BR112017025727B1 - PROPAGATION OF YEASTS SIMULTANEOUSLY WITH SACCHARIFICATION - Google Patents

Abstract

A presente invenção se refere a um método de propagação de leveduras para uso na produção de um produto da fermentação a partir de biomassa lignocelulósica, incluindo as etapas de: a. dispor de um reator, b. colocar em contato no dito reator: uma população de leveduras capaz de metabolizar pentoses e hexoses, a uma razão de 0,2 a 2,0 g de matéria seca de leveduras por Kg de meio completo preparado, a massa bruta oriunda do pré-tratamento da biomassa lignocelulósica, à razão de um teor de matéria seca (MS) entre 8 e 15% de nutrientes e as celulases, à razão de 5 a 15 mg de proteína por grama de Mz; c. incubar a mistura a uma temperatura compreendida entre 25 e 38 ° C, preferencialmente, entre 28 e 33 °C, em microaerobiose, em que a sacarificação da massa bruta e o crescimento das leveduras são realizados simultaneamente.The present invention relates to a yeast propagation method for use in the production of a fermentation product from lignocellulosic biomass, including the steps of: a. have a reactor, b. put in contact in said reactor: a population of yeasts capable of metabolizing pentoses and hexoses, at a rate of 0.2 to 2.0 g of yeast dry matter per kg of prepared complete medium, the gross mass originating from pre-treatment lignocellulosic biomass, at a rate of dry matter (DM) between 8 and 15% of nutrients and cellulases, at a rate of 5 to 15 mg of protein per gram of Mz; w. incubate the mixture at a temperature between 25 and 38 °C, preferably between 28 and 33 °C, in microaerobiosis, in which saccharification of the raw dough and yeast growth are carried out simultaneously.

Description

[0001] A presente invenção refere-se ao domínio das leveduras usadas para fabricar biocombustíveis e outros compostos da química verde, produzidos por um processo de fermentação.[0001] The present invention relates to the field of yeast used to manufacture biofuels and other green chemistry compounds, produced by a fermentation process.

[0002] A diminuição dos estoques de combustíveis fósseis levou a indústria a buscar soluções alternativas, tanto quanto possível, a partir de matérias-primas renováveis e processos menos poluentes. Essas soluções incluem a produção de bioetanol a partir de biomassa vegetal, biomassa de resíduos vegetais ou até mesmo de resíduos urbanos. Para serem aceitas, as versões ecológicas dos compostos químicos devem ser tão ou mais eficazes do que as versões existentes, e seus processos de fabricação devem ser economicamente competitivos.[0002] The decrease in fossil fuel stocks has led the industry to seek alternative solutions, as far as possible, from renewable raw materials and less polluting processes. These solutions include the production of bioethanol from plant biomass, plant waste biomass or even urban waste. To be accepted, environmentally friendly versions of chemical compounds must be as effective or more effective than existing versions, and their manufacturing processes must be economically competitive.

[0003] As aplicações são numerosas: combustíveis de primeira geração, biodiesel ou etanol, derivados de matéria- prima vegetal, como cana-de-açúcar, beterraba, trigo, milho ou óleo vegetal, combustíveis de segunda geração, biodiesel, bioquerosene, etanol celulósico, derivados de biomassa vegetal não alimentar ou de resíduos de cultura e outros produtos químicos pesados ou produtos químicos finos.[0003] The applications are numerous: first generation fuels, biodiesel or ethanol, derived from vegetable raw materials, such as sugar cane, beet, wheat, corn or vegetable oil, second generation fuels, biodiesel, biokerosene, ethanol cellulosic, derivatives of non-food plant biomass or crop residues and other heavy chemicals or fine chemicals.

[0004] A matéria-prima deve ser pré-tratada. De acordo com sua origem, o pré-tratamento é mecânico (ralação, esmagamento, trituração, moagem, pressão), térmico ou químico. A matéria bruta obtida é sujeita a uma extração e/ou a uma hidrólise enzimática. Isto produz um substrato fermentável, ao qual é adicionado o microrganismo fermentador. Por fim, o produto da fermentação pode ser usado para extrair os produtos de interesse, por exemplo, por destilação ou extração com solvente. As diferentes etapas neste processo constituem os bloqueios tecnológicos e têm sido amplamente estudadas: pré-tratamento de biomassa para torná-la acessível às enzimas, definição de misturas enzimáticas para uma hidrólise eficaz dos polímeros de carboidratos ou ainda para a fermentação alcoólica de vários açúcares obtidos (pentoses, hexoses).[0004] The raw material must be pre-treated. According to its origin, pre-treatment is mechanical (grating, crushing, crushing, grinding, pressure), thermal or chemical. The raw material obtained is subjected to extraction and/or enzymatic hydrolysis. This produces a fermentable substrate, to which the fermenting microorganism is added. Finally, the fermentation product can be used to extract the products of interest, for example, by distillation or solvent extraction. The different stages in this process constitute the technological roadblocks and have been widely studied: pre-treatment of biomass to make it accessible to enzymes, definition of enzymatic mixtures for effective hydrolysis of carbohydrate polymers or even for the alcoholic fermentation of various sugars obtained (pentoses, hexoses).

[0005] A etapa de propagação alcoólica da levedura, objeto da presente invenção, é pouco descrita. Como tal, a presente invenção refere-se a um processo de propagação de leveduras que compreende as etapas consistindo em: a) dispor de um reator, b) colocar em contato no dito reator: - uma população de leveduras capaz de metabolizar pentoses e hexoses, a uma razão de 0,2 a 2,0 g de matéria seca de leveduras por Kg de meio completo preparado, - sendo a massa bruta pré-tratada composta por fibras orgânicas, preferencialmente a partir de biomassa vegetal, a uma razão de um teor de matéria seca (MS) compreendida entre 8 e 15%, de preferência compreendida entre 10 e 12%, e ainda mais preferencialmente, a 10%. - nutrientes, - uma fonte de nitrogênio, como extratos de levedura, ureia, amônia, - celulases, à razão de 5 a 15 mg de proteínas enzimáticas por grama de MS, c) incubar a mistura a uma temperatura compreendida entre 25 e 38 °C, preferencialmente, entre 28 e 33 °C, em microaerobiose, em que a sacarificação da massa bruta e o crescimento das leveduras são realizados simultaneamente.[0005] The alcoholic yeast propagation step, object of the present invention, is poorly described. As such, the present invention refers to a yeast propagation process that comprises the steps consisting of: a) having a reactor, b) bringing into contact with said reactor: - a population of yeast capable of metabolizing pentoses and hexoses , at a rate of 0.2 to 2.0 g of yeast dry matter per kg of prepared complete medium, - with the pre-treated raw mass being composed of organic fibers, preferably from plant biomass, at a rate of one dry matter (DM) content comprised between 8 and 15%, preferably comprised between 10 and 12%, and even more preferably, 10%. - nutrients, - a source of nitrogen, such as yeast extracts, urea, ammonia, - cellulases, at a rate of 5 to 15 mg of enzymatic proteins per gram of DM, c) incubate the mixture at a temperature between 25 and 38 ° C, preferably between 28 and 33 °C, in microaerobiosis, in which the saccharification of the raw dough and the growth of yeast are carried out simultaneously.

Breve descrição das figuras:Brief description of the figures:

[0006] A figura 1 mostra um processo de produção de bioetanol que compreende o pré-tratamento e as fases de propagação da levedura e da fermentação alcoólica, detalhando os diferentes substratos suscetíveis a serem gerados pelo processo, que são utilizáveis para as etapas de propagação de levedura e produção de etanol.[0006] Figure 1 shows a bioethanol production process that comprises pre-treatment and the yeast propagation and alcoholic fermentation phases, detailing the different substrates likely to be generated by the process, which are usable for the propagation steps yeast and ethanol production.

[0007] A composição em açúcares dos cinco substratos é a seguinte: (1) celulose (polímero de glicose) e hemicelulose solubilizada (monômeros e oligômeros de hexoses e pentose). Substrato sólido. (2) celulose e hemicelulose hidrolisadas (monômeros e oligômeros de hexoses e pentoses). Substrato líquido contendo sólidos em suspensão. (3) celulose (polímero de glicose). Substrato sólido. (4) Hemicelulose solubilizada (monômeros e oligômeros de hexoses e pentoses). Substrato líquido. (5) celulose hidrolisada (glicose). Substrato líquido contendo sólidos em suspensão.[0007] The sugar composition of the five substrates is as follows: (1) cellulose (glucose polymer) and solubilized hemicellulose (monomers and oligomers of hexoses and pentose). Solid substrate. (2) hydrolyzed cellulose and hemicellulose (monomers and oligomers of hexoses and pentoses). Liquid substrate containing suspended solids. (3) cellulose (glucose polymer). Solid substrate. (4) Solubilized hemicellulose (monomers and oligomers of hexoses and pentoses). Liquid substrate. (5) hydrolyzed cellulose (glucose). Liquid substrate containing suspended solids.

[0008] A figura 2 ilustra a evolução das concentrações de levedura (em células/mL) de substratos (açúcares C5 e C6) e de etanol (em g/kg) durante a propagação no hidrolisado lignocelulósico (ou SHF para hidrólise e fermentação separadas).[0008] Figure 2 illustrates the evolution of yeast concentrations (in cells/mL) of substrates (C5 and C6 sugars) and ethanol (in g/kg) during propagation in lignocellulosic hydrolyzate (or SHF for separate hydrolysis and fermentation ).

[0009] A figura 3 ilustra a evolução das concentrações de levedura (em células/mL), de substratos (açúcares C5 e C6) e de etanol (em g/kg) durante a propagação no suco de C5.[0009] Figure 3 illustrates the evolution of yeast concentrations (in cells/mL), substrates (C5 and C6 sugars) and ethanol (in g/kg) during propagation in C5 juice.

[0010] A figura 4 ilustra a evolução das concentrações de levedura (em células/mL), de substratos (açúcares de C5 e C6) e de etanol (em g/kg) durante a propagação SSP (propagação e sacarificação simultâneas) de acordo com a invenção, a 10% de MS e 10 mg de proteínas enzimáticas por g de MS.[0010] Figure 4 illustrates the evolution of yeast concentrations (in cells/mL), substrates (C5 and C6 sugars) and ethanol (in g/kg) during SSP propagation (simultaneous propagation and saccharification) according to with the invention, 10% DM and 10 mg of enzymatic proteins per g of DM.

[0011] A figura 5 ilustra a evolução das concentrações de levedura (em células/mL), de substratos (açúcares de C5 e C6) e de etanol (em g/kg) durante a propagação SSP de acordo com a invenção, a 12% de MS e 10 mg de proteínas enzimáticas por g de MS.[0011] Figure 5 illustrates the evolution of yeast concentrations (in cells/mL), substrates (C5 and C6 sugars) and ethanol (in g/kg) during SSP propagation according to the invention, at 12 % DM and 10 mg of enzymatic proteins per g of DM.

[0012] A figura 6 ilustra a evolução das concentrações de levedura (em células/mL), de substratos (açúcares de C5 e C6) e de etanol (em g/kg) durante a propagação SSP de acordo com a invenção, a 10% de MS e 7 mg de proteínas enzimáticas por g de MS.[0012] Figure 6 illustrates the evolution of yeast concentrations (in cells/mL), substrates (C5 and C6 sugars) and ethanol (in g/kg) during SSP propagation according to the invention, at 10 % DM and 7 mg of enzymatic proteins per g of DM.

[0013] A figura 7 ilustra a evolução das concentrações de levedura (em células/mL), de substratos (açúcares C5 e C6) e de etanol (em g/kg) durante a propagação SPP de acordo com a invenção, a 32 °C.[0013] Figure 7 illustrates the evolution of yeast concentrations (in cells/mL), substrates (C5 and C6 sugars) and ethanol (in g/kg) during SPP propagation according to the invention, at 32 ° W.

[0014] A figura 8 compara a evolução das concentrações de levedura (em células/mL), de substratos (açúcares C5 e C6) e de etanol (em g/kg) durante a propagação SPP de acordo com a invenção, a 30 e a 32 °C.[0014] Figure 8 compares the evolution of yeast concentrations (in cells/mL), substrates (C5 and C6 sugars) and ethanol (in g/kg) during SPP propagation according to the invention, at 30 and at 32°C.

[0015] A figura 9 ilustra a evolução das concentrações de levedura (em células/mL), de substratos (açúcares de C5 e C6) e de etanol (em g/kg) durante a propagação SSP de acordo com a invenção, a 10% de MS e 7 mg de proteínas enzimáticas por g de MS, com e sem a adição de acetato.[0015] Figure 9 illustrates the evolution of yeast concentrations (in cells/mL), substrates (C5 and C6 sugars) and ethanol (in g/kg) during SSP propagation according to the invention, at 10 % DM and 7 mg of enzymatic proteins per g of DM, with and without the addition of acetate.

[0016] A figura 10 ilustra a evolução das concentrações de levedura (em células/mL), de substratos (açúcares de C5 e C6) e de etanol (em g/kg) durante a propagação SSP de acordo com a invenção, a 10% de MS e 10 mg de proteínas enzimáticas por g de MS, com e sem a adição de acetato.[0016] Figure 10 illustrates the evolution of yeast concentrations (in cells/mL), substrates (C5 and C6 sugars) and ethanol (in g/kg) during SSP propagation according to the invention, at 10 % DM and 10 mg of enzymatic proteins per g of DM, with and without the addition of acetate.

[0017] A figura 11 compara a evolução das concentrações de leveduras (em células/mL) durante a propagação no hidrolisado lignocelulósico (SHF) e a propagação SSP a 10% de MS e 7 mg de proteínas enzimáticas/g de MS com e sem a adição de acetato.[0017] Figure 11 compares the evolution of yeast concentrations (in cells/mL) during propagation in lignocellulosic hydrolyzate (SHF) and SSP propagation at 10% MS and 7 mg of enzymatic proteins/g of MS with and without the addition of acetate.

[0018] A figura 12 compara a evolução das concentrações de leveduras (em células/mL) durante a propagação no suco de C5 e a propagação SSP a 10% de MS e 7 mg de proteínas enzimáticas/g de MS com e sem a adição de acetato.[0018] Figure 12 compares the evolution of yeast concentrations (in cells/mL) during propagation in C5 juice and SSP propagation at 10% DM and 7 mg of enzymatic proteins/g of DM with and without the addition of acetate.

[0019] A figura 13 ilustra as concentrações de açúcares (C5 e C6) e de etanol (em g/kg), durante a fermentação SSCF em pão de trigo com adição de acetato (qsp 4 g/kg) semeado com a levedura I-4783 propagada em SSP.[0019] Figure 13 illustrates the concentrations of sugars (C5 and C6) and ethanol (in g/kg), during SSCF fermentation in wheat bread with the addition of acetate (qsp 4 g/kg) seeded with yeast I -4783 propagated in SSP.

[0020] De acordo com a figura 1, a biomassa vegetal pré-tratada poderia ser usada como um substrato na propagação da levedura e/ou na fermentação alcoólica, em cinco formas diferentes:[0020] According to figure 1, pre-treated plant biomass could be used as a substrate in yeast propagation and/or alcoholic fermentation, in five different ways:

[0021] A solução mais comum é realizar uma hidrólise da massa completa na presença de celulases para obter um hidrolisado lignocelulósico líquido (2) compreendendo uma mistura de hexoses (C6) e pentoses (C5), bem como os oligômeros em baixa quantidade.[0021] The most common solution is to carry out a hydrolysis of the complete mass in the presence of cellulases to obtain a liquid lignocellulosic hydrolyzate (2) comprising a mixture of hexoses (C6) and pentoses (C5), as well as oligomers in low quantities.

[0022] Outro substrato comum é o hidrolisado hemicelulósico, também chamado de “suco de C5” (4), que corresponde à fração solúvel do substrato no término do pré- tratamento. Essa extração do hidrolisado hemicelulósico (4) no término do pré-tratamento resulta em um bagaço celulósico rico em celulose (3) que pode ser hidrolisado graças às celulases que, da mesma forma como com o bagaço completo. Neste caso, o hidrolisado celulósico obtido contém principalmente monômeros de glicose (5).[0022] Another common substrate is hemicellulosic hydrolyzate, also called “C5 juice” (4), which corresponds to the soluble fraction of the substrate at the end of pre-treatment. This extraction of the hemicellulosic hydrolyzate (4) at the end of the pre-treatment results in a cellulosic bagasse rich in cellulose (3) which can be hydrolyzed thanks to cellulases, in the same way as with the complete bagasse. In this case, the cellulosic hydrolyzate obtained mainly contains glucose monomers (5).

[0023] Esse bagaço celulósico rico em celulose (3), que está sob a forma sólida, também pode ser usado sem hidrólise prévia. Neste caso, as celulases são adicionadas na fermentação e a hidrólise da celulose e o consumo de glicose são efetuados simultaneamente.[0023] This cellulosic bagasse rich in cellulose (3), which is in solid form, can also be used without prior hydrolysis. In this case, cellulases are added during fermentation and cellulose hydrolysis and glucose consumption are carried out simultaneously.

[0024] Por fim, a integração do processo mais avançado consiste no uso do bagaço pré-tratado bruto (1) como substrato da fermentação sem a etapa intermediária da hidrólise ou a etapa de separação. Neste caso, as celulases são adicionadas na fermentação e a hidrólise da celulose é realizada simultaneamente ao consumo da xilose e das hexoses. Esta última opção para a etapa de fermentação alcoólica é conhecida como sacarificação e a cofermentação simultânea da xilose e hexoses simultânea (sacarificação e cofermentação simultânea ou SSCF).[0024] Finally, the integration of the most advanced process consists of using raw pre-treated bagasse (1) as a fermentation substrate without the intermediate hydrolysis step or the separation step. In this case, cellulases are added during fermentation and cellulose hydrolysis is carried out simultaneously with the consumption of xylose and hexoses. This last option for the alcoholic fermentation step is known as saccharification and the simultaneous co-fermentation of xylose and hexoses (simultaneous saccharification and co-fermentation or SSCF).

[0025] A propagação das leveduras que serão usadas para a etapa de fermentação cai sobre questões problemáticas, especialmente em termos de transferência de oxigênio.[0025] The propagation of the yeasts that will be used for the fermentation step faces problematic issues, especially in terms of oxygen transfer.

[0026] Ela é tradicionalmente realizada no suco de C5 (4). Dessa forma, o pedido de patente US2014/0065700 menciona uma propagação realizada no suco de C5, e o pedido WO2009/155633 indica como essencial a etapa prévia da hidrólise da celulose. A propagação é pouco abordada na literatura científica, e a propagação em simultâneo com a hidrólise nunca foi descrita. O substrato utilizado é a fração solúvel ao término do pré-tratamento (ou suco de C5), sendo um hidrolisado lignocelulósico obtido pela hidrólise prévia da totalidade do vegetal pré-processado. Após a propagação, as leveduras são usadas também para a fermentação (com (SSF) ou sem sacarificação), para produzir proteínas de interesse Duarte et al., 2008; Applied Biochem Biotechnol, 148: 1 19-29; Meyer et al., 1992; Biotechnol Bioeng, 40 (3): 353-8; Holder et al., 1989; Biological Wastes, 28 (4): 23946; Gonzalez-Valdes & Moo-Young, 1981; Biotechnology Letters, 3 (3): 143-8). Bellissimi & Richards (Bellissimi E, Richards C: Yeast propagation. Dans The alcohol textbook, a référence for the beverage, fuel and industrial alcohol industries, 5a edição, editado por Ingledew WM, Kelsall DR, Austin GD, Kluhspies C. Nottingham: University Press; 2009: 145-159) indicam que o método de produção de leveduras industriais é uma propagação aeróbia, na qual não há nenhuma produção de álcool e uma taxa máxima de células é atingida. Com efeito, para a levedura, a capacidade de crescimento por um longo período e em condições estritamente anaeróbias é limitada.[0026] It is traditionally performed in C5 juice (4). Thus, patent application US2014/0065700 mentions a propagation carried out in C5 juice, and application WO2009/155633 indicates the prior stage of cellulose hydrolysis as essential. Propagation is little discussed in the scientific literature, and propagation simultaneously with hydrolysis has never been described. The substrate used is the soluble fraction at the end of pre-treatment (or C5 juice), being a lignocellulosic hydrolyzate obtained by prior hydrolysis of the entire pre-processed vegetable. After propagation, the yeasts are also used for fermentation (with (SSF) or without saccharification), to produce proteins of interest Duarte et al., 2008; Applied Biochem Biotechnol, 148:119-29; Meyer et al., 1992; Biotechnol Bioeng, 40 (3): 353-8; Holder et al., 1989; Biological Wastes, 28 (4): 23946; Gonzalez-Valdes & Moo-Young, 1981; Biotechnology Letters, 3 (3): 143-8). Bellissimi & Richards (Bellissimi E, Richards C: Yeast propagation. Dans The alcohol textbook, a reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries, 5th edition, edited by Ingledew WM, Kelsall DR, Austin GD, Kluhspies C. Nottingham: University Press; 2009: 145-159) indicate that the industrial yeast production method is aerobic propagation, in which there is no alcohol production and a maximum cell rate is reached. Indeed, for yeast, the ability to grow for a long period and under strictly anaerobic conditions is limited.

[0027] Uma das desvantagens do bagaço pré-tratado bruto antes da liquefação ou hidrólise é a sua viscosidade. Por essa razão, presume-se que a liquefação/solubilização ou a hidrólise é uma etapa essencial. Nenhum documento descreve ou sugere um procedimento de sacarificação e propagação simultâneas.[0027] One of the disadvantages of raw pretreated bagasse before liquefaction or hydrolysis is its viscosity. For this reason, it is assumed that liquefaction/solubilization or hydrolysis is an essential step. No documents describe or suggest a procedure for simultaneous saccharification and propagation.

[0028] O pedido de patente WO2011/56991 A1 descreve um procedimento de sacarificação e fermentação simultâneas, com possivelmente uma propagação arejada, em paralelo, no meio liquefeito rico em hexoses que será utilizado na fermentação. O pedido de patente WO 2010/014817 A2 descreve um procedimento para melhorar a qualidade e/ou a quantidade do organismo fermentador (levedura) durante a fase de fermentação. O pedido de patente WO2014/72232 A1 descreve um processo de propagação aeróbia em um hidrolisado lignocelulósico (usado como fonte de carbono), no qual o hidrolisado é adicionado em batelada a fim de obter e manter um pH determinado no reator. O pedido de patente US2014/0273167 A1 descreve um processo aeróbio de propagação das leveduras, sob agitação e aeração em um substrato rico em hexoses, resultantes da hidrólise. O pedido de patente US2014/0273166 A1 descreve um processo para a propagação de leveduras em um substrato a partir da transformação da biomassa vegetal, um substrato preferencialmente rico em pentoses. AS leveduras sujeitas à propagação, neste caso, são as leveduras transformadas que podem metabolizar as pentoses.[0028] Patent application WO2011/56991 A1 describes a simultaneous saccharification and fermentation procedure, with possibly aerated propagation, in parallel, in the liquefied medium rich in hexoses that will be used in fermentation. Patent application WO 2010/014817 A2 describes a procedure for improving the quality and/or quantity of the fermenting organism (yeast) during the fermentation phase. Patent application WO2014/72232 A1 describes an aerobic propagation process in a lignocellulosic hydrolyzate (used as a carbon source), in which the hydrolyzate is added in batches in order to obtain and maintain a determined pH in the reactor. Patent application US2014/0273167 A1 describes an aerobic process for propagating yeast, under agitation and aeration on a substrate rich in hexoses, resulting from hydrolysis. Patent application US2014/0273166 A1 describes a process for propagating yeast on a substrate from the transformation of plant biomass, a substrate preferably rich in pentoses. The yeasts subject to propagation, in this case, are the transformed yeasts that can metabolize pentoses.

[0029] O processo de propagação no suco de C5 requer uma etapa complexa de extração da fração líquida do bagaço pré-tratado. O processo de propagação no hidrolisado rico em C6 (ou composto por uma mistura de C5-C6) também requer uma etapa de hidrólise específica. Essa etapa é cara e demorada. Assim, continua-se a desejar uma melhoria no processo para uma versão mais integrada, mantendo o desempenho satisfatório em termos de taxa de rendimento, produtividade e taxa de multiplicação.[0029] The propagation process in C5 juice requires a complex step of extracting the liquid fraction from the pre-treated pomace. The propagation process in the hydrolyzate rich in C6 (or composed of a mixture of C5-C6) also requires a specific hydrolysis step. This step is expensive and time-consuming. Therefore, we continue to desire an improvement in the process towards a more integrated version, maintaining satisfactory performance in terms of yield rate, productivity and multiplication rate.

[0030] A presente invenção propõe um processo de sacarificação e de propagação simultâneas. Em relação à técnica anterior em relação ao caráter essencial de uma etapa de hidrólise ou de extração prévia à obtenção de um substrato capaz de propagar as leveduras, a requerente propõe um processo que utiliza o bagaço bruto pré-tratado como substrato da propagação das leveduras, sem etapas prévias de hidrólise ou separação. O dito procedimento combina a sacarificação do bagaço bruto pelas celulases e o desenvolvimento das leveduras a partir do(s) açúcares C5 disponíveis e/ou dos açúcares C6 liberados por hidrólise enzimática.[0030] The present invention proposes a simultaneous saccharification and propagation process. In relation to the prior art in relation to the essential nature of a hydrolysis or extraction step prior to obtaining a substrate capable of propagating yeast, the applicant proposes a process that uses pre-treated raw bagasse as a substrate for yeast propagation, without prior hydrolysis or separation steps. This procedure combines the saccharification of raw bagasse by cellulases and the development of yeasts from the available C5 sugars and/or the C6 sugars released by enzymatic hydrolysis.

[0031] O processo de sacarificação e propagação simultâneas de acordo com a invenção será doravante abreviado como SSP (de acordo com seu nome em inglês Simultaneous Saccharification and Propagation).[0031] The process of simultaneous saccharification and propagation according to the invention will hereinafter be abbreviated as SSP (in accordance with its English name Simultaneous Saccharification and Propagation).

[0032] Uma vantagem da propagação de acordo com a invenção é a redução do tempo e do custo graças à integração do processo, pela remoção de uma etapa.[0032] An advantage of propagation according to the invention is the reduction of time and cost thanks to the integration of the process, by removing a step.

[0033] Outra vantagem da invenção é a limitação dos açúcares fermentáveis devido à hidrólise enzimática realizada simultaneamente, que permite alcançar um rendimento de produção de biomassa elevado sem impor um protocolo de alimentação em batelada (também chamado fermentação descontinuada alimentada).[0033] Another advantage of the invention is the limitation of fermentable sugars due to the enzymatic hydrolysis carried out simultaneously, which allows a high biomass production yield to be achieved without imposing a batch feeding protocol (also called fed-batch fermentation).

[0034] Outra vantagem da invenção é que os níveis de glicose continuamente baixos promovem consumo da xilose, normalmente inibido na presença de glicose.[0034] Another advantage of the invention is that continuously low glucose levels promote xylose consumption, normally inhibited in the presence of glucose.

[0035] Outra vantagem da invenção é que o elevado teor final de biomassa (da ordem de 17,4 g/Kg) permite limitar o tamanho da unidade de propagação de levedura, bem como a diluição do mosto de fermentação devido à semeadura que representa apenas 3% do volume de fermentação SSCF.[0035] Another advantage of the invention is that the high final biomass content (in the order of 17.4 g/kg) allows limiting the size of the yeast propagation unit, as well as the dilution of the fermentation wort due to the sowing that represents only 3% of the SSCF fermentation volume.

[0036] Outra vantagem da invenção é o impacto dos inibidores presentes no bagaço pré-tratado sobre o desempenho do crescimento é significativamente reduzido.[0036] Another advantage of the invention is the impact of the inhibitors present in pre-treated bagasse on growth performance is significantly reduced.

[0037] Por fim, outra vantagem da invenção é que o consumo de glicose conforme ela é liberada pela hidrólise enzimática reduz o risco de contaminação.[0037] Finally, another advantage of the invention is that the consumption of glucose as it is released by enzymatic hydrolysis reduces the risk of contamination.

Descrição detalhada da invençãoDetailed description of the invention

[0038] O processo de sacarificação e propagação simultâneas, de acordo com a invenção, é aplicado a uma biomassa pré-tratada. A dita biomassa é um material lignocelulósico, isto é, um material que contém lignocelulose. O material lignocelulósico pode conter outros constituintes como o material celulósico (celulose, hemicelulose), bem como açúcares fermentáveis ou não, e pectinas. Em geral, o material lignocelulósico é derivado de material vegetal: caules, folhas, cascas, envoltórios de plantas, folhas, galhos ou madeira de árvores. O material lignocelulósico também pode ser derivado de material herbáceo, resíduos da agricultura, resíduos florestais, resíduos sólidos urbanos ou efluente de fábricas de papel.[0038] The process of simultaneous saccharification and propagation, according to the invention, is applied to a pre-treated biomass. Said biomass is a lignocellulosic material, that is, a material that contains lignocellulose. Lignocellulosic material may contain other constituents such as cellulosic material (cellulose, hemicellulose), as well as fermentable or non-fermentable sugars, and pectins. In general, lignocellulosic material is derived from plant material: stems, leaves, bark, plant wraps, leaves, branches or tree wood. Lignocellulosic material can also be derived from herbaceous material, agricultural waste, forestry waste, municipal solid waste or paper mill effluent.

[0039] De acordo com uma modalidade da invenção, a biomassa utilizada no processo é derivada de Miscanthus, álamo ou palha de trigo.[0039] According to one embodiment of the invention, the biomass used in the process is derived from Miscanthus, poplar or wheat straw.

[0040] O material lignocelulósico deve ser pré- tratado para quebrar a lignina e a estrutura cristalina da celulose. Isso facilita a solubilização da hemicelulose e da celulose, o acesso dessas às enzimas que poderiam ser usadas no tratamento da biomassa. Qualquer forma de pré-tratamento, especialmente de impregnação e pré-tratamento, conhecida pela pessoa versada na técnica, pode ser utilizada. Esquematicamente, o pré-tratamento pode ser químico, mecânico ou biológico. O pré-tratamento químico compreende o tratamento com um agente catalisador ácido básico, incluindo ácido sulfúrico, ou com solventes orgânicos, dióxido de enxofre ou dióxido de carbono. A oxidação em meio líquido e a hidrotermólise em pH controlado são também consideradas tratamentos químicos. O pré-tratamento mecânico corresponde a qualquer tratamento mecânico ou físico como esmagamento, irradiação ou explosão sob alta pressão ou alta temperatura (explosão de vapor). De acordo com certas modalidades, os tratamentos químicos e mecânicos podem ser combinados em sequência ou simultaneamente.[0040] The lignocellulosic material must be pretreated to break down the lignin and the crystalline structure of the cellulose. This facilitates the solubilization of hemicellulose and cellulose and their access to enzymes that could be used to treat biomass. Any form of pretreatment, especially impregnation and pretreatment, known to the person skilled in the art can be used. Schematically, pretreatment can be chemical, mechanical or biological. Chemical pretreatment comprises treatment with a basic acid catalyzing agent, including sulfuric acid, or with organic solvents, sulfur dioxide or carbon dioxide. Oxidation in a liquid medium and hydrothermolysis at controlled pH are also considered chemical treatments. Mechanical pretreatment corresponds to any mechanical or physical treatment such as crushing, irradiation or explosion under high pressure or high temperature (steam explosion). According to certain embodiments, chemical and mechanical treatments can be combined sequentially or simultaneously.

[0041] De acordo com uma modalidade vantajosa, o pré- tratamento da matéria-prima compreende as seguintes etapas: • impregnação na presença de um agente catalítico ácido ou básico, em particular, um catalisador ácido, de preferência ácido sulfúrico, nas razões compreendidas entre 0,1 e 2,0% em peso, de preferência, 0,5%. Vantajosamente, a impregnação é implementada a uma temperatura compreendida entre cerca de 50 °C e cerca de 80 °C, em particular, compreendida entre cerca de 60 °C e 70 °C, e de preferência a cerca de 65 °C. • injeção de vapor d’água a uma temperatura compreendida entre cerca de 120 °C e cerca de 250 °C, particularmente compreendida entre cerca de 170 °C e cerca de 190 °C, de preferência, a cerca de 180 °C, a uma pressão compreendida entre cerca de 5 e cerca de 15 bar, particularmente compreendida entre cerca de 8 e cerca de 10 bar, e de preferência, a cerca de 9 bar, e por um período de tempo compreendido entre 1 e 10 minutos, de preferência, de 5 min.[0041] According to an advantageous embodiment, the pre-treatment of the raw material comprises the following steps: • impregnation in the presence of an acidic or basic catalytic agent, in particular, an acidic catalyst, preferably sulfuric acid, in the reasons understood between 0.1 and 2.0% by weight, preferably 0.5%. Advantageously, the impregnation is implemented at a temperature comprised between about 50°C and about 80°C, in particular, comprised between about 60°C and 70°C, and preferably at about 65°C. • injection of water vapor at a temperature between about 120°C and about 250°C, particularly between about 170°C and about 190°C, preferably at about 180°C, at a pressure comprised between about 5 and about 15 bar, particularly comprised between about 8 and about 10 bar, and preferably at about 9 bar, and for a period of time comprised between 1 and 10 minutes, preferably , 5 min.

[0042] A biomassa vegetal pré-tratada pode ser então usada como substrato para propagação de leveduras e/ou na fermentação alcoólica, conforme é indicado pela figura 1 descrita acima. A propagação é também chamada de multiplicação, proliferação ou produção de biomassa. O objetivo é obter uma quantidade de biomassa ideal para a fermentação. O meio de propagação a partir de biomassa pré- tratada pode ser rico em pentoses, rico em hexoses ou uma mistura de pentoses e hexoses. As pentoses representam os açúcares com 5 átomos de carbono, também conhecidos como açúcares C5 ou, mais simplesmente, C5. Os principais representantes monoméricos naturais das pentoses são a D- xilose e a L-arabinose. Por analogia, as hexoses representam os açúcares com 6 átomos de carbono, também conhecidos como açúcares C6 ou, mais simplesmente, C6. Os principais representantes das hexoses na forma monomérica são a glicose, frutose, manose e galactose.[0042] The pre-treated plant biomass can then be used as a substrate for yeast propagation and/or in alcoholic fermentation, as indicated by figure 1 described above. Propagation is also called multiplication, proliferation or biomass production. The objective is to obtain an ideal amount of biomass for fermentation. The propagation medium from pre-treated biomass can be pentose-rich, hexose-rich or a mixture of pentoses and hexoses. Pentoses represent sugars with 5 carbon atoms, also known as C5 sugars or, more simply, C5. The main natural monomeric representatives of pentoses are D-xylose and L-arabinose. By analogy, hexoses represent sugars with 6 carbon atoms, also known as C6 sugars or, more simply, C6. The main representatives of hexoses in monomeric form are glucose, fructose, mannose and galactose.

[0043] A propagação SSP (sacarificação e propagação simultâneas), de acordo com a presente invenção, refere-se às leveduras capazes de transformar de uma só vez uma ou mais pentoses e uma ou mais hexoses.[0043] SSP propagation (simultaneous saccharification and propagation), according to the present invention, refers to yeasts capable of transforming one or more pentoses and one or more hexoses at once.

[0044] A expressão “cepa de levedura” refere-se a uma população homogênea de células de levedura. Uma cepa de levedura é obtida a partir do isolamento de um clone. Um clone gera uma população de células obtidas a partir de uma única célula de levedura.[0044] The term “yeast strain” refers to a homogeneous population of yeast cells. A yeast strain is obtained from the isolation of a clone. A clone generates a population of cells obtained from a single yeast cell.

[0045] A expressão “cepa de levedura derivada” significa uma cepa de levedura derivada por um ou mais cruzamentos, por mutação e/ou por transformação genética.[0045] The expression “derived yeast strain” means a yeast strain derived by one or more crossings, mutation and/or genetic transformation.

[0046] Uma cepa de levedura derivada por cruzamento pode ser obtida por cruzamento interespecífico ou não. Uma cepa de levedura derivada por mutação pode ser uma cepa de levedura que sofreu pelo menos uma mutação espontânea no genoma ou pelo menos uma mutação induzida por mutagênese. A ou as mutações de uma cepa derivada pode(m) afetar o fenótipo ou não. A expressão "mutagênese" significa o processo de ocorrência de uma mutação. Classicamente, existem dois métodos, a mutagênese aleatória e mutagênese de inserção ou direcionada. A primeira consiste na aplicação de tratamento físico (por exemplo, radiação UV) ou de um tratamento com agentes químicos mutagênicos, que irão induzir mutações aleatórias no genoma do organismo estudado. A segunda utiliza métodos de biologia molecular para realizar uma mudança específica (ou seja, promotor, gene, terminador...) em uma região qualquer do genoma, ou em um locus específico. Locus significa o local físico específico e invariável de um gene em um cromossomo. Uma cepa de levedura obtida por transformação genética é uma cepa de levedura em que foi introduzida uma sequência de DNA de preferência, fornecida por um plasmídeo ou integrada diretamente no genoma.[0046] A yeast strain derived by crossing can be obtained by interspecific crossing or not. A mutation-derived yeast strain may be a yeast strain that has undergone at least one spontaneous mutation in the genome or at least one mutation induced by mutagenesis. The mutation(s) of a derived strain may or may not affect the phenotype. The term "mutagenesis" means the process of a mutation occurring. Classically, there are two methods, random mutagenesis and insertion or targeted mutagenesis. The first consists of the application of physical treatment (for example, UV radiation) or treatment with chemical mutagenic agents, which will induce random mutations in the genome of the organism studied. The second uses molecular biology methods to make a specific change (i.e. promoter, gene, terminator...) in any region of the genome, or at a specific locus. Locus means the specific and invariable physical location of a gene on a chromosome. A yeast strain obtained by genetic transformation is a yeast strain into which a preferred DNA sequence has been introduced, provided by a plasmid or integrated directly into the genome.

[0047] Esquematicamente, é possível distinguir quatro fases durante a propagação de uma cepa de levedura: a fase chamada “latência”, durante a qual o crescimento não é detectável, e que pode ser comparada com um período de adaptação; ela é seguida pela “fase de crescimento”, durante a qual as células se multiplicam de acordo com a taxa máxima de crescimento, em seguida, pela “fase estacionária”, que é a que o organismo fermentador entra quando o período de crescimento máximo diminui e para. E, finalmente, a fase de declínio, durante a qual o número de células viáveis irá diminuir. A propagação é, de maneira geral, um processo aeróbio. A aerobiose, ou a aeração do meio de propagação, garante um retorno da produção de biomassa bem melhor do que a anaerobiose. Da mesma forma, nutrientes podem ser adicionados ao meio, como uma fonte de nitrogênio, uma fonte de fósforo ou minerais. As vitaminas e os compostos orgânicos, como aminoácidos ou ácidos nucleicos, raramente são adicionados na indústria por causa de seu custo. Quanto mais rápida e mais curta for a fase de crescimento, mais as contaminações microbianas serão evitadas. Uma contaminação muito forte da propagação causará perdas de rendimento de produção durante a fase subsequente de fermentação. Para limitar a contaminação, os agentes antimicrobianos e antibióticos do tipo penicilina ou virginiamicina, ou os extratos ácidos de lúpulo, podem ser usados.[0047] Schematically, it is possible to distinguish four phases during the propagation of a yeast strain: the phase called “latency”, during which growth is not detectable, and which can be compared with a period of adaptation; it is followed by the “growth phase”, during which cells multiply according to the maximum growth rate, then by the “stationary phase”, which is what the fermenting organism enters when the period of maximum growth decreases is for. And finally, the decline phase, during which the number of viable cells will decrease. Propagation is, in general, an aerobic process. Aerobiosis, or the aeration of the propagation medium, guarantees a much better return on biomass production than anaerobiosis. Likewise, nutrients can be added to the medium, such as a nitrogen source, a phosphorus source, or minerals. Vitamins and organic compounds such as amino acids or nucleic acids are rarely added in industry because of their cost. The faster and shorter the growth phase, the more microbial contaminations will be avoided. Too strong propagation contamination will cause losses in production yield during the subsequent fermentation phase. To limit contamination, antimicrobial agents and antibiotics such as penicillin or virginiamycin, or acidic hop extracts, can be used.

[0048] A propagação por SSP, de acordo com a invenção, deve ser realizada sob microaerobiose. Isso significa que o ambiente deve ser aerado, mas a quantidade de oxigênio fornecida deve ser limitada. A pressão de oxigênio dissolvido é zero, ao contrário da aerobiose. O oxigênio dissolvido no meio de fermentação é medido usando uma sonda de oxigênio de acordo com um método conhecido pela pessoa versada na técnica. A microaerobiose no processo de acordo com a invenção é obtida por aeração e por agitação moderadas. Preferencialmente, a aeração é 0,1 VVM (volume de ar/volume de meio/minuto, para 60 mL em um reator contendo 600 mL de meio minuto por minuto), e a agitação é definida em cerca de 500 rpm. Concretamente, a agitação depende da escala em que o processo está sendo implementado; em outras palavras, a pessoa versada na técnica a ajusta dependendo do material, do volume de tal material e do gasto de energia aceitável. Quanto maior for o volume de trabalho, menor será a agitação.[0048] Propagation by SSP, according to the invention, must be carried out under microaerobiosis. This means that the environment must be aerated, but the amount of oxygen supplied must be limited. Dissolved oxygen pressure is zero, unlike aerobiosis. Dissolved oxygen in the fermentation medium is measured using an oxygen probe according to a method known to the person skilled in the art. Microaerobiosis in the process according to the invention is obtained by moderate aeration and agitation. Preferably, aeration is 0.1 VVM (volume of air/volume of medium/minute, for 60 mL in a reactor containing 600 mL of medium per minute), and agitation is set at about 500 rpm. Concretely, the agitation depends on the scale at which the process is being implemented; in other words, the person skilled in the art adjusts it depending on the material, the volume of such material and the acceptable energy expenditure. The greater the work volume, the less agitation.

[0049] A biomassa então obtida pode ser submetida a um processo de fermentação. A fermentação é realizada, de preferência, a 32 °C, sob agitação moderada, por exemplo, a 90 rpm. A agitação é moderada para não incorporar oxigênio. O pH do meio de fermentação é, de preferência, controlado, por exemplo, pela adição de um tampão ácido-base. O pH alvo preferencial no processo de acordo com a invenção é 5,0. Quando o processo de fermentação se destina à produção de etanol, a quantidade de etanol presente no meio de fermentação é medida por qualquer meio adequado conhecido pela pessoa versada na técnica. Ela pode ser uma medida direta do etanol produzido ou uma medida indireta, utilizando um parâmetro correlacionado com a produção de etanol, como a perda de massa. Por exemplo, a produção de etanol pode ser medida por cromatografia, especialmente por HPLC (cromatografia líquida de alta eficiência), por um kit enzimático ou por titulação com dicromato de potássio. A quantidade de xilose e/ou de glicose presente no meio é medida por qualquer meio adequado conhecido pela pessoa versada na técnica, de preferência, por cromatografia, especialmente por HPLC.[0049] The biomass then obtained can be subjected to a fermentation process. Fermentation is preferably carried out at 32 °C, under moderate stirring, for example at 90 rpm. Agitation is moderate so as not to incorporate oxygen. The pH of the fermentation medium is preferably controlled, for example, by adding an acid-base buffer. The preferred target pH in the process according to the invention is 5.0. When the fermentation process is intended for the production of ethanol, the amount of ethanol present in the fermentation medium is measured by any suitable means known to the person skilled in the art. It can be a direct measurement of the ethanol produced or an indirect measurement, using a parameter correlated with ethanol production, such as mass loss. For example, ethanol production can be measured by chromatography, especially by HPLC (high performance liquid chromatography), by an enzymatic kit or by titration with potassium dichromate. The amount of xylose and/or glucose present in the medium is measured by any suitable means known to the person skilled in the art, preferably by chromatography, especially by HPLC.

[0050] A pessoa versada na técnica sabe determinar as condições adequadas para uma fermentação alcoólica.[0050] A person skilled in the art knows how to determine the appropriate conditions for alcoholic fermentation.

[0051] A título de exemplo, pode-se fazer referência às condições de fermentação descritas no livro de referência “Yeast Technology”, 2a edição, 1991, G. Reed et T.W. Nagodawithana, publicado por Van Nostrand Reinhold, ISBN 0-442-31892-8.[0051] By way of example, reference can be made to the fermentation conditions described in the reference book “Yeast Technology”, 2nd edition, 1991, G. Reed et T.W. Nagodawithana, published by Van Nostrand Reinhold, ISBN 0-442-31892-8.

[0052] O meio de fermentação inclui os seguintes elementos: pelo menos uma fonte de carbono fermentável, pelo menos uma fonte de nitrogênio, pelo menos uma fonte de enxofre, pelo menos uma fonte de fósforo, pelo menos uma fonte de vitaminas e/ou pelo menos uma fonte de minerais.[0052] The fermentation medium includes the following elements: at least one fermentable carbon source, at least one nitrogen source, at least one sulfur source, at least one phosphorus source, at least one vitamin source and/or at least one source of minerals.

[0053] A fonte de carbono, por exemplo, é fornecida sob a forma de um açúcar imediatamente assimilável pela levedura, como a xilose, arabinose, glicose, frutose ou galactose, um dissacarídeo do tipo sacarose e/ou uma mistura desses açúcares.[0053] The carbon source, for example, is provided in the form of a sugar immediately assimilable by yeast, such as xylose, arabinose, glucose, fructose or galactose, a sucrose-type disaccharide and/or a mixture of these sugars.

[0054] Esses açúcares podem ser fornecidos sob a forma de xarope, melaço, EP2 (escoamento pobre proveniente da 2a cristalização de açúcar), a partir de hidrolisados de toda ou de parte do material vegetal e/ou de uma mistura dos mesmos.[0054] These sugars can be supplied in the form of syrup, molasses, EP2 (poor flow from the 2nd sugar crystallization), from hydrolysates of all or part of the plant material and/or a mixture thereof.

[0055] A fonte de nitrogênio, por exemplo, é fornecida sob a forma de extratos de levedura, sulfato de amônio, hidróxido de amônio, fosfato diamônio, amônia, ureia e/ou uma combinação das mesmas.[0055] The nitrogen source, for example, is provided in the form of yeast extracts, ammonium sulfate, ammonium hydroxide, diammonium phosphate, ammonia, urea and/or a combination thereof.

[0056] A fonte de enxofre é adicionada, por exemplo, como sulfato de amônio, sulfato de magnésio, ácido sulfúrico, e/ou uma combinação dos mesmos.[0056] The sulfur source is added, for example, as ammonium sulfate, magnesium sulfate, sulfuric acid, and/or a combination thereof.

[0057] A fonte de fósforo é fornecida sob a forma de ácido fosfórico, fosfato de potássio, fosfato diamônio, fosfato monoamônio ou uma combinação destes.[0057] The phosphorus source is provided in the form of phosphoric acid, potassium phosphate, diammonium phosphate, monoammonium phosphate or a combination of these.

[0058] A fonte de vitaminas, por exemplo, é fornecida sob a forma de licor à base de milho, melaço, hidrolisado de leveduras, solução de vitamina pura ou uma mistura de vitaminas puras e/ou uma combinação dos mesmos. A fonte de vitaminas fornecida para a levedura possui todas as vitaminas em quantidades pelo menos equivalentes às quantidades recomendáveis nos livros de referência. Várias fontes de vitaminas podem ser associadas. Por exemplo, a fonte de minerais é fornecida como um melaço, uma mistura de sais minerais e/ou uma combinação dos mesmos.[0058] The source of vitamins, for example, is provided in the form of corn-based liquor, molasses, yeast hydrolyzate, pure vitamin solution or a mixture of pure vitamins and/or a combination thereof. The source of vitamins provided for yeast has all vitamins in amounts at least equivalent to the amounts recommended in reference books. Various sources of vitamins can be combined. For example, the mineral source is provided as a molasses, a mixture of mineral salts and/or a combination thereof.

[0059] A fonte de minerais fornecida para a levedura possui todos os macroelementos e oligoelementos nas quantidades pelo menos equivalentes às quantidades recomendáveis nos livros de referência. Várias fontes de minerais podem ser associadas.[0059] The source of minerals provided for the yeast has all macroelements and trace elements in quantities at least equivalent to the quantities recommended in reference books. Several mineral sources can be associated.

[0060] Uma mesma substância pode fornecer vários elementos diferentes.[0060] The same substance can provide several different elements.

[0061] A propagação de acordo com a invenção é caracterizada pelo fato de que a sacarificação e a propagação são executadas simultaneamente.[0061] Propagation according to the invention is characterized by the fact that saccharification and propagation are carried out simultaneously.

[0062] O bagaço bruto pré-tratado é usado em uma razão de teor de matéria seca compreendida entre 8 e 15%, de preferência, entre 10 e 12%, e vantajosamente, a 10%. De acordo com uma modalidade da invenção, o bagaço compreende cerca de 1/3 de matéria seca solúvel (tipo "suco de C5) e 2/3 de matéria seca insolúvel (tipo fibras de lignocelulose).[0062] The pre-treated raw bagasse is used in a dry matter content ratio of between 8 and 15%, preferably between 10 and 12%, and advantageously, 10%. According to one embodiment of the invention, the bagasse comprises about 1/3 soluble dry matter (type "C5 juice) and 2/3 insoluble dry matter (type lignocellulose fibers).

[0063] O bagaço bruto pré-tratado é colocado em contato com uma população de leveduras capaz de metabolizar as pentoses e as hexoses. As leveduras são adicionadas, de preferência, sob a forma seca, a uma razão de 0,2 a 2 g/Kg; em outras palavras, à razão de 0,2 a 2 g de matéria seca de levedura por quilograma de meio completo preparado.[0063] The pre-treated raw bagasse is placed in contact with a yeast population capable of metabolizing pentoses and hexoses. The yeasts are preferably added in dry form, at a rate of 0.2 to 2 g/kg; in other words, at the rate of 0.2 to 2 g of yeast dry matter per kilogram of prepared complete medium.

[0064] É adicionado à mistura de bagaço bruto pré- tratado e de levedura uma combinação de celulases e de hemicelulases que possibilitam a sacarificação. A sacarificação corresponde à hidrólise dos polissacarídeos nos açúcares monoméricos solúveis. Isto significa que a concentração de açúcar simples aumentaria no meio se eles não fossem consumidos pelas leveduras para fins de propagação, em paralelo com a sua liberação pelas enzimas. As celulases permitem ainda a hidrólise da celulose para obter glicose. As exocelulases ou as celobio-hidrolases atuam nas extremidades da celulose para formar o dissacarídeo celobiose. As endoglucanases atuam na clivagem das ligações internas de celulose que formam os oligossacarídeos celulósicos. As celobiases ou beta-glicosidases hidrolisam os oligopolímeros celulósicos e a celobiose em suas extremidades redutoras para liberar a glicose.[0064] A combination of cellulases and hemicellulases are added to the mixture of pre-treated raw bagasse and yeast, which enable saccharification. Saccharification corresponds to the hydrolysis of polysaccharides into soluble monomeric sugars. This means that the concentration of simple sugars would increase in the medium if they were not consumed by yeast for propagation purposes, in parallel with their release by enzymes. Cellulases also allow the hydrolysis of cellulose to obtain glucose. Exocellulases or cellobiohydrolases act on the ends of cellulose to form the disaccharide cellobiose. Endoglucanases act to cleavage the internal cellulose bonds that form cellulosic oligosaccharides. Cellobiases or beta-glucosidases hydrolyze cellulosic oligopolymers and cellobiose at their reducing ends to release glucose.

[0065] Na prática, o termo celulases abrange uma mistura de proteínas enzimáticas. De modo preferencial, as enzimas são usadas a uma razão de 5 a 15 mg de proteínas (enzimas) por grama de matéria seca. Vantajosamente, elas são utilizadas a uma razão de 7 a 10 mg de proteína (enzimas) por grama de matéria seca, de preferência, a 7 mg de proteínas enzimáticas por grama de matéria seca. Para possibilitar uma correta compreensão e uma comparação entre as atividades de diferentes composições com uma atividade de celulase, a atividade FPU (unidade de papel de filtro) pode ser usada como referência. A comissão de biotecnologia do organismo internacional IUPAC (União Internacional de Química Pura e Aplicada) recomenda o seguinte procedimento: a atividade FPU é medida em papel Whatman No. 1 na concentração inicial de 50 g.L-1. O objetivo é determinar, por dosagem colorimétrica (ácido dinitrossalicílico, DNS) a quantidade de açúcares redutores liberados do papel Whatman No. 1. A título de exemplo, a amostra de ensaio da solução enzimática a analisar, que libera o equivalente a 2 g.L-1 de glicose em 60 minutos, é determinada. As atividades específicas são obtidas dividindo as atividades expressas em UI.mL-1 pela concentração de proteína; elas são expressas em UI.mg-1. Vantajosamente, a combinação de celulases e hemicelulases implementada em um processo de acordo com a invenção corresponde a uma composição enzimática que apresenta uma ou mais atividade(s) melhorada(s) em relação a uma composição contendo proteínas produzidas pelo fungo nativo. Tais celulases são conhecidas pela pessoa versada na técnica, por exemplo, elas são descritas por Durand et al., 1988 (Enzyme Microb. Technol., 10: 341 -346). De acordo com uma modalidade preferencial da invenção, as celulases correspondem a uma composição enzimática, tal como aquela descrita no pedido WO2010029259 A1, em particular, uma composição enzimática produzida por fungos filamentosos, preferencialmente, por Trichoderma reesei.[0065] In practice, the term cellulases covers a mixture of enzymatic proteins. Preferably, enzymes are used at a rate of 5 to 15 mg of proteins (enzymes) per gram of dry matter. Advantageously, they are used at a rate of 7 to 10 mg of protein (enzymes) per gram of dry matter, preferably at 7 mg of enzymatic proteins per gram of dry matter. To enable a correct understanding and comparison between the activities of different compositions with a cellulase activity, the FPU activity (filter paper unit) can be used as a reference. The biotechnology commission of the international organization IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) recommends the following procedure: FPU activity is measured on Whatman No. 1 paper at an initial concentration of 50 g.L-1. The objective is to determine, by colorimetric dosage (dinitrosalicylic acid, DNS) the amount of reducing sugars released from Whatman No. 1 paper. As an example, the test sample of the enzyme solution to be analyzed, which releases the equivalent of 2 g.L- 1 of glucose in 60 minutes is determined. Specific activities are obtained by dividing the activities expressed in IU.mL-1 by the protein concentration; they are expressed in UI.mg-1. Advantageously, the combination of cellulases and hemicellulases implemented in a process according to the invention corresponds to an enzymatic composition that presents one or more improved activity(ies) in relation to a composition containing proteins produced by the native fungus. Such cellulases are known to the person skilled in the art, for example, they are described by Durand et al., 1988 (Enzyme Microb. Technol., 10: 341-346). According to a preferred embodiment of the invention, cellulases correspond to an enzymatic composition, such as that described in application WO2010029259 A1, in particular, an enzymatic composition produced by filamentous fungi, preferably by Trichoderma reesei.

[0066] A mistura é então incubada em microaerobiose, a uma temperatura compreendida entre 25 e 38 °C, e preferencialmente, entre 28 e 33 °C, preferencialmente, entre 30 e 32 °C.[0066] The mixture is then incubated in microaerobiosis, at a temperature between 25 and 38 °C, and preferably between 28 and 33 °C, preferably between 30 and 32 °C.

[0067] Vantajosamente, o pH da solução é em torno de 5,0.[0067] Advantageously, the pH of the solution is around 5.0.

[0068] A incubação é mantida entre 24 e 50 horas, particularmente entre 28 e 50 horas, e mais preferencialmente, entre 30 e 42 horas.[0068] Incubation is maintained between 24 and 50 hours, particularly between 28 and 50 hours, and more preferably, between 30 and 42 hours.

[0069] Vantajosamente, a concentração celular alvo (final da propagação) é compreendida entre 5,0 x 108 e 1,0 x 109 células por mililitro.[0069] Advantageously, the target cell concentration (end of propagation) is between 5.0 x 108 and 1.0 x 109 cells per milliliter.

[0070] De acordo com um modo particular da modalidade da invenção, as leveduras transformadas capazes de metabolizar de uma só vez as pentoses e hexoses são obtidas através de processos descritos nos pedidos de patentes WO2010000464A1, WO2011128552A1 e WO2012072793A1. Vantajosamente, as ditas cepas são também resistentes ao ácido acético, obtido por um processo conforme descrito no pedido WO2013178915A1.[0070] According to a particular embodiment of the invention, transformed yeast capable of metabolizing pentoses and hexoses at once are obtained through processes described in patent applications WO2010000464A1, WO2011128552A1 and WO2012072793A1. Advantageously, said strains are also resistant to acetic acid, obtained by a process as described in application WO2013178915A1.

[0071] De acordo com uma modalidade da invenção, a cepa de leveduras usada metaboliza preferencialmente a xilose e a glicose. Em outras palavras, de acordo com um modo particular da modalidade, a invenção refere-se a um processo de fermentação de açúcares derivados de biomassa lignocelulósica, preferencialmente das pentoses e/ou das hexoses, usando um microrganismo fermentador, caracterizado pelo fato de que o dito microrganismo foi produzido diretamente em bagaço bruto pré-tratado, de acordo com um método de sacarificação e propagação simultâneas.[0071] According to one embodiment of the invention, the yeast strain used preferentially metabolizes xylose and glucose. In other words, according to a particular mode of the modality, the invention refers to a fermentation process of sugars derived from lignocellulosic biomass, preferably pentoses and/or hexoses, using a fermenting microorganism, characterized by the fact that the said microorganism was produced directly in pre-treated raw bagasse, according to a method of simultaneous saccharification and propagation.

[0072] De acordo com um modo preferencial de modalidade da invenção, a cepa de levedura sujeita a uma propagação e sacarificação simultâneas de acordo com a invenção corresponde a uma das cepas depositadas na CNCM (Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15), sob os números I-4624, I-4625, I-4626 e I-4627, ou que foram depositadas em 26 de junho de 2013, sob o número I-4783.[0072] According to a preferred embodiment of the invention, the yeast strain subject to simultaneous propagation and saccharification according to the invention corresponds to one of the strains deposited in the CNCM (National Collection of Microorganism Cultures, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15), under numbers I-4624, I-4625, I-4626 and I-4627, or which were deposited on June 26, 2013, under number I-4783.

[0073] De acordo com uma modalidade preferencial da invenção, a propagação por SSP precede uma etapa de fermentação.[0073] According to a preferred embodiment of the invention, propagation by SSP precedes a fermentation step.

[0074] A presente invenção também tem como objeto um processo de produção de pelo menos um produto da fermentação, que compreende uma etapa de fermentação em condição anaeróbica ou semiaeróbica, por uma levedura propagada em bagaço bruto pré-tratado, de acordo com um método no qual a sacarificação e a propagação são realizadas simultaneamente.[0074] The present invention also has as its object a process for producing at least one fermentation product, which comprises a fermentation step in anaerobic or semi-aerobic conditions, by yeast propagated in pre-treated raw bagasse, according to a method in which saccharification and propagation are carried out simultaneously.

[0075] O produto da fermentação é especialmente selecionado dentre etanol, um metabólito obtido a partir do etanol ou um metabolito secundário.[0075] The fermentation product is specially selected from ethanol, a metabolite obtained from ethanol or a secondary metabolite.

[0076] Um produto de fermentação preferencial, de acordo com a invenção, é o etanol.[0076] A preferred fermentation product, according to the invention, is ethanol.

[0077] A invenção pode ser mais bem compreendida de acordo com os exemplos a seguir, que sob nenhum aspecto são limitantes.[0077] The invention can be better understood according to the following examples, which are in no way limiting.

Exemplo 1: Condições de pré-tratamento e análise da composição do substrato.Example 1: Pretreatment conditions and analysis of substrate composition.

[0078] O substrato usado para esses testes é do bagaço bruto de palha de trigo obtido por um pré-tratamento de acordo com o método a seguir: a palha esmagada é imersa em água acidificada com entre 0,1 e 2,0% em peso de H2SO4, em seguida, ela é pré-tratada por explosão de vapor contínuo com cerca de 50 por cento de matéria seca por 1 a 10 min entre 170 e 190 °C, de preferência, a 180 °C.[0078] The substrate used for these tests is raw wheat straw bagasse obtained by pre-treatment according to the following method: the crushed straw is immersed in acidified water with between 0.1 and 2.0% in weight of H2SO4, then it is pretreated by continuous steam explosion with about 50 percent dry matter for 1 to 10 min at 170 to 190 °C, preferably at 180 °C.

[0079] Esse bagaço bruto de palha foi analisado por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC ou CLAE) e os níveis de açúcares e inibidores estão indicados na tabela 1. Tabela 1: Composição do bagaço de palha usado para este estudo. NQ significa não quantificado, em outras palavras, não foi mensurado[0079] This raw straw bagasse was analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC or HPLC) and the levels of sugars and inhibitors are indicated in table 1. Table 1: Composition of the straw bagasse used for this study. NQ means not quantified, in other words, it was not measured

[0080] A análise dos substratos mostrou níveis clássicos de furfural e ácido acético. O teor de matéria seca do bagaço bruto de palha é igual a 46,0%. Na maioria dos testes de propagação realizados posteriormente, os mesmos utilizaram 10% da matéria seca, o que corresponde a uma diluição de um fator de 4,6 das concentrações informadas acima, durante a operação no reator, enquanto que os outros dois substratos listados na tabela, ou seja, o hidrolisado e suco de C5, foram utilizados sem diluição adicional.[0080] Analysis of the substrates showed classic levels of furfural and acetic acid. The dry matter content of raw straw bagasse is equal to 46.0%. In most of the propagation tests carried out subsequently, they used 10% of the dry matter, which corresponds to a dilution of a factor of 4.6 of the concentrations reported above, during operation in the reactor, while the other two substrates listed in table, i.e., the hydrolyzate and C5 juice, were used without further dilution.

[0081] Os seguintes experimentos foram realizados com a levedura Saccharomyces cerevisiae depositada na (Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) em 26 de junho de 2013, sob o número I-4783. Os procedimentos implementados estão descritos abaixo. A título de comparação, uma outra cepa de levedura capaz de metabolizar as pentoses e as hexoses forneceriam resultados semelhantes. Os processos de referência usam substratos líquidos, ou seja, hidrolisado lignocelulósico, que requer uma etapa de hidrólise do bagaço pré-tratado antes da propagação, ou suco de C5, (também chamado de hidrolisado hemicelulósico), que requer uma etapa de separação dos açúcares solúveis do bagaço no final do pré-tratamento.[0081] The following experiments were carried out with the yeast Saccharomyces cerevisiae deposited at the (National Collection of Cultures of Microorganisms, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) on June 26, 2013, under number I-4783. The implemented procedures are described below. By way of comparison, another strain of yeast capable of metabolizing pentoses and hexoses would provide similar results. Reference processes use liquid substrates, i.e. lignocellulosic hydrolyzate, which requires a hydrolysis step of pre-treated pomace before propagation, or C5 juice, (also called hemicellulosic hydrolyzate), which requires a sugar separation step soluble residues from the bagasse at the end of pre-treatment.

[0082] Por outro lado, o protocolo de sacarificação e propagação simultâneas (SSP) de acordo com a invenção utiliza o substrato sólido do bagaço bruto pré-tratado.[0082] On the other hand, the simultaneous saccharification and propagation (SSP) protocol according to the invention uses the solid substrate of pre-treated raw bagasse.

Exemplo 2: Processos de referênciaExample 2: Reference processes 2.1. Protocolos2.1. Protocols

[0083] Os antibacterianos e nutrientes foram adicionados respectivamente no suco de C5 no hidrolisado lignocelulósico de acordo com as quantidades adaptadas para a levedura depositada na CNCM sob número I-4783, utilizada nesses ensaios, a saber: NH4OH 25% Ureia Mistura de minerais Antibacteriano[0083] The antibacterials and nutrients were added respectively to the C5 juice in the lignocellulosic hydrolyzate according to the amounts adapted for the yeast deposited at the CNCM under number I-4783, used in these tests, namely: NH4OH 25% Urea Mineral mixture Antibacterial

[0084] A composição da mistura de minerais é apresentada na tabela 2. A pessoa versada na técnica será capaz de ajustar as proporções para maximizar a eficácia. Tabela 2: composição da mistura de minerais [0084] The composition of the mineral mixture is presented in table 2. The person skilled in the art will be able to adjust the proportions to maximize effectiveness. Table 2: composition of the mineral mixture

[0085] Os reatores foram inoculados a uma razão de 0,4 g/Kg de levedura seca, e foram mantidos a uma temperatura de 30 °C.[0085] The reactors were inoculated at a rate of 0.4 g/kg of dry yeast, and were maintained at a temperature of 30 °C.

[0086] O pH foi mantido em 5,0 pela adição de KOH e H2SO4.[0086] The pH was maintained at 5.0 by adding KOH and H2SO4.

[0087] Para as condições de microaerobiose, o fluxo de ar foi definido em 0,1 WM (volume de ar/volume de meio/minuto) e a agitação continuou a 500 rpm.[0087] For microaerobic conditions, the air flow was set at 0.1 WM (air volume/medium volume/minute) and agitation continued at 500 rpm.

[0088] A título informativo, um fluxo de ar a WM 0,1 é igual a 60 mL/min. para um reator contendo 600 mL do meio.[0088] For information purposes, an air flow at WM 0.1 is equal to 60 mL/min. to a reactor containing 600 mL of the medium.

2.2. Resultados2.2. Results 2.2.1. Propagação no hidrolisado lignocelulósico (SHF)2.2.1. Propagation in lignocellulosic hydrolyzate (SHF)

[0089] A cinética de crescimento das leveduras, o consumo de substrato e a produção de etanol durante a propagação de leveduras na condição microaeróbica (0,1 WM) no hidrolisado lignocelulósico estão apresentados na figura 2.[0089] The yeast growth kinetics, substrate consumption and ethanol production during yeast propagation in microaerobic condition (0.1 WM) in lignocellulosic hydrolyzate are shown in figure 2.

[0090] Este teste de propagação durou 46,1 h, mas a Figura 2 mostra que o crescimento das leveduras terminou depois de cerca de 27 h de cultura. O teor final na biomassa produzida foi estimado em 3,9x108 células/mL. A glicose foi consumida preferencialmente ao invés da xilose, como é geralmente o caso em excesso de glicose. Foram produzidos 18 g/Kg de etanol. Nota: A viabilidade das leveduras durante a propagação não está representada na figura, para uma melhor visualização. Após as primeiras horas de cultura, ela foi superior a 95% para todos os testes apresentados nesses exemplos.[0090] This propagation test lasted 46.1 h, but Figure 2 shows that yeast growth ended after about 27 h of culture. The final content in the biomass produced was estimated at 3.9x108 cells/mL. Glucose was consumed preferentially rather than xylose, as is generally the case in excess glucose. 18 g/kg of ethanol were produced. Note: The viability of yeasts during propagation is not represented in the figure, for better visualization. After the first few hours of culture, it was greater than 95% for all tests presented in these examples.

2.2.2. Propagação no suco de C52.2.2. Propagation in C5 juice

[0091] A cinética de crescimento das leveduras, o consumo de substrato e a produção de etanol durante a propagação de leveduras na condição microaeróbica (0,1 WM) no suco de C5 estão apresentados na figura 3.[0091] The yeast growth kinetics, substrate consumption and ethanol production during yeast propagation in microaerobic condition (0.1 WM) in C5 juice are shown in figure 3.

[0092] Esse ensaio de propagação no suco de C5 mostra uma fase de latência mais longa (em relação ao ensaio no hidrolisado lignocelulósico), e em seguida, a biomassa cresce rapidamente até alcançar 7,5x108 células/mL após 41 h de cultura. Foram produzidos 10 g/Kg de etanol.[0092] This propagation test in C5 juice shows a longer latency phase (compared to the test in lignocellulosic hydrolyzate), and then the biomass grows quickly until reaching 7.5x108 cells/mL after 41 h of culture. 10 g/kg of ethanol was produced.

[0093] A diferença de teor final na biomassa já havia sido observada. Em geral, os rendimentos de produção de levedura são mais elevados do que a propagação no suco de C5, do que durante a propagação no hidrolisado lignocelulósico, composto principalmente de açúcar (glicose) C6.[0093] The difference in final biomass content had already been observed. In general, yeast production yields are higher when propagating in C5 juice than during propagation in lignocellulosic hydrolyzate, composed mainly of C6 sugar (glucose).

Exemplo 3: Sacarificação e propagação simultâneas (PSS)Example 3: Simultaneous saccharification and propagation (PSS) 3.1. Processo SSP de acordo com a invenção3.1. SSP process according to the invention

[0094] O processo de sacarificação e propagação simultâneas também é realizado em um reator, incluindo:[0094] The simultaneous saccharification and propagation process is also carried out in a reactor, including:

[0095] Água e bagaço celulósico bruto pré-tratado (substrato sólido) foram adicionados nas respectivas razões de 10% ou 12% de matéria seca (MS) na maioria dos ensaios, e os nutrientes como indicados acima, para os processos de referência.[0095] Water and pre-treated raw cellulosic bagasse (solid substrate) were added in respective ratios of 10% or 12% dry matter (DM) in most tests, and nutrients as indicated above, for the reference processes.

[0096] A propagação iniciou pela adição simultânea das celulases (nas respectivas razões de 7 e 10 mg de proteínas por grama de MS) e de levedura seca, a uma razão de 0,4 g/Kg. As enzimas usadas nos presentes exemplos podem ser substituídas por enzimas comerciais em quantidade equivalente. A título de comparação, a atividade da FPase (veja acima a referência às unidades de papel de filtro) específica para as celulases usadas nos exemplos é compreendida entre 0,8 e 1,5 UI.mg-1. Elas podem ser substituídas pelas enzimas comerciais nas mesmas quantidades (em UI.mg-1).[0096] Propagation began by the simultaneous addition of cellulases (in respective ratios of 7 and 10 mg of proteins per gram of DM) and dry yeast, at a ratio of 0.4 g/Kg. The enzymes used in the present examples can be replaced by commercial enzymes in equivalent amounts. By way of comparison, the FPase activity (see reference to filter paper units above) specific to the cellulases used in the examples is between 0.8 and 1.5 IU.mg-1. They can be replaced by commercial enzymes in the same quantities (in IU.mg-1).

[0097] A temperatura foi mantida respectivamente a 30 °C ou a 32 °C.[0097] The temperature was maintained at 30 °C or 32 °C respectively.

[0098] O pH foi mantido em 5,0 pela adição de KOH e H2SO4.[0098] The pH was maintained at 5.0 by adding KOH and H2SO4.

[0099] Para as condições de microaerobiose, o fluxo de ar foi definido em 0,1 WM (volume de ar/volume de meio/minuto) e a agitação continuou a 500 rpm.[0099] For microaerobic conditions, the air flow was set at 0.1 WM (air volume/medium volume/minute) and agitation continued at 500 rpm.

[0100] As amostras foram coletadas durante os diferentes ensaios de propagação para contar as leveduras e quantificar os açúcares e os produtos de fermentação por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).[0100] Samples were collected during the different propagation tests to count yeast and quantify sugars and fermentation products by high performance liquid chromatography (HPLC).

[0101] As hidrólises enzimáticas totais foram realizadas nas amostras finais para determinar o teor de celulose não hidrolisada ao final da propagação.[0101] Total enzymatic hydrolysis was carried out on the final samples to determine the non-hydrolyzed cellulose content at the end of propagation.

3.2. Teor dos pares de matéria seca (MS)-dose de enzimas3.2. Content of dry matter (DM)-enzyme dose pairs

[0102] Diferentes pares de MS-dose de enzimas foram testados em SSP. Os pré-requisitos foram: (i) uma concentração de açúcares fermentáveis que permita atingir um teor de biomassa da ordem de 15 g/Kg no final da propagação; (ii) uma cinética de hidrólise da celulose que limite a quantidade de glicose, de forma que (1) o fluxo de carbono seja orientado para a produção de biomassa em vez da produção de etanol, que pode ocorrer, mesmo na presença de oxigênio, se a concentração de açúcares for muito importante e (2) o uso de xilose seja favorecido sem que a produtividade fosse prejudicada; e (3) a viscosidade da mistura permita a agitação moderada e a microaeração do meio.[0102] Different MS-dose pairs of enzymes were tested in SSP. The prerequisites were: (i) a concentration of fermentable sugars that allows reaching a biomass content of the order of 15 g/Kg at the end of propagation; (ii) a cellulose hydrolysis kinetic that limits the amount of glucose, so that (1) the carbon flow is oriented towards the production of biomass instead of the production of ethanol, which can occur, even in the presence of oxygen, if the concentration of sugars is very important and (2) the use of xylose is favored without affecting productivity; and (3) the viscosity of the mixture allows moderate agitation and microaeration of the medium.

[0103] Os teores em MS e das doses de enzimas testadas são mostrados na tabela 3. Tabela 3: teores em MS e em doses de enzimas testadas no SSP Lembrete: como para os processos de referência (acima), esses testes de propagação foram semeados com 0,4 g/Kg de levedura seca, e o pH foi ajustado em 5,0 a 30 °C, com agitação moderada a 500 rpm e microaeração de 0,1 VVM.[0103] The DM contents and doses of enzymes tested are shown in table 3. Table 3: DM contents and doses of enzymes tested in the SSP Reminder: As for the reference processes (above), these propagation tests were seeded with 0.4 g/kg dry yeast, and the pH was adjusted to 5.0 at 30 °C, with moderate shaking at 500 rpm and microaeration of 0.1 VVM.

3.2.1. Propagação em SSP a 10% de MS e 10 mg de proteínas enzimáticas/g de MS3.2.1. Propagation in SSP at 10% DM and 10 mg enzyme proteins/g DM

[0104] A levedura I-4783 foi submetida a uma propagação em condição microaeróbia (0,1 WM) no bagaço bruto de palha (a 10% de MS), na presença de celulases (10 mg de proteínas/g MS) que permite realizar, simultaneamente, a hidrólise da celulose. A cinética de crescimento das leveduras e a produção de etanol, bem como a evolução das concentrações de glicose e xilose durante a propagação das leveduras, estão representadas na figura 4. Resultado: esse ensaio de propagação durou 41 horas, no fim do que 5,6x108 células/mL foram obtidas. 11 g/Kg de etanol foram produzidos, e em seguida, parcialmente consumidos durante essa propagação em SSP no bagaço bruto de palha. Além disso, o teor de MS utilizado permitiu adicionar todo o substrato na base curva inicial, mantendo uma baixa viscosidade e permitindo agitação moderada e a microaeração do meio de cultura.[0104] The yeast I-4783 was subjected to propagation in microaerobic conditions (0.1 WM) in raw straw bagasse (at 10% DM), in the presence of cellulases (10 mg of proteins/g DM) which allows simultaneously carry out the hydrolysis of cellulose. The kinetics of yeast growth and ethanol production, as well as the evolution of glucose and xylose concentrations during yeast propagation, are represented in figure 4. Result: this propagation test lasted 41 hours, at the end of which 5, 6x108 cells/mL were obtained. 11 g/kg of ethanol was produced, and then partially consumed during this propagation in SSP in raw straw bagasse. Furthermore, the MS content used allowed adding all the substrate to the initial curved base, maintaining a low viscosity and allowing moderate agitation and microaeration of the culture medium.

[0105] O experimento foi repetido, prolongando o tempo de crescimento além de 41 h. Os resultados (não mostrados) foram os seguintes: 6,5x108 células/mL foram obtidas após 48 h de cultura e a cinética de crescimento foi sobrepostas àquela obtida no procedimento sob as mesmas condições operacionais.[0105] The experiment was repeated, extending the growth time beyond 41 h. The results (not shown) were as follows: 6.5x108 cells/mL were obtained after 48 h of culture and the growth kinetics were superimposed on those obtained in the procedure under the same operating conditions.

3.2.2. Propagação em SSP a 12% de MS e 12 mg de proteínas enzimáticas/g de MS3.2.2. Propagation in SSP at 12% DM and 12 mg enzymatic proteins/g DM

[0106] A levedura I-4783 foi submetida a uma propagação em condição microaeróbia (0,1 WM) no bagaço bruto de palha (a 12% de MS), na presença de celulases (10 mg de proteínas/g MS) que permite realizar, simultaneamente, a hidrólise da celulose. A cinética de crescimento das leveduras e a produção de etanol, bem como a evolução das concentrações de glicose e xilose durante a propagação das leveduras, estão representadas na figura 5. Resultado: esse ensaio de propagação durou 46,3 horas, no fim do que 5,8x108 células/mL foram obtidas. 15 g/Kg de etanol foram produzidos, e em seguida, parcialmente consumidos durante essa propagação em SSP no bagaço bruto de palha.[0106] The yeast I-4783 was subjected to propagation in microaerobic conditions (0.1 WM) in raw straw bagasse (at 12% DM), in the presence of cellulases (10 mg of proteins/g DM) which allows simultaneously carry out the hydrolysis of cellulose. The kinetics of yeast growth and ethanol production, as well as the evolution of glucose and xylose concentrations during yeast propagation, are represented in figure 5. Result: this propagation test lasted 46.3 hours, at the end of which 5.8x108 cells/mL were obtained. 15 g/kg of ethanol was produced, and then partially consumed during this propagation in SSP in raw straw bagasse.

[0107] O aumento do teor em MS de 10% para 12% não causou um aumento significativo da viscosidade susceptível de perturbar a agitação moderada e a microaeração do meio de cultura.[0107] Increasing the MS content from 10% to 12% did not cause a significant increase in viscosity capable of disturbing the moderate agitation and microaeration of the culture medium.

3.2.3. Propagação em SSP a 10% de MS e 7 mg de proteínas enzimáticas/g de MS.3.2.3. Propagation in SSP at 10% DM and 7 mg enzyme proteins/g DM.

[0108] A levedura I-4783 foi submetida a uma propagação em condição microaeróbia (0,1 WM) no bagaço bruto de palha (a 10% de MS), na presença de celulases (7 mg de proteínas enzimáticas/g de MS) que permite realizar, simultaneamente, a hidrólise da celulose. A cinética de crescimento das leveduras e a produção de etanol, bem como a evolução das concentrações de glicose e xilose durante a propagação das leveduras, estão representadas na figura 6. Resultado: esse ensaio de propagação durou 43,9 horas, no fim do que 8,3x108 células/mL foram obtidas. 9,3 g/Kg de etanol foram produzidos, e em seguida, totalmente consumidos durante essa propagação em SSP no bagaço bruto de palha.[0108] The yeast I-4783 was subjected to propagation in microaerobic conditions (0.1 WM) in raw straw bagasse (at 10% DM), in the presence of cellulases (7 mg of enzymatic proteins/g of DM) which allows the hydrolysis of cellulose to be carried out simultaneously. The kinetics of yeast growth and ethanol production, as well as the evolution of glucose and xylose concentrations during yeast propagation, are represented in figure 6. Result: this propagation test lasted 43.9 hours, at the end of which 8.3x108 cells/mL were obtained. 9.3 g/kg of ethanol was produced, and then completely consumed during this propagation in SSP in the raw straw bagasse.

DiscussãoDiscussion

[0109] A comparação dos desempenhos obtidos para os ensaios de SSP realizados com diferentes teores de MS e de doses de enzimas mostra que: - O aumento do teor em MS de 10 a 12% para os ensaios feitos com 10 mg de proteína/Kg de MS levou a um aumento na produção de etanol, mas não teve nenhum impacto positivo sobre o crescimento de leveduras. - A redução da dose das enzimas de 10 para 7 mg de proteínas enzimáticas/g de MS para os testes realizados a 10% de MS resultou em uma maior limitação em termos de glicose, que se traduz em um consumo mais rápido da xilose e em um fluxo de carbono mais orientado para a produção de biomassa. A diferença de rendimento da hidrólise devido ao declínio da dose de enzima é menor que 2% no final da propagação.[0109] Comparison of the performances obtained for SSP tests carried out with different DM levels and enzyme doses shows that: - The increase in DM content of 10 to 12% for tests carried out with 10 mg of protein/kg of MS led to an increase in ethanol production, but had no positive impact on yeast growth. - Reducing the dose of enzymes from 10 to 7 mg of enzyme proteins/g of DM for the tests carried out at 10% DM resulted in a greater limitation in terms of glucose, which translates into a faster consumption of xylose and a carbon flow more oriented towards biomass production. The difference in hydrolysis yield due to the decline in enzyme dose is less than 2% at the end of propagation.

3.3. Efeito da temperatura3.3. Effect of temperature

[0110] Para observar o efeito da temperatura sobre a eficácia da propagação em SSP, a levedura I-4783 foi propagada a 32 °C sob condições microaeróbias (0,1 WM) no bagaço bruto de palha (a uma razão de 10% de MS), na presença de celulases (na razão de 10 mg de proteínas/g de MS). A cinética de crescimento das leveduras e a produção de etanol, bem como a evolução das concentrações de glicose e xilose durante o ensaio de propagação, estão representadas na figura 7. Resultado: este ensaio de propagação durou 42,6h. Observou-se um abrandamento do crescimento no final da cultura. 12 g/Kg de etanol foram produzidos e, em seguida, parcialmente consumidos. A biomassa final foi estimada em 5,7x108 células/mL.[0110] To observe the effect of temperature on the effectiveness of propagation in SSP, yeast I-4783 was propagated at 32 ° C under microaerobic conditions (0.1 WM) in raw straw bagasse (at a ratio of 10% MS), in the presence of cellulases (at a ratio of 10 mg of proteins/g of MS). The kinetics of yeast growth and ethanol production, as well as the evolution of glucose and xylose concentrations during the propagation test, are represented in figure 7. Result: this propagation test lasted 42.6h. A slowdown in growth was observed at the end of the culture. 12 g/kg of ethanol was produced and then partially consumed. The final biomass was estimated at 5.7x108 cells/mL.

[0111] A figura 8 compara a evolução da população das leveduras, bem como as concentrações de xilose e etanol, para os ensaios de SSP realizados respectivamente a 30 °C e a 32 °C, a 10% de MS e a 10 mg de proteínas/g de MS.[0111] Figure 8 compares the evolution of the yeast population, as well as the concentrations of xylose and ethanol, for the SSP tests carried out respectively at 30 °C and 32 °C, at 10% DM and at 10 mg of proteins/g DM.

[0112] Nenhum efeito positivo foi observado em relação ao crescimento das leveduras.[0112] No positive effects were observed in relation to yeast growth.

[0113] Parece que o aumento da temperatura pode favorecer o consumo de xilose, que resulta em uma mais cinética de produção de etanol mais rápida.[0113] It appears that increasing temperature may favor the consumption of xylose, which results in faster ethanol production kinetics.

[0114] O aumento da temperatura melhora a hidrólise enzimática e aumenta a quantidade de açúcares fermentáveis (de 12%, neste caso). Se o mosto de propagação foi transferido integralmente para semear as fermentações alcoólicas, os açúcares residuais, qualquer que seja sua forma, representaram uma pequena proporção e serão usados durante a fermentação alcoólica.[0114] Increasing the temperature improves enzymatic hydrolysis and increases the amount of fermentable sugars (by 12%, in this case). If the propagation wort was transferred entirely to seed alcoholic fermentations, residual sugars, whatever their form, represented a small proportion and will be used during alcoholic fermentation.

3.4. Teste de robustez do processo: ensaios de SSP na presença de acetato em alta concentração3.4. Process robustness test: SSP tests in the presence of acetate at high concentration

[0115] Para avaliar a robustez do processo de SSP, os testes foram realizados mediante a adição de acetato no meio (QSP (suficiente para) 3 g/Kg) para simular uma toxicidade muito elevada do bagaço pré-processado. Estes ensaios foram realizados em pH 5,0, a 30 °C, com 10% de MS e razões de enzima/substrato iguais a 7 mg de proteínas/g de MS e 10 mg de proteínas/g de MS. O aumento do teor de acetato no meio de cultura de 0,7 g/Kg para 3 g/Kg corresponde a um aumento do teor de ácido acético do bagaço pré-tratado de 3,6 g/Kg para 13,8 g/Kg.[0115] To evaluate the robustness of the SSP process, tests were carried out by adding acetate to the medium (QSP (sufficient for) 3 g/Kg) to simulate a very high toxicity of pre-processed bagasse. These assays were carried out at pH 5.0, at 30 °C, with 10% DM and enzyme/substrate ratios equal to 7 mg of proteins/g of DM and 10 mg of proteins/g of DM. The increase in the acetate content in the culture medium from 0.7 g/Kg to 3 g/Kg corresponds to an increase in the acetic acid content of the pretreated bagasse from 3.6 g/Kg to 13.8 g/Kg .

[0116] Essa última concentração deixa uma grande margem para aumentar o teor de compostos voláteis de substratos pré-tratados ao passar para a escala industrial.[0116] This last concentration leaves a large margin to increase the volatile compound content of pretreated substrates when moving to an industrial scale.

[0117] A cinética de crescimento das leveduras, bem como a evolução das concentrações de xilose e etanol durante os ensaios de propagação realizados com e sem a adição de acetato a 10% de MS e 7 mg de proteínas/g de MS são mostrados na figura 9.[0117] The yeast growth kinetics, as well as the evolution of xylose and ethanol concentrations during propagation tests carried out with and without the addition of acetate at 10% DM and 7 mg of proteins/g of DM are shown in figure 9.

[0118] A comparação das cinéticas de SSP realizadas respectivamente na presença de 0,7 g/Kg ou de 3,0 g/Kg de ácido acético mostra que o aumento da concentração de acetato retardou o uso de xilose e gera um atraso de crescimento visível às 25 h de cultura. O fluxo de carbono é em grande parte devido à produção de etanol. No entanto, a concentração de biomassa desaparece no final da cultura: 8,0.108 células/mL foram obtidas em 42,5 horas para o ensaio em 3,0 g/Kg de acetato, enquanto que 8,3.108 células/mL foram obtidas em 43,9 horas para o ensaio de 0,7 g/Kg de acetato.[0118] Comparison of the SSP kinetics carried out respectively in the presence of 0.7 g/Kg or 3.0 g/Kg of acetic acid shows that the increase in acetate concentration delayed the use of xylose and generated a growth delay visible at 25 h of culture. The carbon flow is largely due to ethanol production. However, the biomass concentration disappears at the end of the culture: 8.0.108 cells/mL were obtained in 42.5 hours for the assay in 3.0 g/Kg of acetate, while 8.3.108 cells/mL were obtained in 43.9 hours for the 0.7 g/kg acetate test.

[0119] As cinéticas de crescimento das leveduras, bem como a evolução das concentrações de xilose e etanol durante os ensaios de propagação realizados com e sem a adição de acetato a 10% de MS e 10 mg de proteínas/g de MS são mostrados na figura 10.[0119] The yeast growth kinetics, as well as the evolution of xylose and ethanol concentrations during propagation tests carried out with and without the addition of acetate at 10% DM and 10 mg of proteins/g of DM are shown in figure 10.

[0120] A comparação das cinéticas de SSP realizadas respectivamente na presença de 0,7 g/Kg ou de 3,0 g/Kg de ácido acético mostra que o aumento da concentração de acetato provocou um atraso de crescimento visível às 30 h de cultura, e que o fluxo de carbono é ligeiramente desviado para a produção de etanol. No final da propagação, o teor de biomassa produzida na presença de 3 g/Kg de acetato excede a referência: 6,9.108 células/mL foram obtidas em 46,7 horas em comparação com 6,5.108 células/mL em 48,1 horas para o ensaio sem a adição de acetato. Esses resultados mostram que o aumento significativo na quantidade de ácido acético no bagaço de palha pré-tratado não prejudica significativamente o desempenho do processo de propagação em SSP. Essa robustez não pode ser esperada do processo de propagação de leveduras no suco de C5, sendo a fermentação de xilose muito mais fortemente afetada do que a fermentação de glicose pela toxicidade do meio de cultura.[0120] Comparison of the SSP kinetics carried out respectively in the presence of 0.7 g/Kg or 3.0 g/Kg of acetic acid shows that the increase in acetate concentration caused a visible growth delay at 30 h of culture , and that the carbon flow is slightly diverted towards ethanol production. At the end of propagation, the biomass content produced in the presence of 3 g/Kg of acetate exceeds the reference: 6.9,108 cells/mL were obtained in 46.7 hours compared to 6.5,108 cells/mL in 48.1 hours for the test without the addition of acetate. These results show that the significant increase in the amount of acetic acid in the pretreated straw bagasse does not significantly impair the performance of the propagation process in SSP. This robustness cannot be expected from the yeast propagation process in C5 juice, with xylose fermentation being much more strongly affected than glucose fermentation by the toxicity of the culture medium.

[0121] Novamente, duas razões de enzimas/substratos foram testadas. Os resultados são consistentes com aqueles obtidos anteriormente (supra), ou seja, a redução da dose de enzimas melhora o desempenho do processo de SSP.[0121] Again, two enzyme/substrate ratios were tested. The results are consistent with those obtained previously (above), that is, reducing the dose of enzymes improves the performance of the SSP process.

Exemplo 4: Comparação dos desempenhos do crescimento de SSP, de acordo com a invenção, com aqueles obtidos com os processos de referênciaExample 4: Comparison of SSP growth performances, according to the invention, with those obtained with reference processes

[0122] A evolução da população de levedura é comparável com a obtida pelos processos de referência, nas condições de temperatura, pH, microaeração e agitação moderada e em taxas de semeadura idênticas. As quantidades de açúcares fermentáveis apresentam a mesma ordem de grandeza.[0122] The evolution of the yeast population is comparable to that obtained by reference processes, under conditions of temperature, pH, microaeration and moderate agitation and at identical seeding rates. The amounts of fermentable sugars are in the same order of magnitude.

4.1. Comparação com a propagação no hidrolisado lignocelulósico (SHF)4.1. Comparison with propagation in lignocellulosic hydrolyzate (SHF)

[0123] A evolução da população de leveduras durante a propagação no hidrolisado lignocelulósico e nos ensaios de SSP, com e sem adição de acetato, a 10% da MS e 7 mg de proteínas/g de MS, é representada na figura 11.[0123] The evolution of the yeast population during propagation in the lignocellulosic hydrolyzate and in the SSP tests, with and without the addition of acetate, at 10% DM and 7 mg of proteins/g of DM, is represented in figure 11.

Resultados e discussãoResults and discussion

[0124] Os respectivos substratos do ensaio de propagação no hidrolisado lignocelulósico e no ensaio de propagação SSP sem a adição de acetato são idênticos, com uma diferença: um foi previamente hidrolisado. O crescimento é mais lento no hidrolisado, e isso desde o início da propagação, podendo ser explicado por um teor de acetato ligeiramente maior devido à hidrólise adicional do substrato no início da cultura (1,0 g/Kg vs 0,7 g/Kg de SSP); a pressão osmótica devido aos açúcares também é maior. Além de sua melhor cinética, a propagação em SSP permite obter uma quantidade de biomassa muito maior (8,3.108 células/mL vs. 3,9.108 células/mL).[0124] The respective substrates of the propagation test in lignocellulosic hydrolyzate and in the SSP propagation test without the addition of acetate are identical, with one difference: one was previously hydrolyzed. Growth is slower in the hydrolyzate, and this from the beginning of propagation, which can be explained by a slightly higher acetate content due to additional hydrolysis of the substrate at the beginning of the culture (1.0 g/Kg vs 0.7 g/Kg of SSP); the osmotic pressure due to sugars is also higher. In addition to its better kinetics, propagation in SSP allows obtaining a much greater amount of biomass (8.3,108 cells/mL vs. 3.9,108 cells/mL).

[0125] Além disso, é surpreendente verificar que o ensaio de propagação em SSP realizado na presença de 3 g/Kg de acetato também é melhor do que o ensaio de referência.[0125] Furthermore, it is surprising to see that the SSP propagation test carried out in the presence of 3 g/kg of acetate is also better than the reference test.

4.2. Comparação com a propagação no suco de C54.2. Comparison with propagation in C5 juice

[0126] A evolução da população de leveduras durante a propagação no suco de C5 e nos ensaios de SSP, com e sem adição de acetato, a 10% da MS e 7 mg de proteínas enzimáticas/g de MS, é representada na figura 12.[0126] The evolution of the yeast population during propagation in C5 juice and in SSP assays, with and without addition of acetate, at 10% of DM and 7 mg of enzymatic proteins/g of DM, is represented in figure 12 .

Resultados e discussãoResults and discussion

[0127] A propagação no suco de C5 tem uma cinética de crescimento significativamente mais lenta do que nos ensaios de propagação em SSP no bagaço bruto, no entanto, o aumento da taxa de crescimento no final da propagação permite atingir um conteúdo final de biomassa equivalente às propagações em SSP. No entanto, se a duração da propagação fosse reduzida em relação com o presente ensaio, a vantagem da propagação em SSP em relação à propagação no suco de C5 aumentaria.[0127] Propagation in C5 juice has significantly slower growth kinetics than in SSP propagation tests in raw bagasse, however, the increase in growth rate at the end of propagation allows reaching an equivalent final biomass content to propagations in SSP. However, if the duration of propagation were reduced in relation to the present assay, the advantage of propagation in SSP over propagation in C5 juice would increase.

[0128] O suco de C5 usado para este ensaio de propagação foi o derivado do mesmo bagaço celulósico de palha de trigo que foi usado para os ensaios de propagação em SSP. Ele foi obtido suspendendo o bagaço celulósico em água, e separando a fase sólida da fase líquida. Esse processo de obtenção do suco de C5, na verdade, extrai todos os elementos solúveis do bagaço pré-tratado; portanto, pode ser considerado e foi verificado que o teor de inibidores é proporcional à concentração de xilose, que torna o suco de C5 o substrato mais concentrado em termos de inibidores. Além disso, o fato de que a absorção de xilose é mais afetada pela toxicidade do meio do que o consumo de glicose e que o aumento da toxicidade do bagaço pré-tratado leva a um aumento mais rápido do teor de inibidores no suco de C5 (porque é proporcional ao conteúdo de xilose) faz com o processo SSP seja mais vantajoso com o aumento da toxicidade do bagaço pré-tratado. Assim, o aumento do teor de acetato de 0,7 g/Kg para 3,0 g/Kg na base da curva de SSP, que afeta ligeiramente a cinética de crescimento em SSP, corresponde a um aumento de teor de acetato de 1,6 g/Kg a cerca de 7 g/Kg no suco de C5, que prejudica fortemente o crescimento da levedura.[0128] The C5 juice used for this propagation test was derived from the same cellulosic wheat straw bagasse that was used for the propagation tests in SSP. It was obtained by suspending cellulosic bagasse in water, and separating the solid phase from the liquid phase. This process of obtaining C5 juice, in fact, extracts all the soluble elements from the pre-treated pomace; therefore, it can be considered and has been verified that the inhibitor content is proportional to the xylose concentration, which makes C5 juice the most concentrated substrate in terms of inhibitors. Furthermore, the fact that xylose absorption is more affected by the toxicity of the medium than glucose consumption and that the increased toxicity of the pretreated pomace leads to a faster increase in the inhibitor content in the C5 juice ( because it is proportional to the xylose content) makes the SSP process more advantageous with the increased toxicity of the pre-treated bagasse. Thus, the increase in acetate content from 0.7 g/kg to 3.0 g/kg at the base of the SSP curve, which slightly affects the growth kinetics in SSP, corresponds to an increase in acetate content of 1. 6 g/Kg to around 7 g/Kg in C5 juice, which strongly impairs yeast growth.

4.3. Síntese e comparação dos desempenhos de propagação4.3. Synthesis and comparison of propagation performances

[0129] A tabela 4 fornece, para cada ensaio de propagação: - A concentração de açúcares empregada no meio de cultura (quantidade total e quantidade fermentável para os ensaios realizados em SSP), - A concentração final na biomassa obtida (em células/mL), - O rendimento de produção de biomassa (relatado em relação ao teor de açúcares fermentáveis e relatado em relação ao teor de MS), - Uma estimativa do rendimento de produção de levedura em g de levedura/g de açúcares fermentáveis. Tabela 4: quantidades de açúcares utilizadas, concentrações de biomassa obtidas e rendimentos da produção de biomassa para os diferentes ensaios de propagação (cél. significa células, massa ini. e massa fin. Significam, respectivamente, massa inicial e massa final). Observações: - O açúcar em potencial é calculado supondo-se um rendimento de 100% de hidrólise da celulose. - A quantidade de açúcares fermentáveis é calculada graças à estimativa da quantidade de celulose residual por hidrólise enzimática total em uma amostra coletada no final da cultura. - Para a estimativa do rendimento de produção de biomassa em g de levedura/g de açúcares fermentáveis, a conversão é feita assumindo que 1 g de levedura contém 4,8x1010 células (medido no final da propagação no suco de C5). - A massa final medida é anormalmente baixa para os ensaios de propagação realizados a 10% de MS com 10 mg de proteína a 30 °C, o que os penaliza ao calcular os rendimentos.[0129] Table 4 provides, for each propagation test: - The concentration of sugars used in the culture medium (total amount and fermentable amount for the tests carried out in SSP), - The final concentration in the biomass obtained (in cells/mL ), - The biomass production yield (reported in relation to fermentable sugar content and reported in relation to DM content), - An estimate of the yeast production yield in g yeast/g fermentable sugars. Table 4: amounts of sugars used, biomass concentrations obtained and biomass production yields for the different propagation tests (cell means cells, initial mass and final mass. They mean, respectively, initial mass and final mass). Observations: - Potential sugar is calculated assuming a 100% cellulose hydrolysis yield. - The amount of fermentable sugars is calculated thanks to the estimation of the amount of residual cellulose by total enzymatic hydrolysis in a sample collected at the end of the culture. - To estimate the biomass production yield in g of yeast/g of fermentable sugars, the conversion is made assuming that 1 g of yeast contains 4.8x1010 cells (measured at the end of propagation in C5 juice). - The final measured mass is abnormally low for propagation tests carried out at 10% DM with 10 mg of protein at 30 °C, which penalizes them when calculating yields.

Resultados e discussãoResults and discussion

[0130] A tabela 4 mostra que a concentração final mais importante, em biomassa, foi obtida com o processo SSP executado a 10% de MS e 7 mg de proteína/g de MS. O teor final de biomassa obtida no suco de C5 é semelhante ao obtido com o processo SSP nas melhores condições, enquanto que a propagação no hidrolisado lignocelulósico resultou em um teor final em biomassa significativamente menor do que o dos outros ensaios.[0130] Table 4 shows that the most important final concentration, in biomass, was obtained with the SSP process carried out at 10% DM and 7 mg of protein/g of DM. The final biomass content obtained in the C5 juice is similar to that obtained with the SSP process under the best conditions, while propagation in the lignocellulosic hydrolyzate resulted in a final biomass content significantly lower than that of the other tests.

[0131] O cálculo de rendimento de produção de levedura é igual a 1,6.1010 células/g de açúcares fermentáveis para o ensaio com o melhor desempenho realizado em SSP com 10% de MS e 7 mg de proteína/g de MS a 30 °C (e 1,5.1010 células/g de açúcares fermentáveis para o ensaio com a maior concentração de ácido acético). O rendimento da propagação no suco de C5 é ligeiramente inferior: 1,4.1010 células/g de açúcares fermentáveis foram obtidas. As outras condições de SSP testadas apresentam rendimentos de produção de levedura próximos de 1,0.1010 células/g de açúcares fermentáveis, enquanto o ensaio de referência feito com hidrolisado lignocelulósico apresenta um rendimento de 5,9.109 células/g de açúcares fermentáveis, cerca de 3 vezes menos que o teste SSP de melhor rendimento.[0131] The yeast production yield calculation is equal to 1.6.1010 cells/g of fermentable sugars for the best performing assay performed in SSP with 10% DM and 7 mg protein/g DM at 30° C (and 1.5.1010 cells/g of fermentable sugars for the assay with the highest concentration of acetic acid). The propagation yield in C5 juice is slightly lower: 1.4.1010 cells/g of fermentable sugars were obtained. The other SSP conditions tested show yeast production yields close to 1.0.1010 cells/g of fermentable sugars, while the reference test carried out with lignocellulosic hydrolyzate shows a yield of 5.9.109 cells/g of fermentable sugars, around 3 times less than the best performing SSP test.

[0132] A fim de comparar com referências conhecidas, o rendimento da biomassa é estimado em g de levedura/g de açúcar fermentável, considerando um número de conversão de células/g de MS obtido no final da propagação alcoólica no suco de C5. De acordo com as informações conhecidas pela pessoa versada na técnica, a propagação de referência no hidrolisado lignocelulósico tem apresenta um rendimento da ordem de 0,12 g/g.[0132] In order to compare with known references, the biomass yield is estimated in g of yeast/g of fermentable sugar, considering a conversion number of cells/g of DM obtained at the end of the alcoholic propagation in the C5 juice. According to information known to the person skilled in the art, the reference propagation in lignocellulosic hydrolyzate has a yield of the order of 0.12 g/g.

[0133] A melhor condição de SSP levou à obtenção de 0,33 g de levedura/g de açúcares fermentáveis. A taxa de multiplicação da levedura na propagação é, então, superior a 40 (concentração final estimada de 17,4 g/Kg de levedura).[0133] The best SSP condition led to obtaining 0.33 g of yeast/g of fermentable sugars. The yeast multiplication rate in propagation is then greater than 40 (estimated final concentration of 17.4 g/kg of yeast).

[0134] Em termos de produtividade, o procedimento de propagação em SSP é também o mais eficiente, com efeito:[0134] In terms of productivity, the propagation procedure in SSP is also the most efficient, in effect:

[0135] A produtividade volumétrica média é estimada em 0,38 g de levedura/kg de mosto/h para o processo de SSP contra, respectivamente, 0,37 g/Kg/h e 0,17 g/Kg/h para as propagações no suco de C5 e no hidrolisado lignocelulósico.[0135] The average volumetric productivity is estimated at 0.38 g of yeast/kg of wort/h for the SSP process versus, respectively, 0.37 g/Kg/h and 0.17 g/Kg/h for propagations in C5 juice and lignocellulosic hydrolyzate.

[0136] A produtividade volumétrica média nas 30 primeiras horas de cultura é estimada em 0,33 g de levedura/kg de mosto/h para o processo de SSP contra 0,26 g/Kg/h para as propagações no suco de C5 e no hidrolisado lignocelulósico.[0136] The average volumetric productivity in the first 30 hours of culture is estimated at 0.33 g of yeast/kg of wort/h for the SSP process versus 0.26 g/kg/h for propagations in C5 juice and in lignocellulosic hydrolyzate.

Exemplo 5: Validação do processo de propagação de SSP: desempenhos da levedura propagada em fermentação SSCFExample 5: Validation of the SSP propagation process: performances of yeast propagated in SSCF fermentation

[0137] A presente invenção é um elo intermediário essencial em um processo global industrial de fermentação alcoólica. Este exemplo destina-se a validar que a levedura obtida no final de uma propagação de acordo com a invenção é eficaz para ser usada na fermentação alcoólica com substrato lignocelulósico.[0137] The present invention is an essential intermediate link in a global industrial alcoholic fermentation process. This example is intended to validate that the yeast obtained at the end of a propagation according to the invention is effective for use in alcoholic fermentation with lignocellulosic substrate.

[0138] A levedura I-4783 propagada em SSP foi usada para semear uma fermentação SSCF (sacarificação e cofermentação simultâneas); as duas culturas foram feitas em bagaço bruto de palha. A SSCF foi realizada a 24% de MS com 10 mg de proteína/g de MS, com a adição de acetato no meio (QSP 4 g/Kg). O reator foi semeado com 2,4.107 células/mL (0,5 g/Kg de levedura) e o meio foi mantido em pH 5,5 e a 33 °C durante 142,5 h. A evolução das concentrações de glicose, xilose e etanol durante esta fermentação é ilustrada na figura 13.[0138] Yeast I-4783 propagated in SSP was used to seed an SSCF fermentation (simultaneous saccharification and cofermentation); Both cultures were carried out on raw straw bagasse. SSCF was performed at 24% DM with 10 mg of protein/g of DM, with the addition of acetate in the medium (QSP 4 g/Kg). The reactor was seeded with 2.4,107 cells/mL (0.5 g/kg of yeast) and the medium was maintained at pH 5.5 and 33 °C for 142.5 h. The evolution of glucose, xylose and ethanol concentrations during this fermentation is illustrated in figure 13.

[0139] Essa fermentação de SSCF apresenta uma cinética coerente com o que é normalmente obtido. A levedura consome muito rapidamente a glicose liberada pelas enzimas, de modo que a concentração de glicose é nula nas primeiras horas de fermentação. A xilose liberada é consumida principalmente em 72 h; a cinética da produção de etanol é, em seguida, limitada pela hidrólise enzimática. O teor final do etanol é igual a 67,4 g/Kg, que corresponde a uma diferença 5% menor em relação à concentração obtida depois da SSCF sem a adição de acetato com a levedura I-4783 semeada em suco de C5. Esse resultado permite concluir que o processo de propagação de acordo com a invenção não prejudica o desempenho da levedura produzida em relação a um processo de propagação no suco de C5 comumente usado.[0139] This SSCF fermentation presents kinetics consistent with what is normally obtained. Yeast consumes the glucose released by the enzymes very quickly, so that the glucose concentration is zero in the first hours of fermentation. The released xylose is mainly consumed within 72 h; The kinetics of ethanol production are then limited by enzymatic hydrolysis. The final ethanol content is equal to 67.4 g/kg, which corresponds to a 5% lower difference in relation to the concentration obtained after SSCF without the addition of acetate with yeast I-4783 sown in C5 juice. This result allows us to conclude that the propagation process according to the invention does not impair the performance of the yeast produced in relation to a propagation process in commonly used C5 juice.

Claims (8)

1. Método de propagação de leveduras para uso na produção de um produto da fermentação a partir de biomassa lignocelulósica, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a. Dispor de um reator, b. Colocar em contato no dito reator: - uma população de leveduras capaz de metabolizar pentoses e hexoses, a uma razão de 0,2 a 2,0 g de matéria seca de leveduras por Kg de meio completo preparado, em que cepas de leveduras são selecionadas dentre as cepas depositadas no CNCM em 26 de junho de 2013 sob os números de acesso I-4624, I4625, I-4626, I-4627 e I-4783, - massa bruta obtida do pré-tratamento da biomassa lignocelulósica, à razão de um teor de matéria seca (MS) entre 8 e 15%; - nutrientes; e - celulases, à razão de 5 a 15 mg de proteína por grama de MS, c. incubar a mistura a uma temperatura compreendida entre 25°C e 38°C, preferencialmente, entre 28°C e 33°C, em microaerobiose, em que a sacarificação da massa bruta e o crescimento das leveduras são realizados simultaneamente.1. Yeast propagation method for use in the production of a fermentation product from lignocellulosic biomass, characterized by the fact that it comprises the steps of: a. Have a reactor, b. Bring into contact in said reactor: - a population of yeasts capable of metabolizing pentoses and hexoses, at a rate of 0.2 to 2.0 g of yeast dry matter per kg of prepared complete medium, in which yeast strains are selected among the strains deposited at the CNCM on June 26, 2013 under accession numbers I-4624, I4625, I-4626, I-4627 and I-4783, - gross mass obtained from the pre-treatment of lignocellulosic biomass, at the rate of a dry matter (DM) content between 8 and 15%; - nutrients; and - cellulases, at a rate of 5 to 15 mg of protein per gram of DM, c. incubate the mixture at a temperature between 25°C and 38°C, preferably between 28°C and 33°C, in microaerobiosis, in which saccharification of the raw dough and yeast growth are carried out simultaneously. 2. Método de propagação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as pentoses são xilose e/ou arabinose.2. Propagation method according to claim 1, characterized by the fact that the pentoses are xylose and/or arabinose. 3. Método de propagação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que a hexose é glicose.3. Propagation method according to any one of claims 1 to 2, characterized in that the hexose is glucose. 4. Método de propagação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a incubação na etapa c. é mantida até uma concentração de células compreendida entre 5,0 x 108 e 1,0 x 109 células por mililitro é obtida.4. Propagation method according to any one of claims 1 to 3, characterized by the fact that the incubation in step c. is maintained until a cell concentration of between 5.0 x 108 and 1.0 x 109 cells per milliliter is obtained. 5. Método de propagação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as leveduras são semeadas em uma razão de 0,3 a 0,6 g/Kg sob a forma de leveduras secas, a massa bruta sendo usada em uma razão de 10% de MS e as celulases a uma razão de 7 mg de proteína por grama de MS, sendo a razão de aeração fixada em 0,1 VVM, a temperatura sendo fixada em 30 °C e o pH do meio sendo fixado em pH 5,0.5. Propagation method according to claim 1, characterized by the fact that the yeasts are sown at a rate of 0.3 to 0.6 g/Kg in the form of dry yeasts, the raw mass being used in a ratio of 10% DM and cellulases at a ratio of 7 mg of protein per gram of DM, with the aeration ratio fixed at 0.1 VVM, the temperature being fixed at 30 °C and the pH of the medium being fixed at pH 5.0. 6. Método de produção de um produto fermentado, a partir de biomassa lignocelulósica, caracterizado pelo fato de compreender, sequencialmente, as etapas de: a. pré-tratamento da biomassa lignocelulósica para obter uma massa bruta, b. colocar em contato uma fração da massa bruta pré- tratada, a uma razão de 10 a 12% de material seco (MS), com (i) uma população de levedura capaz de metabolizar as pentoses e hexoses, (ii) celulases a uma razão de 5 a 15 mg de proteína por grama de MS, (iii) opcionalmente, os nutrientes, em que cepas de leveduras são selecionadas dentre as cepas depositadas no CNCM em 26 de junho de 2013 sob os números de acesso I-4624, I-4625, I-4626, I-4627 e I-4783, c. incubar a mistura a uma temperatura compreendida entre 25°C e 38°C, preferencialmente entre 28°C e 33°C, em microaerobiose, a fim de obter leveduras propagadas a partir de sacarificação e propagação simultânea, até atingir uma concentração celular entre 5,0 x 108 e 1,0 x 109 células por mililitro, d. transferir, na totalidade ou parcialmente, as leveduras propagadas mediante o contato com o mosto de fermentação que compreende uma fonte de pentoses e uma fonte de hexoses, e. realizar a fermentação em condições anaeróbicas ou semiaeróbicas, f. obter o produto fermentado.6. Method of producing a fermented product, from lignocellulosic biomass, characterized by the fact that it comprises, sequentially, the steps of: a. pre-treatment of lignocellulosic biomass to obtain a raw mass, b. put in contact a fraction of the pre-treated raw mass, at a ratio of 10 to 12% dry material (DM), with (i) a population of yeast capable of metabolizing pentoses and hexoses, (ii) cellulases at a ratio 5 to 15 mg of protein per gram of DM, (iii) optionally, nutrients, in which yeast strains are selected from the strains deposited in the CNCM on June 26, 2013 under accession numbers I-4624, I- 4625, I-4626, I-4627 and I-4783, c. incubate the mixture at a temperature between 25°C and 38°C, preferably between 28°C and 33°C, in microaerobiosis, in order to obtain yeasts propagated through saccharification and simultaneous propagation, until reaching a cell concentration between 5 .0 x 108 and 1.0 x 109 cells per milliliter, d. transferring, in whole or in part, the yeast propagated through contact with the fermentation must that comprises a source of pentoses and a source of hexoses, e. carry out fermentation under anaerobic or semi-aerobic conditions, f. obtain the fermented product. 7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a biomassa lignocelulósica é a biomassa de origem vegetal.7. Method, according to claim 6, characterized by the fact that the lignocellulosic biomass is biomass of plant origin. 8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 7, caracterizado pelo fato de que o produto fermentado obtido é o etanol.8. Method according to any one of claims 6 to 7, characterized by the fact that the fermented product obtained is ethanol.