BR112018017316B1 - Compostos e métodos para a síntese de 5-(n-protegido-triptaminocarboxiamida)-2´- desoxiuridina fosforamidita, oligonucleotídeo e seu método de produção - Google Patents

Compostos e métodos para a síntese de 5-(n-protegido-triptaminocarboxiamida)-2´- desoxiuridina fosforamidita, oligonucleotídeo e seu método de produção Download PDF

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Abstract

A presente invenção refere-se a triptamina modificada, trip-tamina-2?-deóxi-uridina (TrpdU) e TrpdU-fosforamiditas para síntese de oligonucleotídeo, bem como métodos aprimorados de sua síntese e oli-gonucleotídeos que compreendem pelo menos um nucleotídeo TrpdU modificado.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido Provisório US n° 62/308.132, depositado em 14 de março de 2016, cujo pedido está integralmente incorporado neste documento por referência para qualquer fim.
CAMPO
[002] Esta descrição refere-se ao campo de bases modificadas, nucleotídeos e fosforamiditas, incluindo métodos aprimorados de síntese e oligonucleotídeos compreendendo os nucleotídeos modificados.
ANTECEDENTES
[003] O nucleotídeo quimicamente modificado, TrpdU (e seus análogos 2'-modificados), que porta uma cadeia lateral de 3-(2-amino- etil)-indol, é útil, por exemplo, no desenvolvimento de aptâmeros de alta afinidade para analitos alvo, tais como proteínas. O anel de indol de TrpdU é rico em elétrons e polarizável, o que pode facilitar a formação de estrutura secundária e interfaces hidrofóbicas complementares com analitos alvo. Até hoje, o TrpdU não teve um desempenho tão bom quanto outros nucleotídeos modificados como um reagente de fosforamidita na síntese de oligonucleotídeo de fase sólida, e seu uso tem sido, portanto, limitado.
[004] Permanece a necessidade na técnica de uma fosforamidita de TrpU aprimorada, e métodos aprimorados para produzir uma fosfo- ramidita de TrpU.
SUMÁRIO
[005] Em algumas modalidades, é fornecido um composto com a estrutura
Figure img0001
ou um sal do mesmo. Em algumas modali- dades, R1 é selecionado dentre terc-butil, 1,1-dimetil-propila; 1,1- dimetil-butila; 2-clorofenila; 2-cianofenila; 1-metil-ciclopentila; e 1-metil- ciclohexila. Em algumas modalidades, X1 e X2 são, cada um, indepen-dentemente selecionados dentre metóxi e hidrogênio. Em algumas modalidades, X3 é selecionado dentre metóxi, fluoro, hidrogênio e terc- butildimetilsililóxi.
[006] Em algumas modalidades, R1 é terc-butila. Em algumas modalidades, R1 é 1,1-dimetil-propila. Em algumas modalidades, R1 é 1,1-dimetil-butila; 2-clorofenila. Em algumas modalidades, R1 é 2- cianofenila. Em algumas modalidades, R1 é 1-metil-ciclopentila. Em algumas modalidades, R1 é 1-metil-ciclohexila. Em algumas modalidades, X1 e X2 são metóxi. Em algumas modalidades, X3 é hidrogênio. Em algumas modalidades, X3 é metóxi. Em algumas modalidades, X3 é fluoro. Em algumas modalidades, X3 é terc-butildimetilsililóxi.
[007] Em algumas modalidades, um composto fornecido neste documento é selecionado dentre:
Figure img0002
Figure img0003
Figure img0004
e sais do mesmo.
[008] Em algumas modalidades, é fornecido um composto com a estrutura
Figure img0005
ou ou um sal do mesmo. Em algumas mdalidades, R1 é selecionado dentre terc-butila, 1,1-dimetil-propila; 1,1-dimetil-butila; 2-clrfenila; 2-cianofenila; 1-metil-ciclopentila; e 1- metil-ciclhexila. Em algumas modalidades, X1 e X2 são, cada um, in-dependentemente selecinados dentre metóxi e hidrogênio. Em algumas mdalidades, X3 é selecionado dentre metóxi, fluoro, hidrogênio e terc-butildimetilsililóxi.
[009] Em algumas modalidades, R1 é terc-butila. Em algumas mdalidades, R1 é 1,1-dimetil-propila. Em algumas modalidades, R1 é 1,1-dimetil-butila; 2-clrfenila. Em algumas modalidades, R1 é 2- cianfenila. Em algumas modalidades, R1 é 1-metil-ciclopentila. Em algumas mdalidades, R1 é 1-metil-ciclohexila. Em algumas modalidades, X1 e X2 sã metóxi. Em algumas modalidades, X3 é hidrogênio. Em algumas mdalidades, X3 é metóxi. Em algumas modalidades, X3 é flur. Em algumas mdalidades, X3 é terc-butildimetilsililóxi.
[0010] Em algumas modalidades, o composto é selecionado den tre:
Figure img0006
Figure img0007
Figure img0008
e sais do mesmo.
[0011] Em algumas modalidades, é fornecido um composto com a estrutura
Figure img0009
ou um sal do mesmo. Em algumas modalidades, R1 é selecionado dentre terc-butila, 1,1-dimetil-propila; 1,1-dimetil- butila; 2-clorofenila; 2-cianofenila; 1-metil-ciclopentila; e 1-metil- ciclohexila. Em algumas modalidades, R1 é terc-butila. Em algumas modalidades, R1 é 1,1-dimetil-propila. Em algumas modalidades, R1 é 1,1-dimetil-butila; 2-clorofenila. Em algumas modalidades, R1 é 2-cia- nofenila. Em algumas modalidades, R1 é 1-metil-ciclopentila. Em al- gumas modalidades, R1 é 1-metil-ciclohexil.
[0012] Em algumas modalidades, o composto tem uma estrutura selecionada dentre:
Figure img0010
Figure img0011
e sais do mesmo.
[0013] Em algumas modalidades, é fornecido um composto com a estrutura
Figure img0012
: Em algumas modalidades, R1 é selecio- nado dentre terc-butila, 1,1-dimetil-propila; 1,1-dimetil-butila; 2-clo- rofenila; 2-cianofenila; 1-metil-ciclopentila; e 1-metil-ciclohexila. Em algumas modalidades, R1 é terc-butil. Em algumas modalidades, R1 é 1,1-dimetil-propila. Em algumas modalidades, R1 é 1,1-dimetil-butila; 2- clorofenila. Em algumas modalidades, R1 é 2-cianofenila. Em algumas modalidades, R1 é 1-metil-ciclopentila. Em algumas modalidades, R1 é 1-metil-ciclohexila.
[0014] Em algumas modalidades, um composto tem uma estrutura selecionada dentre:
Figure img0013
[0015] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos de pro dução de um composto com a estrutura:
Figure img0014
ou um sal do mesmo. Em algumas modalidades, R1 é selecionado dentre terc-butila, 1,1-dimetil-propila; 1,1-dimetil-butila; 2-clorofenila; 2-cianofenila; 1-metil-ciclopentila; e 1- metil-ciclohexila. Em algumas modalidades, R1 é terc-butila. Em algu- mas modalidades, R1 é 1,1-dimetil-propila. Em algumas modalidades, R1 é 1,1-dimetil-butila; 2-clorofenila. Em algumas modalidades, R1 é 2- cianofenila. Em algumas modalidades, R1 é 1-metil-ciclopentila. Em algumas modalidades, R1 é 1-metil-ciclohexila. Em algumas modalida-des, o método compreende a reação de N-α-BOC-triptamina com um cloreto de ácido selecionado dentre cloreto de pivaloil, cloreto de 2,2- dimetilbutiroila, cloreto de 2,2-dimetilvaleroila, cloreto de 1-metilci- clopentano-1-carbonila, cloreto de 1-metilciclohexano-1-carbonila, cloreto de 2-clorobenzoila, e cloreto de 2-cianobenzoila. Em algumas mo-dalidades, R1 é terc-butila, e em que o cloreto de ácido é cloreto de pivaloil. Em algumas modalidades, R1 é 1,1-dimetil-propil e o cloreto de ácido é cloreto de 2,2-dimetilbutiroil. Em algumas modalidades, R1 é 1,1-dimetil-butila e o cloreto de ácido é cloreto de 2,2-dimetilvaleroila. Em algumas modalidades, R1 é 2-clorofenila e o cloreto de ácido é cloreto de 2-clorobenzoila. Em algumas modalidades, R1 é 2-cianofenila e o cloreto de ácido é cloreto de 2-cianobenzoila. Em algumas modalidades, R1 é 1-metil-ciclopentila e o cloreto de ácido é cloreto de 1- metilciclopentano-1-carbonila. Em algumas modalidades, R1 é 1-metil- ciclohexila e o cloreto de ácido é cloreto de 1-metilciclohexano-1- carbonila.
[0016] Em algumas modalidades, o método produz um composto selecionado dentre
Figure img0015
Figure img0016
Figure img0017
; e sais do mesmo.
[0017] Em algumas modalidades, é fornecido um método de pro dução de um composto com a estrutura
Figure img0018
: Em algumas modalidades, R1 é selecionado dentre terc-butila, 1,1-dimetil-propila; 1,1-dimetil-butila; 2- clorofenila; 2-cianofenila; 1-metil-ciclopentila; e 1-metil-ciclohexila. Em algumas modalidades, o método compreende a reação do composto
Figure img0019
com ácido trifluoroacético.
[0018] Em algumas modalidades, o método produz um composto selecionado dentre:
Figure img0020
Figure img0021
[0019] Em algumas modalidades, o método compreende ainda a reação de N-α-BOC-triptamina com um cloreto de ácido selecionado dentre cloreto de pivaloil, cloreto de 2,2-dimetilbutiroila, cloreto de 2,2- dimetilvaleroila, cloreto de 1-metilciclopentano-1-carbonila, cloreto de 1-metilciclohexano-1-carbonila, cloreto de 2-clorobenzoila, e cloreto de 2-cianobenzoila, para formar o composto
Figure img0022
[0020] Em algumas modalidades, é fornecido um método de pro dução de um composto com a estrutura:
Figure img0023
Ou ou um sal do mesmo. Em algumas modali- dades, R1 é selecionado dentre terc-butila, 1,1-dimetil-propila; 1,1- dimetil-butila; 2-clorofenila; 2-cianofenila; 1-metil-ciclopentila; e 1-metil- ciclohexila. Em algumas modalidades, X1 e X2 são, cada um, indepen-dentemente selecionados dentre metóxi e hidrogênio. Em algumas modalidades, X3 é selecionado dentre metóxi, fluoro, hidrogênio e terc- butildimetilsililóxi. Em algumas modalidades, o método compreende a reação do composto
Figure img0024
com 5’-O-DMT-5-(2,2,2-trifluoroetioxi-carbonil)-2’-deoxiuridina (TFE- dU).
[0021] Em algumas modalidades, o método produz um composto selecionado dentre:
Figure img0025
Figure img0026
Figure img0027
e sais do mesmo.
[0022] Em algumas modalidades, o método compreende ainda a reação do composto
Figure img0028
com ácido trifluoroacético para formar o composto
Figure img0029
Em algumas modalidades, o método compreende ainda a reação de N-α-BOC-triptamina com um cloreto de ácido selecionado dentre cloreto de pivaloila, cloreto de 2,2- dimetilbutiroila, cloreto de 2,2-dimetilvaleroila, cloreto de 1-metil- ciclopentano-1-carbonila, cloreto de 1-metilciclohexano-1-carbonila, cloreto de 2-clorobenzoila, e cloreto de 2-cianobenzoila, para formar o composto
Figure img0030
[0023] Em algumas modalidades, é fornecido um método de pro dução de um composto com a estrutura:
Figure img0031
ou um sal do mesmo. Em algumas modali- dades, R1 é selecionado dentre terc-butila, 1,1-dimetil-propila; 1,1- dimetil-butil; 2-clorofenila; 2-cianofenila; 1-metil-ciclopentila; e 1-metil- ciclohexila. Em algumas modalidades, X1 e X2 são, cada um, indepen-dentemente selecionados dentre metóxi e hidrogênio. Em algumas modalidades, X3 é selecionado dentre metóxi, fluoro, hidrogênio e terc- butildimetilsililóxi. Em algumas modalidades, o método compreende a reação do composto
Figure img0032
co com 2-cianoetil-N,N,N’,N’-tetraisopropil- fsframidita.
[0024] Em algumas modalidades, o método compreende a reação do composto
Figure img0033
com 5‘—o-DMT-5-(2,2,2-trif|uoroetioxi-car- bonil)-2’-deoxiuridina (TFEdU) para formar o composto
Figure img0034
Em algumas modalidades, o méto- do compreende a reação do composto
Figure img0035
com ácido trifluoroacético para formar o com-posto
Figure img0036
Em algumas modalidades, o méto- do compreende a reação de N-α-BOC-triptamina com um cloreto de ácido selecionado dentre cloreto de pivaloil, cloreto de 2,2-di- metilbutiroila, cloreto de 2,2-dimetilvaleroila, cloreto de 1-metilciclopen- tano-1-carbonila, cloreto de 1-metilciclohexano-1-carbonila, cloreto de 2-clorobenzoila, e cloreto de 2-cianobenzoila, para formar o composto
Figure img0037
[0025] Em algumas modalidades, o método produz um composto selecionado dentre:
Figure img0038
Figure img0039
e sais do mesmo.
[0026] Em algumas modalidades, é fornecido um método de pro- dução de um composto com a estrutura:
Figure img0040
, ou um sal do mesmo, em que, R1 é selecionado dentre terc-butila, 1,1-dimetil-propila; 1,1- dimetil-butila; 2-clorofenila; 2-cianofenila; 1-metil-ciclopentila; e 1-metil- ciclohexila; X1 e X2 são, cada um, independentemente selecionados dentre metóxi e hidrogênio; X3 é selecionado dentre metóxi, fluoro, hidrogênio, e terc- butildimetilsililóxi; compreendendo as etapas de: a) reação de N-α-BOC-triptamina com um cloreto de ácido selecionado dentre cloreto de pivaloila, cloreto de 2,2-dime- tilbutiroila, cloreto de 2,2-dimetilvaleroila, cloreto de 1-metilciclopen- tano-1-carbonila, cloreto de 1-metilciclohexano-1-carbonila, cloreto de 2-clorobenzoila, e cloreto de 2-cianobenzoila, para formar o composto
Figure img0041
b) reação do composto
Figure img0042
com ácido trifluoroacético para formar o composto
Figure img0043
c) reação do composto
Figure img0044
com 5’-O-DMT-5-(2,2,2-trifluoroetioxicarbonil)-2’-deoxiuridina (TFEdU) para formar o composto
Figure img0045
; e d) reação do composto
Figure img0046
com 2-cianoetil-N,N,N’,N’-tetraisopropilfosforamidita.
[0027] Em algumas modalidades, o método produz um composto selecionado dentre:
Figure img0047
Figure img0048
e sais do mesmo.
[0028] Em algumas modalidades, são fornecidos oligonucleotídeos compreendendo pelo menos um nucleotídeo de TrpU protegido, em que pelo menos um nucleotídeo de TrpU protegido no oligonucleotídeo tem a estrutura:
Figure img0049
. Em algumas modalidades, Ri é selecionado dentre terc-butila, 1,1-dimetil-propila; 1,1-dimetil-butila; 2-clorofenila; 2- cianofenila; 1-metil-ciclopentila; e 1-metil-ciclohexila. Em algumas mo-dalidades, X3 é selecionado dentre metóxi, fluoro, hidrogênio e terc- butildimetilsililóxi. Em algumas modalidades, X4 é selecionado dentre OH, -OR, -SR, e -Z-P(Z’)(Z")O-R, em que Z, Z’, e Z" são, cada um, independentemente selecionados dentre O e S, e R é um nucleotídeo adjacente no oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, X5 é selecionado dentre -O-ss, -OR, -SR, e -Z-P(Z’)(Z")O-R, em que ss é um suporte sólido, Z, Z’, e Z" são, cada um , independentemente, selecionados dentre O e S, e R é um nucleotídeo adjacente no oligonucleotí- deo. Em algumas modalidades, o suporte sólido é um vidro de porosidade controlada (CPG). Em algumas modalidades, Z’ é S e Z" é O. Em algumas modalidades, Z’ e Z" são O.
[0029] Em algumas modalidades, é fornecido um método de pro dução de um oligonucleotídeo compreendendo pelo menos um nucleo- tídeo TrpU, compreendendo a incorporação de pelo menos um nucleo- tídeo com a estrutura:
Figure img0050
em uma sequência nucleotídica em um suporte sólido; e remoção do grupo protetor
Figure img0051
do pelo menos um nucleo- tídeo TrpU incorporado no oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, R1 é selecionado dentre terc-butila, 1,1-dimetil-propila; 1,1-dimetil- butila; 2-clorofenila; 2-cianofenila; 1-metil-ciclopentila; e 1-metil-ciclo- hexila. Em algumas modalidades, X3 é selecionado dentre metóxi, fluoro, hidrogênio e terc-butildimetilsililóxi. Em algumas modalidades, X4 é selecionado dentre OH, -OR, -SR, e -Z-P(Z’)(Z")O-R, em que Z, Z’, e Z" são, cada um, independentemente selecionados dentre O e S, e R é um nucleotídeo adjacente no oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, X5 é selecionado dentre -O-ss, -OR, -SR, e -Z-P(Z’)(Z")O-R, em que ss é um suporte sólido, Z, Z’, e Z" são, cada um , independentemente, selecionados dentre O e S, e R é um nucleotídeo adjacente no oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, o suporte sólido é um vidro de porosidade controlada (CPG). Em algumas modalidades, Z’ é S e Z" é O. Em algumas modalidades, Z’ e Z" são O.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0030] Figura 1. Estrutura do TrpdU.
[0031] Figura 2. Esquema de síntese para compostos de triptami- na N-1-protegidos.
[0032] Figura 3. Migração do grupo acila na triptamina protegida após remoção de BOC.
[0033] Figura 4. Perfis de HPLC de aptâmeros sintetizados usando piv-TrpdU cianoetil-N,N-diisopropil fosforamidita (CEP), TrpdU CEP desprotegido, e NapdU CEP.
[0034] Figura 5. Esquema de síntese para trifluoroacetato de N-1- piv-triptamina.
[0035] Figura 6. Esquema de síntese para Piv-TrpdU cianoetil- N,N-di-isopropil fosforamidita (CEP).
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0036] Salvo observação em contrário, os termos técnicos são uti lizados de acordo com o uso convencional. Definições de termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas em Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 019-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-63202182-9); e Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
[0037] Salvo definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente entendido por uma pessoa versada na técnica à qual esta descrição pertence. Os termos singulares "um", "uma" e "o(a)" incluem os referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. "Compreendendo A ou B" significa a inclusão de A, ou B, ou A e B. É ainda para ser compreendido que todos os tamanhos de bases ou tamanhos de aminoácidos e todos os valores de peso molecular ou de massa molecular, dados para os ácidos nucleicos ou polipep- tídeos, são aproximados e estão fornecidos para descrição.
[0038] Além disso, os intervalos fornecidos neste documento são entendidos como sendo arredondamento para todos os valores dentro do intervalo. Por exemplo, um intervalo de 1 a 50 é entendido como incluindo qualquer número, combinação de números, ou subintervalo do grupo que consiste em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 (assim como suas frações, a menos que o contexto dite claramente o contrário). Qualquer intervalo de concentração, intervalo de porcentagem, intervalo de razão, ou intervalo de número inteiro deve ser entendido como incluindo o valor de qualquer número inteiro dentro do intervalo citado e, quando apropriado, suas frações (como um décimo e um centésimo de um número inteiro), a menos que indicado de outra forma. Além disso, deve-se entender que qualquer intervalo numérico citado neste documento em relação a qualquer característica física, tal como subunidades poliméricas, tamanho ou espessura, inclui qualquer número inteiro dentro do intervalo citado, a menos que indicado de outra forma. Conforme usado neste documento, "cerca de" ou "consistindo essencialmente em" significa ± 20% do intervalo, valor ou estrutura indicado, a menos que indicado em contrário. Conforme usado neste documento, os termos "inclui" e "compreende" têm significados amplos e são usados como sinônimos.
[0039] Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos aqui possam ser utilizados na prática ou nos testes da presente descrição, os métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências mencionadas neste documento estão incorporadas para referência integralmente. Em caso de conflito, o presente relatório descrito, incluindo explicações de termos, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser um fator limitante.
[0040] Como usado neste documento, o termo "nucleotídeo" refe re-se a um ribonucleotídeo ou um desoxirribonucleotídeo, ou uma forma modificada do mesmo, bem como um análogo do mesmo. Nucleo- tídeos incluem espécies que incluem purinas (por exemplo, adenina, hipoxantina, guanina e seus derivados e análogos) bem como pirimidi- nas (por exemplo, citosina, uracila, timina e seus derivados e análogos).
[0041] Conforme usado neste documento, o termo "TrpU" é usado para se referir genericamente a nucleotídeos de uridilila compreendendo um grupo funcional de N-(3-indol-2-etil)-carboxamida de posição 5. O uso do termo "TrpU" não se destina a ser limitante em relação à posição 2' da ribose, e o termo deve ser interpretado como incluindo, mas não se limitando a, nucleotídeos compreendendo -H, -OH, -OMe, ou -F na posição 2', a menos que uma fração 2' específica seja indicada. O termo "TrpdU" refere-se normalmente ao nucleotídeo TrpU compreendendo um 2'-H.
[0042] Como usado neste documento, "ácido nucleico", "oligonu- cleotídeo" e "polinucleotídeo" são usados permutavelmente para se referir a um polímero de nucleotídeos e incluem DNA, RNA, híbridos de DNA/RNA e modificações destes tipos de ácidos nucleicos, oligo- nucleotídeos e polinucleotídeos, em que a ligação de várias entidades ou frações às unidades de nucleotídeos em qualquer posição está incluída. Os termos "polinucleotídeo", "oligonucleotídeo" e "ácido nuclei- co" incluem moléculas de fita dupla ou única, bem como moléculas de tripla hélice. Ácido nucleico, oligonucleotídeo e polinucleotídeo são termos mais amplos do que o termo aptâmero e, assim, os termos ácido nucleico, oligonucleotídeo e polinucleotídeo incluem polímeros de nucleotídeos que são aptâmeros, mas os termos ácido nucleico, oligo- nucleotídeo e polinucleotídeo não estão limitados a aptâmeros.
[0043] Conforme usado neste documento, o termo "pelo menos um nucleotídeo", ao se referir às modificações de um ácido nucleico, refere-se a um, vários ou todos os nucleotídeos no ácido nucleico, in-dicando que qualquer uma ou todas as ocorrências de qualquer um ou todos dentre A, C, T, G ou U em um ácido nucleico podem ser modifi-cadas ou não.
[0044] Conforme usado neste documento, uma "fosforamidita" é um nucleotídeo que compreende um grupo
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ligado ao carbono 3' da ribose, ou uma posição equivalente em outra fração de açúcar. Em algumas modalidades, uma fosforamidita compreende um grupo protetor na 5'-OH da ribose, tal como um grupo protetor tritil, por exemplo, um grupo protetor dimetoxitritil.
[0045] Conforme usado neste documento, "síntese de fase sólida" refere-se à síntese de oligonucleotídeo de fase sólida usando química de fosforamidita, a menos que indicado especificamente em contrário.
Compostos
[0046] A presente descrição fornece os compostos mostrados na Tabela A, bem como seus sais, e métodos de produção e uso dos compostos. Tabela A: Compostos da descrição
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[0047] X3 nas estruturas na Tabela A pode, em algumas modali dades, ser selecionado dentre metóxi, fluoro, hidrogênio e terc-butil- dimetilsililóxi. Em algumas modalidades, os compostos de 1 a 7 na Tabela A podem ser usados na síntese de oligonucleotídeo de fase sólida para produzir oligonucleotídeos compreendendo um ou mais nucleotídeos TrpU. Também são fornecidos neste documento compostos compreendendo uma estrutura selecionada dentre os compostos de 8 a 14, em que o carbono 3' da ribose é ligado a uma fase sólida, tal como vidro de porosidade controlada, através de uma fração de li- gante. Em algumas modalidades, o carbono 3' da ribose está ligado a uma fase sólida através de uma fração de ligante selecionado dentre succinato, diglicolato e alquilamino.
[0048] Os compostos na Tabela A podem ser sintetizados, em al gumas modalidades, usando os métodos descritos neste documento, tais como nos Exemplos neste documento.
Sais
[0049] Pode ser conveniente ou desejável preparar, purificar e/ou manusear um sal correspondente do composto.
[0050] Por exemplo, se o composto for aniônico, ou tiver um grupo funcional que possa ser aniônico (por exemplo, -COOH pode ser - COO-), então um sal pode ser formado com um cátion adequado. Exemplos de cátions inorgânicos adequados incluem, mas não estão limitados a, íons de metal alcalino, tais como Na+ e K+, cátions de alcalinos terrosos, tais como Ca2+ e Mg2+, e outros cátions, tais como Al+3. Exemplos de cátions orgânicos adequados incluem, mas não estão limitados a, íon amônio (isto é, NH4 +) e íons amônio substituídos (por exemplo, NH3RX+, NH2RX 2 +, NHRX 3 +, NRX 4 +). Exemplos de alguns íons amônio substituídos adequados são aqueles derivados de: etila- mina, dietilamina, diciclohexilamina, trietilamina, butilamina, etilenodi- amina, etanolamina, dietanolamina, piperazina, benzilamina, fenilben- zilamina, colina, meglumina e trometamina, bem como aminoácidos, como lisina e arginina. Um exemplo de um íon amônio quaternário comum é N(CH3)4+.
[0051] Se o composto for catiônico, ou tiver um grupo funcional que possa ser catiônico (por exemplo, -NH2 pode ser -NH3+), então, um sal pode ser formado com um ânion adequado. Os exemplos de ânions inorgânicos adequados incluem, mas não estão limitados a, àqueles derivados dos seguintes ácidos inorgânicos: clorídrico, bromí- drico, iodídrico, sulfúrico, sulfuroso, nítrico, nitroso, fosfórico e fosforo- so.
[0052] Exemplos de ânions orgânicos adequados incluem, mas não estão limitados a, derivados dos seguintes ácidos orgânicos: 2- acetioxibenzoico, acético, ascórbico, aspártico, benzoico, canforsulfô- nico, cinâmico, cítrico, edético, etanodissulfônico, etanossulfônico, fu- márico, glucoheptônico, glucônico, glutâmico, glicólico, hidroximaleico, carboxílico hidroxinaftaleno, isetiônico, láctico, lactobiônico, láurico, maleico, málico, metanossulfônico, múcico, oleico, oxálico, palmítico, pamoico, pantotênico, fenilacético, fenilsulfônico, propiônico, pirúvico, salicílico, esteárico, succínico, sulfanílico, tartárico, toluenossulfônico e valérico. Exemplos de ânions orgânicos poliméricos adequados incluem, mas não estão limitados a, derivados dos seguintes ácidos poli- méricos: ácido tânico, carboximetilcelulose.
[0053] A menos que especificado em contrário, uma referência a um composto em particular inclui também as formas de sal dos mesmos.
Oligonucleotídeos Modificados
[0054] Conforme usado neste documento, os termos "modificar", "modificado", "modificação" e quaisquer variações dos mesmos, quando usados em referência a um oligonucleotídeo, significam que pelo menos uma das quatro bases constituintes (isto é, A, G, T/U e C) do oligonucleotídeo é um análogo ou éster de um nucleotídeo de ocorrência natural. Em algumas modalidades, o nucleotídeo modificado confere resistência à nuclease ao oligonucleotídeo. As modificações adicionais podem incluir modificações de estrutura principal, metilações, combinações de pareamento de base incomuns, tais como as isobases isocitidina e isoguanidina, e similares. Modificações também podem incluir modificações de 3' e 5', tal como capping. Outras modificações podem incluir a substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural com um análogo, modificações internucleotídicas, tais como, por exemplo, aquelas com ligações não carregadas (por exemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) e aquelas com ligações carregadas (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquelas com intercalantes (por exemplo, acridi- na, psoraleno, etc.), aquelas contendo quelantes (por exemplo, metais, metais radioativos, boro, metais oxidativos, etc.), aquelas contendo alquilantes, e aquelas com ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.). Além disso, qualquer um dos grupos hidroxila normalmente presentes no açúcar de um nucleotídeo pode ser substituído por um grupo fosfonato ou um grupo fosfato; protegido por grupos protetores padrão; ou ativado para preparar ligações adicionais a nucleotídeos adicionais ou a um suporte sólido. Os grupos OH terminais 5' e 3' podem ser fosforilados ou substituídos por aminas, frações de grupo de capping orgânico de cerca de 1 a cerca de 20 átomos de carbono, polímeros de polietilenoglicol (PEG) em uma modalidade variando de cerca de 10 a cerca de 80 kDa, polímeros de PEG em outra modalidade variando de cerca de 20 a cerca de 60 kDa, ou outros polímeros biológicos ou sintéticos hidrofílicos ou hidrofóbi- cos.
[0055] Polinucleotídeos também podem conter formas análogas de açúcares de ribose ou desoxirribose que são geralmente conhecidos na técnica, incluindo 2'-O-metila, 2'-O-alila, 2'-O-etila, 2'-O-propila, 2'- O-CH2CH2OCH3, 2'-fluoro, 2'-NH2 ou 2'-azido, análogos de açúcar car- bocíclico, açúcares a-anoméricos, açúcares epiméricos, tais como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares de piranose, açúcares de fura-nose, sedoheptuloses, análogos acíclicos e análogos de nucleosídeo abásicos, tais como metil ribose. Conforme observado neste documento, uma ou mais ligações fosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligação alternativos. Esses grupos de ligação alternativos incluem modalidades em que o fosfato é substituído por P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (O)NRX 2 ("amidato"), P(O) RX, P(O)ORX', CO ou CH2 ("formacetal"), em que cada RX ou RX' são, independentemente, H ou alquil (C1-C20) substituído ou não substituído contendo opcionalmente uma ligação éter (-O-), arila, alquenila, cicloalquila, cicloalqueni- la ou araldila. Nem todas as ligações em um polinucleotídeo precisam ser idênticas. Substituição das formas análogas de açúcares, purinas e pirimidinas pode ser vantajosa na concepção de um produto final, como também podem as estruturas de cadeia principal alternativas como uma cadeia principal de poliamida, por exemplo.
[0056] Os polinucleotídeos também podem conter formas análo gos de açúcar carbocíclico, açúcares a-anoméricos, açúcares epiméri- cos, tais como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares de piranose, açúcares de furanose, sedoheptuloses, análogos acíclicos e análogos de nucleosídeo abásicos, tais como metil ribose.
[0057] Se estiver presente, uma modificação da estrutura do nu- cleotídeo pode ser conferida antes ou após uma montagem do polímero. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes que não sejam nucleotídeos. Um polinucleotídeo pode ser modificado ainda após a polimerização, como por conjugação com um componente de marcação.
Preparação de Oligonucleotídeos
[0058] A síntese automatizada de oligodesoxinucleosídeos é práti ca de rotina em muitos laboratórios (ver, por exemplo, Matteucci, M. D. e Caruthers, M. H., (1990) J. Am. Chem. Soc., 103:3185-3191, cujos conteúdos estão incorporados por meios deste por referência inte-gralmente). A síntese de oligorribonucleosídeos também é bem conhecida (ver, por exemplo, Scaringe, S. A., et al., (1990) Nucleic Acids Res. 18:5433-5441, cujos conteúdos estão incorporados por meio deste por referência integralmente). Como observado neste documento, as fosforamiditas são úteis para a incorporação do nucleosídeo modificado em um oligonucleotídeo por síntese química, e os trifosfatos são úteis para a incorporação do nucleosídeo modificado em um oligonu- cleotídeo por síntese enzimática. (Ver, por exemplo, Vaught, J.D. et al. (2004) J. Am. Chem. Soc., 126:11231-11237; Vaught, J. V., et al. (2010) J. Am. Chem. Soc. 132, 4141-4151; Gait, M. J. "Oligonucleotide Synthesis a practical approach" (1984) IRL Press (Oxford, UK); Her- dewijn, P. "Oligonucleotide Synthesis" (2005) (Humana Press, Totowa, N.J. (cada um dos quais está incorporado neste documento integralmente por referência).
[0059] Em algumas modalidades, os compostos fornecidos neste documento e, em particular, os compostos de 1 a 7 da Tabela A, podem ser usados em métodos de síntese padrão de oligonucleotídeo de fosforamidita, incluindo métodos automatizados usando sintetizadores comercialmente disponíveis. Após a síntese, o grupo protetor no nu- cleotídeo TrpU é removido através de métodos de desproteção padrão, tais como tBuNH2/MeOH/H2O e MeNH2 (gás).
[0060] Em algumas modalidades, o uso dos compostos fornecidos neste documento, tais como os compostos de 1 a 7 da Tabela A, na síntese de oligonucleotídeo melhora o rendimento do produto de oligo- nucleotídeo desejado. Por exemplo, conforme descrito no Exemplo 4, o uso de Piv-TrpdU CEP no lugar de TrpdU CEP desprotegido melho- rou o rendimento de um oligonucleotídeo 51mer compreendendo 13 nucleotídeos TrpdU em cerca de 1,7. Ver Tabela 10. Para oligonucleo- tídeos mais longos, o rendimento pode ser aumentado em 2 vezes ou mais. Ver Tabela 11.
EXEMPLOS
[0061] Os exemplos a seguir são apresentados a fim de ilustrar mais completamente algumas modalidades da invenção. Eles não devem, de nenhuma forma, ser considerados como limitantes do amplo escopo da invenção. Os versados na técnica podem facilmente adotar os princípios subjacentes desta descoberta para projetar vários compostos sem se desviar do espírito da atual invenção.
Exemplo 1: Investigação de Grupos Protetores para Triptamina
[0062] Um sistema modelo foi usado para determinar a reatividade de vários grupos protetores de sulfonila e acila em condições de des-proteção de oligonucleotídeo padrão. O composto, N-α-terc-butoxi- carboniltriptamina (Figura 2, (1)), foi usado como um modelo para Trp- dU. Vários derivados de N-1 podem ser facilmente sintetizados por tratamento de (1,1 eq) em tetrahidrofurano (THF), seguido pela adição do cloreto ou anidrido de sulfonila ou acila adequado (1,0 eq) (Figura 2). Ver Cole, D. C., et al, J. Med. Chem., 50(23), 5535-5538, 2007. Os derivados de N-1 resultantes (Tabela 1) foram purificados por cristalização, cromatografia, ou usados diretamente em testes de desproteção. Tabela 1. Reagentes para Síntese de Análogos de N-1-Protegidos de a-BOC-Triptamina.
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Figure img0060
* Chuit, C., et al, Tetrahedron, 36(16), 2305-10, 1980; Kudo, Noriaki, K., et al, Chem & Pharm Bull. 44(4), 699-702, 1996; Hoffamn, W. F., et al, J. Med. Chem., 29(5), 842-52, 1986. ** Takahashi, Y., et al, Synthetic Communications, 19(11-12), 1945-54, 1989; Fathi, B., et al, Helvetica Chimica Acta, 85(7), 2083-2088, 2002.
[0063] Condições de teste de desproteção foram baseadas em dois protocolos: terc-butilamina e hidróxido de amônio em 37°C. A fim de dissolver os compostos de modelo hidrofóbico, metanol foi adicionado aos reagentes de desproteção (Tabela 2). Amostras de cada reação de desproteção em 37°C foram analisadas em 1, 4 e 24 horas. Em alguns casos, os substratos também foram submetidos a uma condição de desproteção por "estresse" de 70°C por 24 horas. Tabela 2. Condições de Modelo para Desproteção de Oligonucleotídeo
Figure img0061
[0064] A taxa alvo para clivagem alcalina dos grupos protetores no sistema modelo foi definida por um modelo matemático. Supôs-se que a desproteção seguiria uma cinética de pseudo-primeira ordem na presença de excesso de base. A taxa mínima aceitável foi definida como 99,9% de clivagem às 24 horas. A taxa de reação preferida daria mais margem para a variabilidade e foi definida como 99,9% de clivagem em 12 horas. Com base nestes critérios, o grupo protetor desejado seria 25-44% clivado a 1 hora e 68-90% clivado a 4 horas e >/= 99,9% clivado a 24 horas.
[0065] As reações de desproteção foram monitoradas por croma- tografia clássica em camada fina (TLC) em placas de sílica gel, eluindo com 25% de acetato de etil/75% de hexano. Constatou-se que a técnica de visualização de TLC mais precisa é uma coloração com per- manganato alcalino. A coloração com iodo pode resultar em super- representação do indol não protegido, enquanto a visualização com luz UV pode resultar em super-representação dos derivados de acil N-1- protegidos.
[0066] Os grupos protetores sulfonila foram estudados primeiro. Três derivados foram sintetizados para representar uma gama de es-truturas e reatividades: triflurometanossulfonil (triflil); metanossulfonil (mesil); e benzenossulfonil (besil) (Tabela 1). Verificou-se que todos os três derivados de sulfonila eram completamente estáveis (0% clivados) sob as condições de desproteção do oligo modelo (Tabela 3). Concluiu-se que as condições adversas alcalinas (NaOH + calor) descritas na literatura para clivar os grupos protetores sulfonila N-1-indol são ne-cessárias e mesmo o grupo trifluorometanossulfonil (Tf) altamente reativo é estável para condições mais amenas de desproteção do oligo.
[0067] Um conjunto de 16 análogos de acila (4 arila e 12 alquila) foram sintetizados a partir de BOC-triptamina e o reagente de cloreto de ácido apropriado. Os 16 cloretos de ácido foram obtidos comercialmente ou sintetizados a partir do ácido carboxílico comercialmente disponibilizado por reação com cloreto de tionil ou sintetizados de novo nas etapas 2-3 (Tabela 1).
[0068] Os grupos protetores acila apresentaram uma gama de rea- tividade em condições de desproteção alcalina. Os quatro derivados de aril acila apresentaram um espectro de reatividade (Tabela 4). O grupo benzoíla não substituído foi demasiado e totalmente clivado em menos de 1 hora, enquanto os análogos trissubstituídos em 2,4,6, Mes e Tcb, foram demasiado estáveis e não apresentavam clivagem detec- tável sob condições padrão. Entre esses extremos estava o análogo de 2-metilbenzoil (Tol) moderadamente impedido, que se encaixava nas taxas de clivagem alvo desejadas. O grupo Tol foi escolhido para avaliação adicional. Tabela 3. Desproteção percentual para grupos sulfonila ("Muito Lenta").
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Tabela 4. Porcentagem de desproteção para grupos aril acila ("Ideal" = Tol).
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[0069] Nenhum dos 12 grupos protetores alquil acila atingiu a taxa alvo desejada. Verificou-se que os análogos eram muito reativos (Tabela 5) ou muito estáveis (Tabela 6). Descobriu-se que pequenas mu- danças estruturais alteraram dramaticamente a taxa de clivagem alcalina. Por exemplo, dimetiletilacetil (Dmb) é muito rápido, enquanto die- tilmetilacetil (Meb) é muito lento.
[0070] Nenhum dos análogos demasiado estáveis (Tabela 5) foi considerado para desenvolvimento adicional porque a desproteção incompleta geralmente não é aceitável na síntese de oligonucleotí- deos.
[0071] Havia cinco análogos no grupo muito rápido (Tabela 5) com reatividade aproximadamente equivalente: Piv, Mcp, Mch, Dmv e Dmb. Todos apresentaram ~90% de clivagem a 1 hora e 100% de clivagem a 4 horas, o que foi mais rápido do que as taxas alvo desejadas. No entanto, Piv e Dmb foram selecionados para avaliação adicional.
[0072] Em resumo, o sistema modelo N-α-BOC-triptamina inicial permitiu a identificação de três grupos principais como possível grupo protetor N-1: Tol, Dmb e Piv. Os três grupos principais exibiram um intervalo de reatividade em relação a condições de desproteção de desproteção SOS alcalino: Piv > Dmb > Tol. Tabela 5. Porcentagem de desproteção para grupos alquil acila ("Muito Rápida")
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Tabela 6. Desproteção percentual para grupos alquil acila ("Muito Len- ta
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Exemplo 2: Uso de grupos protetores selecionados em TrpU
[0073] As diferentes reatividades dos três grupos protetores N-1 (Piv> Dmb> Tol) foram observadas após a remoção do grupo N-α- BOC e conversão em forma de base livre. A base livre N-1-protegida é instável porque o grupo acila N-1 (amina aromática) migra para N-a (alquil amina primária), que forma uma ligação amida mais forte (Figura 4). Este rearranjo autodegradativo é análogo à desproteção alcalina padrão.
[0074] Os três análogos, Piv> Dmb> Tol, foram tratados com ácido trifluoroacético em diclorometano para clivar o grupo protetor N-α- BOC. As reações foram interrompidas com carbonato de sódio a 5% e as bases livres de triptamina N-1-protegidas foram extraídas com acetato de isopropila. Foi realizado um teste de estabilidade aquecendo os extratos de base livre (~ 100 mM) a 70°C durante a noite. Verificou-se que o composto de Piv estava completamente decomposto, o composto de Dmb estava ~50% decomposto e o composto de Tol estava <5% decomposto. Um grau similar de degradação foi observado quando os extratos foram concentrados no evaporador rotativo e as aminas puras foram mantidas durante a noite à temperatura ambiente. Concluiu-se que os extratos são estáveis se armazenados no congelador.
[0075] Os três grupos principais (Tol, Dmb, Piv) foram, em segui da, convertidos nas 5'-DMT-2'-desoxiuridina-5-carboxamidas correspondentes removendo o grupo BOC e condensando as triptaminas N- 1-protegidas com 5’-O-DMT-5-(2,2,2-trifluoroetioxi-carbonil)-2'-desoxiu- ridina (TFEdU) para dar origem aos nucleosídeos de TrpdU N-1- protegidos: Tol-TrpdU, Dmb-TrpdU e Piv-TrpdU. Para minimizar a au- todegradação das aminas, a TFEdU foi adicionada diretamente aos extratos secos da reação de-BOC antes da concentração no evapora- dor rotativo. Verificou-se que, utilizando este método, predomina a via de reação desejada, produzindo as 5'-DMT-2'-desoxiuridina-5-carboxa- midas puras, que foram purificadas por cromatografia em sílica gel.
[0076] Estes nucleosídeos foram então avaliados nos testes de desproteção alcalina modelo (Tabela 7). Verificou-se que a clivagem dos grupos protetores acila, Tol e Dmb, era mais lenta nos compostos de nucleosídeos de TrpdU do que no modelo BOC-triptamina inicial (Tabela 6). Tabela 7. Desproteção percentual para Nucleosídeos de TrpdU N-1- Protegidos.
Figure img0066
Exemplo 3: Síntese de Piv-TrpdU CEP
[0077] Foi desenvolvido um processo eficiente de 3 etapas para preparar a cadeia lateral N-1-Piv-triptamina (como o sal de trifluoroace- tato [TFA] estável), que envolve três intermediários cristalinos e não requer cromatografia. O sal de TFA é então acoplado a TFEdU. O processo completo é mostrado nas Figuras 5 e 6.
[0078] N-α-BOC-triptamina. Foi desenvolvido um método de pro duzir N-α-BOC-triptamina que evita a cromatografia em sílica gel. O uso de acetato de isopropila como solvente permite que o produto se cristalize diretamente a partir da mistura de reação. Ver Figura 5.
[0079] O material de partida, a triptamina, é um sólido granular cristalino, de cor laranja pálido ou castanho claro, tal como atualmente disponibilizado comercialmente pela Alfa Aesar (produto A11116). Triptamina marrom com odor fecal deve ser recristalizada antes do uso. Anidrido BOC (dicarbonato di-terc-butil; produto 205249), e todos os outros solventes e reagentes foram adquiridos junto à Sigma- Aldrich e usados como recebidos.
[0080] Um balão de fundo redondo de 1 L, agitado mecanicamen te, foi carregado com triptamina (49,32 g, 308 mmol) e acetato de iso- propila (200 mL). A mistura foi rapidamente agitada sob um borbulha- dor de argônio e uma solução de dicarbonato de di-terc-butil (70,53 g, 323 mmol) em acetato de isopropila (100 mL) foi adicionada gota-a- gota durante 30 minutos. O gás começou a evoluir constantemente após ~ 40 mL terem sido adicionados e todos os sólidos dissolvidos perto do final da adição, gerando uma solução amarela. A agitação foi continuada durante mais 30 minutos e o teste de TLC confirmou o consumo da triptamina de partida (SG60, 10% de MeOH/90% de diclo- rometano, Rf(SM) = 0,1, Rf(produto) = 0,8).
[0081] A solução foi filtrada para remover um pouco de areia e po eira. O filtrado (~395 g) foi concentrado no evaporador rotativo para ~250 g e a solução quente (40°C) foi lentamente diluída com hexanos (~220 mL), até ao início da turvação. A solução foi semeada com 10 mg de produto autêntico e imediatamente cristalizada. A pasta foi en- velhecida sendo agitada durante 1 hora à temperatura ambiente e 1 hora em gelo, depois filtrada e enxaguada com 25% de iPrOAc/75% de hexanos (75 mL). O bolo de filtração foi lavado com hexanos (100 mL) e seco a vácuo para gerar N-α-BOC-triptamina sob a forma de um sólido cristalino branco (mp 86-88°C), 61,75 g, 77% de rendimento.
[0082] N-α-BOC-N-1-trimetilacetil-triptamina. Baseado no traba lho de Cole, D. C., et al, J. Med. Chem., 50(23), 5535-5538, 2007, terc- butóxido de potássio em THF foi inicialmente usado como base e solvente para a reação, mas ~5% de um subproduto de dímero polar (estrutura exata não determinada) foi produzido, o que foi difícil de remover por cristalização. Diversas combinações de solventes e bases foram testadas, o que revelou que o subproduto do dímero poderia ser suprimido pelo uso de terc-butóxido de sódio em éter dietílico. O cloreto de trimetilacetil foi adicionado em pequenas porções no final para titular o ânion N-1, sem gerar subprodutos superacilados. Consultar a Figura 5.
[0083] Um balão de fundo redondo de 1 L cheio de argônio seco com uma grande barra de agitação magnética (1,5") foi carregado com N-α-BOC-triptamina (28,63 g, 110 mmol) e pó de terc-butóxido de sódio (11,63 g, 121 mmol, cuidado: poeira irritante). Adicionou-se éter dietílico (anidro, 400 mL) por cânula sob argônio e agitado durante 10 min para se obter uma pasta lisa e branca. Um funil de adição calibrado foi colocado, enchido com uma solução de cloreto de trimetilacetila (14,6 g, 121 mmol, 110% teórico) em éter dietílico (~50 mL), para um volume total de 60 mL. A pasta foi resfriada em gelo e rapidamente agitada conforme a maior parte da solução de cloreto de ácido (54,5 mL, 110 mmol, 100% teórico) era adicionada em gotas durante ~40 min. A solução foi agitada por mais 20 min e amostrada para TLC [0,2 mL de alíquota em 1 mL de diclorometano] (SG60, 25% etilaceta- to/75% hexanos; Rf(SM) = 0,2, Rf(produto) = 0,4). Se o material inicial for detectável (>1%), então uma carga adicional correspondente de solução de cloreto de ácido é adicionada (1-10% teórico, conforme indicado pela análise de TLC) e a agitação continua por 1 hora.
[0084] A reação foi suprimida com bicarbonato de sódio a 5% (200 mL) e acetato de isopropila (100 mL). A camada orgânica foi lavada com salmoura de NaCl (50 mL), seca com MgSO4, filtrada e evaporada à secura in vacuo para gerar um sólido castanho (~37 g). Este produto bruto foi recristalizado a partir de uma solução quente de acetato de isopropila (74 mL) e hexanos (296 mL). Após o resfriamento a ~35°C, a solução agitada foi semeada com o produto autêntico (50 mg) e imediatamente cristalizada. A pasta foi rapidamente agitada por 1 hora em temperatura ambiente e 1 hora em gelo. A pasta foi filtrada, lavada com uma porção de filtrado (30 mL), e, em seguida, a torta foi lavada com hexanos (60 mL) e seca in vacuo. N-α-BOC-N-1-trimetilacetil- triptamina foi obtida como um sólido cristalino branco a branco-sujo (mp 95-97°C), 30,7 g, 81% de rendimento.
[0085] Se desejado, o produto pode ser reprocessado por recrista- lizações adicionais a partir de acetato de isopropila (2 mL/g) e hexanos (8 mL/g).
[0086] Trifluoroacetato de N-1-trimetilacetil-triptamina. Este sal é um sólido cristalino branco que é filtrado e lavado facilmente e é estável e não higroscópico. O sal se cristaliza diretamente a partir da mistura de reação. Ver Figura 5.
[0087] Um frasco de fundo redondo de 500 mL foi equipado com um adaptador Claisen e borbulhador de óleo configurado para varrer lentamente o espaço livre com argônio. Isto facilita a remoção do gás isobutileno a partir da mistura de reação e reduz produtos secundários.
[0088] Um frasco de fundo redondo de 500 mL (configurado como acima), com uma grande barra de agitação magnética, foi enchido com N-α-BOC-N-1-trimetilacetil-triptamina (30,0 g, 87,1 mmol) dissolvido em diclorometano anidro (90 mL), e ácido trifluoroacético (53 mL, 693 mmol, 8 equiv.) foi adicionado. A solução foi rapidamente agitada conforme o gás isobutileno era emitido e foi removida através do borbu- lhador de óleo. Após 1 hora, os cristais começaram a se formar na mistura e a análise de TLC mostrou que o material inicial tinha sido completamente consumido (SG60, 25% acetato de etila/75% hexanos; Rf(SM) = 0,4; RF(produto) = 0). Éter dietílico (~275 mL) foi adicionado em gotas à mistura bem agitada, fazendo com que ficasse espessa, e a pasta resultante foi rapidamente agitada por 1 hora em temperatura ambiente. Um pouco da torta de parede lisa foi desagregada e a barra de agitação e a pasta foram filtradas e lavadas com éter dietílico (100 mL). A torta foi cuidadosamente lavada com éter dietílico (100 mL) e seca in vacuo para gerar o sal de trifluoroacetato de N-1-trimetilacetil- triptamina como um pó cristalino branco (mp 150-152°C), 30,0 g, 96% de rendimento.
[0089] O sal de trifluoroacetato de N-1-trimetilacetil-triptamina não é significativamente higroscópico e pode ser transportado em temperatura ambiente, com proteção da luz em um recipiente hermeticamente fechado. Testes de estabilidade informais mostraram que o sal era estável em 70° C durante dez dias em um frasco vedado. Para armazenamento em longo prazo (> 1 mês), as condições de armazenamento refrigerado ou congelado podem ser usadas como precaução.
[0090] Um resumo das características de 1H-RMN de certos com postos de triptamina é mostrado na Tabela 8. Tabela 8. Resumo de 1H-RMN para Compostos de Triptamina (ppm vs TMS).
Figure img0067
[0091] 5’-O-(4,4’-Dimetoxitritil)-5-[N-(((N-1-trimetiacetil)-3-in- dol)-2-etil)carboxamida]- -2’-desoxiuridina (Piv-TrpdU). Um frasco de fundo redondo de 200 mL foi enchido com 5’-O-DMT-5-(2,2,2- trifluoroetioxi-carbonil)-2’-desoxiuridina (TFEdU, categoria de grau técnico 90%, 13,1 g, 20 mmol não corrigido) e sal de trifluoroacetato de N-1-trimetilacetil-tripatamina (9,23 g, 26 mmol, 1,3 eq). Acetonitrila anidra (104 mL) foi adicionada por seringa, seguido por trietilamina (5,6 mL, 40 mmol, 2,0 eq). A solução laranja resultante foi aquecida em argônio a 60°C durante 24 horas. Uma alíquota de 0,1 mL foi removida e diluída com diclorometano para análise de TLC (SG60, elu- ente: 1:1 acetona:hexano). Vide Figura 6. Se o material inicial de TFE- dU permanecer detectável (>1%), então uma carga correspondente (15%) de trifluoroacetato de N-1-trimetilacetil-tripatamina adicional é adicionado e o aquecimento continua. Se TFEdU for consumido (<1%), então a mistura de reação é evaporada para uma espuma no rotovap. Redissolver a espuma (~33 g) em diclorometano (30 mL) para croma- tografia.
[0092] Uma coluna de gel de sílica flash de 4"D x 6"H foi condicio nada com 2/2/96 TEA/MeOH/DCM (4 L), em seguida lavada com 2/98 MeOH/DCM (2 L). O produto bruto foi aplicado e eluído com 1/99 MeOH/DCM (2 L), seguido por 2/98 MeOH/DCM. As frações (250 mL) foram coletadas e frações agrupadas 8-19 geraram o nucleosídeo piv- TrpdU como um sólido amarelo claro, 14,8 g (66% de rendimento). Manter o sólido úmido em argônio para minimizar o amarelamento.
Figure img0068
[0093] 1H-RMN (CD3CN, 300 MHz): δ 8,76 (1H, t, J = 6 Hz, CO- NHCH2), 8,54 (s, 1H, H-6), 8,41 (1H, bd, J = 8 Hz, I-7), 7,73 (1H, bs, I2), 7,60 (1H, dt, J = 8,1 Hz, I-4), 6,81-7,43 (15H, m, tritil e I-5 e I-6, sobrepostos), 6,09 (1H, t, J = 6,5 Hz, H-1’), 4,24-4,28 (1H, m, H-3’), 3,98 (1H, q, J = 4 Hz, H-4’), 3,701 (3H, s, MeO), 3,700 (3H, s, MeO’), 3,623,69 (2H, m, CH2-α), 3,25-3,27 (2H, m, H-5’ e H-5"), 2,95 (2H, t, J = 6,8 Hz, CH2-β), 2,18-2,34 (2H, m, H-2’ e H-2"), 1,41 (9H, s, Piv).
[0094] 13C-RMN (CD3CN, 100 MHz, 33xC): δ 177,0, 163,0, 161,8, 158,6, 149,5, 145,6, 145,1, 137,1, 135,8, 130,1, 129,5, 128,0, 127,9, 126,8, 125,0, 123,8, 123,2, 118,7, 118,6, 117,0, 113,1, 105,7, 86,3, 86,2, 71,0, 63,6, 54,8, 40,9, 40,2, 38,3, 27,8, 24,8.
[0095] Espectrometria de Massa [M-H]-: calculada para C46H48N4O9: 800,91; experimental: 799,3.
[0096] 5’-O-(4,4’-Dimetoxitritil)-5-[N-(((N-1-trimetiacetil)-3-indol) -2-etil)carboxamida]-2’-deoxiuridina-3’-O-(N,N-di-isopropil-O-2-cia- noetilfosforamidita (Piv-TrpdU CEP). Todos os solventes de croma- tografia foram desoxigenados por pulverização com argônio utilizando um tubo de dispersão de gás fino. Na preparação para a reação, uma coluna de gel de sílica flash de 6"D x 6"H foi condicionada com 2/30/68 Et3N/hexanos/EtOAc (8 L) e, em seguida, lavada com 30/70 hexa- nos/EtOAc (4 L). O eluente adicional 30/70 (16 L) foi preparado e des- gaseificado.
[0097] Um frasco de fundo redondo seco foi enchido em argônio com Piv-TrpdU (41,3 g, 51,5 mmol), diclorometano anidro (83 mL), 2- cianoetil-N,N,N’,N’-tetraisopropilfosforamidita (18,0 mL, 56,7 mmol, 1,1 eq), e finalmente, pó de trifluoroacetato de piridina (10,95 g, 56,7 mmol, 1,1 eq). A mistura foi rapidamente agitada, gerando uma solução amarela, e após 30 minutos, uma alíquota foi retirada para análise de TLC (SG60, eluente: 1/1 EtOAc/hexano) que mostrou que o material inicial tinha sido consumido e dois produtos não polar foram forma- dos. Vide Figura 6.
[0098] Toda a mistura de reação foi aplicada à coluna flash prepa rada e eluída com 30/70 hexanos/EtOAc, coletando 10 x 0,5 L, em seguida, 10 x 1 L, frações em garrafas de soro revestidas cheias com argônio. O produto (dois diastereômeros) foi coletado a partir de frações agrupadas 8-17, que foram evaporadas em argônio, filtradas por brilho, e marcadas com ACN (2 x 500 mL). A secagem em alto vácuo gerou Piv-TrpdU CEP como uma espuma branca-suja (42,9 g, 83% de rendimento).
Figure img0069
[0099] 1H-RMN (CD3CN, 300 MHz) δ 9,61 (1H, bs, NH-3), 8,73/8,72 (1 H, 2bt, J = 5,6/5,6 Hz, CONHCH2), 8,58/8,56 (1H, 2s, H- 6), 8,43/8,41 (1H, 2bd, J = 8 Hz, Indol-7), 7,74 (1H, bs, Indol-2), 7,60 (1H, bd, J = 8 Hz, Indol-4), 6,83-7,45 (15 H, m, 13xtritil e Indol-5 e In- dol-6, sobrepostos), 6,11/6,09 (1H, 2t, J = 6,6/6,6 Hz), 3,72 (3H, s, OMe), 4,38-4,47 (1H, m, H-3’), 4,12-4,15 (1H, m, H-4’), 3,71 (3H, s, OMe’), 3,51-3,76 (6H, m, CONHCH2, 2 x Me2CH, CH2CH2CN, sobrepostos), 3,29-3,35 (2H, m, H-5’ e H-5"), 2,50/2,61 (2H, 2t, J = 6/6 Hz, CH2CN), 2,27-2,54 (2H, m, H-2’ e H-2"), 1,41 (9H, s, Piv), 1,01-1,16 (12H, m, 2 x [CH3]2CH).
[00100] 31P-RMN (CD3CN, 161 MHz) δ 148.12, 148.09.
[00101] Resumo de dados analíticos adicionais e um histórico de lotes de desenvolvimento para os três análogos de TrpdU CEP N-1- protegidos são fornecidos na Tabela 9. Tabela 9. Histórico de Lotes de Desenvolvimento para Análogos de TrpdU CEP-N-1-Protegidos
Figure img0070
Exemplo 4: Uso de Grupos Protetores Selecionados em Fosfora- miditas de TrpdU
[00102] Os três análogos principais de N-1-protegidos, Tol-TrpdU, Dmb-TrpdU e Piv-TrpdU, foram convertidos em cianoetil-N,N-diiso- propil fosforamiditas (CEPs), substancialmente conforme discutido acima, e seu uso foi avaliado na síntese de oligonucleotídeo de fase sólida.
[00103] Todos os três TrpdU CEPs protegidos funcionaram bem na síntese de oligonucleotídeo de fase sólida, mas Tol-TrpdU mostrou desproteção incompleta em alguns casos, consistente com o sistema de modelo de nucleosídeo (Tabela 7). Dmb-TrpdU e Piv-TrpdU foram completamente desprotegidos e em todas as condições padrão (tBuNH2/MeOH/H2O; MeNH2 (gás)).
[00104] Aptâmeros com a mesma sequência nucleotídica foram sintetizados tanto com Piv-TrpdU CEP, o TrpdU CEP original desprotegido quanto com NapdU CEP (controle positivo; Tabela 10) com cada dU modificado ocupando a posição de base U na sequência. O aptâ- mero é um 51-mer com 13 resíduos de posição dU. Tabela 10: Aptâmeros sintetizados usando Piv-TrpdU, TrpdU e NapdU
Figure img0071
[00105] A Figura 4 mostra os resultados para os três aptâmeros tendo o Piv-TrpdU, TrpdU e NapdU incorporados. O TrpdU CEP desprotegido fornece um amplo pico com muitos subprodutos de eluição precoce e tardios. O Piv-TrpdU CEP oferece um perfil notavelmente mais limpo com largura de pico estreita, comparável ao aptâmero de controle que possui o NapdU CEP.
[00106] O Piv-TrpdU CEP foi usado para sintetizar seis aptâmeros diferentes para demonstrar a melhoria no rendimento usando a nova fosforamidita sobre o TrpdU desprotegido. Os quatro primeiros aptâ- meros na Tabela 11 (Aptâmeros 1 a 4) foram sintetizados em um sin- tetizador MerMade (AME Bioscience) em escala de 1 μmol usando condições padrão, e resultaram anteriormente em baixos rendimentos usando TrpdU desprotegido. O quinto aptâmero 11 (Aptâmero 5) foi sintetizado em um sintetizador ABI usando fluxo de trabalho e condições de desproteção padrão, e mostrou rendimentos aceitáveis com TrpdU não protegido. O sexto aptâmero (Aptâmero 6) foi sintetizado em um sintetizador ABI usando fluxo de trabalho e condições de desproteção padrão, e resultou anteriormente em baixos rendimentos usando TrpdU não protegido. A Tabela 11 mostra os resultados desse experimento. Tabela 11: Rendimentos sintéticos (%SOMAmer de comprimento total) usando Piv-TrpdU versus TrpdU
Figure img0072
[00107] O uso do Piv-TrpdU CEP na síntese de oligonucleotídeo para aptâmeros 1-4 e 6 aumentou o rendimento sintético de aptâmeros em cerca de 250-300% de rendimentos sintéticos de aptâmero com o TrpdU não protegido. O uso de Piv-TrpdU CEP na síntese de oligonu- cleotídeo para aptâmero 5 aumentou o rendimento sintético em cerca de 25% em relação ao rendimento sintético do aptâmero com o não protegido com TrpdU. Assim, embora diferentes sintetizadores possam fornecer diferentes rendimentos, a tendência geral é que o uso do Piv- TrpdU CEP melhore os rendimentos da síntese de oligonucleotídeo em comparação ao uso do TrpdU não protegido.

Claims (17)

1. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula A ou fórmula B:
Figure img0073
ou um sal do mesmo; em que, R1 é selecionado dentre terc-butila, 1,1-dimetil-propila; 1,1- dimetil-butila; 2-clorofenila; 2-cianofenila; 1-metil-ciclopentila; e 1-metil- ciclohexila; X1 e X2 são, cada um, independentemente selecionados dentre metóxi e hidrogênio; X3 é selecionado dentre metóxi, fluoro, hidrogênio, e terc- butildimetilsililóxi.
2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que (i) R1 é terc-butila; e/ou (ii) X1 e X2 são metóxi; e/ou e (iii) X3 é hidrogênio, metóxi ou flúor.
3. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é selecionado de:
Figure img0074
Figure img0075
Figure img0076
Figure img0077
Figure img0078
e sais do mesmo.
4. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula C ou fórmula D:
Figure img0079
ou um sal do mesmo; em que, R1 é selecionado dentre terc-butila, 1,1-dimetil-propila; 1,1- dimetil-butila; 2-clorofenila; 2-cianofenila; 1-metil-ciclopentila; e 1-metil- ciclohexila.
5. Composto, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que R1 é terc-butila.
6. Método de produção de um composto de fórmula:
Figure img0080
, ou um sal do mesmo; em que, R1 é selecionado dentre terc-butila, 1,1-dimetil-propila; 1,1- dimetil-butila; 2-clorofenila; 2-cianofenila; 1-metil-ciclopentila; e 1-metil- ciclohexila; o método, caracterizado pelo fato de que compreende reagir N-α-BOC-triptamina com um cloreto de ácido selecionado dentre cloreto de pivaloil, cloreto de 2,2-dimetilbutiroil, cloreto de 2,2- dimetilvaleroil, cloreto de 1-metilciclopentano-1-carbonil, cloreto de 1- metilciclohexano-1-carbonil, cloreto de 2-clorobenzoil, e cloreto de 2- cianobenzoil.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que R1 é terc-butila e em que o cloreto de ácido é o cloreto de pivaloil.
8. Método de produção de um composto de fórmula:
Figure img0081
em que, R1 é selecionado dentre terc-butila, 1,1-dimetil-propila; 1,1- dimetil-butila; 2-clorofenila; 2-cianofenila; 1-metil-ciclopentila; e 1-metil- ciclohexila; o método, caracterizado pelo fato de que compreende reagir o composto
Figure img0082
com ácido trifluoroacético, opcionalmente o método compreende ainda reagir N-α- BOC-triptamina com um cloreto de ácido selecionado dentre cloreto de pivaloil, cloreto de 2,2-dimetilbutiroila, cloreto de 2,2-dimetilvaleroila, cloreto de 1-metilciclopentano-1-carbonila, cloreto de 1- metilciclohexano-1-carbonila, cloreto de 2-clorobenzoila, e cloreto de 2-cianobenzoila, para formar o composto
Figure img0083
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que R1 é terc-butila.
10. Método de produção de um composto da fórmula:
Figure img0084
, ou um sal do mesmo; em que R1 é selecionado dentre terc-butila, 1,1-dimetil-propila; 1,1- dimetil-butila; 2-clorofenila; 2-cianofenila; 1-metil-ciclopentila; e 1-metil- ciclohexila; X1 e X2 são, cada um, independentemente selecionados dentre metóxi e hidrogênio; X3 é selecionado dentre metóxi, fluoro, hidrogênio, e tercbutildimetilsililóxi; o método, caracterizado pelo fato de que compreende a reação do composto
Figure img0085
com 5’-O-DMT-5-(2,2,2-trifluoroetioxi-carbonil)-2’- deoxiuridina (TFEdU), em que o método opcionalmente compreende a reação do composto
Figure img0086
com ácido trifluoroacético para formar o composto
Figure img0087
opcionalmente compreendendo ainda reagir N-α-BOC- um cloreto de ácido selecionado dentre cloreto de de 2,2-dimetilbutiroil, cloreto de 2,2-dimetilvaleroila, 1-metilciclopentano-1-carbonila, cloreto de 1- metilciclohexano-1-carbonila, cloreto de 2-clorobenzoila, e cloreto de 2-cianobenzoil, para formar o composto
Figure img0088
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o método produz um composto selecionado de:
Figure img0089
Figure img0090
e sais do mesmo.
12. Método de produção de um composto de fórmula:
Figure img0091
ou um sal do mesmo; em que, R1 é selecionado dentre terc-butila, 1,1-dimetil-propila; 1,1- dimetil-butila; 2-clorofenila; 2-cianofenila; 1-metil-ciclopentila; e 1-metil- ciclohexila; X1 e X2 são, cada um, independentemente selecionados dentre metóxi e hidrogênio; X3 é selecionado dentre metóxi, fluoro, hidrogênio, e terc- butildimetilsililóxi; o método, caracterizado pelo fato de que compreende a reação do composto
Figure img0092
com 2-cianoetil-N,N,N’,N’-tetraisopropilfosforamidita.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que R1 é terc-butila; e/ou (ii) X1 e X2 são metóxi; e/ou e (iii) X3 é hidrogênio, metóxi ou flúor.
14. Método, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que o método compreende reagir o composto
Figure img0093
com 5’-O-DMT-5-(2,2,2-trifluoroetioxi-carbonil)-2’- deoxiuridina (TFEdU) para formar o composto
Figure img0094
opcionalmente em que o método compreende reagir o composto
Figure img0095
com ácido trifluoroacético para formar o composto
Figure img0096
opcionalmente o método compreende reagir N-α-BOC- triptamina com um cloreto de ácido selecionado dentre cloreto de pivaloil, cloreto de 2,2-dimetilbutiroila, cloreto de 2,2-dimetilvaleroila, cloreto de 1-metilciclopentano-1-carbonila, cloreto de 1- metilciclohexano-1-carbonila, cloreto de 2-clorobenzoila, e cloreto de 2-cianobenzoila, para formar o composto
Figure img0097
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que produz um composto selecionado de:
Figure img0098
Figure img0099
e sais do mesmo.
16. Oligonucleotídeo, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um nucleotídeo de TrpU protegido, em que pelo menos um nucleotídeo de TrpU protegido no oligonucleotídeo tem a estrutura:
Figure img0100
em que, R1 é selecionado dentre terc-butila, 1,1-dimetil-propila; 1,1- dimetil-butila; 2-clorofenila; 2-cianofenila; 1-metil-ciclopentila; e 1-metil- ciclohexila; X3 é selecionado dentre metóxi, fluoro, hidrogênio, e terc- butildimetilsililóxi; X4 é selecionado dentre OH, -OR, -SR, e -Z-P(Z’)(Z")O-R, em que Z, Z’, e Z" são, cada um, independentemente selecionados dentre O e S, e R é um nucleotídeo adjacente no oligonucleotídeo; e X5 é selecionado dentre -O-ss, -OR, -SR, e -Z-P(Z’)(Z")O- R, em que ss é um suporte sólido, Z, Z’, e Z" são, cada um, independentemente, selecionados dentre O e S, e R é um nucleotídeo adjacente no oligonucleotídeo.
17. Método de produção de um oligonucleotídeo, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um nucleotídeo TrpU, compreendendo incorporar pelo menos um nucleotídeo com a estrutura:
Figure img0101
em que, R1 é selecionado dentre terc-butila, 1,1-dimetil-propila; 1,1- dimetil-butila; 2-clorofenila; 2-cianofenila; 1-metil-ciclopentila; e 1-metil- ciclohexila; X3 é selecionado dentre metóxi, fluoro, hidrogênio, e terc- butildimetilsililóxi; X4 é selecionado dentre OH, -OR, -SR, e -Z-P(Z’)(Z")O-R, em que Z, Z’, e Z" são, cada um, independentemente selecionados dentre O e S, e R é um nucleotídeo adjacente no oligonucleotídeo; e X5 é selecionado dentre -O-ss, -OR, -SR, e -Z-P(Z’)(Z")O- R, em que ss é um suporte sólido, Z, Z’, e Z" são, cada um, independentemente, selecionados dentre O e S, e R é um nucleotídeo adjacente no oligonucleotídeo; em uma sequência nucleotídica em um suporte sólido; e remover o grupo protetor
Figure img0102
do pelo menos um nucleotídeo TrpU incorporado no oligonucleotídeo.
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