BR112015027327B1 - Composto, modulador de cgas, composição farmacêutica compreendendo o referido composto ou modulador - Google Patents

Composto, modulador de cgas, composição farmacêutica compreendendo o referido composto ou modulador Download PDF

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Winfried Barchet
Thomas Zillinger
Roger Jones
Pu Gao
Dinshaw J. Patel
Manuel Ascano
Yang Wu
Yizhou Liu
Gunther Hartmann
Barbara L. Gaffney
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Rutgers, The State University Of New Jersey
The Rockefeller University
Memorial Sloan-Kettering Cancer Center
University Of Bonn
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Abstract

COMPOSTO, MODULADOR DE CGAS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO O REFERIDO COMPOSTO OU MODULADOR E MÉTODOS IN VITRO PARA A INIBIÇÃO DA CGAS OU STING E PARA PROJETAR OU TIPIFICAR UM MODULADOR DA CGAS. A presente invenção refere-se a composições, métodos, kits e ensaios relativos ao uso e/ou à exploração de isômeros de cGAMP, assim como a estrutura da enzima cGAS.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] A presente invenção reivindica prioridade aos pedidos provi sórios de patente dos Estados Unidos 61/817.269, depositado em 29 de abril de 2013, e 61/819.369, depositado em 3 de maio de 2013, cujo conteúdo completo de cada um está aqui incorporado por referência.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0002] A importância de dinucleotídeos cíclicos como mensageiros secundários bacterianos está bem estabelecida, com di-GMP cíclico (c-di-GMP) agora reconhecido como um mensageiro secundário bacte- riano universal. Foi demonstrado que esta molécula versátil desempenha papéis importantes no ciclo celular e na diferenciação, motilidade e virulência, bem como na regulação da formação de biofilme e dispersão. Avanços na compreensão do c-di-GMP surgiu com a identificação, caracterização estrutural, e compreensão mecanística das atividades catalíticas das enzimas bacterianas responsáveis pela síntese e degradação deste mensageiro secundário. As estruturas cristalinas do c-di-GMP no estado livre e quando ligado a enzimas responsáveis por pela sua síntese e degradação mostraram que este mensageiro secundário pode adotar tanto pregas monoméricas ou diméricas bis- intercaladas. Parece que a formação de c-(3',5')-di-GMP a partir de duas moléculas de GTP ocorre através de uma reação em duas etapas e da formação de ligações 3',5'-fosfodiéster, com duas moléculas de pirofosfato como subprodutos da reação de ciclização. Além disso, foram identificados vários receptores-alvo do c-(3',5')-di-GMP e diversas formas que as bactérias sinalizam através deste mensageiro secundário. Na verdade, o campo de estudo do c-di-GMP como um mensageiro secundário tem crescido imensamente e produziu grandes avanços em nossa compreensão da fisiologia e dos mecanismos de sinalização dos dinucleotídeos cíclicos bacterianos ao longo das últimas duas décadas e meia. Em estudos paralelos, riboswitches especí- ficos do c-(3',5')-di-GMP também foram identificados, incluindo aqueles que estão envolvidos no splicing do RNA induzido pelos dinucleotídeos cíclicos.
[0003] Há muito interesse atualmente para se obter uma compre ensão molecular e funcional de sensores da imunidade inata de meta- zoários superiores que reconhecem ácidos nucleicos no citoplasma e desencadeiam a indução pelo interferon tipo I. dsDNA citoplasmático de origem bacteriana ou viral patogênica, e talvez também DNA nuclear ou mitocondrial deslocado após estresse celular, representam tais gatilhos. Estes eventos envolvendo o reconhecimento do ácido nuclei- co próprio, por sua vez, poderia desencadear doenças autoimunes, como lúpus eritematoso sistêmico e síndrome de Sjogren. De fato, nos últimos anos, muitos sensores de DNA citoplasmático foram identificados, incluindo DAI (ativador dependente de DNA do fator regulador de IFN), LRRFIP1 (proteína 1 de interação com o domínio de repetição rico em leucina em Flightless I), DDX41 (polipeptídeo 41 de DEAD-box), e membros da família HIN-200 (proteínas nucleares induzíveis por interferon hematopoiético), tais como AIM2 (ausentes no melanoma 2) e IFI16 (proteína 16 induzível por interferon). Informações moleculares estão disponíveis na família do domínio HIN tal como refletido nas estruturas de seus complexos com dsDNA. Um requisito para vários sensores pode ser um reflexo das atividades específicas do tipo celular diferenciado. A detecção citoplasmática de dsDNA ativa genes estimuladores do interferon (STING) no citoplasma que, por sua vez, inicia uma cascata de eventos primeiramente ativando as quinases IKK (IKB quinase) e TBK1 (quinase 1 de ligação a TANK), levando à fosforilação e ativação da fatores de transcrição NF-KB (fator nuclear KB) e IRF3 (fator regulador de interferon). Estes fatores de transcrição fosforilados são translocados para o núcleo para se direcionar aos genes imunes e inflamatórios levando à produção de citocinas e interferons tipo I, desencadeando assim a resposta imune do hospedeiro. Portanto, existe uma necessidade de agentes terapêuticos para modular a indução do interferon e outros componentes relevantes nestas vias.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0004] A presente invenção apresenta, entre outras coisas, novos análogos, imitadores, miméticos e variantes de GMP-AMP cíclico (cGAMP), tal como descritos mais detalhadamente abaixo. Estes compostos e composições de cGAMP são, entre outras coisas, úteis na elaboração de ferramentas de pesquisa, como uma ferramenta de pesquisa, e como modalidades terapêuticas, tais como moduladores enzimáticos, incluindo agonistas e antagonistas de cGAS. A presente invenção também apresenta dados cristalográficos para a GMP-AMP cíclico sintase (cGAS). Estes dados cristalográficos apresentam a base para a qual os moduladores são elaborados (agonistas e antagonistas), tais como compostos cGAMP ou pequenas moléculas, que são úteis nos campos da pesquisa, terapêutica e/ou diagnóstico.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0005] Figura 1A-H. Estruturas da cGAMP sintase (cGAS) no Es tado Livre e Ligada ao dsDNA. (A) Estrutura cristalina de 2,0 Â de cGAS no estado livre. A estrutura da proteína em uma representação em fita está colorida em cinza claro. (B) Estrutura cristalina de 2,1 Â de cGAS ligada a um DNA duplo complementar de 16 pb (com uma base sobreposta em 5' de cada extremidade). A proteína e o DNA estão coloridos em cinza escuro no complexo binário. (C) Um esquema de pontes de hidrogênio intermoleculares no complexo cGAS-DNA binário. (D) Estruturas sobrepostas de cGAS no estado livre (cinza claro) e no complexo cGAS-DNA (cinza escuro). (E, F) Grandes alterações dentro dos segmentos de β-sheet (painel E) e sítio catalítico (painel F) provenientes da cGAS no estado livre (cinza claro) para o complexo binário com DNA ligado (cinza escuro). (G) Entrada estreita para o sítio catalí- tico na estrutura de cGAS no estado livre, com a proteína em uma re-presentação eletrostática. (H) Entrada ampliada para o sítio catalítico na estrutura do complexo DNA-cGAS binário.
[0006] Figura 2A-H. Estrutura do complexo ternário de cGAS, dsDNA e ATP. (A) Estrutura cristalina de 2,4 Â do complexo ternário de cGAS ligado ao dsDNA e ATP. A proteína e o dsDNA são mostrados na fita, com ATP ligado em uma representação de preenchimento de espaço. (B) Estruturas sobrepostas do complexo binário de cGAS e DNA e o complexo ternário com ATP adicionado. (C, D) Ausência de alterações na estrutura dentro dos segmentos de β-sheet (painel C) e do sítio catalítico (painel D) provenientes do complexo binário de cGAS e dsDNA para o complexo ternário com ATP adicionado. (E, F) Duas visões alternativas de contatos intermoleculares entre ATP e de resíduos do sítio catalítico no complexo ternário. Dois cátions são mostrados como esferas, com pontes de hidrogênio mostradas por linhas tracejadas. (G) Mapa de densidade de elétrons 2Fo-Fc contornado em 1,2a (cinza claro) e mapa de Fo-Fc contornado em 3,0a (cinza escuro) do ATP ligado, par de cátions e resíduos de coordenação no sítio catalítico. Este mapa contém alguma densidade de elétrons fraca inexpli- cada (cinza escuro). (H) Visão do ATP ligado em uma representação de preenchimento de espaço dentro do sítio catalítico, com a proteína em uma representação eletrostática.
[0007] Figura 3A-H. Estrutura do complexo ternário de cGAS, dsDNA com Produtos Ligados 5'-pppG(2',5')pG e 5'-pG(2',5')pA. (A) Estrutura cristalina de 1,9 Â do complexo ternário de cGAS ligado ao dsDNA e 5'-pppG(2',5')pG. A proteína e o DNA são mostrados na fita, com 5'-pppG(2',5')pG ligado em uma representação de preenchimento de espaço. (B, C) Duas visões alternativas de contatos intermolecula- res entre 5'-pppG(2',5')pG e resíduos do sítio catalítico no complexo ternário. Dois cátions são mostrados como esferas, com pontes de hi- drogênio mostradas por linhas tracejadas. (D) Mapa de densidade de elétrons 2Fo-Fc contornados em 1,2α do 5'-pppG(2',5')pG ligado no sítio catalítico do complexo ternário. (E) Visão do 5'-pppG(2',5')pG ligado em uma representação de preenchimento de espaço no interior do sítio catalítico, com a proteína em uma representação eletrostática. (F, G) Duas visões alternativas de contatos intermoleculares entre 5'- pG(2',5')pA e resíduos do sítio catalítico no complexo ternário de 2,3 Â de cGAS, dsDNA e GMP + ATP. (H) Sobreposição das estruturas do 5'-pppG(2',5')pG (cinza escuro) e 5'-pG(2',5')pA (cinza claro) ligados.
[0008] Figura 4A-H. Estrutura do complexo ternário de cGAS, DNA com Produto Ligado c[G(2',5')pA(3',5')p]. (A) Estrutura cristalina de 2,3 Â do complexo ternário de cGAS ligado ao dsDNA e produto c[G(2',5')pA(3',5')p]. A proteína e o DNA são mostrados na fita, com produto ligado c[G(2',5')pA(3',5')p] em uma representação de preenchimento de espaço. (B, C) Duas visões alternativas de contatos in- termoleculares entre o produto c[G(2',5')pA(3',5')p] e resíduos do sítio catalítico no complexo ternário. (D) Mapa de densidade de elétrons 2Fo-Fc contornado em 1,2α do c[G(2',5')pA(3',5')p] ligado no sítio catalítico do complexo ternário. (E) Visão do c[G(2',5')pA(3',5')p] ligado em uma representação de preenchimento de espaço posicionado em direção à extremidade do sítio catalítico, com a proteína em uma representação eletrostática. (F) Uma visão do c[G(2',5')pA(3',5')p] destacando a ligação 2',5' na etapa GpA e a ligação 3',5' na etapa ApG. (G) Empilhamento do resíduo G do 5'-pG(2',5')pA em Tyr 421 no seu complexo ternário com cGAS e dsDNA. (H) Empilhamento do um resíduo A do c[G(2',5')pA(3',5')p] em Tyr 421 no seu complexo ternário com cGAS e dsDNA.
[0009] Figura 5A-D. Caracterização da formação de c[G(2',5')pA(3',5')p] pela cGAS. A geração de c[G(2',5')pA(3',5')p] e produtos lineares e intermediários foi avaliada por cromatografia em camada delgada (TLC) utilizando cGAS recombinante truncada purificada (painel A, aminoácidos 147-507, utilizada em estudos de cristalização) e cGAS de comprimento completo (painéis B-D, aminoácidos 1-507). As linhas curtas e longas tracejadas indicam a origem e as frentes de solvente, respectivamente. (A) Um dsDNA de 45 nt foi incubado com cGAS (x-y) em tampão de reação contendo cátion bivalente indicado (ou EDTA) e α32p-ATP e -GTP. cGAMP quimicamente sintetizado contendo ambas as ligações 3',5' foi corado em todas as amostras e a sua migração, visualizada por UV, é indicada (linhas tracejadas). (B) cGAS foi incubada com fita simples (ss) ou dupla (ds) de DNA, RNA, duplex DNA/RNA, ou DNA modificado com 8-oxoguanina (8-O-G) de sequência semelhante e a formação de c[G(2',5')pA(3',5')p] foi monitorada utilizando α32p-ATP. (C) Adenosina e guanosina mono- e di-fosforiladas foram utilizadas como substratos para determinar a ordem da formação de c[G(2',5')pA(3',5')p]. Espécies intermediárias 2',5'-ligadas migram lentamente quando cGAS e dsDNA são incubados com α32p-ATP e GMP (5'-pGpA) ou GDP (5'-ppGpA). (D) Interme-diários da reação de cGAMP dependente de dsDNA foram visualizados usando 2' ou 3' dATP e dGTP. Espécies intermediárias de migração lenta, correspondendo a pppGpA (linha 1) ou pppGpdA (linhas 2 e 3), são vistas ao alterar a composição da fase móvel da TLC. Espécies intermediárias foram confirmadas usando Y32P-GTP.
[00010] Figura 6A-C. Identificação definitiva de c[G(2',5')pA(3',5')p] como o produto enzimático da cGAS. (A) Cromatogramas em UV 260 nm de GTP, ATP, c[G(2',5')pA(2',5')p], c[G(3',5')pA(3',5')p], c[G(2',5')pA(3',5')p] e soluções da reação de cGAS (rxn, asterisco) a partir de análises de HPLC de fase reversa. Amostras de reação de cGAS foram injetadas isoladamente ou com adição de padrões de referência indicados. A região sombreada mostra o tempo de retenção correspondente à eluição de c[G(2',5')pA(3',5')p]. (B) Cromatogramas em UV 260 nm a partir de análise de HPLC do produto da cGAS obtido a partir de cristais dissolvidos quando injetado isoladamente (traçado superior), ou coinjetados com o composto de referência c[G(2',5')pA(2',5')p] (traçado intermediário). Picos adicionais não identificados estavam presentes na solução de cristal dissolvido, mas eluí- ram posteriormente. Os três compostos de referência de cGAMP foram coinjetados devido a uma alteração (0,5 s) no tempo de retenção de c[G(2',5')pA(3',5')p] como um resultado da aplicação da solução de cristais dissolvidos à coluna. (C) Espectros RMN da região do próton H1' do açúcar de três compostos de referência cGAMP sintetizados quimicamente com a cGAS rxn em D2O a 99,9% em tampão K2HPO4- KH2PO4 10 mM (pH 6,6). O espectro RMN da cGAS rxn corresponde ao composto de referência c[G(2',5')pA(3',5')p]. O próton H1' é um du- pleto (3JHH = 9 Hz), quando o fosfato está ligado à posição 2', mas um singleto quando o fosfato está ligado à posição 3', refletindo as diferentes pregas do anel de açúcar de cinco membros dependendo da posição do grupo fosfato ligado.
[00011] Figura 7A-D. Análise funcional de mutantes da cGAS e do modelo da geração em duas etapas de c[G(2',5')pA(3',5')p]. (A) Níveis de formação de c[G(2',5')pA(3',5')p] pela cGAS wt de comprimento completo e dos mutantes indicados foram comparadas por análise em TLC. As linhas curtas e longas tracejadas indicam a origem e as frentes de solvente, respectivamente. (B, C) Os vetores de expressão da cGAS WT murina, ou portadores de mutações isoladas e múltiplas de alanina dos resíduos de ligação ao DNA (painel B) e catalíticos (painel C) foram transitoriamente transfectados em células HEK 293 juntamente com um repórter IFN-β Gluc, e plasmídeos de expressão constitutiva de STING e luc de vaga-lume. Neste cenário, a cGAS expressa está envolvida no citoplasma pelos plasmídeos de DNA cotransfecta- dos. Os valores de Gluc foram determinados em triplicata, 36 horas após a transfecção, normalizados para a luc de vaga-lume, e são apresentados como vezes de indução em relação ao plasmídeo controle (como média ± s.e.m.). Os dados nos painéis B e C são representativos de 3 - 5 experimentos independentes para cada mutante. (D) Uma representação esquemática de um modelo proposto associado à geração em duas etapas de c[G(2',5')pA(3',5')p] dentro do único sítio catalítico da cGAS. Neste modelo, a primeira etapa envolve a formação de um intermediário 5'-pppGpA seguida pela formação de c[G(2',5')pA(3',5')p]. Deve-se observar ainda que se acredita que o li- gante ligado seja submetido a duas transições flip na via para a formação de c[G(2',5')pA(3',5')p].
[00012] Figura S1A-C. Alinhamento de sequência e estrutura cristalina da cGAS no estado livre e comparação com OAS1 humana. (A) Alinhamento de sequência da cGAS de camundongos e humana (construção usada para estudos estruturais) que abrange os aminoá- cidos 147-507 (extremidade C-terminal). Os supostos resíduos catalíticos estão indicados nas caixas. (B) Duas visões alternativas da estrutura da cGAS no estado livre. A estrutura da proteína é mostrada uma representação em fita e colorida em cinza claro. (C) Visão estéreo de estruturas sobrepostas da cGAS (cinza claro) e oligoadenilato sinte- tase 1 humana (OAS1) (preto; PDB: 1PX5) no estado livre. O r.m.s.d entre as estruturas é de 4,1 Â.
[00013] Figura S2A-F. Características de reconhecimento molecular na estrutura da cGAS ligada ao dsDNA e comparação com hOAS1 ligada ao dsRNA e 2'-dATP. (A, B) Exemplos de contatos intermolecu- lares entre cGAS e dsDNA. As moléculas de água são apresentadas como esferas pretas, e as pontes de hidrogênio são indicadas por linhas tracejadas. Observa-se uma ponte de hidrogênio específica da sequência entre a cadeia lateral da Argl61 e o O2 carbonila de T8, como mostrado no painel B. (C, D, E) Os exemplos de alterações con- formacionais provenientes da cGAS no estado livre (cinza claro) para o complexo binário com dsDNA ligado (cinza). Uma alteração de 5,1 Â é observada no segmento de β-sheet na formação do complexo (painel C). Uma longa a-hélice é quebrada em dois segmentos, com um segmento se movendo em direção ao dsDNA na formação do complexo, incluindo a cadeia lateral da Argl61, que se move em 9,2 Â (painel D). Vários resíduos de Tyr e Lys dentro de segmentos em alça alternam entre 6,7 e 17,6 Â na formação do complexo (painel E). (F) Visão estéreo das estruturas sobrepostas dos componentes proteicos da cGAS no estado de dsDNA ligado (cinza claro) e OAS1 no estado de dsRNA ligado mais 2'-dATP (preto, PDB: 4IG8). O r.m.s.d. entre as estruturas é de 3,2 Â. O dsDNA ligado à cGAS e o dsRNA ligado à OAS1 são omitidos da representação, para maior clareza.
[00014] Figura S3A-I. Estrutura da cGAS com 5'-pppG(2',5')pG no sítio catalítico de seu complexo ternário formada após cristalização com GTP. (A) Estruturas sobrepostas do complexo binário de cGAS com DNA (cinza) e o complexo ternário com produto intermediário 5'- pppG(2',5')pG ligado (cinza escuro). (B, C) Mudanças mínimas são observadas na estrutura dentro dos segmentos de β-sheet (painel B) e sítio catalítico (painel C) provenientes do complexo binário para o complexo ternário com 5'-pppG(2',5')pG ligado. (D) Duas visões alternativas do 5'-pppG(2',5')pG ligado no sítio catalítico do complexo ternário. Cátions Mg2+ são mostrados como esferas. Observa-se que o alinhamento do ligante ligado é 5'-pppG(syn)p(2',5')pG(anti). (E) Duas visões alternativas do mapa de densidade de elétrons de omissão Fo- Fc contornado em 3,0α do 5'-pppG(2',5')pG ligado no sítio catalítico do complexo ternário. (F) Duas visões alternativas das estruturas sobrepostas do 5'-pppG(2',5')pG ligado (cinza) e ATP (cinza escuro) em seus respectivos complexos ternários com cGAS e dsDNA. (G) Mapa de omissão registrado em 4a identificando dois cátions ligados na es- trutura do complexo ternário. (H, I) Geometria de coordenação octaé- drica em torno dos dois cátions ligados na estrutura do complexo ternário.
[00015] Figura S4A-F. Estrutura da cGAS e c[G(2',5')pA(3',5')p] ligado no sítio catalítico do complexo ternário formado após cristalização com GTP + ATP. (A) Estruturas sobrepostas do complexo binário de cGAS e DNA (cinza) e o complexo ternário com GTP + ATP adicionado para o qual o produto ligado é c[G(2',5')pA(3',5')p] (cinza escuro) obtidas a partir da cristalização com ATP e GTP. (B, C) Não ocorreram alterações conformacionais na estrutura dentro dos segmentos de β- sheet (painel B) e sítio catalítico (painel C) provenientes do complexo binário para o complexo ternário com c[G(2',5')pA(3',5')p] ligado. (D) Duas visões alternativas do produto ligado cGAMP no sítio catalítico do complexo ternário. Observa-se que o ligante ligado c[G(2',5')pA(3',5')p] revelou uma ligação 2',5'-fosfodiéster na etapa de GpA. Com base na comparação por HPLC, a estrutura de c[G(2',5')pA(3',5')p] é mostrada com uma ligação 3',5' na etapa de ApG. Ambos os resíduos G e A adotam alinhamentos anti nas suas ligações glicosídicas. (E) Duas visões alternativas do mapa de densidade de elétrons Fo-Fc de omissão contornado em 3,0α de c[G(2',5')pA(3',5')p] ligado no sítio catalítico do complexo ternário. (F) Duas visões alternativas das estruturas sobrepostas de c[G(2',5')pA(3',5')p] ligado (cinza) e ATP (cinza escuro) nos seus respectivos complexos ternários com cGAS e dsDNA.
[00016] Figura S5A-C. Condições da cromatografia em camada delgada (TLC) para monitoramento da formação de cGAMP. (A, B) Os nucleotídeos indicados foram aplicados em placas de gel de sílica da TLC de alto desempenho, resolvidos por vários sistemas de solventes, e visualizados por luz UV. Duas condições de fase móvel foram usadas (A e B). O sistema de solvente 1 foi utilizado na maioria dos expe- rimentos para a detecção de c[G(2',5')pA(3',5')p], ao passo que o solvente 2 foi utilizado para uma melhor separação dos intermediários lineares mono- e tri-fosforilados. As linhas tracejadas indicam as frentes dos solventes. (C) Valores de Rf calculado.
[00017] Figura S6A-E. Exigências de comprimentos e nucleotídeos de dsDNA da atividade da cGAS. (A) cGAS de comprimento completo foi incubada com quantidades equimolares ou normalizadas por massa de dsDNA de 16, 36 ou 45 nt e, posteriormente, testada para a formação de cGAMP. As linhas curtas e longas tracejadas nos painéis A-C indicam a origem e as frentes dos solventes, respectivamente. (B) cGAS truncada (tr) e de comprimento completo (fl) foi incubada com 45 pb de dsDNA em tampão de reação contendo os vários nucleotí- deos indicados. cGAS (tr) apresenta atividade, embora menos do que cGAS (fl). c[G(2',5')pA(3',5')p] se forma usando 2'-dATP, quando 2'- dATP ou GTP foram marcados radioativamente, mas não quando 2'- dGTP foi usado. 2'-dATP com 2'-dGTP não resultou em c[G(2',5')pA(3',5')p], indicando que o bloqueio das posições 2' OH na adenosina e, mais importantemente, na guanosina impediu a produção de c[G(2',5')pA(3',5')p]. Os asteriscos (*) indicam quais nucleotídeos foram suplementados com uma forma marcada radioativamente com α32p. dNTP indica o 2'-desoxinucleotídeo trifosforilado. (C) cGAS de comprimento completo foi incubada em tampão de reação contendo dsDNA e a combinação indicada de ribonucleotídeos, em seguida, analisadas por TLC. Quantidades residuais do produto cíclico foram formadas após a incubação de α32p-ATP com UTP, ou α32p-GTP com GTP, CTP e UTP. A formação ideal do produto requer GTP e ATP. O baixo nível de formação de produtos cíclicos com UTP e ATP, mas não com ATP isolado, sugere que UTP pode ser acomodado no sítio de ligação ao GTP, porém com afinidade e/ou atividade reduzidas. As migrações de todos os produtos estão de acordo com a formação de dinucleotídeos cíclicos. (D) Análise por HPLC da geração do c[G(2',5')pA(3',5')p] pela cGAS dependente de dsDNA ao longo do tempo. Uma única reação da cGAS foi iniciada e as amostras foram analisadas por HPLC nos momentos indicados. (E) Os resíduos altamente conservados G198 e S199 foram mutados para alanina, ou G198 para prolina para reduzir a flexibilidade estérica. Os plasmídeos de expressão para cGAS mutante e WT foram transitoriamente trans- fectados em células HEK 293 juntamente com um repórter IFN-β Gluc, e plasmídeos de expressão constitutiva de STING e luc de vaga-lume. Os valores de Gluc foram determinados em triplicata, 36 horas após a transfecção, normalizados para a luc de vaga-lume, e estão apresentados como vezes de indução em relação ao plasmídeo controle (como média ± s.e.m.). Os dados são representativos de 3 experimentos independentes para cada mutante.
[00018] Figura S7. Sínteses de isômeros de cGAMP. Síntese de cGAMP contendo ligações 2',5' em ambas as etapas de GpA e ApG (6) (painel acima). Síntese de cGAMP contendo ligações 2',5' na etapa de GpA e 3',5' na etapa de ApG (11) (painel do meio). Síntese de cGAMP contendo ligações 3',5' ligações em ambas as etapas de GpA e ApG (15) (painel abaixo).
[00019] Figura S8A-D. Atribuições de ressonância de c[G(2',5')pA(3',5')p] a partir de espectros de RMN bidimensional HMBC, COSY e HSQC. (A) Espectro HMBC mostrando correlações entre compostos aromáticos e o açúcar CI'-HI'. (B) Espectro HMBC mostrando correlações dentro dos anéis de açúcar. Em (A) e (B), as correlações no interior da base guanina estão conectadas por linhas sólidas e as atribuições são especificadas nas margens superior e esquerda para prótons e carbonos, respectivamente, enquanto as correlações dentro da base adenina estão conectadas por linhas tracejadas e as atribuições são especificadas sobre as margens inferior e direita para prótons e carbonos, respectivamente; os grandes acoplamentos C-H 1-ligados não suprimidos são indicados por linhas azuis conectando os pares acoplados de sinais. (C) Espectro COSY filtrado por quantum duplo. As correlações da guanina estão conectadas por linhas sólidas e as ressonâncias estão marcadas nos picos transversais acima da diagonal; as correlações da adenina estão conectadas por linhas tracejadas e as ressonâncias estão marcadas nos picos transversais abaixo da diagonal. (D) Espectro HSQC dos compostos alifáti- cos resumindo atribuições de prótons e carbonos do açúcar. Veja também a Figura 6C e a Tabela S4.
[00020] Figura S9. Indução dependente de STING do interferon- alfa murino e CXCL10 humano por compostos cGAMP. As atividades biológicas dependentes da dose dos isômeros de cGAMP indicados foram medidas por ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA), quantificando a indução do interferon α murino endógeno (m-IFNα) ou proteínas CXCL10 humanas (H-CXCL10). (A-B) Macrófagos derivados de medula óssea de camundongos (BMDM) foram tratados primeiramente com digitonina (Dig) para permeabilizar a membrana plasmática antes da adição de cGAMP (A) ou isômeros de cGAMP foram passivamente entregues às células através da adição de meio de cultura (B). (C) A ativação de cGAMP também foi medida em células THP-1 humanas. Os dados são representativos de 2 experimentos independentes, cada um realizada em triplicata (barras de erro, s.e.m.). (D) Os valores da metade da concentração máxima eficaz (EC50) foram estimados com base em curvas sigmoidais de dose-resposta 4- paramétricas; faixas do intervalo de confiança (CI) de 95% são apresentadas.
[00021] A Figura S10 é um exemplo de diagrama de blocos de um dispositivo computadorizado e um dispositivo computadorizado portátil.
[00022] A Figura S11 é um exemplo de diagrama de blocos de um ambiente de rede para estabelecer um ambiente de comunicação ciente do contexto de múltiplos canais.
DESCRIÇÃO DETALHADA DE CERTAS MODALIDADES
[00023] Foi demonstrado que os genes VSP-1 (ilha de pandemia 1 do Vibrio 7°) codificam uma nova classe de dinucleotídeo ciclases, que preferencialmente sintetizam uma molécula de GMP-AMP cíclico (designado como cGAMP), expandindo assim nosso horizonte para os GA-dinucleotídeos cíclicos (Davies et al. 2012). Mais recentemente, a GMP-AMP cíclico sintase (cGAS, símbolo oficial do gene humano MB21D1) foi identificada como um sensor de DNA citoplásmico que ativou a via do interferon tipo I através da síntese do mensageiro secundário cGAMP (Sun et al. 2013; Wu et al. 2013). cGAS mostrou ser um membro da família da nucleotidiltransferase, e ser capaz de gerar um cGAMP in vitro a partir de GTP e ATP na presença de dsDNA (mas não dsRNA), enquanto que cGAMP quimicamente sintetizado contendo um par de ligações 3',5' revelou estimular a produção de interferon em células THP1 e Raw264.7 em concentrações tão baixas quanto 10 nM. Os autores também demonstraram por meio de experimentos que envolvem a superexpressão ou knockdown de cGAS que o cGAMP sintético ligava-se a e ativava STING, resultando na ativação do fator de transcrição IRF3 e na subsequente indução do interferon (Sun et al. 2013; Wu et al. 2013).
[00024] Um pressuposto fundamental nestes estudos sobre cGAS foi que cGAMP continha um par de ligações 3',5' (Sun et al. 2013; Wu et al. 2013), em conformidade com aquelas descritas anteriormente para o c-di-GMP em sistemas bacterianos, como descrito acima. A presente invenção engloba o reconhecimento de que a estrutura anteriormente atribuída de cGAMP por Sun e Wu estava incorreta. Assim, um aspecto da presente invenção é a identificação do problema anteriormente desconhecido dos erros de identificação da estrutura do cGAMP. A presente divulgação combina ensaios celulares estruturais, químicos, in vitro, bioquímicos e in vivo para estabelecer inequivocamente que este mensageiro secundário contém inesperadamente ligação 2',5' na etapa de GpA e ligação 3',5' na etapa de ApG {designado por C[G(2',5')pA(3',5')p]}, identificando assim de forma correta e pela primeira vez o membro fundador de uma família nova de mensageiros secundários de metazoários que regulam a indução do interferon tipo I em resposta ao DNA citoplasmático.
[00025] Em certas modalidades, a presente invenção apresenta compostos compreendendo GA-dinucleotídeos cíclicos [c[G(2',5')pA(3',5')p] contendo uma ligação 2',5' (na etapa de GpA). Em algumas modalidades, tais compostos são úteis para o estudo da sinalização celular e vigilância imunitária em metazoários. Em algumas modalidades, tais compostos são úteis para o tratamento, diagnóstico ou profilaxia de distúrbios, doenças ou condições na medicina. Em algumas modalidades, tais compostos são úteis para modular alvos envolvidos na resposta imune. Em algumas modalidades, os compostos e/ou composições da presente invenção são úteis como ferramentas e/ou reagentes de pesquisa, particularmente em kits e ensaios para pesquisa biológica ou química.
[00026] A presente invenção também apresenta dados cristalográfi- cos úteis na elaboração de moduladores da cGAS. Em certas modalidades, a invenção apresenta moduladores da cGAS que englobam características para formar interações apropriadas de ligação com cGAS. Em algumas modalidades, tais moduladores de compreender características que formam interações apropriadas de ligação, com alvos que se ligam ao cGAMP.
Definições
[00027] Os compostos da presente invenção incluem aqueles descritos em geral acima, e são ainda ilustrados pelas classes, subclasses e espécies aqui reveladas. Tal como aqui utilizado, as seguintes definições aplicam-se, salvo indicação em contrário. Para os fins desta invenção, os elementos químicos são identificados de acordo com a Tabela Periódica de Elementos, versão CAS, Handbook of Chemistry and Physics, 75th Ed. Além disso, os princípios gerais da química orgânica são descritos em "Organic Chemistry", Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999, e "March's Advanced Organic Chemistry", 5th Ed., Ed.: Smith, M.B. and March, J., John Wiley & Sons, New York: 2001, cujo conteúdo completo está aqui incorporado por referência.
[00028] As abreviações aqui utilizadas têm seu significado convencional nas artes químicas e biológicas. As estruturas e fórmulas químicas aqui apresentadas são construídas de acordo com as regras padrão de valência química conhecida nas artes químicas.
[00029] Salvo indicação em contrário, as estruturas aqui ilustradas pretendem também incluir todas as formas isoméricas (por exemplo, enantioméricas, diastereoméricas e geométricas (ou conformacionais)) da estrutura; por exemplo, as configurações R e S para cada centro assimétrico, isômeros Z e E de ligação dupla, e isômeros conformaci- onais Z e E. Portanto, os isômeros estereoquímicos individuais, bem como misturas enantioméricas, diastereoméricas e geométricas (ou conformacionais) dos presentes compostos estão dentro do âmbito da invenção. Salvo indicação em contrário, todas as formas tautoméricas dos compostos da invenção estão dentro do âmbito da invenção. Além disso, salvo indicação em contrário, as estruturas aqui ilustradas também pretendem incluir compostos que diferem apenas na presença de um ou mais átomos enriquecidos isotopicamente. Por exemplo, compostos possuindo as presentes estruturas, incluindo a substituição de hidrogênio por deutério ou trítio, ou a substituição de um carbono por um carbono enriquecido com 13C ou 14 C estão dentro do âmbito da presente invenção. Tais compostos são úteis, por exemplo, como ferramentas analíticas, como sondas em ensaios biológicos, ou como agentes terapêuticos de acordo com a presente invenção.
[00030] Os compostos apresentados podem compreender uma ou mais frações sacarídicas. Salvo especificação em contrário, ambas as configurações D e L, e suas misturas, estão dentro do âmbito da descrição. Salvo especificação em contrário, ambas as modalidades α- e β-ligadas, e suas misturas, estão contempladas pela presente descrição.
[00031] Se, por exemplo, um enantiômero particular de um composto da presente invenção for desejado, este pode ser preparado por síntese assimétrica, cromatografia quiral, ou por derivação com um auxiliar quiral, onde a mistura diastereomérica resultante é separada e o grupo auxiliar é clivado para fornecer os enantiômeros puros desejados. Alternativamente, onde a molécula contiver um grupo funcional básico, tal como amino, ou um grupo funcional ácido, tal como carboxi- la, os sais diastereoméricos são formados com um ácido ou base oticamente ativo apropriado, seguido pela resolução dos diastereômeros assim formados por cristalização fracionada ou meios cromatográficos bem conhecidos na técnica, e subsequente recuperação dos enantiô- meros puros.
[00032] O termo "acila", tal como aqui utilizado, representa um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila (por exemplo, um grupo haloal- quila), tal como aqui definido, que está ligado ao grupo molecular parental através de um grupo carbonila, tal como aqui definido, e é exemplificado por formila (isto é, um grupo carboxaldeído), acetila, propionila, butanoila e semelhantes. Exemplos de grupos acila não substituídos incluem de 1 a 7, de 1 a 11, ou de 1 a 21 átomos de carbono. Em algumas modalidades, o grupo alquila é ainda substituído por 1, 2, 3 ou 4 substitutos, tais como aqui descritos.
[00033] O termo "alifático" ou "grupo alifático", tal como aqui utilizado, significa uma cadeia linear (ou seja, não ramificada) ou ramificada, cadeia de hidrocarboneto substituído ou não substituído que está completamente saturada ou que contém uma ou mais unidades de in- saturação, ou um hidrocarboneto monocíclico ou hidrocarboneto biclí- cico que está completamente saturado ou que contém uma ou mais unidades de insaturação, mas que não é aromático (também aqui referido como "carbociclo", "cicloalifático" ou "cicloalquila"), que possui um único ponto de fixação ao resto da molécula. Salvo especificação em contrário, os grupos alifáticos contêm 1-6 átomos de carbono alifático. Em algumas modalidades, os grupos alifáticos contêm 1-5 átomos de carbono alifático. Em algumas modalidades, os grupos alifáticos contêm 1-4 átomos de carbono alifático. Em algumas modalidades, os grupos alifáticos contêm 1-3 átomos de carbono alifático, e ainda em outras modalidades, os grupos alifáticos contêm 1-2 átomos de carbono alifático. Em algumas modalidades, "cicloalifático" (ou "carbociclo" ou "cicloalquila") refere-se a um hidrocarboneto C3-C6 monocíclico que está completamente saturado ou que contém uma ou mais unidades de insaturação, mas que não é aromático, que possui um único ponto de fixação ao resto da molécula. Grupos alifáticos adequados incluem, entre outros, grupos alquila, alquenila, alquinila e seus híbridos, lineares ou ramificados, substituídos ou não substituídos, tais como (ciclo- alquila)alquila, (cicloalquenila)alquila ou (cicloalquila)alcenila.
[00034] O termo "heteroátomo" significa um ou mais de oxigênio, enxofre, nitrogênio, fósforo ou silício (incluindo qualquer forma oxidada de nitrogênio, enxofre, fósforo ou silício; a forma quaternizada de qualquer nitrogênio básico ou; um nitrogênio substituível de um anel hete- rocíclico, por exemplo, N (como em 3,4-di-hidro-2 H-pirrolila), NH (como em pirrolidinila) ou NR+ (como em pirrolidinila N-substituído)).
[00035] O termo "insaturado", tal como aqui utilizado, significa que uma fração possui uma ou mais unidades de insaturação.
[00036] O termo "alquila", tal como aqui utilizado, refere-se aos radicais de hidrocarboneto saturado, de cadeia linear ou ramificada derivados de uma fração alifática contendo entre um e seis átomos de carbono pela remoção de um único átomo de hidrogênio. Salvo especificação em contrário, os grupos alquila contêm 1-12 átomos de carbono. Em certas modalidades, os grupos alquila contêm 1-8 átomos de carbono. Em certas modalidades, os grupos alquila contêm 1-6 átomos de carbono. Em algumas modalidades, os grupos alquila contêm 1-5 átomos de carbono, em algumas modalidades, os grupos alquila contêm 1-4 átomos de carbono, em algumas modalidades, os grupos alquila contêm 1-3 átomos de carbono e, em algumas modalidades, os grupos alquila contêm 1-2 átomos de carbono. Exemplos de radicais alquila incluem, entre outros, metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, iso-butila, sec-butila, sec-pentila, iso-pentila, terc-butila, n-pentila, ne- opentila, n-hexila, sec-hexila, n-heptila, n-octila, n-decila, n-undecila, dodecila e semelhantes.
[00037] O termo "alquenila", tal como aqui utilizado, designa um grupo monovalente derivado de uma fração alifática de cadeia linear ou ramificada possuindo pelo menos uma dupla ligação carbono- carbono pela remoção de um único átomo de hidrogênio. Salvo especificação em contrário, os grupos alquenila contêm 2-12 átomos de carbono. Em certas modalidades, grupos alquenila contêm 2-8 átomos de carbono. Em certas modalidades, grupos alquenila contêm 2-6 átomos de carbono. Em algumas modalidades, os grupos alquenila contêm 2-5 átomos de carbono, em algumas modalidades, os grupos alquenila contêm 2-4 átomos de carbono, em algumas modalidades, os grupos alquenila contêm 2-3 átomos de carbono e, em algumas modalidades, os grupos alquenila contêm 2 átomos de carbono. Os grupos alquenila incluem, por exemplo, etenila, propenila, butenila, 1- metil-2-buten-1-ila, e semelhantes.
[00038] O termo "alquinila", tal como aqui utilizado, refere-se a um grupo monovalente derivado de uma fração alifática de cadeia linear ou ramificada possuindo pelo menos uma ligação tripla carbono- carbono pela remoção de um único átomo de hidrogênio. Salvo especificação em contrário, os grupos alquinila contêm 2-12 átomos de carbono. Em certas modalidades, os grupos alquinila contêm 2-8 átomos de carbono. Em certas modalidades, os grupos alquinila contêm 2-6 átomos de carbono. Em algumas modalidades, os grupos alquinila contêm 2-5 átomos de carbono, em algumas modalidades, os grupos alquinila contêm 2-4 átomos de carbono, em algumas modalidades, os grupos alquinila contêm 2-3 átomos de carbono e, em algumas modalidades, os grupos alquinila contêm 2 átomos de carbono. Grupos al- quinila representativos incluem, entre outros, etinila, 2-propinila (pro- pargila), 1-propinila, e semelhantes.
[00039] O termo "alquileno" refere-se a um grupo alquila bivalente. Uma "cadeia de alquileno" é um grupo de polimetileno, ou seja, -(CH2)n-, em que n é um número inteiro positivo, preferencialmente de 1 a 6, de 1 a 4, de 1 a 3, de 1 a 2, ou de 2 a 3. Uma cadeia de alquile- no substituída é um grupo de polimetileno no qual um ou mais átomos de hidrogênio do metileno são substituídos por um substituto. Substitutos adequados incluem aqueles descritos abaixo para um grupo alifáti- co substituído.
[00040] O termo "alquenileno" refere-se a um grupo alquenila bivalente. Uma cadeia de alquenileno substituída é um grupo de polimeti- leno contendo pelo menos uma ligação dupla na qual um ou mais átomos de hidrogênio são substituídos por um substituto. Substitutos adequados incluem aqueles descritos abaixo.
[00041] O termo "halo", tal como aqui utilizado, representa um átomo de halogênio selecionado a partir de bromo, cloro, iodo ou flúor.
[00042] O termo "halogênio" significa F, Cl, Br ou I.
[00043] O termo "haloalcóxi", tal como aqui utilizado, representa um grupo alcoxi, tal como aqui definido, substituído por um grupo halogê- nio (ou seja, F, Cl, Br ou I). Um haloalcóxi pode ser substituído por um, dois, três ou, no caso de grupos alquila de dois carbonos ou mais, quatro halogênios. Grupos haloalcóxi incluem perfluoroalcoxis (por exemplo, -OCF3), -OCHF2, -OCH2F, -OCCl3, -OCH2CH2Br, -OCH2CH(CH2CH2Br)CH3 e -OCHICH3. Em algumas modalidades, o grupo haloalcóxi pode ser ainda substituído por 1, 2, 3 ou 4 grupos substitutos, tal como aqui descritos para os grupos alquila.
[00044] O termo "haloalquila", tal como aqui utilizado, representa um grupo alquila, tal como aqui definido, substituído por um grupo ha- logênio (ou seja, F, Cl, Br ou I). Um haloalquila pode ser substituído por um, dois, três ou, no caso de grupos alquila de dois carbonos ou mais, quatro halogênios. Os grupos haloalquila incluem perfluoroalquis (por exemplo, -CF3), -CHF2, -CH2F, -CCl3, -CH2CH2Br, -CH2CH(CH2CH2Br)CH3 e -CHICH3. Em algumas modalidades, o grupo haloalquila pode ser ainda substituído por 1, 2, 3 ou 4 grupos substitutos, tal como aqui descritos para os grupos alquila.
[00045] O termo "arila" utilizado isoladamente ou como parte de uma fração maior como em "aralquila", "aralcóxi" ou "ariloxialquila", refere-se a sistemas de anéis monocíclicos e bicíclicos possuindo um total de cinco a 10 membros no anel, em que pelo menos um anel no sistema é aromático e em que cada anel no sistema contém de três a sete membros no anel. O termo "arila" pode ser utilizado de modo in- tercambiável com o termo "anel arila". Em algumas modalidades, um grupo arila bicíclico com 8-10 membros é um anel naftila opcionalmente substituído. Em certas modalidades da presente invenção, "arila" refere-se a um sistema de anéis aromáticos que inclui, entre outros, fenila, bifenila, naftila, antracila e afins, que pode conter um ou mais substitutos. Também incluídos dentro do âmbito do termo "arila", tal como aqui utilizado, está um grupo no qual um anel aromático está fundido a um ou mais anéis não aromáticos, tais como indanila, ftali- midila, naftimidila, fenantridinila ou tetra-hidronaftila, e semelhantes.
[00046] Os termos "heteroarila" e "heteroar-", usados isoladamente ou como parte de uma fração maior, por exemplo, "heteroaralquila" ou "heteroaralcóxi", referem-se a grupos possuindo 5 a 10 átomos no anel, preferencialmente 5, 6 ou 9 átomos no anel; possuindo 6, 10 ou 14 elétrons π compartilhados em um arranjo cíclico; e possuindo, além de átomos de carbono, de um a cinco heteroátomos. Os grupos hete- roarila incluem, entre outros, tienila, furanila, pirrolila, imidazolila, pira- zolila, triazolila, tetrazolila, oxazolila, isoxazolila, oxadiazolila, tiazolila, isotiazolila, tiadiazolila, piridila, piridazinila, pirimidinila, pirazinila, indo- lizinila, purinila, naftiridinila e pteridinila. Os termos "heteroarila" e "he- teroar-", tal como aqui utilizados, também incluem grupos em que um anel heteroaromático está fundido a um ou mais anéis arila, cicloalifá- ticos ou heterociclila, onde o radical ou ponto de ligação encontra-se no anel heteroaromático. Exemplos não limitantes incluem indolila, isoindolila, benzotienila, benzofuranila, dibenzofuranila, indazolila, benzimidazolila, benzotiazolila, quinolila, isoquinolila, cinolinilo, ftalazi- nila, quinazolinila, quinoxalinila, 4H-quinolizinila, carbazolila, acridinila, fenazinila, fenotiazinila, fenoxazinila, tetra-hidroquinolinila, tetra- hidroisoquinolinila, e pirido[2,3-b]-l,4-oxazin-3(4H)-ona. Um grupo hete- roarila pode ser mono- ou bicíclico. O termo "heteroarila" pode ser utilizado de modo intercambiável com os termos "anel heteroarila", "grupo heteroarila" ou "heteroaromático", qualquer de quais termos incluindo anéis que estão opcionalmente substituídos. O termo "heteroaralquila" refere-se a um grupo alquila substituído por um heteroarila, em que as frações alquila e heteroarila são estão opcional e independentemente substituídas.
[00047] Tal como aqui utilizados, os termos "heterociclo", "heteroci- clila", "radical heterocíclico" e "anel heterocíclico" são utilizados de modo intercambiável e referem-se a um anel de 5, 6 ou 7 membros, salvo especificação em contrário, contendo um, dois, três ou quatro heteroátomos selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em nitrogênio, oxigênio e enxofre. O anel de 5 membros possui de zero a duas ligações duplas, e os anéis de 6 e 7 membros possuem de zero a três ligações duplas. Exemplos de grupos heterociclila não substituídos são aqueles de 1 a 12 (por exemplo, 1 a 11, 1 a 10, 1 a 9, 2 a 12, 2 a 11, 2 a 10 ou 2 a 9) carbonos. O termo "heterociclila" também representa um composto heterocíclico possuindo uma estrutura multicíclica integrada em que um ou mais átomos de carbono e/ou heteroátomos ligam dois membros não adjacentes de um anel mono- cíclico, por exemplo, um grupo quinuclidinila. O termo "heterociclila" inclui grupos bicíclicos, tricíclicos e tetracíclicos em que qualquer um dos anéis heterocíclicos acima está fundido a um, dois ou três anéis carbocíclicos, por exemplo, um anel arila, um anel ciclo-hexano, um anel ciclo-hexeno, um anel ciclopentano, um anel ciclopenteno ou outro anel heterocíclico monocíclico, tais como indolila, quinolila, isoqui- nolila, tetra-hidroquinolila, benzofurila, benzotienila e semelhantes. Exemplos de heterociclis fundidos incluem tropanos e 1,2,3,5,8,8a- hexa-hidroindolizina. Os heterocíclicos incluem pirrolila, pirrolinila, pir- rolidinila, pirazolila, pirazolinila, pirazolidinila, imidazolila, imidazolinila, imidazolidinila, piridila, piperidinila, homopiperidinila, pirazinila, pipera- zinila, pirimidinila, piridazinila, oxazolila, oxazolidinila, isoxazolila, iso- xazolidini-ila, morfolinila, tiomorfolinila, tiazolila, tiazolidinila, isotiazolila, isotiazolidinila, indolila, indazolila, quinolila, isoquinolila, quinoxalinila, di-hidroquinoxalinila, quinazolinila, cinolinila, ftalazinila, benzimidazoli- la, benzotiazolila, benzoxazolila, benzotiadiazolila, furila, tienila, tiazoli- dinila, isotiazolila, triazolila, tetrazolila, oxadiazolila (por exemplo, 1,2,3- oxadiazolila), purinila, tiadiazolila (por exemplo, 1,2,3-tiadiazolila), te- tra-hidrofuranila, di-hidrofuranila, tetra-hidrotienila, di-hidrotienila, di- hidroindolila, di-hidroquinolila, tetra-hidroquinolila, tetra- hidroisoquinolila, di-hidroisoquinolila, piranila, di-hidropiranila, ditiazoli- la, benzofuranila, isobenzofuranila, benzotienila, e semelhantes, incluindo suas formas di-hidro e tetra-hidro, em que uma ou mais ligações duplas são reduzidas e substituídas por hidrogênios. Ainda outros exemplos de heterociclis incluem: 2,3,4,5-tetra-hidro-2-oxo-oxazolil; 2,3-di-hidro-2-oxo-1H-imidazolil; 2,3,4,5-tetra-hidro-5-oxo-1H-pirazolila (por exemplo, 2,3,4,5-tetra-hidro-2-fenil-5-oxo-1H-pirazolila); 2,3,4,5- tetra-hidro-2,4-dioxo-1H-imidazolila (por exemplo, 2,3,4,5-tetra-hidro- 2,4-dioxo-5-metil-5-fenil-1H-imidazolila); 2,3-di-hidro-2-tioxo-1,3,4- oxadiazolila (por exemplo, 2,3-di-hidro-2-tioxo-5-fenil-1,3,4- oxadiazolila); 4,5-di-hidro-5-oxo-1H-triazolila (por exemplo, 4,5-di- hidro-3-metil-4-amino-5-oxo-1H-triazolila); 1,2,3,4-tetra-hidro-2,4- dioxopiridinila (por exemplo, 1,2,3,4-tetra-hidro-2,4-dioxo-3,3- dietilpiridinila); 2,6-dioxo-piperidinila (por exemplo, 2,6-dioxo-3-etil-3- fenilpiperidinila); 1,6-di-hidro-6-oxopiridiminil; 1,6-di-hidro-4- oxopirimidinila (por exemplo, 2-(metiltio)-1,6-di-hidro-4-oxo-5- metilpirimidin-1-ila); 1,2,3,4-tetra-hidro-2,4-dioxopirimidinila (por exemplo, 1,2,3,4-tetra-hidro-2,4-dioxo-3-etilpirimidinila); 1,6-di-hidro-6-oxo- piridazinila (por exemplo, 1,6-di-hidro-6-oxo-3-etilpiridazinila); 1,6-di- hidro-6-oxo-1,2,4-triazinila (por exemplo, 1,6-di-hidro-5-isopropil-6-oxo- 1,2,4-triazinila); 2,3-di-hidro-2-oxo-1H-indolila (por exemplo, 3,3- dimetil-2,3-di-hidro-2-oxo-1H-indolila e 2,3-di-hidro-2-oxo-3,3'- espiropropano-1H-indol-1-ila); 1,3-di-hidro-1-oxo-2H-iso-indolil; 1,3-di- hidro-1,3-dioxo-2H-iso-indolil; 1H-benzopirazolila (por exemplo, l- (etoxicarbonila)-1H-benzopirazolila); 2,3-di-hidro-2-oxo-1H- benzimidazolila (por exemplo, 3-etil-2,3-di-hidro-2-oxo-1H- benzimidazolila); 2,3-di-hidro-2-oxo-benzoxazolila (por exemplo, 5- cloro-2,3-di-hidro-2-oxo-benzoxazolila); 2,3-di-hidro-2-oxo- benzoxazolil; 2-oxo-2H-benzopiranil; 1,4-benzodioxanil; 1,3- benzodioxanil; 2,3-di-hidro-3-oxo, 4H-1,3-benzotiazinil; 3,4-di-hidro-4- oxo-3H-quinazolinila (por exemplo, 2-metil-3,4-di-hidro-4-oxo-3H- quinazolinila); 1,2,3,4-tetra-hidro-2,4-dioxo-3H-quinazolila (por exemplo, 1-etil-1,2,3,4-tetra-hidro-2,4-dioxo-3H-quinazolila); 1,2,3,6-tetra- hidro-2,6-dioxo-7H-purinila (por exemplo, 1,2,3,6-tetra-hidro-1,3- dimetil-2,6-dioxo-7H -purinila); 1,2,3,6-tetra-hidro-2,6-dioxo-1H-purinila (por exemplo, 1,2,3,6-tetra-hidro-3,7-dimetil-2,6-dioxo-1H-purinila); 2- oxobenz[c,d]indolil; 1,1-dioxo-2H-naft[1,8-c,d]isotiazolil; e 1,8- naftilenedicarboxamida. Heterociclis adicionais incluem 3,3a,4,5,6,6a- hexa-hidro-pirrolo[3,4-b]pirrol-(2H)-ila, e 2,5-diazabiciclo[2.2.1]heptan- 2-ila, homopiperazinila (ou diazepanila), tetra-hidropiranila, ditiazolila, benzofuranila, benzotienila, oxepanila, tiepanila, azocanila, oxecanila e tiocanila.
[00048] Tal como aqui utilizado, o termo "parcialmente insaturado" refere-se a uma fração de anel que inclui pelo menos uma ligação dupla ou tripla. O termo "parcialmente insaturado" pretende englobar anéis possuindo múltiplos sítios de insaturação, mas não pretende incluir radicais arila ou heteroarila, tal como aqui definido.
[00049] Tais como aqui descritos, os compostos da invenção po dem, quando especificado, conter frações "opcionalmente substituídas". Em geral, o termo "substituído", precedido pelo termo "opcionalmente" ou não, significa que um ou mais hidrogênios da fração designada estão substituídos por um substituto adequado. Salvo indicação em contrário, um grupo "opcionalmente substituído" pode possuir um substituto adequado em cada posição substituível do grupo e, quando mais do que uma posição em uma determinada estrutura puder ser substituída por mais do que um substituto selecionado a partir de um grupo especificado, o substituto pode ser o mesmo ou diferente em cada posição. As combinações de substitutos previstas por esta invenção são preferencialmente aquelas que resultam na formação de compostos estáveis ou quimicamente viáveis. O termo "estável", tal como aqui utilizado, refere-se a compostos que não são substancialmente alterados quando sujeitos a condições para permitir sua produção, detecção e, em certas modalidades, sua recuperação, purificação, e uso para um ou mais dos fins aqui descritos.
[00050] Os substitutos monovalentes adequados em um átomo de carbono substituível de um grupo "opcionalmente substituído" são, independentemente, halogênio; -(CH2)o-4R°; -(CH2)o—4OR°; -0(CH2)O- 4R0, -O-(CH2)o—4C(O)OR°; -(CH2)O-4CH(OR°)2; -(CH2)O-4SR°; -(CH2)O- 4Ph, que pode ser substituídos por R°; -(CH2)o—4O(CH2)o—iPh que pode ser substituído por R°; -CH=CHPh, que pode ser substituído por R°; -(CH2)0-4O(CH2)0—1-piridila que pode ser substituído por R°; -NO2; -CN; -N3; -(CH2)O-4N(R°)2; -(CH2)O-4N(R°)C(0)R°; -N(R°)C(S)R°; -(CH2)O-4N(R°)C(0)NR°2; -N(R°)C(S)NR°2; -(CH2)O-4N(R°)C(0)OR°; -N(R°)N(R°)C(O)R°; -N(R°)N(R°)C(O)NR°2; -N(R°)N(R°)C(O)OR°; -(CH2)0-4C(O)R°; -C(S)R°; -(CH2)0-4C(O)OR°; -(CH2)0- 4C(O)SR°; -(CH2)0-4C(O)OSiR°3; -(CH2)0-4OC(O)R°; -OC(O)(CH2)0- 4SR-, SC(S)SR°; -(CH2)0-4SC(O)R°; -(CH2)0-4C(O)NR°2; -C(S)NR°2; -C(S)SR°; -SC(S)SR°, -(CH2)0-4OC(O)NR°2; -C(O)N(OR°)R°; - C(O)C(O)R°; -C(O)CH2C(O)R°; -C(NOR°)R°; -(CH2)0-4SSR°; - (CH2)0-4S(O)2R°; -(CH2)0-4S(O)2OR°; -(CH2)0-4OS(O)2R°; - S(O)2NR°2; -(CH2)0-4S(O)R°; -N(R°)S(O)2NR°2; -N(R°)S(O)2R°; - N(OR°)R°; -C(NH)NR°2; -P(O)2R°; -P(O)R°2; -OP(O)R°2; -OP(O)(OR°)2; SiR°3; -(C1-4 de aliquileno linear ou ramificado)O- N(R°)2; ou -(C1-4 de aliquileno linear ou ramificado)C(O)O-N(R°)2, em que cada R° pode ser substituído como definido abaixo e é, independentemente, hidrogênio, C1-6 alifático, -CH2Ph, -O(CH2)0-1Ph, -CH2- (anel heteroarila de 5-6 membros) ou um anel de 5-6 membros saturado, parcialmente insaturado, ou arila possuindo 0-4 heteroátomos in-dependentemente selecionados a partir de nitrogênio, oxigênio ou enxofre, ou, não obstante à definição acima, duas ocorrências independentes de R°, juntamente com seu(s) átomo(s) interveniente(s), formam um anel saturado, parcialmente insaturado ou arila mono- ou bi- cíclico de 3-12 membros possuindo 0-4 heteroátomos independentemente selecionados a partir de nitrogênio, oxigênio ou enxofre, que podem ser substituídos como definido abaixo.
[00051] Os substitutos monovalentes adequados em R° (ou o anel formado tomando duas ocorrências independentes de R° juntamente com seus átomos intervenientes), são independentemente halogêneo, –(CH2)0–2R, –(haloR), –(CH2)0–2OH, –(CH2)0–2OR, –(CH2)0– 2CH(OR)2; -O(haloR), –CN, –N3, –(CH2)0–2C(O)R, –(CH2)0–2C(O)OH, –(CH2)0–2C(O)OR, –(CH2)0–2SR, –(CH2)0–2SH, –(CH2)0–2NH2, –(CH2)0–2NHR, –(CH2)0–2NR2, –NO2, –SiR3, –OSiR3, -C(O)SR, –(C1–4 alquileno linear ou ramificado)C(O)OR, ou –SSR em que cada R é não substituído ou, onde precedido por "halo", é substituído apenas por um ou mais halogênios, e é independentemente selecionado a partir de C1-4 alifático, -CH2Ph, -O(CH2)0-1Ph, ou um anel saturado, parcialmente insaturado, ou anel arila de 5-6 membros possuindo 0-4 heteroátomos selecionados independentemente a partir de nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Os substitutos bivalentes adequados em um átomo de carbono saturado de R° incluem =O e =S.
[00052] Os substitutos bivalentes adequados em um átomo de carbono saturado de um grupo "opcionalmente substituído" incluem os seguintes: =O, =S, =NNR*2, =NNHC(O)R*, =NNHC(O)OR*, =NNHS(O)2R*, =NR*, =NOR*, –O(C(R*2))2–3O–, ou –S(C(R*2))2–3S–, em que cada ocorrência independente de R* é selecionado a partir de hidrogênio, C1-6 alifático que pode ser substituído como definido abaixo, ou um anel não substituído saturado, parcialmente insaturado ou arila de 5-6 membros possuindo 0-4 heteroátomos selecionados independentemente a partir de nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Os substitutos bivalentes adequados que estão ligados a átomos de carbono vicinais substituíveis de um grupo "opcionalmente substituído", incluem: – O(CR*2)2–3O–, em que cada ocorrência independente de R* é selecionada a partir de hidrogênio, C1-6 alifático que pode ser substituído como definido abaixo, ou um anel não substituído saturado, parcialmente insaturado ou anel arila de 5-6 membros possuindo 0-4 heteroátomos selecionados independentemente a partir de nitrogênio, oxigênio ou enxofre.
[00053] Os substitutos adequados no grupo alifático de R* incluem halogênio, -RΦ, -(haloRΦ), -OH, -OR*, -O(haloRΦ), -CN, -C(O)OH, -C(O)ORΦ, -NH2, -NHR*, -NR*2 ou -NO2, em que cada R* é não substituído ou, onde precedido por "halo", é substituído apenas por um ou mais halogênios, e é independentemente C1-4 alifático, -CH2Ph, -O(CH2)0-1Ph ou um anel saturado, parcialmente insaturado, ou arila de 5-6 membros possuindo 0-4 heteroátomos selecionados indepen-dentemente a partir de nitrogênio, oxigênio ou enxofre.
[00054] Os substitutos adequados em um nitrogênio substituível de um grupo "opcionalmente substituído" incluem -Rt, -NRt2, -C(O)Rt, -C(O)ORt, -C(O)C(O)Rt, -C(O)CH2C(O)Rt, -S(O)2R+, -S(O)2NR^, -C(S)NRt2, -C(NH)NRt2 ou -N(Rt)S(O)2R+; em que cada Rt é inde-pendentemente hidrogênio, C1-6 alifático que pode ser substituído como definido abaixo, -OPh não substituído, ou um anel não substituído saturado, parcialmente insaturado ou arila de 5-6 membros possuindo 0-4 heteroátomos independentemente selecionados a partir de nitrogênio, oxigênio ou enxofre, ou, não obstante à definição anterior, duas ocorrências independentes de Rt, tomados em conjunto com seu(s) átomo(s) interveniente(s) formam um anel não substituído saturado, parcialmente insaturado ou arila de 3-12 membros mono- ou bicíclico com 0-4 heteroátomos selecionados independentemente a partir de nitrogênio, oxigênio ou enxofre.
[00055] Os substitutos adequados no grupo alifático de Rt são in-dependentemente halogênio,, -R*, -(haloR*), -OH, -OR*, -O(haloR*), -CN, -C(O)OH, -C(O)OR*, -NH2, -NHR*, -NR*2 ou -NO2, em que cada R* é não substituído ou, onde precedido por "halo", é substituído apenas por um ou mais halogênios, e é independentemente C1-4 alifá- tico, -CH2Ph, -O(CH2)0-1Ph, ou um anel saturado, parcialmente insatu- rado ou arila de 5-6 membros possuindo 0-4 heteroátomos selecionados independentemente a partir de nitrogênio, oxigênio ou enxofre.
[00056] Em outro aspecto, a presente invenção apresenta composições "farmaceuticamente aceitáveis", que compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais dos compostos aqui descritos, formulados juntamente com um ou mais veículos (aditivos) e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis. Tais como descritas em detalhe, as composições farmacêuticas da presente invenção podem ser especialmente formuladas para administração em forma sólida ou líquida, incluindo aquelas adaptadas para o seguinte: administração oral, por exemplo, medicações líquidas (soluções ou suspensões aquosas ou não aquosas), comprimidos, por exemplo, aqueles destinados para administração oral, sublingual, e absorção sistêmica, em bolus, pós, grânulos, pastas para aplicação na língua; administração parentérica, por exemplo, por injeção subcutânea, intramuscular, intravenosa ou epidural como, por exemplo, uma solução ou suspensão estéril, ou uma formulação de liberação prolongada; aplicação tópica, por exemplo, como um creme, pomada ou um adesivo de liberação prolongada ou spray aplicado à pele, pulmões ou cavidade oral; por via intravaginal ou intrarretal, por exemplo, como um pessário, creme ou espuma; por via sublingual; por via ocular; por via transdérmica; ou por via nasal, pulmonar e outras superfícies mucosas.
[00057] A frase "farmaceuticamente aceitável " é aqui empregada para referir-se àqueles compostos, materiais, composições e/ou apresentações que são, dentro do âmbito do julgamento médico adequado, adequados para utilização em contato com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica, ou outro problema ou complicação, compatível com uma razão de be- nefício/risco razoável.
[00058] A expressão "veículo farmaceuticamente aceitável", tal como aqui utilizada, significa um material, composição ou transportador farmaceuticamente aceitável, tal como um líquido ou sólido de preenchimento, diluente, excipiente ou material solvente para encapsulamento, envolvido no transporte do composto em questão a partir de um órgão, ou parte do corpo, para outro órgão, ou parte do corpo. Cada veículo deve ser "aceitável" no sentido de ser compatível com os demais ingredientes da formulação e não prejudiciais ao paciente. Alguns exemplos de materiais que podem servir como veículos farma- ceuticamente aceitáveis incluem: açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose; amidos, tais como amido de milho e amido de batata; celulose e seus derivados, tais como carboximetilcelulose sódica, etilcelu- lose e acetato de celulose; tragacanto em pó; malte; gelatina; talco; excipientes, tais como manteiga de cacau e ceras para supositórios; óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de cártamo, óleo de sésamo, azeite, óleo de milho e óleo de soja; gli- cóis, tais como propilenoglicol; polióis, tais como glicerina, sorbitol, manitol e polietilenoglicol; ésteres, tais como oleato de etila e laurato de etila; ágar; agentes tamponantes, tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; ácido algínico; água isenta de pirogênios; solução salina isotônica; Solução de Ringer; álcool etílico; soluções de pH tamponando; poliésteres, policarbonatos e/ou polianidridos; e ou- tras substâncias compatíveis não tóxicas empregadas em formulações farmacêuticas.
[00059] Tal como aqui utilizado, o termo "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se àqueles sais que são, dentro do âmbito do julgamento médico adequado, adequados para utilização em contato com os tecidos de seres humanos e animais inferiores sem indevida toxicidade, irritação, resposta alérgica e similares, e são compatíveis com uma razão de benefício/risco razoável. Sais farmaceuticamente aceitável sais são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, S. M. Berge et al., descrevem sais farmaceuticamente aceitáveis em detalhes em J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19, aqui incorporada por referência. Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos desta invenção incluem aqueles derivados de ácidos e bases inorgânicos e orgânicos apropriados. Exemplos de sais não óxicos farmaceutica- mente aceitáveis por adição de ácido são sais de um grupo amino formados com ácidos inorgânicos tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico e ácido perclórico ou com ácidos orgânicos tais como ácido acético, ácido oxálico, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico ou ácido malônico, ou usando outros métodos usados na técnica tais como permuta iônica. Outros sais farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de adipato, al- ginato, ascorbato, aspartato, benzenossulfonato, benzoato, bissulfato, borato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropi- onato, digluconato, dodecila sulfato, etanossulfonato, formato, fumara- to, glico-heptonato, glicerofosfato, gliconato, hemissulfato, heptanoato, hexanoato, iodidrato, 2-hidróxi-etanossulfonato, lactobionato, lactato, laurato, laurila sulfato, malato, maleato, malonato, metanossulfonato, 2-naftalenossulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartarato, tiocianato, p- toluenossulfonato, undecanoato, sais de valerato, e semelhantes.
[00060] Os sais derivados de bases apropriadas incluem metal alcalino, metal alcalinoterroso, amônia e sais N+(Ci-4alquila)4. Sais de metais alcalinos ou alcalinoterrosos representativos incluem sódio, lí- tio, potássio, cálcio, magnésio e semelhantes. Além disso, sais farma- ceuticamente aceitáveis incluem, quando apropriado, amônia não tóxica, amônia quaternária, e cátions amina formados usando contra-íons tais como halogeneto, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, sulfonato de alquila inferior e sulfonato de arila.
[00061] Em certas modalidades, formas neutras dos compostos são regeneradas pelo contato do sal com uma base ou ácido e isolando o composto parental de maneira convencional. Em algumas modalidades, a forma parental do composto difere das várias formas de sal em certas propriedades físicas, tais como solubilidade em solventes polares.
[00062] Um versado na técnica apreciará que os métodos de síntese, tais como aqui descritos, utilizam vários grupos protetores. O termo "grupo protetor", tal como aqui utilizado, significa que uma fração funcional em particular, por exemplo, O, S ou N, está mascarada ou bloqueada, permitindo, se desejado, que uma reação seja realizada seletivamente em um outro sítio reativo em um composto multifuncional. Os grupos protetores adequados são bem conhecidos na técnica e incluem aqueles detalhadamente descritos em Protecting Groups in Organic Synthesis, T.W. Greene e P.G.M. Wuts, 3rd Edition, John Wiley & Sons, 1999, cuja totalidade está aqui incorporada por referência. Em certas modalidades, um grupo protetor reage seletivamente com um bom rendimento para fornecer um substrato protegido que é estável para as reações projetadas; o grupo protetor é, preferencialmente, removido seletivamente por reagentes prontamente disponíveis, preferencialmente não tóxicos, que não atacam os outros grupos funcionais; o grupo protetor forma um derivado separado (mais preferencialmente sem a geração de novos centros estereogênicos); e o grupo protetor terá preferencialmente um mínimo de funcionalidade adicional para evitar outros sítios de reação. Tal como aqui descrito, podem ser utilizados grupos protetores de oxigênio, enxofre, nitrogênio e carbono. A título de exemplo não limitante, os grupos protetores de hidroxila incluem os grupos metila, metoximetila (MOM), metiltiometila (MTM), t- butiltiometila, (fenildimetilsilil)metoximetila (SMOM), benziloximetila (BOM), p-metoxibenziloximetila (PMBM), (4-metoxifenóxi)metil(p- AOM), guaiacolmetila (GUM), t-butoximetila, 4-penteniloximetila (POM), siloximetila, 2-metoxietoximetila (MEM), 2,2,2- tricloroetoximetila, bis(2-cloroetóxi)metila, 2-(trimetilsilil)etoximetila (SEMOR), tetra-hidropiranila (THP), 3-bromotetra-hidropiranila, tetra- hidrotiopiranila, 1-metoxiciclo-hexila, 4-metoxitetra-hidropiranila (MTHP), 4-metoxitetra-hidrotiopiranila, 4-metoxitetra-hidrotiopiranila S,S-dióxido, 1-[(2-cloro-4-metil)fenil]-4-metoxipiperidin-4-ila (CTMP), 1,4-dioxano-2-ila, tetra-hidrofuranila, tetra-hidrotiofuranila, 2,3,3a,4,5,6,7,7a-octa-hidro-7,8,8-trimetil-4,7-metanobenzofuran-2-ila, 1-etoxietila, 1-(2-cloroetóxi)etila, 1-metil-1-metoxietila, 1-metil-1- benziloxietila, 1-metil-1-benzilóxi-2-fluoroetila, 2,2,2-tricloroetila, 2- trimetilsililetila, 2-(fenilselenil)etila, t-butila, alila, p-clorofenila, p- metoxifenila, 2,4-dinitrofenila, benzila, p-metoxibenzila, 3,4- dimetoxibenzila, o-nitrobenzila, p-nitrobenzila, p-halobenzila, 2,6- diclorobenzila, p-cianobenzila, p-fenilbenzila, 2-picolila, 4-picolila, 3- metil-2-picolila N-óxido, difenilmetila, p,p'-dinitrobenzidrila, 5- dibenzosuberila, trifenilmetila, α-naftildifenilmetila, p- metoxifenildifenilmetila, di(p-metoxifenil)fenilmetila, tri(p- metoxifenil)metila, 4-(4'-bromofenaciloxifenil)difenilmetila, 4,4',4''- tris(4,5-dicloroftalimidofenil)metila, 4,4',4''-tris(levulinoiloxifenil)metila, 4,4',4''-tris(benzoiloxifenil)metila, 3-(imidazol-1-ila)bis(4',4''- dimetoxifenil)metila, 1,1-bis(4-metoxifenil)-1'-pirenilmetila, 9-antrila, 9- (9-fenil)xantenila, 9-(9-fenil-10-oxo)antrila, 1,3-benzoditiolan-2-ila, ben- zisotiazolila S,S-dióxido, trimetilsilila (TMS), trietilsilila (TES), tri- isopropilsilila (TIPS), dimetilisopropilsilila (IPDMS), dietilisopropilsilila (DEIPS), dimetiltexilsilila, t-butildimetilsilila (TBDMS), t-butildifenilsilila (TBDPS), tribenzilsilila, tri-p-xililsilila, trifenilsilila, difenilmetilsilila (DPMS), t-butilmetoxifenilsilila (TBMPS), formato, benzoilformato, acetato, cloroacetato, dicloroacetato, tricloroacetato, trifluoroacetato, me- toxiacetato, trifenilmetoxiacetate, fenoxiacetato, p-clorofenoxiacetato, 3-fenilpropionato, 4-oxopentanoato (levulinato), 4,4-(etilenoditio)penta- noato (levulinoilditioacetal), pivaloato, adamantoato, crotonato, 4- metoxicrotonato, benzoato, p-fenilbenzoato, 2,4,6-trimetilbenzoato (mesitoato), carbonato de alquilmetila, carbonato de 9-fluorenilmetila (Fmoc), carbonato de alquiletila, carbonato de alquila 2,2,2-tricloroetila (Troc), carbonato de 2-(trimetilsilila)etila (TMSEC), carbonato de 2- (fenilsulfonila)etila (Psec), carbonato de 2-(trifenilfosfonio)etila (Peoc), carbonato de alquilisobutila, carbonato de alquilvinila, carbonato de alquilalila, carbonato de alquila p-nitrofenila, carbonato de alquilbenzi- la, carbonato de alquil-p-metoxibenzila, carbonato de alquil-3,4- dimetoxibenzila, carbonato de alquil-o-nitrobenzila, carbonato de alquila p-nitrobenzila, tiocarbonato de alquil-S-benzila, carbonato de 4-etóxi-1-naftila, ditiocarbonato de metila, 2-iodobenzoato, 4-azido- butirato, 4-nitro-4-metilpentanoato, o-(dibromometil)benzoato, 2-formil- benzenossulfonato, 2-(metiltiometóxi)etila, 4-(metiltiometóxi)butirato, 2- (metiltiometoximetil)benzoato, 2,6-dicloro-4-metilfenoxiacetato, 2,6- dicloro-4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenoxiacetato, 2,4-bis(1,1- dimetilpropil)fenoxiacetato, clorodifenilacetato, isobutirato, monosucci- noato, (E)-2-metil-2-butenoato, o-(metoxicarbonil)benzoato, α-naftoato, nitrato, N,N,N',N-tetrametilfosforodiamidato de alquila, N- fenilcarbamato de alquila, borato, dimetilfosfinotioila, 2,4- dinitrofenilsulfenato de alquila, sulfato, metanossulfonato (mesilato), benzilsulfonato e tosilato (Ts). Para proteger 1,2- ou 1,3-dióis, os grupos protetores incluem acetal de metileno, acetal de etilideno, acetal de 1-t-butiletilideno, acetal de 1-feniletilideno, acetal de (4- metoxifenil)etilideno, acetal de 2,2,2-tricloroetilideno, acetonida, acetal de ciclopentilideno, acetal de ciclo-hexilideno, acetal de cicloheptilide- no, acetal de benzilideno, acetal de p-metoxibenzilideno, acetal de 3,4- dimetoxibenzilideno, acetal de 2-nitrobenzilideno, acetal de metoxime- tileno, acetal de etoximetileno, outoéster de α-metoxibenzilideno, derivado de α-(N,N'-dimetilamino)benzilideno, outoéster de 2- oxaciclopentilideno, grupo di-t-butilsilileno (DTBS), derivados de 1,3- (1,1,3,3-tetraisopropildisiloxanilideno) (TIPDS), carbonatos cíclicos, boronatos cíclicos, boronato etílico e fenilboronato. Exemplos de grupos protetores são aqui detalhados, no entanto, será apreciado que a presente invenção não se destina a se limitar a estes grupos protetores; em vez disso, vários grupos protetores equivalentes adicionais pode ser prontamente identificados, utilizando os critérios acima referidos e utilizados no método da presente invenção. Além disso, vários grupos protetores são descritos por Greene e Wuts (supra).
[00063] O símbolo "~^", exceto quando utilizado como uma ligação para descrever estereoquímica desconhecida ou mista, indica o ponto de ligação de uma fração química à parte restante de uma molécula ou fórmula química.
[00064] Tal como aqui utilizado, o termo "isolado" refere-se a uma substância e/ou a entidade que foi (1) separada de pelo menos alguns dos componentes com os quais estava associada quando inicialmente produzida (na natureza e/ou em um cenário experimental), e/ou (2) elaborada, produzida, preparada e/ou fabricada pela mão do homem. Substâncias e/ou entidades isoladas podem ser separados a partir de cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou mais do que cerca de 99% dos outros componentes com os quais foram inicialmente associadas. Em algumas modalidades, os agentes isolados são cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou mais do que cerca de 99% puros. Tal como aqui utilizado, uma substância é "pura" se ela estiver substancialmente isenta de outros componentes. Em algumas modalidades, tal como será entendido pelos versados na técnica, uma substância pode ainda ser considerada "isolada" ou mesmo "pura" depois de ter sido combinada com certos outros componentes tais como, por exemplo, um ou mais veículos ou excipientes (por exemplo, tampão, solvente, água, etc.); em tais modalidades, o isolamento ou pureza percentual da substância é calculado sem inclusão de tais veículos ou excipientes. Em algumas modalidades, o isolamento envolve ou exige a interrupção das ligações covalentes (por exemplo, para isolar um domínio polipeptídico de um polipeptídeo mais longo e/ou para isolar um elemento de sequência nucleotídica de um oligonucleotídeo ou ácido nucleico mais longo).
[00065] O termo "modulador" é usado para referir-se a uma entidade cuja presença em um sistema, no qual se observa uma atividade de interesse, correlaciona-se a uma alteração no nível e/ou natureza desta atividade em comparação ao observado em condições de outro modo comparáveis quando o modulador está ausente. Em algumas modalidades, um modulador é um ativador ou agonista, na medida em que a atividade é aumentada na sua presença em comparação ao observado em condições de outro modo comparáveis quando o modula- dor está ausente. Em algumas modalidades, um modulador é um inibi- dor ou antagonista, na medida em que a atividade é reduzida na sua presença em comparação às condições de outro modo comparáveis quando o modulador está ausente. Em algumas modalidades, um mo- dulador interage diretamente com uma entidade-alvo, cuja atividade é de interesse. Em algumas modalidades, um modulador interage indiretamente (isto é, diretamente com um agente intermediário que interage com a entidade-alvo) com uma entidade-alvo, cuja atividade é de interesse. Em algumas modalidades, um modulador afeta o nível de uma entidade-alvo de interesse; alternativa ou adicionalmente, em algumas modalidades, um modulador afeta a atividade de uma entidade-alvo de interesse, sem afetar o nível da entidade-alvo. Em algumas modalidades, um modulador afeta o nível e a atividade de uma entidade-alvo de interesse, de modo que uma diferença observada na atividade não é completamente explicada por ou comparável a uma diferença observada no nível. Tal como aqui utilizada, uma "atividade" é qualquer pro-cesso, realizado por uma molécula, composto, célula, tecido ou órgão. Tais processos podem ser catalíticos ou não catalíticos. Por exemplo, as moléculas de cGAS da presente invenção podem agir como enzimas e, como tais, podem apresentar atividade enzimática.
[00066] O termo "ácido nucleico", no seu sentido mais amplo, inclui qualquer composto e/ou substância que compreende um polímero de nucleotídeos. Estes polímeros são muitas vezes referidos como poli- nucleotídeos. Exemplos de ácidos nucleicos ou polinucleotídeos da invenção incluem, entre outros, ácidos ribonucleicos (RNAs), ácidos desoxirribonucleicos (DNAs), ácidos treonucleicos (TNAs), ácidos gli- conucleicos (GNAs), ácidos nucleicos peptídicos (PNAs), ácidos nu- cleicos bloqueados (LNAs, incluindo LNA possuindo uma configuração β-D-ribo, α-LNA possuindo uma configuração α-L-ribo (um diastereô- mero do LNA), 2'-amino-LNA possuindo uma funcionalização 2'-amino e 2'-amino-α-LNA possuindo uma funcionalização 2'-amino) ou seus híbridos.
[00067] A presente invenção apresenta nucleosídeos e nucleotí- deos modificados. Tal como aqui descrito, "nucleosídeo" é definido como um composto contendo uma molécula de açúcar (por exemplo, uma pentose ou ribose) ou derivado desta, em combinação com uma base orgânica (por exemplo, uma purina ou pirimidina) ou derivado desta (também aqui referido como "nucleobase"). Tal como aqui descrito, "nucleotídeo" é definido como um nucleosídeo incluindo um grupo fosfato. Os nucleotídeos modificados podem ser sintetizados por qualquer método útil, tal como aqui descrito (por exemplo, quimicamente, enzimaticamente, ou por via recombinante para incluir um ou mais nucleosídeos não naturais modificados).
[00068] O pareamento de bases de nucleotídeos modificados engloba não apenas os pares de bases padrão adenosina-timina, adeno- sina-uracila, ou guanosina-citosina, mas também pares de bases formados entre os nucleotídeos e/ou nucleotídeos modificados que compreendem bases não padrão ou modificadas, em que o arranjo de doadores de ponte de hidrogênio e aceitadores de ponte de hidrogênio permite pontes de hidrogênio entre uma base não padrão e uma base padrão ou entre duas estruturas complementares de bases não padrão. Um exemplo de tal pareamento de bases não padrão é o parea- mento de bases entre o nucleotídeo modificado inosina e adenina, ci- tosina ou uracila.
[00069] Os nucleosídeos e nucleotídeos modificados podem incluir uma nucleobase modificada. Exemplos de nucleobases encontradas no RNA incluem, entre outras, adenina, guanina, citosina e uracila. Exemplos de nucleobases encontradas no DNA incluem, entre outras, adenina, guanina, citosina e timina.
[00070] Como estará evidente a partir do contexto, em algumas modalidades, "ácido nucleico" refere-se a resíduos individuais de ácido nucleico (por exemplo, nucleotídeos e/ou nucleosídeos); em algumas modalidades, "ácido nucleico" refere-se a uma cadeia de oligonucleo- tídeos compreendendo os resíduos individuais de ácido nucleico. Em algumas modalidades, um "ácido nucleico" é ou compreende RNA; em algumas modalidades, um "ácido nucleico" é ou compreende DNA. Em algumas modalidades, um ácido nucleico é, compreende, ou é consti tuído por um ou mais resíduos naturais de ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, um ácido nucleico é, compreende, ou é constituído por um ou mais análogos de ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, um análogo de ácido nucleico difere de um ácido nucleico na medida em que não utiliza uma estrutura de fosfodiéster. Por exemplo, em algumas modalidades, um ácido nucleico é, compreende, ou é constituído por um ou mais "ácidos nucleicos peptídicos", os quais são conhecidos na técnica e possuem ligações peptídicas em vez de ligações fosfodiéster na estrutura, que são considerados dentro do âmbito da presente invenção. Alternativa ou adicionalmente, em algumas modalidades, um ácido nucleico possui um ou mais fosforotioato e/ou ligações 5'-N-fosforamidita em vez de ligações fosfodiéster. Em algumas modalidades, um ácido nucleico é, compreende, ou é constituído por um ou mais nucleosídeos naturais (por exemplo, adenosina, timi- dina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, de- soxiguanosina, e desoxicitidina). Em algumas modalidades, um ácido nucleico é, compreende, ou é constituído por um ou mais análogos de nucleosídeo (por exemplo, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metil-adenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinil- citidina, C-5 propinil-uridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5- fluorouridina, C5-iodouridina, C5-propinil-uridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7-deaza-adenosina, 7-deazagua- nosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina, 2- tiocitidina, bases metiladas, bases intercaladas, e suas combinações). Em algumas modalidades, um ácido nucleico compreende um ou mais açúcares modificados (por exemplo, 2'-fluororribose, ribose, 2'- desoxirribose, arabinose e hexose) em comparação àqueles presentes nos ácidos nucleicos naturais. Em algumas modalidades, um ácido nucleico possui uma sequência de nucleotídeos que codifica um produto gênico funcional, tal como um RNA ou uma proteína. Em algumas modalidades, um ácido nucleico inclui um ou mais íntrons. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos são preparados por um ou mais métodos de isolamento a partir de uma fonte natural, síntese enzimáti- ca por polimerização com base em um modelo complementar (in vivo ou in vitro), reprodução em uma célula recombinante ou sistema, e síntese química. Em algumas modalidades, um ácido nucleico possui comprimento de pelo menos 2 (dinucleotídeos ou dinucleosídeos), 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 ou mais resíduos.
[00071] O termo "polipeptídeo", tal como aqui usado, tem o seu significado geralmente reconhecido na técnica de um polímero de pelo menos três aminoácidos, ligados entre si por ligações peptídicas. Em algumas modalidades, o termo é usado para se referir a classes funcionais específicas de polipeptídeos, tais como, por exemplo, receptores, enzimas, proteínas de sinalização, proteínas estruturais, polipeptí- deos autoantigênicos, polipeptídeos do receptor nicotínico de acetilco- lina, polipeptídeos aloantigênicos, etc. Para cada classe, a presente especificação apresenta vários exemplos de sequências de aminoáci- dos dos exemplos conhecidos de polipeptídeos dentro da classe; em algumas modalidades, tais polipeptídeos conhecidos são polipeptídeos de referência para a classe. Em alguns casos, o polipeptídeo codifica- do é menor do que cerca de 50 aminoácidos e o polipeptídeo é então denominado um peptídeo. Se o polipeptídeo for um peptídeo, este terá pelo menos cerca de 2, 3, 4 ou pelo menos 5 resíduos de aminoácidos de comprimento. Assim, os polipeptídeos incluem produtos gênicos, polipeptídeos que ocorrem naturalmente, polipeptídeos sintéticos, homólogos, outólogos, parálogos, fragmentos e outros equivalentes, variantes e análogos dos anteriores. Um polipeptídeo pode ser uma única molécula ou pode ser um complexo multimolecular, tal como um dímero, trímero ou tetrâmero. Eles também podem compreender poli- peptídeos de cadeia simples ou de cadeias múltiplas, tais como anticorpos ou insulina, e podem estar associados ou ligados. Mais comu- mente, ligações dissulfeto são encontrados nos polipeptídeos de cadeias múltiplas. O termo polipeptídeo também pode aplicar-se a polímeros de aminoácidos em que um ou mais resíduos de aminoácidos são um análogo químico artificial de um aminoácido de ocorrência natural correspondente. Em tais modalidades, o termo "polipeptídeo" refere-se a qualquer membro da classe que apresenta homologia de sequência significativa ou identidade com um polipeptídeo de referência relevante. Em muitas modalidades, tal membro também compartilha atividade significativa com o polipeptídeo de referência. Por exemplo, em algumas modalidades, um polipeptídeo-membro exibe um grau global de homologia ou identidade de sequência com um polipeptídeo de referência que é de pelo menos cerca de 30-40%, e é muitas vezes maior do que cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais e/ou inclui pelo menos uma região (isto é, uma região conservada, muitas vezes incluindo um elemento característico da sequência) que exibe identidade de sequência muito elevada, frequentemente superior a 90%, ou mesmo 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%. Tal região conservada geralmente engloba pelo menos 3-4 e muitas vezes até 20 ou mais aminoácidos; em algumas modalidades, uma região conservada engloba pelo menos um trecho de pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais ami- noácidos contíguos. Em algumas modalidades, um polipeptídeo útil, tal como aqui descrito, pode compreender ou consistir em um fragmento de um polipeptídeo precursor. Em algumas modalidades, um polipep- tídeo útil, tal como aqui descrito, pode compreender ou consistir em vários fragmentos, cada um dos quais é encontrado no mesmo poli- peptídeo precursor em um arranjo espacial diferente entre si em relação ao que é encontrado no polipeptídeo de interesse (por exemplo, fragmentos que estão diretamente ligados no precursor podem estar espacialmente separados no polipeptídeo de interesse, ou vice-versa, e/ou fragmentos podem estar presentes em uma ordem diferente no polipeptídeo de interesse em relação ao precursor), de modo que o polipeptídeo de interesse seja um derivado de seu polipeptídeo precursor.
[00072] O termo "variante polipeptídico" refere-se a moléculas que diferem em sua sequência de aminoácidos a partir de uma sequência nativa ou de referência. Os variantes de sequência de aminoácidos podem possuir substituições, deleções e/ou inserções em certas posições no interior da sequência de aminoácidos em comparação a uma sequência nativa ou de referência. Normalmente, os variantes possuirão pelo menos cerca de 50% de identidade (homologia) a uma sequência nativa ou de referência e, preferencialmente, eles serão pelo menos cerca de 80%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90% idênticos (homólogos) a uma sequência nativa ou de referência.
[00073] Em algumas modalidades "variantes miméticos" são apresentados. Tal como aqui utilizado, o termo "variante mimético" é aquele que contém um ou mais aminoácidos que mimetizam uma sequência ativada. Por exemplo, o glutamato pode servir como um mimético para fosfo-treonina e/ou fosfo-serina. Alternativamente, variantes mi- méticos podem resultar em desativação ou em um produto inativado contendo o mimético, por exemplo, fenilalanina pode agir como uma substituição de inativação para tirosina; ou alanina pode agir como uma substituição de inativação para serina.
[00074] O termo "homologia", tal como se aplica a sequências de aminoácidos, é definido como o percentual de resíduos na sequência de aminoácidos candidata que são idênticos aos resíduos na sequência de aminoácidos de uma segunda sequência após alinhamento das sequências e introdução de lacunas, se necessário, para alcançar a homologia percentual máxima. Os métodos e programas computadorizados para o alinhamento são bem conhecidos na técnica. Entende-se que a homologia depende de um cálculo da identidade percentual, mas pode diferir em valores devido a lacunas e penalidades introduzidas no cálculo.
[00075] Por "homólogos", tal como o termo se aplica a sequências de polipeptídeos, significa a sequência correspondente de outras espécies possuindo identidade substancial com uma segunda sequência de uma segunda espécie.
[00076] "Análogos", no contexto de polipeptídeos, destinam-se a incluir variantes de polipeptídeos que diferem por alterações de um ou mais aminoácidos, por exemplo, substituições, adições ou deleções de resíduos de aminoácidos que ainda mantêm uma ou mais das propriedades do polipeptídeo precursor ou de partida.
[00077] Tal como aqui utilizado, o termo "proteína" refere-se a um polipeptídeo (ou seja, uma cadeia de pelo menos dois aminoácidos ligados entre si por ligações peptídicas). As proteínas podem incluir frações além dos aminoácidos (por exemplo, podem ser glicoproteí- nas, proteoglicanos, etc.) e/ou podem ser de outro modo processadas ou modificadas. Os versados na técnica apreciarão que uma "proteína" pode ser uma cadeia polipeptídica completa conforme produzida por uma célula (com ou sem uma sequência sinal), ou pode ser uma fração característica desta. Os versados na técnica apreciarão que uma proteína pode, por vezes, incluir mais do que uma cadeia polipeptídica, por exemplo, ligada por uma ou mais pontes dissulfeto ou associada por outros meios. Os polipeptídeos podem conter L-aminoácidos, D- aminoácidos, ou ambos, e podem conter qualquer um de uma variedade de modificações de aminoácidos ou análogos conhecidos na técnica. Modificações úteis incluem, por exemplo, acetilação terminal, amidação, metilação, etc. Em algumas modalidades, as proteínas podem compreender aminoácidos naturais, aminoácidos não naturais, aminoácidos sintéticos, e suas combinações. O termo "peptídeo" é geralmente utilizado para se referir a um polipeptídeo possuindo um comprimento de menos do que cerca de 100 aminoácidos, menos do que cerca de 50 aminoácidos, menos do que 20 aminoácidos, ou menos do que 10 aminoácidos. Em algumas modalidades, as proteínas são anticorpos, fragmentos de anticorpos, porções biologicamente ativos destes e/ou frações características destes.
[00078] As frases "administração parentérica" e "administrado pa- rentericamente", tal como aqui utilizadas, significam modos de administração diferentes da administração entérica e tópica, geralmente por injeção, e inclui, sem limitação, injeção e infusão por via intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intra-orbital, intra- cardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraespinhal e in- traesternal.
[00079] As frases "administração sistêmica", "administrado sistemi- camente", "administração periférica" e "administrado perifericamente", tal como aqui utilizadas, significam a administração de um composto, fármaco ou outro material não diretamente no sistema nervoso central, de tal modo que ele entre no sistema do paciente e, assim, esteja su- jeito ao metabolismo e a outros processos semelhantes, por exemplo, administração subcutânea.
[00080] O termo "paliativo" refere-se ao tratamento que está focado no alívio de sintomas de uma doença e/ou efeitos colaterais de um regime terapêutico, mas que não é curativo.
[00081] O termo "agente terapêutico" ou "modalidade terapêutica" refere-se a qualquer agente que, quando administrado a um sujeito, possui um efeito terapêutico, diagnóstico e/ou profilático e/ou produz um efeito biológico e/ou farmacológico desejado.
[00082] Tal como aqui utilizado, o termo "quantidade terapeutica- mente eficaz" significa uma quantidade de uma substância (por exemplo, um agente terapêutico, composição e/ou formulação) que produz uma resposta biológica desejada quando administrada como parte de um regime terapêutico. Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma substância é uma quantidade que é suficiente, quando administrada a um sujeito que sofre de ou é suscetível a uma doença, distúrbio e/ou condição, para tratar a doença, distúrbio e/ou condição. Tal como será apreciado pelos versados nesta técnica, a quantidade eficaz de uma substância pode variar dependendo de tais fatores como o desfecho biológico desejado, a substância a ser entregue, a célula ou tecido-alvo, etc. Por exemplo, a quantidade eficaz do composto em uma formulação para o tratamento de uma doença, distúrbio e/ou condição é a quantidade que alivia, melhora, inibe, previne, retarda o início de, reduz a gravidade de e/ou reduz a incidência de um ou mais sintomas ou características da doença, distúrbio e/ou condição. Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz é administrada em uma dose única; em algumas modalidades, múltiplas doses unitárias são necessárias para administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz.
[00083] Tal como aqui utilizado, o termo "tratar" ou "tratamento" re- fere-se a qualquer método usado para parcial ou completamente aliviar, melhorar, inibir, prevenir, retardar o início de, reduzir a gravidade de e/ou reduzir a incidência de um ou mais sintomas ou características de uma doença, distúrbio e/ou condição. O tratamento pode ser administrado a um sujeito que não exiba sinais de uma doença, distúrbio e/ou condição. Em algumas modalidades, o tratamento pode ser administrado a um sujeito que exiba apenas sinais precoces da doença, distúrbio e/ou condição para o propósito de diminuir o risco de desenvolver a patologia associada à doença, distúrbio e/ou condição.
[00084] A expressão "dose unitária", tal como aqui utilizada, refere- se a uma unidade fisicamente discreta de uma formulação adequada para um sujeito a ser tratado. Será entendido, no entanto, que a utilização diária total de uma formulação da presente invenção será decidida pelo médico assistente dentro do âmbito do julgamento médico adequado. O nível de dose eficaz específico para qualquer sujeito ou organismo em particular pode depender de vários fatores incluindo o distúrbio a ser tratado e a gravidade do distúrbio; a atividade do composto ativo específico empregado; composição específica empregada; idade, peso corporal, saúde geral, sexo e dieta do sujeito; momento da administração, e taxa de excreção do composto ativo específico empregado; duração do tratamento; fármacos e/ou terapias adicionais usados em combinação ou coincidentes com composto(s) específi- co(s) utilizado(s), e fatores semelhantes bem conhecidos nas artes médicas. Uma dose unitária em particular pode conter ou não uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente terapêutico.
[00085] Tal como aqui utilizado, o termo "paciente" ou "sujeito" refere-se a um ser humano ou qualquer outro animal não humano (por exemplo, camundongos, ratos, coelhos, cães, gatos, gado, suínos, ovelhas, cavalos ou primatas) aos quais a terapia é administrada. Em muitas modalidades, um paciente é um ser humano. Um ser humano inclui formas pré- e pós-natais. Em algumas modalidades, um paciente é um ser humano que se apresenta a um prestador de cuidados médicos para o diagnóstico ou tratamento de uma doença, distúrbio ou condição. Em algumas modalidades, um paciente exibe um ou mais sintomas ou características de uma doença, distúrbio ou condição. Em algumas modalidades, um paciente não exibe nenhuma característica ou sintoma de uma doença, distúrbio ou condição. Em algumas modalidades, um paciente é alguém com um ou mais traços característicos de suscetibilidade a ou risco de uma doença, distúrbio ou condição.
[00086] Tal como aqui utilizado, o termo "amostra" ou "amostra biológica" refere-se a um subconjunto de seus tecidos, células ou partes de componentes (por exemplo, fluidos corporais, incluindo, entre outros, sangue, muco, fluido linfático, fluido sinovial, líquido cefalorraqui- diano, saliva, líquido amniótico, sangue do cordão amniótico, urina, fluido vaginal e sêmen). Uma amostra pode ainda incluir um homoge- nado, lisado ou extrato preparado a partir de um organismo inteiro ou um subconjunto de seus tecidos, células ou partes de componentes, ou uma fração ou porção dos mesmos, incluindo, entre outros, por exemplo, plasma, soro, fluido espinhal, fluido linfático, seções externas da pele, tratos respiratório, intestinal e urogenital, lágrimas, saliva, leite, células sanguíneas, tumores, órgãos. Um exemplo refere-se ainda a um meio, tal como um caldo ou gel nutritivo, que pode conter com-ponentes celulares, tais como proteínas ou moléculas de ácido nuclei- co.
[00087] Tal como aqui utilizado, "estável" refere-se a um composto ou molécula que seja suficientemente robusto para sobreviver ao isolamento até um grau útil de pureza a partir de uma mistura de reação, e de preferência capaz de formulação em um agente terapêutico eficaz. Alternativamente, pode-se dizer que um composto ou molécula é estável se for suficientemente robusto para resistir a qualquer trata- mento, injúria ou utilização sem sofrer degradação substancial antes de um determinado momento, evento ou localização.
[00088] Tal como aqui utilizado, o termo "estabilização", "estabilizado", "região estabilizada" significa tornar ou se tornar estável.
[00089] Um indivíduo que esteja "sofrendo de" uma doença, distúrbio e/ou condição foi diagnosticado com e/ou exibe um ou mais sintomas da doença, distúrbio e/ou condição.
[00090] Um indivíduo que esteja "suscetível a" uma doença, distúrbio e/ou condição não foi diagnosticado com a doença, distúrbio e/ou condição. Em algumas modalidades, um indivíduo que seja suscetível a uma doença, distúrbio e/ou condição pode exibir sintomas da doença, distúrbio e/ou condição. Em algumas modalidades, um indivíduo que seja suscetível a uma doença, distúrbio e/ou condição pode não apresentar sintomas da doença, distúrbio e/ou condição. Em algumas modalidades, um indivíduo que seja suscetível a uma doença, distúrbio e/ou condição irá desenvolver a doença, distúrbio e/ou condição. Em algumas modalidades, um indivíduo que seja suscetível a uma doença, distúrbio e/ou condição não irá desenvolver a doença, distúrbio e/ou condição.
[00091] O termo "meio legível por computador", tal como aqui utilizado, refere-se ao armazenamento não volátil de dados computadorizados (isto é, armazenamento secundário) e/ou memória para reter dados digitais, mesmo quando não alimentado. Exemplos de meios legíveis por computador incluem, entre outros, disco rígido, disco flexível, memória flash (ou seja, a memória de estado sólido), RAM Ferroe- létrica (F-RAM), RAM Magneto-resistivo (MRAM), disco óptico, discos RAM autônomos, ZIP drives, fita magnética e memória holográfica.
[00092] O termo "sistema computadorizado" ou "computador", tal como aqui utilizado, refere-se a um dispositivo computadorizado que pode ser utilizado para implementar as técnicas descritas na presente descrição. Um exemplo de dispositivo computadorizado 2500 e um dispositivo computadorizado móvel são mostrados na Figura S11.
[00093] Tal como aqui utilizado, o termo "estrutura cristalina" de uma composição deve significar um meio legível por computador no qual está armazenada uma representação da informação da posição tridimensional (isto é, coordenadas) para os átomos da composição.
[00094] Tal como aqui utilizado, o termo "acoplamento" refere-se à orientação, rotação, tradução de uma entidade química no sítio de ligação, domínio, molécula ou complexo molecular ou fração destes com base em geometria de distância ou energia. O acoplamento pode ser realizada por métodos de geometria de distância que encontram conjuntos de átomos de uma entidade química que correspondem a conjuntos de centros esféricos do sítio de ligação, domínio, molécula ou complexo molecular ou fração destes. Ver Meng et al. J. Comp. Chem. 4: 505-524 (1992). Centros esféricos são gerados ao fornecer um raio adicional de determinado comprimento a partir dos átomos (excluindo os átomos de hidrogênio) no sítio de ligação, domínio, molécula ou complexo molecular ou fração destes. Cálculos em tempo real da energia da interação, minimizações de energia ou minimiza- ções de corpo rígido (Gschwend et al., J. Mol. Recognition 9:175-186 (1996)) podem ser realizados durante a orientação da entidade química para facilitar o acoplamento. Por exemplo, experimentos interativos de acoplamento podem ser desenhados para seguir o caminho de menor resistência. Se o usuário em um experimento interativo de acoplamento faz um movimento para aumentar a energia, o sistema irá resistir a este movimento. No entanto, se o usuário faz um movimento para diminuir a energia, o sistema irá favorecer este movimento por uma responsividade aumentada. (Cohen et al., J. Med. Chem. 33:889894 (1990)). O acoplamento pode também ser realizado através da combinação de uma técnica de busca Monte Carlo com a avaliação rápida de energia por meio de potenciais de afinidade molecular. Veja Goodsell and Olson, Proteins: Structure, Function and Genetics 8:195202 (1990). Os programas de software que executam funções de acoplamento incluem, entre outros, MATCHMOL (Cory et al., J. Mol. Graphics 2: 39 (1984); MOLFIT (Redington, Comput. Chem. 16: 217 (1992)) e DOCK (Meng et al., supra).
[00095] Tal como aqui utilizado, o termo "projetado" ou "elaborado" refere-se a um agente (i) cuja estrutura é ou foi selecionado pela mão do homem; (ii) que é produzido por um processo que exige mão do homem; e/ou (iii) que é distinto das substâncias naturais e de outros agentes conhecidos.
[00096] Tal como aqui utilizado, o termo "ambiente de armazenamento" compreende qualquer ambiente compreendendo armazenamento secundário, isto é, armazenamento persistente em longo prazo. Em algumas modalidades, um ambiente de armazenamento compreende meio legível por computador. Em algumas modalidades, um ambiente de armazenamento compreende um ambiente de rede para o estabelecimento de um ambiente de comunicação ciente do contexto de múltiplos canais (isto é, computação em nuvem). Por exemplo, a Figura S11 é um diagrama de blocos de um ambiente de rede para o estabelecimento de um ambiente de comunicação ciente do contexto de múltiplos canais.
[00097] Tal como aqui utilizado, o termo "substancialmente" refere- se à condição qualitativa de exibir extensão ou grau total ou quase total de uma característica ou propriedade de interesse. Um versado na técnica biológica entenderá que os fenômenos biológicos e químicos raramente, se alguma vez, são concluídos e/ou seguem para a integridade ou alcançam ou evitam um resultado absoluto. O termo "substancialmente" é, portanto, aqui utilizado para capturar a possível ausência de integridade inerente em muitos fenômenos biológicos e quí- micos.
Compostos e Composições da Invenção
[00098] Foi surpreendentemente descoberto, ao contrário das divulgações na técnica, que o membro fundador de uma família de mensageiros secundários dinucleotídicos cíclicos de metazoários que regulam a indução do interferon tipo I em resposta ao DNA citoplásmico compreende características únicas até então desconhecidas. Estas descobertas agora proporcionam a oportunidade para projetar análogos, imitadores e/ou miméticos da molécula identificada e usar melhor a molécula ou moléculas desenhadas com base na estrutura das moléculas precursoras em pesquisa e desenvolvimento.
Análogos, imitadores, miméticos e modificações de cGAMP
[00099] A família de mensageiros secundários, denominados cGAMPs ou GAMPs cíclicos, inclui uma ou mais das estruturas cíclicas definidas como possuindo pelo menos um nucleotídeo guanina (G) e uma adenina (A) e estando ligadas de forma cíclica. As ligações entre os dois nucleotídeos envolvem a formação de ligação entre o açúcar e a estrutura. De acordo com a presente invenção, existem quatro membros precursores primários da família de cGAMP. Estes incluem [c[G(2',5')pA(3',5')p]], [c[G(2',5')pA(2',5')p]], [c[G(3',5')pA(2',5')p]], [c[G(3',5')pA(3',5')p]]. Além disso, cada um dos nucleotídeos dos pares pode adotar as orientações syn ou anti de torção glicosídica.
[000100] Tal como aqui utilizado, o termo "cGAMP" refere-se a qualquer das moléculas precursoras da família bem como qualquer uma das possíveis orientações de torção. Os membros individuais da família podem ser referidos pela forma de sua ligação açúcar-estrutura, por exemplo, o mensageiro secundário recém-descoberto, [c[G(2',5')pA(3',5')p]], pode ser referido como o isômero "2-prime- 3'prime", fazendo referência à posição no anel de açúcar formando a ligação açúcar-estrutura. Os demais isômeros podem ser denomina- dos do mesmo modo. Coletivamente, os compostos da invenção que são selvagens, análogos, imitadores, miméticos ou versões modificadas da família de cGAMP, são referidos como o grupo dos "compostos de cGMP."
[000101] Com os ensinamentos aqui apresentados, um especialista pode agora projetar análogos, miméticos ou modificações de qualquer uma das moléculas precursoras para o uso como um modulador, ago- nista ou antagonista, da enzima cGAS e, por fim, como um modulador dos eventos fisiológicos downstream associados à sinalização do interferon. Versões lineares também podem ser desenhadas como agonis- tas, antagonistas ou inibidores competitivos da cGAS ou eventos de sinalização downstream, associados à atividade da enzima cGAS ou à sinalização do interferon.
[000102] A presente invenção contempla vários tipos de compostos ou composições que são baseados em ácidos nucleicos incluindo variantes e derivados. Estes incluem variantes e derivados por substituição, inserção, eliminação e covalentes. O termo "derivado" é utilizado como sinônimo do termo "variante", mas refere-se geralmente a uma molécula que foi modificada e/ou alterada de qualquer maneira em relação a uma molécula de referência ou molécula de partida.
[000103] Tal como aqui utilizado, um "análogo" destina-se a incluir variantes de cGAMP que diferem por uma ou mais alterações, por exemplo, substituições, adições ou deleções que ainda mantêm uma ou mais das propriedades da molécula precursora ou de partida. Os análogos são tipicamente desenhados utilizando relações estrutura- atividade (SAR), tais como aquelas aqui descritas. Proteínas, Variantes, Derivados e Mutantes da cGAS
[000104] Tendo agora em mãos várias estruturas proteicas cristalinas nos estados nativo e de ligação variados, é possível explorar essas estruturas proteicas através da elaboração de variantes, derivados ou mutantes da enzima cGAS. Como tal, os polipeptídeos da enzima cGAS, incluindo seus variantes, derivados e mutantes são considerados compostos da invenção. Estes variantes, derivados e mutantes são úteis como ferramentas de pesquisa, por exemplo, em kits ou ensaios ou como a fonte de uma modalidade terapêutica. Para esta finalidade, os fragmentos ou frações do polipeptídeo da cGAS ou os variantes, derivados e mutantes podem ser usados como antígenos para a produção de anticorpos ou, onde o fragmento mantiver um elemento estrutural associado à atividade, de ligação, catálise ou transporte, estes também poderão ser utilizados como um modulador da própria enzima ou como um substituto para a ligação ao dsDNA. Coletivamente, os compostos da invenção que são selvagens, variantes, derivados ou mutantes da cGAS são referidos como o grupo de "moléculas da cGAS." As moléculas da cGAS podem compreender qualquer fração ou fragmento de uma molécula de cGAS ou podem compreender domínios ou fragmentos mistos de moléculas de cGAS originados a partir de estruturas diferentes, tal como definidos pelas estruturas cristalinas aqui reveladas.
[000105] A presente invenção contempla vários tipos de composições que são baseadas em polipeptídeos, incluindo variantes e derivados. Estas incluem variantes e derivados por substituição, inserção, eliminação e covalentes. O termo "derivado" é utilizado como sinônimo do termo "variante", mas refere-se geralmente a uma molécula que tenha sido modificada e/ou alterada de qualquer maneira em relação a uma molécula de referência ou molécula de partida.
[000106] Como tal, os polipeptídeos que codificam cGAS contendo substituições, inserções e/ou adições, deleções e modificações covalentes no que diz respeito a sequências de referência, em particular, as sequências polipeptídicas aqui descritas, estão incluídos dentro do âmbito da presente invenção. Por exemplo, marcadores de sequência ou aminoácidos, tais como uma ou mais lisinas, podem ser adicionados às sequências peptídicas da invenção (por exemplo, nas extremidades N-terminal ou C-terminal). Marcadores de sequência podem ser utilizados para a purificação ou localização de peptídeos. Lisinas podem ser usadas para aumentar a solubilidade do peptídeo ou para permitir a biotinilação. Alternativamente, os resíduos de aminoácidos localizados nas regiões carbóxi- e amino-terminais da sequência de aminoácidos de um peptídeo ou proteína podem ser opcionalmente suprimidos para proporcionar sequências truncadas. Certos aminoáci- dos (por exemplo, resíduos C-terminais ou N-terminais) podem, alternativamente, ser deletados, dependendo da utilização da sequência, como, por exemplo, a expressão da sequência como parte de uma sequência maior, que é solúvel ou está ligada a um suporte sólido.
[000107] "Variantes de substituição", quando se referem a polipeptí- deos, são aqueles que possuem pelo menos um resíduo de aminoáci- do removido em uma sequência nativa ou de partida e um aminoácido diferente inserido no seu lugar na mesma posição. As substituições podem ser isoladas, onde apenas um aminoácido na molécula foi substituído, ou podem ser múltiplas, onde dois ou mais aminoácidos foram substituídos na mesma molécula.
[000108] Tal como aqui utilizado, o termo "substituição conservadora de aminoácidos" refere-se à substituição de um aminoácido que está normalmente presente na sequência por um aminoácido diferente de tamanho, carga ou polaridade semelhantes. Exemplos de substituições conservadoras incluem a substituição de um resíduo não polar (hidrofóbico) tal como isoleucina, valina e leucina por outro resíduo não polar. Do mesmo modo, exemplos de substituições conservadoras incluem a substituição de um resíduo polar (hidrofílico) por outro, tal como entre arginina e lisina, entre glutamina e asparagina, e entre a glicina e serina. Além disso, a substituição de um resíduo básico, tal como lisina, arginina ou histidina, por outro ou a substituição de um resíduo ácido, tal como ácido aspártico ou ácido glutâmico, por outro resíduo ácido são exemplos adicionais de substituições conservadoras. Exemplos de substituições não conservadoras incluem a substituição de um resíduo de aminoácido não polar (hidrofóbico), tal como iso- leucina, valina, leucina, alanina, metionina, por um resíduo polar (hi- drofílico), tal como cisteína, glutamina, ácido glutâmico ou lisina e/ou um resíduo polar por um resíduo não polar.
[000109] "Variantes de inserção", quando se referem a polipeptídeos, são aqueles com um ou mais aminoácidos inseridos imediatamente adjacentes a um aminoácido em uma posição em particular em uma sequência nativa ou de partida. "Imediatamente adjacente" a um ami- noácido significa ligado ao grupo funcional alfa-carboxila ou alfa-amino do aminoácido.
[000110] "Variantes de deleção", quando se referem a polipeptídeos, são aqueles com um ou mais aminoácidos removidos na sequência de aminoácidos nativa ou de partida. Normalmente, os variantes de dele- ção terão um ou mais aminoácidos deletados em uma região em particular da molécula.
[000111] "Derivados covalentes", quando se referem a polipeptídeos, incluem modificações de uma proteína nativa ou de partida com agente derivado proteináceo ou não proteináceo orgânico e/ou modificações pós-traducionais. As modificações covalentes são tradicionalmente introduzidas pela reação de resíduos de aminoácidos-alvo da proteína com um agente derivado orgânico que é capaz de reagir com determinadas cadeias laterais ou resíduos terminais, ou por mecanismos de aproveitamento de modificações pós-traducional que funcionam em determinadas células hospedeiras recombinantes. Os derivados covalentes resultantes são úteis em programas dirigidos à identificação de resíduos importantes para a atividade biológica, para imuno- ensaios ou para a preparação de anticorpos antiproteína para purificação por imunoafinidade da glicoproteína recombinante. Tais modificações estão dentro do âmbito dos versados na técnica e são realizadas sem experimentação indevida.
[000112] Certas modificações pós-traducionais são o resultado da ação de células hospedeiras recombinantes no polipeptídeo expresso. Resíduos de glutaminila e asparaginila são, com frequência, desami- dados pós-traducionalmente para os resíduos glutamila e aspartila correspondentes. Alternativamente, estes resíduos são desamidados em condições ligeiramente ácidas. Ambas as formas destes resíduos podem estar presentes nos polipeptídeos produzidos de acordo com a presente invenção.
[000113] Outras modificações pós-traducionais incluem a hidroxila- ção de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxila de resíduos se- rila ou treonila, metilação dos grupos alfa-amino das cadeias laterais de lisina, arginina e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), cujo conteúdo está incorporado por referência em sua totalidade.
[000114] "Características", quando se referem a polipeptídeos, são definidas como componentes distintos à base de sequências de ami- noácidos de uma molécula. Características dos polipeptídeos da cGAS codificados pela presente invenção incluem manifestações de superfície, forma conformacional local, pregas, alças, meias-alças, domínios, meios-domínios, sítios, terminais ou qualquer combinação destes.
[000115] Tal como aqui utilizado quando se refere a polipeptídeos, o termo "manifestação de superfície" refere-se a um componente à base de polipeptídeo de uma proteína que aparece sobre uma superfície externa.
[000116] Tal como aqui utilizado quando se refere a polipeptídeos, o termo "forma conformacional local" significa uma manifestação estrutural baseada em polipeptídeo de uma proteína que está localizada dentro de um espaço definido da proteína.
[000117] Tal como aqui utilizado quando se refere a polipeptídeos, o termo "dobra" refere-se à conformação resultante de uma sequência de aminoácidos após minimização de energia. Uma prega pode ocorrer no nível secundário ou terciário do processo de pregueamento. Exemplos de pregas de nível secundário incluem beta-sheets e alfa- hélices. Exemplos de pregas terciárias incluem domínios e regiões formados devido à agregação ou separação de forças energéticas. Regiões formadas desta maneira incluem sítios hidrofóbicos e hidrofíli- cos, e semelhantes.
[000118] Tal como aqui utilizado, o termo "volta" quando se refere à conformação proteica, significa uma curvatura que altera a direção da estrutura de um peptídeo ou polipeptídeo e pode incluir um, dois, três ou mais resíduos de aminoácidos.
[000119] Tal como aqui utilizado quando se refere a polipeptídeos, o termo "alça" refere-se a uma característica estrutural de um polipeptí- deo que pode servir para inverter o sentido da estrutura de um peptí- deo ou polipeptídeo. Onde a alça for encontrada no polipeptídeo e apenas alterar a direção da estrutura, esta pode compreender quatro ou mais resíduos de aminoácidos. Oliva et al. identificaram pelo menos 5 classes de alças proteicas (J. Mol Biol 266 (4): 814-830; 1997). As alças podem ser abertas ou fechadas. As alças fechadas ou alças "cíclicas" pode compreender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoácidos entre as frações de integração. Tais frações de integração podem compreender uma ponte cisteína-cisteína (Cis-Cis) típica em polipeptí- deos possuindo pontes dissulfeto ou, alternativamente, as frações de integração podem ser não proteicas, tais como os agentes dibromozili- la aqui utilizados.
[000120] Tal como aqui utilizado quando se refere a polipeptídeos, o termo "meia-alça" refere-se a uma porção de uma alça identificada possuindo pelo menos metade do número de resíduos de aminoácidos que a alça da qual é derivada. Entende-se que as alças podem nem sempre conter um número par de resíduos de aminoácidos. Por conseguinte, nos casos em que uma alça contém ou é identificada por conter um número ímpar de aminoácidos, uma meia-alça da alça de número ímpar irá compreender a fração de número inteiro ou fração do próximo número inteiro da alça (número de aminoácidos da alça/2+/- 0,5 aminoácidos). Por exemplo, uma alça identificada como uma alça de 7 aminoácidos poderia produzir meias-alças de 3 aminoácidos ou 4 aminoácidos (7/2=3,5+/-0,5 sendo 3 ou 4).
[000121] Tal como aqui utilizado quando se refere a polipeptídeos, o termo "domínio" refere-se a um motivo de um polipeptídeo possuindo um ou mais características ou propriedades estruturais ou funcionais identificáveis (por exemplo, capacidade de ligação, que serve como um sítio para interações proteína-proteína).
[000122] Tal como aqui utilizado quando se refere a polipeptídeos, o termo "meio-domínio" significa uma fração de um domínio identificado possuindo pelo menos metade do número de resíduos de aminoácidos do domínio do qual é derivado. Entende-se que os domínios podem nem sempre conter um número par de resíduos de aminoácidos. Por conseguinte, nos casos em que um domínio contém ou é identificado por compreender um número ímpar de aminoácidos, um meio-domínio do domínio de número ímpar irá compreender a fração de número inteiro ou fração do próximo número inteiro do domínio (número de ami- noácidos do domínio/2+/-0,5 aminoácidos). Por exemplo, um domínio identificado como um domínio de 7 aminoácidos poderia produzir mei-os-domínios de 3 aminoácidos ou 4 aminoácidos (7/2=3,5+/-0,5 sendo 3 ou 4). Entende-se também que subdomínios podem ser identificados dentro dos domínios ou meios-domínios, estes subdomínios possuindo menos do que todas as propriedades estruturais ou funcionais identificadas nos domínios ou meios-domínios dos quais foram derivados. Entende-se também que os aminoácidos que compreendem qualquer um dos tipos de domínio aqui não precisam ser contíguos ao longo da estrutura do polipeptídeo (isto é, aminoácidos não adjacentes podem se preguear estruturalmente para produzir um domínio, meio-domínio ou subdomínio).
[000123] Tal como aqui utilizado quando se refere a polipeptídeos, o termo "sítio" no que diz respeito às modalidades baseadas em amino- ácidos é usado como sinônimo de "resíduo de aminoácido" e "cadeia lateral de aminoácido." Um sítio representa uma posição dentro de um peptídeo ou polipeptídeo que pode ser modificada, manipulada, alterada, derivada ou variada dentro das moléculas à base de polipeptídeos da presente invenção.
[000124] Tal como aqui utilizado, o termo "terminal", quando se refere a polipeptídeos, refere-se a uma extremidade de um peptídeo ou polipeptídeo. Tal extremidade não está limitada apenas ao primeiro ou último sítio do peptídeo ou polipeptídeo, mas pode incluir aminoácidos adicionais nas regiões terminais. As moléculas à base de polipeptí- deos da presente invenção podem ser caracterizadas como possuindo uma extremidade N-terminal (terminada por um aminoácido com um grupo amina livre (NH2)) e uma extremidade C-terminal (terminada por um aminoácido com um grupo carboxila livre (COOH)). As proteínas da invenção são, em alguns casos, compostas por várias cadeias poli- peptídicas reunidas por pontes dissulfeto ou por forças não covalentes (multímeros, oligômeros). Estes tipos de proteínas terão múltiplas extremidades N- e C-terminais. Alternativamente, os terminais dos poli- peptídeos podem ser modificados de tal modo que eles comecem ou terminem, como pode ser o caso, com uma fração não polipeptídica, tal como um conjugado orgânico.
[000125] Uma vez que qualquer uma das características tiver sido identificada ou definida como um componente desejado de um poli- peptídeo da invenção, qualquer uma das várias manipulações e/ou modificações destas características pode ser realizada ao mover, trocar, inverter, deletar, randomizar ou duplicar. Além disso, entende-se que a manipulação das características pode resultar no mesmo resultado que uma modificação feita às moléculas da presente invenção. Por exemplo, uma manipulação que envolveu a deleção de um domínio resultaria na alteração do comprimento de uma molécula tal como seria a modificação de um ácido nucleico que codifica uma molécula de comprimento menos que o completo.
[000126] Modificações e manipulações podem ser realizadas por métodos conhecidos na técnica, tais como, entre outros, mutagênese dirigida ao sítio. As moléculas modificadas resultantes podem então ser testadas quanto à atividade usando ensaios in vitro e in vivo tais como aqueles aqui descritos ou qualquer outro ensaio de triagem adequado conhecido na técnica.
[000127] De acordo com a presente invenção, os polipeptídeos podem compreender uma sequência de consenso que é descoberta através de ciclos de experimentação. Tal como aqui utilizada, uma sequência de "consenso" é uma sequência isolada que representa uma população coletiva de sequências que permitem a variabilidade em um ou mais sítios.
[000128] Tal como é reconhecido pelos versados na técnica, fragmentos proteicos, domínios proteicos funcionais e proteínas homólogas são também considerados como estando dentro do âmbito dos polipeptídeos de interesse da presente invenção. Por exemplo, aqui apresentado está qualquer fragmento proteico (ou seja, uma sequência de polipeptídeos mais curta em pelo menos um resíduo de amino- ácido do que uma sequência polipeptídica de referência, mas de outro modo idêntica) de uma proteína de referência 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou maior do que 100 aminoácidos de comprimento. Em outro exemplo, qualquer proteína que inclui uma extensão de cerca de 20, cerca de 30, cerca de 40, cerca de 50, ou cerca de 100 aminoáci- dos, que seja cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 100% idêntica a qualquer uma das sequências aqui descritas pode ser utilizada de acordo com a invenção. Em certas modalidades, um polipep- tídeo a ser utilizado de acordo com a invenção inclui 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais mutações, como demonstrado em qualquer uma das sequências apresentadas ou mencionadas neste documento.
Anticorpos
[000129] Em algumas modalidades, os compostos de cGAMP ou moléculas de cGAS podem ser utilizados para gerar anticorpos. Como tal, os anticorpos assim gerados são considerados como compostos e composições adicionais da presente invenção. Tal como aqui utilizado, o termo "anticorpo" inclui anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos de comprimento total que possuem uma região Fc de imunoglobulina), composições de anticorpos com especificidade poliepitópica, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos, diacorpos e moléculas de cadeia simples), bem como fragmentos de anticorpos. O termo "imunoglobulina" (Ig) é utilizado de modo intercambiável com "anticorpo" neste documento. Tal como aqui utilizado, o termo "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que constituem a população são idênticos, exceto quanto a possíveis mutações que ocorrem naturalmente e/ou modificações pós-traducionais (por exemplo, isomerizações, amidações), que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único sítio antigênico.
[000130] Os anticorpos monoclonais aqui descritos incluem especificamente anticorpos (imunoglobulinas) "quiméricos" nos quais uma fração da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie em particular ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpos em particular, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é(são) idêntica(s) ou homó- loga(s) às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencente a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada. Os anticorpos quiméricos de interesse aqui descritos incluem, entre outros, anticorpos "primatizados" com-preendendo sequências de ligação ao antígeno do domínio variável derivadas de sequências da região constante de primatas não humanos (por exemplo, macacos do Velho Mundo, macacos, etc.) e seres humanos.
[000131] Um "fragmento de anticorpo" compreende uma porção de um anticorpo intacto, preferencialmente a região de ligação ao antíge- no e/ou variável do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; nanocorpos; moléculas de anticorpo de cadeia simples e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.
[000132] Qualquer uma das cinco classes de imunoglobulinas, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, pode ser gerada pelos compostos ou moléculas da invenção, incluindo as cadeias pesadas designadas alfa, delta, épsilon, gama e mu, respectivamente.
[000133] Embora não se pretenda estar limitado pela teoria, acredita- se que os anticorpos gerados usando os compostos de cGAMP ou moléculas de cGAS aqui descritos resultará em melhor eficácia terapêutica.
[000134] Os anticorpos da invenção podem ser utilizados para tratar condições ou doenças em muitas áreas terapêuticas, tais como, entre outras, sangue, cardiovascular, sistema nervoso central, envenenamento (incluindo antivenenos), dermatologia, endocrinologia, gastrointestinal, imagiologia médica, músculo-esquelética, oncologia, imunolo- gia, inflamação, respiratória, sensorial e anti-infecciosa.
[000135] Em uma modalidade, os variantes de anticorpos podem também incluir, entre outros, variantes de substituição, substituição conservadora de aminoácidos, variantes de inserção, variantes de de- leção e/ou derivados covalentes.
Vacinas
[000136] Tal como aqui utilizada, uma "vacina" é uma preparação biológica que melhora a imunidade a uma doença ou agente infeccioso em particular. De acordo com a presente invenção e, embora não desejando estar limitado pela teoria, acredita-se que a utilização dos compostos de cGAMP ou moléculas de cGAS da invenção podem ser utilizados como uma vacina ou como adjuvante de vacina.
[000137] As vacinas da invenção podem ser utilizadas para tratar condições ou doenças em muitas áreas terapêuticas, tais como, entre outras, cardiovasculares, sistema nervoso central, dermatologia, endo- crinologia, oncologia, imunologia e autoimunidade, inflamação, respiratória, e anti-infecciosa.
Compostos ALB
[000138] Em algumas modalidades, a presente invenção apresenta um modulador de um poliptido que se liga ao cGAMP possuindo uma estrutura que compreende as seguintes características: A L B em que: A é ou compreende uma fração que se encaixa no sítio de ligação à adenosina da cGAS; B é ou compreende uma fração que se encaixa no sítio de ligação à guanosina da cGAS; e opcionalmente, L é uma fração ligante que liga A e B de modo que permite que A e B adotem interações apropriadas para se ligarem à cGAS.
[000139] Em algumas modalidades, o polipeptídeo que se liga ao cGAMP é cGAS. Em algumas modalidades, o polipeptídeo que se liga ao cGAMP é STING.
[000140] Em algumas modalidades, A é o Anel A, tal como definido abaixo e descrito nas classes e subclasses aqui, individualmente e em combinação. Em algumas modalidades, A realiza opcionalmente uma ou mais interações com cGAS em um ou mais sítios selecionados a partir do grupo que consiste em Ser199, Ser420, Lys402, Glu211, Asp213, Asp307, Tyr421, Arg364, e suas combinações. Em algumas modalidades, A realiza opcionalmente uma ou mais interações com cGAS em um ou mais sítios selecionados a partir do grupo que consiste em Tyr421, Asp213, Asp307, Arg364, e suas combinações.
[000141] Em algumas modalidades, B é o Anel B, tal como definido abaixo e descrito nas classes e subclasses aqui, individualmente e em combinação. Em algumas modalidades, B realiza opcionalmente uma ou mais interações com cGAS em um ou mais sítios selecionados a partir do grupo que consiste em Tyr421, Thr197, Ser366, Ser368, Arg364, e suas combinações.
[000142] Em algumas modalidades, uma fração ligante é um ligante adequado para ligar covalentemente A e B e que permite que A e B adotem interações apropriadas para se ligarem à cGAS. Em algumas modalidades, um ligante juntamente com A e/ou B compreende um nucleosídeo contendo opcionalmente um ou mais grupos fosfato. Em algumas modalidades, um ligante juntamente com A e B compreende um dinucleosídeo cíclico contendo opcionalmente um ou mais grupos fosfato. Em algumas modalidades, um modulador é um análogo de GMP-AMP cíclico.
[000143] Em algumas modalidades, uma fração ligante compreende um ou mais grupos ribose ou fosfato. Em algumas modalidades, tais grupos ribose e fosfato, juntamente com o Anel A ou B, formam um ribonucleotídeo. Em algumas modalidades, um modulador compreende um ou mais ribonucleotídeos modificados. Ribonucleotídeos modificados são bem conhecidos na técnica, e incluem modificações feitas a um grupo fosfato, grupo ribose, grupo de bases nucleotídicas, e suas combinações. A presente invenção contempla todos os possíveis ribo- nucleotídeos modificados para moduladores e compostos aqui descritos. Em algumas modalidades, estas modificações aumentam a estabilidade do composto in vivo. Em algumas modalidades, as modificações aumentam a resiliência composto às fosfodiesterases.
[000144] Em algumas modalidades, um ligante compreende um grupo fosfodiéster modificado. Tais modificações são conhecidas na técnica e incluem, sem limitação, a substituição dos fosfodiésteres por fosforotioatos, fosforotioatos quirais, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquil-fosfotriésteres, metila e outros fosfonatos de alquila, incluindo fosfonatos de 3'-alquileno, fosfonatos de 5'-alquileno e fosfonatos quirais, fosfinatos, fosforamidatos incluindo 3'-amino fosforoamidato e aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, selenofosfatos, boranofosfatos, e suas combinações. Em algumas modalidades, um fosfodiéster é modificado para um fosforamidato. Fosforamidatos adequados incluem, sem limitação, aqueles presentes na lista disponível em www.glenresearch.com/Reference/StructureListing.php, cujo conteúdo total está aqui incorporado por referência.
[000145] Em algumas modalidades, um ligante não incluir fósforo. Em algumas modalidades, um ligante compreende uma ligação alquila ou cicloalquila de cadeia curta internucleosídeos, heteroátomo misto e ligações alquila ou cicloalquila internucleosídeos, ou uma ou mais ligações heteroatômicas ou ligações heterocíclicas internucleosídeos. Estas incluem aquelas que possuem ligações de morfolina (formadas, em parte, a partir da fração de açúcar de um nucleosídeo); frações de siloxano; frações de sulfeto, sulfóxido e sulfona; frações de amidas, carboxilatos, formacetila e tioformacetil; frações de formacetila de meti- leno e tioformacetil; frações de riboacetil; frações contendo alqueno; frações de sulfamato; frações de metileneimina e metileno-hidrazina; frações de sulfonato e sulfonamida; frações de amida; e outras apresentando partes misturadas de componentes N, O, S e CH2.
[000146] Além disso, um ligante de fosfodiéster pode ser modificado para melhorar a estabilidade do composto. Por exemplo, em certos casos, a ligação P=O é alterada para uma ligação P=S que não é tão suscetível à degradação por nucleases in vivo. Em certos casos, o grupo hidroxila C-2 da fração de açúcar de um nucleotídeo é convertido a um alquila ou heteroalquila éter. Esta modificação torna o oligo- nucleotídeo menos propenso à degradação nucleolítica.
[000147] A modificação adicional do fosfodiéster é descrita por Dellinger et al. Curr Protoc Nucleic Acid Chem. 2004 Oct; Chapter 4:Unit 4; Marshall et al. Science. 1993 Mar 12;259(5101):1564-70, cujo conteúdo total está aqui incorporado por referência.
[000148] Uma fração ligante pode também compreender uma ou mais frações modificadas de ribose. Em algumas modalidades, um li- gante compreende uma ribose modificada com um dos seguintes na posição 2' ou 3': OH; F; O-, S- ou N-alquil; O-, S- ou N-alquenil; O-, Sou N-alquinil; ou O-alquil-O-alquila, em que o alquila, alquenila e al- quinila podem ser substituídos ou não substituídos de C1 a C10 alquila ou de C2 a C10 alquenila e alquinila. Em algumas modalidades, as modificações 2' ou 3' incluem: 2'-O-Me, 2'-O-MOE, 2'-O-alila, 2'-O- dinitrofosfato, 2'-fluoro, 2'-tio, 2'-aminoetila, 2'-guanidinopropila. Em algumas modalidades, as modificações 2' ou 3' incluem: O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 e O(CH2)nON[(CH2)CH3]2, em que n e m são de 1 a cerca de 10. Em algumas modalidades, um ligante compreende uma ribose modificada posição 2' ou 3' com: C1 a C10 alquila inferior, alquila inferior substituído, alquenila, alquinila, alcarila, aralquila, O-alcarila ou O-aralquila, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N, NH2, heterocicloalquila, heterocicloalcarila, aminoalqui- lamina, polialquilamina, silila substituído, um grupo de clivagem de RNA, um grupo repórter, um intercalador, um grupo para melhorar as propriedades farmacocinéticas de um oligonucleotídeo, ou um grupo para melhorar as propriedades farmacodinâmicas de um oligonucleotí- deo e outros substitutos possuindo propriedades semelhantes. Em algumas modalidades, uma modificação inclui 2'-O-metoxietil(2'-O- CH2CH2OCH3, também conhecido como 2'-O-(2-metoxietila) ou 2'- metoxietóxi ou 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486504) ou seja, um grupo alcoxialcóxi. Outra modificação preferida adicional inclui 2'-dimetilamino-oxietóxi, ou seja, um grupo O(CH2)2ON(CH3)2, tb conhecido como 2-DMAOE, e 2‘-dimetilamino- etoxietóxi (tb conhecido na técnica como 2'-O-dimetil-amino-etóxi-etila ou 2‘-DMAEOE), ou seja, 2'-O—CH2—O—CH2—N(CH3)2. Outras modificações a um ligante de ribose incluem 2'-metóxi (2'-O—CH3), 2'- aminopropóxi (2'-OCH2CH2CH2NH2), 2'-alila (2'-CH2—CH=CH2), 2'-O- alila (2'-O—CH2—CH=CH2) e 2'-fluoro (2'-F). A modificação 2' pode ocorrer na posição arabino (acima) ou na posição ribo (abaixo). Em algumas modalidades, uma modificação 2'-arabino é 2'-F.
[000149] Modificações semelhantes também podem ser feitas em outras posições no oligonucleotídeo, em particular na posição 3' do açúcar na extremidade terminal 3' do nucleotídeo e na posição 5'. Os oligonucleotídeos também podem possuir miméticos de açúcar, tais como frações ciclobutila, no lugar do açúcar pentofuranosila.
[000150] Em algumas modalidades, uma ribose ligante é modificada para uma ácido nucleico bloqueado (LNA) no qual o grupo 2'-hidroxila está ligado ao átomo de carbono 3' ou 4' do anel de açúcar, formando assim uma fração bicíclica de açúcar. A ligação é preferencialmente um grupo metileno (—CH2—) n ligando o átomo de oxigênio 2' ao átomo de carbono 4', em que n é 1 ou 2. Os LNAs e sua preparação são descritos na Publicação de Patente Internacional Nos. WO 98/39352 e WO 99/14226, cujo conteúdo completo está aqui incorporado por referência. Em algumas modalidades, o LNA forma uma fração:
Figure img0001
[000151] Em certas modalidades, um ligante compreende uma fração de hexose. Em algumas modalidades, a hexose é glicose ou ma- nose. Em certos casos, a fração de açúcar ribose é substituída por um grupo ciclo-hexenila ou anel heteroalquila policíclico. Em algumas modalidades, a fração de açúcar ribose é substituída por um grupo morfo- lina. Modificações adicionais da ribose são discutidas por Engels, New Biotechnology, Vol. 30, 3, p. 302 (2013), cujo conteúdo completo está aqui incorporado por referência.
[000152] Em algumas modalidades A ou B é uma nucleobase não modificada ou natural selecionada a partir de adenina (A) e guanina (G) e as bases pirimidínicas timina (T), citosina (C) e uracila (U). Em algumas modalidades, A ou B é uma nucleobase modificada. As nu- cleobases modificadas são conhecidas na técnica e incluem, sem limitação, nucleobases sintéticas e naturais, tais como as nucleobases 5- metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetila citosina, xantina, hipoxantina, 2- aminoadenina, 6-metila e outros derivados alquila de adenina e guani- na, 2-propila e outros derivados alquila de adenina e guanina, 2- tiouracila, 2-tiotimina e 2-tiocitosina, 5-halouracila e citosina, 5- propinila (—C=C—CH3) uracila e citosina e outros derivados alquinila de bases pirimidínicas, 6-azo uracila, citosina e timina, 5-uracila (pseudouracila), 4-tiouracila, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquila, 8- hidroxila e outras adeninas e guaninas 8-substituídas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometila e outras uracilas e citosinas 5- substituídas, 7-metilguanina e 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino- adenina, 8-azaguanina e 8-aza-adenina, 7-desazaguanina e 7-desaza- adenina e 3-desazaguanina e 3-desaza-adenina. Outras nucleobases modificadas incluem pirimidinas tricíclicas tais como fenoxazina citidi- na(1H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), fenotiazina citidi- na(1H-pirimido[5,4-b][1,4]benzotiazin-2(3H)-ona), grampos G tais como uma fenoxazina citidina substituída (por exemplo, 9-(2-aminoetóxi)- H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), carbazol citidina (2H- pirimido[4,5-b]indol-2-ona), piridoindol citidina (H-pirido [3',2':4,5]pirrolo[2,3-d]pirimidin-2-ona). As nucleobases modificadas podem também incluir aquelas em que a base purínica ou pirimidínica é substituída por outros heterociclos, por exemplo, 7-desaza-adenina, 7-desazaguanosina, 2-aminopiridina e 2-piridona. Outras nucleobases incluem aquelas reveladas na Pat. US 3.687.808, aquelas reveladas em The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, aquelas reveladas por Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, e aquelas reveladas por Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993. Em algumas modalidades, uma nucleobase não natural é difluorotolila, nitropirrolila, ou nitroimi- dazolila. Em certas modalidades, uma nucleobase não natural é 7-desaza-adenina, 3-desaza-adenina, N1-metil-guanosina, 6-tiogua- nosina, 2-pirimidinona, 4-tiouridina, 2-piridinona, 5-propinil-uridina, imi- dazol-4-carboxamida, 5-nitroindol, 3-nitropirrol, 2-aminopurina, 5-metil- 2-pirimidinona, N3-tioetiltimidina, 6-tiopurina, 5-iodouridina, 8-azido- adenosina, 5-mercaptouridina, ou aquelas derivadas de 5-bromo- uracila, diaminopurina, 2-tiouracila, 4-tiouracila, pseudouracila, difluo- rotolueno, e di-hidrouracila. As nucleobases modificadas adicionais incluem aquelas encontradas em www.glenresearch.com/Reference/StructureListing.php e www.thermoscientificbio.com/rna-princing-and-modifications/, cujo conteúdo completo de cada um está aqui incorporado por referência. Modificações adicionais são discutidas por Verma et al. Annu. Rev. Bio- chem. 1998. 67:99-134.
[000153] Em algumas modalidades, uma fração ligante compreende um grupo que substitui um fosfodiéster e os grupos ribose de um ribo- nucleotídeo. Tal ligante é referido como um ácido nucleico peptídico (PNA). Em compostos PNA, a estrutura usual de açúcar de um oligo- nucleotídeo é substituída por uma estrutura contendo amida, por exemplo, uma estrutura de aminoetilglicina. As nucleobases são retidas e estão ligadas direta ou indiretamente aos átomos de nitrogênio aza da fração amida da estrutura. Patentes dos Estados Unidos representativas que ensinam a preparação de compostos PNA incluem, entre outras, Patentes US 5.539.082; 5.714.331; e 5.719.262, cada uma das quais está aqui incorporada por referência. Além disso, ensinamento de compostos PNA podem ser encontrados em Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500; Nielsen et al., Chem. Soc. Rev., 1997,26, 73-78; Shakeel et al., Journal of Chemical Technology & Bio-technology, Volume 81, Number 6, June 2006 , pp. 892-899(8); Nielsen, CHEMISTRY & BIODIVERSITY - Vol. 7 (2010), p. 786.
[000154] Estes e outros ligantes adequados são discutidos nas Patentes US 7.365.058, 8.101.348, 8.088.902, 7.579.451, 7.582.744, 8.334.373, 8.017.762, 7.919.612, 7.812.149, e 7.723.508, cujo conteúdo completo de cada uma está aqui incorporado por referência.
[000155] Em algumas modalidades, a presente invenção apresenta um composto de fórmula I:
Figure img0002
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: o Anel A é selecionado a partir do grupo consistindo em:
Figure img0003
o Anel B é selecionado a partir do grupo consistindo em:
Figure img0004
cada X1 e X2 é, independentemente, -CR- ou -N-; X3 é -C(R)2-, -O- ou -NR-; Xa e Xb são, independentemente, -C(R)2-, -C(R)=C(R)-, -O-, -S-, -S(O)-, -S(O)2- ou -N(R)-; Xa1 e Xb1 são, independentemente, -C(R)- ou -N-; Xc e Xd, quando presentes, independentemente, são oxigênio opcionalmente substituído, enxofre opcionalmente substituído, um átomo de nitrogênio substituído, BH3 ou C1-12 alifático opcionalmente substituído; cada Xe e Xf é, independentemente, -O-, -S-, ou -N(R)-; cada W é, independentemente, P ou S; cada R1 e R2 é, independentemente, selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, -NO2, -CN, -ORa, -SR, -N(R)2, -C(O)R, -CO2R, -C(O)C(O)R, -C(O)CH2C(O)R, -S(O)R, -S(O)2R, -C(O)N(R)2, -SO2N(R)2, -OC(O)R, -N(R)C(O)R, -N(R)N(R)2, -N(R)C(=NR)N(R)2, -C(=NR)N(R)2, -C=NOR, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)SO2N(R)2, -N(R)SO2R, -OC(O)N(R)2, e C1-12 alifático ou C1-4 alcóxi-C1-4 alquila opcionalmente substituído; cada R3, R4, R5, R6, R7, R10 e R11 é, independentemente, selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, -NO2, -CN, -OR, -SR, -N(R)2, -C(O)R, -CO2R, -C(O)C(O)R, -C(O)CH2C(O)R, -S(O)R, -S(O)2R, -C(O)N(R)2, -SO2N(R)2, -OC(O)R, -N(R)C(O)R, -N(R)N(R)2, -N(R)C(=NR)N(R)2, -C(=NR)N(R)2, -C=NOR, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)SO2N(R)2, -N(R)SO2R, -OC(O)N(R)2, ou um grupo opcionalmente substituído selecionado a partir de C1-12 alifático, fenila, um anel carbocíclico monocíclico saturado ou parcialmente insaturado de 3-7 membros, um anel carbocíclico bicíclico saturado ou parcialmente insaturado de 7-10 membros, um anel heterocí- clico saturado ou parcialmente insaturado de 3-7 membros possuindo 1-2 heteroátomos selecionados independentemente a partir de nitrogênio, oxigênio ou enxofre, um anel heterocíclico bicíclico saturado ou parcialmente insaturado de 7-10 membros possuindo 1-3 heteroáto- mos selecionados independentemente a partir de nitrogênio, oxigênio ou enxofre, e um anel heteroarila de 5-6 membros possuindo 1-3 hete- roátomos independentemente selecionados a partir de nitrogênio, oxi-gênio ou enxofre; cada R8 e R9, quando presente, é independentemente sele-cionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, -NO2, -CN, -ORa, -SR, -N(R)2, -C(O)R, -CO2R, -C(O)C(O)R, -C(O)CH2C(O)R, -S(O)R, -S(O)2R, -C(O)N(R)2, -SO2N(R)2, -OC(O)R, -N(R)C(O)R, -N(R)N(R)2, -N(R)C(=NR)N(R)2, -C(=NR)N(R)2, -C=NOR, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)SO2N(R)2, -N(R)SO2R, -OC(O)N(R)2, e C1-12 alifático opcionalmente substituído; cada R é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio ou um grupo opcionalmente substituído selecionado a partir de C1-6 alifático, fenila, um anel carbocíclico saturado ou parcialmente insaturado de 3-7 membros, um anel heterocícli- co monocíclico saturado ou parcialmente insaturado de 3-7 membros possuindo 1-2 heteroátomos selecionados independentemente a partir de nitrogênio, oxigênio ou enxofre, ou um anel heteroarila de 5-6 membros possuindo 1-3 heteroátomos independentemente selecionados a partir de nitrogênio, oxigênio ou enxofre; ou: dois grupos R no mesmo nitrogênio são reunidos com os seus átomos intervenientes para formar um anel heteroarila saturado ou parcialmente insaturado opcionalmente substituído de 3-7 membros possuindo 1-4 heteroátomos selecionados independentemente a partir de nitrogênio, oxigênio ou enxofre; e Ra um é um grupo protetor de oxigênio ou R.
[000156] Em algumas modalidades, o Anel A é
Figure img0005
[000157] Em algumas modalidades, o Anel A é
Figure img0006
[000158] Em algumas modalidades, o Anel A é
Figure img0007
[000159] Em algumas modalidades, o Anel B é
Figure img0008
[000160] Em algumas modalidades, o Anel B é
Figure img0009
[000161] Em algumas modalidades, X1 é -CR-. Em algumas modalidades, X1 é -N-. Em algumas modalidades, X2 é -CR-. Em algumas modalidades, X2 é -N-. Em algumas modalidades, X3 é -C(R)2-. Em algumas modalidades, X3 é -O-. Em algumas modalidades, X3 é -NR-.
[000162] Em certas modalidades, Xa é -C(R)2-. Em certas modalidades, Xa é -C(R)=C(R)-. Em certas modalidades, Xa é -O-. Em certas modalidades, Xa é -S-. Em certas modalidades, Xa é -S(O)-.
[000163] Em certas modalidades, Xa é -S(O)2-. Em certas modalidades, Xa é -NR-.
[000164] Em certas modalidades, Xb é -C(R)2-. Em certas modalidades, Xb é -C(R)=C(R)-. Em certas modalidades, Xb é -O-. Em certas modalidades, Xb é -S-. Em certas modalidades, Xb é -S(O)-. Em certas modalidades, Xb é -S(O)2-. Em certas modalidades, Xb é -NR-.
[000165] Em certas modalidades, Xa1 é -C(R)-. Em certas modalidades, Xa1 é -N-. Em certas modalidades, Xb1 é -C(R)-. Em certas moda- lidades, Xb1 é -N-.
[000166] Em algumas modalidades, Xc é oxigênio. Em algumas mo-dalidades, Xc é enxofre. Será apreciado que em certas modalidades em que Xc é oxigênio ou enxofre, o átomo de oxigênio ou enxofre pode possuir uma carga negativa formal. Em algumas modalidades, Xc é um átomo de nitrogênio substituído. Em algumas modalidades, o nitrogênio é substituído, independentemente, por hidrogênio ou grupos C1-12 alifático opcionalmente substituídos. Em algumas modalidades, Xc é C1-12 alifático opcionalmente substituído.
[000167] Em algumas modalidades, Xd é oxigênio. Em algumas mo-dalidades, Xd é enxofre. Será apreciado que em certas modalidades em que Xd é oxigênio ou enxofre, o átomo de oxigênio ou enxofre pode possuir carga negativa formal. Em algumas modalidades, Xd é um átomo de nitrogênio substituído. Em algumas modalidades, o nitrogênio é substituído, independentemente, por hidrogênio ou grupos C1-12 alifáticos opcionalmente substituídos. Em algumas modalidades, Xd é C1-12 alifático opcionalmente substituído.
[000168] Em algumas modalidades, Xe é -O-. Em algumas modalidades, Xe é -S-. Em algumas modalidades, Xe é -N(R)-.
[000169] Em algumas modalidades, Xf é -O-. Em algumas modalidades, Xf é -S-. Em algumas modalidades, Xf é -N(R)-.
[000170] Em algumas modalidades, W é P. Em outras modalidades, W é S.
[000171] Em algumas modalidades, R1 é hidrogênio, halogênio, -ORa, -SR, -N(R)2, e C1-12 alifático ou C1-4 alcóxi-C1-4 alquila opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R1 é hidrogênio. Em algumas modalidades, R1 é halogênio. Em algumas modalidades, R1 é -ORa. Em algumas modalidades, R1 é -OH. Em algumas modalidades, R1 é flúor. Em algumas modalidades, R1 é C1-12 alifático. Em algumas modalidades, R1 é C1-6 alifático. Em algumas modalidades, R1 é C1-3 alifático. Em algumas modalidades, R1 é metila. Em algumas modali-dades, R1 é C1-4 alcóxi-C1-4 alquila. Em algumas modalidades, R1 é me- tóxi-etila.
[000172] Em algumas modalidades, R2 é hidrogênio, halogênio, -ORa, -SR, -N(R)2, e C1-12 alifático ou C1-4 alcóxi-Ci-4 alquila opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R2 é hidrogênio. Em algumas modalidades, R2 é halogênio. Em algumas modalidades, R2 é - ORa. Em algumas modalidades, R2 é -OH. Em algumas modalidades, R2 é flúor. Em algumas modalidades, R2 é C1-12 alifático. Em algumas modalidades, R2 é C1-6 alifático. Em algumas modalidades, R2 é C1-3 alifático. Em algumas modalidades, R2 é metila. Em algumas modalidades, R2 é C1-4 alcóxi-C1-4 alquila. Em algumas modalidades, R2 é me- tóxi-etila.
[000173] Em algumas modalidades, R3 é hidrogênio, halogênio, -NO2, -CN, -OR, -SR, -N(R)2, -C(O)R, -CO2R, -C(O)C(O)R, - C(O)CH2C(O)R, -S(O)R, -S(O)2R, -C(O)N(R)2, -SO2N(R)2, -OC(O)R, -N(R)C(O)R, -N(R)N(R)2, -N(R)C(=NR)N(R)2, -C(=NR)N(R)2, -C=NOR, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)SO2N(R)2, -N(R)SO2R, -OC(O)N(R)2, ou C1-12 alifático opcionalmente substituído. Em certas modalidades, R3 é hidrogênio. Em algumas modalidades, R3 é halogênio. Em certas modalidades, R3 é -NO2. Em algumas modalidades, R3 é -CN. Em certas modalidades, R3 é -OR. Em algumas modalidades, R3 é C1-12 alifático. Em algumas modalidades, R3 é C1-6 alifático.
[000174] Em algumas modalidades, R4 é hidrogênio, halogênio, -NO2, -CN, -OR, -SR, -N(R)2, -C(O)R, -CO2R, -C(O)C(O)R, - C(O)CH2C(O)R, -S(O)R, -S(O)2R, -C(O)N(R)2, -SO2N(R)2, -OC(O)R, -N(R)C(O)R, -N(R)N(R)2, -N(R)C(=NR)N(R)2, -C(=NR)N(R)2, - C=NOR, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)SO2N(R)2, -N(R)SO2R, -OC(O)N(R)2, ou C1-12 alifático opcionalmente substituído. Em certas modalidades, R4 é hidrogênio. Em algumas modalidades, R4 é halogênio. Em certas modalidades, R4 é -NO2. Em algumas modalidades, R4 é -CN. Em certas modalidades, R4 é -OR. Em algumas modalidades, R4 é C1-12 alifático. Em algumas modalidades, R4 é C1-6 alifático.
[000175] Em algumas modalidades, R5 é hidrogênio, halogênio, -NO2, -CN, -OR, -SR, -N(R)2, -C(O)R, -CO2R, -C(O)C(O)R, - C(O)CH2C(O)R, -S(O)R, -S(O)2R, -C(O)N(R)2, -SO2N(R)2, -OC(O)R, -N(R)C(O)R, -N(R)N(R)2, -N(R)C(=NR)N(R)2, -C(=NR)N(R)2, O-C=NOR, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)SO2N(R)2, -N(R)SO2R, -OC(O)N(R)2, ou C1-12 alifático opcionalmente substituído. Em certas modalidades, R5 é hidrogênio. Em algumas modalidades, R5 é halogênio. Em certas modalidades, R5 é -NO2. Em algumas modalidades, R5 é -CN. Em certas modalidades, R5 é -OR. Em algumas modalidades, R5 é C1-12 alifático. Em algumas modalidades, R5 é C1-6 alifático.
[000176] Em algumas modalidades, R6 é hidrogênio, halogênio, -NO2, -CN, -OR, -SR, -N(R)2, -C(O)R, -CO2R, -C(O)C(O)R, - C(O)CH2C(O)R, -S(O)R, -S(O)2R, -C(O)N(R)2, -SO2N(R)2, -OC(O)R, -N(R)C(O)R, -N(R)N(R)2, -N(R)C(=NR)N(R)2, -C(=NR)N(R)2, - C=NOR, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)SO2N(R)2, -N(R)SO2R, -OC(O)N(R)2, ou C1-12 alifático opcionalmente substituído. Em certas modalidades, R6 é hidrogênio. Em algumas modalidades, R6 é halogênio. Em certas modalidades, R6 é -NO2. Em algumas modalidades, R6 é -CN. Em certas modalidades, R6 é -OR. Em algumas modalidades, R6 é C1-12 alifático. Em algumas modalidades, R6 é C1-6 alifático.
[000177] Em algumas modalidades, R7 é hidrogênio, halogênio, -NO2, -CN, -OR, -SR, -N(R)2, -C(O)R, -CO2R, -C(O)C(O)R, - C(O)CH2C(O)R, -S(O)R, -S(O)2R, -C(O)N(R)2, -SO2N(R)2, -OC(O)R, -N(R)C(O)R, -N(R)N(R)2, -N(R)C(=NR)N(R)2, -C(=NR)N(R)2, - C=NOR, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)SO2N(R)2, -N(R)SO2R, -OC(O)N(R)2, ou C1-12 alifático opcionalmente substituído. Em certas modalidades, R7 é hidrogênio. Em algumas modalidades, R7 é halogênio. Em certas modalidades, R7 é -NO2. Em algumas modalidades, R7 é -CN. Em certas modalidades, R7 é -OR. Em algumas modalidades, R7 é C1-12 alifático. Em algumas modalidades, R7 é C1-6 alifático.
[000178] Em algumas modalidades, R8 está presente. Em outras modalidades, R8 está ausente. Em algumas modalidades, R8 é hidro-gênio. Em algumas modalidades, R8 é halogênio. Em algumas modali-dades, R8 é -ORa. Em algumas modalidades, R8 é C1-12 alifático opci-onalmente substituído. Em algumas modalidades, R8 é C1-6 alifático. Em algumas modalidades, R8 é C1-3 alifático.
[000179] Em algumas modalidades, R9 está presente. Em outras modalidades, R9 está ausente. Em algumas modalidades, R9 é hidro-gênio. Em algumas modalidades, R9 é halogênio. Em algumas modali-dades, R9 é -ORa. Em algumas modalidades, R9 é C1-12 alifático opci-onalmente substituído. Em algumas modalidades, R9 é C1-6 alifático. Em algumas modalidades, R9 é C1-3 alifático.
[000180] Em algumas modalidades, R10 é hidrogênio, halogênio, -NO2, -CN, -OR, -SR, -N(R)2, -C(O)R, -CO2R, -C(O)C(O)R, -C(O)CH2C(O)R, -S(O)R, -S(O)2R, -C(O)N(R)2, -SO2N(R)2, -OC(O)R, -N(R)C(O)R, -N(R)N(R)2, -N(R)C(=NR)N(R)2, -C(=NR)N(R)2, -C=NOR, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)SO2N(R)2, -N(R)SO2R, -OC(O)N(R)2, ou C1-12 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R10 é fenila opcionalmente substituído, um anel carbocíclico monocícli- co saturado ou parcialmente insaturado de 3-7 membros, um anel he- terocíclico saturado ou parcialmente insaturado de 3-7 membros pos-suindo 1-2 heteroátomos selecionados independentemente a partir de nitrogênio, oxigênio ou enxofre, ou um anel heteroarila de 5-6 membros possuindo 1-3 heteroátomos independentemente selecionados a partir de nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Em certas modalidades, R10 é hidrogênio. Em algumas modalidades, R10 é halogênio. Em algumas modalidades, R10 é C1-12 alifático. Em algumas modalidades, R10 é C1-6 alifático.
[000181] Em algumas modalidades, R11 é hidrogênio, halogênio, -NO2, -CN, -OR, -SR, -N(R)2, -C(O)R, -CO2R, -C(O)C(O)R, -C(O)CH2C(O)R, -S(O)R, -S(O)2R, -C(O)N(R)2, -SO2N(R)2, -OC(O)R, -N(R)C(O)R, -N(R)N(R)2, -N(R)C(=NR)N(R)2, -C(=NR)N(R)2, -C=NOR, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)SO2N(R)2, -N(R)SO2R, -OC(O)N(R)2, ou C1-12 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R11 é fenila opcionalmente substituído, um anel carbocíclico monocícli- co saturado ou parcialmente insaturado de 3-7 membros, um anel he- terocíclico saturado ou parcialmente insaturado de 3-7 membros pos-suindo 1-2 heteroátomos selecionados independentemente a partir de nitrogênio, oxigênio ou enxofre, ou um anel heteroarila de 5-6 membros possuindo 1-3 heteroátomos independentemente selecionados a partir de nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Em certas modalidades, R11 é hidrogênio. Em algumas modalidades, R11 é halogênio. Em algumas modalidades, R11 é C1-12 alifático. Em algumas modalidades, R11 é C1-6 alifático.
[000182] Será apreciado que, para os compostos aqui descritos, em que fosfatos negativamente carregados são apresentados, a divulgação contempla ambas as formas livre e de sal de tais compostos, e seus tautômeros. Em algumas modalidades, um composto apresentado pode possuir um ou mais nitrogênios protonados que equilibram a carga de um fosfato livre.
[000183] Em algumas modalidades, a presente invenção apresenta um composto de fórmula II:
Figure img0010
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que cada um do Anel A, Anel B, Xa, Xb, Xc, Xd, Xe, Xf, Xa1, Xb1, X2, X3, W, R1, R2, R6, R7, R8, R9, R10 e R11 é como definido acima e descrito nas classes e subclasses aqui, individualmente e em combinação.
[000184] Em algumas modalidades, um composto apresentado é outro além de:
Figure img0011
[000185] Em algumas modalidades, um composto apresentado pos- sui fórmula I-a ou II-a:
Figure img0012
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[000186] Em algumas modalidades, um composto apresentado possui fórmula III, IV, V, VI, VII, VIII ou IX:
Figure img0013
Figure img0014
Figure img0015
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que cada um do Anel A, Xc, Xd, Xe Xf, R1, R2, R6, R7, R8, R9, X2, e X3 é como definido acima e descrito em classes e subclasses aqui, individu- almente e em combinação.
[000187] Em algumas modalidades, um composto apresentado possui fórmula X, XI, XII, XIII, XIV, XV ou XVI:
Figure img0016
Figure img0017
Figure img0018
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que cada um do Anel A, Xc, Xd, Xe, Xf, R1, R2, R6, R7, R8, R9, X2 e X3 é como definido acima e descrito nas classes e subclasses aqui, isoladamente e em combinação.
[000188] Em algumas modalidades, um composto apresentado é se- lecionado a partir de:
Figure img0019
Figure img0020
Figure img0021
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que cada um do Anel A, Xc, Xd, Xe, Xf, R1, R2, R6, R7, R8, R9, X2 e X3 é como definido acima e descrito nas classes e subclasses aqui, isoladamente e em combinação.
[000189] Em algumas modalidades, um composto apresentado é se- lecionado a partir de:
Figure img0022
Figure img0023
Figure img0024
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que cada um do Anel A, Xc, Xd, Xe, Xf, R1, R2, R6, R7, R8, R9, X2 e X3 é como definido acima e descrito nas classes e subclasses aqui, isoladamente e em combinação.
[000190] Em algumas modalidades, um composto apresentado é se- lecionado a partir de:
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Figure img0026
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[000191] Será apreciado que os compostos ilustrados no parágrafo imediatamente precedente podem ser desenhados utilizando outras convenções. Por exemplo, os dois compostos a seguir são considerados equivalentes em estrutura química e estereoquímica:
Figure img0027
[000192] Em algumas modalidades, os compostos apresentados estão em forma isolada. Em algumas modalidades, os compostos apresentados são puros.
Composições Farmacêuticas
[000193] As composições farmacêuticas apresentadas podem estar em diversas formas, incluindo formas de dosagem oral, cremes tópicos, adesivos tópicos, formas de iontoforese, supositório, spray nasal e inalador, colírios, formas para injeção intraocular, formas de depósi- to, assim como soluções injetáveis e infundíveis. Os métodos para preparar a composição farmacêutica são bem conhecidos na técnica.
[000194] As composições farmacêuticas contêm tipicamente o princípio ativo aqui descrito, em uma quantidade eficaz para alcançar o efeito terapêutico desejado, evitando ou minimizando os efeitos colaterais adversos. Preparações e sais farmaceuticamente aceitáveis do princípio ativo são apresentados aqui e são bem conhecidos na técnica. Para a administração de moduladores da cGAS e semelhantes, a quantidade administrada desejavelmente é escolhida de modo que seja terapeuticamente eficaz com poucos ou nenhum efeito colateral adverso. A quantidade da composição terapêutica ou farmacêutica que é eficaz no tratamento de uma determinada doença, distúrbio ou condição depende da natureza e gravidade da doença, do sítio-alvo de ação, do peso do sujeito, de dietas especiais sendo seguidas pelo sujeito, de medicações concomitantes sendo usadas, da via de administração e de outros fatores que são reconhecidos pelos versados na técnica. A dosagem pode ser adaptada pelo clínico de acordo com fatores convencionais, tais como a extensão da doença e os diferentes parâmetros do sujeito. As doses eficazes podem ser extrapoladas a partir de curvas de dose-resposta derivadas de sistemas de teste em modelos in vitro ou com animais (por exemplo, como descrito pelo Departamento de Saúde e Serviços Humanos, Food and Drug Administration, e Centro de Avaliação e Pesquisa de Fármacos dos Estados Unidos em "Guidance for Industry: Estimating Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers", Pharmacology and Toxicology, July 2005, cujo conteúdo completo está aqui incorporado por referência).
[000195] Vários sistemas de liberação são conhecidos e podem ser utilizados para administrar o princípio ativo aqui descrito ou uma com-posição farmacêutica compreendendo o mesmo.
[000196] As composições farmacêuticas aqui descritas podem ser administradas por qualquer via adequada incluindo, entre outras, por via entérica, gastroentérica, epidural, oual, transdérmica, epidural (peridural), intracerebral (no cérebro), intracerebroventricular (nos ventrículos cerebrais), epicutânea (aplicação sobre a pele), intradérmica, (na própria pele), subcutânea (sob a pele), administração nasal (através do nariz), intravenosa (em uma veia), intra-arterial (em uma artéria), intramuscular (no músculo), intracardíaca (no coração), infusão intra- óssea (na medula óssea), intratecal (no canal medular), intraperitoneal (infusão ou injeção no peritôneo), infusão intravesical, intravítrea (através do olho), injeção intracavernosa (na base do pênis), administração intravaginal, intrauterina, administração extra-amniótica, transdérmica (difusão através da pele intacta para distribuição sistêmica), transmucosa (difusão através de uma membrana mucosa), insuflação (aspiração), sublingual, sublabial, enema, colírio (sobre a conjuntiva) ou em gotas para os ouvidos. Em modalidades específicas, as composições podem ser administradas de modo a permitir que elas atravessem a barreira hematoencefálica, barreira vascular, ou outra barreira epitelial. Outros sistemas de liberação bem conhecidos na técnica podem ser utilizados para a liberação de composições farmacêuticas aqui descritas, por exemplo, por meio de soluções aquosas, encapsulamento em micropartículas ou microcápsulas. As composições farmacêuticas da presente invenção também podem ser liberadas em um sistema de liberação controlada. Por exemplo, um material polimérico pode ser usado (ver, por exemplo, Smolen and Ball, Controlled Drug Bioavaila-bility, Drug product design and performance, 1984, John Wiley & Sons; Ranade and Hollinger, Drug Delivery Systems, pharmacology and toxi-cology series, 2003, 2nd edition, CRRC Press). Alternativamente, uma bomba pode ser usada (Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)). As composições aqui descritas também podem ser acopladas a uma classe de polímeros biodegradáveis úteis em alcançar a liberação controlada do fármaco, por exemplo, ácido poliláctico, poliortoéste- res, copolímeros de blocos anfipáticos ligados de forma cruzada e hi- drogéis, ácido poli-hidróxi-butírico e polidiidropiranos.
[000197] Tal como descrito acima, as composições farmacêuticas desejavelmente incluem um veículo farmaceuticamente aceitável. O termo veículo refere-se a diluentes, adjuvantes, excipientes ou transportadores com os quais os moduladores são administrados. Tais veículos farmacêuticos incluem líquidos estéreis, tais como água e óleos, incluindo óleo mineral, óleo vegetal (por exemplo, óleo de soja ou óleo de milho), óleo animal ou óleo de origem sintética. Soluções aquosas de glicerol e dextrose, bem como soluções salinas, também podem ser empregadas como veículos líquidos das composições farmacêuticas da presente invenção. A escolha do veículo depende de fatores bem conhecidos na técnica, tais como a natureza do peptídeo, derivado de peptídeo ou peptidomimético, sua solubilidade e outras propriedades fisiológicas, bem como o sítio-alvo de entrega e aplicação. Exemplos de veículos farmacêuticos adequados são descritos em Remington: The Science and Practice of Pharmacy por Alfonso R. Gennaro, 2003, 21th Edition, Mack Publishing Company. Além disso, os veículos adequados para administração oral são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, nas Patentes US 6.086.918, 6.673.574, 6.960.355, e 7.351.741 e no documento WO2007/131286, cujas revelações estão aqui incorporadas por referência.
[000198] Materiais farmaceuticamente adequados adicionais que podem ser incorporados em preparações farmacêuticas incluem promotores de absorção, incluindo aqueles que se destinam a aumentar a absorção paracelular, reguladores de pH e tampões, ajustadores de osmolaridade, conservantes, estabilizantes, antioxidantes, tensoativos, espessantes, emolientes, agentes dispersores, agentes aromatizantes, agentes corantes e agentes umidificadores.
[000199] Exemplos de excipientes farmacêuticos adequados incluem água, glicose, sacarose, lactose, glicol, etanol, monoestearato de gli- cerol, gelatina, farinha de amido (por exemplo, farinha de arroz), calcário, estearato de sódio, malte, cloreto de sódio, e semelhantes. As composições farmacêuticas compreendendo os moduladores podem assumir a forma de soluções, cápsulas, comprimidos, cremes, géis, pós, formulações de liberação prolongada e semelhantes. A composição pode ser formulada como um supositório, com aglutinantes e veículos tradicionais tais como triglicérides (ver Remington: The Science and Practice of Pharmacy por Alfonso R. Gennaro, 2003, 21th Edition, Mack Publishing Company). Tais composições contêm uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição terapêutica, juntamente com uma quantidade adequada de veículo de modo a fornecer a forma para administração apropriada ao sujeito. As formulações são elaboradas para se adequarem ao modo de administração e ao sítio-alvo de ação (por exemplo, um órgão ou tipo de célula em particular).
[000200] As composições farmacêuticas que compreendem o princípio ativo aqui descritas também incluem composições formuladas como formas neutras ou de sal. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles que se formam com grupos amina livres e aqueles que reagem com os grupos carboxila livres. Os sais não tóxicos de metais alcalinos, metais alcalinoterrosos e de amônia geralmente utilizados na indústria farmacêutica incluem sódio, potássio, lítio, cálcio, magnésio, bário, amônia e sais de zinco de protamina, os quais são preparados por métodos bem conhecidos na técnica. Também estão incluídos os sais não tóxicos por adição de ácido, que são geralmente preparados pela reação dos compostos da presente invenção com ácidos orgânicos ou inorgânicos adequados. Os sais representativos incluem os sais bromidrato, cloridrato, valerato, oxalato, oleato, laurea- to, borato, benzoato, sulfato, bissulfato, acetato, fosfato, tisolato, citrato, maleato, fumarato, tartarato, succinato, napsilato e semelhantes.
[000201] Exemplos de agentes de preenchimento ou aglutinantes que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção incluem acácia, ácido algínico, fosfato de cálcio (dibásico), carboximetilcelulo- se, carboximetilcelulose de sódio, hidroxietilcelulose, hidroxipropilcelu- lose, hidroxipropilmetilcelulose, dextrina, dextratos, sacarose, tilose, amido pré-gelatinizado, sulfato de cálcio, amilose, glicina, bentonita, maltose, sorbitol, etilcelulose, hidrogenofosfato dissódico, fosfato dis- sódico, pirossulfito dissódico, álcool polivinílico, gelatina, glicose, goma de guar, glicose líquida, açúcar compressível, silicato de magnésio e alumínio, maltodextrina, óxido de polietileno, polimetacrilatos, povido- na, alginato de sódio, tragacanto, celulose microcristalina, amido e ze- ína. Em certas modalidades, um material de preenchimento ou aglutinante é celulose microcristalina.
[000202] Exemplos de agentes de desintegração que podem ser usados incluem o ácido algínico, carboximetilcelulose, carboximetilce- lulose de sódio, hidroxipropilcelulose (pouco substituída), celulose mi- crocristalina, celulose em pó, dióxido de silício coloidal, croscarmelose de sódio, crospovidona, metilcelulose, polacrilina de potássio, povido- na, alginato de sódio, amido glicolato de sódio, amido, bissulfito dissó- dico, edatamila dissódico, edetato dissódico, polivinilpirrolidonas com ligação cruzada ao ácido etilenodiamino tetra-acético dissódico (EDTA), amido pré-gelatinizado, amido de carboximetila, amido de carboximetila de sódio, celulose microcristalina.
[000203] Exemplos de lubrificantes incluem estearato de cálcio, óleo de canola, palmitoestearato de glicerila, óleo vegetal hidrogenado (tipo I), óxido de magnésio, estearato de magnésio, óleo mineral, poloxâme- ro, polietileno glicol, laurila sulfato de sódio, estearato de fumarato de sódio, ácido esteárico, talco, estearato de zinco, glicerila beenato, lau- rila sulfato de magnésio, ácido bórico, benzoato de sódio, acetato de sódio, benzoato de sódio/acetato de sódio (em combinação), DL- leucina.
[000204] Exemplos de condicionadores do fluxo de sílica incluem dióxido de silício coloidal, silicato de alumínio e magnésio e goma de guar. Outro condicionador de fluxo de sílica mais preferido consiste em dióxido de silício.
[000205] Exemplos de agentes estabilizadores incluem acácia, albumina, álcool polivinílico, ácido algínico, bentonita, fosfato dicálcico, carboximetilcelulose, hidroxipropilcelulose, dióxido de silício coloidal, ciclodextrinas, monoestearato de glicerila, hidroxipropilmetila celulose, trissilicato de magnésio, silicato de alumínio e magnésio, propilenogli- col, propileno alginato de glicol, alginato de sódio, cera de carnaúba, goma xantana, amido, estearato(s), ácido esteárico, monoglicerídeo esteárico e álcool estearílico.
[000206] Em algumas modalidades, a presente invenção contempla formulações orais que contêm o princípio ativo aqui descrito. Por exemplo, as composições farmacêuticas aqui descritas podem incluir uma ciclodextrina ou derivado de ciclodextrina. As ciclodextrinas são geralmente compostas por cinco ou mais unidades α-D- glicopiranosídicas ligadas l->4. Tipicamente, as ciclodextrinas contêm um certo número de monômeros de glicose variando de seis a oito unidades de um anel, criando uma forma cônica (α-ciclodextrina: molécula de anel de açúcar de seis membros, β-ciclodextrina: molécula de anel de açúcar de sete membros, Y-ciclodextrina: molécula de anel de açúcar de oito membros). Exemplos de ciclodextrinas e derivados de ciclodextrina são revelados na Patente US 7.723.304, Publicação US 2010/0196452, e Publicação US 2010/0144624, cujo conteúdo completo de cada uma está aqui incorporado por referência. Por exemplo, em algumas modalidades, uma ciclodextrina de acordo com a presente invenção é uma ciclodextrina alquilada, ciclodextrina hidro- xialquilada, ou ciclodextrina acilada. Em algumas modalidades, uma ciclodextrina é uma hidroxipropila β-ciclodextrina. Exemplos de derivados de ciclodextrina são descritos em Szejtli, J. Chem Rev, (1998), 98, 1743-1753; and Szente, L and Szejtli, J., Advance Drug Delivery Reviews, 36 (1999) 17-28, cujo conteúdo completo de cada está aqui incorporado por referência. Exemplos de derivados de ciclodextrina incluem ciclodextrinas metiladas (por exemplo, RAMEB; β-ciclodextrina aleatoriamente metilada); ciclodextrinas hidroxialquiladas (hidroxipro- pil-β-ciclodextrina e hidroxipropila Y—ciclodextrina); ciclodextrinas aceti- ladas (acetil—Y—ciclodextrina); ciclodextrinas reativas (clorotriazinila β- ciclodextrina); e ciclodextrinas ramificadas (glicosil- e maltosila β- ciclodextrina); acetil—Y—ciclodextrina; acetil—β—ciclodextrina, sulfobutila β— ciclodextrina, α—, β e Y—ciclodextrinas sulfatadas; ciclodextrinas sulfoal— quiladas; e hidroxipropila β—ciclodextrina.
Dosagem
[000207] Tipicamente, o princípio ativo aqui descrito em uma quanti— dade que varia de 0,001 a 100 mg/kg/dia é administrada ao sujeito. Por exemplo, em algumas modalidades, cerca de 0,01 mg/kg/dia a cerca de 25 mg/kg/dia, cerca de 1 mg/kg/dia a cerca de 20 mg/kg/dia, 0,2 mg/kg/dia a cerca de 10 mg/kg/dia, cerca de 0,02 mg/kg/dia a cer— ca de 0,1 mg/kg/dia, ou cerca de 1 mg/kg/dia a cerca de 100 mg/kg/dia são administrados ao sujeito. Em algumas modalidades, o princípio ativo aqui descrito em uma quantidade de cerca de 10 μg/kg/dia, 50 μg/kg/dia, 100 μg/kg/dia, 200 μg/kg/dia, 300 μg/kg/dia, 400 μg/kg/dia, 500 μg/kg/dia, 600 μg/kg/dia, 700 μg/kg/dia, 800 μg/kg/dia, 900 μg/kg/dia, ou 1000 μg/kg/dia é administrada ao sujeito.
[000208] Em algumas modalidades, o composto é administrado em uma dose eficaz variando de cerca de 1—1.000 μg/kg/dia (por exemplo, variando de cerca de 1—900 μg/kg/dia, 1—800 μg/kg/dia, 1—700 μg/kg/dia, 1-600 μg/kg/dia, 1-500 μg/kg/dia, 1-400 μg/kg/dia, 1-300 μg/kg/dia, 1-200 μg/kg/dia, 1-100 μg/kg/dia, 1-90 μg/kg/dia, 1-80 μg/kg/dia, 1-70 μg/kg/dia, 1-60 μg/kg/dia, 1-50 μg/kg/dia, 1-40 μg/kg/dia, 1-30 μg/kg/dia, 1-20 μg/kg/dia, 1-10 μg/kg/dia). Em algumas modalidades, o composto é administrado em uma dose eficaz variando de cerca de 1-500 μg/kg/dia. Em algumas modalidades, o composto é administrado em uma dose eficaz variando de cerca de 1-100 μg/kg/dia. Em algumas modalidades, o composto é administrado em uma dose eficaz variando de cerca de 1-60 μg/kg/dia. Em algumas modalidades, o composto é administrado em uma dose eficaz selecionada de cerca de 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, ou 1000 ug/kg/dia.
[000209] Em algumas modalidades, uma quantidade terapeutica- mente eficaz de um composto pode ser uma quantidade variando de cerca de 10-1000 mg (por exemplo, cerca de 20 mg - 1000 mg, 30 mg - 1.000 mg, 40 mg - 1.000 mg, 50 mg - 1,000 mg, 60 mg - 1.000 mg, 70 mg - 1.000 mg, 80 mg - 1.000 mg, 90 mg - 1000 mg, cerca de 10900 mg, 10-800 mg, 10-700 mg, 10-600 mg, 10-500 mg, 100-1000 mg, 100-900 mg, 100-800 mg, 100-700 mg, 100-600 mg, 100-500 mg, 100400 mg, 100-300 mg, 200-1000 mg, 200- 900 mg, 200-800 mg, 200700 mg, 200-600 mg, 200-500 mg, 200-400 mg, 300-1000 mg, 300900 mg, 300-800 mg, 300-700 mg, 300- 600 mg, 300-500 mg, 400 mg - 1.000 mg, 500 mg - 1.000 mg, 100 mg - 900 mg, 200 mg - 800 mg, 300 mg - 700 mg, 400 mg -700 mg, e 500 mg - 600 mg ). Em algumas modalidades, um composto está presente em uma quantidade igual ou maior que cerca de 10 mg, 50 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, 500 mg, 550 mg, 600 mg, 650 mg, 700 mg, 750 mg, 800 mg. Em algumas modalidades, um composto está presente em uma quantidade igual ou menor que cerca de 1000 mg, 950 mg, 900 mg, 850 mg, 800 mg, 750 mg, 700 mg, 650 mg, 600 mg, 550 mg, 500 mg, 450 mg, 400 mg, 350 mg, 300 mg, 250 mg, 200 mg, 150 mg, ou 100 mg. Em algumas modalidades, a quantidade tera- peuticamente eficaz aqui descrita é fornecida em uma única dose. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz aqui descrita é fornecida em um único dia.
[000210] Em outras modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser, por exemplo, de cerca de 0,001 mg/kg de peso a 500 mg/kg de peso, por exemplo, de cerca de 0,001 mg/kg de peso a 400 mg/kg de peso, de cerca de 0,001 mg/kg de peso a 300 mg/kg de peso, de cerca de 0,001 mg/kg de peso a 200 mg/kg de peso, de cerca de 0,001 mg/kg de peso a 100 mg/kg de peso, de cerca de 0,001 mg/kg de peso a 90 mg/kg peso, de cerca de 0,001 mg/kg de peso a 80 mg/kg de peso, de cerca de 0,001 mg/kg de peso a 70 mg/kg de peso, de cerca de 0,001 mg/kg de peso a 60 mg/kg de peso, de cerca de 0,001 mg/kg em peso a 50 mg/kg de peso, de cerca de 0,001 mg/kg de peso a 40 mg/kg de peso, de cerca de 0,001 mg/kg de peso a 30 mg/kg de peso, de cerca de 0,001 mg/kg de peso a 25 mg/kg de peso, de cerca de 0,001 mg/kg de peso a 20 mg/kg de peso, de cerca de 0,001 mg/kg de peso a 15 mg/kg de peso, de cerca de 0,001 mg/kg de peso a 10 mg/kg de peso. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz aqui descrita é fornecida em uma única dose. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz aqui descrita é fornecida em um único dia.
[000211] Em ainda outras modalidades, uma quantidade terapeuti- camente eficaz pode ser, por exemplo, de cerca de 0,0001 mg/kg de peso a 0,1 mg/kg de peso, por exemplo, de cerca de 0,0001 mg/kg de peso a 0,09 mg/kg de peso, de cerca de 0,0001 mg/kg de peso a 0,08 mg/kg de peso, de cerca de 0,0001 mg/kg de peso a 0,07 mg/kg de peso, de cerca de 0,0001 mg/kg de peso a 0,06 mg/kg de peso, de cerca de 0,0001 mg/kg de peso a 0,05 mg/kg peso, de cerca de 0,0001 mg/kg de peso a cerca de 0,04 mg/kg de peso, de cerca de 0,0001 mg/kg de peso a 0,03 mg/kg de peso, de cerca de 0,0001 mg/kg de peso a 0,02 mg/kg de peso, de cerca de 0,0001 mg/kg de peso a 0,019 mg/kg de peso, de cerca de 0,0001 mg/kg de peso a 0,018 mg/kg de peso, de cerca de 0,0001 mg/kg de peso a 0,017 mg/kg de peso, de cerca de 0,0001 mg/kg de peso a 0,016 mg/kg de peso, a partir de cerca de 0,0001 mg/kg de peso a 0,015 mg/kg de peso, de cerca de 0,0001 mg/kg de peso a 0,014 mg/kg de peso, de cerca de 0,0001 mg/kg de peso a 0,013 mg/kg de peso, de cerca de 0,0001 mg/kg de peso a 0,012 mg/kg de peso, de cerca de 0,0001 mg/kg de peso a 0,011 mg/kg de peso, de cerca de 0,0001 mg/kg de peso a 0,01 mg/kg de peso, de cerca de 0,0001 mg/kg de peso a 0,009 mg/kg de peso, a partir de cerca de 0,0001 mg/kg de peso a 0,008 mg/kg de peso, de cerca de 0,0001 mg/kg de peso a 0,007 mg/kg de peso, de cerca de 0,0001 mg/kg de peso a 0,006 mg/kg de peso, de cerca de 0,0001 mg/kg de peso a 0,005 mg/kg de peso, de cerca de 0,0001 mg/kg de peso a 0,004 mg/kg de peso, de cerca de 0,0001 mg/kg de peso a 0,003 mg/kg de peso, de cerca de 0,0001 mg/kg de peso a 0,002 mg/kg de peso. Em algumas modalidades, a dose terapeuticamente eficaz pode ser de 0,0001 mg/kg de peso, 0,0002 mg/kg de peso, 0,0003 mg/kg de peso, 0,0004 mg/kg de peso, 0,0005 mg/kg de peso, 0,0006 mg/kg de peso, 0,0007 mg/kg peso, 0,0008 mg/kg de peso, 0,0009 mg/kg de peso, 0,001 mg/kg de peso, 0,002 mg/kg de peso, 0,003 mg/kg de peso, 0,004 mg/kg de peso, 0,005 mg/kg de peso, 0,006 mg/kg de peso, 0,007 mg/kg de peso, 0,008 mg/kg de peso, 0,009 mg/kg de peso, 0,01 mg/kg de peso, 0,02 mg/kg de peso, 0,03 mg/kg de peso, 0,04 mg/kg de peso, 0,05 mg/kg de peso, 0,06 mg/kg de peso, 0,07 mg/kg de peso, 0,08 mg/kg de peso, 0,09 mg/kg de peso, ou 0,1 mg/kg de peso. A dose eficaz para um determinado indivíduo pode ser variada (por exemplo, aumentada ou diminuída) ao longo do tempo, dependendo das necessidades do indivíduo. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz aqui descrita é fornecida em uma única dose. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz aqui descrita é fornecida em um único dia.
[000212] Em algumas modalidades, uma formulação que compreende um composto, tal como aqui descrita, é administrada como uma dose única. Em algumas modalidades, uma formulação que compreende um composto, tal como aqui descrita, é administrada em intervalos regulares. A administração em um "intervalo", tal como aqui utilizado, indica que a quantidade terapeuticamente eficaz é administrada periodicamente (diferente de uma dose de uma só vez). O intervalo pode ser determinado por técnicas clínicas padrão. Em algumas modalidades, uma formulação que compreende um composto, tal como aqui descrita, é administrada bimensalmente, mensalmente, duas vezes ao mês, de três em três semanas, quinzenalmente, semanalmente, duas vezes por semana, três vezes por semana, diariamente, duas vezes ao dia, ou de seis em seis horas. O intervalo de administração para um único indivíduo não precisa ser um intervalo fixo, mas pode variar ao longo do tempo, dependendo das necessidades do indivíduo.
[000213] Tal como aqui utilizado, o termo "bimensalmente" significa a administração uma vez a cada dois meses; o termo "mensalmente" significa a administração uma vez por mês; o termo "de três em três semanas" significa a administração uma vez a cada três semanas; o termo "quinzenalmente" significa a administração uma vez a cada duas semanas; o termo "semanalmente" significa a administração uma vez por semana; e o termo "diariamente" significa a administração uma vez ao dia.
[000214] Em algumas modalidades, uma formulação que compreen- de um composto, tal como aqui descrita, é administrada em intervalos regulares indefinidamente. Em algumas modalidades, uma formulação que compreende um composto, tal como aqui descrita, é administrada em intervalos regulares por um período definido. Em algumas modalidades, uma formulação que compreende um composto, tal como aqui descrita, é administrada em intervalos regulares por 5 anos, 4 anos, 3 anos, 2 anos, 1 ano, 11 meses, 10 meses, 9 meses, 8 meses, 7 meses, 6 meses, 5 meses, 4 meses, 3 meses, 2 semanas, um mês, 3 semanas, 2, semanas, uma semana, 6 dias, 5 dias, 4 dias, 3 dias, 2 dias ou um dia.
Métodos de Utilização
[000215] Em certas modalidades, os compostos apresentados são úteis na medicina. Em algumas modalidades, os compostos apresentados são úteis no tratamento de doenças, distúrbios ou condições imunes. Em algumas modalidades, a presente invenção apresenta um método para o tratamento ou prevenção de uma doença, distúrbio ou condição imune compreendendo a administração a um sujeito em necessidade do composto apresentado ou de uma composição farmacêutica do mesmo.
[000216] Em algumas modalidades, a doença, distúrbio ou condição imune é uma doença, distúrbio ou condição autoimune. Em certas modalidades, a doença, distúrbio ou condição imune é selecionado a partir do grupo que consiste em qualquer uma de várias doenças, distúrbios e/ou condições, incluindo, entre outros, um ou mais dos seguintes: distúrbios autoimunes (por exemplo, diabetes, lúpus, esclerose múltipla, psoríase, artrite reumatoide); distúrbios inflamatórios (por exemplo, artrite, doença inflamatória pélvica); doenças infecciosas (por exemplo, infecções virais (por exemplo, HIV, HCV, RSV), infecções bacterianas, infecções fúngicas, sepse); transtornos neurológicos (por exemplo, mal de Alzheimer, doença de Huntington; autismo, distrofia muscular de Duchenne); distúrbios cardiovasculares (por exemplo, aterosclerose, hipercolesterolemia, trombose, distúrbios de coagulação, distúrbios angiogênicos, tais como degeneração macular); distúrbios proliferativos (por exemplo, câncer, neoplasias benignas); distúrbios respiratórios (por exemplo, doença pulmonar obstrutiva crônica); distúrbios digestivos (por exemplo, doença inflamatória intestinal, úlceras); distúrbios músculo-esqueléticos (por exemplo, fibromialgia, artrite); distúrbios endócrinos, metabólicos e nutricionais (por exemplo, diabetes, osteoporose); distúrbios urológicos (por exemplo, doença renal); transtornos psicológicos (por exemplo, depressão, esquizofrenia); doenças da pele (por exemplo, feridas, eczema); doenças do sangue e do sistema linfático (por exemplo, anemia, hemofilia); etc. Em algumas modalidades, a doença, distúrbio ou condição imune é caracterizado por inflamação. Em algumas modalidades, a doença, distúrbio ou condição imune é causado por, prolongado por, ou relacionado à ativação da cGAS. Em algumas modalidades, a doença, distúrbio ou condição imune é causado por, prolongado por, ou relacionados à ativação de STING.
[000217] Em algumas modalidades, o distúrbio ou doença autoimune é selecionado a partir de encefalomielite disseminada aguda (ADEM), doença de Addison, agamaglobulinemia, alopecia areata, esclerose lateral amiotrófica (também doença de Lou Gehrig; doença de neurônios motores), espondilite anquilosante, síndrome antifosfolipídica, síndrome antissintetase, alergia atópica, dermatite atópica, anemia aplásica autoimune, cardiomiopatia autoimune, enteropatia autoimune, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, doença autoimune da orelha interna, síndrome linfoproliferativa autoimune, neuropatia periférica autoimune, pancreatite autoimune, síndrome poliendócrina autoimune, dermatite autoimune por progesterona, púrpura tromboci- topênica autoimune, urticária autoimune, uveíte autoimune, doença Balo/esclerose concêntrica de Balo, doença de Behçet, doença de Berger, encefalite Bickerstaff, síndrome de Blau, câncer penfigoide bo- lhoso, doença de Castleman, doença celíaca, doença de Chagas, poli- neuropatia desmielinizante inflamatória crônica, osteomielite multifocal crônica recorrente, doença pulmonar obstrutiva crônica, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, síndrome de Cogan, doença por aglutininas a frio, deficiência do componente 2 do complemento, dermatite de contato, arterite craniana, síndrome CREST, doença de Crohn (doença inflamatória intestinal idiopática "IBD"), síndrome de Cushing, angiíte leucocitoclástica cutânea, doença de Dego, dermatite herpetiforme, dermatomiosite, diabetes mellitus tipo 1, esclerose sistêmica cutânea difusa, síndrome de Dressler, lúpus induzido por fár- macos, lúpus eritematoso discoide, eczema, endometriose, artrite relacionada à entesite, fasciíte eosinofílica, gastroenterite eosinofílica, epi- dermólise bolhosa adquirida, eritema nodoso, eritroblastose fetal, crio- globulinemia essencial mista, síndrome de Evan, fibrodisplasia ossifi- cante progressiva, alveolite fibrosante (ou fibrose pulmonar idiopática), gastrite, penfigoide gastrointestinal, glomerulonefrite, síndrome de Goodpasture, doença de Graves, síndrome de Guillain-Barré (GBS), en- cefalopatia de Hashimoto, tireoidite de Hashimoto, púrpura de Henoch- Schonlein, herpes gestacional também conhecido como penfigoide gestacional, hidradenite supurativa, síndrome de Hughes-Stovin, hipo- gamaglobulinemia, doenças desmielinizantes inflamatórias idiopáticas, fibrose pulmonar idiopática, púrpura trombocitopênica idiopática, ne- fropatia por IgA, miosite por corpos de inclusão, polineuropatia desmie- linizante inflamatória crônica, cistite intersticial, artrite juvenil idiopática também conhecida como artrite reumatoide juvenil, doença de Kawasaki, síndrome miastênica de Lambert-Eaton, vasculite leucocitoclásti- ca, líquen plano, líquen escleroso, doença de IgA linear (LAD), hepatite lupoide também conhecida como hepatite autoimune, lúpus eritema- toso, síndrome de Majeed, doença de Ménière, poliangiíte microscópica, síndrome de Miller-Fisher ver síndrome de Guillain-Barré, doença mista do tecido conjuntivo, morfeia, doença de Mucha-Habermann também conhecida como pitiríase liquenoide varioliforme aguda, esclerose múltipla, miastenia grave, miosite, narcolepsia, neuromielite óptica (também doença de Devic), neuromiotonia, penfigoide cicatricial ocular, síndrome de opsoclonia-mioclonia, tireoidite de Ord, reumatismo palindrômico, PANDAS (transtornos neuropsiquiátricos autoimunes pediátricos associados aos estreptococos), degeneração cerebelar pa- raneoplásica, hemoglobinúria paroxística noturna (PHN), síndrome de Romberg Parry, síndrome de Parsonage-Turner, Pars planitis, pênfigo vulgar, anemia perniciosa, encefalomielite perivenosa, síndrome POEMS, poliarterite nodosa, polimialgia reumática, polimiosite, cirrose biliar primária, colangite esclerosante primária, neuropatia inflamatória progressiva, psoríase, artrite psoriática, pioderma gangrenoso, aplasia pura da série vermelha, encefalite de Rasmussen, fenômeno de Raynaud, policondrite recidivante, síndrome de Reiter, síndrome das pernas inquietas, fibrose retroperitoneal, artrite reumatoide, febre reumática, sarcoidose, esquizofrenia, síndrome de Schmidt, síndrome de Schnitzler, esclerite, esclerodermia, doença do soro, síndrome de Sjogren, espondiloartropatia, doença de Still, endocardite bacteriana subaguda (SBE), síndrome de Susac, síndrome de Sweet, coreia de Sydenham ver PANDAS, oftalmia simpática, lúpus eritematoso sistêmico, arterite de Takayasu, arterite temporal (também conhecida como "arterite de células gigantes"), trombocitopenia, síndrome de Tolosa- Hunt, mielite transversa, colite ulcerativa (um dos dois tipos de doença inflamatória intestinal idiopática "IBD"), doença indiferenciada do tecido conjuntivo diferente da doença mista do tecido conjuntivo, espondiloar- tropatia indiferenciada, vasculite por urticária, vasculite, vitiligo e gra- nulomatose de Wegener.
[000218] Em certas modalidades, a administração de um composto a um paciente que dele necessite resulta em uma diminuição da atividade da cGAS. Em algumas modalidades, a administração de um composto a um paciente que dele necessite resulta em uma diminuição da atividade de STING.
[000219] Em algumas modalidades, os compostos utilizados nos métodos apresentados são preparados por síntese química.
[000220] Em certas modalidades, a presente invenção apresenta um método de inibição da cGAS compreendendo o contato da cGAS com um composto apresentado. Em algumas modalidades, a presente invenção apresenta um método de inibição da cGAS em um paciente compreendendo a administração de um composto apresentado a um paciente. Em certas modalidades, a presente invenção apresenta um método de inibição de STING compreendendo o contato de STING com um composto apresentado. Em algumas modalidades, a presente invenção apresenta um método de inibição de STING em um paciente compreendendo a administração de um composto apresentado a um paciente.
[000221] Em certas modalidades, a presente invenção apresenta um método para modular a atividade de um polipeptídeo da cGAS, sendo que o método compreende o contato do polipeptídeo da cGAS com um modulador da cGAS elaborado pelos métodos aqui descritos, que agente modulador não é um modulador, substrato, ou produto conhecido da cGAS. Em algumas modalidades, o agente modulador é um composto apresentado.
Kits
[000222] A invenção apresenta vários kits para conveniente e/ou efe-tivamente realizar os métodos da presente invenção. Tipicamente, os kits irão compreender quantidades e/ou números suficiente de componentes para permitir que um usuário realize múltiplos tratamentos de um ou mais sujeitos e/ou conduza vários experimentos.
[000223] Em um aspecto, a presente invenção apresenta kits com-preendendo as moléculas (compostos e composições, tal como descritos acima) da invenção. Em uma modalidade, o kit compreende um ou mais anticorpos funcionais ou fragmentos funcionais dos mesmos.
[000224] Os kits da invenção podem compreender uma ou mais moléculas precursoras de cGAMP, ou qualquer mimético, análogo ou variante da mesma. Os kits podem também incluir qualquer um dos variantes, derivados ou mutantes da cGAS aqui descritos. O kit pode ainda compreender embalagem e instruções e/ou um agente de liberação para formar uma composição da formulação. O agente de liberação pode compreender uma solução salina, uma solução tamponada, um lipídio ou qualquer agente de liberação aqui descrito.
[000225] Em uma modalidade, a solução tampão pode incluir cloreto de sódio, cloreto de cálcio, fosfato e/ou EDTA. Em uma outra modalidade, a solução tampão pode incluir, entre outros, solução salina, solução salina com cálcio 2 mM, sacarose 5%, sacarose 5% com cálcio 2 mM, manitol 5%, manitol 5% com cálcio 2 mM, Ringer lactato, cloreto de sódio, cloreto de sódio com cálcio 2 mM e manose (Ver, por exemplo, Pub. US 20120258046; aqui incorporado por referência em sua totalidade). Em outra modalidade, as soluções tampão podem ser precipitadas ou podem ser liofilizadas. A quantidade de cada componente pode variar para permitir formulações de tampão consistentes, reproduzíveis, simples ou de maior concentração salina. Os componentes podem também variar a fim de aumentar a estabilidade do composto ou composição na solução tampão ao longo de um período de tempo e/ou em várias condições. Num aspecto, a presente invenção fornece kits para aplicações de pesquisa relacionadas à atividade da cGAS ou sinalização de cGAMP, fornecidos em uma quantidade eficaz para estudar as vias de sinalização concomitantes quando introduzida em uma célula-alvo. Os kits podem ainda compreender um segundo ou novo composto ou composição aqui descrito. Tais segundas ou mais moléculas podem modular a resposta imune ou um processo inflamatório ou compreendem uma ou mais moléculas terapêuticas. Em uma modalidade, um kit compreende pelo menos um polipeptídeo da cGAS e pelo menos uma molécula de cGAMP. Em uma modalidade, os kits da presente invenção compreendem embalagem e instruções.
Estruturas Cristalinas da cGAS
[000226] Entre outras coisas, a presente invenção apresenta uma composição cristalina (ou seja, contendo pelo menos um cristal) ou cristalizável compreendendo um polipeptídeo da cGAS tal como aqui descrito (ver também Gao et al. Cell 153, 1094-1107 (2013), incluindo materiais complementares). Em algumas modalidades, tal composição apresentada consiste em ou consiste essencialmente no polipeptídeo da cGAS. Em algumas modalidades, uma composição é considerada "consistindo em" polipeptídeo da cGAS se incluir apenas o polipeptí- deo, um ou mais solventes e, opcionalmente, sais e/ou metais. Em algumas modalidades, tal composição apresentada inclui um ou mais outros agentes, tais como um ou mais outros polipeptídeos (por exemplo, um ou mais polipeptídeos ou ácidos nucleicos parceiros de ligação à cGAS possíveis ou reais) e/ou um ou mais agentes de interação (por exemplo, pequenas moléculas).
[000227] A presente invenção também apresenta informações estruturais e/ou análises de cristais do polipeptídeo da cGAS e/ou conjuntos destes. Em algumas modalidades, tais informações estruturais incluem, entre outras, padrões e/ou coordenadas de difração, bem como quaisquer conjuntos de dados, imagens, modelos e/ou representações gráficas dos mesmos ou gerados a partir dos mesmos. Em algumas modalidades, tais representações gráficas podem incluir, por exemplo, modelos de preenchimento de espaço, representações de superfície molecular, modelos de escudo ou limites, modelos de fitas, modelos de haste; e/ou suas combinações.
[000228] Em algumas modalidades, as informações fornecidas são ou compreendem diferenças observadas entre duas ou mais estruturas que diferem entre si na presença ou ausência de um ou mais parceiros de ligação e/ou agentes de interação. Em algumas modalidades, as informações fornecidas são ou compreendem diferenças observadas entre duas ou mais estruturas que diferem entre si na presença ou ausência de um ou mais parceiros de ligação e/ou um ou mais moduladores.
[000229] Em algumas modalidades, as informações estruturais e/ou análises podem ser realizadas de um meio concreto (por exemplo, um meio legível por computador) ou um ambiente de armazenamento. Assim, a presente invenção apresenta modalidades concretas das informações estruturais cristalinas do polipeptídeo da cGAS, bem como sua utilização, por exemplo, por ou com um sistema computadorizado, em qualquer uma de várias aplicações. Por exemplo, em algumas modalidades, as informações estruturais e/ou análises podem ser acessadas por, transportados para ou a partir de, e/ou de outra forma utilizadas por um sistema computadorizado ou programa que funciona no mesmo.
Projeto do Fármaco Baseado na Estrutura
[000230] Em algumas modalidades, a presente invenção apresenta sistemas para a identificação e/ou caracterização de moduladores da cGAS. Em algumas modalidades, a presente invenção apresenta um método para projetar ou caracterizar um modulador da cGAS compre-endendo as etapas de: fornecer uma imagem de um cristal da cGAS que inclua pelo menos um possível sítio de interação; acoplar, na imagem, pelo menos uma fração que seja um possível elemento estrutural modulador da cGAS; e avaliar uma ou mais características de uma possível interação entre fração e sítio de interação.
[000231] Em algumas modalidades, o pelo menos único possível sítio de interação inclui um sítio selecionado a partir do grupo que consiste em Ser199, Ser420, Lys402, Glu211, Asp213, Asp307, Tyr421, Arg364, e suas combinações. Em certas modalidades, o pelo menos único possível sítio de interação inclui um sítio selecionado a partir do grupo que consiste em Tyr421, Thr197, Ser366, Ser368, Arg364, e suas combinações. Em certas modalidades, o pelo menos único possível sítio de interação inclui um sítio selecionado a partir do grupo que consiste em Tyr421, Asp213, Asp307, Arg364, e suas combinações. Em algumas modalidades, o pelo menos único possível sítio de interação inclui Arg161. Em algumas modalidades, o modulador é um composto aqui descrito.
[000232] Em algumas modalidades, a única ou mais características incluem pelo menos uma característica selecionada a partir do grupo que consiste em: separação espacial entre a fração e o possível sítio de interação; energia da possível interação entre fração e sítio de interação, e/ou suas combinações.
[000233] Em algumas modalidades, um método compreende ainda uma etapa de fornecer uma imagem de um possível modulador da cGAS compreendendo a fração acoplada à imagem do cristal da cGAS. Em algumas modalidades, um método compreende ainda uma etapa de comparar a imagem com aquela de um cristal da cGAS incluindo um modulador, substrato ou produto ligados conhecidos.
Sistemas Computadorizados
[000234] Tal como será apreciado pelos versados na técnica, a leitura da presente divulgação, em alguns aspectos, da presente invenção é idealmente adequada para utilização em invenções implementadas por computador. Como apresentado na Figura S10, uma implementação de um exemplo de ambiente computadorizado em nuvem 2400 é apresentada e descrita. O ambiente computadorizado em nuvem 2400 pode incluir um ou mais provedores de recursos 2402a, 2402b, 2402c (coletivamente, 2402). Cada provedor de recursos 2402 pode incluir recursos computadorizados. Em algumas implementações, os recursos computadorizados podem incluir qualquer hardware e/ou software utilizado para processar dados. Por exemplo, os recursos computadorizados podem incluir hardware e/ou software capazes de executar algoritmos, programas de computador e/ou aplicativos de computador. Em algumas implementações, os exemplos de recursos computadorizados podem incluir servidores de aplicativos e/ou bases de dados com capacidades de armazenamento e recuperação. Cada provedor de recursos 2402 pode conectado ligado a qualquer outro provedor de recursos 2402 no ambiente computadorizado em nuvem 2400. Em algumas implementações, os provedores de recursos 2402 podem ser conectados através de uma rede computadorizada 2408. Cada provedor de recursos 2402 pode ser conectado a um ou mais dispositivos computadorizados 2404a, 2404b, 2404c (coletivamente, 2404), através da rede computadorizada 2408.
[000235] O ambiente computadorizado em nuvem 2400 pode incluir um gerenciador de recursos 2406. O gerenciador de recursos 2406 pode ser conectado aos provedores de recursos 2402 e aos dispositivos computadorizados 2404 ao longo da rede computadorizada 2408. Em algumas implementações, o gerenciador de recursos 2406 pode facilitar o fornecimento de recursos computadorizados por um ou mais provedores de recursos 2402 a um ou mais dispositivos computadorizados 2404. O gerenciador de recursos 2406 pode receber um pedido de um recurso computadorizado a partir de um dispositivo computadorizado 2404 em particular. O gerenciador de recursos 2406 pode iden- tificar um ou mais provedores de recursos 2402 capazes de fornecer o recurso computadorizado solicitado pelo dispositivo computadorizado 2404. O gerenciador de recursos 2406 pode selecionar um provedor de recursos 2402 para fornecer o recurso computadorizado. O gerenciador de recursos 2406 pode facilitar uma conexão entre o provedor de recursos 2402 e um dispositivo computadorizado 2404 em particular. Em algumas implementações, o gerenciador de recursos 2406 pode estabelecer uma conexão entre um provedor de recurso 2402 em particular e um dispositivo computadorizado 2404 em particular. Em algumas implementações, o gerenciador de recursos 2406 pode redirecionar um dispositivo computadorizado 2404 em particular para um provedor de recurso 2402 em particular com o recurso computadorizado solicitado.
[000236] A Figura S11 mostra um exemplo de um dispositivo compu-tadorizado 2500 e de um dispositivo computadorizado móvel 2550 que podem ser utilizados para implementar as técnicas descritas nesta di-vulgação. O dispositivo computadorizado 2500 pretende representar as várias formas de computadores digitais, tais como laptops, desktops, estações de trabalho, assistentes digitais pessoais, servidores, servidores blade, mainframes e outros computadores apropriados. O dispositivo computadorizado móvel 2550 pretende representar várias formas de dispositivos móveis, tais como assistentes digitais pessoais, telefones celulares, smartphones, tablets e outros dispositivos computadorizados semelhantes. Os componentes aqui apresentados, suas ligações e relações, e suas funções são destinados a ser apenas exemplos, e não pretendem ser limitantes.
[000237] O dispositivo computadorizado 2500 inclui um processador 2502, uma memória de 2504, um dispositivo de armazenamento 2506, uma interface de alta velocidade 2508 conectada à memória 2504 e várias portas de expansão de alta velocidade 2510, e uma interface de baixa velocidade 2512 conectada a uma porta de expansão de baixa velocidade 2514 e o dispositivo de armazenamento 2506. O processador 2502, a memória 2504, o dispositivo de armazenamento de 2506, a interface de alta velocidade 2508, as portas de expansão de alta ve-locidade 2510, e a interface de baixa velocidade de 2512 estão todos interligados utilizando vários barramentos, e podem ser montados sobre uma placa-mãe ou de outros modos, conforme apropriado. O processador 2502 pode processar instruções para execução dentro do dispositivo computadorizado 2500, incluindo instruções armazenadas na memória 2504 ou no dispositivo de armazenamento 2506 para exibir informações gráficas para uma GUI em um dispositivo de entra- da/saída externa, tal como um monitor 2516 acoplado à interface de alta velocidade 2508. Em outras implementações, vários processadores e/ou vários barramentos podem ser utilizados, conforme for apropriado, juntamente com múltiplas memórias e tipos de memória. Além disso, vários dispositivos computadorizados podem ser conectados, com cada dispositivo fornecendo porções das operações necessárias (por exemplo, como um banco de servidores, um grupo de servidores blade, ou um sistema multiprocessador).
[000238] A memória 2504 armazena informações dentro do dispositivo computadorizado 2500. Em algumas implementações, a memória 2504 é uma unidade ou unidades de memória volátil. Em algumas im-plementações, a memória 2504 é uma unidade ou unidades de memória não volátil. A memória 2504 pode também ser outra forma de meio legível por computador, tal como um disco magnético ou óptico.
[000239] O dispositivo de armazenamento 2506 é capaz de fornecer armazenamento em massa para o dispositivo computadorizado 2500. Em algumas implementações, o dispositivo de armazenamento 2506 pode ser ou conter um meio legível por computador, tal como um dispositivo de disco flexível, um dispositivo de disco rígido, um dispositivo de disco óptico, ou um dispositivo de fita, uma memória flash ou outro dispositivo de memória em estado sólido semelhante, ou uma variedade de dispositivos, incluindo dispositivos em uma rede de área de ar-mazenamento ou outras configurações. As instruções podem ser ar-mazenados em um suporte de informações. As instruções, quando executadas por um ou mais dispositivos de processamento (por exemplo, processador 2502), conduzem um ou mais métodos, tais como aqueles descritos acima. As instruções podem também ser armazenadas por um ou mais dispositivos de armazenamento, como meios legíveis por computador ou máquina (por exemplo, a memória 2504, o dispositivo de armazenamento 2506 ou memória no processador 2502).
[000240] A interface de alta velocidade 2508 gerencia as operações de largura de banda intensa para o dispositivo computadorizado 2500, enquanto a interface de baixa velocidade 2512 gerencia as operações de largura de banda inferior. Tal atribuição de funções é apenas um exemplo. Em algumas implementações, a interface de alta velocidade 2508 é acoplada à memória 2504, ao monitor 2516 (por exemplo, através de um processador de gráficos ou acelerador), e às portas de expansão de alta velocidade 2510, que podem aceitar várias placas de expansão (não mostrado). Na implementação, a interface de baixa velocidade 2512 é acoplada ao dispositivo de armazenamento de 2506 e à porta de expansão de baixa velocidade 2514. A porta de expansão de baixa velocidade 2514, que pode incluir várias portas de comunicação (por exemplo, USB, Bluetooth®, Ethernet, Ethernet sem fio), pode ser acoplada a um ou mais dispositivos de entrada/saída, tal como um teclado, um dispositivo apontador, um scanner, ou um dispositivo de rede, tal como um interruptor ou um roteador, por exemplo, através de um adaptador de rede.
[000241] O dispositivo computadorizado 2500 pode ser implementa- da em uma série de diferentes formas, como se mostra na figura. Por exemplo, pode ser implementado como um servidor Standard 2520, ou várias vezes em um grupo de tais servidores. Além disso, pode ser implementado em um computador pessoal, tal como um computador portátil 2522. Também pode ser implementado como parte de um sistema de servidores em rack 2524. Alternativamente, os componentes do dispositivo computadorizado 2500 podem ser combinados com outros componentes em um dispositivo móvel (não mostrado), tal como um dispositivo computadorizado móvel 2550. Cada um de tais dispositivos pode conter um ou mais do dispositivo computadorizado 2500 e dispositivo computadorizado móvel 2550, e um sistema completo pode ser constituído por vários dispositivos computadorizados que se comunicam.
[000242] O dispositivo computadorizado móvel 2550 inclui um processador 2552, uma memória 2564, um dispositivo de entrada/saída tal como um monitor 2554, uma interface de comunicação 2566, e um transmissor 2568, entre outros componentes. O dispositivo computadorizado móvel 2550 pode também ser fornecido com um dispositivo de armazenamento, tal como um micro-disco ou outro dispositivo, para proporcionar armazenamento adicional. O processador 2552, a memória 2564, o monitor 2554, a interface de comunicação 2566, e o transmissor 2568 estão todos interligados através de vários barramentos, e vários dos componentes podem ser montados sobre uma placa-mãe ou de outros modos, conforme apropriado.
[000243] O processador 2552 pode executar instruções dentro do dispositivo computadorizado móvel 2550, incluindo instruções armaze-nadas na memória 2564. O processador 2552 pode ser implementado como um chipset de chips que incluem processadores analógicos e digitais separados e múltiplos. O processador 2552 pode proporcionar, por exemplo, a coordenação dos demais componentes do dispositivo computadorizado móvel 2550, tais como controle de interfaces do usuário, aplicativos executados pelo dispositivo computadorizado móvel 2550, e comunicação sem fio pelo dispositivo computadorizado móvel 2550.
[000244] O processador 2552 pode se comunicar com o usuário através de uma interface de controle 2558 e uma interface de exibição 2556 acoplada ao monitor 2554. O monitor 2554 pode ser, por exemplo, um monitor TFT (Transístor de Película Fina-Tela de Cristal Líquido) ou um monitor OLED (Diodo Emissor de Luz Orgânico), ou outra tecnologia de exibição apropriada. A interface de exibição 2556 pode compreender um circuito apropriado para acionar o monitor 2554 para apresentar as informações gráficas e outras informações a um usuário. A interface de controle 2558 pode receber comandos de um usuário e convertê-los para submissão ao processador 2552. Além disso, uma interface externa 2562 pode proporcionar uma comunicação com o processador 2552, de modo a permitir a comunicação na área próxima do dispositivo computadorizado móvel 2550 com outros dispositivos. A interface externa 2562 pode proporcionar, por exemplo, a comunicação com fio em algumas implementações, ou a comunicação sem fio em outras implementações, e também podem ser usadas várias interfaces.
[000245] A memória 2564 armazena as informações dentro do dispositivo computadorizado móvel 2550. A memória 2564 pode ser implementada como um ou mais de um meio ou meios legíveis por computador, uma unidade ou unidades de memória volátil, ou uma unidade ou unidades de memória não volátil. Uma memória de expansão 2574 pode também ser fornecida e conectada ao dispositivo computadorizado móvel 2550 através de uma interface de expansão 2572, que pode incluir, por exemplo, uma interface de cartão SIMM (módulo de memória única na linha). A memória de expansão 2574 pode fornecer espaço adicional de armazenamento para o dispositivo computadorizado móvel 2550, ou também pode armazenar aplicativos ou outras informações para o dispositivo computadorizado móvel 2550. Especificamente, a memória de expansão 2574 pode incluir instruções para realizar ou complementar os processos descritos acima, e pode incluir informações seguras também. Assim, por exemplo, a memória de expansão 2574 pode ser fornecida como um módulo de segurança para o dispositivo computadorizado móvel 2550, e pode ser programada com instruções que permitem a utilização segura do dispositivo computadorizado móvel 2550. Além disso, aplicativos seguros podem ser fornecidos através de cartões SIMM, juntamente com informações adicionais, tal como a colocação de informações de identificação no cartão SIMM de uma forma não haqueáveis.
[000246] A memória pode incluir, por exemplo, memória flash e/ou a memória NVRAM (memória de acesso aleatório não volátil), tal como discutido abaixo. Em algumas implementações, as instruções são ar-mazenadas em um suporte de informação. As instruções, quando exe-cutadas por um ou mais dispositivos de processamento (por exemplo, processador 2552), realizam um ou mais métodos, tais como aqueles descritos acima. As instruções também podem ser armazenadas por um ou mais dispositivos de armazenamento, como um ou mais meios legíveis por computador ou máquina (por exemplo, a memória 2564, a memória de expansão 2574, ou memória no processador 2552). Em algumas implementações, as instruções podem ser recebidas em um sinal propagado, por exemplo, sobre o transmissor 2568 ou a interface externa 2562.
[000247] O dispositivo computadorizado móvel 2550 pode se comunicar sem fio através da interface de comunicação 2566, que pode incluir circuitos de processamento de sinal digital, quando necessário. A interface de comunicação 2566 pode proporcionar comunicações em diversos modos ou protocolos, tais como chamadas de voz GSM (Sistema Global para Comunicações Móveis), SMS (Serviço de Mensagens Curtas), EMS (Serviço Melhorado de Mensagens) ou mensagens MMS (Serviço de Mensagens Multimídia), CDMA (Acesso Múltiplo por Divisão de Código), TDMA (Acesso Múltiplo por Divisão de Tempo), PDC (Celular Digital Pessoal), WCDMA (Acesso Múltiplo por Divisão de Código de Banda Larga), CDMA2000, ou GPRS (Serviço de Rádio de Pacote Geral), entre outros. Tais comunicações podem ocorrer, por exemplo, através do transmissor 2568 usando uma radiofrequência. Além disso, a comunicação de curto alcance pode ocorrer, tal como a utilização de Bluetooth, Wi-Fi™ ou outros transmissores (não mostrado). Além disso, um módulo receptor de GPS 2570 (Sistema de Posicionamento Global) pode fornecer dados adicionais sem fio relacionados à navegação e localização para o dispositivo computadorizado móvel 2550, que pode ser utilizado de forma adequada por aplicativos em execução no dispositivo computadorizado móvel 2550.
[000248] O dispositivo computadorizado móvel 2550 também pode se comunicar de forma audível utilizando um codec de áudio 2560, que pode receber informações faladas de um usuário e convertê-las em informações digitais utilizáveis. O codec de áudio 2560 pode também gerar som audível para um usuário, como através de um altofa- lante, por exemplo, em um aparelho do dispositivo computadorizado móvel 2550. Este som pode incluir som de chamadas de voz, podem incluir som gravado (por exemplo, mensagens de voz, arquivos de música, etc.) e também pode incluir som gerado pelos aplicativos que operam no dispositivo computadorizado móvel 2550.
[000249] O dispositivo computadorizado móvel 2550 pode ser im-plementado em uma série de formas diferentes, como se mostra na figura. Por exemplo, ele pode ser implementado como um telefone celular 2580. Também pode ser implementado como parte de um smar tphone 2582, assistente digital pessoal, ou outro dispositivo móvel se-melhante.
[000250] Várias implementações dos sistemas e técnicas aqui descritas podem ser realizadas em um circuito eletrônico digital, circuitos integrados, ASICs (circuitos integrados específicos de aplicativos) es-pecialmente elaborados, hardware de computador, firmware, software e/ou suas combinações. Estas várias implementações podem incluir a implementação de um ou mais programas de computadores que sejam executáveis e/ou interpretáveis em um sistema programável incluindo pelo menos um processador programável, que pode ser destinado a fins especiais ou gerais, acoplado para receber dados e instruções a partir de, e para transmitir dados e instruções para, um sistema de armazenamento, pelo menos um dispositivo de entrada e pelo menos um dispositivo de saída.
[000251] Estes programas de computador (também conhecidos como programas, software, aplicativos de software ou código) incluem instruções da máquina para um processador programável, e podem ser implementados em um alto nível de linguagem de programação processual e/ou orientado a objetos e/ou em linguagem de monta- gem/máquina. Tal como aqui utilizados, os termos meio legível por máquina e meio legível por computador referem-se a qualquer produto de programa de computador, aparelho e/ou dispositivo (por exemplo, discos magnéticos, discos ópticos, memória, dispositivos de lógica programável (PLD)) utilizado para fornecer instruções e/ou dados da máquina para um processador programável, incluindo um meio legível por máquina que recebe instruções da máquina como um sinal legível pela máquina. O termo sinal legível por máquina refere-se a qualquer sinal utilizado para fornecer instruções e/ou dados da máquina para um processador programável.
[000252] Para proporcionar a interação com o usuário, os sistemas e técnicas aqui descritos podem ser implementados em um computador possuindo um dispositivo de exibição (por exemplo, um monitor CRT (tubo de raios catódicos) ou monitor LCD (tela de cristal líquido)) para exibir informações ao usuário e um teclado e um dispositivo apontador (por exemplo, um mouse ou um trackball), através dos quais o usuário pode fornecer dados para o computador. Outros tipos de dispositivos podem ser utilizados para proporcionar a interação com um usuário, bem como, por exemplo, o feedback fornecido ao usuário pode ser qualquer forma de feedback sensorial (por exemplo, feedback visual, feedback auditivo, ou feedback tátil); e a inserção de dados do usuário pode ser recebida de qualquer forma, incluindo entrada acústica, por fala ou tátil.
[000253] Os sistemas e técnicas aqui descritos podem ser implementados em um sistema computadorizado que inclui um componente de back-end (por exemplo, como um servidor de dados), ou que inclui um componente de middleware (por exemplo, um servidor de aplicação), ou que inclui um componente de front-end (por exemplo, um computador cliente que possui uma interface gráfica do usuário ou um navegador da Web através do qual o usuário pode interagir com a implementação dos sistemas e técnicas descritas aqui), ou qualquer combinação de tais componentes de back-end, middleware ou front-end. Os componentes do sistema podem ser interligados por qualquer forma ou meio de comunicação de dados digitais (por exemplo, uma rede de comunicação). Exemplos de redes de comunicação incluem uma rede de área local (LAN), uma rede de longa distância (WAN) e a Internet.
[000254] O sistema computadorizado pode incluir clientes e servidores. Um cliente e um servidor estão geralmente remotos entre si e tipicamente interagem através de uma rede de comunicação. A relação entre o cliente e o servidor surge em virtude dos programas de computador sendo executados nos respectivos computadores e apresentan- do uma relação cliente-servidor entre si.
[000255] Em certas modalidades, a presente invenção apresenta um sistema que compreende um computador ou meio legível por computador, em que uma estrutura cristalina da cGAS, ou coordenadas dos mesmos, está incorporada e/ou é exibida.
[000256] Em algumas modalidades, a presente invenção apresenta um método para elaborar e/ou caracterizar um modulador da cGAS, método este que compreende as etapas de: utilizar um sistema apresentado para avaliar uma ou mais características estruturais do modulador da cGAS; e realizar um ou mais ensaios in vitro, in vivo ou celulares para caracterizar o modulador da cGAS.
[000257] Em algumas modalidades, o método compreende ainda a etapa de realizar um experimento competitivo entre o modulador da cGAS e um modulador, substrato ou produto conhecido da cGAS. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a etapa de definir a forma tridimensional do inibidor.
[000258] Em algumas modalidades, a presente invenção apresenta um sistema computadorizado que contém um conjunto de informações para realizar um projeto ou caracterização de um inibidor da cGAS apresentando uma interface de usuário que compreende uma unidade de exibição, cujo conjunto de informações compreende: lógica para inserir uma informação relativa a uma ligação de uma proteína cGAS a uma fração conhecida por se ligar à proteína cGAS; lógica para projetar um candidato a inibidor da cGAS com base na ligação da proteína cGAS à fração conhecida por se ligar à proteína cGAS; lógica para determinar uma informação relativa a uma ligação da proteína cGAS ao inibidor candidato da cGAS; e lógica para tirar uma conclusão relativa às propriedades inibitórias da cGAS do inibidor candidato da cGAS com base na etapa de determinação da etapa (iii).
[000259] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um meio de armazenamento legível por computador que contém um conjunto de informações para um computador de uso geral possuindo uma interface de usuário que compreende uma unidade de exibição, cujo conjunto de informações compreende: lógica para inserir uma informação relativa a uma ligação de uma proteína cGAS a uma substância química conhecida por se ligar à proteína cGAS; lógica para projetar um inibidor candidato da cGAS com base na ligação da proteína cGAS à substância química conhecida por se ligar à proteína cGAS; lógica para determinar uma informação relativa a uma ligação da proteína cGAS ao inibidor candidato da cGAS; e lógica para tirar uma conclusão relativa às propriedades ini-bitórias da cGAS do inibidor candidato da cGAS com base na etapa de determinação da etapa (iii).
[000260] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um sinal eletrônico ou onda portadora que se propaga através da internet entre computadores que compreendem um conjunto de informações para um computador de uso geral possuindo uma interface de usuário que compreende uma unidade de exibição, cujo conjunto de informações compreende um meio de armazenamento legível por computador contendo um conjunto de informações para um computador de uso geral possuindo uma interface de usuário que compreende uma unidade de exibição, cujo conjunto de informações compreende: lógica para inserir uma informação relativa a uma ligação de uma proteína cGAS a uma substância química conhecida por se ligar à proteína cGAS; lógica para projetar um inibidor candidato da cGAS com base na ligação da proteína cGAS à substância química conhecida por se ligar à proteína cGAS; lógica para determinar uma informação relativa a uma ligação da proteína cGAS ao inibidor candidato da cGAS; e lógica para tirar uma conclusão relativa às propriedades inibitórias da cGAS do inibidor candidato da cGAS com base na etapa de determinação da etapa (iii). EXEMPLOS
[000261] As seguintes coordenadas foram depositadas no RCSB Protein Data Bank, com as quais o versado na técnica estará familiarizado, e correspondem às Tabelas 1-7 aqui referenciadas. Ver também Gao et al. Cell 153, 1094-1107 (2013), incluindo materiais suplementares, cujo conteúdo completo está aqui incorporado por referência. Além disso, no contexto das Figuras 1-4, 7 e S1-S4 seguintes, os dados apresentados nas Tabelas 1-7 do pedido provisório de patente US 61/819.369, depositado em 3 de maio de 2013, estão aqui incorporada por referência.
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1 Um método para acessar o RCSB Protein Data Bank é online em www.rcsb.org. Exemplo 1 Estruturas Cristalinas Expressão e Purificação de Proteínas
[000262] O gene que codifica cGAS de camundongo foi comprado de Open Biosystems Inc. As sequências correspondentes ao de comprimento completo e resíduos 147-507 da cGAS foram inseridas em um vetor pRSFDuet-1 modificado (Novagen), em que cGAS foi separada do marcador precedente His6-SUMO por um sítio de clivagem da protease tipo ubiquitina (ULP1). As sequências gênicas foram posteriormente confirmadas por sequenciamento. As proteínas de fusão foram expressas em linhagem celular BL21 (DE3) RIL. As células foram cultivadas a 37°C até a OD600 atingir aproximadamente 0,6. A temperatura foi, em seguida, deslocada para 18°C e as células foram induzidas pela adição de isopropila β-D-1-tiogalactopiranosideo (IPTG) ao meio de cultura em uma concentração final de 0,3 mM. Após a indução, as células foram cultivadas durante a noite. A proteína de fusão foi purificada em uma coluna de afinidade de Ni-NTA. O marcador His6-SUMO foi removido por clivagem com ULP1 durante diálise contra tampão contendo Tris-HCl 40 mM, NaCl 0,3 M, DTT 1 mM, pH 7,5. Após a diá- lise, a amostra de proteína foi ainda fracionada por uma coluna de he- parina, seguida por filtração em gel em uma coluna Superdex G200 16/60. A amostra final de cGAS (comprimento completo) e cGAS (147507) contêm cerca de 30 mg/mL de proteína, Tris 20 mM, NaCl 300 mM, DTT 1 mM, pH 7,5. A proteína com Se-metionina substituída foi expressa em meio M9 contendo Se-metionina (Sigma) e purificada utilizando o mesmo protocolo utilizado para a proteína selvagem. Todos os mutantes foram clonados e purificados utilizando o mesmo protocolo utilizado para a preparação da proteína selvagem. Cristalização
[000263] Para a cristalização da cGAS (147-507) no estado livre, a proteína foi primeiramente diluída em cerca de 15 mg/mL e, em seguida, misturada com uma solução reservatória de volume igual (HEPES 0,1 M, MgAc2 0,1 M, PEG3350 20%, pH 7,6) a 4°C usando difusão de vapor pelo método da gota pendurada.
[000264] Para o complexo binário cGAS (147-507)-dsDNA, a amostra foi preparada pela mistura direta de proteína com um DNA de 16 pb (1 nt saliente em 5' em cada extremidade: cadeia superior 5'- AAATTGCCGAAGACGAA-3'; cadeia inferior 5'- TTTCGTCTTCGGCAATT-3') em uma razão molar 1:1,2. Os cristais foram gerados por difusão de vapor pelo método da gota pendurada a 20°C, a partir de gotas misturadas de 1 μL de solução cGAS-dsDNA e 1 μL de solução reservatório (MÊS 0,1 M, MPD 8%, pH 6,6). Os cristais de cGAS (147-507) com Se-metionina substituída em complexo com dsDNA foram cultivados nas mesmas condições.
[000265] Os complexos ternários cGAS (147-507)-dsDNA-ATP, cGAS (147-507)-dsDNA-GTP, e cGAS (147-507) -dsDNA-3'-dGTP foram pre-parados pela mistura de proteína com dsDNA em uma razão molar de 1:1,2 e, em seguida, incubados na presença de ATP/GTP/3'-dGTP (5 mM) e MgCl2 (10 mM) por 0,5 h à temperatura ambiente. Os cristais para o complexo cGAS (147-507)-dsDNA-ATP foram gerados por difusão de vapor pelo método da gota pendurada a 20°C, a partir de gotas misturadas a partir de 1 μL de solução cGAS-dsDNA-ATP e 1 μL de solução reservatório (HEPES 0,1 M, CaAc2 0,2 M, PEG300 20%, pH 7,7). Para os complexos cGAS (147-507)-dsDNA-GTP e cGAS (147-507)- dsDNA-3'-dGTP, os cristais foram gerados por difusão de vapor pelo método da gota sentada a 20°C, por mistura de volume igual de solução reservatório (para GTP: NaAc 0,1 M, MPD 10%, pH 5.0; para 3'-dGTP: NaAc 0,1 M, MPD 12%, pH 5,2) com as amostras.
[000266] Os complexos ternários cGAS (147-507)-dsDNA-GMP+ATP e cGAS (147-507)-dsDNA- GTP+ATP foram preparados pela mistura da proteína com dsDNA em uma razão molar de 1:1,2 e, em seguida, incubados com GMP/GTP (5 mM), ATP (5 mM) e MgCl2 (10 mM) por 0,5 h à temperatura ambiente. Os cristais do complexo cGAS (147- 507)-dsDNA-GMP+ATP foram gerados por difusão de vapor pelo método da gota sentada a 20°C, a partir de gotas misturadas da solução cGAS-dsDNA-GMP+ATP com uma solução reservatório de volume igual (MES 0,1 M, MPD 40%, pH 6,0). Os cristais para o complexo cGAS (147-507)-DNA-GTP+ATP foram gerados ao longo de duas semanas por sentado difusão de vapor pelo método da gota sentada a 20°C, pela mistura de solução de reservatório de volume igual (HEPES 0,1 M, MgCl2 0,2 M, PEG300 30%, pH 7,5) com a amostra. Determinação da Estrutura
[000267] O cristal derivado do átomo pesado do estado livre foi gerado por imersão em uma solução reservatório com timerosal 5 mM por 24 horas. Os conjuntos de dados de difração de cGAS (147-507) em estado livre (nativa a derivado de Hg) e estado ligado ao DNA (nativa e derivado de Se) foram coletados no Brookhaven National Laboratory. Os conjuntos de dados para todos os complexos ternários foram coletados no Advanced Photo Source (APS) no Argonne National Laboratory. Os dados de difração foram indexados, integrados e dimensionados usando o programa HKL2000 (Otwinowski and Minor, 1997). As estruturas da cGAS (147-507) Hg-substituída em estado livre e cGAS (147507) Se-substituída em estado ligado ao DNA foram ambas solucionadas, utilizando método de dispersão anômala em um único comprimento de onda como implementado no programa PHENIX (Adams et al., 2010). A construção do modelo foi realizada utilizando o programa COOT (Emsley et al., 2010) e refinamento estrutural foi conduzido utilizando o programa PHENIX (Adams et al., 2010). A estatística da coleta de dados e refinamento para estruturas livres e binárias é apresentada na Tabela S1. As estruturas de todos os complexos ternários foram soluci- onadas utilizando o método de substituição molecular em PHASER (McCoy et al., 2007), utilizando a estrutura binária como o modelo de busca. A construção do modelo foi realizada utilizando o programa COOT (Emsley et al., 2010) e o refinamento estrutural foi realizado utilizando o programa PHENIX (Adams et al., 2010). A estatísticas da coleta de dados e refinamento está apresentada nas Tabelas S2 e S3. Tabela S1 Estatística da coleta de dados e refinamento para estruturas da cGAS em estado livre e ligado ao DNA
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Tabela S2 Estatística da coleta de dados e refinamento dos complexos ternários de cGAS e dsDNA com ATP, GTP e 3'-dGTP
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Tabela S3. Estatística da coleta de dados e refinamento dos complexos ternários de cGAS e dsDNA com GMP + ATP e GTP + ATP
Figure img0031
Estrutura da GMP-AMP cíclico sintase (cGAS)
[000268] Nós solucionamos a estrutura cristalina de 2,0 Â da cGAS (construção 147-507) (Figura S1A) no estado livre (Figura 1A e S1B). A proteína adota uma estrutura bilobal com topologia α/β mista (Figura 1A; estatística de raios-x na Tabela S1) característica dos membros da superfamília da nucleotidiltransferase. A busca DALI identificou ILF2/NF45, que contém uma prega na nucleotidiltransferase (PDB: 4AT8) (Wolkowicz and Cook, 2012), como o que mais se assemelha à pregadobra da cGAS, com um escore Z de 15,1 e r.m.s.d. de 3,8 Â. Além disso, o estado livre da oligoadenilato sintetase 1 humana (OAS1) (PDB: 1PX5) ( Hartmann et al. 2003) apresentou um escore Z de 13,3 e um r.m.s.d. de 4,1 Â (comparação de cGAS e OAS1 no estado livre em estéreo na Figura S1C). Estrutura do complexo binário de cGAS com dsDNA ligado
[000269] Cocristalizou-se cGAS ligada a um dsDNA complementar de 16 pb (mais 1 nt saliente em 5' em ambas as extremidades) e solucionamos a estrutura do complexo binário na resolução de 2,1 Â (estatística de raios-x na Tabela S1). A estrutura do complexo binário é apresentada na Figura 1B. A maioria dos contatos intermoleculares no complexo binário cGAS-dsDNA (resumido na Figura 1C) está entre a cGAS e a estrutura de açúcar-fosfato do DNA (Figura S2A, B), com apenas um contato específico de base (Figura S2B). As estruturas sobrepostas de cGAS no estado livre (cinza claro) e ligada ao dsDNA (cinza escuro) são apresentadas na Figura 1D. Existem grandes alterações conformacionais na formação do complexo binário de dsDNA, como pode ser visto dentro de um segmento de β-sheet contendo resíduos Glu211, Asp213 e Asp307 catalíticos (Figura 1E), bem como para segmentos em alça e helicoidais no interior do sítio catalítico contendo Ser199 (Figura 1F). Assim, um segmento de β-sheet se desloca em 5,1 Â na formação do complexo (Figura S2C), assim como a Arg161 envolvida no reconhecimento específico da base se desloca em 9,2 Â (Figura S2D), assim como os resíduos de Tyr e Lys fazem dentro dos segmentos de alça em até 17,6 Â (Figura S2E). Igualmente importante, uma entrada muito estreita leva ao sítio catalítico para cGAS no estado livre (Figura 1G), enquanto esta entrada é ampliada significativamente no complexo binário com DNA (Figura 1H). A prega da cGAS no estado ligado ao dsDNA é semelhante àquela relatada recentemente para o OAS1 no estado ligado ao dsRNA mais 2'-dATP (PDB: 4IG8) (Donovan et al. 2013) (comparação de proteínas em complexos em estéreo na Figura S2D; escore Z de 18,2 e r.m.s.d. de 3,2 Â entre as duas pregas proteicas). Estrutura do complexo ternário de cGAS com dsDNA e ATP ligado
[000270] Cocristalizou-se cGAS ligada ao dsDNA e ATP, e solucionamos a estrutura do complexo ternário na resolução de 2,4 Â. O ATP se liga ao sítio catalítico posicionado no interior da cGAS no complexo ternário (Figura 2A). Existe uma estreita sobreposição do complexo binário de cGAS e dsDNA com o complexo ternário contendo ATP ligado, como apresentado na Figura 2B, com alterações conformacio- nais essencialmente mínimas em qualquer segmento de β-sheet portadores dos resíduos catalíticos ácidos (Figura 2C) ou os segmentos de alça e hélice que formam o sítio catalítico (Figura 2D) na formação do complexo ternário. A única alteração observável é o movimento da cadeia lateral de Glu211 em direção aos outros dois resíduos ácidos no complexo ternário (Figura 2C). O grupo trifosfato do ATP é hidrogênio ligado às cadeias laterais polares (Ser199, Ser420 e Lys402), enquanto dois cátions ligados (provisoriamente atribuídos a Mg2+) servem como uma ponte para interações entre o trifosfato e as cadeias laterais dos resíduos catalíticos ácidos (Glu211, Asp213 e Asp307) (Figura 2E). Além disso, o anel de adenina do ATP ligado empilha-se sobre Tyr421 em uma direção e parcialmente sobre o grupo guanidina da Arg364 na outra direção (Figura 2F).
[000271] Deve-se notar que observamos fraca densidade eletrônica adicional (contornos em cinza escuro na Figura 2G) que é inexplicada neste momento na estrutura de 2,4 Â do complexo ternário. A densidade adicional poderia ser decorrente de moléculas de água ou uma molécula de AMP com modesta (30%) ocupação. Uma visão do ATP ligado observando-se o sítio catalítico do complexo ternário é apresentada na Figura 2H. Estrutura do complexo ternário de cGAS com dsDNA e 5'- pppG(2',5')pG ligado
[000272] Cocristalizou-se cGAS ligada ao dsDNA e GTP e solucionamos a estrutura do complexo ternário na resolução de 1,9 Â. A estrutura do complexo ternário é apresentada na Figura 3A (estatística de raios-x na Tabela S2). Notavelmente, a formação da ligação fosfo- diéster ocorreu no sítio catalítico, resultando no ligante 5'-pppGpG ligado (apresentado em posição no sítio catalítico na representação de preenchimento de espaço na Figura 3A). É importante ressaltar que alterações conformacionais mínimas ocorreram no processo do complexo binário para o complexo ternário com 5'-pppGpG ligado (Figura S3A-C).
[000273] Surpreendentemente, a ligação GpG de 5'-pppGpG é 2',5', em vez do que 3',5' prevista, com o primeiro e o segundo resíduos G em adição adotando orientações syn e anti de torção glicosídica, respectivamente (Figura S3D). O grupo trifosfato de 5'-pppG(2',5')pG é coordenado a dois cátions (Figura 3B), com o primeiro G empilhado na Tyr421, enquanto que o segundo G utiliza sua margem de Watson- Crick para se ligar ao hidrogênio com as cadeias laterais polares (Thr197, Ser366 e Ser368), e sua margem de Hoogsteen para se ligar ao hidrogênio com Arg364 (Figura 3C). A topologia observada de 5'- pppG(syn)(2',5')pG(anti) pode ser rastreada com um elevado grau de confiança devido à evidente densidade observada para este intermediário da reação na estrutura de 1,9 Â do complexo ternário (mapa 2Fo-Fc na Figura 3D, com duas visões do mapa de omissão Fo-Fc apresentadas na Figura S3E). Uma visão do 5'-pppG(2',5')pG ligado observando-se o sítio catalítico do complexo ternário é apresentada na Figura 3E. Nós sobrepusemos as estruturas do 5'-pppG(2',5')pG (cinza) e ATP (cinza escuro) ligados nos seus respectivos complexos ternários com cGAS e dsDNA, e observamos que o primeiro G do 5'- pppG(2',5')pG ligado está posicionado no plano do ATP ligado (Figura S3F). Os dois cátions ligados foram provisoriamente atribuídos a Mg2+ com base em mapas de omissão (Figura S3G) e na coordenação oc- taédrica em torno de cada cátion (Figura S3H, I).
[000274] Também cresceu-se cristais do complexo ternário com 3'- dGTP e observamos a formação do intermediário 5'-pppdG(2',5')pdG relacionado (não pode formar uma ligação 3',5') na estrutura de 2,1 Â deste complexo (estatística de raios-x na Tabela S2). Estrutura do Complexo Ternário de cGAS com dsDNA e 5'- pG(2',5')pA
[000275] Cocristalizou-se também cGAS na presença de dsDNA, GMP e ATP e solucionamos a estrutura de um complexo na resolução de 2,3 Â (estatística estrutural na Tabela S3). Ao utilizar GMP em vez de GTP, esperávamos aprisionar o intermediário após a formação da primeira ligação fosfodiéster, e observamos de fato o produto linear ligado de 5'-pG(syn)(2',5')pA(anti) (Figura 3F, L). Nenhum cátion Mg2+ foi observado na ausência de uma fração trifosfato no produto. Notavelmente, as tentativas de cocristalização da cGAS com dsDNA, GTP e AMP apenas produziu cristais que apresentavam difração muito insatisfatória (resolução de 12 Â). Observamos uma boa sobreposição dos intermediários 5'-pppG(syn)(2',5')pG(anti) (em cinza escuro) e 5'- pG(syn)(2',5')pA(anti) (em cinza claro), como apresentado na Figura 3H. Estrutura do complexo ternário de cGAS com dsDNA e c[G(2',5')pA(3',5')p] ligado
[000276] Cocristalizou-se cGAS com dsDNA, GTP e ATP e solucionamos a estrutura do complexo na resolução de 2,3 Â. Estes cristais levaram duas semanas para crescer, ao contrário dos demais cristais mencionados acima, que cresceram dentro de poucos dias. A estrutura do complexo ternário é apresentada na Figura 4A (estatística de raios-x na Tabela S3). Mais inesperadamente, o pequeno ligante ligado apresentado em uma representação de preenchimento de espaço na Figura 4A é um dinucleotídeo cíclico. Notavelmente, não ocorreram alterações conformacionais no processo do complexo binário para o complexo ternário com dinucleotídeo cíclico ligado, mesmo com a cadeia lateral de Glu211 adotando orientações idênticas (Figura S4A-C).
[000277] É importante notar que podemos rastrear a etapa de GpA no dinucleotídeo cíclico ligado sem ambiguidade (a extremidade 3'-OH de G pode ser rastreada) e estabelecer que esta ligação é 2',5' (Figura S4D). Por outro lado, a ligação na etapa de ApG no dinucleotídeo cíclico ligado poderia ser 2',5' ou 3',5' com base na densidade observada, e não pode ser atribuída exclusivamente com certeza com base na estrutura. Realizamos o refinamento com uma ligação 3',5' na etapa de ApG com base em evidências descritas posteriormente e preparamos os desenhos das Figuras 4 e S4 com ligação 2',5' na etapa de GpA e ligação 3',5' na etapa de ApG. Podemos distinguir G de A com base na densidade observada para o grupo 2-amino de G, e notamos que ambos adotam alinhamento anti no dinucleotídeo cíclico ligado {c[G(2',5')pA(3',5')p]} (Figura S4D). O resíduo A do c[G(2',5')pA(3',5')p] ligado está empilhado sobre Tyr421 (Figura 4B, C), enquanto o resíduo G do c[G(2',5')pA(3',5')p] está ancorado no lugar por pontes de hidrogênio ligando-o às cadeias laterais de Asp213, Asp307 e Arg364 (Figura 4B, C). Além disso, os resíduos A e G parcialmente se empilham entre si. A densidade de elétrons 2Fo-Fc para o c[G(2',5')pA(3',5')p] ligado é apresentada na Figura 4D, com mapas de omissão apresentados na Figura S4E. Uma visão do c[G(2',5')pA(3',5')p] ligado observando-se o sítio catalítico do complexo ternário é apresentada na Figura 4E, com c[G(2',5')pA(3',5')p] ligado em direção a uma extremidade da abertura. Também não se observam cátions ligados, uma vez que c[G(2',5')pA(3',5')p] não contém tri- fosfatos, e a base G coordena-se diretamente com Asp213 e Asp307 (Figura 4C). Nós sobrepusemos as estruturas do c[G(2',5')pA(3',5')p] e ATP ligados nos seus respectivos complexos ternários com cGAS e dsDNA, e observamos que o resíduo A do c[G(2',5')pA(3',5')p] ligado está posicionado no plano do ATP ligado (Figura S4F).
[000278] Uma visão do c[G(2',5')pA(3',5')p] destacando a ligação 2',5' na etapa de GpA e a ligação 3',5' na etapa de ApG é apresentada na Figura 4F. Notamos que, no complexo ternário com o produto linear 5'- pG(2',5')pA, é a base G que empilha-se em Tyr421 (Figura 3G e 4G), enquanto que, no complexo ternário com o produto c[G(2',5')pA(3',5')p], é a base A que empilha-se em Tyr421 (Figura 4C, H). Assim, o produto linear e o produto final cíclico adotam diferentes alinhamentos no interior do sítio catalítico. Exemplo 2 Caracterização Bioquímica da Atividade da cGAS
[000279] Para validar os resultados estruturais, estabelecemos um ensaio de atividade utilizando cromatografia em camada delgada (Figura S5) e monitoramos a formação do dinucleotídeo cíclico c[G(2',5')pA(3',5')p] a partir de ATP e GTP usando proteínas cGAS purificadas recombinantes de comprimento completo e truncadas. cGAS exigiu a presença de dsDNA e Mg2+ ou Mn2+ para atividade (Figura 5A- B). Testamos a formação de c[G(2',5')pA(3',5')p] como uma função do comprimento do dsDNA e descobrimos que o dsDNA de 36 pb ou mais foram ideais, ainda que o dsDNA de 16 pb utilizado para a cristalografia tenha produzido alguma atividade (Figura S6A). RNA de cadeia dupla, um duplex de DNA/RNA, ou DNA ou RNA de cadeia simples não estimularam a formação de dinucleotídeo cíclico (Figura 5B). A quantidade residual de c[G(2',5')pA(3',5')p] detectada para o ssDNA específico utilizado neste experimento foi atribuída a um trecho de complementaridade da sequência, e a substituição de G por 8-oxoguanina (8- oxoG) foi suficiente para desestabilizar sua interação prevista e eliminar a atividade residual da cGAS. A substituição de guanina por 8- oxoG dentro do dsDNA não alterou a atividade da cGAS.
[000280] Quantificamos a atividade da cGAS para produzir c[G(2',5')pA(3',5')p] em várias condições de turnover. Mais de 78% (s.d. +/- 2,6%, n=5) do ATP e GTP originais fornecidos foram convertidos a c[G(2',5')pA(3',5')p] dentro de 40 minutos, levando a uma constante estimada observada da taxa de 0,19 min-1 e envolvendo mais de 750 turnovers por molécula de enzima.
[000281] Para determinar a ordem da formação de intermediários, primeiramente substituímos GTP por GMP ou GDP (Figura 5C). Ambos os compostos levaram à formação dos respectivos produto 5'- pG(2',5')pA e intermediários 5'-ppG(2',5')pA, e apenas 5'-ppG(2',5')pA poderia reagir ainda mais para produzir uma quantidade reduzida do dinucleotídeo cíclico. A substituição de ATP por ADP ou AMP não resultou na formação de qualquer produto ou intermediário, com apenas ADP (com GTP) levando à geração de níveis reduzidos de c[G(2',5')pA(3',5')p].
[000282] A fim de determinar o envolvimento dos grupos 2' ou 3'- hidroxila (OH) do GTP e ATP para a formação de c[G(2',5')pA(3',5')p], testamos trifosfato de 2'- e 3'-desoxiguanosina e trifostato de 2'- e 3'- desoxiadenosina como substratos para cGAS (Figura 5D e S6B). 2'- dGTP foi incapaz de formar um dinucleotídeo cíclico, ao contrário de 3'-dGTP, indicando que o grupo 2'-OH da guanosina foi necessário para a formação da ligação com o α-fosfato na posição 5' da adenosi- na. Por outro lado, 2'- e 3'-dATP levaram à formação significativamente reduzida de GA-dinucleotídeos cíclicos, embora 2'-dATP+GTP tenha produzido visivelmente mais produto. Em ambos os casos, observamos acúmulo dos intermediários 5'-pppG(2',5')pdA da reação (Figura 5D, linhas 2 e 3), que migraram ligeiramente mais rápido do que todos os intermediários de ribose (5'-pppG(2',5')pA, linha 1). Exemplo 3 Identificação de c[G(2',5')pA(3',5')p] como o produto formado pela atividade dsDNA-dependente da cGAS
[000283] As sínteses e a purificação das três moléculas isoméricas de cGAMP, c[G(2',5')pA(2',5')p] (ligações 2',5' nas etapas de GpA e ApG) 6, c[G(2',5')pA(3',5')p] (ligações 2',5' na etapa de GpA e ligação 3',5' na etapa de ApG) 11, e c[G(3',5')pA(3',5')p] (3',5' nas etapas de GpA e ApG) 15 apresentadas na Figura S7 foram realizadas utilizando procedimentos anteriormente apresentados pelo laboratório Jones (Gaffney et al. 2010; Gaffney and Jones, 2012). A identidade das três moléculas isoméricas 6, 11 e 15 de cGAMP (Figura S7) foi validada a partir da análise heteronuclear por RMN utilizando conectividades através das ligações. Os dados experimentais de RMN para c[G(2',5')pA(3',5')p] estão descritos na Figura S8, com os deslocamentos químicos de prótons e carbonos para todas as três moléculas iso- méricas de GMP listados na Tabela S4.
[000284] Analisamos o produto gerado pela atividade dsDNA- dependente da cGAS utilizando cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (HPLC) e comparamos seu perfil de eluição aos compostos c[G(3',5')pA(3',5')p], c[G(2',5')pA(2',5')p], e c[G(2',5')pA(3',5')p] quimicamente sintetizados (Figura 6A e S6D). Um pico proeminente eluiu consistentemente a partir do sistema de HPLC, precisamente em 23,5 minutos, o que corresponde ao perfil de eluição de c[G(2',5')pA(3',5')p]. A coinjeção com c[G(3',5')pA(3',5')p] ou c[G(2',5')pA(2',5')p] demonstrou que o produto de reação da cGAS não coelui, ao contrário da coinjeção com c[G(2',5')pA(3',5')p] quimicamente sintetizado.
[000285] Para demonstrar que o dinucleotídeo cíclico produzido in vitro correspondia à molécula determinada cristalograficamente, analisamos por HPLC os cristais dissolvidos da cGAS que tinham sido co- incubados com DNA, ATP e GTP (Figura 6B). Foi observado um pico correspondente ao c[G(2',5')pA(3',5')p], distinto da molécula de referência c[G(2',5')pA(2',5')p] coinjetada como anteriormente. Picos não identificados adicionais de tempos de retenção mais longos também foram observados. Provavelmente, estes compostos não identificados provenientes do tampão e/ou aditivos de cristalização não foram completamente removidos apesar da lavagem dos cristais antes da análise por HPLC.
[000286] Além disso, c[G(2',5')pA(3',5')p] gerado pela cGAS foi purificado por HPLC e submetido à análise por RMN unidimensional. Seu espectro de RMN na região H1 do açúcar é idêntico àquele do c[G(2',5')pA(3',5')p] padrão quimicamente sintetizado e distinto do c[G(2',5')pA(2',5')p] e c[G(3',5')pA(3',5')p] quimicamente sintetizados (Figura 6C). Assim, HPLC (Figura 6A) e RMN (Figura 6C), independentemente, validam que o produto gerado pela cGAS é c[G(2',5')pA(3',5')p]. Exemplo 4 Análise funcional das proteínas cGAS mutantes
[000287] Em seguida, avaliamos as consequências bioquímicas e funcionais de mutações em cGAS em sua capacidade para formar c[G(2',5')pA(3',5')p] in vitro e para estimular a via do interferon tipo I nas células. Geramos mutantes de substituição de alanina correspon-dentes aos resíduos de aminoácidos que as estruturas cocristalinas revelam estar envolvidos na ligação ao dsDNA ou atividade da cGAS. Para ensaios in vitro de atividade da cGAS, geramos e purificamos seis formas mutantes recombinantes de cGAS; previa-se que quatro eliminassem a ligação ao dsDNA e duas proteínas com mutações pontuais foram substituídas por alanina nos resíduos catalíticos potencialmente importantes. A incubação de DNA com proteínas cGAS mu- tantes levou a pouca ou nenhuma formação de c[G(2',5')pA(3',5')p] para todos, exceto dois mutantes (R161A, S199A, Figura 7A).
[000288] Para avaliar o impacto sobre a função da cGAS nas células, geramos mutantes adicionais de alanina de cGAS para a expressão em células de mamífero. Os mutantes cGAS de comprimento completo, juntamente com STING e um repórter de luciferase de IFN- β, foram transitoriamente expressos em células HEK 293. Neste ensaio, cGAS está envolvida pelos plasmídeos de DNA cotransfecta- dos, e a expressão de cGAS WT resultou na atividade de luciferase aumentada em cerca de 15 vezes em comparação a um plasmídeo controle (Figura 7B). Mutações isoladas de resíduos de ligação ao DNA, incluindo Arg161 responsável pela única interação direta com uma base do DNA, não foram suficientes para prejudicar a atividade da cGAS. No entanto, a ablação de interações com dois ou três fos- fodiésteres consecutivos em qualquer cadeia de DNA (Figura 1C, S2B-C) resultou em uma função diminuída ou completamente anulada da cGAS (Figura 7B). No sítio catalítico, todos os mutantes isolados em Glu211, Asp213 ou Asp307 afetando a ligação de cátions bivalentes (Figura 2E, 3B) resultaram em cGAS não funcional (Figura 7C). Além disso, a anulação da atividade da cGAS necessitou de mutação em ambos os resíduos de aminoácidos envolvidos (i) na ligação do fosfato gama do ATP (ou GTP) (Lys402, Ser420; Figura 2E, 3B), (ii) na ligação da adenosina do ATP adenosina (Glu371, Lys424; Figura 2F), ou (iii) no empilhamento de bases do ATP e c[G(2',5')pA(3',5')p] (Arg364, Tyr 421; Figura 2F, 4B), enquanto mu- tantes isolados destes resíduos apenas comprometeram ligeiramente a função da cGAS (Figura 7C). Gly198 e Ser199 são resíduos altamente conservados que sofrem alterações conformacionais significativas após ligação ao ligante (Figura 1F, 2D). No entanto, mutações isoladas G198A e S199A não comprometeram gravemente a função da cGAS, mas o mutante duplo destas posições não era funcional (Figura S6E). Do mesmo modo, a conversão da Gly198 altamente móvel à prolina restringiu estericamente a atividade anulada da cGAS (Figura S6E). Exemplo 5 Estudos sobre transições conformacionais, formação da ligação e in-termediários Transições conformacionais em cGAS na formação do complexo
[000289] Nossos estudos estruturais destacam o fato de que cGAS sofre uma alteração conformacional significativa na ligação ao dsDNA (Figura 1D), que reposiciona os resíduos catalíticos Glu211, Asp213, Asp307, bem como Ser199 (Figura 1E, F), enquanto, ao mesmo tempo, abre o acesso para o sítio catalítico (Figura 1G, H). Em essência, cGAS adota uma conformação cataliticamente competente apenas quando envolve dsDNA, respondendo, assim, por seu papel como um sensor de dsDNA citossólico. Por outro lado, apenas alterações con- formacionais mínimas que são restritas à cadeia lateral de Glu211 são observadas quando procedendo do complexo binário de cGAS e dsD- NA ao complexo ternário com ATP (Figura 2B-D) e GTP (onde o sítio contém intermediário 5'-pppG (2',5')G fora da via; Figura S3A-C), sem qualquer alteração observada mesmo para a cadeia lateral de Glu211 na formação do complexo ternário com ATP + GTP (onde o sítio con- tém produto c[G(2',5')pA(3',5')p]; Figura S4A-C). Formação da Ligação Fosfodiéster no Sítio Catalítico
[000290] Os experimentos estruturais e funcionais estabeleceram a formação da ligação fosfodiéster no sítio catalítico após a ligação do dsDNA à cGAS, na ausência de quaisquer componentes adicionais. Os estudos sobre a estrutura da cGAS na presença de dsDNA e GTP identificaram acúmulo de intermediário linear da reação 5'- pppG(2',5')pG (Figura 3B,C), enquanto, na presença de GMP e ATP, identificaram o produto linear da reação 5'-pG(2',5')pA. Embora não desejando estar limitado por qualquer teoria em particular, acredita-se que o primeiro intermediário esteja fora da via e, consequentemente, comprometido pela formação da segunda ligação fosfodiéster para formar um produto cíclico, considerando que o primeiro resíduo G é syn, e que a distância é longa entre as posições 2'-OH (ou 3'-OH) do segundo resíduo G e o α-fosfato da fração trifosfato. No entanto, estes resultados sugerem que a formação de c[G(2',5')pA(3',5')p] ocorre provavelmente de uma forma gradual, envolvendo a formação de ligações fosfodiéster sequenciais para produzir o produto dinucleotídeo cíclico. Por outro lado, os estudos sobre a estrutura da cGAS na presença de dsDNA, GTP e ATP resultou na formação de c[G(2',5')pA(3',5')p] (Figura 4B, C), sem acúmulo de um intermediário e consistente com uma reação ao longo da via envolvendo a formação de um par de ligações fosfodiéster sequenciais. Posicionamento dos resíduos de G e A do c[G(2',5')pA(3',5')p] ligado
[000291] Os resíduos de G e A de c[G(2',5')pA(3',5')p] adotam posições distintas na estrutura do complexo ternário com cGAS e dsDNA. O resíduo A do c[G(2',5')pA(3',5')p] ligado se empilha em Tyr421 (Figura 4B) e ocupa a posição do anel de adenina no complexo do ATP (Figura 2F) e a primeira base nos complexos 5'-pppG(2',5')pG (Figura 3C) e 5'-pG(2',5')pA (Figura 3G). O resíduo de A do c[G(2',5')pA(3',5')p] ligado não está envolvido em quaisquer pontes de hidrogênio intermoleculares e, consequentemente, poderia ser potencialmente substituído até mesmo por um resíduo pirimidínico (C ou U). Por outro lado, o resíduo G do c[G(2',5')pA(3',5')p] ligado, que está parcialmente empilhado sobre o resíduo A, forma uma rede de pontes de hidrogênio intermoleculares que envolvem suas margens de Watson-Crick e Hoogsteen (Figura 4B, C) e não pode ser substituído por nenhuma das outras três bases (C, A e U). Deste modo, o sítio de ligação à cGAS possui elementos de reconhecimento distintos que distinguem entre G e A e, por conseguinte, pode ligar-se ao c[G(2',5')pA(3',5')p] em uma orientação única.
[000292] De acordo com os dados cristalográficos, os resultados bi-oquímicos indicam uma forte preferência por GTP, consistente com as interações elaboradas de aminoácidos observadas na estrutura entre cGAS e esta base. A incubação de cGAS com GTP isoladamente, assim como GTP mais CTP ou UTP, pode levar à formação de dinucleo- tídeo cíclico (Figura S6C). Enquanto ATP isolado não produz quaisquer produtos cíclicos ou intermediários, a incubação com UTP resulta na formação de alguns produtos cíclicos, sugerindo que UTP também pode substituir GTP embora em uma taxa muito reduzida de reação. Juntos, estes resultados indicam que cGAS possui exigências mais flexíveis para o segundo nucleotídeo em comparação à primeira gua- nosina. Comparação estrutural dos produtos 5'-pG(2',5')pA linear e c[G(2',5')pA(3',5')p] cíclico
[000293] Observamos uma diferença marcante no alinhamento dentro do sítio catalítico entre o produto 5'-pG(syn)(2',5')pA(anti) linear (Figura 3F, G) e o produto 5'-pG(anti)(2',5')A(anti) cíclico (Figura 4B, C) fora da via. No primeiro caso, é a base G que se empilha sobre Tyr421 (Figura 3G), enquanto, no último, é a base A que se empilha sobre Tyr421 (Figura 4C). Os dois alinhamentos são comparados em estéreo onde o 5'-pG(2',5')pA linear é apresentado na Figura 4G e o c[G(2',5')pA(3',5')p] cíclico na Figura 4H. Isto implica que o intermediário pode ter de reorganizar sua orientação por um flip-over completo no interior do sítio catalítico antes da reação de ciclização. Isto pode não ser muito surpreendente, uma vez que, considerando os três aminoá- cidos básicos (Glu211, Asp213 e Asp307) e um polar (Ser199) que revestem o sítio catalítico, existe apenas um único conjunto de resíduos catalíticos e, consequentemente, após a formação da primeira ligação fosfodiéster, o intermediário pode ter que realinhar, de modo a facilitar a formação da segunda ligação fosfodiéster para concluir a ci- clização. Ligações Fosfodiéster
[000294] Um pressuposto evidente nos estudos anteriores que conduzem à identificação de GAMP cíclico como um mensageiro secundário gerado pela cGAS sensora de dsDNA citoplasmático (Sun et al. 2013; Wu et al. 2013) foi que ambas as ligações fosfodiéster foram de natureza 3',5'. Tais ligações 3',5' foram observadas anteriormente nas estruturas do mensageiro secundário bacteriano c-di-GMP ligado a STING (Yin et al. 2010; Ouygang et al. 2012; Huang et al. 2012; Shu et al. 2012) e riboswitches (Smith et al. 2009; Kulshina et al. 2009). No entanto, a abordagem de espectroscopia de massa utilizada (Wu et al. 2013) não pode distinguir entre as ligações 3',5' e 2',5' para uma ou ambas as ligações fosfodiéster do GAMP cíclico.
[000295] A primeira indicação de uma ligação 2',5' surgiu a partir da estrutura de cGAS, dsDNA e GTP, em que um produto fora da via formada no sítio catalítico exibiu uma ligação 5'-pppG(2',5')pG (Figura 3B, C). Além disso, pG(2',5')pA foi observado na estrutura de cGAS, dsD- NA e GMP + ATP (Figura 3F, G). Mais importante ainda, uma ligação 2',5' também foi observada para a etapa de GpA do produto c[G(2',5')pA(3',5')p] ligado no sítio catalítico na estrutura de cGAS, dsDNA e GTP + ATP (Figura 4B, C).
[000296] Nossas análises bioquímicas iniciais indicaram que a ligação 2',5' entre GTP e ATP ocorre em primeiro lugar, antes da cicliza- ção da adenosina de volta à guanosina. Esta evidência foi corroborada ainda mais pela observação de que a incubação de 2'-dATP com 2'- dGTP não pôde reagir para formar nenhum produto cíclico da reação (Figura S6). Na segunda etapa, a formação de um dinucleotídeo cíclico através do grupo 2' ou 3'-OH da adenosina pode prosseguir, mesmo quando a outra posição está bloqueada por meio da remoção de oxigênio, embora houvesse uma preferência observável para a utilização de 2'-dATP. A produção de dinucleotídeo cíclico em ambos os casos foi muito ineficiente, sugerindo que ambas as posições podem participar na formação de um estado de transição para a hidrólise do fosfato e ciclização eficientes. Este resultado desconcertante, combinado com dados da estrutura ternária relativos à conexão de adenosina para guanosina, nos levou a analisar melhor se cGAS acabaria por ter uma preferência para a geração de uma ligação 2',5' ou 3',5' para a ciclização.
[000297] Observamos um único pico de HPLC, distinto das duas moléculas de GA-dinucleotídeo cíclico de referência (ambas ligações 2',5' ou ambas ligações 3',5') e coincidente com c[G(2',5')pA(3',5')p], como o produto da atividade dsDNA-dependente da cGAS (Figura 6A). Esta conclusão foi validada a partir de um estudo independente de RMN (Figura 6C). Embora a produção biológica de dinucleotídeos cíclicos pareça evolutivamente conservada de procariotos a eucariotos, sua formação com base nas ligações químicas é distinta. No caso de cGAS, a formação de c[G(2',5')pA(3',5')p] parece semelhante aos oli- goadenilatos 2',5' gerados por OAS, mas também para as ligações di- nucleotídicas 3',5' criadas por ciclases bacterianas (Sadler and Williams, 2008; Kodym et al. 2009; Donovan et al. 2013). Possíveis benefícios das ligações 2',5' (etapa de GA) e 3',5' (etapa de AG) em c[G(2',5')pA(3',5')p]
[000298] Não é claro por que cGAS prefere gerar um GA- dinucleotídeo cíclico 2',5' (etapa de GpA) e 3',5' (etapa de ApG). A ligação fosfodiéster 2',5' é incomum e algumas nucleases são conhecidas por serem capazes de hidrolisar tal ligação (Kubota et al. 2004). Sem pretender ficar limitado por qualquer teoria em particular, as ligações 2',5' pode promover uma maior estabilidade nas células para permitir a transdução eficaz do mensageiro secundário, mas a ligação 3',5' pode facilitar sua desagregação por inúmeras endonucleases convencionais para impedir a resposta prolongada do interferon. Juntos, nossa estrutura e estudos funcionais identificaram a natureza química do cGAMP de metazoários, destacando o papel das ligações 2',5' em mensageiros secundários que ativam a via do interferon tipo I. Implicações dos mutantes de cGAS de ligação ao dsDNA
[000299] Os estudos estruturais identificaram contatos intermolecula- res proteína-DNA na formação do complexo cGAS-dsDNA (Figura 1C). Uma vez que estes são principalmente de natureza eletrostática e envolvem o reconhecimento não específico da estrutura de fosfodiéster do DNA, eles foram classificados em três conjuntos de mutantes triplos, com os ensaios in vitro (Figura 7A) e celulares (Figura 7B) estabelecendo a perda completa na atividade e a capacidade de estimular a produção de interferon para o mutante triplo S165A, N172A, K372A, mutante triplo N196A, Y200A, K372A e mutante triplo R158A, R161A, K395A, e perda parcial na atividade para o mutante triplo S165A, N172A, Y200A. Isto reforça a importância da formação do complexo entre cGAS e dsDNA para a atividade catalítica da cGAS. Implicações de mutantes cGAS no sítio catalítico
[000300] Estudos estruturais dos complexos ternários de cGAS e dsDNA com NTPs ligados identificaram Glu211, Asp213, Asp307 como resíduos catalíticos importantes para a formação da ligação fosfo- diéster. Todos os três resíduos catalíticos ácidos estão funcionalmente inativos na substituição por Ala, como observado em ensaios in vitro (Figura 7A; Glu211A) ou celular (Figura 7C, todos os três resíduos catalíticos), ao passo que a mutação S199A reteve atividade substancial. Tyr421 está envolvida em interações de empilhamento com A, enquanto que Arg364 esta ligada pelo hidrogênio com G no complexo ternário cGAMP (Figura 4B, C). A dupla mutação de Y421A, R364A resulta na perda da maior parte da atividade em ensaios celulares (Figura 7C). Papel dos Cátions Bivalentes
[000301] Os estudos estruturais dos complexos ternários de cGAS ligada ao dsDNA com ligantes mostraram que as frações trifosfato do ATP (Figura 2E, F) e 5'-pppG(2',5')pG (Figura 3B, C) são coordenadas para um par de cátions (provisoriamente atribuído ao Mg2+). De fato, estudos funcionais destacaram a importância de cátions bivalentes para a formação de ligações fosfodiéster. A omissão de cátions bivalentes ou a utilização de EDTA impediu a formação de c[G(2',5')pA(3',5')p], ao passo que Mg2+ e Mn2+ promoveram a atividade da cGAS (Figura 5A). Comparação com OAS1 sensora de dsRNA citoplasmático
[000302] Em um estudo paralelo à nossa contribuição, estudos estruturais e ensaios bioquímicos foram recentemente relatados quanto à caracterização da oligoadenilato sintetase humana 1 (OAS1) sensora de dsRNA, que polimeriza o ATP em oligoadenilato linear ligado 2',5' (Donovan et al. 2013). Os estudos cristalográficos inequivocamente demonstraram transições conformacionais na OAS1 em proceder do estado livre (Hartmann et al. 2003) para o complexo ternário com dsRNA ligado e 2'-dATP (Donovan et al. 2013), que seguem um padrão semelhante àquele observado por nós neste estudo para a formação do complexo de cGAS com dsDNA e ligantes ligados. Assim, três resíduos catalíticos Glu da OAS1 são aproximados na formação do complexo ternário com dsRNA e 2'-dATP, criando assim a geometria de coordenação para a ligação de dois íons Mg2+ e 2'-dATP (Donovan et al. 2013), semelhante ao que observamos para o sistema cGAS. Considerando que as únicas estruturas disponíveis eram OAS1 livre (Hartmann et al. 2003) e seu complexo ternário com dsRNA e li- gante ligado (Donovan et al. 2013), estes autores não estavam em posição de determinar como a transição conformacional foi dividida entre as etapas, refletindo a conversão de OAS1 livre para o complexo binário com dsRNA e a conversão do complexo binário para o complexo ternário na presença de 2'-dATP. Nossos resultados na cGAS sensora de dsDNA citoplasmático sugerem que a principal transição conforma- cional provavelmente será restrita à etapa que envolve a conversão da OAS1 do estado livre para o complexo de ligação ao dsRNA, com alterações mínimas na adição de 2'-dATP para formar o complexo ternário.
[000303] Além das semelhanças mencionadas acima, também existem diferenças nos princípios de reconhecimento proteína-ácido nu- cleico entre a cGAS sensora de dsDNA (nosso estudo) e a OAS1 sen- sora de dsRNA (Donovan et al. 2013), em que cGAS tem como alvo a estrutura de açúcar-fosfato do dsDNA dentro de um segmento central do duplex de dsDNA (Figura 1C), enquanto OAS1 tem como alvo a estrutura de açúcar-fosfato do dsRNA por contato de dois segmentos do sulco menor separados por 30 Â (Donovan et al. 2013). Os parâmetros helicoidais de dsRNA e dsDNA são muito distintos, e princípios de reconhecimento diferentes são utilizados nos complexos proteína- dsRNA (revisado em Lunde et al. 2007) e proteína-dsDNA (revisado em Huffman and Brennan, 2002). No entanto, princípios comuns são utilizados para gerar a arquitetura crítica do sítio catalítico, que, por sua vez, acopla o reconhecimento de ácido nucleico (dsRNA ou dsD- NA no citoplasma) com a cascata de eventos downstream que conduzem a um estado antiviral, incluindo a resposta ao interferon tipo I (cGAS) e ativação da RNase L (OAS1).
[000304] Além disso, a formação de iso-RNA linear ligado 2',5' mediada por OAS1 está em paralelo à formação de c[G(2',5')pA(3',5')p] contendo ligação 2',5' na etapa de GpA pela cGAS. Assim, ao contrário de ênfase anterior exclusiva em ligações 3',5', como observado anteriormente para o mensageiro secundário bacteriano c-di-GMP (revisado em Romling et al. 2013), destacamos que o mensageiro secundário de metazoários c[G(2',5')pA(3',5')p] utiliza ligações mistas envolvendo 2', 5' na etapa de GpA e 3',5' na etapa de ApG. cGAS contém um único sítio ativo para a formação da ligação fos- fodiéster gradualmente
[000305] Estudos anteriores demonstraram que a diguanilato ciclase PleD forma um homodímero cabeça-à-cauda para formar um centro de reação em sua interface, de modo que o intermediário não tenha que alterar sua orientação na via para formar c-di-GMP (Chan et al. 2004). Por outro lado, em nossos estudos atuais dos complexos ternários de cGAS, dsDNA e ligantes ligados, não observamos evidência para a formação de dímeros ou oligômeros de ordem superior no cristal. Além disso, o sítio de ligação ao ligante em nossos estruturas está enterrado dentro da topologia da cGAS e não está localizado na superfície, como ocorre em PleD (Chan et al. 2004).
[000306] De fato, a cGAS contém um único sítio ativo para as etapas sequenciais de formação da ligação fosfodiéster, uma característica bastante significativa considerando que os ligantes são GTP e ATP e que a ligação GpA que se forma primeiramente é 2'-5' e a ligação ApG que se forma em segundo lugar é 3',5', resultando na geração de c[G(2',5')pA(3',5')p]. Sem pretender ficar limitado por qualquer teoria em particular, descrevemos um modelo para a formação de c[G(2',5')pA(3',5')p] a partir de GTP e ATP no interior do único sítio ca-talítico da cGAS ligada ao dsDNA na Figura 7D. Neste modelo, a primeira etapa envolve a formação de um intermediário 5'-pppGpA seguida, na segunda etapa, pela formação de c[G(2',5')pA(3',5')p]. Acredita-se também que o ligante ligado sofre dois flip-overs na via para a formação do c[G(2',5')pA(3',5')p]. Implicações para a dinucleotídeo ciclase DncV
[000307] Em um estudo anterior, foi demonstrado que a dinucleotí- deo ciclase bacteriana DncV gera GMP-AMP cíclico (cGAMP) (Davies et al. 2012). Este primeiro relatório sobre a formação de cGAMP levanta a questão interessante quanto à natureza do par de ligações fosfo- diéster neste sistema bacteriano. Exemplo 6 Análise espectral por RMN dos isômeros sintetizados de ligação ao cGAMP
[000308] Isômeros liofilizados de ligação ao cGAMP foram dissolvidos em D2O 99,9% em tampão K2HPO4-KH2PO4 (pH 6,6) 10 mM. Todos os experimentos de RMN são conduzidos a 35°C em um espec- trômetro Bruker de 900 MHz no New York Structural Biology Center. Atribuições de ressonância são feitas com base em experimentos HMBC (retardo de reciclagem de 2 s, tempo de aquisição de 1H de 0,8 s, tempo de aquisição de 13C de 20 ms, aquisição 13C insensível à fase, e detecção de 1H anti-fase com processamento de modo em valor absoluto), COSY filtrado por duplo-quantum (retardo de reciclagem de 2 s, tempo de aquisição direta de 0,8 s, tempo de aquisição indireta de 12 ms), e HSQC (retardo de reciclagem de 1 s, tempo de aquisição de 1H de 48 ms, tempo de aquisição de 13C de 20 ms). Os espectros de prótons 1D com pré-saturação de água são acumulados mais de 8 var-reduras para os isômeros sintetizados de ligação ao cGAMP e 128 varreduras para a reação da cGAS bioenzimaticamente produzida. Exemplo 7 Análise por cromatografia em camada delgada (TLC) Preparação de oligonucleotídeos para ensaios de TLC
[000309] Os oligonucleotídeos utilizados para os ensaios bioquímicos da atividade da nucleotidiltransferase cGAS estão listados na Tabela S6. Os oligodesoxinucleotídeos foram sintetizados internamente utilizando um sintetizador de DNA 3400 (Applied Biosystems), oligorri- bonucleotídeos foram adquiridos (Dharmacon). DNA de cadeia dupla, RNA e duplexes de DNA/RNA foram anelados em Tris-HCl 70 mM, pH 7,6, MgCl2 10 mM, DTT 5mM, em concentrações equimolares por incubação iniciada a 95°C, seguida por uma diminuição de 0,1°C por segundo até 25°C em um aparelho de ciclagem térmica Peltier (MJ Research), e verificados para o anelamento hibridação por eletroforese em gel de agarose, antes da utilização. Análise por TLC da formação do c[G(2',5')pA(3',5')p]
[000310] A cGAS murina purificada recombinante de comprimento completo (fl, aminoácidos 1-507) e truncada (tr, aminoácidos 147-507), incluindo as versões mutantes truncadas 1-6, foram incubadas em 20 μL de reações contendo: 1 μM de cGAS, 3,3 μM de dsDNA, 5 mM de MgCl2, 150 mM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl, pH 7,5 a 25°C, 1 mM de DTT, 10% glicerol, 1 mM de cada um dos nucleotídeos (tipicamente ATP e GTP), e NTPs ou dNTPs radiomarcados com α32P ou Y32P a 37°C por 40 minutos. As reações foram interrompidas pela adição de 20 μL de EDTA 50 mM. 2 μL da solução de reação foi aplicada em placas de TLC de alta eficiência (HPTLC em gel de sílica, poros de 60 A, F254, 10x10 cm, cat # 1.05628.0001, EMD Millipore) e os produtos foram separados com o Solvente 1 (NH4HCO3:C2H5OH:H2O [0,2 M:30%:70%], p:v:v) ou 2 (NH4HCO3:C2H5OH:H2O [0,025 M:30%:70%], p:v:v) a 25°C por uma hora. Os produtos da reação foram visualizadas por UV (254 nm) e imagiologia com fósforo (Typhoon FLA 9500, GE Healthcare). As imagens foram processadas usando Adobe Photoshop e Illustrator CS5. As condições da TLC foram usadas, em grande parte, com base em um protocolo estabelecido para separar 3',5' cAMP (Higashida et al, 2012). Exemplo 8 Quantificação dos Produtos de Reação da cGAS
[000311] O rendimento de c[G(2',5')pA(3',5')p] gerado foi calculado pela análise de densitometria dos experimentos de TLC, utilizando FIJI (ImageJ 1.47i) ou espectrofotometricamente (absorbância a 260 nm, E260=25,4 x 103) após purificação a partir de HPLC. Para as análises de densitometria, a fração de c[G(2',5')pA(3',5')p] marcado com α32P em relação à radioatividade total por linha (c[G(2',5')pA(3',5')p] mais ATP ou GTO marcado com α32P remanescente) foi calculada. Exemplo 9 Preparação dos produtos de reação da cGAS para análise por croma- tografia líquida de alta eficiência
[000312] Os produtos de reação c[G(2',5')pA(3',5')p] gerados in vitro, ou cristais de cGAS lavados e dissolvidos, foram tratados com 25 unidades de Benzonase (Novagen, cat. # 70746, pureza > 90%) por 30 minutos a 37°C, inativados por calor por 10 min a 95°C, e depois centrifugados a 21.000 g por 15 minutos (Sorvall Legend Micro 21R, Thermo Scientific); o sobrenadante foi usado para análise por HPLC. Os produtos da reação, com ou sem 3-8 nmoles de todos 3',5' cGAMP, todos 2',5' cGAMP, ou c[G(2',5')pA(3',5')p] quimicamente sintetizados foram submetidos à análise por HPLC de fase reversa (AKTA Purifier, GE Healthcare) utilizando uma coluna C18 (25 cm x 4,5 mm, poro de 5 μM, Supelco Analytical). Os analitos foram monitorados por UV 260 e 280 nm. Foi usado um gradiente linear de duas etapas: solvente B 010% (volume de 2 colunas), solvente B 10-50% (volume de 2 colunas); solvente A (acetato de trietilamônia:acetonitrila:H2O [0,1 M:3%:97%], w:v:v) e solvente B (metanol:acetonitrila:H2O [45%:45%:10:], v:v:v). Preparação do produto de reação da cGAS para análise por RMN 1D
[000313] 100 μL do produto de reação c[G(2',5')pA(3',5')p] gerado in vitro foram tratados com benzonase e calor como anteriormente, antes do fracionamento por HPLC. Três corridas de HPLC em série foram realizadas (duas injeções de 40 μL e uma de 20 μL da reação), e o pico correspondente ao c[G(2',5')pA(3',5')p] foi coletado em tubo Falcon de 15 mL (aproximadamente 4,5 mL no total). A remoção do solvente foi realizada por centrifugação a vácuo (Vacufuge, Eppendorf) por 3 dias à temperatura ambiente até ficar completamente seco. Exemplo 10 Ensaios celulares Geração de mutantes pontuais da cGAS
[000314] A CDS da cGAS murina foi inserida em um vetor de clonagem pMAX modificado (Amaxa, Cologne, Alemanha). A mutagênese dirigida ao sítio foi realizada usando o método Quikchange (Agilent, Santa Clara, CA) usando DNA polimerase Pfu Ultra Hot Start (Agilent) ou DNA Polimerase KOD Hot Start (Merck, Darmstadt, Alemanha). As CDSs de STING murina e luciferase de vaga-lume (Promega, Madison, WI) foram clonadas em um plasmídeo de expressão pLenti6 modificado com o promotor EF1 (Invitrogen, Carlsbad, CA). O repórter Gluc pGL3 do IFN-beta foi obtido de Brian Monks (Institute of Innate Immunity, University of Bonn, Alemanha). Todas as construções foram verificadas por sequenciamento da CDS. Ensaio de luciferase
[000315] 3x104 células HEK293 por 96 poços foram transfectadas de forma reversa em triplicatas com uma mistura dos plasmídeos de ex-pressão pGL3-IFNbeta-Gluc (50 ng), pLenti-EF1-Fluc (25 ng), pLenti- EF1-mSTING (25 ng) e cGAS (25 ng, pMAX-cGAS WT ou mutantes) ou plasmídeo controle pMAX-GFP (Amaxa) usando Trans-IT LT1 (MirusBio, Madison, WI). Após 36 h, as células foram lisadas em tampão de lise passiva. As atividades da luciferase do vaga-lume e Gaus- sia foram determinadas em um leitor EnVision (Perkin Elmer, Waltham, MA) usando os respectivos substratos de D-luciferina e coelenterazina (PJK GmbH, Kleinblittersdorf, Alemanha). Os valores de IFNbeta-Gluc foram normalizados para os valores constitutivos da luciferase de vaga-lume e as vezes de indução foram calculadas em relação ao plas- mídeo controle pMAX-GFP. Exemplo 11 Síntese de GA-dinucleotídeos cíclicos
[000316] A preparação de todos 2',5'-cGAMP (6, Figura S7), c[G(2',5')pA(3',5')p] (11, Figura S7), e todos 3',5'-cGAMP (15, Figura S7) foi realizada usando o procedimento anteriormente relatado pelo laboratório de Jones (Gaffney et al. 2010; Gaffney and Jones 2012). À adeno- sina fosforamidita, 1 ou 7, (0,784 g, 0,793 mmol) dissolvida em 5 mL de CH3CN e água (0,028 mL, 1,6 mmol, 2 equiv) foi adicionado trifluoroace- tato de piridínio (0,184 g, 0,95 mmol, 1,2 equiv). Após 1 minuto, 6 mL de terc-BuNH2 foram adicionados. Após mais 10 minutos, a mistura foi concentrada. Ao resíduo dissolvido em 10 mL de CH2Cl2 foi adicionada H2O (0,14 mL, 7,9 mmols, 10 equiv), seguida por 10 mL de ácido diclo- roacético 6% (DCA, 7,5 mmols) em CH2Cl2. Após 10 minutos, a reação foi interrompida pela adição de piridina (1,2 mL, 15 mmols, 2 equiv em relação ao DCA). A mistura foi então concentrada, e o resíduo foi dissolvido em 7 mL de CH3CN e concentrado novamente.
[000317] Este processo foi repetido mais duas vezes, a última vez dei-xando o A H-fosfonato, 2 ou 8, em 2 mL. A esta solução adicionou-se uma solução liofilizada de G amidita, 3 ou 12 (1,00 g, 1,03 mmol, 1,3 equiv) em 3 mL de CH3CN. Após 2 minutos, terc-butila hidroperóxido anidro 5,5 M em decano (0,43 mL, 2,4 mmols, 3 equiv) foi adicionado. Após 30 minutos, 0,20 g de NaHSO3 dissolvido em 0,5 mL de H2O foi adicionado. A mistura foi agitada por 5 minutos, e depois concentrada. O óleo residual foi dissolvido em 14 mL de CH2Cl2, seguido pela adição de H2O (0,15 mL, 8,5 mmols, 10 equiv) e, em seguida, 14 mL de DCA 6% (9,8 mmols) em CH2Cl2. Após 10 minutos, a reação foi interrompida com 9 mL de piridina. A mistura foi concentrada até um pequeno volume, mais 25 mL de piridina foram adicionados, e a solução foi concentrada novamente, deixando o dímero linear, 4, 9 ou 13, em 17 mL. A esta solução foi adicionado 5,5-dimetil-2-oxo-2-cloro-1,3,2-dioxafosfinano (DMOCP, 0,54 g de reagente 95%, 2,8 mmols, 3,5 equiv). Após 10 minutos, a reação foi interrompida pela adição de H2O (0,50 mL, 28 mmols, 10 equiv em relação ao DMOCP), e I2 (0,26 g, 1,0 mmol, 1,3 equiv) foi adicionado imediatamente. Após 5 minutos, a mistura foi vertida em 120 mL de H2O, contendo 0,17 g de NaHSO3. Após 5 minutos de agitação, 3,4 g de NaHCO3 foram adicionados lentamente. Depois de mais 5 minutos de agitação, a solução aquosa contendo sólido foi dividida com 135 mL de 1:1 de EtOAc:Et2O. A camada aquosa separada foi em seguida dividida com 35 mL adicionais de 1:1 de EtOAc:Et2O.
[000318] As camadas orgânicas, contendo 5, 10 ou 14, foram combinadas e concentradas até se obter um óleo. Para 14, o óleo foi dissolvido em 5 mL de CH3CN e o grupo cianoetila foi removido pela adição de 5 mL de terc-BuNH2 durante 10 minutos. O resíduo foi purificado em uma coluna de SiO2 de 80 g, utilizando um gradiente de 0 a 25% de CH3OH em CH2Cl2 por 50 minutos. 5 e 10 foram diretamente purificados em SiO2 sem tratamento com terc-BuNH2. Em cada caso, o resíduo após a purificação foi tratado com 21 mL de CH3NH2 em EtOH anidro (33% em peso, 168 mmols, 212 equiv em relação ao grupos protetores de amina). Após 4 h à temperatura ambiente, a mistura foi concentrada até se obter um sólido, ao qual 3 mL de piridina e 1 mL de Et3N foram adicionados. A mistura foi concentrada até se obter um óleo, e este processo foi repetido mais duas vezes para converter o terc-BuNH3+ ao sal Et3NH+. Ao óleo foi adicionado 1 mL de piridina, e o balão foi colocado em um banho de óleo a 55°C. Et3N (7,5 mL) e Et3N^3HF (2,6 mL, 48 mmols de F-, 30 equiv em relação a cada TBS) foram adicionados simultaneamente. A mistura foi agitada a 55°C. Após 3 horas, o balão foi removido a partir do banho de óleo e HPLC em grau de acetona (70 mL) foi lentamente adicionado à mistura em agitação. Após 10 minutos, o sólido foi coletado por filtração, lavado 5x com frações de acetona de 3 mL, e liofilizado em um dessecador em KOH durante a noite. Este processo forneceu 15 puro, mas 6 e 11 foram purificados em uma coluna Prep Nova-Pak C18 de 19x300 mm utilizando um gradiente de 2 a 20% de CH3CN em 0,1 M de NH4HCO3.
[000319] HPLC analítica de fase inversa foi realizada em um sistema Waters 2965 com um detector de arranjo de fotodiodos, utilizando uma coluna Atlantis C18, 100 Â, 4,6 mm x 50 mm, 3,0 μm. Gradientes de CH3CN e 0,1 M de tampão de acetato de trietilamônia (pH 6,8) foram utilizados com uma velocidade de fluxo de 1,0 mL/min. ESI-MS de baixa resolução foi rotineiramente adquirida utilizando um sistema quá-druplo exclusivo de LCZ Waters Micromass. A LCMS de 6, 11 e 15 exibiu m/z (MH) 673 (calculado para C20H23N10O13P2-: 673). Exemplo 12 Indução dependente de STING do interferon-alfa murino e CXCL10 humana por compostos cGAMP. Cultura de THP-1 e condições de ensaio
[000320] Células THP-1 foram cultivadas em RPMI1640 com 10% de FBS, piruvato de sódio e penicilina/estreptomicina (Gibco, Life Technologies). 8x104 células foram plaqueadas por 96 poços em 100 μL de meio e equilibradas por 2 h a 37°C/5% de CO2. Para gerar células tipo macrófagos, 8x104 células THP-1 foram diferenciadas durante a noite com 10 ng/mL de PMA (Sigma), o meio foi alterado e as células foram incubadas por mais 24 h antes da estimulação. Cultura de BMDM e condições de ensaio
[000321] Células macrofágicas derivadas de medula óssea (BMDM) foram lavadas dos fêmures de camundongos C57BL/6. Os eritrócitos foram lisados (PharmLyse, BD Biosciences) e 1x107 células por placa de Petri foram incubadas em DMEM 10% FBS, piruvato de sódio e pe- nicilina/estreptomicina (Gibco, Life Technologies) com 30% de sobre- nadante de células L929 por 7 dias. As células foram coletadas com EDTA a 2 mM de PBS e plaqueadas em uma densidade de 1x105 células por 96 poços. BMDMs foram permeabilizadas com digitonina ou tratadas com controle na presença das concentrações indicadas de cGAMP por 30 minutos, em seguida, suplementadas com meio fresco. Os sobrenadantes foram coletados após 18 horas e as citocinas foram determinadas por ELISA. Permeabilização/estimulação celular
[000322] A permeabilização celular para a entrega de dinucleotídeos cíclicos foi realizada como previamente descrito (Woodward et al., 2010). Resumidamente, o sobrenadante foi removido e as células foram cobertas com 50 μL de Perm-tampão (HEPES 50 mM a pH 7,0, KCl 100 mM, MgCl2 3 mM, ATP 1 mM, GTP 0,1 mM, DTT 0,1 mM, sacarose 85 mM, 0,2% de BSA) +/- 10 μg/mL de digitonina e diluições seriais de isômeros de cGAMP, seguido por 30 minutos de incubação a 37°C. Perm-tampão foi então removido e as células foram cobertas com 100 μL de meio pré-aquecido. A viabilidade de células permeabili- zadas foi > 50% em relação às células não tratadas, tal como monitorado por microscopia óptica e Cell Titer Blue (Roche).
[000323] Os sobrenadantes foram coletados 16 h após a estimulação e as citocinas foram determinadas por ELISA e bioensaio HEK-Blue™ IFN-α/β, respectivamente. ELISA
[000324] A CXCL-10 humana foi determinada por ELISA (BD Opteia human IP-10 ELISA-Set) de acordo com as recomendações do fabricante. O IFNα murino foi determinado por ELISA sanduíche: anti-IFNα monoclonal de rato (clone RMMA-1) foi utilizado como anticorpo de captura, IFNα recombinante foi utilizado como padrão e IFNα policlonal contra soro de coelho para detecção (todos da PBL Interferon Source, Piscataway NJ, EUA), seguido por anti-HRP de coelho (Bio-Rad). Ajuste das Curvas de -ose-resposta
[000325] Curvas sigmoidais de dose-resposta 4-paramétricas e os valores de EC50 foram analisados com Graph Pad Prism (Graph Pad Software, La Jolla CA, EUA). Tabela S4. Alterações químicas de prótons e carbonos para cGAMPs Lista de alterações químicas de prótons
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Figure img0033
Tabela S5. Iniciadores usados nas PCRs Quickchange para muta- gênese (Metabion, Martinsried, D):
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Tabela S6.Oligonucleotídeos usados para análises por TLC:
Figure img0036
[000326] Os nucleotídeos em negrito e sublinhado representam 8- oxoguanosinas que foram utilizadas em oligos modificados gerados separadamente. Os oligonucleotídeos foram sintetizados internamente em sintetizador de DNA 3400 (Applied Biosystems) ou adquiridos (Dharmacon). REFERÊNCIAS Adams, P.D., Afonine, P.V., Bunkoczi, G., Chen, V.B., Davis, I.W., Echols, N., Headd, J.J., Hung, L.W., Kapral, G.J., Grosse-Kunstleve, R.W., et al. (2010). PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 66, 213-221. Burckstummer, T., Baumann, C., Blumi, S., Dixit, E., Durnberger, G., Jahn, H., Planyavsky, M., Bilban, M., Colinge, J., Bennet, K.L. et al. (2009). An orthogonal proteomic-genomic screen identifies AIM2 as a cytoplasmic DNA sensor for the inflammasome. Nat. Immunol. 10, 266272. Chan, C., Paul, R., Samoray, D., Amiot, N.C., Giese, B., Jenal, U. and Schirmer, T. (2004). 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Equivalentes e Escopo
[000327] Os versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes das modalidades específicas de acordo com a invenção aqui descrita. O escopo da presente invenção não se destina a se limitar à descrição acima, mas em vez disso está de acordo com o que é estabelecido nas reivindicações anexas.
[000328] Nas reivindicações, artigos tais como "um", "uma", "a" ou "o" podem significar um ou mais do que um, salvo indicação em contrário, ou de outro modo evidente a partir do contexto. Reivindicações ou descrições que incluem "ou" entre um ou mais membros de um grupo são consideradas satisfeitas se um, mais do que um ou todos os membros do grupo estiverem presentes em, empregados em, ou de outra forma forem relevantes a um determinado produto ou processo, salvo indicação em contrário, ou de outro modo evidente a partir do contexto. A invenção inclui modalidades nas quais exatamente um membro do grupo está presente em, empregado em, ou de outro modo é relevante a um determinado produto ou processo. A invenção inclui modalidades nas quais mais do que um ou todos os membros do grupo estão presentes em, empregados em, ou de outra forma são relevantes a um determinado produto ou processo.
[000329] Também deve-se observar que o termo "compreendendo" ou "que compreende" destina-se a ser aberto e permite, mas não exige, a inclusão de elementos ou etapas adicionais. Quando o termo "compreendendo" ou "que compreende" for aqui utilizado, o termo "consistindo em" ou "consiste em" é, portanto, também englobado e descrito.
[000330] Onde são apresentados intervalos, pontos extremos estão incluídos. Além disso, deve-se entender que, salvo indicação em contrário ou de outra maneira evidente a partir do contexto e entendimento de um versado na técnica, os valores que são expressos como intervalos podem assumir qualquer valor ou subintervalo específico dentro dos intervalos indicados em diferentes modalidades da invenção, ao décimo da unidade do limite inferior do intervalo, a menos que o contexto dite claramente o contrário.
[000331] Além disso, deve-se entender que qualquer modalidade em particular da presente invenção que caia na técnica anterior pode ser explicitamente excluída de qualquer uma ou mais das reivindicações. Uma vez que tais modalidades são consideradas como conhecidas de um versado na técnica, estas podem ser excluídas, mesmo se a exclusão não estiver aqui estabelecida explicitamente. Qualquer modalidade em particular das composições da invenção (por exemplo, qual- quer ácido nucleico ou proteína codificada deste modo; qualquer método de produção, qualquer método de utilização, etc.) pode ser excluída de qualquer uma ou mais reivindicações, por qualquer motivo, relacionada ou não à existência de técnica anterior.
[000332] Todas as fontes citadas, por exemplo, referências, publicações, bancos de dados, inserções em banco de dados, técnica aqui citados, estão incorporadas neste pedido por referência, mesmo se não estiverem expressamente indicadas na citação. Em caso de declarações contraditórias de uma fonte citada e o presente pedido, a declaração no presente pedido prevalecerá.
[000333] Cabeçalhos de seções e tabelas não se destinam a ser limi- tantes.

Claims (18)

1. Composto, caracterizado pelo fato de que é de Fórmula
Figure img0037
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: o Anel A é selecionado a partir do grupo consistindo em:
Figure img0038
o Anel B é selecionado a partir do grupo consistindo em:
Figure img0039
cada X1 e X2 é, independentemente, -CR- ou -N-; X3 é -C(R)2-, -O- ou -NR-; Xa e Xb são, independentemente, -C(R)2-, -C(R)=C(R)-, -O-, -S-, -S(O)-, -S(O)2- ou -N(R)-; Xa1 e Xb1 são, independentemente, -C(R)- ou -N-; Xc e Xd são independentemente oxigênio substituído ou não substituído, enxofre substituído ou não substituído, um átomo de nitrogênio substituído, BH3 ou C1-12 alifático substituído ou não substituído, desde que um ou ambos de Xc e Xd seja enxofre substituído ou não substituído, um átomo de nitrogênio substituído, BH3 ou C1-12 alifático substituído ou não substituído; cada Xe e Xf é, independentemente, -O-, -S-, ou -N(R)-; cada W é P; cada R1 e R2 é, independentemente, selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, -NO2, -CN, -ORa, -SR, -N(R)2, -C(O)R, -CO2R, -C(O)C(O)R, -C(O)CH2C(O)R, -S(O)R, -S(O)2R, -C(O)N(R)2, -SO2N(R)2, -OC(O)R, -N(R)C(O)R, -N(R)N(R)2, -N(R)C(=NR)N(R)2, -C(=NR)N(R)2, -C=NOR, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)SO2N(R)2, -N(R)SO2R, -OC(O)N(R)2, e C1-12 alifático ou C1-4 alcóxi-C1-4 alquila substituído ou não substituído; cada R3, R4, R5, R6, R7, R10 e R11 é, independentemente, selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, -NO2, -CN, -OR, -SR, -N(R)2, -C(O)R, -CO2R, -C(O)C(O)R, -C(O)CH2C(O)R, -S(O)R, -S(O)2R, -C(O)N(R)2, -SO2N(R)2, -OC(O)R, -N(R)C(O)R, -N(R)N(R)2, -N(R)C(=NR)N(R)2, -C(=NR)N(R)2, -C=NOR, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)SO2N(R)2, -N(R)SO2R, -OC(O)N(R)2, ou um grupo substituído ou não substituído selecionado a partir de C112 alifático, fenila, um anel carbocíclico monocíclico saturado ou parcialmente insaturado de 3-7 membros, um anel carbocíclico bicíclico saturado ou parcialmente insaturado de 7-10 membros, um anel heterocíclico saturado ou parcialmente insaturado de 3-7 membros possuindo 1-2 heteroátomos selecionados independentemente a partir de nitrogênio, oxigênio ou enxofre, um anel heterocíclico bicíclico saturado ou parcialmente insaturado de 710 membros possuindo 1-3 heteroátomos selecionados independentemente a partir de nitrogênio, oxigênio ou enxofre, e um anel heteroarila de 5-6 membros possuindo 1-3 heteroátomos independentemente selecionados a partir de nitrogênio, oxigênio ou enxofre; cada R8 e R9, quando presente, é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, -NO2, -CN, -ORa, -SR, -N(R)2, -C(O)R, -CO2R, -C(O)C(O)R, -C(O)CH2C(O)R, -S(O)R, -S(O)2R, -C(O)N(R)2, -SO2N(R)2, -OC(O)R, -N(R)C(O)R, -N(R)N(R)2, -N(R)C(=NR)N(R)2, -C(=NR)N(R)2, -C=NOR, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)SO2N(R)2, -N(R)SO2R, -OC(O)N(R)2, e C1-12 alifático substituído ou não substituído; cada R é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio ou um grupo substituído ou não substituído selecionado a partir de C1-6 alifático, fenila, um anel carbocíclico saturado ou parcialmente insaturado de 3-7 membros, um anel heterocíclico monocíclico saturado ou parcialmente insaturado de 3-7 membros possuindo 1-2 heteroátomos selecionados independentemente a partir de nitrogênio, oxigênio ou enxofre, ou um anel heteroarila de 5-6 membros possuindo 1-3 heteroátomos independentemente selecionados a partir de nitrogênio, oxigênio ou enxofre; ou: dois grupos R no mesmo nitrogênio são reunidos com os seus átomos intervenientes para formar um anel heteroarila saturado ou parcialmente insaturado substituído ou não substituído de 3-7 membros possuindo 1-4 heteroátomos selecionados independentemente a partir de nitrogênio, oxigênio ou enxofre; e Ra um é um grupo protetor de oxigênio ou R, em que o grupo protetor de oxigênio inclui os grupos metila, metoximetila (MOM), metiltiometila (MTM), t-butiltiometila, (fenildimetilsilil)metoximetila (SMOM), benziloximetila (BOM), p- metoxibenziloximetila (PMBM), (4-metoxifenóxi)metil(p-AOM), guaiacolmetila (GUM), t-butoximetila, 4-penteniloximetila (POM), siloximetila, 2-metoxietoximetila (MEM), 2,2,2-tricloroetoximetila, bis(2- cloroetóxi)metila, 2-(trimetilsilil)etoximetila (SEMOR), tetra-hidropiranila (THP), 3-bromotetra-hidropiranila, tetra-hidrotiopiranila, 1-metoxiciclo- hexila, 4-metoxitetra-hidropiranila (MTHP), 4-metoxitetra-hidrotiopiranila, 4-metoxitetra-hidrotiopiranila S,S-dióxido, 1-[(2-cloro-4-metil)fenil]-4- metoxipiperidin-4-ila (CTMP), 1,4-dioxano-2-ila, tetra-hidrofuranila, tetra- hidrotiofuranila, 2,3,3a,4,5,6,7,7a-octa-hidro-7,8,8-trimetil-4,7- metanobenzofuran-2-ila, 1-etoxietila, 1-(2-cloroetóxi)etila, 1-metil-1- metoxietila, 1-metil-1-benziloxietila, 1-metil-1-benzilóxi-2-fluoroetila, 2,2,2- tricloroetila, 2-trimetilsililetila, 2-(fenilselenil)etila, t-butila, alila, p- clorofenila, p-metoxifenila, 2,4-dinitrofenila, benzila, p-metoxibenzila, 3,4- dimetoxibenzila, o-nitrobenzila, p-nitrobenzila, p-halobenzila, 2,6- diclorobenzila, p-cianobenzila, p-fenilbenzila, 2-picolila, 4-picolila, 3-metil- 2-picolila N-óxido, difenilmetila, p,p'-dinitrobenzidrila, 5-dibenzosuberila, trifenilmetila, α-naftildifenilmetila, p-metoxifenildifenilmetila, di(p- metoxifenil)fenilmetila, tri(p-metoxifenil)metila, 4-(4'- bromofenaciloxifenil)difenilmetila, 4,4',4''-tris(4,5- dicloroftalimidofenil)metila, 4,4',4''-tris(levulinoiloxifenil)metila, 4,4',4''- tris(benzoiloxifenil)metila, 3-(imidazol-1-ila)bis(4',4''-dimetoxifenil)metila, 1,1-bis(4-metoxifenil)-1'-pirenilmetila, 9-antrila, 9-(9-fenil)xantenila, 9-(9- fenil-10-oxo)antrila, 1,3-benzoditiolan-2-ila, benzisotiazolila S,S-dióxido, trimetilsilila (TMS), trietilsilila (TES), tri-isopropilsilila (TIPS), dimetilisopropilsilila (IPDMS), dietilisopropilsilila (DEIPS), dimetiltexilsilila, t-butildimetilsilila (TBDMS), t-butildifenilsilila (TBDPS), tribenzilsilila, tri-p- xililsilila, trifenilsilila, difenilmetilsilila (DPMS), t-butilmetoxifenilsilila (TBMPS), formato, benzoilformato, acetato, cloroacetato, dicloroacetato, tricloroacetato, trifluoroacetato, metoxiacetato, trifenilmetoxiacetate, fenoxiacetato, p-clorofenoxiacetato, 3-fenilpropionato, 4-oxopentanoato (levulinato), 4,4-(etilenoditio)penta-noato (levulinoilditioacetal), pivaloato, adamantoato, crotonato, 4-metoxicrotonato, benzoato, p-fenilbenzoato, 2,4,6-trimetilbenzoato (mesitoato), carbonato de alquilmetila, carbonato de 9-fluorenilmetila (Fmoc), carbonato de alquiletila, carbonato de alquila 2,2,2-tricloroetila (Troc), carbonato de 2-(trimetilsilila)etila (TMSEC), carbonato de 2-(fenilsulfonila)etila (Psec), carbonato de 2- (trifenilfosfonio)etila (Peoc), carbonato de alquilisobutila, carbonato de alquilvinila, carbonato de alquilalila, carbonato de alquila p-nitrofenila, carbonato de alquilbenzila, carbonato de alquil-p-metoxibenzila, carbonato de alquil-3,4-dimetoxibenzila, carbonato de alquil-o- nitrobenzila, carbonato de alquila p-nitrobenzila, tiocarbonato de alquil-S- benzila, carbonato de 4-etóxi-1-naftila, ditiocarbonato de metila, 2- iodobenzoato, 4-azido-butirato, 4-nitro-4-metilpentanoato, o- (dibromometil)benzoato, 2-formil-benzenossulfonato, 2- (metiltiometóxi)etila, 4-(metiltiometóxi)butirato, 2- (metiltiometoximetil)benzoato, 2,6-dicloro-4-metilfenoxiacetato, 2,6- dicloro-4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenoxiacetato, 2,4-bis(1,1- dimetilpropil)fenoxiacetato, clorodifenilacetato, isobutirato, monosuccinoato, (E)-2-metil-2-butenoato, o-(metoxicarbonil)benzoato, α- naftoato, nitrato, N,N,N',N-tetrametilfosforodiamidato de alquila, N- fenilcarbamato de alquila, borato, dimetilfosfinotioila, 2,4- dinitrofenilsulfenato de alquila, sulfato, metanossulfonato (mesilato), benzilsulfonato e tosilato (Ts).
2. Composto, caracterizado pelo fato de que é de Fórmula I:
Figure img0040
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: o Anel A é selecionado a partir do grupo consistindo em:
Figure img0041
o Anel B é selecionado a partir do grupo consistindo em:
Figure img0042
cada X1 e X2 é, independentemente, -CR- ou -N-; X3 é -C(R)2-, -O- ou -NR-; Xa e Xb são, independentemente, -C(R)2-, -C(R)=C(R)-, -O-, -S-, -S(O)-, -S(O)2- ou -N(R)-; Xa1 e Xb1 são, independentemente, -C(R)- ou -N-; Xc e Xd são independentemente oxigênio substituído ou não substituído, enxofre substituído ou não substituído, um átomo de nitrogênio substituído, BH3 ou C1-12 alifático substituído ou não substituído, desde que um ou ambos de Xc e Xd seja enxofre substituído ou não substituído, um átomo de nitrogênio substituído, BH3 ou alifático C1-12 substituído ou não substituído; cada Xe e Xf é, independentemente, -O-, -S-, ou -N(R)-; cada W é P; cada R1 e R2 é, independentemente, selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, -NO2, -CN, -ORa, -SR, -N(R)2, -C(O)R, -CO2R, -C(O)C(O)R, -C(O)CH2C(O)R, -S(O)R, -S(O)2R, -C(O)N(R)2, -SO2N(R)2, -OC(O)R, -N(R)C(O)R, -N(R)N(R)2, - N(R)C(=NR)N(R)2, -C(=NR)N(R)2, -C=NOR, -N(R)C(O)N(R)2, - N(R)SO2N(R)2, -N(R)SO2R, -OC(O)N(R)2, e C1-12 alifático ou C1-4 alcóxi-C1-4 alquila substituído ou não substituído; cada R3, R4, R5, R6, R7, R10 e R11 é, independentemente, selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, -NO2, -CN, -OR, -SR, -N(R)2, -C(O)R, -CO2R, -C(O)C(O)R, -C(O)CH2C(O)R, -S(O)R, -S(O)2R, -C(O)N(R)2, -SO2N(R)2, -OC(O)R, -N(R)C(O)R, -N(R)N(R)2, -N(R)C(=NR)N(R)2, -C(=NR)N(R)2, -C=NOR, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)SO2N(R)2, -N(R)SO2R, -OC(O)N(R)2, ou um grupo substituído ou não substituído selecionado a partir de C112 alifático, fenila, um anel carbocíclico monocíclico saturado ou parcialmente insaturado de 3-7 membros, um anel carbocíclico bicíclico saturado ou parcialmente insaturado de 7-10 membros, um anel heterocíclico saturado ou parcialmente insaturado de 3-7 membros possuindo 1-2 heteroátomos selecionados independentemente a partir de nitrogênio, oxigênio ou enxofre, um anel heterocíclico bicíclico saturado ou parcialmente insaturado de 710 membros possuindo 1-3 heteroátomos selecionados independentemente a partir de nitrogênio, oxigênio ou enxofre, e um anel heteroarila de 5-6 membros possuindo 1-3 heteroátomos independentemente selecionados a partir de nitrogênio, oxigênio ou enxofre; cada R8 e R9, quando presente, é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, -NO2, -CN, -ORa, -SR, -N(R)2, -C(O)R, -CO2R, -C(O)C(O)R, - C(O)CH2C(O)R, -S(O)R, -S(O)2R, -C(O)N(R)2, -SO2N(R)2, -OC(O)R, -N(R)C(O)R, -N(R)N(R)2, -N(R)C(=NR)N(R)2, -C(=NR)N(R)2, - C=NOR, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)SO2N(R)2, -N(R)SO2R, -OC(O)N(R)2, e C1-12 alifático substituído ou não substituído; cada R é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio ou um grupo substituído ou não substituído selecionado a partir de C1-6 alifático, fenila, um anel carbocíclico saturado ou parcialmente insaturado de 3-7 membros, um anel heterocíclico monocíclico saturado ou parcialmente insaturado de 3-7 membros possuindo 1-2 heteroátomos selecionados independentemente a partir de nitrogênio, oxigênio ou enxofre, ou um anel heteroarila de 5-6 membros possuindo 1-3 heteroátomos independentemente selecionados a partir de nitrogênio, oxigênio ou enxofre; ou: dois grupos R no mesmo nitrogênio são reunidos com os seus átomos intervenientes para formar um anel heteroarila saturado ou parcialmente insaturado substituído ou não substituído de 3-7 membros possuindo 1-4 heteroátomos selecionados independentemente a partir de nitrogênio, oxigênio ou enxofre; e Ra um é um grupo protetor de oxigênio ou R, em que o grupo protetor de oxigênio inclui os grupos metila, metoximetila (MOM), metiltiometila (MTM), t-butiltiometila, (fenildimetilsilil)metoximetila (SMOM), benziloximetila (BOM), p- metoxibenziloximetila (PMBM), (4-metoxifenóxi)metil(p-AOM), guaiacolmetila (GUM), t-butoximetila, 4-penteniloximetila (POM), siloximetila, 2-metoxietoximetila (MEM), 2,2,2-tricloroetoximetila, bis(2- cloroetóxi)metila, 2-(trimetilsilil)etoximetila (SEMOR), tetra-hidropiranila (THP), 3-bromotetra-hidropiranila, tetra-hidrotiopiranila, 1-metoxiciclo- hexila, 4-metoxitetra-hidropiranila (MTHP), 4-metoxitetra- hidrotiopiranila, 4-metoxitetra-hidrotiopiranila S,S-dióxido, 1-[(2-cloro-4- metil)fenil]-4-metoxipiperidin-4-ila (CTMP), 1,4-dioxano-2-ila, tetra- hidrofuranila, tetra-hidrotiofuranila, 2,3,3a,4,5,6,7,7a-octa-hidro-7,8,8- trimetil-4,7-metanobenzofuran-2-ila, 1-etoxietila, 1-(2-cloroetóxi)etila, 1- metil-1-metoxietila, 1-metil-1-benziloxietila, 1-metil-1-benzilóxi-2- fluoroetila, 2,2,2-tricloroetila, 2-trimetilsililetila, 2-(fenilselenil)etila, t- butila, alila, p-clorofenila, p-metoxifenila, 2,4-dinitrofenila, benzila, p- metoxibenzila, 3,4-dimetoxibenzila, o-nitrobenzila, p-nitrobenzila, p- halobenzila, 2,6-diclorobenzila, p-cianobenzila, p-fenilbenzila, 2- picolila, 4-picolila, 3-metil-2-picolila N-óxido, difenilmetila, p,p'- dinitrobenzidrila, 5-dibenzosuberila, trifenilmetila, α-naftildifenilmetila, p-metoxifenildifenilmetila, di(p-metoxifenil)fenilmetila, tri(p- metoxifenil)metila, 4-(4'-bromofenaciloxifenil)difenilmetila, 4,4',4''- tris(4,5-dicloroftalimidofenil)metila, 4,4',4''-tris(levulinoiloxifenil)metila, 4,4',4''-tris(benzoiloxifenil)metila, 3-(imidazol-1-ila)bis(4',4''- dimetoxifenil)metila, 1,1-bis(4-metoxifenil)-1'-pirenilmetila, 9-antrila, 9- (9-fenil)xantenila, 9-(9-fenil-10-oxo)antrila, 1,3-benzoditiolan-2-ila, benzisotiazolila S,S-dióxido, trimetilsilila (TMS), trietilsilila (TES), tri- isopropilsilila (TIPS), dimetilisopropilsilila (IPDMS), dietilisopropilsilila (DEIPS), dimetiltexilsilila, t-butildimetilsilila (TBDMS), t-butildifenilsilila (TBDPS), tribenzilsilila, tri-p-xililsilila, trifenilsilila, difenilmetilsilila (DPMS), t-butilmetoxifenilsilila (TBMPS), formato, benzoilformato, acetato, cloroacetato, dicloroacetato, tricloroacetato, trifluoroacetato, metoxiacetato, trifenilmetoxiacetate, fenoxiacetato, p- clorofenoxiacetato, 3-fenilpropionato, 4-oxopentanoato (levulinato), 4,4-(etilenoditio)penta-noato (levulinoilditioacetal), pivaloato, adamantoato, crotonato, 4-metoxicrotonato, benzoato, p-fenilbenzoato, 2,4,6-trimetilbenzoato (mesitoato), carbonato de alquilmetila, carbonato de 9-fluorenilmetila (Fmoc), carbonato de alquiletila, carbonato de alquila 2,2,2-tricloroetila (Troc), carbonato de 2-(trimetilsilila)etila (TMSEC), carbonato de 2-(fenilsulfonila)etila (Psec), carbonato de 2- (trifenilfosfonio)etila (Peoc), carbonato de alquilisobutila, carbonato de alquilvinila, carbonato de alquilalila, carbonato de alquila p-nitrofenila, carbonato de alquilbenzila, carbonato de alquil-p-metoxibenzila, carbonato de alquil-3,4-dimetoxibenzila, carbonato de alquil-o- nitrobenzila, carbonato de alquila p-nitrobenzila, tiocarbonato de alquil- S-benzila, carbonato de 4-etóxi-1-naftila, ditiocarbonato de metila, 2- iodobenzoato, 4-azido-butirato, 4-nitro-4-metilpentanoato, o- (dibromometil)benzoato, 2-formil-benzenossulfonato, 2- (metiltiometóxi)etila, 4-(metiltiometóxi)butirato, 2- (metiltiometoximetil)benzoato, 2,6-dicloro-4-metilfenoxiacetato, 2,6- dicloro-4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenoxiacetato, 2,4-bis(1,1- dimetilpropil)fenoxiacetato, clorodifenilacetato, isobutirato, monosuccinoato, (E)-2-metil-2-butenoato, o-(metoxicarbonil)benzoato, α-naftoato, nitrato, N,N,N',N-tetrametilfosforodiamidato de alquila, N- fenilcarbamato de alquila, borato, dimetilfosfinotioila, 2,4- dinitrofenilsulfenato de alquila, sulfato, metanossulfonato (mesilato), benzilsulfonato e tosilato (Ts).
3. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que (a) cada X1 é -N-; e/ou (b) cada X2 é -N-; e/ou (c) X3 é -NR-; e/ou (d) Xa é -O-; e/ou (e) Xb é -O-; e/ou (f) Xa1 e Xb1 são -C(R)-; e/ou (g) um de Xc e Xd é oxigênio e o outro de Xc e Xd é oxigênio ou enxofre; e/ou (h) Xe e Xf são ambos oxigênio; e/ou (i) R1 é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, -ORa, -SR, -N(R)2, e C1-12 alifático ou C1-4 alcóxi-C1-4 alqui substituídos ou não substituídos; e/ou (j) R2 é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, -ORa, -SR, -N(R)2, e C1-12 alifático ou C1-4 alcóxi-C1-4 alquila substituídos ou não substituídos ; e/ou (k) cada R3, R5 e R7 é selecionado independentemente a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halogênio e C1-6 alifático substituído ou não substituído; e/ou (l) cada um de R4 e R6 é selecionado independentemente a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, e -N(R)2; e/ou (m) R8 e R9 são hidrogênio; e/ou (n) R10 e R11 são hidrogênio; e/ou (o) R é hidrogênio.
4. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que: R1 é -OH; e/ou R2 é -OH; e/ou Ra é R; e/ou cada R3, R5, e R7 é hidrogênio; e/ou R4 e R6 são cada um-NH2.
5. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que: o Anel A é selecionado do grupo consistindo em:
Figure img0043
X3 é -C(R)2- ou -NR-; Xa e Xb são independentemente -C(R)2-, -O-, -S-, -S(O)-, ou -S(O)2-; Xa1 e Xb1 são independentemente -C(R)-; Xc e Xd são independentemente oxigênio, enxofre, um átomo de nitrogênio substituído, BH3 ou C1-12 alifático substituído ou não substituído, desde que um ou ambos de Xc e Xd seja enxofre, um átomo de nitrogênio substituído ou BH3; cada R1 e R2 é, independentemente, selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, -CN, -ORa, - N(R)2, -OC(O)R, -OC(O)N(R)2, e C1-12 alifático substituído ou não substituído; cada R3, R4, R5, R6, R7, R10 e R11 é, independentemente, selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, -CN, -OR, -SR, -N(R)2, -C(O)R, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, e C1-6 alifático substituído ou não substituído; cada R é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, C1-6 alifático substituído ou não substituído ou fenila substituída ou não substituída; e o subíndice dos átomos de carbono aos quais cada R8 e R9 está ligado é 0.
6. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anel A é selecionado do grupo consistindo em:
Figure img0044
cada X1 e X2 é, independentemente, -CR- ou -N-, em que cada R é independentemente hidrogênio ou C1-6 alifático; X3 é -NH-; Xa e Xb são, independentemente, -O- ou -S-; Xa1 e Xb1 são, independentemente, -CH-; Xc e Xd são independentemente oxigênio, enxofre, um átomo de nitrogênio substituído, BH3 ou C1-12 alifático substituído ou não substituído, desde que um ou ambos de Xc e Xd seja enxofre, um átomo de nitrogênio substituído ou BH3; cada Xe e Xf é -O-, -S-, ou -NH-; cada R1 e R2 é, independentemente, selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, -CN, -ORa, N(R)2, em que cada R é independentemente hidrogênio ou C1-6 alifático, C1-12 alifático não substituído, e C1-12 alifático alifático substituído com um ou mais de halogênio, -OR, e -N(R)2; cada R3, R4, R5, R6, R7, R10 e R11 é, independentemente, selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, -CN, -OR, em que cada R é hidrogênio ou C1-6 alifático, -SR em que R é hidrogênio ou C1-6 alifático, -N(R)2 em que cada R é independentemente hidrogênio ou C1-6 alifático, -C(O)N(R)2 em que R é independentemente hidrogênio ou C1-6 alifático, -N(R)C(O)R em que R é hidrogênio, C1-6 alifático ou fenila, C1-12 alifático não substituído, e C1-12 alifático substituído com um ou mais de halogênio, -OR°, e - N(R°)2; cada R10 e R11 é independentemente hidrogênio ou C1-2 alquila; Ra é um grupo protetor de oxigênio, hidrogênio ou C1-6 alifático; cada Ro é independentemente hidrogênio ou C1-6 alifático; e o subíndice dos átomos de carbono aos quais cada R8 e R9 está ligado é 0.
7. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anel A é selecionado do grupo que consiste em:
Figure img0045
cada X1 e X2 é independentemente -CH- ou -N; X3 é -NH-; Xa e Xb são independentemente -O- ou -S-; Xa1 e Xb1 são independentemente -CH-; um de Xc e Xd é enxofre e o outro de Xc e Xd é oxigênio ou enxofre; cada Xe e Xf é -O-; cada R1 e R2 é selecionado independentemente do grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, -ORa ou -NH2; cada R3, R4, R5, R6 e R7 é selecionado independentemente do grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, -OR em que R é hidrogênio ou C1-6 alquila, -SR em que R é hidrogênio ou C1-6 alquila, - NH2 e N(H)C(O)R em que R é hidrogênio, C1-6 alquila ou fenil; cada R10 e R11 é independentemente hidrogênio ou C1-2 alquila; Ra é um grupo protetor de oxigênio ou hidrogênio; e o subíndice dos átomos de carbono aos quais cada R8 e R9 está ligado é 0.
8. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que Xc e Xd são ambos enxofre.
9. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo fato de que o composto é de (a) fórmula I-a:
Figure img0046
(b) de fórmula III, IV, V, VI, VII, VIII, ou IX:
Figure img0047
Figure img0048
ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.
10. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3 e 4, caracterizado pelo fato de que o composto é de (a) fórmula II-a:
Figure img0049
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; ou (b) de fórmula X, XI, XII, XIII, XIV, XV ou XVI:
Figure img0050
Figure img0051
ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.
11. Composto de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que é de fórmula II-a,
Figure img0052
Figure img0053
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que cada X1 é -N-; cada R3 e R5 são hidrogênio; cada R4 é -NH2; Xa e Xb são cada um O; Xe e Xf são cada um O; R1 e R2 são OH; Xa1 e Xb1 são CH; R10 e R11 são hidrogênio; e R8 e R9 são hidrogênio.
12. Composto de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que Xc é oxigênio ou enxofre; e/ou Xd é oxigênio ou enxofre; e/ou o subíndice do átomo de carbono ao qual R8 está ligado é 0; e/ou o subíndice do átomo de carbono ao qual R9 está ligado é 0.
13. Composto de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que é de fórmula II-a,
Figure img0054
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que
Figure img0055
cada X1 é -N-; cada R3 e R5 são hidrogênio; cada R4 é NH2; Xa e Xb são cada um O; Xc e Xd, são cada um enxofre; Xe e Xf são -O-; R1 e R2 são -OH; Xa1 e Xb1 são -CH; R10 e R11 são hidrogênio; e o subíndice dos átomos de carbono aos quais cada R8 e R9 está ligado é 0.
14. Composto, caracterizado pelo fato de que é:
Figure img0056
Figure img0057
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo
15. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um composto:
Figure img0058
Figure img0059
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
16. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
17. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 ou composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento ou prevenção de câncer.
18. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, ou composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento ou prevenção de uma doença, distúrbio ou condição imune, em que a doença, distúrbio ou condição imune é selecionado do grupo que consiste em lúpus eritematoso sistêmico, síndrome de Sjogren e síndrome de Aicardi-Goutières.
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