BR112019002417B1 - Cristalização de glicosídeos de esteviol - Google Patents

Abstract

Um método para purificar rebaudiosídeo M, cujo método compreende: (a) fornecer uma solução que compreende rebaudiosídeo M em uma concentração de pelo menos cerca de 10 g/l e em um grau de pureza de pelo menos cerca de 10 % em peso em uma base seca; e (b) cristalizar, a partir da solução, uma composição de alto grau de pureza que compreende rebaudiosídeo M, para, através disso, purificar rebaudiosídeo M.

Description

Campo

[0001] A presente invenção se refere a um método para purificar rebaudiosídeo M e a uma composição que compreende rebaudiosídeo M obtenível pelo método.

Antecedentes

[0002] As folhas da erva perene, Stevia rebaudiana Bert., acumulam quantidades de compostos intensamente adocicados conhecidos como glicosídeos de esteviol. Embora a função biológica desses compostos não seja clara, eles têm importância comercial como adoçantes alternativos de alta potência.

[0003] Esses glicosídeos de esteviol adocicados têm propriedades sensoriais e funcionais que aparentam ser superiores àquelas de muitos adoçantes de alta potência. Além disso, estudos sugerem que o esteviosídeo pode reduzir níveis de glicose sanguínea em diabéticos do Tipo II e pode reduzir a pressão sanguínea em pacientes com hipertensão moderada.

[0004] Os glicosídeos de esteviol se acumulam nas folhas de Stevia onde eles podem compreender de 10 a 20%do peso seco das folhas. O esteviosídeo e o rebaudiosídeo A são tanto termoestáveis quanto estáveis em pH e adequados para uso em bebidas gasosas e muitos outros alimentos. O esteviosídeo é entre 110 e 270 vezes mais doce que a sacarose, o rebaudiosídeo A entre 150 e 320 vezes mais doce que a sacarose. Além disso, o rebaudiosídeo D também é um adoçante de glicosídeo de diterpeno de alta potência que se acumula nas folhas da Stevia. Ele pode ser cerca de 200 vezes mais doce do que a sacarose. O rebaudiosídeo M é um adoçante de glicosídeo de diterpeno de alta potência adicional. Ele está presente em quantidades residuais em determinadas folhas de variedades de Stevia, mas foi sugerido que teria um perfil de paladar superior.

[0005] Os padrões atuais do Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA) exigem que uma quantidade total de glicosídeos de esteviol seja purificada a 95%ou mais.

[0006] Os métodos existentes para purificação de rebaudiosídeo A dependem das etapas de purificação repetida que incluem cromatografia, de uma operação demorada e dispendiosa e do uso de solventes orgânicos. O uso de solventes orgânicos exige que um equipamento complexo e dispendioso, como denominado, por exemplo, equipamento livre de explosão deva ser usado. A necessidade de regenerar os solventes orgânicos e ações que precisam ser tomadas para reduzir seu impacto ambiental devido ao escape de solvente aumentam os custos.

[0007] Esforços anteriormente relatados para purificar a rebaudiosídeo A de misturas de rebaudiosídeo A e esteviosídeo exigem diversas etapas de purificação repetidas. A Patente US n° 5.962.678 revela a recristalização de rebaudiosídeo A com o uso de uma solução de metanol anidro para obter uma rebaudiosídeo A 80% pura. Repetindo-se a recristalização com metanol anidro diversas vezes, a pureza de rebaudiosídeo A pode ser aumentada em mais de 95%. A Publicação de Patente US n° 2006/0083838 revela a purificação de rebaudiosídeo A através de recristalização com um solvente que compreende etanol e entre 4 e 15%de água. O Pedido de Patente Japonesa n°55- 23756 revela um método para purificar rebaudiosídeo A e esteviosídeo por cristalização a partir de etanol aquoso (>70%) para obter um rebaudiosídeo A 80%puro. A Publicação de Patente US n° 2007/0082103 revela um método para purificar rebaudiosídeo A por recristalização a partir de etanol aquoso, afirmando que uma recristalização de duas etapas a partir de rebaudiosídeo cru (60%) resulta na formação de >rebaudiosídeo 98% puro a 97%de rendimento. Os documentos WO2007/149672 e WO2011/082288 revelam métodos de cristalização de etapa única com o uso de solventes orgânicos.

[0008] Esses métodos da técnica anterior, no entanto, não fornecem uma composição de glicosídeo de esteviol substancialmente pura nem uma composição de rebaudiosídeo de pureza suficiente usando apenas uma única etapa de recristalização que tem capacidade para satisfazer padrões atuais de JECFA e exige tipicamente o uso de cromatografia e de solventes orgânicos. Ademais, não foram relatados tais métodos de recuperação em relação à purificação de rebaudiosídeo M.

[0009] Consequentemente, há uma necessidade de um método simples, eficaz e econômico para preparar composições de glicosídeo de esteviol substancialmente puras, que reduzem de modo ideal a necessidade de cromatografia e/ou do uso de solventes orgânicos.

Sumário

[0010] A presente invenção tem como base a constatação de que o rebaudiosídeo M (rebM) pode ser cristalizado diretamente a partir de uma solução de água que compreende aquele glicosídeo de esteviol. Essa cristalização direta permite que uma composição de rebM com alto grau de pureza, como uma composição substancialmente pura de rebM, seja alcançada potencialmente em uma operação de unidade simples, tipicamente sem a necessidade de cromatografia de adsorção (também denominada como “cromatografia de eluição de ligação”) e/ou sem a necessidade do uso de solventes orgânicos.

[0011] Consequentemente, a invenção aborda a necessidade de fornecer um método para purificar uma composição de glicosídeo de esteviol que compreende rebM para obter uma composição que tem uma maior pureza de rebM e, de preferência, com um alto rendimento.

[0012] De acordo com a invenção, é assim fornecido um método para purificar rebaudiosídeo M, cujo método compreende: (a) fornecer uma solução que compreende rebaudiosídeo M em uma concentração de pelo menos cerca de 10 g/l e em um grau de pureza de pelo menos cerca de 10% em peso em uma base seca; e (b) cristalizar, a partir da solução, uma composição de alto grau de pureza que compreende rebaudiosídeo M, para, através disso, purificar o rebaudiosídeo M.

[0013] A invenção também fornece: - um método para purificar rebaudiosídeo M, cujo método compreende purificar o rebaudiosídeo M substancialmente na ausência de um solvente orgânico; - um método para purificar rebaudiosídeo M, cujo método compreende purificar o rebaudiosídeo M na ausência de uma etapa de cromatografia de adsorção; e - uma composição que compreende rebaudiosídeo M obtenível por Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores.

Breve descrição dos desenhos

[0014] A Figura 1 apresenta o processo de recuperação de cristalização direta para glicosídeos de esteviol.

[0015] As Figuras 2 e 3 apresentam diagramas esquemáticos das vias potenciais que levam à biossíntese de glicosídeos de esteviol.

Descrição detalhada

[0016] Ao longo do presente relatório descritivo e das reivindicações anexas, as palavras "compreender”, "incluir" e "ter" e variações como "compreende", "compreendendo", "inclui" e "incluindo" devem ser interpretadas inclusivamente. Ou seja, essas palavras são destinadas a expressar a possível inclusão de outros elementos ou números inteiros não especificamente citados, onde for permitido pelo contexto.

[0017] Os artigos "um" e "uma" são usados no presente documento para se referirem a um ou a mais que um (isto é, a um ou pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, "um elemento" pode significar um elemento ou mais de um elemento.

[0018] Composições de glicosídeo de esteviol podem ser usadas como adoçantes naturais de alta potência. O rebM é um dos glicosídeos de esteviol que pode ser encontrado em quantidades variáveis em composições de glicosídeo de esteviol. Tipicamente, o rebM é encontrado apenas em quantidades-traço em extratos derivados de planta, embora possa estar presente em maiores quantidades em composições de glicosídeo de esteviol derivadas de fermentação.

[0019] Visto que a quantidade do rebM total em uma composição de glicosídeo de esteviol é aumentada, o custo da composição ainda é adicionalmente aumentado.

[0020] Consequentemente, existe uma necessidade de fornecer um método para preparar composições que compreendem rebM de alta pureza de uma maneira econômica.

[0021] Em particular, existe uma necessidade de fornecer um método para preparar composições de glicosídeo de esteviol substancialmente puras que têm uma alta pureza de rebM de uma maneira econômica.

[0022] Est a invenção satisfaz essa necessidade ao fornecer um método para purificar uma composição que compreende rebM de pureza inferior em uma composição que compreende rebM de pureza superior, por exemplo, uma composição que compreende rebM substancialmente pura.

[0023] A pureza, como usado no presente documento em relação a um dado rebaudiosídeo, como rebM, representa a porcentagem em peso daquele rebaudiosídeo em uma dada composição em uma base de peso seco.

[0024] No método da invenção, é fornecida uma solução de grau de pureza inferior de rebM que pode ser diretamente cristalizada para permitir que uma composição de glicosídeo de esteviol de grau de pureza maior seja obtida. O método tipicamente não exige o uso de cromatografia de adsorção ou o uso de solventes orgânicos.

[0025] Ou seja, o método da invenção é tipicamente um em que o rebM com alto grau de pureza que compreende a composição é obtido de um rebM de grau de pureza inferior que compreende a composição por cristalização direta de rebM a partir da água.

[0026] A invenção se refere assim a: - um método para purificar rebM, cujo método compreende purificar o rebM substancialmente na ausência de um solvente orgânico; e - um método para purificar rebM, cujo método compreende purificar o rebM na ausência de uma etapa de cromatografia de adsorção.

[0027] Consequentemente, a invenção se refere a um método para purificar o rebaudiosídeo M, cujo método compreende: (a) fornecer uma solução que compreende rebaudiosídeo M em uma concentração de pelo menos cerca de 10 g/l e em um grau de pureza de pelo menos 10% em peso em uma base seca; e (b) cristalizar, a partir da solução, uma composição de alto grau de pureza que compreende rebaudiosídeo M, para, através disso, purificar o rebaudiosídeo M.

[0028] Ou seja, o método da invenção permite a purificação de uma composição de glicosídeo de esteviol que compreende rebM em um alto grau de pureza, por exemplo, em um grau de pureza de pelo menos cerca de 10% de rebM em peso em uma base seca (no presente documento “uma composição de baixo grau de pureza” ou “uma solução de baixo grau de pureza”), de modo que a composição de glicosídeo de esteviol resultante compreende rebM em um alto grau de pureza (no presente documento “uma composição de alto grau de pureza”), por exemplo, pelo menos cerca de 60% de rebM em peso em uma base seca.

[0029] A Figura 1 ilustra uma maneira com a qual o método da invenção pode ser realizado.

[0030] O processo pode compreender uma etapa de concentração. A invenção se refere assim a um método para purificar o rebaudiosídeo M, cujo método compreende: (c) fornecer uma solução que compreende rebaudiosídeo M em uma concentração de pelo menos cerca de 10 g/l e em um grau de pureza de pelo menos 10% em peso em uma base seca; (d) concentrar a dita solução para alcançar uma solução que compreende rebaudiosídeo M em uma concentração de pelo menos cerca de 80 g/l; e (e) cristalizar, a partir da solução, uma composição de alto grau de pureza que compreende rebaudiosídeo M, para, através disso, purificar o rebaudiosídeo M.

[0031] A concentração de rebM na solução de baixo grau de pureza pode ser pelo menos cerca de 10 g/l, por exemplo, pelo menos cerca de 15 g/l, como pelo menos cerca de 30 g/l, como pelo menos cerca de 40 g/l.

[0032] A solução na etapa (a) pode ser concentrada de modo que a concentração de rebM na solução seja aumentada para pelo menos cerca de 50 g/l, pelo menos cerca de 100 g/l, pelo menos cerca de 150 g/l, pelo menos cerca de 200 g/l, pelo menos cerca de 250 g/l ou pelo menos cerca de 300 g/l ou mais.

[0033] A solução na etapa (a) pode ter um grau de pureza de rebM de pelo menos cerca de 10% em peso em uma base seca em peso, por exemplo, pelo menos cerca de 15% em uma base seca em peso, por exemplo, pelo menos cerca de 20% em uma base seca em peso, por exemplo, pelo menos cerca de 30% em uma base seca em peso, por exemplo, pelo menos cerca de 40% em uma base seca em peso, como pelo menos cerca de 50% em uma base seca em peso ou mais.

[0034] Qualque r combinação das concentrações e purezas mencionadas acima pode ser usada para definir uma solução de baixo grau de pureza adequada para uso no método.

[0035] Por exemplo, a solução na etapa (a) pode ter uma concentração de rebM de 10 g/l e um grau de pureza de 15% ou 20% em peso em uma base seca.

[0036] A solução na etapa (a) pode ser uma composição de glicosídeo de esteviol crua em sua forma bruta, como extraída de plantas Stevia. Alternativamente, a solução pode compreender glicosídeos de esteviol formados por conversão enzimática de esteviol ou glicosídeos de esteviol. Preferencialmente, no entanto, tal solução é uma composição de glicosídeo de esteviol produzida de modo fermentativo. Ou seja, a solução pode ser uma composição que compreende glicosídeos de esteviol produzidos por fermentação.

[0037] Consequentemente, a solução na etapa (a) que compreende rebM pode ser uma obtida a partir da planta Stevia rebaudiana ou por conversão enzimática de esteviol e/ou glicosídeos de esteviol. No entanto, de preferência, tal solução pode ser uma derivada da produção fermentativa de glicosídeos de esteviol (consulte, por exemplo, o documento WO2015/007748).

[0038] Assim, a solução na etapa (a) que compreende rebM pode ser um caldo de fermentação ou pode ser uma derivada de um caldo de fermentação, isto é, produzida por um organismo com capacidade para converter uma fonte de carbono em rebM.

[0039] Se uma composição de glicosídeo de esteviol produzida de modo fermentativo que compreende rebM for usada, uma ou mais etapas de recuperação podem ser executadas a fim de fornecer a solução que compreende rebM na etapa (a). Por exemplo, uma etapa de separação de sólido-líquido, por exemplo, por centrifugação, pode ser usada para separar células do caldo. Opcionalmente, a separação de sólido-líquido pode ser sucedida por uma etapa de clarificação.

[0040] A solução que compreende rebM pode ser fornecida de modo que a concentração de rebM seja menor que cerca de 10 g/l e subsequentemente concentrada para fornecer a solução que compreende rebM em uma concentração de pelo menos cerca de 10 g/l. As técnicas de concentração adequadas são descritas no presente documento.

[0041] A solução que compreende rebM na etapa (a) compreende geralmente outros glicosídeos de esteviol e impurezas. RebM pode representar até cerca de 70 a 75% do total de glicosídeos de esteviol. Outras impurezas, como açúcares, proteínas e sais não digeridos podem compreender cerca de 50% a cerca de 60% de matéria seca total.

[0042] O método da invenção pode resultar na preparação de uma composição de alta pureza que compreende rebM em uma pureza de pelo menos cerca de 60% em peso em uma base seca, por exemplo, pelo menos cerca de 70% em peso em uma base seca, por exemplo, pelo menos cerca de 80% ou more em peso em uma base seca, por exemplo, pelo menos cerca de 90% em peso ou mais em uma base seca, por exemplo, pelo menos cerca de 95% em peso ou mais em uma base seca ou uma pureza ainda maior.

[0043] Uma composição substancialmente pura que compreende rebM pode compreender rebM a uma pureza de pelo menos cerca de 95% em peso em uma base seca, por exemplo, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 95% em peso ou mais em uma base seca ou uma pureza ainda maior.

[0044] No método da invenção, a composição de alta pureza que compreende rebM pode compreender um ou mais glicosídeos de esteviol adicionais. Consequentemente, a composição de alto grau de pureza que compreende rebM pode compreender rebM em uma quantidade de pelo menos cerca de 70% em peso rebM em uma base seca, por exemplo, pelo menos cerca de 80% em peso ou mais em uma base seca, por exemplo, pelo menos cerca de 90% em peso ou mais em uma base seca, por exemplo, pelo menos cerca de 95% em peso ou pelo menos cerca de 98% em peso em uma base seca do total de glicosídeos de esteviol.

[0045] A composição de alta pureza que compreende rebM que é produzida de acordo com o método da invenção pode compreender tipicamente não mais que cerca de 150 ppm em uma base de peso seco de ácido caurenoico e/ou equivalentes de ácido caurenoico, por exemplo, não mais que cerca de 100 ppm em uma base de peso seco de ácido caurenoico e/ou equivalentes de ácido caurenoico, como não mais que cerca de 50 ppm em uma base de peso seco de ácido caurenoico e/ou equivalentes de ácido caurenoico.

[0046] A composição de alta pureza que compreende rebM que é produzida de acordo com o método da invenção pode compreender tipicamente não mais que cerca de 2% em uma base de peso seco de esteviosídeo.

[0047] A concentração, se for usada, pode ser executada por qualquer método conveniente. Tipicamente, qualquer etapa de concentração não compreende a cromatografia para concentrar a quantidade do glicosídeo de esteviol desejado. Ou seja, o método da invenção é tipicamente aquele em que a cromatografia de adsorção não é usada, isto é, não há nenhuma etapa de cromatografia de adsorção. A cromatografia de adsorção é denominada, por vezes, cromatografia por eluição de ligação.

[0048] A etapa de concentração, se usada, pode compreender: uma combinação de ultrafiltração e nanofiltração; evaporação; e/ou secagem por aspersão da solução na etapa (a) e, então, redissolução do material seco por aspersão.

[0049] Uma etapa de concentração pode compreender (i) ultrafiltração e nanofiltração; e/ou (ii) evaporação, por exemplo, uma combinação de ultrafiltração e nanofiltração, seguido de evaporação.

[0050] A ultrafiltração pode ser realizada com uma membrana que tem um corte de cerca de 3 kDa a cerca de 15 kDa, por exemplo, cerca de 10 kDa.

[0051] A nanofiltração pode ser realizada com uma membrana que tem uma retenção nominal de sulfato de sódio acima de 90%.

[0052] No método da invenção, a composição de alto grau de pureza que compreende rebM pode ser, de preferência, cristalizada a partir de uma solução de água. Ou seja, a composição de alto grau de pureza que compreende rebM pode ser cristalizada a partir de uma solução aquosa que compreende rebM em um grau de pureza inferior. Para os propósitos da invenção, uma solução aquosa é uma solução que não compreende substancialmente nenhum solvente orgânico. Então, uma solução aquosa pode ser uma solução em que substancialmente o único solvente é água (isto é, baixas quantidades ou quantidades-traço de outros solventes podem estar presentes, por exemplo, cerca de 2% ou menos solvente orgânico (ou solventes orgânicos), como cerca de 1% ou menos solvente orgânico (ou solventes orgânicos)).

[0053] A cristalização pode ser uma cristalização de etapa única.

[0054] Assim, o método da invenção pode ser executado substancialmente na ausência do solvente orgânico.

[0055] No método da invenção, a solução na etapa (a) ou a solução concentrada (se uma etapa de concentração for usada) pode ser semeada com uma quantidade de rebM suficiente para promover a cristalização do rebM.

[0056] O método da invenção pode compreender separar e lavar a composição de alto grau de pureza que compreende rebM. Tais etapas podem ser executadas substancialmente na ausência de qualquer solvente orgânico.

[0057] O método da invenção pode compreender secar a composição de alto grau de pureza que compreende rebM.

[0058] O método da invenção pode compreender uma ou mais etapas de cristalização de purificação adicional (por exemplo, cristalização de polimento) para remover impurezas adicionais. Tais etapas adicionais podem ser executadas usando água ou na presença de um ou mais solventes orgânicos.

[0059] O método da invenção pode assim ser um em que todas as etapas de cristalização são executadas substancialmente na ausência de qualquer solvente orgânico.

[0060] Um método preferencial da invenção é um em que nenhuma etapa de cromatografia de adsorção é usada e em que a etapa de cristalização ou etapas de cristalização são executadas substancialmente na ausência de qualquer solvente orgânico, por exemplo em água. Em tal método, pode não haver o uso de todo o solvente orgânico, por exemplo em quaisquer etapas de separação e lavagem, em que a água pode ser usada.

[0061] A composição e o rendimento da composição de alta pureza resultante que compreende rebM podem ser controlados através da seleção adequada de parâmetros, como a maneira com a qual a concentração é realizada (se tal etapa for usada), a temperatura da solução, a temperatura de precipitação, o tempo de misturação, o tempo de precipitação, o pH e a semeadura da solução.

[0062] O método de cristalização da solução de baixa pureza ou uma forma concentrada daquela solução pode ser realizada em qualquer temperatura adequada. Tais temperaturas geralmente podem estar na faixa de cerca de 20°C a cerca de 85°C, por exemplo, a cerca de 75°C.

[0063] Em particular, a cristalização da solução de baixa pureza ou uma forma concentrada daquela solução pode compreender adicionalmente resfriar a dita solução ou concentrado de baixa pureza. Em geral, a solução de baixo grau de pureza ou concentrado pode ser resfriada a uma temperatura adequada para precipitação ("temperatura de precipitação") de rebM.

[0064] Exemplos de tais temperaturas de precipitação podem estar em uma faixa de cerca de 4°C a cerca de 65°C, de cerca de 15°C a cerca de 45°C, ou qualquer temperatura entre essas.

[0065] Pode-se permitir que a cristalização da solução de glicosídeo de esteviol de baixa pureza ocorra por um período de tempo suficiente ("tempo de precipitação" ou "tempo de resfriamento") para obter um rendimento desejável da composição de glicosídeo de esteviol substancialmente pura a partir da solução de glicosídeo de esteviol de baixa pureza. Por exemplo, em modalidades particulares, a cristalização da solução de glicosídeo de esteviol de baixa pureza pode prosseguir de cerca de 0,5 horas a cerca de 120 horas (5 dias), cerca de 12 horas a cerca de 96 horas (4 dias), cerca de 24 horas (1 dia) a cerca de 72 horas (3 dias), por cerca de 48 horas (2 dias), ou por qualquer período de tempo entre esses.

[0066] Após a cristalização, um rebM de grau de pureza maior que compreende a composição, por exemplo um rebM substancialmente puro que compreende a composição pode ser obtido.

[0067] O rendimento total da composição de glicosídeo de esteviol de pureza superior pode ser de pelo menos cerca de 20%, por exemplo, pelo menos cerca de 25%, como pelo menos cerca de 30%. O rendimento é usado no presente documento para se referir, em geral, à massa obtida em relação à massa de partida.

[0068] O método da invenção pode compreender adicionalmente a semeadura da solução de glicosídeo de esteviol de baixa pureza mediante o começo da cristalização da solução de glicosídeo de esteviol de baixa pureza. A semeadura pode ser, em geral, realizada à mesma temperatura na qual permite-se que a cristalização proceda. Por exemplo, a semeadura será conduzida a temperaturas na faixa de cerca de 20°C a cerca de 85°C, como a uma temperatura de cerca de 75°C.

[0069] A semeadura da solução de glicosídeo de esteviol de baixo grau de pureza pode ser geralmente realizada pela adição de cristais substancialmente puros de rebM à solução de baixo grau de pureza ou concentrado em uma quantidade suficiente para promover a precipitação de rebM.

[0070] O método da invenção pode compreender adicionalmente separar e lavar a composição de glicosídeo de esteviol de pureza superior após sua cristalização. A composição de glicosídeo de esteviol pode ser separada de seu sobrenadante (o solvente orgânico e impurezas) por uma variedade de técnicas de separação de sólido-líquido que utiliza força centrífuga, que inclui, sem limitação, centrífuga de cesto perfurado vertical e horizontal, centrífuga de cuba sólida, centrífuga de decantador, centrífuga do tipo peeler, centrífuga do tipo pusher, centrífuga do tipo Heinkel, centrífuga de cilindro de discos e separação em ciclone. Adicionalmente, a separação pode ser aperfeiçoada por quaisquer métodos de filtração por gravidade, vácuo ou pressão, que incluem, sem limitação, o uso de correia, tambor, tipo Nutsche, folha, placa, tipo Rosenmund, tipo ignificador e filtros de bolsa e filtro-prensa. A operação do dispositivo de separação de sólido e líquido pode ser contínua, semicontínua ou em modo em lote. A composição de glicosídeo de esteviol de grau de pureza maior também pode ser lavada no dispositivo de separação com uso de água, vários solventes orgânicos e misturas dos mesmos e pode ser parcial ou totalmente seca no dispositivo de separação com uso de qualquer número de gases, incluindo, sem limitação, nitrogênio ou argônio, para evaporar o líquido residual. A composição de glicosídeo de esteviol de pureza superior pode ser automática ou manualmente removida do dispositivo de separação com uso de líquidos, gases ou meios mecânicos pela dissolução de sólido ou manutenção da forma sólida.

[0071] O método da invenção pode compreender adicionalmente secar a composição de glicosídeo de esteviol de pureza superior. Os métodos adequados para secar tais composições são conhecidos àquele versado na técnica e incluem, porém, sem limitação, o uso de um secador giratório a vácuo, secador de leito de fluido, secador de túnel giratório, secador de placa, secador de bandeja, secador do tipo Nauta, secador por aspersão, secador rápido, secador de mícron, secador em recipiente, secador de pás de alta e baixa velocidade e secador de micro-onda. Em uma modalidade exemplificativa, a composição de glicosídeo de esteviol de pureza superior é seca com uso de uma purga de nitrogênio ou argônio para remover o solvente residual a uma temperatura em uma faixa de cerca de 40°C a cerca de 60°C por um período de tempo de cerca de 5 horas a cerca de 5 dias, de cerca de 1 dia a cerca de 4 dias, de cerca de 2 dias a cerca de 3 dias, ou por qualquer período de tempo entre os mesmos.

[0072] Se uma purificação adicional for desejada, o método para purificar a solução de baixa pureza pode ser repetido ou a composição de pureza superior pode ser adicionalmente purificada, por exemplo, por cromatografia de troca iônica.

[0073] Os glicosídeos de esteviol totais compreendem geralmente um ou mais dos glicosídeos de esteviol selecionados a partir do grupo que consiste em rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo F, esteviosídeo, dulcosídeo A, rubusosídeo e esteviolbiosídeo.

[0074] A pureza da composição pode ser medida com o uso de métodos conhecidos por aqueles de habilidade comum na técnica. Tal método inclui cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Aqueles de habilidade comum na técnica também devem observar que a umidade na amostra pode afetar a precisão de medições de pureza. Consequentemente, a composição deve ser substancialmente seca quando medida para pureza. Como usado no presente documento, uma "composição substancialmente seca" e "em uma base seca" são usados de modo alternado e podem compreender até cerca de 10% em peso de umidade.

[0075] A solução de rebM usada na invenção pode ser produzida de modo fermentativo, por exemplo, pode ser um caldo de fermentação ou uma solução derivada de um caldo de fermentação. Tal solução de rebM pode ser derivada de um hospedeiro recombinante capaz de produzir um glicosídeo de esteviol.

[0076] Consequentemente, um hospedeiro recombinante adequado pode ter capacidade para produzir o rebM.

[0077] Um hospedeiro recombinante adequado pode compreender uma ou mais sequências de ácidos nucleicos recombinantes que codificam um ou mais polipeptídeos tendo atividade de UDP-glicosiltransferase (UGT).

[0078] Para os propósitos desta invenção, um polipeptídeo que tem atividade de UGT é aquele que tem atividade de glicosiltransferase (EC 2.4), isto é, que pode atuar como um catalisador para a transferência de uma unidade de monossacarídeo a partir de um açúcar de nucleotídeo ativado (também conhecido como "doador de glicosila") para uma molécula aceitadora de glicosila, geralmente um álcool. O doador de glicosila para uma UGT normalmente é o açúcar de nucleotídeo uridina difosfato glicose (uracil-difosfato glicose, UDP-glicose).

[0079] Tais UGT adicionais podem ser selecionadas de modo a produzir um glicosídeo de esteviol desejado. Diagramas esquemáticos de formação de glicosídeo de esteviol são apresentados em Humphrey et al., Plant Molecular Biology (2006) 61: 47-62 e Mohamed et al., J. Plant Physiology 168 (2011) 1136-1141. Além disso, as Figuras 2 e 3 apresentam os diagramas esquemáticos da formação de glicosídeos de esteviol.

[0080] Um hospedeiro recombinante pode, dessa forma, compreender uma ou mais sequências de ácido nucleico recombinantes que codificam um ou mais dentre: (i) um polipeptídeo tendo atividade de UGT74G1; (ii) um polipeptídeo tendo atividade de UGT2; (ii) um polipeptídeo tendo atividade de UGT85C2; e (iv) um polipeptídeo tendo atividade de UGT76G1.

[0081] Um hospedeiro recombinante pode compreender uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo capaz de catalisar a adição de uma C-13-glicose em esteviol. Isso significa que uma levedura recombinante, adequada para uso em um método da invenção, pode compreender uma UGT que é capaz de catalisar uma reação na qual o esteviol é convertido em esteviolmonosídeo.

[0082] Tal hospedeiro recombinante pode compreender uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem a atividade mostrada por UDP-glicosiltransferase (UGT) UGT85C2, através do que a sequência de nucleotídeo mediante transformação da levedura confere àquela levedura a capacidade de converter esteviol em esteviolmonosídeo.

[0083] A atividade de UGT85C2 é a transferência de uma unidade de glicose para a 13-OH de esteviol.

[0084] As sim, uma UGT85C2 adequada pode funcionar como uma uridina 5'-difosfo glicosila: esteviol 13-OH transferase e uma uridina 5'-difosfo glicosil: esteviol-19- 0-glicosídeo 13-OH transferase. Polipeptídeos UGT85C2 funcionais também podem catalisar as reações da glicosil transferase que usam substratos de glicosídeos de esteviol que não o esteviol e o esteviol-19-O-glicosídeo. Essas sequências podem ser referidas como sequências de UGT1 no presente documento.

[0085] Um hospedeiro recombinante pode compreender uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que tem atividade de UGT2.

[0086] Um polipeptídeo que tem atividade de UGT2 é aquele que funciona como uma uridina 5'-difosfo glicosila: esteviol-13-O-glicosídeo transferase (também referido como um esteviol-13-monoglicosídeo 1,2-glicosilase), transferindo uma porção glicose para o C-2' da 13-O-glicose da molécula receptora, esteviol-13-O-glicosídeo. Normalmente, um polipeptídeo de UGT2 adequado também funciona como uma uridina 5'-difosfo glicosila: rubusosídeo transferase que transfere uma fração de glicose para a C-2' da 13-O-glicose da molécula aceitadora, rubusosídeo.

[0087] Um polipeptídeo que tem atividade de UGT2 também pode catalisar as reações que utilizam substratos de glicosídeo de esteviol além de esteviol-13-0-glicosídeo e rubusosídeo, por exemplo, polipeptídeos de UGT2 funcionais podem utilizar esteviosídeo como um substrato, transferindo uma porção química de glicose para C-2' do resíduo de 19-O- glicose para produzir rebaudiosídeo E. Polipeptídeos funcionais de UGT2 também podem utilizar rebaudiosídeo A como um substrato, transferindo uma porção química de glicose para C-2' do resíduo de 19-O-glicose para produzir o rebaudiosídeo D. No entanto, um polipeptídeo de UGT2 funcional não transfere tipicamente uma porção química de glicose para compostos de esteviol que têm uma glicose ligada a 1,3 na posição C-13, isto é, a transferência de uma porção química de glicose para esteviol 1,3-biosídeo e 1,3-esteviosídeo tipicamente não ocorre.

[0088] Um polipeptídeo tendo atividade de UGT2 também pode transferir porções açúcar a partir de outros doadores diferentes de uridina difosfato glicose. Por exemplo, um polipeptídeo que tem atividade de UGT2 atua como uma uridina 5'-difosfo D-xilosila: esteviol-13-O- glicosídeo transferase, transferindo uma porção xilose para o C-2' da 13-O-glicose da molécula receptora, esteviol-13- O-glicosídeo. Como outro exemplo, um polipeptídeo que tem atividade de UGT2 pode atuar como uma uridina 5'-difosfo L- ramnosila: esteviol-13-0-glicosídeo transferase, transferindo uma porção ramnose para o C-2' da 13-O-glicose da molécula receptora, esteviol.

[0089] Um hospedeiro recombinante pode compreender uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem atividade de UGT pode compreender uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo capaz de catalisar a adição de uma C-19-glicose em esteviolbiosídeo. Ou seja, um hospedeiro recombinante pode compreender um UGT que é capaz de catalisar uma reação na qual esteviolbiosídeo é convertido em esteviosídeo. Por conseguinte, tal hospedeiro recombinante pode ser capaz de converter esteviolbiosídeo a esteviosídeo. A expressão dessa sequência de nucleotídeos pode conferir à levedura recombinante a capacidade de produzir pelo menos esteviosídeo.

[0090] Um hospedeiro recombinante pode, dessa forma, também compreender uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem a atividade mostrada por UDP-glicosiltransferase (UGT) UGT74G1, através do que a sequência de nucleotídeo mediante a transformação da levedura confere à célula a capacidade de converter esteviolbiosídeo em esteviosídeo.

[0091] Os polipeptídeos UGT74G1 adequados podem ser capazes de transferir uma unidade de glicose em 13-OH ou 19-COOH, respectivamente, de esteviol. Um polipeptídeo UGT74G1 adequado pode funcionar como uma uridina 5'-difosfo glicosil: esteviol 19-COOH transferase e uma uridina 5'- difosfo glicosil: esteviol-13-O-glicosídeo 19-COOH transferase. Polipeptídeos UGT74G1 funcionais também podem catalisar reações da glicosil transferase que usam substratos de glicosídeos de esteviol diferentes de esteviol e esteviol-13-O-glicosídeo, ou que transferem porções açúcar a partir de doadores diferentes da uridina difosfato glicose. Essas sequências podem ser referidas no presente documento como sequências de UGT3.

[0092] Um hospedeiro recombinante pode compreender uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo capaz de catalisar glicosilação do C-3’ da glicose na posição C-13 de esteviosídeo. Ou seja, uma levedura recombinante adequada para uso em um método da invenção pode compreender uma UGT que é capaz de catalisar uma reação em que o esteviosídeo é convertido em rebaudiosídeo A. Consequentemente, essa levedura recombinante pode ser capaz de converter esteviosídeo em rebaudiosídeo A. A expressão dessa sequência de nucleotídeos pode conferir à levedura a capacidade de produzir pelo menos rebaudiosídeo A.

[0093] Um hospedeiro recombinante pode, dessa forma, também compreender uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem a atividade mostrada por UDP-glicosiltransferase (UGT) UGT76G1, através do que a sequência de nucleotídeo mediante a transformação de uma levedura confere àquela levedura a capacidade de converter esteviosídeo em rebaudiosídeo A.

[0094] Uma UGT76G1 adequada adiciona uma fração de glicose ao C-3' da C-13-O-glicose da molécula aceitadora, um esteviol 1,2 glicosídeo. Assim, a UGT76G1 funciona, por exemplo, como uma uridina 5'-difosfo glicosil: esteviol-13- 0-1,2 glicosídeo C-3' glicosil transferase e uma uridina 5'-difosfo glicosil: esteviol-19-0-glicose, 13-0-1,2 biosídeo C-3' glicosil transferase. Os polipeptídeos UGT76G1 funcionais também podem catalisar as reações de glicosil transferase que usam substratos de glicosídeos de esteviol que contêm açúcares diferentes de glicose, por exemplo, esteviol ramnosídeos e esteviol xilosídeos. Essas sequências podem ser referidas no presente documento como sequências de UGT4. A UGT4 pode, alternativamente ou adicionalmente, ser capaz de converter RebD a RebM.

[0095] Um hospedeiro recombinante compreende tipicamente sequências de nucleotídeos que codificam pelo menos um polipeptídeo tendo atividade de UGT1, pelo menos um polipeptídeo tendo atividade de UGT2, pelo menos um polipeptídeo tendo atividade de UGT3 e pelo menos um polipeptídeo tendo atividade de UGT4. Uma ou mais dessas sequências de ácidos nucleicos podem ser recombinantes. Um determinado ácido nucleico pode codificar um polipeptídeo que tem uma ou mais das atividades acima. Por exemplo, um ácido nucleico codifica para um polipeptídeo que tem duas, três ou quatro das atividades apresentadas acima. De preferência, uma levedura recombinante para uso no método da invenção compreende atividade de UGT1, UGT2 e UGT3 e UGT4. Sequências de UGT1, UGT2, UGT3 e UGT4 adequadas são descritas na Tabela 1 do documento WO2015/007748.

[0096] Um hospedeiro recombinante pode compreender duas ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo tendo qualquer uma atividade de UGT, por exemplo, atividade de UGT1, 2, 3 ou 4. Quando um hospedeiro recombinante compreende duas ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo tendo qualquer uma atividade de UGT, estas sequências de ácidos nucleicos podem ser iguais ou diferentes e/ou podem codificar polipeptídeos iguais ou diferentes. Em particular, um hospedeiro recombinante pode compreender uma sequência de ácidos nucleicos que codifica dois polipeptídeos UGT2 diferentes.

[0097] Um hospedeiro recombinante pode compreender uma ou mais sequências de nucleotídeo recombinantes que codificam um ou mais dentre: um polipeptídeo que tem atividade de ent-copalil pirofosfato sintase; um polipeptídeo que tem atividade de ent-caureno sintase; um polipeptídeo que tem atividade de ent-caureno oxidase; e um polipeptídeo que tem atividade de ácido caurenoico 13-hidroxilase.

[0098] Para os propósitos desta invenção, um polipeptídeo que tem ent-copalil pirofosfato sintase (EC 5.5.1.13) é capaz de catalisar a reação química:

[0099] Essa enzima tem um substrato, geranilgeranil pirofosfato, e um produto, ent-copalil pirofosfato. Esta enzima participa na biossíntese de giberelina. Essa enzima pertence à família das isomerases, especificamente à classe das liases intramoleculares. O nome sistemático dessa classe de enzimas é ent-copalil-difosfato liase (deciclizante). Outros nomes de uso comum incluem ent- copalil pirofosfato sintase, ent-caureno sintase A e ent- caureno sintetase A.

[0100] As sequências de ácidos nucleicos adequadas que codificam uma ent-copalil pirofosfato sintase podem, por exemplo, compreender uma sequência conforme apresentado em SEQ ID. NO: 1, 3, 5, 7, 17, 19, 59, 61, 141, 142, 151, 152, 153, 154, 159, 160, 182 ou 184 do documento WO2015/007748.

[0101] P ara os propósitos desta invenção, um polipeptídeo que tem atividade de ent-caureno sintase (EC 4.2.3.19) é um polipeptídeo que é capaz de catalisar a reação química: ent-copalil difosfato = ent-caureno + difosfato

[0102] Por conseguinte, essa enzima tem um substrato, ent-copalil difosfato, e dois produtos, ent- caureno e difosfato.

[0103] Es sa enzima pertence à família das liases, especificamente àquelas liases de carbono-oxigênio que atuam em fosfatos. O nome sistemático dessa classe de enzimas é ent-copalil-difosfato difosfato-liase (ciclização, formação de ent-caureno). Outros nomes em uso comum incluem ent-caureno sintase B, ent-caureno sintetase B, ent-copalil-difosfato difosfato-liase e (ciclização). Essa enzima participa na biossíntese de diterpenoide.

[0104] As sequências de ácidos nucleicos adequadas que codificam uma ent-Caureno sintase podem, por exemplo, compreender uma sequência conforme apresentado em SEQ ID. NO: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 63, 65, 143, 144, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 183 ou 184 do documento WO2015/007748.

[0105] Ent-copalil difosfato sintases também podem ter uma atividade ent-caureno sintase distinta associada à mesma molécula proteica. A reação catalisada por ent- caureno sintase é a próxima etapa na via biossintética para giberelinas. Os dois tipos de atividade enzimática são distintos e a mutagênese sítio dirigida para suprimir a ent-caureno sintase da proteína leva ao acúmulo de ent- copalil pirofosfato.

[0106] Consequentemente, uma única sequência de nucleotídeos usada em um hospedeiro recombinante da invenção pode codificar um polipeptídeo que tem atividade de ent-copalil pirofosfato sintase e atividade de ent- caureno sintase. Alternativamente, as duas atividades podem ser codificadas por duas sequências de nucleotídeos separadas distintas.

[0107] Para os propósitos desta invenção, um polipeptídeo que tem atividade de ent-caureno oxidase (EC 1.14.13.78) é um polipeptídeo que é capaz de catalisar três oxidações sucessivas do grupo 4-metila de ent-caureno para gerar ácido caurenoico. Tal atividade normalmente requer a presença de um citocromo P450.

[0108] As sequências de ácidos nucleicos adequadas que codificam uma ent-caureno oxidase podem, por exemplo, compreender uma sequência conforme apresentado em SEQ ID. NO: 21, 23, 25, 67, 85, 145, 161, 162, 163, 180 ou 186 do documento WO2015/007748.

[0109] Para os propósitos da invenção, um polipeptídeo que tem atividade de ácido caurenoico 13- hidroxilase (EC 1.14.13) é aquele que é capaz de catalisar a formação de esteviol (ácido ent-caur-16-en-13-ol-19-oico) usando NADPH e O2. Tal atividade também pode ser referida como atividade de ent-ca 13-hidroxilase.

[0110] As sequências de ácidos nucleicos adequadas que codificam uma ácido caurenoico 13-hidroxilase podem, por exemplo, compreender uma sequência conforme apresentado em SEQ ID. NO: 27, 29, 31, 33, 69, 89, 91, 93, 95, 97, 146, 164, 165, 166, 167 ou 185 do documento WO2015/007748.

[0111] Um hospedeiro recombinante pode compreender uma sequência de ácido nucleico recombinante que codifica um polipeptídeo que tem atividade de NADPH-citocromo p450 redutase. Ou seja, um hospedeiro recombinante da invenção pode ser capaz de expressar uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que tem atividade de NADPH- citocromo p450 redutase. Para os propósitos da invenção, um polipeptídeo tendo atividade de NADPH-citocromo P450 redutase (EC 1.6.2.4; também conhecido como NADPH:ferriemoproteína oxidorredutase, NADPH:hemoproteína oxidorredutase, NADPH:P450 oxidorredutase, P450 redutase, POR, CPR, CYPOR) é tipicamente um que é uma enzima ligada à membrana que permite transferência de elétrons para o citocromo P450 no microssomo da célula eucariota de uma enzima que contém FAD e FMN NADPH:citocromo P450 redutase (POR; EC 1.6.2.4).

[0112] Em um hospedeiro recombinante, a capacidade do hospedeiro de produzir geranilgeranil difosfato (GGPP) pode ser regulada de modo ascendente. Regulada para cima no contexto desta invenção implica que o hospedeiro recombinante produz mais GGPP do que um hospedeiro não recombinante equivalente.

[0113] Consequentemente, um hospedeiro recombinante pode compreender uma ou mais sequências de nucleotídeo que codificam hidroximetilglutaril-CoA redutase, farnesil- pirofosfato sintetase e geranilgeranil difosfato sintase, através do que a(s) sequência(s) de nucleotídeo mediante transformação de um hospedeiro confere(s) àquele hospedeiro a capacidade de produzir níveis elevados de GGPP. Assim, um hospedeiro recombinante de acordo com a invenção pode compreender uma ou mais sequências de ácidos nucleicos recombinantes que codificam uma ou mais dentre hidroximetilglutaril-CoA redutase, farnesil-pirofosfato sintetase e geranilgeranil difosfato sintase.

[0114] Consequentemente, um hospedeiro recombinante pode compreender sequências de ácido nucleico que codificam um ou mais dentre: um polipeptídeo que tem atividade de hidroximetilglutaril-CoA redutase; um polipeptídeo que tem atividade de farnesil- pirofosfato sintetase; e

[0115] Um hospedeiro recombinante pode ser, por exemplo, um organismo multicelular ou uma célula do mesmo ou um organismo unicelular. Um hospedeiro pode ser uma célula hospedeira procariota, arqueobacteriana ou eucariota.

[0116] Uma célula hospedeira procariótica pode ser, porém sem limitação, uma célula hospedeira bacteriana. Uma célula hospedeira eucarionte pode ser, sem limitação, uma célula hospedeira de levedura, fungo, ameba, alga, animal ou de inseto.

[0117] Uma célula hospedeira eucarionte pode ser uma célula hospedeira fúngica. “Fungos” incluem todas as espécies da subdivisão Eumycotina (Alexopoulos, C. J., 1962, em: Introductory Mycology, John Wiley & Sons, Inc., Nova York). O termo fungo inclui, assim, dentre outros, fungos filamentosos e levedura.

[0118] “Fungos filamentosos” são definidos no presente documento como microrganismos eucarióticos que incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycotina e Oomycota (conforme definido por Hawksworth et al., 1995, acima). Os fungos filamentosos são caracterizados por uma parede micelial composta de quitina, celulose, glucana, quitosana, manana e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo se dá por alongamento da hifa e o catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Cepas de fungos filamentosos incluem, porém sem limitação, cepas de Acremonium, Aspergillus, Agaricus, Aureobasidium, Cryptococcus, Corynascus, Chrysosporium, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Monascus, Mucor, Myceliophthora, Mortierella, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Phanerochaete Podospora, Pycnoporus, Rhizopus, Schizophyllum, Sordaria, Talaromyces, Rasmsonia, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes e Trichoderma. Cepas de fungos filamentosos preferenciais que podem servir como células hospedeiras pertencem às espécies Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus fumigatus, Penicillium chrysogenum, Penicillium citrinum, Acremonium chrysogenum, Trichoderma reesei, Rasamsonia emersonii (formalmente conhecido como Talaromyces emersonii), Aspergillus sojae, Chrysosporium lucknowense, Myceliophtora thermophyla. As células hospedeiras de referência para a comparação de características de fermentação de células transformadas e não transformadas, incluem, por exemplo, Aspergillus niger CBS120.49, CBS 513.88, Aspergillus oryzae ATCC16868, ATCC 20423, IFO 4177, ATCC 1011, ATCC 9576, ATCC14488-14491, ATCC 11601, ATCC12892, Aspergillus fumigatus AF293 (CBS101355), P. chrysogenum CBS 455.95, Penicillium citrinum ATCC 38065, Penicillium chrysogenum P2, Acremonium chrysogenum ATCC 36225, ATCC 48272, Trichoderma reesei ATCC 26921, ATCC 56765, ATCC 26921, Aspergillus sojae ATCC11906, Chrysosporium lucknowense ATCC44006 e derivados de todas essas cepas. Particularmente preferenciais como célula hospedeira fúngica filamentosa são Aspergillus niger CBS 513.88 e derivados da mesma.

[0119] Uma célula hospedeira eucarionte pode ser uma célula de levedura. As células hospedeiras de levedura preferidas podem ser selecionadas dos gêneros: Saccharomyces (por exemplo, S. cerevisiae, S. bayanus, S. pastorianus, S. carlsbergensis), Brettanomyces, Kluyveromyces, Candida (por exemplo, C. krusei, C. revkaufi, C. pulcherrima, C. tropicalis, C. utilis), Issatchenkia (por exemplo, I. orientalis), Pichia (por exemplo, P. pastoris), Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Pachysolen, Schwanniomyces, Trichosporon, Yarrowia (por exemplo, Y. lipolytica (classificada anteriormente como Candida lipolytica), Yamadazyma.

[0120] As células hospedeiras procariontes podem ser células hospedeiras bacterianas. A célula hospedeira bacteriana pode ser de bactéria Gram-negativa ou Gram- positiva. Os exemplos de bactérias incluem, porém sem limitação, bactérias que pertencem ao gênero Bacillus (por exemplo, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. puntis, B. megaterium, B. halodurans, B. pumilus), Acinetobacter, Nocardia, Xanthobacter, Escherichia (por exemplo, E. coli (por exemplo, cepas DH 1 OB, Stbl2, DH5-alfa, DB3, DB3.1), DB4, DB5, JDP682 e ccdA- over (por exemplo, U.S. application No. 09/518,188))), Streptomyces, Erwinia, Klebsiella, Serratia (por exemplo, S. marcessans), Pseudomonas (por exemplo, P. aeruginosa), Salmonella (por exemplo, S. typhimurium, S. typhi). As bactérias também incluem, porém sem limitação, bactérias fotossintéticas (por exemplo, bactérias verdes não sulfurosas (por exemplo, bactérias Choroflexus (por exemplo, C. aurantiacus), Chloronema (por exemplo, C. gigateum)), bactérias verdes sulfurosas (por exemplo, bactérias Chlorobium (por exemplo, C. limicola), Pelodictyon (por exemplo, P. luteolum), bactérias roxas sulfurosas (por exemplo, Chromatium (por exemplo, C. okenii)), e bactérias roxas não sulfurosas (por exemplo, Rhodospirillum (por exemplo, R. rubrum), Rhodobacter (por exemplo, R. sphaeroides, R. capsulatus) e bactérias Rhodomicrobium (por exemplo, R. vanellii)).

[0121] As células hospedeiras podem ser células hospedeiras de organismos não microbianos. Exemplos dessas células incluem, porém sem limitação, células de inseto (por exemplo, Drosophila (por exemplo, D. melanogaster), Spodoptera (por exemplo, células de S. frugiperda SF9 ou SF21) e Trichoplusa (por exemplo, células High-Five); células de nemátodos (por exemplo, células de C. elegans); células de aves; células de anfíbios (por exemplo, células de Xenopus laevis); células de répteis; e células de mamíferos (por exemplo, NIH3T3, 293, CHO, COS, VERO, C127, BHK, Per-C6, melanoma Bowes e células HeLa).

[0122] Um hospedeiro recombinante pode ser capaz de se desenvolver em qualquer fonte de carbono adequada conhecida na técnica e converter a mesma em um glicosídeo de esteviol. O hospedeiro recombinante pode ser capaz de converter diretamente biomassa vegetal, celuloses, hemiceluloses, pectinas, ramnose, galactose, fucose, maltose, maltodextrinas, ribose, ribulose, ou amido, derivado de amido, sacarose, lactose e glicerol. Por conseguinte, um hospedeiro preferido expressa enzimas como celulases (endocelulases e exocelulases) e hemicelulases (por exemplo, endo e exoxilanases, arabinases) necessárias para a conversão de celulose em monômeros de glicose e hemicelulose em monômeros de xilose e arabinose, pectinases capazes de converter pectinas em ácido glucurônico e ácido galacturônico ou amilases para converter amido em monômeros de glicose. De preferência, o hospedeiro é capaz de converter uma fonte de carbono selecionada a partir do grupo que consiste em glicose, xilose, arabinose, sacarose, lactose e glicerol. A célula hospedeira pode, por exemplo, ser uma célula hospedeira eucarionte conforme descrito no documento WO03/062430, WO06/009434, EP1499708B1, WO2006096130 ou WO04/099381.

[0123] As técnicas de genética padrão, para a construção de tais hospedeiros recombinantes, como superexpressão de enzimas nas células hospedeiras, modificação genética de células hospedeiras, ou técnicas de hibridização, são métodos conhecidos na técnica, como descrito em Sambrook e Russel (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a edição), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ou F. Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing e Wiley Interscience, Nova York, EUA (1987). Métodos para transformação, modificação genética etc. de células hospedeiras fúngicas são conhecidos, por exemplo, a partir dos documentos EP-A-0 635 574, WO 98/46772, WO 99/60102 e WO 00/37671, WO90/14423, EP-A-0481008, EP-A-0635 574 e US 6.265.186.

[0124] Um processo para a preparação de um glicosídeo de esteviol pode compreender a fermentação de um hospedeiro recombinante como descrito no presente documento que é capaz de produzir pelo menos um glicosídeo de esteviol em um meio de fermentação adequado, e, opcionalmente, recuperar o glicosídeo de esteviol.

[0125] O meio de fermentação usado no processo para a produção de um glicosídeo de esteviol pode ser qualquer meio de fermentação adequado, que permita o crescimento de uma determinada célula hospedeira eucariótica. Os elementos essenciais do meio de fermentação são conhecidos por técnicos no assunto e podem ser adaptados à célula hospedeira selecionada.

[0126] De preferência, o meio de fermentação compreende uma fonte de carbono selecionada a partir do grupo que consiste em biomassa vegetal, celuloses, hemiceluloses, pectinas, ramnose, galactose, fucose, frutose, maltose, maltodextrinas, ribose, ribulose ou amido, derivados de amido, sacarose, lactose, ácidos graxos, triglicerídeos e glicerol. De preferência, o meio de fermentação também compreende uma fonte de nitrogênio como ureia, ou um sal de amônio como sulfato de amônio, cloreto de amônio, nitrato de amônio ou fosfato de amônio.

[0127] O processo de fermentação de acordo com a presente invenção pode ser executado em modo de batelada, batelada alimentada ou contínuo. Um processo separado de hidrólise e fermentação (SHF) ou um processo simultâneo de sacarificação e fermentação (SSF) também pode ser aplicado. Uma combinação desses modos de processo de fermentação também pode ser possível para produtividade ideal. Um processo de SSF pode ser particularmente atraente se amido, celulose, hemicelulose ou pectina for usado como uma fonte de carbono no processo de fermentação, em que pode ser necessário adicionar enzimas hidrolíticas, como celulases, hemicelulases ou pectinases para hidrolisar o substrato.

[0128] O hospedeiro recombinante usado no processo para a preparação de um glicosídeo de esteviol pode ser qualquer hospedeiro recombinante adequado, conforme definido acima no presente documento. Pode ser vantajoso usar um hospedeiro recombinante eucariótico de acordo com a invenção no processo, uma vez que a maioria das células eucarióticas não requer condições estéreis para propagação e são insensíveis a infeções por bacteriófagos. Além disso, as células hospedeiras eucariontes podem ser desenvolvidas em pH baixo para evitar contaminação bacteriana.

[0129] O hospedeiro recombinante pode ser um microrganismo anaeróbico facultativo. Um hospedeiro recombinante anaeróbico facultativo pode ser propagado aerobiamente para uma concentração celular alta. Essa fase anaeróbica pode, então, ser realizada em densidade celular alta, que reduz substancialmente o volume de fermentação requerido e pode minimizar o risco de contaminação com microrganismos aeróbicos.

[0130] O processo de fermentação para a produção de um glicosídeo de esteviol de acordo com a presente invenção pode ser um processo de fermentação aeróbico ou anaeróbico.

[0131] Um processo de fermentação anaeróbico pode ser definido no presente documento como um processo de fermentação executado na ausência de oxigênio ou no qual substancialmente nenhum oxigênio é consumido, de preferência menos de 5, 2,5 ou 1 mmol/l/h, e em que as moléculas orgânicas servem tanto como doadoras de elétron quanto como receptoras de elétron. O processo de fermentação de acordo com a presente invenção também pode ser primeiramente realizado em condições aeróbicas e subsequentemente em condições anaeróbicas.

[0132] O processo de fermentação também pode ser executado sob condições microaeróbicas com limitação de oxigênio. Alternativamente, o processo de fermentação pode ser primeiramente realizado em condições aeróbicas e subsequentemente em condições de oxigênio limitado. Um processo de fermentação de oxigênio limitado é um processo em que o consumo de oxigênio é limitado pela transferência de oxigênio do gás para o líquido. O grau de limitação de oxigênio é determinado pela quantidade e pela composição do fluxo de gás entrante, bem como as propriedades reais de transferência de massa/mistura do equipamento de fermentação usado.

[0133] A produção de um glicosídeo de esteviol no processo pode ocorrer durante a fase de crescimento da célula hospedeira, durante a fase estacionária (estado de equilíbrio) ou durante ambas as fases. Pode ser possível realizar o processo de fermentação em diferentes temperaturas.

[0134] O processo para a produção de um glicosídeo de esteviol pode ser realizado a uma temperatura que é ideal para o hospedeiro recombinante. A temperatura de crescimento ideal pode diferir para cada hospedeiro recombinante transformado e é conhecida por técnicos no assunto. A temperatura ideal pode ser maior que a ideal para organismos do tipo selvagem, para desenvolvimento eficiente do microrganismo em condições não estéreis, sob sensibilidade de infecção mínima e custo de resfriamento mais baixo. Alternativamente, o processo pode ser realizado a uma temperatura que não é ideal para o crescimento do hospedeiro recombinante.

[0135] O processo para a produção de um glicosídeo de esteviol de acordo com a presente invenção pode ser um processo realizado em qualquer valor de pH adequado. Se o hospedeiro recombinante for uma levedura, o pH no meio de fermentação de preferência tem um valor abaixo de 6, de preferência abaixo de 5,5, de preferência abaixo de 5, de preferência abaixo de 4,5, de preferência abaixo de 4, de preferência abaixo de pH 3,5 ou abaixo de pH 3,0, ou abaixo de pH 2,5, de preferência acima de pH 2. Uma vantagem da realização da fermentação nestes valores de pH baixos é que o crescimento de bactérias contaminantes no meio de fermentação pode ser evitado.

[0136] Tal processo pode ser realizado em escala industrial. O produto de tal processo é um caldo de fermentação que compreende um ou mais glicosídeos de esteviol, em particular pelo menos rebM. O caldo pode ser, então, tratado de acordo com o método como descrito no presente documento.

[0137] A invenção também se refere a uma composição que compreende rebaudiosídeo M obtenível por um método de acordo com a invenção (uma “composição da invenção”).

[0138] Uma composição da invenção pode ser usada em qualquer aplicação conhecida para esses compostos. Em particular, essa composição pode, por exemplo, ser usada como um adoçante, por exemplo, em um alimento ou uma bebida. Portanto, de acordo com a invenção, é fornecido um gênero alimentício, ração ou bebida que compreende uma composição da invenção.

[0139] Por exemplo, uma composição da invenção pode ser formulada em refrigerantes, como um adoçante de mesa, goma de mascar, laticínio como iogurte (por exemplo, iogurte natural), torta, cereal ou alimento à base de cereal, nutracêutico, farmacêutico, gel comestível, produto de confeitaria, cosmético, pastas de dente ou outra composição de cavidade oral, etc. Além disso, uma composição da invenção pode ser usada como um adoçante não apenas para bebidas, gêneros alimentícios, e outros produtos dedicados ao consumo humano, mas também em forragem e ração animal com características aprimoradas.

[0140] Consequentemente, a invenção fornece, inter alia, um gênero alimentício, ração ou bebida que compreende uma composição da invenção.

[0141] Durante a fabricação de gêneros alimentícios, bebidas, produtos farmacêuticos, cosméticos, produtos de mesa, goma de mascar, os métodos convencionais como mistura, amassamento, dissolução, conserva, permeação, percolação, borrifo, atomização, infusão e outros métodos podem ser usados.

[0142] Uma composição da invenção pode ser usada em formas secas ou líquidas. Este pode ser adicionado antes ou depois do termotratamento de produtos alimentícios. A quantidade do adoçante depende do propósito de uso. Esse pode ser adicionado em separado ou em combinação com outros compostos.

[0143] Uma composição da invenção pode ser mesclada com um ou mais outros adoçantes calóricos ou não calóricos. Essa mistura pode ser usada para aprimorar o perfil de sabor ou temporal ou a estabilidade. Uma ampla faixa tanto de adoçantes não calóricos quanto calóricos pode ser adequada para mesclagem com uma composição da invenção. Por exemplo, adoçantes não calóricos tais como mogrosídeo, monatina, aspartame, sais de acessulfame, ciclamato, sucralose, sais de sacarina ou eritritol. Adoçantes calóricos adequados para mistura com um glicosídeo de esteviol ou uma composição da invenção incluem álcoois de açúcar e carboidratos como sacarose, glicose, frutose e HFCS. Aminoácidos com sabor doce como glicina, alanina ou serina também podem ser usados.

[0144] Uma composição da invenção pode ser usada em combinação com um supressor de adoçante, como um supressor de adoçante natural. Esse pode ser combinado com um intensificador de sabor umami, como um aminoácido ou um sal deste.

[0145] Uma composição da invenção pode ser combinada com um poliol ou álcool de açúcar, um carboidrato, uma substância fisiologicamente ativa ou ingrediente funcional (por exemplo, um carotenoide, fibra dietética, ácido graxo, saponina, antioxidante, nutracêutico, flavonoide, isotiocianato, fenol, esterol ou estanol vegetal (fitoesteróis e fitoestanóis), um poliol, um prebiótico, um probiótico, um fitoestrogênio, proteína de soja, sulfetos/tióis, aminoácidos, uma proteína, uma vitamina, um mineral e/ou uma substância classificada com base em benefícios de saúde, como cardiovascular, redutor de colesterol ou anti-inflamatório.

[0146] Uma composição da invenção pode incluir um agente saborizante, um componente de aroma, um nucleotídeo, um ácido orgânico, um sal de ácido orgânico, um ácido inorgânico, um composto amargo, uma proteína ou um hidrolisado de proteína, um tensoativo, um flavonoide, um composto adstringente, uma vitamina, uma fibra dietética, um antioxidante, um ácido graxo e/ou um sal.

[0147] Uma composição da invenção pode ser aplicada como um adoçante de alta intensidade para produzir bebidas com zero caloria, calorias reduzidas ou para diabéticos e produtos alimentícios com características de sabor aprimoradas. Também pode ser usado em drinques, gêneros alimentícios, produtos farmacêuticos e outros produtos nos quais o açúcar não pode ser usado.

[0148] Além disso, uma composição da invenção pode ser usada como um adoçante não apenas para bebidas, gêneros alimentícios e outros produtos destinados ao consumo humano, mas também para ração e forragem com características aprimoradas.

[0149] Os exemplos de produtos em que uma composição da invenção pode ser usada como um composto de adoçamento podem ser bebidas alcoólicas como vodca, vinho, cerveja, licor, saquê etc.; sucos naturais, bebidas refrescantes, refrigerantes carbonatados, bebidas dietéticas, bebidas de zero caloria, bebidas e alimentos de caloria reduzida, bebidas de iogurte, sucos instantâneos, café instantâneo, tipos em pó de bebidas instantâneas, produtos enlatados, xaropes, pasta de soja fermentada, molho de soja, vinagre, temperos, maionese, ketchups, curry, sopa, caldo instantâneo, molho de soja em pó, vinagre em pó, tipos de biscoitos, biscoito de arroz, creme crackers, pão, chocolates, caramelo, doces, goma de mascar, geleia, pudim, frutas e vegetais em conserva, creme fresco, compota, marmelada, pasta de flor, leite em pó, sorvete, sorbet, vegetais e frutas embalados em garrafas, feijões cozidos e enlatados, carne e alimentos cozidos em molho adocicado, produtos alimentícios vegetais agrícolas, frutos do mar, presunto, salsicha, embutido de peixe, salsicha de peixe, pasta de peixe, produtos de peixe fritos em imersão, produtos de fruto do mar seco, produtos alimentícios congelados, alga marinha em conserva, carne em conserva, tabaco, produtos medicinais e muitos outros. A princípio, ele pode ter aplicações ilimitadas.

[0150] A composição adoçada compreende uma bebida, cujos exemplos não limitantes incluem bebidas gasosas e não gasosas como colas, refrigerantes de gengibre, cervejas-de- raiz, sidras, refrigerantes com sabor de fruta (por exemplo, refrigerantes com sabor cítrico como lima-limão ou laranja), refrigerantes em pó e similares; sucos de fruta originados de frutas ou vegetais, sucos de fruta incluindo sucos espremidos ou similares, sucos de fruta contendo pedaços de fruta, bebidas de fruta, bebidas de suco de fruta, bebidas contendo sucos de fruta, bebidas com aromatizantes de fruta, sucos vegetais, sucos contendo vegetais e sucos misturados contendo frutas e vegetais; bebidas esportivas, bebidas energéticas, água aromatizada e bebidas similares (por exemplo, água com aromatizantes natural ou sintético); bebidas do tipo chá ou de uso diário como café, chocolate, chá preto, chá verde, chá oolong e similares; bebidas que contêm componentes lácteos como bebidas à base de leite, café contendo componentes lácteos, café com leite, chá com leite, bebidas de leite e frutas, iogurte bebível, bebidas com bactérias formadoras de ácido láctico ou similares; e laticínios.

[0151] Em geral, a quantidade de adoçante presente em uma composição adoçada varia amplamente dependendo do tipo particular de composição adoçada e de sua doçura desejada. Técnicos no assunto podem discernir prontamente a quantidade apropriada de adoçante a colocar na composição adoçada.

[0152] Durante a fabricação de gêneros alimentícios, bebidas, produtos farmacêuticos, cosméticos, produtos de mesa, goma de mascar, os métodos convencionais como mistura, amassamento, dissolução, conserva, permeação, percolação, borrifo, atomização, infusão e outros métodos podem ser usados.

[0153] Assim, as composições que incorporam uma composição da invenção podem ser produzidas por qualquer método conhecido pelos versados na técnica que fornecem misturas uniformes homogêneas ou misturas homogêneas dos ingredientes. Esses métodos incluem mistura seca, secagem por pulverização, aglomeração, granulação a úmido, compactação, cocristalização e similares.

[0154] Em forma sólida, uma composição da invenção pode ser fornecida para consumidores em qualquer forma adequada para entrega no artigo comestível a ser adoçado, incluindo sachês, pacotes, bolsas ou caixas, cubos, tabletes, vapores ou tiras dissolvíveis. A composição pode ser administrada como uma dose unitária ou em forma a granel.

[0155] P ara sistemas e composições adoçantes líquidos, podem ser usadas formas fluidas, semifluidas, pastas e formas cremosas convenientes, embalagem apropriada que usa material de embalagem apropriado em qualquer formato ou forma deve ser inventada para ser conveniente para carregar ou dispensar ou armazenar ou transportar qualquer combinação contendo qualquer um dos produtos adoçantes acima ou combinação de produtos produzidos acima.

[0156] Uma composição da invenção pode incluir agentes de aumento de volume, ingredientes funcionais, corantes, aromatizantes.

[0157] Modalidades da invenção: 1. Um método para purificar rebaudiosídeo M, cujo método compreende: (a) fornecer uma solução que compreende rebaudiosídeo M em uma concentração de pelo menos cerca de 10 g/l e em um grau de pureza de pelo menos cerca de 10% em peso em uma base seca; e (b) cristalizar, a partir da solução, uma composição de alto grau de pureza que compreende rebaudiosídeo M, para, através disso, purificar o rebaudiosídeo M. 2. Um método para purificar rebaudiosídeo M de acordo com a reivindicação 1, cujo método compreende: (a) fornecer uma solução que compreende rebaudiosídeo M em uma concentração de pelo menos cerca de 10 g/l e em um grau de pureza de pelo menos 10% em peso em uma base seca; (b) concentrar a dita solução para alcançar uma solução que compreende rebaudiosídeo M em uma concentração de pelo menos cerca de 80 g/l; e (c) cristalizar, a partir da solução, uma composição de alto grau de pureza que compreende rebaudiosídeo M, para, através disso, purificar o rebaudiosídeo M. 3. Um método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a composição de alto grau de pureza que compreende rebaudiosídeo M compreende rebaudiosídeo M em um grau de pureza maior que cerca de 60% em peso em uma base seca. 4. Um método, de acordo com a reivindicação 3, em que a composição de alto grau de pureza que compreende rebaudiosídeo M compreende rebaudiosídeo M em um grau de pureza maior que cerca de 90% em peso em uma base seca. 5. Um método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a composição de alto grau de pureza que compreende rebaudiosídeo M compreende pelo menos cerca de 98% em peso em uma base seca do total de glicosídeos de esteviol. 6. Um método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a composição de alto grau de pureza que compreende rebaudiosídeo M compreende não mais que cerca de 150 ppm em uma base seca em peso de equivalentes de ácido caurenoico. 7. Um método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a composição de alto grau de pureza compreende não mais que cerca de 2% em peso em uma base seca de esteviosídeo. 8. Um método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a etapa de concentração (b) não compreende cromatografia para concentrar a quantidade do glicosídeo de esteviol desejado. 9. Um método, de acordo com qualquer uma das modalidades 2 a 8, em que a etapa de concentração (b) compreende: uma combinação de ultrafiltração e nanofiltração; evaporação; e/ou secagem por aspersão da solução na etapa (a) e, então, redissolução do material seco por aspersão. 10. Um método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores que é executado substancialmente na ausência de um solvente orgânico. 11. Um método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a composição de alto grau de pureza que compreende rebM é cristalizada a partir de uma solução de água. 12. Um método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, que compreende adicionalmente semear a solução que compreende rebaudiosídeo M com uma quantidade de rebaudiosídeo M suficiente para promover a cristalização do rebaudiosídeo M. 13. Um método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, que compreende adicionalmente separar e lavar a composição de alto grau de pureza que compreende rebaudiosídeo M. 14. Um método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, que compreende adicionalmente secar a composição de alto grau de pureza que compreende rebaudiosídeo M. 15. Um método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma cristalização de purificação adicional é executada. 16. Um método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a solução de rebaudiosídeo M compreende rebaudiosídeo M produzido de modo fermentativo. 17. Um método para purificar rebaudiosídeo M, cujo método compreende purificar o rebaudiosídeo M substancialmente na ausência de um solvente orgânico. 18. Um método para purificar rebaudiosídeo M, cujo método compreende purificar o rebaudiosídeo M na ausência de uma etapa de cromatografia de adsorção. 19. Um método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a solução que compreende rebaudiosídeo M em (a) tem uma concentração de rebaudiosídeo M de pelo menos cerca de 15 g/l, pelo menos cerca de 20 g/l, pelo menos cerca de 25 g/l, pelo menos cerca de 30 g/l ou pelo menos cerca de 40 g/l. 20. Um método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a solução que compreende rebaudiosídeo M em (a) tem um grau de pureza de rebM de pelo menos cerca de 15% em peso em uma base seca, pelo menos cerca de 20% em peso em uma base seca, pelo menos cerca de 25% em peso em uma base seca, pelo menos cerca de 30% em peso em uma base seca, pelo menos cerca de 40% em peso em uma base seca ou pelo menos cerca de 50% em peso ou mais em uma base seca. 21. Uma composição que compreende rebaudiosídeo M obtenível por um método de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores.

[0158] Uma referência, no presente documento, a um documento de patente ou outra matéria que é dada como estado da técnica não deve ser considerada como uma admissão de que aquele documento ou matéria eram conhecidos ou que as informações contidas neles eram parte do conhecimento comum geral na data de prioridade de qualquer uma das reivindicações.

[0159] A divulgação de cada referência apresentada no presente documento é incorporada aqui, por referência, em sua totalidade.

[0160] A presente invenção é adicionalmente ilustrada pelos seguintes Exemplos:

EXEMPLOS Exemplo 1. Cristalização direta de rebaudiosídeo M de um fluxo aquoso

[0161] A cepa Yarrowia lipolytica STV2216 que tem o genótipo apresentado na Tabela 1 foi construída usando a abordagem descrita nos documentos WO2013/110673 e WO2015/007748. Tabela 1. Genótipo da cepa STV2216. Os valores entre parênteses indicam o número de cópia do gene presente na cepa

[0162] A cepa Yarrowia lipolytica foi cultivada em frascos de agitação que contêm um meio que contém 1% de extrato de levedura e 3,6% de glicerol por 1 dia a 30°C e 220 rpm.

[0163] Subsequentemente, um fermentador de semente foi inoculado com a pré-cultura de frasco de agitação. O meio mineral de fermentação de semente tinha como base Verduyn et al. (Verduyn C, Postma E, Scheffers WA, Van Dijken JP. Yeast, julho de 1992;8(7):501-517). O pH foi controlado em 5,0 pela adição de amônia (10% em peso). A temperatura foi controlada em 30°C. pO2 foi controlado em 20% ajustando a velocidade do agitador.

[0164] Um fermentador de produção foi inoculado a partir do fermentador de semente após 2 dias. O meio mineral de fermentação de produção tinha como base Verduyn et al. (Verduyn C, Postma E, Scheffers WA, Van Dijken JP. Yeast, julho de 1992;8(7):501-517). Após a fase de batelada, uma alimentação de glicose foi iniciada e a concentração de glicose no caldo foi mantida limitada. O pH foi controlado em 5,7 pela adição de amônia (10% em peso). A temperatura foi controlada em 30°C. pO2 foi controlado em 20% ajustando a velocidade do agitador.

[0165] Amostras de caldo foram diluídas em água e 33%de acetonitrila e analisadas por LC/MS. A composição de glicosídeos de esteviol (SGs) e glicosídeos de ácido caurenoico (KAGs) no caldo resultante é apresentada na Tabela 2. Tabela 2: Composição de caldo de fermentação

[0166] O caldo de fermentação após as fermentações em escala laboratorial foi processado da seguinte forma: - centrifugação por 30 min a 4000 x g; - pH no sobrenadante foi ajustado para 3,5 e o sobrenadante foi aquecido por 30 min a 70°C; - o sobrenadante aquecido foi clarificado por centrifugação; - o sobrenadante clarificado foi ultrafiltrado através de uma membrana com 10 kDa de recorte; e - o permeado após a ultrafiltração foi nanofiltrado usando uma membrana com 150-300 Da de recorte.

[0167] Observou-se que a cristalização de rebaudiosídeo M começou espontaneamente assim que a concentração de rebaudiosídeo M no retentado de nanofiltração excedeu 30 g/l. Permitiu-se que a cristalização prosseguisse durante a noite, os cristais foram separados por filtração a vácuo e a torta de cristal foi lavada com 2 volumes de torta de água e seca no forno a vácuo. Por fim, 14,5 g de cristais secos foram isolados de 0.871 kg de retentado de NF.

[0168] A composição dos cristais é apresentada na Tabela 3 abaixo. Tabela 3. Composição de cristais de rebaudiosídeo M

[0169] P ara alcançar a purificação adicional de KAGs, os cristais produzidos a partir do caldo de fermentação foram recristalizados a partir da solução aquosa da seguinte forma.

[0170] A suspensão de cristais de 2,5 g em 100 ml de água foi aquecida a 75°C por 10 minutos para dissolver os cristais. A solução foi resfriada a 20°C em 10°C/h e incubada nessa temperatura durante a noite. Os cristais formados foram filtrados por vácuo e lavados com dois volumes de torta de 95% de etanol

[0171] A escolha de lavar o líquido se deve a baixa solubilidade de rebaudiosídeo M no mesmo. Os cristais foram secos a 60 °C sob vácuo durante a noite. O procedimento resultou em 1,7 g de cristais de Reb-M seco. Os cristais continham >95% de Reb-M como determinado por LC-UV e o nível de todo o KAG estava abaixo do limite de detecção de LC-MS.

Claims (16)

1. Método para purificar rebaudiosídeo M caracterizado por compreender as etapas de: (a) fornecer uma solução compreendendo rebaudiosídeo M, em que a solução de rebaudiosídeo M é um caldo de fermentação ou uma solução derivada de um caldo de fermentação, em uma concentração de pelo menos 10 g/l e em um grau de pureza de pelo menos 10% em peso em uma base seca, em que a solução compreende 2% ou menos de solvente orgânico; e (b) cristalizar, a partir da solução, uma composição de alto grau de pureza compreendendo rebaudiosídeo M, para, através disso, purificar o rebaudiosídeo M, em que o método é realizado na ausência de uma etapa de cromatografia de adsorção, em que o método compreende uma etapa de concentração, em que a etapa de concentração compreende: uma combinação de ultrafiltração e nanofiltração; evaporação; e/ou secagem por aspersão da solução na etapa (a) e, então, redissolução do material seco por aspersão, em que a etapa de cristalização ou as etapas de cristalização são realizadas em água e na ausência de solvente orgânico.

2. Método para purificar rebaudiosídeo M, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender as etapas de: (a) fornecer uma solução compreendendo rebaudiosídeo M, em que a solução de rebaudiosídeo M é um caldo de fermentação ou uma solução derivada de um caldo de fermentação, em uma concentração de pelo menos 10 g/l e em um grau de pureza de pelo menos 10% em peso em uma base seca, em que a solução compreende 2% ou menos de solvente orgânico; (b) concentrar a dita solução para alcançar uma solução compreendendo rebaudiosídeo M em uma concentração de pelo menos 50 g/l; e (c) cristalizar, a partir da solução, uma composição de alto grau de pureza compreendendo rebaudiosídeo M, para, através disso, purificar o rebaudiosídeo M, em que o método é realizado na ausência de uma etapa de cromatografia de adsorção, em que a etapa de concentração (b) compreende: uma combinação de ultrafiltração e nanofiltração; evaporação; e/ou secagem por aspersão da solução na etapa (a) e, então, redissolução do material seco por aspersão, em que a etapa de cristalização ou as etapas de cristalização são realizadas em água e na ausência de solvente orgânico.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a composição de alto grau de pureza compreendendo rebaudiosídeo M compreende rebaudiosídeo M em um grau de pureza maior que 60% em peso em uma base seca.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a composição de alto grau de pureza compreendendo rebaudiosídeo M compreende rebaudiosídeo M em um grau de pureza maior que 90% em peso em uma base seca.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a composição de alto grau de pureza compreendendo rebaudiosídeo M compreende pelo menos 98% em peso em uma base seca do total de glicosídeos de esteviol.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a composição de alto grau de pureza compreendendo rebaudiosídeo M compreende até 150 ppm em uma base seca em peso de ácido caurenoico e/ou equivalentes de ácido caurenoico.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a composição de alto grau de pureza compreende até 2% em peso em uma base seca de esteviosídeo.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 7, caracterizado pelo fato de que a etapa de concentração (b) é realizada na ausência de uma cromatografia para concentrar a quantidade do glicosídeo de esteviol desejado.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a composição de alto grau de pureza compreendendo rebaudiosídeo M é cristalizada a partir de uma solução de água.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por compreender adicionalmente semear a solução compreendendo rebaudiosídeo M com uma quantidade de rebaudiosídeo M suficiente para promover a cristalização do rebaudiosídeo M.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por compreender adicionalmente separar e lavar a composição de alto grau de pureza compreendendo o rebaudiosídeo M.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado por compreender adicionalmente secar a composição de alto grau de pureza compreendendo o rebaudiosídeo M.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que uma cristalização de purificação adicional é executada.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado por ser executado na ausência de um solvente orgânico.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a solução compreendendo rebaudiosídeo M em (a) tem uma concentração de rebaudiosídeo M de pelo menos 15 g/l, pelo menos 20 g/l, pelo menos 25 g/l, pelo menos 30 g/l ou pelo menos 40 g/l.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a solução compreendendo rebaudiosídeo M em (a) tem um grau de pureza de rebaudiosídeo M de pelo menos 15% em peso em uma base seca, pelo menos 20% em peso em uma base seca, pelo menos 25% em peso em uma base seca, pelo menos 30% em peso em uma base seca, pelo menos 40% em peso em uma base seca ou pelo menos 50% em peso ou mais em uma base seca.

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