BR112017001669B1 - Processos para a produção de um coquetel enzimático a partir de um micro-organismo celulolítico produzindo celulases e/ou hemicelulases, onde o micro-organismo é um fungo filamentoso, e para a hidrólise enzimática de um alimento - Google Patents
Processos para a produção de um coquetel enzimático a partir de um micro-organismo celulolítico produzindo celulases e/ou hemicelulases, onde o micro-organismo é um fungo filamentoso, e para a hidrólise enzimática de um alimento Download PDFInfo
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Abstract
PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UM COQUETEL ENZIMÁTICO A PARTIR DE MOSTO DE FUNGOS. A presente invenção refere-se a um processo para a produção de um coquetel enzimático a partir de um micro-organismo celulolítico produzindo celulases e/ou hemicelulases, compreendendo: - uma etapa para a produção de enzimas com um meio sendo obtido contendo enzimas e um mosto de micro-organismos, o dito mosto é separado ou não separado, do líquido contendo as ditas enzimas, - uma etapa de resfriamento de dito mosto para uma temperatura abaixo de temperatura da etapa de produção de enzima e por um tempo, de modo que a concentração de beta- glicosidase do líquido originando-se da dita etapa de resfriamento é maior que aquela do líquido originando-se da etapa de produção de enzima, e/ou a razão de volume de sólidos / volume total é menos que a dita razão para a etapa de produção de enzima, e um coquetel enzimático é obtido no fim da etapa de resfriamento.
Description
[001] A presente invenção refere-se a aperfeiçoamento de produção de enzimas celulolíticas e/ou hemicelulolíticas, em particular dentro do contexto de etanol a partir de materiais celulósicos ou lignocelulósicos.
[002] Estes últimos são produzidos de biomassa lignocelulósica e, tanto quanto o uso de terra de agricultura para a produção de biocombustíveis está relacionado, possuem menos problemas de competição com produção de alimento, do que os processos para assim chamada produtos de primeira geração baseados em cana de açúcar, milho, trigo, beterraba, etc.
[003] Os vários estudos técnicos - econômicos demonstram que a redução no custo das celulases é um dos fatores chaves dos processos para a produção biológica de etanol partindo de materiais brutos lignocelulósicos.
[004] No presente, celulases industriais são produzidas principalmente por um fungo filamentoso, Trichoderma reesei, devido sua alta capacidade de secreção. Nos processos convencionais para a produção de celulases, estas são recuperadas no sobrenadante de cultura via várias etapas de separação.
[005] O mosto de fungos (parte sólida recuperada após filtração) não é reutilizado. Ele é visto como um despejo.
[006] Além disso, o coquetel enzimático produzido pelas linhagens hiperprodutoras de Trichoderma reesei é carente em termos Segue-se na folha 1a de atividade beta-glicosidase.
[007] Patentes propuseram processos para aperfeiçoamento de linhagem produtora em várias maneiras: através de superexpressão de gene (tal como pedido de patente EP2082054 com relação à super rexpressão de uma beta-glicosidase), ou através de clonagem de beta- glicosidases mais efetivas originando-se de outros micro-organismos (tal como pedido de patente WO2013115305 que descreve a clonagem do gene beta-glicosidase de Aspergillus em Trichoderma reesei) ou também através de criação de novos genes mais eficazes a partir de diferentes genes de beta-glicosidase (tal como o pedido de patente WO2010029259 que descreve a produção de variantes de beta- glicosidase com aperfeiçoada atividade através de embaralhamento- L).
[008] Também é conhecido de pedido de patente WO11079048 que, em um processo SSF (hidrólise e fermentação simultâneas), o aumento em atividade beta-xilosidase tem um efeito benéfico sobre hidrólise enzimática uma vez que torna possível reduzir a dose de enzimas usada. Ele também torna possível hidrolisar os alquil xilosídeos. A invenção propõe um processo para a produção de um coquetel en- zimático e uma instalação apropriada para implementação de processo de acordo com a invenção, um coquetel que torna possível aumentar significantemente, ou mesmo dramaticamente atividades de beta- glicosidase e beta-xilosidase.
[009] Surpreendentemente, foi verificado que a implementação do processo de acordo com a invenção conduz a um suficiente aperfeiçoamento na atividade específica de beta-glicosidase, FPase e be- ta-xilosidase. Atividade de beta - glicosidase pode estar entre 3 e 10 vezes maior que aquela medida no final de produção de enzima sob condições normais, aquela de beta-xilosidase, 3 vezes maior.
[0010] O mosto de fungos que é separado das enzimas durante uma convencional etapa de produção de enzima é por isso reutilizado, isto deve representar 10-20%em massa com relação à massa total da cultura.
[0011] Mais precisamente, a invenção refere-se a um processo para a produção de um coquetel enzimático a partir de um microorganismo celulolitico produzindo celulases e/ou hemicelulases, compreendendo - uma etapa para a produção de enzimas com um meio sendo obtido contendo enzimas e um mosto de micro-organismos, o dito mosto é separado, ou não separado, do líquido contendo as ditas enzimas, - uma etapa de resfriamento de dito mosto para uma temperatura compreendida entre 4 e 20oC que é uma temperatura abaixo de temperatura da etapa de produção de enzima, por um tempo de modo que - a concentração de beta-glicosidase ou beta-xilosidase do líquido se originando da etapa de resfriamento é maior que aquela do líquido originando-se da etapa de produção de enzima, e/ou - a razão de volume de sólido / volume total é menos que a dita razão para a etapa de produção de enzima, - e um coquetel enzimático é obtido no final da etapa de resfriamento.
[0012] Vantajosamente, a temperatura da etapa de resfriamento está compreendida entre 4 e 20oC, e preferivelmente entre 4oC e 18oC.
[0013] Preferivelmente, a etapa de resfriamento é realizada em um pH compreendido entre 3,5 e 5,5, e preferivelmente maior que 4.
[0014] Em uma maneira preferida, a etapa de resfriamento é realizada em uma atmosfera esgotada de oxigênio, preferivelmente em uma atmosfera anaeróbica.
[0015] Genericamente, um gás neutro, por exemplo, nitrogênio ou dióxido de carbono, é injetado. Preferivelmente, o micro-organismo pertence ao gênero Trichoderma, em particular Trichoderma reesei, e é preferivelmente a linhagem CL847.
[0016] Após a etapa de resfriamento, o coquetel enzimático se originando do mosto é separado e um mosto residual é obtido.
[0017] Genericamente, a separação ocorre por meio de pelo menos uma centrifugação ou filtração / prensagem ou microfiltração, opcionalmente precedida por deposição. As enzimas no líquido separado podem ser concentradas, por exemplo, através de ultrafiltração.
[0018] O micro-organismo usado é selecionado dos fungos celulo- líticos ou outros micro-organismos modificados. Em uma maneira preferida, o micro-organismo celulolítico pertence aos gêneros Trichoder- ma, Aspergillus, Penicillium e Schizophyllum que produzem em particular as celulases e hemicelulases apropriadas para a hidrólise total de elulose e hemiceluloses.
[0019] As linhagens industriais usadas pertencem, em uma maneira preferida, às espécies Trichoderma reesei; o fungo foi genericamente modificado de modo a aperfeiçoar a produção de enzimas celulósicas e/ou hemicelulósicas através de processos de seleção - mutação (mutagênese randômica), tal como, por exemplo, a linhagem IFP CL847 (patente Francesa FR-B-2 555 803). Estas linhagens são bem conhecidas por aqueles versados na técnica.
[0020] O processo de acordo com a presente invenção compreende uma etapa de produção de enzima com um meio sendo obtido contendo enzimas e um mosto de micro-organismos, e com uma opcional separação de dito mosto do líquido contendo as enzimas.
[0021] As linhagens são cultivadas em um fermentador agitado e aerado sob condições compatíveis com seu crescimento e a produção das enzimas; estas condições são conhecidas por aqueles versados na técnica. Uma fonte de carbono para crescimento e uma fonte indutiva para a produção de enzimas são introduzidas. A fonte de carbono pode ser um açúcar solúvel industrial, por exemplo, glicose, lactose ou xilose, ou um extrato da fração hemicelulósica na forma de monôme- ros originando-se da biomassa previamente tratada. A fonte de carbono indutiva pode ser selecionada de lactose, celobiose, soforose, e celulose. O resíduo de hidrólise ou o material lignocelulósico previamente tratado também pode ser usado como uma fonte de carbono para o crescimento do micro-organismo e a indução do sistema de expressão. A última fonte de carbono também pode ser usada por linhagens geneticamente aperfeiçoadas e em particular as linhagens re- combinantes.
[0022] No fim da etapa de produção de enzima, o mosto é separado do líquido ou não é separado do líquido ou também somente uma parte do mosto pode ser separada. O mosto corresponde ao fungo, à parte sólida. O líquido contém as enzimas. O mosto separado pode ser diluído (no todo ou em parte). O mosto separado é preferivelmente diluído com água.
[0023] A separação pode ser adaptada, em particular dependendo das desejadas atividades. A separação pode ser realizada por quaisquer meios conhecidos por aqueles versados na técnica. Preferivelmente, pelo menos uma centrifugação ou uma filtração / prensagem (filtro - prensa) ou microfiltração pode ser mencionada. A centrifugação é opcionalmente precedida por deposição. Uma etapa de concentração de enzimas, por exemplo, através de ultrafiltração, pode ser imaginada.
[0024] O processo de acordo com a invenção continua com uma etapa de resfriamento de dito mosto (separado ou não) para uma temperatura abaixo de temperatura da etapa de produção de enzima e por um específico período de tempo.
[0025] A temperatura da etapa de resfriamento está vantajosamente compreendida entre 4 e 20oC, e preferivelmente entre 4oC e 18oC.
[0026] Preferivelmente, a etapa de resfriamento é realizada em um pH compreendido entre 3,5 e 5,5, e preferivelmente maior que 4. Este intervalo de pH é definido entre o pH de 3 do início de desativação da beta-glicosidase e o pH 6 de possível esporulação dos fungos.
[0027] Preferivelmente, a etapa de resfriamento é realizada em uma atmosfera esgotada de oxigênio, preferivelmente em uma atmosfera anaeróbica. Geralmente, um gás neutro, por exemplo, nitrogênio ou dióxido de carbono, é injetado. Um rendimento aperfeiçoado foi observado em uma atmosfera esgotada de oxigênio, e os melhores rendimentos são em uma atmosfera anaeróbica. Na presença de oxigênio o fungo pode novamente consumir as enzimas. Genericamente, resfriamento por no máximo 120 horas, preferivelmente 12 horas a 90 horas, preferivelmente 24 a 72 horas é suficiente, e genericamente aproximadamente 48 horas.
[0028] Durante esta etapa de resfriamento, uma reação de autólise do fungo presente no mosto é estabelecida, autólise gerada pelas enzimas. As últimas estão presentes tanto no líquido do mosto não separado ou elas são aquelas que ainda estão mantidas dentro do mosto separado e que não foram capazes de serem separadas. É notado experimentalmente que, sob as condições do processo de acordo com a invenção, as atividades de beta-glicosidase e beta-xilosidase aumentam muito significantemente e a pelota de biomassa reduz.
[0029] De modo a otimizar o rendimento de coquetel enzimático, o tempo de resfriamento pode ser determinado anteriormente em um teste de laboratório.
[0030] Vantajosamente, o tempo de resfriamento é controlado durante a implementação do processo, o progresso da reação é monitorado através de retirada de amostras.
[0031] O tempo de resfriamento é tal que - a atividade beta-glicosidase ou beta-xilosidase do líquido originando da etapa de resfriamento é maior que aquela do lí- quido originando da etapa de produção de enzima, e/ou - a razão de volume de sólido / volume total (pelota de biomassa) é menos que a dita razão para a etapa de produção de enzima.
[0032] O substrato usado de modo a determinar a atividade de be- ta-glicosidase ou aril beta-glicosidase é p-nitro fenil-beta-D- glicopiranosídeo (PNPG). Ele é clivado por beta-glicosidase que libera p-nitrofenol.
[0033] Uma unidade de atividade de aril beta-glicosidase é definida como a quantidade de enzima requerida para produzir 1 μmol de p- nitrofenol a partir de PNPG por minuto e é expressa em IU/mL.
[0034] O substrato usado de modo a determinar a atividade beta- xilosidase é p-nitro fenil-beta-D-xilopiranosídeo de acordo com o mesmo princípio.
[0035] Estes parâmetros são determinados a partir de medições.
[0036] Foi observado que, durante o processo, a concentração de beta-glicosidase aumenta, atinge um máximo então diminui. Ao mesmo tempo, foi observado que a pelota de biomassa diminui.
[0037] Por meio de exemplo, foi notado que genericamente a quantidade de líquido liberada é equivalente a pelo menos 10%, e mais frequentemente 30-40% do peso original do mosto separado e que a concentração de proteínas, medida em termos de atividades de beta-glicosidase e beta-xilosidase, foi multiplicada por 3. Determinação de tempo de resfriamento baseado nesta informação está dentro de competência daqueles versados na técnica.
[0038] Após a etapa de resfriamento, o coquetel enzimático (parte líquida) pode ser separado, ou não, do sólido residual; preferivelmente ele é separado.
[0039] Os meios de separação são aqueles descritos anteriormen- te.
[0040] Foi notado que esta separação é mais difícil, mais delicada quando o mosto não foi separado direito no fim da cultura.
[0041] Também, em uma maneira muito preferida, uma separação do mosto é realizada antes de etapa de resfriamento, preferivelmente com um filtro prensa. Preferivelmente, pelo menos 95% do mosto são separados e mesmo em uma maneira mais preferida todo o mosto é separado do líquido. Por “todo” é aqui entendido relacionar-se ao processo de separação usado.
[0042] Preferivelmente, o dito coquetel enzimático se originando da etapa de resfriamento é misturado com as enzimas se originando da etapa de produção de enzima. O dito coquetel é misturado no todo ou em parte. O dito coquetel, misturado ou não, é usado em hidrólise enzimática.
[0043] O mosto residual pode ser opcionalmente submetido a uma nova etapa de resfriamento, mas preferivelmente, seguida por uma separação de um novo coquetel enzimático. As condições destas etapas são aquelas descritas anteriormente. Uma etapa de resfriamento adicional é aqui indicada, mas seu número não é limitado. Assim, a invenção também se refere a um processo implementando as etapas precedentes onde o dito mosto residual é submetido a uma etapa de resfriamento e um coquetel enzimático, separado ou não separado do mosto residual, é obtido no fim da etapa de resfriamento. Preferivelmente, o dito coquetel é separado do mosto residual obtido no fim da dita etapa da dita etapa de resfriamento.
[0044] Preferivelmente, os coquetéis enzimáticos se originando das etapas de resfriamento são misturados. Preferivelmente, eles são misturados com as enzimas se originando da etapa de produção de enzima.
[0045] Geralmente, é possível misturar cada um dos coquetéis uns com os outros e/ou com as enzimas originando-se da etapa de produção de enzimas. A proporção de cada um dos componentes da mistura é determinada de acordo com o uso da dita mistura. Preferivelmente, os coquetéis e enzimas são misturados em suas totalidades.
[0046] Pelo menos um coquetel, misturado ou não, é usado em hidrólise enzimática.
[0047] A invenção será melhor entendida a partir das figuras 1 a 6. As Figuras 7 a 13 se referem aos exemplos.
[0048] A Figura 1 descreve a realização preferida com uma etapa de separação entre a etapa de produção de enzima e a etapa de resfriamento. A Figura 2 é uma representação sem separação do mosto. Nas Figuras 3 e 4, uma etapa de resfriamento adicional é adicionada as Figuras 1 e 2 respectivamente.
[0049] A Figura 5 mostra uma realização combinando a presença ou ausência de separação.
[0050] A Figura 6 mostra uma realização preferida da etapa de separação de mosto antes e/ou após a etapa de resfriamento.
[0051] De acordo com a Figura 1, uma fonte de carbono e uma fonte indutiva são introduzidas (tubulação 1) em uma etapa de produção de enzima (zona de produção de enzima 2), assim como um micro-organismo celulolítico produzindo celulases e/ou hemicelulases (tubulação 3) e os requeridos nutrientes (tubulação 4).
[0052] O produto obtido é separado (zona de separação 5) em um líquido contendo as enzimas (tubulação 6) e um mosto é recuperado (tubulação 7) contendo os fungos e enzimas ali retidas.
[0053] O mosto é submetido à etapa de resfriamento (zona de resfriamento 8).
[0054] Em uma realização, o líquido é retirado da zona de produção de enzima (reator) e o mosto permanece na dita zona onde ele é resfriado.
[0055] Em uma outra realização preferida, o meio de cultura é retirado da zona de produção de enzima e separado em um meio de separação (filtração / prensagem, centrifugação, etc.), preferivelmente após deposição e retirada do líquido, de modo a obter o mosto. Este mosto é introduzido na zona de resfriamento que pode ser o reator da zona de produção de enzima (no caso de um processo descontínuo) ou um outro reator (no caso de um processo contínuo).
[0056] O mosto resfriado (tubulação 9) é separado (zona 10) em um líquido contendo o coquetel enzimático (tubulação 11) e o sólido que é o mosto residual (tubulação 12).
[0057] As enzimas nos fluxos de tubulações 6 e 11 são misturadas e enviadas (tubulação 13) na zona de hidrólise enzimática (14).
[0058] A Figura 3 repete este diagrama, adicionando uma etapa de resfriamento.
[0059] O mosto residual (mosto 12) é submetido à etapa de resfriamento adicional (zona de resfriamento 15).
[0060] Da mesma maneira como previamente, o mosto enviado na etapa de resfriamento adicional (zona 15) pode não ter sido separado na zona 10 após a primeira etapa de resfriamento (zona 8). O mosto resfriado (tubulação 16) é separado (zona 17) em um líquido contendo o coquetel enzimático (tubulação 19) e um sólido que é o mosto residual (tubulação 18). As enzimas no fluxo da tubulação 19 são misturadas com aquelas dos fluxos se originando da etapa de produção de enzima (tubulação 6), da primeira etapa de resfriamento (tubulação 11) e são enviados (tubulação 20) na zona de hidrólise enzimática (14).
[0061] Os números de referência de Figura 1 serão reconhecidos na Figura 2. A etapa de separação (zona 5) após a etapa de produção de enzima é omitida.
[0062] O mesmo se aplica à Figura 4 que é baseada na Figura 2 e que inclui a etapa de resfriamento adicional, os números de referência referindo-se a esta adição são tomados da Figura 3.
[0063] Também é possível combinar em um diagrama a presença de uma separação e a ausência da outra separação. Isto é, por exemplo, ilustrado na Figura 5. Isto mostra a presença da separação no fim da etapa de produção de enzima (zona 5), a ausência de separação no fim da primeira etapa de resfriamento (zona 8) e antes de adicional etapa de resfriamento, e a presença de separação após a etapa de resfriamento adicional (zona 17).
[0064] A Figura 6 mostra uma realização preferida da etapa de separação de mosto antes e/ou após a etapa de resfriamento.
[0065] Com referência à Figura 1, esta é uma realização de zona 5 e/ou de zona 10. No término da zona de produção de enzima 2, o meio de cultura é separado em uma etapa de deposição (zona 30), os fungos estão localizados na lama depositada (tubulação 31) e o licor turvo obtido (tubulação 32) passa em uma etapa de centrifugação (zona de centrifugação 33). Isto resulta em um creme (tubulação 34) contendo os fungos e um licor claro (tubulação 35). De modo a obter a separação, o licor claro passa em uma etapa de microfiltração (zona 36), o retentado (tubulação 37) contém os fungos, e o permeado (tubulação 38) contém as enzimas.
[0066] Os diferentes fluxos contendo os fungos (lama, creme, retido) podem ser misturados e constituem o mosto que será enviado para a etapa de resfriamento ou constituem o mosto residual que será submetido, ou não submetido, a uma nova etapa de resfriamento.
[0067] De modo a concentrar as enzimas, o permeado é passado em uma etapa de ultrafiltração. Um retido concentrado de enzimas (tubulação 40) é então obtido, assim como um permeado (tubulação 41) que pode ser reutilizado no processo.
[0068] Será notado que todas as etapas de deposição e centrifugação podem ser substituídas por uma filtração / prensagem ( filtro / prensa).
[0069] A Figura 7 é uma foto do mosto de Trichoderma reesei CL847 após separação e antes de etapa de resfriamento.
[0070] A Figura 8 mostra a mudança na concentração de proteínas no sobrenadante de cultura.
[0071] A Figura 9 mostra a atividade de beta-glicosidase medida no final da etapa de produção e após resfriamento de fungos a 4oC por 72 horas.
[0072] A produção de celulase é realizada em um biorreator de 20 L (dos quais 12 L são úteis) agitado mecanicamente. O meio mineral tem a seguinte composição: KOH 1.66 g./L, H3PO4 85% 2 mL/L, (NH4)2SO4 2.8 g/L, MgSO4.7 H2O 0.6 g/L, CaCL2 0.6 g/L, MnSO4 3.2 mg/L, ZnSO4.7 H2O 2.8 mg/L, CoCl2 10 4.0 mg/L, FeSO4.7 H2O 10 mg/L, infusão de milho 1,2 g/L, agente antiespumante 0,5 mL/L.
[0073] O biorreator contendo o meio mineral é esterilizado a 120oC por 20 minutos, a fonte contendo carbono glicose é esterilizada separadamente a 120oC por 20 minutos então adicionada de maneira estéril no biorreator de modo a ter-se uma concentração final de 30 g/L. O biorreator é semeado em 10% (v/v) com uma pré-cultura líquida da linhagem de Trichoderma reesei CL847. O meio mineral da pré-cultura é idêntico àquele do biorreator à parte da adição de ftalato de potássio em 5 g/L de modo a tamponar o pH. O crescimento dos fungos na pré- cultura é realizado usando glicose como substrato contendo carbono, em uma concentração de 30 g/L. O crescimento do inóculo demora de 2 a 3 dias e é realizado a 28oC em uma incubadora agitada. A transferência para o biorreator é realizada se a concentração de glicose residual é de menos que 15 g/L.
[0074] O experimento de produção realizado no biorreator com- preende duas fases: - uma fase de crescimento sobre um substrato contendo carbono glicose (concentração inicial = 30 g/L) em uma temperatura de 27oC e um pH de 4,8 (regulado com amônia 5,5 M). Aeração é em 0,5 vvm e agitação é aumentada entre 200 e 800 rpm dependendo da pO2 ((pressão de oxigênio dissolvido), que é mantida maior que 30%. - uma fase de produção de enzima. Quando o substrato original do fermentador é exaurido, uma solução de lactose em 250 g/L é continuamente injetada em uma taxa de fluxo de 35 a 45 mg por g de células e por hora até 164 horas. A temperatura é reduzida para 25oC e o pH para 4 até o fim da cultura. O pH é ajustado pela adição de uma solução 5,5 N de amônia que supre o nitrogênio requerido para a síntese das proteínas excretadas. O teor de oxigênio dissolvido é mantido acima de 15 a 20% através de ação de aeração e agitação.
[0075] A produção de enzimas é seguida por ensaio das proteínas extracelulares através do processo Lowry e padrão BSA, após separação do micélio por filtração ou de células formadas. A concentração final de proteínas obtida é igual a 45 g/L.
[0076] Esta etapa de produção foi seguida por separação do mosto de fungos do sobrenadante de cultura. O mosto foi prensado de modo a extrair-se uma quantidade máxima de sobrenadante (Figura 7) e pesado. O último foi colocado em um recipiente fechado a 4oC por 72 horas.
[0077] Amostras do sobrenadante liberado após a autólise dos fungos foram tomadas cada 24 horas até 72 horas.
[0078] O peso do líquido foi determinado após 72 horas. Ele é equivalente a 30% do peso do mosto. Ensaios das concentrações são mostrados na Figura 8. Pode ser visto que a concentração é multiplicada por 3 em relação ao fim da produção de enzima assim como a atividade de beta-glicosidase (Figura 9).
[0079] A Figura 10 mostra a atividade de beta-glicosidase medida no final da cultura e após autólise dos fungos a 4oC e 20oC por 72 horas.
[0080] A Figura 11 mostra a atividade de beta-glicosidase específica (IU/mg) obtida após as duas séries de separação.
[0081] A Figura 12 mostra a atividade FPase específica (IU/mg) obtida após duas séries de separação.
[0082] A Figura 13 corresponde à identificação das enzimas na etapa de separação.
[0083] O processo é implementado em uma unidade piloto de 6 m3. Os fungos Trichoderma reesei CL847 são cultivados sob as mesmas condições descritas no Exemplo 1. No final da fase de produção as enzimas são separadas em 4 etapas: uma etapa de deposição, uma etapa de centrifugação, uma etapa de microfiltração e uma etapa de ultrafiltração.
[0084] Estas quatro etapas são mostradas diagramaticamente na Figura 6. As primeiras três etapas servem para eliminar os fungos e a última etapa (ultrafiltração) serve para concentrar as enzimas produzidas.
[0085] Todas as frações de fungos recuperadas (lama de deposi- tador, creme de centrífuga e retido de microfiltração), são colocados no biorreator, resfriados a 8oC por 72 horas e diluídos com água para um volume final igual a 4 m3. O mosto sofre uma segunda série de separações: centrifugação, microfiltração e ultrafiltração.
[0086] A quantidade de enzimas recuperada no final da segunda série de separação é similar àquela obtida no final da primeira, isto é, aproximadamente 70 kg de proteínas após a primeira série e 64 kg após a segunda série de separação. Em contraste, é interessante notar que a atividade beta-glicosidase (Figura 11) e a atividade FPase (Figura 12)específicas para o coquetel enzimático obtido são 20% maior após a etapa de resfriamento (autólise dos fungos). O coquetel enzimático recuperado é consequentemente muito mais efetivo.
[0087] Eletroforeses bidimensionais foram realizadas de modo a ver se houve significante modificação da composição do coquetel en- zimático durante as etapas de separação. Partindo de amostras des- salinizadas de antemão usando FPLC (cromatografia líquida de proteína rápida), com depósitos de 200 microgramas sobre o gel 2D, e mancha de azul Coomassie, as proteínas são separadas de acordo com sua massa molecular e seu ponto isoelétrico.
[0088] Os géis explorados são mostrados na Figura 13, Figura 13a corresponde ao creme e Figura 13b ao licor claro.
[0089] As principais enzimas foram identificadas na etapa de centrifugação no licor claro e o creme. Uma significante diferença foi notada nos perfis dos géis. Os cremes de centrifugação mostram beta- xilosidases. Esta atividade foi medida sobre pnp=-xilose para confirmação e uma atividade específica foi verificada a qual foi aproximadamente 3 vezes maior nos cremes do que no coquetel enzimático obtido no fim de produção (1,2 IU/mg nos cremes e 0,4 IU/mg na amostra final do fermentador).
Claims (18)
1. Processo para a produção de um coquetel enzimático a partir de um micro-organismo celulolítico produzindo celulases e/ou hemicelulases, onde o micro-organismo é um fungo filamentoso, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) - produzir enzimas para obter um meio contendo enzimas e um mosto de micro-organismos, e separar o dito mosto do líquido contendo as ditas enzimas, (b) - resfriar o dito mosto para uma temperatura compreendida entre 4 e 20oC, que é uma temperatura abaixo da temperatura da etapa de produção da enzima, por um tempo de 12 a 90 horas, de modo que: - a concentração de beta-glicosidase ou beta-xilosidase do líquido originário da etapa de resfriamento é maior do que aquela do líquido originário da etapa de produção de enzima (a), e/ou - a razão de volume de sólidos/volume total é menor do que a dita razão para a etapa de produção de enzima, e (c) - obter um coquetel enzimático ao fim da etapa de resfriamento (b).
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito mosto separado é diluído com água.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, após o resfriamento (b), o coquetel enzimático originário do mosto é separado e é obtido um mosto residual.
4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a separação ocorre por pelo menos uma centrifugação ou filtração/prensagem ou microfiltração, opcionalmente precedida por sedimentação.
5. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que as enzimas do líquido separado estão concentradas.
6. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o resfriamento (b) é realizado a um pH entre 3,5 e 5,5.
7. Processo para a produção de um coquetel enzimático a partir de um micro-organismo celulolítico que produz celulases e/ou hemicelulases, onde o micro-organismo é um fungo filamentoso, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) - produzir enzimas para obter um meio contendo enzimas e um mosto de micro-organismos, opcionalmente, separar o dito mosto do dito líquido contendo as ditas enzimas, (b) - resfriar o dito mosto para uma temperatura compreendida entre 4 e 20oC, que é uma temperatura abaixo da temperatura da etapa de produção da enzima, por um tempo de modo que: - a concentração de beta-glicosidase ou beta-xilosidase do líquido originário da etapa de resfriamento é maior do que aquela do líquido originário da etapa de produção da enzima (a), e/ou - a razão de volume de sólidos/volume total é menor do que a dita razão para a produção de enzima, e (c) - obter um coquetel enzimático ao fim da etapa de resfriamento (b), em que o resfriamento (b) é realizado em uma atmosfera sem oxigênio.
8. Processo para a produção de um coquetel enzimático a partir de um micro-organismo celulolítico que produz celulases e/ou hemicelulases, onde o microrganismo é um fungo filamentoso, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) - produzir enzimas para obter um meio contendo enzimas e um mosto de micro-organismos, opcionalmente, separar o dito mosto do líquido contendo as ditas enzimas, (b) - resfriar o dito mosto para uma temperatura compreendida entre 4 e 20oC, que é uma temperatura abaixo da temperatura da etapa de produção da enzima, por um tempo de modo que: - a concentração de beta-glicosidase ou beta-xilosidase do líquido originário da etapa de resfriamento é maior do que aquela do líquido originário da etapa de produção de enzima (a), e/ou - a razão de volume de sólidos/volume total é menor do que a dita razão para a etapa de produção de enzima, e (c) - obter um coquetel enzimático ao fim da etapa de resfriamento (b), em que, no resfriamento (b), um gás neutro é injetado.
9. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o microrganismo pertence ao gênero Trichoderma.
10. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o dito mosto residual é submetido a resfriamento e é obtido no final do resfriamento um coquetel enzimático, opcionalmente separado do mosto residual.
11. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que são misturados coquetéis enzimáticos originários da produção do mosto separado.
12. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um coquetel enzimático é misturado com o líquido separado contendo enzimas e originário da produção da enzima (a).
13. Processo para a hidrólise enzimática de um alimento, compreendendo submeter o dito alimento a pelo menos um coquetel enzimático obtido como definido na reivindicação 1.
14. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o microrganismo pertence a Trichoderma reesei.
15. Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o microrganismo pertence à cepa CL 847.
16. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o resfriamento é realizado em uma atmosfera anaeróbica.
17. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o gás de resfriamento é dióxido de carbono ou nitrogênio.
18. Processo para a produção de um coquetel enzimático a partir de um micro-organismo celulolítico que produz celulases e/ou hemicelulases, onde o microrganismo é um fungo filamentoso, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) - produzir enzimas para obter um meio contendo enzimas e um mosto de micro-organismos, e separar o dito mosto do líquido contendo as ditas enzimas, (b) - resfriar o dito mosto para uma temperatura compreendida entre 4 e 20oC, que é uma temperatura abaixo da temperatura da etapa de produção da enzima, por um tempo de 12 a 90 horas, de modo que: - a concentração de beta-glicosidase ou beta-xilosidase do líquido originário da etapa de resfriamento é maior do que aquela do líquido originário da etapa de produção de enzima (a), e/ou - a razão de volume de sólidos/volume total é menor do que a dita razão para a etapa de produção de enzima, e (c) - obter um coquetel enzimático ao fim da etapa de resfriamento (b), através da mistura do líquido contendo as referidas enzimas de (a) e o líquido originário do resfriamento em (b).
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