BR112017013453B1 - Produto, composição farmacêutica e uso do peptídeo de fusão - Google Patents

Abstract

NOVO PEPTÍDEO INIBIDOR DE PI3Ky PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS DO SISTEMA RESPIRATÓRIO. Peptídeo de fusão compreendendo: i) uma sequência de aminoácidos como definido na SEQ ID No: 1, ou um homólogo relacionado com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID No: 1 e possuindo a capacidade da sequência SEQ ID N°: 1 para inibir a função quinase independente de PI3K, e ii) um peptídeo possuindo a capacidade de penetrar numa célula.

Description

CAMPO DE INVENÇÃO

[0001] A presente descrição se refere a um novo inibidor peptídico de PI3KY para o tratamento de patologias do aparelho respiratório.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] A asma é uma doença respiratória crônica caracterizada por inflamação, hiperresponsabilidade das vias aéreas (AHR) e edema da mucosa, que em conjunto conduzem à broncoconstrição episódica e à obstrução das vias aéreas. A eficácia dos atuais tratamentos anti-asmáticos é insatisfatória, e a asma permanece como uma questão global não resolvida.

[0003] O tônus da musculatura das vias aéreas é determinado por um delicado equilíbrio entre a ativação das vias de sinalização pró-contrátil e pró-relaxamento em células musculares lisas. A contração é desencadeada principalmente por acetilcolina, o principal neurotransmissor parassimpático nas vias respiratórias, que ativa os receptores muscarínicos M3, levando a mobilização de cálcio intracelular e extracelular (Ca2+). Por outro lado, o relaxamento das vias aéreas é alcançado por ativação mediada por catecolamina de e2-adrenérgicos (β2-AR), que promovem a produção de AMP cíclico (AMPc) e a consequente modulação de efetores principais da homeostase de Ca2+. De acordo com a ação pró-relaxante de AMPc, os agonistas de β2-ARs proporcionam alívio sintomático de broncoespasmo em pacientes com asma. No entanto, a sua eficácia é limitada no tempo, principalmente devido à dessensibilização de β2-ARs que ocorre após a exposição repetida a agonistas. Da mesma forma, a inibição da degradação de cAMP por inibidores da fosfodiesterase 4 (PDE4), as principais enzimas responsáveis pela hidrólise de cAMP nas vias aéreas, foi clinicamente testada, mas apresenta efeitos colaterais inaceitáveis, como vômitos, náuseas, diarréia e perda de peso, devido a uma inibição não - seletiva da PDE4 no sistema nervoso central.

[0004] Portanto, a identificação de novas enzimas que regulam a homeostase de cAMP, assim como novas estratégias para manipular a via de transdução de sinal β 2-Ar / cAMP em células do músculo liso é desejável para o tratamento de doenças respiratórias. Além disso, a mesma abordagem também pode ser usada para fins terapêuticos em outros contextos patológicos, como a fibrose cística, onde é necessário aumentar os níveis de AMPc nas células epiteliais das vias aéreas.

[0005] No epitélio respiratório, a produção de cAMP a seguir de β2-ARs é necessária para garantir a abertura do canal de cloreto dependente de cAMP (regulador da condutância transmembranar da fibrose cística, CFTR). Mutações no gene que codifica para esta proteína são a principal causa de fibrose cística (FC). Entre estes, a deleção de fenilalanina 508 (ΔF508) constitui a alteração mais comum em pacientes com FC e leva a defeitos tanto na expressão da membrana quanto na abertura do canal. Foram desenvolvidos vários fármacos corretores e potenciadores CFTR, que resgatam a expressão da membrana e a abertura mediada pelo AMPc do canal, respectivamente, mas sua eficácia não é satisfatória. Em particular, os potenciadores CFTR requerem altas concentrações de cAMP intracelular para serem eficazes. Portanto, os medicamentos capazes de estimular os níveis de cAMP podem constituir novas estratégias para aumentar a eficácia dos tratamentos atualmente disponíveis ou corrigir diretamente defeitos funcionais da CFTR na FC.

[0006] Estudos anteriores demonstraram que o fosfoinositídeo (phosphoinositide) Y 3-quinase (PI3KY) controla a compartimentalização de cAMP a seguir de β 2-AR. Nos cardiomiócitos, PI3KY atua como uma proteína âncora (AKAP) (1), que liga a proteína quinase A (PKA) a várias isoformas de PDE3 e PDE4. PKA, por sua vez fosforila e promove a ativação das PDE e a consequente redução de cAMP a seguir de PI3KY β 2-ARs associado, em última análise, limitando a libertação arritmogênica de Ca2+ (2). Embora tenham sido desenvolvidos vários inibidores da atividade da quinase de PI3KY, não existem atualmente métodos para se interferir seletivamente na atividade de proteína de adaptador ou de âncora de PI3KY.

SUMARIO DA INVENÇÃO

[0007] Levando em conta estas premissas, existe, portanto, necessidade de soluções melhoradas e mais eficazes para o tratamento de doenças do sistema respiratório em comparação com as terapias conhecidas.

[0008] De acordo com a invenção, o objeto acima mencionado é conseguido graças à solução especificamente ressaltada nas reivindicações anexas, que constituem parte integrante do presente relatório descritivo.

[0009] Uma forma de realização da presente invenção se refere a um peptídeo de fusão compreendendo: i) uma sequência de aminoácidos como definida na SEQ ID NO: 1 ou um homólogo relacionado tendo pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NO: 1 e tendo a habilidade da sequência SEQ ID NO: 1 para inibir a função independente quinase de PI3KY, e ii) um peptídeo que tem a habilidade de penetrar numa célula, para utilização como um medicamento, em particular para o tratamento de doenças respiratórias.

[0010] Uma forma de realização diferente da presente invenção se refere a um produto compreendendo i) um peptídeo de fusão como definido acima e ii) um potenciador do regulador de condutância transmembranar de fibrose cística (CFTR) e / ou um corretor do regulador de condutância transmembranar de fibrose cística (CFTR) como uma preparação combinada para uso sequencial, simultânea ou separada para o tratamento de doenças respiratórias, de preferência fibrose cística.

[0011] A presente descrição proporciona, in vitro e in vivo, evidência experimental da eficácia do tratamento de patologias do sistema respiratório por meio de administração de um peptídeo de fusão compreendendo os resíduos 126150 da PI3KY Humana (SEQ ID No: 1), ou seus homólogos. O peptídeo de fusão da presente descrição é, de fato, capaz de inibir a interação entre a PKA e PI3KY e, consequentemente, de reduzir a atividade das PDE associadas com PI3KY, o aumento dos níveis de cAMP e reduzir a entrada de Ca2+ através canais de cálcio operados por voltagem (VOCCs). Além disso, o peptídeo de fusão aqui descrito aumenta os níveis de cAMP in vivo nas vias aéreas e funciona como um broncodilatador quando administrado por uma via intra-traqueal a camundongos saudáveis e asmáticos. Por fim, o peptídeo de fusão realiza a função de potenciador CFTR, com aumento de cAMP, aumentando assim a condutância de cloreto (Cl-) de CFTR em linhas de células epiteliais brônquicas que expressam o tipo selvagem ou um gene CFTR mutante ΔF508, que é a mutação mais frequente em pacientes com fibrose cística.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0012] A invenção será agora descrita em detalhes, apenas a título de exemplo ilustrativo e não limitativo, com referência às figuras anexas, em que: - Figura 1. Um peptídeo Troiano derivado de PI3KY que inibe a atividade de PDE e aumenta a sinalização de β 2-Ar / cAMP em células do músculo liso das vias aéreas. A) Representação esquemática do peptídeo inibidor PI3KY permeável às membranas celulares. A região de PI3KY Humana 126-150 foi fundida com a sequência de Penetratina 1 de Antennapedia. B) Localização intracelular do peptídeo troiano inibitório PI3KY. Os hBSMC foram incubados com o peptídeo marcado com fluoresceína (FITC, 50 μM) e a fluorescência intracelular foi analisada após 30 minutos desde o início do tratamento. São apresentadas manchas de actina filamentosas (painéis da esquerda) e fluorescência FITC (painéis centrais) com ampliação relativa (painéis da direita). Atividade C) Fosfodiesterase precipitada por anti-PDE4B e anticorpos anti-PDE4D em células de músculo liso de traqueia isolada de PI3KY + / + e PI3KY - / - de animais e tratados com veículo ou o peptídeo de Tróia inibidora de PI3KY (50 μM, 30 minutos; N>4 experiências independentes). D) hBSMCs foram transfectados com a sonda FRET para AMPc, ICUE3, e pré-tratados com tanto veículo, peptídeo inibidor PI3KY Penetratina ou peptídeo de controle 1 (50 μM, 30 minutos) antes da ativação de β2-ARs com isoproterenol (ISO; 100 nM) e o antagonista seletivo de β 1 -AR, CGP- 20712A (CGP, 100 nM). São apresentados traços FRET representativos de n > 3 experimentos independentes. E) Variação máxima no sinal FRET (%) das curvas conforme medido em D. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 por ANOVA unidirecional seguida do teste de Bonferroni. - Figura 2. O peptídeo troiano inibitório PI3KY inibe a entrada de cálcio através do canal de tipo L nas células musculares lisas humanas das vias aéreas. A) representativos de traços de Ca2+ transientes gravados em hBSMCs pré-tratados com veículo, de controle ou peptídeo P1 Troiano inibidor de PI3KY (50 μM, 30 minutos) antes da estimulação com o agonista muscarínico carbacol (Carb, 10 μM, painel superior) e uma solução de despolarização (KCl 40 mM, painel inferior). B) Alteração máxima da taxa de fluorescência do indicador INDO-1 (R) dos transientes de Ca2+ mostrados em A. C) a fosforilação dependente de AMPc da subunidade Cav1,2 (Ser-1928) do tipo L de canal de cálcio (LTCC) em hBSMC tratados com o peptídeo Troiano inibitório PI3KY ou peptídeo controle P1 (50 μM, 30 minutos). Imagens representativas e quantificação relativa de n > 3 experiências de Western blot independentes são mostradas. ** P <0,01 e *** P <0,001 por ANOVA unidirecional seguida do teste de Bonferroni. - Figura 3. O peptídeo troiano inibitório PI3KY aumenta os níveis de cAMP nas vias aéreas in vivo, e atenua a hiperreação das vias respiratórias em camundongossaudáveis e asmáticos. A) O peptídeo troiano inibitório PI3KY foi marcado com FITC e administrado via via intra- traqueal para camundongosda linhagem BALC / c (1,5 μg / rato). A fluorescência no pulmão e na traqueia foi analisada por microscopia confocal em 30 minutos após o tratamento. Os camundongosde controle foram instilados com um volume igual de solução usada para rotulagem FITC. São apresentadas imagens de fluorescência FITC de seções de traquéia, pulmões, cérebro e miocárdio de animais tratados com veículo (painéis superiores) ou com o peptídeo troiano inibitório PI3KY (painéis inferiores). B) níveis de cAMP em toda a traquéia (painel esquerdo) e nos pulmões (painel direito) de camundongos tratados como descrito em A. * P <0,05 e ** P <0,01 por ANOVA unidirecional seguida do teste de Bonferroni. C) A hiperreatividade das vias respiratórias foi medida como resistência média do pulmão em camundongos saudáveis, anestesiados e ventilados, tratados com spray de veículo, peptídeo Troiano inibitório PI3KY (1,5 μg) ou peptídeo controle P1 (quantidade equimolar) antes da exposição a doses crescentes de metacolina . * P <0,05 e ** P <0,01 comparado ao veículo; #P <0,05 versus P1 por ANOVA de duas vias seguida pelo teste de Bonferroni. D) A hiperreatividade das vias aéreas foi medida como mudança no volume corrente em camundongos asmáticos, anestesiados e ventilados, em resposta à metacolina (500 mg / kg, administrada por via intravenosa). Os animais sensibilizados para ovalbumina foram tratados com veículo, peptídeo Troiano inibitório PI3KY (150 μg) ou peptídeo controle P1 (quantidade equimolar) durante 30 minutos antes da administração de metacolina. ** P <0,01 versus o veículo e o peptídeo de controle; ### P <0,001 versus linha de base usando ANOVA de dois sentidos seguida do teste de Bonferroni. - Figura 4. O peptídeo troiano derivado de PI3KY aumenta a fosforilação dependente de cAMP e a condutância de cloreto de CFTR de tipo selvagem. A) fosforilação mediada por cAMP de CFTR em células epiteliais das vias aéreas humanas (NuLi-1) tratadas com veículo (pista 1), peptídeo de controle P1 (25 μM, pista 2), peptídeo troiano inibitório PI3KY (25 μM, pista 3), inibidor PDE4 Rolipram sozinho (PDE4i; 10 μM, pista 4) ou em conjunto com o peptídeo Troiano derivado de PI3KY (pista 5) durante 30 minutos. Imagens representativas da detecção Western Blot de imunoprecipitações CFTR e fosforilação por PKA de n > 3 experiências independentes são mostradas. B) Traço representativo de correntes CFTR medidas nas câmaras de Ussing em culturas de células NuLi-1. Os seguintes tratamentos foram aplicados nos tempos indicados: amilorida (inibidor do canal ENAC, 10 μM), peptídeo de controle P1 (30 μM), concentrações crescentes do peptídeo Troiano derivado de PI3KY (10 μM, 20 μM e 30 μM), inibidor de PDE4 Rolipram (PDE4i; 10 μM), forscolina (FSK, 10 μM) e inibidor CFTR 172 (CFTRi; 20 μM). - Figura 5. O peptídeo Troiano derivado de PI3KY aumenta a condutância de CFTR em células epiteliais das vias aéreas com mutação ΔF508. A) Traço representativo de correntes CFTR medidas nas câmaras de Ussing em culturas de células epiteliais das vias aéreas com mutação ΔF508 (CuFi-1), tratadas com o corretor VX-809 (20 μM, 24 horas). Os seguintes tratamentos foram aplicados nos momentos indicados: amilorida (inibidor do canal ENAC, 10 μM), potenciador CFTR VX-770 (10 μM), peptídeo de controle P1 (10 μM), peptídeo troiano inibitório PI3KY (10 μM), forscolina (FSK, 10 uM) e inibidor CFTR 172 (CFTRi, 20 μM). B) Variações de corrente médias em resposta aos tratamentos indicados. ** P <0,01 por ANOVA unidirecional seguida do teste de Bonferroni. - Figura 6. Sequências de polipeptídeos penetrantes adequados para produzir peptídeos de fusão do presente relatório descritivo. - Figura 7. O peptídeo Troiano derivado de PI3KY reduz a inflamação pulmonar em camundongoasmáticos. A) Imagens representativas das imagens de hematoxilina-eosina (imagens superiores) e periódicas de ácido-Schiff (imagens de baixo) de seções pulmonares de camundongos ou camundongos naives sensibilizados com ovalbumina e pré-tratados com o peptídeo Troiano derivado de PI3KY (25 μg / rato / injeção) ou com peptídeo de controle P1 (quantidades equimolares), antes de cada administração intranasal de ovalbumina. As seções foram coradas com hematoxilina-eosina para analisar a morfologia do tecido e o nível de inflamação e com o reagente periódico de ácido- Schiff para determinar a presença de células de cálice. B) Análise semi-quantitativa do grau de inflamação peribronquial nas seções pulmonares como mostrado em A). C) Porcentagem de células epiteliais positivas para a coloração com reagente periódico de ácido- Schiff no epitélio das seções pulmonares como mostrado em A). D - G) Número de neutrófilos (D), macrófagos (E), linfócitos (F) e eosinófilos (G) na lavagem broncoalveolar de camundongos pré- tratados com o peptídeo Troiano derivado do peptídeo de controle PI3KY ou P1 como descrito em A). * P <0,05, ** P <0,01 e *** P <0,001 por ANOVA unidirecional seguida do teste de Bonferroni.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0013] A invenção será agora descrita em detalhe, apenas a título de exemplo ilustrativo e não limitativo, com referência ao desenho único em que um sistema de extração sob pressão utilizável para fins de implementação do método aqui descrito é representado esquematicamente.

[0014] Na descrição a seguir, são apresentados vários detalhes específicos para fornecer uma compreensão completa das formas de realização. As modalidades podem ser implementadas na prática sem um ou mais dos detalhes específicos, ou com outros métodos, componentes, materiais, etc. Em outros casos, estruturas, materiais ou operações bem conhecidos não são mostrados ou descritos em detalhes para evitar obscurecer certos aspectos das formas de realização.

[0015] Ao longo do presente relatório descritivo, a referência a "uma modalidade" ou "realização" significa que uma característica, estrutura ou característica específica descrita em conexão com a forma de realização está incluída em pelo menos uma modalidade. Portanto, a aparência de expressões "em uma determinada modalidade" ou "em uma modalidade" em vários pontos ao longo da presente descrição não se refere necessariamente sempre à mesma forma de realização. Além disso, as características, estruturas ou características particulares podem ser combinadas de qualquer maneira adequada em uma ou mais formas de realização.

[0016] Os títulos usados aqui servem meramente por conveniência e não interpretam o objeto ou o significado das formas de realização.

[0017] Uma forma de realização da presente descrição se refere a um peptídeo de fusão compreendendo: i) uma sequência de aminoácidos como definida na SEQ ID NO: 1 ou um homólogo relacionado tendo pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NO: 1 e tendo a habilidade da sequência SEQ ID NO: 1 para inibir a função independente de quinase de PI3KY, e

[0018] ii) um peptídeo que tem a habilidade de penetrar numa célula, para utilização como um medicamento, em particular para o tratamento de doenças respiratórias.

[0019] Uma forma de realização diferente da presente invenção se refere a um produto que compreende i) um peptídeo de fusão como definido acima e ii) um potenciador do regulador de condutância transmembranar de fibrose cística e / ou um corretor do regulador de condutância transmembranar de fibrose cística (CFTR), como uma preparação combinada para uso sequencial, simultâneo ou separado para o tratamento de doenças respiratórias, de preferência fibrose cística.

[0020] O uso de um produto que compreende um peptídeo de fusão como definido acima, um corretor do regulador de condutância transmembranar da fibrose cística (CFTR) e um potenciador do regulador de condutância transmembranar da fibrose cística (CFTR) como uma preparação combinada para uso sequencial, simultâneo ou separado é particularmente adequado para o tratamento de pacientes com fibrose cística que carregam a mutação ΔF508 de CFTR.

[0021] A presente descrição diz respeito à produção e às aplicações terapêuticas de um peptídeo de fusão permeável a membranas celulares, que inibe a interação entre PI3KY e o ativador de PDE, PKA. O peptídeo de fusão da presente invenção reduz a atividade de PDE específica, reforçando a sinalização da via de transdução de sinal β2-AR / cAMP e produz efeitos pro-relaxantes mediados por cAMP, tanto em células de músculo liso de vias respiratórias humanas quanto in vivo, em um modelo pré-clínico de asma alérgica. Além disso, o peptídeo de fusão com atividade inibidora de PI3KY aumenta a mesma via de sinalização nas células epiteliais do trato respiratório e estimula a abertura dependente de cAMP do canal CFTR de tipo selvagem (cujas sequências de nucleotídeos e aminoácidos estão disponíveis no banco de dados da sequência GenBank como acesso de Números NM_000492.3 e NP_000483.3, respectivamente) e de CFTR com a mutação ΔF508 (a sequência desta mutação está disponível no banco de dados da sequência GenBank com o número de acesso S64640.1), que é a principal causa da fibrose cística.

[0022] Em geral, os resultados aqui mostrados demonstram a possibilidade de usar o peptídeo de fusão ou seus homólogos, tendo a habilidade de inibir PI3KY, como terapia local por inalação, para o tratamento de doenças respiratórias, como asma alérgica e fibrose cística.

[0023] Embora na última década tenham sido desenvolvidos numerosos inibidores da atividade quinase de PI3KY, muitos dos quais atualmente estão em desenvolvimento clínico para o tratamento de doenças neoplásicas, não há métodos que permitam interferências seletivas na atividade independente da quinase, ou melhor, com a PKA - ou proteína de ancoragem AKAP, da enzima.

[0024] Foi previamente demonstrado que um peptídeo que compreende o sítio de ligação de PI3K para PKA, que consiste nos resíduos 126-150 da PI3KY humana, desloca a interação entre as duas proteínas e reduz a atividade da PDE ligada a PI3KY, PDE3B, em estudos in vitro de interação (1).

[0025] A presente invenção mostra, de um modo completamente inesperado, que o peptídeo 126-150 PI3KY (SEQ ID No .: 1 -KATHRSPGQIHLVQRHPPSEESQAF) conjugado com um peptídeo permeável a membranas celulares, tais como, por exemplo, a uma Penetratina de Antennapedia (SEQ ID nO .: 3) (3), pode ser utilizado como um inibidor da função independente da quinase da PI3KY in vivo. O peptídeo de fusão inibidor PI3KY Penetra nas células do músculo liso das vias respiratórias e aumenta a via de sinalização β2--AR / cAMP. Em particular, os dados mostram que o peptídeo de fusão aumenta os níveis de AMPc e limita a hiperreatividade das vias aéreas em um modelo pré-clínico de asma alérgica e que ele atinge eficientemente o trato respiratório inferior quando administrado localmente pela via intratraqueal. Estes dados demonstram, portanto, o uso clínico de um peptídeo de fusão inibidora de PI3KY em terapia com aerossóis para o tratamento de doenças respiratórias.

[0026] A terapia de inalação corrente para doenças bronco-obstrutivas baseia-se no uso de agonistas β2-AR, tais como salbutamol e formoterol e de inibidores de PDE4, tais como Roflumilaste, o qual foi recentemente aprovado para o tratamento de doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC).

[0027] Embora o tratamento agudo com agonistas de β-AR produza benefícios clínicos evidentes, a exposição crônica ou repetida a esses medicamentos pode resultar em redução significativa e / ou perda completa de sua eficácia em pacientes asmáticos, devido à dessensibilização dependente do agonista da membrana β-ARs.

[0028] A presente invenção proporciona uma solução para este problema e propõe a utilização de um peptídeo inibidor que afecta a atividade da enzima PI3KY e, como tal, não atua directamente sobre a estimulação de β2-AR, mas aumenta a cascata de sinalização que segue estes eventos. Deste modo, um peptídeo inibidor PI3KY oferece a oportunidade única para modular p domínios de AMPc β2-AR- dependentes, assegurando os efeitos bronco-relaxante semelhantes aos mediada por agonistas β2-AR sem induzir a inativação do receptor.

[0029] Os dados aqui apresentados demonstram que a inibição da função de PKA de ancoragem de PI3KY só reduz a atividade de PDE em células que expressam PI3KY (PI3KY + / +), mas não em células sem a enzima (PI3KY - / -), indicando assim que o peptídeo de fusão da presente invenção inibe as PDEs exclusivamente reguladas por PI3KY.

[0030] O peptídeo inibidor de PI3KY, portanto, representa uma ferramenta única que garante a inibição seletiva das PDEs e permite limitar os principais efeitos colaterais associados aos inibidores não seletivos da PDE4, como Roflumilast, decorrentes principalmente da inibição de isoformas que não são expressas no sistema respiratório.

[0031] Embora os inibidores de PDE4 sejam caracterizados por importantes efeitos pró-relaxantes em células isoladas, eles não são ideais broncodilatadores in vivo, onde eles exercem principalmente funções anti-inflamatórias.

[0032] Os resultados aqui apresentados demonstram que o peptídeo de fusão, com a habilidade de inibir a função independente de quinase de PI3K, objeto da presente descrição, tem uma função broncodilatadora forte in vivo, em animais saudáveis e em um modelo pré-clínico da asma alérgica. Esses efeitos podem ser explicados pela habilidade do peptídeo para interferir na atividade catalítica de múltiplas isoformas de PDE, não só incluindo PDE4, mas também a PDE3.

[0033] De acordo com os dados atuais, demonstrou-se que a inibição de PDE3 e PDE4 pode ser aditiva ou sinérgica. Em particular, os inibidores de PDE4 e PDE3 são ineficazes se usados isoladamente, mas atuam sinergicamente na inibição da contração muscular lisa. Portanto, a inibição da atividade independente de quinase de PI3KY é uma ferramenta única para inibir simultaneamente isoformas específicas de PDE3 e PDE4, em particular as que envolvem criticamente a contratilidade do músculo liso brônquico.

[0034] Uma vez que PDE3 e PDE4 não são apenas expressas nas vias aéreas, mas também no miocárdio e no sistema nervoso central, a inibição sistêmica de até mesmo isoenzimas selecionadas pode causar efeitos colaterais importantes. Em particular, a inibição de PDE3 e de PDE4 in vivo pode ter efeitos pró-arrítmicos, pró- eméticos e pró-anorexígenos.

[0035] A presente invenção mostra que o peptídeo de fusão que tem a habilidade de inibir a atividade independente de quinase de PI3KY é terapeuticamente eficaz e que uma formulação de aerossol do peptídeo inibidor de PI3KY é distribuída eficientemente no tracto respiratório inferior. Além disso, o uso de uma molécula peptídica proporciona um efeito terapêutico ou efeito colateral mais amplo em comparação com moléculas pequenas, tais como inibidores de PDE, que podem se difundir rapidamente para outros tecidos fora do sistema respiratório.

[0036] Os dados fornecidos aqui demonstram que uma versão fluorescente do peptídeo inibidor de PI3KY se acumula na traquéia e nos pulmões após administração intratraqueal, sem atingir o miocárdio e o cérebro.

[0037] Com base nesses dados, é possível concluir que uma terapia de inalação baseada em um peptídeo, permeável a membranas celulares, que inibe seletivamente a atividade independente da quinase da enzima PI3KY é altamente eficaz. Esta abordagem terapêutica pode ser utilizada para o tratamento de doenças respiratórias, da asma e da fibrose cística, em que agentes capazes de aumentar o cAMP intracelular a seguir de β 2 -ARs são necessários.

[0038] Os resultados apresentados aqui demonstram que o peptídeo inibidor PI3KY não só aumenta os níveis de cAMP no músculo liso, mas também no compartimento epitelial das vias aéreas, abrindo assim a possibilidade de explorar este composto para estimular também a abertura do canal CFTR mediada pelo cAMP, que é defeituoso em pacientes com fibrose cística.

[0039] Os dados fornecidos aqui também mostram que a inibição de PI3KY atua de forma sinérgica com um potenciador CFTR conhecido, clinicamente avançado, VX-770, aumentando a condutância de uma das formas mutantes mais comuns de CFTR na fibrose cística. Esses dados demonstram, pela primeira vez, a habilidade de uma molécula inibidora de PI3KY aumentar a atividade de um potenciador CFTR conhecido, o VX-770, que é conhecido por estimular a condutância de diferentes formas mutantes de CFTR, com exceção da mutante mais comum na fibrose cística, ΔF508.

[0040] O peptídeo de fusão da presente descrição pode, portanto, ser usado em combinação com um potenciador do regulador de condutância transmembranar da fibrose cística (CFTR) e / ou um corretor do regulador de condutância transmembranar da fibrose cística (CFTR), como uma preparação combinada para uso sequencial, simultâneo ou uso separado no tratamento de doenças respiratórias caracterizadas por uma abertura defeituosa de CFTR mediada por cAMP, como em pacientes com fibrose cística.

[0041] O uso combinado de um potenciador do regulador de condutância transmembranar da fibrose cística (CFTR) e um corretor do regulador de condutância transmembranar da fibrose cística (CFTR), juntamente com o peptídeo de fusão da presente invenção, é particularmente adequado para o tratamento de pacientes com fibrose cística que possuem a mutação ΔF508 CFTR, a quem a administração de um corretor CFTR é necessária para permitir a expressão de CFTR mutante na membrana.

[0042] Os potenciadores do regulador de condutância transmembranar da fibrose cística (CFTR), que podem ser vantajosamente utilizados em combinação com o peptídeo de fusão da presente invenção, são, por exemplo: Ivacaftor ou VX- 770 (N- (2,4-Di-terc-butil -5-hidroxifenil) -1,4-di-hidro-4-ossoquinolina-3-carboxamida) e VX-532 (4-Metil-2- (5-fenil-1H-pirazol-3-il) -fenol).

[0043] Os corretores do regulador de condutância transmembranar da fibrose cística (CFTR), que podem ser vantajosamente utilizados em combinação com o peptídeo de fusão da presente invenção e com um potenciador do regulador de condutância transmembranar da fibrose cística (CFTR) são, por exemplo: VX-809 (3 - ácido (6- (1- (2,2-difluorobenzo [d] [1,3] dioxol-5il) ciclopropanocarboxamido) -3- metilpiridin-2-il) benzóico) e VX-661 ((R) -1- (2,2-difluorobenzo [d] [1,3] dioxol-5-il) - N- (1- (2,3-di-hidroxipropil) -6-fluoro-2- (1-hidroxi-2-metilpropan-2- Il) -1H-indol-5-il) ciclopropanocarboxamida).

[0044] Em geral, este estudo demonstra o potencial terapêutico de um peptídeo de fusão que inibe seletivamente a atividade independente de quinase de PI3KY.

[0045] A molécula pode ser usada para tratar doenças respiratórias, incluindo asma alérgica, onde drogas destinadas a aumentar os níveis intracelulares de cAMP e promover o relaxamento do músculo liso brônquico são altamente desejáveis.

[0046] Além disso, este composto pode ser aplicado a pacientes com fibrose cística onde os agentes que elevam as concentrações de cAMP são ferramentas- chave para estimular a abertura mediada por cAMP de CFTR defeituoso.

[0047] Além disso, a inibição mediada por peptídeo de PI3KY pode ser aplicada a todas as condições patológicas caracterizadas por uma CFTR hipofuncional, incluindo a DPOC, onde a exposição à fumaça de cigarro demonstrou alterar a atividade da CFTR.

[0048] Finalmente, através do bloco funcional de PDE4, o peptídeo de fusão da presente invenção possuindo a habilidade de inibir PI3KY é capaz de exercer importantes ações anti-inflamatórias. A evidência experimental aqui relatada demonstra que o peptídeo realmente limita a inflamação peribronquial associada à asma alérgica. Sendo assim, é evidente que a inibição da atividade independente de quinase de PI3KY pode proporcionar múltiplos benefícios terapêuticos independentes no tratamento de doenças respiratórias, atuando simultaneamente como broncodilatador, potenciador de CFTR e agente antiinflamatório.

[0049] Abaixo, a invenção será descrita em detalhes, a título de exemplo não limitativo, com referência a um peptídeo de fusão possuindo a sequência mostrada na SEQ ID NO: 2 (doravante também conhecido como "peptídeo Troiano derivado de PI3KY"), compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 e um peptídeo penetrante na célula correspondente ao Penetratina 1 de Antennapedia (SEQ ID NO: 3, descrito em (3)).

[0050] É claro que o alcance desta descrição não está de forma alguma limitado à sequência específica do peptídeo de fusão da SEQ ID NO: 2, uma vez que o peptídeo de fusão da presente descrição pode compreender i) sequências com uma homologia com SEQ ID No: 1 de pelo menos 90% e tendo a habilidade de SEQ ID NO: 1 para inibir a função independente de quinase de PI3KY e ii) sequências de um peptídeo que penetra na célula, por exemplo, seleccionada a partir do polipeptídeo HIV-TAT, peptídeos de Antennapedia homeodomain, também conhecidos como peptídeos penetrantes ou pAntp, peptídeo R7, peptídeo KALA buforin 2, MAP, transportan, transportan 10, peptídeo pVec, ou MPG. As sequências correspondentes aos polipeptídeos que penetram nas células mencionadas acima são mostradas na Figura 6 e especificados na SEQ ID NO: 3 a 12.

[0051] Além disso, ao produzir o peptídeo Troiano derivado de PI3KY, o peptídeo possuindo a habilidade de penetrar na célula foi fundido com o terminal N da SEQ ID NO: 1. É, contudo, possível se produzir um peptídeo de fusão que se enquadre no âmbito da presente descrição criando uma fusão do peptídeo que tem a habilidade de penetrar a célula no terminal C da SEQ ID NO: 1.

Materiais e métodos

[0052] Determinação da habilidade de um peptídeo homólogo para SEQ ID NO: 1 para inibir a função de quinase independente de PI3KY

[0053] Para determinar a habilidade de um peptídeo homólogo, possuindo pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NO: 1, para inibir a função de AKAP de PI3KY, utilizou-se um ensaio de competição previamente descrito (1). O peptídeo homólogo foi novamente suspenso em solução salina tamponada com fosfato (PBS) até uma concentração final de 50 μM ou 250 μM. As células HEK293 (Número ATCC: CRL-1573 ™) foram transfectadas, utilizando o método do fosfato de cálcio, com uma construção feita do vetor de expressão pcDNA3.1 (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA, código de produto V790-20), na qual o cDNA de PI3KY humano foi clonado (SEQ ID NO: 13) usando as enzimas de restrição BamHI e XbaI (New England Biolabs, Ipswich, MA, EUA). A construção pcDNA3.1-PI3KY está disponível gratuitamente pelo Dr. Emilio Hirsch na Universidade de Turim, Turim, na Itália.

[0054] Em 48 horas após a transfecção, as células foram lisadas em tampão de lise frio contendo 120 mmol / L de NaCl, 50 mmol / L de Tris-HCl (pH 8,0), inibidores de protease completos (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) e inibidores da fosfatase (50 mmol /L fluoreto de sódio, 1 mmol/L ortovanadato de sódio e 10 mmol/L pirofosfato de sódio). Após 30 minutos de incubação no gelo, os lisados foram centrifugados a 13000 rpm durante 10 min a 4 °C e o sobrenadante foi incubado com o peptídeo durante 30 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação, a subunidade reguladora de PKA (PKA RII) foi imunoprecipitado por incubação do extracto de proteína com 30 μl de uma mistura 1: 1 de Proteína A e Sepharose (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Reino Unido) e um anticorpo anti-PKA RII C20 (Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, Texas, EUA; código do produto: sc-908) durante 2 h a 4 °C, com agitação. Os complexos imunes foram lavados extensivamente com tampão de lise e a associação de PI3K com PKA RII foi analisado por análise de Western blot utilizando um anticorpo monoclonal anti- PI3KY (livremente disponível a partir de Dr. Emilio Hirsch na Universidade de Turim, Turim, Itália).

Animais

[0055] Camundongos com knock-out para PI3KY (PI3KY - / - ) e camundongos com knock-inque expressam uma forma cataliticamente inativa de PI3KY (PI3KY KD / KD) foram gerados como anteriormente descrito (4, 5). Camundongos mutantes foram cruzados com animais de um fundo genético C57BL / 6J durante 15 gerações e camundongos C57BL / 6J foram utilizados como controles (PI3KY + / + ). Para os estudos de hiperreatividade das vias respiratórias em camundongos asmáticos e saudáveis, foram utilizados camundongos fêmeas BALB / C. Em todos os experimentos, foram utilizados animais com idades entre 8 e 12 semanas. Os camundongos foram mantidos em grupos, com acesso livre a alimento (dieta padrão) e água, num sistema controlado que proporciona um ciclo de 12 horas de luz e 12 horas de escuro. Os animais foram usados de acordo com as diretrizes e regulamentos institucionais sobre bem-estar animal, aprovado pelo Comitê de Ética animal do local.

Cultura celular e transfecção

[0056] Células lisas brônquicas humanas musculares (hBSMCs) foram adquiridas a partir de Lonza (CC-2576, Lonza Walkersville, Inc. EUA), cultivadas em meio Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco, Carlsbad, CA), e suplementadas com soro fetal bovino a 10% ( FBS) e 5 mM de penicilina / estreptomicina (Gibco, Carlsbad, CA). Células até uma passagem 15 foram utilizadas para experiências.

[0057] Células lisas brônquicas humanas musculares (hBSMCs) foram transfectadas com um plasmídeo que codifica para a sonda FRET para AMPc, ICUE3 (descrito na patente norte-americana US 8236523 B2) (2), através de eletroporação com um dispositivo Nucleofector (Amaxa, Gaithersburg, MD), de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, 1 x 10 6 células foram re- suspensas em 100 μL de solução nucleofection (VPI-1004, Amaxa, Gaithersburg, MD), misturada com 1 μg de pcDNA3-ICUE3 (descrito na patente norte-americana US 8236523 B2), e submetidas a eletroporação num aparelho de nucleofecção de Amaxa Biosystems (Programa a-033). Experimentos de imagem de células vivas foram realizadas a 24 horas após a transfecção.

[0058] Linhas de células epiteliais das vias respiratórias humanas que expressam um tipo selvagem de CFTR (Nuli-1) ou com a mutação ΔF508 (CUFI-1) foram adquiridas da ATCC (Nuli-1 código de produto: ATCC CRL-4011 ™; CUFI-1 código de produto: ATCC® CRL-4013 ™). As células foram cultivadas em meio Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco, Carlsbad, CA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 30 ug / mL de penicilina, 100 ug / mL de estreptomicina e 300 μg / ml de higromicina B (Gibco, Carlsbad, CA).

Extração de proteínas e imunoprecipitacão

[0059] Para a extração de proteínas a partir de traqueia de murino - células musculares lisas (mTSMCs) e células do músculo liso dos brônquios humanos (hBSMCs), as células foram tratadas com as drogas / peptídeos indicados e imediatamente lisadas em tampão de lise frio contendo 120 mmol / L de NaCl, 50 mmol / L de Tris -HCl (pH 8,0), inibidores de protease completos (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) e inibidores de fosfatase (50 mmol / L de fluoreto de sódio, 1 mmol / L de ortovanadato de sódio e 10 mmol / L de pirofosfato de sódio). Após 30 minutos de incubação no gelo, os lisados foram centrifugados a 13000 rpm durante 10 min a 4 °C e utilizadas para transferência de Western ou sujeitas a imunoprecipitacão e medições da atividade da fosfodiesterase.

[0060] Para os ensaios de imunoprecipitação, os extratos de proteína foram pré- incubados com 30 μL de uma mistura 1: 1 de proteína A ou G e sefarose (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Reino Unido) e subsequentemente incubadas com 20 μL de uma mistura 1: 1 de proteína A ou G e sefarose e 1 mg de anticorpo primário para cada mg de proteína, durante 2 horas a 4 °C. Os complexos imunes foram lavados extensivamente com tampão de lise e utilizado para transferência de Western ou submetidos a medições de atividade da fosfodiesterase.

Imagem e análise FRET

[0061] As medições dos níveis de cAMP foram realizadas em células humanas do músculo liso dos brônquios (hBSMCs) que expressam a sonda FRET ICUE3, como descrito anteriormente (2). Resumidamente, as células foram mantidas em uma solução K+ -Ringer contendo (em mmol / L) NaCl 121,6, KCl 5,4, 1,8 MgCl2 , 1,8 de CaCl2, 4 de NaHCO3, 0,8 NaH2PO4, 5 D-glicose, 5 de piruvato de sódio, 10 de HEPES, a pH 7,4. Gravações FRET foram realizadas antes e depois da adição de 100 nmol / L de isoproterenol (Iso) e 100 nmol / L de CGP-20712A (CGP), usando um sistema SP5 Leica TCS (Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL, EUA) com um laser de argônio e com uma lente de 63x de imersão. Para excitar PCP e YFP, foram utilizados comprimentos de onda de 458 e 514 nm, respectivamente. As imagens foram adquiridas a cada 4 segundos, sem qualquer linha média, a uma velocidade de varredura de 400 MHz e uma resolução de 512 x 512 pixels. A eficiência FRET foi calculada usando o "Método 3" fornecido pelo assistente e aplicativo Leica para imagiologia FRET sensibilizado para emissão, de acordo com o qual: E A (i) = B / A, em que E um (i) é a eficiência de TERF aparente; A e B são as intensidades do canal de PCP e de FRET, respectivamente. Para imagiologia em hBSMCs tratados com peptídeos, células que expressam o indicador de FRET ICUE3 foram pré-incubadas com 50 μM do peptídeo de Tróia derivado de PI3KY (SEQ ID NO: 2 - RQIKIWFQNRRMKWKKGKATHRSPGQIHLVQRHPPSEESQAF) ou o peptídeo de controle P1 (SEQ ID No: 3 - RQIKIWFQNRRMKWKK) durante 30 minutos antes do tratamento com a norma ISO e CGP.

Ensaio de atividade da fosfodiesterase

[0062] A atividade de fosfodiesterase em imunoprecipitados foi medida de acordo com o método de dois passos de Thompson e Appleman, tal como foi previamente descrito (2), com pequenas modificações. Resumidamente, os imunoprecipitados foram ensaiados em um volume total de 200 μL de mistura de reação contendo 40 mmol / L Tris-HCl (pH 8,0), 1 mmol / L de MgCl2, 1,4 mmol / L de 2-mercapto-etanol e 0,1 pCi de [3H] cAMP (Amersham Bioscience, Buckinghamshire, Reino Unido) durante 40 min a 33 °C. Para parar a reação, as amostras foram fervidas a 95 °C durante 3 min. O produto de reação 5'-AMP foi então hidrolisado por incubação da mistura com 50 μg de veneno de cobra de Crotalus Atrox durante 15 min a 37 °C (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). A adenosina resultante foi separada por cromatografia de permuta aniônica com 400 μL de uma suspensão de resina Dowex AG1-X8 (Bio-Rad, Segrate, Milão, Itália), água e etanol a 100%, em partes iguais. A quantidade de adenosina marcada radioativamente no sobrenadante foi quantificada por contagem de cintilação (cintilação líquida Ultima Gold da Perkin Elmer, Waltham, MA).

Isolamento de células do músculo liso da traqueia de rato

[0063] Células de músculo liso de traqueia de murino foram cultivadas a partir de explantes de traqueia, utilizando os métodos descritos anteriormente, com modificações. Toda a traqueia entre a laringe e brônquios foi removida e colocada numa placa de Petri estéril contendo solução salina equilibrada de Hanks em temperatura ambiente e uma concentração 2x de (Gibco, Carlsbad, CA, código de produto: 15240-062) antibiótico-antimicótico. Usando um microscópio de dissecação, o tecido circundante adicional foi removido, o segmento de traqueia foi dividido longitudinalmente e cortado em quadrados de 2-3 mm de tamanho. Todos os segmentos de uma única traqueia foram então colocados com a face interior na direção do fundo de uma placa de cultura de células estéril de 60 mm. Após a adesão dos explantes para a placa, 2,5 ml de meio Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco, Carlsbad, CA), suplementado com soro bovino fetal a 20% foi adicionado para cobrir os explantes. Os explantes foram incubados a 37 °C numa atmosfera umidificada com 95% de ar e 5% de CO2. Três dias após o plaqueamento, as concentrações de FBS e antibiótico-antimicótico foram reduzidas para 10% e 1x, respectivamente. Segmentos de traqueia foram removidos quando as células se tornaram confluentes localmente. Uma vez que as placas de 60 milímetros se tornaram confluentes, as células foram descoladas por tripsinização e transferidas para uma única placa de 60 mm. Células de músculo liso de traqueia foram ainda subdivididas por várias passagens em uma proporção de 1: 2. Mais de 90% destas células eram células musculares lisas, tal como determinado por imunofluorescência realizada com um anticorpo específico para a actina do músculo liso. Todas as experiências foram realizadas em células confluentes em 3 passagens.

Medições de transientes de cálcio

[0064] hBSMCs foram carregadas com o indicador de cálcio Indo-1 AM (2 μM, Invitrogen, Carlsbad, Califórnia) a 37 °C durante 40 minutos na presença de peptídeo de controle P1, peptídeo de Tróia derivado de PI3K ou veículo. As células foram lavadas com uma solução de Tyrode contendo (em mmol / L): 5 HEPES, 154 NaCl, 4 KCl, 2 de CaCl2, 1 MgCl2, 5,5, D-glucose a um pH de 7,35 e colocadas em um microscópio invertido. As células foram mantidas em solução de Tyrode e tratadas com uma solução de despolarização de KCl contendo (em mmol / L): 5 HEPES, 118 NaCl, 40 KCl, 2 de CaCl2, 1 MgCl2, 5,5 D-glucose, a pH 7,35. Transientes de cálcio foram analisados como a razão dos sinais de fluorescência medida a 400 nm e 490 nm na sequência da excitação de células Indo-1 AM- carregadas a 350 nm. As experiências foram registadas e analisadas com o software Igor â Software, utilizando as funções adicionadas por Jason Rothman (Neuromatic, www.thinkrandom.com).

Medições de correntes de cloreto na câmara Ussing

[0065] Para medir correntes de cloreto em células epiteliais brônquicas humanas primárias normal e ΔF508, as células foram cultivadas em inserções Snapwell de1,12 cm2. Os filtros foram montados em câmaras de Ussing, e um gradiente de cloreto de foi aplicado por incubação das células num tampão de alto teor de cloreto basolateral contendo (em mmol / L): 140 NaCl, 5 KCl, 0,36 K2HPO4, 0,44 KH2PO4, 1,3 de CaCl2, 0,5 MgCl2, 4,2 de NaHCO3, 10 HEPES, e 10 de glucose, a pH 7,4 e um tampão apical baixo cloreto contendo (em mmol / L): 133,3 Na-gluconato, 5 K- gluconato, 2,5 NaCl, 0,36 K2HPO4, 0,44 KH2PO4, 5,7 de CaCl2, 0,5 MgCl2, 4,2 de NaHCO3, 10 HEPES, e 10 manitol, a um pH de 7,4. Os tampões foram arejadas com uma mistura de 95% de O2 e 5% de CO2 e a temperatura foi mantida a 37 °C durante a experiência. As culturas foram mantidas a uma voltagem de 0 mV usando uma braçadeira EVC4000 Multicanal V / I (World Precision Instruments, Sarasota, FL, EUA). Após um período de estabilização de 30 minutos, as drogas foram adicionadas em momentos específicos, ao passo que a corrente foi registada continuamente.

Extração e quantificação de cAMP

[0066] Os pulmões e a traqueia foram explantados a partir de animais a seguir da sua eutanásia, pulverizados em nitrogênio líquido e usados para extração a frio de cAMP com ácido tricloroacético a 6%. As amostras foram sonicadas durante 10 segundos e centrifugou-se a 13000 rpm, a 4 °C durante 15 minutos. Os sobrenadantes foram lavados quatro vezes com cinco volumes de éter dietílico saturado com água e liofilizados. O teor de cAMP foi detectado com um equipamento BioTrak imunoensaio enzimático de Amersham (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, EUA, código do produto: RPN225), de acordo com o protocolo do fabricante.

Análise da eficiência de transdução do peptídeo de Tróia derivado de PI3KY in vivo

[0067] hBSMCs foram incubadas com o peptídeo derivado de Tróia PI3KY (SEQ ID NO: 2) conjugadas com fluoresceína (50 μM) ou veículo durante 30 minutos, fixadas com 4% de paraformaldeído (PFA), durante 10 minutos, e permeabilizadas com solução salina tamponada com fosfato ( PBS) + 0,5% de Triton (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durante 5 minutos em temperatura ambiente. As células foram depois incubadas com PBS contendo 3% de albumina de soro bovino (BSA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e faloidina-Alexa 488 (1: 1000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) durante 30 minutos e montadas sobre lâminas de microscópio com reagente ProLong® Antifade (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). As imagens de fluorescência Red (actina) e FITC (peptídeos) foram adquiridas com um equipamento Zeiss Observer-Z1, equipado com um módulo ApoTome (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha).

[0068] Animais de tipo selvagem, camundongos BALB / c, foram injectados por via intra-traqueal com 1,5 μg do peptídeo derivado de Tróia PI3KY conjugado com fluoresceína ou veículo, em um volume final de 70 μL de PBS. Após 30 minutos, os animais foram anestesiados, a traqueia e os pulmões foram insuflados com PBS, extraídos e congelados em OCT. Criocortes de 10 micra foram obtidos com um criostato Leica CM1850 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemanha) e a fluorescência foi adquirida com um equipamento Zeiss Observador-Z1, equipado com um módulo ApoTome (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha).

Imunização com ovalbumina

[0069] Ovalbumina (100 μg) (OVA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), complexada com o sulfato de alumínio e potássio (1 mg, alúmen), foi administrada por via intraperitoneal (ip) nos dias 1 e 14, e intra-nasalmente (in) ( 50μg de OVA em 50 μl de PBS) nos dias 14, 25, 26, e 27. Os camundongos de controle receberam injeções ip de alúmen e injeções de PBS única. A hiper-reatividade de vias aéreas induzida por metacolina inalada foi medida em 24 horas após a dose final de OVA (Dia 28). Medição da reatividade das vias aéreas

[0070] Método 1. Os camundongos sensibilizados a ovalbumina foram anestesiados (pentobarbital de sódio, 70-90 mg / kg, ip), traqueostomizados, e ligados a um ventilador FlexiVent para pequenos animais (SCIREQ, Montreal, Quebec, Canadá). Para induzir a constrição das vias aéreas, os camundongos foram expostos a concentrações crescentes de metacolina aerossolizada (10 -9 a 10 -4 M, concentração final).

[0071] Método 2: Os camundongos sensibilizados a ovalbumina foram tratados, por instilação intra-traqueal, com 70 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo veículo ou 150 μg do peptídeo de Tróia derivado de PI3K ou quantidades equimolares de peptídeo de controle P1. Hiperresponsividade das vias aéreas foi avaliada em 30 minutos após o tratamento de acordo com um protocolo previamente publicado (6). Resumidamente, os camundongoforam anestesiados (pentobarbital de sódio, 70-90 mg / kg, ip), traqueostomizados e ventilados com uma pressão inspiratória final positiva de 10 cm de H2O, pressão expiratória final positiva (PEEP) de 3 cm de H2O, taxa respiratória de 90 respirações / min em ar ambiente. A pressão de abertura das vias aéreas (PAO), proximal em relação ao tubo endotraqueal e a pressão no interior da câmara foram medidas com transdutores de pressão (instrumentos especiais, Digima Clic; Nordlingen, Alemanha). O fluxo de gás foi medido com um pneumotacógrafo (instrumentos especiais, Digima Clic; Nordlingen, Alemanha). O volume corrente foi calculado como a integral do sinal de fluxo. Variáveis de ventilação mecânica foram registadas usando o software UTI-Lab (KleisTEK Advanced Electronic Systems, Bari, Itália). A hiper-reatividade foi avaliada como uma mudança no volume corrente após o tratamento com 500 mg / kg de metacolina administrados por via intravenosa.

Análise de inflamação das vias respiratórias em camundongos asmáticos

[0072] Camundongos de tipo selvagem BALB / C foram tratados, por instilação intra-traqueal, com 25 μg do peptídeo de Tróia derivado de PI3K ou quantidades equimolares de peptídeo de controle P1, num volume final de 70 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS), antes de cada administração intra-nasal de ovalbumina (dias 14, 25, 26, e 27 do protocolo de imunização com ovalbumina). Ao fim de 24 horas após a última injecção (dia 28), os camundongos foram anestesiados (pentobarbital de sódio, 70-90 mg / kg, IP) e as traqueias com incisão e canuladas. As vias aéreas foram lavadas com 2,5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS). O número total de células na lavagem bronco-alveolar (BAL) foi determinada com um hemocitômetro de Neubauer. Um volume de 50 μL de BAL foi centrifugada em lâminas de vidro de citospina a 400 rpm em temperatura ambiente durante 5 minutos e coradas com um sistema Diff-Quick (LabAids, Ronkonkoma, EUA). Um total de 100 células por lâmina foi contado e estas foram classificadas como neutrófilos, macrófagos, linfócitos e eosinófilos, com base em critérios morfológicos. Os eritrócitos e células epiteliais foram ignorados e os resultados foram expressos em células / ml.

[0073] Para avaliar a inflamação peribronquial, os pulmões de um grupo de animais que não tinham sido submetidos a lavagem broncoalveolar foram explantados, fixados em solução de paraformaldeído a 4% (PFA) durante 24 horas a 4 °C e embebidos em parafina. Fatias que tinham 5 μm de espessura foram desparafinizadas, coradas com uma solução de hematoxilina-eosina (Bio-Optica, Milão, Itália), desidratadas e montadas com lamelas de vidro. A extensão da inflamação peribrônquico foi classificada como se segue: 0- normal; 1- poucas células inflamatórias; 3- um anel de espessura de células inflamatórias.

[0074] Para avaliar a presença de células caliciformes, as fatias de pulmão foram coradas com o reagente de ácido periódico de Schiff (PAS) (Bio-Optica, Milão, Itália) e a percentagem de células PAS positivas foi calculada por contagem do número de células epiteliais PAS positivas e células epiteliais no total.

Anticorpos, reagentes e plasmídeos

[0075] PDE4B e PDE4D foram imunoprecipitados como descrito anteriormente (2), utilizando anticorpos policlonais de coelho livremente disponíveis pelo Dr. Marco Conti na Universidade da Califórnia, San Francisco, San Francisco, CA, EUA. Anticorpos comerciais específicos para a PDE4B e PDE4D podem ser adquiridos a partir de Abcam (Abcam, Cambridge, MA, EUA): código de produto anti-PDE4B: ab14611; código do produto anti-PDE4D: ab14614. Os anticorpos policlonais de coelho contra a Cav1.2 e fosfo-Cav1.2 estão livremente disponíveis pelo Dr. William A. Catterall na Universidade de Washington, Seattle, WA, EUA .

[0076] O anticorpo que reconhece substratos fosforilados por PKA (P-PKA substrato) foi adquirido a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA; Código do Produto: # 9621) e o anticorpo contra M3A7 clone de CFTR a partir da Millipore (Billerica, MA, EUA; produto código: 05-583).ICUE3-pcDNA3 foi descrito anteriormente (2).

[0077] Isoproterenol, CGP-20712A, carbacol, Rolipram, amilorida e forscolina foram todos adquiridos de Sigma (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). O CFTR corretor de VX-809, o potenciador de CFTR VX-770 e o inibidor de CFTR 172 foram adquiridos a partir de Selleckchem (Houston, TX, EUA).

[0078] O peptídeo de controle P1 (SEQ ID No: 3 - RQIKIWFQNRRMKWKK) e o peptídeo de Tróia derivado de PI3KY (SEQ ID NO: 2 - RQIKIWFQNRRMKWKKGKATHRSPGQIHLVQRHPPSEESQAF) foram sintetizados por GenScript (GenScript, Piscataway, NJ, EUA) e Chinapeptides (Chinapeptides Co. Ltd., Xangai, China).

Análise estatística

[0079] O software Prism (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EUA) foi utilizado para análise estatística. Os valores de P foram calculados usando o teste t de Student, com ANOVA de um modo ou de duas vias seguida por teste de Bonferroni, conforme apropriado. Em todas as figuras, os gráficos representam a média ± erro padrão de pelo menos 3 experiências independentes.

Resultados

[0080] Peptídeo de Tróia derivado de PI3KY Aumenta sinalização de β 2 -AR / cAMP em células do músculo liso brônquico

[0081] As estratégias para aumentar os níveis de cAMP a seguir de β 2 -ARs no músculo liso dos brônquios são de grande interesse para o tratamento de doenças respiratórias. Para explorar o potencial terapêutico de inibição da sinalização PI3KY- Dependente β2-AR-cAMP, um inibidor peptídico da atividade independente-quinase PI3KY, a sequência da qual está apresentada em SEQ ID No: 2, foi concebido. Um estudo anterior indica que um peptídeo compreendendo os resíduos 126-150 da PI3KY Humana (SEQ ID No: 1) inibe a PKA ancoragem e diminui a atividade de PI3KY ligada a fosfodiesterase 3B in vitro (1). Para inibir a atividade de ancoragem de PKA de PI3KY in vivo, um peptídeo de fusão inibidor permeável a membranas celulares foi obtido pela ligação ao domínio de PI3KY Humana (SEQ ID No: 1) 126-150 com o peptídeo de Tróia de Antennapedia Penetratina 1 (SEQ ID No: 3 - A Figura 1A). Uma versão do peptídeo inibidor PI3KY de Tróia marcado com fluoresceína (FITC) é acumulado no citoplasma das células do músculo liso dos brônquios humanos (hBSMCs) em 30 minutos após a incubação, demonstrando que o inibidor é eficientemente transduzido in vivo em células isoladas (Figura 1B). Além disso, o peptídeo inibidor PI3KY reduziu significativamente a atividade catalítica de PDE4B e PDE4D em células musculares lisas de traqueias dos camundongos de tipo selvagem (PI3KY + / +), mas não de animais desprovidos da enzima (PI3KY - / -) (Figura 1C), demonstrando a habilidade do peptídeo para interferir seletivamente com ancoragem PI3KY-dependente de PKA. De acordo com estes dados, o pré- tratamento de hBSMCs com o peptídeo inibidor PI3KY de Tróia traz aumento da acumulação de AMPc em 35% no seguimento da estimulação de β2-ARs, enquanto que os níveis de cAMP foram inalterados em células tratadas com peptídeo de controle P1 (Figuras 1D e E).

[0082] Uma vez que o cAMP é conhecido por induzir um decréscimo de níveis intracelulares de Ca2+ e, em consequência, por promover o relaxamento do músculo liso, a habilidade do peptídeo inibidor PI3KY de Tróia modificar concentrações de Ca2+ em hBSMCs foi analisada. O pico máximo de Ca2+ transiente induzido pelo agonista muscarínico carbacol foi significativamente menor em hBSMCs pré-tratados com o inibidor de PI3K, em comparação com as células expostas ao veículo ou ao peptídeo de controle P1 (Figura 2A-B). O principal mecanismo pelo qual os nucleotídeos cíclicos limitam a quantidade intracelular de Ca2+ em células do músculo liso é a inibição de canais de Ca2+ dependentes da voltagem (VOCCs). Além disso, foi anteriormente demonstrado que o PI3KY é um regulador chave de cAMP na vizinhança destes canais de Ca2+ (2). Para verificar se a inibição da atividade de ancoragem de PI3KY prejudica o influxo de Ca2+ através de VOCCs, hBSMCs foram expostos a uma solução contendo KCl, capazes de despolarizar a membrana e, portanto, para ativar VOCCs. O influxo de Ca2+ induzido por KCl foi completamente abolido pelo peptídeo inibidor PI3KY de Tróia, enquanto que não foi alterado em hBSMCs tratados com peptídeo de controle P1 ou veículo (Figura 2A- B). Para continuar a apoiar estes resultados, a fosforilação mediada por cAMP da subunidade formadora de poro do canal de Ca2+, Cav1.2, se mostrou significativamente mais elevada em hBSMCs tratados com o inibidor de PI3K em comparação com células de controle tratadas com veículo ou com o peptídeo P1 (Figura 2C).

[0083] No geral, estes dados indicam que um peptídeo de Tróia que inibe a função de ancoragem de PKA de PI3KY constitui um novo método para a inibição da PDE seleccionadas e reforço de cAMP de sinalização a seguir de β2-ARs, em células do músculo liso.

[0084] Peptídeo de Tróia derivado de PI3KY limita hiperreatividade das vias respiratórias em camundongossaudáveis e asmáticos

[0085] Para determinar a eficiência de transdução do peptídeo inibidor PI3KY in vivo nas vias respiratórias, uma fluoresceína (ITCF) marcada com uma forma do peptídeo foi instilada por via intra-traqueal em camundongos de tipo selvagem BALB / C. FITC foi detectado na traqueia e nos pulmões, mas não no cérebro ou no miocárdio, em 30 minutos após a administração (Figura 3A); isto demonstra que o peptídeo é eficazmente distribuído no trato respiratório dos animais. Além disso, os níveis de cAMP foram 30% mais elevados na traqueia e nos pulmões dos camundongos injetados com o peptídeo inibidor de Tróia PI3KY em comparação com os animais de controle tratados com solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou com peptídeo de controle P1 (Figura 3B). De acordo com uma acumulação de cAMP aumentada no trato respiratório, a hiper-reatividade das vias aéreas induzida pelo agonista muscarínico metacolina foi significativamente atenuada pelo peptídeo inibidor PI3K, mas não pelo peptídeo controle P1, em camundongos saudáveis (Figura 5C). Para verificar se a administração intra-traqueal do peptídeo de Tróia derivado de PI3KY suprime a hiper-responsividade das vias respiratórias associada com asma alérgica, (OVA), em que asma induzida foi gerada num modelo pré-clínico da ovalbumina. A redução do volume corrente induzida por metacolina foi significativamente atenuada em animais tratados com o peptídeo inibidor PI3KY em comparação com camundongos de controle, que receberam PBS ou o peptídeo P1 (Figura 3D).

[0086] Tomados em conjunto, estes dados demonstram a habilidade do peptídeo de Tróia derivado de PI3K para aumentar os níveis de cAMP in vivo das vias respiratórias e para funcionar como um broncodilatador.

[0087] Peptídeo de Tróia derivado de PI3KY aumenta os níveis de cAMP e aumenta a condutância de CFTR nas células epiteliais brônquicas que expressam o tipo selvagem ou um gene CFTR mutante ΔF508

[0088] Subsequentemente, a habilidade do peptídeo inibidor PI3KY de Tróia para aumentar os níveis de cAMP não só em células do músculo liso, mas também em células epiteliais das vias aéreas, foi examinada. Para este efeito, analisou-se a fosforilação mediada por cAMP do regulador da condutância transmembranar da fibrose cística (CFTR), o canal principal de cloreto (Cl -) no epitélio das vias respiratórias, cuja ativação é dependente de cAMP. A fosforilação CFTR foi significativamente mais elevada em células normais humanas epiteliais brônquicas (Nuli-1) tratadas com o peptídeo derivado de PI3KY Troiano, em comparação com células de controle expostas ao veículo ou ao peptídeo de controle P1 (Figura 4A). Em particular, a inibição da função de ancoragem da PI3KY reforça a fosforilação CFTR dependente de cAMP induzida por um conhecido inibidor de PDE4 (Figura 4B), o que sugere que o peptídeo inibidor PI3KY não só inibe PDE4, mas também de outras isoformas de PDE conhecidas como estando associadas com PI3KY, tal como a PDE3 (2).

[0089] Para examinar se o aumento da fosforilação de CFTR correlaciona com maior condutância de Cl-, medições de correntes de Cl- foram realizadas em câmaras de Ussing em células Nuli-1 que expressam o tipo selvagem de CFTR. Correntes dependentes de CFTR aumentaram significativamente após a aplicação do peptídeo de Tróia derivado de PI3KY, enquanto que o peptídeo controle de P1 não alterou a condutância (Figura 4C). Estes dados, portanto, revelam um novo papel para o peptídeo inibidor PI3KY como um potenciador de CFTR.

[0090] As moléculas com atividade de potenciador de CFTR são necessárias para estimular a abertura do CFTR defeituoso no tratamento de fibrose cística (FC). Para determinar se o peptídeo de Tróia derivado de PI3K é capaz de corrigir o defeito de condutância de Cl- da CFTR mutante, correntes dependentes de CFTR foram medidas em células epiteliais brônquicas expressando o mutante CFTR ΔF508-CFTR (CUFI-1). O inibidor inibidor PI3KY sinergicamente aumenta a atividade do potenciador CFTR conhecido, VX-770, o que resulta em um aumento das correntes de CFTR em cerca de 5 vezes mais do que a atividade basal (Figuras 4A e B). Em contraste, o peptídeo de controle P1 não alterou a atividade de CFTR de na presença de VX-770 (Figuras 4A e B).

[0091] No geral, estes dados revelam uma nova função para o peptídeo inibidor PI3KY como um potenciador de CFTR, que promove a abertura do canal cAMP- dependente de tipo selvagem e do mutante de CFTR (ΔF508-CFTR).

[0092] Peptídeo derivado de PI3KY troiano limita a inflamação pulmonar em camundongos asmáticos

[0093] É bem conhecido que um aumento de cAMP em leucócitos promove uma resposta anti-inflamatória. Portanto, foi avaliada a habilidade do peptídeo derivado de PI3KY de Tróia aumentar as concentrações de cAMP neste tipo de célula e, sendo assim, de limitar a inflamação associada com doenças respiratórias crônicas. Os camundongos pré-tratados com o peptídeo de controle P1 antes de cada injeção intranasal de ovalbumina mostraram um aumento na inflamação peribronquial (Figuras 7A e B) e no número de células goblet contendo muco e positivas para o reagente periódico de ácido de Schiff (PAS) em termos de coloração (Figuras 7A e C), em comparação com animais de controle não sensibilizados a ovalbumina (naive). O peptídeo derivado de PI3KY troiano reduziu significativamente tanto a infiltração peribrônquica inflamatória (Figuras 7A e B) quanto o número de células cálice (Figuras 7A e C). Em concordância com estes resultados, o número de neutrófilos presentes no lavado broncoalveolar foi significativamente menor nos animais tratados com o peptídeo inibidor PI3KY de Tróia em comparação com os controles que receberam o peptídeo P1 (Figura 7D). Em contraste, outras populações de leucócitos, tais como macrófagos, linfócitos e eosinófilos foram inalteradas (Figura 7E-FG).

[0094] No geral, esta evidência experimental demonstra a habilidade do peptídeo de Tróia derivado de PI3K para inibir seletivamente a neutrofilia associada com doenças respiratórias crônicas, e, sendo assim, funcionar como uma droga anti- inflamatória.

Referências:

[0095] 1. A. Perino, et al., Mol Cell 42 , 84 (08 de abril de 2011).

[0096] 2. A. Ghigo et al., Circulation 126 , 2073 (23 de outubro de 2012).

[0097] 3. M. Della Peruta, C. Giagulli, C. Laudanna, A. Scarpa, C. Sorio, Mol cancer 9, 61 (2010).

[0098] 4. E. Hirsch et al., Science 287 , 1049 (fevereiro 11, 2000).

[0099] 5. E. Patrucco et al., Cellular 118 , 375 (6 de agosto de 2004).

[00100] 6. V. Fanelli et al., Intensive Care Med 36 de 1935 (Nov, 2010).

Claims (13)

1. Produto caracterizado pelo fato de que compreende: 1) um peptídeo de fusão compreendendo a) uma sequência de aminoácidos como definido na SEQ ID No: 1 e possuindo a habilidade da sequência SEQ ID N°: 1 para inibir a função quinase independente de PI3Ky, e b) um peptídeo possuindo a habilidade para penetrar uma célula, e ii) um potenciador do regulador da condutância transmembranar da fibrose cística (CFTR) e/ou um corretor do regulador da condutância transmembranar da fibrose cística (CFTR) como uma preparação combinada para utilização sequencial, simultânea ou separada no tratamento de doenças respiratórias, doenças de preferência bronco-obstrutivas e mais preferencialmente fibrose cística.

2. Produto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do peptídeo possuindo a habilidade para penetrar uma célula ser selecionado entre as sequências especificadas na SEQ ID No: 3-12.

3. Produto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o peptídeo possuindo a habilidade para penetrar uma célula é conjugado com o C-terminal ou N-terminal da SEQ ID No: 1 ou de seus homólogos.

4. Produto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o potenciador do regulador da condutância transmembranar da fibrose cística (CFTR) é selecionado a partir de VX-770 (N- (2,4- Di-terc-butil-5-hidroxifenil) -1, 4- di-hidro-4-ossoquinolin-3-carboxamida) e VX-532 (4- metil-2- (5-fenil-1H-pirazol-3-il) -fenol).

5. Produto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o corretor do regulador da condutância transmembranar da fibrose cística (CFTR) é selecionado a partir de VX-809 (ácido 3- (6-(1-(2,2-difluorobenzo [d] [1 , 3] dioxol-5-il) ciclopropanocarboxamido) -3- metilpiridin-2-il) benzóico) e VX-661 ((R) -1- (2,2-difluorobenzo [d] [1,3] dioxol- 5-il) - N- (1- (2,3-di-hidroxipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5- il)ciclopropanocarboxamida).

6. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de compreender pelo menos um peptídeo de fusão e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que o peptídeo de fusão compreende: a) uma sequência de aminoácidos como definido na SEQ ID No: 1 e possuindo a habilidade da sequência SEQ ID N°: 1 para inibir a função quinase independente de PI3Ky, e b) um peptídeo possuindo a habilidade para penetrar uma célula.

7. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato do peptídeo possuindo a habilidade para penetrar uma célula ser selecionado entre as sequências especificadas na SEQ ID No: 3-12.

8. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o peptídeo possuindo a capacidade para penetrar uma célula é conjugado com o C-terminal ou N-terminal da SEQ ID No: 1 ou de seus homólogos.

9. Uso do peptídeo de fusão caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para tratar doenças respiratórias, de preferência doenças bronco-obstrutivas, e em que o peptídeo de fusão compreende: a) uma sequência de aminoácidos como definido na SEQ ID No: 1 e possuindo a habilidade da sequência SEQ ID N°: 1 para inibir a função quinase independente de PI3Ky, e b) um peptídeo possuindo a habilidade para penetrar uma célula.

10. Uso do peptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato do peptídeo possuindo a habilidade para penetrar uma célula ser selecionado entre as sequências especificadas na SEQ ID No: 3-12.

11. Uso do peptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que o peptídeo possuindo a habilidade para penetrar uma célula é conjugado com o C-terminal ou N-terminal da SEQ ID No: 1 ou de seus homólogos.

12. Uso do peptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que as doenças respiratórias são selecionadas a partir de asma alérgica, fibrose cística e doença pulmonar obstrutiva crônica.

13. Uso do peptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que o medicamento é adequado para administração por inalação.