BR112018000542B1 - Agente de ácido ribonucleico de fita dupla para inibição da expressão de transtiretina em uma célula, composição farmacêutica, uso dos anteriores, e método in vitro para inibição da expressão de transtiretina em uma célula - Google Patents

Agente de ácido ribonucleico de fita dupla para inibição da expressão de transtiretina em uma célula, composição farmacêutica, uso dos anteriores, e método in vitro para inibição da expressão de transtiretina em uma célula Download PDF

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Abstract

A presente invenção fornece agentes de iRNA, por exemplo, agentes de iRNA de fita dupla, que alvejam o gene de transtirretina (TTR) e métodos de uso de tais agentes de iRNA para tratar ou prevenir doenças associadas à TTR.

Description

Pedidos Relacionados
[001] Este pedido reivindica o benefício da prioridade ao Pedido de Patente Provisório Norte-americano N° 62/199.563, depositado em 31 de Julho de 2015, e ao Pedido de Patente Provisório Norte- americano N° 62/287.518, depositado em 27 de Janeiro de 2016. Os conteúdos completos de cada dentre os pedidos anteriores estão aqui incorporados por referência.
[002] Este pedido está relacionado ao Pedido de Patente Provisório Norte-americano N° 61/881.257, depositado em 23 de Setembro de 2013, e o Pedido Internacional No. PCT/US 2014/056923, depositado em 23 de Setembro de 2014, os conteúdos completos de cada dentre os quais estão aqui incorporados por referência. Além disso, este pedido está relacionado ao Pedido Provisório Norte-americano No. 61/561.710, depositado em 18 de Novembro de 2011, Pedido Internacional No. PCT/US 2012/065601, depositado em 16 de Novembro de 2012, Pedido Provisório Norte-americano No. 61/615.618, depositado em 26 de Março de 2012, Pedido provisório Norte-americano No. 61/680.098, depositado em 6 de Agosto de 2012, Pedido Norte- americano No. 14/358.972, depositado em 16 de Maio de 2014 e Pedido Internacional No. PCT/US2012/065691, depositado em 16 de Novembro de 2012, os conteúdos completos de cada um dos quais são por este meio incorporado aqui por referência.
Listagem de Sequência
[003] O pedido presente contém uma Listagem de Sequência que foi submetida eletronicamente em formato ASCII e está incorporada por referência na sua totalidade. A referida cópia de ASCII, criada em 8 de Julho de 2016, é chamada 121301-03020_SL.txt e tem um tamanho de 68.289 bytes.
Antecedentes da Invenção
[004] Transtiretina (TTR) (também conhecida como pré-albumina) é encontrado no soro e líquido cefalorraquidiano (LCR). A TTR transporta a proteína de ligação ao retinol (RBP) e a tiroxina (T4) e da mesma forma atua como veículo de retinol (vitamina A) através de sua associação com RBP no sangue e no CSF. Transtiretina é nomeada pelo seu transporte de tiroxina e retinol. A TTR também funciona como uma protease e pode clivar proteínas incluindo apoA-I (a apolipopro- teína de HDL principal), o peptídeo β amiloide e o neuropeptídeo Y. Ver Liz, M.A. et al. (2010) IUBMB Life, 62 (6): 429-435.
[005] TTR é um tetrâmero de quatro subunidades idênticas de 127 aminoácidos (monômeros) que são ricos na estrutura de folha beta. Cada monômero tem duas folhas beta de 4 cadeias e a forma de um elipsoide prolado. As interações de folhas beta antiparalelas ligam- se os monômeros nos dímeros. Uma alça curta de cada monômero forma a interação dímero-dímero principal. Estes dois pares de alças separam as folhas beta convexas opostas dos dímeros para formar um canal interno.
[006] O fígado é o principal sítio de expressão de TTR. Outros sítios significativos de expressão incluem o plexo coroide, a retina (particularmente, o epitélio do pigmento retiniano) e o pâncreas.
[007] A transtiretina é um dos, pelo menos, 27 tipos distintos de proteínas que é uma proteína precursora na formação de fibrilas ami- loides. Ver Guan, J. et al. (4 de Novembro de 2011) Current perspectives on cardiac amyiloidosis, Am J Physiol Heart Circ Physiol, doi: 10.1152 / ajpheart.00815.2011. A deposição extracelular de fibrilas amiloides em órgãos e tecidos é a característica da amiloidose. As fibrilas amiloides são compostas por agregados de proteína dobrada, o que pode resultar de um excesso de produção ou de mutações específicas em proteínas precursoras. O potencial amiloidogênico da TTR pode estar relacionado à sua estrutura de folha beta extensa; estudos cristalográficos de raios-X indicam que certas mutações amiloidogêni- cas desestabilizam a estrutura tetramérica da proteína. Veja, por exemplo, Saraiva M.J.M. (2002) Expert Reviews in Molecular Medicine, 4(12):1-11.
[008] A amiloidose é um termo geral para o grupo de doenças amiloides que são caracterizadas por depósitos amiloides. As doenças amiloides são classificadas com base na sua proteína precursora; por exemplo, o nome começa com "A" para amiloide e é seguido por uma abreviatura da proteína precursora, por exemplo, ATTR para transtire- tina amloidogênica. Ibid.
[009] Existem inúmeras doenças associadas à TTR, a maioria das quais são doenças amiloides. A TTR de sequência normal está associada à amiloidose cardíaca em pessoas idosas e é denominada amiloidose sistêmica senil (SSA) (também denominada amiloidose cardíaca senil (SCA) ou amiloidose cardíaca). A SSA é frequentemente acompanhado de depósitos microscópicos em muitos outros órgãos. A amiloidose de TTR se manifesta de várias formas. Quando o sistema nervoso periférico é afetado de forma mais proeminente, a doença é denominada polineuropatia amiloidótica familiar (FAP). Quando o co-ração está envolvido principalmente, porém, o sistema nervoso não está, a doença é chamada de cardiomiopatia amiloidótica familiar (FAC). Um terceiro tipo principal de amiloidose de TTR é a amiloidose leptomeníngea, também conhecida como amiloidose leptomeningeal ou meningocerebrovascular, amiloidose do sistema nervoso central (SNC) ou forma VII de amiloidose. As mutações na TTR também po- dem causar opacidades vítreas amiloidóticas, síndrome do túnel do carpo e hipertiroxinemia eutireoidea, que é uma doença não amiloidó- tica que se pensa ser secundária a uma associação aumentada de de tiroxina com TTR devido a uma molécula de TTR mutante com afinidade aumentada para tiroxina Verm por exemplo, Moses et al. (1982) J. Clin. Invest., 86, 2025-2033
[0010] As proteínas amiloidogênicas anormais podem ser herdadas ou adquiridas através de mutações somáticas. Guan, J. et al. (Nov. 4, 2011) Current perspectives on cardiac amyloidosis, Am J Physiol Heart Circ Physiol, doi:10.1152/ajpheart.00815.2011. ATTR associada à transtiretina é a forma mais frequente de amiloidose sistêmica hereditária. Lobato, L. (2003) J. Nephrol., 16: 438-442. As mutações de TTR aceleram o processo de formação de amiloide de TTR e são o fator de risco mais importante para o desenvolvimento de ATTR. Mais de 85 variantes de TTR amiloidogênicas são conhecidas por causar amiloidose familiar sistêmica. As mutações de TTR geralmente dão origem à deposição de amiloide sistêmica, com envolvimento particular do sistema nervoso periférico, embora algumas mutações estejam associadas a cardiomiopatia ou opacidades vítreas. Ibid.
[0011] A mutação V30M é a mutação TTR mais prevalente. Veja, por exemplo, Lobato, L. (2003) J Nephrol, 16: 438-442. A mutação V122I é carregada por 3,9 % da população Afro-Americana e é a causa mais comum da FAC. Jacobson, D.R. et al. (1997) N. Engl. J. Med. 336 (7): 466-73. Estima-se que o SSA afeta mais de 25 % da população com mais de 80 anos. Westermark, P. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (7): 2843-5.
[0012] Consequentemente, há uma necessidade na técnica por tratamentos efetivos para doenças associadas à TTR.
Sumário da Invenção
[0013] A presente invenção fornece agentes de RNAi, por exemplo, agentes de RNAi de fita dupla e composições alvejando o gene de Transtretina (TTR). A presente invenção também fornece métodos para inibir a expressão de TTR e métodos de tratamento ou prevenção de uma doença associada à TTR em um indivíduo usando os agentes de RNAi, por exemplo, agentes de RNAi de fita dupla, da invenção. A presente invenção baseia-se, pelo menos em parte, na descoberta de que os agentes de RNAi em que substancialmente todos os nucleotídeos na fita senso e substancialmente todos os nucleotídeos da fita antissenso são nucleotídeos modificados e que não compreendem mais do que 8 modificações de 2’-flúor na fita senso, não mais do que 6 modificações de 2’-flúor na fita antissenso, duas ligações de fosforotioato na extremidade 5’ da fita senso, duas ligações de fosforotioato na extremidade 5’ da fita antissenso, e um ligante, por exemplo, um ligante de GalNAc3, são aqui mostrados serem eficazes no silenciamento da atividade do gene de TTR. Esses agentes mostram uma atividade de silenciamento de gene de TTR surpreendentemente realçada. Sem pretender ser limitado pela teoria, acredita-se que uma combinação ou subcombinação das modificações anteriores e os locais alvo específicos nestes agentes de RNAi conferem aos agentes de RNAi da invenção eficácia, estabilidade, potência e durabilidade melhoradas.
[0014] Por conseguinte, em um aspecto, a presente invenção fornece agentes de ácido ribonucleico de fita dupla (RNAi) para inibir a expressão de transtiretina (TTR) em uma célula, em que o agente de RNAi compreende uma fita senso complementar a uma fita antissenso, em que a fita antissenso compreende uma região complementar à SEQ ID NO: 2 (5’- UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA -3’), em que cada fita tem cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos no comprimento, em que substancialmente todos os nucleotídeos da fita senso e substancialmente todos os nucleotídeos da fita antissenso são nucleotídeos modificados, em que a fita senso não possui mais de 8 modificações de 2’-fluoro; em que a fita antissenso compreende não mais do que 6 modificações de 2’-fluoro; em que a fita senso e a fita antissenso compreendem cada qual independentemente duas ligações de fosforotioato no terminal 5’; e em que a fita senso é conjugada com pelo menos um ligante.
[0015] Em uma modalidade, e em que o agente de RNAi de fita dupla é representado pela fórmula (IIIe): senso: 5’- Na-YYY-Nb - 3’ antissenso: 3’-np’-Na’ - Y’Y’Y’-Nb’-5’(IIIe)
[0016] em que:
[0017] np’ é uma projeção de 2 nucleotídeos e cada nucleotídeo dentro de np' está ligado a um nucleotídeo adjacente através de uma ligação de fosforotioato;
[0018] cada Na, Nb, Na’ e Nb’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 0-25 nucleotídeos que são modificados ou não modificados ou suas combinações, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de forma diferente;
[0019] YYY e Y’Y’Y ‘representam cada qual independentemente um motif de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos.
[0020] Em uma modalidade, o motif YYY ocorre no ou perto do sítio de clivagem da fita senso. Em uma modalidade, o motif Y’Y’Y ‘ocorre nas posições 11, 12 e 13 da fita antissenso a partir da extremidade 5’.
[0021] Em uma modalidade, os nucleotídeos Y contêm uma modificação de 2’-fluoro.
[0022] Em uma modalidade, os nucleotídeos Y ‘contêm uma modificação de 2’-O-metila.
[0023] A região de fita dupla pode ter 15 a 30 nucleotídeos no comprimento, 17-23 pares de nucleotídeos no comprimento, 17-25 pares de nucleotídeos no comprimento, 23-27 pares de nucleotídeos no comprimento, 19-21 pares de nucleotídeos no comprimento, ou 2123 pares de nucleotídeos no comprimento.
[0024] Cada fita do agente de RNAi de fita dupla pode ter 15-30 nucleotídeos ou 19-30 nucleotídeos.
[0025] Em uma modalidade, as modificações nos nucleotídeos são selecionadas a partir do grupo que consiste em um desoxinucleotídeo, um nucleotídeo de desoxitimina de terminal 3’ (dT), um nucleotídeo modificado por 2’-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2’-fluoro, um nucleotídeo modificado por 2’-desóxi, um nucleotídeo bloqueado, um nucleotídeo desbloqueado, um nucleotídeo conformacionalmente restrito, um nucleotídeo de etila constrangido, um nucleotídeo abásico, um nucleotídeo de 2’-amino-modificado, um nucleotídeo modificado por 2’-O-alila, nucleotídeo modificado por 2’-C-alquila, nucleotídeo modificado por 2’-hidróxi, um nucleotídeo modificado por 2’-metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2’-O-alquila, um nucleotídeo de morfolino, um fosforamidato, uma base não natural compreendendo nucleotídeo, um nucleotídeo modificado por tetra-hidropirano, um nucleotídeo modificado por 1,5-anidro-hexitol, um nucleotídeo modificado por ciclo-hexenila, um nucleotídeo compreendendo um grupo fosforotioato, um nucleotídeo compreendendo um grupo metilfosfonato, um nucleotídeo compreendendo um 5’-fosfato e um nucleotídeo compreendendo uma mímica de 5’ -fosfato, e suas combinações.
[0026] Em uma modalidade, as modificações nos nucleotídeos são modificações de 2’-O-metila ou 2’-fluoro.
[0027] A fita senso pode compreender não mais do que 7 modificações de 2’-fluoro, não mais do que 6 modificações de 2’-fluoro, não mais do que 5 modificações de 2’-fluoro, não mais do que 4 modificações de 2’-fluoro, não mais do que 3 modificações de 2’- fluoro, ou não mais do que 2 modificações de 2’-fluoro.
[0028] A fita antissenso pode compreender não mais do que 5 modificações de 2’-fluoro, não mais do que 4 modificações de 2’-fluoro, não mais do que 3 modificações de 2’-flúor ou não mais do que 2 modificações de 2’-fluoro.
[0029] Em uma modalidade, o agente de RNAi de fita dupla compreende ainda um 5’-fosfato ou uma mímica de 5’-fosfato no nucleotídeo 5’ da fita antissenso. Em outra modalidade, o agente de RNAi de fita dupla compreende ainda uma mímica de 5’- fosfato no nucleotídeo 5’ da fita antissenso.
[0030] Em uma modalidade, o mímico de 5’-fosfato é um 5’-vinil fosfato (5’-VP).
[0031] Em uma modalidade, o ligante é um ou mais derivados de GalNAc ligados através de um ligante ramificado bivalente ou trivalente. Em outra modalidade, o ligante é
Figure img0001
[0032] Em uma modalidade, o ligante é ligado à extremidade 3’ da fita senso.
[0033] Em uma modalidade, o agente de RNAi de fita dupla é conjugado com o ligante como mostrado no esquema seguinte
Figure img0002
[0034] em que X é O ou S.
[0035] Em uma modalidade, as fitas antissenso compreendem uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo consistindo em
[0036] 5’- usCfsuugguuacaugAfaaucccasusc - 3’ (SEQ ID NO: 6),
[0037] 5’- usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3’ (SEQ ID NO: 7),
[0038] 5’- UfsCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3’ (SEQ ID NO: 8) e
[0039] 5’- VPusCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3’ (SEQ ID NO: 9), em que a, c, g e u são 2’-O-metila (2’-OMe) A, C, G ou U; Af, Cf, Gf e Uf são 2’-flúor A, C, G ou U; e s é uma ligação de fosforotioato; e VP é uma mímica de 5’-fosfato.
[0040] Em uma modalidade, as fitas de senso e antissenso compreendem as sequências de nucleotídeo selecionadas a partir do grupo consistindo em
[0041] 5’- usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga - 3’ (SEQ ID NO: 10) e
[0042] 5’- usCfsuugguuacaugAfaaucccasusc - 3’ (SEQ ID NO: 6);
[0043] 5’- UsgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga - 3’ (SEQ ID NO: 10) e
[0044] 5’- usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3’ (SEQ ID NO: 7);
[0045] 5’- usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga - 3’ (SEQ ID NO: 10) e
[0046] 5’- UfsCuguugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3’ (SEQ ID NO: 8); e
[0047] 5’- usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga - 3’ (SEQ ID NO: 10) e
[0048] 5’- VPusCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3’ (SEQ ID NO: 9), em que a, c, g e u são 2’-O-metila (2’-OMe ) A, C, G ou U; Af, Cf, Gf e Uf são 2’-flúor A, C, G ou U; e s é uma ligação de fosforotioato; e VP é uma mímica de 5’-fosfato. Em outra modalidade, as fitas de senso e antissenso compreendem as sequências de nucleotídeo 5’-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga - 3’ (SEQ ID NO: 10) e 5’- usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3’ (SEQ ID NO: 7), em que a, c, g e u são 2’-O-metila (2’-OMe) A, C, G ou U; Af, Cf, Gf e Uf são 2’-flúor A, C, G ou U; e s é uma ligação de fosforotioato. Em ainda outra modalidade, o agente de RNAi é selecionado a partir do grupo de qualquer um dos agentes de RNAi listados em qualquer uma das Tabelas 1 e 3. Em ainda outra modalidade, o agente de RNAi é AD- 65492.
[0049] Em um aspecto, a presente invenção fornece agentes de ácido ribonucleico de fita dupla (RNAi) para inibir a expressão de transtiretina (TTR) em uma célula, em que o agente de RNAi compreende uma fita senso complementar a uma fita antissenso, em que a fita antissenso compreende uma região completamente complementar a SEQ ID NO: 2 (5’- UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA- 3’), em que cada fita tem cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos no comprimento, em que substancialmente todos os nucleotídeos da fita senso e substancialmente todos os nucleotídeos da fita antissenso são nucleotídeos modificados, em que a fita senso não contém mais do que 8 modificações de 2’-fluoro; em que a fita antissenso compreende não mais do que 6 modificações de 2’-fluoro; em que a fita senso e a fita antissenso compreendem cada qual independentemente duas ligações de fosforotioato no terminal 5’; e em que a fita senso é conjugada com pelo menos um ligante, em que o ligante é um ou mais derivados de GalNAc ligados através de um ligante ramificado bivalente ou trivalente.
[0050] Em uma modalidade, o agente de RNAi de fita dupla é representado pela fórmula (IIIe): senso: 5’- Na-YYYY - Nb - 3’ antissenso: 3 ‘- np’-Na’- Y’Y’Y’-Nb’ - 5’ (IIIe)
[0051] em que:
[0052] np’ é uma projeção de 2 nucleotídeos e cada nucleotídeo dentro de np’ é ligado a um nucleotídeo adjacente através de uma ligação de fosforotioato;
[0053] cada Na, Nb, Na’ e Nb’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 8-10 nucleotídeos que são modificados ou não modificados ou suas combinações, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de forma diferente;
[0054] YYY e Y’Y’Y’ representam cada independentemente um motif de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, e em que as modificações são modificações 2’-O-metila ou 2’-fluoro.
[0055] A presente invenção também fornece células que contem os agentes de RNAi de fita dupla da invenção, as células compreendendo os vetores da invenção, e composições farmacêuticas compreendendo os agentes de RNAi de fita dupla da invenção ou os vetores da invenção.
[0056] Em uma modalidade, o agente de RNAi de fita dupla é administrado em uma solução não tamponada, por exemplo, solução salina ou água.
[0057] Em outra modalidade, o agente de RNAi de fita dupla é administrado em uma solução tampão. Em uma modalidade, a solução tampão compreende acetato, citrato, prolamina, carbonato ou fosfato ou qualquer combinação destes. Em outra modalidade, a solução tampão é solução salina tamponada com fosfato (PBS).
[0058] Em outro aspecto, a presente invenção fornece métodos de inibição da expressão de transtiretina (TTR) em uma célula. Os métodos incluem (a) contatar a célula com os agentes de RNAi de fita dupla da invenção, os vetores da invenção ou as composições farmacêuticas da invenção; e (b) manter a célula produzida na etapa (a) durante um tempo suficiente para obter a degradação da transcrição do mRNA de um gene de TTR, inibindo assim a expressão do gene de TTR na célula.
[0059] Em uma modalidade, a célula está dentro de um indivíduo.
[0060] Em uma modalidade, o indivíduo é um humano.
[0061] Em uma modalidade, o indivíduo sofre de doença associada à TTR.
[0062] Em uma modalidade, a expressão de TTR é inibida por pelo menos cerca de 10 %, cerca de 15 %, cerca de 20 %, cerca de 25 %, cerca de 30 %, cerca de 40 %, cerca de 50 %, cerca de 60 %, cerca de 70 %, cerca de 80 %, cerca de 90 %, cerca de 95 %, cerca de 98 % ou cerca de 100 %.
[0063] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece métodos de tratar um indivíduo que possui um transtorno associado à transtiretina (TTR), administrando-se ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz dos agentes de RNAi de fita dupla da invenção, ou os vetores da invenção, ou as composições farmacêuticas da invenção, tratando desse modo o indivíduo.
[0064] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece métodos de profilaticamente tratar um indivíduo em risco de desenvolver um transtorno associado à transtiretina (TTR), administrando-se ao indivíduo uma quantidade profilaticamente eficaz dos agentes de RNAi de fita dupla da invenção ou os vetores da invenção, ou as composições farmacêuticas da invenção, desse modo tratando de forma profilática o indivíduo.
[0065] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece métodos de tratar um indivíduo com transtorno associado à transtiretina (TTR). Os métodos incluem administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de RNAi de fita dupla, em que o agente de RNAi de fita dupla compreende uma fita senso complementar a uma fita antissenso, em que a fita antissenso compreende uma região complementar de SEQ ID NO: 2 (5’- UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA -3’), em que cada fita tem cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos no comprimento, em que substancialmente todos os nucleotídeos da fita senso e substancialmente todos os nucleotídeos da fita antissenso são nucleotídeos modificados, em que a fita senso compreende não mais do que 8 modificações de 2’-fluoro; em que a fita antissenso compreende não mais do que 6 modificações de 2’-fluoro; em que a fita senso e a fita antissenso compreendem cada qual independentemente duas ligações de fosforotioato no terminal 5’; e em que a fita senso é conjugada com pelo menos um ligante.
[0066] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece métodos de profilaticamente tratar um indivíduo em risco de desenvolver um transtorno associado à transtiretina (TTR). Os métodos incluem a administração ao indivíduo de uma quantidade profilática efetiva de um agente de RNAi de fita dupla, em que o agente de RNAi de fita dupla compreende uma fita senso complementar a uma fita antissenso, em que a fita antissenso compreende uma região complementar de SEQ ID NO: 2 (5’- UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA -3’), em que cada fita tem cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos no comprimento, em que substancialmente todos os nucleotídeos da fita senso e substancialmente todos os nucleotídeos da fita antissenso são nucleotídeos modificados, em que a fita senso não compreende mais do que 8 modificações de 2’-fluoro; em que a fita antissenso compreende não mais do que 6 modificações de 2’-fluoro; em que a fita senso e a fita antissenso compreendem cada qual independentemente duas ligações de fosforotioato no terminal 5’; e em que a fita senso é conjugada com pelo menos um ligante.
[0067] Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de reduzir, desacelerar ou interromper uma Pontuação de Comprometimento de Neuropatia (NIS) ou um NIS modificado (mNIS+7) em um indivíduo tendo transtorno associado à transtiretina (TTR). Os métodos incluem administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz dos agentes de RNAi de fita dupla da invenção, ou os vetores da invenção, ou as composições farmacêuticas da invenção, reduzindo, desacelerando ou interrompendo uma Pontuação de Comprometimento de Neuropatia (NIS) ou um NIS modificado (mNIS + 7) no indivíduo.
[0068] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece métodos de reduzir, desacelerar ou interromper uma Pontuação de Comprometimento de Neuropatia (NIS) ou um NIS modificado (mNIS + 7), um indivíduo com transtretina associada à transtiretina (TTR). Os métodos incluem administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de RNAi de fita dupla, em que o agente de RNAi de fita dupla compreende uma fita senso complementar a uma fita antissenso, em que a referida fita antissenso compreende uma região complementar à SEQ ID NO: 2, em que cada fita é de cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos no comprimento, em que substancialmente todos os nucleotídeos da fita senso e substancialmente todos os nucleotídeos da fita antissenso são nucleotídeos modificados, em que a fita senso não compreende mais do que 8 modificações de 2’-fluoro; em que a fita antissenso compreende não mais do que 6 modificações de 2’-fluoro; em que a fita senso e a fita antissenso compreendem cada qual independentemente duas ligações de fosforotioato no terminal 5’; e em que a fita senso é conjugada com pelo menos um ligante.
[0069] Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos para aumentar um teste de caminhada de 6 minutos (6MWT) em um indivíduo tendo um transtorno associado à transtiretina (TTR). Os métodos incluem administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz dos agentes de RNAi de fita dupla da invenção, ou os vetores da invenção, ou as composições farmacêuticas da invenção, desse modo aumentando um teste de caminhada de 6 minutos (6MWT) no indivíduo.
[0070] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece métodos para aumentar um teste de caminhada de 6 minutos (6MWT) em um indivíduo com transtorno associado à transtiretina (TTR). Os métodos incluem administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de RNAi de fita dupla, em que o agente de RNAi de fita dupla compreende uma fita senso complementar a uma fita antissenso, em que a referida fita antissenso compreende uma região complementar à SEQ ID NO: 2, em que cada fita é de cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos no comprimento, em que substancialmente todos os nucleotídeos da fita senso e substancialmente todos os nucleotídeos da fita antissenso são nucleotídeos modificados, em que a fita senso não compreende mais do que 8 modificações de 2’-fluoro; em que a fita antissenso compreende não mais do que 6 modificações de 2’-fluoro; em que a fita senso e a fita antissenso compreendem cada qual independentemente duas ligações de fosforotioato no terminal 5’; e em que a fita senso é conjugada com pelo menos um ligante.
[0071] Em uma modalidade, o agente de RNAi de fita dupla é representado pela fórmula (IIIe): senso: 5’- Na-YYYY -Nb -3’ antissenso: 3 ‘- np’-Na’- Y’Y’Y’-Nb’ -5’(IIIe)
[0072] em que:
[0073] np’ é uma projeção de 2 nucleotídeos e cada nucleotídeo dentro de np’ está ligado a um nucleotídeo adjacente através de uma ligação de fosforotioato;
[0074] cada Na, Nb, Nb e Nb’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 0-25 nucleotídeos que são modificados ou não modificados ou suas combinações, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de forma diferente;
[0075] YYY e Y’Y’Y ‘representam cada qual independentemente um motif de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos.
[0076] Em uma modalidade, o indivíduo é humano.
[0077] Em uma modalidade, o indivíduo é um indivíduo que sofre de uma doença associada à TTR. Em outra modalidade, o indivíduo é um indivíduo em risco de desenvolver uma doença associada à TTR. Em uma modalidade, o indivíduo em risco de desenvolver uma doença associada à TTR possui uma mutação do gene de TTR associada ao desenvolvimento de uma doença associada à TTR ou a um indivíduo com antecedentes familiares de doença associada à TTR ou a um indivíduo que tenha sinais ou sintomas que sugerem o desenvolvimento da amiloidose de TTR.
[0078] Em uma modalidade, a doença associada à TTR é selecionada a partir do grupo que consiste em amiloidose sistêmica senil (SSA), amiloidose familiar sistêmica, polineuropatia amiloidótica fami-liar (FAP), miocardiopatia familiar amiloidótica (FAC), amiloidose leptomeningeal/do Sistema Nervoso Central (SNC) e hipertiroxinemia.
[0079] Em uma modalidade, o indivíduo tem uma amiloidose associada à TTR e o método reduz um depósito de TTR amiloide no indivíduo.
[0080] Em uma modalidade, o agente de RNAi de fita dupla é administrado ao indivíduo por meios de administração selecionados a partir do grupo que consiste em subcutânea, intravenosa, intramuscular, intrabronquial, intrapleural, intraperitoneal, intra-arterial, linfática, cerebral e qualquer combinação destas. Em outra modalidade, o agente de RNAi de fita dupla é administrado ao indivíduo por meio de administração subcutânea, intramuscular ou intravenosa. Em ainda outra modalidade, o agente de RNAi de fita dupla é administrado ao indivíduo por meio de administração subcutânea.
[0081] Em uma modalidade, os métodos compreendem ainda a avaliação do nível de expressão de mRNA de TTR ou expressão de proteína TTR em uma amostra derivada do indivíduo.
[0082] Em uma modalidade, a administração do agente de RNAi de fita dupla não resulta em uma resposta inflamatória no indivíduo conforme avaliado com base no nível de uma citoquina ou quimioquina selecionada a partir do grupo que consiste em G-CSF, IFN-y, IL-10, IL- 12 (p70), IL1β, IL-1ra, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, TNFα e quaisquer combinações destes, em uma amostra do indivíduo.
[0083] Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de tratar um indivíduo com transtorno associado à transtiretina (TTR). Os métodos incluem administrar ao indivíduo uma dose fixa de cerca de 12,5 mg a cerca de 200 mg (por exemplo, cerca de 12,5 mg, cerca de 25 mg, cerca de 50 mg, cerca d 75 mg, cerca de 100 mg, cerca de 125 mg, cerca de 150 mg, cerca de 175 mg ou cerca de 200 mg) de um agente de RNAi de fita dupla, em que o agente de RNAi de fita dupla compreende uma fita senso complementar a uma fita antissenso, em que a fita antissenso compreende uma região complementar à SEQ ID NO: 2 (5’- UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA -3’), em que cada fita tem cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos no comprimento, em que substancialmente todos os nucleotídeos da fita senso e substancialmente todos os nucleotídeos da fita antissenso são nucleotídeos modificados, em que a fita senso não compreende mais do que 8 modificações de 2’-fluoro; em que a fita antissenso compreende não mais do que 6 modificações de 2’-fluoro; em que a fita senso e a fita antissenso compreendem cada qual independentemente duas ligações de fosforotioato no terminal 5’; e em que a fita senso é conjugada com pelo menos um ligante.
[0084] Em outro aspecto, a presente invenção fornece métodos de profilaticamente tratar um indivíduo em risco de devolver um transtorno associado à transtiretina (TTR). Os métodos incluem administrar ao indivíduo uma dose fixa de cerca de 12,5 mg a cerca de 200 mg (por exemplo, cerca de 12,5 mg, cerca de 25 mg, cerca de 50 mg, cerca de 75 mg, cerca de 100 mg, cerca de 125 mg, cerca de 150 mg, cerca de 175 mg ou cerca de 200 mg) de um agente de RNAi de fita dupla, em que o agente de RNAi de fita dupla compreende uma fita senso complementar a uma fita antissenso, em que a fita antissenso compreende uma região complementar à SEQ ID NO: 2 (5’- UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA -3’), em que cada fita tem cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos no comprimento, em que substancialmente todos os nucleotídeos da fita senso e substancialmente todos os nucleotídeos da fita antissenso são nucleotídeos modificados, em que a fita senso não compreende mais do que 8 modificações de 2’-fluoro; em que a fita antissenso compreende não mais do que 6 modificações de 2’-fluoro; em que a fita senso e a fita antissenso compreendem cada qual independentemente duas ligações de fosforotioato no terminal 5’; e em que a fita senso é conjugada com pelo menos um ligante.
[0085] Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de tratar um indivíduo com transtorno associado à transtiretina (TTR). Os métodos incluem administrar ao indivíduo uma dose de cerca de 0,15 mg/kg a cerca de 2,5 mg/kg de (por exemplo, cerca de 0,15 mg/kg, cerca de 0,3 mg/kg, cerca de 0,6 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 1,25 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 2,5 mg/kg, ou cerca de 3 mg/kg) de um agente de RNAi de fita dupla, em que o agente de RNAi de fita dupla compreende uma fita senso complementar a uma fita antissenso, em que a fita antissenso inclui uma região complementar à SEQ ID NO: 2 (5’- UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA -3’), em que cada fita tem cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos no comprimento, em que substancialmente todos os nucleotídeos da fita senso e substancialmente todos os nucleotídeos da fita antissenso são nucleotídeos modificados, em que a fita senso não contém mais do que 8 modificações de 2’-fluoro; em que a fita antissenso compreende não mais do que 6 modificações de 2’-fluoro; em que a fita senso e a fita antissenso compreendem cada qual independentemente duas ligações de fosforotioato no terminal 5’; e em que a fita senso é conjugada a pelo menos um ligante.
[0086] Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de profilaticamente tratar um indivíduo em risco de desenvolver um transtorno associado à transtiretina (TTR). Os métodos incluem administrar ao indivíduo uma dose de cerca de 0,15 mg/kg a cerca de 2,5 mg/kg de (por exemplo, cerca de 0,15 mg/kg, cerca de 0,3 mg/kg, cerca de 0,6 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 1,25 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 2,5 mg/kg, ou cerca de 3 mg/kg) de um agente de RNAi de fita dupla, em que o agente de RNAi de fita dupla compreende uma fita senso complementar a uma fita antissenso, em que a fita antissenso inclui uma região complementar à SEQ ID NO: 2 (5’- UGGGAUUU- CAUGUAACCAAGA -3’), em que cada fita tem cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos no comprimento, em que substancialmente todos os nucleotídeos da fita senso e substancialmente todos os nucleotídeos da fita antissenso são nucleotídeos modificados, em que a fita senso não contém mais do que 8 modificações de 2’-fluoro; em que a fita an- tissenso compreende não mais do que 6 modificações de 2’-fluoro; em que a fita senso e a fita antissenso compreendem cada qual independentemente duas ligações de fosforotioato no terminal 5’; e em que a fita senso é conjugada com pelo menos um ligante.
[0087] Em outro aspecto, a presente invenção fornece métodos de reduzir, desacelerar ou interromper uma Pontuação de Comprometimento de Neuropatia (NIS) ou um NIS modificado (mNIS + 7) em um indivíduo tendo um transtorno associado à transtiretina (TTR). Os métodos incluem administrar ao indivíduo uma dose de cerca de 0,15 mg/kg a cerca de 2,5 mg/kg de (por exemplo, cerca de 0,15 mg/kg, cerca de 0,3 mg/kg, cerca de 0,6 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 1,25 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 2,5 mg/kg, ou cerca de 3 mg/kg) de um agente de RNAi de fita dupla, em que o agente de RNAi de fita dupla compreende uma fita senso complementar a uma fita an- tissenso, em que a fita antissenso inclui uma região complementar à SEQ ID NO: 2 (5’-UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA -3’), em que cada fita tem cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos no comprimento, em que substancialmente todos os nucleotídeos da fita senso e substancialmente todos os nucleotídeos da fita antissenso são nucleotídeos modificados, em que a fita senso não contém mais do que 8 modificações de 2’-fluoro; em que a fita antissenso compreende não mais do que 6 modificações de 2’-fluoro; em que a fita senso e a fita antissenso compreendem cada qual independentemente duas ligações de fosforo- tioato no terminal 5’; e em que a fita senso é conjugada com pelo menos um ligante.
[0088] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece métodos para aumentar um teste de caminhada de 6 minutos (6MWT) em um indivíduo com transtorno associado à transtiretina (TTR). Os métodos incluem administrar ao indivíduo uma dose de cerca de 0,15 mg/kg a cerca de 2,5 mg/kg de (por exemplo, cerca de 0,15 mg/kg, cerca de 0,3 mg/kg, cerca de 0,6 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 1,25 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 2,5 mg/kg, ou cerca de 3 mg/kg) de um agente de RNAi de fita dupla, em que o agente de RNAi de fita dupla compreende uma fita senso complementar a uma fita an- tissenso, em que a fita antissenso inclui uma região complementar à SEQ ID NO: 2 (5’- UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA -3’), em que cada fita tem cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos no comprimento, em que substancialmente todos os nucleotídeos da fita senso e substancialmente todos os nucleotídeos da fita antissenso são nucleotídeos modificados, em que a fita senso não contém mais do que 8 modificações de 2’-fluoro; em que a fita antissenso compreende não mais do que 6 modificações de 2’-fluoro; em que a fita senso e a fita antissenso compreendem cada qual independentemente duas ligações de fosforo- tioato no terminal 5’; e em que a fita senso é conjugada com pelo menos um ligante.
[0089] Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de tratar um indivíduo com transtorno associado à transtiretina (TTR). Os métodos incluem administrar ao indivíduo uma dose fixa de cerca de 10 mg a cerca de 600 mg, cerca de 25 mg a cerca de 500 mg, cerca de 50 mg a cerca de 500 mg ou cerca de 80 mg a cerca de 500 mg, cerca de 25 mg a cerca de 300 mg, cerca de 50 mg a cerca de 300 mg, ou cerca de 80 mg a cerca de 300 mg (por exemplo, cerca de 10, cerca de 20, cerca de 30, cerca de 40, cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 75, cerca de 80, cerca de 90, cerca de 100, cerca de 110, cerca de 120, cerca de 125, cerca de 130, cerca de 140, cerca de 150, cerca de 160, cerca de 170, cerca de 175, cerca de 180, cerca de 190, cerca de 200, cerca de 210, cerca de 220, cerca de 225, cerca de 230, cerca de 240, cerca de 250 mg, cerca de 260, cerca de 270, cerca de 275, cerca de 280, cerca de 290, cerca de 300, cerca de 310, cerca de 320, cerca de 325, cerca de 330, cerca de 340, cerca de 350, cerca de 360, cerca de 370, cerca de 375, cerca de 380, cerca de 390, cerca de 400, cerca de 410, cerca de 420, cerca de 425, cerca de 430, cerca de 440, cerca de 450 mg, cerca de 460, cerca de 470, cerca de 475, cerca de 480, cerca de 490, cerca de 500, cerca de 510, cerca de 520, cerca de 525, cerca de 530, cerca de 540, cerca de 550, cerca de 560, cerca de 570, cerca de 575, cerca de 580, cerca de 590 ou cerca de 600 mg) de um agente de RNAi de fita dupla, em que o agente de RNAi de fita dupla compreende uma fita senso complementar a uma fita antissenso, em que a fita antissenso compreende uma região complementar de SEQ ID NO: 2 (5’- UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA -3’), em que cada fita tem cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos no comprimento, em que substancialmente todos os os nucleotídeos da fita senso e substancialmente todos os nucleotídeos da fita antissenso são nucleotídeos modificados, em que a fita senso não compreende mais do que 8 modificações de 2’-fluoro; em que a fita antissenso compreende não mais do que 6 modificações de 2’-fluoro; em que a fita senso e a fita antissenso compreendem cada qual independentemente duas ligações de fosforotioato no terminal 5’; e em que a fita senso é conjugada com pelo menos um ligante.
[0090] Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de profilaticamente tratar um indivíduo em risco de desenvolver um transtorno associado à transtiretina (TTR). Os métodos incluem administrar ao indivíduo uma dose fixa de cerca de 10 mg a cerca de 600 mg, cerca de 25 mg a cerca de 500 mg, cerca de 50 mg a cerca de 500 mg ou cerca de 80 mg a cerca de 500 mg, cerca de 25 mg a cerca de 300 mg, cerca de 50 mg a cerca de 300 mg, ou cerca de 80 mg a cerca de 300 mg (por exemplo, cerca de 10, cerca de 20, cerca de 30, cerca de 40, cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 75, cerca de 80, cerca de 90, cerca de 100, cerca de 110, cerca de 120, cerca de 125, cerca de 130, cerca de 140, cerca de 150, cerca de 160, cerca de 170, cerca de 175, cerca de 180, cerca de 190, cerca de 200, cerca de 210, cerca de 220, cerca de 225, cerca de 230, cerca de 240, cerca de 250 mg, cerca de 260, cerca de 270, cerca de 275, cerca de 280, cerca de 290, cerca de 300, cerca de 310, cerca de 320, cerca de 325, cerca de 330, cerca de 340, cerca de 350, cerca de 360, cerca de 370, cerca de 375, cerca de 380, cerca de 390, cerca de 400, cerca de 410, cerca de 420, cerca de 425, cerca de 430, cerca de 440, cerca de 450 mg, cerca de 460, cerca de 470, cerca de 475, cerca de 480, cerca de 490, cerca de 500, cerca de 510, cerca de 520, cerca de 525, cerca de 530, cerca de 540, cerca de 550, cerca de 560, cerca de 570, cerca de 575, cerca de 580, cerca de 590 ou cerca de 600 mg) de um agente de RNAi de fita dupla, em que o agente de RNAi de fita dupla compreende uma fita senso complementar a uma fita antissenso, em que a fita antissenso compreende uma região complementar à SEQ ID NO: 2 (5’- UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA -3’), em que cada fita tem cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos no comprimento, em que substancialmente todos os nucleotídeos da fita senso e substancialmente todos os nucleotídeos da fita antissenso são nucleotídeos modificados, em que a fita senso não compreende mais do que 8 modificações de 2’- fluoro; em que a fita antissenso compreende não mais do que 6 modificações de 2’-fluoro; em que a fita senso e a fita antissenso compreendem cada qual independentemente duas ligações de fosforotioato no terminal 5’; e em que a fita senso é conjugada com pelo menos um ligante.
[0091] Em outro aspecto, a presente invenção fornece métodos de reduzir, desacelerar ou interromper uma Pontuação de Comprometimento de Neuropatia (NIS) ou um NIS modificado (mNIS + 7) em um indivíduo tendo um transtorno associado à transtiretina (TTR). Os métodos incluem administrar ao indivíduo uma dose fixa de cerca de 10 mg a cerca de 600 mg, cerca de 25 mg a cerca de 500 mg, cerca de 50 mg a cerca de 500 mg ou cerca de 80 mg a cerca de 500 mg, cerca de 25 mg a cerca de 300 mg, cerca de 50 mg a cerca de 300 mg, ou cerca de 80 mg a cerca de 300 mg (por exemplo, cerca de 10, cerca de 20, cerca de 30, cerca de 40, cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 75, cerca de 80, cerca de 90, cerca de 100, cerca de 110, cerca de 120, cerca de 125, cerca de 130, cerca de 140, cerca de 150, cerca de 160, cerca de 170, cerca de 175, cerca de 180, cerca de 190, cerca de 200, cerca de 210, cerca de 220, cerca de 225, cerca de 230, cerca de 240, cerca de 250, cerca de 260, cerca de 270, cerca de 275, cerca de 280, cerca de 290, cerca de 300, cerca de 310, cerca de 320, cerca de 325, cerca de 330, cerca de 340, cerca de 350, cerca de 360, cerca de 370, cerca de 375, cerca de 380, cerca de 390, cerca de 400, cerca de 410, cerca de 420, cerca de 425, cerca de 430, cerca de 440, cerca de 450, cerca de 460, cerca de 470, cerca de 475, cerca de 480, cerca de 490, cerca de 500, cerca de 510, cerca de 520, cerca de 525, cerca de 530, cerca de 540, cerca de 550, cerca de 560, cerca de 570, cerca de 575, cerca de 580, cerca de 590 ou cerca de 600 mg) de um agente de RNAi de fita dupla, em que o agente de RNAi de fita dupla compreende uma fita senso complementar a uma fita antissenso, em que a fita antissenso compreende uma região complementar à SEQ ID NO: 2 (5’- UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA -3’), em que cada fita tem cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos no comprimento, em que substancialmente todos os nucleotídeos da fita senso e substancialmente todos os nucleotídeos da fita antissenso são nucleotídeos modificados, em que a fita senso não contém mais de 8 modificações de 2’-fluoro; em que a fita antissenso compreende não mais do que 6 modificações de 2’-fluoro; em que a fita senso e a fita antissenso compreendem ca- da qual independentemente duas ligações de fosforotioato no terminal 5’; e em que a fita senso é conjugada com pelo menos um ligante.
[0092] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece métodos para aumentar um teste de caminhada de 6 minutos (6MWT) em um indivíduo tendo um transtorno associado à transtiretina (TTR). Os métodos incluem administrar ao indivíduo uma dose fixa de cerca de 10 mg a cerca de 600 mg, cerca de 25 mg a cerca de 500 mg, cerca de 50 mg a cerca de 500 mg ou cerca de 80 mg a cerca de 500 mg, cerca de 25 mg a cerca de 300 mg, cerca de 50 mg a cerca de 300 mg, ou cerca de 80 mg a cerca de 300 mg (por exemplo, cerca de 10, cerca de 20, cerca de 30, cerca de 40, cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 75, cerca de 80, cerca de 90, cerca de 100, cerca de 110, cerca de 120, cerca de 125, cerca de 130, cerca de 140, cerca de 150, cerca de 160, cerca de 170, cerca de 175, cerca de 180, cerca de 190, cerca de 200, cerca de 210, cerca de 220, cerca de 225, cerca de 230, cerca de 240, cerca de 250, cerca de 260, cerca de 270, cerca de 275, cerca de 280, cerca de 290, cerca de 300, cerca de 310, cerca de 320, cerca de 325, cerca de 330, cerca de 340, cerca de 350, cerca de 360, cerca de 370, cerca de 375, cerca de 380, cerca de 390, cerca de 400, cerca de 410, cerca de 420, cerca de 425, cerca de 430, cerca de 440, cerca de 450, cerca de 460, cerca de 470, cerca de 475, cerca de 480, cerca de 490, cerca de 500, cerca de 510, cerca de 520, cerca de 525, cerca de 530, cerca de 540, cerca de 550, cerca de 560, sobre 570, cerca de 575, cerca de 580, cerca de 590 ou cerca de 600 mg) de um agente de RNAi de fita dupla, em que o agente de RNAi de fita dupla compreende uma fita senso complementar a uma fita antissenso, em que a fita antissenso compreende uma região complementar à SEQ ID NO: 2 (5’ -UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA -3’), em que cada fita tem cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos no comprimento, em que substancialmente todos os nucleotídeos da fita senso e substanci- almente todos os nucleotídeos da fita antissenso são nucleotídeos modificados, em que a fita senso compreende não mais do que 8 modificações de 2’-fluoro; em que a fita antissenso compreende não mais do que 6 modificações de 2’-fluoro; em que a fita senso e a fita antis- senso compreendem cada qual independentemente duas ligações de fosforotioato no terminal 5’; e em que a fita senso é conjugada com pelo menos um ligante.
[0093] Em uma modalidade, o agente de RNAi de fita dupla é representado pela fórmula (IIIe): senso: 5’- Na-YYYY -Nb -3’ antissenso: 3 ‘- np’-Na’- Y’Y’Y’-Nb’ -5’ (IIIe)
[0094] em que:
[0095] np’ é uma projeção de 2 nucleotídeos e cada nucleotídeo dentro de np’ está ligado a um nucleotídeo adjacente através de uma ligação de fosforotioato;
[0096] cada Na, Nb, Nb e Nb’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 0-25 nucleotídeos que são modificados ou não modificados ou suas combinações, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de forma diferente;
[0097] YYY e Y’Y’Y ‘representam cada qual independentemente um motif de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos.
[0098] Em uma modalidade, a fita antissenso compreende uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste em
[0099] 5’- usCfsuugguuacaugAfaaucccasusc - 3’ (SEQ ID NO: 6),
[00100] 5’- usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3’ (SEQ ID NO: 7),
[00101] 5’- UfsCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3’ (SEQ ID NO: 8) e
[00102] 5’- VPusCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3’ (SEQ ID NO: 9), em que a, c, g e u são 2’-O-metila (2’-OMe) A, C, G ou U; Af, Cf, Gf e Uf são 2’-flúor A, C, G ou U; s é uma ligação de fosforotioato; e VP é uma mímica de 5’-fosfato.
[00103] Em uma modalidade, as fitas de senso e antissenso compreendem as sequências de nucleotídeo selecionadas a partir do grupo consistindo em
[00104] 5’- usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga - 3’ (SEQ ID NO: 10) e
[00105] 5’- usCfsuugguuacaugAfaaucccasusc - 3’ (SEQ ID NO: 6);
[00106] 5’- UsgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga - 3’ (SEQ ID NO: 10) e
[00107] 5’- usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3’ (SEQ ID NO: 7);
[00108] 5’- usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga - 3’ (SEQ ID NO: 10) e
[00109] 5’- UfsCuguugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3’ (SEQ ID NO: 8); e
[00110] 5’- usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga - 3’ (SEQ ID NO: 10) e
[00111] 5’- VPusCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3’ (SEQ ID NO: 9), em que a, c, g e u são 2’-O-metila (2’-OMe ) A, C, G ou U; Af, Cf, Gf e Uf são 2’-flúor A, C, G ou U; e s é uma ligação de fosforotioa- to; e VP é uma mímica de 5’-fosfato.
[00112] Em uma modalidade, as fitas de senso e antissenso compreendem as sequências de nucleotídeo
[00113] 5’- usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga - 3’ (SEQ ID NO: 10) e
[00114] 5’-usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3’ (SEQ ID NO: 7),
[00115] em que a, c, g e u são 2’-O-metila (2’-OMe) A, C, G ou U; Af, Cf, Gf e Uf são 2’-flúor A, C, G ou U; e s é uma ligação de fosforoti- oato.
[00116] A dose fixa do agente de RNAi de fita dupla pode ser administrada ao indivíduo aproximadamente uma vez a cada 4 semanas, a cada 5 semanas, a cada seis semanas, a cada oito semanas ou a cada trimestre.
[00117] A dose do agente de RNAi de fita dupla pode ser administrada ao indivíduo aproximadamente uma vez a cada 4 semanas, a cada 5 semanas, a cada seis semanas, a cada oito semanas ou a cada trimestre.
[00118] Em uma modalidade, o agente de RNAi de fita dupla é administrado ao indivíduo aproximadamente uma vez por trimestre.
[00119] Em uma modalidade, o agente de RNAi de fita dupla é administrado cronicamente ao indivíduo.
[00120] Em uma modalidade, o indivíduo é humano.
[00121] Em uma modalidade, o indivíduo é um indivíduo que sofre de uma doença associada à TTR. Em outra modalidade, o indivíduo é um indivíduo em risco de desenvolver uma doença associada à TTR. Em uma modalidade, o indivíduo em risco de desenvolver uma doença associada à TTR carrega uma mutação do gene de TTR associada ao desenvolvimento de uma doença associada à TTR ou a um indivíduo com antecedentes familiares de doença associada à TTR ou indivíduo que tem sinais ou sintomas sugerindo o desenvolvimento da amiloido- se de TTR.
[00122] Em uma modalidade, a doença associada à TTR é selecionada a partir do grupo que consiste em amiloidose sistêmica senil (SSA), amiloidose familiar sistêmica, polineuropatia amiloidótica familiar (FAP), miocardiopatia amiloidótica familiar (FAC), amiloidose lepto- meningeal/do Sistema Nervoso Central (SNC), e hipertiroxinemia.
[00123] Em uma modalidade, o indivíduo tem uma amiloidose associada à TTR e o método reduz um depósito de TTR amiloide no indivíduo.
[00124] Em uma modalidade, o agente de RNAi de fita dupla é administrado ao indivíduo por meios de administração selecionados a partir do grupo que consiste em subcutânea, intravenosa, intramuscular, intrabronquial, intrapleural, intraperitoneal, intra-arterial, linfática, cerebral e qualquer combinação destas. Em outra modalidade, o agente de RNAi de fita dupla é administrado ao indivíduo por meio de administração subcutânea, intramuscular ou intravenosa. Em ainda outra modalidade, o agente de RNAi de fita dupla é administrado ao indivíduo através da administração subcutânea, por exemplo, por autoadmi- nistração, por exemplo, por uma seringa pré-carregada ou por uma seringa de autoinjeção.
[00125] Em uma modalidade, os métodos compreendem ainda a avaliação da nível de expressão de mRNA de TTR ou de expressão de proteína TTR em uma amostra derivada do indivíduo.
[00126] Em uma modalidade, a administração do agente de RNAi de fita dupla não resulta em uma resposta inflamatória no indivíduo conforme avaliado com base no nível de uma citocina ou quimiocina selecionada a partir do grupo que consiste em G-CSF, IFN-y, IL-10, IL- 12 (p70), IL1β, IL-1ra, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MIP-1α, MIP -1β, TNFα e quaisquer combinações destes, em uma amostra do indivíduo.
[00127] Em uma modalidade, o agente adequado para uso nos métodos da invenção é AD-65492. AD-65492 pode ser administrado cronicamente ao indivíduo a cada 4 semanas, a cada 5 semanas, ou a cada seis semanas, ou a cada trimestre.
[00128] Em um aspecto, a presente invenção fornece agentes de ácido ribonucleico de fita dupla (RNAi) para uso na inibição da expressão de transtiretina (TTR) em uma célula. Os agentes incluem uma fita senso complementar a uma fita antissenso, em que as fitas de senso e antissenso compreendem as sequências de nucleotídeo selecionadas a partir do grupo consistindo em qualquer uma das sequências de nu- cleotídeo na Tabela 5.
[00129] Em outro aspecto, a presente invenção fornece agentes de ácido ribonucleico de fita dupla (RNAi ) para uso na inibição da expressão da transtiretina (TTR) em uma célula. Os agentes incluem uma fita senso complementar a uma fita antissenso, a fita antissenso compreendendo uma região de complementaridade que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que se diferem em não mais do que 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências antissenso na Tabela 6, em que substancialmente todos os nucleotídeos da fita senso e substancialmente todos os nucleotídeos da fita antissenso são nucleotídeos modificados; e em que a fita senso é conjugada com pelo menos um ligante.
[00130] A fita senso e antissenso pode compreender sequências de nucleotídeo selecionadas a partir do grupo constituído por qualquer uma das sequências de nucleotídeo da Tabela 6 ou Tabela 7.
[00131] Em um aspecto, a presente invenção fornece agentes de ácido ribonucleico de fita dupla (RNAi) para uso na inibição da expressão de transtiretina ( TTR) em uma célula, em que os agentes de RNAi compreendem uma fita senso complementar a uma fita antissenso, em que a fita senso compreende a sequência de nucleotídeo 5’- usgsgga- uUfuCfAfUfguaaccaaga - 3’ (SEQ ID NO: 10) e a fita antissenso compreende a sequência de nucleotídeo 5’- usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfuc- ccasusc - 3’ (SEQ ID NO: 7), em que a, c, g e u são 2’-O-metil (2’- OMe) A, C, G ou U; Af, Cf, Gf e Uf são 2’-flúor A, C, G ou U; e s é uma ligação de fosforotioato.
[00132] Em outro aspecto, a presente invenção fornece métodos de tratar um indivíduo que sofre de uma doença associada à TTR. Os métodos incluem administrar ao indivíduo uma dose de cerca de 50 mg a cerca de 300 mg de um agente de RNAi de fita dupla, em que o agente de RNAi compreende uma fita senso complementar a uma fita antis- senso, em que a fita senso compreende a sequência de nucleotídeo 5’- usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga - 3’ (SEQ ID NO: 10) e a fita antis- senso compreende a sequência de nucleotídeo 5’- usCfsuugG- fuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3’ (SEQ ID NO: 7), em que a, c, g e u são 2’-O-metila ( 2’-OMe) A, C, G ou U; Af, Cf, Gf e Uf são 2’-flúor A, C, G ou U; e s é uma ligação de fosforotioato, tratando assim o indivíduo que sofre de uma doença associada à TTR.
[00133] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece métodos de profilaticamente tratar um indivíduo em risco de desenvolver uma doença associada à TTR. Os métodos incluem administrar ao indivíduo uma dose de cerca de 50 mg a cerca de 300 mg de um agente de RNAi de fita dupla, em que o agente de RNAi compreende uma fita senso complementar a uma fita antissenso, em que a fita senso compreende a sequência de nucleotídeo 5’- usgsggauUfuCfAfUfguaaccaa- ga - 3’ (SEQ ID NO: 10) e a fita antissenso compreende a sequência de nucleotídeo 5’- USCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3’ (SEQ ID NO: 7), em que a, c, g e u são 2’-O-metila (2’-OMe) A, C, G ou U; Af, Cf, Gf e Uf são 2’-flúor A, C, G ou U; e s é uma ligação de fosforotioa- to, tratando assim de forma profilática o indivíduo em risco dea desenvolver uma doença associada à TTR.
[00134] Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de reduzir, desacelerar ou interromper uma Pontuação de Comprometimento de Neuropatia (NIS) ou um NIS modificado (mNIS+7) em um indivíduo que sofre de uma doença associada à TTR ou em risco de desenvolver uma doença associada à TTR. Os métodos incluem administrar ao indivíduo uma dose de cerca de 50 mg a cerca de 300 mg de um agente de RNAi de fita dupla, em que o agente de RNAi compreende uma fita senso complementar a uma fita antissenso, em que a fita senso compreende a sequência de nucleotídeo 5’- usgsgga- uUfuCfAfUfguaaccaaga - 3’ (SEQ ID NO: 10) e a fita antissenso compreende a sequência de nucleotídeo 5’- usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfuc- ccasusc - 3’ (SEQ ID NO: 7), em que a, c, g e u são 2’-O-metila ( 2’- OMe) A, C, G ou U; Af, Cf, Gf e Uf são 2’-flúor A, C, G ou U; e s é uma ligação de fosforotioato, desse modo reduzindo, desacelerando ou in- terrompendo uma Pontuação de Comprometimento de Neuropatia (NIS) ou um NIS modificado (mNIS+7) no indivíduo.
[00135] Em outro aspecto, a presente invenção fornece métodos para aumentar um teste de caminhada de 6 minutos (6MWT) em um indivíduo que sofre de uma doença associada à TTR ou em risco de desenvolver uma doença associada à TTR. Os métodos incluem administrar ao indivíduo uma dose de cerca de 50 mg a cerca de 300 mg de um agente de RNAi de fita dupla, em que o agente de RNAi compreende uma fita senso complementar a uma fita antissenso, em que a fita senso compreende a sequência de nucleotídeo 5’- usgsgga- uUfuCfAfUfguaaccaaga - 3’ (SEQ ID NO: 10) e a fita antissenso compreende a sequência de nucleotídeo 5’- usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfuc- ccasusc - 3’ (SEQ ID NO: 7), em que a, c, g e u são 2’-O-metila (2’- OMe) A, C, G ou U; Af, Cf, Gf e Uf são 2’-flúor A, C, G ou U; e s é uma ligação de fosforotioato, desse modo aumentando um teste de caminhada de 6 minutos (6MWT) em um indivíduo que sofre de uma doença associada à TTR ou em risco de desenvolver uma doença associada à TTR.
[00136] A presente invenção é também ilustrada pela seguinte descrição detalhada e desenhos.
Breve Descrição dos Desenhos
[00137] A Figura 1 é um gráfico que representa a estabilidade dos agentes de RNAi indicados em um ensaio de estabilidade de tristos- soma de vinte e quatro horas.
[00138] A Figura 2A é um gráfico que representa a estabilidade dos agentes de RNAi indicados em um ensaio de estabilidade ao citosol em rato de vinte e quatro horas e a Figura 2B é um gráfico que representa a estabilidade dos agentes de RNAi indicados em um ensaio de estabilidade de tristossoma de vinte e quatro horas.
[00139] A Figura 3 é um gráfico que representa a supressão da pro- teína TTR em camundongos transgênicos que expressam a variante de V30M de TTR humana (VT30M hTTR) após a administração de uma única dose subcutânea de 1 mg/kg dos agentes de RNAi indicados.
[00140] A figura 4 é um gráfico que representa a supressão da proteína TTR em camundongos transgênicos que expressam o hTT R V30M após a administração de uma única dose subcutânea de 2,5 mg/kg dos agentes de RNAi indicados.
[00141] A figura 5 é um gráfico que representa a supressão da proteína TTR em camundongos transgênicos que expressam hTTR V30M após a administração de uma dose semanal de 2 mg/kg de DA -65492 durante três semanas (QWx3).
[00142] A figura 6A é um gráfico que representa a supressão da proteína TTR em camundongos transgênicos que expressam hTTR V30M após a administração subcutânea de uma dose de 0,3 mg/kg mensal dos agentes de RNAi indicados por quatro meses (QMx4 @ 0,3 mg/kg). A Figura 6B é um gráfico que representa a supressão da proteína TTR em camundongos transgênicos que expressam hTTR V30M após a administração subcutânea de uma dose de 1 mg/kg mensal dos agentes de RNAi indicados por quatro meses (QMx4 @ 1 mg/kg). A Figura 6C é um gráfico que representa a supressão de proteína TTR em camundongos transgênicos que expressam hTTR V30M após a administração subcutânea de uma dose de 3 mg/kg mensal dos agentes de RNAi indicados por quatro meses (QMx4 @ 3 mg/kg).
[00143] A Figura 7 mostra o projeto do estudo da administração subcutânea de AD-65492 e AD-66017 para macacos Cynomologous.
[00144] Figura 8A é um gráfico que representa a supressão da proteína TTR em macacos Cynomologous após a administração de uma única dose subcutânea de 0,3 mg/kg dos agentes de RNAi indicados. A Figura 8B é um gráfico que representa a supressão da proteína TTR em macacos Cynomologous após a administração de uma única dose subcutânea de 1 mg/kg de AD-65492, uma única dose subcutânea de 1 mg/kg de AD-66017 ou uma única dose subcutânea de 2,5 mg/kg de AD-51547. A Figura 8C é um gráfico que representa a supressão da proteína TTR em macacos Cynomologous após a administração de uma única dose subcutânea de 3 mg/kg de AD-65492, uma única dose subcutânea de 3 mg/kg de AD-66017 ou uma única dose subcutânea de 5 mg/kg de AD-51547.
[00145] A Figura 9A é um gráfico que representa a supressão de proteína TTR em macacos Cynomologous após a administração de uma dose subcutânea mensal de 1 mg/kg durante quatro meses (QMx4) de AD-65492, uma dose subcutânea mensal de 1 mg/kg por quatro meses (QMx4) de AD-66017, ou uma dose diária de 5 mg/kg por cinco dias, seguido por uma dose semanal de 5 mg/kg por quatro semanas (QDx5, QWx4) de AD-51547. A Figura 9B é um gráfico que representa a supressão da proteína TTR em macacos Cynomologous após a administração de uma dose subcutânea mensal de 3 mg/kg por quatro meses (QMx4) dos agentes de RNAi indicados.
[00146] A Figura 10A é um gráfico que descreve a manutenção da supressão de TTR por administração subcutânea de uma dose de 1 mg/kg mensal de AD-65492 por quatro meses (QMx4, linha contínua) em comparação com a supressão de TTR após uma única dose de 1 mg/kg subcutânea de AD-65492 (linha tracejada) em macacos Cyno- mologous.
[00147] A Figura 10B é um gráfico que descreve um efeito aditivo da administração subcutânea de uma dose mensal de 1 mg/kg de AD- 66017 durante quatro meses (QMx4, linha contínua) na supressão da proteína TTR em comparação com uma única dose subcutânea de 1 mg/kg de AD-66017 (linha tracejada) em macacos Cynomologous.
[00148] A Figura 11 é um gráfico que representa a supressão de TTR sérica sustentada em macacos Cynomologos após a administra-ção subcutânea mensal de uma dose de 1 mg/kg de AD-65492 por quatro meses (QMx4) ou administração subcutânea mensal de uma dose de 3 mg/kg de AD -65492 durante quatro meses (QMx4) em comparação a uma única dose de 1mg/kg administrada por via subcutânea de AD-65492 ou de uma única dose de 0,3 mg/kg administrada por via subcutânea de AD-65492.
[00149] A Figura 12 ilustra o projeto de estudo da administração subcutânea de AD-65492 a macacos Cynomologous.
[00150] A Figura 13 é um gráfico que representa a forte supressão de TTR sérica em macacos Cynomologous após a administração sub-cutânea mensal de uma dose de 0,3 mg/kg de AD-65492 durante seis meses (QMx6) ou administração subcutânea mensal de uma dose de 0,6 mg/kg de AD- 65492 durante seis meses (QMx6) ou administração de uma dose de 1 mg/kg inicial de AD-65492 (QMx1) seguido de uma dose de 0,3 mg/kg mensal de AD-65492 a partir da dose pós-inicial do dia 28 durante cinco meses (QMx5).
Descrição Detalhada da Invenção
[00151] A presente invenção fornece agentes de RNAi, por exemplo, agentes de RNAi de fita dupla e composições que alvejam o gene da Transtretina (TTR). A presente invenção também fornece métodos para inibir a expressão de TTR e métodos de tratamento ou prevenção de uma doença associada à TTR em um indivíduo usando os agentes de RNAi, por exemplo, agentes de RNAi de fita dupla, da invenção. A presente invenção baseia-se, pelo menos em parte, na descoberta de que os agentes de RNAi em que substancialmente todos os nucleotí- deos na fita senso e substancialmente todos os nucleotídeos da fita antissenso são nucleotídeos modificados e que não compreendem mais do que 8 modificações de 2’-flúor (por exemplo, não mais do que 7 modificações de 2’-fluoro, não mais do que 6 modificações de 2’- fluoro, não mais do que 5 modificações de 2’-fluoro, não mais do que 4 modificações de 2’-fluoro, não mais do que 5 modificações de 2’-fluoro, não mais do que 4 modificações de 2’-fluoro, não mais do que 3 modificações de 2’-fluoro, ou não mais do que 2 modificações de 2’-fluoro) na fita senso, não mais do que 6 modificações de 2’-flúor (por exemplo, não mais do que 5 modificações de 2’-fluoro, não mais do que 4 modificações de 2’-fluoro, não mais do que 3 modificações de 2’-flúor ou não mais do que 2 modificações de 2’-fluoro) na fita antissenso, duas ligações de fosforotioato na extremidade 5’ da fita senso, duas ligações de fosforotioato na extremidade 5’ da fita antissenso e um li- gante, por exemplo, um ligante GalNAc3, são aqui mostrados eficazes para silenciar seletivamente a atividade do gene de TTR. Esses agentes mostram uma atividade de silenciamento de gene de TTR surpreendentemente realçada. Sem pretender ser limitado pela teoria, acredita-se que uma combinação ou subcombinação das modificações anteriores e os locais alvo específicos nestes agentes de RNAi conferem, aos agentes de RNAi da invenção, eficácia melhorada, estabilidade, potência e durabilidade.
[00152] A seguinte descrição detalhada descreve como fazer e usar composições contendo iRNAs para inibir seletivamente a expressão de um gene de TTR, bem como composições, usos e métodos para tratar indivíduos tendo doenças e transtornos que se beneficiarão da inibição e/ou redução da expressão de um gene de TTR.
I. Definições
[00153] Para que a presente invenção possa ser mais facilmente compreendida, certos termos são primeiro definidos. Além disso, deve notar-se que, sempre que um valor ou faixa de valores de um parâmetro são recitados, pretende-se que os valores e intervalos intermediários para os valores recitados também se destinem a fazer parte desta invenção.
[00154] Os artigos "a/o" e "um/uma "são usados aqui para se referir a um ou a mais de um (ou seja, a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, "um elemento" significa um elemento ou mais de um elemento, por exemplo, uma pluralidade de elementos.
[00155] O termo "incluindo" é usado aqui para significar, e é usado de forma alternadamente com, o termo "incluindo, porém, não limitado a".
[00156] O termo "ou" é usado aqui para significar, e é usado alternadamente com o termo "e/ou", a menos que o contexto indique claramente de outra maneira.
[00157] O termo "cerca" é aqui usado para significar dentro das faixas típicas de tolerâncias na técnica. Por exemplo, "cerca" pode ser entendido como dentro de cerca de 2 desvios padrão da média. Em certas modalidades, cerca de significa +10 %. Em certas modalidades, cerca de significa +5 %. Quando cerca de está presente antes de uma série de números ou de uma faixa, entende-se que "cerca de" pode modificar cada um dos números na série ou faixa.
[00158] Quando aqui usado, uma "transtiretina" ("TTR") refere-se ao gene e à proteína bem conhecidos. A TTR também é conhecido como pré-albumina, HsT2651, PALB e TBPA. A TTR funciona como um transportador da proteína de ligação ao retinol (RBP), tiroxina (T4) e retinol, e também atua como uma protease. O fígado secreta TTR no sangue e o plexo coroide secreta TTR no líquido cefalorraquidiano. A TTR também é expressa no pâncreas e no epitélio pigmentar retinal. A maior relevância clínica da TTR é que igualmente a proteína TTR normal e mutante pode formar fibrilas amiloides que se agregam em depósitos extracelulares, causando amiloidose. Veja, por exemplo, Saraiva M.J.M. (2002) Expert Reviews in Molecular Medicine, 4 (12): 1-11 para uma revisão. A clonagem molecular e a sequência de nucleotídeo da transtiretina de rato, bem como a liberação da expressão de mRNA, foram descritas por Dickson, P.W. et al. (1985) J. Biol. Chem. 260(13) 8214-8219. A estrutura de cristal de raios X de TTR humana foi descrita em Blake, C.C. et al. (1974) J Mol Biol 88, 1-12. A sequência de uma transcrição de mRNA de TTR humana pode ser constatada em National Center for Biotechnology Information (NCBI) número de acesso de RefSeq NMS-003771 (por exemplo, SEQ ID NOs: 1 e 5). A sequência do mRNA de TTR de camundongo pode ser constatada no número de acesso de RefSeq NM_013697.2, e a sequência do mRNA TTR de camundongo pode ser constatada no número de acesso Re- fSeq NM_012681.1. Exemplos adicionais de sequências de mRNA de TTR são facilmente disponíveis usando os bancos de dados publicamente disponíveis, por exemplo, GenBank, UniProt e OMIM.
[00159] Quando aqui usado, a "sequência alvo" refere-se a uma porção contígua da sequência de nucleotídeo de uma molécula de mRNA formada durante a transcrição de um gene de TTR, incluindo mRNA que é um produto do processamento de RNA de um produto de transcrição primário. Em uma modalidade, a porção alvo da sequência será pelo menos suficientemente longa para servir como substrato para a clivagem direcionada por RNAi ou perto da porção da sequência de nucleotídeo de uma molécula de mRNA formada durante a transcrição de um gene de TTR. Em uma modalidade, a sequência alvo está dentro da região de codificação da proteína do gene de TTR. Em outra modalidade, a sequência alvo está dentro da UTR 3’ do gene de TTR.
[00160] A sequência alvo pode ser de cerca de 9 a 36 nucleotídeos no comprimento, por exemplo, cerca de 15 a 30 nucleotídeos no comprimento. Por exemplo, a sequência alvo pode ser de cerca de 15-30 nucleotídeos, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18 -22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21 -29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 ou 21-22 nucleotídeos no comprimento. Em algumas modalidades, a sequência alvo é cerca de 19 a cerca de 30 nucleotídeos no comprimento. Em outras modalidades, a sequência alvo tem de cerca de 19 a cerca de 25 nucleotídeos no comprimento. Ainda em outras modalidades, a sequência alvo tem cerca de 19 a cerca de 23 nucleotídeos no comprimento. Em algumas modalidades, a sequência alvo tem cerca de 21 a cerca de 23 nucleo- tídeos no comprimento. As faixas e os comprimentos intermediários para os intervalos e comprimentos relacionados acima também são considerados para preparar parte da invenção.
[00161] Em algumas modalidades da invenção, a sequência alvo de um gene de TTR compreende os nucleotídeos 615-637 de SEQ ID NO: 1 ou os nucleotídeos 505-527 de SEQ ID NO: 5 (isto é, 5’- GATGGGATTTCATGTAACCAAGA - 3’; SEQ ID NO : 4).
[00162] Quando aqui usado, o termo "fita que compreende uma sequência" refere-se a um oligonucleotídeo que compreende uma fita de nucleotídeos que é descrita pela sequência referida usando a nomenclatura de nucleotídeos padrão.
[00163] "G", "C", "A", "T" e "U" cada qual geralmente representa um nucleotídeo que contém guanina, citosina, adenina, timidina e uracila como uma base, respectivamente. No entanto, entende-se que o termo "ribonucleotídeo" ou "nucleotídeo" também pode se referir a um nucleotídeo modificado, conforme detalhado mais adiante, ou uma porção de substituição substitutiva (ver, por exemplo, Tabela 2). A pessoa versada é bem consciente de que a guanina, a citosina, a ade- nina e a uracila podem ser substituídas por outras porções sem alterar substancialmente as propriedades de pareamento da base de um oli- gonucleotídeo que compreende um nucleotídeo que tenha essa porção de substituição. Por exemplo, sem limitação, um nucleotídeo que compreende inosina como base pode parear por base com nucleotí- deos contendo adenina, citosina ou uracila. Desse modo, os nucleotí- deos que contêm uracila, guanina ou adenina podem ser substituídos nas sequências de nucleotídeos do dnRNA caracterizado na invenção por um nucleotídeo contendo, por exemplo, inosina. Em outro exemplo, a adenina e a citosina em qualquer parte do oligonucleotídeo podem ser substituídas por guanina e uracila, respectivamente, para formar o pareamento de base Wobble G-U com o mRNA alvo. As sequências contendo essas porções de substituição são adequadas para as composições e métodos apresentados na invenção.
[00164] Os termos "RNAi", "agente de RNAi", "agente de RNAi", "agente de interferência de RNA", quando aqui usados alternadamente, referem-se a um agente que contém RNA, uma vez que o termo é definido aqui, e que media a clivagem alvejada de uma transcrição de RNA através de um caminho complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). O RNAi direciona a degradação específica da sequência de mRNA através de um processo conhecido como RNA interferente (RNAi). O RNAi modula, por exemplo, inibe a expressão de um gene de TTR em uma célula, por exemplo, uma célula dentro de um indivíduo, tal como um indivíduo mamífero.
[00165] Em uma modalidade, um agente de RNAi da invenção inclui um RNA de fita única que interage com uma sequência de RNA alvo, por exemplo, uma sequência de mRNA alvo de TTR, para direcionar a clivagem do RNA alvo. Sem querer ser ligado pela teoria, acredita-se que o RNA de fita dupla longo introduzido nas células seja dividido em RNAs interferentes curtos de fita dupla (sRNAis) compreendendo uma fita senso e uma fita antissenso por uma endonuclease de Tipo III conhecida como Dicer (Sharp et al . (2001) Genes Dev. 15: 485). Dicer, uma enzima tipo ribonuclease-III, processa esses dsRNA em RNAs interferentes curtos de 19-23 pares de bases com duas projeções de base 3’ (Bernstein, et al., (2001) Nature 409: 363). Esses siRNAs são então incorporados em um complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) onde uma ou mais helicases desenrolam o duplex de sRNAi, permitindo que a fita antissenso complementar guie o reconhecimento do alvo (Nykanen, et al., (2001) Cell 107: 309). Na ligação ao mRNA alvo apropriado, uma ou mais endonucleases dentro de RISC clivam o alvo para induzir o silenciamento (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15: 188). Desse modo, em um aspecto, a invenção refere-se a um siRNA de fita única (ssrNA) (a fita antissenso de um duplex de sRNAi) gerado dentro de uma célula e que promove a formação de um complexo de RISC para efetuar o silenciamento do gene alvo, isto é, um gene de TTR. Consequentemente, o termo "sRNAi" é também aqui usado para se referir a um RNAi como descrito acima.
[00166] Em outra modalidade, o agente de RNAi pode ser um RNA de fita única que é introduzido em uma célula ou organismo para inibir um mRNA alvo. Os agentes de RNAi de fita única se ligam à RISC endonuclease, Argonaute 2, que então cliva o mRNA alvo. Os siRNA de fita única são geralmente 15 a 30 nucleotídeos e são quimicamente modificados. O projeto e o teste de siRNAs de fita única são descritos na Patente Norte-americano No. 8.101.348 e em Lima et al., (2012) Cell 150: 883-894, cujos conteúdos completos de cada uma estão aqui incorporados por referência. Qualquer uma das sequências de nucleo- tídeos antissenso aqui descritas pode ser usada como um RNA de fita única como aqui descrito ou como quimicamente modificado pelos métodos descritos em Lima et al., (2012) Cell 150: 883-894.
[00167] Em outra modalidade, um "iRNAi" para uso nas composições, usoa e métodos da invenção é um RNA de fita dupla e é aqui referido como um "agente de RNAi de fita dupla", "molécula de RNA de fita dupla (dsRNA)", "agente de dsRNA" ou "dsRNA". O termo "dsRNA" refere-se a um complexo de moléculas de ácido ribonucleico, possuindo uma estrutura duplex compreendendo duas fitas de ácido nucleico antiparalelos e substancialmente complementares, referidos como tendo orientações de "senso" e "antissenso" em relação a um RNA alvo, i.e., um gene de TTR. Em algumas modalidades da invenção, um RNA de fita dupla (dsRNA) desencadeia a degradação de um RNA alvo, por exemplo, um mRNA, através de um mecanismo de si- lenciamento de gene pós-transcricional referido aqui como RNA interferente ou RNAi.
[00168] Em geral, a maioria dos nucleotídeos de cada fita de uma molécula de dsRNA são ribonucleotídeos, porém, como descrito em detalhes aqui, cada um ou ambas fitas também podem incluir um ou mais não ribonucleotídeos, por exemplo, um desoxirribonucleotídeo e/ou um nucleotídeo modificado. Além disso, como usado nesta especificação, um "agente de RNAi" pode incluir ribonucleotídeos com modificações químicas; um agente de RNAi pode incluir modificações substanciais em múltiplos nucleotídeos.
[00169] Quando aqui usado, o termo "nucleotídeo modificado" refere-se a um nucleotídeo tendo, independentemente, uma porção de açúcar modificado, uma ligação internucleotídica modificada e/ou uma nucleobase modificada. Desse modo, o termo nucleotídeo modificado abrange substituições, adições ou remoção, por exemplo, de um grupo ou átomo funcional, para ligações de internucleosídeo, porções de açúcar ou nucleobases. As modificações adequadas para uso nos agentes da invenção incluem todos os tipos de modificações aqui divulgadas ou conhecidas na técnica. Quaisquer tais modificações, tal como usadas em uma molécula do tipo siRNA, são abrangi-das por "agente de RNAi" para os propósitos desta especificação e reivindicações.
[00170] A região duplex pode ser de qualquer comprimento que permita a degradação específica de um RNA alvo desejado através de uma via de RISC, e pode variar de cerca de 9 a 36 pares de bases no comprimento, por exemplo, cerca de 15-30 pares de bases no comprimento, por exemplo, cerca de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 pares de bases no comprimento, tais como cerca de 15-30, 15-29, 1528, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 1518, 15-17, 18- 30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 1822, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 1923, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20- 27, 20-26, 20-25, 20 24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 2124, 21-23 ou 21-22 pares de bases no comprimento. As faixas e os comprimentos intermediários para os intervalos e comprimentos relacionados acima também são considerados fazerem parte da invenção.
[00171] Os duas fitas que formam a estrutura duplex podem ser porções diferentes de uma molécula de RNA maior, ou podem ser moléculas de RNA separadas. Onde os duas fitas são parte de uma molécula maior e, portanto, estão conectados por uma cadeia ininterrupta de nucleotídeos entre a extremidade 3’ de uma fita e a extremidade 5’ da respectiva outra linha que forma a estrutura duplex, a cadeia de RNA de conexão é referida como um "alça em forma de grampo de cabelo". Um alça em forma de grampo de cabelo pode compreender pelo menos um nucleotídeo não pareado. Em algumas modalidades, a alça em forma de grampo de cabelo pode compreender pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 20, a pelo menos 23 ou mais nucleotídeos não pareados. Em algumas modalidades, a alça em forma de grampo de cabelo pode ser de 10 ou menos nucleotídeos. Em algumas modalidades, a alça em forma de grampo de cabelo pode ser de 8 ou menos nucleotídeos não pareados. Em algumas modalidades, a alça em forma de grampo de cabelo pode ser de 4-10 nucleotídeos não pareados. Em algumas modalidades, a alça em forma de grampo de cabelo pode ser de 4-8 nucleotídeos.
[00172] Onde os duas fitas substancialmente complementares de um dsRNA são compreendidos por moléculas de RNA separadas, essas moléculas não precisam, porém, podem ser conectadas covalen- temente. Onde os duas fitas estão conectados covalentemente por meios que não uma cadeia não ininterrupta de nucleotídeos entre a extremidade 3’ de uma fita e a extremidade 5’ da respectiva outra linha que forma a estrutura duplex, a estrutura de conexão é referida como uma "ligador". As fitas de RNA podem ter o mesmo número ou um número diferente de nucleotídeos. O número máximo de pares de bases é o número de nucleotídeos na fita mais curto do dsRNA menos quaisquer projeções que estão presentes no duplex. Além da estrutura duplex, um RNAi pode compreender uma ou mais projeções de nucle- otídeo.
[00173] Em uma modalidade, um agente de RNAi da invenção é um dsRNA, cada fita dos quais tem 24-30 nucleotídeos no comprimento, que interage com uma sequência de RNA alvo, por exemplo, uma sequência de mRNA alvo de TTR, para direcionar a clivagem do RNA alvo . Sem querer ser ligado pela teoria, o RNA duplo de fita dupla introduzido nas células é dividido em siRNA por uma endonuclease Tipo III conhecida como Dicer (Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15: 485). Dicer, uma enzima tipo ribonuclease-III, processa o dsRNA em RNAs interferentes curtos de 19-23 pares de bases com duas projeções características de base 3’ (Bernstein, et al., (2001) Nature 409: 363). Os siRNAs são então incorporados em um complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) onde uma ou mais helicases desenrolam o duplex de sRNAi, permitindo a fita antissenso complementar guiar o reconhecimento do alvo (Nykanen, et al., (2001) Cell 107: 309). Na ligação ao mRNA alvo apropriado, uma ou mais endonucleases dentro do RISC clivam o alvo para induzir o silenciamento (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15: 188). Em uma modalidade do agente de RNAi, pelo menos uma fita compreende uma projeção 3’ de pelo menos 1 nucleotídeo. Em outra modalidade, pelo menos uma fita compreende uma projeção 3’ de pelo menos 2 nucleotídeos, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 nucleotídeos. Em outras modalidades, pelo menos uma fita do agente de RNAi compreende uma projeção 5’de pelo menos 1 nucleotídeo. Em certas modalidades, pelo menos uma fita compreende uma projeção 5’de pelo menos 2 nucleotídeos, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 nucleotídeos. Em ainda outras modalidades, tanto a extremidade 3’ como a extremidade 5’ de uma fita do agente de RNAi compreendem uma projeção de pelo menos 1 nucleotídeo.
[00174] Em uma modalidade, um agente de RNAi da invenção é um agente de dsRNA, cada fita dos quais compreende 19-23 nucleotídeos que interagem com uma sequência de RNA de TTR para direcionar a clivagem do RNA alvo. Sem querer ser vinculado pela teoria, o RNA de fita dupla longo introduzido nas células é dividido em siRNA por uma endonuclease Tipo III conhecida como Dicer (Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15: 485). Dicer, uma enzima tipo ribonuclease-III, processa o dsrNA em RNAs interferentes curtos de 19-23 pares de bases com duas projeções 3’ de base características (Bernstein, et al., (2001) Nature 409: 363). Os siRNAs são então incorporados em um complexo de si- lenciamento induzido por RNA (RISC) onde uma ou mais helicases desenrolam o duplex de sRNAi, permitindo que a fita antissenso complementar guie o reconhecimento do alvo (Nykanen, et al., (2001) Cell 107: 309). Na ligação ao mRNA alvo apropriado, uma ou mais endonucleases dentro do RISC clivam o alvo para induzir o silenciamento (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15: 188). Em uma modalidade, um agente de RNAi da invenção é um dsRNA de 24-30 nucleotídeos que interage com uma sequência de RNA de TTR para direcionar a cliva- gem do RNA alvo.
[00175] Quando aqui usado, o termo "projeção de nucleotídeo" refere-se a pelo menos um nucleotídeo não pareado que se projeta da estrutura duplex de um RNAi, por exemplo, um dsRNA. Por exemplo, quando uma extremidade 3’ de uma fita de um dsRNA se estende para além da extremidade 5’ do outra fita, ou vice-versa, há uma projeção de nucleotídeo. Um dsRNA pode compreender uma projeção de pelo menos um nucleotídeo; alternativamente, a projeção pode compreender pelo menos dois nucleotídeos, pelo menos três nucleotídeos, pelo menos quatro nucleotídeos, pelo menos cinco nucleotídeos ou mais. Uma projeção de nucleotídeo pode compreender ou consistir em um análogo de nucleotídeo/nucleosídeo, incluindo um desoxinucleotí- deo/nucleosídeo. A(s) projeção(ões) pode(m) estar na fita senso, na fita antissenso ou qualquer combinação dos mesmos. Além disso, o(s) nucleotídeo(s) de uma projeção pode estar presente na extremidade 5’, extremidade 3’ ou ambas as extremidades de uma fita antissenso ou senso de um dsRNA. Em uma modalidade do dsRNA, pelo menos uma fita compreende uma projeção 3’ de pelo menos 1 nucleotídeo. Em outra modalidade, pelo menos uma fita compreende uma projeção 3’ de pelo menos 2 nucleotídeos, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 nucleotídeos. Em outras modalidades, pelo menos uma fita do agente de RNAi compreende uma projeção 5’de pelo menos 1 nucleotídeo. Em certas modalidades, pelo menos uma fita compreende uma projeção 5’de pelo menos 2 nucleotídeos, por exem-plo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 nucleotídeos. Em ainda outras modalidades, tanto a extremidade 3 ‘como a extremidade 5’ de uma fita do agente de RNAi compreendem uma projeção de pelo menos 1 nucleotídeo.
[00176] Em uma modalidade, a fita antissenso de um dsRNA tem uma projeção de 1-10 nucleotídeos , por exemplo, 0 -3, 1-3, 2-4, 2-5, 4-10, 5-10, por exemplo, uma projeção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeo, na extremidade 3’ e/ou na extremidade 5’. Em uma modalidade, a fita senso de um dsRNA tem uma projeção de 1-10 nucleotí- deos, por exemplo, uma projeção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nu- cleotídeos, na extremidade 3’ e/ou na extremidade 5’. Em outra modalidade, um ou mais dos nucleotídeos na projeção são substituídos por um tiofosfato de nucleosídeo.
[00177] Em certas modalidades, a projeção na fita senso ou na fita antissenso, ou ambos, pode incluir comprimentos prolongados com mais de 10 nucleotídeos, por exemplo, 1 -30 nucleotídeos, 2-30 nu- cleotídeos, 10-30 nucleotídeos ou 10-15 nucleotídeos no comprimento. Em certas modalidades, uma projeção estendida está na fita senso do duplex. Em certas modalidades, uma projeção estendida está presente na extremidade 3’ da fita senso do duplex. Em certas modalidades, uma projeção estendida está presente na extremidade 5’ da fita senso do duplex. Em certas modalidades, uma projeção estendida está na fita antissenso do duplex. Em certas modalidades, uma projeção estendida está presente na extremidade 3’ da fita antissenso do duplex. Em certas modalidades, uma projeção estendida está presente na ex-tremidade 5’ da fita antissenso do duplex. Em certas modalidades, um ou mais dos nucleotídeos na projeção são substituídos por um tiofosfa- to de nucleosídeo. Em certas modalidades, a projeção inclui uma porção autocomplementar de tal forma que a projeção é capaz de formar uma estrutura em forma de grampo de cabelo que é estável sob condições fisiológicas.
[00178] "Cega" ou "extremidade cega" significa que não há nucleo- tídeos não pareados naquela extremidade do agente de RNAi de fita dupla, ou seja, sem projeção de nucleotídeo. Um agente de RNAi de "extremidade cega" é um dsRNA que é de fita dupla por todo o seu comprimento, isto é, nenhuma projeção de nucleotídeo em qualquer extremidade da molécula. Os agentes de RNAi da invenção incluem agentes de RNAi com projeções de nucleotídeo em uma extremidade (isto é, agentes com uma projeção e uma extremidade cega) ou com projeções de nucleotídeo em ambas as extremidades.
[00179] O termo "fita antissenso" ou "fita guia" refere-se aa fita de um iRNA, por exemplo, um dsRNA, que inclui uma região que é substancialmente complementar a uma sequência alvo, por exemplo, um mRNA de TTR. Quando aqui usado, o termo "região de complementaridade" refere-se à região na fita antissenso que é substancialmente complementar a uma sequência, por exemplo, uma sequência alvo, por exemplo, uma sequência de nucleotídeo de TTR, como aqui definido. Onde a região de complementaridade não é totalmente complementar à sequência alvo, os não pareamentos podem estar nas regiões internas ou terminais da molécula. Geralmente, os não parea- mentos mais tolerados estão nas regiões terminais, por exemplo, dentro de 5, 4, 3, 2 ou 1 nucleotídeos do terminal 5’e/ou 3’ do iRNA. Em uma modalidade, um agente de RNAi de fita dupla da invenção inclui um não pareamento de nucleotídeo na fita antissenso. Em outra modalidade, um agente de RNAi de fita dupla da invenção inclui um não pa- reamento de nucleotídeo na fita senso. Em uma modalidade, o parea- mento de nucleotídeo está, por exemplo, em 5, 4, 3, 2 ou 1 nucleotídeos do terminal 3’ do iRNA. Em outra modalidade, o não pareamento de nu- cleotídeo está, por exemplo, no nucleotídeo de terminal 3’ do iRNA.
[00180] O termo "fita de senso" ou "fita passageiro", quando aqui usado, refere-se aa fita de um iRNA que inclui uma região que é substancialmente complementar a uma região da fita antissenso à medida em que o termo é aqui definido.
[00181] Quando aqui usado, o termo "região de clivagem" refere-se a uma região que está localizada imediatamente adjacente ao sítio de clivagem. O sítio de clivagem é o sítio no alvo em que ocorre a clivagem. Em algumas modalidades, a região de clivagem compreende três bases em cada extremidade e imediatamente adjacente ao sítio de clivagem. Em algumas modalidades, a região de clivagem compreende duas bases em cada extremidade e imediatamente adjacente ao sítio de clivagem. Em algumas modalidades, o sítio de clivagem ocorre especificamente no sítio ligado pelos nucleotídeos 10 e 11 da fita antissenso, e a região de clivagem compreende os nucleotídeos 11, 12 e 13.
[00182] Quando aqui usado, e a menos que de outra maneira indicado, o termo "complementar" quando usado para descrever uma primeira sequência de nucleotídeo em relação a uma segunda sequência de nucleotídeo, refere-se à capacidade de um oligonucleotídeo ou po- linucleotídeo compreendendo a primeira sequência de nucleotídeo para hibridizar e formar uma estrutura duplex sob certas condições com um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo compreendendo a segunda sequência de nucleotídeo, como será entendido pela pessoa versada. Tais condições podem, por exemplo, ser condições rigorosas, em que as condições rigorosas podem incluir: NaCl a 400 mM, PIPES a 40 mM pH 6,4, EDTA a 1 mM, 50oC ou 70° C durante 12-16 horas, seguido por lavagem (ver, por exemplo,"Molecular Cloning: A Laboratory Ma-nual, Sambrook, et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Outras condições, como condições fisiologicamente relevantes que podem ser constatadas dentro de um organismo, podem ser aplicadas. A pessoa versada será capaz de determinar o conjunto de condições mais adequadas para um teste de complementaridade de duas sequências de acordo com a aplicação final dos nucleotídeos hibridizados.
[00183] As sequências complementares dentro de um iRNA, por exemplo, dentro de um dsRNA como aqui descrito, incluem o parea- mento de base do oligonucleotídeo ou polinucleotídeo compreendendo uma primeira sequência de nucleotídeo a um oligonucleotídeo ou poli- nucleotídeo compreendendo uma segunda sequência de nucleotídeo em todo o comprimento de uma ou ambas as sequências de nucleotí- deo. Tais sequências podem ser referidas como"totalmente complementares" em relação a cada uma delas. No entanto, quando uma primeira sequência é referida como"substancialmente complementar" em relação a uma segunda sequência aqui, as duas sequências podem ser totalmente complementares, ou podem formar uma ou mais, porém, geralmente não mais de 5, 4, 3 ou 2 pares de base não parea- dos na a hibridização para um duplex até 30 pares de bases, enquanto mantendo a capacidade de hibridizar sob as condições mais relevantes para a sua aplicação final, por exemplo, inibição da expressão de gene através de uma via de RISC. No entanto, quando dois oligonu- cleotídeos são projetados para formar-se, na hibridização, uma ou mais projeções de fita única, tais projeções não devem ser consideradas como pareamentos em relação à determinação da complementaridade. Por exemplo, um dsRNA compreendendo um oligonucleotídeo com 21 nucleotídeos no comprimento e outro oligonucleotídeo com 23 nucleotídeos no comprimento, em que o oligonucleotídeo mais longo compreende uma sequência de 21 nucleotídeos que é totalmente complementar ao oligonucleotídeo mais curto, pode ainda ser referido como "totalmente complementar" para os propósitos descritos aqui.
[00184] As sequências "complementares", quando aqui usadas, também podem incluir, ou ser formadas inteiramente por pares de bases não Watson-Crick e/ou pares de bases formados de nucleotídeos não naturais e modificados, na medida em que os requisitos acima em relação à sua capacidade de hibridizar são cumpridos. Tais pares de bases não Watson-Crick incluem, porém, não estão limitados ao pa- reamento de base G:U Wobble ou Hoogstein.
[00185] Os termos "complementares", "totalmente complementares" e "substancialmente complementares" aqui podem ser usados em relação ao pareamento de base entre a fita senso e a fita antissenso de um dsRNA, ou entre a fita antissenso de um agente de iRNA e uma sequência alvo, como será entendido a partir do contexto de seu uso.
[00186] Quando aqui usado, um polinucleotídeo que é "substancialmente complementar a pelo menos parte de "um RNA mensageiro (mRNA) refere-se a um polinucleotídeo que é substancialmente complementar a uma porção contígua do mRNA de interesse (por exemplo, um mRNA que codifica um gene de TTR). Por exemplo, um poli- nucleotídeo é complementar a pelo menos uma parte de um mRNA de TTR se a sequência for substancialmente complementar a uma porção não interrompida de um mRNA que codifica um gene de TTR.
[00187] Consequentemente, em algumas modalidades, os polinu- cleotídeos antissenso aqui descritos são totalmente complementares à sequência de TTR alvo. Em outras modalidades, os polinucleotídeos antissenso aqui descritos são totalmente complementares à SEQ ID NO: 2 (5’- UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA -3’). Em uma modalidade, a sequência de polinucleotídeo antissenso é 5’- UCUUGGUUACAU- GAAAUCCCAUC - 3’ (SEQ ID NO: 3).
[00188] Em outras modalidades, os polinucleotídeos antissenso aqui descritos são substancialmente complementares à sequência de TTR alvo e compreendem uma sequência de nucleotídeo contígua que é pelo menos cerca de 80 % complementar em todo o seu comprimento para a região equivalente da sequência de nucleotídeo de qualquer uma de SEQ ID NO: 2 (5’- UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA -3’), ou um fragmento de qualquer uma de SEQ ID NO: 1, 2 e 5, tal como cerca de 85 %, cerca de 86 %, cerca de 87 %, cerca de 88 %, cerca de 89 %, cerca de 90 %, cerca de 91 %, cerca de 92 %, cerca de 93 %, cerca de 94 %, cerca de 95 %, cerca de 96 %, cerca de 97 %, cerca de 98 % ou cerca de 99 % complementar.
[00189] Em uma modalidade, um agente de RNAi da invenção inclui uma fita senso que é substancialmente complementar a um polinucleo- tídeo antissenso que, por sua vez, é complementar a uma sequência de TTR alvo, e em que o polinucleotídeo de fita de senso compreende uma sequência de nucleotídeo contígua que é pelo menos cerca de 80 % complementar em todo o seu comprimento para a região equivalente da sequência de nucleotídeo de qualquer uma das sequências nas Tabelas 1, 3, 5, 6 e 7, tal como cerca de 85 %, cerca de 86 %, cerca de 87 %, cerca de 88 %, cerca de 89 %, cerca de 90 %, cerca de 91 %, cerca de 92 %, cerca de 93 %, cerca de 94 %, cerca de 95 %, cerca de 96 %, cerca de 97 %, cerca de 98 % ou cerca de 99 % com-plementar.
[00190] Em outra modalidade, um agente de RNAi da invenção inclui uma fita antissenso que é substancialmente complementar à sequência de TTR alvo e compreende uma sequência de nucleotídeo contígua que é pelo menos cerca de 80 % complementar ao longo de todo o seu comprimento à região equivalente da sequência de nucleo- tídeo de qualquer uma das sequências na Tabela 1 e 3, tal como cerca de 85 %, cerca de 86 %, cerca de 87 %, cerca de 88 %, cerca de 89 %, cerca de 90 %, cerca de 91 %, cerca de 92 %, cerca de 93 %, cerca de 94 %, cerca de 95 %, cerca de 96 %, cerca de 97 %, cerca de 98 %, ou cerca de 99 % complementar.
[00191] Em algumas modalidades, a maioria dos nucleotídeos de cada fita são ribonucleotídeos, porém, como descrito em detalhes aqui, cada um ou ambos as fitas também podem incluir um ou mais não ribonucleotídeos, por exemplo, um desoxirribonucleotídeo e/ou um nucleotídeo modificado. Além disso, um "iRNA" pode incluir ribonucleo- tídeos com modificações químicas. Tais modificações podem incluir todos os tipos de modificações aqui divulgadas ou conhecidas na técnica. Quaisquer tais modificações, como usadas em uma molécula de iRNA, são abrangidas por "iRNA" para os propósitos desta especificação e reivindicações.
[00192] Em um aspecto da invenção, um agente para uso nos métodos e composições da invenção é uma molécula de ácido nucleico antissenso de fita única que inibe um mRNA alvo através de um mecanismo de inibição antissenso. A molécula de RNA antissenso de de fita única é complementar a uma sequência dentro do mRNA alvo. Os oligonucleotídeos antissenso de fita única podem inibir a translação de uma maneira estequiométrica por pareamento de base ao mRNA e obstruir fisicamente a maquinaria de translação, ver Dias, N. et al., (2002) Mol Cancer Ther 1:347-355. A molécula de RNA antissenso de fita única pode ter cerca de 15 a cerca de 30 nucleotídeos no comprimento e tem uma sequência que é complementar a uma sequência alvo. Por exemplo, a molécula de RNA antissenso de fita única pode compreender uma sequência que é pelo menos cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais nucleotídeos contíguos de qualquer uma das sequências antissenso aqui descritas.
[00193] Uma "doença associada à TTR", quando aqui usado, pretende incluir qualquer doença associada à proteína ou gene de TTR. Uma tal doença pode ser causada, por exemplo, pelo excesso de produção da proteína TTR, por mutações do gene de TTR, por clivagem anormal da proteína TTR, por interações anormais entre TTR e outras proteínas ou outras substâncias endógenas ou exógenas. Uma "doença associada à TTR" inclui qualquer tipo de amiloidose de TTR (ATTR) em que TTR desempenha um papel na formação de agregados extra- celulares anormais ou depósitos de amiloides. As doenças associadas à TTR incluem amiloidose sistêmica senil (SSA), amiloidose familiar sistêmica, polineuropatia familiar amiloidótica (FAP), miocardiopatia familiar amiloidótica (FAC), amiloidose leptomeningeal/do Sistema Nervoso Central (SNC), opacidades vítreas amiloidóticas, síndrome do túnel do carpo e hipertiroxinemia . Os sintomas da amiloidose de TTR incluem neuropatia sensorial (por exemplo, parestesia, hipestesia em membros distais), neuropatia autonômica (por exemplo, disfunção gas-trointestinal, tal como úlcera gástrica ou hipotensão ortostática), neu- ropatia motora, convulsões, demência, mielopatia, polineuropatia, sín- drome do túnel do carpo, insuficiência autonômica, miocardiopatia, opacidades vítreas, insuficiência renal, nefropatia, mBMI substancialmente reduzido (Índice de Massa Corporal modificado), disfunção do nervo craniano e distrofia da treliça córnea.
II. iRNAs da Invenção
[00194] A presente invenção fornece RNAis que inibem seletivamente a expressão de um ou mais genes TTR. Em uma modalidade, o agente de iRNA inclui moléculas de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibir a expressão de um gene de TTR em uma célula, tal como uma célula dentro de um indivíduo, por exemplo, um mamífero, tal como um humano tendo uma doença associada à TTR. O dsR- NA inclui uma fita antissenso tendo uma região de complementaridade que é complementar a pelo menos uma parte de um mRNA formado na expressão de um gene de TTR. A região de complementaridade é de cerca de 30 nucleotídeos ou menos no comprimento (por exemplo, cerca de 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18 ou 18 nucleo- tídeos ou menos no comprimento). No contato com uma célula que expressa o gene de TTR, o iRNA inibe selectivamente a expressão do gene de TTR (por exemplo, um gene de TTR humano, de primata, não primata ou de pássaro) em pelo menos cerca de 10 % como analisado, por exemplo, um método com base em PCR ou DNA ramificado (bDNA), ou por um método com base em proteína, tal como por análise de imunofluorescência, usando, por exemplo, Manchamento do Oeste ou técnicas de citocitometria de fluxo.
[00195] Um dsRNA inclui duas fitas de RNA que são complementares e hibridizam para formar uma estrutura duplex em condições em que o dsRNA será usado. Uma fita de um dsRNA (a fita antissenso) inclui uma região de complementaridade que é substancialmente com-plementar e, em geral, totalmente complementar, a uma sequência alvo. A sequência alvo pode ser derivada da sequência de um mRNA formado durante a expressão de um gene de TTR. O outra fita (a fita senso) inclui uma região que é complementar aa fita antissenso, de modo que os duas fitas hibridizem e formem uma estrutura duplex quando combinados em condições adequadas. Como descrito em outro lugar aqui e como conhecido na técnica, as sequências complementares de um dsRNA podem também estar contidas como regiões autocomplementares de uma única molécula de ácido nucleico, em oposição a estarem em oligonucleotídeos separados.
[00196] Geralmente, a estrutura duplex está entre 15 e 30 pares de bases no comprimento, por exemplo, entre, 15-29, 15-28, 15-27, 1526, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 1830, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18 -23, 18-22, 18-21, 1820, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 1921, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20 22, 20-21, 21 -30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 ou 21-22 pares de bases no comprimento. As faixas e comprimentos intermediários às faixas e comprimentos relacionados acima também são consideradas fazerem parte da invenção.
[00197] Similarmente, a região de complementaridade para a sequência alvo tem entre 15 e 30 nucleotídeos no comprimento, por exemplo, entre 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18- 24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20- 21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 ou 21-22 nucleotídeos no comprimento. As faixas e comprimentos intermediários às faixas e compri- mentos relacionados acima também são consideradas fazerem parte da invenção.
[00198] Em algumas modalidades, o dsRNA tem cerca de 15 a cerca de 20 nucleotídeos no comprimento, ou cerca de 25 a cerca de 30 nucleotídeos no comprimento. Em geral, o dsRNA é suficientemente longo para servir como um substrato para a enzima Dicer. Por exemplo, é bem conhecido na técnica que dsRNAs maiores que cerca de 21-23 nucleotídeos no comprimento podem servir como substratos para Dicer. Como a pessoa ordinariamente versada também reconhecerá, a região de um RNA alvejado para clivagem fará, na maioria das vezes, parte de uma molécula de RNA maior, muitas vezes uma molécula de mRNA. Quando relevante, uma "parte" de um alvo de mRNA é uma sequência contígua de um alvo de mRNA de comprimento suficiente para permitir que ele seja um substrato para a clivagem direcionada a RNAi (isto é, a clivagem através de uma via de RISC).
[00199] Uma pessoa versada na técnica também reconhecerá que a região duplex é uma porção funcional primária de um dsRNA, por exemplo, uma região duplex de cerca de 9 a 36 pares de base, por exemplo, cerca de 10-36, 11-36, 12-36, 13-36, 14-36, 15-36, 9-35, 1035, 11-35, 12-35, 13-35, 14-35, 15-35, 9-34, 10-34, 11- 34, 12-34, 1334, 14-34, 15-34, 9-33, 10-33, 11-33, 12-33, 13-33, 14-33, 15-33, 9-32, 10-32, 11-32, 12-32, 13-32, 14-32, 15-32, 9-31, 10-31, 11-31, 12-31, 13-32, 14-31, 15- 31, 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18- 20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21- 27, 21-26, 21-25, 21-24, 21 -23, ou 21-22 pares de bases. Desse modo, em uma modalidade, na medida em que se processa para um duplex funcional, de por exemplo, 15-30 pares de ba ses, que visa um RNA desejado para clivagem, uma molécula de RNA ou complexo de moléculas de RNA tendo uma região duplex maior que 30 pares de bases é um dsRNA. Desse modo, um técnico ordinariamente versado reconhecerá que em uma modalidade, um miRNA é um dsRNA. Em outra modalidade, um dsRNA não é um miRNA de ocorrência natural. Em outra modalidade, um agente de iRNA útil para direcionar a expressão do gene de TTR não é gerado na célula alvo por clivagem de um dsRNA maior.
[00200] Um dsRNA como aqui descrito pode ainda incluir uma ou mais projeções de nucleotídico de fita única, por exemplo, 1, 2, 3 ou 4 nucleotídeos. Os dsRNAs que têm pelo menos uma projeção de nu- cleotídeo podem ter propriedades de inibição inesperadamente superiores em relação às suas contrapartes de extremidade cega. Uma projeção de nucleotídeo pode compreender ou consistir em um análogo de nucleotídeo/nucleosídeo, incluindo um desoxinucleotí- deo/nucleosídeo. A(s) projeção(ões) pode(m) estar na fita senso, na fita antissenso ou qualquer combinação dos mesmos. Além disso, o(s) nucleotídeo(s) de uma projeção pode(m) estar presentes na extremidade 5’, extremidade 3’ ou ambas as extremidades de uma fita antissenso ou de senso de um dsRNA. Em certas modalidades, projeções estendidas, mais longas são possíveis.
[00201] Um dsRNA pode ser sintetizado por métodos convencionais conhecidos na técnica, como também discutido abaixo, por exemplo, por uso de um sintetizador de DNA automatizado, tal como são comercialmente disponíveis de, por exemplo, Biosearch, Applied Biosystems, Inc.
[00202] Os compostos de iRNA da invenção podem ser preparados usando um procedimento de duas etapas. Primeiro, as fitas individuais da molécula de RNA de fita dupla são preparados separadamente. Então, as fitas dos componentes são recozidos. As fitas individuais do composto de siRNA podem ser preparados usando a síntese orgânica em fase de solução ou em fase sólida ou ambas. A síntese orgânica oferece a vantagem de que as fitas de oligonucleotídeos compreendendo nucleotídeos não naturais ou modificados podem ser facilmente preparados. Os oligonucleotídeos de fita única da invenção podem ser preparados usando a síntese orgânica em fase de solução ou em fase sólida ou ambas.
[00203] Em um aspecto, um dsRNA da invenção inclui pelo menos duas sequências de nucleotídeos, uma sequência de senso e uma sequência antissenso. A fita senso é selecionado a partir do grupo de sequências fornecido em qualquer uma das Tabelas 1, 3, 5, 6 e 7, e a fita antissenso correspondente da fita senso é selecionado a partir do grupo de sequências de qualquer uma das Tabelas 1, 3, 5, 6 e 7. Neste aspecto, uma das duas sequências é complementar à outra das duas sequências, com uma das sequências sendo substancialmente complementares a uma sequência de um mRNA gerado na expressão de um gene de TTR . Como tal, neste aspecto, um dsRNA incluirá dois oligonucleotídeos, em que um oligonucleotídeo é descrito como a fita senso em qualquer uma das Tabelas 1, 3, 5, 6 e 7 e o segundo oligo- nucleotídeo é descrito como a fita antissenso correspondente da fita senso em qualquer uma das Tabelas 1, 3, 5, 6 e 7. Em uma modalida-de, as sequências substancialmente complementares do dsRNA estão contidas em oligonucleotídeos separados. Em outra modalidade, as sequências substancialmente complementares do dsRNA estão contidas em um único oligonucleotídeo.
[00204] Deve entender-se que, embora algumas das sequências nas Tabelas 1, 3, 5, 6 e 7 sejam descritas como sequências modificadas e/ou conjugadas, o RNA do iRNA da invenção, por exemplo, um dsRNA da invenção, pode compreender qualquer uma das sequências apresentadas nas Tabelas 1, 3, 5, 6 e 7 que seja não modificada, não conjugada e/ou modificada e/ou conjugada de forma diferente da des- crita no mesmo.
[00205] A pessoa versada é bem consciente de que os dsRNAs tendo uma estrutura duplex dentre cerca de 20 e 23 pares de bases, por exemplo, 21, os pares de bases foram saudados como particularmente eficazes na indução da interferência de RNA (Elbashir et al., EMBO 2001, 20: 6877- 6888). No entanto, outros descobriram que as estruturas duplex de RNA mais curtas ou mais longas também podem ser eficazes (Chu e Rana (2007) RNA 14: 1714-1719; Kim et al. (2005) Nat Biotech 23: 222-226). Nas modalidades descritas acima, em virtude da natureza das sequências de oligonucleotídeos fornecidas em qualquer uma das Tabelas 1, 3, 5, 6 e 7, os dsRNAs aqui descritos podem incluir pelo menos uma fita de um comprimento de minimamente 21 nucleotídeos. Pode-se esperar razoavelmente que os dúplices mais curtos tendo uma das sequências de qualquer uma das Tabelas 1, 3, 5, 6 e 7 menos apenas alguns nucleotídeos em uma ou ambas as extremidades podem ser igualmente eficazes em comparação com o dsRNA descritos acima. Por conseguinte, os dsRNAs tendo uma sequência de pelo menos 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais nucleotídeos contíguos derivados de uma das sequências de qualquer uma das Tabelas 1, 3, 5, 6 e 7 e diferindo em sua capacidade de inibir a expressão de um gene de TTR por não mais do que cerca de 5, 10, 15, 20, 25 ou 30 % de inibição de um dsRNA que compreende a sequência completa, devem ser considerados dentro do escopo da presente invenção.
[00206] Além disso, os RNAs fornecidos em qualquer uma das Tabelas 1, 3, 5, 6 e 7 identificam um(s) sítio(s) em uma transcrição de TTR que é suscetível à clivagem mediada por RISC. Como tal, a presente invenção também apresenta os iRNAs que direcionam dentro de um desses sítios. Quando aqui usado, um iRNA é referido para direcionar dentro de um sítio particular de uma transcrição de RNA se o iR- NA promove a clivagem da transcrição em qualquer lugar dentro desse sítio particular. Um tal iRNA geralmente incluirá pelo menos cerca de 15 nucleotídeos contíguos de uma das sequências fornecidas em qualquer uma das Tabelas 1, 3, 5, 6 e 7 acopladas à sequência de nu- cleotídeo adicional tiradas da região contígua à sequência selecionada em um gene de TTR.
[00207] Enquanto uma sequência alvo é geralmente cerca de 15 a 30 nucleotídeos no comprimento, há uma grande variação na adequação de sequências particulares nesta faixa para direcionar a clivagem de qualquer determinado RNA alvo. Vários pacotes de software e as diretrizes aqui estabelecidas fornecem a orientação para a identificação de sequências líder ideais para qualquer determinado alvo de gene, porém, uma abordagem empírica pode também ser adotada em que uma "janela" ou "máscara" de um determinado tamanho (como exemplo não limitantee, 21 nucleotídeos) é literal ou figurativamente (incluindo, por exemplo, in silico) colocada na sequência de RNA alvo para identificar sequências na faixa de tamanho que podem servir como sequências alvo. Ao mover a "janela" da sequência progressivamente, um nucleotídeo a montante ou a jusante de uma localização de sequência alvo inicial, a próxima sequência alvo potencial pode ser identificada, até que o conjunto completo de possíveis sequências seja identificado para qualquer tamanho de alvo selecionado. Este processo, acoplado com a síntese sistemática e teste das sequências identificadas (usando ensaios como aqui descritos ou conhecidos na técnica) para identificar as sequências que funcionam de forma otimizada pode identificar as sequências de RNA que, quando direcionadas com um agente de iRNA, mediam a melhor inibição da expressão do gene alvo. Desse modo, enquanto as sequências identificadas, por exemplo, em qualquer uma das Tabelas 1, 3, 5, 6 e 7 representam sequências alvo efetivas, é considerado que a otimização adicional da eficiência de inibição pode ser obtida progressivamente por "caminhada da janela" de um nucleotídeo a montante ou a jusante das sequências dadas para identificar sequências com características de inibição iguais ou melhores.
[00208] Além disso, é considerado que para qualquer sequência identificada, por exemplo, em qualquer uma das Tabelas 1, 3, 5, 6 e 7, outra otimização poderia ser obtida sistematicamente adicionando-se ou removendo-se os nucleotídeos para gerar sequências mais longas ou mais curtas e testando-se essas sequências geradas por caminhada de uma janela do tamanho mais longo ou mais curto para cima ou para baixo do RNA alvo a partir desse ponto. Mais uma vez, o acoplamento desta abordagem para a geração de novos alvos candidatos com o teste de eficácia de iRNAs com base nessas sequências alvo em um ensaio de inibição como conhecido na técnica e/ou como aqui descrito pode levar a melhorias adicionais na eficiência da inibição. Ainda mais, tais sequências otimizadas podem ser ajustadas, por exemplo, pela introdução de nucleotídeos modificados como aqui descrito ou como é conhecido na técnica, adição ou alterações na projeção, ou outras modificações como é conhecido na técnica e/ou discutido aqui para também otimizar a molécula (por exemplo, aumentando a estabilidade no soro ou a meia-vida circulante, aumentando a estabilidade térmica, realçando a liberação da transmembrana, direcionando para um local determinado ou tipo de célula, aumentando a interação com enzimas de via de silenciamento, aumentando a liberação dos endossomas) como um inibidor de expressão.
[00209] Um iRNA como aqui descrito pode conter um ou mais não pareamentos à sequência alvo. Em uma modalidade, um iRNA como aqui descrito contém não mais de 3 não pareamentos. Se a fita antis- senso do iRNA contém não pareamentos para uma sequência alvo, é preferível que a área de não pareamento não esteja localizada no cen tro da região de complementaridade. Se a fita antissenso do iRNA contém não pareamentos na sequência alvo, é preferível que o não pare- amento seja restrito a estar dentro dos últimos 5 nucleotídeos da extremidade 5’ou 3’ da região de complementaridade. Por exemplo, para um agente de iRNA de 23 nucleotídeos, a fita que é complementar a uma região de um gene de TTR, geralmente não contém qualquer não pareamento dentro dos 13 nucleotídeos centrais. Os métodos aqui descritos ou métodos conhecidos na técnica podem ser usados para determinar se um iRNA que contém um não pareamento a uma sequência alvo é efetivo na inibição da expressão de um gene de TTR. A consideração da eficácia de iRNAs com não pareamentos na inibição da expressão de um gene de TTR é importante, especialmente se a região particular de complementaridade em um gene de TTR é conhecida por ter uma variação da sequência polimórfica dentro da população.
III. iRNAs modificados da invenção
[00210] Em uma modalidade, o RNA do iRNA da invenção, por exemplo, um dsRNA, é não modificado e não compreende, por exemplo, modificações químicas e/ou conjugações conhecidas na técnica e aqui descritas. Em outra modalidade, o RNA de um iRNA da invenção, por exemplo, um dsRNA, é modificado quimicamente para realçar a estabilidade ou outras características benéficas. Em certas modalidades da invenção, substancialmente todos os nucleotídeos de um iRNA da invenção são modificados. Em outras modalidades da invenção, todos os nucleotídeos de um iRNA da invenção são modificados. Em algumas modalidades, substancialmente todos os nucleo- tídeos de um iRNA da invenção são modificados e o iRNA compreende não mais do que 8 modificações de 2’-flúor (por exemplo, não mais do que 7 modificações de 2’-fluoro, não mais do que 6 modificações de 2’-fluoro, não mais de 5 modificações de 2’-fluoro, não mais do que 4 modificações de 2’-fluoro, não mais do que 3 modificações de 2’-fluoro, ou não mais do que 2 modificações de 2’-fluoro) na fita senso e não mais de 6 modificações de 2’-flúor (por exemplo, não mais do que 5 modificações de 2’-fluoro, não mais de 4 modificações de 2’-fluoro, não mais do que 3 modificações de 2’-flúor ou não mais de 2 modificações de 2’-fluoro) na fita antissenso. Em outras modalidades, todos os nucleotídeos de um iRNA da invenção são modificados e o iRNA não com-preende mais do que 8 modificações de 2 ‘flúor (por exemplo, não mais do que 7 modificações de 2’-fluoro, não mais do que 6 modificações de 2’-fluoro, não mais do que 5 modificações de 2’-fluoro, não mais do que 4 modificações de 2’-fluoro, não mais do que 3 modificações de 2’-fluoro, ou não mais do que 2 modificações de 2’-fluoro) na fita senso e não mais do que 6 modificações de 2’-flúor (por exemplo, não mais do que 5 modificações de 2’-fluoro, não mais de 4 modificações de 2’-fluoro, não mais do que 3 modificações de 2’-flúor ou não mais do que 2 modificações de 2’-fluoro) na fita antissenso. Os iRNAs da invenção em que "substancialmente todos os nucleotídeos são modificados" são em grande parte, porém, não totalmente modificados e podem incluir não mais do que 5, 4, 3, 2 ou 1 nucleotídeos não modificados.
[00211] Os ácidos nucleicos apresentados na invenção podem ser sintetizados e/ou modificados por métodos bem estabelecidos na técnica, tais como os descritos em "Currents protocols in nucleic acid chemistry", Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque, NY, USA, que está aqui incorporado por referência. As modificações incluem, por exemplo, modificações finais, por exemplo, modificações de extremidade 5’ (fosforilação, conjugação, ligações invertidas) ou modificações de extremidade 3’ (conjugação, nucleotídeos de DNA, ligações invertidas, etc.); modificações de base, por exemplo, substituição com bases estabilizadoras, bases desestabilizadoras ou bases que paream-se pela base com um repertório expandido de pares, remoção de bases (nucleotídeos abásicos) ou bases conjugadas; modificações de açúcar (por exemplo, na posição 2’ ou posição 4’) ou substituição do açúcar; e/ou modificações da estrutura, incluindo modificação ou substituição das ligações de fosfodiéster. Exemplos específicos de compostos de iRNA úteis nas modalidades aqui descritas incluem, porém, não estão limitados a, RNAs que contêm estruturas modificadas ou ligações de internucleosídeo não naturais. Os RNAs tendo estruturas modificadas incluem, entre outros, aqueles que não têm um átomo de fósforo na estrutura. Para os propósitos desta especificação, e às vezes referenciados na técnica, os RNA modificados que não têm um átomo de fósforo em sua estrutura de internucleosí- deo também podem ser considerados oligonucleosídeos. Em algumas modalidades, um iRNA modificado terá um átomo de fósforo em seu estrutura de internucleosídeo.
[00212] As estruturas de RNA modificados incluem, por exemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirais, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metil e outros alquilfosfonatos incluindo fos- fatos de 3’-alquileno e fosfonatos quirais, fosfinatos, fosforamidatos incluindo 3’-amino fosforamidato e aminoalquilfosforamidatos, tionofos- foramidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres e borano- fosfatos tendo ligações 3’-5’normais, análogos ligados a 2’-5’destes, e aqueles com polaridade invertida em que os pares adjacentes das unidades de nucleosídeo são 3’-5’ a 5’-3’ ou 2’-5’a 5’-2’ ligados. Vários sais, sais mistos e formas de ácidos livres também estão incluídos.
[00213] Patentes Norte-americanas representativas que ensinam a preparação das ligações contendo fósforo acima incluem, porém, não estão limitadas a, Patentes Norte-americanas Nos. 3.687.808; 4,469,863; 4,476,301; 5.023.243; 5.177.195; 5.188.897; 5.264.423; 5,276,019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.316; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; 5.625.050; 6.028.188; 6.124.445; 6.160.109; 6.169.170; 6.172.209; 6. 239.265; 6.277.603; 6.326.199; 6.346.614; 6.444.423; 6.531.590; 6.534.639; 6.608.035; 6.683.167; 6.858.715; 6.867.294; 6.878.805; 7.015.315; 7.041.816; 7.273.933; 7.321.029; e Pat US RE39464, cujos conteúdos completos de cada uma estão aqui incorporados por referência.
[00214] As estruturas de RNA modificados que não incluem um átomo de fósforo nele têm as estruturas que são formadas por ligações de nucleosídeo de alquila ou cicloalquila de cadeia curta, hetero- átomos mistos e ligações de internucleosídeo de alquila ou cicloalqui- la, ou uma ou mais ligações de internucleosídeo heteroatômicas ou heterocíclicas de cadeia curta. Estes incluem aqueles tendo ligações de morfolino (formadas em parte pela porção de açúcar de um nucleo- sídeo); estruturas de siloxano; estruturas de sulfeto, sulfóxido e sulfona; estruturas de formacetila e tioformacetila; estruturas de formacetila e de tioformacetila de metileno; estruturas contendo alceno; estruturas de sulfamato; estruturas de metilenoimino e metileno-hidrazino; estruturas de sulfonato e sulfonamida; estruturas de amida; e outros tendo partes componentes de N, O, S e CH2.
[00215] Patentes Norte-americanas representativas que ensinam a preparação dos oligonucleosídeos acima incluem, porém, não estão limitadas a, Patente Norte-americano Nos. 5.034.506; 5,166,315; 5.118.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.64.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5 561 225; 5.596.086; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; e 5.677.439, cujos conteúdos completos de cada uma estão aqui incorporados por referência.
[00216] Em outras modalidades, mímicos de RNA adequados são considerados para uso em iRNAs, em que igualmente o açúcar e a ligação de internucleosídeo, isto é, a estrutura, das unidades de nucle- otídeos são substituídas por novos grupos. As unidades de base são mantidas para hibridização com um composto alvo de ácido nucleico apropriado. Um tal composto oligomérico, uma mímica de RNA que demonstrou ter excelentes propriedades de hibridização, é referido como um ácido peptideonucleico (PNA). Em compostos de PNA, a estrutura de açúcar de um RNA é substituída por uma estrutura contendo amida, em particular uma estrutura de aminoetilglicina. As nucleoba- ses são mantidas e estão ligadas direta ou indiretamente a átomos de aza nitrogênio da porção amida da estrutura. Patentes Norte- americanas representativas que ensinam a preparação dos compostos de PNA incluem, porém, não estão limitadas a, Patentes Norte- americanas Nos. 5.539.082; 5.714.331; e 5.719.262, cujos conteúdos completos de cada uma estão aqui incorporados por referência. Os compostos de PNA adicionais adequados para uso nos iRNAs da invenção são descritos, por exemplo, em Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500.
[00217] Algumas modalidades apresentadas na invenção incluem RNAs com estruturas de fosforotioato e oligonucleosídeos com estruturas de heteroátomos e, em particular, --CH2--NH--CH2-, --CH2--N(CH3)- -O--CH2-- [conhecidas como uma estrutura de metileno (metilimino) ou MMI], --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-- and -- N(CH3)--CH2--CH2-- [em que a estrutura de fosfodiéster nativa é representada como --O--P--O--CH2--] da Patente Norte-americana No. 5.489.677 acima mencionada e as estruturas de amida da Patente Norte-americana No. 5.602.240, acima mencionada. Em algumas modalidades, os RNAs apresentados aqui têm estruturas de cadeia principal de morfolino da Patente Norte-americano No. 5.034.506 acima mencionada.
[00218] Os RNAs modificados também podem conter uma ou mais porções de açúcar substituídas. Os iRNAs, por exemplo, dsRNAs, apresentados aqui podem incluir um dos seguintes na posição 2’: OH; F; O-, S- ou N-alquila; O-, S- ou N-alquenila; O-, S- ou N-alquinila; ou O-alquil-O-alquila, em que a alquila, alquenila e alquinila podem ser C1 a C10 alquila substituída ou não substituído ou C2 a C10 alquenila e al- quinila. Modificações exemplares adequadas incluem O[(CH2)nO] mCH3, O(CH2).nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2) nCH3, O(CH2)nONH2, and O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, onde n e m são de 1 a cerca de 10. Em outras modalidades, o dsRNA inclui um dos seguintes na posição 2’: C1 a C10 alquila inferior, alquila inferior substituído, alcarila, aralquila, O- alcarila ou O-aralquila, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquila, heterociclo- alcarila, aminoalquilamino, polialquilamino, silila substituída, um grupo de clivagem de RNA, um grupo repórter, um intercalador, um grupo para melhorar as propriedades farmacocinéticas de um iRNA, ou um grupo para melhorar as propriedades farmacodinâmicas de um iRNA e outros substituintes tendo propriedades similares. Em algumas modalidades, a modificação inclui um 2’-metoxietóxi (2'-O--CH2CH2OCH3, também conhecido como 2’-O-(2-metoxietil) ou 2’-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78: 486-504), isto é, um grupo alcóxi-alcóxi. Outra modificação exemplar é 2’-dimetilaminooxietóxi, isto é, um grupo O(CH2)2ON(CH3)2, também conhecido como 2’-DMAOE, como descrito nos exemplos aqui abaixo e 2’-dimetilaminoetoxietóxi (também conhecido na técnica em 2’-O-dimetilaminoetoxietila ou 2’-DMAEOE), isto é, 2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2.
[00219] Outras modificações incluem 2’-metóxi (2’-OCH3), 2’- aminopropóxi (2’-OCH2CH2CH2NH2) e 2’-flúor (2’-F). Modificações similares também podem ser feitas em outras posições no RNA de um iRNA, em particular a posição 3’ do açúcar no nucleotídeo de terminal 3’ ou em dsRNA ligados a 2’-5’e a posição 5’ do nucleotídeo de termi nal 5’. Os iRNAs também podem ter mímicos de açúcar, tais como porções de ciclobutila no lugar do açúcar de pentofuranosila. Patentes Norte-americanas representativas que ensinam a preparação de tais estruturas de açúcar modificado incluem, porém, não estão limitadas a, Pat. Norte-americana Nos 4.981.957; 5.118.800; 5,319,080; 5,359,044; 5.393.878; 5,446,137; 5,466,786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; e 5.700.920, algumas das quais são comumente pertencentes ao presente pedido. O conteúdo completo de cada uma dos anteriores está aqui incorporado por referência.
[00220] O RNA de um iRNA da invenção também pode incluir modificações ou substituições de nucleobase (muitas vezes referida na técnica simplesmente como "base"). Quando aqui usado, as nucleobases "não modificadas" ou "naturais" incluem as bases de purina adenina (A) e guanina (G), e as bases de pirimidina timina (T), citosina (C) e uracila (U). As nucleobases modificadas incluem outras nucleobases sintéticas e naturais tais como desóxi-timina (dT), 5-metilcitosina (5- me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6- metila e outros derivados de alquila de adenina e guanina, 2-propila e outros derivados de alquila de adenina e guanina, 2-tiouracila, 2- tiotimina e 2-tiocitosina, 5-halouracila e citosina, 5-propinil uracila e ci- tosina, 6-azo uracila, citosina e timina, 5-uracila (pseudouracila), 4- tiouracila, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquila, 8-hidroxil anal, outras adeninas e guaninas 8-substituídas, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometila e outras uracilas e citosinas 5-substituídas, 7- metilguanina e 7-metiladenina, 8-azaguanina e 8-azaadenina, 7- deazaguanina e 7-daazaadenina e 3-deazaguanina e 3- desazaadenina. Outras nucleobases incluem aquelas descritas na Pat. Norte-americana No. 3.687.808, aquelas descritas em Modified Nu cleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008; aquelas descritas em The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990, aquelas descritas por Englisch et al., Angewandte Chemie, Edição Internacional, 1991, 30, 613, e aquelas descritas por Sanghvi, Y S., Capítulo 15, dsRNA Research and Applications, páginas 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993. Certas destas nucleobases são particularmente úteis para aumentar a afinidade de ligação dos compostos oligoméricos apresentados na invenção. Estas incluem pirimidinas 5-substituídas, 6- azapirimidinas e purinas N-2, N-6 e 0-6 substituídas, incluindo 2- aminopropiladenina, 5-propiniluracila e 5-propinilcitosina. As substituições de 5-metilcitosina demonstraram aumentar a estabilidade do duplex de ácido nucleico por 0,6-1,2 ° C (Sanghvi, YS, Crooke, ST and Lebleu, B., Eds., DsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) e são substituições de base exemplares, ainda mais particularmente quando combinadas com modificações de açúcar de 2’-O-metoxietila.
[00221] Patentes Norte-americanas representativas que ensinam a preparação de certas nucleobases modificadas notadas acima, bem como outras nucleobases modificadas incluem, porém, não estão limitadas às Patentes Norte-americanas acima mencionadas Nos. 3.687.808, 4.845.205; 5.130.30, 5.134.066, 5.175.273, 5.367.066, 5.432.272, 5.457.187, 5.459.255, 5.484.908, 5.502.177, 5.525.711, 5.52.540, 5.587.469, 5.594.121, 5.596.091, 5.614.617, 5.681.941, 5.750.692, 6.015.886, 6.147.200, 6.166.197, 6.222.025, 6.235.887, 6.380.368, 6.528.640, 6.639.062, 6.617.438, 7.045.610, 7.427.672, e 7.495.088, cujos conteúdos completos de cada uma estão aqui incorporados por referência.
[00222] O RNA de um iRNA também pode ser modificado para in- cluir um ou mais porções de açúcar bicíclico. Um "açúcar bicíclico" é um anel de furanosila modificado pela ponte de dois átomos. Um "nu- cleosídeo bicíclico" ("BNA") é um nucleosídeo tendo uma porção de açúcar compreendendo uma ponte que conecta dois átomos de carbono do anel de açúcar, desse modo formando um sistema de anel bicíclico. Em certas modalidades, a ponte conecta o carbono 4’ e o carbono 2’ do anel de açúcar. Desse modo, em algumas modalidades, um agente da invenção pode incluir um ou mais ácidos nucleicos bloqueados (LNA). Um ácido nucleico bloqueado é um nucleotídeo tendo uma porção de ribose modificada em que a porção de ribose compreende uma ponte extra que conecta os carbonos 2’ e 4’. Em outras palavras, um LNA é um nucleotídeo compreendendo uma porção de açúcar bicíclico compreendendo uma ponte 4’-CH2-O-2’. Esta estrutura efetivamente "bloqueia" a ribose na conformação estrutural 3’-endo. A adição de ácidos nucleicos bloqueados aos siRNAs mostrou aumentar a estabilidade do siRNA no soro e reduzir os efeitos off-target (Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33 (1): 439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6 (3): 833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31 (12): 3185-3193). Exemplos de nucleosí- deos bicíclicos para uso nos polinucleotídeos da invenção incluem, sem limitação, nucleosídeos compreendendo uma ponte entre os átomos de anel 4’ e 2’ ribosila. Em certas modalidades, os agentes de po- linucleotídeo antissenso da invenção incluem um ou mais nucleosí- deos bicíclicos que compreendem uma ponte de 4’a 2’. Exemplos de tais nucleosídeos bicíclicos em ponte 4’ a 2’, incluem, porém, não estão limitados a, 4‘-(CH2)—O-2‘ (LNA); 4‘-(CH2)—S-2‘; 4‘-(CH2)2—O-2‘ (ENA); 4‘-CH(CH3)—O-2‘ (também referido como "etila constrangida" ou "cEt") e 4-CH(CH2OCH3)—O^ (e seus análogos; ver, por exemplo., Norte-americano Pat. No. 7,399,845); 4‘-C(CH3)(CH3)—O-2‘ (e seus análogos; ver, por exemplo, Patente Norte-americana No. 8.278.283); 4-CH2—N(OCH3)-2‘ (e seus análogos; ver, por exemplo, Patente Norte-americana No. 8.278.425); 4‘-CH2—O—N(CH3)-2‘ (veja, por exemplo, Publicação de Patente Norte-americano No. 2004/0171570); 4‘-CH2—N(R)—O-2‘, em que R é H, C1-C12 alquila, ou um grupo protetor (veja, por exemplo, Pat. Norte-americana No. 7.427.672); 4‘-CH2—C(H)(CH3)-2‘ (veja, por exemplo, Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); e 4‘-CH2—C(=CH2)-2‘ (e seus análogos; ver, por exemplo, Patente Norte-americana No. 8.278.426). O conteúdo completo de cada uma dos anteriores está aqui por este meio incorporado por referência.
[00223] Patentes Norte-americanas e Publicações de Patente Norte-americana representativas adicionais que ensinam a preparação de nucleotídeos de ácido nucleico bloqueados incluem, porém, não estão limitados as seguintes: Patentes Norte-americanas Nos. 6.268.490; 6.525.191; 6.670.461; 6.770.748; 6.794.499; 6.998.484; 7.053.207; 7.034.133; 7.084.125; 7.399.845; 7.427.672; 7.569.686; 7.741.457; 8.022.193; 8.030.467; 8.278.425; 8.278.426; 8.278.283; US 2008/0039618; e US 2009/0012281, cujos conteúdos completos de cada uma das quais estão por este meio incorporados por referência.
[00224] Qualquer um dos nucleosídeos bicíclicos anteriores pode ser preparado tendo uma ou mais configurações de açúcares estereo- quimicas incluindo, por exemplo, α-L-ribofuranose e β-D-ribofuranose (ver WO 99/14226).
[00225] O RNA de um iRNA também pode ser modificado para incluir um ou mais nucleotídeos de etila constrangida. Quando aqui usado, um "nucleotídeo de etila constrangida" ou "cEt" é um ácido nuclei- co bloqueado compreendendo uma porção de açúcar bicíclico compreendendo uma ponte de 4’-CH (CH3)-0-2’. Em uma modalidade, um nucleotídeo de etila constrangida está na conformação S aqui referida como "S-cEt".
[00226] Um iRNA da invenção também pode incluir um ou mais "nu- cleotídeos conformacionalmente restritos" ("CRN"). CRN são análogos de nucleotídeos com um ligador que conecta os carbonos C2’ e C4’ da ribose ou os carbonos C3 e C5’ da ribose. CRN bloqueia o anel de ribose em uma conformação estável e aumenta a afinidade de hibridi- zação para mRNA. O ligador é de comprimento suficiente para colocar o oxigênio em uma posição ideal para a estabilidade e afinidade resultando no enrugamento de anel de ribose menor.
[00227] As publicações representativas que ensinam a preparação de alguns dos CRN acima mencionados incluem, porém, não estão limitadas à Publicação de Patente Norte-americana No. 2013/0190383; e a publicação PCT WO 2013/036868, o conteúdo completo de cada uma das quais está por este meio aqui incorporado por referência.
[00228] Um ou mais dos nucleotídeos de um iRNA da invenção também podem incluir um nucleotídeo substituído por hidroximetila. Um "nucleotídeo substituído por hidroximetila" é um 2’-3’-seco- nucleotídeo acíclico, também referido como uma modificação de "ácido nucleico não bloqueado" ("UNA").
[00229] As publicações Norte-americano representativas que ensinam a preparação da UNA incluem, porém, não estão limitadas à Patente Norte-americana No. 8.314.227; e Publicações de Patente Norte- americana Nos. 2013/0096289; 2013/0011922; e 2011/0313020, cujos conteúdos completos de cada uma estão por este meio aqui incorporados por referência.
[00230] As modificações potencialmente estabilizadoras às extremidades das moléculas de RNA podem incluir N-(acetilaminocaproil)-4- hidroxiprolinol (Hyp-C6-NHAc), N-(caproil-4-hidroxiprolinol (Hyp-C6), N-(acetil-4-hidroxiprolinol (Hyp-NHAc), timidina-2’-0-desoxitimidina (éter), N-(aminocaproil)-4-hidroxiprolinol (Hyp-C6-amino), 2- docosanoil-uridina-3" - fosfato, base invertida dT (idT) e outros. A des- crição desta modificação pode ser constatada na Publicação PCT No. WO 2011/005861.
[00231] Outras modificações dos nucleotídeos de um iRNA da invenção incluem um 5’ fosfato ou mímico de 5’ fosfato, por exemplo, um fosfato de terminal 5’ ou mímico de fosfato na fita antissenso de um agente de iRNA. Os mímicos de fosfato adequados são descritos, por exemplo, na Publicação de Patente Norte-americana No. 2012/0157511, cujos conteúdos completos estão por este meio aqui incorporados por referência.
A. iRNAs modificados Compreendendo Motifs da Invenção
[00232] Em certos aspectos da invenção, os agentes de iRNA de fita dupla da invenção incluem modificações químicas como descrito, por exemplo, no Pedido Provisório Norte-americano No. 61/561.710, depositado em 18 de Novembro de 2011, ou em PCT/US2012/065691, depositado em 16 de Novembro de 2012, cujos conteúdos completos de cada dos quais estão por este meio incorporados aqui por referência.
[00233] Mais especificamente, foi surpreendentemente descoberto que, quando a fita senso e a fita antissenso do agente de RNAi de fita dupla são modificados para ter um ou mais motifs de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos em ou perto do sítio de clivagem de pelo menos uma fita de um agente de RNAi, a atividade de silenciamento de genes do agente de RNAi foi superiormente realçada.
[00234] Consequentemente, a invenção fornece agentes de RNAi de fita dupla capazes de inibir a expressão de um gene alvo (isto é, gene de TTR) in vivo. O agente de RNAi compreende uma fita senso e uma fita antissenso. Cada fita do agente de RNAi pode variar a partir de 12-30 nucleotídeos no comprimento. Por exemplo, cada fita pode ter entre 14 a 30 nucleotídeos no comprimento, 17 a 30 nucleotídeos no comprimento, 25 a 30 nucleotídeos no comprimento, 27-30 nucleo- tídeos no comprimento, 17-23 nucleotídeos no comprimento, 17-21 nucleotídeos no comprimento, 17-19 nucleotídeos no comprimento, 19-25 nucleotídeos no comprimento, 19-23 nucleotídeos no comprimento, 19-21 nucleotídeos no comprimento, 21-25 nucleotídeos no comprimento ou 21-23 nucleotídeos no comprimento.
[00235] A fita senso e a fita antissenso tipicamente formam um RNA de fita dupla duplex ("dsRNA"), também referido aqui como um "agente de RNAi". A região duplex de um agente de RNAi pode ser pares de 12 a 30 nucleotídeos no comprimento. Por exemplo, a região duplex pode ser entre pares de 14 a 30 nucleotídeos no comprimento, pares de 17-30 nucleotídeos no comprimento, pares de 27-30 nucleotídeos no comprimento, pares de 17 a 23 nucleotídeos no comprimento, pares de 17-21 nucleotídeos no comprimento, pares de 17 -19 nucleotí- deos no comprimento, pares de 19-25 nucleotídeos no comprimento, pares de 19-23 nucleotídeos no comprimento, pares de 19 a 21 nucle- otídeos no comprimento, pares de 21-25 nucleotídeos no comprimento ou pares de 21-23 nucleotídeos no comprimento. Em outro exemplo, a região duplex é selecionada entre 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 e 27 nucleotídeos no comprimento.
[00236] Em uma modalidade, o agente de RNAi pode conter uma ou mais regiões de projeção e/ou grupos de tamponamento na extremidade 3’, extremidade 5’ ou ambas as extremidades de um ou ambos as fitas. A projeção pode ser 1-6 nucleotídeos no comprimento, por exemplo 2-6 nucleotídeos no comprimento, 1-5 nucleotídeos no comprimento, 2-5 nucleotídeos no comprimento, 1-4 nucleotídeos no comprimento, 2-4 nucleotídeos no comprimento, 1- 3 nucleotídeos no comprimento, 2-3 nucleotídeos no comprimento ou 1-2 nucleotídeos no comprimento. As projeções podem ser o resultado de uma fita mais longo do que o outro, ou o resultado de duas fitas do mesmo compri- mento a serem escalonados. A projeção pode formar um não parea- mento com o mRNA alvo ou pode ser complementar às sequências de genes sendo direcionadas ou pode ser outra sequência. As primeira e segunda fitas também podem ser ligadas, por exemplo, por bases adicionais para formar um grampo de cabelo de cabelo, ou por outros li- gadores não base.
[00237] Em uma modalidade, os nucleotídeos na região de projeção do agente de RNAi podem ser cada qual independentemente um nu- cleotídeo modificado ou não modificado, incluindo, mas não limitado a 2’-açúcar modificado, tal como 2-F, 2’-O-metila, timidina (T), 2’-O- metoxietil-5-metiluridina (Teo), 2’-O-metoxietiladenosina (Aeo), 2’-O- metoxietil-5-metilcitidina (m5Ceo) e quaisquer combinações destes. Por exemplo, TT pode ser uma sequência de projeção para qualquer extremidade em qualquer um das fitas. A projeção pode formar um não pareamento com o mRNA alvo ou pode ser complementar às se-quências de genes sendo direcionadas ou pode ser outra sequência.
[00238] As projeções de 5’ ou 3’ na fita senso, fita antissenso ou ambos as fitas do agente de RNAi podem ser fosforiladas. Em algumas modalidades, a(s) região(ões) de projeção contém dois nucleotí- deos que possuem um fosforotioato entre os dois nucleotídeos, onde os dois nucleotídeos podem ser iguais ou diferentes. Em uma modalidade, a projeção está presente na extremidade 3’ da fita senso, fita antissenso ou ambos as fitas. Em uma modalidade, esta projeção de 3’ está presente na fita antissenso. Em uma modalidade, esta projeção de 3 está presente na fita senso.
[00239] O agente de RNAi pode conter apenas uma única projeção, o que pode fortalecer a atividade de interferência do RNAi, sem afetar a sua estabilidade geral. Por exemplo, a projeção de fita única pode estar localizada na extremidade terminal 3’ da fita senso ou, alternativamente, na extremidade terminal 3’ da fita antissenso. O RNAi tam- bém pode ter uma extremidade cega, localizada na extremidade 5’ da fita antissenso (ou a extremidade 3’ da fita senso) ou vice-versa. Geralmente, a fita antissenso do RNAi possui uma projeção de nucleotí- deos na extremidade 3’ e a extremidade 5’ é cega. Embora não desejem ser ligados pela teoria, a extremidade cega assimétrica na extremidade 5’ da fita antissenso e a extremidade 3’ da fita antissenso favorecem a transferência da fita guia no processo RISC.
[00240] Em uma modalidade, o agente de RNAi compreende uma fita senso de 21 nucleotídeos e uma fita antissenso de 23 nucleotí- deos, em que a fita senso contém pelo menos um motif de três modificações de 2’-F em três nucleotídeos consecutivos nas posições 9, 10, 11 a da extremidade 5; a fita antissenso contém pelo menos um motif de três modificações de 2’-O-metila em três nucleotídeos consecutivos nas posições 11, 12, 13 da extremidade 5’, em que uma extremidade do agente de RNAi é cega, enquanto a outra extremidade compreende uma projeção de 2 nucleotídeos. De preferência, a projeção de 2 nu- cleotídeos está na extremidade 3’ da fita antissenso.
[00241] Quando a projeção de 2 nucleotídeos está na extremidade 3’ da fita antissenso, pode haver duas ligações internucleotídicas de fosforotioato entre os três nucleotídeos terminais, em que dois dos três nucleotídeos são os nucleotídeos de projeção, e o terceiro nucleotídeo é um nucleotídeo pareado ao lado do nucleotídeo de projeção. Em uma modalidade, o agente de RNAi adicionalmente possui duas ligações internucleotídicas de fosforotioato entre os três nucleotídeos terminais tanto na extremidade 5’ da fita senso quanto na extremidade 5’ da fita antissenso. Em uma modalidade, cada nucleotídeo na fita senso e na fita antissenso do agente de RNAi, incluindo os nucleotídeos que fazem parte dos motifs, são nucleotídeos modificados. Em uma modalidade, cada resíduo é modificado independentemente com um 2’-O-metila ou 3’-fluoro, por exemplo, em um motif alternativo. Em uma modalidade, todos os nucleotídeos de um iRNA da invenção são modificados e o iRNA compreende não mais do que 8 modificações de 2’- flúor (por exemplo, não mais do que 7 modificações de flúor 2, não mais do que 6 modificações de 2-fluoro, não mais do que 5 modificações de 2-fluoro, não mais do que 4 modificações de 2-fluoro, não mais do que 3 modificações de 2-fluoro, ou não mais do que 2 modificações de 2-fluoro) na fita senso e não mais do que 6 modificações de 2 ‘flúor (por exemplo, não mais do que 5 modificações de 2-fluoro, não mais do que 4 modificações de 2-fluoro, não mais do que 3 modificações de 2-flúor ou não mais do que 2 modificações de 2-fluoro) na fita antissenso. Opcionalmente, o agente de RNAi compreende ainda um ligante (de preferência GalNAc3).
[00242] Em uma modalidade, a fita senso do agente de RNAi contém pelo menos um motif de três modificações idênticas em três nu- cleotídeos consecutivos, onde um dos motifs ocorre no sítio de clivagem na fita senso.
[00243] Em uma modalidade, a fita antissenso do agente de RNAi também pode conter pelo menos um motif de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, em que um dos motifs ocorre no sítio de clivagem ou próximo dele na fita antissenso.
[00244] Para um agente de RNAi possuindo uma região duplex com um comprimento de 17-23 nucleotídeos, o sítio de clivagem da fita an- tissenso é normalmente em torno das posições 10, 11 e 12 da extremidade 5’. Desse modo, os motifs de três modificações idênticas podem ocorrer nas posições 9, 10, 11; posições 10, 11, 12; posições 11, 12, 13; posições 12, 13, 14; ou 13, 14, 15 posições da fita antissenso, a contagem a partir do 1° nucleotídeo da extremidade 5’ da fita antis- senso, ou a contagem a partir do 1° nucleotídeo pareado dentro da região duplex da extremidade 5’ da fita antissenso. O sítio de clivagem na fita antissenso também pode mudar de acordo com o comprimento da região duplex do iRNA da extremidade 5’.
[00245] A fita senso do agente de RNAi pode conter pelo menos um motif de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos no sítio de clivagem da fita; e a fita antissenso pode ter pelo menos um motif de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos em ou perto do sítio de clivagem da fita. Quando a fita senso e a fita antissenso formam um duplex de dsRNA, a fita senso e a fita antis- senso podem estar tão alinhados que um motif dos três nucleotídeos na fita senso e um motif dos três nucleotídeos na fita antissenso tem pelo menos um sobreposição de nucleotídeos, ou seja, pelo menos um dos três nucleotídeos do motif na fita senso forma um par de bases com pelo menos um dos três nucleotídeos do motif na fita antissenso. Alternativamente, pelo menos dois nucleotídeos podem se sobrepor, ou todos os três nucleotídeos podem se sobrepor.
[00246] Em uma modalidade, todos os nucleotídeos na fita senso e fita antissenso do agente de iRNA, incluindo os nucleotídeos que fazem parte dos motifs, podem ser modificados. Cada nucleotídeo pode ser modificado com a mesma modificação ou diferente que pode incluir uma ou mais alterações de um ou ambos os oxigênios de fosfato de não liganção e/ou de um ou mais dos oxigênios de fosfato de ligação; alteração de um constituinte do açúcar ribose, por exemplo, da 2’ hi- droxila no açúcar ribose; substituição por atacado da porção de fosfato com ligadores de "defosfo"; modificação ou substituição de uma base natural; e substituição ou modificação da estrutura de ribose-fosfato.
[00247] Como os ácidos nucleicos são polímeros de subunidades, muitas das modificações ocorrem em uma posição que é repetida dentro de um ácido nucleico, por exemplo, uma modificação de uma base, ou uma porção de fosfato, ou um O de não ligação de uma porção de fosfato. Em alguns casos, a modificação ocorrerá em todas as posições do indivíduo no ácido nucleico, mas em muitos casos não será. A título de exemplo, uma modificação só pode ocorrer em uma posição terminal 3 ‘ou 5’, só pode ocorrer em uma região terminal, por exemplo, em uma posição em um nucleotídeo terminal ou nos últimos 2, 3, 4, 5 ou 10 nucleotídeos de uma fita. Uma modificação pode ocorrer em uma região de fita dupla, uma região de fita única ou em ambos. Uma modificação pode ocorrer apenas na região de fita dupla de um RNA ou só pode ocorrer em uma região de fita única de um RNA. Por exemplo, uma modificação de fosforotioato em uma posição O de não ligação pode ocorrer somente em um ou ambos os terminais, pode apenas ocorrer em uma região terminal, por exemplo, em uma posição em um nucleotídeo terminal ou nos últimos 2, 3, 4, 5 ou 10 nucleotí- deos de uma fita, ou pode ocorrer em regiões de fita dupla e de fita única, particularmente nos terminais. A extremidade 5’ou as extremidades podem ser fosforiladas.
[00248] Pode ser possível, por exemplo, para realçar a estabilidade, incluir bases particulares em projeções, ou incluir nucleotídeos modificados ou substitutos de nucleotídeos, em projeções de fita única, por exemplo, em uma projeção de 5’ ou 3’, ou em ambas. Por exemplo, pode ser desejável incluir nucleotídeos de purina em projeções. Em algumas modalidades, todas ou algumas das bases em uma projeção de 3 ‘ou 5’ podem ser modificadas, por exemplo, com uma modificação aqui descrita. As modificações podem incluir, por exemplo, o uso de modificações na posição 2’ do açúcar ribose com modificações que são conhecidas na técnica, por exemplo, o uso de desoxirribonucleotí- deos, 2’-desóxi-2’-flúor (2’-F) ou 2’-O-metila modificada em vez do ri- boaçúcar da nucleobase, e modificações no grupo fosfato, por exemplo, modificações de fosforotioato. Projeções não precisamser homó-logas com a sequência alvo.
[00249] Em uma modalidade, cada resíduo da fita senso e da fita antissenso é modificado independentemente com LNA, CRN, cET, UNA, HNA, CeNA, 2’-metoxietila, 2’-O-metila, 2’-O-alila, 2’-C-alila, 2’- desóxi, 2’-hidroxila ou 2’-fluoro. As fitas podem conter mais de uma modificação. Em uma modalidade, cada resíduo da fita senso e da fita antissenso é modificado independentemente com 2’-O-metila ou 2’- fluoro.
[00250] Pelo menos duas modificações diferentes estão tipicamente presentes na fita senso e na fita antissenso. Essas duas modificações podem ser as modificações 2’-O-metila ou 2’-fluoro, ou outras.
[00251] Em uma modalidade, Na e/ou Nb compreende(m) modificações de um padrão alternativo. O termo "motivo alternativo" quando aqui utilizado refere-se a um motif com uma ou mais modificações, cada modificação ocorrendo em nucleotídeos alternados de uma fita. O nucleotídeo alternativo pode se referir a um por cada outro nucleotídeo ou um por cada três nucleotídeos, ou a um padrão similar. Por exemplo, se A, B e C representam um tipo de modificação no nucleotídeo, o motif alternativo pode ser "ABABABABABAB ...", "AABBAABBAABB ...", "AABAABAABAAB ...", "AAABAAABAAAB ...", "AAABBBAAABBB ..." ou "ABCABCABCABC ...", etc.
[00252] O tipo de modificações contidas no motif alternativo podem ser iguais ou diferentes. Por exemplo, se A, B, C, D representam um tipo de modificação no nucleotídeo, o padrão alternativo, isto é, modificações em todos os outros nucleotídeos, pode ser o mesmo, mas cada um das fitas de senso ou fita antissenso pode ser selecionado de várias possibilidades de modificações dentro do motif alternativo, tal como "ABABAB ...", "ACACAC ..." "BDBDBD ..." ou "CDCDCD ...", etc.
[00253] Em uma modalidade, o agente de RNAi da invenção que compreende o padrão de modificação para o motif alternativo na fita senso relativo ao padrão de modificação para o motif alternado na fita antissenso é desviado. O desvio pode ser tal que o grupo modificado de nucleotídeos da fita senso corresponde a um grupo de nucleotídeos modificados de forma diferente da fita antissenso e vice-versa. Por exemplo, a fita senso quando pareado com a fita antissenso no dsRNA duplex, o motif alternativo na fita senso pode começar com "ABABAB" de 5’-3’ da fita e o motif alternativo na fita antissenso pode começar com "BABABA" de 5’-3’ da fita na região duplex. Como outro exemplo, o motif alternativo na fita senso pode começar com "AABBAABB" de 5’-3’ da fita e o motif alternativo na fita antisenese pode começar com "BBAABBAA" de 5’-3’ da fita dentro da região duplex, de modo que haja um desvio completo ou parcial dos padrões de modificação entre a fita senso e a fita antissenso.
[00254] Em uma modalidade, o agente de RNAi de compreende o padrão do motif alternativo da modificação de 2’-O-metila e da modificação de 2’-F na fita senso inicialmente tem um desvio em relação ao padrão do motif alternativo de modificação de 2’-O-metila e modificação de 2’-F na fita antissenso inicialmente, isto é, no nucleotídeo modificado com 2’-O-metila nos pares de bases de fita de senso com um nucleotídeo modificado por 2’-F na fita antissenso e vice-versa. A 1 posição da fita senso pode começar com a modificação de 2’-F, e a 1 posição da fita antissenso pode começar com a modificação de 2’-O- metila.
[00255] A introdução de um ou mais motifs de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos para a fita senso e/ou a fita antissenso interrompe o padrão de modificação inicial presente na fita senso e/ou na fita antissenso. Esta interrupção do padrão de modificação da fita senso e/ou antissenso por meio da introdução de um ou mais motifs de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos para a fita senso e/ou antissenso surpreendentemente realça a atividade de silenciamento de genes para o gene alvo.
[00256] Em uma modalidade, quando o motif de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos é introduzido em qualquer uma das fitas, a modificação do nucleotídeo ao lado do motif é uma modificação diferente da modificação do motivo. Por exemplo, a porção da sequência que contém o motif é "...NaYYYNb...", onde "Y" representa a modificação do motif de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, e "Na" e "Nb" representam uma modificação no nucleotídeo ao lado do motif "YYY" que é diferente da modificação de Y, e onde Na e Nb podem ser as mesmas modificações ou diferentes. Altnernativamente, Na e/ou Nb podem estar presentes ou ausentes quando houver uma modificação de asa presente.
[00257] O agente de RNAi pode ainda compreender pelo menos uma ligação internucleotídica de fosforotioato ou metilfosfonato. A modificação da ligação internucleotídica de fosforotioato ou metilfosfonato pode ocorrer em qualquer nucleotídeo da fita senso ou de uma fita an- tissenso ou de ambos as fitas em qualquer posição da fita. Por exemplo, a modificação da ligação internucleotídica pode ocorrer em cada nucleotídeo na fita senso e/ou na fita antissenso; cada modificação da ligação internucleotídica pode ocorrer em um padrão alternativo na fita senso e/ou na fita antissenso; ou a fita senso ou a fita antissenso podem conter ambas as modificações da ligação internucleotídica em um padrão alternativo. O padrão alternativo da modificação da ligação in- ternucleotídica na fita senso pode ser o mesmo ou diferente da fita an- tissenso e o padrão alternado da modificação da ligação internucleotí- dica na fita senso pode ter uma mudança em relação ao padrão alternado da modificação da ligação internucleotídica na fita antissenso. Em uma modalidade, um agente de RNAi de fita dupla compreende 68 ligações de fosforotioato internucleotídicas. Em uma modalidade, a fita antissenso compreende duas ligações internucleotídicas de fosfo- rotioato nas ligações no terminal 5’ e duas ligações internucleotídicas de fosforotioato no terminal 3’, e a fita senso compreende pelo menos duas ligações internucleotídicas de fosforotioato no terminal 5’ ou no terminal 3’.
[00258] Em uma modalidade, o RNAi compreende uma modificação de ligação internucleotídica de fosforotioato ou metilfosfonato na região de projeção. Por exemplo, a região de projeção pode conter dois nucleotídeos possuindo uma ligação internucleotídica de fosforotioato ou metilfosfonato entre os dois nucleotídeos. As modificações da ligação internucleotídica também podem ser feitas para ligar os nucleotí- deos de projeção com os nucleotídeos pares emparelhados dentro da região duplex. Por exemplo, pelo menos 2, 3, 4 ou todos os nucleotí- deos de projeção podem ser ligados através de ligação internucleotídi- ca de fosforotioato ou metilfosfonato e, opcionalmente, pode haver ligações internucleotídicas de fosforotioato ou metilfosfonato adicionais que ligam o nucleotídeo de projeção com um nucleotídeo emparelhado que está ao lado do nucleotídeo de projeção. Por exemplo, pode haver pelo menos duas ligações internucleotídicas de fosforotioato entre os três nucleotídeos terminais, em que dois dos três nucleotídeos são nu- cleotídeos de projeção, e o terceiro é um nucleotídeo emparelhado ao lado do nucleotídeo de projeção. Estes três nucleotídeos terminais podem estar na extremidade 3’ da fita antissenso, na extremidade 3’ da fita senso, na extremidade 5’ da fita antissenso e/ou na extremidade 5’ da fita antissenso.
[00259] Em uma modalidade, a projeção de 2 nucleotídeos está na extremidade 3’ da fita antissenso e existem duas ligações internucleo- tídicas de fosforotioato entre os três nucleotídeos terminais, em que dois dos três nucleotídeos são os nucleotídeos de projeção e o terceiro nucleotídeo é um nucleotídeo emparelhado ao lado do nucleotídeo de projeção. Opcionalmente, o agente de RNAi pode adicionalmente ter duas ligações internucleotídicas de fosforotioato entre os três nucleotí- deos do terminal, tanto na extremidade 5’ da fita senso como na extremidade 5’ da fita antissenso.
[00260] Em uma modalidade, o agente de RNAi compreende não pareamento(s) com o alvo, dentro do duplex, ou suas combinações. O não pareamento pode ocorrer na região de projeção ou na região duplex. O par de bases pode ser classificado com base na sua propensão para promover a dissociação ou a fusão (por exemplo, na energia livre de associação ou dissociação de um emparelhamento particular, a abordagem mais simples é examinar os pares em uma base de par individual, embora análises similares ou próximas adjacentes também possam ser usadas). Em termos de promoção da dissociação: A:U é preferido sobre G:C; G:U é preferido sobre G:C; e I:C é preferido sobre G:C (I = inosina). Desequilíbrios, por exemplo, pares não canônicos ou que não são canônicos (como descrito em outro lugar aqui) são preferidos em pares canônicos (A:T, A:U, G:C); e os emparelhamentos que incluem uma base universal são preferidos sobre os emparelhamentos canônicos.
[00261] Em uma modalidade, o agente de RNAi compreende pelo menos um dos primeiros pares de bases 1, 2, 3, 4 ou 5 dentro das regiões duplas a partir da extremidade 5’ da fita antissenso selecionado independentemente do grupo de: A:U, G:U, I:C, e pares não pa- reados, por exemplo, não canônicos ou diferentes de emparelhamen- tos canônicos ou emparelhamentos que incluem uma base universal, para promover a dissociação da fita antissenso na extremidade 5’ do duplex.
[00262] Em uma modalidade, o nucleotídeo na posição 1 dentro da região duplex a partir da extremidade 5’ na fita antissenso é selecionado a partir do grupo que consiste em A, dA, dU, U e dT. Alternativamente, pelo menos um dos primeiros pares de bases 1, 2 ou 3 dentro da região duplex a partir da extremidade 5’ da fita antissenso é um par de bases AU. Por exemplo, o primeiro par de bases dentro da região duplex a partir da extremidade 5’ da fita antissenso é um par de bases AU.
[00263] Em uma modalidade, a sequência de fita de senso pode ser representado pela fórmula (I): 5’np-Na-(XXX)i-Nb-Y Y Y -Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3’ (I)
[00264] em que:
[00265] i e j são cada um independentemente 0 ou 1;
[00266] p e q são cada um independentemente 0-6;
[00267] cada Na representa independentemente uma sequência oli- gonucleotídica compreendendo 0-25 nucleotídeos modificados, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de forma diferente;
[00268] cada Nb representa independentemente uma sequência oli- gonucleotídica compreendendo 0-10 nucleotídeos modificados;
[00269] cada np e nq representam independentemente um nucleotí- deo de projeção;
[00270] em que Nb e Y não têm a mesma modificação; e
[00271] XXX, YYY e ZZZ representam cada um, independentemente, um motif de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos. De preferência, YYY é todos os nucleotídeos 2’-F modificados.
[00272] Em uma modalidade, o Na e/ou Nb compreendem modificações do padrão alternativo.
[00273] Em uma modalidade, o motif YYY ocorre no ou perto do sítio de clivagem da fita senso. Por exemplo, quando o agente de RNAi tem uma região duplex de 17-23 nucleotídeos no comprimento, o motif YYY pode ocorrer nas proximidades do sítio de clivagem (por exemplo: pode ocorrer nas posições 6, 7, 8, 7, 8, 9 8, 9, 10, 9, 10, 11, 10, 11, 12 ou 11, 12, 13) do - fita de senso, a contagem a partir do 1° nucleotídeo, da extremidade 5’; ou opcionalmente, a contagem a partir do 1° nucleotídeo emparelhado dentro da região duplex, a partir da extremidade 5’.
[00274] Em uma modalidade, i é 1 e j é 0, ou i é 0 e j é 1, ou ambos i e j são 1. A fita senso pode, portanto, ser representado pelas seguintes fórmulas: 5’np-Na-YYY-Nb -ZZZ-Na-nq 3 ‘(Ib); 5’ np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3 ‘(Ic); ou 5’np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3’ (Id).
[00275] Quando a fita senso é representado pela fórmula (Ib), Nb representa uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0-10, 0-7 0-5, 0-4, 0-2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na independentemente pode representar uma sequência oligonucleotídica compreendendo nucleidos 2-20, 2-15 ou 2-10 modificados.
[00276] Quando a fita senso é representado como a fórmula (Ic), Nb representa uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0-10, 07, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na pode representar independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 2-20, 2-15 ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00277] Quando a fita senso é representado como a fórmula (Id), cada Nb representa independentemente uma sequência oligonucleotí- dica compreendendo 0-10, 0- 7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0 nucleotídeos modificados. De preferência, Nb é 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Cada Na pode representar independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 2-20, 2-15 ou 2-10 nucleotídeos modificados. Cada um dentre X, Y e Z pode ser igual ou diferente um do outro.
[00278] Em outras modalidades, i é 0 e j é 0, e a fita senso pode ser representado pela fórmula: 5’np-Na-YYY-Na-nq 3’ (Ia).
[00279] Quando a fita senso é representado pela fórmula (Ia), cada Na independentemente pode representar uma sequência oligonucleotí- dica compreendendo 2-20, 2-15 ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00280] Em uma modalidade, a sequência de fita antissenso do iR- NA pode ser representada pela fórmula (II): 5’nq’-Na’-(Z’Z’Z’) k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(X’X’X’)lN’a-np’3’ (II)
[00281] em que:
[00282] k e l são cada um independentemente 0 ou 1;
[00283] p’ e q’ são cada um independentemente 0-6;
[00284] cada Na’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0 a 25 nucleotídeos modificados, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de forma diferente;
[00285] cada Nb’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0-10 nucleotídeos modificados;
[00286] cada np’e nq’ representam independentemente um nucleotí- deo de projeção;
[00287] em que Nb’ e Y’ não têm a mesma modificação; e
[00288] X’X’X’, Y’Y’Y’ e Z’Z’Z’representam cada um, independente mente, um motif de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos.
[00289] Em uma modalidade, Na e/ou Nb ‘compreendem modificações do padrão alternativo.
[00290] O motif Y’Y’Y’ ocorre no ou perto do sítio de clivagem da fita antissenso. Por exemplo, quando o agente de RNAi tem uma região duplex de comprimento de nucleotídeo de 17-23, o motif Y’Y’Y ‘pode ocorrer nas posições 9, 10, 11; 10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14; ou 13, 14, 15 da fita antissenso, com a contagem a partir do primeiro nu- cleotídeo, da extremidade 5’; ou opcionalmente, a contagem a partir do 1° nucleotídeo emparelhado dentro da região duplex, a partir da extremidade 5’. De preferência, o motif Y’Y’Y’ ocorre nas posições 11, 12, 13.
[00291] Em uma modalidade, o motif Y’Y’Y’ é todos os nucleotídeos modificados por 2’-OMe.
[00292] Em uma modalidade, k é 1 e l é 0, ou k é 0 e l é 1 ou ambos k e l são 1. A fita antissenso pode, portanto, ser representado pelas seguintes fórmulas: 5’nq’-Na’-Z’Z’Z’-Nb’-Y’Y’Y’-Na’-np’ 3’ (IIb); 5’nq’-Na’-Y’Y’Y’-Nb’-X’X’X’-np’ 3’ (IIc); ou 5’nq’-Na’-Z’Z’Z’-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-X’X’X’-Na’-np’ 3’ (IId).
[00293] Quando a fita antissenso é representado pela fórmula (IIb), Nb’ representa uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 2-20, 2-15 ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00294] Quando a fita antissenso é representado como a fórmula (IIc), Nb’ representa uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 2-20, 2-15 ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00295] Quando a fita antissenso é representado como a fórmula (IId), cada Nb’ representa independentemente uma sequência oligonu- cleotídica compreendendo 0-10, 0 -7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0 nu- cleotídeos modificados. Cada Na’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 2-20, 2-15 ou 2-10 nucle- otídeos modificados. De preferência, Nb é 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
[00296] Em outras modalidades, k é 0 e l é 0 e a fita antissenso pode ser representado pela fórmula: 5’np’-Na’-Y’ Y’Y’-Na’-nq’ 3’ (Ia).
[00297] Quando a fita antissenso é representado como a fórmula (IIa), cada Na’ representa independentemente uma sequência oligonu- cleotídica compreendendo 2-20, 2-15 ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00298] Cada um dentre X’, Y’ e Z’ pode ser o mesmo ou diferente um do outro.
[00299] Cada nucleotídeo da fita senso e da fita antissenso pode ser modificado independentemente com LNA, CRN, UNA, cEt, HNA, CeNA, 2’-metoxietila, 2’-O-metila, 2’-O-alila, 2’-C-alila, 2’-hidroxila ou 2’-fluoro. Por exemplo, cada nucleotídeo da fita senso e da fita antis- senso é modificado independentemente com 2’-O-metila ou 2’-fluoro. Cada X, Y, Z, X’, Y’ e Z’, em particular, pode representar uma modificação 2’-O-metila ou uma modificação 2’-fluoro.
[00300] Em uma modalidade, a fita senso do agente de RNAi pode conter YYY que ocorre nas posições 9, 10 e 11 da fita quando a região duplex é 21 nt, a contagem a partir do 1° nucleotídeo da extremidade 5’ou, opcionalmente, a contagem a partir do 1° nucleotídeo emparelhado dentro da região duplex, da extremidade 5’; e Y representa a modificação 2’-F.
[00301] Em uma modalidade, a fita antissenso pode conter o motif Y’Y’Y’ que ocorre nas posições 11, 12, 13 da fita, a contagem a partir do primeiro nucleotídeo da extremidade 5’ ou, opcionalmente, a contagem a partir do 1 °. nucleotídeo emparelhado dentro da região duplex, a partir da extremidade 5’; e Y’ representa a modificação 2’-O-metila.
[00302] A fita senso representado por qualquer uma das fórmulas acima (Ia), (Ib), (Ic) e (Id) forma um duplex com uma fita antissenso representado por qualquer uma das fórmulas (IIa), (IIb), (IIc) e (IId), respectivamente.
[00303] Os agentes de RNAi para utilização nos métodos da invenção podem compreender uma fita senso e uma fita antissenso, cada fita possuindo 14 a 30 nucleotídeos, o duplex de iRNA representado pela fórmula (III): senso: 5’np -Na-(XXX)i-Nb- YYY -Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3’ antissenso: 3’ np’-Na’-(X’X’X’) k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb ‘-(Z’Z’Z’)l-Na’-nq’ 5’ (III)
[00304] em que:
[00305] i, j, k e l são cada um independentemente 0 ou 1;
[00306] p, p’, q e q’ são cada um independentemente 0-6;
[00307] cada Na e Na’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0-25 nucleotídeos modificados, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de forma diferente;
[00308] cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0-10 nucleotídeos modificados;
[00309] em que cada np’, np, nq’ e nq, cada um dos quais pode ou não estar presente, representa independentemente um nucleotídeo de projeção; e
[00310] XXX, YYY, ZZZ, X’X’X’, Y’Y’Y’ e Z’Z’Z’ representam cada um, independentemente, um motif de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos. Em uma modalidade, i é 0 e j é 0; ou i é 1 e j é 0; ou i é 0 e j é 1; ou ambos i e j são 0; ou ambos i e j são 1. Em outra modalidade, k é 0 e l é 0; ou k é 1 e l é 0; k é 0 e l é 1; ou ambos k e l são 0; ou ambos k e l são 1.
[00311] As combinações excepcionais da fita senso e da fita antis- senso que formam um duplex de RNAi incluem as fórmulas abaixo: 5’ np-Na -YYY -Na-nq 3’ 3’ np’-Na’-Y’Y ‘Y’ -Na’nq’ 5’ (IIIa) 5’ np -Na-YYY -Nb -ZZZ -Na-nq 3’ 3’ np’-Na’-Y’Y’Y’-Nb’-Z’ Z’Z’-Na’nq’ 5’ (IIIb) 5’np-Na- XXX -Nb-YYY -Na-nq 3’ 3’ np’-Na’-X’X’X’-Nb’-Y ‘Y’Y’-Na’-nq’ 5’ (IIIc) 5’ np -Na-XXX -Nb-Y Y Y -Nb- ZZZ -Na-nq 3’ 3’ np’-Na’-X’X’ X’-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-Z’Z’Z’-Na-nq’ 5’ (IIId) 5’-Na-YYY -Nb- 3’ 3’ np’-Na’ -Y’Y’Y’ -Nb’ 5’ (IIIe)
[00312] Quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIIa), cada Na representa independentemente uma sequência oligonucleotídi- ca compreendendo 2 a 20, 2-15 ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00313] Quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIIb), cada Nb representa independentemente uma sequência oligonu- cleotídica compreendendo 1-10, 1-7, 1-5 ou 1-4 nucleotídeos modificados. Cada Na representa independentemente uma sequência oligo- nucleotídica compreendendo 2-20, 2-15 ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00314] Quando o agente de RNAi é representado como a fórmula (IIIc), cada Nb, Nb’ representa independentemente uma sequência oli- gonucleotídica compreendendo 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 2-20, 2-15 ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00315] Quando o agente de RNAi é representado como a fórmula (IIId), cada Nb, Nb’ representa independentemente uma sequência oli- gonucleotídica compreendendo 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na, Na’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 2-20, 2-15 ou 210 nucleotídeos modificados. Cada um dentre Na, Na’, Nb e Nb’ compreende independentemente modificações de padrão alternativo.
[00316] Quando o agente de RNAi é representado como a fórmula (IIIe), cada Na, Na’, Nb e Nb’ representa independentemente uma sequência oligonucleotídica compreendendo 0-25 nucleotídeos que são quer modificados ou não modificados ou suas combinações, cada se- quência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de forma diferente.
[00317] Cada um dentre X, Y e Z nas fórmulas (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), (IIId) e (IIIe) podem ser iguais ou diferentes um do outro.
[00318] Quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), (IIId) e (IIIe), pelo menos um dos nucleotídeos Y pode formar um par de bases com um dos nucleotídeos Y’. Alternativamente, pelo menos dois dos nucleotídeos Y formam pares de bases com os nucleotídeos Y’ correspondentes; ou todos os três dos nucleo- tídeos Y formam todos os pares de bases com os nucleotídeos Y’ correspondentes.
[00319] Quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIIb) ou (IIId), pelo menos um dos nucleotídeos Z pode formar um par de bases com um dos nucleótidos Z’. Alternativamente, pelo menos dois dos nucleotídeos Z formam pares de bases com os nucleotídeos Z’ correspondentes; ou todos os três dos nucleotídeos Z formam todos os pares de bases com os nucleotídeos Z’ correspondentes.
[00320] Quando o agente de RNAi é representado como a fórmula (IIIc) ou (IIId), pelo menos um dos nucleotídeos X pode formar um par de bases com um dos nucleotídeos X’.
[00321] Alternativamente, pelo menos dois dos nucleotídeos X formam pares de bases com os nucleotídeos X’ correspondentes; ou todos os três dos nucleotídeos X formam todos os pares de bases com os nucleotídeos X’ correspondentes.
[00322] Em uma modalidade, a modificação no nucleotídeo Y é diferente da modificação no nucleotídeo Y’, a modificação no nucleotídeo Z é diferente da modificação no nucleotídeo Z’ e/ou a modificação no nucleotídeo X é diferente da modificação no nucleotídeo X’.
[00323] Em uma modalidade, quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIId), as modificações de Na são modificações de 2’- O-metila ou 2’-fluoro. Em outra modalidade, quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIId), as modificações de Na são modificações de 2’-O-metila ou 2’-flúor e np’ > 0 e pelo menos um np’ está ligado a um nucleotídeo adjacente a através da ligação de fosforotioa- to. Ainda em outra modalidade, quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIId), as modificações de Na são modificações de 2’- O-metila ou 2’-fluoro, np’ > 0 e pelo menos um np’ está ligado a um nu- cleotídeo adjacente através da ligação de fosforotioato, e a fita senso é conjugada com um ou mais derivados de GalNAc ligados através de um ligante ramificado bivalente ou trivalente (descrito abaixo). Em outra modalidade, quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIId), as modificações de Na são modificações de 2’-O-metila ou 2’- fluoro, np’ > 0 e pelo menos um np’ está ligado a um nucleotídeo adjacente por meio de ligação de fosforotioato, a fita senso compreende pelo menos uma ligação de fosforotioato e a fita senso é conjugada com um ou mais derivados de GalNAc ligados através de um ligante ramificado bivalente ou trivalente.
[00324] Em uma modalidade, quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIIa), as modificações de Na são modificações de 2’- O-metila ou 2’-fluoro, np’ > 0 e pelo menos um np’ está ligado a um nu- cleotídeo adjacente por meio de ligação de fosforotioato, a fita senso compreende pelo menos uma ligação de fosforotioato e a fita senso é conjugada com um ou mais derivados de GalNAc ligados através de um ligante ramificado bivalente ou trivalente.
[00325] Em uma modalidade, dois agentes de RNAi representados pela fórmula (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), (IIId) e (IIIe) estão ligados entre si na extremidade 5’, e uma ou ambas as extremidades 3’ e são opcionalmente conjugados com um ligante. Cada um dos agentes pode atingir o mesmo gene ou dois genes diferentes; ou cada um dos agentes pode atingir o mesmo gene em dois sítios alvo diferentes.
[00326] Várias publicações descrevem agentes de RNAi multiméri- cos que podem ser utilizados nos métodos da invenção. Tais publicações incluem WO2007/091269, Patente Norte-americana No. 7858769, WO2010/141511, WO2007/117686, WO2009/014887 e WO2011/03 1520, cujos conteúdos inteiros de cada um estão aqui incorporados por referência.
[00327] Conforme descrito em mais detalhes abaixo, o agente de RNAi que contém conjugações de uma ou mais porções de carboidrato para um agente de RNAi pode otimizar uma ou mais propriedades do agente de RNAi. Em muitos casos, a porção de carboidrato será anexada a uma subunidade modificada do agente de RNAi. Por exemplo, o açúcar ribose de uma ou mais subunidades de ribonucleotídeos de um agente de dsRNA pode ser substituído por outra porção, por exemplo, um veículo não carboidrato (de preferência cíclico) ao qual está ligado um ligante de carboidrato. Uma subunidade de ribonucleo- tídeo em que o açúcar ribose da subunidade foi desse modo substituído é aqui referida como uma subunidade de modificação de substitui-ção de ribose (RRMS). Um veículo cíclico pode ser um sistema de anel carbocíclico, isto é, todos os átomos do anel são átomos de carbono ou um sistema de anel heterocíclico, isto é, um ou mais átomos do anel podem ser um heteroátomo, por exemplo, nitrogênio, oxigênio, enxofre. O veículo cíclico pode ser um sistema de anel monocíclico, ou pode conter dois ou mais anéis, por exemplo, anéis fundidos. O veículo cíclico pode ser um sistema de anel totalmente saturado, ou pode conter uma ou mais ligações duplas.
[00328] O ligante pode ser ligado ao polinucleotídeo através de um veículo. Os veículos incluem (i) pelo menos um "ponto de ligação da estrutura", de preferência dois "pontos de ligação da estrutura" e (ii) pelo menos um "ponto de ligação de amarração". Um "ponto de ligação da estrutura", quando aqui utilizado, refere-se a um grupo funcio- nal, por exemplo um grupo hidroxila ou, em geral, uma ligação disponível para, e que é adequada para a incorporação do veículo na estrutura, por exemplo, o fosfato ou o fosfato modificado, por exemplo, a estrutura contendo um enxofre de um ácido ribonucleico. Um "ponto de ligação de amarração" (TAP) em algumas modalidades refere-se a um átomo de anel constituinte do veículo cíclico, por exemplo, um átomo de carbono ou um heteroátomo (distinto de um átomo que proporciona um ponto de ligação da estrutura) que conecta uma porção selecionada. A porção pode ser, por exemplo, um carboidrato, por exemplo, monossacarídeo, dissacarídeo, trissacarídeo, tetrassacarídeo, oligos- sacarídeo e polissacarídeo. Opcionalmente, a unidade selecionada está ligada por uma amarração intermediária ao veículo cíclico. Desse modo, o veículo cíclico irá frequentemente incluir um grupo funcional, por exemplo, um grupo amino ou, geralmente, proporcionar uma ligação, que seja adequada para incorporação ou amarração de outra entidade química, por exemplo, um ligante ao anel constituinte.
[00329] Os agentes de RNAi podem ser conjugados com um ligante através de um veículo, em que o veículo pode ser grupo cíclico ou grupo acíclico; de preferência, o grupo cíclico é selecionado a partir de pirrolidinila, pirazolinila, pirazolidinila, imidazolinila, imidazolidinila, pi- peridinila, piperazinila, [1,3]dioxolano, oxazolidinila, isoxazolidinila, morfolinila, tiazolidinila, isotiazolidinila, quinoxalinila, piridazinonila, te- trahidrofurilo e decalina; de preferência, o grupo acíclico é selecionado a partir de uma estrutura de serinol ou de uma estrutura de dietanola- mina.
[00330] Em certas modalidades específicas, o agente de RNAi, por exemplo, para utilização nos métodos da invenção, é um agente selecionado a partir do grupo de agentes listados em qualquer uma das Tabelas 1, 3, 5, 6 e 7. Estes agentes podem ainda compreender um ligante.
[00331] Em certas modalidades, o agente de RNAi da invenção é um agente selecionado a partir do grupo que consiste em AD-66016, AD-65492, AD-66017 e AD-66018.
IV. iRNAs Conjugados com Ligantes
[00332] Outra modificação do RNA de um iRNA da invenção envolve ligar quimicamente ao RNA um ou mais ligantes, porções ou conjugados que melhoram a atividade, distribuição celular ou absorção celular do iRNA. Tais fragmentos incluem mas não estão limitados a porções lipídicas tais como uma porção de colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556), ácido cólico (Ma- noharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4: 1053-1060), um tio- éter, por exemplo, beril-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. NY Acad. Sci., 1992, 660: 306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3: 2765-2770), um tio colesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20: 533-538), uma cadeia alifática, por exemplo, resíduos de dodecandiol ou undecila (Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10: 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259: 327-330; Svi- narchuk et al., Biochimie, 1993, 75 : 49-54), um fosfolípido, por exemplo, di-hexadecil-rac-glicerol ou 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3- fosfonato de trietil-amônio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36: 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18: 3777-3783), uma cadeia de poliamina ou polietilenoglicol (Manoharan et al., Nu-cleosides & Nucleotides, 1995, 14: 969 -973), ou ácido adamantano acético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36: 3651-3654), uma porção de palmitila (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264: 229-237), ou uma unidade de octadecilamina ou hexilamino- carboniloxipolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277: 923-937).
[00333] Em uma modalidade, um ligante altera a distribuição, o al- vejamento ou o tempo de vida de um agente de iRNA no qual está in- corporado. Em modalidades preferidas, um ligante proporciona uma afinidade melhorada para um alvo selecionado, por exemplo, molécula, célula ou tipo de célula, compartimento, por exemplo, um compartimento celular ou de órgãos, tecido, órgão ou região do corpo, como, por exemplo, em comparação com uma espécie ausente, um tal ligan- te. Os ligantes preferidos não participarão do emparelhamento duplex em um ácido nucleico duplexado.
[00334] Os ligantes podem incluir uma substância que ocorre naturalmente, tal como uma proteína (por exemplo, albumina sérica humana (HSA), lipoproteína de baixa densidade (LDL) ou globulina); carboidrato (por exemplo, um dextrano, pululano, quitina, quitosana, inulina, ciclodextrina, N-acetilgalactosamina ou ácido hialurônico); ou um lipídeo. O ligante também pode ser uma molécula recombinante ou sintética, tal como um polímero sintético, por exemplo, um poliaminoácido sintético. Exemplos de poliaminoácidos incluem o poliaminoácido que é uma polilisina (PLL), ácido poli-L-aspártico, ácido poli-L-glutâmico, copolímero de estireno-anidrido de ácido maleico, copolímero de poli (L-lactídeo-co-glicolado), copolímero éter divinílico-anidrido maleico, copolímero de N-(2-hidroxipropil) metacrilamida (HMPA), polietilenogli- col (PEG), álcool polivinílico (PVA), poliuretano, ácido poli (2- etilacrilico), polímeros de N-isopropilacrilamida ou polifosfazina. Exem-plo de poliaminas incluem: polietilenimina, polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, pseudopeptídeo-poliamina, poliamina pepti- domimética, dendrímero poliamina, arginina, amidina, protamina, lipídeo catiônico, porfirina catiônica, sal quaternário de uma poliamina ou peptídeo alfa helicoidal.
[00335] Ligantes também podem incluir grupos de alvejamento, por exemplo, um agente de alvejamento de célula ou tecido, por exemplo, uma lectina, glicoproteína, lipídeo ou proteína, por exemplo, um anticorpo, que se liga a um tipo de célula especificado, como uma célula de rim. Um grupo de alvejamento pode ser uma tirotropina, melanotro- pina, lectina, glicoproteína, proteína A de tensoativo, carboidrato de mucina, lactose multivalente, galactose monovalente, N-acetil- galactosamina, manose multivalente de N-acetil-glicoseamina, fucose multivalente, poliaminoácidos glicosilados, galactose multivalente, transferrina, bifosfonato, poliglutamato, poliaspartato, um lipídeo, colesterol, um esteroide, ácido biliar, folato, vitamina B12, vitamina A, biotina ou um peptídeo RGD ou peptídeo RGD mimético. Em certas modalidades, os ligantes incluem galactose monovalente ou multiva-lente. Em certas modalidades, os ligantes incluem colesterol.
[00336] Outros exemplos de ligantes incluem corantes, agentes de intercalação (por exemplo, acridinas), reticulantes (por exemplo, psoraleno, mitomicina C), porfirinas (TPPC4, texafirina, Sapphyrin), hidro- carbonetos aromáticos policíclicos (por exemplo, fenazina, di- hidrofenazina), endonucleases artificiais (por exemplo, EDTA), moléculas lipofílicas, por exemplo, colesterol, ácido cólico, ácido adamantano acético, ácido 1-pireno butírico, di-hidrotestosterona, 1,3-Bis-O (hexadecil) glicerol, grupo geraniloxi-hexila, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanodiol, grupo heptadecila, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido O3-(oleoil)litocólico, ácido O3-(oleoil)colênico, dimetoxitritila ou fenoxazina) e conjugados peptídicos (por exemplo, peptídeo antenna- pédia, peptídeo Tat), agentes alquilantes, fosfato, amino, mercapto, PEG (por exemplo, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliaminas, alquila, alquila substituída, marcadores radiorrotulados, enzimas, haptenos (por exemplo, biotina), facilitadores de transporte/absorção (por exemplo, aspirina, vitamina E, ácido fólico), ribonucleases sintéticas (por exemplo, imidazol, bisimidazol, histamina, aglutinantes de imidazol, conjugados acridina-imidazol, complexos de Eu3 + de tetraazamacro- ciclos), dinitrofenila, HRP ou AP.
[00337] Os ligantes podem ser proteínas, por exemplo, glicoproteí- nas ou peptídeos, por exemplo, moléculas com afinidade específica para um coligante, ou anticorpos, por exemplo, um anticorpo, que se liga a um tipo de célula especificado, tal como uma célula hepática. Os ligantes também podem incluir hormônios e receptores hormonais. Eles também podem incluir espécies não peptídicas, tais como lipídeos, lectinas, carboidratos, vitaminas, cofactores, lactose multivalente, galactose multivalente, N-acetil-galactosamina, manose multivalente de N-acetil-glicosamina ou fucose multivalente. O ligante pode ser, por exemplo, um lipopolissacarídeo, um ativador da p38 MAP cinase ou um ativador de NF-KB.
[00338] O ligante pode ser uma substância, por exemplo, um fárma- co, que pode aumentar a absorção do agente de iRNA na célula, por exemplo, interrompendo a citoestrutura da célula, por exemplo, interrompendo os microtúbulos, microfilamentos e/ou filamentos intermediários da célula. O fármaco pode ser, por exemplo, táxon, vincristina, vinblastina, citocalasina, nocodazol, jasplakinolide, latrunculina A, fa- loidina, swinholide A, indanocina ou mioservina.
[00339] Em algumas modalidades, um ligante ligado a um iRNA como aqui descrito, age como um modulador farmacocinético (modu- lador de PK). Os moduladores de PK incluem lipófilos, ácidos biliares, esteroides, análogos de fosfolipídeos, peptídeos, agentes de ligação de proteína, PEG, vitaminas, etc. Os moduladores de PK exemplares incluem, mas não estão limitados a, colesterol, ácidos graxos, ácido cólico, ácido litocólico, dialquilglicerídeos, diacilglicerídeos, fosfolipí- deos, esfingolipídeos, naproxeno, ibuprofeno, vitamina E, biotina etc. Oligonucleotídeos que compreendem um número das ligações de fos- forotioato são também conhecidos por se ligar à proteína do soro, desse modo, oligonucleotídeos curtos, por exemplo, oligonucleotídeos de cerca de 5 bases, 10 bases, 15 bases ou 20 bases, compreendendo múltiplas ligações de fosforotioato na estrutura, também são passíveis da presente invenção como ligantes (por exemplo, como ligantes mo- duladores de PK). Além disso, os aptâmeros que se ligam aos componentes do soro (por exemplo, proteínas de soro) também são adequados para utilização como ligantes moduladores de PK nas modalidades aqui descritas.
[00340] Os oligonucleotídeos conjugados por ligante da invenção podem ser sintetizados pela utilização de um oligonucleotídeo que possui uma funcionalidade reativa pendente, tal como o derivado da ligação de uma molécula de ligação ao oligonucleotídeo (descrito abaixo). Este oligonucleotídeo reativo pode ser reagido diretamente com ligantes comercialmente disponíveis, ligantes que são sintetizados suportando qualquer um de uma variedade de grupos protetores, ou ligantes que têm uma porção de ligação a ele ligada.
[00341] Os oligonucleotídeos utilizados nos conjugados da presente invenção podem ser feitos de forma conveniente e rotineira através da técnica bem conhecida de síntese em fase sólida. O equipamento para tal síntese é vendido por vários fornecedores, incluindo, por exemplo, Applied Biosystems (Foster City, Calif.). Qualquer outro meio para tal síntese conhecida na técnica pode ser adicionalmente ou alternativamente empregado. Também é conhecido utilizar técnicas similares para preparar outros oligonucleotídeos, tais como fosforotioatos e derivados alquilados.
[00342] Nos oligonucleotídeos conjugados por ligante e nucleosí- deos ligados específicos de sequência que transportam moléculas de ligante da presente invenção, os oligonucleotídeos e oligonucleosídeos podem ser montados em um sintetizador de DNA adequado utilizando precursores de nucleotídeos ou nucleosídeos padrão, ou precursores de nucleotídeo-conjugado ou nucleosídeos que já possuem o fragmento de ligação, precursores de ligante-nucleotídeo ou nucleosídeo- conjugado que já suportam a molécula de ligante, ou blocos de cons- trução transportando ligante não nucleosídeo.
[00343] Quando se utilizam precursores de nucleotídeo-conjugado que já transportam uma porção de ligação, a síntese dos nucleosídeos ligados especificamente à sequência é tipicamente completada, e a molécula de ligante é então reagida com a porção de ligação para formar o oligonucleotídeo conjugado por ligante. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos ou nucleosídeos ligados da presente invenção são sintetizados por um sintetizador automatizado usando fosfo- ramiditas derivadas de conjugados de ligante-nucleosídeo em adição às fosforamiditas padrão e fosforamiditas não padrão que estão comercialmente disponíveis e rotineiramente utilizadas na síntese de oli- gonucleotídeos.
A. Conjugados Lipídicos
[00344] Em uma modalidade, o ligante ou o conjugado é uma molécula lipídica ou baseada em lipídeos. Tal molécula baseada em lipídeos ou lipídeos liga de preferência uma proteína de soro, por exemplo, albumina sérica humana (HSA). Um ligante de ligação de HSA permite a distribuição do conjugado a um tecido alvo, por exemplo, um tecido alvo não renal do corpo. Por exemplo, o tecido alvo pode ser o fígado, incluindo células parenquimatosas do fígado. Outras moléculas que podem se ligar à HSA também podem ser usadas como ligantes. Por exemplo, naproxeno ou aspirina pode ser usada. Um ligante lipídi- co ou com base em lipídeos pode (a) aumentar a resistência à degra-dação do conjugado, (b) aumentar a alvejamento ou o transporte para uma célula alvo ou membrana celular e/ou (c) pode ser usado para ajustar a ligação a uma proteína sérica, por exemplo, HSA.
[00345] Um ligante com base em lipídeo pode ser usado para inibir, por exemplo, controlar a ligação do conjugado a um tecido alvo. Por exemplo, um ligante lipídico ou com base em lipídeos que se ligam à HSA mais fortemente será menos propenso a ser alvo do rim e, por- tanto, menos provável de ser limpo do corpo. Um ligante lipídico ou com base em lipídeos que se ligam à HSA menos fortemente pode ser usado para direcionar o conjugado ao rim.
[00346] Em uma modalidade preferida, o ligante com base em lipídeo liga-se à HSA. De preferência, ele se liga à HSA com uma afinidade suficiente de tal modo que o conjugado será de preferência distribuído a um tecido não renal. No entanto, é preferido que a afinidade não seja tão forte que a ligação de HSA-ligante não possa ser revertida.
[00347] Em outra modalidade preferida, o ligante à base de lipídeos liga HSA fracamente ou não, de tal modo que o conjugado seja de preferência distribuído ao rim. Outras porções que visam células do rim também podem ser utilizadas no lugar ou em adição ao ligante à base de lipídeos.
[00348] Em outro aspecto, o ligante é uma porção, por exemplo, uma vitamina, que é absorvida por uma célula alvo, por exemplo, uma célula de proliferação. Estes são particularmente úteis para tratar transtornos caracterizados por proliferação celular indesejada, por exemplo, do tipo maligno ou não maligno, por exemplo, células cancerosas. As vitaminas exemplares incluem vitamina A, E e K. Outras vitaminas exemplares incluem vitamina B, por exemplo, ácido fólico, B12, riboflavina, biotina, piridoxal ou outras vitaminas ou nutrientes ab-sorvidos por células alvo, como células do fígado. Também estão incluídas HSA e lipoproteínas de baixa densidade (LDL) .
B. Agentes de Permeação Celular
[00349] Em outro aspecto, o ligante é uma agente de permeação celular, de preferência um agente de permeação de células helicoidais. De preferência, o agente é anfipático. Um agente exemplar é um pep- tídeo como tat ou antenopédia. Se o agente é um peptídeo, ele pode ser modificado, incluindo um peptidilmimético, invertômeros, ligações não peptídicas ou pseudo-peptídicas, e uso de D-aminoácidos. O agente helicoidal é de preferência um agente alfa-helicoidal, que de preferência tem uma fase lipofílica e uma fase lipofóbica.
[00350] O ligante pode ser um peptídeo ou peptidomimético. Um peptidomimético (também aqui referido como um oligopendomético) é uma molécula capaz de dobrar em uma estrutura tridimensional definida semelhante a um peptídeo natural. A ligação de peptídeos e pepti- domiméticos a agentes de iRNA pode afetar a distribuição farmacoci- nética do iRNA, como por meio do realce do reconhecimento e absorção celular. O peptídeo ou a porção peptidomimética pode ter cerca de 5-50 aminoácidos de comprimento, por exemplo, com cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 aminoácidos de comprimento.
[00351] Um peptídeo ou peptidomimético pode ser, por exemplo, um peptídeo de permeação celular, peptídeo catiônico, peptídeo anfi- pático ou peptídeo hidrofóbico (por exemplo, consistindo principalmente em Tyr, Trp ou Phe). A porção peptídica pode ser um peptídeo den- drímero, peptídeo constrangido ou peptídeo reticulado. Em outra alternativa, a porção peptídica pode incluir uma sequência de translocação de membrana hidrofóbica (MTS). Um peptídeo contendo MTS hidrofó- bico exemplar é RFGF possuindo a sequência de aminoácidos AA- VALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 11). Um análogo de RFGF (por exemplo, a sequência de aminoácidos AALLPVLLAAP (SEQ ID NO: 12) contendo uma MTS hidrofóbica também pode ser uma porção alvejante. A porção de peptídeo pode ser um peptídeo de "liberação", que pode transportar moléculas polares grandes incluindo peptídeos, oligonucleotídeos, e proteína através das membranas celulares. Por exemplo, verificou-se que as sequências da proteína Tat HIV (GRK- KRRQRRRPPQ) (SEQ ID NO: 13) e a proteína Drosophila Antennape- dia (RQIKIWFQNRRMKWKK) (SEQ ID NO: 14) são capazes de funcionar como peptídeos de liberação. Um peptídeo ou peptidomimético pode ser codificado por uma sequência aleatória de DNA, tal como um peptídeo identificado a partir de uma biblioteca de exibição de fagos ou uma biblioteca combinatória de um único composto (OBOC) (Lam et al., Nature, 354 : 82-84, 1991). Exemplos de um peptídeo ou peptido- mimético ligado a um agente de dsRNA através de uma unidade de monômero incorporada para fins de alvejamento celular é um peptídeo de ácido arginina-glicina-aspártico (RGD) ou imitador de RGD. Uma porção de peptídeo pode variar em comprimento de cerca de 5 amino- ácidos a cerca de 40 aminoácidos. As porções peptídicas podem ter uma modificação estrutural, de modo a aumentar a estabilidade ou as propriedades conformacionais diretas. Pode ser utilizada qualquer das modificações estruturais descritas abaixo.
[00352] Um peptídeo RGD para utilização nas composições e métodos da invenção pode ser linear ou cíclico, e pode ser modificado, por exemplo, glicosilado ou metilado, para facilitar o alvejamento a um tecido específico (s)). Os peptídeos e peptidomiméticos contendo RGD podem incluir D-aminoácidos, bem como imitadores de RGD sintéticos. Além de RGD, pode-se usar outras porções que alvejam o ligante da integrina. Os conjugados preferidos deste ligante alveja PECAM-1 ou VEGF.
[00353] Um "peptídeo de permeação celular" é capaz de permear uma célula, por exemplo, uma célula microbiana, tal como uma célula bacteriana ou fúngica, ou uma célula de mamífero, tal como uma célula humana. Um peptídeo permeável a células microbianas pode ser, por exemplo, um peptídeo linear α-helicoidal (por exemplo, LL-37 ou Ceropin P1), um peptídeo contendo ligação de dissulfeto (por exemplo, α-defensina, β-defensina ou bactenecina), ou um peptídeo contendo apenas um ou dois aminoácidos dominantes (por exemplo, PR-39 ou indolicidina). Um peptídeo de permeação celular também pode incluir um sinal de localização nuclear (NLS). Por exemplo, um peptídeo de permeação celular pode ser um peptídeo anfipático bipartido, tal como MPG, que é derivado do domínio de peptídeo de fusão de gp41 de HIV-1 e o NLS de antígeno T grande de SV40 (Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31: 2717-2724, 2003).
C. Conjugados de Carboidrato
[00354] Em algumas modalidades das composições e métodos da invenção, um oligonucleotídeo de iRNA compreende ainda um carboidrato. O iRNA conjugado com carboidratos é vantajoso para a liberação in vivo de ácidos nucleicos, bem como composições adequadas para uso terapêutico in vivo, como aqui descrito. Quando aqui utilizado, "carboidrato" refere-se a um composto que é um carboidrato per se constituído por uma ou mais unidades de monossacarídeo com pelo menos 6 átomos de carbono (que pode ser linear, ramificado ou cíclico) com um átomo de oxigênio, nitrogênio ou enxofre ligado a cada átomo de carbono; ou um composto possuindo como parte dele uma porção de carboidrato constituída por uma ou mais unidades de mo- nossacarídeo, cada uma com pelo menos seis átomos de carbono (que pode ser linear, ramificado ou cíclico), com um átomo de oxigênio, nitrogênio ou enxofre ligado a cada átomo de carbono . Os carboidratos representativos incluem os açúcares (mono-, di-, tri- e oligossa- carídeos contendo cerca de 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 unidades de monossaca- rídeos) e polissacarídeos tais como amidos, glicogênio, celulose e gomas de polissacarídeo. Os monossacarídeos específicos incluem TTR e açúcares acima (por exemplo, TTR, C6, C7 ou C8); os di- e trissaca- rídeos incluem açúcares com duas ou três unidades de monossacarí- deos (por exemplo, TTR, C6, C7 ou C8).
[00355] Em uma modalidade, um conjugado de carboidrato para utilização nas composições e métodos da invenção é um monossaca- rídeo. Em outra modalidade, um conjugado de carboidrato para utilização nas composições e métodos da invenção é selecionado a partir do grupo que consiste em:
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[00356] Em uma modalidade, o monossacarídeo é uma N- acetilgalactosamina, tal como
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[00357] Outro conjugado representativo de carboidrato para utiliza- ção nas modalidades aqui descritas inclui, mas não está limitado a,
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[00358] (Fórmula XXIII), quando um dentre X ou Y é um oligonu- cleotídeo, o outro é um hidrogênio.
[00359] Em certas modalidades da invenção, o GalNAc ou derivado de GalNAc está ligado a um agente de iRNA da invenção através de um ligador monovalente. Em algumas modalidades, o GalNAc ou deri- vado de GalNAc está ligado a um agente de iRNA da invenção através de um ligador bivalente. Ainda em outras modalidades da invenção, o GalNAc ou derivado de GalNAc está ligado a um agente de iRNA da invenção através de um ligador trivalente.
[00360] Em uma modalidade, os agentes de iRNA de fita dupla da invenção compreendem um GalNAc ou derivado de GalNAc ligado ao agente de iRNA. Em outra modalidade, os agentes de iRNA de fita dupla da invenção compreendem uma pluralidade (por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou 6) GalNAc ou derivados de GalNAc, cada um independentemente ligado a uma pluralidade de nucleotídeos do agente de iRNA de fita dupla através de um pluralidade de ligadores monovalentes.
[00361] Em algumas modalidades, por exemplo, quando os duas fitas de um agente de iRNA da invenção são parte de uma molécula maior ligada por uma cadeia ininterrupta de nucleotídeos entre a extremidade 3’ de uma fita e a extremidade 5’ do respectivo outro uma fita que forma uma alça em forma de grampo de cabelo que compreende uma pluralidade de nucleotídeos não pareados, cada nucleotídeo não pareado dentro do alça em forma de grampo de cabelo pode independentemente compreender um GalNAc ou derivado de GalNAc ligado através de um ligador monovalente. A alça em forma de grampo de cabelo também pode ser formada por uma projeção expandida em uma fita do duplex.
[00362] Em algumas modalidades, o conjugado de carboidrato compreende ainda um ou mais ligantes adicionais como descrito acima, tais como, mas não limitado a, um modulador de PK e/ou um pep- tídeo de permeação celular.
[00363] Os conjugados de carboidratos adicionais adequados para utilização na presente invenção incluem os descritos nas Publicações PCT Nos WO 2014/179620 e WO 2014/179627, cujo conteúdo inteiro de cada um está aqui incorporado por referência.
D. Ligadores
[00364] Em algumas modalidades, o conjugado ou ligante aqui descrito pode ser ligado a um oligonucleotídeo de iRNA com vários ligan- tes que podem ser cliváveis ou não cliváveis.
[00365] O termo "ligador" ou "grupo de ligação" significa uma porção orgânica que liga duas partes de um composto, por exemplo, liga co- valentemente duas partes de um composto. Os ligadores tipicamente compreendem uma ligação direta ou um átomo tal como oxigênio ou enxofre, uma unidade tal como NR8, C (O), C (O) NH, SO, SO2, SO2NH ou uma cadeia de átomos, tais como, mas não limitada à alquila substituída ou não substituída, alquenila substituída ou não substituída, alquinila substituída ou não substituída, arilalquila, arilalquenila, arilalquinila, heteroarilalquila, heteroarilalquenila, heteroarilalquinila, heterociclilalquila, heterociclilalquenila, heterociclilalquinila, arila, hete- roarila, heterociclila, cicloalquila, cicloalquenila, alquilarilalquila, alquila- rilalquenila, alquilarilalquinila, alquenilarilalquila, alquenilarilalquenila, alquenilarilalquinila, alquinilarilalquila, alquinilarilalquenila, alquinilari- lalquinila, alquil-heteroarilalquila, alquil-heteroarilalquenila, alquil- heteroarilalquinila, alquenil-heteroarilalquila, alquenil-heteroaril- alquenila, alquenil-heteroarilalquinila, alquinil-heteroarilalquila, alquinil- heteroarilalquenila, alquinil-heteroarilalquinila, alquil-heterociclilalquila, alquil-heterociclilalquenila, alquil-hererociclilalquinila, alquenil- heterociclilalquila, alquenil-heterociclilalquenila, alquenil-heterociclil- alquinila, alquinil-heterociclilalquila, alquinil-heterociclilalquenila, al- quinil-heterociclilalquinila, alquilarila, alquenilarila, alquinilarila, alquil- heteroarila, alquenil-heteroarila, alquinil-hererarila, os quais um ou mais metilenos podem ser interrompidos ou terminados por O, S, S (O), SO2, N (R8), C(O), arila substituída ou não substituída, heteroarila substituída ou não substituída, heterocíclico substituído ou não substituído; onde R8 é hidrogênio, acila, alifático ou alifático substituído. Em uma modalidade, o ligador está entre cerca de 1-24 átomos, 2-24, 324, 4-24, 5-24, 6-24, 6-18, 7-18, 8-18 átomos, 7-17, 8-17, 6-16, 7-16 ou 8-16 átomos.
[00366] Um grupo de ligação clivável é aquele que é suficientemente estável fora da célula, mas que, após a entrada em uma célula alvo, é clivado para liberar as duas partes que o ligador está mantendo juntas. Em uma modalidade preferida, o grupo de ligação clivável é clivado pelo menos cerca de 10 vezes, 20, vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes ou mais, ou pelo menos cerca de 100 vezes mais rápido em uma célula alvo ou sob uma primeira condição de referência (o que pode, por exemplo, ser selecionado para imitar ou representar condições intracelulares) do que no sangue de um indivíduo ou sob uma segunda condição de referência (que pode, por exemplo, ser selecionado para imitar ou representar condições encontradas no sangue ou no soro).
[00367] Os grupos de ligação cliváveis são suscetíveis a agentes de clivagem, por exemplo, pH, potencial redox ou a presença de moléculas degradativas. Geralmente, os agentes de clivagem são mais prevalentes ou encontrados em níveis mais altos ou atividades dentro das células do que no soro ou no sangue. Exemplos de tais agentes de- gradativos incluem: agentes redox que são selecionados para substratos particulares ou que não possuem especificidade de substrato, incluindo, por exemplo, enzimas oxidativas ou redutoras ou agentes redutores tais como mercaptanos, presentes nas células, que podem degradar um grupo de ligação redox clivável por redução; esterases; endossomas ou agentes que podem criar um ambiente ácido, por exemplo, aqueles que resultam em um pH de cinco ou inferior; enzimas que podem hidrolisar ou degradar um grupo de ligação clivável por ácido, atuando como um ácido geral, peptidases (que podem ser específicas do substrato) e fosfatases. Um grupo de ligação clivável, tal como uma ligação de dissulfeto, pode ser suscetível ao pH. O pH do soro humano é de 7,4, enquanto o pH intracelular médio é ligeiramente inferior, variando de cerca de 7,1-7,3. Os endossomas têm um pH mais ácido, na faixa de 5,5-6,0, e as lisossomas têm um pH ainda mais ácido a cerca de 5,0. Alguns ligadores terão um grupo de ligação clivável que é clivado a um pH preferido, liberando desse modo um lipídeo catiônico do ligante dentro da célula ou no compartimento desejado da célula.
[00368] Um ligador pode incluir um grupo de ligação clivável que é clivável por uma enzima particular. O tipo de grupo de ligação clivável incorporado em um ligador pode depender da célula a ser segmentada. Por exemplo, um ligante de alvejamento no fígado pode ser ligado a um lipídeo catiônico através de um ligador que inclui um grupo éster. As células do fígado são ricas em esterases e, portanto, o ligador será dividido de forma mais eficiente em células do fígado do que em tipos celulares que não são ricos em esterase. Outros tipos celulares ricos em esterases incluem células do pulmão, córtex renal e testículos.
[00369] Os ligadores que contêm ligações peptídicas podem ser usados ao alvejar tipos de células ricas em peptidases, tais como células de fígado e sinoviócitos.
[00370] Em geral, a adequação de um grupo de ligação clivável candidato pode ser avaliada testando a capacidade de um agente (ou condição) degradativo para clivar o grupo de ligação candidato. Também será desejável testar também o grupo de ligação clivável candidato quanto à capacidade de resistir à clivagem no sangue ou quando em contato com outro tecido não alvo. Desse modo, pode-se determinar a susceptibilidade relativa à clivagem entre uma primeira e uma segunda condição, em que o primeiro é selecionado para ser indicativo de clivagem em uma célula alvo e o segundo é selecionado para ser indicativo de clivagem em outros tecidos ou fluidos biológicos, por exemplo, sangue ou soro. As avaliações podem ser realizadas em sis-temas livres de células, em células, em cultura celular, em cultura de órgãos ou tecidos ou em animais inteiros. Pode ser útil fazer avaliações iniciais em condições de células livres ou de cultura e confirmar por avaliações adicionais em animais inteiros. Em modalidades preferidas, os compostos candidatos úteis são clivados pelo menos cerca de 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou cerca de 100 vezes mais rápido na célula (ou sob condições in vitro selecionadas para imitar condições intracelulares) em comparação com sangue ou soro (ou em condições in vitro selecionadas para imitar condições extracelulares).
i. Grupos de ligação cliváveis por Redox
[00371] Em uma modalidade, um grupo de ligação clivável é um grupo de ligação que pode ser clivado por redox que é clivado após a redução ou oxidação. Um exemplo de grupo de ligação redutível é um grupo de ligação de dissulfeto (-S-S-). Para determinar se um grupo de ligação clivável candidato é um "grupo de ligação redutível clivável" adequado, ou, por exemplo, é adequado para utilização com uma porção de iRNA particular e um agente de direcionamento particular, pode-se olhar para os métodos aqui descritos. Por exemplo, um candidato pode ser avaliado por incubação com ditiotreitol (DTT) ou outro agente redutor usando reagentes conhecidos na técnica, que imitam a taxa de clivagem que seria observada em uma célula, por exemplo, uma célula alvo. Os candidatos também podem ser avaliados em condições selecionadas para imitar o sangue ou condições séricas. Em uma modalidade, os compostos candidatos são clivados em pelo menos cerca de 10 % no sangue. Em outras modalidades, os compostos candidatos úteis são degradados pelo menos cerca de 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou cerca de 100 vezes mais rápido na célula (ou sob condições in vitro selecionadas para imitar as condições intracelulares) em comparação com o sangue (ou sob condições in vitro seleci- onadas para imitar condições extracelulares). A taxa de clivagem dos compostos candidatos pode ser determinada usando ensaios de cinéticos enzimática padrão em condições escolhidas para imitar meios intracelulares e comparadas com condições escolhidas para imitar meios extracelulares.
ii. Grupos de ligação cliváveis baseados em fosfato
[00372] Em uma outra modalidade, um ligador clivável compreende um grupo de ligação clivável com base em fosfato. Um grupo de ligação clivável com base em fosfato é clivado por agentes que degradam ou hidrolisam o grupo fosfato. Um exemplo de um agente que cliva os gru-pos fosfato nas células são enzimas tais como as fosfatases nas células. Exemplos de grupos de ligação à base de fosfato são -OP(O)(ORk)- O-, -OP(S)(ORk)-O-, -OP(S)(SRk)-O-, -SP(O)(ORk)-O-, -OP(O)(ORk)-S, -SP(O)(ORk)-S-, -OP(S)(ORk)-S-, -SP(S)(ORk)-O-, -OP(O)(Rk)-O-, - OP(S)(Rk)-O-, -SP(O)(Rk)-O-, -SP(S)(Rk)-O-, -SP(O)(Rk)-S-, - OP(S)(Rk)-S-. As modalidades preferidas são -OP(O)(OH)-O-, - OP(S)(OH)-O-, -OP(S)(SH)-O-, -SP(O)(OH)-O-, -OP(O)(OH)-S-, - SP(O)(OH)-S-, -OP(S)(OH)-S-, -SP(S)(OH)-O-, - OP(O)(H)-O-, - OP(S)(H)-O-, -SP(O)(H)-O, -SP(S)(H)-O-, -SP(O)(H)-S-, -OP(S)(H)-S-. Uma modalidade preferida é -O-P(O)(OH)-O-. Esses candidatos podem ser avaliados utilizando métodos análogos aos descritos acima.
iii. Grupos de ligação cliváveis por ácido
[00373] Em outra modalidade, um agente de ligação clivável compreende um grupo de ligação clivável pelo ácido. Um grupo de ligação clivável pelo ácido é um grupo de ligação que é clivado em condições ácidas. Em modalidades preferidas, os grupos de ligação cliváveis por ácido são clivados em um ambiente ácido com um pH de cerca de 6,5 ou inferior (por exemplo, cerca de 6,0, 5,75, 5,5, 5,25, 5,0 ou inferior) ou por agentes tais como enzimas que podem atuar como ácido geral. Em uma célula, organelas de pH baixo específicas, tais como endos- somas e lisossomas, podem proporcionar um ambiente de clivagem para grupos de ligação cliváveis por ácido. Exemplos de grupos de ligação cliváveis com ácido incluem, mas não estão limitados a, hidra- zonas, ésteres e ésteres de aminoácidos. Os grupos cliváveis com ácido podem ter a fórmula geral -C=NN-, C(O)O ou -OC(O). Uma modalidade preferida é quando o carbono ligado ao oxigênio do éster (o grupo alcóxi) é um grupo arila, grupo alquila substituída ou grupo alquila terciário tal como dimetil pentila ou t-butila. Esses candidatos podem ser avaliados utilizando métodos análogos aos descritos acima.
iv. Grupos de ligação com base em éster
[00374] Em outra modalidade, um agente de ligação clivável compreende um grupo de ligação clivável com base em éster. Um grupo de ligação clivável com base em éster é clivado por enzimas tais como esterases e amidases nas células. Exemplos de grupos de ligação cliváveis baseados em éster incluem, mas não estão limitados a ésteres de grupos alquileno, alquenileno e alquinileno. Os grupos de ligação cliváveis com éster têm a fórmula geral -C(O)O- ou -OC(O)-. Esses candidatos podem ser avaliados utilizando métodos análogos aos des-critos acima.
v. Grupos de clivagem com base em peptídeos.
[00375] Ainda em outra modalidade, um ligante clivável compreende um grupo de ligação clivável com base em peptídeo. Um grupo de ligação clivável com base em peptídeo é clivado por enzimas tais como peptidases e proteases nas células. Os grupos de ligação cliváveis ba-seados em peptídeos são ligações peptídicas formadas entre aminoá- cidos para produzir oligopeptídeos (por exemplo, dipeptídeos, tripeptí- deos, etc.) e polipeptídeos. Os grupos cliváveis baseados em peptí- deos não incluem o grupo amida (-C(O)NH-). O grupo amida pode ser formado entre qualquer alquileno, alquenileno ou alquineleno. Uma ligação peptídica é um tipo especial de ligação de amida formada entre aminoácidos para produzir peptídeos e proteínas. O grupo de clivagem à base de peptídeo é geralmente limitado à ligação peptídica (isto é, a ligação de amida) formada entre aminoácidos produzindo peptídeos e proteínas e não inclui o grupo funcional amida inteiro. Os grupos de ligação cliváveis baseados em peptídeos têm a fórmula geral - NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-, onde RA e RB são os grupos R dos dois aminoácidos adjacentes. Esses candidatos podem ser avaliados utilizando métodos análogos aos descritos acima.
[00376] Em uma modalidade, um iRNA da invenção é conjugado com um carboidrato através de um ligador. Os exemplos não limitati- vos de conjugados de hidratos de iRNA com ligadores das composições e métodos da invenção incluem, mas não estão limitados a,
Figure img0010
Figure img0011
[00377] quando um dentre X ou Y é um oligonucleotídeo, o outro é um hidrogênio.
[00378] Em certas modalidades das composições e métodos da in-venção, um ligante é um ou mais derivados de "GalNAc" (N- acetilgalactosamina) ligados através de um ligador ramificado bivalente ou trivalente.
[00379] Em uma modalidade, um dsRNA da invenção é conjugado com um ligante ramificado bivalente ou trivalente selecionado a partir do grupo de estruturas mostradas em qualquer fórmula (XXXII)- (XXXV):
Figure img0012
[00380] em que:
[00381] q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B e q5C representam independentemente para cada ocorrência q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B e q5C representam independentemente para cada ocorrência 0-20 e em que a unidade de repetição pode ser a mesma ou diferente; P2A P2B P3A P3B P4A P4B P5A P5B P5C T2A T2B T3A T3B T4A T4B T4A T5B, T5C são cada um independentemente para cada ocorrência ausentes, CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH ou CH2O;
[00382] Q2A, Q2B, Q3A, Q3B, Q4A, Q4B, Q5A, Q5B, Q5C são independen temente para cada ocorrência ausentes, alquileno, alquileno substituído em que um ou mais metilenos podem ser interrompidos ou terminados por um ou mais de O, S, S (O), SO2, N (RN), C(R’)=C(R"), C=C ou C(O);
[00383] R2A, R2B, R3A, R3B, R4A, R4B, R5A, R5B, R5C são cada um in dependentemente para cada ocorrência ausentes, NH, O, S, CH2, (O)- CH(Ra)-NH-, CO, CH=N-O,
Figure img0013
Figure img0014
ou heterociclila;
[00384] L2A, L2B, L3A, L3B, L4A, L4B, L5A, L5B e L5C representam o ligan- te; isto é, cada qual independentemente para cada ocorrência, um monossacarídeo (tal como GalNAc), dissacarídeo, trissacarídeo, te- trassacarídeo, oligossacarídeo ou polissacarídeo; e Ra é H ou cadeia lateral de aminoácido. Os derivados de GalNAc de conjugação trivalente são particularmente úteis para utilização com agentes de iRNA para inibir a expressão de um gene alvo, tais como os da fórmula (XXXVI): Fórmula XXXVI
Figure img0015
[00385] em que L5A, L5B e L5C representam uma monossacarídeo, como derivado de GalNAc.
[00386] Exemplos de grupos ligadores ramificados bivalentes e tri-valentes adequados que conjugam derivados de GalNAc incluem, mas não estão limitados a, estruturas citadas acima como fórmulas II, VII, XI, X e XIII.
[00387] Patentes Norte-americanas representativas que ensinam a preparação de conjugados de RNA incluem, mas não estão limitadas a, Pat. Norte-americana Números 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5,52,538; 5.578.717, 5.580.731; 5.591.584; 5,109,124; 5.111.802; 5.138.045; 5.414.077; 5,486,603; 5.512.439; 5.578.718; 5.608.046; 4.587.044; 4.605.735; 4,667,025; 4.762.779; 4.789.737; 4.824.941; 4.835.263; 4.876.335; 4.904.582; 4.958.013; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5,245,022; 5.254.469; 5,258,506; 5,262,536; 5.272.250; 5,292,873; 5,317,098; 5.371.241, 5.391.723; 5.416.203, 5.451.463; 5.510.475; 5.512.667; 5.514.785; 5.565.552; 5.567.810; 5.574.142; 5.585.481; 5.587.371; 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928 e 5.688.941; 6,294,664; 6,320,017; 6,576,752; 6.783.931; 6.900.297; 7.037.646; 8.106.022, cujos conteúdos inteiros de cada uma estão aqui incorporados por referência.
[00388] Não é necessário que todas as posições em um dado composto sejam modificadas uniformemente e, de fato, mais de uma das modificações acima mencionadas podem ser incorporadas em um único composto ou mesmo em um único nucleosídeo dentro de um iRNA. A presente invenção também inclui compostos de iRNA que são compostos quiméricos.
[00389] Os compostos de iRNA "quiméricos" ou "quimeras", no contexto desta invenção, são compostos de iRNA, de preferência dsR- NAs, que contêm duas ou mais regiões quimicamente distintas, cada uma constituída por pelo menos uma unidade de monômero, isto é, um nucleotídeo no caso de um composto de dsRNA. Estes iRNAs tipi-camente contêm pelo menos uma região em que o RNA é modificado de modo a conferir ao iRNA uma resistência aumentada à degradação da nuclease, aumento da captação celular e/ou afinidade de ligação aumentada para o ácido nucleico alvo. Uma região adicional do iRNA pode servir como substrato para enzimas capazes de clivar RNA: DNA ou RNA: híbridos de RNA. A título de exemplo, a RNase H é uma en donuclease celular que cliva a fita de RNA de um duplex de RNA:DNA. A ativação da RNase H, portanto, resulta na clivagem do alvo de RNA, realçando desse modo a eficiência da inibição do iRNA da expressão gênica. Consequentemente, podem ser obtidos resultados comparáveis com iRNAs mais curtos quando são utilizados RNAs quiméricos, em comparação com dsRNAs de fosforotioato desóxi que se hibridi- zam com a mesma região alvo. A clivagem do alvo de RNA pode ser detectada rotineiramente por electroforese em gel e, se necessário, técnicas de hibridização de ácido nucleico associadas conhecidas na técnica.
[00390] Em certos casos, o RNA de um iRNA pode ser modificado por um grupo não ligante. Uma série de moléculas não ligantes foram conjugadas com iRNAs para realçar a atividade, liberação celular ou absorção celular do iRNA, e os procedimentos para realizar tais conju-gações estão disponíveis na literatura científica. Essas porções não ligantes incluíram porções lipídicas, tais como colesterol (Kubo, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365 (1): 54-61; Letsinger et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1989, 86: 6553), ácido cólico (Manoha- ran et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4: 1053), um tioéter, por exemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. NY Acad. Sci., 1992, 660: 306, Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3: 2765), um tio colesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20: 533), uma cadeia alifática, por exemplo, dodecandiol ou resíduos de undecila (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10: 111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259 : 327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), um fosfolipídeo, por exemplo, di-hexadecil-rac-glicerol ou 1,2- di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamônio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36: 3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18 : 3777), uma poliamina ou um cadeia de polietilenoglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14: 969), ou áci- do adamantano acético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36: 3651), a (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264: 229), ou uma porção de octadecilamina ou hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277: 923). Patentes dos Estados Unidos representativas que ensinam a preparação de tais conjugados de RNA foram listadas acima. Protocolos de conjugação típicos envolvem a síntese de um RNAs que transporta um aminoliga- dor em uma ou mais posições da sequência. O grupo amino é em seguida reagido com a molécula sendo conjugada utilizando reagentes apropriados de acoplamento ou ativação. A reação de conjugação pode ser realizada quer com o RNA ainda ligado ao suporte sólido quer após a clivagem do RNA, em fase de solução. A purificação do conjugado de RNA por HPLC proporciona tipicamente o conjugado puro.
V. Liberação de um iRNA da Invenção
[00391] A liberação de um iRNA da invenção a uma célula, por exemplo, uma célula dentro de um indivíduo, tal como um indivíduo humano (por exemplo, um indivíduo que dele necessite, tal como um indivíduo que tem uma doença, transtorno ou condição associada à TTR) pode ser alcançada de várias maneiras diferentes. Por exemplo, a liberação pode ser realizada contatando uma célula com um iRNA da invenção in vitro ou in vivo. A liberação in vivo também pode ser realizada diretamente através da administração de uma composição que compreende um RNAm, por exemplo, um dsRNA, a um indivíduo. Alternativamente, a administração in vivo pode ser realizada indiretamente através da administração de um ou mais vetores que codificam e direcionam a expressão do iRNA. Essas alternativas são discutidas mais adiante.
[00392] Em geral, qualquer método de liberação de uma molécula de ácido nucleico (in vitro ou in vivo) pode ser adaptado para utilização com um iRNA da invenção (ver, por exemplo, Akhtar S. e Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol. 2 (5): 139-144 e WO94/02595, que estão aqui incorporados por referência na sua totalidade). Para a liberação in vivo, os fatores a serem considerados para fornecer uma molécula de iRNA incluem, por exemplo, a estabilidade biológica da molécula administrada, a prevenção de efeitos não específicos e o acúmulo da molécula administrada no tecido alvo. Os efeitos não específicos de um iRNA podem ser minimizados pela administração local, por exemplo, por injeção direta ou implantação em um tecido ou administração tópica da preparação. A administração local a um sítio de tratamento maximiza a concentração local do agente, limita a exposição do agente aos tecidos sistêmicos que de outra forma podem ser prejudicados pelo agente ou que podem degradar o agente e permitir uma menor dose total da molécula de iRNA a ser administrada . Vários estudos demonstraram o sucesso no nocaute de produtos de gene quando um iRNA é administrado localmente. Por exemplo, a administração intraocular de um dsRNA de VEGF por injeção intravítrea em macacos ci- nomolgo (Tolentino, MJ, et al (2004) Retina 24: 132-138) e injeções subretinas em camundongos (Reich, SJ, et al., 2003). Mol. Vis. 9: 210216) mostraram igualmente prevenir a neovascularização em um modelo experimental de degeneração macular relacionada à idade. Além disso, a injeção intratumoral direta de um dsrNA em camundongos reduz o volume do tumor (Pille, J. et al. (2005) Mol. Ther.11: 267-274) e pode prolongar a sobrevivência de camundongos transportando tumor (Kim, WJ., et al (2006) Mol. Ther. 14: 343-350; Li, S., et al (2007) Mol. Ther. 15: 515-523). A interferência de RNA também mostrou sucesso com a liberação local ao SNC por injeção direta (Dorn, G., et al. (2004) Nucleic Acids 32: e49; Tan, PH., et al (2005) Gene Ther. 12: 59- 66; Makimura, H., et al (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., et al. (2004) Neuroscience 129: 521-528; Thakker, ER., et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 17270-17275; Akaneya, Y., et al. (2005) J. Neurophysiol 93: 594-602) e aos pulmões por administração intranasal (Howard, KA., et al., 2006) Mol Ther. 14: 476-484; Zhang, X., et al (2004) J. Biol. Chem. 279: 10677-10684; Bitko, V., et al. (2005) Nat. Med. 11: 50-55). Para administração de um iRNA sistematicamente para o tratamento de uma doença, o RNA pode ser modificado ou alternativamente liberado usando um sistema de administração de fár- maco; Ambos os métodos atuam para evitar a rápida degradação do dsRNA por endo e exonucleases in vivo. A modificação do RNA ou do veículo farmacêutico também pode permitir o alvejamento da composição de iRNA no tecido alvo e evitar efeitos indesejáveis fora do alvo. As moléculas de iRNA podem ser modificadas por conjugação química a grupos lipofílicos tais como o colesterol para realçar a absorção celular e evitar a degradação. Por exemplo, um iRNA direcionado contra ApoB conjugado com uma porção de colesterol lipofílico foi ingerido sistematicamente em camundongos e resultou em nocaute do mRNA apoB tanto no fígado quanto no jejuno (Soutschek, J., et al. (2004) Nature 432: 173-178). A conjugação de um iRNA com um aptâmero demonstrou inibir o crescimento do tumor e mediar a regressão tumoral em um modelo de câncer de próstata do camundongo (McNamara, JO., et al. (2006) Nat. Biotechnol. 24: 1005-1015). Em uma modalidade alternativa, o iRNA pode ser administrado utilizando sistemas de ad-ministração de fármaco, tais como uma nanopartícula, um dendrímero, um polímero, lipossomas ou um sistema de liberação catiônica. Os sis-temas de liberação catiônica carregados positivamente facilitam a ligação de uma molécula de iRNA (carregada negativamente) e também realçam as interações na membrana celular carregada negativamente para permitir a absorção eficiente de um iRNA pela célula. Os lipídeos, dendrímeros ou polímeros catiônicos podem ser ligados a um iRNA ou induzidos a formar uma vesícula ou micela (ver, por exemplo, Kim SH, et al (2008) Journal of Controlled Release 129 (2): 107-116) que encer- ra um iRNA. A formação de vesículas ou micelas evita ainda a degra-dação do iRNA quando administrado sistematicamente. Os métodos para fazer e administrar complexos catiônicos de iRNA estão bem dentro das habilidades de alguém versado na técnica (ver, por exemplo, Sorensen, DR., et al., 2003) J. Mol. Biol 327: 761-766; Verma, UN., et al (2003) Clin. Cancer Res. 9: 1291-1300; Arnold, AS et al (2007) J. Hypertens. 25: 197-205, que estão aqui incorporados por referência na sua totalidade). Alguns exemplos não limitantes de sistemas de administração de fármacos úteis para a liberação sistêmica de iRNAs incluem DOTAP (Sorensen, DR., et al., 2003), supra; Verma, UN., et al (2003), supra), Oligofectamine, "Solid nucleic acid lipid particles" (Zimmermann, TS, et al (2006) Nature 441: 111-114), cardiolipina (Chien, PY., et al. (2005) Cancer Gene Ther. 12: 321-328; Pal, A., et al (2005) Int J. Oncol. 26: 1087-1091), polietilenoimina (Bonnet ME, et al., 2008) Pharm. Res. Aug 16 Epub ahead of print; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol 71659), peptídeos Arg-Gly-Asp (RGD) (Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3: 472-487) e poliamidoaminas (Tomalia, DA, et al., 2007) Biochem. Soc. Trans. 35: 61-67; Yoo, H., et al (1999) Pharm. Res. 16: 1799-1804). Em algumas modalidades, um iRNA forma um complexo com ciclodextrina para administração sistêmica. Os métodos para administração e composições farmacêuticas de iRNAs e ciclodex- trinas podem ser constatados na Patente Norte-americano N° 7 427 605, que está aqui incorporada por referência na sua totalidade.
A. iRNAs codificados por vetor da Invenção
[00393] O iRNA que alveja o gene de TTR podem ser expressos a partir de unidades de transcrição inseridas em vetores de DNA ou RNA (veja, por exemplo, Couture, A, et al., TIG. (1996), 12: 5-10; Skillern, A., et al., Publicação Internacional PCT N ° WO 00/22113, Conrad, Publicação Internacional PCT N ° WO 00/22114 e Conrad, Patente Norte-americana N ° 6 054 299). A expressão pode ser transitória (na ordem de horas a semanas) ou sustentada (semanas a meses ou mais), dependendo da construção específica usada e do tecido alvo ou tipo celular. Estes transgenes podem ser introduzidos como uma construção linear, um plasmídeo circular ou um vetor viral, que pode ser um vetor de integração ou não integração. O transgene também pode ser construído para permitir que ele seja herdado como um plasmídeo ex- tra-cromossômico (Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92: 1292).
[00394] As fitas ou fita individual de um iRNA podem ser transcritos a partir de um promotor em um vetor de expressão. Onde duas fitas separadas devem ser expressas para gerar, por exemplo, um dsRNA, dois vetores de expressão separados podem ser cointroduzidos (por exemplo, por transfecção ou infecção) em uma célula alvo. Alternati-vamente, cada fita individual de um dsRNA pode ser transcrito por promotores, os quais estão localizados no mesmo plasmídeo de ex-pressão. Em uma modalidade, um dsRNA é expresso como polinu- cleotídeos repetidos invertidos unidos por uma sequência polinucleotí- dica de ligação, de tal modo que o dsRNA possui uma estrutura de haste e alça.
[00395] Os vetores de expressão de iRNA são geralmente plasmí- deos de DNA ou vetores virais. Os vetores de expressão compatíveis com células eucarióticas, de preferência os compatíveis com células vertebradas, podem ser utilizados para produzir construções recombi- nantes para a expressão de um iRNA como aqui descrito. Os vetores de expressão de células eucarióticas são bem conhecidos na técnica e estão disponíveis a partir de várias fontes comerciais. Tipicamente, esses vetores são proporcionados contendo sítios de restrição conve-nientes para inserção do segmento de ácido nucleico desejado. A libe-ração de vetores de expressão de iRNA pode ser sistêmica, por exemplo, por administração intravenosa ou intramuscular, por adminis- tração a células alvo explantadas do paciente, seguido de reintrodução no paciente ou por qualquer outro meio que permita a introdução em uma célula alvo desejada.
[00396] Os plasmídeos de expressão de iRNA podem ser transfec- tados em células alvo como um complexo com veículos lipídicos ca- tiônicos (por exemplo, Oligofectamina) ou veículos não catiônicos à base de lipídeos (por exemplo, Transit-TKOTM). As transfecções de múltiplos lipídeos para nocautes mediados por iRNA que alvejam diferentes regiões de um RNA alvo durante um período de uma semana ou mais também são contempladas pela invenção. A introdução bem sucedida de vetores em células hospedeiras pode ser monitorada usando vários métodos conhecidos. Por exemplo, a transfecção transitória pode ser sinalizada com um repórter, como um marcador fluorescente, como Green Fluorescent Protein (GFP). A transfecção estável de células ex vivo pode ser assegurada usando marcadores que proporcionam a célula transfectada com resistência a fatores ambientais específicos (por exemplo, antibióticos e fármacos), como a resistência à higromicina B.
[00397] Os sistemas de vetor viral que podem ser utilizados com os métodos e composições aqui descritos incluem, mas não estão limitados a, (a) vetores de adenovírus; (b) vetores de retrovírus, incluindo, mas não se limitando a, vetores lentivirais, vírus da leucemia de murí- deo de Moloney, etc.; (c) vetores de vírus adenoassociados; (d) vetores do vírus do herpes simples; (e) vetores SV 40; (f) vetores do polio- mavírus; (g) vírus do papilomavírus; (h) vetores de picornavírus; (i) vetores de vírus varíola tais como uma orthopox, por exemplo, vetores do vírus da vacínia ou avipox, por exemplo, varíola canária ou varíola das aves; e (j) um adenovírus dependente ou dependente de ajuda. Os vírus com defeito de replicação também podem ser vantajosos. Diferentes vetores serão ou não serão incorporados ao genoma das célu- las. As construções podem incluir sequências virais para transfecção, se desejado. Alternativamente, a construção pode ser incorporada em vetores capazes de replicação epissômica, por exemplo, Vetores EPV e EBV. As construções para a expressão recombinante de um iRNA geralmente requerem elementos reguladores, por exemplo, promotores, realçadores, etc., para garantir a expressão do iRNA em células alvo. Outros aspectos a serem considerados para vetores e construções também são descritos abaixo.
[00398] Os vetores úteis para a liberação de um iRNA incluirão elementos reguladores (promotor, realçador, etc.) suficientes para a expressão do iRNA na célula ou tecido alvo desejado. Os elementos reguladores podem ser selecionados para fornecer expressão constitutiva ou regulada/induzível.
[00399] A expressão do iRNA pode ser regulada com precisão, por exemplo, usando uma sequência reguladora induzível que é sensível a certos reguladores fisiológicos, por exemplo, níveis circulantes de gli-cose ou hormônios (Docherty et al., 1994, FASEB J. 8: 20-24). Tais sistemas de expressão induzíveis, adequados para o controle da ex-pressão de dsRNA em células ou em mamíferos, incluem, por exemplo, regulação por ecdisona, por estrogênio, progesterona, tetraciclina, indutores químicos de dimerização e isopropil-beta-D1- tiogalactopiranosídeo (IPTG). Uma pessoa versada na técnica seria capaz de escolher a sequência reguladora/promotora apropriada com base no uso pretendido do transgene de iRNA.
[00400] Podem ser utilizados vetores virais que contêm sequências de ácido nucleico que codificam um iRNA. Por exemplo, pode ser utilizado um vetor retroviral (ver Miller et al., Meth. Enzymol. 217: 581-599 (1993)). Estes vetores retrovirais contêm os componentes necessários para a embalagem correta do genoma viral e a integração no DNA das células hospedeiras. As sequências de ácido nucleico que codificam um iRNA são clonadas em um ou mais vetores, o que facilita a liberação do ácido nucleico a um paciente. Mais detalhes sobre os vetores retrovirais podem ser constatados, por exemplo, em Boesen et al., Biotherapy 6: 291-302 (1994), que descreve a utilização de um vetor retroviral para administrar o gene mdr1 às células-tronco hematopoiéti- cas, a fim de tornar as células-tronco mais resistentes à quimioterapia. Outras referências que ilustram o uso de vetores retrovirais na terapia gênica são: Clowes et al., J. Clin. Invest. 93: 644-651 (1994); Kiem et al., Blood 83: 1467-1473 (1994); Salmons e Gunzberg, Human Gene Therapy 4: 129-141 (1993); e Grossman e Wilson, Curr. Opin. in Genetics e Devel. 3: 110-114 (1993). Os vetores de lentivira considerados para utilização incluem, por exemplo, os vetores baseados no HIV descritos nas Patentes Norte-americanas Nos. 6.143.520; 5.665.557; e 5.981.276, que estão aqui incorporados por referência.
[00401] Os adenovírus também são considerados para utilização na liberação de iRNAs da invenção. Os adenovírus são veículos especi-almente atraentes, por exemplo, para administrar genes aos epitélios respiratórios. Os adenovírus naturalmente infectam epitélios respiratórios onde causam uma doença leve. Outros alvos para sistemas de administração com base em adenovírus são fígado, sistema nervoso central, células endoteliais e músculos. Os adenovírus têm a vantagem de serem capazes de infectar células não divisórias. Kozarsky e Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3: 499-503 (1993) apresentam uma revisão da terapia gênica baseada em adenovírus. Bout et al., Human Gene Therapy 5: 3-10 (1994) demonstra o uso de vetores de adenovírus para transferir genes para os epitélios respiratórios de macacos reso. Outros casos do uso de adenovírus na terapia gênica podem ser constatados em Rosenfeld et al., Science 252: 431-434 (1991); Rosenfeld et al., Cell 68: 143-155 (1992); Mastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91: 225-234 (1993); Publicação PCT WO94/12649; e Wang, et al., Gene Therapy 2: 775-783 (1995). Um vetor AV adequado para expressar um iRNA caracterizado na invenção, um método para construir o vetor AV recombinante e um método para liberação do vetor em células-alvo, são descritos em Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010.
[00402] Os vetores de vírus adenoassociados (AAV) também podem ser usados para administrar um iRNA da invenção (Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204: 289-300 (1993); Patente Norte- americana N° 5 436 146). Em uma modalidade, o iRNA pode ser expresso como duas moléculas de RNA de fita única separadas, a partir de um vetor AAV recombinante que tem, por exemplo, os promotores de RNA de U6 ou H1 ou o promotor de citomegalovírus (CMV). Os vetores AAV adequados para expressar o dsRNA apresentado na invenção, métodos para construir o vetor AV recombinante, e métodos para fornecer os vetores em células alvo são descritos em Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J et al. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; Pat. Norte- americana N ° 5.252.479; Pat. Norte-americana No. 5.139.941; Pedido de Patente Internacional N ° WO 94/13788; e Pedido de Patente Internacional N° WO 93/24641, cujas divulgações completas estão aqui incorporadas por referência.
[00403] Outro vetor viral adequado para a liberação de um iRNA da invenção é um vírus da varíola, tal como um vírus da vacínia, por exemplo, uma vacina atenuada tal como Vírus Ankara Modificado (MVA) ou NYVAC, um avipox tal como varíola de aves ou varíola canária.
[00404] O tropismo dos vetores virais pode ser modificado por pseudtipagem dos vetores com proteínas envelope ou outros antíge- nos de superfície de outros vírus, ou substituindo proteínas de capsí- deo viral diferentes, conforme apropriado.Por exemplo, os vetores len- tivirais podem ser pseudtipados com proteínas superficiais do vírus da estomatite vesicular (VSV), raiva, Ebola, Mokola e similares. Os vetores AAV podem ser feitos para atingir diferentes células, construindo os vetores para expressar diferentes serótipos de proteína de capsí- deo; ver, por exemplo, Rabinowitz J E et al. (2002), J Virol 76: 791801, cuja descrição completa está aqui incorporada por referência.
[00405] A preparação farmacêutica de um vetor pode incluir o vetor em um diluente aceitável, ou pode incluir uma matriz de liberação lenta, na qual o veículo de administração de genes está embutido. Alter-nativamente, onde o vetor completo de administração de genes pode ser produzido intato a partir de células recombinantes, por exemplo, vetores retrovirais, a preparação farmacêutica pode incluir uma ou mais células que produzem o sistema de liberação de genes.
VI. Composições Farmacêuticas da Invenção
[00406] A presente invenção também inclui composições farmacêuticas e formulações que incluem os iRNAs da invenção. Em uma modalidade aqui fornecida estão composições farmacêuticas contendo um iRNA, como aqui descrito, e um veículo farmaceuticamente aceitável. As composições farmacêuticas contendo o iRNA são úteis para tratar uma doença ou transtorno associado com a expressão ou atividade de um gene de TTR. Tais composições farmacêuticas são formuladas com base no modo de liberação. Um exemplo são composições que são formuladas para administração sistêmica por meio de administração parenteral, por exemplo, por liberação subcutânea (SC) ou intravenosa (IV). Outro exemplo são as composições que são formuladas para administração direta no parênquima cerebral, por exemplo, por infusão no cérebro, como por infusão de bomba contínua. As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas em dosagens suficientes para inibir a expressão de um gene de TTR. Em uma modalidade, os agentes de iRNA da invenção, por exemplo, um agente de dsRNA, são formados para administração subcutânea em um veículo farmaceuticamente aceitável.
[00407] A composição farmacêutica pode ser administrada por infusão intravenosa durante um período de tempo, tal como durante um período de 5, 6, 7 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 e 21, 22, 23, 24 ou cerca de 25 minutos. A administração pode ser repetida, por exemplo, de forma regular, tal como, semanalmente, quinzenalmente (ou seja, a cada duas semanas) por um mês, dois meses, três meses, quatro meses ou mais. A administração também pode ser repetida, por exemplo, mensalmente, ou em uma base trimestral, por exemplo, aproximadamente a cada 12 semanas. Após um regime de tratamento inicial, os tratamentos podem ser administrados de forma menos frequente. Por exemplo, após a administração semanal ou quinzenalmente durante três meses, a administração pode ser repetida uma vez por mês, por seis meses ou por ano ou mais.
[00408] A composição farmacêutica pode ser administrada uma vez por dia, ou o iRNA pode ser administrado como duas, três ou mais subdoses em intervalos apropriados ao longo do dia ou mesmo usando infusão contínua ou liberação através de uma formulação de liberação controlada. Nesse caso, o iRNA contido em cada subdosagem deve ser correspondentemente menor para atingir a dosagem diária total. A unidade de dosagem também pode ser composta para administração durante vários dias, por exemplo, utilizando uma formulação de liberação sustentada convencional que proporciona uma liberação prolongada do iRNA durante um período de vários dias. As formulações de liberação sustentada são bem conhecidas na técnica e são particularmente úteis para a liberação de agentes em um sítio particular, tais como podem ser usadas com os agentes da presente invenção. Nesta modalidade, a unidade de dosagem contém um múltiplo correspondente da dose diária.
[00409] Em outras modalidades, uma dose única das composições farmacêuticas pode ser de longa duração, de modo que as doses sub-sequentes sejam administradas em intervalos não superiores a 3, 4 ou 5 dias, em intervalos não superiores a 1, 2, 3 ou 4 semanas, ou em intervalos não superiores a 9, 10, 11 ou 12 semanas. Em algumas modalidades da invenção, uma única dose das composições farma-cêuticas da invenção é administrada uma vez por semana. Em outras modalidades da invenção, uma dose única das composições farma-cêuticas da invenção é administrada bimensalmente. Em outras moda-lidades, uma dose única das composições farmacêuticas da invenção é administrada mensalmente. Ainda em outras modalidades, uma única dose das composições farmacêuticas da invenção é administrada trimestralmente.
[00410] O técnico versado observará que certos fatores podem in-fluenciar a dosagem e o tempo necessário para tratar eficazmente um indivíduo, incluindo mas não limitado à gravidade da doença ou trans-torno, tratamentos anteriores, saúde geral e/ou idade do indivíduo, e outras doenças presentes. Além disso, o tratamento de um indivíduo com uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição pode incluir um único tratamento ou uma série de tratamentos. As estimativas de dosagens eficazes e meias-vidas in vivo para os iRNAs individuais abrangidos pela invenção podem ser feitas utilizando metodologias convencionais ou com base em testes in vivo usando um modelo animal apropriado, como descrito em outro lugar aqui.
[00411] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas de várias maneiras, dependendo se o tratamento local ou sistêmico é desejado e da área a ser tratada. A administração pode ser tópica (por exemplo, por um emplastro transdérmi- co), pulmonar, por exemplo, por inalação ou insuflação de pós ou aerossóis, incluindo por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica e transdérmica, oral ou parenteral. A administração parenteral inclui injeção intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intraperitoneal ou intra-muscular ou infusão; subdérmica, por exemplo, através de um dispositivo implantado; ou intracraniana, por exemplo, por administração in- traparenquímica, intratecal ou intraventricular.
[00412] O iRNA pode ser administrado de forma a atingir um tecido específico, como o fígado (por exemplo, os hepatócitos do fígado).
[00413] As composições e formulações farmacêuticas para administração tópica podem incluir manchas transdérmicas, unguentos, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, pulverizadores, líquidos e pós. Os veículos farmacêuticos convencionais, bases aquosas, em pó ou oleosas, espessantes e similares podem ser necessários ou desejáveis. Os preservativos revestidos, luvas e similares também podem ser úteis. As formulações tópicas adequadas incluem aquelas nas quais os iRNAs apresentados na invenção estão em mistura com um agente de liberação tópico tal como lipídeos, lipossomas, ácidos graxos, ésteres de ácidos graxos, esteroides, agentes quelantes e tensoativos. Os lipídeos e lipossomas adequados incluem neutros (por exemplo, diole- oilfosfatidil DOPE etanolamina, dimerossil fosfatidilcolina DMPC, dies- tearolifosfatidilcolina) negativos (por exemplo, DYDH dimyristoilfosfati- dil glicerol) e catiônicos (por exemplo, dioleoiltetrametilaminopropil DOTAP e dioleoilfosfatidil etanolamina DOTAP). Os iRNAs apresentados na invenção podem ser encapsulados dentro dos lipossomas ou podem formar complexos, em particular aos lipossomas catiônicos. Alternativamente, os iRNAs podem ser complexados em lipídeos, em particular para lipídeos catiônicos. Os ácidos graxos e ésteres ade-quados incluem, mas não estão limitados a, ácido araquidônico, ácido oleico, ácido eicosanoico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolênico, dicaprato, tricaprato, monooleína, dilaurina, 1-monocaprato de glicerila, 1-dodecilazaciclo-heptan-2-ona, uma acilcarnitina, uma acilcolina ou um C1-20 alquil éster (por exemplo, IPM isopropilmiristato), monoglicerídeo, diglicerídeo ou seu sal farmaceuticamente aceitável). As formulações tópicas são descritas em detalhes na Patente Norte- americano N ° 6 747 014, que está aqui incorporada por referência.
A. Formulações de iRNA Compreendendo Montagens Moleculares Membranosas
[00414] Um iRNA para uso nas composições e métodos da invenção pode ser formulado para administração em uma montagem molecular membranosa, por exemplo, um lipossoma ou uma micela. Quando aqui utilizado, o termo "lipossoma" refere-se a uma vesícula composta por lipídeos anfifílicos dispostos em pelo menos uma bicamada, por exemplo, uma bicamada ou uma pluralidade de bicamadas. Os lipossomas incluem vesículas unilamelares e multilamelares que possuem uma membrana formada a partir de um material lipofílico e um interior aquoso. A porção aquosa contém a composição de iRNA. O material lipofílico isola o interior aquoso de um exterior aquoso, que tipicamente não inclui a composição de iRNA, embora em alguns exemplos, pode. Os lipossomas são úteis para a transferência e liberação de ingredientes ativos para o sítio de ação. Como a membrana lipossômica é estruturalmente semelhante às membranas biológicas, quando os lipossomas são aplicados a um tecido, a bicamada lipos- sômica se funde com a bicamada das membranas celulares. À medida que a fusão do lipossoma e da célula progride, os conteúdos aquosos internos que incluem o iRNA são liberados na célula onde o iRNA pode se ligar especificamente a um RNA alvo e pode mediar o iRNA. Em alguns casos, os lipossomas também são especificamente orientados, por exemplo, para alvejar o iRNA para tipos de células particulares.
[00415] Um lipossoma contendo um agente de iRNA pode ser preparado por uma variedade de métodos. Em um exemplo, o componen- te lipídico de um lipossoma é dissolvido em um detergente, de modo que as micelas são formadas com o componente lipídico. Por exemplo, o componente lipídico pode ser um lipídeo catiônico anfipático ou conjugado lipídico. O detergente pode ter uma alta concentração crítica de micelas e pode ser não iônico. Exemplos de detergentes incluem colato, CHAPS, octilglucosídeo, desoxicolato e lauroil sarcosina. A preparação do agente de iRNA é então adicionada às micelas que in-cluem o componente lipídico. Os grupos catiônicos sobre o lipídeo in-teragem com o agente de iRNA e se condensam em torno do agente de iRNA para formar um lipossoma. Após a condensação, o detergente é removido, por exemplo, por diálise, para produzir uma preparação lipossômica de agente de iRNA.
[00416] Se necessário, pode ser adicionado um composto veículo que auxilia na condensação durante a reação de condensação, por exemplo, por adição controlada. Por exemplo, o composto veículo pode ser um polímero diferente de um ácido nucleico (por exemplo, es- permina ou espermidina). O pH também pode ser ajustado para favorecer a condensação.
[00417] Os métodos para a produção de veículos de liberação de polinucleotídeos estáveis, que incorporam um complexo polinucleotídi- co/lipídico catiônico como componentes estruturais do veículo de libe-ração, são descritos adicionalmente, por exemplo, WO 96/37194, cujos conteúdos inteiros estão aqui incorporados por referência. A formação de lipossomas também pode incluir um ou mais aspectos dos métodos exemplificativos descritos em Felgner, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8: 7413-7417, 1987; Pat. Norte-americana N ° 4.897.355; Pat. Norte-americana N° 5.171.678; Bangham, et al. M. Mol. Biol. 23: 238, 1965; Olson, et al. Biochim. Biophys. Acta 557: 9, 1979; Szoka, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 4194, 1978; Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta 775: 169, 1984; Kim, et al. Biochim. Biop hys. Acta 728: 339, 1983; e Fukunaga, et al. Endocrinol. 115: 757, 1984. As técnicas comumente utilizadas para a preparação de agregados lipídicos de tamanho apropriado para utilização como veículos de liberação incluem a sonicação e o congelamento-descongelamento mais extrusão (ver, por exemplo, Mayer, et al., Biochim. Biophys. Acta 858: 161, 1986) . A microfluidização pode ser utilizada quando são de-sejáveis agregados consistentemente pequenos (50 a 200 nm) e rela-tivamente uniformes (Mayhew, et al., Biochim. Biophys. Acta 775: 169, 1984). Estes métodos são facilmente adaptados para acondicionar as preparações do agente de iRNA em lipossomas.
[00418] Os lipossomas se dividem em duas grandes classes. Os lipossomas catiônicos são lipossomas carregados positivamente que interagem com as moléculas de ácido nucleico carregadas negativa-mente para formar um complexo estável. O complexo de ácido nuclei- co/lipossoma carregado positivamente se liga à superfície celular car-regada negativamente e é internalizado em um endossoma. Devido ao pH ácido dentro do endosoma, os lipossomas são rompidos, liberando seus conteúdos para o citoplasma celular (Wang et al., Biochem. Biophys, Res. Commun., 1987, 147, 980-985).
[00419] Lipossomas que são sensíveis ao pH ou carregados negati-vamente, atrapalham ácidos nucleicos em vez de complexos com ele. Uma vez que tanto o ácido nucleico como o lipídeo são carregados de forma semelhante, a repulsão em vez da formação complexa ocorre. No entanto, algum ácido nucleico é aprisionado dentro do interior aquoso desses lipossomas. Os lipossomas sensíveis ao pH foram utilizados para administrar ácidos nucleicos que codificam o gene da timi- dina cinase para monocamadas celulares em cultura. A expressão do gene exógeno foi detectada nas células alvo (Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).
[00420] Um dos principais tipos de composição lipossômica inclui fosfolipídeos diferentes da fosfatidilcolina naturalmente derivada. As composições de lipossomas neutros, por exemplo, podem ser formadas a partir de dincistoil fosfatidilcolina (DMPC) ou dipalmitoil fosfatidil- colina (DPPC). As composições de lipossomas aniônicos geralmente são formadas a partir de dimiristoil fosfatidilglicerol, enquanto os lipos- somas fusogênicos aniônicos são formados principalmente a partir de dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE). Outro tipo de composição lipos- sômica é formada a partir de fosfatidilcolina (PC) tal como, por exemplo, PC de soja e PC de ovo. Outro tipo é formado a partir de misturas de fosfolipídeo e/ou fosfatidilcolina e/ou colesterol.
[00421] Exemplos de outros métodos para introduzir lipossomas em células in vitro e in vivo incluem a Pat. Norte-americana No. 5.283.185; Pat. Norte-americana N° 5.171.678; WO 94/00569; WO 93/24640; WO 91/16024; Felgner, J. Biol. Chem. 269: 2550, 1994; Nabel, Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 11307, 1993; Nabel, Human Gene Ther. 3: 649, 1992; Gershon, Biochem. 32: 7143, 1993; e Strauss EMBO J. 11: 417, 1992.
[00422] Os sistemas lipossômicos não iônicos também foram examinados para determinar a sua utilidade na administração de fármacos à pele, em sistemas particulares que compreendem tenso- ativo não iônico e colesterol. Foram utilizadas formulações lipossô- micas não iônicas que compreendem NovasomeTM I (gliceril- dilaurato/colesterol/polioxietileno-10-estearil éter) e NovasomeTM II (gli- ceril destearato/colesterol/polioxietileno-10-estearil éter) para libertar ciclosporina-A na derme da pele de rato. Os resultados indicaram que tais sistemas lipossômicos não iônicos foram efetivos para facilitar a deposição de ciclosporina A em diferentes camadas da pele (Hu et al., S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4 (6) 466).
[00423] Os lipossomas também incluem lipossomas "estericamente estabilizados", um termo que, quando aqui utilizado, refere-se a lipos- somas compreendendo um ou mais lipídeos especializados que, quando incorporados nos lipossomas, resultam em tempos de vida melhorados em relação aos lipossomas que não possuem tais lipídeos especializados. Exemplos de lipossomas estericamente estabilizados são aqueles em que parte da porção lipídica formadora de vesículas do lipossoma (A) compreende um ou mais glicolipídeos, tais como mo- nossialogangliosídeo GM1, ou (B) é derivado com um ou mais polímeros hidrofílicos, tais como uma porção de polietileno glicol (PEG). Embora não desejando ser vinculado por qualquer teoria particular, pensa-se na técnica que, pelo menos para lipossomas estericamente estabilizados contendo lipossomas de gangliosídeos, esfingomielina ou PEG, a semi-vida de circulação melhorada desses lipossomas esteri- camente estabilizados deriva de um absorção reduzida em células do sistema reticuloendotelial (RES) (Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765).
[00424] Vários lipossomas compreendendo um ou mais glicolipí- deos são conhecidos na técnica. Papahadjopoulos et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) relatou a capacidade do monossialoganglio- sídeo GM1, sulfato de galactocerebrosídeo e fosfatidilinositol para melhorar as meias-vidas sanguíneas dos lipossomas. Esses achados foram expostos por Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949). Pat. Norte-americana N ° 4 837 028 e WO 88/04924, ambos por Allen et al., descreve lipossomas compreendendo (1) esfingomieli- na e (2) o de gangliosídeo GM1 ou um éster de sulfato de galactoce- rebrosídeo. A Pat. Norte-americana No. 5 543 152 (Webb et al.) descreve lipossomas compreendendo esfingomielina. Os lipossomas compreendendo 1,2-sn-dimiristoilfosfatidilcolina são descritos em WO 97/13499 (Lim et al.).
[00425] Em uma modalidade, são utilizados lipossomas catiônicos. Os lipossomas catiônicos possuem a vantagem de poderem se fundir na membrana celular. Os lipossomas não catiônicos, embora não se- jam capazes de fundir-se de forma eficiente com a membrana plasmá- tica, são absorvidos por macrófagos in vivo e podem ser usados para fornecer agentes de iRNA aos macrófagos.
[00426] Outras vantagens dos lipossomas incluem: os lipossomas obtidos a partir de fosfolipídeos naturais são biocompatíveis e biode-gradáveis; Os lipossomas podem incorporar uma ampla gama de fár- macos solúveis em água e lipídeos; Os lipossomas podem proteger os agentes de iRNA encapsulados nos seus compartimentos internos do metabolismo e da degradação (Rosoff, em "Pharmaceutical Dosage Forms", Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, volume 1, página 245). Considerações importantes na preparação de formulações de lipossomas são a carga da superfície lipídica, o tamanho da vesícula e o volume aquoso dos lipossomas.
[00427] Lipídeo catiônico sintético carregado positivamente, cloreto de N-[1-(2,3-dioleilóxi) propil]-N,N,N-trimetilamônio (DOTMA) pode ser usado para formar lipossomas pequenos que interagem espontaneamente com ácido nucleico para formar complexos de lipídeo-ácido nu- cleico que são capazes de se fundir com os lipídeos carregados negativamente das membranas celulares de células de cultura de tecidos, resultando na liberação de agente de iRNA (ver, por exemplo, Felgner, PL et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8: 7413-7417, 1987 e US 4.897.355 para uma descrição de DOTMA e a sua utilização com DNA).
[00428] Um análogo de DOTMA, 1,2-bis (oiloilóxi)-3- (trimetilamônia)propano (DOTAP) pode ser utilizado em combinação com um fosfolipídeo para formar vesículas de complexação de DNA. Lipofectin ™ Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.) é um agente eficaz para a liberação de ácidos nucleicos altamente aniô- nicos em células de cultura de tecido vivo que compreendem liposso- mas DOTMA carregados positivamente que interagem espontanea- mente com polinucleotídeos negativamente carregados para formar complexos. Quando são utilizados lipossomas carregados positivamente sufivientemente, a carga líquida nos complexos resultantes também é positiva. Os complexos carregados positivamente preparados desta forma se ligam espontaneamente a superfícies celulares carregadas negativamente, se fundem com a membrana plasmática e fornecem eficientemente ácidos nucleicos funcionais em, por exemplo, células de cultura de tecidos. Outro lipídeo catiônico comercialmente disponível, 1,2-bis (oleoilóxi)-3,3-(trimetilamônia)propano ("DOTAP") (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) difere do DOTMA, na medida em que as porções de oleoíla estão ligadas por éster, em vez disso do que as ligações de éter.
[00429] Outros compostos lipídicos catiônicos relatados incluem aqueles que foram conjugados a uma variedade de porções incluindo, por exemplo, carboxiespermina que foi conjugada com um dos dois tipos de lipídeos e inclui compostos tais como dioctaoleoilamina 5- carboxiespermilglicina ("DOGS") (Transfectam ™, Promega, Madison, Wisconsin) e dipalmitoilfosfatidiletanolamina 5-carboxispermil-amida ("DPPES") (ver, por exemplo, Patente Norte-americana No. 5 171 678).
[00430] Outro conjugado lipídico catiônico inclui derivação do lipídeo com colesterol ("DC-Chol") que foi formulado em lipossomas em combinação com DOPE (Ver, Gao, X. e Huang, L., Biochim. Biophys. Res. Commun. 179: 280, 1991). A lipopolisilina, preparada por conjugação de polilisina em DOPE, foi relatada como eficaz para a transfecção na presença de soro (Zhou, X. et al., Biochim. Biophys. Acta 1065: 8, 1991). Para certas linhagems celulares, estes lipossomas que contêm lipídeos catiônicos conjugados são considerados exibidos com menor toxicidade e proporcionam uma transfecção mais eficaz do que as composições contendo DOTMA. Outros produtos lipídicos catiônicos comercialmente disponíveis incluem DMRIE e DMRIE-HP (Vical, La Jolla, Califórnia) e Lipofectamina (DOSPA) (Life Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland). Outros lipídeos catiônicos adequados para a administração de oligonucleotídeos são descritos em WO 98/39359 e WO 96/37194.
[00431] As formulações lipossômicas são particularmente adequadas para administração tópica, os lipossomas apresentam várias vantagens em relação a outras formulações. Tais vantagens incluem efeitos colaterais reduzidos relacionados com a alta absorção sistêmica do fármaco administrado, acúmulo aumentado do fármaco administrado no alvo desejado e a capacidade de administrar o agente de iRNA na pele. Em algumas implementações, os lipossomas são usados para fornecer agente de iRNA a células epidérmicas e também para realçar a penetração do agente de iRNA em tecidos dérmicos, por exemplo, na pele. Por exemplo, os lipossomas podem ser aplicados topicamente. A liberação tópica de fármacos formulados como lipossomas na pele foi documentada (ver, por exemplo, Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, vol. 2.405-410 e du Plessis et al., Antiviral Research, 18, 1992, 259 -265; Mannino, R.J. e Fould-Fogerite, S., Biotechniques 6: 682-690, 1988; Itani, T. et al. Gene 56: 267-276. 1987; Nicolau, C. et al., Meth. Enz. 149: 157-176, 1987; Straubinger, R.M. e Papahadjop- oulos, D. Meth. Enz. 101: 512-527, 1983; Wang, CY e Huang, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7851- 7855, 1987).
[00432] Os sistemas lipossômicos não iônicos também foram exami-nados para determinar a sua utilidade na administração de fármacos à pele, em sistemas particulares que compreendem tensoativo não iônico e colesterol. Foram utilizadas formulações lipossômicas não iônicas que compreendem Novasome I (gliceril-dilaurato/colesterol/polioxietileno-10- estearil éter) e Novasome II (gliceril destearato /colesterol/polioxietileno-10- estearil éter) para administrar um fármaco na derme da pele do camun- dongo. Tais formulações com o agente de iRNA são úteis para o tratamento de um transtorno dermatológico.
[00433] Os lipossomas que incluem iRNA podem ser altamente de-formáveis. Tal deformabilidade pode permitir que os lipossomas pene-trem através dos poros que são menores que o raio médio do liposso- ma. Por exemplo, os transferossomas são um tipo de lipossomas de-formáveis. Os transferossomas podem ser feitos adicionando ativado- res de borda de superfície, geralmente tensoativos, a uma composição lipossômica padrão. Os transferossomas que incluem o agente de iR- NA podem ser administrados, por exemplo, subcutaneamente por infecção, a fim de administrar o agente de iRNA aos queratinócitos na pele. A fim de atravessar a pele de mamífero intacta, as vesículas lipí- dicas devem passar por uma série de poros finos, cada um com um diâmetro inferior a 50 nm, sob a influência de um gradiente transdér- mico adequado. Além disso, devido às propriedades lipídicas, esses transferossomas podem ser auto-otimizados (adaptáveis à forma dos poros, por exemplo, na pele), autorreparadores e podem frequentemente atingir seus alvos sem fragmentação e, muitas vezes, autocar- regáveis.
[00434] Outras formulações adequadas à presente invenção são descritas na publicação PCT n° WO 2008/042973, cujo conteúdo com-pleto está aqui incorporado por referência.
[00435] Os transferossomas são ainda outro tipo de lipossomas e são agregados lipídicos altamente deformáveis que são candidatos atraentes para veículos de liberação de fármacos. Os transferossomas podem ser descritos como gotas lipídicas que são tão altamente deformáveis, que são facilmente capazes de penetrar através de poros que são menores que a gota. Os transferossomas são adaptáveis ao ambiente em que são usados, por exemplo, eles são auto-otimizantes (adaptáveis à forma dos poros na pele), autorreparadores, frequente- mente alcançam seus objetivos sem fragmentação e muitas vezes au- tocarregados. Para preparar transferossomas, é possível adicionar ati- vadores de borda de superfície, geralmente tensoativos, a uma com-posição lipossômica padrão. Os transferossomas foram utilizados para fornecer albumina sérica à pele. A liberação de albumina sérica mediada por transferossomas demonstrou ser tão eficaz quanto a injeção subcutânea de uma solução que contém albumina sérica.
[00436] Tensoativos encontram ampla aplicação em formulações tais como emulsões (incluindo microemulsões) e lipossomas. A maneira mais comum de classificar e ordenar as propriedades de muitos tipos diferentes de tensoativos, tanto naturais como sintéticos, é através do equilíbrio hidrofílico/lipofílico (HLB). A natureza do grupo hidrofílico (também conhecida como "cabeça") fornece os meios mais úteis para categorizar os diferentes tensoativos utilizados nas formulações (Rieger, em "Pharmaceutical Dosage Forms", Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., 1988 págs. 285).
[00437] Se a molécula de tensoativo não for ionizada, ela é classificada como um tensoativo não iônico. Os tensoativos não iônicos encontram ampla aplicação em produtos farmacêuticos e cosméticos e são utilizáveis em uma ampla gama de valores de pH. Em geral, seus valores de HLB variam de 2 a cerca de 18, dependendo da sua estrutura. Os tensoativos não iônicos incluem ésteres não iônicos tais como ésteres de etileno glicol, ésteres de propileno glicol, ésteres de gliceri- la, ésteres de poliglicerila, ésteres de sorbitano, ésteres de sacarose e ésteres etoxilados. As alcanolamidas e éteres não iônicos tais como etoxilatos de álcoois graxos, álcoois propoxilados e polímeros em bloco etoxilados/propoxilados também estão incluídos nesta classe. Os tensoativos de polioxietileno são os membros mais populares da classe de tensoativo não iônico.
[00438] Se a molécula de tensoativo carrega uma carga negativa quando dissolvida ou dispersa em água, o tensoativo é classificado como aniônico. Os tensoativos aniônicos incluem carboxilatos tais como sabões, acil lactilatos, acil amidas de aminoácidos, ésteres de ácido sulfúrico tais como alquil sulfatos e alquil sulfatos etoxilados, sulfonatos tais como alquilbenzenossulfonatos, acil isetionatos, acil tauratos e sulfossucinatos e fosfatos. Os membros mais importantes da classe de tensoativo aniônico são os alquil sulfatos e os sabões.
[00439] Se a molécula de tensoativo carrega uma carga positiva quando dissolvida ou dispersa em água, o tensoativo é classificado como catiônico. Os tensoativos catiônicos incluem sais de amônio quaternário e aminas etoxiladas. Os sais de amônio quaternário são os membros mais utilizados desta classe.
[00440] Se a molécula de tensoativo tiver a capacidade de carregar uma carga positiva ou negativa, o tensoativo é classificado como anfo- térico. Os tensoativos anfotéricos incluem derivados de ácido acrílico, alquilamidas substituídas, N-alquilbetaínas e fosfatídeos.
[00441] O uso de tensoativos em produtos de fármaco, formulações e em emulsões foi revisado (Rieger, em "Pharmaceutical Dosage Forms", Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., 1988, p. 285).
[00442] O iRNA para utilização nos métodos da invenção também pode ser proporcionado como formulações micelares. As "micelas" são aqui definidas como um tipo particular de montagem molecular, em que as moléculas anfipáticas estão dispostas em uma estrutura esférica de tal modo que todas as porções hidrofóbicas das moléculas são direcionadas para dentro, deixando as porções hidrofílicas em contacto com a fase aquosa circundante. O arranjo inverso existe se o ambiente for hidrofóbico.
[00443] Uma formulação micelar mista adequada para administração através de membranas transdérmicas pode ser preparada misturando uma solução aquosa da composição de siRNA, um C8 a C22 al- quil sulfato de metal alcalino e um composto formador de micelas. Os compostos formadores de micelas exemplares incluem lecitina, ácido hialurônico, sais farmaceuticamente aceitáveis de ácido hialurônico, ácido glicólico, ácido lático, extrato de camomila, extrato de pepino, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolênico, monooleína, monoolea- tos, monolauratos, óleo de borragem, óleo de prímula da noite, mentol, tri-hidroxi oxo-colanilglicina e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, glicerina, poliglicerina, lisina, polilisina, trioleína, éteres de polioxietile- no e seus análogos, éteres de alquila de polidocanol e seus análogos, chenodesoxicolato, desoxicolato e suas misturas. Os compostos for-madores de micelas podem ser adicionados ao mesmo tempo ou após a adição do alquil sulfato de metal alcalino. As micelas mistas formam substancialmente qualquer tipo de mistura dos ingredientes, mas uma mistura vigorosa para fornecer micelas de tamanho menor.
[00444] Em um método, prepara-se uma primeira composição mice- lar que contém a composição de siRNA e pelo menos o alquil sulfato de metal alcalino. A primeira composição micelar é então misturada com pelo menos três compostos formadores de micelas para formar uma composição micelar mista. Em outro método, a composição mice- lar é preparada misturando a composição de siRNA, o alquil sulfato de metal alcalino e pelo menos um dos compostos formadores de mice- las, seguido da adição dos compostos formadores de micelas rema-nescentes, com mistura vigorosa.
[00445] Fenol e/ou m-cresol podem ser adicionados à composição micelar mista para estabilizar a formulação e proteger contra o cresci-mento bacteriano. Alternativamente, o fenol e/ou o m-cresol podem ser adicionados com os ingredientes formadores de micelas. Um agente isotônico tal como glicerina pode também ser adicionado após a for-mação da composição micelar mista.
[00446] Para a liberação da formulação micelar sob a forma de um spray, a formulação pode ser colocada em um aplicador de aerossol e o aplicador é carregado com um propelente. O propelente, que está sob pressão, está na forma líquida no aplicador. As proporções dos ingredientes são ajustadas de modo que as fases aquosa e propulsora se tornem uma, isto é, há uma fase. Se houver duas fases, é necessário agitar o aplicador antes de distribuir uma porção do conteúdo, por exemplo, através de uma válvula medida. A dose dispensada de agente farmacêutico é impulsionada a partir da válvula medida em um spray fino.
[00447] Os propulsores podem incluir clorofluorocarbonos contendo hidrogênio, fluorocarbonetos contendo hidrogênio, éter dimetílico e éter dietílico. Em certas modalidades, podem ser utilizados HFA 134a (1,1,1,2 tetrafluoroetano).
[00448] As concentrações específicas dos ingredientes essenciais podem ser determinadas por experimentação relativamente direta. Para a absorção através das cavidades bucais, muitas vezes é desejável aumentar, por exemplo, pelo menos dupla ou tripla, a dosagem para injeção ou administração através do trato gastrointestinal.
B. Partículas lipídicas
[00449] Os iRNAs, por exemplo, os dsRNA da invenção podem ser completamente encapsulados em uma formulação lipídica, por exemplo, uma LNP ou outra partícula de ácido nucleico-lipídeo.
[00450] Quando aqui utilizado, o termo "LNP" refere-se a uma partícula de ácido nucleico-lipídeo estável. As LNPs tipicamente contêm um lipídeo catiônico, um lipídeo não catiônico e um lipídeo que evita a agregação da partícula (por exemplo, um conjugado PEG-lipídeo). As LNPs são extremamente úteis para aplicações sistêmicas, pois exibem uma vida útil prolongada após a injeção intravenosa (i.v.) e acumulam- se em sítios distais (por exemplo, sítios separados fisicamente do sítio de administração). As LNPs incluem "pSPLP", que incluem um com- plexo de agente de condensação-ácido nucleico conforme estabelecido na Publicação PCT N ° WO 00/03683. As partículas da presente invenção tipicamente têm um diâmetro médio de cerca de 50 nm a cerca de 150 nm, mais tipicamente cerca de 60 nm a cerca de 130 nm, mais tipicamente cerca de 70 nm a cerca de 110 nm, mais tipicamente cerca de 70 nm a cerca de 90 nm, e são substancialmente não tóxicas. Além disso, os ácidos nucleicos quando presentes nas partículas de ácido nucleico-lipídeo da presente invenção são resistentes em solução aquosa à degradação com uma nuclease. As partículas de ácido nucleico-lipídeo e seu método de preparação são descritas, por exemplo, nas Patentes Norte-americanas Nos. 5.976.567; 5.981.501; 6.534.484; 6,586,410; 6.815.432; Publicação Norte-americano No. 2010/0324120 e Publicação PCT N° WO 96/40964.
[00451] Em uma modalidade, a relação de lipídeo/fármaco (relação massa/massa) (por exemplo, relação lipídeo para dsRNA) estará na faixa de cerca de 1:1 a cerca de 50:1, de cerca de 1:1 a cerca de 25:1, de cerca de 3:1 a cerca de 15:1, de cerca de 4:1 a cerca de 10:1, de cerca de 5:1 a cerca de 9:1, ou cerca de 6:1 a cerca de 9:1. Os intervalos intermediários para as faixas citadas acima também são considerados para preparar parte da invenção.
[00452] O lipídeo catiônico pode ser, por exemplo, cloreto de N,N- dioleil-N, N-dimetilamônio (DODAC), brometo de N, N-distearil-N, N- dimetilamônio (DDAB), cloreto de N-(I-(2,3-Dioleoilóxi)propil)-N,N, N- trimetilamônio (DOTAP), cloreto de N-(I-(2,3-dioleilóxi)propil)-N,N- trimetilamônio (DOTMA), N,N-dimetil -2,3-dioleilóxi)propilamina (DOD- MA), 1,2-DiLinoleilóxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), l, 2- Dilinolenilóxi-N,N-dimetilaminopropano (DLenDMA), 1,2- Dilinoleilcarbamoilóxi-3- Dimetilaminopropano (DLin-C-DAP), 1,2- Dilinoleióxi-3-(dimetilamino) acetoxipropano (DLin-DAC), 1,2- Dilinoleióxi-3-morfolinopropano (DLin-MA), 1,2-Dilinoleoil-3- dimetilaminopropano (DLinDAP), 1,2-Dilinoletiltio-3- dimetilaminopropano (DLin-S-DMA), 1-Linoleoil-2-linoleilóxi-3- dimetilaminopropano (DLin-2-DMAP), sal de cloreto de 1,2-dilinoleilóxi- 3-trimetilaminopropano (DLin-TMA.Cl), sal de cloreto de 1,2-dilino-oleil- 3-trimetilaminopropano (DLin-TAP.Cl), 1,2-Dilinoleilóxi-3-(N- metilpiperazino) propano (DLin-MPZ) ou 3-(N,N -Dilinoleilamino)-1,2- propanodiol (DLinAP), 3-(N,N-Dioleilamino)-1,2-propanedio (DOAP), 1,2-Dilinoleloxo-3-(2-N,N-dimetilamino) etoxipropano (DLin-EG-DMA), l, 2-Dilinolenilóxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), 2,2-Dilinoleil-4- dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano (DLin-K-DMA) ou seus análogos (3aR, 5s, 6aS)-N,N-dimetil-2,2-di ((9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dienil) tetra- hidro-3aH-ciclopenta [d] [1,3] dioxol- 5-amina (ALN100), (6Z, 9Z, 28Z, 31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-il 4-(dimetilamino) butanoato (MC3), 1,1 ‘-(2-(4-(2-((2-(bis (2-hidroxidodecil)amino)etil)(2- hidroxidodecil)amino)etil)piperazin-1-il)etilazanodi-il)didodecano-2-ol (Tech G1) ou um mistura destes. O lipídeo catiônico pode compreender desde cerca de 20 % em mol a cerca de 50 % em mol ou cerca de 40 % em mol do lipídeo total presente na partícula.
[00453] Em uma outra modalidade, o composto 2,2-Dilinoleil-4- dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano pode ser usado para preparar nanopar- tículas de lipídeo-siRNA. A síntese de 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil- [1,3]-dioxolano é descrita no pedido de patente provisória dos Estados Unidos número 61/107.998 depositado em 23 de outubro de 2008, que está aqui incorporado por referência.
[00454] Em uma modalidade, a partícula de lipídeo-siRNA inclui 40 % de 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano: 10 % de DSPC: 40 % de colesterol: 10 % de PEG-C-DOMG (por cento em moles) com um tamanho de partícula de 63,0 ± 20 nm e uma Relação de 0,027 siRNA/Lipídeo.
[00455] O lipídeo ionizável/não catiônico pode ser um lipídeo aniô- nico ou um lipídeo neutro incluindo, mas não limitado a, distearoilfosfa- tidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidil- colina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilgli- cerol (DPPG), dioleoil- fosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfos- fatidilcolina (POPC), palmitoiloilfosfatidiletanolamina (POPE), dioleoil- fosfatidil-etanolamina 4-(N-maleimidometil)-ciclo-hexano-l-carboxilato (DOPE-mal), dipalmitoil fosfatidil etanolamina (DPPE), dimiristoilfosfo- roetanolamina (DMPE), distearoil -fosfatidil-etanolamina (DSPE), 16-O- monometil PE, 16-O-dimetil PE, 18-1 -trans PE, 1-estearoil-2-oleoil- fosfatidetanolamina (SOPE), colesterol ou uma mistura destes. O lipídeo não catiônico pode ser de cerca de 5 % em mol a cerca de 90 % em mol, cerca de 10 % em mol, ou cerca de 58 % em mol se o colesterol estiver incluído, do lipídeo total presente na partícula.
[00456] O lipídeo conjugado que inibe a agregação de partículas pode ser, por exemplo, um lipídeo de polietilenoglicol (PEG) incluindo, sem limitação, um PEG-diacilglicerol (DAG), um PEG-dialquilaxipropila (DAA), um PEG-fosfolipídeo, uma PEG-ceramida (Cer) ou uma mistura dos mesmos. O conjugado PEG-DAA pode ser, por exemplo, uma PEG-dilaurioxipropila (Ci2), uma PEG-dimidristiloxipropila (Ci4), uma PEG-dipalmityloxipropila (Ci6) ou uma PEG-disteariloxipropila (C]8). O lipídeo conjugado que impede a agregação de partículas pode ser de 0 % em mol a cerca de 20 % em mol ou cerca de 2 % em mol do lipídeo total presente na partícula.
[00457] Em algumas modalidades, a partícula de ácido nucleico- lipídeo inclui ainda colesterol, por exemplo, cerca de 10 % em mol a cerca de 60 % em mol ou cerca de 48 % em mol do lipídeo total presente na partícula.
[00458] Em uma modalidade, o lipídeo ND984HCI (PM 1487) (ver Pedido de Patente Norte-americana N ° 12/056,230, depositado 3/26/2008, que está aqui incorporado por referência), Colesterol (Sig- ma-Aldrich) e PEG-Ceramida C16 (Avanti Polar Lipids) pode ser usado para preparar nanopartículas de lipídeo-dsRNA (ou seja, partículas LNP01). As soluções mãe de cada um em etanol podem ser preparadas da seguinte forma: ND98, 133 mg/ml; Colesterol, 25 mg/ml, PEG- Ceramida C16, 100 mg/ml. As soluções mãe ND98, colesterol e PEG- Ceramida C16 podem então ser combinadas em uma relação molar, por exemplo, 42:48:10. A solução de lipídeo combinada pode ser misturada com dsRNA aquoso (por exemplo, em acetato de sódio pH 5) de tal modo que a concentração final de etanol seja de cerca de 35-45 % e a concentração final de acetato de sódio seja de cerca de 100-300 mM. As nanopartículas de Lipídeo-dsRNA normalmente se formam espontaneamente após a mistura. Dependendo da distribuição de ta-manho de partícula desejado, a mistura de nanopartículas resultante pode ser extrusada através de uma membrana de policarbonato (por exemplo, corte de 100 nm) usando, por exemplo, um extrusor de barril térmico, tal como Lipex Extruder (Northern Lipids, Inc). Em alguns casos, a etapa de extrusão pode ser omitida. A remoção de etanol e a permuta de tampão simultânea podem ser realizadas, por exemplo, por diálise ou filtração de fluxo tangencial. O tampão pode ser permutado com, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato (PBS) a cerca de pH 7, por exemplo, cerca de pH 6,9, cerca de pH 7,0, cerca de pH 7,1, cerca de pH 7,2, cerca de pH 7,3 ou cerca de pH 7,4.
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Fórmula 1
[00459] As formulações de LNP01 são descritas, por exemplo, na Publicação de Pedido Internacional No. WO 2008/042973, que está aqui incorporada por referência.
[00460] As formulações de lipídeo-dsRNA exemplares adicionais são descritas na Tabela 1. Tabela A
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[00461] DSPC: distearoilfosfatidilcolina
[00462] DPPC: dipalmitoilfosfatidilcolina
[00463] PEG-DMG: PEG-didimiristoil glicerol (C14-PEG ou PEG- C14) (PEG com peso molecular médio de 2000)
[00464] PEG-DSG:PEG-distiril glicerol (C18-PEG ou PEG-C18) (PEG com peso molecular médio de 2000)
[00465] PEG-cDMA:PEG-carbamoil-1,2-dimicristiloxipropilamina (PEG com peso molecular médio de 2000)
[00466] SNALP (1,2-Dilinolenilóxi-N,N-dimetilaminopropano (DLin- DMA)) compreendendo formulações são descritos na Publicação Internacional No. WO2009/127060, depositada em 15 de abril de 2009, que está aqui incorporada por referência.
[00467] Formulações compreendendo XTC são descritas na Publicação PCT No. WO 2010/088537, cuja íntegra é pelo presente incorporada aqui por referência.
[00468] Formulações compreendendo MC3 são descritas, por exemplo, na Publicação Norte-americana No. 2010/0324120, depositada em 10 de junho de 2010, cuja íntegra é pelo presente incorporada por referência.
[00469] Formulações compreendendo ALNY-100 são descritas na Publicação PCT No. WO 2010/054406, cuja íntegra é pelo presente incorporada aqui por referência.
[00470] Formulações compreendendo C12-200 são descritas na Publicação PCT No. WO 2010/129709, cuja íntegra é pelo presente incorporada aqui por referência.
[00471] Composições e formulações para administração oral incluem pós ou grânulos, microparticulados, nanoparticulados, suspensões ou soluções em água ou meios não aquosos, cápsulas, cápsulas de gel, sachês, comprimidos ou minicomprimidos. Espessantes, agentes aromatizantes, diluentes, emulsificante, auxiliares de dispersão ou aglutinantes podem ser desejáveis. Em algumas modalidadses, formu-lações orais são aquelas em que dsRNAs apresentados na invenção são administrados em conjunto com um ou mais tensoativos realçado- res de penetração e quelantes. Tensoativos adequados incluem ácidos graxos e/ou ésteres ou sais dos mesmos, ácidos biliares e/ou sais dos mesmos. Sais/ácidos biliares adequados incluem ácido quenodesoxi- cólico (CDCA) e ácido ursodesoxiquenodesoxicólico (UDCA), ácido cólico, ácido desidrocólico, ácido desoxicólico, ácido glucólico, ácido glicólico, ácido glicodesoxicólico, ácido taurocólico, ácido taurodesoxi- cólico, tauro-24,25-di-hidro-fusidato sódico e glicodi-hidrofusidato sódi- co. Ácidos graxos adequados incluem ácido araquidônico, ácido unde- canoico, ácido oleico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido lino- lênico, dicaprato, tricaprato, mono-oleína, dilaurina, gliceril 1- monocaprato, 1-dodecilazaciclo-heptan-2-ona, uma acilcarnitina, uma acilcolina, ou um monoglicerídeo, um diglicerídeo ou um sal farmaceu- ticamente aceitável dos mesmos (por exemplo, sódio). Em algumas modalidades, combinações de realçadores de penetração são usados, por exemplo, sais/ácidos graxos em combinação com sais/ácidos bilia-res. Uma combinação exemplar é o sal de sódio de ácido láurico, ácido cáprico e UDCA. Outros realçadores de penetração incluem poli- oxietileno-9-lauril éter, polioxietileno-20-cetil éter. DsRNAs representados na invenção podem ser oralmente liberados, em forma granular, incluindo partículas secas vaporizadas, ou complexadas para formar micro ou nanopartículas. Agentes de complexação de DsRNA incluem poli-aminoácidos; poli-iminas; poliacrilatos; polialquilacrilatos, polio- xetanos, polialquilcianoacrilatos; gelatinas cationizadas, albuminas, amidos, acrilatos, polietilenoglicóis (PEG) e amidos; polialquilcianoacri- latos; poli-iminas derivatizadas por DEAE, pollulans, celuloses e amidos. Agentes de complexação adequados incluem quitosana, N- trimetilquitosana, poli-L-lisina, poli-histidina, poliornitina, poliespermi- nas, protamina, polivinilpiridina, politiodietilaminometiletileno P(TDAE), poliaminoestireno (por exemplo, p-amino), poli(metilcianoacrilato), po- li(etilcianoacrilato), poli(butilcianoacrilato), poli(isobutilcianoacrilato), poli(iso-hexilcianoacrilato), DEAE-metacrilato, DEAE-hexilacrilato, DEAE-acrilamida, DEAE-albumina e DEAE-dextrano, polimetilacrilato, polihexilacrilato, ácido poli(D,L-lático), ácido poli(DL-lático-coglicólico (PLGA), alginato, e polietilenoglicol (PEG). Formulações orais para dsRNAs e sua preparação são descritas em detalhes na Patente Norte-americana 6.887.906, Publicação Norte-americana No. 20030027780, e Patente Norte-americana No. 6.747.014, cada uma das quais é incorporada aqui por referência.
[00472] Composições e formulações para administração parenteral, intraparenquimatosa (no cérebro), intratecal, intraventricular ou intra- hepática podem incluir soluções aquosas estéreis que podem também conter tampões, diluentes e outros aditivos adequados, tais como, porém não limitados a, realçadores de penetração, compostos veículo e outros veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[00473] Composições farmacêuticas da presente invenção incluem, porém não estão limitadas a, soluções, emulsões, e formulações con-tendo lipossoma. Estas composições podem ser geradas de uma vari-edade de componentes que incluem, porém não estão limitados a, lí-quidos pré-formados, sólidos autoemulsificantes e semissólidos au- toemulsificantes. São particularmente preferidas as formulações que alvejam o fígado quando tratando transtornos hepáticos, tal como car cinoma hepático.
[00474] As formulações farmacêuticas da presente invenção, que podem convenientemente ser apresentadas em forma de dosagem unitária, podem ser preparadas de acordo com técnicas convencionais bem conhecidas na indústria farmacêutica. Tais técnicas incluem a etapa de trazer em associação os ingredientes ativos com o(s) veícu- lo(s) ou excipiente(s) farmacêuticos. Em geral, as formulações são preparadas uniformemente e intimamente trazendo em associação o(s) ingrediente(s) ativos com veículo(s) líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos, e em seguida, se necessário, modelando o produto.
[00475] As composições da presente invenção podsem ser formuladas em qualquer de muitas formas de dosagem possíveis, tais como, porém não limitadas a, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, xaropes líquidos, géis macios, supositórios, e enemas. As composições da presente invenção podem também ser formuladas como suspensões em meios aquosos, não aquosos ou mistos. Suspensões aquosas podem também conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão incluindo, por exemplo, carboximetilcelulose sódica, sorbitol e/ou dextrana. A suspensão pode também conter estabilizantes.
C. Formulações Adicionais Emulsões
[00476] As composições da presente invenção podem ser preparadas e formuladas como emulsões. Emulsões são sistemas tipicamente heterogêneos de um líquido disperso em outro na forma de gotículas geralmente excedendo a 0,1 μm em diâmetro (veja, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a. ed.), Nova Iorque, NY; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., Volume 1, p. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi et al., em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301). Emulsões são frequentemente sistemas bifásicos compreendendo duas fases líquidas imiscíveis intimamente misturadas e dispersas entre si. Em geral, emulsões podem ser da variedade de ou água-em- óleo (w/o) ou óleo-em-água (o/w). Quando uma fase aquosa é finamente dividida em e dispersa como pequenas gotículas em uma fase de volume oleosa, a composição resultante é chamada uma emulsão de água-em-óleo (w/o). Alternativamente, quando uma fase oleosa é finamente dividida em e dispersa como pequenas gotículas em uma fase de volume aquosa, a composição resultante é chamada uma emulsão de óleo-em-água (o/w). Emulsões podem conter componentes adicionais além das fases dispersas, e o fármaco ativo que pode estar presente como uma solução na fase aquosa, fase oleosa ou em si como uma fase separada. Excipientes farmacêuticos, tais como emulsificantes, estabilizantes, corantes, e antioxidantes podem também estar presente em emulsões quando necessário. Emulsões farmacêuticas podem também ser emulsões múltiplas que estão compreendidas de mais de duas fases, tais como, por exemplo, no caso de emulsões de óleo-em-água-em-óleo (o/w/o) e água-em-óleo-em-água (w/o/w). Tais formulações de complexo frequentemente fornecem certas vantagens que emulsões binárias simples não fornecem. Emulsões múltiplas em que gotículas de óleo individuais de uma emulsão o/w incluem pequenas gotículas de água constituem uma emulsão w/o/w. Da mesma forma um sistema de gotículas de óleo fechadas em glóbulos de água estabilizado em uma fase contínua oleosa fornece uma emulsão de o/w/o.
[00477] Emulsões são caracterizadas por pouca ou nenhuma estabilidade termodinâmica. Frequentemente, a fase dispersa ou descontínua da emulsão é bem dispersa na fase externa ou contínua e mantida nesta forma por meio dos recursos emulsificantes ou da viscosidade da formulação. Qualquer das fases da emulsão pode ser um semissó- lido ou um sólido, como é o caso de cremes e bases de unguento do estilo de emulsão. Outros métodos de emulsões de estabilização vinculam o uso de emulsificantes que podem ser incorporados em qualquer fase da emulsão. Emulsificantes podem amplamente ser classificados em quatro categorias: tensoativos sintéticos, emulsificantes de ocorrência natural, bases de absorção, e sólidos finamente dispersos (veja, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a. ed.), Nova Iorque, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., volume 1, p. 199).
[00478] Tensoativos sintéticos, também conhecidos como agentes tensoativos, encontraram ampla aplicabilidade na formulação de emul-sões e foram revisados na literatura (veja, por exemplo, Ansel's Phar-maceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Po-povich NG., e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a. ed.), Nova Iorque, NY; Rieger, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., 1988, volume 1, p. 199). Tensoativos são tipicamente amfifílicos e compreendem uma porção hidrofílica e uma hidrofóbica. A relação da natureza hidrofílica para a hidrofóbica do tensoativo foi denominada o equilíbrio hidrófilo/lipófilo (HLB) e é uma ferramenta valiosa na cate- gorização e seleção de tensoativos na preparação de formulações. Os tensoativos podem ser classificados em diferentes classes com base na natureza do grupo hidrofílico: não iônico, aniônico, catiônico e anfo- térico (veja, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a. ed.), Nova Iorque, NY Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., volume 1, p. 285).
[00479] Emulsificantes de ocorrência natural usados em formulações de emulsão incluem lanolina, cera de abelha, fosfatídeos, lecitina e acácia. Bases de absorção possuem propriedades hidrofílicas tais que elas possam absorver água para formar emulsões de w/o ainda mantêm suas consistências semissólidas, tais como lanolina anidrosa e petrolato hidrofílico. Sólidos finamente divididos também foram usados como bons emulsificantes especialmente em combinação com tensoativos e em preparações viscosas. Estas incluem sólidos inorgânicos polares, tais como hidróxidos de metal pesado, argilas sem dilatação, tais como bentonita, atapulgita, hectorita, caulim, montmoriloni- ta, silicato de alumínio coloidal e silicato de alumínio de magnésio co- loidal, pigmentos e sólidos não polares, tais como triestearato de glice- rila ou carbono.
[00480] Uma grande variedade de materiais não emulsificantes é também incluída em formulações de emulsão e contribui para as propriedades de emulsões. Estas incluem gorduras, óleos, ceras, ácidos graxos, alcoóis graxos, ésteres graxos, umectantes, coloides hidrofíli- cos, conservantes e antioxidantes (Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., volume 1, p. 335; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., volume 1, p. 199).
[00481] Hidrocoloides ou coloides hidrofílicos incluem gomas de ocorrência natural e polímeros sintéticos tais como polissacarídeos (por exemplo, acácia, ágar, ácido algínico, carragenina, goma guár, goma caraia, e tragacanto), derivados de celulose (por exemplo, car- boximetilcelulose e carboxipropilcelulose), e polímeros sintéticos (por exemplo, carbômeros, éteres de celulose, e polímeros de carboxivini- la). Estes dispersam-se ou dilatam-se em água para formar soluções coloidais que estabilizam emulsões formando películas interfaciais fortes em torno das gotículas de fase dispersa e aumentando a viscosidade da fase externa.
[00482] Visto que emulsões frequentemente contêm um número de ingredientes, tais como carboidratos, proteínas, esteróis e fosfatídeos que podem facilmente suportar o crescimento de micróbios, estas for-mulações frequentemente incorporam conservantes. Os conservantes comumente usados incluídos em formulações de emulsão incluem me- til parabeno, propil parabeno, sais de amônio quaternário, cloreto de benzalcônio, ésteres de ácido p-hidroxibenzoico, e ácido bórico. Antio- xidantes são também comumente adicionados a formulações de emulsão para prevenir a deterioração da formulação. Antioxidantes usados podem ser sequestrantes de radical livre, tais como tocoferóis, alquil galatos, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ou agentes de redução, tais como ácido ascórbico e metabissulfito de sódio, e siner- gistas antioxidantes tais como ácido cítrico, ácido tartárico, e lecitina.
[00483] A aplicação de formulações de emulsão por meio de rotinas dermatológica, oral e parenteral e métodos para sua fabricação foram revisados na literatura (veja, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Do-sage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a. ed.), Nova Iorque, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., volume 1, p. 199). Formulações de emulsão para liberação oral foram muito am-plamente usadas, por causa da facilidade de formulação, bem como eficácia de um ponto de vista de absorção e biodisponibilidade (veja, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., e Ansel HC., 2004, Lippincott Willi-ams & Wilkins (8a. ed.), Nova Iorque, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., volume 1, p. 245; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., volume 1, p. 199). Laxativos com base em óleo mineral, vitaminas solúveis em óleo e preparações nutritivas com alto teor de gordura estão entre os materiais que foram comumente administrados oralmente como emulsões de o/w.
ii. Microemulsões
[00484] Em uma modalidade da presente invenção, as composições de iRNAs e ácidos nucleicos são formulasdas como microemulsões. Uma microemulsão pode ser definida como um sistema de água, óleo e anfifilo que é uma única solução líquida oticamente isotrópica e ter- modinamicamente estável (veja, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms e Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a. ed.), Nova Iorque, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., volume 1, p. 245). Tipicamente microemulsões são sistemas que são preparados primeiro dispersando um óleo em uma solução tensoativa aquosa e em seguida adicionando uma quantidade suficiente de um quarto componente, geralmente um álcool de comprimento de cadeia inter-mediário para formar um sistema transparente. Portanto, microemul- sões foram também descritas como dispersões isotropicamente claras, termodinamicamente estáveis de dois líquidos imiscíveis que são es- tabilizados por películas interfaciais de moléculas tensoativas (Leung e Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polimers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, Nova Iorque, páginas 185-215). Microemulsões comumente são preparadas por meio de uma combinação de três a cinco componentes que incluem óleo, água, tensoativo, cotensoativo e eletrólito. Se a microemulsão for do tipo água-em-óleo (w/o) ou um de óleo-em-água (o/w) é dependente das propriedades do óleo e tensoativo usados e na estrutura e da estrutura e empacotamento geométrico das cabeças polares e caudas de hidro- carboneto das moléculas tensoativas (Schott, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271).
[00485] O método fenomenológico utilizando diagramas de fase foi extensivamente estudado e produziu um conhecimento abrangente, para alguém versado na técnica, de como formular microemulsões (veja, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., e Ansel HC., 2004, Lippincott Willi-ams & Wilkins (8a. ed.), Nova Iorque, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., volume 1, p. 245; Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., volume 1, p. 335). Comparado a emulsões convencionais, microemulsões oferecem a vantagem de solubilizar fár- macos insolúveis em água em uma formulação de gotículas termodina- micamente estáveis que são formadas espontaneamente.
[00486] Tensoativos usados na preparação de microemulsões incluem, porém não estão limitados a, tensoativos iônicos, tensoativos não iônicos, Brij 96, polioxietileno oleil éteres, ésteres de ácido graxo de poliglicerol, monolaurato de tetraglicerol (ML310), mono-oleato te- traglicerol (MO310), mono-oleato hexaglicerol (PO310), pentaoleato de hexaglicerol (PO500), monocaprato de decaglicerol (MCA750), mono- oleato de decaglicerol (MO750), sequioleato de decaglicerol (SO750), decaoleato de decaglicerol (DAO750), sozinhos ou em combinação com cotensoativos. O cotensoativo, geralmente um álcool de cadeia curta, tal como etanol, 1-propanol, e 1-butanol, serve para aumentar a fluidez interfacial penetrando na película tensoativa e consequentemente criando uma película desordenada por causa do espaço vazio gerado entre moléculas tensoativas. Microemulsões podem, entretanto, ser preparadas sem o uso de cotensoativos e sistemas de microe- mulsão autoemulsificantes sem álcool são conhecidos na técnica. A fase aquosa pode tipicamente ser, porém não é limitada a, água, uma solução aquosa do fármaco, glicerol, PEG300, PEG400, poliglicerois, propileno glicóis, e derivados de etileno glicol. A fase oleosa pode incluir, porém não está limitada a, materiais tais como Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, ésteres de ácido graxo, mono, di, e triglicerí- deos de cadeia média (C8-C12), ésteres de ácido graxo de glicerila polioxietilado, alcoóis graxos, glicerídeos poliglicolizados, C8-C10 gli- cerídeos poliglicolizados saturados, óleos vegetais e óleo de silicone.
[00487] Microemulsões são particularmente de interesse do ponto de vista de solubilização de fármaco e a absorção realçada de fárma- cos. Microemulsões com base em lipídeo (ambas o/w e w/o) foram propostas para realçar a biodisponibilidade oral de fármacos, incluindo peptídeos (veja, por exemplo, Patentes Norte-americanas Nos. 6.191.105, 7.063.860, 7.070.802, 7.157.099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Microemulsões proporcionam vantagens de solubilização de fármaco melhorada, proteção de fárma- co de hidrólise enzimática, possível realce de absorção de fármaco devido a alterações induzidas por tensoativo em fluidez e permeabilidade da membrana devido a alterações induzidas por tensoativo em fluidez e permeabilidade da membrana, facilidade de preparação, faci- lidade de administração oral em formas de dosagem sólida, potência clínica melhorada, e toxicidade diminuída (veja, por exemplo, Patente Norte-americana Nos. 6.191.105, 7.063.860, 7.070.802, 7.157.099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). Frequentemente as microemul- sões podem formar-se espontaneamente quando seus componentes são trazidos junto em temperatura ambiente. Isto pode ser particularmente vantajoso quando formulando fármacos termolábeis, peptídeos ou iRNAs. Microemulsões foram eficazes na liberação transdérmica de componentes ativos em aplicações tanto cosméticas quanto farmacêu-ticas. Espera-se que as composições e formulações de microemulsão da presente invenção facilitem a absorção sistêmica aumentada de iRNAs e ácidos nucleicos do trato gastrointestinal, bem como melhorem a captação celular local de iRNAs e ácidos nucleicos.
[00488] Microemulsões da presente invenção podem também conter componentes e aditivos asdicionais, tais como, monoestearato de sorbitano (Grill 3), Labrasol, e realçadores de penetração para melhorar as propriedades da formulação e realçar a absorção dos iRNAs e ácidos nucleicos da presente invenção. Realçadores de penetração usados nas microemulsões da presente invenção podem ser classificados como pertencentes a uma das cinco amplas categorias -- ten- soativos, ácidos graxos, sais biliares, agentes quelantes, e tensoativos não quelantes (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Cada destas classes foram descritas acima.
iii. Micropartículas
[00489] Um agente de iRNA da invenção pode ser incorporado em uma partícula, por exemplo, uma micropartícula. Micropartículas podem ser produzidas por secagem por liofilização, porém podem também ser produzidos por outros métodos incluindo liofilização, evaporação, secagem de leito fluído, secagem a vácuo, ou uma combinação destas técnicas.
iv. Realçadores de Penetração
[00490] Em uma modalidade, a presente invenção emprega vários realçadores de penetração para efetuar a liberação eficiente de ácidos nucleicos, particularmente iRNAs, à pele de animais. A maior parte dos fármacos está presente em solução em formas tanto ionizadas quanto não ionizadas. Contudo, usualmente somente lipídios solúveis ou fár- macos lipofílicos cruzam prontamente membranas celulares. Foi des-coberto que ainda fármacos não lipofílicos podem cruzar membranas celulares se a membrana a ser cruzada for tratada com um realçador de penetração. Além de auxiliar a difusão de fármacos não lipofílicos atravessar membranas celulares, realçadores de penetração também realçam a permeabilidade de fármacos lipofílicos.
[00491] Realçadores de penetração podem ser classificados como pertencendo a uma de cinco amplas categorias, isto é, tensoativos, ácidos graxos, sais biliares, agentes quelantes, e não tensoativos não quelantes (veja, por exemplo, Malmsten, M. Surfactants and polimers in drug delivery, Informa Health Care, Nova Iorque, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p,92). Cada das acima classes mencionadas de realçadores de penetração são descritas abaixo em maiores detalhes.
[00492] Tensoativos (ou"agentes de superfície ativa") são entidades químicas que, quando dissolvidas em uma solução aquosa, reduzem a tensão da superfície da solução ou a tensão interfacial entre a solução aquosa e outro líquido, com o resultado que a absorção de iRNAs através da mucosa é realçada. Além dos sais biliares e ácidos graxos, estes realçadores de penetração incluem, por exemplo, sulfato de lau- rila de sódio, polioxietileno-9-lauril éter e polioxietileno-20-cetil éter (veja, por exemplo, Malmsten, M. Surfactants and polimers in drug delivery, Informa Health Care, Nova Iorque, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p,92); e emulsões perfluoroquímicas, tal como FC-43. (Takahashi et al., J. Pharm. Phar-macol., 1988, 40, 252).
[00493] Vários ácidos graxos e seus derivados que agem como re- alçadores de penetração incluem, por exemplo, ácido oleico, ácido láu- rico, ácido cáprico (ácido n-decanoico), ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolênico, dicaprato, tricaprato, monooleína (1-monooleoil-rac-glicerol), dilaurina, ácido caprílico, ácido araquidônico, glicerol 1-monocaprato, 1-dodecilazaciclo-heptan-2-ona, acilcarnitinas, acilcolinas, C1-20 alquil ésteres dos mesmos (por exemplo, metila, isopropila e t-butila), e mono e di-glicerídeos dos mesmos (isto é, oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc.) (veja, por exemplo, Touitou, E., et al. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Re-views in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).
[00494] A função fisiológica da bile inclui a facilitação de dispersão e absorção de lipídios e vitaminas solúveis em gordura (veja, por exemplo, Malmsten, M. Surfactants and polimers in drug delivery, Informa Health Care, Nova Iorque, NY, 2002; Brunton, Capítulo 38 em: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9a. ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, Nova Iorque, 1996, pp. 934-935). Vários sais biliares naturais, e seus derivados sintéticos, agem como realçadores de penetração. Desse modo, o termo"sais biliares" inclui quaisquer dos componentes de ocorrência natural de bile, bem como, quaisquer de seus derivados sintéticos. Adequados sais biliares incluem, por exemplo, ácido cólico (ou seu sal de sódio farmaceuticamente aceitável, colato de sódio), ácido desidrocólico (de-hidrocolato de sódio), ácido desoxicólico (desoxicolato de sódio), ácido glucólico (gluco- lato de sódio), ácido glicólico (glicocolato sódio), ácido glicodesoxicóli- co (glicodesoxicolato de sódio), ácido taurocólico (taurocolato de sódio), ácido taurodesoxicólico (taurodesoxicolato de sódio), ácido che- nodesoxicólico (chenodesoxicolato de sódio), ácido ursodesoxicólico (UDCA), tauro-24,25-di-hidro-fusidato de sódio (STDHF), glicodi- hidrofusidato de sódio e polioxietileno-9-lauril éter (POE) (veja, por exemplo, Malmsten, M. Surfactants and polimers in drug delivery, In-forma Health Care, Nova Iorque, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Swinyard, capítulo 39 em: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a. ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, páginas 782-783; Mura- nishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 133; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).
[00495] Agentes quelantes, como usado em conexão com a presente invenção, podem ser definidos como compostos que removem íons metálicos da solução formando complexos com isso, com o resultado que absorção de iRNAs através da mucosa é realçada. Com relação ao seu uso como realçadores de penetração na presente invenção, agentes quelantes têm a vantagem adicionada de também servir como inibidores de DNase, como mais caracterizados DNA nucleases requerem um íon de metal divalente para catálise e são desse modo inibidos por agentes quelantes (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Adequados agentes quelantes incluem, porém não são limitados a, etilenodiaminatetra-acetato de dissódio (EDTA), ácido cítrico, salicila- tos (por exemplo, salicilato de sódio, 5-metoxisalicilato e homovanila- to), derivados de N-acila de colágeno, lauret-9 e derivados de N-amino acila de beta-dicetonas (enaminas)(veja, por exemplo, Katdare, A. et al., Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).
[00496] Como usado aqui, compostos de realce de não penetração de tensoativo não quelante podem ser definidos como compostos que demonstram insignificante atividade como agentes quelantes ou como tensoativos, porém que não obstante, realçam absorção de iRNAs através da mucosa alimentar (veja, por exemplo, Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Esta classe de realçadores de penetração inclui, por exemplo, ureias cíclicas não saturadas, 1-alquil- e derivados de 1-alquenilazaciclo- alcanona (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92); e agentes anti-inflamatórios não esteroidais, tais como, diclofenaco de sódio, indometacina e fenilbutazona (Ya- mashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).
[00497] Agentes que realçam absorção de iRNAs no nível celular podem também ser adicionados às composições farmacêuticas e outras da presente invenção. Por exemplo, lipídios catiônicos, tais como, lipofectina (Junichi et al, U.S. Pat. No. 5.705.188), derivados de glicerol catiônico, e moléculas policatiônicas, tal como, polilisina (Lollo et al., Pedido PCT WO 97/30731), são também conhecidos por realçar a absorção celular de dsRNAs. Exemplos de reagentes de transfecção comercialmente disponíveis incluem, por exemplo, Lipofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine 2000™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), 293fectin™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Cellfectin™ (Invitro- gen; Carlsbad, CA), DMRIE-C™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), FreeStyle™ MAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine™ 2000 CD (Invi- trogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), iR- NAMAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), Oligofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Optifect™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), reagente de trans- fecção X-tremeGENE Q2 (Roche; Grenzacherstrasse, Suíça), reagente de transfecção lipossômica DOTAP (Grenzacherstrasse, Suíça), reagente de transfecção lipossômica DOSPER (Grenzacherstrasse, Suíça), ou Fugene (Grenzacherstrasse, Suíça), Reagente Transfec- tam® (Promega; Madison, WI), Reagente de transfecção TransFast™ (Promega; Madison, WI), Reagente Tfx™-20 (Promega; Madison, WI), Reagente Tfx™-50 (Promega; Madison, WI), DreamFect™ (OZ Biosci-ences; Marseille, França), EcoTransfect (OZ Biosciences; Marseille, França), Reagente de transfecção TransPassa D1 (New England Biolabs; Ipswich, MA, USA), LyoVec™/LipoGen™ (Invitrogen; São Diego, CA, USA), Reagente de transfecção de PerFectina (Genlantis; São Diego, CA, USA), Reagente de transfecção NeuroPORTER (Genlantis; São Diego, CA, USA), Reagente de transfecção GenePORTER (Gen- lantis; São Diego, CA, USA), Reagente de transfecção GenePORTER 2 (Genlantis; São Diego, CA, USA), Reagente de transfecção de cito- fectina (Genlantis; São Diego, CA, USA), Reagente de transfecção BaculoPORTER (Genlantis; São Diego, CA, USA), reagente de trans- fecção TroganPORTER™ (Genlantis; São Diego, CA, USA ), RiboFect (Bioline; Taunton, MA, USA), PlasFect (Bioline; Taunton, MA, USA), UniFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, USA), Sure- FECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, USA), ou Hi- Fect™ (B-Bridge International, Mountain View, CA, USA), entre outros.
[00498] Outros agentes podem ser utilizados para realçar a penetração dos ácidos nucleicos administrads, incluindo glicóis, tais como, etileno glicol e propileno glicol, pirróis, tais como, 2-pirrol, azones, e terpenos, tais como, limoneno e mentona.
v. Veículos
[00499] Certas composições da presente invenção também incorporam compostos de veículo na formulação. Como usado aqui, "composto de veículo" ou "veículo" pode referir-se a um ácido nucleico, ou aná- logo do mesmo, que é inerte (isto é, não possui atividade biológica por si) porém, é reconhecido como um ácido nucleico por processos in vi-vo que reduzem a biodisponibilidade de um ácido nucleico tendo ativi-dade biológica, por exemplo, degradando ácido nucleico biologicamente ativo ou promovendo sua remoção de circulação. A coadministração de um ácido nucleico e um composto de veículo, tipicamente com um excesso da última substância, pode resultar em uma redução substancial da quantidade de ácido nucleico recuperada no fígado, rim ou outros reservatórios extracirculatórios, presumivelmente devido à competição entre o composto de veículo e o ácido nucleico para um receptor comum. Por exemplo, a recuperação de um dsRNA de fosforotioato parcialmente em tecido hepático pode ser reduzida quando ele é co- administrado com ácido poliinossínico, sulfato de dextrano, ácido poli- citídico ou ácido 4-acetamido-4'isotiociano-estilbeno-2,2'-dissulfônico (Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183.
vi. Excipientes
[00500] Em contraste a um composto de veículo, um "veículo far-macêutico" ou "excipiente" é um solvente farmaceuticamente aceitável, agente de suspensão ou qualquer outro veículo farmacologicamente inerte para liberar um ou mais ácidos nucleicos a um animal. O exci- piente pode ser líquido ou sólido e é selecionado, com a maneira pla-nejada de administração em mente, a fim de fornecer o volume desejado, consistência, etc., quando combinado com um ácido nucleico e os outros componentes de uma dada composição farmacêutica. Veículos farmacêuticos típicos incluem, porém não são limitados a, agentes de ligação (por exemplo, amido de milho pré-gelatinizado, polivinilpirro- lidona ou hidroxipropil metilcelulose, etc.); cargas (por exemplo, lactose e outros açúcares, celulose microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de cálcio, etil celulose, poliacrilatos ou fosfato de hidrogênio de cálcio, etc.); lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco, sílica, dióxido de silício coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, óleos vegetais hidrogenados, amido de milho, polietileno glicóis, benzoato de sódio, acetato de sódio, etc.); desintegrantes (por exemplo, amido, gli- colato de amido de sódio, etc.); e agentes umectantes (por exemplo, sulfato de laurila de sódio, etc).
[00501] Excipientes orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis adequados para administração não parenteral que não per-niciosamente reagem com com ácidos nucleicos podem também ser usados para formular as composições da presente invenção. Adequados veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, porém não são limitados a, água, soluções de sal, álcoois, polietileno glicóis, gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulose, polivinilpirrolidona e similares.
[00502] Formulações para administração tópica de ácidos nucleicos podem incluir soluções aquosas estéreis e não estéreis, soluções não aquosas em solventes comuns, tais como, álcoois, ou soluções dos ácidos nucleicos em bases de óleo líquidas ou sólidas. As soluções podem também conter tampões, diluentes e outros adequados aditivos. Excipientes orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis adequados para administração não parenteral que não perniciosamente reagem com ácidos nucleicos podem ser usados.
[00503] Adequados excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem, porém não são limitados a, água, soluções de sal, álcool, polietile- no glicóis, gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulose, polivinilpirrolidona e similares.
vii. Outros Componentes
[00504] As composições da presente invenção podem adicionalmente conter outros componentes auxiliares convencionalmente en- contrados em composições farmacêuticas, em seus níveis de uso es-tabelecidos na técnica. Desse modo, por exemplo, as composições podem conter materiais farmaceuticamente ativos, compatíveis, adici-onais, tais como, por exemplo, antipruríticos, adstrigentes, anestésicos locais ou agentes anti-inflamatórios, ou podem conter materiais adicio-nais úteis em fisicamente formulando várias formas de dosagem das composições da presente invenção, tais como, corantes, agentes aro- matizantes, preservativos, antioxidantes, opacificantes, agentes es- pessantes e estabilizantes. Entretanto, tais materiais, quando adicio-nados, não devem interferir indevidamente com as atividades biológicas dos componentes das composições da presente invenção. As for-mulações podem ser esterilizadas e, se desejado, misturadas com agentes auxiliares, por exemplo, lubrificantes, conservantes, estabili- zantes, agentes umectantes, emulsificantes, sais para influenciar a pressão osmótica, tampões, colorantes, aromatizantes e/ou substâncias aromáticas e similares que não interagem deleteriamente com ácido(s) nucleico(s) da formulação.
[00505] Suspensões aquosas podem conter substâncias que aumenta a viscosidade da suspensão incluindo, por exemplo, carboxime- tilcelulose sódica, sorbitol e/ou dextrana. A suspensão pode também conter estabilizantes.
[00506] Em algumas modalidades, composições farmacêuticas re-presentadas na invenção incluem (a) um ou mais compostos de iRNA e (b) um ou mais agentes que funcionam por um mecanismo não iRNA e que são úteis no tratamento de um transtorno hemolítico. Exemplos de tais agentes incluem, porém não estão limitados a um agente anti- inflamatório, agente antiesteatose, agente antiviral, e/ou antifibrose.
[00507] Além disso, outras substâncias comumente usadas para proteger o fígado, tal como silimarina, podem também ser usadas em conjunto com os iRNAs descritos aqui. Outros agentes úteis para tratar doenças do fígado incluem telbivudina, entecavir, e inibidores de pro-tease, tais como telaprevir e outros descritos, por exemplo, em Tung et al., Publicações de Pedido Norte-americano Nos. 2005/0148548, 2004/0167116, e 2003/0144217; e em Hale et al., Publicação de Pedido Norte-americano No. 2004/0127488.
[00508] Toxicidade e eficácia terapêutica de tais compostos podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrões em culturas celulares ou animais experimentais, por exemplo, para determinar a LD50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose terapeu- ticamente eficaz em 50% da população). A relação de dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e ele pode ser expresso como a relação LD50/ED50. Os compostos que exibem altos índices terapêuticos são preferidos.
[00509] Os dados obtidos de ensaios de cultura celular e estudos animais podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagem para uso em humanos. A dosagem de composições representada aqui na invenção situa-se geralmente na faixa de concentrações circulantes que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta faixa, dependendo da forma de dosagem empregada e da rotina de administração utilizada. Para qualquer composto usado nos métodos representados na invenção, a dose terapeuti- camente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura celular. A dose pode ser formulada em modelos animais para obter uma faixa de concentração de plasma circulante do composto ou, quando apropriado, do produto de polipeptídeo de uma sequência alvo (por exemplo, obtendo uma concentração reduzida do polipeptí- deo) que inclui a IC50 (isto é, a concentração do composto teste que obtém uma metade da inibição máxima de sintomas) como determinado em cultura celular. Tal informação pode ser usada para mais precisamente determinasr doses úteis em humanos. Os níveis em plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alta eficiência.
[00510] Além de sua administração, como descrito acima, os iRNAs representados na invenção podem ser administrados em combinação com outros agentes conhecidos eficazes no tratamento de processos patológicos mediados por expressão de TTR. Em qualquer evento, o médico que está realizando a administração pode ajustar a quantidade e tempo de duração da administração de iRNA com base nos resultados observados usando medidas padrões de eficácia conhecidas na técnica ou descritas aqui.
VII. Métodos para Inibir a Expressão de TTR
[00511] A presente invenção também fornece métodos de inibição da expressão de um transtiretina (TTR) em uma célula. Os métodos incluem contatar uma célula com um agente de RNAi, por exemplo, agente de RNAi de fita dupla, em uma quantidade eficaz para inibir a expressão de TTR na célula, desse modo inibindo a expressão de TTR na célula.
[00512] O contato de uma célula com um agente de RNAi, por exemplo, um agente de RNAi de fita dupla, pode ser feito in vitro ou in vivo. O contato de uma célula in vivo com o agente de RNAi inclui contatar uma célula ou grupo de células em um indivíduo, por exemplo, um indivíduo humano, com o agente de RNAi. Combinações de métodos in vitro e in vivo de contatar um célula ou grupo de células são também possíveis. O contato de uma célula ou um grupo de células pode ser direto ou indireto, como descrito acima. Além disso, o contato de uma célula ou grupo de células pode ser realizado por meio de um ligante de alvejamento, incluindo qualquer ligante descrito aqui ou co-nhecido na técnica. Em modalidades preferidas, o ligante de alveja- mento é uma porção de carboidrato, por exemplo, um ligante de Gal- NAc3, ou qualquer outro ligante que direciona o agente de RNAi para um sítio de interesse, por exemplo, o fígado de um indivíduo.
[00513] O termo "inibir," como usado aqui, é usado alternadamente com "reduzir," "silenciar," "infra-regular", "suprimir", e outros termos similares, e inclui qualquer nível de inibição. Preferivelmente inibir inclui uma inibição estatisticamente significante ou clinicamente significante.
[00514] A frase "inibir a expressão de uma TTR" é destinada a referir-se à inibição de expressão de qualquer tipo de TTR (tal como, por exemplo, um gene de TTR de camundongo, um gene de TTR de rato, um gene de TTR de macaco, ou um gene de TTR humano) bem como variantes ou mutantes de um gene TTR. Desse modo, o gene de TTR pode ser um gene de TTR do tipo selvagem, um gene de TTR mutante (tal como um gene de TTR mutante que dá origem à deposição de amiloide), ou um gene de TTR transgênico no contexto de uma célula geneticamente manipulada, grupo de células, ou organismo.
[00515] "Inibição da expressão de um gene de TTR" inclui qualquer nível de inibição de um gene de TTR, por exemplo, pelo menos supressão parcial da expressão de um gene de TTR. A expressão do gene de TTR pode ser avaliada com base no nível, ou na mudança no nível, de qualquer variável associada com expressão do gene de TTR, por exemplo, nível de mRNA de TTR, nível de proteína de TTR, ou o número ou extensão de depósitos de amiloide. Este nível pode ser avaliado em uma célula individual ou em um grupo de células, incluindo, por exemplo, uma amostra derivada de um indivíduo.
[00516] A inibição pode ser avaliada por um decréscimo em um nível absoluto ou relativo de uma ou mais variáveis que estão associadas com a expressão de TTR comparada com um nível de controle. O nível de controle pode ser qualquer tipo de nível de controle que seja utilizado na técnica, por exemplo, um nível de linha de base de pré- dose, ou um nível determinado de um similar indivíduo, célula, ou amostra que não é tratada ou é tratada com um controle (tal como, por exemplo, controle apenas de tampão ou controle de agente inativo).
[00517] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, expressão de um gene de TTR é inibida por pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%. pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou para abaixo do nível de detecção do ensaio. Em algumas modalidades, a inibição de expressão de um gene de TTR resulta em normalização do nível do gene de TTR de modo que a diferença entre o nível antes do tratamento e um nível de controle normal seja reduzido em pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95%. Em algumas modalidades, a inibição é uma inibição clinicamente relevante.
[00518] A inibição da expressão de um gene de TTR pode ser mani-festada por uma redução da quantidade de mRNA expressa por uma primeira célula ou grupo de células (tais células podem estar presentes, por exemplo, em uma amostra derivada de um indivíduo) em que um gene de TTR é transcrito e que foi ou foram tratadas (por exemplo, contatando a célula ou células com um agente de RNAi da invenção, ou administrando um agente de RNAi da invenção a um indivíduo em que as células estão ou estavam presentes) de modo que a expressão de um gene de TTR seja inibida, quando comparada a uma segunda célula ou grupo de células substancialmente idênticas à primeira célula ou grupo de células, porém sque não foi ou não foram desse modo tratadas (célula(s) de controle). Em modalidades preferidas, a inibição é avaliada expressando o nível de mRNA em células tratadas como uma percentagem do nível de mRNA em células de controle, usando a seguinte fórmula:
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[00519] Alternativamente, a inibição da expressão de um gene de TTR pode ser avaliada em termos de uma redução de um parâmetro que é funcionalmente ligado à expressão do gene de TTR, por exemplo, expressão de proteína de TTR, nível de proteína de ligação de retinol, nível de vitamina A, ou presença de depósitos de amiloide com-preendendo TTR. Silenciamento de gene pode ser determinado em qualquer célula expressando TTR, ou constitutivamente ou por enge-nharia genômica, e por qualquer ensaio conhecido na técnica. O fígado é o maior sítio de expressão de TTR. Outros sítios significantes de expressão o plexo coroide, retina e pâncreas.
[00520] Inibição da expressão de uma proteína de TTR pode ser manifestada por uma redução no nível da proteína TTR que é expressa por uma célula ou grupo de células (por exemplo, o nível de proteína expresso em uma amostra derivada de um indivíduo). Como explicado acima para a avaliação de supressão de mRNA, a inibição de níveis de expressão de proteína em uma célula ou grupo de células tratadas pode similarmente ser expressa como uma percentagem do nível de proteína em uma célula de controle ou grupo de células.
[00521] Uma célula ou grupo de células de controle que podem ser usadas para avaliar a inibição da expressão de um gene de TTR inclui um célula ou grupo de células que não ainda não foram contatadas com um agente de RNAi da invenção. Por exemplo, a célula ou grupo de células de controle podem ser derivadas de um paciente individual (por exemplo, um indivíduo humano ou animal) antes do tratamento do indivíduo com um agente de RNAi.
[00522] O nível de mRNA de TTR que é expresso por uma célula ou grupo de células, ou o nível de mRNA de TTR circulante, pode ser de-terminado usando qualquer método conhecido na técnica para avaliar a expressão de mRNA. Em uma modalidade, o nível de expressão de TTR em uma amostra é determinado detectando um polinucleotídeo transcrito, ou porção do mesmo, por exemplo, mRNA do gene de TTR. RNA pode ser extraído de células usando técnicas de extração de RNA incluindo, por exemplo, usando extração de isotiocianato de gua- nidina/fenol de ácido (RNAzol B; Biogenesis), kits de preparação de RNA de RNeasy (Qiagen) ou PAXgene (PreAnalytix, Suíça). Formatos de ensaio típicos utilizando hibridização de ácido ribonucleico incluem ensaios de execução nuclear, RT-PCR, ensaios de proteção de RNase (Melton et al., Nuc. Acids Res. 12:7035), Northern blotting, hibridização in situ, e análise de microarranjo. mRNA de TTR circulante pode ser detectado usando os métodos descritos na PCT/US2012/043584, cuja íntegra é pelo presente incorporada aqui por referência.
[00523] Em uma modalidade, o nível de expressão de TTR é determinado usando uma sonda de ácido nucleico. O termo "sonda", como usado aqui, refere-se a qualquer molécula que é capaz de se ligar seletivamente a uma TTR específica. Sondas podem ser sintetizadas por aquele versado na técnica, ou derivadas de preparações biológicas apropriadas. Sondas podem ser especificamente designadas para ser rotuladas. Exemplos de moléculas que podem ser utilizadas como sondas incluem, porém não estão limitadas a, RNA, DNA, proteínas, anticorpos, e moléculas orgânicas.
[00524] mRNA isolado pode ser usado em ensaios de hibridização ou amplificação que incluem, porém não estão limitados a, Análises Southern ou Northern, análises de reação em cadeia de polimerase (PCR) e ensaios de sonda. Um método para a determinação de níveis de mRNA envolve contatar o mRNA isolado com uma molécula de ácido nucleico (sonda) que pode hibridizar para mRNA de TTR. Em uma modalidade, o mRNA é imobilizado em uma superfície sólida e contatado com uma sonda, por exemplo conduzindo o mRNA isolado em um gel de agarose e transferindo o mRNA do gel para uma membrana, tal como nitrocelulose. Em uma modalidade alternativa, a(s) sonda(s) são imobilizadas em uma superfície sólida e o mRNA é contatado com a(s) sonda(s), por exemplo, em uma disposição de lasca de gene Af- fymetrix. Alguém versado na técnica pode prontamente adaptar métodos de detecção de mRNA conhecidos para uso na determinação do nível de mRNA de TTR.
[00525] Um método alternativo para determinação do nível de expressão de TTR em uma amostra envolve o processo de amplificação e/ou transcriptase reversa de ácido nucleico (para preparar cDNA) de por exemplo mRNA na amostra, por exemplo, por RT-PCR (a modalidade experimental mencionada em Mullis, 1987, Patente Norte- americana No. 4,683,202), reação de cadeia ligase (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193), replicação de sequência auto- sustentada (Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:18741878), sistema de amplificação transcricional (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-Beta Replicase (Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197), replicação de círculo circulante (Lizardi et al., Patente Norte-americana No. 5.854.033) ou qualquer outro método de amplificação de ácido nucleico, seguido pela detecção das moléculas amplificadas usando técnicas bem conhecidas por aquele versado na técnica. Estes esquemas de detecção são especialmente úteis para a detecção de moléculas de ácido nucleico se tais moléculas estão presentes em números muito baixos. Em aspectos particula- res da invenção, o nível de expressão de TTR é determinado por RT- PCR fluorogênica quantitativa (isto é, o Sistema TaqManTM).
[00526] Os níveis de expressão de mRNA de TTR podem ser moni-torados usando uma mancha de membrana (tal como usado em análises de hibridização tal como Northern, Southern, ponto, e similares), ou micropoços, tubos de amostra, géis, contas ou fibras (ou qualquer suporte sólido compreendendo ácidos nucléicos ligados). Ver Patente dos Estados Unidos N°s. 5.770.722, 5.874.219, 5.744.305, 5.677.195 e 5.445.934, que são incorporadas aqui por referência. A determinação de nível de expressão de TTR pode também compreender uso de sondas de ácido nucleico em solução.
[00527] Em modalidades preferidas, o nível de expressão de mRNA é avaliado usando ensaios de DNA ramificado (bDNA) ou PCR em tempo real (qPCR). O uso destes métodos é descrito e exemplificado nos exemplos apresentados aqui.
[00528] O nível de expressão de proteína de TTR pode ser determinado usando qualquer método conhecido na técnica para a medição dos níveis de proteína. Tais métodos incluem, por exemplo, eletroforese, eletroforese capilar, cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), cromatografia de camada fina (TLC), cromatografia de hiperdifusão, re-ações de precipitina em fluido ou gel, espectroscopia de absorção, en-saios colorimétricos, ensaios fotométricos de reações de precipitina em espectro fluido ou gel, citometria de fluxo, imunodifusão (simples ou du-pla), imunoeletroforese, Western blotting, radioimunoensaio (RIA), en-saios imunoabsorventes ligados a enzima (ELISAs), ensaios imunofluo- rescentes, ensaios de eletroquimioluminescência, e similares.
[00529] Em algumas modalidades, a eficácia dos métodos da invenção pode ser monitorada por detecção ou monitoramento de uma redução em um depósito de TTR amiloide. Redução em um depósito de TTR amiloide, como usado aqui, inclui qualquer diminuição no ta- manho, número, ou severidade de depósitos de TTR, ou para uma prevenção ou redução na formação de depósitos de TTR, dentro de um órgão ou área de um indivíduo, como pode ser avaliado in vitro ou in vivo usando qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, alguns métodos de avaliação de depósitos amiloides são descritos em Gertz, M.A. & Rajukumar, S.V. (Editors) (2010), Amyloidosis: Diagnosis e Treatment, Nova Iorque: Human Press. Métodos de avaliação de depósitos amiloides podem incluir análises bioquímicas, bem como avaliação visual ou computadorizada de depósitos amiloides, como tornado visível, por exemplo, usando manchamento imuno- histoquímico, rotulação fluorescente, microscopia de luz, microscopia de elétron, microscopia fluorescente, ou outros tipos de microscopia. Modalidades de imageamento invasivas ou não invasivas, incluindo, por exemplo, CT, PET, ou imageamento NMR/MRI podem ser empregadas para avaliar depósitos amiloides.
[00530] Os métodos da invenção podem reduzir depósitos de TTR em qualquer número de tecidos ou regiões do corpo incluindo, porém não limitado ao coração, fígado, baço, esôfago, estômago, intestino (íleo, duodeno e cólon), cérebro, nervo ciático, gânglio da raiz dorsal, rim e retina.
[00531] O termo "amostra" como usado aqui refere-se a uma coleção de fluidos similares, células, ou tecidos isolados de um indivíduo, bem como fluidos, células, ou tecidos presentes dentro de um indivíduo. Exemplos de fluidos biológicos incluem sangue, soro e fluidos serosos, plasma, linfa, urina, fluido cerebroespinhal, saliva, fluidos oculares, e similares. Amostras de tecido podem incluir amostras de tecidos, órgãos ou regiões localizadas. Por exemplo, amostras podem ser derivadas de órgãos particulares, partes de órgãos, ou fluidos ou células dentro destes órgãos. Em certas modalidades, amostras podem ser derivadas do fígado (por exemplo, fígado inteiro ou certos segmentos de fígado ou certos tipos de células no fígado, tais como, por exemplo, hepatócitos), a retina ou partes da retina (por exemplo, epitélio de pigmento retinal), o sistema nervoso central ou partes do sistema ner-voso central (por exemplo, ventrículos ou plexo coroide), ou o pâncreas ou certas células ou partes do pâncreas. Em modalidades preferidas, a "amostra derivada de um indivíduo" refere-se a sangue tirado do indivíduo ou plasma derivado dele. Em outra modalidade, a "amostra derivada de um indivíduo" refere-se ao tecido do fígado ou tecido da retina derivado do indivíduo.
[00532] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, o agente de RNAi é administrado a um indivíduo de modo que o agente de RNAi é liberado para um local específico dentro do indivíduo. A inibição de expressão de TTR pode ser avaliada usando medidas do nível ou alteração no nível de mRNA de TTR ou proteína de TTR em uma amostra derivada de fluido ou tecido do local específico dentro do indivíduo. Em modalidades preferidas, o local é selecionado do grupo consistindo em fígado, plexo coroide, retina, e pâncreas. O local pode também ser uma subseção ou subgrupo de células de qualquer um dos locais acima mencionados (por exemplo, hepatócitos ou epitélio de pigmento retinal). O local pode também incluir células que expressam um tipo particular de receptor (por exemplo, hepatócitos que expressam o receptor de asialoglicloproteína).
VIII. Métodos para Tratamento ou Prevenção da doença associada com TTR
[00533] A presente invenção também fornece métodos para tratamento ou prevenção da doença associada com TTR em um indivíduo. Os métodos incluem administrar ao indivíduo uma quantidade terapeu- ticamente eficaz ou quantidade profilaticamente eficaz de um agente de um agente de RNAi da invenção.
[00534] Como usado aqui, um "indivíduo" é um animal, tal como um mamífero, incluindo um primata (tal como um humano, um primata não humano, por exemplo, um macaco, e um chimpanzé), um não primata (tal como uma vaca, um porco, um camelo, uma lhama, um cavalo, uma cabra, um coelho, uma ovelha, um hamster, um porquinho da índia, um gato, um cão, um rato, um camundongo, um cavalo, e uma baleia), ou um pássaro (por exemplo, um pato ou um ganso). Um indivíduo pode incluir um organismo transgênico.
[00535] Em uma modalidade, o indivíduo é um humano, tal como um humano sendo tratado ou avaliado quanto a uma doença, transtorno ou condição que se beneficiaria de redução em expressão de gene de TTR; um humano em risco de uma doença, transtorno ou condição que se beneficiaria de redução em expressão de gene de TTR; um humano tendo uma doença, transtorno ou condição que se beneficiaria de redução em expressão de gene de TTR; e/ou humano sendo tratado para uma doença, transtorno ou condição que se beneficiaria de redução em expressão de gene de TTR, como descrito aqui.
[00536] Em algumas modalidades, o indivíduo está sofrendo de uma doença associada com TTR. Em outras modalidades, o indivíduo é um indivíduo em risco de desenvolvimento da doença associada com TTR, por exemplo, um indivíduo com uma mutação de gene TTR que está associada com o desenvolvimento de uma doença associada à TTR (por exemplo, antes do início dos sinais ou sintomas sugerindo o desenvolvimento de amiloidose de TTR), um indivíduo com histórico familiar de doença associada com TTR (por exemplo, antes do início dos sinais ou sintomas sugerindo o desenvolvimento de amiloidose de TTR), ou um indivíduo que tem sinais ou sintomas sugerindo o desenvolvimento de amiloidose de TTR.
[00537] Uma"doença associada com TTR," como usado aqui, inclui qualquer doença causada por ou associada com a formação de depósitos de amiloides nos quais os precursores de fibrila consistem em proteína de TTR do tipo selvagem ou variante. TTR mutante e tipo sel-vagem dão origem a várias formas de deposição amiloide (amiloidose). Amiloidose envolve a formação e agregação de proteínas desnaturadas, resultando em depósitos extracelulares que prejudicam a função do órgão. Síndromes clínicas associadas com agregação de TTR incluem, por exemplo, amiloidose sistêmica senil (SSA); amiloidose familiar sistêmica; polineuropatia amiloidótica familiar (FAP); cardiomiopatia amiloidótica familiar (FAC); e amiloidose leptomeníngea, também co-nhecida como leptomeníngea ou amiloidose meningocerebrovascular, amiloidose do sistema nervoso central (CNS), ou amiloidose forma VII.
[00538] Em uma modalidade, os agentes de RNAi da invenção são administrados a indivíduos sofrendo de cardiomiopatia amiloidótica familiar (FAC). Em outra modalidade, os agentes de RNAi da invenção são administrados a indivíduos sofrendo de FAC com um fenótipo misto, isto é, um indivíduo tendo ambas deficiências cardíacas e neuroló-gicas. Em ainda outra modalidade, os agentes de RNAi da invenção são administrados a indivíduos sofrendo de FAP com um fenótipo misto, isto é, um indivíduo tendo ambas deficiências neurológica e cardíaca. Em uma modalidade, os agentes de RNAi da invenção são administrados a indivíduos sofrendo de FAP que foi tratado com um transplante ortotópico de fígado (OLT). Em outra modalidade, os agentes de RNAi da invenção são administrados a indivíduos sofrendo de ami- loidose sistêmica senil (SSA). Em outras modalidades dos métodos da invenção, agentes de RNAi da invenção são administrados a indivíduos sofrendo de cardiomiopatia amiloidótica familiar (FAC) e amiloi- dose sistêmica senil (SSA). TTR de sequência normal causa amiloido- se cardíaca em pessoas que são idosas e é denominada amiloidose sistêmica senil (SSA) (também chamada amiloidose cardíaca senil (SCA) ou amiloidose cardíaca). SSA muitas vezes está acompanhada por depósitos microscópicos em muitos outros órgãos. Mutações de TTR aceleram o processo de formação de TTR amiloide e são o fator de risco mais importante para o desenvolvimento de amiloidose de TTR clinicamente significante (também chamada ATTR (tipo transtire- tina de amiloidose)). Mais de 85 variantes de TTR amiloidogênica são conhecidas por causar amiloidose familiar sistêmica.
[00539] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, agentes de RNAi da invenção são administrados a indivíduos sofrendo de polineuropatia amiloidótica familiar relacionada com transtiretina (TTR) (FAP). Tais indivíduos podem sofrer de manifestações oculares, tais como opacidade vítrea e glaucoma. É conhecido por aquele versado na técnica que transtiretina amiloidogênica (ATTR) sintetizada por epi- télio de pigmento retinal (RPE) desempenha papéis importante na progressão de amiloidose ocular. Estudos anteriores têm mostrado que fotocoagulação a laser panretinal, que reduz as células de RPE, preveniu a progressão de deposição amilóide no vítreo, indicando que a supressão efetiva de expressão de ATTR em RPE pode se tornar uma nova terapia para amiloidose ocular (ver, por exemplo, Kawaji, T., et al., Ophthalmology. (2010) 117: 552-555). Os métodos da invenção são úteis para tratamento de manifestações oculares de FAP associado com TTR, por exemplo, amiloidose ocular. O agente de RNAi pode ser liberado de uma maneira adequada para alvejamento de um tecido particular, tal como o olho.Modos de liberação ocular incluem retrobulbar, pálpebra subcutânea, câmara subconjuntival, subtendão, anterior ou injeção intravítrea (ou injeção ou infusão interna). Formulações específicas para liberação ocular incluem colírios ou pomadas.
[00540] Outra doença associada com TTR é hipertiroxinemia, também conhecida como "hipertiroxinemia distranstiretinêmica" ou "hipertiroxine- mia disprealbuminêmica". Este tipo de hipertiroxinemia pode ser secun-dária a uma associação aumentada de tiroxina com TTR devido à molé-cula de TTR mutante TTR com afinidade aumentada por tiroxina. Ver, por exemplo, Moses et al. (1982) J. Clin. Invest., 86, 2025-2033.
[00541] Os agentes de RNAi da invenção podem ser administrados a um indivíduo usando qualquer modo de administração conhecido na técnica, incluindo, porém não limitado a, subcutâneo, intravenoso, intramuscular, intraocular, intrabronquial, intrapleural, intraperitoneal, intra-arterial, linfático, cerebrospinal, e quaisquer combinações dos mesmos.
[00542] Em modalidades preferidas, os agentes são administrados ao indivíduo subcutaneamente. Em algumas modalidades, a um indivíduo é administrado uma dose única de um agente de RNAi por meio de injeção subcutânea, por exemplo, injeção abdominal, na coxa, ou na parte superior do braço. Em outras modalidades, a um indivíduo é administrado uma dose dividida de um agente de RNAi por meio de injeção subcutânea. Em uma modalidade, a dose dividida do agente de RNAi é administrada ao indivíduo por meio de injeção subcutânea em dois locais anatômicos diferentes no indivíduo. Por exemplo, o indivíduo pode ser injetado subcutaneamente com uma dose dividida de cerca de 250 mg (por exemplo, cerca de metade de uma dose de 500 mg) no braço direito e cerca de 250 mg no braço esquerdo. Em algumas modalidades da invenção, a administração subcutânea é autoad- ministração por meio de, por exemplo, uma seringa preenchida ou seringa ou seringa auto-injetora. Em algumas modalidades, a dose do agente de RNAi para administração subcutânea está contida em um volume de menos do que ou igual a um ml de, por exemplo, um veículo farmaceuticamente aceitável.
[00543] Em algumas modalidades, a administração é por meio de uma injeção de depósito. Uma injeção de depósito pode liberar o agente de RNAi de uma forma consistente durante um período de tempo prolongado. Portanto, uma injeção de depósito pode reduz a freqüência de dosagem necessária para obter um efeito desejado, por exemplo, uma inibição desejada de TTR, ou um efeito terapêutico ou profilático. Uma injeção de depósito pode também fornecer concentra-ções de soro mais consistentes. Injeções de depósito podem incluir injeções subcutâneas ou injeções intramusculares. Em modalidades preferidas, a injeção de depósito é uma injeção subcutânea.
[00544] Em algumas modalidades, a administração é por meio de uma bomba. A bomba pode ser uma bomba externa ou uma bomba cirurgicamente implantada. Em certas modalidades, a bomba é uma bomba osmótica subcutaneamente implantada. Em outras modalidades, a bomba é uma bomba de infusão. Uma bomba de infusão pode ser usada para infusões intravenosas, subcutâneas, arteriais, ou epi- durais. Em modalidades preferidas, a bomba de infusão é uma bomba de infusão subcutânea. Em outras modalidades, a bomba é uma bomba cirurgicamente implantada que libera o agente de RNAi no fígado.
[00545] Em modalidades nas quais o agente de RNAi é administrado por meio de uma bomba de infusão subcutânea, uma única dose do agente de RNAi pode ser administrada ao indivíduo durante um período de tempo de cerca de 45 minutos a cerca de 5 minutos, por exemplo, cerca de 45 minutos, cerca de 40 minutos, cerca de 35 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 25 minutos, cerca de 20 minutos, cerca de 15 minutos, cerca de 10 minutos, ou cerca de 5 minutos.
[00546] Outros modos de administração incluem epidural, intracerebral, intracerebroventricular, administração nasal, intra-arterial, intra- cardíaca, infusão intraóssea, intratecal, e intravítrea, e pulmonar. O modo de administração pode ser escolhido com base em se tratamento local ou sistêmico é desejado e com base na área a ser tratada. A via e o local de administração podem ser escolhidos para aumentar alvejamento.
[00547] Em algumas modalidades, o agente de RNAi é administrado a um indivíduo em uma quantidade efetiva para inibir expressão de TTR em uma célula dentro do indivíduo. A quantidade efetiva para inibir expressão de TTR em uma célula dentro de um indivíduo pode ser avaliada usando métodos discutidos acima, incluindo métodos que en-volvem avaliação da inibição de mRNA de TTR, proteína de TTR, ou variáveis relacionadas, tais como depósitos amiloides.
[00548] Em algumas modalidades, o agente de RNAi é administrado a um indivíduo em uma quantidade profilaticamente ou terapeutica- mente eficaz.
[00549] "Quantidade terapeuticamente eficaz," como usado aqui, está destinado a incluir uma quantidade de um agente de RNAi que, quando administrada a um paciente para tratamento de uma doença associada com TTR, é suficiente para tratamento efetivo da doença (por exemplo, diminuindo, melhorando ou mantendo a doença existente ou um ou mais sintomas de doença). A "quantidade terapeuticamen- te eficaz" pode variar dependendo do agente de RNAi, como o agente é administrado, a doença e sua severidade e histórico, idade, peso, histórico familiar, composição genética, estágio de processos patológicos mediados por expressão de TTR, os tipos de tratamentos anteriores ou concomitantes, caso existam, e outras características individuais do paciente a ser tratado.
[00550] "Quantidade profilaticamente eficaz," como usado aqui, está destinado a incluir uma quantidade de um agente de RNAi que, quando administrado a um indivíduo que ainda não experimenta ou exibe sintomas da doença associada com TTR, porém que pode estar predisposto à doença, é suficiente para prevenir ou melhorar a doença ou um ou mais sintomas da doença. Sintomas que podem ser melhorados incluem neuropatia sensorial (por exemplo, parestesia, hipeste- sia em membros distais), neuropatia autonômica (por exemplo, disfunção gastrointestinal, tal como úlcera gástrica, ou hipotensão ortostáti- ca), neuropatia motora, convulsões, demência, mielopatia, polineuro- patia, síndrome do túnel do carpo, insuficiência autonômica, cardiomi- opatia, opacidades vítreas, insuficiência renal, nefropatia, mBMI subs-tancialmente reduzido (Índice de Massa Corporal modificada), disfunção de nervo craniano, e distrofia de treliça corneana. Melhoramento da doença inclui retardamento do curso da doença ou redução da severidade de doença de desenvolvimento posterior. A "quantidade profi- laticamente efetiva" pode variar dependendo do agente de RNAi, como o agente é administrado, o grau de risco de doença, e o histórico, idade, peso, histórico familiar, composição genética, os tipos de tratamentos anteriores ou concomitantes, caso existam, e outras características individuais do paciente a ser tratado.
[00551] A "quantidade terapeuticamente efetiva" ou "quantidade profilaticamente efetiva" também inclui uma quantidade de um agente de RNAi que produz algum efeito local ou sistêmico desejado em uma relação risco/benefício razoável aplicável a qualquer tratamento. Agentes de RNAi empregados nos métodos da presente invenção podem ser administrados em uma quantidade suficiente para produzir uma relação risco/benefício razoável aplicável em tal tratamento.
[00552] Como usado aqui, as frases "quantidade terapeuticamente eficaz" e "quantidade profilaticamente eficaz" também incluem uma quantidade que fornece um benefício no tratamento, prevenção, ou gestão de processos patológicos ou sintoma(s) de processos patológicos mediados por expressão de TTR. Sintomas de amiloidose de TTR incluem neuropatia sensorial (por exemplo, parestesia, hipestesia em membros distais), neuropatia autonômica (por exemplo, disfunção gastrointestinal, tal como úlcera gástrica, ou hipotensão ortostática), neu- ropatia motora, convulsões, demência, mielopatia, polineuropatia, sín- drome do túnel do carpo, insuficiência autonômica, cardiomiopatia, opacidades vítreas, insuficiência renal, nefropatia, mBMI substancialmente reduzido (Índice de Massa Corporal modificada), disfunção de nervo craniano, e distrofia de treliça corneana.
[00553] Em uma modalidade, por exemplo, quando o indivíduo tem FAP, FAP com fenótipo misto, FAC com fenótipo misto, ou FAP e teve um OLT, tratamento do indivíduo com um agente de dsRNA da invenção retarda a progressão de neuropatia. Em outra modalidade, por exemplo, quando o indivíduo tem FAP, FAP com fenótipo misto, FAC com fenótipo misto, SSA, ou FAP e teve um OLT, tratamento do indivíduo com um agente de dsRNA da invenção retarda a progressão de neuropatia e cardiomiopatia.
[00554] Por exemplo, em uma modalidade, os métodos da invenção retardam, reduzem ou interrompem o comprometimento neurológico. Qualquer medida adequada de comprometimento neurológico pode ser usada para determinar se um indivíduo tiver reduzido, retardado, ou interrompido o comprometimento neurológico.
[00555] Uma medida adequada é uma Pontuação de Dano de Neu- ropatia (NIS). NIS refere-se a um sistema de pontuação que mede a fraqueza, sensação, e reflexos, especialmente com respeito à neuro- patia periférica. A pontuação NIS avalia um grupo padrão de músculos quanto à fraqueza (1 é 25% fraco, 2 é 50% fraco, 3 é 75% fraco, 3,25 é movimento contra gravidade, 3,5 é movimento com gravidade eliminada, 3,75 é cintilação muscular sem movimento, e 4 é paralizado), um grupo padrão de reflexos de estiramento muscular (0 é normal, 1 é diminuído, 2 é ausente), e pressão de toque, vibração, posição de articulação e movimento, e picada de agulha (Todos classificados em dedo indicador e dedo grande: 0 é normal, 1 é diminuído, 2 é ausente). Avaliações são corrigidas para idade, sexo e aptidão física.
[00556] Em uma modalidade, os métodos da invenção reduzem um NIS em pelo menos 10%. Em outras modalidades, os métodos da invenção resultam em uma redução de NIS em pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, ou em pelo menos 50%. Em outras modalidades, os métodos de interromper um aumento da pontuação de NIS, por exemplo, o método resulta em 0% de aumento da pontuação de NIS. Em ainda outras modalidades, os métodos da invenção diminuem a taxa em que uma pontuação de NIS aumenta, por exemplo, a taxa de aumento de uma pontuação de NIS em um sujeito tratado com um agente de RNAi da invenção em comparação com a taxa de aumento de uma pontuação de NIS em um indivíduo que é não tratado com um agente de RNAi da invenção.
[00557] Métodos para a determinação de um NIS em um indivíduo humano são bem conhecidos de alguém versado na técnica e podem ser encontrados em, por exemplo, Dyck, PJ et al., (1997) Neurology 1997. 49(1): pgs. 229-239); Dyck PJ. (1988) Muscle Nerve. Jan; l l(l):21-32.
[00558] Outra medida adequada de comprometimento neurológico é uma pontuação de Comprometimento por Neuropatia Modificada (mNIS+7). Conforme conhecido por alguém versado na técnica, mNIS + 7 refere-se a um exame clínico baseado em exames de medida de comprometimento neurológico (NIS) combinado com medidas eletrofi- siológicas da pequena e grande função da fibra nervosa (NCS e QST), e medição da função autonômica (pressão arterial postural). A pontuação mNIS + 7 é uma modificação da pontuação NIS + 7 (que representa NIS mais sete testes). NIS + 7 analisa fraqueza e reflexos de estiramento muscular. Cinco dos sete testes incluem atributos da condução de nervos. Esses atributos são as amplitudes do potencial de ação do músculo do composto de nervo peroneal, velocidade de condução do nervo motor e latência distal do nervo motor (MNDL), MNDL tibial, amplitude do potencial de ação do nervo sensorial e sural. Estes valores são corrigidos para variáveis de idade, sexo, altura e peso. Os dois restantes dos sete testes incluem limiar de detecção vibratória e diminuição da frequência cardíaca com respiração profunda.
[00559] A pontuação mNIS + 7 modifica NIS + 7 para levar em con-sideração o uso do Teste de Sensação Quantitativa Somatotópica In-teligente, novas avaliações autonômicas e o uso do potencial de ação do músculo composto das amplitudes dos nervos ulnar, peroneal e tibial e potenciais de ação do nervo sensorial dos nervos ulnar e sural (Suanprasert, N. et al., (2014) J. Neurol. Sci., 344(1-2): pgs. 121-128).
[00560] Em uma modalidade, os métodos da invenção reduzem um mNIS+7 em pelo menos 10%. Em outras modalidades, os métodos da invenção resultam em uma redução de uma pontuação de mNIS+7 em pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, ou em pelo menos 50%. Em outras modalidades, os métodos de interromper um aumento de mNIS+7, por exemplo, o método resulta em a 0% de aumento do mNIS+7. Em ainda outras modalidades, os métodos da invenção diminua a taxa na qual uma pontuação de NIS + 7 aumenta, por exemplo, a taxa de aumento de uma pontuação de NIS+7 em um indivíduo tratado com um agente de RNAi da invenção em comparação com a taxa de aumento de uma pontuação de NIS + 7 em um indivíduo que não é tratado com um agente de RNAi da invenção.
[00561] Os métodos terapêuticos e profiláticos da presente invenção também podem melhorar outros parâmetros clínicos, tal como ca-pacidade de caminhar, no indivíduo a ser tratado. Por exemplo, durante ou após um período de tratamento, um indivíduo pode ter uma capacidade ou atividade de exercício aumentada.
[00562] Qualquer medida adequada da capacidade de exercício pode ser usada para determinar se um indivíduo tem uma capacidade ou atividade de exercício aumentada. Uma medida adequada é um teste de caminhada de 6 minutos (6MWT), que mede o quão longe o indivíduo pode andar em 6 minutos, isto é, a distância da caminhada de 6 minutos (6MWD). Em uma modalidade, os métodos da invenção fornecer ao indivíduo um aumento da linha de base no 6MWD por pelo menos cerca de 10 minutos, por exemplo, cerca de 10, 15, 20, ou cerca de 30 minutos.
[00563] A quantidade terapeuticamente eficaz e quantidade profila- ticamente eficaz de um agente de RNAi da invenção também inclui uma quantidade que melhora um ou mais parâmetros de qualidade de vida versus linha de base, por exemplo, um aumento na pontuação em pelo menos uma das escalas funcionais da pesquisa de saúde SF- 36®; e/ou uma maior longevidade; e/ou diminuiu a hospitalização.
[00564] Qualquer medida adequada de qualidade de vida pode ser utilizada. Por exemplo, a pesquisa de saúde SF-36® fornece um auto- relatório, escala de múltiplos ítens medindo oito parâmetros de saúde: funcionamento físico, limitações de função devido a problemas de saúde física, dor corporal, saúde geral, vitalidade (energia e fadiga), fun-cionamento social, limitações de funções devido a problemas emocionais, e saúde mental (sofrimento psicológico e bem-estar psicológico). A pesquisa também fornece um sumário de componente físico e um sumário de componente mental. Em uma modalidade, os métodos da invenção fornecem ao indivíduo uma melhoria versus linha de base em pelo menos um dos parâmetros SF-36 relacionados à saúde física (saúde física, função física, dor corporal e/ou saúde geral) e/ou em pelo menos um dos parâmetros relacionados à saúde mental SF-36 (vitalidade, funcionamento social, saúde mental e/ou emocional). Tal melhoria pode assumir a forma de um aumento de pelo menos 1, por exemplo, pelo menos 2 ou pelo menos 3 pontos, na escala para qualquer um ou mais parâmetros.
[00565] Os métodos da presente invenção podem também melhorar o prognóstico do indivíduo a ser tratado. Por exemplo, os métodos da invenção podem fornecer ao indivíduo uma redução na probabilidade de um evento de piora clínica durante o período de tratamento.
[00566] A dose de um agente de RNAi que é administrado a um in- divíduo pode ser adaptada para equilibrar os riscos e benefícios de uma dose específica, por exemplo, para alcançar um nível desejado de supressão de genes TTR (conforme avaliado, por exemplo, com base em Supressão de mRNA de TTR, expressão de proteína de TTR ou uma redução de um depósito de amiloide como definido acima) ou um efeito terapêutico ou profilático desejado, evitando ao mesmo tempo os efeitos colaterais indesejáveis.
[00567] Em uma modalidade, um agente iRNA da invenção é admi-nistrado a um indivíduo como uma dose baseada em peso. Uma"dose baseada em peso" (por exemplo, uma dose em mg/kg) é uma dose do agente de iRNA que irá mudar de acordo com o peso do indivíduo. Em outra modalidade, um agente de iRNA é administrado a um indivíduo como uma dose fixa. Uma"dose fixa" (por exemplo, uma dose em mg) significa que uma dose de um agente de iRNA é utilizada para todos os indivíduos, independentemente de quaisquer fatores específicos relacionados ao assunto, tal como o peso. Em uma modalidade particular, uma dose fixa de um agente iRNA da invenção baseia-se em um peso ou idade predeterminada.
[00568] Os indivíduos podem ser administrados uma quantidade terapêutica de iRNA, tal como cerca de 0,01 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,15 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,35 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,55 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,65 mg/kg, 0,7 mg/kg, 0,75 mg/kg, 0,8 mg/kg, 0,85 mg/kg, 0,9 mg/kg, 0,95 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,25 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg, 1,5 mg/kg, 1,6 mg/kg, 1,7 mg/kg, 1,8 mg/kg, 1,9 mg/kg, 2,0 mg/kg, 2,1 mg/kg, 2,2 mg/kg, 2,3 mg/kg, 2,4 mg/kg, 2,5 mg/kg de dsRNA, 2,6 mg/kg de dsRNA, 2,7 mg/kg de dsR- NA, 2,8 mg/kg de dsRNA, 2,9 mg/kg de dsRNA, 3,0 mg/kg de dsRNA, 3,1 mg/kg de dsRNA, 3,2 mg/kg de dsRNA, 3,3 mg/kg de dsRNA, 3,4 mg/kg de dsRNA, 3,5 mg/kg de dsRNA, 3,6 mg/kg de dsRNA, 3,7 mg/kg de dsRNA, 10 mg/kg de dsRNA, 15 mg/kg de dsRNA, 20 mg/kg de dsRNA, 25 mg/kg de dsRNA, 30 mg/kg de dsRNA, 35 mg/kg de dsRNA, 40 mg/kg de dsRNA, 45 mg/kg de dsRNA, ou cerca de 50 mg/kg de dsRNA. Valores e faixas intermediárias aos valores mencionados são também destinados a fazer parte desta invenção.
[00569] Em certas modalidades, por exemplo, quando uma composição da invenção compreende um dsRNA como descrito aqui e um lipídio, indivíduos podem receber uma quantidade terapêutica de iR- NA, tal como cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,2 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,2 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,3 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,3 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,4 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,4 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 1,5 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 1,5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 2 mg/kg a cerca de 2,5 mg/kg, cerca de 2 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 3 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 3 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 3,5 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 4 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 4,5 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 4 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 4,5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 5,5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 6 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 6,5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 7 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 7,5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 8 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 8,5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 9 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, ou cerca de 9,5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Valores e faixas intermediárias aos valores mencionados são também destinados a fazer parte desta invenção.
[00570] Por exemplo, o dsRNA pode ser administrado em uma dose de cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, ou cerca de 10 mg/kg. Valores e faixas intermediárias aos valores mencionados são também destinados a fazer parte desta in-venção.
[00571] Em algumas modalidades, por exemplo, quando uma composição da invenção compreende um dsRNA como descrito aqui e um N-acetilgalactosamina, indivíduos podem receber uma quantidade te-rapêutica de iRNA, tal como cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,15 mg/kg a cerca de 3 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,2 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,2 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,3 mg/kg a cerca de 3 mg/kg, cerca de 0,3 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,3 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,4 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,4 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,6 mg/kg a cerca de 3 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 3 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 1,25 mg/kg a cerca de 3 mg/kg, cerca de 1,5 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 1,5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 2 mg/kg a cerca de 2,5 mg/kg, cerca de 2 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 3 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 3 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 3,5 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 4 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 4,5 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 4 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 4,5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 5,5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 6 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 6,5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 7 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 7,5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 8 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 8,5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 9 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, ou cerca de 9,5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Valores e faixas intermediárias aos valores mencionados são também destinados a fazer parte desta invenção.
[00572] Por exemplo, o dsRNA pode ser administrado em uma dose de cerca de 0,1, 0,15, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,25, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, ou cerca de 10 mg/kg. Valores e faixas intermediárias aos valores mencionados são também destinados a fazer parte desta invenção.
[00573] Em outras modalidades, por exemplo, quando uma composição da invenção compreende um dsRNA como descrito aqui e um N- acetilgalactosamina, indivíduos podem receber uma quantidade tera-pêutica de iRNA, tal como uma dose de cerca de 0,1 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 0,25 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 0,5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 0,75 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 1 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 1,5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 2 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 2,5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 3 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 3,5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 4 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 4,5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 7,5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 10 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 15 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 25 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 25 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 30 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 35 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 40 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 45 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 0,1 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 0,25 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 0,5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 0,75 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 1 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 1,5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 2 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 2,5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 3 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 3,5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 4 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 4,5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 7,5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 10 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 15 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 25 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 25 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 30 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 35 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 40 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 0,1 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 0,25 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 0,5 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 0,75 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 1 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 1,5 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 2 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 2,5 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 3 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 3,5 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 4 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 4,5 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 5 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 7,5 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 10 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 15 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 25 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 25 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 30 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 35 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 0,1 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 0,25 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 0,5 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 0,75 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 1 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 1,5 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 2 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 2,5 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 3 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 3,5 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 4 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 4,5 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 5 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 7,5 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 10 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 15 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 25 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 0,1 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 0,25 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 0,5 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 0,75 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 1 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 1,5 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 2 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 2,5 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 3 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 3,5 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 4 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 4,5 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 5 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 7,5 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 10 a cerca de 20 mg/kg, ou cerca de 15 a cerca de 20 mg/kg. Em uma modalidade, quando uma composição da invenção compreende um dsRNA como descrito aqui e um N-acetilgalactosamina, indivíduos podem receber uma quantidade terapêutica de cerca de 10 a cerca de 30 mg/kg de dsRNA. Valores e faixas intermediárias aos valores mencionados são também destinados a fazer parte desta invenção.
[00574] Por exemplo, indivíduos podem receber uma quantidade terapêutica de iRNA, tal como cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,25, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 20,5, 21, 21,5, 22, 22,5, 23, 23,5, 24, 24,5, 25, 25,5, 26, 26,5, 27, 27,5, 28, 28,5, 29, 29,5, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ou cerca de 50 mg/kg. Valores e faixas intermediárias aos valores mencionados são também destinados a fazer parte desta invenção.
[00575] Em algumas modalidades, o agente de RNAi é administrado como uma dose fixa entre cerca de 25 mg a cerca de 900 mg, por exemplo, entre cerca de 25 mg a cerca de 850 mg, entre cerca de 25 mg a cerca de 800 mg, entre cerca de 25 mg a cerca de 750 mg, entre cerca de 25 mg a cerca de 700 mg, entre cerca de 25 mg a cerca de 650 mg, entre cerca de 25 mg a cerca de 600 mg, entre cerca de 25 mg a cerca de 550 mg, entre cerca de 25 mg a cerca de 500 mg, entre cerca de 100 mg a cerca de 850 mg, entre cerca de 100 mg a cerca de 800 mg, entre cerca de 100 mg a cerca de 750 mg, entre cerca de 100 mg a cerca de 700 mg, entre cerca de 100 mg a cerca de 650 mg, entre cerca de 100 mg a cerca de 600 mg, entre cerca de 100 mg a cerca de 550 mg, entre cerca de 100 mg a cerca de 500 mg, entre cerca de 200 mg a cerca de 850 mg, entre cerca de 200 mg a cerca de 800 mg, entre cerca de 200 mg a cerca de 750 mg, entre cerca de 200 mg a cerca de 700 mg, entre cerca de 200 mg a cerca de 650 mg, entre cerca de 200 mg a cerca de 600 mg, entre cerca de 200 mg a cerca de 550 mg, entre cerca de 200 mg a cerca de 500 mg, entre cerca de 300 mg a cerca de 850 mg, entre cerca de 300 mg a cerca de 800 mg, entre cerca de 300 mg a cerca de 750 mg, entre cerca de 300 mg a cerca de 700 mg, entre cerca de 300 mg a cerca de 650 mg, entre cerca de 300 mg a cerca de 600 mg, entre cerca de 300 mg a cerca de 550 mg, entre cerca de 300 mg a cerca de 500 mg, entre cerca de 400 mg a cerca de 850 mg, entre cerca de 400 mg a cerca de 800 mg, entre cerca de 400 mg a cerca de 750 mg, entre cerca de 400 mg a cerca de 700 mg, entre cerca de 400 mg a cerca de 650 mg, entre cerca de 400 mg a cerca de 600 mg, entre cerca de 400 mg a cerca de 550 mg, ou entre cerca de 400 mg a cerca de 500 mg.
[00576] Em algumas modalidades, o agente de RNAi é administrado como uma dose fixa de cerca de 12,5 mg, cerca de 15 mg, cerca de 20 mg, cerca de 25 mg, cerca de 30 mg, cerca de 35 mg, cerca de 40 mg, cerca de 45 mg, cerca de 50 mg, cerca de 55 mg, cerca de 60 mg, cerca de 65 mg, cerca de 70 mg, cerca de 75 mg, cerca de 80 mg, cerca de 85 mg, cerca de 90 mg, cerca de 95 mg, cerca de 100 mg, cerca de 110 mg, cerca de 120 mg, cerca de 125 mg, cerca de 130 mg, cerca de 140 mg, cerca de 150 mg, cerca de 160 mg, cerca de 170 mg, cerca de 175 mg, cerca de 180 mg, cerca de 190 mg, 200 mg, cerca de 225 mg, cerca de 250 mg, cerca de 275 mg, cerca de 300 mg, cerca de 325 mg, cerca de 350 mg, cerca de 375 mg, cerca de 400 mg, cerca de 425 mg, cerca de 450 mg, cerca de 475 mg, cerca de 500 mg, cerca de 525 mg, cerca de 550 mg, cerca de 575 mg, cerca de 600 mg, cerca de 625 mg, cerca de 650 mg, cerca de 675 mg, cerca de 700 mg, cerca de 725 mg, cerca de 750 mg, cerca de 775 mg, cerca de 800 mg, cerca de 825 mg, cerca de 850 mg, cerca de 875 mg, ou cerca de 900 mg.
[00577] Em certas modalidades, o agente de RNAi é administrado a um indivíduo como uma dose fixa de cerca de 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, ou cerca de 600 mg uma vez a cada três meses (isto é, uma vez por trimestre). Em uma modalidade, a administração é administração subcutânea, por exemplo, por meio de auto- administração, por exemplo, uma seringa pré-carregada ou seringa de autoinjetor. Em algumas modalidades, uma dose do agente de RNAi para administração subcutânea está contida em um volume inferior ou igual a 1 ml de, por exemplo, um veículo farmaceuticamente aceitável.
[00578] Em algumas modalidades, O agente de RNAi é administrado em duas ou mais doses. Se desejado para facilitar infusões repetidas ou frequentes, implantação de um dispositivo de liberação, por exemplo, uma bomba, stent semi-permanente (por exemplo, intravenoso, intraperitoneal, intracisternal ou intracapsular), ou o reservatório pode ser aconselhável. Em algumas modalidades, o número ou quantidade de doses subsequentes depende da obtenção de um efeito desejado, por exemplo, a supressão de um gene TTR, ou a obtenção de um efeito terapêutico ou profilático, por exemplo, reduzindo um depósito amilóide ou reduzindo um sintoma de uma doença associada com TTR.
[00579] Em algumas modalidades, o agente de RNAi é administrado de acordo com um cronograma. Por exemplo, o agente de RNAi pode ser administrado duas vezes por semana, três vezes por semana, quatro vezes por semana, ou cinco vezes por semana. Em algumas moda-lidades, o cronograma envolve administrações regularmente espaçadas, por exemplo, a cada hora, a cada quatro horas, a cada seis horas, a cada oito horas, a cada doze horas, diariamente, a cada 2 dias, a cada 3 dias, a cada 4 dias, a cada 5 dias, semanalmente, duas semanas, mensalmente ou trimestralmente. Em uma modalidade, a dosagem de 0,3 mg/kg, 0,6 mg/kg, 1 mg/kg, 1,25 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2, . 2,5 mg/kg, ou 3 mg/kg é administrada mensalmente. Em outra modalidade ,uma dosagem de 0,3 mg/kg, 0,6 mg/kg, 1 mg/kg, 1,25 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2. 2,5 mg/kg, ou 3 mg/kg é administrada trimestralmente.
[00580] Em outras modalidades, o cronograma envolve administrações estreitamente espaçadas, seguidas de um período de tempo mais longo durante o qual o agente não é administrado. Por exemplo, o cronograma pode envolver um conjunto inicial de doses que são administradas em um período de tempo relativamente curto (por exemplo, cerca de cada 6 horas, cerca de cada 12 horas, cerca de cada 24 horas, cerca de cada 48 horas, ou cerca de cada 72 horas) seguido por um período de tempo mais longo (por exemplo, cerca de 1 semana, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 4 semanas, cerca de 5 semanas, cerca de 6 semanas, cerca de 7 semanas, cerca de 8 semanas, cerca de 9 semanas, cerca de 10 semanas, cerca de 11 semanas, ou cerca de 12 semanas) durante o qual o agente de RNAi não é administrado. Em uma modalidade, o agente de RNAi é inicialmente administrado por hora e é posteriormente administrado em um intervalo mais longo (por exemplo, diariamente, semanalmente, quinzenas, mensalmente, ou trimestralmente). Em outra modalidade, o agente de RNAi é inicialmente administrado diariamente e é poste-riormente administrado em um intervalo mais longo (por exemplo, se-manalmente, quinzenalmente, mensalmente, ou trimestralmente). Em certas modalidades, o intervalo mais longo aumenta ao longo do tempo ou é determinado com base na obtenção de um efeito desejado.
[00581] Em uma modalidade específica, o agente de RNAi é administrado uma vez por dia durante uma primeira semana, seguido de semanal, mensal ou dosagem trimestral começando no oitavo dia de administração. Em outra modalidade específica, o agente de RNAi é administrado todos os dias durante uma primeira semana, seguido de semanal, mensal ou dosagem trimestral a partir do oitavo dia de admi-nistração. Em outra modalidade, o agente de RNAi é administrado uma vez por dia durante cinco dias durante uma primeira semana, seguido de administração semanal, mensal ou de dosagem trimestral.
[00582] Qualquer um destes cronogramas pode ser repetido opcio-nalmente para uma ou mais iterações. O número de iterações pode depender da obtenção de um efeito desejado, por exemplo, a supressão de um gene TTR, nível de proteína de ligação ao retinol, nível de vitamina A, e/ou a obtenção de um efeito terapêutico ou profilático, por exemplo, reduzindo um depósito amilóide ou redução de um sintoma de doença associada com TTR.
[00583] Em algumas modalidades, o agente de RNAi é administrado com outros agentes terapêuticos ou outros regimes terapêuticos. Por exemplo, outros agentes ou outros regimes terapêuticos adequados para o tratamento de uma doença associada com TTR podem incluir um transplante de fígado, que pode reduzir os níveis de TTR mutantes no corpo; Tafamidis (Vyndaqel), que estabiliza cinéticamente o tetrâ- mero TTR que prevê a dissociação do tetrâmero necessária para a amiloidogênese TTR; e diuréticos, que podem ser empregados, por exemplo, para reduzir o edema em TTR amiloidose com envolvimento cardíaco.
[00584] Em uma modalidade, à um indivíduo é administrado uma dose inicial e uma ou mais doses de manutenção de um agente de RNAi. A dose ou doses de manutenção podem ser iguais ou inferiores à dose inicial, por exemplo, metade da dose inicial. Um regime de manutenção pode tratar o indivíduo com uma dose ou doses variando de 0,01 μg a 15 mg/kg de peso corporal por dia, por exemplo, 1 mg/kg, 1,25 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,15 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,001 mg/kg, ou 0,00001 mg/kg de peso corporal por dia, ou uma dose ou doses de cerca de 12,5 mg a cerca de 900 mg, por exemplo, cerca de 25 mg, cerca de 30 mg about 35 mg, cerca de 40 mg, cerca de 45 mg, cerca de 50 mg, cerca de 55 mg, cerca de 60 mg, cerca de 65 mg, cerca de 70 mg, cerca de 75 mg, cerca de 80 mg, cerca de 85 mg, cerca de 90 mg, cerca de 95 mg, cerca de 100 mg, cerca de 125 mg, cerca de 150 mg, cerca de 175 mg, 200 mg, cerca de 225 mg, cerca de 250 mg, cerca de 275 mg, cerca de 300 mg, cerca de 325 mg, cerca de 350 mg, cerca de 375 mg, cerca de 400 mg, cerca de 425 mg, cerca de 450 mg, cerca de 475 mg, cerca de 500 mg, cerca de 525 mg, cerca de 550 mg, cerca de 575 mg, cerca de 600 mg, cerca de 625 mg, cerca de 650 mg, cerca de 675 mg, cerca de 700 mg, cerca de 725 mg, cerca de 750 mg, cerca de 775 mg, cerca de 800 mg, cerca de 825 mg, cerca de 850 mg, cerca de 875 mg, ou cerca de 900 mg por semana. As doses de manutenção são, por exemplo, administradas não mais que uma vez a cada 2 dias, uma vez a cada 5 dias, uma vez a cada 7 dias, uma vez a cada 10 dias, uma vez a cada 14 dias, uma vez a cada 21 dias, uma vez a cada 30 dias, uma vez a cada 90 dias. Além disso, o regime de tratamento pode durar um período de tempo que variará de acordo com a natureza da doença particular, sua gravidade e a condição geral do paciente. Em certa modalidades, a dosagem pode ser liberada não mais de uma vez por dia, por exemplo, não mais de uma vez por 24, 36, 48 ou mais horas, por exemplo, não mais de uma vez a cada 5 ou 8 dias. Após o tratamento, o paciente pode ser monitorado quanto a mudanças na sua condição. A dosagem do agente de RNAi pode ser aumentada no caso de o paciente não responder significativamente aos níveis de dosagem atuais, ou a dose pode ser diminuída se for observado um alívio dos sintomas do estado da doença, se o estado da doença tiver sido ablado ou se os efeitos colaterais indesejados forem observados.
VI. Kits
[00585] A presente invenção também proporciona kits para realizar qualquer dos métodos da invenção. Tais tais um ou mais agentes(s) de RNAi e instruções de uso, por exemplo, instruções para inibir a ex-pressão de um TTR em uma célula, contactando a célula com o(s) agente(s) de RNAi em uma quantidade efetiva para inibir a expressão da TTR. Os kits podem, opcionalmente, compreender ainda meios para contatar a célula com o agente de RNAi (por exemplo, um dispositivo de injeção ou uma bomba de infusão), meios para medir uma inibição de TTR (por exemplo, meios para medir uma inibição de mRNA de TTR ou proteína de TTR ). Tais meios para medir uma inibição de TTR podem compreender um meio para obter uma amostra de um indivíduo, por exemplo, uma amostra de plasma. Os kits da invenção podem, opcionalmente, compreender ainda meios para administrar o(s) agente(s) de RNAi a um sujeito ou meios para determinar a eficácia terapêutica ou a quantidade profilaticamente eficaz.
[00586] Agentes de RNAi adequados para inclusão nos kits da invenção incluem qualquer um dos agentes de RNAi listados em qualquer uma das Tabelas 1, 3, 5, 6 ou 7. Em uma modalidade, o agente de RNAi é selecionado a partir do grupo consistindo de AD-66016, AD- 65492, AD-66017 e AD-66018.
[00587] O agente de RNAi pode ser fornecido em qualquer forma conveniente, tal como uma solução em água estéril para injeção. Por exemplo, o agente de RNAi pode ser fornecido como uma solução de 500 mg/ml, 450 mg/ml, 400 mg/ml, 350 mg/ml, 300 mg/ml, 250 mg/ml, 200 mg/ml, 150 mg/ml, 100 mg/ml, ou 50 mg/ml em água estéril por injeção.
[00588] Esta invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos que não devem ser interpretados como limitativos. O conteúdo de todas as referências e patentes publicadas e os pedidos de patente citados ao longo do pedido são aqui incorporados por referência.
EXEMPLOS Exemplo 1: Estabilidade in vitro e atividade de silenciamento de agentes de RNAi quimicamente modificados que visam TTR
[00589] As seguintes experiências demonstraram os efeitos benéficos de certas modificações químicas, incluindo não mais de 8 modificações de 2'-flúor na cadeia de senso, não mais do que 6 modificações de 2' -flúor na cadeia antisenso, seis ligações de nucleotídeos de fosforotioato, e um ligante, por exemplo, um ligante GalNAc3, na atividade de silenciamento de agentes RNAi que visam TTR. As sequências dos agentes investigados são fornecidas na Tabela 1 abaixo.
[00590] As sequências de siRNA TTR foram sintetizadas a uma escala de 1 μmol num sintetizador Mermade 192 (BioAutomation) usando a química de fosforamidita mediada por suporte sólido. O suporte sólido foi o vidro de poro controlado (500 A) carregado com ligante Gal- NAc personalizado ou suporte sólido universal (AM bioquímico). Os reagentes de síntese auxiliares, os fosforamiditos 2'-F e 2'-O-metil RNA e desoxi foram obtidos da Thermo-Fisher (Milwaukee, WI) e Hon- gene (China). 2'F, 2'-O-Metila, GNA (ácidos nucleicos de glicol),5' fos- fato e modificações abasicas foram introduzidas utilizando os fosfora- miditos correspondentes. A síntese de cadeias únicas conjugadas GalNAc 3 foi realizada em um suporte de CPG modificado com Gal- NAc. O suporte sólido universal CPG personalizado foi utilizado para a síntese de feixes simples antisenso. O tempo de acoplamento para todos os fosforamiditos (100 mM em acetonitrila) foi de 5 minutos empregando 5-etiltio-1H-tetrazol (ETT) como ativador (0,6 M em acetoni- trila). As ligações de fosforotioato foram geradas utilizando uma solução 50 mM de 3-((dimetilamino-metilideno)amino)-3H-1,2,4-ditiazol-3- tiona (DDTT, obtido a partir de Chemgenes (Wilmington, MA, EUA)) em acetonitrilo/piridina anidroso (1: 1 v / v). O tempo de oxidação foi de 3 minutos. Todas as sequências foram sintetizadas com remoção final do grupo DMT ("DMT off").
[00591] Após a conclusão da síntese de fase sólida, os oligoribonu- cleotídeos foram clivados do suporte sólido e desprotegidos em placas seladas de 96 poços profundos usando 200 μL de reagentes de Meti- lamina Aquosa a 60° C durante 20 minutos. No final da etapa de des-proteção de clivagem, a placa de síntese foi deixada para chegar à temperatura ambiente, e precipitou-se por adição de 1 mL de acetoni- trila: mistura etanol (9: 1). As placas foram arrefecidas a -80 °C durante 2 horas, o superanatante decantou cuidadosamente com a ajuda de uma pipeta multicanal. O pélete de oligonucleotídeo foi ressuspenso em tampão NaOAc 20 mM e foi dessalinizado usando uma coluna de exclusão de tamanho HiTrap de 5 mL (GE Healthcare) em um sistema purificador AKTA equipado com um amostrador automático A905 e um coletor de fração Frac 950. As amostras dessalinizadas foram coletadas em placas de 96 poços. As amostras de cada sequência foram analisadas por LC-MS para confirmar a identidade, UV (260 nm) para quantificação e um conjunto selecionado de amostras foi analisado por cromatografia IEX para determinar a pureza.
[00592] O recozimento de cadeias simples TTR foi realizado em um robô de manipulação de líquido Tecan. As misturas equimolares de feixes únicos senso e antisenso foram combinadas e recozidas em placas de 96 poços. Depois de combinar as cadeias simples complementares, a placa de 96 poços foi selada e aqueceu-se fortemente num forno a 100 °C durante 10 minutos e deixou-se passar lentamente à temperatura ambiente durante um período de 2 a 3 horas. A concentração de cada duplex foi normalizada para 10μM em 1X PBS.
[00593] Estes duplexes foram testados para estabilidade metabólica in vitro usando um ensaio de estabilidade de citosol de rato.Para tal ensaio, o citosol do fígado do rato fêmea (Xenotech Cat. R1500.C) foi descongelado até à temperatura ambiente e diluído para 1 mg/mL em tampão Tris 50 mM: HCl pH 7,4, MgCl2 5 mM. Foram preparadas amostras de vinte e quatro horas misturando 100 μl de 1 μg/mL de Citosol com 25 μl de amostra de siRNA de 0,4 mg/mL em um tubo de microcentrífuga e incubando durante 24 horas em um Thermomixer Eppendorf ajustado para 37 °C e 300 rpm. Após 24 horas de incubação, adicionaram-se a cada amostra 300 μl de tampão de carga de lise Phenomenex (Cat. # ALO-8498) e 12,5 μL de siRNA interno de 0,4 mg/mL. As amostras de hora zero foram preparadas misturando 100 μl de 1 mg/mL de citosol com 25 μl de amostra de siRNA de 0,4 mg/mL, 300 μl de tampão de carga de lise Phenomenex e 12,5μL de 0,4 mg/mL padrão interno de siRNA. O siRNA foi extraído de amostras de 24 horas e amostras de 0 horas utilizando um kit de partida Phenomenex Clarity OTX (Cat. # KSO-8494). Após a extração das amostras, foram transferidas para um tubo microcentrífugo e secadas usando um concentrador Labconco CentriVap (n° 7810010). As amostras foram então ressuspensas com 500 μL de água livre de nuclease. Cinquenta μL de cada amostra foram executadas em um LC binário Agilent Technologies 1260 Infinity com LC/MS de Agilent Technologies 6130 Quadrupole. A análise foi realizada usando a con-figuração de coluna dupla no modo de regeneração. O método da bomba quaternária foi executado por 12,20 minutos a 0,400 mL/min com o seguinte calendário:
Figure img0021
[00594] O método de Bomba Binária foi conduzido durante 12,20 minutos a 0,700 mL/min com o seguinte calendário:
[00595] Função de Tempo Parâmetro
Figure img0022
[00596] Ambas as colunas esquerda e direita foram estabelecidas a 75°C. O sinal UV foi medido a 260nm de comprimento de onda. O per-centual restante de cada fita foi calculado usando a seguinte equação:
[00597] % de fita restante = 100* (Área de PicoFilamento 24h/Área de PicoFilamento 0h*(Área de PicoPadrão 24h/Área de PicoPadrão 0h)).
[00598] Os resultados destes ensaios de estabilidade de citosol de vinte e quatro horas demonstram que todas as duplas são altamente estáveis.
[00599] Um subgrupo destes agentes foi também avaliado quanto à estabilidade metabólica in vitro usando um ensaio de estabilidade de tritossoma. Para os ensaios de estabilidade de tritossoma, tritossomas de fígado de rato (Produto personalizado Xenotech PR14044) foram descongelados para a temperatura ambiente e diluídos para 0,5 uni- dades/mL de Fosfatase Ácida em Citrato de Sódio a 20 mM, Tampão em pH 5,0. Amostras de vinte e quatro horas foram preparadas mistu-rando 100 μL de 0,5 unidades/mL de Tritossomas de Fosfatase Ácida com 25 μL de 0,4 mg/mL de amostra de siRNA em um tubo microcen- trífugo e incubando durante vinte e quatro horas em um Termomistu- rados Eppendorf configurado a 37°C e 300 rpm. Após vinte e quatro horas de incubação, 300 μL de Tampão de Carregamento de Lise Phenomenex (Cat.# ALO-8498) e 12,5 μL de um siRNA padrão interno a 0,4 mg/mL foram adicionados a cada amostra. Amostras de Tempo de 0 hora foram preparadas misturando 100 μL de 0,5 unidades/mL de Tritossomas de Fosfastase Ácida com 25 μL de 0,4 mg/mL de amostra de siRNA, 300 μL de Tampão de Carregamento de Lise Phenomenex, e 12,5 μL de um siRNA padrão interno a 0,4 mg/mL. siRNA foi extraído de amostras de vinte e quatro horas e amostras de 0 hora usando um Phenomenex Clarity OTX Starter Kit (Cat.# KSO-8494). Após as amos-tras serem extraídas, elas foram transferidas para um tubo microcentrí- fugo e secas usando um Concentrador Labconco CentriVap (Cat.# 7810010). As amostras foram em seguida ressuspensas com 500 μL de água sem nuclease. Cinquenta μL de cada amostra foram conduzidos em um Agilent Technologies 1260 Infinity Binary LC com Agilent Technologies 6130 Quadrupolo LC/MS. A análise foi conduzida usando configuração de coluna dupla em modo de regeneração. O método de bomba quaternária foi conduzido durante 12,20 minutos a 0,400mL/min com o seguinte calendário:
Figure img0023
[00600] O método de Bomba Binária foi conduzido durante 12,20 min a 0,700mL/min com o seguinte calendário:
Figure img0024
[00601] Ambas as colunas esquerda e direita foram configuradas a 75,00°C. O sinal UV foi medido a 260 nm de comprimento de onda. O per-centual restante de cada fita foi calculado usando a seguinte equação:
[00602] % de Fita restante = 100*(Área de PicoFilamento 24h/Área de PicoFilamento 0h*(Área de PicoPadrão 24h/Área de PicoPadrão 0h)).
[00603] Os resultados dos ensaios de estabilidade de tritossoma de vinte e quatro horas, fornecidos na Figura 1, demonstram que todas as duplas são altamente estáveis em tritossomas. Tabela 1. Sequências de Fita de Senso e Antissenso Modificadas de dsRNAs de TTR
Figure img0025
[00604] Tabela 2. Abreviações de monômeros de nucleotídeo usadas em representação de sequência de ácido nucleico. Será entendido que estes monômeros, quando presentes em um oligonucleotídeo, são mutuamente ligados por ligações de 5'-3'-fosfodiéster.
Figure img0026
Figure img0027
[00605] Um grupo adicional de agentes que alvejam TTR foi designado e sintetizado. As sequências destes agentes são fornecidas na Tabela 3, abaixo.
[00606] Estes agentes adicionais foram avaliados em ensaios in vi-tro. Em particular, a IC50 para cada agente de iRNA foi determinada em células Hep3B (uma cepa de célula de hepatoma humana) ou he- patócitos de cinomolgos primários (Life Technologies) por transfecção reversa padrão usando Lipofectamine RNAiMAX. Células Hep3b foram cultivadas em EMEM com 10% de FBS, enquanto hepatógicos cino- molgos primários foram descongelados imediatamente antes do uso e cultivados em WMEM com 10% de FBS. Transfecção reversa foi reali-zada adicionando 5 μL de dupla de RNA por poço em uma placa de 384 poços junto com 4,9 μL sde Opti-MEM plus 0,1 μL de Lipofectami- ne RNAiMax por poço (Invitrogen, Carlsbad CA. cat # 13778-150) e incubando em temperatura ambiente durante 15-20 minutos. Após a incubação, 40 μL de meio de crescimento completo sem antibiótico contendo 5.000 células Hep3B ou hepatócitos cinomolgos primários foram então adicionados a cada poço. Poços revestidos por colágeno foram usados para os hepatócitos primários. Células foram incubadas durante 24 horas a 37°C em uma atmosfera de 5% de CO2 antes da lise e análise de TTR e mRNA de GAPDH por RT-qPCR. Oito diferentes concentrações de siRNA variando de 10nM a 0,38fM foram avaliadas para a determinação de IC50 e TTR/GAPDH para células transfec- tadas por siRNA foi normalizado para células transfectadas com 10nM de siRNA de Luciferase.
[00607] Silenciamento de livre captação em hepatócitos de cinomo- lgos primários foi avaliado seguindo incubação com siRNA de TTR durante 24 horas. O método foi similar àquele descrito acima, com a exceção de que 5 μL de meio de crescimento completo foram substituídos pelos 5 μL contendo Lipofectamine RNAiMax e Optimem. Análise a jusante para mRNA de GAPDH e TTR foi realizada como descrito acima. Para uma curva de dose-resposta típica, siRNAs foram titulados de 500 nM a 0,1,8 pM por diluição serial de 8,6 vezes.
[00608] Os resultados destes ensaios (fornecidos na Tabela 4) de-monstram que todas as duplas inibem potencialmente a expressão de mRNA de TTR.
[00609] A estabilidade in vitro destes agentes adicionais foi também avaliada usando os ensaios de estabilidade de citosol e tritossoma descritos acima.
[00610] Os resultados do ensaio de estabilidade de citosol de vinte e quatro horas são fornecidos na Figura 2A e os resultados de ensaio de estabilidade de tritossoma de vinte e quatro horas são fornecidos na Figura 2B e demonstram que todas as duplas são altamente estáveis em tritossomas e citosol de rato. Tabela 3. Sequências de Fita de Senso e Antissenso Modificadas de dsRNAs de TTR
Figure img0028
Tabela 4. Atividade In vitro de Agentes de RNAi de *1 FTR Adicionais
Figure img0029
Legendas da figura acima: Hepatócitos de Cinomolgos; Transfecção; Captação Livre
Exemplo 2. Silenciamento de TTR In Vivo
[00611] A eficácia in vivo dos agentes adicionais descritos acima foi avaliada em camundongos transgênicos que expressam a variante valina 30 metionina de TTR humana (V30M hTTR) (veja, por exemplo, Nagata, et al. (1995) J Biochem. 117:169-175; Kohno, et al. (1997) Am J Pathol. 150(4):1497-508). A variante V30M de TTR é conhecida causar polineuropatia amiloide familiar tipo I em humanos. Veja, por exemplo, Lobato, L. (2003) J Nephrol., 16(3):438-42.
[00612] Camundongos TTR V30m com onze a treze meses de idade foram subcutaneamente administrados uma única dose de 1 mg/kg ou 2,5 mg/kg dos agentes e o nível de TTR foi determinado no soro da pré-dose dos animais e nos dias 3, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 56, 70 e 84 pós-dose. Em sintese, os níveis de TTR foram ensaiados usando um ensaio de imunoabsorvente ligado a enzima TTR validado (ELISA) (veja, por exemplo, Coelho, et al. (2013) N Engl J Med 369:819). Mi- croplacas com 96 poços foram revestidas a 4° com pAb de TTR antihumana de coelho (Abcam) 24 horas antes do início do ensaio ELISA de Proteína de Soro de TTR. No dia do ensaio, as placas foram lavadas em TBS-T, e bloqueadas em 1x Powerblock (Biogenex) durante 2 horas em temperatura ambiente. Amostras de soro foram diluídas 15.000 vezes em 1X Powerblock. Uma curva padrão de TTR humana de 12 pontos empregando um padrão de proteína de TTR humana (Sigma-Aldrich, P1742), foi gerada usando diluições seriais de 1,6x, variando de 250 a 0 ng/mL. Após o bloqueio, volumes de 100 μL de padrões e amostras foram adicionados à placa e deixados incubar durante 2 horas em temperatura ambiente. As placas foram lavadas em TBS-T, e incubadas durante 1 hora em temperatura ambiente com anticorpo primário AntihTTR de Ovelha (AbCam) diluído 1:2500 em 1X Powerblock. Após uma lavagem com TBS-T, as placas foram incubadas durante 1 hora em temperatura ambiente com anticorpo secundá- rio de fosfatase alcalina antiovelha de asno (AbCam) diluído 3:10000 em 1X Powerblock. As placas foram lavadas em TBS-T e volume de 100 μL de substrato preparado (comprimitos de fosfato de p-nitrofenila SIGMAFAST™) foi adicionado por poço e deixado reagir durante 30 minutos em temperatura ambiente no escuro. As reações foram saciadas com 0,05 ml por poço de NaOH a 1 M. Absorvência a 405 nm foi lida em uma leitora de placa SpectraMax, e os dados foram ajustados para uma curva de 4 parâmetros para determinar os níveis de proteína de TTR de soro em μg/mL. Os níveis de proteína de animais individuais foram normalizados para seus valores de proteína de plasma pré- dose individuais respectivos para determinar a fração de TTR restante relativa à pré-dose.
[00613] Os resultados dos experimentos de única dose de 1 mg/kg são fornecidos na Figura 3 e os resultados dos experimentos de única dose de 2,5 mg/kg são fornecidos na Figura 4. Os resultados demonstram que todos os agentes potencialmente e de forma durável inibem a expressão de TTR, com um ponto mais alto atingido em torno do dia 7 após a administração. Os resultados também demonstram que no dia 42 após uma única dose de 1 mg/kg de AD-65492, AD-66017, ou AD- 66018, mais do que 40% de supressão de TTR de soro permanece, e no dia 42 após uma única dose de 2,5 mg/kg de AD-65492 ou AD- 66018, mais do que 60% de supressão de TTR de soro permanece. Recuperação para concentrações de TTR de soro de linha de base ocorre entre 56 e 84 dias após a administração, após uma única dose de 1 mg/kg, e entre os dias 70 e 84 após administração seguindo uma única dose de 2,5 mg/kg.
[00614] A dose eficaz para 80% de silenciamento nos animais (ED80) foi calculada como 1 mg/kg. Estes dados, desse modo, indicam que AD-65492, AD-66016, AD-66017, e AD-66018 são eficazses para tratar um indivíduo tendo um transtorno associado com TTR em regi mes de dosagem de baixa dose e/ou mensal.
Exemplo 3. Estudo de Toxicidade Exploratória de Rato
[00615] Estudos de toxicidade preclínica de AD-66016, AD-65492, AD-66017, e AD-66018 foram também realizados em ratos. Em síntese, nos dias 1, 8, e 15, cinco ratos machos por grupo foram subcuta- neamente administrados ou uma dose de 30 mg/kg ou 100 mg/kg de AD-66016, AD-65492, AD-66017, ou AD-66018. Animais de controle foram administrados um placebo nos dias 1, 8, e 15. No dia 16, todos os animais foram sacrificados. Antes do sacrifício, os animais foram monitorados diariamente quanto a quaisquer sintomas clínicos e os pesos corporais foram medidos semanalmente. Após o sacrifício, os animais foram necropsiados, e as amostras aforam analisadas por completa química de soro, hematologia e painéis de coagulação, por histopatologia do fígado e rins, e para concentração de transaminase hepática.
[00616] Os resultados destas análises demonstram que AD-66016, AD-65492, AD-66017, e AD-66018 são clinicamente bem tolerados sem nenhum sinal clínico adverso ou mudanças de peso corporal.
Exemplo 4. Eficácia de Administração de Múltiplas Doses de AD- 65492 e AD-66017
[00617] O efeito de um regime de múltiplas doses de AD-65492 e AD-66017 na expressão de proteína de TTR em camundongos trans- gênicos (Tg) hTTR V30M foi avaliado.
[00618] Em um grupo de experimentos, camundongos hTTR V30M com onze a treze meses de idade foram subcutaneamente administrados uma dose semanal de 2 mg/kg de AD-65492 durante três semanas (QWx3) e o nível de proteína TTR foi determinado no soro dos animais pré-dose e nos dias 7, 14, 17, e 21 após a dose, como descrito acima.
[00619] A Figura 5 demonstra que a administração de AD-65492 em um regime de dosagem de QWx3 a camundongos hTTR V30M Tg ob-teve e sustentou uma supressão maior do que 90% de expressão de proteína de TTR de soro.
[00620] Em outro grupo de experimentos, AD-65492 e AD-66017 foram subcutaneamente administrados a camundongos hTTR V30M Tg com onze a treze meses de idade em uma dose de 0,3 mg/kg uma vez ao mês durante quatro meses (QMx4 @ 0,3 mg/kg), em uma dose de 1 mg/kg uma vez ao mês durante quatro meses (QM4 @ 1 mg/kg), ou em uma dose de 3 mg/kg uma vez ao mês durante quatro meses (QM4 @ 3 mg/kg). Os níveis de proteína de TTR de soro foram determinados como descrito acima pré-dose e nos dias 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 84, 91, 98, e 185 pós-dose.
[00621] Como mostrado nas Figuras 6A-6C, os níveis de nocaute de TTR no dia 7 pós-dose foram similares após segunda, terceira e quarta doses e o ponto mais alto de expressão de TTR obtido na dose de 3 mg/kg, 1 mg/kg e 0,3 mg/kg é maior do que 80%, cerca de 70 a 85%, e cerca de 25 a 35%, respectivamente. Estes gráficos também demonstram que AD-65492 fornece um nível mais sustentado de si- lenciamento de TTR do que AD-66017, para mais de 100 dias após a dose final, com cerca de 60%, 40%, e cerca de 35% de supressão de TTR restante a 3 mg/kg, 1 mg/kg, e 0,3 mg/kg, respectivamente. Além disso, para AD-65492, multi-dosagem (QMx4) é aditiva na dose de 0,3 mg/kg resultando em cerca de 40% de nocaute de TTR após a quarta dosagem mensal, quando comparado à primeira dose tendo um nocaute de cerca de 25 a 35%. Além disso, embora existisse alguma recuperação dos níveis de proteína de TTR antes de cada dose mental em todos os níveis de dose para cada agente, como uma única dose subcutânea, a dose eficaz para obter 80% de nocaute (ED80) para os regimes de múltiplas doses foi calculada como cerca de 1 mg/kg. Desse modo, a atividade farmacodinâmica e cinéticas de ambos os com- postos em todos os três regimes de dose foram comparáveis à atividade farmacodinâmica e cinéticas dos mesmos compostos quando administrados como uma dose única.
Exemplo 5. Silenciamento de TTR em Primatas Não Humanos
[00622] Como demonstrado nos Exemplos acima, AD-65492 e AD- 66017 são bem tolerados e potentemente e de forma durável suprimem os níveis da proteína de TTR in vivo.
[00623] Consequentemente, a eficácia de AD-65492 e AD-66017 foi também estudada pela administração de diferentes doses e diferentes regimes de dosagem destes agentes de iRNA em macacos Cinomol- gos. A Figura 7 fornece um esboço deste estudo. Em síntese, quatro grupos, Grupos 1, 2, 4, e 5, foram subcutaneamente administrados ou uma única dose de 0,3 mg/kg (Grupos 1 e 4) ou uma única dose de 1 mg/kg do agente de iRNA (Grupos 2 e 5). Quatro outros grupos, Grupos 3 e 6-8, foram administrados uma dose mental de 1 mg/kg durante 4 meses (QMx4) (Grupos 7 e 8) ou uma dose mensal de 3 mg/kg durante 4 meses (QMx4) (Grupos 3 e 6). Soro foi coletado nos Dias -7 e - 1 pré-dose e dias 3, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77, 84, 91, 105, e 119 pós-dose; plasma foi coletado no dia 1 pré-dose, e 0,5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96 e 168 horas pós dose. O nível de soro de proteína de TTR foi determinado como descrito acima.
[00624] A Figura 8A fornece os resultados do estudo de única dose de 0,3 mg/kg, a Figura 8B fornece os resultados do estudo de dose única de 1 mg/kg, e a Figura 8C fornece os resultados do estudo de dose única de 3 mg/kg. Para os propósitos de comparação, a Figura 8B também representa o efeito de administração de uma única dose subcutânea de 2,5 mg/kg de AD-51547 na expressão de TTR em macacos Cinomolgos, e Figura 8C também representa o efeito de administração de uma única dose subcutânea de 5 mg/kg de AD-51547 na expressão de TTR em macacos Cinomolgos. Estesa gráficos demons- tram que a ED50 para ambos os agentes de iRNA AD-65492 e AD- 66017 é de cerca de 0,3 mg/kg, que o ponto mais alto de expressão de TTR é alcançado em torno do dia 28 para ambas as doses e para ambos os agentes de iRNA, e que AD-65492 é mais eficaz na supressão de expressão de proteína de TTR do que AD-66017 no maior nível de dose com uma única dose. Os gráficos também demonstram que AD- 65942 fornece mais de 90% de supressão sustentada de expressão de TTR até o Dia 42 seguindo uma única dose de 1 mg/kg e mais de 80% de supressão de TTR até o Dia 63, com cerca de 40% restando supressão de TTR no dia 119 pós-dose, e que AD-66017 fornece um máximo de 73% supressão de expressão de TTR após uma única dose de 1 mg/kg, com recuperação de expressão de TTR começando antes do Dia 35 e recuperação para cerca de 20% de linha de base no dia 119 pós-dose.
[00625] A Figura 9A fornece os resultados do estudo de múltiplas doses de 1 mg/kg e a Figura 9B fornece os resultados do estudo de múltiplas doses de 3 mg/kg para AD-65492 e AD-66017. Para os propósitos de comparação, a Figura 9A também representa o efeito da administração de uma dose diária de 5 mg/kg de AD-51547 durante 5 dias (primeiras cinco setas nos dias 0-4), seguida por uma dose semanal de 5 mg/kg durante quatro semanas (setas nos dias 7, 14, 21, e 28) (QDx5, QWx4) na expressão de TTR em macacos Cinomolgos. Os gráficos demonstram que ambos os agentes de iRNA fornecem robusta supressão de proteína de TTR e que ambos os agentes de iRNA suprimem completamente a expressão de proteína de TTR entre os Dias 21 e 28 na dose de 3 mg/kg. Os gráficos também demonstram que AD-65492 é mais eficaz do que AD-66017 na dose de 1 mg/kg. Além disso, os gráficos demonstram que o ponto mais alto de expressão de TTR é alcançado entre os Dias 35 e 42 para ambos os agentes de iRNA a 1 mg/kg, com mais de 85% de supressão antes da segunda dose mensal de AD-65492, e cerca de 70% de supressão antes da segunda dose mensal de AD-66017. Manutenção de cerca de 95% e 85% de supressão após a terceira e quarta doses mensais para AD- 65492 e AD-66017, respectivamente, foi obtida.
[00626] Além disso, como demonstrado na Figura 10A, dosagem mensal (QMx4) de AD-65492 resulta em manutenção de mais de 95% de supressão de TTR e, como demonstrado na Figura 10B, múltipla dosagem (QMx4) de AD-66017 é aditiva na dose de 1 mg/kg. A Figura 10B também demonstra que existe 85% de supressão de expressão de proteína de TTR após a segunda dose mensal de AD-66017 e que esta supressão é mantida com a terceira e quarta doses mensais.
Exemplo 6. Projeto e Síntese de Agentes Quimicamente Modificados Alvejamento de TTR
[00627] Agentes de RNAi de fita dupla adicional alvejando TTR em que substancialmente todos os nucleotídeos de fita de senso e subs-tancialmente todos os nucleotídeos de fita antissenso são nucleotídeos modificados e compreendendo uma fita antissenso compreendendo uma região de complementaridade para SEQ ID NO:2 foram designados e sintetizados como descrito acima.
[00628] As sequências de nucleotídeo das fitas de senso e antis- senso destes agentes são fornecidos na Tabela 5.
Exemplo 7. Projeto e Síntese de Agentes Quimicamente Modificados Alvejando TTR
[00629] Agentes de RNAi de fita dupla adicionais alvejando TTR foram designados e sintetizados como descrito acima.
[00630] As sequências de nucleotídeo das fitas de senso e antis- senso modificados destes agentes são fornecidos na Tabela 6, e as sequências de nucleotídeo das fitas de senso e antissenso modificados destes agentes são fornecidos na Tabela 7. Tabela 5. Sequências de Fita de Senso e Antissenso Modificadas de dsRNAs de TTR
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Figure img0031
Tabela 6. Sequências de Fita de Senso e Antissenso Não Modificadas de dsRNAs de TTR
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Tabela 7. Sequências de Fita de Senso e Antissenso Modificadas de dsRNAs de TTR
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Exemplo 8. Administração de AD-65492 a Macacos Cinomolgos
[00631] A eficácia de AD-65492 foi também avaliada pela administração a macacos Cinomolgos.
[00632] Em um primeiro conjunto de experimentos, quatro grupos (Grupos 1, 2, 3, e 7), foram subcutaneamente administrados uma única dose de 0,3 mg/kg (Grupo 1); uma única dose de 1 mg/kg (Grupo 2); uma dose mensal de 1 mg/kg durante 4 meses (QMx4) (Grupo 7); ou uma dose mensal de 3 mg/kg durante 4 meses (QMx4) (Grupo 3).
[00633] Soro, plasma, e escassas amostras de fígado foram coletados pré-dose e nos dias 3, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77, 84, 91, 98, 112, 126, 154, 175, 203, 230, 260, 290, 310, 335, e 364 para os Grupos 3 e 4.
[00634] Para os Grupos 1 e 2, soro foi coletado nos dias -7 e -1 pré- dose, e dias 3, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77, 84, 91, 105, e 119 pós-dose; plasma foi coletado no dia 1 pré-dose, e 0,5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96 e 168 horas pós-dose.
[00635] Para os Grupos 3 e 7 soro foi coletado nos dias -7 e -1 pré- dose, e dias 3, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77, 84, 91, 98, 112, 127, 155, 176, 204, 232, 260, 288, 316, 344 e 372 pós-dose; plasma foi coletado no dia 1 pré-dose, e 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 96 e 168 horas pós-dose; plasma foi também coletado no dia 85 pré-dose e 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 96 e 168 horas pós-dose.
[00636] Para o Grupo 7, escassas amostras de fígado foram coletados no dia 1, oito horas pré-dose (isto é, 8 horas antes da dose de AD- 65492 ser administrada ao indivíduo, uma escassa amostra de fígado foi coletada do indivíduo); e em pós-dose dia 7; dia 22; dia 29, oito horas pré-dose; dia 57, oito horas pré-dose; dia 85, oito horas pré-dose; dia 91; dia 106; e dia 141.
[00637] Para o Grupo 3, escassas amostras de fígado foram coletados pós-dose no dia 29, oito horas pré-dose; dia 57, oito horas pré- dose; dia 85, oito horas pré-dose; dia 91, dia 106, e dia 141.
[00638] O nível de soro de proteína de TTR foi determinado como descrito acima.
[00639] A Figura 11 fornece os resultados destes estudos, e mostra robusta supressão de expressão de TTR obtida pela administração de AD-65492. Os dados demonstram que AD-65492 fornece mais de 90% de supressão sustentada de expressão de TTR durante aproximadamente 6 semanas e 17 semanas após a dose final seguindo dosagem mensal durante quatro meses (QMx4) com 1 mg/kg (Grupo 7) de AD- 65492 ou 3 mg/kg de AD-65492 (Grupo 3), respectivamente. Os dados também demonstram cerca de 40% de supressão de expressão de TTR em 17 semanas após a dose final seguindo dosagem mensal durante quatro meses (QMx4) com 1 mg/kg de AD-65492 (Grupo 7).
[00640] Os dados indicam que a dosagem trimestral de indivíduos humanos com AD-65492 seria eficaz na supressão de expressão de TTR em um nível de dose intermediário a 1 mg/kg e 3 mg/kg, por exemplo, 2 mg/kg, assumindo uma translação de 1:1 entre a dosagem em macacos Cinomolgos e humanos.
[00641] Em um segundo grupo de experimentos, três grupos (Grupos 9, 10, e 11; veja a Figura 12), foram subcutaneamente administrados uma dose mensal de 0,3 mg/kg durante 6 meses (QMx6) (Grupo 9); uma dose mensal de 0,6 mg/kg durante 6 meses (QMx6) (Grupo 10); ou uma dose inicial dose de 1 mg/kg seguida por uma dose de manutenção mensal de 0,3 mg/kg durante um mês (QMx1) após a dose inicial durante cinco meses (QMx5) (Grupo 11).
[00642] Amostras de soro foram coletados nos dias -7 e -1 pré- dose, e dias 4, 8, 11, 15, 22, 29, 36, 43, 50, 57, 64, 71, 78, 85, 92, 99, 113, 127, 155, 176, e 204, 232, 260 e 288 pós-dose. O nível de soro de proteína de TTR foi determinado como descrito acima.
[00643] A Figura 13 fornece os resultados destes estudos, e de- monstra robusta supressão de TTR obtida por AD-65492 após uma dose mensal de 0,6 mg/kg durante dois meses (QMx2), que é comparável à supressão de expressão de TTR seguindo uma dose inicial de 1 mg/kg. Os dados também demonstram que AD-65492 fornece cerca de 80% de supressão sustentada de expressão de TTR após dosagem mensal durante dois meses a 0,3 mg/kg; três de quatro macacos obtiveram 60% a 85% de supressão de TTR seguindo uma dose mensal de 0,3 mg/kg de AD-65492 durante dois meses. Até 90% de supressão de expressão de TTR foram demonstrados seguiindo uma dose única de 1 mg/kg, com uma segunda dose de 0,3 mg/kg mantendo o ponto mais alto durante três semanas após dosagem da segunda dose.
Equivalentes:
[00644] Aqueles versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes para as modalidades específicas e métodos descritos aqui. Pretende-se que tais equivalentes sejam abrangidos pelo escopo das reivindicação a seguir.

Claims (16)

1. Agente de ácido ribonucleico (RNAi) de fita dupla para inibição da expressão de transtiretina (TTR) em uma célula, caracteri-zado pelo fato de que compreende uma fita senso complementar a uma fita antissenso, em que a referida fita antissenso compreende uma região totalmente complementar à SEQ ID NO: 2, em que cada fita tem 14-30 nucleotídeos de comprimento, em que substancialmente todos os nucleotídeos da fita senso e substancialmente todos os nucleotídeos da fita antissenso são nucleotídeos modificados, em que a fita senso compreende não mais do que 8 modifi-cações de 2’-fluoro; em que a fita antissenso compreende não mais do que 6 modificações de 2’-fluoro; em que a fita senso e a fita antissenso compreendem cada qual independentemente duas ligações de fosforotioato no terminal 5’; e em que a fita senso é conjugada a pelo menos um ligante.
2. Agente de RNAi de fita dupla, de acordo com a reivindi-cação 1, caracterizado pelo fato de que é representado pela fórmula (IIIe): senso: 5’- Na-YYY-Nb - 3’ antissenso: 3’- np’-Na’ - Y’Y’Y’-Nb’-5’(IIIe) em que: np’ é uma projeção de 2 nucleotídeos, e cada nucleotídeo dentro de np' está ligado a um nucleotídeo adjacente através de uma ligação de fosforotioato; cada Na, Nb, Na’ e Nb’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 0-25 nucleotídeos que são modificados ou não modificados ou suas combinações, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de forma diferente; YYY e Y’Y’Y’ representam cada qual independentemente um motif de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos.
3. Agente de RNAi de fita dupla, de acordo com a reivin-dicação 2, caracterizado pelo fato de que (I) o motif YYY ocorre no ou perto do sítio de clivagem da fita senso; (II) o motif Y’Y’Y’ ocorre nas posições 11, 12 e 13 da fita antissenso a partir da extremidade 5’; (III) os nucleotídeos Y contêm uma modificação de 2’- fluoro; (IV) os nucleotídeos Y’ contêm uma modificação de 2’-O- metila; (V) a região de fita dupla tem 15-30, 17-23, 17-25, 23-27, 19-21 ou 21-23 pares de nucleotídeos de comprimento; e/ou (VI) cada fita possui 15-30 ou 19-30 nucleotídeos.
4. Agente de RNAi de fita dupla, de acordo com a reivin-dicação 1, caracterizado pelo fato de que: (I) as modificações nos nucleotídeos são selecionadas dentre o grupo consistindo em um desoxinucleotídeo, um desoxinu- cleotídeo-timina (dT) da extremidade 3’, um nucleotídeo modificado por 2’-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2’-fluoro, um nucleo- tídeo modificado por 2’-desóxi, um nucleotídeo bloqueado, um nu- cleotídeo desbloqueado, um nucleotídeo conformacionalmente restrito, um nucleotídeo de etila constrangida, um nucleotídeo abásico, um nucleotídeo modificado por 2’-amino, um nucleotídeo modificado por 2’-O-alila, um nucleotídeo modificado por 2’-C-alquila, um nucle- otídeo modificado por 2’-hidroxila, um nucleotídeo modificado por 2’- metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2’-O-alquila, um nucleo- tídeo de morfolino, um fosforamidato, uma base não natural com-preendendo nucleotídeo, um nucleotídeo modificado por tetra- hidropirano, um nucleotídeo modificado por 1,5-anidro-hexitol, um nucleotídeo modificado por ciclo-hexenila, um nucleotídeo compre-endendo um grupo fosforotioato, um nucleotídeo compreendendo um grupo metilfosfonato, um nucleotídeo compreendendo um 5’- fosfato, e um nucleotídeo compreendendo um mimético de 5’- fosfato, e suas combinações, opcionalmente em que as modificações nos nucleotídeos são modificações de 2’-O-metila ou 2’-fluoro; (II) a fita senso compreende não mais do que 6, 5 ou 4 modificações de 2’-fluoro; (III) a fita antissenso compreende não mais do que 5, 4, 3 ou 2 modificações de 2’-fluoro; (IV) o agente de RNAi de fita dupla compreende ainda um 5’-fosfato ou um mimético de 5’ -fosfato no nucleotídeo 5’ da fita an- tissenso; (V) o agente de RNAi de fita dupla compreende ainda um mimético de 5'-fosfato no nucleotídeo 5' da fita antissenso, opcionalmente em que o mimético de 5'-fosfato é um 5'-vinil fosfato (5'-VP); (VI) o ligante é um ou mais derivados de GalNAc ligados através de um ligante ramificado bivalente ou trivalente; (VII) o ligante é
Figure img0036
(VIII) o ligante está ligado à extremidade 3’ da fita senso, opcionalmente em que o agente de RNAi está conjugado com o ligante como mostrado no seguinte esquema
Figure img0037
em que X é O ou S; (IX) as fitas antissenso compreendem uma sequência de nucleotídeo selecionada dentre o grupo que consiste em 5’- usCfsuugguuacaugAfaaucccasusc - 3’ (SEQ ID NO: 6), 5’- usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3’ (SEQ ID NO: 7), 5’- UfsCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3’ (SEQ ID NO: 8), e 5’- VPusCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3’ (SEQ ID NO: 9), em que a, c, g e u são 2’-O-metila (2’-OMe) A, C, G e U, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf são 2’-flúor A, C, G e U, respectivamente; s é uma ligação de fosforotioato; e VP é um mimético de 5’-fosfato; (X) as fitas de senso e antissenso compreendem as se-quências de nucleotídeo selecionadas dentre o grupo consistindo em 5’- usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga - 3’ (SEQ ID NO: 10) e 5’- usCfsuugguuacaugAfaaucccasusc - 3’ (SEQ ID NO: 6); 5’- usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga - 3’ (SEQ ID NO: 10) e 5’- usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3’ (SEQ ID NO: 7); 5’- usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga - 3’ (SEQ ID NO: 10) e 5’- UfsCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3’ (SEQ ID NO: 8); e 5’- usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga - 3’ (SEQ ID NO: 10) e 5’- VPusCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3’ (SEQ ID NO: 9), em que a, c, g e u são 2’-O-metila (2’-OMe) A, C, G e U, respectivamen- te; Af, Cf, Gf e Uf são 2’-flúor A, C, G e U, respectivamente; e s é uma ligação de fosforotioato; e VP é um mitético de 5’-fosfato; e/ou (XI) o referido agente de RNAi é selecionado dentre o grupo de agentes de RNAi listados em qualquer uma das Tabelas 1, 3, 5, 6 ou 7.
5. Agente de RNAi de fita dupla, de acordo com a reivin-dicação 1, caracterizado pelo fato de que as fitas de senso e antis- senso compreendem as sequências de nucleotídeo 5’- usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga - 3’ (SEQ ID NO: 10) e 5’- usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3’ (SEQ ID NO: 7), em que a, c, g e u são 2’-O-metila (2’-OMe) A, C, G e U, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf são 2’-flúor A, C, G e U, respectivamente; e s é uma ligação de fosforotioato.
6. Agente de RNAi de fita dupla, de acordo com a reivin-dicação 5, caracterizado pelo fato de que as fitas de senso e antis- senso consistem nas sequências de nucleotídeo 5’- usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga - 3’ (SEQ ID NO: 10) e 5’- usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3’ (SEQ ID NO: 7), em que a, c, g e u são 2’-O-metila (2’-OMe) A, C, G e U, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf são 2’-flúor A, C, G e U, respecti-vamente; e s é uma ligação de fosforotioato; em que o ligante está ligado à extremidade 3’ da fita senso, em que o agente de RNAi está conjugado com o ligante como mostrado no seguinte esquema
Figure img0038
em que X é O.
7. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o agente de RNAi de fita dupla, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, opcionalmente em que: (I) o agente de RNAi de fita dupla é administrado em uma solução não tamponada, opcionalmente em que a referida solução não tamponada é solução salina ou água; e/ou (II) o referido agente de RNAi de fita dupla é administrado com uma solução tampão, em que opcionalmente (a) a referida solução tampão compreende acetato, citrato, prolamina, carbonato ou fosfato ou qualquer combinação dos mesmos, ou (b) a referida solução tampão é solução salina tamponada com fosfato (PBS).
8. Método in vitro para inibição da expressão de transtireti- na (TTR) em uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende: contatar a célula com o agente de RNAi de fita dupla, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou com a compo-sição farmacêutica, como definida na reivindicação 7, inibindo assim a expressão do gene de TTR na célula, em que opcionalmente a expressão de TTR é inibida em pelo menos cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 98% ou cerca de 100%.
9. Agente de RNAi de fita dupla, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado(a) pelo fato de que é para uso em um método para tratamento de um indivíduo que sofre de uma doença associada a TTR ou em risco de desenvolver uma doença associada a TTR, o referido método compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz ou uma quantidade profilaticamente efi- caz do agente de RNAi de fita dupla, ou da composição farmacêutica, tratando assim o referido indivíduo.
10. Agente de RNAi de fita dupla, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou composição, de acordo com a reivin-dicação 7, caracterizado pelo fato de que é para uso em: (I) um método para reduzir, desacelerar ou interromper uma Pontuação de Comprometimento de Neuropatia (NIS) ou uma NIS modificada (mNIS + 7) em um indivíduo que sofre de uma doença as-sociada a TTR ou está em risco de desenvolver uma doença associada a TTR, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz ou uma quantidade profilaticamente eficaz do agente de RNAi de fita dupla, ou da composição farmacêutica, reduzindo, desacelerando ou interrompendo uma Pontuação de Comprometimento de Neuropatia (NIS) ou uma NIS modificada (mNIS + 7) no referido indivíduo; ou (II) um método para aumentar um teste de caminhada de 6 minutos (6MWT) em um indivíduo que sofre de uma doença associada a TTR ou está em risco de desenvolver uma doença associada a TTR, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade te- rapeuticamente eficaz ou uma quantidade profilaticamente eficaz do agente de RNAi de fita dupla, ou da composição farmacêutica, aumen-tando assim um teste de caminhada de 6 minutos (6MWT) no referido indivíduo.
11. Agente de RNAi de fita dupla ou composição, de acordo com as reivindicações 9 ou 10, caracterizado(a) pelo fato de que: (I) o indivíduo é um ser humano; (II) o referido indivíduo é um indivíduo que sofre de uma doença associada a TTR; (III) o referido indivíduo é um indivíduo em risco de desen-volver uma doença associada a TTR; (IV) o referido indivíduo carrega uma mutação no gene da TTR que está associada ao desenvolvimento de uma doença associada a TTR; (V) a referida doença associada a TTR é selecionada dentre o grupo que consiste em amiloidose sistêmica senil (SSA), amiloi- dose familiar sistêmica, polineuropatia amiloidótica familiar (FAP), car- diomiopatia amiloidótica familiar (FAC), amiloidose leptomenín- gea/Sistema Nervoso Central (SNC), e hipertiroxinemia; (VI) o referido indivíduo tem uma amiloidose associada a TTR e o referido método reduz um depósito de TTR amilóide no referido indivíduo; (VII) o referido agente de RNAi de fita dupla é administrado ao referido indivíduo por um meio de administração selecionada dentre o grupo que consiste em subcutânea, intravenosa, intramuscular, in- trabrônquica, intrapleural, intraperitoneal, intra-arterial, linfática, cérebro-espinhal e quaisquer combinações das mesmas; (VIII) o referido agente RNAi de fita dupla é administrado ao referido indivíduo por via subcutânea, intramuscular ou intravenosa; (IX) o referido agente de RNAi de fita dupla é administrado ao referido indivíduo por meio de administração subcutânea, opcionalmente em que a administração subcutânea é auto-administração, opcionalmente, em que a auto-administração é através de uma seringa pré-cheia ou seringa auto-injetora; e/ou (X) o método compreende ainda avaliar o nível de expressão de mRNA de TTR ou expressão de proteína TTR em uma amostra derivada do indivíduo.
12. Agente de RNAi de fita dupla, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é para uso em: (I) um método para tratamento de um indivíduo que sofre de uma doença associada a TTR ou está em risco de desenvolver uma doença associada a TTR; (II) um método para reduzir, desacelerar ou interromper uma Pontuação de Comprometimento de Neuropatia (NIS) ou uma NIS modificada (mNIS + 7) em um indivíduo que sofre de uma doença associada a TTR ou está em risco de desenvolver uma doença asso-ciada a TTR; ou (III) um método para aumentar um teste de caminhada de 6 minutos (6MWT) em um indivíduo que sofre de uma doença associada a TTR ou está em risco de desenvolver uma doença associada a TTR.
13. Agente de RNAi de fita dupla, de acordo com a reivindi-cação 12, caracterizado pelo fato de que: (I) o agente de RNAi de fita dupla é cronicamente adminis-trado ao indivíduo; (II) o indivíduo é um ser humano, opcionalmente em que o referido indivíduo é um indivíduo que sofre de uma doença associada a TTR ou o referido indivíduo é um indivíduo em risco de desenvolver uma doença associada a TTR; (III) o referido indivíduo carrega uma mutação no gene da TTR que está associada ao desenvolvimento de uma doença associada a TTR, em que a referida doença associada a TTR é selecionada dentre o grupo que consiste em amiloidose sistêmica senil (SSA), ami- loidose familiar sistêmica, polineuropatia amiloidótica familiar (FAP), cardiomiopatia amiloidótica familiar (FAC), amiloidose leptomenín- gea/Sistema Nervoso Central (SNC) e hipertiroxinemia; (IV) o referido indivíduo tem uma amiloidose associada a TTR e o referido método reduz um depósito de TTR amilóide no referido indivíduo; (V) o referido agente de RNAi de fita dupla é administrado ao referido indivíduo por (a) um meio de administração selecionada dentre o grupo que consiste em subcutânea, intravenosa, intramuscular, intrabrônquica, intrapleural, intraperitoneal, intra-arterial, linfática, cérebro-espinhal e quaisquer combinações das mesmas, (b) o referido agente de RNAi de fita dupla é administrado ao referido indivíduo via administração subcutânea, intramuscular ou intravenosa, ou (c) o refe-rido agente de RNAi de fita dupla é administrado ao referido indivíduo via administração subcutânea, em que opcionalmente a administração subcutânea é auto-administração, em que opcionalmente a auto- administração é através de uma seringa pré-cheia ou seringa auto- injetora; e/ou (VI) o método compreende ainda avaliar o nível de expressão de mRNA de TTR ou expressão de proteína TTR em uma amostra derivada do indivíduo.
14. Agente de RNAi de fita dupla, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, caracterizado pelo fato de que as fitas senso e antissenso do agente compreendem as sequências de nucleo- tídeos 5’- usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga - 3’ (SEQ ID NO: 10) e 5’- usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3’ (SEQ ID NO: 7), em que a, c, g e u são 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G e U, res-pectivamente; Af, Cf, Gf e Uf são 2'-flúor A, C, G e U, respectivamente; e s é uma ligação fosforotioato.
15. Agente de RNAi de fita dupla, de acordo com a reivindi-cação 14, caracterizado pelo fato de que as fitas senso e antissenso consistem nas sequências de nucleotídeos 5’- usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga - 3’ (SEQ ID NO: 10) e 5’- usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc - 3’ (SEQ ID NO: 7), em que a, c, g e u são 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G e U, res-pectivamente; Af, Cf, Gf e Uf são 2'-flúor A, C, G e U, respectivamente; e s é uma ligação fosforotioato em que o ligante está ligado à extremidade 3' da fita senso, em que o agente de RNAi está conjugado ao ligante, conforme mostrado no esquema a seguir
Figure img0039
em que X é O.
16. Uso do agente de RNAi de fita dupla, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou da composição farmacêutica, como definida na reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento ou uma composição farmacêutica para: (a) o tratamento de um indivíduo humano que sofre de uma doença associada à TTR ou está em risco de desenvolver uma doença associada à TTR; (b) a redução, desaceleração ou interrupção de uma Pon-tuação de Comprometimento de Neuropatia (NIS) ou um NIS modificado (mNIS+7) em um indivíduo humano que sofre de uma doença associada à TTR ou está em risco de desenvolver uma doença associada à TTR; e/ou (c) aumentar um teste de caminhada de 6 minutos (6MWT) em um indivíduo humano que sofre de uma doença associada à TTR ou está em risco de desenvolver uma doença associada à TTR.
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