BR112016020688B1

BR112016020688B1 - Vetores virais recombinantes, vírus adenoassociado recombinante, composição farmacêutica, bem como uso dos mesmos

Info

Publication number: BR112016020688B1
Application number: BR112016020688-6A
Authority: BR
Inventors: Lili Wang; James M. Wilson
Original assignee: The Trustees Of The University Of Pennsylvania
Priority date: 2014-03-09
Filing date: 2015-03-09
Publication date: 2024-01-30
Also published as: US11732246B2; IL247329A0; EP3778627A1; IL247329B; WO2015138348A1; US10167454B2; HUE051311T2; CL2016002235A1; AU2020201190B2; JP6920500B2; WO2015138357A2; JP6822841B2; HRP20201544T1; CA2939950C; JP2017512466A; CL2019002280A1; BR122023023004A2; ES2821938T3; LT3116900T; EP3116900A1

Abstract

composições úteis no tratamento da deficiência da ornitina transcarbamilase (otc). vetores virais compreendendo sequências de dna e rn a de hotc manipuladas são fornecidos, que quando administrados a um sujeito em necessidade do mesmo são úteis para o tratamento de hiperamonemia, deficiência de ornitina transcarbamilase e sintomas a estes associados. são também fornecidos métodos de utilização de hotc para tratamento de fibrose/cirrose hepática em pacientes com otcd através da administração de hotc.

Description

DECLARAÇÃO SOBRE PESQUISA OU DESENVOLVIMENTO FINANCIADA PELO GOVERNO FEDERAL

[001] Este trabalho foi apoiado parcialmente através de bolsas do National Institutes of Health, Nos. P01-HD057247, P01-HL059407 e P30-DK047757. O governo dos Estados Unidos da América pode ter certos direitos nesta invenção.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DE MATERIAL APRESENTADO EM FORMATO ELETRÔNICO

[002] O Requerente pelo presente incorpora por referência o material Listagem de Sequências depositado em formato electrónico juntamente. Este arquivo é identificado como "UPN-14- 7037PCT_ST25.txt".

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] A deficiência de ornitina transcarbamilase (OTC) é responsável por quase a metade de todos os casos de erros inatos na síntese de ureia, com uma prevalência estimada em pelo menos 1 em 15.000. Os defeitos do ciclo da ureia colocam os pacientes em risco de vida com perigoso aumento de amônia que pode levar a deficiência cognitiva irreversível, coma e morte. Os recém-nascidos do sexo masculino com deficiência completa desenvolvem coma hiperamonêmico nos primeiros 3 dias de vida, que se não tratado, é letal.

[004] As terapias atuais para a deficiência de OTC (OTCD) têm inúmeros desafios. Os pacientes podem ser controlados com uma dieta com baixa proteína em combinação com o uso de medicamentos que ativam vias alternativas de liberação de nitrogênio, mas isso não impede crises hiperamonêmicas. Apesar do uso de diálise e terapia de via alternativa, existe quase uma taxa de mortalidade de 50% em recém-nascidos. O transplante de fígado pode curar OTCD, mas o fígado doador é fator limitativo, o procedimento acarreta uma morbilidade significativa e imunossupressores são necessários para a duração da vida do indivíduo.

[005] A terapia genética de uma doença metabólica tal como OTCD apresenta um modelo mais complicado para a terapia de substituição de genes que outras condições. Uma vez que o gene atua de uma forma independente da célula (isto é, só pode influenciar a célula na qual ele é expresso), os efeitos terapêuticos devem ser diretamente correlacionados com o número de células alvo que são transduzidas, em vez de com o nível de expressão no fígado, tal como com uma proteína segregada onde a alta expressão por célula pode superar a baixa transdução. Além disso, existe pelo menos um estudo publicado que o mRNA de hOTCwt é instável. [Wang, L. et al, Molecular Genetics and Metabolism, 105 (2012) 203-211].

[006] Existem estudos publicados do uso de vetores virais para a tentativa de tratamento da deficiência de OTC. Por exemplo, vários grupos têm tentado isto em modelos de murino de deficiência de OTC, utilizando adenovírus recombinantes que transportam cDNA de OTC de rato, camundongo ou humano. Algum índice de reconstituição bem- sucedido de atividade OTC no fígado e correção de distúrbios metabólicos têm sido descritos em modelos animais com vírus que transportam cDNA de OTC de rato ou camundongo. Estudos anteriores usando vetores adenovirais têm ilustrado as dificuldades de expressar níveis aceitáveis de OTC humana ativa em camundongos OTCD.

[007] Sendo assim, existe uma necessidade de outras abordagens de terapia para OTCD.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] Em um aspecto, a invenção fornece um vetor viral recombinante possuindo um cassete de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucleico manipulada que codifica ornitina transcarbamilase humana (hOTCase) e sequências de controle da expressão que direcionam a expressão de hOTC em uma célula do fígado, em que a sequência de ácido nucleico da hOTC é menos do que em que a sequência de ácido nucleico da hOTC é menos do que 80% idêntica à sequência hOTC de tipo selvagem (por exemplo, SEQ ID NO: 1), ou um seu fragmento que compreende a hOTC madura mas desprovido de pelo menos a sequência líder nativa, ou outro intermediário que compreende pelo menos a hOTC madura) e expressa uma hOTCase funcional. Adequadamente, a sequência manipulada foi preferencialmente otimizada para códons e melhorada adicionalmente de tal modo que aumenta pelo menos um de transdução, transcrição e/ou tradução da enzima.

[009] A sequência de ácido nucleico pode compreender a hOTC madura de SEQ ID NO: 5 ou uma sequência de ácido nucleico pelo menos cerca de 96 a cerca de 99% idêntica a ela ou a uma sequência de ácido nucleico compreendendo pelo menos a hOTC madura de SEQ ID NO: 9, ou uma sequência de ácido nucleico pelo menos cerca de 96 a cerca de 99% idêntica à mesma, que expressam uma hOTCase funcional. Em uma modalidade, a hOTC é do comprimento total da SEQ ID NO: 5 ou uma sequência de ácido nucleico pelo menos cerca de 96 a cerca de 99% idêntica à mesma ou uma sequência de ácido nucleico de comprimento total de SEQ ID NO: 9, ou uma sequência de ácido nucleico pelo menos cerca de 96 a cerca de 99% idêntica à mesma. A sequência hOTC pode ser a dos nucleotídeos correspondentes da SEQ ID NO: 3, 4, 8 ou 9. Abrangido no âmbito se a invenção são as cadeias complementares para aquelas na listagem de sequências. O vetor viral pode ser selecionado de um vetor de vírus adeno-associado (AAV), um vetor adenoviral e um vetor lentiviral.

[0010] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um vírus adeno-associado recombinante (rAAV) que tem um capsídeo de AAV e nele acondicionado um cassete de expressão compreendendo pelo menos uma sequência de repetição terminal invertida (ITR) de AAV, uma sequência de ácido nucleico manipulada que codifica ornitina transcarbamilase humana (hOTCase) e sequências de controle de expressão que direcionam a expressão de hOTC em uma célula do fígado, compreendendo as referidas sequências de controle de expressão um promotor específico do fígado. A sequência de ácido nucleico da hOTC manipulada é menos do que 80% idêntica à sequência hOTC de tipo selvagem sobre a sequência hOTC madura ou de comprimento total da sequência de tipo selvagem (por exemplo, SEQ ID NO: 1) e expressa uma hOTCase funcional. A sequência de ácido nucleico de hOTC sintética compreende pelo menos a hOTC madura de SEQ ID NO: 5 ou uma sequência de ácido nucleico pelo menos cerca de 96 a cerca de 99,9% idêntica à mesma ou a uma sequência de ácido nucleico que compreende pelo menos a hOTC madura de SEQ ID NO: 9 ou uma sequência de ácido nucleico pelo menos cerca de 96 a cerca de 99,9% idêntica à mesma.

[0011] Em ainda um aspecto adicional, a invenção fornece um vetor viral compreendendo um gene hOTC que codifica uma ornitina transcarbamilase quimérica que compreende ornitina transcarbamilase madura humana com um peptídeo heterólogo de trânsito, em que a sequência codificante da ornitina transcarbamilase madura humana é selecionada a partir da sequência de ácido nucleico compreendendo pelo menos a hOTC madura de SEQ ID NO: 3, 4, 5, 8 ou 9. Opcionalmente, as sequências de comprimento total de qualquer uma destas sequências, que incluem a sequência de trânsito, podem ser selecionadas. Alternativamente, um gene OTC quimérico incluindo uma sequência heteróloga de trânsito, como aqui descrito, e estas hOTC madura pode ser selecionado.

[0012] Em outro aspecto, uma composição farmacêutica compre endendo um veículo e uma quantidade eficaz de um vetor tal como aqui descrito é fornecida.

[0013] Ainda outro aspecto é um vetor viral tal como aqui descrito usado na preparação de um medicamento para a administração de ornitina transcarbamilase a um indivíduo com necessidade do mesmo e/ou para o tratamento da deficiência de ornitina transcarbamilase. Em uma modalidade particularmente desejável, o indivíduo é um indivíduo humano. O indivíduo pode ser homozigoto ou heterozigoto para a deficiência de ornitina transcarbamilase.

[0014] Em ainda outro aspecto, é fornecida a utilização de um vetor viral compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica a ornitina transcarbamilase funcional humana na prevenção e/ou tratamento de fibrose ou cirrose relacionada com deficiência de ornitina transcarbamilase (OTCD) em um indivíduo para OTCD. Em uma modalidade, o indivíduo é um paciente humano. Em outra modalidade, o indivíduo é heterozigoto e pode apresentar um início tardio dos sintomas.

[0015] Em ainda outro aspecto, é fornecida a utilização de um vetor viral compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica a ornitina transcarbamilase funcional humana na prevenção e/ou tratamento de carcinoma hepatocelular em um indivíduo tendo OTCD. Em uma modalidade, o indivíduo é um paciente humano. Em outra modalidade, o indivíduo é heterozigoto para OTCD e pode apresentar um início tardio dos sintomas.

[0016] Outros aspectos e vantagens da invenção serão facilmente evidentes a partir da seguinte descrição detalhada da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0017] Figura 1A proporciona um cDNA de hOTC de tipo selvagem, que tem 324 A, 223 C, 246 G e 269 T [SEQ ID NO: 1].

[0018] Figura 1B a 1C proporciona a sequência de ornitina transcarbamilase humana codificada pela sequência da Figura 1A [SEQ ID NO: 2].

[0019] Figura 2 proporciona um cDNA de hOTC manipulado, com uma relação GC alterada. A contagem das bases na sequência é 283 A, 285 C, 284 G, 216 T [SEQ ID NO: 3].

[0020] Figura 3 proporciona um cDNA de hOTC manipulado denominado LW3 [SEQ ID NO: 4]. A contagem das bases nesta sequência é 279 A, 303 C, 288 G e 220 T. O códon de iniciação para a matriz de leitura aberta (ORF) de hOTC é precedido por uma sequência Kozak nesta Figura. A sequência codificante para o líder começa no nucleotídeo 15 (primeiros 96 nucleotídeos), seguido pela sequência codificante para o aminoácido 322 de hOTCase. Nesta Figura, o códon de paragem é seguido por um local de restrição Notl (GCGGCCGC) que é um vestígio do vetor.

[0021] Figura 4 proporciona um cDNA de hOTC manipulado denominado LW4 [SEQ ID NO: 5]. A contagem das bases nesta sequência é 278 A, 303 C, 289 G e 220 T. A sequência codificante para o líder começa no nucleotídeo 15 (primeiros 96 nucleotídeos), seguido pela sequência codificante para o aminoácido 322 de hOTCase. Nesta Figura, o códon de paragem é seguido por um local de restrição Notl (GCGGCCGC), que é um vestígio do vetor.

[0022] Figuras 5A a 5C proporciona um alinhamento das sequências de cDNA de hOTC do tipo selvagem, e cinco sequências manipuladas, GS [SEQ ID NO: 3], LW3 [SEQ ID NO: 4], LW4 [SEQ ID NO: 5], LW5 [SEQ ID NO: 8] e LW6 [SEQ ID NO: 9]. As sequências alinhadas contêm uma sequência Kozak (primeiros 14 nucleotídeos de LW3 e LW4) e um local de enzima de restrição (códon de terminação na sequência para LW3 e LW4), que não fazem parte da matriz de leitura aberta.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0023] Um cDNA de ornitina transcarbamilase (OTC) humana (h) manipulado é aqui fornecido, o qual foi desenhado para maximizar a tradução e melhorar a estabilidade do mRNA, em comparação com o DNA e/ou mRNA de hOTC de tipo selvagem. Também aqui são fornecidas sequências de mRNA de hOTC manipuladas. Estas composições podem ser usadas em métodos terapêuticos e/ou profiláticos tal como aqui descrito. Opcionalmente, estas composições são usadas em combinação com outras terapias consistente o padrão de tratamento para as condições para as quais o indivíduo (por exemplo, um indivíduo humano) foi diagnosticado.

[0024] Para fins de comparação, uma sequência de cDNA de OTC humana de tipo selvagem é ilustrada na Figura 1A. Esta sequência codifica para a ornitina transcarbamilase humana das sequências de aminoácidos das FiguraS 1A - 1C. Esta mesma sequência de aminoácidos é codificada pelos genes hOTC manipulados das FiguraS 2A - Figura 5. A enzima hOTC, que pode ser referida como hOTCase para distinguir do gene, é expressa a partir desta sequência sob a forma de uma pré-proteína que tem um peptídeo líder de 32 aminoácidos na sua extremidade N-terminal (codificada por nt 1- 96 da Figura 1, aproximadamente aminoácido 1 até aproximadamente 32 da SEQ ID NO: 2), que é clivado depois de direcionar a enzima para a mitocôndria celular, deixando a proteína "madura" de 322 resíduos do aminoácidos (aproximadamente aminoácido 33 a aproximadamente aminoácido 354 da SEQ ID NO: 2). Esta hOTCase " chamada assim madura" é uma proteína homotrimérica com sequência de 322 de resíduos de aminoácidos em cada cadeia polipeptídica. Opcionalmente, como uma alternativa à sequência de tipo selvagem da SEQ ID NO: 2, pode-se selecionar uma sequência que inclui uma ou mais das posições polimórficas que ocorrem naturalmente que não estão envolvidas na doença: F101, L111, WI193-194 da SEQ ID NO: 2 (ver, por exemplo, http://www.uniprot.org/uniprot/P00480).

[0025] Embora todas as sequências de cDNA manipuladas sejam cerca de 77% a cerca de 78% idênticas à sequência de ácido nucleico de hOTC wt da Figura 1A [SEQ ID NO: 1], existem diferenças estruturais entre estas sequências (ver o alinhamento na Figura 5 ilustrativo do mesmo). Particularmente, existe cerca de 4% de diferença na sequência de ácidos nucleicos entre hOTCco da Figura 2 [SEQ ID NO: 3] e a hOTCcoLW4 da Figura4 [SEQ ID NO: 5]. Há apenas uma diferença de nt entre LW-3 [Figura 3, SEQ ID NO: 4] e LW-4 [Figura 4, SEQ ID NO: 5], ou seja, diferença de 0,094% (1/1062) (um A na LW-3 é alterado para um G em LW-4 como mostrado na Figura 5].

[0026] Em uma modalidade, uma sequência codificante hOTC modificada é fornecida cuja sequência tem menos do que cerca de 80% de identidade, preferencialmente cerca de 77% de identidade ou menos com a sequência codificante hOTC de tipo selvagem de comprimento total (Figura 1A, SEQ ID NO: 1), que codifica hOTCase funcional. Em uma modalidade, a sequência codificante hOTC modificada é caracterizada por uma melhor estabilidade em comparação com a hOTC wt após a entrega mediada por AAV (por exemplo, rAAV). Adicionalmente ou alternativamente, uma sequência codificante de hOTC modificada é fornecida à qual falta matrizes de leitura alternativas para proteínas de pelo menos cerca de 9 aminoácidos de comprimento. Adicionalmente, ou alternativamente, uma sequência codificante de hOTC modificada é fornecida a qual tem níveis de expressão de hOTCase pelo menos cerca de 25 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, ou pelo menos cerca de 100 vezes quando medida após expressão de um vetor viral, em comparação com a hOTCase de tipo selvagem. Adicionalmente, ou alternativamente, uma sequência codificante de hOTC modificada é fornecida que tem atividade hepática hOTCase que é pelo menos cerca de 10 vezes maior, pelo menos cerca de 20 vezes maior, ou pelo menos cerca de 30 vezes maior em comparação com a hOTCase do tipo selvagem expressa de um vetor viral.

[0027] Em uma modalidade, uma sequência codificante hOTC modificada é 96% a 99,9% idêntica à sequência que codifica para a enzima madura (cerca de 99 nt a cerca de 1068) ou comprimento total da Figura 4 (hOTCco-LW4, SEQ ID NO: 5), ou 96,5% a 99% idêntica, ou cerca de 97%, ou cerca de 98% idêntica à SEQ ID NO: 5 (Figura 4).

[0028] Em uma modalidade, uma sequência codificante hOTC modificada é 96% a 99,9% idêntica à sequência que codifica para a enzima madura (cerca de 99 nt a cerca de 1068) da Figura 3 (hOTCco-LW3, SEQ ID N0: 4), ou 96,5% a 99% idêntica, ou cerca de 97%, ou cerca de 98% idêntica à SEQ ID NO: 4 (Figura 3).

[0029] Em uma outra modalidade, uma sequência codificante de hOTC modificada é 96% a 99,9% idêntica à sequência que codifica para a enzima madura (cerca de 99 nt a cerca de 1068) ou o comprimento total da Figura 2 (hOTCco, SEQ ID NO: 3), ou 96,5% a 99% idêntica, ou cerca de 97%, ou 98% idêntica à SEQ ID NO: 3 (Figura 2).

[0030] Em ainda outra modalidade, uma sequência codificante de hOTC modificada tem a sequência que codifica a proteína madura (cerca de 99 nt a cerca de 1068) ou o comprimento total de hOTCco- LW5 [SEQ ID NO: 8] ou hOTCco-LW6 [SEQ ID NO: 9], ou uma sequência 96% a 99,9% idêntica à mesma. A hOTCco-LW5 e hOTCco-LW6 são cerca de 97% idênticas entre si, e cada uma delas é cerca de 78% idêntica à sequência de tipo selvagem [SEQ ID NO:1].

[0031] As sequências das Figuras 2-5 são fornecidas como as cadeias direto das sequências de cDNA. A presente invenção também engloba as cadeias inverso correspondentes a estas sequências de cDNA e sequências de RNA correspondente, por exemplo, mRNA. Por exemplo, o mRNA manipulado da SEQ ID NO: 10, corresponde ao DNA da SEQ ID NO: 4; o RNA manipulado da SEQ ID NO: 11, corresponde ao DNA da SEQ ID NO: 5; o RNA manipulado da SEQ ID NO: 12, corresponde ao DNA da SEQ ID NO: 8; e o RNA da SEQ ID NO: 13 corresponde ao DNA da SEQ ID NO: 9. Estas sequências de RNA e sequências que são 95% a 99%, ou cerca de 97%, ou cerca de 98% idêntica a uma ou mais destas sequências estão englobadas dentro do âmbito da presente invenção. Os métodos para alinhar e determinar a identidade de RNA são conhecidos na técnica e incluem bases de dados publicadas e serviços baseados na web disponíveis publicamente ou comercialmente disponíveis. Ver, por exemplo, LocARNA, CARNA, bem como outros programas identificados em outro local no presente documento.

[0032] Em uma modalidade da invenção, a sequência de mRNA pode ser entregue usando um sistema de entrega de RNA selecionado, exemplos dos quais são aqui fornecidos.

[0033] São também aqui englobados fragmentos, por exemplo, as sequências que codificam para o peptídeo de trânsito (aminoácidos 1 a cerca de 32), cerca de aminoácido 332 a cerca de 354, uma enzima intermediária hOTC, ou a enzima madura, ou outros fragmentos que podem ser desejados. Pode ser feita referência a SEQ ID NO: 2. Ver, por exemplo, Ye et al., 2001, Hum Gene Ther 12: 1035-1046.

[0034] Em uma outra modalidade, um OTC quimérico é fornecido em que a pré-sequência do terminal N da OTC de tipo selvagem é substituída com uma sequência de trânsito de uma outra fonte que é compatível com o sistema do indivíduo tal que efetivamente transporte a hOTCase madura codificado pelo gene OTC quimérico para o organelo desejado. Ver, por exemplo, Ye et al., 2001, Hum Gene Ther 12: 1035-1046. Tais sequências de trânsito codificam um peptídeo de trânsito (também denominado um peptídeo sinal, sinal de direcionamento, ou sinal de localização) o qual é fundido com a sequência codificante para a hOTC madura de SEQ ID NO: 1, 3, 4, 5, 8 e/ou 9. Por exemplo, a sequência hOTC de trânsito de tipo selvagem corresponde a cerca dos primeiros 98 nucleotídeos da SEQ ID NO: 1. Para construir um OTC quimérico, estas sequências de N terminal de tipo selvagem podem ser removidas (ácidos nucleicos cerca de 1 a cerca de 96 nt - 98 nt) e substituídas por uma sequência heteróloga de trânsito. Peptídeos de trânsito adequados são de preferência, embora não necessariamente, de origem humana. Peptídeos de trânsito adequados podem ser escolhidos de http://proline.bic.nus.edu.sg/spdb/zhang270.htm, que é aqui incorporada por referência, ou pode ser determinado utilizando uma variedade de programas computacionais para determinar o peptídeo de trânsito em uma proteína selecionada. Embora não se limitando, tais sequências podem ser de cerca de 15 a cerca de 50 aminoácidos de comprimento, ou cerca de 20 a cerca de 28 aminoácidos de comprimento, ou podem ser maiores ou menores consoante o necessário.

[0035] O termo "percentagem (%) de identidade", "identidade de sequência", "identidade de sequência percentual", ou "percentual idênticos" no contexto de sequências de ácidos nucleicos se refere aos resíduos nas duas sequências que são iguais quando alinhadas para correspondência. O comprimento da comparação de identidade de sequência pode ser ao longo de todo o comprimento do genoma, o comprimento total de uma sequência que codifica o gene, ou um fragmento de pelo menos cerca de 500 a 5000 nucleotídeos, se desejado. No entanto, a identidade entre fragmentos mais pequenos, por exemplo de pelo menos cerca de nove nucleotídeos, usualmente pelo menos cerca de 20 a 24 nucleotídeos, pelo menos cerca de 28 a 32 nucleotídeos, pelo menos cerca de 36 ou mais nucleotídeos, também pode ser desejada.

[0036] A percentagem de identidade pode ser facilmente determinada para sequências de aminoácidos ao longo de todo o comprimento de uma proteína, polipeptídeo, cerca de 32 aminoácidos, cerca de 330 aminoácidos, ou um seu fragmento peptídico ou a sequência de ácido nucleico correspondente que codifica as sequências. Um fragmento de aminoácido apropriado pode ser pelo menos cerca de 8 aminoácidos de comprimento, e pode ser de até cerca de 700 aminoácidos. Geralmente, quando se refere a "identidade", "homologia" ou "similaridade" entre duas sequências diferentes, "identidade", "homologia" ou "similaridade" é determinada em referência a sequências "alinhadas". Sequências "alinhadas" ou "alinhamento" se refere a múltiplas sequências de ácidos nucleicos ou sequências de proteínas (aminoácidos), muitas vezes contendo correções para bases ou aminoácidos em falta ou adicionais, em comparação com uma sequência de referência.

[0037] Os alinhamentos são realizados utilizando qualquer um de uma variedade Programas publicamente ou comercialmente disponíveis para Alinhamento de Múltiplas Sequências. Os programas para alinhamento de sequências estão disponíveis para sequências de aminoácidos, por exemplo, os programas "Clustal X", "MAP", "PIMA", "MSA", "BLOCKMAKER", "MEME" e "Match-Box". Geralmente, qualquer um desses programas são utilizados em configurações padrão, embora um perito na técnica pode alterar estas configurações conforme necessário. Alternativamente, um perito na técnica pode utilizar outro programa ou algoritmo de computador que fornece pelo menos o nível de identidade ou alinhamento como o fornecido pelos algoritmos e programas referenciados. Ver, por exemplo, J.D. Thomson et al., Nucl. Acids. Res., "A comprehensive comparison of multiple sequence alignments", 27(13): 2682-2690 (1999).

[0038] Programas de alinhamento de múltiplas sequências também estão disponíveis para as sequências de ácidos nucleicos. Exemplos de tais programas incluem "Clustal W", "CAP Sequence Assembly", "BLAST", "MAP", e "MEME", que estão acessíveis através de Servidores da Web na internet. Outras fontes para tais programas são conhecidas dos peritos na técnica. Alternativamente, também são usados utilitários do Vector NTI. Existem também um certo número de algoritmos conhecidos na técnica que podem ser utilizados para medir a identidade de sequência de nucleotídeos, incluindo os que constam dos programas descritos acima. Como outro exemplo, as sequências de polinucleotídeos podem ser comparadas utilizando Fasta™, um programa em GCG Versão 6.1. O Fasta™ fornece alinhamentos e percentagem de identidade sequência das regiões com a melhor sobreposição entre as sequências de consulta e pesquisa. Por exemplo, percentagem de identidade de sequência entre as sequências de ácidos nucleicos pode ser determinada utilizando Fasta™ com os seus parâmetros base (um tamanho de palavra de 6 e o fator NOPAM para a matriz de pontuação), conforme previsto em GCG Versão 6.1, aqui incorporada por referência.

[0039] Em uma modalidade, os genes hOTC modificados aqui descritos são manipulados em um elemento genético (vetor) adequado útil para a produção de vetores virais e/ou para entrega a uma célula hospedeira, por exemplo, DNA nu, fago, transposão, cosmideo, epissoma, etc., que transfere as sequências hOTC transportadas no mesmo. O vetor selecionado pode ser administrado por qualquer método adequado, incluindo transfecção, eletroporação, entrega por lipossoma, técnicas de fusão membranar, pellets de DNA revestidos a alta velocidade, infecção viral e fusão de protoplastos. Os métodos utilizados para fazer tais construtos são conhecidos para aqueles com perícia na manipulação de ácidos nucleicos e inclui técnicas de manipulação genética, manipulação recombinante e de síntese. Ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NI.

[0040] Tal como aqui utilizado, um "cassete de expressão" se refere a uma molécula de ácido nucleico que compreende as sequências, promotor de hOTC e pode incluir outras sequências reguladoras das mesmas, podendo este cassete ser acondicionado em um capsídeo de um vetor viral (por exemplo, uma partícula viral). Tipicamente, um tal cassete de expressão para a produção de um vetor viral contém as sequências de hOTC aqui descritas flanqueadas por sinais do genoma viral acondicionados e outras sequências de controle de expressão tal como as aqui descritas. Por exemplo, para um vetor viral de AAV, os sinais de acondicionamento são a repetição terminal 5’ invertida (ITR) e ITR 3’.

[0041] Em uma modalidade, as sequências de ITR de AAV2, ou a versão do mesmo suprimida (ΔITR), são utilizadas por conveniência e para acelerar a aprovação regulamentar. No entanto, as ITR de outras fontes AAV podem ser selecionadas. Quando a fonte da ITR de AAV2 e o capsídeo de AAV é de outra fonte de AAV, o vetor resultante pode ser denominado pseudotipado.

[0042] Normalmente, um cassete de expressão para um vetor de AAV compreende um ITR 5’ de AAV, as sequências codificantes de hOTC e quaisquer sequências de regulação, e um ITR 3’ de AAV. No entanto, outras configurações destes elementos podem ser adequadas. Uma versão mais curta de ITR 5’, denominada ΔITR, foi descrito, na qual a sequência D e o local terminal de resolução (trs) são eliminados. Em outras modalidades, ITRs 5’e 3’ do AAV de comprimento total são utilizadas.

[0043] Em uma modalidade, o construto é uma molécula de DNA (por exemplo, um plasmídeo) útil para a produção de vetores virais. Um plasmídeo ilustrativo contendo elementos do vetor desejáveis é exemplificado por pAAVsc.TBG.hOTCco-LW4, cuja sequência é a SEQ ID NO: 6, e que é aqui incorporada por referência. Este plasmídeo ilustrativo contém um cassete de expressão compreendendo: scITR (nt 5-109 de SEQ ID NO: 6), um sinal TATA (nt 851-854 da SEQ ID NO: 6), uma sequência codificante sintética hOTC (nt 976-2037 de SEQ ID NO: 6), um poli A (nt 2182-2046 no complemento da SEQ ID NO: 6), um scITR (nt 2378- 2211 no complemento da SEQ ID NO: 6), e um promotor específico do fígado (TBG) (nt 4172- 4760) da SEQ ID NO: 6). Outros cassetes de expressão podem ser gerados utilizando outras sequências codificantes de hOTC sintética, e outros elementos de controle da expressão, aqui descrito.

[0044] A abreviatura "sc" neste contexto se refere a autocomplementar. "AAV autocomplementar" se refere a um construto em que uma região codificante transportada por uma sequência de ácido nucleico de AAV recombinante foi concebido de modo a formar um molde intramolecular de DNA de cadeia dupla. Após a infecção, em vez de esperar pela síntese mediada por células da segunda cadeia, as duas metades complementares de scAAV irão associar-se para formar uma unidade de DNA de cadeia dupla (dsDNA) que está pronto para replicação e transcrição imediata. Ver, por exemplo, D M McCarty et al., "Self-complementary recombinant adeno-associated vírus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis", Gene Therapy, (agosto de 2001), Vol 8, Número 16, Páginas 1248-1254. AAV autocomplementares são descritos em, por exemplo, Patente U.S. Nos. 6.596.535; 7.125.717; e 7.456.683, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

[0045] O cassete de expressão contém tipicamente uma sequência de promotor como parte das sequências de controle de expressão, por exemplo, situada entre a sequência ITR 5’ selecionada e a sequência codificante hOTC. O plasmídeo e vetor ilustrativos aqui descritos utilizam um promotor de globulina ligadora de tiroxina (TBG). Em alternativa, outros promotores específicos de fígado podem ser utilizados [ver, por exemplo, The Liver Specific Gene Promotor Database, Cold Spring Harbor, http://rulai.schl.edu/LSPD/, tais como, por exemplo, alfa 1 antitripsina (A1AT); albumina humana Miyatake et al., J. Virol., 71: 5124 32 (1997), humAlb; e promotor central do vírus da hepatite B, Sandig et al., Gene Ther., 3: 1002 9 (1996)]. Potenciador/promotor mínimo de TTR, promotor de alfa antitripsina, LSP (845 nt)25(requer íntron exceto scAAV); ou LSP1. Apesar de ser menos desejado, outros promotores, tais como promotores constitutivos, promotores reguláveis [ver, por exemplo, WO 2011/126808 e WO 2013/04943], ou um promotor reativo a estímulos fisiológicos podem ser utilizados podem ser utilizados nos vetores aqui descritos.

[0046] Além de um promotor, um cassete de expressão e/ou um vetor pode conter uma ou mais outra sequência adequada de iniciação da transcrição, terminação, potenciadora, sinais de processamento de RNA eficientes, tais como sinais de excisão e sinais de poliadenilação (poliA); sequências que estabilizam o mRNA citoplasmático; sequências que potenciam a eficiência de tradução (isto é, sequência de consenso Kozak); sequências que aumentam a estabilidade da proteína; e quando desejado, sequências que potenciam a secreção do produto codificado. Exemplos de sequências de poliA adequadas incluem, por exemplo, SV40, SV50, hormônio de crescimento bovino (bGH), hormônio de crescimento humano, e poliA sintéticos. Exemplos de potenciadores adequados incluem, por exemplo, o potenciador de alfa fetoproteína, o promotor/potenciador mínimo de TTR, LSP (potenciador do promotor de globulina ligadora de TH/microglobulina alfa 1/bicunina), entre outros. Em uma modalidade, o cassete de expressão compreende um ou mais potenciadores de expressão. Em uma modalidade, o cassete de expressão contém dois ou mais potenciadores de expressão. Estes potenciadores podem ser o mesmo ou podem ser diferentes um do outro. Por exemplo, um potenciador pode incluir um potenciador mic/bik Alfa. Este potenciador pode estar presente em duas cópias que estão localizadas em locais adjacentes. Em alternativa, as duas cópias do potenciador podem ser separadas por uma ou mais sequências. Em ainda outra modalidade, o cassete de expressão contém adicionalmente um íntron, por exemplo, o íntron Promega. Outros íntrons adequados incluem aqueles conhecidos na técnica, por exemplo, tal como são descritos em WO 2011/126808. Opcionalmente, uma ou mais sequências podem ser selecionadas para estabilizar o mRNA. Um exemplo de tal sequência é uma sequência WPRE modificada, que podem ser manipuladas a montante da sequência de poliA e a jusante da sequência codificante [ver, por exemplo, MA Zanta-Boussif et al., Gene Therapy (2009) 16: 605- 619.

[0047] Estas sequências controle estão "operacionalmente ligadas" a sequências de genes hOTC. Tal como aqui utilizado, o termo "operacionalmente ligado" se refere a ambas as sequências controle de expressão que são contíguas ao gene de interesse e sequências controle da expressão que atuam in trans ou a uma distância para controlar o gene de interesse.

[0048] Vetores virais recombinantes de AAV são bem adequados para entrega das sequências de expressão de hOTC aqui descritas. Tais vetores de AAV podem conter ITRs que são da mesma fonte de AAV como o capsídeo. Em alternativa, as ITRs de AAV podem ser de uma fonte de AAV diferente daquele que fornece o capsídeo.

[0049] Onde um AAV pseudotipado é para ser produzido, os ITRs na expressão são selecionados a partir de uma fonte que difere da fonte de AAV do capsídeo. Por exemplo, AAV2 ITR pode ser selecionado para utilização com um capsídeo de AAV com uma eficiência particular, para o direcionamento ao fígado (por exemplo, hepatócitos). Os capsídeos de AAV podem ser selecionados de entre AAV8 [Patente US 7790449; Patente US 7282199] e rh10 [WO 2003/042397] para as composições aqui descritas. No entanto, outros AAV, incluindo, por exemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV9, e outros, tais como, por exemplo, aqueles descritos no documento WO 2003/042397; WO 2005/033321, WO 2006/110689; US 7588772 B2, que são aqui incorporados por referência] podem ser utilizados em seres humanos.

[0050] Em uma modalidade, um AAV autocomplementar é fornecido. Este vetor viral pode conter um AAV ITR Δ5’ e um ITR 3’. Em um exemplo, o vetor viral é scAAV2/8.TBG.hOTCco. Em outro exemplo, o vetor viral é scAAV2/rh10.TBG.hOTCco. Estes vetores contêm ambos as extremidades de AAV2 ΔITR 5’, o promotor específico do fígado TBG, uma sequência codificante de hOTCco manipulada da invenção, uma poliA de SV40, e o AAV2 ITR 3’ em um capsídeo AAV8 [ver, por exemplo, Patente dos US No. 8.318480B2] ou capsídeo de AAV rh10. A sequência pode ser selecionada da hOTC manipulada de uma SEQ ID NO: 3, 4, 5, 8 ou 9. Opcionalmente, a sequência de trânsito da hOTC manipulada pode ser substituída com uma sequência heteróloga de trânsito para fornecer uma hOTC quimérica, que retém a hOTCase madura.

[0051] Em outra modalidade, um vetor viral AAV de cadeia simples é fornecido. Um tal vetor pode conter um AAV ITR 5’ e um ITR 3’. Um exemplo é AAV2/8.TBG.hOTCco, que contém o comprimento total de AAV2 - ITR 5’, o promotor específico do fígado TBG, a sequência codificante de hOTC, um hormônio de crescimento bovino poli A, e AAV2- ITR 3’. Outro exemplo é AAV2/8.TBG.hOTCco-.WPRE.bGH, que contém os mesmos elementos do vetor, e adicionalmente contém o elemento regulador pós-transcricional do vírus da hepatite da marmota (WPRE). Em outras modalidades, o WPRE está ausente dos construtos para serem utilizados in vivo. A sequência hOTC manipulada (aqui abreviada hOTCco) pode ser selecionada a partir de hOTC manipulada de uma das SEQ ID NO: 3, 4, 5, 8 ou 9. Opcionalmente, a sequência do peptídeo de trânsito do hOTC manipulado pode ser substituído com uma sequência heteróloga de trânsito para fornecer uma hOTC quimérica, que retém a hOTCase madura.

[0052] Ainda outros promotores podem ser selecionados, incluindo promotores específicos de tecidos. Os métodos para produzir e isolar vetores virais de AAV adequados para entrega a um indivíduo são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo a Publicação de Pedido de Patente US No. 2007/0036760 (15 de fevereiro, 2007), Patente US 7790449; Patente US 7282199; WO 2003/042397; WO2005/033321, WO 2006/110689; e US 7588772 B2]. As sequências de AAV8 e métodos de produção de vetores baseados no capsídeo AAV8 são descritos na Patente US 7,282,199 B2, US 7,790,449, e US 8,318,480, que são aqui incorporadas por referência. Em um sistema, uma linha celular produtora é transitoriamente transfectada com um construto que codifica o transgene flanqueado por ITR e um construto(s) que codifica rep e cap. Em um segundo sistema, uma linha celular de encapsidação que fornece estavelmente rep e cap é transitoriamente transfectada com um construto que codifica o transgene flanqueado por ITRs. Em cada um destes sistemas, os viriões de AAV são produzidos em resposta à infecção com adenovírus auxiliares ou vírus do herpes, o que requer a separação dos rAAVs de vírus contaminantes. Mais recentemente, os sistemas têm sido desenvol- vidos que não requerem infecção com vírus auxiliar para recuperar o AAV - as funções auxiliares necessárias (isto é, adenovírus E1, E2a, VA, e E4 ou vírus do herpes UL5, UL8, UL52, e UL29, e polimerase do vírus do herpes) também são fornecidos, in trans, pelo sistema. Nestes sistemas mais recentes, as funções auxiliares podem ser fornecidas por transfecção transiente das células com construtos que codificam para as funções auxiliares necessárias, ou as células podem ser manipuladas para conter de forma estável os genes que codificam as funções auxiliares, cuja expressão pode ser controlada ao nível da transcrição ou pós-transcricional. Ainda em um outro sistema, o transgene flanqueado por ITRs e os genes rep/cap são introduzidos em células de inseto por infecção com vetores à base de baculovírus. Para revisão sobre estes sistemas de produção, ver em geral, por exemplo, Zhang et al., 2009, "Adenovirus-adeno-associated vírus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production", Human Gene Therapy 20: 922-929, o conteúdo de cada um dos quais é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Os métodos para produzir e utilizar estes e outros sistemas de produção de AAV são também descritos nas seguintes patentes dos Estados Unidos, o conteúdo de cada uma das quais é aqui incorporado por referência na sua totalidade: 5.139.941; 5.741.683; 6.057.152; 6.204.059; 6.268.213; 6.491.907; 6.660.514; 6.951.753; 7.094.604; 7.172.893; 7.201.898; 7.229.823; e 7.439.065.

[0053] O espaço disponível para o empacotamento pode ser conservado através da combinação de mais do que uma unidade de transcrição em um único construto, reduzindo assim a quantidade de espaço necessário de sequência reguladora. Por exemplo, um único promotor pode dirigir a expressão de um único RNA que codifica dois ou três ou mais genes, e tradução dos genes a jusante são acionados por sequências IRES. Em outro exemplo, um único promotor pode dirigir a expressão de um RNA que contém, em uma única matriz de leitura aberta (ORF), dois ou três ou mais genes separados uns dos outros por sequências que codificam para um peptídeo de autoclivagem (por exemplo, T2A) ou um local de reconhecimento para protease (por exemplo, furina). A ORF codifica assim uma única poliproteína, o que, quer durante (no caso de T2A) ou após a tradução, é clivada em proteínas individuais (tais como, por exemplo, transgene e fator de transcrição dimerizável). Deve notar-se, contudo, que embora estes IRES e sistemas de poliproteína podem ser utilizados para conservar o espaço de empacotamento de AAV, eles só podem ser usados para a expressão de componentes que podem ser conduzidos pelo mesmo promotor. Em outra alternativa, a capacidade do transgene de AAV pode ser aumentada através do fornecimento de AAV ITRs de dois genomas que podem hibridar para formar concatameros de cabeça com cauda.

[0054] Opcionalmente, os genes hOTC aqui descritos podem ser usados para gerar outros vetores virais que não rAAV. Tais outros vetores virais podem incluir qualquer vírus adequado para a terapia genética pode ser utilizado, incluindo, mas não se limitando a adenovírus; vírus do herpes; lentivírus; retrovírus; etc. Covenien- temente, onde um destes outros vetores é gerado, é produzido como um vetor viral de replicação defeituosa.

[0055] Um "vírus de replicação defeituosa" ou "vetor viral" se refere a uma partícula viral sintética ou artificial, em que um cassete de expressão contendo um gene de interesse é acondicionado em um capsídeo ou envelope viral, em que quaisquer sequências genômicas virais também acondicionadas dentro do capsídeo ou envelope viral são deficientes na replicação; isto é, elas não podem gerar viriões da progênie, mas mantêm a capacidade de infectar as células alvo. Em uma modalidade, o genoma do vetor viral não inclui genes que codificam as enzimas necessárias para replicar (o genoma pode ser manipulado para ser "gutless" - contendo apenas o transgene de interesse flanqueado pelos sinais necessários para a amplificação e o empacotamento do genoma artificial), mas estes genes podem ser fornecidos durante a produção. Sendo assim, é considerado seguro para utilização em terapia genética uma vez que a replicação e infecção por viriões da progênie não pode ocorrer exceto na presença da enzima viral necessário para a replicação. Tais vírus de replicação defeituosa podem ser vírus adeno-associado (AAV), adenovírus, lentivírus (de integração ou não integração), ou outra fonte adequada de vírus.

[0056] As composições farmacêuticas aqui descritas são desenha das para a administração a indivíduos em necessidade das mesmas por qualquer via adequada, ou uma combinação de diferentes vias. A administração direta ou intra-hepática para o fígado é desejada e pode ser opcionalmente realizada via administração intravascular, por exemplo, através da veia porta, veia hepática, duto biliar, ou por transplante. Em alternativa, outras vias de administração podem ser selecionadas (por exemplo, oral, inalação, intranasal, intratraqueal, intra-arterial, intra-ocular, intravenosa, intramuscular e outras vias parentais). Os construtos de hOTC para administração aqui descritos podem ser administrados em uma composição única ou várias composições. Opcionalmente, dois ou mais diferentes AAV podem ser administrados [ver, por exemplo, WO 2011/126808 e WO 2013/049493]. Em outra modalidade, esses múltiplos vírus podem conter diferentes vírus de replicação defeituosa (por exemplo, AAV, adenovírus e/ou lentivírus). Em alternativa, a administração pode ser mediada por construtos não virais, por exemplo, "DNA nu", "DNA de plasmídeo nu", RNA e mRNA; juntamente com várias composições de administração e partículas nano, incluindo, por exemplo, micelas, lipossomas, lipídeos catiônicos - composições de ácido nucleico, composições de poli-glicano e outros polímeros, conjugados de ácidos nucleicos à base de lipídeos e/ou colesterol e outros construtos, tais como são aqui descritos. Ver, por exemplo, X. Su et al., Mol. Pharmaceutics, 2011, 8(3), pp 774-787; publicação na web: 21 de março, 2011; WO2013/182683, WO 2010/053572 e WO 2012/170930, as quais são aqui incorporadas por referência. Tais construtos não virais de administração de hOTC podem ser administrados pelas vias anteriormente descritas.

[0057] Os vetores virais, ou regiões de transferência de DNA ou RNA não virais, podem ser formulados com um veículo fisiologi- camente aceitável para utilização em aplicações de transferência genética e de terapia genética. No caso de vetores virais de AAV, a quantificação das cópias do genoma ("GC") pode ser utilizada como a medida da dose contida na formulação. Qualquer método conhecido na técnica pode ser utilizado para determinar o número de cópias do genoma (GC) das composições de vírus de replicação defeituosa da invenção. Um método para a realização da titulação do número de AAV GC é como se segue: Amostras purificadas de vetor de AAV foram primeiro tratadas com DNase para eliminar o DNA genômico de AAV não encapsidado ou DNA plasmídico contaminante do processo de produção. As partículas resistentes a DNase são em seguida submetidas a um tratamento térmico para liberar o genoma do capsídeo. Os genomas liberados são então quantificados por PCR em tempo real utilizando conjuntos iniciador/sonda tendo como alvo uma região específica do genoma viral (geralmente o sinal de poliA). As composições de vírus de replicação defeituosa podem ser formuladas em unidades de dosagem que contêm uma quantidade de vírus de replicação defeituosa que é na gama de cerca de 1,0 x 109 GC a cerca de 1,0 x 1015 GC (para tratar um indivíduo médio de 70 kg de peso corporal), e de preferência 1,0 x 1012 GC a 1,0 x 1014 GC para um paciente humano. De preferência, a dose de vírus de replicação defeituosa na formulação é de 1,0 x 109 GC, 5,0 x 109 GC, 1,0 x 1010 GC, 5,0 x 1010 GC, 1,0 x 1011 GC, 5,0 x 1011 GC, 1,0 x 1012 GC, 5,0 x 1012 GC, ou 1,0 x 1013 GC, 5,0 x 1013 GC, 1,0 x 1014 GC, 5,0 x 1014 GC, ou 1,0 x 1015 GC.

[0058] DNA e RNA é geralmente medido em nanogramas (ng) a microgramas (μg) de quantidades dos ácidos nucleicos. Em geral, para um tratamento em um ser humano as doses preferidas de RNA são na gama de 1 ng a 700 μg, 1 ng a 500 μg, 1 ng a 300 μg, 1 ng a 200 μg, ou 1 ng a 100 μg são formuladas e administradas. Quantidades semelhantes de dosagem de uma molécula de DNA contendo um cassete de expressão e não administrada a um indivíduo por meio de um vetor viral podem ser utilizadas para entrega de construtos de DNA de hOTC não viral.

[0059] A produção de lentivírus é medida tal como aqui descrito e expresso como UI por unidade de volume (por exemplo, mL). UI é unidade infecciosa, ou em alternativa as unidades de transdução (TU); UI e TU podem ser utilizadas alternadamente como uma medida quantitativa do título de uma preparação de vetor de partícula viral. O vetor lentiviral é tipicamente não integrante. A quantidade de partículas virais é pelo menos cerca de 3x106 UI, e pode ser pelo menos cerca de 1x107 UI, pelo menos cerca de 3x107UI, pelo menos cerca de 1x108 UI, pelo menos cerca de 3x108 UI, pelo menos cerca de 1x109 UI, ou pelo menos cerca de 3x109 UI.

[0060] Os vetores recombinantes acima descritos podem ser entregues a células hospedeiras de acordo com métodos publicados. O rAAV, preferencialmente ressuspenso em um veículo fisiologicamente compatível, pode ser administrado a um paciente mamífero humano ou não-humano. Os veículos adequados podem ser facilmente selecionados por um perito na técnica tendo em vista a indicação para a qual a transferência de vírus é dirigida. Por exemplo, um veículo adequado inclui solução fisiológica, o que pode ser formulado com uma variedade de soluções tampão (por exemplo, solução fisiológica tamponada com fosfato). Outros veículos exemplificativos incluem solução fisiológica estéril, lactose, sacarose, fosfato de cálcio, gelatina, dextrano, agar, pectina, óleo de amendoim, óleo de sésamo, e água. A seleção do veículo não é uma limitação da presente invenção.

[0061] Opcionalmente, as composições da invenção podem conter, para além do rAAV e veículo(os), outros ingredientes farmacêuticos convencionais, tais como conservantes ou estabili- zantes químicos. Conservantes adequados exemplificativos incluem clorobutanol, sorbato de potássio, ácido sórbico, dióxido de enxofre, gaiato de propilo, os parabenos, etilvanilina, glicerina, fenol e paraclorofenol. Estabilizadores químicos adequados incluem gelatina e albumina.

[0062] Os vetores virais aqui descritos podem ser utilizados na preparação de um medicamento para a administração de ornitina transcarbamilase a um indivíduo (por exemplo, um paciente humano) em necessidade do mesmo, fornecendo hOTCase funcional a um indivíduo, e/ou para o tratamento da deficiência de ornitina transcarbamilase. Um curso de tratamento pode opcionalmente envolver a administração repetida do mesmo vetor viral (por exemplo, um vetor AAV8) ou um vetor viral diferente (por exemplo, um AAV8 e um AAVrh10). Ainda outras combinações podem ser selecionadas utilizando os vetores virais e sistemas de entrega não virais aqui descritos.

[0063] Em outra modalidade, as sequências de ácido nucleico aqui descritas podem ser entregues através de uma via não viral. Por exemplo, uma sequência de hOTC pode ser entregue através de um sistema veículo de expressão ou entregue na forma de RNA (por exemplo, mRNA) utilizando um de um número de sistemas veículo que são conhecidos na técnica. Tais sistemas veículo incluem aqueles fornecidos por entidades comerciais, como PhaseRx’, a chamada tecnologia "SMARTT". Estes sistemas utilizam copolímeros de bloco para a entrega a uma célula hospedeira alvo. Ver, por exemplo, US 2011/0286957, intitulada "Multiblock Polymers", publicada a 24 de novembro, 2011; US 2011/0281354, publicado 17 de novembro, 2011; EP2620161, publicada a 31 de julho, 2013; e WO 2015/017519, publicada a 5 de fevereiro, 2015. Ver, também, S. Uchida et al., (fev 2013) PLoS ONE 8 (2): e56220. Ainda outros métodos envolvem a produção e injeção dsRNAs sintéticos [ver Soutschek et al., Nature (2004) 432(7014): 173-8; ver também Morrissey et al., Hepatol. (2005) 41(6): 1349-56], a administração local no fígado tem também sido demonstrado através da injeção de RNA de cadeia dupla diretamente para o sistema circulatório adjacente ao fígado utilizando cateterismo da veia renal. [Ver Hamar et al., PNAS (2004) 101(41): 14883-8]. Ainda outros sistemas envolvem a entrega do dsRNA e particularmente siRNA utilizando complexos catiônicos ou formulações de lipossomas [ver, p.e., Landen et al., Cancer Biol. Ther. (2006) 5(12); ver também Khoury et al., Arthritis Rheumatol. (2006) 54(6): 1867-77. Outras tecnologias de entrega de RNA também estão disponíveis, por exemplo, de Veritas Bio [ver, por exemplo, US 2013/0323001, 23 de dezembro, 2010, "In vivo delivery of double stranded RNA to a target cell" (conteúdo citosólico incluindo RNAs, por exemplo, mRNA, siRNA/shRNA/miRNA expresso, bem como siRNA/shRNA/miRNA injetado/introduzido, ou possivelmente mesmo DNA transfetado presente no citosol empacotado dentro exovesículas e ser transportado para locais distantes tais como o fígado)]. Ainda outros sistemas para a entrega in vivo de sequências de RNA foram descritos. Ver, por exemplo, US 2012/0195917 (2 de agosto, 2012) (análogos de RNA 5’-cap para melhorar a estabilidade e aumentar a expressão do RNA), WO2013/143555A1, 3 de outubro, 2013, e/ou estão disponíveis comercialmente (BioNTech, Alemanha; Valera (Cambridge, MA); Zata Pharmaceuticals).

[0064] Assim, em uma modalidade, a invenção fornece um mRNA de hOTC manipulado da sequência madura (pelo menos cerca de nt 99 - 1098) ou o comprimento total de SEQ ID NO: 10, 11, 12, 13, ou uma sequência tendo pelo menos 97% a 99% de identidade à mesma, em uma composição para a administração de RNA de cadeia dupla ou de cadeia simples que resulta na expressão da hOTCase madura em uma célula hospedeira alvo, por exemplo, uma célula do fígado.

[0065] A cinética da composição aqui descrita que contêm mRNA (administrada diretamente, em comparação com transcrita a partir de uma molécula de entrega de DNA) é particularmente bem adequada para utilização em indivíduos em crise aguda, uma vez que a expressão da hOTCase a partir do mRNA pode ser observada dentro de um período de várias horas. A fim de evitar a rápida eliminação do RNA, este é modificado tal como aqui descrito (por exemplo, utilizando uma cobertura ou uma base modificada), de tal modo que os seus efeitos podem ser retidos durante mais de 24 horas, mais de 48 horas, ou até cerca de 3 dias (cerca de 72 horas). Pode ser desejável coadministrar um mRNA diretamente, tal como aqui descrito e coadministrar ao mesmo, ou substancialmente ao mesmo, tempo, um DNA ou composição de hOTC à base de vetor viral tal como aqui definido. Assim, um indivíduo pode receber tratamento imediato, e no momento em que a expressão mediada por mRNA começa a diminuir, a expressão de hOTC a longo prazo conferida por uma expressão mediada por vetor viral começa a ter resultado. Em alternativa, um indivíduo pode receber uma segunda administração de uma composição baseada em mRNA, tal como aqui definido. As composições de mRNA aqui descritas podem ser utilizadas em outros regimes terapêuticos ou métodos, incluindo os que envolvem pacientes OTCD que não estão em crise aguda.

[0066] As composições de acordo com a presente invenção podem compreender um veículo farmaceuticamente aceitável, tal como definido acima. Em uma modalidade, a composição compreende um copolímero em bloco associado a um polinucleotídeo hOTC como aqui descrito. Os copolímeros em bloco podem formar uma micela, de modo que a micela compreende uma pluralidade de copolímeros em bloco.

[0067] Normalmente, uma tal composição contém uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de mRNA correspondente à sequência hOTC que codifica a hOTCase madura (pelo menos cerca de nt 99 a 1098) ou o comprimento total de qualquer uma das SEQ ID NO: 10, 11, 12, 13. Além disso, esta molécula de ácido nucleico pode incluir a região 5’ não traduzida (UTR), também conhecida como a sequência líder ou RNA líder, e um ou mais de um íntron opcional(ais), um éxon opcional(ais), uma sequência Kozak opcional, um WPRE opcional, e um poliA, e a UTR 3’ que flanqueia as sequências codificantes. Sequências líder adequadas incluem as discutidas acima em ligação com as sequências de DNA de hOTC, cuja discussão é incorporada aqui por referência. Exemplos de fontes de sequências líder adequadas, que não sejam as sequências líder hOTC nativas, ou as correspondentes à Figura 2, Figura 3 ou Figura 4, ou Figura 5 são discutidas acima. De modo semelhante, as fontes adequadas de íntrons, poliA, e sequências Kozak são discutidas acima e são aplicáveis para a entrega das sequências de RNA correspondentes discutidas no presente parágrafo. Além disso, várias modificações do RNA podem ser produzidas, por exemplo, uma estrutura de cobertura 5’ modificada pode ser manipulada no construto, a fim de evitar a rápida eliminação do mRNA in vivo, ou por outra razão desejada. Métodos de produção de tais estruturas de cobertura 5’ é conhecido dos peritos na técnica. Ver, por exemplo, US 2012/0195917 e WO 2013/143555A1, 3 de outubro, 2013. Além disso, os nucleotídeos modificados podem ser usados para fazer o mRNA in vitro, como pseudouridina. Também RNA pode ser dosado de maneira repetitiva, ou indivíduo pode ser dosado em primeiro lugar com mRNA para gerir crises neonatais seguido de administração mediada por vetor viral (por exemplo, AAV) para a terapia de longo prazo e para prevenir a fibrose/cirrose e/ou carcinoma hepatocelular.

[0068] O mRNA pode ser sintetizado a partir de sequências de DNA de hOTC aqui descritas, utilizando técnicas que são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, Cazenave C, Uhlenbeck OC, "RNA template-directed RNA synthesis by T7 RNA polymerase". Proc Natl Acad Sci U.S.A. 19 de julho, 1994; 91(15): 6972-6, descreve a utilização da T7 RNA polimerase para a produção de RNA a partir de cDNA ou de RNA molde. Ver também, Wichlacz A, Legiewicz M, Ciesiolka J., "Generating in vitro transcripts with homogenous 3’ ends using trans-acting antigenomic delta ribozyme", Nucleic Acids Res. 18 de fevereiro, 2004; 32(3): e39; Krieg PA, Melton DA., "Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs", Nucleic Acids Res. 25 de setembro, 1984; 12(18):7057-70; e Rio, D. C. et al., "RNA: A Laboratory Manual". Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2011, 205-220. Cada uma destas referências é aqui incorporada por referência. Além disso, kits e protocolos para produção de mRNA estão disponíveis comercialmente, incluindo, sem limitação, o Riboprobe® In Vitro Transcription System (Promega Corp.); RiboMAX™ Large Scale RNA Production Systems (Promega Corp.); Kit MAXIscript (Ambion); Kit MEGIscript (Ambion); Kit MessageAmp™ aRNA (Ambion); Kits mMESSAGE mMACHINE® (Ambion); e Kit HiScribe™ T7 High Yield RNA Synthesis (New England Biolabs® Inc.). RNA personalizado também pode ser produzido comercialmente a partir de empresas incluindo, sem limitação, TriLink Biotechnologies; bioSYNTHESIS; GE Dharmacon; e IBA Lifesciences.

[0069] As sequências de DNA de hOTC aqui descritas podem ser produzidas in vitro e sinteticamente, utilizando técnicas bem conhecidas na especialidade. Por exemplo, a síntese precisa com base em PCR (PAS) de método de sequência de DNA longo pode ser utilizada, tal como descrito por Xiong et al., "PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences", Nature Protocols 1, 791-797 (2006). Um método que combina os métodos de duplo PCR assimétrico e PCR de extensão de sobreposição está descrito por Young e Dong, "Two-step total gene synthesis method", Nucleic Acids Res. 2004; 32(7): E59. Ver também, Gordeeva et al., J Microbiol Methods. "Improved PCR-based gene synthesis method and its application to the Citrobacter freundii phytase gene codon modification". maio 2010;81(2):147-52. Epub 10 de março, 2010; ver, também, as seguintes patentes de síntese de oligonucleotídeos e síntese de genes, Gene Seq. abr 2012;6(1):10-21; US 8008005; e US 7985565. Cada um destes documentos é aqui incorporado por referência. Além disso, kits e protocolos para a produção de DNA através de PCR estão disponíveis comercialmente. Estes incluem o uso de polimerases incluindo, sem limitação, a polimerase Taq; OneTaq® (New England Biolabs); Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs); e GoTaq® G2 Polymerase (Promega). O DNA pode também ser produzido a partir de células transfectadas com plasmídeos contendo as sequências de hOTC aqui descritas. Os kits e protocolos são conhecidos e comercialmente disponíveis e incluem, sem limitação, kits de plasmídeo QIAGEN; Kits Chargeswitch® Pro Filter Plasmid (Invitrogen); e Kits GenElute™ Plasmid (Sigma Aldrich). Outras técnicas úteis para esta invenção incluem métodos de amplificação isotérmica específicos de sequência, que eliminam a necessidade de ciclos térmicos. Em vez de calor, estes métodos empregam tipicamente uma polimerase de DNA de deslocamento da cadeia para separar o DNA duplex, como polimerase de DNA Bst, Fragmento Grande (New England Biolabs). O DNA pode também ser produzido a partir de moléculas de RNA através de amplificação por meio da utilização de transcriptase reversa (RT), que são polimerases de DNA dependentes de RNA. As RTs polimerizam uma cadeia de DNA que é complementar ao molde de RNA original e é referida como cDNA. Este cDNA pode ser amplificado em seguida através de PCR ou métodos isotérmicos conforme descrito acima. DNA personalizado também pode ser produzido comercialmente a partir de empresas, incluindo, sem limitação, GenScript; GENEWIZ®; GeneArt® (Life Technologies); e Tecnologias de DNA Integrado.

[0070] O termo "expressão" é aqui utilizado no seu sentido mais lato e compreende a produção de RNA ou de RNA e proteína. No que diz respeito ao RNA, o termo "expressão" ou "tradução" se refere em particular à produção de peptídeos ou proteínas. A expressão pode ser transitória ou pode ser estável.

[0071] O termo "tradução" no contexto da presente invenção se refere a um processo no ribossomo, em que uma cadeia de mRNA controla a montagem de uma sequência de aminoácidos para gerar uma proteína ou um peptídeo.

[0072] De acordo com a presente invenção, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" da hOTC é administrada tal como é aqui descrito para conseguir um resultado desejado, isto é, o tratamento da deficiência de OTC ou um ou mais dos seus sintomas. Como aqui descrito, um resultado desejado inclui redução dos níveis de ácido orótico, reduzindo hiperamonemia e/ou minimizando ou eliminando uma ou mais das complicações neurofísicas incluindo atraso no desenvolvimento, deficiência na aprendizagem, deficiência intelectual, transtorno do déficit de atenção com hiperatividade e déficits de funções executivas de aprendizagem. O tratamento pode incluir tratamento de indivíduos com doença grave de início neonatal (sexo masculino ou, mais raramente, feminino) e de início tardio da doença (parcial) em sexo masculino e feminino, que se pode apresentar desde a infância até mais tarde na infância, adolescência ou idade adulta. Em certas modalidades, a invenção fornece um método de tratamento e/ou prevenção de fibrose e/ou cirrose em indivíduos, particularmente aqueles indivíduos heterozigotos de início tardio por administração de hOTC tal como aqui descrito. Em uma modalidade, os objetivos terapêuticos para a deficiência de OTC são de manter amônia plasmática menor do que <80 μmol/L, glutamina no plasma < 1.000 μmol/L, argininemia 80-150 μmol/L e aminoácidos de cadeia ramificada dentro da gama normal. No entanto, outros pontos finais terapêuticos podem ser selecionados pelo médico assistente.

[0073] Em ainda outra modalidade, a invenção fornece um método de resgatar e/ou tratar um indivíduo OTCD neonato compreendendo o passo de fornecer um gene hOTC para o fígado de um indivíduo recém-nascido (por exemplo, um paciente humano). Este método pode utilizar qualquer sequência de ácido nucleico que codifica uma hOTCase funcional, se uma hOTC sintética tal como aqui descrito ou um hOTC de tipo selvagem, ou um hOTC de outra fonte, ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o tratamento neonatal é definido como sendo administrada um hOTC como aqui descrito em um período de 8 horas, as primeiras 12 horas, as primeiras 24 horas, ou as primeiras 48 horas após o parto. Em outra modalidade, especialmente para um primata, a administração neonatal está dentro do período de cerca de 12 horas a cerca de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, ou cerca de 1 mês, ou após cerca de 24 horas até cerca de 48 horas. Para analisar diluição devido à rápida renovação das células de fígado em um mamífero em crescimento (por exemplo, um primata não humano ou humano), terapia neonatal é desejavelmente seguido por readministração a cerca de 3 meses de idade, cerca de 6 meses, cerca de 9 meses, ou cerca de 12 meses. Opcionalmente, mais de uma readministração é permitida. Tal readministração pode ser com o mesmo tipo de vetor, um vetor viral diferente, ou via entrega não viral. Em uma modalidade, um sistema de administração de RNA baseado em hOTC funcional é utilizado para estabilizar um indivíduo (por exemplo, um paciente humano) em crise, seguido por administração de um vetor viral de administração mediada de um hOTC funcional. Em outra modalidade, a terapia inicial envolve a coadministração de sistemas mediados virais e não-virais de hOTC. Em uma modalidade adicional, o DNA de hOTC e construtos de RNA podem ser utilizados sozinhos, ou em combinação com o padrão de tratamento para o diagnóstico e a condição do paciente.

[0074] Conforme descrito nos exemplos práticos aqui descritos, os inventores constataram que os indivíduos OTCD heterozigotos, incluindo aqueles com início tardio de OTCD, têm aumento de fibrose e/ou esteatose microvesicular por todo o fígado. Tal fibrose hepática e/ou esteatose microvesicular pode levar a cirrose relacionada com OTCD. Assim, em uma outra modalidade, a invenção fornece métodos para prevenir a fibrose hepática e/ou a condição médica associada a cirrose relacionada com OTCD ao administrar ao indivíduo (por exemplo, um paciente humano) um hOTC. Este aspecto da invenção pode utilizar um sistema de administração viral ou não viral. O cassete de expressão de ácido nucleico pode conter um DNA ou RNA de hOTC sintética tal como aqui fornecido, ou outra sequência adequada que expressa a hOTCase funcional. Em uma modalidade, um método de tratamento e/ou prevenção de fibrose hepática, esteatose microvesicular, e/ou cirrose relacionada com OTCD é fornecido o qual envolve a administração de OTCase a um indivíduo com OTCD. O indivíduo pode ser um paciente humano. Em uma modalidade, o paciente é heterozigoto e tem início tardio de OTCD. O paciente pode ter sido previamente tratado para OTCD, ou pode ter recebido outros tratamentos convencionais. Atualmente, não existe um padrão de tratamento para OTCD, mas os sintomas raros são geridos, por exemplo, por meio de interrupção da ingestão de proteínas, aumentos compensatórios em carboidratos e lipídios na dieta, hemodiálise para pacientes comatosos com níveis extremamente elevados no sangue; e/ou administração intravenosa de benzoato de sódio, arginina, e/ou fenilacetato de sódio. A FDA US aprovou o fenilbutirato de glicerol (Ravicti®) para a gestão a longo prazo de algumas disfunções do ciclo da ureia para pacientes com 2 anos de idade e mais velhos; este medicamento ajuda a livrar o corpo de amônia e destina-se a pacientes que não podem ser geridos por uma dieta com restrição de proteína ou apenas suplementos de aminoácidos. Em uma modalidade, o tratamento do paciente (por exemplo, uma primeira injeção) é iniciado antes do primeiro ano de vida. Em outra modalidade, o tratamento é iniciado após o primeiro 1 ano, ou após os primeiros 2 a 3 anos de idade, depois de 5 anos de idade, depois de 11 anos de idade, ou com mais idade.

[0075] Em uma modalidade, o método da invenção fornece para tratamento e/ou inversão da fibrose hepática e/ou cirrose relacionada com OTCD por administração ao indivíduo de uma OTCase funcional que é codificada por um DNA manipulado de SEQ ID NO: 1, 3, 4, 5, 8 ou 9, ou um DNA quimérico como aqui definido. A administração do DNA pode ser mediada por um vetor viral contendo o manipulado em um cassete de expressão, ou por um sistema de administração não viral, cada um dos quais medeiam a expressão de OTCase funcional nas células do fígado do indivíduo. Em uma outra modalidade, é administrado ao indivíduo um RNA manipulado de SEQ ID NO: 10, 11, 12 ou 13, ou um RNA quimérico como aqui definido. A administração do RNA pode ser mediada por um vetor viral contendo o RNA manipulado em um cassete de expressão, ou por um sistema de administração não viral, cada um dos quais medeiam a expressão de OTCase funcional nas células do fígado do indivíduo.

[0076] Os indivíduos OTCD heterozigotos têm um risco aumentado de desenvolver carcinoma hepatocelular (HCC). Ver, por exemplo, JM Wilson et al., "Molecular Genetics and Metabolism" (2012), Mol Genet Metab. fev 2012; 105(2):263-265, Publicado online a 7 de novembro, 2011. Assim, em outra modalidade, a invenção fornece métodos para prevenir o tratamento e/ou prevenção de HCC, fornecendo ao indivíduo (por exemplo, um paciente humano) um hOTC. Este aspecto da invenção pode utilizar um sistema de administração viral ou não viral. O cassete de expressão de ácido nucleico pode conter um DNA ou RNA de hOTC sintética tal como aqui fornecido, ou outra sequência apropriada e que expressa hOTCase funcional. O paciente pode ter sido previamente não tratado para OTCD, ou pode ter recebido outros tratamentos convencionais, isto é, padrão de tratamento. Em uma modalidade, o tratamento do paciente (por exemplo, uma primeira injeção) é iniciado antes do diagnóstico com HCC. Em outra modalidade, o tratamento do paciente é iniciado após o diagnóstico de HCC. Opcionalmente, o tratamento envolve a coadministração com sorafenib (comercialmente disponível como Nexavar®), ou a ser utilizado em conjunto com a quimioembolização, radiação, ablação térmica, injeção percutânea de etanol, terapia-alvo (por exemplo, terapêutica anti-angiogênese), infusão arterial hepática de fármacos anticâncer, imunoterapia, ou com opções cirúrgicas incluindo, por exemplo, a ressecção, criocirurgia, e transplante de fígado. Quando utilizado para o tratamento do HCC, pode ser desejável selecionar um sistema de administração não integrante (por exemplo, administração direta de RNA, ou vírus não integrados tais como os adenovírus ou os lentivírus não integrado) para a entrega de um DNA ou RNA de hOTC sintética como aqui descrito.

[0077] Por "OTC funcional", se entende um gene que codifica a OTCase do tipo selvagem tal como caracterizada pela SEQ ID NO: 2 ou uma outra OTCase que fornece, pelo menos, cerca de 50%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, em menos cerca de 90%, ou aproximadamente a mesma, ou mais do que 100% do nível de atividade biológica da enzima ornitina transcarbamilase humana do tipo selvagem, que pode ser caracterizada pela sequência de SEQ ID N0: 2 ou uma sua variante natural ou polimorfismo a qual não está associada com a doença. Mais particularmente, como pacientes heterozigotos podem ter um nível funcional de OTCase tão baixo quanto cerca de 50% ou inferior, o tratamento eficaz pode não requerer a substituição da atividade da OTCase a níveis na gama de pacientes "normais" ou sem OTCD. Do mesmo modo, os pacientes que não tenham quantidades detectáveis de OTCase podem ser resgatados por administrar a função OTCase para níveis de atividade inferior a 100%, e pode opcionalmente ser submetidos a um tratamento adicional subsequentemente. Tal como aqui descrito, a terapia genética aqui descrita, se viral ou não viral, pode ser usada em conjunto com outros tratamentos, isto é, o padrão de tratamento para o diagnóstico do indivíduo (paciente).

[0078] Em uma modalidade, uma tal OTCase funcional tem uma sequência que tem cerca de 95% ou mais de identidade com a proteína madura (isto é, cerca de 322 aminoácidos finais) ou a sequência de comprimento total de SEQ ID NO: 2, ou cerca de 97% de identidade ou mais, ou cerca de 99% ou mais com a SEQ ID NO: 2 ao nível dos aminoácidos. Tal OTCase funcional pode ter também englobar polimorfismos naturais que não estão associados a qualquer doença (por exemplo, F101, L111, e/ou WI193-194 da SEQ ID NO: 2). A identidade pode ser determinada pela preparação de um alinhamento das sequências e através da utilização de uma variedade de algoritmos e/ou programas de computador conhecidos na técnica ou comercialmente disponíveis [por exemplo, BLAST, ExPASy; ClustalO; FASTA; utilizando, por exemplo, o algoritmo de Needleman- Wunsch, algoritmo de Smith-Waterman].

[0079] Existe uma variedade de ensaios para medição da expressão de OTC e níveis de atividade in vitro. Ver, por exemplo, X Ye, et al., 1996 "Prolonged metabolic correction in adult ornithine transcarbamylasedeficient mice with adenoviral vectors". J Biol Chem 271:3639-3646) ou in vivo. Por exemplo, a atividade da enzima OTC pode ser medida utilizando um método de aplicações líquidas da espectrometria da cromatografia de massa com diluição de isótopos estáveis para detectar a formação de citrulina normalizada para [1, 2,3,4,5-13C5] citrulina (98% 13C). O método é adaptado de um ensaio anteriormente desenvolvido para a detecção de atividade de N-acetilglutamato sintase [Morizono H et al., "Mammalian N- acetylglutamate synthase". Mol Genet Metab. 2004;81(Suppl 1):S4-11]. Frações de fígado fresco congelado são pesadas e brevemente homogeneizadas em tampão contendo HEPES 10 mM, 0,5% de Triton X100, EDTA 2,0 mM e DTT 0,5 mM. O volume de tampão de homogeneização é ajustado para se obter 50 mg/mL de tecido. A atividade enzimática é medida utilizando 250 μg de tecido de fígado em Tris-acetato 50 mM, ornitina 4 mM, fosfato de carbamilo 5 mM, pH 8,3. A atividade enzimática é iniciada com a adição de fosfato de carbamilo 50 mM preparado de fresco dissolvido em Tris-acetato 50 mM, pH 8,3, permitindo prosseguir durante 5 minutos a 25 °C e extinta por adição de um volume igual de 13C5-citrulina 5 mM em 30% de TCA. Os detritos são separados por 5 minutos de microcentrifugação, e os sobrenadantes são transferidos para frascos para espectroscopia de massa. Dez μL de amostra são injetados em um LC-MS Agilent 1100 Series sob condições isocráticas com uma fase móvel de 93% de solvente A (1 mL de ácido trifluoroacético em 1 L de água): 7% de solvente B (1 mL de ácido trifluoroacético em 1L de 1:9 de água/acetonitrilo). Os picos correspondentes a citrulina [massa 176,1:razão de carga (m/z)] e 13C5-citrulina (181,1 m/z) são quantificados, e as suas proporções são comparadas com as proporções obtidas para uma curva padrão de citrulina executada com cada ensaio. As amostras são normalizadas para quer o total de tecido de fígado ou para a concentração de proteína determinada utilizando um kit de ensaio de proteína Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA). Outros ensaios que não requerem a biópsia do fígado, podem também ser utilizados. Um tal ensaio é um ensaio de aminoácidos no plasma, em que a proporção entre a glutamina e a citrulina é avaliada e se a glutamina é alta (> 800 microlitros/litro) e citrulina baixa (por exemplo, um dígito), é suspeito existir um defeito no ciclo da ureia. Os níveis plasmáticos de amônia podem ser medidos e uma concentração de cerca de 100 micromoles por litro é indicativo de OTCD. Os gases no sangue podem ser avaliados se um paciente está a hiperventilar; a alcalose respiratória é frequente em OTCD. O ácido orótico na urina, por exemplo, superior a cerca de 20 micromoles por milimole de creatina é indicativo de OTCD, como é o elevado nível de orotato na urina após o teste de desempenho com alopurinol. Os critérios de diagnóstico para OTCD foram estabelecidos em Tuchman et al., 2008, "Urea Cycle Disorders Consortium (UCDC) of the Rare Disease Clinical Research Network (RDCRN)". Tuchman M et al., "Consortium of the Rare Diseases Clinical Research Network. Cross-sectional multicenter study of patients with urea cycle disorders in the United States". Mol Genet Metab. 2008; 94:397-402, que é aqui incorporada por referência. Ver, também, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK154378/, que fornece uma discussão do presente padrão de tratamento para OTCD.

[0080] É para ser notado que o termo "um" ou "uma" se refere a um ou mais. Como tal, os termos "um" (ou "uma"), "um/uma ou mais" e "pelo menos um/uma" são aqui utilizados indiferentemente.

[0081] As palavras "compreende", "compreender" e "compreen dendo" devem ser interpretadas inclusivamente em vez de exclusivamente. Os termos "consiste", "consistindo", e suas variantes, são para ser interpretados exclusivamente, em vez de inclusivamente. Embora várias modalidades na especificação são apresentadas usando a linguagem "compreendendo", sob outras circunstâncias, a modalidade relacionada também se destina a ser interpretada e descrita usando a linguagem "consistindo em'' ou" consistindo essencialmente em".

[0082] Como aqui utilizado, o termo "cerca de" significa uma variação de 10% (± 10%) a partir da referência fornecida, a menos que especificado de outra forma.

[0083] O termo "regulação" ou suas variações, tal como aqui utilizado se refere à capacidade de um composto de fórmula (I) para inibir um ou mais componentes de uma via biológica.

[0084] Um "indivíduo" é um mamífero, por exemplo, um ser humano, camundongo, rato, porquinho-da-índia, cão, gato, cavalo, vaca, porco ou um primata não humano, tal como um macaco, chimpanzé, babuíno ou gorila.

[0085] Conforme aqui utilizado, o termo "doença", "distúrbio" e "condição" são utilizados indiferentemente para indicar um estado anormal em um indivíduo.

[0086] A menos que definido de outro modo na presente especificação, os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o normalmente entendido por um vulgar perito na técnica e por referência a textos publicados, que fornecem a um perito na técnica um guia geral para muitos dos termos utilizados no presente pedido de patente.

[0087] Os exemplos que se seguem são apenas ilustrativos e não se destinam a limitar a presente invenção.

Exemplo 1 - Vetores scAAV Contendo hOTC

[0088] pAAVsc.TBG.hOTCwt e pAAVsc.TBG.hOTCco-LW4 foram construídos através da substituição da sequência codificante de mOTC com hOTC do tipo selvagem (WT) (hOTCwt) ou cDNA de hOTCcoLW, respectivamente, em um plasmídeo anteriormente descrito derivado do pAAVsc.TBG.mOTC1.3 com o íntron interrompido [Moscioni D et al., "Long-term correction of ammonia metabolism and prolonged survival in ornithine transcarbamylase-deficient mice following liver-directed treatment with adeno-associated viral vectors", Mol Ther. 2006;14: 25-33; Cunningham SC et al., "AAV2/8-mediated correction of OCT deficiency is robust in adult but not neonatal Spf(ash) mice", Mol Ther. 2009; 17:13401346; . Wang L et al., "Sustained correction of OTC deficiency in spfash mice using optimized self-complementary AAV2/8 vectors", Gene Ther. abril 2012; 19(4):404-10, Epub a 18 de Agosto, 2011].

[0089] O scAAV2/8.TBG.hOTCco-LW4 contém um AAV2 ITR 3’ e um ITR 5' com uma deleção na sequência D e trs (local terminal de resolução), um promotor TBG, o gene hOTCco-LW4, e 137 bp de poliA de SV40. As duas preparações de vetor (AAV2/8sc.TBG.hOTCwt e AAV2/8sc.TBG.hOTCco-LW4) utilizadas no estudo de comparação inicial foram purificadas por dois ciclos de centrifugação em gradiente de cloreto de césio, tal como previamente descrito [Wang L et al., "Systematic evaluation of AAV vectors for liver directed gene transfer in murine models". Mol Ther. 2010; 18:118-125]. Os vetores utilizados no resto do estudo foram produzidos por um método de produção em escala baseado em transfecção com polietilenoimina (PEI) e purificado a partir do sobrenadante ou lisado total por centrifugação em gradiente de iodixanol como descrito [Lock M et al., Hum Gene Ther. 2010; 21:1259-1271]. Os títulos genômicos [cópias do genoma (GC)/mL] de vetores AAV foram determinados por PCR em tempo real usando conjuntos de iniciador e sonda tendo como alvo o promotor TBG (iniciador direto 5’-AAACTGCCAATTCCACTGCTG-3’ [SEQ ID NO: 14], iniciador inverso 5’-CCATAGGCAAAAGCACCAAGA-3’ [SEQ ID NO: 15], sonda 6FAM-TTGGCCCAATAGTGAGAACTTTTTCCTGC [SEQ ID NO: 16] -TAMRA), e utilizando um plasmídeo linearizado como padrão. O iniciador direto é localizado 400 bp a jusante da extremidade forquilha fechada 5’. Fagone et al ["Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adeno-associated viral vectors and improved over alternative methods", Hum Gene Ther Methods. fev 2012; 23(1):1-7] descreveu recentemente que o método de PCR quantitativo (Q-PCR) poderia subestimar significativamente o título de vetores scAAV, especialmente quando os iniciadores de PCR se encontram perto da forquilha fechada do vetor scAAV. O título de um lote do vetor AAV2/8sc.TBG.hOTCco-LW4 utilizando um conjunto iniciador e sonda tendo como alvo a região poliA (1900 bp a jusante da forquilha fechada 5’), e o título genômico foi de 1,1 vezes do título original, que se encontrava dentro do erro intraensaio de Q-PCR.

[0090] Os níveis de expressão de proteína OTC e atividade de OTC foram avaliados no fígado de camundongos spfash 14 dias após a injeção i.v. de 1x1011 GC dos vetores AAV2/8sc.TBG.hOTCwt ou AAV2/8sc.TBG.hOTCco-LW4. Os camundongos spfash são um modelo para início tardio da doença OTC em seres humanos. Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Universidade da Pensilvânia. Os camundongos spfash foram mantidos no Biotério dos Laboratórios de Pesquisa Translacional da Universidade da Pensilvânia, como descrito anteriormente. Os camundongos spfash com três a seis meses de idade e seus companheiros de ninhada normais foram utilizados nos estudos. Os vetores foram administrados por injeção intravenosa (i.v.) através da veia da cauda. A extensão da transferência de genes baseada em genomas de vetor residentes não foi estatisticamente diferente entre os dois grupos. As amostras de urina foram colhidas antes e em vários pontos de tempo após o tratamento com o vetor para a análise de ácido orótico, como previamente descrito [Moscioni D et al., "Long-term correction of ammonia metabolism and prolonged survival in ornithine transcarbamylase-deficient mice following liver-directed treatment with adeno- associated viral vectors", Mol Ther. 2006;14: 25-33].

[0091] A análise por Western blot para detectar a expressão de hOTC em lisado de fígado foi realizada como previamente descrito [Wang L et al., 2012, epub 2011)]. O anticorpo primário para detectar hOTC foi um anticorpo policlonal de coelho personalizado fornecido pelo laboratório de Hiroki Morizono do Children’s National Medical Center. Os lisados de fígado (10 μg/poço) foram também transferidos e sondados por um anticorpo anti-tubulina (Abcam, Cambridge, MA). A análise de Western demonstrou 100 vezes maior expressão de hOTC do vetor hOTCco-LW4 em comparação com o vetor hOTCwt, atingindo níveis em ligeiro excesso aos observados em camundongos WT.

[0092] A atividade da enzima OTC foi medida utilizando um método de aplicações líquidas da espectrometria da cromatografia de massa com diluição de isótopos estáveis para detectar a formação de citrulina normalizada para [1, 2,3,4,5-13C5] citrulina (98% 13C). O método é adaptado de um ensaio anteriormente desenvolvido para a detecção de atividade de N-acetilglutamato sintase [Morizono H et al., "Mammalian N-acetylglutamate synthase". Mol Genet Metab. 2004;81(Suppl 1):S4-11]. Frações de fígado fresco congelado são pesadas e brevemente homogeneizadas em tampão contendo HEPES 10 mM, 0,5% de Triton X-100, EDTA 2,0 mM e DTT 0,5 mM. O volume de tampão de homogeneização foi ajustado para se obter 50 mg/mL de tecido. A atividade enzimática é medida utilizando 250 μg de tecido de fígado em Tris-acetato 50 mM, ornitina 4 mM, fosfato de carbamilo 5 mM, pH 8,3. A atividade enzimática é iniciada com a adição de fosfato de carbamilo 50 mM preparado de fresco dissolvido em Tris- acetato 50 mM, pH 8,3, permitindo prosseguir durante 5 minutos a 25°C e extinta por adição de um volume igual de 13C5-citrulina 5 mM em 30% de TCA. Os detritos são separados por 5 minutos de microcentrifugação, e os sobrenadantes são transferidos para frascos para espectroscopia de massa. Dez μL de amostra são injetados em um LC-MS Agilent 1100 Series sob condições isocráticas com uma fase móvel de 93% de solvente A (1 mL de ácido trifluoroacético em 1 L de água): 7% de solvente B (1 mL de ácido trifluoroacético em 1L de 1:9 de água/acetonitrilo). Os picos correspondentes a citrulina [massa 176,1:razão de carga (m/z)] e 13C5-citrulina (181,1 m/z) são quantificados, e as suas proporções são comparadas com as proporções obtidas para uma curva padrão de citrulina executada com cada ensaio. As amostras são normalizadas para quer o total de tecido de fígado ou para a concentração de proteína determinada utilizando um kit de ensaio de proteína Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA).

[0093] O vetor portador do cDNA de hOTC manipulado denomi nado aqui LW4 (Figura 4) foi demonstrado melhorar os níveis de proteína hOTC expressa em 100 vezes. Uma avaliação da atividade da enzima OTC geralmente correlaciona com os experimentos de Westem blot para OTC embora a proteína OTC foi mais elevada do que a atividade da enzima OTC quando comparado com OTC endógeno. Quando subtraindo os níveis basais de atividade nos camundongos spfash, a hOTCco-LW4 resultou em atividade mais do que 33 vezes maior do que a hOTCwt. Níveis de expressão de hOTC sustentados e relacionados com a dose foram observados nos camundongos spfash tratados. Em comparação com um vetor de OTC de murino anteriormente descrito que difere principalmente no cDNA, o vetor que transporta o vetor hOTCco-LW4 foi cerca de 10 vezes mais potente.

[0094] O vetor ilustrativo transportando a hOTCco-LW4 modificado (Figura 4) apresentou alto nível de transdução, tal como medido por ensaios histológicos de OTC, ao longo de uma ampla gama de doses. Entre doses 1x1011 GC e 3x109 GC, a eficiência de transdução, como medida pela coloração histoquímica, varia entre 50-70%. Com a menor dose de 1x109 GC, 40% das áreas de fígado foram positivas por coloração histoquímica de OTC. A falta de um efeito claro da dose por histoquímica e imunocoloração poderá ser devido ao fato de que a otimização de códons melhorou significativamente a expressão de hOTC nos hepatócitos transduzidos. Isto leva a uma maior sensibilidade para detectar células transduzidas com número baixo de cópias do genoma do vetor. A transdução pode ser saturada com doses elevadas de vetor (1x1011 - 1x1010 GC), e, por conseguinte, a eficiência de transdução medida por métodos de detecção in situ não discrimina entre os grupos de dose baixa e elevada, em contraste com a atividade da enzima OTC em lisados de fígado medida por espectrometria de massa.

[0095] Um estudo adicional foi realizado em que a expressão neonatal de hOTC foi avaliada em camundongos spfash, injetados no dia 1 de vida, utilizando o scAAV2/8.TBG.hOTCco a uma dose de 5x1010 GC/cria injetada através da veia temporal. Uma expressão sólida foi detectada às 24 e 48 horas. Foram efetuados estudos adicionais utilizando doses de 1 x 1011, 3 x 1010 e 1 x1010 e avaliados durante 12 semanas. Durante o período de 16 semanas do estudo, a redução nos níveis sólidos de expressão iniciais foi observada em cada uma das doses. Isto se acredita ser devido à diluição, isto é, um resultado natural da proliferação de células do fígado em animais em crescimento. Assim, enquanto a recuperação inicial da atividade hepática de OTC é observada na sequência da transferência neonatal de genes em camundongos spfash, este resultado é temporário, com a atividade de OTC a diminuir desde cerca de 1000% dos níveis de tipo selvagem (wt) a cerca de 1 semana, a cerca de 50% dos níveis wt às 4 semanas, a cerca de 10% dos níveis wt às 12 semanas (nível 1x1011 GC); ou cerca de 500% do nível wt na semana 1, a cerca de 20% dos níveis de wt, ou cerca de 10% dos níveis de wt na semana 1 (dose de 3 x 1010 GC) ou cerca de 200% do nível de wt na semana 1, a cerca de 10% do nível de wt na semana 4 (dose de 1 x 1010 GC). Em um estudo, utilizando animais que receberam a primeira injeção de 3 x 1010 GC no dia 1, os animais foram injetados com um segundo vetor de AAV contendo o gene hOTCco (scAAVrh10.hOTCco; 1,8 x 1010 GC) na semana 4. Como um controle, um grupo de animais não recebeu qualquer readministração e um grupo recebeu apenas o segundo vetor às 4 semanas. A readministração do AAV.hOTCco resultou na recuperação da atividade OTC no fígado.

[0096] Foram concebidos estudos adicionais para avaliar a capacidade para resgatar crias OTC-KO por terapia genética neonatal, tanto a curto prazo como a longo prazo.

Exemplo 2 - Produção de Vetores scAAV tendo sequências com códon otimizado A. scAAV8.TBG.hOTC-co

[0097] Os plasmídeos contendo sequência hOTC com um códon otimizado de SEQ ID NO: 3, 4, 5, 9 ou 10, respectivamente, são clonados como descrito no Exemplo 1, substituindo a sequência codificante mOTC com hOTCco em um plasmídeo derivado do anteriormente descrito pAAVsc.TBG.mOTC1.3 com o íntron. O plasmídeo resultante pAAVsc.TBG.hOTCco é clonado em um capsídeo AAV8 [Gao et al., PNAS USA, 2002, 99:11854-11859] utilizando técnicas convencionais.

B. scAAVrh10.TBG.hOTC-co

[0098] Os plasmídeos contendo sequência hOTC com um códon otimizado de SEQ ID NO: 3, 4, 5, 9 ou 10, respectivamente, são clonados como descrito no Exemplo 1, substituindo a sequência codificante mOTC com hOTCco em um plasmídeo derivado do anteriormente descrito pAAVsc.TBG.mOTC1.3 com o íntron. Os plasmídeos resultantes pAAVsc.TBG.hOTCco são clonados em um capsídeo AAVrh10 [Gao et al., PNAS USA, 2002, 99:11854-11859] utilizando técnicas convencionais.

Exemplo 3 - Produção de Vetores ssAAV tendo sequências com códons otimizados

[0099] ssAAV2/8.LSP1.hOTC-co

[00100] Os plasmídeos contendo sequência hOTCco com o códon otimizado são clonados como descrito, substituindo a sequência codificante mOTC do plasmídeo pLSP1mOTC [Cunningham et al., Mol Ther., 2009, 17: 1340-1346] com a correspondente sequência de cDNA de SEQ ID NO: 3, 4, 5, 9 ou 10. Os plasmídeos resultantes pAAVsc.LSP1.hOTCco são clonados em capsídeos AAV8 para formar os correspondentes vetores ssAAV2/8.LSP1.hOTC-co usando técnicas descritas no Exemplo 1.

B. ssAAV2/rh10.LSP1.hOTC-co

[00101] Os plasmídeos contendo sequência hOTCco com o códon otimizado são clonados como descrito, substituindo a sequência codificante mOTC do plasmídeo pLSP1mOTC [Cunningham et al., Mol Ther., 2009, 17: 1340-1346] com a correspondente sequência de cDNA de SEQ ID NO: 3, 4, 5, 9 ou 10. Os plasmídeos resultantes pAAVsc.LSP1.hOTCco são clonados em capsídeos AAV8 para formar os correspondentes vetores ssAAV2/8.LSP1.hOTC-co usando técnicas descritas no Exemplo 1.

[00102] Os vetores produzidos de acordo com a Parte A ou B podem ser purificados através de duas rondas de centrifugação em gradiente de cloreto de césio, tampão trocado com PBS e concentrados utilizando dispositivos filtros de centrífuga Amicon Ultra 15 - 100K (Millipore, Bedford, MA). O título do genoma (GC/mL) de vetores AAV pode ser determinada por PCR em tempo real utilizando um conjunto inici- ador/sonda correspondente ao promotor TBG e padrões de plasmídeo linearizado. Os vetores podem ser indivíduos a testes de controle de qualidade adicionais, tais como eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) para análise da pureza do vetor e lisado de amebócitos de Limulus (LAL) para a detecção de endotoxinas (Cambrex Bio Science, Walkersville, MD, EUA).

Exemplo 4 - ssAAV8.TBG.hOTCco no Modelo de Início Tardio de OTCD

[00103] Um vetor AAV8 foi produzido usando os métodos aqui descritos. O vetor tem nele empacotados um AAV2 ITR 5’, um promotor TBG, um íntron, um hOTCco, um elemento WPRE, um hormônio de crescimento bovino poli A, e um AAV2 ITR 3’. A expressão e a cinética deste vetor foram comparadas com um vetor AAV8 autocomplementar com ou sem o elemento WPRE. Os resultados mostram que os construtos de cadeia simples com o elemento WPRE superaram aqueles vetores que não possuem o elemento WPRE; em doses comparáveis ambos os vetores de cadeia simples (com e sem WPRE) foram menos sólidos do que o vetor autocomplementar sem WPRE nos pontos de tempo medidos.

[00104] No entanto, os vetores de cadeia simples podem ter outras propriedades desejáveis, por exemplo, em termos de cinética, dependendo da idade e condição do paciente.

Exemplo 5 - Produção de Vetores de Adenovírus tendo sequências com códons otimizados

[00105] O cDNA de hOTCco [SEQ ID NO: 3, 4, 5, 9 e 10] com ligantes Notl foi clonado a jusante de um promotor PEPCK de rato para gerar pPEPCK-hOTC como descrito em A. Mian et al., Molecular Therapy, 2004, 10: 492-499 (2004). Este plasmídeo é digerido com Ascl, e o fragmento de PEPCK-hOTCco resultante é inserido no plasmídeo estrutural de adenovírus pC4HSU31 para produzir os plasmídeos parentais pC4HSU-PEPCK-hOTCco. O plasmídeo pWPRE é digerido com ClaI para liberar o WPRE, que é depois inserido no local MluI do pPEPCK-hOTC, para gerar o plasmídeo pPEPCK- hOTCco-WPRE com as suas respectivas sequências de hOTCco. Os restantes passos para gerar o plasmídeo adenoviral pC4HSU-PEPCK- hOTCco-WPRE são tal como anteriormente descrito. Todos os locais de clonagem são confirmados por análise da sequência de DNA. A identidade de plasmídeos recombinantes adenovirais pode ser confirmada por digestão com enzimas de restrição HindlII e BamHI. Os plasmídeos adenovirais são linearizados com Pmel antes da transfecção em células 293Cre4. Os vetores adenovirais são resgatados e amplificado com células 293Cre4 e vírus auxiliar AdLC8cluc. A suspensão células 293N3Scre8 pode ser utilizada no passo final de produção do vetor. Purificação, quantificação por OD260 e extração do DNA viral são realizadas tal como descrito em detalhe em um outro local [Brunetti-Pierri, N., et al., (2004). "Acute toxicity after high-dose systemic injection of helper-dependent adenoviral vectors into nonhuman primates". Hum. Gene Ther. 15: 3546; Ng, P., Parks, R. J. e Graham, F. L. (2002). "Preparation of helperdependent adenoviral vectors". Methods Mol. Med. 69: 371-388].

Exemplo 6 - Produção de Vetores Lentivirais hOTCco

[00106] A. Os vetores lentivirais de replicação defeituosa contendo as sequências hOTCco aqui fornecidos podem ser produzidos através da substituição da sequência do gene OTC de rato inserida no plasmídeo pLenti-GIII-CMV-GFP-2A-Puro [comercialmente disponível de Applied Biological Materials (ABM) Inc.; Canadá] com a sequência desejada de hOTCco [SEQ ID NO: 3, 4, 5, 9 e 10]. Os vírus são produzidos de acordo com as instruções do fabricante. O sistema ABM inclui uma deleção potenciadora na região U3 do ΔLTR 3’ de modo a assegurar a auto-inativação do vetor lentiviral após a transdução e integração no DNA genômico da célula alvo; contém genes lentivirais mínimos necessários para o empacotamento, replicação e transdução (Gag/Pol/Rev), derivados de diferentes plasmídeos e todos tendo em falta os sinais de empacotamento; além disso, nenhum dos genes Gag, Pol, ou Rev são incorporados no genoma viral empacotado, tornando assim o vírus maduro incompetente para a replicação.

[00107] B. Vetores Lentivirais hOTC de Replicação defeituosa, não integrante

[00108] Um construto de DNA contendo um promotor específico do fígado e o DNA de hOTCco de SEQ ID NO: 3, 4, 5, 9 e 10 são manipulados em vetores de lentivírus que são pseudotipado em vírus sindbis envelope E2 produzido como descrito em US2011/0064763, que é aqui incorporada por referência. Todos os vetores contêm dador de excisão, sinal de empacotamento (psi), um elemento reativo a Rev (RRE), dador de excisão, aceitador de excisão, trato central de poli purina (cPPT). O elemento WPRE é eliminado em certos vírus.

[00109] C. O DNA de hOTCco da SEQ ID NO: 3, 4, 5 9 e 10, é clonado em um lentivírus pseudotipado com um gene de envelope do vírus da estomatite vesicular (VSV), adquirido da InvivoGen (SanDiego, CA) utilizando as instruções do fabricante.

Exemplo 7 - Produção de Sistemas de Administração de RNA de hOTCco

[00110] O RNA pode ser preparado por transcrição in vitro a partir de um molde de DNA ou sintetizado. O cassete de expressão de RNA é preparado que inclui uma UTR 5’, um íntron opcional com locais dadores e aceitadores de excisão, uma sequência Kozak opcional, a sequência codificante de hOTC aqui fornecida, uma poliA, e uma UTR 3’, utilizando técnicas conhecidas.

[00111] A. Uma quantidade adequada de mRNA é incorporada em nanopartículas de um polímero envolto por lipídio sensível a pH geradas utilizando técnicas publicadas. [X. Su et al., Mol. Pharmaceutics, 2011, 8 (3), pp 774-787; publicação na web: 21 de março, 2011].

[00112] B. As formulações de nanopartículas poliméricas com 25 kDa de polietilenoimina ramificada (PEI) são preparadas como se segue. Quando PEI está presente, esta pode ser ramificada em PEI de um peso molecular que varia de 10 a 40 kDa, por exemplo, PEI ramificada de 25 kDa (Sigma # 408727). Polímeros exemplificativos adicionais adequados para a presente invenção incluem os descritos na Publicação PCT W02013182683, o conteúdo da qual é aqui incorporado por referência. A quantidade necessária de mRNA é diluída imediatamente antes da aplicação na água para injeção (Braun, Melsungen) para um volume total de 4 mL e adicionada rapidamente a 4 mL de uma solução aquosa de PEI ramificada de 25 kDa utilizando uma pipeta a uma proporção de N/P de 10. A solução é misturada por pipetagem para cima e para baixo.

[00113] C. Para uma nanopartícula baseada em lipídeo, um a formulação de lipídeo é produzida usando um cassete de expressão contendo o RNA de hOTCco em uma formulação de cK - E12:DOPE:Chol:PEG-DMG2K (quantidades relativas de 50:25:20:5 (mg:mg:mg:mg)) para fornecer uma solução para administração. O lipídeo catiônico cK -E12 é utilizado (ver, por exemplo, WO 2013/063468), e é combinado com dioleoilfosfatidil-etanolamina ou "DOPE", colesterol (chol), e polietilenoglicol (PEG) ou um lipídeo PEGilado (PEG-DMG2K) utilizando métodos de formulação descritos nas publicações das patentes internacionais WO 2010/053572 e WO2012/170930, ambas as quais são aqui incorporadas por referência.

Exemplo 8 - Sistemas de Administração de DNA de hOTCco

[00114] A. O DNA plasmídico nu - As sequências hOTCco [SEQ ID NO: 3, 4, ou 5] são manipuladas como construtos de DNA plasmídico nu que são entregues a uma célula alvo do fígado (por exemplo, via administração intravascular) e expressam a proteína humana OTC na célula alvo.

[00115] B. Complexos de lipídeos catiônico-DNA - Os complexos de lipídeos catiônicos - DNA são preparados utilizando uma quantidade adequada de um cassete de expressão contendo pelo menos um promotor, um íntron opcional, umas sequências Kozak opcionais, um hOTCco de SEQ ID NO: 3, 4 ou 5, uma poliA, e outras sequências de controle de expressão opcionais. O promotor pode ser um promotor específico do fígado. Alternativamente, um outro promotor não específico de tecido pode ser selecionado. Por exemplo, uma quantidade adequada de DNA é formulada com um lipídeo catiônico de cK - E12:DOPE:Chol:PEG-DMG2K (quantidades relativas de 50:25:20:5 (mg:mg:mg:mg)) para formar complexo de lipídeo catiônico - DNA apropriado para a administração a um indivíduo. O lipídeo catiônico cK -E12 é utilizado (ver, por exemplo, WO 2013/063468), e é combinado com dioleoilfosfatidil-etanolamina ou "DOPE", colesterol (chol), e polietilenoglicol (PEG) ou um lipídeo PEGilado (PEG-DMG2K) utilizando métodos de formulação descritos nas publicações das patentes internacionais WO 2010/053572 e WO 2012/170930, ambas as quais são aqui incorporadas por referência.

Exemplo 9 - Correção a Longo Prazo de uma Forma de Deficiência Neonatal Letal de OTC por Múltiplos Tratamentos com vetores AAV de Diferentes Sorotipos

[00116] No presente estudo, o scAAV8.TBG.hOTCcoLW4 preparado como descrito no Exemplo 1 foi usado para resgate de animais em um modelo de camundongo neonatal de OTCD de início (precoce). Os camundongos OTC KO foram gerados através da deleção dos éxons 2-3, e as propriedades deste camundongo caracterizado em termos de semelhança com os pacientes humanos com mutações nulas de OTC. Em resumo, o modelo nocaute (KO) de OTC gerado no nosso laboratório através da deleção dos éxons 2-3 reproduz de perto a forma inicial neonatal grave de OTCD em seres humanos. As crias neonatais macho OTC KO filhotes têm elevados níveis de amônia no plasma devido à ausência de expressão de OTC no fígado, e eles inevitavelmente morrem em um período de 24 horas após o nascimento. As fêmeas heterozigotas reproduzem normalmente, têm níveis de amônia no plasma normal, atividade hepática reduzida da enzima OTC, níveis de ácido orótico elevados na urina, e em alguns casos menor peso corporal em comparação com o tipo selvagem da mesma ninhada (WT). Uma única injeção do vetor scAAV8-hOTCco preparado como descrito no Exemplo 1 em uma dose de 1-3x10e10 GC/cria imediatamente após o nascimento é capaz de resgatar as crias OTC KO e prolongar a vida a 6 semanas. Para atingir a correção a longo termo, um grupo de camundongos OTC- KO de 4 semanas de idade receberam uma segunda administração de vetor do vetor scAAVrh10-hOTCco, que tinha sido preparado tal como descrito no Exemplo 1.

[00117] Mais de 30 crias OTC-KO retiradas por cesariana foram resgatadas com sucesso com a administração do gene. As crias resgatadas tinham menor peso corporal do que os seus companheiros de ninhada normais e tinha um fenótipo transitório de pelagem escassa e pele anormal. Mais importante ainda, os seus níveis plasmáticos de amônia estavam na gama normal. No entanto, a eficácia não pode ser mantida para além da semana 6 devido à perda do genoma do vetor durante a proliferação rápida do fígado na fase neonatal. A segunda administração de vetor do vetor scAAVrh10- hOTCco vetor em camundongos OTC-KO com 4 semanas de idade é capaz de prolongar ainda mais as suas vidas para a vida adulta. Os camundongos mais velhos atingiram 18 meses de idade. Os camundongos resgatados de longa duração apresentam níveis próximos dos normais de amônia no plasma, embora os níveis de ácido orótico na urina em um subconjunto destes camundongos foram significativamente elevados. A coloração com vermelho Sirius em amostras de fígado de camundongos heterozigotos de diferentes idades (6, 12 e 18 meses de idade) mostraram fibrose hepática em camundongos OTC-KO heterozigotos envelhecidos (18 meses de idade) do sexo feminino, semelhante a uma amostra de fígado de um paciente OTCD com 11 anos.

Exemplo 10 - Tratamento Deficiência de OTC de Início Tardio (OTCD)

[00118] Camundongos heterozigotos OTC-KO de dois meses de idade receberam uma injeção única na veia da cauda de um vetor AAV8 autocomplementar que codifica para um gene humano OTC (SEQ ID NO: 5) com códons otimizados com cópias do genoma do vetor a 1x1010, 3x1010 e 1x1011 cópias por camundongo.

[00119] Uma semana após o tratamento com o vetor, os camundongos em todos os três grupos de dose de vetor tinham níveis normais de ácido orótico na urina, que foram mantidas durante todo o estudo (16 meses). Amostras de fígado foram colhidas dos camundongos tratados a partir de 18 meses de idade para análise de patologia e comparação com camundongos heterozigotos não tratados da mesma idade e WT da mesma ninhada. Todos os camundongos tratados apresentaram histologia do fígado normal semelhante ao WT, em contraste com os animais não tratados heterozigotos que tinham fibrose por todo o fígado. Em conclusão, uma única injeção do vetor AAV8sc-hOTCco pode prevenir a fibrose hepática em heterozigotos OTC-KO e tem um grande potencial para a correção da fibrose hepática em pacientes com OTCD.

[00120] Os vetores de terapia genética aqui descritos são capazes de expressão rápida, robusta e prolongada do gene mesmo em camundongos com uma completa falta de OTC. As fêmeas heterozigotas são capazes de reproduzir e dar à luz descendência masculina hemizigota, mas estas crias morrem no período de um dia após nascimento se não tratadas. Os camundongos fêmeas heterozigotos mais velhos não tratados mostram evidências de aumento da fibrose e esteatose microvesicular, uma constatação que parece semelhante ao observado em pacientes heterozigotos humanos. Um tratamento de transferência genética que é capaz de resgatar machos afetados foi desenvolvido e machos tratados sobreviveram mais de 72 semanas.

[00121] Assim, estes dados demonstram que a terapia genética com hOTC específica do fígado pode prevenir a fibrose hepática. Estes dados correlacionam-se com no tratamento de seres humanos heterozigotos deficientes em OTC, por exemplo, os indivíduos terem início tardio de OTCD.

Listagem de Sequências de Texto Livre

[00122] A seguinte informação é fornecida para as sequências que contêm texto sob identificador numérico <223>.

[00123] A prioridade do Pedido de Patente Provisório US No. 61/950.157, depositado em 9 de março de 2014, e todos os documentos publicados, citados neste relatório descritivo são aqui incorporados por referência. Do mesmo modo, a SEQ ID NO que são aqui referenciadas e que aparecem na Listagem de Sequências anexa são incorporadas por referência. Embora a invenção tenha sido descrita com referência a modalidades particulares, será apreciado que modificações possam ser feitas sem se afastar do espírito da invenção. Tais modificações se destinam- a cair dentro do âmbito das reivindicações anexas.

Claims

1. Vetor viral recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica a ornitina transcarbamilase humana (hOTC) e sequências de controle de expressão que direcionam a expressão da hOTC em uma célula do fígado, em que a sequência de ácido nucleico da hOTC codifica a sequência madura ou de comprimento total da hOTC, e expressa uma hOTCase funcional, em que a referida sequência de ácido nucleico de hOTC compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5.

2. Vetor viral recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico da hOTC tem a sequência de SEQ ID NO: 5.

3. Vetor viral recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica a ornitina transcarbamilase humana (hOTC) e sequências de controle de expressão que direcionam a expressão de hOTC em uma célula do fígado, em que a sequência de ácido nucleico hOTC codifica a proteína hOTC madura ou de comprimento total e expressa uma hOTC funcional, em que a sequência de ácido nucleico de hOTC compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4 ou de SEQ ID NO: 3.

4. Vetor viral recombinante, de acordo a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a hOTC é uma OTC quimérica que compreende uma sequência de trânsito heteróloga substituída pela sequência de trânsito nativa de SEQ ID NO: 5.

5. Vetor viral recombinante ,de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o vetor viral é selecionado dentre um vetor do vírus adeno-associado (AAV), um vetor adenoviral, e um vetor lentiviral.

6. Vetor viral recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que as sequências de controle de expressão compreendem um promotor específico do fígado, opcionalmente em que o promotor específico do fígado é um promotor da globulina ligadora de tiroxina (TBG).

7. Vetor viral recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão compreende ainda um ou mais dentre um íntron, uma sequência Kozak, uma poliA, e elementos de regulação pós-transcricional.

8. Vetor viral recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vetor viral recombinante é um vetor de AAV recombinante que compreende um capsídeo de AAV que tem empacotado em si uma sequência de ácido nucleico que compreende pelo menos uma sequência ITR e o ácido nucleico que codifica hOTC, opcionalmente em que o capsídeo de AAV é selecionado dentre AAV8, AAV9 e/ou AAVrh10.

9. Vírus adeno-associado recombinante (rAAV), caracterizado pelo fato de que tem um capsídeo de AAV e empacotado neste um cassete de expressão compreendendo pelo menos uma sequência de repetição terminal invertida (ITR) de AAV, uma sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos a ornitina transcarbamilase madura humana (hOTC), e sequências de controle de expressão que direcionam a expressão da hOTC em uma célula do fígado, as referidas sequências de controle de expressão compreendendo um promotor específico do fígado, em que a sequência de ácido nucleico de hOTC compreende pelo menos a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5 que codifica a hOTC madura.

10. rAAV, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico hOTC tem a sequência de SEQ ID NO: 5.

11. rAAV, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, carac- terizado pelo fato de que o capsídeo de AAV é selecionado dentre AAV8, AAV9 ou AAVrh10.

12. rAAV, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão compreende ainda uma sequência de repetição terminal invertida (ITR) 5’ de AAV e uma sequência ITR 3’, ou em que a pelo menos uma ITR de AAV compreende uma ITR 5’, em que a sequência D e o sítio terminal de resolução é deletado, ou em que as ITRs 5’ e 3’ são de AAV2.

13. Vírus adeno-associado recombinante (rAAV), caracterizado pelo fato de que possui um capsídeo de AAV e empacotado nele um cassete de expressão compreendendo pelo menos uma sequência de repetição terminal invertida (ITR) de AAV, uma sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos a ornitina transcarbamilase humana madura (hOTC) e expressão sequências de controle que direcionam a expressão do hOTC em uma célula do fígado, compreendendo as referidas sequências de controle de expressão um promotor específico do fígado, em que o ácido nucleico que codifica a hOTC apresenta a sequência codificante de SEQ ID NO: 3, ou em que o ácido nucleico que codifica a hOTC apresenta a sequência codificante de SEQ ID NO: 4.

14. Vetor viral, caracterizado pelo fato de que compreende um gene hOTC que codifica uma ornitina transcarbamilase quimérica o qual compreende pelo menos ornitina transcarbamilase madura humana com uma sequência heteróloga de trânsito, em que a sequência codificante que codifica ornitina transcarbamilase madura humana é selecionada dentre uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3, 4 ou 5.

15. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação do hOTC é a sequência da SEQ ID NO: 5.

16. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um veículo e uma quantidade eficaz do vetor, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, do rAAV, como definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 13, e/ou do vetor viral, como definido na reivindicação 14 ou 15.

17. Vetor viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, rAAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, e/ou vetor de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que é para uso em um método de tratamento de deficiência de ornitina transcarbamilase (OTCD) em um paciente humano.

18. Uso do vetor viral, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, do rAAV, como definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 13, e/ou do vetor, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição para o tratamento de deficiência de ornitina transcar- bamilase (OTCD) em um paciente humano.