BR112018015657B1

BR112018015657B1 - PROCESS FOR PROPAGATION OF YEAST CAPABLE OF FERMENTING GLUCOSE AND XYLOSE

Info

Publication number: BR112018015657B1
Application number: BR112018015657-4A
Authority: BR
Inventors: Fabio Sabbatini
Original assignee: Beta Renewables S.P.A.
Priority date: 2016-02-22
Filing date: 2017-02-20
Publication date: 2024-05-21

Abstract

Um processo para a propagação de uma levedura capaz de fermentar glicose e xilose de um hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica, compreendendo o processo propagar a levedura durante dois ciclos de propagação. O primeiro ciclo de propagação compreende as etapas de: colocar a levedura sob uma densidade de levedura de partida em contato com um primeiro meio de cultura que compreende uma primeira parte do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica; e permitir que a levedura se propague para criar um primeiro caldo populado que compreende água e uma primeira levedura propagada, 50% da gli-cose e menos de 20% da xilose no primeiro meio de cultura são consumidos durante o primeiro ciclo de propagação. O segundo ciclo compreende as etapas de: separar o primeiro caldo populado em uma primeira porção removida e uma primeira porção residual, em que tanto a primeira porção residual quanto a primeira porção removida compreendem alguma levedura da primeira levedura propagada; contatar a primeira porção residual com um segundo meio de cultura que compreende uma segunda porção do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica; e permitir que a levedura se propague para criar um segundo caldo que compreende água e uma segunda levedura propagada, 50% da glicose e menos de (...).A process for propagating a yeast capable of fermenting glucose and xylose from a lignocellulosic raw material hydrolyzate, the process comprising propagating the yeast during two propagation cycles. The first propagation cycle comprises the steps of: placing the yeast under a starting yeast density in contact with a first culture medium comprising a first part of the lignocellulosic raw material hydrolyzate; and allowing the yeast to propagate to create a first populated broth comprising water and a first propagated yeast, 50% of the glucose and less than 20% of the xylose in the first culture medium are consumed during the first propagation cycle. The second cycle comprises the steps of: separating the first populated broth into a first removed portion and a first residual portion, wherein both the first residual portion and the first removed portion comprise some yeast from the first propagated yeast; contacting the first residual portion with a second culture medium comprising a second portion of the lignocellulosic raw material hydrolyzate; and allowing the yeast to propagate to create a second broth comprising water and a second propagated yeast, 50% glucose and less than (...).

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃOBACKGROUND OF THE INVENTION

[0001] A fermentação de açúcares monoméricos a álcool por meio de levedura é muito bem conhecida há milhares de anos. Ou seja, a cerveja tem sido produzida por quase todas as culturas e populações na história da espécie humana. No campo de biocombustíveis, matérias-primas de primeira geração que possuem um elevado teor de amido, tal como milho, têm sido utilizadas com sucesso em escala industrial para produzir etanol. Processos fermentativos de tecnologia de primeira geração tiram vantagem da instalação para hidrolisar a matéria-prima para a produção de um mosto hidrolisado que apresenta uma concentração muito alta de açúcares monoméricos C6, predominantemente glicose, e muito pouco ou nenhum inibidor de levedura, tal como ácido acético. Além disso, nenhuma hemicelulose derivada de açúcares, tal como xilose, está presente na matéria-prima de primeira geração.[0001] The fermentation of monomeric sugars to alcohol using yeast has been very well known for thousands of years. In other words, beer has been produced by almost every culture and population in the history of the human species. In the field of biofuels, first generation raw materials that have a high starch content, such as corn, have been used successfully on an industrial scale to produce ethanol. First-generation technology fermentative processes take advantage of the facility to hydrolyze the raw material for the production of a hydrolyzed wort that has a very high concentration of C6 monomeric sugars, predominantly glucose, and very little or no yeast inhibitors such as acid acetic. Furthermore, no hemicellulose derived from sugars, such as xylose, is present in the first generation feedstock.

[0002] O uso de um hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica apresenta uma série de problemas de exigência, a maioria deles decorrentes na condução do processo em escala industrial. A maioria dos problemas está relacionada com tornar o processo economicamente viável; outros estão ligados a características específicas do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica que tornam a utilização de um hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica mais difícil do que no caso de um hidrolisado de primeira geração.[0002] The use of a lignocellulosic raw material hydrolyzate presents a series of demanding problems, most of which arise when conducting the process on an industrial scale. Most problems are related to making the process economically viable; others are linked to specific characteristics of the lignocellulosic feedstock hydrolyzate that make the use of a lignocellulosic feedstock hydrolyzate more difficult than in the case of a first generation hydrolyzate.

[0003] Um primeiro inconveniente na conversão de um hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica por meio de uma levedura é a presença de açúcares monoméricos C5, principalmente xilose. Xilose é conhecida por ser difícil ou impossível de ser convertida por enzimas naturais e leveduras, e coquetéis especiais de enzimas geneticamente modificadas e leveduras têm sido engenheirados para converter a porção hemicelulósica. Mesmo com levedura geneticamente modificada para tornar possível fermentar tanto glicose quanto xilose, a conversão de xilose é lenta.[0003] A first drawback in the conversion of a lignocellulosic raw material hydrolyzate using yeast is the presence of C5 monomeric sugars, mainly xylose. Xylose is known to be difficult or impossible to convert by natural enzymes and yeast, and special cocktails of genetically modified enzymes and yeast have been engineered to convert the hemicellulose portion. Even with yeast genetically modified to make it possible to ferment both glucose and xylose, xylose conversion is slow.

[0004] Uma segunda desvantagem na conversão de um hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica por meio de uma levedura é a baixa concentração de açúcar de um hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica, que é tipicamente menor que 100 g de açúcares totais por kg de hidrolisado em base úmida. Sob baixa concentração de açúcar, a taxa de absorção de açúcares pela levedura é lenta e, desse modo, é facilitada a propagação de contaminantes biológicos, tais como bactérias, que consomem uma parte relevante dos açúcares disponíveis para produzir bioprodutos não desejados, tais como ácidos lácticos. O problema é ainda reforçado pela taxa de conversão lenta de xilose pela levedura. Desse modo, a esterilização do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica por meio de agentes químicos ou bioquímicos, tais como antibióticos, ou por meio de agentes físicos, tais como calor ou luz, é frequentemente praticada, aumentando a totalidade dos custos.[0004] A second disadvantage in converting a lignocellulosic raw material hydrolyzate by means of a yeast is the low sugar concentration of a lignocellulosic raw material hydrolyzate, which is typically less than 100 g of total sugars per kg of hydrolyzate. on a wet basis. Under low sugar concentration, the rate of sugar absorption by yeast is slow and, therefore, the spread of biological contaminants, such as bacteria, is facilitated, which consume a relevant part of the available sugars to produce unwanted bioproducts, such as acids. lactic acids. The problem is further reinforced by the slow rate of xylose conversion by yeast. Therefore, sterilization of lignocellulosic raw material hydrolyzate by means of chemical or biochemical agents, such as antibiotics, or by means of physical agents, such as heat or light, is often practiced, increasing the total costs.

[0005] Uma terceira desvantagem na conversão de um hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica por meio de uma levedura é a presença de compostos inibidores no hidrolisado. Compostos tais como ácido acético, ácido fórmico, furfural, que são tipicamente produzidos no pré- tratamento ou hidrólise da matéria-prima lignocelulósica, reduzem a capacidade da levedura em absorver açúcares, ou pelo menos a taxa de absorção. Remoção de compostos inibidores em várias fases a montante para a conversão de levedura é frequentemente praticada, aumentando de novo a totalidade dos custos.[0005] A third disadvantage in converting a lignocellulosic raw material hydrolyzate using yeast is the presence of inhibitory compounds in the hydrolyzate. Compounds such as acetic acid, formic acid, furfural, which are typically produced in the pre-treatment or hydrolysis of lignocellulosic feedstock, reduce the ability of yeast to absorb sugars, or at least the rate of absorption. Removal of inhibitory compounds at various stages upstream to yeast conversion is frequently practiced, again increasing the overall costs.

[0006] Uma quarta desvantagem na conversão de um hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica por meio de uma levedura, que normalmente requer agitação do hidrolisado, é que o hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica é muitas vezes produzido em forma de pasta; assim, é difícil e caro submeter o hidrolisado a agitação. A pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica pode ser separada em um componente líquido que compreende água e açúcares solúveis, e um componente sólido que compreende matéria-prima lignocelulósica pré-tratada insolúvel em água, novamente aumentando os custos do processo.[0006] A fourth disadvantage in converting a lignocellulosic raw material hydrolyzate by means of a yeast, which normally requires stirring the hydrolyzate, is that the lignocellulosic raw material hydrolyzate is often produced in paste form; therefore, it is difficult and expensive to subject the hydrolyzate to agitation. The lignocellulosic feedstock hydrolyzate slurry can be separated into a liquid component comprising water and soluble sugars, and a solid component comprising water-insoluble pretreated lignocellulosic feedstock, again increasing process costs.

[0007] Um importante problema em um processo de fermentação de um hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica é reduzir a quantidade de levedura totalmente necessária, o que tem um grande impacto no custo do produto final. Para resolver o problema, uma etapa de propagação é normalmente praticada, na qual a levedura é inserida em um meio de propagação em condições que promovem o crescimento da levedura, permitindo desse modo produzir mais células de levedura a serem usadas em um processo de fermentação seguinte. A propagação pode ser realizada em modo descontínuo, descontínuo com alimentação e contínuo. Embora a propagação de uma levedura em um meio de propagação que compreende açúcares sintéticos -tanto xilose quanto glicose - tem sido demonstrada ser eficaz em escala de laboratório, têm sido propostas diferentes abordagens para propagar a levedura em um hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica para reduzir os custos de meio de propagação.[0007] An important problem in a fermentation process of a lignocellulosic raw material hydrolyzate is to reduce the amount of yeast completely required, which has a major impact on the cost of the final product. To solve the problem, a propagation step is usually practiced, in which yeast is inserted into a propagation medium under conditions that promote yeast growth, thereby allowing more yeast cells to be produced to be used in a following fermentation process. . Propagation can be carried out in batch, feed-batch and continuous mode. Although propagation of yeast on a propagation medium comprising synthetic sugars - both xylose and glucose - has been demonstrated to be effective on a laboratory scale, different approaches have been proposed to propagate yeast on a lignocellulosic feedstock hydrolyzate to reduce propagation medium costs.

[0008] WO2009155633A1 descreve a utilização de um substrato que compreende material contendo composto C5, na cultura da levedura Saccharomyces ou na produção de um produto de levedura Saccharomyces, em que o material contendo composto C5 é: (a) material contendo composto C5 obtido de hidrolisado lignocelulósico; (b) material contendo composto C5 obtido a partir da fermentação de hidrolisado lignocelulósico; ou (c) uma mistura de (a) e (b). O pedido de patente também descreve um método de produção de biomassa de levedura Saccharomyces ou um produto de levedura Saccharomyces usando o substrato, o método compreendendo a incubação de um substrato que compreende um material contendo composto C5 com uma levedura Saccharomyces em condições que levam ao crescimento da levedura Saccharomyces ou à produção do produto. Portanto, o pedido de patente é omisso sobre problemas específicos e soluções afins envolvidos na propagação de leveduras em um hidrolisado lignocelulósico.[0008] WO2009155633A1 describes the use of a substrate comprising C5 compound-containing material, in the cultivation of Saccharomyces yeast or in the production of a Saccharomyces yeast product, wherein the C5 compound-containing material is: (a) C5 compound-containing material obtained from lignocellulosic hydrolyzate; (b) material containing C5 compound obtained from the fermentation of lignocellulosic hydrolyzate; or (c) a mixture of (a) and (b). The patent application also describes a method of producing a Saccharomyces yeast biomass or a Saccharomyces yeast product using the substrate, the method comprising incubating a substrate comprising a C5 compound-containing material with a Saccharomyces yeast under conditions conducive to growth. from Saccharomyces yeast or the production of the product. Therefore, the patent application is silent on specific problems and related solutions involved in the propagation of yeast in a lignocellulosic hydrolyzate.

[0009] WO2014072232A1 descreve um processo para a propagação aeróbica de levedura no qual a levedura é cultivada em um reator, compreendendo as etapas de: a) encher o reator com uma fonte de carbono e uma população inicial de levedura, b) opcionalmente cultivar a população inicial de levedura no reator em modo descontínuo, c) medir o pH no reator, d) adicionar hidrolisado lignocelulósico ao reator em modo descontínuo com alimentação sob uma taxa de forma a ajustar o pH no reator em um valor predeterminado, e e) após propagação suficiente, isolar levedura a partir do reator. A fonte de carbono da etapa a) pode ser hidrolisado lignocelulósico diluído, em que a diluição do hidrolisado lignocelulósico é proporcionada para reduzir os efeitos de compostos inibidores do hidrolisado lignocelulósico. Controlar um crescimento em modo descontínuo com alimentação é difícil em escala industrial e aumenta os custos, bem como manter condições aeróbicas em um processo de propagação em um hidrolisado lignocelulósico, o que requer forte agitação e elevado fluxo de ar. Além disso, o pedido de patente não reconhece a presença de contaminantes biológicos como crítica na etapa de propagação. Notadamente, afirma que contaminação bacteriana ou por levedura selvagem é raramente um problema durante a propagação, porque tanques de propagação de levedura são menores e podem ser mais facilmente limpos do que tanques de fermentação. Além da limpeza, produtos antibacterianos podem ser adicionados para impedir o crescimento de micróbios indesejados.[0009] WO2014072232A1 describes a process for the aerobic propagation of yeast in which the yeast is cultivated in a reactor, comprising the steps of: a) filling the reactor with a carbon source and an initial population of yeast, b) optionally cultivating the initial population of yeast in the reactor in batch mode, c) measuring the pH in the reactor, d) adding lignocellulosic hydrolyzate to the reactor in batch mode with feed at a rate so as to adjust the pH in the reactor to a predetermined value, and e) after propagation enough, isolate yeast from the reactor. The carbon source of step a) may be diluted lignocellulosic hydrolyzate, wherein the dilution of the lignocellulosic hydrolyzate is provided to reduce the effects of lignocellulosic hydrolyzate inhibitory compounds. Controlling growth in batch mode with feeding is difficult on an industrial scale and increases costs, as well as maintaining aerobic conditions in a propagation process in a lignocellulosic hydrolyzate, which requires strong agitation and high air flow. Furthermore, the patent application does not recognize the presence of biological contaminants as critical in the propagation stage. Notably, it states that bacterial or wild yeast contamination is rarely a problem during propagation, because yeast propagation tanks are smaller and can be more easily cleaned than fermentation tanks. In addition to cleaning, antibacterial products can be added to prevent the growth of unwanted microbes.

[00010] US8450094 descreve um método de propagação de uma levedura em um meio de propagação, no qual xilose é alimentada ao meio como uma fonte de carbono para o crescimento de massa celular. Uma primeira massa de células é propagada sob condições aeróbicas com um fluxo de ar de pelo menos 1,0 volume de ar por volume de meio por minuto em uma segunda massa de células, que é opcionalmente propagada em uma etapa seguinte em uma terceira massa celular. O método sequencial descrito na patente para a produção de uma quantidade razoável de levedura requer longos tempos de propagação em condições favoráveis a contaminantes biológicos, exigindo desse modo a esterilização da fonte de carbono.[00010] US8450094 describes a method of propagating a yeast in a propagation medium, in which xylose is fed to the medium as a carbon source for the growth of cell mass. A first cell mass is propagated under aerobic conditions with an air flow of at least 1.0 volume of air per volume of medium per minute into a second cell mass, which is optionally propagated in a following step into a third cell mass. . The sequential method described in the patent for producing a reasonable amount of yeast requires long propagation times under conditions favorable to biological contaminants, thereby requiring sterilization of the carbon source.

[00011] Há assim a necessidade de um processo para propagar uma levedura em um hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica que possa ser utilizado em uma escala industrial. Acredita-se que o processo descrito supera as desvantagens acima mencionadas na utilização de um hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica, proporcionando uma solução para a propagação de uma levedura em um hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica em escala industrial.[00011] There is therefore a need for a process to propagate yeast in a lignocellulosic raw material hydrolyzate that can be used on an industrial scale. It is believed that the described process overcomes the above-mentioned disadvantages of using a lignocellulosic raw material hydrolyzate, providing a solution for the propagation of a yeast in a lignocellulosic raw material hydrolyzate on an industrial scale.

SUMÁRIOSUMMARY

[00012] É descrito um processo para a propagação de uma levedura capaz de fermentar glicose e xilose de um hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica, compreendendo o processo propagação da levedura por pelo menos um primeiro e segundo ciclos de propagação. O primeiro ciclo de propagação (Pn, em que n = 1) compreende as etapas de: colocar a levedura sob uma densidade inicial de levedura em contato com um primeiro meio de cultura que compreende uma primeira parte do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica; e permitir que a levedura se propague para criar um primeiro caldo populado que compreende água e uma primeira levedura propagada, em que pelo menos 50% da glicose e menos de 20% da xilose no primeiro meio de cultura são consumidos durante o primeiro ciclo de propagação. O segundo ciclo (P2, n = 2) compreende as etapas de: separar o primeiro caldo populado em pelo menos uma primeira porção removida e uma primeira porção residual, em que tanto a primeira parte residual quanto a primeira porção removida compreendem alguma levedura da primeira levedura propagada; contatar a primeira porção residual com um segundo meio de cultura que compreende uma segunda porção do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica; e permitir que a levedura se propague para criar um segundo caldo populado que compreende água e uma segunda levedura propagada, em que pelo menos 50% da glicose e menos de 20% da xilose no segundo meio de cultura são consumidos durante o segundo ciclo de propagação.[00012] A process is described for the propagation of a yeast capable of fermenting glucose and xylose from a hydrolyzate of lignocellulosic raw material, comprising the process of propagating the yeast by at least a first and second propagation cycles. The first propagation cycle (Pn, where n = 1) comprises the steps of: placing the yeast under an initial yeast density in contact with a first culture medium comprising a first part of the lignocellulosic raw material hydrolyzate; and allowing the yeast to propagate to create a first populated broth comprising water and a first propagated yeast, wherein at least 50% of the glucose and less than 20% of the xylose in the first culture medium are consumed during the first propagation cycle . The second cycle (P2, n = 2) comprises the steps of: separating the first populated broth into at least a first removed portion and a first residual portion, wherein both the first residual portion and the first removed portion comprise some yeast from the first propagated yeast; contacting the first residual portion with a second culture medium comprising a second portion of the lignocellulosic raw material hydrolyzate; and allowing the yeast to propagate to create a second populated broth comprising water and a propagated second yeast, wherein at least 50% of the glucose and less than 20% of the xylose in the second culture medium are consumed during the second propagation cycle .

[00013] O processo descrito pode ainda compreender subsequentes ciclos de propagação Pn, em que n é um número inteiro maior que 2 e é um (1) maior que o número de ciclos imediatamente anteriores (n-1), cada ciclo de propagação Pn compreendendo as etapas de: separar o caldo populado Pn-1 em pelo menos uma porção removida Pn-1 e uma porção residual Pn-1, em que tanto a porção residual Pn-1 quanto a porção removida Pn-1 compreendem alguma levedura da levedura propagada Pn-1; contatar a porção residual do caldo populado de pelo menos um dos ciclos anteriores e um meio de cultura Pn que compreende uma porção Pn do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica; e permitir que a levedura se propague para criar um caldo populado Pn, em que pelo menos 50% da glicose e menos de 20% da xilose no meio de cultura Pn são consumidos durante o ciclo de propagação Pn.[00013] The described process may further comprise subsequent propagation cycles Pn, where n is an integer greater than 2 and is one (1) greater than the number of immediately preceding cycles (n-1), each propagation cycle Pn comprising the steps of: separating the broth populated Pn-1 into at least a removed portion Pn-1 and a residual portion Pn-1, wherein both the residual portion Pn-1 and the removed portion Pn-1 comprise some yeast from the yeast propagated Pn-1; contacting the residual portion of the broth populated from at least one of the previous cycles and a Pn culture medium comprising a Pn portion of the lignocellulosic raw material hydrolyzate; and allowing the yeast to propagate to create a Pn-populated broth, in which at least 50% of the glucose and less than 20% of the xylose in the Pn culture medium are consumed during the Pn propagation cycle.

[00014] É também descrito que a etapa de permitir que a levedura se propague nos ciclos de propagação Pn pode ser conduzida em modo descontínuo, em que n é um número inteiro igual ou maior que 1.[00014] It is also described that the step of allowing the yeast to propagate in Pn propagation cycles can be conducted in batch mode, where n is an integer equal to or greater than 1.

[00015] É ainda descrito que a densidade inicial de levedura no primeiro ciclo de propagação pode se situar na faixa de 1 x 106 a 1 x 108 de células de levedura por miligrama do primeiro meio de cultura, em base úmida.[00015] It is further described that the initial yeast density in the first propagation cycle can be in the range of 1 x 106 to 1 x 108 yeast cells per milligram of the first culture medium, on a wet basis.

[00016] É também descrito que a quantidade de porção removida Pn- 1 e a quantidade da porção Pn do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica podem ser selecionadas de modo a ter uma densidade inicial de levedura no ciclo de propagação Pn na faixa de 1 x 106 a 1 x 108 células de levedura por miligrama do meio de cultura Pn em base úmida, em que n é um número inteiro maior que 1.[00016] It is also described that the amount of removed portion Pn-1 and the amount of the Pn portion of the lignocellulosic raw material hydrolyzate can be selected so as to have an initial yeast density in the propagation cycle Pn in the range of 1 x 106 to 1 x 108 yeast cells per milligram of Pn culture medium on a wet basis, where n is an integer greater than 1.

[00017] É ainda descrito que a densidade inicial de levedura no ciclo de propagação Pn, em que n é um número inteiro maior que 1, pode ser maior que a densidade inicial de levedura no primeiro ciclo de propagação.[00017] It is further described that the initial yeast density in the propagation cycle Pn, where n is an integer greater than 1, may be greater than the initial yeast density in the first propagation cycle.

[00018] É também descrito que a densidade final de levedura no ciclo de propagação Pn pode se situar na faixa de 1 x 107 a 1 x 109 de células de levedura por miligrama do caldo populado Pn em base úmida, em que n é um número inteiro igual ou maior que 1.[00018] It is also described that the final density of yeast in the Pn propagation cycle can be in the range of 1 x 107 to 1 x 109 yeast cells per milligram of broth populated Pn on a wet basis, where n is a number integer equal to or greater than 1.

[00019] É ainda descrito que o tempo de propagação do primeiro ciclo de propagação pode ser inferior a um valor selecionado a partir do grupo que consiste de 30 horas, 25 horas e 20 horas.[00019] It is further described that the propagation time of the first propagation cycle may be less than a value selected from the group consisting of 30 hours, 25 hours and 20 hours.

[00020] É também descrito que o tempo de propagação do ciclo de propagação Pn pode ser inferior a um valor percentual selecionado a partir do grupo que consiste de 70%, 50% e 40% do primeiro tempo de propagação, em que n é um número inteiro maior que 1.[00020] It is also described that the propagation time of the propagation cycle Pn may be less than a percentage value selected from the group consisting of 70%, 50% and 40% of the first propagation time, where n is a integer greater than 1.

[00021] É ainda descrito que o meio de cultura pode adicionalmente compreender uma fonte de nitrogênio.[00021] It is further described that the culture medium may additionally comprise a source of nitrogen.

[00022] É também descrito que nenhuma vitamina e/ou oligoelementos podem ser adicionados ao processo.[00022] It is also described that no vitamins and/or trace elements can be added to the process.

[00023] É ainda descrito que o hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica pode conter contaminantes biológicos, e a densidade de contaminantes biológicos no meio de cultura Pn de partida pode se situar em uma faixa selecionada do grupo que consiste em 100 UFC/ml a 106 UFC/ml, de 101 UFC/ml a 105 UFC/ml e de 102 UFC/ml a 103 UFC/ml de meio de cultura Pn de partida, em que n é um número inteiro igual ou maior que 1.[00023] It is further described that the lignocellulosic raw material hydrolyzate may contain biological contaminants, and the density of biological contaminants in the starting Pn culture medium may fall within a range selected from the group consisting of 100 CFU/ml to 106 CFU/ml, from 101 CFU/ml to 105 CFU/ml and from 102 CFU/ml to 103 CFU/ml of Pn starting culture medium, where n is an integer equal to or greater than 1.

[00024] É também descrito que o hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica pode não ser submetido a qualquer esterilização.[00024] It is also described that the lignocellulosic raw material hydrolyzate may not be subjected to any sterilization.

[00025] É ainda descrito que não há agentes antibacterianos podem ser adicionados ao processo.[00025] It is further described that no antibacterial agents can be added to the process.

[00026] É também descrito que o hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica pode ser uma pasta que compreende matéria-prima lignocelulósica pré-tratada insolúvel em água.[00026] It is also described that the hydrolyzate of lignocellulosic raw material can be a paste comprising pretreated lignocellulosic raw material insoluble in water.

[00027] É adicionalmente descrito que a matéria seca do meio de cultura Pn pode ser inferior a 30% e maior do que um valor percentual selecionado a partir do grupo que consiste de 5%, 10%, 15% e 20%, em que n é um número inteiro igual ou maior que 1.[00027] It is further described that the dry matter of the Pn culture medium can be less than 30% and greater than a percentage value selected from the group consisting of 5%, 10%, 15% and 20%, wherein n is an integer equal to or greater than 1.

[00028] É também descrito que todos os ciclos de propagação podem ser realizados em um único vaso de propagação.[00028] It is also described that all propagation cycles can be carried out in a single propagation vessel.

[00029] É ainda descrito que o vaso de propagação pode não ser submetido a qualquer esterilização e/ou limpeza entre e/ou durante os ciclos de propagação.[00029] It is further described that the propagation vessel may not be subjected to any sterilization and/or cleaning between and/or during propagation cycles.

[00030] É também colocado que o processo descrito pode ainda compreender as etapas de: introduzir uma ou mais porções removidas Pn e um meio de fermentação que compreende uma porção adicional do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica em pelo menos um vaso de fermentação; permitir que a levedura fermente glicose e xilose para criar um caldo de fermentação que compreende um produto de fermentação, em que n é um número inteiro igual ou superior a 1.[00030] It is also stated that the described process may further comprise the steps of: introducing one or more removed portions Pn and a fermentation medium comprising an additional portion of the lignocellulosic raw material hydrolyzate into at least one fermentation vessel; allow yeast to ferment glucose and xylose to create a fermentation broth comprising a fermentation product, where n is an integer equal to or greater than 1.

DESCRIÇÃO DETALHADADETAILED DESCRIPTION

[00031] É descrito um processo multietapas para propagar sequencialmente uma levedura em dois ou mais ciclos de propagação em meios de cultura respectivos, cada um compreendendo uma porção de um hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica. A levedura é capaz de fermentar açúcares monoméricos tanto de glicose quanto de xilose, os quais são os dois principais componentes de açúcar do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica.[00031] A multistep process is described for sequentially propagating a yeast in two or more propagation cycles in respective culture media, each comprising a portion of a lignocellulosic raw material hydrolyzate. Yeast is capable of fermenting monomeric sugars of both glucose and xylose, which are the two main sugar components of lignocellulosic feedstock hydrolyzate.

[00032] De acordo com um aspecto, o processo descrito proporciona uma solução que pode ser implementada em escala industrial, superando os problemas que ocorrem em uma planta de conversão real.[00032] According to one aspect, the described process provides a solution that can be implemented on an industrial scale, overcoming the problems that occur in a real conversion plant.

[00033] De acordo com outro aspecto, o processo descrito permite produzir a levedura necessária em uma etapa de fermentação seguinte partindo de uma pequena quantidade de levedura, evitando assim ou reduzindo sensivelmente os custos de fermentação associados a fontes de carbono caras.[00033] According to another aspect, the described process makes it possible to produce the yeast necessary in a following fermentation step starting from a small amount of yeast, thus avoiding or significantly reducing the fermentation costs associated with expensive carbon sources.

[00034] De acordo com um aspecto adicional, no processo descrito a propagação de levedura ocorre em um hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica já disponível na planta de conversão, evitando desse modo ou reduzindo grandemente os custos associados a fontes de carbono caras.[00034] According to a further aspect, in the described process yeast propagation occurs in a hydrolyzate of lignocellulosic raw material already available in the conversion plant, thereby avoiding or greatly reducing the costs associated with expensive carbon sources.

[00035] De acordo com um aspecto adicional, o processo descrito permite a utilização de um hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica que pode conter contaminantes biológicos em um nível não desprezível, sem o uso de qualquer agente ou procedimento de esterilização.[00035] According to an additional aspect, the described process allows the use of a lignocellulosic raw material hydrolyzate that may contain biological contaminants at a non-negligible level, without the use of any sterilization agent or procedure.

[00036] De acordo com um aspecto adicional, no processo descrito a propagação de levedura pode ocorrer sem a adição de vitaminas e outros nutrientes dispendiosos.[00036] According to a further aspect, in the described process yeast propagation can occur without the addition of vitamins and other expensive nutrients.

[00037] De acordo com um aspecto adicional, no processo descrito a propagação de levedura é conduzida durante um tempo de propagação que é mais curto do que nos processos descritos no estado da técnica.[00037] According to a further aspect, in the described process yeast propagation is conducted during a propagation time that is shorter than in the processes described in the prior art.

[00038] No contexto da presente descrição, por "propagação de uma levedura", ou "crescimento de levedura", ou "produção de uma levedura", entende-se o processo de aumentar a quantidade de levedura, ou biomassa de levedura, obtida alimentando uma quantidade inicial de levedura com uma fonte de carbono e opcionalmente outros nutrientes em condições adequadas. O aumento da quantidade de biomassa de levedura ou de levedura ocorre elevando o número de células de levedura totalmente produzidas, e pode ser verificado mediante determinação da densidade de células no início e no final da etapa ou etapas de propagação, ou durante a etapa ou etapas de propagação. A densidade celular pode ser determinada contando as células de levedura presentes em amostras representativas do meio de cultura em momentos diferentes da etapa ou etapas de propagação.[00038] In the context of the present description, by "propagation of a yeast", or "growth of yeast", or "production of a yeast", is meant the process of increasing the amount of yeast, or yeast biomass, obtained feeding an initial amount of yeast with a carbon source and optionally other nutrients under suitable conditions. The increase in the amount of yeast or yeast biomass occurs by increasing the number of fully produced yeast cells, and can be verified by determining the cell density at the beginning and end of the propagation step or steps, or during the step or steps of propagation. Cell density can be determined by counting yeast cells present in representative samples of the culture medium at different times of the propagation step or steps.

[00039] A levedura do processo descrito é capaz de fermentar não apenas açúcares monoméricos C6, de preferência glicose, mas também açúcares monoméricos C5, preferencialmente xilose. Como uma levedura que ocorre naturalmente não é tipicamente capaz de assimilar xilose, a levedura utilizada no processo descrito é de preferência uma levedura que não ocorre naturalmente ou derivada de uma levedura que não ocorre naturalmente.[00039] The yeast of the described process is capable of fermenting not only C6 monomeric sugars, preferably glucose, but also C5 monomeric sugars, preferably xylose. As a naturally occurring yeast is typically not capable of assimilating xylose, the yeast used in the described process is preferably a non-naturally occurring yeast or derived from a non-naturally occurring yeast.

[00040] O termo levedura "de ocorrência não natural" significa que o organismo microbiano tem pelo menos uma alteração genética que não é normalmente encontrada em uma cepa de ocorrência natural das espécies mencionadas, incluindo cepas que ocorrem naturalmente das espécies mencionadas, a fim de tornar a levedura que ocorre naturalmente capaz de fermentar tanto glicose quanto xilose. As alterações genéticas podem incluir, por exemplo, modificações que introduzem ácidos nucleicos passíveis de expressão que codificam polipeptídios metabólicos, outras adições de ácidos nucleicos, supressões de ácidos nucleicos e/ou outra perturbação funcional do material genético da levedura. Tais modificações podem incluir, por exemplo, regiões de codificação e seus fragmentos funcionais, para polipeptídios heterólogos, homólogos ou tanto heterólogos quanto homólogos para as espécies mencionadas. Modificações adicionais podem incluir, por exemplo, regiões reguladoras não codificadoras em que as modificações alteram a expressão de um gene ou operon.[00040] The term "non-naturally occurring" yeast means that the microbial organism has at least one genetic alteration that is not normally found in a naturally occurring strain of the mentioned species, including naturally occurring strains of the mentioned species, in order to make naturally occurring yeast capable of fermenting both glucose and xylose. Genetic changes may include, for example, modifications that introduce expressible nucleic acids encoding metabolic polypeptides, other additions of nucleic acids, deletions of nucleic acids, and/or other functional disruption of the yeast's genetic material. Such modifications may include, for example, coding regions and functional fragments thereof, for heterologous, homologous or both heterologous and homologous polypeptides for the mentioned species. Additional modifications may include, for example, non-coding regulatory regions where the modifications alter the expression of a gene or operon.

[00041] A levedura que não ocorre naturalmente da presente invenção pode conter alterações genéticas estáveis, que se referem a levedura que pode ser propagada por mais de cinco gerações sem perda da alteração. De um modo geral, as alterações genéticas estáveis incluem modificações que persistem por mais de 10 gerações; particularmente, modificações estáveis persistirão por mais de cerca de 25 gerações, e mais particularmente, modificações genéticas estáveis serão maiores que 50 gerações, incluindo indefinidamente.[00041] The non-naturally occurring yeast of the present invention may contain stable genetic alterations, which refer to yeast that can be propagated for more than five generations without loss of the alteration. Generally speaking, stable genetic changes include modifications that persist for more than 10 generations; particularly, stable modifications will persist for more than about 25 generations, and more particularly, stable genetic modifications will be greater than 50 generations, including indefinitely.

[00042] A levedura da presente invenção pode ser selecionada a partir de qualquer gênero e espécie de leveduras conhecidos. As leveduras são descritas, por exemplo, por N.J.W. Kreger-van Rij, The Yeasts, Vol. 1 de Biology of Yeasts, Cap. 2, A.H. Rose e J.S. Harrison, Eds. Academic Press, Londres, 1987. Em uma modalidade de realização da presente invenção, a levedura é selecionada do grupo que consiste de Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Debaromyces, Nadsonia, Lipomyces, Torulopsis, Kloeckera, Pichia, Schizosaccharomyces, Trigonopsis, Brettanomyces, Cryptococcus, Trichosporon, Aureobasidium, Lipomyces, Phaffia, Rhodotorula, Yarrowia e Schwanniomyces. De preferência, a levedura é selecionada de cepas de Saccharomyces cerevisiae.[00042] The yeast of the present invention can be selected from any known genus and species of yeast. Yeasts are described, for example, by N.J.W. Kreger-van Rij, The Yeasts, Vol 1 of Biology of Yeasts, Ch 2, A. H. Rose and J. S. Harrison, Eds. Academic Press, London, 1987. In one embodiment of the present invention, the yeast is selected from the group consisting of Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Debaromyces, Nadsonia, Lipomyces, Torulopsis, Kloeckera, Pichia, Schizosaccharomyces, Trigonopsis , Brettanomyces, Cryptococcus, Trichosporon, Aureobasidium, Lipomyces, Phaffia, Rhodotorula, Yarrowia and Schwanniomyces. Preferably, the yeast is selected from strains of Saccharomyces cerevisiae.

[00043] No processo descrito, a principal fonte de carbono utilizada para propagar a levedura é um hidrolisado derivado de uma matéria- prima lignocelulósica. Uma descrição detalhada de uma matéria-prima lignocelulósica pode ser encontrada em WO2015028156A1, páginas 11-14, que é aqui incorporado como referência. Uma matéria-prima lignocelulósica preferida é selecionada a partir do grupo de resíduos agrícolas, em particular palhas, tais como palha de trigo, palha de arroz, ou bagaço, tal como bagaço de cana-de-açúcar. As madeiras duras e as madeiras macias também se beneficiam desse processo. Opcionalmente, podem também ser usadas outras fontes de carbono, tais como melaço ou açúcares sintéticos, mas os açúcares monoméricos do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica são preferencialmente pelo menos 80% em peso, mais preferencialmente pelo menos 90%, e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, das fontes de carbono totais utilizadas no processo. Em uma modalidade de realização ainda mais preferida, o hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica é a única fonte de carbono usada no processo descrito para a propagação da levedura.[00043] In the described process, the main carbon source used to propagate the yeast is a hydrolyzate derived from a lignocellulosic raw material. A detailed description of a lignocellulosic raw material can be found in WO2015028156A1, pages 11-14, which is incorporated herein by reference. A preferred lignocellulosic raw material is selected from the group of agricultural residues, in particular straws, such as wheat straw, rice straw, or bagasse, such as sugarcane bagasse. Hardwoods and softwoods also benefit from this process. Optionally, other carbon sources may also be used, such as molasses or synthetic sugars, but the monomeric sugars of the lignocellulosic feedstock hydrolyzate are preferably at least 80% by weight, more preferably at least 90%, and even more preferably at least least 95% of the total carbon sources used in the process. In an even more preferred embodiment, the lignocellulosic raw material hydrolyzate is the only carbon source used in the described process for yeast propagation.

[00044] O hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica é de preferência derivado da matéria-prima lignocelulósica por meio de um processo multietapas que compreende pré-tratar a matéria-prima lignocelulósica para produzir uma matéria-prima lignocelulósica pré- tratada e submeter a matéria-prima lignocelulósica pré-tratada a hidrólise enzimática. O pré-tratamento aumenta a acessibilidade dos hidratos de carbono contidos na matéria-prima à ação de enzimas. Um pré-tratamento preferido compreende tratar hidrotermicamente a matéria-prima lignocelulósica com água na fase de vapor em um reator pressurizado, e explodir com vapor a matéria-prima tratada hidrotermicamente liberando rapidamente a pressão aplicada à matéria- prima. O tratamento hidrotérmico é conduzido de preferência a uma temperatura em um intervalo de 130°C a 230°C durante um tempo de 1 minuto a 180 minutos. O reator é preferencialmente pressurizado por vapor a uma pressão de pelo menos 1 MPa para obter uma ruptura eficaz da matéria-prima.[00044] The lignocellulosic raw material hydrolyzate is preferably derived from the lignocellulosic raw material through a multi-step process comprising pre-treating the lignocellulosic raw material to produce a pre-treated lignocellulosic raw material and subjecting the lignocellulosic raw material to lignocellulosic raw material pretreated with enzymatic hydrolysis. Pre-treatment increases the accessibility of the carbohydrates contained in the raw material to the action of enzymes. A preferred pretreatment comprises hydrothermally treating the lignocellulosic feedstock with water in the vapor phase in a pressurized reactor, and steam blasting the hydrothermally treated feedstock by rapidly releasing the pressure applied to the feedstock. The hydrothermal treatment is preferably conducted at a temperature in a range of 130°C to 230°C for a time of 1 minute to 180 minutes. The reactor is preferably pressurized by steam at a pressure of at least 1 MPa to obtain effective rupture of the raw material.

[00045] Em uma modalidade de realização da presente invenção, a matéria-prima lignocelulósica é submetida a um processo ou etapa de imersão para remover uma parte de compostos não lignocelulósicos contidos na matéria-prima lignocelulósica bruta, tais como sais inorgânicos, ceras e ácidos orgânicos, antes de ser hidrotermicamente tratada no reator pressurizado. Na etapa ou processo de imersão, contaminantes externos, tais como terra, pedras e resíduos de colheita, também podem ser separados. O processo de imersão compreende preferencialmente introduzir a matéria-prima lignocelulósica em um líquido de impregnação compreendendo água a uma temperatura de 20°C a 100°C, mais preferivelmente de 40°C e 70°C, e durante um tempo de impregnação que é de 30 segundos a 30 minutos, mais preferivelmente de 3 minutos a 15 minutos.[00045] In one embodiment of the present invention, the lignocellulosic raw material is subjected to an immersion process or step to remove a portion of non-lignocellulosic compounds contained in the raw lignocellulosic raw material, such as inorganic salts, waxes and acids. organics, before being hydrothermally treated in the pressurized reactor. In the soaking step or process, external contaminants such as earth, stones and crop residues can also be separated. The immersion process preferably comprises introducing the lignocellulosic raw material into an impregnation liquid comprising water at a temperature of 20°C to 100°C, more preferably 40°C and 70°C, and for an impregnation time which is from 30 seconds to 30 minutes, more preferably from 3 minutes to 15 minutes.

[00046] Opcionalmente, a matéria-prima lignocelulósica é submetida a um tratamento hidrotérmico preliminar em água ou um líquido que compreende água, para solubilizar uma porção dos hidratos de carbono insolúveis em água contidos na matéria-prima lignocelulósica, antes de ser introduzida no vaso do reator pressurizado. O tratamento hidrotérmico preliminar é conduzido em condições pressurizadas na presença de água em fase vapor ou fase líquida, ou uma mistura de ambas, a uma temperatura de 100°C a 190°C, de preferência de 130°C a 180°C, e mais preferencialmente de 140°C a 170°C. O tratamento hidrotérmico preliminar é conduzido durante um tempo na faixa de 10 minutos a 3 horas, de preferência de 15 minutos a 3 horas, e mais preferencialmente de 20 minutos a 60 minutos. O tratamento hidrotérmico preliminar solubiliza principalmente o componente hemicelulósico da matéria-prima lignocelulósica, que pode ser submetida a degradação térmica a temperatura mais alta, e um líquido que compreende água e polímeros e oligômeros de xilose solúveis em água e opcionalmente outros açúcares derivados de hemicelulose é desse modo separado da matéria-prima lignocelulósica sólida.[00046] Optionally, the lignocellulosic raw material is subjected to a preliminary hydrothermal treatment in water or a liquid comprising water, to solubilize a portion of the water-insoluble carbohydrates contained in the lignocellulosic raw material, before being introduced into the vessel. of the pressurized reactor. The preliminary hydrothermal treatment is conducted under pressurized conditions in the presence of water in vapor phase or liquid phase, or a mixture of both, at a temperature of 100°C to 190°C, preferably 130°C to 180°C, and more preferably from 140°C to 170°C. The preliminary hydrothermal treatment is conducted for a time in the range of 10 minutes to 3 hours, preferably 15 minutes to 3 hours, and more preferably 20 minutes to 60 minutes. The preliminary hydrothermal treatment mainly solubilizes the hemicellulosic component of the lignocellulosic feedstock, which can be subjected to thermal degradation at higher temperature, and a liquid comprising water and water-soluble xylose polymers and oligomers and optionally other sugars derived from hemicellulose is thereby separated from the solid lignocellulosic raw material.

[00047] A matéria-prima lignocelulósica pré-tratada é submetida a hidrólise enzimática para hidrolisar os açúcares poliméricos e oligoméricos em açúcares monoméricos, compreendendo glicose e xilose. A hidrólise enzimática compreende contatar a matéria-prima lignocelulósica pré-tratada em forma de pasta com uma enzima ou composição de enzima, em condições que promovem a atividade enzimática. Desse modo, uma pasta da matéria-prima lignocelulósica pré-tratada é proporcionada misturando a matéria-prima lignocelulósica pré-tratada com um líquido que compreende água para ter um teor de matéria seca preferencialmente entre 10% e 25%; opcionalmente, quando é praticado o tratamento hidrotérmico preliminar, pode também ser usada pelo menos uma porção do líquido produzido que compreende água e polímeros e oligômeros de xilose solubilizados nela. A hidrólise enzimática é tipicamente conduzida sob um pH entre 4,5 e 5, a uma temperatura entre 45°C e 55°C e por um tempo de hidrólise de 24 horas a 72 horas, sob agitação de mistura.[00047] The pretreated lignocellulosic raw material is subjected to enzymatic hydrolysis to hydrolyze polymeric and oligomeric sugars into monomeric sugars, comprising glucose and xylose. Enzymatic hydrolysis comprises contacting pretreated lignocellulosic raw material in paste form with an enzyme or enzyme composition, under conditions that promote enzymatic activity. In this way, a paste of the pretreated lignocellulosic raw material is provided by mixing the pretreated lignocellulosic raw material with a liquid comprising water to have a dry matter content preferably between 10% and 25%; Optionally, when preliminary hydrothermal treatment is practiced, at least a portion of the produced liquid comprising water and xylose polymers and oligomers solubilized therein may also be used. Enzymatic hydrolysis is typically conducted at a pH between 4.5 and 5, at a temperature between 45°C and 55°C and for a hydrolysis time of 24 hours to 72 hours, under mixing agitation.

[00048] A hidrólise enzimática pode ser realizada em uma ou mais etapas. De preferência, a hidrólise enzimática é realizada em duas etapas em vasos de hidrólise separados. Nas primeiras etapas de hidrólise, que é conduzida durante um tempo entre 12 horas e 30 horas em um primeiro vaso, uma hidrólise parcial da matéria-prima lignocelulósica pré-tratada é obtida para alcançar a liquefação da matéria-prima lignocelulósica pré-tratada, obtendo assim uma mistura parcialmente hidrolisada que tem uma viscosidade mais baixa que a pasta inicial. A mistura parcialmente hidrolisada é então deslocada para um segundo vaso de hidrólise, em que uma segunda etapa de hidrólise é continuada durante um tempo entre 12 horas e 60 horas para obter o hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica, compreendendo água, matéria-prima lignocelulósica pré-tratada residual insolúvel em água e açúcares solúveis em água compreendendo glicose e xilose. O hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica pode compreender adicionalmente outros açúcares monoméricos solúveis em água C6 e C5, tipicamente em concentração mais baixa do que a de glicose e de xilose, respectivamente.[00048] Enzymatic hydrolysis can be carried out in one or more steps. Preferably, the enzymatic hydrolysis is carried out in two steps in separate hydrolysis vessels. In the first hydrolysis steps, which is conducted for a time between 12 hours and 30 hours in a first vessel, a partial hydrolysis of the pretreated lignocellulosic raw material is obtained to achieve liquefaction of the pretreated lignocellulosic raw material, obtaining thus a partially hydrolyzed mixture that has a lower viscosity than the initial paste. The partially hydrolyzed mixture is then moved to a second hydrolysis vessel, wherein a second hydrolysis step is continued for a time between 12 hours and 60 hours to obtain the lignocellulosic feedstock hydrolyzate, comprising water, pre-lignocellulosic feedstock. -treated residual water-insoluble and water-soluble sugars comprising glucose and xylose. The lignocellulosic feedstock hydrolyzate may additionally comprise other water-soluble monomeric sugars C6 and C5, typically in lower concentration than glucose and xylose, respectively.

[00049] Ainda mais preferencialmente, a hidrólise enzimática é realizada de acordo com o ensinamento de WO2010113130, que é aqui incorporado como referência.[00049] Even more preferably, enzymatic hydrolysis is carried out in accordance with the teaching of WO2010113130, which is incorporated herein by reference.

[00050] Pelo menos uma porção da matéria-prima lignocelulósica pré-tratada residual insolúvel em água pode ser removida do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica. Separação de matéria-prima lignocelulósica pré-tratada residual insolúvel em água pode ser obtida, por exemplo, por decantação, centrifugação ou prensagem do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica, ou uma combinação das mesmas. No entanto, mesmo que a presença de matéria-prima lignocelulósica pré-tratada residual insolúvel em água no processo de propagação descrito possa dar origem a problemas de mistura, alguns açúcares monoméricos solúveis em água impregnados nos sólidos residuais podem ser retirados do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica na etapa de separação e perder-se; desse modo, em uma modalidade de realização preferida da presente invenção nenhuma remoção de sólido é praticada e o hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica é uma pasta que compreende matéria-prima lignocelulósica pré-tratada insolúvel em água.[00050] At least a portion of the residual water-insoluble pretreated lignocellulosic raw material can be removed from the lignocellulosic raw material hydrolyzate. Separation of water-insoluble residual pretreated lignocellulosic raw material can be achieved, for example, by decanting, centrifuging or pressing the lignocellulosic raw material hydrolyzate, or a combination thereof. However, even though the presence of residual water-insoluble pretreated lignocellulosic feedstock in the described propagation process may give rise to mixing problems, some water-soluble monomeric sugars impregnated in the residual solids may be removed from the raw material hydrolyzate. lignocellulosic raw materials in the separation stage and are lost; Thus, in a preferred embodiment of the present invention no solid removal is practiced and the lignocellulosic raw material hydrolyzate is a paste comprising pretreated water-insoluble lignocellulosic raw material.

[00051] O processo ou processos descritos acima para derivar o hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica da matéria-prima lignocelulósica são modalidades de realização exemplares e preferidas da presente invenção para fornecer o hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica utilizado como fonte de carbono principal para a propagação de uma levedura de acordo com o processo descrito, e entende-se que elas não se destinam a limitar de qualquer forma o escopo da invenção.[00051] The process or processes described above for deriving lignocellulosic feedstock hydrolyzate from lignocellulosic feedstock are exemplary and preferred embodiments of the present invention for providing lignocellulosic feedstock hydrolyzate used as the main carbon source for the propagation of a yeast according to the described process, and it is understood that they are not intended to limit in any way the scope of the invention.

[00052] O hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica pode ter uma matéria seca compreendida entre 5% e 30%, de preferência entre 10% e 20%.[00052] The lignocellulosic raw material hydrolyzate can have a dry matter of between 5% and 30%, preferably between 10% and 20%.

[00053] O hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica tem uma concentração de glicose que pode situar-se na faixa de 20 g/kg a 100 g/kg do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica em base úmida, de preferência de 30 g/kg a 70 g/kg, e mais preferencialmente de 40 g/kg a 50 g/kg.[00053] The lignocellulosic raw material hydrolyzate has a glucose concentration that can be in the range of 20 g/kg to 100 g/kg of the lignocellulosic raw material hydrolyzate on a wet basis, preferably 30 g/kg to 70 g/kg, and more preferably from 40 g/kg to 50 g/kg.

[00054] O hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica tem uma concentração de xilose que pode situar-se na faixa de 10 g/kg a 40 g/kg do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica em base úmida, de preferência de 15 g/kg a 30 g/kg, e mais preferencialmente de 20 g/kg a 25 g/kg.[00054] The lignocellulosic raw material hydrolyzate has a xylose concentration that can be in the range of 10 g/kg to 40 g/kg of the lignocellulosic raw material hydrolyzate on a wet basis, preferably 15 g/kg to 30 g/kg, and more preferably from 20 g/kg to 25 g/kg.

[00055] O hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica pode compreender ainda compostos inibidores selecionados a partir das listas de ácido acético, ácido fórmico, furfural e hidroximetil furfural (5- HMF), que se formam em etapas ou processos de pré-tratamento e de hidrólise anteriores e inibem o crescimento da levedura, levando pelo menos a um retardamento na taxa de crescimento.[00055] The hydrolyzate of lignocellulosic raw material may further comprise inhibitory compounds selected from the lists of acetic acid, formic acid, furfural and hydroxymethyl furfural (5-HMF), which are formed in pre-treatment and processing steps or processes. previous hydrolysis and inhibit yeast growth, leading to at least a retardation in the growth rate.

[00056] Particularmente, o ácido acético pode ter uma concentração que se situa na faixa de 2 g/kg a 7 g/kg do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica em base úmida.[00056] In particular, acetic acid can have a concentration ranging from 2 g/kg to 7 g/kg of the lignocellulosic raw material hydrolyzate on a wet basis.

[00057] O hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica pode ainda conter contaminantes biológicos, como normalmente ocorre na operação em escala industrial. Contaminantes biológicos são microrganismos diferentes da levedura que deve ser propagada de acordo com o processo descrito e cuja presença é em geral prejudicial ao rendimento do processo descrito, consumindo uma parte dos açúcares monoméricos totalmente disponíveis para o crescimento da levedura desejada. Contaminantes biológicos podem incluir bactérias e fungos, assim como leveduras diferentes da levedura desejada a ser propagada, tais como leveduras do tipo selvagem. Bactérias de ácido láctico, em particular, espécies Lactobacillus, são os contaminantes bacterianos primários. As concentrações de ácido láctico de misturas de fermentação são geralmente tomadas como uma medida do grau de contaminação. A contaminação biológica tem sido controlada por meio de esterilização do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica, meios de cultura e de fermentação e equipamentos envolvidos no processo, o que pode ser obtido mediante adição de agentes antibacterianos, tais como antibióticos ou outros agentes assépticos, ou por procedimentos de esterilização, tal como pasteurização, aplicando agentes físicos, incluindo entre outros, calor, luz e radiação, antes, entre ou durante o curso das operações de fermentação/propagação. Por "esterilização" considera-se aqui a redução da densidade de contaminantes biológicos por um fator de pelo menos 100. O uso de agentes antibacterianos e procedimentos de esterilização, o que introduz custos adicionais, é preferencialmente evitado no processo descrito, ao mesmo tempo que mantém o crescimento de contaminantes biológicos em um nível baixo razoável.[00057] The lignocellulosic raw material hydrolyzate may also contain biological contaminants, as normally occurs in industrial-scale operations. Biological contaminants are microorganisms other than yeast that must be propagated according to the described process and whose presence is generally detrimental to the yield of the described process, consuming a portion of the monomeric sugars fully available for the growth of the desired yeast. Biological contaminants can include bacteria and fungi, as well as yeasts other than the desired yeast to be propagated, such as wild-type yeast. Lactic acid bacteria, in particular, Lactobacillus species, are the primary bacterial contaminants. Lactic acid concentrations of fermentation mixtures are generally taken as a measure of the degree of contamination. Biological contamination has been controlled through sterilization of the lignocellulosic raw material hydrolyzate, culture and fermentation media and equipment involved in the process, which can be achieved by adding antibacterial agents, such as antibiotics or other aseptic agents, or by sterilization procedures, such as pasteurization, applying physical agents, including but not limited to heat, light and radiation, before, between or during the course of fermentation/propagation operations. By "sterilization" we mean here the reduction of the density of biological contaminants by a factor of at least 100. The use of antibacterial agents and sterilization procedures, which introduce additional costs, is preferably avoided in the described process, while at the same time keeps the growth of biological contaminants at a reasonable low level.

[00058] De preferência, o hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica não é submetido a qualquer etapa ou procedimento de esterilização, que seriam difíceis e caros de praticar em escala industrial.[00058] Preferably, the lignocellulosic raw material hydrolyzate is not subjected to any sterilization step or procedure, which would be difficult and expensive to practice on an industrial scale.

[00059] Preferencialmente, nenhum agente antibacteriano é usado no processo descrito, nem é adicionado ao hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica antes do processo descrito.[00059] Preferably, no antibacterial agent is used in the described process, nor is it added to the lignocellulosic raw material hydrolyzate before the described process.

[00060] No processo descrito, a levedura é propagada em ciclos sequenciais de propagação que são aqui indicados por Pn, em que n é maior ou igual a 1, em respectivos meios de cultura que compreendem diferentes alíquotas do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica. O processo de propagação descrito compreende pelo menos dois ciclos de propagação. Para reduzir o custo da levedura de partida no processo inteiro, preferencialmente, os ciclos de propagação são pelo menos três, mais preferivelmente pelo menos cinco, e ainda mais preferencialmente pelo menos sete. Mesmo se não houver um limite teórico, acredita-se que os ciclos de propagação podem ser repetidos até vinte vezes sem alterar a capacidade de a levedura fermentar tanto glicose quanto xilose.[00060] In the described process, yeast is propagated in sequential propagation cycles that are indicated here by Pn, where n is greater than or equal to 1, in respective culture media comprising different aliquots of the lignocellulosic raw material hydrolyzate. The described propagation process comprises at least two propagation cycles. To reduce the cost of starter yeast in the entire process, preferably the propagation cycles are at least three, more preferably at least five, and even more preferably at least seven. Even if there is no theoretical limit, it is believed that propagation cycles can be repeated up to twenty times without altering the yeast's ability to ferment both glucose and xylose.

[00061] De preferência, cada ciclo de propagação é conduzido em modo descontínuo, no qual o hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica é adicionado antes de iniciar o ciclo de propagação, ou no início do ciclo de propagação.[00061] Preferably, each propagation cycle is conducted in batch mode, in which the lignocellulosic raw material hydrolyzate is added before starting the propagation cycle, or at the beginning of the propagation cycle.

[00062] No primeiro ciclo de propagação, uma primeira quantidade de levedura é colocada em contato com um primeiro meio de cultura e mantida sob condições que promovem a propagação da levedura para produzir uma primeira levedura propagada. Em cada ciclo de propagação seguinte Pn, uma porção da levedura propagada em um ciclo de propagação anterior, que é de preferência o ciclo propagação imediatamente anterior Pn-1, é usada como inóculo para a execução do ciclo de propagação Pn. Desse modo, uma quantidade adequada de uma levedura previamente propagada é posta em contato com um meio de cultura Pn e deixada propagar para produzir uma levedura propagada Pn. Em todos os ciclos de propagação Pn, uma porção do carbono de açúcar pode ser convertida em um produto de fermentação pelas células de levedura, dependendo das condições de propagação. O etanol é um produto de fermentação preferido.[00062] In the first propagation cycle, a first amount of yeast is brought into contact with a first culture medium and maintained under conditions that promote the propagation of yeast to produce a first propagated yeast. In each following propagation cycle Pn, a portion of the yeast propagated in a previous propagation cycle, which is preferably the immediately preceding propagation cycle Pn-1, is used as an inoculum for carrying out the propagation cycle Pn. In this way, a suitable amount of a previously propagated yeast is brought into contact with a Pn culture medium and allowed to propagate to produce a Pn propagated yeast. In all Pn propagation cycles, a portion of the sugar carbon can be converted to a fermentation product by yeast cells, depending on propagation conditions. Ethanol is a preferred fermentation product.

[00063] O Primeiro Ciclo De Propagação Tem Características Distintas No Que Diz Respeito A Todos Os Ciclos De Propagação Seguintes. Notadamente, No Primeiro Ciclo De Propagação, É Usada Uma Levedura De Partida. Quando A Levedura Partida É Contatada Com O Primeiro Meio De Cultura, A Absorção De Açúcares Pela Levedura Inicialmente Não Ocorre De Forma Significativa. Esse Período É Referido Como Fase De Latência E Pode Ser Considerado Um Período De Adaptação Da Levedura Ao Hidrolisado De Matéria-prima Lignocelulósica, Em Que O Crescimento Da Levedura É Negligenciável. A Levedura Utilizada Nos Ciclos De Propagação Seguintes Pn, Em Que N É Maior Que 1, É Uma Levedura Propagada No Hidrolisado De Matéria-prima Lignocelulósica, Desse Modo, A Correspondente Fase De Latência Pn É Significativamente Reduzida Em Relação À Fase De Latência Do Primeiro Ciclo De Propagação.[00063] The First Propagation Cycle Has Distinct Characteristics With Respect To All Subsequent Propagation Cycles. Notably, in the first propagation cycle, a starter yeast is used. When broken yeast is contacted with the first culture medium, absorption of sugars by the yeast initially does not occur to a significant extent. This period is referred to as the latency phase and can be considered a period of adaptation of the yeast to the hydrolyzate of lignocellulosic raw material, in which the growth of the yeast is negligible. The Yeast Used In The Following Pn Propagation Cycles, Where N Is Greater Than 1, Is A Yeast Propagated In The Hydrolyzate Of Lignocellulosic Raw Material, Therefore, The Corresponding Pn Latency Phase Is Significantly Reduced In Relation To The Latency Phase Of The First Propagation Cycle.

[00064] A Taxa De Absorção De Açúcares É Um Parâmetro Importante Do Processo Descrito, Especialmente No Caso Em Que O Hidrolisado De Matéria-prima Lignocelulósica Compreende Alguns Contaminantes Biológicos E Não São Usados Nenhuma Esterilização E Agentes Antibacterianos, Uma Vez Que Nessas Condições É Reforçado O Crescimento Competitivo De Contaminantes Biológicos. A Absorção De Glicose Pela Levedura É Preferida Em Relação À Absorção De Xilose, Desse Modo A Concentração De Glicose No Meio De Propagação Começará A Diminuir, Ao Passo Que A Absorção De Xilose Não Prosseguirá De Forma Significativa Até A Concentração De Glicose Ser Reduzida Abaixo De Certo Valor Crítico. Como A Afinidade Da Levedura Pelos Açúcares Restantes Diminui No Meio De Cultura, A Taxa De Absorção Total De Açúcares Pela Levedura Diminuirá Ao Longo Do Tempo, Tornando Favorável O Crescimento Competitivo De Contaminantes Biológicos. Assim, No Processo Descrito, Todos Os Ciclos De Propagação Pn, Em Que N É Um Número Inteiro Igual Ou Maior Que 1, São Prolongados Por Um Tempo Suficiente Para Consumir Pelo Menos 50% Da Glicose Contida No Meio De Propagação De Partida, E Menos De 20% Da Xilose Contida No Meio De Propagação De Partida. Pretende-se Que O Consumo De Glicose E Xilose Seja O Consumo Total Ocorrido Durante A Etapa De Propagação, E Isso Pode Ser Verificado Medindo A Concentração De Açúcar Correspondente No Meio De Propagação. Desse Modo, O Consumo Total De Açúcares Que Ocorre No Ciclo De Propagação Pn Inclui Também A Incorporação De Açúcares Por Contaminantes Biológicos, Que Se Pretende Seja Minimizada No Processo Descrito, E O Açúcar Eventualmente Convertido No Produto De Fermentação. Para Melhorar O Rendimento Do Processo Em Termos De Biomassa De Levedura Produzida, Preferencialmente Os Ciclos De Propagação São Conduzidos Por Um Tempo De Propagação Suficiente Para Consumir Pelo Menos 70% Da Glicose Do Meio De Propagação De Partida, E Mais Preferencialmente Pelo Menos 80%. Ao Mesmo Tempo, Para Evitar Que A Taxa De Absorção Total De Açúcares Atinja Um Valor Crítico Para O Crescimento Competitivo De Contaminantes Biológicos, Preferencialmente O Ciclo De Propagação Pn É Prolongado Por Um Tempo De Propagação Suficiente Para Consumir Menos De 10% Da Xilose No Meio De Cultura De Partida, Mais Preferivelmente Menos De 5%. Nota-se Que Cada Ciclo De Propagação Do Processo Descrito Pode Ser Caracterizado Por Um Tempo Específico De Consumo E Propagação De Glicose E Xilose, Desde Que Esses Parâmetros Estão Dentro Das Faixas Descritas. Observa-se Também Que, Enquanto A Quantidade Total De Xilose Consumida Na Etapa De Propagação É Preferivelmente Maior Que 0, Em Alguns Casos Xilose Pode Não Ser Apreciavelmente Consumida Pelo Menos No Primeiro Ciclo De Propagação. Ou Seja, O Primeiro Ciclo De Propagação Requer Tipicamente Um Tempo De Propagação Que É Maior Do Que O Tempo De Propagação Nos Ciclos De Propagação Seguintes, Devido À Sua Fase De Latência Mais Longa. O Primeiro Ciclo De Propagação Pode Ser Conduzido Durante Um Tempo De Propagação Que É Menor Que 30 Horas, Mas Preferencialmente Menor Que 25 Horas, Mais Preferencialmente Menor Que 20 Horas, E Ainda Mais Preferencialmente Menor Que 16 Horas. O Tempo De Propagação Dos Ciclos De Propagação Pn Seguintes, Em Que N É Um Número Inteiro Maior Que 1, É De Preferência Menor Que 70%, Mais Preferencialmente Menor Que 50%, E Mais Preferencialmente Menor Que 40%, Do Primeiro Tempo De Propagação.[00064] The Sugar Absorption Rate Is An Important Parameter Of The Described Process, Especially In The Case Where The Lignocellulosic Raw Material Hydrolyzate Comprises Some Biological Contaminants And No Sterilization And Antibacterial Agents Are Used, Since Under These Conditions It Is Reinforced The Competitive Growth of Biological Contaminants. Glucose uptake by yeast is preferred over xylose uptake, thus the glucose concentration in the propagation medium will begin to decrease, whereas xylose uptake will not proceed significantly until the glucose concentration is reduced below Certain Critical Value. As yeast's affinity for remaining sugars decreases in the culture medium, the rate of total sugar absorption by yeast will decrease over time, making the competitive growth of biological contaminants favorable. Thus, in the process described, all Pn propagation cycles, where N is an integer equal to or greater than 1, are prolonged for a time sufficient to consume at least 50% of the glucose contained in the starting propagation medium, and less 20% Of The Xylose Contained In The Starting Propagation Medium. Glucose and Xylose Consumption is intended to be the total consumption occurring during the propagation stage, and this can be verified by measuring the corresponding sugar concentration in the propagation medium. Therefore, the total consumption of sugars that occurs in the Pn propagation cycle also includes the incorporation of sugars by biological contaminants, which is intended to be minimized in the process described, and the sugar eventually converted into the fermentation product. To improve the yield of the process in terms of yeast biomass produced, preferably the propagation cycles are conducted for a propagation time sufficient to consume at least 70% of the glucose of the starting propagation medium, and more preferably at least 80%. At the same time, to prevent the total sugar absorption rate from reaching a critical value for the competitive growth of biological contaminants, preferably the Pn propagation cycle is prolonged for a propagation time sufficient to consume less than 10% of the xylose in the medium Of Starting Culture, More Preferably Less Than 5%. It is noted that each propagation cycle of the described process can be characterized by a specific time of consumption and propagation of glucose and xylose, as long as these parameters are within the described ranges. It is also noted that, while the total amount of xylose consumed in the propagation stage is preferably greater than 0, in some cases xylose may not be appreciably consumed in at least the first propagation cycle. That is, the first propagation cycle typically requires a propagation time that is greater than the propagation time in subsequent propagation cycles, due to its longer latency phase. The First Propagation Cycle May Be Conducted During A Propagation Time That Is Less Than 30 Hours, But Preferably Less Than 25 Hours, More Preferably Less Than 20 Hours, And Most Preferably Less Than 16 Hours. The Propagation Time of the following Pn propagation cycles, where N is an integer greater than 1, is preferably less than 70%, more preferably less than 50%, and most preferably less than 40%, of the first propagation time .

[00065] Mesmo que mais de um vaso de propagação possa ser utilizado, de preferência todos os ciclos de propagação são conduzidos em um único vaso de propagação. A fim de minimizar os custos, o vaso ou vasos de propagação preferencialmente não são submetidos a qualquer esterilização e/ou limpeza entre e/ou durante os ciclos de propagação.[00065] Even if more than one propagation vessel can be used, preferably all propagation cycles are conducted in a single propagation vessel. In order to minimize costs, the propagation vessel or vessels are preferably not subjected to any sterilization and/or cleaning between and/or during propagation cycles.

[00066] Para limitar o efeito de crescimento competitivo de contaminantes biológicos, o hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica é de preferência mantido a uma temperatura de 45°C a 55°C antes de ser usado no processo descrito, e ainda mais preferivelmente à temperatura da hidrólise enzimática ou da etapa de hidrólise enzimática final. Nessa temperatura, a atividade dos contaminantes biológicos é significativamente reduzida.[00066] To limit the effect of competitive growth of biological contaminants, the lignocellulosic raw material hydrolyzate is preferably maintained at a temperature of 45°C to 55°C before being used in the described process, and even more preferably at the temperature enzymatic hydrolysis or the final enzymatic hydrolysis step. At this temperature, the activity of biological contaminants is significantly reduced.

[00067] Em cada ciclo de propagação Pn , em que n é um número inteiro igual ou maior do que 1, uma porção Pn do hidrolisado de matéria- prima lignocelulósica é usada para formar o meio de cultura. A temperatura da porção Pn do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica é reduzida à temperatura de propagação do ciclo de propagação Pn, a qual se situa preferencialmente na faixa de 28°C a 35°C. Trocadores de calor podem ser usados para resfriar a porção Pn do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica à temperatura de propagação no interior do vaso de propagação ou antes de entrar no vaso de propagação.[00067] In each Pn propagation cycle, where n is an integer equal to or greater than 1, a Pn portion of the lignocellulosic raw material hydrolyzate is used to form the culture medium. The temperature of the Pn portion of the lignocellulosic raw material hydrolyzate is reduced to the propagation temperature of the Pn propagation cycle, which is preferably in the range of 28°C to 35°C. Heat exchangers can be used to cool the Pn portion of the lignocellulosic feedstock hydrolyzate to the propagation temperature inside the propagation vessel or before entering the propagation vessel.

[00068] Água ou um líquido que compreende água e quantidades limitadas opcionais de fontes de carbono adicionais diferentes do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica podem ser usados para atingir a matéria seca desejada. Uma das vantagens oferecidas pelo processo descrito é a possibilidade de ser realizado em uma matéria seca que é maior do que outros processos conhecidos que utilizam um hidrolisado lignocelulósico como principal fonte de carbono. A matéria seca do meio de cultura é de preferência inferior a 30%, uma vez que seria difícil ser agitado, e é preferencialmente maior que 5%, mais preferivelmente maior que 10%, ainda mais preferivelmente maior que 15%, mais preferivelmente maior que 20%. A água ou o líquido que compreende água pode ser adicionada sob uma temperatura que é inferior à temperatura de propagação para resfriar a porção Pn do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica.[00068] Water or a liquid comprising water and optional limited amounts of additional carbon sources other than lignocellulosic feedstock hydrolyzate can be used to achieve the desired dry matter. One of the advantages offered by the described process is the possibility of being carried out on a dry matter that is larger than other known processes that use a lignocellulosic hydrolyzate as the main carbon source. The dry matter of the culture medium is preferably less than 30%, since it would be difficult to stir, and is preferably greater than 5%, more preferably greater than 10%, even more preferably greater than 15%, more preferably greater than 20%. Water or liquid comprising water can be added under a temperature that is lower than the propagation temperature to cool the Pn portion of the lignocellulosic raw material hydrolyzate.

[00069] Portanto, a densidade de contaminantes biológicos no meio de cultura Pn de partida pode ser mantida em um nível razoável, que pode se situar em uma faixa de 100 UFC/ml a 106 UFC/ml, preferivelmente de 101 UFC/ml a 105 UFC/ml, e mais preferivelmente de 102 UFC/ml a 103 UFC/ml, de meio de cultura Pn de partida, em que n é um número inteiro igual ou superior a 1.[00069] Therefore, the density of biological contaminants in the starting Pn culture medium can be maintained at a reasonable level, which can be in a range of 100 CFU/ml to 106 CFU/ml, preferably from 101 CFU/ml to 105 CFU/ml, and more preferably from 102 CFU/ml to 103 CFU/ml, of Pn starting culture medium, where n is an integer equal to or greater than 1.

[00070] O meio de cultura Pn, em que n é um número inteiro igual ou maior que 1, pode ainda compreender uma fonte de nitrogênio, tipicamente ureia, que é uma fonte de nutrientes de baixo custo para a levedura, mas é preferencialmente livre de vitaminas e/ou oligoelementos adicionados, que são tipicamente utilizados em escala de laboratório como suplementos para crescimento, mas são extremamente caros. Em outras palavras, preferencialmente vitaminas e/ou oligoelementos não são adicionados ao hidrolisado de matéria- prima lignocelulósica e aos meios de cultura durante o processo ou em etapas anteriores do processo.[00070] The culture medium Pn, where n is an integer equal to or greater than 1, may further comprise a source of nitrogen, typically urea, which is a low-cost source of nutrients for yeast, but is preferably free of added vitamins and/or trace elements, which are typically used on a laboratory scale as growth supplements, but are extremely expensive. In other words, preferably vitamins and/or trace elements are not added to the lignocellulosic raw material hydrolyzate and culture media during the process or in previous stages of the process.

[00071] Preferencialmente, o pH do meio de cultura Pn é ajustado em um valor de 5,0 a 5,5, por exemplo, adicionando uma quantidade adequada de uma base (solução de NaOH). Se necessário, para manter o pH na faixa desejada, alíquotas adicionais da base podem ser adicionadas durante a etapa de propagação.[00071] Preferably, the pH of the Pn culture medium is adjusted to a value of 5.0 to 5.5, for example, by adding an appropriate amount of a base (NaOH solution). If necessary, to maintain the pH in the desired range, additional aliquots of the base can be added during the propagation step.

[00072] No primeiro ciclo de propagação, a levedura pode ser adicionada ao primeiro meio de cultura, ou a componentes usados para formar o primeiro meio de cultura. Em uma modalidade de realização da presente invenção, a levedura é adicionada à primeira porção do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica usado para formar o primeiro meio de propagação. A quantidade de levedura em contato com o primeiro meio de cultura variará de acordo com o volume total do primeiro meio de propagação. De preferência, no primeiro ciclo de propagação é adicionada uma quantidade de levedura que tem uma densidade de levedura de partida que se situa entre 1 x 106 e 1 x 108 células de levedura por miligrama do primeiro meio de cultura, em base úmida.[00072] In the first propagation cycle, yeast can be added to the first culture medium, or to components used to form the first culture medium. In one embodiment of the present invention, yeast is added to the first portion of the lignocellulosic raw material hydrolyzate used to form the first propagation medium. The amount of yeast in contact with the first culture medium will vary according to the total volume of the first propagation medium. Preferably, in the first propagation cycle an amount of yeast is added that has a starting yeast density that is between 1 x 106 and 1 x 108 yeast cells per milligram of the first culture medium, on a wet basis.

[00073] Em todos os ciclos de propagação Pn, em que n é um número inteiro igual ou superior a 1, a propagação ocorre preferencialmente em condições aeróbicas a fim de aumentar a quantidade de levedura propagadas produzida. Condições aeróbicas são caracterizados por uma saturação de oxigênio significativa no meio de propagação que é maior que 10%. A saturação de oxigênio é a razão da concentração de oxigênio dissolvido (O2) no meio de cultura para a quantidade máxima de oxigênio que se dissolverá no meio de cultura à temperatura e pressão sob equilíbrio estável. Desse modo, um fluxo de oxigênio, ar ou outra mistura de gases compreendendo oxigênio é introduzido no meio de propagação, preferencialmente sob uma vazão média entre 50 vvm e 200 vvm. Para promover a difusão de oxigênio no meio de propagação, agitação ou mistura podem também ser proporcionadas ao meio de propagação. Condições aeróbicas podem ser mantidas durante pelo menos uma parte da etapa de propagação. Em alguns casos, intervalos cíclicos específicos de condições aeróbias/anaeróbias podem ser atingidos agindo sobre a mistura do meio de cultura.[00073] In all Pn propagation cycles, where n is an integer equal to or greater than 1, propagation preferably occurs under aerobic conditions in order to increase the amount of propagated yeast produced. Aerobic conditions are characterized by a significant oxygen saturation in the propagation medium that is greater than 10%. Oxygen saturation is the ratio of the concentration of dissolved oxygen (O2) in the culture medium to the maximum amount of oxygen that will dissolve in the culture medium at the temperature and pressure under stable equilibrium. In this way, a flow of oxygen, air or other gas mixture comprising oxygen is introduced into the propagation medium, preferably at an average flow rate between 50 vvm and 200 vvm. To promote the diffusion of oxygen into the propagation medium, agitation or mixing may also be provided to the propagation medium. Aerobic conditions can be maintained during at least part of the propagation stage. In some cases, specific cyclical ranges of aerobic/anaerobic conditions can be achieved by acting on the culture medium mixture.

[00074] No final do ciclo de propagação Pn, em que n é um número inteiro igual ou superior a 1, é obtido um caldo populado Pn que compreende água e uma primeira levedura propagada. O caldo populado adicionalmente pode ainda compreender produtos de fermentação, ou seja, etanol, que foi produzido pela atividade fermentativa da levedura, açúcares solúveis em água não consumidos pela levedura e matéria-prima lignocelulósica pré-tratada residual insolúvel em água. Em uma modalidade de realização preferida da presente invenção, o hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica compreende ainda enzimas residuais da etapa ou etapas de hidrólise, uma porção das quais ainda estão ativas. Mesmo que as condições de propagação não sejam ótimas para a atividade da enzima, uma parte dos hidratos de carbono insolúveis em água na matéria-prima lignocelulósica pré-tratada residual insolúvel em água pode ser hidrolisada em açúcares solúveis em água adicionais que são, por conseguinte, disponíveis para a levedura. Nesse caso, a quantidade total de glicose e xilose consumidas pela levedura levará em conta os açúcares adicionais solúveis em água.[00074] At the end of the propagation cycle Pn, where n is an integer equal to or greater than 1, a broth populated Pn is obtained comprising water and a first propagated yeast. The additionally populated broth may further comprise fermentation products, i.e., ethanol, which was produced by the fermentative activity of the yeast, water-soluble sugars not consumed by the yeast, and residual water-insoluble pretreated lignocellulosic raw material. In a preferred embodiment of the present invention, the lignocellulosic raw material hydrolyzate further comprises residual enzymes from the hydrolysis step or steps, a portion of which are still active. Even if propagation conditions are not optimal for enzyme activity, a part of the water-insoluble carbohydrates in the residual water-insoluble pretreated lignocellulosic feedstock can be hydrolyzed into additional water-soluble sugars which are therefore , available to yeast. In this case, the total amount of glucose and xylose consumed by the yeast will take into account additional water-soluble sugars.

[00075] Em todos os ciclos de propagação Pn, será produzida uma quantidade de levedura propagada que pode ser 5 a 15 vezes a quantidade de levedura de partida correspondente. A mesma faixa preferida se aplica à densidade de células de levedura.[00075] In all Pn propagation cycles, an amount of propagated yeast will be produced that can be 5 to 15 times the corresponding amount of starting yeast. The same preferred range applies to yeast cell density.

[00076] Preferencialmente, no ciclo de propagação Pn a densidade de levedura final situa-se entre 1 x 107 e 1 x 109 células de levedura por miligrama do primeiro meio de cultura, em base úmida.[00076] Preferably, in the Pn propagation cycle the final yeast density is between 1 x 107 and 1 x 109 yeast cells per milligram of the first culture medium, on a wet basis.

[00077] Nos ciclos de propagação Pn seguintes, em que n é um número inteiro maior que 1, o caldo populado Pn-1 é então separado em pelo menos duas partes, a saber, a porção removida e a porção residual do caldo populado Pn-1, cada porção compreendendo alguma porção da levedura Pn-1 previamente propagada. A separação preferida compreende uma divisão do caldo populado Pn-1 em uma porção residual Pn-1 e uma porção removida Pn-1, em que as duas porções têm a mesma composição. Na modalidade de realização mais preferida da presente invenção, a porção removida do caldo populado Pn-1 é removida do vaso de propagação, e a porção residual Pn-1 é deixada no vaso de propagação para o ciclo de propagação Pn. Em algumas modalidades de realização da presente invenção, a separação pode compreender uma separação seletiva de componentes específicos do caldo populado, por exemplo, por meio de filtração ou centrifugação, para produzir duas porções com composições diferentes. Desse modo, em alguns casos as duas porções podem se caracterizar por ter densidades diferentes de leveduras populadas. Em algumas modalidades de realização da presente invenção, as duas porções podem apresentar teores diferentes de matéria-prima lignocelulósica pré-tratada residual insolúvel em água.[00077] In the following Pn propagation cycles, where n is an integer greater than 1, the Pn-1 populated broth is then separated into at least two parts, namely, the removed portion and the residual portion of the Pn populated broth. -1, each portion comprising some portion of the previously propagated Pn-1 yeast. The preferred separation comprises a division of the populated broth Pn-1 into a residual portion Pn-1 and a removed portion Pn-1, wherein the two portions have the same composition. In the most preferred embodiment of the present invention, the removed portion of the Pn-1 populated broth is removed from the propagation vessel, and the residual Pn-1 portion is left in the propagation vessel for the Pn propagation cycle. In some embodiments of the present invention, the separation may comprise a selective separation of specific components from the populated broth, for example, by means of filtration or centrifugation, to produce two portions with different compositions. Therefore, in some cases the two portions may be characterized by having different densities of yeast populations. In some embodiments of the present invention, the two portions may have different levels of residual water-insoluble pretreated lignocellulosic raw material.

[00078] Após o primeiro ciclo de propagação (Pn = 1), o processo sofre o segundo ciclo de propagação (Pn = 2) como descrito acima para os ciclos de propagação em que n é um número inteiro maior que 1.[00078] After the first propagation cycle (Pn = 1), the process undergoes the second propagation cycle (Pn = 2) as described above for propagation cycles in which n is an integer greater than 1.

[00079] A quantidade da porção residual Pn-1 é de preferência menor que 50% do caldo populado Pn-1 em peso em base úmida, mais preferivelmente menor que 40%, e ainda mais preferencialmente menor que 25%.[00079] The amount of the residual portion Pn-1 is preferably less than 50% of the broth populated Pn-1 by weight on a wet basis, more preferably less than 40%, and even more preferably less than 25%.

[00080] Em cada ciclo de propagação Pn seguinte à primeira propagação P1, a porção residual de um ciclo de propagação anterior é usada como inóculo de levedura. Preferencialmente, no ciclo de propagação Pn é utilizada a parte residual do ciclo de propagação Pn-1 imediatamente anterior. Desse modo, uma parte residual de um ciclo de propagação anterior é posto em contato com um meio de cultura que compreende uma porção correspondente Pn do hidrolisado de matéria- prima lignocelulósica. Em uma modalidade de realização preferida da presente invenção, uma alíquota Pn do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica é adicionada ao vaso de propagação contendo a porção residual do ciclo de propagação Pn-1 para formar o meio de cultura Pn. A densidade de contaminantes biológicos na porção residual que é utilizada no ciclo de propagação Pn pode ser maior do que a densidade de contaminantes biológicos no hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica, devido à propagação de contaminantes competitivos. A adição de uma porção Pn adequada do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica diluirá nesse caso a um valor desejado a densidade de contaminantes biológicos no meio de propagação Pn de partida.[00080] In each Pn propagation cycle following the first P1 propagation, the residual portion of a previous propagation cycle is used as yeast inoculum. Preferably, in the Pn propagation cycle the residual part of the immediately previous Pn-1 propagation cycle is used. In this way, a residual part of a previous propagation cycle is brought into contact with a culture medium comprising a corresponding Pn portion of the lignocellulosic raw material hydrolyzate. In a preferred embodiment of the present invention, a Pn aliquot of the lignocellulosic feedstock hydrolyzate is added to the propagation vessel containing the residual portion of the Pn-1 propagation cycle to form the Pn culture medium. The density of biological contaminants in the residual portion that is used in the Pn propagation cycle may be greater than the density of biological contaminants in the lignocellulosic feedstock hydrolyzate, due to the propagation of competitive contaminants. The addition of a suitable Pn portion of the lignocellulosic raw material hydrolyzate will in this case dilute the density of biological contaminants in the starting Pn propagation medium to a desired value.

[00081] Preferencialmente, a quantidade da porção residual de um ciclo de propagação anterior e a quantidade da porção Pn do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica usado para formar o meio de cultura Pn são selecionadas para ter uma densidade de levedura de partida no ciclo de propagação Pn que é maior do que a densidade de levedura de partida no primeiro ciclo de propagação.[00081] Preferably, the amount of the residual portion from a previous propagation cycle and the amount of the Pn portion of the lignocellulosic raw material hydrolyzate used to form the Pn culture medium are selected to have a starting yeast density in the propagation cycle. propagation Pn which is greater than the starting yeast density in the first propagation cycle.

[00082] Ainda mais preferencialmente, a quantidade da parte residual de um ciclo de propagação anterior e a quantidade da porção Pn do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica usado para formar o meio de cultura Pn são selecionadas para ter uma densidade de levedura de partida no ciclo de propagação Pn que é maior do que entre 1 x 106 e 1 x 108 células de levedura por miligrama do meio de cultura Pn em base úmida, em que n é um número inteiro maior do que 1.[00082] Even more preferably, the amount of the residual part from a previous propagation cycle and the amount of the Pn portion of the lignocellulosic raw material hydrolyzate used to form the Pn culture medium are selected to have a starting yeast density at Pn propagation cycle that is greater than between 1 x 106 and 1 x 108 yeast cells per milligram of Pn culture medium on a wet basis, where n is an integer greater than 1.

[00083] As porções removidas dos caldos populados, que compreendem levedura propagada nos diferentes ciclos de propagação, podem então ser usadas para fermentar um meio de fermentação que contém açúcares solúveis em água para produzir um produto de fermentação. De preferência, o produto de fermentação é etanol.[00083] The portions removed from the populated broths, which comprise yeast propagated in the different propagation cycles, can then be used to ferment a fermentation medium containing water-soluble sugars to produce a fermentation product. Preferably, the fermentation product is ethanol.

[00084] Em uma modalidade de realização preferida da presente invenção, uma ou mais porções removidas de caldos populados são contatadas com um meio de fermentação que compreende uma porção adicional do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica em um vaso de fermentação. O hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica é usado como uma fonte de carbono para formar o meio de fermentação, de tal maneira que a levedura propagada já esteja adaptada ao meio de fermentação. Xilose remanescente e opcionalmente glicose contida na porção ou porções removidas de caldos populados também são fermentados no processo, para aumentar o rendimento total da fermentação. A fermentação produz um caldo de fermentação, compreendendo o produto da fermentação, que pode ser separado e recuperado.[00084] In a preferred embodiment of the present invention, one or more portions removed from populated broths are contacted with a fermentation medium comprising an additional portion of the lignocellulosic raw material hydrolyzate in a fermentation vessel. The lignocellulosic raw material hydrolyzate is used as a carbon source to form the fermentation medium, such that the propagated yeast is already adapted to the fermentation medium. Remaining xylose and optionally glucose contained in the portion or portions removed from populated broths are also fermented in the process, to increase the total fermentation yield. Fermentation produces a fermentation broth, comprising the fermentation product, which can be separated and recovered.

ExperimentosExperiments Preparação do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósicaPreparation of lignocellulosic raw material hydrolyzate

[00085] Palha de trigo foi selecionada para proporcionar o processo descrito.[00085] Wheat straw was selected to provide the described process.

[00086] Em primeiro lugar, o material de alimentação foi submetido a um processo de pré-tratamento, mediante aplicação de um tratamento hidrotérmico preliminar a uma temperatura de 158°C durante 65 minutos, com uma primeira solubilização da matéria-prima. O processo gerou uma pasta pré-tratada de matéria-prima, que foi separada em uma porção de líquido, compreendendo principalmente xilo-oligômeros, e uma porção de sólido por meio de uma prensa. A porção sólida foi submetida a um tratamento hidrotérmico com vapor a 204°C durante 4 minutos, seguido de explosão por vapor, para produzir uma matéria- prima lignocelulósica pré-tratada sólida.[00086] Firstly, the feed material was subjected to a pre-treatment process, by applying a preliminary hydrothermal treatment at a temperature of 158°C for 65 minutes, with a first solubilization of the raw material. The process generated a pre-treated paste of raw material, which was separated into a liquid portion, comprising mainly xylo-oligomers, and a solid portion using a press. The solid portion was subjected to hydrothermal steam treatment at 204°C for 4 minutes, followed by steam explosion, to produce a solid pretreated lignocellulosic raw material.

[00087] A matéria-prima lignocelulósica pré-tratada sólida e a porção líquida compreendendo xilo-oligômeros foram misturadas em um biorreator, e água foi adicionada para obter uma pasta de matéria-prima lignocelulósica pré-tratada com um teor de matéria seca de 15% em peso, o pH foi ajustado em 5,0 ± 0,2 por adição de NaOH e, em seguida, a pasta de matéria-prima lignocelulósico pré-tratada foi submetida a hidrólise enzimática.[00087] The solid pretreated lignocellulosic raw material and the liquid portion comprising xylo-oligomers were mixed in a bioreactor, and water was added to obtain a slurry of pretreated lignocellulosic raw material with a dry matter content of 15 % by weight, the pH was adjusted to 5.0 ± 0.2 by adding NaOH, and then the pretreated lignocellulosic raw material slurry was subjected to enzymatic hydrolysis.

[00088] Um coquetel enzimático comercial CTec3 da Novozymes, capaz de hidrolisar tanto açúcares C6 quanto açúcares C5, foi adicionado correspondendo a uma dosagem de mg de proteína 7% por grama de glucanos na matéria-prima lignocelulósica pré-tratada e a pasta foi hidrolisada a 50°C sob agitação contínua durante 72 horas.[00088] A commercial enzymatic cocktail CTec3 from Novozymes, capable of hydrolyzing both C6 sugars and C5 sugars, was added corresponding to a dosage of mg of 7% protein per gram of glucans in the pretreated lignocellulosic raw material and the paste was hydrolyzed at 50°C under continuous stirring for 72 hours.

[00089] O hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica resultante era uma pasta, possuindo uma matéria seca de 15% em peso, compreendendo uma fração líquida e uma matéria-prima lignocelulósica pré-tratada residual insolúvel em água. A composição do hidrolisado é apresentada na Tabela 1. Na tabela, a matéria-prima lignocelulósica pré-tratada residual insolúvel em água é separada em seus componentes (glucanos insolúveis, xilanos insolúveis e lignina e outros produtos insolúveis). Ácido acético, ácido fórmico, furfural e hidroximetil furfural são compostos inibidores de propagação de levedura.[00089] The resulting lignocellulosic raw material hydrolyzate was a paste, having a dry matter of 15% by weight, comprising a liquid fraction and a residual pretreated lignocellulosic raw material insoluble in water. The composition of the hydrolyzate is shown in Table 1. In the table, the residual water-insoluble pretreated lignocellulosic raw material is separated into its components (insoluble glucans, insoluble xylans and lignin and other insoluble products). Acetic acid, formic acid, furfural and hydroxymethyl furfural are yeast propagation inhibitory compounds.

[00090] Ácido láctico é produzido por contaminação bacteriana e por isso é considerado como um marcador da presença de bactérias. Desse modo, certa contaminação biológica estava presente no hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica. O hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica foi mantido à temperatura de 50°C até sua utilização nos experimentos de propagação seguintes. Nenhum antibiótico foi introduzido. Tabela 1. Composição da hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica em base úmida. [00090] Lactic acid is produced by bacterial contamination and is therefore considered as a marker of the presence of bacteria. Therefore, certain biological contamination was present in the lignocellulosic raw material hydrolyzate. The lignocellulosic raw material hydrolyzate was kept at a temperature of 50°C until its use in the following propagation experiments. No antibiotics were introduced. Table 1. Composition of lignocellulosic raw material hydrolyzate on a wet basis.

Experimentos de propagaçãoPropagation experiments

[00091] O processo descrito foi comprovado realizando três ciclos de propagação sequenciais, de acordo com um procedimento que pode ser implementado em escala industrial. Nenhuma esterilização foi praticada entre os ciclos.[00091] The described process was proven by carrying out three sequential propagation cycles, according to a procedure that can be implemented on an industrial scale. No sterilization was practiced between cycles.

[00092] As composições, os meios de cultura e os caldos populados são apresentados na tabela 2. Somente compostos solúveis em água relevante para o processo são considerados na tabela. Outros compostos solúveis em água e compostos sólidos não são apresentados.[00092] The compositions, culture media and populated broths are presented in table 2. Only water-soluble compounds relevant to the process are considered in the table. Other water-soluble compounds and solid compounds are not shown.

[00093] No primeiro ciclo de propagação, o primeiro meio de cultura foi formado inserindo um volume de 1,2 l de pasta de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósico quente em um biorreator e completando com solução de ureia sob 1,5 g/l. O pH foi ajustado em 5,2 ± 0,1 por controle com NaOH. Não foram usados vitaminas e outros nutrientes. O meio de cultura foi resfriado até 32°C antes de introduzir a levedura.[00093] In the first propagation cycle, the first culture medium was formed by inserting a volume of 1.2 l of hot lignocellulosic raw material hydrolyzate slurry into a bioreactor and topping up with urea solution at 1.5 g/l . The pH was adjusted to 5.2 ± 0.1 by controlling with NaOH. No vitamins and other nutrients were used. The culture medium was cooled to 32°C before introducing the yeast.

[00094] Propagação em cada ciclo foi realizada sob agitação a 300 rpm sob configuração de batelada, em condições aeróbias de fluxo de ar de 1 VVh. VVh corresponde ao volume de gás que está fluindo por volume de meio de cultura por hora.[00094] Propagation in each cycle was carried out under agitation at 300 rpm under batch configuration, in aerobic conditions with an air flow of 1 VVh. VVh corresponds to the volume of gas that is flowing per volume of culture medium per hour.

[00095] A densidade de células de levedura foi determinada por contagem de células (câmara de contagem de células Neubauer) e a composição do meio de cultura foi analisada por CLAE para determinar a concentração de glicose e xilose residuais e compostos essenciais para a propagação de levedura. Ambas as medições foram realizadas no início e no final de cada ciclo de propagação.[00095] The density of yeast cells was determined by cell counting (Neubauer cell counting chamber) and the composition of the culture medium was analyzed by HPLC to determine the concentration of residual glucose and xylose and compounds essential for the propagation of yeast. Both measurements were performed at the beginning and end of each propagation cycle.

[00096] No primeiro ciclo de propagação, uma levedura comercial geneticamente modificada CelluX™2 distribuída por Leaf Technologies, capaz de fermentar glicose e xilose, foi inserida no meio de cultura sob uma densidade de levedura de partida de 1,3 x 107 células de levedura por miligrama de meio de cultura.[00096] In the first propagation cycle, a genetically modified commercial yeast CelluX™2 distributed by Leaf Technologies, capable of fermenting glucose and xylose, was inserted into the culture medium under a starting yeast density of 1.3 x 107 cells. yeast per milligram of culture medium.

[00097] Primeiro ciclo de propagação foi conduzido durante um tempo de propagação de 14 horas para levar em conta a fase de latência inicial. Uma concentração de células de levedura de 1,5 x 108 células de levedura por miligrama foi obtida no primeiro caldo populado. Desempenhos de crescimento foram avaliados calculando um fator de crescimento, que é a razão entre a concentração de células de levedura no final e no início da propagação. Um fator de crescimento de cerca de 10 foi obtido no primeiro ciclo de propagação.[00097] First propagation cycle was conducted for a propagation time of 14 hours to take into account the initial latency phase. A yeast cell concentration of 1.5 x 108 yeast cells per milligram was obtained in the first populated broth. Growth performances were evaluated by calculating a growth factor, which is the ratio between the concentration of yeast cells at the end and beginning of propagation. A growth factor of about 10 was obtained in the first propagation cycle.

[00098] Cerca de 76% da glicose inicial e menos de 10% da xilose inicial no primeiro meio de propagação de partida foram consumidos. A concentração de ácido láctico não aumentou significativamente, indicando que a propagação de contaminantes bacterianos estava em níveis razoáveis. Uma certa quantidade de etanol também foi produzida.[00098] About 76% of the initial glucose and less than 10% of the initial xylose in the first starting propagation medium were consumed. The lactic acid concentration did not increase significantly, indicating that the spread of bacterial contaminants was at reasonable levels. A certain amount of ethanol was also produced.

[00099] No final do primeiro ciclo de propagação, uma porção do primeiro caldo populado foi removida do biorreator, e uma porção residual de cerca de 240 ml do primeiro caldo populado foi deixada para segundo ciclo de propagação.[00099] At the end of the first propagation cycle, a portion of the first populated broth was removed from the bioreactor, and a residual portion of about 240 ml of the first populated broth was left for the second propagation cycle.

[000100] No segundo ciclo de propagação, o biorreator foi enchido com uma segunda porção do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica, que foi resfriada a cerca de 32°C antes de ser introduzida, e suplementado com ureia. O segundo meio de cultura tinha um volume de 1,2 l, como na primeira realização de propagação. Desse modo, a segunda porção do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica representou cerca de 80% do segundo meio de cultura e a porção residual do primeiro caldo populado representou cerca de 20% do segundo meio de cultura (razão de hidrolisado de fresco para hidrolisado residual de 4:1).[000100] In the second propagation cycle, the bioreactor was filled with a second portion of the lignocellulosic raw material hydrolyzate, which was cooled to about 32°C before being introduced, and supplemented with urea. The second culture medium had a volume of 1.2 l, as in the first propagation run. Thus, the second portion of the lignocellulosic raw material hydrolyzate represented about 80% of the second culture medium and the residual portion of the first populated broth represented about 20% of the second culture medium (ratio of fresh hydrolyzate to residual hydrolyzate of 4:1).

[000101] O teor de glicose do segundo meio de cultura de partida foi ligeiramente menor do que no primeiro meio de cultura, uma vez que a porção residual do primeiro caldo populado foi esgotada por glicose. Além disso, um pouco de etanol estava presente no segundo meio de cultura, ainda que sem um nível problemático para propagação. Desse modo, a segunda propagação ocorreu na presença de uma concentração de etanol de partida no segundo meio de propagação. A concentração de levedura de partida no segundo ciclo de propagação foi de 5,3 x 107. Ácido láctico estava presente em baixa concentração, semelhante ao primeiro meio de cultura.[000101] The glucose content of the second starting culture medium was slightly lower than that in the first culture medium, since the residual portion of the first populated broth was depleted of glucose. Furthermore, some ethanol was present in the second culture medium, although not at a problematic level for propagation. Thus, the second propagation occurred in the presence of a starting ethanol concentration in the second propagation medium. The starting yeast concentration in the second propagation cycle was 5.3 x 107. Lactic acid was present in low concentration, similar to the first culture medium.

[000102] Segunda propagação foi realizada durante 6 horas. Uma concentração de células de levedura de 1,7 x 108 células de levedura por miligrama foi obtida no segundo meio de cultura populada correspondente a um fator de crescimento de cerca de 3,2.[000102] Second propagation was carried out for 6 hours. A yeast cell concentration of 1.7 x 108 yeast cells per milligram was obtained in the second populated culture medium corresponding to a growth factor of about 3.2.

[000103] Cerca de 66% da glicose inicial e menos de 10% da xilose inicial no segundo meio de propagação de partida foram consumidos. Novamente, a concentração de ácido láctico não aumentou significativamente, indicando que a propagação de contaminantes bacterianos estava em níveis razoáveis, e uma certa quantidade de etanol também foi produzida.[000103] About 66% of the initial glucose and less than 10% of the initial xylose in the second starting propagation medium were consumed. Again, the lactic acid concentration did not increase significantly, indicating that the spread of bacterial contaminants was at reasonable levels, and a certain amount of ethanol was also produced.

[000104] Após o ciclo de propagação 2 ser completado, um terceiro ciclo é realizado de acordo com o mesmo procedimento do ciclo de propagação 2 (terceiro tempo de propagação de 6 horas).[000104] After propagation cycle 2 is completed, a third cycle is carried out according to the same procedure as propagation cycle 2 (third propagation time of 6 hours).

[000105] A concentração inicial de células de levedura foi de 4,2 x 107 e concentração de células de levedura de 1,3 x 108 por miligrama foi obtida no terceiro meio de cultura populado correspondente a um fator de crescimento de cerca de 3.[000105] The initial concentration of yeast cells was 4.2 x 107 and a yeast cell concentration of 1.3 x 108 per milligram was obtained in the third populated culture medium corresponding to a growth factor of about 3.

[000106] Cerca de 63% da glicose inicial e menos de 10% da xilose inicial no terceiro meio de propagação terceiro de partida foram consumidos, com pouco ácido láctico produzido. Tabela 2. Composição dos meios de cultura de partida (t0) e dos caldos populados (t14, t6) dos ciclos de propagação. [000106] About 63% of the initial glucose and less than 10% of the initial xylose in the third starting propagation medium were consumed, with little lactic acid produced. Table 2. Composition of the starting culture media (t0) and populated broths (t14, t6) of the propagation cycles.

Experimentos de fermentaçãoFermentation experiments

[000107] As porções removidas dos caldos propagados foram usadas como inóculo para a fermentação de diferentes alíquotas do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica.[000107] The portions removed from the propagated broths were used as inoculum for the fermentation of different aliquots of the lignocellulosic raw material hydrolyzate.

[000108] Em cada etapa de fermentação, uma alíquota de 960 ml de hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica foi introduzida em um vaso de fermentação, resfriada a cerca de 32°C; em seguida, foi adicionado um volume de 240 ml de cada porção removida de um caldo propagado para formar o correspondente meio de fermentação. O pH foi ajustado em 5 ± 0,1 por uma solução de NaOH e suplementado com uma solução de ureia sob 1,0 g/l. Assim, em cada etapa de fermentação, o volume da porção removida correspondente usada como inóculo foi de cerca de 1:5 do volume total do meio de fermentação.[000108] In each fermentation step, an aliquot of 960 ml of lignocellulosic raw material hydrolyzate was introduced into a fermentation vessel, cooled to about 32°C; then, a volume of 240 ml of each portion removed from a propagated broth was added to form the corresponding fermentation medium. The pH was adjusted to 5 ± 0.1 by a NaOH solution and supplemented with a urea solution under 1.0 g/l. Thus, in each fermentation step, the volume of the corresponding removed portion used as inoculum was about 1:5 of the total volume of the fermentation medium.

[000109] A fermentação foi realizada durante 48 horas na ausência de fluxo de ar, em configuração de batelada, mantendo uma temperatura de 32°C sob agitação a 300 rpm. Na fermentação, hidrólise enzimática da matéria-prima lignocelulósica pré-tratada residual insolúvel em água foi continuada pelas enzimas contidas no hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica e alguns açúcares adicionais tornaram-se disponíveis para a levedura.[000109] Fermentation was carried out for 48 hours in the absence of air flow, in batch configuration, maintaining a temperature of 32°C under stirring at 300 rpm. In fermentation, enzymatic hydrolysis of the water-insoluble residual pretreated lignocellulosic feedstock was continued by the enzymes contained in the lignocellulosic feedstock hydrolyzate and some additional sugars became available to the yeast.

[000110] As composições de meios de fermentação e caldos de fermentação foram medidas no início (t0, meio de fermentação) e no final (t48, caldo de fermentação) das etapas de fermentação, e são apresentadas na Tabela 3. Note-se que todos os meios de fermentação continham algum etanol do caldo de propagação correspondente diluído com hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica fresco; a concentração de etanol foi suficientemente baixa de modo a não criar problemas para as etapas de fermentação. Em todas as etapas de fermentação, a contaminação bacteriana foi muito baixa ou negligenciável, como evidenciado pela concentração de ácido láctico que foi estável.[000110] The compositions of fermentation media and fermentation broths were measured at the beginning (t0, fermentation medium) and at the end (t48, fermentation broth) of the fermentation stages, and are presented in Table 3. Note that all fermentation media contained some ethanol from the corresponding propagation broth diluted with fresh lignocellulosic raw material hydrolyzate; the ethanol concentration was low enough so as not to create problems for the fermentation stages. In all fermentation stages, bacterial contamination was very low or negligible, as evidenced by the lactic acid concentration which was stable.

[000111] Quase todos os açúcares monoméricos nos meios de fermentação foram consumidos pela levedura propagada, mostrando que a levedura geneticamente modificada manteve sua capacidade de fermentar tanto glicose quanto xilose ao longo de vários ciclos de propagação/fermentação. Tabela 3. Composição dos meios de fermentação de partida (t0) e dos caldos de fermentação (t48) dos ciclos de propagação. [000111] Almost all of the monomeric sugars in the fermentation media were consumed by the propagated yeast, showing that the genetically modified yeast maintained its ability to ferment both glucose and xylose over several propagation/fermentation cycles. Table 3. Composition of the starting fermentation media (t0) and fermentation broths (t48) of the propagation cycles.

Claims

1. Processo para a propagação de uma levedura capaz de fermentar glicose e xilose de um hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica, o hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica contendo contaminantes biológicos e a densidade de contaminantes biológicos no meio de cultivo Pn inicial está na faixa de 100 CFU/ml a 106 CFU/ml do meio de cultivo Pn inicial, em que n é um número inteiro igual ou superior a 1, caracterizado pelo fato de que compreende: propagar a levedura por pelo menos um primeiro ciclo de propagação e um segundo ciclo de propagação, o primeiro ciclo de propagação (Pn, em que n = 1) compreendendo as etapas de: a) colocar a levedura sob uma densidade inicial de levedura em contato com um primeiro meio de cultura que compreende uma primeira porção do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica, o referido hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica não tendo sido submetido a esterilização; a densidade de levedura inicial no primeiro ciclo de propagação estando entre 1 x 106 e 1 x 108 células de levedura por miligrama do primeiro meio de cultivo em base úmida; b) permitir que a levedura se propague para criar um primeiro caldo populado que compreende água e uma primeira levedura propagada, em que menos de 20% da xilose e pelo menos 50% da glicose no primeiro meio de cultura são consumidos durante o primeiro ciclo de propagação, o segundo ciclo de propagação (P2, n = 2) compreendendo as etapas de: a. separar o primeiro caldo populado em pelo menos uma primeira porção removida e uma primeira porção residual, em que tanto a primeira porção residual quanto a primeira porção removida compreendem alguma levedura da primeira levedura propagada, b. contatar a primeira porção residual com um segundo meio de cultura que compreende uma segunda porção do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica; e c. permitir que a levedura se propague para criar um segundo caldo populado que compreende água e uma segunda levedura propagada, em que menos de 20% da xilose e pelo menos 50% da glicose no segundo meio de cultura são consumidos durante o segundo ciclo de propagação; em que a matéria seca do meio de cultivo Pn é inferior a 30% e superior a um valor percentual de 5%, em que n é um número inteiro igual ou superior a 1; o pH do meio de cultivo Pn é ajustado para um valor de 5,0 a 5,5.1. Process for propagating a yeast capable of fermenting glucose and xylose from a lignocellulosic raw material hydrolyzate, the lignocellulosic raw material hydrolyzate containing biological contaminants and the density of biological contaminants in the initial Pn culture medium is in the range of 100 CFU/ml to 106 CFU/ml of the initial Pn culture medium, where n is an integer equal to or greater than 1, characterized by the fact that it comprises: propagating the yeast for at least a first propagation cycle and a second propagation cycle, the first propagation cycle (Pn, where n = 1) comprising the steps of: a) placing the yeast under an initial density of yeast in contact with a first culture medium comprising a first portion of the yeast hydrolyzate lignocellulosic raw material, said lignocellulosic raw material hydrolyzate having not been subjected to sterilization; the initial yeast density in the first propagation cycle being between 1 x 106 and 1 x 108 yeast cells per milligram of the first wet-based culture medium; b) allowing the yeast to propagate to create a first populated broth comprising water and a first propagated yeast, in which less than 20% of the xylose and at least 50% of the glucose in the first culture medium are consumed during the first cycle of propagation, the second propagation cycle (P2, n = 2) comprising the steps of: a. separating the first populated broth into at least a first removed portion and a first residual portion, wherein both the first residual portion and the first removed portion comprise some yeast from the first propagated yeast, b. contacting the first residual portion with a second culture medium comprising a second portion of the lignocellulosic raw material hydrolyzate; and c. allowing the yeast to propagate to create a second populated broth comprising water and a propagated second yeast, wherein less than 20% of the xylose and at least 50% of the glucose in the second culture medium are consumed during the second propagation cycle; wherein the dry matter of the cultivation medium Pn is less than 30% and greater than a percentage value of 5%, where n is an integer equal to or greater than 1; the pH of the Pn culture medium is adjusted to a value of 5.0 to 5.5.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente ciclos de propagação Pn subsequentes, em que n é um número inteiro maior que 2 e é um (1) maior do que o número de ciclos de um ciclo imediatamente anterior (n- 1), cada ciclo de propagação Pn compreendendo as etapas de: a. separar o caldo populado Pn-1 em pelo menos uma porção removida Pn-1 e uma porção residual Pn-1, em que tanto a porção residual Pn-1 quanto a porção removida Pn-1 compreendem alguma levedura da levedura propagada Pn-1, b. contatar a porção residual do caldo populado de pelo menos um dos ciclos de propagação anteriores e um meio de cultura Pn que compreende uma porção Pn do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica, e c. permitir que a levedura se propague para criar um caldo populado Pn, em que menos de 20% de xilose e pelo menos 50% de glicose no meio de cultura Pn são consumidos no ciclo de propagação Pn.2. Process according to claim 1, characterized by the fact that it additionally comprises subsequent Pn propagation cycles, wherein n is an integer greater than 2 and is one (1) greater than the number of cycles of a cycle immediately preceding (n- 1), each propagation cycle Pn comprising the steps of: a. separating the stock populated Pn-1 into at least a removed portion Pn-1 and a residual portion Pn-1, wherein both the residual portion Pn-1 and the removed portion Pn-1 comprise some yeast from the propagated yeast Pn-1, B. contacting the residual portion of the broth populated from at least one of the previous propagation cycles and a Pn culture medium comprising a Pn portion of the lignocellulosic feedstock hydrolyzate, and c. allow yeast to propagate to create a Pn-populated broth, in which less than 20% xylose and at least 50% glucose in the Pn culture medium are consumed in the Pn propagation cycle.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a etapa de permitir que a levedura se propague nos ciclos de propagação Pn é conduzida em modo descontínuo, em que n é um número inteiro igual ou superior a 1, e igual ou inferior a 2.3. Process according to claim 1 or 2, characterized by the fact that the step of allowing the yeast to propagate in Pn propagation cycles is conducted in batch mode, where n is an integer equal to or greater than 1 , and equal to or less than 2.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a etapa de permitir que a levedura se propague nos ciclos de propagação Pn é conduzida em modo de batelada, em que n é um número inteiro maior que 2.4. Process according to claim 1 or 2, characterized by the fact that the step of allowing the yeast to propagate in Pn propagation cycles is conducted in batch mode, where n is an integer greater than 2.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a quantidade de porção removida Pn-1 e a quantidade da porção Pn do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica são selecionadas de modo a ter uma densidade de levedura de partida no ciclo de propagação Pn entre 1 x 106 e 1 x 108 células de levedura por miligrama do meio de cultura Pn em base úmida, em que n é um número inteiro maior do que 1.5. Process according to any one of claims 1 to 4, characterized by the fact that the amount of removed portion Pn-1 and the amount of portion Pn of the lignocellulosic raw material hydrolyzate are selected so as to have a density of starter yeast in the Pn propagation cycle between 1 x 106 and 1 x 108 yeast cells per milligram of Pn culture medium on a wet basis, where n is an integer greater than 1.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a densidade de levedura de partida no ciclo de propagação Pn, em que n é um número inteiro maior do que 1, é maior do que a densidade de levedura de partida no primeiro ciclo de propagação.6. Process according to claim 5, characterized by the fact that the starting yeast density in the propagation cycle Pn, where n is an integer greater than 1, is greater than the starting yeast density in the first propagation cycle.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a densidade de levedura final no ciclo de propagação Pn situa-se na faixa de 1 x 107 a 1 x 109 células de levedura por miligrama do caldo populado Pn em base úmida, em que n é um número inteiro igual ou superior a 1.7. Process according to any one of claims 1 to 6, characterized by the fact that the final yeast density in the Pn propagation cycle is in the range of 1 x 107 to 1 x 109 yeast cells per milligram of broth populated Pn on a wet basis, where n is an integer equal to or greater than 1.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o tempo de propagação do primeiro ciclo de propagação é inferior a um valor de 30 horas.8. Process according to any one of claims 1 to 7, characterized by the fact that the propagation time of the first propagation cycle is less than a value of 30 hours.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o tempo de propagação do ciclo de propagação Pn é inferior a um valor percentual de 70% do primeiro tempo de propagação, em que n é um número inteiro maior do que 1.9. Process according to claim 8, characterized by the fact that the propagation time of the propagation cycle Pn is less than a percentage value of 70% of the first propagation time, where n is an integer greater than 1.

10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura compreende adicionalmente uma fonte de nitrogênio.10. Process according to any one of claims 1 to 9, characterized in that the culture medium additionally comprises a source of nitrogen.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que nenhuma vitamina e/ou oligoelementos são adicionados ao processo.11. Process according to claim 10, characterized by the fact that no vitamins and/or trace elements are added to the process.

12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica não é submetido a qualquer esterilização.12. Process according to any one of claims 1 to 11, characterized by the fact that the lignocellulosic raw material hydrolyzate is not subjected to any sterilization.

13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que nenhum agente antibacteriano é adicionado ao processo.13. Process according to any one of claims 1 to 12, characterized in that no antibacterial agent is added to the process.

14. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica é uma pasta que compreende matéria- prima lignocelulósica pré-tratada insolúvel em água.14. Process according to any one of claims 1 to 13, characterized by the fact that the lignocellulosic raw material hydrolyzate is a paste comprising pretreated lignocellulosic raw material insoluble in water.

15. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que todos os ciclos de propagação são conduzidos em um único vaso de propagação.15. Process according to any one of claims 1 to 14, characterized by the fact that all propagation cycles are conducted in a single propagation vessel.

16. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o vaso de propagação não é submetido a qualquer esterilização e/ou limpeza entre e/ou durante os ciclos de propagação.16. Process, according to any one of claims 1 to 15, characterized by the fact that the propagation vessel is not subjected to any sterilization and/or cleaning between and/or during propagation cycles.

17. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a. introduzir uma ou mais porções removidas Pn e um meio de fermentação que compreende uma porção adicional do hidrolisado de matéria-prima lignocelulósica em pelo menos um vaso de fermentação; b. permitir que a levedura fermente glicose e xilose para criar um caldo de fermentação que compreende um produto de fermentação, em que n é um número inteiro igual ou superior a 1.17. Process, according to any one of claims 1 to 16, characterized by the fact that it comprises the steps of: a. introducing one or more removed portions Pn and a fermentation medium comprising an additional portion of the lignocellulosic raw material hydrolyzate into at least one fermentation vessel; B. allow yeast to ferment glucose and xylose to create a fermentation broth comprising a fermentation product, where n is an integer equal to or greater than 1.