CN101784666A

CN101784666A - 用于生产感兴趣的化合物的重组宿主细胞

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Publication number: CN101784666A
Application number: CN200880005328A
Authority: CN
Inventors: 科尼利斯·玛丽亚·雅各布斯·沙吉; 诺埃尔·尼古拉斯·玛丽亚·伊丽莎白·范佩吉; 赫尔曼·埃布尔·伯纳德·沃伊斯坦; 亚历山大·玛丽亚·科斯塔洛蒂格斯·艾维斯; 罗纳德·彼得·德弗里斯; 安娜·玛尔塞拉·莱文丘克里尔
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2007-02-15
Filing date: 2008-02-12
Publication date: 2010-07-21
Also published as: EA018840B1; EP2631295A2; US20100112638A1; EP2115145A1; AU2008214663A1; JP2010517587A; EP2631295A3; AU2008214663B2; EA200901110A1; WO2008098933A1; CA2677568A1

Abstract

本发明涉及用于生产感兴趣的化合物的重组宿主细胞。本发明还涉及经分离的真菌启动子DNA序列，涉及包含与编码感兴趣的化合物的编码序列可操作关联的这些启动子的DNA构建体、载体和真菌细胞。本发明还涉及使用本发明的启动子来表达感兴趣的基因和/或生产感兴趣的化合物的方法。

Description

用于生产感兴趣的化合物的重组宿主细胞

发明领域

本发明涉及用于生产感兴趣的化合物的重组宿主细胞。本发明还涉及经分离的真菌启动子DNA序列，涉及包含与编码感兴趣的化合物的编码序列可操作关联的这些启动子的DNA构建体、载体和真菌细胞。本发明还涉及使用根据本发明的启动子来表达感兴趣的基因和/或生产感兴趣的化合物的方法。

发明背景

在宿主细胞中生产重组多肽通常通过这样来完成：构建表达盒，其中编码多肽的DNA被放到适于所述宿主细胞的启动子的表达控制下。可通过质粒或载体介导的转化将表达盒引入宿主细胞。可通过在表达盒中含有的启动子正确发挥功能所必需的诱导条件下，培养经转化的宿主细胞，来实现对多肽的生产。

对于每种宿主细胞而言，通过转化被引入宿主的编码序列的表达和该编码序列编码的重组多肽的产生需要能获得功能性启动子。数种启动子已知在宿主细胞中有功能，例如，来自真菌宿主细胞的那些。有一些关于启动子交叉物种使用的例子：Aspergillus nidulans的启动子(A.nidulansgpdA基因已知在Aspergillus niger(A.niger)中有功能)(J Biotechnol.1991 Jan；17(1)：19-33.Intracellular and extracellular production of proteins inAspergillus under the control of expression signals of the highly expressed A.nidulans gpdA gene.Punt PJ，Zegers ND，Busscher M，Pouwels PH，van denHondel CA.)。另一例子是用于A.niger和A.nidulans中的A.nigerβ-木糖苷酶xlnD启动子(Transcriptional regulation of the xylanolytic enzymesystem of Aspergillus，van Peij，NNME，博士论文LandbouwuniversiteitWageningen，the Netherlands，ISBN 90-5808-154-0)和Escherichia coli β-葡糖苷酸酶基因在A.niger、A.nidulans和Cladosporium fulvum中的表达，如Curr Genet.1989 Mar；15(3)：177-80：Roberts IN，Oliver RP，Punt PJ，van denHondel CA.“Expression of the Escherichia coli beta-glucuronidase gene inindustrial and phytopathogenic filamentous fungi”所述。

但是，人们仍需要改进重组表达和对感兴趣的化合物的生产。例如，与在真菌宿主细胞中生产感兴趣的化合物相关的一个已知问题是：仅部分菌丝体参与对化合物的生产。在并非在细胞周期的所有阶段表达都是组成型的其它宿主细胞中也同样存在这个问题。因此，本发明的一个目的是提供改进的表达和生产***。

附图描述

图1描述了pGBTOPGLA的质粒图谱，其是整合型的葡糖淀粉酶表达载体。

图2描述了pGBTOPGLA-2的质粒图谱，其是具有多克隆位点的整合型葡糖淀粉酶表达载体。

图3描述了pGBTOPGLA-16的质粒图谱，其是整合型的葡糖淀粉酶表达载体，其含有与葡糖淀粉酶编码序列可操作关联的根据本发明的启动子。

图4描述了在针对表达glaA构建体的A.niger菌株的培养液中的葡糖淀粉酶活性，它们全部都处于有区别的启动子的控制下。构建体被描述于表2中。葡糖淀粉酶活性以相对单位表示，第4天WT1培养物的平均值被设定为100％。每种类型示出的两个转化子是经独立分离和培养的转化子。

图5描述了pGBDEL-PGLAA的质粒图谱，其是置换型载体。

图6描述了启动子置换的示意图。

图7描述了通过同源重组进行的整合的示意图。

图8描述了P.cinnabarinus重组菌株G13(A)、S1(B)和L12-8(C)的夹层菌落(sandwiched colonies)第6天(上图)和第10天(下图)的漆酶空间活性(关于对菌株的解释，见表4。漆酶活性作为灰色或黑色的染色被检测。黑箭头表示菌落的边缘)。

图9描述了菌株GS8(A)和亲本G14菌株(B)的漆酶活性。漆酶活性作为灰色或黑色的染色被检测。在G-S8中，菌丝体的最大部分被用于分泌。

发明详述

本发明的一个目的是提供改进的表达***，其基于包含多种有区别的(distinct)启动子序列的重组宿主细胞。这些启动子可例如在细胞周期的不同阶段、或在真菌细胞或真菌菌丝体的不同部分展示出有区别的活性。它们还可被特意性的方便的底物或化合物所诱导。当想要在单个宿主中同时过量表达多种基因时，若干种有区别的功能性启动子也是有利的。为防止压制(squelching)(特定转录因子的滴定)，优选使用多个有区别的启动子，例如，每种待表达基因一种特定的启动子。

因此，本发明涉及包含至少两种DNA构建体的重组宿主细胞，每种DNA构建体包含与启动子DNA序列可操作关联的编码序列，其中，所述至少两种DNA构建体包含至少两种有区别的启动子DNA序列，并且，其中，所述DNA构建体包含的编码序列编码相关的多肽。所述重组宿主细胞在本文中将被称为“根据本发明的重组宿主细胞”。根据本发明的重组宿主细胞有利地用于对至少一种感兴趣的化合物进行重组生产。任选地，所述两种DNA构建体被包含在单个构建体中。根据本发明的一个方面，重组宿主包含通过重组技术引入宿主细胞的至少一种DNA构建体，即，重组宿主所源自的亲本宿主可能已含有包含编码感兴趣的化合物的编码序列的天然DNA构建体。

感兴趣的化合物可以是例如RNA、多肽、代谢产物，或者可以是整个宿主细胞或其部分(即，生物质或经加工的生物质，例如，生物质的提取物)。

术语“有区别的启动子DNA序列”在本文中被定义为并非均从单个基因获得的启动子DNA序列。有区别的启动子DNA序列将被称为“根据本发明的启动子序列”。根据本发明，启动子序列可以是相对编码序列来说天然或外源的，并且，启动子序列可以是相对于宿主细胞来说天然或外源的。

术语“相关多肽”在本文中被定义为涵盖对单种感兴趣的化合物生产中所涉及的多肽。一种或多种多肽可以是实际上的感兴趣的化合物；另外一种多肽可任选地是调控子，例如，感兴趣的多肽的转录活化因子。如果感兴趣的化合物是代谢产物，那么相关多肽可以是代谢产物生产中所涉及的酶。

或者，相关多肽可共享高度匹配百分比。根据本发明的一种实施方式中，相关多肽共享至少50％的匹配百分比。更优选地，相关多肽至少60％，进一步更优选至少70％，进一步更优选至少80％，进一步更优选至少90％，进一步更优选至少99％。最优选地，相关多肽是相同的多肽。

就本发明的目的而言，优选使用Thompson JD，Higgins DG，and GibsonTJ(1994)ClustalW：improving the sensitivity of progressive multiple sequencealignment through sequence weighting，positions-specific gap penalties andweight matrix choice.Nucleic Acids Research 22：4673-4680中定义的ClustalW来测定两种多肽之间或两条核酸序列之间的同一性程度，即，匹配百分比。

根据一种优选的实施方式中，所述至少两种有区别的启动子DNA序列具有有区别的表达特征。

根据另一优选的实施方式，所述至少两种启动子DNA序列中的至少一种选自

(a)DNA序列，其包含选自SEQ ID NO：1至4和13至55和表1所列出的基因的启动子DNA序列构成的组的核苷酸序列，

(b)能与(a)的DNA序列杂交的DNA序列，

(c)与(a)的DNA序列共享至少80％同源性的DNA序列

(d)(a)至(c)的DNA序列中任何序列的变体，以及

(e)(a)至(d)的DNA序列中任何序列的亚序列

构成的组；

其中，优选地，所述至少两种有区别的启动子DNA序列具有有区别的表达特征。

就本发明的目的而言，表1所描述的基因的启动子DNA序列被定义为各基因起始密码子(ATG)恰好上游的1500bp的核苷酸序列。根据本发明的一种更优选的实施方式中，所述至少两种启动子DNA序列中的至少一种选自表1所描述的基因的启动子DNA序列，其中，优选地，所述至少两种有区别的启动子DNA序列具有有区别的表达特征，即，选自不同的列(例如，表1第I列中列出的基因的启动子DNA序列组合表1第II列中列出的基因的启动子DNA序列)。

优选的启动子组合是：An03g06550的启动子DNA序列(例如，SEQID NO：16所提供的具有经优化的翻译起始位点的glaA启动子)与An12g06930或An05g02100的启动子DNA序列中的至少一种(例如，具有经优化的翻译起始位点(细节如WO 2006/077258所述)的WO2006/092396提到的amyB启动子；SEQ ID NO：17代表具有经优化的翻译起始位点的启动子DNA序列An12g06930)组合。

其它优选的启动子组合是：基因An03g06550(例如，SEQ ID NO：16所提供的具有经优化的翻译起始位点的glaA启动子)、An12g06930和/或An05g02100(例如，WO 2006/092396提到的amyB启动子；SEQ ID NO：17代表具有经优化的翻译起始位点的启动子DNA序列An12g06930)的启动子DNA序列中的至少一种与An16g01830的启动子序列(SEQ ID NO：18所提供的gpdA启动子)、WO 2005/100573中提到的启动子(例如，SEQ ID NO：13、14、15、19或20中提供的启动子)中的至少一种组合。

其它优选的启动子组合是：基因An03g06550(例如，SEQ ID NO：16所提供的具有经优化的翻译起始位点的glaA启动子)、An12g06930和/或An05g02100(例如，WO 2006/092396提到的amyB启动子；SEQ ID NO：17代表具有经优化的翻译起始位点的启动子DNA序列An12g06930)、An16g01830(SEQ ID NO：18所提供的gpdA启动子)、WO 2005/100573提到的启动子(例如，SEQ ID NO：13、14、15、19或20中提供的启动子)构成的组中的启动子DNA序列中的至少一种与表1的第II列所列出的基因的启动子DNA序列中的至少一种组合。

I	II	III
I	II	III	An03g06550	An15g01590	An15g07090
An15g07700	An14g00420	An04g06510	An03g06550	An15g01590	An15g07090
An15g07700	An14g00420	An04g06510	An11g01630	An01g03090	An14g03080
An08g05640	An02g07020	An11g10490	An11g01630	An01g03090	An14g03080
An08g05640	An02g07020	An11g10490	An02g10320	An04g08150	An08g03490
An01g06860	An16g09070	An18g05640	An02g10320	An04g08150	An08g03490
An01g06860	An16g09070	An18g05640	An04g08190	An07g00070	An01g03480
An04g06380	An04g09490	An08g01960	An04g08190	An07g00070	An01g03480
An04g06380	An04g09490	An08g01960	An15g03940	An18g03380	An09g06790
An04g03360	An15g01580	An07g03880	An15g03940	An18g03380	An09g06790
An04g03360	An15g01580	An07g03880	An04g00990	An08g09880	An14g00010
An11g03340	An03g02400	An08g10060	An04g00990	An08g09880	An14g00010
An11g03340	An03g02400	An08g10060	An04g06920	An03g02360	An01g05960
An16g03330	An01g11660	An12g04870	An04g06920	An03g02360	An01g05960
An16g03330	An01g11660	An12g04870	An16g07110	An01g01950	An04g02260
An11g01660	An17g00230	An06g01550	An16g07110	An01g01950	An04g02260
An11g01660	An17g00230	An06g01550	An01g07140	An08g08370	An08g06960
An16g02930	An18g05480	An15g01700	An01g07140	An08g08370	An08g06960

I	II	III
I	II	III	An12g00710	An02g14590	An01g02900
An16g05930	An12g09270	An16g05920	An12g00710	An02g14590	An01g02900
An16g05930	An12g09270	An16g05920	An16g05920	An16g01880	An08g07290
An13g00320	An11g02540	An07g09990	An16g05920	An16g01880	An08g07290
An13g00320	An11g02540	An07g09990	An12g06930	An02g00090	An17g00550
An05g02100	An09g00840	An16g01830	An12g06930	An02g00090	An17g00550
An05g02100	An09g00840	An16g01830		An01g10930	An18g04840
		An18g04220		An01g10930	An18g04840

表1：Aspergillus niger基因序列。第I、II和III列代表差异表达的基因，即，基因的启动子的有区别的表达特征，其中，“有区别的表达特征”如下文所定义。基因号参见Pel et al.，Genome sequencing and analysisof the versatile cell factory Aspergillus nigerCBS 513.88，Nature Biotechnology25，221-231(2007)公开的序列，所述序列通过引用并入本文。Aspergillusniger的经注释的基因组已保藏于EMBL数据库中。

术语“宿主细胞”涵盖所有合适的真核和原核宿主细胞。对宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码感兴趣的化合物的基因及其来源。技术人员知道如何选择合适的宿主细胞。

根据一种实施方式，根据本发明的重组宿主细胞被用于生产多肽。

根据另一实施方式，根据本发明的重组宿主细胞被用于生产特定的初级或次级代谢产物，所述代谢产物是感兴趣的化合物，例如(β-内酰胺)抗生素、维生素或类胡萝卜素。

术语“DNA构建体”在本文中被定义为核酸分子，其为单链或双链，其是从天然存在的基因分离的，或已被修饰以含有以天然不存在的方式组合或并置的核酸片断。

术语“编码序列”在本文中被定义为：当放置于合适的控制序列的控制下时，转录成mRNA(其被翻译为多肽)的核酸序列。编码序列的边界通常由ATG起始密码子(正常情况下存在于mRNA的5’末端的开放读码框的起点)和转录终止子序列(位于mRNA的3’末端的开放读码框的恰下游)来限定。编码序列可包括但不限于：基因组DNA、cDNA、半合成的核酸序列、合成的核酸序列和重组核酸序列。

在本发明的上下文中，启动子DNA序列是这样的DNA序列：当其与编码序列可操作关联时，其能控制编码序列的表达。启动子DNA序列可包括但不限于：基因组DNA、半合成的核酸序列、合成的核酸序列和重组核酸序列。

术语“启动子”或“启动子序列”可互换使用，在本文中它们被定义为：与RNA聚合酶结合并将聚合酶引导到编码序列的正确转录起始位点以启动转录的DNA序列。RNA聚合酶能有效催化与编码区域的合适DNA链互补的信使RNA的装配。术语“启动子”或“启动子序列”还应当被理解为包括用于在转录为mRNA之后进行的翻译的5’非编码区域(启动子和翻译起点之间)、顺式作用转录控制元件(例如增强子)和能与转录因子相互作用的其它核苷酸序列。

术语“可操作关联”(“operative association”)在本文中被定义为这样的构造：其中，启动子DNA序列适当地放在相对于编码区域的位置上，所述位置使得启动子DNA序列能指导编码序列编码的多肽的产生。

术语“有区别的表达特征”在本文中被定义为：当在相似的条件下检验时，至少两种启动子之间表达水平的差异，所述差异在至少一种场合下发生。这些场合在下文中列出，但是仅仅是出于阐述性目的而对其加以描述，它们并不应被解释为穷尽性列举。

有区别的表达特征包含作为细胞分化结果的表达差异。细胞分化是发育生物学的概念，其描述了细胞获得“类型”的过程。在分化期间，细胞或生物的遗传材料保留为相同的(只除了极少的例外)，但是形态可能戏剧性地改变。分化可能涉及细胞生理的数个方面的改变；分化期间，大小、形状、极性、代谢活性、对信号的应答性或基因表达情形均可改变。从而，真菌可在菌丝的不同部分间有所分化(例如，菌丝的菌丝尖端对接近顶点的部分)或者在菌丝体的不同部分间有所分化(例如，营养菌丝体的中央和***之间，或者营养菌丝体和生殖菌丝体(例如，子实体或分生孢子)之间)。

分化例如可作为衰老、生长条件、营养组成、胁迫(环境条件)、温度、辐射、压力、形态、光照、生长速度、发酵类型(分批、补料分批、连续生长条件、深浸、表面或固体状态)的结果而发生。营养组成介导的分化的一个例子是通过营养物——木糖来诱导Aspergillus中的转录因子XlnR。转录因子XlnR诱导多种编码细胞外酶的基因的转录，而其它基因的转录不被诱导(de Vries and Visser，Microb.Mol.Biol.Rev.65：497-522)。

分化可能涉及细胞生理的数个方面的改变，可在转录、翻译、蛋白表达或酶活性水平上发现其基础。分化可在DNA、RNA、mRNA、蛋白或酶活性或代谢产物的水平上发生。可通过对(潜在)分化细胞的DNA、RNA、mRNA、蛋白或酶活性或代谢产物水平加以测量和比较，来鉴定分化以及由此的有区别的表达特征。鉴定出的(代谢，RNA或蛋白)差异可与涉及的基因相关。这些基因是具有有区别的表达特征的候选基因。可通过测量研究中(潜在)分化的细胞之间基因的mRNA水平，来研究表达情形和可能的有区别的表达特征。差异表达的基因含有具有有区别的表达特征的启动子。差异表达的基因优选在表达水平上有至少2倍的区别，更优选地，至少3倍，进一步更优选地，至少5倍，进一步更优选地，至少10倍，进一步更优选地，至少20倍，进一步更优选地，至少50倍，最优选地，至少100倍。优选地，当在相似的条件下检验时，一种启动子导致检测不到的表达，而比较之下，另一种启动子导致高水平的表达。

对于具有有区别的表达特征的启动子DNA序列的应用而言，有区别的表达特征可能与工业条件和工艺相关。这些分化的条件涉及但不限于：工业生长和对生物质及产物的生产期间细胞之间存在的空间、时间、环境或营养差异。

有区别的表达特征可能在细胞周期的不同阶段或者细胞的不同部分中反映出来。

重组宿主细胞

根据本发明，根据本发明的重组宿主细胞可以是任何合适的真核或原核宿主细胞。

根据一种实施方式中，重组宿主细胞是原核细胞。原核宿主细胞可以是可用于本发明方法中的任何原核宿主细胞。优选地，原核宿主细胞是细菌细胞。术语“细菌细胞”包括革兰氏阴性和革兰氏阳性微生物。合适的细菌可选自，例如，Escherichia、Anabaena、Caulobacter、Gluconobacter、Rhodobacter、Pseudomonas、Paracoccus、Bacillus、Brevibacterium、Corynebacterium、Rhizobium(Sinorhizobium)、Flavobacterium、Klebsiella、Enterobacter、Lactobacillus、Lactococcus、Methylobacterium、Propionibacterium、Staphylococcus或Streptomyces。优选地，细菌细胞选自B.subtilis、B.amyloliquefaciens、B.licheniformis、B.puntis、B.megaterium、B.halodurans、B.pumilus、G.oxydans、Caulobactert crescentus CB 15、Methylobacterium extorquens、Rhodobactersphaeroides、Pseudomonas zeaxanthinifaciens、Paracoccus denitrificans、E.coli、C.glutamicum、Staphylococcus carnosus、Streptomyces lividans、Sinorhizobium melioti和Rhizobium radiobacter构成的组。

根据一种实施方式，重组宿主细胞是真核细胞。真核宿主细胞可以是可用于本发明方法中的任何真核宿主细胞。优选地，真核细胞是哺乳动物、昆虫、植物、真菌或藻类细胞。优选的哺乳动物细胞包括，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、293细胞、PerC6细胞和杂交瘤。优选的昆虫细胞包括，例如，Sf9和Sf21细胞及其衍生物。更优选地，重组宿主细胞是真菌宿主细胞。真菌宿主细胞可以是可用于本发明方法中的任何真菌细胞。“真菌”在本文中使用时包括Ascomycota、Basidiomycota、Chytridiomycota和Zygomycota门(如Hawksworth et al.，In，Ainsworth and Bisby′s Dictionary of The Fungi，8th edition，1995，CABInternational，University Press，Cambridge，UK所定义)以及Oomycota(如上文Hawksworth et al.所提到的)和所有有丝***孢子(mitosporic)真菌(上文Hawksworth et al.)

根据一种优选的实施方式中，真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”在本文中使用时包括产子囊酵母(Endomycetales)、担孢子(basidiosporogenous)酵母和属于Fungi Imperfecti(Blastomycetes)的酵母。鉴于对酵母的归类未来可能有所改变，因此就本发明的目的而言，酵母将被定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，and Davenport，R.R.，eds，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)所述。

根据一种更优选的实施方式，酵母宿主细胞是Candida、Hansenula、Kluyveromyces、Pichia、Saccharomyces、Schizosaccharomyces或Yarrowia细胞。

根据一种进一步更优选的实施方式，酵母宿主细胞是Saccharomycescarlsbergensis、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces diastaticus、Saccharomyces douglasii、Saccharomyces kluyveri、Saccharomyces norbensis或Saccharomyces oviformis细胞。根据另一种进一步更优选的实施方式，酵母宿主细胞是Kluyveromyces lactis细胞。根据另一种进一步更优选的实施方式中，酵母宿主细胞是Yarrowia lipolytica细胞。

根据另一优选的实施方式，真菌宿主细胞是有丝真菌细胞。“有丝真菌”包括Eumycota和Oomycota亚门的所有有丝形式(如上文Hawksworth et al.，1995所定义)。有丝真菌的特征在于几丁质、纤维素、葡聚糖、脱乙酰几丁质、甘露聚糖和其它复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长通过菌丝延长进行，碳代谢大多是专性需氧的。相反，酵母(例如Saccharomyces cerevisiae)的营养生长主要是通过单细胞菌体的出芽来进行，碳代谢可以是发酵性的。

根据一种更优选的实施方式，有丝真菌宿主细胞是Acremonium、Agraricus、Aspergillus、Aureobasidium、Chrysosporum、Coprinus、Cryptococcus、Filibasidium、Flammulina、Fusarium、Humicola、Magnaporthe、Mucor、Myceliophthora、Neocallimastix、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Phanerochaete、Piromyces、Pleurotus、Schizophyllum、Shiitake、Talaromyces、Thermoascus、Thielavia、Tolypocladium、Trametes或Trichoderma菌株的物种，但不限于此。

根据一种进一步更优选的实施方式，有丝真菌宿主细胞是Aspergillusawamori、Aspergillus aculeatus、Aspergillus foetidus、Aspergillusjaponicus、A.nidulans、Asprgillus niger、Aspergillus sojae、Aspergillustubigenis、Aspergillus vadensis或Aspergillus oryzae细胞。根据另一种进一步更优选的实施方式，有丝真菌宿主细胞是Fusarium bactridioides、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、Fusarium culmorum、Fusariumgraminearum、Fusarium graminum、Fusarium heterosporum、Fusariumnegundi、Fusarium oxysporum、Fusarium reticulatun、Fusarium roseum、Fusarium sambucinum、Fusarium sarcochroum、Fusarium sporotrichioides、Fusarium sulphureum、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides或Fusarium venenatum细胞。根据另一种进一步更优选的实施方式，有丝真菌宿主细胞是Agraricus bisprorus、Chrysosporium lucknowense、Humicolainsolens、Humicola lanuginosa、Mucor miehei、Myceliophthorathermophila、Neurospora crassa、Penicillium purpurogenum、Penicilliumchrysogenum、Pycnoporus cinnabarinus、Thielavia terrestris、Trichodermaharzianum、Trichoderma koningii、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei或Trichoderma viride细胞。

若干有丝真菌的菌株是公众可从大量培养机构容易获得的，例如，American Type Culture Collection(ATCC)，Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)，Centraalbureau VoorSchimmelcultures(CBS)，Banque de Resources Fongiques de Marseille，France和Agricultural Research Service Patent Culture Collection，NorthernRegional Research Center(NRRL)Aspergillus niger CBS 513.88，Aspergillus oryzae ATCC 20423、IFO 4177、ATCC 1011、ATCC 9576、ATCC14488-14491、ATCC 11601、ATCC12892，P.chrysogenum CBS455.95，Penicillium citrinum ATCC 38065，Penicillium chrysogenum P2，Acremonium chrysogenum ATCC 36225或ATCC 48272、Trichoderma reeseiATCC 26921或ATCC 56765或ATCC 26921，Aspergillus sojaeATCC11906，Chrysosporium lucknowense ATCC44006，Pycnoporuscinnabarinus BRFM44及其衍生物。

任选地，有丝真菌宿主细胞较之野生型细胞而言包含升高的未折叠蛋白应答(UPR)，以增强感兴趣的化合物的生产能力。可通过US2004/0186070A1和/或US2001/0034045A1和/或WO01/72783A2所述的技术来增加UPR。更具体地，HAC1和/或IRE1和/或PTC2的蛋白水平被调节，以获得具有升高的UPR的宿主细胞。

备选地，或与升高的UPR组合，有丝真菌宿主细胞可包含ER和细胞质之间的sec61转位(translocation)通道的特定单向突变，如WO2005/123763所述。此类突变赋予了这样的表型：其中，从头合成的多肽可经由sec61进入ER，但在该单向突变体中，经由sec61的反向运输受损。

备选地，或与升高的UPR和/或sec61转位通道的单向突变组合，有丝真菌宿主细胞可以是经遗传修饰的，以获得较之野生型细胞而言展示出较低的蛋白酶表达和/或蛋白酶分泌的表型，以增强感兴趣的化合物的生产能力。可通过对蛋白酶表达的转录调控子的缺失和/或修饰和/或失活，来获得此类表型。此类转录调控子例如是prtT。通过调节prtT来降低蛋白酶的表达优选通过US2004/0191864A1、WO2006/04312和WO2007/062936描述的技术来进行。

备选地，或与升高的UPR和/或sec61转位通道的单向突变、展示出较低的蛋白酶表达和/或蛋白酶分泌的表型组合，有丝真菌宿主细胞展示出草酸缺陷型表型，以增强感兴趣的化合物的生产产率。草酸缺陷型表型优选通过WO2004/070022(通过引用并入本文)描述的技术获得。

备选地，或与升高的UPR和/或sec61转位通道的单向突变、展示出较低的蛋白酶表达和/或蛋白酶分泌和/或草酸缺陷型的表型组合，有丝真菌宿主细胞展示出较之野生型细胞而言的表型差异的组合，以增强感兴趣的化合物的生产产率。这些差异包括但不限于：葡糖淀粉酶和/或中性α-淀粉酶A和/或中性α-淀粉酶B、蛋白酶和草酸水解酶的表达降低。可根据US2004/0191864A1描述的技术通过遗传修饰来获得有丝真菌宿主细胞展示的所述表型差异。

启动子DNA序列

优选地，通过测量与启动子可操作关联的编码序列所编码的蛋白的浓度来测定启动子活性。备选地，通过测量与启动子可操作关联的编码序列编码的蛋白的酶促活性来测定启动子活性。最优选地，通过测量lacZ报道基因的编码序列的表达来测定启动子活性(及其长度)(Luo(Gene 163(1995)127-131)。根据另一优选的实施方式中，通过使用绿色荧光蛋白作为编码序列来测定启动子活性(Microbiology.1999 Mar；145(Pt 3)：729-34.Santerre Henriksen AL，Even S，Muller C，Punt PJ，van den Hondel CA，NielsenJ.Study)。

此外，可通过测量处于启动子控制下产生的转录本的mRNA水平来测定启动子活性。例如可通过Northern印迹杂交或实时定量PCR来测量mRNA水平(J.Sambrook，2000，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，3dedition，Cold Spring Harbor，N.Y.)。

根据本发明的一个方面，根据本发明的启动子DNA序列是能与包含选自下述组的核苷酸序列的DNA序列杂交的DNA序列，所述组由SEQID NO：1至4和13至55和表1列出的基因的启动子DNA序列构成。根据一种优选的实施方式，根据本发明的启动子DNA序列是包含选自由SEQ ID NO：1至4和13至55和表1列出的基因的启动子DNA序列构成的组的核苷酸序列的DNA序列。本发明包括下述(经分离的)启动子DNA序列，它们保留有启动子活性，并可在非常低严紧度的条件下，优选地，低严紧度条件下，更优选地，中等严紧度条件下，更优选地，中-高严紧度条件下，进一步更优选地，高严紧度条件下，最优选地，非常高严紧度条件下，与对应于：

(i)选自SEQ ID NO：1至4和13至55和表1列出的基因的启动子DNA序列的组的序列的第1至1500位核苷酸，优选地，第100至1490位核苷酸，更优选地，第200至1480位，进一步更优选地，第300至1470位，进一步更优选地，第350至1450位，最优选地，第360至1400位，

(ii)(i)的亚序列，或

(iii)(i)、(ii)的互补链(上文的J.Sambrook et al.)的探针杂交。

选自SEQ ID NO：1至4和13至55和表1列出的基因的启动子DNA序列的组的序列的亚序列可以是至少100个核苷酸，优选至少200个核苷酸，更优选至少300个核苷酸，进一步更优选至少400个核苷酸，最优选至少500个核苷酸。杂交条件在本说明书中有进一步定义。

可根据本领域公知的方法，用选自SEQ ID NO：1至4和13至55和表1列出的基因的启动子DNA序列的组的序列或其亚序列来设计核酸探针，以从不同属或种的菌株鉴定和克隆DNA启动子。特别地，可遵循标准的Southern印迹杂交流程，用此类探针与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以鉴定和分离其中的相应基因。此类探针可比整条序列短得多，但长度应当为至少15个核苷酸，优选至少25个，更优选至少35个核苷酸。此外，此类探针可用于通过PCR来扩增DNA启动子。还可使用更长的探针。可使用DNA、RNA和肽核酸(PNA)探针。典型地，对探针加以标记，以检测相应的基因(例如，用32P、33P、3H、35S、生物素或亲和素或荧光标志来进行)。本发明包括此类探针。

因此，可对从其它此类生物制备的基因组DNA或cDNA文库加以筛选，选出能与上文所述的DNA杂交并且编码多肽的DNA。可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其它分离技术，来分离来自其它此类生物的基因组DNA或其它DNA。可将来自文库的DNA或分离的DNA转到并固定到硝酸纤维素或其它合适的介载体(carrier)材料上。为鉴定出与选自SEQ ID NO：1至4和13至55和表1列出的基因的启动子DNA序列的组的序列共享同源性的克隆或DNA，或其亚序列，可在Southern印迹杂交中使用介载体材料。

就本发明的目的而言，杂交表示：在非常低至非常高的严紧度条件下，核酸序列能与经标记的核酸探针杂交，所述探针对应于选自SEQ IDNO：1至4和13至55的组的核酸序列、互补序列或其亚序列，或对应于表1列出的基因之一的启动子DNA序列、互补序列或其序列。用例如X-射线显影来检测核酸探针在上述条件下与之杂交的分子。还可使用其它杂交技术，例如，使用荧光来检测和使用玻片和/或DNA微阵列作为支持物的技术。在FEMS Yeast Res.2003Dec；4(3)：259-69(Daran-Lapujade P，DaranJM，Kotter P，Petit T，Piper MD，Pronk JT.“Comparative genotyping of theSaccharomyces cerevisiae laboratory strains S288C and CEN.PK113-7D usingoligonucleotide microarrays”中给出了DNA微阵列杂交检测的一个例子。此外，在Nucleic Acids Res.2003 Oct 1；31(19)：119(Brandt O，Feldner J，Stephan A，Schroder M，Schnolzer M，Arlinghaus HF，Hoheisel JD，Jacob A.PNA microarrays for hybridisation of unlabelled DNA samples.)中描述了用PNA微阵列来进行杂交。

优选地，核酸探针是选自SEQ ID NO：1至4和13至55的组或表1列出的基因之一的启动子DNA序列的组的核酸序列。更优选地，核酸探针是这样的序列，其具有选自SEQ ID NO：1至4和13至55的组或表1列出的基因之一的启动子DNA序列的组的序列的第20至1480位核苷酸，更优选地，第500至1450位核苷酸，进一步更优选地，第800至1420位核苷酸，最优选地，选自SEQ ID NO：1至4和13至55的组或表1列出的基因之一的启动子DNA序列的组的序列的第900至1400位核苷酸。另一优选的探针是转录起始位点上游的DNA序列的部分。

对于长度为至少100个核苷酸的长探针而言，非常低至非常高的严紧度条件被定义为：遵循标准的Southern印迹杂交流程，在42℃，在5xSSPE，0.3％SDS，200微克/ml经剪切和变性的鲑鱼精DNA以及25％甲酰胺(用于非常低和低的严紧度)、35％甲酰胺(用于中等和中-高严紧度)或50％甲酰胺(用于高和非常高的严紧度)中预杂交和杂交。

对于长度为至少100个核苷酸的长探针而言，介载体材料最终被洗三次，每次15分钟，这使用2x SSC，0.2％SDS进行，优选针对非常低的严紧度在至少45℃进行，更优选针对低严紧度在至少50℃进行，更优选针对中等严紧度在至少55℃进行，更优选针对中-高严紧度在至少60℃进行，更优选针对中-高严紧度在至少60℃来进行，进一步更优选针对高严紧度在至少65℃进行，最优选针对高严紧度在至少70℃进行。

对于长度为大约15个核苷酸至大约100个核苷酸的短探针而言，严谨条件被定义为：按照标准的Southern印迹杂交流程，在0.9M NaCl，0.09M Tris-HCl pH 7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1x Denhardt′s溶液，1mM焦磷酸钠，1mM磷酸二氢钠，0.1mM ATP和每ml 0.2mg酵母RNA中，以比根据Bolton and McCarthy(1962，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 48：1390)计算的Tm低5℃至10℃的温度进行预杂交、杂交和杂交后洗涤。

对于长度为大约15个核苷酸至大约100个核苷酸的短探针而言，在比计算出的Tm低5℃至10℃的温度下，在6x SCC加0.1％SDS中对介载体材料进行15分钟的洗涤，以及用6x SSC进行两次每次15分钟的洗涤。

根据另一实施方式，首先用选自SEQ ID NO：1至4和13至55的组的序列或表1所列出的基因之一的启动子DNA序列来克隆天然基因、所述天然基因的编码序列或其部分(与选自SEQ ID NO：1至4和13至55的组的序列或表1所列出的基因之一的启动子DNA序列可操作地关联的)。这可用选自SEQ ID NO：1至4和13至55的组的序列、表1所列出的基因之一的启动子DNA序列或前文所定义的其亚序列开始，使用该序列作为探针来进行。将探针与给定宿主(Aspergillus niger或本申请定义的任何其它真菌宿主)的cDNA文库或基因组文库杂交。一旦天然基因或其部分被克隆，随后即可用其自身作为探针，通过本文所述的杂交实验，来克隆源于其它真菌的与所述天然基因共享同源性的基因。优选地，此类基因与所述天然基因共享至少55％的同源性，更优选至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，进一步更优选至少75％，优选大约80％，更优选大约90％，进一步更优选大约95％，最优选与所述天然基因有大约97％的同源性。与所述天然基因共享同源性的基因的编码序列上游的序列是本发明的启动子。

备选地，可使用例如本文所述的比对或BLAST算法，用选自SEQ IDNO：1至4和13至55的组的序列或前文所定义的其亚序列或表1所列出的基因序列或其亚序列，检索基因组数据库，来鉴定天然基因、编码序列或其部分(与根据本发明的启动子可操作地关联的)的序列。随后可用得到的序列来鉴定在本申请所定义的任何其它真菌宿主中的直向同源体(orthologues)或同源基因。鉴定的直向同源体或同源基因的编码序列上游的序列是本发明的启动子。

根据又一实施方式，根据本发明的启动子DNA序列是(经分离的)DNA序列，其与选自SEQ ID NO：1至4和13至55的组的序列或与表1所列出的基因之一的启动子DNA序列共享至少80％的同源性(同一性)。优选地，该DNA序列与选自SEQ ID NO：1至4和13至55的组的序列或与表1所列出的基因之一的启动子DNA序列共享至少优选大约85％，更优选大约90％，进一步更优选大约95％，最优选大约97％的同源性。

就本发明的目的而言，术语“同源性”和“同一性”可互换使用。

优选地，用BLAST程序来确定两条核酸序列间的同源性(同一性)程度。用于进行BLAST分析的软件是公众可通过National Center forBiotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得的。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用字长(W)为11、BLOSUM62计分矩阵(见Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))、比对(B)为50、期望(E)为10、M＝5、N＝-4以及两条链比较作为默认设置。

根据本发明的又一实施方式，启动子DNA序列是选自SEQ ID NO：1至4和13至55的组或表1所列出的基因之一的启动子DNA序列的组的序列。

术语“变体”或“变体启动子”在本文中被定义为具有下述核苷酸序列的启动子，所述核苷酸序列包含亲本启动子的一个或多个核苷酸的取代、缺失和/或***，其中所述变体启动子比相应的亲本启动子具有更大或更小的启动子活性。术语“变体启动子”将包括天然变体和使用本领域公知的方法(例如经典诱变、定点诱变和DNA改组)获得的体外产生的变体。变体启动子可具有一处或多处突变。每处突变是独立的核苷酸取代、缺失和/或***。

根据一种优选的实施方式，变体启动子是这样的启动子，其较之首先鉴定的启动子序列(例如，选自SEQ ID NO 1至4和13至55的序列或表1所列出的基因之一的启动子DNA序列)至少具有经修饰的调控位点。此种调控位点可整个移除，或按照上文所解释的那样被特定突变。此类启动子变体的调控由此被修饰，使得例如其不再被葡萄糖所诱导。此类启动子变体的例子和如何获得它们的技术被描述于EP 673429或WO 94/04673中。

启动子变体可以是等位变体。等位变体指基因的占据相同染色体座的两种或多种备选形式中的任一。等位变体通过突变天然产生，其可在种群内导致多态性。可通过(a)在非常低、低、中等、中-高、高或非常高严紧度的条件下，与(i)选自SEQ ID NO：1至4和13至55的组的序列或表1所列出的基因之一的启动子DNA序列、(ii)(i)的亚序列或(iii)(i)、(ii)的互补链杂交，以及(b)从DNA分离变体启动子，来获得变体启动子。严紧度和洗涤条件如本文所定义。

根据另一实施方式，启动子是选自SEQ ID NO：1至4和l 3至55的组或表1所列出的基因之一的启动子DNA序列的组的序列的亚序列，所述亚序列仍具有启动子活性。所述亚序列优选包含至少大约100个核苷酸，更优选至少大约200个核苷酸，最优选至少大约300个核苷酸。

根据另一优选的实施方式，亚序列是选自SEQ ID NO：1至4和13至55的组的序列或表1所列出的基因之一的启动子DNA序列所包括的核酸序列，其中，5’和/或3’末端的一个或多个核苷酸缺失，并且所述核苷酸序列仍具有启动子活性。

根据另一优选的实施方式，启动子序列是“剪削的(trimmed)”启动子序列，即，翻译起点和/或转录起点上游的序列片段。Gene.1994 Aug5；145(2)：179-87：the effect of multiple copies of the upstream region onexpression of the Aspergillus niger glucoamylase-encoding gene.Verdoes JC，Punt PJ，Stouthamer AH，van den Hondel CA中描述了剪削启动子并对其进行功能分析的一个例子。

根据本发明的启动子可以是这样的启动子：其序列可提供有连接子，用于引入特定的限制性位点，以协助启动子序列与编码多肽的核酸序列的编码区域的连接。

除非另有指明，本文中通过对DNA分子测序测得的所有核苷酸序列都是用自动DNA测序仪测定的。因此，如本领域对于通过该自动手段测定的任何DNA序列已知的那样，本文测定的任何核苷酸序列可能含有一些错误。典型地，通过自动方法测定的核苷酸序列与被测序的DNA的实际核苷酸序列至少大约90％相同，更典型地，至少大约95％至至少大约99.9％相同。可以通过其它方法，包括本领域公知的手动DNA测序方法对实际序列进行更为精确的测定。

本领域技术人员能鉴定出此类错误鉴定的碱基，并且知道如何校正此类错误。

本文提供的序列信息因此不应当被狭义解释为需要包括进错误鉴定的碱基。本文公开的特定序列可容易地用于从例如有丝真菌(特别是Aspergillus niger)分离出原始DNA序列，以及进行进一步序列分析，由此鉴定出测序错误。

本发明包括启动子功能等同物，其典型地含有不改变所关注的启动子生物学功能的突变。术语“功能等同物”还包括A.nigerDNA序列的直向同源体。A.nigerDNA序列的直向同源体是可从其它菌株或物种分离并且具有相似或相同的生物学活性的DNA序列。

本发明的启动子序列可从任何属的微生物获得。就本发明的目的而言，在本文中与给定来源一同使用时，术语“从……获得”将表示多肽是通过该来源生产的或是通过***有来自该来源的基因的细胞生产的。

根据本发明的一种实施方式，启动子从原核来源获得，优选从Escherichia、Anabaena、Caulobactert、Gluconobacter、Rhodobacter、Pseudomonas、Paracoccus、Bacillus、Brevibacterium、Corynebacterium、Rhizobium(Sinorhizobium)、Flavobacterium、Klebsiella、Enterobacter、Lactobacillus、Lactococcus、Methylobacterium、Propionibacterium、Staphylococcus或Streptomyces的物种获得。更优选地，启动子序列从B.subtilis、B.amyloliquefaciens、B.licheniformis、B.puntis、B.megaterium、B.halodurans、B.pumilus、G.oxydans、Caulobactert crescentus CB 15、Methylobacterium extorquens、Rhodobacter sphaeroides、Pseudomonaszeaxanthinifaciens、Paracoccus denitrificans、E.coli、C.glutamicum、Staphylococcus carnosus、Streptomyces lividans、Sinorhizobium melioti或Rhizobium radiobacter获得。

根据另一实施方式，启动子序列从真菌来源获得，优选从酵母菌株，例如Candida、Hansenula、Kluyveromyces、Pichia、Saccharomyces、Schizosaccharomyces或Yarrowia菌株获得，更优选从Saccharomycescarlsbergensis、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces diastaticus、Saccharomyces douglasii、Saccharomyces kluyveri、Saccharomyces norbensis或Saccharomyces oviformis菌株获得。根据另一更优选的实施方式，启动子序列从Kluyveromyces lactis菌株获得。根据另一更优选的实施方式，启动子序列从Yarrowia lipolytica菌株获得。

根据又一实施方式，启动子序列从有丝真菌菌株，例如Acremonium、Agraricus、Aspergillus、Aureobasidium、Chrysosporum、Coprinus、Cryptococcus、Filibasidium、Fusarium、Humicola、Magnaporthe、Mucor、Myceliophthora、Neocallimastix、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Piromyces、Panerochaete、Pleurotus、Schizophyllum、Talaromyces、Thermoascus、Thielavia、Tolypocladium或Trichoderma菌株获得，更优选从Agraricus bisporus、Aspergillus aculeatus、Aspergillusawamori、Aspergillus foetidus、Aspergillus japonicus、Aspergillusnidulans、Aspergillus niger、Aspergillus sojae、Aspergillus tubigenis、Aspergillus oryzae、Aspergillus vadensis、Chrysosporum lucknowense、Humicola insolens、Humicola lanuginosa、Mucor miehei、Myceliophthorathermophila、Neurospora crassa、Penicillium purpurogenum、Penicilliumchrysogenum、Pycnoporus cinnabarinus、Schizophyllum commune、Thielaviaterrestris、Trichoderma harzianum、Trichoderma koningii、Trichodermalongibrachiatum、Trichoderma reesei或Trichoderma viride菌株获得。

根据又一优选的实施方式，启动子序列从Fusarium bactridioides、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、Fusarium culmorum、Fusariumgraminearum、Fusarium graminum、Fusarium heterosporum、Fusariumnegundi、Fusarium oxysporum、Fusarium reticulatum、Fusarium roseum、Fusarium sambucinum、Fusarium sarcochroum、Fusarium sporotrichioides、Fusarium sulphureum、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides或Fusarium venenatum菌株获得。

应当理解，对于上文提到的物种，本发明包括完美和不完美的状态以及其它分类学等同物，例如，无性型(anamorph)，无论它们已知的物种名是什么。本领域技术人员将容易地识别出合适的等同物的身份。公众可容易地大量培养机构获得这些物种的菌株，例如，American Type CultureCollection(ATCC)、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(DSM)、Centraalbureau Voor Schimmelcultures(CBS)和Agricultural Research Service Patent Culture Collection、NorthernRegional Research Center(NRRL)。

此外，可使用上文所述的探针，从其它来源鉴定并获得根据本发明的启动子序列，所述来源包括从自然界(例如土壤、肥料、水等)分离的微生物。用于从自然栖息地分离微生物的技术是本领域公知的。然后可通过对另一种微生物的基因组DNA文库加以类似的筛选来获得核酸序列。一旦已用探针探测到了编码启动子的核酸序列，即可通过利用本领域普通技术人员已知的技术(见例如，上文所述的Sambrook，et al.)分离或克隆出序列。

本发明中，启动子DNA序列还可是杂种启动子，其包含本发明的一种或多种启动子的部分；本发明的启动子的部分和另一已知启动子的部分，例如一种启动子的引导序列和来自其它启动子的转录起始位点；或本发明的一种或多种启动子的部分和一种或多种其它启动子的部分。所述其它启动子可以是在所选的真菌宿主细胞中展示出转录活性的任何启动子序列，包括变体、截短的启动子和杂种启动子，其可从编码细胞外或细胞内多肽的基因获得，其可与宿主细胞同源或异源。其它启动子序列可以是相对编码多肽的核酸序列来说天然的或外源的，相对所述细胞来说天然的或外源的。

根据一种优选的实施方式，鉴定的启动子的重要的调控亚序列可与“基础”启动子融合，以增强它们的启动子活性(例如，描述于MolMicrobiol.1994 May；12(3)：479-90.Regulation of the xylanase-encoding xlnAgene of Aspergillus tubigensis.de Graaff LH，van den Broeck HC，van OoyenAJ，Visser J.中)。

可用于与本发明的启动子一起构建杂种启动子的其它启动子的其它例子包括从针对A.oryzae TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、A.niger中性α-淀粉酶、A.niger酸稳定的α-淀粉酶、A.niger或Aspergillus awamori葡糖淀粉酶(glaA)、A.niger gpdA、A.niger葡萄糖氧化酶goxC、Rhizomucor miehei脂肪酶、A.oryzae碱性蛋白酶、A.oryzae磷酸丙糖异构酶、A.nidulans乙酰胺酶和Fusarium oxysporum胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)以及NA2-tpi启动子(来自针对A.niger中性α-淀粉酶和A.oryzae磷酸丙糖异构酶的基因的启动子的杂种)、Saccharomyces cerevisiae烯醇酶(ENO-1)、Saccharomyces cerevisiae半乳糖激酶(GAL1)、Saccharomyces cerevisiae醇脱氢酶/3-磷酸甘油醛脱氢酶(ADH2/GAP)和Saccharomyces cerevisiae 3-磷酸甘油激酶的基因获得的启动子及其突变、截短和杂种启动子。Romanoset al.，1992，Yeast 8：423-488描述了用于酵母宿主细胞的其它有用启动子。

在本发明中，启动子DNA序列可以是或可以不是“串联”启动子。“串联”启动子在本文中被定义为这样的两条或多条启动子序列，它们每条都与编码序列可操作关联，并且能介导编码序列转录成mRNA。串联启动子包含本发明的两条或多条启动子或者本发明的一条或多条启动子与一条或多条其它已知启动子，例如，上文关于可用于构建杂种启动子的部分所例示的那些。串联启动子的两条或多条序列可同时促进核酸序列的转录。备选地，串联启动子的启动子序列中的一条或多条可在细胞生长的不同阶段或菌丝体的不同形态部分促进核酸序列的转录。

在本发明中，启动子序列可以是相对于编码感兴趣的化合物的编码序列和/或相对于真菌宿主细胞来说外源的。本发明的变体、杂种或串联启动子应当被理解为对于编码感兴趣的化合物的编码序列来说外源的，即使野生型启动子相对于编码序列或相对于真菌宿主细胞来说是天然的。

本发明的变体、杂种或串联启动子具有所述变体、杂种或串联启动子来源的亲本启动子的启动子活性的至少大约20％，优选至少大约40％，更优选至少大约60％，更优选至少大约80％，更优选至少大约90％，更优选至少大约100％，进一步更优选至少大约200％，最优选至少大约300％，最优选至少大约400％。

编码序列

在本发明中，根据本发明的DNA构建体中的编码序列编码多肽。多肽可以是具有感兴趣的生物学活性的任何多肽。多肽可以是相对根据本发明的宿主细胞来说同源或异源的。优选地，多肽是酶。

术语“多肽”在本文中并不表示指特定长度的编码产物，其因此包括肽、寡肽和蛋白。

术语“同源基因”或“同源多肽”在本文中被定义为可从属于相同物种的菌株(包括其变体，就像该菌株实际含有所述基因或多肽那样)获得的基因或多肽。优选地，供体和受体菌株是相同的。当基因或多肽的片段和突变体所源自的基因或多肽是同源基因或多肽时，所述片段和突变体也被认为是同源的。此外，只要编码序列是同源的，调控序列和编码序列的非天然组合也被认为是同源的。这遵循：术语“异源”在本文中指供体和受体菌株不属于相同物种或其变体的那些基因或多肽。

术语“异源多肽”在本文中被定义为并非真菌细胞天然的多肽、其中引入了修饰从而改变了天然序列的天然多肽或者由于通过重组DNA技术对真菌细胞进行操作使得其表达量被改变的天然多肽。例如，可通过例如将编码序列放到本发明启动子控制下，增强多肽的表达，使用信号序列加速感兴趣的天然多肽运出到外面以及增加编码细胞天然生产的多肽的基因的拷贝数，来重组生产天然多肽。

根据本发明的一个优选方面，多肽是肽激素或其变体、酶或细胞内蛋白。

细胞内多肽可以是涉及分泌过程的蛋白、涉及折叠过程的蛋白、肽氨基酸转运蛋白、糖基化因子、其受体或部分、抗体或其部分或受体蛋白。优选地，细胞内蛋白是伴侣分子或转录因子。其一个例子被描述于ApplMicrobiol Biotechnol.1998Oct；50(4)：447-54(“Analysis of the role of the genebipA，encoding the major endoplasmic reticulum chaperone protein in thesecretion of homologous and heterologous proteins in black Aspergilli.Punt PJ，van Gemeren IA，Drint-Kuijvenhoven J，Hessing JG，van Muijlwijk-HarteveldGM，Beijersbergen A，Verrips CT，van den Hondel CA)中。这可用于例如改进宿主细胞作为蛋白生产者的效率(如果该编码序列，例如伴侣分子或转录因子，已知是蛋白生产中的限制因素的话)。另外的优选的细胞内多肽是细胞内酶，例如amadoriase、过氧化氢酶(catalase)、酰基-CoA氧化酶、亚油酸异构酶、反-2-烯酰基-ACP还原酶、单端孢霉烯3-O-乙酰转移酶、醇脱氢酶、肉毒碱消旋酶、D-扁桃酸脱氢酶、烯酰基CoA水合酶、果糖基胺氧(frustosyl amine oxygen)氧化还原酶、2-羟基庚-2，4-二烯-1，7-二酸异构酶、NADP依赖性苹果酸脱氢酶、氧化还原酶、醌还原酶等细胞内多肽。其它细胞内酶是神经酰胺酶、环氧化物水解酶氨肽酶、酰基转移酶、醛缩酶、羟化酶、氨肽酶。

根据本发明另一优选的方面，多肽是细胞外分泌的。优选地，细胞外多肽是酶。细胞外酶的例子是：纤维素酶，例如内切葡聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维二糖水解酶或β-葡糖苷酶；半纤维素酶或胶质水解(pectinolytic)酶，例如，木聚糖酶，木糖苷酶，甘露聚糖酶，半乳糖酶，半乳糖苷酶，胶质甲酯酶，胶质裂解酶，果胶酸裂解酶，内聚半乳糖醛酸酶，外聚半乳糖醛酸酶，鼠李半乳糖醛酸酶，***聚糖酶，***呋喃糖苷酶，***木聚糖水解酶，半乳糖醛酸酶，裂解酶；淀粉水解酶；磷酸酶(例如，植酸酶)，酯酶(例如脂肪酶)，蛋白水解酶(六蛋白酶、肽酶)，氧化还原酶(例如氧化酶)，转移酶或异构酶；过氧化物酶(例如木质素酶)。

根据本发明的DNA构建体包含的编码序列还可编码涉及对初级或次级代谢产物(例如有机酸、类胡萝卜素、(β-内酰胺)抗生素和维生素)合成的酶。此类代谢产物可被认为是根据本发明的生物化合物。

编码感兴趣的多肽的编码序列可从任何原核生物、真核生物或其它来源获得。优选地，编码序列和与其关联的启动子是宿主细胞同源的，从而产生是自身克隆的重组宿主细胞。

根据本发明的一种实施方式，根据本发明的DNA构建体中的编码序列可以是变体，包含经优化终止子序列的经优化序列，例如，WO2006077258中所描述的。

编码序列可以是部分合成的核酸序列或完全合成的核酸序列。编码序列可以经过密码子使用方面的优化，优选地，根据WO2006/077258和/或WO2008/000632(通过引用并入本文)所述的方法来进行。WO2008/000632提出了密码子对优化。密码子对优化是这样的方法：其中，在其密码子使用方面(特别是所用的密码子对)对编码多肽的核苷酸序列进行了优化，以使编码多肽的核苷酸序列表达有所改进和/或对编码的多肽的生产有所改进。密码子对被定义为编码序列中两个随后的(subsequent)三体(密码子)的组。

备选地，编码序列可编码反义RNA和/或RNAi(RNA干扰)构建体的表达。表达反义RNA的一个例子在Appl Environ Microbiol.2000Feb；66(2)：775-82.(Characterization of a foldase，protein disulfide isomerase A，in the protein secretory pathway of Aspergillus niger.Ngiam C，Jeenes DJ，PuntPJ，Van Den Hondel CA，Archer DB)或(Zrenner R，Willmitzer L，Sonnewald U.Analysis of the expression of potato uridinediphosphate-glucosepyrophosphorylase and its inhibition by antisense RNA.Planta.(1993)；190(2)：247-52.)中展示。基因表达的部分、接近完全或完全失活可用于：例如，失活控制不想要的代谢途径侧支的基因，例如，以增加特定次级代谢产物(例如(β-内酰胺)抗生素或类胡萝卜素)的生产。完全失活还可用于减少毒性化合物或不想要的化合物的生产(Penicillium中的黄青霉素；Aspergillus中的黄曲霉毒素：MacDonald KD et al，：heterokaryonstudies and the genetic control of penicillin and chrysogenin production inPenicillium chrysogenum.J Gen Microbiol.(1963)33：375-83)。完全失活还可用于改变生物的形态以改进发酵过程和下游加工。

本发明的另一实施方式涉及广泛的代谢重整或对真菌细胞的工程改造。引入全新途径和/或修饰不想要的途径，将提供特别适于生产特定化合物(例如蛋白或代谢产物)的细胞。

在本发明的方法中，当编码序列编码多肽时，所述多肽还可包括融合或杂种多肽，其中，另一多肽在所述多肽或其片段的N-末端或C-末端融合。融合多肽是通过将编码一种多肽的核酸序列(或其部分)与编码另一多肽的核酸序列(或其部分)融合来生产的。用于生产融合多肽的技术是本领域已知的，其包括：将编码多肽的编码序列以符合读码框并且使融合的多肽的表达处于相同启动子和终止子控制下的方式连接起来。杂种多肽可包含从至少两种不同多肽获得的部分或完全多肽序列的组合，其中，一种或多种可以是相对真菌细胞来说异源的。

控制序列

本发明的DNA序列除包含启动子DNA序列之外还可包含一种或多种控制序列，所述控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中在与控制序列相容的条件下的表达。“表达”应当被理解为包括多肽生产中所涉及的任何步骤，其包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。一种或多种控制序列可以是对编码序列或宿主来说天然的。备选地，一种或多种控制序列可被对编码序列来说是外源的一种或多种控制序列替代，以改进编码序列在宿主细胞中的表达。

术语“控制序列”在本文中被定义为包括对于编码序列的表达来说必需或有利的所有组分，这包括根据本发明的启动子。每种控制序列可以是编码多肽的核酸序列天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于：引导序列、最优Kozak或翻译起始序列(Kozak，1991，J.Biol.Chem.266：19867-19870)(例如WO2006/077258中描述的)、聚腺苷化序列、前肽(propeptide)序列、信号肽序列、上游活化序列、根据本发明的启动子(包括源于其的串联启动子和变体、片段和杂种)和转录终止子。就最小程度而言，控制序列包括转录和翻译终止信号和根据本发明的启动子(的部分)。控制序列可提供有连接子，用于引入特定的限制性位点，以协助控制序列与编码序列的编码区域的连接。

控制序列可以是合适的转录终止子序列，即，被宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码序列的3’末端可操作关联。在所选用的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。

用于有丝真菌宿主细胞的优选终止子从针对A.oryzae TAKA淀粉酶、A.niger葡糖淀粉酶、A.nidulans氨基苯甲酸合酶、A.niger α-葡糖苷酶、trpC基因和Fusarium oxysporum胰蛋白酶样蛋白酶的基因获得。

用于酵母宿主细胞的优选终止子可从针对Saccharomyces cerevisiae烯醇酶、Saccharomyces cerevisiae细胞色素C(CYC1)和Saccharomycescerevisiae 3-磷酸甘油醛脱氢酶的基因获得。用于酵母宿主细胞的其它有用的终止子可见上文Romanos et al，1992所述。

控制序列还可是合适的引导序列，即，对于宿主细胞的翻译来说重要的mRNA 5’非翻译区域。引导序列与编码多肽的核酸序列的5’末端可操作关联。在所选的宿主细胞中有功能的任何引导序列都可用于本发明。

用于有丝真菌宿主细胞的优选引导子从针对A.oryzae TAKA淀粉酶、A.nidulans磷酸丙糖异构酶和A.niger glaA的基因获得。

用于酵母宿主细胞的合适的引导子从针对Saccharomyces cerevisiae烯醇酶(ENO-1)、Saccharomyces cerevisiae 3-甘油磷酸激酶、Saccharomyces cerevisiae α-因子和Saccharomyces cerevisiae醇脱氢酶/3-磷酸甘油醛脱氢酶(ADH2/GAP)的基因获得。

控制序列还可以是聚腺苷化序列，这是与核酸序列的3’末端可操作关联并且当转录时被宿主细胞识别为向经转录的mRNA添加聚腺苷残基的信号的序列。在所选的宿主细胞中有功能的任何聚腺苷化序列都可用于本发明。

用于有丝真菌宿主细胞的优选的聚腺苷化序列是从针对A.oryzaeTAKA淀粉酶、A.niger葡糖淀粉酶、A.nidulans氨基苯甲酸合酶、Fusarium oxysporum胰蛋白酶样蛋白酶和A.niger α-葡糖苷酶的基因获得的。

可用于酵母宿主细胞的聚腺苷化序列参见Guo and Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 15：5983-5990的描述。

控制序列还可以是编码与多肽的氨基末端相连的氨基酸序列并且指导被编码的多肽进入细胞分泌途径的信号肽编码区域。核酸序列的编码序列的5’末端可固有地含有与编码分泌的多肽的编码区域片断以符合翻译读码框的方式天然相连的信号肽编码区域。备选地，编码序列的5’末端可含有对编码序列来说是外源的信号肽编码区域。编码序列天然不含信号肽编码区域的情况下，可能会需要外源信号肽编码区域。备选地，可简单地用外源信号肽编码区域代替天然信号肽编码区域，以增强多肽的分泌。但是，指导表达的多肽进入所选用的宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区域都可用于本发明。

用于有丝真菌宿主细胞的合适的信号肽编码区域的例子是从针对A.oryzae TAKA淀粉酶、A.niger中性淀粉酶、A.ficuum植酸酶、A.niger葡糖淀粉酶、A.niger内切木聚糖酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纤维素酶和Humicola lanuginosa脂肪酶的基因获得的信号肽编码区域。

用于酵母宿主细胞的有用的信号肽是从针对Saccharomyces cerevisiaeα-因子和Saccharomyces cerevisiae转化酶的基因获得的。

其它有用的信号肽编码区域见上文Romanoset al.，1992所述。

控制序列还可以是编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列的多肽编码区域。得到的多肽已知是酶原(proenzyme)或前多肽(或者，在一些情况下是酶原(zymogen))。前多肽通常没有活性，其可通过从前多肽催化或自催化切割出前肽从而转化为活性多肽。可从针对Bacillus subtilis碱性蛋白酶(aprE)、Bacillus subtilis中性蛋白酶(nprT)、Saccharomycescerevisiae α-因子、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、Myceliophthorathermophila漆酶(WO 95/33836)和A.niger内切木聚糖酶(endol)的基因获得前肽编码区域。

当在多肽的氨基末端既存在信号肽又存在前肽区域时，前肽区域被放到多肽的氨基末端邻侧，信号肽区域被放到前肽区域的氨基末端邻侧。

还可能想要添加允许基因扩增的调控序列。调控序列的例子是：在真核***中，是二氢叶酸还原酶基因(其在存在甲氨蝶呤时被扩增)和金属硫蛋白基因(其在有重金属时被扩增)。

除去creA结合位点(如EP 673 429之前描述的碳分解代谢产物阻遏)、pacC和areA的改变(针对pH和氮调控)可能是重要的。

表达载体

本发明还涉及包含DNA构建体(包含与根据本发明的启动子DNA可操作关联的编码序列)的重组表达载体。任选地，本发明的至少两种DNA构建体(包含与启动子DNA序列可操作关联的编码序列)包含在单个DNA构建体中，所述单个DNA构建体被包含在重组表达载体中。

优选地，本发明的至少一种DNA构建体(包含与启动子DNA序列可操作关联的编码序列)存在于载体上。载体被引入宿主细胞，使得其保持为染色体整合子和/或保持为自复制的染色体外载体。

重组表达载体可以是任何载体(例如质粒或病毒)，其可方便地用于重组DNA流程，并导致编码序列的表达。对载体的选择典型地将取决于载体将被引入的宿主细胞与载体的相容性。载体可以是线性或闭合的环状质粒。技术人员使用本领域的一般性知识，知道如何选择合适、方便的载体。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外的物体存在的载体，其复制独立于染色体的复制进行，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。为进行自主复制，载体可包含复制起点，这使得载体能在目的宿主细胞中自主复制。用于酵母宿主细胞的复制起点的例子是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合以及ARS4和CEN6的组合。复制起点可以具有使其在宿主细胞中以温度敏感性方式发挥功能的突变(见，例如Ehrlich，1978，Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 75：1433)。有丝真菌中自主保持的克隆载体的一个例子是包含AMA1序列的克隆载体。AMA1是从A.nidulans分离的6.0kb的基因组DNA片段，其能在Aspergillus中自主保持(见，例如，Aleksenko andClutterbuck(1997)，Fungal Genet.Biol.21：373-397)。

备选地，载体可以是这样的载体：当其被引入宿主细胞中时，其整合进基因组，并与其被整合进的染色体一起复制。此类整合型***的一个例子被描述于EP0357127B1中。此外，可使用单个载体或质粒，或一起含有待引入宿主细胞基因组的总DNA的两个或多个载体或质粒，或可使用转座子。

本发明的载体优选含有一种或多种可选择标记，其允许对经转化的细胞进行容易的选择。可用至少两种载体(一种包含选择标记)来对宿主进行共转化。可选择标记是这样的基因，其产物提供生物杀灭剂或病毒抗性、对重金属的抗性、针对营养缺陷型的原营养型等。用于酵母宿主细胞的合适标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于有丝真菌宿主细胞的可选择标记包括但不限于：amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷转移酶)、trpC(邻氨基苯甲酸合酶)基因以及其等同物。还可使用赋予针对例如腐草霉素、潮霉素B或G418的抗性的标记。优选用于Aspergillus细胞的是A.nidulans或A.oryzae的amdS和pyrG基因以及Streptomyces hygroscopicus的bar基因。优选地，应用EP 635574或WO 97/0626描述的技术，使用amdS基因，从而能够开发出不含选择标记的重组宿主细胞，可用同样的选择标记基因对其进行再转化。优选的选择标记基因是与A.nidulans gpdA启动子融合的A.nidulans amdS编码序列(EP635 574)。还可使用来自其它有丝真菌的amdS基因(WO97/06261)。

为整合进宿主细胞基因组，载体可依赖于启动子序列和/或编码多肽的编码序列或用于通过同源重组或非同源重组将载体稳定整合进基因组的任何其它载体元件。备选地，载体可还含有其它核酸序列，用于指导通过同源重组进宿主细胞基因组来进行的整合。所述其它核酸序列使得载体能在染色体中的精确位置整合进宿主细胞基因组。为增加在精确位置整合的可能性，整合元件应当优选含有足够数量的与相应靶序列共享高百分比同一性的核酸，优选至少30bp，优选至少50bp，优选至少0.1kb，进一步优选至少0.2kb，更优选至少0.5kb，进一步更优选至少1kb，最优选至少2kb，以增强同源重组的概率。优选地，通过宿主细胞增加的同源重组能力，来增加靶向整合进宿主细胞基因组(即，整合进预定的靶基因座)的效率。细胞的此类表型优选包括如WO2005/095624所述的不足的ku70基因。WO2005/095624公开了一种优选的方法，用于获得包含增加的靶向整合效率的有丝真菌细胞。整合元件可以是与宿主细胞基因组中靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码核酸序列。为促进靶向整合，优选在转化宿主细胞之前对克隆载体进行线性化。优选地，以使得克隆载体的至少一个末端但是优选任何末端的侧翼序列与靶基因座同源的的方式来进行线性化。

优选地，克隆载体中与靶基因座同源的整合元件源于高度表达的基因座，这意味着它们源于能在真菌宿主细胞中高水平表达的基因。能高水平表达的基因，即，高度表达的基因，在本文中被定义为：其mRNA占细胞总mRNA的至少0.5％(w/w)的基因，例如，在诱导条件下的；或者其基因产物占细胞总蛋白的至少1％(w/w)的基因；或者，在分泌出的基因产物的情况下，可分泌至至少0.1g/l的水平(如EP 357 127 B1所述)。大量优选的高度表达的真菌基因的例子是：来自Aspergilli或Trichoderm的淀粉酶、葡糖淀粉酶、醇脱氢酶、木聚糖酶、磷酸甘油醛脱氢酶或纤维二糖水解酶基因。用于这些目的的最优选的高度表达的基因是葡糖淀粉酶基因(优选A.niger葡糖淀粉酶基因)、A.oryzae TAKA-淀粉酶基因、A.nidulans gpdA基因、选自SEQ ID NO：1至4和13至55的组的序列的基因座或表1所列出的基因的基因座、选自SEQ ID NO：13至55的组的序列的A.niger基因座或表1所列出的基因的A.niger基因座或Trichodermareesei纤维二糖水解酶基因。

备选地，载体可通过非同源重组整合进宿主细胞的基因组。

可向宿主细胞中***超过一个拷贝的编码多肽的核酸序列从而增强基因产物的生产。这优选可通过将DNA序列的拷贝整合进其基因组来实现，更优选地，通过将DNA序列的整合靶向于高度表达的基因座(例如，葡糖淀粉酶基因座或选自SEQ ID NO：1至4和13至55的组的序列的基因座或表1所列出的基因的基因座)实现。备选地，这可通过包括进可扩增的可选择标记基因和核酸序列来进行，其中，可通过在存在合适的可选择试剂的情况下培养细胞，来选出含有可选择标记基因的经扩增拷贝以及由此含有核酸序列的额外拷贝的细胞。为增加将过表达的DNA序列的拷贝数，可使用WO98/46772所述的基因转化技术。

用于将上文所述的元件连接起来以构建本发明的重组表达载体的流程是本领域技术人员公知的(见，例如，上文的Sambrook et al.)。

转化

使用通常已知的技术，将表达载体或核酸构建体引入细胞。这可能涉及由以本身已知的手段进行原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生构成的过程。用于转化Aspergillus细胞的合适流程描述于EP 238 023和Yelton et al.，1984，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81：1470-1474中。使用Agrobacterium tumefaciens来转化Aspergillus和其它有丝真菌宿主细胞的合适流程被描述于例如Nat Biotechnol.1998Sep；16(9)：839-42.Erratum in：Nat Biotechnol 1998Nov；16(11)：1074.Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi.deGroot MJ，Bundock P，Hooykaas PJ，Beijersbergen AG.Unilever ResearchLaboratory Vlaardingen，The Netherlands中。Malardier et al.，1989，Gene 78：147156或WO 96/00787中描述了转化Fusarium物种的一种合适方法。还可应用其它方法，例如，使用生物弹轰击转化，如Biolistic transformationof the obligate plant pathogenic fungus，Erysiphe graminis f.sp.hordei.Christiansen SK，Knudsen S，Giese H.Curr Genet.1995Dec；29(1)：100-2所述。可使用Becker and Guarente，In Abelson，J.N.and Simon，M.I.，editors，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，Volume 194，pp 182-187，Academic Press，Inc.，New York、Ito et al.，1983，Journal of Bacteriology 153：163和Hinnen et al.，1978，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 75：1920描述的流程来转化酵母。

本发明还涉及制备根据本发明的重组宿主细胞的方法，所述方法包括：

(a)提供至少两种DNA构建体，每种DNA构建体包含与启动子DNA序列可操作关联的编码序列，其中，所述至少两种DNA构建体包含至少两种有区别的启动子DNA序列，并且，其中，所述DNA构建体中包含的编码序列编码相关多肽，

(b)提供合适的宿主细胞，并且

(c)用所述DNA构建体转化所述宿主细胞。

任选地，所述两种DNA构建体包含于单个构建体中。任选地，至少一种DNA构建体存在于载体上。

根据一种优选的实施方式，转化步骤通过至少两个单独的转化事件来进行。转化事件在本文中被定义为：通过在亲本宿主细胞中引入DNA构建体以及分离亲本细胞的经转化的后代的转化流程。

表达

本发明还涉及在合适的宿主细胞中表达编码序列的方法。所述方法包括下述步骤：

(b)提供合适的宿主细胞，

(c)用所述DNA构建体转化所述宿主细胞

(d)在有益于所述编码序列表达的条件下培养所述宿主细胞。

根据一种优选的实施方式，转化步骤通过至少两个单独的转化事件来进行。

本发明还涉及通过在有益于编码序列表达的条件下培养根据本发明的重组宿主细胞来表达编码序列的方法。

生产

本发明还涉及生产多肽的方法，所述方法包括：

(a)在有益于所述多肽表达的条件下培养根据本发明的重组宿主细胞，

(b)任选地，从培养基中回收所述多肽，以及

(c)任选地，对所述多肽加以纯化。

本发明还涉及生产代谢产物的方法，所述方法包括：

(a)在有益于所述代谢产物表达的条件下培养根据本发明的重组宿主细胞，

(b)任选地，从培养基中回收所述代谢产物，以及

(c)任选地，对所述代谢产物加以纯化。

在本发明的生产方法中，使用本领域已知的方法，在适于生产多肽或代谢产物的营养培养基中培养细胞。培养方法的例子(不应被解释为对本发明的限制)是深浸发酵、固态上的表面发酵和在液体底物上的表面发酵。例如，可通过在合适的培养基中、允许编码序列表达和/或多肽被分离的条件下进行摇瓶培养、实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模的发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。培养发生于包含碳源和氮源以及无机盐的合适营养培养基中，使用本领域已知的方法来进行培养。合适的培养基可从商业供货商处获得，或者使用公开的组成(例如，American Type Culture Collection目录中的)来制备。如果多肽或代谢产物分泌进营养培养基，可直接从培养基回收多肽或代谢产物。如果多肽或代谢产物不分泌，可从细胞裂解物对其加以回收。

可使用本领域已知的特异于多肽的方法来检测所述多肽。这些检测方法可包括：使用特异性抗体、形成酶产物或酶底物的消失。

可通过本领域已知的方法来回收得到的多肽或代谢产物。例如，可通过传统流程，包括但不限于，离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从营养培养基分离多肽或代谢产物。然后可通过本领域已知的大量方法对经分离的多肽加以进一步纯化，所述方法包括但不限于，色谱(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和尺寸排除)、电泳流程(例如制备性等电聚焦)、差异溶解度(例如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE萃取(见，例如Protein Purification，J.-C.Janson and Lars Ryden，editors，VCHPublishers，New York，1989)。

对表达的调节

本发明涉及包含下述启动子DNA序列的核酸构建体，所述启动子DNA序列包含选自SEQ ID NO：1至4和13至55和表1所列出的基因的启动子DNA序列构成的组的核苷酸序列，所述核酸构建体用于改变编码感兴趣的化合物的编码序列的表达，所述编码序列是真菌宿主细胞内源的。所述构建体可含有用于改变内源基因的表达所必需的最小数量的组分。

根据一种优选的实施方式，核酸构建体含有(a)靶向(targeting)序列，(b)启动子DNA序列，其包含选自SEQ ID NO：1至4和13至55的序列和表1所列出的基因的启动子DNA序列构成的组的核苷酸序列，(c)外显子和(d)剪接子供***点。核酸构建体引入细胞后，构建体通过同源重组在内源基因位点整合进细胞基因组。靶向序列指导元件(a)-(d)整合进内源基因，使得元件(b)-(d)与内源基因可操作地关联。

根据另一实施方式，核酸构建体含有(a)靶向序列，(b)启动子DNA序列，其包含选自SEQ ID NO：1至4和13至55的序列和表1所列出的基因的启动子DNA序列构成的组的核苷酸序列，(c)外显子，(d)剪接子供***点，(e)内含子和(f)剪接子受***点，其中，靶向序列指导元件(a)-(f)的整合，使得元件(b)-(f)与内源基因可操作地关联。但是，构建体还可含有其它组分，例如可选择标记。可使用的可选择标记是本文前文中描述的那些。

在以上两种实施方式中，这些组分的引入导致产生新转录单元，其中，内源基因的表达被改变。大体上，新转录单元是通过靶向序列引入的序列与内源基因的融合产物。根据其中内源基因被改变的一种实施方式，基因被活化。根据该实施方式，使用同源重组，通过***调控序列，置换、破坏或禁用掉与亲本细胞内源基因正常关联的调控区域，这使得待表达的基因以比相应亲本细胞中所示更高的水平表达。

靶向序列可处于内源基因中、基因紧邻处、上游基因中或内源基因上游或有一定距离。可使用一条或多条靶向序列。例如，环状质粒或DNA片段优选利用单条靶向序列，而线性质粒或DNA片段优选利用两条靶向序列。

构建体还含有内源基因的一个或多个外显子。外显子被定义为这样的DNA序列，其会被拷贝成RNA，并且存在于成熟mRNA分子中，使得外显子序列与内源基因的编码区域同框。外显子可任选含有编码一个或多个氨基酸和/或部分编码氨基酸的DNA。备选地，外显子含有对应于5’非编码区域的DNA。外来的一个或多个外显子编码一个或多个氨基酸和/或氨基酸的部分的情况下，核酸构建体被设计为：当转录和剪接时，读码框与内源基因的编码区域同框，使得源于第二外显子的mRNA的部分的合适读码框保持不变。构建体的剪接供***点指导了一个外显子向另一外显子的剪接。典型地，第一外显子位于第二外显子的5’，在第一外显子的3’侧覆盖并侧翼于第一外显子的剪接供***点能识别在第二外显子的5’侧侧翼于第二外显子的剪接受***点。剪接受***点像剪接供***点一样，是指导一个外显子剪接为另一外显子的序列。与剪接供***点组合作用，剪接装置使用剪接受***点来实现对内含子的移除。

用于改变给定DNA序列的表达的一种优选策略包括缺失掉给定的DNA序列和/或用经修饰启动子DNA序列(例如根据本发明的启动子)来置换给定DNA序列的内源启动子序列。缺失和置换优选通过EP 0 357 127中描述的基因置换技术来进行。优选按照EP 63 5574所述，使用amdS基因作为选择标记，来进行对基因和/或启动子序列的特异性缺失。通过按照EP 635 574所述，在氟乙酰胺培养基上进行反向选择，得到的菌株不含选择标记，并可用于进一步的基因修饰。

备选地或与提到的其它技术组合，可使用基于在E.coli中的粘粒体内重组的技术，如A rapid method for efficient gene replacement in thefilamentous fungus A.nidulans(2000)Chaveroche，M-K.，Ghico，J-M.andd’Enfert C；Nucleic acids Research，vol 28，no 22中所述。该技术可应用于其它有丝真菌，例如A.niger。

本文描述和要求保护的本发明并不限于本文公开的特定实施方式的范围，因为这些实施方式仅仅意欲用于对本发明的若干方面加以阐述。本发明优选方面的任何等同实施方式和/或组合都包括在本发明的范围内。事实上，除了本文展示和描述的之外，对本发明的多种修饰也是本领域技术人员从前文描述中显而易见的。此类修饰也将落在所附权利要求的范围内。在有矛盾多情况下，以本发明的公开内容(包括定义)为准。

实施例

实验信息

菌株

WT1：该A.niger菌株被用作为野生型菌株。该菌株被保藏于CBSInstitute，保藏号为CBS 513.88。

WT2：该A.niger菌株是包含编码葡糖淀粉酶的基因(glaA)缺失的WT1菌株。WT2是通过使用EP 0635574B1所述的“MARKER-GENEFREE”方法构建的，在该专利中详细描述了如何在CBS 513.88基因组中缺失glaA特异DNA序列。该流程产生了不含标记基因的ΔglaA重组A.niger CBS513.88菌株，该菌株不具有任何外源DNA序列。

BFRM 44：该菌株用于实施例9中，其可从Banque de ResourcesFongiques de Marseille，Marseiile，France以保藏号BRFM44获得。

葡糖淀粉酶活性

按照WO 98/46772所述，使用对硝基苯α-D-吡喃葡糖苷(Sigma)来测定葡糖淀粉酶活性。

实施例1：构建包含与编码序列可操作关联的、根据本发明的启动子的 DNA构建体

本实施例描述了对处于根据本发明的启动子控制下的表达构建体的构建。此处使用的编码序列或报道子构建体是编码A.niger CBS 513.88葡糖淀粉酶的glaA基因。葡糖淀粉酶被用作为能测量根据本发明的启动子活性的报道基因。

1.1对整合型葡糖淀粉酶表达载体(pGBTOPGLA)的描述

将来自A.niger的葡糖淀粉酶编码基因glaA和葡糖淀粉酶启动子克隆进表达载体(其被描述于WO99/32617中)。根据已知的原则和常规克隆技术来进行克隆，产生了质粒pGBTOPGLA(见图1)。大体上，该表达载体包含葡糖淀粉酶启动子、编码序列和终止子区域，其侧翼是E.coli载体中的3’和3”glaA靶向位点。

1.2构建具有多克隆位点MCS的整合型葡糖淀粉酶表达载体(pGBTOPGLA-2)

使用pGBTOPGLA作为模板，采用技术人员已知的PCR方法(上文Sambrook et al.)，产生了含有glaA编码序列一部分并且侧翼有XhoI和BglII限制性位点的PCR片段。用XhoI和BglII消化该片段，将其引入经XhoI和BglII消化过的载体pGBTOPGLA，得到载体pGBTOPGLA-2(见图2)。通过序列分析证实了引入的包含MCS和glaA编码序列的一部分的PCR片段的序列。

1.3构建具有与葡糖淀粉酶编码序列可操作关联的根据本发明的启动子的整合型表达载体(pGBTOPGLA-3)

对菌株CBS 513.88的基因组DNA进行测序和分析。使用：

5’-PCR引物，其含有选自SEQ ID NO：13至55和表1所列出的基因的启动子DNA序列的组的序列的第1至20位核苷酸，所述核苷酸在5’末端侧翼有XhoI限制性位点，以及

3’-PCR引物，其含有恰选自上文所述的序列的第1477至1497位核苷酸(一些情况下，大约2000个核苷酸)，所述核苷酸在3’末端侧翼有AscI限制性位点，以及

菌株CBS 513.88的基因组DNA作为模板，

采用技术人员已知的PCR方法(上文Sambrook et al.)，通过PCR扩增，向根据本发明的启动子连接上合适的限制性位点。用AscI和XhoI来消化得到的大约1.5-2kb的片段(其包含SEQ ID NO：13至55之一的序列或表1所列出的基因的启动子DNA序列之一的序列)，并将其引入经AscI和XhoI消化过的载体pGBTOPGLA-2中，产生例如载体pGBTOPGLA-16(关于载体的一般性规划参见图3)以及其它载体，例如表2中列出的。

表2：具有用于在A.niger中表达葡糖淀粉酶glaA的多种不同启动子的表达构建体

质粒名	启动子	SEQ ID NO：	编码序列
质粒名	启动子	SEQ ID NO：	编码序列	pGBtopGLA-1	glaA	-	GlaA
pGBtopGLA-16	具有经修饰的翻译起始位点的glaA	16	GlaA	pGBtopGLA-1	glaA	-	GlaA

质粒名	启动子	SEQ ID NO：	编码序列
质粒名	启动子	SEQ ID NO：	编码序列	pGBtopGLA-17	具有经修饰的翻译起始位点的amyB	17	GlaA
pGBtopGLA-18	gpdA	18	GlaA	pGBtopGLA-17	具有经修饰的翻译起始位点的amyB	17	GlaA
pGBtopGLA-18	gpdA	18	GlaA	pGBtopGLA-19	An18g04220	19	GlaA

通过序列分析证实了引入的包含根据本发明的启动子的PCR片段的序列。

实施例2：经DNA构建体转化的真菌宿主细胞

在下述实施例中，通过转化在真菌宿主细胞中引入表达构建体。

为在WT1中引入额外的pGBTOPGLA-1和pGBTOPGLA-16至-19，以增加glaA拷贝数，按照WO98/46772和WO99/32617所述来进行转化以及随后的转化子选择。简言之，分离上文所述的pGBTOPGLA载体的线性DNA，用含有amdS可选择标记基因的载体(被称为pGBAAS-1(按照EP635574B1所述构建的))对其进行共转化。两种类型的载体都包含与A.niger宿主菌株的glaA基因座同源的两个DNA结构域，以指导靶向WT1中glaA的3’-3”终止子基因座。按照标准流程，在乙酰胺培养基上选择转化子，并对菌落加以纯化。将孢子涂布到氟乙酰胺培养基上来选择丢失了amdS标记的菌株。针对在glaA基因座的整合和拷贝数，对生长中的菌落加以检测。选择具有额外的glaA拷贝的pGBTOPGLA-1、pGBTOPGLA-16、pGBTOPGLA-17、pGBTOPGLA-18和pGBTOPGLA-19。

备选地，可将图7描述的环状构建体在WT1的glaA编码序列处整合进基因组。此外，根据本发明的启动子控制的感兴趣的基因和可选择标记基因可以在单个构建体上。在WO99/32617中可找到该载体和如何用于转化的例子。

实施例3：将处于根据本发明的启动子控制下的额外的glaA基因引入真菌宿主细胞

为改变和增加给定基因在宿主细胞中的表达水平，可在给定的宿主细胞中引入与根据本发明的启动子可操作相连的额外的葡糖淀粉酶拷贝。在本实施例中，将可操作地连接有glaA编码序列的本发明启动子引入到真菌宿主细胞内源存在的编码葡糖淀粉酶的glaA基因邻侧。在下述实施例中，通过测量选出的转化子中报道子(葡糖淀粉酶)的活性，来测量本发明的启动子的活性。因此，测定培养基中的葡糖淀粉酶活性。

用选择的WT 1的pGBTOPGLA-1、pGBTOPGLA-16、pGBTOPGLA-17、pGBTOPGLA-18、pGBTOPGLA-19转化子和WT1和WT2菌株来进行摇瓶实验，这按照EP 635574B1所述，使用500ml带盖摇瓶，在摇床中于34℃和170rpm，于100ml培养基中进行。发酵4和6天后，取样，按上文所述测定葡糖淀粉酶活性。培养4天或6天后，所选的WT1的pGBTOPGLA-1、pGBTOPGLA-16、pGBTOPGLA-17、pGBTOPGLA-18、pGBTOPGLA-19转化子的葡糖淀粉酶活性较之WT1增加(图4)。其令人吃惊地显示，引入处于并非glaA的另一启动子控制下的第二glaA基因拷贝，使得表达的增加超过了基于拷贝数所预计的情况(超过200％)。此外，使用经修饰的glaA或amyB启动子，鉴定到了要比基于拷贝数的预计更大的增加。

此外，具有多个pGBTOPGLA构建体拷贝的菌株显示，对于所有载体来说，直到至少5个拷贝，每个基因拷贝的生产都是恒定的(数据未示出)。

实施例4：构建包含根据本发明的启动子的启动子置换构建体pGBDEL- PGLAA

为改变宿主细胞中给定基因的表达水平，可用根据本发明的启动子置换所述给定基因的内源启动子。在本实施例中，用根据本发明的启动子置换了真菌宿主细胞中编码葡糖淀粉酶的glaA基因的启动子。实施例4、5和6描述了该过程中的多个不同步骤。

按照已知的原则，设计用于葡糖淀粉酶启动子的置换型载体，按照常规克隆流程对其加以构建(见图5)。大体上，glaA启动子置换型载体pGBDEL-PGLAA包含：将在预期的基因组基因座经由同源重组被根据本发明的启动子置换的glaA启动子序列的大约1000bp的侧翼区域。此处使用的侧翼区域(见图5)是glaA启动子5’上游区域和glaA编码序列的部分。此外，置换型载体含有A.nidulans双向amdS选择标记，其位于正向重复之间。用于本实施例中的正向重复是glaA编码序列的部分。对这些缺失载体的一般性设计以前在EP635574B1和WO 98/46772中描述过。

实施例5：在真菌宿主细胞中用根据本发明的启动子置换glaA启动子

分离经NotI消化的缺失载体pGBDEL-PGLAA的线性DNA，用其转化WT 1(CBS513.88)。该线性DNA可在glaA基因座整合进基因组，由此用含有amdS和根据本发明的启动子的构建体取代glaA启动子区域(见图6)。按照标准流程，在乙酰胺培养基上选择转化子，并对菌落加以纯化。针对在glaA基因座的整合，对生长中的菌落加以检测。可通过具有根据本发明的启动子所特有的大小的条带的扩增以及glaA启动子所特有的条带的丢失，来检测glaA启动子的缺失。将孢子涂布到氟乙酰胺培养基上来选出丢失了amdS标记的菌株。使用Southern杂交印迹分析，针对葡糖淀粉酶启动子的正确缺失以及根据本发明的启动子的置换，来对候选菌株加以测试。菌株dPGLAA被选择为glaA启动子被根据本发明的启动子置换并且具有恢复的功能性glaA编码序列的代表性菌株(见图6)。

实施例6：在真菌宿主细胞中，生产处于置换的根据本发明的启动子控制下的glaA编码序列编码的葡糖淀粉酶多肽

用选择的dPGLAA菌株(WT1的正确的pGBDEL-PGLAA转化子，实施例5中分离的)和菌株WT1来进行摇瓶实验，这按照EP 635 574 B1所述，使用500ml带盖摇瓶，在摇床中于34℃和170rpm，于100ml培养基中进行。发酵4和6天后，取样，来测定葡糖淀粉酶活性。发酵4天或6天后，所选的WT1的dpGLAA转化子的葡糖淀粉酶活性较之针对WT1所测得的有所改变。

实施例7：在真菌宿主细胞中整合处于多个启动子控制下的glaA基因

为改变和增加给定基因在宿主细胞中的表达水平，可在给定的宿主细胞中引入与多个根据本发明的启动子可操作关联的给定基因的多个额外拷贝。在本实施例中，将与glaA编码序列可操作关联的多个根据本发明的启动子引入真菌宿主细胞WT2中。实施例7和8描述了该过程中的数个不同步骤。

为将pGBTOPGLA-1和pGBTOPGLA-16、pGBTOPGLA-17及pGBTOPGLA-18载体的组合引入WT2，按照WO98/46772和WO99/32617所述进行共转化和随后的转化子选择。原则上，分离上文所述的pGBTOPGLA载体中两种的线性DNA，与含有amdS可选择标记基因的载体(被命名为pGBAAS-1(按照EP 635574B1所述进行构建的))进行共转化。两种类型的载体都包含与A.niger宿主菌株的glaA基因座同源的两个DNA结构域，以指导靶向WT2中glaA的3’-3”终止子基因座。按照标准流程，在乙酰胺培养基上选择转化子，并对菌落加以纯化。使用PCR技术来鉴定共转化子，针对glaA拷贝数和两种不同的pGBTOPGLA-构建体在glaA基因座的整合来检测菌落。选择具有两个glaA拷贝和pGBTOPGLA-1/16、pGBTOPGLA-16/17和pGBTOPGLA-17/18的组合的转化子。

实施例8：在真菌宿主细胞中，生产处于多个本发明启动子控制下的glaA 编码序列编码的葡糖淀粉酶多肽

用选择的pGBTOPGLA-1/16、pGBTOPGLA-16/17和pGBTOPGLA-17/18菌株(实施例7中分离的)和菌株WT1来进行摇瓶实验，这按照EP635574B1所述，使用500ml带盖摇瓶，在摇床中于34℃和170rpm，于100ml培养基中进行。发酵4和6天后，取样，来测定葡糖淀粉酶活性。发酵4天或6天后测量时，所选的WT2的pGBTOPGLA-16/17和pGBTOPGLA-17/18转化子的葡糖淀粉酶活性较之pGBTOPGLA-1/16转化子和WT1增加(数据未示出)。这清楚表明，处于多个非天然启动子控制下的glaA基因的表达可提供增加的glaA表达。

实施例9：Pycnoporus cinnabarinus中的Pycnoporus cinnabarinus lcc3-1基因编码的漆酶多肽的差异生产

如下文详细描述的，显示：SC3启动子驱动的lcc3-1表达导致漆酶在P.cinnabarinus菌落的***释放。相反，GPD启动子和漆酶启动子驱动的表达导致漆酶分别在菌落中央(centre)和中部(middle)释放。

通过用两种表达构建体转化菌株BRFM 44，漆酶在菌落的***和中部(SC3和GPD驱动的lcc3-1表达)、***和中央(SC3和GPD驱动的表达)以及中部和中央(漆酶启动子和GPD启动子驱动的表达)释放。

因此，通过使用表达构建体的组合，菌丝体的多个部份可参与漆酶的分泌。该现象伴随有液体摇动培养物中漆酶活性的增加。

9.1材料和方法

对P.cinnabarinus的培养

在30℃，于液体或固体(1.5％琼脂)酵母麦芽培养基(YM)(每升含有10g葡萄糖、5g蛋白胨、3g酵母提取物和3g麦芽提取物)中，常规培养单核状态的漆酶缺陷型Pycnoporus cinnabarinus菌株BRFM 44(Banque de Resources Fongiques de Marseille，Marseille，France)。为生产漆酶，使用对于在野生型P.cinnabarinus中的漆酶生产来说最优的条件(Lomascolo et al.，2003)。在1L Erlenmeyer瓶中，含或不含经过滤灭菌的乙醇的250ml最小限度培养基(MM)中，以250rpm于30℃培养菌株。MM每升含有：20g麦芽糖、1g酵母提取物、2.3gC₄H₄O₆Na₂.2H₂O、1.84g(NH₄)₂C₄H₄O₆、1.33g KH₂PO₄、0.1gCaCl₂.2H₂O、0.5g MgSO₄、0.07g FeSO₄.7H₂O、0.048g ZnSO₄.7H₂O、0.036g MnSO₄.H₂O、0.1g CuSO₄和1ml维生素溶液(Tatum et al.，1950)。

转化P.cinnabarinus

按照Alves AM，Record E，Lomascolo A，Scholtmeijer K，Asther M，Wessels JG，and Wosten HA.Highly efficient production of laccase by thebasidiomycete Pycnoporus cinnabarinus，Appl Environ Microbiol.2004Nov；70(11)：6379-84所述，转化P.cinnabarinus。除非另有指明，转化流程中的所有步骤都在30℃进行。在Waring掺合机中，于50ml YM培养基中对15天龄的菌落(直径6-8cm)均质1分钟。加入相同体积的培养基后，在200rpm对均质物进行24小时的培养。再次均质该培养物，在YM中稀释两倍，再在200rpm培养24小时。使用1mg ml^-1的glucanex(Sigma-Aldrich)，轻柔摇动下，在0.5M MgSO₄或0.5M蔗糖中，对菌丝体进行原生质体化。在冰上对1E+7原生质体和5μg质粒DNA进行15分钟的孵育。加入1倍体积的聚乙二醇4000后，在室温下对混合物进行5分钟的孵育。在2.5ml再生培养基中对原生质体进行过夜再生(Specht etal.，1988，Exp.Mycol.12：357-366)。加入三倍体积的YM培养基(含有5μg ml^-1腐草霉素和1％低熔点琼脂糖)后，将混合物涂布到含有5μg ml^-1抗生素的YM琼脂培养基上。通过除了加入抗生素之外还向培养基中加入500μg ml^-1咖啡因，用相同的选择盒再次转化其中已经引入了腐草霉素抗性盒的转化子。

构建漆酶表达载体

为表达位于S.commune的SC3和GPD启动子之后的来自P.cinnabarinus的漆酶lcc3-1基因，使用引物NcoIPyc和BclIPyc(表3)，通过PCR来扩增其编码序列。这产生了在起始密码子中具有引入的NcoI位点以及在终止密码子之后直接就是BclI限制性位点的片段。为表达处于漆酶启动子后的lcc3-1基因，使用引物PromoNCOforward和PromoLACreverse(表3)来扩增编码序列，得到在5’末端具有引入的NcoI位点和在终止密码子之后即是SmaI位点的片段。将扩增的lcc3-1的编码序列克隆进表达载体pESC及其衍生物pEGP和pELP，分别产生质粒pESCL1、pEGPL1、pELPL1。质粒pESC含有腐草霉素抗性盒(Schurenand Wessels，1994)，其中，内部的NcoI位点已缺失。此外，其含有SC3基因的调控序列，可使用NcoI和BamHI位点在其间克隆编码序列。SC3启动子被含在1.2kb的HinDIII/NcoI片段中，而其终止子由434bp的BamHI/EcoRI片段构成。质粒pEGP和pELP是pESC的衍生物，其中，SC3启动子分别被GPD(700bp)(Harmsen et al.1992)和漆酶(2.5kb)的HinDIII/NcoI启动子片段置换。按照下文所述来分离漆酶启动子。通过自身连接使得经BglII消化的P.cinnabarinus的基因组DNA成环，将其用作为使用引物INVSE和INVASE(表3)进行的反向PCR的模板。将得到的3.5kb的片段克隆进XL-TOPO(Invitrogen)，产生质粒pPL100。测序证实，pPL100含有2.5kb的启动子区域。使用引物promoLACforward和promoNCOrev(表3)，通过PCR扩增该区域，分别在5’和3’末端引入HinDIII和NcoI位点。

引物	序列	SEQ ID NO：
引物	序列	SEQ ID NO：	NcoIPyc	ttctgaccatggcgaggttccagtc	5
BclIPyc	acagtaactgattcagctcagaggtcgctg	6	NcoIPyc	ttctgaccatggcgaggttccagtc	5
BclIPyc	acagtaactgattcagctcagaggtcgctg	6	PromoNCOforward	accccctctttctgaccatggcgaggttccagtc	7
PromoLACreverse	taacccgggcgctcagaggtcgctggggtcaagtgc	8	PromoNCOforward	accccctctttctgaccatggcgaggttccagtc	7
PromoLACreverse	taacccgggcgctcagaggtcgctggggtcaagtgc	8	INVSE	tctgatcatgtcgaggttccagtcc	9

引物	序列	SEQ ID NO：
引物	序列	SEQ ID NO：	INVASE	gtcttcaaggacctgcggacagacatc	10
Promolacforward	accaagcttagatctccgaaccagaaatgc	11	INVASE	gtcttcaaggacctgcggacagacatc	10
Promolacforward	accaagcttagatctccgaaccagaaatgc	11	PromoNCOrev	gactggaacctcgccatggtcagaaagaggggt	12

表3：用于构建漆酶表达载体的引物、各引物序列和各SEQ ID NO。

漆酶活性测定

在补充有0.2mM ABTS(2，2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)，Sigma-Aldrich)和0.1mM CuSO₄的固体YM培养基上，监测P.cinnabarinus菌株的漆酶活性。通过在存在50mM Na-K-酒石酸pH 4.0时，按照420nm(消光系数36000mM^-1cm^-1)处5mM ABTS的氧化，测定培养基中的漆酶活性。活性被表示为nkat ml^-1。1nkat被定义为每秒钟催化1nmol ABTS氧化的酶的量。在30℃进行一式三份重复检验。标准偏差没有超过平均值的10％。

9.2在Pycnoporus cinnabarinus中生产漆酶

先前，上文所述的Alves et al.展示了在Pycnoporus cinnabarinus中的漆酶生产。

用处于漆酶启动子(SEQ ID NO：3)调控下或Schizophyllumcommune的3-磷酸甘油醛脱氢酶(GPD)基因(SEQ ID NO：1)的调控下或SC3疏水蛋白基因(SEQ ID NO：2)的调控下的天然lcc3-1漆酶基因(SEQ ID NO：4)来转化Pycnoporous cinnabarinus的漆酶缺陷型单核状态菌株BRFM 44(Banque de Resources Fongiques de Marseille，Marseille，France)。SC3驱动的表达导致液体摇动培养物中最大107nkat ml-1的漆酶活性。该值分别是GPD和漆酶启动子的情况下的大约1.4和1.6倍高(表4)。当lcc3-1在任何启动子之后表达时，存在25g L^-1乙醇时，lcc3-1mRNA和漆酶活性强烈增加(表3)。通过在存在40g L^-1乙醇时进行培养，在漆酶启动子或GPD的启动子之后表达lcc3-1基因的转化子中，漆酶生产进一步增加。在这种情况下，最大活性分别为3900和4660nkat ml^- ¹，对应于每升1和1.2g漆酶。

菌株	使用的启动子	活性-EtOH	活性+EtOH
菌株	使用的启动子	活性-EtOH	活性+EtOH	BRFM 44	-----	n.d	n.d.
S1	SC3	107	431	BRFM 44	-----	n.d	n.d.
S1	SC3	107	431	S2	SC3	49	138
L12-7	lcc3-1	175	1223	S2	SC3	49	138

菌株	使用的启动子	活性-EtOH	活性+EtOH
菌株	使用的启动子	活性-EtOH	活性+EtOH	L12-8	lcc3-1	20	666
G11	GPD	60	700	L12-8	lcc3-1	20	666
G11	GPD	60	700	G14	GPD	145	1393

表4：表达处于漆酶启动子(L12-7&L12-8)或S.commune的GPD(G11 and G14)启动子或SC3的启动子(S1&S2)之后的漆酶基因lcc3-1的P.cinnabarinus BRFM 44的重组菌株的14天培养物的培养基中的漆酶活性(nkat ml^-1)。在存在或不存在25g L^-1乙醇时培养菌株。n.d.：未能检测到。实验以一式三份重复进行。标准偏差小于10％。

9.3Pycnoporus cinnabarinus中的差异漆酶生产

将分别从SC3、GPD和漆酶启动子表达的漆酶基因lcc3-1的构建体pESCL1、pEGPL1、pELPL1转化进P.cinnabarinus的漆酶阴性的单核体BRFM 44(上文Alves et al.，2004)。通过向培养基中加入ABTS(其被该酶转化为绿色产物)，来选择生产漆酶的转化子。监测空间和时间上的漆酶活性，即，在不同的时间间隔监测漆酶活性，以及对菌落中漆酶活性的定位加以评定。每种构建体选择两个独立的转化子，以排除位置的影响。琼脂培养基和菌落之间存在的PC膜不影响漆酶在含有ABTS的培养基上的空间和时间活性。从第6天起，具有引入的处于GPD启动子调控下的漆酶基因的菌落唯一地显示出处于菌落中央的漆酶活性(图8)。培养10天后，活性延伸至***，底物的降解增加。SC3驱动的表达从第5天起在菌落***产生了活性。培养10天后，仍在***观察到了活性，并且分解的产物的强度增加。用受其自身启动子调控的漆酶基因转化的菌株在菌落中部显示了活性。该活性在第4天被观察到。培养10天后，活性区向外延伸达到与菌落***延伸相似的程度。我们根据这些结果推断：漆酶在培养基中的空间和时间活性取决于所用的启动子。

使用腐草霉素组合500μg ml^-1咖啡因进行的选择，用pESCL1对重组菌株G14(用pEGPL1)进行再转化。这产生了在菌落的两个区域(对应于单个转化的区域)分泌漆酶的菌株。例如，菌株G-S8在菌落的中央和***部分都释放漆酶(图9)，菌丝体的最大部分用于分泌。

在存在40g L^-1乙醇时，测定了液体摇动培养物中的漆酶活性。菌株G-S8产生了比亲本G14更多的漆酶(表5)。

转化子	活性(nkat/ml)	产量(g/L)
转化子	活性(nkat/ml)	产量(g/L)	S1	500	0.125
L12-7	3600	0.9	S1	500	0.125
L12-7	3600	0.9	G14	4660	1.12

转化子	活性(nkat/ml)	产量(g/L)
转化子	活性(nkat/ml)	产量(g/L)	G-S8	5310	1.3

表5：P.cinnabarinus BMRF 44(漆酶阴性背景)的重组菌株中的漆酶生产。S表示菌株已用表达处于SC3启动子后的lcc3-1的构建体转化过。类似地，G和L表示，菌株已分别经从GPD和漆酶启动子表达lcc3-1基因的构建体转化过。在平板上选择的12个转化子中显示出最高活性的菌株被示于此处。在存在40g L^-1乙醇时对培养物进行培养。

序列表

<110>帝斯曼知识产权资产管理有限公司

<120>用于生产感兴趣的化合物的重组宿主细胞

<130>25226WO

<160>55

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>648

<212>DNA

<213>Schizophyllum commune

<400>1

cgaccgagcg cgcgccaccc agcctatccc gcgcgggtcg ggacccaaaa taagcgggcc 60

ccgccgcgcc ccgtcgggcg agcgggtgta tctacgaacg gaactgggag gcgactcgga 120

agagtttggt tagaaagggg aacaccatcg cggacggccc agtgctctgg dcagctgagc 180

gtgcattgtg ttcaattctg acctgtggca tgtaaggaac gtgctcggga tcggagggtg 240

gcgcgagagc ctcttcggtg tgagattagt aactgtactg cgaagccgcg gaggggttag 300

gatgagaggt agacagggtc gcagcccagg tgcgagaagg actgcgaagg actgttcttc 360

gaccgcgcac ctgcaattgc gcgcatggat agaatagagc gtcgccctcg agggggactc 420

gaccagggct ggtggtggcg cccgacggga ctggctgggc atttgcagat ggcgcgcagt 480

ccaggccgcc gccgatgtgt tcatcccgtt ttgtcagtat cgatcggatc tttcgggcgt 540

gggtataaaa gcgcgccgcc cgccgtctcc ctctttctcc agcactccca tccagagcac 600

ttccctctcc catcgcatcc catcacacaa taatgcccat caccatgg 648

<210>2

<211>1033

<212>DNA

<213>Schizophyllum commune

<400>2

agcttctccg gccccgaatc gaacggcagg atgtgtgggc gtgtccaata ttgccatgaa 60

aatctgtcag aagtgagccc tctcgtcacc ctgtacagct tcgctgagtt gaaaagcagg 120

gttcatcttg ggctcactga tgcactgagc tcgaccggag aactaaatga ccagccggag 180

tgttcactaa cttaacgccg ggtattcagg gcagcttctc tatgttgcgc ctacgacgta 240

gatcaccgcc catgaacggg ggaaacgggg aggggtgcgt ttggtacgtc tttacgtctg 300

gctatgttgt attgaccagc gtctgcagaa gatgggcacg acgatgcgcc gagccggcca 360

gtgtcgtcgg atgtccactg ttgaggccat ccttttgcta gacagacgga agagctttgg 420

aggtgcgatt cctctacgaa tgggaagggg cttagatgga gagtgacacg tctgagctcc 480

ccaacacgcc ttcgccgagg gtgcgtctcc gcggacattc acctcagttc attgttctga 540

cctgcctaat tgtatagacc ggccaacaac cttgctgacg cccatcataa cagtgccctg 600

cacagagcct tcccactcag tcggcgcctc cctcaatcaa tcccactaac tcgccggctc 660

tgccccttcg ccgctcgaca cgtcgcttgg aagagcccgg gcacgggcgt ccgctccccc 720

cttccctccg cgtcgtcatg cacgcagcgt taatgttgct gcaggcgagc cgtaagtata 780

ttcaaaggcg tagcgaatga atagcaggcg cgcggggacc tggcacgcgc ggcatgaaca 840

tgcagacttg ggtgacgata acttgaactc agacgcggcg aatgaatatc caaacgcgcg 900

ggaagaaaat aatttacggg agcctcccca ggtataaaag cccctcaccc gctcactctt 960

tctccagtcg aacaccccag ttcaactacc cagcccttcc ttccttcgct atccttcytt 1020

acaacctgct cgc 1033

<210>3

<211>2527

<212>DNA

<213>Pycnoporus cinnabarinus

<400>3

agatctccga accagaaatg cgattgcgtt caggcccaat taagaataaa gctgcgtcag 60

ggcagcgacg tatcttgatc catcattgac tcaccggcat cggcgtcaac accaaagcaa 120

gctcgtccca cccataggcg tgcaccggcc ggcgtgcgcc attgaggtac atgagcgggg 180

cgaaagtccg ccattggtag ccctgtcgtg gacgcgcggc gatgaaacgt ttcccaccat 240

tgggaagaaa cgtctgcggc ccatcatccc ttcaccggat gacaaggcgg cgtcgcgcct 300

ttgccgcaga ggccggcggg cgacatgcac agcgaaggtc cgttgcggat gggaagcagg 360

caatcagtgg gtgtcctacg ccgccacgat ggtcggggag cgtaggcgcc ctcccataag 420

gcggcaagca tcatgatgct ctccgattcg ggaagcctgg tgcgatgctg gagagactct 480

ctccgagaga ccagtgtgcg caacgttcct ggcctggaag actttaaagt gagtgtagaa 540

gggcgagcag aggacgatca tcggattgca ggaaccatcg gcatcctcag cctgggaagg 600

atggctcttg gtagacattc gcggaaggtg tcctagatgt gagcgggctt cttggatgat 660

catgtcgtaa ctttttctga cctcgtcggt ggtacgcatg gcaggattga gcattacggt 720

atgcctccca ttcataaacg ataacccctt ccttcaggtt ggtcatctcc atagagcggc 780

acgctctcaa ggcctaggct attcacacct ccttcgcaac atccctattc acggtgtctg 840

taaggaacga cttgtcatgg gatcacatga agtgcagcat actgttcgcc ggtctcgcag 900

tacagacgct agtacgggaa gtcgacatcc aagcgttcag tcaccacatg gcaaaaaagc 960

tgcaccatac tctttatggt gagttgttcg tgagtggtat acagtcattc atgagggaat 1020

gcccaccgga tagggtgtgg cggccgcaat attcatcgcc tggcaatagt cgatgtgcgt 1080

ccttgttcaa tgaatatcat gggtcacatg tggagacggt taaacagcgt tgactgtgaa 1140

tccctggtgt gtgttgggcc gaacaggtac gttgcaggaa caccaatatc tcttcggcag 1200

cccagttctt tgcgagcggc acaggcaggc atcgcgcaac agatcccagc catccggcct 1260

ctgacattcg ggatacctga agcccttcag gtacggagcg aagaggtggg ctctctgcag 1320

cgattggcgg acggatagct gtatttcctc tctcaccatt gggaagatgt gaaaggctcc 1380

atcatatagc ggctcaactc tacctcgaat gtccaaacac ggcgggaata cttatttatg 1440

tggacaaggc cgagctatga tagcttgctc ccgaagttgg taagtcccgc aatctgcggt 1500

tcaggcaaca gtctcggaaa aataagaaga atattgtagg tgcgtgtagg cgtatcgccc 1560

aaatgcgcac acacggaggc tttaggagat gaagcgcccg tgagcggtaa gggagttggt 1620

tcaccgccgc cccgaccgac tctctctctt tcccagcatc atgtctcggc gcaaacttta 1680

ccctctattg accaactcca cgagaaagca ggaacagctt ccttgtctct catgacgtcc 1740

gcaatccaga cccttagccg gttcgttact catcgttatc cctgccgcca tggtagtgga 1800

gtcagcctgg ccagtgcgta gtcccgtctc tcttgctgca ctagagaagc cccatgagac 1860

agcgtttttt gctttatttc tgctgtttct atagacacca taggggcaaa cgatcctgca 1920

cgcccagagg tattgggctc gtcagattcc cagtttttct cctcggtctg aatcggctgc 1980

acggcagata aatcggccgg aaatgctata gcccttcata gcccgctatg agagtcgcaa 2040

aaggcttgtc agtcaggtcg gtcgagtggc tctcacgaag agcgtcaact tcgcgcgaca 2100

gccgcctttc agggcaagat agatcctccc atcatcccct actgcgctca gcgccggtac 2160

cgaacaattg acttaccgac atcctccggg acgcgcaaat gctgttcgac ggaacgtaat 2220

cctcttcgtc ccgcctcttt tcgctctcac gcattccgtg tggttcgcgc gacggccgct 2280

catcaggacc agaccagtct caatgtctgg taccggcaca atggtgacac tgcggcaact 2340

gagtaggtct ggtcactctg gtgcaccgtc gcttacgctg accttcggga tactgtcctg 2400

cagacatctg gagcgcctgt ctttccccta gtataaatga tgtctgtccg caggtccttg 2460

aagaccgctc gagtcccact tgagttttag gtaggacctg tccaccaaac ccctctttct 2520

gatcatg 2527

<210>4

<211>2629

<212>DNA

<213>Pycnoporus cinnabarinus

<400>4

aagcgggtct ctcccgcctc tgttggctct cacgcattcc gcatggttcg cgcgacggcc 60

gctcctcagg gccagaccag tgtcaatgtc tggtgccggt gcagtggtga cagtgcgaca 120

actgagtaag gctcgtcggt ttcctgcccc gccgcttatg ctgaccacgg gcgtgttgct 180

gtacagactt caagggcgtc tgtacttgcg tagtataaag gatgtcgctc gagagccgtt 240

cgaagacaac tcgagtccca cttgagtttc gacgaggaca tccctttcag cgacccttct 300

ttcagtcatg tccagattcc aatctctcct ctcctttgtc ctcgtctctc ttgccgctgt 360

ggccaacgct gccatcggtc ctgtggcaga cttgaccctc accaacgccg cggtcagccc 420

cgatggcttc agccgcgagg ctgttgtggt caatgggatc acccccgctc ctctcattgc 480

tggacaaaaa gtgagtacat attcctagct tacgaggggt attcacgtct gaccgaactg 540

gctagggcga ccgtttccag ctgaatgtca tcgacaatct gacgaaccat accatgctga 600

agactactag tatcgtaaga tatatacact ctctgttgac gccctctcgc tcatacgcgc 660

tcgctagcac tggcatggct tcttccagca cggtacgaat tgggccgacg gtgtgtcgtt 720

cgtcaaccag tgccccatcg cttcgggcca ttcgttcttg tacgacttcc aggttcccga 780

ccaagcaggt aatgagattt gacccgttct ttcattcggc gggcctgagc tcctctctct 840

ttgctaggga cgttctggta tcacagccat ctttccaccc agtactgtga tggtttgcgg 900

gggcccttcg tcgtctacga ccccaatgat cctcaggcta gcctgtatga cattgacaac 960

ggtgagcatt aaatgtcccg tgaccttccc tacgttctca tgcttccacc gctctcagat 1020

gacactgtca ttacattggc cgactggtac cacgtcgccg ctaagcttgg cccacgcttc 1080

ccgtacgctt tcttttgggc atctcggcgt ttcctgtggg ctcattctcg gggatcatag 1140

gcttggcgcg gatgcaactc tcatcaacgg gctgggtcga agccccggta ctaccactgc 1200

tgatctggca gttatcaagg tcacgcaggg caagcggttc gtatccacaa tcgccctcca 1260

gtcgctggct ctgacacttg ttcttcccgc aggtaccgat tccgtttggt gtccctttct 1320

tgcgacccga accacacctt tagcatcgat ggccacacta tgactgtgat cgaggcggac 1380

tcagtgaata ctcagcccct cgaagttgac tcgattcaga tcttcgccgc ccagcggtac 1440

tccttcgtgg taagtggaag ctcgctgaca tcatgccggt gatagatttc tcacacattg 1500

tcatacagct ggatgctagc cagcccgtcg acaactactg gatccgtgct aaccctgctt 1560

tcggaaacgt cggattcgcc ggtggaatca actctgctat tctgcggtat gacggcgcac 1620

ccgaggtgga gcctaccacg acccaaacca cttcgacgaa gcctctcaac gaggctgact 1680

tgcatcccct cacccctatg cctgtggtgc gtgtctccta aggcccatct cactgattgg 1740

atgcaaactg atggggtgca tatcagcctg gtcgtcccga ggccggtggt gttgacaagc 1800

ctctgaacat ggtcttcaac ttcgtgagca ttgccttcgc gccattgtgg gacaatatct 1860

gatgtccttg cagaacggca ccaacttctt catcaacaat cactcctttg tcccaccctc 1920

cgtcccggtt ctgctccaga ttctcagcgg tgctcaggcc gcgcaggacc tcgttccgga 1980

cggcagcgtc tacgttctcc cgagcaactc gtctattgag atctccttcc ccgcaactgc 2040

caatgctcct ggcacccctc accccttcca cctgcacggt gtacgtccgg tcctcgcgca 2100

tctgatgatg agttgatagc taacaatcac accagcacac cttcgctgtc gtccgaagcg 2160

ccggaagcag cgagtacaac tacgataacc cgatcttccg cgacgtcgtg agcaccggcc 2220

agcccggaga caacgtcacc atccggttcc agaccaacaa ccccggcccc tggttcctcc 2280

actgccacat cgacttccac ttggaagccg gttttgctgt cgtcctggcc gaggacactc 2340

cagacacggc ggcggtcaac cctgtccccc agtcgtggtc ggatctgtgc cccatctacg 2400

acgcacttga ccccagcgat ctctgagcgg tatcggtggc attatttgga aaacgttgaa 2460

tacgctggac ttccatcggt tacggattta cggattcggg ttaacattat gtacctcata 2520

cggcttggat gaaatggacg gtccgtccga gcttcattgt gcttcatgtt aacaaaaggg 2580

ttgtatgtag aataatttcc agggcaatca actcgacgct atcgatcac 2629

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>5

ttctgaccat ggcgaggttc cagtc 25

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>6

acagtaactg attcagctca gaggtcgctg 30

<210>7

<211>34

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>7

accccctctt tctgaccatg gcgaggttcc agtc 34

<210>8

<211>36

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>8

taacccgggc gctcagaggt cgctggggtc aagtgc 36

<210>9

<211>25

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>9

tctgatcatg tcgaggttcc agtcc 25

<210>10

<211>27

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>10

gtcttcaagg acctgcggac agacatc 27

<210>11

<211>30

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>11

accaagctta gatctccgaa ccagaaatgc 30

<210>12

<211>33

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>12

gactggaacc tcgccatggt cagaaagagg ggt 33

<210>13

<211>2000

<212>DNA

<213>Aspergillus niger

<400>13

cctcaagctg tggcccagcc ttcctcaccc agccattttc gagctggttg gactccccaa 60

gtactacgac agtttgatcg aagaggccaa ccgtcggcgg tgccccaagt cgaagaagga 120

gcttagcgat cccagcatct gtctcttctg tggagatatt ttctgctcgc aggcagtatg 180

ctgcatggag aacaagctgg gcggatgcaa ccagcacgtt caaaagtagg tccattccca 240

cctctttggg gagtatctgg agaactcttc taacaacgaa tagatgtggc aagaatatcg 300

gtttgttcat caacatccgc aagtgcactg tgctctactt gcacaaccac aatggatcat 360

ggcactacgc accgtacctt gaccgacatg gcgaggtcga cccgggtctc cggcgcaacc 420

gccagctgat cctcaaccag aagcgctacg accgacttct tcgggatgtg tggttgtcgc 480

acagcatccc ggccaccatc agtcggaagc tggaggcgga catcaacaac ggcgggtggg 540

agacgatcta gacattggtc cctgggagtt attgtgttcc gtgtttcagc attgttgtgt 600

atcctgattt ggcttgatga cccgtgccaa aagctcatga tgactttgca tgcattttat 660

cgaactgttt gttcttgaaa ataatttaca tatatgtatc tacgatgcag agggcccttg 720

ttcttgttga tggcggttga tactatatag tactctatgc gttgtgcttg gcgagattca 780

ctgatgctgt cggtaatggt tgtttgacag tgtgaatctt gatctgaatc gtgatttatc 840

ctatcctgca cactgaacta ggtattgatc tacatgtaga cctcgattcg aaaccagatc 900

agccgtgtga ctcacatgga gcgggtgtct cgcaaggata actttagccc tggtactagc 960

ccccatacgc actgtcatta gtgaggtgct gagacaattt aagctttcgc ttcagccata 1020

gcttataaac agtaagatta tgagaggggg aaaagcttca accaagacta ttttcacccg 1080

tctttaggtt gttcataatg ggctacggct tcatggctct catgcctcca tcgtataatc 1140

gtcccttgta gacagtagcc agctacttac tagttagcac agtggacaca agccagcgaa 1200

tcggggtgaa gccaattagc attggatatc cacgaagtat gatcgtcacc ctccatgact 1260

tcacacggtt gctgcatcgg ttcaccgggt tgaacctagc cgggcaggat cggagcaagt 1320

cgctggatcc ctcacggatc acagagctcc agctccacga agaaaagcag gatgcgatcc 1380

ccgcacatcg gagaattgca taccgttgaa gcaatccaag caattggcag gtgtcatctc 1440

cattacgtac cgtgaccttc ataccctccg tatttatacc tgcccctccc tcccccgctt 1500

ctcctgcttt cttcctctct ctttctctct tccatcaact caacttccat ctacttcact 1560

acttcctgtc aagtcttcca tcgactttca tcacaagtca tcctctccca tgtttgtatt 1620

ccctgtatag accgtactga cctcttccct agaaaccctc gtgcaatgta attccacctg 1680

cgtcggcccc tccccggggt ctcgtctcaa tacttcatta cacacgatgg aagtcatgca 1740

atgcctttgg ctggactctc tcaatgatca ggtatctcag gtaaatcttg ggcgtggacc 1800

ggtgttcgtt cctatccgtt ggttgtgcag cattgctagc attgctgcct gccatcggct 1860

ctgggttcgt tctgagatta tacggttaaa cttgatctgg ataataccag cgaaaggatc 1920

atgccttccc tcgtttcccc ccacttgatg gaatggctaa caattcccag tcccacctac 1980

cacaccctta aagcaacatg 2000

<210>14

<211>2000

<212>DNA

<213>Aspergillus niger

<400>14

ctcagtcaat caactgacgg aattcatgtt caacttcacc cagaagagtc ggcgccagcg 60

gatcaaccag cggaaccgga cagagcgtct gagtgacctc ctggactgga aacgcatggg 120

ccttgagtat gtcaaggctc ggcagttggc actccgtcga ggtatgtgta tttccaagcc 180

actattgatt agattgctca cacgttcatg cagcctatcc ttcgtctttc ggcacgcctg 240

atgatgttta cgacgtaatc ggtggcacgg agcagaagat atcgcgacca ttatccgtac 300

ccggatcccc gcgagatcgt tctggtatga tgactcccgg ggattttgcc tctttgcagg 360

aggtgaaaga aggcctgagt acggaggact atgtcgcatg gcgactgccg taagtccacc 420

accccacccc cttgggtgaa tgaatgacac aaggagcgct gatgctgata aactggctgt 480

ctagaactag cgaggaagag gagccagatg accagtattt cccgctcacc ctgcgcacga 540

agaagaatac cgaccgtccg gcgtcgccgc tcgatcagct gtcggtcaat ggtgacagtt 600

gatcgactgg tgagatagcg cggtgcgaca gtctggaatt ctgaatagcc tgcatattcg 660

aggtaccgtt cttggtggaa tgatcgtgtt cgcgtttact tgctctcact aatcgcccgc 720

gtgtgaaata ctgcttttgg tcacccacct gctattgtta tccaaagcaa gcttcattca 780

gaaaagatgg tagctgattt agcccatcga gctctgatca gcatggcatt tcactttgtt 840

gttccatttt tttcatcttg cattgctcgt ttcctccatt cttgcattgt tttatccctt 900

ctttgcatat gtcatcactg ttgtagccag cgaattgtat cttctgattg gattctaccg 960

cagtaggtcc aggttgagat agtcgaatgc acgatgaata ttgtatccct acagtaacat 1020

accatcacga gctccgtgct cccgtccatc gtatccagcc cgccgacgcg gtaaccgata 1080

attcgtgctg ttgagagcga cgatgcacaa gcagctaggc tgatcatccg atccgaagca 1140

gagccaagca gatccttcct caagagtgtc tagacccgcc agccaggacc gaagacatcc 1200

ggttgttgag actagcctgg ccaaccatat agagttgagt cataataacc ttgtccgttg 1260

tgcttccgag cgggtctcga agcgggggag aggatgagac aaggttcatg atgaggtggt 1320

tactgctgga gaaccggaaa agaacgccag gagcacacca ctccggcgac aggatctcca 1380

atgaggcatc tgcttcgttt tcgtgggggt cctggatgtg tttctcggtg agggaagacg 1440

acaatcgcgg atcctaactt agtagtgggg gtttagtcca gggtctcgct tgaccccgct 1500

gcttcccatt tatgccacgt cttctccctc ctctctcgct tgctttcctt tcccttcatc 1560

ttcccatctt ctcactatct atcttcagtt atattgtttc cgaataactt acttcttctt 1620

ccccaacaac ttcctcgtta accgtccggt acgactcaca atgaggccgc gcacgcagga 1680

tcagactccg ggtcttttcg ctatgggttc agatgggtca aggtatcgta caatagtata 1740

acagtcactg ctcgcgcatg acaggtgttc ggctcgtgct tctgttcctt tccttctggt 1800

ttggacagga gcgcggtcgt tctgagatta tactgtcaaa acttgatcta gataatacta 1860

gcgaaaggac atgcgtggca ctgattgtcc cctactattt gacctacaga agacgagagg 1920

gatctcgcat ccctctctgt tgctgacagt ttccagacct ttgcaattac cctcgacctg 1980

agtgtatttg tgccaaaatg 2000

<210>15

<211>2000

<212>DNA

<213>Aspergillus niger

<400>15

gaccgacctc ggaaatggat aggttaggaa aattgggggg gaagggccac acaaaaaatt 60

agcaagaaat taggagaaga gtgaaagaat tttgccccgg aatcctctcc ctgatccagg 120

tataagtagc agacggatgt cttcttggga agatgggaag aaaaacgggc tggcaggtga 180

gcaagaggat aaaaattaca caatgggttc ccgaagggat tctcttggtg gaaaggggtg 240

gtggccacga taacaagcaa caacactgca gggaaaaacc gcgagcaagc cagccactag 300

cggctgactg tgtgggatat gctttcgtcc ggttttccag aggccacggg atgatgtcga 360

tgggagggat tgggttggct tgcgccgcgc cgcccacttt tctcccctat ccagcttgcg 420

ccgcgccgac ccccccctga gatttgctcc ttattccccc gagagggatc aatttctctg 480

atgtatccaa aaagctatat aacccgtgca ccacccacgg agacaagcgc gctgaggcat 540

tgggggaagt cgtttttttt ttttctacca tagcgccaga ggtgtgtgga ctaacatttc 600

tgtgctattt gcgagctagc tcagggagct acggatcgtc gcgcgtttcc ccggcgaaag 660

gcgctccgta cggagccggg ttgtcccaaa acggcagata cccaatacga tgagtcggtg 720

aggcatttcc cgagggagca gaccaggagc acagcaacag aacacaattg gggaagcttc 780

cctccttcca gccgacgcgg cgcaaacctg cttgcgtctc agaagtggga attttcttgc 840

tcagaaactc cggtgctggt ggagccgcat gcccgattcg gcccggtttg attgcgaccg 900

agaagctggc catcatatta gctgggcctt ggctgcttcc cattggcttc cgggacaccg 960

ccaagtgggg gtgtaccact ctatcggacc catttggatg cagggaccca cccgcacgtc 1020

tggttttttc ccttctttgc ggtctcccgt tttgctgtga aaattttgca taccgtagct 1080

ggtctctatt gcttgtctct tgtcttgtcc tgtcttttcc ggtctgttgc tgggttaggt 1140

ggcccggtgt cagaagcgga agggagaagg ggacaattta tatgtaagga aagaatgaag 1200

ggagggaccc gtagagacaa gacaagaatg tttttttctc tcctttttgt gacgacacga 1260

gggaaaaaag gaattgaacg gaagggatcg gttcatacaa gtgtaaaata cacacacgac 1320

tacggaataa tcccatcaga tgcagcaatg ggttatctga aggggaagga gatgtgtgag 1380

tgaatgagag agtaagccaa tgctccatcg cggaccagca cggtcaggtg aagaccctga 1440

aaccattggc tgtaccagta gtaactcccc tggttacccc catcccgagt gatcccgaag 1500

ggtgtgtatg tgtgtatgtg tacacagtat gtgtaaggaa gtgtggtaag tgtgtatgtg 1560

cggtggaatg cccactgctt tcccggggga aggaaaaagg atgatgagcc aaaaacgagg 1620

cgccaaacac ggtgtaaggg aaaaagaagg gaaaggataa actagggata acggatgata 1680

ccaaagacag acacaaacag gaaaaacagg aacaatacaa tacaaacaaa cggtgccaaa 1740

acaccaaaca aaaaagtagg tagggctttt ttttctggtc ccaacaaagc gcactaacac 1800

ccgacggggg ggctgggtgg gaaaagggca aaaaaccgcg aaaatttagc gggagagtat 1860

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<210>16

<211>1992

<212>DNA

<213>Aspergillus niger

<400>16

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<212>DNA

<213>Aspergillus niger

<400>17

ctcgaggaca acgcatcgtt tgatacactt cccgccaata tggacgttgt ccagaagcct 60

gttcagcatc gatctgggcg tctcgttctg taagcattct cctagttact gatgactttc 120

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<213>Aspergillus niger

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gtcacgttgt ccataattga ataaatatga gcagtccttt gtggcgtgga aacatactta 60

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<212>DNA

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acattcgagc agaaacagtg ggtcccggct ggaacaattc ctgtttgggt aatgtaggtc 360

tcgtgtcttc tttggctgca tacgaaaata tgatgccggc acctgaaaag tgtggaagaa 420

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<213>Aspergillus niger

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accagaagga agcgttcaag catctcagtc atcaattcca cggcaagggc agtggcaaga 120

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atattcatct gcgggtgagg agtcaatgag atatattggg agaattgaac tatttgccgg 60

acttgcgcga tatgttgact gtcccagaga gattgtaagc agattggtcc ctggagagga 120

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attcaatgat caagtgatct ttcagccgag cagagttcgc catgtacgtt tccgaacggg 240

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ccgggaagat gggtaagatg gcacgcacaa ttgcgccatc attcaacatc accattggcc 720

ccaacagaac aagattgtcg gccgagccat tttcttgcaa ggtagtcggc cgacagctct 780

cgggagggaa gagagtcgaa acgctagcaa gcggcagata cgaacgaaca gagttgggca 840

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cgcacggttc atctcctcct atagtttagg aacagtgccg gaactagagg acggtacatg 1020

agttaaggtc agtggttcgt gccttgggga atcccaatct cgccttggaa ttcaggttcc 1080

ttctctccaa aaagatcccg gagggggagg ggcatttccc aatgcggccg gcgctaaaca 1140

tcccacctgg aatgagctca tgcgggtcca atcagggccg ttctgccccg tgggcggtgg 1200

cagattgcgt gatcgggatc gcctgcccag cggctgtcat tcgttggagg ggcatccaag 1260

ctgtggttcg ggttcaatgt ggatgttgtc cccctctgcc tcgtagctcc atccccgttc 1320

cattcacggg ctcctcgtct cttggttccc cgacctcggg cctcatcggg gtatatttag 1380

tacttccagc ttcctccgtt gcattcatct tcttttgctt cctactcatc cttctcttct 1440

accattctaa ttaaaaaagt ttatacccac ccctctacaa ctcccttcac tttcacaatg 1500

<210>24

<211>1500

<212>DNA

<213>Aspergillus niger

<400>24

cataattaaa taaagaatag atttcaattc aagtctattt attattttag taattcccat 60

cttgattgat tctcccatca gcttatttaa tttgactaca agttatcaca tgcgactggg 120

gtaattattc ccaattccaa gagatccaag agaagtcccc gacaattact acagacgact 180

ccaagcattc atcagcagaa ggattaaatc taatgggaca gtgatgtgac accgtgactg 240

gttggcaacc aagtgtatcc tgtattcccc cctctatgag aaacctactt agactcaacc 300

aggctcaccg gtgaactccc catggtggtc gcatgatcag accgcccagt gaaccgtgtc 360

cgaccgggac aatcctctaa aagtatggga atcaccgtga ttgccgccca ttcccccacg 420

tcggggctca ccggggaaca tgggggaagg agtgaagaga ggcaacgtgt ctgtgtaagc 480

atggatatgt cctaatttcg gagtaaggat ctccggggag gggaaagaga gatagacatt 540

tgggaagggg aaatagggtg aagatgaggt tgtattggct gagtgcagag gatttgacga 600

tacgagtagg taaaggaaat ccggacatct gataagcacc tcccgtgcag cggggggagc 660

caggccaatg ggaagggaga tgtcaggtga tccgccagtc tgcaggatct cttggcgtgc 720

agggcaaatg cgagtttctc tccagatttc agcaggttct agattgcgac ggcgtattgc 780

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aatggctcat agtaccagca agagaagaat tttctctctc gcttcgagaa agcaatcaaa 900

aaaaaatcct atcctaccct accctaccct aatacttcca ttgccacccg attcctcccg 960

atagtagagc gggcgactgc cattggcggg cgggccagcg gattcccgcc gatagataac 1020

gggcagattc tgtgacctca aactatcgac taacagcccg aacttcggcg ccaccgccaa 1080

acccgccccg gaagccggcc tcatttgccg tttggggcgt gccaggaaat gcccgcctgc 1140

agcggagact ccctagtgtg gtctgtgttg cctgtgtcgt ctgtgtagta tactagttac 1200

tagtctacta ctgtacagtg gatggcctga gggggggact ttatgtccga ctccggctgt 1260

tctcctccct ctatccactc taccctcttc cctctcttct gtctttctcc ccgctctcgc 1320

ccctcccctc ctcgaaaaca taaatcggcc tttccccctc gccatcttct tcttcttctc 1380

cctctccttt ctctttcttc ttcagactac ttctctttct ttcatctttt ctctatattc 1440

ctgttttcct agatacccca gttaaaaaag ttctctcaat caatcctccc cttcagaatg 1500

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<212>DNA

<213>Aspergillus niger

<400>25

aaagtcggca cctccaggct acccggaccc cgcggtatga gccacctcca ttaacctgct 60

acgactggcc tgttcatttc ggcccgttgc tcgagccaaa gggggtatca cctcgactgg 120

agctactagt cttttagtcc caggatggct tcctggttta gcaggtggac cctccgcccg 180

agccatgacg cgggtcaggt atactccaga caggaggccg aagccatgtc cttcaagtgc 240

gagagaagcg taggctgaac catgatatgt cacggagcca tcatcacaga tattgcctcg 300

gtatatccgg tagacgactc gaatcattta gagactcttt gcgtgtacgt ggtgtgggca 360

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gcgctacgga gtactttcgg agaatcagca cccctgcaca aagcattgtc aatgtgtttt 480

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gtccgaaaga gctttcacgt aacactggtg aacatcccac tcgggaagcc gagacttgtg 600

acctacttag tcaaatgaga tgattatcaa agccattaaa tgcctcgctg tcaggggccc 660

tggtaagtgt cttcattaat cgaaacccat cttcattcgt ccccgccttc agtgctcatc 720

attttaggtt tagaagcaag attgagtgcc acctgcttta caaaccagca tgggtagtct 780

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gagggggtct cggtcattta tcgggatgag agccaatcag cgtgcgctca tcatctgatc 960

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tccggtgcaa caaatcatcg ttggagaatc cccagctccc ccgccaactg gggtcgatgc 1080

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<212>DNA

<213>Aspergillus niger

<400>26

ataactaatg gtttgaattg cttactcagt ttctttctct cggacgagca gcgaaaaaga 60

acaggcaagg caggacaaac gacaagcgaa gtattccgat ccgtggatga caagcaccaa 120

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attactaagg gcagttatta ccacgcgtcg ggacaggggg agatgtattt ccacggcctc 360

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<212>DNA

<213>Aspergillus niger

<400>27

cagcgcatgt ctgcagcgtg cgggcaagtc cgcgagcgtc tctggggtcg cttgcgcccg 60

cgcgccttca cactgcacga tgcgtatgac gaatacaggg gacctcctct ctacataaac 120

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<210>28

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<212>DNA

<213>Aspergillus niger

<400>28

ggcctttagg atggatcgcg gccgtcaagc atcaacacca ctagctgact agtgatgctt 60

cacaccttga accaatagtg tatcgactct atccctcaaa atcggctaat cattcgattc 120

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aggcccggct ctcgtcggtg gtcgctgcct acagcccttt ctccgcccga cagtgataat 240

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<212>DNA

<213>Aspergillus niger

<400>29

gtggacttct tccggtcgga aggcttggac tcggcgctgg ttttctcgtt tcgtgtatag 60

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<212>DNA

<213>Aspergillus niger

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tgatcgcgac aatgcattgg ccacgcttga atttgagggt ggtaagatgg ctgctttgta 60

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<213>Aspergillus niger

<400>32

aatctacctg acaaatatgt ttaaatcctt gctaaagcag aacatgtgag attttcaaat 60

tatttattat ggaagatttc aaggcccaat ttgacaggtt ttatgtactg ataaacaatc 120

acagcttgaa ttgacactga actccaataa atgtgacaca tagtctgaac agcagatgct 180

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caatgcattt atgacaaatc aacgccaaga taccctcgct ccagtacgta atgcaggtat 300

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cgctccctca gccctacaag gctgccgctg cacttttgtg aaatatcagt tgacccctgg 1200

ccttgcgcaa cgtggatgtc ctttttctta ctgctttctc tttaaatcca aagtcactcg 1260

ctctctgtct accttggccc agccgtttac ggatgaaaac cgtgtcgacg atctatgacg 1320

ttttgcttgt tcgatcagtc aacaagcgtt tatatcatag aatgggctga gtgtacgcct 1380

ttcctgccct tctctggctt tgtgcgtttt cactgtggtt agatacgctt gtgtgtgaat 1440

aatttttact gtcgctcttt cgctccctga ggtggctgct cagtctggat tcacaagatg 1500

<210>33

<211>1500

<212>DNA

<213>Aspergillus niger

<400>33

cacggctaag gctggtgtcg tcagcccgga agaggagcaa ctgcgcttct gggtccgggg 60

agagaagggc agcttcaaga aggtgagaca acggcctttc accctaggat gtcggttagt 120

aacaaaatac tgatgcgtac acgctcgata gttccatctc gacgtgcagg aagagcagct 180

caaggctggt gtgaagccag gtgacagcgg atatggccga gagccttctg agagatacgg 240

taagtcaagg attgccgccg ttggactttc gcaacaggct aacagtctct gttaggtact 300

ctcacgacta ttcaggacgg caagcccgtc aaggaagtca tgcccacagt agagcccccg 360

acctggacgg aatactaccg caagctggcg cgggctcttg gtggagaggg cgacctccct 420

gccagcggcg ccgaggctcg tgaagtgatc cggctgatcg agttggctca ggagagctcg 480

aaacagggaa agaccctgga tgtataagtc tcgtgtaaag agtgtgccta tcatgggtca 540

tgatttaatg atggatagaa ttgttttcgc attgtacgag tggtagtgtg aagtttttag 600

attgtttctc tttgaaggaa tagatacagc agacctgctc aatgccacta acatattagt 660

gtgctccacc tgctgcaggc gagtgttcga ctgttgtacg taggctctag ttactccaag 720

gacagacatc cctatacagt ctggtcccaa cagcgtcccc aaatcccccc tcatttcccc 780

tcacgacggg ctttacgagt gagaggcgcg agggttcggg gggcgccatg tttttgggga 840

accccagatt gatcgacgat tgctcaagtc tgggcgggaa tgaggttagt tacgcggtct 900

gaaatcccga taccagcagg agcccatgaa acaggggtat ttggggggaa aagacagccg 960

ggttcgggta acagtcggcg taatattaca ggccagtgac ctcatcgtca gctgccccga 1020

cgctaaaccg gaagcagagt ttccattacc caacgcgaat atcatgagtg gcagaaagat 1080

gtcttggacc agccagcaaa agggcgtgtt tcccttcttt ccagggcatc aatggccatc 1140

tccaactcag cgctgcattc ctgccctctg cccgctctct tccgcggaga tcctcgtggt 1200

tacaatgtat gagtcctcgt tttgcgtgcc gacttttcca ccgtcttctc agtgctggcc 1260

ggatggcccc attctagtat tttaatctcg aggaacccca taatggtcct gtccactcgc 1320

tcttcgtctg tttcagacct ccaatgggat tctttggttt atatttagct tctctctccc 1380

ctcctgtcaa tccacgtagt tcaaggtagg ttctgtcctc gcgggccccc ctgatatgga 1440

cccgtcgggg ctccatttaa tcaaactgat gcctggtcgc ttgatcggtg tcaatgcatg 1500

<210>34

<211>1500

<212>DNA

<213>Aspergillus niger

<400>34

ttttccaatt ttagcccttg accaccaatc acgttggttt catgcggtat ttttcacact 60

tgcctcattc gcactaagat ggtccgcgat gccgaaaaag gaaactgaga cccactcaac 120

ttggcatcgt gaatcgagtc atccgccgtg gagccgttgc acaggcgggc cagtatcaat 180

gagggaaagg gaaagggaaa aagagggaaa agaagggaac atacatggga ataaggcaag 240

gagaaaatag atttttcatg gatcaaaggt agcactttat atacacagtt tgattacccc 300

tcgtacaagc cgcatcgaag ctgtactacg tagtatctag ccaccgtggt atcttgtgta 360

ggaacaaaac atcaacttga cagttggaga caacaacggc aacgtggaga cccatgcaca 420

agggcgggcc atccatgatc ctcaggcaga aacagccagg ccgtccaacg acttgccccg 480

gaccgggccc cgttcctggc cgatcgcata gcaccggctt tctgggtttg gctggctggc 540

cgatagtatt tggcttccca aagaagtagt attgcaggta tgacttaata atggctgtgc 600

cattcggatt aatctcattt tgggaaattt cgatttttat ttttcatttt tttttttttc 660

cccttcgatg tgataataag aaatgtttat tatttaatta ttattatttg ttttaccttt 720

ggggaaatac gattcctcgt ctggcttcag ctccagtttg tataaagagc cagcatctcc 780

cgggtggatt tgcacctgat tccactgctt tgttcgtgtc catcacattg aatatcctcc 840

ctgtgattta atttgacctg atctgatttg aattcgcatc cttctttcct tcttggataa 900

attgggattc tctccgctat ttttccctct tctttcccac cttcccctct tcatctgtgt 960

ttcttccatc tttgaatccc aaactctccc aaactagcct ctttgtgcat tccattggtg 1020

acgtgtcggt tgatggctgg taccgacaag tgaaccccgt ttcagtctgt ttggctcgtt 1080

tctcttgctc tccccgataa gcttcgagct ttcgtcattg ccctggcccg tagcaacgcc 1140

agatcaccaa ttttcctttg catcaatcga cgcttccatt gaggtaggtt tgtcgctagt 1200

ggtctagaat tcccatactt tcttttctgg cttccttcta tatctccctg cgccggcgcc 1260

atctcctgca catcttcatg cagctgtgtg gctgccttat ctttcccagc ttcagcttcc 1320

catcctcttc ccccctccat tctcgcgcac gaaccagttt cttttattgc tagcagcttg 1380

gctcctgcct tgttactcat gcatggctca ccaagtaaca gatataaacc cactagtgcc 1440

gcctcttttc tgagttcaat tgagcctctc aactcctctt gccactccac tcccatcatg 1500

<210>35

<211>1500

<212>DNA

<213>Aspergillus niger

<400>35

cttggcctcg cgcgatccgc ttggtgagga acggtgttat tgacttgaag aagcttgtga 60

cacaccggtt cctcttggag gatgcgatca aggccttcga aacggctgcc aaccccaaga 120

cgggagccat caaggttcaa atcatgagct ccgaagacga tgtgaaggct gcttccgctg 180

gtcagaagat ttaaacagtc gtacattcgt gagcacatgc ctccactgct ttatattggg 240

tgactggtca ccttggatac ctttcgcatt catgacacat atttttcatg acattttgat 300

ggatggttta tcgtgtaacg ttcccctttt ttatgacgtt gttagagatc cctgctggtt 360

ggaggcatag agatgcacgt agaattctat tccttcattt ttgactctca caacatctgc 420

atccgacata tcgcaggtag agaagctgtc tctcatcgca ttgacaagcc tttgcataga 480

atgaagcggc agagtaaccc agagctgcag cttgactgaa cactttgtct taacgcatct 540

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attgcttaat gcttgcagca ctggcagtaa gcgaccgcct cttgacaggt cagagccacc 720

tatcagctac aactacgtat cagcagaccg gatccgttgc atccgacgct ttgtctgact 780

cttgtgcggt ttttgagtga ccagaatatt tactttggtc catgttcttt gagtgagatc 840

tgatcctgat cctttgaatg tctcagtttg tttgtttgcg gggcgtcagg cggggcacgt 900

ggtggggaga gtgaggagag ccaccatcac tgtcacttcc tcgattccat ctccatacta 960

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gagagatata ccgattagac gtgcccagag tctaggctgc tgcacgagat tcaatgaacg 1080

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tgggatatga agtcacggct tgctgtaatc cggggtgatc ccagagccaa catcataatg 1500

<210>36

<211>1500

<212>DNA

<213>Aspergillus niger

<400>36

tcaggtcttc ctgaagttta tctcttcttt cgcggctact gacgtcagtc tccttgcgaa 60

gcgactcgag ctcaatttgg atggtggtaa tatcgcggtc gagctctctg atcacatcgg 120

gcttcgattc ttgctgtagt cgcaaggcgg acgccgcctc gtctaccaga tcaatcgcct 180

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aagccacgtc cttctcaatc aacctgtact cgttcaaagt cgtggcaccg caacattgca 420

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tcgccgggac aggcggccag ccgattgcct ctcaggcgtc gcgaggcttc tcgaaggctc 1260

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<210>37

<211>1500

<212>DNA

<213>Aspergillus niger

<400>37

cagccttgtg ggtccggcat cacaggtcca ttgttgagtc acgaagccta ctctgtacaa 60

gccatgccat ctgaaagaaa agacagagag ggagggatgg ataaccacgg aaagggagga 120

gcaggtgact gctgaaatcc gaggagggga gggatgatct catcctgccg accgttccgg 180

gatgcgagga tctgcagagt tgcaaagcac ggcggaagat ttagtctcac tgtagctcga 240

agcttctcga gagagggagg gagtgcattg actgattatt gatcccgttg gaacccgccg 300

ggttgcacga tgggacgtgg cgtggtcgcc attggtctgt gccgaagctg gtggaagctg 360

cttgatgacc agcgctgagt acggtgctga gtcacggtga aatcatagtt agttaacatt 420

cctggagata attattcagt atgagtgaaa agactagatg cttctgatga tggaatagat 480

gatagagatg ggatggacag tgagtagtga tgatggaaaa ttgtagaaag gtagccagaa 540

ttgaagaatg aagataagac cgaaggaaat ccgacgagat ccagaccggg cgatcccccg 600

tgacgccaag ccatgacgat ggaacttgag tggcttcacg gcttcaattc tggcttcttc 660

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caacaccctc tctcccttgc ctggtccgtt cccgactctg tccatctggc tccatccatc 780

agtccatggt ccacgctgat cctcacacta gccatgccgg acctgatccc caccccaact 840

gtgatgcaga cccagctgcg ttgttgcggt tgttgatgtt gatgctgctg tgatggccat 900

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atcacacaac cgacacaaca actggtccgc ctcggaactg acttacttca tgcagaggaa 1080

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cctactatct cactttcttc ccatctctat acactttcag tccagtcaat cgcagccatg 1500

<210>38

<211>1500

<212>DNA

<213>Aspergillus niger

<400>38

ttggatggag gctgaccatg ctgcagagat ggatgaactt ttaccgattt aatgacggtg 60

tttaattggt cacattggac aattgcaatg attgatttaa tctaaacata attcttatga 120

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atctactccg tagtagaaat atcaaacgta caatgacaga tcctaaaccc ttggtcagct 240

accacacttc cagtgcagaa cgatacctac tgctgatcat cacagaatcc tcctgtccac 300

ccaccaccct gttcaatgca ctaacccttg aattagtctc tctccatgac actggacaaa 360

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cccaagccga ggcaggagta gagggtgact agggcggttt tcatcgtggt gtagatagct 540

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ctgtcagttt ggctgtgtct aaccattgca tctctagtat cttcaccaca cacaaccatg 1500

<210>39

<211>1500

<212>DNA

<213>Aspergillus niger

<400>39

ttttcggtag aatccacttc gtcttcagga agcacttcga ggaatcttcg tgtcagcgtc 60

tgtcataggt tctcattgga agagacatga cttgattgta tggcacattc tcgcccgcta 120

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ccgacgccac tggattgggg aagtcatacg acgctaccac ctgtgacacg cggctccaag 300

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<212>DNA

<213>Aspergillus niger

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aaaccgttgt cgcacaaatt ccatccatcc atgatgagag ctaatcatag cgattaagtt 60

cggacgtgca tttctggaaa catggtggaa tcggtccgtg ggtggtaaac gatgcgcata 120

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aggagaccga caaggaattt gcagctcggg tggtgcagtt gatgggtggg gaggattgcg 660

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ggattgcaag gatggatatg tggatcagat ggtgtgaaga agatctgtct gttagcatac 1200

ttcataagtt ccaaggagga gtaaatgtgg agtcataaga gtaatatcga atatcataga 1260

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<212>DNA

<213>Aspergillus niger

<400>41

tttgccctaa ctattctcta tatggagtgc gccctccacc gattatcata taaataatga 60

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cggcaccact aaggatatag gcaacctcat cgctcttttc ggccggcccg aactcctcag 180

ctgggtgacg gtcagtactc gtacaccaat aaattcaatc ctgataaaat cacatagaag 240

ggaaactatc ttcaatcgaa ccagaacgat tgttagcccc gtcttaccag ctagatcaca 300

aactaccatg caagctctgt caggagtaaa tatgcatgac ccatggatct agtctgcagc 360

aaatcaagga caatcaggag tcaaaaattc tccagctcaa acagttgcgc ttctaactct 420

acgaagtgaa ttcaattgag accggtttaa tcctcggcga cggcgtggaa aagtccaatt 480

agcttgcaag gatgaagatg gcatatgcat acgctgagat actaacagaa agaattggca 540

gtaatgatca caaataacat taggaagcga ggtctaaaac agactatctg gcactgaggg 600

aatggctcca gaaagctgaa actgggttgg gtagctgtta atacatgcag atgggatatt 660

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cggatctggc ggctaatcgg ttgacctgtg tacatggacc acatcggtag taccgacctg 1320

cacaggtgac cgactgatgc gtctggctct aacgtaccgt ccgtgccaca tatcatatat 1380

cgccattata cctcatgacc atgacaaaat atcttgttgc gctgctcatt gtcgtcggca 1440

cttttcacat attaatcaat tatcgcgtta cacgtctcta tcgctcgcct gctcaccatg 1500

<210>42

<211>1500

<212>DNA

<213>Aspergillus niger

<400>42

tccatgctat atcctacact gcgccacgtg gtagcggcct aaggtcgctg cgaacgcgac 60

tcagacaact atatgaacta tcgtctgtat tactacgtct gtcgtttcgg ttatatgtgc 120

tcatggatcc ctggcgggtt ggtaggtacc cgtacggcat ccgaaaaagc aaaatgagga 180

agtctaggca ccaacaactt ccggagaaat atcggtgctt tacccagctt cctcacgcgg 240

aggaagcccg aagaagggcc caaacaaagc gggattgaac acggttagcc gagaactcaa 300

ctgactttac agaagcctag caagtggggc cccgaagtag gtacgagaga gattacgacg 360

caagttagac ccttcgccac ctctcccccc ggggaagtac cgtcgctgcg agattaatcg 420

cgcatagggt gctgagacac cccgtggaga agggttgtct ggtccggggc aatgggctgc 480

tggcgatacg ggccgaatta cgtattattg cctcgcggac atattgacgc tctccgcaag 540

aatgaaattg agctgctgtg gaatgaactc acgcgggatt ctttgcaaca acgtcatact 600

cgagatccct tttgctaatc taaatcttcg cttttctcta ggcctaggga tcttcgagaa 660

acttgaatac gaccgagaaa cgcccagtcg ttttgacccc atgggaggca cacctaatgt 720

acgaaggtat cgcctagtat ttctcaaatg cttcgagtag tctaaccatt acatattgtg 780

gcagagtacg gagtacttag tgtgctacca gttccgaccg ggcagtctcc ggagaaaatt 840

actcgggtcc cagtcaaccc cggtcctgct gagccgtccg acttggcaat tgggtgtgag 900

cccgtaaaac tttgcccgtg cacgttcctt ccgagcgggg aagggcatgg aagtttcttt 960

gctaaacgga ctcagagtat tgggggcgtc gctcacttgc tactactcaa tcaagttagg 1020

catgtttggc cttgagggtt tccgggggtc ctgtatttct aacgacccga cttctgttag 1080

ctgttcaaga acccttgacg tcgagccttt cacgctcgct gcgattaaaa gaaccttttc 1140

tccatggcgt gggttggatt tgatagtcgt taggcgcgtt gcttttctta ttcacatcac 1200

cccataataa tacaaacctg atacaccttg atgcaaccgc gtttgggtcc agaagagaaa 1260

gaaaagactt gattgtcgga tactctgggg acttgtgggg tcgaggaagt ggggtctggg 1320

acatggaggc cggggattgg agagagggac aataatggta cggagtacaa taatccgcag 1380

acaaccttcc cggctaaaca ggcattatta tatagagggc attggggtcg tctgactatt 1440

tttcttccac cctgaccaca cataatcctt ttatcatatt gattcgacaa actcgaaatg 1500

<210>43

<211>1500

<212>DNA

<213>Aspergillus niger

<400>43

gacacaagcc gaggatgacc acatcatagt aatctaccta agtggcaagg cgggatatgg 60

tattcctatc cacggtagca atgtacgaaa atgtttctct ctggctgaac caaacccatt 120

tcctgaaaag agagtttggg taggaaaatc ttcggggaca tgtagactat agtggcggtc 180

accacgcaca ccaaggtccc tgaggatatt tgcaggtgga tgggttacgt attggcttac 240

ttggcagagg aagagcaggg cggtgatgtg tggagaccag tgattggctt gatattggcc 300

tagatggggc tgttttctcg tgattcggga ttttagacca ataggaggcg agtcttggtg 360

ctgggatgga ggggcactgc atgtatgcct gaggtgtcga ggtgggatgg tttcctcagt 420

atcatcttta aaaggcagag ataagcttgt tggcggtgat ataacggagg gaaggggaac 480

tgggctgttg atacagctac acattaagga ttcggagaat tgagtggcaa accccgttat 540

tcggagaaag aaaagcagtt ctgtgtccat ttcggattta cggctgacct ctcctttggt 600

tctgcgaata ggcttgatat gcagtattga ttgattctta gttgccaatg gctatcccct 660

aagcatattg atagaaaatc catctgaatt gggaaccagg ttggaggtgg agtggcgtca 720

ggatcagggg ttgtacgaga agtaaccaag ctttggttgt accgatgcag actcggacga 780

agcgccggct tggttggatt gactgtctct gataactaga tctgccagtt gataccacgc 840

cgcaagagga taatgagcct cgggaattga tactctactg atagcagtgc tacttggctg 900

cagaattgat gcccagaagt catgagcgtg atttgtgatg gcccagagat gcaagccaga 960

tagacccatg attgaaccct gcagagagag ccgacctagt acgggatatc tgatccggaa 1020

acccattcca ggaagaagca gcaagacatg aacatcgcct cgagggccga tttgtcaacg 1080

gggacggtct agatatggtg gccagcggac gggaatggcg caggcccgaa aaaggaatgc 1140

gtggtggggt cagtcagtct cgggcggtct tcttgataat acagttcccc ctccaagccc 1200

taccaatcga agagtttcgg tatccttctg cttcggatca cctcatggcg ccgtgggcgg 1260

gccgtcgccg catcattcgt tgcccttgac acaggaacca ttcgctgaac tgaagctaag 1320

gtcgaattac ccgccacagg ctcgttgccc cgttccgtct ccccttcttc cctatataac 1380

caaccttcca ttcccttccc aaacttcttc actctcacaa ctcattacta ctactactac 1440

tactcaatca ctcttaacct ttctagtaca cgttactacc aactaatctc attcacaatg 1500

<210>44

<211>1500

<212>DNA

<213>Aspergillus niger

<400>44

gctgctcgac cggaggctct gtgacataag tcgtgtctta atcacccaaa ttggattcgt 60

cgcaagggtc gagcaagcgc ccgccgttat ggaggcgtaa cctcgtgaga gccaccaact 120

atctgttcca ctgtcagcct caccatcacc cattctccgt agcatcactc ctcacctgtt 180

gtttcgtaga aatactcccg agaccgatcg tagaccgcca aatagacggc ccacgtcggc 240

aggtatccca ggagcatggg acccaatcct tgataaaggc ctcgaatacc atcctcccgc 300

catattactc gtccagttcc tagcatgccc cggtacagtg ttttggcctc gaccgccttg 360

ccacgtcgtc gcgcgaaccc accctgagcc tgcagcttgg tcttgatcac atcgagaggg 420

caggtgacaa ttcccgaggc tacgcccgca ctggccccgc agaacggcgt gatgtaataa 480

tccggcacac gtgtagcgag catttcgaag cgatcgagaa gagtgggctg ggatggggac 540

tcggccgata catgaagcgt cgacgaaggc gaactgtccg aagttgtacc ctgctgctct 600

tgagagccgc tggcagcccc cgaagggcca tggccttcag agaacatctt tccagccagc 660

actcaaagca gtatgcaatc cgtctactat gtcaccgagg gttcccggat ccgagcatat 720

cggtgctcgc tccggaaccc aagaataacc cgtgtgtcaa atcgtggtga gaggggagga 780

aagcgtgacg tcgttcgggg cgctggtaga acaggaaaaa ctaccccgag acaatgaatt 840

gaagggtttt ttctttcgca gagaggagcc gatgctgccg ggaggagtgg gcgtaataag 900

gttggcctat ctgaagcaca gacggggcgg ggtttgtagg agcaacgcag ctcccctatc 960

ggagtgaaag ggaatcgaac taagaaaaat gttcaacgga tagataataa gcggcatgcc 1020

cagtgagtac aaaccaaagt atcagaaaca aagaccgtcg gggtgaagtc cgaacagatg 1080

ggagcgccgg tgttaagagg aggcagacgg aacaggacgg agcaatgagg acgggatgaa 1140

ttgagctgga gggattgtct tagtcgtatt ccagtcagtc aggtggagtg gagtcgggaa 1200

tgagtgagtg aatcttgtcc gcctccaagc gcgccgctct tctggcctga ggcaaccatg 1260

gcgcaagctg agccggtcac gtggaaacca gtcttacaaa gtaacttctc ggaatgattc 1320

ctcctgcctc aggcaccaac atcggatgtt tttcggaaag tcacccgccg aacctccgtt 1380

ttgcacaatc tccaacgtcg ggccatctcc tgctcagctt gactgacatt tcgcgatcct 1440

ccccctccac accaccccgt caattggacc cgaacaaccc cgctgggatc aatcaccatg 1500

<210>45

<211>1500

<212>DNA

<213>Aspergillus niger

<400>45

ggactgatgg ctccagtata agaagctccg ccctatgcac ctattggtgc ctgaggtctc 60

acatactttt aagcgaactg aacaaactag gattccgtat gaatataaga aatagctgga 120

aggctatctc atcttgttca aaggcacgtt cgattagcac gatctatccg tcctagatat 180

ggcagggctt gctcgaaaag ctcgggatcg cccggctcgg cttgtgccaa gatgacccga 240

gcctgcttat ttaaggcttg cgatttgata ctattggtgc tcaagagtat gttgatactc 300

aaaagtttgg ctcaaatata aaagaatcat taaaataagg ctcaatattt tataaggacc 360

aggataatga tggacaaccc ggctggacag aagtacaata cttgatattg ttagtgcaca 420

gtttatttag atcacatagc tagattatgt aagcttagac aagcgctcag aataacagtc 480

actttctcta atatattctc ctggggcaat ccaagatcat tcagggattg ctcaaaacat 540

atacttttgt acttctctta tactccaggc cactcagtga acaagaagca gcgccacgtt 600

caacctaaag tggaaagggg aagtcactca attttcgcag aaatccaatt cagtagcagt 660

acggctagtt gcaatatata taccaagcag cacaaccatt gagaacaagt tcttactact 720

gaagctatcg gacaatccag cagtatttcc agctatagtg acggcatcaa accatttact 780

tattctatac ttcatctaag caattgttct tattagcaat tggctatctt tggaacggcg 840

gtgatggcat cggagttcgc agcgagagat gggctgctta tcgcccaccc ctgccactga 900

taagcgatgc agatctgata tgttctcaac acattgacca gtcgcatctt atggctattg 960

ccactccacc gtcatcggca gccggcggaa gaggcaagca gattgcatca acagagaaca 1020

tcttcatctg aatgattgga ttatggaatt cctattatca ttgggaatta tcatgctgaa 1080

cggcgactct ccggatgggt tggcaagtcg ccgagcacgg ggccaacacg atcgctgatt 1140

ggtgcaaaac gccgaagcag ctgtacggcg cggggcagct tccaatccat cgcgagctct 1200

cctttaacag ctgccccctc gcttccattt aaaagccctt cgcgcggcca tttttctcgt 1260

gctttatctt ctctccccat agtcatctca attgcaccag ttgaagctat aatcggtgct 1320

ggtttgctgc ttgtctggtt gagcatcgat cgaggagctc cttatcaatc atcattgcgt 1380

tatcgtcatc gtatccttcc ccacatccct gatttccagc tgggtatttc tgtgcccctg 1440

gccaccccaa ctcattcctt tttctcagac ccatctcctc tccattaatt catcacaatg 1500

<210>46

<211>1500

<212>DNA

<213>Aspergillus niger

<400>46

ccaggagggt tctgactaag ttgttgcatg gctgcgggag gcagggcgat agtaatatta 60

gactgcgtta atattatgca ggcgtggctt tttactgcac ccggccatca gtgaatcaag 120

ggagggtgga tcagccaatg tcgcccccct ccttccaaac aaacaaatca ttcacgttgt 180

caagatgctt cccttccttt ctgtgacacg gaatggccgg agacagcgat gttttagcca 240

ctgggattgc agtatgtggt ggttccgggt aacatcgaca tgtcagtgaa tcaatcaatg 300

atgcaaaccg ttttggtcgt acgtaaattg tttgtctggt gacgggaatc ggtctgccaa 360

cccgacgaca gccgcatcat agttataatt attttagatt atgattcggt tgaaggagga 420

ctcggtacca ttcatcatcg tcatcatcag caatcatcat caaagatcaa tgctctcctt 480

cgggatcagt gtcacggtca cactgtggca aaacattctg tgtagccgat ctggagattc 540

ctactctata caaggataga tgaaatcgat ggacaataac aacaacaaca acatcatcat 600

catcatcatc atcatcatca caaaggagct gtatacaaag agtatagtat gcatgtatgc 660

atgtatgtat gtatttacgt gggatacaga atgtgtagag aatcagttag gattcggaaa 720

gtcacgactc aagaatcctc cgaaagaggc aagaatgttg gtaacaaaat aacagcaaaa 780

aaagaaagaa ggcaaaaaga gcaggtgatg ccctcgtgac ctgcccgcat ccatcatccc 840

aaatcctccc gtcaggaact ccagcttcat ccactccatt ctttcttagc gctactccat 900

ccaatctcca gtctctctcc tccttccctc catctcggtt cgtctccatc cgctttttct 960

ccgccggcga aaacggattc cccccgattc aggtactcac cgtccacatc tccccgtttg 1020

tcgtagcctg ctccggctct ctccagacag tctctccact ctctccccac tccaagacac 1080

gctctcgaag catccaatga actctccgcc ccctagcttc cgaatctccc acctcgttcg 1140

cctgtcttcg ggcccttgag atctgggccc ccgttttttc ttgccatggt cctaccccga 1200

ggatggggtc ctccaatccc tgggatggag gcgaatcgcc gacggatgga gcgtcaaatt 1260

ctttcacttc cattttagtg gcattcactc gttgacaccg tcatacttac cgagttcatc 1320

tttgtgtgcg gcccccctcc ccccccctct ccccctctgc ccggacccca tatatatccc 1380

tccatctccc ccgggtctgt cagccctttg gatgtctttc tctcccatca atcttctctt 1440

tttcccatct tcccatccct ggcagaggat tccgcgttgt atgaatccac cggcaacatg 1500

<210>47

<211>1500

<212>DNA

<213>Aspergillus niger

<400>47

gaatatacct caaaccagag gtgccatatg gtccgggcga gacctgtccc aaccagatga 60

aagtggcacg acgtgttcaa cggagttgtc atggccccgg tccataattt agattcaatg 120

ctactggggc catctgataa cgtgggggtc cagtgagatt gatcccttgt ctggggaatg 180

atttcaagac ttgcggtgtg tgggacgccc ttgcttggat gggttggcat gtcccaacca 240

agcttggatc atgtggttgc ctgaggcgat aagagtcaat gggaggaatg taacatgggt 300

cacgtggtgc accgttgtgg aaagtgttgg gggtgaatgc atgcctgaat catgtggcga 360

cgatcatcag gttttcattc tccggactat tcaaaggagc atcaacggag cacccggaaa 420

caatttgtgc cgaggagctt gcggctcgca gtcatgccaa aacggaattt gatgtttcaa 480

actcggccgg tggcaataat gtccactcat agggctgccc tgtgcggaaa agtctgatct 540

gagtggacca atgactgatc caaggcatgc tgattatagc actagaatgc gttagtgtgg 600

ccacagcata agcaatgact ccaatgtttc aattctccag aattaggatc aactctggaa 660

gaaataggga ctattgctcg agtcgcaagc tagatggagt ggtgctactc cgagcaggca 720

atactttgat gcggaaaagg aaaccgtccc gcaatcccaa tcgggatgga tagccacagt 780

caagccaccc gagcaatgac accagccaca cagagcgatc aaggggcaaa aaacgttggg 840

gattcaacga atggttgaac tgttctgatt ggtggtccgc tcccgacctt acccaaagcg 900

gcagcttctg gccgagcagc gccatcgaat cagagggagc ccaacaagct tagttggagg 960

aacaggcggc gctgtatggt tggagatact ccggccattt gccatcgcgg atacactctg 1020

ccatccggac accttccaga cgtgcctgga taatactgtg gtagtagtcc ccttcctcac 1080

gctccctttc ttgtgtctgt tgaaccgtcg gccactttgg gacctcggga tctcatgatt 1140

acttcactga tctaccagtg aacttgccgt caggccaccc ttcttaactt attccatgcg 1200

ggtgtcctca tagtcgcatc attatcattg attgtccgcc ttgcttttcc ccaaccatca 1260

tccgccggtg gaccctggta gagttcaact gcctccgaat tttccctcct tcactggctc 1320

agatctgccg cttacttctt cggcctttcg attgcattcc ccaccctttt tctccgtctc 1380

ttttttatcg ctcgcctccg gctcttctct ttaaacccac cctctcccgc acgcatcctt 1440

ctcctcctca tccgaaccat actgcagggg tcgacaatac acacgaagga catcaccatg 1500

<210>48

<211>1500

<212>DNA

<213>Aspergillus niger

<400>48

ggaggggctc ctcctcgcga tctgtccaag ctcggcatgg tcgatctcat gcaagaaaag 60

gaacgcatcg aagaagaact ctcggctctg agtagcttcc ttggctcggt gagttgaact 120

gatattggat aagccttgcc actctgtgag atgtcgactg acgatgcttt ctgtctagca 180

tggcgttaat atgaacacat ctctcactac tttcgatggc ttcccacgag acgatatcga 240

tgttgcccaa agtgagtcac tactttttgc ctccgcagtg cgtctgctaa acagtagtta 300

gtacgcacca ctcgagcccg gattattcga ctgcggaatg accataaaga cgtgatgtca 360

catctggaga aaggaattca caaccacttt gccaatctgc agcgggcgca aactgccgca 420

cagtcgggtg gcttggggtc gcaacctagt gtgactggga ataatacctc cggcactggg 480

gcatctgggt tacccttcgc aaaggtcaat agtgtggtgc ctggaagtcc cgcagaccag 540

gcaggtctaa gggttggaga taccgttcgg gagttcggaa gtgccaactg gctcaaccat 600

gaacgtctct ccagggtggc ggagatagtg cagcagagtg aaggggtaag taggcgatgt 660

gcttccaacc tcttagtcgt ctagtccagg gacatgcact cgggagaacg ctctaggcta 720

acgtcttcta gcgcactgtg gcggtcaaag tcgtgaggaa agatccgagt tcttccagca 780

gcatcgactt gtccctgcag cttgtccctc gccgtgattg gggcggtcgg ggcctgttgg 840

gctgtcatct cgtgccgctg tagtggactg gcatcgggtt aggcacgagg atgacggccg 900

tttactgtac tctgggatag tccctagaat actaggactt agccgggtac gatctacttt 960

cgtttatgat ttctcccttt tgcttgctat tggactttat gaggaatgtg acatgtattc 1020

atgatcgaac gcgacgtgtt tattcttgca gggaaatacc tagggaagca ttcagggtgg 1080

cgtttcagtt taggttcaag agatgaaatt gcacctgttt atatggacat tgtctatcag 1140

ttccgtacag cgtagagcgt tcactcgcga agaaccgcgt ggatcgacag cgaggcatgc 1200

aataaatgca gtttgcgcga tcctgcgggg cacgtggctg cctgaggccc aaaaagatca 1260

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cttcgtccat cgagtgtcgc atctcactgt cgacttttaa tttccgtcga cttctatcgc 1440

agactctgta tcgcttctct tcatctccaa cccctcacat cacatccaac cttcatcatg 1500

<210>49

<211>1500

<212>DNA

<213>Aspergillus niger

<400>49

ctatagagcc gctcatcctg ctggcacgaa gctttcggga aggcatcatt cttttgtctg 60

ccgatcactc ctggatctga ctcaggtttt tgtctcccag caaacccatt gcaagttatg 120

cgacacggag ttcattccat catgcagcgg acggtgtctc tgaaaagaag ccctaaatga 180

gcacgtcatg gctcctcatg actgggatat ggtaccagat aaatttgtgc tggggtctga 240

cgttggagcg aaggcatcgt ccgttgagcc gtacatgaca ttctatgact ggttgccata 300

gttgttagtc caggtatttg atcatacatg gaaactcggc aaacacaaga tagaaactgg 360

caacttgtat gataagatgc gtttccccag cgggcatcca tggcaggttt agaatgaggc 420

gtatatctac ggtccctcca taaagtgcgg ataaacaggc ctgtcacaga gctcctcttc 480

cacgaatggc ctattagatc cagcaaaatg agccaagaat agtagtgtcc tcctccaact 540

ctcttagatt gggattatca acattgggca tactggagtc gctgtcggcc gtgatttggg 600

cctggcgggt aatgcgacat gttagattgg cagcgatgca ggtggagcag gaagagacac 660

ggttgcattt agtctacgag agtgaaattc ggttagaatg caaatgcacc taaggttcat 720

ggggttaaga cgagtgtctc accttgcgac tccggcactg gtcacacaga acaccatcat 780

caacaaatcg atcaaatgaa tcggcaatgg tcaatgaggt aaggcatgct aagggatgag 840

acgatgagag tccaactcac agccggtctt ttgctgtttc cacgggtgcc gataccgacc 900

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agagggtaac acacaaagta ctatgcccaa catgcttgcc gaccagaaac accacggtcc 1320

gtgaccgggg actagggaga gacccatcca agatgatgcc gaacactcgc aattccattc 1380

gcataaggtg gtagagaggt ataaagtcac cgggagaagt ccatggtctc atagtcaaag 1440

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<211>1500

<212>DNA

<213>Aspergillus niger

<400>50

cgcccttatc tcatggaatt tcctttttgt gggacccttg cacctgtcac ccaaacattg 60

aacaatagca ataacaacaa acgagcccat cgaacccatg agcactatcc gaagcgaccc 120

tactaatgaa acctccagat aaaaatggta cgtatcgagg gcaagattag ttccaggtgg 180

gaaaaaagag agacaggggg cacaagtggg tccagcagcc aaccagccat tgggtcaaaa 240

gcggggaaga gagagccaca gcgggatagt ggccagagcg atgagtggcc aacggcatca 300

ggaacagcct gcaggcccca ctgaccccaa cactcattgg acagcaggga gaaacatgaa 360

acaaagtcta agttggcatt caacgtcctg tggctcagta aagcgaggtt tctgccccct 420

gaacttattt ccttttgatt atcgggggag gtggatgatg atgacatcct aatttttgga 480

cgggttacaa gtagtcagtt tagttgatcc cgcttttacc gttgggaccg agtggtgaat 540

gttactgcct ggtagactaa agtatgtact agtaagtaaa gtaccagtag tagtagtggt 600

gatgtactac gctgtagtga cgggacgatg tgcctgactg atgcaggtac ggaatcccgc 660

gcggttcatc aaagtaaata attgctatct actattgctt gaaatccaaa aaagttcgaa 720

cctaaaaatc cagtagggga accatcgatg acccaactaa gtatctaccg accccattaa 780

ctcccccctc cccccctgag ccgaagagtt agtcgactgt tcttccggtc gaaaagagca 840

atggagcgac cgatcaacag cacttgtctc gcaacgcatg gacagcttgg acagcatgga 900

cagtaattca gggccaggga cgaaagtcac ttggcggcac tagttggtct agtcaaactg 960

gcgaaggggc tggttggacc aaccaagagc tgtgggtgag acgggcgcag aacccacgag 1020

gcgcgaaaac gaaaaaaaac gagcgaaaga agtgagaagt gagaggggcc atcgcgggtt 1080

gccccaaact tgcccatgaa ggtgctctca caccgcatcg gcgctctgat tgattcgggg 1140

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<213>Aspergillus niger

<400>51

gaagaagcga ccggggagga cagaacccga atgcgattgg ggagtctctg gtctgaaaac 60

aaaagccgca cagaagagga cacatcgaca acggccatta ttcatctctc actcggtcca 120

gatgcgttag ctcgcagtca gatatgccgc tgagctataa gctagttaag ctgccagcgg 180

gacaaatgta agccaacaga caccgaaacc tctggttttg gcctggtcgc ttgcgagatt 240

catggcctat gatacagatc aagatcgaat ccagtgctac cttgcgcaaa gcaaagtggg 300

cattccgatg caagggaagg ccaagcaaac aataaggcca cgcaagaggg gtaatgtgtt 360

cttccgccgg ggctacggtg aaagacattt cgccccataa acaccgcgcc aagaggattc 420

gccaggtcaa acagtctcca tagcggggtt ttcctgggat aagccacacc acaggtttcg 480

atctgctgat ggtagagcgt tgccagccaa cggtctcccg tacactcttt tcccggaatt 540

attctgccta aggcactcag ccctgtcagg ggcatttcta acttcttggc cagcaagaca 600

agagattcga aacacagcca ctccgcccgg aatcgctcag cctagaaaac gggaatgttg 660

tcaatcagcc ttatgtcatt atctcggctc tgtctcactc gccaagggat tatcccgtgg 720

ggcgtcgttg cgcccagtga ctgtcagccc aacagaagcc catggatgca tctgcgacca 780

gccggatcca acagcagccg cggatgctca tcgatggcgg gcatgtcgcc attccagatt 840

caacgcacag cgggccatga catgcaccaa gcgccaatac caagactgct gcctaggacg 900

atagggaaac ggacgactga ccatggagat ggagccctgc ctgtggctga gatgaagggg 960

gagggaccct ttcagggtcc accgctgacc tgtctgccaa gaagcctcat tgagcacgcg 1020

gagtgggggg atcactggcc ccagagacca ccatgaaaca ataattgtca attcctatgg 1080

agcaatcagc cacaatagtg ggaattcagg cgcctgtctg gggctagaaa cggtgaaccg 1140

tcaaatcacc gttcatggtg cttcactcca taccggggtt gttgcattgc attcccctat 1200

cccaagaagc ccccacgaaa atagcctacc tactcttacc aggttgtcga caatcaatca 1260

atgaatgctc aagccactgg caaatgacct gaggccaagt gtatgatatc catgctcagg 1320

atctcttggt gactgcgaag agccgactcc actgaggcat aacgaggtat ataaaccccc 1380

ccttcatccc ctcttgccct ccatcaacaa acccaaccac aaccacaaag caatcaatct 1440

cattatacaa ccacttttcc tccattccct cataacctct ttcacaactc catcacaatg 1500

<210>52

<211>1500

<212>DNA

<213>Aspergillus niger

<400>52

aagcgggcag ctgagtcagc caccgcggaa cggaggaatt gccggccgac attcgtcaaa 60

cccacaaaaa aagagtgggt gataggtttt cttttaccat cccaatctca aaagacgagg 120

ccggagcgca cttctctcaa caaccacatt aaacctttag gtatgtggta ttctcccgca 180

agccacggct gattgcccgt tattttgatc atgttcaaaa aacatttttt gtcatggcca 240

aaaaagcggt agcattcagt agtgggctct gaaatagcgg agtgaacaaa tgctgattaa 300

aattgatcat gcagaagttt agtcttcagc gtaacgatgg cccccaagag caagaagacc 360

ggtgacaccg tcggctcgcg cctggcgctt gtgatgaagt ccggaaaggg tatgttatac 420

cagaatttgc cagttcagac attttagaca gtctctaatc gagcccatct agtcaccctc 480

ggctacaagt ccaccatcaa gaccctccgc gtgagtatac cggataattc aggcaatagc 540

cgtgcagaac atccgtgaat ggtcgactaa taacgtcaac agtccggcaa ggccaagctg 600

gtcatcatcg ccgccaacac tcctcctctt cgcaagagtg agcttgagta ctacgccatg 660

ctcgccaagg cccccgtcca ccacttctcc ggcaacaacg tgagtgactg cgatcagatc 720

tttggcatct ctatggagtg gggtccggac ctagttctgg atagactact tccgtagtga 780

tcgcaacgta aaactggagt aaacgctaac attatggtga acagatcgag ctcggtaccg 840

cctgcggtaa gctcttccgc acctccacca tggctatcct cgatgctggt gactccgaca 900

tcctgtccag ccagtaggtg taaagcctag tcaatggatt catgttatgt ctgaacggcg 960

gtatgccatg atgcacaacg tcacggcacg atttagataa tgacaatgaa ctttacatct 1020

atattgggtt tcgtttctaa acgctgtagg ataagactgt aggagtgatc tggaagatag 1080

cacggtcgca tcactaaaga accggaggga ggagtggcag ctcaactcca ctttatgagt 1140

cacgtgatta aaagtcaggc atttagacaa ttataaagca gcgaaaagtc atcacattcc 1200

attccgcagt aactaaaaca tgtttcattc acggcttaga aagaactgat atatcagtct 1260

gaacaagaat gtcggagttg ccgtagtctt acaaatgcgt catagcggct acagaatgtg 1320

attggcggag agggtagggt ttagggctgt gccactcggt agcgggcgct tgcttggaaa 1380

tcaacgtgga gagtgcctgc gcccataatc ccccttccct ttcgcctccc gacaccacct 1440

ttttcgacaa cctcaccgtt cgcaggaagt gcagccgccc catttccagc agtcaagatg 1500

<210>53

<211>1500

<212>DNA

<213>Aspergillus niger

<400>53

tcgcccccct taggggtggg taataattac accattgacc atcttgattg atatcatata 60

ttggaaaacg gagtgatggc aaaaaaaaaa gaaaacaaaa agggtaaggg gatgactgaa 120

aacagagggg agatacgtag attttccacg ttactaaaaa gtaaataacg actccagctt 180

gtgtggccca tcatccatgg tatctgaggc acctcgaatc cttgacacga catctggtag 240

gtcagtttgg taggcagcat gagccacctc aggcggcagt aagccaatca ccgaggaccc 300

tgccaagtaa tccgcaattc attcgaccga caagtcaaag aatctccagg cccgaattgg 360

tgagggctga ggcgtcgggg ggttgtggtt gttgtggaca gagttggacg gcgaaaagtg 420

ggtaacgata cgcgcgtttt ggtactgcgt gcggtaatac cgatggtaac ccccgcccgg 480

tgcaggtggg atgaatgggg gagggtgaag cgggcttgtg ataggctgca ggggcgccca 540

tctgcttacc atatttacac cacccgggcc tttttaggaa taatccagta tcgcatacag 600

gtacaggact gggcgcgcaa gtaaattagc agatccagat cccaaaataa ccaccagcgc 660

cgccccccct ctccccttct tcccaggtcc tactagggag tagcgccagt cctatcttcc 720

ctgcttgggt ggtcaatcaa ttcccttttc accacttacc gtccaactca agcctcctcc 780

tccctccccg tccgtctctt agttccttcc ttccttcttt tcgttctttt gatcttcgac 840

ctctttttcc tttcggttcc tgttcgctct ttttttcgtc gacacttcgt ttcccccgac 900

tcatcttctg caacactagc gaccttccct ccctcccttc cttctttctt gctttcgttt 960

gaggaaagaa gagggaggcc tttcttggct gagacaggtt cagccaacgg cagtcgggag 1020

gcttttgctt ttgaaatccc accccctagt cgtgttttgt tctttacttc acttcaccct 1080

tccattcgtt tatcgaacgt ccctccagcg acgaccaacc ggccccgccc tggaagtcga 1140

cctacagagc aagagaaaaa aataagcaga cgatcgtttc gagttgagat tgttgtttag 1200

ttttacgccc ttgaaacaca ctccggcact ggtgccttca gagaaaaaga acgctgcgcc 1260

agcatcaaaa gtcattcttc gacgcgttct gaacatacac atccattgcg ccagaagtgc 1320

tatctgttta cgcttatttc actggaaatc ggatcagagt aatttttaat gggccactgt 1380

taatgtaagt tgcaggatct tgcattcaaa acgccatccg accccttagt aaggccatat 1440

tgatactcat ggtttagaag aagatattaa acggttcggt gattgtggct attcaacatg 1500

<210>54

<211>1500

<212>DNA

<213>Aspergillus niger

<400>54

gtaaataaaa tacgacaaag caaacccaga cccatgatac ttgtaataaa aagatcaaga 60

acaccccaac gtcccagtca taccatgaac caacccgaaa aagcaacccg tcgcgtcact 120

gctgcggaag gacaactgac gcgccgaccg cgcaggatgg ctaaaaagaa acaagcagga 180

aaataaaaaa ggcgtttaac caccgaaacc gtagagggta cctgaggaat tccatgttag 240

acgcgttgga cacacaaaag ccaaaacgtg tggtacttac ggccctgtct cttaagagca 300

tagacgacgt cgagggaggt gacggtcttg cgcttggcgt gctcagtgta ggtgacagcg 360

tcacggatga caccctcaag gaaggtcttg aggacaccac gggtctcctc gtagatcatg 420

gcagagatac gcttgacacc accacgacga gcgagacgac ggatagcggg cttagtgata 480

ccctggatgt tgtcacgcaa gatcttgcgg tgacgcttgg cgccaccctt gccgagaccc 540

tttccaccct ttccacctgt tgagacgcgt caagtcagtc actgttgatc atggagtaga 600

cggcagtgga caatctatcg agatgataga tagcccatga tgggaagtga tgaacttacg 660

gccagtcatt gtgaaggttg tctaaaaagt aaacggaaat agagttgaat taaagttgag 720

ggtgaagatg gtggagataa gttaagcgtt ttagagtgag gatggatgta aagggaagag 780

ggcagagagc atccatggga cgggagatat ttgtatagca gaaggcgcgc cgcggggagg 840

gcgttggaat cacacgctag agcgcggatc gaccaatcag agcgcaggat cccggccggc 900

ggactgatct ggcggcaacg tgaccgggca gggatgattc cgctgggatg agactgattc 960

ccacgggaat gctcccaacc acccagatca gcaatcagag ggtgtcaggg acattcctgt 1020

cgatggccat gagcatctgc aacaggttga taggatcaca ttccgggcct gaggttggga 1080

tcaatgtgag gcaggggcag cttctagatc cgtgatcctg gcttcctatt ggctggcggg 1140

cattagggcg ctcgcttagc gctccgagca ggcagaaagg ggactgaccg cctttgggca 1200

cttttgattt tcccagccaa aagtgagccc cgaaatcacg gcttatggtg tgctgctttc 1260

cgaacacttt ttcgatcaaa ggaacggcac gctaaggccc cctccctttg ctggcaaacc 1320

cagatcacca cctacccttt cgcttactac aaatacctct ccccacccgc ctcctccatc 1380

cttcttccat ctcctcatcc cgtctaccct tatctatcaa cctccatcaa tctttcatcc 1440

tcaacgtcat ctttccatct ctaaaacaac taaatccatc aaacttaatc cactaagatg 1500

<210>55

<211>1500

<212>DNA

<213>Aspergillus niger

<400>55

tgcgcattga tattcggaga tcgtagggct cgaatttgag agaccaggta gtccctgatt 60

cgttccactg cctacgtagt ttgtcagtcg gtttgtaaag tgaatctata tcggaagcag 120

tacctttttc ttgatatcac ccagtaaagg ccgcacatct tcgatagact tgctactatt 180

ggtgcctgag gccttggcct cgatgctagc cgtccgagtt tcaatctcat tcaaggcctt 240

gacccagttc tcatcaatag gcccctccgc cactaaccgg acggtcttcg gagacaaact 300

gatttcttcc acggcaggac caagcagctg ttcaacattc cgccgattct cgagcatcgc 360

attcagctgt atagaccgag attgcaaact ctcaatttct gccgatacag ctcccaattc 420

attctgaaag tcattcaaat acatttcaac tgacttggag acgtcatcgc agccagtgat 480

tgccgagtgc aggtcctgga atttgtccct ttctttctca aattgctgga tggtctgggc 540

accgacatcg ctttgccaag ctcttcgcgg ttggtcttct tccgcgataa agtcctccag 600

gctgagtcca tgaaaatcaa tgtcttccac gagctccggg ggtttcagtt ccgcgacgga 660

cgctggagag ctgtctcttg ttttgccttg tttcccaatg atcccattca agacttcgag 720

cggatcagcg acatcggatg ggcggggtct tgtagcactc ggttttggcg aggatccttc 780

gcctcgcgca ggcgcagaga gggaggtaga cgaatcattc ggggtcgaca agagagacaa 840

cgctgaacct tggcgactag acgcggggcg attgttctga ggggttggag ccaagcgaga 900

agaggtcctt cgaggcaagg gagagctgct gcgactatcg aattggggac cggagggcgt 960

cgcatggccc gaaatgcggt ctagccacat cttgggaggc cggcacggag aagcgtgcgg 1020

atagcggaga gctccccggg ttcatcgagg ggtgaggtag aggggtgagg gaagttctcc 1080

cagaacacag atgggtactg ggagatgtta cagggcggcg aacattcgag gagatggaga 1140

tcaagaccga gaccaggctg atattgtcga caggagataa ccagtagata actactgcta 1200

ctataatggt taggagtata cgtggaatag caggccgaga tgctacggcg aactgcagca 1260

accgcggacg tggtttgtcc gagactaggc tggactggga ctagcgacca caaaaccccg 1320

ccacaaccag tgcctttttt tcgcagtcca tttgtcgatt tcttttcgcc tgtgtccccc 1380

tcttcgtcct tccttcgctt ttttctcttc cttttcctct aatctcctcc tcaattccaa 1440

catcctcctc acctctccct ttcacttttt acctcatacc ccctaatatc catcaccatg 1500

Claims

1.重组宿主细胞，其包含至少两种DNA构建体，每种DNA构建体包含与启动子DNA序列可操作关联的编码序列，其中，所述至少两种DNA构建体包含至少两种有区别的启动子DNA序列，并且，其中，所述DNA构建体包含的所述编码序列编码相关的多肽。

2.权利要求1的重组宿主细胞，其中，所述至少两种有区别的启动子DNA序列具有有区别的表达特征。

3.权利要求1或2中任意一项的重组宿主细胞，其中，所述至少两种启动子DNA序列中的至少一种选自如下序列构成的组：

(b)能与(a)的所述DNA序列杂交的DNA序列，

(c)与(a)的所述DNA序列共享至少80％同源性的DNA序列

(d)(a)至(c)的所述DNA序列中任何序列的变体，以及

(e)(a)至(d)所述的DNA序列中任何序列的亚序列。

4.权利要求1至3中任意一项的重组宿主细胞，其中，所述宿主细胞是真菌细胞。

5.权利要求4的重组宿主细胞，其中，所述宿主细胞是Agaricus、Aspergillus、Penicillium、Pycnoporus或Trichoderma的物种。

6.权利要求5的重组宿主细胞，其中，所述Aspergillus是Aspergillusniger、Aspergillus sojae、Aspergillus oryzae物种。

7.权利要求1至6中任意一项的重组宿主细胞，其中，所述编码序列编码酶。

8.权利要求1至6中任意一项的重组宿主细胞，其中，所述编码序列编码代谢产物生产中所涉及的酶。

9.制备权利要求1至8中任意一项所述的重组细胞的方法，所述方法包括：

(a)提供至少两种DNA构建体，每种DNA构建体包含与启动子DNA序列可操作关联的编码序列，其中，所述至少两种DNA构建体包含至少两种有区别的启动子DNA序列，并且，其中，所述DNA构建体中包含的所述编码序列编码相关多肽，

(b)提供合适的宿主细胞，并且

(c)用所述DNA构建体转化所述宿主细胞。

10.权利要求9的方法，其中，步骤(c)通过至少两个单独的转化事件来进行。

11.表达编码序列的方法，所述方法包括：

(b)提供合适的宿主细胞，

(c)用所述DNA构建体转化所述宿主细胞，

(d)在有益于所述编码序列表达的条件下培养所述宿主细胞。

12.权利要求11的方法，其中，步骤(c)通过至少两个单独的转化事件来进行。

13.表达编码序列的方法，所述方法包括在有益于表达所述编码序列的条件下培养权利要求1至8中任意一项所述的重组宿主。

14.生产多肽的方法，所述方法包括：

(a)在有益于所述多肽表达的条件下培养下述重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含至少两种DNA构建体，每种DNA构建体包含与启动子DNA序列可操作关联的编码序列，其中，所述至少两种DNA构建体包含至少两种有区别的启动子DNA序列，并且，其中，所述DNA构建体包含的所述编码序列编码相关的多肽，

(b)任选地，从培养基中回收所述多肽，以及

(c)任选地，对所述多肽加以纯化。

15.生产多肽的方法，所述方法包括：

(a)在有益于所述多肽表达的条件下培养权利要求1至8中任意一项所述的重组宿主细胞，

(b)任选地，从培养基中回收所述多肽，以及

(c)任选地，对所述多肽加以纯化。

16.生产代谢产物的方法，所述方法包括：

(a)在有益于所述代谢产物生产的条件下培养权利要求8的重组宿主细胞，

(b)任选地，从培养基中回收所述代谢产物，以及

(c)任选地，对所述代谢产物加以纯化。