BR112019009711A2 - método de indução de neuro-regeneração, método de proteção de neurônios contra perda ou dano neuronal, método de prevenção ou tratamento de doença neurodegenerativa devido à perda ou dano neuronal, e método de triagem de candidatos de fármaco para o tratamento de doenças neurodegenerativas - Google Patents

método de indução de neuro-regeneração, método de proteção de neurônios contra perda ou dano neuronal, método de prevenção ou tratamento de doença neurodegenerativa devido à perda ou dano neuronal, e método de triagem de candidatos de fármaco para o tratamento de doenças neurodegenerativas Download PDF

Info

Publication number
BR112019009711A2
BR112019009711A2 BR112019009711A BR112019009711A BR112019009711A2 BR 112019009711 A2 BR112019009711 A2 BR 112019009711A2 BR 112019009711 A BR112019009711 A BR 112019009711A BR 112019009711 A BR112019009711 A BR 112019009711A BR 112019009711 A2 BR112019009711 A2 BR 112019009711A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
mek1
cells
neural stem
stem cells
disease
Prior art date
Application number
BR112019009711A
Other languages
English (en)
Inventor
Choi Kang-Yell
Kim Mi-Yeon
Han Sungho
Original Assignee
Genuv Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genuv Inc filed Critical Genuv Inc
Publication of BR112019009711A2 publication Critical patent/BR112019009711A2/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/4833—Physical analysis of biological material of solid biological material, e.g. tissue samples, cell cultures
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5026—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on cell morphology
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5058—Neurological cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5073—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/08—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from cells of the nervous system
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)

Abstract

a presente invenção refere-se a um método de indução de neuro-regeneração que compreende administrar um inibidor de mek1/2 a um paciente em necessidade do mesmo. na presente invenção, o inibidor de mek1/2 induz a neuro-regeneração diferenciando-se células-tronco neurais em neurônios, protegendo-se células-tronco neurais e neurônios contra a citotoxicidade de beta-amiloides, ou por ambas as alternativas acima. além disso, a presente invenção se refere a um método de proteção de neurônios contra perda ou dano neuronal que compreende a administração de um inibidor de mek1/2. adicionalmente, esta invenção se refere a um método de prevenção ou tratamento de doença neurodegenerativa devido à perda ou dano neuronal para pacientes em necessidade do mesmo que compreende administrar um inibidor de mek1/2.

Description

MÉTODO DE INDUÇÃO DE NEURO-REGENERAÇÃO, MÉTODO DE PROTEÇÃO DE NEURÔNIOS CONTRA PERDA OU DANO NEURONAL, MÉTODO DE PREVENÇÃO OU TRATAMENTO DE DOENÇA NEURODEGENERATIVA DEVIDO À PERDA OU DANO NEURONAL, E MÉTODO DE TRIAGEM DE CANDIDATOS DE FÁRMACO PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS NEURODEGENERATIVAS CAMPO DA TÉCNICA [001] A presente invenção refere-se a um método de indução de neuro-regeneração que compreende administrar um inibidor de MEK1/2 a um paciente em necessidade do mesmo e a uma composição que compreende um inibidor de MEK1/2 para uso no método acima. Na presente invenção, o inibidor de MEK1/2 induz a neuro-regeneração diferenciando-se células-tronco neurais em neurônios, protegendo-se células-tronco neurais e neurônios contra a citotoxicidade de beta-amiloides, ou por ambas as alternativas acima. Além disso, a presente invenção se refere a um método de proteção de neurônios contra perda ou dano neuronal que compreende administrar um inibidor de MEK1/2 e a uma composição que compreende um inibidor de MEK1/2 para uso no método acima. Adicionalmente, esta invenção se refere a um método de prevenção ou tratamento de doença neurodegenerativa devido à perda ou danos neuronais para pacientes em necessidade do mesmo que compreende administrar um inibidor de MEK1/2 e uma composição que compreende o inibidor de MEK1/2 para uso no método acima.
TÉCNICA ANTECEDENTE
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 9/273
2/100 [002] Doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer (DA) e a doença de Parkinson (DP) são prevalentes na população idosa e o número de pacientes está aumentando exponencialmente com o envelhecimento da sociedade. Além disso, relatos de tipos de inicio precoce de doença neurodegenerativa em jovens não são incomuns. Dessa forma, existe um grande interesse em desenvolver tratamentos que ajudem a interromper o progresso da doença ou recuperar tecidos cerebrais danificados.
[003] As causas exatas dessa doença neurodegenerativa ainda não foram estabelecidas. De acordo com o que é conhecido até agora, as células neuronais em locais específicos no cérebro (por exemplo, o hipocampo ou substância negra) são danificadas levando a uma rede neural defeituosa entre o número reduzido de células neuronais, o que resulta em vários sintomas da doença neurodegenerativa.
[004] A pesquisa está sendo realizada em vários campos para procurar tratamentos. Até o momento, os fármacos relacionados ao alívio de sintomas incluem memantina (antagonista de receptor NMDA), L-DOPA (fármaco imitador da dopamina), etc. Outros fármacos também são limitados a um efeito de curto prazo ou tornando difícil esperar que os mesmos forneçam tratamento além do alívio temporário dos sintomas. Portanto, um tratamento fundamental para a causa da doença neurodegenerativa é de grande necessidade.
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 10/273
3/100 [005] Células-tronco neurais (NSC) e células progenitoras neurais (NPC), células com capacidade de se diferenciar em células neurais, estão presentes no cérebro adulto. Células-tronco neurais estão presentes na zona subventricular do ventrículo lateral e do giro denteado do hipocampo, e é nessa região que a neurogênese ocorre durante toda a vida do animal através da diferenciação e proliferação de células-tronco neurais (Zhao et ai. (2008) Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell 132:645 a 6 6 0) .
[006] Uma vez que o dano e a perda de células neuronais cerebrais ocorrem em doenças neurodegenerativas, a substituição de neurônios danificados ou perdidos por neurônios de funcionamento normal por meio da estimulação de NSCs e NPCs pode ser um tratamento fundamental para doenças neurodegenerativas. Esse método de tratamento inclui o método de tratamento com células-tronco, em que as NSCs e NPCs são isoladas do corpo do paciente, estimuladas in vitro para se diferenciarem em neurônios e, então, transplantadas de volta para os pacientes. No entanto, há dificuldade em isolar NSCs e NPCs de pacientes e, então, transplantá-las de volta nos pacientes. Além disso, as NSCs e NPCs transplantadas perdem rapidamente sua atividade no cérebro, exigindo transplantes repetidos. Como alternativa, em vez de transplantar célulastronco neurais em pacientes, um método de geração de neurônios
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 11/273
4/100 no cérebro do paciente, estimulando NSCs e NPCs para diferenciar com o uso de fármacos, foi recentemente proposto (Davies et al. (2015) Stemistry: The Control of Stem Cells in Situ Using Chemistry. J. Med. Chem. 58:2.863 a 2.894).
[007] 0 beta-amiloide (Αβ) é um peptídeo de 36 a 43 aminoácidos, que é produzido pela divagem da proteína precursora de amiloide (APP), uma proteína de membrana integral do tipo 1, pela β-secretase e γ-secretase. O beta-amiloide (Αβ) se agrega como oligômeros beta-amiloide solúveis (Αβ) e, então, através de protofibrilas, forma fibrilas Αβ insolúveis para eventualmente se acumularem como placas amiloides no cérebro. A deposição de Αβ no cérebro está associada a danos nas sinapses, danos neuronais e atrofia cerebral e, por fim, resulta em danos na memória e nas funções cognitivas, dois sintomas muito típicos da doença de Alzheimer (DA). Entre as várias formas de Αβ, oligômeros Αβ solúveis, especialmente trímeros e tetrâmeros, são considerados as formas mais tóxicas de Αβ que estão associadas com disfunção neuronal e dano sináptico (Murakami, (2014) Conformation-specific antibodies to target amyloid β oligomers and their application to immunotherapy for Alzheimer's disease. Biosci. Biotechnol. Biochem. 78(8):1.293 a 1.305; Jana et al. (2016) Membranebound tetramer and trimer Αβ oligomeric species correlate with toxicity towards cultured neurons. J Neurochem. 136(3):594 a 608) .
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 12/273
5/100 [008] Portanto, proteger os neurônios contra Αβ, especialmente as formas oligoméricas de Αβ, é considerado o alvo potencial para o tratamento de DA. No entanto, pacientes com DA já sofreram danos neuronais significativos, portanto, além da neuroproteção, a neuro-regeneração através da diferenciação de células-tronco neurais endógenas é necessária para o tratamento fundamental da DA.
[009] A MEK (proteína quinase quinase ativada por mitógenos; também conhecida como MAP2K ou MAPKK) é um membro da via de transdução de sinal MAP quinase (proteína quinase ativada por mitógeno; MAPK) (aqui escrita como via MAPK/ERK) que segue na sequência de Ras-Raf-MEK-ERK. Quando várias moléculas de sinalização, como fatores de crescimento, hormônios, citoquinas, etc., se ligam a receptores de membrana celular e ativam a tirosina quinase receptora, a proteína Ras GTPase é ativada, o que resulta no recrutamento de Raf citoplasmático para a membrana celular. A Raf ativada fosforila e ativa a MEK e ERK, sequencialmente, e a ERK ativada, por sua vez, transloca-se no núcleo para ativar vários fatores de transcrição. Esses fatores de transcrição, então, se ligam aos promotores de vários genes para controlar a proliferação, diferenciação e sobrevivência de células. Como a via de transdução de sinal MAPK/ERK está hiperativada nas células tumorais, as quinases foram vistas como alvos importantes para inibir o progresso da doença no câncer e outras doenças
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 13/273
6/100 proliferativas .
[010] Existem 7 proteínas (MEK1-MEK7) conhecidas na família MEK e, dessas, apenas MEK1 e MEK2 estão envolvidas na transdução de sinal da via Ras-Raf-MEK-ERK. Embora MEK1 e MEK2 sejam codificadas por genes diferentes, as mesmas compartilham alta homologia (80%) tanto dentro dos domínios da quinase catalítica C-terminal quanto da maioria das regiões reguladoras do terminal-N. Embora formas oncogênicas de MEK1 e MEK2 não tenham sido encontradas em cânceres humanos, sabese que a ativação constitutiva de MEK mostrou resultar em transformação celular. Além disso, a MEK também pode ser ativada por outros oncogenes. Consequentemente, a inibição de MEK1 e MEK2 foi estudada como um alvo para o desenvolvimento de fármacos anticancerígenos. Não está claro, no entanto, o papel que MEK1 e MEK2 e a via MAPK/ERK têm na proliferação e na diferenciação de células-tronco neurais adultas.
[011] Além disso, há resultados de estudos que indicam uma ligação entre a via MAPK/ERK e as proteínas Αβ ou tau no cérebro de pacientes com Alzheimer (DA). Infelizmente, não está claro se o tratamento de DA exigirá a ativação ou a inibição dessa via de sinalização e se o controle dessa via de transdução do sinal pode ou não estar vinculado ao tratamento de DA.
[012] Há relatos de níveis aumentados de expressão de proteínas na via MAPK/ERK em pacientes com doença
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 14/273
7/100 de Alzheimer de estágio muito precoce (Arendt et al. (1995) Increased Expression and Subcellular Translocation of the Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase and Mitogen-Activated Protein Kinase in Alzheimer's Disease. Neuroscience 68(1):5 a 18; Gartner et al. (1999) Elevated Expression of p21ras is an Early Event in Alzheimer's Disease and Precedes Neurofibrillary Degeneration. Neuroscience 91(1) ; 1 a 5) , da associação entre ERK1/2 e MEK1/2 com a hiperfosforilação da tau no cérebro de pacientes com Alzheimer (Pei et al. (2002) Up-Regulation of Mitogen-Activated Protein Kinases ERK1/2 and MEK1/2 is Associated with the Progression of Neurofibrillary Degeneration in Alzheimer's Disease. Brain Res Mol Brain Res. 109(1-2):45 a 55), e de expressão aumentada de Ras e ativação de ERK1/2 em células B103 (células de neuroblastoma de camundongo) expressando proteína precursora de amiloide (APP) (Chaput et al. (2012) SILAC-based Proteomic Analysis to Investigate the Impact of Amyloid Precursor Protein Expression in Neuronal-Like B103 Cells. Electrophoresis 33(24):3.728 a 3.737) .
[013] Entretanto, outros estudos mostraram que, quando a ERK1/2 é ativada, a apoptose induzida por Αβ é inibida e o acúmulo de Αβ diminui (Guerra et al. (2004) Plasma Membrane Oestrogen Receptor Mediates Neuroprotection Against β-Amyloid Toxicity Through Activation of Raf-1/MEK/ERK Cascade in Septal-Derived Cholinergic SN56 Cells. J. Neurochem. 91:99 a
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 15/273
8/100
109; Watson et al. (2005) Macrophage Inflammatory Protein 2 Inhibits β-Amyloid Peptide (1-42)-Mediated Hippocampal Neuronal Apoptosis through Activation of Mitogen-Activated Protein Kinase and Phosphatidylinositol 3-Kinase Signaling Pathways. Molecular Pharmacology 67(3):757 a765; Mills et al. (1997) Regulation of Amyloid Precursor Protein Catabolism Involves the Mitogen-Activated Protein Kinase Signal Transduction Pathway. J. Neurosci. 17:9.415 a 9.422). Além disso, foi relatado que a ERK1/2 diminui a atividade da γsecretase, que produz Αβ da APP, e diminui a expressão e a atividade da BACE1 (β-secretasel) em condições de estresse oxidativo (Tamagno et ai. (2009) JNK and ERK1/2 Pathways Have a Dual Opposite Effect on the Expression of BACE1. Neurobiology of Aging 30:1.563 a 1.573).
[014] Portanto, há visões conflitantes sobre os papéis da regulação da via MAPK/ERK e inibição da MEK em relação às doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer, que ainda precisam ser claramente elucidadas.
REVELAÇÃO DA INVENÇÃO PROBLEMA TÉCNICO [015] Os inventores da presente invenção fornecerão um método para induzir a neuro-regeneração através da diferenciação de células-tronco neurais em neurônios e da proteção de células-tronco neurais e neurônios de Αβ com um composto inibindo tanto MEK1 como MEK2. Adicionalmente, os
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 16/273
9/100 inventores fornecerão um método de proteção de neurônios contra perda ou dano neuronal e um método de prevenção ou tratamento de doença neurodegenerativa devido à perda ou dano neuronal com o composto que inibe tanto MEK1 como MEK2.
SOLUÇÃO PARA O PROBLEMA [016] Os presentes inventores constataram que o composto que inibe tanto MEK1 como MEK2 (aqui designado por inibidor de MEK1/2), especificamente, o composto representado por [Fórmula 1] pode induzir eficazmente a diferenciação de células-tronco neurais em neurônios; mais especificamente, protege células-tronco neurais e neurônios contra beta-amiloide ao mesmo tempo em que induz a diferenciação de células-tronco neurais em neurônios.
[FÓRMULA 1]
Figure BR112019009711A2_D0001
r f [017] Um aspecto da presente invenção se refere à composição indutora da diferenciação de células-tronco neurais que compreende o composto de [Fórmula 1] . A composição não ilícita crescimento cancerígeno em células-tronco neurais.
[018] A composição indutora de diferenciação de
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 17/273
10/100 células-tronco neurais induz a diferenciação de células-tronco neurais em neurônios, mesmo na presença de beta-amiloide.
[019] A indução da diferenciação de neurônios pela composição indutora da diferenciação de células-tronco neurais pode ser o resultado da inibição de MEK1 e MEK2.
[020] A presente composição pode incluir um inibidor específico de MEK1/2 diferente do composto de [Fórmula 1] . Essa composição induz a diferenciação de células-tronco neurais em neurônios, mesmo na presença de beta-amiloide.
[021] Um outro aspecto da presente invenção se refere ao método de diferenciação de células-tronco neurais em neurônios com o uso da composição indutora de diferenciação de células-tronco neurais.
[022] O método de diferenciação pode consistir em tratar células-tronco neurais com a composição indutora de diferenciação de células-tronco neurais e permitir de 1 a 7 dias para a conclusão da diferenciação.
[023] Um outro aspecto da presente invenção se refere ao composto de [Fórmula 1] para uso na indução da diferenciação de células-tronco neurais, especificamente para uso na proteção de células-tronco neurais e neurônios e na diferenciação de células-tronco neurais em neurônios, mesmo na presença de beta-amiloide. Ainda outro aspecto da presente invenção se refere a um inibidor de MEK1/2 específico para uso na indução da diferenciação de células-tronco neurais,
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 18/273
11/100 especificamente para uso na proteção de células-tronco neurais e neurônios e na diferenciação de células-tronco neurais em neurônios, mesmo na presença de beta-amiloide.
[024] Outro aspecto da presente invenção se refere a um kit para uso na indução da diferenciação de células-tronco neurais em neurônios in vitro. Esse kit pode incluir a composição indutora de diferenciação de célulastronco neurais, meios de cultura, placas, soluções de revestimento e aditivos necessários para o cultivo de células, como fatores de crescimento, etc.
[025] Outro aspecto da presente invenção se refere a um método de indução de neuro-regeneração que compreende administrar um inibidor específico de MEK1/2 a um paciente em necessidade do mesmo. Na presente invenção, o inibidor de MEK1/2 induz a neuro-regeneração diferenciando-se células-tronco neurais em neurônios, protegendo-se célulastronco neurais e neurônios contra a citotoxicidade de betaamiloides, ou por ambas as alternativas acima. O inibidor de MEK1/2 com a máxima preferência para esse método é o composto de [Fórmula 1]. Um aspecto adicional da presente invenção se refere ao inibidor específico de MEK1/2, especificamente ao composto de [Fórmula 1], para uso na indução de neuroregeneração .
[026] Outro aspecto da presente invenção se refere a um método de proteção de neurônios contra a perda ou
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 19/273
12/100 danos neuronais que compreende administrar um inibidor específico de MEK1/2 a um paciente com necessidade do mesmo. O inibidor de MEK1/2 com a máxima preferência para esse método é o composto de [Fórmula 1]. Um aspecto adicional da presente invenção se refere ao inibidor específico de MEK1/2, especificamente ao composto de [Fórmula 1], para uso na proteção de neurônios contra a perda ou danos neuronais.
[027] Outro aspecto da presente invenção se refere a uma composição farmacêutica que compreende o composto de [Fórmula 1] como o seu ingrediente ativo para a prevenção ou tratamento de doenças neurodegenerativas ou o método de prevenção ou tratamento de doenças neurodegenerativas com o uso do composto de [Fórmula 1].
[028] A doença neurodegenerativa pertence a distúrbios funcionais em vários sistemas, como o controle motor, cognição, percepção, função sensorial, e o sistema nervoso autônomo devido à perda ou diminuição da função neuronal. Exemplos de doenças neurodegenerativas incluem demência, doença de Alzheimer (DA), demência vascular, demência senil, demência frontotemporal (FTD), demência do corpo de Lewy (LBD) , doença de Parkinson (PD) , atrofia de múltiplos sistemas (MSA), degeneração corticobasal (CBD), paralisia supranuclear progressiva (PSP), doença de Huntington (HD), esclerose lateral amiotrófica (ALS, doença de LouGehrig), esclerose lateral primária (PLS), atrofia muscular
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 20/273
13/100 espinhal, paralisia bulbar progressiva (PBP), atrofia muscular progressiva (PMA), paralisia pseudobulbar, paraplegia espástica hereditária (HSP), ataxia cerebelar, doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD), esclerose múltipla (MS), síndrome de Guillain-Barré (GBS), etc.
[029] A composição ou método farmacêutico pode incluir ou usar outro inibidor específico de MEK1/2 diferente do composto de [Fórmula 1].
[030] Um aspecto adicional da presente invenção se refere ao composto de [Fórmula 1] para uso na prevenção e tratamento de doença neurodegenerativa. Além disso, se refere ao inibidor específico de MEK1/2 para uso na prevenção e tratamento de doenças neurodegenerativas.
[031] Outro aspecto da presente invenção se refere a um método de triagem de compostos que induzem a diferenciação de células-tronco neurais em neurônios e protegem as mesmas em ambientes simulados de doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer. O método de triagem de acordo com a presente invenção compreende as etapas de:
[032] 1) tratar células-tronco neurais isoladas de camundongos adultos com substâncias indutoras de dano neuronal, como beta-amiloide (especificamente em sua forma oligomérica), MPTP (1-metil-4-fenil-1,2,3,6tetrahidropiridina), rotenona, oxidopamina, glutamato, LPS
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 21/273
14/100 (lipopolissacarideo), S100B (proteína de ligação ao cálcio B S100);
[033] 2) adicionar um material de teste às células-tronco neurais tratadas com as substâncias indutoras de danos de neurônios acima; e [034] 3) examinar a diferenciação ou morte das células-tronco neurais por análise morfológica.
[035] A seguir, vários aspectos e modalidades da presente invenção serão descritos em detalhe.
[036] Conforme usado aqui na presente invenção, células-tronco neurais se referem a ter a capacidade de proliferar continuamente no estado indiferenciado (autorenovação) e a capacidade de se diferenciar em vários neurônios e glia de uma célula-tronco (multipotência) . A célula-tronco neural é de origem animal. O termo animal se refere não apenas a seres humanos e primatas, mas destina-se a incluir animais como vacas, porcos, ovelhas, cavalos, camundongos, ratos, gatos, etc. e, de preferência, seres humanos. Em alguns casos, o termo célula-tronco neural é usado para incluir células progenitoras neurais.
[037] Conforme usado aqui na presente invenção, o termo diferenciação se refere ao desenvolvimento de uma célula em uma célula especializada. Mais especificamente, se refere ao fenômeno em que a estrutura ou função da célula se especializa através da divisão celular, proliferação e
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 22/273
15/100 crescimento da célula e às mudanças na estrutura (morfologia) ou função das células e tecidos, a fim de executar as tarefas atribuídas a eles. A diferenciação de células-tronco neurais é precedida pela divisão assimétrica da célula-mãe em duas células que têm propriedades diferentes. Uma das células-filha é a mesma que a célula-mãe, permanecendo como célula-tronco, e a outra se diferencia em uma célula especializada. O fato de esse tipo de processo de divisão assimétrica acompanhar a diferenciação de células-tronco neurais significa que a diferenciação de células-tronco neurais engloba o significado de proliferação.
[038] Conforme usado aqui na presente invenção, o termo proliferação se refere ao fenômeno no qual uma célula se divide e prolifera. Isso se refere especificamente ao aumento do mesmo tipo de células através da divisão celular, ao aumento do número de células através da reprodução da mesma forma de células.
[039] Como usado aqui na presente invenção, o termo proteção refere-se a impedir que as células sejam danificadas por estímulos externos prejudiciais para que as células-tronco neurais possam se proliferar ou diferenciar sem sofrer morte celular, e os neurônios diferenciados possam sobreviver na presença de fatores citotóxicos, especificamente, beta-amiloide. Em relação à DA, o termo proteção na presente invenção inclui o aspecto de que as
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 23/273
16/100 células-tronco neurais e os neurônios são protegidos contra danos causados por beta-amiloide através da redução da razão de Αβ (1-42)/Αβ (1-40) no cérebro (Majid et al. (2015) Pharmacologic Treatment with Histone Deacetylase 6 Inhibitor (ACY-738) Recovers Alzheimer's Disease Phenotype in Amyloid Precursor Protein/Presenilin 1 (APP/PS1) Mice. Alzheimers Dement. 170 a 181; Borchelt et al. (1996) Familial Alzheimer's Disease-Linked Presenilin 1 Variants Elevate Αβ1-42/1-40 Ratio In Vitro and In Vivo. Neuron. 17:1.005 a 1.013) .
[040] Conforme usado aqui na presente invenção, o termo prevenção se refere a todas as atividades que inibem ou retardam o progresso de doenças neurodegenerativas através da administração da composição farmacêutica de acordo com a presente invenção. Tratamento se refere a todas as atividades que aliviam os sintomas ou melhoram o estado da doença em pacientes neurodegenerativos suspeitos ou diagnosticados.
[041] Um aspecto da presente invenção se refere à composição indutora da diferenciação de células-tronco neurais que compreende o composto representado como [Fórmula 1] .
[FÓRMULA 1]
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 24/273
17/100
Figure BR112019009711A2_D0002
[042]
O nome comum do composto representado acima como [Fórmula 1] é trametinib e seu nome químico é N-(3{3-ciclopropil-5-[(2-fluoro-4-iodofenil)amino]-6,8-dimetil 2,4,7-trioxo-3,4,6,7-tetra-hidropirido[4,3-d] pirimidin1(2H)-ii}fenil)acetamida. O mesmo é revelado no Exemplo 4-1 do documento W02005/121142, cujo requerente é a Japan Tobacco Inc. O composto de [Fórmula 1] inibe tanto MEK1 como MEK2, os componentes a montante de ERK na via de transdução de sinal MAPK/ERK (proteína ativada por mitogênio/quinase regulada extracelular). Esse composto é usado como um fármaco contra o câncer para melanoma e câncer de células não pequenas. Na presente invenção, o mesmo é usado na forma de uma base livre ou de um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável. Exemplos de solvatos possíveis são hidratos, dimetilsulfóxido, ácido acético, etanol, nitrometano, clorobenzeno, 1-pentanol, álcool isopropílico, etilenoglicol, 3-metil-l-butanol, etc.
[043] Em particular, um aspecto da presente invenção se refere a uma composição que compreende o composto de [Fórmula 1], que protege as células-tronco neuronais e os
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 25/273
18/100 neurônios e diferencia as células-tronco neurais em neurônios. O beta-amiloide se acumula no cérebro como placas amiloides, está associado a danos sinápticos, danos neuronais e atrofia cerebral, e é conhecido por ocasionar os sintomas típicos da doença de Alzheimer, disfunção cognitiva e da memória. Portanto, a proteção de células-tronco neurais e neurônios contra beta-amiloide, enquanto a regeneração de neurônios através da diferenciação de células-tronco neurais endógenas pode constituir um tratamento fundamental para a doença de Alzheimer.
[044] Αβ(1-42), que consiste em 42 aminoácidos, tem uma tendência maior de formar agregados do que Αβ(1-40) e uma tendência maior de formar os trímeros ou tetrâmeros mais tóxicos e, portanto, é considerado fortemente associado ao estado patológico da doença de Alzheimer. Portanto, é preferencial a composição que pode proteger e diferenciar células-tronco neurais mesmo na presença de Αβ(1-42), especialmente oligômeros Αβ (1-42).
[045] Conforme mostrado nos exemplos de teste, com o propósito de encontrar uma composição que induz a diferenciação de células-tronco neurais de camundongo em neurônios, os inventores confirmaram que o composto de [Fórmula 1] é muito eficaz na indução da diferenciação de células-tronco neurais isoladas de cérebro embrionário ou adulto de camundongo em neurônios.
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 26/273
19/100
[046] As células-tronco neurais têm a capacidade
de se diferenciar em vários neurônios ou glia, como
oligodendrócitos, astrócitos e microglia. 0 composto de
[Fórmula 1] diferencia as células-tronco neurais principalmente em neurônios e limita a diferenciação em glia. Portanto, o composto de [Fórmula 1] pode efetivamente induzir a geração de neurônios (neurogênese), permitindo a substituição de neurônios danificados por esses novos neurônios no cérebro de pacientes com doença neurodegenerativa com dano neuronal, e pode ser usado como fármaco que promove a regeneração neural ou neuro-regeneração.
[047] De acordo com os exemplos específicos da presente invenção, os inventores estabeleceram através de experimentos in vitro tratados com Αβ oligoméricos que simulam o ambiente cerebral de pacientes com Alzheimer que o composto de [Fórmula 1] protege contra a morte de células-tronco neurais ou neurônios e induz a diferenciação de células-tronco neurais em neurônios (Figura 2) [048] Adicionalmente, um aspecto da presente invenção se refere à composição indutora da diferenciação de células-tronco neurais que compreende um composto específico que inibe tanto MEK1 como MEK2. Nesta invenção, o composto que inibe tanto MEK1 como MEK2 é também denominado inibidor MEK1/2. Inibidor de MEK1/2 preferencialmente tem um valor de IC50 no nível nM e uma diferença de menos de lOx nos valores
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 27/273
20/100 de IC50 de MEK1 e MEK2, de preferência, menos de 5x. O IC50 para MEK1 e 2 pode ser medido por métodos em referências como [Yamaguchi et al. (2011) International Journal of Oncology 39:23 a 31] . O inibidor de MEK1/2 que pode ser usado na presente invenção é um composto que induz a diferenciação de célulastronco neurais em neurônios, protegendo simultaneamente as células-tronco neurais e os neurônios contra materiais tóxicos como Αβ. Exemplos de inibidores de MEK1/2 que podem ser usados na presente invenção são os seguintes: trametinib, pimasertib(AS703026), AZD8330, binimetinib (MEK162, ARRY-162, ARRY-438162), refametinib (RDEA119, Bay 86-9766), PD318088, PD0325901, RO5126766.
[049] A estrutura química dos inibidores de
MEK1/2 preferenciais e seus valores de IC50 e as referências que descrevem os métodos de medição dos valores de IC50 estão listados da seguinte forma:
Nome Estrutura Química Valor de IC50 para MEK 1, MEK2 (Referências para o método de medição dos valores de IC50)
Trametinib H O τύ r r |í “7 0,92 ~ 3,4 nM (International Journal of Oncology 2011;39:23 a 31)
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 28/273
21/100
Pimasertib (AS703026) μ QH *ί Η T ' < 1 μΜ (US 2009/0093462, Tabela I, Exemplo 115)
AZD8330 H: bx ,:f ,.RH F .. v G • H i , 'x Nx V r T T 1 ( Z' X C ... ” - 7 nM (AACR Annual Meeting, 2009, Abst 3696)
Binimetinib (ARRY-162, ARRY-438162) Br F v' x F H---A Α ,Νχ /X .OH /h ~ Ϊ ° 0 12 nM (American College of Rheumatology, 2006 Annual Scientific Meeting, Abst 794)
Refametinib (RDEA119, Bay 86-9766) ,A ..,,x.... .,,Xs a 0:H (’ K J 1 ' ..IS. OH Ο' 'NH ... F 1 Η i ..-0 xAsz x---Ax. F MEK1: 19 nM, MEK2: 4 7 nM (Cancer Res. 2009; 69(17) :6.839 a 6.847)
PD318088 ?H H ÓH ,.-Χχ^Νχ^.Λ^ Br ΧΊ F 1,4 nM (WO 02/06213, Exemplo 40)
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 29/273
22/100
PD0325901 i n t OH ..... 3,6 ~24 nM (Oncotarget 2012;3:1.533 a 1.545)
RO5126766 (CH5126766) J, O τ'ΐόίχ 4 z O I A IL L;.jL Ίφζ T o. ,.½.... 1 J 160 nM (Cancer Res. 2013; 73 (13) : 4.050 a 4.060)
[050] Além disso, um aspecto da presente invenção se refere a uma composição que compreende um inibidor de MEK1/2 para diferenciar as células-tronco neurais em neurônios enquanto protege as células-tronco neurais e neurônios contra beta-amiloide, especialmente a forma oligomérica Αβ (1-42).
[051] A utilização de um inibidor seletivo para MEK1 ou MEK2, não o inibidor de MEK1/2 que inibe MEK1 e MEK2, não é desejável, uma vez que sua atividade indutora de diferenciação de células-tronco neuronais é fraca. Por exemplo, cobimetinib é um inibidor seletivo de MEK1 que mostra lOOx ou maior seletividade para MEK1 em comparação com MEK2 (MEK1 IC50 = 0,95 nM, MEK2 IC50 = 199 nM; Molecules 2017; 22:1.551) . Ao contrário do inibidor de MEK 1/2, o cobimetinib não induz a diferenciação de células-tronco
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 30/273
23/100 neurais adultas de camundongo, mesmo a uma concentração elevada de 10 μΜ, independentemente do fato de o beta-amiloide ter sido tratado ou não (Exemplo 7).
[052] Além disso, o fato de a inibição de MEK1 e MEK2 estar envolvida na indução da diferenciação de NSC em neurônios e na proteção de NSC e neurônios foi confirmado por experimentos no Exemplo 5. Esses experimentos usaram shRNA (RNA em forma de grampo (hairpin) curto) para inibir a expressão de MEK1 e MEK2 e usaram plasmideos com MEK1 constitutivamente ativa (CAMEK1) e MEK2 constitutivamente ativa (CAMEK2) para ativar a expressão de MEK1 e MEK2 (Exemplo 5) .
[053] No entanto, nem todos os inibidores de MEK1/2 apresentam o mesmo efeito. Por exemplo, os inibidores de MEK1/2 U0126, PD184352 e BI847325 mostraram células-tronco neurais fracas (NSC) para efeitos indutores de diferenciação de neurônios ou causaram citotoxicidade, tornando-as inadequadas para uso como composição indutora de diferenciação de células-tronco neurais da presente invenção (Figuras 10a e 10c) . Por conseguinte, o NSC para atividade indutora de diferenciação de neurônios ou a atividade de proteção de NSC e neurônios pode diferir dependendo das diferentes propriedades exclusivas que o composto tem para além de sua atividade inibidora de MEK1/2. Na presente invenção, os inibidores de MEK1/2 que mostraram NSC para atividade indutora
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 31/273
24/100 de diferenciação de neurônios ou atividade de proteção de NSC e neurônios são trametinib, pimasertib(AS703026), AZD8330, binimetinib, refametinib, PD318088, PD0325901 e RO5126766.
[054] Em particular, o composto de [Fórmula 1] (trametinib) mostrou diferenciação e proteção marcadamente superiores contra as capacidades de Αβ mesmo quando comparado com os outros inibidores de MEK1/2 que podem ser usados na presente invenção. Por exemplo, o composto de [Fórmula 1] mostrou diferenciação e proteção marcadamente superiores às capacidades de Αβ em comparação com AS703026 a lOOx ou maior concentração inferior. Esse efeito do composto de [Fórmula 1] é marcadamente superior a apenas o efeito previsto de sua atividade inibidora de MEK1/2.
[055] O composto de [Fórmula 1] nunca foi usado com a finalidade de induzir a diferenciação de células-tronco neurais em neurônios e só foi conhecido como um inibidor de MEK1/2 que inibe as atividades de MEK1 e MEK2 através de ligação não competitiva de ATP e como melanoma e fármacos de tratamento de câncer de células não pequenas.
[056] Outro aspecto da presente invenção se refere ao método de indução da diferenciação de NCS em neurônios com o uso do composto de [Fórmula 1] ou outros inibidores de MEK1/2.
[057] Quanto ao método revelado na presente invenção, as células-tronco neurais podem ser isoladas de
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 32/273
25/100 cérebro embrionário ou adulto de acordo com métodos conhecidos. Alternativamente, as células-tronco neurais podem ser compradas no mercado ou podem ser cultivadas por qualquer método convencional conhecido na técnica. Não há restrição particular quanto ao disposto acima. Na seção de Exemplos a seguir, foram usadas células-tronco neurais isoladas dos lobos frontais dos embriões de camundongos do dia 14,5 e da zona subventricular de ratos da semana 8.
[058] Antes da diferenciação, as células-tronco neurais podem ser inoculadas em um meio de cultura e cultivadas a 37 °C. O meio de cultura pode ser qualquer meio sem soro suplementado com fator de crescimento sem restrições particulares. O meio pode ser, por exemplo, Mistura de Nutriente F12/Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM/F12) (1:1) com a adição de um ou mais componentes médios selecionados do grupo consistindo em putrescina 90 a 110 μΜ, selenita 20 a 40 nM, progesterona 10 a 30 nM, 1,0 a 2,0 mg/ml de glicose d-(+), 20 a 30 pg/ml de insulina, 0,05 a 0,2 mg/ml de apo-transferrina, Glutamax 0,3 a 0,6 mM, 50 a 150 lU/ml de penicilina, e 50 a 150 pg/ml de estreptomicina, e com a adição adicional de fator de crescimento selecionado do grupo que consiste em 10 a 30 ng/ml de bFGF, 10 a 30 ng/ml de EGF, ou misturas dos mesmos.
[059] As células-tronco neurais podem ser cultivadas em meio N2 suplementado com fator de crescimento
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 33/273
26/100 [Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM/F12 (1:1) suplementado com putrescina 100 μΜ, selenita 30 nM, progesterona 20 nM, 1,55 mg/ml de d-(+)-glicose, 25 pg/ml de insulina, 0,1 mg/ml de apo-transferrina, Glutamax 0,5 mM, 100 Ul/ml de penicilina e 100 pg/ml de estreptomicina)] para obter células-tronco neurais não diferenciadas.
[060] A diferenciação de células-tronco neurais cultivadas em neurônios envolve o tratamento de células-tronco neurais com a composição indutora de diferenciação que compreende o composto de [Fórmula 1] e, então, permitindo a diferenciação de acordo com um método conhecido na técnica. Por exemplo, a composição indutora da diferenciação de célulastronco neurais da presente invenção é adicionada ao meio contendo as células-tronco neurais cultivadas e a diferenciação é induzida a 37 °C.
[061] As células-tronco neurais diferenciam-se em neurônios através de um processo de diferenciação sob as várias condições de cultura mencionadas acima (por exemplo, o conteúdo e a quantidade dos componentes do meio e o período de cultura). As condições de cultura não estão particularmente limitadas às condições mencionadas acima. De preferência, a temperatura da cultura é de 35 °C a 40 °C, na qual a diferenciação das células-tronco neurais pode ser induzida. Se a temperatura da cultura for inferior a 35 °C ou exceder 40 °C, as células-tronco neurais sofrem morte celular antes de se
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 34/273
27/100 diferenciar em neurônios.
[062] Antes de a composição de indução de diferenciação de células-tronco neurais que compreende o composto de [Fórmula 1] ser adicionada, é preferencial assegurar uma concentração suficiente de células na cultura de células-tronco neurais. Além disso, para observar alterações na cultura como proliferação, diferenciação ou morte celular, é preferencial tratar as células-tronco neurais com a composição indutora da diferenciação de células-tronco neurais que compreende o composto de [Fórmula 1] pelo método descrito acima dentro de um período de cultura de 7 dias ou menos. Para esse fim, o período de cultura das células-tronco neurais é, de preferência, de pelo menos 1 dia até um máximo de 7 dias para assegurar uma concentração suficiente de células.
[063] Quanto à concentração do composto de [Fórmula 1], é preferencial adicionar o mesmo às células-tronco neurais a uma concentração de 1 nM a 20 μΜ. Se a concentração for inferior a 1 nM, a capacidade de indução de diferenciação de células-tronco neurais é reduzida, se for superior a 20 μΜ, a citotoxicidade celular torna-se um problema. Para a adição do composto, as células-tronco neurais são tipicamente semeadas nas cavidades da placa para cobrir até 70 a 80% da superfície da cavidade. Por exemplo, IxlO5 células/cavidade são semeadas em placas de 12 cavidades, 5xl05 células/cavidade para placas de 6 cavidades.
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 35/273
28/100 [064] Além disso, como será explicado mais tarde na seção de Exemplos, é preferencial usar o composto de [Fórmula 1] a uma concentração de 10 nM a 10 mM, com mais preferência, 10 nM a 100 nM. Se a concentração for inferior a 10 nM, o tempo necessário para induzir a diferenciação aumenta, o que não é econômico. No entanto, se for superior a 10 μΜ, o composto de [Fórmula 1] como ingrediente ativo torna-se em excesso e, após subsequente administração in vivo, a inibição de MEK1 e MEK2 pode tornar-se demasiado forte, podendo afetar muitas vias de sinalização intracelular e, como resultado, pode induzir muitas reações indesejáveis.
[065] Após a adição da composição indutora de diferenciação de células-tronco neurais que compreende o composto de [Fórmula 1] que é um inibidor de MEK1 e MEK2 para a cultura de células-tronco neurais, demora de 1 a 7 dias, de preferência, cerca de 3 a 5 dias, para que o processo de diferenciação se complete.
EFEITO VANTAJOSO DA INVENÇÃO [066] Quando a composição indutora da diferenciação de células-tronco neurais da presente invenção é aplicada a pacientes com doença neurodegenerativa, a mesma induz as células-tronco neurais no cérebro do paciente a diferenciarem-se em neurônios e permite a substituição de neurônios lesionados ou perdidos por neurônios recentemente fabricados. Ou seja, a composição da presente invenção induz
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 36/273
29/100 a regeneração neural ou neuro-regeneração através da neurogênese de células-tronco neurais. Portanto, a composição pode ser usada para a prevenção ou tratamento de doenças neurodegenerativas. Na presente invenção, neurogênese significa a geração de neurônios a partir de células-tronco neurais, e regeneração neural ou neuro-regeneração significa a regeneração organizacional e funcional do sistema nervoso que foi degenerado devido à morte celular neuronal através da neurogênese. Além disso, a composição da presente invenção pode exercer um efeito de tratamento ou prevenção, protegendo células-tronco neurais ou neurônios contra oligômeros de beta-amiloide.
[067] Além disso, as aplicações da presente invenção podem ser amplamente usadas como materiais para o exame de efeitos de drogas ou para numerosos estudos no desenvolvimento de novos fármacos para doenças neurodegenerativas.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [068] A Figura 1 é a análise morfológica do Exemplo 1, em que a diferenciação de células-tronco neurais embrionárias de camundongo em neurônios, quando tratadas com várias concentrações de trametinib e pimasertib (AS703026), é observada por microscopia de fase de contrato. UD e D são células-tronco neurais embrionárias de camundongo indiferenciadas obtidas do Exemplo 1 Etapa IA e células-tronco
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 37/273
30/100 embrionárias de camundongo diferenciadas obtidas da Etapa 1B, respectivamente, que não são tratadas com qualquer material de teste.
[069] A Figura 2 é a análise morfológica do Exemplo 2, em que a linha inferior mostra o resultado de células-tronco neurais adultas de camundongo tratadas com beta-amiloide oligomérico 10 μΜ (Αβι-42) e a fileira de cima mostra células-tronco neurais não tratadas com beta-amiloide. UD e D são células-tronco neurais adultas de camundongo indiferenciadas obtidas do Exemplo 2 Etapa IA e células-tronco adultas de camundongo diferenciadas obtidas da Etapa 1B, respectivamente, que não são tratadas com qualquer material de teste. Trametinib (10 nM), trametinib (100 nM), memantina (5 μΜ) , memantina (10 μΜ) e AS703026 (10 μΜ) são os resultados obtidos quando as células estaminais neuronais adultas indiferenciadas de camundongo obtidas do Exemplo 2 de Etapa IA foram tratadas com os respectivos materiais de teste nas respectivas concentrações.
[070] A Figura é a comparação da análise da morfologia celular de células-tronco neurais embrionárias do dia 14,5 de camundongo que são tratadas (linha de baixo) ou não tratadas (linha de cima) com beta-amiloide oligomérico 10 μΜ de acordo com o Exemplo Comparativo 1. UD (não diferenciada) e D (diferenciada) são células-tronco neurais embrionárias de camundongo não diferenciadas e diferenciadas, obtidas do
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 38/273
31/100
Exemplo Comparativo 1, Etapa 1, respectivamente, que não são tratadas com qualquer material de teste. Trametinib (100 nM), memantina (10 μΜ) e AS703026 (10 μΜ) são os resultados obtidos quando células-tronco neurais embrionárias de camundongo não diferenciadas obtidas do Exemplo Comparativo 1 Etapa 1 foram tratadas com os respectivos materiais de teste nas respectivas concentrações .
[071] A Figura 4 mostra as imagens de microscopia fluorescente do Exemplo 3. Na primeira linha, UD e D são células-tronco neurais embrionárias não diferenciadas e diferenciadas, respectivamente, não tratadas com qualquer material de teste. A segunda e terceira fileiras são imagens de células tratadas com as respectivas concentrações de trametinib e AS703026. Os pontos azuis representam os núcleos das células manchados com DAPI e as células com ramificações finas alongadas em vermelho representam os neurônios manchados com Tujl acoplado à rodamina.
[072] A Figura 5 mostra o resultado do Exemplo 4-1 que mostra os níveis relativos de expressão de mRNA do marcador específico de neuronal Tujl (Figura 5a) e do marcador neuronal dopaminérgico TH (Figura 5b) em células-tronco neurais embrionárias de camundongo tratadas com várias concentrações de trametinib e AS703026.
[073] A Figura 6 faz parte do resultado do Exemplo 4-2 que mostra os níveis relativos de expressão de
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 39/273
32/100 mRNA do marcador neuronal dopaminérgico TH (Figura 6a) , do marcador neuronal colinérgico ChAT (Figura 6b) , do marcador neuronal motor Isll (Figura 6c) e do marcador neuronal GABAérgico Gadl (Figura 6d) em células-tronco neurais embrionárias de camundongo tratadas com várias concentrações de trametinib.
[074] A Figura 7 faz parte do resultado do Exemplo 4-2 que mostra os níveis relativos de expressão de mRNA do marcador neuronal Tujl (Figura 7a), do marcador neuronal colinérgico ChAT (Figura 7b) e do marcador neuronal dopaminérgico TH (Figura 7c) em células-tronco neuronais adultas de camundongo tratadas com trametinib 10 nM (Tra) e AS703026 10 μΜ (AS).
[075] A Figura 8a é o resultado do Exemplo 5-1 que confirma a presença ou ausência de expressão do marcador neuronal dopaminérgico TH através de RT-PCR para analisar a capacidade de células-tronco neurais embrionárias de camundongo, em que a expressão de MEK1 ou MEK1 e MEK2 é inibida, para diferenciar em neurônios.
[076] A Figura 8b faz parte do resultado do Exemplo 5-1 que mostra os níveis relativos de expressão de mRNA de Tujl e TH em células-tronco neurais embrionárias de camundongo em que a expressão de MEK1 ou MEK2 ou MEK1 e MEK2 é inibida por shMEKl e shMEK2 e confirma a presença ou ausência das proteínas Tujl e TH através de western blotting.
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 40/273
33/100 [077] A Figura 8c faz parte do resultado do Exemplo 5-2 que mostra os níveis relativos de expressão de mRNA de Tujl e TH em células-tronco neurais embrionárias de camundongo em que a expressão de MEK1 ou MEK2 ou MEK1 e MEK2 é ativada por CAMEK1 e CAMEK2 e confirma a presença ou ausência das proteínas Tujl e TH através de western blotting.
[078] A Figura 9 é o resultado do Exemplo 5-3 que mostra as observações da morfologia celular como visto pela microscopia de contraste de fase (Figura 9a) e a análise dos níveis relativos de expressão de mRNA do marcador neuronal Tujl (Figura 9b) em células-tronco neuronais adultas de camundongo tratadas ou não tratadas com Αβ, em que a expressão de MEK1 ou MEK2 ou tanto de MEK1 como de MEK2 é inibida por shMEKl e shMEK2.
[079] A Figura 10 é o resultado do Exemplo 6 que mostra as observações da morfologia celular como visto pela microscopia de contraste de fase (Figura 10a) e o nível de expressão de mRNA relativo de Tujl (Figura 10b) em célulastronco neurais embrionárias de camundongo tratadas com inibidores de MEK1/2 trametinib, AZD8330, PD184352, refametinib, PD318088, binimetinib, e AS703026 em concentrações de 0,1 μΜ, 1,0 μΜ e 10 μΜ. A Figura 10c são as observações de microscopia de contraste de fase de célulastronco neuronais adultas de camundongo tratadas com PD0325901, RO5126766, BI847325 e U0126 (Figura 10c).
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 41/273
34/100 [080] A Figura 11 é o resultado do Exemplo 7 que mostra observações de morfologia celular como observado por microscopia de contraste de fase de células-tronco neurais adultas de camundongo tratadas ou não tratadas com Αβ que foram, então, submetidas ao tratamento com inibidores de MEK1/2 trametinib (0,1 μΜ), AS703026 (10 μΜ), AZD8330 (1 μΜ), PD318088 (1 μΜ), binimetinib (10 μΜ), refametinib (1 μΜ) , PD0325901 (10 μΜ), RO5126766 (10 μΜ) e cobimetinib (10 μΜ) que é conhecido por ser um inibidor seletivo de MEK1 em comparação com MEK2. As linhas marcadas com são células não tratadas com betaamiloide e as marcadas com Αβι-42 são células tratadas com beta-amiloide 10 μΜ.
[081] A Figura 12 faz parte do resultado do Exemplo 8 que mostra o manchamento imuno-histoquímico de NeuN em fatias no córtex somatossensorial de camundongos 5XFAD administrados com trametinib (Figura 12a). A Figura 12b mostra a relação quantitativa do número de células NeuN manchadas em camundongos administrados com trametinib em comparação com os controles que foram administrados apenas com veículos (Figura 12b) .
[082] A Figura 13 faz parte do resultado do Exemplo 8 que mostra o manchamento imuno-histoquímico de NeuN em fatias do córtex motor de camundongos 5XFAD administrados com trametinib (Figura 13a) . A Figura 13b mostra a relação quantitativa do número de células NeuN manchadas em camundongos
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 42/273
35/100 administrados com trametinib em comparação com os controles que foram administrados apenas com veículos (Figura 13b).
[083] A Figura 14 faz parte do resultado do Exemplo 8 que mostra o manchamento imuno-histoquímico de NeuN em fatias do subículo do hipocampo de camundongos 5XFAD administrados com trametinib (Figura 14a). A Figura 14b mostra a relação quantitativa do número de células NeuN manchadas em camundongos administrados com trametinib em comparação com os controles que foram administrados apenas com veículos (Figura 14b) .
[084] A Figura 15 é o resultado do Exemplo 9-1 que mostra o manchamento imuno-histoquímico de Tujl em lâminas do córtex somatossensorial de camundongos 5XFAD administrados com trametinib (Figura Nas gravuras, as partes marcadas com setas (-½) indicam células manchadas com Tujl e as partes marcadas com setas (▼) indicam placas formadas por agregação de beta-amiloide.
[085] A Figura 16 é o resultado dos Exemplos 92 e 9-3 que mostra o manchamento de Nissl, NeuN, Dcx e BrdU em lâminas do giro denteado do hipocampo de camundongos 5XFAD administrados com trametinib (Figura 16a) e a quantificação de células etiquetadas com BrdU (Figura 16b). Na Figura 16a, as partes marcadas com setas (->) indicam células manchadas com Dcx e as partes marcadas com setas (▼) indicam células etiquetadas com BrdU.
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 43/273
36/100 [086] A Figura 17 é o resultado do Exemplo 10 que mostra manchamento TUNEL (etiquetagem terminal de desoxinucleotidil transferase dUTP nick), um indicador de apoptose, em fatias do subículo do hipocampo e córtex somatossensorial de camundongos 5XFAD administrados com trametinib. Células no subículo do hipocampo que sofreram apoptose e apresentam fluorescência verde são indicadas por setas (->) .
[087] A Figura 18 é o resultado do Exemplo 11 que mostra Células de Purkinje através de manchamento de Tujl e calbindina em fatias do cerebelo de camundongos 5XFAD administrados com trametinib. São mostradas duas (manchamento de Tujl) ou três (manchamento de calbindina) gravuras de fatia de cada grupo.
[088] A Figura 19 é o resultado do Exemplo 12 que confirma a presença ou ausência da proteína pERK através de western blotting com o uso dos hemisférios cerebrais de camundongos 5XFAD administrados com trametinib (Figura 19a); A Figura 19b é a quantificação dos níveis de proteína pERK (Figura 19b).
[089] A Figura 20 é o resultado do Exemplo 13 que mostra a quantificação de Αβ40 e Αβ42 e a razão (Αβ42/Αβ40) através de ELISA (Ensaio de imunoabsorção enzimática) com o uso dos hemisférios cerebrais de camundongos 5XFAD administrados com trametinib.
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 44/273
37/100 [090] As marcas de asterisco (*) nos gráficos das Figuras indicam o disposto a seguir através dos resultados estatísticos do teste t: *: P < 0,05, **: P < 0,01, ***: p < 0,005.
MELHOR MODO PARA EXECUTAR A INVENÇÃO [091] Quando as células-tronco neurais foram tratadas com o composto de [Fórmula 1] da presente invenção, os presentes inventores observaram um aumento do nível de expressão no marcador neuronal Tujl, bem como níveis aumentados de expressão em todos os seguintes: o marcador do neurônio dopaminérgico TH, o marcador do neurônio GABAérgico Gadl, o marcador do neurônio motor Isll, e o marcador do neurônio colinérgico ChAT (Exemplo 4). Isso significa que o composto de [Fórmula 1] pode diferenciar células-tronco neurais em vários tipos de neurônios, como neurônios dopaminérgicos, neurônios GABAérgicos, neurônios colinérgicos e neurônios motores. Consequentemente, o composto de [Fórmula 1] pode ser usado no tratamento de várias doenças neurodegenerativas que são causadas por várias perdas ou danos neuronais. Por exemplo, a doença de Parkinson está geralmente associada à perda de neurônios dopaminérgicos, doenças do neurônio motor como a doença de Lou-Gehrig/ELA, paralisia bulbar progressiva (PBP), atrofia muscular progressiva (AMP), esclerose lateral primária (PLS), paralisia pseudobulbar (PBA) e paraplegia espástica hereditária (HSP) estão associados com a perda de neurônios
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 45/273
38/100 motores, e demência, como a doença de Alzheimer, demência vascular e demência senil estão geralmente associados à perda de neurônios colinérgicos. Além disso, a doença de Huntington geralmente está associada à perda de neurônios espinosos médios GABAérgicos no estriado dos gânglios da base.
[092] Em particular, devido ao fato de que o composto de [Fórmula 1] permite a diferenciação de célulastronco neurais em neurônios, protegendo as mesmas contra Αβ, o principal recurso neuropatológico da doença de Alzheimer, pode ser utilmente aplicado como um tratamento para a doença de Alzheimer.
[093] Os presentes inventores confirmaram que o composto de [Fórmula 1] aumentou o número de neurônios nas regiões do subiculo e da camada de córtex cerebral 5 no modelo de camundongo de Alzheimer (5xFAD) que expressa os genes de Alzheimer humanos (Exemplo 8) . O camundongo 5xFAD porta as mutações genéticas para APP (proteína precursora amiloide) e presenilina (PSEN1) que são conhecidas por causar doença de Alzheimer familiar e acumula altos níveis de deposição de amiloide no subiculo e na camada 5 do córtex cerebral com perda neuronal concomitante nessas regiões. A constatação de que o composto de [Fórmula 1] aumentou o número de neurônios no modelo de camundongo 5xFAD suporta o fato de que o composto de [Fórmula 1] induz a diferenciação de células-tronco neurais em neurônios in vivo para aumentar o número de neurônios e/ou
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 46/273
39/100 protege os neurônios contra beta-amiloide.
[094] Além disso, o composto de [Fórmula 1] aumentou o número de neurônios em várias regiões do córtex cerebral nos camundongos 5xFAD, especialmente no córtex motor e nas regiões do córtex somatossensorial, quando comparado com controles (Exemplo 8, Figuras 12, 13) . Isso mostra que o composto de [Fórmula 1] pode ser usado para o tratamento de doença do neurônio motor, como ALS, causada pela perda de neurônios nessa região.
[095] Além disso, o composto de [Fórmula 1] aumentou a arborização do axônio ou a estrutura preservada do axônio das Células de Purkinje no cerebelo de camundongo 5xFAD quando comparado com controles (Exemplo 11, Figura 18). Isso mostra que o composto de [Fórmula 1] pode ser usado para o tratamento de ataxia cerebelar causada pela perda ou dano de Células de Purkinje cerebelares.
[096] O composto de [Fórmula 1] gera novos neurônios (neurogênese), protege os neurônios ou faz os dois e, por meio disso, tem o efeito de induzir a regeneração neural ou a neuro-regeneração. Como mostrado nos resultados do Exemplo 9, o composto de [Fórmula 1] aumentou a expressão do marcador neuronal Tujl (marcador para neurônios no processo de neurogênese) na região do córtex somatossensorial do camundongo modelo de Alzheimer (5xFAD), aumentou o número de células em formato do tipo 2 ou tipo 3 (que aparecem
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 47/273
40/100 especificamente durante a neurogênese) na zona subgranular (SGZ) do giro denteado (resultados de manchamento de Nissl e NeuN na Figura 16), e aumentou o número de células neuronais imaturas que expressam DCX e células em divisão manchadas por BrdU (Figura 16). Os resultados confirmam que trametinib induz a neurogênese no córtex cerebral e no giro denteado hipocampal do camundongo.
[097] Além disso, o composto de [Fórmula 1] diminuiu o número de células moribundas conforme detectado pelo ensaio TUNEL no camundongo 5xFAD (Exemplo 10, Figura 17), aumentou a arborização do axônio ou a estrutura do axônio preservada das Células de Purkinje cerebelares (Exemplo 11, Figura 18), e diminuiu a razão de Αβ (1-42)/Αβ(1-40) no tecido cerebral de camundongo 5xFAD (Exemplo 13, Figura 20) . Isso mostra que o composto de [Fórmula 1] pode desempenhar um papel na neuro-regeneração protegendo os neurônios e melhorando a sua condição ou atividade em um ambiente onde ocorrem danos e perdas neuronais.
[098] Consequentemente, outro aspecto da presente invenção se refere à composição farmacêutica que compreende o composto de [Fórmula 1] como um ingrediente ativo para a prevenção e tratamento de doença neurodegenerativa, ao método de prevenção e tratamento para doença neurodegenerativa com o uso do composto de [Fórmula 1], e ao composto de [Fórmula 1] para uso na prevenção e tratamento de doença
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 48/273
41/100 neurodegenerativa. Na presente invenção, outros inibidores de MEK1/2 que diferenciam NSC em neurônios enquanto os protegem contra substâncias tóxicas como Αβ podem ser usados no lugar do composto de [Fórmula 1], mas é particularmente preferencial usar o composto de [Fórmula 1].
[099] Conforme mencionado acima, a doença neurodegenerativa significa a degeneração da função mental e física causada pela perda gradual da estrutura e função dos neurônios. Especificamente, inclui distúrbios selecionados dentre demência, doença de Alzheimer, demência vascular, demência senil, demência frontotemporal, demência de corpos de Lewy, doença de Parkinson, atrofia de múltiplos sistemas, degeneração corticobasal, paralisia supranuclear progressiva, doença de Huntington, doença de Lou Gehrig/ALS, esclerose lateral primária, atrofia muscular espinhal, paralisia bulbar progressiva (PBP) , atrofia muscular progressiva (PMA), paralisia pseudobulbar, paraplegia espástica hereditária (HSP), ataxia cerebelar, doença de Creutzfeldt-Jakob, esclerose múltipla, síndrome de Guillain-Barré, etc.
[0100] Em particular, devido ao fato de que o composto de [Fórmula 1] mostra um efeito indutor de diferenciação significativo e efeito neuroprotetor, mesmo a concentrações mais baixas do que as concentrações anteriores utilizadas para a sua atividade anticancerígena, o mesmo pode ser administrado com segurança a uma dose inferior à utilizada
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 49/273
42/100 para o tratamento do câncer. Ao usar o composto de [Fórmula 1] como um fármaco contra o câncer, a dose recomendada é de 2 mg uma vez ao dia e, se uma dose menor for necessária devido a efeitos colaterais, a dose é reduzida para 1,5 mg uma vez ao dia e, então, para 1 mg uma vez ao dia. Na presente invenção, confirmamos que o composto de [Fórmula 1] apresenta atividade indutora da diferenciação de células-tronco neurais a uma dose tão baixa quanto 0,1 mg/kg/dia em experimentos de camundongos 5xFAD. Quando essa dose é convertida para ajustar para uma pessoa de 60 kg, a mesma se traduz em 0,48 mg/dia (Journal of Basic and Clinical Pharmacy, 7(2), 27 a 31, 2016).
[0101] No presente pedido, o termo que compreende como ingrediente ativo indica a inclusão de um ingrediente suficiente para suprimir a doença neurodegenerativa associada à presente invenção.
[0102] A composição preventiva ou terapêutica da presente invenção pode ser produzida em formulações habitualmente usadas na técnica, por exemplo, medicação oral ou medicação parentérica, como injetáveis.
[0103] A composição farmacêutica da presente invenção pode incluir carreadores, excipientes e diluentes adequados comumente usados em preparações farmacêuticas e pode ser formulado na forma de formulações orais como pó, grânulos, tabletes, cápsulas, suspensões, emulsões, xaropes, aerossóis, etc., ou preparações tópicas, supositórios, emplastros e
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 50/273
43/100 soluções injetáveis esterilizadas.
[0104] Os carreadores, excipientes e diluentes que podem ser incluídos na composição da presente invenção são lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, amido, borracha de acácia, alginato, gelatina, fosfato de cálcio, silicato de cálcio, celulose, metilcelulose, celulose microcristalina, croscarmelose sódica, hidroxipropilmetilcelulose, polivinilpirrolidona, água, hidroxibenzoato de metila, hidroxibenzoato de propila, talco, estearato de magnésio, laurilsulfato de sódio, dióxido de silício coloidal, croscarmelose sódica, óleo mineral, etc.
[0105] Diluentes e excipientes vulgarmente usados, como cargas, extensores, aglutinantes, agentes umectantes, desintegradores e tensoativos são usados para formulações farmacêuticas. As formulações sólidas para administração oral incluem tabletes, pílulas, pó, grânulos, cápsulas, etc. A formulação sólida é preparada por meio da adição de pelo menos um excipiente como amido, carbonato de cálcio, sacarose, lactose ou gelatina à composição da presente invenção. Além de excipientes simples, também são usados lubrificantes como o estearato de magnésio e o talco. Formulações líquidas para administração oral incluem suspensão, líquidos para uso interno, emulsão, xaropes, etc., e além dos diluentes simples comumente usados, como água e parafina líquida, as mesmas podem incluir vários excipientes,
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 51/273
44/100 como agentes umectantes, adoçantes, fragrâncias, conservantes, etc. Formulações para administração parenteral incluem soluções aquosas esterilizadas, soluções não aquosas, suspensões, emulsões, formulações liofilizadas, supositórios e emplastros. Para soluções e suspensões não aquosas, podem ser usados propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais, como óleo de oliva, e ésteres injetáveis como oleato de etila. Witepsol, macrogol, Tween 61, manteiga de cacau, gordura láurica, glicerogelatina, etc., podem ser usados para a base de supositório.
[0106] A composição da presente invenção pode ser administrada por via oral ou parentérica e pode ser uma administração sistêmica ou tópica.
[0107] A dose recomendada da composição terapêutica da presente invenção pode variar dependendo da condição do paciente, do peso do paciente, da gravidade da doença, da forma de medicação, da via de administração, do periodo de tratamento, etc. e pode ser adequadamente determinada pelos versados na técnica. Por exemplo, a composição da presente invenção pode ser administrada diariamente a uma dose de 0, 0001 a 10 g/kg, de preferência, 0,001 a 8 mg/kg. A dosagem pode ser uma vez por dia ou dividida em várias vezes ao dia. De preferência, o composto de [Fórmula 1] pode ser administrado a uma dose diária na faixa de 0,1 mg a 10 mg, 0,1 mg a 5 mg, 0,1 mg a 2 mg, 0,1 mg a 1 mg, 0,1 mg
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 52/273
45/100 a 0,5 mg, 0,25 mg a 2 mg, 0,25 mg a 1 mg, 0,25 mg a 0,5 mg, 0,5 mg a 2 mg, 0,5 mg a 1 mg. Por exemplo, o composto de [Formula 1] pode ser administrado a uma dose diária de 0,1 mg, 0,125 mg, 0,25 mg, 0,5 mg, 0,75 mg, 1 mg, 1,5 mg ou 2 mg.
[0108] Em outro aspecto da presente invenção, a presente invenção revela um método de triagem de materiais que induzem a diferenciação de células-tronco neurais em neurônios e, ao mesmo tempo, protegem NSCs e os neurônios em ambientes simulados de doença neurodegenerativa, como a doença de Alzheimer. O método de triagem usa substâncias indutoras de dano neuronal, como beta-amiloide, MPTP (1-metil-4-fenil1,2,3, 6-tetra-hidropiridina), rotenona, oxidopamina, glutamato, LPS (lipopolissacarideo) e S100B (proteina ligante de cálcio S100 B) e células-tronco neurais derivadas do camundongo e inclui as etapas de:
[0109] 1) tratar células-tronco neurais isoladas de camundongos adultos com substâncias indutoras de dano neuronal, como beta-amiloide (especificamente em sua forma oligomérica), MPTP (1-metil-4-fenil-1,2,3,6tetrahidropiridina), rotenona, oxidopamina, glutamato, LPS (lipopolissacarideo) e S100B (proteina de ligação ao cálcio B S100); [0110] 2) adicionar um material de teste às células-tronco neurais tratadas com as substâncias indutoras de danos de neurônios acima; e
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 53/273
46/100 [0111] 3) examinar a diferenciação ou morte das células-tronco neurais por análise morfológica.
[0112] No método de triagem, é preferencial que as células-tronco neurais usadas sejam derivadas do camundongo. O uso de células-tronco neurais de animais como o camundongo sobre células-tronco neurais humanas tem as vantagens de métodos de cultura celular mais fácil e questões éticas menos controversas. Culturas de células-tronco neurais humanas requerem substituição frequente do meio de cultura e fatores de crescimento caros, enquanto as culturas de célulastronco neurais de camundongos não. As culturas de célulastronco neurais humanas exigem 7 dias cada para o processo de expansão e diferenciação celular, enquanto as culturas de células-tronco neurais de camundongo exigem 3 a 4 dias para expansão e apenas um curto periodo de tempo para diferenciação, permitindo velocidade mais rápida de triagem.
[0113] As células-tronco neurais podem ser isoladas de cérebro adulto de camundongo e cultivadas para uso. As células-tronco neurais adultas de camundongo são isoladas desde a semana 8 até à semana 12, por exemplo, da zona sub-ventricular do camundongo de 8 semanas. É comum isolar as células-tronco neurais dos camundongos dos lobos frontais dos embriões de camundongos que são de 12 a 16 dias de gestação. Em comparação com células-tronco neurais adultas de camundongos, as células-tronco neurais embrionárias de
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 54/273
47/100 camundongos têm um tronco mais forte, o que as tornaria mais propensas a resistir a ambientes tóxicos. No entanto, os presentes inventores observaram que quando as células-tronco neurais embrionárias de camundongo foram tratadas com betaamiloide, irrelevante se o material de teste foi ou não adicionado, todas as células morreram e não foi observada diferenciação neuronal (Exemplo Comparativo 1, Figura 3) . Em contraste, as células-tronco neuronais isoladas de cérebros adultos de camundongo mostraram uma tolerância mais forte à beta-amiloide e foram assim consideradas mais adequadas para a triagem do material indutor de diferenciação de célulastronco neurais em ambiente simulado de DA. Portanto, foram usadas células-tronco neurais do camundongo adulto para os métodos da presente invenção.
[0114] As células-tronco neurais isoladas de camundongos adultos podem ser inoculadas em um meio de cultura no estado não diferenciado e cultivadas a 37 °C. O meio de cultura para as células estaminais neuronais pode ser qualquer meio sem soro suplementado com fator de crescimento, mas é, de preferência, um meio IPM suplementado com fator de crescimento quando se isolam e cultivam primeiro as células-tronco neurais de camundongo adulto e, então, meio N2 quando se isolam e cultivam células isoladas após a formação de neuroesferas. O meio IPM é um meio Neurobasal que pode incluir 1 a 4% de suplemento B27, 0,5 a 2% de Glutamax, 100 Ul/ml de penicilina
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 55/273
48/100 e 100 pg/ml de estreptomicina. O meio N2 é uma Mistura de Nutriente F12/Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (F12/DMEM) (1:1) que pode ainda conter um ou mais componentes de meio selecionados do grupo que consiste em putrescina 90 a 110 μΜ, selenita 20 a 40 nM, progesterona 10 a 30 nM, 1,0 a 2,0 mg/ml de d-(+)-glicose, 20 a 30 mg/ml de insulina, 0,05 a 0,2 mg/ml de apo-transferrina, Glutamax 0,3 a 0,6 mM, 50 a 150 lU/ml penicilina e 50 a 150 mg/ml de estreptomicina. O meio N2 pode ser suplementado com fator de crescimento selecionado do grupo que consiste em 10 a 30 ng/ml de bFGF, 10 a 30 ng/ml de EGF e misturas dos mesmos. Os fatores de crescimento desempenham um papel na manutenção das células-tronco neurais no estado não diferenciado. A fim de determinar com precisão a atividade do material de teste na indução da diferenciação de células-tronco neurais, o material de teste deve ser adicionado às célulastronco neurais mantidas no estado não diferenciado por fatores de crescimento que suprimem a diferenciação.
[0115] No método de seleção da presente invenção, pode ser usado beta-amiloide comercial, aquele disponível junto à Gibco (Waltham, MA), por exemplo. É preferencial usar beta-amiloide de origem humana. As formas mais comuns de betaamiloide são Αβ (1-40), que consiste em 40 aminoácidos e Αβ (1-42), que consiste em 42 aminoácidos. Dos dois, Αβ (1-42) tem uma tendência mais forte para formar agregados, especialmente os trímeros e tetrâmeros altamente tóxicos e é,
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 56/273
49/100 portanto, considerado mais correlacionado com o estado patológico da doença de Alzheimer (Dahlgren et al. (2002) Oligomeric and Fibrillar Species of Amyloid-β Peptides Differentially Affect Neuronal Viability, J. Biol. Chem. 277(35):32.046 a 32.053; K. Murakami (2014) ConformationSpecific Antibodies to Target Amyloid-β Oligomers and Their Application to Immunotherapy for Alzheimer's Disease, Biosci. Biotechnol. Biochem. 78(8): 1.293 a 1.305). Por isso, é preferencial usar Αβ (1-42), particularmente a forma oligomérica de Αβ (1-42), no método de triagem da presente invenção .
[0116] No método de triagem da presente invenção, a forma oligomérica de beta-amiloide deve ser oligômeros com menos de 24, de preferência, 12 ou menos monômeros de betaamiloide, com mais preferência, uma mistura que consiste principalmente em tetrâmeros e trímeros de beta-amiloide com quase nenhuma protofibrila ou fibrila de beta-amiloide. A forma oligomérica de Αβ(1-42) na presente invenção pode ser preparada pelo método revelado na referência [Dahlgren et al. (2002) Oligomeric and Fibrillar Species of Amyloid-β Peptides Differentially Affect Neuronal Viability, J. Biol. Chem. 277(35): 32.046 a 32.053]. Especificamente, Αβ (1-42) é dissolvido em hexafluoroisopropanol (HFIP), seco em um vácuo e o peptídeo seco é ressuspenso em DMSO a uma concentração de 5 mM. DMEM/F12 (sem vermelho de fenol) é adicionado e a
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 57/273
50/100 concentração do peptídeo é ajustada para 100 μΜ, após isso, é cultivado a 4 °C por 24 horas.
[0117] No método de triagem da presente invenção, o MPTP é um pró-fármaco para a neurotoxina MPP+ (l-metil-4fenilpiridínio). Ο MPP+ causa sintomas permanentes da doença de Parkinson (DP) através da destruição de neurônios dopaminérgicos na substância negra do cérebro.
[0118] A rotenona, uma substância que causa a degeneração de neurônios dopaminérgicos na substância negra por meio da inibição da atividade do complexo mitocondrial 1 na célula, é conhecida por produzir as características patológicas da DP.
[0119] A oxidopamina, também chamada de 6hidroxidopamina (6-OHDA) ou 2,4,5-tri-hidroxifenetilamina, é um composto neurotóxico usado pelos pesquisadores para destruir seletivamente neurônios dopaminérgicos e noradrenérgicos no cérebro. Acredita-se que a oxidopamina entre no neurônio através dos transportadores de reabsorção dopaminérgica e noradrenérgica. A fim de danificar seletivamente os neurônios dopaminérgicos, a mesma também é
usada com um inibidor seletivo da reabsorção noradrenérgica,
como a desipramina. [0120] 0 glutamato atua como o principal
neurotransmissor excitatório no sistema nervoso central (SNC), mas é conhecido por danificar os neurônios e causar a morte
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 58/273
51/100 celular quando presente em altas concentrações. A excitotoxicidade do glutamato não está associada apenas a danos agudos no SNC, como isquemia ou lesões cerebrais traumáticas, mas também a doenças neurodegenerativas crônicas, como ELA, esclerose múltipla, DP, etc.
[0121] O LPS (lipopolissacarídeo) é um componente da superfície celular de bactérias Gram negativas e o isolado de Salmonella typhimurium (Sigma, St. Louis, MO) pode ser usado, por exemplo. LPS provoca uma forte resposta imune em animais e provoca uma resposta inflamatória, ativando microglia no sistema nervoso. A secreção de substâncias inflamatórias devido à microglia hiperativada pode perturbar a homeostase do sistema imune e causar doença neurodegenerativa relacionada à doença autoimune do SNC, como esclerose múltipla, DA e DP.
[0122] A S100B é uma proteína de ligação ao cálcio expressa e secretada pelos astrócitos. Tem atividade neurotrófica para o desenvolvimento e manutenção de neurônios e afeta as funções cognitivas normais do cérebro. No entanto, níveis anormalmente altos de S100B ativam a glia e causam respostas neuroinflamatórias que são prejudiciais aos neurônios.
[0123] No método de triagem da presente invenção, as células-tronco neurais são tratadas com substâncias indutoras de dano neuronal como beta-amiloide antes da adição
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 59/273
52/100 do material de teste. Em experimentos publicados anteriormente, as células-tronco neurais foram primeiro tratadas com os materiais de teste um certo tempo antes de o beta-amiloide ser adicionado para observar o efeito de proteção neural dos materiais de teste (J. Korean Neurol. Assoc. 21(2):174 a 182, 2003). Esse método não reflete a situação real do tratamento em que os pacientes de Alzheimer são administrados com fármacos, já que o beta-amiloide já está presente em seus cérebros. As células estaminais neuronais devem primeiro ser tratadas com beta-amiloide antes da adição do material de teste, como realizado na presente invenção, de modo a simular mais de perto o ambiente cerebral dos pacientes de Alzheimer no momento em que o tratamento é iniciado.
[0124] O material de teste é adicionado às células-tronco neurais depois de serem tratadas com betaamiloide e adicionalmente cultivadas com a adição diária de fatores de crescimento. Depois de tratar as células-tronco neurais com o material de teste, pode determinar-se se o material de teste tem ou não atividade indutora de diferenciação de células-tronco neurais por uma análise morfológica, o mais cedo possível, 12 horas e mais tarde, 48 a 72 horas após o tratamento.
[0125] A análise morfológica usa o microscópio de contraste de fase para observar e determinar a morfologia da célula. Como pode ser observado na parte superior da Figura 2,
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 60/273
53/100 as células-tronco neurais diferenciadas (D) marcadas com UD (não diferenciadas) e D (diferenciadas) podem ser claramente distinguidas das não indiferenciadas (UD) . Em células não diferenciadas, os corpos celulares são largos, a forma das neurites, como axônios e dendritos, é difícil de discernir, e o número total de células é alto, uma vez que as células estão se dividindo continuamente. Em células diferenciadas, os corpos celulares são pequenos e redondos, enquanto as neurites são finas e estendidas.
[0126] As células-tronco neurais usadas no método de triagem da presente invenção são células relativamente frágeis em comparação com linhas de células normais ou de câncer e respondem com sensibilidade à toxicidade do material de teste. Se o material de teste mostrar toxicidade celular, as células mortas podem ser vistas no microscópio, tornando possível determinar a toxicidade celular ao mesmo tempo que determinar a atividade indutora de diferenciação.
[0127] De acordo com o método de triagem da presente invenção, materiais que possuem atividades indutoras de diferenciação de células-tronco neurais podem ser triados em um ambiente que simula o ambiente cerebral de um paciente de Alzheimer, especialmente em que formas oligoméricas de betaamiloide, a forma conhecida por estar fortemente correlacionada com a perda neuronal, estão presentes. Isso torna o método de triagem da presente invenção adequado para
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 61/273
54/100 a triagem de materiais candidatos que podem ser usados para o tratamento fundamental da doença de Alzheimer. Além disso, o método de triagem é conveniente na medida em que permite determinar se as células se diferenciaram ou não examinando a morfologia celular, sem necessidade de análises experimentais adicionais. Além disso, quando é permitido que as célulastronco neurais se diferenciem naturalmente em meios sem fatores de crescimento, isso demora pelo menos 48 horas, após as quais a mudança na morfologia celular pode ser observada. No caso de células tratadas com materiais que têm atividade indutora de diferenciação altamente eficiente, seu efeito pode ser observado em até 12 horas após o tratamento e, no máximo, 48 a 72 horas após o tratamento, apesar da presença de fatores de crescimento no meio de cultura celular para supressão da diferenciação. Desse modo, o método de triagem é rápido e eficiente, uma vez que a toxicidade do material de teste pode também ser determinada ao mesmo tempo que o efeito indutor de diferenciação é determinado.
[0128] Além disso, a presente invenção se refere ao kit que pode ser usado para realizar o método de triagem mencionado acima. Esse kit pode incluir células-tronco neurais derivadas de camundongos adultos, substâncias indutoras de dano neuronal como beta-amiloide, MPTP, rotenona, oxidopamina, glutamato, LPS ou S100B, fatores de crescimento, meios de cultura, suplementos para culturas celulares e placas de
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 62/273
55/100 cultura celular (revestidas ou com soluções de revestimento separadas).
[0129] A presente invenção será explicada em mais detalhes com referência aos exemplos a seguir. No entanto, esses exemplos não devem ser interpretados como limitando ou restringindo o escopo e revelação da invenção. Deve ser entendido que, com base nos ensinamentos da presente invenção, incluindo os exemplos a seguir, os versados na técnica arte podem prontamente praticar outras modalidades da presente invenção, cujos resultados experimentais não são explicitamente apresentados. Tais modificações e variações pretendem estar dentro do escopo das reivindicações anexas.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1: A CAPACIDADE INDUTORA DE DIFERENCIAÇÃO DE NSC DO COMPOSTO DE [FÓRMULA 1] EM CÉLULAS-TRONCO NEURAIS EMBRIONÁRIAS DE CAMUNDONGOS [0130] Etapa 1: Cultivar células-tronco neurais embrionárias de camundongos [0131] Etapa IA: Cultivar células-tronco neurais embrionárias de camundongos no estado não diferenciado [0132] As células-tronco neurais foram isoladas do cérebro de um embrião de camundongo de 14,5 dias, tratadas com 10 ng/ml de fator de crescimento de fibroblastos básico humano (bFGF) (Peprotech, Princeton, NG, cat n° 100-18B) e 20 ng/ml de fator de crescimento epidérmico humano (EGF)
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 63/273
56/100
(Peprotech, cat n° AF-100-15) em um meio de cultura N2, e
cultivadas em suspensão em um frasco de 25 cm2 (Nunc,
Pittsburgh, PA) por 4 dias. A formação de neuroesferas foi
observada após 2 dias.
[0133] De modo a isolar as células isoladas,
prepararam-se placas de 6 cavidades no dia anterior tratando as cavidades com 15 pg/ml de solução de poli-L-ornitina. (Sigma, St. Louis, MO, cat n° P2533) e incubando de um dia para o outro a 37 °C para revestimento. O dia do isolamento de célula única, a solução de poli-L-ornitina foi removida, as placas foram lavadas com PBS três vezes e com 10 pg/ml de solução de fibronectina (Gibco, Waltham, MA, cat n° 33016015) foi adicionada e incubada a 37 °C por 2 horas para revestimento. Quando a preparação da placa estava completa, as neuroesferas foram tratadas com TryPLE (Gibco cat n° 12604013), separadas em células únicas, e contadas e preparadas para incluir 4~5xl05 células por 200-300 μΐ de solução de cultura (meio de cultura N2 com 10 ng/ml de bFGF e 20 ng/ml de EGF) . Imediatamente antes da semeadura, a solução de revestimento foi aspirada e as células únicas foram uniformemente semeadas na placa de cultura antes de a placa ser seca. Permitiu-se que as células se ligassem às placas durante cerca de 1 minuto e, após verificar se as células estavam suficientemente ligadas, adicionou-se às células mais 1,5 ml de meio de cultura (meio de cultura N2 com 10 ng/ml de bFGF e 20 ng/ml de EGF) e
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 64/273
57/100 cultivadas em uma incubadora a 37 °C.
[0134] A composição do meio de cultura N2 é a seguinte:
[0135] Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)/F12 (1:1) (Gibco, cat n° 11320033), putrescina 100 μΜ (Sigma, cat n° 51799), selenita 30 nM (Sigma cat n° S5261), progesterona 20 nM (Sigma cat n° P0130), 1,55 mg/ml de d-(+)glicose (Sigma, cat n° G8270), 25 pg/ml de insulina (Gibco, cat n° 12585014), 0,1 mg/ml de apo-transferrina (Sigma cat n° T1147), Glutamax 0,5 mM (Gibco, cat n° A1286001), 100 lU/ml de penicilina (Gibco, cat n° 15140122), 100 pg/ml de estreptomicina (Gibco, cat n° 15140122).
ETAPA 1B: CULTIVAR CÉLULAS-TRONCO NEURAIS SEM INIBIR A DIFERENCIAÇÃO [0136] Células-tronco neurais embrionárias de camundongos foram cultivadas de acordo com o procedimento na Etapa IA, com exceção da adição de bFGF e EGF quando as célulastronco neurais foram separadas em células individuais e semeadas.
ETAPA 2: ADIÇÃO DE MATERIAL DE TESTE [0137] Várias concentrações do composto de [Fórmula 1] (doravante também referido como trametinib) (Medchem express, Monmouth Junction, NJ, cat n° HY-10999A) e AS703026 (pimasertib) (Selleckchem, Houston, TX, cat n° S1475) foram adicionados diariamente às células-tronco neurais
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 65/273
58/100 embrionárias de camundongo cultivados conforme descrito na Etapa IA e cultivadas por 4 dias.
ETAPA 3: ANÁLISE DE MORFOLOGIA [0138] A morfologia celular foi observada por microscopia de contraste de fase após quatro dias de cultura, e os resultados são mostrados na Figura 1.
[0139] Na Figura 1, UD (não diferenciado) é NSC embrionário de camundongo não diferenciado obtido na Etapa IA, em que as células não são tratadas com nenhum material de teste. D (diferenciado) é NSC embrionário diferenciado embrionário de camundongo obtido no Etapa 1B, em que as células não são tratadas com nenhum material de teste. NSC não diferenciado do grupo UD tem corpos celulares largos, a forma da neurite é difícil de distinguir e o número total de células é maior em comparação com o grupo D devido à divisão celular contínua. As células diferenciadas do grupo D possuem corpos celulares redondos menores com neurites finas alongadas, tornando-as facilmente distinguíveis das células do grupo UD.
[0140] Conforme mostrado na Figura 1, o composto de [Fórmula 1] (trametinib) induziu prontamente a diferenciação de NSC em neurônios em baixas concentrações de 10 nM, 25 nM e 100 nM (0,1 μΜ). O grupo tratado com AS703026 necessitou de 1,0 μΜ, uma concentração 100 vezes maior que aquela de trametinib, para iniciar a diferenciação neuronal.
[0141] Tomados em conjunto, esses resultados
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 66/273
59/100 indicam que o composto de [Fórmula 1] (trametinib) induz a diferenciação de NSC em neurônios e esse efeito é observado mesmo em concentrações muito baixas (a 10 nM e superior). Isso sugere que o composto de [Fórmula 1] pode ser usado para a composição e método de diferenciação para induzir a diferenciação de NSC em neurônios e para o tratamento de doença neurodegenerativa.
EXEMPLO 2: A CAPACIDADE INDUTORA DE DIFERENCIAÇÃO DE NSC DO COMPOSTO DE [FÓRMULA 1] EM NSC ADULTO DE CAMUNDONGO (MÉTODO DE TRIAGEM DE SUBSTÂNCIAS QUE PODEM INDUZIR A DIFERENCIAÇÃO DE NSC EM NEURÔNIOS, PROTEGENDQ-QS AO MESMO TEMPO)
ETAPA 1: CULTIVAR NSC ADULTO DE CAMUNDONGO
ETAPA IA: CULTIVAR NSC ADULTO DE CAMUNDONGO NO ESTADO NÃO DIFERENCIADO [0142] NSC foram isolados da zona subventricular do cérebro de camundongos da semana 8, tratados com 20 ng/ml de fator de crescimento de fibroblastos humano básico (bFGF) e 20 ng/ml de fator de crescimento epidérmico humano (EGF) em um meio IPM e cultivados como uma suspensão em placas de 24 cavidades durante 7 dias. A formação de neuroesferas foi observada após 4 dias.
[0143] Dois dias antes do isolamento de células individuais, foram preparadas placas de 6 cavidades tratando os poços com solução de 10 pg/ml de poli-L-ornitina e incubando
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 67/273
60/100 de um dia para o outro à temperatura ambiente para revestimento. No dia seguinte, a solução de poli-L-ornitina foi removida e as placas foram lavadas 3 vezes com água destilada esterilizada três vezes. Posteriormente, uma solução de 0,5 mg/ml de laminina (Roche, Upper Bavaria, Alemanha, cat n° 11243217001) foi adicionada e incubada de um dia para o outro a 37 °C para revestimento. Quando a preparação da placa estava completa, as neuroesferas foram tratadas com 0,025% de Tripsina-EDTA, separadas em células individuais, e contadas e preparadas para compreender 4~5xl05 células por 200-300 μΐ de solução de cultura. A solução de cultura usada é o meio de cultura N2 (suplementado com 20 ng/ml de bFGF e 20 ng/ml de EGF) . Imediatamente antes da semeadura, a solução de revestimento foi aspirada e as células únicas foram uniformemente semeadas na placa de cultura antes de a placa ser seca. Permitiu-se que as células se ligassem às placas durante cerca de um minuto e, após verificar se as células estavam suficientemente ligadas, adicionou-se às células mais
1,5 ml de meio de cultura (meio de cultura N2 com 20 : ng/ml de
bFGF e 20 ng/ml de EGF) e cultivadas em uma incubadora a 37 °C
por 24 horas.
[0144] As composições do meio de cultura IPM e N2
são as seguintes:
[0145] Meio IPM: Meio neurobasal (Gibco, cat n°
21103049), suplemento B27 (Gibco, cat n° A3582801), Glutamax,
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 68/273
61/100
100 IU/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina.
[0146] Meio N2: Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)/F12 (1:1), putrescina 100 μΜ, selenita 30 nM, progesterona 20 nM, 1,55 mg/ml de d-(+)-glicose, 25 pg/ml de insulina, 0,1 mg/ml de apo-transferrina, Glutamax a 0,5 mM, 100 IU/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina.
ETAPA IB: CULTIVAR CÉLULAS-TRONCO NEURAIS SEM INIBIR A DIFERENCIAÇÃO [0147] Células-tronco neurais adultas de camundongos foram cultivadas de acordo com o procedimento na Etapa 1A, com exceção da adição de bFGF e EGF quando as célulastronco neurais foram separadas em células individuais e semeadas.
ETAPA 2: TRATAMENTO COM BETA-AMILOIDE [0148] Após a troca do meio do NSC cultivado na Etapa 1, cada cavidade foi tratada com beta-amiloide 10 μΜ (Αβ) (Gibco, cat n° 03112) . As cavidades não tratadas com betaamiloide foram deixadas para uso como controles negativos.
[0149] Αβ humano (1-42) da Gibco (Waltham, MA) foi adquirido para ser usado para beta-amiloide (Αβ), e o processo seguinte foi seguido para criar oligômeros. Primeiro, o beta-amiloide foi dissolvido em HFIP a 100% (1,1,1,3,3,3hexafluoro-2-propanol) (Sigma, cat n° 105228) para obter uma concentração de 1 mg/ml e vortexado à temperatura ambiente por 1 hora. Então, secou-se durante 10 minutos em uma velocidade
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 69/273
62/100
Vac, após o que adicionou-se DMSO (Sigma, cat n° D2650) para levar a concentração a 5 mM e, então, agitou-se ligeiramente em vórtice à temperatura ambiente durante 10 minutos. DMEM/F12 (sem vermelho de fenol) (Gibco, cat n° 21041025) foi adicionado para uma concentração final de 100 μΜ. A solução foi incubada a 4 °C durante 24 horas e, então, adicionada às células cultivadas.
ETAPA 3: ADIÇÃO DE MATERIAL DE TESTE [0150] Imediatamente após o tratamento com betaamiloide, 10 nM, trametinib 100 nM, 5 μΜ, memantina 10 μΜ (Sigma, cat n° M9292) e AS703026 10 μΜ (pimasertib) foram adicionados às culturas celulares. Os NCS foram cultivados com a adição diária de EGF, bFGF, beta-amiloide e materiais de teste durante 4 dias.
ETAPA 4: ANÁLISE DE MORFOLOGIA [0151] A morfologia celular foi observada por microscopia de contraste de fase após quatro dias de cultura, e os resultados são mostrados na Figura 2.
[0152] Na Figura 2, a linha superior é NSC adulto de camundongo não tratado com beta-amiloide e a linha inferior é NSC tratado com beta-amiloide 10 μΜ. UD (não diferenciado) é NSC adulto de camundongo não diferenciado obtido na Etapa IA, em que as células não são tratadas com nenhum material de teste. D (diferenciado) é NSC adulto diferenciado embrionário de camundongo obtido no Etapa 1B, em que as células não são
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 70/273
63/100 tratadas com nenhum material de teste. Do grupo não tratado com Αβ no topo, NSC não diferenciado do grupo UD tem corpos celulares largos, a forma da neurite é difícil de distinguir e o número total de células é maior em comparação com o grupo D devido à divisão celular contínua. As células diferenciadas do grupo D possuem corpos celulares redondos menores com neurites finas alongadas, tornando-as facilmente distinguíveis das células do grupo UD.
[0153] O grupo tratado com trametinib induziu prontamente a diferenciação de NSC em neurônios a baixas concentrações de 10 nM e 100 nM, independentemente de ter sido tratado ou não com beta-amiloide. O grupo tratado com AS703026 exigiu uma concentração muito maior do que aquela de trametinib, 10 μΜ, para diferenciação neuronal, independentemente de ter sido tratado ou não com beta-amiloide. Ambos os materiais não provocaram toxicidade celular nessas concentrações, confirmando que são candidatos adequados para a doença de Alzheimer (DA).
[0154] Além disso, no grupo tratado com memantina, um fármaco atualmente usado para o alívio dos sintomas da DA, a diferenciação de NSC em neurônios não foi observada, mas sim o oposto, a morte de células-tronco neurais, foi observada. A memantina é um antagonista do receptor NMDA envolvido na transdução do sinal do glutamato e trabalha para ajudar a normalizar a transdução de sinal neuronal em pacientes
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 71/273
64/100 com DA. Esse tipo de mecanismo não fornece um tratamento fundamental para a DA através da recuperação de neurônios danificados. A constatação de que a memantina não induz a diferenciação de NSC, mas sim a morte celular, confirma que a mesma não pode ser usada como um tratamento fundamental para a demência.
EXEMPLO COMPARATIVO 1: EFEITO DO TRATAMENTO COM BETA-AMILOIDE EM CÉLULAS-TRONCO NEURAIS EMBRIONÁRIAS DE CAMUNDONGOS
ETAPA 1: CULTIVAR NSC EMBRIONÁRIO DE CAMUNDONGO [0155] As células foram cultivadas conforme descrito no Exemplo 1, Etapas IA e 1B. ETAPA 2: TRATAMENTO COM BETA-AMILOIDE [0156] NSC embrionário de camundongo cultivado conforme descrito na Etapa 1 acima foi tratado com betaamiloide com o uso do mesmo método que no Exemplo 2, Etapa 2.
ETAPA 3: ADIÇÃO DE MATERIAL DE TESTE [0157] Imediatamente após o tratamento com betaamiloide, foram adicionados trametinib 100 nM, memantina 10 μΜ e AS703026 10 μΜ (pimasertib). NCS foi cultivado com a adição diária de EGF, bFGF, beta-amiloide e materiais de teste durante 4 dias.
ETAPA 4: ANÁLISE DE MORFOLOGIA [0158] A morfologia celular foi observada por microscopia de contraste de fase após quatro dias de cultura,
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 72/273
65/100 e os resultados são mostrados na Figura 3.
[0159] Na Figura 3, a linha superior é NSC embrionário de camundongo não tratado com beta-amiloide e a linha inferior é NSC tratado com beta-amiloide. UD (não diferenciado) é NSC não diferenciado embrionário de camundongo (não tratado com nenhum material de teste) e D (diferenciado) é NSC embrionário de camundongo diferenciado (não tratado com nenhum material de teste) . No grupo tratado com Αβ, todas as células morreram, independentemente de os materiais de teste terem sido adicionados ou não e, portanto, o efeito dos materiais de teste não pôde ser determinado.
EXEMPLO 3: ANÁLISE IMUNOCITOQUÍMICA [0160] A fim de reconfirmar a diferenciação de NSC em neurônios no Exemplo 1, foi realizado o manchamento imunocitoquímico de marcadores Tujl e DAPI (4',6-diamidino-2fenulindol). Tujl (beta-tubulina específica da classe III do neurônio) é uma proteína marcadora específica de neurônio, que foi conjugada a rodamina para mostrar vermelho fluorescente, enquanto o DAPI se liga ao DNA da célula e mancha os núcleos da célula de azul fluorescente.
[0161] NSC embrionários cultivados conforme descrito no Exemplo 1 foram semeados em placas de 24 cavidades com lamelas e tratadas com trametinib e AS703026 nas respectivas concentrações durante 4 dias consecutivos. O meio foi removido e as células foram lavadas com PBS. Após a fixação
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 73/273
66/100 com formaldeido a 10% (Sigma cat n° HT501128) à temperatura ambiente durante 10 minutos, os mesmos foram novamente lavados com PBS. Os mesmos foram permeabilizados com Triton X-100 a 0,2% (Sigma, cat n° 93443) à temperatura ambiente durante 15 minutos, lavados com PBS, e incubados com BSA a 10% (Sigma, cat n° A2153) + soro de cabra normal a 1% (Vector lab, Burlingame, CA, cat n° S1000) à temperatura ambiente por 1 hora. O anticorpo anti-Tujl (Cell signaling, Danvers, MA, cat n° 4466) foi diluído em BSA a 1% + soro de cabra normal a 1% a uma razão de 1:200 e adicionado às células e incubados a 4 °C de um dia para o outro. A solução foi removida, lavada com PBS, e incubada à temperatura ambiente por 1 hora com o anticorpo secundário (anticorpo conjugado com rodamina) diluída em BSA a 1% + soro de cabra normal a 1% a uma razão de 1:200. Então, as células foram lavadas com PBS, incubadas com 5 pg/ml de DAPI (Sigma, cat n° D9542) por 5 minutos, lavadas com PBS novamente, e montadas em uma lâmina de vidro para análise com um microscópio fluorescente. Os resultados são mostrados na Figura 4. Conforme visto na Figura 4, o grupo tratado com AS703026 1,0 μΜ mostrou imagens de neuritos alongados finos vermelhos, indicando que a diferenciação de neurônio ocorre a essa concentração, embora apenas a uma certa medida. A concentrações inferiores a essa (0,1 μΜ) , não foi observada diferenciação.
[0162] Em contrapartida, o grupo tratado com
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 74/273
67/100 trametinib, mesmo a uma concentração muito baixa de 10 nM, mostrou atividade de diferenciação crescentemente ativa. Quanto à morfologia das células, um número crescente de neurônios mostrando neuritos alongados é visível em células tratadas com trametinib a 10 nM.
EXEMPLO 4: ANÁLISE DOS NÍVEIS RELATIVOS DE EXPRESSÃO DE MRNA
EXEMPLO 4-1: ANÁLISE DE EXPRESSÃO DE MRNA DE TUJ1 E TH INDUZIDA PELO COMPOSTO DE [FÓRMULA 1] EM NSC EMBRIONÁRIO DE CAMUNDONGO [0163] De modo a determinar quais tipo de células os NSC diferenciaram no Exemplo 1, analisou-se a expressão de mRNA do marcador específico de neurônios Tujl e o marcador de neurônios dopaminérgicos TH (tirosina-hidroxilase) através de RT-PCR quantitativa (qRT-PCR).
ETAPA 1: ISOLAMENTO DE RNA [0164] Após completar a análise de morfologia no Exemplo 1, o meio de cada grupo tratado de células foi removido e TRIzol® (Invitrogen, Waltham, MA) foi adicionado à placa e incubado por 5 minutos à temperatura ambiente para facilitar a lise celular. Os lisados celulares, em conjunto com TRIzol, foram transferidos para um tubo, misturados completamente com clorofórmio (Sigma, cat n° 366919), centrifugados e o sobrenadante transferido para um novo tubo. Isopropanol (Ducsan, GyunggiDo, Coréia, cat n° 67-63-0) foi adicionado e
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 75/273
68/100 misturado para isolamento de RNA, então centrifugado novamente para remover o sobrenadante e obter o pélete. O pélete de RNA foi ressuspenso em etanol a 75% (Ducsan, cat n° 64-17-15), centrifugado e o sobrenadante removido. O pélete foi, então, ressuspenso em água destilada tripla esterilizada para obter o mRNA, incubado durante 10 minutos a 55 °C e armazenado a 80 °C.
ETAPA 2. TRANSCRIÇÃO REVERSA [0165] Após medir a concentração de RNA, cada grupo de RNA foi ajustado para 2 pg e o experimento foi realizado com o uso de um kit de transcrição reversa (Invitrogen, cat n° 28025013) . Água destilada tripla esterilizada, 1 pM de oligo dT e 1 mM de dNTP foram adicionados ao RNA e incubados durante 5 minutos a 65 °C. Isso foi seguido da adição de tampão 5X First-strand, DTT 10 mM e transcriptase reversa M-MLV e incubados a 42 °C durante 1 hora, depois a 72 °C durante 15 minutos e a 4 °C durante 30 minutos. O cDNA sintetizado foi armazenado a -20 °C.
ETAPA 3: qRT-PCR [0166] A PCR foi realizada pela mistura de 1 μΐ de cDNA (sintetizado acima), primer 1 pM, água destilada tripla e Verde Rotor-Gene SYBR® (Qiagen, Venlo, Holanda, cat n° 204074) e com o uso de Rotor-Gene Q (Qiagen). Os primers (Bioneer, Daejeon, Coréia) usados são mostrados na Tabela 2.
[TABELA 2]
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 76/273
69/100
Gene Primer de Avanço Primer Reverso
GAPDH 5' - CGTGCCGCCTGGAGAAACC- 3' 5' - TGGAAGAGTGGGAGTTGCTGTTG- 3'
Tujl 5' - GGTCTGGCGCCTTTGGA-3' 5' - CACCACTCTGACCAAAGATAAAGTT G-3'
TH 5' - AGGTATACGCCACGCTGAAG -3' 5'-CTCGGGTGAGTGCATAGGTG- 3'
[0167] Os resultados são mostrados na Figura 5.
As Figuras 5a, 5b são os valores médios dos níveis relativos
de expressão de mRNA para cada grupo após 3 ciclos de
experimentos. O termo nível de expressão de mRNA relativo significa que, para normalizar o nível total de RNA de cada grupo, o nível de expressão de RNA de cada marcador de diferenciação é dividido pelo nível de expressão de GAPDH cujo nível de expressão é razoavelmente constante nas células e, então, os valores de cada material de teste são comparados com aqueles dos controles (NSC não diferenciados) em cada grupo.
[0168] Conforme mostrado na Figura 5, o grupo tratado com trametinib apresentou altos níveis de expressão do marcador específico de neurônio Tujl e do marcador de neurônio dopaminérgico TH nas concentrações de 10 nM, 25 nM e 100 nM. Esse resultado indica que trametinib eficientemente induz a diferenciação de NSC em neurônios, especialmente em neurônios dopaminérgicos. Além disso, o trametinib exerceu o seu efeito indutor de diferenciação a uma concentração muito baixa de 1
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 77/273
70/100 nM. Isso sugere que a composição de acordo com a presente invenção pode ser usada para o tratamento de doença neurodegenerativa.
[0169] 10 μΜ (10.000 nM) AS703026 produziu resultados comparáveis àqueles trametinib 25 nM, indicando que o trametinib induz a diferenciação de NSC em neurônios a 400 vezes (ou mais) uma concentração inferior àquela do AS703026.
Exemplo 4-2: ANÁLISE DE EXPRESSÃO DE RNA DE TH, ChAT, Isll E Gadl INDUZIDA PELO COMPOSTO DA [FÓRMULA 1] EM NSC EMBRIONÁRIO E ADULTO DE CAMUNDONGO [0170] A fim de determinar se o composto da [Fórmula 1] induz a diferenciação de NSC em tipos de célula além de neurônios dopaminérgicos, a expressão de mRNA do marcador neuronal colinérgico ChAT (colina acetiltransferase), do marcador de neurônio motor Isll (Isletl) e do marcador do neurônio GABAérgico Gadl (glutamato descarboxilase 1) foi determinada por meio de qRT-PCR.
[0171] As células-tronco neurais foram cultivadas conforme descrito no Exemplo 1 e, após a adição de trametinib 1 nM, 10 nM, 25 nM e 100 nM durante 2 dias, o RNA foi isolado e examinado para os marcadores de diferenciação. A expressão de mRNA foi determinada pelo mesmo método que no Exemplo 4-1 e os iniciadores usados são mostrados na Tabela 3.
[0172] Os resultados são mostrados na Figura 6.
[TABELA 3]
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 78/273
71/100
Gene Primer de Avanço Primer Reverso
GAPDH 5'- CGTGCCGCCTGGAGAAACC- 3' 5' - TGGAAGAGTGGGAGTTGCTGTTG-3'
Tujl 5'- GGTCTGGCGCCTTTGGA-3' 5' - CACCACTCTGACCAAAGATAAAGTTG- 3'
TH 5'-AGGTATACGCCACGCTGAAG- 3' 5'-CTCGGGTGAGTGCATAGGTG-3'
ChAT 5'-CCTGCCAGTCAACTCTAGCC- 3' 5'-TACAGAGAGGCTGCCCTGAG-3'
Gadl 5' - TCATGTTATGGAAATCTTGCTTCA G-3' 5' - CGAGTCACAGAGATTGGTCATATACTA CT-3'
Isll 5'-CGGAGAGACATGATGGTGGT- 3' 5'-GGCTGATCTATGTCGCTTTGC-3'
[0173] Conforme mostrado na Figura 6, a expressão de todos os marcadores de neurônios testados, o marcador de neurônios dopaminérgicos TH, o marcador de neurônios colinérgicos ChAT, o marcador de neurônios motores Isll e o marcador de neurônios GABAergic Gadl aumentou com o aumento da
concentração do trametinib adicionado. Isso sugere que
trametinib pode ser usado no tratamento de doenças
neurodegenerativas neuronais. causadas por vários tipos de danos
[0174] A fim de determinar se o mesmo efeito
ocorre em NSC adulto de camundongo, trametinib 10 nM e AS703026 10 μΜ foram adicionados, cada um, por 2 dias ao NSC adulto de camundongo cultivado conforme descrito no Exemplo 2, Etapa IA, e os níveis de expressão de mRNA do marcador neuronal Tujl, do marcador neuronal dopaminérgico TH e do marcador neuronal
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 79/273
72/100 colinérgico ChAT foram analisados por qRT-PCR.
[0175] Esse resultado é mostrado na Figura 7. Trametinib aumentou a expressão de Tujl, TH e ChAT em NSC adulto como fez no NSC embrionário. É de salientar que trametinib exibiu um NSC mais forte para o efeito indutor da diferenciação de neurônios a uma concentração 1.000 vezes inferior à do AS703026.
EXEMPLO 5: EXAME DA CAPACIDADE INDUTORA DE DIFERENCIAÇÃO DE NSC ATRAVÉS DO CONTROLE DA EXPRESSÃO DE MEK1 E MEK2 EM CÉLULAS-TRONCO NEURAIS
EXEMPLO 5-1: INIBIÇÃO DA EXPRESSÃO DE MEK1, MEK2 EM CÉLULAS-TRONCO NEURAIS EMBRIONÁRIAS DE CAMUNDONGOS [0176] Foi examinado o NSC para a capacidade de indução da diferenciação neuronal em relação aos níveis de expressão de MEK1 e MEK2. O método seguinte foi usado para produzir células em que a expressão de MEK1 e MEK2 é controlada.
[0177] Primeiro, para produzir NSCs em que a expressão de MEK1 e MEK2 é inibida, foram usados os respectivos shRNAs que inibem a expressão de MEK1 e MEK2. Especificamente, NSCs embrionários de camundongo cultivados conforme descrito no Exemplo 1, Etapa IA foram semeados em placas e cultivados durante 24 horas. Então, 1 pg/ml de shRNA-MEKl (CCGGGCCATCCAACATTCTAGTGAACTCGAGTTCACTAGAATGTTGGATG GCTTTTT) ou shRNA-MEK2
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 80/273
73/100 (CCGGCCTCCGAGAGAAGCACCAGATCTCGAGATCTGGTGCTTCTCTCGGA GGTTTTTG) foram transfectados nas células com o uso de lipofectamina (Invitrogen, cat n° 18324010) para criar NSCs em que é inibida a expressão de MEK1 ou MEK2 ou ambos.
[0178] Após 4 horas, o meio de cultura dessas células transfectadas foi substituído por meio de cultura N2, cultivado por mais 4 dias e, então, o RNA foi extraído com o uso do método no Exemplo 4-1. O NSC para a capacidade indutora de diferenciação neuronal foi analisado por PCR de transcrição reversa (RT-PCR). Especificamente, o RNA foi convertido em cDNA através de transcrição reversa e, então, DNA polimerase EX-Taq (SG Bio, Kyunggi Do, Coréia) e o primer foram adicionados para realizar PCR no Termo Ciclador T100™ (Biorad, Hercules, CA) . A PCR foi realizada incubando a 95 °C durante 5 minutos, então repetindo 25 a 35 ciclos de reação em que 1 ciclo consiste em incubar a 95 °C durante 30 segundos, a 55 ~ 62 °C durante 30 segundos e a 72 °C por 30 segundos. Os resultados de PCR foram examinados pela realização de eletroforese em gel em gel de agarose a 2%, que foi, então, analisado por um analisador de imagem, LAS-3000 (Fujifilm, Tóquio, Japão).
[0179] Os primers usados para RT-PCR e qRT-PCR no presente Exemplo, assim como nos Exemplos 5-2 e 5-3, são mostrados na Tabela 4.
[TABELA 4]
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 81/273
74/100
Gene Primer de Avanço Primer Reverso
GAPDH 5' - CGTGCCGCCTGGAGAAACC -3' 5' - TGGAAGAGTGGGAGTTGCTGTTG- 3'
Tu jl 5' - GGTCTGGCGCCTTTGGA- 3' 5' - CACCACTCTGACCAAAGATAAAGT TG-3'
TH 5' - AGGTATACGCCACGCTGAA G-3' 5'-CTCGGGTGAGTGCATAGGTG- 3'
MEK1 5' - CGGCGGTTAACGGGACCA34' 5' - GGATTGCGGGTTTGATCTCCA-3'
MEK2 5' - CCTGGATGAGCAGCAAAGG A-3' 5'-CAGTGAGCCACCATCCATGT- 3'
[0180] Os resultados são mostrados na Figura 8a.
Conforme mostrado na Figura 8a, a expressão do marcador do neurônio dopaminérgico TH é significativamente aumentada nos NSC, em que tanto MEK1 como MEK2 são inibidas pela transfecção tanto de shMEKl como de shMEK2 (shMEKl+, shMEK2+) em comparação com NSC, em que apenas a expressão de MEK2 é inibida (shMEKl, shMEK2+).
[0181] De modo a examinar mais uma vez o efeito de inibição apenas de MEK1 ou MEK2 ou inibição tanto MEK1 como MEK2, o NSC para o efeito indutor de diferenciação neuronal foi examinado por qRT-PCR e Western blotting. NSC em que apenas MEK1 ou MEK2 são inibidos e NSC em que tanto MEK1 como MEK2 são inibidos foram produzidos com os métodos mencionados acima. Após 4 horas, o meio de cultura das células transfectadas foi
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 82/273
75/100 substituído por meio de cultura N2, cultivado por mais 4 dias e a qRT-PCR foi realizada com o uso do método no Exemplo 4-1. Os resultados são mostrados no gráfico da Figura 8b. Conforme mostrado no gráfico da Figura 8b, a expressão dos marcadores de neurônio Tujl e TH é significativamente aumentada quando a expressão de MEK1 e MEK2 é inibida em comparação com quando somente MEK1 ou MEK2 é.
[0182] O Western blotting foi realizado para examinar se o efeito indutor de diferenciação de NSC em neurônios é observado com a inibição da expressão de MEK1 e MEK2, não apenas em mRNA, mas também em níveis de proteína.
[0183] O Western blotting foi realizado em cada grupo de células pelo seguinte método: Após a cultura do NSC em que a expressão de MEK1 e MEK2 é inibida por 4 dias, o meio foi removido, tampão RIPA (Tris HC1 0,05 M pH 7,4 (Sigma, cat n° T3253) , NaCI 0,15 M (Ducsan, cat n° 7647-14-5), ácido desoxicólico 0,25% (Sigma, cat n° D6750), NP-40 a 1% (USB, Waltham, MA, cat n° 19628), EDTA 1 mM (Sigma, cat n° EDS) , PMSF 1 mM (Acros organics, Geel, Bélgica, cat n° 215740050), ortovanadato de sódio 1 mM (Bio labs, Ipswich, MA, cat n° P0758L) , fluoreto de sódio 1 mM (Sigma, cat n° S7920), inibidores de protease (Sigma, cat n° P83430)) foi adicionado à placa em gelo, e as células foram coletadas com um raspador. Após incubação em gelo durante 10 minutos, o sobrenadante foi coletado após centrifugação a 13.000 rpm a 4 °C. A concentração
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 83/273
76/100 de proteína foi medida, tampão de amostra (Tris-HCl 0,25 M pH 6,8, SDS a 0,05% (Amersco, Solon, OH, cat n° 227), glicerol a 50% (Ducsan, cat n° 56-81-5), DTT 0,25 M (Invitrogen, cat n° R0861), 0,5 mg/ml de BPB (Bio-rad, Hercules, CA, cat n° 1610404) foi adicionado, e a amostra foi fervida a 100 °C por 10 minutos e, então, armazenada -20 °C.
[0184] 10 a 20 pg de amostras de proteína foram carregadas em gel SDS-PAGE a 8 a 12%, separadas e transferidas para uma membrana de nitrocelulose, que foi, então, bloqueada com leite desnatado a 5% à temperatura ambiente durante 1 hora. Anticorpos contra Tujl, TH (Cell signaling, cat n° 2792), MEK1/2 (Santa Cruz, Dallas, TX, cat n° Sc-292838), e ERK (Santa Cruz, cat n° Sc-135900) foram, cada um, preparados em Tween 20 a 0,1% (Sigma, cat n° P1379) contendo solução salina tamponada com tris (TBS) e incubados com a membrana à temperatura ambiente por 2 horas ou a 4 °C de um dia para o outro, após isso, foi incubado com um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de raiz-forte à temperatura ambiente por 1 hora. A expressão de proteína foi detectada com um equipamento fotossensível e o resultado é mostrado na imagem de fundo da Figura 8b. Conforme mostrado na Figura 8b, os níveis de expressão tanto de mRNA quanto de proteínas no marcador de neurônio Tujl e o marcador de neurônio dopaminérgico TH aumentaram significativamente em NSC, onde a expressão de MEK1 e MEK2 são inibidas pelo uso tanto de shMEKl como shMEK2
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 84/273
77/100 (shMEKl+, shMEK2+).
[0185] Em contrapartida, no caso de NSC, onde apenas uma das expressões de MEK1 ou MEK2 é inibida, um nivel mais baixo de expressão de Tujl e TH é comparado com aquele de NSC com a inibição de MEK1 e MEK2.
EXEMPLO 5-2: INDUÇÃO DE EXPRESSÃO DE CAMEK1 E CAMEK2 EM CÉLULAS-TRONCO NEURAIS EMBRIONÁRIAS DE CAMUNDONGO [0186] A fim de examinar o NSC ao efeito indutor de diferenciação de neurônios em relação à ativação de MEK1 e MEK2, um plasmideo MEK1 (CAMEK1) constitutivamente ativo e MEK2 (CAMEK2) constitutivamente ativo que possui mutações para a expressão constitutiva de MEK1 e MEK2, respectivamente, foram usados nos experimentos. Especificamente, NSCs embrionários de camundongo cultivados conforme descrito no Exemplo 1, Etapa IA foram semeados em placas e cultivados durante 24 horas. Então, 1 pg/ml de CAMEK1 e CAMEK2 foram transfectados nas células com o uso de lipofectamina para criar NSC em que a expressão de CAMEK1 ou CAMEK2 ou ambos são expressos. Após 4 horas, o meio de cultura dessas células transfectadas foi substituído por meio de cultura N2 que não contém EGF ou bFGF, cultivado por mais 4 dias, RNA e proteína foram extraídos e realizados RTPCR quantitativa (qRT-PCR) e western blotting foram. Através desses experimentos, o efeito da ativação de MEK1 e MEK2 no NSC para o efeito indutor da diferenciação de neurônios foi examinado e mostrado na Figura 8c.
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 85/273
78/100 [0187] Ao contrário da Figura 8b, a Figura 8c mostra que, quando MEK1 e MEK2 são ativados em um ambiente indutor de diferenciação, a diferenciação do NCS é inibida. A expressão de mRNA e proteína do marcador de neurônio Tujl e do marcador de neurônio dopaminérgico TH mostrou-se inibida por qRT-PCR e Western blotting. A expressão de Tujl e TH foi significativamente menor no caso da ativação de MEK1 e MEK2 em comparação com apenas um deles sendo ativado.
EXEMPLO 5-3: INIBIÇÃO DE MEK1 E MEK2 EM CÉLULASTRONCO NEURAIS ADULTAS DE CAMUNDONGO [0188] Os seguintes experimentos foram realizados para determinar se a inibição de MEK1 e MEK2 induz a diferenciação de NSC em NSC adulto de camundongo e se o efeito é o mesmo em condições onde beta-amiloide está presente.
[0189] NSCs adultos de camundongo cultivados conforme descrito no Exemplo 2, Etapa IA foram semeados em placas e cultivados durante 24 horas. Então, 1 pg/ml de shRNAMEK1 (CCGGGCCATCCAACATTCTAGTGAACTCGAGTTCACTAGAATGTTGGATG GCTTTTT) ou shRNA-MEK2 (CCGGCCTCCGAGAGAAGCACCAGATCTCGAGATCTGGTGCTTCTCTCGGA GGTTTTTG) foram transfectados nas células com o uso de lipofectamina (Invitrogen) para criar NSC em que a expressão de MEK1 ou MEK2, ou ambos, é inibida.
[0190] Após 4 horas, o meio de cultura dessas células transfectadas foi substituído por meio de cultura N2
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 86/273
79/100 ou meio N2 tratado com beta-amiloide 10 μΜ, cultivado por mais 2 dias, e a morfologia celular observada ao microscópio. Extraiu-se o RNA com o uso do método do Exemplo 4, qRT-PCR foi realizada e analisou-se o efeito de indução de diferenciação de neurônios de NSC.
[0191] O resultado é mostrado na Figura 9.
[0192] Conforme mostrado na Figura 9a, a diferenciação foi mais prontamente induzida em NSC, em que a expressão de MEK1 e MEK2 foi inibida pela transfecção tanto de shMEKl como de shMEK2 do que em NSC, em que apenas um dentre shMEKl ou shMEK2 foi transfectado.
[0193] No caso de células tratadas com Αβ, as células morreram no grupo em que MEK1 e MEK2 não foram inibidos, mas no grupo em que MEK1, MEK2 ou MEK1 e MEK2 foram inibidos, a morte celular não ocorreu, mas não houve indução de diferenciação.
[0194] Além disso, conforme mostrado na Figura 9b, a expressão do marcador neuronal Tujl foi significativamente aumentada na NSC, onde a expressão de MEK1 e MEK2 foi inibida pelo tratamento tanto de shMEKl como de shMEK2 (shMEKl+shMEK2). Em contrapartida, nas NSCs onde a expressão de MEK1 ou MEK2 foi inibida (shMEKl, shMEK2), a expressão do marcador neuronal Tujl foi baixa, assim como a NCS para o efeito indutor de diferenciação de neurônios comparado ao caso em que tanto MEK1 como MEK2 foram inibidos.
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 87/273
80/100
No caso de células tratadas com Αβ, foi observado algum efeito indutor de proteção e diferenciação nas NSCs em que tanto MEK1 como MEK2 foram inibidos, mas na NSC, onde a expressão de MEK1 e MEK2 foi inibida, o efeito de proteção e indução de diferenciação foi significativamente maior.
[0195] A partir desses resultados, revela-se que a inibição de MEK1 e MEK2 em NSC adulta não apenas induz a diferenciação de NSC, mas também demonstra um efeito protetor contra beta-amiloide.
EXEMPLO 6: EFEITO INDUTOR DE DIFERENCIAÇÃO DE NSC DE OUTROS INIBIDORES DE MEK1/2 [0196] De modo a testar se outros inibidores de MEK1/2 além de trametinib demonstram um efeito protetor e indutor de diferenciação de NSC, as NSC embrionárias de camundongo foram tratadas com cada um dos materiais de teste. Especificamente, as NSCs embrionárias de camundongo cultivadas conforme descrito no Exemplo 1, Etapa IA foram tratadas com os respectivos inibidores de MEK1/2 AZD8330 (Selleckchem, cat n° 2134), PD184352 (Selleckchem, cat n° S1020), refametinib (Selleckchem, cat n° S1089), PD318088 (Selleckchem, cat n° S1568), binimetinib (Selleckchem, cat n° S7007) e AS703026 a concentrações de 0,1 μΜ, 1,0 μΜ, e 10 μΜ e incubadas. Para comparação, as NSCs também foram tratadas com trametinib nas mesmas concentrações. No dia 2 de cultura, a morfologia celular foi observada por microscopia de contraste de fase e os
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 88/273
81/100 resultados são mostrados na Figura 10a. A Figura 10b é a análise da expressão de mRNA de Tujl nas células de cada grupo.
[0197] Conforme mostrado nas Figuras 10a e 10b, AZD8330, refametinib, PD318088, binimetinib e AS703026 todas as diferenciações induzidas, embora a partir de diferentes concentrações. AZD8330, refametinib e PD318088 exibiram morfologia de diferenciação começando em 1,0 μΜ, enquanto binimetinib e AS703026 começou em 10 μΜ. O exame da expressão do marcador de diferenciação neuronal Tujl por RT-PCR também mostrou que os mesmos induzem a diferenciação nas mesmas concentrações. Trametinib mostrou um excelente efeito indutor da diferenciação de NSC em comparação com outros compostos, mesmo em uma baixa concentração de 0,1 μΜ. Em contrapartida, PD184352 mostrou apenas um efeito indutor de diferenciação de
NSC fraco em 0, 1 μΜ, e em 1, 0 μΜ e 10 μΜ, todas as células
morreram. [0198] Além disso, as NSCs adultas de camundongo
cultivadas como no Exemplo 2, Etapa IA ., foram tratadas com
outros inibidores de MEK1/2 PD0325901 (Selleckchem, cat n° S1036), RO5126766 (Selleckchem, cat n° S7170), BI847325 (Selleckchem, cat n° S7843) e U0126 (A.G. Scientific, São Diego, CA, EUA, cat n° U-102) a várias concentrações, e os seus efeitos indutores de diferenciação de NSC foram examinados. Após o tratamento com os materiais de teste, a morfologia celular foi observada por microscopia de contraste
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 89/273
82/100 de fase no dia 2 de cultura. Os resultados são mostrados na Figura 10c. Conforme mostrado nas Figuras 10c, PD0325901 mostrou um efeito indutor de diferenciação começando a 0,1 μΜ, RO5126766 a 1,0 μΜ. PD0325901, em particular, apresentou um excelente efeito indutor, pois induziu a diferenciação em uma ampla gama de concentrações, de 0,1 μΜ a 10 μΜ. Em contrapartida, BI847325 mostrou apenas um efeito indutor de diferenciação fraco em 0,1 μΜ, e em 1,0 μΜ e 10 μΜ, todas as células morreram. Quando tratada com concentrações mais baixas de BI847325 (1,0 nM e 10 nM), a proliferação celular pareceu ser de alguma forma inibida e não foi observado um efeito indutor de diferenciação. U0126 mostrou inibição da proliferação celular a 0,1 μΜ e 1,0 μΜ e em 10 μΜ, mostrou citotoxicidade celular. Além disso, U0126 não mostrou qualquer efeito indutor de diferenciação evidente a 2,5 μΜ e, dessa forma, não conseguiu mostrar nenhum efeito indutor de diferenciação de NSC em todas as concentrações testadas.
[0199] Esses resultados revelam que nem todos os inibidores de MEK1/2 anteriormente conhecidos induzem eficazmente a diferenciação de NSC. De acordo com os resultados do Exemplo 5, é evidente que a inibição de MEK1 e MEK2 está envolvida na indução da diferenciação de NSC. No entanto, pensa-se que a propriedade distinta de cada inibidor de MEK1/2 afeta as suas capacidades indutoras de diferenciação de NSC, conduzindo a diferenças observadas no Exemplo 6.
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 90/273
83/100
EXEMPLO 7: EFEITO INDUTOR DA DIFERENCIAÇÃO DE NSC DE OUTROS INIBIDORES DE MEK1/2 NA PRESENÇA DE FATORES CITOTÓXICOS CELULARES [0200] NSC adultas cultivadas conforme descrito no Exemplo 2, Etapa IA, foram tratadas com beta-amiloide 10 μΜ conforme descrito no Exemplo 2, Etapa 2, para criar um ambiente citotóxico, após o qual inibidores de MEK1/2 AS703026 (10 μΜ), AZD8330 (1 μΜ) , PD318088 (1 μΜ) , binimetinib (10 μΜ), refametinib (1 μΜ), PD0325901 (10 μΜ) e RO5126766 (10 μΜ) foram adicionados à concentração que causou o efeito indutor de maior diferenciação no Exemplo 6 e cultivados. A título de comparação, foram incluídos o grupo tratado com trametinib 0,1 μΜ e o grupo tratado com cobimetinib 10 μΜ (conhecido como um inibidor seletivo de MEK1 em comparação com MEK2), bem como os grupos não tratados com beta-amiloide para cada um dos compostos testados. A morfologia celular foi observada por microscopia de contraste de fase no segundo dia de cultura, e os resultados são mostrados na Figura 11.
[0201] Na Figura 11, a linha marcada com é o grupo de NSC adulta de camundongo que não é tratado com betaamiloide e a linha marcada com Αβι-42 é o grupo tratado com beta-amiloide 10 μΜ. Em condições em que a citotoxicidade é causada pelo tratamento de 10 μΜ de beta-amiloide, foi demonstrado que a adição de AS703026, AZD8330, PD318088, binimetinib, refametinib, PD0325901 e RO5126766, em cada
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 91/273
84/100 concentração ideal que induz a maior diferenciação, forneceu proteção celular e induziu a diferenciação de NSC. Em contrapartida, a adição de cobimetinib, um inibidor conhecido por ser mais seletivo para MEK1 do que MEK2, não induziu a diferenciação de NSC adulta mesmo em uma alta concentração de 10 μΜ, independentemente de ter sido ou não adicionada betaamiloide .
EXEMPLO 8 : DETECÇÃO DE UM AUMENTO NO NÚMERO DE NEURÔNIOS NO MODELO DE CAMUNDONGO DA DOENÇA DE ALZHEIMER [0202] Através desses experimentos anteriores, foi mostrado que, entre os compostos que suprimem tanto MEK1 como MEK2, certos compostos induzem a diferenciação de NSC em neurônios e protegem NSC e neurônios contra beta-amiloide, trametinib, em particular, mostrando um poderoso efeito. Para confirmar essa constatação no modelo de camundongo da doença neurodegenerativa, a neuro-regeneração e o efeito terapêutico de trametinib foram examinados com o uso do camundongo 5XFAD, um modelo animal que apresenta sintomas de DA que é a forma mais comum de doença neurodegenerativa. O camundongo 5XFAD apresenta patologias neuronais, degeneração e morte celular de neurônios, especialmente na camada cortical somatossensorial 5 e no subiculo do cérebro (Oakley et ai. (2006) Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer's disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation. J
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 92/273
85/100
Neurosci. 26(40):10.129 a 10.140).
[0203] Trametinib foi administrado por via oral ao camundongo modelo de DA 5XFAD (B6SJL-Tg (APPSwFILon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax) com 12 meses de idade diariamente por 28 dias consecutivos a uma dose de 0,1 mg/kg e 1,0 mg/kg, enquanto o veículo (DMSO a 4% + óleo de milho) foi administrado aos camundongos do grupo de controle no mesmo método (7 camundongos/grupo). Para a manchamento de BrdU a ser realizado mais tarde, 50 mg/kg de BrdU (Sigma, cat n° B5002) foi adicionado à dose diária para os últimos 5 dias. O camundongo foi, então, anestesiado e perfundido com PBS para a extração do cérebro. Dos cérebros extraídos de 3 camundongos de cada grupo, metade do tecido cerebral (hemisférios) foi imediatamente armazenado no congelador para Western blot e os experimentos de ELISA foram realizados mais tarde. A outra metade dos hemisférios mais outros 3 cérebros de camundongos extraídos por grupo foram colocados em solução de formalina a 10% a 4 °C durante 1 dia, que foi, então, seguido pelas etapas para permitir uma boa penetração de parafina no tecido cerebral. Os tecidos cerebrais foram imersos sequencialmente em álcool a 70%, 80%, 95%, 100% durante 1 hora cada, para desidratação, então imersos em xileno 3 vezes durante 1 hora cada para limpeza e embebidos em parafina, colocando-se em parafina líquida 2 vezes por 1 hora cada. Após esses procedimentos, o tecido cerebral embebido em parafina (bloco
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 93/273
86/100 de parafina) foi cortado em seções de 5 pm, montado em lâminas e armazenado à temperatura ambiente. Antes do manchamento imuno-histoquímico, os tecidos nas lâminas foram reidratados por imersão sequencial em xileno, álcool a 100%, 90%, 80%, 70% e 50% e, então, água durante 5 minutos cada. Após a colocação em tampão citrato de sódio (10 mM, pH 6) (Sigma, S4641), o processo de recuperação de antigeno foi realizado a 120 °C por 15 minutos, bloqueado com BSA a 10% (albumina sérica bovina) e incubado com anticorpos contra o marcador NeuN (Cell signaling, cat n° 24307) a 4 °C por 1 dia. No dia seguinte, as lâminas foram incubadas com anticorpos anti-coelho (Vector lab, cat n° PI-1000) à temperatura ambiente por 1 hora e, então, manchadas com manchamento de DAB para a análise da distribuição neuronal no cérebro.
[0204] Uma vez que o camundongo 5XFAD é conhecido por ter danos neuronais extensos na camada 5 do córtex cerebral e no subículo do hipocampo, essas regiões do cérebro foram examinadas primeiro.
[0205] A Figura 12 é o resultado da análise das seções sagitais do córtex somatossensorial no córtex cerebral. Conforme mostrado na Figura 12a, no camundongo 5XFAD administrado com veículo (DMSO a 4% + óleo de milho) (controle, primeira gravura à esquerda), o número de células manchadas com NeuN (positivo) diminuiu devido ao dano considerável dos neurônios na camada do córtex cerebral 5. Em comparação, 0,1
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 94/273
87/100 mg/kg e 1,0 mg/kg de camundongo 5XFAD administrado com trametinib mostraram um aumento significativo no número de neurônios manchados com NeuN. A Figura 12b indica o número de células manchadas com NeuN contadas e representadas como a porcentagem do número de células por unidade de área na região da camada 5 do córtex somatossensorial. Amostras de área foram retiradas de 3 áreas por camundongo, 3 camundongos por grupo, então o número de células contadas foi de um total de 9 áreas. Calculou-se a porcentagem do número de células manchadas com NeuN no grupo administrado com trametinib em comparação com o grupo que administrado com veículo.
[0206] A Figura 13 é o resultado da análise das seções coronais do córtex motor no córtex cerebral do camundongo. Conforme mostrado na Figura 13a, o camundongo 5XFAD administrado com veículo (controle) mostrou dano neuronal extenso na camada 5 do córtex motor com um número reduzido de neurônios manchados com NeuN, enquanto o grupo de trametinib novamente mostrou um aumento significativo no número de neurônios, como com os resultados do córtex somatossensorial. A Figura 13b indica o número de células manchadas com NeuN contadas e representadas como a porcentagem do número de células por unidade de área na região da camada 5 do córtex motor. Amostras de área foram retiradas de 6 áreas por camundongo, 3 camundongos por grupo, então o número de células contadas foi de um total de 18 áreas. Calculou-se a porcentagem
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 95/273
88/100 do número de células manchadas com NeuN no grupo administrado com trametinib em comparação com o grupo que administrado com veículo .
[0207] A Figura 14 é o resultado da análise das seções sagitais do subículo no hipocampo de camundongo. Conforme mostrado na Figura 14a, o camundongo 5XFAD administrado com veículo (controle) mostrou que número significativamente pequeno de neurônios manchados com o marcador neuronal NeuN no subículo do hipocampo, enquanto o grupo administrado com trametinib mostrou novamente um aumento significativo no número de neurônios, como com os resultados do córtex cerebral. A Figura 14b indica o número de células manchadas com NeuN contadas e representadas como a porcentagem do número de células por unidade de área na área pontilhada do subículo do hipocampo mostrado na Figura 14a. Amostras de área foram retiradas de 3 áreas por camundongo, 3 camundongos por grupo, então o número de células contadas foi de um total de 9 áreas. Calculou-se a porcentagem do número de células manchadas com NeuN no grupo administrado com trametinib em comparação com o grupo que administrado com veículo. Através dos experimentos acima, foi mostrado que o trametinib tem o efeito de aumentar o número de neurônios na camada 5 do córtex cerebral e no subículo do hipocampo do camundongo 5XFAD.
EXEMPLO 9: DETECÇÃO DE NEUROGÊNESE NO MODELO DE CAMUNDONGO DA DOENÇA DE ALZHEIMER
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 96/273
89/100 [0208] A fim de determinar se o aumento no número de neurônios na camada 5 do córtex cerebral e no subículo do hipocampo do camundongo 5XFAD administrado com trametinib conforme mostrado no Exemplo 8 foi devido ao efeito de neurogênese do trametinib, foi realizada análise imunohistoquímica com vários marcadores celulares que aparecem ao longo do processo de diferenciação de NSC em neurônio.
[0209] DCX (duplacortina), uma proteína expressa em células precursoras neurais, é expressa principalmente na migração ou diferenciação de neurônios e indica que a célula é um neurônio imaturo no processo de neurogênese. Tujl (classe específica de neurônio ΙΙΙβ tubulina), uma proteína expressa em células precursoras neurais ativamente divididas ou neurônios pós-mitóticos imaturos recém-gerados, indica que a célula é um neurônio no processo de neurogênese. Portanto, detectando a presença de DCX ou Tujl por manchamento imunohistoquímico, pode-se determinar que a neurogênese ocorre através da diferenciação de NSC em neurônios.
[0210] BrdU (5-Bromodesoxicitidina), um análogo da nucleotase timidina, substitui a timidina durante a síntese de DNA em uma célula em divisão, permitindo a detecção de células em divisão durante a neurogênese por manchamento imunohistoquímico.
EXEMPLO 9-1: DETECÇÃO DA EXPRESSÃO DE TUJ1 NO CÓRTEX SOMATOSSENSORIAL DO CÉREBRO
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 97/273
90/100 [0211] Anticorpos anti-Tujl foram adicionados às lâminas de tecido cerebral de camundongo 5XFAD no Exemplo 8 e incubados a 4 °C durante 1 dia e, após isso, as lâminas de tecido foram manchadas de modo fluorescente por incubação com anticorpos secundários de isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Invitrogen, cat n° A21121) à temperatura ambiente por 1 hora.
A imagem de microscopia fluorescente do córtex somatossensorial do córtex cerebral é mostrada na Figura 15. Na Figura 15, as áreas marcadas com setas (^) indicam células manchadas com Tujl e as partes marcadas com setas (▼) indicam placas formadas por agregação de beta-amiloide. Havia placas presentes nos grupos tratados com veículo e tratados com trametinib. Contudo, o grupo tratado com 0,1 mg/kg de trametinib, em particular, mostrou um aumento significativo no número de células manchadas com Tujl em comparação com o grupo tratado com veículo, apesar dos níveis similares de placas de beta-amiloide presentes nas amostras.
EXEMPLO 9-2: DETECÇÃO DE EXPRESSÃO DE Nissl, NeuN, AND PCX NO GIRO PENTEADO DO HIPOCAMPO [0212] Quando a neurogênese é ativada na zona subgranular (SGZ) do giro denteado, ocorre a divisão celular assimétrica e, como resultado, as células Tipo 2 são geradas no início. As células do tipo 2 têm um pequeno soma com um núcleo atípico, são curtas e horizontais e expressam nestina ou Dcx. As células do tipo 3 são células que sofreram
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 98/273
91/100 diferenciação adicional das células do tipo 2 e também são chamadas de neuroblastos. As células do tipo 3 são células no estágio inicial de diferenciação na linhagem neuronal, e não na glial. As células do Tipo 3 estão situadas mais próximas da camada granular da zona subgranular do giro denteado e, diferentemente das células do Tipo 2, mudaram da forma orientada horizontalmente para a orientada verticalmente. O fato de que as células Tipo 2 e Tipo 3 estão presentes na zona subgranular do giro denteado indica que a neurogênese está ocorrendo.
[0213] O manchamento de Nissl, que mancha o corpo Nissl do neurônio, é um método que mostra a distribuição e a condição dos neurônios no cérebro. Os tecidos do cérebro nas lâminas do Exemplo 8 foram reidratados por imersão sequencial em xileno, álcool a 100%, 90%, 80%, 70%, 50% e, então, água durante 5 minutos cada. Depois de colocar em solução de violeta de cresila a 0,1% (Sigma, cat n° C5042) à temperatura ambiente por 15 minutos, os mesmos foram desidratados por imersão sequencial em álcool a 80%, 90%, 100% e xileno. AS lamelas foram colocadas nas lâminas e os neurônios foram examinados.
[0214] O manchamento de NeuN foi realizado pelo mesmo método conforme descrito no Exemplo 8, assim como o manchamento com DCX, mas com o uso de anticorpos anti-DCX (Santa Cruz, cat n° Sc271390) em vez de anticorpos anti-NeuN.
[0215] Os resultados são mostrados na Figura 16a.
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 99/273
92/100
Dos manchamentos de Nissl e NeuN no camundongo 5XFAD administrado com trametinib, foi demonstrado que o número de células com a morfologia das células Tipo 2 ou Tipo 3 que aparecem especificamente durante a neurogênese aumentou consideravelmente na zona subgranular (SGZ) e em uma área mais próximo da zona granular do que SGZ no giro denteado. Além disso, os neurônios imaturos (marcados com setas (^) na coluna denominada Dcx na Figura 16) que também são manchados por DCX foram vistos como presentes, confirmando que a neurogênese ocorre no giro denteado do hipocampo em camundongos administrados com trametinib.
EXEMPLO 9-3: Manchamento de BrdU NA REGIÃO DE GIRO DENTEADO DO HIPOCAMPO [0216] A divisão assimétrica das células-tronco neurais deve prosseguir para que a neurogênese ocorra, e isso foi examinado por meio do seguinte experimento.
[0217] As lâminas de tecido cerebral de camundongo 5XFAD administrado com BrdU (administração diária de 50 mg/kg de BrdU durante 5 dias consecutivos antes do sacrifício conforme descrito no Exemplo 8) foram reidratadas, colocadas em HCI 1,5 M (ácido clorídrico) e incubadas a 37 °C durante 30 minutos. As lâminas foram bloqueadas com solução contendo BSA a 0,5% (albumina de soro bovino), TritonX-100 a 0,3% e soro de cabra normal a 10% e incubadas com anticorpo anti-BrdU (Cell signaling, cat n° 5292) a 4 °C por 1 dia. O
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 100/273
93/100 manchamento imunofluorescente foi realizado no dia seguinte por incubação das lâminas com anticorpo secundário de isotiocianato de fluoresceina (FITC) à temperatura ambiente durante 1 hora e, depois disso, o manchamento da região do giro denteado do hipocampo foi examinado com um microscópio de fluorescência.
[0218] Os resultados são mostrados na Figura 16a na coluna etiquetada BrdU. As células marcadas por setas (▼) são as células marcadas com BrdU. Em comparação com o grupo administrado com veículo, o camundongo 5XFAD administrado com trametinib mostrou um aumento no número de células manchadas com BrdU no giro denteado. A Figura 16b mostra o número de células etiquetadas com BrdU, o que novamente mostrou que o grupo administrado com trametinib mostrou um aumento no número de células manchadas com BrdU. A Figura 16b quantificou o número de células de um total de 9 áreas (3 camundongos por grupo e 3 áreas por camundongo) e a média é mostrada no gráfico.
[0219] A partir desses resultados, é revelado que trametinib induz neurogênese através da diferenciação de NSC no modelo de camundongo de DA. Isso sugere que não só o trametinib pode ser usado como um tratamento fundamental para a DA, mas também para o tratamento e prevenção de doenças causadas por danos ou perda neuronal no córtex cerebral, particularmente no córtex motor.
EXEMPLO 10: ATIVIDADE NEUROPROTETORA NO MODELO DE
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 101/273
94/100
CAMUNDONGO DE DA [0220] De modo a determinar se o trametinib tern um efeito neuroprotetor no cortex cerebral e no subiculo do hipocampo dos camundongos 5XFAD, foi realizado o ensaio imunohistoquimico TUNEL (marcação final da desoxinucleotidiltransferase dUTP-rotulagem) para detectar a apoptose celular. O ensaio TUNEL mancha o terminal 3'-hidroxila do DNA fragmentado, permitindo a detecção de células em apoptose no tecido .
[0221] As lâminas de tecido cerebral sagital descritas no Exemplo 8 foram reidratadas e coradas manchadas com o kit de teste TUNEL (Promega, Wisconsin, EUA, cat n° G3250). Especificamente, as lâminas do tecido cerebral foram permeabilizadas com solução de proteinase K a 20 pg/ml durante 10 minutos, incubadas com tampão de equilíbrio durante 10 minutos e, então, incubadas com solução de TdT a 37 °C durante 1 hora. Foi observado o manchamento da área do cortex somatossensorial e subiculo, áreas conhecidas por mostrar morte celular significativa em camundongos. O ensaio TUNEL também foi realizado nas lâminas de tecido do cérebro de camundongo adulto normal (como controle) para confirmar que o manchamento foi realizado adequadamente.
[0222] Os resultados são mostrados na Figura 17. O manchamento de fluorescência verde não foi observado no camundongo normal (marcado camundongo normal na Figura 17)
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 102/273
95/100 devido ao fato de que apoptose não ocorreu. No entanto, a fluorescência verde foi observada em muitas das células do córtex somatossensorial (linha marcada córtex na Figura 17) e no subiculo (linha marcada subiculo na Figura 17) do camundongo 5XFAD. Na Figura 17, as células manchadas foram marcadas com setas (^) no subiculo; no córtex somatossensorial, nenhuma marcação separada foi feita devido a muitas células estarem manchadas. No caso de camundongos 5XFAD administrados com trametinib, o número de células manchadas com TUNEL no córtex somatossensorial e no subiculo foi significativamente inferior em comparação com o grupo administrado com veiculo.
[0223] Esses resultados demonstram que o trametinib exerce um efeito protetor contra a morte de neurônios no modelo de camundongo de DA.
EXEMPLO 11: PROTEÇÃO DE CÉLULA DE PURKINJE CEREBELAR NO MODELO DE CAMUNDONGO DE DA [0224] As lâminas de tecido cerebral (de camundongo 5XFAD) descritas no Exemplo 8 foram incubadas com anticorpos anti-Tujl e anti-calbindina (Cell signaling, cat n° 13176) a 4o C por 1 dia e foram manchadas por imunofluorescência com anticorpos secundários de isotiocianato de fluoresceina (FITC) ou anticorpos secundários anti-rodamina à temperatura ambiente por 1 hora. A imagem de imunofluorescência da camada de células de Purkinje é mostrada na Figura 18. Duas lâminas para manchamento de Tujl e três
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 103/273
96/100 para manchamento de calbindina são mostradas para cada grupo de tratamento.
[0225]
Conforme mostrado na Figura 18 as células de Purkinje do grupo tratado com veiculo exibiram axônios salientes finos que mostram um padrão de ser cortado no meio. Em contraste, o grupo administrado com trametinib, particularmente o grupo tratado com 0,3 mg/kg de trametinib, exibiu células de Purkinje com arborização de axônio aumentada ou pelo menos com estrutura de axônio preservada quando comparado com o controle tratado com veiculo.
[0226]
O cerebelo é conhecido por desempenhar um papel importante na integração do reconhecimento sensorial e na regulação e controle dos movimentos motores. As células mais impressionantes do cerebelo, as células de Purkinje, são uma das maiores células do cérebro e, através de sua elaborada arborização de axônios, formam sinapses entre si e se estendem profundamente no núcleo do cerebelo para regular e controlar o músculo motor. Os resultados experimentais acima indicam que trametinib protege as células de Purkinje e aumenta a arborização dos axônios no cerebelo, possivelmente fornecendo tratamento para doenças, como a ataxia cerebelar, que são causadas pela perda ou dano das células de Purkinje no cerebelo.
EXEMPLO 12: INIBIÇÃO DO TRAMETINIB DA ATIVIDADE DE MEK NO MODELO DE CAMUNDONGO DE DA
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 104/273
97/100 [0227] Como os fármacos para tratamento da doença neurodegenerativa atuam no sistema nervoso central, é importante saber se podem ou não atravessar a barreira hematoencefálica para atuar no cérebro. Entre os inibidores da MEK1/2, sabe-se que compostos como AS703026 atravessam eficazmente a BBB e inibem MEK e diminuem a expressão de ERK fosforilada no cérebro do camundongo (Shaw et ai. (2012) Evaluation of brain pharmacokinetics as a potential differentiation factor for the MEK inhibitors, MSC2015103 and pimasertib. Resumo LB-456, American Association for Cancer Research Annual Meeting, Chicago, IL, EUA). Para confirmar que o inibidor de MEK1/2 trametinib entra no cérebro para produzir os resultados experimentais acima quando PO administrado a camundongos 5XFAD, o nivel de expressão de pERK foi medido no tecido cerebral.
[0228] Os hemisférios cerebrais de camundongo 5XFAD (3 camundongos por grupo) do Exemplo 8 armazenados em um congelador foram colocados em nitrogênio liquido e triturados em um pilão carregado com nitrogênio liquido. O pó foi dividido em 6 partes, colocado em tubos novos e colocado de volta no congelador. Um dos tubos foi retirado e usado para Western blotting, conforme descrito no Exemplo 5-2. O pó foi cuidadosamente suspenso com uma pipeta em tampão RIPA, incubado em gelo durante 10 minutos, centrifugado a 13.000 rpm, 4 °C e o sobrenadante foi coletado. Depois de medir a concentração de
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 105/273
98/100 proteína, o tampão de amostra (Tris-HCI 0,25 M pH 6,8, SDS a 0,05%, glicerol a 50%, DTT 0,25 M, 0,5 mg/ml de BPB) foi adicionado, fervido a 100 °C durante 10 minutos e armazenado a -20 °C. 10 pg de amostra de proteína foram carregados em gel de SDS-PAGE a 10%, submetido à eletroforese, transferido para uma membrana de nitrocelulose, e bloqueado com leite desnatado a 5% à temperatura ambiente durante 1 hora. Western blotting foi realizado com o uso de anticorpos anti-pERK (Cell signaling, cat n° 4370) e anti-ERK em solução salina tamponada com tris (TBS) com Tween 20 a 0,1%, que foi incubado à temperatura ambiente por 1 hora e subsequentemente seguido de incubação com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano à temperatura ambiente por 1 hora. As bandas de proteínas foram detectadas com um sistema de imagem fotossensível (Figura 19a) . A fim de quantificar a alteração na expressão de pERK, os níveis de expressão de pERK e ERK foram medidos por densitometria e o nível de expressão de pERK foi normalizado contra o nível de expressão de ERK. O nível de expressão normalizado de pERK no grupo tratado com trametinib versus o grupo tratado com veículo é mostrado na Figura 19b.
[0229] Conforme mostrado na Figura 19, o nível de proteína de pERK no cérebro de 0,1 mg/kg e 1,0 mg/kg de camundongo administrado com trametinib é consideravelmente inferior àquele do grupo de veículo.
[0230] Essa constatação indica que a
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 106/273
99/100 administração PO de trametinib resulta na administração de trametinib ao cérebro para subsequentemente inibir a atividade de MEK e diminuir a expressão de pERK, através da qual a neurogese e a neuroproteção parecem ser manifestadas.
EXEMPLO 13: DIMINUIÇÃO NA DEPOSIÇÃO DE BETA-AMILOIDE NO MODELO DE CAMUNDONGO DE DA [0231] Uma vez que a principal característica patológica da DA é a deposição de Αβ, foi examinada a capacidade de o trametinib diminuir a deposição de Αβ. Com o uso do pó moído de hemisférios cerebrais de camundongo 5XFAD obtidos no Exemplo 12, quantificou-se a quantidade de Αβ(1-40) e Αβ(1-42) por ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado à enzima). O ensaio foi realizado com o kit ELISA (Invitrogen, MA, cat n° KHB3442) da seguinte forma: Primeiro, o pó de cérebro de camundongo foi cuidadosamente suspenso com uma pipeta em uma solução de guanidina-HCl 5 M, centrifugado a 16.000xg (rpm), 4 e o sobrenadante foi coletado. Depois de medir a concentração de proteína, o tampão de diluição foi adicionado para obter 30 a 50 pg de proteína em 100 μΐ de solução. Foram adicionados 100 μΐ de anticorpos anti-Αβ(1-40) e Αβ(1-42) às placas de 96 cavidades, incubados à temperatura ambiente durante 2 horas, depois removidos e lavados 4 vezes com tampão de lavagem. 100 μΐ de cada anticorpo secundário conjugado com HRP foram adicionados e incubados à temperatura ambiente durante 30 minutos. A solução foi, então, removida e lavada novamente 4
Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 107/273
100/100 vezes com tampão de lavagem. 100 μΐ da proteína preparada a partir do pó do cérebro de camundongo foram adicionados às cavidades, incubados no escuro durante 30 minutos e 100 μΐ da solução de paragem adicionada para terminar a reação. Em seguida, a reação de quimiluminescência foi medida a 450 nm com um leitor de placa de ELISA. A absorvância foi convertida em referência à concentração padrão e a concentração de cada proteína foi determinada. A quantidade de Αβ(1-40) e Αβ(1-42) em referência à quantidade total de proteína (30 a 50 pg) foi calculada e, então, a quantidade de Αβ(1-42) em referência à quantidade de Αβ(1-40) foi calculada. As médias das 3 medições de camundongo para cada grupo foram obtidas e são mostradas na Figura 20. Conforme mostrado na Figura 20, a quantidade de Αβ(1-42)/Αβ(1-40) diminuiu no grupo tratado com trametinib em comparação com o grupo tratado com veículo.
[0232] Esse resultado indica que, no modelo animal de DA, o trametinib diminuiu a quantidade de Αβ, particularmente a forma Αβ(1-42) que tem uma forte tendência de formar oligômeros ou agregados tóxicos e, dessa forma, podería fornecer proteção aos neurônios.

Claims (2)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. MÉTODO DE INDUÇÃO DE NEURO-REGENERAÇÃO, caracterizado por compreender administrar um composto (ou compostos) que inibe tanto a proteína quinase ativada por mitogênio (MEK) 1 como MEK2 (inibidor MEK1/2) a um paciente em necessidade do mesmo, em que o inibidor MEK1/2 é pelo menos um selecionado do grupo que consiste em trametinib, pimasertib (AS703026), binimetinib, refametinib,
    Figure BR112019009711A2_C0001
    (AZD8330),
    OH
    Figure BR112019009711A2_C0002
    (PD318088),
    Figure BR112019009711A2_C0003
    (PD0325901) e
    Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 109/273
    1/Ί
    Figure BR112019009711A2_C0004
    2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo inibidor de MEK1/2 induzir a neuroregeneração diferenciando-se células-tronco neurais em neurônios, protegendo-se células-tronco neurais e neurônios contra a citotoxicidade de beta-amiloides, ou por ambas as alternativas acima.
    3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo inibidor MEK1/2 ser trametinib.
    4. MÉTODO DE PROTEÇÃO DE NEURÔNIOS CONTRA PERDA OU DANO NEURONAL, caracterizado por compreender administrar um composto (ou compostos) que inibe tanto a proteína quinase ativada por mitogênio (MEK) 1 como MEK2 (inibidor MEK1/2), em que o inibidor MEK1/2 é pelo menos um selecionado do grupo que consiste em trametinib, pimasertib (AS703026), binimetinib, refametinib,
    Figure BR112019009711A2_C0005
    (AZD8330),
    Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 110/273
    3/7
    Figure BR112019009711A2_C0006
    (PD318088),
    Figure BR112019009711A2_C0007
    (PD0325901) e
    Figure BR112019009711A2_C0008
    5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo inibidor MEK1/2 ser trametinib.
    6 . MÉTODO DE PREVENÇÃO OU TRATAMENTO DE DOENÇA NEURODEGENERATIVA DEVIDO À PERDA OU DANO NEURONAL, caracterizado por compreender administrar um composto (ou compostos) que inibe tanto a proteína quinase ativada por mitogênio (MEK) 1 como MEK2 (inibidor MEK1/2) a um paciente em necessidade do mesmo, em que o inibidor MEK1/2 é pelo menos um selecionado do grupo que consiste em trametinib, pimasertib (AS703026), binimetinib, refametinib,
    Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 111/273
    ΜΊ (AZD8330) ,
    OH i Η
    Figure BR112019009711A2_C0009
    F (PD318088),
    Figure BR112019009711A2_C0010
    (PD0325901) e
    Figure BR112019009711A2_C0011
    7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pela doença neurodegenerativa ser selecionada do grupo que consiste em demência, doença de Alzheimer, demência vascular, demência senil, demência frontotemporal, demência de corpos de Lewy, doença de Parkinson, atrofia de múltiplos sistemas, degeneração corticobasal, paralisia supranuclear
    Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 112/273
    5/7 progressiva, doença de Huntington, esclerose lateral amiotrófica (ALS, doença de Lou Gehrig), esclerose lateral primária, atrofia muscular espinhal, paralisia bulbar progressiva (PBP), atrofia muscular progressiva (PMA), paralisia pseudobulbar, paraplegia espástica hereditária (HSP), ataxia cerebelar, doença de Creutzfeldt-Jakob, esclerose múltipla e sindrome de Guillain-Barré, etc.
    8 . MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo inibidor MEK1/2 ser trametinib. 9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado Alzheimer . pela doença neurodegenerativa ser doença de 10 . MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado vascular. pela doença neurodegenerativa ser demência 11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pela doença neurodegenerativa ser esclerose
    lateral amiotrófica (ALS, doença de Lou-Gehrig).
    12 . MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pela doença neurodegenerativa ser doença de Huntington. 13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8,
    caracterizado por trametinib ser administrado 0,1 mg a 2 mg uma vez por dia.
    14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13,
    Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 113/273
    6/7 caracterizado por trametinib ser administrado 0,1 mg a 1 mg uma vez por dia.
    15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por trametinib ser administrado 0,1 mg a 0,5 mg uma vez por dia.
    16. MÉTODO DE TRIAGEM DE CANDIDATOS DE FÁRMACO PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS NEURODEGENERATIVAS, caracterizado por compreender as etapas de:
    1) tratar células-tronco neurais derivadas de camundongo adulto com pelo menos uma substância indutora de dano neuronal selecionada do grupo que consiste em betaamiloide, MPTP (1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina), rotenona, oxidopamina, glutamato, LPS (lipopolissacarideo) e S100B (proteína B de ligação a cálcio S100);
  2. 2) adicionar um material de teste às células-tronco neurais tratadas com a substância indutora de danos de neurônios acima; e
    3) examinar a diferenciação e morte das células- tronco neurai s por análise morfológica das células. 17 . MÉTODO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pela substância indutora de dano neuronal ser
    beta-amiloide.
    18 . MÉTODO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo beta-amiloide estar na forma oligomérica. 19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18,
    Petição 870190044886, de 13/05/2019, pág. 114/273
    7/7 caracterizado pelo beta-amiloide na forma oligomérica compreender trimeros e tetrâmeros de beta-amiloide.
    20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo beta-amiloide ser Αβ(1-42) que consiste em 42 aminoácidos.
BR112019009711A 2016-11-25 2017-11-23 método de indução de neuro-regeneração, método de proteção de neurônios contra perda ou dano neuronal, método de prevenção ou tratamento de doença neurodegenerativa devido à perda ou dano neuronal, e método de triagem de candidatos de fármaco para o tratamento de doenças neurodegenerativas BR112019009711A2 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20160158739 2016-11-25
KR20170036268 2017-03-22
PCT/KR2017/013444 WO2018097628A2 (ko) 2016-11-25 2017-11-23 신경줄기세포의 분화 촉진 및 보호용 조성물 및 이를 이용하여 신경재생을 유도하는 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112019009711A2 true BR112019009711A2 (pt) 2019-08-13

Family

ID=62196019

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112019009711A BR112019009711A2 (pt) 2016-11-25 2017-11-23 método de indução de neuro-regeneração, método de proteção de neurônios contra perda ou dano neuronal, método de prevenção ou tratamento de doença neurodegenerativa devido à perda ou dano neuronal, e método de triagem de candidatos de fármaco para o tratamento de doenças neurodegenerativas

Country Status (20)

Country Link
US (3) US10485802B2 (pt)
EP (2) EP3425390B1 (pt)
JP (2) JP6663509B2 (pt)
KR (4) KR102114017B1 (pt)
CN (2) CN109073634B (pt)
AU (1) AU2017363804B2 (pt)
BR (1) BR112019009711A2 (pt)
CA (1) CA3041245C (pt)
CL (1) CL2019001415A1 (pt)
DK (1) DK3425390T3 (pt)
ES (1) ES2848720T3 (pt)
HU (1) HUE052854T2 (pt)
IL (1) IL266573B (pt)
MX (1) MX2019006040A (pt)
MY (1) MY194462A (pt)
NZ (1) NZ754020A (pt)
PH (1) PH12019501143A1 (pt)
SG (2) SG11201903725UA (pt)
WO (1) WO2018097628A2 (pt)
ZA (1) ZA201903226B (pt)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112019009711A2 (pt) 2016-11-25 2019-08-13 Genuv Inc método de indução de neuro-regeneração, método de proteção de neurônios contra perda ou dano neuronal, método de prevenção ou tratamento de doença neurodegenerativa devido à perda ou dano neuronal, e método de triagem de candidatos de fármaco para o tratamento de doenças neurodegenerativas
US20220313782A1 (en) * 2019-05-02 2022-10-06 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions involving tert activating therapies
KR20220024161A (ko) * 2019-05-22 2022-03-03 주식회사 지뉴브 트라메티닙 및 마커를 이용한 신경퇴행성 질환의 치료를 위한 투여 방법 및 투약 용법
CN111143763B (zh) * 2019-12-13 2021-09-17 广东电网有限责任公司 电力设备状态的评估方法、装置及其存储介质
KR20230004597A (ko) * 2020-04-14 2023-01-06 주식회사 지뉴브 신경퇴행성질환 치료제에 대한 반응을 평가하기 위한 방법 및 조성물
WO2022045723A1 (ko) * 2020-08-24 2022-03-03 차의과학대학교 산학협력단 신경줄기세포의 도파민 신경세포로의 분화 촉진용 조성물
CN112695019B (zh) * 2021-03-23 2021-06-25 翌圣生物科技（上海）有限公司 逆转录酶突变体及其应用
CN115322966B (zh) * 2022-08-19 2024-04-16 山东大学 叶酸钙纳米颗粒的批量制备方法及诱导神经干细胞分化为胆碱能神经元的方法

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6310060B1 (en) * 1998-06-24 2001-10-30 Warner-Lambert Company 2-(4-bromo or 4-iodo phenylamino) benzoic acid derivatives and their use as MEK inhibitors
WO2002014536A2 (en) * 2000-08-11 2002-02-21 Cephalon, Inc. Odulating multiple lineage kinase proteins
EP2330113B1 (en) * 2002-04-19 2016-06-29 The Governing Council Of The University Of Toronto Immunological methods and compositions for the treatment of Alzheimer's disease
AU2003252559A1 (en) 2002-08-17 2004-03-03 Hae-Young Suh A method for transdifferentiating mesenchymal stem cells into neuronal cells
CN101006086B (zh) 2004-06-11 2010-09-29 日本烟草产业株式会社 用于治疗癌症的5-氨基-2,4,7-三氧代-3,4,7,8-四氢-2H-吡啶并[2,3-d]嘧啶衍生物和相关化合物
CN101076543A (zh) * 2004-10-13 2007-11-21 阿布林克斯公司 用于治疗和诊断变性神经疾病如阿尔茨海默症的单结构域骆驼抗淀粉样蛋白β的抗体以及包含它的多肽
EP1802579B1 (en) 2004-10-20 2013-11-20 Merck Serono SA Derivatives of 3-arylaminopyridine
AU2005313020A1 (en) * 2004-12-09 2006-06-15 Neuro Therapeutics Ab Materials and methods related to Dickkopfs (DKK) and Neurogenesis
JP4792290B2 (ja) * 2005-12-27 2011-10-12 財団法人 東京都医学総合研究所 神経幹細胞の製造方法
FR2905009A1 (fr) * 2006-08-18 2008-02-22 Servier Lab Methode de criblage de composes aux proprietes anti-amyloide
KR101082484B1 (ko) * 2007-11-06 2011-11-11 한국과학기술원 퇴행성 신경질환 치료제의 스크리닝 방법
KR20100088342A (ko) * 2009-01-30 2010-08-09 연세대학교 산학협력단 신경줄기세포의 분화 촉진용 조성물
US20120134969A1 (en) * 2009-05-25 2012-05-31 Hiroshi Handa Pharmaceutical composition containing nuclear factor involved in proliferation and differentiation of central neuronal cells
WO2010138679A1 (en) * 2009-05-28 2010-12-02 University Of Central Florida Research Foundation, Inc. Method of screening drugs for reversal of amyloid beta neurotoxicity
JPWO2011062013A1 (ja) * 2009-11-18 2013-04-04 国立大学法人徳島大学 神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞への選択的分化誘導剤
KR101211610B1 (ko) 2010-05-10 2012-12-12 주식회사 스템폰즈 Ｂｍｉ１, ＭＥＫ 억제제와 ＧＳＫ 억제제를 이용하여 체세포로부터 배아줄기세포 유사세포로의 역분화를 유도하는 조성물 및 이를 이용한 배아줄기세포 유사세포의 제조방법
US10196606B2 (en) * 2011-12-13 2019-02-05 Unisa Ventures Pty Ltd Method of producing multipotent stem cells
ES2415581B2 (es) 2011-12-20 2014-02-19 Universidad Nacional De Educación A Distancia Compuestos potenciadores del aprendizaje.
US9452215B2 (en) * 2012-02-22 2016-09-27 The Regents Of The University Of Colorado Bourvadin derivatives and therapeutic uses thereof
CN102604894B (zh) * 2012-02-29 2014-07-30 中国科学院广州生物医药与健康研究院 用于制备神经干细胞的培养基及其用途
MY169266A (en) 2012-05-30 2019-03-20 Merck Patent Gmbh Solid state forms of n-((s)-2,3-dihydroxy-propyl)-3-(2-fluoro-4-iodo-phenylamino)-isonicotinamide
WO2015020234A1 (ja) 2013-08-06 2015-02-12 武田薬品工業株式会社 ドパミン神経細胞の製造方法
US9532987B2 (en) * 2013-09-05 2017-01-03 Genentech, Inc. Use of a combination of a MEK inhibitor and an ERK inhibitor for treatment of hyperproliferative diseases
US9943549B2 (en) * 2015-03-17 2018-04-17 Food Industry Research And Development Institute Isolation of human neural stem cells from amniotic fluid of patients with neural tube defects
US10179132B2 (en) 2015-05-26 2019-01-15 Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University Composition for inducing differentiation of multipotent neural stem cells into dopaminergic neurons and method for inducing differentiation of multipotent neural stem cells into dopaminergic neurons by using the same
KR20160138756A (ko) 2015-05-26 2016-12-06 연세대학교 산학협력단 신경줄기세포로부터 도파민 신경세포로의 분화 유도용 조성물 및 이를 이용하여 신경줄기세포로부터 도파민 신경세포로 분화시키는 방법
WO2017117386A1 (en) 2015-12-30 2017-07-06 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Methods of treating cancer using network brakes
EP3430171B1 (en) 2016-03-16 2022-03-02 The Regents of the University of California Detection and treatment of anti-pd-1 therapy resistant metastatic melanomas
EP4339288A3 (en) 2016-03-18 2024-06-05 Caris Science, Inc. Oligonucleotide probes and uses thereof
HUE057398T2 (hu) 2016-03-25 2022-05-28 Ab Science A masitinib alkalmazása egy amiotrófiás laterálszklerózisos beteg alpopuláció kezelésére
CN105796544A (zh) * 2016-04-06 2016-07-27 福州大学 Mapk信号通路抑制剂在制备治疗帕金森药物上的应用
CN105816461B (zh) * 2016-04-06 2018-10-30 福州大学 曲美替尼在制备治疗帕金森症药物上的应用
US11324747B2 (en) 2016-06-07 2022-05-10 Centre For Cellular And Molecular Platforms Methods and compositions for managing neuroinflammation and neurodegeneration
BR112019009711A2 (pt) 2016-11-25 2019-08-13 Genuv Inc método de indução de neuro-regeneração, método de proteção de neurônios contra perda ou dano neuronal, método de prevenção ou tratamento de doença neurodegenerativa devido à perda ou dano neuronal, e método de triagem de candidatos de fármaco para o tratamento de doenças neurodegenerativas
WO2018225063A1 (en) 2017-06-04 2018-12-13 Rappaport Family Institute For Research In The Medical Sciences Method of predicting personalized response to cancer treatment with immune checkpoint inhibitors and kits therefor

Also Published As

Publication number Publication date
EP3800471A1 (en) 2021-04-07
EP3425390A4 (en) 2019-12-25
DK3425390T3 (da) 2021-02-15
CA3041245A1 (en) 2018-05-31
HUE052854T2 (hu) 2021-05-28
KR20180116235A (ko) 2018-10-24
JP2019513806A (ja) 2019-05-30
US10485802B2 (en) 2019-11-26
SG11201903725UA (en) 2019-05-30
IL266573B (en) 2022-03-01
ZA201903226B (en) 2023-12-20
JP2020074796A (ja) 2020-05-21
MY194462A (en) 2022-11-30
JP6663509B2 (ja) 2020-03-11
CN109073634B (zh) 2022-07-08
CN109073634A (zh) 2018-12-21
AU2017363804A1 (en) 2019-06-20
EP3425390A2 (en) 2019-01-09
US20180169102A1 (en) 2018-06-21
SG10202105383QA (en) 2021-07-29
KR20210095748A (ko) 2021-08-02
KR101892457B1 (ko) 2018-08-31
KR20200056465A (ko) 2020-05-22
US20200046706A1 (en) 2020-02-13
AU2017363804B2 (en) 2021-12-23
US11147816B2 (en) 2021-10-19
EP3425390B1 (en) 2020-12-23
ES2848720T3 (es) 2021-08-11
CA3041245C (en) 2022-12-06
WO2018097628A2 (ko) 2018-05-31
US20210401844A1 (en) 2021-12-30
MX2019006040A (es) 2019-08-21
KR102519796B1 (ko) 2023-04-11
PH12019501143A1 (en) 2019-12-16
NZ754020A (en) 2022-11-25
IL266573A (en) 2019-07-31
CL2019001415A1 (es) 2019-10-04
US11701360B2 (en) 2023-07-18
WO2018097628A3 (ko) 2018-08-09
CN115025225A (zh) 2022-09-09
KR102114017B1 (ko) 2020-05-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11701360B2 (en) Composition for inducing differentiation and protection of neural stem cells and method for inducing neuro-regeneration using the same composition
US9527860B2 (en) Chromane-like cyclic prenylflavonoids for the medical intervention in neurological disorders
Paik et al. Somatostatin-mediated changes in microtubule-associated proteins and retinoic acid–induced neurite outgrowth in SH-SY5Y cells
ES2948767T3 (es) Moléculas orgánicas pequeñas para uso en el tratamiento de trastornos neuroinflamatorios
Huang et al. Fyn regulates multipolar–bipolar transition and neurite morphogenesis of migrating neurons in the developing neocortex
US20080153886A1 (en) Use Of Heterocyclic Compounds As Neurogenic Agents
Zhu et al. Parkinson’s disease-like forelimb akinesia induced by BmK I, a sodium channel modulator
EA038404B1 (ru) Применение траметиниба для лечения нейродегенеративного заболевания, вызванного утратой или повреждением нейронов
Choi et al. Inhibition of oxaliplatin-induced neurotoxicity by silymarin through increased expression of brain-derived neurotrophic factor and inhibition of p38-MAPK
KR101734937B1 (ko) ERRγ 역작동제를 유효성분으로 함유하는 암의 치료를 위한 방사성 요오드 요법에 적용되는 효능 증진제
Jastrzębski et al. Effects of small molecules on neurogenesis: Neuronal proliferation and differentiation
US20230106974A1 (en) Agent for protection of blood brain spinal cord barrier
US20230117374A1 (en) Suppression of Neuroinflammation and Composition and Method Therefore
Zhong et al. Artesunate Mitigates Cognitive Deficits by Promoting Hippocampal Neural Stem/Progenitor Cells Proliferation and Neurogenesis in Cadmium-Exposed Mice
KR20140100021A (ko) 메틸 갈레이트를 포함하는 신경교종 예방 및 치료용 약학 조성물
WO2019193091A1 (en) Selective pde4d inhibitors against demyelinating diseases

Legal Events

Date Code Title Description
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]
B06W Patent application suspended after preliminary examination (for patents with searches from other patent authorities) chapter 6.23 patent gazette]