BR112019005639B1 - Método para preparar uma ração para melhorar a digestibilidade de amido e o rendimento de glicose em um ruminante utilizando alfa-1,4/1,6- glicosídeo hidrolases ativas (glch) - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a usos de, pelo menos, uma alfa-1,4/1,6-glicosídeo hidrolase (GLCH) como aditivo de ração para ruminantes, em que a referida hidrolase: (a) tem pelo menos 20% de atividade a um pH inferior ou igual a 3 na presença de pepsina em comparação com a atividade da hidrolase a pH 6 na presença de pepsina, (b) a referida hidrolase é ativa em, pelo menos, duas de três câmaras digestivas de um ruminante compreendendo um rúmen, um abomaso e um intestino delgado e (c) a hidrolase funciona com amilase pancreática para aumentar o rendimento de glicose.

Description

CAMPO

[001] O campo se refere a nutrição animal e, em particular, ao uso de alfa-1,4/1,6 glicosídeo hidrolases (GLCH) ativas de baixo pH como, por exemplo, alfa-amilases, glicoamilases e alfa-glucosidases como aditivo de ração para ruminantes para melhorar a digestão de amido.

ANTECEDENTES

[002] Os ruminantes têm a capacidade única de converter a forragem grosseira em proteína e energia através dos seus sistemas digestivos microbianos/de enzimas. Em conformidade, os ruminantes desempenham um papel importante na ecologia da terra e na cadeia alimentar.

[003] A principal diferença entre ruminantes e não ruminantes é que os estômagos dos ruminantes têm quatro compartimentos: rúmen, retículo, omaso e abomaso. Nas primeiras duas câmaras, o rúmen e o retículo, a comida é misturada com saliva e separada em camadas de material sólido e líquido. Os sólidos aglomeram-se para formar a mastigação merícica ou bolo alimentar.

[004] A mastigação merícica é regurgitada e mastigada para a misturar completamente com saliva e quebrar o tamanho das partículas. A fibra, principalmente a celulose e a hemicelulose, é essencialmente quebrada nessas câmaras por micróbios (principalmente bactérias, bem como alguns protozoários, fungos e leveduras) nos três principais ácidos graxos voláteis (VFAs): ácido acético, propiônico e ácido butírico. A proteína e o carboidrato não estrutural (pectina, açúcares e amidos) também são fermentados.

[005] Embora o rúmen e o retículo tenham nomes diferentes, representam o mesmo espaço funcional do material de digestão e podem mover-se para a frente e para trás entre eles. Juntas, essas câmaras são chamadas de retículo-rúmen. O material de digestão degradado, que agora está na parte inferior líquida do retículo-rúmen passa em seguida para a câmara seguinte, o omaso, onde a água e muitos dos elementos minerais inorgânicos são absorvidos na corrente sanguínea.

[006] Após isso, o material de digestão é passado para o verdadeiro estômago, o abomaso. O abomaso é o equivalente direto do estômago monogástrico e o material de digestão é digerido aqui de maneira muito semelhante. O material de digestão é finalmente movido para o intestino delgado, onde ocorre a digestão e absorção de nutrientes. Os micróbios produzidos no retículo-rúmen também são digeridos no intestino delgado. A fermentação continua no intestino grosso da mesma forma que no retículo-rúmen.

[007] As enzimas para utilização como aditivo de ração para ruminantes são principalmente enzimas fibrolíticas, tais como celulases, beta-glucanases e hemicelulases (Tabela 1 em Beauchemin et al., 2004. A rationale for the development of feed enzyme products for ruminants. Can. J. Anim. Sci. 84: 23-36). Os relatórios sobre hidrolases de amido para utilização em ruminantes são limitados. As hidrolases de amido são agrupadas como endo- e exo-amilases.

[008] As endoamilases, também chamadas de alfa-amilases (E.C. 3.2.1.1), são enzimas de degradação de amido que catalisam a hidrólise de ligações alfa-1,4-O-glicosídicas internas em polissacarídeos, ao mesmo tempo que retêm uma configuração alfa-anomérica nos produtos. A maioria das alfa-amilases precisa de íons de cálcio (Ca2+) para a sua atividade, integridade estrutural e estabilidade.

[009] A família alfa-amilase, ou seja, o clã GH-H de glicosídeo hidrolases é a maior família de glicosídeo hidrolases, transferases e isomerases compreendendo cerca de 30 diferentes especificidades de enzimas. Uma grande variedade de enzimas tem a capacidade de agir sobre o amido. Estas enzimas podem ser divididas em quatro grupos: endoamilases, exoamilases e enzimas de desramificação e transferases.

[0010] As endoamilases clivam ligações alfa-1,4 internas, resultando em produtos alfa-anoméricos.

[0011] Exoamilases clivam ligações alfa-1,4 ou alfa-1,6 de resíduos de glicose externos, resultando em produtos alfa ou beta-anoméricos.

[0012] As enzimas de desramificação hidrolisam ligações alfa-1,6 exclusivamente, deixando polissacarídeos lineares longos.

[0013] As transferases clivam uma ligação alfa-1,4 glicosídica da molécula doadora e transferem parte do doador para um aceitador glicosídico formando uma nova ligação glicosídica.

[0014] As glicosídeo hidrolases foram divididas em classes com base no seu modo de reação e famílias com base em suas semelhanças bem definidas de sequência de aminoácidos. A maioria das enzimas de conversão de amido pertencem à família GH-13. A família GH-13 pode ainda ser classificada com base em uma unidade maior chamada clã, que é a estrutura tridimensional de módulo catalítico. Entre os 14 clãs (A-N) definidos para glicosidases e transglicosidases, a família alfa- amilase (GH-13) pertence ao oitavo clã GH-H.

[0015] Os animais sintetizam e segregam alfa-amilase pancreática digestiva para a hidrólise do amido. Esta alfa-amilase tem um pH ideal em torno de pH 6-7 e está ativa no intestino delgado.

[0016] A adição de amilases microbianas à ração pode aumentar ainda mais a digestão de amido por parte dos animais, possivelmente devido ao fato de a amilase pancreática segregada não ser suficiente e/ou a passagem do alimento no trato digestivo do intestino delgado ser bastante rápida, fazendo com que a amilase pancreática não tenha tempo suficiente para digerir completamente o amido, especialmente no caso das aves de capoeira. (Isaksen, M. F. Cowieson, A. J. Kragh, K. M. (2010). Starch- and protein-degrading enzymes: biochemistry, enzymology and characteristics relevant to animal feed use. Em: Enzymes in farm animal nutrition /editado por M.R. Bedford e G.G. Partridge. Páginas 85-95).

[0017] Assim, endoamilases têm sido uma das enzimas de ração amplamente utilizadas na indústria de ração. As amilases de ração mais comuns são derivadas de Bacillus subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis e Aspergillus oryzae.

[0018] Estas amilases de ração têm atividade ideal na gama de pH de pH4 a pH8. A maioria delas tem tolerância considerável à pepsina. No entanto, estas enzimas de rações parecem não ter um domínio de ligação a amido em bruto (SBD) e podem ter capacidade limitada para hidrolisar amido em bruto não gelatinizado.

[0019] Planchot et al., (Extensive degradation of native starch granules by alpha-amylase from Aspergillus fumigatus, Journal of Cereal Science, Volume 21, Edição 2, 1995, Páginas 163-171), relataram a baixa eficiência de alfa-amilase de Bacillus sp. na degradação de amido granular em comparação com a amilase pancreática.. EFSA (Scientific Opinion on the safety and efficacy of Ronozyme RumiStar (alpha-amylase) as a feed additive for dairy cows. Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDAP). EFSA Journal 2012;10(7):2777) relataram a utilização de uma alfa- amilase de B. licheniformis para vacas leiteiras. O efeito foi, por vezes, evidente mas, por vezes, o efeito não foi significativo. Dettori-Campus et al. (Hydrolysis of starch granules by the amylase from Bacillus stearothermophilus NCA 26. Process Biochemistry, Volume 27, Edição 1, janeiro de 1992, Páginas 17-21) estudaram amilases de cerca de 16 estirpes de Bacillus e mostraram a sua preferência por amido solúvel em vez de amido em bruto com a maior proporção de atividade de amido em bruto para amido solúvel sendo 0,25 para a estirpe B. amylolyticus.

[0020] Tricarico et al. (Dietary supplementation of ruminant diets with an Aspergillus oryzae alpha-amylase. Animal Feed Science and Technology. Volume 145, Edições 1-4, 14 de agosto de 2008, Páginas 136-150) analisaram o uso de alfa-amilase de Aspergillus oryzae em suplementos alimentares de dietas de ruminantes e sugerem que este suplemento de amilase pode melhorar a produtividade animal, modificando a digestão do amido ruminal, sem necessariamente aumentar a digestão de amido no rúmen. Tal efeito poderia vir de impurezas de enzimas uma vez que, por definição, se espera que a adição de amilase aumente a digestão de amido (Beauchemin, Holtshausen, (2010). Developments in enzyme usage in ruminants. Em: Developments in enzyme usage in ruminants. Em: Enzymes in farm animal nutrition /editado por M.R. Bedford e G.G. Partridge. Páginas 206-230).

[0021] Monteiro de Souza et al., (Application of microbial alpha amylase in industry - a review. Brazilian Journal of Microbiology (2010) 41: 850-861), analisaram alfa-amilases de importância industrial e quase todas elas tinham um pH ideal superior a pH 5, exceto uma de Aspergillus kawachii que tinha um pH e estabilidade ideais a 3,0. É a amilase A. kawachii que tem sido utilizada em conjunto com a glicoamilase para a liquefação e fermentação simultâneas de amido de milho para bioetanol devido à sua capacidade para degradar amido em bruto ou amido granular (Dunn-Coleman et al., 2008, US7354752 B2).

[0022] A digestibilidade de amido em rações é altamente variável e dependente de uma série de fatores, incluindo a estrutura física do amido e da matriz da ração.

[0023] A Publicação de Pedido de Patente US 2005/0037053, publicada a 17 de fevereiro de 2005, divulga o uso de uma enzima que tem atividade de amilase e é capaz de degradar amido resistente em uma ração compreendendo amido para animais monogástricos, como suínos e aves de capoeira.

[0024] A WO 2008/06881, publicada a 17 de janeiro de 2008, divulga o uso de amilases bacterianas em rações de ruminantes da subfamília Bovinae para melhorar a produção de leite, digestibilidade aparente da dieta alimentada, desaparecimento de matéria seca da composição de ração, ganho de peso e/ou a Razão de Conversão de Ração.

[0025] A WO 2015/128366, publicada a 3 de setembro de 2015, divulga o uso de amilases bacterianas em combinação com uma ou mais proteases na ração de ruminantes da subfamília Bovinae para melhorar a digestibilidade do milho e/ou silagem de milho, em especial para melhorar a produção de leite, ganho de peso e/ou a Razão de Conversão de Ração.

[0026] Nesse sentido, continua a existir a necessidade de aumentar a digestibilidade de amido, aumentar o rendimento de glicose, aumentar a digestão de matéria seca e/ou produção de gás para os ruminantes.

SUMÁRIO

[0027] Em uma modalidade, é divulgado um método para melhorar a digestibilidade de amido e o rendimento de glicose em um ruminante que compreende adicionar, pelo menos, uma alfa-1,4/1,6-glicosídeo hidrolase (GLCH) como um aditivo de ração alimentar para ruminantes, em que a referida hidrolase: (a) tem pelo menos 20% de atividade a um pH inferior ou igual a 3 na presença de pepsina em comparação com a atividade da hidrolase a pH 6 na presença de pepsina, (b) a referida hidrolase é ativa em, pelo menos, duas de três câmaras digestivas de um ruminante compreendendo um rúmen, um abomaso e um intestino delgado e (c) a hidrolase funciona com enzimas digestivas presentes nas câmaras digestivas do ruminante para aumentar a digestibilidade de amido e o rendimento de glicose.

[0028] Em uma segunda modalidade, a pelo menos uma enzima GLCH é capaz de hidrolisar amido em bruto sob condições comparáveis às encontradas no rúmen ou abomaso.

[0029] Em uma terceira modalidade, a hidrolase é selecionada a partir do grupo consistindo em alfa-amilases, glicoamilases e alfa- glucosidases. De preferência, o grupo é composto por alfa-amilases e glicoamilases.

[0030] Em uma quarta modalidade, as alfa-amilases são membros da família GH 13 ou são selecionadas a partir do grupo consistindo em alfa-amilase (EC 3.2.1.1); pululanase (EC 3.2.1.41); ciclomaltodextrina glucanotransferase (EC 2.4.1.19); ciclomaltodextrinase (EC 3.2.1.54); trealose-6-fosfato hidrolase (EC3.2.1.93); oligo-alfa-glucosidase (EC 3.2.1.10); amilase maltogênica (EC 3.2.1.133); neopululanase (EC 3.2.1.135); alfa-glucosidase (EC 3.2.1.20); alfa-amilase formando maltotetrose (EC3.2.1.60); isoamilase (EC 3.2.1.68); glucodextranase (EC 3.2.1.70); alfa-amilase formando malto-hexose (EC 3.2.1.98); alfa- amilase formando maltotriose (EC 3.2.1.116); enzima de ramificação (EC 2.4.1.18); trealose sintase (EC 5.4.99.16); 4-alfa-glucano- transferase (EC 2.4.1.25); alfa-amilase formando maltopentose (EC 3.2.1.-); amilosucrase (EC 2.4.1.4); sacarose fosforilase (EC 2.4.1.7); malto-oligosiltrealose trealo-hidrolase (EC 3.2.1.141); isomaltulose sintase (EC 5.4.99.11); malto-oligosiltrealose sintase (EC 5.4.99.15); amilo-alfa-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.33); e alfa-1,4-glucano: fosfato alfa-maltosiltransferase (EC 2.4.99.16).

[0031] Em uma quinta modalidade, as glucosidases são membros da família GH 13, ou GH31 ou são selecionadas a partir do grupo consistindo em alfa-glucosidase (EC 3.2.1.20); alfa-galactosidase (EC 3.2.1.22); alfa-manosidase (EC 3.2.1.24); alfa-1,3-glucosidase (EC 3.2.1.84); sacarase-isomaltase (EC 3.2.1.48) (EC 3.2.1.10); alfa- xilosidase (EC 3.2.1.177); alfa-glucano liase (EC 4.2.2.13); isomaltosiltransferase (EC 2.4.1.-); oligossacarídeo alfa-1,4- glucosiltransferase (EC 2.4.1.161); sulfoquinovosidase (EC 3.2.1.-).

[0032] Em uma sexta modalidade, as glicoamilases são membros da família GH15 ou são selecionadas a partir do grupo consistindo em glicoamilase (EC 3.2.1.3); glucodextranase. (EC 3.2.1.70); alfa-trealase (EC 3.2.1.28); e dextrano dextrinase (EC 2.4.1.2).

[0033] Em uma sétima modalidade, é divulgado um método para aumentar a digestibilidade de amido, aumentar o rendimento de glicose, aumentar a digestão de matéria seca e aumentar a produção de gás durante a fermentação em um ruminante, compreendendo adicionar à ração uma composição enzimática compreendendo (i), pelo menos, uma enzima GLCH como aditivo de ração para ruminantes, em que a referida enzima: (a) tem pelo menos 20% de atividade a um pH inferior ou igual a 3 na presença de pepsina em comparação com a atividade das enzimas a pH 6 na presença de pepsina, (b) a referida enzima é ativa em pelo menos duas de três câmaras digestivas de um ruminante compreendendo um rúmen, um abomaso e um intestino delgado e (c) a enzima funciona com amilase pancreática para aumentar o rendimento de glicose e (ii) pelo menos uma protease.

[0034] Em uma nona modalidade, a pelo menos uma enzima GLCH é capaz de hidrolisar amido em bruto.

[0035] Em uma décima modalidade, a enzima GLCH é selecionada a partir do grupo consistindo em alfa-amilases, glicoamilases e alfa- glucosidases. De preferência, a enzima é selecionada a partir do grupo consistindo em alfa-amilases e glicoamilases.

[0036] Em uma décima primeira modalidade, a pelo menos uma enzima GLCH é selecionada a partir do grupo consistindo em alfa- amilase (EC 3.2.1.1); pululanase (EC 3.2.1.41); ciclomaltodextrina glucanotransferase (EC 2.4.1.19); ciclomaltodextrinase (EC 3.2.1.54); trealose-6-fosfato hidrolase (EC3.2.1.93); oligo-alfa-glucosidase (EC 3.2.1.10); amilase maltogênica (EC 3.2.1.133); neopululanase (EC 3.2.1.135); alfa-glucosidase (EC 3.2.1.20); alfa-amilase formando maltotetrose (EC3.2.1.60); isoamilase (EC 3.2.1.68); glucodextranase (EC 3.2.1.70); alfa-amilase formando malto-hexose (EC 3.2.1.98); alfa- amilase formando maltotriose (EC 3.2.1.116); enzima de ramificação (EC 2.4.1.18); trealose sintase (EC 5.4.99.16); 4-alfa-glucano- transferase (EC 2.4.1.25); alfa-amilase formando maltopentose (EC 3.2.1.-); amilosucrase (EC 2.4.1.4); sacarose fosforilase (EC 2.4.1.7); malto-oligosiltrealose trealo-hidrolase (EC 3.2.1.141); isomaltulose sintase (EC 5.4.99.11); malto-oligosiltrealose sintase (EC 5.4.99.15); amilo-alfa-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.33); e alfa-1,4-glucano: fosfato alfa-maltosiltransferase (EC 2.4.99.16).

[0037] Em uma décima segunda modalidade, as glucosidases são selecionadas a partir do grupo consistindo em alfa-glucosidase (EC 3.2.1.20); alfa-galactosidase (EC 3.2.1.22); alfa-manosidase (EC 3.2.1.24); alfa-1,3-glucosidase (EC 3.2.1.84); sacarase-isomaltase (EC 3.2.1.48) (EC 3.2.1.10); alfa-xilosidase (EC 3.2.1.177); alfa-glucano liase (EC 4.2.2.13); isomaltosiltransferase (EC 2.4.1.-); oligossacarídeo alfa-1,4-glucosiltransferase (EC 2.4.1.161); sulfoquinovosidase (EC 3.2.1.-).

[0038] Na décima terceira modalidade, as glicoamilases são selecionadas a partir da família das glicosil hidrolases GH15.

[0039] Em uma décima quarta modalidade, a protease é selecionada a partir do grupo consistindo em uma protease ácida ou uma metaloprotease neutra e, de preferência, a protease é uma protease aspártica fúngica ou uma metaloprotease neutra bacteriana.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0040] A Figura 1 retrata a liberação de glicose e maltose de milho a partir de farinha de milho pela alfa-amilase AkAA na presença de pepsina e protease AFP (Exemplo 2).

[0041] A Figura 2 retrata a liberação de glicose, maltose e maltotriose a partir de farinha de milho por alfa-amilase AkAA e pancreatina e a sinergia de AkAA com pancreatina no aumento da glicose e na redução da liberação de maltotriose (Exemplo 4).

[0042] A Figura 3 mostra a atividade de alfa-amilase AtAA em farinha de milho na presença de pepsina a pH 2,5 e pancreatina a pH 6,7 e a conversão completa de maltotriose quando AtAA e pancreatina foram doseados em conjunto (Exemplo 5).

[0043] A Figura 4 mostra a estabilidade das alfa-amilases AkAA e AcAA e a sua mistura com glicoamilases TrGA e CS4 e aspartil protease quando incubadas com fluido ruminal (Exemplo 6).

[0044] A Figura 5 mostra a atividade de alfa-amilases AkAA e AcAA na presença de pepsina, testadas a pH 3.2-6.0 (Exemplo 7).

[0045] A Figura 6 mostra a atividade de coquetéis de enzimas contendo alfa-amilases AkAA, AcAA e glicoamilase TrGA, CS4 e a aspartil peptidase AFP na presença de pancreatina (Exemplo 8).

[0046] A Figura 7 mostra a interação de glicoamilase com pancreatina no aumento da hidrólise de grânulos de amido de milho (Exemplo 10).

[0047] A Figura 8 mostra a interação de glicoamilase com pancreatina no aumento da hidrólise de farinha de milho (Exemplo 10).

[0048] A Figura 9 mostra a liberação de glicose de grânulos de amido de milho por maltase de levedura (alfa-glucosidase) na presença de uma quantidade fixa de pancreatina (Exemplo 13).

[0049] A Figura 10 mostra a estabilidade de cinco alfa-glucosidases no fluido ruminal e a interação com pancreatina na liberação de glicose (Exemplo 15).

[0050] A Figura 11 mostra a interação das cinco alfa-glucosidases com pancreatina na liberação de glicose a pH 6.0 (Exemplo 16).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0051] Todas as patentes, pedidos de patente e publicações mencionados estão incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0052] Na presente invenção, inúmeros termos e abreviações são usados. As definições a seguir se aplicam a não ser que especificamente determinado de outro modo.

[0053] Os artigos "um", "uma" e "o", "a" que precedem um elemento ou componente são concebidos como não restritivos em relação ao número de casos (isto é, ocorrências) do elemento ou componente. Portanto, "um", "uma" e "o", "a" devem ser lidos incluindo um ou pelo menos um, e a forma de palavra no singular do elemento ou componente também inclui o plural, a não ser que o número obviamente signifique o singular.

[0054] O termo "que compreende" ou "compreendendo" significa a presença dos recursos, números inteiros, etapas ou componentes determinados conforme referidos nas reivindicações, mas não exclui a presença ou a adição de um ou mais outros recursos, números inteiros, etapas, componentes ou grupos dos mesmos. O termo "que compreende" ou "compreendendo" destina-se a incluir modalidades englobadas pelos termos "que consiste essencialmente em", "que consiste em" e "consistindo em". Similarmente, o termo "que consiste essencialmente em" destina-se a incluir modalidades englobadas pelo termo "que consiste em".

[0055] Quando presentes, todas as faixas são inclusivas e combináveis. Por exemplo, quando uma faixa de "1 a 5" é mencionada, a faixa mencionada deve ser interpretada como incluindo as faixas "1 a 4", "1 a 3", "1 a 2", "1 a 2 e 4 a 5", "1 a 3 e 5" se similares.

[0056] Como usado aqui em combinação com um valor numérico, o termo "cerca de" se refere a uma faixa de +/- 0,5 do valor numérico, a menos que o termo seja especificamente definido de outro modo no contexto. Por exemplo, a expressão "valor de pH de cerca de 6" se refere a valores de pH de cerca de 5,5 a 6,5, a menos que o valor de pH seja especificamente definido de outro modo.

[0057] Pretende-se que cada limitação numérica máxima dada ao longo deste Relatório Descritivo inclua cada limitação numérica inferior, como se tais limitações numéricas inferiores fossem expressamente escritas no presente documento. Cada limitação numérica mínima dada ao longo deste Relatório Descritivo incluirá cada limitação numérica superior, como se tais limitações numéricas superiores fossem expressamente escritas no presente documento. Cada faixa numérica dada ao longo deste Relatório Descritivo incluirá todas as faixas numéricas mais estreitas que estejam abrangidas dentro de tal faixa numérica mais ampla, como se tais faixas numéricas mais estreitas fossem, todas, expressamente escritas no presente documento.

[0058] Os termos alfa-1,4/1,6-glicosídeo hidrolases ou alfa-1,4;1,6- glicosídeo hidrolases são aqui usados indistintamente ("GLCH"). Referem-se a enzimas capazes de hidrolisar ligações alfa-1,4 e/ou ligações alfa-1,6 em um oligômero ou moléculas de polímero em que estas glicosídeo hidrolases que (a) têm pelo menos 20% de atividade a um pH inferior ou igual a 3 na presença de pepsina em comparação com a atividade das enzimas a pH 6 na presença de pepsina, (b) tais enzimas são ativas em pelo menos duas de três câmaras digestivas de um ruminante compreendendo um rúmen, um abomaso e um intestino delgado e (c) as enzimas funcionam com amilase pancreática para aumentar o rendimento de glicose. De preferência, estas enzimas possuem um ou dois módulos de ligação de carboidrato e são capazes de hidrolisar amido em bruto. De preferência, estas enzimas de glicosídeo hidrolase são selecionadas a partir do grupo consistindo em alfa-amilases, glicoamilases e/ou alfa-glucosidases.

[0059] O termo "glicosídeo hidrolase" é usado de forma intercambiável com "glicosidases" e "glicosil hidrolases". As glicosídeo hidrolases auxiliam na hidrolase de ligações glicosídicas em açúcares complexos (polissacarídeos). Juntamente com as glicosiltransferases, as glicosidases formam o mecanismo catalítico principal para a síntese e quebra de ligações glicosídicas. As glicosídeo hidrolases são classificadas em EC 3.2.1 como enzimas que catalisam a hidrólise de O- ou S-glicosídeos. As glicosídeo hidrolases podem também ser classificadas de acordo com o resultado estereoquímico da reação de hidrólise. Assim, elas podem ser classificadas como enzimas de retenção ou de inversão. As glicosídeo hidrolases podem ser também classificadas como exo ou endo atuantes, dependendo de se atual na extremidade (usualmente não redutora) ou no meio, respectivamente, de uma cadeia de oligo/polissacarídeos. As glicosídeo hidrolases podem ser também classificadas por métodos baseados em sequência ou estrutura. As mesmas são tipicamente nomeadas de acordo com o substrato sobre as quais as mesmas atuam.

[0060] O termo "glicosiltransferase" se refere a uma enzima que catalisa a formação de uma ligação glicosídica entre monossacarídeos.

[0061] Os termos "glicano" e "polissacarídeo" são usados de forma intercambiável. O glicano se refere a um polissacarídeo ou oligossacarídeo ou à seção de carboidrato de um glicoconjugado, tal como glicoproteína, um glicolipídio ou um proteoglicano, mesmo se o carboidrato for apenas um oligossacarídeo. Os glicanos podem ser homo- ou heteropolímeros de resíduos de monossacarídeo. Podem ser moléculas lineares ou ramificadas. Os glicanos podem ser encontrados ligados às proteínas como em glicoproteínas e proteoglicanos. Em geral, são encontrados na superfície externa das células. Os glicanos O- e N-ligados são muito comuns em eucariotas, mas também são encontrados, embora menos comumente, em procariotas.

[0062] O termo "alfa-amilase" é usado indistintamente com alfa-1,4- D-glucano glucanohidrolase e glicogenase. Alfa-amilases (E.C. 3.2.1.1) geralmente, mas nem sempre, necessitam de cálcio para funcionar. Estas enzimas catalisam a endohidrolise de ligações alfa-1,4- glicosídicas em oligossacarídeos e polissacarídeos. As alfa-amilases atuam sobre amido, glicogênio e polissacarídeos e oligossacarídeos relacionados de maneira aleatória, liberando grupos redutores na configuração alfa.

[0063] O termo "alfa-amilase ativa de pH baixo" ("LpHAA") se refere a uma alfa-amilase que que tem pelo menos 20% de atividade a um pH inferior ou igual a 3,0 em comparação com a sua atividade a pH 6,0. O termo "glicoamilase" (EC 3.2.1.3) é usado indistintamente com glucano 1,4-alfa-glicosidase, amiloglucosidase, gama-amilase, alfa-glicosidase lisossômica, maltase ácida, exo-1,4-alfa-glicosidase, glicose amilase, gama-1,4 glucano gluco-hidrolase, maltase ácida e 1,4-alfa-D-glucano hidrolase. Esta enzima cliva as últimas ligações alfa-1,4-glicosídicas na extremidade não redutora de amilose e amilopectina para produzir glicose. Também cliva as ligações alfa-1,6-glicosídicas.

[0064] O termo "alfa-glucosidase" (E.C.3.2.1.20) é usado indistintamente com maltase, glucoinvertase, glucosiosucrase, maltase- glicoamilase, alfa-glucopiranosidase, glucosidoinvertase, alfa-D-glico- sidase, alfa-glucosídeo hidrolase, alfa-1,4-glucosidase e alfa-D-gluco- sídeo gluco-hidrolase. Esta enzima hidrolisa resíduos de alfa-glicose ligados (1-4) não redutores terminais para liberar uma única molécula de alfa-glicose. A alfa-glucosidase é uma carboidrato-hidrolase que libera alfa-glicose, em oposição à beta-glicose.

[0065] O termo "ração" é usado em referência a produtos que são alimentados a animais na criação de gado. Os termos "ração" e "ração animal" são usados indistintamente. Em uma modalidade preferencial, o alimento ou a ração é para consumo por não ruminantes e ruminantes.

[0066] O termo "produto microbiano alimentado diretamente" ("DFM"), conforme usado no presente documento, é originado de micro-organismos de ocorrência natural vivos (viáveis). As categorias de DFMs incluem Bacillus, Bactérias formadoras de ácido láctico e Leveduras. Os Bacillus são hastes gram-positivas exclusivas que formam esporos. Os esporos são muito estáveis e podem suportar condições ambientais como calor, umidade e uma faixa de pH. Esses esporos germinam em células vegetativas ativas quando ingeridos por um animal e podem ser usados em refeição e dietas peletizadas. As bactérias formadoras de ácido láctico são cocos gram-positivos que produzem ácido láctico que são antagonistas a patógenos. Uma vez que as bactérias formadoras de ácido láctico parecem ser de algum modo sensíveis ao calor, não podem ser usadas em dietas peletizadas. Os tipos de bactérias formadoras de ácido láctico incluem Bifidobacterium, Lactobacillus e Streptococcus. As leveduras não são bactérias. Esses microrganismos pertencem aos fungos do grupo de planta.

[0067] O termo "protease", como usado aqui, se refere a uma enzima com capacidade para clivar uma ligação peptídica. Os termos "protease", "peptidase" e "proteinase" podem ser usados de forma intercambiável. As proteases podem ser encontradas em animais, plantas, bactérias, archaea e vírus. A proteólise pode ser atingida por enzimas atualmente classificadas em seus grupos amplos: proteases aspárticas, cisteína proteases, serina proteases, treonina proteases, proteases glutâmicas e metaloproteases.

[0068] Em particular, o termo "protease" significa um domínio de proteína ou polipeptídeo derivado de um microrganismo, por exemplo, um fungo, bactéria ou de uma planta ou animal e que tem a capacidade de catalisar a clivagem de ligações peptídicas em uma ou mais de várias posições de uma cadeia principal de proteína (por exemplo, E.C. 3,4).

[0069] O termo "protease ácida" significa ter uma protease que tem a capacidade de hidrolisar proteínas sob condições ácidas. Pode incluir qualquer número de agentes de hidrólise de proteínas, tais como endopeptidases e exopeptidases.

[0070] Os termos "protease aspártica" e "protease de ácido aspártico" são usados de modo intercambiável no presente documento e são um tipo de protease ácida. Proteases aspárticas (EC 3.4.23), também conhecidas como aspartil proteases, usam uma molécula de água ativada ligada a um ou mais resíduos de aspartato catalítico para hidrolisar uma ligação de peptídeo em um substrato de polipeptídeo. Em geral, as mesmas têm dois aspartatos altamente conservados no local ativo e são idealmente ativos em pH ácido.

[0071] A abreviação "AFP" se refere a uma protease fúngica aspártica, isto é, uma protease aspártica de uma fonte de organismo fúngico.

[0072] O termo "metaloprotease" é qualquer protease cujo mecanismo catalítico envolva um metal. A maioria das metaloproteases necessitam de zinco, mas algumas usam cobalto. O íon metálico é coordenado para a proteína através de três ligantes. Os ligantes que coordenam o íon metálico podem variar com histidina, glutamato, aspartato, lisina e arginina. A quarta posição de coordenação é absorvida por uma molécula de água lábil.

[0073] Existem dois subgrupos de metaloproteinases que incluem (a), exopeptidases, metaloexopeptidases (número EC: 3.4.17), e (b), metaloendopeptidases (3.4.24).

[0074] Metaloendopeptidases bem conhecidas incluem proteínas ADAM e metaloproteinases de matriz.

[0075] O termo "pepsina" como aqui utilizado se refere a uma enzima que decompõe proteínas em peptídeos menores a um pH baixo de 2,0 a 3,5, ou seja, trata-se de uma protease pertencente à família peptidase aspártica A1. É produzida e segregada para o estômago e é uma das principais enzimas digestivas dos sistemas digestivos de seres humanos e animais, onde ajuda a digerir as proteínas na comida ou ração.

[0076] O termo "ruminante" como aqui utilizado se refere a um mamífero que é capaz de adquirir nutrientes de alimentos à base de plantas fermentando-os em um estômago especializado antes da digestão, principalmente através de ações microbianas. O processo tipicamente requer que a ingesta fermentada (conhecida como mastigação merícica) seja regurgitada e mastigada novamente. O processo de remastigação merícica para quebrar ainda mais a matéria vegetal e estimular a digestão é chamado de ruminação. Cerca de 150 espécies de ruminantes incluem tanto espécies domésticas como selvagens. Os ruminantes incluem, mas não se limitam a, gado, vacas, cabras, ovelhas, girafas, iaques, veados, alces, antílopes, búfalos e similares.

[0077] O termo "câmaras digestivas de um ruminante" como usado neste documento, se refere ao rúmen, retículo, omaso, abomaso e intestino delgado (McDonald et al., 2011 Animal Nutrition (7a Edição), páginas 156-191). O abomaso é o equivalente direto do estômago monogástrico.

[0078] O termo "forragem", como utilizado neste documento, se refere a um tipo de ração animal e é qualquer produto alimentício agrícola usado especificamente para alimentar gado, tal como bovinos, cabras, ovelhas, cavalos, galinhas e porcos. "Forragem" se refere principalmente ao alimento dado aos animais (incluindo plantas cortadas e levadas a eles), em vez do alimento que eles próprios angariam para si próprios (chamado igualmente de forragem). A forragem também é designada como provisões para animais e inclui feno, palha, silagem, rações comprimidas e peletizadas, óleos e rações mistas, e grãos germinados e leguminosas (como brotos de feijão, malte fresco ou malte utilizado). A maioria da ração para animais vem de plantas, mas alguns fabricantes adicionam ingredientes a rações processadas que são de origem animal.

[0079] O termo "ração" é usado em referência a produtos que são alimentados a animais na criação de gado. Os termos "ração" e "ração animal" são usados indistintamente.

[0080] O amido é um carboidrato polimérico consistindo de um grande número de unidades de glicose ligadas por laços glicosídicos e é o carboidrato armazenado mais comum em plantas. Assim, "amido" pode se referir a qualquer material compreendido pelos carboidratos polissacarídicos complexos de plantas, compreendidos por amilose e amilopectina com a fórmula (C6H10O5)x, em que X pode ser qualquer número. Em particular, o termo se relaciona com qualquer material à base de plantas incluindo, mas não se limitando a, grãos, gramas, tubérculos e raízes e mais especificamente trigo, cevada, milho, centeio, arroz, sorgo, farelo, mandioca, milhete, batata, batata doce e tapioca.

[0081] Os termos "domínio de ligação de amido (SBD)" ou "módulo de ligação de carboidrato (CBM)" são usados indistintamente neste documento. Os SBDs podem ser divididos em nove famílias de CBM. Como fonte de energia, o amido é degradado por um grande número de várias enzimas amilolíticas. No entanto, apenas cerca de 10% delas são capazes de ligar e degradar amido em bruto. Estas enzimas possuem normalmente um módulo estrutural de sequência distinto chamado de domínio de ligação de amido que medeia a ligação aos grânulos de amido. O SBD se refere a uma sequência de aminoácidos que se liga preferencialmente a um substrato de amido (polissacarídeo) ou a um maltossacarídeo, alfa-, beta- e gama-ciclodextrina e similares. São normalmente motivos de aproximadamente 100 resíduos de aminoácidos encontrados em cerca de 10% das enzimas amilolíticas microbianas.

[0082] O termo "domínio catalítico" se refere a uma região estrutural de um polipeptídeo que é diferente do CBM e que contém o local ativo para a hidrólise do substrato.

[0083] O termo "amido granular" se refere a amido em bruto (não cozido), por exemplo, amido que não foi submetido a gelatinização.

[0084] Os termos "enzima de hidrolisação de amido granular (GSH)" e "atividade de hidrolisação de amido granular (GSH)" são utilizados indistintamente neste documento e se referem a enzimas que têm a capacidade de hidrolisar amido em forma granular sob condições relevantes do trato digestivo comparáveis às condições encontradas no trato digestivo dos animais e, em particular, dos ruminantes.

[0085] O termo "gelatinização" se refere a quebrar as ligações intermoleculares de moléculas de amido na presença de água e calor, permitindo que os locais de ligação de hidrogênio envolvam mais água. Isso dissolve de forma irreversível o grânulo de amido em água para formar uma suspensão viscosa.

[0086] O termo "grau de polimerização (DP)" se refere ao número de unidades monoméricas em uma macromolécula, ou polímero ou molécula de oligômero. Por exemplo, pode referir o número (n) de unidades de monômero em um determinado sacarídeo. Exemplos de DP1 são os monossacarídeos, como glicose e frutose. Exemplos de DP2 são os dissacarídeos, como maltose e sacarose. Um DP>3 denota polímeros com um grau de polimerização maior que 3.

[0087] O termo "isolado" significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitativos de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância de ocorrência não natural, (2) qualquer substância incluindo, porém sem limitação, qualquer célula hospedeira, enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removida de um ou mais ou da totalidade dos constituintes de ocorrência natural aos quais está associada na natureza; (3) qualquer substância modificada pelo homem em relação a essa substância presente na natureza; ou (4) qualquer substância modificada mediante aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes aos quais está naturalmente associada. Os termos "molécula de ácido nucleico isolada", "polinucleotídeo isolado" e "fragmento de ácido nucleico isolado" serão usados de forma intercambiável e se referem a um polímero de RNA ou DNA que é de fita simples ou dupla fita, que contém opcionalmente bases de nucleotídeo sintéticas, não naturais ou alteradas. Uma molécula de ácido nucleico isolada na forma de um polímero de DNA pode ser compreendida por um ou mais segmentos de cDNA, DNA genômico ou DNA sintético.

[0088] O termo "purificado" conforme aplicado aos ácidos nucleicos ou polipeptídeos, de modo geral, denotados como um ácido nucleico ou polipeptídeo que é essencialmente livre de outros componentes conforme determinado pelas técnicas analíticas bem conhecidas na técnica (por exemplo, um polipeptídeo ou polinucleotídeo purificado forma uma banda discreta em um gel eletroforético, eluato cromatográfico e/ou uma mídia submetida a centrifugação de gradiente por densidade). Por exemplo, um ácido nucleico ou polipeptídeo que origina essencialmente uma banda em um gel eletroforético é "purificado". Um ácido nucleico ou polipeptídeo purificado é pelo menos cerca de 50% puro, normalmente pelo menos cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 99,5%, cerca de 99,6%, cerca de 99,7%, cerca de 99,8% ou mais puro (por exemplo, porcentagem em peso em uma base molar). Em um sentido relacionado, uma composição é enriquecida para uma molécula quando há um aumento substancial na concentração da molécula após aplicação de uma técnica de purificação ou enriquecimento. O termo "enriquecido" se refere a um composto, polipeptídeo, célula, ácido nucleico, aminoácido ou outro material ou componente especificado que esteja presente em uma composição em uma concentração relativa ou absoluta que seja maior que uma composição inicial.

[0089] Os termos "peptídeos", "proteínas" e "polipeptídeos" são usados indistintamente no presente documento e referem-se a um polímero de aminoácidos unidos por ligações peptídicas. Uma "proteína" ou um "polipeptídeo" compreende uma sequência polimérica de resíduos de aminoácido. O código de uma única letra e de 3 letras para aminoácidos definido em conformidade com IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN) é usado ao longo desta descrição. A única letra X se refere a qualquer um dos vinte aminoácidos. Compreende-se também que um polipeptídeo pode ser codificado por mais do que uma sequência de nucleotídeos devido à degeneração do código genético. As mutações podem ser denominadas pelo código de uma letra para o aminoácido original, seguidas por um número da posição e, então, o código de uma letra para o aminoácido variante. Por exemplo, a mutação de glicina (G) na posição 87 para serina (S) é representada como "G087S" ou "G87S". Ao descrever as modificações, uma posição seguida pelos aminoácidos listados entre parênteses indica uma lista de substituições nessa posição por qualquer um dos aminoácidos listados. Por exemplo, 6(L, I) significa que a posição 6 pode ser substituída por uma leucina ou uma isoleucina. Algumas vezes, em uma sequência, uma barra (/) é usada para definir substituições, por exemplo, F/V indica que a posição particular pode ter uma fenilalanina ou valina nessa posição.

[0090] As mutações podem ser denominadas pelo código de uma letra para o aminoácido original, seguidas por um número da posição e, então, o código de uma letra para o aminoácido variante. Por exemplo, a mutação de glicina (G) na posição 87 para serina (S) é representada como "G087S" ou "G87S".

[0091] O termo forma "madura" de uma proteína, de um polipeptídeo ou de um peptídeo se refere à forma funcional da proteína, do polipeptídeo ou da enzima sem a sequência de peptídeo de sinalização e sequência de pró-peptídeo.

[0092] O termo forma "precursora" de uma proteína ou de um peptídeo se refere a uma forma madura da proteína que tem uma pró- sequência ligada de modo operacional ao terminal amino ou carbonila da proteína. O precursor também pode ter uma sequência "de sinalização" ligada de modo operacional ao terminal amino da pró- sequência. O precursor também pode ter polipeptídeos adicionais que estão envolvidos na atividade pós-transcrição (por exemplo, polipeptídeos clivados a partir da mesma para deixar a forma madura de uma proteína ou um peptídeo).

[0093] Uma "pró-sequência" ou "sequência de pró-peptídeo" se refere a uma sequência de aminoácidos entre a sequência de peptídeo de sinalização e a sequência de enzima madura (por exemplo, uma glicosídeo hidrolase como descrita neste documento) que é necessária para o enovelamento e a secreção adequada de uma enzima; as mesmas são denominadas, às vezes, como chaperonas intramoleculares. A clivagem da pró-sequência ou sequência de pró- peptídeos resulta em uma enzima ativa madura que é frequentemente expressa como pró-enzimas.

[0094] Os termos "sequência de sinalização" e "peptídeo de sinalização" se referem a uma sequência de resíduos de aminoácido que pode participar na secreção ou no transporte direto da forma madura ou precursora de uma proteína. A sequência de sinalização está tipicamente localizada no N-terminal da sequência de proteínas precursora ou madura. A sequência de sinalização pode ser endógena ou exógena. Uma sequência de sinalização está normalmente ausente da proteína madura. Uma sequência de sinalização é tipicamente clivada da proteína por uma peptidase de sinalização após a proteína ser transportada. O gene de interesse pode ser expresso com ou sem uma sequência de sinal.

[0095] O termo "tipo selvagem" em referência a uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de ácidos nucleicos indica que a sequência de aminoácidos ou sequência de ácidos nucleicos é uma sequência nativa ou de ocorrência natural. Conforme usado no presente documento, o termo "de ocorrência natural" se refere a qualquer coisa (por exemplo, proteínas, aminoácidos ou sequências de ácidos nucleicos) que seja encontrada na natureza. Inversamente, o termo "de ocorrência não natural" se refere a qualquer coisa que não seja encontrada na natureza (por exemplo, ácidos nucleicos recombinantes e sequências de proteínas produzidas no laboratório ou modificação da sequência de tipo selvagem).

[0096] Conforme usado no presente documento em relação às posições de resíduo de aminoácido, "que corresponde a" ou "corresponde a" ou "corresponde" se refere a um resíduo de aminoácido na posição enumerada em uma proteína ou um peptídeo, ou um resíduo de aminoácido que seja análogo, homólogo ou equivalente a um resíduo enumerado em uma proteína ou um peptídeo. Conforme usado no presente documento, "região correspondente", em geral, se refere a uma posição análoga em uma proteína relacionada ou uma proteína de referência.

[0097] Os termos "derivado de" e "obtido a partir de" se referem a não apenas uma proteína produzida ou produzível por uma cepa do organismo em questão, mas também uma proteína codificada por uma sequência de DNA isolada de tal cepa e produzida em um organismo hospedeiro que contém tal sequência de DNA. Adicionalmente, o termo se refere a uma proteína que é codificada por uma sequência de DNA de origem sintética e/ou de cDNA e que tem as características de identificação da proteína em questão.

[0098] O termo "aminoácido" se refere à unidade estrutural química básica de uma proteína ou um polipeptídeo. Assim, um códon para o aminoácido alanina, um aminoácido hidrofóbico, pode ser substituído por um códon que codifica outro resíduo menos hidrofóbico (tal como glicina) ou um resíduo mais hidrofóbico (tal como valina, leucina ou isoleucina). Similarmente, espera-se também que alterações que resultam em substituição de um resíduo negativamente carregado por outro (tal como ácido aspártico por ácido glutâmico) ou um resíduo positivamente carregado por outro (tal como lisina por arginina) produzam um produto funcionalmente equivalente. Em muitos casos, não seria esperado também que as alterações de nucleotídeo que resultam em alteração das porções N-terminais e C-terminais da molécula de proteína alterassem a atividade da proteína. Cada uma das modificações propostas está bem dentro da habilidade comum na técnica, tal como está a determinação de manutenção de atividade biológica dos produtos codificados.

[0099] O termo "com otimização de códon", em referência a genes ou regiões de codificação de moléculas de ácido nucleico para transformação de vários hospedeiros, se refere à alteração de códons no gene ou regiões de codificação as moléculas de ácido nucleico para refletir o uso de códon típico do organismo hospedeiro sem alterar o polipeptídeo para o qual o DNA codifica.

[00100] O termo "gene" se refere a uma molécula de ácido nucleico que expressa uma proteína específica, incluindo sequências reguladoras anteriores (sequências de não codificação 5') e posteriores (sequências de não codificação 3') à sequência de codificação. "Gene nativo" se refere a um gene conforme encontrado na natureza com suas próprias sequências reguladoras. "Geme quimérico" se refere a qualquer gene que não seja um gene nativo, que compreende sequências reguladoras e de codificação que não são encontradas juntas na natureza. Consequentemente, um gene quimérico pode compreender sequências reguladoras e sequências de codificação que são derivadas de fontes diferentes, ou sequências reguladoras e sequências de codificação derivadas da mesma fonte, mas dispostas de uma maneira diferente daquela encontrada na natureza. "Gene endógeno" se refere a um gene nativo em sua localização natural no genoma de um organismo. Um gene "estranho" se refere a um gene que não é normalmente encontrado no organismo hospedeiro, mas que é introduzido no organismo hospedeiro por transferência de gene. Os genes estranhos podem compreender genes nativos inseridos em um organismo não nativo ou genes quiméricos. Um "transgene" é um gene que foi introduzido no genoma por um procedimento de transformação.

[00101] O termo "sequência de codificação" se refere a uma sequência de nucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos específica. "Sequências reguladoras adequadas" se referem a sequências de nucleotídeos localizadas a montante (sequências de não codificação 5'), dentro ou a jusante (sequências de não codificação 3') de uma sequência de codificação e que influenciam a transcrição, estabilidade ou processamento de RNA ou tradução da sequência de codificação associada. As sequências reguladoras podem incluir promotores, sequências de iniciação de tradução, local de processamento de RNA, locais de ligação efetores e estruturas de haste-laço.

[00102] O termo "operacionalmente ligado" se refere à associação de sequências de ácidos nucleicos em uma única molécula de ácido nucleico de modo que a função de um seja afetada pelo outro. Por exemplo, um promotor é operacionalmente ligado a uma sequência de codificação quando o mesmo tem a capacidade de afetar a expressão dessa sequência de codificação, isto é, a sequência de codificação está sob o controle transcricional do promotor. As sequências de codificação podem ser operativamente ligadas às sequências reguladoras em uma orientação senso ou antissenso.

[00103] Os termos "sequência regulatória" ou "sequência de controle" são usados indistintamente no presente documento e se referem a um segmento de uma sequência de nucleotídeos que tem capacidade para aumentar ou diminuir a expressão de genes específicos dentro de um organismo. Os exemplos de sequências reguladoras incluem, porém sem limitação, promotores, sequência de sinal, operadores e similares. Conforme indicado acima, as sequências reguladoras podem ser operacionalmente ligadas em orientação senso ou antissenso à sequência de codificação/gene de interesse.

[00104] "Promotor" ou "sequências promotoras" se referem a sequências de DNA que definem onde começa a transcrição de um gene por RNA polimerase. As sequências promotoras estão tipicamente localizadas diretamente a montante ou na extremidade 5' do local de iniciação de transcrição. Os promotores podem ser derivados na sua totalidade de uma sequência nativa ou de ocorrência natural ou podem ser compostos por diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza ou ainda compreender segmentos de DNA sintéticos. É entendido por aqueles versados na técnica que diferentes promotores podem direcionar a expressão de um gene em diferentes tecidos ou tipos de célula ou em diferentes estágios de desenvolvimento ou em resposta a diferentes condições ambientais ou fisiológicas ("promotores induzíveis").

[00105] As "sequências de não codificação 3'" se referem a sequências de DNA localizadas a jusante de uma sequência de codificação e incluem sequências que codificam sinais reguladores com capacidade para afetar o processamento de mRNA ou a expressão de gene, tal como terminação de transcrição.

[00106] O termo "transformação", como usado aqui, se refere à transferência ou à introdução de uma molécula de ácido nucleico em um organismo hospedeiro. A molécula de ácido nucleico pode ser introduzida como uma forma linear ou circular de DNA. A molécula de ácido nucleico pode ser um plasmídeo que replica autonomamente, ou pode integrar-se no genoma de um hospedeiro de produção. Os hospedeiros de produção que contêm o ácido nucleico transformado são denominados organismos "transformados" ou "recombinantes" ou "transgênicos" ou "transformantes".

[00107] O termo "recombinante", como usado aqui, se refere a uma combinação artificial de dois segmentos de sequências e ácidos nucleicos de outro modo separados, por exemplo, por síntese química, ou pela manipulação de segmentos isolados de ácidos nucleicos por meio de técnicas de engenharia genética. Por exemplo, DNA em que um ou mais segmentos ou genes foram inseridos, naturalmente ou por manipulação em laboratório, de uma molécula diferente, de outra parte da mesma molécula ou uma sequência artificial, resultando na introdução de uma nova sequência em um gene e subsequentemente em um organismo. Os termos "recombinante", "transgênico", "transformado", "geneticamente modificado" ou "modificado para expressão de gene exógena" são usados indistintamente no presente documento.

[00108] Os termos "construto recombinante", "construto de expressão", "construto de expressão recombinante" e "cassete de expressão" são usados de forma intercambiável. Uma construção recombinante compreende uma combinação artificial de fragmentos de ácido nucleico, por exemplo, sequências reguladoras e codificantes que não são todas encontradas juntas na natureza. Por exemplo, uma construção pode compreender sequências reguladoras e sequências codificantes que são derivadas de fontes diferentes, ou sequências reguladoras e sequências codificantes derivadas da mesma fonte, mas dispostas de uma maneira diferente daquela encontrada na natureza. Tal construto pode ser usado sozinho ou pode ser usado em conjunto com um vetor. Se um vetor for usado, então, a escolha de vetor depende do método que será usado para transformar células hospedeiras conforme é conhecido pelos indivíduos versados na técnica. Por exemplo, pode ser usado um vetor plasmidial. O indivíduo versado na técnica está ciente dos elementos genéticos que devem estar presentes no vetor a fim de transformar, selecionar e propagar com sucesso células hospedeiras. O indivíduo versado na técnica também reconhecerá que diferentes eventos de transformação independentes podem resultar em diferentes níveis e padrões de expressão (Jones et al., (1985) EMBO J 4:2411 a 2418; De Almeida et al., (1989) Mol Gen Genetics 218:78 a 86) e, dessa forma, que múltiplos eventos são tipicamente rastreados a fim de obter linhagens que exibam o padrão e nível de expressão desejados. Tal triagem pode ser realizada usando ensaios biológicos moleculares, bioquímicos e outros ensaios incluindo análise Southern de DNA, análise Northern de expressão de RNAm, PCR, PCR quantitativa em tempo real (qPCR), PCR de transcrição reversa (RT-PCR), análise de immunoblot da expressão proteica, ensaios enzimáticos ou de atividade e/ou análise fenotípica.

[00109] Os termos "hospedeiro de produção", "hospedeiro" e "célula hospedeira" são usados indistintamente no presente documento e se referem a qualquer organismo, ou célula do mesmo, seja humano ou não humano, em que um construto recombinante pode ser introduzido de modo estável ou temporário a fim de expressar um gene. Esse termo abrange qualquer progênie de uma célula original que não seja idêntica à célula original devido a mutações que ocorrem durante a propagação.

[00110] O termo "porcentagem de identidade" é uma relação entre duas ou mais sequências de polipeptídeos ou duas ou mais sequências de polinucleotídeos, conforme determinado através da comparação de sequências. Na técnica, "identidade" também significa o grau de relação de sequência entre as sequências de polipeptídeos ou polinucleotídeos, conforme possa ser o caso, conforme determinado pelo número de nucleotídeos ou aminoácidos correlacionados entre as cadeias de tais sequências. "Identidade" e "similaridade" podem ser facilmente calculadas por métodos conhecidos, incluindo, porém sem limitação, aqueles descritos em: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NI (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., e Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); e Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. e Devereux, J., eds.) Stockton Press, NI (1991). Os métodos para determinar a identidade e a similaridade são codificados em programas de computador publicamente disponíveis.

[00111] Conforme usado no presente documento, "% de identidade" ou porcentagem de identidade" ou "PID" se refere à identidade de sequência de proteínas. A porcentagem de identidade pode ser determinada com o uso de técnicas padrão conhecidas na técnica. Algoritmos úteis incluem os algoritmos BLAST (Consultar, Altschul et al., J Mol Biol, 215:403 a 410, 1990; e Karlin e Altschul, Proc Natl Acad Sci EUA, 90:5.873 a 5.787, 1993). O programa BLAST usa diversos parâmetros de pesquisa, a maioria dos quais é definida para os valores padrão. O algoritmo NCBI BLAST encontra as sequências mais relevantes em termos de similaridade biológica, mas não é recomendado para sequências de consulta de menos de 20 resíduos (Altschul et al., Nucleic Acids Res, 25:3.389 a 3.402, 1997; e Schaffer et al., Nucleic Acids Res, 29:2.994 a 3.005, 2001). Os parâmetros BLAST padrão exemplificativos para uma pesquisa de sequência de ácidos nucleicos incluem: Limite de palavras vizinhas = 11; Corte de-valor E = 10; Matriz de Pontuação = NUC.3.1 (correspondência = 1, não correspondência = -3); Abertura de Intervalo = 5; e Extensão de Intervalo = 2. Os parâmetros BLAST padrão exemplificativos para as pesquisas de sequência de aminoácidos incluem: Tamanho de palavra = 3; Corte de-valor E = 10; Matriz de Pontuação = BLOSUM62; Abertura de intervalo = 11; e Extensão de intervalo = 1. Um valor de percentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos é determinado pelo número de resíduos idênticos correspondentes dividido pelo número total de resíduos da sequência de "referência" que inclui quaisquer lacunas criadas pelo programa para alinhamento ideal/máximo. Os algoritmos BLAST se referem à sequência "de referência" como a sequência "de consulta".

[00112] Conforme usado no presente documento, "proteínas homólogas" ou "enzimas homólogas" se refere a proteínas que têm similaridade distinta na estrutura primária, secundária e/ou terciária. A homologia da proteína pode se referir à similaridade na sequência de aminoácidos linear quando as proteínas estão alinhadas. A pesquisa homóloga de sequências de proteínas pode ser feita com o uso de BLASTP e PSI-BLAST de NCBI BLAST com limiar (corte de valor E) a 0,001. (Altschul SF, Madde TL, Shaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs". Nucleic Acids Res, 1 de setembro de 1997; 25(17): 3.389 a 3.402). Com o uso dessas informações, as sequências de proteínas podem ser agrupadas. Uma árvore filogenética pode ser construída com o uso das sequências de aminoácidos.

[00113] Os alinhamentos de sequências e os cálculos de identidade porcentual podem ser realizados com o uso do programa Megalign da suíte de computação de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI), o programa AlignX da Vector NTI v. 7.0 (Informax, Inc., Bethesda, MD) ou o Suíte de Software Aberto EMBOSS (EMBL-EBI; Rice et al., Trends in Genetics 16, (6):276 a 277 (2000)). O alinhamento múltiplo das sequências pode ser realizado com o uso do método CLUSTAL (tal como CLUSTALW; por exemplo, versão 1.83) de alinhamento (Higgins e Sharp, CABIOS, 5:151 a 153 (1989); Higgins et al., Nucleic Acids Res. 22:4.673 a 4.680 (1994); e Chenna et al., Nucleic Acids Res 31 (13): 3.497 a 3.500 (2003)), disponíveis junto ao European Molecular Biology Laboratory por meio do European Bioinformatics Institute) com os parâmetros-padrão. Os parâmetros adequados para alinhamentos de proteína CLUSTALW incluem penalidade por existência de GAP=15, extensão de GAP=0,2, matriz = Gonnet (por exemplo, Gonnet250), ENDGAP de proteína = -1, GAPDIST de proteína=4 e KTUPLE=1. Em uma modalidade, um alinhamento rápido ou lento é usado com os ajustes-padrão quando há um alinhamento lento. Alternativamente, os parâmetros que usam o método CLUSTALW (por exemplo, versão 1.83) podem ser modificados para usar também KTUPLE =1, GAP PENALTY=10, extensão de GAP=1, matriz = BLOSUM (por exemplo, BLOSUM64), WINDOW=5 e TOP DIAGONALS SAVED=5.

[00114] Várias sequências de aminoácidos de polipeptídeo e sequências de polinucleotídeos são reveladas no presente documento como características de certos aspectos. As variantes dessas sequências que são pelo menos cerca de 70 a 85%, 85 a 90% ou 90% a 95% idênticas às sequências reveladas no presente documento podem ser usadas em certas modalidades. Alternativamente, uma sequência de polipeptídeos ou sequência de polinucleotídeos variante, em certas modalidades, pode ter pelo menos 60%, 61%, 62%,63%,64%, 65%, 66%, 67%, 68%,69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com uma sequência revelada no presente documento. A sequência de aminoácidos ou sequência de polinucleotídeos variante tem a mesma função da sequência revelada ou pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da função da sequência revelada.

[00115] O termo "variante", em relação a um polipeptídeo, se refere a um polipeptídeo que se diferencia de um polipeptídeo de tipo selvagem, original ou de referência especificado em que o mesmo inclui uma ou mais substituições, inserções ou deleções de um aminoácido de ocorrência natural ou feitas pelo homem. Similarmente, o termo "variante", em relação a um polinucleotídeo, se refere a um polinucleotídeo que difere em sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo do tipo selvagem, original ou de referência especificado. A identidade do polipeptídeo ou polinucleotídeo do tipo selvagem, original ou de referência será evidente a partir do contexto.

[00116] Os termos "plasmídeo", "vetor" e "cassete" se referem a um elemento cromossômico extra que muitas vezes carrega genes que não são parte do metabolismo central da célula e normalmente sob a forma de DNA de fita dupla. Tais elementos podem ser sequências de replicação autônoma, sequências de integração ao genoma, sequências de fago ou nucleotídicas, em forma linear ou circular, de um DNA ou RNA de fita simples ou dupla, derivadas de qualquer fonte, em que várias sequências nucleotídicas foram unidas ou recombinadas numa construção exclusiva que é capaz de introduzir um polinucleotídeo de interesse numa célula. "Cassete de transformação" se refere a um vetor específico que contém um gene e que tem elementos adicionalmente ao gene que facilita a transformação de uma célula hospedeira específica. Os termos "cassete de expressão" e "vetor de expressão" são usados indistintamente no presente documento e se referem a um vetor específico que contém um gene e que tem elementos adicionalmente ao gene que permite a expressão daquele gene em um hospedeiro.

[00117] O termo "expressão", conforme usado no presente documento, se refere à produção de um produto final funcional (por exemplo, um mRNA ou uma proteína) na forma precursora ou madura. A expressão pode também se referir à tradução de mRNA em um polipeptídeo.

[00118] A expressão de um gene envolve a transcrição do gene e a tradução do mRNA em um precursor ou proteína madura. "Inibição antissenso" se refere à produção de transcritos de RNA de antissenso com capacidade para suprimir a expressão da proteína direcionada. "Cossupressão" se refere à produção de transcritos de RNA senso com capacidade para suprimir a expressão de genes estranhos ou endógenos idênticos ou substancialmente similares (Patente U.S. No 5,231,020). Proteína "madura" se refere a um polipeptídeo processado por pós-tradução, isto é, um polipeptídeo a partir do qual quaisquer pré- ou pró-peptídeos presentes no produto de tradução primário foram removidos. Proteína "precursora" se refere ao produto primário da tradução de mRNA, isto é, com pré- ou pró-peptídeos ainda presentes. Os pré- e pró-peptídeos podem ser, mas sem limitação, sinais de localização intracelulares. "Transformação estável" se refere à transferência de um fragmento de ácido nucleico em um genoma de um organismo hospedeiro, incluindo genomas tanto nucleares quanto organelares, resultando em herança geneticamente estável. Em contraste, "transformação temporária" se refere à transferência de um fragmento de ácido nucleico para o núcleo ou organela que contém DNA de um organismo hospedeiro, resultando na expressão de genes sem integração ou herança estável. Os organismos hospedeiros que contêm os fragmentos de ácido nucleico transformados são denominados de organismos "transgênicos".

[00119] O vetor de expressão pode ser um dentre qualquer número de vetores ou cassetes úteis para a transformação de hospedeiros de produção adequados conhecidos na técnica. Tipicamente, o vetor ou o cassete incluirão sequências que direcionam a transcrição e a tradução do gene relevante, um marcador selecionável e sequências que permitem replicação autônoma ou integração cromossômica. Os vetores adequados, de modo geral, incluem uma região 5' do gene que abriga controles de iniciação transcricional e uma região 3' do fragmento de DNA que controla a terminação transcricional. Ambas as regiões de controle podem ser derivadas de genes homólogos para genes de uma célula hospedeira de produção transformada e/ou genes nativos ao hospedeiro de produção, embora tais regiões de controle não precisem de ser derivadas assim.

[00120] Conforme usado no presente documento, "proteínas homólogas" ou "enzimas homólogas" se referem a proteínas que têm similaridade distinta na estrutura primária, secundária e/ou terciária. A homologia da proteína pode se referir à similaridade na sequência de aminoácidos linear quando as proteínas estão alinhadas. A pesquisa homóloga de sequências de proteínas pode ser feita com o uso de BLASTP e PSI-BLAST de NCBI BLAST com limiar (corte de valor E) a 0,001. (Altschul SF, Madde TL, Shaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs". Nucleic Acids Res 1 de setembro de 1997; 25(17): 3.389 a 3.402). Com o uso dessas informações, as sequências de proteínas podem ser agrupadas. Uma árvore filogenética pode ser construída com o uso das sequências de aminoácidos. As sequências de aminoácidos podem ser inseridas em um programa como o conjunto de Vector NTI Advance e uma Guide Tree pode ser criada com o uso do método de Agrupamento de Vizinhos (NJ) (Saitou e Nei, Mol Biol Evol, 4:406 a 425, 1987). A construção da árvore pode ser calculada usando a correção de Kimura para a distância da sequência e ignorando as posições com lacunas. Um programa como AlignX pode exibir os valores de distância calculados entre parênteses a seguir ao nome da molécula exibido na árvore filogenética.

[00121] Compreendendo a homologia entre as moléculas pode revelar a história evolutiva das moléculas, bem como as informações sobre sua função; se uma proteína recentemente sequenciada for homóloga a uma proteína já caracterizada, há uma forte indicação da nova função bioquímica da proteína. A relação mais fundamental entre duas entidades é a homologia; se diz que duas moléculas são homólogas se derivarem de um ancestral comum. As moléculas homólogas ou os homólogos, podem ser divididos em duas classes, parálogos e ortólogos. Os parálogos são homólogos que estão presentes dentro de uma espécie. Os parálogos diferem frequentemente nas suas funções bioquímicas detalhadas. Os ortólogos são homólogos que estão presentes dentro de diferentes espécies e têm funções muito semelhantes ou idênticas. Uma superfamília de proteína é o maior agrupamento (clado) de proteínas para os quais o ancestral comum pode ser inferido. Normalmente, esse ancestral comum se baseia no alinhamento de sequência e na similaridade mecânica. As superfamílias contêm, tipicamente, diversas famílias de proteína que mostram a similaridade de sequência na família. O termo "clã de proteína" é comumente usado para superfamílias de protease com base no sistema de classificação de protease MEROPS.

[00122] O algoritmo CLUSTAL W é um outro exemplo de um algoritmo de alinhamento de sequência (Consultar, Thompson et al., Nucleic Acids Res, 22:4.673 a 4.680, 1994). Os parâmetros padrão para o algoritmo CLUSTAL W incluem: Penalidade por abertura da lacuna = 10,0; Penalidade por extensão da lacuna = 0,05; Matriz de peso de proteína = série BLOSUM; Matriz de peso de DNA = IUB; % de sequências divergentes em atraso = 40; Distância de separação de lacuna = 8; Peso de transições de DNA = 0,50; Lista de resíduos hidrofílicos = GPSNDQEKR; Uso de matriz negativa = DESATIVADO; Alternância de penalidades específicas de resíduo = ATIVADA; Alternância de penalidades hidrofílica = ATIVADA; e Alternância de penalidades de separação de lacuna final= DESATIVADA. Em algoritmos CLUSTAL, estão incluídas as deleções que ocorrem em qualquer terminal. Por exemplo, uma variante com uma deleção de cinco aminoácidos em qualquer terminal (ou dentro do polipeptídeo) de um polipeptídeo de 500 aminoácidos teria uma porcentagem de identidade de sequência de 99% (495/500 resíduos idêntico x 100) em relação ao polipeptídeo "de referência". Tal variante seria abrangida por uma variante tendo "pelo menos 99% de identidade de sequência" com o polipeptídeo.

[00123] Conforme usado no presente documento, o termo "ensaio funcional" se refere a um ensaio que fornece uma indicação de uma atividade de enzima. Em algumas modalidades, o termo se refere a sistemas de ensaio em que uma enzima é analisada pela sua habilidade de funcionar em sua capacidade normal.

[00124] Os ruminantes têm a capacidade única de converter a forragem grosseira em proteína e energia através dos seus sistemas digestivos microbianos/de enzimas. Em conformidade, os ruminantes desempenham um papel importante na ecologia da terra e na cadeia alimentar.

[00125] A principal diferença entre um ruminante e um não ruminante é que o ruminante tem um estômago com quatro compartimentos consistindo em rúmen, retículo, omaso e abomaso. O abomaso é o equivalente direto do estômago monogástrico (McDonald et al., 2011 Animal, Animal Nutrition (7a Edição), páginas 156 a 191).

[00126] O rúmen é o maior compartimento, com um volume de 150 a 200 litros (40 a 50 galões).

[00127] No sistema digestivo há bilhões de microrganismos. Eles ajudam a vaca a digerir e utilizar os nutrientes da ração. Para alcançar uma eficiente utilização da ração e uma elevada produção de leite, as bactérias devem ter condições ideais. São as bactérias que digerem a ração. Alimentar uma vaca, na verdade, envolve alimentar os microrganismos no seu rúmen.

[00128] O processo de fermentação ocorre no rúmen e no retículo. O rúmen da vaca é como uma grande tina de fermentação. Mais de 200 diferentes bactérias e 20 tipos protozoários ajudam a vaca a utilizar composições de ração fibrosas e fontes de nitrogênio não proteicas.

[00129] A fermentação ocorre quando microrganismos convertem carboidratos em ácidos graxos voláteis e gases. Este processo permite que a vaca converta fibras celulósicas em energia.

[00130] Dos gases produzidos no rúmen durante a fermentação (500 a 1500 litros por dia) (150 a 400 galões), 20 a 40% consistem de metano e dióxido de carbono. A produção de gases de fermentação representa uma considerável perda de energia. Alguns modificadores de fermentação, tais como os ionóforos, melhoram a eficiência energética dos ruminantes por meio da redução dessas perdas de energia de gás.

[00131] Os gases de fermentação são expelidos por meio de eructação. Quando a eructação é impossível ou ineficaz, as vacas podem sofrer de meteorismo. Quando a ração entra no rúmen, é acumulada em camadas no tapete ruminal que flutua sobre o topo dos conteúdos ruminais. Por meio de contrações rítmicas da parede ruminal, o material recentemente comido se acumula na parte de trás do tapete. O tapete ruminal consiste de material não digerido com 15% de matéria seca. As bactérias aderem à ração e digerem gradualmente o material fermentável. Quando a vaca rumina, a mastigação merícica da camada da frente é eructada. A saliva é adicionada à boca e através da ação de moagem dos dentes, as superfícies expostas a microrganismos se tornam maiores.

[00132] As partículas de ração tornam-se mais pequenas à medida que as bactérias trabalham e o processo de ruminação continua. Elas gradualmente absorvem líquido e afundam-se para a parte inferior do rúmen. O conteúdo ruminal no fundo do retículo-rúmen tem um teor de matéria seca de 5%.

[00133] O rúmen contrai apenas uma vez a cada minuto. As contrações permitem a mistura de conteúdos líquidos e sólidos no rúmen para estimular a fermentação e evitar a estagnação. As contrações também servem para liberar gases presos no tapete ou na porção de fluido do conteúdo ruminal. Os gases de fermentação são então liberados por meio de eructação. A interrupção desse processo pode resultar em meteorismo. As partículas de ração do tamanho e densidade corretos são segregadas para o líquido no retículo por meio das contrações ruminais. As contrações posteriores forçam estas partículas e alguns dos conteúdos líquidos para fora do retículo-rúmen e para o omaso.

[00134] O rúmen e o retículo são basicamente um compartimento, mas com diferentes funções. Embora grande parte da ação fermentativa ocorra no rúmen, o retículo serve como área de preparação para a passagem para o omaso ou regurgitação.

[00135] O valor de pH ruminal ideal é entre 6 e 7. Os microrganismos ruminais são mais saudáveis dentro desta gama. Se o pH varia demasiado, alguns tipos de microrganismos são eliminados e há uma utilização reduzida da ração. Os microrganismos que digerem a celulose (feno, silagem, etc.) não conseguem crescer ou fermentar celulose com um valor de pH inferior a 6,0. Quando o pH ruminal é inferior a 6, o rúmen é considerado acidótico. A acidose ruminal pode ser aguda, com uma grave e rápida queda no pH. Mais comum em rebanhos de alta produção é a acidose subclínica que se caracteriza por períodos intermitentes crônicos de baixo pH ruminal.

[00136] Como notado acima, a digestibilidade de amido em rações é altamente variável e dependente de uma série de fatores, incluindo a estrutura física do amido e da matriz da ração.

[00137] Verificou-se que a digestibilidade de amido, especialmente a hidrólise do amido em bruto, em uma dieta de ruminante, pode ser melhorada com o uso de pelo menos uma alfa-1,4/1,6-glicosídeo hidrolase (GLCH) como aditivo de ração para um ruminante em que a referida hidrolase: (a) tem pelo menos 20% de atividade a um pH inferior ou igual a 3 na presença de pepsina em comparação com a atividade das enzimas a pH 6 na presença de pepsina, (b) as referidas hidrolases são ativas em pelo menos duas câmaras digestivas de um ruminante compreendendo um rúmen, um retículo, um omaso e um abomaso e (c) a hidrolase funciona com enzimas digestivas presentes nas câmaras digestivas do ruminante para aumentar o rendimento de glicose e a digestibilidade de amido.

[00138] Ainda em outro aspecto, é descrito um método para aumentar a digestibilidade de amido, aumentar o rendimento de glicose, aumentar a digestão de matéria seca e aumentar a produção de gás durante a fermentação em um ruminante, compreendendo adicionar à ração uma composição enzimática compreendendo (i), pelo menos, uma enzima GLCH como aditivo de ração para ruminantes, em que a referida enzima: (a) tem pelo menos 20% de atividade a um pH inferior ou igual a 3 na presença de pepsina em comparação com a atividade das enzimas a pH 6 na presença de pepsina, (b) a referida enzima é ativa em pelo menos duas de três câmaras digestivas de um ruminante compreendendo um rúmen, um abomaso e um intestino delgado e (c) a enzima funciona com amilase pancreática para aumentar o rendimento de glicose e (ii) pelo menos uma protease.

[00139] Algumas enzimas digestivas presentes nas câmaras digestivas de um ruminante com as quais a hidrolase pode trabalhar para aumentar o rendimento de glicose incluem, mas não se limitam a, enzimas amilolíticas microbianas ruminais, pepsina ou pancreatina.

[00140] De preferência, a hidrolase é capaz de hidrolisar amido em bruto sob condições comparáveis às condições encontradas no rúmen ou abomaso.

[00141] A hidrolase pode ser selecionada a partir do grupo consistindo em alfa-amilases, glicoamilases e alfa-glucosidases ou a hidrolase é selecionada a partir do grupo consistindo em alfa-amilases e glicoamilases.

[00142] Qualquer alfa-amilase adequada (E.C. 3.2.1.1), quer esteja ou não comercialmente disponível, pode ser utilizada no método aqui descrito.

[00143] Exemplos de alfa-amilases incluem, mas não se limitam a, uma alfa-amilase de tipo selvagem, uma variante ou seu fragmento ou uma alfa-amilase híbrida geneticamente modificada derivada, por exemplo, de um domínio catalítico de origem microbiana e um domínio de ligação de amido de outra origem microbiana. Exemplos não limitativos de outras alfa-amilases que podem ser úteis para fazer esses híbridos podem ser derivados de Bacillus, Aspergillus, Trichoderma, Rhizopus, Fusarium, Penicillium, Neurospora e Humicola.

[00144] Podem também ser mencionadas alfa-amilases que têm atividade de hidrolisação de amido granular (GSH) ou alfa-amilases que foram recombinantemente manipuladas para ter atividade de GSH. Tal atividade de GSH é vantajosa, uma vez que estas enzimas quebram mais do amido, especialmente qualquer amido granular (bruto), que possa estar presente em qualquer ração que contenha melaço e similares. Alfa-amilases tendo atividade GSH incluem, mas não se limitam a, alfa-amilases obtidas a partir de Aspergillus kawachi (por exemplo, AkAA), Aspergillus niger (por exemplo, AnAA), A. clavatus (AcAA), A. terreus (AtAA) e Trichoderma reesei (por exemplo, TrAA).

[00145] Alfa-amilases, AkAA, AcAA e AtAA, têm dois domínios de ligação de carboidrato, um dos quais pertence à família de domínio/módulo de ligação de carboidrato 20 (CBM20 ou CD20), enquanto a outra é por vezes chamada de local de ligação secundário (SBS). SBSs e CBMs parecem funcionar 1) visando a enzima no seu substrato, 2) guiando o substrato para o sulco de local ativo, 3) por interrupção do substrato, 4) reforçando a processividade, 5) por regulação alostérica, 6) passando produtos de reação e/ou 7) ancorando a parede celular do microrganismo original.

[00146] Muitas destas funções putativas estão de acordo com as funções atribuídas à ligação não catalítica em CBMs. Em contraste com os CBMs, os SBSs têm uma posição fixa em relação ao local catalítico, tornando-os mais ou menos adequados para assumir funções específicas (Cuyvers S., Dornez E., Delcour J. A., Courtin C. M. (2012), Occurrence and functional significance of secondary carbohydrate binding sites in glycoside hydrolases. Crit. Rev. Biotechnol. 32, 93-107).

[00147] Algumas alfa-amilases comercialmente disponíveis que podem ter atividade GSH ou enzimas usadas em processos de hidrólise de carboidratos estão comercialmente disponíveis, ver, por exemplo, TERMAMYL® 120-L, LC e SC SAN SUPER®, SUPRA®, e LIQUEZYME® SC comercializadas pela Novo Nordisk A/S, FUELZYME® LF da Verenium, e CLARASE® L, SPEZYME® FRED, SPEZYME® XTRA, GC626, e GZYME® G997 comercializadas pela Danisco, US, Inc., Genencor Division.

[00148] Em outras modalidades, é desejável que a alfa-amilase seja uma alfa-amilase estável ao ácido com 20% de atividade a pH inferior ou igual a 3,0 em comparação com a sua atividade a pH 6,0

[00149] Alfa-amilases podem ser selecionadas a partir do grupo consistindo em alfa-amilase (EC 3.2.1.1); pululanase (EC 3.2.1.41); ciclomaltodextrina glucanotransferase (EC 2.4.1.19); ciclomaltodextrinase (EC 3.2.1.54); trealose-6-fosfato hidrolase (EC3.2.1.93); oligo-alfa-glucosidase (EC 3.2.1.10); amilase maltogênica (EC 3.2.1.133); neopululanase (EC 3.2.1.135); alfa-glucosidase (EC 3.2.1.20); alfa-amilase formando maltotetrose (EC3.2.1.60); isoamilase (EC 3.2.1.68); glucodextranase (EC 3.2.1.70); alfa-amilase formando malto-hexose (EC 3.2.1.98); alfa-amilase formando maltotriose (EC 3.2.1.116); enzima de ramificação (EC 2.4.1.18); trealose sintase (EC 5.4.99.16); 4-alfa-glucanotransferase (EC 2.4.1.25); alfa-amilase formando maltopentose (EC 3.2.1.-); amilosucrase (EC 2.4.1.4); sacarose fosforilase (EC 2.4.1.7); malto-oligosiltrealose trealo-hidrolase (EC 3.2.1.141); isomaltulose sintase (EC 5.4.99.11); malto- oligosiltrealose sintase (EC 5.4.99.15); amilo-alfa-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.33); e alfa-1,4-glucano: fosfato alfa-maltosiltransferase (EC 2.4.99.16);

[00150] Qualquer glicoamilase adequada (GA) (E.C. 3.2.1.3), esteja ou não comercialmente disponível, pode ser utilizada no método aqui descrito.

[00151] A adequação de uma glicoamilase (Amiloglucosidase sin. (GA) (E.C. 3.2.1.3) irá depender da sua atividade em relação à maltose. Assim, uma glicoamilase adequada deve ter pelo menos 20% da atividade sobre a maltose em uma base de proteína em comparação com a atividade de glicoamilase obtida de Trichoderma reesei (TrGA) quando analisadas em 2% (p/v) de maltose, pH 6.0 e 40 °C. A TrGA é amplamente utilizada no processamento de bioetanol de primeira geração devido às suas capacidades de geração de glicose a partir de amido (patente US, 2008, US 7413879 B2, Trichoderma reesei glucoamylase and homologs thereof). STARGEN™ 002 é um produto enzimático de hidrolisação de amido granular para produção de etanol vendido pela DuPont.

[00152] É importante para a nutrição animal que a taxa de hidrólise de maltose para glicose seja elevada, uma vez que é a glicose que é absorvida pela corrente sanguínea no aparelho digestivo, e não o seu dímero correspondente, a maltose.

[00153] Assim, a baixa atividade de glicoamilase de Aspergillus niger (AnGA) na maltose torna uma glicoamilase imprópria para utilização nos métodos aqui descritos. A glicoamilase é conhecida por ter muitos sublocais para ligação perto do local ativo. Uma teoria de sublocais foi desenvolvida para analisar as afinidades de substrato de glicoamilases. Um dos pressupostos desta teoria é que um substrato pode ser ligado à enzima de um modo produtivo ou não produtivo. Acredita-se que a baixa atividade de glicoamilase de Aspergillus niger (AnGA) pode ser devida à probabilidade da maltose se ligar a AnGA de um modo não produtivo. (Swanson et al., 1977, Biotechnol. Bioeng. 19:1715-1718).

[00154] Exemplos de glicoamilases incluem, mas não se limitam a, uma glicoamilase de tipo selvagem, uma variante ou seu fragmento ou uma glicoamilase híbrida geneticamente modificada que pode ser derivada, por exemplo, de um domínio catalítico de origem microbiana e um domínio de ligação de amido de outra origem microbiana. Glicoamilases híbridas incluem, por exemplo, glicoamilases tendo um domínio catalítico de um GA de um organismo (por exemplo, Talaromyces GA) e um domínio de ligação de amido (SBD) de um organismo diferente (por exemplo; Trichoderma GA).

[00155] Tais glicoamilases híbridas também podem ser feitas usando um peptídeo para alinhar um domínio catalítico de um GA de um organismo (por exemplo, Talaromyces GA) e um domínio de ligação de amido (SBD) de um organismo diferente (por exemplo; Trichoderma GA).

[00156] Exemplos de tais glicoamilases híbridas incluem, mas não se limitam a, glicoamilase de Aspergillus niger G1 e G2 (Ver, por exemplo, Boel et al., (1984) EMBO J. 3:1097-1102; WO 92/00381, WO 00/04136 e Patente dos E.U.A. N° 6,352,851); glicoamilases de Aspergillus awamori (ver, por exemplo, WO 84/02921); glicoamilases de Aspergillus oryzae (ver, por exemplo, Hata et al., (1991) Agric. Biol. Chem. 55:941949) e Aspergillus shirousami. (Ver, por exemplo, Chen et al., (1996) Prot. Eng. 9:499-505; Chen et al. (1995) Prot. Eng. 8:575-582; e Chen et al., (1994) Biochem J. 302:275-281).

[00157] Algumas glicoamilases são expressas de forma endógena por bactérias, plantas e/ou fungos. Por exemplo, algumas glicoamilases são produzidas por várias estirpes de fungos filamentosos.

[00158] De preferência, a glicoamilase terá atividade de hidrolisação de amido granular (GSH) ou terá sido recombinantemente manipulada para ter atividade de GSH. Tal atividade de GSH é vantajosa, uma vez que estas enzimas quebram mais do amido, especialmente qualquer amido granular (bruto), que possa estar presente em qualquer ração que contenha melaço e similares.

[00159] As glicoamilases que podem ser usadas no método aqui divulgado incluem aquelas obtidas a partir de estirpes de Talaromyces ((por exemplo, glicoamilases T. emersonii, T. leycettanus, T. duponti e T. thermophilus (Ver, por exemplo, WO 99/28488; Patente dos E.U.A. No. RE: 32,153; Patente dos E.U.A. N° 4,587,215)); estirpes de Trichoderma, (por exemplo, T. reesei) e glicoamilases tendo pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90% e cerca de 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 divulgada na Patente dos E.U.A: U.S. N° 2006-0094080; estirpes de Rhizopus, (por exemplo, R. niveus e R. oryzae); estirpes de Mucor e estirpes de Humicola, ((por exemplo, H. grisea (ver, por exemplo, Boel et al., (1984) EMBO J. 3:1097-1102; WO 92/00381; WO 00/04136; Chen et al., (1996) Prot. Eng. 9:499-505; Taylor et al., (1978) Carbohydrate Res. 61:301-308; Patente dos E.U.A. 4.514.496; Patente U.S. N° 4.092.434; Patente U.S. N° N° 4,618,579; Jensen et al., (1988) Can. J. Microbiol. 34:218-223 e SEQ ID NO: 3 de WO 2005/052148)). Em algumas modalidades, a glicoamilase tem, pelo menos, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 92%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% e cerca de 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 de WO 05/052148. Outras glicoamilases úteis na presente invenção incluem as obtidas a partir de Athelia rolfsii e suas variantes (Ver, por exemplo, WO 04/111218) e Penicillium spp. (por exemplo, Penicillium chrysogenum).

[00160] Glicoamilases comercialmente disponíveis incluem, mas não se limitam a, Spirizyme Ultra, Spirizyme® Achieve, Spirizyme® Fuel, SPIRIZYME® EXCEL, DISTILLASE®, OPTIDEX® L-400 and G ZYME® G990 4X, GC480, G-ZYME® 480, FERMGEN® 1-400 (Danisco US, Inc, Genencor Division), CU.CONC® (Shin Nihon Chemicals, Japão), GLUCZYME® (Amano Pharmaceuticals, Japão (Ver, por exemplo, Takahashi et al., (1985) J. Biochem. 98:663-671)). Enzimas secundárias que encontram uso na invenção incluem três formas de glicoamilase (por exemplo, E.C.3.2.1.3) produzida por Rhizopus sp., nomeadamente "Gluc1" (MW 74,000), "Gluc2" (58,600 MW) e "Gluc3" (MW 61,400).

[00161] Qualquer alfa-glucosidase adequada (E.C.3.2.1.20) pode ser usada como aqui descrita.

[00162] Como foi observado acima, a alfa-glucosidase libera glicose da maltose, isomaltose e maltossacarídeos no seu modo hidrolítico. Também pode transferir unidade de de glicose para moléculas aceitadoras incluindo glicose, maltose, isomaltose e maltossacarídeos ou quaisquer outras moléculas adequadas no seu modo sintético, especialmente a uma maior concentração de substrato e elevada concentração de produto. No trato digestivo, o modo sintético ou reação de transferência é mínimo, uma vez que a glicose de produto gerada será removida devido à absorção.

[00163] As proteases (também denominadas peptidases ou proteinases) são enzimas com capacidade para clivar ligações de peptídeo. As proteases evoluíram múltiplas vezes e diferentes classes de proteases podem realizar a mesma reação por mecanismos catalíticos completamente diferentes. As proteases podem ser encontradas em animais, plantas, bactérias, archaea e vírus.

[00164] A proteólise pode ser atingida por enzimas atualmente classificadas em seus grupos amplos: proteases aspárticas, cisteína proteases, serina proteases, treonina proteases, proteases glutâmicas e metaloproteases.

[00165] De preferência, a protease é uma protease ácida e, mais preferencialmente, é uma protease fúngica ácida.

[00166] Nesta divulgação podem ser usadas quaisquer proteases neutras ou ácidas. Por exemplo, proteases fúngicas ácidas incluem as obtidas a partir de Aspergillus, Trichoderma, Mucor and Rhizopus, tal como A. niger, A. awamori, A. oryzae, Trichoderma reesei e M. miehei. AFP pode ser derivada da expressão de proteína endógena ou heteróloga de origem bacteriana, vegetal ou fúngica. De preferência, AFP é segregada a partir de estirpes de Trichoderma.

[00167] Exemplos de proteases ácidas incluem, mas não se limitam a, uma protease de tipo selvagem, uma variante ou seu fragmento ou uma protease ácida híbrida geneticamente modificada que pode ser derivada, por exemplo, de um domínio catalítico de origem microbiana e um domínio de ligação de amido de outra origem microbiana.

[00168] Em outro aspecto, a protease pode ser uma protease neutra tal como uma metaloprotease (Metalopeptidase sin.), e, mais preferencialmente, uma metaloprotease bacteriana.

[00169] Em outro aspecto, qualquer ácido nucleico isolado, recombinante, substancialmente puro, de origem sintética ou de ocorrência não natural, constituído por uma sequência de nucleotídeos codificando qualquer polipeptídeo possuindo qualquer das atividades de glicosídeo hidrolase descritas neste documento (incluindo qualquer proteína de fusão, etc.) que foi discutido acima. É também de interesse um vetor composto por um polinucleotídeo codificando qualquer uma das glicosídeo hidrolases aqui descritas. Será evidente para a pessoa versada que o vetor pode ser qualquer vetor de expressão adequado e que a escolha de vetor pode variar dependendo do tipo de célula em que o vetor deve ser inserido. Os vetores adequados incluem pGAPT- PG, pRAX1, pGAMD, pGPT-pyrG1, pC194, pJH101, pE194 e pHP13 (consultar Harwood e Cutting [eds.], Capítulo 3, Molecular Biological Methods for Bacillus, John Wiley & Sons [1990]). Consultar também Perego, Integrational Vectors for Genetic Manipulations in Bacillus subtilis, em Sonenshein et al., [eds.] Bacillus subtilis and Other GramPositive Bacteria: Biochemistry, Physiology and Molecular Genetics, American Society for Microbiology, Washington, D.C. [1993], páginas 615 a 624), e p2JM103BBI.

[00170] O vetor de expressão pode ser um dentre qualquer número de vetores ou cassetes úteis para a transformação de hospedeiros de produção adequados conhecidos na técnica. Tipicamente, o vetor ou o cassete incluirão sequências que direcionam a transcrição e a tradução do gene relevante, um marcador selecionável e sequências que permitem replicação autônoma ou integração cromossômica. Os vetores adequados, de modo geral, incluem uma região 5' do gene que abriga controles de iniciação transcricional e uma região 3' do fragmento de DNA que controla a terminação transcricional. Ambas as regiões de controle podem ser derivadas de genes homólogos para genes de uma célula hospedeira de produção transformada e/ou genes nativos ao hospedeiro de produção, embora tais regiões de controle não precisem de ser derivadas assim.

[00171] Os fragmentos de DNA que controlam a terminação transcricional podem ser também derivados de vários genes nativos a uma célula hospedeira de produção preferencial. Em certas modalidades, a inclusão de uma região de controle de terminação é opcional. Em certas modalidades, o vetor de expressão inclui uma região de controle de terminação derivada da célula hospedeira preferencial.

[00172] O vetor de expressão pode ser incluído no hospedeiro de produção, particularmente, nas células de hospedeiros de produção microbianos. As células hospedeiras de produção podem ser hospedeiros microbianos encontrados dentro das famílias fúngicas ou bacterianas e que crescem ao longo de uma faixa ampla de temperatura, valores de pH e tolerâncias a solvente. Por exemplo, contempla-se que qualquer um dentre bactérias, algas e fungos, tais como fungos filamentosos e leveduras, possa adequadamente hospedar o vetor de expressão.

[00173] A inclusão do vetor de expressão na célula hospedeira de produção pode ser usada para expressar a proteína de interesse de modo que a mesma possa residir de modo intracelular, extracelular ou uma combinação de ambos dentro e fora das células. A expressão extracelular produz a recuperação da proteína desejada de um produto de fermentação mais fácil que métodos para recuperação de proteína produzida por expressão intracelular.

[00174] O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor, tal como um plasmídeo ou vírus, que pode ser convenientemente submetido a procedimentos de DNA recombinante e levar à expressão da sequência de nucleotídeos. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor será introduzido. Os vetores podem ser plasmídeos lineares ou circulares fechados. O vetor pode ser um vetor autonomamente replicante, ou seja, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter quaisquer meios para assegurar a autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser tal que, quando introduzido no hospedeiro de produção, seja integrado no genoma e replicado juntamente com o cromossomo (ou cromossomos) no qual foi integrado. Alguns exemplos não limitativos desses vetores são fornecidos no Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains (FGSC, < www.fgsc.net»). Exemplos adicionais de expressão adequada e/ou vetores de integração são fornecidos em Sambrook et al., (1989) supra, Ausubel (1987) supra, van den Hondel et al. (1991) em Bennett e Lasure (Eds.) MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press. 396-428 e Patente dos EUA N° 5,874,276. Vetores particularmente úteis incluem pTREX, pFB6, pBR322, PUCI8, pUCI00 e pENTR/D. Plasmídeos adequados para uso em células bacterianas incluem pBR322 e pUC19 permitindo a replicação em E. coli e pE194, por exemplo, permitindo a replicação em Bacillus.

[00175] Em resumo, em relação à produção em células hospedeiras de produção, pode ser feita referência a Sambrook et al., (1989) supra, Ausubel (1987) supra, van den Hondel et al. (1991) em Bennett e Lasure (Eds.) MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press (1991) páginas 70 a 76 e 396 a 428; Nunberg et al., (1984) Mol. Cell BioI. 4:2.306 a 2.315; Boel et al., (1984) 30 EMBO J. 3:1.581 a 1585; Finkelstein em BIOTECHNOLOGY OF FILAMENTOUS FUNGI, Finkelstein et al. Eds. Butterworth-Heinemann, Boston, MA (1992), Cap. 6; Kinghorn et al. (1992) APPLIED MOLECULAR GENETICS OF FILAMENTOUS FUNGI, Blackie Academic e Professional, Chapman e Hall, Londres; Kelley et al., (1985) EMBO J. 4:475 a 479; Penttila et al., (1987) Gene 61: 155 a 164; e Patente U.S. N° 5,874,276. Uma lista de vetores adequados pode ser encontrada em Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains (FGSC, www at fgsc.net). Os vetores adequados incluem aqueles obtidos, por exemplo, da Invitrogen Life Technologies e Promega. Vetores específicos adequados para uso em células hospedeiras fúngicas incluem vetores, tais como pFB6, pBR322, pUC 18, pUC100, pDON™201, pDONR™221, pENTR™, pGEM®3Z e pGEM®4Z.

[00176] O sistema de vetor pode ser um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que contenham, em conjunto, o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transpóson.

[00177] O vetor pode também conter um ou mais marcadores selecionáveis para permitir a seleção fácil das células transformadas. Um marcador selecionável é um gene, cujo produto fornece resistência viral ou a biocida e similares. Os exemplos de marcadores selecionáveis incluem aqueles que conferem resistência antimicrobiana. Os marcadores nutricionais também encontram uso na presente invenção, incluindo aqueles marcadores conhecidos na técnica, como amdS, argB e pyr4. Os marcadores úteis para a transformação de Trichoderma são conhecidos na técnica (consultar, por exemplo, Finkelstein, capítulo 6, em Biotechnology of Filamentous Fungi, Finkelstein et al., EDS Butterworth-Heinemann, Boston MA (1992) e Kinghorn et al., (1992) Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi, Blackie Academic and Professional, Chapman e Hall, Londres). Em algumas modalidades, os vetores de expressão também incluem um réplicon, uma resistência a antibiótico de codificação de gene para permitir a seleção de bactérias que abrigam plasmídeos recombinantes, e locais de restrição únicos em regiões não essenciais do plasmídeo para permitir a inserção de sequências heterólogas. O gene de resistência antibiótica particular escolhido não é essencial; qualquer um dentre os muitos genes de resistência conhecidos na técnica é adequado. As sequências procarióticas são preferencialmente escolhidas de modo a não interferirem na replicação ou integração do DNA em Trichoderma reesei.

[00178] O vetor pode também conter um elemento (ou elementos) que permita integração estável do vetor no genoma do hospedeiro produto ou replicação autônoma do vetor no hospedeiro de produção independente do genoma da célula. Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode se basear na sequência de nucleotídeos que codifica a protease aspártica ou qualquer outro elemento do vetor para integração estável do vetor no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga.

[00179] Para replicação autônoma, o vetor pode, ainda, compreender uma origem de replicação que permite que o vetor replique autonomamente no hospedeiro de produção.

[00180] Mais de uma cópia da sequência de nucleotídeos que codifica uma glicosídeo hidrolase pode ser inserida no hospedeiro de produção para aumentar a sua produção. Um aumento no número de cópias da sequência de nucleotídeos pode ser obtido integrando pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma do hospedeiro de produção ou incluindo um gene marcador selecionável amplificável e, assim, cópias adicionais da sequência de nucleotídeos podem ser selecionadas cultivando as células hospedeiras de produção na presença de um agente selecionável adequado.

[00181] Um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica qualquer das glicosídeo hidrolases é introduzido no hospedeiro de produção de modo que o vetor seja mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extracromossômico autorreplicante. A integração é, de modo geral, considerada como sendo uma vantagem visto que a sequência de nucleotídeos tem maior probabilidade se ser mantida de forma estável no hospedeiro de produção. A integração do vetor no cromossomo hospedeiro de produção pode ocorrer por recombinação homóloga ou não homóloga conforme foi discutido acima.

[00182] Os vetores exemplificativos incluem, porém sem limitação, pGXT (igual ao vetor pTTTpyr2 conforme descrito no pedido publicado PCT WO2015/017256). Podem ser mencionados também vetores de expressão bacteriana padrões incluindo bacteriófagos À e M13, assim como plasmídeos, tais como plasmídeos com base em pBR322, pSKF, pET23D, e sistemas de expressão de fusão, tais como MBP, GST e LacZ. As etiquetas de epítopo também podem ser adicionadas a proteínas recombinantes para fornecer métodos convenientes de isolamento, por exemplo, c-myc.

[00183] Os exemplos de vetores de expressão e/ou integração adequados são fornecidos em Sambrook et al., (1989) supra, Bennett e Lasure (Eds.) More Gene Manipulations in Fungi, (1991) Academic Press páginas 70 a 76 e páginas 396 a 428 e artigos mencionados nos mesmos; USP 5.874.276 e Fungal Genetic Stock Center Catalogue of Strains, (FGSC, www.fgsc.net.). Os vetores úteis podem ser obtidos junto à Promega e Invitrogen. Alguns vetores úteis específicos incluem pBR322, pUC18, pUC100, pDON™201, pENTR™, pGEN®3Z e pGEN®4Z. Entretanto, outras formas de vetores de expressão que servem funções equivalentes e que são ou se tornam conhecidos na técnica podem ser também usados. Assim, pode ser empregada uma ampla variedade de combinações de hospedeiros/vetores de expressão na expressão de sequências de DNA reveladas no presente documento. Os vetores de expressão úteis, por exemplo, podem consistir em segmentos de sequências de DNA sintético, não cromossômico e cromossômico tais como vários derivados conhecidos de SV40 e plasmídeos bacterianos conhecidos, por exemplo, plasmídeos de E. coli, incluindo col E1, pCR1, pBR322, pMb9, pUC 19 e derivados dos mesmos, plasmídeos de gama de hospedeiro mais ampla, por exemplo, RP4, fago de DNA, por exemplo, os numerosos derivados de fago .lambda., por exemplo, NM989, e outros fagos de DNA, por exemplo, M13 e fagos filamentosos de DNA de cadeia simples, plasmídeos de leveduras, tais como o plasmídeo 2.mu ou derivados dos mesmos.

[00184] A escolha de um hospedeiro de produção pode ser qualquer microrganismo adequado, tal como bactérias, fungos e algas. Tipicamente, a escolha dependerá do gene que codifica a glicosídeo hidrolase de interesse.

[00185] Os exemplos de hospedeiros de produção adequados incluem, porém sem limitação, células bacterianas, fúngicas, vegetais, etc. De preferência, o hospedeiro de produção pode ser selecionado dentre E. coli, Streptomyces, Hansenula, Trichoderma (particularmente T. reesei), Bacillus, Lactobacillus, Aspergillus (particularmente A. niger), uma célula vegetal e/ou esporos de Bacillus, Trichoderma ou Aspergillus.

[00186] Em algumas modalidades, uma enzima de glicosídeo hidrolase recombinante pode ser usada nos métodos e nas composições revelados no presente documento. Em um aspecto preferencial, é proporcionado um alimento ou aditivo de ração compreendendo a glicosídeo hidrolase aqui descrita.

[00187] Muitos métodos de transfecção padrões podem ser usados para produzir linhagens celulares de fungos filamentosos e bactérias (por exemplo, Aspergillus ou Trichoderma) que expressam grandes quantidades da glicosídeo hidrolase desejada. Alguns dos métodos publicados para a introdução de construtos de DNA nas cepas de produção de celulase de Trichoderma incluem Lorito, Hayes, DiPietro e Harman, (1993) Curr. Genet. 24: 349 a 356; Goldman, VanMontagu e Herrera-Estrella, (1990) Curr. Genet. 17:169 a 174; e Penttila, Nevalainen, Ratto, Salminen e Knowles, (1987) Gene 6: 155 a 164, consultar também USP 6.022.725; USP 6.268.328 e Nevalainen et al., "The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes" em Molecular Industrial Mycology, Eds, Leong e Berka, Marcel Dekker Inc., NY (1992) páginas 129 a 148; para Aspergillus incluem Yelton, Hamer e Timberlake, (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1.470 a 1.474, para Fusarium incluem Bajar, Podila e Kolattukudy, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8.202 a 8.212, para Streptomyces incluem Hopwood et al., 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces: Laboratory Manual, The John Innes Foundation, Norwich, UK, e Fernandez-Abalos et al., Microbiol 149:1.623 a 1.632 (2003) e para Bacillus incluem Brigidi, DeRossi, Bertarini, Riccardi e Matteuzzi, (1990) FEMS Microbiol. Lett. 55: 135-138).

[00188] Entretanto, pode ser usado qualquer um dos procedimentos bem conhecidos para introduzir sequências de nucleotídeos estranhas em células hospedeiras. Esses incluem o uso de transfecção com fosfato de cálcio, polibreno, fusão de protoplastos, eletroporação, biolística, lipossomos, microinjeção, vetores plasmáticos, vetores virais e quaisquer dos outros métodos bem conhecidos de introdução de DNA genômico, cDNA, DNA sintético clonados ou outro material genético estranho em uma célula hospedeira (consultar, por exemplo, Sambrook et al., supra). Também é de uso o método de transfecção mediado por Agrobacterium descrito na Patente no U.S. 6.255.115. Também é necessário que o procedimento de manipulação genética particular usado tenha capacidade para introduzir de modo bem-sucedido o pelo menos um gene na célula hospedeira com capacidade para expressar o gene.

[00189] Dependendo da célula hospedeira usada, podem ser feitas modificações pós-transcrição e/ou pós-tradução. Um exemplo não limitativo de uma modificação pós-transcrição e/ou pós-tradução é "recorte" ou "truncamento" de um polipeptídeo. Por exemplo, isso pode resultar em levar uma glicosídeo hidrolase de um estado inativo ou substancialmente inativo a um estado ativo como no caso de um pró- peptídeo submetido a processamento pós-tradução adicional a um peptídeo maduro que tem a atividade enzimática. Em outro caso, esse recorte pode resultar em tornar madura uma glicosídeo hidrolase, conforme descrito no presente documento e remover, ainda, aminoácidos N ou C-terminais para gerar formas truncadas que mantém atividade enzimática.

[00190] Outros exemplos de modificações pós-transcrição ou pós- tradução incluem, porém sem limitação, miristoilação, glicosilação, truncação, lipidação e fosforilação de tirosina, serina ou treonina. A pessoa versada perceberá que o tipo de modificações pós-transcrição ou pós-tradução que uma proteína pode sofrer pode depender do organismo hospedeiro em que a proteína é expressa.

[00191] Os métodos de transformação para Aspergillus e Trichoderma são descritos, por exemplo, em Yelton et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470 a 1474; Berka et al., (1991) em Applications of Enzyme Biotechnology, Eds. Kelly e Baldwin, Plenum Press (NY); Cao et al., (2000) Sci. 9:991 a 1.001; Campbell et al., (1989) Curro Genet. 16:53 a 56; Pentilla et al., (1987) Gene 61:155 a 164); de Groot et al., (1998) Nat. Biotechnol. 16:839 a 842; USP 6,022,725; USP 6,268,328 e EP 238 023. A expressão de proteína heteróloga em Trichoderma é descrita nos documentos USP 6.022.725; USP 6.268.328; Harkki et ale (1991); Enzyme Microb. Technol. 13:227 a 233; Harkki et al., (1989) Bio Technol. 7:596 a 603; EP 244,234; EP 215,594; e Nevalainen et al., "The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes", em MOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY, Eds. Leong e Berka, Marcel Dekker Inc., NY (1992) páginas 129 a 148). Também é feita referência ao documento W096100787 e Bajar et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8.202 a 28.212 para transformação de cepas de Fusarium.

[00192] Após o vetor de expressão ser introduzido nas células, as células transfectadas ou transformadas são cultivadas sob condições que favorecem a expressão de genes sob controle das sequências promotoras. Em alguns casos, a sequência promotora é o promotor de cbh1. Grandes bateladas de células transformadas podem ser cultivadas conforme descrito em Ilmen et al 1997 ("Regulation of cellulase gene expression in the filamentous fungus Trichoderma reesei." Appl. Envir. Microbiol. 63:1.298 a 1.306).

[00193] A absorção de DNA na cepa hospedeira de Trichoderma sp. depende da concentração de íon de cálcio. Geralmente, CaCl2 a cerca de 10 a 50 mM é usado em uma solução de absorção. Compostos adequados adicionais incluem um sistema de tamponamento, tais como tampão TE (Tris 10 mM, pH 7,4; EDTA 1 mM) ou MOPS 10 mM, pH 6,0 e polietileno glicol. Acredita-se que o polietileno glicol funde as membranas celulares, permitindo, assim, que o conteúdo do meio seja entregue ao citoplasma da cepa de Trichoderma sp. Essa fusão deixa frequentemente múltiplas cópias do DNA de plasmídeo integradas no cromossomo hospedeiro.

[00194] Geralmente, a transformação de Trichoderma sp. usa protoplastos ou células que foram submetidas a um tratamento de permeabilidade, tipicamente em uma densidade de 105 a 107/mL, particularmente, 2x106/mL. Um volume de 100 μl desses protoplastos ou células em uma solução apropriada (por exemplo,

[00195] sorbitol a 1,2 M e CaCl2 a 50 mM) pode ser misturado com o DNA desejado. Em geral, uma alta concentração de PEG é adicionada à solução de absorção. De 0,1 a 1 volume de PEG 4000 a 25% pode ser adicionado à suspensão de protoplastos; entretanto, é útil adicionar cerca de 0,25 volume à suspensão de protoplastos. Aditivos, tais como dimetil sulfóxido, heparina, espermidina, cloreto de potássio e similares, podem também ser adicionados à solução de absorção para facilitar a transformação. Procedimentos similares estão disponíveis para outras células hospedeiras fúngicas. Consultar, por exemplo, a Patente U.S. N° 6.022.725.

[00196] O meio usado para cultivar as células pode ser qualquer meio convencional adequado para cultivar a célula hospedeira e obter expressão de qualquer das glicosídeo hidrolases aqui descritas. Mídias e componentes de mídia adequados estão disponíveis junto a fornecedores comerciais ou podem ser preparadas de acordo com receitas publicadas (por exemplo, conforme descrito em catálogos da American Type Culture Collection).

[00197] Em algumas modalidades, a preparação de um caldo de fermentação inteiro gasto de um micro-organismo recombinante pode ser alcançada com o uso de qualquer método de cultivo conhecido na técnica resultando na expressão da enzima de interesse. A fermentação pode, portanto, ser entendida como compreendendo o cultivo em frasco de agitação, fermentação em pequena ou grande escala (incluindo as fermentações em batelada, em batelada alimentada ou de estado sólido) em fermentadores industriais realizados em um meio adequado e sob condições que permitem que a enzima seja expressa ou isolada. O termo "caldo de fermentação inteiro gasto" é definido no presente documento como conteúdo não fracionado do material de fermentação que inclui o meio de cultura, proteínas extracelulares (por exemplo, enzimas) e biomassa celular. Entende-se que o termo "caldo de fermentação inteiro gasto" também engloba biomassa celular que foi lisada ou permeabilizada com o uso de métodos bem conhecidos na técnica.

[00198] Células hospedeiras podem ser cultivadas sob condições adequadas que permitem a expressão de qualquer das glicosídeo hidrolases aqui descritas. A expressão das enzimas pode ser constitutiva de modo que as mesmas sejam continuamente produzidas ou induzíveis, exigindo um estímulo para iniciar a expressão. No caso da expressão induzível, a produção de proteína pode ser iniciada quando exigido, por exemplo, pela adição de uma substância indutora ao meio de cultura, por exemplo, dexametasona ou IPTG ou soforose.

[00199] Polipeptídeos podem também ser produzidos de modo recombinante em um sistema isento de células in vitro, tal como o sistema de reticulócitos de coelho TNT™ (Promega). Um hospedeiro de expressão pode também ser cultivado no meio apropriado para o hospedeiro, sob condições aeróbicas. Agitação ou uma combinação de balanço e aeração pode ser fornecida, com a produção ocorrendo na temperatura apropriada para esse hospedeiro, por exemplo, de cerca de 25 °C a cerca de 75 °C (por exemplo, 30 °C a 45 °C), dependendo das necessidades do hospedeiro e da produção da alfa-glucosidase desejada. A cultura pode ocorrer de cerca de 12 a cerca de 100 horas ou mais (e qualquer valor de hora entre os mesmos, por exemplo, de 24 a 72 horas). Tipicamente, o caldo de cultura está a um pH de cerca de 4,0 a cerca de 8,0, dependendo novamente das condições de cultura necessárias para o hospedeiro em relação à produção da enzima de interesse, tal como a glicosídeo hidrolase aqui descrita. Desde a produção, hospedeiros e células transformadas podem ser cultivados em mídia de nutriente convencional. A mídia de cultura para células hospedeiras apropriadas pode ser modificada conforme apropriado para ativar promotores e selecionar células transformadas. As condições de cultura específicas, tais como temperatura, pH e similares, podem ser aquelas que são usadas para a célula hospedeira selecionada para expressão e serão evidentes para aqueles versados na técnica. Adicionalmente, as condições de cultura preferenciais podem ser encontradas na literatura científica, tal como Sambrook, (1982) supra; Kieser, T, MJ. Bibb, MJ. Buttner, KF Chater e D.A. Hopwood (2000) PRACTICAL STREPTOMYCES GENETICS. John Innes Foundation, Norwich, Reino Unido; Harwood, et al., (1990) MOLECULAR BIOLOGICAL METHODS FOR BACILLUS, John Wiley e/ou da American Type Culture Collection (ATCC; www.atcc.org).

[00200] Qualquer um dos métodos de fermentação bem conhecidos na técnica pode ser usado para fermentar a cepa fúngica transformada ou derivada conforme descrito acima.

[00201] Uma fermentação em batelada clássica é um sistema fechado, em que a composição do meio é estabelecida no início da fermentação, e a composição não é alterada durante a fermentação. No início da fermentação, o meio é inoculado com o organismo (ou organismos) desejado(s). Em outras palavras, o processo de fermentação inteiro ocorre sem a adição de quaisquer componentes ao sistema de fermentação inteiro.

[00202] Alternativamente, uma fermentação em batelada se qualifica como uma "batelada" em relação à adição da fonte de carbono. Além disso, são feitas frequentemente tentativas de controlar fatores, tais como pH e concentração de oxigênio, por todo o processo de fermentação. Tipicamente, o metabólito e as composições de biomassa do sistema de batelada mudam constantemente até ao momento em que a fermentação é interrompida. Dentro das culturas de batelada, as células progridem através de uma fase de latência estática até uma fase logarítmica de crescimento elevado e finalmente até uma fase estacionária, em que a taxa de crescimento é diminuída ou retida. Deixadas não tratadas, as células na fase estacionária eventualmente morreriam. Em geral, as células na fase logarítmica são responsáveis pelo volume de produção de produto. Uma variação adequada no sistema de batelada padrão é o sistema de "fermentação em batelada alimentada". Nessa variação de um sistema de batelada típico, o substrato é adicionado em incrementos conforme a fermentação progride. Os sistemas de batelada alimentada são úteis quando se sabe que a repressão de catabólito inibiria o metabolismo das células, e/ou em que é desejável ter quantidades limitadas de substratos no meio de fermentação. A medição da concentração de substrato atual em sistemas de batelada alimentada é difícil e, portanto, estimada com base nas mudanças de fatores mensuráveis, tais como pH, oxigênio dissolvido e a pressão parcial de gases residuais, tal como CO2. As fermentações em batelada e batelada alimentada são bem conhecidas na técnica.

[00203] Fermentação contínua é outro método conhecido de fermentação. A mesma é um sistema aberto em que um meio de fermentação definido é adicionado a um biorreator, e uma quantidade igual de meio condicionado é removida simultaneamente para o processamento. A fermentação contínua geralmente mantém as culturas em uma densidade constante, em que as células são mantidas principalmente em crescimento de fase logarítmica. A fermentação contínua permite a modulação de um ou mais fatores que afetam o crescimento celular e/ou concentração de produto. Por exemplo, um nutriente limitante, tal como a fonte de carbono ou fonte de nitrogênio, por ser mantido em uma taxa fixa, e a todos os outros parâmetros é permitida moderação. Em outros sistemas, inúmeros fatores que afetam o crescimento podem ser alterados continuamente, embora a concentração celular, medida por turvação de mídia, seja mantida constante. Os sistemas contínuos se esforçam para manter condições de crescimento de estado estável. Portanto, a perda celular devido ao meio que é extraído deve ser equilibrada em relação à taxa de crescimento celular na fermentação. Métodos de modulação de nutrientes e fatores de crescimento para processos de fermentação contínua, assim como técnicas para maximizar a taxa de formação de produto, são bem conhecidos na técnica de microbiologia industrial.

[00204] As técnicas de separação e concentração são conhecidas na técnica, e métodos convencionais podem ser usados para preparar um caldo ou solução concentrada que compreende um polipeptídeo de alfa- glucosidase da invenção.

[00205] Após a fermentação, é obtido um caldo de fermentação e as células microbianas e vários sólidos suspensos, incluindo os materiais de fermentação brutos residuais, são removidos por técnicas de separação convencionais a fim de obter uma solução contendo enzima. Filtração, centrifugação, microfiltração, filtração em tambor giratório a vácuo, ultrafiltração, centrifugação seguida por ultrafiltração, extração ou cromatografia ou similares são geralmente usadas.

[00206] Pode ser, por vezes, desejável concentrar uma solução ou caldo que compreende o polipeptídeo de interesse para otimizar a recuperação. O uso de caldo ou soluções não concentradas aumentaria tipicamente o tempo de incubação a fim de coletar o precipitado de enzima enriquecido ou purificado.

[00207] A solução contendo enzima pode ser concentrada com o uso de técnicas de concentração convencionais até o nível de enzima desejado ser obtido. A concentração da solução contendo enzima pode ser alcançada por qualquer uma das técnicas discutidas no presente documento. Os exemplos de métodos de enriquecimento e purificação incluem, porém sem limitação, filtragem a vácuo giratória e/ou ultrafiltração.

[00208] Uma glicosídeo hidrolase conforme descrito no presente documento pode ser testada quanto à atividade com o uso de uma variedade de testes conhecidos na técnica. Por exemplo, a atividade pode ser testada combinando a enzima com glicoproteína ou oligossacarídeo e água, conforme necessário. A atividade pode ser medida por análise dos produtos de reação, que podem ser separados e visualizados, por exemplo, por cromatografia em camada delgada, ou por HPLC utilizando colunas para análise de monossacarídeos e oligossacarídeos, ensaio de enzima acoplado usando glicose oxidase-peroxidase para quantificação de glicose e reagente de ácido 3,5-dini- trosalicílico (DNS) para reduzir ensaio de açúcar redutor global (ver Exemplos em baixo).

[00209] Além disso, uma glicosídeo hidrolase, conforme descrito neste documento, encapsulada ou não, pode ser na forma de um grânulo.

[00210] Acredita-se que uma glicosídeo hidrolase conforme descrito no presente documento, pode ser usada em combinação com uma ou mais enzimas adicionais. Em algumas modalidades, a uma ou mais enzimas, esterases, formamidase, -galactosidases adicionais, por exemplo α ou β-galactosidases, exo-glucanases, glucano liases, endo- glucanases, glicoamilases, glicose oxidases, glucosidases, por exemplo, α ou β-glucosidases, glucuronidases, hemicelulases, hidrolases, invertases, isomerases, lacases, fenol oxidases, lipase, liases, manosidases, oxidases, oxidorredutases, pectinase, pectato liases, pectina acetil esterases, pectina despolimerases, peptidase, pectina metil esterases, enzimas pectinolíticas, peroxidases, fenoloxidases, fitase, poligalacturonases, ramno-galacturonases, ribonucleases, taumatina, transferases, proteínas de transporte, transglutaminases, xilanases, hexose oxidase (D-hexose: (3/4- oxidorreductase, EC 1.1.3.5), fosfatases ácidas e/ou outras ou combinações das mesmas. As mesmas incluem enzimas que, por exemplo, modulam a viscosidade da composição ou ração.

[00211] Qualquer uma das enzimas GLCH aqui abordadas, de preferência, alfa-amilases, glicoamilases e alfa-glucosidases podem ser utilizadas em combinação com uma alimentação direta microbiana. As categorias de DFMs incluem Bacillus, Bactérias formadoras de Ácido Láctico e Leveduras. Os Bacillus são hastes gram-positivas exclusivas que formam esporos. Os esporos são muito estáveis e podem suportar condições ambientais como calor, umidade e uma faixa de pH. Esses esporos germinam em células vegetativas ativas quando ingeridos por um animal e podem ser usados em refeição e dietas peletizadas. As bactérias formadoras de ácido láctico são cocos gram-positivos que produzem ácido láctico que são antagonistas a patógenos. Uma vez que as bactérias formadoras de ácido láctico parecem ser de algum modo sensíveis ao calor, não podem ser usadas em dietas peletizadas. Os tipos de bactérias formadoras de ácido láctico incluem Bifidobacterium, Lactobacillus e Streptococcus. As leveduras não são bactérias. Esses microrganismos pertencem aos fungos do grupo de planta.

[00212] Qualquer das enzimas GLCH aqui abordadas, de preferência, alfa-amilases, glicoamilases e alfa-glucosidases podem ser utilizadas em combinação com fármacos veterinários adequados para reduzir a acidose ou para reduzir organismos protozoários ruminais.

[00213] Tais fármacos veterinários podem incluir ionóforos, tais como a monensina e seus derivados.

[00214] Ligantes de toxinas são concebidos para ligar as toxinas nas rações e proteger os animais dos seus efeitos prejudiciais. Por conseguinte, qualquer uma das enzimas GLCH aqui discutidas pode também ser utilizada em combinação com ligantes de toxinas ou adsorventes de toxinas. Um exemplo de um ligante de toxina é um ligante de micotoxina incluindo, mas não limitado a, diferentes aluminossilicatos de cálcio e sódio hidratado (HSCAS), bentonita, argilas, zeólito, paredes celulares de levedura e enzimas de degradação de toxinas.

[00215] Em outro aspecto, qualquer das enzimas GLCH aqui discutidas pode também ser utilizada em combinação com ervas, óleos essenciais, e agentes antiaglomerantes.

[00216] Um óleo essencial é um líquido hidrofóbico concentrado contendo compostos de aroma voláteis de plantas. Os óleos essenciais são também conhecidos como óleos voláteis, óleos etéreos, aetheroleum ou simplesmente como o óleo da planta da qual foram extraídos, tais como óleo de cravo-da-índia. Um óleo é "essencial", no sentido de que contém a "essência" da fragrância da planta - a fragrância característica da planta a partir da qual é obtido. O termo essencial aqui usado não significa indispensável como acontece com os termos aminoácidos essenciais ou ácidos graxos essenciais, que são assim chamados pois são nutricionalmente exigidos por um determinado organismo vivo. Os óleos essenciais são geralmente extraídos por destilação, frequentemente por meio de vapor. Outros processos incluem expressão, extração de solvente, extração de óleo absoluto, resinagem e prensagem a frio. São usados em perfumes, cosméticos, sabonetes e outros produtos, na aromatização de alimentos e bebidas, e para a adição de aromas a incenso e produtos de limpeza doméstica.

[00217] Alimentações animais podem incluir material vegetal, tal como milho, trigo, sorgo, feijão soja, canola, girassol ou misturas de qualquer um desses materiais vegetais ou fontes de proteína vegetais para ruminantes. É contemplado que os parâmetros de desempenho animal, tais como crescimento, ingesta de ração e eficácia de ração, mas também uniformidade aprimorada, concentração de amônia reduzida no alojamento de animais e, consequentemente, bem-estar e situação de saúde dos animais aprimorados, serão melhorados. Mais especificamente, conforme usado no presente documento, "desempenho animal" pode ser determinado pela eficiência de ração e/ou ganho de peso do animal e/ou pela razão de conversão de ração e/ou pela digestibilidade de um nutriente em uma ração (por exemplo, digestibilidade de aminoácido) e/ou energia digerível ou energia metabolizável em uma ração e/ou por retenção de nitrogênio e/ou pela capacidade de um animal para evitar os efeitos negativos de enterite necrótica e/ou por resposta imunológica do sujeito.

[00218] Os termos "ração animal", "ração", "composição de ração" e "forragem" são usados intercambiavelmente e podem compreender um ou mais materiais alimentícios selecionados dentre o grupo que compreende a) cereais, como pequenos grãos (por exemplo, trigo, cevada, centeio, aveias e combinações dos mesmos) e/ou grãos grandes como maís ou sorgo; b) subprodutos de cereais, como farinha de milho com glúten, Grãos Secos de Destilaria com Solúveis (DDGS) (particularmente Grãos Secos de Destilaria com Solúveis à base de milho (cDDGS), farelo de trigo, sêmea de trigo, farelo fino de trigo, farelo de arroz, cascas de arroz, cascas de aveia, semente de palma e polpa de cítricos; c) proteína obtida a partir de fontes como soja, girassol, amendoim, tremoço, ervilhas, fava, algodão, canola, farinha de peixe, proteína de plasma seca, farinha de carne e ossos, proteína da batata, soro, copra, gergelim; d) óleos e gorduras obtidos a partir de fontes vegetais e animais; e/ou e) minerais e vitaminas.

[00219] Quando usada como, ou na preparação de, uma ração, tal como ração funcional, a enzima ou composição de aditivo de ração da presente invenção pode ser usada em conjunção com um ou mais dentre: um transportador nutricionalmente aceitável, um diluente nutricionalmente aceitável, um excipiente nutricionalmente aceitável, um adjuvante nutricionalmente aceitável, um ingrediente nutricionalmente ativo. Por exemplo, poderia ser mencionado pelo menos um componente selecionado dentre o grupo que consiste em uma proteína, um peptídeo, sacarose, lactose, sorbitol, glicerol, propileno glicol, cloreto de sódio, sulfato de sódio, acetato de sódio, citrato de sódio, formiato de sódio, sorbato de sódio, cloreto de potássio, sulfato de potássio, acetato de potássio, citrato de potássio, formiato de potássio, acetato de potássio, sorbato de potássio, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, acetato de magnésio, citrato de magnésio, formiato de magnésio, sorbato de magnésio, metabissulfito de sódio, metil parabeno e propil parabeno.

[00220] Em uma modalidade preferencial, a enzima ou composição de aditivo de ração da presente invenção é misturada com um componente de ração para formar uma composição de ração. O termo "componente de ração" como usado aqui significa toda ou parte da composição de ração. Parte da composição de ração pode significar um constituinte da composição de ração ou mais do que um constituinte da composição de ração, por exemplo, 2 ou 3 ou 4. Em uma modalidade, o termo "componente de ração" abrange uma pré-mistura ou constituintes de pré-mistura. Preferencialmente, a ração pode ser uma forragem, ou uma pré-mistura da mesma, uma ração de composto, ou uma pré-mistura da mesma.

[00221] A composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção pode ser misturada com uma ração de composto, um componente de ração de composto ou com uma pré-mistura de uma ração de composto ou com uma forragem, um componente de forragem ou uma pré-mistura de uma forragem.

[00222] Qualquer composição de ração descrita no presente documento pode compreender um ou mais materiais de ração selecionados dentre o grupo que compreende a) cereais, como pequenos grãos (por exemplo, trigo, cevada, centeio, aveias, triticale e combinações dos mesmos) e/ou grãos grandes como maís ou sorgo; b) subprodutos de cereais, tais como farinha de milho com glúten, torta úmida (particularmente, torta úmida à base de milho), Grãos Secos de Destilaria (DDG) (particularmente, Grãos Secos de Destilaria à base de milho (cDDG)), Grãos Secos de Destilaria com Solúveis (DDGS) (particularmente, Grãos Secos de Destilaria com Solúveis à base de milho (cDDGS)), farelo de trigo, sêmea de trigo, farelo fino de trigo, farelo de arroz, cascas de arroz, cascas de aveia, semente de palma e polpa de cítricos; c) proteína obtida a partir de fontes como soja, girassol, amendoim, tremoço, ervilhas, fava, algodão, canola, farinha de peixe, proteína de plasma seca, farinha de carne e ossos, proteína da batata, soro, copra, gergelim; d) óleos e gorduras obtidos a partir de fontes vegetais e animais; e) minerais e vitaminas.

[00223] O termo "forragem" conforme usado no presente documento significa qualquer alimento que seja proporcionado a um animal (ao invés de o animal ter de forragear por si próprio). A forragem engloba plantas que foram cortadas. Ademais, forragem inclui silagem, alimentações comprimidas e peletizadas, óleos e rações mistas e também grãos germinados e legumes.

[00224] A forragem pode ser obtida a partir de uma ou mais das plantas selecionadas dentre: milho (maís) alfafa (luzerna), cevada, cornichão, brássicas, couve-de-folha, couve, colza (canola), rutabaga (couve-nabo), nabo, trevo, trevo híbrido, trevo vermelho, trevo subterrâneo, trevo branco, festuca, bromus, painço, aveia, sorgo, sojas, árvores (brotos de árvores em talhadia de cabeça para feno), trigo e legumes.

[00225] O termo "ração de composto" significa uma ração comercial na forma de uma farinha, um pélete, nozes, bolo ou um farelo. As rações de composto podem ser mescladas a partir de várias matérias-primas e aditivos. Estas combinações são formuladas de acordo com os requisitos específicos do animal alvo.

[00226] As rações de composto podem ser rações completas que proporcionam todos os nutrientes diários requeridos, concentrados que proporcionam uma parte da ração (proteína, energia) ou suplementos que proporcionam somente micronutrientes adicionais, tais como minerais e vitaminas.

[00227] Os principais ingredientes usados em ração de composto são os grãos de ração que incluem milho, trigo, farinha de canola, farinha de colza, tremoço, feijão soja, sorgo, aveia e cevada.

[00228] Adequadamente, uma pré-mistura denominada aqui pode ser uma composição composta por microingredientes, tais como vitaminas, minerais, conservantes químicos, antibióticos, produtos de fermentação e outros ingredientes essenciais. As pré-misturas são normalmente composições adequadas para combinação em rações comerciais.

[00229] Em uma modalidade, a composição de ração compreende ou consiste em milho, DDGS (tais como cDDGS), trigo, farelo de trigo ou qualquer combinação dos mesmos.

[00230] Em uma modalidade, o componente de ração pode ser milho, DDGS (por exemplo, cDDGS), trigo, farelo de trigo ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, a composição de ração compreende ou consiste em milho, DDGS (tais como cDDGS) ou uma combinação dos mesmos.

[00231] Uma composição de ração descrito no presente documento pode conter pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% ou pelo menos 60% em peso de farinha de milho e soja ou milho e soja com gordura total ou farinha de trigo ou farinha de girassol.

[00232] Por exemplo, uma composição de ração pode conter entre cerca de 5 a cerca de 40% de DDGS de milho. Para aves, a composição de ração pode conter, em média, entre cerca de 7 a 15% de DDGS de milho. Para suínos (porcos), a composição de ração pode conter, em média, 5 a 40% de DDGS de milho. A mesma pode conter milho como um único grão, em tal caso, a composição de ração pode compreender entre cerca de 35% a cerca de 80% de milho.

[00233] Nas composições de ração que compreendem grãos misturados, por exemplo, que compreendem milho e trigo, por exemplo, a composição de ração pode compreender pelo menos 10% de milho.

[00234] Adicional ou alternativamente, uma composição de ração pode também compreender pelo menos um material de ração rico em fibras e/ou pelo menos um subproduto do pelo menos um material de ração rico em fibras para proporcionar uma composição de ração rico em fibras. Os exemplos de materiais de ração ricos em fibras incluem: trigo, cevada, centeio, aveia, subprodutos de cereais, tais como farinha de milho com glúten, ração de milho com glúten, torta úmida, Grãos Secos de Destilaria (DDG), Grãos Secos de Destilaria com Solúveis (DDGS), farelo de trigo, sêmea de trigo, farelo fino de trigo, farelo de arroz, cascas de arroz, cascas de aveia, semente de palma e polpa de cítricos. Algumas fontes de proteínas podem ser também consideradas como ricas em fibras: proteína obtida a partir de fontes, tais como girassol, tremoço, feijões de fava e algodão. Em um aspecto, a composição de ração conforme descrita no presente documento compreende pelo menos um material rico em fibras e/ou pelo menos um subproduto do pelo menos um material de ração rico em fibras selecionado dentre o grupo que consiste em Grãos Secos de Destilaria com Solúveis (DDGS), particularmente, cDDGS, torta úmida, Grãos Secos de Destilaria (DDG), particularmente, cDDG, farelo de trigo e trigo, por exemplo. Em uma modalidade, a composição de ração da presente invenção compreende pelo menos um material rico em fibras e/ou pelo menos um subproduto do pelo menos um material de ração rico em fibras selecionado dentre o grupo que consiste em Grãos Secos de Destilaria com Solúveis (DDGS), particularmente, cDDGS, farelo de trigo e trigo, por exemplo.

[00235] A ração pode ser um ou mais dos seguintes: uma ração de composto e pré-mistura, incluindo péletes, nozes ou bolo (de gado); uma cultura ou resíduo de cultura: milho, soja, sorgo, aveia, cevada, copra, palha, joio, desperdício de beterraba-sacarina; farinha de peixe; farinha de carne e ossos; melaços; bolo de óleo e bolo de bagaço; oligossacarídeos; plantas de forragem conservadas; silagem; alga marinha; sementes e grãos, inteiros ou preparados por esmagamento, moagem, etc.; grãos germinados e legumes; extrato de levedura.

[00236] O termo "ração" conforme usado no presente documento engloba, em algumas modalidades, alimento para animais de estimação. Um alimento para animais de estimação é material vegetal ou animal destinado ao consumo por animais de estimação, tal como alimento para cães ou alimento para gatos. O alimento para animais de estimação, como alimento para cães e gatos, pode estar em uma forma seca, como croquete para cães, ou forma enlatada úmida. O alimento para gatos pode conter o aminoácido taurina.

[00237] A ração animal pode também incluir um alimento para peixes. Um alimento para peixes contém normalmente macronutrientes, elementos vestigiais e vitaminas necessários para manter o peixe cativo em boa saúde. O alimento para peixes pode estar na forma de um floco, pélete ou comprimido. As formas peletizadas, algumas das quais se afundam rapidamente, são frequentemente usadas para peixe maior ou espécies que se alimentam do fundo. Alguns alimentos para peixes contêm aditivos, tais como betacaroteno ou hormônios sexuais, para intensificar artificialmente a cor de peixe ornamental.

[00238] Em ainda outro aspecto, a ração animal engloba alimento para pássaros. O alimento para pássaros inclui alimento que é usado tanto em alimentadores de pássaros como para alimentar pássaros de estimação. Tipicamente, o alimento para pássaros compreende uma variedade de sementes, mas pode também englobar sebo (gordura de bovino ou carneiro).

[00239] Conforme usado neste documento, o termo "contatado" se refere à aplicação direta ou indireta de uma glicosídeo hidrolases como descrito no presente documento

[00240] (ou composição contendo uma glicosídeo hidrolase) a um produto (por exemplo, a ração). Exemplos dos métodos de aplicação que podem ser usados incluem, porém sem limitação, tratamento do produto em um material compreendendo a composição de aditivo de ração, aplicação direta por mistura da composição de aditivo de ração com o produto, pulverização da composição de aditivo de ração na superfície do produto ou imersão do produto em uma preparação da composição de aditivo de ração. Em uma modalidade, a composição de aditivo de ração da presente invenção é preferencialmente misturada com o produto (por exemplo, composição de ração). Alternativamente, a composição de aditivo de ração pode ser incluída na emulsão ou ingredientes em bruto de uma composição de ração. Isso permite que a composição confira um benefício de desempenho.

[00241] O termo termicamente estável significa que pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% ou 98% da enzima que estava presente/ativa no aditivo antes de aquecer até à temperatura especificada ainda está presente/ativa depois de resfriar à temperatura ambiente. Preferencialmente, pelo menos cerca de 80% da enzima que está presente e ativa no aditivo antes do aquecimento até à temperatura especificada está ainda presente e ativa após resfriar até à temperatura ambiente.

[00242] Também é possível que as glicosídeo hidrolases (ou uma composição enzimática que compreende tais glicosídeo hidrolases como descritas no presente documento) aqui descritas possam ser homogeneizadas para produzir um pó.

[00243] Em uma modalidade preferencial alternativa, uma glicosídeo hidrolase conforme descrito no presente documento (ou uma composição de enzimas compreendendo uma glicosídeo hidrolase conforme descrito no presente documento), pode ser formulada em grânulos conforme descrito no documento WO2007/044968 (denominados grânulos TPT) ou WO1997/016076 ou WO1992/012645 incorporado ao presente documento a título de referência. "TPT" significa Tecnologia de Proteção Térmica.

[00244] Em outro aspecto, quando a composição de aditivo de ração é formulada em grânulos, os grânulos compreendem um sal de barreira hidratado revestido sobre o núcleo de proteína. A vantagem de tal revestimento de sal é termotolerância melhorada, estabilidade no armazenamento melhorada e proteção contra outros aditivos de ração tendo de outro modo efeito adverso na enzima. Preferencialmente, o sal usado para o revestimento de sal tem uma atividade de água maior do que 0,25 ou umidade constante maior do que 60% a 20 °C. Em algumas modalidades, o revestimento de sal compreende Na2SO4.

[00245] Um método para preparar uma glicosídeo hidrolase conforme descrito no presente documento (ou uma composição de enzimas compreendendo uma glicosídeo hidrolase conforme descrito no presente documento) pode também compreender a etapa adicional de peletizar o pó. O pó pode ser misturado com outros componentes conhecidos na técnica. O pó, ou mistura compreendendo o pó, pode ser forçado através de uma matriz, e as fitas resultantes são cortadas em péletes adequados de comprimento variável.

[00246] Opcionalmente, a etapa de peletização pode incluir um tratamento com vapor, ou estágio de condicionamento, antes da formação dos péletes. A mistura que compreende o pó pode ser colocada em um condicionador, por exemplo, um misturador com injeção de vapor. A mistura é aquecida no condicionador até uma temperatura especificada, tal como de 60 a 100 °C, temperaturas típicas seriam 70 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C ou 95 °C. O tempo de permanência pode ser variável de segundos a minutos e até mesmo horas. Tal como 5 segundos, 10 segundos, 15 segundos, 30 segundos, 1 minutos, 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos e 1 hora. Será entendido que uma glicosídeo hidrolase conforme descrito no presente documento (ou uma composição enzimática compreendendo uma glicosídeo hidrolase conforme descrito no presente documento) é adequada para adição a qualquer material de ração apropriado.

[00247] Será entendido pela pessoa versada que diferentes animais requerem diferentes composições de ração, e até o mesmo animal pode requerer diferentes composições de ração, dependendo do propósito para o qual o animal é criado.

[00248] Opcionalmente, a composição de ração pode também conter minerais adicionais, como, por exemplo, cálcio e/ou vitaminas adicionais. Em algumas modalidades, a composição de ração é uma mistura de farinha de feijão soja e milho.

[00249] A composição de ração é tipicamente produzida em moinhos de ração nos quais as matérias-primas são em primeiro lugar trituradas até um tamanho de partículas adequado e depois misturadas com aditivos apropriados. A composição de ração pode ser depois produzida como um mingau ou péletes; em que os últimos envolvem tipicamente um método pelo qual a temperatura é aumentada até um nível alvo, e depois a ração é passada através de uma matriz para produzir péletes de um tamanho particular. Os péletes são deixados para resfriar. Subsequentemente podem ser adicionados aditivos líquidos como gordura e enzima. A produção de composição de ração pode também envolver uma etapa adicional que inclui extrusão ou expansão antes da peletização - em particular por técnicas adequadas que podem incluir pelo menos o uso de vapor.

[00250] A composição de ração pode ser uma composição de ração para um animal monogástrico, tais como aves (por exemplo, frango de corte, poedeira, b reprodutores de frangos de corte, peru, pato, ganso, galinha d'água) e suínos (todas as categorias de idade), um ruminante, tal como gado (por exemplo, vacas ou touros (incluindo bezerros)), cavalos, ovelha, um animal de estimação (por exemplo, cães, gatos) ou peixes (por exemplo, peixe agástrico, peixe gástrico, peixe de água doce, tais como salmão, bacalhau, truta e carpa, por exemplo, carpa koi, peixe marinho, tal como badejo, e crustáceos, tais como camarões, mexilhões e vieiras). Preferencialmente, a composição de ração é para porcos.

[00251] A composição de aditivo de ração e/ou a composição de ração que compreende a mesma podem ser usados em qualquer forma adequada. A composição de aditivo de ração pode ser usada na forma de preparações sólidas ou líquidas ou suas alternativas. Exemplos de preparações sólidas incluem pós, pastas, bolo alimentar, cápsulas, péletes, comprimidos, poeiras e grânulos que podem ser molháveis, secos por pulverização ou liofilizados. Exemplos de preparações líquidas incluem, porém sem limitação, soluções, suspensões e emulsões aquosas, orgânicas ou aquosas-orgânicas.

[00252] Em algumas aplicações, as composições de aditivo de ração podem ser misturadas com a ração ou administradas na água potável.

[00253] Uma composição de aditivo de ração que compreende misturar por adição uma glicosídeo hidrolase conforme ensinado no presente documento com um carreador, diluente ou excipiente e (opcionalmente) embalagem aceitável de ração.

[00254] A composição de ração e/ou a composição de aditivo de ração podem ser combinados com pelo menos um mineral e/ou pelo menos uma vitamina. As composições assim derivadas podem ser referidas no presente documento como uma pré-mistura. A composição de ração pode compreender pelo menos 0,0001% em peso do aditivo de ração. Adequadamente, a composição de ração pode compreender pelo menos 0,0005%; pelo menos 0,0010%; pelo menos 0,0020%; pelo menos 0,0025%; pelo menos 0,0050%; pelo menos 0,0100%; pelo menos 0,020%; pelo menos 0,100%; pelo menos 0,200%; pelo menos 0,250%; pelo menos 0,500% em peso do aditivo de ração.

[00255] Preferencialmente, um alimento ou composição de aditivo de ração pode compreender adicionalmente pelo menos um carreador fisiologicamente aceitável. O carreador fisiologicamente aceitável é, de preferência, selecionado dentre pelo menos um dentre maltodextrina, calcário (carbonato de cálcio), ciclodextrina, trigo ou um componente de trigo, sacarose, amido, Na2SO4, Talco, PVA e misturas dos mesmos. Em uma modalidade adicional, o alimento ou aditivo de ração pode compreender adicionalmente um quelador de íon de metal. O quelador de íon de metal pode ser selecionado dentre EDTA ou ácido cítrico.

[00256] Em algumas modalidades, o alimento ou composição de aditivo de ração compreende uma glicosídeo hidrolase conforme descrito no presente documento, a um nível de pelo menos 0,0001 g/kg, 0,001 g/kg, pelo menos 0,01 g/kg, pelo menos 0,1 g/kg, pelo menos 1 g/kg, pelo menos 5 g/kg, pelo menos 7,5 g/kg, pelo menos 10,0 g/kg, pelo menos 15,0 g/kg, pelo menos 20,0 g/kg, pelo menos 25,0 g/kg. Em algumas modalidades, o alimento ou aditivo de ração é compreendido a um tal nível que, quando adicionado a um material de ração ou alimento, o material de ração compreenda uma glicosídeo hidrolase conforme descrito no presente documento em uma faixa de 1 a 500 mg/kg, 1 a 100 mg/kg, 2 a 50 mg/kg ou 2 a 10 mg/kg. Em algumas modalidades da presente invenção, o material de ração ou alimento compreende pelo menos 100, 1.000, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 10.000, 20.000, 30.000, 50.000, 100.000, 500.000, 1.000.000 ou 2.000.000 Unidades de glicosídeo hidrolase por quilograma de material de alimentação ou ração.

[00257] As faixas podem incluir, porém sem limitação, qualquer combinação das faixas inferior e superior discutidas acima.

[00258] Formulações que compreendem qualquer das glicosídeo hidrolases aqui descritas e composições descritas no presente documento podem ser produzidas de qualquer modo para assegurar que a formulação compreende enzimas ativas. Tais formulações podem ser como um líquido, um pó seco ou um grânulo. Preferencialmente, a composição de aditivo de ração está em uma forma sólida adequada para adição a um pélete de ração.

[00259] Pó seco ou grânulos podem ser preparados por meios conhecidos por aqueles versados na técnica, tais como granulação de alto cisalhamento, granulação em tambor, extrusão, esferonização, aglomeração em leito fluidizado, secagem por pulverização em leito fluidizado.

[00260] Glicosídeo hidrolases e composições descritas no presente documento podem ser revestidas, por exemplo, encapsuladas. Em uma modalidade, o revestimento protege as enzimas do calor e pode ser considerado um termoprotetor. Em uma modalidade, o revestimento protege a enzima de baixo pH. Eudragit® é um exemplo de um material de revestimento que pode ser usado.

[00261] A composição de aditivo de ração descrita no presente documento pode ser formulada a um pó seco ou grânulos conforme descrito no documento WO2007/044968 (denominados grânulos TPT) ou WO1997/016076 ou WO1992/012645 (cada um dos quais é incorporado ao presente documento a título de referência).

[00262] Em uma modalidade, a ração animal pode ser formulada em um grânulo para composições de ração que compreendem: um núcleo; um agente ativo; e pelo menos um revestimento, sendo que o agente ativo do grânulo retém pelo menos 50% de atividade, pelo menos 60% de atividade, pelo menos 70% de atividade, pelo menos 80% de atividade após as condições selecionadas a partir de um ou mais dentre a) um processo de peletização de ração, b) um processo de pré-tratamento de ração aquecida a vapor, c) armazenamento, d) armazenamento como um ingrediente em uma mistura não peletizada e e) armazenamento como um ingrediente em uma mistura de base de ração ou uma pré-mistura de ração que compreende pelo menos um composto selecionado dentre minerais vestigiais, ácidos orgânicos, açúcares redutores, vitaminas, cloreto de colina e compostos que resultam em uma pré-mistura de ração ou mistura de base de ração ácida ou básica.

[00263] Em relação ao grânulo, pelo menos um revestimento pode compreender um material de hidratação por umidificação que constitui pelo menos 55% em p/p do grânulo; e/ou pelo menos um revestimento pode compreender dois revestimentos. Os dois revestimentos podem ser um revestimento de hidratação por umidificação e um revestimento de barreira de umidificação. Em algumas modalidades, o revestimento de hidratação por umidificação pode ser entre 25% e 60% em p/p do grânulo, e o revestimento de barreira de umidificação pode ser entre 2% e 15% em p/p do grânulo. O revestimento de hidratação por umidificação pode ser selecionado dentre sais inorgânicos, sacarose, amido e maltodextrina, e o revestimento de barreira de umidificação pode ser selecionado dentre polímeros, gomas, soro de leite e amido.

[00264] O grânulo pode ser produzido com o uso de um processo de peletização de ração, e o processo de pré-tratamento de ração pode ser conduzido entre 70 °C e 95 °C por até diversos minutos, tal como entre 85 °C e 95 °C.

[00265] A composição de aditivo de ração pode ser formulada em um grânulo para ração animal que compreende: um núcleo; um agente ativo, sendo que o agente ativo do grânulo retém pelo menos 80% de atividade após o armazenamento e após um processo de peletização aquecido por vapor em que o grânulo é um ingrediente; um revestimento de barreira de umidificação; e um revestimento de hidratação por umidificação que é pelo menos 25% em p/p do grânulo, sendo que o grânulo tem uma atividade de água menor do que 0,5 antes do processo de peletização aquecido por vapor.

[00266] O grânulo pode ter um revestimento de barreira de umidificação selecionado dentre polímeros e gomas, e o material de hidratação por umidificação pode ser um sal inorgânico. O revestimento de hidratação por umidificação pode ser entre 25% e 45% em p/p do grânulo, e o revestimento de barreira de umidificação pode ser entre 2% e 10% em p/p do grânulo.

[00267] Um grânulo pode ser produzido com o uso de um processo de peletização aquecido por vapor que pode ser conduzido entre 85 °C e 95 °C por até diversos minutos.

[00268] Alternativamente, a composição está em uma formulação líquida adequada para consumo, de preferência, tal consumo de líquido contém um ou mais dos seguintes: um tampão, sal, sorbitol e/ou glicerol.

[00269] Também, a composição de aditivo de ração pode ser formulada aplicando-se, por exemplo, aspergindo-se, a enzima (ou enzimas) em um substrato carreador, tal como trigo triturado, por exemplo.

[00270] Em uma modalidade, a composição de aditivo de ração pode ser formulada como uma pré-mistura. A título de exemplo apenas, a pré- mistura pode compreender um ou mais componentes de ração, como um ou mais minerais e/ou uma ou mais vitaminas.

[00271] Em algumas modalidades, uma glicosídeo hidrolase estará em um carreador fisiologicamente aceitável. Os carreadores adequados podem ser grandes macromoléculas lentamente metabolizadas, tais como proteínas, polipeptídeos, lipossomas, polissacarídeos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido e partículas virais inativas. Sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser usados, por exemplo, sais de ácidos minerais, tais como cloridratos, bromidratos, fosfatos e sulfatos, ou sais de ácidos orgânicos, tais como acetatos, propionatos, malonatos e benzoatos. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis em composições terapêuticas podem conter, adicionalmente, líquidos, tais como água, solução salina, glicerol e etanol. Adicionalmente, substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes ou emulsificantes ou substâncias de tamponamento de pH, podem estar presentes em tais composições. Tais carreadores permitem que as composições farmacêuticas sejam formuladas como tabletes, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas fluidas e suspensões para ingestão pelo paciente. Uma vez formuladas, as composições da invenção podem ser administradas diretamente ao ruminante.

[00272] Os exemplos não limitativos das composições e métodos revelados no presente documento incluem: 1. Método para melhorar a digestibilidade de amido e o rendimento de glicose em um ruminante que compreende adicionar pelo menos uma alfa-1,4/1,6-glicosídeo hidrolase (GLCH) como um aditivo de ração alimentar para ruminantes, em que a referida hidrolase: (a) tem pelo menos 20% de atividade a um pH inferior ou igual a 3 na presença de pepsina em comparação com a atividade da hidrolase a pH 6 na presença de pepsina, (b) a referida hidrolase é ativa em pelo menos duas de três câmaras digestivas de um ruminante compreendendo um rúmen, um abomaso e um intestino delgado e (c) a hidrolase funciona com enzimas digestivas presentes nas câmaras digestivas do ruminante para aumentar a digestibilidade de amido e o rendimento de glicose. 2. Hidrolase de acordo com a modalidade 1, em que a pelo menos uma enzima GLCH é capaz de hidrolisar amido em bruto sob condições comparáveis às encontradas no rúmen ou abomaso. 3. Hidrolase de acordo com a modalidade 1, em que a referida hidrolase é selecionada a partir do grupo consistindo em alfa- amilases, glicoamilases e alfa-glucosidases. 4. Hidrolase de acordo com a modalidade 2, em que a referida hidrolase é selecionada a partir do grupo consistindo em alfa- amilases e glicoamilases. 5. Hidrolase de acordo com a modalidade 3 ou 4, em que as alfa-amilases são membros da família GH 13 ou são selecionadas a partir do grupo consistindo em alfa-amilase (EC 3.2.1.1); pululanase (EC 3.2.1.41); ciclomaltodextrina glucanotransferase (EC 2.4.1.19); ciclomaltodextrinase (EC 3.2.1.54); trealose-6-fosfato hidrolase (EC3.2.1.93); oligo-alfa-glucosidase (EC 3.2.1.10); amilase maltogênica (EC 3.2.1.133); neopululanase (EC 3.2.1.135); alfa-glucosidase (EC 3.2.1.20); alfa-amilase formando maltotetrose (EC3.2.1.60); isoamilase (EC 3.2.1.68); glucodextranase (EC 3.2.1.70); alfa-amilase formando malto-hexose (EC 3.2.1.98); alfa-amilase formando maltotriose (EC 3.2.1.116); enzima de ramificação (EC 2.4.1.18); trealose sintase (EC 5.4.99.16); 4-alfa-glucanotransferase (EC 2.4.1.25); alfa-amilase formando maltopentose (EC 3.2.1.-); amilosucrase (EC 2.4.1.4); sacarose fosforilase (EC 2.4.1.7); malto-oligosiltrealose trealo-hidrolase (EC 3.2.1.141); isomaltulose sintase (EC 5.4.99.11); malto- oligosiltrealose sintase (EC 5.4.99.15); amilo-alfa-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.33); e alfa-1,4-glucano: fosfato alfa-maltosiltransferase (EC 2.4.99.16). 6. Hidrolase de acordo com a modalidade 3 ou 4, em que as glucosidases são membros da família GH 13 ou GH31 ou são selecionadas a partir do grupo consistindo em alfa-glucosidase (EC 3.2.1.20); alfa-galactosidase (EC 3.2.1.22); alfa-manosidase (EC 3.2.1.24); alfa-1,3-glucosidase (EC 3.2.1.84); sacarase-isomaltase (EC 3.2.1.48) (EC 3.2.1.10); alfa-xilosidase (EC 3.2.1.177); alfa-glucano liase (EC 4.2.2.13); isomaltosiltransferase (EC 2.4.1.-); oligossacarídeo alfa-1,4-glucosiltransferase (EC 2.4.1.161); sulfoquinovosidase (EC 3.2.1.-). 7. Hidrolase de acordo com a modalidade 3 ou 4, em que as glicoamilases são membros da família GH15 ou são selecionadas a partir do grupo consistindo em glicoamilase (EC 3.2.1.3); glucodextranase. (EC 3.2.1.70); alfa-trealase (EC 3.2.1.28); e dextrano dextrinase (EC 2.4.1.2). 8. Método para aumentar a digestibilidade de amido, aumentar o rendimento de glicose, aumentar a digestão de matéria seca e aumentar a produção de gás durante a fermentação em um ruminante, compreendendo adicionar à ração uma composição enzimática compreendendo (i), pelo menos, uma enzima GLCH como aditivo de ração para ruminantes, em que a referida enzima: (a) tem pelo menos 20% de atividade a um pH inferior ou igual a 3 na presença de pepsina em comparação com a atividade das enzimas a pH 6 na presença de pepsina, (b) a referida enzima é ativa em pelo menos duas de três câmaras digestivas de um ruminante compreendendo um rúmen, um abomaso e um intestino delgado e (c) a enzima funciona com amilase pancreática para aumentar o rendimento de glicose e (ii) pelo menos uma protease. 9. Composição enzimática de acordo com a modalidade 8, em que a pelo menos uma enzima GLCH é capaz de hidrolisar amido em bruto. 10. Composição enzimática de acordo com a modalidade 8, em que a referida enzima GLCH é selecionada a partir do grupo consistindo em alfa-amilases, glicoamilases e alfa-glucosidases. 11. Composição enzimática de acordo com a modalidade 9, em que a referida enzima é selecionada a partir do grupo consistindo em alfa-amilases e glicoamilases. 12. Composição enzimática de acordo com a modalidade 10 ou 11, em que a pelo menos uma enzima GLCH é selecionada a partir do grupo consistindo em alfa-amilase (EC 3.2.1.1); pululanase (EC 3.2.1.41); ciclomaltodextrina glucanotransferase (EC 2.4.1.19); ciclomaltodextrinase (EC 3.2.1.54); trealose-6-fosfato hidrolase (EC3.2.1.93); oligo-alfa-glucosidase (EC 3.2.1.10); amilase maltogênica (EC 3.2.1.133); neopululanase (EC 3.2.1.135); alfa-glucosidase (EC 3.2.1.20); alfa-amilase formando maltotetrose (EC3.2.1.60); isoamilase (EC 3.2.1.68); glucodextranase (EC 3.2.1.70); alfa-amilase formando malto-hexose (EC 3.2.1.98); alfa-amilase formando maltotriose (EC 3.2.1.116); enzima de ramificação (EC 2.4.1.18); trealose sintase (EC 5.4.99.16); 4-alfa-glucanotransferase (EC 2.4.1.25); alfa-amilase formando maltopentose (EC 3.2.1.-); amilosucrase (EC 2.4.1.4); sacarose fosforilase (EC 2.4.1.7); malto-oligosiltrealose trealo-hidrolase (EC 3.2.1.141); isomaltulose sintase (EC 5.4.99.11); malto- oligosiltrealose sintase (EC 5.4.99.15); amilo-alfa-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.33); e alfa-1,4-glucano: fosfato alfa-maltosiltransferase (EC 2.4.99.16). 13. Composição enzimática de acordo com a reivindicação 10 ou 11, em que as glucosidases são selecionadas a partir do grupo consistindo em alfa-glucosidase (EC 3.2.1.20); alfa-galactosidase (EC 3.2.1.22); alfa-manosidase (EC 3.2.1.24); alfa-1,3-glucosidase (EC 3.2.1.84); sacarase-isomaltase (EC 3.2.1.48) (EC 3.2.1.10); alfa- xilosidase (EC 3.2.1.177); alfa-glucano liase (EC 4.2.2.13); isomaltosiltransferase (EC 2.4.1.-); oligossacarídeo alfa-1,4- glucosiltransferase (EC 2.4.1.161); sulfoquinovosidase (EC 3.2.1.-). 14. Composição enzimática de acordo com a modalidade 10 ou 11, em que as glicoamilases são selecionadas a partir da família das glicosil hidrolases GH15. 15. Composição enzimática de acordo com a modalidade 8, em que a protease é selecionada a partir do grupo consistindo em uma protease ácida ou uma metaloprotease neutra. 16. Composição enzimática de acordo com a modalidade 15, em que a protease é uma protease aspártica fúngica ou uma metaloprotease neutra bacteriana. EXEMPLOS

[00273] A menos que definido de outro modo no presente documento, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado conforme comumente entendido por uma pessoa com habilidade comum na técnica à qual a presente divulgação pertence. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2a Edição, John Wiley e Sons, Nova Iorque (1994), e Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.I. (1991) proporcionam a uma pessoa versada na técnica um dicionário geral de muitos dos termos usados nesta descrição.

[00274] A descrição é adicionalmente definida nos Exemplos a seguir. Deve-se compreender que os Exemplos, embora indicando certas modalidades, são dados a título de ilustração apenas. A partir da discussão acima e dos Exemplos, uma pessoa versada na técnica pode determinar características essenciais desta descrição e, sem se afastar do espírito e do escopo da mesma, pode fazer várias mudanças e modificações para adaptar a mesma para vários usos e condições.

EXEMPLO 1 Materiais utilizados nos exemplos subsequentes

[00275] As amostras de proteína listadas na Tabela 1 foram usadas em exemplos subsequentes. A Tabela 1 mostra o tipo de enzima, organismo de fonte (quando conhecido) e fonte interna ou comercial das amostras e referências de patentes para sequências.Tabela 1. Lista de componentes de enzimas avaliados.

EXEMPLO 2 Hidrólise de farinha de milho por amilase AkAA na presença da pepsina porcina de protease aspártica e Trichoderma reesei AFP

[00276] A mistura de reação continha 1 mL de pasta fluida de farinha de milho (20% p/p, pH 3,2), AkAA (209 mg/mL) 20 μL, pepsina porcina (Sigma, P7000, 10000 U/mL em água) 50 μL, AFP de Trichoderma reesei (5 mg/mL) 5 μL e 50 μL e água para um volume final de 1,07 mL. A reação foi realizada a 40 °C durante 5 h com agitação a 200 rpm. No final da reação, 30 μL de sobrenadante de reação foram misturados com 0,23 mL de água e filtrados através de um filtro de membrana de 0,22 μm. O filtrado (40 μL) foi submetido a análise por HPLC em uma coluna HPLC Aminex HPX-87N (Bio-Rad) coim um caudal de 0,6 mL/min, a 78 °C, durante 15 minutos, utilizando água como eluente. Picos de glicose e maltose foram detetados com um detector de RI em linha (índice refratário), e as áreas dos picos foram integradas usando software Chromeleon (Dionex) de acordo com as instruções do fabricante.

[00277] A atividade de enzimas de ração para ruminantes não deve ser afetada pela pepsina se é suposto serem funcionais no abomaso e intestino delgado.

[00278] A Figura 1 mostra que nem a pepsina nem a AFP afetaram negativamente a liberação de glicose (G1) e maltose (G2) da farinha de milho a pH3.2. pH 3,2 é um dos valores de pH que podem ocorrer no abomaso, especialmente após a ingestão de alimento (Constable et al., 2005. Effect of suckling cow's milk or milk replacer on abomasal luminal pH in dairy calves, J. Vet. Intern. Med. 19:97-102). Na verdade, a adição de pepsina e AFP à mistura de reação contendo AkAA aumentou a liberação de G1 em 4 e 22%, respectivamente. A pepsina, por si só, causou pouca ou nenhuma liberação de G1 e G2 a partir da farinha de milho, enquanto AFP, por si só, provocou alguma liberação de G1, mas não de G2. AFP adicionada à mistura de reação contendo AkAA não só aumentou a liberação de G1, como também aumentou a quantidade de G1 em relação a G2, indicando que AFP favoreceu mais a liberação de glicose, um monômero (G1). É G1 que pode ser absorvido pelos animais diretamente na corrente sanguínea.

[00279] Nas condições comparáveis às encontrados no estômago ruminal e abomaso, acredita-se que as duas proteases aspárticas podem ter tornado os grânulos de amido de milho mais acessível a AkAA ao hidrolisar proteínas que rodeiam os grânulos e proteínas encontradas no interior dos grânulos (Mu-Forster et al., 1996. Physical association of starch biosynthetic enzymes with starch granules of maize endosperm granule-associated forms of starch synthase I and starch branching enzyme II, Plant Physiol. 111: 821-829; Mu-Forster et al., 1998. Surface localization of zein storage proteins in starch granules from maize endosperm, proteolytic removal by thermolysin and in vitro cross-linking of granule-associated polypeptides. Plant Physiol. 116: 1563-1571). A pepsina é a principal enzima proteolítica produzida no estômago e abomaso. Ela digere proteínas através da clivagem de ligações peptídicas interiores com um pH ideal de 2 a 4. A AFP é endopeptidase extracelular de T. reesei com gama de pH ideal de 3 a 4,5 (Tabela 1).

[00280] O milho utilizado no Exemplo 2 e outros Exemplos, a menos que especificado de outra forma, consistiu de 88,2% de matéria seca (MS), 9,3% de proteína bruta (PB), 2,0% de fibra em detergente ácido (FDA), 6,6% de fibra em detergente neutro tratada com amilase (FDNa), 78,5% de carboidratos não fibrosos (CNF), 89,0% de nutrientes digestíveis totais (NDT).

EXEMPLO 3 Estabilidade da amilase AkAA na presença de fluido ruminal

[00281] Para que um aditivo de enzima de ração animal seja eficaz em ruminantes, é importante que a enzima tenha estabilidade considerável no fluido ruminal e sob condições ruminais. Os dados da Tabela 2 mostram que AkAA é estável na presença de fluido ruminal isento de células incubado a 40 °C durante 4,5 h, com a liberação de glicose e maltose a não ser significativamente afetada por quantidades crescentes de fluido ruminal.

[00282] A AkAA usada tinha uma concentração de proteína total de 209 mg/mL, grânulos de amido de arroz (Sigma S7260) foram preparados em água até obter pasta fluida a 8% (p/p) com pH ajustado para 3,2. O pH tornou-se pH 5,3 após misturar com a mistura de pré- incubação. O fluido ruminal tinha um pH de 6,1 coletado de vacas leiteiras alimentadas com uma ração de grama (41,66%), cevada integral (14,79%), milho (16,78%), polpa de beterraba seca e bolo de resíduo de beterraba (3,02%), cevada moída (6,66%), farinha de sementes de colza (4,88%), farinha de soja (4,46%), Komix (mistura de vitaminas e minerais, 0,2%), cápsulas R0d Suplex (mistura de vitaminas a 0,05%), Suplex E-5000 (vitamina E e selênio, 0,03%), giz (0,07%), sal (0,06%) e água (7,33%). O fluido ruminal foi oferecido pelo Departamento de Ciência Animal, Universidade de Aarhus (Blichers Alle 20, DK-8830 Tjele, Dinamarca). O açúcar liberado pela reação foi analisado em HPLC com coluna de HPLC Aminex HPX-87N da Bio-Rad como Exemplo 2.Tabela 2. Estabilidade da AkAA no fluido ruminal em 40 °C por 4,5 horas.

EXEMPLO 4 Estabilidade de AkAA a pancreatina e efeito de AkAA com pancreatina no aumento do rendimento de glicose e redução do rendimento de maltotriose

[00283] A mistura de reação continha pancreatina porcina (Sigma P7545, 25 mg/mL feitos em 0,1% de NaCl), 0, 5, 10 e 20 μL, AkAA (209 mg/mL) 20 μL, 0,1 M de Mes (pH 6,7) 60 μL tendo 5 mM de CaCh, Tween 80 (0,01% p/v). Solução de NaCl a 0,1% foi adicionada a um volume final de reação de 0,12 mL. A mistura de reação foi incubada a 40 °C por 3 h e, em seguida, o substrato de 1,5 mL de pasta fluida de farinha de milho (10% p/p) foi adicionado e incubado adicionalmente a 40 °C por 13 horas. O sobrenadante obtido foi diluído 8,33 vezes e 40 μL foram analisados em HPLC quanto a glicose, maltose e maltotriose utilizando detector de RI como descrito no Exemplo 2.

[00284] A Figura 2 mostra que AkAA estava ativa em condições que simulam as do intestino delgado ruminal. Mostrou efeitos adicionais e complementares com as 3 doses de pancreatina porcina (Pan) testadas. A inclusão de AkAA com Pan aumentou a produção de glicose e maltose e diminuiu a formação/acumulação de maltotriose, o que é nutricionalmente vantajoso, uma vez que a glicose pode ser absorvida diretamente enquanto a maltose pode ser hidrolisada pela alfa- glicosidase mucosal intestinal (maltase) (Nichols et al., 1998. Human small intestinal maltase-glucoamylase cDNA cloning, homology to sucrase-isomaltase, J. Biol. Chem. 273:3076-3081). A pancreatina é o principal coquetel de enzimas digestivas para animais, especialmente, monogástricos e ruminantes. A mesma contém componentes enzimáticos como a tripsina, amilase e lipase, ribonuclease e protease, produzidos pelas células exócrinas do pâncreas porcino. Assim, a pancreatina é uma combinação de enzimas que lhe permitem a hidrólise de proteínas, amido e gorduras.

EXEMPLO 5 Atividade da amilase AtAA sobre a farinha de milho na presença de pepsina e pancreatina

[00285] Para a reação de pepsina, a mistura de reação teve 0,1 mL de pasta fluida de amido de milho a 10% (p/p) (Sigma) S4126 preparados em 60 mM de glicina-HCl (pH 2,5), 10 μL de pepsina (Sigma P7000, 10000 U/mL em água), e 0,6 μL (16,76 mg/mL) de amilase AtAA. A reação foi realizada a 40 °C durante 3 h. As amostras foram centrifugadas. O sobrenadante foi diluído, filtrado e analisado em HPLC usando detector de RI para análise de açúcar como descrito no Exemplo 2. A reação de pancreatina foi igual à reação de pepsina, exceto que a pasta fluida de amido de milho foi preparada em 0,1 M de Mes (pH 6,7) e foram adicionados 5 μL de 25 mg/mL de pancreatina porcina (Pan) (Sigma P7545, dissolvida em NaCl a 0,1%).

[00286] A Figura 3 mostra que a alfa-amilase AtAA de Aspergillus terreus (AtAmy1) estava ativa quando testada na presença de pepsina a pH 2,5 ou pancreatina a pH 6,7. Além disso, AtAA e pancreatina mostraram um efeito complementar na conversão de toda a maltotriose basicamente para glicose que pode ser absorvida diretamente pelos animais.

EXEMPLO 6 Hidrólise de amido de milho por amilases AkAA e AcAA na presença de fluido ruminal

[00287] Fluido ruminal isento de células, 240 μL foram misturados com 10 μL de amostras de enzimas: AkAA (209 mg/mL), AcAA (172 mg/mL), AkAA com GA Trichoderma reesei (TrGA) e AFP Trichoderma reesei (223 mg/mL) ou AcAA com variante TrGA de CS4 e AFP (125 mg/mL) (Tabela 1) e incubadas a 40 °C por 4 h, seguido da adição de 250 μL de pasta fluida de amido de milho (Sigma S4126) dissolvida em acetato a 0,1 M contendo 5 mM de CaCl2 (pH4.5) e incubada adicionalmente por 30 min. No final da reação, as amostras de reação foram filtradas e os sobrenadantes foram analisados para detecção de açúcares redutores totais, utilizando reagente de ácido 3,5- dinitrosalicílico alcalino (DNS) de acordo com Yu et al., (Yu et al, 1997. Methods for the assay of 1,5-anhydro-D-fructose and alpha-1,4-glucan lyase. Carbohydr. Res. 305:73-82) com pequenas modificações. Ou seja, 10 μL de amostras de reação diluídas foram transferidos para uma placa PCR de 96 poços contendo 120 μL do reagente DNS. A placa foi incubada a 95 °C durante 5 min, seguido de 5 min de resfriamento a 20 °C e, em seguida, 100 μL destas misturas foram transferidos para uma nova placa de 96 poços que foi utilizada para medir a densidade óptica a 550 nm em um espectrofotômetro.

[00288] A Figura 4 mostra redução muito pequena na atividade de hidrólise de milho para todas as 4 amostras de enzimas testadas após incubação no fluido ruminal. A presença de GA de Trichoderma reesei e sua variante (CS4) e enzimas AFP de Trichoderma reesei teve um efeito benéfico sobre a hidrólise total do substrato catalisado por ambas as amostras de amilase AkAA e AcAA. Ambas as misturas de enzimas de amilase/glicoamilase/protease foram preparadas em uma proporção de proteína total de 29:70:1. Como mostrado na Figura 4, as amilases AkAA, AcAA e sua mistura com glicoamilases TrGA e CS4 e a protease aspártica AFP perderam menos de 13% da sua atividade total após 4 h de pré-incubação no fluido ruminal a 40 °C, seguido de 30 min de incubação com amido de milho a 40 °C, pH 4,5 (quando comparado com misturas não tratadas).

[00289] Estes resultados sob condições ruminais simuladas indicam que estas duas amilases e as suas misturas com glicoamilases e peptidase aspártica poderiam sobreviver no trato digestivo de um ruminante.

EXEMPLO 7 Atividade das amilases AkAA e AcAA na presença de pepsina sob diferentes condições de pH

[00290] A mistura de reação continha 1,0 mL de pasta fluida de farinha de milho (20% p/p) preparado em 0,1 M de glicina-HCl (pH 3,2), 0,1 M de acetato (pH 4,1, 4,7) ou 0,1 M de Mes (pH 6,0), todos com 5 mM de CaCh, 25 μL de AkAA (209 mg/mL) ou AcAA (172 mg/mL), 25 μL de pepsina (Sigma P7000, 10000 U/mL em água). A reação foi realizada a 40°C por 2 horas. No final da reação, o sobrenadante obtido por centrifugação foi filtrado através de filtro de 0,45 μm e diluído por 20 vezes. As amostras diluídas foram avaliadas quanto a açúcar redutor total conforme descrito no Exemplo 6.

[00291] A Figura 5 mostra hidrólise de farinha de milho pelas amostras AkAA e AcAA incubadas a pH 3,2, 4,1, 4,7 e 6,0 na ausência ou presença de pepsina. A atividade de amilase, medida como a liberação de açúcar redutor total por AkAA e AcAA não foi significativamente afetada na presença de pepsina em comparação com a ausência de pepsina. Além disso, indica que estas duas amilases compartilhando 70% de identidade são ativas em condições comparáveis às que seriam encontradas no trato digestivo de um ruminante: por exemplo, uma das condições de acidez do abomaso (pH 3,2), condições do intestino delgado superior (pH 4,1-4,7) e condições comparáveis às encontradas no intestino delgado e rúmen (ambas a pH 6,0 ou cerca de pH 6,0). Assim, as amilases AkAA e AcAA parecem mais ativas a um pH relevante para o rúmen do que outras amilases atualmente em uso como aditivos de ração de monogástricos, como, por exemplo, alfa-amilases de Bacillus amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. subtilis, Aspergillus niger e A. oryzae (Monteiro de Souza et al., Application of microbial alpha-amylase in industry - a review. Brazilian Journal of Microbiology (2010) 41: 850-861).

EXEMPLO 8 Atividade de misturas de endo- /exo-glucano hidrolases e endo proteases na presença de pancreatina

[00292] A mistura de reação continha 1,0 mL de pasta fluida de farinha de milho (20% p/p, em 0,1 M de Mes, 5 mM de CaCl2 pH 6,0), 25 μL do coquetel de enzimas de AkAA+TrGA+AFP (223 mg/mL) ou AcAA+CS4+AFP (125 mg/mL), 25 μL de pancreatina porcina (Sigma P7545, 25 mg/mL em 0,1% de NaCl). A reação foi realizada a 40 °C por 2 horas. No final da reação, o sobrenadante obtido por centrifugação foi filtrado através de filtro de 0,45 μm e diluído por 20 vezes. As amostras diluídas foram avaliadas quanto a açúcar redutor total conforme descrito no Exemplo 6. A Figura 6 mostra que após 2 h de incubação com farinha de milho (20% p/p) a 40 °C e pH 6,0 na presença de pancreatina, a mistura de enzimas de AkAA+TrGA+AFP e a mistura de enzimas de AcAA+CS4+AFP aumentou a produção de açúcar redutor em 4,2 e 3,8 vezes, respectivamente. Este estudo demonstra que a mistura AkAA+TrGA+AFP e AcAA+CS4+AFP sobreviveu na passagem pelo rúmen e abomaso e que pode interagir de forma sinérgica com enzimas de pancreatina para promover a liberação de açúcar.

[00293] Tal como AkAA (Exemplo 4), também foi verificado que AcAA interage de forma sinérgica com pancreatina. A Tabela 3 mostra que se AcAA for doseada juntamente com pancreatina, a geração de potência redutora (valor DNS) é 1,6 vezes a soma de potência redutora gerada individualmente pelas duas enzimas a pH 6,0 e o valor correspondente a pH 6,7 é de 1,25 vezes.

[00294] A mistura de reação continha 1 mL de pasta fluida de amido de milho 20% (p/v) em 0,1 M de Mes (pH 6,0 e 6,7) com 5 mM de CaCl2, com e sem 25 μL de pancreatina porcina (2,5% p/v) e 25 μL de AcAA (17,2 mg/mL) a 40 °C durante 2 horas. O açúcar redutor gerado foi avaliado como no Exemplo 6. Tabela 3. O efeito de sinergia de AcAA com a pancreatina a pH 6,0 e 6,7

EXEMPLO 9 Atividade de liberação de açúcares redutores das misturas AFP de endo-, exo-glucano hidrolases e endo proteases na presença de pepsina a pH 2,5 em relação a pH 6,0

[00295] A Tabela 4 mostra a atividade da mistura de AkAA, AcAA, TrGA, CS4 e AFP na ausência e presença de pepsina a pH 2,5 em relação a pH 6,0. Pode ser visto que a atividade a pH 2,5 é superior a 20% vs pH 6,0 para ambos os coquetéis de enzimas sob condições experimentais. Seria vantajoso que as enzimas nos coquetéis de enzimas fossem estáveis e ativas em condições comparáveis às encontradas no estômago ou abomaso de um ruminante onde prevalece um pH menor.

[00296] A mistura de reação continha 1,0 mL de pasta fluida de farinha de milho (10% p/p) em 0,1 M de glicina-HCl (pH 2,5) com 5 mM de CaCl2 ou 0,1 M de Mes-NaOH (pH 6,0) com 5 mM de CaCh, 25 μL de coquetel de enzimas de AkAA+TrGA+AFP (223 mg/mL) ou AcAA+CS4+AFP (125 mg/mL) e 25 μL de pepsina (10000 U/mL). A reação foi realizada a 40 °C durante 2 h com agitação a 300 rpm. No final da reação, o substrato foi separado da enzima e dos produtos por centrifugação a 3500 rpm durante 5 min em um filtro de 0,45 μm e placa de filtro de 96 poços. O filtrado foi diluído 2 vezes e avaliado quanto a valor de açúcar redutor como descrito no Exemplo 6. Tabela 4. Atividade de liberação de açúcares redutores da mistura de endo-, exo-glucano hidrolases e endo proteases de AkAA, AcAA, TrGA, CS4 e AFP na presença e ausência de pepsina a pH 2,5 em relação a pH 6,0 A atividade a pH 6,0 é considerada como 100%.

EXEMPLO 10 Hidrólise de amido de milho por glicoamilase sob condições digestivas do intestino delgado na presença de pancreatina

[00297] A mistura de reação continha 0,5 mL de pasta fluida de amido de milho (Sigma S4126) ou pasta fluida de farinha de milho (10% p/v) em 0,1 M de Mes (pH 6,0), 50 μL de pancreatina (concentração final na mistura de reação 0,25%) e a glicoamilase a 400 ppm em um volume final de 0,56 mL. A reação foi realizada a 40 °C durante 1 h com agitação a 300 rpm. No final da reação, o sobrenadante foi obtido por separação centrífuga dos grânulos de amido utilizando uma centrífuga de bancada e avaliado quanto a açúcar redutor total pelo método de reagente DNS descrito no Exemplo 6, nomeadamente 10 μL do sobrenadante ou sobrenadante diluído foram misturados com 100 μL de reagente DNS em uma placa de PCR de 96 poços. A placa de PCR foi então incubada a 95 °C por 5 min, seguido de 5 min de resfriamento a 20 °C. A mistura de reação de 90 μL foi transferida para uma placa de leitura de 96 poços e a absorbância a 550 nm foi medida como o valor DNS.

[00298] A Figura 7, com amido de milho como substrato, e a Figura 8, com farinha de milho como substrato, mostram que todas as cinco glicoamilases de CS4, TrGA, Brew1, AfuGA e FvGA (para obter detalhes, consulte a Tabela 1) interagiram de forma sinérgica com pancreatina na produção de açúcares redutores, como indicado nos valores DNS. Glicoamilases (GAs) (1,4-alfa-D-glucano glucohidrolase (EC3.2.1.3) catalisam a hidrólise de ligações alfa-1,4 e alfa-1,6- glicosídicas para liberar beta-D-glicose a partir das extremidades não redutoras de amido e poli- e oligossacarídeos relacionados (Sauer et al. 2000. Glucoamylase: structure/function relationships, and protein engineering, Biochim. Biophys. Acta, 1543:275-293). Assim, em contraste com certos tipos de alfa-glucosidases, GA também é capaz de hidrolisar o amido cru e ligações alfa-1,4, e alfa-1,6-glicosídicas encontradas em alfa-glucanos e seus oligômeros.

[00299] As figuras 7 e 8 mostram que a pancreatina porcina e todas as cinco GAs tinham determinadas capacidades para hidrolisar grânulos de amido de milho com a maior atividade observada em FvGA a pH 6,0 e 40 °C. Foi observada uma sinergia significativa quando a mistura de reação continha tanto as GAs como a pancreatina porcina. Se acredita que esse sinergismo pode ser devido não só à alfa-amilase pancreática presente no produto de pancreatina adquirido à Sigma, mas também possivelmente devido às proteases também presentes neste produto de pancreatina que podem interagir com qualquer proteína que possa estar presente na superfície dos grânulos de amido de milho, bem como no interior do grânulo.

[00300] Este exemplo mostra que as glicoamilases podem interagir de forma sinérgica com enzimas digestivas pancreáticas na geração de glicose do milho com a composição química apresentada em (ver o Exemplo 2. As cinco GAs utilizadas neste experimento e as três amilases AkAA, AcAA e AtAA usadas nos Exemplos 2 a 9 acima possuem todos os módulos de ligação de carboidrato pertencentes à família 20 (CBM20) (Christiansen et al., 2009. The carbohydrate-binding module family 20 - diversity, structure, and function, FEBS Journal, 276: 5006-5029; Janeceka et al., 2011. Structural and evolutionary aspects of two families of non-catalytic domains present in starch and glycogen binding proteins from microbes, plants and animals. Enzyme and Microbial Technology, 49: 429- 440). Estas enzimas podem ter um local adicional de ligação de carboidrato para além do módulo de ligação de carboidrato (Sorimachi et al., 1997. Solution structure of the granular starch binding domain of Aspergillus niger glucoamylase bound to betacyclodextrin, Structure, 5:647-661). Estes módulos de ligação de carboidrato e locais de ligação de carboidrato podem ser necessários para atividade em grânulos de amido e maltossacarídeos e, assim, contribuir para o efeito sinérgico quando combinados com pancreatina.

EXEMPLO 11 Hidrólise do amido de milho por glicoamilase sob condições ruminais

[00301] A Tabela 5 mostra que a atividade restante para as cinco glicoamilases é, no mínimo, de 80% após 4 h de incubação em fluído ruminal na ausência de substrato de amido, exceto para AfuGA que tem 65% de atividade restante. Como enzima de ração de ruminantes, é necessário ter estabilidade considerável no fluido ruminal a 40 °C por 4 horas.

[00302] Assim, estas enzimas mostram utilidade como enzimas de ração para ruminantes, uma vez que foram estáveis e mantiveram atividade no fluido ruminal a 40 °C por 4 horas.

[00303] A mistura de pré-incubação continha 0,25 mL de fluido ruminal isento de células, 5 μL de cada uma das 5 glicoamilases a 400 ppm. A pré-incubação ocorreu a 40 °C durante 4 h com agitação a 300 rpm em uma placa de 48 poços. Para controle, o tempo de pré- incubação foi zero. Após a pré-incubação, 0,25 mL de pasta fluida de amido de milho (Sigma S4126) (10% p/v) em 0,1 M Mes (pH 6,0) foram adicionados e reagidos durante 30 min a 40 °C com agitação. O sobrenadante foi obtido por separação centrífuga dos grânulos de amido utilizando uma centrífuga de bancada e avaliado quanto a açúcar redutor total pelo método DNS como descrito no Exemplo 10.Tabela 5. Estabilidade das cinco glicoamilases na presença de fluido ruminal a 40 °C durante 4 horas.

EXEMPLO 12 Atividade de cinco glicoamilases a pH 2,5 em relação a pH 6,0 na presença de pepsina

[00304] Seria vantajoso que as enzimas fossem estáveis e ativas em condições que simulam as encontradas no estômago ruminal ou abomaso ruminal onde prevalece um pH menor. A atividade a pH 2,5 deve ser consideravelmente elevada o suficiente para ter significado na digestibilidade nesta câmara de digestão com baixo pH em relação à atividade no rúmen e no intestino delgado com um pH de cerca de 6 com base em uma dieta amilácea. A Tabela 6 mostra que todas as cinco glicoamilases têm mais do que 20% de atividade a pH 2,5 em comparação com a sua atividade a pH 6,0. Assim, uma atividade equilibrada no rúmen, abomaso e intestino delgado, aumentará as oportunidades para digerir nutrientes amiláceos.

[00305] A mistura de reação continha, em microplacas de 48 poços, 0,5 mL de pasta fluida de farinha de milho (10% p/v) preparada em glicina-HCl (60 mM, pH 2,5) ou em Mes-NaOH (100 mM, pH 6,0), 50 μL de pepsina porcina (concentração final de 1000 U/mL) e 5 μL de glicoamilase (concentração final, 400 ppm). A reação foi realizada a 40 °C por 60 min. O açúcar redutor liberado foi analisado pelo reagente DNS como descrito no Exemplo 10. A atividade a pH 6,0 é usada como 100%.Tabela 6. Relação da atividade das cinco glicoamilases a pH 2,5 e pH 6,0. A atividade a pH 6,0 para cada enzima é relatada como 100%.

EXEMPLO 13 Liberação de glicose a partir de amido de milho por alfa- glicosidase de levedura na presença de pancreatina em condições que simulam as do intestino delgado

[00306] A mistura de reação continha: 0,5 mL de pasta fluida de amido de milho (Sigma S4126) (10% p/v) suspensos em 0,1 M de Mes (pH 6,0) contendo 5 mM de CaCh, 0, 10, 20 ou 35 μL de alfa- glicosidase de levedura (que também pode ser referida como maltase adquirida à Megazyme, E-MALTS, 1000 U/mL), 0 a 25 μL de pancreatina porcina (2,5% p/v em 1% de NaCl, adquirida à Sigma cat. NO: P7545), e 0 a 60 μL de água, em um volume total de 0,56 mL. As misturas de reação foram incubadas em uma incubadora com agitação a 40 °C durante 60 min em uma placa de 48 poços. A placa foi centrifugada a 3500 rpm durante 10 minutos usando uma centrífuga de bancada para separar grânulos de amido não digeridos. O sobrenadante obtido foi transferido para uma placa de 96 poços para o ensaio de glicose usando o kit de ensaio de glicose com base em glicose oxidase/peroxidase (GOPOD).

[00307] Para o ensaio de glicose GOPOD, 8 μL do sobrenadante foram transferidos para placas de leitura com 96 placas possuindo 240 μL de reagente GOPOD da Megazyme (K-GLUC 09/14). A placa foi incubada a 50 °C durante 20 min e a absorbância a 510 nm foi lida de acordo com as instruções da Megazyme.

[00308] É bem sabido que o produto de pancreatina (Sigma P7545) contém alfa-amilase pancreática, lipase, ribonuclease e várias proteases, incluindo tripsina, quimiotripsina, elastase. Os produtos hidrolíticos de amido dietético por alfa-amilase porcina e bovina são principalmente maltose (Banks et al., 1976. The action pattern of bovine pancreatic alpha-amylase. Intl J. Biochem., 7: 107-110). Sabe- se que os animais, incluindo os animais monogástricos e ruminantes, hidrolisam a maltose utilizando uma enzima ligada a uma membrana do intestino delgado (Nichols et al., 1998. Human Small Intestinal Maltase-glucoamylase cDNA Cloning, homology to sucrase- isomaltase, J. Biol. Chem. 273:3076-3081). Uma enzima que se move livremente tem maior eficácia catalítica do que uma enzima ligada a uma membrana (imobilizada).

[00309] A Figura 9 mostra que, sem pancreatina, a alfa-glicosidase de levedura doseada de 0, 10, 20, 35 μL não foi capaz de aumentar a liberação de glicose a partir de grânulos de amido de milho.

[00310] No entanto, na presença de 2,5 μL pancreatina, foi liberada glicose e a adição de 10 μL de alfa-glicosidase duplicou a quantidade de glicose liberada. O rendimento de glicose aumentou à medida que a dose de alfa-glucosidase foi aumentada. Isto indica que a alfa- glucosidase de levedura interagiu de forma sinérgica com as enzimas presentes na pancreatina para liberar a glicose do amido de milho. Acredita-se que as proteases presentes na pancreatina podem promover, em certa medida, esta sinergia, uma vez que a protease pode hidrolisar proteínas presentes na superfície dos grânulos de amido, bem como proteínas que residem no interior do grânulo. Estas proteínas sobre e dentro dos grânulos de amido podem afetar negativamente a digestão de amido (McAllister et al., 1993. Effect of the protein matrix on the digestion of cereal grains by ruminal microorganisms. J. Anim. Sci. 71:205-212).

[00311] A alfa-glucosidase usada no Exemplo 13 é uma forma altamente purificada de Saccharomyces cerevisiae comprada à Megazyme International Ireland (EC 3.2.1.20, CAZy Family: GH13, Protein database entries: P53341, P38158, CAS: 9001-42-7). Este exemplo mostra que a alfa-glucosidase microbiana livre apresenta boa sinergia com enzimas digestivas pancreáticas. Foi verificado, no entanto, que esta alfa-glicosidase de levedura é instável e inativa em condições comparáveis às encontradas no estômago ruminal e abomaso ruminal. Acredita-se que novos esforços, tais como revestimento desta alfa-glucosidase de levedura ou manipulação de proteínas podem ser necessários para a tornar estável a um pH tão baixo na presença de pepsina para que seja capaz de funcionar no intestino delgado ruminal.

EXEMPLO 14 Liberação de glicose a partir de amido de milho por alfa- glucosidases fúngicas na presença de pancreatina em condições imitando as do intestino delgado

[00312] Três alfa-glucosidases fúngicas: TG L-2000, Aclglu1 e Nfiglu1 (Tabela 1) foram examinadas quanto à sua estabilidade e atividade na presença de pepsina, pancreatina e fluido ruminal (Tabelas 7.1, 7.2 e 7.3, em baixo). As Tabelas 7.1 a 7.3 mostram que todos as três alfa-glucosidases interagiram de forma sinérgica com pancreatina no aumento da liberação de glicose a partir de amido de milho.

[00313] O estudo de sinergia com pancreatina foi realizado da seguinte forma: 0,5 mL de pasta fluida de amido de milho (Sigma S4126) (10% p/v) em 0,1 M de Mes (pH 6,0) com 5 mM de CaCl2 foram incubados com 0 ou 2,5 μL de alfa-glicosidase TG L-2000 (3,1 mg/mL) e 0 ou 2,5 μL de pancreatina porcina (Sigma P7545, 2,5% p/v em 1% de NaCl). A reação foi realizada a 40 °C por 1 hora. A mistura de reação foi, então, filtrada através de um filtro de 0,22 μm. A glicose liberada no filtrado foi avaliada usando o kit de ensaio de glicose Megazyme (GOPOD) (K-GLUC 09/14) (como descrito no Exemplo 13 acima) e foi realizada como se segue: 8 μL de filtrado foram misturados com 0,24 mL de reagente GOPOD em uma placa de 96 poços e leitura a 510 nm após incubação a 50 °C durante 20 min. As unidades de OD medidas a 510 nm, foram utilizadas como uma quantificação da liberação de glicose.

[00314] O estudo de sinergia com pepsina e pancreatina (Pan) foi realizado da seguinte forma: a mistura de pré-incubação continha 0,1 mL de glicina-HCl (pH 3,0), 5 mM de CaCl2, 25 μL de pepsina porcina (Sigma P7000, 5000 U/mL) e 2,5 μL de TG L-2000. Esta mistura foi incubada a 4 °C por 2 horas. No final da incubação, 0,5 mL de pasta fluida de amido de milho (10%, p/v) de 0,1 M de Mes (pH 6,0) e 2,5 μL de pancreatina (2,5%) foram adicionados e incubados adicionalmente a 40 °C por 1 hora. Um ensaio da glicose liberada foi realizado conforme descrito acima com relação ao estudo de pancreatina usando o kit de ensaio de glicose Megazyme.

[00315] O estudo de estabilidade e interação de hidrolase de amido no rúmen foi feito da seguinte forma: 2,5 μL de alfa-glucosidase TG L- 2000 com 0,24 mL de fluido ruminal isento de células e incubação a 40 °C por 4 horas. No final da incubação, 0,25 mL de amido de milho (10% p/v) de 0,1 M de acetato (pH 4,5) foram adicionados e incubados adicionalmente a 40 °C por 30 min. A glicose liberada foi avaliada utilizando o kit de ensaio de glicose Megazyme como descrito acima para o estudo de pancreatina.

[00316] Alfa-glucosidase e pancreatina porcina usadas individualmente produziram uma versão limitada de glicose de amido de milho (Tabela 7.1). A combinação de alfa-glucosidase TG L-2000 e pancreatina liberou uma quantidade de glicose 5,2 vezes maior do que a soma da liberação de glicose individual por cada uma das duas preparações enzimáticas (Tabela 7.1). Da mesma forma, quando Aclglu1 e Nfiglu1 foram combinadas com pancreatina sob as mesmas condições, o aumento da liberação de glicose foi de 8,3 vezes (Tabela 7.2) e 7,8 vezes (Tabela 7.3) em relação ao somatório das liberações individuais por Aclglu1 e pancreatina ou Nfiglu1 e pancreatina, respectivamente.

[00317] A estabilidade de pepsina das três alfa-glucosidases foi testada a pH 3,0 na presença de pepsina (Tabela 7.1). É evidente que a combinação de 2,5 μL de alfa-glicosidase TG L-2000 e a pancreatina aumentou a liberação de glicose por 7,3 vezes mesmo após pré- incubação com pepsina na ausência de substrato a pH 3,0 e 40 °C durante 2 h (Tabela 7.1). Para as alfa-glucosidases Aclglu1 e Nfiglu1, testadas sob as mesmas condições, o aumento da liberação de glicose pela combinação foi de 4,1 vezes (Tabela 7.2) e 6,9 vezes (Tabela 7.3). Todas as três alfa-glucosidases mostraram estabilidade de pepsina porque, apesar da pré-incubação com pepsina, todas elas ainda mostraram um efeito sinérgico quando combinadas com pancreatina no ensaio de mistura.

[00318] Da mesma forma, foi avaliada a sinergia e a estabilidade das três alfa-glucosidases no fluido ruminal (Tabela 7.1 a 7.3). A Tabela 7.1 mostra que para alfa-glicosidase TG L-2000 adicionada ao fluido ruminal, a liberação de glicose aumentou 2,0 vezes em comparação com a soma da glicose liberada individualmente pela alfa- glicosidase TG L-2000 e por fluido ruminal; e com pré-incubação no fluido ruminal, a liberação de glicose na presença de TG L-2000 também aumentou 2,0 vezes em comparação com a liberação na ausência da alfa-glicosidase (Tabela 7.1), o que significa que a alfa- glicosidase TG L-2000 é estável no fluido ruminal. Para a alfa- glicosidase Aclglu1 e Nfiglu1, a sua presença resultou em um aumento da liberação de glicose de 2,0 e 2,8 vezes, respectivamente, para "tratamentos com pré-incubação e sem pré-incubação " (Tabela 7.2 - 7.3) com fluido ruminal. Tabela 7.1. Efeito sinérgico de alfa-glucosidase TG L-2000 de Aspergillus niger com pancreatina (Pan), atividade amilolítica no fluido ruminal e tolerância na presença de pepsina na liberação de glicose (G1) do amido de milho. O número de repetições (n) foi de 2 a 4. Tabela 7.2. Efeito sinérgico de alfa-glucosidase de Aspergillus clavatus (Aclglu1) com pancreatina (Pan), atividade amilolítica no fluido ruminal e tolerância na presença de pepsina na liberação de glicose (G1) de amido de milho.

[00319] As condições de reação e de ensaio foram as mesmas que para a Tabela 7.1, com a diferença que foram usados 0 ou 50 μg de alfa-glucosidase Aclglu1 (Tabela 1) de A. clavatus. O número de repetições (n) foi de 2 a 4. Tabela 7.3. Efeito sinérgico de alfa-glucosidase de Neosartorya fischeri (Nfiglu1) com pancreatina (Pan), atividade amilolítica no fluido ruminal e tolerância na presença de pepsina na liberação de glicose (G1) do amido de milho.

[00320] As condições de reação e de ensaio foram as mesmas das descritas acima para a Tabela 7.1, com a diferença que foram usados 0 ou 50 μg de alfa-glucosidase Nfiglu1 de N. fischeri. O número de repetições (n) foi de 2 a 4.

EXEMPLO 15 Estabilidade de alfa-glucosidases fúngicas no fluido ruminal e interação com pancreatina na liberação de glicose

[00321] A mistura de pré-incubação continha 50 μg de cada uma das alfa-glucosidases fúngicas: TG L-2000, Aclglu1, Nfiglu1, TauSec098 e TauSec099 (Tabela 1) dissolvidas em 2.5 μL e 240 μL de fluido ruminal isento de células misturados em uma placa de 24 poços. Para controle não foram adicionadas alfa-glucosidases. As misturas foram incubadas a 40 °C por 4 horas. No final da incubação, 250 μL de pasta fluida de amido de milho (10% p/v, Sigma S4126) dissolvidos em 0,1 M de Mes, 5 mM de CaCl2 (pH 6) e 2,5 μL de pancreatina (Sigma P7545) em 0, 1% de NaCl, 2,5%, p/v) foram adicionados e a reação efetuada a 40 °C por 30 min (n=4). O sobrenadante obtido após a centrifugação foi diluído 10 vezes e a glicose liberada foi quantificada como descrito no Exemplo 13 usando o kit de ensaio de glicose Megazyme.

[00322] A Figura 10 mostra que uma pré-incubação das cinco alfa- glucosidases em fluido ruminal a 40 °C por 4 h não causou perda de atividade em comparação com tratamento "sem pré-incubação". Tudo indica que mais glicose foi liberada em amostras pré-incubadas do que a liberada em amostras que não foram pré-incubadas (Figura 10). Isto pode ser uma indicação de que estas alfa-glicosidases foram interagindo com hidrolases de amido presentes no fluido ruminal que tinha um nível residual de substrato de amido.

Exemplo 16 Sinergia de cinco alfa-glucosidases com pancreatina na liberação de glicose a partir de amido de milho a pH 6,0

[00323] A mistura de reação continha 0,5 mL de pasta fluida de amido de milho (Sigma S4126) (10% p/v) em 0,1 M de Mes (pH 6,0) contendo 5 mM de CaCh, 50 μg de alfa-glucosidase em 2,5 μL e 0 ou 2,5 μL de solução de pancreatina (Sigma P7545, 2,5% p/v em 0,1% de NaCl). Para controle foi omitida alfa-glucosidase. A reação foi realizada a 40 °C por 60 min (n=4) e a glicose liberada foi quantificada utilizando o kit de ensaio de glicose descrito no Exemplo 13.

[00324] A Figura 11 mostra que houve produção limitada de glicose (0,67 mg/mL de mistura de reação) para o controle usando apenas pancreatina e sem enzima adicional. Quando foi usada apenas alfa- glucosidase, a liberação de glicose foi baixa, exceto para TG L-2000, que mostrou liberação de glicose (0,80 mg/mL de mistura de reação). Quando foram usadas em conjunto alfa-glucosidase e pancreatina, a liberação de glicose aumentou na faixa de 11 a 20 vezes, dependendo da quantidade de alfa-glicosidase usada. Isto ilustra o efeito sinérgico na liberação de glicose a partir de amido de milho que pode ser obtido quando qualquer uma das cinco alfa-glucosidases e a pancreatina são usadas.

Exemplo 17 Atividade das alfa-glucosidases tratadas com pepsina a pH 2,5 e pH 6,0

[00325] A mistura de reação continha 50 μg das cinco alfa- glucosidases de TG L-2000, Aclglu1, Nfiglu1, TauSec098 e TauSec099 (Tabela 1) em 2,5 μL, 75 μL de pepsina (Sigma P7000, solução de estoque 5000U/mL) e 1,5 mL de maltose (21,5 mg/mL) em 0,1 M de glicina-HCl com 5 mM de CaCl2 pH 2,5 ou em 0,1 M de Mes-NaOH com 5 mM de CaCh a pH 6,0. A reação foi realizada a 40 °C por 30 min. No final da reação, a mistura de reação foi então diluída 10 vezes e avaliada quanto a liberação de glicose utilizando o kit de ensaio de glicose Megazyme como descrito no Exemplo 13 acima.Tabela 8. Proporção de atividade a pH 2,5 para pH 6,0 para cinco alfa- glucosidases. A atividade a pH 6,0 é considerada como 100%.

[00326] A Tabela 8 mostra que todas as quatro glucosidases foram mais ativas a pH 2,5 do que a pH 6,0 na presença de pepsina, exceto para Nfiglu1, que teve 84% de atividade a pH 2,5 em comparação com pH 6,0. Assim, estas enzimas mostram utilidade como enzimas de ração para ruminantes, uma vez que foram estáveis e mantiveram atividade no fluido ruminal a 40 °C por 4 horas.

Exemplo 18 Utilização de glicoamilases em combinação com metalopeptidases P14L e P7L para aumentar a digestão de matéria seca e produção de gás na fermentação ruminal em milho

[00327] Os efeitos das 4 glicoamilases (CS4, TrGA, AfuGA, FvGA) e duas metalopeptidases/proteases (P14L, P7L) e suas combinações sobre a digestão de matéria seca (DMS) e produção de gás em 0, 3, 7, 9, 12 e 24 horas de incubação/fermentação foram avaliados como descrito abaixo. Foram aplicadas glicoamilases e proteases a uma concentração de 0,25 mg/g.

[00328] Os efeitos das 4 glicoamilases (CS4, TrGA, AfuGA, FvGA) e duas metalopeptidases proteases (P14L, P7L) e suas combinações foram avaliados na fermentação microbiana ruminal utilizando milho dentado como substrato em cultura de lote in vitro de fluido ruminal. Os experimentos foram baseados no protocolo estabelecido e publicado anteriormente (Adesogan, A.T., Krueger, N.A., e Kim, S.C. 2005. Anim. Feed Sci. Technol. 123: 211-223). O milho dentado utilizado neste sistema de fermentação de lote in vitro tinha 88,8% de matéria seca (MS), 9,3% de proteína bruta (PB), 3,2% de fibra em detergente ácido (FDA), 8,3% de fibra em detergente neutro tratada com amilase (FDNa), 76,9% de carboidratos não fibrosos (CNF), 88,0% de nutrientes digestíveis totais (NDT). O mesmo foi moído para 4 mm. Todas as enzimas foram aplicadas a 0,25 mg de proteína de enzima por grama de milho dentado em três rodadas separadas com 4 replicações por tratamento e a fermentação ou incubação durou 0, 3, 7, 9, 12 e 24 h, a 39°C. O milho dentado moído foi pesado em 6 replicações por rodada nos sacos de filtro F57 (ANKOM Technology, Macedon, NY). Antes da colocação nos frascos, as enzimas foram diluídas em 0,1 M de tampão citrato-fosfato (pH 6,0) e adicionadas a 0,5 g de milho dentado moídos em sacos F57 (Krueger, N. A. e A. T. Adesogan. 2008. Anim. Feed Sci. Tech. 145: 84-94; Goering, H. K. e P. J. Van Soest. 1970. Agric. Handbook No. 379. ARS USDA, Washington, DC, página 20). Os sacos de filtro F57 foram selados com um Uline Tabletop Poly Bag Sealer (Impulse® tipo AIE-200) e colocados imediatamente nos recipientes de fermentação que eram frascos de soro de 160 mL. Frascos em branco que consistem de apenas um saco de filtro, bem como controles contendo apenas milho dentado moído sem enzima foram também incluídos. Fluido ruminal foi aspirado representativamente de três vacas leiteiras, Holstein lactantes e ruminalmente canuladas 2 a 3 h após o consumo de ração total misturada (TMR). A composição de ingrediente TMR alimentada às vacas leiteiras fistulizadas com base na matéria seca consistia de 38,2% de silagem de milho, 27,3% de milho com casca moído, 14,5% de farinha de soja com 44% de proteína bruta, 9,1% de polpa cítrica, 4,5% pré-mistura de engorda em confinamento, 4,0% de feno de alfafa em meia florescência, 1,8% de suplemento energético (MS Specialty Nutrition, Dundee, IL), 0,5% de Novasil (BASF, Alemanha), 100% no total.

[00329] O fluido ruminal coletado foi filtrado através de quatro camadas de morim antes de misturar com saliva artificial pré-aquecida (39 °C). A composição da saliva artificial incluiu uma solução micromineral de CaC^2H2O, MnCh4H2O, CoCh6H2O, FeC^6H2O; uma solução macromineral de Na2HPO^12H2O, KH2PO4, MgSO4^7H2O; uma solução tampão de (NH4)2HCO3 e NaHCOa; uma solução de peptona tripticase (Tryptone, Sigma-Aldrich, Louise St, MO, E.U.A.); resazurina (indicador de oxirredução) e uma solução de redução contendo cisteína HCl, 1 M NaOH, Na2S^9H2O e água destilada. A proporção de volume entre o fluido ruminal e a saliva artificial é de 1:2. O fluido ruminal tamponado (52 mL) foi adicionado a frascos de soro de 160 mL contendo os sacos de filtro e os frascos foram fechados com rolhas de borracha e selados com selos de alumínio. Os frascos foram incubados por 0, 3, 7, 9, 12 e 24 h, a 39 °C em uma incubadora de ar forçado. No final da incubação, os sacos de filtro contendo os resíduos foram secos no forno a 60 °C durante 48 h, e pesados para quantificar a DMS. A pressão de gás dentro das garrafas foi medida com um transdutor de pressão e posteriormente convertida em volume de gás em 0, 3, 7, 9, 12 e 24 h de incubação. Foi utilizada a seguinte fórmula para a conversão da pressão de gás para volume de gás: Volume de gás (mL) = (pressão de gás (psi) * 4,8843) + 3,1296

[00330] A equação foi formulada com base nas condições do experimento, utilizando frascos de soro de 160 mL e é utilizada para todos os experimentos da Tabela 9.1-9.2.

[00331] Análise estatística: Para todos os experimentos no Exemplo 18, os dados coletados foram analisados utilizando-se o procedimento GLIMMIX do SAS (versão 9.1; SAS Institute, Cary, NC). Os experimentos foram concebidos como projeto de bloco completamente aleatorizado, onde cada rodada foi considerada um bloco. A dose foi usada como efeito fixo no modelo quando as enzimas foram testadas a diferentes doses. A variável de resposta incluiu DMS in vitro e produção de gás. A rodada foi considerada um fator aleatório. Os efeitos fixos do modelo incluíram o tempo de amostragem para os parâmetros de fermentação medidos em diferentes horas de pós- incubação. O procedimento UNIVARIATE do SAS foi utilizado para testar os resíduos de valores atípicos e normalidade antes das análises finais serem realizadas. Os efeitos do tratamento foram declarados significativos a P < 0,05, enquanto quaisquer tendências foram definidas a 0,05 < P < 0,10.

[00332] Os resultados da avaliação das quatro glicoamilases (CS4, TrGA, AfuGA, FvGA) e duas metalopeptidases/protease (P14L, P7L) e suas combinações sobre a digestão de matéria seca (DMS) e produção de gás em 0, 3, 7, 9, 12 e 24 horas de incubação/fermentação podem ser encontrados nas Tabelas 9.1.1 a 9.1.4. Foram aplicadas glicoamilases e proteases a uma concentração de 0,25 mg/g.

[00333] Tratamento CS4+/-P14L: Não foram observados efeitos claros sobre a DMS em resposta à suplementação com CS4 em 0, 3 e 7 h de incubação ou fermentação (Tabela 9.1.1). No entanto, a DMS foi melhorada em 56, 36 e 25% às 9, 12 e 24 h de incubação, respectivamente (P < 0,05). Da mesma forma, a protease P14L melhorou a DMS em 79, 59, e 32% às 9, 12 e 24 h de incubação, respectivamente (P < 0,05). A combinação de CS4 e P14L melhorou a DMS em 109, 86 e 45% às 9, 12 e 24 h de incubação, respectivamente (P < 0,05).

[00334] Tratamento TrGA+/-P14L: A DMS foi aumentada em 62% e 79% com TrGA e P14L às 9 h de incubação, respectivamente (Tabela 9.1.2). A combinação de ambas as enzimas às 9 h de incubação aumentou a DMS para 124% em comparação com o controle (P < 0,01).

[00335] Tratamento AfuGA+/-P14: Os efeitos da combinação de AfuGA e P14L sobre os parâmetros de fermentação ruminal são apresentados na Tabela 9.1.3. A DMS foi aumentada às 7, 9, 12 e 24 h de incubação com AfuGA, P14L e a combinação (P < 0,05). Os efeitos de ambas as enzimas em combinação são evidentes, já que aumentaram a DMS em 119, 146, 108 e 60% às 7, 9, 12, e 24 h de incubação, respectivamente, e a magnitude dos efeitos foram maiores que as enzimas fornecidas isoladamente (P < 0,05).

[00336] Tratamento FvGA+/-P14L: Os efeitos da combinação de FvGA e P14L sobre os parâmetros de fermentação ruminal são apresentados na Tabela 9.1.4. Não foram observados efeitos sobre a DMS em resposta a suplementação de FvGA às 0, 3 e 7 h de incubação; no entanto, a DMS foi melhorada em 42, 79 e 93% às 9 h de incubação (P < 0,01) com FvGA, P14L, e sua combinação, respectivamente.

[00337] Foi verificado que todas as quatro glicoamilases, a metalopeptidase P14L e suas combinações aumentam significativamente a produção de gás pelo menos às 12 e 24 h de incubação (P < 0,05) (Tabelas 9.1.1 a 9.14).

[00338] Tratamento CS4, TrGA, AfuGA, FvGA +/- P7L: Os efeitos de combinar as 4 glicoamilases (CS4, TrGA, AfuGA, FvGA) com a metalopeptidase/protease P7L sobre a DMS às 0, 3, 7, 9, 12 e 24 h de incubação/fermentação são apresentados nas Tabelas 9.2.1 a 9.2.4. Tal como nas Tabelas 9.1.1 a 9.1.4, ambas as glicoamilases e protease foram aplicadas a uma concentração de 0,25 mg/g.

[00339] Com base nos resultados observados, são observados efeitos sinérgicos ou adicionais das 4 glicoamilases em combinação com P7L, independentemente do tempo de incubação. Efeitos adicionais com a combinação de CS4 e P7L melhoraram a DMS em 49, 112, 72, 60, 55 e 19% às 0, 3, 7, 9, 12, e 24 h de incubação, respectivamente (Tabela 9.2.1; P < 0,01). A DMS foi também aumentada em 41, 109, 73, 64, 60 e 25% às 0, 3, 7, 9, 12 e 24 h, respectivamente, com a combinação de TrGA e P7L (Tabela 9.2.2; P < 0,01).

[00340] A combinação de AfuGA (Tabela 9.2.3) e P7L melhorou a DMS em 23, 116, 85, 66, 58 e 21% às 0, 3, 7, 9, 12 e 24 h, respectivamente (P < 0,01). Enquanto a eficácia de FvGA em combinação com P7L foi eficaz na melhoria de DMS às 3, 7, 9 e 12 h de incubação, não são observados efeitos às 0 e 24 h, em comparação com o Controle (Tabela 9.2.4). A melhoria de DMS foi ainda apoiada pelo maior volume de gás acumulado observado na maioria dos pontos no tempo de incubação para todas as 4 glicoamilases, a protease P7L e suas combinações (P < 0,05) (Tabelas 9.2.1 a 9.2.4). Tabela 9.1. 1. Efeitos de CS4 e protease (P14L) e sua combinação na digestibilidade in vitro de matéria seca e produção de gás.a-c As médias dentro de uma linha com diferentes sobrescritos diferem (P < 0,05). Tabela 9.1. 2. Efeitos de TrGA e protease (P14L) e sua combinação na digestibilidade in vitro da matéria seca e produção de gás.a-c As médias dentro de uma linha com diferentes sobrescritos diferem (P < 0,05). Tabela 9,1. 3. Efeitos de AfuGA e protease (P14L) e sua combinação na digestibilidade in vitro da matéria seca e produção de gás. a-c As médias dentro de uma linha com diferentes sobrescritos diferem entre si (P < 0,05). Tabela 9.1. 4. Efeitos de FvGA e protease (P14L) e sua combinação na digestibilidade in vitro da matéria seca e produção de gás.a-c As médias dentro de uma linha com diferentes sobrescritos diferem (P < 0,05). Tabela 9.2.1 Efeitos de CS4 e protease (P7L) e sua combinação na digestibilidade in vitro da matéria seca e produção de gás.a-c As médias dentro de uma linha com diferentes sobrescritos diferem (P < 0,05). Tabela 9.2. 2. Efeitos de TrGA e protease (P7L) e sua combinação na digestibilidade in vitro da matéria seca e produção de gás.a-c As médias dentro de uma linha com diferentes sobrescritos diferem (P < 0,05). Tabela 9.2. 3. Efeitos de AfuGA e protease (P7L) e sua combinação na digestibilidade in vitro da matéria seca e produção de gás. a-c As médias dentro de uma linha com sobrescritos diferente diferem (P < 0,05). Tabela 9.2. 4. Efeitos de FvGA e protease (P7L) e sua combinação na digestibilidade in vitro da matéria seca e produção de gás.a-c As médias dentro de uma linha com sobrescritos diferente diferem (P < 0,05).

Exemplo 19 Hidrólise de maltose por glicoamilases

[00341] Tipicamente, é a glicose que é absorvida em animais. A maltose é um dissacarídeo formado a partir de duas unidades de glicose. Assim, a maltose precisa ser hidrolisada para monômeros de glicose para ser absorvida. É vantajoso que uma glicoamilase tenha elevada atividade catalítica na maltose de substrato para além de outras propriedades preferidas para uso como uma enzima de aditivo de ração. De preferência, uma glicoamilase deve ter pelo menos 20% da atividade na maltose de substrato, quando comparada com a atividade de TrGA sob as condições de teste aqui descritas.

[00342] A atividade de glicoamilase na maltose foi determinada como se segue. Foi preparada uma mistura de reação que continha 2% (p/v) ou 8% (p/v) de maltose (M-5885, Sigma) e 10 μg de glicoamilase em 50 mM de Mes-NaOH (pH 6,0) contendo 5 mM de CaCl2, em um volume final de 0,05 mL em uma microplaca de 96 poços. Cada reação de glicoamilase-maltose foi repetida em triplicado.

[00343] A reação foi realizada a 40 °C durante 20 minutos, o que estava na gama linear no que toca à liberação de glicose. A reação foi realizada em uma máquina de PCR a 95 °C durante 5 minutos. Após resfriamento até à temperatura ambiente (23 °C), 10 μL da mistura de reação que foi diluída para uma concentração na faixa de 0,5 a 0,9 mg de glicose por mL foram misturados com 0,24 mL de reagente GOPOD (D-Glucose Assay Kit, GOPOD Format da Megazyme) em uma microplaca. A mistura foi então incubada a 50 °C durante 20 min e foi lida a absorbância a 510 nm. Foi usado o padrão de glicose do fabricante para criar uma curva padrão de calibração.

[00344] Os dados da Tabela 10 mostram que todas as glicoamilases testadas tiveram atividade na maltose em condições semelhantes ou próximas às encontradas em condições digestivas in vivo, tais como um pH quase neutro de 6,0 pH.

[00345] Foi observado que AnGA foi uma exceção, na medida em que sobre o substrato maltose sob estas condições de teste. AnGA, portanto, não é uma glicoamilase adequada para uso como aqui descrito.Tabela 10. Hidrólise de maltose por 4 glicoamilases a duas concentrações de maltose e pH 6,0.*A atividade de TrGA em maltose foi tratada como 100%.

Claims (1)

1. Método para preparar uma ração para melhorar a digestibilidade de amido e o rendimento de glicose em um ruminante, caracterizado pelo fato de que compreende adicionar uma composição de aditivo de ração compreendendo uma enzima glicoamilase (EC 3.2.1.3) derivada de Thrichoderma reesei, sendo que a referida glicoamilase tem: (a) pelo menos 20% de atividade a um pH inferior ou igual a 3 na presença de pepsina em comparação com a atividade da glicoamilase a pH 6 na presença de pepsina, (b) a referida glicoamilase é ativa em pelo menos duas de três câmaras digestivas de um ruminante compreendendo um rúmen, um abomaso e um intestino delgado, e (c) a glicoamilase funciona com enzimas digestivas presentes nas câmaras digestivas do ruminante para aumentar a digestibilidade de amido e o rendimento de glicose.