, C5), 140,9 (C4), 130,4 (C1), 104,5 (C2, C6), 79,3 (NHCOOC(CHa)), 61,0 (OCH3), 56,4 (2XOCH3), 40,0 (C7‘), 39,7 (C1’), 30,2 (C2’), 29,5 (C6’), 28,5 (NHCOOC(CHe)), 261 (C3’), 25,8 (C4’).

[0161] Em uma modalidade, a síntese de N-(6-aminohexil)-3,4,5-trimetoxibenzamida (10) foi conforme a seguir: a etapa de desproteção foi realizada adicionando-se TFA (4 ml) a uma solução de 9 (1 g, 2,4 mmol) em CH2Cl2 (8 ml). A reação foi agitada à temperatura ambiente durante uma hora. Após neutralização com uma solução saturada de NaHCO3, a fase orgânica foi separada. A fase orgânica foi seca sobre Na2SO4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia flash (10% de MeOH/CH2Cl2) com um rendimento de 98%.

[0162] Em uma modalidade, a caracterização estrutural do composto N-(6-aminohexil)- 3,4,5-trimetoxibenzamida (10) foi conforme a seguir: 1H RMN (400 MHz, MeOD): δ = 7,19 (2H, s, H2, H6), 3,89 (6H, s, 2XOCH3), 3,80 (3H, s, OCH3), 3,39 (1H, t, J = 7,1 Hz, H2), 2,99 - 2,90 (2H, m, H7), 1,77 - 1,55 (4H, m, H3, H6), 1,50 - 1,36 (4H, m, H4, H5); e 13C RMN (100 MHz, MeOD): δ = 169,4 (CONH), 154,3 (C3, C5), 141,8 (C4’), 131,1 (C1), 105,9 (C2, C6), 61,2 (OCH3), 56,7 (2XOCH3), 40,8 (C7‘), 40,6 (CT), 30,2 (C6‘, 28,4 (C3‘), 27,4 (C4‘), 27,0 (C5‘).

[0163] Em uma modalidade, a síntese do brometo de [5- (6- (3,4,5-trimetoxibenzamido) hexilamino) carbonilpentil] trifenilfosfônio (12) foi a seguinte: a uma solução de 10 (689 mg, 2,2 mmol) em DMF (7,4 ml) a 4 °C N, N-dietilpropan-2-amina (0,476 ml, 2,7 mmol) e PyBOP (1.572 mg, 2,7 mmol) em CH2Cl2 (7,4 ml) foram adicionados. A mistura foi mantida em banho de gelo e agitada durante meia hora. Após este período, o composto 11 (1218, 2,7 mmol) foi adicionado e depois a reação foi aquecida até à temperatura ambiente. A reação foi mantida sob agitação durante 20 horas. Depois a mistura foi diluída com AcOEt (40 ml) e lavada com solução saturada de NaHCO3 (2x10 ml). A fase orgânica foi seca sobre Na2SO4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia flash (10% de MeOH / CH2Cl2), rendimento: 63%.

[0164] Em uma modalidade, a caracterização estrutural do composto brometo de [5-(6- (3,4,5-trimetoxibenzamido)hexilamino)carbonilpentil] trifenilfosfônio (12) foi conforme a seguir: 1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ = 7,85 - 7,76 (3H, m, H4’’), 7,73 - 7,59 (12H, m, H2’’, H3’’, H5’’, H6’’), 7,12 (2H, s, H2, H6), 6,93 (1H, t, J = 5,7 Hz, H1’), 6,26 (1H, t, J = 5,7 Hz, H8’), 3,88 (6H, s, 2XOCH3), 3,85 (1H, s, OCH3), 3,39 (dd, J = 13,2, 6,7 Hz, 1H), 3,19 - 3,05 (4H, m, H7’, H14’), 2,14 (1H, t, J = 7,1 Hz, H10’), 1,69 - 1,26 (14H, m, H3’, H4’, H5’, H6’ H11’, H12’, H13’ ); e 13C RMN (100 MHz, CDCl3): δ = 173,3 (C9’), 167,2 (PhCONH), 153,1 (C3, C5), 140,4 (C4), 135,4 (d, JCP = 2,9 Hz, C4’’), 133,4 (d, JCP = 9,9 Hz, C2’’,C6’’), 130,7 (d, JCP = 12,6 Hz, C3’’,C5’’), 130,4 (C1), 117,9 (d, JCP = 86,2 Hz, C1’’), 104,5 (C2, C6), 60,9 (OCH3), 56,4 (2XOCH3), 39,7 (C2‘), 39,0 (C7’), 36,3 (C10’), 30,0 (C3’), 29,8 (C6‘), 28,9 (d, J = 5,0 Hz, C12’), 26,6 (C4’), 25,9 (C5‘), 24,9 (C11 ’), 22,3 (d, J = 43,5 Hz, C14’), 22,1 (d, J = 12,5 Hz, C13’).

[0165] Em uma modalidade, brometo de [5-(6-(3,4,5-tri-hidroxibenzamido)hexilamino) carbonilpentil]trifenilfosfônio (AntiOxBEN3) foi sintetizado da seguinte maneira: 1,0 g; 1,4 mmol foi dissolvido em 7,6 ml de diclorometano anidro. A mistura reacional foi agitada sob argônio e arrefecida a uma temperatura abaixo de -75 °C. A solução de tribrometo de boro (4,3 ml de solução 1 M em diclorometano; 4,3 mmol) foi adicionada gota a gota e a reação foi mantida a -75 ° C durante 10 minutos. Uma vez completada a adição, a reação foi mantida a -70 °C durante 10 minutos e depois deixada aquecer até à temperatura ambiente com agitação contínua durante 12 horas. Depois disso, a reação foi terminada por adição cautelosa de água (20 ml). Após remoção da água, o produto resultante foi dissolvido em metanol e seco sobre Na2SO4 anidro, filtrado e o solvente foi evaporado. O resíduo foi purificado por cromatografia flash (10% de MeOH/CH2Cl2) e obteve-se um rendimento de 55%.

[0166] Em uma modalidade, a caracterização estrutural do composto brometo de [5-(6- (3,4,5-tri-hidroxibenzamido)hexilamino) carbonilpentil]trifenilfosfônio (AntiOxBEN3) foi conforme a seguir: 1H RMN (400 MHz, MeOD): δ = 7,92 - 7,83 (3H, m, H4’’), 7,82 - 7,70 (12H, m, 12H, m, H2’’, H3’’, H5’’, H6’’), 6,83 (2H, s, H2, H6), 3,43 - 3,34 (2H, m, H14’), 3,33 - 3,25 (2H, m, H2’), 3,14 (1H, t, J = 6,9 Hz, H7’), 2,15 (1H, t, J = 7,0 Hz, H10’), 1,72 - 1,28 (14H, m, H3’, H4’, H5’, H6’ H11’, H12’, H13’); 13C RMN (100 MHz, MeOD): δ = 176,3 (C9), 170,5 (PhCOONH), 146,5 (C3, C5), 138,1(C4), 136,1 (d, J = 2,9 Hz, C4’’), 134,7 (d, JCP = 10,0 Hz, C2’’, C6’’), 131,5 (d, JCP = 12,6 Hz, C3’’, C4’’), 125,4 (C1), 119,7 (d, JCP = 86,3 Hz, C1’’), 107,8 (C2, C6), 40,8 (C2‘), 40,5 (C7‘), 36,2 (C10’), 30,9 (C3‘), 30,8 (C6’), 30,2 (C4’), 29,9 (C5’), 27,4 (d, JCP = 2,5 Hz, C12’), 26,1 (C11’), 23,1 (d, JCP = 4,2 Hz, C13’), 22,6 (d, JCP = 51,3 Hz, C14’); ESI /MS m/z (%): 628 (M++H- Br-, 38), 627 (M+- Br, 100), 556 (35), 547 (46); e ESI/HRMS m/z calculado para C37H44N2O5P+ (M+- Br): 627.2982; encontrou 627.2970.

[0167] A atividade de eliminação de radicais livres de AntiOxCINs foi avaliada por meio de ensaios de capacidade antioxidante total baseados em radicais DPPH; ABTS~+ e GO;

[0168] Todos esses métodos envolveram a medida espectrofotométrica da diminuição da absorbância resultante da desativação radical (DPPH; ABTS~+ ou GO^) com um antioxidante. Os resultados foram expressos em IC50, que é definido como a concentração mínima de antioxidante necessária para reduzir a quantidade de radical em 50%. Ensaios antioxidantes foram realizados em um leitor de multiplicação (Powerwave XS Microplate Reader) de instrumentos da Bio Tech.

[0169] Em uma modalidade, a atividade de eliminação do radical DPPH foi realizada da seguinte forma: soluções dos compostos de ensaio com concentrações crescentes (faixa entre 0 μM e 500 μM) foram preparadas em etanol. Preparou-se também uma solução etanólica de DPPH (6,85 mM) e depois diluiu-se para se obter a absorvância de 0,72 ± 0,02 a 515 nm. Cada solução de composto (20 μl) foi adicionada a 180 μl da solução de DPPH em triplicado, e a absorbância a 515 nm foi registrada minuciosamente ao longo de 45 minutos. A percentagem de inibição do radical baseou-se na comparação entre o branco (20 μl de etanol e 180 μl de solução de DPPH)), o que correspondeu a 100% de soluções de radicais e compostos de teste. As curvas de dose-resposta foram estabelecidas para a determinação dos valores de IC50. Dados são médias ± SEM de três experimentos independentes.

[0170] Em uma modalidade, a atividade de eliminação de ABTS^ + foi avaliada como se segue: soluções etanólicas dos compostos de ensaio com concentrações crescentes (intervalo entre 10 μM e 500 μM) foram preparadas. A solução de cátions de radicais ABTS foi obtida por adição de solução aquosa de persulfato de potássio a 150 mM (163 ml) a 10 ml de solução aquosa 7 mM de ABTS, seguida de armazenamento no escuro à temperatura ambiente durante 16 h (concentração final de 2,45 mM). A solução foi então diluída em etanol para atingir a absorvência de 0,72 ± 0,02. Após a adição do composto (20 μl), em triplicado, à solução de ABTS~+ (180 μl), a medição espectrofotométrica foi realizada a cada minuto durante 15 minutos. A percentagem de inibição do radical baseou-se na comparação entre o branco (20 μl de etanol e 180 μl de solução de ABTS~+), o que corresponde a 100% de soluções de compostos de teste e radicais. As curvas de dose-resposta foram estabelecidas para a determinação dos valores de IC50. Dados são médias ± SEM de três experimentos independentes.

[0171] Em uma modalidade, a atividade de eliminação de GO foi avaliada da seguinte forma: soluções de compostos de teste com concentrações de 10 μM a 100 μM foram preparadas em etanol. Uma solução etanólica de 5 mM GO foi preparada e diluída para atingir a absorvância de 1,00 ± 0,02 a 428 nm. A adição (20 μl) em triplicado de solução de composto à solução GO ((180 μl) foi seguida pela medição da absorbância a 428 nm durante 30 minutos, no escuro, à temperatura ambiente. A percentagem de inibição do radical baseou-se na comparação entre o branco (20 μl de etanol e 180 μl de solução GO)), o que corresponde a 100% de soluções de compostos de teste e radicais. As curvas de dose-resposta foram estabelecidas para a determinação dos valores de IC50.

[0172] Dados são médias ± SEM de três experimentos independentes.

[0173] Em uma modalidade, as propriedades redox e lipofílica de AntiOxBENs foram avaliadas por técnicas eletroquímicas.

[0174] Em uma modalidade, os dados analíticos eletroquímicos foram obtidos utilizando um potenciostato controlado por computador Autolab PGSTAT302N (Metrohm Autolab, Utrecht, Holanda). Geralmente, os dados de voltametria cíclica (CV) foram adquiridos a uma taxa de varredura de 50 mVs-1. Resultados de voltametria de pulso diferencial (VPD) foram adquiridos em um potencial de etapa de 4 mV, amplitude de pulso de 50 mV e taxa de varredura de 8 mVs-1. Os sinais eletroquímicos foram monitorados pelo pacote de software Sistema eletroquímico de propósito geral (GPES) versão 4.9. Todos os experimentos eletroquímicos foram realizados em temperatura ambiente em uma célula eletroquímica que foi colocada em uma gaiola de Faraday, a fim de minimizar a contribuição do ruído de fundo para o sinal analítico.

[0175] Em uma modalidade, o processo de avaliação das propriedades redox de AntiOxBENs foi conduzido da seguinte forma: as soluções estoque de cada composto (10 mM) foram preparadas dissolvendo-se a quantidade apropriada em etanol. As soluções de trabalho voltamétricas foram preparadas na célula eletroquímica, com concentração final de 0,1 mM. O eletrólito de suporte com pH 7,4 foi preparado diluindo 6,2 ml de hidrogenofosfato de dipotássio 0,2 M e 43,8 ml de di-hidrogenofosfato de potássio 0,2 M a 100 ml. Os dados voltamétricos foram adquiridos em um sistema de três eletrodos constituído de um eletrodo de carbono vítreo (GCE, d = 2 mm) como eletrodo de trabalho, um contra-eletrodo de fio de platina e um eletrodo de referência Ag/AgCl saturado. Em uma modalidade, a avaliação das propriedades lipofílicas do AntiOxBENs foi realizada da seguinte forma: a célula eletroquímica foi um sistema de quatro eletrodos com arranjos de microinterfaces líquido-líquido (μITIES) contendo dois eletrodos de referência Ag/AgCl e dois contra-eletrodos de Pt, um em cada fase. A membrana microporosa foi selada com um selante de fluorosilicone (Dow Corning 730) em um cilindro de vidro que foi preenchido com 4,0 ml da fase aquosa, onde as alíquotas das soluções AntiOxBENs foram adicionadas. A membrana foi então imersa na fase orgânica contida na célula. A solução de referência da fase orgânica (uma solução aquosa de BTPPACl 2 mM + NaCl 2 mM) foi estabilizada mecanicamente. A solução eletrólita de suporte aquosa era um tampão Tris-HCl de 10 mM de pH 7,0.

[0176] Em uma modalidade, as propriedades quelantes de ferro AntiOxBENs foram avaliadas pelo método espectrofotométrico de ferrozina realizado em um leitor multiplacas (Powerwave XS Microplate Reader) de instrumentos Bio-Tech.

[0177] Em uma modalidade, as propriedades quelantes de ferro AntiOxBENs foram avaliadas da seguinte forma: em cada poço, uma solução do composto teste (100 μM) e sulfato de amônio (II) em acetato de amônio (20 μM) foi incubada por 10 min e a absorbância foi lida a 562 nm. Em seguida, uma solução recentemente preparada de ferrozina (5 mM) foi adicionada a cada poço (96 μM concentração final). Após uma nova incubação a 37 °C durante 10 min, mediu-se a absorvância do complexo [Fe (ferrozina) 3] 2+ a 562 nm. Os poços em branco foram executados usando DMSO em vez dos compostos de teste. EDTA foi usado como uma referência. Todos os compostos foram testados a uma concentração final de 100 μM. A absorvência da primeira leitura foi subtraída aos valores finais para abolir qualquer absorvância devida aos compostos de teste. Os dados são médias ± SEM de três experiências independentes e são expressas como % de quelação de Fe(II) (EDTA = 100%).

[0178] Em uma modalidade, a avaliação do perfil de toxicidade funcional mitocondrial de AntiOxBENs foi realizada em mitocôndrias de fígado de ratos (RLM). Os RLM foram preparados por homogeneização de tecidos, seguida por centrifugações diferenciais em tampão gelado contendo sacarose 250 mM, HEPES 10 mM (pH 7,4), EGTA 1 mM e 0,1% de albumina de soro bovino isento de gordura. Depois de obter uma preparação mitocondrial em bruto, os sedimentos foram lavados duas vezes e ressuspensos em tampão de lavagem (sacarose 250 mM e HEPES 10 mM, pH 7,4). A concentração de proteína foi determinada pelo ensaio de biureto usando BSA como padrão.

[0179] Em uma modalidade, foi avaliada a captação mitocondrial de AntiOxBENs.

[0180] Em uma modalidade, a captação de mitocôndrias AntiOxBENs pela RLM energizada foi avaliada da seguinte forma: RLM (0,5 mg proteína/ml) foram incubados com AntiOxBENs a 37 ° C sob agitação constante em 1 ml de meio KCl (120 mM de KCl, 10 mM de HEPES, pH 7,2 e 1 mM EGTA). Cinco adições sequenciais de 1 μM de cada AntiOxBENs foram realizadas para calibrar a resposta do eletrodo na presença de rotenona (1,5 μM). Em seguida, succinato (10 mM) foi adicionado para gerar Δ^. A valinomicina (0,2 μg / ml) foi adicionada no final do ensaio para dissipar Δ^. As medidas foram realizadas com um eletrodo íon-seletivo, que mede a distribuição do cátion tetrafenilfosfônio (TPP+) e do eletrodo Ag/AgCl2 como referência. A razão de acumulação mitocondrial foi calculada pelo desaparecimento de AntiOxBENs de meio extra para intramitocondrial assumindo um volume intramitocondrial de 0,5 μl/mg de proteína e uma correção de ligação para a captação mitocondrial de compostos TPP.

[0181] O resultado de AntiOxBENs na peroxidação lipídica de RLM foi avaliado. Dois métodos diferentes foram usados.

[0182] Em uma modalidade, o efeito de AntiOxBENs na peroxidação lipídica de RLM foi medido pelo ensaio de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) como segue: RLM (2 mg de proteína/ml) foram incubados em 0,8 ml de meio contendo 100 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl e pH 7,6, a 37 °C, suplementado com 5 mM de glutamato/2,5 mM de malato como substrato. RLM foram incubados por um período de 5 min com cada AntiOxBENs (5 μM) e, em seguida, mitocôndrias foram expostas à condição de estresse oxidativo pela adição de 100 μM de FeSO4/500 μM H2O2/ ascorbato 5 mM por 15 min a 37 °C. Após exposição ao estresse oxidativo, 60 μl de hidroxitolueno butilado a 2% (v/v) em DMSO foram adicionados, seguido por 200 μl de ácido perclórico a 35% (v/v) e 200 μl de ácido tiobarbitúrico a 1% (p/v). As amostras foram então incubadas durante 15 min a 100 ° C, deixadas a arrefecer e o sobrenadante transferido para um tubo de vidro. Após a adição de 2 ml de água MiliQ e 2 ml de butano 1-ol, as amostras foram vigorosamente submetidas a vórtice durante alguns segundos. As duas fases foram permitidas para separar. A fluorescência de alíquotas (250 μl) da camada orgânica foi analisada em um leitor de placas (ÀEx = 515 nm; ÀEm = 553 nm) para TBARS. A produção de TBARS em RLM energizada com glutamato/malato foi considerada insignificante. Os dados são médias ± SEM de três experimentos independentes e são expressos como % de controle (controle = 100%).

[0183] Em uma modalidade, o efeito de AntiOxBENs na peroxidação lipídica de RLM foi medido por uma segunda metodologia como segue: o consumo de oxigênio de 2 mg de RLM, em um volume total de 1 ml de meio de reação consistindo de 100 mM KCl, 10 mM Tris. O HCl e o pH 7,6, utilizando glutamato/malato (5 mM / 2,5 mM) como substrato respiratório, foram monitorizados a 37 °C com um eletrodo de oxigênio de Clark. RLM foram incubados por 5 min período com cada AntiOxBENs (5 μM) e, em seguida, o processo de peroxidação lipídica começou pela adição de 1 mM ADP e 0,1 mM FeSO4 (concentrações finais). A concentração saturada de O2 no meio de incubação foi assumida como sendo de 217 μM a 37 °C. Mudanças dependentes do tempo no consumo de oxigênio resultantes da peroxidação de membranas RLM por um par pró- oxidante (1 mM ADP/0,1 mM FeSO4) foram registradas. Os traços são médias ±SEM gravadas de deis experimentos independentes. A fase de retardamento de tempo associada ao consumo mais lento de oxigênio que se seguiu à adição de ADP/Fe2 + foi usada para medir a eficácia de AntiOxBENs para prevenir a peroxidação lipídica. Os dados são médias ± SEM de seis experimentos independentes e são expressos como% de controle (controle = 100%).

[0184] Em uma modalidade, avaliou-se o efeito de AntiOxBENs na abertura de poros de transição de permeabilidade mitocondrial.

[0185] Em uma modalidade, o efeito do AntiOxBENs na abertura do poro de transição da permeabilidade mitocondrial foi medido da seguinte forma: o edema mitocondrial foi estimado medindo-se as alterações da luz dispersa de uma suspensão mitocondrial, conforme monitorado espectrofotometricamente a 540 nm. Concentrações crescentes de AntiOxBENs (2,5 - 10 μM) foram adicionadas ao meio de reação (sacarose 200 mM, KH2PO4 1 mM, Tris 10 mM (pH 7,4), succinato 5 mM e EGTA 10 μM suplementado com rotenona 1,5 μM), na presença de RLM (1 mg) e deixada a incubar durante um período de 5 min antes do ensaio. Os experimentos foram iniciados pela adição de uma concentração adequada de Ca2 + (15 a 50 μM), titulada a cada dia. A ciclosporina A (CsA), um dessensibilizador de PTP, foi adicionada para demonstrar a abertura de mPTP. A reação foi agitada continuamente e a temperatura foi mantida a 37 °C. Os dados são médias ± SEM de três experiências independentes e são expressas como absorbância a 540 nm.

[0186] Em uma modalidade, o efeito do AntiOxCINs na respiração mitocondrial foi avaliado.

[0187] Em uma modalidade, a avaliação do efeito AntiOxBENs na respiração mitocondrial foi realizada da seguinte forma: a respiração do MLR isolada foi avaliada polarograficamente com um eletrodo de oxigênio do tipo Clark, conectado a um registrador adequado em câmara de 1 ml termostatizada com agitador magnético a 37 °C. O meio respiratório padrão consistiu em sacarose 130 mM, 50 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 5 mM HEPES (pH 7,3) e EGTA 10 μM. Concentrações crescentes de AntiOxBENs (2,5 a 10 μM) foram adicionadas ao meio reacional contendo substratos respiratórios glutamato/malato (10 mM e 5 mM, respectivamente) ou succinato (5 mM) e RLM (1 mg) e incubadas por um período de 5 min anterior ao ensaio. O estado 2 foi considerado como a respiração durante o tempo de incubação de 5 min com AntiOxBENs. Para induzir a respiração do estado 3, adicionaram-se 125 nmol de ADP (utilizando glutamato/malato) ou 75 nmol de ADP (utilizando succinato). O estado 4 foi determinado após o término da fosforilação do ADP. A adição subsequente de oligomicina (2 μg/ml) inibiu a ATP e originou o estado de respiração de inibição da oligomicina. Finalmente, 1 μM de FCCP foi adicionado para induzir a respiração desacoplada. O RCR foi de 7,3 ± 0,6 e 4,1 ± 0,3 para os experimentos de controle, com glutamato-malato ou succinato como substrato respiratório, respectivamente. O índice ADP/O foi 2,6 ± 0,1 e 1,5 ± 0,1 com os mesmos substratos respiratórios, respectivamente. Os dados são médias são médias ± SEM de sete experimentos independentes.

[0188] Em uma modalidade, avaliou-se o efeito de AntiOxBENs no potencial elétrico transmembrana (Δ^).

[0189] Em uma modalidade, a avaliação do efeito de AntiOxBENs no potencial elétrico transmembrana mitocondrial (Δ^) foi realizada da seguinte forma: o potencial elétrico transmembrana mitocondrial (Δ^) foi estimado através da avaliação das alterações de fluorescência da safranina (5 μM) e registrado em espectrofluorômetro operando em comprimentos de onda de excitação e emissão de 495 e 586 nm, com largura de fenda de 5 nm. Concentrações crescentes de AntiOxBENs (2,5 a 10 μM) foram adicionadas ao meio de reação (sacarose 200 mM, KH2PO4 1 mM, 10 mM Tris (pH 7,4) e 10 μM EGTA) contendo substratos respiratórios glutamato/malato (5 mM e 2,5 mM, respectivamente ) ou succinato (5 mM) e RLM (0,5 mg em volume final de 2 ml) e deixou-se a incubar durante um período de 5 min antes de iniciar o ensaio, a 25 °C. Nesse ensaio, safranina (5 μM) e ADP (25 nmol) foram utilizados para iniciar o ensaio e induzir a despolarização, respectivamente. Em seguida, foi adicionado 1 μM de FCCP no final de todas as experiências para despolarizar as mitocôndrias. O Δ^ foi calculado usando uma curva de calibração obtida quando o RLM foi incubado em meio reacional livre de K+ contendo sacarose a 200 mM, NaH2PO4 a 1 mM, Tris a 10 mM (pH 7,4) e EGTA a 10 μM, suplementado com 0,4 μg de valinomicina. A extensão das alterações de fluorescência da safranina induzida por Δ^ mostrou ser semelhante no meio padrão e livre de K+ A “repolarização” correspondeu à recuperação do potencial de membrana após a completa fosforilação do ADP adicionado. A fase de retardo refletiu o tempo necessário para fosforilar o ADP adicionado. A RLM isolada desenvolveu um Δ^ ~ 226 mV e Δ^ ~ 202 mV (negativo interno) quando glutamato/malato ou succinato foram usados, respectivamente. Dados são médias ± SEM de cinco experimentos independentes.

[0190] Em uma modalidade, o perfil de citotoxicidade do AntiOxBENs foi avaliado em células HepG2 de carcinoma hepatocelular humano. As células de carcinoma hepatocelular humano HepG2 foram cultivadas em meio de alta glicose composto por meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; D5648) suplementado com piruvato de sódio (0,11 g/l), bicarbonato de sódio (1,8 g/l) e 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de solução de antibiótico penicilina-estreptomicina 100x. As células foram mantidas a 37 °C em um incubador umidificado com 5% de CO2. As células HepG2 foram semeadas a uma densidade de 4 x 104 células/ml e cultivadas durante 24 horas antes do tratamento.

[0191] Em uma modalidade a triagem de citotoxicidade foi realizada da seguinte forma: as células foram colocadas em placa de 48 poços (2 x 104 células/500 μl) e incubadas durante 48 horas com concentrações de AntiOxBENs variando de 25 μM a 500 μM. Após incubação, o ensaio de sulforrodamina B (SRB) foi utilizado para determinação da densidade celular com base na medição do teor de proteína celular. Resumidamente, após incubação, o meio foi removido e os poços foram enxaguados com PBS (1X). As células foram fixadas por adição de 1% de ácido acético em 100% de metanol durante pelo menos 2 horas a -20 °C. Posteriormente, a solução de fixação foi descartada e as placas foram secadas em estufa a 37 °C. Duzentos e cinquenta microlitros de SRB a 0,5% em solução de ácido acético a 1% foram adicionados e incubados a 37 °C durante 1 h. Os poços foram então lavados com ácido acético a 1% em água e secos. Em seguida, 500 ml de Tris (pH 10) foi adicionado e as placas foram agitadas por 15 min.

[0192] Por fim, 200 μl de cada sobrenadante foram transferidos para placas de 96 poços e a densidade óptica foi medida a 540 nm. Os dados são médias ± SEM de quatro experimentos independentes e os resultados são expressos como porcentagem de controle (controle = 100%), que representa a densidade celular sem qualquer tratamento no respectivo ponto de tempo.

[0193] Em uma modalidade, todos os dados biológicos foram analisados como segue: no software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc.), com todos os resultados sendo expressos como médias ± EPM para o número de experimentos indicados. Os dados foram analisados pelo teste t de Student para comparação de duas médias, e One-way ANOVA com pós-teste de comparação múltipla de Dunnet. O último teste foi utilizado para comparar mais de dois grupos com uma variável independente. Significância foi aceita com *P <0,05, **P <0,01, ***P <0,0005, ****P <0,0001.

[0194] A divulgação não deve ser vista de forma alguma restrita às modalidades descritas e uma pessoa com habilidade comum na técnica irá prever muitas possibilidades para modificações das mesmas.

[0195] As modalidades descritas acima são combináveis. As reivindicações seguintes estabelecem ainda modalidades particulares da divulgação. REFERÊNCIAS 1. Pagano, G., Talamanca, A. A., Castello, G., Cordero, M. D., d'Ischia, M., Gadaleta, M. N., Pallardo, F. V., Petrovic, S., Tiano, L., e Zatterale, A. (2014) Oxidative stress and mitochondrial dysfunction across broad-ranging pathologies: toward mitochondria-targeted clinical strategies. Oxidative medicine and cellular longevity, 2014, 541230. 2. Smith, R. A., Hartley, R. C., Cocheme, H. M., e Murphy, M. P. (2012) Mitochondrial pharmacology. Trends in pharmacological sciences, 33, 341-352. 3. Teixeira, J., Soares, P., Benfeito, S., Gaspar, A., Garrido, J., Murphy, M. P., e Borges, F. (2012) Rational discovery and development of a mitochondria-targeted antioxidant based on cinnamic acid scaffold. Free radical research, 46, 600-611. 4. Reily, C., Mitchell, T., Chacko, B. K., Benavides, G., Murphy, M. P., e Darley-Usmar, V. (2013) Mitochondrially targeted compounds and their impact on cellular bioenergetics. Redox biology, 1, 86-93. 5. Trnka, J., Elkalaf, M., e Andel, M. (2015) Lipophilic triphenylphosphonium cations inhibit mitochondrial electron transport chain and induce mitochondrial proton leak. PloS one, 10, e0121837.

Claims (18)

1. Composto de fórmula I

ou um sal, para uso em medicina caracterizado por: R1, R2, R3, R4, R5, R6 e R7 são independentemente selecionados entre si; R1, R2, R3, R4 e R5 são selecionados de H, halogênio, hidroxila, metila, metoxila, amino ou grupo nitro; R6 ser uma amida secundária ou amida terciária; R7 ser uma cadeia de alquila; uma cadeia de alquenila; uma cadeia de alquinila; uma arila substituída selecionada dentre: alcano-arila substituída, alceno-arila substituída ou alcino-arila substituída, preferencialmente por C1-C6-alquila, C3-C8- cicloalquila, C6-C10-arila, C6-C10-aril-C1-C8-alquila, C1-C6-alcóxi, C6-C10-arilóxi, C6- C10-aril-C1-C8-alcóxi, hidroxila, CO2H, C1-C6-alcoxicarbonila, C6-C10- ariloxicarbonila, C6-C10-aril-C1-C8-alcoxicarbonila, C1-C6-alquilcarbonila, C6-C10- arilcarbonila, C6-C10-aril-C1-C8-alquilcarbonila, C1-C6-alquilcarbóxi, C6-C10- arilcarbóxi, C1-C6-alquilmercaptila, C6-C10-arilmercaptila, C1-C6- alquilmercaptocarbonila, C3-C8- cicloalquilmercaptocarbonila, C6-C10- arilmercaptocarbonila, C1-C6-alquilmercaptocarboxi, C6-C10- arilmercaptocarboxi, C1-C6-alquilsulfonila, C6-C10-arilsulfonila, C1-C6-alquilsulfóxi, C6-C10- arilsulfóxi; sendo cada uma dessas é substituída uma ou diversas vezes por C1-C6-alquila, C1- C6-alcóxi, COOH; CONH2, substituída uma ou duas vezes por C1-C6-alquila; SO3H, amino, tiol, hidroxila, nitro, ciano, flúor, cloro, bromo, iodo, CF3 ou OCF3; em que inúmeros desses substituintes opcionais são combinados para formar sistemas de homo ou hetero anéis saturados, insaturados ou aromáticos anelados; ou um heterociclo saturado, insaturado ou aromático substituído uma ou diversas vezes por C1-C6-alquila, C1-C6-alcóxi, COOH; CONH2, substituído uma ou duas vezes, ou uma amida secundária; Z- ser um ânion aceitável; em que a cadeia de alquila, a cadeia de alquenila, ou a cadeia de alquinila é uma cadeia C5-C30.

2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser:

3. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por R7 ser uma amida secundária de R8-(C=O)NH-R9 amida, R8 e R9 serem independentemente selecionados entre si e R8 e R9 serem uma cadeia de alquila, cadeia de alquenila, uma cadeia de alquinila ou uma arila substituída.

4. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a arila substituída é uma alcano-arila substituída, alceno-arila substituída ou alquina-arila substituída.

5. Composto, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a alcano-arila substituída, alceno-arila substituída ou alcino-arila substituída é C1- C6-alquila, C3-C8-cicloalquila, C6-C10-arila, C6-C10-aril-C1-C8-alquila, C1-C6- alcóxi, C6-C10-arilóxi, C6-C10-aril-C1-C8-alcóxi, hidroxila, CO2H, C1-C6- alcoxicarbonila, C6-C10-ariloxicarbonila, C6-C10-aril-C1-C8-alcoxicarbonila, C1-C6- alquilcarbonila, C6-C10-arilcarbonila, C6-C10-aril-C1-C8-alquilcarbonila, C1-C6- alquilcarbóxi, C6- C10-arilcarbóxi, C1-C6-alquilmercaptila, C6-C10-arilmercaptila, C1-C6- alquilmercaptocarbonila, C3-C8-cicloalquilmercaptocarbonila, C6-C10- arilmercaptocarbonila, C1-C6-alquilmercaptocarboxi, C6-C10- arilmercaptocarboxi, C1-C6-alquilsulfonila, C6-C10-arilsulfonila, C1-C6-alquilsulfóxi, C6-C10- arilsulfóxi; sendo que, cada uma dessas é substituída uma ou diversas vezes por C1-C6- alquila, C1-C6-alcóxi, COOH; CONH2, substituída uma ou duas vezes por C1-C6- alquila; SO3H, amino, tiol, hidroxila, nitro, ciano, flúor, cloro, bromo, iodo, CF3 ou OCF3; em que inúmeros desses substituintes opcionais são combinados para formar sistemas de homo ou hetero anéis saturados, insaturados ou aromáticos anelados; ou um heterociclo saturado, insaturado ou aromático substituído uma ou diversas vezes por C1-C6-alquila, C1-C6-alcóxi, COOH; CONH2, substituído uma ou duas vezes.

6. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a cadeia de alquila, a cadeia de alquenila ou a cadeia de alquinila é uma cadeia C5-C18.

7. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a cadeia de alquila, a cadeia de alquenila ou a cadeia de alquinila é uma cadeia C5-C14.

8. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a cadeia de alquila é uma cadeia C5 alquila, cadeia C6 alquila, uma cadeia C7 alquila, uma cadeia C8 alquila, uma cadeia C9 alquila, uma cadeia C10 alquila, uma cadeia C11 alquila, uma cadeia C12 alquila, uma cadeia C13 alquila ou uma cadeia C14 alquila.

9. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que R1 e R5 são H; R2 e R3 são OH; R4 é H ou OH; R7 é a cadeia C6 alquila; R8 e R9 são independentemente um do outro a cadeia C5 alquila ou a cadeia C6 alquila; o halogênio é F, Cl, Br, I, At.

10. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o composto é brometo de 6-(3,4- dihidroxibenzamido) hexiltrifenilfosfônio, ou brometo de 6-(3,4,5- trihidroxibenzamido) hexiltrifenilfosfônio ou brometo de 5-(6-(3,4,5- trihidroxibenzamido) hexilamino) carbonilpentil]trifenilfosfônio.

11. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por seu uso na modulação de pelo menos uma dentre morfologia mitocondrial e expressão de enzimas OXPHOS, em particular, para prevenção ou supressão de sintomas associados a um distúrbio mitocondrial ou com um estado associado à disfunção mitocondrial ou doenças mitocondriais.

12. Composto, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o distúrbio mitocondrial ser um distúrbio selecionado do grupo que consiste em: epilepsia mioclônica; epilepsia mioclônica com fibras vermelhas rasgadas; neuropatia óptica hereditária de Leber; neuropatia ataxia e retinite pigmentosa; miopatia mitocondrial, encefalopatia, lactacidose, acidente vascular cerebral; síndrome de Leigh; síndrome tipo Leigh; atrofia óptica dominante; síndrome de Kearns-Sayre; diabetes e surdez maternalmente herdados; síndrome de Alpers- Huttenlocher; espectro de neuropatia de ataxia; ataxia de Friedreich’s; oftalmoplegia externa progressiva crônica; síndrome de Pearson; encefalopatia neuro-gastro-intestinal mitocondrial; síndrome de Sengers; 3-acidúria metilglutacônica, surdez sensorioneural, encefalopatia e achados neurorradiológicos da síndrome tipo Leigh; miopatia; miopatia mitocondrial; cardiomiopatia; e encefalomiopatia, síndrome de Leigh deficiente devido à deficiência de proteínas com excesso de complexo IV; deficiências isoladas ou combinadas de OXPHOS com defeitos genéticos até agora não resolvidos, incluindo oxidação de piruvato perturbada e taxas de produção de ATP mais PCR; ou à condição associada à disfunção mitocondrial é uma condição selecionada do grupo que consiste em: acidose tubular renal; mal de Parkinson; doença de Alzheimer; esclerose lateral amiotrica; doença de Huntington; distúrbios invasivos do desenvolvimento; perda de audição; surdez; diabetes; envelhecimento; e efeitos adversos de drogas que dificultam a função mitocondrial.

13. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por seu uso na preparação de um medicamento para o tratamento, prevenção ou supressão de uma doença neurodegenerativa, doença hepática gordurosa não alcoólica, neoplasia, câncer, escleroderma, doença hepática de sobrecarga de ferro, doença hepática de sobrecarga de cobre, alopecia, infertilidade humana, pancreatite aguda, fibromialgia, distúrbio mitocondrial ou uma condição associada à disfunção mitocondrial ou doenças mitocondriais; na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de câncer em que o câncer é câncer do fígado, câncer pancreático ou câncer biliar; na preparação de um medicamento para o tratamento ou na prevenção de doença hepática gordurosa não alcoólica, em que, a doença hepática gordurosa não alcoólica é doença hepática gordurosa não alcoólica, uma esteato-hepatite não alcoólica ou uma cirrose hepática; na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de doença renal, em que, a doença renal é câncer renal ou insuficiência renal; ou doença neoplásica, em particular carcinoma das células basais, câncer dos ossos, câncer do intestino, câncer do cérebro, câncer da mama, câncer do colo do útero, leucemia, câncer do fígado, câncer do pulmão, linfoma, melanoma, câncer do ovário, câncer pancreático, câncer da próstata, câncer de tireoide ou câncer biliar.

14. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por seu uso como agente antimicrobiano, em particular como um desinfetante; como um cosmético, suplemento, ou nutracêutico, nomeadamente um produto antienvelhecimento ou antirrugas; em uma manutenção de uma cultura celular pluripotente, como um suplemento para cultura de células, particularmente, como composto de meio de crescimento.

15. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por seu uso como um protetor muscular ou recuperação muscular após o exercício físico ou para uso como uma sonda em estudos de imagem, em particular para monitorar estudos de imagem mitocondrial.

16. Composição farmacêutica ou cosmética caracterizada por compreender qualquer composto descrito nas reivindicações de 1 a 15 e um veículo, adjuvante, excipiente, diluente ou misturas farmaceuticamente aceitáveis, em que o veículo farmaceuticamente aceitável é selecionado dentre: solução salina, goma-arábica, gelatina, pasta de amido, talco, queratina, sílica coloidal, ureia ou suas misturas; o adjuvante é selecionado dentre: adjuvante de emulsão de óleo-em-água, adjuvante de alumínio, um ligando de TLR-4, uma saponina e suas misturas; o excipiente é selecionado dentre: glicose, lactose, sacarose, monoestearato de glicerol, cloreto de sódio, glicerol, propileno, glicol, água, etanol ou suas misturas.

17. Composição, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada por seu uso na preparação de medicamentos para o tratamento ou prevenção de uma doença neurodegenerativa, doença hepática gordurosa não alcoólica, neoplasia, doença renal, esclerodermia, doença hepática por sobrecarga de ferro, doença por sobrecarga hepática de cobre, alopecia, infertilidade humana, pancreatite aguda ou fibromialgia.

18. Nanocarreador ou lipossoma caracterizado por compreender os compostos, descrito em qualquer uma das reivindicações de 1 a 15, ou a composição, descrita na reivindicação 16.

Images