BR112019005639B1

BR112019005639B1 - METHOD FOR PREPARING A FEED TO IMPROVE STARCH DIGESTIBILITY AND GLUCOSE YIELD IN A RUMINANT USING ALFA-1,4/1,6- ACTIVE GLYCOSIDE HYDROLASES (GLCH)

Info

Publication number: BR112019005639B1
Application number: BR112019005639-4A
Authority: BR
Inventors: Shukun Yu; Karsten Matthias Kragh; Wenting Li
Original assignee: Dupont Nutrition Biosciences Aps
Priority date: 2016-09-23
Filing date: 2017-09-15
Publication date: 2024-04-16

Abstract

A presente invenção refere-se a usos de, pelo menos, uma alfa-1,4/1,6-glicosídeo hidrolase (GLCH) como aditivo de ração para ruminantes, em que a referida hidrolase: (a) tem pelo menos 20% de atividade a um pH inferior ou igual a 3 na presença de pepsina em comparação com a atividade da hidrolase a pH 6 na presença de pepsina, (b) a referida hidrolase é ativa em, pelo menos, duas de três câmaras digestivas de um ruminante compreendendo um rúmen, um abomaso e um intestino delgado e (c) a hidrolase funciona com amilase pancreática para aumentar o rendimento de glicose.The present invention relates to uses of at least one alpha-1,4/1,6-glucoside hydrolase (GLCH) as a feed additive for ruminants, wherein said hydrolase: (a) is at least 20% of activity at a pH of less than or equal to 3 in the presence of pepsin compared to the activity of the hydrolase at pH 6 in the presence of pepsin, (b) said hydrolase is active in at least two of three digestive chambers of a ruminant comprising a rumen, an abomasum and a small intestine and (c) the hydrolase works with pancreatic amylase to increase glucose yield.

Description

CAMPOFIELD

[001] O campo se refere a nutrição animal e, em particular, ao uso de alfa-1,4/1,6 glicosídeo hidrolases (GLCH) ativas de baixo pH como, por exemplo, alfa-amilases, glicoamilases e alfa-glucosidases como aditivo de ração para ruminantes para melhorar a digestão de amido.[001] The field concerns animal nutrition and, in particular, the use of low pH active alpha-1,4/1,6 glycoside hydrolases (GLCH) such as, for example, alpha-amylases, glucoamylases and alpha-glucosidases as a feed additive for ruminants to improve starch digestion.

ANTECEDENTESBACKGROUND

[002] Os ruminantes têm a capacidade única de converter a forragem grosseira em proteína e energia através dos seus sistemas digestivos microbianos/de enzimas. Em conformidade, os ruminantes desempenham um papel importante na ecologia da terra e na cadeia alimentar.[002] Ruminants have the unique ability to convert coarse forage into protein and energy through their microbial/enzyme digestive systems. Accordingly, ruminants play an important role in the earth's ecology and food chain.

[003] A principal diferença entre ruminantes e não ruminantes é que os estômagos dos ruminantes têm quatro compartimentos: rúmen, retículo, omaso e abomaso. Nas primeiras duas câmaras, o rúmen e o retículo, a comida é misturada com saliva e separada em camadas de material sólido e líquido. Os sólidos aglomeram-se para formar a mastigação merícica ou bolo alimentar.[003] The main difference between ruminants and non-ruminants is that ruminant stomachs have four compartments: rumen, reticulum, omasum and abomasum. In the first two chambers, the rumen and reticulum, food is mixed with saliva and separated into layers of solid and liquid material. The solids clump together to form meric mastication or bolus.

[004] A mastigação merícica é regurgitada e mastigada para a misturar completamente com saliva e quebrar o tamanho das partículas. A fibra, principalmente a celulose e a hemicelulose, é essencialmente quebrada nessas câmaras por micróbios (principalmente bactérias, bem como alguns protozoários, fungos e leveduras) nos três principais ácidos graxos voláteis (VFAs): ácido acético, propiônico e ácido butírico. A proteína e o carboidrato não estrutural (pectina, açúcares e amidos) também são fermentados.[004] Meric chew is regurgitated and chewed to mix it completely with saliva and break down the particle size. Fiber, primarily cellulose and hemicellulose, is essentially broken down in these chambers by microbes (primarily bacteria, as well as some protozoa, fungi, and yeast) into the three main volatile fatty acids (VFAs): acetic, propionic, and butyric acid. Protein and non-structural carbohydrate (pectin, sugars and starches) are also fermented.

[005] Embora o rúmen e o retículo tenham nomes diferentes, representam o mesmo espaço funcional do material de digestão e podem mover-se para a frente e para trás entre eles. Juntas, essas câmaras são chamadas de retículo-rúmen. O material de digestão degradado, que agora está na parte inferior líquida do retículo-rúmen passa em seguida para a câmara seguinte, o omaso, onde a água e muitos dos elementos minerais inorgânicos são absorvidos na corrente sanguínea.[005] Although the rumen and reticulum have different names, they represent the same functional space of digestion material and can move back and forth between them. Together, these chambers are called the reticulo-rumen. The degraded digestion material, which is now in the liquid lower part of the reticulum-rumen, then passes to the next chamber, the omasum, where water and many of the inorganic mineral elements are absorbed into the bloodstream.

[006] Após isso, o material de digestão é passado para o verdadeiro estômago, o abomaso. O abomaso é o equivalente direto do estômago monogástrico e o material de digestão é digerido aqui de maneira muito semelhante. O material de digestão é finalmente movido para o intestino delgado, onde ocorre a digestão e absorção de nutrientes. Os micróbios produzidos no retículo-rúmen também são digeridos no intestino delgado. A fermentação continua no intestino grosso da mesma forma que no retículo-rúmen.[006] After this, the digestion material is passed to the true stomach, the abomasum. The abomasum is the direct equivalent of the monogastric stomach and digestion material is digested here in a very similar way. The digested material is ultimately moved to the small intestine, where digestion and absorption of nutrients occurs. The microbes produced in the reticulo-rumen are also digested in the small intestine. Fermentation continues in the large intestine in the same way as in the reticulo-rumen.

[007] As enzimas para utilização como aditivo de ração para ruminantes são principalmente enzimas fibrolíticas, tais como celulases, beta-glucanases e hemicelulases (Tabela 1 em Beauchemin et al., 2004. A rationale for the development of feed enzyme products for ruminants. Can. J. Anim. Sci. 84: 23-36). Os relatórios sobre hidrolases de amido para utilização em ruminantes são limitados. As hidrolases de amido são agrupadas como endo- e exo-amilases.[007] Enzymes for use as feed additives for ruminants are mainly fibrolytic enzymes, such as cellulases, beta-glucanases and hemicellulases (Table 1 in Beauchemin et al., 2004. A rationale for the development of feed enzyme products for ruminants. Can. J. Anim Sci. 84: 23-36). Reports on starch hydrolases for use in ruminants are limited. Starch hydrolases are grouped as endo- and exo-amylases.

[008] As endoamilases, também chamadas de alfa-amilases (E.C. 3.2.1.1), são enzimas de degradação de amido que catalisam a hidrólise de ligações alfa-1,4-O-glicosídicas internas em polissacarídeos, ao mesmo tempo que retêm uma configuração alfa-anomérica nos produtos. A maioria das alfa-amilases precisa de íons de cálcio (Ca2+) para a sua atividade, integridade estrutural e estabilidade.[008] Endoamylases, also called alpha-amylases (E.C. 3.2.1.1), are starch degradation enzymes that catalyze the hydrolysis of internal alpha-1,4-O-glycosidic bonds in polysaccharides, while retaining a alpha-anomeric configuration in products. Most alpha-amylases require calcium ions (Ca2+) for their activity, structural integrity and stability.

[009] A família alfa-amilase, ou seja, o clã GH-H de glicosídeo hidrolases é a maior família de glicosídeo hidrolases, transferases e isomerases compreendendo cerca de 30 diferentes especificidades de enzimas. Uma grande variedade de enzimas tem a capacidade de agir sobre o amido. Estas enzimas podem ser divididas em quatro grupos: endoamilases, exoamilases e enzimas de desramificação e transferases.[009] The alpha-amylase family, that is, the GH-H clan of glycoside hydrolases is the largest family of glycoside hydrolases, transferases and isomerases comprising about 30 different enzyme specificities. A wide variety of enzymes have the ability to act on starch. These enzymes can be divided into four groups: endoamylases, exoamylases and debranching enzymes and transferases.

[0010] As endoamilases clivam ligações alfa-1,4 internas, resultando em produtos alfa-anoméricos.[0010] Endoamylases cleave internal alpha-1,4 bonds, resulting in alpha-anomeric products.

[0011] Exoamilases clivam ligações alfa-1,4 ou alfa-1,6 de resíduos de glicose externos, resultando em produtos alfa ou beta-anoméricos.[0011] Exoamylases cleave alpha-1,4 or alpha-1,6 bonds from external glucose residues, resulting in alpha or beta-anomeric products.

[0012] As enzimas de desramificação hidrolisam ligações alfa-1,6 exclusivamente, deixando polissacarídeos lineares longos.[0012] Debranching enzymes hydrolyze alpha-1,6 bonds exclusively, leaving long linear polysaccharides.

[0013] As transferases clivam uma ligação alfa-1,4 glicosídica da molécula doadora e transferem parte do doador para um aceitador glicosídico formando uma nova ligação glicosídica.[0013] Transferases cleave an alpha-1,4 glycosidic bond from the donor molecule and transfer part of the donor to a glycosidic acceptor forming a new glycosidic bond.

[0014] As glicosídeo hidrolases foram divididas em classes com base no seu modo de reação e famílias com base em suas semelhanças bem definidas de sequência de aminoácidos. A maioria das enzimas de conversão de amido pertencem à família GH-13. A família GH-13 pode ainda ser classificada com base em uma unidade maior chamada clã, que é a estrutura tridimensional de módulo catalítico. Entre os 14 clãs (A-N) definidos para glicosidases e transglicosidases, a família alfa- amilase (GH-13) pertence ao oitavo clã GH-H.[0014] Glycoside hydrolases have been divided into classes based on their mode of reaction and families based on their well-defined amino acid sequence similarities. Most starch converting enzymes belong to the GH-13 family. The GH-13 family can be further classified based on a larger unit called a clan, which is the three-dimensional structure of the catalytic module. Among the 14 clans (A-N) defined for glycosidases and transglycosidases, the alpha-amylase family (GH-13) belongs to the eighth clan GH-H.

[0015] Os animais sintetizam e segregam alfa-amilase pancreática digestiva para a hidrólise do amido. Esta alfa-amilase tem um pH ideal em torno de pH 6-7 e está ativa no intestino delgado.[0015] Animals synthesize and secrete digestive pancreatic alpha-amylase for the hydrolysis of starch. This alpha-amylase has an ideal pH of around pH 6-7 and is active in the small intestine.

[0016] A adição de amilases microbianas à ração pode aumentar ainda mais a digestão de amido por parte dos animais, possivelmente devido ao fato de a amilase pancreática segregada não ser suficiente e/ou a passagem do alimento no trato digestivo do intestino delgado ser bastante rápida, fazendo com que a amilase pancreática não tenha tempo suficiente para digerir completamente o amido, especialmente no caso das aves de capoeira. (Isaksen, M. F. Cowieson, A. J. Kragh, K. M. (2010). Starch- and protein-degrading enzymes: biochemistry, enzymology and characteristics relevant to animal feed use. Em: Enzymes in farm animal nutrition /editado por M.R. Bedford e G.G. Partridge. Páginas 85-95).[0016] The addition of microbial amylases to feed can further increase starch digestion by animals, possibly due to the fact that secreted pancreatic amylase is not sufficient and/or the passage of food through the digestive tract of the small intestine is quite quickly, meaning that pancreatic amylase does not have enough time to completely digest the starch, especially in the case of poultry. (Isaksen, M. F. Cowieson, A. J. Kragh, K. M. (2010). Starch- and protein-degrading enzymes: biochemistry, enzymology and characteristics relevant to animal feed use. In: Enzymes in farm animal nutrition /edited by M.R. Bedford and G.G. Partridge. Pages 85-95).

[0017] Assim, endoamilases têm sido uma das enzimas de ração amplamente utilizadas na indústria de ração. As amilases de ração mais comuns são derivadas de Bacillus subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis e Aspergillus oryzae.[0017] Thus, endoamylases have been one of the feed enzymes widely used in the feed industry. The most common feed amylases are derived from Bacillus subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis and Aspergillus oryzae.

[0018] Estas amilases de ração têm atividade ideal na gama de pH de pH4 a pH8. A maioria delas tem tolerância considerável à pepsina. No entanto, estas enzimas de rações parecem não ter um domínio de ligação a amido em bruto (SBD) e podem ter capacidade limitada para hidrolisar amido em bruto não gelatinizado.[0018] These feed amylases have ideal activity in the pH range of pH4 to pH8. Most of them have considerable tolerance to pepsin. However, these feed enzymes appear to lack a raw starch-binding domain (SBD) and may have limited ability to hydrolyze ungelatinized raw starch.

[0019] Planchot et al., (Extensive degradation of native starch granules by alpha-amylase from Aspergillus fumigatus, Journal of Cereal Science, Volume 21, Edição 2, 1995, Páginas 163-171), relataram a baixa eficiência de alfa-amilase de Bacillus sp. na degradação de amido granular em comparação com a amilase pancreática.. EFSA (Scientific Opinion on the safety and efficacy of Ronozyme RumiStar (alpha-amylase) as a feed additive for dairy cows. Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDAP). EFSA Journal 2012;10(7):2777) relataram a utilização de uma alfa- amilase de B. licheniformis para vacas leiteiras. O efeito foi, por vezes, evidente mas, por vezes, o efeito não foi significativo. Dettori-Campus et al. (Hydrolysis of starch granules by the amylase from Bacillus stearothermophilus NCA 26. Process Biochemistry, Volume 27, Edição 1, janeiro de 1992, Páginas 17-21) estudaram amilases de cerca de 16 estirpes de Bacillus e mostraram a sua preferência por amido solúvel em vez de amido em bruto com a maior proporção de atividade de amido em bruto para amido solúvel sendo 0,25 para a estirpe B. amylolyticus.[0019] Planchot et al., (Extensive degradation of native starch granules by alpha-amylase from Aspergillus fumigatus, Journal of Cereal Science, Volume 21, Issue 2, 1995, Pages 163-171), reported the low efficiency of alpha-amylase of Bacillus sp. in the degradation of granular starch compared to pancreatic amylase. EFSA (Scientific Opinion on the safety and efficacy of Ronozyme RumiStar (alpha-amylase) as a feed additive for dairy cows. Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDAP) . EFSA Journal 2012;10(7):2777) reported the use of an alpha-amylase from B. licheniformis for dairy cows. The effect was sometimes evident but sometimes the effect was not significant. Dettori-Campus et al. (Hydrolysis of starch granules by the amylase from Bacillus stearothermophilus NCA 26. Process Biochemistry, Volume 27, Issue 1, January 1992, Pages 17-21) studied amylases from about 16 strains of Bacillus and showed their preference for soluble starch in rather than raw starch with the highest activity ratio of raw starch to soluble starch being 0.25 for the B. amylolyticus strain.

[0020] Tricarico et al. (Dietary supplementation of ruminant diets with an Aspergillus oryzae alpha-amylase. Animal Feed Science and Technology. Volume 145, Edições 1-4, 14 de agosto de 2008, Páginas 136-150) analisaram o uso de alfa-amilase de Aspergillus oryzae em suplementos alimentares de dietas de ruminantes e sugerem que este suplemento de amilase pode melhorar a produtividade animal, modificando a digestão do amido ruminal, sem necessariamente aumentar a digestão de amido no rúmen. Tal efeito poderia vir de impurezas de enzimas uma vez que, por definição, se espera que a adição de amilase aumente a digestão de amido (Beauchemin, Holtshausen, (2010). Developments in enzyme usage in ruminants. Em: Developments in enzyme usage in ruminants. Em: Enzymes in farm animal nutrition /editado por M.R. Bedford e G.G. Partridge. Páginas 206-230).[0020] Tricarico et al. (Dietary supplementation of ruminant diets with an Aspergillus oryzae alpha-amylase. Animal Feed Science and Technology. Volume 145, Issues 1-4, August 14, 2008, Pages 136-150) analyzed the use of alpha-amylase from Aspergillus oryzae in dietary supplements to ruminant diets and suggest that this amylase supplement may improve animal productivity by modifying ruminal starch digestion, without necessarily increasing starch digestion in the rumen. Such an effect could come from enzyme impurities since, by definition, the addition of amylase is expected to increase starch digestion (Beauchemin, Holtshausen, (2010). Developments in enzyme usage in ruminants. Em: Developments in enzyme usage in ruminants. In: Enzymes in farm animal nutrition /edited by M.R. Bedford and G.G. Partridge.

[0021] Monteiro de Souza et al., (Application of microbial alpha amylase in industry - a review. Brazilian Journal of Microbiology (2010) 41: 850-861), analisaram alfa-amilases de importância industrial e quase todas elas tinham um pH ideal superior a pH 5, exceto uma de Aspergillus kawachii que tinha um pH e estabilidade ideais a 3,0. É a amilase A. kawachii que tem sido utilizada em conjunto com a glicoamilase para a liquefação e fermentação simultâneas de amido de milho para bioetanol devido à sua capacidade para degradar amido em bruto ou amido granular (Dunn-Coleman et al., 2008, US7354752 B2).[0021] Monteiro de Souza et al., (Application of microbial alpha amylase in industry - a review. Brazilian Journal of Microbiology (2010) 41: 850-861), analyzed alpha-amylases of industrial importance and almost all of them had a pH ideal greater than pH 5, except one of Aspergillus kawachii which had an ideal pH and stability at 3.0. It is A. kawachii amylase that has been used in conjunction with glucoamylase for the simultaneous liquefaction and fermentation of corn starch to bioethanol due to its ability to degrade raw starch or granular starch (Dunn-Coleman et al., 2008, US7354752 B2).

[0022] A digestibilidade de amido em rações é altamente variável e dependente de uma série de fatores, incluindo a estrutura física do amido e da matriz da ração.[0022] The digestibility of starch in feed is highly variable and dependent on a number of factors, including the physical structure of the starch and the feed matrix.

[0023] A Publicação de Pedido de Patente US 2005/0037053, publicada a 17 de fevereiro de 2005, divulga o uso de uma enzima que tem atividade de amilase e é capaz de degradar amido resistente em uma ração compreendendo amido para animais monogástricos, como suínos e aves de capoeira.[0023] US Patent Application Publication 2005/0037053, published on February 17, 2005, discloses the use of an enzyme that has amylase activity and is capable of degrading resistant starch in a feed comprising starch for monogastric animals, such as pigs and poultry.

[0024] A WO 2008/06881, publicada a 17 de janeiro de 2008, divulga o uso de amilases bacterianas em rações de ruminantes da subfamília Bovinae para melhorar a produção de leite, digestibilidade aparente da dieta alimentada, desaparecimento de matéria seca da composição de ração, ganho de peso e/ou a Razão de Conversão de Ração.[0024] WO 2008/06881, published on January 17, 2008, discloses the use of bacterial amylases in feed for ruminants of the subfamily Bovinae to improve milk production, apparent digestibility of the diet fed, disappearance of dry matter from the composition of feed, weight gain and/or Feed Conversion Ratio.

[0025] A WO 2015/128366, publicada a 3 de setembro de 2015, divulga o uso de amilases bacterianas em combinação com uma ou mais proteases na ração de ruminantes da subfamília Bovinae para melhorar a digestibilidade do milho e/ou silagem de milho, em especial para melhorar a produção de leite, ganho de peso e/ou a Razão de Conversão de Ração.[0025] WO 2015/128366, published on September 3, 2015, discloses the use of bacterial amylases in combination with one or more proteases in the feed of ruminants of the subfamily Bovinae to improve the digestibility of corn and/or corn silage, in particular to improve milk production, weight gain and/or Feed Conversion Ratio.

[0026] Nesse sentido, continua a existir a necessidade de aumentar a digestibilidade de amido, aumentar o rendimento de glicose, aumentar a digestão de matéria seca e/ou produção de gás para os ruminantes.[0026] In this sense, there continues to be a need to increase starch digestibility, increase glucose yield, increase dry matter digestion and/or gas production for ruminants.

SUMÁRIOSUMMARY

[0027] Em uma modalidade, é divulgado um método para melhorar a digestibilidade de amido e o rendimento de glicose em um ruminante que compreende adicionar, pelo menos, uma alfa-1,4/1,6-glicosídeo hidrolase (GLCH) como um aditivo de ração alimentar para ruminantes, em que a referida hidrolase: (a) tem pelo menos 20% de atividade a um pH inferior ou igual a 3 na presença de pepsina em comparação com a atividade da hidrolase a pH 6 na presença de pepsina, (b) a referida hidrolase é ativa em, pelo menos, duas de três câmaras digestivas de um ruminante compreendendo um rúmen, um abomaso e um intestino delgado e (c) a hidrolase funciona com enzimas digestivas presentes nas câmaras digestivas do ruminante para aumentar a digestibilidade de amido e o rendimento de glicose.[0027] In one embodiment, a method is disclosed for improving starch digestibility and glucose yield in a ruminant comprising adding at least one alpha-1,4/1,6-glucoside hydrolase (GLCH) as a feed additive for ruminants, wherein said hydrolase: (a) has at least 20% activity at a pH of less than or equal to 3 in the presence of pepsin compared to the activity of the hydrolase at pH 6 in the presence of pepsin, (b) said hydrolase is active in at least two of three digestive chambers of a ruminant comprising a rumen, an abomasum and a small intestine and (c) the hydrolase works with digestive enzymes present in the digestive chambers of the ruminant to increase the starch digestibility and glucose yield.

[0028] Em uma segunda modalidade, a pelo menos uma enzima GLCH é capaz de hidrolisar amido em bruto sob condições comparáveis às encontradas no rúmen ou abomaso.[0028] In a second embodiment, the at least one GLCH enzyme is capable of hydrolyzing raw starch under conditions comparable to those found in the rumen or abomasum.

[0029] Em uma terceira modalidade, a hidrolase é selecionada a partir do grupo consistindo em alfa-amilases, glicoamilases e alfa- glucosidases. De preferência, o grupo é composto por alfa-amilases e glicoamilases.[0029] In a third embodiment, the hydrolase is selected from the group consisting of alpha-amylases, glucoamylases and alpha-glucosidases. Preferably, the group is composed of alpha-amylases and glucoamylases.

[0030] Em uma quarta modalidade, as alfa-amilases são membros da família GH 13 ou são selecionadas a partir do grupo consistindo em alfa-amilase (EC 3.2.1.1); pululanase (EC 3.2.1.41); ciclomaltodextrina glucanotransferase (EC 2.4.1.19); ciclomaltodextrinase (EC 3.2.1.54); trealose-6-fosfato hidrolase (EC3.2.1.93); oligo-alfa-glucosidase (EC 3.2.1.10); amilase maltogênica (EC 3.2.1.133); neopululanase (EC 3.2.1.135); alfa-glucosidase (EC 3.2.1.20); alfa-amilase formando maltotetrose (EC3.2.1.60); isoamilase (EC 3.2.1.68); glucodextranase (EC 3.2.1.70); alfa-amilase formando malto-hexose (EC 3.2.1.98); alfa- amilase formando maltotriose (EC 3.2.1.116); enzima de ramificação (EC 2.4.1.18); trealose sintase (EC 5.4.99.16); 4-alfa-glucano- transferase (EC 2.4.1.25); alfa-amilase formando maltopentose (EC 3.2.1.-); amilosucrase (EC 2.4.1.4); sacarose fosforilase (EC 2.4.1.7); malto-oligosiltrealose trealo-hidrolase (EC 3.2.1.141); isomaltulose sintase (EC 5.4.99.11); malto-oligosiltrealose sintase (EC 5.4.99.15); amilo-alfa-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.33); e alfa-1,4-glucano: fosfato alfa-maltosiltransferase (EC 2.4.99.16).[0030] In a fourth embodiment, the alpha-amylases are members of the GH 13 family or are selected from the group consisting of alpha-amylase (EC 3.2.1.1); pullulanase (EC 3.2.1.41); cyclomaltodextrin glucanotransferase (EC 2.4.1.19); cyclomaltodextrinase (EC 3.2.1.54); trehalose-6-phosphate hydrolase (EC3.2.1.93); oligo-alpha-glucosidase (EC 3.2.1.10); maltogenic amylase (EC 3.2.1.133); neopululanase (EC 3.2.1.135); alpha-glucosidase (EC 3.2.1.20); alpha-amylase forming maltotetrose (EC3.2.1.60); isoamylase (EC 3.2.1.68); glucodextranase (EC 3.2.1.70); alpha-amylase forming maltohexose (EC 3.2.1.98); alpha-amylase forming maltotriose (EC 3.2.1.116); branching enzyme (EC 2.4.1.18); trehalose synthase (EC 5.4.99.16); 4-alpha-glucantransferase (EC 2.4.1.25); alpha-amylase forming maltopentose (EC 3.2.1.-); amylosucrase (EC 2.4.1.4); sucrose phosphorylase (EC 2.4.1.7); malto-oligosyltrehalose trehalohydrolase (EC 3.2.1.141); isomaltulose synthase (EC 5.4.99.11); malto-oligosyltrehalose synthase (EC 5.4.99.15); amylo-alpha-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.33); and alpha-1,4-glucan:alpha-maltosyltransferase phosphate (EC 2.4.99.16).

[0031] Em uma quinta modalidade, as glucosidases são membros da família GH 13, ou GH31 ou são selecionadas a partir do grupo consistindo em alfa-glucosidase (EC 3.2.1.20); alfa-galactosidase (EC 3.2.1.22); alfa-manosidase (EC 3.2.1.24); alfa-1,3-glucosidase (EC 3.2.1.84); sacarase-isomaltase (EC 3.2.1.48) (EC 3.2.1.10); alfa- xilosidase (EC 3.2.1.177); alfa-glucano liase (EC 4.2.2.13); isomaltosiltransferase (EC 2.4.1.-); oligossacarídeo alfa-1,4- glucosiltransferase (EC 2.4.1.161); sulfoquinovosidase (EC 3.2.1.-).[0031] In a fifth embodiment, the glucosidases are members of the GH 13, or GH31 family or are selected from the group consisting of alpha-glucosidase (EC 3.2.1.20); alpha-galactosidase (EC 3.2.1.22); alpha-mannosidase (EC 3.2.1.24); alpha-1,3-glucosidase (EC 3.2.1.84); sucrase-isomaltase (EC 3.2.1.48) (EC 3.2.1.10); alpha-xylosidase (EC 3.2.1.177); alpha-glucan lyase (EC 4.2.2.13); isomaltosyltransferase (EC 2.4.1.-); oligosaccharide alpha-1,4-glucosyltransferase (EC 2.4.1.161); sulfoquinovosidase (EC 3.2.1.-).

[0032] Em uma sexta modalidade, as glicoamilases são membros da família GH15 ou são selecionadas a partir do grupo consistindo em glicoamilase (EC 3.2.1.3); glucodextranase. (EC 3.2.1.70); alfa-trealase (EC 3.2.1.28); e dextrano dextrinase (EC 2.4.1.2).[0032] In a sixth embodiment, glucoamylases are members of the GH15 family or are selected from the group consisting of glucoamylase (EC 3.2.1.3); glucodextranase. (EC 3.2.1.70); alpha-trehalase (EC 3.2.1.28); and dextran dextrinase (EC 2.4.1.2).

[0033] Em uma sétima modalidade, é divulgado um método para aumentar a digestibilidade de amido, aumentar o rendimento de glicose, aumentar a digestão de matéria seca e aumentar a produção de gás durante a fermentação em um ruminante, compreendendo adicionar à ração uma composição enzimática compreendendo (i), pelo menos, uma enzima GLCH como aditivo de ração para ruminantes, em que a referida enzima: (a) tem pelo menos 20% de atividade a um pH inferior ou igual a 3 na presença de pepsina em comparação com a atividade das enzimas a pH 6 na presença de pepsina, (b) a referida enzima é ativa em pelo menos duas de três câmaras digestivas de um ruminante compreendendo um rúmen, um abomaso e um intestino delgado e (c) a enzima funciona com amilase pancreática para aumentar o rendimento de glicose e (ii) pelo menos uma protease.[0033] In a seventh embodiment, a method is disclosed for increasing starch digestibility, increasing glucose yield, increasing dry matter digestion and increasing gas production during fermentation in a ruminant, comprising adding to the feed a composition enzyme comprising (i) at least one GLCH enzyme as a feed additive for ruminants, wherein said enzyme: (a) has at least 20% activity at a pH of less than or equal to 3 in the presence of pepsin compared to the activity of enzymes at pH 6 in the presence of pepsin, (b) said enzyme is active in at least two of three digestive chambers of a ruminant comprising a rumen, an abomasum and a small intestine and (c) the enzyme functions with amylase pancreatic to increase glucose yield and (ii) at least one protease.

[0034] Em uma nona modalidade, a pelo menos uma enzima GLCH é capaz de hidrolisar amido em bruto.[0034] In a ninth embodiment, the at least one GLCH enzyme is capable of hydrolyzing raw starch.

[0035] Em uma décima modalidade, a enzima GLCH é selecionada a partir do grupo consistindo em alfa-amilases, glicoamilases e alfa- glucosidases. De preferência, a enzima é selecionada a partir do grupo consistindo em alfa-amilases e glicoamilases.[0035] In a tenth embodiment, the GLCH enzyme is selected from the group consisting of alpha-amylases, glucoamylases and alpha-glucosidases. Preferably, the enzyme is selected from the group consisting of alpha-amylases and glucoamylases.

[0036] Em uma décima primeira modalidade, a pelo menos uma enzima GLCH é selecionada a partir do grupo consistindo em alfa- amilase (EC 3.2.1.1); pululanase (EC 3.2.1.41); ciclomaltodextrina glucanotransferase (EC 2.4.1.19); ciclomaltodextrinase (EC 3.2.1.54); trealose-6-fosfato hidrolase (EC3.2.1.93); oligo-alfa-glucosidase (EC 3.2.1.10); amilase maltogênica (EC 3.2.1.133); neopululanase (EC 3.2.1.135); alfa-glucosidase (EC 3.2.1.20); alfa-amilase formando maltotetrose (EC3.2.1.60); isoamilase (EC 3.2.1.68); glucodextranase (EC 3.2.1.70); alfa-amilase formando malto-hexose (EC 3.2.1.98); alfa- amilase formando maltotriose (EC 3.2.1.116); enzima de ramificação (EC 2.4.1.18); trealose sintase (EC 5.4.99.16); 4-alfa-glucano- transferase (EC 2.4.1.25); alfa-amilase formando maltopentose (EC 3.2.1.-); amilosucrase (EC 2.4.1.4); sacarose fosforilase (EC 2.4.1.7); malto-oligosiltrealose trealo-hidrolase (EC 3.2.1.141); isomaltulose sintase (EC 5.4.99.11); malto-oligosiltrealose sintase (EC 5.4.99.15); amilo-alfa-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.33); e alfa-1,4-glucano: fosfato alfa-maltosiltransferase (EC 2.4.99.16).[0036] In an eleventh embodiment, the at least one GLCH enzyme is selected from the group consisting of alpha-amylase (EC 3.2.1.1); pullulanase (EC 3.2.1.41); cyclomaltodextrin glucanotransferase (EC 2.4.1.19); cyclomaltodextrinase (EC 3.2.1.54); trehalose-6-phosphate hydrolase (EC3.2.1.93); oligo-alpha-glucosidase (EC 3.2.1.10); maltogenic amylase (EC 3.2.1.133); neopululanase (EC 3.2.1.135); alpha-glucosidase (EC 3.2.1.20); alpha-amylase forming maltotetrose (EC3.2.1.60); isoamylase (EC 3.2.1.68); glucodextranase (EC 3.2.1.70); alpha-amylase forming maltohexose (EC 3.2.1.98); alpha-amylase forming maltotriose (EC 3.2.1.116); branching enzyme (EC 2.4.1.18); trehalose synthase (EC 5.4.99.16); 4-alpha-glucantransferase (EC 2.4.1.25); alpha-amylase forming maltopentose (EC 3.2.1.-); amylosucrase (EC 2.4.1.4); sucrose phosphorylase (EC 2.4.1.7); malto-oligosyltrehalose trehalohydrolase (EC 3.2.1.141); isomaltulose synthase (EC 5.4.99.11); malto-oligosyltrehalose synthase (EC 5.4.99.15); amylo-alpha-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.33); and alpha-1,4-glucan:alpha-maltosyltransferase phosphate (EC 2.4.99.16).

[0037] Em uma décima segunda modalidade, as glucosidases são selecionadas a partir do grupo consistindo em alfa-glucosidase (EC 3.2.1.20); alfa-galactosidase (EC 3.2.1.22); alfa-manosidase (EC 3.2.1.24); alfa-1,3-glucosidase (EC 3.2.1.84); sacarase-isomaltase (EC 3.2.1.48) (EC 3.2.1.10); alfa-xilosidase (EC 3.2.1.177); alfa-glucano liase (EC 4.2.2.13); isomaltosiltransferase (EC 2.4.1.-); oligossacarídeo alfa-1,4-glucosiltransferase (EC 2.4.1.161); sulfoquinovosidase (EC 3.2.1.-).[0037] In a twelfth embodiment, glucosidases are selected from the group consisting of alpha-glucosidase (EC 3.2.1.20); alpha-galactosidase (EC 3.2.1.22); alpha-mannosidase (EC 3.2.1.24); alpha-1,3-glucosidase (EC 3.2.1.84); sucrase-isomaltase (EC 3.2.1.48) (EC 3.2.1.10); alpha-xylosidase (EC 3.2.1.177); alpha-glucan lyase (EC 4.2.2.13); isomaltosyltransferase (EC 2.4.1.-); oligosaccharide alpha-1,4-glucosyltransferase (EC 2.4.1.161); sulfoquinovosidase (EC 3.2.1.-).

[0038] Na décima terceira modalidade, as glicoamilases são selecionadas a partir da família das glicosil hidrolases GH15.[0038] In the thirteenth modality, glycoamylases are selected from the GH15 family of glycosyl hydrolases.

[0039] Em uma décima quarta modalidade, a protease é selecionada a partir do grupo consistindo em uma protease ácida ou uma metaloprotease neutra e, de preferência, a protease é uma protease aspártica fúngica ou uma metaloprotease neutra bacteriana.[0039] In a fourteenth embodiment, the protease is selected from the group consisting of an acidic protease or a neutral metalloprotease and, preferably, the protease is a fungal aspartic protease or a bacterial neutral metalloprotease.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURASBRIEF DESCRIPTION OF FIGURES

[0040] A Figura 1 retrata a liberação de glicose e maltose de milho a partir de farinha de milho pela alfa-amilase AkAA na presença de pepsina e protease AFP (Exemplo 2).[0040] Figure 1 depicts the release of corn glucose and maltose from corn flour by alpha-amylase AkAA in the presence of pepsin and AFP protease (Example 2).

[0041] A Figura 2 retrata a liberação de glicose, maltose e maltotriose a partir de farinha de milho por alfa-amilase AkAA e pancreatina e a sinergia de AkAA com pancreatina no aumento da glicose e na redução da liberação de maltotriose (Exemplo 4).[0041] Figure 2 depicts the release of glucose, maltose and maltotriose from corn flour by alpha-amylase AkAA and pancreatin and the synergy of AkAA with pancreatin in increasing glucose and reducing the release of maltotriose (Example 4) .

[0042] A Figura 3 mostra a atividade de alfa-amilase AtAA em farinha de milho na presença de pepsina a pH 2,5 e pancreatina a pH 6,7 e a conversão completa de maltotriose quando AtAA e pancreatina foram doseados em conjunto (Exemplo 5).[0042] Figure 3 shows the activity of AtAA alpha-amylase in corn flour in the presence of pepsin at pH 2.5 and pancreatin at pH 6.7 and the complete conversion of maltotriose when AtAA and pancreatin were dosed together (Example 5).

[0043] A Figura 4 mostra a estabilidade das alfa-amilases AkAA e AcAA e a sua mistura com glicoamilases TrGA e CS4 e aspartil protease quando incubadas com fluido ruminal (Exemplo 6).[0043] Figure 4 shows the stability of the alpha-amylases AkAA and AcAA and their mixture with glucoamylases TrGA and CS4 and aspartyl protease when incubated with rumen fluid (Example 6).

[0044] A Figura 5 mostra a atividade de alfa-amilases AkAA e AcAA na presença de pepsina, testadas a pH 3.2-6.0 (Exemplo 7).[0044] Figure 5 shows the activity of alpha-amylases AkAA and AcAA in the presence of pepsin, tested at pH 3.2-6.0 (Example 7).

[0045] A Figura 6 mostra a atividade de coquetéis de enzimas contendo alfa-amilases AkAA, AcAA e glicoamilase TrGA, CS4 e a aspartil peptidase AFP na presença de pancreatina (Exemplo 8).[0045] Figure 6 shows the activity of enzyme cocktails containing alpha-amylases AkAA, AcAA and glucoamylase TrGA, CS4 and the aspartyl peptidase AFP in the presence of pancreatin (Example 8).

[0046] A Figura 7 mostra a interação de glicoamilase com pancreatina no aumento da hidrólise de grânulos de amido de milho (Exemplo 10).[0046] Figure 7 shows the interaction of glucoamylase with pancreatin in increasing the hydrolysis of corn starch granules (Example 10).

[0047] A Figura 8 mostra a interação de glicoamilase com pancreatina no aumento da hidrólise de farinha de milho (Exemplo 10).[0047] Figure 8 shows the interaction of glucoamylase with pancreatin in increasing the hydrolysis of corn flour (Example 10).

[0048] A Figura 9 mostra a liberação de glicose de grânulos de amido de milho por maltase de levedura (alfa-glucosidase) na presença de uma quantidade fixa de pancreatina (Exemplo 13).[0048] Figure 9 shows the release of glucose from corn starch granules by yeast maltase (alpha-glucosidase) in the presence of a fixed amount of pancreatin (Example 13).

[0049] A Figura 10 mostra a estabilidade de cinco alfa-glucosidases no fluido ruminal e a interação com pancreatina na liberação de glicose (Exemplo 15).[0049] Figure 10 shows the stability of five alpha-glucosidases in ruminal fluid and the interaction with pancreatin in the release of glucose (Example 15).

[0050] A Figura 11 mostra a interação das cinco alfa-glucosidases com pancreatina na liberação de glicose a pH 6.0 (Exemplo 16).[0050] Figure 11 shows the interaction of the five alpha-glucosidases with pancreatin in the release of glucose at pH 6.0 (Example 16).

DESCRIÇÃO DETALHADADETAILED DESCRIPTION

[0051] Todas as patentes, pedidos de patente e publicações mencionados estão incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade.[0051] All mentioned patents, patent applications and publications are incorporated into this document by reference in their entirety.

[0052] Na presente invenção, inúmeros termos e abreviações são usados. As definições a seguir se aplicam a não ser que especificamente determinado de outro modo.[0052] In the present invention, numerous terms and abbreviations are used. The following definitions apply unless specifically stated otherwise.

[0053] Os artigos "um", "uma" e "o", "a" que precedem um elemento ou componente são concebidos como não restritivos em relação ao número de casos (isto é, ocorrências) do elemento ou componente. Portanto, "um", "uma" e "o", "a" devem ser lidos incluindo um ou pelo menos um, e a forma de palavra no singular do elemento ou componente também inclui o plural, a não ser que o número obviamente signifique o singular.[0053] The articles "a", "an" and "the", "a" preceding an element or component are intended as non-restrictive with respect to the number of cases (i.e., occurrences) of the element or component. Therefore, "a", "an" and "the", "a" must be read as including one or at least one, and the singular word form of the element or component also includes the plural, unless the number obviously mean the singular.

[0054] O termo "que compreende" ou "compreendendo" significa a presença dos recursos, números inteiros, etapas ou componentes determinados conforme referidos nas reivindicações, mas não exclui a presença ou a adição de um ou mais outros recursos, números inteiros, etapas, componentes ou grupos dos mesmos. O termo "que compreende" ou "compreendendo" destina-se a incluir modalidades englobadas pelos termos "que consiste essencialmente em", "que consiste em" e "consistindo em". Similarmente, o termo "que consiste essencialmente em" destina-se a incluir modalidades englobadas pelo termo "que consiste em".[0054] The term "comprising" or "comprising" means the presence of the features, integers, steps or components determined as referred to in the claims, but does not exclude the presence or addition of one or more other features, integers, steps , components or groups thereof. The term "comprising" or "comprising" is intended to include embodiments encompassed by the terms "consisting essentially of", "consisting of" and "consisting of". Similarly, the term "consisting essentially of" is intended to include embodiments encompassed by the term "consisting of."

[0055] Quando presentes, todas as faixas são inclusivas e combináveis. Por exemplo, quando uma faixa de "1 a 5" é mencionada, a faixa mencionada deve ser interpretada como incluindo as faixas "1 a 4", "1 a 3", "1 a 2", "1 a 2 e 4 a 5", "1 a 3 e 5" se similares.[0055] When present, all ranges are inclusive and combinable. For example, when a range from "1 to 5" is mentioned, the mentioned range should be interpreted as including the ranges "1 to 4", "1 to 3", "1 to 2", "1 to 2 and 4 to 5", "1 to 3 and 5" if similar.

[0056] Como usado aqui em combinação com um valor numérico, o termo "cerca de" se refere a uma faixa de +/- 0,5 do valor numérico, a menos que o termo seja especificamente definido de outro modo no contexto. Por exemplo, a expressão "valor de pH de cerca de 6" se refere a valores de pH de cerca de 5,5 a 6,5, a menos que o valor de pH seja especificamente definido de outro modo.[0056] As used herein in combination with a numerical value, the term "about" refers to a range of +/- 0.5 of the numerical value, unless the term is specifically defined otherwise in the context. For example, the expression "pH value of about 6" refers to pH values of about 5.5 to 6.5, unless the pH value is specifically defined otherwise.

[0057] Pretende-se que cada limitação numérica máxima dada ao longo deste Relatório Descritivo inclua cada limitação numérica inferior, como se tais limitações numéricas inferiores fossem expressamente escritas no presente documento. Cada limitação numérica mínima dada ao longo deste Relatório Descritivo incluirá cada limitação numérica superior, como se tais limitações numéricas superiores fossem expressamente escritas no presente documento. Cada faixa numérica dada ao longo deste Relatório Descritivo incluirá todas as faixas numéricas mais estreitas que estejam abrangidas dentro de tal faixa numérica mais ampla, como se tais faixas numéricas mais estreitas fossem, todas, expressamente escritas no presente documento.[0057] It is intended that each maximum numerical limitation given throughout this Descriptive Report includes each lower numerical limitation, as if such lower numerical limitations were expressly written in this document. Each minimum numerical limitation given throughout this Descriptive Report will include each upper numerical limitation, as if such upper numerical limitations were expressly written herein. Each numerical range given throughout this Descriptive Report will include all narrower numerical ranges that are encompassed within such broader numerical range, as if such narrower numerical ranges were all expressly written herein.

[0058] Os termos alfa-1,4/1,6-glicosídeo hidrolases ou alfa-1,4;1,6- glicosídeo hidrolases são aqui usados indistintamente ("GLCH"). Referem-se a enzimas capazes de hidrolisar ligações alfa-1,4 e/ou ligações alfa-1,6 em um oligômero ou moléculas de polímero em que estas glicosídeo hidrolases que (a) têm pelo menos 20% de atividade a um pH inferior ou igual a 3 na presença de pepsina em comparação com a atividade das enzimas a pH 6 na presença de pepsina, (b) tais enzimas são ativas em pelo menos duas de três câmaras digestivas de um ruminante compreendendo um rúmen, um abomaso e um intestino delgado e (c) as enzimas funcionam com amilase pancreática para aumentar o rendimento de glicose. De preferência, estas enzimas possuem um ou dois módulos de ligação de carboidrato e são capazes de hidrolisar amido em bruto. De preferência, estas enzimas de glicosídeo hidrolase são selecionadas a partir do grupo consistindo em alfa-amilases, glicoamilases e/ou alfa-glucosidases.[0058] The terms alpha-1,4/1,6-glycoside hydrolases or alpha-1,4;1,6-glycoside hydrolases are used interchangeably here ("GLCH"). Refer to enzymes capable of hydrolyzing alpha-1,4 bonds and/or alpha-1,6 bonds in an oligomer or polymer molecules in which these glycoside hydrolases that (a) have at least 20% activity at a lower pH or equal to 3 in the presence of pepsin compared to the activity of enzymes at pH 6 in the presence of pepsin, (b) such enzymes are active in at least two of three digestive chambers of a ruminant comprising a rumen, an abomasum and an intestine small and (c) the enzymes work with pancreatic amylase to increase glucose yield. Preferably, these enzymes have one or two carbohydrate-binding modules and are capable of hydrolyzing crude starch. Preferably, these glycoside hydrolase enzymes are selected from the group consisting of alpha-amylases, glucoamylases and/or alpha-glucosidases.

[0059] O termo "glicosídeo hidrolase" é usado de forma intercambiável com "glicosidases" e "glicosil hidrolases". As glicosídeo hidrolases auxiliam na hidrolase de ligações glicosídicas em açúcares complexos (polissacarídeos). Juntamente com as glicosiltransferases, as glicosidases formam o mecanismo catalítico principal para a síntese e quebra de ligações glicosídicas. As glicosídeo hidrolases são classificadas em EC 3.2.1 como enzimas que catalisam a hidrólise de O- ou S-glicosídeos. As glicosídeo hidrolases podem também ser classificadas de acordo com o resultado estereoquímico da reação de hidrólise. Assim, elas podem ser classificadas como enzimas de retenção ou de inversão. As glicosídeo hidrolases podem ser também classificadas como exo ou endo atuantes, dependendo de se atual na extremidade (usualmente não redutora) ou no meio, respectivamente, de uma cadeia de oligo/polissacarídeos. As glicosídeo hidrolases podem ser também classificadas por métodos baseados em sequência ou estrutura. As mesmas são tipicamente nomeadas de acordo com o substrato sobre as quais as mesmas atuam.[0059] The term "glycoside hydrolase" is used interchangeably with "glycosidases" and "glycosyl hydrolases". Glycoside hydrolases assist in the hydrolase of glycosidic bonds in complex sugars (polysaccharides). Together with glycosyltransferases, glycosidases form the main catalytic mechanism for the synthesis and cleavage of glycosidic bonds. Glycoside hydrolases are classified in EC 3.2.1 as enzymes that catalyze the hydrolysis of O- or S-glycosides. Glycoside hydrolases can also be classified according to the stereochemical result of the hydrolysis reaction. Thus, they can be classified as retention or inversion enzymes. Glycoside hydrolases can also be classified as exo or endo acting, depending on whether they are present at the end (usually non-reducing) or in the middle, respectively, of an oligo/polysaccharide chain. Glycoside hydrolases can also be classified by sequence or structure-based methods. They are typically named according to the substrate on which they act.

[0060] O termo "glicosiltransferase" se refere a uma enzima que catalisa a formação de uma ligação glicosídica entre monossacarídeos.[0060] The term "glycosyltransferase" refers to an enzyme that catalyzes the formation of a glycosidic bond between monosaccharides.

[0061] Os termos "glicano" e "polissacarídeo" são usados de forma intercambiável. O glicano se refere a um polissacarídeo ou oligossacarídeo ou à seção de carboidrato de um glicoconjugado, tal como glicoproteína, um glicolipídio ou um proteoglicano, mesmo se o carboidrato for apenas um oligossacarídeo. Os glicanos podem ser homo- ou heteropolímeros de resíduos de monossacarídeo. Podem ser moléculas lineares ou ramificadas. Os glicanos podem ser encontrados ligados às proteínas como em glicoproteínas e proteoglicanos. Em geral, são encontrados na superfície externa das células. Os glicanos O- e N-ligados são muito comuns em eucariotas, mas também são encontrados, embora menos comumente, em procariotas.[0061] The terms "glycan" and "polysaccharide" are used interchangeably. Glycan refers to a polysaccharide or oligosaccharide or the carbohydrate section of a glycoconjugate, such as a glycoprotein, a glycolipid, or a proteoglycan, even if the carbohydrate is just an oligosaccharide. Glycans can be homo- or heteropolymers of monosaccharide residues. They can be linear or branched molecules. Glycans can be found attached to proteins such as glycoproteins and proteoglycans. They are generally found on the outer surface of cells. O- and N-linked glycans are very common in eukaryotes, but are also found, although less commonly, in prokaryotes.

[0062] O termo "alfa-amilase" é usado indistintamente com alfa-1,4- D-glucano glucanohidrolase e glicogenase. Alfa-amilases (E.C. 3.2.1.1) geralmente, mas nem sempre, necessitam de cálcio para funcionar. Estas enzimas catalisam a endohidrolise de ligações alfa-1,4- glicosídicas em oligossacarídeos e polissacarídeos. As alfa-amilases atuam sobre amido, glicogênio e polissacarídeos e oligossacarídeos relacionados de maneira aleatória, liberando grupos redutores na configuração alfa.[0062] The term "alpha-amylase" is used interchangeably with alpha-1,4-D-glucan glucanohydrolase and glycogenase. Alpha-amylases (E.C. 3.2.1.1) generally, but not always, require calcium to function. These enzymes catalyze the endohydrolysis of alpha-1,4-glycosidic bonds in oligosaccharides and polysaccharides. Alpha-amylases act on starch, glycogen and related polysaccharides and oligosaccharides in a random manner, releasing reducing groups in the alpha configuration.

[0063] O termo "alfa-amilase ativa de pH baixo" ("LpHAA") se refere a uma alfa-amilase que que tem pelo menos 20% de atividade a um pH inferior ou igual a 3,0 em comparação com a sua atividade a pH 6,0. O termo "glicoamilase" (EC 3.2.1.3) é usado indistintamente com glucano 1,4-alfa-glicosidase, amiloglucosidase, gama-amilase, alfa-glicosidase lisossômica, maltase ácida, exo-1,4-alfa-glicosidase, glicose amilase, gama-1,4 glucano gluco-hidrolase, maltase ácida e 1,4-alfa-D-glucano hidrolase. Esta enzima cliva as últimas ligações alfa-1,4-glicosídicas na extremidade não redutora de amilose e amilopectina para produzir glicose. Também cliva as ligações alfa-1,6-glicosídicas.[0063] The term "low pH active alpha-amylase" ("LpHAA") refers to an alpha-amylase that has at least 20% activity at a pH less than or equal to 3.0 compared to its activity at pH 6.0. The term "glucoamylase" (EC 3.2.1.3) is used interchangeably with glucan 1,4-alpha-glucosidase, amyloglucosidase, gamma-amylase, lysosomal alpha-glucosidase, acid maltase, exo-1,4-alpha-glucosidase, glucose amylase , gamma-1,4 glucan glucohydrolase, acid maltase and 1,4-alpha-D-glucan hydrolase. This enzyme cleaves the last alpha-1,4-glycosidic bonds at the non-reducing end of amylose and amylopectin to produce glucose. It also cleaves alpha-1,6-glycosidic bonds.

[0064] O termo "alfa-glucosidase" (E.C.3.2.1.20) é usado indistintamente com maltase, glucoinvertase, glucosiosucrase, maltase- glicoamilase, alfa-glucopiranosidase, glucosidoinvertase, alfa-D-glico- sidase, alfa-glucosídeo hidrolase, alfa-1,4-glucosidase e alfa-D-gluco- sídeo gluco-hidrolase. Esta enzima hidrolisa resíduos de alfa-glicose ligados (1-4) não redutores terminais para liberar uma única molécula de alfa-glicose. A alfa-glucosidase é uma carboidrato-hidrolase que libera alfa-glicose, em oposição à beta-glicose.[0064] The term "alpha-glucosidase" (E.C.3.2.1.20) is used interchangeably with maltase, glucoinvertase, glucosiosucrase, maltase-glucoamylase, alpha-glucopyranosidase, glucosidoinvertase, alpha-D-glucosidase, alpha-glucoside hydrolase, alpha -1,4-glucosidase and alpha-D-glucoside glucohydrolase. This enzyme hydrolyzes terminal non-reducing (1-4) linked alpha-glucose residues to release a single alpha-glucose molecule. Alpha-glucosidase is a carbohydrate hydrolase that releases alpha-glucose, as opposed to beta-glucose.

[0065] O termo "ração" é usado em referência a produtos que são alimentados a animais na criação de gado. Os termos "ração" e "ração animal" são usados indistintamente. Em uma modalidade preferencial, o alimento ou a ração é para consumo por não ruminantes e ruminantes.[0065] The term "feed" is used in reference to products that are fed to animals in livestock farming. The terms "feed" and "animal feed" are used interchangeably. In a preferred embodiment, the food or feed is for consumption by non-ruminants and ruminants.

[0066] O termo "produto microbiano alimentado diretamente" ("DFM"), conforme usado no presente documento, é originado de micro-organismos de ocorrência natural vivos (viáveis). As categorias de DFMs incluem Bacillus, Bactérias formadoras de ácido láctico e Leveduras. Os Bacillus são hastes gram-positivas exclusivas que formam esporos. Os esporos são muito estáveis e podem suportar condições ambientais como calor, umidade e uma faixa de pH. Esses esporos germinam em células vegetativas ativas quando ingeridos por um animal e podem ser usados em refeição e dietas peletizadas. As bactérias formadoras de ácido láctico são cocos gram-positivos que produzem ácido láctico que são antagonistas a patógenos. Uma vez que as bactérias formadoras de ácido láctico parecem ser de algum modo sensíveis ao calor, não podem ser usadas em dietas peletizadas. Os tipos de bactérias formadoras de ácido láctico incluem Bifidobacterium, Lactobacillus e Streptococcus. As leveduras não são bactérias. Esses microrganismos pertencem aos fungos do grupo de planta.[0066] The term "directly fed microbial product" ("DFM"), as used herein, originates from live (viable) naturally occurring microorganisms. Categories of DFMs include Bacillus, Lactic acid-forming Bacteria, and Yeast. Bacillus are unique gram-positive rods that form spores. Spores are very stable and can withstand environmental conditions such as heat, humidity, and a range of pH. These spores germinate into active vegetative cells when ingested by an animal and can be used in meals and pelleted diets. Lactic acid-forming bacteria are gram-positive cocci that produce lactic acid that are antagonistic to pathogens. Since lactic acid-forming bacteria appear to be somewhat sensitive to heat, they cannot be used in pelleted diets. Types of lactic acid-forming bacteria include Bifidobacterium, Lactobacillus, and Streptococcus. Yeasts are not bacteria. These microorganisms belong to the plant group fungi.

[0067] O termo "protease", como usado aqui, se refere a uma enzima com capacidade para clivar uma ligação peptídica. Os termos "protease", "peptidase" e "proteinase" podem ser usados de forma intercambiável. As proteases podem ser encontradas em animais, plantas, bactérias, archaea e vírus. A proteólise pode ser atingida por enzimas atualmente classificadas em seus grupos amplos: proteases aspárticas, cisteína proteases, serina proteases, treonina proteases, proteases glutâmicas e metaloproteases.[0067] The term "protease", as used here, refers to an enzyme with the ability to cleave a peptide bond. The terms "protease", "peptidase" and "proteinase" can be used interchangeably. Proteases can be found in animals, plants, bacteria, archaea and viruses. Proteolysis can be achieved by enzymes currently classified into their broad groups: aspartic proteases, cysteine proteases, serine proteases, threonine proteases, glutamic proteases and metalloproteases.

[0068] Em particular, o termo "protease" significa um domínio de proteína ou polipeptídeo derivado de um microrganismo, por exemplo, um fungo, bactéria ou de uma planta ou animal e que tem a capacidade de catalisar a clivagem de ligações peptídicas em uma ou mais de várias posições de uma cadeia principal de proteína (por exemplo, E.C. 3,4).[0068] In particular, the term "protease" means a protein or polypeptide domain derived from a microorganism, for example, a fungus, bacterium or from a plant or animal and which has the ability to catalyze the cleavage of peptide bonds in a or more than several positions of a protein backbone (e.g., E.C. 3.4).

[0069] O termo "protease ácida" significa ter uma protease que tem a capacidade de hidrolisar proteínas sob condições ácidas. Pode incluir qualquer número de agentes de hidrólise de proteínas, tais como endopeptidases e exopeptidases.[0069] The term "acid protease" means having a protease that has the ability to hydrolyze proteins under acidic conditions. It may include any number of protein hydrolyzing agents, such as endopeptidases and exopeptidases.

[0070] Os termos "protease aspártica" e "protease de ácido aspártico" são usados de modo intercambiável no presente documento e são um tipo de protease ácida. Proteases aspárticas (EC 3.4.23), também conhecidas como aspartil proteases, usam uma molécula de água ativada ligada a um ou mais resíduos de aspartato catalítico para hidrolisar uma ligação de peptídeo em um substrato de polipeptídeo. Em geral, as mesmas têm dois aspartatos altamente conservados no local ativo e são idealmente ativos em pH ácido.[0070] The terms "aspartic protease" and "aspartic acid protease" are used interchangeably herein and are a type of acid protease. Aspartic proteases (EC 3.4.23), also known as aspartyl proteases, use an activated water molecule linked to one or more catalytic aspartate residues to hydrolyze a peptide bond in a polypeptide substrate. In general, they have two highly conserved aspartates in the active site and are ideally active at acidic pH.

[0071] A abreviação "AFP" se refere a uma protease fúngica aspártica, isto é, uma protease aspártica de uma fonte de organismo fúngico.[0071] The abbreviation "AFP" refers to an aspartic fungal protease, that is, an aspartic protease from a fungal organism source.

[0072] O termo "metaloprotease" é qualquer protease cujo mecanismo catalítico envolva um metal. A maioria das metaloproteases necessitam de zinco, mas algumas usam cobalto. O íon metálico é coordenado para a proteína através de três ligantes. Os ligantes que coordenam o íon metálico podem variar com histidina, glutamato, aspartato, lisina e arginina. A quarta posição de coordenação é absorvida por uma molécula de água lábil.[0072] The term "metalloprotease" is any protease whose catalytic mechanism involves a metal. Most metalloproteases require zinc, but some use cobalt. The metal ion is coordinated to the protein through three ligands. The ligands that coordinate the metal ion can vary with histidine, glutamate, aspartate, lysine and arginine. The fourth coordination position is absorbed by a labile water molecule.

[0073] Existem dois subgrupos de metaloproteinases que incluem (a), exopeptidases, metaloexopeptidases (número EC: 3.4.17), e (b), metaloendopeptidases (3.4.24).[0073] There are two subgroups of metalloproteinases that include (a), exopeptidases, metalloexopeptidases (EC number: 3.4.17), and (b), metalloendopeptidases (3.4.24).

[0074] Metaloendopeptidases bem conhecidas incluem proteínas ADAM e metaloproteinases de matriz.[0074] Well-known metalloendopeptidases include ADAM proteins and matrix metalloproteinases.

[0075] O termo "pepsina" como aqui utilizado se refere a uma enzima que decompõe proteínas em peptídeos menores a um pH baixo de 2,0 a 3,5, ou seja, trata-se de uma protease pertencente à família peptidase aspártica A1. É produzida e segregada para o estômago e é uma das principais enzimas digestivas dos sistemas digestivos de seres humanos e animais, onde ajuda a digerir as proteínas na comida ou ração.[0075] The term "pepsin" as used here refers to an enzyme that breaks down proteins into smaller peptides at a low pH of 2.0 to 3.5, that is, it is a protease belonging to the A1 aspartic peptidase family . It is produced and secreted into the stomach and is one of the main digestive enzymes in the digestive systems of humans and animals, where it helps digest proteins in food or feed.

[0076] O termo "ruminante" como aqui utilizado se refere a um mamífero que é capaz de adquirir nutrientes de alimentos à base de plantas fermentando-os em um estômago especializado antes da digestão, principalmente através de ações microbianas. O processo tipicamente requer que a ingesta fermentada (conhecida como mastigação merícica) seja regurgitada e mastigada novamente. O processo de remastigação merícica para quebrar ainda mais a matéria vegetal e estimular a digestão é chamado de ruminação. Cerca de 150 espécies de ruminantes incluem tanto espécies domésticas como selvagens. Os ruminantes incluem, mas não se limitam a, gado, vacas, cabras, ovelhas, girafas, iaques, veados, alces, antílopes, búfalos e similares.[0076] The term "ruminant" as used herein refers to a mammal that is capable of acquiring nutrients from plant-based foods by fermenting them in a specialized stomach prior to digestion, primarily through microbial actions. The process typically requires the fermented ingesta (known as meric mastication) to be regurgitated and chewed again. The process of rechewing merice to further break down plant matter and stimulate digestion is called rumination. About 150 species of ruminants include both domestic and wild species. Ruminants include, but are not limited to, cattle, cows, goats, sheep, giraffes, yaks, deer, elk, antelopes, buffaloes and the like.

[0077] O termo "câmaras digestivas de um ruminante" como usado neste documento, se refere ao rúmen, retículo, omaso, abomaso e intestino delgado (McDonald et al., 2011 Animal Nutrition (7a Edição), páginas 156-191). O abomaso é o equivalente direto do estômago monogástrico.[0077] The term "digestive chambers of a ruminant" as used herein refers to the rumen, reticulum, omasum, abomasum and small intestine (McDonald et al., 2011 Animal Nutrition (7th Edition), pages 156-191). The abomasum is the direct equivalent of the monogastric stomach.

[0078] O termo "forragem", como utilizado neste documento, se refere a um tipo de ração animal e é qualquer produto alimentício agrícola usado especificamente para alimentar gado, tal como bovinos, cabras, ovelhas, cavalos, galinhas e porcos. "Forragem" se refere principalmente ao alimento dado aos animais (incluindo plantas cortadas e levadas a eles), em vez do alimento que eles próprios angariam para si próprios (chamado igualmente de forragem). A forragem também é designada como provisões para animais e inclui feno, palha, silagem, rações comprimidas e peletizadas, óleos e rações mistas, e grãos germinados e leguminosas (como brotos de feijão, malte fresco ou malte utilizado). A maioria da ração para animais vem de plantas, mas alguns fabricantes adicionam ingredientes a rações processadas que são de origem animal.[0078] The term "forage", as used herein, refers to a type of animal feed and is any agricultural food product used specifically to feed livestock, such as cattle, goats, sheep, horses, chickens and pigs. "Forage" refers primarily to the food given to animals (including plants cut and brought to them), rather than the food they raise for themselves (also called forage). Forage is also referred to as animal feed and includes hay, straw, silage, compressed and pelleted feeds, oils and mixed feeds, and sprouted grains and legumes (such as bean sprouts, fresh malt or spent malt). Most pet food comes from plants, but some manufacturers add ingredients to processed pet foods that are of animal origin.

[0079] O termo "ração" é usado em referência a produtos que são alimentados a animais na criação de gado. Os termos "ração" e "ração animal" são usados indistintamente.[0079] The term "feed" is used in reference to products that are fed to animals in livestock farming. The terms "feed" and "animal feed" are used interchangeably.

[0080] O amido é um carboidrato polimérico consistindo de um grande número de unidades de glicose ligadas por laços glicosídicos e é o carboidrato armazenado mais comum em plantas. Assim, "amido" pode se referir a qualquer material compreendido pelos carboidratos polissacarídicos complexos de plantas, compreendidos por amilose e amilopectina com a fórmula (C6H10O5)x, em que X pode ser qualquer número. Em particular, o termo se relaciona com qualquer material à base de plantas incluindo, mas não se limitando a, grãos, gramas, tubérculos e raízes e mais especificamente trigo, cevada, milho, centeio, arroz, sorgo, farelo, mandioca, milhete, batata, batata doce e tapioca.[0080] Starch is a polymeric carbohydrate consisting of a large number of glucose units linked by glycosidic bonds and is the most common stored carbohydrate in plants. Thus, "starch" can refer to any material comprised of complex plant polysaccharide carbohydrates comprised of amylose and amylopectin with the formula (C6H10O5)x, where X can be any number. In particular, the term relates to any plant-based material including, but not limited to, grains, grasses, tubers and roots and more specifically wheat, barley, corn, rye, rice, sorghum, bran, cassava, millet, potato, sweet potato and tapioca.

[0081] Os termos "domínio de ligação de amido (SBD)" ou "módulo de ligação de carboidrato (CBM)" são usados indistintamente neste documento. Os SBDs podem ser divididos em nove famílias de CBM. Como fonte de energia, o amido é degradado por um grande número de várias enzimas amilolíticas. No entanto, apenas cerca de 10% delas são capazes de ligar e degradar amido em bruto. Estas enzimas possuem normalmente um módulo estrutural de sequência distinto chamado de domínio de ligação de amido que medeia a ligação aos grânulos de amido. O SBD se refere a uma sequência de aminoácidos que se liga preferencialmente a um substrato de amido (polissacarídeo) ou a um maltossacarídeo, alfa-, beta- e gama-ciclodextrina e similares. São normalmente motivos de aproximadamente 100 resíduos de aminoácidos encontrados em cerca de 10% das enzimas amilolíticas microbianas.[0081] The terms "starch binding domain (SBD)" or "carbohydrate binding module (CBM)" are used interchangeably in this document. SBDs can be divided into nine CBM families. As a source of energy, starch is degraded by a large number of various amylolytic enzymes. However, only about 10% of them are capable of binding and degrading raw starch. These enzymes typically possess a distinct structural sequence module called the starch-binding domain that mediates binding to starch granules. SBD refers to an amino acid sequence that preferentially binds to a starch substrate (polysaccharide) or a maltosaccharide, alpha-, beta- and gamma-cyclodextrin and the like. They are typically motifs of approximately 100 amino acid residues found in about 10% of microbial amylolytic enzymes.

[0082] O termo "domínio catalítico" se refere a uma região estrutural de um polipeptídeo que é diferente do CBM e que contém o local ativo para a hidrólise do substrato.[0082] The term "catalytic domain" refers to a structural region of a polypeptide that is different from the CBM and that contains the active site for substrate hydrolysis.

[0083] O termo "amido granular" se refere a amido em bruto (não cozido), por exemplo, amido que não foi submetido a gelatinização.[0083] The term "granular starch" refers to raw (uncooked) starch, for example, starch that has not undergone gelatinization.

[0084] Os termos "enzima de hidrolisação de amido granular (GSH)" e "atividade de hidrolisação de amido granular (GSH)" são utilizados indistintamente neste documento e se referem a enzimas que têm a capacidade de hidrolisar amido em forma granular sob condições relevantes do trato digestivo comparáveis às condições encontradas no trato digestivo dos animais e, em particular, dos ruminantes.[0084] The terms "granular starch hydrolyzing enzyme (GSH)" and "granular starch hydrolyzing activity (GSH)" are used interchangeably in this document and refer to enzymes that have the ability to hydrolyze starch in granular form under conditions relevant conditions of the digestive tract comparable to the conditions found in the digestive tract of animals and, in particular, ruminants.

[0085] O termo "gelatinização" se refere a quebrar as ligações intermoleculares de moléculas de amido na presença de água e calor, permitindo que os locais de ligação de hidrogênio envolvam mais água. Isso dissolve de forma irreversível o grânulo de amido em água para formar uma suspensão viscosa.[0085] The term "gelatinization" refers to breaking the intermolecular bonds of starch molecules in the presence of water and heat, allowing the hydrogen bonding sites to enclose more water. This irreversibly dissolves the starch granule in water to form a viscous suspension.

[0086] O termo "grau de polimerização (DP)" se refere ao número de unidades monoméricas em uma macromolécula, ou polímero ou molécula de oligômero. Por exemplo, pode referir o número (n) de unidades de monômero em um determinado sacarídeo. Exemplos de DP1 são os monossacarídeos, como glicose e frutose. Exemplos de DP2 são os dissacarídeos, como maltose e sacarose. Um DP>3 denota polímeros com um grau de polimerização maior que 3.[0086] The term "degree of polymerization (DP)" refers to the number of monomeric units in a macromolecule, or polymer or oligomer molecule. For example, it may refer to the number (n) of monomer units in a given saccharide. Examples of DP1 are monosaccharides, such as glucose and fructose. Examples of DP2 are disaccharides such as maltose and sucrose. A DP>3 denotes polymers with a degree of polymerization greater than 3.

[0087] O termo "isolado" significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitativos de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância de ocorrência não natural, (2) qualquer substância incluindo, porém sem limitação, qualquer célula hospedeira, enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removida de um ou mais ou da totalidade dos constituintes de ocorrência natural aos quais está associada na natureza; (3) qualquer substância modificada pelo homem em relação a essa substância presente na natureza; ou (4) qualquer substância modificada mediante aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes aos quais está naturalmente associada. Os termos "molécula de ácido nucleico isolada", "polinucleotídeo isolado" e "fragmento de ácido nucleico isolado" serão usados de forma intercambiável e se referem a um polímero de RNA ou DNA que é de fita simples ou dupla fita, que contém opcionalmente bases de nucleotídeo sintéticas, não naturais ou alteradas. Uma molécula de ácido nucleico isolada na forma de um polímero de DNA pode ser compreendida por um ou mais segmentos de cDNA, DNA genômico ou DNA sintético.[0087] The term "isolated" means a substance in a form or environment that does not occur in nature. Non-limiting examples of isolated substances include (1) any non-naturally occurring substance, (2) any substance including, but not limited to, any host cell, enzyme, variant, nucleic acid, protein, peptide or cofactor, which is at least partially removed from one or more or all of the naturally occurring constituents with which it is associated in nature; (3) any substance modified by man in relation to that substance present in nature; or (4) any substance modified by increasing the amount of the substance relative to other components with which it is naturally associated. The terms "isolated nucleic acid molecule", "isolated polynucleotide" and "isolated nucleic acid fragment" will be used interchangeably and refer to an RNA or DNA polymer that is single-stranded or double-stranded, which optionally contains bases synthetic, unnatural or altered nucleotides. An isolated nucleic acid molecule in the form of a DNA polymer can be comprised of one or more segments of cDNA, genomic DNA or synthetic DNA.

[0088] O termo "purificado" conforme aplicado aos ácidos nucleicos ou polipeptídeos, de modo geral, denotados como um ácido nucleico ou polipeptídeo que é essencialmente livre de outros componentes conforme determinado pelas técnicas analíticas bem conhecidas na técnica (por exemplo, um polipeptídeo ou polinucleotídeo purificado forma uma banda discreta em um gel eletroforético, eluato cromatográfico e/ou uma mídia submetida a centrifugação de gradiente por densidade). Por exemplo, um ácido nucleico ou polipeptídeo que origina essencialmente uma banda em um gel eletroforético é "purificado". Um ácido nucleico ou polipeptídeo purificado é pelo menos cerca de 50% puro, normalmente pelo menos cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 99,5%, cerca de 99,6%, cerca de 99,7%, cerca de 99,8% ou mais puro (por exemplo, porcentagem em peso em uma base molar). Em um sentido relacionado, uma composição é enriquecida para uma molécula quando há um aumento substancial na concentração da molécula após aplicação de uma técnica de purificação ou enriquecimento. O termo "enriquecido" se refere a um composto, polipeptídeo, célula, ácido nucleico, aminoácido ou outro material ou componente especificado que esteja presente em uma composição em uma concentração relativa ou absoluta que seja maior que uma composição inicial.[0088] The term "purified" as applied to nucleic acids or polypeptides is generally denoted as a nucleic acid or polypeptide that is essentially free of other components as determined by analytical techniques well known in the art (e.g., a polypeptide or purified polynucleotide forms a discrete band in an electrophoretic gel, chromatographic eluate, and/or a media subjected to density gradient centrifugation). For example, a nucleic acid or polypeptide that essentially gives rise to a band on an electrophoretic gel is "purified." A purified nucleic acid or polypeptide is at least about 50% pure, typically at least about 60%, about 65%, about 70%, about 75%, about 80%, about 85%, about 90%, about 91%, about 92%, about 93%, about 94%, about 95%, about 96%, about 97%, about 98%, about 99%, about 99.5%, about 99.6%, about 99.7%, about 99.8% or purer (e.g., percentage by weight on a molar basis). In a related sense, a composition is enriched for a molecule when there is a substantial increase in the concentration of the molecule after application of a purification or enrichment technique. The term "enriched" refers to a compound, polypeptide, cell, nucleic acid, amino acid, or other specified material or component that is present in a composition in a relative or absolute concentration that is greater than an initial composition.

[0089] Os termos "peptídeos", "proteínas" e "polipeptídeos" são usados indistintamente no presente documento e referem-se a um polímero de aminoácidos unidos por ligações peptídicas. Uma "proteína" ou um "polipeptídeo" compreende uma sequência polimérica de resíduos de aminoácido. O código de uma única letra e de 3 letras para aminoácidos definido em conformidade com IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN) é usado ao longo desta descrição. A única letra X se refere a qualquer um dos vinte aminoácidos. Compreende-se também que um polipeptídeo pode ser codificado por mais do que uma sequência de nucleotídeos devido à degeneração do código genético. As mutações podem ser denominadas pelo código de uma letra para o aminoácido original, seguidas por um número da posição e, então, o código de uma letra para o aminoácido variante. Por exemplo, a mutação de glicina (G) na posição 87 para serina (S) é representada como "G087S" ou "G87S". Ao descrever as modificações, uma posição seguida pelos aminoácidos listados entre parênteses indica uma lista de substituições nessa posição por qualquer um dos aminoácidos listados. Por exemplo, 6(L, I) significa que a posição 6 pode ser substituída por uma leucina ou uma isoleucina. Algumas vezes, em uma sequência, uma barra (/) é usada para definir substituições, por exemplo, F/V indica que a posição particular pode ter uma fenilalanina ou valina nessa posição.[0089] The terms "peptides", "proteins" and "polypeptides" are used interchangeably in this document and refer to a polymer of amino acids joined by peptide bonds. A "protein" or a "polypeptide" comprises a polymeric sequence of amino acid residues. The single-letter, 3-letter code for amino acids defined in accordance with IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN) is used throughout this description. The single letter X refers to any of the twenty amino acids. It is also understood that a polypeptide can be encoded by more than one nucleotide sequence due to the degeneracy of the genetic code. Mutations can be named by the one-letter code for the original amino acid, followed by a position number, and then the one-letter code for the variant amino acid. For example, the mutation from glycine (G) at position 87 to serine (S) is represented as "G087S" or "G87S". When describing modifications, a position followed by the amino acids listed in parentheses indicates a list of substitutions at that position for any of the listed amino acids. For example, 6(L, I) means that position 6 can be replaced by a leucine or an isoleucine. Sometimes in a sequence a slash (/) is used to define substitutions, for example, F/V indicates that the particular position may have a phenylalanine or valine at that position.

[0090] As mutações podem ser denominadas pelo código de uma letra para o aminoácido original, seguidas por um número da posição e, então, o código de uma letra para o aminoácido variante. Por exemplo, a mutação de glicina (G) na posição 87 para serina (S) é representada como "G087S" ou "G87S".[0090] Mutations can be named by the one-letter code for the original amino acid, followed by a position number and then the one-letter code for the variant amino acid. For example, the mutation from glycine (G) at position 87 to serine (S) is represented as "G087S" or "G87S".

[0091] O termo forma "madura" de uma proteína, de um polipeptídeo ou de um peptídeo se refere à forma funcional da proteína, do polipeptídeo ou da enzima sem a sequência de peptídeo de sinalização e sequência de pró-peptídeo.[0091] The term "mature" form of a protein, polypeptide or peptide refers to the functional form of the protein, polypeptide or enzyme without the signal peptide sequence and pro-peptide sequence.

[0092] O termo forma "precursora" de uma proteína ou de um peptídeo se refere a uma forma madura da proteína que tem uma pró- sequência ligada de modo operacional ao terminal amino ou carbonila da proteína. O precursor também pode ter uma sequência "de sinalização" ligada de modo operacional ao terminal amino da pró- sequência. O precursor também pode ter polipeptídeos adicionais que estão envolvidos na atividade pós-transcrição (por exemplo, polipeptídeos clivados a partir da mesma para deixar a forma madura de uma proteína ou um peptídeo).[0092] The term "precursor" form of a protein or peptide refers to a mature form of the protein that has a prosequence operably linked to the amino or carbonyl terminus of the protein. The precursor may also have a "signal" sequence operatively linked to the amino terminus of the prosequence. The precursor may also have additional polypeptides that are involved in post-transcriptional activity (e.g., polypeptides cleaved from it to leave the mature form of a protein or peptide).

[0093] Uma "pró-sequência" ou "sequência de pró-peptídeo" se refere a uma sequência de aminoácidos entre a sequência de peptídeo de sinalização e a sequência de enzima madura (por exemplo, uma glicosídeo hidrolase como descrita neste documento) que é necessária para o enovelamento e a secreção adequada de uma enzima; as mesmas são denominadas, às vezes, como chaperonas intramoleculares. A clivagem da pró-sequência ou sequência de pró- peptídeos resulta em uma enzima ativa madura que é frequentemente expressa como pró-enzimas.[0093] A "prosequence" or "propeptide sequence" refers to an amino acid sequence between the signal peptide sequence and the mature enzyme sequence (e.g., a glycoside hydrolase as described herein) that is necessary for the proper folding and secretion of an enzyme; They are sometimes called intramolecular chaperones. Cleavage of the prosequence or propeptide sequence results in a mature active enzyme that is often expressed as proenzymes.

[0094] Os termos "sequência de sinalização" e "peptídeo de sinalização" se referem a uma sequência de resíduos de aminoácido que pode participar na secreção ou no transporte direto da forma madura ou precursora de uma proteína. A sequência de sinalização está tipicamente localizada no N-terminal da sequência de proteínas precursora ou madura. A sequência de sinalização pode ser endógena ou exógena. Uma sequência de sinalização está normalmente ausente da proteína madura. Uma sequência de sinalização é tipicamente clivada da proteína por uma peptidase de sinalização após a proteína ser transportada. O gene de interesse pode ser expresso com ou sem uma sequência de sinal.[0094] The terms "signal sequence" and "signal peptide" refer to a sequence of amino acid residues that can participate in the secretion or direct transport of the mature or precursor form of a protein. The signal sequence is typically located at the N-terminus of the precursor or mature protein sequence. The signaling sequence can be endogenous or exogenous. A signal sequence is normally absent from the mature protein. A signal sequence is typically cleaved from the protein by a signal peptidase after the protein is transported. The gene of interest can be expressed with or without a signal sequence.

[0095] O termo "tipo selvagem" em referência a uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de ácidos nucleicos indica que a sequência de aminoácidos ou sequência de ácidos nucleicos é uma sequência nativa ou de ocorrência natural. Conforme usado no presente documento, o termo "de ocorrência natural" se refere a qualquer coisa (por exemplo, proteínas, aminoácidos ou sequências de ácidos nucleicos) que seja encontrada na natureza. Inversamente, o termo "de ocorrência não natural" se refere a qualquer coisa que não seja encontrada na natureza (por exemplo, ácidos nucleicos recombinantes e sequências de proteínas produzidas no laboratório ou modificação da sequência de tipo selvagem).[0095] The term "wild type" in reference to an amino acid sequence or a nucleic acid sequence indicates that the amino acid sequence or nucleic acid sequence is a native or naturally occurring sequence. As used herein, the term "naturally occurring" refers to anything (e.g., proteins, amino acids, or nucleic acid sequences) that is found in nature. Conversely, the term "non-naturally occurring" refers to anything that is not found in nature (e.g., recombinant nucleic acids and protein sequences produced in the laboratory or modification of wild-type sequence).

[0096] Conforme usado no presente documento em relação às posições de resíduo de aminoácido, "que corresponde a" ou "corresponde a" ou "corresponde" se refere a um resíduo de aminoácido na posição enumerada em uma proteína ou um peptídeo, ou um resíduo de aminoácido que seja análogo, homólogo ou equivalente a um resíduo enumerado em uma proteína ou um peptídeo. Conforme usado no presente documento, "região correspondente", em geral, se refere a uma posição análoga em uma proteína relacionada ou uma proteína de referência.[0096] As used herein in relation to amino acid residue positions, "corresponding to" or "corresponds to" or "corresponds" refers to an amino acid residue at the enumerated position in a protein or a peptide, or a amino acid residue that is analogous, homologous or equivalent to a residue listed in a protein or peptide. As used herein, "corresponding region" generally refers to an analogous position in a related protein or a reference protein.

[0097] Os termos "derivado de" e "obtido a partir de" se referem a não apenas uma proteína produzida ou produzível por uma cepa do organismo em questão, mas também uma proteína codificada por uma sequência de DNA isolada de tal cepa e produzida em um organismo hospedeiro que contém tal sequência de DNA. Adicionalmente, o termo se refere a uma proteína que é codificada por uma sequência de DNA de origem sintética e/ou de cDNA e que tem as características de identificação da proteína em questão.[0097] The terms "derived from" and "obtained from" refer to not only a protein produced or producible by a strain of the organism in question, but also a protein encoded by a DNA sequence isolated from such a strain and produced in a host organism that contains such a DNA sequence. Additionally, the term refers to a protein that is encoded by a DNA sequence of synthetic origin and/or cDNA and that has the identifying characteristics of the protein in question.

[0098] O termo "aminoácido" se refere à unidade estrutural química básica de uma proteína ou um polipeptídeo. Assim, um códon para o aminoácido alanina, um aminoácido hidrofóbico, pode ser substituído por um códon que codifica outro resíduo menos hidrofóbico (tal como glicina) ou um resíduo mais hidrofóbico (tal como valina, leucina ou isoleucina). Similarmente, espera-se também que alterações que resultam em substituição de um resíduo negativamente carregado por outro (tal como ácido aspártico por ácido glutâmico) ou um resíduo positivamente carregado por outro (tal como lisina por arginina) produzam um produto funcionalmente equivalente. Em muitos casos, não seria esperado também que as alterações de nucleotídeo que resultam em alteração das porções N-terminais e C-terminais da molécula de proteína alterassem a atividade da proteína. Cada uma das modificações propostas está bem dentro da habilidade comum na técnica, tal como está a determinação de manutenção de atividade biológica dos produtos codificados.[0098] The term "amino acid" refers to the basic chemical structural unit of a protein or polypeptide. Thus, a codon for the amino acid alanine, a hydrophobic amino acid, can be replaced by a codon encoding another less hydrophobic residue (such as glycine) or a more hydrophobic residue (such as valine, leucine, or isoleucine). Similarly, changes that result in the substitution of one negatively charged residue for another (such as aspartic acid with glutamic acid) or one positively charged residue for another (such as lysine for arginine) are also expected to produce a functionally equivalent product. In many cases, nucleotide changes that result in alteration of the N-terminal and C-terminal portions of the protein molecule would also not be expected to alter the activity of the protein. Each of the proposed modifications is well within the common skill in the art, as is the determination of maintenance of biological activity of the encoded products.

[0099] O termo "com otimização de códon", em referência a genes ou regiões de codificação de moléculas de ácido nucleico para transformação de vários hospedeiros, se refere à alteração de códons no gene ou regiões de codificação as moléculas de ácido nucleico para refletir o uso de códon típico do organismo hospedeiro sem alterar o polipeptídeo para o qual o DNA codifica.[0099] The term "codon-optimized", in reference to genes or coding regions of nucleic acid molecules for multi-host transformation, refers to changing codons in the gene or coding regions of the nucleic acid molecules to reflect the use of a codon typical of the host organism without altering the polypeptide for which the DNA codes.

[00100] O termo "gene" se refere a uma molécula de ácido nucleico que expressa uma proteína específica, incluindo sequências reguladoras anteriores (sequências de não codificação 5') e posteriores (sequências de não codificação 3') à sequência de codificação. "Gene nativo" se refere a um gene conforme encontrado na natureza com suas próprias sequências reguladoras. "Geme quimérico" se refere a qualquer gene que não seja um gene nativo, que compreende sequências reguladoras e de codificação que não são encontradas juntas na natureza. Consequentemente, um gene quimérico pode compreender sequências reguladoras e sequências de codificação que são derivadas de fontes diferentes, ou sequências reguladoras e sequências de codificação derivadas da mesma fonte, mas dispostas de uma maneira diferente daquela encontrada na natureza. "Gene endógeno" se refere a um gene nativo em sua localização natural no genoma de um organismo. Um gene "estranho" se refere a um gene que não é normalmente encontrado no organismo hospedeiro, mas que é introduzido no organismo hospedeiro por transferência de gene. Os genes estranhos podem compreender genes nativos inseridos em um organismo não nativo ou genes quiméricos. Um "transgene" é um gene que foi introduzido no genoma por um procedimento de transformação.[00100] The term "gene" refers to a nucleic acid molecule that expresses a specific protein, including regulatory sequences preceding (5' non-coding sequences) and subsequent (3' non-coding sequences) the coding sequence. "Native gene" refers to a gene as found in nature with its own regulatory sequences. "Chimeric gene" refers to any gene, other than a native gene, that comprises regulatory and coding sequences that are not found together in nature. Accordingly, a chimeric gene may comprise regulatory sequences and coding sequences that are derived from different sources, or regulatory sequences and coding sequences derived from the same source but arranged in a manner different from that found in nature. "Endogenous gene" refers to a native gene in its natural location in an organism's genome. A "foreign" gene refers to a gene that is not normally found in the host organism, but that is introduced into the host organism by gene transfer. Foreign genes may comprise native genes inserted into a non-native organism or chimeric genes. A "transgene" is a gene that has been introduced into the genome by a transformation procedure.

[00101] O termo "sequência de codificação" se refere a uma sequência de nucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos específica. "Sequências reguladoras adequadas" se referem a sequências de nucleotídeos localizadas a montante (sequências de não codificação 5'), dentro ou a jusante (sequências de não codificação 3') de uma sequência de codificação e que influenciam a transcrição, estabilidade ou processamento de RNA ou tradução da sequência de codificação associada. As sequências reguladoras podem incluir promotores, sequências de iniciação de tradução, local de processamento de RNA, locais de ligação efetores e estruturas de haste-laço.[00101] The term "coding sequence" refers to a nucleotide sequence that encodes a specific amino acid sequence. "Suitable regulatory sequences" refer to nucleotide sequences located upstream (5' non-coding sequences), within or downstream (3' non-coding sequences) of a coding sequence and which influence the transcription, stability or processing of RNA or translation of the associated coding sequence. Regulatory sequences may include promoters, translation initiation sequences, RNA processing site, effector binding sites, and stem-loop structures.

[00102] O termo "operacionalmente ligado" se refere à associação de sequências de ácidos nucleicos em uma única molécula de ácido nucleico de modo que a função de um seja afetada pelo outro. Por exemplo, um promotor é operacionalmente ligado a uma sequência de codificação quando o mesmo tem a capacidade de afetar a expressão dessa sequência de codificação, isto é, a sequência de codificação está sob o controle transcricional do promotor. As sequências de codificação podem ser operativamente ligadas às sequências reguladoras em uma orientação senso ou antissenso.[00102] The term "operationally linked" refers to the association of nucleic acid sequences in a single nucleic acid molecule so that the function of one is affected by the other. For example, a promoter is operably linked to a coding sequence when it has the ability to affect the expression of that coding sequence, that is, the coding sequence is under the transcriptional control of the promoter. The coding sequences can be operatively linked to the regulatory sequences in a sense or antisense orientation.

[00103] Os termos "sequência regulatória" ou "sequência de controle" são usados indistintamente no presente documento e se referem a um segmento de uma sequência de nucleotídeos que tem capacidade para aumentar ou diminuir a expressão de genes específicos dentro de um organismo. Os exemplos de sequências reguladoras incluem, porém sem limitação, promotores, sequência de sinal, operadores e similares. Conforme indicado acima, as sequências reguladoras podem ser operacionalmente ligadas em orientação senso ou antissenso à sequência de codificação/gene de interesse.[00103] The terms "regulatory sequence" or "control sequence" are used interchangeably herein and refer to a segment of a nucleotide sequence that has the ability to increase or decrease the expression of specific genes within an organism. Examples of regulatory sequences include, but are not limited to, promoters, signal sequences, operators, and the like. As indicated above, regulatory sequences can be operably linked in sense or antisense orientation to the coding sequence/gene of interest.

[00104] "Promotor" ou "sequências promotoras" se referem a sequências de DNA que definem onde começa a transcrição de um gene por RNA polimerase. As sequências promotoras estão tipicamente localizadas diretamente a montante ou na extremidade 5' do local de iniciação de transcrição. Os promotores podem ser derivados na sua totalidade de uma sequência nativa ou de ocorrência natural ou podem ser compostos por diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza ou ainda compreender segmentos de DNA sintéticos. É entendido por aqueles versados na técnica que diferentes promotores podem direcionar a expressão de um gene em diferentes tecidos ou tipos de célula ou em diferentes estágios de desenvolvimento ou em resposta a diferentes condições ambientais ou fisiológicas ("promotores induzíveis").[00104] "Promoter" or "promoter sequences" refer to DNA sequences that define where transcription of a gene by RNA polymerase begins. Promoter sequences are typically located directly upstream or at the 5' end of the transcription initiation site. Promoters may be derived entirely from a native or naturally occurring sequence or may be composed of different elements derived from different promoters found in nature or comprise synthetic DNA segments. It is understood by those skilled in the art that different promoters can direct the expression of a gene in different tissues or cell types or at different stages of development or in response to different environmental or physiological conditions ("inducible promoters").

[00105] As "sequências de não codificação 3'" se referem a sequências de DNA localizadas a jusante de uma sequência de codificação e incluem sequências que codificam sinais reguladores com capacidade para afetar o processamento de mRNA ou a expressão de gene, tal como terminação de transcrição.[00105] "3' non-coding sequences" refer to DNA sequences located downstream of a coding sequence and include sequences that encode regulatory signals with the ability to affect mRNA processing or gene expression, such as termination of transcription.

[00106] O termo "transformação", como usado aqui, se refere à transferência ou à introdução de uma molécula de ácido nucleico em um organismo hospedeiro. A molécula de ácido nucleico pode ser introduzida como uma forma linear ou circular de DNA. A molécula de ácido nucleico pode ser um plasmídeo que replica autonomamente, ou pode integrar-se no genoma de um hospedeiro de produção. Os hospedeiros de produção que contêm o ácido nucleico transformado são denominados organismos "transformados" ou "recombinantes" ou "transgênicos" ou "transformantes".[00106] The term "transformation", as used herein, refers to the transfer or introduction of a nucleic acid molecule into a host organism. The nucleic acid molecule can be introduced as a linear or circular form of DNA. The nucleic acid molecule may be a plasmid that replicates autonomously, or it may integrate into the genome of a production host. Production hosts that contain the transformed nucleic acid are called "transformed" or "recombinant" or "transgenic" or "transformant" organisms.

[00107] O termo "recombinante", como usado aqui, se refere a uma combinação artificial de dois segmentos de sequências e ácidos nucleicos de outro modo separados, por exemplo, por síntese química, ou pela manipulação de segmentos isolados de ácidos nucleicos por meio de técnicas de engenharia genética. Por exemplo, DNA em que um ou mais segmentos ou genes foram inseridos, naturalmente ou por manipulação em laboratório, de uma molécula diferente, de outra parte da mesma molécula ou uma sequência artificial, resultando na introdução de uma nova sequência em um gene e subsequentemente em um organismo. Os termos "recombinante", "transgênico", "transformado", "geneticamente modificado" ou "modificado para expressão de gene exógena" são usados indistintamente no presente documento.[00107] The term "recombinant", as used herein, refers to an artificial combination of two otherwise separate segments of nucleic acid sequences and nucleic acids, for example, by chemical synthesis, or by manipulation of isolated segments of nucleic acids by means of of genetic engineering techniques. For example, DNA into which one or more segments or genes have been inserted, naturally or by laboratory manipulation, of a different molecule, another part of the same molecule, or an artificial sequence, resulting in the introduction of a new sequence into a gene and subsequently in an organism. The terms "recombinant", "transgenic", "transformed", "genetically modified" or "modified for exogenous gene expression" are used interchangeably herein.

[00108] Os termos "construto recombinante", "construto de expressão", "construto de expressão recombinante" e "cassete de expressão" são usados de forma intercambiável. Uma construção recombinante compreende uma combinação artificial de fragmentos de ácido nucleico, por exemplo, sequências reguladoras e codificantes que não são todas encontradas juntas na natureza. Por exemplo, uma construção pode compreender sequências reguladoras e sequências codificantes que são derivadas de fontes diferentes, ou sequências reguladoras e sequências codificantes derivadas da mesma fonte, mas dispostas de uma maneira diferente daquela encontrada na natureza. Tal construto pode ser usado sozinho ou pode ser usado em conjunto com um vetor. Se um vetor for usado, então, a escolha de vetor depende do método que será usado para transformar células hospedeiras conforme é conhecido pelos indivíduos versados na técnica. Por exemplo, pode ser usado um vetor plasmidial. O indivíduo versado na técnica está ciente dos elementos genéticos que devem estar presentes no vetor a fim de transformar, selecionar e propagar com sucesso células hospedeiras. O indivíduo versado na técnica também reconhecerá que diferentes eventos de transformação independentes podem resultar em diferentes níveis e padrões de expressão (Jones et al., (1985) EMBO J 4:2411 a 2418; De Almeida et al., (1989) Mol Gen Genetics 218:78 a 86) e, dessa forma, que múltiplos eventos são tipicamente rastreados a fim de obter linhagens que exibam o padrão e nível de expressão desejados. Tal triagem pode ser realizada usando ensaios biológicos moleculares, bioquímicos e outros ensaios incluindo análise Southern de DNA, análise Northern de expressão de RNAm, PCR, PCR quantitativa em tempo real (qPCR), PCR de transcrição reversa (RT-PCR), análise de immunoblot da expressão proteica, ensaios enzimáticos ou de atividade e/ou análise fenotípica.[00108] The terms "recombinant construct", "expression construct", "recombinant expression construct" and "expression cassette" are used interchangeably. A recombinant construct comprises an artificial combination of nucleic acid fragments, for example, regulatory and coding sequences that are not all found together in nature. For example, a construct may comprise regulatory sequences and coding sequences that are derived from different sources, or regulatory sequences and coding sequences derived from the same source but arranged in a manner different from that found in nature. Such a construct can be used alone or can be used in conjunction with a vector. If a vector is used, then the choice of vector depends on the method that will be used to transform host cells as is known to those skilled in the art. For example, a plasmid vector may be used. The person skilled in the art is aware of the genetic elements that must be present in the vector in order to successfully transform, select and propagate host cells. The person skilled in the art will also recognize that different independent transformation events can result in different levels and patterns of expression (Jones et al., (1985) EMBO J 4:2411 to 2418; De Almeida et al., (1989) Mol Gen Genetics 218:78 to 86) and thus that multiple events are typically screened in order to obtain lineages that exhibit the desired pattern and level of expression. Such screening can be performed using molecular biological, biochemical and other assays including DNA Southern analysis, mRNA expression Northern analysis, PCR, real-time quantitative PCR (qPCR), reverse transcription PCR (RT-PCR), immunoblot of protein expression, enzymatic or activity assays and/or phenotypic analysis.

[00109] Os termos "hospedeiro de produção", "hospedeiro" e "célula hospedeira" são usados indistintamente no presente documento e se referem a qualquer organismo, ou célula do mesmo, seja humano ou não humano, em que um construto recombinante pode ser introduzido de modo estável ou temporário a fim de expressar um gene. Esse termo abrange qualquer progênie de uma célula original que não seja idêntica à célula original devido a mutações que ocorrem durante a propagação.[00109] The terms "production host", "host" and "host cell" are used interchangeably herein and refer to any organism, or cell thereof, whether human or non-human, in which a recombinant construct can be introduced stably or temporarily in order to express a gene. This term covers any progeny of an original cell that is not identical to the original cell due to mutations that occur during propagation.

[00110] O termo "porcentagem de identidade" é uma relação entre duas ou mais sequências de polipeptídeos ou duas ou mais sequências de polinucleotídeos, conforme determinado através da comparação de sequências. Na técnica, "identidade" também significa o grau de relação de sequência entre as sequências de polipeptídeos ou polinucleotídeos, conforme possa ser o caso, conforme determinado pelo número de nucleotídeos ou aminoácidos correlacionados entre as cadeias de tais sequências. "Identidade" e "similaridade" podem ser facilmente calculadas por métodos conhecidos, incluindo, porém sem limitação, aqueles descritos em: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NI (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., e Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); e Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. e Devereux, J., eds.) Stockton Press, NI (1991). Os métodos para determinar a identidade e a similaridade são codificados em programas de computador publicamente disponíveis.[00110] The term "percent identity" is a relationship between two or more polypeptide sequences or two or more polynucleotide sequences, as determined through sequence comparison. In the art, "identity" also means the degree of sequence relationship between polypeptide or polynucleotide sequences, as the case may be, as determined by the number of correlated nucleotides or amino acids between the chains of such sequences. "Identity" and "similarity" can be readily calculated by known methods, including, but not limited to, those described in: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NI (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); and Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, NI (1991). Methods for determining identity and similarity are encoded in publicly available computer programs.

[00111] Conforme usado no presente documento, "% de identidade" ou porcentagem de identidade" ou "PID" se refere à identidade de sequência de proteínas. A porcentagem de identidade pode ser determinada com o uso de técnicas padrão conhecidas na técnica. Algoritmos úteis incluem os algoritmos BLAST (Consultar, Altschul et al., J Mol Biol, 215:403 a 410, 1990; e Karlin e Altschul, Proc Natl Acad Sci EUA, 90:5.873 a 5.787, 1993). O programa BLAST usa diversos parâmetros de pesquisa, a maioria dos quais é definida para os valores padrão. O algoritmo NCBI BLAST encontra as sequências mais relevantes em termos de similaridade biológica, mas não é recomendado para sequências de consulta de menos de 20 resíduos (Altschul et al., Nucleic Acids Res, 25:3.389 a 3.402, 1997; e Schaffer et al., Nucleic Acids Res, 29:2.994 a 3.005, 2001). Os parâmetros BLAST padrão exemplificativos para uma pesquisa de sequência de ácidos nucleicos incluem: Limite de palavras vizinhas = 11; Corte de-valor E = 10; Matriz de Pontuação = NUC.3.1 (correspondência = 1, não correspondência = -3); Abertura de Intervalo = 5; e Extensão de Intervalo = 2. Os parâmetros BLAST padrão exemplificativos para as pesquisas de sequência de aminoácidos incluem: Tamanho de palavra = 3; Corte de-valor E = 10; Matriz de Pontuação = BLOSUM62; Abertura de intervalo = 11; e Extensão de intervalo = 1. Um valor de percentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos é determinado pelo número de resíduos idênticos correspondentes dividido pelo número total de resíduos da sequência de "referência" que inclui quaisquer lacunas criadas pelo programa para alinhamento ideal/máximo. Os algoritmos BLAST se referem à sequência "de referência" como a sequência "de consulta".[00111] As used herein, "% identity" or "percent identity" or "PID" refers to protein sequence identity. Percent identity can be determined using standard techniques known in the art. Algorithms Useful algorithms include BLAST algorithms (See, Altschul et al., J Mol Biol, 215:403 to 410, 1990; and Karlin and Altschul, Proc Natl Acad Sci USA, 90:5873 to 5787, 1993). search parameters, most of which are set to default values. The NCBI BLAST algorithm finds the most relevant sequences in terms of biological similarity, but is not recommended for query sequences of fewer than 20 residues (Altschul et al., Nucleic Acids Res, 25:3389-3402, 1997; and Schaffer et al., Nucleic Acids Res, 29:2994-3005, 2001). 11; E-value cutoff = 10; Scoring Matrix = NUC.3.1 (match = 1, non-match = -3); Range Opening = 5; and Range Length = 2. Exemplary default BLAST parameters for amino acid sequence searches include: Word Size = 3; E-value cutoff = 10; Score Matrix = BLOSUM62; Range opening = 11; and Gap Extent = 1. An amino acid sequence identity percentage (%) value is determined by the number of corresponding identical residues divided by the total number of residues of the "reference" sequence that includes any gaps created by the program for optimal alignment /maximum. BLAST algorithms refer to the "reference" sequence as the "query" sequence.

[00112] Conforme usado no presente documento, "proteínas homólogas" ou "enzimas homólogas" se refere a proteínas que têm similaridade distinta na estrutura primária, secundária e/ou terciária. A homologia da proteína pode se referir à similaridade na sequência de aminoácidos linear quando as proteínas estão alinhadas. A pesquisa homóloga de sequências de proteínas pode ser feita com o uso de BLASTP e PSI-BLAST de NCBI BLAST com limiar (corte de valor E) a 0,001. (Altschul SF, Madde TL, Shaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs". Nucleic Acids Res, 1 de setembro de 1997; 25(17): 3.389 a 3.402). Com o uso dessas informações, as sequências de proteínas podem ser agrupadas. Uma árvore filogenética pode ser construída com o uso das sequências de aminoácidos.[00112] As used herein, "homologous proteins" or "homologous enzymes" refers to proteins that have distinct similarity in primary, secondary and/or tertiary structure. Protein homology can refer to the similarity in linear amino acid sequence when proteins are aligned. Homologous searching of protein sequences can be done using BLASTP and PSI-BLAST of NCBI BLAST with threshold (E-value cutoff) at 0.001. (Altschul SF, Madde TL, Shaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleic Acids Res, September 1, 1997; 25(17): 3,389 to 3,402). Using this information, protein sequences can be grouped. A phylogenetic tree can be constructed using amino acid sequences.

[00113] Os alinhamentos de sequências e os cálculos de identidade porcentual podem ser realizados com o uso do programa Megalign da suíte de computação de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI), o programa AlignX da Vector NTI v. 7.0 (Informax, Inc., Bethesda, MD) ou o Suíte de Software Aberto EMBOSS (EMBL-EBI; Rice et al., Trends in Genetics 16, (6):276 a 277 (2000)). O alinhamento múltiplo das sequências pode ser realizado com o uso do método CLUSTAL (tal como CLUSTALW; por exemplo, versão 1.83) de alinhamento (Higgins e Sharp, CABIOS, 5:151 a 153 (1989); Higgins et al., Nucleic Acids Res. 22:4.673 a 4.680 (1994); e Chenna et al., Nucleic Acids Res 31 (13): 3.497 a 3.500 (2003)), disponíveis junto ao European Molecular Biology Laboratory por meio do European Bioinformatics Institute) com os parâmetros-padrão. Os parâmetros adequados para alinhamentos de proteína CLUSTALW incluem penalidade por existência de GAP=15, extensão de GAP=0,2, matriz = Gonnet (por exemplo, Gonnet250), ENDGAP de proteína = -1, GAPDIST de proteína=4 e KTUPLE=1. Em uma modalidade, um alinhamento rápido ou lento é usado com os ajustes-padrão quando há um alinhamento lento. Alternativamente, os parâmetros que usam o método CLUSTALW (por exemplo, versão 1.83) podem ser modificados para usar também KTUPLE =1, GAP PENALTY=10, extensão de GAP=1, matriz = BLOSUM (por exemplo, BLOSUM64), WINDOW=5 e TOP DIAGONALS SAVED=5.[00113] Sequence alignments and percentage identity calculations can be performed using the Megalign program of the LASERGENE bioinformatics computing suite (DNASTAR Inc., Madison, WI), the AlignX program of Vector NTI v. 7.0 (Informax, Inc., Bethesda, MD) or the EMBOSS Open Software Suite (EMBL-EBI; Rice et al., Trends in Genetics 16, (6):276 to 277 (2000)). Multiple sequence alignment can be performed using the CLUSTAL (such as CLUSTALW; e.g., version 1.83) alignment method (Higgins and Sharp, CABIOS, 5:151 to 153 (1989); Higgins et al., Nucleic Acids Res. 22:4,673 to 4,680 (1994); and Chenna et al., Nucleic Acids Res 31 (13): 3,497 to 3,500 (2003)), available from the European Molecular Biology Laboratory through the European Bioinformatics Institute) with the parameters -standard. Suitable parameters for CLUSTALW protein alignments include existence penalty GAP=15, GAP extent=0.2, matrix = Gonnet (e.g. Gonnet250), protein ENDGAP = -1, protein GAPDIST=4, and KTUPLE= 1. In one embodiment, a fast or slow alignment is used with the default settings when there is a slow alignment. Alternatively, parameters using the CLUSTALW method (e.g. version 1.83) can be modified to also use KTUPLE=1, GAP PENALTY=10, GAP extension=1, array = BLOSUM (e.g. BLOSUM64), WINDOW=5 and TOP DIAGONALS SAVED=5.

[00114] Várias sequências de aminoácidos de polipeptídeo e sequências de polinucleotídeos são reveladas no presente documento como características de certos aspectos. As variantes dessas sequências que são pelo menos cerca de 70 a 85%, 85 a 90% ou 90% a 95% idênticas às sequências reveladas no presente documento podem ser usadas em certas modalidades. Alternativamente, uma sequência de polipeptídeos ou sequência de polinucleotídeos variante, em certas modalidades, pode ter pelo menos 60%, 61%, 62%,63%,64%, 65%, 66%, 67%, 68%,69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com uma sequência revelada no presente documento. A sequência de aminoácidos ou sequência de polinucleotídeos variante tem a mesma função da sequência revelada ou pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da função da sequência revelada.[00114] Various polypeptide amino acid sequences and polynucleotide sequences are disclosed herein as characteristic of certain aspects. Variants of these sequences that are at least about 70 to 85%, 85 to 90%, or 90% to 95% identical to the sequences disclosed herein may be used in certain embodiments. Alternatively, a polypeptide sequence or variant polynucleotide sequence, in certain embodiments, may be at least 60%, 61%, 62%,63%,64%, 65%, 66%, 67%, 68%,69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86% , 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identity with a sequence disclosed herein. The variant amino acid sequence or polynucleotide sequence has the same function as the disclosed sequence or at least about 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% , 95%, 96%, 97%, 98% or 99% of sequence function revealed.

[00115] O termo "variante", em relação a um polipeptídeo, se refere a um polipeptídeo que se diferencia de um polipeptídeo de tipo selvagem, original ou de referência especificado em que o mesmo inclui uma ou mais substituições, inserções ou deleções de um aminoácido de ocorrência natural ou feitas pelo homem. Similarmente, o termo "variante", em relação a um polinucleotídeo, se refere a um polinucleotídeo que difere em sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo do tipo selvagem, original ou de referência especificado. A identidade do polipeptídeo ou polinucleotídeo do tipo selvagem, original ou de referência será evidente a partir do contexto.[00115] The term "variant", in relation to a polypeptide, refers to a polypeptide that differs from a specified wild-type, original or reference polypeptide in that it includes one or more substitutions, insertions or deletions of a naturally occurring or man-made amino acid. Similarly, the term "variant", in relation to a polynucleotide, refers to a polynucleotide that differs in nucleotide sequence from a specified wild-type, original or reference polynucleotide. The identity of the wild-type, original or reference polypeptide or polynucleotide will be evident from the context.

[00116] Os termos "plasmídeo", "vetor" e "cassete" se referem a um elemento cromossômico extra que muitas vezes carrega genes que não são parte do metabolismo central da célula e normalmente sob a forma de DNA de fita dupla. Tais elementos podem ser sequências de replicação autônoma, sequências de integração ao genoma, sequências de fago ou nucleotídicas, em forma linear ou circular, de um DNA ou RNA de fita simples ou dupla, derivadas de qualquer fonte, em que várias sequências nucleotídicas foram unidas ou recombinadas numa construção exclusiva que é capaz de introduzir um polinucleotídeo de interesse numa célula. "Cassete de transformação" se refere a um vetor específico que contém um gene e que tem elementos adicionalmente ao gene que facilita a transformação de uma célula hospedeira específica. Os termos "cassete de expressão" e "vetor de expressão" são usados indistintamente no presente documento e se referem a um vetor específico que contém um gene e que tem elementos adicionalmente ao gene que permite a expressão daquele gene em um hospedeiro.[00116] The terms "plasmid", "vector" and "cassette" refer to an extra chromosomal element that often carries genes that are not part of the cell's central metabolism and usually in the form of double-stranded DNA. Such elements may be autonomously replicating sequences, genome integration sequences, phage or nucleotide sequences, in linear or circular form, from a single- or double-stranded DNA or RNA, derived from any source, into which several nucleotide sequences have been joined. or recombined into a unique construct that is capable of introducing a polynucleotide of interest into a cell. "Transformation cassette" refers to a specific vector that contains a gene and that has elements in addition to the gene that facilitate transformation of a specific host cell. The terms "expression cassette" and "expression vector" are used interchangeably herein and refer to a specific vector that contains a gene and that has elements in addition to the gene that allow expression of that gene in a host.

[00117] O termo "expressão", conforme usado no presente documento, se refere à produção de um produto final funcional (por exemplo, um mRNA ou uma proteína) na forma precursora ou madura. A expressão pode também se referir à tradução de mRNA em um polipeptídeo.[00117] The term "expression", as used herein, refers to the production of a functional end product (e.g., an mRNA or a protein) in precursor or mature form. The expression can also refer to the translation of mRNA into a polypeptide.

[00118] A expressão de um gene envolve a transcrição do gene e a tradução do mRNA em um precursor ou proteína madura. "Inibição antissenso" se refere à produção de transcritos de RNA de antissenso com capacidade para suprimir a expressão da proteína direcionada. "Cossupressão" se refere à produção de transcritos de RNA senso com capacidade para suprimir a expressão de genes estranhos ou endógenos idênticos ou substancialmente similares (Patente U.S. No 5,231,020). Proteína "madura" se refere a um polipeptídeo processado por pós-tradução, isto é, um polipeptídeo a partir do qual quaisquer pré- ou pró-peptídeos presentes no produto de tradução primário foram removidos. Proteína "precursora" se refere ao produto primário da tradução de mRNA, isto é, com pré- ou pró-peptídeos ainda presentes. Os pré- e pró-peptídeos podem ser, mas sem limitação, sinais de localização intracelulares. "Transformação estável" se refere à transferência de um fragmento de ácido nucleico em um genoma de um organismo hospedeiro, incluindo genomas tanto nucleares quanto organelares, resultando em herança geneticamente estável. Em contraste, "transformação temporária" se refere à transferência de um fragmento de ácido nucleico para o núcleo ou organela que contém DNA de um organismo hospedeiro, resultando na expressão de genes sem integração ou herança estável. Os organismos hospedeiros que contêm os fragmentos de ácido nucleico transformados são denominados de organismos "transgênicos".[00118] Expression of a gene involves transcription of the gene and translation of the mRNA into a precursor or mature protein. "Antisense inhibition" refers to the production of antisense RNA transcripts with the ability to suppress expression of the targeted protein. "Cosuppression" refers to the production of sense RNA transcripts with the ability to suppress the expression of identical or substantially similar foreign or endogenous genes (U.S. Patent No. 5,231,020). "Mature" protein refers to a post-translationally processed polypeptide, that is, a polypeptide from which any pre- or pro-peptides present in the primary translation product have been removed. "Precursor" protein refers to the primary product of mRNA translation, that is, with pre- or pro-peptides still present. Pre- and pro-peptides can be, but are not limited to, intracellular localization signals. "Stable transformation" refers to the transfer of a nucleic acid fragment into a genome of a host organism, including both nuclear and organellar genomes, resulting in genetically stable inheritance. In contrast, "temporary transformation" refers to the transfer of a nucleic acid fragment into the nucleus or DNA-containing organelle of a host organism, resulting in gene expression without stable integration or inheritance. Host organisms that contain the transformed nucleic acid fragments are called "transgenic" organisms.

[00119] O vetor de expressão pode ser um dentre qualquer número de vetores ou cassetes úteis para a transformação de hospedeiros de produção adequados conhecidos na técnica. Tipicamente, o vetor ou o cassete incluirão sequências que direcionam a transcrição e a tradução do gene relevante, um marcador selecionável e sequências que permitem replicação autônoma ou integração cromossômica. Os vetores adequados, de modo geral, incluem uma região 5' do gene que abriga controles de iniciação transcricional e uma região 3' do fragmento de DNA que controla a terminação transcricional. Ambas as regiões de controle podem ser derivadas de genes homólogos para genes de uma célula hospedeira de produção transformada e/ou genes nativos ao hospedeiro de produção, embora tais regiões de controle não precisem de ser derivadas assim.[00119] The expression vector may be one of any number of vectors or cassettes useful for transforming suitable production hosts known in the art. Typically, the vector or cassette will include sequences that direct transcription and translation of the relevant gene, a selectable marker, and sequences that allow autonomous replication or chromosomal integration. Suitable vectors generally include a 5' region of the gene that harbors transcriptional initiation controls and a 3' region of the DNA fragment that controls transcriptional termination. Both control regions may be derived from genes homologous to genes of a transformed production host cell and/or genes native to the production host, although such control regions need not be so derived.

[00120] Conforme usado no presente documento, "proteínas homólogas" ou "enzimas homólogas" se referem a proteínas que têm similaridade distinta na estrutura primária, secundária e/ou terciária. A homologia da proteína pode se referir à similaridade na sequência de aminoácidos linear quando as proteínas estão alinhadas. A pesquisa homóloga de sequências de proteínas pode ser feita com o uso de BLASTP e PSI-BLAST de NCBI BLAST com limiar (corte de valor E) a 0,001. (Altschul SF, Madde TL, Shaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs". Nucleic Acids Res 1 de setembro de 1997; 25(17): 3.389 a 3.402). Com o uso dessas informações, as sequências de proteínas podem ser agrupadas. Uma árvore filogenética pode ser construída com o uso das sequências de aminoácidos. As sequências de aminoácidos podem ser inseridas em um programa como o conjunto de Vector NTI Advance e uma Guide Tree pode ser criada com o uso do método de Agrupamento de Vizinhos (NJ) (Saitou e Nei, Mol Biol Evol, 4:406 a 425, 1987). A construção da árvore pode ser calculada usando a correção de Kimura para a distância da sequência e ignorando as posições com lacunas. Um programa como AlignX pode exibir os valores de distância calculados entre parênteses a seguir ao nome da molécula exibido na árvore filogenética.[00120] As used herein, "homologous proteins" or "homologous enzymes" refer to proteins that have distinct similarity in primary, secondary and/or tertiary structure. Protein homology can refer to the similarity in linear amino acid sequence when proteins are aligned. Homologous searching of protein sequences can be done using BLASTP and PSI-BLAST of NCBI BLAST with threshold (E-value cutoff) at 0.001. (Altschul SF, Madde TL, Shaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleic Acids Res Sep 1, 1997; 25 (17): 3,389 to 3,402). Using this information, protein sequences can be grouped. A phylogenetic tree can be constructed using amino acid sequences. Amino acid sequences can be entered into a program such as the NTI Advance Vector suite and a Guide Tree can be created using the Neighbor Clustering (NJ) method (Saitou and Nei, Mol Biol Evol, 4:406 to 425 , 1987). Tree construction can be calculated using Kimura's correction for sequence distance and ignoring positions with gaps. A program such as AlignX can display the calculated distance values in parentheses following the molecule name displayed in the phylogenetic tree.

[00121] Compreendendo a homologia entre as moléculas pode revelar a história evolutiva das moléculas, bem como as informações sobre sua função; se uma proteína recentemente sequenciada for homóloga a uma proteína já caracterizada, há uma forte indicação da nova função bioquímica da proteína. A relação mais fundamental entre duas entidades é a homologia; se diz que duas moléculas são homólogas se derivarem de um ancestral comum. As moléculas homólogas ou os homólogos, podem ser divididos em duas classes, parálogos e ortólogos. Os parálogos são homólogos que estão presentes dentro de uma espécie. Os parálogos diferem frequentemente nas suas funções bioquímicas detalhadas. Os ortólogos são homólogos que estão presentes dentro de diferentes espécies e têm funções muito semelhantes ou idênticas. Uma superfamília de proteína é o maior agrupamento (clado) de proteínas para os quais o ancestral comum pode ser inferido. Normalmente, esse ancestral comum se baseia no alinhamento de sequência e na similaridade mecânica. As superfamílias contêm, tipicamente, diversas famílias de proteína que mostram a similaridade de sequência na família. O termo "clã de proteína" é comumente usado para superfamílias de protease com base no sistema de classificação de protease MEROPS.[00121] Understanding the homology between molecules can reveal the evolutionary history of the molecules, as well as information about their function; If a newly sequenced protein is homologous to an already characterized protein, there is a strong indication of the protein's new biochemical function. The most fundamental relationship between two entities is homology; Two molecules are said to be homologous if they derive from a common ancestor. Homologous molecules or homologues can be divided into two classes, paralogs and orthologs. Paralogs are homologs that are present within a species. Paralogs often differ in their detailed biochemical functions. Orthologs are homologs that are present within different species and have very similar or identical functions. A protein superfamily is the largest grouping (clade) of proteins for which common ancestor can be inferred. Typically, this common ancestor is based on sequence alignment and mechanical similarity. Superfamilies typically contain several protein families that show sequence similarity within the family. The term "protein clan" is commonly used for protease superfamilies based on the MEROPS protease classification system.

[00122] O algoritmo CLUSTAL W é um outro exemplo de um algoritmo de alinhamento de sequência (Consultar, Thompson et al., Nucleic Acids Res, 22:4.673 a 4.680, 1994). Os parâmetros padrão para o algoritmo CLUSTAL W incluem: Penalidade por abertura da lacuna = 10,0; Penalidade por extensão da lacuna = 0,05; Matriz de peso de proteína = série BLOSUM; Matriz de peso de DNA = IUB; % de sequências divergentes em atraso = 40; Distância de separação de lacuna = 8; Peso de transições de DNA = 0,50; Lista de resíduos hidrofílicos = GPSNDQEKR; Uso de matriz negativa = DESATIVADO; Alternância de penalidades específicas de resíduo = ATIVADA; Alternância de penalidades hidrofílica = ATIVADA; e Alternância de penalidades de separação de lacuna final= DESATIVADA. Em algoritmos CLUSTAL, estão incluídas as deleções que ocorrem em qualquer terminal. Por exemplo, uma variante com uma deleção de cinco aminoácidos em qualquer terminal (ou dentro do polipeptídeo) de um polipeptídeo de 500 aminoácidos teria uma porcentagem de identidade de sequência de 99% (495/500 resíduos idêntico x 100) em relação ao polipeptídeo "de referência". Tal variante seria abrangida por uma variante tendo "pelo menos 99% de identidade de sequência" com o polipeptídeo.[00122] The CLUSTAL W algorithm is another example of a sequence alignment algorithm (See, Thompson et al., Nucleic Acids Res, 22:4,673 to 4,680, 1994). Default parameters for the CLUSTAL W algorithm include: Gap opening penalty = 10.0; Penalty for gap extension = 0.05; Protein weight matrix = BLOSUM series; DNA weight matrix = IUB; % of divergent sequences in delay = 40; Gap separation distance = 8; Weight of DNA transitions = 0.50; List of hydrophilic residues = GPSNDQEKR; Negative matrix usage = OFF; Waste Specific Penalties Toggle = ON; Hydrophilic Penalty Toggle = ON; and End Gap Separation Penalties Toggle= OFF. In CLUSTAL algorithms, deletions that occur at any terminal are included. For example, a variant with a five amino acid deletion at either terminus (or within the polypeptide) of a 500 amino acid polypeptide would have a percentage sequence identity of 99% (495/500 identical residues x 100) to the polypeptide." of reference". Such a variant would be encompassed by a variant having "at least 99% sequence identity" with the polypeptide.

[00123] Conforme usado no presente documento, o termo "ensaio funcional" se refere a um ensaio que fornece uma indicação de uma atividade de enzima. Em algumas modalidades, o termo se refere a sistemas de ensaio em que uma enzima é analisada pela sua habilidade de funcionar em sua capacidade normal.[00123] As used herein, the term "functional assay" refers to an assay that provides an indication of an enzyme activity. In some embodiments, the term refers to assay systems in which an enzyme is analyzed for its ability to function at its normal capacity.

[00124] Os ruminantes têm a capacidade única de converter a forragem grosseira em proteína e energia através dos seus sistemas digestivos microbianos/de enzimas. Em conformidade, os ruminantes desempenham um papel importante na ecologia da terra e na cadeia alimentar.[00124] Ruminants have the unique ability to convert coarse forage into protein and energy through their microbial/enzyme digestive systems. Accordingly, ruminants play an important role in the earth's ecology and food chain.

[00125] A principal diferença entre um ruminante e um não ruminante é que o ruminante tem um estômago com quatro compartimentos consistindo em rúmen, retículo, omaso e abomaso. O abomaso é o equivalente direto do estômago monogástrico (McDonald et al., 2011 Animal, Animal Nutrition (7a Edição), páginas 156 a 191).[00125] The main difference between a ruminant and a non-ruminant is that the ruminant has a stomach with four compartments consisting of the rumen, reticulum, omasum and abomasum. The abomasum is the direct equivalent of the monogastric stomach (McDonald et al., 2011 Animal, Animal Nutrition (7th Edition), pages 156 to 191).

[00126] O rúmen é o maior compartimento, com um volume de 150 a 200 litros (40 a 50 galões).[00126] The rumen is the largest compartment, with a volume of 150 to 200 liters (40 to 50 gallons).

[00127] No sistema digestivo há bilhões de microrganismos. Eles ajudam a vaca a digerir e utilizar os nutrientes da ração. Para alcançar uma eficiente utilização da ração e uma elevada produção de leite, as bactérias devem ter condições ideais. São as bactérias que digerem a ração. Alimentar uma vaca, na verdade, envolve alimentar os microrganismos no seu rúmen.[00127] In the digestive system there are billions of microorganisms. They help the cow digest and utilize the nutrients in the feed. To achieve efficient feed utilization and high milk production, bacteria must have ideal conditions. These are the bacteria that digest the feed. Feeding a cow actually involves feeding the microorganisms in its rumen.

[00128] O processo de fermentação ocorre no rúmen e no retículo. O rúmen da vaca é como uma grande tina de fermentação. Mais de 200 diferentes bactérias e 20 tipos protozoários ajudam a vaca a utilizar composições de ração fibrosas e fontes de nitrogênio não proteicas.[00128] The fermentation process occurs in the rumen and reticulum. The cow's rumen is like a large fermentation vat. More than 200 different bacteria and 20 types of protozoa help the cow utilize fibrous feed compositions and non-protein nitrogen sources.

[00129] A fermentação ocorre quando microrganismos convertem carboidratos em ácidos graxos voláteis e gases. Este processo permite que a vaca converta fibras celulósicas em energia.[00129] Fermentation occurs when microorganisms convert carbohydrates into volatile fatty acids and gases. This process allows the cow to convert cellulose fibers into energy.

[00130] Dos gases produzidos no rúmen durante a fermentação (500 a 1500 litros por dia) (150 a 400 galões), 20 a 40% consistem de metano e dióxido de carbono. A produção de gases de fermentação representa uma considerável perda de energia. Alguns modificadores de fermentação, tais como os ionóforos, melhoram a eficiência energética dos ruminantes por meio da redução dessas perdas de energia de gás.[00130] Of the gases produced in the rumen during fermentation (500 to 1500 liters per day) (150 to 400 gallons), 20 to 40% consist of methane and carbon dioxide. The production of fermentation gases represents a considerable loss of energy. Some fermentation modifiers, such as ionophores, improve ruminant energy efficiency by reducing these gas energy losses.

[00131] Os gases de fermentação são expelidos por meio de eructação. Quando a eructação é impossível ou ineficaz, as vacas podem sofrer de meteorismo. Quando a ração entra no rúmen, é acumulada em camadas no tapete ruminal que flutua sobre o topo dos conteúdos ruminais. Por meio de contrações rítmicas da parede ruminal, o material recentemente comido se acumula na parte de trás do tapete. O tapete ruminal consiste de material não digerido com 15% de matéria seca. As bactérias aderem à ração e digerem gradualmente o material fermentável. Quando a vaca rumina, a mastigação merícica da camada da frente é eructada. A saliva é adicionada à boca e através da ação de moagem dos dentes, as superfícies expostas a microrganismos se tornam maiores.[00131] Fermentation gases are expelled through eructation. When eructation is impossible or ineffective, cows may suffer from meteorism. When feed enters the rumen, it is accumulated in layers in the ruminal mat that floats on top of the rumen contents. Through rhythmic contractions of the rumen wall, recently eaten material accumulates at the back of the mat. The rumen mat consists of undigested material with 15% dry matter. The bacteria adhere to the feed and gradually digest the fermentable material. When the cow chews the cud, the merice chewing of the front layer is eructated. Saliva is added to the mouth and through the grinding action of the teeth, the surfaces exposed to microorganisms become larger.

[00132] As partículas de ração tornam-se mais pequenas à medida que as bactérias trabalham e o processo de ruminação continua. Elas gradualmente absorvem líquido e afundam-se para a parte inferior do rúmen. O conteúdo ruminal no fundo do retículo-rúmen tem um teor de matéria seca de 5%.[00132] The feed particles become smaller as the bacteria work and the rumination process continues. They gradually absorb liquid and sink to the bottom of the rumen. The rumen content at the bottom of the rumen reticulum has a dry matter content of 5%.

[00133] O rúmen contrai apenas uma vez a cada minuto. As contrações permitem a mistura de conteúdos líquidos e sólidos no rúmen para estimular a fermentação e evitar a estagnação. As contrações também servem para liberar gases presos no tapete ou na porção de fluido do conteúdo ruminal. Os gases de fermentação são então liberados por meio de eructação. A interrupção desse processo pode resultar em meteorismo. As partículas de ração do tamanho e densidade corretos são segregadas para o líquido no retículo por meio das contrações ruminais. As contrações posteriores forçam estas partículas e alguns dos conteúdos líquidos para fora do retículo-rúmen e para o omaso.[00133] The rumen contracts only once every minute. Contractions allow the mixing of liquid and solid contents in the rumen to stimulate fermentation and prevent stagnation. Contractions also serve to release gases trapped in the mat or in the fluid portion of the rumen contents. The fermentation gases are then released through eructation. Interruption of this process can result in meteorism. Feed particles of the correct size and density are secreted into the liquid in the reticulum through rumen contractions. Further contractions force these particles and some of the liquid contents out of the reticulum-rumen and into the omasum.

[00134] O rúmen e o retículo são basicamente um compartimento, mas com diferentes funções. Embora grande parte da ação fermentativa ocorra no rúmen, o retículo serve como área de preparação para a passagem para o omaso ou regurgitação.[00134] The rumen and reticulum are basically one compartment, but with different functions. Although much of the fermentative action occurs in the rumen, the reticulum serves as a staging area for passage to the omasum or regurgitation.

[00135] O valor de pH ruminal ideal é entre 6 e 7. Os microrganismos ruminais são mais saudáveis dentro desta gama. Se o pH varia demasiado, alguns tipos de microrganismos são eliminados e há uma utilização reduzida da ração. Os microrganismos que digerem a celulose (feno, silagem, etc.) não conseguem crescer ou fermentar celulose com um valor de pH inferior a 6,0. Quando o pH ruminal é inferior a 6, o rúmen é considerado acidótico. A acidose ruminal pode ser aguda, com uma grave e rápida queda no pH. Mais comum em rebanhos de alta produção é a acidose subclínica que se caracteriza por períodos intermitentes crônicos de baixo pH ruminal.[00135] The ideal rumen pH value is between 6 and 7. Ruminal microorganisms are healthier within this range. If the pH varies too much, some types of microorganisms are eliminated and there is reduced use of the feed. Microorganisms that digest cellulose (hay, silage, etc.) cannot grow or ferment cellulose with a pH value lower than 6.0. When ruminal pH is less than 6, the rumen is considered acidotic. Ruminal acidosis can be acute, with a severe and rapid drop in pH. More common in high-production herds is subclinical acidosis, which is characterized by chronic intermittent periods of low rumen pH.

[00136] Como notado acima, a digestibilidade de amido em rações é altamente variável e dependente de uma série de fatores, incluindo a estrutura física do amido e da matriz da ração.[00136] As noted above, the digestibility of starch in feed is highly variable and dependent on a number of factors, including the physical structure of the starch and the feed matrix.

[00137] Verificou-se que a digestibilidade de amido, especialmente a hidrólise do amido em bruto, em uma dieta de ruminante, pode ser melhorada com o uso de pelo menos uma alfa-1,4/1,6-glicosídeo hidrolase (GLCH) como aditivo de ração para um ruminante em que a referida hidrolase: (a) tem pelo menos 20% de atividade a um pH inferior ou igual a 3 na presença de pepsina em comparação com a atividade das enzimas a pH 6 na presença de pepsina, (b) as referidas hidrolases são ativas em pelo menos duas câmaras digestivas de um ruminante compreendendo um rúmen, um retículo, um omaso e um abomaso e (c) a hidrolase funciona com enzimas digestivas presentes nas câmaras digestivas do ruminante para aumentar o rendimento de glicose e a digestibilidade de amido.[00137] It has been found that starch digestibility, especially raw starch hydrolysis, in a ruminant diet can be improved with the use of at least one alpha-1,4/1,6-glucoside hydrolase (GLCH ) as a feed additive for a ruminant wherein said hydrolase: (a) has at least 20% activity at a pH of less than or equal to 3 in the presence of pepsin compared to the activity of the enzymes at pH 6 in the presence of pepsin , (b) said hydrolases are active in at least two digestive chambers of a ruminant comprising a rumen, a reticulum, an omasum and an abomasum and (c) the hydrolase functions with digestive enzymes present in the digestive chambers of the ruminant to increase yield glucose and starch digestibility.

[00138] Ainda em outro aspecto, é descrito um método para aumentar a digestibilidade de amido, aumentar o rendimento de glicose, aumentar a digestão de matéria seca e aumentar a produção de gás durante a fermentação em um ruminante, compreendendo adicionar à ração uma composição enzimática compreendendo (i), pelo menos, uma enzima GLCH como aditivo de ração para ruminantes, em que a referida enzima: (a) tem pelo menos 20% de atividade a um pH inferior ou igual a 3 na presença de pepsina em comparação com a atividade das enzimas a pH 6 na presença de pepsina, (b) a referida enzima é ativa em pelo menos duas de três câmaras digestivas de um ruminante compreendendo um rúmen, um abomaso e um intestino delgado e (c) a enzima funciona com amilase pancreática para aumentar o rendimento de glicose e (ii) pelo menos uma protease.[00138] In yet another aspect, a method is described for increasing starch digestibility, increasing glucose yield, increasing dry matter digestion and increasing gas production during fermentation in a ruminant, comprising adding to the feed a composition enzyme comprising (i) at least one GLCH enzyme as a feed additive for ruminants, wherein said enzyme: (a) has at least 20% activity at a pH of less than or equal to 3 in the presence of pepsin compared to the activity of enzymes at pH 6 in the presence of pepsin, (b) said enzyme is active in at least two of three digestive chambers of a ruminant comprising a rumen, an abomasum and a small intestine and (c) the enzyme functions with amylase pancreatic to increase glucose yield and (ii) at least one protease.

[00139] Algumas enzimas digestivas presentes nas câmaras digestivas de um ruminante com as quais a hidrolase pode trabalhar para aumentar o rendimento de glicose incluem, mas não se limitam a, enzimas amilolíticas microbianas ruminais, pepsina ou pancreatina.[00139] Some digestive enzymes present in the digestive chambers of a ruminant that hydrolase can work with to increase glucose yield include, but are not limited to, ruminal microbial amylolytic enzymes, pepsin or pancreatin.

[00140] De preferência, a hidrolase é capaz de hidrolisar amido em bruto sob condições comparáveis às condições encontradas no rúmen ou abomaso.[00140] Preferably, the hydrolase is capable of hydrolyzing crude starch under conditions comparable to the conditions found in the rumen or abomasum.

[00141] A hidrolase pode ser selecionada a partir do grupo consistindo em alfa-amilases, glicoamilases e alfa-glucosidases ou a hidrolase é selecionada a partir do grupo consistindo em alfa-amilases e glicoamilases.[00141] The hydrolase can be selected from the group consisting of alpha-amylases, glucoamylases and alpha-glucosidases or the hydrolase is selected from the group consisting of alpha-amylases and glucoamylases.

[00142] Qualquer alfa-amilase adequada (E.C. 3.2.1.1), quer esteja ou não comercialmente disponível, pode ser utilizada no método aqui descrito.[00142] Any suitable alpha-amylase (E.C. 3.2.1.1), whether or not commercially available, can be used in the method described here.

[00143] Exemplos de alfa-amilases incluem, mas não se limitam a, uma alfa-amilase de tipo selvagem, uma variante ou seu fragmento ou uma alfa-amilase híbrida geneticamente modificada derivada, por exemplo, de um domínio catalítico de origem microbiana e um domínio de ligação de amido de outra origem microbiana. Exemplos não limitativos de outras alfa-amilases que podem ser úteis para fazer esses híbridos podem ser derivados de Bacillus, Aspergillus, Trichoderma, Rhizopus, Fusarium, Penicillium, Neurospora e Humicola.[00143] Examples of alpha-amylases include, but are not limited to, a wild-type alpha-amylase, a variant or fragment thereof, or a genetically modified hybrid alpha-amylase derived, for example, from a catalytic domain of microbial origin and a starch-binding domain of other microbial origin. Non-limiting examples of other alpha-amylases that may be useful for making such hybrids can be derived from Bacillus, Aspergillus, Trichoderma, Rhizopus, Fusarium, Penicillium, Neurospora and Humicola.

[00144] Podem também ser mencionadas alfa-amilases que têm atividade de hidrolisação de amido granular (GSH) ou alfa-amilases que foram recombinantemente manipuladas para ter atividade de GSH. Tal atividade de GSH é vantajosa, uma vez que estas enzimas quebram mais do amido, especialmente qualquer amido granular (bruto), que possa estar presente em qualquer ração que contenha melaço e similares. Alfa-amilases tendo atividade GSH incluem, mas não se limitam a, alfa-amilases obtidas a partir de Aspergillus kawachi (por exemplo, AkAA), Aspergillus niger (por exemplo, AnAA), A. clavatus (AcAA), A. terreus (AtAA) e Trichoderma reesei (por exemplo, TrAA).[00144] Alpha-amylases that have granular starch (GSH) hydrolyzing activity or alpha-amylases that have been recombinantly engineered to have GSH activity may also be mentioned. Such GSH activity is advantageous since these enzymes break down more of the starch, especially any granular (raw) starch that may be present in any feed containing molasses and the like. Alpha-amylases having GSH activity include, but are not limited to, alpha-amylases obtained from Aspergillus kawachi (e.g., AkAA), Aspergillus niger (e.g., AnAA), A. clavatus (AcAA), A. terreus ( AtAA) and Trichoderma reesei (e.g. TrAA).

[00145] Alfa-amilases, AkAA, AcAA e AtAA, têm dois domínios de ligação de carboidrato, um dos quais pertence à família de domínio/módulo de ligação de carboidrato 20 (CBM20 ou CD20), enquanto a outra é por vezes chamada de local de ligação secundário (SBS). SBSs e CBMs parecem funcionar 1) visando a enzima no seu substrato, 2) guiando o substrato para o sulco de local ativo, 3) por interrupção do substrato, 4) reforçando a processividade, 5) por regulação alostérica, 6) passando produtos de reação e/ou 7) ancorando a parede celular do microrganismo original.[00145] Alpha-amylases, AkAA, AcAA, and AtAA, have two carbohydrate-binding domains, one of which belongs to the carbohydrate-binding domain/module 20 (CBM20 or CD20) family, while the other is sometimes called secondary binding site (SBS). SBSs and CBMs appear to function by 1) targeting the enzyme at its substrate, 2) guiding the substrate into the active site groove, 3) by disrupting the substrate, 4) enhancing processivity, 5) by allosteric regulation, 6) passing reaction and/or 7) anchoring the cell wall of the original microorganism.

[00146] Muitas destas funções putativas estão de acordo com as funções atribuídas à ligação não catalítica em CBMs. Em contraste com os CBMs, os SBSs têm uma posição fixa em relação ao local catalítico, tornando-os mais ou menos adequados para assumir funções específicas (Cuyvers S., Dornez E., Delcour J. A., Courtin C. M. (2012), Occurrence and functional significance of secondary carbohydrate binding sites in glycoside hydrolases. Crit. Rev. Biotechnol. 32, 93-107).[00146] Many of these putative functions are in accordance with the functions attributed to non-catalytic binding in CBMs. In contrast to CBMs, SBSs have a fixed position relative to the catalytic site, making them more or less suited to take on specific functions (Cuyvers S., Dornez E., Delcour J. A., Courtin C. M. (2012), Occurrence and functional significance of secondary carbohydrate binding sites in glycoside hydrolases. Rev. Biotechnol 32, 93-107).

[00147] Algumas alfa-amilases comercialmente disponíveis que podem ter atividade GSH ou enzimas usadas em processos de hidrólise de carboidratos estão comercialmente disponíveis, ver, por exemplo, TERMAMYL® 120-L, LC e SC SAN SUPER®, SUPRA®, e LIQUEZYME® SC comercializadas pela Novo Nordisk A/S, FUELZYME® LF da Verenium, e CLARASE® L, SPEZYME® FRED, SPEZYME® XTRA, GC626, e GZYME® G997 comercializadas pela Danisco, US, Inc., Genencor Division.[00147] Some commercially available alpha-amylases that may have GSH activity or enzymes used in carbohydrate hydrolysis processes are commercially available, see, for example, TERMAMYL® 120-L, LC and SC SAN SUPER®, SUPRA®, and LIQUEZYME ® SC marketed by Novo Nordisk A/S, FUELZYME® LF from Verenium, and CLARASE® L, SPEZYME® FRED, SPEZYME® XTRA, GC626, and GZYME® G997 marketed by Danisco, US, Inc., Genencor Division.

[00148] Em outras modalidades, é desejável que a alfa-amilase seja uma alfa-amilase estável ao ácido com 20% de atividade a pH inferior ou igual a 3,0 em comparação com a sua atividade a pH 6,0[00148] In other embodiments, it is desirable that the alpha-amylase is an acid-stable alpha-amylase with 20% activity at pH less than or equal to 3.0 compared to its activity at pH 6.0

[00149] Alfa-amilases podem ser selecionadas a partir do grupo consistindo em alfa-amilase (EC 3.2.1.1); pululanase (EC 3.2.1.41); ciclomaltodextrina glucanotransferase (EC 2.4.1.19); ciclomaltodextrinase (EC 3.2.1.54); trealose-6-fosfato hidrolase (EC3.2.1.93); oligo-alfa-glucosidase (EC 3.2.1.10); amilase maltogênica (EC 3.2.1.133); neopululanase (EC 3.2.1.135); alfa-glucosidase (EC 3.2.1.20); alfa-amilase formando maltotetrose (EC3.2.1.60); isoamilase (EC 3.2.1.68); glucodextranase (EC 3.2.1.70); alfa-amilase formando malto-hexose (EC 3.2.1.98); alfa-amilase formando maltotriose (EC 3.2.1.116); enzima de ramificação (EC 2.4.1.18); trealose sintase (EC 5.4.99.16); 4-alfa-glucanotransferase (EC 2.4.1.25); alfa-amilase formando maltopentose (EC 3.2.1.-); amilosucrase (EC 2.4.1.4); sacarose fosforilase (EC 2.4.1.7); malto-oligosiltrealose trealo-hidrolase (EC 3.2.1.141); isomaltulose sintase (EC 5.4.99.11); malto- oligosiltrealose sintase (EC 5.4.99.15); amilo-alfa-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.33); e alfa-1,4-glucano: fosfato alfa-maltosiltransferase (EC 2.4.99.16);[00149] Alpha-amylases can be selected from the group consisting of alpha-amylase (EC 3.2.1.1); pullulanase (EC 3.2.1.41); cyclomaltodextrin glucanotransferase (EC 2.4.1.19); cyclomaltodextrinase (EC 3.2.1.54); trehalose-6-phosphate hydrolase (EC3.2.1.93); oligo-alpha-glucosidase (EC 3.2.1.10); maltogenic amylase (EC 3.2.1.133); neopululanase (EC 3.2.1.135); alpha-glucosidase (EC 3.2.1.20); alpha-amylase forming maltotetrose (EC3.2.1.60); isoamylase (EC 3.2.1.68); glucodextranase (EC 3.2.1.70); alpha-amylase forming maltohexose (EC 3.2.1.98); alpha-amylase forming maltotriose (EC 3.2.1.116); branching enzyme (EC 2.4.1.18); trehalose synthase (EC 5.4.99.16); 4-alpha-glucanotransferase (EC 2.4.1.25); alpha-amylase forming maltopentose (EC 3.2.1.-); amylosucrase (EC 2.4.1.4); sucrose phosphorylase (EC 2.4.1.7); malto-oligosyltrehalose trehalohydrolase (EC 3.2.1.141); isomaltulose synthase (EC 5.4.99.11); malto-oligosyltrehalose synthase (EC 5.4.99.15); amylo-alpha-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.33); and alpha-1,4-glucan: alpha-maltosyltransferase phosphate (EC 2.4.99.16);

[00150] Qualquer glicoamilase adequada (GA) (E.C. 3.2.1.3), esteja ou não comercialmente disponível, pode ser utilizada no método aqui descrito.[00150] Any suitable glucoamylase (GA) (E.C. 3.2.1.3), whether or not commercially available, can be used in the method described here.

[00151] A adequação de uma glicoamilase (Amiloglucosidase sin. (GA) (E.C. 3.2.1.3) irá depender da sua atividade em relação à maltose. Assim, uma glicoamilase adequada deve ter pelo menos 20% da atividade sobre a maltose em uma base de proteína em comparação com a atividade de glicoamilase obtida de Trichoderma reesei (TrGA) quando analisadas em 2% (p/v) de maltose, pH 6.0 e 40 °C. A TrGA é amplamente utilizada no processamento de bioetanol de primeira geração devido às suas capacidades de geração de glicose a partir de amido (patente US, 2008, US 7413879 B2, Trichoderma reesei glucoamylase and homologs thereof). STARGEN™ 002 é um produto enzimático de hidrolisação de amido granular para produção de etanol vendido pela DuPont.[00151] The suitability of a glucoamylase (syn. Amyloglucosidase (GA) (E.C. 3.2.1.3) will depend on its activity towards maltose. Thus, a suitable glucoamylase must have at least 20% activity towards maltose on a of protein compared to the glucoamylase activity obtained from Trichoderma reesei (TrGA) when analyzed in 2% (w/v) maltose, pH 6.0 and 40 °C. its capabilities for generating glucose from starch (US patent, 2008, US 7413879 B2, Trichoderma reesei glucoamylase and homologs thereof STARGEN™ 002 is an enzymatic product for hydrolyzing granular starch for ethanol production sold by DuPont.

[00152] É importante para a nutrição animal que a taxa de hidrólise de maltose para glicose seja elevada, uma vez que é a glicose que é absorvida pela corrente sanguínea no aparelho digestivo, e não o seu dímero correspondente, a maltose.[00152] It is important for animal nutrition that the rate of hydrolysis of maltose to glucose is high, since it is glucose that is absorbed into the bloodstream in the digestive tract, and not its corresponding dimer, maltose.

[00153] Assim, a baixa atividade de glicoamilase de Aspergillus niger (AnGA) na maltose torna uma glicoamilase imprópria para utilização nos métodos aqui descritos. A glicoamilase é conhecida por ter muitos sublocais para ligação perto do local ativo. Uma teoria de sublocais foi desenvolvida para analisar as afinidades de substrato de glicoamilases. Um dos pressupostos desta teoria é que um substrato pode ser ligado à enzima de um modo produtivo ou não produtivo. Acredita-se que a baixa atividade de glicoamilase de Aspergillus niger (AnGA) pode ser devida à probabilidade da maltose se ligar a AnGA de um modo não produtivo. (Swanson et al., 1977, Biotechnol. Bioeng. 19:1715-1718).[00153] Thus, the low activity of Aspergillus niger glucoamylase (AnGA) on maltose makes it unsuitable for use in the methods described here. Glucoamylase is known to have many subsites for binding near the active site. A subsite theory has been developed to analyze the substrate affinities of glucoamylases. One of the assumptions of this theory is that a substrate can be bound to the enzyme in a productive or non-productive way. It is believed that the low activity of Aspergillus niger glucoamylase (AnGA) may be due to the likelihood of maltose binding to AnGA in a non-productive manner. (Swanson et al., 1977, Biotechnol. Bioeng. 19:1715-1718).

[00154] Exemplos de glicoamilases incluem, mas não se limitam a, uma glicoamilase de tipo selvagem, uma variante ou seu fragmento ou uma glicoamilase híbrida geneticamente modificada que pode ser derivada, por exemplo, de um domínio catalítico de origem microbiana e um domínio de ligação de amido de outra origem microbiana. Glicoamilases híbridas incluem, por exemplo, glicoamilases tendo um domínio catalítico de um GA de um organismo (por exemplo, Talaromyces GA) e um domínio de ligação de amido (SBD) de um organismo diferente (por exemplo; Trichoderma GA).[00154] Examples of glucoamylases include, but are not limited to, a wild-type glucoamylase, a variant or fragment thereof, or a genetically modified hybrid glucoamylase that can be derived, for example, from a catalytic domain of microbial origin and a catalytic domain of starch binding of other microbial origin. Hybrid glycoamylases include, for example, glycoamylases having a catalytic domain from a GA from one organism (e.g., Talaromyces GA) and a starch-binding domain (SBD) from a different organism (e.g., Trichoderma GA).

[00155] Tais glicoamilases híbridas também podem ser feitas usando um peptídeo para alinhar um domínio catalítico de um GA de um organismo (por exemplo, Talaromyces GA) e um domínio de ligação de amido (SBD) de um organismo diferente (por exemplo; Trichoderma GA).[00155] Such hybrid glycoamylases can also be made using a peptide to align a catalytic domain of a GA from one organism (e.g., Talaromyces GA) and a starch-binding domain (SBD) from a different organism (e.g., Trichoderma GA).

[00156] Exemplos de tais glicoamilases híbridas incluem, mas não se limitam a, glicoamilase de Aspergillus niger G1 e G2 (Ver, por exemplo, Boel et al., (1984) EMBO J. 3:1097-1102; WO 92/00381, WO 00/04136 e Patente dos E.U.A. N° 6,352,851); glicoamilases de Aspergillus awamori (ver, por exemplo, WO 84/02921); glicoamilases de Aspergillus oryzae (ver, por exemplo, Hata et al., (1991) Agric. Biol. Chem. 55:941949) e Aspergillus shirousami. (Ver, por exemplo, Chen et al., (1996) Prot. Eng. 9:499-505; Chen et al. (1995) Prot. Eng. 8:575-582; e Chen et al., (1994) Biochem J. 302:275-281).[00156] Examples of such hybrid glucoamylases include, but are not limited to, Aspergillus niger G1 and G2 glucoamylase (See, for example, Boel et al., (1984) EMBO J. 3:1097-1102; WO 92/00381 , WO 00/04136 and U.S. Patent No. 6,352,851); glycoamylases from Aspergillus awamori (see, for example, WO 84/02921); glycoamylases from Aspergillus oryzae (see, for example, Hata et al., (1991) Agric. Biol. Chem. 55:941949) and Aspergillus shirousami. (See, for example, Chen et al., (1996) Prot. Eng. 9:499-505; Chen et al. (1995) Prot. Eng. 8:575-582; and Chen et al., (1994) Biochem J. 302:275-281).

[00157] Algumas glicoamilases são expressas de forma endógena por bactérias, plantas e/ou fungos. Por exemplo, algumas glicoamilases são produzidas por várias estirpes de fungos filamentosos.[00157] Some glucoamylases are expressed endogenously by bacteria, plants and/or fungi. For example, some glucoamylases are produced by several strains of filamentous fungi.

[00158] De preferência, a glicoamilase terá atividade de hidrolisação de amido granular (GSH) ou terá sido recombinantemente manipulada para ter atividade de GSH. Tal atividade de GSH é vantajosa, uma vez que estas enzimas quebram mais do amido, especialmente qualquer amido granular (bruto), que possa estar presente em qualquer ração que contenha melaço e similares.[00158] Preferably, the glucoamylase will have granular starch (GSH) hydrolyzing activity or will have been recombinantly manipulated to have GSH activity. Such GSH activity is advantageous since these enzymes break down more of the starch, especially any granular (raw) starch that may be present in any feed containing molasses and the like.

[00159] As glicoamilases que podem ser usadas no método aqui divulgado incluem aquelas obtidas a partir de estirpes de Talaromyces ((por exemplo, glicoamilases T. emersonii, T. leycettanus, T. duponti e T. thermophilus (Ver, por exemplo, WO 99/28488; Patente dos E.U.A. No. RE: 32,153; Patente dos E.U.A. N° 4,587,215)); estirpes de Trichoderma, (por exemplo, T. reesei) e glicoamilases tendo pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90% e cerca de 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 divulgada na Patente dos E.U.A: U.S. N° 2006-0094080; estirpes de Rhizopus, (por exemplo, R. niveus e R. oryzae); estirpes de Mucor e estirpes de Humicola, ((por exemplo, H. grisea (ver, por exemplo, Boel et al., (1984) EMBO J. 3:1097-1102; WO 92/00381; WO 00/04136; Chen et al., (1996) Prot. Eng. 9:499-505; Taylor et al., (1978) Carbohydrate Res. 61:301-308; Patente dos E.U.A. 4.514.496; Patente U.S. N° 4.092.434; Patente U.S. N° N° 4,618,579; Jensen et al., (1988) Can. J. Microbiol. 34:218-223 e SEQ ID NO: 3 de WO 2005/052148)). Em algumas modalidades, a glicoamilase tem, pelo menos, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 92%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% e cerca de 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 de WO 05/052148. Outras glicoamilases úteis na presente invenção incluem as obtidas a partir de Athelia rolfsii e suas variantes (Ver, por exemplo, WO 04/111218) e Penicillium spp. (por exemplo, Penicillium chrysogenum).[00159] Glycoamylases that can be used in the method disclosed herein include those obtained from strains of Talaromyces (e.g., T. emersonii, T. leycettanus, T. duponti and T. thermophilus glucoamylases (See, e.g., WO 99/28488; U.S. Patent No. RE: 32,153; U.S. Patent No. 4,587,215)); Trichoderma strains, (e.g., T. reesei) and glycoamylases having at least about 80%, about 85%, about of 90% and about 95% sequence identity with SEQ ID NO: 4 disclosed in U.S. Patent No. 2006-0094080; of Mucor and strains of Humicola, ((e.g., H. grisea (see, e.g., Boel et al., (1984) EMBO J. 3:1097-1102; WO 92/00381; WO 00/04136; Chen et al., (1996) Prot. Eng. 9:499-505; Taylor et al., (1978) Carbohydrate Res. 61:301-308; No. 4,618,579; Jensen et al., (1988) Can. J. Microbiol 34:218-223 and SEQ ID NO: 3 of WO 2005/052148)). In some embodiments, the glucoamylase is at least about 85%, about 90%, about 92%, about 94%, about 95%, about 96%, about 97%, about 98% and about 99% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 of WO 05/052148. Other glycoamylases useful in the present invention include those obtained from Athelia rolfsii and its variants (See, for example, WO 04/111218) and Penicillium spp. (e.g. Penicillium chrysogenum).

[00160] Glicoamilases comercialmente disponíveis incluem, mas não se limitam a, Spirizyme Ultra, Spirizyme® Achieve, Spirizyme® Fuel, SPIRIZYME® EXCEL, DISTILLASE®, OPTIDEX® L-400 and G ZYME® G990 4X, GC480, G-ZYME® 480, FERMGEN® 1-400 (Danisco US, Inc, Genencor Division), CU.CONC® (Shin Nihon Chemicals, Japão), GLUCZYME® (Amano Pharmaceuticals, Japão (Ver, por exemplo, Takahashi et al., (1985) J. Biochem. 98:663-671)). Enzimas secundárias que encontram uso na invenção incluem três formas de glicoamilase (por exemplo, E.C.3.2.1.3) produzida por Rhizopus sp., nomeadamente "Gluc1" (MW 74,000), "Gluc2" (58,600 MW) e "Gluc3" (MW 61,400).[00160] Commercially available glycoamylases include, but are not limited to, Spirizyme Ultra, Spirizyme® Achieve, Spirizyme® Fuel, SPIRIZYME® EXCEL, DISTILLASE®, OPTIDEX® L-400 and G ZYME® G990 4X, GC480, G-ZYME® 480, FERMGEN® 1-400 (Danisco US, Inc, Genencor Division), CU.CONC® (Shin Nihon Chemicals, Japan), GLUCZYME® (Amano Pharmaceuticals, Japan (See, for example, Takahashi et al., (1985) J. Biochem. 98:663-671)). Secondary enzymes that find use in the invention include three forms of glucoamylase (e.g., E.C.3.2.1.3) produced by Rhizopus sp., namely "Gluc1" (MW 74,000), "Gluc2" (58,600 MW) and "Gluc3" (MW 61,400 ).

[00161] Qualquer alfa-glucosidase adequada (E.C.3.2.1.20) pode ser usada como aqui descrita.[00161] Any suitable alpha-glucosidase (E.C.3.2.1.20) can be used as described herein.

[00162] Como foi observado acima, a alfa-glucosidase libera glicose da maltose, isomaltose e maltossacarídeos no seu modo hidrolítico. Também pode transferir unidade de de glicose para moléculas aceitadoras incluindo glicose, maltose, isomaltose e maltossacarídeos ou quaisquer outras moléculas adequadas no seu modo sintético, especialmente a uma maior concentração de substrato e elevada concentração de produto. No trato digestivo, o modo sintético ou reação de transferência é mínimo, uma vez que a glicose de produto gerada será removida devido à absorção.[00162] As noted above, alpha-glucosidase releases glucose from maltose, isomaltose and maltosaccharides in its hydrolytic mode. It can also transfer glucose units to acceptor molecules including glucose, maltose, isomaltose and maltosaccharides or any other suitable molecules in its synthetic mode, especially at a higher substrate concentration and high product concentration. In the digestive tract, the synthetic mode or transfer reaction is minimal since the product glucose generated will be removed due to absorption.

[00163] As proteases (também denominadas peptidases ou proteinases) são enzimas com capacidade para clivar ligações de peptídeo. As proteases evoluíram múltiplas vezes e diferentes classes de proteases podem realizar a mesma reação por mecanismos catalíticos completamente diferentes. As proteases podem ser encontradas em animais, plantas, bactérias, archaea e vírus.[00163] Proteases (also called peptidases or proteinases) are enzymes with the ability to cleave peptide bonds. Proteases have evolved multiple times and different classes of proteases can carry out the same reaction by completely different catalytic mechanisms. Proteases can be found in animals, plants, bacteria, archaea and viruses.

[00164] A proteólise pode ser atingida por enzimas atualmente classificadas em seus grupos amplos: proteases aspárticas, cisteína proteases, serina proteases, treonina proteases, proteases glutâmicas e metaloproteases.[00164] Proteolysis can be achieved by enzymes currently classified into their broad groups: aspartic proteases, cysteine proteases, serine proteases, threonine proteases, glutamic proteases and metalloproteases.

[00165] De preferência, a protease é uma protease ácida e, mais preferencialmente, é uma protease fúngica ácida.[00165] Preferably, the protease is an acidic protease and, more preferably, it is an acidic fungal protease.

[00166] Nesta divulgação podem ser usadas quaisquer proteases neutras ou ácidas. Por exemplo, proteases fúngicas ácidas incluem as obtidas a partir de Aspergillus, Trichoderma, Mucor and Rhizopus, tal como A. niger, A. awamori, A. oryzae, Trichoderma reesei e M. miehei. AFP pode ser derivada da expressão de proteína endógena ou heteróloga de origem bacteriana, vegetal ou fúngica. De preferência, AFP é segregada a partir de estirpes de Trichoderma.[00166] In this disclosure, any neutral or acidic proteases can be used. For example, acidic fungal proteases include those obtained from Aspergillus, Trichoderma, Mucor and Rhizopus, such as A. niger, A. awamori, A. oryzae, Trichoderma reesei and M. miehei. AFP can be derived from the expression of an endogenous or heterologous protein of bacterial, plant or fungal origin. Preferably, AFP is secreted from Trichoderma strains.

[00167] Exemplos de proteases ácidas incluem, mas não se limitam a, uma protease de tipo selvagem, uma variante ou seu fragmento ou uma protease ácida híbrida geneticamente modificada que pode ser derivada, por exemplo, de um domínio catalítico de origem microbiana e um domínio de ligação de amido de outra origem microbiana.[00167] Examples of acidic proteases include, but are not limited to, a wild-type protease, a variant or fragment thereof, or a genetically modified hybrid acidic protease that can be derived, for example, from a catalytic domain of microbial origin and a starch-binding domain of other microbial origin.

[00168] Em outro aspecto, a protease pode ser uma protease neutra tal como uma metaloprotease (Metalopeptidase sin.), e, mais preferencialmente, uma metaloprotease bacteriana.[00168] In another aspect, the protease can be a neutral protease such as a metalloprotease (syn. Metallopeptidase), and, more preferably, a bacterial metalloprotease.

[00169] Em outro aspecto, qualquer ácido nucleico isolado, recombinante, substancialmente puro, de origem sintética ou de ocorrência não natural, constituído por uma sequência de nucleotídeos codificando qualquer polipeptídeo possuindo qualquer das atividades de glicosídeo hidrolase descritas neste documento (incluindo qualquer proteína de fusão, etc.) que foi discutido acima. É também de interesse um vetor composto por um polinucleotídeo codificando qualquer uma das glicosídeo hidrolases aqui descritas. Será evidente para a pessoa versada que o vetor pode ser qualquer vetor de expressão adequado e que a escolha de vetor pode variar dependendo do tipo de célula em que o vetor deve ser inserido. Os vetores adequados incluem pGAPT- PG, pRAX1, pGAMD, pGPT-pyrG1, pC194, pJH101, pE194 e pHP13 (consultar Harwood e Cutting [eds.], Capítulo 3, Molecular Biological Methods for Bacillus, John Wiley & Sons [1990]). Consultar também Perego, Integrational Vectors for Genetic Manipulations in Bacillus subtilis, em Sonenshein et al., [eds.] Bacillus subtilis and Other GramPositive Bacteria: Biochemistry, Physiology and Molecular Genetics, American Society for Microbiology, Washington, D.C. [1993], páginas 615 a 624), e p2JM103BBI.[00169] In another aspect, any isolated, recombinant, substantially pure nucleic acid of synthetic or non-natural origin, consisting of a nucleotide sequence encoding any polypeptide having any of the glycoside hydrolase activities described herein (including any protein of merger, etc.) which was discussed above. Also of interest is a vector composed of a polynucleotide encoding any of the glycoside hydrolases described herein. It will be apparent to the skilled person that the vector may be any suitable expression vector and that the choice of vector may vary depending on the type of cell into which the vector is to be inserted. Suitable vectors include pGAPT-PG, pRAX1, pGAMD, pGPT-pyrG1, pC194, pJH101, pE194, and pHP13 (see Harwood and Cutting [eds.], Chapter 3, Molecular Biological Methods for Bacillus, John Wiley & Sons [1990]). . See also Perego, Integrational Vectors for Genetic Manipulations in Bacillus subtilis, in Sonenshein et al., [eds.] Bacillus subtilis and Other GramPositive Bacteria: Biochemistry, Physiology and Molecular Genetics, American Society for Microbiology, Washington, D.C. [1993], pages 615 to 624), and p2JM103BBI.

[00170] O vetor de expressão pode ser um dentre qualquer número de vetores ou cassetes úteis para a transformação de hospedeiros de produção adequados conhecidos na técnica. Tipicamente, o vetor ou o cassete incluirão sequências que direcionam a transcrição e a tradução do gene relevante, um marcador selecionável e sequências que permitem replicação autônoma ou integração cromossômica. Os vetores adequados, de modo geral, incluem uma região 5' do gene que abriga controles de iniciação transcricional e uma região 3' do fragmento de DNA que controla a terminação transcricional. Ambas as regiões de controle podem ser derivadas de genes homólogos para genes de uma célula hospedeira de produção transformada e/ou genes nativos ao hospedeiro de produção, embora tais regiões de controle não precisem de ser derivadas assim.[00170] The expression vector may be one of any number of vectors or cassettes useful for transforming suitable production hosts known in the art. Typically, the vector or cassette will include sequences that direct transcription and translation of the relevant gene, a selectable marker, and sequences that allow autonomous replication or chromosomal integration. Suitable vectors generally include a 5' region of the gene that harbors transcriptional initiation controls and a 3' region of the DNA fragment that controls transcriptional termination. Both control regions may be derived from genes homologous to genes of a transformed production host cell and/or genes native to the production host, although such control regions need not be so derived.

[00171] Os fragmentos de DNA que controlam a terminação transcricional podem ser também derivados de vários genes nativos a uma célula hospedeira de produção preferencial. Em certas modalidades, a inclusão de uma região de controle de terminação é opcional. Em certas modalidades, o vetor de expressão inclui uma região de controle de terminação derivada da célula hospedeira preferencial.[00171] DNA fragments that control transcriptional termination can also be derived from various genes native to a preferred production host cell. In certain embodiments, the inclusion of a termination control region is optional. In certain embodiments, the expression vector includes a termination control region derived from the preferred host cell.

[00172] O vetor de expressão pode ser incluído no hospedeiro de produção, particularmente, nas células de hospedeiros de produção microbianos. As células hospedeiras de produção podem ser hospedeiros microbianos encontrados dentro das famílias fúngicas ou bacterianas e que crescem ao longo de uma faixa ampla de temperatura, valores de pH e tolerâncias a solvente. Por exemplo, contempla-se que qualquer um dentre bactérias, algas e fungos, tais como fungos filamentosos e leveduras, possa adequadamente hospedar o vetor de expressão.[00172] The expression vector can be included in the production host, particularly in the cells of microbial production hosts. Production host cells can be microbial hosts found within the fungal or bacterial families and that grow over a wide range of temperature, pH values, and solvent tolerances. For example, it is contemplated that any of bacteria, algae and fungi, such as filamentous fungi and yeast, may suitably host the expression vector.

[00173] A inclusão do vetor de expressão na célula hospedeira de produção pode ser usada para expressar a proteína de interesse de modo que a mesma possa residir de modo intracelular, extracelular ou uma combinação de ambos dentro e fora das células. A expressão extracelular produz a recuperação da proteína desejada de um produto de fermentação mais fácil que métodos para recuperação de proteína produzida por expressão intracelular.[00173] The inclusion of the expression vector in the production host cell can be used to express the protein of interest so that it can reside intracellularly, extracellularly or a combination of both inside and outside the cells. Extracellular expression makes recovery of the desired protein from a fermentation product easier than methods for recovering protein produced by intracellular expression.

[00174] O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor, tal como um plasmídeo ou vírus, que pode ser convenientemente submetido a procedimentos de DNA recombinante e levar à expressão da sequência de nucleotídeos. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor será introduzido. Os vetores podem ser plasmídeos lineares ou circulares fechados. O vetor pode ser um vetor autonomamente replicante, ou seja, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter quaisquer meios para assegurar a autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser tal que, quando introduzido no hospedeiro de produção, seja integrado no genoma e replicado juntamente com o cromossomo (ou cromossomos) no qual foi integrado. Alguns exemplos não limitativos desses vetores são fornecidos no Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains (FGSC, < www.fgsc.net»). Exemplos adicionais de expressão adequada e/ou vetores de integração são fornecidos em Sambrook et al., (1989) supra, Ausubel (1987) supra, van den Hondel et al. (1991) em Bennett e Lasure (Eds.) MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press. 396-428 e Patente dos EUA N° 5,874,276. Vetores particularmente úteis incluem pTREX, pFB6, pBR322, PUCI8, pUCI00 e pENTR/D. Plasmídeos adequados para uso em células bacterianas incluem pBR322 e pUC19 permitindo a replicação em E. coli e pE194, por exemplo, permitindo a replicação em Bacillus.[00174] The recombinant expression vector can be any vector, such as a plasmid or virus, which can be conveniently subjected to recombinant DNA procedures and lead to expression of the nucleotide sequence. The choice of vector will typically depend on the compatibility of the vector with the host cell into which the vector will be introduced. Vectors can be linear or closed circular plasmids. The vector may be an autonomously replicating vector, that is, a vector that exists as an extrachromosomal entity, the replication of which is independent of chromosomal replication, for example, a plasmid, an extrachromosomal element, a minichromosome or an artificial chromosome. The vector may contain any means to ensure self-replication. Alternatively, the vector may be such that, when introduced into the production host, it is integrated into the genome and replicated together with the chromosome (or chromosomes) into which it was integrated. Some non-limiting examples of these vectors are provided in the Fungal Genetics Stock Center Catalog of Strains (FGSC, <www.fgsc.net»). Additional examples of suitable expression and/or integration vectors are provided in Sambrook et al., (1989) supra, Ausubel (1987) supra, van den Hondel et al. (1991) in Bennett and Lasure (Eds.) MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press. 396-428 and US Patent No. 5,874,276. Particularly useful vectors include pTREX, pFB6, pBR322, PUCI8, pUCI00, and pENTR/D. Suitable plasmids for use in bacterial cells include pBR322 and pUC19 allowing replication in E. coli and pE194, for example, allowing replication in Bacillus.

[00175] Em resumo, em relação à produção em células hospedeiras de produção, pode ser feita referência a Sambrook et al., (1989) supra, Ausubel (1987) supra, van den Hondel et al. (1991) em Bennett e Lasure (Eds.) MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press (1991) páginas 70 a 76 e 396 a 428; Nunberg et al., (1984) Mol. Cell BioI. 4:2.306 a 2.315; Boel et al., (1984) 30 EMBO J. 3:1.581 a 1585; Finkelstein em BIOTECHNOLOGY OF FILAMENTOUS FUNGI, Finkelstein et al. Eds. Butterworth-Heinemann, Boston, MA (1992), Cap. 6; Kinghorn et al. (1992) APPLIED MOLECULAR GENETICS OF FILAMENTOUS FUNGI, Blackie Academic e Professional, Chapman e Hall, Londres; Kelley et al., (1985) EMBO J. 4:475 a 479; Penttila et al., (1987) Gene 61: 155 a 164; e Patente U.S. N° 5,874,276. Uma lista de vetores adequados pode ser encontrada em Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains (FGSC, www at fgsc.net). Os vetores adequados incluem aqueles obtidos, por exemplo, da Invitrogen Life Technologies e Promega. Vetores específicos adequados para uso em células hospedeiras fúngicas incluem vetores, tais como pFB6, pBR322, pUC 18, pUC100, pDON™201, pDONR™221, pENTR™, pGEM®3Z e pGEM®4Z.[00175] In summary, in relation to production in production host cells, reference can be made to Sambrook et al., (1989) supra, Ausubel (1987) supra, van den Hondel et al. (1991) in Bennett and Lasure (Eds.) MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press (1991) pages 70 to 76 and 396 to 428; Nunberg et al., (1984) Mol. Cell BioI. 4:2,306 to 2,315; Boel et al., (1984) 30 EMBO J. 3:1,581 to 1585; Finkelstein in BIOTECHNOLOGY OF FILAMENTOUS FUNGI, Finkelstein et al. Eds. Butterworth-Heinemann, Boston, MA (1992), Ch. 6; Kinghorn et al. (1992) APPLIED MOLECULAR GENETICS OF FILAMENTOUS FUNGI, Blackie Academic and Professional, Chapman and Hall, London; Kelley et al., (1985) EMBO J. 4:475 to 479; Penttila et al., (1987) Gene 61: 155 to 164; and U.S. Patent No. 5,874,276. A list of suitable vectors can be found in the Fungal Genetics Stock Center Catalog of Strains (FGSC, www at fgsc.net). Suitable vectors include those obtained, for example, from Invitrogen Life Technologies and Promega. Specific vectors suitable for use in fungal host cells include vectors such as pFB6, pBR322, pUC 18, pUC100, pDON™201, pDONR™221, pENTR™, pGEM®3Z and pGEM®4Z.

[00176] O sistema de vetor pode ser um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que contenham, em conjunto, o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transpóson.[00176] The vector system can be a single vector or plasmid or two or more vectors or plasmids that together contain the total DNA to be introduced into the host cell genome, or a transposon.

[00177] O vetor pode também conter um ou mais marcadores selecionáveis para permitir a seleção fácil das células transformadas. Um marcador selecionável é um gene, cujo produto fornece resistência viral ou a biocida e similares. Os exemplos de marcadores selecionáveis incluem aqueles que conferem resistência antimicrobiana. Os marcadores nutricionais também encontram uso na presente invenção, incluindo aqueles marcadores conhecidos na técnica, como amdS, argB e pyr4. Os marcadores úteis para a transformação de Trichoderma são conhecidos na técnica (consultar, por exemplo, Finkelstein, capítulo 6, em Biotechnology of Filamentous Fungi, Finkelstein et al., EDS Butterworth-Heinemann, Boston MA (1992) e Kinghorn et al., (1992) Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi, Blackie Academic and Professional, Chapman e Hall, Londres). Em algumas modalidades, os vetores de expressão também incluem um réplicon, uma resistência a antibiótico de codificação de gene para permitir a seleção de bactérias que abrigam plasmídeos recombinantes, e locais de restrição únicos em regiões não essenciais do plasmídeo para permitir a inserção de sequências heterólogas. O gene de resistência antibiótica particular escolhido não é essencial; qualquer um dentre os muitos genes de resistência conhecidos na técnica é adequado. As sequências procarióticas são preferencialmente escolhidas de modo a não interferirem na replicação ou integração do DNA em Trichoderma reesei.[00177] The vector may also contain one or more selectable markers to allow easy selection of transformed cells. A selectable marker is a gene, the product of which provides viral or biocide resistance and the like. Examples of selectable markers include those that confer antimicrobial resistance. Nutritional markers also find use in the present invention, including those markers known in the art, such as amdS, argB and pyr4. Markers useful for Trichoderma transformation are known in the art (see, e.g., Finkelstein, chapter 6, in Biotechnology of Filamentous Fungi, Finkelstein et al., EDS Butterworth-Heinemann, Boston MA (1992) and Kinghorn et al., (1992) Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi, Blackie Academic and Professional, Chapman and Hall, London). In some embodiments, the expression vectors also include a replicon, an antibiotic resistance gene encoding to allow selection of bacteria harboring recombinant plasmids, and unique restriction sites in non-essential regions of the plasmid to allow insertion of heterologous sequences. . The particular antibiotic resistance gene chosen is not essential; any of the many resistance genes known in the art is suitable. Prokaryotic sequences are preferably chosen so as not to interfere with DNA replication or integration in Trichoderma reesei.

[00178] O vetor pode também conter um elemento (ou elementos) que permita integração estável do vetor no genoma do hospedeiro produto ou replicação autônoma do vetor no hospedeiro de produção independente do genoma da célula. Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode se basear na sequência de nucleotídeos que codifica a protease aspártica ou qualquer outro elemento do vetor para integração estável do vetor no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga.[00178] The vector may also contain an element (or elements) that allows stable integration of the vector into the genome of the product host or autonomous replication of the vector in the production host independent of the cell's genome. For integration into the host cell genome, the vector may be based on the nucleotide sequence encoding the aspartic protease or any other element of the vector for stable integration of the vector into the genome by homologous or non-homologous recombination.

[00179] Para replicação autônoma, o vetor pode, ainda, compreender uma origem de replicação que permite que o vetor replique autonomamente no hospedeiro de produção.[00179] For autonomous replication, the vector may further comprise an origin of replication that allows the vector to replicate autonomously in the production host.

[00180] Mais de uma cópia da sequência de nucleotídeos que codifica uma glicosídeo hidrolase pode ser inserida no hospedeiro de produção para aumentar a sua produção. Um aumento no número de cópias da sequência de nucleotídeos pode ser obtido integrando pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma do hospedeiro de produção ou incluindo um gene marcador selecionável amplificável e, assim, cópias adicionais da sequência de nucleotídeos podem ser selecionadas cultivando as células hospedeiras de produção na presença de um agente selecionável adequado.[00180] More than one copy of the nucleotide sequence encoding a glycoside hydrolase can be inserted into the production host to increase its production. An increase in the number of copies of the nucleotide sequence can be obtained by integrating at least one additional copy of the sequence into the genome of the production host or by including an amplifiable selectable marker gene, and thus additional copies of the nucleotide sequence can be selected by culturing the cells. production hosts in the presence of a suitable selectable agent.

[00181] Um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica qualquer das glicosídeo hidrolases é introduzido no hospedeiro de produção de modo que o vetor seja mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extracromossômico autorreplicante. A integração é, de modo geral, considerada como sendo uma vantagem visto que a sequência de nucleotídeos tem maior probabilidade se ser mantida de forma estável no hospedeiro de produção. A integração do vetor no cromossomo hospedeiro de produção pode ocorrer por recombinação homóloga ou não homóloga conforme foi discutido acima.[00181] A vector comprising the nucleotide sequence encoding any of the glycoside hydrolases is introduced into the production host so that the vector is maintained as a chromosomal integrant or as a self-replicating extrachromosomal vector. Integration is generally considered to be an advantage as the nucleotide sequence is more likely to be maintained stably in the production host. Integration of the vector into the host production chromosome can occur by homologous or non-homologous recombination as discussed above.

[00182] Os vetores exemplificativos incluem, porém sem limitação, pGXT (igual ao vetor pTTTpyr2 conforme descrito no pedido publicado PCT WO2015/017256). Podem ser mencionados também vetores de expressão bacteriana padrões incluindo bacteriófagos À e M13, assim como plasmídeos, tais como plasmídeos com base em pBR322, pSKF, pET23D, e sistemas de expressão de fusão, tais como MBP, GST e LacZ. As etiquetas de epítopo também podem ser adicionadas a proteínas recombinantes para fornecer métodos convenientes de isolamento, por exemplo, c-myc.[00182] Exemplary vectors include, but are not limited to, pGXT (same as the pTTTpyr2 vector as described in PCT published application WO2015/017256). Standard bacterial expression vectors including À and M13 bacteriophages can also be mentioned, as well as plasmids such as plasmids based on pBR322, pSKF, pET23D, and fusion expression systems such as MBP, GST and LacZ. Epitope tags can also be added to recombinant proteins to provide convenient methods of isolation, e.g. c-myc.

[00183] Os exemplos de vetores de expressão e/ou integração adequados são fornecidos em Sambrook et al., (1989) supra, Bennett e Lasure (Eds.) More Gene Manipulations in Fungi, (1991) Academic Press páginas 70 a 76 e páginas 396 a 428 e artigos mencionados nos mesmos; USP 5.874.276 e Fungal Genetic Stock Center Catalogue of Strains, (FGSC, www.fgsc.net.). Os vetores úteis podem ser obtidos junto à Promega e Invitrogen. Alguns vetores úteis específicos incluem pBR322, pUC18, pUC100, pDON™201, pENTR™, pGEN®3Z e pGEN®4Z. Entretanto, outras formas de vetores de expressão que servem funções equivalentes e que são ou se tornam conhecidos na técnica podem ser também usados. Assim, pode ser empregada uma ampla variedade de combinações de hospedeiros/vetores de expressão na expressão de sequências de DNA reveladas no presente documento. Os vetores de expressão úteis, por exemplo, podem consistir em segmentos de sequências de DNA sintético, não cromossômico e cromossômico tais como vários derivados conhecidos de SV40 e plasmídeos bacterianos conhecidos, por exemplo, plasmídeos de E. coli, incluindo col E1, pCR1, pBR322, pMb9, pUC 19 e derivados dos mesmos, plasmídeos de gama de hospedeiro mais ampla, por exemplo, RP4, fago de DNA, por exemplo, os numerosos derivados de fago .lambda., por exemplo, NM989, e outros fagos de DNA, por exemplo, M13 e fagos filamentosos de DNA de cadeia simples, plasmídeos de leveduras, tais como o plasmídeo 2.mu ou derivados dos mesmos.[00183] Examples of suitable expression and/or integration vectors are provided in Sambrook et al., (1989) supra, Bennett and Lasure (Eds.) More Gene Manipulations in Fungi, (1991) Academic Press pages 70 to 76 and pages 396 to 428 and articles mentioned therein; USP 5,874,276 and Fungal Genetic Stock Center Catalog of Strains, (FGSC, www.fgsc.net.). Useful vectors can be obtained from Promega and Invitrogen. Some specific useful vectors include pBR322, pUC18, pUC100, pDON™201, pENTR™, pGEN®3Z, and pGEN®4Z. However, other forms of expression vectors that serve equivalent functions and that are or become known in the art may also be used. Thus, a wide variety of host/expression vector combinations can be employed in expressing the DNA sequences disclosed herein. Useful expression vectors, for example, may consist of segments of synthetic, non-chromosomal and chromosomal DNA sequences such as various known derivatives of SV40 and known bacterial plasmids, e.g., E. coli plasmids, including col E1, pCR1, pBR322, pMb9, pUC 19 and derivatives thereof, broader host range plasmids, e.g., RP4, DNA phage, e.g., the numerous derivatives of lambda phage, e.g., NM989, and other DNA phage , for example, M13 and single-stranded DNA filamentous phages, yeast plasmids such as the 2.mu plasmid or derivatives thereof.

[00184] A escolha de um hospedeiro de produção pode ser qualquer microrganismo adequado, tal como bactérias, fungos e algas. Tipicamente, a escolha dependerá do gene que codifica a glicosídeo hidrolase de interesse.[00184] The choice of a production host can be any suitable microorganism, such as bacteria, fungi and algae. Typically, the choice will depend on the gene encoding the glycoside hydrolase of interest.

[00185] Os exemplos de hospedeiros de produção adequados incluem, porém sem limitação, células bacterianas, fúngicas, vegetais, etc. De preferência, o hospedeiro de produção pode ser selecionado dentre E. coli, Streptomyces, Hansenula, Trichoderma (particularmente T. reesei), Bacillus, Lactobacillus, Aspergillus (particularmente A. niger), uma célula vegetal e/ou esporos de Bacillus, Trichoderma ou Aspergillus.[00185] Examples of suitable production hosts include, but are not limited to, bacterial, fungal, plant cells, etc. Preferably, the production host may be selected from E. coli, Streptomyces, Hansenula, Trichoderma (particularly T. reesei), Bacillus, Lactobacillus, Aspergillus (particularly A. niger), a plant cell and/or spores of Bacillus, Trichoderma or Aspergillus.

[00186] Em algumas modalidades, uma enzima de glicosídeo hidrolase recombinante pode ser usada nos métodos e nas composições revelados no presente documento. Em um aspecto preferencial, é proporcionado um alimento ou aditivo de ração compreendendo a glicosídeo hidrolase aqui descrita.[00186] In some embodiments, a recombinant glycoside hydrolase enzyme can be used in the methods and compositions disclosed herein. In a preferred aspect, there is provided a food or feed additive comprising the glycoside hydrolase described herein.

[00187] Muitos métodos de transfecção padrões podem ser usados para produzir linhagens celulares de fungos filamentosos e bactérias (por exemplo, Aspergillus ou Trichoderma) que expressam grandes quantidades da glicosídeo hidrolase desejada. Alguns dos métodos publicados para a introdução de construtos de DNA nas cepas de produção de celulase de Trichoderma incluem Lorito, Hayes, DiPietro e Harman, (1993) Curr. Genet. 24: 349 a 356; Goldman, VanMontagu e Herrera-Estrella, (1990) Curr. Genet. 17:169 a 174; e Penttila, Nevalainen, Ratto, Salminen e Knowles, (1987) Gene 6: 155 a 164, consultar também USP 6.022.725; USP 6.268.328 e Nevalainen et al., "The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes" em Molecular Industrial Mycology, Eds, Leong e Berka, Marcel Dekker Inc., NY (1992) páginas 129 a 148; para Aspergillus incluem Yelton, Hamer e Timberlake, (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1.470 a 1.474, para Fusarium incluem Bajar, Podila e Kolattukudy, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8.202 a 8.212, para Streptomyces incluem Hopwood et al., 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces: Laboratory Manual, The John Innes Foundation, Norwich, UK, e Fernandez-Abalos et al., Microbiol 149:1.623 a 1.632 (2003) e para Bacillus incluem Brigidi, DeRossi, Bertarini, Riccardi e Matteuzzi, (1990) FEMS Microbiol. Lett. 55: 135-138).[00187] Many standard transfection methods can be used to produce cell lines of filamentous fungi and bacteria (e.g., Aspergillus or Trichoderma) that express large amounts of the desired glycoside hydrolase. Some of the published methods for introducing DNA constructs into cellulase-producing strains of Trichoderma include Lorito, Hayes, DiPietro, and Harman, (1993) Curr. Genet. 24: 349 to 356; Goldman, VanMontagu and Herrera-Estrella, (1990) Curr. Genet. 17:169 to 174; and Penttila, Nevalainen, Ratto, Salminen and Knowles, (1987) Gene 6: 155 to 164, see also USP 6,022,725; USP 6,268,328 and Nevalainen et al., "The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes" in Molecular Industrial Mycology, Eds, Leong and Berka, Marcel Dekker Inc., NY (1992) pages 129 to 148; for Aspergillus include Yelton, Hamer, and Timberlake, (1984) Proc. Natl. Academic. Sci. USA 81: 1470 to 1474, for Fusarium include Bajar, Podila and Kolattukudy, (1991) Proc. Natl. Academic. Sci. USA 88: 8202 to 8212, for Streptomyces include Hopwood et al., 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces: Laboratory Manual, The John Innes Foundation, Norwich, UK, and Fernandez-Abalos et al., Microbiol 149:1623 to 1632 (2003) and for Bacillus include Brigidi, DeRossi, Bertarini, Riccardi and Matteuzzi, (1990) FEMS Microbiol. Lett. 55: 135-138).

[00188] Entretanto, pode ser usado qualquer um dos procedimentos bem conhecidos para introduzir sequências de nucleotídeos estranhas em células hospedeiras. Esses incluem o uso de transfecção com fosfato de cálcio, polibreno, fusão de protoplastos, eletroporação, biolística, lipossomos, microinjeção, vetores plasmáticos, vetores virais e quaisquer dos outros métodos bem conhecidos de introdução de DNA genômico, cDNA, DNA sintético clonados ou outro material genético estranho em uma célula hospedeira (consultar, por exemplo, Sambrook et al., supra). Também é de uso o método de transfecção mediado por Agrobacterium descrito na Patente no U.S. 6.255.115. Também é necessário que o procedimento de manipulação genética particular usado tenha capacidade para introduzir de modo bem-sucedido o pelo menos um gene na célula hospedeira com capacidade para expressar o gene.[00188] However, any of the well-known procedures can be used to introduce foreign nucleotide sequences into host cells. These include the use of calcium phosphate transfection, polybrene, protoplast fusion, electroporation, biolistics, liposomes, microinjection, plasma vectors, viral vectors, and any of the other well-known methods of introducing cloned genomic DNA, cDNA, synthetic DNA, or other foreign genetic material in a host cell (see, e.g., Sambrook et al., supra). Also of use is the Agrobacterium-mediated transfection method described in U.S. Patent No. 6,255,115. It is also necessary that the particular genetic manipulation procedure used be capable of successfully introducing the at least one gene into the host cell capable of expressing the gene.

[00189] Dependendo da célula hospedeira usada, podem ser feitas modificações pós-transcrição e/ou pós-tradução. Um exemplo não limitativo de uma modificação pós-transcrição e/ou pós-tradução é "recorte" ou "truncamento" de um polipeptídeo. Por exemplo, isso pode resultar em levar uma glicosídeo hidrolase de um estado inativo ou substancialmente inativo a um estado ativo como no caso de um pró- peptídeo submetido a processamento pós-tradução adicional a um peptídeo maduro que tem a atividade enzimática. Em outro caso, esse recorte pode resultar em tornar madura uma glicosídeo hidrolase, conforme descrito no presente documento e remover, ainda, aminoácidos N ou C-terminais para gerar formas truncadas que mantém atividade enzimática.[00189] Depending on the host cell used, post-transcriptional and/or post-translational modifications can be made. A non-limiting example of a post-transcriptional and/or post-translational modification is "clipping" or "truncation" of a polypeptide. For example, this may result in taking a glycoside hydrolase from an inactive or substantially inactive state to an active state as in the case of a propeptide undergoing further post-translational processing to a mature peptide that has enzymatic activity. In another case, this cut may result in making a glycoside hydrolase mature, as described in this document, and also removing N or C-terminal amino acids to generate truncated forms that maintain enzymatic activity.

[00190] Outros exemplos de modificações pós-transcrição ou pós- tradução incluem, porém sem limitação, miristoilação, glicosilação, truncação, lipidação e fosforilação de tirosina, serina ou treonina. A pessoa versada perceberá que o tipo de modificações pós-transcrição ou pós-tradução que uma proteína pode sofrer pode depender do organismo hospedeiro em que a proteína é expressa.[00190] Other examples of post-transcriptional or post-translational modifications include, but are not limited to, myristoylation, glycosylation, truncation, lipidation and phosphorylation of tyrosine, serine or threonine. The skilled person will appreciate that the type of post-transcriptional or post-translational modifications that a protein may undergo may depend on the host organism in which the protein is expressed.

[00191] Os métodos de transformação para Aspergillus e Trichoderma são descritos, por exemplo, em Yelton et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470 a 1474; Berka et al., (1991) em Applications of Enzyme Biotechnology, Eds. Kelly e Baldwin, Plenum Press (NY); Cao et al., (2000) Sci. 9:991 a 1.001; Campbell et al., (1989) Curro Genet. 16:53 a 56; Pentilla et al., (1987) Gene 61:155 a 164); de Groot et al., (1998) Nat. Biotechnol. 16:839 a 842; USP 6,022,725; USP 6,268,328 e EP 238 023. A expressão de proteína heteróloga em Trichoderma é descrita nos documentos USP 6.022.725; USP 6.268.328; Harkki et ale (1991); Enzyme Microb. Technol. 13:227 a 233; Harkki et al., (1989) Bio Technol. 7:596 a 603; EP 244,234; EP 215,594; e Nevalainen et al., "The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes", em MOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY, Eds. Leong e Berka, Marcel Dekker Inc., NY (1992) páginas 129 a 148). Também é feita referência ao documento W096100787 e Bajar et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8.202 a 28.212 para transformação de cepas de Fusarium.[00191] Transformation methods for Aspergillus and Trichoderma are described, for example, in Yelton et al. (1984) Proc. Natl. Academic. Sci. USA 81: 1470 to 1474; Berka et al., (1991) in Applications of Enzyme Biotechnology, Eds. Kelly and Baldwin, Plenum Press (NY); Cao et al., (2000) Sci. 9:991 to 1001; Campbell et al., (1989) Curro Genet. 16:53 to 56; Pentilla et al., (1987) Gene 61:155 to 164); de Groot et al., (1998) Nat. Biotechnol. 16:839 to 842; USP 6,022,725; USP 6,268,328 and EP 238,023. Heterologous protein expression in Trichoderma is described in USP 6,022,725; USP 6,268,328; Harkki et al (1991); Enzyme Microb. Technol. 13:227 to 233; Harkki et al., (1989) Bio Technol. 7:596 to 603; EP 244,234; EP 215,594; and Nevalainen et al., "The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes," in MOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY, Eds. Leong and Berka, Marcel Dekker Inc., NY (1992) pages 129 to 148). Reference is also made to document W096100787 and Bajar et al., (1991) Proc. Natl. Academic. Sci. USA 88:8,202 to 28,212 for transformation of Fusarium strains.

[00192] Após o vetor de expressão ser introduzido nas células, as células transfectadas ou transformadas são cultivadas sob condições que favorecem a expressão de genes sob controle das sequências promotoras. Em alguns casos, a sequência promotora é o promotor de cbh1. Grandes bateladas de células transformadas podem ser cultivadas conforme descrito em Ilmen et al 1997 ("Regulation of cellulase gene expression in the filamentous fungus Trichoderma reesei." Appl. Envir. Microbiol. 63:1.298 a 1.306).[00192] After the expression vector is introduced into the cells, the transfected or transformed cells are cultivated under conditions that favor the expression of genes under the control of the promoter sequences. In some cases, the promoter sequence is the cbh1 promoter. Large batches of transformed cells can be cultured as described in Ilmen et al 1997 ("Regulation of cellulase gene expression in the filamentous fungus Trichoderma reesei." Appl. Envir. Microbiol. 63:1298 to 1306).

[00193] A absorção de DNA na cepa hospedeira de Trichoderma sp. depende da concentração de íon de cálcio. Geralmente, CaCl2 a cerca de 10 a 50 mM é usado em uma solução de absorção. Compostos adequados adicionais incluem um sistema de tamponamento, tais como tampão TE (Tris 10 mM, pH 7,4; EDTA 1 mM) ou MOPS 10 mM, pH 6,0 e polietileno glicol. Acredita-se que o polietileno glicol funde as membranas celulares, permitindo, assim, que o conteúdo do meio seja entregue ao citoplasma da cepa de Trichoderma sp. Essa fusão deixa frequentemente múltiplas cópias do DNA de plasmídeo integradas no cromossomo hospedeiro.[00193] The absorption of DNA in the host strain of Trichoderma sp. depends on the calcium ion concentration. Generally, CaCl2 at about 10 to 50 mM is used in an absorption solution. Additional suitable compounds include a buffer system such as TE buffer (10 mM Tris, pH 7.4; 1 mM EDTA) or 10 mM MOPS, pH 6.0 and polyethylene glycol. It is believed that polyethylene glycol fuses cell membranes, thus allowing the contents of the medium to be delivered to the cytoplasm of the Trichoderma sp strain. This fusion often leaves multiple copies of the plasmid DNA integrated into the host chromosome.

[00194] Geralmente, a transformação de Trichoderma sp. usa protoplastos ou células que foram submetidas a um tratamento de permeabilidade, tipicamente em uma densidade de 105 a 107/mL, particularmente, 2x106/mL. Um volume de 100 μl desses protoplastos ou células em uma solução apropriada (por exemplo,[00194] Generally, the transformation of Trichoderma sp. uses protoplasts or cells that have undergone a permeability treatment, typically at a density of 105 to 107/mL, particularly, 2x106/mL. A volume of 100 μl of these protoplasts or cells in an appropriate solution (e.g.

[00195] sorbitol a 1,2 M e CaCl2 a 50 mM) pode ser misturado com o DNA desejado. Em geral, uma alta concentração de PEG é adicionada à solução de absorção. De 0,1 a 1 volume de PEG 4000 a 25% pode ser adicionado à suspensão de protoplastos; entretanto, é útil adicionar cerca de 0,25 volume à suspensão de protoplastos. Aditivos, tais como dimetil sulfóxido, heparina, espermidina, cloreto de potássio e similares, podem também ser adicionados à solução de absorção para facilitar a transformação. Procedimentos similares estão disponíveis para outras células hospedeiras fúngicas. Consultar, por exemplo, a Patente U.S. N° 6.022.725.[00195] 1.2 M sorbitol and 50 mM CaCl2) can be mixed with the desired DNA. In general, a high concentration of PEG is added to the absorption solution. From 0.1 to 1 volume of 25% PEG 4000 can be added to the protoplast suspension; however, it is useful to add about 0.25 volume to the protoplast suspension. Additives such as dimethyl sulfoxide, heparin, spermidine, potassium chloride and the like can also be added to the absorption solution to facilitate transformation. Similar procedures are available for other fungal host cells. See, for example, U.S. Patent No. 6,022,725.

[00196] O meio usado para cultivar as células pode ser qualquer meio convencional adequado para cultivar a célula hospedeira e obter expressão de qualquer das glicosídeo hidrolases aqui descritas. Mídias e componentes de mídia adequados estão disponíveis junto a fornecedores comerciais ou podem ser preparadas de acordo com receitas publicadas (por exemplo, conforme descrito em catálogos da American Type Culture Collection).[00196] The medium used to cultivate the cells can be any conventional medium suitable for cultivating the host cell and obtaining expression of any of the glycoside hydrolases described here. Suitable media and media components are available from commercial suppliers or can be prepared according to published recipes (e.g., as described in American Type Culture Collection catalogs).

[00197] Em algumas modalidades, a preparação de um caldo de fermentação inteiro gasto de um micro-organismo recombinante pode ser alcançada com o uso de qualquer método de cultivo conhecido na técnica resultando na expressão da enzima de interesse. A fermentação pode, portanto, ser entendida como compreendendo o cultivo em frasco de agitação, fermentação em pequena ou grande escala (incluindo as fermentações em batelada, em batelada alimentada ou de estado sólido) em fermentadores industriais realizados em um meio adequado e sob condições que permitem que a enzima seja expressa ou isolada. O termo "caldo de fermentação inteiro gasto" é definido no presente documento como conteúdo não fracionado do material de fermentação que inclui o meio de cultura, proteínas extracelulares (por exemplo, enzimas) e biomassa celular. Entende-se que o termo "caldo de fermentação inteiro gasto" também engloba biomassa celular que foi lisada ou permeabilizada com o uso de métodos bem conhecidos na técnica.[00197] In some embodiments, the preparation of an entire fermentation broth spent from a recombinant microorganism can be achieved using any cultivation method known in the art resulting in the expression of the enzyme of interest. Fermentation can therefore be understood as comprising shake flask cultivation, small-scale or large-scale fermentation (including batch, fed-batch or solid-state fermentations) in industrial fermentors carried out in a suitable medium and under conditions that allow the enzyme to be expressed or isolated. The term "spent whole fermentation broth" is defined herein as unfractionated contents of fermentation material that includes culture medium, extracellular proteins (e.g., enzymes) and cellular biomass. The term "spent whole fermentation broth" is understood to also encompass cellular biomass that has been lysed or permeabilized using methods well known in the art.

[00198] Células hospedeiras podem ser cultivadas sob condições adequadas que permitem a expressão de qualquer das glicosídeo hidrolases aqui descritas. A expressão das enzimas pode ser constitutiva de modo que as mesmas sejam continuamente produzidas ou induzíveis, exigindo um estímulo para iniciar a expressão. No caso da expressão induzível, a produção de proteína pode ser iniciada quando exigido, por exemplo, pela adição de uma substância indutora ao meio de cultura, por exemplo, dexametasona ou IPTG ou soforose.[00198] Host cells can be cultured under suitable conditions that allow the expression of any of the glycoside hydrolases described here. The expression of enzymes can be constitutive so that they are continuously produced or inducible, requiring a stimulus to initiate expression. In the case of inducible expression, protein production can be initiated when required, for example, by adding an inducing substance to the culture medium, for example, dexamethasone or IPTG or sophorose.

[00199] Polipeptídeos podem também ser produzidos de modo recombinante em um sistema isento de células in vitro, tal como o sistema de reticulócitos de coelho TNT™ (Promega). Um hospedeiro de expressão pode também ser cultivado no meio apropriado para o hospedeiro, sob condições aeróbicas. Agitação ou uma combinação de balanço e aeração pode ser fornecida, com a produção ocorrendo na temperatura apropriada para esse hospedeiro, por exemplo, de cerca de 25 °C a cerca de 75 °C (por exemplo, 30 °C a 45 °C), dependendo das necessidades do hospedeiro e da produção da alfa-glucosidase desejada. A cultura pode ocorrer de cerca de 12 a cerca de 100 horas ou mais (e qualquer valor de hora entre os mesmos, por exemplo, de 24 a 72 horas). Tipicamente, o caldo de cultura está a um pH de cerca de 4,0 a cerca de 8,0, dependendo novamente das condições de cultura necessárias para o hospedeiro em relação à produção da enzima de interesse, tal como a glicosídeo hidrolase aqui descrita. Desde a produção, hospedeiros e células transformadas podem ser cultivados em mídia de nutriente convencional. A mídia de cultura para células hospedeiras apropriadas pode ser modificada conforme apropriado para ativar promotores e selecionar células transformadas. As condições de cultura específicas, tais como temperatura, pH e similares, podem ser aquelas que são usadas para a célula hospedeira selecionada para expressão e serão evidentes para aqueles versados na técnica. Adicionalmente, as condições de cultura preferenciais podem ser encontradas na literatura científica, tal como Sambrook, (1982) supra; Kieser, T, MJ. Bibb, MJ. Buttner, KF Chater e D.A. Hopwood (2000) PRACTICAL STREPTOMYCES GENETICS. John Innes Foundation, Norwich, Reino Unido; Harwood, et al., (1990) MOLECULAR BIOLOGICAL METHODS FOR BACILLUS, John Wiley e/ou da American Type Culture Collection (ATCC; www.atcc.org).[00199] Polypeptides can also be produced recombinantly in an in vitro cell-free system, such as the TNT™ rabbit reticulocyte system (Promega). An expression host can also be grown in the appropriate medium for the host under aerobic conditions. Agitation or a combination of rocking and aeration may be provided, with production occurring at the appropriate temperature for that host, e.g., from about 25°C to about 75°C (e.g., 30°C to 45°C). , depending on the needs of the host and the production of the desired alpha-glucosidase. Culture can occur from about 12 to about 100 hours or more (and any hour value in between, e.g., 24 to 72 hours). Typically, the culture broth is at a pH of about 4.0 to about 8.0, again depending on the culture conditions required by the host in relation to the production of the enzyme of interest, such as the glycoside hydrolase described herein. From production, transformed hosts and cells can be cultured in conventional nutrient media. Culture media for appropriate host cells can be modified as appropriate to activate promoters and select for transformed cells. Specific culture conditions, such as temperature, pH and the like, may be those used for the host cell selected for expression and will be apparent to those skilled in the art. Additionally, preferred culture conditions can be found in scientific literature, such as Sambrook, (1982) supra; Kieser, T, MJ. Bibb, MJ. Buttner, K. F. Chater and D. A. Hopwood (2000) PRACTICAL STREPTOMYCES GENETICS. John Innes Foundation, Norwich, UK; Harwood, et al., (1990) MOLECULAR BIOLOGICAL METHODS FOR BACILLUS, John Wiley and/or the American Type Culture Collection (ATCC; www.atcc.org).

[00200] Qualquer um dos métodos de fermentação bem conhecidos na técnica pode ser usado para fermentar a cepa fúngica transformada ou derivada conforme descrito acima.[00200] Any of the fermentation methods well known in the art can be used to ferment the transformed or derived fungal strain as described above.

[00201] Uma fermentação em batelada clássica é um sistema fechado, em que a composição do meio é estabelecida no início da fermentação, e a composição não é alterada durante a fermentação. No início da fermentação, o meio é inoculado com o organismo (ou organismos) desejado(s). Em outras palavras, o processo de fermentação inteiro ocorre sem a adição de quaisquer componentes ao sistema de fermentação inteiro.[00201] A classic batch fermentation is a closed system, in which the composition of the medium is established at the beginning of fermentation, and the composition is not changed during fermentation. At the beginning of fermentation, the medium is inoculated with the desired organism (or organisms). In other words, the entire fermentation process occurs without adding any components to the entire fermentation system.

[00202] Alternativamente, uma fermentação em batelada se qualifica como uma "batelada" em relação à adição da fonte de carbono. Além disso, são feitas frequentemente tentativas de controlar fatores, tais como pH e concentração de oxigênio, por todo o processo de fermentação. Tipicamente, o metabólito e as composições de biomassa do sistema de batelada mudam constantemente até ao momento em que a fermentação é interrompida. Dentro das culturas de batelada, as células progridem através de uma fase de latência estática até uma fase logarítmica de crescimento elevado e finalmente até uma fase estacionária, em que a taxa de crescimento é diminuída ou retida. Deixadas não tratadas, as células na fase estacionária eventualmente morreriam. Em geral, as células na fase logarítmica são responsáveis pelo volume de produção de produto. Uma variação adequada no sistema de batelada padrão é o sistema de "fermentação em batelada alimentada". Nessa variação de um sistema de batelada típico, o substrato é adicionado em incrementos conforme a fermentação progride. Os sistemas de batelada alimentada são úteis quando se sabe que a repressão de catabólito inibiria o metabolismo das células, e/ou em que é desejável ter quantidades limitadas de substratos no meio de fermentação. A medição da concentração de substrato atual em sistemas de batelada alimentada é difícil e, portanto, estimada com base nas mudanças de fatores mensuráveis, tais como pH, oxigênio dissolvido e a pressão parcial de gases residuais, tal como CO2. As fermentações em batelada e batelada alimentada são bem conhecidas na técnica.[00202] Alternatively, a batch fermentation qualifies as a "batch" with respect to the addition of the carbon source. Additionally, attempts are often made to control factors, such as pH and oxygen concentration, throughout the fermentation process. Typically, the metabolite and biomass compositions of the batch system constantly change until the time fermentation is stopped. Within batch cultures, cells progress through a static latency phase to a logarithmic phase of high growth and finally to a stationary phase, in which the growth rate is slowed or arrested. Left untreated, cells in the stationary phase would eventually die. In general, cells in the logarithmic phase are responsible for the volume of product production. A suitable variation on the standard batch system is the "fed-batch fermentation" system. In this variation of a typical batch system, substrate is added in increments as fermentation progresses. Fed-batch systems are useful when it is known that catabolite repression would inhibit cell metabolism, and/or where it is desirable to have limited amounts of substrates in the fermentation medium. Measuring actual substrate concentration in fed-batch systems is difficult and is therefore estimated based on changes in measurable factors such as pH, dissolved oxygen, and the partial pressure of waste gases such as CO2. Batch and fed-batch fermentations are well known in the art.

[00203] Fermentação contínua é outro método conhecido de fermentação. A mesma é um sistema aberto em que um meio de fermentação definido é adicionado a um biorreator, e uma quantidade igual de meio condicionado é removida simultaneamente para o processamento. A fermentação contínua geralmente mantém as culturas em uma densidade constante, em que as células são mantidas principalmente em crescimento de fase logarítmica. A fermentação contínua permite a modulação de um ou mais fatores que afetam o crescimento celular e/ou concentração de produto. Por exemplo, um nutriente limitante, tal como a fonte de carbono ou fonte de nitrogênio, por ser mantido em uma taxa fixa, e a todos os outros parâmetros é permitida moderação. Em outros sistemas, inúmeros fatores que afetam o crescimento podem ser alterados continuamente, embora a concentração celular, medida por turvação de mídia, seja mantida constante. Os sistemas contínuos se esforçam para manter condições de crescimento de estado estável. Portanto, a perda celular devido ao meio que é extraído deve ser equilibrada em relação à taxa de crescimento celular na fermentação. Métodos de modulação de nutrientes e fatores de crescimento para processos de fermentação contínua, assim como técnicas para maximizar a taxa de formação de produto, são bem conhecidos na técnica de microbiologia industrial.[00203] Continuous fermentation is another known method of fermentation. It is an open system in which a defined fermentation medium is added to a bioreactor, and an equal amount of conditioned medium is simultaneously removed for processing. Continuous fermentation generally maintains cultures at a constant density, where cells are maintained primarily in logarithmic phase growth. Continuous fermentation allows the modulation of one or more factors that affect cell growth and/or product concentration. For example, a limiting nutrient, such as carbon source or nitrogen source, can be maintained at a fixed rate, and all other parameters are allowed moderation. In other systems, numerous factors that affect growth can be changed continuously, although cell concentration, measured by media turbidity, is kept constant. Continuous systems strive to maintain steady-state growth conditions. Therefore, cell loss due to the medium that is extracted must be balanced against the rate of cell growth in fermentation. Methods of modulating nutrients and growth factors for continuous fermentation processes, as well as techniques for maximizing the rate of product formation, are well known in the art of industrial microbiology.

[00204] As técnicas de separação e concentração são conhecidas na técnica, e métodos convencionais podem ser usados para preparar um caldo ou solução concentrada que compreende um polipeptídeo de alfa- glucosidase da invenção.[00204] Separation and concentration techniques are known in the art, and conventional methods can be used to prepare a broth or concentrated solution comprising an alpha-glucosidase polypeptide of the invention.

[00205] Após a fermentação, é obtido um caldo de fermentação e as células microbianas e vários sólidos suspensos, incluindo os materiais de fermentação brutos residuais, são removidos por técnicas de separação convencionais a fim de obter uma solução contendo enzima. Filtração, centrifugação, microfiltração, filtração em tambor giratório a vácuo, ultrafiltração, centrifugação seguida por ultrafiltração, extração ou cromatografia ou similares são geralmente usadas.[00205] After fermentation, a fermentation broth is obtained and microbial cells and various suspended solids, including residual crude fermentation materials, are removed by conventional separation techniques in order to obtain an enzyme-containing solution. Filtration, centrifugation, microfiltration, vacuum rotating drum filtration, ultrafiltration, centrifugation followed by ultrafiltration, extraction or chromatography or the like are generally used.

[00206] Pode ser, por vezes, desejável concentrar uma solução ou caldo que compreende o polipeptídeo de interesse para otimizar a recuperação. O uso de caldo ou soluções não concentradas aumentaria tipicamente o tempo de incubação a fim de coletar o precipitado de enzima enriquecido ou purificado.[00206] It may sometimes be desirable to concentrate a solution or broth comprising the polypeptide of interest to optimize recovery. The use of broth or non-concentrated solutions would typically increase the incubation time in order to collect the enriched or purified enzyme precipitate.

[00207] A solução contendo enzima pode ser concentrada com o uso de técnicas de concentração convencionais até o nível de enzima desejado ser obtido. A concentração da solução contendo enzima pode ser alcançada por qualquer uma das técnicas discutidas no presente documento. Os exemplos de métodos de enriquecimento e purificação incluem, porém sem limitação, filtragem a vácuo giratória e/ou ultrafiltração.[00207] The enzyme-containing solution can be concentrated using conventional concentration techniques until the desired enzyme level is obtained. The concentration of the enzyme-containing solution can be achieved by any of the techniques discussed herein. Examples of enrichment and purification methods include, but are not limited to, spin vacuum filtration and/or ultrafiltration.

[00208] Uma glicosídeo hidrolase conforme descrito no presente documento pode ser testada quanto à atividade com o uso de uma variedade de testes conhecidos na técnica. Por exemplo, a atividade pode ser testada combinando a enzima com glicoproteína ou oligossacarídeo e água, conforme necessário. A atividade pode ser medida por análise dos produtos de reação, que podem ser separados e visualizados, por exemplo, por cromatografia em camada delgada, ou por HPLC utilizando colunas para análise de monossacarídeos e oligossacarídeos, ensaio de enzima acoplado usando glicose oxidase-peroxidase para quantificação de glicose e reagente de ácido 3,5-dini- trosalicílico (DNS) para reduzir ensaio de açúcar redutor global (ver Exemplos em baixo).[00208] A glycoside hydrolase as described herein can be tested for activity using a variety of tests known in the art. For example, activity can be tested by combining the enzyme with glycoprotein or oligosaccharide and water as needed. Activity can be measured by analysis of the reaction products, which can be separated and visualized, for example, by thin-layer chromatography, or by HPLC using columns for analysis of monosaccharides and oligosaccharides, coupled enzyme assay using glucose oxidase-peroxidase to glucose quantification and 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) reagent to reduce overall reducing sugar assay (see Examples below).

[00209] Além disso, uma glicosídeo hidrolase, conforme descrito neste documento, encapsulada ou não, pode ser na forma de um grânulo.[00209] Furthermore, a glycoside hydrolase, as described herein, whether encapsulated or not, may be in the form of a granule.

[00210] Acredita-se que uma glicosídeo hidrolase conforme descrito no presente documento, pode ser usada em combinação com uma ou mais enzimas adicionais. Em algumas modalidades, a uma ou mais enzimas, esterases, formamidase, -galactosidases adicionais, por exemplo α ou β-galactosidases, exo-glucanases, glucano liases, endo- glucanases, glicoamilases, glicose oxidases, glucosidases, por exemplo, α ou β-glucosidases, glucuronidases, hemicelulases, hidrolases, invertases, isomerases, lacases, fenol oxidases, lipase, liases, manosidases, oxidases, oxidorredutases, pectinase, pectato liases, pectina acetil esterases, pectina despolimerases, peptidase, pectina metil esterases, enzimas pectinolíticas, peroxidases, fenoloxidases, fitase, poligalacturonases, ramno-galacturonases, ribonucleases, taumatina, transferases, proteínas de transporte, transglutaminases, xilanases, hexose oxidase (D-hexose: (3/4- oxidorreductase, EC 1.1.3.5), fosfatases ácidas e/ou outras ou combinações das mesmas. As mesmas incluem enzimas que, por exemplo, modulam a viscosidade da composição ou ração.[00210] It is believed that a glycoside hydrolase as described herein can be used in combination with one or more additional enzymes. In some embodiments, the one or more additional enzymes, esterases, formamidase, -galactosidases, e.g. α- or β-galactosidases, exo-glucanases, glucan lyases, endo-glucanases, glucoamylases, glucose oxidases, glucosidases, e.g., α or β -glucosidases, glucuronidases, hemicellulases, hydrolases, invertases, isomerases, laccases, phenol oxidases, lipase, lyases, mannosidases, oxidases, oxidoreductases, pectinase, pectate lyases, pectin acetyl esterases, pectin depolymerases, peptidase, pectin methyl esterases, pectinolytic enzymes, peroxidases , phenoloxidases, phytase, polygalacturonases, rhamno-galacturonases, ribonucleases, thaumatin, transferases, transport proteins, transglutaminases, xylanases, hexose oxidase (D-hexose: (3/4- oxidoreductase, EC 1.1.3.5), acid phosphatases and/or others or combinations thereof. They include enzymes that, for example, modulate the viscosity of the composition or feed.

[00211] Qualquer uma das enzimas GLCH aqui abordadas, de preferência, alfa-amilases, glicoamilases e alfa-glucosidases podem ser utilizadas em combinação com uma alimentação direta microbiana. As categorias de DFMs incluem Bacillus, Bactérias formadoras de Ácido Láctico e Leveduras. Os Bacillus são hastes gram-positivas exclusivas que formam esporos. Os esporos são muito estáveis e podem suportar condições ambientais como calor, umidade e uma faixa de pH. Esses esporos germinam em células vegetativas ativas quando ingeridos por um animal e podem ser usados em refeição e dietas peletizadas. As bactérias formadoras de ácido láctico são cocos gram-positivos que produzem ácido láctico que são antagonistas a patógenos. Uma vez que as bactérias formadoras de ácido láctico parecem ser de algum modo sensíveis ao calor, não podem ser usadas em dietas peletizadas. Os tipos de bactérias formadoras de ácido láctico incluem Bifidobacterium, Lactobacillus e Streptococcus. As leveduras não são bactérias. Esses microrganismos pertencem aos fungos do grupo de planta.[00211] Any of the GLCH enzymes discussed here, preferably alpha-amylases, glucoamylases and alpha-glucosidases can be used in combination with a direct microbial feed. Categories of DFMs include Bacillus, Lactic Acid-forming Bacteria, and Yeast. Bacillus are unique gram-positive rods that form spores. Spores are very stable and can withstand environmental conditions such as heat, humidity, and a range of pH. These spores germinate into active vegetative cells when ingested by an animal and can be used in meals and pelleted diets. Lactic acid-forming bacteria are gram-positive cocci that produce lactic acid that are antagonistic to pathogens. Since lactic acid-forming bacteria appear to be somewhat sensitive to heat, they cannot be used in pelleted diets. Types of lactic acid-forming bacteria include Bifidobacterium, Lactobacillus, and Streptococcus. Yeasts are not bacteria. These microorganisms belong to the plant group fungi.

[00212] Qualquer das enzimas GLCH aqui abordadas, de preferência, alfa-amilases, glicoamilases e alfa-glucosidases podem ser utilizadas em combinação com fármacos veterinários adequados para reduzir a acidose ou para reduzir organismos protozoários ruminais.[00212] Any of the GLCH enzymes discussed here, preferably alpha-amylases, glucoamylases and alpha-glucosidases, can be used in combination with suitable veterinary drugs to reduce acidosis or to reduce ruminal protozoan organisms.

[00213] Tais fármacos veterinários podem incluir ionóforos, tais como a monensina e seus derivados.[00213] Such veterinary drugs may include ionophores, such as monensin and its derivatives.

[00214] Ligantes de toxinas são concebidos para ligar as toxinas nas rações e proteger os animais dos seus efeitos prejudiciais. Por conseguinte, qualquer uma das enzimas GLCH aqui discutidas pode também ser utilizada em combinação com ligantes de toxinas ou adsorventes de toxinas. Um exemplo de um ligante de toxina é um ligante de micotoxina incluindo, mas não limitado a, diferentes aluminossilicatos de cálcio e sódio hidratado (HSCAS), bentonita, argilas, zeólito, paredes celulares de levedura e enzimas de degradação de toxinas.[00214] Toxin binders are designed to bind toxins in feed and protect animals from their harmful effects. Therefore, any of the GLCH enzymes discussed herein can also be used in combination with toxin binders or toxin adsorbents. An example of a toxin binder is a mycotoxin binder including, but not limited to, different hydrated sodium calcium aluminosilicates (HSCAS), bentonite, clays, zeolite, yeast cell walls, and toxin-degrading enzymes.

[00215] Em outro aspecto, qualquer das enzimas GLCH aqui discutidas pode também ser utilizada em combinação com ervas, óleos essenciais, e agentes antiaglomerantes.[00215] In another aspect, any of the GLCH enzymes discussed here can also be used in combination with herbs, essential oils, and anti-caking agents.

[00216] Um óleo essencial é um líquido hidrofóbico concentrado contendo compostos de aroma voláteis de plantas. Os óleos essenciais são também conhecidos como óleos voláteis, óleos etéreos, aetheroleum ou simplesmente como o óleo da planta da qual foram extraídos, tais como óleo de cravo-da-índia. Um óleo é "essencial", no sentido de que contém a "essência" da fragrância da planta - a fragrância característica da planta a partir da qual é obtido. O termo essencial aqui usado não significa indispensável como acontece com os termos aminoácidos essenciais ou ácidos graxos essenciais, que são assim chamados pois são nutricionalmente exigidos por um determinado organismo vivo. Os óleos essenciais são geralmente extraídos por destilação, frequentemente por meio de vapor. Outros processos incluem expressão, extração de solvente, extração de óleo absoluto, resinagem e prensagem a frio. São usados em perfumes, cosméticos, sabonetes e outros produtos, na aromatização de alimentos e bebidas, e para a adição de aromas a incenso e produtos de limpeza doméstica.[00216] An essential oil is a concentrated hydrophobic liquid containing volatile aroma compounds from plants. Essential oils are also known as volatile oils, ethereal oils, aetheroleum or simply as the oil of the plant from which they are extracted, such as clove oil. An oil is "essential" in the sense that it contains the "essence" of the plant's fragrance - the characteristic fragrance of the plant from which it is obtained. The term essential used here does not mean indispensable as with the terms essential amino acids or essential fatty acids, which are so called because they are nutritionally required by a given living organism. Essential oils are generally extracted by distillation, often using steam. Other processes include expression, solvent extraction, absolute oil extraction, resining and cold pressing. They are used in perfumes, cosmetics, soaps and other products, to flavor foods and drinks, and to add aromas to incense and household cleaning products.

[00217] Alimentações animais podem incluir material vegetal, tal como milho, trigo, sorgo, feijão soja, canola, girassol ou misturas de qualquer um desses materiais vegetais ou fontes de proteína vegetais para ruminantes. É contemplado que os parâmetros de desempenho animal, tais como crescimento, ingesta de ração e eficácia de ração, mas também uniformidade aprimorada, concentração de amônia reduzida no alojamento de animais e, consequentemente, bem-estar e situação de saúde dos animais aprimorados, serão melhorados. Mais especificamente, conforme usado no presente documento, "desempenho animal" pode ser determinado pela eficiência de ração e/ou ganho de peso do animal e/ou pela razão de conversão de ração e/ou pela digestibilidade de um nutriente em uma ração (por exemplo, digestibilidade de aminoácido) e/ou energia digerível ou energia metabolizável em uma ração e/ou por retenção de nitrogênio e/ou pela capacidade de um animal para evitar os efeitos negativos de enterite necrótica e/ou por resposta imunológica do sujeito.[00217] Animal feeds may include plant material, such as corn, wheat, sorghum, soybeans, canola, sunflower or mixtures of any of these plant materials or vegetable protein sources for ruminants. It is contemplated that animal performance parameters such as growth, feed intake and feed effectiveness, but also improved uniformity, reduced ammonia concentration in animal housing and consequently improved animal welfare and health status, will be improved. More specifically, as used herein, "animal performance" may be determined by the feed efficiency and/or weight gain of the animal and/or the feed conversion ratio and/or the digestibility of a nutrient in a feed (e.g. example, amino acid digestibility) and/or digestible energy or metabolizable energy in a feed and/or by nitrogen retention and/or by the ability of an animal to avoid the negative effects of necrotic enteritis and/or by the subject's immunological response.

[00218] Os termos "ração animal", "ração", "composição de ração" e "forragem" são usados intercambiavelmente e podem compreender um ou mais materiais alimentícios selecionados dentre o grupo que compreende a) cereais, como pequenos grãos (por exemplo, trigo, cevada, centeio, aveias e combinações dos mesmos) e/ou grãos grandes como maís ou sorgo; b) subprodutos de cereais, como farinha de milho com glúten, Grãos Secos de Destilaria com Solúveis (DDGS) (particularmente Grãos Secos de Destilaria com Solúveis à base de milho (cDDGS), farelo de trigo, sêmea de trigo, farelo fino de trigo, farelo de arroz, cascas de arroz, cascas de aveia, semente de palma e polpa de cítricos; c) proteína obtida a partir de fontes como soja, girassol, amendoim, tremoço, ervilhas, fava, algodão, canola, farinha de peixe, proteína de plasma seca, farinha de carne e ossos, proteína da batata, soro, copra, gergelim; d) óleos e gorduras obtidos a partir de fontes vegetais e animais; e/ou e) minerais e vitaminas.[00218] The terms "animal feed", "feed", "feed composition" and "forage" are used interchangeably and may comprise one or more food materials selected from the group comprising a) cereals, such as small grains (e.g. , wheat, barley, rye, oats and combinations thereof) and/or large grains such as maize or sorghum; b) cereal by-products such as corn flour with gluten, Distillers' Dried Grains with Solubles (DDGS) (particularly corn-based Distillers' Dried Grains with Solubles (cDDGS), wheat bran, wheat bran, fine wheat bran , rice bran, rice husks, oat husks, palm seeds and citrus pulp; c) protein obtained from sources such as soybeans, sunflower, peanuts, lupins, peas, broad beans, cotton, canola, fish meal, dry plasma protein, meat and bone meal, potato protein, whey, copra, sesame; d) oils and fats obtained from vegetable and animal sources; and/or e) minerals and vitamins.

[00219] Quando usada como, ou na preparação de, uma ração, tal como ração funcional, a enzima ou composição de aditivo de ração da presente invenção pode ser usada em conjunção com um ou mais dentre: um transportador nutricionalmente aceitável, um diluente nutricionalmente aceitável, um excipiente nutricionalmente aceitável, um adjuvante nutricionalmente aceitável, um ingrediente nutricionalmente ativo. Por exemplo, poderia ser mencionado pelo menos um componente selecionado dentre o grupo que consiste em uma proteína, um peptídeo, sacarose, lactose, sorbitol, glicerol, propileno glicol, cloreto de sódio, sulfato de sódio, acetato de sódio, citrato de sódio, formiato de sódio, sorbato de sódio, cloreto de potássio, sulfato de potássio, acetato de potássio, citrato de potássio, formiato de potássio, acetato de potássio, sorbato de potássio, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, acetato de magnésio, citrato de magnésio, formiato de magnésio, sorbato de magnésio, metabissulfito de sódio, metil parabeno e propil parabeno.[00219] When used as, or in the preparation of, a feed, such as functional feed, the enzyme or feed additive composition of the present invention can be used in conjunction with one or more of: a nutritionally acceptable carrier, a nutritionally acceptable diluent acceptable, a nutritionally acceptable excipient, a nutritionally acceptable adjuvant, a nutritionally active ingredient. For example, there could be mentioned at least one component selected from the group consisting of a protein, a peptide, sucrose, lactose, sorbitol, glycerol, propylene glycol, sodium chloride, sodium sulfate, sodium acetate, sodium citrate, sodium formate, sodium sorbate, potassium chloride, potassium sulfate, potassium acetate, potassium citrate, potassium formate, potassium acetate, potassium sorbate, magnesium chloride, magnesium sulfate, magnesium acetate, magnesium citrate magnesium, magnesium formate, magnesium sorbate, sodium metabisulfite, methyl paraben and propyl paraben.

[00220] Em uma modalidade preferencial, a enzima ou composição de aditivo de ração da presente invenção é misturada com um componente de ração para formar uma composição de ração. O termo "componente de ração" como usado aqui significa toda ou parte da composição de ração. Parte da composição de ração pode significar um constituinte da composição de ração ou mais do que um constituinte da composição de ração, por exemplo, 2 ou 3 ou 4. Em uma modalidade, o termo "componente de ração" abrange uma pré-mistura ou constituintes de pré-mistura. Preferencialmente, a ração pode ser uma forragem, ou uma pré-mistura da mesma, uma ração de composto, ou uma pré-mistura da mesma.[00220] In a preferred embodiment, the enzyme or feed additive composition of the present invention is mixed with a feed component to form a feed composition. The term "feed component" as used herein means all or part of the feed composition. Part of the feed composition may mean one constituent of the feed composition or more than one constituent of the feed composition, for example, 2 or 3 or 4. In one embodiment, the term "feed component" encompasses a premix or premix constituents. Preferably, the feed may be a forage, or a premix thereof, a compost feed, or a premix thereof.

[00221] A composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção pode ser misturada com uma ração de composto, um componente de ração de composto ou com uma pré-mistura de uma ração de composto ou com uma forragem, um componente de forragem ou uma pré-mistura de uma forragem.[00221] The feed additive composition according to the present invention can be mixed with a compost feed, a compost feed component or with a premix of a compost feed or with a forage, a forage component or a premix of a forage.

[00222] Qualquer composição de ração descrita no presente documento pode compreender um ou mais materiais de ração selecionados dentre o grupo que compreende a) cereais, como pequenos grãos (por exemplo, trigo, cevada, centeio, aveias, triticale e combinações dos mesmos) e/ou grãos grandes como maís ou sorgo; b) subprodutos de cereais, tais como farinha de milho com glúten, torta úmida (particularmente, torta úmida à base de milho), Grãos Secos de Destilaria (DDG) (particularmente, Grãos Secos de Destilaria à base de milho (cDDG)), Grãos Secos de Destilaria com Solúveis (DDGS) (particularmente, Grãos Secos de Destilaria com Solúveis à base de milho (cDDGS)), farelo de trigo, sêmea de trigo, farelo fino de trigo, farelo de arroz, cascas de arroz, cascas de aveia, semente de palma e polpa de cítricos; c) proteína obtida a partir de fontes como soja, girassol, amendoim, tremoço, ervilhas, fava, algodão, canola, farinha de peixe, proteína de plasma seca, farinha de carne e ossos, proteína da batata, soro, copra, gergelim; d) óleos e gorduras obtidos a partir de fontes vegetais e animais; e) minerais e vitaminas.[00222] Any feed composition described herein may comprise one or more feed materials selected from the group comprising a) cereals, such as small grains (e.g., wheat, barley, rye, oats, triticale and combinations thereof) and/or large grains such as maize or sorghum; b) cereal by-products, such as corn flour with gluten, wet cake (particularly corn-based wet cake), Dried Distillers Grains (DDG) (particularly corn-based Distillers Dried Grains (cDDG)), Distillers' Dried Grains with Solubles (DDGS) (particularly, corn-based Distillers' Dried Grains with Solubles (cDDGS)), wheat bran, wheat bran, fine wheat bran, rice bran, rice husks, oats, palm kernels and citrus pulp; c) protein obtained from sources such as soybeans, sunflower, peanuts, lupins, peas, broad beans, cotton, canola, fish meal, dry plasma protein, meat and bone meal, potato protein, whey, copra, sesame; d) oils and fats obtained from vegetable and animal sources; e) minerals and vitamins.

[00223] O termo "forragem" conforme usado no presente documento significa qualquer alimento que seja proporcionado a um animal (ao invés de o animal ter de forragear por si próprio). A forragem engloba plantas que foram cortadas. Ademais, forragem inclui silagem, alimentações comprimidas e peletizadas, óleos e rações mistas e também grãos germinados e legumes.[00223] The term "forage" as used herein means any food that is provided to an animal (rather than the animal having to forage for itself). Forage includes plants that have been cut down. Furthermore, forage includes silage, compressed and pelleted feeds, oils and mixed feeds, and also sprouted grains and legumes.

[00224] A forragem pode ser obtida a partir de uma ou mais das plantas selecionadas dentre: milho (maís) alfafa (luzerna), cevada, cornichão, brássicas, couve-de-folha, couve, colza (canola), rutabaga (couve-nabo), nabo, trevo, trevo híbrido, trevo vermelho, trevo subterrâneo, trevo branco, festuca, bromus, painço, aveia, sorgo, sojas, árvores (brotos de árvores em talhadia de cabeça para feno), trigo e legumes.[00224] Forage can be obtained from one or more of the plants selected from: corn (maize), alfalfa (lucerne), barley, cornichão, brassicas, kale, cabbage, rapeseed (canola), rutabaga (kale -turnip), turnip, clover, hybrid clover, red clover, underground clover, white clover, fescue, bromus, millet, oats, sorghum, soybeans, trees (tree shoots in coppice head for hay), wheat and legumes.

[00225] O termo "ração de composto" significa uma ração comercial na forma de uma farinha, um pélete, nozes, bolo ou um farelo. As rações de composto podem ser mescladas a partir de várias matérias-primas e aditivos. Estas combinações são formuladas de acordo com os requisitos específicos do animal alvo.[00225] The term "compost feed" means a commercial feed in the form of a flour, a pellet, nuts, cake or a bran. Compost feeds can be mixed from various raw materials and additives. These combinations are formulated according to the specific requirements of the target animal.

[00226] As rações de composto podem ser rações completas que proporcionam todos os nutrientes diários requeridos, concentrados que proporcionam uma parte da ração (proteína, energia) ou suplementos que proporcionam somente micronutrientes adicionais, tais como minerais e vitaminas.[00226] Compost rations can be complete rations that provide all required daily nutrients, concentrates that provide a part of the ration (protein, energy) or supplements that provide only additional micronutrients, such as minerals and vitamins.

[00227] Os principais ingredientes usados em ração de composto são os grãos de ração que incluem milho, trigo, farinha de canola, farinha de colza, tremoço, feijão soja, sorgo, aveia e cevada.[00227] The main ingredients used in compost feed are feed grains which include corn, wheat, canola meal, rapeseed meal, lupins, soybeans, sorghum, oats and barley.

[00228] Adequadamente, uma pré-mistura denominada aqui pode ser uma composição composta por microingredientes, tais como vitaminas, minerais, conservantes químicos, antibióticos, produtos de fermentação e outros ingredientes essenciais. As pré-misturas são normalmente composições adequadas para combinação em rações comerciais.[00228] Suitably, a premix referred to herein may be a composition composed of microingredients, such as vitamins, minerals, chemical preservatives, antibiotics, fermentation products and other essential ingredients. Premixes are typically compositions suitable for combination in commercial feeds.

[00229] Em uma modalidade, a composição de ração compreende ou consiste em milho, DDGS (tais como cDDGS), trigo, farelo de trigo ou qualquer combinação dos mesmos.[00229] In one embodiment, the feed composition comprises or consists of corn, DDGS (such as cDDGS), wheat, wheat bran or any combination thereof.

[00230] Em uma modalidade, o componente de ração pode ser milho, DDGS (por exemplo, cDDGS), trigo, farelo de trigo ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, a composição de ração compreende ou consiste em milho, DDGS (tais como cDDGS) ou uma combinação dos mesmos.[00230] In one embodiment, the feed component may be corn, DDGS (e.g., cDDGS), wheat, wheat bran, or a combination thereof. In one embodiment, the feed composition comprises or consists of corn, DDGS (such as cDDGS) or a combination thereof.

[00231] Uma composição de ração descrito no presente documento pode conter pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% ou pelo menos 60% em peso de farinha de milho e soja ou milho e soja com gordura total ou farinha de trigo ou farinha de girassol.[00231] A feed composition described herein may contain at least 30%, at least 40%, at least 50% or at least 60% by weight of corn and soybean meal or corn and soybean meal with full fat or corn meal. wheat or sunflower flour.

[00232] Por exemplo, uma composição de ração pode conter entre cerca de 5 a cerca de 40% de DDGS de milho. Para aves, a composição de ração pode conter, em média, entre cerca de 7 a 15% de DDGS de milho. Para suínos (porcos), a composição de ração pode conter, em média, 5 a 40% de DDGS de milho. A mesma pode conter milho como um único grão, em tal caso, a composição de ração pode compreender entre cerca de 35% a cerca de 80% de milho.[00232] For example, a feed composition may contain between about 5 to about 40% corn DDGS. For poultry, the feed composition can contain, on average, between about 7 to 15% corn DDGS. For swine (pigs), the feed composition may contain, on average, 5 to 40% corn DDGS. It may contain corn as a single grain, in which case the feed composition may comprise from about 35% to about 80% corn.

[00233] Nas composições de ração que compreendem grãos misturados, por exemplo, que compreendem milho e trigo, por exemplo, a composição de ração pode compreender pelo menos 10% de milho.[00233] In feed compositions comprising mixed grains, for example, comprising corn and wheat, for example, the feed composition may comprise at least 10% corn.

[00234] Adicional ou alternativamente, uma composição de ração pode também compreender pelo menos um material de ração rico em fibras e/ou pelo menos um subproduto do pelo menos um material de ração rico em fibras para proporcionar uma composição de ração rico em fibras. Os exemplos de materiais de ração ricos em fibras incluem: trigo, cevada, centeio, aveia, subprodutos de cereais, tais como farinha de milho com glúten, ração de milho com glúten, torta úmida, Grãos Secos de Destilaria (DDG), Grãos Secos de Destilaria com Solúveis (DDGS), farelo de trigo, sêmea de trigo, farelo fino de trigo, farelo de arroz, cascas de arroz, cascas de aveia, semente de palma e polpa de cítricos. Algumas fontes de proteínas podem ser também consideradas como ricas em fibras: proteína obtida a partir de fontes, tais como girassol, tremoço, feijões de fava e algodão. Em um aspecto, a composição de ração conforme descrita no presente documento compreende pelo menos um material rico em fibras e/ou pelo menos um subproduto do pelo menos um material de ração rico em fibras selecionado dentre o grupo que consiste em Grãos Secos de Destilaria com Solúveis (DDGS), particularmente, cDDGS, torta úmida, Grãos Secos de Destilaria (DDG), particularmente, cDDG, farelo de trigo e trigo, por exemplo. Em uma modalidade, a composição de ração da presente invenção compreende pelo menos um material rico em fibras e/ou pelo menos um subproduto do pelo menos um material de ração rico em fibras selecionado dentre o grupo que consiste em Grãos Secos de Destilaria com Solúveis (DDGS), particularmente, cDDGS, farelo de trigo e trigo, por exemplo.[00234] Additionally or alternatively, a feed composition may also comprise at least one fiber-rich feed material and/or at least one by-product of the at least one fiber-rich feed material to provide a fiber-rich feed composition. Examples of fiber-rich feed materials include: wheat, barley, rye, oats, cereal by-products such as gluten corn meal, gluten corn feed, wet cake, Distillers Dried Grains (DDG), Dried Grains Distillery with Solubles (DDGS), wheat bran, wheat bran, fine wheat bran, rice bran, rice husks, oat husks, palm kernels and citrus pulp. Some protein sources can also be considered to be rich in fiber: protein obtained from sources such as sunflower, lupine, fava beans and cotton. In one aspect, the feed composition as described herein comprises at least one fiber-rich material and/or at least one by-product of the at least one fiber-rich feed material selected from the group consisting of Distillers' Dried Grains with Solubles (DDGS), particularly, cDDGS, wet cake, Distillers' Dried Grains (DDG), particularly, cDDG, wheat bran and wheat, for example. In one embodiment, the feed composition of the present invention comprises at least one fiber-rich material and/or at least one by-product of the at least one fiber-rich feed material selected from the group consisting of Distillers' Dried Grains with Solubles ( DDGS), particularly, cDDGS, wheat bran and wheat, for example.

[00235] A ração pode ser um ou mais dos seguintes: uma ração de composto e pré-mistura, incluindo péletes, nozes ou bolo (de gado); uma cultura ou resíduo de cultura: milho, soja, sorgo, aveia, cevada, copra, palha, joio, desperdício de beterraba-sacarina; farinha de peixe; farinha de carne e ossos; melaços; bolo de óleo e bolo de bagaço; oligossacarídeos; plantas de forragem conservadas; silagem; alga marinha; sementes e grãos, inteiros ou preparados por esmagamento, moagem, etc.; grãos germinados e legumes; extrato de levedura.[00235] The feed may be one or more of the following: a compound and premix feed, including pellets, nuts or cake (from livestock); a crop or crop residue: corn, soybeans, sorghum, oats, barley, copra, straw, chaff, sugar beet waste; Fish's flour; meat and bone meal; molasses; oil cake and pomace cake; oligosaccharides; preserved forage plants; silage; seaweed; seeds and grains, whole or prepared by crushing, grinding, etc.; sprouted grains and legumes; Yeast extract.

[00236] O termo "ração" conforme usado no presente documento engloba, em algumas modalidades, alimento para animais de estimação. Um alimento para animais de estimação é material vegetal ou animal destinado ao consumo por animais de estimação, tal como alimento para cães ou alimento para gatos. O alimento para animais de estimação, como alimento para cães e gatos, pode estar em uma forma seca, como croquete para cães, ou forma enlatada úmida. O alimento para gatos pode conter o aminoácido taurina.[00236] The term "food" as used herein encompasses, in some embodiments, food for pets. A pet food is plant or animal material intended for consumption by pets, such as dog food or cat food. Pet food, such as dog and cat food, can be in a dry form, such as dog kibble, or moist canned form. Cat food may contain the amino acid taurine.

[00237] A ração animal pode também incluir um alimento para peixes. Um alimento para peixes contém normalmente macronutrientes, elementos vestigiais e vitaminas necessários para manter o peixe cativo em boa saúde. O alimento para peixes pode estar na forma de um floco, pélete ou comprimido. As formas peletizadas, algumas das quais se afundam rapidamente, são frequentemente usadas para peixe maior ou espécies que se alimentam do fundo. Alguns alimentos para peixes contêm aditivos, tais como betacaroteno ou hormônios sexuais, para intensificar artificialmente a cor de peixe ornamental.[00237] The animal feed may also include a fish feed. A fish food typically contains macronutrients, trace elements and vitamins necessary to keep captive fish in good health. Fish food can be in the form of a flake, pellet or tablet. Pelleted forms, some of which sink quickly, are often used for larger fish or bottom-feeding species. Some fish foods contain additives, such as beta-carotene or sex hormones, to artificially enhance the color of ornamental fish.

[00238] Em ainda outro aspecto, a ração animal engloba alimento para pássaros. O alimento para pássaros inclui alimento que é usado tanto em alimentadores de pássaros como para alimentar pássaros de estimação. Tipicamente, o alimento para pássaros compreende uma variedade de sementes, mas pode também englobar sebo (gordura de bovino ou carneiro).[00238] In yet another aspect, animal feed includes food for birds. Bird food includes food that is used both in bird feeders and for feeding pet birds. Typically, bird food comprises a variety of seeds, but may also include tallow (beef or lamb fat).

[00239] Conforme usado neste documento, o termo "contatado" se refere à aplicação direta ou indireta de uma glicosídeo hidrolases como descrito no presente documento[00239] As used herein, the term "contacted" refers to the direct or indirect application of a glycoside hydrolases as described herein.

[00240] (ou composição contendo uma glicosídeo hidrolase) a um produto (por exemplo, a ração). Exemplos dos métodos de aplicação que podem ser usados incluem, porém sem limitação, tratamento do produto em um material compreendendo a composição de aditivo de ração, aplicação direta por mistura da composição de aditivo de ração com o produto, pulverização da composição de aditivo de ração na superfície do produto ou imersão do produto em uma preparação da composição de aditivo de ração. Em uma modalidade, a composição de aditivo de ração da presente invenção é preferencialmente misturada com o produto (por exemplo, composição de ração). Alternativamente, a composição de aditivo de ração pode ser incluída na emulsão ou ingredientes em bruto de uma composição de ração. Isso permite que a composição confira um benefício de desempenho.[00240] (or composition containing a glycoside hydrolase) to a product (for example, feed). Examples of application methods that may be used include, but are not limited to, treating the product in a material comprising the feed additive composition, direct application by mixing the feed additive composition with the product, spraying the feed additive composition on the surface of the product or immersing the product in a feed additive composition preparation. In one embodiment, the feed additive composition of the present invention is preferably mixed with the product (e.g., feed composition). Alternatively, the feed additive composition may be included in the emulsion or raw ingredients of a feed composition. This allows composition to confer a performance benefit.

[00241] O termo termicamente estável significa que pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% ou 98% da enzima que estava presente/ativa no aditivo antes de aquecer até à temperatura especificada ainda está presente/ativa depois de resfriar à temperatura ambiente. Preferencialmente, pelo menos cerca de 80% da enzima que está presente e ativa no aditivo antes do aquecimento até à temperatura especificada está ainda presente e ativa após resfriar até à temperatura ambiente.[00241] The term thermally stable means that at least about 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% or 98 % of the enzyme that was present/active in the additive before heating to the specified temperature is still present/active after cooling to room temperature. Preferably, at least about 80% of the enzyme that is present and active in the additive before heating to the specified temperature is still present and active after cooling to room temperature.

[00242] Também é possível que as glicosídeo hidrolases (ou uma composição enzimática que compreende tais glicosídeo hidrolases como descritas no presente documento) aqui descritas possam ser homogeneizadas para produzir um pó.[00242] It is also possible that the glycoside hydrolases (or an enzyme composition comprising such glycoside hydrolases as described herein) described herein can be homogenized to produce a powder.

[00243] Em uma modalidade preferencial alternativa, uma glicosídeo hidrolase conforme descrito no presente documento (ou uma composição de enzimas compreendendo uma glicosídeo hidrolase conforme descrito no presente documento), pode ser formulada em grânulos conforme descrito no documento WO2007/044968 (denominados grânulos TPT) ou WO1997/016076 ou WO1992/012645 incorporado ao presente documento a título de referência. "TPT" significa Tecnologia de Proteção Térmica.[00243] In an alternative preferred embodiment, a glycoside hydrolase as described herein (or an enzyme composition comprising a glycoside hydrolase as described herein), can be formulated into granules as described in document WO2007/044968 (called TPT granules ) or WO1997/016076 or WO1992/012645 incorporated herein by reference. "TPT" stands for Thermal Protection Technology.

[00244] Em outro aspecto, quando a composição de aditivo de ração é formulada em grânulos, os grânulos compreendem um sal de barreira hidratado revestido sobre o núcleo de proteína. A vantagem de tal revestimento de sal é termotolerância melhorada, estabilidade no armazenamento melhorada e proteção contra outros aditivos de ração tendo de outro modo efeito adverso na enzima. Preferencialmente, o sal usado para o revestimento de sal tem uma atividade de água maior do que 0,25 ou umidade constante maior do que 60% a 20 °C. Em algumas modalidades, o revestimento de sal compreende Na2SO4.[00244] In another aspect, when the feed additive composition is formulated into granules, the granules comprise a hydrated barrier salt coated on the protein core. The advantage of such a salt coating is improved thermotolerance, improved storage stability and protection against other feed additives otherwise having an adverse effect on the enzyme. Preferably, the salt used for salt coating has a water activity greater than 0.25 or constant humidity greater than 60% at 20 ° C. In some embodiments, the salt coating comprises Na2SO4.

[00245] Um método para preparar uma glicosídeo hidrolase conforme descrito no presente documento (ou uma composição de enzimas compreendendo uma glicosídeo hidrolase conforme descrito no presente documento) pode também compreender a etapa adicional de peletizar o pó. O pó pode ser misturado com outros componentes conhecidos na técnica. O pó, ou mistura compreendendo o pó, pode ser forçado através de uma matriz, e as fitas resultantes são cortadas em péletes adequados de comprimento variável.[00245] A method for preparing a glycoside hydrolase as described herein (or an enzyme composition comprising a glycoside hydrolase as described herein) may also comprise the additional step of pelletizing the powder. The powder may be mixed with other components known in the art. The powder, or mixture comprising the powder, may be forced through a die, and the resulting ribbons are cut into suitable pellets of varying length.

[00246] Opcionalmente, a etapa de peletização pode incluir um tratamento com vapor, ou estágio de condicionamento, antes da formação dos péletes. A mistura que compreende o pó pode ser colocada em um condicionador, por exemplo, um misturador com injeção de vapor. A mistura é aquecida no condicionador até uma temperatura especificada, tal como de 60 a 100 °C, temperaturas típicas seriam 70 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C ou 95 °C. O tempo de permanência pode ser variável de segundos a minutos e até mesmo horas. Tal como 5 segundos, 10 segundos, 15 segundos, 30 segundos, 1 minutos, 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos e 1 hora. Será entendido que uma glicosídeo hidrolase conforme descrito no presente documento (ou uma composição enzimática compreendendo uma glicosídeo hidrolase conforme descrito no presente documento) é adequada para adição a qualquer material de ração apropriado.[00246] Optionally, the pelletizing step may include a steam treatment, or conditioning stage, before forming the pellets. The mixture comprising the powder can be placed in a conditioner, for example, a steam injection mixer. The mixture is heated in the conditioner to a specified temperature, such as 60 to 100 °C, typical temperatures would be 70 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C or 95 °C. The residence time can vary from seconds to minutes and even hours. Such as 5 seconds, 10 seconds, 15 seconds, 30 seconds, 1 minute, 2 minutes, 5 minutes, 10 minutes, 15 minutes, 30 minutes and 1 hour. It will be understood that a glycoside hydrolase as described herein (or an enzyme composition comprising a glycoside hydrolase as described herein) is suitable for addition to any appropriate feed material.

[00247] Será entendido pela pessoa versada que diferentes animais requerem diferentes composições de ração, e até o mesmo animal pode requerer diferentes composições de ração, dependendo do propósito para o qual o animal é criado.[00247] It will be understood by the skilled person that different animals require different feed compositions, and even the same animal may require different feed compositions, depending on the purpose for which the animal is raised.

[00248] Opcionalmente, a composição de ração pode também conter minerais adicionais, como, por exemplo, cálcio e/ou vitaminas adicionais. Em algumas modalidades, a composição de ração é uma mistura de farinha de feijão soja e milho.[00248] Optionally, the feed composition may also contain additional minerals, such as, for example, calcium and/or additional vitamins. In some embodiments, the feed composition is a mixture of soybean flour and corn.

[00249] A composição de ração é tipicamente produzida em moinhos de ração nos quais as matérias-primas são em primeiro lugar trituradas até um tamanho de partículas adequado e depois misturadas com aditivos apropriados. A composição de ração pode ser depois produzida como um mingau ou péletes; em que os últimos envolvem tipicamente um método pelo qual a temperatura é aumentada até um nível alvo, e depois a ração é passada através de uma matriz para produzir péletes de um tamanho particular. Os péletes são deixados para resfriar. Subsequentemente podem ser adicionados aditivos líquidos como gordura e enzima. A produção de composição de ração pode também envolver uma etapa adicional que inclui extrusão ou expansão antes da peletização - em particular por técnicas adequadas que podem incluir pelo menos o uso de vapor.[00249] The feed composition is typically produced in feed mills in which the raw materials are first crushed to a suitable particle size and then mixed with appropriate additives. The feed composition can then be produced as a gruel or pellets; wherein the latter typically involve a method by which the temperature is increased to a target level, and then the feed is passed through a die to produce pellets of a particular size. The pellets are left to cool. Subsequently liquid additives such as fat and enzyme can be added. The production of feed composition may also involve an additional step including extrusion or expansion prior to pelletization - in particular by suitable techniques which may include at least the use of steam.

[00250] A composição de ração pode ser uma composição de ração para um animal monogástrico, tais como aves (por exemplo, frango de corte, poedeira, b reprodutores de frangos de corte, peru, pato, ganso, galinha d'água) e suínos (todas as categorias de idade), um ruminante, tal como gado (por exemplo, vacas ou touros (incluindo bezerros)), cavalos, ovelha, um animal de estimação (por exemplo, cães, gatos) ou peixes (por exemplo, peixe agástrico, peixe gástrico, peixe de água doce, tais como salmão, bacalhau, truta e carpa, por exemplo, carpa koi, peixe marinho, tal como badejo, e crustáceos, tais como camarões, mexilhões e vieiras). Preferencialmente, a composição de ração é para porcos.[00250] The feed composition may be a feed composition for a monogastric animal, such as poultry (e.g., broiler, layer, broiler breeders, turkey, duck, goose, moorhen) and pigs (all age categories), a ruminant such as cattle (e.g. cows or bulls (including calves)), horses, sheep, a pet (e.g. dogs, cats) or fish (e.g. agastric fish, gastric fish, freshwater fish such as salmon, cod, trout and carp, e.g. koi carp, marine fish such as whiting, and crustaceans such as prawns, mussels and scallops). Preferably, the feed composition is for pigs.

[00251] A composição de aditivo de ração e/ou a composição de ração que compreende a mesma podem ser usados em qualquer forma adequada. A composição de aditivo de ração pode ser usada na forma de preparações sólidas ou líquidas ou suas alternativas. Exemplos de preparações sólidas incluem pós, pastas, bolo alimentar, cápsulas, péletes, comprimidos, poeiras e grânulos que podem ser molháveis, secos por pulverização ou liofilizados. Exemplos de preparações líquidas incluem, porém sem limitação, soluções, suspensões e emulsões aquosas, orgânicas ou aquosas-orgânicas.[00251] The feed additive composition and/or the feed composition comprising it can be used in any suitable form. The feed additive composition can be used in the form of solid or liquid preparations or alternatives thereof. Examples of solid preparations include powders, pastes, bolus, capsules, pellets, tablets, dusts and granules which may be wettable, spray-dried or freeze-dried. Examples of liquid preparations include, but are not limited to, aqueous, organic or aqueous-organic solutions, suspensions and emulsions.

[00252] Em algumas aplicações, as composições de aditivo de ração podem ser misturadas com a ração ou administradas na água potável.[00252] In some applications, feed additive compositions can be mixed with feed or administered in drinking water.

[00253] Uma composição de aditivo de ração que compreende misturar por adição uma glicosídeo hidrolase conforme ensinado no presente documento com um carreador, diluente ou excipiente e (opcionalmente) embalagem aceitável de ração.[00253] A feed additive composition comprising additively mixing a glycoside hydrolase as taught herein with a carrier, diluent or excipient and (optionally) acceptable feed packaging.

[00254] A composição de ração e/ou a composição de aditivo de ração podem ser combinados com pelo menos um mineral e/ou pelo menos uma vitamina. As composições assim derivadas podem ser referidas no presente documento como uma pré-mistura. A composição de ração pode compreender pelo menos 0,0001% em peso do aditivo de ração. Adequadamente, a composição de ração pode compreender pelo menos 0,0005%; pelo menos 0,0010%; pelo menos 0,0020%; pelo menos 0,0025%; pelo menos 0,0050%; pelo menos 0,0100%; pelo menos 0,020%; pelo menos 0,100%; pelo menos 0,200%; pelo menos 0,250%; pelo menos 0,500% em peso do aditivo de ração.[00254] The feed composition and/or the feed additive composition can be combined with at least one mineral and/or at least one vitamin. The compositions thus derived may be referred to herein as a premix. The feed composition may comprise at least 0.0001% by weight of the feed additive. Suitably, the feed composition may comprise at least 0.0005%; at least 0.0010%; at least 0.0020%; at least 0.0025%; at least 0.0050%; at least 0.0100%; at least 0.020%; at least 0.100%; at least 0.200%; at least 0.250%; at least 0.500% by weight of the feed additive.

[00255] Preferencialmente, um alimento ou composição de aditivo de ração pode compreender adicionalmente pelo menos um carreador fisiologicamente aceitável. O carreador fisiologicamente aceitável é, de preferência, selecionado dentre pelo menos um dentre maltodextrina, calcário (carbonato de cálcio), ciclodextrina, trigo ou um componente de trigo, sacarose, amido, Na2SO4, Talco, PVA e misturas dos mesmos. Em uma modalidade adicional, o alimento ou aditivo de ração pode compreender adicionalmente um quelador de íon de metal. O quelador de íon de metal pode ser selecionado dentre EDTA ou ácido cítrico.[00255] Preferably, a food or feed additive composition may additionally comprise at least one physiologically acceptable carrier. The physiologically acceptable carrier is preferably selected from at least one of maltodextrin, limestone (calcium carbonate), cyclodextrin, wheat or a wheat component, sucrose, starch, Na2SO4, Talc, PVA and mixtures thereof. In a further embodiment, the food or feed additive may further comprise a metal ion chelator. The metal ion chelator can be selected from EDTA or citric acid.

[00256] Em algumas modalidades, o alimento ou composição de aditivo de ração compreende uma glicosídeo hidrolase conforme descrito no presente documento, a um nível de pelo menos 0,0001 g/kg, 0,001 g/kg, pelo menos 0,01 g/kg, pelo menos 0,1 g/kg, pelo menos 1 g/kg, pelo menos 5 g/kg, pelo menos 7,5 g/kg, pelo menos 10,0 g/kg, pelo menos 15,0 g/kg, pelo menos 20,0 g/kg, pelo menos 25,0 g/kg. Em algumas modalidades, o alimento ou aditivo de ração é compreendido a um tal nível que, quando adicionado a um material de ração ou alimento, o material de ração compreenda uma glicosídeo hidrolase conforme descrito no presente documento em uma faixa de 1 a 500 mg/kg, 1 a 100 mg/kg, 2 a 50 mg/kg ou 2 a 10 mg/kg. Em algumas modalidades da presente invenção, o material de ração ou alimento compreende pelo menos 100, 1.000, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 10.000, 20.000, 30.000, 50.000, 100.000, 500.000, 1.000.000 ou 2.000.000 Unidades de glicosídeo hidrolase por quilograma de material de alimentação ou ração.[00256] In some embodiments, the food or feed additive composition comprises a glycoside hydrolase as described herein, at a level of at least 0.0001 g/kg, 0.001 g/kg, at least 0.01 g/kg kg, at least 0.1 g/kg, at least 1 g/kg, at least 5 g/kg, at least 7.5 g/kg, at least 10.0 g/kg, at least 15.0 g/kg kg, at least 20.0 g/kg, at least 25.0 g/kg. In some embodiments, the feed or feed additive is comprised to such a level that, when added to a feed or feed material, the feed material comprises a glycoside hydrolase as described herein in a range of 1 to 500 mg/min. kg, 1 to 100 mg/kg, 2 to 50 mg/kg or 2 to 10 mg/kg. In some embodiments of the present invention, the feed or food material comprises at least 100, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 20,000, 30,000, 50,000, 100,000, 500,000, 1,000,000 or 2.0 00,000 Glycoside Units hydrolase per kilogram of feed material or feed.

[00257] As faixas podem incluir, porém sem limitação, qualquer combinação das faixas inferior e superior discutidas acima.[00257] The ranges may include, but are not limited to, any combination of the lower and upper ranges discussed above.

[00258] Formulações que compreendem qualquer das glicosídeo hidrolases aqui descritas e composições descritas no presente documento podem ser produzidas de qualquer modo para assegurar que a formulação compreende enzimas ativas. Tais formulações podem ser como um líquido, um pó seco ou um grânulo. Preferencialmente, a composição de aditivo de ração está em uma forma sólida adequada para adição a um pélete de ração.[00258] Formulations comprising any of the glycoside hydrolases described herein and compositions described herein can be produced in any way to ensure that the formulation comprises active enzymes. Such formulations may be as a liquid, a dry powder or a granule. Preferably, the feed additive composition is in a solid form suitable for addition to a feed pellet.

[00259] Pó seco ou grânulos podem ser preparados por meios conhecidos por aqueles versados na técnica, tais como granulação de alto cisalhamento, granulação em tambor, extrusão, esferonização, aglomeração em leito fluidizado, secagem por pulverização em leito fluidizado.[00259] Dry powder or granules can be prepared by means known to those skilled in the art, such as high shear granulation, drum granulation, extrusion, spheronization, fluidized bed agglomeration, fluidized bed spray drying.

[00260] Glicosídeo hidrolases e composições descritas no presente documento podem ser revestidas, por exemplo, encapsuladas. Em uma modalidade, o revestimento protege as enzimas do calor e pode ser considerado um termoprotetor. Em uma modalidade, o revestimento protege a enzima de baixo pH. Eudragit® é um exemplo de um material de revestimento que pode ser usado.[00260] Glycoside hydrolases and compositions described herein can be coated, for example, encapsulated. In one embodiment, the coating protects the enzymes from heat and can be considered a thermoprotectant. In one embodiment, the coating protects the enzyme from low pH. Eudragit® is an example of a coating material that can be used.

[00261] A composição de aditivo de ração descrita no presente documento pode ser formulada a um pó seco ou grânulos conforme descrito no documento WO2007/044968 (denominados grânulos TPT) ou WO1997/016076 ou WO1992/012645 (cada um dos quais é incorporado ao presente documento a título de referência).[00261] The feed additive composition described herein can be formulated into a dry powder or granules as described in WO2007/044968 (so-called TPT granules) or WO1997/016076 or WO1992/012645 (each of which is incorporated into the this document for reference purposes).

[00262] Em uma modalidade, a ração animal pode ser formulada em um grânulo para composições de ração que compreendem: um núcleo; um agente ativo; e pelo menos um revestimento, sendo que o agente ativo do grânulo retém pelo menos 50% de atividade, pelo menos 60% de atividade, pelo menos 70% de atividade, pelo menos 80% de atividade após as condições selecionadas a partir de um ou mais dentre a) um processo de peletização de ração, b) um processo de pré-tratamento de ração aquecida a vapor, c) armazenamento, d) armazenamento como um ingrediente em uma mistura não peletizada e e) armazenamento como um ingrediente em uma mistura de base de ração ou uma pré-mistura de ração que compreende pelo menos um composto selecionado dentre minerais vestigiais, ácidos orgânicos, açúcares redutores, vitaminas, cloreto de colina e compostos que resultam em uma pré-mistura de ração ou mistura de base de ração ácida ou básica.[00262] In one embodiment, animal feed can be formulated into a granule for feed compositions comprising: a core; an active agent; and at least one coating, wherein the active agent of the granule retains at least 50% activity, at least 60% activity, at least 70% activity, at least 80% activity after conditions selected from one or more of a) a feed pelletizing process, b) a steam-heated feed pretreatment process, c) storage, d) storage as an ingredient in a non-pelletized mixture, and e) storage as an ingredient in a feed mixture. feed base or a feed premix comprising at least one compound selected from trace minerals, organic acids, reducing sugars, vitamins, choline chloride and compounds that result in an acidic feed premix or feed base mix or basic.

[00263] Em relação ao grânulo, pelo menos um revestimento pode compreender um material de hidratação por umidificação que constitui pelo menos 55% em p/p do grânulo; e/ou pelo menos um revestimento pode compreender dois revestimentos. Os dois revestimentos podem ser um revestimento de hidratação por umidificação e um revestimento de barreira de umidificação. Em algumas modalidades, o revestimento de hidratação por umidificação pode ser entre 25% e 60% em p/p do grânulo, e o revestimento de barreira de umidificação pode ser entre 2% e 15% em p/p do grânulo. O revestimento de hidratação por umidificação pode ser selecionado dentre sais inorgânicos, sacarose, amido e maltodextrina, e o revestimento de barreira de umidificação pode ser selecionado dentre polímeros, gomas, soro de leite e amido.[00263] In relation to the granule, at least one coating may comprise a wetting hydration material that constitutes at least 55% w/w of the granule; and/or at least one coating may comprise two coatings. The two coatings can be a humidification hydration coating and a humidification barrier coating. In some embodiments, the wetting hydration coating can be between 25% and 60% w/w of the granule, and the wetting barrier coating can be between 2% and 15% w/w of the granule. The wetting hydration coating can be selected from inorganic salts, sucrose, starch and maltodextrin, and the wetting barrier coating can be selected from polymers, gums, whey and starch.

[00264] O grânulo pode ser produzido com o uso de um processo de peletização de ração, e o processo de pré-tratamento de ração pode ser conduzido entre 70 °C e 95 °C por até diversos minutos, tal como entre 85 °C e 95 °C.[00264] The granule can be produced using a feed pelletizing process, and the feed pretreatment process can be conducted between 70 °C and 95 °C for up to several minutes, such as between 85 °C and 95°C.

[00265] A composição de aditivo de ração pode ser formulada em um grânulo para ração animal que compreende: um núcleo; um agente ativo, sendo que o agente ativo do grânulo retém pelo menos 80% de atividade após o armazenamento e após um processo de peletização aquecido por vapor em que o grânulo é um ingrediente; um revestimento de barreira de umidificação; e um revestimento de hidratação por umidificação que é pelo menos 25% em p/p do grânulo, sendo que o grânulo tem uma atividade de água menor do que 0,5 antes do processo de peletização aquecido por vapor.[00265] The feed additive composition can be formulated into an animal feed granule comprising: a core; an active agent, wherein the active agent in the granule retains at least 80% activity after storage and after a steam-heated pelletizing process in which the granule is an ingredient; a humidification barrier coating; and a wet hydration coating that is at least 25% w/w of the granule, with the granule having a water activity of less than 0.5 prior to the steam-heated pelletizing process.

[00266] O grânulo pode ter um revestimento de barreira de umidificação selecionado dentre polímeros e gomas, e o material de hidratação por umidificação pode ser um sal inorgânico. O revestimento de hidratação por umidificação pode ser entre 25% e 45% em p/p do grânulo, e o revestimento de barreira de umidificação pode ser entre 2% e 10% em p/p do grânulo.[00266] The granule may have a humidification barrier coating selected from polymers and gums, and the humidification hydration material may be an inorganic salt. The wet hydration coating can be between 25% and 45% w/w of the granule, and the wet barrier coating can be between 2% and 10% w/w of the granule.

[00267] Um grânulo pode ser produzido com o uso de um processo de peletização aquecido por vapor que pode ser conduzido entre 85 °C e 95 °C por até diversos minutos.[00267] A granule can be produced using a steam-heated pelletizing process that can be conducted between 85 °C and 95 °C for up to several minutes.

[00268] Alternativamente, a composição está em uma formulação líquida adequada para consumo, de preferência, tal consumo de líquido contém um ou mais dos seguintes: um tampão, sal, sorbitol e/ou glicerol.[00268] Alternatively, the composition is in a liquid formulation suitable for consumption, preferably such liquid consumption contains one or more of the following: a buffer, salt, sorbitol and/or glycerol.

[00269] Também, a composição de aditivo de ração pode ser formulada aplicando-se, por exemplo, aspergindo-se, a enzima (ou enzimas) em um substrato carreador, tal como trigo triturado, por exemplo.[00269] Also, the feed additive composition can be formulated by applying, for example, sprinkling, the enzyme (or enzymes) on a carrier substrate, such as crushed wheat, for example.

[00270] Em uma modalidade, a composição de aditivo de ração pode ser formulada como uma pré-mistura. A título de exemplo apenas, a pré- mistura pode compreender um ou mais componentes de ração, como um ou mais minerais e/ou uma ou mais vitaminas.[00270] In one embodiment, the feed additive composition can be formulated as a premix. By way of example only, the premix may comprise one or more feed components, such as one or more minerals and/or one or more vitamins.

[00271] Em algumas modalidades, uma glicosídeo hidrolase estará em um carreador fisiologicamente aceitável. Os carreadores adequados podem ser grandes macromoléculas lentamente metabolizadas, tais como proteínas, polipeptídeos, lipossomas, polissacarídeos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido e partículas virais inativas. Sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser usados, por exemplo, sais de ácidos minerais, tais como cloridratos, bromidratos, fosfatos e sulfatos, ou sais de ácidos orgânicos, tais como acetatos, propionatos, malonatos e benzoatos. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis em composições terapêuticas podem conter, adicionalmente, líquidos, tais como água, solução salina, glicerol e etanol. Adicionalmente, substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes ou emulsificantes ou substâncias de tamponamento de pH, podem estar presentes em tais composições. Tais carreadores permitem que as composições farmacêuticas sejam formuladas como tabletes, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas fluidas e suspensões para ingestão pelo paciente. Uma vez formuladas, as composições da invenção podem ser administradas diretamente ao ruminante.[00271] In some embodiments, a glycoside hydrolase will be in a physiologically acceptable carrier. Suitable carriers may be large, slowly metabolized macromolecules, such as proteins, polypeptides, liposomes, polysaccharides, polylactic acids, polyglycolic acids, polymeric amino acids, amino acid copolymers, and inactive viral particles. Pharmaceutically acceptable salts may be used, for example, salts of mineral acids, such as hydrochlorides, hydrobromides, phosphates and sulfates, or salts of organic acids, such as acetates, propionates, malonates and benzoates. Pharmaceutically acceptable carriers in therapeutic compositions may additionally contain liquids, such as water, saline, glycerol and ethanol. Additionally, auxiliary substances, such as wetting or emulsifying agents or pH buffering substances, may be present in such compositions. Such carriers allow pharmaceutical compositions to be formulated as tablets, pills, tablets, capsules, liquids, gels, syrups, fluid pastes and suspensions for ingestion by the patient. Once formulated, the compositions of the invention can be administered directly to the ruminant.

[00272] Os exemplos não limitativos das composições e métodos revelados no presente documento incluem: 1. Método para melhorar a digestibilidade de amido e o rendimento de glicose em um ruminante que compreende adicionar pelo menos uma alfa-1,4/1,6-glicosídeo hidrolase (GLCH) como um aditivo de ração alimentar para ruminantes, em que a referida hidrolase: (a) tem pelo menos 20% de atividade a um pH inferior ou igual a 3 na presença de pepsina em comparação com a atividade da hidrolase a pH 6 na presença de pepsina, (b) a referida hidrolase é ativa em pelo menos duas de três câmaras digestivas de um ruminante compreendendo um rúmen, um abomaso e um intestino delgado e (c) a hidrolase funciona com enzimas digestivas presentes nas câmaras digestivas do ruminante para aumentar a digestibilidade de amido e o rendimento de glicose. 2. Hidrolase de acordo com a modalidade 1, em que a pelo menos uma enzima GLCH é capaz de hidrolisar amido em bruto sob condições comparáveis às encontradas no rúmen ou abomaso. 3. Hidrolase de acordo com a modalidade 1, em que a referida hidrolase é selecionada a partir do grupo consistindo em alfa- amilases, glicoamilases e alfa-glucosidases. 4. Hidrolase de acordo com a modalidade 2, em que a referida hidrolase é selecionada a partir do grupo consistindo em alfa- amilases e glicoamilases. 5. Hidrolase de acordo com a modalidade 3 ou 4, em que as alfa-amilases são membros da família GH 13 ou são selecionadas a partir do grupo consistindo em alfa-amilase (EC 3.2.1.1); pululanase (EC 3.2.1.41); ciclomaltodextrina glucanotransferase (EC 2.4.1.19); ciclomaltodextrinase (EC 3.2.1.54); trealose-6-fosfato hidrolase (EC3.2.1.93); oligo-alfa-glucosidase (EC 3.2.1.10); amilase maltogênica (EC 3.2.1.133); neopululanase (EC 3.2.1.135); alfa-glucosidase (EC 3.2.1.20); alfa-amilase formando maltotetrose (EC3.2.1.60); isoamilase (EC 3.2.1.68); glucodextranase (EC 3.2.1.70); alfa-amilase formando malto-hexose (EC 3.2.1.98); alfa-amilase formando maltotriose (EC 3.2.1.116); enzima de ramificação (EC 2.4.1.18); trealose sintase (EC 5.4.99.16); 4-alfa-glucanotransferase (EC 2.4.1.25); alfa-amilase formando maltopentose (EC 3.2.1.-); amilosucrase (EC 2.4.1.4); sacarose fosforilase (EC 2.4.1.7); malto-oligosiltrealose trealo-hidrolase (EC 3.2.1.141); isomaltulose sintase (EC 5.4.99.11); malto- oligosiltrealose sintase (EC 5.4.99.15); amilo-alfa-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.33); e alfa-1,4-glucano: fosfato alfa-maltosiltransferase (EC 2.4.99.16). 6. Hidrolase de acordo com a modalidade 3 ou 4, em que as glucosidases são membros da família GH 13 ou GH31 ou são selecionadas a partir do grupo consistindo em alfa-glucosidase (EC 3.2.1.20); alfa-galactosidase (EC 3.2.1.22); alfa-manosidase (EC 3.2.1.24); alfa-1,3-glucosidase (EC 3.2.1.84); sacarase-isomaltase (EC 3.2.1.48) (EC 3.2.1.10); alfa-xilosidase (EC 3.2.1.177); alfa-glucano liase (EC 4.2.2.13); isomaltosiltransferase (EC 2.4.1.-); oligossacarídeo alfa-1,4-glucosiltransferase (EC 2.4.1.161); sulfoquinovosidase (EC 3.2.1.-). 7. Hidrolase de acordo com a modalidade 3 ou 4, em que as glicoamilases são membros da família GH15 ou são selecionadas a partir do grupo consistindo em glicoamilase (EC 3.2.1.3); glucodextranase. (EC 3.2.1.70); alfa-trealase (EC 3.2.1.28); e dextrano dextrinase (EC 2.4.1.2). 8. Método para aumentar a digestibilidade de amido, aumentar o rendimento de glicose, aumentar a digestão de matéria seca e aumentar a produção de gás durante a fermentação em um ruminante, compreendendo adicionar à ração uma composição enzimática compreendendo (i), pelo menos, uma enzima GLCH como aditivo de ração para ruminantes, em que a referida enzima: (a) tem pelo menos 20% de atividade a um pH inferior ou igual a 3 na presença de pepsina em comparação com a atividade das enzimas a pH 6 na presença de pepsina, (b) a referida enzima é ativa em pelo menos duas de três câmaras digestivas de um ruminante compreendendo um rúmen, um abomaso e um intestino delgado e (c) a enzima funciona com amilase pancreática para aumentar o rendimento de glicose e (ii) pelo menos uma protease. 9. Composição enzimática de acordo com a modalidade 8, em que a pelo menos uma enzima GLCH é capaz de hidrolisar amido em bruto. 10. Composição enzimática de acordo com a modalidade 8, em que a referida enzima GLCH é selecionada a partir do grupo consistindo em alfa-amilases, glicoamilases e alfa-glucosidases. 11. Composição enzimática de acordo com a modalidade 9, em que a referida enzima é selecionada a partir do grupo consistindo em alfa-amilases e glicoamilases. 12. Composição enzimática de acordo com a modalidade 10 ou 11, em que a pelo menos uma enzima GLCH é selecionada a partir do grupo consistindo em alfa-amilase (EC 3.2.1.1); pululanase (EC 3.2.1.41); ciclomaltodextrina glucanotransferase (EC 2.4.1.19); ciclomaltodextrinase (EC 3.2.1.54); trealose-6-fosfato hidrolase (EC3.2.1.93); oligo-alfa-glucosidase (EC 3.2.1.10); amilase maltogênica (EC 3.2.1.133); neopululanase (EC 3.2.1.135); alfa-glucosidase (EC 3.2.1.20); alfa-amilase formando maltotetrose (EC3.2.1.60); isoamilase (EC 3.2.1.68); glucodextranase (EC 3.2.1.70); alfa-amilase formando malto-hexose (EC 3.2.1.98); alfa-amilase formando maltotriose (EC 3.2.1.116); enzima de ramificação (EC 2.4.1.18); trealose sintase (EC 5.4.99.16); 4-alfa-glucanotransferase (EC 2.4.1.25); alfa-amilase formando maltopentose (EC 3.2.1.-); amilosucrase (EC 2.4.1.4); sacarose fosforilase (EC 2.4.1.7); malto-oligosiltrealose trealo-hidrolase (EC 3.2.1.141); isomaltulose sintase (EC 5.4.99.11); malto- oligosiltrealose sintase (EC 5.4.99.15); amilo-alfa-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.33); e alfa-1,4-glucano: fosfato alfa-maltosiltransferase (EC 2.4.99.16). 13. Composição enzimática de acordo com a reivindicação 10 ou 11, em que as glucosidases são selecionadas a partir do grupo consistindo em alfa-glucosidase (EC 3.2.1.20); alfa-galactosidase (EC 3.2.1.22); alfa-manosidase (EC 3.2.1.24); alfa-1,3-glucosidase (EC 3.2.1.84); sacarase-isomaltase (EC 3.2.1.48) (EC 3.2.1.10); alfa- xilosidase (EC 3.2.1.177); alfa-glucano liase (EC 4.2.2.13); isomaltosiltransferase (EC 2.4.1.-); oligossacarídeo alfa-1,4- glucosiltransferase (EC 2.4.1.161); sulfoquinovosidase (EC 3.2.1.-). 14. Composição enzimática de acordo com a modalidade 10 ou 11, em que as glicoamilases são selecionadas a partir da família das glicosil hidrolases GH15. 15. Composição enzimática de acordo com a modalidade 8, em que a protease é selecionada a partir do grupo consistindo em uma protease ácida ou uma metaloprotease neutra. 16. Composição enzimática de acordo com a modalidade 15, em que a protease é uma protease aspártica fúngica ou uma metaloprotease neutra bacteriana. EXEMPLOS[00272] Non-limiting examples of the compositions and methods disclosed herein include: 1. Method for improving starch digestibility and glucose yield in a ruminant comprising adding at least one alpha-1,4/1,6- glycoside hydrolase (GLCH) as a feed additive for ruminants, wherein said hydrolase: (a) has at least 20% activity at a pH of less than or equal to 3 in the presence of pepsin compared to the activity of hydrolase a pH 6 in the presence of pepsin, (b) said hydrolase is active in at least two of three digestive chambers of a ruminant comprising a rumen, an abomasum and a small intestine and (c) the hydrolase functions with digestive enzymes present in the digestive chambers from the ruminant to increase starch digestibility and glucose yield. 2. Hydrolase according to embodiment 1, wherein the at least one GLCH enzyme is capable of hydrolyzing crude starch under conditions comparable to those found in the rumen or abomasum. 3. Hydrolase according to embodiment 1, wherein said hydrolase is selected from the group consisting of alpha-amylases, glucoamylases and alpha-glucosidases. 4. Hydrolase according to embodiment 2, wherein said hydrolase is selected from the group consisting of alpha-amylases and glucoamylases. 5. Hydrolase according to embodiment 3 or 4, wherein the alpha-amylases are members of the GH family 13 or are selected from the group consisting of alpha-amylase (EC 3.2.1.1); pullulanase (EC 3.2.1.41); cyclomaltodextrin glucanotransferase (EC 2.4.1.19); cyclomaltodextrinase (EC 3.2.1.54); trehalose-6-phosphate hydrolase (EC3.2.1.93); oligo-alpha-glucosidase (EC 3.2.1.10); maltogenic amylase (EC 3.2.1.133); neopululanase (EC 3.2.1.135); alpha-glucosidase (EC 3.2.1.20); alpha-amylase forming maltotetrose (EC3.2.1.60); isoamylase (EC 3.2.1.68); glucodextranase (EC 3.2.1.70); alpha-amylase forming maltohexose (EC 3.2.1.98); alpha-amylase forming maltotriose (EC 3.2.1.116); branching enzyme (EC 2.4.1.18); trehalose synthase (EC 5.4.99.16); 4-alpha-glucanotransferase (EC 2.4.1.25); alpha-amylase forming maltopentose (EC 3.2.1.-); amylosucrase (EC 2.4.1.4); sucrose phosphorylase (EC 2.4.1.7); malto-oligosyltrehalose trehalohydrolase (EC 3.2.1.141); isomaltulose synthase (EC 5.4.99.11); malto-oligosyltrehalose synthase (EC 5.4.99.15); amylo-alpha-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.33); and alpha-1,4-glucan:alpha-maltosyltransferase phosphate (EC 2.4.99.16). 6. Hydrolase according to embodiment 3 or 4, wherein the glucosidases are members of the GH 13 or GH31 family or are selected from the group consisting of alpha-glucosidase (EC 3.2.1.20); alpha-galactosidase (EC 3.2.1.22); alpha-mannosidase (EC 3.2.1.24); alpha-1,3-glucosidase (EC 3.2.1.84); sucrase-isomaltase (EC 3.2.1.48) (EC 3.2.1.10); alpha-xylosidase (EC 3.2.1.177); alpha-glucan lyase (EC 4.2.2.13); isomaltosyltransferase (EC 2.4.1.-); oligosaccharide alpha-1,4-glucosyltransferase (EC 2.4.1.161); sulfoquinovosidase (EC 3.2.1.-). 7. Hydrolase according to embodiment 3 or 4, wherein the glucoamylases are members of the GH15 family or are selected from the group consisting of glucoamylase (EC 3.2.1.3); glucodextranase. (EC 3.2.1.70); alpha-trehalase (EC 3.2.1.28); and dextran dextrinase (EC 2.4.1.2). 8. Method for increasing starch digestibility, increasing glucose yield, increasing dry matter digestion and increasing gas production during fermentation in a ruminant, comprising adding to the feed an enzyme composition comprising (i), at least, a GLCH enzyme as a feed additive for ruminants, wherein said enzyme: (a) has at least 20% activity at a pH of less than or equal to 3 in the presence of pepsin compared to the activity of enzymes at pH 6 in the presence of pepsin, (b) said enzyme is active in at least two of three digestive chambers of a ruminant comprising a rumen, an abomasum and a small intestine and (c) the enzyme functions with pancreatic amylase to increase the yield of glucose and ( ii) at least one protease. 9. Enzymatic composition according to embodiment 8, wherein the at least one GLCH enzyme is capable of hydrolyzing crude starch. 10. Enzyme composition according to embodiment 8, wherein said GLCH enzyme is selected from the group consisting of alpha-amylases, glucoamylases and alpha-glucosidases. 11. Enzyme composition according to embodiment 9, wherein said enzyme is selected from the group consisting of alpha-amylases and glucoamylases. 12. Enzyme composition according to embodiment 10 or 11, in which the at least one GLCH enzyme is selected from the group consisting of alpha-amylase (EC 3.2.1.1); pullulanase (EC 3.2.1.41); cyclomaltodextrin glucanotransferase (EC 2.4.1.19); cyclomaltodextrinase (EC 3.2.1.54); trehalose-6-phosphate hydrolase (EC3.2.1.93); oligo-alpha-glucosidase (EC 3.2.1.10); maltogenic amylase (EC 3.2.1.133); neopululanase (EC 3.2.1.135); alpha-glucosidase (EC 3.2.1.20); alpha-amylase forming maltotetrose (EC3.2.1.60); isoamylase (EC 3.2.1.68); glucodextranase (EC 3.2.1.70); alpha-amylase forming maltohexose (EC 3.2.1.98); alpha-amylase forming maltotriose (EC 3.2.1.116); branching enzyme (EC 2.4.1.18); trehalose synthase (EC 5.4.99.16); 4-alpha-glucanotransferase (EC 2.4.1.25); alpha-amylase forming maltopentose (EC 3.2.1.-); amylosucrase (EC 2.4.1.4); sucrose phosphorylase (EC 2.4.1.7); malto-oligosyltrehalose trehalohydrolase (EC 3.2.1.141); isomaltulose synthase (EC 5.4.99.11); malto-oligosyltrehalose synthase (EC 5.4.99.15); amylo-alpha-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.33); and alpha-1,4-glucan:alpha-maltosyltransferase phosphate (EC 2.4.99.16). 13. Enzyme composition according to claim 10 or 11, wherein the glucosidases are selected from the group consisting of alpha-glucosidase (EC 3.2.1.20); alpha-galactosidase (EC 3.2.1.22); alpha-mannosidase (EC 3.2.1.24); alpha-1,3-glucosidase (EC 3.2.1.84); sucrase-isomaltase (EC 3.2.1.48) (EC 3.2.1.10); alpha-xylosidase (EC 3.2.1.177); alpha-glucan lyase (EC 4.2.2.13); isomaltosyltransferase (EC 2.4.1.-); oligosaccharide alpha-1,4-glucosyltransferase (EC 2.4.1.161); sulfoquinovosidase (EC 3.2.1.-). 14. Enzyme composition according to modality 10 or 11, in which glucoamylases are selected from the GH15 family of glycosyl hydrolases. 15. Enzyme composition according to embodiment 8, wherein the protease is selected from the group consisting of an acidic protease or a neutral metalloprotease. 16. Enzyme composition according to embodiment 15, wherein the protease is a fungal aspartic protease or a bacterial neutral metalloprotease. EXAMPLES

[00273] A menos que definido de outro modo no presente documento, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado conforme comumente entendido por uma pessoa com habilidade comum na técnica à qual a presente divulgação pertence. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2a Edição, John Wiley e Sons, Nova Iorque (1994), e Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.I. (1991) proporcionam a uma pessoa versada na técnica um dicionário geral de muitos dos termos usados nesta descrição.[00273] Unless otherwise defined herein, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by a person of ordinary skill in the art to which the present disclosure belongs. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2nd Edition, John Wiley and Sons, New York (1994), and Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.I. (1991) provide a person skilled in the art with a general dictionary of many of the terms used in this description.

[00274] A descrição é adicionalmente definida nos Exemplos a seguir. Deve-se compreender que os Exemplos, embora indicando certas modalidades, são dados a título de ilustração apenas. A partir da discussão acima e dos Exemplos, uma pessoa versada na técnica pode determinar características essenciais desta descrição e, sem se afastar do espírito e do escopo da mesma, pode fazer várias mudanças e modificações para adaptar a mesma para vários usos e condições.[00274] The description is further defined in the following Examples. It should be understood that the Examples, although indicating certain embodiments, are given by way of illustration only. From the above discussion and the Examples, a person skilled in the art can determine essential features of this disclosure and, without departing from the spirit and scope thereof, can make various changes and modifications to adapt the same for various uses and conditions.

EXEMPLO 1EXAMPLE 1 Materiais utilizados nos exemplos subsequentesMaterials used in subsequent examples

[00275] As amostras de proteína listadas na Tabela 1 foram usadas em exemplos subsequentes. A Tabela 1 mostra o tipo de enzima, organismo de fonte (quando conhecido) e fonte interna ou comercial das amostras e referências de patentes para sequências.Tabela 1. Lista de componentes de enzimas avaliados. [00275] The protein samples listed in Table 1 were used in subsequent examples. Table 1 shows the enzyme type, source organism (when known), and internal or commercial source of the samples and patent references for sequences. Table 1. List of enzyme components evaluated.

EXEMPLO 2EXAMPLE 2 Hidrólise de farinha de milho por amilase AkAA na presença da pepsina porcina de protease aspártica e Trichoderma reesei AFPHydrolysis of corn flour by AkAA amylase in the presence of the aspartic protease porcine pepsin and Trichoderma reesei AFP

[00276] A mistura de reação continha 1 mL de pasta fluida de farinha de milho (20% p/p, pH 3,2), AkAA (209 mg/mL) 20 μL, pepsina porcina (Sigma, P7000, 10000 U/mL em água) 50 μL, AFP de Trichoderma reesei (5 mg/mL) 5 μL e 50 μL e água para um volume final de 1,07 mL. A reação foi realizada a 40 °C durante 5 h com agitação a 200 rpm. No final da reação, 30 μL de sobrenadante de reação foram misturados com 0,23 mL de água e filtrados através de um filtro de membrana de 0,22 μm. O filtrado (40 μL) foi submetido a análise por HPLC em uma coluna HPLC Aminex HPX-87N (Bio-Rad) coim um caudal de 0,6 mL/min, a 78 °C, durante 15 minutos, utilizando água como eluente. Picos de glicose e maltose foram detetados com um detector de RI em linha (índice refratário), e as áreas dos picos foram integradas usando software Chromeleon (Dionex) de acordo com as instruções do fabricante.[00276] The reaction mixture contained 1 mL of corn flour slurry (20% w/w, pH 3.2), AkAA (209 mg/mL) 20 μL, porcine pepsin (Sigma, P7000, 10000 U/ mL in water) 50 μL, Trichoderma reesei AFP (5 mg/mL) 5 μL and 50 μL and water to a final volume of 1.07 mL. The reaction was carried out at 40 °C for 5 h with stirring at 200 rpm. At the end of the reaction, 30 μL of reaction supernatant was mixed with 0.23 mL of water and filtered through a 0.22 μm membrane filter. The filtrate (40 μL) was subjected to HPLC analysis on an Aminex HPX-87N HPLC column (Bio-Rad) with a flow rate of 0.6 mL/min, at 78 °C, for 15 minutes, using water as eluent. Glucose and maltose peaks were detected with an in-line RI (refractory index) detector, and peak areas were integrated using Chromeleon software (Dionex) according to the manufacturer's instructions.

[00277] A atividade de enzimas de ração para ruminantes não deve ser afetada pela pepsina se é suposto serem funcionais no abomaso e intestino delgado.[00277] The activity of ruminant feed enzymes should not be affected by pepsin if they are supposed to be functional in the abomasum and small intestine.

[00278] A Figura 1 mostra que nem a pepsina nem a AFP afetaram negativamente a liberação de glicose (G1) e maltose (G2) da farinha de milho a pH3.2. pH 3,2 é um dos valores de pH que podem ocorrer no abomaso, especialmente após a ingestão de alimento (Constable et al., 2005. Effect of suckling cow's milk or milk replacer on abomasal luminal pH in dairy calves, J. Vet. Intern. Med. 19:97-102). Na verdade, a adição de pepsina e AFP à mistura de reação contendo AkAA aumentou a liberação de G1 em 4 e 22%, respectivamente. A pepsina, por si só, causou pouca ou nenhuma liberação de G1 e G2 a partir da farinha de milho, enquanto AFP, por si só, provocou alguma liberação de G1, mas não de G2. AFP adicionada à mistura de reação contendo AkAA não só aumentou a liberação de G1, como também aumentou a quantidade de G1 em relação a G2, indicando que AFP favoreceu mais a liberação de glicose, um monômero (G1). É G1 que pode ser absorvido pelos animais diretamente na corrente sanguínea.[00278] Figure 1 shows that neither pepsin nor AFP negatively affected the release of glucose (G1) and maltose (G2) from corn flour at pH3.2. pH 3.2 is one of the pH values that can occur in the abomasum, especially after food ingestion (Constable et al., 2005. Effect of suckling cow's milk or milk replacer on abomasal luminal pH in dairy calves, J. Vet. Intern. Med. 19:97-102). In fact, the addition of pepsin and AFP to the AkAA-containing reaction mixture increased G1 release by 4 and 22%, respectively. Pepsin alone caused little or no release of G1 and G2 from cornmeal, while AFP alone caused some release of G1 but not G2. AFP added to the reaction mixture containing AkAA not only increased the release of G1, but also increased the amount of G1 in relation to G2, indicating that AFP favored the release of glucose, a monomer (G1). It is G1 that can be absorbed by animals directly into the bloodstream.

[00279] Nas condições comparáveis às encontrados no estômago ruminal e abomaso, acredita-se que as duas proteases aspárticas podem ter tornado os grânulos de amido de milho mais acessível a AkAA ao hidrolisar proteínas que rodeiam os grânulos e proteínas encontradas no interior dos grânulos (Mu-Forster et al., 1996. Physical association of starch biosynthetic enzymes with starch granules of maize endosperm granule-associated forms of starch synthase I and starch branching enzyme II, Plant Physiol. 111: 821-829; Mu-Forster et al., 1998. Surface localization of zein storage proteins in starch granules from maize endosperm, proteolytic removal by thermolysin and in vitro cross-linking of granule-associated polypeptides. Plant Physiol. 116: 1563-1571). A pepsina é a principal enzima proteolítica produzida no estômago e abomaso. Ela digere proteínas através da clivagem de ligações peptídicas interiores com um pH ideal de 2 a 4. A AFP é endopeptidase extracelular de T. reesei com gama de pH ideal de 3 a 4,5 (Tabela 1).[00279] Under conditions comparable to those found in the ruminal stomach and abomasum, it is believed that the two aspartic proteases may have made the corn starch granules more accessible to AkAA by hydrolyzing proteins surrounding the granules and proteins found within the granules ( Mu-Forster et al., 1996. Physical association of starch biosynthetic enzymes with starch granules of maize endosperm granule-associated forms of starch synthase I and starch branching enzyme II, Plant Physiol 111: 821-829; , 1998. Surface localization of zein storage proteins in starch granules from maize endosperm, proteolytic removal by thermolysin and in vitro cross-linking of granule-associated polypeptides. Plant Physiol 116: 1563-1571). Pepsin is the main proteolytic enzyme produced in the stomach and abomasum. It digests proteins through the cleavage of interior peptide bonds with an ideal pH range of 2 to 4. AFP is extracellular endopeptidase from T. reesei with an ideal pH range of 3 to 4.5 (Table 1).

[00280] O milho utilizado no Exemplo 2 e outros Exemplos, a menos que especificado de outra forma, consistiu de 88,2% de matéria seca (MS), 9,3% de proteína bruta (PB), 2,0% de fibra em detergente ácido (FDA), 6,6% de fibra em detergente neutro tratada com amilase (FDNa), 78,5% de carboidratos não fibrosos (CNF), 89,0% de nutrientes digestíveis totais (NDT).[00280] The corn used in Example 2 and other Examples, unless otherwise specified, consisted of 88.2% dry matter (DM), 9.3% crude protein (CP), 2.0% acid detergent fiber (ADF), 6.6% neutral detergent fiber treated with amylase (FDNa), 78.5% non-fibrous carbohydrates (CNF), 89.0% total digestible nutrients (TDN).

EXEMPLO 3EXAMPLE 3 Estabilidade da amilase AkAA na presença de fluido ruminalStability of AkAA amylase in the presence of rumen fluid

[00281] Para que um aditivo de enzima de ração animal seja eficaz em ruminantes, é importante que a enzima tenha estabilidade considerável no fluido ruminal e sob condições ruminais. Os dados da Tabela 2 mostram que AkAA é estável na presença de fluido ruminal isento de células incubado a 40 °C durante 4,5 h, com a liberação de glicose e maltose a não ser significativamente afetada por quantidades crescentes de fluido ruminal.[00281] For an animal feed enzyme additive to be effective in ruminants, it is important that the enzyme has considerable stability in the rumen fluid and under rumen conditions. The data in Table 2 show that AkAA is stable in the presence of cell-free rumen fluid incubated at 40 °C for 4.5 h, with the release of glucose and maltose not being significantly affected by increasing amounts of rumen fluid.

[00282] A AkAA usada tinha uma concentração de proteína total de 209 mg/mL, grânulos de amido de arroz (Sigma S7260) foram preparados em água até obter pasta fluida a 8% (p/p) com pH ajustado para 3,2. O pH tornou-se pH 5,3 após misturar com a mistura de pré- incubação. O fluido ruminal tinha um pH de 6,1 coletado de vacas leiteiras alimentadas com uma ração de grama (41,66%), cevada integral (14,79%), milho (16,78%), polpa de beterraba seca e bolo de resíduo de beterraba (3,02%), cevada moída (6,66%), farinha de sementes de colza (4,88%), farinha de soja (4,46%), Komix (mistura de vitaminas e minerais, 0,2%), cápsulas R0d Suplex (mistura de vitaminas a 0,05%), Suplex E-5000 (vitamina E e selênio, 0,03%), giz (0,07%), sal (0,06%) e água (7,33%). O fluido ruminal foi oferecido pelo Departamento de Ciência Animal, Universidade de Aarhus (Blichers Alle 20, DK-8830 Tjele, Dinamarca). O açúcar liberado pela reação foi analisado em HPLC com coluna de HPLC Aminex HPX-87N da Bio-Rad como Exemplo 2.Tabela 2. Estabilidade da AkAA no fluido ruminal em 40 °C por 4,5 horas. [00282] The AkAA used had a total protein concentration of 209 mg/mL, rice starch granules (Sigma S7260) were prepared in water until 8% (w/w) slurry was obtained with pH adjusted to 3.2 . The pH became pH 5.3 after mixing with the pre-incubation mixture. Rumen fluid had a pH of 6.1 collected from dairy cows fed a ration of grass (41.66%), whole barley (14.79%), corn (16.78%), dried beet pulp and cake of beet residue (3.02%), ground barley (6.66%), rape seed flour (4.88%), soy flour (4.46%), Komix (mixture of vitamins and minerals, 0.2%), R0d Suplex capsules (0.05% vitamin mix), Suplex E-5000 (vitamin E and selenium, 0.03%), chalk (0.07%), salt (0.06% ) and water (7.33%). Ruminal fluid was a gift from the Department of Animal Science, Aarhus University (Blichers Alle 20, DK-8830 Tjele, Denmark). The sugar released by the reaction was analyzed on HPLC with a Bio-Rad Aminex HPX-87N HPLC column as Example 2. Table 2. Stability of AkAA in rumen fluid at 40 °C for 4.5 hours.

EXEMPLO 4EXAMPLE 4 Estabilidade de AkAA a pancreatina e efeito de AkAA com pancreatina no aumento do rendimento de glicose e redução do rendimento de maltotrioseStability of AkAA to pancreatin and effect of AkAA with pancreatin on increasing glucose yield and reducing maltotriose yield

[00283] A mistura de reação continha pancreatina porcina (Sigma P7545, 25 mg/mL feitos em 0,1% de NaCl), 0, 5, 10 e 20 μL, AkAA (209 mg/mL) 20 μL, 0,1 M de Mes (pH 6,7) 60 μL tendo 5 mM de CaCh, Tween 80 (0,01% p/v). Solução de NaCl a 0,1% foi adicionada a um volume final de reação de 0,12 mL. A mistura de reação foi incubada a 40 °C por 3 h e, em seguida, o substrato de 1,5 mL de pasta fluida de farinha de milho (10% p/p) foi adicionado e incubado adicionalmente a 40 °C por 13 horas. O sobrenadante obtido foi diluído 8,33 vezes e 40 μL foram analisados em HPLC quanto a glicose, maltose e maltotriose utilizando detector de RI como descrito no Exemplo 2.[00283] The reaction mixture contained porcine pancreatin (Sigma P7545, 25 mg/mL made in 0.1% NaCl), 0, 5, 10 and 20 μL, AkAA (209 mg/mL) 20 μL, 0.1 M Mes (pH 6.7) 60 μL having 5 mM CaCh, Tween 80 (0.01% w/v). 0.1% NaCl solution was added to a final reaction volume of 0.12 mL. The reaction mixture was incubated at 40 °C for 3 h and then the substrate of 1.5 mL corn flour slurry (10% w/w) was added and further incubated at 40 °C for 13 h . The supernatant obtained was diluted 8.33 times and 40 μL was analyzed on HPLC for glucose, maltose and maltotriose using an RI detector as described in Example 2.

[00284] A Figura 2 mostra que AkAA estava ativa em condições que simulam as do intestino delgado ruminal. Mostrou efeitos adicionais e complementares com as 3 doses de pancreatina porcina (Pan) testadas. A inclusão de AkAA com Pan aumentou a produção de glicose e maltose e diminuiu a formação/acumulação de maltotriose, o que é nutricionalmente vantajoso, uma vez que a glicose pode ser absorvida diretamente enquanto a maltose pode ser hidrolisada pela alfa- glicosidase mucosal intestinal (maltase) (Nichols et al., 1998. Human small intestinal maltase-glucoamylase cDNA cloning, homology to sucrase-isomaltase, J. Biol. Chem. 273:3076-3081). A pancreatina é o principal coquetel de enzimas digestivas para animais, especialmente, monogástricos e ruminantes. A mesma contém componentes enzimáticos como a tripsina, amilase e lipase, ribonuclease e protease, produzidos pelas células exócrinas do pâncreas porcino. Assim, a pancreatina é uma combinação de enzimas que lhe permitem a hidrólise de proteínas, amido e gorduras.[00284] Figure 2 shows that AkAA was active in conditions that simulate those of the ruminal small intestine. It showed additional and complementary effects with the 3 doses of porcine pancreatin (Pan) tested. The inclusion of AkAA with Pan increased the production of glucose and maltose and decreased the formation/accumulation of maltotriose, which is nutritionally advantageous since glucose can be absorbed directly while maltose can be hydrolyzed by intestinal mucosal alpha-glucosidase ( maltase) (Nichols et al., 1998. Human small intestinal maltase-glucoamylase cDNA cloning, homology to sucrase-isomaltase, J. Biol. Chem. 273:3076-3081). Pancreatin is the main digestive enzyme cocktail for animals, especially monogastric and ruminant animals. It contains enzymatic components such as trypsin, amylase and lipase, ribonuclease and protease, produced by the exocrine cells of the porcine pancreas. Thus, pancreatin is a combination of enzymes that allow it to hydrolyze proteins, starch and fats.

EXEMPLO 5EXAMPLE 5 Atividade da amilase AtAA sobre a farinha de milho na presença de pepsina e pancreatinaAtAA amylase activity on corn flour in the presence of pepsin and pancreatin

[00285] Para a reação de pepsina, a mistura de reação teve 0,1 mL de pasta fluida de amido de milho a 10% (p/p) (Sigma) S4126 preparados em 60 mM de glicina-HCl (pH 2,5), 10 μL de pepsina (Sigma P7000, 10000 U/mL em água), e 0,6 μL (16,76 mg/mL) de amilase AtAA. A reação foi realizada a 40 °C durante 3 h. As amostras foram centrifugadas. O sobrenadante foi diluído, filtrado e analisado em HPLC usando detector de RI para análise de açúcar como descrito no Exemplo 2. A reação de pancreatina foi igual à reação de pepsina, exceto que a pasta fluida de amido de milho foi preparada em 0,1 M de Mes (pH 6,7) e foram adicionados 5 μL de 25 mg/mL de pancreatina porcina (Pan) (Sigma P7545, dissolvida em NaCl a 0,1%).[00285] For the pepsin reaction, the reaction mixture had 0.1 mL of 10% (w/w) cornstarch slurry (Sigma) S4126 prepared in 60 mM glycine-HCl (pH 2.5 ), 10 μL of pepsin (Sigma P7000, 10000 U/mL in water), and 0.6 μL (16.76 mg/mL) of AtAA amylase. The reaction was carried out at 40 °C for 3 h. Samples were centrifuged. The supernatant was diluted, filtered and analyzed on HPLC using an RI detector for sugar analysis as described in Example 2. The pancreatin reaction was the same as the pepsin reaction, except that the corn starch slurry was prepared at 0.1 M Mes (pH 6.7) and 5 μL of 25 mg/mL porcine pancreatin (Pan) (Sigma P7545, dissolved in 0.1% NaCl) were added.

[00286] A Figura 3 mostra que a alfa-amilase AtAA de Aspergillus terreus (AtAmy1) estava ativa quando testada na presença de pepsina a pH 2,5 ou pancreatina a pH 6,7. Além disso, AtAA e pancreatina mostraram um efeito complementar na conversão de toda a maltotriose basicamente para glicose que pode ser absorvida diretamente pelos animais.[00286] Figure 3 shows that the Aspergillus terreus alpha-amylase AtAA (AtAmy1) was active when tested in the presence of pepsin at pH 2.5 or pancreatin at pH 6.7. Furthermore, AtAA and pancreatin showed a complementary effect in converting all maltotriose primarily to glucose that can be directly absorbed by animals.

EXEMPLO 6EXAMPLE 6 Hidrólise de amido de milho por amilases AkAA e AcAA na presença de fluido ruminalHydrolysis of corn starch by AkAA and AcAA amylases in the presence of rumen fluid

[00287] Fluido ruminal isento de células, 240 μL foram misturados com 10 μL de amostras de enzimas: AkAA (209 mg/mL), AcAA (172 mg/mL), AkAA com GA Trichoderma reesei (TrGA) e AFP Trichoderma reesei (223 mg/mL) ou AcAA com variante TrGA de CS4 e AFP (125 mg/mL) (Tabela 1) e incubadas a 40 °C por 4 h, seguido da adição de 250 μL de pasta fluida de amido de milho (Sigma S4126) dissolvida em acetato a 0,1 M contendo 5 mM de CaCl2 (pH4.5) e incubada adicionalmente por 30 min. No final da reação, as amostras de reação foram filtradas e os sobrenadantes foram analisados para detecção de açúcares redutores totais, utilizando reagente de ácido 3,5- dinitrosalicílico alcalino (DNS) de acordo com Yu et al., (Yu et al, 1997. Methods for the assay of 1,5-anhydro-D-fructose and alpha-1,4-glucan lyase. Carbohydr. Res. 305:73-82) com pequenas modificações. Ou seja, 10 μL de amostras de reação diluídas foram transferidos para uma placa PCR de 96 poços contendo 120 μL do reagente DNS. A placa foi incubada a 95 °C durante 5 min, seguido de 5 min de resfriamento a 20 °C e, em seguida, 100 μL destas misturas foram transferidos para uma nova placa de 96 poços que foi utilizada para medir a densidade óptica a 550 nm em um espectrofotômetro.[00287] Cell-free ruminal fluid, 240 μL was mixed with 10 μL of enzyme samples: AkAA (209 mg/mL), AcAA (172 mg/mL), AkAA with GA Trichoderma reesei (TrGA) and AFP Trichoderma reesei ( 223 mg/mL) or AcAA with TrGA variant of CS4 and AFP (125 mg/mL) (Table 1) and incubated at 40 °C for 4 h, followed by the addition of 250 μL of cornstarch slurry (Sigma S4126 ) dissolved in 0.1 M acetate containing 5 mM CaCl2 (pH4.5) and incubated additionally for 30 min. At the end of the reaction, the reaction samples were filtered and the supernatants were analyzed for detection of total reducing sugars using alkaline 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) reagent according to Yu et al., (Yu et al, 1997 . Methods for the assay of 1,5-anhydro-D-fructose and alpha-1,4-glucan lyase. Carbohydr. Res. 305:73-82. That is, 10 μL of diluted reaction samples were transferred to a 96-well PCR plate containing 120 μL of DNS reagent. The plate was incubated at 95 °C for 5 min, followed by 5 min cooling at 20 °C, and then 100 μL of these mixtures were transferred to a new 96-well plate that was used to measure the optical density at 550 nm in a spectrophotometer.

[00288] A Figura 4 mostra redução muito pequena na atividade de hidrólise de milho para todas as 4 amostras de enzimas testadas após incubação no fluido ruminal. A presença de GA de Trichoderma reesei e sua variante (CS4) e enzimas AFP de Trichoderma reesei teve um efeito benéfico sobre a hidrólise total do substrato catalisado por ambas as amostras de amilase AkAA e AcAA. Ambas as misturas de enzimas de amilase/glicoamilase/protease foram preparadas em uma proporção de proteína total de 29:70:1. Como mostrado na Figura 4, as amilases AkAA, AcAA e sua mistura com glicoamilases TrGA e CS4 e a protease aspártica AFP perderam menos de 13% da sua atividade total após 4 h de pré-incubação no fluido ruminal a 40 °C, seguido de 30 min de incubação com amido de milho a 40 °C, pH 4,5 (quando comparado com misturas não tratadas).[00288] Figure 4 shows very small reduction in corn hydrolysis activity for all 4 enzyme samples tested after incubation in rumen fluid. The presence of GA from Trichoderma reesei and its variant (CS4) and AFP enzymes from Trichoderma reesei had a beneficial effect on the total hydrolysis of the substrate catalyzed by both AkAA and AcAA amylase samples. Both amylase/glucoamylase/protease enzyme mixtures were prepared at a total protein ratio of 29:70:1. As shown in Figure 4, the amylases AkAA, AcAA and their mixture with glucoamylases TrGA and CS4 and the aspartic protease AFP lost less than 13% of their total activity after 4 h of pre-incubation in rumen fluid at 40 °C, followed by 30 min incubation with corn starch at 40 °C, pH 4.5 (when compared to untreated mixtures).

[00289] Estes resultados sob condições ruminais simuladas indicam que estas duas amilases e as suas misturas com glicoamilases e peptidase aspártica poderiam sobreviver no trato digestivo de um ruminante.[00289] These results under simulated rumen conditions indicate that these two amylases and their mixtures with glucoamylases and aspartic peptidase could survive in the digestive tract of a ruminant.

EXEMPLO 7EXAMPLE 7 Atividade das amilases AkAA e AcAA na presença de pepsina sob diferentes condições de pHActivity of AkAA and AcAA amylases in the presence of pepsin under different pH conditions

[00290] A mistura de reação continha 1,0 mL de pasta fluida de farinha de milho (20% p/p) preparado em 0,1 M de glicina-HCl (pH 3,2), 0,1 M de acetato (pH 4,1, 4,7) ou 0,1 M de Mes (pH 6,0), todos com 5 mM de CaCh, 25 μL de AkAA (209 mg/mL) ou AcAA (172 mg/mL), 25 μL de pepsina (Sigma P7000, 10000 U/mL em água). A reação foi realizada a 40°C por 2 horas. No final da reação, o sobrenadante obtido por centrifugação foi filtrado através de filtro de 0,45 μm e diluído por 20 vezes. As amostras diluídas foram avaliadas quanto a açúcar redutor total conforme descrito no Exemplo 6.[00290] The reaction mixture contained 1.0 mL of corn flour slurry (20% w/w) prepared in 0.1 M glycine-HCl (pH 3.2), 0.1 M acetate ( pH 4.1, 4.7) or 0.1 M Mes (pH 6.0), all with 5 mM CaCh, 25 μL of AkAA (209 mg/mL) or AcAA (172 mg/mL), 25 μL of pepsin (Sigma P7000, 10000 U/mL in water). The reaction was carried out at 40°C for 2 hours. At the end of the reaction, the supernatant obtained by centrifugation was filtered through a 0.45 μm filter and diluted 20 times. The diluted samples were evaluated for total reducing sugar as described in Example 6.

[00291] A Figura 5 mostra hidrólise de farinha de milho pelas amostras AkAA e AcAA incubadas a pH 3,2, 4,1, 4,7 e 6,0 na ausência ou presença de pepsina. A atividade de amilase, medida como a liberação de açúcar redutor total por AkAA e AcAA não foi significativamente afetada na presença de pepsina em comparação com a ausência de pepsina. Além disso, indica que estas duas amilases compartilhando 70% de identidade são ativas em condições comparáveis às que seriam encontradas no trato digestivo de um ruminante: por exemplo, uma das condições de acidez do abomaso (pH 3,2), condições do intestino delgado superior (pH 4,1-4,7) e condições comparáveis às encontradas no intestino delgado e rúmen (ambas a pH 6,0 ou cerca de pH 6,0). Assim, as amilases AkAA e AcAA parecem mais ativas a um pH relevante para o rúmen do que outras amilases atualmente em uso como aditivos de ração de monogástricos, como, por exemplo, alfa-amilases de Bacillus amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. subtilis, Aspergillus niger e A. oryzae (Monteiro de Souza et al., Application of microbial alpha-amylase in industry - a review. Brazilian Journal of Microbiology (2010) 41: 850-861).[00291] Figure 5 shows hydrolysis of corn flour by AkAA and AcAA samples incubated at pH 3.2, 4.1, 4.7 and 6.0 in the absence or presence of pepsin. Amylase activity, measured as the release of total reducing sugar by AkAA and AcAA, was not significantly affected in the presence of pepsin compared to the absence of pepsin. Furthermore, it indicates that these two amylases sharing 70% identity are active under conditions comparable to those that would be found in the digestive tract of a ruminant: for example, one of the acidity conditions of the abomasum (pH 3.2), conditions of the small intestine upper (pH 4.1-4.7) and conditions comparable to those found in the small intestine and rumen (both at pH 6.0 or around pH 6.0). Thus, AkAA and AcAA amylases appear more active at a rumen-relevant pH than other amylases currently in use as monogastric feed additives, such as, for example, alpha-amylases from Bacillus amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. subtilis , Aspergillus niger and A. oryzae (Monteiro de Souza et al., Application of microbial alpha-amylase in industry - a review. Brazilian Journal of Microbiology (2010) 41: 850-861).

EXEMPLO 8EXAMPLE 8 Atividade de misturas de endo- /exo-glucano hidrolases e endo proteases na presença de pancreatinaActivity of mixtures of endo-/exo-glucan hydrolases and endo proteases in the presence of pancreatin

[00292] A mistura de reação continha 1,0 mL de pasta fluida de farinha de milho (20% p/p, em 0,1 M de Mes, 5 mM de CaCl2 pH 6,0), 25 μL do coquetel de enzimas de AkAA+TrGA+AFP (223 mg/mL) ou AcAA+CS4+AFP (125 mg/mL), 25 μL de pancreatina porcina (Sigma P7545, 25 mg/mL em 0,1% de NaCl). A reação foi realizada a 40 °C por 2 horas. No final da reação, o sobrenadante obtido por centrifugação foi filtrado através de filtro de 0,45 μm e diluído por 20 vezes. As amostras diluídas foram avaliadas quanto a açúcar redutor total conforme descrito no Exemplo 6. A Figura 6 mostra que após 2 h de incubação com farinha de milho (20% p/p) a 40 °C e pH 6,0 na presença de pancreatina, a mistura de enzimas de AkAA+TrGA+AFP e a mistura de enzimas de AcAA+CS4+AFP aumentou a produção de açúcar redutor em 4,2 e 3,8 vezes, respectivamente. Este estudo demonstra que a mistura AkAA+TrGA+AFP e AcAA+CS4+AFP sobreviveu na passagem pelo rúmen e abomaso e que pode interagir de forma sinérgica com enzimas de pancreatina para promover a liberação de açúcar.[00292] The reaction mixture contained 1.0 mL of corn flour slurry (20% w/w, in 0.1 M Mes, 5 mM CaCl2 pH 6.0), 25 μL of the enzyme cocktail of AkAA+TrGA+AFP (223 mg/mL) or AcAA+CS4+AFP (125 mg/mL), 25 μL of porcine pancreatin (Sigma P7545, 25 mg/mL in 0.1% NaCl). The reaction was carried out at 40 °C for 2 hours. At the end of the reaction, the supernatant obtained by centrifugation was filtered through a 0.45 μm filter and diluted 20 times. The diluted samples were evaluated for total reducing sugar as described in Example 6. Figure 6 shows that after 2 h of incubation with corn flour (20% w/w) at 40 °C and pH 6.0 in the presence of pancreatin , the AkAA+TrGA+AFP enzyme mixture and the AcAA+CS4+AFP enzyme mixture increased reducing sugar production by 4.2 and 3.8 times, respectively. This study demonstrates that the mixture AkAA+TrGA+AFP and AcAA+CS4+AFP survived passage through the rumen and abomasum and that it can interact synergistically with pancreatin enzymes to promote sugar release.

[00293] Tal como AkAA (Exemplo 4), também foi verificado que AcAA interage de forma sinérgica com pancreatina. A Tabela 3 mostra que se AcAA for doseada juntamente com pancreatina, a geração de potência redutora (valor DNS) é 1,6 vezes a soma de potência redutora gerada individualmente pelas duas enzimas a pH 6,0 e o valor correspondente a pH 6,7 é de 1,25 vezes.[00293] Like AkAA (Example 4), it was also found that AcAA interacts synergistically with pancreatin. Table 3 shows that if AcAA is dosed together with pancreatin, the generation of reducing power (DNS value) is 1.6 times the sum of reducing power generated individually by the two enzymes at pH 6.0 and the corresponding value at pH 6. 7 is 1.25 times.

[00294] A mistura de reação continha 1 mL de pasta fluida de amido de milho 20% (p/v) em 0,1 M de Mes (pH 6,0 e 6,7) com 5 mM de CaCl2, com e sem 25 μL de pancreatina porcina (2,5% p/v) e 25 μL de AcAA (17,2 mg/mL) a 40 °C durante 2 horas. O açúcar redutor gerado foi avaliado como no Exemplo 6. Tabela 3. O efeito de sinergia de AcAA com a pancreatina a pH 6,0 e 6,7 [00294] The reaction mixture contained 1 mL of 20% (w/v) corn starch slurry in 0.1 M Mes (pH 6.0 and 6.7) with 5 mM CaCl2, with and without 25 μL of porcine pancreatin (2.5% w/v) and 25 μL of AcAA (17.2 mg/mL) at 40 °C for 2 hours. The reducing sugar generated was evaluated as in Example 6. Table 3. The synergy effect of AcAA with pancreatin at pH 6.0 and 6.7

EXEMPLO 9EXAMPLE 9 Atividade de liberação de açúcares redutores das misturas AFP de endo-, exo-glucano hidrolases e endo proteases na presença de pepsina a pH 2,5 em relação a pH 6,0Reducing sugar release activity of AFP mixtures of endo-, exo-glucan hydrolases and endo proteases in the presence of pepsin at pH 2.5 compared to pH 6.0

[00295] A Tabela 4 mostra a atividade da mistura de AkAA, AcAA, TrGA, CS4 e AFP na ausência e presença de pepsina a pH 2,5 em relação a pH 6,0. Pode ser visto que a atividade a pH 2,5 é superior a 20% vs pH 6,0 para ambos os coquetéis de enzimas sob condições experimentais. Seria vantajoso que as enzimas nos coquetéis de enzimas fossem estáveis e ativas em condições comparáveis às encontradas no estômago ou abomaso de um ruminante onde prevalece um pH menor.[00295] Table 4 shows the activity of the mixture of AkAA, AcAA, TrGA, CS4 and AFP in the absence and presence of pepsin at pH 2.5 in relation to pH 6.0. It can be seen that the activity at pH 2.5 is greater than 20% vs pH 6.0 for both enzyme cocktails under experimental conditions. It would be advantageous if the enzymes in the enzyme cocktails were stable and active under conditions comparable to those found in the stomach or abomasum of a ruminant where a lower pH prevails.

[00296] A mistura de reação continha 1,0 mL de pasta fluida de farinha de milho (10% p/p) em 0,1 M de glicina-HCl (pH 2,5) com 5 mM de CaCl2 ou 0,1 M de Mes-NaOH (pH 6,0) com 5 mM de CaCh, 25 μL de coquetel de enzimas de AkAA+TrGA+AFP (223 mg/mL) ou AcAA+CS4+AFP (125 mg/mL) e 25 μL de pepsina (10000 U/mL). A reação foi realizada a 40 °C durante 2 h com agitação a 300 rpm. No final da reação, o substrato foi separado da enzima e dos produtos por centrifugação a 3500 rpm durante 5 min em um filtro de 0,45 μm e placa de filtro de 96 poços. O filtrado foi diluído 2 vezes e avaliado quanto a valor de açúcar redutor como descrito no Exemplo 6. Tabela 4. Atividade de liberação de açúcares redutores da mistura de endo-, exo-glucano hidrolases e endo proteases de AkAA, AcAA, TrGA, CS4 e AFP na presença e ausência de pepsina a pH 2,5 em relação a pH 6,0 A atividade a pH 6,0 é considerada como 100%. [00296] The reaction mixture contained 1.0 mL of corn flour slurry (10% w/w) in 0.1 M glycine-HCl (pH 2.5) with 5 mM CaCl2 or 0.1 M Mes-NaOH (pH 6.0) with 5 mM CaCh, 25 μL of AkAA+TrGA+AFP (223 mg/mL) or AcAA+CS4+AFP (125 mg/mL) and 25 μL enzyme cocktail of pepsin (10000 U/mL). The reaction was carried out at 40 °C for 2 h with stirring at 300 rpm. At the end of the reaction, the substrate was separated from the enzyme and products by centrifugation at 3500 rpm for 5 min in a 0.45 μm filter and 96-well filter plate. The filtrate was diluted 2 times and evaluated for reducing sugar value as described in Example 6. Table 4. Reducing sugar releasing activity of the mixture of endo-, exo-glucan hydrolases and endo proteases of AkAA, AcAA, TrGA, CS4 and AFP in the presence and absence of pepsin at pH 2.5 compared to pH 6.0. Activity at pH 6.0 is considered 100%.

EXEMPLO 10EXAMPLE 10 Hidrólise de amido de milho por glicoamilase sob condições digestivas do intestino delgado na presença de pancreatinaHydrolysis of corn starch by glucoamylase under small intestinal digestive conditions in the presence of pancreatin

[00297] A mistura de reação continha 0,5 mL de pasta fluida de amido de milho (Sigma S4126) ou pasta fluida de farinha de milho (10% p/v) em 0,1 M de Mes (pH 6,0), 50 μL de pancreatina (concentração final na mistura de reação 0,25%) e a glicoamilase a 400 ppm em um volume final de 0,56 mL. A reação foi realizada a 40 °C durante 1 h com agitação a 300 rpm. No final da reação, o sobrenadante foi obtido por separação centrífuga dos grânulos de amido utilizando uma centrífuga de bancada e avaliado quanto a açúcar redutor total pelo método de reagente DNS descrito no Exemplo 6, nomeadamente 10 μL do sobrenadante ou sobrenadante diluído foram misturados com 100 μL de reagente DNS em uma placa de PCR de 96 poços. A placa de PCR foi então incubada a 95 °C por 5 min, seguido de 5 min de resfriamento a 20 °C. A mistura de reação de 90 μL foi transferida para uma placa de leitura de 96 poços e a absorbância a 550 nm foi medida como o valor DNS.[00297] The reaction mixture contained 0.5 mL of corn starch slurry (Sigma S4126) or corn flour slurry (10% w/v) in 0.1 M Mes (pH 6.0) , 50 μL of pancreatin (final concentration in the reaction mixture 0.25%) and glucoamylase at 400 ppm in a final volume of 0.56 mL. The reaction was carried out at 40 °C for 1 h with stirring at 300 rpm. At the end of the reaction, the supernatant was obtained by centrifugal separation of the starch granules using a benchtop centrifuge and evaluated for total reducing sugar by the DNS reagent method described in Example 6, namely 10 μL of the supernatant or diluted supernatant was mixed with 100 µL of DNS reagent in a 96-well PCR plate. The PCR plate was then incubated at 95°C for 5 min, followed by 5 min of cooling at 20°C. The 90 μL reaction mixture was transferred to a 96-well reading plate and the absorbance at 550 nm was measured as the DNS value.

[00298] A Figura 7, com amido de milho como substrato, e a Figura 8, com farinha de milho como substrato, mostram que todas as cinco glicoamilases de CS4, TrGA, Brew1, AfuGA e FvGA (para obter detalhes, consulte a Tabela 1) interagiram de forma sinérgica com pancreatina na produção de açúcares redutores, como indicado nos valores DNS. Glicoamilases (GAs) (1,4-alfa-D-glucano glucohidrolase (EC3.2.1.3) catalisam a hidrólise de ligações alfa-1,4 e alfa-1,6- glicosídicas para liberar beta-D-glicose a partir das extremidades não redutoras de amido e poli- e oligossacarídeos relacionados (Sauer et al. 2000. Glucoamylase: structure/function relationships, and protein engineering, Biochim. Biophys. Acta, 1543:275-293). Assim, em contraste com certos tipos de alfa-glucosidases, GA também é capaz de hidrolisar o amido cru e ligações alfa-1,4, e alfa-1,6-glicosídicas encontradas em alfa-glucanos e seus oligômeros.[00298] Figure 7, with corn starch as substrate, and Figure 8, with corn flour as substrate, show that all five CS4 glycoamylases, TrGA, Brew1, AfuGA, and FvGA (for details, see Table 1) interacted synergistically with pancreatin in the production of reducing sugars, as indicated in DNS values. Glycoamylases (GAs) (1,4-alpha-D-glucan glucohydrolase (EC3.2.1.3) catalyze the hydrolysis of alpha-1,4 and alpha-1,6-glycosidic bonds to release beta-D-glucose from non-reducing ends of starch and related poly- and oligosaccharides (Sauer et al. 2000. Glucoamylase: structure/function relationships, and protein engineering, Biochim. Biophys. Acta, 1543:275-293). alpha-glucosidases, GA is also capable of hydrolyzing raw starch and alpha-1,4, and alpha-1,6-glycosidic bonds found in alpha-glucans and their oligomers.

[00299] As figuras 7 e 8 mostram que a pancreatina porcina e todas as cinco GAs tinham determinadas capacidades para hidrolisar grânulos de amido de milho com a maior atividade observada em FvGA a pH 6,0 e 40 °C. Foi observada uma sinergia significativa quando a mistura de reação continha tanto as GAs como a pancreatina porcina. Se acredita que esse sinergismo pode ser devido não só à alfa-amilase pancreática presente no produto de pancreatina adquirido à Sigma, mas também possivelmente devido às proteases também presentes neste produto de pancreatina que podem interagir com qualquer proteína que possa estar presente na superfície dos grânulos de amido de milho, bem como no interior do grânulo.[00299] Figures 7 and 8 show that porcine pancreatin and all five GAs had certain capabilities to hydrolyze corn starch granules with the highest activity observed in FvGA at pH 6.0 and 40 ° C. Significant synergy was observed when the reaction mixture contained both GAs and porcine pancreatin. It is believed that this synergism may be due not only to the pancreatic alpha-amylase present in the pancreatin product purchased from Sigma, but also possibly due to the proteases also present in this pancreatin product that may interact with any protein that may be present on the surface of the granules. of corn starch, as well as inside the granule.

[00300] Este exemplo mostra que as glicoamilases podem interagir de forma sinérgica com enzimas digestivas pancreáticas na geração de glicose do milho com a composição química apresentada em (ver o Exemplo 2. As cinco GAs utilizadas neste experimento e as três amilases AkAA, AcAA e AtAA usadas nos Exemplos 2 a 9 acima possuem todos os módulos de ligação de carboidrato pertencentes à família 20 (CBM20) (Christiansen et al., 2009. The carbohydrate-binding module family 20 - diversity, structure, and function, FEBS Journal, 276: 5006-5029; Janeceka et al., 2011. Structural and evolutionary aspects of two families of non-catalytic domains present in starch and glycogen binding proteins from microbes, plants and animals. Enzyme and Microbial Technology, 49: 429- 440). Estas enzimas podem ter um local adicional de ligação de carboidrato para além do módulo de ligação de carboidrato (Sorimachi et al., 1997. Solution structure of the granular starch binding domain of Aspergillus niger glucoamylase bound to betacyclodextrin, Structure, 5:647-661). Estes módulos de ligação de carboidrato e locais de ligação de carboidrato podem ser necessários para atividade em grânulos de amido e maltossacarídeos e, assim, contribuir para o efeito sinérgico quando combinados com pancreatina.[00300] This example shows that glucoamylases can interact synergistically with pancreatic digestive enzymes in the generation of glucose from corn with the chemical composition presented in (see Example 2. The five GAs used in this experiment and the three amylases AkAA, AcAA and AtAA used in Examples 2 to 9 above have all carbohydrate-binding modules belonging to family 20 (CBM20) (Christiansen et al., 2009. The carbohydrate-binding module family 20 - diversity, structure, and function, FEBS Journal, 276 : 5006-5029; Janeceka et al., 2011. Structural and evolutionary aspects of two families of non-catalytic domains present in starch and glycogen binding proteins from microbes, plants and animals. These enzymes may have an additional carbohydrate binding site in addition to the carbohydrate binding module (Sorimachi et al., 1997. Solution structure of the granular starch binding domain of Aspergillus niger glucoamylase bound to betacyclodextrin, Structure, 5:647-661 ). These carbohydrate-binding modules and carbohydrate-binding sites may be required for activity on starch granules and maltosaccharides and thus contribute to the synergistic effect when combined with pancreatin.

EXEMPLO 11EXAMPLE 11 Hidrólise do amido de milho por glicoamilase sob condições ruminaisHydrolysis of corn starch by glucoamylase under ruminal conditions

[00301] A Tabela 5 mostra que a atividade restante para as cinco glicoamilases é, no mínimo, de 80% após 4 h de incubação em fluído ruminal na ausência de substrato de amido, exceto para AfuGA que tem 65% de atividade restante. Como enzima de ração de ruminantes, é necessário ter estabilidade considerável no fluido ruminal a 40 °C por 4 horas.[00301] Table 5 shows that the remaining activity for the five glucoamylases is at least 80% after 4 h of incubation in rumen fluid in the absence of starch substrate, except for AfuGA which has 65% remaining activity. As a ruminant feed enzyme, it is required to have considerable stability in rumen fluid at 40°C for 4 hours.

[00302] Assim, estas enzimas mostram utilidade como enzimas de ração para ruminantes, uma vez que foram estáveis e mantiveram atividade no fluido ruminal a 40 °C por 4 horas.[00302] Thus, these enzymes show usefulness as feed enzymes for ruminants, since they were stable and maintained activity in rumen fluid at 40 °C for 4 hours.

[00303] A mistura de pré-incubação continha 0,25 mL de fluido ruminal isento de células, 5 μL de cada uma das 5 glicoamilases a 400 ppm. A pré-incubação ocorreu a 40 °C durante 4 h com agitação a 300 rpm em uma placa de 48 poços. Para controle, o tempo de pré- incubação foi zero. Após a pré-incubação, 0,25 mL de pasta fluida de amido de milho (Sigma S4126) (10% p/v) em 0,1 M Mes (pH 6,0) foram adicionados e reagidos durante 30 min a 40 °C com agitação. O sobrenadante foi obtido por separação centrífuga dos grânulos de amido utilizando uma centrífuga de bancada e avaliado quanto a açúcar redutor total pelo método DNS como descrito no Exemplo 10.Tabela 5. Estabilidade das cinco glicoamilases na presença de fluido ruminal a 40 °C durante 4 horas. [00303] The pre-incubation mixture contained 0.25 mL of cell-free rumen fluid, 5 μL of each of the 5 glucoamylases at 400 ppm. Preincubation occurred at 40 °C for 4 h with shaking at 300 rpm in a 48-well plate. For control, the pre-incubation time was zero. After pre-incubation, 0.25 mL corn starch slurry (Sigma S4126) (10% w/v) in 0.1 M Mes (pH 6.0) was added and reacted for 30 min at 40° C with agitation. The supernatant was obtained by centrifugal separation of the starch granules using a benchtop centrifuge and evaluated for total reducing sugar by the DNS method as described in Example 10. Table 5. Stability of the five glucoamylases in the presence of ruminal fluid at 40 °C for 4 hours.

EXEMPLO 12EXAMPLE 12 Atividade de cinco glicoamilases a pH 2,5 em relação a pH 6,0 na presença de pepsinaActivity of five glucoamylases at pH 2.5 compared to pH 6.0 in the presence of pepsin

[00304] Seria vantajoso que as enzimas fossem estáveis e ativas em condições que simulam as encontradas no estômago ruminal ou abomaso ruminal onde prevalece um pH menor. A atividade a pH 2,5 deve ser consideravelmente elevada o suficiente para ter significado na digestibilidade nesta câmara de digestão com baixo pH em relação à atividade no rúmen e no intestino delgado com um pH de cerca de 6 com base em uma dieta amilácea. A Tabela 6 mostra que todas as cinco glicoamilases têm mais do que 20% de atividade a pH 2,5 em comparação com a sua atividade a pH 6,0. Assim, uma atividade equilibrada no rúmen, abomaso e intestino delgado, aumentará as oportunidades para digerir nutrientes amiláceos.[00304] It would be advantageous for the enzymes to be stable and active in conditions that simulate those found in the ruminal stomach or ruminal abomasum where a lower pH prevails. Activity at pH 2.5 should be considerably high enough to have significance in digestibility in this low pH digestion chamber relative to activity in the rumen and small intestine at a pH of about 6 based on a starchy diet. Table 6 shows that all five glucoamylases have more than 20% activity at pH 2.5 compared to their activity at pH 6.0. Thus, balanced activity in the rumen, abomasum and small intestine will increase opportunities to digest starchy nutrients.

[00305] A mistura de reação continha, em microplacas de 48 poços, 0,5 mL de pasta fluida de farinha de milho (10% p/v) preparada em glicina-HCl (60 mM, pH 2,5) ou em Mes-NaOH (100 mM, pH 6,0), 50 μL de pepsina porcina (concentração final de 1000 U/mL) e 5 μL de glicoamilase (concentração final, 400 ppm). A reação foi realizada a 40 °C por 60 min. O açúcar redutor liberado foi analisado pelo reagente DNS como descrito no Exemplo 10. A atividade a pH 6,0 é usada como 100%.Tabela 6. Relação da atividade das cinco glicoamilases a pH 2,5 e pH 6,0. A atividade a pH 6,0 para cada enzima é relatada como 100%. [00305] The reaction mixture contained, in 48-well microplates, 0.5 mL of corn flour slurry (10% w/v) prepared in glycine-HCl (60 mM, pH 2.5) or in Mes -NaOH (100 mM, pH 6.0), 50 μL of porcine pepsin (final concentration, 1000 U/mL), and 5 μL of glucoamylase (final concentration, 400 ppm). The reaction was carried out at 40 °C for 60 min. The released reducing sugar was analyzed by the DNS reagent as described in Example 10. The activity at pH 6.0 is used as 100%. Table 6. Relationship of the activity of the five glucoamylases at pH 2.5 and pH 6.0. Activity at pH 6.0 for each enzyme is reported as 100%.

EXEMPLO 13EXAMPLE 13 Liberação de glicose a partir de amido de milho por alfa- glicosidase de levedura na presença de pancreatina em condições que simulam as do intestino delgadoRelease of glucose from corn starch by yeast alpha-glucosidase in the presence of pancreatin under conditions simulating those of the small intestine

[00306] A mistura de reação continha: 0,5 mL de pasta fluida de amido de milho (Sigma S4126) (10% p/v) suspensos em 0,1 M de Mes (pH 6,0) contendo 5 mM de CaCh, 0, 10, 20 ou 35 μL de alfa- glicosidase de levedura (que também pode ser referida como maltase adquirida à Megazyme, E-MALTS, 1000 U/mL), 0 a 25 μL de pancreatina porcina (2,5% p/v em 1% de NaCl, adquirida à Sigma cat. NO: P7545), e 0 a 60 μL de água, em um volume total de 0,56 mL. As misturas de reação foram incubadas em uma incubadora com agitação a 40 °C durante 60 min em uma placa de 48 poços. A placa foi centrifugada a 3500 rpm durante 10 minutos usando uma centrífuga de bancada para separar grânulos de amido não digeridos. O sobrenadante obtido foi transferido para uma placa de 96 poços para o ensaio de glicose usando o kit de ensaio de glicose com base em glicose oxidase/peroxidase (GOPOD).[00306] The reaction mixture contained: 0.5 mL corn starch slurry (Sigma S4126) (10% w/v) suspended in 0.1 M Mes (pH 6.0) containing 5 mM CaCh , 0, 10, 20 or 35 μL yeast alpha-glucosidase (which may also be referred to as maltase purchased from Megazyme, E-MALTS, 1000 U/mL), 0 to 25 μL porcine pancreatin (2.5% w /v in 1% NaCl, purchased from Sigma cat. NO: P7545), and 0 to 60 μL of water, in a total volume of 0.56 mL. The reaction mixtures were incubated in a shaking incubator at 40 °C for 60 min in a 48-well plate. The plate was centrifuged at 3500 rpm for 10 minutes using a benchtop centrifuge to separate undigested starch granules. The obtained supernatant was transferred to a 96-well plate for glucose assay using the glucose oxidase/peroxidase-based glucose assay kit (GOPOD).

[00307] Para o ensaio de glicose GOPOD, 8 μL do sobrenadante foram transferidos para placas de leitura com 96 placas possuindo 240 μL de reagente GOPOD da Megazyme (K-GLUC 09/14). A placa foi incubada a 50 °C durante 20 min e a absorbância a 510 nm foi lida de acordo com as instruções da Megazyme.[00307] For the GOPOD glucose assay, 8 μL of the supernatant was transferred to 96-plate reading plates containing 240 μL of Megazyme's GOPOD reagent (K-GLUC 09/14). The plate was incubated at 50°C for 20 min and the absorbance at 510 nm was read according to Megazyme instructions.

[00308] É bem sabido que o produto de pancreatina (Sigma P7545) contém alfa-amilase pancreática, lipase, ribonuclease e várias proteases, incluindo tripsina, quimiotripsina, elastase. Os produtos hidrolíticos de amido dietético por alfa-amilase porcina e bovina são principalmente maltose (Banks et al., 1976. The action pattern of bovine pancreatic alpha-amylase. Intl J. Biochem., 7: 107-110). Sabe- se que os animais, incluindo os animais monogástricos e ruminantes, hidrolisam a maltose utilizando uma enzima ligada a uma membrana do intestino delgado (Nichols et al., 1998. Human Small Intestinal Maltase-glucoamylase cDNA Cloning, homology to sucrase- isomaltase, J. Biol. Chem. 273:3076-3081). Uma enzima que se move livremente tem maior eficácia catalítica do que uma enzima ligada a uma membrana (imobilizada).[00308] It is well known that the pancreatin product (Sigma P7545) contains pancreatic alpha-amylase, lipase, ribonuclease and various proteases, including trypsin, chymotrypsin, elastase. The hydrolytic products of dietary starch by porcine and bovine alpha-amylase are mainly maltose (Banks et al., 1976. The action pattern of bovine pancreatic alpha-amylase. Intl J. Biochem., 7: 107-110). It is known that animals, including monogastric animals and ruminants, hydrolyze maltose using an enzyme bound to a membrane of the small intestine (Nichols et al., 1998. Human Small Intestinal Maltase-glucoamylase cDNA Cloning, homology to sucrase-isomaltase, J. Biol. 273:3076-3081). A freely moving enzyme has greater catalytic effectiveness than a membrane-bound (immobilized) enzyme.

[00309] A Figura 9 mostra que, sem pancreatina, a alfa-glicosidase de levedura doseada de 0, 10, 20, 35 μL não foi capaz de aumentar a liberação de glicose a partir de grânulos de amido de milho.[00309] Figure 9 shows that, without pancreatin, yeast alpha-glucosidase dosed at 0, 10, 20, 35 μL was not able to increase the release of glucose from corn starch granules.

[00310] No entanto, na presença de 2,5 μL pancreatina, foi liberada glicose e a adição de 10 μL de alfa-glicosidase duplicou a quantidade de glicose liberada. O rendimento de glicose aumentou à medida que a dose de alfa-glucosidase foi aumentada. Isto indica que a alfa- glucosidase de levedura interagiu de forma sinérgica com as enzimas presentes na pancreatina para liberar a glicose do amido de milho. Acredita-se que as proteases presentes na pancreatina podem promover, em certa medida, esta sinergia, uma vez que a protease pode hidrolisar proteínas presentes na superfície dos grânulos de amido, bem como proteínas que residem no interior do grânulo. Estas proteínas sobre e dentro dos grânulos de amido podem afetar negativamente a digestão de amido (McAllister et al., 1993. Effect of the protein matrix on the digestion of cereal grains by ruminal microorganisms. J. Anim. Sci. 71:205-212).[00310] However, in the presence of 2.5 μL pancreatin, glucose was released and the addition of 10 μL alpha-glucosidase doubled the amount of glucose released. Glucose yield increased as the dose of alpha-glucosidase was increased. This indicates that yeast alpha-glucosidase interacted synergistically with enzymes present in pancreatin to release glucose from corn starch. It is believed that the proteases present in pancreatin can promote, to some extent, this synergy, since the protease can hydrolyze proteins present on the surface of starch granules, as well as proteins that reside inside the granule. These proteins on and within starch granules can negatively affect starch digestion (McAllister et al., 1993. Effect of the protein matrix on the digestion of cereal grains by ruminal microorganisms. J. Anim. Sci. 71:205-212 ).

[00311] A alfa-glucosidase usada no Exemplo 13 é uma forma altamente purificada de Saccharomyces cerevisiae comprada à Megazyme International Ireland (EC 3.2.1.20, CAZy Family: GH13, Protein database entries: P53341, P38158, CAS: 9001-42-7). Este exemplo mostra que a alfa-glucosidase microbiana livre apresenta boa sinergia com enzimas digestivas pancreáticas. Foi verificado, no entanto, que esta alfa-glicosidase de levedura é instável e inativa em condições comparáveis às encontradas no estômago ruminal e abomaso ruminal. Acredita-se que novos esforços, tais como revestimento desta alfa-glucosidase de levedura ou manipulação de proteínas podem ser necessários para a tornar estável a um pH tão baixo na presença de pepsina para que seja capaz de funcionar no intestino delgado ruminal.[00311] The alpha-glucosidase used in Example 13 is a highly purified form of Saccharomyces cerevisiae purchased from Megazyme International Ireland (EC 3.2.1.20, CAZy Family: GH13, Protein database entries: P53341, P38158, CAS: 9001-42-7 ). This example shows that free microbial alpha-glucosidase synergizes well with pancreatic digestive enzymes. It has been found, however, that this yeast alpha-glucosidase is unstable and inactive under conditions comparable to those found in the rumen stomach and rumen abomasum. It is believed that further efforts such as coating this yeast alpha-glucosidase or protein manipulation may be necessary to make it stable at such a low pH in the presence of pepsin that it is able to function in the ruminal small intestine.

EXEMPLO 14EXAMPLE 14 Liberação de glicose a partir de amido de milho por alfa- glucosidases fúngicas na presença de pancreatina em condições imitando as do intestino delgadoRelease of glucose from corn starch by fungal alpha-glucosidases in the presence of pancreatin under conditions mimicking those of the small intestine

[00312] Três alfa-glucosidases fúngicas: TG L-2000, Aclglu1 e Nfiglu1 (Tabela 1) foram examinadas quanto à sua estabilidade e atividade na presença de pepsina, pancreatina e fluido ruminal (Tabelas 7.1, 7.2 e 7.3, em baixo). As Tabelas 7.1 a 7.3 mostram que todos as três alfa-glucosidases interagiram de forma sinérgica com pancreatina no aumento da liberação de glicose a partir de amido de milho.[00312] Three fungal alpha-glucosidases: TG L-2000, Aclglu1 and Nfiglu1 (Table 1) were examined for their stability and activity in the presence of pepsin, pancreatin and rumen fluid (Tables 7.1, 7.2 and 7.3, below). Tables 7.1 to 7.3 show that all three alpha-glucosidases interacted synergistically with pancreatin in increasing glucose release from corn starch.

[00313] O estudo de sinergia com pancreatina foi realizado da seguinte forma: 0,5 mL de pasta fluida de amido de milho (Sigma S4126) (10% p/v) em 0,1 M de Mes (pH 6,0) com 5 mM de CaCl2 foram incubados com 0 ou 2,5 μL de alfa-glicosidase TG L-2000 (3,1 mg/mL) e 0 ou 2,5 μL de pancreatina porcina (Sigma P7545, 2,5% p/v em 1% de NaCl). A reação foi realizada a 40 °C por 1 hora. A mistura de reação foi, então, filtrada através de um filtro de 0,22 μm. A glicose liberada no filtrado foi avaliada usando o kit de ensaio de glicose Megazyme (GOPOD) (K-GLUC 09/14) (como descrito no Exemplo 13 acima) e foi realizada como se segue: 8 μL de filtrado foram misturados com 0,24 mL de reagente GOPOD em uma placa de 96 poços e leitura a 510 nm após incubação a 50 °C durante 20 min. As unidades de OD medidas a 510 nm, foram utilizadas como uma quantificação da liberação de glicose.[00313] The synergy study with pancreatin was carried out as follows: 0.5 mL of corn starch slurry (Sigma S4126) (10% w/v) in 0.1 M Mes (pH 6.0) with 5 mM CaCl2 were incubated with 0 or 2.5 μL of alpha-glucosidase TG L-2000 (3.1 mg/mL) and 0 or 2.5 μL of porcine pancreatin (Sigma P7545, 2.5% w/w). v in 1% NaCl). The reaction was carried out at 40 °C for 1 hour. The reaction mixture was then filtered through a 0.22 μm filter. Glucose released into the filtrate was assessed using the Megazyme Glucose Assay Kit (GOPOD) (K-GLUC 09/14) (as described in Example 13 above) and was performed as follows: 8 μL of filtrate was mixed with 0. 24 mL of GOPOD reagent in a 96-well plate and read at 510 nm after incubation at 50 °C for 20 min. OD units measured at 510 nm were used as a quantification of glucose release.

[00314] O estudo de sinergia com pepsina e pancreatina (Pan) foi realizado da seguinte forma: a mistura de pré-incubação continha 0,1 mL de glicina-HCl (pH 3,0), 5 mM de CaCl2, 25 μL de pepsina porcina (Sigma P7000, 5000 U/mL) e 2,5 μL de TG L-2000. Esta mistura foi incubada a 4 °C por 2 horas. No final da incubação, 0,5 mL de pasta fluida de amido de milho (10%, p/v) de 0,1 M de Mes (pH 6,0) e 2,5 μL de pancreatina (2,5%) foram adicionados e incubados adicionalmente a 40 °C por 1 hora. Um ensaio da glicose liberada foi realizado conforme descrito acima com relação ao estudo de pancreatina usando o kit de ensaio de glicose Megazyme.[00314] The synergy study with pepsin and pancreatin (Pan) was carried out as follows: the pre-incubation mixture contained 0.1 mL of glycine-HCl (pH 3.0), 5 mM CaCl2, 25 μL of porcine pepsin (Sigma P7000, 5000 U/mL) and 2.5 μL of TG L-2000. This mixture was incubated at 4 °C for 2 hours. At the end of incubation, 0.5 mL of corn starch slurry (10%, w/v) of 0.1 M Mes (pH 6.0) and 2.5 μL of pancreatin (2.5%) were added and further incubated at 40°C for 1 hour. A released glucose assay was performed as described above in relation to the pancreatin study using the Megazyme glucose assay kit.

[00315] O estudo de estabilidade e interação de hidrolase de amido no rúmen foi feito da seguinte forma: 2,5 μL de alfa-glucosidase TG L- 2000 com 0,24 mL de fluido ruminal isento de células e incubação a 40 °C por 4 horas. No final da incubação, 0,25 mL de amido de milho (10% p/v) de 0,1 M de acetato (pH 4,5) foram adicionados e incubados adicionalmente a 40 °C por 30 min. A glicose liberada foi avaliada utilizando o kit de ensaio de glicose Megazyme como descrito acima para o estudo de pancreatina.[00315] The stability and interaction study of starch hydrolase in the rumen was carried out as follows: 2.5 μL of alpha-glucosidase TG L- 2000 with 0.24 mL of cell-free rumen fluid and incubation at 40 °C for 4 hours. At the end of incubation, 0.25 mL of cornstarch (10% w/v) of 0.1 M acetate (pH 4.5) was added and further incubated at 40 °C for 30 min. Released glucose was assessed using the Megazyme glucose assay kit as described above for the pancreatin study.

[00316] Alfa-glucosidase e pancreatina porcina usadas individualmente produziram uma versão limitada de glicose de amido de milho (Tabela 7.1). A combinação de alfa-glucosidase TG L-2000 e pancreatina liberou uma quantidade de glicose 5,2 vezes maior do que a soma da liberação de glicose individual por cada uma das duas preparações enzimáticas (Tabela 7.1). Da mesma forma, quando Aclglu1 e Nfiglu1 foram combinadas com pancreatina sob as mesmas condições, o aumento da liberação de glicose foi de 8,3 vezes (Tabela 7.2) e 7,8 vezes (Tabela 7.3) em relação ao somatório das liberações individuais por Aclglu1 e pancreatina ou Nfiglu1 e pancreatina, respectivamente.[00316] Alpha-glucosidase and porcine pancreatin used individually produced a limited version of corn starch glucose (Table 7.1). The combination of alpha-glucosidase TG L-2000 and pancreatin released an amount of glucose 5.2 times greater than the sum of individual glucose release by each of the two enzyme preparations (Table 7.1). Likewise, when Aclglu1 and Nfiglu1 were combined with pancreatin under the same conditions, the increase in glucose release was 8.3-fold (Table 7.2) and 7.8-fold (Table 7.3) relative to the sum of individual releases per Aclglu1 and pancreatin or Nfiglu1 and pancreatin, respectively.

[00317] A estabilidade de pepsina das três alfa-glucosidases foi testada a pH 3,0 na presença de pepsina (Tabela 7.1). É evidente que a combinação de 2,5 μL de alfa-glicosidase TG L-2000 e a pancreatina aumentou a liberação de glicose por 7,3 vezes mesmo após pré- incubação com pepsina na ausência de substrato a pH 3,0 e 40 °C durante 2 h (Tabela 7.1). Para as alfa-glucosidases Aclglu1 e Nfiglu1, testadas sob as mesmas condições, o aumento da liberação de glicose pela combinação foi de 4,1 vezes (Tabela 7.2) e 6,9 vezes (Tabela 7.3). Todas as três alfa-glucosidases mostraram estabilidade de pepsina porque, apesar da pré-incubação com pepsina, todas elas ainda mostraram um efeito sinérgico quando combinadas com pancreatina no ensaio de mistura.[00317] The pepsin stability of the three alpha-glucosidases was tested at pH 3.0 in the presence of pepsin (Table 7.1). It is evident that the combination of 2.5 μL of alpha-glucosidase TG L-2000 and pancreatin increased glucose release by 7.3-fold even after pre-incubation with pepsin in the absence of substrate at pH 3.0 and 40°. C for 2 h (Table 7.1). For the alpha-glucosidases Aclglu1 and Nfiglu1, tested under the same conditions, the increase in glucose release by the combination was 4.1-fold (Table 7.2) and 6.9-fold (Table 7.3). All three alpha-glucosidases showed pepsin stability because despite pre-incubation with pepsin, they all still showed a synergistic effect when combined with pancreatin in the mixing assay.

[00318] Da mesma forma, foi avaliada a sinergia e a estabilidade das três alfa-glucosidases no fluido ruminal (Tabela 7.1 a 7.3). A Tabela 7.1 mostra que para alfa-glicosidase TG L-2000 adicionada ao fluido ruminal, a liberação de glicose aumentou 2,0 vezes em comparação com a soma da glicose liberada individualmente pela alfa- glicosidase TG L-2000 e por fluido ruminal; e com pré-incubação no fluido ruminal, a liberação de glicose na presença de TG L-2000 também aumentou 2,0 vezes em comparação com a liberação na ausência da alfa-glicosidase (Tabela 7.1), o que significa que a alfa- glicosidase TG L-2000 é estável no fluido ruminal. Para a alfa- glicosidase Aclglu1 e Nfiglu1, a sua presença resultou em um aumento da liberação de glicose de 2,0 e 2,8 vezes, respectivamente, para "tratamentos com pré-incubação e sem pré-incubação " (Tabela 7.2 - 7.3) com fluido ruminal. Tabela 7.1. Efeito sinérgico de alfa-glucosidase TG L-2000 de Aspergillus niger com pancreatina (Pan), atividade amilolítica no fluido ruminal e tolerância na presença de pepsina na liberação de glicose (G1) do amido de milho. O número de repetições (n) foi de 2 a 4. Tabela 7.2. Efeito sinérgico de alfa-glucosidase de Aspergillus clavatus (Aclglu1) com pancreatina (Pan), atividade amilolítica no fluido ruminal e tolerância na presença de pepsina na liberação de glicose (G1) de amido de milho.[00318] Likewise, the synergy and stability of the three alpha-glucosidases in rumen fluid was evaluated (Table 7.1 to 7.3). Table 7.1 shows that for alpha-glucosidase TG L-2000 added to rumen fluid, glucose release increased 2.0-fold compared to the sum of glucose released individually by alpha-glucosidase TG L-2000 and rumen fluid; and with pre-incubation in rumen fluid, glucose release in the presence of TG L-2000 also increased 2.0-fold compared to release in the absence of alpha-glucosidase (Table 7.1), meaning that alpha-glucosidase TG L-2000 is stable in rumen fluid. For the alpha-glucosidase Aclglu1 and Nfiglu1, their presence resulted in an increase in glucose release of 2.0- and 2.8-fold, respectively, for "pre-incubation and non-pre-incubation treatments" (Table 7.2 - 7.3 ) with rumen fluid. Table 7.1. Synergistic effect of alpha-glucosidase TG L-2000 from Aspergillus niger with pancreatin (Pan), amylolytic activity in ruminal fluid and tolerance in the presence of pepsin on the release of glucose (G1) from corn starch. The number of repetitions (n) was 2 to 4. Table 7.2. Synergistic effect of alpha-glucosidase from Aspergillus clavatus (Aclglu1) with pancreatin (Pan), amylolytic activity in ruminal fluid and tolerance in the presence of pepsin on the release of glucose (G1) from corn starch.

[00319] As condições de reação e de ensaio foram as mesmas que para a Tabela 7.1, com a diferença que foram usados 0 ou 50 μg de alfa-glucosidase Aclglu1 (Tabela 1) de A. clavatus. O número de repetições (n) foi de 2 a 4. Tabela 7.3. Efeito sinérgico de alfa-glucosidase de Neosartorya fischeri (Nfiglu1) com pancreatina (Pan), atividade amilolítica no fluido ruminal e tolerância na presença de pepsina na liberação de glicose (G1) do amido de milho.[00319] The reaction and assay conditions were the same as for Table 7.1, with the difference that 0 or 50 μg of Aclglu1 alpha-glucosidase (Table 1) from A. clavatus were used. The number of repetitions (n) was 2 to 4. Table 7.3. Synergistic effect of alpha-glucosidase from Neosartorya fischeri (Nfiglu1) with pancreatin (Pan), amylolytic activity in ruminal fluid and tolerance in the presence of pepsin on the release of glucose (G1) from corn starch.

[00320] As condições de reação e de ensaio foram as mesmas das descritas acima para a Tabela 7.1, com a diferença que foram usados 0 ou 50 μg de alfa-glucosidase Nfiglu1 de N. fischeri. O número de repetições (n) foi de 2 a 4. [00320] The reaction and assay conditions were the same as those described above for Table 7.1, with the difference that 0 or 50 μg of Nfiglu1 alpha-glucosidase from N. fischeri were used. The number of repetitions (n) was 2 to 4.

EXEMPLO 15EXAMPLE 15 Estabilidade de alfa-glucosidases fúngicas no fluido ruminal e interação com pancreatina na liberação de glicoseStability of fungal alpha-glucosidases in rumen fluid and interaction with pancreatin on glucose release

[00321] A mistura de pré-incubação continha 50 μg de cada uma das alfa-glucosidases fúngicas: TG L-2000, Aclglu1, Nfiglu1, TauSec098 e TauSec099 (Tabela 1) dissolvidas em 2.5 μL e 240 μL de fluido ruminal isento de células misturados em uma placa de 24 poços. Para controle não foram adicionadas alfa-glucosidases. As misturas foram incubadas a 40 °C por 4 horas. No final da incubação, 250 μL de pasta fluida de amido de milho (10% p/v, Sigma S4126) dissolvidos em 0,1 M de Mes, 5 mM de CaCl2 (pH 6) e 2,5 μL de pancreatina (Sigma P7545) em 0, 1% de NaCl, 2,5%, p/v) foram adicionados e a reação efetuada a 40 °C por 30 min (n=4). O sobrenadante obtido após a centrifugação foi diluído 10 vezes e a glicose liberada foi quantificada como descrito no Exemplo 13 usando o kit de ensaio de glicose Megazyme.[00321] The pre-incubation mixture contained 50 μg of each of the fungal alpha-glucosidases: TG L-2000, Aclglu1, Nfiglu1, TauSec098 and TauSec099 (Table 1) dissolved in 2.5 μL and 240 μL of cell-free rumen fluid mixed in a 24-well plate. For control, no alpha-glucosidases were added. The mixtures were incubated at 40 °C for 4 hours. At the end of incubation, 250 μL of cornstarch slurry (10% w/v, Sigma S4126) dissolved in 0.1 M Mes, 5 mM CaCl2 (pH 6) and 2.5 μL of pancreatin (Sigma P7545) in 0.1% NaCl, 2.5%, w/v) were added and the reaction carried out at 40 °C for 30 min (n=4). The supernatant obtained after centrifugation was diluted 10-fold and the released glucose was quantified as described in Example 13 using the Megazyme glucose assay kit.

[00322] A Figura 10 mostra que uma pré-incubação das cinco alfa- glucosidases em fluido ruminal a 40 °C por 4 h não causou perda de atividade em comparação com tratamento "sem pré-incubação". Tudo indica que mais glicose foi liberada em amostras pré-incubadas do que a liberada em amostras que não foram pré-incubadas (Figura 10). Isto pode ser uma indicação de que estas alfa-glicosidases foram interagindo com hidrolases de amido presentes no fluido ruminal que tinha um nível residual de substrato de amido.[00322] Figure 10 shows that a pre-incubation of the five alpha-glucosidases in rumen fluid at 40 ° C for 4 h did not cause loss of activity compared to "no pre-incubation" treatment. Everything indicates that more glucose was released in pre-incubated samples than was released in samples that were not pre-incubated (Figure 10). This may be an indication that these alpha-glucosidases were interacting with starch hydrolases present in rumen fluid that had a residual level of starch substrate.

Exemplo 16Example 16 Sinergia de cinco alfa-glucosidases com pancreatina na liberação de glicose a partir de amido de milho a pH 6,0Synergy of five alpha-glucosidases with pancreatin in the release of glucose from corn starch at pH 6.0

[00323] A mistura de reação continha 0,5 mL de pasta fluida de amido de milho (Sigma S4126) (10% p/v) em 0,1 M de Mes (pH 6,0) contendo 5 mM de CaCh, 50 μg de alfa-glucosidase em 2,5 μL e 0 ou 2,5 μL de solução de pancreatina (Sigma P7545, 2,5% p/v em 0,1% de NaCl). Para controle foi omitida alfa-glucosidase. A reação foi realizada a 40 °C por 60 min (n=4) e a glicose liberada foi quantificada utilizando o kit de ensaio de glicose descrito no Exemplo 13.[00323] The reaction mixture contained 0.5 mL of corn starch slurry (Sigma S4126) (10% w/v) in 0.1 M Mes (pH 6.0) containing 5 mM CaCh, 50 μg of alpha-glucosidase in 2.5 μL and 0 or 2.5 μL of pancreatin solution (Sigma P7545, 2.5% w/v in 0.1% NaCl). For control, alpha-glucosidase was omitted. The reaction was carried out at 40 °C for 60 min (n=4) and the released glucose was quantified using the glucose assay kit described in Example 13.

[00324] A Figura 11 mostra que houve produção limitada de glicose (0,67 mg/mL de mistura de reação) para o controle usando apenas pancreatina e sem enzima adicional. Quando foi usada apenas alfa- glucosidase, a liberação de glicose foi baixa, exceto para TG L-2000, que mostrou liberação de glicose (0,80 mg/mL de mistura de reação). Quando foram usadas em conjunto alfa-glucosidase e pancreatina, a liberação de glicose aumentou na faixa de 11 a 20 vezes, dependendo da quantidade de alfa-glicosidase usada. Isto ilustra o efeito sinérgico na liberação de glicose a partir de amido de milho que pode ser obtido quando qualquer uma das cinco alfa-glucosidases e a pancreatina são usadas.[00324] Figure 11 shows that there was limited glucose production (0.67 mg/mL of reaction mixture) for the control using only pancreatin and no additional enzyme. When only alpha-glucosidase was used, glucose release was low, except for TG L-2000, which showed glucose release (0.80 mg/mL of reaction mixture). When alpha-glucosidase and pancreatin were used together, glucose release increased in the range of 11 to 20 times, depending on the amount of alpha-glucosidase used. This illustrates the synergistic effect on glucose release from corn starch that can be obtained when any of the five alpha-glucosidases and pancreatin are used.

Exemplo 17Example 17 Atividade das alfa-glucosidases tratadas com pepsina a pH 2,5 e pH 6,0Activity of alpha-glucosidases treated with pepsin at pH 2.5 and pH 6.0

[00325] A mistura de reação continha 50 μg das cinco alfa- glucosidases de TG L-2000, Aclglu1, Nfiglu1, TauSec098 e TauSec099 (Tabela 1) em 2,5 μL, 75 μL de pepsina (Sigma P7000, solução de estoque 5000U/mL) e 1,5 mL de maltose (21,5 mg/mL) em 0,1 M de glicina-HCl com 5 mM de CaCl2 pH 2,5 ou em 0,1 M de Mes-NaOH com 5 mM de CaCh a pH 6,0. A reação foi realizada a 40 °C por 30 min. No final da reação, a mistura de reação foi então diluída 10 vezes e avaliada quanto a liberação de glicose utilizando o kit de ensaio de glicose Megazyme como descrito no Exemplo 13 acima.Tabela 8. Proporção de atividade a pH 2,5 para pH 6,0 para cinco alfa- glucosidases. A atividade a pH 6,0 é considerada como 100%. [00325] The reaction mixture contained 50 μg of the five alpha-glucosidases of TG L-2000, Aclglu1, Nfiglu1, TauSec098 and TauSec099 (Table 1) in 2.5 μL, 75 μL of pepsin (Sigma P7000, 5000U stock solution /mL) and 1.5 mL of maltose (21.5 mg/mL) in 0.1 M glycine-HCl with 5 mM CaCl2 pH 2.5 or in 0.1 M Mes-NaOH with 5 mM CaCh at pH 6.0. The reaction was carried out at 40 °C for 30 min. At the end of the reaction, the reaction mixture was then diluted 10-fold and assessed for glucose release using the Megazyme glucose assay kit as described in Example 13 above. Table 8. Ratio of activity at pH 2.5 to pH 6 .0 for five alpha-glucosidases. Activity at pH 6.0 is considered 100%.

[00326] A Tabela 8 mostra que todas as quatro glucosidases foram mais ativas a pH 2,5 do que a pH 6,0 na presença de pepsina, exceto para Nfiglu1, que teve 84% de atividade a pH 2,5 em comparação com pH 6,0. Assim, estas enzimas mostram utilidade como enzimas de ração para ruminantes, uma vez que foram estáveis e mantiveram atividade no fluido ruminal a 40 °C por 4 horas.[00326] Table 8 shows that all four glucosidases were more active at pH 2.5 than at pH 6.0 in the presence of pepsin, except for Nfiglu1, which had 84% activity at pH 2.5 compared to pH 6.0. Thus, these enzymes show usefulness as feed enzymes for ruminants, as they were stable and maintained activity in rumen fluid at 40 °C for 4 hours.

Exemplo 18Example 18 Utilização de glicoamilases em combinação com metalopeptidases P14L e P7L para aumentar a digestão de matéria seca e produção de gás na fermentação ruminal em milhoUse of glucoamylases in combination with P14L and P7L metallopeptidases to increase dry matter digestion and gas production in rumen fermentation in corn

[00327] Os efeitos das 4 glicoamilases (CS4, TrGA, AfuGA, FvGA) e duas metalopeptidases/proteases (P14L, P7L) e suas combinações sobre a digestão de matéria seca (DMS) e produção de gás em 0, 3, 7, 9, 12 e 24 horas de incubação/fermentação foram avaliados como descrito abaixo. Foram aplicadas glicoamilases e proteases a uma concentração de 0,25 mg/g.[00327] The effects of 4 glucoamylases (CS4, TrGA, AfuGA, FvGA) and two metallopeptidases/proteases (P14L, P7L) and their combinations on dry matter digestion (DMS) and gas production in 0, 3, 7, 9, 12 and 24 hours of incubation/fermentation were evaluated as described below. Glycoamylases and proteases were applied at a concentration of 0.25 mg/g.

[00328] Os efeitos das 4 glicoamilases (CS4, TrGA, AfuGA, FvGA) e duas metalopeptidases proteases (P14L, P7L) e suas combinações foram avaliados na fermentação microbiana ruminal utilizando milho dentado como substrato em cultura de lote in vitro de fluido ruminal. Os experimentos foram baseados no protocolo estabelecido e publicado anteriormente (Adesogan, A.T., Krueger, N.A., e Kim, S.C. 2005. Anim. Feed Sci. Technol. 123: 211-223). O milho dentado utilizado neste sistema de fermentação de lote in vitro tinha 88,8% de matéria seca (MS), 9,3% de proteína bruta (PB), 3,2% de fibra em detergente ácido (FDA), 8,3% de fibra em detergente neutro tratada com amilase (FDNa), 76,9% de carboidratos não fibrosos (CNF), 88,0% de nutrientes digestíveis totais (NDT). O mesmo foi moído para 4 mm. Todas as enzimas foram aplicadas a 0,25 mg de proteína de enzima por grama de milho dentado em três rodadas separadas com 4 replicações por tratamento e a fermentação ou incubação durou 0, 3, 7, 9, 12 e 24 h, a 39°C. O milho dentado moído foi pesado em 6 replicações por rodada nos sacos de filtro F57 (ANKOM Technology, Macedon, NY). Antes da colocação nos frascos, as enzimas foram diluídas em 0,1 M de tampão citrato-fosfato (pH 6,0) e adicionadas a 0,5 g de milho dentado moídos em sacos F57 (Krueger, N. A. e A. T. Adesogan. 2008. Anim. Feed Sci. Tech. 145: 84-94; Goering, H. K. e P. J. Van Soest. 1970. Agric. Handbook No. 379. ARS USDA, Washington, DC, página 20). Os sacos de filtro F57 foram selados com um Uline Tabletop Poly Bag Sealer (Impulse® tipo AIE-200) e colocados imediatamente nos recipientes de fermentação que eram frascos de soro de 160 mL. Frascos em branco que consistem de apenas um saco de filtro, bem como controles contendo apenas milho dentado moído sem enzima foram também incluídos. Fluido ruminal foi aspirado representativamente de três vacas leiteiras, Holstein lactantes e ruminalmente canuladas 2 a 3 h após o consumo de ração total misturada (TMR). A composição de ingrediente TMR alimentada às vacas leiteiras fistulizadas com base na matéria seca consistia de 38,2% de silagem de milho, 27,3% de milho com casca moído, 14,5% de farinha de soja com 44% de proteína bruta, 9,1% de polpa cítrica, 4,5% pré-mistura de engorda em confinamento, 4,0% de feno de alfafa em meia florescência, 1,8% de suplemento energético (MS Specialty Nutrition, Dundee, IL), 0,5% de Novasil (BASF, Alemanha), 100% no total.[00328] The effects of 4 glucoamylases (CS4, TrGA, AfuGA, FvGA) and two metallopeptidase proteases (P14L, P7L) and their combinations were evaluated on ruminal microbial fermentation using dent corn as substrate in in vitro batch culture of rumen fluid. The experiments were based on the previously established and published protocol (Adesogan, A.T., Krueger, N.A., and Kim, S.C. 2005. Anim. Feed Sci. Technol. 123: 211-223). The dent corn used in this in vitro batch fermentation system had 88.8% dry matter (DM), 9.3% crude protein (CP), 3.2% acid detergent fiber (ADF), 8. 3% neutral detergent fiber treated with amylase (FDNa), 76.9% non-fibrous carbohydrates (CNF), 88.0% total digestible nutrients (TDN). It was milled to 4 mm. All enzymes were applied at 0.25 mg of enzyme protein per gram of dent corn in three separate rounds with 4 replicates per treatment and fermentation or incubation lasted for 0, 3, 7, 9, 12 and 24 h, at 39° W. Ground dent corn was weighed in 6 replicates per round into F57 filter bags (ANKOM Technology, Macedon, NY). Before placing in the vials, the enzymes were diluted in 0.1 M citrate-phosphate buffer (pH 6.0) and added to 0.5 g of ground dent corn in F57 bags (Krueger, N. A. and A. T. Adesogan. 2008. Anim. Feed Sci. Tech. 145: 84-94; Goering, H. K. and P. J. Van Soest. Agric. The F57 filter bags were sealed with a Uline Tabletop Poly Bag Sealer (Impulse® type AIE-200) and immediately placed into the fermentation vessels which were 160 mL serum bottles. Blank bottles consisting of only a filter bag as well as controls containing only ground dent corn without enzyme were also included. Ruminal fluid was aspirated representatively from three lactating, ruminally cannulated Holstein dairy cows 2 to 3 h after consumption of total mixed ration (TMR). The TMR ingredient composition fed to fistulized dairy cows on a dry matter basis consisted of 38.2% corn silage, 27.3% ground shelled corn, 14.5% soybean meal with 44% crude protein , 9.1% citrus pulp, 4.5% feedlot premix, 4.0% mid-bloom alfalfa hay, 1.8% energy supplement (MS Specialty Nutrition, Dundee, IL), 0.5% from Novasil (BASF, Germany), 100% in total.

[00329] O fluido ruminal coletado foi filtrado através de quatro camadas de morim antes de misturar com saliva artificial pré-aquecida (39 °C). A composição da saliva artificial incluiu uma solução micromineral de CaC^2H2O, MnCh4H2O, CoCh6H2O, FeC^6H2O; uma solução macromineral de Na2HPO^12H2O, KH2PO4, MgSO4^7H2O; uma solução tampão de (NH4)2HCO3 e NaHCOa; uma solução de peptona tripticase (Tryptone, Sigma-Aldrich, Louise St, MO, E.U.A.); resazurina (indicador de oxirredução) e uma solução de redução contendo cisteína HCl, 1 M NaOH, Na2S^9H2O e água destilada. A proporção de volume entre o fluido ruminal e a saliva artificial é de 1:2. O fluido ruminal tamponado (52 mL) foi adicionado a frascos de soro de 160 mL contendo os sacos de filtro e os frascos foram fechados com rolhas de borracha e selados com selos de alumínio. Os frascos foram incubados por 0, 3, 7, 9, 12 e 24 h, a 39 °C em uma incubadora de ar forçado. No final da incubação, os sacos de filtro contendo os resíduos foram secos no forno a 60 °C durante 48 h, e pesados para quantificar a DMS. A pressão de gás dentro das garrafas foi medida com um transdutor de pressão e posteriormente convertida em volume de gás em 0, 3, 7, 9, 12 e 24 h de incubação. Foi utilizada a seguinte fórmula para a conversão da pressão de gás para volume de gás: Volume de gás (mL) = (pressão de gás (psi) * 4,8843) + 3,1296[00329] The collected ruminal fluid was filtered through four layers of cheesecloth before mixing with pre-heated artificial saliva (39 °C). The composition of the artificial saliva included a micromineral solution of CaC^2H2O, MnCh4H2O, CoCh6H2O, FeC^6H2O; a macromineral solution of Na2HPO^12H2O, KH2PO4, MgSO4^7H2O; a buffer solution of (NH4)2HCO3 and NaHCOa; a trypticase peptone solution (Tryptone, Sigma-Aldrich, Louise St, MO, USA); resazurin (redox indicator) and a reducing solution containing cysteine HCl, 1 M NaOH, Na2S^9H2O and distilled water. The volume ratio between rumen fluid and artificial saliva is 1:2. Buffered rumen fluid (52 mL) was added to 160 mL serum bottles containing the filter bags and the bottles were closed with rubber stoppers and sealed with aluminum seals. The flasks were incubated for 0, 3, 7, 9, 12 and 24 h at 39 °C in a forced air incubator. At the end of the incubation, the filter bags containing the residues were dried in the oven at 60 °C for 48 h, and weighed to quantify DMS. The gas pressure inside the bottles was measured with a pressure transducer and subsequently converted into gas volume at 0, 3, 7, 9, 12 and 24 h of incubation. The following formula was used to convert gas pressure to gas volume: Gas volume (mL) = (gas pressure (psi) * 4.8843) + 3.1296

[00330] A equação foi formulada com base nas condições do experimento, utilizando frascos de soro de 160 mL e é utilizada para todos os experimentos da Tabela 9.1-9.2.[00330] The equation was formulated based on the experiment conditions, using 160 mL serum bottles and is used for all experiments in Table 9.1-9.2.

[00331] Análise estatística: Para todos os experimentos no Exemplo 18, os dados coletados foram analisados utilizando-se o procedimento GLIMMIX do SAS (versão 9.1; SAS Institute, Cary, NC). Os experimentos foram concebidos como projeto de bloco completamente aleatorizado, onde cada rodada foi considerada um bloco. A dose foi usada como efeito fixo no modelo quando as enzimas foram testadas a diferentes doses. A variável de resposta incluiu DMS in vitro e produção de gás. A rodada foi considerada um fator aleatório. Os efeitos fixos do modelo incluíram o tempo de amostragem para os parâmetros de fermentação medidos em diferentes horas de pós- incubação. O procedimento UNIVARIATE do SAS foi utilizado para testar os resíduos de valores atípicos e normalidade antes das análises finais serem realizadas. Os efeitos do tratamento foram declarados significativos a P < 0,05, enquanto quaisquer tendências foram definidas a 0,05 < P < 0,10.[00331] Statistical analysis: For all experiments in Example 18, the collected data were analyzed using the SAS GLIMMIX procedure (version 9.1; SAS Institute, Cary, NC). The experiments were designed as a completely randomized block design, where each round was considered a block. Dose was used as a fixed effect in the model when enzymes were tested at different doses. The response variable included in vitro DMS and gas production. The round was considered a random factor. The fixed effects of the model included sampling time for fermentation parameters measured at different post-incubation hours. The SAS UNIVARIATE procedure was used to test residuals for outliers and normality before final analyzes were performed. Treatment effects were declared significant at P < 0.05, while any trends were defined at 0.05 < P < 0.10.

[00332] Os resultados da avaliação das quatro glicoamilases (CS4, TrGA, AfuGA, FvGA) e duas metalopeptidases/protease (P14L, P7L) e suas combinações sobre a digestão de matéria seca (DMS) e produção de gás em 0, 3, 7, 9, 12 e 24 horas de incubação/fermentação podem ser encontrados nas Tabelas 9.1.1 a 9.1.4. Foram aplicadas glicoamilases e proteases a uma concentração de 0,25 mg/g.[00332] The results of the evaluation of the four glucoamylases (CS4, TrGA, AfuGA, FvGA) and two metallopeptidases/protease (P14L, P7L) and their combinations on dry matter digestion (DMS) and gas production in 0, 3, 7, 9, 12 and 24 hours of incubation/fermentation can be found in Tables 9.1.1 to 9.1.4. Glycoamylases and proteases were applied at a concentration of 0.25 mg/g.

[00333] Tratamento CS4+/-P14L: Não foram observados efeitos claros sobre a DMS em resposta à suplementação com CS4 em 0, 3 e 7 h de incubação ou fermentação (Tabela 9.1.1). No entanto, a DMS foi melhorada em 56, 36 e 25% às 9, 12 e 24 h de incubação, respectivamente (P < 0,05). Da mesma forma, a protease P14L melhorou a DMS em 79, 59, e 32% às 9, 12 e 24 h de incubação, respectivamente (P < 0,05). A combinação de CS4 e P14L melhorou a DMS em 109, 86 e 45% às 9, 12 e 24 h de incubação, respectivamente (P < 0,05).[00333] CS4+/-P14L Treatment: No clear effects on DMS were observed in response to CS4 supplementation at 0, 3 and 7 h of incubation or fermentation (Table 9.1.1). However, DMS was improved by 56, 36 and 25% at 9, 12 and 24 h of incubation, respectively (P < 0.05). Similarly, P14L protease improved DMS by 79, 59, and 32% at 9, 12, and 24 h of incubation, respectively (P < 0.05). The combination of CS4 and P14L improved DMS by 109, 86 and 45% at 9, 12 and 24 h of incubation, respectively (P < 0.05).

[00334] Tratamento TrGA+/-P14L: A DMS foi aumentada em 62% e 79% com TrGA e P14L às 9 h de incubação, respectivamente (Tabela 9.1.2). A combinação de ambas as enzimas às 9 h de incubação aumentou a DMS para 124% em comparação com o controle (P < 0,01).[00334] TrGA+/-P14L Treatment: DMS was increased by 62% and 79% with TrGA and P14L at 9 h of incubation, respectively (Table 9.1.2). The combination of both enzymes at 9 h of incubation increased DMS to 124% compared to control (P < 0.01).

[00335] Tratamento AfuGA+/-P14: Os efeitos da combinação de AfuGA e P14L sobre os parâmetros de fermentação ruminal são apresentados na Tabela 9.1.3. A DMS foi aumentada às 7, 9, 12 e 24 h de incubação com AfuGA, P14L e a combinação (P < 0,05). Os efeitos de ambas as enzimas em combinação são evidentes, já que aumentaram a DMS em 119, 146, 108 e 60% às 7, 9, 12, e 24 h de incubação, respectivamente, e a magnitude dos efeitos foram maiores que as enzimas fornecidas isoladamente (P < 0,05).[00335] AfuGA+/-P14 Treatment: The effects of the combination of AfuGA and P14L on rumen fermentation parameters are presented in Table 9.1.3. DMS was increased at 7, 9, 12 and 24 h of incubation with AfuGA, P14L and the combination (P < 0.05). The effects of both enzymes in combination are evident, as they increased DMS by 119, 146, 108, and 60% at 7, 9, 12, and 24 h of incubation, respectively, and the magnitude of the effects were greater than the enzymes supplied alone (P < 0.05).

[00336] Tratamento FvGA+/-P14L: Os efeitos da combinação de FvGA e P14L sobre os parâmetros de fermentação ruminal são apresentados na Tabela 9.1.4. Não foram observados efeitos sobre a DMS em resposta a suplementação de FvGA às 0, 3 e 7 h de incubação; no entanto, a DMS foi melhorada em 42, 79 e 93% às 9 h de incubação (P < 0,01) com FvGA, P14L, e sua combinação, respectivamente.[00336] FvGA+/-P14L Treatment: The effects of the combination of FvGA and P14L on rumen fermentation parameters are presented in Table 9.1.4. No effects on DMS were observed in response to FvGA supplementation at 0, 3 and 7 h of incubation; however, DMS was improved by 42, 79, and 93% at 9 h of incubation (P < 0.01) with FvGA, P14L, and their combination, respectively.

[00337] Foi verificado que todas as quatro glicoamilases, a metalopeptidase P14L e suas combinações aumentam significativamente a produção de gás pelo menos às 12 e 24 h de incubação (P < 0,05) (Tabelas 9.1.1 a 9.14).[00337] It was found that all four glucoamylases, metallopeptidase P14L and their combinations significantly increase gas production at least at 12 and 24 h of incubation (P < 0.05) (Tables 9.1.1 to 9.14).

[00338] Tratamento CS4, TrGA, AfuGA, FvGA +/- P7L: Os efeitos de combinar as 4 glicoamilases (CS4, TrGA, AfuGA, FvGA) com a metalopeptidase/protease P7L sobre a DMS às 0, 3, 7, 9, 12 e 24 h de incubação/fermentação são apresentados nas Tabelas 9.2.1 a 9.2.4. Tal como nas Tabelas 9.1.1 a 9.1.4, ambas as glicoamilases e protease foram aplicadas a uma concentração de 0,25 mg/g.[00338] CS4, TrGA, AfuGA, FvGA +/- P7L Treatment: The effects of combining the 4 glucoamylases (CS4, TrGA, AfuGA, FvGA) with the metallopeptidase/protease P7L on DMS at 0, 3, 7, 9, 12 and 24 h of incubation/fermentation are presented in Tables 9.2.1 to 9.2.4. As in Tables 9.1.1 to 9.1.4, both glucoamylases and protease were applied at a concentration of 0.25 mg/g.

[00339] Com base nos resultados observados, são observados efeitos sinérgicos ou adicionais das 4 glicoamilases em combinação com P7L, independentemente do tempo de incubação. Efeitos adicionais com a combinação de CS4 e P7L melhoraram a DMS em 49, 112, 72, 60, 55 e 19% às 0, 3, 7, 9, 12, e 24 h de incubação, respectivamente (Tabela 9.2.1; P < 0,01). A DMS foi também aumentada em 41, 109, 73, 64, 60 e 25% às 0, 3, 7, 9, 12 e 24 h, respectivamente, com a combinação de TrGA e P7L (Tabela 9.2.2; P < 0,01).[00339] Based on the results observed, synergistic or additional effects of the 4 glucoamylases are observed in combination with P7L, regardless of the incubation time. Additional effects with the combination of CS4 and P7L improved DMS by 49, 112, 72, 60, 55, and 19% at 0, 3, 7, 9, 12, and 24 h of incubation, respectively (Table 9.2.1; P < 0.01). DMS was also increased by 41, 109, 73, 64, 60 and 25% at 0, 3, 7, 9, 12 and 24 h, respectively, with the combination of TrGA and P7L (Table 9.2.2; P < 0 .01).

[00340] A combinação de AfuGA (Tabela 9.2.3) e P7L melhorou a DMS em 23, 116, 85, 66, 58 e 21% às 0, 3, 7, 9, 12 e 24 h, respectivamente (P < 0,01). Enquanto a eficácia de FvGA em combinação com P7L foi eficaz na melhoria de DMS às 3, 7, 9 e 12 h de incubação, não são observados efeitos às 0 e 24 h, em comparação com o Controle (Tabela 9.2.4). A melhoria de DMS foi ainda apoiada pelo maior volume de gás acumulado observado na maioria dos pontos no tempo de incubação para todas as 4 glicoamilases, a protease P7L e suas combinações (P < 0,05) (Tabelas 9.2.1 a 9.2.4). Tabela 9.1. 1. Efeitos de CS4 e protease (P14L) e sua combinação na digestibilidade in vitro de matéria seca e produção de gás.a-c As médias dentro de uma linha com diferentes sobrescritos diferem (P < 0,05). Tabela 9.1. 2. Efeitos de TrGA e protease (P14L) e sua combinação na digestibilidade in vitro da matéria seca e produção de gás.a-c As médias dentro de uma linha com diferentes sobrescritos diferem (P < 0,05). Tabela 9,1. 3. Efeitos de AfuGA e protease (P14L) e sua combinação na digestibilidade in vitro da matéria seca e produção de gás. a-c As médias dentro de uma linha com diferentes sobrescritos diferem entre si (P < 0,05). Tabela 9.1. 4. Efeitos de FvGA e protease (P14L) e sua combinação na digestibilidade in vitro da matéria seca e produção de gás.a-c As médias dentro de uma linha com diferentes sobrescritos diferem (P < 0,05). Tabela 9.2.1 Efeitos de CS4 e protease (P7L) e sua combinação na digestibilidade in vitro da matéria seca e produção de gás.a-c As médias dentro de uma linha com diferentes sobrescritos diferem (P < 0,05). Tabela 9.2. 2. Efeitos de TrGA e protease (P7L) e sua combinação na digestibilidade in vitro da matéria seca e produção de gás.a-c As médias dentro de uma linha com diferentes sobrescritos diferem (P < 0,05). Tabela 9.2. 3. Efeitos de AfuGA e protease (P7L) e sua combinação na digestibilidade in vitro da matéria seca e produção de gás. a-c As médias dentro de uma linha com sobrescritos diferente diferem (P < 0,05). Tabela 9.2. 4. Efeitos de FvGA e protease (P7L) e sua combinação na digestibilidade in vitro da matéria seca e produção de gás.a-c As médias dentro de uma linha com sobrescritos diferente diferem (P < 0,05). [00340] The combination of AfuGA (Table 9.2.3) and P7L improved DMS by 23, 116, 85, 66, 58 and 21% at 0, 3, 7, 9, 12 and 24 h, respectively (P < 0 .01). While the efficacy of FvGA in combination with P7L was effective in improving DMS at 3, 7, 9 and 12 h of incubation, no effects are observed at 0 and 24 h, compared to the Control (Table 9.2.4). The DMS improvement was further supported by the greater volume of accumulated gas observed at most incubation time points for all 4 glucoamylases, the P7L protease and their combinations (P < 0.05) (Tables 9.2.1 to 9.2.4 ). Table 9.1. 1. Effects of CS4 and protease (P14L) and their combination on in vitro dry matter digestibility and gas production.ac Means within a line with different superscripts differ (P < 0.05). Table 9.1. 2. Effects of TrGA and protease (P14L) and their combination on in vitro dry matter digestibility and gas production.ac Means within a line with different superscripts differ (P < 0.05). Table 9.1. 3. Effects of AfuGA and protease (P14L) and their combination on in vitro dry matter digestibility and gas production. ac The means within a row with different superscripts differ from each other (P < 0.05). Table 9.1. 4. Effects of FvGA and protease (P14L) and their combination on in vitro dry matter digestibility and gas production.ac Means within a line with different superscripts differ (P < 0.05). Table 9.2.1 Effects of CS4 and protease (P7L) and their combination on in vitro dry matter digestibility and gas production.ac Means within a line with different superscripts differ (P < 0.05). Table 9.2. 2. Effects of TrGA and protease (P7L) and their combination on in vitro dry matter digestibility and gas production.ac Means within a line with different superscripts differ (P < 0.05). Table 9.2. 3. Effects of AfuGA and protease (P7L) and their combination on in vitro dry matter digestibility and gas production. ac Means within a row with different superscripts differ (P < 0.05). Table 9.2. 4. Effects of FvGA and protease (P7L) and their combination on in vitro dry matter digestibility and gas production.ac Means within a line with different superscripts differ (P < 0.05).

Exemplo 19Example 19 Hidrólise de maltose por glicoamilasesMaltose hydrolysis by glucoamylases

[00341] Tipicamente, é a glicose que é absorvida em animais. A maltose é um dissacarídeo formado a partir de duas unidades de glicose. Assim, a maltose precisa ser hidrolisada para monômeros de glicose para ser absorvida. É vantajoso que uma glicoamilase tenha elevada atividade catalítica na maltose de substrato para além de outras propriedades preferidas para uso como uma enzima de aditivo de ração. De preferência, uma glicoamilase deve ter pelo menos 20% da atividade na maltose de substrato, quando comparada com a atividade de TrGA sob as condições de teste aqui descritas.[00341] Typically, it is glucose that is absorbed in animals. Maltose is a disaccharide formed from two glucose units. Thus, maltose needs to be hydrolyzed to glucose monomers to be absorbed. It is advantageous for a glucoamylase to have high catalytic activity on the substrate maltose in addition to other properties preferred for use as a feed additive enzyme. Preferably, a glucoamylase should have at least 20% activity on the substrate maltose as compared to the activity of TrGA under the test conditions described herein.

[00342] A atividade de glicoamilase na maltose foi determinada como se segue. Foi preparada uma mistura de reação que continha 2% (p/v) ou 8% (p/v) de maltose (M-5885, Sigma) e 10 μg de glicoamilase em 50 mM de Mes-NaOH (pH 6,0) contendo 5 mM de CaCl2, em um volume final de 0,05 mL em uma microplaca de 96 poços. Cada reação de glicoamilase-maltose foi repetida em triplicado.[00342] Glucoamylase activity on maltose was determined as follows. A reaction mixture containing 2% (w/v) or 8% (w/v) maltose (M-5885, Sigma) and 10 μg glucoamylase in 50 mM Mes-NaOH (pH 6.0) was prepared. containing 5 mM CaCl2, in a final volume of 0.05 mL in a 96-well microplate. Each glucoamylase-maltose reaction was repeated in triplicate.

[00343] A reação foi realizada a 40 °C durante 20 minutos, o que estava na gama linear no que toca à liberação de glicose. A reação foi realizada em uma máquina de PCR a 95 °C durante 5 minutos. Após resfriamento até à temperatura ambiente (23 °C), 10 μL da mistura de reação que foi diluída para uma concentração na faixa de 0,5 a 0,9 mg de glicose por mL foram misturados com 0,24 mL de reagente GOPOD (D-Glucose Assay Kit, GOPOD Format da Megazyme) em uma microplaca. A mistura foi então incubada a 50 °C durante 20 min e foi lida a absorbância a 510 nm. Foi usado o padrão de glicose do fabricante para criar uma curva padrão de calibração.[00343] The reaction was carried out at 40 °C for 20 minutes, which was in the linear range with regard to glucose release. The reaction was carried out in a PCR machine at 95 °C for 5 minutes. After cooling to room temperature (23 °C), 10 μL of the reaction mixture that was diluted to a concentration in the range of 0.5 to 0.9 mg of glucose per mL was mixed with 0.24 mL of GOPOD reagent ( D-Glucose Assay Kit, Megazyme's GOPOD Format) on a microplate. The mixture was then incubated at 50 °C for 20 min and the absorbance at 510 nm was read. The manufacturer's glucose standard was used to create a standard calibration curve.

[00344] Os dados da Tabela 10 mostram que todas as glicoamilases testadas tiveram atividade na maltose em condições semelhantes ou próximas às encontradas em condições digestivas in vivo, tais como um pH quase neutro de 6,0 pH.[00344] The data in Table 10 show that all glucoamylases tested had activity on maltose under conditions similar to or close to those found in in vivo digestive conditions, such as an almost neutral pH of 6.0 pH.

[00345] Foi observado que AnGA foi uma exceção, na medida em que sobre o substrato maltose sob estas condições de teste. AnGA, portanto, não é uma glicoamilase adequada para uso como aqui descrito.Tabela 10. Hidrólise de maltose por 4 glicoamilases a duas concentrações de maltose e pH 6,0.*A atividade de TrGA em maltose foi tratada como 100%.[00345] It was observed that AnGA was an exception, in that it was on the maltose substrate under these test conditions. AnGA, therefore, is not a suitable glucoamylase for use as described here. Table 10. Hydrolysis of maltose by 4 glucoamylases at two concentrations of maltose and pH 6.0. *TrGA activity in maltose was treated as 100%.

Claims

1. Método para preparar uma ração para melhorar a digestibilidade de amido e o rendimento de glicose em um ruminante, caracterizado pelo fato de que compreende adicionar uma composição de aditivo de ração compreendendo uma enzima glicoamilase (EC 3.2.1.3) derivada de Thrichoderma reesei, sendo que a referida glicoamilase tem: (a) pelo menos 20% de atividade a um pH inferior ou igual a 3 na presença de pepsina em comparação com a atividade da glicoamilase a pH 6 na presença de pepsina, (b) a referida glicoamilase é ativa em pelo menos duas de três câmaras digestivas de um ruminante compreendendo um rúmen, um abomaso e um intestino delgado, e (c) a glicoamilase funciona com enzimas digestivas presentes nas câmaras digestivas do ruminante para aumentar a digestibilidade de amido e o rendimento de glicose.1. Method for preparing a feed for improving starch digestibility and glucose yield in a ruminant, characterized in that it comprises adding a feed additive composition comprising a glucoamylase enzyme (EC 3.2.1.3) derived from Thrichoderma reesei, said glucoamylase having: (a) at least 20% activity at a pH of less than or equal to 3 in the presence of pepsin compared to the activity of glucoamylase at pH 6 in the presence of pepsin, (b) said glucoamylase is active in at least two of three digestive chambers of a ruminant comprising a rumen, an abomasum and a small intestine, and (c) glucoamylase functions with digestive enzymes present in the ruminant's digestive chambers to increase starch digestibility and glucose yield .