BR112015026384B1 - Método para produzir peptídeo recombinante (peoi) ou proteína de interesse (proi) - Google Patents

Abstract

MÉTODOS PARA A EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS E PEPTÍDEOS. A presente invenção se refere ao campo da biologia molecular, expressão de proteína e peptídeo recombinante e se relaciona a métodos compreendendo sequências de ácido nucleicos compreendendo alócritos de T1SSs ou fragmentos dos mesmos para a produção eficiente de PeOIs ou PrOI recombinante. Os alócritos ou fragmentos dos mesmos melhoram a expressão do PeOI ou PrOI como IB e função como marcadores-IB.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção situa-se no campo da biologia molecular, peptídeo recombinante e expressão da proteína e refere-se a métodos que compreendem as sequências de ácidos nucleicos de substratos / alócritos dos sistemas de secreção do tipo 1 ou fragmentos destes para a produção eficiente de peptídeos e proteínas recombinantes de interesse. Os alócritos ou seus fragmentos melhoram a expressão de peptídeos e de proteínas de interesse na forma de corpos de inclusão (IB) e funcionam como marcadores-IB.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Nos últimos anos, a produção de proteína recombinante/ enzima foi utilizada em processos industriais que tornou cada vez mais importante e espera-se que logo muitos processos industriais envolvam tecnologias recombinantes. Atualmente, os peptídeos bioativos e as proteínas são utilizados como agentes de cura em uma variedade de doenças, tais como diabetes (insulina), infecções virais e leucemia (interferon), doenças do sistema imunológico (interleucinas), e deficiências de célula vermelhas do sangue (eritropoietina) para nomear alguns. Além disso, são necessárias grandes quantidades de proteínas e peptídeos para várias aplicações industriais, incluindo, por exemplo, a indústria de celulose e papel, têxteis, indústria alimentícia, de cosméticos, cuidados pessoais, refino de açúcar, tratamento de águas residuais, produção de bebidas alcoólicas e como catalisadores para a geração de novos produtos farmacêuticos.

[003] No entanto, a expressão de peptídeos e proteínas recombinantes é ainda limitada, como são necessários grandes esforços, a fim de se obter os desejados peptídeos e proteínas com uma dobra nativa, em elevada quantidade e pureza elevada.

[004] Geralmente, a purificação do produto é cara e, especialmente, a etapa final para 100% de pureza tende a aumentar os custos de forma exponencial porque as proteínas com características similares são difíceis de separas umas das outras (Hacking, A.J. (1986) Aspectos econômicos da biotecnologia, Cambridge University Press).

[005] Em muitos casos, é útil para expressar a proteína ou o peptídeo na forma insolúvel, particularmente quando o peptídeo de interesse (PeOI) ou proteína de interesse (PrOI) é bastante curto, normalmente solúvel, e/ou sujeito a degradação proteolítica no interior da célula hospedeira.

[006] A produção de peptídeo em forma insolúvel tanto facilita a recuperação simples e protege o peptídeo a partir da degradação proteolítica indesejável. Um dos meios de produzir o peptídeo em forma insolúvel é produzir de forma recombinante o peptídeo como parte de um peptídeo/proteína de fusão insolúvel, incluindo no peptídeo de fusão em pelo menos um marcador de solubilidade (por exemplo, um marcador de corpo de inclusão (IB)) que introduz a formação de IB. Tipicamente, a proteína de fusão é concebida para incluir pelo menos um peptídico clivável ligante de modo que os PeOI ou PrOI podem ser subsequentemente recuperados a partir de uma proteína de fusão. A proteína de fusão pode ser concebidas para incluir a pluralidade de marcadores-IB, ligantes de peptídeos cliváveis, e regiões que codificam o PeOI ou PrOI.

[007] Proteínas de fusão compreendendo um marcador de peptídeo que facilita a expressão de proteínas insolúveis são bem conhecidos no estado da arte. Tipicamente, a porção marcadora da proteína quimérica ou de fusão é grande, aumentando a probabilidade de que a proteína de fusão seja insolúvel. Exemplos de grandes peptídeos tipicamente usados para incluir, mas não estão limitados acetil-transferase (Dykes et al., (1988) Eur. J. Biochem., 174:411), β- galactosidase (Schellenberger et al., (1993) Int. J. Proteína Peptídeo Res., 41 :326; Shen et al., (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 281 :4627; e Kempe et al., (1985) Gene, 39:239), glutationa-S-transferase(Ray et al., (1993) Bio/Tecnologia, 11 :64 e Hancock et al. (WO94/04688)), o N- terminais de L-ribulocinase (U.S. Pat. No. 5,206,154 e Lai et al., (1993) Antimicrob. Agentes & Chemo.), 37: 1614, proteína gp55 bacteriófago T4 (Gramm et al., (1994) Bio/Tecnologia, 12: 1017), isomerase da proteína bacteriana cetoesteróide (Kuliopulos et al., (1994) J Am. Chem. Soc. 116:4599 and in U.S. Pat. No. 5,648,244), ubiquitina (Pilon et al., (1997) Biotecnol. Prog., 13:374-79), proquimosina bovina (Haught et al., (1998) Biotecnol. Bioengenharia. 57:55-61), e bactericida / proteína indutora da permeabilidade ("BPI"; Better, M. D. and Gavit, P D., U.S. Pat. No. 6,242,219). O estado da técnica está repleto de exemplos específicos desta tecnologia, veja, por exemplo, a U.S. Pat. No. 6,037,145, ensinam que os identificados que protege a proteína quimérica expressa a partir de uma protease específica; U.S. Pat. No. 5,648,244,ensina que a sínteses de uma proteína de fusão possuindo um marcador e um agente de ligação clivável para uma fácil purificação da proteína desejada; e U.S. Pat. Nos. 5,215,896; 5 302,526; 5,330,902; e publicação de Pedido de Patente U.S. No. 2005/221444, descriminando a função do marcador de fusão contendo composições de aminoácidos especificamente concebidos para aumentar a insolubilidade da proteína quimérica ou peptídeo.

[008] No entanto, os métodos conhecidos no estado da técnica não proporcionam uma solução para redobrar o PeOI ou PrOI. Assim, há ainda a necessidade na técnica de métodos que permitam a produção melhorada de um PeOI ou PrOI recombinante.

[009] Os presentes inventores verificaram que os métodos compreendendo sequências de ácidos nucleicos que compreendem fragmentos de gene hemolisina A (HlyA) ou lipase A (LipA) supera a necessidade da técnica anterior. Ambos os genes são parte de um sistema de secreção do tipo 1 (T1SS), que ocorrem principalmente em bactérias Gram- negativas e exporta os seus substratos cognatos em uma única etapa a partir do citosol para o meio extracelular, sem a formação de intermediários de substâncias Periplasmática.

[010] Entre a família de T1SS o Hly T1SS descrito por Bakkes et al. envolvendo HlyA como um substrato de transporte é de particular interesse, uma vez que transporta a chamada GG repete com a sequência de consenso GGxGxDxUx (x: quaisquer resíduos de aminoácido, U: resíduos de aminoácido grande hidrofóbicos) (Ostolaza, H. et al., (1995) Eur J Biochem 228, 39-44). Essas repetições GG ligam íons Ca2+ com alta afinidade. Este evento de ligação ocorre após a secreção do T1SS alócrito para o exterior, onde a concentração de Ca2+ é elevada (até a faixa mM) em comparação com a concentração de Ca2+ para dentro das células (nM alta). Os Ca2+ para as repetições de ligação GG catalisa a dobra dos alócritos na conformação ativa nativa e íons Ca2+ para agir como um auxiliar de dobra /chaperones (Jumpertz, T. et ai, Microbiologia 156, 24952505, DOI:. Mic.0.038562- 0 [pii]). Outros componentes do HlyA T1SS da E. coli são a proteína da membrana interior HlyB, que é um transportador de cassete (ABC) de ligação de ATP, a proteína da membrana externa (OMP) TolC e a proteína de fusão de membrana (MFP) HlyD na membrana interna.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[011] Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de produção de um PeOI ou PrOI recombinante, em que o método compreende: (a) introduzir uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão que compreende pelo menos um PeOI ou PrOI, e pelo menos um alócrito de um T1SS ou seu fragmento, em uma célula hospedeira, em que a célula hospedeira não expressa um transportador ABC heterólogo, um MFP heterólogo e/ou um OMP heterólogo da T1SS;(b) cultivar as células hospedeiras sob condições que permitem a expressão da proteína de fusão, em que a proteína de fusão é expressa em forma de IB; (c) isolar a proteína de fusão recombinante a partir das referidas células hospedeiras; e (d) submeter a proteína de fusão recombinante a condições que permitem que os PeOI ou PrOI dobrem em uma conformação tridimensional funcional.

[012] Em várias modalidades, o alócrito de um T1SS é selecionado a partir de um grupo que consiste em HlyA, CyaA, EhxA, LktA, PILktA, PasA, PvxA, MmxA, LtxA, ApxIA, ApxIIA, ApxIIIA, ApxIVA, Apxl, ApxII, AqxA, VcRtxA, VvRtxA, MbxA, RTX cytotoxin, RtxLl, RtxL2, FrhA, LipA, TliA, PrtA, PrtSM, PrtG, PrtB, PrtC, Apr A, AprX, ZapA, ZapE, Sap, HasA, colicin V, LapA, ORF, RzcA, RtxA, XF2407, XF2759, RzcA, RsaA, Crs, CsxA, CsxB, SlaA, SwmA, S111951, NodO, PlyA, PlyB, FrpA, FrpC e seus fragmentos.

[013] Em modalidades preferidas, o alócrito de um T1SS pode ser HlyA compreendendo ou consistindo de uma sequência de aminoácidos conforme estabelecidos na SEQ ID NO:2, um fragmento ou um polipeptídio que tem pelo menos 80% da sequência de identidade da sequência dos aminoácidos da SEQ ID NO:2 ou a um de seus fragmentos.

[014] Em modalidades mais preferidas, o fragmento de HlyA consiste na sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO:4 ou um polipeptídio que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

[015] Em várias modalidades, o meio de expressão compreende 20,0 mM ou menos de Ca2+.

[016] Em outras modalidades, a presente invenção refere-se a um método em que a expressão do gene transportador endógeno ABC, o gene MFP endógeno e/ou o gene da OMP endógeno da T1SS ou a atividade dos produtos dos genes correspondentes na célula hospedeira é inibido ou o transporte é ineficiente.

[017] Em outras várias modalidades, a célula hospedeira não expressa transportador ABC endógeno, MFP endógeno e/ou OMP endógeno do T1SS.

[018] Em ainda outras modalidades, o peptídeo ou a proteína recombinante podem ser expostos a um tampão de recobrimento, em que o tampão de recobrimento compreende, pelo menos, 0,01 mM de Ca2+.

[019] Em várias modalidades dos métodos da invenção, (I) a célula hospedeira é uma célula procariótica; e/ou (II) a expressão é realizada em meio de uma cultura mínimo; e/ou (III) o peptídeo ou a proteína de fusão recombinante é purificado utilizando um método selecionado a partir de cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iônica, cromatografia de fase reversa, cromatografia por exclusão de tamanho, e suas combinações; e/ou (IV) o método compreende uma etapa (e) adicionar de contatar a proteína de fusão recombinante com a protease adequada para a clivagem da proteína de fusão para se obter o alócrito e os PeOI ou PrOI como moléculas separadas e/ou (V) o método compreende uma etapa (e) tal como definido em (IV), seguido por purificação dos PeOI ou PrOI.

[020] Em ainda outras modalidades, a presente invenção também se relaciona com um método em que pelo menos um PeOI ou PrOI é selecionado a partir do grupo que consiste em nisina, HCRF, IFABP, IFNA2, PAM, o peptídeo 101, peptídeo 102, peptídeo 103, MAB- 40 Mab-42, Fuzeon®, calcitonina de salmão, calcitonina humana, peptídeos 1, 238, 239, 240 ou 241.

[021] Além disso, a molécula de ácido nucleico que codifica a proteína de fusão compreende ainda uma sequência nucleotídica reguladora que modula a expressão da proteína de fusão em modalidades adicionais.

[022] Entende-se que todas as combinações das modalidades acima descritas também se destinam a cair dentro do escopo da presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[023] A Figura 1 mostra uma representação esquemática de algumas das construções de plasmídeo utilizado.

[024] A Figura 2 mostra um gel insolúvel de SDS-PAGE (15%) e as frações solúveis de lisados celulares de IFABR e MBP (e as mutações indicadas dos mesmos) fundido com o terminal N de HlyAl/ HlyAc (Figura 2). As amostras foram carregadas em um SDS-PAGE e coradas com cor Azul Brilhantes de Coomassie (CBB). A Figura 2B mostra amostras de lisados celulares de E. coli que expressam as proteínas de fusão de HlyAl e indicou PrOI ou PeOI, em que a PrOI ou PeOI são C-terminais fundidos em HlAly, analisadas por SDS-PAGe e visualizado por coloração com BCC. A figura 2C representa um SDS-PAGE (15) das frações solúveis e insolúveis após a disfunção celular de células produtoras de peso IFABP (codificada pelo plasmídeo pQE-IFABP em peso) ou HlyAl- IFABP em peso (codificado por plAR_207). O produto de uma degradação solúvel de HlyAl-IFABP em peso é indicado. A figura 2D mostra a expressão de peptídeo 238, 239, 240 e 241 fundidos com HlyAl e demostra que a expressão de peptídeos 240 e 241 sem falha de proteína de fusão HlyAl.

[025] A figura 3 mostra os experimentos de HlyAl ser redobrada na presença de EDTA ou de Ca2+ e aplicada a uma IMAC e SEC. A: Na presença de Ca2+, HlyAl, que leva um N terminal de His6-tag, foi carregado para o IMAC (faixa esquerda) e as proteínas ligadas foram eluídas com um gradiente de imidazole. B: análise SEC (Superdex 75 10/300 coluna, GE Healthcare) HlyAl de fluído a partir da IMAC. C e D: HlyAl foi analisada por IMAC e SEC, na presença de EDTA.

[026] A Figura 4 mostra experimentos de HlyAl-nisina ser redobrada quer na presença de Ca2+ ou de EDTA, concentrada e aplicada a um SEC. A: Fração de HlyAl-nisina insolúvel (“pelete”) e solúvel (“sobrenadante”) após a redobra na presença de Ca2+ e frações de eluição de análise de SEC. B: Fração de HlyAl-nisina insolúvel (“pelete”) e solúvel (“sobrenadante”) após a redobra na presença de EDTA e frações de eluição de análise de SEC. C: cromatografias SEC de A e B. D: HlyAl-nisina foi incubada com fator Xa (NEB), as amostras da mistura foram colhidas em diversos pontos no tempo (0, 20, 40, 60, 90, 120 min da esquerda para a direita), carregado de um gel de SDS-PAGE e corados com CBB. E: cromatografias de HPLC de nisina de referência (linha superior) e nisina que foi produzido com a tecnologia inventada (linha inferior). F: Análise de SDS- Page com frações de eluição de HPLC. Faixa da esquerda: reação fator Xa, após 90 min, outras faixas: frações de eluição de HPLC. As setas indicam as posições de nisina e HlyAl.

[027] A figura 5 mostra as experiências de redobra da LipAl-nisina na presença de Ca2+ e de EDTA. A LipAl-nisina foi produzida com IBS em E. coli e IBS isolados foram redobradas na presença de Ca2+ ou de EDTA. Na presença de Ca2+, pura e solúvel LipAl-nisina foi produzida em um estado homogêneo. Em contraste, a LipAl-nisina foi agregada na presença de EDTA. A e B: a análise de SDS-PAGE de frações de eluição de SEC e da correspondente cromatografia de SEC-LipAl nisina redobrada com Ca2+. C e D: LipAl-nisina foi redobrada na presença de EDTA e analisada como descrito em A e B.

[028] A figura 6, mostra análises de peptídeos codificados por pIAR_215, pIAR_220, pIAR_221, pIAR_222 e pIAR_223 e experiências de redobra de peptídeo expresso (codificados por plAR_220, pIAR_222 e pIAR_223) na presença de Ca2+ e EDTA. As proteínas indicadas foram produzidas como IBS em E. coli e IBs isolados foram redobrados com a presença de Ca+ ou EDTA. A: a análise de SDS-PAGE de amostras simples indicadas. B-G: a análise SEC de proteínas indicadas redobradas.

[029] A figura 7 mostra a produção de HCHF. A: IBS de HlyAl-HCRF, codificado pelo plasmídeo pIAR_202, foram redobradas que na presença de Ca2+ ou de EDTA. B: HlyAl- HCRF redobrado, na presença de Ca2+, foi incubada com Fator Xa, durante 10 min, 40 min e 120 min. As setas indicam a posição de HlyAl-HCRF, HlyAl e HCRF, respectivamente. HlyAl-HCRF redobrado, em tampão contando Ca2+ ou qualquer EDTA, foi aplicado para análise de SEC e de frações de eluição foram analisadas por SDS-PAGA.C: as cromatografias de eluição da análise SEC acima mencionado. D: gel SDS-PAGE corado com CBB após a análise SEC de HlyAl-HCRF redobrado na presença de Ca2+. E: gel SDS-PAGE corado com BCC após análise SEC de HlyAl-HCRF redobrado na presença de EDTA. As setas indicam a posição de HlyAl-HCRF. HlyAl-HCR foi redobrada na presença de Ca2+, incubados com o Fator Xa, durante 2 h e a mistura de digestão foi purificada com HPLC. F: A cromatografia de HPLC. G: gel de SDS-PAGE de frações de eluição de HPLC corado com CBB. As setas indicam a posição de HCRF.

[030] A figura 8 mostra a produção e os estudos funcionais de HlyAl -IF ABP. A análise SEC de HlyAl -IF ABP redobrado. A e C: gel de SDS-PAGE de frações de eluição a partir da análise de SEC HlyAl -IF ABP redobrado com Ca2+ e cromatografia de eluição de SEC. B e D: o gel de SDS-PAGE de frações de eluição a partir de análise de SEC HlyAl -IF ABP redobrada com EDTA e cromatografia de eluição de SEC. E: HlyAl -IF ABP purificado em presença quer de Ca2+ ou EDTA foram incubados com o Fator Xa e proteínas simples foram analisadas com SDS-PAGE em pontos de tempos indicados. As setas indica a posição de IF ABP. F e G: Estudos funcionais de HlyAl-IFABP usando experiências com titulação com DAUDA. F: HlyAl-IFABP foi redobrada na presença de Ca2+ e purificada por SEC. DAUDA foi titulada para HlyAl-IFABP, a fluorescências a 500 nm foi registrada e representada graficamente em função da concentração de DAUDA. A faixa preta representa a curva do ajustamento teórico. G: As mesmas experiências como em F foram repetidas com HlyAl-IFABP purificado na presença de EDTA.

[031] A figura 9 mostra a produção de HlyAl-IFNA2. A: a análise de SDS-PAGE de HlyAl-IFNA2 redobrada na presença de arginina 0,5 M. O secretado IFNA2-HlyAl serviu de referência para a proteína oxidada contendo títulos bissulfetos ligada (faixa da esquerda). Na ausência de DTT, HlyAl-IFNA2 migra na mesma altura em exceção como referência. Em contraste, HlyAl-IFNA2 na presença de DTT migra mais lentamente. Estes resultados indicam a formação de pontes bissulfeto dentro do HlyAl-IFNA2 redobrado. B e C: análises de SEC HlyAl-IFNA2 após redobrado na presença de Ca2+ e de EDTA, respectivamente. B: A redobra na presença de Ca2+. C: redobra na presença de EDTA.

[032] A figura 10 mostra a experiência de ligação de HlyAl-MBP redobrada e a resina amilose. A HlyAl-MBP foi expressa em E. Coli (faixa “lisado celular”) e IBS de HlyAl-MBP foram preparados (faixa “denat. HlyAl- MBP”), desnaturado e redobrado na presença de Ca+. Alguns HlyAl - MBP precipitados durante a redobra (faixa “precipitada”) e HlyAl-MBP solúvel (pista "redobrada") foi carregada para resina amilose. A HlyAl-MBP ligada a amilose e nenhuma proteína permaneceu dentro do escoamento. Após a lavagem, HlyAl-MBP foi eluída por maltose (faixa "eluição").

[033] A figura 11 mostra a produção de peptídeo 101, 102 e 103. A: Expressão de HlyAl fundido aos peptídeos 101, 102 e 103. B-D: esquema de purificação de HlyAl fundido aos peptídeos 101, 102 e 103. As células que expressam as proteínas de fusão correspondentes foram quebradas e os lisados celulares (faixa “lisado celular”) foram centrifugados. Sem as proteínas de fusão eram visíveis às frações solúveis (faixa ”fração solúvel”) e as proteínas de fusão agregadas como IBS. IBS foram desnaturadas (Faixa ”desnat. IBS”) e redobradas na presença de Ca2+. As proteínas de fusão foram eficientemente redobradas com Ca2+ (“peptídeo redobrado 10x”) e não há proteínas precipitadas (“pélete”). As renaturação das proteínas de fusão foram incubadas com Fator Xa e peptídeos 101, 102 e 103 foram separados a partir de HlyAl (faixa “fator Xa”). Um produto de clivagem inesperada ocorreu em todos os casos (ver na faixa ”+ fator Xa”).

[034] A figura 12 mostra as experiências de digestão do Fator Xa com o peptídeo 103 fundido com HlyAl-R210D (codificado pelo plasmídeo pIAR_112). As IBS redobradas (faixa “-”) foram incubadas com o Fator Xa (“+”) e as amostras foram analisadas por SDS-PAGE. Nenhum produto de clivagem ocorreu inespecífico (em comparação com os resultados mostrados na Figura 11).

[035] A Figura 13 mostra a produção de Fuzeon®. HlyAl - Fuzeon® foi redobrada na presença de Ca2+ (A) ou EDTA (B) e carregou-se em uma coluna de Superdex 75 16/60. As setas indicam a posição do HlyAl-Fuzeon®. C: HlyAl-Fuzeon® foi redobrada na presença de Ca2+ e incubada com o Fator Xa, durante 10 min, 40 min e 120 min. As setas indicam a posição dos produtos de clivagem HlyAl e Fuzeon®.

[036] A figura 14 mostra as experiências de IBS de HlyAl M88A-Met-peptídeo 103 que foram desnaturados e incubados com CNBr por períodos indicados. As amostras foram analisadas por SDS-PAGE. O produto de clivagem HlyAl M88A-Met é visível no gel. Nenhum produto inespecífico de clivagem foi obtido. Uma vez que o peptídeo 103 não foi corado pela CBB (presumivelmente devido ao seu peso molecular relativamente pequeno), que foi purificado por HPLC e sequenciado por espectrometria de massa. Usando este método, o peptídeo 103 foi identificado.

[037] A Figura 15 mostra as análises de HlyAl M88A-Met-peptídeo 3 em culturas de fermentação em lote e a expressão. As células de E. coli que transportam pIAR_115 plasmídeos foram incubadas em culturas descontínuas (faixa da esquerda), ou pela fermentação com glicose (faixa do meio) ou glicerol (faixa da direita) como alimentador. As densidades celulares elevadas (>50) foram obtidas por fermentação com glicose e glicerina na alimentação animal.No entanto, a glicose parece reprimir a expressão da proteína de fusão sob condições utilizadas. Na presença de glicerol, em contraste, densidades celulares elevadas e elevados níveis de expressão foram conseguidos.

[038] A figura 16 mostra a análise de secreção de diferentes peptídeos fundidos para HlyAl. A: análise de secreção de peptídeo fundidos 101, 102 e 103 com HlyAl. Os PeOI foram fundidos no C-terminal para HlyAl (plasmídeos pIAR_101, pIAR_102 e pIAR_103) e co-expressa com HlyB e HlyD (pK184-HlyBD). O lisado celular e amostras sobrenadantes foram analisados por SDS-PAGE. B: Análise de secreção de HlyAL-Mab40.As células expressam HlyAl-Mab40 e, se indicado por um +, HlyB e HlyD (a partir do plasmídeo pK184-HlyBD). Além disso, a influência de IPTG e defletores (arejamento) diferentes para a expressão e secreção são investigados. Após o crescimento celular, o lisado celular e as amostras de sobrenadante foram analisados por SDS- PAGE. Os peptídeos analisados fundidos no C-terminal para HlyAl foram eficientemente segregada pela T1SS dedicado.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[039] Os termos utilizados aqui têm, salvo indicações em contrário, os seguintes significados.

[040] “Pelo menos um”, tal como aqui utilizado, refere- se a um ou mais, em particular 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais.

[041] O “isolado” ou “isolamento”, como aqui indiferentemente utilizado em relação a uma molécula, significa que as referidas moléculas tenham sido pelo menos parcialmente, separadas de outras moléculas que estão naturalmente associados com a referida molécula. O “isolado”, pode significar que a molécula tenha sido purificada para separá-lo de outros componentes e moléculas, tais como outras proteínas e ácidos nucleicos e fragmentos celulares que podem ter origem a partir de uma célula hospedeira.

[042] O “ácido nucleico” tal como aqui utilizado inclui todas as formas naturais de ácidos nucleicos, tais como DNA e RNA. De preferencia, as moléculas de ácidos nucleicos são DNA. A “identidade da sequência do ácido nucleico” tal como aqui utilizado, significa que o resíduo em uma dada posição é idêntico à que está em uma posição correspondente de um ácido nucleico de referência. A identidade da sequência de ácido nucleico preferida da presente invenção é de 80%, mas preferido 90% ou ainda mais preferido 95%.

[043] O termo “fragmento”, tal como aqui utilizado em ligação uma molécula de ácido nucleico, refere-se a uma sequência de ácido nucleico que está em comparação com a sua sequência de ácido nucleico de referência encurtado na extremidade 3’ e 5’ ou mais nucleotídeos terminais. O encurtamento ocorre na extremidade de 3', e 5'ou ambos de modo que a cadeia contígua de nucleotídeos da sequência de referência permaneça. O fragmento tem de preferência um comprimento de pelo menos 20, mais preferencialmente pelo menos 50 nucleotídeos.

[044] O termo “peptídeo” é usado ao longo das especificações para designar uns polímeros com resíduos de aminoácidos ligados uns aos outros por ligações peptídicas. Um peptídeo de acordo com a presente invenção tem 2-100 resíduos de aminoácidos.

[045] O termo “proteína” e “polipeptídio” são utilizados indiferentemente ao longo do fascículo para designar um polímero de resíduos de aminoácidos ligados uns aos outros por ligações peptídicas. Uma proteína ou polipeptídio de acordo com a presente invenção tem, de preferência 100 ou mais resíduos de aminoácidos.

[046] Os termos “proteína de interesse”, “PrOI” ou “peptídeo de interesse”, “PeOI”, tal como aqui utilizado, referem-se a qualquer produto do gene que é expresso através da expressão recombinante. O termo “um peptídeo ou proteína de interesse” tal como aqui descrito abrange qualquer peptídeo ou proteína naturalmente ou que não ocorre naturalmente. Em algumas modalidades, o PeOI ou PrOI é um peptídeo não natural / sintético ou proteína. Sintético, neste contexto, significa que a sequência do peptídeo ou proteína tem sido concebida artificialmente. Assim, uma sequência que codificando um PeOI ou PrOI pode compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica para um, dois ou mais peptídeos ou proteínas ocorrendo naturalmente. Estes peptídeos ou proteínas que ocorrem naturalmente podem ter sido adicionalmente modificados, por exemplo, por mutagênese da sequência que codifica.

[047] O termo “um fragmento N-terminal” refere-se a uma sequência de peptídeo ou proteína que é, em comparação com uma sequência de peptídeo de referência ou proteína C- terminal truncada, de tal modo que um polímero de aminoácidos contígua a partir do N-terminal do peptídeo ou proteína permaneça. Em algumas formas de modalidade tais fragmentos podem ter um comprimento de pelo menos 10 aminoácidos.

[048] O termo “um fragmento C-terminal” refere-se a uma sequência de peptídeo ou proteína que é, em comparação com uma sequência de peptídeo de referência ou proteína N- terminal truncada, de tal modo que um polímero de aminoácidos contígua a partir do C-terminal do peptídeo ou proteína permaneça. Em algumas formas de modalidades, tais fragmentos podem ter um comprimento de pelo menos 10 aminoácidos.

[049] O termo “proteína de fusão”, tal como aqui utilizado diz respeito a peptídeos e proteínas que são Nou C-terminais ligados uns aos outros. Tais proteínas de fusão podem ser codificadas por sequência de ácidos nucleicos que são operacionalmente fundidos uns com os outros. Em determinadas modalidades, uma proteína de fusão refere-se a pelo menos um PeOI ou PrOI C-terminal fundido com uma cadeia de polipeptídio de acordo com a invenção, por exemplo, uma cadeia de polipeptídio compreendendo HlyA ou um fragmento ou um homólogo deste.

[050] Geralmente, versado na técnica entende que, para colocar a presente invenção em prática, qualquer sequência de nucleotídeo aqui descrita pode ou deve compreender um início adicional e/ou códon de terminação ou que um início e/ou códon de terminação de qualquer das sequências aqui descritas podem ou devem ser supridas, dependendo da construção de ácido nucleico utilizado. Versado na técnica irá basear esta decisão, por exemplo, no fato de uma sequência de ácidos nucleicos compreendida nas moléculas de ácido nucleico da presente invenção consistem em ser traduzido e/ou a ser traduzido como uma proteína de fusão.

[051] O termo “introdução”, no que diz respeito a uma molécula de ácido nucleico, tal como aqui utilizado, refere-se à absorção e incorporação de DNA exógeno em uma célula hospedeira. Tal absorção da molécula de ácido nucleico pode depender da competência natural da célula hospedeira ou em métodos de transfecção, tais como eletroporação ou transformação de cloreto de cálcio, que são bem conhecidos na arte.

[052] O termo “célula hospedeira”, tal como aqui utilizado refere-se a um organismo que alberga a molécula de ácido nucleico ou um vetor que codifica os PeOI ou PrOI recombinantes. Em formas de realizações preferidas, a célula hospedeira é uma célula procariótica. Em modalidades mais preferidas da célula hospedeira é E. coli, que podem incluir, mas não está limitada a BL21, DH1, DH5a, DM1, HB101, JMlOl-110, K12, Rosetta (DE3) pLysS, com certeza, TOP10, XII-Azul, XL2 cepas -blue e XLIO-azuis.

[053] Os termos “de expressão” ou “expresso”, como aqui indiferentemente utilizado, referem-se a um processo no qual a informação a partir de um gene é utilizado para a síntese de um produto de gene. Em sistemas de expressão baseados em células a expressão compreende os passos de transcrição e tradução.

[054] O termo “expressão recombinante”, como aqui utilizado, refere-se à transcrição e tradução de um gene exógeno em um organismo hospedeiro. O DNA exógeno refere-se a qualquer ácido desoxirribonucleico que se origina for à do referido organismo. O termo “heterólogo”, tal como aqui utilizado em relação à proteína refere-se a uma proteína que é expressa a partir de um DAN exógeno. Isto também inclui as proteínas que são expressas a partir de sequências de ácidos nucleicos que são idênticos às sequências de ácidos nucleicos endógenos e que foram duplicados artificialmente.

[055] O termo “produção”, como aqui utilizado em relação a um peptídeo ou proteína recombinante, significa que um peptídeo ou proteína recombinante é expresso em uma célula hospedeira e é subsequentemente isolado a partir de outras moléculas da célula hospedeira.

[056] A “cultura”, “cultivar” ou “cultivação”, tal como aqui utilizado, refere-se ao crescimento de uma célula hospedeira em um meio de cultura especialmente preparada sob condições controladas. Os termos “condições adequadas para a expressão recombinante” ou “condições que permitem a expressão” referem-se a condições que permitem a produção da PrOI em uma célula hospedeira através de métodos conhecidos pela arte, em que as células cultivadas sob de meios definidos e condições de temperatura. O meio pode ser nutriente, mínimo, seletivo, diferencial ou meio enriquecido. De preferência, o meio de cultura mínimo. O crescimento e expressão de temperatura da célula hospedeira podem varias desde 4°C até 45°C. De um modo preferido, o crescimento e expressão de temperatura de intervalo de 30° C até 39°C. O termo “meio de expressão”, tal como aqui utilizado refere-se a qualquer um dos meios acima, quando eles são utilizados para o cultivo de uma célula hospedeira durante a expressão de uma proteína.

[057] O termo “submeter”, tal como aqui utilizado, significa que vários componentes, por exemplo, proteínas e um tampão, são postos em contato.

[058] O termo “corpos de inclusão” ou “IB”, como aqui indiferentemente utilizado, refere-se a agregados nucleares ou citoplasmáticos de substâncias, por exemplo, proteínas. Os Ibs não são dissolvidos e tem uma membrana de lipídeo não-unidade. No método da presente invenção, o Ibs consiste principalmente da proteína de fusão que compreende pelo menos um PeOI ou PrOI e pelo menos um alócrito de T1SS ou seu fragmento.

[059] Os termos “substratos” ou “alócrito”, como aqui indiferentemente utilizado, referem-se a um soluto que pode ser uma carga de T1SS. O substrato ou alócrito uma proteína que contém os motivos de sequência de peptídeo específico, tais como GG e repete o sinal de secreção, que permitem o transporte por meio do T1SS.

[060] Os termos “Tipo 1 de sistema de secreção” ou “T1SS” como aqui utilizado referem-se a um complexo de proteínas que consiste em três subunidades de proteína: uma proteína transportadora ABC, um MFP, e uma OMP. Os transportadores de ABC são proteínas transmembranases que utilizam a energia da adenosina trifosfato (ATP) por hidrólise para realizar certos processos biológicos, incluindo translocação de vários substratos através das membranas. As famílias de proteínas de fusão MFP como proteínas auxiliares ou “adaptadoras”, que ligam um carregador primário na membrana citoplasmática de uma bactéria gram-negativa com um fator de proteína de membrana externa que atua com uma porina ou com função de um canal de membrana externa. Por isso, o complexo de proteína tripartido permite o transporte de várias moléculas, tais como íons, drogas e proteínas para passar a membrana interna e externa de bactérias Gram-negativas. Um subgrupo de substrato de T1SS são RTX (repetições de toxina) toxinas.

[061] O termo “conformação tridimensional funcional” tal como aqui utilizado em relação à proteína refere-se à estrutura de uma proteína que permite que a referida proteína tenha uma atividade específica, tais como a catálise do substrato, a localização específica de proteínas ou de interação com outras proteínas que é pelo menos 5%, 10%, 20%, 40%, ou 50%, ou mais preferencialmente pelo menos 80%, ou menos de preferencia 100% das atividades da mesma proteína na sua conformação nativa. A conformação tridimensional funcional requer geralmente que a proteína seja solúvel. A conformação nativa de uma proteína é a sua forma apropriadamente dobrada e/ou montadas, que é operativa e funcional. O estado nativo de uma biomolécula pode possuir todos os quatro níveis de estrutura biomolecular, com o secundário na estrutura quaternária sendo formado a partir de interações fracas ao longo da espinha dorsal covalentemente ligada. Isto está em contraste com o estado desnaturado, em que estas interações fracas são interrompidas, o que conduz à perda dessas formas de estrutura e retendo apenas a estrutura primária da biomolécula.

[062] O termo “inibir”, com aqui utilizado, refere-se a uma redução detectável e significativa da atividade da proteína ou atividade de expressão do gene causada por uma molécula efetora. Os métodos para detectar a atividade da proteína ou da expressão dos genes são conhecidos na arte.

[063] A presente invenção refere-se aos métodos que compreendem as sequências de ácidos nucleicos de substratos/ alócritos do tipo 1 de sistemas de secreção ou fragmentos destes para a produção eficiente de peptídeos e proteínas recombinantes de interesse. Os alócritos ou seus fragmentos melhora a expressão dos peptídeos e das proteínas de interesse na forma de corpos de inclusão (IB) e funcionam como Marcadores-IB. Mais importante, os seus fragmentos e alócritos permitem a renaturação eficiente dos corpos de inclusão em uma conformação tridimensional funcional. Portanto, os alócritos ou seus fragmentos combinam as vantagens dos Marcadores-IB e a solubilidade dos marcadores, sem as desvantagens correspondentes.

[064] O sistema de secreção do Hly é um sistema de secreção de proteínas, que ocorre na maior parte das bactérias Gram-negativas. Este sistema de secreção pertence à família de T1SS, que transportam os seus substratos de forma de ATP conduzido em um passo único a partir do citosol para o espaço extracelular, sem uma estação intermediária no periplasma. O sistema de secreção Hly compreende HlyB, o que representa um transportador ABC, o MFP HlyD, e o universal OMP TolC. A 110 kDa toxina hemolítica HlyA é um substrato de transporte do sistema de secreção Hly. No nível genético, os componentes necessários para a secreção específica-HlyA são organizados em uma estrutura operon. A sequência de ácido nucleico que codifica para HlyA através do sistema de secreção Hly. A HlyC catalise de acilação de HlyA, o que torna HlyA hemolítica. A HlyA é uma proteína, que consiste em 1024 resíduos de aminoácidos e requer, para a sua exportação por meio do sistema de secreção do Hly suas extremidades C- terminal compreendendo cerca de 10-60aminoácidos chamados sinal de secreção. Além disso, a HlyA é caracterizada por um domínio rico compreendendo de várias glicinas (GG) que repete (GGXGXDXUX, em que X pode ser qualquer aminoácido, L é um grande ácido hidrofóbico, localizado no amino N- terminal do sinal de secreção). A repetição GG são características das repetições em toxinas (RTX) da família. A repetição GG liga o Ca2+ que induz a dobrar. Assim, na ausência de Ca2+ do domínio compreendendo a repetição GG é desestruturada. A sequência de aminoácidos de uma proteína HlyA é apresentada na SEQ ID NO: 2, tal como codificada pela sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID N:1. Um fragmento de HlyA, que foi expressa em níveis elevados em comparação com o tipo selvagem de HlyA faltando à parte N-terminal de HlyA (figura 1) foi nomeado HlyAl. A sequência de aminoácidos de HlyAl é apresentada na SEQ ID NO: 4 enquanto que a sequência de codificação nucleotídica é apresentada na SEQ ID NO:3.

[065] A presente invenção baseia-se na descoberta surpreendente dos inventores de que um PeOI ou PrOI fundido com pelo menos um alócrito de um T1SS ou um fragmento leva à expressão da proteína de fusão na forma de IB mesmo se os PeOI não conjugados ou PrOI só é expresso em uma forma solúvel. Além disso, foi encontrado pelos presentes inventores que o Ca+ provoca a dobra do IB desnaturado das proteínas de fusão que são constituídas pela alócrito e os PeOI ou PrOI em uma conformação tridimensional solúvel e funcional. Portanto, os alócritos ou fragmentos dos mesmos são marcadores bifuncionais que combinam as vantagens de Marcadores-IB (alto rendimento, elevada pureza inicial, imunidade contra a degradação proteolítica) e de marcadores solubilidade (produtos bioativos solúveis), sem as desvantagens correspondentes (marcadores de corpo de inclusão: agregados, produtos não ativos; marcadores de solubilidade: baixo rendimento, de baixa pureza, propenso à degradação proteolítica).

[066] Assim, em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para a produção de um PeOI recombinante ou PrOI, em que o método compreende: (a) introdução de uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão que compreende pelo menos um PeOI ou PrOI, e em pelo menos um alócrito de T1SS ou um fragmento, em uma célula hospedeira; (b) cultivar a célula hospedeira sob condições que permitem a expressão da proteína de fusão, em que a proteína de fusão seja expressão sob a forma de IB; (c) isolamento da proteína de fusão recombinante a partir das referidas células hospedeiras. Outras modalidades pode compreender o passo (d) de submeter à proteína de fusão recombinante a condições que permitem que os PeOI ou PrOI dobrem em uma conformação tridimensional funcional. Em várias outras modalidades do primeiro aspecto, a célula hospedeira não expressa um transportador ABC heterólogo, um MFP heterólogo e/ou OMP heterólogo da T1SS.

[067] Em várias modalidades, estes aspectos da invenção também incluir alócritos de um T1SS que são selecionados a partir do grupo que consiste de HlyA, CyaA, ehxA, lktA, PILktA, PASA, PvxA, MmxA, LtxA, ApxIA, ApxIIA, ApxIIIA, ApxIVA, Apxl , ApxII, AqxA, VcRtxA, VvRtxA, MbxA, RTX citotoxina, RtxLl, RtxL2, FrhA, LipA, TliA, PrtA, PrtSM, PRTG, PRTB, PRTC, APRA, APRX, ZapA, ZAPE, Sap, Hasa, colicinas V, Lapa , ORF, RzcA, RTXA, XF2407, XF2759, RzcA, RSAA, Crs, CsxA, CsxB, slaa, SWMA, S111951, Nodo, plya, PlyB, FrpA, FRPC, similar a FRPC ou outros alócritos T1SS, conforme descrito no Linhartova et al . (Linhartova, I. et al., FEMS Microbiol Rev 34, 1076-1112, FMR231 [pii] 10,1111 / j.l574-6976.2010.00231.x) e seus fragmentos. Em várias modalidades preferidas, os alócritos são caracterizados pela presença de pelo menos uma repetição da sequência GG consenso GGxGxDxUx (em que X pode ser qualquer aminoácido, L é um hidrófobo, amino ácido grande).Em modalidades mais preferidas, o alócrito de um T1SS é HlyA que compreende ou consiste de sequências de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO:2, seu fragmento ou um polipeptídio que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2 ou seu fragmento. Em outras modalidades diferentes do fragmento de HlyA consiste na sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO:4 ou um polipeptídio que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:4.

[068] Em várias modalidades, este aspecto da invenção também inclui as sequências de homólogas de métodos de antemão das SEQ ID NO:1-4. O termo “homologado” ou “homólogo”, tal como aqui utilizado refere-se a uma sequência de polinucleotídeos ou polipeptídios que tem uma alta semelhança ou elevada identidade de sequência (por exemplo, 70%, 80%, 90%, 95%, 97,5%, 99% ou mais) como outro peptídeo ou sequência polinucletídica ou parte dela. No que diz respeito à molécula de ácido nucleico acima, os termos homólogos incluem assim as sequências de ácidos nucleicos que tem pelo menos 70, preferivelmente 80, mais preferivelmente 90, ainda mais preferivelmente 95, 97,5 ou 99% de identidade de sequência com a sequência de nucleotídeos da primeira sequência de ácido nucleico, tal como definido acima. A identidade de sequência pode ocorres ao longo de um trecho contínuo de nucleotídeo ou pode ser descontínua.

[069] Em várias modalidades o primeiro aspecto da invenção, o alócrito de um T1SS pode ser fundido com o C- terminal dos PeOI ou PrOI. Em outras várias modalidades do primeiro aspecto, o alócrito pode ser fundido com o N- terminal do PeOI ou PrOI.

[070] Em modalidades, o meio de expressão compreende 20,0mm ou menos de Ca2+. Em uma modalidade mais preferida da concentração de Ca2+ no meio de expressão é de 0,1mm ou menos.

[071] Em várias modalidades, a expressão do gene transportado endógeno ABC, o gene endógeno MFP e/ou gene endógeno da OMP T1SS ou a atividade dos produtos dos genes correspondentes na célula hospedeira é inibida. Em várias modalidades, a célula hospedeira endógena transportadora de ABC não expressa, MFP endógena e/ ou OMP endógeno do T1SS. Os métodos para inibir a expressão de genes, tais como a sua deleção ou inserção de sequências de nucleotídeos que destroem a integridade da sequência do promotor ou do gene em si são conhecidos na arte. A atividade preferida da expressão do gene após a eliminação ou troca pode ser inferior a 35%, 30%, 25%, 15%, 10% ou 5% da atividade medida em células não tratadas. Em outras modalidades da invenção, o transportador ABC endógeno, p MFP endógeno e/ou a OMP endógena do sistema de secreção do tipo 1 são inibidas por anticorpos ou inibidores de pequenas moléculas. Em modalidades preferidas da invenção, a atividade do transportador ABC é inibida por ortovanato ou um inibidor de ATP homóloga como o 8-azido-ATP. Esses ATP miméticos são conhecidos na arte. A atividade preferida da proteína após o tratamento inibidor pode ser inferior a 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% ou 5% da atividade medida em células não tratadas. Em outras modalidades da invenção, o transporte é inibido ou bloqueado pela própria alócrito, por exemplo, por excessiva expressão dos alócritos ou a ligação do peptídeo e proteínas de fusão.

[072] Em outras modalidades, o peptídeo ou proteína recombinante é exposto a um tampão de recobrimento, em que o tampão de recobrimento compreende pelo menos 0,01, mais preferivelmente 0,01-40 mM de Ca2+.

[073] Em várias modalidades dos métodos da invenção, (I) a célula hospedeira é uma célula procariótica; e/ou (II) a expressão é realizada em meio de cultura mínima; e/ou (III) o peptídeo de fusão recombinantes ou a proteína é purificada utilizando um método selecionado a partir da cromatografia de afinidade, cromatografia de troca de íons, cromatografia de fase reversa, cromatografia de exclusão de tamanho, e as suas combinações; e/ou (IV) o método compreende o passo adicional (e), o contato da proteína de fusão recombinante com uma protease adequada para a clivagem da proteína de fusão para obter a alócrito e os PeOI oi PrOI com moléculas separadas; e/ou (V) o método compreende de passos (e) tal como definidos em (IV)seguida por purificação dos PeOI ou PrOI.

[074] Em ainda outra modalidade, a presente invenção também se relaciona com um método em que pelo menos um PeOI ou PrOI é selecionado a partir do grupo que consiste em nisina, HCRF, IFABP, IFNA2, PAM, o peptídeo 101, peptídeo 102, peptídeo 103, MAB- 40 Mab-42, Fuzeon®, calcitonina de salmão, calcitonina humana, peptídeo inibidor 1, 238, 239, 240 ou 241.

[075] A molécula de ácido nucleico que codifica a proteína de fusão compreende ainda uma sequência nucleotídica reguladora que modula a expressão da proteína de fusão em várias modalidades. Uma sequência de ácido nucleico reguladora preferida é apresentada na SEQ ID NO:39. O termo “Sequência nucleica” que estão localizadas 5’ de um gene e aumentar a atividade do referido gene de expressão.

[076] Os termos “tag de afinidade”, como aqui utilizado refere-se a entidades, que estão acoplados aos PeOI ou PrOI e permitir o enriquecimento marcados dos PeOI ou PrOI, utilizando um receptor de tag de afinidade. O termo “cromatografia de afinidade”, como aqui utilizado refere-se à formação do complexo de peptídeo marcado ou proteína receptora. Em certas modalidades marcadores de afinidade pode ser selecionadas a partir do grupo que consistem em Strep-Tag® ou Strep-Tag® II, o myc-tag, o FLAG-tag, a His- tag, o pequeno modificador ubiquitina-like (Sumo) tag , o covalente ainda peptídeo NorpD dissociáveis (CYD) tag, a cadeia pesada da proteína C (HPC) tag, o peptídeo de ligação a calmodulina (CBP) tag, ou HÁ-tag ou proteínas tais como proteína de ligação a estreptavidina (SBP), de ligação à maltose proteína (MBP) e glutationa-S- transferase.

[077] O termo “local de clivagem de protease” refere-se ao peptídeo de sequência que pode ser clivada por uma protease selecionada permitindo assim a separação das sequências peptídicas ou proteicas, que estão interligados por um sítio de clivagem de protease. Em certas modalidades, o sítio ativo de clivagem de protease é selecionado no grupo consistindo um fator Xa, um vírus protease-(TEv), um enteroquinase-, um protease- SUMO expresso, um IgA-Protease-, uma proteinase Arg-C -, um endopeptidases-Asp-N, uma endopeptidase-Asp-N + N-terminal Glu-, um caspasel-, um caspase2-, um caspase3-, um caspase4, um caspase5, um caspase6, um caspase7, um caspase8, um caspase9 , um caspaselO, uma especificidade de alta quimotripsina, uma specificity- quimotripsina-baixo, um clostripaína (Clostridiopeptidase B) -, um endopeptidase- glutamilo, uma granzymeB-, um pepsin-, um - endopeptidase- prolina, uma proteinase K, uma estafilocócica I- peptidase, uma trombina, um tripsina, e um local de clivagem de Termolisina.

[078] A clivagem química termo refere-se à clivagem de ligações peptídicas causadas por um composto químico. Tais compostos podem incluir, mas não estão limitados a brometo de cianogênio (CNBr) a clivagem C-terminal de resíduos de metionina, BNPS-escatol, NCS ou TFA a clivagem C-terminal para resíduos de triptofano e os íons de Ni2+ de clivagem C-terminal ao tetrapeptídeo S / TXHZ (X e Z podem ser quaisquer resíduos de aminoácido, exceto X = prolina) (Kopera et al., (2012), PLoS ONE 7 (5)).

[079] O “Fundido”, tal como utilizado no contexto da presente invenção, significa que os peptídeos ou proteínas resultantes estão diretamente ligados uns aos outros ou ligados entre si por um ou mais aminoácidos, peptídeos ou proteínas, por exemplo, um ou mais locais de clivagem da protease e/ou tag de afinidade.

[080] Se o PeOI ou PrOI compreende de dois ou mais peptídeos ou proteínas ocorrendo naturalmente, os dois ou mais peptídeos ou proteínas podem ser separados pelo local de clivagem da protease.

[081] Geralmente, qualquer peptídeo ou proteína pode ser escolhida como PeOI ou PrOI. Em certas modalidades, o PrOI é uma proteína que não forma um homo-dimero ou homomultimero. A evasão de peptídeos de auto interação com proteínas ou pode ser vantajoso, se o peptídeo ou a proteína recombinante deve ser segregado para o sobrenadante da cultura de células, pois as formações dos complexos proteicos maiores também podem perturbar uma exportação eficiente de proteína. No entanto, o PrOI também pode ser um peptídeo ou uma proteína, que é uma subunidades de um complexo de peptídeo ou proteína maior. Tal peptídeo ou proteína pode ser isolado opcionalmente após a expressão e secreção e ser adequado para uma reconstituição in vitro do peptídeo ou proteína de múltiplos complexos. Em certas modalidades, o PeOI ou PrOI é um peptídeo com menos do que 100 resíduos de aminoácidos. Se estes peptídeos compreendem de pré- e/ou pós- sequências no seu estado nativo depois da tradução da sequência de ácido nucleico que codifica para o PeOI pode ser manipulado para ser limitado a uma sequência que codifica o peptídeo maduro. Um exemplo de peptídeo é a insulina, por exemplo, insulina humana. A secreção de sobre expressão de peptídeo e proteína é especialmente vantajoso quando o peptídeo ou a proteína é prejudicial para a célula hospedeira. Por essa razão, a presente invenção é particularmente vantajosa para a expressão de lipases e proteases que são conhecidos por serem tóxicos para a célula hospedeira e, assim, a expressão de realização específica da presente invenção.

[082] A União internacional de Bioquímica e Biologia Molecular desenvolveu uma nomenclatura para as enzimas, os números de EC; cada enzima é descrita por uma sequência de quatro números procedidos por “EC”. O primeiro número classifica amplamente a enzima com base no seu mecanismo.

[083] A nomenclatura completa pode ser consultada em http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/.

[084] Desse modo, um PeOI ou PrOI de acordo com a presente invenção podem ser escolhidos a partir de qualquer uma das classes EC1 (oxidoredutases), EC 2 (transferase), EC 3 (hidrolases), EC 4 (liases), EC 5 (isomerases) e EC6(ligases) e suas subclasses dos mesmos.

[085] Em certas modalidades, o PeOI ou PrOI é dependente dos cofatores ou abriga um grupo prostético. Para a expressão de tais proteínas ou peptídeos, em algumas modalidades, o cofator correspondente do grupo prostético ou pode ser adicionado ao meio de cultura durante a expressão.

[086] Em certos casos, o PeOI ou PrOI é uma desidrogenase ou uma oxidase.

[087] No caso do PeOI ou PrOI ser uma desidrogenasse, em algumas modalidades, os PeOI ou PrOI é escolhido a partir do grupo que consiste em álcool desidrogenasses, glutamato desidrogenasses, lactato, desidrogenasses celobiose desidrogenasses, formiato de desidrogenasses e aldeídos desidrogenasses.

[088] No caso do PeOI ou PrOI ser uma oxidase, em algumas modalidades, os PeOI ou PrOI é escolhido dentre o grupo consistindo de oxidorredutases citocromo P450, em particular P450 BM3 e suas mutações, peroxidases, monoxigenases, hidrogenases, oxidases de monoamina, aldeídos oxidases, xantina oxidases, oxidases de aminoácido oxidases, e NADH oxidases.

[089] Em outras modalidades, o PeOI ou PrOI é uma transaminase ou uma quinase.

[090] No caso do PeOI ou PrOI ser uma transaminase, em algumas modalidades o PeOI ou PrOI é escolhido a partir do grupo consistindo de alanina aminotransferases, aspartato aminotransferases, transaminases glutamato-oxalato, transferase histidinol-fosfato e as transaminases histidinol-piruvato.

[091] Em várias modalidades, se o PeOI ou PrOI é uma quinase, ou PeOI ou PrOI é escolhido dentre o grupo consistindo de cinases de nucleotídeos difosfato, quinases de monofosfato de nucleosídeo, piruvato-quinase e glucoquinase.

[092] Em algumas modalidades, se o PeOI ou PrOI é uma hidrolase, o PeOI ou PrOI é escolhido a partir do grupo que consiste em lipases, proteases, amilases, celulases, hidrolases nitrilo, halogenases, fosfolipases e esterases.

[093] Em certas modalidades, se o PeOI ou PrOI é uma liase, o PeOI ou PrOI é escolhido a partir do grupo que consiste em, por exemplo aldolases, liases hidroxintrilo, enzimas dependentes de tiamina, por exemplo, benzaldeído,liases e piruvato descarboxilases.

[094] Em várias modalidades, se o PeOI ou PrOI é uma isomerase, a PeOI ou PrOI é escolhido a partir do grupo que consiste em isómeros e ases mutases.

[095] Em algumas modalidades, se o PeOI ou PrOI é uma ligase, o PeOI ou PrOI pode ser uma DNA ligase.

[096] Em certas modalidades, o PeOI ou PrOI pode ser um anticorpo. Isto pode incluir uma imunoglobina completa ou seu fragmento, imunoglobina que incluem as várias classes e isótopos, tais como IgA, IgD, IgE, IgGl, IgG2a, IgG2b e IgG3, IgM, etc. Seus fragmentos podem incluir Fab, Fv e F(ab')2, Fab',e outros semelhantes.

[097] Também aqui contempladas são terapeuticamente ativas PeOI ou PrOI, por exemplo, uma citosina.

[098] Assim, em certas modalidades do PeOI ou PrOI é selecionado a partir do grupo que consiste citosinas, em particular os interferon humanos ou murinos, interleucinas, fatores estimuladores de colônias, fatores de necrose, por exemplo, fator de necrose tumoral e fatores de crescimento. Em algumas modalidades, se o PeOI ou PrOI é um interferon, os PeOI ou PrOI pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em interferon alfa, por exemplo, alfa-1, alfa-2, alfa-2a, e alfa-2b, alfa-2 , alfa-8, 16-alfa, alfa-21, beta, por exemplo, beta-1, beta-1a, e beta-1b, ou gama.

[099] Em outras modalidades, O PeOI ou PrOI é um peptídeo antimicrobiano, em particular, um peptídeo selecionado a partir do grupo que consiste de bacteriocinas e lantibióticos, por exemplo, nisina, catelicidinas, defensinas e saposinas.

[100] Nas outras modalidades, o PeOI ou PrOI é um peptídeo adesivo com especificidades de superfície distintas, por exemplo, para o aço, alumínio, e outros metais ou especificidades em relação a outras superfícies, como o carbono, cerâmica, minerais, plásticos, madeira e outros materiais biológicos tais como células adesivas ou peptídeos que funcionam em ambientes aquosos em condições de anaeróbicas.

[101] Em outras modalidades, o PeOI ou PrOI tem um comprimento que varia de 2-100 aminoácidos, em que os referidos aminoácidos são selecionados dentre o grupo dos 20 aminoácidos proteogênico. Mas preferencialmente, o referido PeOI ou PrOI são selecionados a partir do grupo de peptídeos ou proteínas que consistem de DYKDDDDKMASMTGGQQMGHHHHHH (SEQ ID NO: 45),MGSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPSGPGGYGPGGP (SEQ ID NO:46),ENREVPPGFTALIKTLRKCKII (SEQ ID NO:47), NL VS GLIE ARK YLEWLHRKLKNCKV (SEQ ID NO:48), HHHHHHIEGRAMSILKSPIDERSILK (SEQ ID NO:49),HHHHHHIEGRPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPG (SEQ ID NO:50), HHHHHHIEGRG APGAPGS QGAPGLQ (SEQ ID NO:51), GGGRGDMGSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPSGPGGYGPGGPRGDGGG (SEQ ID NO:52).

[102] Também são divulgados aqui PeOI ou PrOI, que são terapeuticamente peptídeos ou proteínas ativas. Em certas modalidades, o PeOI ou PrOI é um peptídeo terapeuticamente ativo. Em algumas modalidades, um peptídeo terapeuticamente ativo pode ser selecionado a partir do grupo que consiste de Fuzeon/T20, calcitonina humana, calcitonina de salmão, fator de libertação de corticotropina humano, Mab40, Mab42, os peptídeos associados com a doença de Alzheimer, exenatida, glatiramer /Copaxone, teriparatida / FORSTEO , o romiplostim / Nplate, o pramlintitde / Symlin, timalfasina / ZADAXIN, enfuvirtida, hormônios andrenocorticotropin (ACTH), peptídeo natriurético cerebral, nesiritide / Natrecor, corticoliberin, Sermorelin, somatorelin, secretina (humanos e porcin), terlipressina, sinapultida, teduglutide, VX-001, peptídeo vasoativo intestinal, avipdadil, linaclotidep, e teduglutideo.

[103] Em certas modalidades, o PeOI ou PrOI é um substrato de secreção do tipo 1. Mais do que 1000 ou proteínas são anotados têm sido descritos como substratos de secreção do tipo 1 na literatura. Muitos deles têm características de interessantes para o uso biotecnológico, em hidrolases específicas, como proteases e lipases. As proteases adequadas e lipases têm sido descritos por Baumann et ai. (1993) EMBO J. 12, 3357-3364; e Meier et ai. (2007) J. Biol. CHEM .: 282 (43), pp. 31.477-31.483. O conteúdo de cada um destes documentos é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

[104] Claro que a sequência de ácido nucleico que codifica para pelo menos um PeOI ou PrOI pode ser substituído por mutagênese e assim conduzir a uma PeOI mutado ou PrOI no nível de proteína.

[105] O termo “mutação”, tal como utilizado aqui, refere-se a uma variação da sequência de nucleotídeos e/ou sequência de aminoácidos de uma determinada sequência de nucleotídeos ou proteínas e inclui substituições, deleções, truncados e inserções. Em um especifico exemplo, a mutação é uma mutação de ponto, por exemplo, a substituição de um ou mais nucleotídeos e / ou aminoácidos em uma dada sequência. Entende-se que, o termo “mutação” é usado em relação a uma sequência de proteína, que a sequência de nucleotídeos que codificam a proteína podem compreender múltiplas mutações ou modificações, incluindo mutações silenciosas que, por exemplo, tem a finalidade de aumentar a eficiência da expressão (códon otimizado) sem alterar a sequência de aminoácidos. Na presente invenção, a mutação é preferivelmente a substituição de um ou dois aminoácidos por outros aminoácidos. Em alternativa, ou, além disso, a molécula de ácido nucleico pode compreender trocas de nucleotídeos que não alteram a sequência de proteína, chamada de mutações silenciosas. Em algumas modalidades, as mutações, por exemplo, mutações silenciosas aumentam a expressão e/ou a eficiência da secreção do peptídeo ou da proteína codificada pela molécula de ácido nucleico. Importante, as mutações podem ser introduzidas em toda a molécula de ácido nucleico da presente invenção. Assim, as mutações não podem ser limitadas a sequências que codificam um peptídeo ou proteína. Por isso, também não codificantes trechos da sequência pode ser submetidos à mutagênese. Este tipo de mutação também cai dentro do âmbito do termo mutação silencioso. A mutagênese das sequências não codificadoras podem ser vantajosas, por exemplo, para uma proteína ou uma proteína codificada por uma sequência diferente do estiramento dentro da molécula de ácido nucleico.

[106] O termo “mutagenese”, tal como é utilizado aqui, significa que as condições experimentais são escolhidas de tal modo que o aminoácido que ocorre naturalmente em uma dada posição na sequência de uma sequência da proteína pode ser substituída por pelo menos um aminoácido que não está presente nesta posição específica na respectiva sequência polipeptídica natural. O termo “mutagênese” também inclui a modificação (adicional) do comprimento dos segmentos da sequência por supressão ou inserção de um ou mais aminoácidos. Assim, está dentro do âmbito da invenção que, por exemplo, um aminoácido na posição da sequência escolhida é substituído por uma extensão de três mutações aleatórias, que conduz a uma inserção de dois resíduos de aminoácidos em comparação com o comprimento do respectivo segmento da proteína do tipo selvagem Tal inserção ou deleção podem ser introduzidas de forma independente um do outro em qualquer um dos segmentos de peptídeos que pode ser sujeito a mutagênese no invento.

[107] O termo “mutagênese ao acaso” significa que nenhum aminoácido único predeterminado (mutação) está presente em uma determinada posição, mas que uma sequência de pelo menos dois aminoácidos diferentes pode ser incorporado com certa probabilidade para uma posição pré- definida na sequência durante a mutagênese.

[108] “Códons otimizados” significa que os códons que codificam um resíduo de aminoácido é substituído por um códon diferente que codifica para o mesmo aminoácido, mas sendo mais frequentemente utilizadas por um dado organismos hospedeiro para este aminoácido particular. Entende-se que tais sequências de nucleotídeos que codificam um polipeptídio homólogo pode ter alta variabilidade de sequência de modo que a identidade da sequência entre as moléculas de ácidos nucleicos que codificam os mesmos polipeptídios ou homólogos podem ser baixa.

[109] A sequência de codificação de uma sequência natural da proteína, ou seja, o respectivo segmento de gene de uma enzima, pode ser utilizada como um ponto de partida para a mutagênese das posições de aminoácidos selecionados na presente invenção. Para a mutagênese das posições de aminoácidos referidos, versado na técnica tem à sua disposição diversos métodos standard estabelecidos para a mutagênese direto-local (Sambrook, J. et ai (2001) Molecular Cloning:. A Laboratory Manual, 3a Ed ., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). A técnica utilizada é a introdução de mutações por meio de PCR (reação em cadeia da polimerase) utilizando as misturas de oligonucleotídeos, que apresentam uma composição de base degenerada nas posições da sequência desejada. Por exemplo, a utilização do códon de NNK ou NNS (onde N=adenina, guanina, citosina ou timina; K=guanina ou timina; s=adenina ou citosina) permite a incorporação de todos os 20 aminoácidos mais o códon de terminação âmbar durante a mutagênese, enquanto o códon VVS limita o número de aminoácidos eventualmente incorporados a 12, uma vez que exclui os aminoácidos Cys, He, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr e Val sejam incorporada na posição selecionada na sequência de polipeptídio (V=adenina, guanina ou citosina); utilizando o códon NMS (em que M=adenina ou citosina), por exemplo, restringe o número de aminoácidos possíveis para 11 a uma posição de sequência selecionada, uma vez que não inclui os aminoácidos Arg, Cys, Gly, He, Leu, Met, Fen , Trp, Val seja incorporada em uma posição de sequência selecionada. Outra possibilidade é a utilização de códons NDT ou NDC (em que D=adenina, guanina ou timina), pois isso proporciona uma porção de 1:1 entre o número de códons e os aminoácidos codificados, assim, reduz o esforço de rastreio e leva a um conjunto equilibrado de 12 resíduos de aminoácidos polares, não polares, aromático, não aromático, hidrofílico e hidrofóbico (Arg, Asn, Asp, Cys, Gly, His, He, Leu, Phe, Ser, Tyr, Val (Reetz MT et ai, 2008, ChemBioChem, 21; 9 (11):. 1797-804)).

[110] Em certas modalidades, o PeOI ou PrOI compreende uma deleção de pelo menos 10, 20, 30, 40, 50 ou mais aminoácidos N- e/ou C-terminal em relação ao peptídeo do tipo selvagem ou uma sequência de proteína.

[111] Em várias modalidades, os PeOI ou PrOI são escolhidos dentre os grupos consistindo de MBP, lipase CalB, protease SprP, hidrolase PlaB, hydrolase Plak,hidrolase PlbF, lipase TesA, Vif, interfon humano alfa-1, alfa-2, alfa-8, alfa-16, alfa-21, interfon humano beta, interfone humano gama, interfone murinho alfa, interfone murinho gama, IFABP, Cas2, proteína affibody Za3, nisina, fator de libertação de corticotropina, peptídeo beta-amilóide, exenatida, Fuzeon/t20, calcitonina de salmão, Mab40, Mab42, lipase LipAm SprP, o HIV-1 de proteína Vif e calcitonina humana.

[112] O PeOI ou PrOI pode ser clonado em um vetor. Em certas modalidades, o vetor é selecionado a partir do grupo que consiste de uma fonte de alimentação do vetor, vetor pSU, vetor pET, um vetor pBAD, um vetor pK184, um vetor pMONO, um vetor pSELECT, vetor de marcador pSELECT, um vetor pVITRO, um vetor pVIVO, um vetor pORF, um vetor pBLAST, um vetor pUNO, um vetor pDUO, um vetor pZERO, um vetor pDeNy, um vetor pDRIVE, um vetor pDRIVE-SEAP, um vetor HaloTag®Fusion, um vetor pTARGET™, um vetor Flexi®, um vetor pDEST, um vetor pHIL, um vetor pPIC, um vetor pMET-, um vetor pPink, um vetor pLP, um vetor pTOPO, um vetor pBud, um vetor pCEP, um vetor pCMV, um vetor pDisplay, um vetor pEF, um vetor pFL, um vetor pFRT, um vetor pFastBac, um vetor pGAPZ, um vetor pIZ/V5, um vetor pLenti6, um vetor pMIB, um vetor pOG, um vetor pOpti-, um vetor pREP4, um vetor pRSET, um vetor pSCREEN, um vetor pSecTag, um vetor pTEFl, um vetor pTracer, um vetor pTrc, um vetor pUB6, um vetor pVAXl, um vetor pYC2, um vetor pYES2, um vetor pZeo, um vetor pcDNA, um vetor pFLAG, um vetor pTAC, um vetor pT7, um vetor gateway®, um vetor pQE, um vetor pLEXY, um vetor pRNA, um vetor pPK, um vetor pUMVC, um vetor pLIVE, um vetor pCRUZ, um vetor Duet, e outros vetores ou derivados Em formas de realizações preferidas o vetor é um vetor pSU.

[113] Os vetores da presente invenção podem ser escolhidos a partir do grupo que consiste de alto, médio e baixos vetores de cópia.

[114] Os vetores acima descritos podem ser utilizados para a transformação ou transfecção de uma célula hospedeira, a fim de conseguir a expressão de um peptídeo ou proteína que é codificada por uma molécula de ácido nucleico acima descrita e compreendida do vetor DNA.

[115] A célula hospedeira pode ser especificamente escolhida como uma célula hospedeira capaz de expressar o gene. Além disso, ou de outra forma, a fim de produzir um peptídeo ou uma proteína, um fragmento de peptídeo ou proteína ou uma proteína de fusão do peptídeo ou da proteína com outro polipeptídio, o ácido nucleico que codifica para o peptídeo ou proteína pode ser geneticamente manipulada para a expressão em um sistema adequado. A transformação pode ser realizada utilizando técnicas convencionais (Sambrook, J. et ai. (2001), supra).

[116] Os organismos hospedeiros procariotas ou eucariotas, compreendendo tal vetor de expressão recombinantes de um PeOI ou PrOI como aqui descrito formam também parte da presente invenção. As células hospedeiras adequadas podem ser células procarióticas. Em certas modalidades as células hospedeiras são selecionadas a partir do grupo que consiste de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, tal como E. coli. Em certas modalidades a célula hospedeira é E. coli, particularmente E. coli BL21(DE3) ou outra E.coli K12 ou E. coli B834 ou E. coli DH5a ou XL-1 derivados. Em outras modalidades a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo que consiste em Escherichia coli (E.coli), Pseudomas, Serratia marcescens, Salmonella, Shigella (e outras Enterbacteriaceae), Neisseria, Hemophilus, Klebsiella, Proteus, Enterobacter, Helicobacter, Acinetobacter, Moraxella, Helicobacter, Stenotrophomonas, Bdellovibrio, Legionella, bactérias do ácido acético, Bacillus, células Bacilli, Carynebacterium, Clostridium, Listeria, estreptococos, estafilococos, e Archaea. As células hospedeiras eucariotas adequadas são entre outras células CHO, células de insetos, fungos, células de levedura, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, de S. pombe, Pichia pastoris.

[117] As células hospedeiras transformadas são cultivadas sob condições adequadas para a expressão da sequência de nucleotídeos que codifica um peptídeo ou proteína da invenção. Em certas modalidades, as células são cultivadas sob condições adequadas para a expressão da sequência de nucleotídeos que codifica um PeOI ou PrOI.

[118] Para reproduzir o PeOI ou PrOI recombinante, um vetor é introduzido em um organismo hospedeiro procariótico ou eucariótico adequado por meio de tecnologia de DNA recombinante. Para esta finalidade, a célula hospedeira é transformada com um primeiro vetor que compreende uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção, utilizando métodos standard estabelecidos (Sambrook, J. et ai. (2001), supra). A célula hospedeira é então cultivada em condições que permitem a expressão, do DNA heterólogo e, assim, a síntese do polipeptídio correspondente. Subsequentemente, o polipeptídio é recuperado, a partir da célula.

[119] Para a expressão das proteínas e peptídeos da presente invenção vários protocolos adequados são conhecidos pelo técnico no assunto.

[120] De modo geral, qualquer meio de cultura conhecido adequado para o crescimento do hospedeiro selecionado, podem ser empregues neste método. Em várias modalidades, o meio é um meio rico ou um meio mínimo. Também contemplado aqui é um método, em que os passos de cultivar as células e expressar o peptídeo ou proteína de compreender a utilização de suporte diferente. Por exemplo, o passo de crescimento pode ser realizado utilizando um meio rico, o meio é selecionado a partir do grupo que consiste em meio LB, meio TB, meio 2YT, meio sintético e meio mínimo.

[121] Em algumas modalidades, o meio pode ser suplementado com IPTG, arabinose, triptofano e/ou maltose, e/ ou a temperatura da cultura pode ser alterada e/ou a cultura pode ser exposta a luz UV. Em várias modalidades, as condições que permitem a secreção do peptídeo ou proteína recombinante são as mesmas usadas para a expressão do peptídeo ou proteína.

[122] Em certas modalidades, a célula hospedeira é uma célula procariótica tal como E. coli, em particular, E. coli BL21 (DE3) e E. coli DH5a.

[123] Em algumas realizações, toda a cultura da célula hospedeira, por exemplo, durante o crescimento e expressão, é realizado em um meio mínimo. O meio mínimo é vantajoso para o peptídeo ou a expressão da proteína recombinante, como a proteína, lipídeo, hidrato de carbono, pigmento, e teor de impurezas neste meio é reduzida e, assim, contorna ou reduz a necessidade de passos de purificação extensos.

[124] Além disso, os inventores verificaram que uma suplementação no tampão de recobrimento com sais de minerais alcalino-terroso é vantajoso para sujeitar os recombinantes PeOI ou PrOI para dobrar em um conformação tridimensional funcional. Em algumas modalidades, a concentração final no tampão de recobrimento é pelo menos 0,01 mm. Em certas modalidades, o tampão de recobrimento pode ser completado com pelo menos um sal de metal alcalino-terroso selecionado a partir do grupo que consiste de um sal de magnésio, sal de cálcio, sal de estrôncio, ou sal de bário. Em algumas modalidades, o tampão de recobrimento compreende, pelo menos 0,01 mM de sal de cálcio. A concentração total de, pelo menos, 0,01mM de sal de metal alcalino-terroso pode ser conseguido por meio da combinação de vários sais de metais alcalino-terroso diferente e/ou do mesmo metal alcalino-terroso. Se o metal alcalino-terroso é selecionado a partir de sal de magnésio, salde cálcio, salde estrôncio, ou sal de bário, a composição pode compreender, pelo menos 0,001 mM de um cálcio único, de estrôncio ou de bário, levando a uma concentração total de pelo menos 0,01 mM. Em particular, uma concentração de sal de cálcio de pelo menos 0,01 mM pode ser conseguido por meio da combinação de vários sais de cálcio conduzindo a uma concentração total de pelo menos 0,01 mM. Em certas modalidades, os sais de cálcio são selecionados a partir do grupo que consiste em CaCl2, CaCO3, Ca(OH)2, CaSθ4-2H20, Ca3(PO4)2, Ca(CH3COO)2^H20, e Ca(C2H3O2)2.Em modalidades específicas, o tampão contém íons de pelo menos 0,01 mM de Ca2+. Em várias modalidades a concentração de Ca2+ no tampão de recobrimento é no intervalo de 20-100 mM. Em uma modalidade preferida, a concentração de Ca2+ é de 20 mM.

[125] Em várias modalidades, o método também inclui a purificação do peptídeo ou proteína recombinantes, em que o peptídeo ou proteína recombinante é purificada utilizando um método selecionado a partir da cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iônica, cromatográfica de fase reversa, cromatografia de exclusão de tamanho e suas combinações.

[126] Em várias modalidades, o método pode compreender o tratamento do peptídeo ou proteína recombinante com uma protease adequada para a clivagem de um sítio ativo da protease de um peptídeo ou proteína recombinante. Em algumas modalidades, o peptídeo ou a proteína recombinante é purificado antes da clivagem proteolítica utilizando um ou mais métodos descritos acima. Além disso, após a clivagem do peptídeo ou proteína recombinante, o método pode compreender um passo adicional de purificação tal como definido acima. Assim, em algumas modalidades o peptídeo ou proteína recombinante é purificada, submetido à clivagem proteolítica e os PeOI ou PrOI é ainda purificados. Por meio da introdução de um sítio ativo específico da protease de clivagem entre HlyA ou fragmentos de Hlya e os PeOI (por exemplo, a protease do Fator Xa) ou por clivagem química, a alócrito e os PeOI ou PrOI podem ser separados e PrOI ou PeOI são produzidos sem qualquer aminoácidos adicional/artificial. A clivagem química pode ser processada por cianogenbromida, B-bromossuccinimida, N- clorossuccinimida, BNPS-escatol (3-bromo-3-metil-2-(o- nitrofenilsulfenilo)indolenina) ou íons de Ni2+. Tais métodos são bem conhecidos na técnica.

[127] Após a purificação e/ou a secreção de peptídeos na presente invenção, em particular dos PeOI ou PrOI, o peptídeo ou proteína pode estar fundido a uma porção que se prolonga meia-vida no soro do peptídeo ou proteína. Tais grupos são bem conhecidos na arte e os peritos na arte podem recorrer a uma prática de rotina para identificar as porções adequadas. As porções exemplares incluem, mas não estão limitados a uma parte Fc de uma imunoglobina, um domínio CH3 de uma imunoglobina, um domínio CH4 de uma imunoglobina, albumina ou fragmento de albumina, um peptídeo de ligação da albumina, uma proteína de ligação da albumina, transferrina, uma molécula de poliaquileno- glicerol, amido de hidroxietileno, ácido palmítico e outras moléculas de ácido graxo. A fusão pode ser com a N- ou C- terminal, mas também pode ser a de uma cadeia lateral de aminoácido que é receptivo a tal modificação, incluindo cisteína, lisina, serina, treonina, ácido glutâmico e cadeias laterais do ácido aspártico.

[128] Em várias modalidades, os resíduos de cisteína na sequência polipeptídica da proteína ou do peptídeo presente na invenção, por exemplo, o PeOI ou PrOI, podem ser mutados para outros aminoácidos ou eliminados, por exemplo, para prevenir a formação de pontes de dissulfeto. Em outras modalidades, o peptídeo ou a proteína da presente invenção podem incluir um ou mais aminoácidos que são mutados para resíduos de cisteína para gerar sítios de acoplamento para modificações, por exemplo, para conjugação de outros compostos, tais como polietileno glicol (PEG), biotina, peptídeos ou proteínas, ou para a formação de ligações de dissulfeto que não ocorrem naturalmente. Assim, o método acima descrito pode também compreender o acoplamento de compostos, tais como polietileno glicol (PEG), biotina, peptídeo ou proteínas, ou para a formação de ligações de dissulfeto que não ocorrem naturalmente.

EXEMPLOS Materiais e métodos

[129] As proteínas foram expressas em Escherichia coli BL21 (DE3)(Novagen). Todos os oligonucleotídeos foram adquiridos a Eurofins MWG. Todas as enzimas foram adquiridas a partir de NEB, Clontech, Invitrogen ou Fermentos.

1. Clonagem com In-fusion ND 1.1 Linearização do vetor

[130] O vetor foi linearizado por meio do PCR utilizando oligonucleotídeos recozidos nas posições desejadas, Por exemplo, o plasmídeos o plasmídeo PSU-HlyAl foi amplificado com os oligonucleótidos pSUrev_lin_para (5'-TAATATATTAATTTAAATGATAGCAATCTTACT-3') (SEQ ID NO: 40) e pSUrev_X_rev (5'-TGCTGATGTGGTCAGG-3) (SEQ ID NO: 41). Se desejado, os oligonucleotídeos codificados em um sítio de clivagem da protease, por exemplo, pSUrev_lin_Xa_rev o oligonucleótido (5'-ATCACGGCCAATTGCTGATGTGGTCAGG-3') (SEQ ID NO: 42) codifica um sítio de clivagem do fator Xa (sequência primária: IDGR). Os produtos de PCR foram tratados com Dpnl para destruir o modelo de PCR. Se desejado, os produtos de PCR foram purificados com o kit de purificação de PCR (Qiagen, Hilden) ou por extração de Gel (Qiagen, Hilden).

1.2. As amplificações das inserções

[131] Os genes de interesse foram amplificados por PCR com oligonucleotídeos que se ligam aos gene de interesse e que transportam as saliências 5’ que complementam ao vetor linearizado. Por exemplo, a saliência do oligonucleotídeo (5'-GCAATTGATGGCCGT-3') (SEQ ID NO: 43), era complementar ao oligonucleotídeo pSUrev_lin_Xa_rev, e a saliência do oligonucleótido reverso (5'-TAAATTAATATATTA-3) (SEQ ID NO: 44) era complementar ao oligonucleótido pSUrev_lin_for. Se desejado, os produtos de PCR foram purificados com o kit de purificação de PCR (Qiagen, Hilden) ou por extração por Gel (Qiagen, Hilden).

1.3. Reação com In-fusion HD

[132] A reação foi realizada de acordo com o manual (Clontech).

1.4. Transformação

[133] As células de E. coli foram transformadas com o produto In-fusion, crescidas durante a noite em placas de ágar contendo o marcador de seleção desejado e as colônias individuais foram escolhidas para a preparação dos plasmídeos. As sequências de todos os plasmídeos forma verificadas por sequenciação.

2. Inserção ou deleção de nucleotídeo (s) por PCR e ligação subsequente 2.1 Fosforilação

[134] Os oligonucleotídeos foram encomendados com um 5’-fosfato ou fosforilados nas suas extremidades 5’ com polinucleotídeos-quinase de t4 (NEB) de acordo com o manual.

2.2. Amplificação de plasmídeo

[135] Para a eliminação de nucleotídeo, os plasmídeos foram amplificados por PCR com os nucleotídeos desejados com oligonucleotídeos fosforilados. Pr inserção, os plasmídeos foram amplificados por PCR com os nucleótidos desejados com oligonucleotídeos 5’-fosforilado que realizados os nucleotídeos a ser inseridos na suas extremidades 5’. As reações de PCR foram incubadas com Dpnl a 37°C para destruir o modelo de DNA, o gel-extracted e 50 ng de plasmídeos linearizados foram ligados durante a noite a 4°C com ligases (NEB) e o tampão de reação recomendado. Amostras de ligação foram utilizadas para a transformação de E. coli, os plasmídeos foram isolados e as sequências foram verificadas por sequenciação.

3. Sítio direcionado de mutagênese

[136] A mutagênese foi realizada de acordo com Sítio direcionado Mutagênese Protocolo de (Agilent).

4. A sobre-expressão dos genes de interesse

[137] A E. coli transformada com o plasmídeo pretendido e crescido em meio 2YT a 37°C e agitação. A expressão foi induzida com IPTG 1mM e as células foram cultivadas durante 4h. Tipicamente, a DO600 das culturas foi variando entre 5 e 8. As células foram recolhidas por centrifugação e armazenadas a - 20°C.

5. Preparação de IBs

[138] As células foram ressuspensas em tampão de ressuspenção (10 mM de Tris-HCl, 120 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, pH 7,3) e quebrado por três passagens por meio de um disruptor de células (2,5 kbar (250 MPa), Constant Systems). Os lisados celulares foram centrifugados durante 20 min, 13.500xg, a 4°C, o sedimento foi lavado com o tampão de ressuspenção suplementado com 0,5% de Triton-X- 100 e 1 mM de DTT. Após a centrifugação durante 20 min, 13.500 xg, a 4°C, o sedimento foi lavado com tampão de ressuspensão. Após centrifugação, o sedimento contendo a IBS foi solubilizado / desnaturados a 4°C / a temperatura ambiente em tampão de desnaturação (10 mM Tris-HCl, NaCl 120 mM, ETDA 0,1 mM, glicerol a 10%, 6 M guanidina- cloridrato, / 8 M ureia, pH 7,3). Os IBs desnaturado foram armazenadas a -20°C.

6. Clivagem química com brometo de cianogênio (CNBr)

[139] Os IBs desnaturados foram suplementados com 0,1 N HC1 e o excesso molar de 100 vezes de CNBr (Sigma-Aldrich). A reação foi incubada à temperatura ambiente.

7. Clivagem química de 3-bromo-3-metil-2-(2- nitrofeniltio)-3H-indolo (BNPS-escatol)

[140] Os IBs foram solubilizados em 50% de H2O e de ácido acético a 50% e encubadas com BNPS-escatol (dissolvidos em ácido acético) à temperatura ambiente ou a outras temperaturas. Mais detalhes são descritos na Vestling et ai. (1994) RCM 8, 786-790; e Rahali et ai. (1999) Journal of Chemistry proteína 18, 1-12.

8. Clivagem química com N-clorossuccinimida (NCS)

[141] OS IBs foram dissolvidos em ureia 8M, pH 7,3, e misturou-se com NCS (Dissolvido em ácido acético). Mais detalhes são descritos na Shechter et al. (1976) Biochemistry 15, 5071-5075; e Lischwe et ai. (1977) The Journal of Biological Chemistry 252, 4976-4980.

9. Clivagem química com ácido trifluoroacético (TFA)

[142] OS IBs foram dissolvidos em TFA. Os DMSO e HC1 (37%) foram adicionados para iniciar a reação de clivagem. A mistura da reação foi incubada a temperaturas diferentes. Mais detalhes são descritos na Clivagem química com ácido trifluoroacético (TFA)

[143] IBs foram dissolvidos em TFA. DMSO e HC1 (37%) foram adicionados para iniciar a reação de clivagem. A mistura de reação foi incubada a temperaturas diferentes. Mais detalhes são descritos na Dimarchi et al. (1987) Processo seletivo para clivagem da ligação peptídica, EP0288272A3.

10. A redobra do IBs

[144] Os IBs desnaturados foram diluídos até 0,2 mg/mL em tampão de desnaturação e redobrado, quer enquanto era dialisado contra o tampão de recobrimento (10 mM de Tris- HCl, 120 mM de NaCl, pH 7,3) suplementado com 20 mM de CaCl2 ou EDTA 0,2 mM ou diluindo desnaturado IBs imediatamente em tampão de ressuspensão (suplementado com 20 mM de CaCl2 ou 0,2 mM de EDTA) a 0,2 mg / mL. Os componentes do tampão de recobrimento pode ser alterada e outros tampões (HEPES, CAPS, Bicina, citrato, etc.), os valores de pH que variam de 0-14, concentrações de sal e suplemento adicionais pôde ser utilizados. A concentração de proteína para a redobra pode também ser alterada, por exemplo, variando entre 0,01-20 mg/mL. Os IBs redobrados foram centrifugados durante 20 min, 50.000xg, a 4°C e o sobrenadante foi utilizado para experiências adicionais.

11. A concentração das amostras de proteína

[145] As proteínas foram concentradas por ultrafiltração (dispositivos de filtro Amicon, Milipore) com o desejado peso molecular de corte (MWCO).

12. Cromatografia de afinidade de íons de metal imobilizado (IMAC)

[146] IMACs foram realizadas com sistemas de FPLC (Akta Sistemas, GE Healthcare). As proteínas redobradas, que continham uma cauda de His, foram carregadas para uma coluna do IMAC, equilibrada em tampão de IMAC A MAC A (10 mM de Tris-HC1, KC1 100 mM, 10% glicerol, 10 mM de imidazole, pH 7,3) suplementado com EDTA 0,1 mM ou CaCI2 20 mM. As proteínas foram eluídas com um gradiente linear de 10 a 500 mM de imidazola.

13. Digestão do fator Xa

[147] 50 μg de proteína foram incubadas com 1 μg de fator Xa (NEB), tanto quer a 4°C, 20°C ou 25°C e foram recolhidas amostras a vários pontos de tempo.

14. A cromatográfica de exclusão de tamanho (SEC)

[148] As proteínas foram carregadas em uma coluna de SEC (Superdex 75 16/60, 10/300, Superdex 75, Superdex 200 16/60, Superdex 20010/300, GE Helthcare) equilibrada no tampão correspondente.

15. HPLC

[149] A PR-HPLC analítica foi realizada com um WP LiChrospher 300 RP-18 extremidade tampada na coluna (Merck) a temperatura ambiente. Os IBs redobrados/ desnaturados foram injetados e eluídos por meio da mistura do tampão aquoso A (0% de acetonitrilo, 0,1% (v/v) de ácido trifluoroacético) com o tampão de solvente orgânico B (100% de acetonitrilo, 0,1% (v/v) de ácido trifluoroacético). As proteínas ou peptídeos foram eluídos com um gradiente de 0-100% do tampão B. As cromatografias mostram a absorbância a 220nm. O eluente foi fracionado, recolhido e o solvente foi evaporado.

16. Espectroscopia de fluorescência com DAUDA

[150] Ácido 11-(Dansilamino)undecanóico (Dauda, Cayman Chemical) foi preparado como uma solução-mãe 1 mM em 50% de isopropanol e 50% de tampão (KH2P04 20 mM, EDTA 0,25 mM, pH 7,3) e em seguida diluído para as concentrações adequadas, com tampão. 100 nM de proteína foi usada em tampão e uma cuvete de 1mL de vidro de sílica. O sinal de fluorescência foi registrado a um comprimento de onde de 500nm após excitação a 350 nm, utilizando um Fluorolog®-3 (Horiba) (Kim e Frieden (1998) Protein Sci 7, 1.821-1.828). A largura da fenda foi ajustada para 4,3 nm, para ambos, a excitação e de emissão, e o sinal foi integrado para 0,5s. Os sinais de fluorescência de DAUDA em tampão na ausência de proteína foi subtraída como fundo. Os sinais de fluorescência corrigidos e normalizados foram representados graficamente contra a concentração DAUDA. Os dados foram ajustados utilizando o programa Prism 5.

17. Os ensaios de ligação da resina de amilose

[151] A Redobra HlyAl-MBP foi carregada em uma resina de amilose por fluxo de gravidade e após uma lavagem exaustiva, a proteína foi eluída com tampão de recobrimento contendo 10 mM de maltose.

18. Os Ensaios de secreção

[152] As células de E. coli foram transformadas com os plasmídeos (que codifica o transportador ABC HlyB e HlyD a proteína de fusão de membrana para permitir a montagem da hemolisina um T1SS e as proteínas de fusão de plasmídeo que codifica. PK184 HlyB, D foi anteriormente descrito por Bakkes et al. (2010) JBC, 285 (52):.. 40.573-80 As células foram cultivadas em meio 2xYT suplementado com (30 ug / ml) e ampicilina (100 ug/mL) e CaCl2 a 5 mM durante a noite de 50 ml de meio de crescimento foi inoculado com células de um início OD600 de 0,1. As células foram cultivadas a 37°C e agitação e a expressão foi induzida com IPTG 1 mM a uma DO600 de 0,4-0,6. Após 2-6 h, as culturas foram centrifugadas (20 min, 50,000 x g, 4°C) e amostras de sobrenadante (16 μm) e as células (ODeq = 0,08) foram analisadas por SDS-PAGE e coradas com Coomassie Brilliant Blue (CBB).

19. Sequência do vetor usado e da proteína codificadas pelos vetores usados.

[153] A seguir o DNA foi clonado no esqueleto do plasmídeo PSU.

Exemplo 1: Formação de IBs ou de PeOI ou PrOI que estão no N-terminal ou C-terminal fundido com HlyA ou seus fragmentos

[154] Todos as PrOI ou PeOI indicados fundidos no N- terminal do HlyA ou fragmentos de HlyA (por exemplo HlyAl, ver na figura 1 para um regime de algumas construções) agregados na célula como IBs (figura 2). Notavelmente, IFABP não conjugada é normalmente solúvel no interior das células (Ver na figura 2C). Estes resultados indicam que HlyA e fragmentos de HlyA induz a formação de IBs e transfere essa característica para os peptídeos e proteínas fundidas.

[155] As PrOI ou PeOI fundidos no C-terminal da HlyA ou fragmentos de HlyA (por exemplo HlyAl, ver na figura 1 para uma vista esquemática das construções) foram expressos em E. coli (figura 2C). Assim, HlyA e fragmentos de HlyA forçam a agregação comi IBs de PrOI ou PeOI e fundidos com o seu N- ou C-terminal.

[156] As proteínas de fusão de Hlya ou seus fragmentos peptídicos e oligômeros constituídos por duas, três, quatro, cinco, seis, oito, nove, dez ou mais monômeros de um peptídeo diferente também são expressos como agregados insolúveis no interior das células. A figura 2D mostra a expressão do peptídeo 238 (SEQ ID NO:53) como monômero , trímero (peptídeo 240 [SEQ ID NO:55]) e pentâmero (peptídeo 241 [SEQ ID NO:56]) fundido com HlyAl. Sem a fusão para HlyA, os peptídeos trimericos e pentamericos não foram produzidas pelas células (veja pET16b_240 e pET16b_241). Os peptídeos oligoméricos ou não são expressos no interior das células ou degradados proteoliticamente.

[157] Dados de expressão semelhantes foram obtidos com os seguintes peptídeos fundidos a HlyAl Mab40 (SEQ ID NO: 63), Mab42 (SEQ ID NO: 64), a calcitonina de salmão (SEQ ID NO: 65), calcitonina humana (SEQ ID NO: 60) , peptídeo inibidor 1 (SEQ ID NO: 62) e outros.

Exemplo 2:Purificação e redobra de HlyA e HlyAl

[158] Os HlyA HlyAl foram produzidos em E. coli como IBs. Os Ibs foram redobrados na presença de EDTA ou de CaCl2, respectivamente. As eficiências da dobra foram cerca de 35% com EDTA e não homogêneo, HlyA instável ou HlyAl foram obtidos. Os resultados da figura 3a e B mostra o fragmento HlyAl ou HlyA. Em contraste, mais de90% de HlyA ou HlyAl foram redobradas na presença de Ca2+ e as proteínas foram estáveis e homogêneas (figura 3C e D).

Exemplo 3: A purificação e redobra de HlyAl-nisina

[159] A partir de 5g de células que expressão HlyAl- nisina (codificada pelo plasmídeo pIAR_241), cerca de 140mg bruto de IBS de HlyAl-nisina foram preparados, desnaturados e redobrados. Na presença de EDTA, a maioria da proteína era insolúvel e agregada e apenas pequenas quantidades não homogêneas de HlyaAl-nisina foram produzidas (figura 4 B e C). A redobra com Ca2+, em contraste, produziram uma espécie de proteínas homogêneas com elevada pureza e com rendimento elevados (figura 4 B e C). A eficiência da redobra foi superior a 95% na presença de Ca2+ e abaixo de 25% na presença de EDTA. Após a redobra, a nisina foi separada a partir d HlyAl por proteólise específica no sítio com fator Xa (figura 4 D). Depois de 90 minutos, 100 μm da mistura da reação foi purificada por HPLC (figura 4E). As frações de eluição foram analisadas por análise de SDS-PAGE (figura 4F), Western Blotting e espectrometria de massa (dados não apresentados) e a molécula completa de nisina foi identificado.

Exemplo 4: Purificação e redobra da LipAl-nisina

[160] A lipase A (Lip A) é outra proteína RTX que é secretada por uma T1SS dedicado. A construção comparável a HlyAl-nisina foram clonados em que a nisina oi fundida a um fragmento C-terminal de LipA. Este fragmento de domínio coberto de RTX e o sinal de secreção de LipA (codifica no plasmídeo pIAR_302). Subsequentemente, o LipA-nisina 1 foi produzido em E. coli e a formação do IBs foi examinada. Como mostra na figura 5a, LipAl-nisina forma IBs. Além disso, a redobra de desnaturação LipAl-nisina foi analisada na presença de Ca2+ e de EDTA, respectivamente. AS analyses de SEC de LipAl-nisina redobrada demonstra que a proteína de fusão se comporta semelhante a HlyAl-nisina e Ca2+ que induz a redobra de LipAl-nisina estável, proteína homogênea (figura 5B). Na presença de EDTA, em contraste, LipAL- nisina é menos eficiente e redobrada da maioria das formas agregadas da LipAl-nisina (figura 5C e D). Portanto, HlyA, LipA e provavelmente outros membros da superfamília da proteína RT pode ser utilizada pra produzir PrOI e PeOI como IBs e para redobrar proteínas de fusão pela adição de Ca2+, outros íons metálicos ou condições específicas de redobra.

Exemplo 5: Análise de diferentes fragmentos de HlyA e a sua integridade para induzir a redobra.

[161] O HlyAl-nisina foi truncada por etapas de repetições GG a partir do N-terminal (figura 1) para investigar a influência de cada repetição GG para a formação de IBs e a redobra. As proteínas expressas a partir dos plasmídeos IAR_215, pIAR_220, pIAR_221, pIAR_222 foram investigados. Para examinar a influência da parte C- terminal de HlyAl, pIAR_223 foi concebido. O pIAR_223 corresponde à nisina fundido no C-terminal para todas as 4 repetições de GG HlyAl a que falta a extremidade C-terminal de HlyAl (que inclui o sinal de secreção).

[162] Apenas a proteína expressa a partir do plasmídeo pIAR_222 foi expressa em E. coli em quantidades que eram visíveis na amostras no lisado das células (figura 6 A). No entanto, A IBS de células que expressam as proteínas codificadas por pIAR_215, pIAR_220-223pode ser separado, desnaturado e renaturado, quer com Ca2+ ou EDTA. As proteínas redobradas foram concentradas e analisadas por SEC. A clivagem das proteínas concentradas com fator Xa foi analisada. Apenas os plasmídeos pIAR_220, pIAR_222 e pIAR_223 proteína recombinante produzida em quantidades significativas. Por conseguinte, estas proteínas são consideradas as seguintes interpretações. IBs de proteínas codificadas a partir do plasmídeo pIAR_220 (duas repetições GG), pIAR-222 (sem repetições) e pIAR_223 (apenas quatro repetições GG, nenhuma parte C-terminal de HlyAl) foram produzidas. Portanto, as repetições GG e a porção C- terminal de HlyAl que consiste do sinal de secreção são potentes para induzir a formação de IBS.

[163] A proteína codificada por pIAR_220(duas repetições) foi redobrada e concentrou-se mais eficaz na presença de Ca2+ comparado com o EDTA (figura 6B e C), enquanto que a redobra e a concentração foi comparável eficiente para a proteína codificada pelo pIAR_222 (sem repetição GG) com ambos, o Ca2+ e EDTA. Assim, duas repetições GG permitem aumentar a eficiência de redobra de um modo dependente de Ca2+. A análise SEC de proteínas codificadas por pIAR_220 e pIAR_222 apoiaram estes resultados. A proteína codificada por pIAR_220 mostrou um sinal distinto e simétrica por análise SEC apenas na presença de Ca2+ (figura 6C), ao passo que as cromatográficas de análise SEC com a proteína codificada pelo pIAR_222 são comparáveis, na presença de EDTA e de Ca2+ (Figura 6D e E) e a proteína codificada por pIAR_222 assim não dobram em, um estado homogêneo solúvel. Isso demonstra que as repetições GG são essenciais para a renaturação eficiente.

[164] A proteína codificada por pIAR_223 (4 repetições GG sem a parte C-terminal da HlyAl) elui como um sinal simétrico da SEC apenas na presença de Ca2+. Em contraste, na presença de EDTA a proteína recombinante é expressa a partir de pIAR_223 não homogêneo (figura 6F e G).

Exemplo 6: Purificação e redobra da HlyAl-HCRF

[165] Fora de cerca de 5 g de células, cerca de 200mg de IBs brutos foram purificados por HlyAl-HCRF (codificada pelo plasmídeo pIAR-202) que foram desnaturados em guanidínio-cloridrato e subsequentemente redobrado (figura 7A). A redobra de 40 mg de HlyAl-HCRF na presença de RDTA produziu cerca de 8,4 mg de proteína solúvel, no entanto, a amostra de proteína era instável e não homogêneo (figura 7 C e E). Em contraste, a redobra na presença de Ca2+ rendeu 34mg de proteína solúvel e homogênea (que corresponde a uma taca de redobra de cerca de 85%) (figura 7C e D).

[166] A redobra de hlyAl-HCRF foi digerida com fator Xa (figura 7 G) e a mistura de reação foi purificada por HPLC (figura 7 F). Com esta estratégia, HCRF foi clivada e separa com HlyAl.

Exemplo 7: Produção de IFABP

[167] HlyAl-IFABP (codifica no plasmídeo pIAR_207) e foi expressa a partir de cerca de 6g de células, 205 mg de IBs desnaturadas foram preparadas. HlyAl-IFABP foi redobrada (>65%) na presença de Ca2+ e de EDTA estável, em estado homogêneo (figura 8A-D). Apesar de forçar a agregação de IFABP em Ibs, HlyAl não troca a redobra de IFABP desnaturado in vitro. Com esta estratégia HlyAl-IFABP foi produzida com rendimentos elevados, pureza elevada e uma forma solúvel.Com base na análise de SEC, o efeito positivo de Ca2+ foi negligenciável para renaturação de HlyAl-IFABP, no entanto, a atividade biológica de HlyAl- IFABP é mais elevada na presença de Ca2+ (Figura 8F e G). Portanto, em algumas modalidades de alócrito T1SS ou seus fragmentos como função Marcadores-IB e não interferem na eficiente renaturação de PeOI ou PrOI fundido. A presença de íons Ca2+ aumenta a sua estabilidade e solubilidade, ao aumentar a estabilidade e/ ou do alócrito ou seus fragmentos.

[168] O IFABP foi clivado a partir da HlyAl com fator Xa. 1 μg do fator Xa digerido > 95 μg de 50 HlyAl-IFABP em 3 h a 20°C (Figura 8E).A atividade biológica de HlyAl-IFABP foi examinada com ácido 11-(((5-(dimetilamino)-1-naftalenil)sulfonil)amino)undecanóico (Dauda), um ácido graxo análogo fluorescente (Figura 8F e G). A KD para HlyAl-IFABP redobrado de Ca2+ e de EDTA foram determinadas como sendo 140,8 ± 13,1 nM e 264,3 nM nM ± 13,2 nM, respectivamente. HlyAl-IFABP está demonstrando biológico ativo que a tecnologia desenvolvida permite a produção de proteína ativa e solúvel. A atividade é comparável com os valores da literatura para IFABP (Kd = 20,9 nM ± 0,6 nM).

Exemplo 8: Produção de IFNA2

[169] HlyAl-IFNA2 (codifica pelo menos o plasmídeo pIAR_210) foi expresso em níveis elevados em E. coli 310 mg desnaturadas de Ibs foram purificados a partir de cerca de 5g de células. A redobra de HlyAl-IFNA2 foi realizada na presença de Ca2+ ou de EDTA. ± 3-4% de HlyAl -IFNA2 foi redobrada na presença de ambos os reagentes. A análise de SDS_PAGE com ou sem um agente redutor (DTT) sugeriu um estado de oxidação de HlyAl-IFNA2 após a redobra e, portanto, a formação de ligações de dissulfeto (dados não mostrados). A redobra eficiente foi aumentada para cerca de 100% por meio da adição de 0,5 M de arginina. Novamente, HlyAl não interfere na redobra de IFNA2, e IFNA2 foi produzida com rendimentos elevados com a invenção apresentada. A redobra HlyAl-IFNA2 foi oxidada, como demonstrado na análise de SDS-PAGE na presença e na ausência de DTT (figura 9 A) e biológicos ativos (dados não mostrados).

[170] HlyAl-IFNA2 redobrado na presença de arginina e de Ca2+ era solúvel e homogêneo (Figura 9B). Em contraste, foram observados dois sinais de eluição para HlyAl-IFNA2 redobrado com arginina e EDTA (figura 9 C).Portanto, o redobramento na presença de Ca2+ aumentou a homogeneidade de HlyAl-IFNA2 em comparação com a redobra na presença de EDTA.

Exemplo 9: Produção de MBP

[171] MBP é bem conhecido como o marcador de solubilidade para a expressão de PrOI fundido dentro do E. coli (Nallamsetty, S. & Waugh, DSA (2007) Nat Protoc, 2, 383-391). No entanto, as forças HlyAl a força de agregação de MBP como Ibs e HlyAl-MBP IBs(codificada pelo plasmídeo pIAR_213) foram preparador (figura 10). HlyAl-MBP foi redobrada e concentrou-se na presença de Ca2+. A Análise SEC demonstrou a produção de HlyAl-MBP solúvel (dados não mostrados). As redobras HlyAl-MBP ligado a amilose imobilizada demonstra a funcionalidade biológica de redobra MBP (figura 10).

Exemplo 10: pIAR_101-103- A redobra e a digestão do fator Xa

[172] A proteína de fusão de peptídeos e HlyAl 101, 102 e 103 (codificadas pelo plasmídeos pIAR_101, pIAR_102 e pIAR_103) foram expressas em E. coli como Ibs (Figura 11). Fora cerca de 4,5 g de células 72 mg, 92 mg e 108 mg de Ibs brutos foram preparados.

[173] Os Ibs foram redobrados com Ca2+ para quase 100% e as proteínas foram concentradas (comparadas faixa “pelete” e ”peptídeo redobrado 10X”, figura 11B-D). As proteínas de fusão foram incubadas com o Fator Xa e os PeOI poderiam ser separados do HlyAl. Os peptídeos foram purificados por HPLC. O peptídeo 103 foi identificado por espectrometria de massa (dados não mostrados).

Exemplo 11: Purificação e redobra de HlyAl-Fuzeon®

[174] Fora de cerda de 4 g de células 130 mg de Ibs de HlyAl- Fuzeon® bruto (codificado pelo plasmídeo pIAR_201) foram purificados, que foram desnaturados em guanidínio- cloridrato e subsequentemente renaturada. A eficiência de redobra foi de ± 30% com Ca2+ e ± 11% com EDTA. A análise SEC demonstrada que HlyAl-Fuzeon® só podia ser produzido em um estado solúvel, na presença de Ca2+ (figura 12a e B). A figura 12C mostra os resultados da separação de Fuzeon® proteolítica de HlyAl-Fuzeon® com Fator Xa.

Exemplo 12: A degeneração de um sítio de clivagem para o fator Xa inespecífica em HlyAl

[175] A espectrometria de massa identificou um sítio de clivagem inespecífica para o Fator Xa no HlyAl (sequência primária SYGR, aa207-210). A mutação do tipo selvagem para HlyAl HlyAl-R210D no plasmídeo pIAR_112 foi construído com a finalidade de interromper este sítio de clivagem e para aumentara eficiência da clivagem do fator Xa em sítios de clivagem destinado entre HlyAl e PeOI ou PrOI. A digestão do fator Xa de HlyAl-R210D fundido com o peptídeo 103 indicou que o sítio dos produtos de HlyAl-R210D não foram formados (figura 13).

Exemplo 13: Clivagem química de proteínas de fusão

[176] A clivagem química de ligações peptídicas é bem conhecida na literatura. A aplicabilidade desta abordagem para separar PrOI ou PeOI a partir do marcador bifuncional foi investigada. O Brometo de cianogênio (CNBr), um reagente químico que cliva as ligações peptídicas no C- terminal de resíduos de metionina, BNPs-escatol e, NCS E TFA, reagentes químicos que clivam as ligações peptídicas no C-terminal de resíduos de triptofano , foram escolhidos. Os resíduos de metionina e triptofano individuais dentro do HlyAl foram mutados para alanina (M88A, W109A) e uma mitionina ou triptofano foi colocado no N-terminal para o PeOI ou PrOI. Por exemplo, uma metionina foi adicionada ao N-terminal para o peptídeo 103 (proteína HlyAl M88A-met- peptídeo 3, codificada no plasmídeo pIAR_I15). Tal como mostrado pela análise de SDS-PAGE na figura 14, os peptídeos foram clivados com sucesso fora do HlyAl. A: o peptídeo 103 separado do HlyAl M88A-met por CNBr. A identidade do peptídeo 103 foi confirmado por espectrometria de massa (dados não mostrados). B: cerca de 50% dos peptídeos codificados por pIAR_202w, pIAR_238, pIAR_239, pIAR_240 e pIAR_241 foram clivados a partir de HlyAl por NCS em 3h. pIAR_240 e pIAR_241 são claramente visíveis no gel corado com coomassie (indicado pela seta), enquanto que os outros peptídeos estavam muito pequenos para serem corados. As espécies visíveis acima de 50kDa na amostra o corresponde a dímeros de cisteína com pontes de peptídeos.

Exemplo14: Proteínas de fusão expressas por meio de fermentação HlyAl

[177] O E. coli que transportam os plasmídeos pIAR-115 foi utilizado para fermentação. Quando a glicose foi usada como alimento durante a fermentação, a expressão foi reprimida. Essa repressão pode resultar de uma repressão de Iac que o promotor regula a expressão do plasmídeo pIAR_115 pela glicose. Portanto, o glicerol foi testado como alimento durante a fermentação. Com esta estratégia, mais de 2,5 kg de células úmidas foram produzidas a partir de 10L de caldo de fermentação. Os níveis de expressão de HlyAl M88A-Met-péptido 3 foram comparáveis ou mesmo aumentada para culturas descontínuas (figura 15). Fora de 440g de células (massa celular molhada), foram preparados 65g de Ibs. Portanto pelo aumento da massa celular e/ou os níveis de expressão.

[178] Todos os documentos aqui citados são aqui incorporados por referência na sua totalidade.

[179] As invenções aqui descritas de forma ilustrativa podem ser adequadamente praticadas na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações, não especificamente aqui reveladas. Assim, por exemplo, os termos “compreendendo”, ”incluindo”, “contendo”, etc., devem ser lidas expansivamente e sem limitações. Além disso, os termos e expressões aqui utilizados têm sido usados como termos de descrições e não de limitações, e não há qualquer intenção na utilização desses termos e expressões, de excluir quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou suas porções, mas é reconhecido que são possíveis várias modificações dentro do âmbito da invenção reivindicada. Além disso, deve ser entendido que, embora a presente invenção tenha sido especificamente divulgada por formas de realizações preferidas e características opcionais, modificação e variação dos inventos incorporados nele aqui divulgados podem ser invocadas por aqueles peritos na técnica, e que tais modificações e variações são consideradas como estando dentro do âmbito desta invenção. A invenção foi descrita de forma ampla e genérica aqui. Cada uma das espécies mais estreitas e grupos subgenéricos abrangidos na descrição genérica também fazem parte da invenção. Isto inclui a descrição genérica da invenção com a condição ou limitação negativa removendo qualquer objeto do gênero, independentemente de haver ou não o material retirado, é aqui especificamente recitada. Além disso, onde as características ou aspectos da invenção são descritos em termos de grupos Markush, aqueles especialistas na arte irão reconhecer que a invenção também é, assim, descrita em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo Markush. Outras modalidades da invenção irão tornar-se evidentes a partir das reinvindicações seguinte.

Claims (11)

1. Método para produzir um peptídeo recombinante (PeOI) ou proteína de interesse (PrOI) caracterizado pelo fato de que compreende: (a) introduzir uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína de fusão compreendendo pelo menos um PeOI ou PrOI e pelo menos um alócrito de um sistema de secreção do tipo 1 (T1SS) ou um fragmento do mesmo; em uma célula hospedeira, em que a célula hospedeira não expressa um transportador de cassete (ABC) de ligação de ATP heteróloga, uma proteína de fusão de membrana heteróloga (MFP) e/ou uma proteína de membrana externa heteróloga (OMP) da T1SS, em que o referido fragmento possui um comprimento de pelo menos 50 nucleotídeos; (b) cultivar a célula hospedeira sob condições que permitem a expressão da proteína de fusão, em que a proteína de fusão é expressa na forma de corpos de inclusão (IB); (c) isolar a proteína de fusão recombinante das referidas células hospedeiras; e (d) submeter a proteína de fusão recombinante a condições que permitem o PeOI ou PrOI a dobrar em uma conformação tridimensional funcional.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o alócrito de um T1SS é selecionado do grupo consistindo em HlyA, CyaA, EhxA, LktA, PILktA, PasA, PvxA, MmxA, LtxA, ApxIA, ApxIIA, ApxIIIA, ApxIVA, Apxl, ApxII, AqxA, VcRtxA, VvRtxA, MbxA, citotoxina RTX, RtxL1, RtxL2, FrhA, LipA, TliA, PrtA, PrtSM, PrtG, PrtB, PrtC, AprA, AprX, ZapA, ZapE, Sap, HasA, colicina V, LapA, ORF, RzcA, RtxA, XF2407, XF2759, RzcA, RsaA, Crs, CsxA, CsxB, SlaA, SwmA, S111951, NodO, PlyA, PlyB, FrpA, FrpC.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o alócrito de um T1SS é HlyA compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos, tal como apresentada na SEQ ID NO: 2, ou um fragmento da mesma.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o fragmento de HlyA consiste na sequência de aminoácidos, tal como apresentada na SEQ ID NO: 4.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o meio de expressão compreende 20,0 mM ou menos de Ca2+.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a expressão do gene transportador de ABC endógeno, o gene MFP endógeno e/ou o gene OMP endógeno do T1SS ou a atividade dos produtos do gene correspondente na célula hospedeira é inibida ou o transporte é ineficiente.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira não expressa o transportador ABC endógeno, MFP endógeno e/ou OMP endógeno do T1SS.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que na etapa (d) o peptídeo ou proteína recombinante é exposto ao tampão de recobrimento, em que o tampão de recobrimento compreende pelo menos 0,01 mM de Ca2+.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que: (I) a célula hospedeira é uma célula procariótica; e/ou (II) a expressão é realizada em meio de cultura mínimo; e/ou (III) o peptídeo ou proteína de fusão recombinante é purificado usando um método selecionado de cromatografia por afinidade, cromatografia de troca iônica, cromatografia de fase reversa, cromatografia por exclusão por tamanho e combinação das mesmas; e/ou (IV) o método compreende a etapa adicional (e) de contatar a proteína de fusão recombinante com uma protease adequada para clivagem da proteína de fusão para gerar o alócrito e o peptídeo ou PrOI como moléculas separadas; e/ou (V) o método compreende a etapa adicional (e) da clivagem da proteína de fusão recombinante por tratamento químico para gerar o alócrito e o PeOI ou PrOI como moléculas separadas; e/ou (VI) o método compreende uma etapa (e) como definida em (IV) ou (V) seguida por purificação do PeOI ou PrOI.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que pelo menos um PeOI ou PrOI é selecionado do grupo consistindo de Nisina, HCRF, IFABP, IFNA2, MBP, peptídeo 101, peptídeo 102, peptídeo 103, MAB-40, Mab-42, Fuzeon®, Calcitonina de salmão, Calcitonina humana, inibidor de peptídeo 1, peptídeo 238, tal como apresentado na SEQ ID NO: 53, peptídeo 239, tal como apresentado na SEQ ID NO: 54, peptídeo 240, tal como apresentado na SEQ ID NO: 55 e peptídeo 241, tal como apresentado na SEQ ID NO: 56.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico codificando a proteína de fusão ainda compreende uma sequência de nucleotídeos regulatória que modula a expressão da proteína de fusão.