BR112016016329B1

BR112016016329B1 - Método para realizar cromatografia com resina de cromatografia de troca aniônica irradiada com radiação gama para purificar uma proteína terapêutica recombinante

Info

Publication number: BR112016016329B1
Application number: BR112016016329-0A
Authority: BR
Inventors: Rahul Godawat; Veena Warikoo; Rohan Patil; Konstantin Konstantinov; Venkat Kishore Ryakala; Mahsa Rohani
Original assignee: Genzyme Corporation
Priority date: 2014-01-17
Filing date: 2015-01-16
Publication date: 2023-12-26
Also published as: US20180354986A1; CY1124062T1; DK3094640T3; BR112016016329A2; RU2016133483A; TW201936628A; WO2015109146A1; HK1227042B; TWI709570B; HUE052611T2; JP7055161B2; CA2936951C; CN106103464B; IL246774B; CA2936951A1; CN106103464A; AU2015206422B2; TWI671312B; SG11201605626SA; EP3094640B1

Abstract

cromatografia estéril e processos de produção. nesta invenção são oferecidos métodos para a realização de cromatografia com resina de cromatografia irradiada com radiação gama que incluem oferecer uma coluna cromatográfica incluindo uma resina de cromatografia irradiada com radiação gama; realizar um primeiro ciclo de cromatografia através da coluna, onde o ciclo inclui expor a resina de cromatografia a um tampão desnaturante; e realizar pelo menos um ciclo de cromatografia adicional através da coluna. também são oferecidos processos integrados, fechados ou substancialmente fechados, e contínuos para a produção de uma proteína recombinante que incluem o uso de pelo menos uma coluna cromatográfica incluindo uma resina de cromatografia irradiada com radiação gama, onde a resina de cromatografia irradiada com radiação gama é exposta a um tampão desnaturante durante cada ciclo no processo, e um tampão com carga biológica reduzida é usado no processo.

Description

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados

[001] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente Provisória US N° 61/928.906, depositado em 17 de janeiro de 2014, que está aqui incorporado em sua íntegra a título de referência.

Campo Técnico

[002] Esta invenção refere-se a métodos de biotecnologia e à bioprodução de proteínas recombinantes.

Antecedentes

[003] Células de mamífero incluindo um ácido nucleico que codifica uma proteína recombinante são frequentemente usadas para produzir proteínas terapeuticamente ou comercialmente importantes. No atual ambiente de diversos pipelines de produtos, as empresas de biotecnologia se veem cada vez mais pressionadas a desenvolver soluções inovadoras para a produção altamente flexível e de baixo custo de substâncias medicamentosas à base de proteína terapêutica. Uma das estratégias para o isolamento eficiente de proteínas recombinantes é através de processos que incluem cromatografia contínua (por exemplo, usando um sistema fechado). Uma limitação conhecida da cromatografia contínua é a presença de agentes contaminantes no sistema (por exemplo, carga biológica aumentada), que resulta em um produto contaminado, uma redução no rendimento de produção, e uma redução na taxa de fluxo (ou aumento na pressão) no sistema. Por exemplo, a carga biológica aumentada em um sistema pode resultar na paralisação completa do sistema.

Sumário

[004] A presente invenção baseia-se, pelo menos em parte, na descoberta de que a radiação gama de resina de cromatografia resulta em uma redução na capacidade de ligação da resina (por exemplo, uma redução (por exemplo, uma redução contínua na capacidade de ligação da resina ao longo de múltiplos ciclos de cromatografia), e de que a capacidade de ligação da resina irradiada com radiação gama pode ser recuperada por exposição da resina a um tampão desnaturante. Tendo em vista esta descoberta, são oferecidos nesta invenção métodos para realizar cromatografia com resina de cromatografia irradiada com radiação gama que incluem oferecer uma coluna cromatográfica incluindo uma resina de cromatografia irradiada com radiação gama; realizar um primeiro ciclo de cromatografia através da coluna, onde o ciclo inclui expor a resina de cromatografia a um tampão desnaturante; e realizar pelo menos um ciclo de cromatografia adicional através da coluna. Também são oferecidos processos integrados, fechados ou substancialmente fechados, e contínuos para a produção de uma proteína recombinante que incluem o uso de pelo menos uma coluna cromatográfica incluindo uma resina de cromatografia irradiada com radiação gama, onde a resina de cromatografia irradiada com radiação gama é exposta a um tampão desnaturante durante cada ciclo no processo, e um tampão com carga biológica reduzida é usado no processo. Qualquer um dos métodos e processos descritos neste relatório pode ser um método ou processo de carga biológica reduzida, estéril, asséptico, ou absolutamente estéril (conforme definido neste relatório). Qualquer um dos métodos e processos descritos neste relatório pode ser uma combinação de asséptico e carga biológica reduzida, estéril, ou absolutamente estéril.

[005] São oferecidos nesta invenção métodos para realizar cromatografia com resina de cromatografia irradiada com radiação gama que incluem: (a) oferecer uma coluna cromatográfica contendo uma resina de cromatografia irradiada com radiação gama; (b) realizar um primeiro ciclo de cromatografia através da coluna, onde o ciclo inclui expor a resina de cromatografia a um tampão desnaturante; e (c) realizar pelo menos um ciclo de cromatografia adicional através da coluna. Em algumas modalidades desses métodos, a realização dos ciclos em (b) e/ou (c) inclui as etapas de: (a) capturar uma proteína recombinante expondo a resina de cromatografia com um líquido contendo uma proteína recombinante; (b) lavar a resina de cromatografia expondo a resina de cromatografia com um tampão de lavagem; (c) eluir a proteína recombinante expondo a resina de cromatografia com um tampão de eluição; e (d) regenerar a resina de cromatografia expondo a resina de cromatografia ao tampão desnaturante.

[006] Em alguns exemplos de qualquer um dos métodos descritos neste relatório, o líquido contendo uma proteína recombinante é um meio de cultura líquido. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste relatório, os ciclos em (b) e (c) são realizados usando-se um sistema fechado e integrado. Em alguns exemplos de qualquer um dos métodos descritos neste relatório, o tampão é tampão com carga biológica reduzida (por exemplo, um tampão com carga biológica reduzida preparado por filtração).

[007] Em alguns exemplos de qualquer um dos métodos descritos neste relatório, o tampão desnaturante inclui um ou mais dentre ureia, cloreto de guanidina, e TritonTM X-100. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste relatório, o ciclo de (b) inclui ainda expor a resina de cromatografia a um tampão de lavagem incluindo cerca de 0,5 M e cerca de 1,5 M de hidróxido de sódio subsequente à exposição ao tampão desnaturante. Em algumas modalidades onde é usada uma resina de cromatografia por afinidade incluindo um ligando de proteína, o ciclo de (b) inclui ainda expor a resina de cromatografia a um tampão de lavagem incluindo cerca de 1 mM e cerca de 100 mM de hidróxido de sódio. Em alguns exemplos de qualquer um dos métodos descritos neste relatório, a coluna faz parte de um sistema de cromatografia multicolunas (MCCS) (por exemplo, o sistema de cromatografia contracorrente periódica (PCCS).

[008] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste relatório, a resina de cromatografia é resina de cromatografia por troca aniônica, resina de cromatografia por troca catiônica, resina de cromatografia de exclusão por tamanho, resina de cromatografia por interação hidrofóbica, resina de cromatografia por afinidade, ou qualquer combinação das mesmas. Em alguns exemplos, a resina de cromatografia é resina de cromatografia por troca aniônica.

[009] Em alguns exemplos de qualquer um dos métodos descritos neste relatório, a resina de cromatografia fora tratada com uma dose de radiação gama entre cerca de 10 kGy e cerca de 40 kGy (por exemplo, entre cerca de 15 kGy e cerca de 35 kGy, ou entre cerca de 20 kGy e cerca de 30 kGy). Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos neste relatório, quatro ou mais (por exemplo, nove ou mais, quatorze ou mais, dezenove ou mais, vinte e quatro ou mais, vinte e nove ou mais, ou trinta e nove ou more) ciclos adicionais de cromatografia são realizados. Em alguns exemplos de qualquer um dos métodos descritos neste relatório, a etapa (c) é realizada durante um período de pelo menos 4 dias (por exemplo, pelo menos 5 dias, pelo menos 7 dias, pelo menos 14 dias, ou pelo menos 28 dias). Em alguns exemplos de qualquer um dos métodos descritos neste relatório, a proteína recombinante é uma proteína terapêutica recombinante.

[0010] Também são oferecidos processos integrados, fechados ou substancialmente fechados, e contínuos para a produção de uma proteína recombinante purificada que incluem: (a) oferecer um meio de cultura líquido incluindo uma proteína recombinante que é substancialmente livre de células; e (b) alimentar continuamente o meio de cultura líquido em um sistema de cromatografia multicolunas (MCCS) incluindo pelo menos uma coluna cromatográfica contendo resina de cromatografia irradiada com radiação gama, onde a resina de cromatografia é exposta, durante cada ciclo, a um tampão desnaturante; onde o processo utiliza tampão com carga biológica reduzida, é integrado, e opera continuamente desde o meio de cultura líquido até um eluato do MCCS que é a proteína recombinante purificada. Em algumas modalidades desses processos, o MCCS efetua pelo menos duas operações unitárias diferentes. Em alguns exemplos de qualquer um dos processos descritos neste relatório o MCCS envolve troca de coluna. Em algumas modalidades de qualquer um dos processos descritos neste relatório, todas as colunas no MCCS contêm resina de cromatografia irradiada com radiação gama.

[0011] Em alguns exemplos de qualquer um dos processos descritos neste relatório, o MCCS efetua as operações unitárias de capturar a proteína recombinante e inativar vírus, ou as operações unitárias de capturar e purificar a proteína recombinante. Em algumas modalidades de qualquer um dos processos descritos neste relatório, o MCCS é o sistema de cromatografia contracorrente periódica. Em alguns exemplos de qualquer um dos processos descritos neste relatório, o MCCS inclui uma pluralidade de colunas para cromatografia por afinidade, cromatografia por troca catiônica, cromatografia por troca aniônica, cromatografia de exclusão por tamanho, ou cromatografia por interação hidrofóbica, ou qualquer combinação das mesmas. Em algumas modalidades de qualquer um dos processos descritos neste relatório, onde o MCCS inclui uma coluna para cromatografia por afinidade, e a cromatografia por afinidade é realizada com um mecanismo de captura selecionado do grupo que consiste em: um mecanismo de captura de ligação de proteína A, um mecanismo de captura de ligação de substrato, um mecanismo de captura de ligação de anticorpo ou de fragmento de anticorpo, um mecanismo de captura de ligação de aptâmero, e um mecanismo de captura de ligação de cofator. Em alguns exemplos de qualquer um dos processos descritos neste relatório, a cromatografia por afinidade é realizada com um mecanismo de captura de ligação de proteína A, e a proteína recombinante é um anticorpo ou um fragmento de anticorpo. Em alguns exemplos de qualquer um dos processos descritos neste relatório, a proteína recombinante é uma proteína recombinante terapêutica. Algumas modalidades de qualquer um dos processos descritos neste relatório incluem ainda formular a proteína recombinante purificada como uma composição farmacêutica. Em algumas modalidades de qualquer um dos processos descritos neste relatório, o tampão desnaturante inclui um ou mais dentre ureia, cloreto de guanidina, e TritonTM X-100. Em alguns exemplos de qualquer um dos processos descritos neste relatório, a resina de cromatografia é exposta a um tampão de lavagem incluindo cerca de 0,5 M e cerca de 1,5 M de hidróxido de sódio subsequente à exposição a um tampão desnaturante em cada ciclo.

[0012] Também são oferecidos processos integrados, fechados ou substancialmente fechados, e contínuos para a produção de uma proteína recombinante que incluem: (a) oferecer um meio de cultura líquido incluindo uma proteína recombinante que é substancialmente livre de células; (b) alimentar continuamente o meio de cultura líquido em um primeiro sistema de cromatografia multicolunas (MCCS1); (c) capturar a proteína recombinante from o meio de cultura líquido usando o MCCS1; (d) produzir um eluato proveniente do MCCS1 que inclui a proteína recombinante e alimentar continuamente o eluato em um segundo sistema de cromatografia multicolunas (MCCS2); (e) alimentar continuamente a proteína recombinante proveniente do eluato no MCCS2 e subsequentemente eluir a proteína recombinante para desta forma produzir a proteína recombinante purificada, onde: o processo utiliza tampão com carga biológica reduzida, é integrado, e opera continuamente desde o meio de cultura líquido to a proteína recombinante purificada, e pelo menos uma coluna no MCCS1 e/ou MCCS2 é uma coluna cromatográfica contendo resina de cromatografia irradiada com radiação gama e a resina de cromatografia é exposta a um tampão desnaturante durante cada ciclo no processo. Em alguns exemplos de qualquer um dos processos descritos neste relatório, o MCCS1 e/ou o MCCS2 efetua pelo menos duas operações unitárias diferentes. Em alguns exemplos de qualquer um dos processos descritos neste relatório, o uso do MCCS1 ou do MCCS2, ou de ambos, envolve troca de coluna.

[0013] Em algumas modalidades de qualquer um dos processos descritos neste relatório, o MCCS1 efetua ainda as operações unitárias de capturar a proteína recombinante e inativar vírus. Em algumas modalidades de qualquer um dos processos descritos neste relatório, o MCCS2 efetua as operações unitárias de purificar e polir a proteína recombinante. Em alguns exemplos de qualquer um dos processos descritos neste relatório, o MCCS1 e/ou o MCCS2 utiliza pelo menos duas colunas cromatográficas. Em alguns exemplos de qualquer um dos processos descritos neste relatório, todas as colunas cromatográficas no MCCS1 e no MCCS2 são colunas cromatográficas contendo resina de cromatografia irradiada com radiação gama. Em alguns exemplos de qualquer um dos processos descritos neste relatório, o MCCS1 é um primeiro sistema de cromatografia contracorrente periódica (PCCS1). Em algumas modalidades de qualquer um dos processos descritos neste relatório, a captura é efetuada usando-se cromatografia por afinidade, cromatografia por troca catiônica, cromatografia por troca aniônica, ou cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia por interação hidrofóbica, ou qualquer combinação das mesmas. Em alguns exemplos de qualquer um dos processos descritos neste relatório, a captura é efetuada usando-se cromatografia por afinidade com um mecanismo de captura selecionado do grupo de: um mecanismo de captura de ligação de proteína A, um mecanismo de captura de ligação de substrato, um mecanismo de captura de ligação de anticorpo ou de fragmento de anticorpo, um mecanismo de captura de ligação de aptâmero, e um mecanismo de captura de ligação de cofator. Em algumas modalidades de qualquer um dos processos descritos neste relatório, a cromatografia por afinidade é realizada com um mecanismo de captura de ligação de proteína A, e a proteína recombinante é um anticorpo ou um fragmento de anticorpo.

[0014] Em algumas modalidades de qualquer um dos processos descritos neste relatório, o MCCS2 é um segundo sistema de cromatografia contracorrente periódica (PCCS2). Em alguns exemplos de qualquer um dos processos descritos neste relatório, a proteína recombinante é uma proteína recombinante terapêutica. Algumas modalidades de qualquer um dos processos descritos neste relatório incluem ainda formular a proteína recombinante purificada como uma composição farmacêutica. Em alguns exemplos de qualquer um dos processos descritos neste relatório, o processo é realizado continuamente por um período de pelo menos 4 dias (por exemplo, pelo menos 5 dias, pelo menos 7 dias, pelo menos 14 dias, ou pelo menos 28 dias).

[0015] Em algumas modalidades de qualquer um dos processos descritos neste relatório, a resina de cromatografia é resina de cromatografia por troca aniônica, resina de cromatografia por troca catiônica, resina de cromatografia de exclusão por tamanho, resina de cromatografia por interação hidrofóbica, resina de cromatografia por afinidade, ou qualquer combinação das mesmas. Em alguns exemplos de qualquer um dos processos descritos neste relatório, a resina de cromatografia é resina de cromatografia por troca aniônica. Em alguns exemplos de qualquer um dos processos descritos neste relatório, a resina de cromatografia fora tratada com uma dose de radiação gama entre cerca de 10 kGy e cerca de 40 kGy (por exemplo, entre cerca de 15 kGy e cerca de 35 kGy, ou entre cerca de 20 kGy e cerca de 30 kGy). Em algumas modalidades de qualquer um dos processos descritos neste relatório, o tampão desnaturante inclui um ou mais dentre ureia, cloreto de guanidina, e TritonTM X-100. Em algumas modalidades de qualquer um dos processos descritos neste relatório, a resina de cromatografia é exposta a um tampão de lavagem incluindo cerca de 0.5 M e cerca de 1.5 M de hidróxido de sódio subsequente à exposição ao tampão desnaturante. Em algumas modalidades de qualquer um dos processos descritos neste relatório onde a resina de cromatografia é uma resina de afinidade com um ligando de proteína (por exemplo, um ligando da proteína A), a resina de cromatografia é exposta a um tampão de lavagem incluindo entre cerca de 1 mM e cerca de 100 mM de hidróxido de sódio subsequente à exposição ao tampão desnaturante.

[0016] Conforme usado neste relatório, a palavra “um” antes de um substantivo representa um ou mais do substantivo em particular. Por exemplo, a expressão “uma coluna cromatográfica” representa “uma ou mais colunas cromatográficas”.

[0017] O termo “resina de cromatografia irradiada com radiação gama” significa uma resina de cromatografia que fora exposta à radiação gama. Por exemplo, uma resina de cromatografia irradiada com radiação gama pode ser uma resina de cromatografia exposta a uma quantidade de radiação gama suficiente para reduzir a carga biológica da resina de cromatografia. Em alguns exemplos, uma resina de cromatografia irradiada com radiação gama fora exposta a uma dose de entre cerca de 1 kGy e cerca de 15 kGy, uma dose de entre cerca de 1 kGy e cerca de 20 kGy de radiação gama, uma dose de entre cerca de 1 kGy e cerca de 25 kGy de radiação gama, uma dose de entre cerca de 1 kGy e cerca de 30 kGy de radiação gama, ou uma dose de entre cerca de 1 kGy e cerca de 35 kGy de radiação gama. Uma resina de cromatografia irradiada com radiação gama pode ter um nível de garantia de esterilidade de cerca de ou menor que 1 x 10-6, 1 x 10-7, 1 x 10-8, 1 x 10-9, ou 1 x 10-10. Métodos exemplificativos para irradiar uma resina de cromatografia com radiação gama estão descritos neste relatório. Métodos adicionais para irradiar uma resina de cromatografia com radiação gama são conhecidos na literatura.

[0018] O termo “coluna cromatográfica contendo, incluindo, ou compreendendo uma resina de cromatografia irradiada com radiação gama” significa uma coluna cromatográfica incluindo uma resina de cromatografia irradiada com radiação gama (conforme definido neste relatório). Por exemplo, tal coluna cromatográfica pode incluir uma resina de cromatografia irradiada com radiação gama que fora exposta a uma dose de entre cerca de 1 kGy e cerca de 15 kGy, uma dose de entre cerca de 1 kGy e cerca de 20 kGy de radiação gama, uma dose de entre cerca de 1 kGy e cerca de 25 kGy de radiação gama, uma dose de entre cerca de 1 kGy e cerca de 30 kGy de radiação gama, ou uma dose de entre cerca de 1 kGy e cerca de 35 kGy de radiação gama. Por exemplo, tal coluna cromatográfica pode conter uma resina de cromatografia irradiada com radiação gama tendo um nível de garantia de esterilidade de cerca de ou menor que 1 x 10-6, 1 x 10-7, 1 x 10-8, 1 x 10-9, ou 1 x 10-10. Em algumas modalidades, a coluna cromatográfica contendo, incluindo, ou compreendendo uma resina de cromatografia irradiada com radiação gama tem uma carga biológica reduzida, ou é estéril, absolutamente estéril, ou asséptica (conforme definido neste relatório) (i.e., as superfícies internas e o conteúdo da coluna cromatográfica contendo, incluindo, ou compreendendo uma resina de cromatografia irradiada com radiação gama tem uma carga biológica reduzida, é estéril, é absolutamente estéril, ou é asséptico). Em algumas modalidades, a coluna cromatográfica contendo, incluindo, ou compreendendo uma resina de cromatografia irradiada com radiação gama é asséptica e tem uma carga biológica reduzida, é estéril, ou é absolutamente estéril.

[0019] O termo “tampão desnaturante” significa um líquido incluindo uma quantidade suficiente de um ou mais agentes químicos (por exemplo, detergentes, redutores, ácidos, bases, agentes caotrópicos, solventes orgânicos, ou agentes reticuladores, ou qualquer combinação das mesmas) que resultam na desnaturação de uma proteína. Exemplos não limitativos de tampões desnaturantes estão descritos neste relatório. Exemplos adicionais de tampões de lavagem desnaturantes são conhecidos na literatura. Métodos para detectar desnaturação de proteínas também são bastante conhecidos na literatura (por exemplo, métodos para detectar desnaturação de proteínas diretamente (por exemplo, espectroscopia) ou indiretamente (por exemplo, através da atividade da proteína (por exemplo, atividade enzimática ou atividade de ligação da proteína)). Exemplos não limitativos de métodos para detectar desnaturação de proteínas estão descritos neste relatório. Em qualquer um dos métodos ou processos descritos neste relatório, um tampão desnaturante pode ser usado para regenerar uma coluna cromatográfica incluindo uma resina de cromatografia esterilizada com radiação gama (por exemplo, qualquer uma dentre a resina de cromatografia ou a combinação ou as resinas de cromatografia descritas nesta invenção).

[0020] O termo “tampão com carga biológica reduzida” significa um líquido tratado (por exemplo, filtrado, autoclavado, ou irradiado com radiação gama) (por exemplo, uma solução tamponada tratada) que tem um nível de agentes contaminantes biológicos autorreplicantes que é menor que nível de agentes contaminantes biológicos autorreplicantes encontrados em um líquido não tratado idênticos. Exemplos não limitativos de contaminantes biológicos autorreplicantes podem ser bactérias (por exemplo, bactérias Gram-positivas ou Gram-negativas, ou esporos bacterianos ou fúngicos), micobactérias, vírus (por exemplo, um vesivírus, um vírus do Vale Cache, um parvovírus, um vírus do herpes, e um bunyavírus), parasitas, fungos, levedura, e protozoários. Por exemplo, um tampão com carga biológica reduzida pode ter um nível de garantia de esterilidade de cerca de ou menor que 1 x 10-6, 1 x 10-7, 1 x 10-8, 1 x 10-9, ou 1 x 10-10.

[0021] “Esterilidade absoluta” ou “absolutamente estéril” são termos usados para descrever uma composição ou processo que é/são completamente livres de contaminantes biológicos autorreplicantes. Por exemplo, o termo pode aplicar-se a uma resina de cromatografia irradiada com radiação gama, sua superfície interna e conteúdo (por exemplo, resina de cromatografia) de uma coluna cromatográfica, e/ou um tampão. Uma composição ou processo absolutamente estéril pode ser limpo (como esse termo é conhecido na literatura).

[0022] “Estéril” ou “esterilidade” são termos usados para descrever uma composição ou processo que têm um nível de garantia de esterilidade de cerca de ou menor que 1,0 x 10-6 (por exemplo, cerca de ou menor que 1,0 x 10-7, cerca de ou menor que 1,0 x 10-8, cerca de ou menor que 1,0 x 10-9, ou 1 x 10-10). Para determinar se uma composição ou processo é estéril podem ser usados inúmeros processos de produção validados conhecidos na literatura. Por exemplo, uma composição ou processo estéril pode ser completamente livre de contaminantes biológicos autorreplicantes viáveis (por exemplo, qualquer um dos contaminantes biológicos autorreplicantes descritos neste relatório). Uma composição ou processo estéril também pode ser limpo (como esse termo é conhecido na literatura).

[0023] O termo “esterilização” significa um processo validado usado para deixar uma composição estéril (conforme definido neste relatório). A taxa de inativação de contaminantes biológicos autorreplicantes indicativos resistentes (por exemplo, bactérias) durante um processo de tratamento pode ser medida para determinar se a esterilidade (conforme definido neste relatório) fora atingida para uma composição.

[0024] O termo “nível de garantia de esterilidade” ou “SAL” é conhecido na literatura e significa um nível de confiança de obtenção de esterilidade absoluta em um lote de unidades tratadas. A probabilidade geralmente é calculada com base nos resultados de estudos de inativação efetuadas durante a validação e expressa na forma de 1 x 10-n.

[0025] O termo “asséptico” é usado para descrever uma composição ou processo que é livre de contaminantes biológicos autorreplicantes e/ou proteínas causadores de doenças ou causadores de sintomas (por exemplo, qualquer um dos contaminantes biológicos autorreplicantes descritos neste relatório, toxinas (por exemplo, endotoxinas), ou proteínas inflamatórias). Uma composição ou processo asséptico também pode ser limpo (como esse termo é conhecido na literatura).

[0026] O termo “ciclo de cromatografia” ou “ciclo cromatográfico” é um termo técnico e significa todas as etapas realizadas em uma única rodada de cromatografia usando uma única coluna cromatográfica. Por exemplo, um ciclo de cromatografia pode incluir uma etapa de equilibrar uma coluna cromatográfica com um tampão, passar uma amostra incluindo uma proteína recombinante através da coluna cromatográfica, eluir a proteína recombinante da coluna cromatográfica, e lavar a coluna cromatográfica passando um tampão desnaturante através da coluna. Exemplos adicionais de etapas realizadas em um ciclo de cromatografia estão descritos neste relatório. Outros exemplos de etapas realizadas em um ciclo de cromatografia também são bastante conhecidos na literatura.

[0027] O termo “operação unitária” é um termo técnico e significa uma etapa funcional que pode ser realizada em um processo de purificação de uma proteína recombinante a partir de um meio de cultura líquido. Por exemplo, uma operação unitária pode ser filtração (por exemplo, remoção de bactérias contaminantes, levedura, vírus, ou micobactérias, e/ou matéria particulada de um fluido incluindo uma proteína recombinante), captura, remoção de epítopo tag, purificação, contenção ou armazenamento, polimento, inativação de vírus, ajuste da concentração iônica e/ou do pH de fluido incluindo a proteína recombinante, e remoção de sais indesejados.

[0028] O termo “captura” significa uma etapa realizada para purificar parcialmente ou isolar (por exemplo, pelo menos ou cerca de 5%, por exemplo, pelo menos ou cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou pelo menos ou cerca de 95% em peso pura) e concentrar uma proteína recombinante (por exemplo, uma proteína terapêutica recombinante) de um ou mais outros componentes presentes em um meio de cultura líquido ou um meio de cultura líquido diluído (por exemplo, proteínas de meios de cultura ou um ou mais outros componentes (por exemplo, DNA, RNA, ou outras proteínas) presentes ou secretadas a partir de uma célula de mamífero). Tipicamente, a captura é efetuada usando-se uma resina de cromatografia que liga uma proteína recombinante (por exemplo, através do uso de cromatografia por afinidade). Métodos não limitativos para capturar uma proteína recombinante a partir de um meio de cultura líquido ou um meio de cultura líquido diluído estão descritos neste relatório e outros são conhecidos na literatura. Uma proteína recombinante pode ser capturada a partir de um meio de cultura líquido usando pelo menos uma coluna cromatográfica e/ou membrana cromatográfica (por exemplo, qualquer uma das colunas cromatográficas e/ou membranas cromatográficas descritas neste relatório).

[0029] O termo “purificação” significa uma etapa realizada para isolar uma proteína recombinante (por exemplo, uma proteína terapêutica recombinante) de uma ou mais outras impurezas (por exemplo, impurezas em massa) ou componentes presentes em um fluido incluindo uma proteína recombinante (por exemplo, proteínas de meios de cultura líquidos ou um ou mais outros componentes (por exemplo, DNA, RNA, outras proteínas, endotoxinas, vírus, etc.) presentes ou secretadas a partir de uma célula de mamífero). Por exemplo, a purificação pode ser efetuada durante ou depois de uma etapa de captura inicial. A purificação pode ser efetuada usando-se uma resina de cromatografia, membrana, ou qualquer outro suporte sólido que liga seja uma proteína recombinante ou contaminante (por exemplo, através do uso de cromatografia por afinidade, cromatografia por interação hidrofóbica, cromatografia por troca aniônica ou catiônica, ou cromatografia em peneira molecular). Uma proteína recombinante pode ser purificada a partir de um fluido incluindo a proteína recombinante usando pelo menos uma coluna cromatográfica e/ou membrana cromatográfica (por exemplo, qualquer uma das colunas cromatográficas ou membranas cromatográficas descritas neste relatório).

[0030] O termo “polimento” é um termo técnico e significa uma etapa realizada para remover traços remanescentes ou pequenas quantidades de contaminantes ou impurezas de um fluido incluindo uma proteína recombinante (por exemplo, uma proteína terapêutica recombinante) que está perto de uma pureza desejada final. Por exemplo, o polimento pode ser efetuado passando-se um fluido incluindo a proteína recombinante através de colunas cromatográficas ou membranas absorventes que se ligam seletivamente seja à proteína recombinante alvo ou a pequenas quantidades de contaminantes ou impurezas presentes em um fluido incluindo uma proteína recombinante. Neste exemplo, o eluato/filtrado das colunas cromatográficas ou membranas absorventes inclui a proteína recombinante.

[0031] O termo “filtração” significa a remoção de pelo menos parte (por exemplo, pelo menos 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%) dos contaminantes biológicos indesejados (por exemplo, uma célula de mamífero, bactérias, células de levedura, vírus, ou micobactérias) e/ou matéria particulada (por exemplo, proteínas precipitadas) de um líquido (por exemplo, um meio de cultura líquido ou fluido presente em qualquer um dos processos descritos nesta invenção).

[0032] O termo “eluato/filtrado” é um termo técnico e significa um fluido que é emitido de uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que inclui uma quantidade detectável de uma proteína recombinante (por exemplo, uma proteína terapêutica recombinante).

[0033] O termo “processo integrado” significa um processo que é realizado usando elementos estruturais que funcionam cooperativamente para obter um resultado específico (por exemplo, a purificação de uma proteína recombinante a partir de um meio de cultura líquido).

[0034] O termo “processo contínuo” significa um processo que alimenta continuamente um fluido através de pelo menos de uma parte do sistema. Por exemplo, um processo contínuo é um processo que alimenta continuamente um meio de cultura líquido incluindo uma proteína recombinante proveniente de um biorreator através de um MCCS. Um outro exemplo de um processo contínuo é um processo que alimenta continuamente um meio de cultura líquido incluindo uma proteína recombinante proveniente de um biorreator através de um primeiro e um segundo MCCS (MCCS1 e MCCS2). Exemplos adicionais incluem um processo que alimenta continuamente um meio de cultura líquido incluindo uma proteína recombinante através de um MCCS, um processo que alimenta continuamente um meio de cultura líquido incluindo uma proteína recombinante através de um MCCS1 e um MCCS2, ou um processo que alimenta continuamente um fluido incluindo uma proteína recombinante através de um MCCS2.

[0035] O termo “processo fechado” é um termo técnico e significa um processo que é realizado de tal maneira que os componentes do processo (por exemplo, resinas de cromatografia e/ou tampões) que entram em contato com a proteína recombinante ou com líquidos incluindo a proteína recombinante não sejam intencionalmente expostos a agentes contaminantes por um período de tempo significativo (por exemplo, não intencionalmente expostos ao ar por um período de tempo significativo).

[0036] O termo “substância medicamentosa à base de proteína terapêutica” significa uma proteína recombinante (por exemplo, uma imunoglobulina, fragmento de proteína, proteína geneticamente manipulada, ou enzima) que fora suficientemente purificada ou isolada a partir de proteínas, lipídios e ácidos nucleicos contaminantes (por exemplo, proteínas, lipídios e ácidos nucleicos contaminantes presentes em um meio de cultura líquido ou a partir de uma célula hospedeira (por exemplo, de uma célula hospedeira de mamífero, levedura, ou bactéria) e contaminantes biológicos (por exemplo, contaminantes virais e bacterianos), e pode ser formulada como um agente farmacêutico sem quaisquer outras etapas de substancial purificação e/ou descontaminação.

[0037] O termo “sistema de cromatografia multicolunas” ou “MCCS” significa um sistema de um total de duas ou mais colunas cromatográficas e/ou membranas cromatográficas interconectadas ou permutáveis. Um exemplo não limitativo de um sistema de cromatografia multicolunas é o sistema de cromatografia contracorrente periódica (PCC) incluindo um total de duas ou mais colunas cromatográficas e/ou membranas cromatográficas interconectadas ou permutáveis. Exemplos adicionais de sistemas de cromatografia multicolunas estão descritos neste relatório e são conhecidos na literatura.

[0038] O termo “substancialmente livre” significa uma composição (por exemplo, um meio de cultura líquido) que é pelo menos ou cerca de 90% livre (por exemplo, pelo menos ou cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, ou pelo menos ou cerca de 99% livre, ou cerca de 100% livre) de uma substância específica (por exemplo, uma célula de mamífero ou uma proteína, ácido nucleico, carboidrato, ou lipídio contaminante proveniente de uma célula de mamífero).

[0039] O termo “célula de mamífero” significa qualquer célula proveniente ou derivada de qualquer mamífero (por exemplo, um ser humano, um hamster, um camundongo, um macaco-verde, um rato, um porco, uma vaca, ou um coelho). Por exemplo, uma célula de mamífero pode ser uma célula imortalizada. Em algumas modalidades, a célula de mamífero é uma célula diferenciada. Em algumas modalidades, a célula de mamífero é uma célula não diferenciada. Exemplos não limitativos de células de mamífero estão descritos neste relatório. Exemplos adicionais de células de mamífero são conhecidos na literatura.

[0040] O termo “cultivo” ou “cultivo de células” significa a manutenção ou proliferação de uma célula de mamífero em um conjunto de condições físicas controladas.

[0041] O termo “cultura de células de mamífero” significa um meio de cultura líquido incluindo uma pluralidade de células de mamífero que é mantida ou proliferada em um conjunto de condições físicas controladas.

[0042] O termo “meio de cultura líquido” significa um fluido que inclui nutrientes suficientes para permitir que uma célula (por exemplo, uma célula de mamífero) cresça ou prolifere in vitro. Por exemplo, um meio de cultura líquido pode incluir um ou mais dentre: aminoácidos (por exemplo, 20 aminoácidos), uma purina (por exemplo, hipoxantina), uma pirimidina (por exemplo, timidina), colina, inositol, tiamina, ácido fólico, biotina, cálcio, niacinamida, piridoxina, riboflavina, timidina, cianocobalamina, piruvato, ácido lipoico, magnésio, glicose, sódio, potássio, ferro, cobre, zinco, e bicarbonato de sódio. Em algumas modalidades, um meio de cultura líquido pode incluir soro de um mamífero. Em algumas modalidades, um meio de cultura líquido não inclui soro ou outro extrato de um mamífero (um meio de cultura líquido definido). Em algumas modalidades, um meio de cultura líquido pode incluir metais traço, um hormônio de crescimento de mamífero, e/ou um fator de crescimento de mamífero. Um outro exemplo de meio de cultura líquido é meio mínimo (por exemplo, um meio incluindo apenas sais inorgânicos, uma fonte de carbono, e água). Exemplos não limitativos de meio de cultura líquido estão descritos neste relatório. Exemplos adicionais de meio de cultura líquido são conhecidos na literatura e encontram-se comercialmente disponíveis. Um meio de cultura líquido pode incluir qualquer densidade de células de mamífero. Por exemplo, conforme usado neste relatório, um volume de meio de cultura líquido removido de um biorreator pode ser substancialmente livre de células de mamífero.

[0043] O termo “meio de cultura líquido livre de componentes derivados de animal” significa um meio de cultura líquido que não inclui quaisquer componentes (por exemplo, proteínas ou soro) derivados de um mamífero.

[0044] O termo “meio de cultura líquido livre de soro” significa um meio de cultura líquido que não inclui um soro de mamífero.

[0045] O termo “meio de cultura líquido contendo soro” significa um meio de cultura líquido que inclui um soro de mamífero

[0046] O termo “meio de cultura líquido quimicamente definido” é um termo técnico e significa um meio de cultura líquido no qual todos os componentes químicos são conhecidos. Por exemplo, um meio de cultura quimicamente definido líquido não inclui soro bovino fetal, albumina sérica bovina, ou albumina sérica humana, uma vez que estas preparações tipicamente incluem uma mistura complexa de albuminas e lipídios.

[0047] O termo “meio de cultura líquido livre de proteína” significa um meio de cultura líquido que não inclui qualquer proteína (por exemplo, qualquer proteína detectável).

[0048] O termo “imunoglobulina” significa um polipeptídio incluindo uma sequência aminoacídica de pelo menos 15 aminoácidos (por exemplo, pelo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100 aminoácidos) de uma proteína imunoglobulina (por exemplo, uma sequência de domínio variável, uma sequência de esqueleto, e/ou uma sequência de domínio constante). A imunoglobulina pode, por exemplo, incluir pelo menos 15 aminoácidos de uma imunoglobulina de cadeia leve, por exemplo, pelo menos 15 aminoácidos de uma imunoglobulina de cadeia pesada. A imunoglobulina pode ser um anticorpo isolado (por exemplo, uma IgG, IgE, IgD, IgA, ou IgM), por exemplo, uma subclasse de IgG (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4). A imunoglobulina pode ser um fragmento de anticorpo, por exemplo, um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2, ou um fragmento scFv. A imunoglobulina também pode ser anticorpo biespecífico ou um anticorpo triespecífico, ou um anticorpo dimérico, trimérico, ou multimérico, ou um diacorpo, um Affibody®, ou um Nanobody®. A imunoglobulina também pode ser uma proteína geneticamente manipulada incluindo pelo menos um domínio de imunoglobulina (por exemplo, uma proteína de fusão). Exemplos não limitativos de imunoglobulinas estão descritos neste relatório e exemplos adicionais de imunoglobulinas são conhecidos na literatura.

[0049] O termo “fragmento de proteína” ou “fragmento de polipeptídio” significa uma porção de uma sequência polipeptídica que tem pelo menos ou cerca de 4 aminoácidos, pelo menos ou cerca de 5 aminoácidos, pelo menos ou cerca de 6 aminoácidos, pelo menos ou cerca de 7 aminoácidos, pelo menos ou cerca de 8 aminoácidos, pelo menos ou cerca de 9 aminoácidos, pelo menos ou cerca de 10 aminoácidos, pelo menos ou cerca de 11 aminoácidos, pelo menos ou cerca de 12 aminoácidos, pelo menos ou cerca de 13 aminoácidos, pelo menos ou cerca de 14 aminoácidos, pelo menos ou cerca de 15 aminoácidos, pelo menos ou cerca de 16 aminoácidos, pelo menos ou cerca de 17 aminoácidos, pelo menos ou cerca de 18 aminoácidos, pelo menos ou cerca de 19 aminoácidos, ou pelo menos ou cerca de 20 aminoácidos de comprimento, ou mais de 20 aminoácidos de comprimento. Um fragmento de proteína recombinante pode ser produzido usando-se qualquer um dos processos descritos nesta invenção.

[0050] O termo “proteína geneticamente manipulada” significa um polipeptídio que não é naturalmente codificado por um ácido nucleico endógeno presente em um organismo (por exemplo, um mamífero). Exemplos de proteínas geneticamente manipuladas incluem enzimas (por exemplo, com uma ou mais substituições, deleções, inserções, ou adições de aminoácidos que resultam em um aumento na estabilidade e/ou na atividade catalítica da enzima geneticamente modificada), proteínas de fusão, anticorpos (por exemplo, anticorpos divalentes, anticorpos trivalentes, ou um diacorpo), e proteínas ligadoras de antígeno que incluem pelo menos uma sequência de cadafalso recombinante.

[0051] O termo “proteína secretada” ou “proteína recombinante secretada” significa uma proteína (por exemplo, uma proteína recombinante) que originalmente inclui pelo menos uma sequência-sinal de secreção quando ela é transladada dentro de uma célula de mamífero, através de clivagem enzimática, pelo menos em parte, da sequência-sinal de secreção na célula de mamífero, é secretada pelo menos parcialmente no espaço extracelular (por exemplo, um meio de cultura líquido). Os especialistas na técnica vão perceber que uma proteína “secretada” não precisa dissociar-se totalmente da célula para ser considerada uma proteína secretada.

[0052] O termo “biorreator de perfusão” significa um biorreator incluindo uma pluralidade de células (por exemplo, células de mamífero) em um primeiro meio de cultura líquido, onde o cultivo das células presentes no biorreator inclui a remoção periódica ou contínua do primeiro meio de cultura líquido e, ao mesmo tempo ou imediatamente depois, a adição de substancialmente o mesmo volume de um segundo meio de cultura líquido ao biorreator. Em alguns exemplos, há uma variação incremental (por exemplo, aumento ou redução) no volume do primeiro meio de cultura líquido removido e acrescentado em períodos incrementais (por exemplo, um período de cerca de 24 horas, um período de entre cerca de 1 minuto e cerca de 24 horas, ou um período de mais de 24 horas) durante o período de cultura (por exemplo, a taxa de realimentação diária do meio de cultura). A fração de meio de cultura removido e substituído diariamente pode variar dependendo das células particulares sendo cultivadas, da densidade inicial de inoculação, e da densidade celular em um momento particular. “RV” ou “volume de reator” significa o volume do meio de cultura presente no início do processo de cultura (por exemplo, o volume total do meio de cultura presente depois da inoculação).

[0053] O termo “biorreator de alimentação intermitente” é um termo técnico e significa a biorreator incluindo uma pluralidade de células (por exemplo, células de mamífero) em um primeiro meio de cultura líquido, onde o cultivo das células presentes no biorreator inclui a adição periódica ou contínua de um segundo meio de cultura líquido ao primeiro meio de cultura líquido sem remoção substancial ou significativa do primeiro meio de cultura líquido ou do segundo meio de cultura líquido da cultura de células. O segundo meio de cultura líquido pode ser o mesmo que o primeiro meio de cultura líquido. Em alguns exemplos de cultura de alimentação intermitente, o segundo meio de cultura líquido é uma forma concentrada do primeiro meio de cultura líquido. Em alguns exemplos de cultura de alimentação intermitente, o segundo meio de cultura líquido é acrescentado como um pó seco.

[0054] O termo “meio de cultura líquido clarificado” significa um meio de cultura líquido obtido a partir de uma cultura de células bacterianas ou de levedura que é substancialmente livre (por exemplo, pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, ou 99% livre) de bactérias ou células de levedura.

[0055] A menos que definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados neste relatório têm o mesmo significado que aquele comumente conhecido especialista na técnica à qual a invenção pertence. Neste relatório estão descritos métodos e materiais para uso na presente invenção; outros métodos e materiais adequados conhecidos na literatura também podem ser usados. Os materiais, métodos, e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a ser limitativos. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes, sequências, lançamentos em bancos de dados, e outras referências mencionadas neste relatório estão aqui incorporados em sua integridade a título de referência. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo as definições, prevalecem.

[0056] Outros aspectos e vantagens da invenção tornar-se-ão aparentes a partir da descrição detalhada e das figuras que seguem, e a partir das reivindicações.

Descrição dos Desenhos

[0057] A Figura 1 é um gráfico das isotermas de ligação em t0 da resina multimodal não tratada (virgem) com grupos de troca aniônica e hidrofóbicos (AE resin) e da resina AE irradiada com 25 kGy de radiação gama (sem ciclos de cromatografia).

[0058] A Figura 2 é um gráfico da percentagem da capacidade de ligação normalizada da resina AE virgem (não tratada), da resina AE irradiada com 15 kGy de radiação gama, e da resina AE irradiada com 25 kGy de radiação gama depois de múltiplos ciclos de cromatografia de coluna, quando um tampão de 700 mM de arginina, 100 mM de acetato (pH 3,0), seguido por uma solução de NaOH a 1 N é usado para lavar cada resina (depois de eluição da proteína recombinante) em cada ciclo. A percentagem da capacidade de ligação de cada resina é normalizada para a capacidade de ligação da resina AE virgem (não tratada) no tempo 0 (t0), que também se mostrou muito similar àquela da resina irradiada com radiação gama em t0 (27 ± 2 mg/mL).

[0059] A Figura 3 é um gráfico mostrando a taxa de queda média na capacidade de ligação depois de múltiplos ciclos de cromatografia de coluna para resina AE virgem (não tratada), a resina AE irradiada com 15 kGy de radiação gama, e a resina AE irradiada com 25 kGy de radiação gama, quando um tampão de 700 mM de arginina, 100 mM de acetato (pH 3,0), seguido por uma solução de NaOH a 1 N é usado para lavar cada resina (depois de eluição da proteína recombinante) em cada ciclo.

[0060] A Figura 4 é um gráfico da percentagem da capacidade de ligação normalizada da resina AE virgem (não tratada) depois de múltiplos ciclos de cromatografia de coluna usando uma única coluna de cromatografia incluindo a resina AE virgem (não tratada) lavada com 700 mM de arginina, 100 mM de acetato (pH 3,0), seguido por uma solução de NaOH 1 N depois de eluição da proteína recombinante em cada ciclo (arginina virgem de pH baixo), ou usando uma única coluna de cromatografia incluindo resina AE irradiada com 25 kGy de radiação gama lavada depois de eluição da proteína recombinante (em cada ciclo) com 8 M de ureia, 1 M de NaCl, 0,1 M de ácido cítrico, pH 2,5 (ureia de pH baixo); 6 M de HCl de guanidina (pH 2,5) (guanidina de pH baixo); 0,5% Triton-X 100 em 0,1 M de ácido acético (pH 2,5) seguido por 0,7 M de ácido acético, 20% de etanol, 50% de etileno glicol (pH 2,5) (Triton de pH baixo); 700 mM de arginina, 100 mM de acetato (pH 3,0) (arginina de pH baixo); ou 0,7 M de ácido acético, 20% de etanol, 50% de etileno glicol (pH 2,5) (orgânico de pH baixo), cada um deles seguido por uma solução de NaOH a 1 N. A percentagem da capacidade de ligação de cada resina em cada ciclo foi normalizada para a capacidade de ligação da resina AE virgem (não tratada) no tempo 0 (t0), que também se mostrou muito similar àquela da resina irradiada com radiação gama em t0 (27 ± 2 mg/mL).

[0061] A Figura 5 é um perfil cromatográfico representativo de uma corrida de cromatografia multicolunas (MCC) mostrando a absorvência do eluato em 280 nm depois de múltiplos ciclos de cromatografia de coluna realizados usando três colunas cromatográficas incluindo resina AE irradiada com 25 kGy de radiação gama, quando 8 M de ureia, 1 M de NaCl, 0,1 M de ácido cítrico, pH 2,5, seguido por uma solução de NaOH a 1 N é usado para lavar cada resina (depois de eluição da proteína recombinante) em cada ciclo. Os picos que representam a proteína ligada liberada da resina AE durante exposição a 8 M de ureia, 1 M de NaCl, 0,1 M de ácido cítrico, tampão desnaturante pH 2,5 em três ciclos diferentes estão indicados com uma seta. O cromatógrafo mostra o traço de UV para todas as três colunas cromatográficas usadas para realizar a rodada de MCC.

[0062] A Figura 6 é um gráfico da percentagem de proteína recombinante recuperada ligada à resina de cromatografia por ciclo depois de múltiplos ciclos de cromatografia de coluna usando uma única coluna cromatográfica incluindo resina AE virgem (não tratada) lavada com 700 mM de arginina, 100 mM de acetato (pH 3,0), seguido por uma solução de NaOH a 1 N depois de eluição da proteína recombinante em cada ciclo (arginina virgem de pH baixo), ou usando uma única coluna cromatográfica incluindo resina AE irradiada com 25 kGy de radiação gama lavada depois de eluição da proteína recombinante (em cada ciclo) com 8 M de ureia, 1 M de NaCl, 0,1 M de ácido cítrico, pH 2,5 (ureia de pH baixo); 6 M de HCl de guanidina (pH 2,5) (guanidina de pH baixo); 0,5% Triton-X 100 em 0,1 M de ácido acético (pH 2,5) seguido por 0,7 M de ácido acético, 20% etanol, 50% de etileno glicol (pH 2,5) (Triton de pH baixo); ou 0,7 M de ácido acético, 20% de etanol, 50% de etileno glicol (pH 2,5) (orgânico de pH baixo); cada um deles seguido por uma solução de NaOH a 1 N.

[0063] A Figura 7 é um gráfico da proteína da célula hospedeira (ng/mg) presente no eluato depois de múltiplos ciclos de cromatografia de coluna usando uma única coluna cromatográfica incluindo a resina AE virgem (não tratada) lavada com 700 mM de arginina, 100 mM de acetato (pH 3,0), seguido por uma solução de NaOH a 1 N depois de eluição da proteína recombinante em cada ciclo (arginina virgem de pH baixo), ou usando uma única coluna cromatográfica incluindo resina AE irradiada com 25 kGy de radiação gama lavada depois de eluição da proteína recombinante (em cada ciclo) com 8 M de ureia, 1 M de NaCl, 0,1 M de ácido cítrico, pH 2,5 (ureia de pH baixo); 6 M guanidina HCl (pH 2,5) (guanidina de pH baixo); 0,5% de Triton-X 100 em 0,1 M de ácido acético (pH 2,5) seguido por 0,7 M de ácido acético, 20% de etanol, 50% de etileno glicol (pH 2,5) (Triton de pH baixo); ou 0,7 M de ácido acético, 20% de etanol, 50% de etileno glicol (pH 2,5) (orgânico de pH baixo); cada um deles seguido por uma solução de NaOH a 1 N.

[0064] A Figura 8 é uma lista de doenças de armazenamento lisossômico e da proteína terapêutica recombinante que pode ser usada para tratar cada doença.

Descrição Detalhada

[0065] São oferecidos nesta invenção métodos para realizar cromatografia com resina de cromatografia irradiada com radiação gama que incluem oferecer uma coluna cromatográfica incluindo uma resina de cromatografia irradiada com radiação gama e realizar um primeiro ciclo de cromatografia através da coluna, onde o ciclo inclui expor a resina de cromatografia a um tampão desnaturante. Também são oferecidos processos integrados, fechados ou substancialmente fechados, e contínuos para a produção de uma proteína recombinante que incluem o uso de pelo menos uma coluna cromatográfica incluindo uma resina de cromatografia irradiada com radiação gama, onde a resina de cromatografia irradiada com radiação gama é exposta a um tampão desnaturante durante cada ciclo no processo, e um tampão com carga biológica reduzida é usado no processo. Aspectos não limitativos desses métodos e processos estão descritos abaixo. Como pode ser apreciado na técnica, os vários aspectos descritos abaixo podem ser usados em qualquer combinação, sem exceção.

Resina de cromatografia irradiada com radiação gama

[0066] Uma ampla variedade de tipos diferentes de resina de cromatografia conhecidos na literatura (ou combinações dos mesmos) pode ser exposta à radiação gama usando-se métodos conhecidos na literatura. Por exemplo, um isótopo tal como cobalto-60 ou césio-137 é usado como a fonte de raios gama. A resina de cromatografia que é exposta à radiação gama pode estar presente em uma coluna cromatográfica embalada. Em outros exemplos, a resina de cromatografia que é exposta à radiação gama está presente em um recipiente vedado (por exemplo, uma pasta em um recipiente vedado).

[0067] A resina de cromatografia pode ser exposta à radiação gama a uma temperatura de entre cerca de -25 °C e cerca de 0 °C, inclusive, ou entre cerca de 0 °C e cerca de 25 °C, inclusive. A resina de cromatografia pode ser exposta a uma dose de radiação gama of entre cerca de 0,1 kGy e cerca de 100 kGy, entre cerca de 1 kGy e cerca de 100 kGy, entre cerca de 1 kGy e cerca de 90 kGy, entre cerca de 1 kGy e cerca de 80 kGy, entre cerca de 1 kGy e cerca de 70 kGy, entre cerca de 1 kGy e cerca de 65 kGy, entre cerca de 5 kGy e cerca de 65 kGy, entre cerca de 10 kGy e cerca de 60 kGy, entre cerca de 10 kGy e cerca de 55 kGy, entre cerca de 10 kGy e cerca de 50 kGy, entre cerca de 10 kGy e cerca de 45 kGy, entre cerca de 10 kGy e cerca de 40 kGy, entre cerca de 10 kGy e cerca de 35 kGy, entre cerca de 10 kGy e cerca de 30 kGy, entre cerca de 15 kGy e cerca de 50 kGy, entre cerca de 15 kGy e cerca de 45 kGy, entre cerca de 15 kGy e cerca de 40 kGy, entre cerca de 15 kGy e cerca de 35 kGy, ou entre cerca de 20 kGy e cerca de 30 kGy.

[0068] A resina de cromatografia irradiada com radiação gama pode ser uma resina de cromatografia por troca aniônica, uma resina de cromatografia por troca catiônica, uma resina de cromatografia de exclusão por tamanho, uma resina de cromatografia por interação hidrofóbica, uma resina de cromatografia por afinidade, ou qualquer combinação das mesmas. Exemplos não limitativos de resina de cromatografia por afinidade incluem resinas com um ligando de peptídio, um ligando de proteína (por exemplo, proteína A ou proteína G), um ligando de aptâmero, um ligando de substrato, um ligando de produto, um ligando de metal, e um ligando de cofator. Uma resina de cromatografia irradiada com radiação gama pode ser uma resina de cromatografia bimodal (por exemplo, com as características de resina de cromatografia por troca aniônica e por interação hidrofóbica).

Colunas cromatográficas incluindo uma resina de cromatografia irradiada com radiação gama

[0069] Os métodos descritos nesta invenção incluem o uso de uma coluna cromatográfica incluindo uma resina de cromatografia irradiada com radiação gama e os processos descritos nesta invenção incluem o uso de um ou dois MCCSs que incluem pelo menos uma coluna cromatográfica incluindo uma resina de cromatografia irradiada com radiação gama. A resina de cromatografia irradiada com radiação gama pode ser qualquer tipo de resina descrito neste relatório (ou qualquer tipo de resina conhecido na literatura). A resina de cromatografia irradiada com radiação gama pode ser preparada usando-se qualquer um dos métodos descritos nesta invenção ou conhecidos na literatura.

[0070] Essas colunas cromatográficas podem ser produzidas embalando-se uma coluna cromatográfica com uma resina de cromatografia não tratada, e expondo-se a coluna embalada à radiação gama (por exemplo, usando qualquer uma das exposições e condições descritas neste relatório). Em outros exemplos, colunas cromatográficas incluindo resinas irradiadas com radiação gama podem ser produzidas expondo-se a resina de cromatografia à radiação gama (por exemplo, resina de cromatografia apresentada em um recipiente) e embalando-se uma coluna cromatográfica com a resina de cromatografia irradiada com radiação gama. Nesses métodos, a resina de cromatografia que é exposta à radiação gama pode estar presentes como uma pasta no recipiente, e a coluna cromatográfica é embalada em uma capa de carga biológica reduzida. Em outros métodos, a resina de cromatografia pode ser exposta à radiação gama como uma mistura sólida no recipiente, e a pasta de resina de cromatografia irradiada com radiação gama pode ser preparada usando-se um tampão com carga biológica reduzida (por exemplo, preparado em uma capa de carga biológica reduzida), e a pasta resultante usada embalar uma coluna cromatográfica em uma capa de carga biológica reduzida. Em alguns desses exemplos, a coluna cromatográfica, antes de ser embalada, pode ser tratada para reduzir a carga biológica (por exemplo, autoclavada, irradiada com radiação gama, ou exposta a óxido de etileno).

[0071] A coluna cromatográfica incluindo uma resina de cromatografia irradiada com radiação gama pode ter um nível de garantia de esterilidade (SAL) de entre cerca de 1 x 10-3 e cerca de 1 x 10-12, entre cerca de 1 x 10-4 e cerca de 1 x 10-12, entre 1 x 10-5 e cerca de 1 x 10-11, entre cerca de 1 x 10-5 e cerca de 1 x 10-10, entre cerca de 1 x 10-5 e cerca de 1 x 10-9, entre cerca de 1 x 10-6 e cerca de 1 x 10-9, ou entre cerca de 1 x 10-6 e cerca de 1 x 10-8, inclusive.

Tampões com carga biológica reduzida

[0072] Os métodos e processos descritos neste relatório podem ser realizados usando-se um ou mais tampões com carga biológica reduzida. Como pode ser apreciado na técnica, um tampão com carga biológica reduzida pode ser qualquer tipo de tampão usado em um ciclo de cromatografia (por exemplo, um tampão usado em qualquer uma das etapas em um ciclo de cromatografia ou em qualquer uma das operações unitárias descritas neste relatório). Métodos exemplificativos para reduzir a carga biológica de um tampão incluem filtração (filtração com tamanho de poro de 0.2 μm), autoclavagem, e radiação gama. Métodos adicionais para reduzir a carga biológica de um tampão são conhecidos na literatura. Um tampão com carga biológica reduzida pode ter um nível de garantia de esterilidade de entre cerca de 1 x 10-3e cerca de 1 x 10-12, entre cerca de 1 x 10-4 e cerca de 1 x 10-12, entre 1 x 10-5 e cerca de 1 x 10-11, entre cerca de 1 x 10-5 e cerca de 1 x 10-10, entre cerca de 1 x 10-5 e cerca de 1 x 10-9, entre cerca de 1 x 10-6 e cerca de 1 x 10-9, ou entre cerca de 1 x 10-6 e cerca de 1 x 10-8, inclusive.

Tampões desnaturantes

[0073] Os métodos e processos descritos neste relatório incluem o uso de um tampão desnaturante. Tampões desnaturantes incluem uma quantidade suficiente de um ou mais agentes químicos (por exemplo, detergentes, redutores, ácidos, agentes caotrópicos, solventes orgânicos, ou agentes reticuladores, ou qualquer combinação dos mesmos) que resultam na desnaturação de uma proteína. Detergentes exemplificativos não limitativos que podem ser incluídos em um tampão desnaturante incluem Triton X-100, dodecil sulfato de sódio, e brometo de etil trimetil amônio. Exemplos não limitativos de solventes orgânicos que podem ser incluídos em um tampão desnaturante incluem etanol, butanol, fenol, propanol, e metanol. Exemplos não limitativos de redutores que podem ser incluídos em um tampão desnaturante incluem 2-mercaptoetanol, ditiotreitol, e tris(2-carboxietil)fosfina. Exemplos não limitativos de ácidos que podem ser incluídos em tampões desnaturantes incluem ácido acético, ácido ticloroacético, e ácido sulfossalicílico. Exemplos não limitativos de agentes caotrópicos que podem ser incluídos em um tampão desnaturante incluem ureia (por exemplo, ureia 6 a 9 M), tioureia, cloreto de guanídio (por exemplo, cloreto de guanídio 5 a 7 M), perclorato de lítio (por exemplo, perclorato de lítio 4 a 7 M), ou acetato de lítio. Exemplos não limitativos de agentes reticuladores que podem ser incluídos em um tampão desnaturante incluem formaldeído e glutaraldeído.

[0074] Exemplos não limitativos de tampões desnaturantes incluem: ureia 8 M, NaCl 1 M, ácido cítrico 0,1 M, pH 2,5 (por exemplo, seguido por NaOH a 1 N); HCl de guanidina 6 M, pH 2,5 (por exemplo, seguido por NaOH a 1 N ou NaOH 1 M mais NaCl 1 M); e 0,5% Triton-X 100 em ácido acético 0,1 M, pH 2,5 (por exemplo, seguido por ácido acético 0,7 M, etanol a 20%, etileno glicol a 50%, pH 2,5, seguido por NaOH a 1 N).

Proteínas terapêuticas recombinantes

[0075] Uma proteína recombinante descrita nesta invenção pode ser uma proteína terapêutica recombinante. Exemplos não limitativos de proteínas terapêuticas recombinantes que podem ser produzidos pelos métodos oferecidos nesta invenção incluem imunoglobulinas (incluindo imunoglobulinas de cadeias leves e pesadas, anticorpos, ou fragmentos de anticorpos (por exemplo, qualquer um dos fragmentos de anticorpos descritos neste relatório), enzimas (por exemplo, uma galactosidase (por exemplo, uma alfa-galactosidase), as proteínas Myozyme®, ou Cerezyme®), (por exemplo, eritropoietina humana, fator de necrose tumoral (TNF), ou um interferon alfa ou beta), ou proteínas imunogênicas ou antigênicas ou fragmentos de proteínas (por exemplo, proteínas para uso em uma vacina). Exemplos não limitativos de enzimas terapêuticas recombinantes que podem ser usadas para tratar uma variedade de doenças de armazenamento lisossômico estão mostrados na Figura 8. A proteína terapêutica recombinante pode ser um polipeptídio ligador de antígeno geneticamente modificado que inclui pelo menos um cadafalso de proteína recombinante multifuncional (vide, por exemplo, as proteínas ligadoras de antígeno recombinantes descritas por Gebauer et al., Current Opin. Chem. Biol. 13:245-255, 2009; e na Publicação de Pedido de Patente US N° 2012/0164066 (aqui incorporada em sua integridade a título de referência)). Exemplos não limitativos de proteínas terapêuticas recombinantes que são anticorpos incluem: panitumumab, omalizumab, abagovomab, abciximab, actoxumab, adalimumab, adecatumumab, afelimomab, afutuzumab, alacizumab, alacizumab, alemtuzumab, alirocumab, altumomab, amatuximab, anatumomab, apolizumab, atinumab, tocilizumab, basilizimab, bectumomab, belimumab, bevacizumab, biciromab, canakinumab, cetuximab, daclizumab, densumab, eculizumab, edrecolomab, efalizumab, efungumab, ertumaxomab, etaracizumab, golimumab, infliximab, natalizumab, palivizumab, panitumumab, pertuzumab, ranibizumab, rituximab, tocilizumab, e trastuzumab. Exemplos adicionais de anticorpos terapêuticos recombinantes que podem ser produzidos pelos métodos descritos nesta invenção são conhecidos na literatura. Exemplos não limitativos adicionais de proteínas terapêuticas recombinantes que podem ser produzidas/purificadas pelos presentes métodos incluem: alglucosidase alfa, laronidase, abatacept, galsulfase, lutropina alfa, fator anti- hemofílico, agalsidase beta, interferon beta-1a, darbepoetina alfa, tenecteplase, etanercept, fator de coagulação IX, hormônio estimulante de folículos, interferon beta-1a, imiglucerase, dornase alfa, epoetina alfa, e alteplase.

[0076] Uma proteína terapêutica recombinante solúvel secretada pode ser recuperada do meio de cultura líquido (por exemplo, um primeiro e/ou segundo meio de cultura líquido) por remoção ou outro tipo de separação física do meio de cultura líquido das células (por exemplo, células de mamífero). Uma variedade de métodos diferentes para remover meio de cultura líquido de células (por exemplo, células de mamífero) são conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, centrifugação, filtração, pipetagem, e/ou aspiração. A proteína terapêutica recombinante secretada pode ser recuperada e ainda purificada a partir do meio de cultura líquido usando-se uma variedade de técnicas bioquímicas que incluem vários tipos de cromatografia (por exemplo, cromatografia por afinidade, cromatografia em peneira molecular, cromatografia por troca catiônica, cromatografia por troca aniônica, ou cromatografia por interação hidrofóbica, ou qualquer combinação das mesmas) e/ou filtração (por exemplo, filtração por corte de peso molecular).

Ciclo de cromatografia

[0077] Como bem se sabe na técnica, as etapas em um ciclo de cromatografia podem diferir dependendo da resina de cromatografia, dos tampões usados para realizar cada etapa no ciclo, e das características biofísicas da proteína recombinante alvo (por exemplo, proteína terapêutica recombinante). Por exemplo, uma coluna de cromatografia por afinidade pode incluir as etapas de carregar uma coluna de cromatografia por afinidade com um fluido incluindo a proteína recombinante alvo, lavar a coluna para remover material biológico indesejado (por exemplo, proteínas contaminantes e/ou moléculas pequenas), eluir a proteína recombinante alvo ligada à coluna, e reequilibrar a coluna. Um ciclo de cromatografia usando uma coluna de cromatografia por troca catiônica e/ou aniônica, onde a proteína recombinante alvo liga-se à resina de cromatografia na etapa de carregamento, pode incluir as etapas de carregamento da coluna com um fluido incluindo a proteína alvo, lavagem da coluna para remover material biológico indesejado, eluição da proteína recombinante alvo ligada à coluna, e reequilíbrio da coluna. Em outros exemplos, um ciclo de cromatografia usando uma coluna de cromatografia por troca catiônica e/ou aniônica, onde material biológico indesejado liga-se à resina de cromatografia durante a etapa de carregamento, enquanto que a proteína recombinante alvo não se liga, pode incluir as etapas de carregamento da coluna com um fluido incluindo a proteína alvo, coleta da proteína recombinante alvo no escoamento, e reequilíbrio da coluna. Como bem se sabe na técnica, qualquer uma das etapas individuais em um ciclo de cromatografia pode incluir um único tampão ou múltiplos tampões (por exemplo, dois ou mais tampões), qualquer uma das etapas individuais em um ciclo de cromatografia pode incluir um pode incluir um gradiente de tampão. Qualquer combinação dos vários aspectos bastante conhecidos de um único ciclo de cromatografia pode ser usada nesses métodos em qualquer combinação, por exemplo, diferentes resinas de cromatografia, taxas de fluxo, tampões, volumes de espaços vazios da coluna, volumes de leitos da coluna, volumes do tampão usado em cada etapa, volumes do fluido incluindo a proteína alvo, e o número e tipos de tampões usados em cada etapa.

Métodos para realização de cromatografia com resina esterilizada com radiação gama

[0078] São oferecidos nesta invenção métodos para realizar cromatografia com resina de cromatografia irradiada com radiação gama. Esses métodos incluem oferecer uma coluna cromatográfica incluindo uma resina de cromatografia irradiada com radiação gama, realizar um primeiro ciclo de cromatografia através da coluna, onde o ciclo inclui expor a resina de cromatografia a um tampão desnaturante, e realizar pelo menos um ciclo de cromatografia adicional através da coluna. A resina de cromatografia irradiada com radiação gama pode ser qualquer tipo de resina de cromatografia e/ou pode ser qualquer uma das resinas de cromatografia irradiadas com radiação gama descritas nesta invenção ou conhecidas na literatura. A coluna cromatográfica pode ser qualquer uma das colunas cromatográficas incluindo uma resina de cromatografia irradiada com radiação gama descritas nesta invenção ou conhecidas na literatura. A proteína recombinante pode ser uma proteína terapêutica recombinante (por exemplo, qualquer uma das proteínas terapêuticas recombinantes descritas nesta invenção ou conhecidas na literatura).

[0079] Em alguns exemplos, a coluna faz parte de um sistema de cromatografia multicolunas (MCCS), por exemplo, pode fazer parte do sistema de cromatografia contracorrente periódica (PCCS).

[0080] O tampão desnaturante pode ser qualquer um dos tampões desnaturantes exemplificativos descritos nesta invenção ou conhecidos na literatura. Por exemplo, o tampão desnaturante pode incluir um ou mais dentre ureia, cloreto de guanidina, e TritonTM X-100. Em alguns exemplos, a resina de cromatografia é exposta ao tampão desnaturante por um período de entre pelo menos 1 minuto e cerca de 2 horas (por exemplo, entre 1 minuto e cerca de 1,5 horas, entre cerca de 1 minuto e cerca de 1,0 hora, entre cerca de 1 minuto e cerca de 55 minutos, entre cerca de 1 minuto e cerca de 50 minutos, entre cerca de 1 minuto e cerca de 45 minutos, entre cerca de 1 minuto e cerca de 40 minutos, entre cerca de 1 minuto e cerca de 40 minutos, entre cerca de 1 minuto e cerca de 35 minutos, entre cerca de 1 minuto e cerca de 30 minutos, entre cerca de 1 minuto e cerca de 25 minutos, entre cerca de 1 minuto e cerca de 20 minutos, entre cerca de 1 minuto e cerca de 15 minutos, ou entre cerca de 1 minuto e cerca de 10 minutos). Em alguns exemplos, expor a resina de cromatografia a um tampão desnaturante inclui passar entre cerca de 0,5x o volume do leito e cerca de 10x o volume do leito (por exemplo, entre cerca de 0,5x o volume do leito e cerca de 9,0x o volume do leito, entre cerca de 0,5x o volume do leito e cerca de 8,0x o volume do leito, entre cerca de 0,5x o volume do leito e cerca de 7,0x o volume do leito, entre cerca de 0,5x o volume do leito e cerca de 6,0x o volume do leito, entre cerca de 0,5x o volume do leito e cerca de 5,0x o volume do leito, entre cerca de 0,5x o volume do leito e cerca de 4,0x o volume do leito, entre cerca de 0,5x o volume do leito e cerca de 3,5x o volume do leito, entre cerca de 0,5x o volume do leito e cerca de 3,0x o volume do leito, entre cerca de 0,5x o volume do leito e cerca de 2,5x o volume do leito, entre cerca de 0,5x o volume do leito e cerca de 2,0x o volume do leito, ou entre cerca de 0,5x o volume do leito e cerca de 1,5x o volume do leito) de tampão desnaturante pela coluna cromatográfica. Em alguns exemplos, o primeiro ciclo de cromatografia pode incluir expor a resina de cromatografia a um tampão de lavagem compreendendo cerca de 0,5 M e cerca de 1,5 M de hidróxido de sódio subsequente à exposição ao tampão desnaturante.

[0081] O primeiro ciclo de cromatografia realizado através da coluna pode ser qualquer ciclo de cromatografia descrito neste relatório ou conhecido na literatura que inclui expor a resina de cromatografia a um tampão desnaturante. O pelo menos um ciclo de cromatografia adicional realizado através da coluna pode ser qualquer ciclo de cromatografia descrito neste relatório ou conhecido na literatura. Por exemplo, o primeiro ciclo de cromatografia e o pelo menos um ciclo de cromatografia adicional pode incluir as etapas de: capturar a proteína recombinante expondo a resina de cromatografia com um líquido incluindo uma proteína recombinante; lavar a resina de cromatografia expondo a resina de cromatografia com um tampão de lavagem, eluir a proteína recombinante expondo a resina de cromatografia com um tampão de eluição; e regenerar a resina de cromatografia expondo a resina de cromatografia ao tampão desnaturante. Em alguns exemplos, o líquido incluindo a proteína recombinante é um meio de cultura líquido (por exemplo, um meio de cultura líquido coletado de uma perfusão ou cultura em batelada).

[0082] O primeiro ciclo de cromatografia e o pelo menos um ciclo de cromatografia adicional podem ser realizados usando-se um sistema fechado e integrado (por exemplo, qualquer um dos sistemas fechados e integrados exemplificativos descritos neste relatório ou conhecidos na literatura). Por exemplo, o primeiro ciclo de cromatografia e o pelo menos um ciclo de cromatografia adicional podem ser realizados usando-se um sistema fechado e integrado, onde o tampão é tampão com carga biológica reduzida (por exemplo, todos os tampões usados no primeiro ciclo e no pelo menos um ciclo adicional). Como bem se sabe na técnica, um tampão com carga biológica reduzida pode ser produzido usando-se uma variedade de métodos diferentes (por exemplo, preparado por filtração, por autoclavagem, ou tratamento térmico).

[0083] O pelo menos um ciclo de cromatografia adicional pode ocorrer em dois ou mais (por exemplo, 3 ou mais, 4 ou mais, 5 ou mais, 6 ou mais, 7 ou mais, 8 ou mais, 9 ou mais, 10 ou mais, 11 ou mais, 12 ou mais, 13 ou mais, 14 ou mais, 15 ou mais, 20 ou mais, 25 ou mais, 30 ou mais, 35 ou mais, 40 ou mais, 45 ou mais, 50 ou mais, 55 ou mais, 60 ou mais, 65 ou mais, 70 ou mais, 75 ou mais, 80 ou mais, 85 ou mais, 90 ou mais, 95 ou mais, ou 100 ou mais) ciclos de cromatografia adicional . Em alguns exemplos, o pelo menos um ciclo de cromatografia adicional é realizada continuamente por um período de pelo menos 3 dias (por exemplo, pelo menos 4 dias, pelo menos 5 dias, pelo menos 6 dias, pelo menos 7 dias, pelo menos 8 dias, pelo menos 9 dias, pelo menos 10 dias, pelo menos 11 dias, pelo menos 12 dias, pelo menos 13 dias, pelo menos 14 dias, pelo menos 15 dias, pelo menos 16 dias, pelo menos 17 dias, pelo menos 18 dias, pelo menos 19 dias, pelo menos 20 dias, pelo menos 21 dias, pelo menos 22 dias, pelo menos 23 dias, pelo menos 24 dias, pelo menos 25 dias, pelo menos 30 dias, pelo menos 35 dias, pelo menos 40 dias, pelo menos 45 dias, pelo menos 50 dias, pelo menos 55 dias, pelo menos 60 dias, pelo menos 65 dias, pelo menos 70 dias, pelo menos 75 dias, pelo menos 80 dias, pelo menos 85 dias, pelo menos 90 dias, pelo menos 95 dias, ou pelo menos 100 dias).

Processos integrados, fechados ou substancialmente fechados, e contínuos para a produção de uma proteína recombinante

[0084] São oferecidos nesta invenção processos integrados, fechados ou substancialmente fechados, e contínuos para a produção de uma proteína recombinante purificada (por exemplo, uma proteína terapêutica recombinante). Esses processos incluem oferecer um meio de cultura líquido incluindo uma proteína recombinante (por exemplo, uma proteína terapêutica recombinante) que é substancialmente livre de células.

[0085] Alguns processos incluem alimentar continuamente o meio de cultura líquido em um sistema de cromatografia multicolunas (MCCS) que inclui pelo menos uma coluna cromatográfica incluindo uma resina esterilizada com radiação gama, onde a resina de cromatografia é exposta, durante cada ciclo, a um tampão desnaturante (por exemplo, exposta a qualquer um dos tampões desnaturantes descritos neste relatório ou conhecidos na literatura por qualquer uma das durações descritas neste relatório). Esses processos utilizam um tampão com carga biológica reduzida, são integrados, e operam continuamente desde o meio de cultura líquido até um eluato proveniente do MCCS que é a proteína recombinante purificada (por exemplo, uma substância medicamentosa à base de proteína terapêutica).

[0086] Alguns processos incluem alimentar continuamente o meio de cultura líquido em um primeiro MCCS (MCCS1), capturar a proteína recombinante do meio de cultura líquido usando o MCCS1, produzir um eluato proveniente do MCCS1 que inclui a proteína recombinante e alimentar continuamente o eluato em um segundo MCCS (MCCS2), e alimentar continuamente a proteína recombinante do eluato no MCCS2 e subsequentemente eluir a proteína recombinante para desta forma produzir a proteína recombinante purificada, onde pelo menos uma coluna no MCCS1 e/ou o MCCS2 é uma coluna cromatográfica que inclui resina de cromatografia irradiada com radiação gama e a resina de cromatografia é exposta a um tampão desnaturante durante cada ciclo no processo (por exemplo, exposta a qualquer um dos tampões desnaturantes descritos neste relatório ou conhecidos na literatura por qualquer uma das durações descritas neste relatório). Esses processos utilizam tampão com carga biológica reduzida, são integrados, e operam continuamente desde o meio de cultura líquido até a proteína recombinante purificada.

[0087] Em alguns exemplos, cada um das colunas cromatográficas usadas no MCCS, MCCS1, e/ou MCCS2 inclui uma resina de cromatografia irradiada com radiação gama. Algumas modalidades incluem ainda uma etapa de formular a proteína recombinante purificada como uma composição farmacêutica.

[0088] Os processos descritos nesta invenção oferece a produção contínua e rápida de uma proteína recombinante purificada a partir um meio de cultura líquido incluindo a proteína recombinante. Por exemplo, o tempo transcorrido entre a alimentação de um meio de cultura líquido incluindo uma proteína terapêutica no MCCS ou MCCS1 e a eluição da proteína recombinante a partir do MCCS ou MCCS2, respectivamente, pode variar, por exemplo, entre cerca de 4 horas e cerca de 48 horas, inclusive, por exemplo, entre cerca de 4 horas e cerca de 40 horas, entre cerca de 4 horas e cerca de 35 horas, entre cerca de 4 horas e cerca de 30 horas, entre cerca de 4 horas e cerca de 28 horas, entre cerca de 4 horas e cerca de 26 horas, entre cerca de 4 horas e cerca de 24 horas, entre cerca de 4 horas e cerca de 22 horas, entre cerca de 4 horas e cerca de 20 horas, entre cerca de 4 horas e cerca de 18 horas, entre cerca de 4 horas e cerca de 16 horas, entre cerca de 4 horas e cerca de 14 horas, entre cerca de 4 horas e cerca de 12 horas, entre cerca de 6 horas e cerca de 12 horas, entre cerca de 8 horas e cerca de 12 horas, entre cerca de 6 horas e cerca de 20 horas, entre cerca de 6 horas e cerca de 18 horas, entre cerca de 6 horas e cerca de 14 horas, entre cerca de 8 horas e cerca de 16 horas, entre cerca de 8 horas e cerca de 14 horas, entre cerca de 8 horas e cerca de 12 horas, entre cerca de 10 horas e 20 horas, entre cerca de 10 horas e 18 horas, entre cerca de 10 horas e 16 horas, entre cerca de 10 horas e 14 horas, entre cerca de 12 horas e cerca de 14 horas, entre cerca de 10 horas e cerca de 40 horas, entre cerca de 10 horas e cerca de 35 horas, entre cerca de 10 horas e cerca de 30 horas, entre cerca de 10 horas e cerca de 25 horas, entre cerca de 15 horas e cerca de 40 horas, entre cerca de 15 horas e cerca de 35 horas, entre cerca de 15 horas e cerca de 30 horas, entre cerca de 20 horas e cerca de 40 horas, entre cerca de 20 horas e cerca de 35 horas, ou entre cerca de 20 horas e cerca de 30 horas, inclusive. Em outros exemplos, o tempo transcorrido entre a alimentação do meio de cultura líquido incluindo a proteína recombinante no MCCS ou MCCS1 e a eluição da proteína recombinante a partir do MCCS ou MCCS2, respectivamente, é, por exemplo, maior que cerca de 4 horas e menor que cerca de 40 horas, inclusive, por exemplo, maior que cerca de 4 horas e menor que cerca de 39 horas, cerca de 38 horas, cerca de 37 horas, cerca de 36 horas, cerca de 35 horas, cerca de 34 horas, cerca de 33 horas, cerca de 32 horas, cerca de 31 horas, cerca de 30 horas, cerca de 29 horas, cerca de 28 horas, cerca de 27 horas, cerca de 26 horas, cerca de 25 horas, cerca de 24 horas, cerca de 23 horas, cerca de 22 horas, cerca de 21 horas, cerca de 20 horas, cerca de 19 horas, cerca de 18 horas, cerca de 17 horas, cerca de 16 horas, cerca de 15 horas, cerca de 14 horas, cerca de 13 horas, cerca de 12 horas, cerca de 11 horas, cerca de 10 horas, cerca de 9 horas, cerca de 8 horas, cerca de 7 horas, cerca de 6 horas, cerca de 5 horas, ou cerca de 4,5 horas, inclusive.

[0089] Aspectos não limitativos dos MCCSs que podem ser usados em qualquer um desses processos (MCCS, MCCS1, e/ou MCCS2) estão descritos nos Pedidos de Patente Provisória US Nos 61/775.060 e 61/856.390 (cada um deles aqui incorporado título de referência).

[0090] Alguns processos exemplificativos não utilizam uma etapa de contenção (por exemplo, não utilizam um reservatório (por exemplo, tanque de ruptura) no processo inteiro. Outros podem usar um máximo de 1, 2, 3, 4, ou 5 reservatórios (por exemplo, tanques de ruptura) no processo inteiro. Qualquer um dos processos descritos nesta invenção podem utilizar um máximo de 1, 2, 3, 4, ou 5 reservatórios (por exemplo, tanques de ruptura) no processo inteiro, onde cada tanque de ruptura contém apenas uma proteína recombinante por um período de tempo total de , por exemplo, entre cerca de 5 minutos e menos de cerca de 6 horas, inclusive, por exemplo, entre cerca de 5 minutos e cerca de 5 horas, cerca de 4 horas, cerca de 3 horas, cerca de 2 horas, cerca de 1 hora, ou cerca de 30 minutos, inclusive.

[0091] Alguns processos utilizam um, dois, três, quatro, cinco, ou seis reservatórios (por exemplo, tanques de ruptura) e podem ter uma capacidade que varia, por exemplo, entre 1 mL e cerca de 300 mL, inclusive, por exemplo, entre 1 mL e cerca de 280 mL, cerca de 260 mL, cerca de 240 mL, cerca de 220 mL, cerca de 200 mL, cerca de 180 mL, cerca de 160 mL, cerca de 140 mL, cerca de 120 mL, cerca de 100 mL, cerca de 80 mL, cerca de 60 mL, cerca de 40 mL, cerca de 20 mL, ou cerca de 10 mL (inclusive). Quaisquer reservatórios (por exemplo, tanques de ruptura) usados (emn qualquer um dos processos descritos nesta invenção) para conter o fluido antes de ele ser alimentado no MCCS ou MCCS1 podem ter uma capacidade que varia, por exemplo, entre 1 mL e cerca de 100%, inclusive, por exemplo, entre 1 mL e cerca de 90%, cerca de 80%, cerca de 70%, cerca de 60%, cerca de 50%, cerca de 40%, cerca de 30%, cerca de 20%, cerca de 10%, ou cerca de 5%, inclusive, do volume de carregamento da primeira coluna do MCCS ou MCCS1. Um ou mais reservatórios (por exemplo, tanques de ruptura) podem ser usados para conter o eluato proveniente do MCCS1 antes de eles ser introduzido no MCCS2 podem ter uma capacidade que varia, por exemplo, entre 1 mL e cerca de 100%, inclusive, por exemplo, entre 1 mL e cerca de 90%, cerca de 80%, cerca de 70%, cerca de 60%, cerca de 50%, cerca de 40%, cerca de 30%, cerca de 20%, cerca de 10%, ou cerca de 5%, inclusive, do volume de carregamento da primeira coluna do MCCS2.

[0092] Vários aspectos adicionais desses processos estão descritos em maiores detalhes abaixo e podem ser usados em qualquer combinação nos processos oferecidos nesta invenção sem limitação. Aspectos exemplificativos dos processos oferecidos estão descritos abaixo; no entanto, o especialista na técnica vai perceber que etapas adicionais podem ser acrescentadas aos processos descritos nesta invenção e outros materiais podem ser usados para a realização de qualquer uma das etapas de os processos descritos nesta invenção.

Meio de cultura líquido

[0093] Meio de cultura líquido que inclui uma proteína recombinante (por exemplo, proteína terapêutica recombinante) que é substancialmente livre de células pode ser derivado de qualquer fonte. Por exemplo, o meio de cultura líquido pode ser obtido a partir de uma cultura de células recombinantes (por exemplo, uma cultura de células recombinantes de bactéria, levedura, ou mamífero). O meio de cultura líquido pode ser obtido a partir de uma cultura de células de alimentação intermitente (por exemplo, célula de mamífero) (por exemplo, um biorreator de alimentação intermitente incluindo uma cultura de células de mamífero que secretam a proteína recombinante) ou uma cultura de células de perfusão (por exemplo, célula de mamífero) (por exemplo, um biorreator de perfusão incluindo uma cultura de células de mamífero que secretam a proteína recombinante). O meio de cultura líquido também pode ser um meio de cultura líquido clarificado proveniente de uma cultura de células bacterianas ou de levedura que secretam a proteína recombinante.

[0094] O meio de cultura líquido obtido a partir de uma cultura de células recombinantes pode ser filtrado ou clarificado para obter um meio de cultura líquido que é substancialmente livre de células e/ou vírus. Métodos para filtração ou clarificação de um meio de cultura líquido para remover células são conhecidos na literatura (por exemplo, filtração de 0,2 μm e filtração usando um sistema Alternating Tangential Flow (ATFTM)). As células recombinantes também podem ser removidas do meio de cultura líquido usando-se centrifugação e remoção do sobrenadante que é meio de cultura líquido que é substancialmente livre de células, ou deixando-se as células sedimentarem no fundo gravitacional de um recipiente (por exemplo, biorreator) incluindo o meio de cultura líquido, e removendo-se o meio de cultura líquido (o meio de cultura líquido que é substancialmente livre de células) que está distante das células recombinantes sedimentadas.

[0095] O meio de cultura líquido pode ser obtido a partir de uma cultura de células recombinantes (por exemplo, células recombinantes de bactéria, levedura, ou mamífero) que produzem qualquer uma das proteínas recombinantes (por exemplo, proteínas terapêuticas recombinantes) descritas neste relatório ou conhecidas na literatura. Alguns exemplos de qualquer um dos processos descritos nesta invenção podem incluir ainda uma etapa de cultivar células recombinantes (por exemplo, células recombinantes de bactéria, levedura, ou mamífero) que produzem a proteína recombinante (por exemplo, proteína terapêutica recombinante).

[0096] O meio de cultura líquido pode ser qualquer um dos tipos de meio de cultura líquido descritos neste relatório ou conhecidos na literatura. Por exemplo, o meio de cultura líquido pode ser selecionado do grupo de: meio de cultura líquido livre de componentes derivados de animais, meio de cultura líquido livre de soro, meio de cultura líquido contendo soro, meio de cultura líquido definido quimicamente, e meio de cultura líquido livre de proteína. Em qualquer um dos processos descritos nesta invenção, um meio de cultura líquido obtido a partir de uma cultura pode ser diluído por adição de um segundo fluido (por exemplo, um tampão) antes de ele ser alimentado no MCCS ou MCCS1.

[0097] O meio de cultura líquido incluindo uma proteína recombinante que é substancialmente livre de células pode ser armazenado por exemplo, a uma temperatura abaixo de cerca de 15°C (por exemplo, abaixo de cerca de 10°C, abaixo de cerca de 4°C, abaixo de cerca de 0°C, abaixo de cerca de -20°C, abaixo de cerca de -50°C, abaixo de cerca de -70°C, ou abaixo de cerca de -80°C) por pelo menos 1 dia (por exemplo, pelo menos cerca de 2 dias, pelo menos cerca de 5 dias, pelo menos cerca de 10 dias, pelo menos cerca de 15 dias, pelo menos cerca de 20 dias, ou pelo menos cerca de 30 dias) antes da alimentação do meio de cultura líquido no MCCS ou MCCS1. Alternativamente, em alguns exemplos o meio de cultura líquido é alimentado no MCCS ou MCCS1 diretamente de um biorreator (por exemplo, alimentado no MCCS ou MCCS1 diretamente do biorreator depois de uma etapa de filtração ou clarificação).

Sistemas de cromatografia multicolunas

[0098] Os processos descritos nesta invenção incluem o uso de um MCCS ou dois ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, ou seis) sistemas de cromatografia multicolunas (MCCSs) (por exemplo, um MCCS1 e MCCS2). Um MCCS pode incluir duas ou mais colunas cromatográficas, duas ou mais membranas cromatográficas, ou uma combinação de pelo menos uma coluna cromatográfica e pelo menos uma membrana cromatográfica. Em exemplos não limitativos, um MCCS (por exemplo, MCCS, MCCS1, e/ou MCCS2 em qualquer um dos processos desta invenção) pode incluir quatro colunas cromatográficas, três colunas cromatográficas e uma membrana cromatográfica, três colunas cromatográficas, duas colunas cromatográficas, duas membranas cromatográficas, e duas colunas cromatográficas e uma membrana cromatográfica. Exemplos adicionais de combinações de colunas cromatográficas e/ou membranas cromatográficas podem ser considerados para uso em um MCCS (por exemplo, MCCS, MCCS1, e/ou MCCS2 em qualquer um dos processos descritos nesta invenção) pelo especialista na técnica, sem limitação. As colunas cromatográficas e/ou membranas cromatográficas individuais presentes em um MCCS podem ser idênticas (por exemplo, ter o mesmo formato, volume, resina, mecanismo de captura, e operação unitária), ou podem ser diferentes (por exemplo, ter um ou mais de um formato diferente, volume, resina, mecanismo de captura, e operação unitária). As colunas cromatográficas e/ou membranas cromatográficas individuais presentes em um MCCS (por exemplo, MCCS, MCCS1, e/ou MCCS2 em qualquer um dos processos descritos nesta invenção) podem efetuar a mesma operação unitária (por exemplo, a operação unitária de captura, purificar, ou polir) ou operações unitárias diferentes (por exemplo, operações unitárias diferentes selecionadas, por exemplo, do grupo de capturar, purificar, polir, inativar vírus, ajustar a concentração iônica e/ou o pH de um fluido incluindo a proteína recombinante, e fitlrar). Por exemplo, nos exemplos dos processos descritos nesta invenção, pelo menos uma coluna cromatográfica e/ou membrana cromatográfica no MCCS ou MCCS1 realiza a operação unitária de captura da proteína recombinante.

[0099] A uma ou mais colunas cromatográficas que podem estar presentes em um MCCS (por exemplo, presentes no MCCS, MCCS1, e/ou MCCS2) podem ter um volume de resina de, por exemplo, entre cerca de 1 mL e cerca de 2 mL, cerca de 5 mL, cerca de 10 mL, cerca de 15 mL, cerca de 20 mL, cerca de 25 mL, cerca de 30 mL, cerca de 35 mL, cerca de 40 mL, cerca de 45 mL, cerca de 50 mL, cerca de 55 mL, cerca de 60 mL, cerca de 65 mL, cerca de 70 mL, cerca de 75 mL, cerca de 80 mL, cerca de 85 mL, cerca de 90 mL, cerca de 95 mL, ou cerca de 100 mL, inclusive. A uma ou mais colunas cromatográficas que podem estar presentes em um MCCS (por exemplo, presentes no MCCS, MCCS1, e/ou MCCS2) podem ter um volume de resina de entre cerca de 2 mL e cerca de 100 mL, entre cerca de 2 mL e cerca de 90 mL, entre cerca de 2 mL e cerca de 80 mL, entre cerca de 2 mL e cerca de 70 mL, entre cerca de 2 mL e cerca de 60 mL, entre cerca de 2 mL e cerca de 50 mL, entre cerca de 5 mL e cerca de 50 mL, entre cerca de 2 mL e cerca de 45 mL, entre cerca de 5 mL e cerca de 45 mL, entre cerca de 2 mL e cerca de 40 mL, entre cerca de 5 mL e cerca de 40 mL, entre cerca de 2 mL e cerca de 35 mL, entre cerca de 5 mL e cerca de 35 mL, entre cerca de 2 mL e cerca de 30 mL, entre cerca de 5 mL e cerca de 30 mL, entre cerca de 2 mL e cerca de 25 mL, entre cerca de 5 mL e cerca de 25 mL, entre cerca de 15 mL e cerca de 60 mL, entre cerca de 10 mL e cerca de 60 mL, entre cerca de 10 mL e cerca de 50 mL, e entre cerca de 15 mL e cerca de 50 mL. A uma ou mais colunas cromatográficas em um MCCS (por exemplo, o MCCS, MCCS1, e/ou MCCS2) usadas em qualquer um dos processos descritos nesta invenção podem ter o substancialmente o mesmo volume de resina ou podem ter volumes de resina diferentes. A taxa de fluxo usada para a uma ou mais colunas cromatográficas em um MCCS (por exemplo, o MCCS, MCCS1, e/ou MCCS2) pode variar, por exemplo, entre cerca de 0,2 mL/minuto e cerca de 25 mL/minuto (por exemplo, entre cerca de 0,2 mL/minuto e cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,2 mL/minuto e cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 10 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL minuto e cerca de 14 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 25,0 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 15,0 mL/minuto).

[00100] A uma ou mais colunas cromatográficas em um MCCS (por exemplo, MCCS, MCCS1, e/ou MCCS2) podem ter substancialmente o mesmo formato ou podem formatos substancialmente diferentes. Por exemplo, a uma ou mais colunas cromatográficas em MCCS (por exemplo, no MCCS, MCCS1, e/ou MCCS2) podem ter substancialmente o formato de um cilindro circular ou podem ter substancialmente o mesmo formato de um cilindro oval.

[00101] A uma ou mais membranas cromatográficas que podem estar presentes em um MCCS (por exemplo, presentes no MCCS, MCCS1, e/ou MCCS2) podem ter um volume de leito de, por exemplo, entre cerca de 1 mL e cerca de 500 mL (por exemplo, entre cerca de 1 mL e cerca de 475 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 450 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 425 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 400 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 375 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 350 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 325 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 300 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 275 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 250 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 225 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 200 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 175 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 150 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 125 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 100 mL, entre cerca de 2 mL e cerca de 100 mL, entre cerca de 5 mL e cerca de 100 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 80 mL, entre cerca de 2 mL e cerca de 80 mL, entre cerca de 5 mL e cerca de 80 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 60 mL, entre cerca de 2 mL e cerca de 60 mL, entre cerca de 5 mL e cerca de 60 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 40 mL, entre cerca de 2 mL e cerca de 40 mL, entre cerca de 5 mL e cerca de 40 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 30 mL, entre cerca de 2 mL e cerca de 30 mL, entre cerca de 5 mL e cerca de 30 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 25 mL, entre cerca de 2 mL e cerca de 25 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 20 mL, entre cerca de 2 mL e cerca de 20 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 15 mL, entre cerca de 2 mL e cerca de 15 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 10 mL, ou entre cerca de 2 mL e cerca de 10 mL).

[00102] Um ou mais (por exemplo, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze, dezesseis, dezessete, dezoito, dezenove, vinte, vinte e um, vinte e dois, vinte e três, ou vinte e quatro) tipos diferentes de tampão com carga biológica reduzida podem ser empregados durante o uso do MCCS, MCCS1, e/ou MCCS2 em qualquer um dos processos descritos nesta invenção. Como se sabe na técnica, o um ou mais tipos de tampão com carga biológica reduzida usados no MCCS, MCCS1, e/ou MCCS2 nos processos descritos nesta invenção vão depender da resina presente nas colunas cromatográticas e/ou nas membranas cromatográficas do MCCS, MCCS1, e/ou MCCS2, das propriedades biofísicas da proteína recombinante, e da operação unitária (por exemplo, qualquer uma das operações unitárias exemplificativas descritas neste relatório) realizada pelas colunas cromatográficas e/ou membranas cromatográficas específicas do MCCS, MCCS1, e/ou MCCS2. O volume e o tipo de tampão empregado durante o uso do MCCS, MCCS1, e/ou MCCS2 em qualquer um dos processos descritos nesta invenção também podem ser determinados pelo especialista na técnica (por exemplo, discutido mais detalhadamente abaixo). Por exemplo, o volume e os tipos de tampão empregado durante o uso do MCCS, MCCS1, e/ou MCCS2 em qualquer um dos processos descritos nesta invenção podem ser escolhidos de forma a otimizar um ou mais dos seguintes itens na proteína recombinante purificada (por exemplo, produto medicamentoso à base de proteína recombinante): o rendimento total de proteína recombinante, a atividade da proteína recombinante, o nível de pureza da proteína recombinante, e a remoção de contaminantes biológicos de um fluido (por exemplo, meio de cultura líquido) incluindo a proteína recombinante (por exemplo, ausência de vírus ativos, micobactérias, levedura, bactérias, ou células de mamífero).

[00103] O MCCS, MCCS1, e/ou MCCS2 pode ser o sistema de cromatografia contracorrente periódica (PCCS). Um PCCS pode, por exemplo, incluir duas ou mais colunas cromatográficas (por exemplo, três colunas ou quatro colunas) que são comutadas para possibilitar a eluição contínua de proteína recombinante a partir das duas ou mais colunas cromatográficas. Um PCCS pode incluir duas ou mais colunas cromatográficas, duas ou mais membranas cromatográficas, ou pelo menos uma coluna cromatográfica e pelo menos uma membrana cromatográfica. Uma operação (ciclo) em uma coluna geralmente consiste nas etapas de carregamento, lavagem, eluição, e regeneração. Nos PCCSs, são usadas múltiplas colunas para efetuar as mesmas etapas distinta e continuamente de forma cíclica. Como as colunas são operadas em série, o escoamento e a lavagem através de uma coluna é capturada por outra coluna. Este aspecto único dos PCCSs permite que carregamento da resina perto de sua capacidade de ligação estática em vez de perto da capacidade de ligação dinâmica, como é típico durante a cromatografia em bateladas. Como resultado da contínua ciclagem e eluição, o fluido que entra em um PCCS é continuamente processado, e o eluato incluindo proteína recombinante é produzido continuamente.

[00104] A estratégia de comutação de colunas é empregada para passar de uma etapa para outra em um ciclo de PCCS. Exemplos de comutação de colunas que podem ser usados em um PCCS estão descritos nos Pedidos de Patente Provisória Série Nos 61/775.060 e 61/856.390. Por exemplo, um método de comutação de colunas pode empregar duas operações de comutação automáticas por coluna: a primeira delas está relacionada com a ruptura do produto inicial, ao passo que a segunda coincide com a saturação da coluna. A determinação de quando as operações de comutação de colunas devem ocorrer pode ser determinada por monitoramento da concentração de proteína recombinante (por exemplo, monitoramento feito por monitoramento de UV) no eluato proveniente de cada coluna cromatográfica presente em um PCCS. Por exemplo, a comutação de colunas pode ser determinada por qualquer ferramenta PAT capaz de medir em linha a concentração de produto com controle de retroalimentação. A ferramenta PAT é capaz de medir em linha e em tempo real a concentração de produto com controle de retroalimentação. Como se sabe na técnica, as comutações de coluna também podem ser projetadas com base no tempo ou na quantidade de fluido (por exemplo, tampão) que passa pela uma ou mais colunas cromatográficas e/ou membranas cromatográficas no MCCS, MCCS1, e/ou MCCS2.

[00105] Nos PCCSs, o tempo de residência (RT) da proteína recombinante em cada coluna cromatográfica e/ou membrana cromatográfica presente no PCCS pode ser diminuído sem aumento do tamanho da coluna/membrana porque o produto partido proveniente da primeira coluna/membrana pode ser capturado em outra coluna/membrana no PCCS. Um sistema de processo contínuo pode ser desenhado para processar meio de cultura líquido a qualquer taxa de perfusão (D) variando o volume da coluna/membrana (V) e o RT usando-se a equação de: V = D * RT.

[00106] A uma ou mais operações unitárias que podem ser efetuadas pelo MCCS ou pelo MCC1 e/ou MCCS2 usados nos processos ora descritos incluem, por exemplo, captura da proteína recombinante, inativação de vírus presentes em um fluido incluindo a proteína recombinante, purificação da proteína recombinante, polimento da proteína recombinante, contenção de um fluido incluindo a proteína recombinante (por exemplo, usando qualquer um dos tanques de ruptura exemplificativos descritos neste relatório), filtração ou remoção de material particulado e/ou células de um fluido incluindo a proteína recombinante, e ajuste da concentração iônica e/ou do pH de um fluido incluindo a proteína recombinante.

[00107] Em algumas modalidades, o MCCS ou o MCCS1 inclui pelo menos uma coluna cromatográfica e/ou membrana cromatográfica que realiza a operação unitária de captura da proteína recombinante. A operação unitária de captura pode ser efetuada usando-se pelo menos uma coluna cromatográfica e/ou resina de cromatografia, por exemplo, que utiliza um mecanismo de captura. Exemplos não limitativos de mecanismos de captura incluem um mecanismo de captura de ligação de proteína A, um mecanismo de captura de ligação de anticorpo ou de fragmento de anticorpo, um mecanismo de captura de ligação de substrato, um mecanismo de captura de ligação de aptâmero, um mecanismo de captura de ligação de tag (por exemplo, um mecanismo de captura à base de poli-His tag), e um mecanismo de captura de ligação de cofator. A captura também pode ser efetuada usando-se uma resina que pode ser usada para realizar cromatografia por troca catiônica, por troca aniônica, em peneira molecular, ou cromatografia por interação hidrofóbica. Resinas não limitativas que podem ser usadas para capturar uma proteína recombinante estão descritas neste relatório. Exemplos adicionais de resinas que podem ser usadas para capturar uma proteína recombinante são conhecidos na literatura.

[00108] A operação unitária de inativação de vírus presentes em um fluido incluindo a proteína recombinante pode ser efetuada usando-se um MCCS, MCCS1, e/ou MCCS2 (por exemplo, que inclui, por exemplo, uma coluna cromatográfica, uma membrana cromatográfica, ou um tanque de contenção que é capaz de incubar um fluido incluindo a proteína recombinante a um pH de entre cerca de 3,0 e 5,0 (por exemplo, entre cerca de 3,5 e cerca de 4,5, entre cerca de 3,5 e cerca de 4,25, entre cerca de 3,5 e cerca de 4,0, entre cerca de 3,5 e cerca de 3,8, ou cerca de 3,75) por um período de pelo menos 30 minutos (por exemplo, um período de entre cerca de 30 minutos e 1,5 horas, um período de entre cerca de 30 minutos e 1,25 horas, um período de entre cerca de 0,75 horas e 1,25 horas, ou um período de cerca de 1 hora).

[00109] A operação unitária de purificação de uma proteína recombinante pode ser efetuada usando-se um ou mais MCCSs (por exemplo, um MCCS, MCCS1, e/ou MCCS2) que incluem, por exemplo, uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que inclui uma resina, por exemplo, que utiliza um sistema de captura. Exemplos não limitativos de mecanismos de captura incluem um mecanismo de captura de ligação de proteína A, um mecanismo de captura de ligação de anticorpo ou de fragmento de anticorpo, um mecanismo de captura de ligação de substrato, um mecanismo de captura de ligação de aptâmero, um mecanismo de captura de ligação de tag (por exemplo, um mecanismo de captura à base de poli-His tag), e um mecanismo de captura de ligação de cofator. A purificação também pode efetuada usando-se uma resina que pode ser usada para realizar cromatografia por troca catiônica ou por troca aniônica, cromatografia em peneira molecular, ou cromatografia por interação hidrofóbica. Resinas não limitativas que podem ser usadas para purificar uma proteína recombinante estão descritas neste relatório. Exemplos adicionais de resinas que podem ser usadas para purificar uma proteína recombinante são conhecidos na literatura.

[00110] A operação unitária de polimento de uma proteína recombinante pode ser efetuada usando-se um ou mais MCCSs (por exemplo, um MCCS, MCCS1, e/ou MCCS) que incluem, por exemplo, uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que inclui uma resina, por exemplo, que pode ser usada para realizar cromatografia por troca catiônica, por troca aniônica, em peneira molecular, ou cromatografia por interação hidrofóbica. Resinas não limitativas que podem ser usadas para polir uma proteína recombinante estão descritas neste relatório. Exemplos adicionais de resinas que podem ser usadas para polir uma proteína recombinante são conhecidos na literatura.

[00111] A operação unitária de contenção de um fluido incluindo a proteína recombinante pode ser realizada usando um MCCS (por exemplo, um MCCS, MCCS1, e/ou MCCS2) que inclui pelo menos um reservatório (por exemplo, um tanque de ruptura) ou um máximo de 1, 2, 3, 4, ou 5 reservatórios (por exemplo, tanques de ruptura) no MCCS ou o MCCS1 e MCCS2 combinados. Por exemplo, cada um dos reservatórios (por exemplo, tanques de ruptura) que podem ser usados para efetuar esta operação unitária pode ter um volume de entre cerca de 1 mL e cerca de 1 L (por exemplo, entre cerca de 1 mL e cerca de 800 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 600 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 500 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 400 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 350 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 300 mL, entre cerca de 10 mL e cerca de 250 mL, entre cerca de 10 mL e cerca de 200 mL, entre cerca de 10 mL e cerca de 150 mL, ou entre cerca de 10 mL e cerca de 100 mL). Os reservatórios (por exemplo, tanques de ruptura) usados nos processos descritos neste relatório podem ter uma capacidade que varia, por exemplo, entre 1 mL e cerca de 300 mL, inclusive, por exemplo, entre 1 mL e cerca de 280 mL, cerca de 260 mL, cerca de 240 mL, cerca de 220 mL, cerca de 200 mL, cerca de 180 mL, cerca de 160 mL, cerca de 140 mL, cerca de 120 mL, cerca de 100 mL, cerca de 80 mL, cerca de 60 mL, cerca de 40 mL, cerca de 20 mL, ou cerca de 10 mL, inclusive. Qualquer um dos reservatórios (por exemplo, tanques de ruptura) usados (em qualquer um dos processos descritos nesta invenção) para conter o fluido antes de ele entrar no MCCS ou MCCS1 pode ter uma capacidade que varia, por exemplo, entre 1 mL e cerca de 100%, inclusive, entre cerca de 1 mL e cerca de 90%, cerca de 80%, cerca de 70%, cerca de 60%, cerca de 50%, cerca de 40%, cerca de 30%, cerca de 20%, cerca de 10%, ou cerca de 5%, inclusive, do volume de carregamento da primeira coluna do MCCS ou MCCS1. Qualquer um dos reservatórios (por exemplo, tanques de ruptura) usados para conter o eluato proveniente do MCCS1 (incluindo a proteína recombinante) antes de ele entrar no MCCS2 pode ter uma capacidade que varia, por exemplo, entre 1 mL e cerca de 100%, inclusive, por exemplo, entre cerca de 1 mL e cerca de 90%, cerca de 80%, cerca de 70%, cerca de 60%, cerca de 50%, cerca de 40%, cerca de 30%, cerca de 20%, cerca de 10%, ou cerca de 5%, inclusive, do volume de carregamento da primeira coluna do MCCS2.

[00112] Cada um dos reservatórios (por exemplo, tanques de ruptura) pode conter o fluido incluindo a proteína recombinante por pelo menos 10 minutos (por exemplo, pelo menos 20 minutos, pelo menos 30 minutos, pelo menos 1 hora, pelo menos 2 horas, pelo menos 4 horas, ou pelo menos 6 horas). Em outros exemplos, os reservatórios (por exemplo, tanques de ruptura) contêm apenas uma proteína recombinante por um período de tempo total de, por exemplo, entre cerca de 5 minutos e menos de cerca de 6 horas, inclusive, por exemplo, entre cerca de 5 minutos e cerca de 5 horas, cerca de 4 horas, cerca de 3 horas, cerca de 2 horas, cerca de 1 hora, ou cerca de 30 minutos, inclusive. Os reservatórios (por exemplo, tanques de ruptura) podem ser usados tanto para contenção quanto para refrigeração (por exemplo, a uma temperatura de inferior a 25°C, inferior a 15°C, ou inferior a 10°C) o fluido incluindo a proteína recombinante. O reservatório pode ter qualquer formato, incluindo um cilindro circular, um cilindro oval, ou uma bolsa selada e impermeável aproximadamente retangular.

[00113] As operações unitárias de filtração de um fluido incluindo a proteína recombinante podem ser realizadas usando-se um MCCS (por exemplo, o MCCS, MCCS1, e/ou MCCS2) que inclui, por exemplo, um filtro, ou uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que inclui uma resina de peneira molecular. Como se sabe na técnica, encontra-se disponível na técnica uma ampla variedade de filtros submicrônicos (por exemplo, um filtro com um tamanho de poro menor que 1 μm, menor que 0,5 μm, menor que 0,3 μm, cerca de 0,2 μm, menor que 0,2 μm, menor que 100 nm, menor que 80 nm, menor que 60 nm, menor que 40 nm, menor que 20 nm, ou menor que 10 nm) que são capazes de remover todo material precipitado e/ou células (por exemplo, proteína desenrolada precipitada; proteínas de células hospedeiras indesejadas precipitadas; lipídios precipitados; bactérias; células de levedura; células fúngicas; micobactérias; e/ou células de mamífero). É sabido que filtros tendo um tamanho de poro de cerca de 0,2 μm ou menor que 0,2 μm removem efetivamente as bactérias do fluido incluindo a proteína recombinante. Como se sabe na técnica, uma coluna cromatográfica ou uma membrana cromatográfica incluindo uma resina de peneira molecular também pode ser usada em um MCCS (por exemplo, o MCCS, MCCS1, e/ou MCCS2) para realizar a operação unitária de filtração de um fluido incluindo uma proteína recombinante.

[00114] As operações unitárias de ajuste da concentração iônica e/ou do pH de um fluido incluindo a proteína recombinante podem ser realizadas usando-se um MCCS (por exemplo, um MCCS, um MCCS1, e/ou um MCCS2) que inclui e utiliza um reservatório de ajuste de tampão (por exemplo, um reservatório de ajuste de tampão em linha) que adiciona uma nova solução de tampão a um fluido que inclui a proteína recombinante (por exemplo, entre colunas dentro do MCCS, MCCS1, e/ou MCCS2, ou depois da última coluna um penúltimo MCCS (por exemplo, o MCCS1) e antes de o fluido incluindo a proteína recombinante ser alimentado na primeira coluna do MCCS seguinte (por exemplo, o MCCS2)). Como pode ser apreciado na técnica, o reservatório de ajuste de tampão em linha pode ter qualquer tamanho (por exemplo, maior que 100 mL) e pode incluir qualquer solução tamponada (por exemplo, uma solução tamponada que tem um ou mais de: um pH aumentado ou diminuído em relação ao fluido incluindo a proteína recombinante, uma concentração iônica aumentada ou diminuída (por exemplo, sal) em relação ao fluido incluindo a proteína recombinante, e/ou uma concentração aumentada ou diminuída de um agente que compete com a proteína recombinante pela ligação à resina presente na pelo menos uma coluna cromatográfica ou pelo menos uma membrana cromatográfica em um MCCS (por exemplo, o MCCS, MCCS1, e/ou MCCS2)).

[00115] O MCCS, MCCS1, e/ou MCCS2 podem efetuar duas ou mais operações unitárias. Por exemplo, o MCCS, MCCS1, e/ou MCCS2 podem efetuar, cada um deles, pelo menos as seguintes operações unitárias: capturar a proteína recombinante e inativar vírus presentes no fluido incluindo a proteína recombinante; capturar a proteína recombinante, inativar vírus presentes no fluido incluindo a proteína recombinante, e ajustar a concentração iônica e/ou do pH de um líquido incluindo a proteína recombinante; purificar a proteína recombinante e polir a proteína recombinante; purificar a proteína recombinante, polir a proteína recombinante, e filtrar um fluido incluindo a proteína recombinante ou remover precipitados e/ou matéria particular de um fluido incluindo a proteína recombinante; e purificar a proteína recombinante, polir a proteína recombinante, filtrar um fluido incluindo a proteína recombinante ou remover precipitados e/ou matéria particulada de um fluido incluindo a proteína recombinante, e ajustar a concentração iônica e/ou o pH de um líquido incluindo a proteína recombinante.

Captura da proteína recombinante

[00116] Os presentes processos incluem uma etapa de captura da proteína recombinante usando um MCCS ou MCCS1. Como pode ser apreciado na técnica, o meio de cultura líquido incluindo a proteína recombinante pode ser continuamente alimentado no MCCS ou MCCS1 usando-se uma variedade de meios diferentes. Por exemplo, o meio de cultura líquido pode ser ativamente bombeado para dentro do MCCS ou MCCS1, ou o meio de cultura líquido pode ser alimentado no MCCS ou MCCS1 usando-se força gravitacional. O meio de cultura líquido pode ser armazenado em um reservatório (por exemplo, um tanque de contenção) antes de ele ser alimentado no MCCS ou MCCS1 ou o meio de cultura líquido pode ser ativamente bombeado a partir de um biorreator incluindo uma cultura células (por exemplo, células de mamífero que secretam a proteína recombinante para o meio de cultura) para dentro do MCCS ou MCCS1.

[00117] O meio de cultura líquido pode ser alimentado (carregado) no MCCS ou MCCS1 a uma taxa de fluxo de entre cerca de 0,2 mL/minuto e cerca de 25 mL/minuto (por exemplo, entre cerca de 0,2 mL/minuto e cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,2 mL/minuto e cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 10 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL minuto e cerca de 14 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 25,0 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 15,0 mL/minuto). O meio de cultura líquido incluindo a proteína recombinante pode ser derivado de qualquer uma das fontes exemplificativas descritas neste relatório ou conhecidas na literatura.

[00118] Alguns exemplos incluem ainda a etapa opcional de filtração do meio de cultura líquido antes de ele ser alimentado no MCCS ou MCCS1. Qualquer um dos meios de filtração de um meio de cultura líquido ou um fluido incluindo a proteína recombinante exemplificativos descritos neste relatório, ou qualquer meio de filtração conhecido na literatura, pode ser usado para filtrar o meio de cultura líquido incluindo a proteína recombinante antes de ele ser alimentado no MCCS ou MCCS1.

[00119] Nos processos descritos nesta invenção, a captura da proteína recombinante a partir do meio de cultura líquido é efetuada usando-se o MCCS ou MCCS1. Como pode ser apreciado na técnica, para conseguir capturar a proteína recombinante, pelo menos uma coluna cromatográfica ou pelo menos uma membrana cromatográfica no MCCS ou MCCS1 deve incluir uma resina que utiliza um mecanismo de captura (por exemplo, qualquer um dos mecanismos de captura exemplificativos descritos neste relatório), ou inclui uma resina capaz de realizar cromatografia por troca catiônica, por troca aniônica, em peneira molecular, ou por interação hidrofóbica. Por exemplo, se a proteína recombinante for um anticorpo ou um fragmento de anticorpo, o sistema de captura pode ser um mecanismo de captura ligador de proteína A ou um mecanismo de captura ligador de antígeno (onde o antígeno de captura é especificamente reconhecido pelo anticorpo recombinante ou fragmento de anticorpo). Se a proteína recombinante for uma enzima, o mecanismo de captura pode usar um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga especificamente à enzima para capturar a enzima recombinante, um substrato da enzima para capturar a enzima recombinante, um cofator da enzima para capturar a enzima recombinante, ou, se a enzima recombinante incluir uma tag, uma proteína, um quelato metálico, ou um anticorpo (ou fragmento de anticorpo) que se liga à especificamente tag presente na enzima recombinante. Resinas não limitativas que podem ser usadas para capturar uma proteína recombinante estão descritas neste relatório e resinas adicionais que podem ser usadas para capturar uma proteína recombinante são conhecidas na literatura. Um exemplo não limitativo de resina que utiliza a um mecanismo de captura de ligação de proteína A é a resina MabSelect SuRe (GE Healthcare, Piscataway, NJ).

[00120] Tamanhos e formatos não limitativos exemplificativos das colunas cromatográficas ou membranas cromatográficas presentes no MCCS ou MCCS1 que podem ser usadas para capturar a proteína recombinante estão descritos neste relatório. O meio de cultura líquido alimentado (carregado) no MCCS ou MCCS1 pode incluir, por exemplo, entre cerca de 0,05 mg/mL e cerca de 100 mg/mL proteína recombinante (por exemplo, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 90 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 80 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 70 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 60 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 50 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 40 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 30 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 20 mg/mL, entre 0,5 mg/mL e cerca de 20 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 15 mg/mL, entre cerca de 0,5 mg/mL e cerca de 15 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 10 mg/mL, ou entre cerca de 0,5 mg/mL e cerca de 10 mg/mL proteína recombinante). O tempo médio necessário para a proteína recombinante ligar-se à resina usada para realizar a operação unitária de captura pode variar, por exemplo, entre cerca de 5 segundos e cerca de 10 minutos (por exemplo, entre cerca de 10 segundos e cerca de 8 minutos, entre cerca de 10 segundos e cerca de 7 minutos, entre cerca de 10 segundos e cerca de 6 minutos, entre cerca de 10 segundos e cerca de 5 minutos, entre cerca de 30 segundos e cerca de 5 minutos, entre cerca de 1 minuto e cerca de 5 minutos, entre cerca de 10 segundos e cerca de 4 minutos, entre cerca de 30 segundos e cerca de 4 minutos, ou entre cerca de 1 minuto e cerca de 4 minutos).

[00121] Como pode ser apreciado na técnica, para capturar a proteína recombinante usando as colunas cromatográficas ou membranas cromatográficas presentes no MCCS ou MCCS1, devem ser realizadas as etapas cromatográficas sequenciais de carregamento, lavagem, eluição, e regeneração das colunas cromatográficas ou membranas cromatográficas presentes no MCCS ou MCCS1. Qualquer uma das taxas de fluxo, volumes de tempo, e/ou espaços de tempo exemplificativos indicados para cada etapa cromatográfica sequencial descrita neste relatório podem ser usados na uma ou mais dessas etapas cromatográficas sequenciais diferentes (por exemplo, uma ou mais das etapas cromatográficas sequenciais de carregamento, lavagem, eluição, e regeneração das colunas cromatográficas ou membranas cromatográficas presentes no MCCS ou MCCS1 que são usadas para capturar a proteína recombinante). Taxas de fluxo, volumes de tempo, e/ou espaços de tempo não limitativos indicados para cada etapa cromatográfica sequencial que podem ser usados para capturar colunas cromatográficas e/ou membranas cromatográficas no MCCS ou MCCS1 (por exemplo, um PCCS ou PCCS1) estão dados abaixo. Além disso, tampões exemplificativos que podem ser usados no MCCS e/ou MCCS1 estão descritos abaixo.

[00122] O MCCS ou MCCS1 incluindo pelo menos uma coluna cromatográfica e/ou membrana cromatográfica incluindo uma resina que pode realizar a operação unitária de captura (por exemplo, qualquer uma das resinas exemplificativas que podem ser usadas para captura descritas neste relatório) pode ser carregado o meio de cultura líquido incluindo uma proteína recombinante usando-se qualquer uma das taxas de fluxo de carregamento (taxas de alimentação) descritas acima. Em alguns exemplos, uma única coluna cromatográfica ou uma única membrana cromatográfica incluindo uma resina que é capaz de realizar a operação unitária de captura é carregada em, por exemplo, entre cerca de 10 minutos e cerca de 90 minutos (por exemplo, entre cerca de 15 minutos e cerca de 90 minutos, entre cerca de 20 minutos e 80 minutos, entre cerca de 30 minutos e 80 minutos, entre cerca de 40 minutos e cerca de 80 minutos, entre cerca de 50 minutos e cerca de 80 minutos, e entre cerca de 60 minutos e 80 minutos). Em alguns exemplos, onde o MCCS ou MCCS1 inclui pelo menos duas colunas cromatográficas que incluem uma resina que é capaz de realizar a operação unitária de captura em série, o tempo necessário para carregar duas das colunas cromatográficas em série varia, por exemplo, entre cerca de 50 minutos e cerca de 180 minutos (por exemplo, entre cerca de 60 minutos e cerca de 180 minutos, entre cerca de 70 minutos e cerca de 180 minutos, entre cerca de 80 minutos e cerca de 180 minutos, entre cerca de 90 minutos e cerca de 180 minutos, entre cerca de 100 minutos e cerca de 180 minutos, entre cerca de 110 minutos e 150 minutos, e entre cerca de 125 minutos e cerca de 145 minutos).

[00123] Subsequente ao carregamento da proteína recombinante na pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica no MCCS ou MCCS1 que inclui uma resina que é capaz de realizar a operação unitária de captura, a pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica é lavada com pelo menos um tampão de lavagem. Como pode ser apreciado na técnica, o pelo menos um (por exemplo, dois, três, ou quatro) tampão de lavagem deve eluir todas as proteínas que não são a proteína recombinante proveniente da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membranas cromatográfica, sem perturbar a interação da proteína recombinante com a resina.

[00124] O tampão de lavagem pode ser passado pela pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica a uma taxa de fluxo de entre cerca de 0,2 mL/minuto e cerca de 25 mL/minuto (por exemplo, entre cerca de 0,2 mL/minuto e cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,2 mL/minuto e cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 10 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL minuto e cerca de 14 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 25,0 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 15,0 mL/minuto). O volume de tampão de lavagem usado (por exemplo, o volume total combinado de tampão de lavagem usado quando mais de um tampão de lavagem é usado) pode variar, por exemplo, entre cerca de 1X o volume da coluna (CV) e cerca de 15X CV (por exemplo, entre cerca de 1X CV e cerca de 14X CV, cerca de 1X CV e cerca de 13X CV, cerca de 1X CV e cerca de 12X CV, cerca de 1X CV e cerca de 11X CV, cerca de 2X CV e cerca de 11X CV, cerca de 3X CV e cerca de 11X CV, cerca de 4X CV e cerca de 11X CV, cerca de 5X CV e cerca de 11X CV, ou cerca de 5X CV e cerca de 10X CV). O tempo total da lavagem pode variar, por exemplo, entre cerca de 2 minutos e cerca de 3 horas (por exemplo, entre cerca de 2 minutos e cerca de 2,5 horas, entre cerca de 2 minutos e cerca de 2,0 horas, entre cerca de 5 minutos e cerca de 1,5 horas, entre cerca de 10 minutos e cerca de 1,5 horas, entre cerca de 10 minutos e cerca de 1,25 horas, entre cerca de 20 minutos e cerca de 1,25 horas, ou entre cerca de 30 minutos e cerca de 1 hora).

[00125] Subsequente à lavagem da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica no MCCS ou MCCS1 que inclui uma resina que é capaz de realizar a operação unitária de captura, a proteína recombinante é eluída da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica passando-se um tampão de eluição pela pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica no MCCS ou MCCS1 que inclui uma resina que é capaz de realizar a operação unitária de captura. O tampão de eluição pode ser passado pela pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que inclui uma resina que é capaz de realizar a operação unitária de captura a uma taxa de fluxo de entre cerca de 0,2 mL/minuto e cerca de 25 mL/minuto (por exemplo, entre cerca de 0,2 mL/minuto e cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,2 mL/minuto e cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 10 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 6,0 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 5,0 mg/minuto, entre cerca de 0,5 mL minuto e cerca de 14 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 25,0 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 15,0 mL/minuto). O volume de tampão de eluição usado para eluir a proteína recombinante proveniente de cada pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica incluindo uma resina que é capaz de realizar a operação unitária de purificação pode variar, por exemplo, entre cerca de 1X o volume da coluna (CV) e cerca de 15X CV (por exemplo, entre cerca de 1X CV e cerca de 14X CV, cerca de 1X CV e cerca de 13X CV, cerca de 1X CV e cerca de 12X CV, cerca de 1X CV e cerca de 11X CV, cerca de 2X CV e cerca de 11X CV, cerca de 3X CV e cerca de 11X CV, cerca de 4X CV e cerca de 11X CV, cerca de 5X CV e cerca de 11X CV, ou cerca de 5X CV e cerca de 10X CV). O tempo total da eluição pode variar, por exemplo, entre cerca de 2 minutos e cerca de 3 horas (por exemplo, entre cerca de 2 minutos e cerca de 2,5 horas, entre cerca de 2 minutos e cerca de 2,0 horas, entre cerca de 2 minutos e cerca de 1,5 horas, entre cerca de 2 minutos e cerca de 1,5 horas, entre cerca de 2 minutos e cerca de 1,25 horas, entre cerca de 2 minutos e cerca de 1,25 horas, entre cerca de 2 minutos e cerca de 1 hora, entre cerca de 2 minutos e cerca de 40 minutos, entre cerca de 10 minutos e cerca de 40 minutos, entre cerca de 20 minutos e cerca de 40 minutos). Exemplos não limitativos de tampões de eluição que podem ser usados nesses métodos vão depender do mecanismo de captura e/ou da proteína recombinante. Por exemplo, um tampão de eluição pode incluir uma concentração de sal diferente (por exemplo, concentração de sal aumentada), um pH diferente (por exemplo, uma concentração de sal aumentada ou diminuída), ou uma molécula que vai competir com a proteína recombinante pela ligação da resina que é capaz de realizar a operação unitária de captura. Exemplos de tais tampões de eluição para cada mecanismo de captura descrito neste relatório são bastante conhecidos na literatura.

[00126] Subsequente à eluição da proteína recombinante da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica no MCCS ou o MCCS1 que inclui uma resina que é capaz de realizar a operação unitária de captura, e antes de o volume seguinte de meio de cultura líquido poder ser carregado na pelo menos uma coluna cromatográfica ou membranas cromatográfica, a pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica deve ser equilibrada usando-se um tampão de regeneração. O tampão de regeneração pode ser passado pela pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que inclui uma resina que é capaz de realizar a operação unitária de captura a uma taxa de fluxo de, por exemplo, entre cerca de 0,2 mL/minuto e cerca de 25 mL/minuto (por exemplo, entre cerca de 0,2 mL/minuto e cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,2 mL/minuto e cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 10 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 6,0 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 5,0 mg/minuto, entre cerca de 0,5 mL minuto e cerca de 14 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 25,0 mL/minuto, entre cerca de 5,0 mL/minuto e cerca de 15,0 mL/minuto, ou entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 15,0 mL/minuto). Em alguns exemplos, o tampão de regeneração é um tampão desnaturante (por exemplo, qualquer um dos tampões desnaturantes ou combinações de tampões desnaturantes descritas neste relatório). O volume de tampão de regeneração usado para equilibrar a pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que inclui uma resina que é capaz de realizar a operação unitária de captura pode variar, por exemplo, entre cerca de 1X o volume da coluna (CV) e cerca de 15X CV (por exemplo, entre cerca de 1X CV e cerca de 14X CV, cerca de 1X CV e cerca de 13X CV, cerca de 1X CV e cerca de 12X CV, cerca de 1X CV e cerca de 11X CV, cerca de 2X CV e cerca de 11X CV, cerca de 3X CV e cerca de 11X CV, cerca de 2X CV e cerca de 5X CV, cerca de 4X CV e cerca de 11X CV, cerca de 5X CV e cerca de 11X CV, ou cerca de 5X CV e cerca de 10X CV).

[00127] Em alguns dos processos descritos nesta invenção, o MCCS ou MCCS1 inclui um reservatório que contém um fluido incluindo a proteína recombinante a um pH baixo (por exemplo, um pH inferior a 4,6, inferior a 4,4, inferior a 4,2, inferior a 4,0, inferior a 3,8, inferior a 3,6, inferior a 3,4, inferior a 3,2, ou inferior a 3,0) por, por exemplo, cerca de 1 minuto a 1,5 horas (por exemplo, cerca de 1 hora), e inativa o vírus presente em um fluido incluindo a proteína recombinante. Um exemplo de um reservatório que pode ser usado para realizar a operação unitária de inativação de vírus é um frasco de agitação (por exemplo, um frasco de agitação de 500 mL, por exemplo, um frasco de agitação de 500 mL com uma placa de agitação programada) que é capaz de conter um fluido incluindo uma proteína recombinante por, por exemplo, cerca de 1 minuto a 1,5 horas, por exemplo, antes de o fluido incluindo a proteína recombinante ser alimentado o MCCS2. O reservatório que é usado para realizar a operação unitária de inativação de vírus pode ser um frasco de agitação de 500 mL com uma placa de agitação programada (por exemplo, uma placa de agitação programada para misturar (por exemplo, misturar periodicamente) o fluido dentro do reservatório, por exemplo, a cada 4 horas). Um outro exemplo de um reservatório que pode ser usado para realizar a operação unitária de inativação de vírus é uma bolsa de plástico (por exemplo, uma bolsa de plástico de 500 mL) que é capaz de conter um fluido incluindo uma proteína recombinante por, por exemplo, cerca de 1 minuto a 1,5 horas, por exemplo, antes de o fluido incluindo a proteína recombinante ser alimentado no MCCS2. Em alguns exemplos, o fluido incluindo a proteína recombinante já pode ter um pH baixo (por exemplo, um pH inferior a 4,6, inferior a 4,4, inferior a 4,2, inferior a 4,0, inferior a 3,8, inferior a 3,6, inferior a 3,4, inferior a 3,2, ou inferior a 3,0) quando é alimentado no reservatório que é usado para realizar a operação unitária de inativação de vírus. Como pode ser apreciado pelos especialistas na técnica, uma variedade de outros meios podem ser usados para realizar a operação unitária de inativação de vírus. Por exemplo, irradiação de um fluido incluindo a proteína recombinante com UV também pode ser usada para realizar a operação unitária de inativação de vírus. Exemplos não limitativos de reservatórios que podem ser usados para realizar a operação unitária de inativação de vírus presentes em um fluido incluindo a proteína recombinante estão descritos neste relatório.

[00128] O MCCS ou MCCS1 pode incluir um PCCS incluindo quatro colunas cromatográficas, onde pelo menos três das quatro colunas cromatográficas realizam a operação unitária de captura a proteína recombinante proveniente do meio de cultura líquido (por exemplo, usando um MCCS que inclui qualquer uma das pelo menos uma coluna cromatográfica que incluem uma resina que é capaz de realizar a operação unitária de captura (por exemplo, qualquer uma daquelas descritas neste relatório)). Nestes exemplos, a quarta coluna do PCC pode realizar a operação unitária de inativação de vírus em um fluido que inclui a proteína recombinante (por exemplo, qualquer uma das colunas exemplificativas descritas neste relatório que podem ser usadas para obter a inativação de vírus de um fluido incluindo a proteína recombinante).

[00129] Em alguns exemplos, um fluido incluindo a proteína recombinante é continuamente eluído do MCCS1 (por exemplo, PCCS1), e é continuamente alimentado no MCCS2 (por exemplo, PCCS2). A percentagem da proteína recombinante recuperada no eluato do MCCS ou MCCS1 (por exemplo, PCCS ou PCCS1) pode ser de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 72%, pelo menos 74%, pelo menos 76%, pelo menos 78%, pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, ou pelo menos 98%). O eluato proveniente do MCCS1 (por exemplo, PCCS1) pode ser alimentado no MCCS2 (por exemplo, PCCS2) usando-se uma variedade de meios conhecidos na literatura (por exemplo, tubulação). O eluato proveniente do MCCS1 (por exemplo, PCCS1) pode ser alimentado no MCCS2 (por exemplo, PCCS2) a uma taxa de fluxo de, por exemplo, entre cerca de 0,2 mL/minuto e cerca de 25 mL/minuto (por exemplo, entre cerca de 0,2 mL/minuto e cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,2 mL/minuto e cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 10 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 6,0 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 5,0 mg/minuto, entre cerca de 0,5 mL minuto e cerca de 14 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 25,0 mL/minuto, entre cerca de 5,0 mL/minuto e cerca de 15,0 mL/minuto, entre cerca de 15 mL/minuto e cerca de 25 mL/minuto, ou entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 15,0 mL/minuto).

[00130] Alguns processos descritos neste relatório podem incluir ainda uma etapa de ajuste da concentração iônica e/ou do pH do eluato from o MCCS1 (por exemplo, PCCS1) antes de ele ser alimentado no MCCS2 (por exemplo, PCCS2). Como descrito neste relatório, a concentração iônica e/ou o pH do eluato proveniente do MCCS1 (por exemplo, PCCS1) podem ser ajustados (antes de ele ser alimentado no MCCS2) por adição de um tampão ao eluato (por exemplo, através do uso de um reservatório de ajuste de tampão em linha). O tampão pode ser adicionado ao eluato proveniente do MCCS1 a uma taxa de fluxo de, por exemplo, entre cerca de 0,1 mL/minuto e cerca de 15 mL/minuto (por exemplo, entre cerca de 0,1 mL/minuto e cerca de 12,5 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto e cerca de 10,0 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto e cerca de 8,0 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto e cerca de 6 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto e 4 mL/minuto, ou entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 5 mL/minuto).

[00131] Os processos descritos nesta invenção podem incluir ainda uma etapa de contenção ou armazenamento (e opcionalmente também refrigeração do eluato proveniente do MCCS1 antes da alimentação do eluato proveniente do MCCS1 no MCCS2. Como descrito neste relatório, essa etapa de contenção ou armazenamento pode ser efetuada usando-se qualquer um dos reservatórios (por exemplo, tanques de apoio) descritos neste relatório.

[00132] Os processos descritos nesta invenção também podem incluir uma etapa de filtração do eluato proveniente do MCCS1 antes de o eluato ser alimentado no MCCS2. Qualquer um dos filtros ou métodos de filtração exemplificativos descritos neste relatório pode ser usado para filtrar o eluato proveniente do MCCS1 antes de o eluato ser alimentado no MCCS2.

Polimento e purificação da proteína recombinante

[00133] O MCCS, MCCS1, e/ou MCCS2 podem ser usados para realizar a operação unitária de purificação e polimento da proteína recombinante. Por exemplo, o MCCS2 pode ser usado para realizar a operação de purificação e polimento da proteína recombinante e o eluato proveniente do MCCS2 é uma substância medicamentosa à base de proteína. O MCCS, MCCS1, e/ou MCCS2 podem incluir pelo menos uma (por exemplo, dois, três, ou quatro) coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de purificação de uma proteína recombinante, e pelo menos uma (por exemplo, dois, três, ou quatro) coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de polimento da proteína recombinante.

[00134] A pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de purificação da proteína recombinante pode incluir uma resina que utiliza um mecanismo de captura (por exemplo, qualquer um dos mecanismos de captura descritos neste relatório ou conhecidos na literatura), ou uma resina que pode ser usada para realizar cromatografia por troca aniônica, por troca catiônica, em peneira molecular, ou por interação hidrofóbica. A pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de polimento da proteína recombinante pode incluir uma resina que pode ser usada para realizar cromatografia por troca aniônica, por troca catiônica, em peneira molecular, ou por interação hidrofóbica (por exemplo, qualquer uma das resinas exemplificação para realização de cromatografia por troca aniônica, por troca catiônica, em peneira molecular, ou por interação hidrofóbica descritas neste relatório ou conhecidas na literatura).

[00135] O tamanho, o formato, e o volume da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de purificação da proteína recombinante, e/ou o tamanho e formato da pelo menos uma membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de polimento da proteína recombinante podem ser qualquer combinação dos tamanhos, formatos, e volumes exemplificativos de colunas cromatográficas ou membranas cromatográficas descritos neste relatório. Como pode ser apreciado pelo especialista na técnica, a etapa de purificação ou polimento de uma proteína recombinante pode, por exemplo, incluir as etapas de carregamento, lavagem, eluição, e equilíbrio da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica usada para realizar a operação unitária de purificação ou polimento da proteína recombinante. Tipicamente, o tampão de eluição que sai de uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica usada para realizar a operação unitária de purificação inclui a proteína recombinante. Tipicamente, o carregamento e/ou tampão de lavagem que sai de uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica usada para realizar a operação unitária de polimento inclui a proteína recombinante.

[00136] Por exemplo, o tamanho da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de purificação da proteína recombinante pode ter um volume de, por exemplo, entre cerca de 2,0 mL e cerca de 200 mL (por exemplo, entre cerca de 2,0 mL e cerca de 180 mL, entre cerca de 2,0 mL e cerca de 160 mL, entre cerca de 2,0 mL e cerca de 140 mL, entre cerca de 2,0 mL e cerca de 120 mL, entre cerca de 2,0 mL e cerca de 100 mL, entre cerca de 2,0 mL e cerca de 80 mL, entre cerca de 2,0 mL e cerca de 60 mL, entre cerca de 2,0 mL e cerca de 40 mL, entre cerca de 5,0 mL e cerca de 40 mL, entre cerca de 2,0 mL e cerca de 30 mL, entre cerca de 5,0 mL e cerca de 30 mL, ou entre cerca de 2,0 mL e cerca de 25 mL). A taxa de fluxo do fluido incluindo a proteína recombinante quando ele é carregado na pelo menos uma coluna cromatográfica ou pelo menos uma membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de purificação da proteína recombinante pode variar, por exemplo, entre cerca de 0,1 mL/minuto e cerca de 25 mL/minuto (por exemplo, entre cerca de 0,1 mL/minuto e cerca de 12,5 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto e cerca de 10,0 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto e cerca de 8,0 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto e cerca de 6 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto e 4 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto e cerca de 3 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto e cerca de 2 mL/minuto, ou cerca de 0,2 mL/minuto e cerca de 4 mL/minuto). A concentração da proteína recombinante no fluido carregado na pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de purificação da proteína recombinante pode variar, por exemplo, entre cerca de 0,05 mg/mL e cerca de 100 mg/mL proteína recombinante (por exemplo, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 90 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 80 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 70 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 60 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 50 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 40 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 30 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 20 mg/mL, entre 0,5 mg/mL e cerca de 20 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 15 mg/mL, entre cerca de 0,5 mg/mL e cerca de 15 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 10 mg/mL, ou entre cerca de 0,5 mg/mL e cerca de 10 mg/mL proteína recombinante). A resina na pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica usada para realizar a operação unitária de purificação pode ser uma resina que pode ser usada para realizar cromatografia por troca aniônica ou cromatografia por troca catiônica. A resina na pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que é usada para realizar a operação unitária de purificação pode ser uma resina de troca catiônica (por exemplo, a resina Capto-S, GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ).

[00137] Subsequente ao carregamento da proteína recombinante na pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de purificação da proteína recombinante, a pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica é lavada com pelo menos um tampão de lavagem. Como deve ser apreciado na técnica, o pelo menos um (por exemplo, dois, três, ou quatro) tampão de lavagem deve eluir todas as proteínas que não são a proteína recombinante da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membranas cromatográfica, sem perturbar a interação da proteína recombinante com a resina ou de alguma forma eluir a proteína recombinante.

[00138] O tampão de lavagem pode ser passado pela pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica a uma taxa de fluxo de entre cerca de 0,2 mL/minuto e cerca de 25 mL/minuto (por exemplo, entre cerca de 0,2 mL/minuto e cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,2 mL/minuto e cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 10 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL minuto e cerca de 14 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 25,0 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 15,0 mL/minuto), O volume de tampão de lavagem usado (por exemplo, o volume total combinado de tampão de lavagem usado quando mais de um tampão de lavagem é usado) pode variar, por exemplo, entre cerca de 1X o volume da coluna (CV) e cerca de 15X CV (por exemplo, entre cerca de 1X CV e cerca de 14X CV, cerca de 1X CV e cerca de 13X CV, cerca de 1X CV e cerca de 12X CV, cerca de 1X CV e cerca de 11X CV, cerca de 2X CV e cerca de 11X CV, cerca de 3X CV e cerca de 11X CV, cerca de 4X CV e cerca de 11X CV, cerca de 2,5X CV e cerca de 5,0X CV, cerca de 5X CV e cerca de 11X CV, ou cerca de 5X CV e cerca de 10X CV). O tempo total da lavagem pode variar, por exemplo, entre cerca de 2 minutos e cerca de 3 horas (por exemplo, entre cerca de 2 minutos e cerca de 2,5 horas, entre cerca de 2 minutos e cerca de 2,0 horas, entre cerca de 5 minutos e cerca de 1,5 horas, entre cerca de 10 minutos e cerca de 1,5 horas, entre cerca de 10 minutos e cerca de 1,25 horas, entre cerca de 20 minutos e cerca de 1,25 horas, entre cerca de 30 minutos e cerca de 1 hora, entre cerca de 2 minutos e 10 minutos, entre cerca de 2 minutos e 15 minutos, ou entre cerca de 2 minutos e 30 minutos).

[00139] Subsequente à lavagem da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica usada para realizar a operação unitária de purificação da proteína recombinante, a proteína recombinante é eluída da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica por passagem de um tampão de eluição pela pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica usada para realizar a operação unitária de purificação da proteína recombinante. O tampão de eluição pode ser passado pela pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de purificação da proteína recombinante a uma taxa de fluxo de entre cerca de 0,2 mL/minuto e cerca de 25 mL/minuto (por exemplo, entre cerca de 0,2 mL/minuto e cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,2 mL/minuto e cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 10 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 6,0 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 5,0 mg/minuto, entre cerca de 0,5 mL minuto e cerca de 14 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 25,0 mL/minuto, ou entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 15,0 mL/minuto). O volume do tampão de eluição usado para eluir a proteína recombinante de cada pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de purificação da proteína recombinante pode variar, por exemplo, entre cerca de 1X o volume da coluna (CV) e cerca de 25X CV (por exemplo, entre cerca de 1X CV e cerca de 20X CV, entre cerca de 15X CV e cerca de 25X CV, entre cerca de 1X CV e cerca de 14X CV, cerca de 1X CV e cerca de 13X CV, cerca de 1X CV e cerca de 12X CV, cerca de 1X CV e cerca de 11X CV, cerca de 2X CV e cerca de 11X CV, cerca de 3X CV e cerca de 11X CV, cerca de 4X CV e cerca de 11X CV, cerca de 5X CV e cerca de 11X CV, ou cerca de 5X CV e cerca de 10X CV). O tempo total da eluição pode variar, por exemplo, entre cerca de 2 minutos e cerca de 3 horas (por exemplo, entre cerca de 2 minutos e cerca de 2,5 horas, entre cerca de 2 minutos e cerca de 2,0 horas, entre cerca de 2 minutos e cerca de 1,5 horas, entre cerca de 2 minutos e cerca de 1,5 horas, entre cerca de 2 minutos e cerca de 1,25 horas, entre cerca de 2 minutos e cerca de 1,25 horas, entre cerca de 2 minutos e cerca de 1 hora, entre cerca de 2 minutos e cerca de 40 minutos, entre cerca de 10 minutos e cerca de 40 minutos, entre cerca de 20 minutos e cerca de 40 minutos, ou entre cerca de 30 minutos e 1,0 hora). Exemplos não limitativos de tampões de eluição que podem ser usados nesses métodos vão depender da resina e/ou das propriedades biofísicas da proteína recombinante. Por exemplo, um tampão de eluição pode incluir uma concentração diferente de sal (por exemplo, uma concentração aumentada de sal), um pH diferente (por exemplo, uma concentração aumentada ou diminuída de sal), ou uma molécula que vai competir com a proteína recombinante pela ligação à resina. Exemplos de tais tampões de eluição para cada um dos mecanismos de captura exemplificativos descritos neste relatório são bastante conhecidos na literatura.

[00140] Subsequente à eluição da proteína recombinante da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica usada para realizar a operação unitária de purificação da proteína recombinante, e antes de volume de fluido seguinte incluindo uma proteína recombinante poder ser passado pela pelo menos uma coluna cromatográfica ou membranas cromatográfica, a pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica deve ser equilibrada usando-se um tampão de regeneração. O tampão de regeneração pode ser passado pela pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica usada para realizar a operação unitária de purificação da proteína recombinante a uma taxa de fluxo de, por exemplo, entre cerca de 0,2 mL/minuto e cerca de 25 mL/minuto (por exemplo, entre cerca de 0,2 mL/minuto e cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,2 mL/minuto e cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 10 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 6,0 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 5,0 mg/minuto, entre cerca de 0,5 mL minuto e cerca de 14 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 25,0 mL/minuto, entre cerca de 5,0 mL/minuto e cerca de 15,0 mL/minuto, ou entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 15,0 mL/minuto). O volume de tampão de regeneração usado para equilibrar a pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que inclui uma resina que pode ser usada para realizar a operação unitária de purificação da proteína recombinante pode variar, por exemplo, entre cerca de 1X o volume da coluna (CV) e cerca de 15X CV (por exemplo, entre cerca de 1X CV e cerca de 14X CV, entre cerca de 1X CV e cerca de 13X CV, entre cerca de 1X CV e cerca de 12X CV, entre cerca de 1X CV e cerca de 11X CV, entre cerca de 2X CV e cerca de 11X CV, entre cerca de 3X CV e cerca de 11X CV, entre cerca de 2X CV e cerca de 5X CV, entre cerca de 2.5X CV e cerca de 7.5X CV, entre cerca de 4X CV e cerca de 11X CV, entre cerca de 5X CV e cerca de 11X CV, ou entre cerca de 5X CV e cerca de 10X CV). A concentração de proteína recombinante no eluato da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica usada para realizar a operação unitária de purificação da proteína recombinante pode variar, por exemplo, entre cerca de 0,05 mg/mL e cerca de 100 mg/mL proteína recombinante (por exemplo, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 90 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 80 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 70 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 60 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 50 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 40 mg/mL, entre cerca de 2,5 mg/mL e cerca de 7,5 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 30 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 20 mg/mL, entre 0,5 mg/mL e cerca de 20 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 15 mg/mL, entre cerca de 0,5 mg/mL e cerca de 15 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 10 mg/mL, ou entre cerca de 0,5 mg/mL e cerca de 10 mg/mL proteína recombinante).

[00141] A pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de polimento da proteína recombinante pode incluir uma resina que pode ser usada para efetuar cromatografia por troca catiônica, cromatografia por troca aniônica, ou cromatografia em peneira molecular. Como pode ser apreciado na técnica, o polimento uma proteína recombinante usando a pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de polimento da proteína recombinante pode incluir, por exemplo, as etapas de carregamento, embutidura, e regeneração da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de polimento da proteína recombinante. Por exemplo, quando as etapas de carregamento, embutidura, e regeneração são usadas para efetuar o polimento, a proteína recombinante não liga a resina na pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que é usada para realizar a operação unitária de polimento da proteína recombinante, e a proteína recombinante é eluída da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica nas etapas de carregamento e embutidura, e a etapa de regeneração é usada para remover quaisquer impurezas da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica antes de fluido adicionado incluindo a proteína recombinante poder ser carregado na pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica. Taxas de fluxo e volumes de tampão exemplificativos a serem usados em cada das etapas de carregamento, embutidura, e regeneração estão descritos abaixo.

[00142] O tamanho, o formato, e o volume da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de polimento da proteína recombinante, e/ou o tamanho e formato da pelo menos uma membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de polimento da proteína recombinante podem ser qualquer combinação dos tamanhos, formatos, e volumes exemplificativos das colunas cromatográficas ou membranas cromatográficas descritas neste relatório. Por exemplo, o tamanho da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de polimento da proteína recombinante pode ter um volume de, por exemplo, entre cerca de 0,5 mL e cerca de 200 mL (por exemplo, entre cerca de 0,5 mL e cerca de 180 mL, entre cerca de 0,5 mL e cerca de 160 mL, entre cerca de 0,5 mL e cerca de 140 mL, entre cerca de 0,5 mL e cerca de 120 mL, entre cerca de 0,5 mL e cerca de 100 mL, entre cerca de 0,5 mL e cerca de 80 mL, entre cerca de 0,5 mL e cerca de 60 mL, entre cerca de 0,5 mL e cerca de 40 mL, entre cerca de 5,0 mL e cerca de 40 mL, entre cerca de 0,5 mL e cerca de 30 mL, entre cerca de 5,0 mL e cerca de 30 mL, entre cerca de 0,5 mL e cerca de 25 mL, entre cerca de 0,2 mL e cerca de 10 mL, ou entre cerca de 0,2 mL e cerca de 5 mL). A taxa de fluxo do fluido incluindo a proteína recombinante quando ele é carregado no pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de polimento da proteína recombinante pode variar, por exemplo, entre cerca de 0,1 mL/minuto e cerca de 25 mL/minuto (por exemplo, entre cerca de 0,1 mL/minuto e cerca de 12,5 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto e cerca de 10,0 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto e cerca de 8,0 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto e cerca de 6 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto to 4 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto e cerca de 3 mL/minuto, entre cerca de 2 mL/minuto e cerca de 6 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto e cerca de 2 mL/minuto, ou cerca de 0,2 mL/minuto e cerca de 4 mL/minuto). O volume total de fluido incluindo uma proteína recombinante carregado na pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de polimento da proteína recombinante pode variar, por exemplo, entre cerca de 1,0 mL e cerca de 250 mL (por exemplo, entre cerca de 1,0 mL e cerca de 225 mL, entre cerca de 1,0 mL e cerca de 200 mL, entre cerca de 1,0 mL e cerca de 175 mL, entre cerca de 1,0 mL e cerca de 150 mL, entre cerca de 100 mL e cerca de 125 mL, entre cerca de 100 mL e cerca de 150 mL, entre cerca de 1,0 mL e cerca de 150 mL, entre cerca de 1,0 mL e cerca de 125 mL, entre cerca de 1,0 mL e cerca de 100 mL, entre cerca de 1,0 mL e cerca de 75 mL, entre cerca de 1,0 mL e cerca de 50 mL, ou entre cerca de 1,0 mL e cerca de 25 mL). A resina na pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica usada para realizar o polimento pode ser uma resina de troca aniônica ou de troca catiônica. A resina na pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que é usada para realizar a operação unitária de polimento pode ser uma resina de troca catiônica (por exemplo, resina Sartobind® Q, Sartorius, Goettingen, Alemanha).

[00143] Subsequente à etapa de carregamento, é efetuada a etapa de embutidura (por exemplo, um tampão de embutidura é passado pela menos uma membrana cromatográfica ou membrana cromatográfica para coletar a proteína recombinante que não se liga substancialmente à pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica). Nestes exemplos, o tampão de embutidura pode ser passado pela pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica a uma taxa de fluxo de entre cerca de 0,2 mL/minuto e cerca de 50 mL/minuto (por exemplo, entre cerca de 1 mL/minuto e cerca de 40 mL/minuto, entre cerca de 1 mL/minuto e cerca de 30 mL/minuto, entre cerca de 5 mL/minuto e cerca de 45 mL/minuto, entre cerca de 10 mL/minuto e cerca de 40 mL/minuto, entre cerca de 0,2 mL/minuto e cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,2 mL/minuto e cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 10 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL minuto e cerca de 14 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 25,0 mL/minuto, ou entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 15,0 mL/minuto). O volume de tampão de embutidura usado pode variar, por exemplo, entre cerca de 1X o volume da coluna (CV) e cerca de 100X CV (por exemplo, entre cerca de 1X CV e cerca de 90X CV, entre cerca de 1X CV e cerca de 80X CV, entre cerca de 1X CV e cerca de 70X CV, entre cerca de 1X CV e cerca de 60X CV, entre cerca de 1X e cerca de 50X CV, entre cerca de 1X CV e cerca de 40X CV, entre cerca de 1X CV e cerca de 30X CV, entre cerca de 1X CV e cerca de 20X CV, entre cerca de 1X CV e cerca de 15X CV, entre cerca de 5X CV e cerca de 20X CV, entre cerca de 5 X CV e cerca de 30X CV, entre cerca de 1X CV e cerca de 14X CV, cerca de 1X CV e cerca de 13X CV, cerca de 1X CV e cerca de 12X CV, cerca de 1X CV e cerca de 11X CV, cerca de 2X CV e cerca de 11X CV, cerca de 3X CV e cerca de 11X CV, cerca de 4X CV e cerca de 11X CV, cerca de 2,5X CV e cerca de 5,0X CV, cerca de 5X CV e cerca de 11X CV, ou cerca de 5X CV e cerca de 10X CV). O tempo total da embutidura pode variar, por exemplo, entre cerca de 1 minuto e cerca de 3 horas (por exemplo, entre cerca de 1 minuto e cerca de 2,5 horas, entre cerca de 1 minuto e cerca de 2,0 horas, entre cerca de 1 minutos e cerca de 1,5 horas, entre cerca de 2 minutos e cerca de 1,5 horas, entre cerca de 1 minutos e cerca de 1,25 horas, entre cerca de 2 minutos e cerca de 1,25 horas, entre cerca de 1 minuto e cerca de 5 minutos, entre cerca de 1 minuto e cerca de 10 minutos, entre cerca de 2 minutos e cerca de 4 minutos, entre cerca de 30 minutos e cerca de 1 hora, entre cerca de 2 minutos e 10 minutos, entre cerca de 2 minutos e 15 minutos, ou entre cerca de 2 minutos e 30 minutos), A concentração combinada de proteína recombinante presente no eluato que atravessa a coluna na etapa de carregamento e na etapa de embutidura pode variar, por exemplo, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 100 mg/mL de proteína recombinante (por exemplo, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 90 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 80 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 70 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 60 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 50 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 40 mg/mL, entre cerca de 2,5 mg/mL e cerca de 7,5 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 30 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 20 mg/mL, entre 0,5 mg/mL e cerca de 20 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 15 mg/mL, entre cerca de 0,5 mg/mL e cerca de 15 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 10 mg/mL, entre cerca de 0,5 mg/mL e cerca de 10 mg/mL, ou entre cerca de 1 mg/mL e cerca de 5 mg/mL de proteína recombinante).

[00144] Subsequente à etapa de embutidura e antes de o volume de fluido seguinte incluindo a proteína recombinante ser carregado na pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de polimento, a pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica deve ser regenerada usando-se um tampão de regeneração. O tampão de regeneração deve ser passado pela pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de polimento da proteína recombinante a uma taxa de fluxo de, por exemplo, entre cerca de 0,2 mL/minuto e cerca de 50 mL/minuto (por exemplo, entre cerca de 1 mL/minuto e cerca de 40 mL/minuto, entre cerca de 1 mL/minuto e cerca de 30 mL/minuto, entre cerca de 5 mL/minuto e cerca de 45 mL/minuto, entre cerca de 10 mL/minuto e cerca de 40 mL/minuto, entre cerca de 0,2 mL/minuto e cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,2 mL/minuto e cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 10 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL minuto e cerca de 14 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 25,0 mL/minuto, ou entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 15,0 mL/minuto). O volume de tampão de regeneração usado para regenerar a pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de polimento pode variar, por exemplo, entre cerca de 1X o volume da coluna (CV) e cerca de 500X CV (por exemplo, entre cerca de 1X CV e cerca de 450X CV, entre cerca de 1X CV e cerca de 400X CV, entre cerca de 1X CV e cerca de 350X CV, entre cerca de 1X CV e cerca de 300X CV, entre cerca de 1X CV e cerca de 250X CV, entre cerca de 1X CV e cerca de 200X CV, entre cerca de 1X CV e cerca de 150X CV, entre cerca de 1X CV e cerca de 100 X CV, entre cerca de 1X CV e cerca de 90X CV, entre cerca de 1X CV e cerca de 80X CV, entre cerca de 1X CV e cerca de 70X CV, entre cerca de 1X CV e cerca de 60X CV, entre cerca de 1X e cerca de 50X CV, entre cerca de 1X CV e cerca de 40X CV, entre cerca de 1X CV e cerca de 30X CV, entre cerca de 1X CV e cerca de 20X CV, entre cerca de 1X CV e cerca de 15X CV, entre cerca de 5X CV e cerca de 20X CV, entre cerca de 5 X CV e cerca de 30X CV, entre cerca de 1X CV e cerca de 14X CV, cerca de 1X CV e cerca de 13X CV, cerca de 1X CV e cerca de 12X CV, cerca de 1X CV e cerca de 11X CV, cerca de 2X CV e cerca de 11X CV, cerca de 3X CV e cerca de 11X CV, cerca de 4X CV e cerca de 11X CV, cerca de 2.5X CV e cerca de 5,0X CV, cerca de 5X CV e cerca de 11X CV, ou cerca de 5X CV e cerca de 10X CV).

[00145] Em outros exemplos, a uma ou mais colunas cromatográficas e/ou membranas cromatográficas usadas para realizar a operação unitária de polimento incluem uma resina que liga seletivamente ou retém as impurezas presentes em um fluido incluindo a proteína recombinante, e no lugar de regenerar a uma ou mais colunas e/ou membranas, a uma ou mais colunas e/ou membranas são substituídas (por exemplo, substituídas por colunas e/ou membranas substancialmente similares) depois que a capacidade de ligação da resina na uma ou mais colunas e/ou membranas tiver sido atingida ou estiver substancialmente perto de ser atingida.

[00146] Em alguns exemplos desses processos descritos nesta invenção, o MCCS2 inclui um PCCS incluindo três colunas cromatográficas e uma membrana cromatográfica, por exemplo, onde the três colunas cromatográficas no PCCS realizam a operação unitária de purificação da proteína recombinante (por exemplo, usando pelo menos uma coluna cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de purificação da proteína) e a membrana cromatográfica no PCCS realiza a operação unitária de polimento da proteína recombinante. Nestes exemplos, a membrana cromatográfica no PCCS que pode ser usada para realizar a operação unitária de polimento da proteína terapêutica pode ser qualquer uma das membranas cromatográficas exemplificativas descritas neste relatório que podem ser usadas para realizar a operação unitária de polimento da proteína recombinante. Qualquer um dos métodos de comutação de colunas descritos neste relatório pode ser usado para determinar quando as três primeiras colunas cromatográficas e a membrana cromatográfica no PCCS deste exemplo podem ser comutadas.

[00147] Algumas modalidades deste exemplo podem incluir ainda uma etapa de ajustar a concentração iônica e/ou o pH do eluato proveniente das três colunas cromatográficas no PCCS antes de o eluato ser alimentado na membrana cromatográfica no PCCS. As descritas neste relatório, a concentração iônica e/ou o pH do eluato proveniente das três colunas cromatográficas no PCCS pode ser ajustado (antes de ele ser alimentado na membrana cromatográfica no PCCS deste exemplo)) por adição de um tampão ao eluato das três colunas cromatográficas no PCCS (por exemplo, através do uso de um reservatório de ajuste de tampão em linha). O tampão pode ser adicionado ao eluato a uma taxa de fluxo de, por exemplo, entre cerca de 0,1 mL/minuto e cerca de 15 mL/minuto (por exemplo, entre cerca de 0,1 mL/minuto e cerca de 12,5 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto e cerca de 10,0 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto e cerca de 8,0 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto e cerca de 6 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto e 4 mL/minuto, ou entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 5 mL/minuto).

[00148] Estes exemplos podem incluir ainda uma etapa de contenção ou armazenamento do eluato proveniente das três colunas cromatográficas no PCCS deste exemplo antes da alimentação do eluato na membrana cromatográfica (membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de polimento da proteína recombinante). Como descrito neste relatório, essa etapa de contenção ou armazenamento pode ser efetuada usando qualquer um dos reservatórios (por exemplo, tanques de apoio) descritos neste relatório.

[00149] Estes exemplos também podem incluir uma etapa de filtração do eluato proveniente da membrana cromatográfica no sistema PCCS exemplificativo (eluato da membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de polimento da proteína recombinante). Qualquer um dos filtros ou métodos de filtração exemplificativos descritos neste relatório pode ser usado para filtrar o eluato a partir da membrana cromatográfica neste PCCS exemplificativo (eluato da membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de polimento da proteína recombinante).

[00150] Como observado pelos especialistas na técnica, a proteína recombinante purificada pode ser periodicamente eluída do MCCS ou MCCS2 usando qualquer um dos processos descritos nesta invenção. Por exemplo, qualquer um dos processos descritos nesta invenção pode eluir a proteína recombinante purificada por uma duração de, por exemplo, entre cerca de 30 segundos e cerca de 5 horas (por exemplo, entre cerca de 1 minuto e cerca de 4 horas, entre cerca de 1 minuto e cerca de 3 horas, entre cerca de 1 minuto e cerca de 2 horas, entre cerca de 1 minuto ou cerca de 1,5 horas, entre cerca de 1 minuto e cerca de 1 hora, ou entre cerca de 1 minuto e cerca de 30 minutos) a uma frequência de, por exemplo, entre cerca de 1 minuto e cerca de 6 horas (por exemplo, entre cerca de 1 minuto e cerca de 5 horas, entre cerca de 1 minuto e cerca de 4 horas, entre cerca de 1 minuto e cerca de 3 horas, entre cerca de 1 minuto e 2 horas, entre cerca de 1 minuto e 1 hora, ou entre cerca de 1 minuto e 30 minutos), dependendo, por exemplo, das colunas cromatográficas e/ou membranas cromatográficas usadas no MCCS ou no MCCS1 e MCCS2.

Métodos de cultura

[00151] Alguns dos processos descritos nesta invenção incluem ainda uma etapa de cultivar células (por exemplo, células de mamífero recombinantes) que secretam uma proteína recombinante em um biorreator (por exemplo, um biorreator de perfusão ou alimentação intermitente) que inclui um meio de cultura líquido, onde um volume do meio de cultura líquido que é substancialmente livre de células (por exemplo, células de mamífero) é contínua ou periodicamente removido do biorreator (por exemplo, biorreator de perfusão) e alimentado no MCCS ou MCCS1. O biorreator pode ter um volume de, por exemplo, entre cerca de 1 L e cerca de 10.000 L (por exemplo, entre cerca de 1 L e cerca de 50 L, entre cerca de 50 L e cerca de 500 L, entre cerca de 500 L e cerca de 1000 L, entre 500 L e cerca de 5000L, entre cerca de 500 L e cerca de 10.000 L, entre cerca de 5000 L e cerca de 10.000 L, entre cerca de 1 L e cerca de 10.000 L, entre cerca de 1L e cerca de 8.000 L, entre cerca de 1 L e cerca de 6.000 L, entre cerca de 1 L e cerca de 5.000 L, entre cerca de 100 L e cerca de 5.000 L, entre cerca de 10 L e cerca de 100 L, entre cerca de 10 L e cerca de 4.000 L, entre cerca de 10 L e cerca de 3.000 L, entre cerca de 10 L e cerca de 2.000 L, ou entre cerca de 10 L e cerca de 1.000 L). A quantidade de meio de cultura líquido presente em um biorreator pode variar, por exemplo, entre cerca de entre cerca de 0,5 L e cerca de 5.000 L (por exemplo, entre cerca de 0,5 L e cerca de 25 L, entre cerca de 25 L e cerca de 250 L, entre cerca de 250 L e cerca de 500 L, entre 250 L e cerca de 2500 L, entre cerca de 250 L e cerca de 5.000 L, entre cerca de 2500 L e cerca de 5.000 L, entre cerca de 0,5 L e cerca de 5.000 L, entre cerca de 0,5 L e cerca de 4.000 L, entre cerca de 0,5 L e cerca de 3.000 L, entre cerca de 0,5 L e cerca de 2.500 L, entre cerca de 50 L e cerca de 2.500 L, entre cerca de 5 L e cerca de 50 L, entre cerca de 5 L e cerca de 2.000 L, entre cerca de 5 L e cerca de 1.500 L, entre cerca de 5 L e cerca de 1.000 L, ou entre cerca de 5 L e cerca de 500 L). a cultura de células pode ser feita, por exemplo, usando um biorreator de alimentação intermitente ou um biorreator de perfusão. Exemplos não limitativos e diferentes aspectos de cultura de células (por exemplo, cultura de células de mamífero) estão descritos abaixo e podem ser usados em qualquer combinação.

Células

[00152] As células que são cultivadas em alguns dos processos descritos nesta invenção podem ser bactérias (por exemplo, bactérias gram negativas), levedura (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, ou Arxula adeninivorans), ou células de mamífero. A célula de mamífero pode ser uma célula que cresce em suspensão ou uma célula aderente. Exemplos não limitativos de células de mamífero que podem ser cultivadas em qualquer um dos processos descritos nesta invenção incluem: células de ovário de hamster chinês (CHO) (por exemplo, células CHO DG44 ou células CHO-K1s), Sp2.0, células de mieloma (por exemplo, NS/0), células B, células de hibridoma, células T, células de rim embrionário humano (HEK) (por exemplo, HEK 293E e HEK 293F), células epiteliais de rim de macaco-verde afriano (Vero), e células epiteliais de rim de Madin-Darby Canove (Cocker Spaniel) (MDCK). Em alguns exemplos onde uma célula aderente é cultivada, a cultura também pode incluir uma pluralidade de microcarreadores (por exemplo, microcarreadores que incluem um ou mais poros). Células de mamífero adicionais que podem ser cultivadas em qualquer um dos processos descritos nesta invenção são conhecidas na literatura.

[00153] A célula de mamífero pode incluir um ácido nucleico recombinante (por exemplo, um ácido nucleico estavelmente integrado no genoma da célula de mamífero) que codifica uma proteína recombinante (por exemplo, uma proteína recombinante). Exemplos não limitativos de ácidos nucleicos recombinantes que codificam proteínas recombinantes exemplificativas estão descritos abaixo, assim como proteínas recombinantes que podem ser produzidas usando os métodos descritos nesta invenção. Em alguns casos, a célula de mamífero que é cultivada em um biorreator (por exemplo, qualquer um dos biorreatores descritos neste relatório) foi derivada de uma cultura maior.

[00154] Um ácido nucleico codificando uma proteína recombinante pode ser introduzido em uma célula de mamífero usando-se uma ampla variedade de métodos conhecidos em biologia molecular e genética molecular. Exemplos não limitativos incluem transfecção (por exemplo, lipofecção), transdução (por exemplo, lentivírus, adenovírus, ou retrovírus infecção), e electroporação. Em alguns casos, o ácido nucleico que codifica uma proteína recombinante não está estavelmente integrado em um cromossoma da célula de mamífero (transfecção transitória), enquanto que em outros o ácido nucleico está integrado. Alternativamente ou adicionalmente, o ácido nucleico codificando uma proteína recombinante pode estar presente em um plasmídio e/ou em um cromossoma artificial de mamífero (por exemplo, um cromossoma artificial humano). Alternativamente ou adicionalmente, o ácido nucleico pode ser introduzido na célula usando-se um vetor viral (por exemplo, um vetor de lentivírus, retrovírus, ou adenovírus). O ácido nucleico pode ser operacionalmente ligado a uma sequência de promotor (por exemplo, um promotor forte, tal como um promotor de β-actina e um promotor de CMV, ou um promotor induzível). Um vetor incluindo o ácido nucleico também pode, se desejado, incluir um marcador selecionável (por exemplo, um gene que confere resistência à higromicina, puromicina, ou neomicina à célula de mamífero).

[00155] Em alguns casos, a proteína recombinante é uma proteína secretada e é liberada pela célula de mamífero no meio extracelular (por exemplo, o primeiro e/ou o segundo meio de cultura líquido). Por exemplo, uma sequência de ácidos nucleicos codificando uma proteína recombinante solúvel pode incluir uma sequência que codifica um peptídio-sinal de secreção no terminal N ou C da proteína recombinante, que é clivado por uma enzima presente na célula de mamífero, e subsequentemente liberado no meio extracelular (por exemplo, o primeiro e/ou o segundo meio de cultura líquido).

Meios de cultura

[00156] Meios de cultura líquidos são conhecidos na literatura. Os meios de cultura líquidos (por exemplo, um primeiro e/ou o segundo meio de cultura de tecido) podem ser suplementados com um soro de mamífero (por exemplo, soro de bezerro fetal e soro bovino), e/ou um hormônio de crescimento ou fator de crescimento (por exemplo, insulina, transferrina, e fator de crescimento epidérmico). Alternativamente ou adicionalmente, os meios cultura líquidos (por exemplo, um primeiro e/ou segundo meio de cultura líquido) pode ser um meio de cultura líquido quimicamente definido, um meio de cultura líquido livre de componentes derivados de animais, um meio de cultura líquido livre de soro, ou um meio de cultura líquido contendo soro. Exemplos não limitativos de meios de cultura líquidos quimicamente definidos, meios de cultura líquidos livres de componentes derivados de animais, meios de cultura líquidos livres de soro, e meios de cultura líquidos contendo soro encontram-se comercialmente disponíveis.

[00157] Um meio de cultura líquido inclui tipicamente uma fonte de energia (por exemplo, um carboidrato, tal como glicose), aminoácidos essenciais (por exemplo, o conjunto básico de vinte aminoácidos mais cisteína), vitaminas e/ou outros compostos orgânicos necessários em concentrações baixas, aminoácidos livres, e/ou elementos de traço. Os meios de cultura líquidos (por exemplo, um primeiro e/ou segundo meio de cultura líquido) podem, se desejado, ser suplementados com, por exemplo, um hormônio ou fator de crescimento de mamífero (por exemplo, insulina, transferrina, ou fator de crescimento epidérmico), sais e tampões (por exemplo, sais de cálcio, magnésio, e fosfato), nucleosídeos e bases (por exemplo, adenosina, timidina, e hipoxantina), hidrolisados de proteína e tecido, e/ou qualquer combinação destes aditivos.

[00158] Uma ampla variedade de meios de cultura líquidos diferentes que podem ser usados para cultivas células (por exemplo, células de mamífero) em qualquer um dos métodos descritos nesta invenção são conhecidos na literatura. Componentes de meios que também podem ser úteis nos presentes processos incluem, porém sem limitação, hidrolisados quimicamente definidos (CD), por exemplo, peptona CD, polipeptídios CD (dois ou mais aminoácidos), e fatores de crescimento CD. Exemplos adicionais de meio de cultura de tecido líquido e componentes de meios são conhecidos na literatura.

[00159] Os especialistas na técnica vão perceber que o primeiro meio de cultura líquido e o segundo meio de cultura líquido descritos neste relatório podem ser o mesmo tipo de meio ou meios diferentes.

Características adicionais de biorreatores exemplificativos

[00160] A superfície interna de qualquer um dos biorreatores descritos neste relatório pode ter pelo menos um revestimento (por exemplo, pelo menos um revestimento de gelatina, colágeno, L-ornitina, poliestireno, e laminina), e como se sabe na técnica, um ou mais orifícios para aspersão de O2, CO2, e N2 no meio de cultura líquido, e um mecanismo de agitação para agitar o meio de cultura líquido. O biorreator pode incubar a cultura de células em uma atmosfera umidificada controlada (por exemplo, a uma umidade de mais de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95%, ou uma umidade de 100%). O biorreator também pode ser equipado com um dispositivo mecânico que é capaz de remover um volume do meio de cultura líquido do biorreator e, opcionalmente, um filtro no dispositivo mecânico que remove as células do meio de cultura líquido durante o processo de transferência do meio de cultura líquido para fora do biorreator (por exemplo, um sistema ATF ou o sistema de filtração de células descrito no Pedido de Patente Provisória Série N° 61/878.502).

Temperatura

[00161] A etapa de cultivo de células de mamífero pode ser efetuada a uma temperatura de cerca de 31°C a cerca de 40°C. Os especialistas na técnica vão perceber que a temperatura pode ser alterada em tempos específicos durante a etapa de cultivo, por exemplo, de hora em hora ou diariamente. Por exemplo, a temperatura pode ser alterada ou desviada (por exemplo, aumentada ou diminuída) em cerca de um dia, dois dias, três dias, quatro dias, cinco dias, seis dias, sete dias, oito dias, nove dias, dez dias, onde dias, doze dias, quatorze dias, quinze dias, dezesseis dias, dezessete dias, dezoito dias, dezenove dias, ou cerca de vinte dias ou mais depois da inoculação inicial do biorreator com a célula (por exemplo, célula de mamífero). Por exemplo, a temperatura pode ser desviada para cima (por exemplo, uma alteração de até ou cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou até ou cerca de 20 °C). Por exemplo, a temperatura pode ser desviada para baixo (por exemplo, uma alteração de até ou cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou até ou cerca de 20°C).

CO2

[00162] A etapa de cultivo descrita neste relatório pode incluir ainda a exposição do meio de cultura líquido no biorreator a uma atmosfera incluindo no máximo ou cerca de 15% CO2 (por exemplo, no máximo ou cerca de 14% CO2, 12% CO2, 10% CO2, 8% CO2, 6% CO2, 5% CO2, 4% CO2, 3% CO2, 2% CO2, ou no máximo ou cerca de 1% CO2).

Biorreator de perfusão

[00163] A etapa de cultivo descrita neste relatório pode ser efetuada usando-se um biorreator de perfusão. O cultivo de uma célula (por exemplo, uma célula de mamífero) em um biorreator de perfusão inclui a remoção do biorreator de um primeiro volume de um primeiro meio de cultura líquido (por exemplo, incluindo qualquer concentração de células de mamífero, por exemplo, um primeiro volume de um primeiro meio de cultura líquido que é substancialmente livre de células), e a adição de um segundo volume de um segundo meio de cultura líquido ao primeiro meio de cultura líquido. A remoção e a adição podem ser feitas simultaneamente ou sequencialmente, ou uma combinação das duas. Além disso, a remoção e a adição podem ser feitas continuamente (por exemplo, a uma taxa que remove e substitui um volume de entre 0,1% e 800% (por exemplo, entre 1% e 700%, entre 1% e 600%, entre 1% e 500%, entre 1% e 400%, entre 1% e 350%, entre 1% e 300%, entre 1% e 250%, entre 1% e 100%, entre 100% e 200%, entre 5% e 150%, entre 10% e 50%, entre 15% e 40%, entre 8% e 80%, ou entre 4% e 30%) do volume do biorreator ou do volume do primeiro meio de cultura líquido durante qualquer período de tempo dado (por exemplo, durante um período de 24 horas, durante um período de tempo incremental de cerca de 1 hora e cerca de 24 horas, ou durante um período de tempo incremental de mais de 24 horas)) ou periodicamente (por exemplo, uma vez a cada três dias, uma vez em dias alternados, uma vez ao dia, duas vezes ao dia, três vezes ao dia, quatro vezes ao dia, ou cinco vezes ao dia), ou qualquer combinação das mesmas. Onde feitas periodicamente, o volume que é removido ou substituído (por exemplo, dentro de um período de cerca de 24 horas, dentro de um período de tempo incremental de cerca de 1 hora e cerca de 24 horas, ou dentro de um período de tempo incremental de mais de 24 horas) pode variar, por exemplo, entre 0,1% e 800% (por exemplo, entre 1% e 700%, entre 1% e 600%, entre 1% e 500%, entre 1% e 400%, entre 1% e 300%, entre 1% e 200%, entre 1% e 100%, entre 100% e 200%, entre 5% e 150%, entre 10% e 50%, entre 15% e 40%, entre 8% e 80%, ou entre 4% e 30%) do volume do biorreator ou do volume do primeiro meio de cultura líquido. O primeiro volume do primeiro meio de cultura líquido removido e o segundo volume do segundo meio de cultura líquido adicionado podem, em alguns casos, ser mantidos aproximadamente os mesmos durante cada período de 24 horas (ou, alternativamente, um período de tempo incremental de cerca de 1 hora e cerca de 24 horas ou um período de tempo incremental de mais de 24 horas) durante todo o período de cultivo ou durante parte dele. Como se sabe na técnica, a taxa à qual o primeiro volume do primeiro meio de cultura líquido é removido (volume/unidade de tempo) e a taxa à qual o segundo volume do segundo meio de cultura líquido é adicionado (volume/unidade de tempo) podem podem variar. A taxa à qual o primeiro volume do primeiro meio de cultura líquido é removido (volume/unidade de tempo) e a taxa à qual o segundo volume do segundo meio de cultura líquido é adicionado (volume/unidade de tempo) podem ser aproximadamente iguais ou podem ser diferentes.

[00164] Alternativamente, o volume removido e adicionado podem variar (por exemplo, aumentar gradualmente) durante cada período de 24 horas (ou alternativamente, um período de tempo incremental de entre 1 hora e cerca de 24 horas ou um período de tempo incremental de mais de 24 horas) durante o período de cultura. Por exemplo, o volume do primeiro meio de cultura líquido removido e o volume do segundo meio de cultura líquido adicionado dentro de cada período de 24 horas (ou alternativamente, um período de tempo incremental de entre cerca de 1 hora e mais de 24 horas ou um período de tempo incremental de mais de 24 horas) durante o período de cultivo podem ser aumentados (por exemplo, gradualmente ou através de incrementos escalonados) durante o período de cultivo de um volume que varia entre 0,5% e cerca de 20% do volume do biorreator ou do volume do primeiro meio de cultura líquido e cerca de 25% e cerca de 150% do volume do biorreator ou do volume do primeiro meio de cultura líquido.

[00165] Os especialistas na técnica vão perceber que o primeiro meio de cultura líquido e o segundo meio de cultura líquido podem ser o mesmo tipo de meio. Em outros casos, o primeiro meio de cultura líquido e o segundo meio de cultura líquido podem ser diferentes.

[00166] O primeiro volume do primeiro meio de cultura líquido pode ser removido, por exemplo, por um sistema mecânico que pode remover o primeiro volume do primeiro meio de cultura líquido do biorreator (por exemplo, o primeiro volume do primeiro meio de cultura líquido que é substancialmente livre de células do biorreator). Alternativamente ou adicionalmente, o primeiro volume do primeiro meio de cultura líquido pode ser removido percolação ou escoamento por gravidade do primeiro volume do primeiro meio de cultura líquido através de uma membrana estéril com um corte de peso molecular que exclui a célula (por exemplo, célula de mamífero).

[00167] O segundo volume do segundo meio de cultura líquido pode ser adicionado ao primeiro meio de cultura líquido de maneira automática, por exemplo, por uma bomba de perfusão.

[00168] Em alguns casos, a remoção do primeiro volume do primeiro meio de cultura líquido (por exemplo, um primeiro volume do primeiro meio de cultura líquido que é substancialmente livre de células de mamífero) e a adição de um segundo volume do segundo meio de cultura líquido ao primeiro meio de cultura líquido não ocorrem dentro de pelo menos 1 hora (por exemplo, dentro de 2 horas, dentro de 3 horas, dentro de 4 horas, dentro de 5 horas, dentro de 6 horas, dentro de 7 horas, dentro de 8 horas, dentro de 9 horas, dentro de 10 horas, dentro de 12 horas, dentro de 14 horas, dentro de 16 horas, dentro de 18 horas, dentro de 24 horas, dentro de 36 horas, dentro de 48 horas, dentro de 72 horas, dentro de 96 horas, ou depois de 96 horas) da inoculação do biorreator com uma célula de mamífero.

Biorreator de alimentação intermitente

[00169] As etapas de cultivo descritas neste relatório podem ser efetuadas usando-se um biorreator de alimentação intermitente. O cultivo de uma célula em um biorreator de alimentação intermitente inclui, durante a maior parte do período de cultivo, a adição (por exemplo, adição periódica ou contínua) de um segundo volume de um segundo meio de cultura líquido ao primeiro meio de cultura líquido. A adição do segundo meio de cultura líquido pode ser feita continuamente (por exemplo, a uma taxa que acrescenta um volume de entre 0,1% e 300% (por exemplo, entre 1% e 250%, entre 1% e 100%, entre 100% e 200%, entre 5% e 150%, entre 10% e 50%, entre 15% e 40%, entre 8% e 80%, ou entre 4% e 30%) do volume do biorreator ou do volume do primeiro meio de cultura líquido durante qualquer período de tempo dado (por exemplo, durante um período de 24 horas, durante um período de tempo incremental de cerca de 1 hora e cerca de 24 horas, ou durante um período de tempo incremental de mais de 24 horas)) ou periodicamente (por exemplo, uma vez a cada três dias, uma vez em dias alternados, uma vez ao dia, duas vezes ao dia, três vezes ao dia, quatro vezes ao dia, ou cinco vezes ao dia), ou qualquer combinação dos mesmos. Onde feito periodicamente, o volume que é adicionado (por exemplo, dentro de um período de cerca de 24 horas, dentro de um período de tempo incremental de cerca de 1 hora e cerca de 24 horas, ou dentro de um período de tempo incremental de mais de 24 horas) pode variar, por exemplo, entre 0,1% e 300% (por exemplo, entre 1% e 200%, entre 1% e 100%, entre 100% e 200%, entre 5% e 150%, entre 10% e 50%, entre 15% e 40%, entre 8% e 80%, ou entre 4% e 30%) do volume do biorreator ou do volume do primeiro meio de cultura líquido. O segundo volume do segundo meio de cultura líquido adicionado pode em alguns casos ser mantido aproximadamente o mesmo durante cada período de 24 horas (ou, alternativamente, um período de tempo incremental de cerca de 1 hora e cerca de 24 horas ou um período de tempo incremental de mais de 24 horas) durante todo o período de cultivo ou parte dele. Como se sabe na técnica, a taxa à qual o segundo volume do segundo meio de cultura líquido é adicionado (volume/unidade de tempo) pode variar durante todo o período de cultivo ou parte dele. Por exemplo, o volume do segundo meio de cultura líquido adicionado pode variar (por exemplo, aumentar gradualmente) durante cada período de 24 horas (ou alternativamente, um período de tempo incremental de entre 1 hora e cerca de 24 horas ou um período de tempo incremental de mais de 24 horas) durante o período de cultura. Por exemplo o volume do segundo meio de cultura líquido adicionado dentro de cada período de 24 horas (ou alternativamente, um período de tempo incremental de entre cerca de 1 hora e mais de 24 horas ou um período de tempo incremental de mais de 24 horas) durante o período de cultivo pode ser aumentado (por exemplo, gradualmente ou por incrementos escalonados) durante o período de cultivo de um volume que varia entre 0,5% e cerca de 20% do biorreator volume ou do volume do primeiro meio de cultura líquido e cerca de 25% e cerca de 150% do biorreator volume ou do volume do primeiro meio de cultura líquido. A taxa à qual o segundo volume do segundo meio de cultura líquido é adicionado (volume/unidade de tempo) pode ser aproximadamente o mesmo durante todo o período de cultivo ou parte dele.

[00170] Os especialistas na técnica vão perceber que o primeiro meio de cultura líquido e o segundo meio de cultura líquido podem ser o mesmo tipo de meio. Em outros casos, o primeiro meio de cultura líquido e o segundo meio de cultura líquido podem ser diferentes. O volume do segundo meio de cultura líquido pode ser adicionado ao primeiro meio de cultura líquido de maneira automática, por exemplo, por uma bomba de perfusão.

[00171] Em alguns casos, a adição de um segundo volume do segundo meio de cultura líquido ao primeiro meio de cultura líquido não ocorre dentro de pelo menos 1 hora (por exemplo, dentro de 2 horas, dentro de 3 horas, dentro de 4 horas, dentro de 5 horas, dentro de 6 horas, dentro de 7 horas, dentro de 8 horas, dentro de 9 horas, dentro de 10 horas, dentro de 12 horas, dentro de 14 horas, dentro de 16 horas, dentro de 18 horas, dentro de 24 horas, dentro de 36 horas, dentro de 48 horas, dentro de 72 horas, dentro de 96 horas, ou depois de 96 horas) da inoculação do biorreator com uma célula de mamífero. O meio de cultura de células em culturas de alimentação intermitente é tipicamente coletado ao final do período de cultura e usado em qualquer um dos processos descritos nesta invenção, no entanto, o meio de cultura de células em culturas de alimentação intermitente também pode ser coletado em um ou mais pontos do tempo durante o período de cultura e usado em qualquer um dos processos descritos nesta invenção.

[00172] Os especialistas na técnica vão perceber que quaisquer dos vários parâmetros de cultivo (por exemplo, recipientes, volumes, taxas ou frequências de substituição dos volumes de cultura, frequências de agitação, temperaturas, meios, e concentrações de CO2) podem ser usados em qualquer combinação para a realização desses métodos. Além disso, qualquer uma das células de mamífero descritas neste relatório ou conhecidas na literatura pode ser usada para produzir uma proteína recombinante.

Sistemas de produção biológica exemplificativos

[00173] Exemplos de sistemas de produção biológica úteis para a realização dos processos descritos nesta invenção e que incluem um MCCS ou um MCCS1 e MCCS2 estão descritos nos Pedidos de Patente Provisória US Série N° 61/775.060 e 61/856.390 (aqui incorporados a título de referência). Nesses sistemas exemplificativos, pelo menos uma (por exemplo, pelo menos duas, três, quatro, cinco, ou seis) coluna cromatográfica incluindo uma resina de cromatografia irradiada com radiação gama está presente no MCCS ou no MCCS1 e/ou MCCS2. Por exemplo, o sistema todo pode incluir um total de dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze, dezesseis, dezessete, dezoito, dezenove , ou vinte colunas cromatográficas incluindo uma resina de cromatografia irradiada com radiação gama. Por exemplo, o MCCS, MCCS1, e/ou o MCCS2 pode incluir (ou cada um deles pode incluir) uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, ou dez colunas cromatográficas incluindo uma resina de cromatografia irradiada com radiação gama.

[00174] Por exemplo, sistemas úteis podem incluir um MCCS1 que inclui uma entrada e um MCCS2 que inclui uma saída, ou um MCCS que inclui uma entrada e uma saída. Em algumas modalidades, o MCCS1 e o MCCS2 estão em comunicação hidráulica um com o outro. Esses sistemas também podem ser configurados de maneira que o fluido possa passar pela entrada, através do MCCS1 e MCCS2, e sair do sistema de produção pela saída. Esses sistemas proporcionam a produção contínua e rápida de uma substância medicamentosa terapêutica a partir de um meio de cultura líquido. Por exemplo, o tempo transcorrido entre a alimentação de um fluido (por exemplo, um meio de cultura líquido) incluindo uma proteína terapêutica no MCCS1 e eluição da proteína recombinante purificada (por exemplo, substância medicamentosa à base de proteína terapêutica) da saída do MCCS2 pode variar, por exemplo, entre cerca de 4 horas e cerca de 48 horas, inclusive.

[00175] Alguns sistemas exemplificativos não incluem um tanque de ruptura. Em outros, o sistema pode incluir um máximo de 1, 2, 3, 4, ou 5 tanques de ruptura no sistema inteiro (por exemplo, onde cada tanque de ruptura contém apenas uma proteína terapêutica por um período de tempo total de, por exemplo, entre cerca de 5 minutos e cerca de 6 horas, inclusive). Os tanques de ruptura podem ter uma capacidade que varia entre 1 mL e cerca de 300 mL, inclusive. Qualquer um dos tanques de ruptura dispostos no sistema de maneira que o fluido entre nos tanques de ruptura antes de entrar no MCCS1 ou MCCS pode ter uma capacidade que varia entre 1 mL e cerca de 100%, inclusive, do volume de carregamento da primeira coluna do MCCS1 ou do MCCS, respectivamente. Qualquer um dos tanques de ruptura dispostos no sistema de maneira que o fluido entre nos tanques de ruptura antes de entrar no MCCS2 (e depois de sair do MCCS1) pode ter uma capacidade que varia, por exemplo, entre 1 mL e cerca de 100%, inclusive, do volume de carregamento da primeira coluna do MCCS2.

Estruturas e aspectos de sistemas exemplificativos adicionais

[00176] O MCCS ou MCCS1 pode incluir uma entrada através da qual o fluido (por exemplo, um meio de cultura líquido que é substancialmente livre de células) pode ser passado para dentro do MCCS ou MCCS1, respectivamente. A entrada pode ter qualquer estrutura conhecida na técnica para tais finalidades. Ela pode incluir, por exemplo, uma rosca, nervuras, ou um selo que permite que um conduto de fluido seja inserido, de modo que depois da inserção do conduto de fluido na entrada o fluido entra no MCCS ou MCCS1 através da entrada sem significativa percolação do fluido para fora da entrada. Entradas não limitativas que podem ser usados nos presentes sistemas são conhecidas e serão reconhecidas pelos especialistas na técnica.

[00177] O MCCS ou MCCS1 pode incluir pelo menos duas colunas cromatográficas, pelo menos duas membranas cromatográficas, ou pelo menos uma coluna cromatográfica e pelo menos uma membrana cromatográfica, e uma entrada. O MCCS ou MCCS1 pode ser qualquer um dos MCCSs exemplificativos descritos neste relatório, ou ter uma ou mais das características exemplificativas de um MCCS (em qualquer combinação) descritas neste relatório. As colunas cromatográficas e/ou as membranas cromatográficas presentes no MCCS ou MCCS1 pode ter um ou mais dos formatos, tamanhos, volumes (volumes de leito), e/ou operações unitárias exemplificativos descritos neste relatório.

[00178] As colunas cromatográficas e/ou as membranas cromatográficas presentes no MCCS ou MCCS1 podem incluir uma ou mais de quaisquer das resinas exemplificativas descritas neste relatório ou conhecidas na literatura. Por exemplo, a resina incluída em uma ou mais das colunas cromatográficas e/ou membranas cromatográficas presentes no MCCS ou MCCS1 pode ser uma resina que utiliza um mecanismo de captura (por exemplo, um mecanismo de captura de ligação de proteína A, um mecanismo de captura de ligação de proteína G, um mecanismo de captura de ligação de anticorpo ou de fragmento de anticorpo, um mecanismo de captura de ligação de substrato, um mecanismo de captura de ligação de cofator, um mecanismo de captura de ligação de aptâmero, e/ou um mecanismo de captura de ligação de tag). A resina incluída em uma ou mais das colunas cromatográficas e/ou membranas cromatográficas do MCCS ou MCCS1 pode ser uma resina de troca catiônica, uma resina de troca aniônica, uma resina de peneira molecular, ou uma resina por interação hidrofóbica, ou qualquer combinação das mesmas. Exemplos adicionais de resinas que podem ser usadas para purificar uma proteína recombinante são conhecidos na literatura, e podem ser incluídas em uma ou mais das colunas cromatográficas e/ou membranas cromatográficas presentes no MCCS ou MCCS1. As colunas cromatográficas e/ou membranas cromatográficas presentes no MCCS ou MCCS1 podem incluir a mesma resina e/ou resinas diferentes (por exemplo, qualquer uma das resinas descritas neste relatório ou conhecidas na literatura para uso na purificação de proteínas recombinantes).

[00179] As duas ou mais colunas cromatográficas e/ou resinas de cromatografia presentes no MCCS ou MCCS1 podem realizar uma ou mais operações unitárias (por exemplo, capturar uma proteína recombinante, purificar uma proteína recombinante, polir uma proteína recombinante, inativar vírus, ajustar a concentração iônica e/ou o pH de um fluido incluindo a proteína recombinante, ou filtrar um fluido incluindo uma proteína recombinante). Em exemplos não limitativos, o MCCS ou MCCS1 pode realizar as operações unitárias de capturar uma proteína recombinante a partir de um fluido (por exemplo, um meio de cultura líquido) e inativar os vírus presentes no fluido incluindo a proteína recombinante. O MCCS ou MCCS1 pode realizar qualquer combinação de uma ou mais operações unitárias descritas neste relatório ou conhecidas na literatura.

[00180] As colunas cromatográficas e/ou membranas cromatográficas presentes no MCCS ou MCCS1 podem ser conectadas ou afastadas uma da outra por um mecanismo de comutação (por exemplo, um mecanismo de comutação de colunas). O MCCS ou MCCS1 também podem incluir uma ou mais (por exemplo, duas, três, quatro, ou cinco) bombas (por exemplo, bombas automáticas, por exemplo, bombas peristálticas automáticas). Os eventos de comutação de colunas podem ser desencadeados pela detecção de um nível de proteína recombinante detectada por absorvência de UV correspondente a um certo nível de proteína recombinante no fluido que passa pelo MCCS ou MCCS1 (por exemplo, a entrada no e/ou o eluato proveniente de uma ou mais das colunas cromatográficas e/ou membranas cromatográficas no MCCS ou MCCS1), um volume de líquido (por exemplo, tampão) específico, ou um tempo transcorrido específico. Comutação de colunas geralmente significa um mecanismo pelo qual se permite que pelo menos duas colunas cromatográficas e/ou membranas cromatográficas diferentes em um MCCS ou MCCS1 (por exemplo, duas ou mais colunas cromatográficas e/ou membranas cromatográficas diferentes presentes no MCCS1 ou MCCS2) passem por uma etapa diferente (por exemplo, equilíbrio, carregamento, eluição, ou lavagem), substancialmente ao mesmo tempo durante pelo menos parte do processo.

[00181] O MCCS ou MCCS1 pode ser um sistema de cromatografia contracorrente periódica (PCCS). Por exemplo, o PCCS que é o MCCS ou MCCS1 (i.e., PCCS ou PCCS1, respectivamente) pode incluir quatro colunas cromatográficas, onde as três primeiras colunas realizam a operação de capturar uma proteína recombinante a partir de um fluido (por exemplo, um meio de cultura líquido), e a quarta coluna da PCCS realiza a operação unitária de inativar vírus no fluido incluindo a proteína recombinante. um PCCS que é o MCCS ou MCCS1 pode utilizar um mecanismo de comutação de colunas. O sistema PCC pode utilizar um sistema ÃKTA modificado (GE Healthcare, Piscataway, NJ) capaz de operar até, por exemplo, quatro, cinco, seis, sete, ou oito colunas, ou mais.

[00182] O MCCS ou MCCS1 pode ser equipado com: um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, ou dez) monitores de UV, uma ou mais (por exemplo, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, ou dez) válvulas, um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, ou dez) medidores de pH, e/ou um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, ou dez) medidores de condutividade. O MCCS ou MCCS1 também pode ser equipado com um sistema operacional que utiliza um software (por exemplo, o software baseado no Unicorn, GE Healthcare, Piscataway, NJ) para detectar quando um evento de comutação de colunas deve ocorrer (por exemplo, com base na absorvência de UV, no volume de líquido, ou no tempo transcorrido) e efetuar os eventos de comutação de colunas.

[00183] O MCCS ou MCCS1 podem incluir ainda um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze, dezesseis, dezessete, dezoito, dezenove, vinte, vinte e um, vinte e dois, vinte e três, ou vinte e quatro) reservatórios de ajuste de tampão em linha e/ou reservatórios de tampão. Em outros exemplos, o MCCS ou MCCS1 pode incluir um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, ou seis) tanques de ruptura que podem conter o fluido que não consegue passar rapidamente para dentro de uma ou mais das colunas cromatográficas e/ou membranas cromatográficas no MCCS ou MCCS1. Os sistemas descritos neste relatório podem incluir um ou mais tanques de ruptura (por exemplo, um tanque de ruptura descrito neste relatório) no MCCS, MCCS1, e/ou MCCS2. Outros exemplos dos sistemas descritos neste relatório não incluem um tanque de ruptura no MCCS, MCCS1, ou MCCS2, ou não incluem um tanque de ruptura no sistema inteiro. Outros exemplos dos sistemas descritos neste relatório incluem um máximo de um, dois, três, quatro, ou cinco tanques de ruptura (por exemplo, quaisquer tanques de ruptura descritos neste relatório) no sistema inteiro.

Segundo MCCS

[00184] O segundo MCCS (MCCS2) nos sistemas exemplificativos inclui pelo menos duas colunas cromatográficas, pelo menos duas membranas cromatográficas, ou pelo menos uma coluna cromatográfica e pelo menos uma membrana cromatográfica, e uma saída. O MCCS2 pode ser qualquer um dos MCCSs exemplificativos descritos neste relatório, ou pode ter uma ou mais das características exemplificativas de um MCCS (em qualquer combinação) descritas neste relatório. As colunas cromatográficas e/ou as membranas cromatográficas presentes no MCCS2 podem ter um ou mais dentre: qualquer um dos formatos, tamanhos, volumes (volumes de leito), e/ou operações unitárias descritos neste relatório. As colunas cromatográficas e/ou as membranas cromatográficas podem incluir qualquer uma das resinas exemplificativas descritas neste relatório ou conhecidas na literatura. Por exemplo, a resina incluída em uma ou mais das colunas cromatográficas e/ou membranas cromatográficas presentes no MCCS2 pode ser uma resina que utiliza um mecanismo de captura (por exemplo, um mecanismo de captura de ligação de proteína A, um mecanismo de captura de ligação de proteína G, um mecanismo de captura de ligação de anticorpo ou de fragmento de anticorpo, um mecanismo de captura de ligação de substrato, um mecanismo de captura de ligação de cofator, um mecanismo de captura de ligação de tag, e/ou um mecanismo de captura de ligação de aptâmero). Resinas úteis incluem, por exemplo, uma resina de troca catiônica, uma resina de troca aniônica, uma resina de peneira molecular, e uma resina por interação hidrofóbica. Exemplos adicionais de resinas são conhecidos na literatura. As colunas cromatográficas e/ou membranas cromatográficas presentes no MCCS2 podem incluir a mesma resina e/ou resinas diferentes (por exemplo, qualquer uma das resinas descritas neste relatório ou conhecidas na literatura para uso na purificação de proteínas recombinantes).

[00185] As colunas cromatográficas e/ou membranas cromatográficas presentes no MCCS2 pode efetuar uma ou mais operações unitárias (por exemplo, qualquer uma das operações unitárias descritas neste relatório ou qualquer combinação das operações unitárias descritas neste relatório). Em exemplos não limitativos, o MCCS2 pode efetuar as operações unitárias de purificação de uma proteína recombinante a partir de um fluido e polimento da proteína recombinante presente no fluido incluindo a proteína recombinante. Em outros exemplos não limitativos, o MCCS2 pode realizar as operações unitárias de purificação de uma proteína recombinante presente em um fluido, polimento de uma proteína recombinante presente em um fluido, e filtração de um fluido incluindo uma proteína recombinante. Em um outro exemplo, o MCCS2 pode efetuar as operações unitárias de purificação de uma proteína recombinante presente em um fluido, polimento de uma proteína recombinante presente em um fluido, filtração de um fluido incluindo uma proteína recombinante, e ajuste da concentração iônico e/ou do pH de um fluido incluindo uma proteína recombinante. O MCCS2 pode efetuar qualquer combinação de duas ou mais operações unitárias descritas neste relatório ou conhecidos na literatura.

[00186] As colunas cromatográficas e/ou membranas cromatográficas presentes no MCCS2 podem ser conectadas ou afastadas uma em relação à outra por um mecanismo de comutação (por exemplo, um mecanismo de comutação de colunas). O MCCS2 também pode incluir uma ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, ou cinco) bombas (por exemplo, bombas automáticas, por exemplo, bombas peristálticas automáticas). Os eventos de comutação de colunas podem ser desencadeados pela detecção de um nível de proteína recombinante detectada por absorvência de UV correspondente a um certo nível de proteína recombinante no fluido que passa pelo MCCS2 (por exemplo, a entrada no e/ou o eluato proveniente de uma ou mais das colunas cromatográficas e/ou membranas cromatográficas no MCCS2), um volume de líquido (por exemplo, tampão) específico, ou um tempo transcorrido específico.

[00187] O MCCS2 pode ser um sistema de cromatografia contracorrente periódica (i.e., PCCS2). Por exemplo, o PCCS2 pode incluir três colunas que realizam a operação unitária de purificação de uma proteína recombinante a partir de um fluido, e uma membrana cromatográfica que realiza a operação unitária de polimento de uma proteína recombinante presente em um fluido. Por exemplo, as três colunas que realizam a operação unitária de purificação de uma proteína recombinante a partir de um fluido podem incluir, por exemplo, uma resina de troca catiônica, e a membrana cromatográfica que realiza a operação unitária de polimento pode incluir uma resina de troca catiônica. Um PCCS2 pode utilizar um mecanismo de comutação de colunas. O PCCS2 pode utilizar um sistema ÃKTA modificado (GE Healthcare, Piscataway, NJ) capaz de operar até, por exemplo, quatro, cinco, seis, sete, ou oito colunas, ou mais.

[00188] O MCCS2 pode ser equipado com: um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, ou dez) monitores de UV, uma ou mais (por exemplo, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, ou dez) válvulas, um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, ou dez) medidores de pH, e/ou um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, ou dez) medidores de condutividade. O MCCS2 também pode ser equipado com um sistema operacional que utiliza um software (por exemplo, o software baseado no Unicorn, GE Healthcare, Piscataway, NJ) para detectar quando um evento de comutação de colunas deve ocorrer (por exemplo, com base na absorvência de UV, no volume de líquido, ou no tempo transcorrido) e efetuar os eventos de comutação de colunas.

[00189] O MCCS2 pode incluir ainda um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze, dezesseis, dezessete, dezoito, dezenove, vinte, vinte e um, vinte e dois, vinte e três, ou vinte e quatro) reservatórios de ajuste de tampão e/ou reservatórios de tampão em linha. Em outros exemplos, o MCCS2 pode incluir um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, ou seis) tanques de ruptura (por exemplo, qualquer um dos tanques de ruptura descritos neste relatório) que podem conter o fluido que não consegue passar rapidamente para dentro de uma ou mais das colunas cromatográficas e/ou membranas cromatográficas no MCCS2.

[00190] O MCCS2 inclui uma saída através da qual a substância medicamentosa à base de proteína terapêutica pode sair do sistema. A saída pode incluir, por exemplo, uma rosca, nervuras, ou um selo que permite que um conduto de fluido seja inserido ou um frasco projetado para conter ou armazenar a proteína recombinante purificada (por exemplo, substância medicamentosa à base de proteína terapêutica). Uma saída pode incluir uma superfície que pode ser usada para selar um frasco com carga biológica reduzida ou outro recipiente de armazenamento deste tipo à saída para permitir que a proteína recombinante purificada (por exemplo, substância medicamentosa à base de proteína terapêutica) escoe diretamente para dentro do frasco com carga biológica reduzida ou recipiente de armazenamento. Saídas não limitativas que podem ser usadas nos presentes sistemas são conhecidas e serão identificadas pelos especialistas na técnica.

[00191] Os sistemas descritos neste relatório também podem incluir um conduto de fluido que é disposto entre o MCCS1 e o MCCS2. Qualquer um dos condutos de fluido descritos neste relatório pode ser, por exemplo, um tubo que é feito de, por exemplo, polietileno, policarbonato, ou plástico. O conduto de fluido disposto entre o MCCS1 e o MCCS2 pode incluir ainda um ou mais dos seguintes itens em qualquer combinação: um ou mais reservatórios de ajuste de tampão em linha que estão em comunicação hidráulica com o conduto de fluido e são posicionados de maneira que o tampão armazenado nos reservatórios de ajuste de tampão em linha seja adicionado ao fluido presente no conduto de fluido; um tanque de ruptura (por exemplo, qualquer um dos tanques de ruptura descritos neste relatório) que está em comunicação hidráulica com o conduto de fluido e é posicionado de maneira que ele possa conter qualquer excesso de fluido presente no conduto de fluido que não pode ser livremente alimentado no MCCS2; e um ou mais filtros que são dispostos no conduto de fluido de maneira que eles sejam capazes de filtrar (por exemplo, remover bactérias) o fluido presente no conduto de fluido. Qualquer um dos reservatórios de ajuste de tampão em linha pode incluir, por exemplo, um volume de entre cerca de 0,5 L a 50 L de tampão (por exemplo, a uma temperatura de ou abaixo de 25°C, 15°C, ou 10°C).

[00192] Os sistemas descritos neste relatório podem opcionalmente incluir um conduto de fluido disposto entre a coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica final no MCCS2 e a saída. Os sistemas descritos neste relatório podem incluir ainda um ou mais filtros em conexão hidráulica com o conduto de fluido disposto entre a coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica final no MCCS2 e a saída, de maneira que o filtro possa remover, por exemplo, material precipitado, matéria particulada, ou bactérias do fluido presente no conduto de fluido disposto entre a coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica final no MCCS2 e a saída.

[00193] Alguns exemplos dos sistemas oferecidos nesta invenção também incluem um biorreator que está em conexão hidráulica com a entrada do MCCS ou MCCS1. Qualquer um dos biorreatores exemplificativos descritos neste relatório ou conhecidos na literatura pode ser usado nos presentes sistemas.

[00194] Alguns exemplos dos sistemas oferecidos nesta invenção também incluem um sistema de bombas. Um sistema de bombas pode incluir um ou mais dos seguintes itens: uma ou mais (por exemplo, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, ou dez) bombas (por exemplo, qualquer uma das bombas descritas neste relatório ou conhecidos na literatura), um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, ou cinco) filtros (por exemplo, qualquer um dos filtros descritos neste relatório ou conhecidos na literatura), um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, ou dez) detectores de UV, e um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, ou cinco) tanques de ruptura (por exemplo, qualquer um dos tanques de ruptura descritos neste relatório). Alguns exemplos dos sistemas oferecidos nesta invenção incluem ainda um conduto de fluido disposto entre a bomba e a entrada do o MCCS ou MCCS1 (por exemplo, qualquer um dos condutos de fluido exemplificativos descritos neste relatório ou conhecidos na literatura). Em alguns exemplos, este conduto de fluido em particular pode incluir uma ou mais (por exemplo, duas, três, ou quatro) bombas (por exemplo, qualquer uma das bombas descritas neste relatório ou conhecidos na literatura) e/ou um ou mais (por exemplo, dois, três, ou quatro) tanques de ruptura (por exemplo, qualquer um dos tanques de ruptura exemplificativos descritos neste relatório), onde essas bombas e/ou tanques de ruptura estão em conexão hidráulica com o fluido presente no conduto de fluido.

[00195] Alguns exemplos dos sistemas descritos neste relatório incluem ainda um outro conduto de fluido conectado ao conduto de fluido entre a bomba e a entrada, onde uma extremidade do outro conduto de fluido é fluidamente conectada a um biorreator e a outra extremidade é fluidamente conectada ao conduto de fluido entre a bomba e a entrada. Este outro conduto de fluido pode incluir um filtro que é capaz de remover células do meio de cultura líquido removido do biorreator (por exemplo, sistema de retenção de células ATF).

[00196] Os sistemas oferecidos nesta invenção permitem a produção contínua de uma proteína recombinante purificada (por exemplo, substância medicamentosa à base de proteína terapêutica). Como se sabe na técnica, os sistemas podem proporcionar a eluição periódica de uma proteína recombinante purificada (por exemplo, substância medicamentosa à base de proteína terapêutica). Os sistemas descritos neste relatório também podem resultar em um rendimento líquido de proteína recombinante purificada (por exemplo, substância medicamentosa à base de proteína terapêutica) de pelo menos cerca de 5 g/dia, pelo menos cerca de 10 g/dia, pelo menos cerca de 15 g/dia, pelo menos cerca de 20 g/dia, pelo menos cerca de 30 g/dia, ou pelo menos cerca de 40 g/dia durante um período contínuo de pelo menos cerca de 5 dias, pelo menos cerca de 10 dias, pelo menos cerca de 15 dias, pelo menos cerca de 20 dias, pelo menos cerca de 25 dias, pelo menos cerca de 30 dias, pelo menos cerca de 40 dias, pelo menos cerca de 50 dias, pelo menos cerca de 60 dias, pelo menos cerca de 70 dias, pelo menos cerca de 80 dias, pelo menos cerca de 90 dias, ou pelo menos cerca de 100 dias.

[00197] A invenção está ainda descritos nos exemplos que se seguem, que não limitam o escopo da invenção descrita nas reivindicações.

EXEMPLOS Exemplo 1. Efeito da radiação gama na capacidade de ligação da resina de cromatografia em t0

[00199] Um conjunto de experiências foi realizado para estudar o efeito da radiação gama na capacidade de ligação de uma resina de cromatografia bimodal tendo propriedades de troca aniônica e hidrofóbicas (resina AE). A resina AE usada nessas experiências foi a Capto Adhere (GE Healthcare Life Sciences), que tem um ligando de N- benzil-N-metill etanolamina, um tamanho de partícula médio de 75 μm, e uma capacidade iônica de 0,09 - 0,12 mmol Cl-1/mL no meio. A resina AE ou ficou não tratada (virgem) ou foi tratada para reduzir a carga biológica da resina (exposta a 25 kGy de radiação gama). A irradiação foi feita usando-se 0,2 mL de resina suspendida em 50 mM de fosfato de sódio, pH 7,0.

[00200] A quantidade de proteína (Fabrazyme®) ligada à resina AE não tratada (em meio de cultura líquido) e à resina AE irradiada com 25 kGy de radiação gama em t0 (sem corridas de cromatografia) foi determinada a diferentes concentrações da proteína alvo (Fabrazyme®). A Figura 1 mostra as isotermas de ligação em t0 para a resina AE não tratada e para a resina AE irradiada com 25 kGy de radiação gama. Esses dados mostram que a ligação da proteína alvo não se altera depois de irradiação gama da resina em t0.

Exemplo 2. Efefeito da radiação gama na capacidade de ligação da resina de cromatografia em múltiplos ciclos e uso de tampões desnaturantes para mitigar a perda na capacidade de ligação

[00201] Foram feitas experiências para testar o efeito da radiação gama na capacidade de ligação da resina de cromatografia em múltiplos ciclos. Na cromatografia multicolunas, cada uma das colunas usadas é carregada com proteína (Fabrazyme® em meio de cultura líquido) até sua capacidade de ligação. Equilíbrio e lavagem das colunas foram feitos com 20 mM de MES (ácido 2-(N-morfolino)etanossulônico), pH 7,0. Tampão de eluição, 200 mM de arginina, 270 mM de MES, 20% de etileno glicol pH 7,5 foi usado para eluir a proteína ligada das colunas. Para testar o desempenho da resina de cromatografia irradiada com radiação gama durante todo seu ciclo de vida neste exemplo, colunas contendo resina AE não tratada ou resina de cromatografia irradiada com 25 kGy de radiação gama (preparada da maneira descrita no Exemplo 1) foram cicladas usando-se um sistema de cromatografia multicolunas (MCCS) ou colunas individuais foram usadas para efetuar vários ciclos de cromatografia em condições mimetizando as condições de MCCS (cada coluna foi carregada até sua capacidade de ligação estática, antes de a lavagem e eluição serem feitas). Cada uma das etapas de lavagem e eluição nas experiências neste exemplo foram efetuadas de forma escalonada.

[00202] Múltiplos ciclos de cromatografia em coluna foram realizados usando uma única coluna cromatográfica incluindo a resina AE (resina virgem, irradiada com 15 kGy de radiação gama, ou irradiada com 25 kGy de radiação gama) e um tampão de lavagem de 700 mM de arginina, 100 mM de acetato (pH 3,0), seguido por uma solução de NaOH 1 N (depois de eluição da proteína recombinante) em cada ciclo. A percentagem de capacidade de ligação normalizada (em comparação com a resina não tratada (virgem) em t0) em múltiplos ciclos foi determinada. Os dados dessas experiências mostram que embora a capacidade de ligação para a resina não tratada e para a resina irradiada com radiação gama sejam similares em t0, a capacidade de ligação da resina não tratada e da resina irradiada com radiação gama mostram uma taxa de redução na capacidade de ligação diferente depois de múltiplos ciclos de cromatografia (Figura 2). Embora a resina virgem mostre uma redução na capacidade de ligação, a resina irradiada com radiação gama mostra uma redução mais drástica na capacidade de ligação depois de múltiplos ciclos de cromatografia (Figura 2). A taxa de queda calculada na capacidade de ligação para cada resina neste conjunto de experiências também está mostrada na Figura 3. Estes dados demonstram que o uso de radiação gama para reduzir a carga biológica de cromatografia resulta em uma redução na capacidade de ligação da resina que fica progressivamente pior depois de múltiplos ciclos de cromatografia. Conjuntos de experiências foram realizados para determinar se uma variedade de tampões desnaturantes poderiam ser usados para recuperar a capacidade de ligação perdida de resina de cromatografia irradiada com radiação gama. Nessas experiências, ciclos de cromatografia realizados usando a resina AE virgem (não tratada) foram efetuados usando um tampão de lavagem de 700 mM de arginina, 100 mM de acetato (pH 3,0), seguido por uma solução de NaOH a 1 N (arginina de pH baixo). Ciclos de cromatografia foram também efetuados usando a resina irradiada com 25 kGy de radiação gama usando uma ou mais das seguintes combinações de tampões para lavar a resina depois de eluição da proteína recombinante em cada ciclo: 8 M de ureia, 1 M de NaCl, 0,1 M de ácido cítrico, pH 2,5, seguido por uma solução de NaOH a 1 N (ureia de pH baixo); 6 M HCl de guanidina (pH 2,5), seguido por uma solução de NaOH a 1 N (ou NaOH 1 M + NaCl 1 M) (guanidina de pH baixo); 0,5% de Triton-X 100 em 0,1 M de ácido acético (pH 2,5), seguido por uma solução de 0,7 M de ácido acético, 20% de etanol, 50% de etileno glicol (pH 2,5), seguido por uma solução de NaOH a 1 N (Triton de pH baixo); 0,7 M de ácido acético, 20% de etanol, 50% de etileno glicol (pH 2,5), seguido por uma solução de NaOH a 1 N (orgânico de pH baixo); ou 700 mM de arginina, 100 mM de acetato (pH 3,0), seguido por uma solução de NaOH a 1 N (arginina de pH baixo). A percentagem de capacidade de ligação normalizada (normalizada para a capacidade de ligação de resina virgem (não tratada) em t = 0), a percentagem de recuperação de proteína recombinante (em relação à quantidade de proteína recombinante presente no fluido carregado na resina) por ciclo, e os níveis de proteína da célula hospedeira (ng/mg) presentes no eluato por ciclo foram determinados. Os dados na Figura 4 mostram que todos os tampões desnaturantes testados foram capazes de mitigar a perda na capacidade de ligação da resina de cromatografia irradiada com radiação gama, à exceção de 0,7 M de ácido acético, 20% de etanol, 50% de etileno glicol (pH 2,5) e 700 mM de arginina, 100 mM de acetato (pH 3,0). Os dados na Figura 4 mostram que todos os tampões desnaturantes, à exceção de 0,7 M de ácido acético, 20% de etanol, 50% de etileno glicol (pH 2,5) e 700 mM de arginina, 100 mM de acetato (pH 3,0), são capazes de limpar eficientemente uma resina de cromatografia irradiada com radiação gama e manter a capacidade de ligação da resina de cromatografia irradiada com radiação gama depois de múltiplos ciclos de cromatografia.

[00203] Os dados na Figura 6 mostram que todos os tampões desnaturantes testados resultam em uma percentagem estável de recuperação da proteína recombinante ligada à resina de cromatografia irradiada com radiação gama por ciclo depois de múltiplos ciclos. Os dados na Figura 6 mostram que cada um dos tampões desnaturantes testados era capaz de recuperar qualquer que fosse a quantidade de proteína ligada à resina de cromatografia irradiada com radiação gama por ciclo em extensão semelhante. Os dados na Figura 7 mostram que o uso dos vários tampões desnaturantes testados resultam em níveis aceitáveis de proteína da célula hospedeira no eluato de proteína recombinante em cada ciclo.

[00204] Acreditava-se que o tampão desnaturante usado em cada ciclo recuperasse a capacidade de ligação da resina de cromatografia irradiada com radiação gama liberando proteínas fortemente ligadas da resina. Cromatógrafos representativos de múltiplos ciclos de cromatografia realizados usando três colunas cromatográficas incluindo 25 kGy de resina AE irradiada com radiação gama, lavada com ureia 8 M, NaCl 1 M, ácido cítrico 0,1 M, pH 2,5, e uma solução de NaOH a 1 N depois de eluição da proteína recombinante (depois de cada ciclo) foram registrados (Figura 5). Os cromatógrafos mostram que o tratamento da resina irradiada com radiação gama com o tampão desnaturante resultou na liberação de substancialmente a mesma quantidade de proteína da resina irradiada com radiação gama em cada uma das três colunas cromatográficas durante os múltiplos ciclos (vide setas na Figura 5).

[00205] Em suma, esses dados mostram que diferentes tampões desnaturantes podem ser usados para recuperar a capacidade de ligação da resina de cromatografia irradiada com radiação gama para atingir o desempenho esperado.

Outras Modalidades

[00206] Deve ficar entendido que embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com sua descrição detalhada, a descrição precedente destina-se a ilustrar e não a limitar o escopo da invenção, que é definida pelo escopo das reivindicações em anexo. Outros aspectos, vantagens, e modificações estão dentro do escopo das reivindicações em anexo.

Claims

1. Método para realizar cromatografia com uma resina de cromatografia de troca aniônica irradiada com radiação gama para purificar uma proteína terapêutica recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer uma coluna cromatográfica contendo uma resina de cromatografia de troca aniônica irradiada com radiação gama; (b) realizar pelo menos dois ciclos de cromatografia através da coluna cromatográfica, em que cada um dos pelo menos dois ciclos de cromatografia compreende a recuperação da capacidade de ligação da resina de cromatografia de troca aniônica com radiação gama pela exposição da resina de cromatografia de troca aniônica irradiada com radiação gama a um tampão desnaturante, em que o tampão desnaturante compreende ureia, cloreto de guanidina ou 4-(1,1,3,3- tetrametilbutil)fenil-polietilenoglicol; em que, durante cada exposição, a taxa de fluxo, volume e concentração do tampão de desnaturação são selecionados para recuperar substancialmente a capacidade de ligação perdida devido à resina de cromatografia de troca aniônica irradiada com radiação gama.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a realização de cada um dos pelo menos dois ciclos em (b) compreende as etapas de: (a) capturar a proteína terapêutica recombinante expondo a resina de cromatografia de troca aniônica irradiada com radiação gama com um líquido contendo a proteína terapêutica recombinante; (b) lavar a resina de cromatografia de troca aniônica irradiada com radiação gama expondo a resina de cromatografia de troca aniônica irradiada com radiação gama com um tampão de lavagem; (c) eluir a proteína terapêutica recombinante expondo a resina de cromatografia de troca aniônica irradiada com radiação gama com um tampão de eluição; e (d) recuperar a capacidade de ligação da resina de cromatografia de troca aniônica irradiada com radiação gama expondo a resina de cromatografia de troca aniônica irradiada com radiação gama ao tampão desnaturante.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o líquido contendo a proteína terapêutica recombinante é um meio de cultura líquido.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos dois ciclos de cromatografia na etapa (b) são realizados usando-se um sistema fechado e integrado.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o tampão desnaturante tem um nível de garantia de esterilidade de 1 x 10-6 ou menos de 1 x 10-6.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tampão desnaturante compreende 6M a 9M de ureia.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tampão desnaturante compreende cloreto de guanidina 5M a 7M.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tampão desnaturante compreende 4- (1,1,3,3- tetrametilbutil) fenil-polietilenoglicol.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tampão desnaturante é selecionado a partir do grupo que consiste em: Ureia 8 M, NaCl 1 M, ácido cítrico 0,1 M, pH 2,5; Cloreto de guanidina 6 M, pH 2,5; e 0,5% de 4- (1,1,3,3-tetrametilbutil) fenil-polietilenoglicol em ácido acético 0,1 M, pH 2,5.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada um dos pelo menos dois ciclos em (b) compreende ainda, após a exposição da resina de cromatografia de troca aniônica irradiada com radiação gama ao tampão desnaturante, expor a resina de cromatografia de troca aniônica irradiada com radiação gama a um tampão de lavagem compreendendo 0,5 M a 1,5 M de hidróxido de sódio.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a coluna cromatográfica faz parte de um sistema de cromatografia multicolunas (MCCS).

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o MCCS é um sistema de cromatografia contracorrente periódica (PCCS).

13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a resina de cromatografia de troca aniônica irradiada com radiação gama fora tratada com uma dose de radiação gama de 10 kGy a 40 kGy.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a resina de cromatografia de troca aniônica irradiada com radiação gama foi tratada com uma dose de irradiação gama de 15 kGy a 35 kGy.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a resina de cromatografia de troca aniônica com radiação gama foi tratada com uma dose de irradiação gama de 20 kGy a 30 kGy.

16. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que (b) compreende a realização de pelo menos cinco ciclos de cromatografia.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que (b) compreende a realização de pelo menos dez ciclos de cromatografia.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que (b) compreende a realização de pelo menos quinze ciclos de cromatografia.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que (b) compreende a realização de pelo menos vinte ciclos de cromatografia.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que (b) compreende a realização de pelo menos vinte e cinco ciclos de cromatografia.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que (b) compreende a realização de pelo menos trinta ciclos de cromatografia.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que (b) compreende a realização de pelo menos quarenta ciclos de cromatografia.

23. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que (b) é realizada continuamente por um período de pelo menos 4 dias.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que (b) é realizada continuamente ao longo de um período de pelo menos 5 dias.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que (b) é realizada continuamente ao longo de um período de pelo menos 7 dias.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que (b) é realizada continuamente ao longo de um período de pelo menos 14 dias.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que (b) é realizada continuamente ao longo de um período de pelo menos 28 dias.